(57)【要約】  本発明は、数平均分子量が３ｋＤａ〜１０ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーとのブロックコポリマーと、アンチセンスオリゴとを含む、ポリイオンコンプレックスミセルを提供する。
2019240223.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
数平均分子量が３ｋＤａ〜１０ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーとのブロックコポリマーと、アンチセンスオリゴとを含む、ポリイオンコンプレックスミセル。
【請求項２】
数平均分子量が３ｋＤａ〜１０ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーとのブロックコポリマーのＰＥＧ側の末端が細胞表面または細胞外基質に結合する分子により修飾されている、請求項１に記載のポリイオンコンプレックスミセル。
【請求項３】
細胞表面への結合分子が、ＧＬＵＴ１リガンドである、請求項２に記載のポリイオンコンプレックスミセル。
【請求項４】
ＧＬＵＴ１リガンドが、グルコースである、請求項３に記載のポリイオンコンプレックスミセル。
【請求項５】
数平均分子量が３ｋＤａ〜１０ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーとのブロックコポリマーのＰＥＧ側末端の１０〜４０モル％がグルコースにより修飾されている、請求項４に記載のポリイオンコンプレックスミセル。
【請求項６】
ＰＥＧブロックの数平均分子量が４ｋＤａ〜７ｋＤａである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリイオンコンプレックスミセル。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリイオンコンプレックスミセルを含む医薬組成物。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリイオンコンプレックスミセルを含んでなる、投与計画に従って対象に投与するための医薬組成物であって、
該投与計画は、絶食させるか、または低血糖を誘発させた対象に該医薬組成物を投与することおよび該対象において血糖値の上昇を誘発させることを含み、
該ポリイオンコンプレックスミセルは、その外表面がＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されている、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、数平均分子量が３ｋＤａ〜１０ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーとのブロックコポリマーと、アンチセンスオリゴヌクレオチドとを含む、ポリイオンコンプレックスミセルに関する。
【背景技術】
【０００２】
薬剤送達システムの開発は、内包される薬物を効率的にかつ選択的に標的組織または臓器へと送達するものである。薬剤送達システムは、内包される薬物の血中滞留性を高める役割を果たし得る。【０００３】
脳に対する薬剤送達システムとしては、特許文献１では、表面をグルコースで修飾したミセルが開示されている。特許文献１では、血糖操作を行いつつ、表面をグルコースで修飾したミセルを投与すると、ミセルの脳への集積が顕著に高まることを明らかにしている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】WO2015/075942
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、数平均分子量が３ｋＤａ〜１０ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーとのブロックコポリマーと、アンチセンスオリゴヌクレオチド（またはオリゴヌクレオチド）とを含む、ポリイオンコンプレックスミセルを提供する。
【０００６】
本発明者らは、数平均分子量が２ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーとのブロックコポリマーと、アンチセンスオリゴヌクレオチドとを混合すると、ポリイオンコンプレックスミセルの形成効率が低いことを見出した。本発明者らはまた、数平均分子量が１２ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーとのブロックコポリマーと、アンチセンスオリゴヌクレオチドとを混合すると、ポリイオンコンプレックスミセルは、ＰＥＧブロック側を修飾する薬剤送達のための標的化分子がＰＥＧの内部に潜り込み、ミセルの表面に提示される効率が低くなることを見出した。本発明者らはさらに、数平均分子量が３ｋＤａ〜１０ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーとのブロックコポリマーと、核酸とを含む、ポリイオンコンプレックスミセルは、核酸がDNAまたはmRNAである場合には形成効率が低いのに対して、核酸がアンチセンスオリゴヌクレオチドの場合には効率良く形成され得ること、および、ミセルが形成された場合にＰＥＧブロック側を修飾する薬剤送達のための標的化分子がミセル表面に露出しやすくなることを見出した。
【０００７】
本発明によれば、以下の発明が提供され得る。
（１）数平均分子量が３ｋＤａ〜１０ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーとのブロックコポリマーと、アンチセンスオリゴヌクレオチドとを含む、ポリイオンコンプレックスミセル。
（２）数平均分子量が３ｋＤａ〜１０ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーとのブロックコポリマーのＰＥＧ側の末端が細胞表面または細胞外基質に結合する分子により修飾されている、上記（１）に記載のポリイオンコンプレックスミセル。
（３）細胞表面への結合分子が、ＧＬＵＴ１リガンドである、上記（２）に記載のポリイオンコンプレックスミセル。
（４）ＧＬＵＴ１リガンドが、グルコースである、上記（３）に記載のポリイオンコンプレックスミセル。
（５）数平均分子量が３ｋＤａ〜１０ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーとのブロックコポリマーのＰＥＧ側末端の１０〜４０モル％がグルコースにより修飾されている、上記（４）に記載のポリイオンコンプレックスミセル。
（６）ＰＥＧブロックの数平均分子量が４ｋＤａ〜７ｋＤａである、上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリイオンコンプレックスミセル。
（７）上記（１）〜（６）のいずれかに記載のポリイオンコンプレックスミセルを含む医薬組成物。
（８）上記（１）〜（６）のいずれかに記載のポリイオンコンプレックスミセルを含んでなる、投与計画に従って対象に投与するための医薬組成物であって、
該投与計画は、絶食させるか、または低血糖を誘発させた対象に該医薬組成物を投与することおよび該対象において血糖値の上昇を誘発させることを含み、
該ポリイオンコンプレックスミセルは、その外表面がＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されている、医薬組成物。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】図１Ａは、カチオン性ポリマーとアンチセンスオリゴの混合比（Ｎ／Ｐ比）と散乱光強度（ＳＬＩ）および多分散度（ＰＤＩ）との関係を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ミセルを構成するカチオン性ポリマーの総数に対するグルコース修飾を受けたカチオン性ポリマーの割合（glucose contains in micelle (%)）と、粒径およびＰＤＩと関係を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）存在下におけるＡＳＯミセルの拡散時間とミセル形成に用いたＡＳＯ濃度との関係を示す。
【図２】図２は、マウスに投与されたＡＳＯミセルを耳の血管において観察した蛍光電子顕微鏡像である。
【図３】図３は、マウスに投与されたＡＳＯミセルの血中滞留性（Relative Invensity）を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、蛍光標識したＡＳＯミセルを投与したマウスの脳組織に蓄積したＡＳＯミセルの量とＡＳＯ表面のグルコース修飾の割合との関係を示す。縦軸は、投与量に対する脳組織に蓄積したミセルの割合を脳組織１ｇあたりで換算して求めた値を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、蛍光標識したＡＳＯミセルを投与したアルツハイマー病のマウスの脳組織に蓄積したＡＳＯミセルの量とＡＳＯ表面のグルコース修飾の割合との関係を示す。縦軸は、投与量に対する脳組織に蓄積したミセルの割合を脳組織１ｇあたりで換算して求めた値を示す。
【図５】図５は、カチオン性ポリマーの２５％がグルコースで修飾されたＧｌｃ−ＰＩＣ（ＡＳＯ）の各臓器への蓄積量と裸のＡＳＯの脳への各臓器への蓄積の比を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、ＰＥＧブロックにおけるＰＥＧの平均分子量が２ｋＤａであるＡＳＯミセルの散乱光強度（ＳＬＩ）を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＰＥＧブロックにおけるＰＥＧの平均分子量が１２ｋＤａであるＡＳＯミセルの散乱光強度（ＳＬＩ）を示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ＰＥＧブロックにおけるＰＥＧの平均分子量が２ｋＤａであるモデルミセルと、ＰＥＧブロックにおけるＰＥＧの平均分子量が１２ｋＤａであるＡＳＯミセルのマウス脳への集積の程度を示す図である。
【図６Ｄ】図６Ｄは、ＰＥＧブロックにおけるＰＥＧの平均分子量が５ｋＤａであり、アニオン性ポリマーがプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）またはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であるミセルの形成効率を示す。縦軸は、散乱光強度（ＳＬＩ）を示す。
【発明の詳細な説明】
【０００９】
本明細書では、「ミセル」とは、１層の分子膜（または分子層）により形成される小胞を意味する。ミセルとしては、界面活性剤などの両親媒性分子により形成されるミセル、および、ポリイオンコンプレックスにより形成されるミセル（ＰＩＣミセル）が挙げられる。ミセルは、血中滞留時間の観点では、その外表面をポリエチレングリコールで修飾することが好ましいと知られている。
【００１０】
本明細書では、「ポリイオンコンプレックス」（以下、「ＰＩＣ」ともいう）とは、ＰＥＧとアニオン性ブロックとの共重合体と、ＰＥＧとカチオン性ブロックとの共重合体とを水溶液中で荷電を中和するように混合すると両ブロック共重合体のカチオン性ブロックとアニオン性ブロックとの間で形成されるイオン層である。ＰＥＧと上記の荷電性連鎖とを結合させる意義は、ポリイオンコンプレックスが凝集して沈殿することを抑制すること、および、それにより、ポリイオンコンプレックスが粒径数十ｎｍの単分散なコア−シェル構造を有するナノ微粒子を形成することである。この際、ＰＥＧはナノ微粒子の外殻（シェル）を覆うため、生体適合性が高く、血中滞留時間を向上させる点で都合がよいことでも知られている。また、ポリイオンコンプレックス形成において、一方の荷電性ブロックコポリマーは、ＰＥＧ部分を必要とせず、ホモポリマー、界面活性剤、核酸および／または酵素に置き換えてもよいことが明らかとなっている。そして、ポリイオンコンプレックス形成においては、アニオン性ポリマーおよびカチオン性ポリマーの少なくとも１つがＰＥＧとの共重合体を形成しており、その両方がＰＥＧとの共重合体を形成していてもよい。また、ＰＥＧ含有量を増加させるとＰＩＣミセルが形成されやすく、ＰＥＧ含有量を低減させるとＰＩＣｓｏｍｅが形成されやすいことがよく知られている。ポリイオンコンプレックスの作製によく用いられるアニオン性ポリマーまたはブロックとしては、例えば、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸および核酸（例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ）が挙げられ、カチオン性ポリマーまたはブロックとしては、例えば、ポリリジンおよびポリ（５−アミノペンチルアスパラギン酸）が挙げられる。ここで、ｍＲＮＡとは、翻訳によりタンパク質合成に用いられるメッセンジャーＲＮＡを意味し、ｓｉＲＮＡとは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を誘導することができる二本鎖ＲＮＡ（核酸）を意味する。ｓｉＲＮＡは、特に限定されないが、２０〜３０ｂｐ、好ましくは、２１〜２３ｂｐ、２５ｂｐ、２７ｂｐからなる二本鎖ＲＮＡであって、標的遺伝子の配列と相同な配列を有する二本鎖ＲＮＡである。本発明では、ＰＩＣにおいてアニオン性ポリマーとしてアンチセンスオリゴを用いることができる。
【００１１】
本明細書では、「低血糖を誘発させる」とは、対象において、その処置がされなければ示したはずの血糖よりも血糖値を低下させることをいう。低血糖を誘発させる方法としては、糖尿病薬の投与などが挙げられる。例えば、低血糖を誘発させる際に、低血糖を誘発させるという目的を達する限りにおいて、例えば、他の薬剤を摂取し、または水などの飲料を飲むことは許容される。低血糖を誘発させることは、血糖に実質的に影響しない他の処置を伴ってもよい。
【００１２】
本明細書では、「絶食させる」とは、対象に絶食、例えば、３時間以上、４時間以上、５時間以上、６時間以上、７時間以上、８時間以上、９時間以上、１０時間以上、１１時間以上、１２時間以上、１３時間以上、１４時間以上、１５時間以上、１６時間以上、１７時間以上、１８時間以上、１９時間以上、２０時間以上、２１時間以上、２２時間以上、２３時間以上、２４時間以上、２５時間以上、２６時間以上、２７時間以上、２８時間以上、２９時間以上、３０時間以上、３１時間以上、３２時間以上、３３時間以上、３４時間以上、３５時間以上、３６時間以上、３７時間以上、３８時間以上、３９時間以上、４０時間以上、４１時間以上、４２時間以上、４３時間以上、４４時間以上、４５時間以上、４６時間以上、４７時間以上または４８時間以上の絶食をさせることを意味する。絶食により対象は低血糖を引き起こす。絶食期間は、対象の健康状態に鑑みて医師等により決定され、例えば、対象が空腹時血糖に達する時間以上の期間とすることが好ましい。絶食期間は、例えば、脳血管内皮細胞の血管内表面でのＧＬＵＴ１の発現が増大する、またはプラトーに達する以上の時間としてもよい。絶食期間は、例えば、１２時間以上、２４時間以上または３６時間以上である上記期間とすることができる。また、絶食は、血糖値やＧＬＵＴ１の血管内表面での発現に実質的に影響しない他の処置を伴ってもよい。
【００１３】
本明細書では、「血糖値の上昇を誘発させる」とは、低血糖を誘発させた対象、または、低血糖状態を維持させた対象において血糖値を上昇させることをいう。血糖値は、当業者に周知の様々な方法により上昇させることができるが、例えば、血糖値の上昇を誘発するものの投与、例えば、グルコース、フルクトース（果糖）、ガラクトースなどの血糖値の上昇を誘発する単糖の投与、マルトースなどの血糖値の上昇を誘発する多糖の投与、若しくは、デンプンなどの血糖値の上昇を誘発する炭水化物の摂取、または、食事により上昇させることができる。
【００１４】
本明細書では、「血糖操作」とは、対象に対して、低血糖を誘発させ、その後、血糖値を上昇させることをいう。対象に対して低血糖を誘発させた後は、対象の血糖値を低血糖に維持することができる。対象の血糖値を低血糖に維持する時間は、例えば、０時間以上、１時間以上、２時間以上、３時間以上、４時間以上、５時間以上、６時間以上、７時間以上、８時間以上、９時間以上、１０時間以上、１１時間以上、１２時間以上、１３時間以上、１４時間以上、１５時間以上、１６時間以上、１７時間以上、１８時間以上、１９時間以上、２０時間以上、２１時間以上、２２時間以上、２３時間以上、２４時間以上、２５時間以上、２６時間以上、２７時間以上、２８時間以上、２９時間以上、３０時間以上、３１時間以上、３２時間以上、３３時間以上、３４時間以上、３５時間以上、３６時間以上、３７時間以上、３８時間以上、３９時間以上、４０時間以上、４１時間以上、４２時間以上、４３時間以上、４４時間以上、４５時間以上、４６時間以上、４７時間以上、４８時間以上とすることができる。その後、血糖値を上昇させることができる。本明細書では、「血糖を維持する」とは、対象において低血糖を維持するという目的を達する限りにおいて、例えば、他の薬剤を摂取し、または水などの飲料を飲むことは許される。低血糖を誘発させることは、血糖に実質的に影響しない他の処置を伴ってもよい。
【００１５】
本明細書では、「対象」とは、ヒトを含む哺乳動物である。対象は、健常の対象であってもよいし、何らかの疾患に罹患した対象であってもよい。ここで疾患としては、脳神経疾患、例えば、精神病性障害、うつ病、気分障害、不安、睡眠障害、認知症および物質関連障害が挙げられる。また、認知症としては、特に限定されないがアルツハイマー病およびクロイツフェルト・ヤコブ病が挙げられる。
【００１６】
本明細書では、「血液脳関門」とは、血行と脳の間に存在して物質の透過に対して選択性を持つ機能的障壁をいう。血液脳関門の実態は、脳血管内皮細胞などであると考えられている。血液脳関門の物質透過性については、不明な点が多いが、グルコース、アルコールおよび酸素は血液脳関門を通過し易いことが知られ、脂溶性物質や小分子（例えば、分子量５００未満）は、水溶性分子や高分子（例えば、分子量５００以上）に比べて通過し易い傾向があると考えられている。多くの脳疾患治療薬や脳診断薬が血液脳関門を通過せず、このことが脳疾患の治療や脳の分析等の大きな障害となっている。本明細書では、「血液神経関門」とは、血行と末梢神経の間に存在して物質の透過に対して選択性を持つ機能的障壁をいう。本明細書では、「血液髄液関門」とは、血行と脳脊髄液との間に存在して物質の透過に対して選択性を持つ機能的障壁をいう。本明細書では、「血液網膜関門」とは、血行と網膜組織の間に存在して物質の透過に対して選択性を持つ機能的障壁をいう。血液神経関門、血液髄液関門および血液網膜関門の実体は、それぞれの関門に存在する血管内皮細胞などであると考えられており、その機能は血液脳関門と同様であると考えられている。
【００１７】
本明細書では、「ＧＬＵＴ１リガンド」とは、ＧＬＵＴ１と特異的に結合する物質を意味する。ＧＬＵＴ１リガンドとしては、様々なリガンドが知られ、特に限定されないが例えば、グルコースおよびヘキソースなどの分子が挙げられ、ＧＬＵＴ１リガンドは、いずれも本発明でグルコースの代わりにキャリアまたはコンジュゲートの調製に使用することができる。ＧＬＵＴ１リガンドは、好ましくはＧＬＵＴ１に対してグルコースと同等またはそれ以上の親和性を有する。２−Ｎ−４−（１−アジ−２，２，２−トリフルオロエチル）ベンゾイル−１，３−ビス（Ｄ−マンノース−４−イルオキシ）−２−プロピルアミン（ＡＴＢ−ＢＭＰＡ）、６−（Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ）−２−デオキシグルコース（６−ＮＢＤＧ）、４，６−Ｏ−エチリデン−α−Ｄ−グルコース、２−デオキシ−Ｄ−グルコースおよび３−Ｏ−メチルグルコースもＧＬＵＴ１と結合することが知られ、これらの分子もＧＬＵＴ１リガンドとして本発明に用いることができる。
【００１８】
本明細書では、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」、「アンチセンスオリゴ」、「ＡＳＯ」または「アンチセンス化合物」は、相互互換的に用いられ、生理的条件（例えば、細胞内）で細胞から産生される標的となる核酸とハイブリダイズすることのできる分子である。「アンチセンスオリゴ」または「アンチセンス化合物」は、単量体単位のポリマーであって、各単量体単位は塩基とバックボーンを有し、バックボーンは単量体間の連結を有し、これにより、アンチセンスオリゴと標的となる核酸（例えば、ＲＮＡ）との間にワトソン−クリック型のベースペアリングを可能とした分子である。アンチセンスオリゴとしては、例えば、核酸、特にＲＮＡおよびＤＮＡ並びにこれらの安定性を高めたアナログ（例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）、架橋核酸（ＢＮＡ）、モルフォリノオリゴ、ペプチド核酸）等の様々な核酸が開発されている。いずれのアンチセンスオリゴも、標的となる核酸とワトソン−クリック型のベースペアリングを形成するために塩基を有し、アニオン性のポリマーとなっている。アンチセンスオリゴ（またはオリゴヌクレオチド）は、ある態様では、１５塩基長以上、１６塩基長以上、１７塩基長以上、１８塩基長以上、１９塩基長以上、２０塩基長以上、２１塩基長以上、２２塩基長以上、２３塩基長以上、２４塩基長以上、２５塩基長以上、または２６塩基長以上であり得、および／または、１００塩基長以下、９０塩基長以下、８０塩基長以下、７０塩基長以下、６０塩基長以下、５０塩基長以下、４０塩基長以下、または３０塩基長以下であり得る。アンチセンスオリゴ（またはオリゴヌクレオチド）は、ある態様では、１５〜５０塩基長、１５〜４０塩基長、１５〜３０塩基長、２０〜５０塩基長、２０〜４０塩基長、２０〜３０塩基長、１８〜４０塩基長、１８〜３０塩基長、１８〜２５塩基長、または２１〜２６塩基長であり得る。ある態様では、アンチセンスオリゴは、両末端に安定性を高めた核酸アナログを有するＲＮＡおよびＤＮＡなどの核酸であり得る。
【００１９】
本明細書では、「単分散」とは、粒子群が、各粒子の粒径の標準偏差が１０％以内である、粒子群であることを意味する。ここで粒径は、例えば、動的散乱光法に基づいて決定することができる。観察された散乱光の時間的な揺らぎから光子相関法により自己相関関数を求め、キュムラント法およびヒストグラム法解析等により、拡散係数や粒子径、粒子径分布を求めることができる。
【００２０】
本発明者らは、ＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーブロックとのブロックコポリマーと、アンチセンスオリゴとのＰＩＣミセルにおいて、ＰＥＧブロックを構成するＰＥＧの数平均分子量が小さいとミセル形成効率が低下することを示した。本発明者らはまた、ＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーブロックとのブロックコポリマーと、アンチセンスオリゴとのＰＩＣミセルにおいて、ＰＥＧブロックを構成するＰＥＧの数平均分子量が大きいと、ＰＥＧブロック側を薬剤送達のための標的化分子で修飾しても、当該標的化分子がミセル表面に表出しにくいことを示した。本発明者らはさらに、アンチセンスオリゴとのＰＩＣミセルにおいて、ＰＥＧブロックを構成するＰＥＧの数平均分子量が中程度である場合には、ミセル形成効率に優れ、標的化分子がミセル表面に露出しやすくなることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明によれば、ＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーブロックとのブロックコポリマーと、アンチセンスオリゴとのＰＩＣミセルであって、ＰＥＧブロックの数平均分子量が例えば３ｋＤａ〜１０ｋＤａである、ＰＩＣミセルが提供される。
【００２１】
本発明では、ＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーブロックとのブロックコポリマーにおけるＰＥＧブロックの数平均分子量は、特に限定されないが例えば、その下限値を３ｋＤａ以上、３．５ｋＤａ以上、４ｋＤａ以上、または４．５ｋＤａ以上とすることができる。本発明では、ＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーブロックとのブロックコポリマーにおけるＰＥＧブロックの数平均分子量は、その上限値を１１ｋＤａ以下、１０ｋＤａ以下、９ｋＤａ以下、８ｋＤａ以下、７ｋＤａ以下、６ｋＤａ以下、または５．５ｋＤａ以下とすることができる。本発明では、ＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーブロックとのブロックコポリマーにおけるＰＥＧブロックの数平均分子量は、例えば、上記の下限値から選択される１つの下限値と、上記の上限値から選択される１つの上限値との範囲の数値であり得る。本発明では、ＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーブロックとのブロックコポリマーにおけるＰＥＧブロックの数平均分子量は、例えば、３ｋＤａ〜１０ｋＤａ、３．５ｋＤａ〜９ｋＤａ、４ｋＤａ〜７ｋＤａ、４ｋＤａ〜６ｋＤａ、例えば、約５ｋＤａ（例えば、５ｋＤａ±３０％、±２５％、±２０％、±１５％、または±１０％）であり得る。
【００２２】
本発明によれば、アニオン性であるアンチセンスオリゴは、ＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーブロックとのブロックコポリマーとの間でイオン相互作用により、ポリイオンコンプレックスミセルを形成できる。アニオン性であるアンチセンスオリゴと前記ブロックコポリマーとのポリイオンコンプレックスミセルでは、アンチセンスオリゴは、ＰＥＧによる修飾を有していても有していなくてもよい。ある態様では、アンチセンスオリゴは、前記ブロックコポリマーが有するＰＥＧ鎖の数平均分子量の、５％以下、１０％以下、１５％以下、２０％以下、３０％以下、４０％以下、５０％以下、６０％以下、７０％以下、８０％以下、９０％以下または９５％以下の数平均分子量のＰＥＧブロックを有していてもよい。ある態様では、アンチセンスオリゴは、ＰＥＧによる修飾を有しない。
【００２３】
ＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーブロックとのブロックコポリマーと、アンチセンスオリゴとの混合比は、例えば、Ｎ／Ｐ比（ポリマー側鎖の窒素原子数とDNAのリン酸基数の比）で、１．０〜２．０、１．１〜１．９、１．２〜１．８、１．３〜１．７、１．４〜１．６または約１．５とすることができる。
【００２４】
本明細書では、ＰＥＧは、直鎖状のＰＥＧでありうる。本発明では、ＰＥＧに置き換えて他の親水性ポリマーブロックを用いてもよい。
【００２５】
本明細書では、カチオン性ポリマーとしては、カチオン性単量体単位のポリマーを用いることができる。カチオン性単量体単位としては、特に限定されないが例えば、非天然のカチオン性アミノ酸（例えば、修飾された天然のカチオン性アミノ酸）、または天然のカチオン性アミノ酸を用いることができる。天然のカチオン性アミノ酸としては、リジンおよびオルニチンから選択される１以上の天然のカチオン性アミノ酸が挙げられる。非天然のカチオン性アミノ酸としては、カチオン性側鎖で修飾されたグルタミン酸およびアスパラギン酸から選択される修飾された１以上の天然アミノ酸が挙げられる。カチオン性側鎖としては、例えば、５−アミノペンチル基、４−アミノブチル基、３−アミノプロピル基、２−アミノエチル基を有する基が挙げられ、これらの基においては、ＣがＮにより置き換えられていてもよい。カチオン性側鎖としてはまた、−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ２、−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ２（ジエチルトリアミン（ＤＥＴ）ということがある）、−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ２（トリエチルテトラアミン（ＴＥＴ）ということがある）、および−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ２（テトラエチルペンタアミン（ＴＥＰ）ということがある）が挙げられる。カチオン性アミノ酸は、例えば、架橋の利便性を高めるために、その側鎖が２−イミノチオランまたはジメチル３，３’−ジチオビス（プロピオンイミダート）（ＤＴＢＰ）により修飾されていてもよい｛但し、少なくとも一部または全部のアミノ酸はカチオン性を維持する｝。
【００２６】
本発明では、ＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーブロックとのブロックコポリマーは、ＰＥＧ側の末端が薬剤送達のための標的化分子で修飾されていてもよい。ここで、薬剤送達のための標的化分子とは、上記ブロックコポリマーを用いてミセルを形成させたときにミセルの表面に露出し、標的化したい体内の部位の表面に選択的に発現する分子（例えば、膜タンパク質、糖タンパク質、受容体、およびその他）に選択的に結合する分子（例えば、抗体若しくは抗体の抗原結合断片、受容体のリガンド、レクチン、または親和性を有するペプチド、例えば、ＲＧＤペプチド若しくはｃＲＧＤペプチド）を言う。本明細書では、「選択的」とは、他の分子に対するよりも強い親和性で特定の分子に結合しうることを言う。薬剤送達においては、標的化したい体内の部位の表面に選択的に発現する分子に対して選択的に結合する標的化分子をミセル表面に露出させることにより、ミセルを当該標的化したい体内の部位に集積させ得る。
【００２７】
本明細書では、薬剤送達のための標的化分子としては、細胞表面に結合する分子、または細胞外基質に結合する分子が上げられる。細胞表面に結合する分子は、例えば、細胞表面に露出する受容体、チャンネルなどの膜タンパク質、糖タンパク質に結合する分子であり得る。例えば、ＧＬＵＴ１は、体内の特定箇所の血管内皮細胞の血管側表面に表出する。従って、薬剤送達のための標的化分子としては例えば、ＧＬＵＴ１に結合する分子（以下、「ＧＬＵＴ１リガンド」という）が挙げられる。ＧＬＵＴ１リガンドとしては、様々なリガンドが知られており、特に限定されないが例えば、グルコースおよびヘキソースなどの分子が挙げられる。ＧＬＵＴ１リガンドとしてはまた、ＧＬＵＴ１と結合することが知られる、２−Ｎ−４−（１−アジ−２，２，２−トリフルオロエチル）ベンゾイル−１，３−ビス（Ｄ−マンノース−４−イルオキシ）−２−プロピルアミン（ＡＴＢ−ＢＭＰＡ）、６−（Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ）−２−デオキシグルコース（６−ＮＢＤＧ）、４，６−Ｏ−エチリデン−α−Ｄ−グルコース、２−デオキシ−Ｄ−グルコースおよび３−Ｏ−メチルグルコースが挙げられる。
【００２８】
本発明で用いられ得るアンチセンスオリゴとしては、特に限定されないが例えば、ＢＡＣＥ１遺伝子、ＲＡＧＥ遺伝子、Ｍａｒａｔ１遺伝子、第ＶＩＩ因子、Ｅｇ５、ＰＣＳＫ９、ＴＰＸ２、ａｐｏＢ、ＳＡＡ、ＴＴＲ、ＲＳＶ、ＰＤＧＦベータ遺伝子、Ｅｒｂ−Ｂ遺伝子、Ｓｒｃ遺伝子、ＣＲＫ遺伝子、ＧＲＢ２遺伝子、ＲＡＳ遺伝子、ＭＥＫＫ遺伝子、ＪＮＫ遺伝子、ＲＡＦ遺伝子、Ｅｒｋ１／２遺伝子、ＰＣＮＡ（ｐ２１）遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＪＵＮ遺伝子、ＦＯＳ遺伝子、ＢＣＬ−２遺伝子、サイクリンＤ遺伝子、ＶＥＧＦ遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子、サイクリンＡ遺伝子、サイクリンＥ遺伝子、ＷＮＴ−１遺伝子、ベータカテニン遺伝子、ｃ−ＭＥＴ遺伝子、ＰＫＣ遺伝子、ＮＦＫＢ遺伝子、ＳＴＡＴ３遺伝子、サバイビン遺伝子、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ遺伝子、ＳＯＲＴ１遺伝子、ＸＢＰ１遺伝子、トポイソメラーゼＩ遺伝子、トポイソメラーゼＩＩアルファ遺伝子、ｐ７３遺伝子、ｐ２１（ＷＡＦ１／ＣＩＰ１）遺伝子、ｐ２７（ＫＩＰ１）遺伝子、ＰＰＭ１Ｄ遺伝子、ＲＡＳ遺伝子、カベオリンＩ遺伝子、ＭＩＢ Ｉ遺伝子、ＭＴＡＩ遺伝子、Ｍ６８遺伝子、癌抑制遺伝子、およびｐ５３癌抑制遺伝子からなる群から選択される遺伝子を標的とするアンチセンスオリゴが挙げられる。また例えば、アンチセンスオリゴは、発生関連タンパク質（例えば、接着分子、サイクリンキナーゼインヒビター、Wntファミリーのメンバー、Paxファミリーのメンバー、Winged ヘリックスファミリーのメンバー、Hoxファミリーのメンバー、サイトカイン/リンホカインおよびその受容体、増殖/分化因子およびその受容体、神経伝達物質およびその受容体など)；腫瘍遺伝子をコードするタンパク質(例えば、ABLI、BCLI、BCL2、BCL6、CBFA2、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRB2、ERBB2、ERBB3、ETSI、ETSI、ETV6、FGR、FOS、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCLI、MYCN、NRAS、PIM 1、PML、RET、SRC、TALI、TCL3およびYESなど)；腫瘍抑制タンパク質(たとえば、APC、BRCA1、BRCA2、MADH4、MCC、NF 1、NF2、RB 1、TP53またはWTIなど)；および酵素(たとえば、ACCシンターゼおよびオキシダーゼ、ACPデサチュラーゼおよびヒドロキシラーゼ、ADPグルコースピロホスホリラーゼ、アセチラーゼおよびデアセチラーゼ、ATPアーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、カルコンシンターゼ、キチナーゼ、シクロオキシゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、デキストリナーゼ、DNAおよびRNAポリメラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルカナーゼ、グルコースオキシダーゼ、顆粒結合デンプン合成酵素、GTPアーゼ、ヘリカーゼ、ヘミセルラーゼ、インテグラーゼ、イヌリナーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、リゾチーム、ノパリン合成酵素、オクトピン合成酵素、ペクチンエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、ホスホリラーゼ、フィターゼ、植物成長調節因子合成酵素、ポリガラクツロナーゼ、プロテイナーゼおよびペプチダーゼ、プルラナーゼ、レコンビナーゼ、逆転写酵素、RUBISCO、トポイソメラーゼまたはキシラナーゼなど)をコードする遺伝子を標的とすることができる。また例えば、アンチセンスオリゴは、腫瘍増殖(血管新生を含む)または���移活性に関与するタンパク質をコードする遺伝子を標的とすることもできる。また例えば、アンチセンスオリゴは、１つ以上の分泌タンパク質、細胞周期制御タンパク質、遺伝子調節タンパク質、アポトーシス調節タンパク質または免疫応答、炎症、補体カスケードもしくは血液凝固系に関与するタンパク質をコードする遺伝子を標的とすることもできる。また例えば、アンチセンスオリゴは、c-myc、c-myb、mdm2、PKA-I(I型プロテインキナーゼA)、Ras、c-Rafキナーゼ、CDC25ホスファターゼ、サイクリン、サイクリン依存性キナーゼ(cdks)、テロメラーゼ、PDGF/sisおよびmosをコードする遺伝子を標的とすることができる。また例えば、アンチセンスオリゴは、Bcr/Abl融合腫瘍遺伝子などの染色体転座によって生じる融合遺伝子によってコードされるmRNAを標的化するのに用いることもできる。また例えば、アンチセンスオリゴは、サイクリン依存性キナーゼ、増殖性細胞核抗原(PCNA)、形質転換成長因子β(TGF-β)、核因子κB(NF-κB)、E2F、HER-2/neu、PKA、TGF-α、EGFR、TGF-β、IGFIR、P12、MDM2、VEGF、MDR、トランスフェリン、フェリチン、フェリチン受容体、トランスフェリン受容体、IRE、C-fos、HSP27、メタロチオネインなどのタンパク質をコードする遺伝子を標的とすることもできる。
【００２９】
本発明によれば、ＰＩＣミセルは、数平均分子量が３ｋＤａ〜１０ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーブロックとのブロックコポリマーとアンチセンスオリゴとを混合して作成することができる。この際、数平均分子量が３ｋＤａ〜１０ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーブロックとのブロックコポリマーとアンチセンスオリゴとは、電気的に中和する量比で混合してもよい。また、ＰＩＣミセルを形成させ、その後、ミセルを形成するポリマー間を架橋してもよい。架橋は、例えば、架橋剤を用いて行うことができる。架橋はまた、例えば、本実施例で開示するようにカチオン性ポリマーの側鎖に導入した２−イミノチオランやジメチル３，３’−ジチオビス（プロピオンイミダート）（ＤＴＢＰ）間のＳ−Ｓ結合により形成させてもよい。本発明では、架橋をしないＰＩＣミセルであっても、ＰＥＧの数平均分子量を調節することによる、薬剤送達のための標的化分子のミセル表面への表出は理論的に起こると考えられる。
【００３０】
本発明では、数平均分子量が３ｋＤａ〜１０ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーブロックとのブロックコポリマーと、アンチセンスオリゴとは、前記ブロックコポリマーとアンチセンスオリゴとの間でイオン層を形成し、これによりポリイオンコンプレックスミセルの形態となり得る。本発明のある態様では、数平均分子量が３ｋＤａ〜１０ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーブロックとのブロックコポリマーのＰＥＧ側の末端は、例えば、ＧＬＵＴ１リガンド、例えばグルコースにより修飾されていてよい。本発明のある態様では、グルコースはその６位の炭素に連結した酸素原子を介してＰＥＧブロックを修飾していてよい。本発明のある態様では、ＧＬＵＴ１リガンドは、カチオン性ポリマーのＰＥＧ末端に連結される。
【００３１】
本発明では、ＧＬＵＴ１リガンドにより修飾された数平均分子量が３ｋＤａ〜１０ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーブロックとのブロックコポリマーとアンチセンスオリゴとを含む、ＰＩＣミセルは、投与計画に従って投与され得るものであり、投与計画は、絶食させるか、または低血糖を誘発させた対象に該ミセルを投与することおよび該対象において血糖値の上昇を誘発させることを含むものである。ＷＯ２０１５０７５９４２Ａに開示されるように、ＧＬＵＴ１リガンドにより表面が修飾された小胞は、投与されると脳への送達効率がＧＬＵＴ１リガンドで修飾されていない小胞よりも高まる。また、ＷＯ２０１５０７５９４２Ａに開示されるように、ＧＬＵＴ１リガンドにより表面が修飾された小胞は、上記投与計画に従って投与されると、脳への送達効率がこのような操作をせずに単に投与されたＧＬＵＴ１リガンドにより表面が修飾された小胞よりもさらに高まる。また、上記のＧＬＵＴ１リガンドにより修飾された数平均分子量が３ｋＤａ〜１０ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーブロックとのブロックコポリマーとアンチセンスオリゴとを含む、ＰＩＣミセルは、血液神経関門、血液網膜関門または血液髄液関門を通過させることができる。
【００３２】
本発明では、ＧＬＵＴ１リガンドにより修飾された数平均分子量が３ｋＤａ〜１０ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーブロックとのブロックコポリマーとアンチセンスオリゴとを含む、ＰＩＣミセルは、ＧＬＵＴ１リガンドを有しない数平均分子量が３ｋＤａ〜１０ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーブロックとのブロックコポリマーをさらに含んでいてもよい。本発明のある態様では、ＧＬＵＴ１リガンドにより修飾された数平均分子量が３ｋＤａ〜１０ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーブロックとのブロックコポリマーとＧＬＵＴ１リガンドを有しない数平均分子量が３ｋＤａ〜１０ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーブロックとのブロックコポリマーとは、１０：９０〜４０：６０（例えば、２０：８０〜３０：７０、例えば、２５：７５）のモル比で上記ＰＩＣミセルに含まれていてもよい。あるいは、数平均分子量が３ｋＤａ〜１０ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーとのブロックコポリマーのＰＥＧ側末端の１０〜４０モル％（例えば、２０〜２０モル％、例えば、２５モル％）をグルコースにより修飾させることができる。ＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されたブロックコポリマーの比率を１０：９０〜４０：６０（または１０〜４０モル％）とすることにより、ＰＩＣミセルは、血管内皮細胞を通り抜け易くなり、組織の実質により多く集積しやすくなる。本発明のある態様では、ＧＬＵＴ１リガンドにより修飾された数平均分子量が３ｋＤａ〜１０ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーブロックとのブロックコポリマーとＧＬＵＴ１リガンドを有しない数平均分子量が３ｋＤａ〜１０ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーブロックとのブロックコポリマーとは、５０：５０〜１００：０（例えば、６０：４０〜９０：１０、７０：３０〜８０：２０）のモル比で上記ＰＩＣミセルに含まれていてもよい。あるいは、数平均分子量が３ｋＤａ〜１０ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーとのブロックコポリマーのＰＥＧ側末端の５０〜１００モル％がグルコースにより修飾させることができる。ＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されたブロックコポリマーの比率を５０：５０〜１００：０（または５０モル％〜１００モル％）とすることにより、上記ＰＩＣミセルは、血管内皮細胞に取り込まれるが、血管内皮細胞から組織実質に放出されにくくなり、結果として血管内皮細胞に集積しやすくなると考えられる。従って、ＧＬＵＴ１を発現する血管内皮細胞を通過させたいか、ＧＬＵＴ１を発現する血管内皮細胞に蓄積させたいかによって、ＰＩＣにおけるＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されたブロックコポリマーの比率を調節することができる。
【００３３】
本発明のミセルは、経口投与および非経口投与（例えば、静脈内投与または腹腔内投与）により投与することができる。
【００３４】
本発明によれば、本発明のミセルを含む医薬組成物が提供される。本発明の医薬組成物は、本発明のミセルおよび薬学的に許容可能な賦形剤を含んでいてもよい。
【実施例】
【００３５】
実施例１：ＰＩＣ（ＡＳＯ）ミセルの構築
本実施例では、アンチセンスオリゴ（ＡＳＯ）とポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ブロックを有するカチオン性ポリマーとを用いてポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）ミセル（以下、「ＰＩＣ（ＡＳＯ）ミセル」ということがある）を構築した。脳への集積効率を確認するため、上記と同様にＧｌｃ（６）をＰＥＧ鎖に連結させた。また、架橋剤を用いずに分子間架橋を導入するため、リジン側鎖に２−イミノチオラン（２−ＩＴ）またはジメチル３，３’−ジチオビス（プロピオンイミダート）（ＤＴＢＰ）を導入した。ＰＥＧの長さは、数平均分子量５ｋＤａに設定した。【００３６】
（１）ＤＩＧ（６）の合成
１，２-ｏ-イソプロピリデン-α-Ｄ-グルコフラノース（東京化成工業（株）社製）を１１．７ｇナスフラスコに量り取り、ピリジン（和光純薬工業（株）社製）６０ｍLを加えてドライヤーで加熱して溶解させ、その後ジクロロメタン（和光純薬工業（株）社製）を６０ｍＬ加えた。塩化ピバロイル（和光純薬工業（株）社製）を７．２ｍL滴下し、室温で５時間撹拌混合した。反応後、溶媒を減圧下にて除去し、純水を１００ｍL軽く撹拌しながら加えた。析出してきた白色の固形物を吸引ろ過（桐山ろ紙５Ｃ）にて回収し、純水で洗浄した。得られた白色固形物を減圧下にて乾燥した。乾燥させた白色固形物全量を６５度に温めた少量のメタノールに溶解させ、その後冷却することで再結晶にて精製を行い、針状の結晶を得た。【００３７】
ジメトキシプロパン（和光純薬工業（株）社製）２９０ｍLとｐ−トルエンスルホン酸（和光純薬工業（株）社製）３６７ｍｇを加え、７５℃に加熱して溶解させ、針状結晶へと加え、７５℃で３０分撹拌混合し、室温へと戻した。反応後トリエチルアミン（和光純薬工業（株）社製）を１ｍL少しずつ滴下し、トルエン（和光純薬工業（株）社製）を５０ｍL加えた。混合液を減圧下にて５０ｍL程度まで濃縮し、再度トルエンを５０ｍL加えて再度２０ｍL程度まで濃縮した。得られた濃縮液をジクロロメタン１００ｍLと純水１００ｍLで３回抽出し、ジクロロメタン層をビーカーに回収し、無水硫酸ナトリウム（和光純薬工業（株）社製）を適量加えて３０分撹拌混合した。吸引ろ過（桐山ろ紙５Ｃ）にて固形物を除去し、ろ液を減圧下で濃縮した。濃縮されたオイル状の溶液をシリカゲル（メルク社製）にて分離精製を行った。展開溶媒としてはヘキサン（和光純薬工業（株）社製）：酢酸エチル（和光純薬工業（株）社製）＝７：３を用いた。【００３８】
精製物にメタノール（和光純薬工業（株）社製）３０ｍLを加えて７０℃に加熱して溶解した。５規定の水酸化ナトリウム水溶液を６０ｍL加え、７０℃で１時間激しく撹拌した。ジクロロメタン３００ｍLを反応液に加えて抽出し、ジクロロメタン層を回収し、その後同様の条件で抽出を２回繰り返した。抽出液に適量の無水硫酸ナトリウムを加えて３０分間撹拌し、吸引濾過（桐山ろ紙５Ｃ）にて固形物を除去し、ジクロロメタンを減圧下にて濃縮し、白色固形物を得た。白色固形物を７５℃に温めた少量のエタノールで溶かし、冷却して析出してきた粒上の結晶を吸引ろ過（桐山ろ紙５Ｃ）で回収し、減圧下で乾燥させることでＤＩＧ（６）を得た。【００３９】
（２）ＤＩＧ（６）−ＰＥＧ−ＮＨ2の合成
ＤＩＧ（６）を５２０ｍｇ量り取り、少量のジクロロメタンおよびベンゼンで溶解し、凍結乾燥を行った。乾燥したＤＩＧ（６）にアルゴン雰囲気下で蒸留にて精製したテトラヒドロフランを７５ｍL添加し、０．３ｍｏｌ／Ｌのカリウムナフタレン溶液を６．７ｍL加え、５分撹拌した。これに蒸留にて精製したエチレンオキサイド１３．５ｍL加え、２５度で３日間撹拌した。３日後、反応溶液を１．５Lのジエチルエーテル（昭和エーテル社製）に滴下し、沈殿物を吸引ろ過（ＪＣＷＰ  １０μｍ）にて回収し、ＤＩＧ（６）−ＰＥＧ−ＯＨを得た。【００４０】
ＤＩＧ（６）−ＰＥＧ−ＯＨを６ｇフラスコに量り取りベンゼンに溶解した後、凍結乾燥した。その後アルゴン雰囲気下で蒸留にて精製したテトラヒドロフランを４０ｍＬ加え、蒸留にて精製したトリエチルアミンを０．３２ｍＬ加えた。別のフラスコに蒸留煮て精製したテトラヒドロフランを２０ｍＬ取り、蒸留にて精製したメタンスルホン酸クロライドを０．１９ｍL加えた。メタンスルホン酸クロライドの溶液を水浴で冷やしながら、ＰＥＧ溶液をゆっくり滴下し、２時間撹拌混合した。反応中に析出した沈殿物を吸引ろ過（ＪＣＷＰ  １０μｍ）にて除去し、ろ液を１Ｌのジエチルエーテルに滴下して、沈殿物を吸引ろ過（桐山ろ紙５Ｃ）にて回収した。その後、沈殿物をナスフラスコにいれ、アンモニア水５００ｍＬ（和光純薬（株）社製）で溶かし、室温で４日間撹拌した。その後、反応液を減圧下で濃縮し、陽イオン交換カラムで精製してＤＩＧ（６）−ＰＥＧ−ＮＨ2（分子量５，３００）を得た。【００４１】
（３）Ｇｌｃ（６）−ＰＥＧ−ＰＬｙｓの合成
ＤＩＧ（６）−ＰＥＧ−ＮＨ2５３０ｍｇをフラスコに量り取り、ベンゼンを加えて溶解し、凍結乾燥を行った。その後、チオ尿素（和光純薬工業（株）社製）を１ｍｏｌ／Ｌの濃度で溶解した蒸留にて精製したＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを１２ｍL加えて溶解した。別のフラスコにＮＣＡ−Ｌｙｓ（ＴＦＡ）をアルゴン雰囲気下で１，３３０ｍｇ量り取り、チオ尿素を１ｍｏｌ／Ｌの濃度で溶解した蒸留にて精製したＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを２６ｍL加えて溶解した。ＮＣＡ−Ｌｙｓ（ＴＦＡ）をＰＥＧ溶液に添加し、３日間２５℃で撹拌混合した。反応液は透析膜（ＭＷＣＯ：３，５００）に入れて外液を水で透析し、凍結乾燥にてＤＩＧ（６）−ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＴＦＡ）を回収した。
乾燥後、５００ｍｇをフラスコに取り５０ｍLのメタノールと５ｍLの１規定の水酸化ナトリウムを加えて溶解し、３５℃で２４時間撹拌した。その後、反応液を透析膜（ＭＷＣＯ:３，５００）に入れて外液を水で透析し、凍結乾燥にてＤＩＧ（６）−ＰＥＧ−ＰＬｙｓを回収した。【００４２】
得られたＤＩＧ（６）−ＰＥＧ−ＰＬｙｓを８０％トリフルオロ酢酸（東京化成工業（株）社製）に溶解し、室温で３０分反応させ、反応液は水酸化ナトリウムにて中和後、透析膜（ＭＷＣＯ:３，５００）に入れて透析した。外液は０．０１規定の塩酸で３回、純水で３回透析を行い、凍結乾燥にてＧｌｃ（６）−ＰＥＧ−ＰＬｙｓを回収した。リジンの数平均重合度は４２であった。【００４３】
その後、以下スキームに従ってリジンの側鎖に２−ＩＴまたはＤＴＢＰを導入した。【００４４】
【化１】
2019240223.tif 000003
【００４５】
上記で得られたＧｌｃ（６）−ＰＥＧ−ＰＬｙｓ  ５０ｍｇを０．１Ｍのホウ砂緩衝液（ｐＨ  ９．０）に５ｍL溶解した。別の容器に、ジ-tert-ブチルペルオキシド（ＤＴＢＰ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）  ５．５ｍｇ（Ｇｌｃ（６）−ＰＥＧ−ＰＬｙｓのＰＬｙｓに対して０．１当量）を冷水に溶解した。ＤＴＢＰ溶液をＧｌｃ（６）−ＰＥＧ−ＰＬｙｓ溶液へと滴下し、２５℃で４５分間撹拌した。その後、２−イミノチオラン（２−ＩＭ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）  ５８ｍｇ（Ｇｌｃ（６）−ＰＥＧ−ＰＬｙｓのＰＬｙｓに対して２．４当量）を粉末のまま添加し、２５℃で３０分撹拌した。反応液を３５℃に加温し、一晩撹拌した。反応溶液を透析膜（ＭＷＣＯ：３，５００）に移し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）溶液で透析（３０分で外液を交換し、２回透析）した。次いで、ＤＴＴ（和光純薬工業（株）社製）  ５４ｍｇ（Ｇｌｃ（６）−ＰＥＧ−ＰＬｙｓのＰＬｙｓに対して２．０当量）を透析膜の内液に加え、３０分間静置した。その後、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ溶液で３０分で３回、純水で３０分を３回透析した。透析後、フィルター（日本ミリポア社製、ＳｔｅｒｉｖｅｘＴＭ ＧＰ ０．２２μｍ）で処理した後、凍結乾燥し、Ｇｌｃ（６）−ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＤＴＢＰ／ＩＭ）の白色粉末を得た（収量：６０．４ｍｇ）。ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＤＴＢＰ／ＩＭ）に結合したＤＴＢＰおよびＩＭの量は、1Ｈ−ＮＭＲにより測定したＤＴＢＰのＣＨ2ピーク、ＩＭのＣＨ2及びＰＥＧのＣＨ2主鎖ピークとの積分比から算出した。得られたＧｌｃ（６）−ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＤＴＢＰ／ＩＭ）のＤＴＢＰ、ＩＭの導入率はそれぞれ１８％、８２％であった（すなわち、上記化学式においてａが０．２であり、ｂが６．２であり、ｃが３５．５であり、ａ＋ｂ＋ｃが４１．９である、分子が得られた）。【００４６】
（３）Ｇｌｃ−ＰＩＣ（ＡＳＯ）ミセルの調整
Ｇｌｃ（６）−ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＤＴＢＰ／ＩＭ）を１００ｍＭのジチオスレイトールを含む１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ溶液で５ｍｇ／ｍＬとなるように溶解した。ＡＳＯを１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ溶液で３０μＭの濃度で溶解した。電荷が釣り合うように双方の溶液を混合し、１５秒間撹拌混合した。その後、透析カセット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、ＭＷＣＯ：３，５００）に入れ、０．５％ジメチルスルホキシド（和光純薬工業（株）社製）及び５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ溶液を外液として２日間透析を行った。その後外液を５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ溶液に変えて再度２日間透析を行い、Ｇｌｃ−ＰＩＣ（ＡＳＯ）ミセル（以下「ＡＳＯミセル」ともいう）を得た（図１参照）。なお、ＡＳＯの配列は、５’−GGGTCagctgccaatGCTAG−３’であった｛ここで、大文字はＬＮＡであり、小文字はＤＮＡである｝。蛍光標識を付与した場合は、ＡＳＯの３’末端が標識された。【００４７】
なお、電荷が釣り合うＮ／Ｐ比は、以下の通り決定した。具体的には、ＰＩＣ（ＡＳＯ）は、Ｎ／Ｐ比（アミジン数／リン酸数）を０．２〜１．９までの様々な値でＰＥＧ−ＰＬｙｓとＡＳＯとを混合して、上記と同様の方法でミセルを作製した。その後、ゼータサイザーを用いて粒径、散乱光強度（ＳＬＩ）および多分散度（ＰＤＩ）を測定した。結果は、図１Ａに示される通りであった。図１Ａに示されるように、Ｎ／Ｐ比が０．５以下である場合にはＰＤＩの値が高くミセルが良好に形成しなかったことを示唆した。一方で、Ｎ／Ｐ比１．５以上である場合には、ＳＬＩがプラトーに達した。このことは、Ｎ／Ｐ比が１．５であるときにカチオン性ポリマーとＡＳＯが電気的に中和したことを示唆する。従って、以降の実験では、カチオン性ポリマーとＡＳＯとは、Ｎ／Ｐ比が１．５となるように混合してミセルを形成させた。【００４８】
実施例２：グルコース修飾率
次に、グルコース修飾率と粒子形成との関係、血中滞留性との関係、および脳への蓄積との関係を調べた。【００４９】
（１）グルコース修飾率と粒子形成および粒子の安定性との関係
Ｇｌｃ（６）−ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＤＴＢＰ／ＩＭ）とメトキシ−ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＤＴＢＰ／ＩＭ）とを１００：０、７５：２５、５０：５０、２５：７５、または０：１００のモル比で混合し、グルコース修飾率（グルコース含有量ともいう）を１００％、７５％、５０％、２５％、または０％にそれぞれ調整した。ゼータサイザーを用いて、得られた様々なグルコース含量を有するミセルの粒径（Ｚ−ａｖｅｒａｇｅ）、および多分散度（ＰＤＩ）を測定した。すると、図１Ｂに示されるように、全てのグルコース含量のミセルが０．２未満のＰＤＩを示し、良好にミセルを形成した。また、粒径は、５０〜７０ｎｍ程度であり、グルコース含量の増加に伴って粒径が増大した。【００５０】
さらに、ＡＳＯミセルのインビボでの安定性を評価した。安定性は、蛍光相関スペクトロスコピー（ＦＣＳ）により測定した。グルコース含量１００％および０％のミセルをＡｌｅｘａ６４７標識ＡＳＯを用いて調製した。それぞれのミセルを１０％ＦＢＳを含むリン酸緩衝生理食塩水で希釈し、５ｎＭ〜５μＭのＡＳＯ濃度の溶液を作製し、３７℃で１時間インキュベートした。それぞれのサンプル１００μＬずつを８穴Lab-Tek Chamber（Nalge Nunc Int. Corp., Rochester, NY）に移し、ConfoCor3 systemと組み合わせたZeiss LSM 510（Carl Zeiss, Germany）を用いて観察した。Ａｌｅｘａ６４７は、バンドパス励起光フィルターを備えたＨｅ−Ｎｅレーザー（６３３ｎｍ）を用いて励起した。対応する拡散時間（Diffusion time）はZeiss Confocor3ソフトウェアを用いて解析した。結果は図１Ｃに示される通りであった。図１Ｃに示されるように、どちらのミセルも５０ｎＭ以上の濃度において拡散時間に大きな変化は認められなかった。この結果は、血中の厳しい環境下でもミセルが解離せず安定的に存在しうることを示すものである。【００５１】
（２）グルコース修飾率とインビボにおける血中滞留性との関係
全ての動物実験は、東京大学動物倫理委員会の関連規定を遵守して行われた。Ａｌｅｘａ６４７標識ＡＳＯ（２２．５μＭ）を含むミセルを調製し、マウス（BALB/c、雌、６週齢）に静脈投与した。その後、蛍光強度の経時変化をIVRT-CLSM (Nikon Corp., Tokyo, Japan)を用いて観察した。結果は、図２および３に示される通りであった。
図３に示されるように、グルコース含量が０％または２５％である場合に最も高い血中滞留性を示した。また、グルコース含量が高まるほど血中滞留性が低下することが明らかになった。
図２には、１５μＭ  ＡＳＯを含むグルコース含量２５％のミセルの耳の血管の蛍光電子顕微鏡像を代表的な例として示す。図２に示されるように、２時間でミセルに含まれるＡＳＯに標識されたＡｌｅｘａ６４７由来の蛍光が低下するようすが示されている。【００５２】
実施例３：脳へのミセルの送達
本実施例では、上記のように作製したＡＳＯミセルの脳実質への送達効率を評価した。【００５３】
０％、２５％または５０％のグルコース含有量を有するＧｌｃ−ＰＩＣ（ＡＳＯ）は、上述のようにＡｌｅｘａ６４７標識ＡＳＯを用いて調製した。正常なマウス（BALB/c、雌、６週齢、ｎ＝３）またはアルツハイマー病マウス（BALB/c、雌、６週齢、ｎ＝３）を２４時間絶食させ、血糖値を低下させ、その後、２００μＬの２０（ｗ／ｖ）％グルコースを含むＰＢＳを腹腔内投与した。投与３０分後に、マウスに２０μｇのＡＳＯを含む、０％、２５％若しくは５０％のグルコース含有量を有するＧｌｃ−ＰＩＣ（ＡＳＯ）またはミセルに内包していない裸のＡＳＯを尾静脈投与した。
マウスを犠牲にし、脳を摘出した。摘出した脳をＰＢＳで洗浄して残存する血液を取り除いた。脳重量を計測した後にそれぞれの脳組織を細断した。対照として、ＰＢＳまたは投与量と同量のミセル溶液を脳組織と混合した試料を用いた。溶解緩衝液中でマルチビーズショッカーを用いて組織をホモジェナイズし、２，５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。１００μＬの上清を９６穴黒色プレートに移し、ＴＥＣＡＮマイクロプレートリーダーを用いてそれぞれの蛍光強度を測定した。脳組織の蛍光強度は、対照に対する相対蛍光強度により示した。結果は、図４Ａに示される通りであった。【００５４】
図４Ａに示されるように、裸のＡＳＯまたはグルコース含量が０％であるＧｌｃ−ＰＩＣ（ＡＳＯ）では、脳組織におけるＡｌｅｘａ６４７に由来する蛍光はほとんど観察されなかったのに対して、２５％のグルコース含量のミセル、または５０％のグルコース含量のミセルではそれぞれ、６．２％または３．６％の蛍光が観察された。【００５５】
また、アルツハイマー病のマウスの脳へのミセルの集積についても確認したところ、図４Ｂに示されるように、２５％のグルコース含量のミセルは、０％のグルコース含量のミセルと比較して１１倍高い脳への蓄積を示した。この結果は、Ｇｌｃ−ＰＩＣ（ＡＳＯ）がアルツハイマー病治療のための薬剤送達システムとして利用できる可能性を示唆するものである。
図５には、２５％のグルコース含量のＧｌｃ−ＰＩＣ（ＡＳＯ）の各臓器への蓄積量と裸のＡＳＯの脳への各臓器への蓄積の比を示した。すると、２５％のグルコース含量のＧｌｃ−ＰＩＣ（ＡＳＯ）は肝臓その他のあらゆる組織に対して裸のＡＳＯよりも蓄積が少なく、脳に特異的に高い蓄積を示すことが明らかとなった。図中、「0％」は、グルコース修飾率が0％であることを示し、「25％」は、グルコース修飾率が25％であることを示し、「50％」は、グルコース修飾率が50％であることを示す。【００５６】
参考例
本参考例では、ＰＥＧの数平均分子量を変えた以外は上記実施例に記載の手法と同様の手法によりＧｌｃ−ＰＩＣ（ＡＳＯ）ミセルを形成させた。より具体的には、ＰＥＧブロックの数平均分子量が２ｋＤａのＧｌｃ−ＰＩＣ（ＡＳＯ）ミセルとＰＥＧブロックの数平均分子量が１２ｋＤａのＧｌｃ−ＰＩＣ（ＡＳＯ）ミセルのミセル形成効率および脳への送達効率を示す。結果は、図６Ａ〜６Ｃに示される通りであった。【００５７】
図６Ａに示されるように、ＰＥＧブロックにおけるＰＥＧの平均分子量が２ｋＤａの場合、ミセルは形成されるものの、二峰性の粒径分布を示しミセルの形成効率は高くなかったのに対して、図６Ｂに示されるように、１２ｋＤａのＰＥＧブロックを有するミセルは、高いミセル形成効率を示した。また、１２ｋＤａのＰＥＧブロックを有するミセルは、単分散性の粒径分布を示した。この結果は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および抗体の種別によらず同様であった。【００５８】
図６Ｃに示されるように、脳へのミセルの集積量は、２ｋＤａの平均分子量のＰＥＧブロックを有するASOミセル（Gluc/m(2k)）では、脳への集積が６．２％であったのに対して、１２ｋＤａの平均分子量のＰＥＧブロックを有するASOミセル（Gluc/m(12k)）では、脳への集積が０．２％であった。この結果から、脳へのミセルの送達効率の面では、２ｋＤａの平均分子量のＰＥＧブロックを有するミセルが有利であることが明らかとなった。なお、本実験では、数平均分子量２ｋＤのモデルミセルは、ASOを用いず、Gluc-PEG-PAsp(2k-80), PEG-PAsp(2k-75), PEG-DAP(2k-76)を用いて調製した｛ここでDAPは、側鎖をジアミノペンタンで修飾したPEG-Paspを示し；２ｋはPEGの数平均分子量を表し、その後の数字はアミノ酸の数平均重合度を表す｝。【００５９】
上記から、ＰＥＧブロックの数平均分子量が１２ｋＤａである場合、ミセル形成効率は高いが、脳への集積効率が低く、他方で、数平均分子量が２ｋＤａである場合、脳への集積効率が高いが、ミセル形成効率は低い。【００６０】
本参考例ではまた、ＰＥＧブロックにおけるＰＥＧの平均分子量が５ｋＤａの上記カチオン性ポリマーと、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）またはｍＲＮＡとを用いて、上記実施例に記載のＡＳＯミセルの作製手法と同様の手法によりミセルを形成させた。ここで、ｐＤＮＡとしては、配列番号２の塩基配列（4931塩基長）を有するプラスミドＤＮＡを用い、ｍＲＮＡとしてはＥＧＦＰをコードする配列番号３の塩基配列（720塩基長）を有するｍＲＮＡを用いた。ミセルの形成効率を確認すると、図６Ｄに示されるように、アニオン性ポリマーとしてｐＤＮＡを用いた場合も、ｍＲＮＡを用いた場合も、ＡＳＯを用いた場合とは異なり、得られたミセルが単分散性を有さず、ミセル形成効率はＡＳＯミセルよりも低いことが明らかとなった。【００６１】
このことから、本実施例において、５ｋＤａの数平均分子量を有するＰＥＧブロックを含むＧｌｃ−ＰＩＣ（ＡＳＯ）の形成効率が高く、Ｇｌｃ−ＰＩＣ（ＡＳＯ）の脳への集積効率が高いという上記結果は、ＰＥＧの数平均分子量とアニオン性ポリマーの種類に依存する結果であると理解される。すなわち、ＰＥＧの数平均分子量が２ｋＤａの場合には、Ｇｌｃ−ＰＩＣ（ＡＳＯ）の形成効率が低いために、製造コスト、製造効率において不利であり、ＰＥＧの数平均分子量が１２ｋＤａの場合には、脳への送達効率が低いために不利であり、本実施例のこれらの中間的な数平均分子量を有するＰＥＧを有する場合には、アニオン性ポリマーとしてＡＳＯを用いた場合には、ｐＤＮＡやｍＲＮＡよりもミセル形成効率が格段に高く、これにより、Ｇｌｃ−ＰＩＣ（ＡＳＯ）は、ミセル形成効率および脳への送達効率の両方に優れるものとなった。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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