(57)【要約】  本発明によれば、澱粉を分解し、有効に資化し得るCupriavidus属に属する微生物を提供することができる。  Cupriavidus属に属する微生物由来の分泌シグナルが連結した、αアミラーゼをコードする遺伝子を導入した、Cupriavidus属に属する微生物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Cupriavidus属に属する微生物由来の分泌シグナルが連結した、αアミラーゼをコードする遺伝子を導入した、Cupriavidus属に属する微生物。
【請求項２】
前記αアミラーゼが、Streptococcus属に属する微生物由来のαアミラーゼである、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
前記Cupriavidus属に属する微生物が、ポリヒドロキシアルカノエートを合成する、請求項１又は２に記載の微生物。
【請求項４】
前記Cupriavidus属に属する微生物が、Cupriavidus necatorである、請求項１〜３の何れか一項に記載の微生物。
【請求項５】
前記ポリヒドロキシアルカノエートが、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−コ−３−ヒドロキシヘキサノエート）である、請求項３又は４に記載の微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Cupriavidus属に属する微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
環境問題、食糧問題、健康及び安全に対する意識の高まり；並びに天然及び自然志向の高まり等を背景に、微生物の生産、及び微生物による物質製造（例えば、発酵生産、及びバイオ変換等）の意義及び重要性が益々高まっている。【０００３】
微生物の生産、及び微生物による物質の製造においては、微生物によって好適に資化される炭素源（例えば、培養及び／又は発酵等のための炭素源）が必要である。その炭素源の代表的なものとして、糖質（例えば、澱粉）、油脂（例えば、植物油脂）、及び脂肪酸（例えば、植物由来の脂肪酸）等の利用が益々望まれてきている。糖質原料である澱粉は、ポテト、コーン、米及びキャッサバ等から生産され得る安価な発酵原料であり、好適な炭素源の候補の一つとして考えられるかもしれない。【０００４】
グルコースやシュークロース等の低分子量の糖質原料のように、一般に微生物が細胞内に取り込み、異化及び同化されやすい構造の炭素源を原料として利用することは容易である。しかし、澱粉は、グルコースが多数結合した高分子であり、特に生澱粉は、アミロースとアミロペクチンの鎖が水素結合によって規則的に集合したミセル構造（結晶構造）を有しており、酵素による分解を受けにくく、そのままでは微生物によって資化できない問題がある。【０００５】
生澱粉をグルコース等の低分子量の糖質原料に分解するためには、熱や物理的破壊等のエネルギー投入により結晶化度を低下させることが必要であり、通常、加熱糊化（可溶化、又はα化とも言う）が行われる（特許文献１）。そして、その後、分解酵素であるアミラーゼを作用させて糖化する。しかし、このような方法では糊化工程でエネルギーを消費してしまう。このため、澱粉、特に生澱粉は有効に産業利用されているとはいえない。【０００６】
生澱粉の利用に伴うエネルギー消費を少なくするため、物質生産を担う微生物が生澱粉を分解可能なアミラーゼを分泌でき、生澱粉を原料として物質を直接生産させる事ができれば意義深い。【０００７】
微生物を用いた物質生産の宿主としてCupriavidus属に属する微生物が挙げられる。また、Cupriavidus属に属する微生物を用いた物質生産の例として、例えば、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）等の脂肪族ポリエステル、並びにブタノール及びイソプロパノール等が挙げられる。【０００８】
Cupriavidus属に属する微生物であるCupriavidus necatorを用いて、アセトンとブタノールを生産した例がある（非特許文献１）。Cupriavidus necatorを用いて、糖質原料であるフルクトースからイソプロパノールを生産した例がある（非特許文献２）。また、Cupriavidus necatorを用いて、スクロースからポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）を生産した例が報告されている（非特許文献３）。しかし、いずれも原料として澱粉は利用していない。【０００９】
Cupriavidus necatorは、αアミラーゼをコードする遺伝子を有さないため、澱粉分解酵素を発現できず、澱粉を好適に利用できないため、糖化したポテト由来の澱粉を用いてＰＨＡを生産した例が報告されている（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特許第４７６７１２８号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Chakravarty J., et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 102(12):5021-5031(2018)
【非特許文献２】Marc J., et al., Metab.Eng.,42:74-84(2017)
【非特許文献３】Arikawa H., et al, Appl. Microbiol, Biotechnol,101(20):7497-7507(2017)
【非特許文献４】Haas R., et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 72(1):253-256(2008)
【非特許文献５】Matsui Y., et al., J. Appl. Glycosci., 54:217-222(2007)
【非特許文献６】Shigechi H., et al., AEM., 70(8):5037-5040(2004)
【非特許文献７】Huong KH., et al., Int Biol Macromol., 116:217-223（2018）
【非特許文献８】Syafig IM., et al., Enzyme Microb Technol.,98:1-8(2017)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明者らは、まず、非可溶化澱粉（生澱粉とも言う）を分解可能であると報告されているStreptococcus bovis由来のαアミラーゼ（非特許文献５）をCupriavidus necator H16株に導入し、その澱粉分解活性を確認したが、分解活性を示さなかった。このように、澱粉、特に生澱粉を炭素源として好適に利用することは容易ではない。【００１３】
例えば、非特許文献６ではRhizopus由来の分泌シグナル配列を利用し、酵母Saccharomyces cerevisiaeにStreptococcus bovis由来αアミラーゼを表層提示発現（分泌発現の一種）させている。タンパク質を分泌発現させるためには、分泌シグナルとタンパク質をコードする遺伝子を連結させた遺伝子配列の導入が必須であるが、分泌タンパク質と分泌シグナルをどのように組み合わせれば、目的とする微生物が澱粉分解活性を示すのかを見出すのは困難である。細胞外に酵素を分泌させることは、細胞内で単に異種遺伝子を発現させるよりも困難とされている。澱粉を原料として、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）等の脂肪族ポリエステル等を生産可能なCupriavidus属に属する微生物による効率的な物質製造を工業的に可能にするためには、更なる研究が必要である。【００１４】
本発明は、澱粉を分解し、有効に資化し得るCupriavidus属に属する微生物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、Cupriavidus属に属する微生物由来の分泌シグナルが連結した、αアミラーゼをコードする遺伝子を導入した、Cupriavidus属に属する微生物に関する。【００１６】
前記微生物において、前記αアミラーゼが、Streptococcus属に属する微生物由来のαアミラーゼであってよい。【００１７】
前記微生物において、前記Cupriavidus属に属する微生物が、ポリヒドロキシアルカノエートを合成してよい。【００１８】
前記微生物において、前記Cupriavidus属に属する微生物が、Cupriavidus necatorであってよい。【００１９】
前記ポリヒドロキシアルカノエートが、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−コ−３−ヒドロキシヘキサノエート）であってよい。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、澱粉を分解し、有効に資化し得るCupriavidus属に属する微生物を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本開示の微生物は、Cupriavidus属に属する微生物由来の分泌シグナルが連結した、αアミラーゼをコードする遺伝子を導入した、Cupriavidus属に属する微生物である。
【００２２】
本開示の微生物は、本発明者らが、Cupriavidus属に属する微生物が保有する遺伝子の中から、細胞外に分泌されるタンパク質（分泌タンパク質）をコードする遺伝子を見出し、該遺伝子中に存在するシグナル様配列（分泌シグナル）とαアミラーゼ遺伝子とを連結させた遺伝子をCupriavidus属に属する微生物に導入したものである。当該微生物によれば、澱粉分解活性を有する澱粉分解酵素であるαアミラーゼを細胞外に分泌させることが可能であるため、生澱粉をα化することなく資化でき、有効利用できる。本開示の微生物を用いた物質生産は、工業的な物質生産としても適している。
【００２３】
本開示の微生物は、Cupriavidus属に属する微生物であれば、限定されるものではないが、ポリヒドロキシアルカノエートを合成すること、つまり、ＰＨＡ合成能を有することが好ましい。Cupriavidus属に属する微生物の中でも、高いＰＨＡ合成能を有するため、Cupriavidus necatorが特に好ましい。
【００２４】
ＰＨＡ合成能を有するCupriavidus属に属する微生物としては、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を本来的に有する野生株だけではなく、そのような野生株を人工的に突然変異処理して得られる変異株や、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を本来的に有しない微生物に対して遺伝子工学的手法により外来のＰＨＡ合成酵素遺伝子が導入された組み換え菌株であってもよい。
【００２５】
ＰＨＡ合成能を有するCupriavidus属に属する微生物が、遺伝子工学的手法により外来のＰＨＡ合成酵素遺伝子が導入された組み換え菌株である場合、前記外来のＰＨＡ合成酵素遺伝子としては、例えば、Cupriavidus necator H16株が保有する配列番号２に記載するアミノ酸配列をコードするＰＨＡ合成酵素遺伝子、又は、該アミノ酸配列に対して８５％以上の配列同一性を有し、且つ、ＰＨＡ合成活性を有するポリペプチドをコードするＰＨＡ合成酵素遺伝子；並びにAeromonas caviaeが保有する配列番号３に記載するアミノ酸配列をコードするＰＨＡ合成酵素遺伝子、又は、該アミノ酸配列に対して８５％以上の配列同一性を有し、且つ、ＰＨＡ合成活性を有するポリペプチドをコードするＰＨＡ合成酵素遺伝子等が挙げられるが、これらに限定されず、その他のＰＨＡ合成酵素遺伝子も好適に利用出来る。なお、上記配列同一性は好ましくは９０％以上であり、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上である。これらの中でも、ＰＨＡとしてポリ（３−ヒドロキシブチレート−コ−３−ヒドロキシヘキサノエート）（ＰＨＢＨと称することがある）を合成活性を有するＰＨＡ合成酵素遺伝子が好ましい。ＰＨＢＨは、Cupriavidus necatorに、Aeromonas caviae由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子が導入された形質転換体により合成すればよい。
【００２６】
本開示の微生物に導入された上記遺伝子は、Cupriavidus属に属する微生物由来の分泌シグナルが連結したαアミラーゼをコードするものである。
【００２７】
分泌シグナルとは、分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列である。また、分泌シグナルペプチドとは、細胞内で合成されたタンパク質を細胞内膜外又は細胞外へ分泌させるために必要なシグナルペプチドである。
【００２８】
分泌シグナルは、Cupriavidus属に属する微生物由来の分泌シグナルであれば特に制限されない。例えばCupriavidus necator、Cupriavidus oxalaticus、Cupriavidus pauculus、Cupriavidus respiraculi、Cupriavidus taiwanensis及びCupriavidus metallidurans等のCupriavidus属に属する微生物由来の分泌シグナルが利用出来る。
【００２９】
αアミラーゼは、澱粉分解活性を有するαアミラーゼであればなんら制限されるものではなく、本開示の微生物に導入された上記遺伝子は、このようなαアミラーゼをコードしていればなんら制限されるものではない。
【００３０】
αアミラーゼをコードする遺伝子としては、例えばBacillus属、Streptococcus属、Panibacillus属、及びRhyzopus属の微生物由来のαアミラーゼをコードする遺伝子が挙げられる。これらの中でも、Streptococcus属の微生物由来のαアミラーゼをコードする遺伝子が好ましい。本開示の微生物が生澱粉を好適に分解可能となるためである。
【００３１】
Bacillus属に属する微生物由来のαアミラーゼをコードする遺伝子として、Bacillus stearothermophilus、及びBacillus amyloliquefaciens等の微生物由来のαアミラーゼをコードする遺伝子が挙げられる。
【００３２】
Streptococcus属に属する微生物由来のαアミラーゼをコードする遺伝子として、Streptococcus bovis等の微生物由来のαアミラーゼをコードする遺伝子が挙げられる。
【００３３】
Paenibacillus属に属する微生物由来のαアミラーゼをコードする遺伝子として、Paenibacillus sp. 等の微生物由来のαアミラーゼをコードする遺伝子が挙げられる。
【００３４】
Cupriavidus属に属する微生物由来の分泌シグナルとαアミラーゼをコードする遺伝子との「連結」は、分泌シグナルとαアミラーゼをコードする部分との直接的な結合であってよく、分泌シグナルペプチドとαアミラーゼをコードする部分との間に１又は２以上の塩基が含まれる間接的な結合であってよい。
【００３５】
Cupriavidus属に属する微生物由来の分泌シグナルが連結したαアミラーゼをコードする遺伝子を導入する方法としては、プラスミドベクターを用いてCupriavidus属に属する微生物に導入する方法や、ゲノムＤＮＡに導入する方法などを用いることができる。プラスミドベクターを用いたCupriavidus属に属する微生物への導入は、一般的に行われている方法、例えば、電気導入法、カルシウム法等の任意の方法を用いて行うことができる。ゲノムＤＮＡへの導入は、一般的に行われている方法、例えば、相同性組み換え、トランスポゾンを利用する方法、及びファージを利用する方法等の任意の方法を用いて行うことができる。
【００３６】
プラスミドベクターは、Cupriavidus属に属する微生物由来の分泌シグナルが連結したαアミラーゼをコードする塩基配列を有するＤＮＡ断片を、ｐＣＵＰ２等のプラスミドベクターと連結することにより作製すればよい。
【００３７】
本開示のCupriavidus属に属する微生物の培養条件は、当該微生物が育成可能な条件であればよいが、例えば、温度条件としては、２０℃以上５０℃以下、培養時間としては、１０時間以上１００時間以下程度であってよい。
【００３８】
また、Cupriavidus属に属する微生物内に蓄積された物質は公知の方法により回収することができる。蓄積された物質がＰＨＡである場合、例えば、次のような方法により回収することができる。Cupriavidus属に属する微生物の培養終了後、培養液から遠心分離器等で菌体を分離し、その菌体をメタノール等により洗浄し、乾燥させる。この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いてＰＨＡを抽出する。このＰＨＡを含んだ有機溶剤の溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、そのろ液にヘキサン等の貧溶媒を加えてＰＨＡを沈殿させる。さらに、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させてＰＨＡを回収すればよい。
【００３９】
本開示の微生物によれば、澱粉分解活性を有するαアミラーゼを細胞外に分泌させることが可能であるため、澱粉を分解し、有効に資化し得る。
【００４０】
さらに、本開示の微生物がＰＨＡを合成するCupriavidus属に属する微生物であれば、澱粉から直接ＰＨＡを合成できるため、省エネルギー、低コストでのＰＨＡ生産が可能になることが期待される。
【００４１】
現在、環境への意識の高まりから非石油由来のプラスチックが注目されている。非石油来のプラスチックのうち、特にＰＨＡは微生物が菌体内に産生及び蓄積される熱可塑性ポリエステルであって、生分解性を有しており、自然界の炭素循環プロセスに取り込まれることから生態系への悪影響が小さいと予想され、ＰＨＡの実用化が切望されている。そのため、ＰＨＡは、本開示の微生物を用いて生産される物質の好例の一つである。
【００４２】
本開示のCupriavidus属に属する微生物は、ＰＨＡの他、エタノール、ブタノール及びプロパノール等のアルコール類；乳酸、酢酸、アミノ酸及び核酸等の酸類、脂質類、並びに油脂類等の生産にも用いることができる。例えば、Cupriavidus malaysiensis（非特許文献７）やCupriavidus sp. USMAA1020（非特許文献８）を用いたＰＨＡの生産例が報告されている。
【実施例】
【００４３】
以下に実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら制限されるものではない。【００４４】
全体的な遺伝子操作は、Molecular Cloning （Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989又は2001)）の記載に従い行うことができる。また、遺伝子操作に使用する酵素、及びクローニング宿主等は、市場の供給者から購入し、その説明に従い使用することができる。なお、酵素としては、遺伝子操作に使用できるものであれば特に限定されない。【００４５】
以下の製造例、実施例、及び比較例で使用されるＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ，ｄＲ株（以下、「ＫＮＫ００５ｄＺＧ株」と記載する）は、Cupriavidus necator H16株の染色体上にAeromonas caviae由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子（配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子）が導入され、染色体上のＰＨＡ分解酵素遺伝子であるｐｈａＺ１，２，６遺伝子が欠失し、糖取込みに関するｎａｇオペロン遺伝子のうち、ｎａｇＥ構造遺伝子の７９３番目の塩基であるＧがＣに置換され、さらにｎａｇＲ遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失した形質転換微生物である。この形質転換微生物は、国際公開第２０１７／１０４７２２号に記載の方法に準じて作製することができる。【００４６】
（製造例１）ｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ａｍｙＡ１５３５／ＫＮＫ００５ｄＺＧ株の作製
まず、プラスミドベクターの作製を行った。作製方法は以下のとおりである。合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、ｔｒｃプロモーター、及びStreptococcus bovis 148株（NRIC 1535）に由来する分泌型αアミラーゼ（以下、「ａｍｙＡ１５３５」と記載する）のアミノ酸配列（配列番号１）をコードする塩基配列を有するＤＮＡ断片（配列番号４）を得た。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳｐｅＩで消化した。このＤＮＡ断片を、国際公開公報２００７／０４９７１６号公報に記載のプラスミドベクターｐＣＵＰ２を制限酵素ＭｕｎＩ及びＳｐｅＩで切断したものと連結し、プラスミドベクターｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ａｍｙＡ１５３５を得た。なお、当該分泌型αアミラーゼとは、分泌シグナルペプチドを有するαアミラーゼである。【００４７】
次に、プラスミドベクターｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ａｍｙＡ１５３５をＫＮＫ００５ｄＺＧ株へ導入し、形質転換体ｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ａｍｙＡ１５３５／ＫＮＫ００５ｄＺＧ株を得た。【００４８】
プラスミドベクターの細胞への導入は以下のように電気導入によって行った。遺伝子導入装置はＢｉｏｒａｄ社製のジーンパルサーを用い、キュベットは同じくＢｉｏｒａｄ社製のｇａｐ０．２ｃｍを用いた。キュベットに、コンピテント細胞４００μｌと発現ベクター２０μｌを注入してパルス装置にセットし、静電容量２５μＦ、電圧１．５ｋＶ、抵抗値８００Ωの条件で電気パルスをかけた。パルス後、キュベット内の菌液をＮｕｔｒｉｅｎｔＢｒｏｔｈ培地（ＤＩＦＣＯ社製）で３０℃、３時間振とう培養し、選択プレート（ＮｕｔｒｉｅｎｔＡｇａｒ培地（ＤＩＦＣＯ社製）、カナマイシン１００ｍｇ／Ｌ）で、３０℃にて２日間培養して、生育してきた形質転換体ｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ａｍｙＡ１５３５／ＫＮＫ００５ｄＺＧ株を取得した。【００４９】
（製造例２）ｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ＳＰｆｌｉＣａｍｙＡ１５３５／ＫＮＫ００５ｄＺＧ株の作製
まず、プラスミドベクターの作製を行った。作製は以下のように行った。合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、ｔｒｃプロモーター、及び分泌シグナルペプチドがCupriavidus necator H16株ｆｌｉＣ遺伝子由来の分泌シグナルペプチドに置換されたａｍｙＡ１５３５（ＳＰｆｌｉＣａｍｙＡ１５３５）をコードする塩基配列を有するＤＮＡ断片（配列番号５）を得た。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳｐｅＩで消化した。このＤＮＡ断片を、国際公開公報第２００７／０４９７１６号公報に記載のプラスミドベクターｐＣＵＰ２を制限酵素ＭｕｎＩ及びＳｐｅＩで切断したものと連結し、プラスミドベクターｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ＳＰｆｌｉＣａｍｙＡ１５３５を得た。【００５０】
次に、プラスミドベクターｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ＳＰｆｌｉＣａｍｙＡ１５３５を、製造例１と同様の方法で、ＫＮＫ００５ｄＺＧ株へ導入し、形質転換体ｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ＳＰｆｌｉＣａｍｙＡ１５３５／ＫＮＫ００５ｄＺＧ株を得た。【００５１】
（製造例３）ｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ＳＰｐｌｃＮ４ａｍｙＡ１５３５／ＫＮＫ００５ｄＺＧ株の作製
まず、プラスミドベクターの作製を行った。作製は以下のように行った。合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、ｔｒｃプロモーター、及び分泌シグナルペプチドがCupriavidus necator H16株ｐｌｃＮ４遺伝子由来の分泌シグナルペプチドに置換されたａｍｙＡ１５３５（ＳＰｐｌｃＮ４ａｍｙＡ１５３５）をコードする塩基配列を有するＤＮＡ断片（配列番号６）を得た。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳｐｅＩで消化した。このＤＮＡ断片を、国際公開公報第２００７／０４９７１６号公報に記載のプラスミドベクターｐＣＵＰ２を制限酵素ＭｕｎＩ及びＳｐｅＩで切断したものと連結し、プラスミドベクターｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ＳＰｐｌｃＮ４ａｍｙＡ１５３５を得た。【００５２】
次に、プラスミドベクターｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ＳＰｐｌｃＮ４ａｍｙＡ１５３５を、製造例１と同様の方法で、ＫＮＫ００５ｄＺＧ株へ導入し、形質転換体ｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ＳＰｐｌｃＮ４ａｍｙＡ１５３５／ＫＮＫ００５ｄＺＧ株を得た。【００５３】
（比較例１）ＫＮＫ００５ｄＺＧ株による澱粉分解能試験
種母培地の組成は、１ｗ／ｖ％  Ｍｅａｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％  Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎ、０．２ｗ／ｖ％  Ｙｅａｓｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ｗ／ｖ％  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１５ｗ／ｖ％  ＫＨ２ＰＯ４とした。【００５４】
澱粉含有プレート培地の組成は、ニュートリエント寒天培地（Ｄｉｆｃｏ）に１ｗ／ｖ％  コーンスターチを加えたものとした。【００５５】
ＫＮＫ００５ｄＺＧ株のグリセロールストック（５０μＬ）を種母培地（５ｍＬ）に接種して培養温度３０℃で２４時間振とう培養し、得られた培養液を種母とした。【００５６】
澱粉分解能試験は以下のように行った。滅菌水を用いてＯＤ６００＝２．０に調整した種母培養液１０μｌを澱粉含有プレート培地（ニュートリエント寒天培地（Ｄｉｆｃｏ）に１ｗ／ｖ％  コーンスターチ）にスポットし、３０℃で３日間生育させた。生育したコロニーの周囲に、澱粉が分解されたことによるクリアゾーン（ハローとも称する）が観察されるか否かを判定した。また、クリアゾーンの直径が大きい方が、澱粉分解能が高く優れる。【００５７】
その結果、本比較例において、クリアゾーンは観察されず、ＫＮＫ００５ｄＺＧ株は澱粉分解能を示さなかった。結果は表１に示す。【００５８】
（比較例２）ｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ａｍｙＡ１５３５／ＫＮＫ００５ｄＺＧ株による澱粉分解能試験
種母培地及び澱粉含有プレート培地の組成は、比較例１に記載のものと同様とした。製造例１で作製したｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ａｍｙＡ１５３５／ＫＮＫ００５ｄＺＧ株について、比較例１と同様の方法で培養及び澱粉分解能試験を行った。ただし、種母培地及び澱粉含有プレート培地は、カナマイシンを最終濃度１００μｇ／ｍｌとなるように添加した。【００５９】
本比較例において、クリアゾーンは観察されず、ｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ａｍｙＡ１５３５／ＫＮＫ００５ｄＺＧ株は澱粉分解能を示さなかった。結果は表１に示す。【００６０】
（実施例１）ｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ＳＰｆｌｉＣａｍｙＡ１５３５／ＫＮＫ００５ｄＺＧ株による澱粉分解能試験
種母培地及び澱粉含有プレート培地の組成は、比較例１に記載のものと同様とした。製造例２で作製したｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ＳＰｆｌｉＣａｍｙＡ１５３５／ＫＮＫ００５ｄＺＧ株について、比較例１と同様の方法で培養及び澱粉分解能試験を行った。ただし、種母培地及び澱粉含有プレート培地は、カナマイシンを最終濃度１００μｇ／ｍｌとなるように添加した。【００６１】
本実施例においては、クリアゾーンが観察され、ｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ＳＰｆｌｉＣａｍｙＡ１５３５／ＫＮＫ００５ｄＺＧ株は澱粉分解能を示した。クリアゾーンの直径を測定した。結果は表１に示す。【００６２】
（実施例２）ｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ＳＰｐｌｃＮ４ａｍｙＡ１５３５／ＫＮＫ００５ｄＺＧ株による澱粉分解能試験
種母培地及び澱粉含有プレート培地の組成は、比較例１に記載のものと同様とした。製造例３で作製したｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ＳＰｐｌｃＮ４ａｍｙＡ１５３５／ＫＮＫ００５ｄＺＧ株について、比較例１と同様の方法で培養及び澱粉分解能試験を行った。ただし、種母培地及び澱粉含有プレート培地は、カナマイシンを最終濃度１００μｇ／ｍｌとなるように添加した。【００６３】
本実施例においては、クリアゾーンが観察され、ｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ＳＰｐｌｃＮ４ａｍｙＡ１５３５／ＫＮＫ００５ｄＺＧ株は澱粉分解能を示した。クリアゾーンの直径を測定した。結果は表１に示す。【００６４】
【表１】
2020100888.tif 000002
【００６５】
Cupriavidus属に属する微生物由来の分泌シグナルが連結した、αアミラーゼをコードする遺伝子を導入した実施例の微生物は、澱粉を分解できたため、澱粉を有効に資化し得ることが示された。
【配列表】
2020100888000001.app
【国際調査報告】
2020100888.tif 000003
2020100888.tif 000004
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