(57)【要約】  本発明は、光学素子に励起光を入射することにより生じる表面プラズモン共鳴により蛍光物質を励起して、前記蛍光物質から放出される蛍光の測定を行う表面プラズモン励起増強蛍光測定において、前記蛍光の測定を行う前に、前記光学素子の除電を行う表面プラズモン励起増強蛍光測定法である。本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定法は、光学ノイズが低く、高感度かつ高精度な分析が可能である。
2019230222.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光学素子に励起光を入射することにより生じる表面プラズモン共鳴により蛍光物質を励起して、前記蛍光物質から放出される蛍光の測定を行う表面プラズモン励起増強蛍光測定において、前記蛍光の測定を行う前に、前記光学素子の除電を行う表面プラズモン励起増強蛍光測定法。
【請求項２】
前記除電の方法は、前記光学素子に送風を行う方法である請求項１に記載の表面プラズモン励起増強蛍光測定法。
【請求項３】
前記除電の方法は、静電気除去装置を用いる方法である請求項１に記載の表面プラズモン励起増強蛍光測定法。
【請求項４】
前記除電の方法は、前記光学素子に金属を接触させる方法である請求項１に記載の表面プラズモン励起増強蛍光測定法。
【請求項５】
前記除電の方法は、前記光学素子に帯電防止剤を接触させる方法である請求項１に記載の表面プラズモン励起増強蛍光測定法。
【請求項６】
前記光学素子の除電を送風以外の方法で行った後、前記光学素子に送風を行う請求項１に記載の表面プラズモン励起増強蛍光測定法。
【請求項７】
前記送風以外の方法は、静電気除去装置を用いる方法、前記光学素子に金属を接触させる方法、または前記光学素子に帯電防止剤を接触させる方法である請求項６に記載の表面プラズモン励起増強蛍光測定法。
【請求項８】
除電をブランク測定の前に行う請求項１〜７のいずれかに記載の表面プラズモン励起増強蛍光測定法。
【請求項９】
除電を蛍光測定の直前にも行う請求項８に記載の表面プラズモン励起増強蛍光測定法。
【請求項１０】
前記光学素子はプリズムである請求項１〜９のいずれかに記載の表面プラズモン励起増強蛍光測定法。
【請求項１１】
前記光学素子は、微細な凸部または凹部が周期的に配列されている回折格子である請求項１〜９のいずれかに記載の表面プラズモン励起増強蛍光測定法。
【請求項１２】
前記表面プラズモン励起増強蛍光測定が、前記プリズムから入射される励起光により表面プラズモン共鳴を生じさせる金属膜と、該金属膜に固定化された第１の捕捉体とを含む検出チップを用いて行われ、
前記第１の捕捉体に被検出物質を結合させる第一工程、
前記第１の捕捉体に結合した被検出物質に、蛍光物質で標識された第２の捕捉体を結合させる第二工程、および
前記金属膜に前記プリズムから励起光を入射し、表面プラズモン共鳴により前記蛍光物質を励起して、前記蛍光物質から放出される蛍光を測定する第三工程
を含む請求項１０に記載の表面プラズモン励起増強蛍光測定法。
【請求項１３】
前記検出チップは、上部および側部に開口を有する収容部を含むウェル本体と、被検出物質を補足する補足領域を有する側壁部材とを有し、
前記側壁部材は、前記収容部の側部の開口を介して前記補足領域の少なくとも一部が前記収容部内に露出し、かつ前記収容部の側部の開口の少なくとも一部を閉塞するように前記ウェル本体に固定され、
前記側壁部材は、前記プリズムを備え、該プリズムは、光が入射する入射面と、該入射面から入射された光が反射する反射面とを有し、
前記反射面上に前記金属膜が設けられ、
前記金属膜上に前記補足領域が配置され、該補足領域に前記第１の捕捉体が結合されている
請求項１２に記載の表面プラズモン励起増強蛍光測定法。
【請求項１４】
前記表面プラズモン励起増強蛍光測定が、入射される励起光により表面プラズモン共鳴を生じさせる前記回折格子を有する金属膜と、該金属膜に固定化された第１の捕捉体とを含む検出チップを用いて行われ、
前記第１の捕捉体に被検出物質を結合させる第一工程、
前記第１の捕捉体に結合した被検出物質に、蛍光物質で標識された第２の捕捉体を結合させる第二工程、および
前記金属膜に前記プリズムから励起光を入射し、表面プラズモン共鳴により前記蛍光物質を励起して、前記蛍光物質から放出される蛍光を測定する第三工程
を含む請求項１１に記載の表面プラズモン励起増強蛍光測定法。
【請求項１５】
前記検出チップは、上部および側部に開口を有する収容部を含むウェル本体と、被検出物質を補足する補足領域を有する側壁部材とを有し、
前記側壁部材は、前記収容部の側部の開口を介して前記補足領域の少なくとも一部が前記収容部内に露出し、かつ前記収容部の側部の開口の少なくとも一部を閉塞するように前記ウェル本体に固定され、
前記側壁部材は、前記回折格子を有する金属膜を備え、
前記回折格子は、前記収容部の側部の開口を介して前記収容部内に露出し、
前記捕捉領域は前記回折格子上に配置され、前記捕捉領域に前記第１の捕捉体が結合されており、
前記ウェル本体の前記収容部を構成する側壁の少なくとも一部は光透過性を有する
請求項１４に記載の表面プラズモン励起増強蛍光測定法。
【請求項１６】
光学素子に励起光を入射することにより生じる表面プラズモン共鳴により蛍光物質を励起して、前記蛍光物質から放出される蛍光の測定を行う表面プラズモン励起増強蛍光測定装置であって、前記光学素子の除電を行う除電手段を備えた表面プラズモン励起増強蛍光測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモン励起増強蛍光測定法に関し、詳しくは、光学ノイズが低く、高精度、高感度な表面プラズモン励起増強蛍光測定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生化学検査において、抗原抗体反応などの生化学反応が利用されている。たとえば、蛍光免疫測定法（Fluoroimmunoassay, FIA）では、抗原などの被検出物質に蛍光物質を含む標識物質を結合させて被検出物質を蛍光標識する。蛍光標識された被検出物質に励起光を照射し、蛍光物質から発せられる蛍光を検出して、その蛍光の強度から被検出物質の量などを特定する。ＦＩＡの中で、被検出物質の検出を特に高感度で行うことが可能な方法として表面プラズモン励起増強蛍光測定法（Surface Plasmon-Field Enhanced Fluorescence Spectroscopy, SPFS）が知られている。【０００３】
ＳＰＦＳでは、被検出物質と特異的に結合する第１の捕捉体（たとえば１次抗体）を金属膜上に固定して、被検出物質を捕捉するための反応場を形成する。たとえば、ウェル（液体を収容する有底の凹部材）の底面に検査チップを備えたＳＰＦＳ装置が知られている。この検査チップでは、ウェルは光透過性を有する誘電体部材の上に形成された金属膜上に、貫通孔を有するウェル部材を固定することで形成されており、反応場は、ウェルの底面を構成する金属膜上に配置されている。被検出物質を含む検体をこのウェルに導入することで、金属膜上に固定された反応場を形成する第１の捕捉体に被検出物質を結合させる。次いで、蛍光標識された第２の捕捉体（たとえば２次抗体）をウェルに導入することで、第１の捕捉体に結合した被検出物質に第２の捕捉体をさらに結合させる。つまり、被検出物質を間接的に蛍光標識する。誘電体部材側から金属膜に励起光を照射すると、蛍光物質が、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance, SPR）により増強された電場により励起されて蛍光を放出する。【０００４】
ＳＰＦＳは高感度、高精度であるので、光学ノイズも高く検出してしまう。ＳＰＦＳで正確なデータを得るためには、ノイズの低減が必須である。
特許文献１には、ＳＰＦＳにおいてノイズの低減を図る技術として、プラズモン励起センサーと流路天板との間の流路に光学ノイズ吸収剤からなる層を設けたセンサーチップが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１２−３７４７７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１に記載された技術により、プラズモン発生直後に一定量の光学ノイズを吸収することにより、光学ノイズの絶対量を低減させることができるが、高感度、高精度であるＳＰＦＳにおいては、正確なデータを得るために、さらなるノイズの低減が要求される。【０００７】
本発明は、ノイズが低く、高感度かつ高精度な分析が可能な表面プラズモン励起増強蛍光測定法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、ＳＰＦＳに使用するプリズムなどの光学素子に付着した埃等が、ＳＰＦＳにおいて発生するノイズの一因となっているという知見を得て、本発明を完成するに至った。【０００９】
すなわち、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定法は、光学素子に励起光を入射することにより生じる表面プラズモン共鳴により蛍光物質を励起して、前記蛍光物質から放出される蛍光の測定を行う表面プラズモン励起増強蛍光測定において、前記蛍光の測定を行う前に、前記光学素子の除電を行う。【００１０】
前記除電の方法としては、光学素子に送風を行う方法、静電気除去装置を用いる方法、前記光学素子に金属を接触させる方法、および前記プリズムに帯電防止剤を接触させる方法を挙げることができる。【００１１】
前記表面プラズモン励起増強蛍光測定法においては、前記光学素子の除電を送風以外の方法で行った後、前記光学素子に送風を行うことも好ましい。
前記送風以外の方法としては、静電気除去装置を用いる方法、前記光学素子に金属を接触させる方法、または前記光学素子に帯電防止剤を接触させる方法を挙げることができる。【００１２】
この態様の表面プラズモン励起増強蛍光測定法において、除電をブランク測定の前に行うことが好ましく、さらに蛍光測定の直前にも行うことが好ましい。
前記光学素子としては、プリズムおよび微細な凸部または凹部が周期的に配列されている回折格子を挙げることができる。【００１３】
本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定法の一態様は、前記表面プラズモン励起増強蛍光測定が、前記プリズムから入射される励起光により表面プラズモン共鳴を生じさせる金属膜と、該金属膜に固定化された第１の捕捉体とを含む検出チップを用いて行われ、前記第１の捕捉体に被検出物質を結合させる第一工程、前記第１の捕捉体に結合した被検出物質に、蛍光物質で標識された第２の捕捉体を結合させる第二工程、および前記金属膜に前記プリズムから励起光を入射し、表面プラズモン共鳴により前記蛍光物質を励起して、前記蛍光物質から放出される蛍光を測定する第三工程を含む。【００１４】
前記態様の表面プラズモン励起増強蛍光測定法において、例えば前記検出チップは、上部および側部に開口を有する収容部を含むウェル本体と、被検出物質を補足する補足領域を有する側壁部材とを有し、
前記側壁部材は、前記収容部の側部の開口を介して前記補足領域の少なくとも一部が前記収容部内に露出し、かつ前記収容部の側部の開口の少なくとも一部を閉塞するように前記ウェル本体に固定され、
前記側壁部材は、前記プリズムを備え、該プリズムは、光が入射する入射面と、該入射面から入射された光が反射する反射面とを有し、
前記反射面上に前記金属膜が設けられ、
前記金属膜上に前記補足領域が配置され、該補足領域に前記第１の捕捉体が結合されている。【００１５】
本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定法の他の態様は、前記表面プラズモン励起増強蛍光測定が、入射される励起光により表面プラズモン共鳴を生じさせる前記回折格子を有する金属膜と、該金属膜に固定化された第１の捕捉体とを含む検出チップを用いて行われ、
前記第１の捕捉体に被検出物質を結合させる第一工程、
前記第１の捕捉体に結合した被検出物質に、蛍光物質で標識された第２の捕捉体を結合させる第二工程、および
前記金属膜に前記プリズムから励起光を入射し、表面プラズモン共鳴により前記蛍光物質を励起して、前記蛍光物質から放出される蛍光を測定する第三工程を含む。【００１６】
前記態様の表面プラズモン励起増強蛍光測定法において、例えば前記検出チップは、上部および側部に開口を有する収容部を含むウェル本体と、被検出物質を補足する補足領域を有する側壁部材とを有し、
前記側壁部材は、前記収容部の側部の開口を介して前記補足領域の少なくとも一部が前記収容部内に露出し、かつ前記収容部の側部の開口の少なくとも一部を閉塞するように前記ウェル本体に固定され、
前記側壁部材は、前記回折格子を有する金属膜を備え、
前記回折格子は、前記収容部の側部の開口を介して前記収容部内に露出し、
前記捕捉領域は前記回折格子上に配置され、前記捕捉領域に前記第１の捕捉体が結合されており、
前記ウェル本体の前記収容部を構成する側壁の少なくとも一部は光透過性を有する。【００１７】
本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置は、光学素子に励起光を入射することにより生じる表面プラズモン共鳴により蛍光物質を励起して、前記蛍光物質から放出される蛍光の測定を行う表面プラズモン励起増強蛍光測定装置であって、前記光学素子の除電を行う除電手段を備える。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定法は、光学ノイズが低く、高感度かつ高精度な分析が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、第一の実施形態に係る生化学検査システムの構成を示す模式図である。
【図２】図２ａ〜ｃは、第一の実施形態に係る検査チップの構造を示す模式図である。図２ａは、検査チップの斜視図である。図２ｂは、ウェル本体の斜視図である。図２ｃは、ウェル本体の斜視投影図である。
【図３】図３は、第一の実施形態に係る側壁部材の構造を示す模式図である。
【図４】図４は、第一の実施形態に係る検査チップを第１開口側から見た場合の模式図である。
【図５】図５は、第一の実施形態に係る制御演算部のブロック図である。
【図６】図６は、攪拌装置の回転体に設置された第一の実施形態に係る検査チップの円運動を説明する模式図である。
【図７】図７は、第一の実施形態に係る生化学検査システムの動作を説明するフローチャートである。
【図８】図８は、第一の実施形態に係る送液・搬送部の動作を説明する模式図である。
【図９】図９は、側壁部材をウェルの側面に有する第一の実施形態に係る検査チップを、ウェルの開口側から見た場合の模式図である。
【図１０】図１０は、第二の実施形態に係る検出システムの構成を示す模式図である。
【図１１】図１１Ａは、第二の実施形態に係る検出チップの斜視図であり、図１１Ｂは、ウェル本体の斜視図であり、図１１Ｃは、ウェル本体の斜視透視図である。
【図１２】図１２は、第二の実施形態に係る検出チップに入射する光と検出チップから出射する光を示す模式図である。
【図１３】図１３は、図１２の断面図における反応場近傍を拡大した部分拡大断面図である。
【図１４】図１４Ａおよび図１４Ｂは、回折格子の斜視図である。
【図１５】図１５は、第二の実施形態に係る検出方法のフローチャートであり、検出システムの動作手順の一例を示すフローチャートである。
【図１６】図１６Ａおよび図１６Ｂは、第二の実施形態に係る検出システムの第１変形例を説明するための、検出チップに入射する光と検出チップから出射する光を示す模式図である。
【図１７】図１７Ａおよび図１７Ｂは、第二の実施形態に係る検出システムの第２変形例を説明するための、検出チップに入射する光と検出チップから出射する光を示す模式図である。
【図１８】図１８（Ａ）および（Ｂ）は、それぞれプリズムの除電を行った表面プラズモン励起増強蛍光測定法において得られたブランクおよび蛍光シグナル値のグラフである。図１８（Ｃ）および（Ｄ）は、それぞれプリズムの除電を行わなかった表面プラズモン励起増強蛍光測定法において得られたブランクおよび蛍光シグナル値のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明に係る表面プラズモン励起増強蛍光測定法は、光学素子に励起光を入射することにより生じる表面プラズモン共鳴により蛍光物質を励起して、前記蛍光物質から放出される蛍光の測定を行う表面プラズモン励起増強蛍光測定において、前記蛍光の測定を行う前に、前記光学素子の除電を行う。
【００２１】
前記光学素子は、表面プラズモン励起増強蛍光測定において、励起光の入射を受けて表面プラズモン共鳴を発生させる部位であり、以下に説明する第一の実施形態においてはプリズムが、第二の実施形態においては回折格子が前記光学素子に該当する。
【００２２】
以下、図面を参照しながら本発明に係る表面プラズモン励起増強蛍光測定法を実施する形態を説明する。
［第一の実施形態］
第一の実施形態は、生化学検査方法であり、１つの検査を構成する個々のステップをそれぞれ行う複数の測定ユニットが生産ラインに順に並んでおり、検査チップが生産ラインに沿って進行することにより、個々のステップが順に行われ検査が進行していくとともに、複数の検査チップを次々と導入することにより、複数の検査をほぼ同時に行える連続形態を採用している。ただし、本発明は連続形態には限定されない。たとえば、１つの検査を構成する個々のステップを同じ位置で行い、検査の進行が検査チップの進行に依存しない非連続形態を採用することもできる。
【００２３】
（生化学検査システム）
図１は、本実施形態で使用する生化学検査システムＡの構成を示す模式図である。生化学検査システムＡは、ＳＰＦＳを利用した生化学検査を行うシステムである。具体的に、生化学検査システムＡは、金属膜上に固定化された第１の捕捉体により被検出物質を捕捉し、第１の捕捉体に捕捉された被検出物質に、蛍光物質により蛍光標識された第２の捕捉体を結合させて被検出物質を蛍光標識する。その後、金属膜に励起光を照射して金属膜近傍において表面プラズモン共鳴に基づく増強電場を発生させ、増強電場によって励起された蛍光物質から放出された蛍光を検出して被検出物質の存在や量を測定する。
【００２４】
図１に示すように、生化学検査システムＡは加振部１０と、投光部２０と、送液搬送部３０と、検出部４０とにより、加振部１０に配置された検査チップに励起光を照射し、検出部４０により、検査チップから出射された蛍光を検出するように構成されている。
【００２５】
（加振部）
加振部１０は、検査チップ６０ａ、６０ｃおよび６０ｄに対応する位置１０ａ、１０ｃおよび１０ｄに、回転振動により各検査チップ６０ａ、６０ｃおよび６０ｄ内に収容された液体を攪拌する、図示しない攪拌装置をそれぞれ備える。攪拌装置は、励起光、蛍光、プラズモン散乱光等の光路を妨げないように配置され、偏芯した回転体を有する。回転体は検査チップと接触した状態で回転振動を行うことで、検査チップの周方向の回転振動を加えて検査チップ内に収容された液体を攪拌する。ただし、攪拌装置は、偏芯した回転体を有するものに限定されず、検査チップに回転振動を加えることにより検査チップ内に収容された液体を攪拌できるものであればよい。
【００２６】
攪拌装置が検査チップ内に収容された液体を攪拌することで、生化学検査における各ステップの反応や洗浄などを効率的に行うことができる。検査チップ内の液体を効率よく攪拌する観点から、攪拌反装置は、液体を収容した検査チップの固有振動数、またはその前後の振動周波数で検査チップに回転振動を加えることが好ましい。また、異なる固有振動数（ｎ次の固有振動数およびｍ次の固有振動数、ｎおよびｍは正の整数）を順次切り替えながら検査チップに回転振動を加えてもよい。なお、攪拌装置を設ける位置は、前述した位置に限定されず、各ステップの操作内容によって、必要に応じて設置位置もしくは数を変更し、またはすべての検査チップに対応して攪拌装置をそれぞれ設けることも可能である。
【００２７】
（投光部）
投光部２０は、光源ユニットと第１角度調整部と（いずれも図示しない）からなり、検査チップに対して励起光を照射する。
【００２８】
光源ユニットは、光源と、ビーム整形光学系と、ＡＰＣ機構と、温度調整機構とからなり、検査チップに励起光を照射する。図２ａ〜ｃは、検査チップ６０の構造を有する模式図である。検査チップ６０の構造については後述するが、図２ａに示すように、検査チップ６０は、ウェル本体６１と側壁部材６２とからなり、図２ｂおよびｃに示されるように、側壁部材６２と隣接するウェル本体６１の側壁に、第２開口６４が設けられている。図３は、検査チップ６０の高さ方向（図２における上下方向）の断面における第２開口６４近傍を拡大した部分拡大断面図であり、側壁部材６２の構造を示す模式図である。側壁部材６２の構造の詳細は後述するが、図３に示すように、側壁部材６２は、プリズム７１と、金属膜７５と、捕捉膜７６とからなり、第２開口６４において捕捉膜７６が露出して反応場７７を形成する。
【００２９】
図４は、検査チップ６０の横断面を示す図であり、検査チップ６０に入射する光と検査チップ６０から出射する光とを示す模式図である。図４に示すように、光源ユニットは、波長および光量が一定の励起光９１を、検査チップ６０のプリズム７１に対して、プリズム７１の反射面７３における照射スポットの形状がほぼ円形となるように照射する。照射スポットの大きさは、反応場７７より小さいことが好ましい。
【００３０】
光源の種類は、特に限定されず、例えばレーザーダイオード（ＬＤ）である。光源の他の例には、発光ダイオード、水銀灯、その他のレーザー光源が含まれる。光源から照射される光がビームでない場合は、光源から照射される光は、レンズや鏡、スリットなどによりビームに変換される。また、光源から照射される光が単色光でない場合は、光源から照射される光は、回折格子などにより単色光に変換される。さらに、光源から照射される光が直線偏光でない場合は、光源から照射される光は、偏光子などにより直線偏光に変換される。
【００３１】
ビーム整形光学系は、たとえば、コリメーターと、バンドパスフィルターと、直線偏光フィルターと、半波長板と、スリットと、ズーム手段とからなる。ただし、ビーム整形光学系は、これらの一部のみを含むように構成されてもよい。コリメーターは、光源から出射された励起光をコリメートする。バンドパスフィルターは、光源から出射された励起光を中心波長のみの狭帯域光にする。光源から出射された励起光は、若干の波長分布幅を有するからである。直線偏光フィルターは、光源から出射された励起光を完全な直線偏光の光にする。半波長板は、反射面７３にＰ波成分が入射するように、励起光の偏光方向を調整する。スリットおよびズーム手段は、反射面７３における照射スポットの形状が所定サイズの円形となるように、励起光のビーム径や輪郭形状等を調整する。
【００３２】
ＡＰＣ機構は、光源の出力が一定となるように光源を制御する。具体的には、ＡＰＣ機構は、励起光から分岐させた光の光量をフォトダイオードなどにより検出し、回帰回路で投入エネルギーを制御して光源の出力を一定に制御する。
【００３３】
温度調整機構は、たとえば、ヒーターやペルチェ素子である。光源から出射される波長およびエネルギーは、温度によって変動することがあるので、温度調整機構は、光源の温度を一定に維持することにより光源から出射される光の波長およびエネルギーを一定に制御する。
【００３４】
第１角度調整部は、励起光９１の光軸と検査チップ６０とを相対的に回転させて、反射面７３に対する励起光９１の入射角αを調整する。
たとえば、第１角度調整部は、検査チップ６０の高さ方向に沿った軸（図４において紙面と垂直な軸）を中心として、光学ユニットを回動させて入射角αを走査する。これにより、前述した走査によって入射角αが変動したとしても、反射各７３における励起光９１の照射スポットに位置はほとんど変化せずに維持される。
【００３５】
このように、第１角度調整部が励起光９１の入射角αを走査することにより、後述する検出部４０において増強角が特定される。増強角とは、反射面７３に対して励起光９１を照射した場合に、反射面７３を通過して検査チップ６０のウェル本体６１側に放出され、励起光９１と同一波長のプラズモン散乱光９４の光量が最大となるときの入射角たる角度である。増強角は、後述する光学ブランク測定および蛍光値測定時の励起光９１の入射角αとして設定される。なお、増強角など励起光９１の入射条件は、検査チップ６０の設計要素（たとえば、プリズム７１の材料や形状、金属膜７５の膜厚、励起光９１の波長など）や、検査チップ６０内に収容される液体の屈折率等によっておおむね決定されるが、プリズム７１の形状誤差、検査チップ６０内に収容される液体の組成（たとえば、蛍光物質の種類や量など）等により変動することもあることから、検査ごとに最適な増強角を特定することが好ましい。
【００３６】
（検出部）
検出部４０は、第１レンズと、光学フィルターと、第２レンズと、位置切替手段と、受光センサーと（いずれも図示せず）からなり、検査チップ６０から出射された蛍光９３およびプラズモン散乱光９４を検出する。
【００３７】
第１レンズは、たとえば集光レンズであり、反応場７７近傍から出射される光を集光する。第２レンズは、たとえば結像レンズであり、第１レンズで集光された光を受光センサーの受光面に結像させる。第１レンズと第２レンズの間の光路は、ほぼ平行な光路となっている。
【００３８】
光学フィルターは、蛍光９３を検出する場合、位置切替部により、第１レンズと第２レンズの間の光路上に配置される。光学フィルターは、たとえば、所定の光成分を反射する多層膜を含むフィルター、または所定の光成分を吸収する色ガラスフィルターであり、第１レンズで集光された光のうち、励起光９１やプラズモン散乱光９４などの励起光成分を除去し、蛍光９３のみを受光センサーに導く。これにより、受光センサーにおいて、高いＳ（シグナル）／Ｎ（ノイズ）比で蛍光９３を検出することができる。光学フィルターの例には、励起光反射フィルター、短波長カットフィルターおよびバンドパスフィルターが含まれる。
【００３９】
プラズモン散乱光９３を検出する場合、光学フィルターは、第１レンズと第２レンズの間の光路外に配置される。この場合、プラズモン散乱光９４の光量が最大となるときの入射角たる増強角が特定される。
【００４０】
位置切替部は、必要に応じて、光学フィルターを、第１レンズと第２レンズの間の光路上に、または同光路外に配置する。具体的には、蛍光９３を検出する場合には、光学フィルターを同光路上に配置し、プラズモン散乱光９４を検出する場合には、光学フィルターを同光路外に配置する。
【００４１】
受光センサーは、蛍光９３やプラズモン散乱光９４を検出する。受光センサーは、たとえば、光電子増倍管（ＰＭＴ）やアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）などである。ただし、受光センサーは、これらに限定されず、微弱な蛍光９３を検出することが可能で、高い感度を有するものであればよい。
【００４２】
また、検出部４０は、プラズモン散乱光９４を検出する代わりに、励起光９１の反射光９２を検出するように構成されてもよい。たとえば、上記受光センサーにより、または反射光検出用の受光センサー（たとえばフォトダイオード）を別途設けて、反射光９２を検出するように構成されてもよい。この場合、投光部２０の第１角度調整部が励起光９１の入射角αを走査する際、検出部４０においては、増強角の代わりに、共鳴角が特定され、後述する光学ブランク測定および蛍光値測定時の励起光９１の入射角αとして設定される。共鳴角とは、反射面７３に対して励起光９３を照射した場合に、反射面７３に反射された励起光９１の反射光９２の光量が最小となるときの入射角たる角度である。なお、共鳴角は、増強角の極近傍に存在する。
【００４３】
また、投光部２０と受光センサーは、検査部６０と同じ高さに配置されている。これにより、生化学検査システムの小型化を図ることができる。ただし、投光部２０と受光センサーは、必ずしも検査部６０と同じ高さに配置されている必要はない。たとえば、ミラーなどを用いて投光部２０と受光センサーの位置を自由に変更することも可能である。
【００４４】
（送液搬送部）
送液搬送部３０は、送液手段と搬送手段と（いずれも図示せず）からなる。送液手段は、必要に応じて、試薬等の液体を検査チップに供給し、また、検査チップ内に収容された液体を回収する。搬送手段は、必要に応じて、検査チップを移動させて適切な位置に配置する。
【００４５】
送液手段は、試薬チップと、ピペットユニットと、第１移動機構と（いずれも図示せず）からなる。
試薬チップは、検体、検体希釈用液、測定用緩衝液、洗浄液、被検出物質に蛍光標識を付与するための標識液等をそれぞれ収容可能な容器である。検体および被検出物質の種類は特に限定されない。検体の例には、血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、鼻孔液、唾液、精液などの体液および組織抽出液が含まれる。被検出物質の例には、核酸（ＤＮＡやＲＮＡ）、タンパク質（ポリぺプチド、オリゴペプチドなど）、アミノ酸、糖質、脂質およびこれらの修飾分子が含まれる。検体希釈用液は、たとえばＢＳＡ（bovine serum albumin）,Ａｎｔｉｆｏａｍ  ＳＩ、ＮａＮ３、ＣＭＤ（carboxymethyl-dextran）、ＨＡＭＡ（human anti-mouse antibodies）阻害剤、ＰＢＳＴ（phosphate buffered saline with Tween 20）からなる。測定用緩衝液は、たとえばＢＳＡ、Ａｎｔｉｆｏａｍ  ＳＩ、ＮａＮ３、ＰＢＳＴからなる。標識液は、たとえば蛍光物質により標識された２次抗体とＰＢＳＴとからなる。また、試薬チップは通常、複数の容器が液体の種類に応じて配置されるか、または複数の容器が一体化されている。
【００４６】
ピペットユニットは、シリンジポンプとノズルとからなる。シリンジポンプは、シリンジと、シリンジ内を往復運動可能なプランジャーと、駆動機構とからなり、プランジャーの往復運動により液体を定量的に吸引または吐出する。駆動機構は、プランジャーを往復運動させるための手段であり、たとえばステッピングモーターからなる。ノズルの一旦はシリンジポンプと接続されている。シリンジポンプと接続しないシリンジの他端には、ピペットチップが装着されている。ただし、ピペットチップを使用せずに、試薬等の液体をノズルにより検査チップ内に直接供給し、または検査チップ内に収容された液体をノズルにより直接回収することも可能である。
【００４７】
第１移動機構は、ノズルを移動させて所定の位置に配置する。たとえば、第１移動機構は、ノズルを垂直方向と水平方向との二方向に自在に移動させる。第１移動機構の例には、ロボットアームと、２軸ステージまたは上下動自在なターンテーブルとからなるものが含まれる。
【００４８】
搬送手段は、検査チップ保持部と、第２移動機構（いずれも図示せず）からなる。
検査チップ保持部は、検査チップ６０を保持するためのものであり、第２移動機構に固定され、または着脱自在に構成されている。第２移動機構は、検査チップ保持部を移動させることによって、検査チップ保持部に保持された検査チップ６０を、検査を構成する個々のステップをそれぞれ行う各測定ユニットに対応する位置１０ａ〜１０ｅなど、必要に応じて適切な位置に配置する。第２移動機構の例には、コンベアや回転ステージが含まれる。ただし、複数の検査をほぼ同時に行える連続形態を採用せず、１つの検査を構成する個々のステップを同じ位置で行う非連続形態を選択する場合は、第２移動機構を設ける必要はない。たとえば、第２移動機構を省略し、検査チップ保持部のみを設けて検査チップ６０を保持するように構成してもよい。また、連続形態を選択する場合でも、検査の進行に応じて検査チップ６０を移動させる必要がなければ、１つの検査を構成する個々のステップをそれぞれ行う各測定ユニットに対応して複数の検査チップ６０を設け、１つの測定ユニットにおける作業が完了したら、検査チップ６０を移動させるのではなく、検査チップ６０内の試薬等の液体を送液手段等により次の測定ユニットに対応する検査チップ６０内に移し替えることが可能である。この場合も、第２移動機構を省略し、検査チップ保持部のみを設けて各検査チップ６０を保持するように構成してもよい。
【００４９】
（制御演算部）
図５は、制御演算部５０のブロック図である。制御演算部５０は、図５に示すように、ＣＰＵ５１と、投光制御部５２と、送液駆動制御部５３と、送液移動制御部５４と、搬送制御部５５と、検出制御部５６と、演算部５７とからなる。
【００５０】
ＣＰＵ５１は、測定全体の制御を行い、必要に応じて後述する各制御部または演算部を作動させる。投光制御部５２は、投光部２０の制御を行い、励起光を所定の位置に照射する。送液駆動制御部５３は、送液搬送部３０の送液手段のピペットユニットの制御を行い、所定の液体を所定量で吸引または吐出する。送液移動制御部５４は、送液搬送部３０の送液手段の第１移動機構の制御を行い、ノズルを所定の位置に配置する。搬送制御部５５は、送液搬送部３０の搬送手段の制御を行い、必要に応じて検査チップを適切な位置に配置する。検出制御部５６は、検出部４の制御を行い、必要に応じてプラズモン散乱光または蛍光の検出を行う。演算部５７は、プラズモン散乱光の光量に基づいて増強角を特定し、蛍光の光量に基づいて被検出物質の濃度の算出などの定量的計測を行い、またその他データの補正処理等を行う。
【００５１】
（検査チップ）
図２ａ〜ｃは、検査チップ６０の構造を示す模式図である。図２ａは、検査チップ６０の斜視図である。図２ａに示すように、検査チップ６０はウェル本体６１と側壁部材６２とからなる。ウェル本体６１は、液体を収容可能な有底の構造である。
【００５２】
（ウェル本体）
図２ｂは、ウェル本体６１の斜視図であり、図２ｃは、ウェル本体６１の斜視透視図である。図２ｂおよび２ｃに示すように、ウェル本体６１は、一方端に第１開口６３を有し、側壁部材６２と隣接する側壁に第２開口６４を有し、第１開口６３とは反対する側の側面端に底面構造６６を有する。また、ウェル本体６１は、側壁部材６２が配置された側の外壁が、側壁部材６２の幅に合わせて水平に削られ、底面構造６６により底面端が閉塞されている略円筒である。第１開口６３および第２開口６４と接続しているウェル本体６１内部の空間は、試薬等の液体を収容する液体収容部６５となる。ただし、ウェル本体６１の形状は円筒に限定されず、たとえば横断面が正方形の角筒、または横断面が非対称の形状を有するものであってもよい。特に、ウェル本体６１が縦に長い形状を呈する場合、被検出物質の検出精度の更なる向上と、安定して且つ効率的な攪拌とを同時に実現する効果が顕著である。また、側壁部材６２が配置された側のウェル本体６１の外壁の形状も、側壁部材６２を固定できればよく、平面に限定されることはない。
【００５３】
ウェル本体６１は、励起光９１の波長を有する光および蛍光９３の波長を有する光に対して透明な材料で形成されており、たとえば樹脂またはガラスで形成されている。ただし、後述する検査方法における測定を妨げない限り、ウェル本体６１の一部を、励起光９１の波長を有する光および蛍光９３の波長を有する光に対して不透明な材料で形成してもよい。
【００５４】
底面構造６６は、先端６６ａが側壁部材６２側に偏っている曲面となっている。図４は、検査チップ６０を第１開口６３側から見たときの模式図である。図４に示すように、先端６６ａは、ウェル本体６１の横断面の対称中心ｃではなく、対称中心ｃから側壁部材６２側に偏った先端位置ｘに位置する。先端位置ｘと、試薬等の液体を収容した状態での検査チップ６０の重心（以下、単に「検査チップ６０の重心」という）Ｇ２とは、検査チップ６０の長さ方向において同じ軸上に位置する。図６は、攪拌装置の回転体９９に設置された検査チップ６０の円運動を説明するための模式図である。図６の上方は、検査チップ６０内の液体を攪拌する際、攪拌装置の回転体９９に設置された検査チップ６０の側面図を示す。図６の下方は、検査チップ６０内の液体を攪拌する際、検査チップ６０を第１開口６３側から見たときの模式図を示す。図６に示すように、検査チップ６０と回転体９９とは、円端６６ａで接触していることから、先端６６ａを、検査チップ６０の重心Ｇ２が存在する検査チップ６０の長さ方向の軸上に配置することにより、図６の下方に示すように、検査チップ６０の重心Ｇ２と先端６６ａとは、同じ運動軌道で円運動を行うこととなり、検査チップ６０は、回転体９９の円運動に連れて安定した円運動を行うことが可能となる。なお、図６の下方においては、表記の便宜上、検査チップ６０を直線で表記しており、検査チップ６０の重心および先端６６ａの運動軌道をそれぞれ破線で表記している。
【００５５】
以上のように、検査チップ６０が安定した円運動を行うことが可能となれば、検査チップ６０が攪拌装置から転落することがなくなり、円運動により、検査チップ６０内に収容された試薬等の液体を効率よく攪拌し、試薬等を後述する反応場に十分に供給することができる。
【００５６】
ただし、底面構造６６は、曲面に限定されず、たとえば、先端位置ｘに先端を有する角錐、または先端位置ｘに突出部を有する平面であってもよい。すなわち、底面構造６６は、先端位置ｘにおいて攪拌装置の回転体９９と接触して円運動を受けるように構成されていればよい。また、回転体９９に装着した際の安定性の観点から、底面構造６６は、接触する回転体９９の面と同じ形状であることが好ましい。
【００５７】
また、実施形態において、先端位置ｘと、検査チップ６０の重心Ｇ２とは、検査チップ６０の長さ方向において同じ軸上に位置しているが、先端位置ｘは、これに限定されず、ウェル本体６１の横断面の中心位置（本実施形態においては対称中心ｃ）から、側壁部材６２側に偏っていればよい。たとえば、側壁部材６２の重さ等により、先端位置ｘと、検査チップ６０の重心Ｇ２とを、検査チップ６０の長さ方向において同じ軸上に配置することが、検査チップ６０の構造上不可能な場合もある。その場合、先端位置ｘと、検査チップ６０の重心Ｇ２とは、必ずしも検査チップ６０の長さ方向において同じ軸上に位置する必要はなく、先端位置ｘを、側壁部材６２側に偏るように配置すれば、検査チップ６０の円運動を安定させて検査チップ６０内に収容された試薬等の液体を効率よく攪拌する効果が得られる。
【００５８】
また、前述したとおり、検査チップ６０の重心とは、正確には試薬等の液体を収容した状態での検査チップ６０の重心であるが、製造等の便宜上、検査チップ６０の重心を検査チップ６０自体の重心とすることも可能である。
【００５９】
また、本実施形態において、検査チップ６０としては、前述したとおり、ウェル６１が、先端６６ａが側壁部材６２側に偏っている底面構造６６を有するものを使用しているが、本発明はこれに限定されない。たとえば、ウェル本体６１は、先端６６ａがウェル本体６１の横断面の対称中心ｃに位置するように構成されてもよい。
【００６０】
（側壁部材）
図３は、検査チップ６０の高さ方向（図２における上下方向）の断面における第２開口６４近傍を拡大した部分拡大断面図であり、側壁部材６２の構造を示す模式図である。図３に示すように、側壁部材６２は、プリズム７１と、金属膜７５と、捕捉膜７６とからなり、第２開口６４において捕捉膜７６が露出して反応場７７を形成する。側壁部材６２は、検査チップ６０内に収容された試薬等の液体が漏洩することなく第２開口６４を閉塞できるように、図示されていない接着層を介してウェル本体６１に接着されている。ただし、側壁部材６２は、接着層を使用せずに、レーザー溶着、超音波溶着、クランプ部材を用いた圧着などによりウェル本体６１と接合されていてもよい。
【００６１】
プリズム７１は、励起光９１に対して透明な誘導体からなる光学素子であり、複屈折特性を少なからず有する。プリズム７１の材料の例には、樹脂およびガラスが含まれ、好ましくは、屈折率が１．４〜１．６であり、且つ複屈折が小さい樹脂である。
【００６２】
図４は、検査チップ６０を第１開口６３側から見たときの模式図であり、検査チップ６０に入射する光と検査チップ６０から出射する光とを示す模式図である。図４に示すように、プリズム７１は、台形を底面とする柱体であり、台形の一方の底面に対応する面が反射面７３で、一方の脚に対応する面が入射面７４である。投光部２０から出射された励起光９１は、入射面７２に入射される。プリズム７１は、入射面７２を通過してプリズム７１の内部に入射した光が反射面７３で反射し、反射面７３で反射された反射光９２が出射面７４を通過してプリズム７１の外部に出射するように構成されている。ただし、プリズム７１の形状は、台形を底面とする柱体に限定されず、たとえば、三角柱または半円柱であってもよい。また、平面であることが好ましい。
【００６３】
また、励起光９１の光源がレーダーダイオード（ＬＤ）である場合、励起光９１がＬＤに戻ると、ＬＤの励起状態が乱されてしまい、励起光９１の波長や出力が変動してしまうので、入射面７２は、励起光９１が投光部２０に戻らないように形成されており、励起光９１が入射面７２に垂直に入射しないように反射面７３との角度が設定される。本実施形態において、入射面７２と反射面７３との角度、および、反射面７３と出射面７４との角度は、いずれも約８０°である。
【００６４】
金属膜７５は、プリズム７１の反射面７３上に形成されている。金属膜７５の材料は、表面プラズモン共鳴を生じさせうる金属であれば特に制限されない。金属膜７５の材料の例には、金、銀、銅、アルミニウムおよびこれらの合金が含まれる。金属膜７５の形成方法は、特に限定されない。金属膜７５の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、めっきが含まれる。金属膜７５の厚みは、特に限定されないが、３０〜７０ｎｍの範囲内であることが好ましい。
【００６５】
捕捉膜７６は、金属膜７５上において、被検出物質と特異的に結合する第１の捕捉体が固定化される領域である。第１の捕捉体の種類は、被検出物質との特異的に結合可能なものであれば特に限定されない。第１の捕捉体の例には、被検出物質と特異的に結合可能な抗体（１次抗体）またはその断片、核酸、酵素などが含まれる。
【００６６】
反応場７７は、第２開口６４においてウェル本体６１の液体収容部６５に露出している捕捉膜７６の領域である。反応場７７において、金属膜７５上に固定化され、捕捉膜７６を形成する第１の捕捉体は、検体中に存在する被検出物質と特異的に結合することにより被検出物質を選択的に捕捉する。検出精度の観点からは、反応場７７が形成される面、すなわち、本実施例においては、反応場７７には対応する金属膜７５の領域の面は、平面であることが好ましい。また、反応場７７の上に、第１の捕捉体の捕捉能力を長時間維持するための保護層を設けてもよい。
【００６７】
反応場７７の大きさは特に制限されない。捕捉膜７６が第２開口６４を閉塞できる大きさである場合、反応場７７の大きさは第２開口６４により規定される。これにより、反応場７７の大きさを高精度且つ容易に調整することができる。一方、捕捉膜７６が第２開口６４よりも小さい場合、捕捉膜７６の大きさがそのまま反応場７７の大きさとなる。
【００６８】
また、反応場７７は、ウェル本体６１の底面構造６６側の底面から離れた位置の配置されることが好ましい。これにより、液体収容部６５内に試薬等の液体を反応場７７に供給し反応を効率よく行うことができる。また、蛍光９３を検出する際、ウェル本体６１の底面構造６６側の底面に起因するノイズによって検出精度が低下してしまうことを防止することもできる。
【００６９】
（生化学検査システムの動作）
図７は、生化学検査システムＡの動作を説明するためのフローチャートである。図７を用いて生化学検査システムＡの動作を説明する。
【００７０】
まず、測定の準備を行う（工程Ｓ１０）。具体的に、制御演算部５０の制御により、送液搬送部３０が対象の検査チップ６０を生化学検査システムＡの位置１０ａ（図１参照）に移動させ、検査チップ６０を位置１０ａに対応する攪拌装置の回転体に装着する。そして、送液搬送部３０により洗浄液が検査チップ６０に供給され、加振部１０により検査チップ６０内の液体を攪拌しながら液体収容部６５内の洗浄を行う。この際、反応場７７上に第１の捕捉体の捕捉能力を長時間維持するための保護層が設けられている場合、保護層も除去される。その後、送液搬送部３０により、検査チップ６０内の洗浄液が回収され、測定用緩衝液が検査チップ６０内に新たに供給される。
【００７１】
次に、励起光を検査チップ６０に照射して、増強角を特定するための増強測定および光学ブランクを測定するための光学ブランク値測定を行う（工程Ｓ２０）。具体的には、制御演算部５０の制御により、送液搬送部３０が対象の検査チップ６０を生化学検査システムＡの位置１０ｂ（図１参照）に配置し、投光部１０が、検査チップ６０の反応場７７に対応する反射面７３の領域に、入射角αを走査しながら励起光９１を照射する。それと同時に、検出部４０は、励起光９１に照射された金属膜７５から検査チップ６０の内部側に放出されたプラズモン散乱光９４を検出する。制御演算部５０は、励起光９１の入射角αとプラズモン散乱光９４の強度との関係を含むデータを取得し、同データに基づいて、プラズモン散乱光９４の強度が最大となったときの入射角αを増強角として特定し、励起光９１の入射角αの増強角に設定する。また、増強角は、０．１°程度のオーダーで決定される。
【００７２】
その後、制御演算部５０の制御により、投光部１０は、検査チップ６０の反応場７７に対応する反射面７３の領域に、増強角に設定された入射角αで励起光９１を照射する。それと同時に、検出部４０は、蛍光９３と同じ波長の光の光量を検出する。制御演算部５０は、検出部４０により測定された光の光量を光学ブランクとして記録する。
【００７３】
その後、送液搬送部３０により、検査チップ６０内の測定用緩衝液が回収され、測定用検体が検査チップ６０内に新たに供給される。なお、測定用検体としては、受検者から直接採取した検体を使用してもよいし、受検者から直接採取した検体を、検体希釈用液で希釈されたものを使用してもよい。
【００７４】
次に、反応場７７に露出している第１の捕捉体に、検体中に存在する被検出物質を結合させるための１次反応を行う（工程Ｓ３０）。具体的には、制御演算部５０の制御により、送液搬送部３０が対象の検査チップ６０を生化学検査システムＡの位置１０ｃ（図１参照）に移動させ、検査チップ６０を位置１０ｃに対応する攪拌装置の回転体に装着する。そして、加振部１０により検査チップ６０内の液体を攪拌する。この際、検体中に存在する被検出物質は、反応場７７に露出している第１の捕捉体と特異的に結合するので、第１の捕捉体に捕捉され、反応場７７に留まることとなる。
【００７５】
反応に十分な時間が経過した後、検査チップ６０内を洗浄するために、送液搬送部３０により、検査チップ６０内の測定用検体が回収され、洗浄液が検査チップ６０内に新たに供給される。この際、加振部１０により、検査チップ６０内の液体を攪拌し続けるので、検査チップ６０内に非特異的に吸着した被検出物質や夾雑物等が除去される。
【００７６】
その後、送液搬送部３０により、検査チップ６０内の洗浄液が回収され、標識液が検査チップ６０内に新たに供給される。
次に、第１の捕捉体に捕捉された被検出物質に、蛍光標識を付与するための２次反応を行う（工程Ｓ４０）。具体的には、制御演算部５０の制御により、送液搬送部３０が対象の検査チップ６０を生化学検査システムＡの位置１０ｄ（図１参照）に移動させ、検査チップ６０を位置１０ｄに対応する攪拌装置の回転体に装着する。そして、加振部１０により検査チップ６０内の液体を攪拌する。標識液には、蛍光標識された第２の捕捉体が存在し、第２の捕捉体は、第１の捕捉体と特異的に結合する被検出物質の部位とは異なる部位にて被検出物質と特異的に結合するので、被検出物質は、第２の捕捉体と特異的に結合することにより間接的に蛍光標識されることとなる。なお、第２の捕捉体の種類は、第１の捕捉体と特異的に結合する被検出物質の部位とは異なる部位にて被検出物質と特異的に結合できるものであれば特に限定されない。たとえば、第２の捕捉体は、被検出物質に特異的な生体分子であってもよいし、その断片等であってもよい。また、第２の捕捉体は、１分子からなるものであってもよく、２以上の分子が結合してなる複合体であってもよい。      
【００７７】
反応に十分な時間が経過した後、検査チップ６０内を洗浄するために、送液搬送部３０により、検査チップ６０内の標識液が回収され、洗浄液が検査チップ６０内に新たに供給される。この際、加振部１０により検査チップ６０内の液体を攪拌し続けるので、検査チップ６０内に非特異的に吸着した第２に捕捉体や夾雑物等が除去される。
【００７８】
その後、送液搬送部３０により、検査チップ６０内の洗浄液が回収され、測定用緩衝液が検査チップ６０内に新たに供給される。
次に、蛍光標識された被検出物質からの蛍光値を測定するための蛍光値測定を行う（工程Ｓ５０）。具体的には、制御演算部５０の制御により、送液搬送部３０が対象の検査チップ６０を生化学検査システムＡの位置１０ｅ（図１参照）に配置し、投光部１０が、検査チップ６０の反応場７７に対応する反射面７３の領域に、増強角に設定された入射角αで励起光９１を照射する。それと同時に、検出部４０は、蛍光９３と同じ波長の光の光量を検出する。制御演算部５０は、検出部４０により測定された光の光量を蛍光値として記録する。この際、液体収容部６５内の液体（測定用緩衝液）の液面と反応場７７の位置とが接近していると、液面で反射または屈折した蛍光までも検出部４０により検出されてしまうおそれがあるので、検出精度の観点から、反応場７７は、液体収容部６５内の液体（測定用緩衝液）の液面以下で、且つ液面から離れた位置に位置することが好ましい。そのため、本工程における測定用緩衝液は、他工程において使用される液体よりも量が多く供給されてもよい。
【００７９】
その後、制御演算部５０の制御により検査チップ６０が処分されるとともに、制御演算部５０は、取得した蛍光値から、工程Ｓ２０で取得した光学ブランク値を引くことで、被検出物質の量に相関するシグナル値を算出する。また、制御演算部５０は、予め作成しておいた検量線に基づいて、同シグナル値を、被検出物質の量や濃度などに更に換算してもよい。
【００８０】
その後、検査が終了する。以上各工程により、生化学検査システムＡは、検体中の被検出物質の存在または量を測定することができる。
なお、上記工程Ｓ２０では、励起光９１の入射角αを増強角に設定したが、増強角の代わりに、励起光９１の入射角αを共鳴角に設定してもよい。この場合、工程Ｓ２０において、投光部１０は、検査チップ６０の反応場７７に対応する反射面７３の領域に、入射角αを走査しながら励起光９１を照射する。それと同時に、検出部４０は、反射光９２の光量を検出する。制御演算部５０は、励起光９１の入射角αと反射光９２の光量との関係を含むデータを取得し、同データに基づいて、反射光９２の光量が最小となったときの入射角αを共鳴角として特定し、励起光９１の入射角を共鳴角に設定する。
【００８１】
本発明に係る表面プラズモン励起増強蛍光測定法における第一の実施形態では、プリズムから励起光を入射することにより生じる表面プラズモン共鳴により、第２の捕捉体の標識に用いられた蛍光物質を励起して、この蛍光物質から放出される蛍光の測定を行う前に、前記プリズムの除電を行う。上記の本実施形態においては、工程Ｓ５０で行われる蛍光値測定の前に、プリズム７１の除電を行う。このようにプリズムの除電を行うことにより、プリズムに付着していた埃等が除去され、蛍光の測定においてプリズムに付着した埃等に起因する光学ノイズが低減されることにより、高感度かつ高精度な表面プラズモン励起増強蛍光測定分析が可能になる。プリズムの除電を行うタイミングは、前記蛍光の測定を行う前であれば特に制限はない。
【００８２】
たとえば、表面プラズモン励起増強蛍光測定が、前記プリズムから入射される励起光により表面プラズモン共鳴を生じさせる金属膜と、該金属膜に固定化された第１の捕捉体とを含む検出チップを用いて行われ、前記第１の捕捉体に被検出物質を結合させる第一工程、前記第１リガンドに結合した被検出物質に、蛍光物質で標識された第２の捕捉体を結合させる第二工程、および前記金属膜に前記プリズムから励起光を入射し、表面プラズモン共鳴により前記蛍光物質を励起して、前記蛍光物質から放出される蛍光を測定する第三工程を含む場合、プリズムの除電を行うタイミングは、蛍光を測定する前であればいずれの時点であってもよい。
【００８３】
上記の実施形態においては、工程Ｓ３０が第一の工程に該当し、工程Ｓ４０が第二の工程に該当し、工程Ｓ５０が第三の工程に該当するので、プリズム７１の除電は、工程Ｓ５０の前であればいずれの時点で行ってもよい。上記の実施形態のように、複数の検査をほぼ同時に行う連続形態を採用する場合には、各検査チップに対して、蛍光測定の前に次々プリズムの除電を行うことが好ましい。
【００８４】
除電のタイミングは、ブランク測定の前であることが最も効果的である。また、低濃度のシグナル測定に備えるために、蛍光測定の直前にも除電を行うことが効果的である。
プリズムの除電を行う方法には特に制限はなく、たとえば、送風によりプリズムに風を当てる方法、静電気除去装置を用いる方法、プリズムに金属を接触させる方法、プリズムに帯電防止剤を接触させる方法などを挙げることができる。
【００８５】
プリズムへの送風は、例えば、光の入射面、出射面、入射から出射に至るまでの光路の近辺に数秒〜数分程度の間、風を当てるようにすればよい。プリズムに送風する方法としては、軸流送風機や遠心送風機など送風機等の送風手段を用いる方法等を挙げることができる。
【００８６】
プリズムに送風する際の風量および風速は、プリズムの除電が行えれば特に制限はなく、風量では通常０．５〜５．０ｍ3／ｍｉｎ、好ましくは通常０．５〜３．５ ｍ3／ｍｉｎ、風速では、通常０．３〜１５ｍ／ｓ、好ましくは通常１．０〜５ｍ／ｓである。送風される空気の温度には制限はなく、低温でも、常温でも、高温でもよい。
【００８７】
前記送風手段に制御部を設けて、該制御部により、風速、送風される空気の温度等を制御するようにしてもよい。
静電気除去装置を用いる方法としては、たとえば、送風型静電気除去装置、交流電圧印加式静電気除去装置、直流式静電気帯電除電器、ｎａｎｏ除電除去装置、直流式エアー・ガン式静電気除去装置（いずれもウエッジ株式会社製）等を用いてプリズムの除電を行う方法が挙げられる。
【００８８】
プリズムに金属を接触させる方法としては、光の入射面、出射面、入射から出射に至るまでの光路の近辺に数秒〜数分程度の間、金属を接触させる方法を挙げることができる。前記金属としては、化学的に不活性な（活性な金属イオンを持たない）ステンレス、金属酸化物などがある。
【００８９】
プリズムに帯電防止剤を接触させる方法としては、光の入射面、出射面、入射から出射に至るまでの光路の近辺に数秒〜数分程度の間、帯電防止剤を接触させる方法を挙げることができる。前記帯電防止剤としては界面活性剤、カーボン、プラスチック添加剤、スプレーなどがある。
【００９０】
上記のようにプリズムの除電を行うことにより、除電前にプリズムに付着した埃等をプリズムから離脱させることができるが、プリズムの除電を行った後であっても、除電前にプリズムに付着していた埃等がプリズムから離脱せず、そのままプリズムに付着したままになっていることも考えられる。そこで、プリズムの除電を、プリズムに送風をする方法以外の方法で行った場合には、除電後プリズムに付着したままになっている埃等を除去するために、除電後にプリズムに送風することが好ましい。プリズムは除電によりすでに埃等を保持する性質が実質的に失われているので、除電後プリズムに送風を行えば、プリズムに付着している埃等があったとしても、これを容易にプリズムから除去することができる。
【００９１】
プリズムの除電を、プリズムに送風をすることにより行った場合には、除電とともに埃等の除去も同時に行うことができるので効果的である。また、プリズムの除電を、プリズムに送風をする方法以外の方法で行った後にプリズムに送風を行った場合には、プリズムに送風をする方法以外の方法によりプリズムの除電が行われ、さらに送風によってもプリズムの除電が行われ、その上送風により埃等の除去も行うことができることからきわめて効果的である。
プリズムに送風をする方法以外の方法で行った後に行うプリズムへの送風の条件は、上記に示したプリズムへの送風条件と同様である。
【００９２】
［第二の実施形態］
第二の実施形態は、回折格子を利用してＳＰＲを生じさせる回折格子結合型ＳＰＦＳ（ＧＣ−ＳＰＦＳ）を用いた表面プラズモン励起増強蛍光測定法である。以下、ＧＣ−ＳＰＦＳにより被検出物質を検出する検出チップ、検出システムおよび検出方法について説明する。
【００９３】
図１０は、第二の実施形態に係る検出システム３００の構成を示す模式図である。図１０に示されるように、検出システム３００は、所定の位置に検出チップ４００を装着された状態で動作する。検出システム３００は、検出チップ４００以外に、励起光照射ユニット３１０、蛍光検出ユニット３２０、送液ユニット１３０、加振部１４０、および制御部３５０を有する。検出システム３００では、所定の位置に検出チップ４００を装着した状態で、検出チップ４００の回折格子４２８（金属膜４２５）で表面プラズモン共鳴が発生するように検出チップ４００に励起光αを照射し、回折格子４２８近傍において表面プラズモン共鳴に基づく増強電場を発生させる。そして、当該増強電場により回折格子４２８上の反応場４２６に存在する蛍光物質を励起させ、蛍光物質が発する蛍光βを検出することで、検体中の被検出物質の有無や量を測定する。
【００９４】
第二の実施形態における励起光照射ユニット３１０、蛍光検出ユニット３２０、送液ユニット１３０、加振部１４０、および制御部３５０は、それぞれ第一の実施形態における投光部２０、検出部４０、送液搬送部３０、加振部１０および制御演算部５０に対応する。
【００９５】
検出システム３００は、主として、検出チップ４００が光学素子として回折格子４２８を有する点、および励起光照射ユニット３１０が回折格子４２８に励起光αを照射することでＳＰＲを生じさせる点で、第一の実施形態と異なる。
【００９６】
（検出チップ）
図１１Ａ〜Ｃは、第二の実施形態に係る検出チップ４００の構成を示す模式図である。図１１Ａは、検出チップ４００の斜視図であり、図１１Ｂは、ウェル本体２１０の斜視図であり、図１１Ｃは、ウェル本体２１０の斜視透視図である。図１２は、検出チップ４００に入射する光（励起光α）と検出チップ４００から出射する光（励起光の反射光α'および蛍光β）を示す模式図である。図１２は、検出チップ４００の高さ方向に沿う断面図であり、収容部２１１内に液体（例えば測定用緩衝液）が収容されている状態を示している。図１３は、図１２の断面図における反応場４２６近傍を拡大した部分拡大断面図である。
【００９７】
図１１Ａおよび図１２に示されるように、検出チップ４００は、ウェル本体２１０および側壁部材４２０を有する。
ウェル本体２１０は、第一の実施形態に係る検出チップ６０のウェル本体６１と形状以外については同様である。ウェル本体２１０は、その内部に収容部（ウェル）２１１を有している。収容部２１１は、液体を収容できるように構成された有底の凹部であり、上部に設けられた第１開口２１２および側部に設けられた第２開口２１３により外部に開放されている。
【００９８】
ウェル本体２１０は、光（少なくとも励起光αの波長の光および蛍光βの波長の光）に対して透明な材料で形成されている。ただし、後述の検出方法における光の取り出しの妨げにならない限り、ウェル本体２１０の一部は光に対して不透明な材料で形成されていてもよい。少なくとも、収容部２１１を構成する側壁の一部は、光透過性を有している。本実施の形態では、少なくとも、収容部２１１を構成する４つの側壁のうちの反応場４２６と対向する側壁は、光透過性を有している。光に対して透明な材料の例には、樹脂およびガラスが含まれる。
【００９９】
本実施の形態に係る検出チップ４００では、励起光照射ユニット３１０から出射された光（励起光α）と、反応場４２６近傍から放出され検出部１２５により検出される光（励起光の反射光α'および蛍光β）が、いずれも反応場４２６と対向する側壁を透過する（図１０参照）。したがって、これらの光の屈折を抑制したい場合は、図１２に示されるように、収容部において反応場４２６（捕捉領域４２７）と対向する側壁の内面および外面は、いずれも平面であることが好ましい。
【０１００】
側壁部材４２０は、基板４２１、金属膜４２５および反応場４２６を有している。「反応場」とは、金属膜４２５上に配置された捕捉領域４２７のうち、第２開口２１３を介して収容部２１１内に露出している領域を意味する（図１３参照）。金属膜４２５の表面において反応場４２６に対応する部分の少なくとも一部には、光学素子としての回折格子４２８が形成されている。図１１Ａ、図１２および図１３に示されるように、側壁部材４２０は、捕捉領域４２７の少なくとも一部が収容部２１１内に露出して反応場４２６となり、かつ側壁部材４２０が第２開口２１３の少なくとも一部を完全に閉塞するようにウェル本体２１０に固定されている。
【０１０１】
基板４２１は、金属膜４２５を支持するとともに、ウェル本体２１０の第２開口２１３を閉塞するための部材である。基板４２１は、収容部２１１を構成する側壁としても機能する。基板４２１の形状および材料は、上記機能を実現可能であれば特に限定されない。基板４２１の材料の例には、樹脂およびガラスが含まれる。
【０１０２】
金属膜４２５は、基板４２１のウェル本体２１０側の面上に配置されている。前述のとおり、金属膜４２５には、光学素子としての回折格子４２８が形成されている。金属膜４２５は、基板４２１のウェル本体２１０側の表面の全体に形成されていてもよいし、一部のみに形成されていてもよい。また、回折格子４２８は、金属膜４２５のウェル本体２１０側の表面の全体に形成されていてもよいし、一部のみに形成されていてもよい。回折格子４２８は、金属膜４２５の表面において反応場４２６に対応する部分の少なくとも一部に形成されている。回折格子４２８に光を照射すると、金属膜４２５中に生じる表面プラズモンと、回折格子４２８により生じるエバネッセント光とが結合してＳＰＲが生じ、金属膜４２５の表面上に局在する増強電場が生じる。金属膜４２５の材料は、ＳＰＲを生じさせる金属であれば特に限定されない。金属膜４２５の材料の例には、金、銀、銅、アルミニウムおよびこれらの合金が含まれる。金属膜４２５の形成方法は、特に限定されない。金属膜４２５の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、めっきが含まれる。金属膜４２５の厚みは、特に限定されないが、３０〜７０ｎｍの範囲内であることが好ましい。
【０１０３】
回折格子４２８は、金属膜４２５に光を照射された時に、エバネッセント光を生じさせる。回折格子４２８の形状は、エバネッセント光を生じさせることができれば特に限定されない。たとえば、回折格子４２８は、図１４Ａに示されるように１次元回折格子であってもよいし、図１４Ｂに示されるように２次元回折格子であってもよい。図１４Ａに示される１次元回折格子では、金属膜４２５の表面に、互いに平行な複数の凸条が所定の間隔で形成されている。図１４Ｂに示される２次元回折格子では、金属膜４２５の表面に、所定形状の凸部が周期的に配置されている。凸部の配列の例には、正方格子、三角（六方）格子などが含まれる。回折格子４２８の断面形状の例には、矩形波形状、正弦波形状、鋸歯形状などが含まれる。回折格子のピッチは、ＳＰＲを発生させる観点から、１００〜２０００ｎｍの範囲が好ましい。ここで「回折格子のピッチ」とは、図１４Ａおよび１４Ｂに示されるように、凸部の配列方向における凸部の中心間距離Λをいう。なお、本実施の形態では、凸部の配列方向が収容部２１１の深さ方向に沿うように、回折格子４２８が配置される。
【０１０４】
回折格子４２８の形成方法は、特に限定されない。たとえば、平板状の基板４２１の上に金属膜４２５を形成した後、金属膜４２５に凹凸形状を付与してもよい。また、予め凹凸形状を付与された基板４２１の上に、金属膜４２５を形成してもよい。いずれの方法であっても、回折格子４２８を含む金属膜４２５を形成することができる。
【０１０５】
反応場４２６は、収容部２１１内に露出している、被検出物質を捕捉するための領域である。前述のとおり、反応場４２６は、金属膜４２５上に配置された捕捉領域４２７のうち、第２開口２１３を介して収容部２１１内に露出している領域を意味する。本実施の形態では、反応場４２６の少なくとも一部は、回折格子４２８の上に位置する。
【０１０６】
反応場４２６は、収容部２１１の内側面に配置される。このとき、反応場４２６は、収容部２１１の最深部から離れた位置に配置されることが好ましい。このような構成とすることで、収容部２１１内に検体などを導入したときに反応場４２６において効率よく反応を生じさせることができる。また、蛍光βの検出時に、収容部２１１の底部に起因するノイズが検出結果に混じることを抑制することもできる。
【０１０７】
捕捉領域４２７は、金属膜４２５上において被検出物質を捕捉するための第１の捕捉体が固定化されている領域である。第１の捕捉体の種類は、被検出物質に特異的に結合するための認識部位を有していれば特に制限されない。第１の捕捉体の例には、被検出物質に特異的に結合可能な抗体（１次抗体）またはその断片、被検出物質に特異的に結合可能な酵素などが含まれる。
なお、検出チップ４００は、収容部２１１以外にも液体を収容可能な第２収容部をさらに有していてもよい。
【０１０８】
（検出システム）
次に、検出システム３００の検出チップ４００以外の構成要素について説明する。前述のとおり、検出システム３００は、検出チップ４００以外に、励起光照射ユニット３１０、蛍光検出ユニット３２０、送液ユニット１３０、加振部１４０、および制御部３５０を有する（図１０参照）。
【０１０９】
励起光照射ユニット３１０は、ウェル本体２１０の側壁および収容部２１１を介して回折格子４２８に励起光αを照射する。励起光の反射光α'または蛍光βの測定時には、励起光照射ユニット３１０は、回折格子４２８（金属膜４２５）に対する入射角が回折格子４２８でＳＰＲを生じさせる角度となるように、回折格子４２８（金属膜４２５）に対するＰ波のみを回折格子４２８に向けて出射する。このとき、励起光照射ユニット３１０は、励起光αの光軸および反射光α'の光軸を含む平面が回折格子の凸部の配列方向に沿うように回折格子４２８に励起光αを照射する。「励起光」とは、蛍光物質を直接または間接的に励起させる光である。たとえば、励起光αは、回折格子４２８でＳＰＲが生じる角度で回折格子４２８に照射されたときに、蛍光物質を励起させる増強電場を回折格子４２８上に生じさせる光である。励起光照射ユニット３１０は、光源ユニット１１１および第１角度調整部１１２を含む。光源ユニット１１１は、コリメートされ、かつ波長および光量が一定の励起光αを、反応場４２６（回折格子４２８）における照射スポットの形状が略円形となるように出射する。第１角度調整部１１２は、反応場４２６（回折格子４２８）に対する励起光αの入射角を調整する。
【０１１０】
回折格子４２８に対する励起光αの入射角は、ＳＰＲにより形成される増強電場の強度が最も強くなり、その結果として蛍光物質からの蛍光βの強度が最も強くなる角度が好ましい。励起光αの入射角は、回折格子４２８のピッチΛや励起光αの波長、金属膜４２５を構成する金属の種類などに応じて適切に選択される。たとえば、励起光αの入射角θは、以下の式（１）を満たすように設定される。
【０１１１】
【数１】
2019230222.tif 000003
【０１１２】
ｋ0：励起光αの波数＝２π／（λ0／ｎ）
λ0：真空中の励起光αの波長
ｎ：回折格子４２８上の媒質（収容部２１１内の液体）の屈折率
θ：励起光αの回折格子４２８に対する入射角
ｍ：整数
Λ：回折格子４２８のピッチ
ここで、ｋspは、２種類の媒質の界面（金属膜４２５と収容部２１１内の液体との界面）において励起されるプラズモンの波数であり、以下の式（２）のように定義される。
【０１１３】
【数２】
2019230222.tif 000004
【０１１４】
ω：励起光αの角周波数
ｃ：光速度
ε1：回折格子４２８上の媒質（収容部２１１内の液体）の誘電率＝ｎ2
ε2：回折格子４２８を構成する媒質（金属）の誘電率
励起光αの最適な入射角は、各種条件の変更により変わるため、第１角度調整部１１２は、励起光αの光軸と回折格子４２８とを相対的に回転させることで入射角を調整する。
【０１１５】
蛍光検出ユニット３２０は、回折格子４２８への励起光αの照射によって生じ、収容部２１１およびウェル本体２１０の側壁を透過した蛍光βを検出する。また、必要に応じて、蛍光検出ユニット３２０は、回折格子４２８への励起光αの照射によって生じ、収容部２１１およびウェル本体２１０の側壁を透過した励起光の反射光α'も検出する。蛍光検出ユニット３２０は、光学フィルター１２２、位置切替部１２４、検出部１２５および第２角度調整部３２６を含む。
【０１１６】
光学フィルター１２２は、蛍光成分のみを検出部１２５に導き、高いＳ（シグナル）／Ｎ（ノイズ）比で蛍光βを検出するために、励起光成分（プラズモン散乱光γ）を除去する。光学フィルター１２２の例には、励起光反射フィルター、短波長カットフィルターおよびバンドパスフィルターが含まれる。光学フィルター１２２は、例えば、所定の光成分を反射する多層膜を含むフィルター、または所定の光成分を吸収する色ガラスフィルターである。
【０１１７】
位置切替部１２４は、光学フィルター１２２の位置を切り替える。具体的には、検出部１２５が蛍光βを検出する時には、光学フィルター１２２を光路上に配置し、検出部１２５がプラズモン散乱光γを検出する時には、光学フィルター１２２を光路外に配置する。
【０１１８】
検出部１２５は、蛍光βおよびプラズモン散乱光γを検出する受光センサーである。検出部１２５は、微小量の被検出物質からの微弱な蛍光βを検出することが可能な、高い感度を有する。検出部１２５は、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）やアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）などである。
【０１１９】
蛍光検出ユニット３２０は、検出部１２５の検出範囲を拡げるために集光レンズをさらに有していてもよいが、バックグラウンドの低減の観点からは集光レンズを含まない方が好ましい。
【０１２０】
第２角度調整部３２６は、蛍光検出ユニット３２０の光軸と回折格子４２８とを相対的に回転させることで蛍光検出ユニット３２０の光軸の角度を調整する。たとえば、第２角度調整部３２６は、蛍光検出ユニット３２０の光軸と金属膜４２５との交点を中心として、検出部１２５を回転させる。第２角度調整部３２６が検出部１２５の位置を適宜調整することで、反応場４２６（回折格子４２８）から放出され、収容部２１１およびウェル本体２１０の側壁を透過した蛍光βの強度が最大となる角度（蛍光ピーク角）で、蛍光検出ユニット３２０は蛍光βを検出することができる。また、光源ユニット１１１を移動させて励起光αの入射角を調整しているときに、光源ユニット１１１の位置に合わせて検出部１２５を移動させて反射光α'を検出することができる。
【０１２１】
送液ユニット１３０は、検出チップ４００の収容部２１１内に各種液体を導入する。また、送液ユニット１３０は、検出チップ４００の収容部２１１内から各種液体を除去する。本実施の形態では、送液ユニット１３０は、例えば検体や、蛍光物質で標識された第２の捕捉体を含む標識液（以下「標識液」ともいう）、洗浄液、測定用緩衝液などの注入および吸引を行う。送液ユニット１３０は、液体チップ１３１、ピペット１３２およびピペット制御部１３６を含む。
【０１２２】
液体チップ１３１は、検体や標識液、洗浄液、測定用緩衝液などの液体をそれぞれ収容するための容器である。液体チップ１３１としては、通常、複数の容器が液体の種類に応じて配置されるか、または複数の容器が一体化したチップが配置される。
【０１２３】
ピペット１３２は、シリンジポンプ１３３と、シリンジポンプ１３３に接続されたノズルユニット１３４と、ノズルユニット１３４の先端に装着されたピペットチップ１３５とを有する。シリンジポンプ１３３内のプランジャーの往復運動によって、ピペットチップ１３５における液体の吸引および排出が定量的に行われる。
【０１２４】
ピペット制御部１３６は、シリンジポンプ１３３の駆動装置、およびノズルユニット１３４の移動装置を含む。シリンジポンプ１３３の駆動装置は、シリンジポンプ１３３のプランジャーを往復運動させるための装置であり、例えば、ステッピングモーターを含む。ノズルユニット１３４の移動装置は、例えば、ノズルユニット１３４を、垂直方向と水平方向との二方向に自在に動かす。ノズルユニット１３４の移動装置は、例えば、ロボットアーム、２軸ステージまたは上下動自在なターンテーブルによって構成される。
【０１２５】
ピペット制御部１３６は、シリンジポンプ１３３を駆動して、液体チップ１３１から各種液体をピペットチップ１３５内に吸引させる。そして、ピペット制御部１３６は、ノズルユニット１３４を移動させて、検出チップ２００の収容部２１１内に第１開口２１２からピペットチップ１３５を挿入させるとともに、シリンジポンプ１３３を駆動して、ピペットチップ１３５内の液体を収容部２１１内に注入させる。また、液体の導入後、ピペット制御部１３６は、シリンジポンプ１３３を駆動して、収容部２１１内の液体をピペットチップ１３５内に吸引させる。このように収容部２１１内の液体を順次交換することによって、反応場４２６において第１の捕捉体と被検出物質を反応させたり（１次反応）、被検出物質と蛍光物質で標識された第２の捕捉体とを反応させたりする（２次反応）。
【０１２６】
加振部１４０は、収容部２１１内の液体を撹拌するために検出チップ４００を振動させる。このように検出チップ２００を振動させて収容部２１１内の液体を撹拌することで、反応場４２６における１次反応や２次反応、洗浄などを効率的に行うことができる。加振部１４０は、例えばピエゾ素子や偏芯させた回転体などである。加振部１４０は、励起光α、蛍光βおよびプラズモン散乱光γの光路を妨げない位置に配置される。
【０１２７】
加振部１４０により検出チップ４００に加えられる振動の方向は、特に限定されない。振動方向の例には、水平方向や垂直方向（高さ方向）、周方向などが挙げられる。たとえば、加振部１４０としてのピエゾ素子を検出チップ４００の側面に接触させた状態でピエゾ素子を駆動することで、検出チップ４００に水平方向の往復振動を加えることができる。また、加振部１４０としてピエゾ素子を検出チップ４００の底面に接触させた状態でピエゾ素子を駆動することで、検出チップ４００に垂直方向の往復振動を加えることができる。また、加振部１４０としての偏芯させた回転体を検出チップ４００の底面に接触させた状態で回転体を回転させることで、検出チップ４００に周方向の回転振動を加えることができる。収容部２１１内の液体を効率よく撹拌する観点からは、収容部２１１内に液体が収容されている状態の検出チップ４００の固有振動数、またはその前後の振動周波数で検出チップ４００を振動させることが好ましい。また、異なる固有振動数（ｎ次の固有振動数およびｍ次の固有振動数、ｎおよびｍは正の整数）を順次切り替えながら検出チップ４００を振動させてもよい。
【０１２８】
制御部３５０は、光源ユニット１１１、第１角度調整部１１２、位置切替部１２４、検出部１２５、第２角度調整部３２６、ピペット制御部１３６、加振部１４０を制御する。制御部３５０は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
【０１２９】
なお、本実施の形態では、励起光αを照射されうる位置に配置された検出チップ４００に対して、送液ユニット１３０による液体の導入および除去、ならびに加振部１４０による振動の印加を行うことができるように、送液ユニット１３０および加振部１４０が配置されているが、送液ユニット１３０および加振部１４０の位置はこれに限定されない。たとえば、検出チップ４００が第１の位置に配置されている場合に、送液ユニット１３０による液体の導入および除去、ならびに加振部１４０による振動の印加が行われ、検出チップ４００が第２の位置に配置されている場合に、励起光照射ユニット３１０による励起光αの照射および蛍光検出ユニット３２０による蛍光βの検出が行われてもよい。この場合は、検出システム３００は、検出チップ４００を第１の位置および第２の位置に移動させるための搬送ユニットをさらに有する。
【０１３０】
（検出方法）
次に、検出システム３００を用いた被検出物質の検出方法について説明する。図１５は、本実施の形態の検出方法を行う際の検出システム３００の動作手順の一例を示すフローチャートである。
【０１３１】
まず、検出の準備をする（工程Ｓ１１０）。具体的には、検出システム３００の所定の位置に検出チップ４００を設置する。また、検出チップ４００の反応場４２６上に保湿剤が存在する場合には、収容部２１１内を洗浄して反応場４２６上の保湿剤を除去する。この後、制御部３５０は、ピペット制御部１３６を制御して、収容部２１１内に測定用緩衝液を導入させる。
【０１３２】
次いで、検出チップ４００の回折格子４２８（金属膜４２５）に対する励起光αの入射角を共鳴角に設定する（工程Ｓ１２０）。具体的には、制御部３５０は、光源ユニット１１１および第１角度調整部１１２を制御して、励起光αを回折格子４２８に照射させながら、回折格子４２８に対する励起光αの入射角を走査する。これと同時に、制御部３５０は、検出部１２５および第２角度調整部３２６を制御して、励起光の反射光α'を検出させる。このとき、制御部３５０は、位置切替部１２４を制御して、光学フィルター１２２を光路外に移動させる。制御部３５０は、励起光αの入射角と反射光α'の強度との関係を含むデータを得る。そして、制御部３５０は、データを解析して、反射光α'の強度が最小となる入射角（共鳴角）を決定する。最後に、制御部３５０は、第１角度調整部１１２を制御して、回折格子４２８に対する励起光αの入射角を共鳴角に設定する。
【０１３３】
次いで、光学ブランク値を測定する（工程Ｓ１３０）。具体的には、制御部３５０は、光源ユニット１１１を制御して、励起光αを回折格子４２８に照射させる。これと同時に、制御部３５０は、検出部１２５および第２角度調整部３２６を制御して、蛍光βと同じ波長の背景光の光量を検出させる。このとき、制御部３５０は、位置切替部１２４を制御して、光学フィルター１２２を光路上に移動させる。また、制御部３５０は、第２角度調整部３２６を制御して、金属膜４２５の垂線に対する蛍光検出ユニット３２０の光軸の角度を適切な角度（好ましくは工程Ｓ１６０における蛍光ピーク角）にする。たとえば、金属膜４２５の垂線に対する蛍光検出ユニット３２０の光軸の角度は、金属膜４２５に対する励起光αの入射角の２倍程度であればよい。制御部３５０は、測定された背景光の光量をブランク値として記録する。
【０１３４】
次いで、検出チップ４００の収容部２１１内に検体を導入し、反応場４２６の第１の捕捉体に、検体中に含まれる被検出物質を特異的に結合させる（１次反応（工程Ｓ１４０））。具体的には、制御部３５０は、ピペット制御部１３６を制御して、収容部２１１内の測定緩衝液を除去させるとともに、収容部２１１内に検体を導入させる。また、制御部３５０は、加振部１４０を制御して、検出チップ４００を振動させて収容部２１１内の検体を撹拌させる。この後、制御部３５０が、ピペット制御部１３６を制御して、収容部２１１内の検体を除去させるとともに、収容部２１１内に洗浄液を導入させて、収容部２１１内を洗浄する。このときも、制御部３５０は、加振部１４０を制御して、検出チップ４００を振動させて収容部２１１内の洗浄液を撹拌させる。検体および被検出物質の種類は、特に限定されない。
【０１３５】
次いで、回折格子４２８上の第１の捕捉体に結合した被検出物質に、蛍光物質で標識された第２の捕捉体を結合させる（２次反応（工程Ｓ１５０））。これにより、被検出物質が間接的に蛍光物質で標識される。具体的には、制御部３５０は、ピペット制御部１３６を制御して、収容部２１１内の洗浄液を除去させるとともに、収容部２１１内に第２の捕捉体を含む標識液を導入させる。また、制御部３５０は、加振部１４０を制御して、検出チップ４００を振動させて収容部２１１内の標識液を撹拌させる。この後、制御部３５０は、ピペット制御部１３６を制御して、収容部２１１内の標識液を除去させるとともに、収容部２１１内に洗浄液を導入させて、収容部２１１内を洗浄する。このときも、制御部３５０は、加振部１４０を制御して、検出チップ４００を振動させて収容部２１１内の洗浄液を撹拌させる。さらに、制御部３５０は、ピペット制御部１３６を制御して、収容部２１１内の洗浄液を除去させるとともに、収容部２１１内に測定用緩衝液を導入させる。      
【０１３６】
次いで、被検出物質を標識する蛍光物質からの蛍光値を測定する（工程Ｓ１６０）。具体的には、制御部３５０は、光源ユニット１１１を制御して、励起光αを、ウェル本体２１０の側壁および収容部２１１内の測定用緩衝液を介して回折格子４２８（反応場４２６）に照射させる。これと同時に、制御部３５０は、検出部１２５および第２角度調整部３２６を制御して、蛍光βと同じ波長の光（その大部分は収容部２１１内の測定用緩衝液およびウェル本体２１０の側壁を透過してきた蛍光β）の光量を検出させる。このとき、制御部３５０は、位置切替部１２４を制御して、光学フィルター１２２を光路上に移動させる。また、制御部３５０は、第２角度調整部３２６を制御して、金属膜４２５の垂線に対する蛍光検出ユニット３２０の光軸の角度を適切な角度（好ましくは蛍光ピーク角）にする。たとえば、金属膜４２５の垂線に対する蛍光検出ユニット３２０の光軸の角度は、金属膜４２５に対する励起光αの入射角の２倍程度であればよい。制御部３５０は、測定された光量を蛍光値として記録する。
【０１３７】
最後に、被検出物質の存在または量を算出する（工程Ｓ１７０）。蛍光値は、主として、被検出物質を標識する蛍光物質に由来する蛍光成分（シグナル値）と、光学ブランク値とを含む。したがって、制御部３５０は、工程Ｓ１６０で得られた蛍光値から工程Ｓ１３０で得られた光学ブランク値を引くことで、被検出物質の量に相関するシグナル値を算出することができる。そして、あらかじめ作成しておいた検量線により、被検出物質の量や濃度などに換算する。
【０１３８】
以上の手順により、検体に含まれる被検出物質の存在または量を検出することができる。
以上のように、本実施の形態に係る検出チップ４００、検出システム３００および検出方法によれば、収容部２１１内の液体の液面を透過させずに蛍光βを検出するため、液面および気泡による検出結果への影響を抑制して、被検出物質を高い信頼性で検出することができる。
【０１３９】
なお、本実施の形態では、励起光αの光軸および反射光α'の光軸を含む平面が収容部
２１１の深さ方向に沿うように回折格子４２８に励起光αを照射する検出チップ、検出システムおよび検出方法について説明したが、本実施の形態に係る検出チップ、検出システムおよび検出方法はこれに限定されない。たとえば、図１７Ａおよび図１７Ｂに示されるように、本実施の形態に係る検出システムは、励起光αの光軸および反射光α'の光軸を含む平面が水平方向に沿うように回折格子４２８に励起光αを照射してもよい。この場合、凸部の配列方向が水平方向に沿うように回折格子４２８が配置され、蛍光βも水平方向に沿って放出される。したがって、光源ユニット１１１および検出部１２５は、検出チップ４００と同じ高さに配置されうる。また、この場合、収容部２１１の形状によっては、収容部２１１を構成する４つの側壁のうちの反応場４２６が配置されている側の側壁および反応場４２６と対向する側壁以外の２つの側壁のうちの一方を透過させて励起光αを照射し、他方を透過させて蛍光βを検出することもできる。もちろん、収容部２１１の形状によっては、収容部２１１を構成する４つの側壁のうちの反応場４２６と対向する側壁を透過させて励起光αを照射し、蛍光βを検出することもできる。
【０１４０】
また、本実施の形態では、収容部２１１側から回折格子４２８に励起光αを照射する検出チップ、検出システムおよび検出方法について説明したが、本実施の形態に係る検出チップ、検出システムおよび検出方法は、これに限定されない。たとえば、図１８Ａおよび図１８Ｂに示されるように、本実施の形態に係る検出システムは、基板４２１側から回折格子４２８に励起光αを照射してもよい。このように基板４２１側から回折格子４２８に励起光αを照射した場合、励起光αの一部は金属膜４２５を透過して回折格子４２８に到達し、ＳＰＲを生じさせる。そして、ＳＰＲにより増強された電場により蛍光物質が励起され、所定の方向に指向性を持った蛍光βが出射される。したがって、光源ユニット１１１および検出部１２５は、検出チップ４００と同じ高さに配置されうるが、検出チップ４００は、光源ユニット１１１および検出部１２５の間に位置することとなる。なお、図１８Ａおよび図１８Ｂに示される例では、凸部の配列方向が水平方向に沿うように回折格子４２８が配置され、蛍光βも水平方向に沿って放出される。また、このように基板４２１側から回折格子４２８に励起光αを照射する場合、基板４２１は、励起光αに対して透明な誘電体からなることが好ましく、回折格子４２８は金属膜４２５の両面に形成されていることが好ましい。基板４２１の材料の例には、励起光αに対して透明な樹脂およびガラスが含まれる。たとえば、樹脂からなる基板４２１の表面にＵＶ樹脂を用いたナノインプリントにより回折格子を形成し、その上に金属膜４２５を形成することで、金属膜４２５の両面に回折格子４２８を形成することができる。また、このように基板４２１側から回折格子４２８に励起光αを照射する場合、工程Ｓ２０では励起光αの入射角を共鳴角に設定してもよいが、励起光αの入射角を増強角に設定してもよい。励起光αの入射角を増強角に設定する場合は、金属膜４２５に対する励起光αの入射角を走査するとともに、回折格子４２８から放出されたプラズモン散乱光γの光量を検出部１２５により検出する。そして、プラズモン散乱光γの光量が最大となったときの励起光αの入射角を増強角として決定する。
【０１４１】
本発明に係る表面プラズモン励起増強蛍光測定法における第二の実施形態では、回折格子に励起光を入射することにより生じる表面プラズモン共鳴により、第２の捕捉体の標識に用いられた蛍光物質を励起して、この蛍光物質から放出される蛍光の測定を行う前に、前記回折格子の除電を行う。上記の本実施形態においては、工程Ｓ１６０で行われる蛍光値測定の前に、回折格子４２８の除電を行う。このように回折格子の除電を行うことにより、回折格子に付着していた埃等が除去され、蛍光の測定において回折格子に付着した埃等に起因する光学ノイズが低減されることにより、高感度かつ高精度な表面プラズモン励起増強蛍光測定分析が可能になる。
【０１４２】
回折格子の除電の方法は、第一の実施形態において挙げた方法と同様である。回折格子の除電を行うタイミングも、第一の実施形態における除電のタイミングと同様である。
【実施例】
【０１４３】
［実施例１］
前述した生化学検査システムＡを用いて表面プラズモン励起増強蛍光測定を行った。
送液搬送部３０により、対象の検査チップ６０を生化学検査システムＡの位置１０ａに移動し、検査チップ６０を位置１０ａに対応する攪拌装置の回転体に装着した。送液搬送部３０により洗浄液を検査チップ６０に供給し、加振部１０により検査チップ６０内の液体を攪拌しながら液体収容部６５内の洗浄を行った。その後、送液搬送部３０により、検査チップ６０内の洗浄液を回収し、測定用緩衝液を検査チップ６０内に新たに供給した。【０１４４】
次に、ブランク測定を行う前に、プリズム７１の除電を、シシド静電気株式会社WINSTAT BF-XMBを用いて送風することにより行った。
次に、送液搬送部３０により、対象の検査チップ６０を生化学検査システムＡの位置１０ｂに配置し、投光部１０によって、検査チップ６０の反応場７７に対応する反射面７３の領域に、入射角αを走査しながら励起光９１を照射した。それと同時に、検出部４０により、蛍光９３と同じ波長の光の光量を検出した。制御演算部５０により、検出部４０により測定された光の光量を光学ブランクとして記録した。また、ＳＰＲの反射率を求めた。【０１４５】
その後、送液搬送部３０により、検査チップ６０内の測定用緩衝液を回収し、測定用検体を検査チップ６０内に新たに供給した。
次に、送液搬送部３０により、対象の検査チップ６０を生化学検査システムＡの位置１０ｃに移動し、検査チップ６０を位置１０ｃに対応する攪拌装置の回転体に装着した。加振部１０により検査チップ６０内の液体を攪拌した。【０１４６】
反応に十分な時間が経過した後、検査チップ６０内を洗浄するために、送液搬送部３０により、検査チップ６０内の測定用検体を回収し、洗浄液を検査チップ６０内に新たに供給した。【０１４７】
その後、送液搬送部３０により、検査チップ６０内の洗浄液を回収し、標識液を検査チップ６０内に新たに供給した。
次に、送液搬送部３０により、対象の検査チップ６０を生化学検査システムＡの位置１０ｄに移動し、検査チップ６０を位置１０ｄに対応する攪拌装置の回転体に装着した。加振部１０により検査チップ６０内の液体を攪拌した。標識液に存在する蛍光標識された第２の捕捉体を被検出物質と結合させ、被検出物質を間接的に蛍光標識した。【０１４８】
反応に十分な時間が経過した後、検査チップ６０内を洗浄するために、送液搬送部３０により、検査チップ６０内の標識液を回収し、洗浄液を検査チップ６０内に新たに供給した。【０１４９】
その後、送液搬送部３０により、検査チップ６０内の洗浄液を回収し、測定用緩衝液を検査チップ６０内に新たに供給した。
次に、送液搬送部３０により、対象の検査チップ６０を生化学検査システムＡの位置１０ｅに配置し、投光部１０から、検査チップ６０の反応場７７に対応する反射面７３の領域に、入射角αを走査しながら励起光９１を照射した。それと同時に、検出部４０により、蛍光９３と同じ波長の光の光量を検出した。制御演算部５０により、検出部４０により測定された光の光量を蛍光値として記録した。また、ＳＰＲの反射率を求めた。【０１５０】
図１８（Ａ）に、ブランクにおける入射角αと蛍光シグナル値およびＳＰＲ反射率との関係を示す。図１８（Ｂ）に、被検出物質の測定値における入射角αと蛍光シグナル値およびＳＰＲ反射率との関係を示す。図１８（Ａ）および（Ｂ）において、黒色の線が蛍光シグナル値を示し、グレーの線がＳＰＲ反射率を示す。【０１５１】
［比較例１］
ブランク測定を行う前に、プリズム７１の除電およびプリズム７１への送風を行わなかったこと以外は実施例と同様の方法により表面プラズモン励起増強蛍光測定を行った。【０１５２】
図１８（Ｃ）に、ブランクにおける入射角αと蛍光シグナル値およびＳＰＲ反射率との関係を示す。図１８（Ｄ）に、被検出物質の測定値における入射角αと蛍光シグナル値およびＳＰＲ反射率との関係を示す。図１８（Ｃ）および（Ｄ）において、黒色の線が蛍光シグナル値を示し、グレーの線がＳＰＲ反射率を示す。【０１５３】
プリズム７１の除電およびプリズム７１への送風を行わなかった比較例１においては、図１８（Ｃ）に示すとおり、ブランクにおける蛍光シグナル値に、５８°および６５°付近に２つのピークが出現した。本来の増強角である６５°付近では、図１８（Ｄ）に示すとおり、被検出物質の測定値は高シグナル値であるので、ブランクの蛍光シグナル値が高くても被検出物質の測定値は大きな影響を受けない。しかし、本来の増強角とは異なる５８°付近の角度を増強角として設定してシグナルを測定した場合、被検出物質の測定値は高くないので、ブランクの蛍光シグナル値が高いことは、被検出物質の測定値に大きな影響を及ぼす。【０１５４】
これに対し、プリズム７１の除電およびプリズム７１への送風を行った実施例１においては、図１８（Ａ）に示すとおり、ブランクにおける蛍光シグナル値に６５°付近に１つのピークが出現し、５８°付近にはピークは出現しなかった。このため、実施例１においては、本来の増強角である６５°付近以外においても、被検出物質の測定値に与えるブランクの影響は小さい。【０１５５】
比較例１において、図１８（Ｃ）に示すように、ブランクにおける蛍光シグナル値に５８°付近のピークが現れるのは、プリズム７１に付着した埃等が原因であると考えられる。一方、実施例１において、図１８（Ａ）に示すように、ブランクにおける蛍光シグナル値に５８°付近のピークが現れないのは、プリズム７１の除電およびプリズム７１への送風により、プリズム７１に付着していた埃等が除去されたためであると考えられる。【０１５６】
図１８（Ａ）〜（Ｄ）の結果から、プリズム７１の除電およびプリズム７１への送風が与えるＳＰＲの反射率への影響は小さいことがわかる。
【符号の説明】
【０１５７】
１０  加振部
１０ａ、１０ｂ、１０ｃ、１０ｄ、１０ｅ  位置
２０  投光部
３０  送液搬送部
４０  検出部
５０  制御演算部
５１  ＣＰＵ
５２  投光制御部
５３  送液駆動制御部
５４  送液移動制御部
５５  搬送制御部
５６  検出制御部
５７  演算部
６０、６０ａ、６０ｂ、６０ｃ、６０ｄ、６０ｅ、６０ｙ  検査チップ
６１  ウェル本体
６１ｙ  ウェル
６２、６２ｙ  側壁部材
６３  第１開口
６４  第２開口
６５  液体収容部
６６  底面構造
６６ａ  先端
７１  プリズム
７２  入射面
７３  反射面
７４  出射面
７５  金属膜
７６  捕捉膜
７７  反応場
９１  励起光
９２  反射光
９３  蛍光
９４  プラズモン散乱光
９９  回転体
Ａ  生化学検査システム
ｃ  対称中心
Ｇ２  重心
α  入射角
３００  検出システム
３１０  励起光照射ユニット
１１１  光源ユニット
１１２  第１角度調整部
３２０  蛍光検出ユニット
１２２  光学フィルター
１２４  位置切替部
１２５  検出部
１３０  送液ユニット
１３１  液体チップ
１３２  ピペット
１３３  シリンジポンプ
１３４  ノズルユニット
１３５  ピペットチップ
１３６  ピペット制御部
１４０  加振部
３５０  制御部
４００  検出チップ
２１０  ウェル本体
２１１  収容部
２１２  第１開口
２１３  第２開口
２１４  保持部
４２０  側壁部材
４２５  金属膜
４２６  反応場
４２７  捕捉領域
３２６  第２角度調整部
４２１  基板
４２８  回折格子
α  励起光
α'  励起光の反射光
β  蛍光
γ  プラズモン散乱光
【図１】
2019230222.tif 000005
【図２】
2019230222.tif 000006
【図３】
2019230222.tif 000007
【図４】
2019230222.tif 000008
【図５】
2019230222.tif 000009
【図６】
2019230222.tif 000010
【図７】
2019230222.tif 000011
【図８】
2019230222.tif 000012
【図９】
2019230222.tif 000013
【図１０】
2019230222.tif 000014
【図１１】
2019230222.tif 000015
【図１２】
2019230222.tif 000016
【図１３】
2019230222.tif 000017
【図１４】
2019230222.tif 000018
【図１５】
2019230222.tif 000019
【図１６】
2019230222.tif 000020
【図１７】
2019230222.tif 000021
【図１８】
2019230222.tif 000022
【国際調査報告】
2019230222.tif 000023
2019230222.tif 000024
2019230222.tif 000025
2019230222.tif 000026