(57)【要約】  本発明は、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）抵抗性のナス科植物を提供することを目的とする。本発明は、ＣＭＶに対して非機能的であるｅＩＦ４Ｅタンパク質をコードする変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子を有する、ＣＭＶ抵抗性ナス科植物を提供する。また、ナス科植物のｅＩＦ４Ｅ遺伝子を変異させる工程を含む、ＣＭＶ抵抗性植物の作出方法であって、前記変異が、ＣＭＶに対して非機能的なｅＩＦ４Ｅタンパク質をコードする変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子への変異である、方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）に対して非機能的であるｅＩＦ４Ｅタンパク質をコードする変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子を有する、ＣＭＶ抵抗性ナス科植物。
【請求項２】
ナス属の植物である、請求項１に記載のＣＭＶ抵抗性ナス科植物。
【請求項３】
前記植物がトマトであり、前記変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子が、トマトの３番染色体上のｅＩＦ４Ｅ遺伝子である、請求項１又は２に記載のＣＭＶ抵抗性植物。
【請求項４】
前記変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子が、エクソン２の塩基配列に、以下のいずれか一以上の変異：
（ａ）フレームシフト変異
（ｂ）ナンセンス変異
（ｃ）連続又は非連続の３ｎ塩基（ｎ＝１〜７）の欠損
（ｄ）１又は複数の塩基の置換、欠失、付加、及び／又は挿入
を有する、請求項１〜３のいずれかに記載のＣＭＶ抵抗性植物。
【請求項５】
前記植物がトマトであり、前記変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子が、トマトの３番染色体上のｅＩＦ４Ｅ遺伝子のエクソン２中の塩基配列（配列番号２）における：１塩基挿入；３塩基欠損；及び９塩基欠損からなる群から選択される変異を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＣＭＶ抵抗性植物。
【請求項６】
前記植物がトマトであり、前記変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子が、トマトの３番染色体上のｅＩＦ４Ｅ遺伝子のエクソン２中の塩基配列ＡＧＧＧＴＡＡＡＴＣＴＧＡＴＡＣＣＡＧＣ（配列番号３）における：１５番目と１６番目の塩基間への１塩基挿入；１６〜１８番目の３塩基欠損；８〜１８番目のいずれか９塩基の欠損からなる群から選択される変異を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＣＭＶ抵抗性植物。
【請求項７】
ナス科植物のｅＩＦ４Ｅ遺伝子を変異させる工程を含む、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）抵抗性植物の作出方法であって、前記変異が、ＣＭＶに対して非機能的なｅＩＦ４Ｅタンパク質をコードする変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子への変異である、方法。
【請求項８】
前記植物がトマトであり、前記変異工程が、トマトの３番染色体上のｅＩＦ４Ｅ遺伝子を変異させる工程である、請求項７に記載のＣＭＶ抵抗性植物の作出方法。
【請求項９】
前記変異工程が、ｅＩＦ４Ｅ遺伝子のエクソン２の塩基配列に、以下のいずれか一以上の変異：
（ａ）フレームシフト変異
（ｂ）ナンセンス変異
（ｃ）連続又は非連続の３ｎ塩基（ｎ＝１〜７）の欠損
（ｄ）１又は複数の塩基の置換、欠失、付加、及び／又は挿入
を導入する工程である、請求項７又は８に記載のＣＭＶ抵抗性植物の作出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物ウイルス抵抗性植物に関し、特に、ナス科のキュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）抵抗性植物に関する。本発明はまた、そのようなウイルス抵抗性植物の作出方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ 以下ＣＭＶ）は、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）などのナス科作物やキュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖａｓ Ｌ．）など多くの作物において重大な病気を引き起こす植物ウイルスの一つである。ＣＭＶは、主にアブラムシによって伝搬され、１０００種以上の植物、作物に感染し、世界中の温帯、亜熱帯及び熱帯地域の重要な農作物に経済的な被害をもたらしている。このウイルスが作物に感染すると、感染部位で増殖した後、維管束、特に篩管を通じて全身に広がり、モザイク、黄化、糸葉、矮化、壊疽などの症状を引き起こし、果実や葉の品質及び収量が低下する。例えば、１９８７年、イタリアやスペインの主要トマト産地において、ＣＭＶが突如発生し、着果したトマト果実の殆どが被害を受け、壊滅的な状況に陥ったことが報告されている。また、インドネシアや韓国でも唐辛子やピーマンにおいてＣＭＶの多大な被害が報告されている。また日本でも防除の間隙をぬって、発生することがある。【０００３】
このように多種多様な作物に感染し、経済的被害を及ぼすＣＭＶの感染から作物を守る術はあまり多くない。殆どの植物ウイルスに対して殺菌剤などは無効力である。また、ＣＭＶを含め一般的な多くの植物ウイルスの防除方法として、アブラムシのような媒介昆虫を防虫ネットなどで侵入阻止する方法、農薬などで殺虫する方法が挙げられるが、ウイルス病を完全に防除することは難しい。【０００４】
植物ウイルスの感染には、宿主の遺伝子も関与しており、遺伝学的に優性のウイルス抵抗性（タバコから単離された、タバコモザイクウイルスの感染拡大を阻止するＮ遺伝子等）のみならず、劣性遺伝するウイルス抵抗性もまた見つかっている。この現象の代表的なものとして、ポティウイルス科のウイルスとそれに対応する抵抗性遺伝子としてのｅＩＦ４Ｅファミリー（ｅＩＦ４Ｅ、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ等）の関係が挙げられる。ポティウイルス科のウイルスは、非常に多く、様々な植物に感染するポティウイルスが分化し、存在している。また、ｅＩＦ４Ｅは、ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒの１つで、宿主の翻訳開始因子である。例えば、ポティウイルス科のＴｕｒｎｉｐｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓは自身をコピーするためのＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼなど様々なウイルスのタンパク質を翻訳するために、植物リボゾームをウイルスＲＮＡに結合させる目的で、宿主植物の翻訳開始因子を利用する。さらに、ウイルスの複製や細胞間移行にもｅＩＦ４Ｅが必要なことも知られている。したがって、この宿主翻訳遺伝子の欠陥がウイルス抵抗性を与え得る。【０００５】
これまで、モデル植物であるシロイヌナズナ、ナス科のタバコ属、トマト、トウガラシなどで実際にｅＩＦ４Ｅファミリー遺伝子の変異により、ポティウイルス科のウイルスへの抵抗性が獲得されたことが示されている（非特許文献１及び２等）。しかしながら、ＣＭＶに対する抵抗性は、シロイヌナズナでのみ確認されているに留まり、トマトを含む他の植物では未だ見つかっていない。特に、非特許文献１は、トマトにおけるポティウイルス感染と、ｅＩＦ４Ｅ１及びｅＩＦ４Ｅ２のノックダウンに関するが、ｅＩＦ４Ｅ又はｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅをサイレンシングしたトランスジェニック株においてＣＭＶ等ポティウイルス科以外のウイルス感染が弱まらなかったことから、ウイルス感染サイクルにおけるｅＩＦ４Ｅの関与は、ポティウイルス科に限定されると考えられることが記載されている（非特許文献１、４頁左欄１２〜１５行等）。また、キュウリにｅＩＦ４Ｅの機能を完全に失う変異を導入した場合、ＣＶＹＶ（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ  ｖｅｉｎ  ｙｅｌｌｏｗｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ）、ＺＹＭＶ（Ｚｕｃｃｈｉｎｉ  ｙｅｌｌｏｗ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）、ＰＲＳＶ（Ｐａｐａｙａ  ｒｉｎｇ  ｓｐｏｔ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）に対する抵抗性は付与されたが、ＣＭＶへの抵抗性は付与されなかったことも報告されている（非特許文献３、特にＴａｂｌｅ２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Mazier et al. (2011) PLOS ONE 6: e29595
【非特許文献２】Sato et al. (2005) FEBS Lett. 579(5): 1167-1171.
【非特許文献３】J. Chandrasekaran et al., (2016) Molecular Plant Pathology, 17(7): 1140-1153
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ｅＩＦ４Ｅファミリー遺伝子の抑制が与えると考えられているウイルス抵抗性は、当該遺伝子のホモログごとに異なり、宿主植物によっても異なる。また、その殆どはポティウイルス科の植物ウイルスに対するものであり、トマトで見つかっているのもＰｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ Ｙ（ＰＶＹ）、Ｐｅｐｐｅｒ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ（ＰｅｐＭｏＶ）、Ｔｏｂａｃｃｏ eｔｃｈ ｖｉｒｕｓ（ＴＥＶ）などに対する抵抗性に留まる。一方、別の科のウイルスであるＣＭＶへの抵抗性は確認されていない。ＣＭＶはＲＮＡウイルスという点においてポティウイルス科のウイルスと共通するが、その遺伝子構成は大きく異なり、ゲノムＲＮＡもポティウイルスとは形態が異なる。ポティウイルス科のウイルスが１分節のゲノムであるのに対し、ＣＭＶは３分節ゲノムで構成されており、それぞれウイルス粒子を形成し、全ての粒子、分節が揃って感染増殖する。ＣＭＶによる病害は激しい症状を呈する重要病害であるにも関わらず、翻訳開始因子に限らなくても、これまで作物ではほとんど抵抗性遺伝子が見つかっておらず、ナス科においては皆無である。そのためＣＭＶの防除は媒介虫アブラムシの防除のみに頼っており、育種現場では抵抗性品種の作出が望まれてきた。【０００８】
以上のような背景のもと、本発明は、ＣＭＶ抵抗性ナス科植物及びその作出方法、ＣＭＶ抵抗性ナス科植物を作出するための変異遺伝子並びにこれらの利用を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ナス科植物であるトマトのｅＩＦ４Ｅの特定のホモログの所定の箇所に変異を有する個体を作出し、この個体にＣＭＶを接種したところ、長期に渡ってＣＭＶ抵抗性を有することを確認し、本発明を完成させた。このようなＣＭＶ抵抗性植物はナス科では初めての報告である。【００１０】
すなわち、本発明は以下のものに関する。
［１］
キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）に対して非機能的であるｅＩＦ４Ｅタンパク質をコードする変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子を有する、ＣＭＶ抵抗性ナス科植物。
［２］
ナス属の植物である、［１］に記載のＣＭＶ抵抗性ナス科植物。
［３］
前記植物がトマトであり、前記変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子が、トマトの３番染色体上のｅＩＦ４Ｅ遺伝子である、［１］又は［２］に記載のＣＭＶ抵抗性植物。
［４］
前記変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子が、エクソン２の塩基配列に、以下のいずれか一以上の変異：
（ａ）フレームシフト変異
（ｂ）ナンセンス変異
（ｃ）連続又は非連続の３ｎ塩基（ｎ＝１〜７）の欠損
（ｄ）１又は複数の塩基の置換、欠失、付加、及び／又は挿入
を有する、［１］〜［３］のいずれかに記載のＣＭＶ抵抗性植物。
［５］
前記植物がトマトであり、前記変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子が、トマトの３番染色体上のｅＩＦ４Ｅ遺伝子のエクソン２の塩基配列（配列番号２）における：１塩基挿入；３塩基欠損；及び９塩基欠損からなる群から選択される変異を有する、［１］〜［４］のいずれか一項に記載のＣＭＶ抵抗性植物。
［６］
前記植物がトマトであり、前記変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子が、トマトの３番染色体上のｅＩＦ４Ｅ遺伝子のエクソン２中の塩基配列ＡＧＧＧＴＡＡＡＴＣＴＧＡＴＡＣＣＡＧＣ（配列番号３）における：１５番目と１６番目の塩基間への１塩基挿入；１６〜１８番目の３塩基欠損；８〜１８番目のいずれか９塩基の欠損からなる群から選択される変異を有する、［１］〜［４］のいずれか一項に記載のＣＭＶ抵抗性植物。
［７］
ナス科植物のｅＩＦ４Ｅ遺伝子を変異させる工程を含む、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）抵抗性植物の作出方法であって、前記変異が、ＣＭＶに対して非機能的なｅＩＦ４Ｅタンパク質をコードする変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子への変異である、方法。
［８］
前記植物がトマトであり、前記変異工程が、トマトの３番染色体上のｅＩＦ４Ｅ遺伝子を変異させる工程である、［７］に記載のＣＭＶ抵抗性植物の作出方法。
［９］
前記変異工程が、ｅＩＦ４Ｅ遺伝子のエクソン２の塩基配列に、以下のいずれか一以上の変異：
（ａ）フレームシフト変異
（ｂ）ナンセンス変異
（ｃ）連続又は非連続の３ｎ塩基（ｎ＝１〜７）の欠損
（ｄ）１又は複数の塩基の置換、欠失、付加、及び／又は挿入
を導入する工程である、［７］又は［８］に記載のＣＭＶ抵抗性植物の作出方法。【００１１】
本発明は、また、以下のものにも関する。
［１０］
［１］〜［４］のいずれか一項に記載のＣＭＶ抵抗性植物の加工品。
［１１］
ナス科植物のｅＩＦ４Ｅ遺伝子を変異させる工程を含む、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）抵抗性植物の加工品の製造方法であって、前記変異が、ＣＭＶに対して非機能的なｅＩＦ４Ｅタンパク質をコードする変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子への変異である、方法。
［１２］
前記植物がトマトであり、前記変異工程が、トマトの３番染色体上のｅＩＦ４Ｅ遺伝子を変異させる工程である、［１１］に記載の加工品の製造方法。
［１３］
前記変異工程が、ｅＩＦ４Ｅ遺伝子のエクソン２の塩基配列に、以下のいずれか一以上の変異：
（ａ）フレームシフト変異
（ｂ）ナンセンス変異
（ｃ）連続又は非連続の３ｎ塩基（ｎ＝１〜７）の欠損
（ｄ）１又は複数の塩基の置換、欠失、付加、及び／又は挿入
を導入する工程である、［１１］又は［１２］に記載の加工品の製造方法。【００１２】
本発明は、また、以下のものにも関する。
［１４］
キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）に対して非機能的であるｅＩＦ４Ｅタンパク質をコードする変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子。
［１５］
ナス科植物由来である、［１４］に記載の変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子。
［１６］
トマトの３番染色体上のｅＩＦ４Ｅ遺伝子由来である［１４］又は［１５］に記載の変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子。
［１７］
エクソン２の塩基配列に、以下のいずれか一以上の変異：
（ａ）フレームシフト変異
（ｂ）ナンセンス変異
（ｃ）連続又は非連続の３ｎ塩基（ｎ＝１〜７）の欠損
（ｄ）１又は複数の塩基の置換、欠失、付加、及び／又は挿入
を有する、［１４］〜［１６］のいずれかに記載の前記変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子。
［１８］
トマト由来であり、トマトの３番染色体上のｅＩＦ４Ｅ遺伝子のエクソン２の塩基配列（配列番号２）における：１塩基挿入；３塩基欠損；及び９塩基欠損からなる群から選択される変異を有する、［１４］〜［１７］のいずれかに記載の変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子。
［１９］
トマト由来であり、トマトの３番染色体上のｅＩＦ４Ｅ遺伝子のエクソン２中の塩基配列ＡＧＧＧＴＡＡＡＴＣＴＧＡＴＡＣＣＡＧＣ（配列番号３）における：１５番目と１６番目の塩基間への１塩基挿入；１６〜１８番目の３塩基欠損；８〜１８番目のいずれか９塩基の欠損からなる群から選択される変異を有する、［１４］〜［１８］のいずれかに記載の変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子。
［２０］
ＣＭＶ抵抗性ナス科植物の作出における、［１４］〜［１９］のいずれかに記載の変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子の使用。
［２１］
ナス科植物の加工品の製造における、［１］〜［６］のいずれかに記載のＣＭＶ抵抗性ナス科植物の使用。
［２２］
［１４］〜［１９］のいずれかに記載の変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子を有する、ナス科植物の植物細胞。
［２３］
［１］〜［６］のいずれかに記載のＣＭＶ抵抗性ナス科植物の植物細胞の作出方法。
［２４］
［１］〜［６］のいずれかに記載のＣＭＶ抵抗性ナス科植物の種子の作出方法。
［２５］
ＣＭＶ抵抗性ナス科植物の種子の作出における、［１４］〜［１９］のいずれかに記載の変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子の使用。
［２６］
［１４］〜［１９］のいずれかに記載の変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子を含む、ベクター、プロモーター又はキット。
［２７］
ＣＭＶ抵抗性ナス科植物、その植物細胞、その植物の種子又はその子孫の作出における、［２６］記載のベクター、プロモーター又はキットの使用。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ＣＭＶ抵抗性ナス科植物及びその作出方法、ＣＭＶ抵抗性ナス科植物を作出するための変異遺伝子並びにこれらの利用を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】野生株のトマトの３番染色体に存在するｅＩＦ４ＥのｍＲＮＡ配列に対応する塩基配列を示す（配列番号１）。実際のＲＮＡは図中のＴ（チミン）がＵ（ウラシル）である。波線で示した箇所（１６６塩基）がエクソン２の塩基配列であり（配列番号２）、網掛け部が編集標的部位（配列番号３）である。図中四角枠内のＴＧＧ（ＰＡＭ配列）の３塩基前に存在する塩基（Ａ）から上流が編集される。
【図２】Ａ１２７系統６個体、Ｂ９５系統４個体、Ｂ１００系統５個体（いずれもＴ１個体）のＣＭＶ接種２６日後のウイルス蓄積量を示すグラフである。Ａ１２７−１は４箇所から取得したサンプル、それ以外は２箇所から取得したサンプルについて、抗ＣＭＶ抗体を用いてＥＬＩＳＡ値（吸光値）を測定し、Ａ１２７−１及びＡ１２７−８のＣＭＶ抵抗性が確認された。
【図３】Ａ１２７系統１８個体（いずれもＴ１個体）のＣＭＶ接種２０日後のウイルス蓄積量を示すグラフである。抗ＣＭＶ抗体を用いてＥＬＩＳＡ値（吸光値）を測定し、Ａ１２７−１４、Ａ１２７−２１及びＡ１２７−２４のＣＭＶ抵抗性が確認された。
【図４】Ａ１３２系統５個体、Ａ１４３系統４個体（いずれもＴ１個体）のＣＭＶ接種３０日後のウイルス蓄積量を示すグラフである。抗ＣＭＶ抗体を用いたＥＬＩＳＡ値（吸光値）を測定し、Ａ１３２−１及びＡ１３２−５のＣＭＶ抵抗性が確認された。
【図５】Ａ１２７系統Ｔ１個体のＣＭＶ接種２３日後の症状を示す写真である。図５ａ：無症状のＡ１２７−８。図５ｂ：モザイク、黄化及び縮葉が見られるＡ１２７−２。
【図６−１】図６−１は、Ａ１２７−１４、Ａ１２７−２１及びＡ１２７−２４のＴ１個体の３番染色体に存在するｅＩＦ４Ｅ遺伝子中の編集部位付近のシーケンス解析結果を示す。各配列群の一番上が野生型（ＷＴ）の配列である。図中上部に線を引いた箇所が編集標的部位であり、四角で囲った塩基が野生型からの変異を示す。
【図６−２】図６−２は、Ａ１３２−１及びＡ１３２−５のＴ１個体の３番染色体に存在するｅＩＦ４Ｅ遺伝子中の編集部位付近のシーケンス解析結果を示す。各配列群の一番上が野生型（ＷＴ）の配列である。図中上部に線を引いた箇所が編集標的部位であり、四角で囲った塩基が野生型からの変異を示す。
【図７】Ａ１３２系統４個体及び、Ａ１４３系統３個体（いずれもＴ１個体）のＰＶＹ接種２４日後のウイルス蓄積量を示すグラフである。抗ＰＶＹ抗体を用いたＥＬＩＳＡ値（吸光値）を測定し、全ての個体でＰＶＹ抵抗性が確認された。
【図８】実施例５において、各Ｔ２世代のＣＭＶ抵抗性を確認したグラフである。目視観察による発病率と、ＥＬＩＳＡ（ウイルス蓄積度）検定による感染率をもとに罹病率を確認した。ゆえに罹病率とは発病率と感染率を総合したものを示す。カッコ内の数字は試験に供した株数を示す。
【図９−１】実施例６において、Ａ１３２−５及びＡ１２７−２４からのＴ２世代の目視観察及びＥＬＩＳＡによる罹病率を野生型対照と比較したグラフである。なお、発病が確認された株は全てＥＬＩＳＡ陽性であったため、発病率とウイルス感染率が同率であった場合、発病率のみで示した。
【図９−２】実施例６において、いくつかの株についてＴ２世代のウイルス蓄積度をＥＬＩＳＡにより測定した結果を各株について示す。
【図１０】実施例７において、アブラムシ虫媒ＣＭＶ接種試験を行い、Ｔ２世代のＣＭＶ抵抗性を確認した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施形態」とも言う。）について詳細に説明する。なお、本発明は以下の本実施形態及び図面に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。
【００１６】
一態様において、本実施形態は、ＣＭＶ抵抗性ナス科植物に関する。本実施形態において、ＣＭＶ抵抗性植物とは、感染後のＣＭＶの増殖を抑制する性質及び／又はＣＭＶの感染症状の発現を抑制する性質を有する植物である。
【００１７】
ＲＮＡウイルスであるＣＭＶは、３分節ゲノムで構成されており、それぞれウイルス粒子を形成し、全ての粒子及び分節が揃って、植物に感染し、増殖する。ＣＭＶが植物に感染する際には宿主である植物のゲノムの翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅを利用し、ＣＭＶのＲＮＡ末端のキャップ構造がｅＩＦ４Ｅに結合することで、ウイルス移行タンパク質の翻訳が開始する。なお、ＣＭＶは、ウイルスゲノムＲＮＡの５’末端に、動植物のｍＲＮＡと同じようにキャップ構造を有するという点で、ウイルスゲノムＲＮＡの５’末端にＶＰｇというタンパク質が結合したポティウイルス等とは構造が大きく異なる。ＶＰｇを有するウイルスは、ＶＰｇと植物のｅＩＦ４Ｅとが高い親和性を有し、ＶＰｇが植物のｅＩＦ４Ｅと強く結合してウイルス遺伝子が植物の翻訳系を利用するが、ＣＭＶは、このようなＶＰｇを有するウイルスとは感染機構が異なると考えられる。
【００１８】
ある植物がＣＭＶ抵抗性であるか否かは、例えば後述の実施例に示すとおり、常法により植物にＣＭＶを感染させ、植物体中のＣＭＶの蓄積をＥＬＩＳＡ法、ＰＣＲ等、公知の手法で確認することにより判断することができる。また、ＣＭＶを感染させた植物のＣＭＶ感染症状（モザイク、黄化、糸葉、矮化、壊疽等）の有無を確認することによっても判断することができる。ＣＭＶには、ＣＭＶ−Ｙ系統、ＣＭＶ−Ｏ系統、ＣＭＶ−Ｆｎｙ系統、ＣＭＶ−Ｎｔ９系統等の複数の系統が知られており、各系統の感染に対する植物のＣＭＶ感染症状は異なり得ることが知られるため、感染させるＣＭＶ系統に応じて、症状の有無を確認することができる。一態様において、本実施形態のＣＭＶ抵抗性植物は、後述の変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子を有しない植物と比較して、植物体中のＣＭＶの蓄積が低減している植物、及び／又はＣＭＶを感染させた場合のＣＭＶ感染症状が低減した植物である。一態様において、本実施形態のＣＭＶ抵抗性植物は、ＣＭＶ感染後２０日以上経っても、植物体中のＣＭＶの蓄積が、ＣＭＶ非接種株と同程度である植物、及び／又はＣＭＶ感染症状が確認されない植物である。
【００１９】
本実施形態におけるＣＭＶ抵抗性植物は、ＣＭＶに抵抗性を示す限り、他のウイルスや細菌、例えば、ナス科に感染する全てのポティウイルス（ＰＶＹ等）、ＰＶＹと同様ＶＰｇをウイルスゲノムの５’末端に有し、翻訳開始因子の変異による抵抗性が報告されているＢｙｍｏｖｉｒｕｓ及びＳｏｂｅｍｏｖｉｒｕｓ属に属するウイルス、翻訳開始因子の変異による抵抗性が報告されているＣａｒｍｏｖｉｒｕｓ属に属するウイルス、これまで翻訳開始因子の変異による抵抗性は報告されていないものの、トマトを含む作物生産で甚大な被害をおよぼしているジェミニウイルス科のウイルス（トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）等）等に対する抵抗性を示す、複合抵抗性植物であってもよい。
【００２０】
本実施形態において、ＣＭＶ抵抗性植物は、ナス科の植物であり、Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ科に属する植物であれば特に限定されず、ナス属（Ｓｏｌａｎｕｍ属）、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ属、Ｃａｐｓｉｃｕｍ属等に属する植物が挙げられ、より具体的には、トマト、ナス、タバコ、トウガラシ、ジャガイモ等が挙げられる。一態様において、好ましくは、本実施形態のＣＭＶ抵抗性植物は、ナス属の植物であり、より好ましくは、トマト、ナス、ジャガイモであり、特に好ましくはトマトである。
【００２１】
一態様において、本実施形態は、上記ＣＭＶ抵抗性植物の一部であってもよく、より具体的には、果実、シュート、茎、根、若枝、葯といった器官、植物の組織、花粉、種子等が挙げられる。一態様において、本実施形態は、このような植物又はその一部の作出方法、このような植物又はその一部の作出における、本実施形態の変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子の使用にも関する。
【００２２】
一態様において、本実施形態における上記ＣＭＶ抵抗性植物は、例えば食用等の加工品とすることもできる。すなわち、本実施形態は、ＣＭＶに対して非機能的であるｅＩＦ４Ｅタンパク質をコードする変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子を有するＣＭＶ抵抗性ナス科植物の加工品にも関する。さらに、本実施形態は、ナス科植物のｅＩＦ４Ｅ遺伝子を変異させる工程を含む、ＣＭＶ抵抗性植物の加工品の製造方法であって、前記変異が、ＣＭＶに対して非機能的なｅＩＦ４Ｅタンパク質をコードする変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子への変異である、方法にも関する。
【００２３】
加工品は、特に制限されず、植物の種類に応じた食用、医療用等の加工品とすることができる。例えば、ＣＭＶ抵抗性植物がトマトの場合、トマトの食用加工品としては、缶詰トマト、トマトペースト、ケチャップ、トマトソース、トマトスープ、乾燥トマト、トマトジュース、トマトパウダー、トマト濃縮物、トマトを原料とする栄養補助食品（サプリメント）等が挙げられる。加工品の製造は、ＣＭＶ抵抗性植物を原料として、当業者に公知の手法を用いて実施することができる。
本実施形態におけるＣＭＶ抵抗性植物は、ＣＭＶ抵抗性を示す植物である限り、接ぎ木に利用する穂木、台木等であってもよい。また、一態様において、本実施形態は、上述のＣＭＶ抵抗性植物を再生し得る植物細胞（カルスを含む）等にも関し、かかる植物細胞は、本実施形態におけるＣＭＶ抵抗性植物と同様、ＣＭＶに対して非機能的であるｅＩＦ４Ｅタンパク質をコードする変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子を有する。本実施形態におけるＣＭＶ抵抗性植物は、このような植物細胞から得られた植物も含む。一態様において、本実施形態は、このような植物細胞の作出方法及びこのような植物細胞の作出における本実施形態の変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子の使用にも関する。
【００２４】
本実施形態におけるＣＭＶ抵抗性植物は、ＣＭＶに対して非機能的なｅＩＦ４Ｅタンパク質をコードする変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子（以下、「ＣＭＶ抵抗性遺伝子」ともいう。）を有する。一態様において、本実施形態は、このような変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子、このような変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子を含む、ベクター、プロモーター又はキット、並びに、ＣＭＶ抵抗性ナス科植物、その植物細胞、その植物の一部（種子等）又はその子孫の作出における、このようなベクター、プロモーター又はキットの使用にも関する。
【００２５】
ｅＩＦ４Ｅは、真核生物における翻訳開始因子の一種であり、タンパク質合成の開始において重要な役割を有する。ｅＩＦ４Ｅは、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅとともに、ｅＩＦ４Ｅファミリーを構成しており、また、ナス科植物は、複数のｅＩＦ４Ｅのアイソフォームを有すると考えられる。例えば、トマトにおいては、ｅＩＦ４Ｅは２種のアイソフォームからなり、２番染色体及び３番染色体上に存在することが知られる。また、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅは、トマトにおいて１種存在し、９番染色体上に存在することが知られる。トウガラシにも、トマトのｅＩＦ４Ｅと相同な遺伝子として４番染色体にあるｐｖｒ１及びｐｖｒ２の存在が知られ（ｐｖｒ１とｐｖｒ２はアレルの関係にある）、トマトのｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅと相同な遺伝子として、３番染色体にあるｐｖｒ６が知られている。これらの遺伝子のうち、ｅＩＦ４Ｅ又はこれと相同なタンパク質をコードする遺伝子がＣＭＶに対して非機能的であることが好ましい。
【００２６】
本実施形態において、ＣＭＶに対して非機能的なｅＩＦ４Ｅタンパク質とは、ＣＭＶが植物に感染し増殖する際に利用できないか、ＣＭＶの感染及び増殖が低減するｅＩＦ４Ｅタンパク質を指し、一態様において、ＣＭＶ抵抗性遺伝子は、タンパク質をコードしないよう変異したものであってもよい。理論に束縛されるものではないが、ＣＭＶが植物に感染する際には、ナス科植物に存在する複数のアイソフォームのうち特定のｅＩＦ４Ｅを用いるところ、この特定のアイソフォーム（ＣＭＶに対して機能的なｅＩＦ４Ｅ）をコードする遺伝子が変異し、ＣＭＶに対して非機能的なｅＩＦ４Ｅタンパク質をコードするようになると、ウイルスゲノム上にコードされる、感染増殖に必要なタンパク質の翻訳が進行しないため、もしくはｅＩＦ４Ｅとの相互作用を必要とするＣＭＶタンパク質が機能を果たせないため、ＣＭＶ感染、ＣＭＶ増殖及びＣＭＶ感染症状の発現のいずれか１つ以上が阻害され、ＣＭＶ抵抗性植物となると考えられる。一方、ナス科植物に存在する複数のｅＩＦ４Ｅホモログのうち、１つが変異しても、植物自体は他のホモログを利用可能であるため、或いは、植物自体はＣＭＶに非機能的なｅＩＦ４Ｅタンパク質を利用可能な場合もあるため、宿主であるナス科植物の生育には影響なく、ＣＭＶ抵抗性が付与可能であると考えられる。
【００２７】
一態様において、本実施形態におけるＣＭＶ抵抗性植物は、ＣＭＶに対して機能的なｅＩＦ４Ｅタンパク質をコードする遺伝子が全て変異している。例えば、複二倍体等の倍数体植物の場合、複数存在する、ＣＭＶに対して機能的なｅＩＦ４Ｅタンパク質をコードする遺伝子が、全てＣＭＶ抵抗性遺伝子に変異していることが好ましい。このようなＣＭＶ抵抗性植物は、ＣＭＶに対して機能的なｅＩＦ４Ｅタンパク質をコードする遺伝子が変異している限り、他の正常ｅＩＦ４Ｅ遺伝子を有するものであってよい。また、外来のＣＭＶ抵抗性遺伝子を導入し、内生のＣＭＶに対して機能的なｅＩＦ４Ｅタンパク質をコードする遺伝子を全て欠失、破壊等したものであってもよい。
【００２８】
一態様において、本実施形態におけるＣＭＶ抵抗性遺伝子は、ナス科植物の、ＣＭＶに対して機能的なｅＩＦ４Ｅ遺伝子の塩基配列に変異を有する遺伝子であり、好ましくは、前記ｅＩＦ４Ｅ遺伝子のエクソン２の塩基配列に変異を有する遺伝子である。より具体的には、ナス科植物がトマトである場合、トマトの３番染色体上のｅＩＦ４Ｅ遺伝子に変異を有し、好ましくはそのエクソン２の塩基配列（配列番号２）に変異を有し、より好ましくは、前記エクソン２中の塩基配列ＡＧＧＧＴＡＡＡＴＣＴＧＡＴＡＣＣＡＧＣ（配列番号３）に変異を有する。
【００２９】
一態様において、本実施形態のＣＭＶ抵抗性遺伝子は、ｅＩＦ４Ｅ遺伝子の、エクソン２の塩基配列に、以下のいずれか一以上の変異を有する：
（ａ）フレームシフト変異
（ｂ）ナンセンス変異
（ｃ）連続又は非連続の３ｎ塩基（ｎ＝１〜７）の欠損
（ｄ）１又は複数の塩基の置換、欠失、付加、及び／又は挿入。
【００３０】
（ａ）フレームシフト変異は、塩基の欠失又は挿入により、コドンの読み枠がずれ、異なるアミノ酸配列をコードするようになる変異であり、これにより、ＣＭＶ抵抗性遺伝子となる。
【００３１】
（ｂ）ナンセンス変異は、本来アミノ酸をコードしていたコドンが終止コドンに変わる変異であり、これにより、ＣＭＶ抵抗性遺伝子となる。
【００３２】
（ｃ）連続又は非連続の３ｎ塩基（ｎ＝１〜７、好ましくはｎ＝１〜３、例えば３、６又は９塩基、より好ましくはｎ＝３、例えば９塩基）の欠損により、当該欠損領域以下の塩基によりコードされるアミノ酸が微妙に変化し、これにより、ＣＭＶ抵抗性遺伝子となる。
【００３３】
（ｄ）１又は複数の塩基の置換、欠失、付加、及び／又は挿入により、変異領域以下の塩基がコードするアミノ酸の読み枠が変化する。これにより、ｅＩＦ４Ｅタンパク質が壊れる、構造が変化する、等により、ＣＭＶ抵抗性遺伝子となる。一態様において、好ましくは、この変異は、コドンの３番目以外の塩基の変異である。本実施形態において、置換、欠失、付加、及び／又は挿入される塩基の個数は、ＣＭＶ抵抗性遺伝子が得られる限り特に限定されないが、例えば、１〜５個、１〜３個、１〜２個又は１個とすることができる。
【００３４】
上記（ａ）〜（ｄ）の変異は、択一的なものではなく、例えば、（ｃ）や（ｄ）の変異の結果として、（ａ）や（ｂ）の変異が起こり得る。
【００３５】
一態様において、本実施形態のＣＭＶ抵抗性遺伝子は、連続又は非連続の９塩基の欠損、連続又は非連続の３塩基の欠損、１塩基挿入によるフレームシフト変異、のいずれか１以上を有することが好ましい。
【００３６】
一態様において、前記変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子は、トマトの３番染色体上のｅＩＦ４Ｅ遺伝子のエクソン２中の塩基配列（配列番号２）、好ましくは、エクソン２中の塩基配列ＡＧＧＧＴＡＡＡＴＣＴＧＡＴＡＣＣＡＧＣ（配列番号３）における：１塩基挿入；３塩基欠損；及び９塩基欠損からなる群から選択される変異を有し、上記変異以外の変異（例えば、配列番号２及び／又は配列番号３の塩基配列における、１又は複数の塩基の置換等）を有していてもよい。また、一態様において、前記変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子は、トマトの３番染色体上のｅＩＦ４Ｅ遺伝子のエクソン２中の塩基配列ＡＧＧＧＴＡＡＡＴＣＴＧＡＴＡＣＣＡＧＣ（配列番号３）における：１５番目と１６番目の塩基間への１塩基挿入（一態様において、Ｃ（シトシン）の挿入）；１６〜１８番目の３塩基欠損；８〜１８番目のいずれか９塩基の欠損（好ましくは、１０番目及び１３番目以外の９塩基の欠損）；からなる群から選択される変異を有し、上記変異以外の変異を有していてもよい。配列番号３の塩基配列は、トマトのエクソン２の塩基配列（配列番号２）の１３５〜１５４番目の塩基に対応する。
【００３７】
一態様において、好ましくは、前記変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子は、トマトの３番染色体上のｅＩＦ４Ｅ遺伝子のエクソン２中の塩基配列ＡＧＧＧＴＡＡＡＴＣＴＧＡＴＡＣＣＡＧＣ（配列番号３）が、配列番号４〜９のいずれかに変異したものである。
上述のとおり、本実施形態のＣＭＶ抵抗性遺伝子は、所望のＣＭＶ抵抗性を示す限り上記以外の変異を有するものであってもよく、一態様において、例えば、ｅＩＦ４Ｅ遺伝子の塩基配列と、８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列において、上記のいずれか変異を有するものであってもよい。
【００３８】
本実施形態は、また、ナス科植物にＣＭＶ抵抗性を付与するための上記変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子の使用及びＣＭＶ抵抗性遺伝子である上記変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子自体にも関する。
【００３９】
上記ＣＭＶ抵抗性遺伝子を有するＣＭＶ抵抗性植物は、限定されるものではないが、大別すると、以下に例示する２通りの方法で得ることができる。
（１）直接ゲノム編集：ＣＭＶに対して機能的なｅＩＦ４Ｅを有する植物の直接ゲノム編集により、目的とする箇所にピンポイントで変異を導入し、ＣＭＶ抵抗性遺伝子を有する植物を作出する。
（２）変異遺伝子導入：下記（Ａ）と（Ｂ）を組み合わせた方法である。（Ａ）：ＣＭＶ抵抗性遺伝子を作製し、適当なプロモーターを用いて植物に導入する。（Ｂ）：植物が有する内生ｅＩＦ４Ｅのうち、ＣＭＶに対して機能的なｅＩＦ４Ｅを、ＣＭＶに対して非機能的なものとする。
以下、それぞれの方法について説明する。
【００４０】
上記（１）の方法は、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ等、部位特異的ヌクレアーゼを用いた公知のゲノム編集技術を用いて実施することができる。ゲノムの特定部位を切断可能な制限酵素を用いて二本鎖切断を導入すると、これが修復される際に、修復エラーにより各種変異が導入され、ＣＭＶに対して機能的なｅＩＦ４Ｅをコードする遺伝子が、ＣＭＶ抵抗性遺伝子に変異する。
【００４１】
特に高い特異性及び高効率で変異を導入するために、好ましくは、ＣＲＩＳＰＲシステムを用いることができ、特に好ましくは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いることができる。このシステムでは、標的遺伝子と相補的な２０塩基長程度の配列を含むガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）が標的を認識し、Ｃａｓ９タンパク質が二本鎖を切断し、これが非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）修復経路によって修復される際に、修復エラーにより標的部位に変異が導入される。
【００４２】
植物へのＣａｓタンパク質及びｓｇＲＮＡの送達は、それらをコードするベクターを介して、当業者に公知の方法、例えばアグロバクテリウム法、標準的なトランスフェクション法、エレクトロポレーション法、パーティクルボンバードメント法等を用いて行うことができる。
【００４３】
簡便には、後述の実施例に示すように、Ｃａｓ遺伝子及びｓｇＲＮＡを組み込んだバイナリベクターを構築し、これを用いてアグロバクテリウムを形質転換した後、このアグロバクテリウムを用いて植物を形質転換することで、植物へのＣａｓタンパク質及びｓｇＲＮＡの送達を行うことができる（Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ  Ｆａｕｓｅｒ  ｅｔ．ａｌ．  Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  （２０１４）  ７９，  ３４８−３５９、大澤良、江面浩（２０１３）新しい植物育種技術を理解しよう  国際文献社、等参照）。
【００４４】
アグロバクテリウムにより形質転換する植物の形態は、植物体を再生しうるものであれば特に限定されず、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルス等が挙げられる。アグロバクテリウムの除菌後、用いたベクターに応じた薬剤中で培養して、薬剤耐性を指標に目的遺伝子が組み込まれた切片の選別培養をすることができる。
【００４５】
高効率で標的部位への変異導入が可能になるように、ガイドＲＮＡを設計することができる。
ＣＲＩＳＰＲシステムでは、ＰＡＭ配列と呼ばれる３塩基の配列（最も一般的なＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来Ｃａｓ９を用いる場合、ＮＧＧ）の３塩基前が基本的に切断される。標的配列の直後にＰＡＭ配列が存在する必要があるため、ＰＡＭ配列の上流を標的配列として、ガイドＲＮＡを設計することができる。例えば、トマトの３番染色体に存在するｅＩＦ４Ｅ遺伝子のｍＲＮＡに対応する配列（配列番号１）を示す図１中、エクソン２（図１中、波線部。配列番号２）に存在する四角で示した箇所をＰＡＭ配列とし、この３塩基から上流の通常２０塩基（配列番号３）を標的としてガイドＲＮＡを設計することができる。ナス科の他の植物に対して直接ゲノム編集を行う場合も、トマトの場合と同様に、ＣＭＶに対して機能的なｅＩＦ４Ｅコードする遺伝子のエクソン２の中でＰＡＭ配列を選択してガイドＲＮＡを設計し、この標的部位に変異を導入して、ＣＭＶ抵抗性遺伝子を有する植物を作出することができる。
【００４６】
ガイドＲＮＡの塩基配列におけるＧＣ含有率が高いほど切断効率が高くなるため、ＧＣ含有率を考慮してガイドＲＮＡを設計することができる。また、オフターゲット効果による非特異的な切断を極力減らすよう設計することができる。一態様において、植物がトマトである場合、ガイドＲＮＡは、３番染色体のエクソン２中の特定の配列（配列番号３）を標的とする塩基配列を有するように設計することができる。
【００４７】
ＣＲＩＳＰＲシステムにより１箇所の二本鎖切断を導入すると、２０塩基程度が修復され、修復エラーにより変異が導入されると考えられる。よって、一態様において、本実施形態のＣＭＶ抵抗性遺伝子が有する変異は、連続又は非連続の３ｎ塩基（ｎ＝１〜７、好ましくは１〜３）の変異である。
【００４８】
次に、上記（２）の方法について説明する。この方法は、下記（Ａ）と（Ｂ）の工程を組み合わせた方法である。（Ａ）と（Ｂ）を実施する順序は、植物が死に至らない限り、（Ｂ）を先に実施してもよい。なお、（Ｂ）のみを特定の部位において実施する方法が、上記（１）の方法である。
【００４９】
（Ａ）ＣＭＶに対して非機能的なｅＩＦ４Ｅタンパク質をコードする変異遺伝子を作製し、適当なプロモーターを用いて植物に導入する工程。
（Ａ）の変異遺伝子の作製は、当業者に公知の手法を用いて実施することができ、例えば、所望の変異を有する塩基配列を合成し、これをＰＣＲ等で増幅して得ることができる。作製した変異遺伝子の植物への導入も、当業者に公知の手法を用いて実施することができる。簡便には、変異遺伝子を搭載したベクターを用いて、例えば、ポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法等を用いて実施することができる。ナス科植物由来のｅＩＦ４Ｅ遺伝子を変異させたＣＭＶ抵抗性遺伝子であれば、別種の植物のＣＭＶ抵抗性遺伝子を導入してもよい。
【００５０】
（Ｂ）植物が有する内生ｅＩＦ４Ｅのうち、ＣＭＶに対して機能的なｅＩＦ４Ｅを、ＣＭＶに対して非機能的なものとする工程。
（Ｂ）の実施には、植物に変異を導入する方法として公知の手法を用いることができ、例えば、イオンビーム、ＥＭＳなどの変異原処理を用いることができる。上述のＣＲＩＳＰＲやＴＡＬＥＮなどのゲノム編集技術等によっても実施することができる。内生ｅＩＦ４Ｅのうち、ＣＭＶに対して機能的なｅＩＦ４Ｅを、全てＣＭＶに対して非機能的なものとすることが望ましい。
【００５１】
ＣＭＶ抵抗性遺伝子を有する植物細胞からの植物体の再生は、植物の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことができる。例えば、トマトについては、ＳｕｎＨＪｅｔ ａｌ.，Ｐｌａｎｔ ＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ．４７：４２６，２００６、タバコについては、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ ＲＡ ｅｔ ａｌ.、ＥＭＢＯ Ｊ．６：３９０１，１９８７等を参照して行うことができる。
【００５２】
植物が、ＣＭＶ抵抗性遺伝子を有することの確認は、上述のとおり、常法によりＣＭＶを接種して、植物体中のＣＭＶの蓄積をＥＬＩＳＡ法、ＰＣＲ等で確認することにより、また、植物体のＣＭＶ感染症状を観察することにより、確認することができる。
【００５３】
ＣＭＶ抵抗性遺伝子を有するＣＭＶ抵抗性植物が一旦得られれば、当該植物の子孫やクローンを公知の手法により得ることができる。したがって、本実施形態のＣＭＶ抵抗性植物には、これらの子孫及びクローンも含まれる。
【００５４】
本実施形態は、さらに、ナス科植物のｅＩＦ４Ｅ遺伝子を変異させる工程を含む、ＣＭＶ抵抗性植物の作出方法にも関する。当該方法は、ＣＭＶ抵抗性植物にかかる上記記載を参照して実施することができる。一態様において、上記の作出方法は、さらに、本実施形態のＣＭＶ抵抗性植物を自家受粉又は他家受粉させて後代を得る工程を含む。植物の自家受粉又は他家受粉は、公知の手法により実施することができる。
【００５５】
本実施形態は、また、上記ＣＭＶ抵抗性植物を作出するためのガイドＲＮＡ及びガイドＲＮＡを含むベクターにも関する。ガイドＲＮＡが有する配列は上述したとおりである。本実施形態はさらに、上記ガイドＲＮＡを含むキットにも関する。当該キットは、ＣＲＩＳＰＲシステムによるゲノム編集を実施するために必要な部位特異的ヌクレアーゼ等を含むことができ、ＣＭＶ抵抗性植物を作出するために使用することができる。
【実施例】
【００５６】
［実施例１］３番染色体上のｅＩＦ４遺伝子に変異を導入したトマトの作出
まず、トマトの染色体３番に存在するとされているｅＩＦ４Ｅ遺伝子（Ｓｏｌｙｃ０３ｇ００５８７０）の２番目のエクソン（配列番号２）内にｓｇＲＮＡが認識する部位を任意に設定し、この２０塩基長（ＡＧＧＧＴＡＡＡＴＣＴＧＡＴＡＣＣＡＧＣ（配列番号３））の二本鎖ＤＮＡをベクターｐＵＣ１９＿ＡｔＵ６ｏｌｉｇｏ（国立研究開発法人農業生物資源研究所より入手）内の制限酵素ＢｂｓＩサイトに構築した。なお、野生株のトマトの３番染色体に存在するｅＩＦ４ＥのｍＲＮＡ配列に対応する塩基配列を図１に示す（配列番号１）。実際のＲＮＡは図中のＴ（チミン）がＵ（ウラシル）である。【００５７】
このベクターからｓｇＲＮＡ配列領域を含むカセット部位を切り出し、バイナリベクターｐＺＤ＿ＯｓＵ３ｇＹＳＡ＿ＨｏｌｇｅｒＣａｓ９＿ＮＰＴII内の制限酵素Ｉ−ＳｃｅＩサイトに構築した。さらにこのバイナリベクターを用いてアグロバクテリウムＬＢＡ４４０４（タカラバイオ社製）を形質転換した。【００５８】
また、トマトの染色体９番に存在するｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子（Ｓｏｌｙｃ０９ｇ０９０５８０）についても同様の方法で２番目のエクソン内の認識部位（ＧＧＣＣＡＣＣＧＡＡＧＣＡＣＣＧＧＴＡＧ（配列番号１０））をバイナリベクターに構築し、アグロバクテリウムを形質転換した。【００５９】
形質転換するトマトの品種はマニーメーカーと自社品種Ｓを用いた。アグロバクテリウムを用いたトマトの形質転換は一般的な書籍等に引用されている方法を基準にした（形質転換プロトコール（化学同人社））。すなわち、トマトの種子を無菌培地で播種させた子葉片、又は通常播種した子葉片若しくは本葉片を殺菌したものを、前述の組み換えアグロバクテリウム培養液（濁度０．１〜１．０）に１０分程度浸漬し、アグロバクテリウムを感染させた。【００６０】
３日後、アグロバクテリウムを除菌し、葉片をカルベニシリン（１００〜５００ｍｇ／ｍｌ）、又はメロペン（２０〜５０ｍｇ／ｍｌ）とカナマイシン（３０〜１００ｍｇ／ｍｌ）を加えたムラシゲスクーグ培地（ＭＳ培地；ＭＳ基本、３％ショ糖、１．５ｍｇ／Ｌゼアチン、１％寒天）上に移し、２５℃照明下（１６時間照明／８時間暗黒）で選抜培養した。その後、約１０日から２週間毎に移植継代で培地を交換することで、葉片からカルス形成を促し、引き続き継代培養を繰り返すことで不定芽を誘導した。【００６１】
不定芽が数センチほどに大きくなれば、発根培地（ＭＳ基本、１．５％ショ糖、１％寒天、５０〜２５０ｍｇ／ｍｌカルベニシリン、２０〜１００ｍｇ／ｍｌカナマイシン、場合によってナフタレン酢酸（ＮＡＡ）添加）に移植し、１ヶ月毎に継代しながら１〜３ヶ月培養した。【００６２】
発根培地培養までは全て無菌培養である。発根してきた個体は、無菌培地から取り出し、市販の黒土や赤玉土などを混合したポット培土に移植し生育させた。【００６３】
再生した個体（トランスジェニック当代；以下Ｔ０）が組み換え及び編集（塩基の欠損、挿入又は置換）されているかを確認するため、任意のプライマー、例えば、Ｓｏｌｙｃ０３ｇ００５８７０内の領域に対しては、プライマー１（ＡＴＣＣＡＴＣＡＣＣＣＡＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＴＴ（配列番号１１））及びプライマー２（ＧＴＣＣＡＣＡＡＡＧＣＴＡＴＴＴＴＴＴＣＴＣＣＣ（配列番号１２））、Ｓｏｌｙｃ０９ｇ０９０５８０内の領域については、プライマー３（ＣＣＧＴＣＧＴＧＡＡＡＡＡＧＣＴＡＴＡＣＡＡＡＡＧＧＡＧ（配列番号１３））及びプライマー４（ＧＣＴＴＴＴＣＧＡＡＧＡＧＡＡＣＴＴＣＣＣＣ（配列番号１４））等を用いてＰＣＲ（ＫＯＤＰｌｕｓ Ｎｅｏ／東洋紡社）で増幅し、増幅断片の編集部位にある制限酵素サイトが制限酵素によって切断されるのかを確認した（データ非提示）。【００６４】
その結果、幾つかの再生個体でｅＩＦ４Ｅの配列が編集されていることが確認され、編集系統が選抜された（表１）。【００６５】
【表１】
2019151417.tif 000002
【００６６】
［実施例２］変異トマトのＣＭＶ抵抗性確認試験
次に、編集系統の個体（Ｔ０）を隔離温室内で生育し、自家受粉させて種子を回収した。トランスジェニック後代（Ｔ１）となるこれらの種子を播種し、実生苗にＣＭＶ−Ｙ系統を機械的接種した。その結果、ｅＩＦ４Ｅの編集系統Ａ１２７及びＡ１３２のＴ１個体Ａ１２７−８、Ａ１２７−１４、Ａ１２７−２１、Ａ１２７−２４、Ａ１３２−１、Ａ１３２−５は接種２０日以上でも症状が見られなかった（図５）。また、抗ＣＭＶ抗体（日本植物防疫協会より入手）を用いて、ＣＭＶ接種２０日以降、ウイルス蓄積度を測るＥＬＩＳＡ検定を行ったところ、非接種株と同程度のウイルス蓄積度であり、ＣＭＶの感染は確認できなかった（図２〜４）。また、当該個体は接種後６０日以上たっても病徴が見られず、ＣＭＶ抵抗性を示していた（表２）。
【表２】
2019151417.tif 000003
【００６７】
一方、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの変異系統であるＢ９５やＢ１００のＴ１の実生苗にＣＭＶを接種したものは全て接種２０日後に症状が現れ、抵抗性を示さなかった（データ非提示）。【００６８】
［実施例３］ＣＭＶ抵抗性遺伝子のシーケンシング
前述のプライマー１及び２を用いてＣＭＶ抵抗性Ｔ１個体のｅＩＦ４Ｅ編集部位付近、すなわち、３番染色体上のｅＩＦ４Ｅ遺伝子中、エクソン２の配列（配列番号２）の１４番目付近から３’側の領域をＰＣＲ（Ｔ１００サーマルサイクラー、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）で増幅し、増幅断片をクローニングして塩基配列を確認した。【００６９】
その結果、同領域に数塩基の欠損、挿入、若しくは数塩基の置換が確認された（図６−１、６−２）。配列番号３に対応する領域に以下の変異を有する個体が確認された。下線が変異箇所、「・」は塩基が存在しない箇所を示す。
野生型：ＡＧＧＧＴＡＡＡＴＣＴＧＡＴＡ・ＣＣＡＧＣ（配列番号３）
変異１：ＡＧＧＧＴＡＡＡＴＣＴＧＡＴＡＣＣＣＡＧＣ（配列番号４）
変異２：ＡＧＧＧＴＡＡＡＴＣＴＧＡＴＡ・・・・ＧＣ（配列番号５）
変異３：ＡＧＧＧＴＡＡ・・Ｃ・・Ａ・・・・・・ＧＣ（配列番号６）
変異４：ＡＧＧＧＴＡＡＡＴＧＴＧＡＴＡ・・・・ＧＣ（配列番号７）
変異５：ＡＧＴＧＴＡＡ・・Ｃ・・Ａ・・・・・・ＧＣ（配列番号８）
変異６：ＡＧＧＧＴＡＡＡＴＧＴＡＡＣＡ・・・・ＧＣ（配列番号９）【００７０】
［実施例４］ＰＶＹ抵抗性の確認試験
Ａ１３２及びＡ１４３のＴ１種子を別に播種し、それら実生苗にＰＶＹ−Ｎ系統を接種したところ、全ての個体で接種から２１日以上たっても症状やウイルスの蓄積が見られず、ＰＶＹ抵抗性が確認された（図７）。【００７１】
［実施例５］変異トマトのＣＭＶ抵抗性確認試験（Ｔ２世代）１
実施例２で得られたＴ１個体、Ａ１２７−２４、Ａ１３２−１及びＡ１３２−５について、実施例２と同様隔離温室内で生育し、自家受粉によってＴ２種子を回収した。
Ｔ２世代となるこれらの種子を播種し、各Ｔ２世代につき、図８中右欄の括弧内に示す株数の実生苗にＣＭＶ−Ｙ系統を機械的接種した。塩基配列を確認したところ、Ａ１２７−２４からのＴ２世代１６株は、全て１塩基挿入ホモ（１挿ホモ）であった。Ａ１３２−１からのＴ２世代３０株は、９塩基欠損ホモ４株（９欠ホモ）、９塩基欠損／３塩基欠損１６株（９欠／３欠）及び３塩基欠損ホモ１０株（３欠ホモ）の編集パターンを含んでいた。Ａ１３２−５からのＴ２世代２７株は、全て３欠ホモであった。すなわち、図８中、「９欠ホモ」及び「９欠／３欠」はＡ１３２−１からのＴ２世代、「３欠ホモ」はＡ１３２−１及びＡ１３２−５からのＴ２世代、「１挿ホモ」はＡ１２７−２４からのＴ２世代である。【００７２】
接種２０日後、実施例２と同様の手法によりＣＭＶ抵抗性を確認した。すなわち、感染症状の観察とウイルス蓄積度を測るＥＬＩＳＡ検定により、ウイルスの罹病率を確認した。結果を図８に示す。図８中、抵抗性率とは、ＥＬＩＳＡ検定陰性の株の割合である。【００７３】
［実施例６］変異トマトのＣＭＶ抵抗性確認試験（Ｔ２世代）２
さらに３塩基欠損ホモと考えられるＡ１３２−５と、１塩基挿入ホモと考えられるＡ１２７−２４のＴ２世代の実生苗を用い、実施例５と同様、ＣＭＶ―Ｙを機械的接種して抵抗性を確認した。図９−１中括弧内に示す数字は供試株数である。対照には、非編集（非組換え）の野生株（野生型品種Ｓ）を用いた。接種２０日後、感染症状の観察により発病率を、ＥＬＩＳＡによる検定によりウイルス感染率を調査し、総合して罹病率としてＣＭＶ抵抗性を確認した。図９−２はいくつかの株について、ウイルス感染をＥＬＩＳＡ検定で測定した結果を示す。陽性対照として、野生株（野生型品種Ｓ）にＣＭＶ接種したものを用い、陰性対照としてＣＭＶ接種をしていない野生株を用いた。その結果、図９−１に示すように、図８中、１挿ホモにあたるＡ１２７−２４からのＴ２世代を含め、いずれの株からのＴ２世代も、対照に比べ、ウイルス抵抗性が高かった。【００７４】
実施例５及び６の結果から、ｅＩＦ４Ｅ変異は、いずれの変異パターンもＣＭＶ抵抗性を有することが、Ｔ２世代でも確認された。【００７５】
［実施例７］アブラムシによる虫媒接種試験
キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）は実圃場では、主にアブラムシによって伝搬感染するほか、種子伝染、接触伝染する。そのため、機械的接種試験に加えて、アブラムシ虫媒接種試験を行い、対照との抵抗性の比較を行った。
まず、ＣＭＶ−Ｏ系統を感染させたタバコから吸汁させることにより、モモアカアブラムシにＣＭＶを獲得させた。【００７６】
実施例５で得られたＡ１３２−１からのＴ２世代のうち、９塩基欠損ホモ株（Ａ１３２−１−１３）の種子を播種し、本葉１〜２枚サイズの実生苗に、ＣＭＶを獲得させたモモアカアブラムシを１株あたり１０頭ずつ放飼し、虫媒接種を行った。
対照には野生型Ｓの実生苗を用い、同様の条件で実施した。接種後２１日から２６日にかけ、症状調査とＲＴ−ＰＣＲにより罹病率を算出した。すなわち、目視観察による発病率と、ＲＴ−ＰＣＲによる感染率を統合したものが罹病率である。【００７７】
ＲＴ−ＰＣＲにはプライマー５及び６を用い、酵素（逆転写酵素ＡＭＶリバーストランスクリプターゼ（プロメガ社製）とＥＸＴａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製））で行った。その結果、編集系統は対照に比べ顕著に罹病率が下がり、ＣＭＶ抵抗性があることが確認された。
プライマー５：ＧＴＡＣＡＧＡＧＴＴＣＡＧＧＧＴＴＧＡＧＣＧ（配列番号１５）
プライマー６：ＡＧＣＡＡＴＡＣＴＧＣＣＡＡＣＴＣＡＧＣＴＣＣ（配列番号１６）
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明によれば、ＣＭＶ抵抗性のナス科植物、ＣＭＶ抵抗性植物の作出方法を提供が可能になる。本発明は、主に農業分野において産業上の利用可能性を有する。
【図１】
2019151417.tif 000004
【図２】
2019151417.tif 000005
【図３】
2019151417.tif 000006
【図４】
2019151417.tif 000007
【図５】
2019151417.tif 000008
【図６−１】
2019151417.tif 000009
【図６−２】
2019151417.tif 000010
【図７】
2019151417.tif 000011
【図８】
2019151417.tif 000012
【図９−１】
2019151417.tif 000013
【図９−２】
2019151417.tif 000014
【図１０】
2019151417.tif 000015
【配列表】
2019151417000001.app
【国際調査報告】
2019151417.tif 000016
2019151417.tif 000017
2019151417.tif 000018
2019151417.tif 000019