(57)【要約】  本発明の課題は、天然ビオチンに対する低親和性のストレプトアビジン変異体に対して高い親和性を有するビオチン改変二量体においてハロゲン元素を標識することにより、イメージング診断または治療を可能にするようなハロゲン化したビオチン改変二量体を提供することである。本発明によれば、下記式（１）で示される化合物又はその塩が提供される。2019230905.tif 000047（式中の各記号の意味は、本明細書に記載の通りである）。
2019230905.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で示される化合物又はその塩。
【化１】
2019230905.tif 000041
（式中、
Ｘ１ａ、Ｘ１ｂ、Ｘ２ａ及びＸ２ｂはそれぞれ独立にＯ又はＮＨを示し、
Ｙ１及びＹ２はそれぞれ独立にＣ又はＳを示し、
Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立にＯ、Ｓ又はＮＨを示し、
Ｖ１及びＶ２はそれぞれ独立にＳ又はＳ＋−Ｏ−を示し、ｎ１及びｎ２はそれぞれ独立に０又は１の整数を示し、
Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３はそれぞれ独立に、２価の連結基を示し、
Ｌ４は、３価の連結基を示し、
Ｈａｌは、ハロゲン元素を示し、
ｐは１〜５の整数を示す。）
【請求項２】
式（１）で示される化合物が、下記式（１ａ）又は下記式（１ｂ）で示される化合物である、請求項１に記載の化合物。
【化２】
2019230905.tif 000042
（式中の各記号の意味は請求項１と同義である。）
【請求項３】
ｎ１及びｎ２が０である、下記式（２）又は下記式（３）で示される、請求項１又は２に記載の化合物又はその塩。
【化３】
2019230905.tif 000043
（式中の各記号の意味は請求項１と同義である。）
【請求項４】
Ｘ１ａ、Ｘ１ｂ、Ｘ２ａ及びＸ２ｂがＮＨを示し、Ｙ１及びＹ２がＣを示し、
Ｚ１及びＺ２がＮＨを示し、Ｖ１及びＶ２がＳを示す、請求項１から３の何れか一項に記載の化合物又はその塩。
【請求項５】
Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３がそれぞれ独立に、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ―、−ＣＯ−、−Ｏ−、及び炭素数１から１０のアルキレン基から選択される基の組み合わせからなる２価の連結基である、請求項１から４の何れか一項に記載の化合物又はその塩。
【請求項６】
Ｌ１が、−（ＣＨ２）ｍ１−Ｌ１１−（ＣＨ２）ｍ２−Ｌ１２−※を示し、
Ｌ２が、※−Ｌ１３−（ＣＨ２）ｍ３−Ｌ１４−（ＣＨ２）ｍ４−を示し、
Ｌ３が、Ｌ１５−Ｌ２１−Ｌ１６−を示す、
ここで、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１３、Ｌ１４、Ｌ１５、及びＬ１６はそれぞれ独立に、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ―、−ＣＯ−又は−Ｏ―を示し、
ｍ１、ｍ２、ｍ３、及びｍ４はそれぞれ独立に１から１０の整数を示し、
※はベンゼン環との結合位置を示し、
Ｌ２１は、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２）ｍ５−を示し、ｍ５は１から１０の整数を示す、請求項１から５の何れか一項に記載の化合物又はその塩。
【請求項７】
Ｈａｌが、Ｉ、１２５Ｉ、又は２１１Ａｔである、請求項１から６の何れか一項に記載の化合物又はその塩。
【請求項８】
ｐが１である、請求項１から７の何れか一項に記載の化合物又はその塩。
【請求項９】
以下の何れかの化合物。
【化４】
2019230905.tif 000044
【請求項１０】
（１）請求項１から９の何れか１項に記載の化合物；及び（ｂ）配列番号１９に記載のアミノ酸配列を含むストレプトアビジン変異体に分子プローブを結合させることにより得られる、ストレプトアビジン変異体−分子プローブ結合物：を含む治療又は診断のためのキット。
【請求項１１】
下記式（Ａ）で表される化合物と、ハロゲン化ナトリウム又はハロゲンとを反応させることを含む、請求項１から９の何れか１項に記載の化合物又はその塩の製造方法。
【化５】
2019230905.tif 000045
（式中の各記号の意味は請求項１と同義である。）
【請求項１２】
下記式（Ｂ）で表される化合物と、ハロゲン化ナトリウム又はハロゲンとを反応させることを含む、請求項１から９の何れか１項に記載の化合物又はその塩の製造方法。
【化６】
2019230905.tif 000046
（式中の各記号の意味は請求項１と同義である。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハロゲン化したビオチン改変二量体およびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アビジンとビオチン、あるいはストレプトアビジンとビオチンの間の親和性は非常に高く（Kd=10-15 から10-14M）、生体二分子間の相互作用としては、最も強い相互作用の一つである。現在、アビジン／ストレプトアビジン - ビオチン相互作用は、生化学、分子生物学、あるいは医学の分野で広く応用されている。アビジン／ストレプトアビジンとビオチンの高い結合能と抗体分子とを組み合わせたドラッグデリバリーの方法、プレターゲティング法が考案されている。【０００３】
ニワトリ由来のアビジンや微生物由来のストレプトアビジンは人体に対し高い免疫原性を示すため、人体に投与後、早期に抗アビジン／ストレプトアビジン抗体が産生されることが問題となりプレターゲティング法の実用化を妨げている原因の１つとなっている。この問題を解決するための低免疫原性ストレプトアビジンが報告されている（国際公開ＷＯ２０１０／０９５４５５）。【０００４】
低免疫原性ストレプトアビジンは、人体に対する免疫原性が低下しているという特徴を有するものであるが、人体に内在するビオチンに対する親和性を有するため、診断用途の場合にはバックグラウンドが高くなるという問題や、治療用途の場合にも疾患に特異的に薬効を発揮できない可能性があるという懸念があった。【０００５】
そこで、天然ビオチンに対する親和性を低減させたストレプトアビジン変異体、並びにこの天然ビオチンに対する低親和性のストレプトアビジン変異体に対して高い親和性を有するビオチン改変体が報告されれている（国際公開ＷＯ２０１４／１２９４４６）。また、天然ビオチンに対する親和性を低減させたストレプトアビジン変異体、並びにこの天然ビオチンに対する低親和性のストレプトアビジン変異体に対して高い親和性を有するビオチン改変二量体が報告されている（国際公開ＷＯ２０１５／１２５８２０）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２０１０／０９５４５５
【特許文献２】国際公開ＷＯ２０１４／１２９４４６
【特許文献３】国際公開ＷＯ２０１５／１２５８２０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、天然ビオチンに対する低親和性のストレプトアビジン変異体に対して高い親和性を有するビオチン改変二量体においてハロゲン元素を標識することにより、イメージング診断または治療を可能にするようなハロゲン化したビオチン改変二量体を提供することを解決すべき課題とした。更に本発明は、上記ハロゲン化したビオチン改変二量体と、ストレプトアビジン変異体との組み合わせを用いた診断キット・治療キットを提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討し、国際公開ＷＯ２０１５／１２５８２０に記載されたビオチン改変二量体にハロゲン元素を導入することに成功した。そして、得られたハロゲン化したビオチン改変二量体が、天然ビオチンに対する低親和性のストレプトアビジン変異体に対して高い親和性で結合することを確認し、本願発明を完成するに至った。【０００９】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
［１］  下記式（１）で示される化合物又はその塩。
【化１】
2019230905.tif 000003
（式中、
Ｘ１ａ、Ｘ１ｂ、Ｘ２ａ及びＸ２ｂはそれぞれ独立にＯ又はＮＨを示し、
Ｙ１及びＹ２はそれぞれ独立にＣ又はＳを示し、
Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立にＯ、Ｓ又はＮＨを示し、
Ｖ１及びＶ２はそれぞれ独立にＳ又はＳ＋−Ｏ−を示し、ｎ１及びｎ２はそれぞれ独立に０又は１の整数を示し、
Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３はそれぞれ独立に、２価の連結基を示し、
Ｌ４は、３価の連結基を示し、
Ｈａｌは、ハロゲン元素を示し、
ｐは１〜５の整数を示す。）【００１０】
［２］  式（１）で示される化合物が、下記式（１ａ）又は下記式（１ｂ）で示される化合物である、［１］に記載の化合物。
【化２】
2019230905.tif 000004
（式中の各記号の意味は［１］と同義である。）
［３］  ｎ１及びｎ２が０である、下記式（２）又は下記式（３）で示される、［１］又は［２］に記載の化合物又はその塩。
【化３】
2019230905.tif 000005
（式中の各記号の意味は［１］と同義である。）【００１１】
［４］  Ｘ１ａ、Ｘ１ｂ、Ｘ２ａ及びＸ２ｂがＮＨを示し、Ｙ１及びＹ２がＣを示し、
Ｚ１及びＺ２がＮＨを示し、Ｖ１及びＶ２がＳを示す、［１］から［３］の何れか一に記載の化合物又はその塩。
［５］  Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３がそれぞれ独立に、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ―、−ＣＯ−、−Ｏ−、及び炭素数１から１０のアルキレン基から選択される基の組み合わせからなる２価の連結基である、［１］から［４］の何れか一に記載の化合物又はその塩。
［６］  Ｌ１が、−（ＣＨ２）ｍ１−Ｌ１１−（ＣＨ２）ｍ２−Ｌ１２−※を示し、
Ｌ２が、※−Ｌ１３−（ＣＨ２）ｍ３−Ｌ１４−（ＣＨ２）ｍ４−を示し、
Ｌ３が、Ｌ１５−Ｌ２１−Ｌ１６−を示す、
ここで、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１３、Ｌ１４、Ｌ１５、及びＬ１６はそれぞれ独立に、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ―、−ＣＯ−又は−Ｏ―を示し、
ｍ１、ｍ２、ｍ３、及びｍ４はそれぞれ独立に１から１０の整数を示し、
※はベンゼン環との結合位置を示し、
Ｌ２１は、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２）ｍ５−を示し、ｍ５は１から１０の整数を示す、［１］から［５］の何れか一に記載の化合物又はその塩。
［７］  Ｈａｌが、Ｉ、１２５Ｉ、又は２１１Ａｔである、［１］から［６］の何れか一に記載の化合物又はその塩。
［８］  ｐが１である、［１］から［７］の何れか一に記載の化合物又はその塩。【００１２】
［９］  以下の何れかの化合物。
【化４】
2019230905.tif 000006
【００１３】
［１０］  （１）［１］から［９］の何れか一に記載の化合物；及び（ｂ）配列番号１９に記載のアミノ酸配列を含むストレプトアビジン変異体に分子プローブを結合させることにより得られる、ストレプトアビジン変異体−分子プローブ結合物：を含む治療又は診断のためのキット。
［１１］  下記式（Ａ）で表される化合物と、ハロゲン化ナトリウム又はハロゲンとを反応させることを含む、［１］から［９］の何れか一に記載の化合物又はその塩の製造方法。
【化５】
2019230905.tif 000007
（式中の各記号の意味は［１］と同義である。）
［１２］  下記式（Ｂ）で表される化合物と、ハロゲン化ナトリウム又はハロゲンとを反応させることを含む、［１］から［９］の何れか一に記載の化合物又はその塩の製造方法。
【化６】
2019230905.tif 000008
（式中の各記号の意味は［１］と同義である。）
【発明の効果】
【００１４】
本発明によるハロゲン化したビオチン改変二量体及びそれを含むキットは、プレターゲティング法に基づく診断法・治療法において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ドメイン構造の概略を示す。
【図２】図２は、CEA-V2122のSDS-PAGE泳動CBB 染色像を示す。
【図３】図３は、HER2-V2122構造図を示す。
【図４】図４は、HER2-V2122のSDS-PAGE泳動CBB 染色像を示す。
【図５】図５は、磁気ビーズによりPsyche Bアスタチン標識体とHerceptin-Cupidとの結合複合体を確認した結果を示す。
【図６】図６は、卵巣癌細胞SKOV3を用いてPsyche Bアスタチン標識体とHerceptin-Cupidとの結合複合体を確認した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明について更に詳細に説明する。
（１）ハロゲン化したビオチン改変二量体
本発明は、下記式（１）で示される化合物又はその塩であり、好ましくは下記式（１ａ）、下記式（１ｂ）、下記式（２）、又は下記式（３）で示される化合物又はその塩である。本発明の化合物は、「ハロゲン化ビオチン改変二量体」とも称する。
【００１７】
【化７】
2019230905.tif 000009
【００１８】
【化８】
2019230905.tif 000010
【００１９】
【化９】
2019230905.tif 000011
【００２０】
（式中、
Ｘ１ａ、Ｘ１ｂ、Ｘ２ａ及びＸ２ｂはそれぞれ独立にＯ又はＮＨを示し、
Ｙ１及びＹ２はそれぞれ独立にＣ又はＳを示し、
Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立にＯ、Ｓ又はＮＨを示し、
Ｖ１及びＶ２はそれぞれ独立にＳ又はＳ＋−Ｏ−を示し、ｎ１及びｎ２はそれぞれ独立に０又は１の整数を示し、
Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３はそれぞれ独立に、２価の連結基を示し、
Ｌ４は、３価の連結基を示し、
Ｈａｌは、ハロゲン元素を示し、
ｐは１〜５の整数を示す。）
【００２１】
式（１）、式（１ａ）、式（１ｂ）、式（２）、式（３）において、下記構造：
【化１０】
2019230905.tif 000012
で示される部分は好ましくは、
【化１１】
2019230905.tif 000013
の何れかであるが、これらに限定はされない。
【００２２】
Ｘ１ａ、Ｘ１ｂ、Ｘ２ａ及びＸ２ｂがＮＨを示すことが好ましく、Ｙ１及びＹ２がＣを示すことが好ましく、Ｚ１及びＺ２がＮＨを示すことが好ましく、Ｖ１及びＶ２がＳを示すことが好ましい。
【００２３】
Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３はそれぞれ独立に、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ―、−ＣＯ−、−Ｏ−、及び炭素数１から１０のアルキレン基から選択される基の組み合わせからなる２価の連結基であることが好ましい。
Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３はそれぞれ独立に、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−Ｏ−、及び炭素数１から１０のアルキレン基から選択される基の組み合わせからなる２価の連結基であることが好ましい。
【００２４】
Ｌ１、及びＬ２はそれぞれ独立に、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、及び炭素数１から１０のアルキレン基から選択される基の組み合わせからなる２価の連結基であることが好ましい。
【００２５】
Ｌ１は、−（ＣＨ２）ｍ１−Ｌ１１−（ＣＨ２）ｍ２−Ｌ１２−※を示すことが好ましく、Ｌ２は、※−Ｌ１３−（ＣＨ２）ｍ３−Ｌ１４−（ＣＨ２）ｍ４−を示すことが好ましく、Ｌ３は、Ｌ１５−Ｌ２１−Ｌ１６−を示すことが好ましい。
Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１３、Ｌ１４、Ｌ１５、及びＬ１６はそれぞれ独立に、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ―、−ＣＯ−又は−Ｏ―を示す。
Ｌ１１、及びＬ１２は、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−又は−Ｏ―であることが好ましい。特に好ましくは、Ｌ１１が−Ｏ―であり、Ｌ１２が−ＮＨＣＯ−である。
Ｌ１３、及びＬ１４は、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−又は−Ｏ―であることが好ましい。特に好ましくは、Ｌ１３が−ＣＯＮＨ−であり、Ｌ１４が−Ｏ―である。
Ｌ１５は、−ＣＯＮＨ−、又は単結合であることが好ましい。
Ｌ１６は、−ＮＨＣＯ−であることが好ましい。
ｍ１、ｍ２、ｍ３、及びｍ４はそれぞれ独立に１から１０の整数を示し、好ましくは２から１０の整数、より好ましくは２から８の整数、より好ましくは２から６の整数を示す。
※はＬ４との結合位置を示し、
Ｌ２１は、好ましくは、−（ＣＨ２）２−（Ｏ（ＣＨ２）２）ｍ５−を示す。
ｍ５は１から１０の整数を示し、好ましくは１から６の整数、より好ましくは１から４の整数を示す。
【００２６】
Ｌ４は、３価の連結基を示し、好ましくは、
【化１２】
2019230905.tif 000014
又は、
【化１３】
2019230905.tif 000015
である（ベンゼンに由来する３価の連結基または窒素原子）。
【００２７】
Ｈａｌで表されるハロゲン元素としては、フッ素（Ｆ）、塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）、ヨウ素（Ｉ）、アスタチン（Ａｔ）、テネシン（Ｔｓ）及びその同位体を挙げることができるが、好ましくはヨウ素、アスタチン及びその同位体である。ハロゲン元素としては、123I、124I、125Ｉ、131I、２１０Ａｔ、２１１Ａｔなどが挙げられる。上記の中でも、Ｉ、123Ｉ、124Ｉ、125Ｉ、131Ｉ、211Ａｔが好ましい。
【００２８】
ｐは１〜５の整数を示し、好ましくは１〜３の整数を示し、特に好ましくは１を示す。
【００２９】
（２）ハロゲン化ビオチン改変二量体の製造方法
本発明のハロゲン化ビオチン改変二量体は、後記の実施例に記載の通り、  N-Bromo-succinimideあるいはN-Iodo-succinimideのメタノールと酢酸の混合溶液に、メタノールに溶解したハロゲン化ナトリウム（ヨウ化ナトリウム、Ｎａ１２５Ｉなど）又はハロゲン（２１１Ａｔ）を加えて攪拌した後に、メタノールに溶解した下記式（Ａ）で表される化合物を加えて反応させることにより製造することができる。N-Bromo-succinimideあるいはN-Iodo-succinimideの添加量は、好ましくは０．１〜１．０当量であり、より好ましくは０．１〜０．５当量であり、さらに好ましくは０．１〜０．３当量である。N-Bromo-succinimideあるいはN-Iodo-succinimideの添加量は、ハロゲン化ナトリウム又はハロゲンの添加量（当量）よりは多くすることが好ましいが、N-Bromo-succinimideあるいはN-Iodo-succinimideの添加量を多くし過ぎると、式（Ａ）で表される化合物が分解する懸念があるので、適量に調節することが好ましい。
【００３０】
【化１４】
2019230905.tif 000016
【００３１】
（式中の各記号の意味は、式（１）における定義と同義である。）
【００３２】
また、本発明のハロゲン化ビオチン改変二量体は、後記の実施例に記載の通り、下記（Ｂ）で表される化合物のメタノールとアセトニトリルの混合溶液に、Tetrakis(pyridine)copper(II) triflate （添加量は好ましくは１〜１０当量であり、より好ましくは２〜８当量である）と3,4,7,8-Tetramethyl-1,10-phenanthroline（添加量は好ましくは１〜１０当量であり、より好ましくは２〜８当量である）とハロゲン化ナトリウムを加えて反応させることにより製造することができる。
【００３３】
【化１５】
2019230905.tif 000017
【００３４】
（式中の各記号の意味は、式（１）における定義と同義である。）
【００３５】
（３）ハロゲン化ビオチン改変二量体の利用
本発明によれば、本発明のハロゲン化ビオチン改変二量体と、ストレプトアビジン変異体―分子プローブ結合物とを組み合わせた治療剤又は診断剤が提供される。
【００３６】
ストレプトアビジン変異体としては、国際公開ＷＯ２０１４／１２９４４６及び国際公開ＷＯ２０１５／１２５８２０に記載のストレプトアビジン変異体を使用することができる。特に好ましくは、国際公開ＷＯ２０１５／１２５８２０の実施例３（国際公開ＷＯ２０１５／１２５８２０の配列番号４）に記載されているストレプトアビジン変異体V2122を使用することができる。
【００３７】
分子プローブとしては、例えば抗体、ペプチド、核酸、アプタマー等を挙げることができ、具体的には、癌に特異的に発現する以下抗原を標的とした抗体、ペプチド、核酸、アプタマー等を用いることができる。
【００３８】
エピレギュリン、ROBO1,2,3,4、1-40-β-アミロイド, 4-1BB, 5AC, 5T4, ACVR2B, 腺がん抗原,  α-フェトプロテイン, アンギオポエチン2, 炭疽毒素, AOC3 (VAP-1), B-リンパ腫細胞, B7-H3, BAFF, βアミロイド, C242抗原, C5, CA-125, カルボニックアンヒドラーゼ9 (CA-IX), 心臓ミオシン, CCL11 (eotaxin-1), CCR4, CCR5, CD11, CD18, CD125, CD140a, CD147 (basigin), CD147 (basigin), CD15, CD152, CD154 (CD40L), CD154, CD19, CD2, CD20, CD200, CD22, CD221, CD23 (IgE受容体), CD25(IL-2受容体のα鎖), CD28, CD3, CD30 (TNFRSF8), CD33, CD37, CD38(サイクリックADPリボースヒドロラーゼ), CD4, CD40, CD41(インテグリンα-IIb), CD44 v6, CD5, CD51, CD52, CD56, CD6, CD70, CD74, CD79B, CD80, CEA, CFD, ch4D5, CLDN18.2, クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）,クランピング因子A, CSF2, CTLA-4, サイトメガロウイルス, サイトメガロウイルス糖タンパク質B, DLL4, DR5, E. coli 志賀毒素１型, E. coli志賀毒素２型、EGFL7, EGFR, エンドトキシン, EpCAM, エピシアリン（episialin）, ERBB3, 大腸菌（Escherichia coli）, 呼吸器合胞体｛こきゅうき ごうほうたい｝ウイルス（respiratory syncytial virus）のFタンパク質, FAP, フィブリンIIβ鎖, フィブロネクチンエクストラドメイン-B, 葉酸受容体1, Frizzled 受容体, GD2, GD3ガングリオシド, GMCSF受容体α鎖, GPNMB, Ｂ型肝炎表面抗原, Ｂ型肝炎ウイルス、HER1, HER2/neu, HER3, HGF, HIV-1, HLA-DRβ, HNGF, Hsp90, ヒトβアミロイド,ヒト分散因子（scatter factor）受容体キナーゼ, ヒトTNF, ICAM-1 (CD54), IFN-α, IFN-γ, IgE, IgE Fc 領域, IGF-1受容体, IGF-I, IgG4, IGHE, IL-1β, IL-12, IL-13, IL-17, IL-17A, IL-22, IL-23, IL-4, IL-5, IL-6, IL-6受容体, IL-9, ILGF2, インフルエンザA ヘマグルチニン, インスリン様増殖因子I受容体, インテグリンα4, インテグリンα4β7, インテグリンα5β1, インテグリンα7 β7, インテグリンαIIbβ3, インテグリンαvβ3, インテグリンγ誘導タンパク質,インターフェロン受容体, インターフェロンα/β受容体, ITGA2, ITGB2 (CD18), KIR2D, L-セレクチン(CD62L), Lewis-Y抗原, LFA-1 (CD11a), リポタイコ酸, LOXL2, LTA, MCP-1, メソテリン、MS4A1, MUC1, ムチンCanAg, ミオスタチン, N-グリコリルノイラミン酸, NARP-1, NCA-90 (顆粒球抗原), NGF, NOGO-A, NRP1, Oryctolagus cuniculus, OX-40, oxLDL, PCSK9, PD-1, PDCD1, PDGF-R α, フォスファチジルセリン,前立腺がん細胞、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）,狂犬病｛きょうけんびょう｝ウイルス糖タンパク質、RANKL, 呼吸器合胞体｛こきゅうき ごうほうたい｝ウイルス, RHD, Ｒｈ（Rhesus）因子, RON, RTN4, スクレロスチン, SDC1, セレクチンP, SLAMF7, SOST, スフィンゴシン-1-ホスフェート, TAG-72, TEM1, テネイシンC, TFPI, TGFβ1, TGFβ2, TGF-β, TNF-α, TRAIL-R1, TRAIL-R2, 腫瘍抗原CTAA16.88,MUC1の腫瘍特異的グリコシル化, TWEAK受容体, TYRP1(グリコプロテイン75), VEGF-A, VEGFR-1, VEGFR2, ビメンチン, VWF
【００３９】
癌抗原特異的抗体分子などの分子プローブとストレプトアビジン変異体との融合体を調製し、患者に投与することで、癌細胞に特異的にストレプトアビジン変異体を集積できることができる。次に、上記ストレプトアビジン変異体に親和性を有する本発明のハロゲン化ビオチン改変二量体を患者に投与することによって、癌細胞へ的確にハロゲンを集積させることが可能になる。本発明においては、低免疫原性化により抗体産生が抑制され、抗体による早期の体内からのクリアランス、アナフィラキシーなどのショックを防ぐことができる。また、本発明においては患者から採取した組織、血清等を用いた体外診断薬、臨床検査薬として使用することで、組織、血清等に存在するビオチン或いはビオチン結合タンパク由来ノイズが低減し、よりＳ／Ｎ比の高い診断、検査が可能となる。
【００４０】
あるいはまた、本発明においては、癌抗原特異的抗体分子などの分子プローブとストレプトアビジン変異体との融合体と、本発明のハロゲン化ビオチン改変二量体とを結合させた結合体を調製し、上記結合体を患者に投与することもできる。
【００４１】
ストレプトアビジン変異体に結合させる抗体は種々の分子を用いることができる。ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体はどちらも使用することができる。抗体のサブクラスは特に問わないが、好ましくはＩｇＧ、特にＩｇＧ1が好適に用いられる。また、「抗体」は改変抗体および抗体断片の全てを含む。ヒト化抗体、ヒト型抗体、ヒト抗体、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、サル等の各種動物由来抗体、ヒト抗体と各種動物由来抗体とのキメラ抗体、ｄｉａｂｏｄｙ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ‘、Ｆ（ａｂ）’2が挙げられるが、これらに限らない。
【００４２】
ストレプトアビジン変異体と抗体の結合物は、当業者に公知の方法を用いて得ることができる。例えば、化学的結合方法（US5,608,060）によって得ることもできるし、ストレプトアビジン変異体をコードするＤＮＡと抗体をコードするＤＮＡを連結し、発現ベクター等を用いて宿主細胞に発現させることにより、融合タンパクとして得ることもできる。ストレプトアビジン変異体をコードするＤＮＡと抗体をコードするＤＮＡとの連結は、リンカーと呼ばれる適当なペプチドをコードするＤＮＡを介しても良い。ストレプトアビジン変異体―抗体結合物は、抗体と標的分子との特異的結合力を残して作製されることが望ましい。
【００４３】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００４４】
ハロゲン化したビオチン改変体２量体化合物の合成
一般的方法
核磁気共鳴 (NMR) スペクトルは、JEOL ECX500 (1H NMR: 500MHz)、またはJEOL ECS400(1H NMR: 400MHz) スペクトロメータを用いて測定した。化学シフトは、内部参照として重溶媒中の残存溶媒ピークに対する値としてppmで記載した （CDCl3:δ= 7.26 ppm,  CD3OD:δ= 3.31 ppm）。低分解能質量スペクトル (LHMS) は、Shimadzu LCMS-2020システムによりESI-MSを用いて測定した。反応は薄層クロマトグラフィー (TLC)、あるいは低分解能質量分析 (LRMS) によって追跡した。【００４５】
逆相高速液体クロマトグラフフィー (HPLC) は、JASCO-HPLCシステムを用いて行った。254 nmの紫外光を用いて検出し、移動相はグラジエント溶媒系 (アセトニトリル／0.1% トリフルオロ酢酸MQ溶液あるいは0.1%ギ酸MQ溶液) を用いた。分析については、YMC-Triart-C18 (150 mm×4.6 mm I.D.) のカラムを用い、流速 1 mL/minで行った。分取については、YMC-Triart-C18 (250 mm×10 mm I.D. あるいは 150 mm×4.6 mm I.D.) のカラムを用い、前者では流速6.3 mL/min、後者では流速1 mL/minで行った。【００４６】
＜実施例１＞
（１）
(3aS,3a'S,4S,4'S,6aR,6a'R)-4,4'-(((((5-((2-(2-(2-(3-(Trimethylstannyl)benzamido)ethoxy)ethoxy)ethyl)carbamoyl)-1,3-phenylene)bis(azanediyl))bis(6-oxohexane-6,1-diyl))bis(azanediyl))bis(5-oxopentane-5,1-diyl))bis(tetrahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-2(3H)-iminium) formate【００４７】
【化１６】
2019230905.tif 000018
【００４８】
ビスイミノビオチン1（国際公開ＷＯ２０１５／１２５８２０；特開2017-66155号公報）（44.7 mg, 34 μmol）のメタノール（1 ml）溶液に化合物2（19.3 mg, 51 μmol）とトリエチルアミン（47.3 μl, 510 μmol）を加え室温で2時間攪拌した。溶媒を減圧除去し、得られた粗生成物を逆相HPLC（グラジエント：2% for 2 min; 2-100% for 90 min CH3CN in 0.1% HCOOH水溶液, 保持時間 = 43.6 min, YMC-Triart C18, flow rate = 6.3 ml/min）で精製することで標題化合物3（15.0 mg, 収率 33%, 白色アモルファス状）を得た。【００４９】
1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ：0.29 (s, 9H), 1.35-1.45 (m, 8H), 1.48-1.80 (m, 16H), 2.18 (t, 4H, J =7.4 Hz), 2.37 (t, 4H, J = 7.4 Hz), 2.80 (d, 2H, J = 13.2 Hz), 2.97 (dd, 2H, J = 5.2 Hz, 13.2 Hz), 3.24-3.29 (m, 2H), 3.50-3.58 (m, 4H), 3.62-3.67 (m, 8H), 4.50 (dd, 2H, J = 4.6 Hz, 8.0 Hz), 4.70 (dd, 2H, J = 4.6 Hz, 8.0 Hz), 7.37 (t, 1H, J =7.4 Hz), 7.62 (d, 1H, J =6.9 Hz), 7.70 (d, 2H, J =2.1 Hz),7.92-7.94 (m, 1H), 8.01 (t, 1H, J = 1.7 Hz), 8.51-8.57 (m, 1H). LRMS (ESI): m/z 614 [M+2H]2+.【００５０】
（２）
(3aS,3a'S,4S,4'S,6aR,6a'R)-4,4'-(((((5-((2-(2-(2-(3-Iodobenzamido)ethoxy)ethoxy)ethyl)carbamoyl)-1,3-phenylene)bis(azanediyl))bis(6-oxohexane-6,1-diyl))bis(azanediyl))bis(5-oxopentane-5,1-diyl))bis(tetrahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-2(3H)-iminium) 2,2,2-trifluoroacetate【００５１】
【化１７】
2019230905.tif 000019
【００５２】
N-Bromo-succinimide（0.0027 mg, 0.152 μmol）のメタノール（560 μl）と酢酸 (0.76 μl)の混合溶液に,メタノール（100 μl）に溶解したヨウ化ナトリウム（0.00114 mg, 0.076 μmol）を加えて室温で5分間攪拌した後、メタノール(100 μl)に溶解したビスイミノビオチン3（0.1 mg, 0.076 μmol）を加えて、室温で10分間攪拌した。反応溶液を濃縮せずに逆相HPLC（グラジエント：30% for 2 min; 30-100% for 20 min CH3CN in 0.1% CF3COOH水溶液, 保持時間 = 8.5 min, YMC-Triart C18, flow rate = 1.0 ml/min）で精製することで、標題化合物4（黄色高粘着油状）を得た。得られた生成物はLC-MS解析において別法で合成した標品と保持時間および観測質量が一致した。
標題化合物4のことをPsycheB-ヨウ素体とも称する。【００５３】
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ：1.34-1.75 (m, 24H), 2.18 (t, 4H, J = 7.2 Hz), 2.38 (t, 4H, J = 7.2 Hz), 2.80 (d, 2H, J = 13.0 Hz), 2.98 (dd, 2H, J = 4.9 Hz, 13.5 Hz), 3.18 (t, 4H, J = 7.2 Hz), 3.23-3.28 (m, 2H), 3.55 (t, 4H, J = 5.4 Hz), 3.63-3.70 (m, 8H), 4.50 (dd, 2H, J = 4.5 Hz, 8.1 Hz), 4.70 (dd, 2H, J = 4.5 Hz, 8.1 Hz), 7.19 (t, 1H, J = 7.6 Hz), 7.70 (d, 2H, J = 1.8 Hz), 7.76-7.80 (m, 1H), 7.83-7.87 (m, 1H), 7.98 (t, 1H, J = 1.8 Hz), 8.15 (t, 1H, 1.8 Hz). LRMS (ESI): m/z595 [M+2H]2+.【００５４】
（３）
(3aS,3a'S,4S,4'S,6aR,6a'R)-4,4'-(((((5-((2-(2-(2-(3-(Iodo-125I)benzamido)ethoxy)ethoxy)ethyl)carbamoyl)-1,3-phenylene)bis(azanediyl))bis(6-oxohexane-6,1-diyl))bis(azanediyl))bis(5-oxopentane-5,1-diyl))bis(tetrahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-2(3H)-iminium) 2,2,2-trifluoroacetate【００５５】
【化１８】
2019230905.tif 000020
【００５６】
N-Bromosuccinimide（0.00271 mg, 0.152 μmol）のメタノール（560 μl）と酢酸 (0.76 μl)の混合溶液に,メタノール（100 μl）に溶解した Na125I（7.1 MBq）を加えて室温で5分間攪拌した後、メタノール(100 μl)に溶解したビスイミノビオチン3（0.1 mg, 0.076 μmol）を加えて、室温で10分間攪拌した。反応溶液を濃縮せずに逆相HPLC（30% for 2 min; 30-100% for 20 min CH3CN in 0.1% CF3COOH水溶液, 保持時間 = 8.5 min, YMC-Triart C18, flow rate = 1.0 ml/min）で精製することで標題化合物5を得た。【００５７】
（４）
(3aS,3a'S,4S,4'S,6aR,6a'R)-4,4'-(((((5-((2-(2-(2-(3-(Astato-211At)benzamido)ethoxy)ethoxy)ethyl)carbamoyl)-1,3-phenylene)bis(azanediyl))bis(6-oxohexane-6,1-diyl))bis(azanediyl))bis(5-oxopentane-5,1-diyl))bis(tetrahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-2(3H)-iminium) 2,2,2-trifluoroacetate【００５８】
【化１９】
2019230905.tif 000021
【００５９】
N-Iodosuccinimide（0.0034 mg, 0.152 μmol）のメタノール（560 μl）と酢酸 (0.76 μl)の混合溶液に,メタノール（100 μl）に溶解した 211At（20.6 MBq）を加えて室温で１分間攪拌した後、メタノール(100 μl)に溶解したビスイミノビオチン3（0.1 mg, 0.076 μmol）を加えて、室温で10分間攪拌した。反応溶液を濃縮せずに逆相HPLC精製（30% for 2 min; 30-80% for 13 min CH3CN in 0.1% CF3COOH水溶液, 保持時間 = 7.0 min, YMC-Triart C18, flow rate = 1.0 ml/min）で精製することで標題化合物6を得た。標題化合物6は、Psyche B-At211とも称する。【００６０】
＜実施例２＞
（１）
2,5-Dioxopyrrolidin-1-yl 3-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)benzoate
【化２０】
2019230905.tif 000022
3-(4,4,5,5-Tetramethyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)benzoic acidのジクロロメタン (3 ml) 、トリエチルアミン (26 μl, 188 μmol) の混合溶液にN-Hydroxysuccinimide (21.4 mg, 188 μmol)、1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide Hydrochloride (36 mg, 188 μmol)を加え、アルゴン雰囲気下、室温で４時間攪拌した。溶媒を減圧除去後、水を加え酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和塩化アンモニウム水溶液で1度、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で1度、飽和食塩水で1度洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧除去し、標的化合物7 (42.7 mg, 収率 80%, 白色個体)を得た。【００６１】
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ：1.35 (s, 12H), 2.85-2.98 (br, 4H), 7.52 (t, 1H, J = 7.6 Hz), 8.06-8.10 (m, 1H), 8.20(dt, 1H, J = 1.8 Hz, J = 7.6 Hz), 8.59 (s, 1H). LRMS (ESI): m/z 368 [M+Na]+.【００６２】
（２）
(3-((2-(2-(2-(3,5-bis(6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-Iminohexahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)pentanamido)hexanamido)benzamido)ethoxy)ethoxy)ethyl)carbamoyl)phenyl)boronic acid
【化２１】
2019230905.tif 000023
【００６３】
ビスイミノビオチン1（国際公開ＷＯ２０１５／１２５８２０；特開2017-66155号公報）（10 mg, 7.68 μmol）のDMF（400 μl）溶液に化合物7（3.9 mg, 11.5 μmol）とトリエチルアミン（16 μl, 115 μmol）を加え室温で4.5時間攪拌した。溶媒を減圧除去し、得られた粗生成物を逆相HPLC（グラジエント：0% for 5 min; 0-100% for 90 min CH3CN in 0.1% HCOOH水溶液, 保持時間 = 32.5 min, YMC-Triart C18, flow rate = 3.5 ml/min）で精製することで標題化合物8（3.6 mg, 収率 39%, 白色アモルファス状）を得た。【００６４】
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ：1.34-1.75 (m, 24H), 2.17 (t, 4H, J = 7.4 Hz), 2.37 (t, 4H, J = 7.4 Hz), 2.79 (d, 2H, J = 13.2 Hz), 2.96 (dd, 2H, J = 4.6 Hz, 13.2 Hz), 3.17 (t, 4H, J = 6.3 Hz), 3.21-3.28 (m, 2H), 3.50-3.57 (m, 4H), 3.61-3.69 (m, 8H), 4.49 (dd, 2H, J = 4.0 Hz, 7.4 Hz), 4.69 (dd, 2H, J = 4.6 Hz, 8.0 Hz), 7.35 (t, 1H, J = 7.4 Hz), 7.65-7.79 (m, 3H), 7.96-8.03 (m, 2H), 8.50 (s, 1H). LRMS (ESI): m/z 554 [M+2H]2+.【００６５】
（３）(3aS,3a'S,4S,4'S,6aR,6a'R)-4,4'-(((((5-((2-(2-(2-(3-Iodobenzamido)ethoxy)ethoxy)ethyl)carbamoyl)-1,3-phenylene)bis(azanediyl))bis(6-oxohexane-6,1-diyl))bis(azanediyl))bis(5-oxopentane-5,1-diyl))bis(tetrahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-2(3H)-iminium) 2,2,2-trifluoroacetate
【化２２】
2019230905.tif 000024
【００６６】
ビスイミノビオチン8のメタノール（17.5 μl）とアセトニトリル (2.5 μl)の混合溶液に Tetrakis(pyridine)copper(II) triflate (2.8 mg, 4.2 μmol)と3,4,7,8-Tetramethyl-1,10-phenanthroline (0.99 mg, 4.2 μmol) とヨウ化ナトリウム（0.0125 mg, 0.0834 μmol）を加えて、室温で10分間攪拌した。反応溶液のLCMS解析を行い、別法で合成した標品と保持時間および観測質量が一致した。
標題化合物4のことをPsycheB-ヨウ素体とも称する。【００６７】
＜実施例３＞
Methyl 5-((2S,3S,4R)-3,4-diaminotetrahydrothiophen-2-yl)pentanoate hydrobromide
【化２３】
2019230905.tif 000025
【００６８】
ビオチン 7(2.5 g, 10.2 mmol)に47%臭化水素水溶液を12 mlを加え、アルゴン雰囲気下、150 ℃で48時間還流しながら攪拌した後、溶媒を減圧除去した。得られた粗生成物8は更なる精製操作を行わずに次の反応に用いた。【００６９】
Methyl 5-((2S,3S,4R)-3,4-diaminotetrahydrothiophen-2-yl)pentanoate hydrobromide
【化２４】
2019230905.tif 000026
【００７０】
粗生成物8にメタノールを20 mlを加え、アルゴン雰囲気下、還流しながら5時間攪拌した。溶媒を減圧除去し、得られた粗生成物9は更なる精製操作を行わずに次の反応に用いた。【００７１】
5-((2S,3S,4R)-3,4-Diaminotetrahydrothiophen-2-yl)pentan-1-ol
【化２５】
2019230905.tif 000027
【００７２】
水素化アルミニウムリチウム(1.55 g, 40.9 mmol) のTHF(50 ml)溶液に、氷冷下、粗生成物9のTHF (400 ml)溶液を30分かけて滴下した。アルゴン雰囲気下、氷浴上で3時間攪拌した後、水（1.5 ml）,15% NaOH水溶液（1.5 ml）,水（4.5 ml）を加え、硫酸ナトリウム濾過で得られた濾液を減圧濃縮した。得られた粗精製物10（1.9 g, 黄色固体）は更なる精製操作は行わずに次の反応に使用した。【００７３】
Di-tert-butyl ((2S,3S,4R)-2-(5-hydroxypentyl)tetrahydrothiophene-3,4-diyl)dicarbamate
【化２６】
2019230905.tif 000028
【００７４】
粗生成物10の1,4-dioxane(20 ml)溶液に室温で、二炭酸ジ-tert-ブチル(4.26 g, 20.5 mmol)を加え、氷冷下で1M NaOH水溶液(20 ml)を加えた。アルゴン雰囲気下、室温で15時間攪拌した。溶媒を減圧除去した後、1M HCl水溶液を加え、酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水で有機層を洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧除去した。得られた粗精製物をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン/酢酸エチル＝67:33 → 20:80 → 0:100 →酢酸エチル/メタノール＝95:5 → 90:10）で精製することで標的化合物11(1.77 g, 化合物7から4段階で収率 46%, 白色アモルファス)を得た。【００７５】
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ：1.20-1.38 (m, 4H), 1.38-1.50 (m, 19H), 1.50-1.57 (m, 2H), 1.57-1.78 (m, 1H), 2.45 (t, J = 10.3 Hz, 1H), 3.10-3.27 (m, 1H), 3.45-3.46 (m, 1H), 3.60 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 4.05-4.25 (m, 1H), 4.25-4.40 (m, 1H), 4.70-4.85 (m, 1H), 4.90-5.05 (m, 1H). LRMS (ESI): m/z 427 [M+H]+.【００７６】
Di-tert-butyl ((2S,3S,4R)-2-(5-oxopentyl)tetrahydrothiophene-3,4-diyl)dicarbamate
【化２７】
2019230905.tif 000029
【００７７】
化合物11(1.15 g, 2.84 mmol)の酢酸エチル(12ml)溶液に2-iodoxybenzoic acid(4.08ｇ, 5.68 mmol,純度39%市販品)を加えた。アルゴン雰囲気下、80 ℃で還流しながら4時間攪拌した。溶液をセライトで濾過し、濾液を減圧除去した。得られた粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン/酢酸エチル＝76:24 →）で精製することで標的化合物12(0.53 g, 収率46%, 白色アモルファス)を得た。【００７８】
12H NMR (500 MHz, CD3OD) δ：1.30-1.50 (m, 24H), 2.42 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 2.47 (t, J = 10.3 Hz, 1H), 3.15-3.25 (m, 1H), 3.45-3.55 (m, 1H), 4.10-4.35 (m, 2H), 4.65-4.80 (m, 1H), 4.90-5.00 (m, 1H), 9.75 (t, J = 1.7 Hz, 1H) .【００７９】
Di-tert-butyl ((2S,3S,4R)-2-(5,5-bis(4-(1,3-dioxoisoindolin-2-yl)butoxy)pentyl)tetrahydrothiophene-3,4-diyl)dicarbamate
【化２８】
2019230905.tif 000030
【００８０】
化合物12(235.7 mg, 0.59 mmol)のメタノール(2 ml)溶液に室温でオルトギ酸メチル（333 μl, 2.95 mmol）及びp-トルエンスルホン酸ピリジニウム(13.6 mg, 0.059 mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下、室温で10時間攪拌し、溶媒及びオルトギ酸メチルを減圧除去した。トルエン(13 ml)及び2-(4-Hydroxybutyl)isoindoline-1,3-dione(1.03 g. 4.68 mmol)加えて、Dean-stark装置を用いて還流しながら8時間攪拌した。溶媒を減圧除去し、得られた粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン/酢酸エチル＝64:36 → 46:54 → 35:65）で精製することで標的化合物13(0.32g, 収率67%)を得た。【００８１】
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ：1.28-1.80 (m, 34H), 2.46 (t, J =10.3 Hz, 1H), 3.05-3.35 (m, 1H), 3.34-3.44 (m, 2H), 3.47-3.62 (m, 3H), 3.70, (t, J = 7.4 Hz, 4H), 4.18-4.23 (m, 1H), 4.28-4.33 (m, 1H), 4.39 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 4.74-4.81 (m, 1H), 4.97-5.03 (m, 1H), 7.68-7.74 (m, 4H), 7.80-7.84 (m, 4H).【００８２】
2-(4-((5-((2S,3S,4R)-3,4-Diaminotetrahydrothiophen-2-yl)pentyl)oxy)butyl)isoindoline-1,3-dione
【化２９】
2019230905.tif 000031
【００８３】
化合物13 (302 mg, 0.367 mmol)のジクロロメタン(7.2 ml)の溶液に室温で、トリエチルシラン (468 μl, 2.93 mmol), 三フッ化ホウ素ジエチルエーテラート (234 μl, 0.881 mmol)を加え、アルゴン雰囲気下、室温で11時間攪拌した。反応溶液にメタノール (500 μl)を加え室温で一時間攪拌した後、溶媒を減圧除去した。得られた粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム/メタノール＝99:1 → 75:25 → 65:35）で精製した。得られた化合物に飽和重曹水を加え、ジクロロメタンで抽出した。硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧除去し、標的化合物14(67.6 mg, 収率45%, 黄色油状)を得た。【００８４】
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ：1.32-1.62 (m, 9H), 1.67-1.76 (m, 3H), 2.55 (d, J = 13.2 Hz, 1H), 2.93 (dd, J = 5.7 Hz, 12.6 Hz, 1H), 3.20-3.30 (m, 1H), 3.41 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 3.45 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 3.68 (t, J = 6.9 Hz, 2H) 3.82 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 3.94 (t, J = 6.3 Hz, 1H), 7.76-7.81 (m, 2H), 7.82-7.87 (m, 2H). LRMS (ESI): m/z 406 [M+H]+.【００８５】
tert-Butyl ((3aS,4S,6aR,E)-4-(5-(4-(1,3-dioxoisoindolin-2-yl)butoxy)pentyl)tetrahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-2(3H)-ylidene)carbamate
【化３０】
2019230905.tif 000032
【００８６】
化合物14 (43.5 mg, 0.107 mmol)のジオキサン (300 μl)、トリエチルアミン(30 μl, 0.214 mmol)混合溶液に室温で、ジオキサン (400 μl)に溶解したGoodman試薬 (42 mg, 0.107mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下、室温で21時間攪拌し、溶媒を減圧除去した。得られた粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム/メタノール＝100:0 → 10:1 → 5:1）で精製し、標的化合物15 (9.1 mg, 収率16%)を得た。【００８７】
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ：1.32-1.50 (m, 4H), 1.43 (s, 9H), 1.51-1.69 (m, 5H), 1.71-1.81 (m, 3H), 2.86-2.95 (m, 2H), 3.18-3.24 (m, 1H), 3.38 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 3.42 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 3.71 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 4.42 (dd, J = 5.2 Hz, 8.0 Hz, 1H),4.62 (m, 1H), 7.67-7.73 (m, 2H), 7.80-7.86 (m, 2H). LRMS (ESI): m/z 531 [M+H]+.【００８８】
tert-Butyl ((3aS,4S,6aR,E)-4-(5-(4-aminobutoxy)pentyl)tetrahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-2(3H)-ylidene)carbamate
【化３１】
2019230905.tif 000033
【００８９】
化合物15 (31.7 mg, 0.06 mmol)のエタノール (500 μl)溶液に室温で、ヒドラジン水和物 (10 mg, 0.3 mmol)を加えた。反応溶液を50 ℃で10時間攪拌した。反応溶液を吸引ろ過し、濾液を減圧除去した。得られた粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（アミノシリカ、クロロホルム/メタノール＝100:0 → 94:6 ）で精製し、標的化合物16 (11.8 mg, 収率49%)を得た。【００９０】
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ：1.40-1.50 (m, 13H), 1.51-1.69 (m, 7H), 1.72-1.82 (m, 1H), 2.69 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.81 (d, J = 6.3 Hz, 1H), 2.97 (dd,J = 4.9 Hz, 13.0 Hz, 1H), 3.24-3.32 (m, 1H), 3.40-3.48 (m, 4H), 4.41 (dd, J = 4.5 Hz, 8.1 Hz, 1H), 4.62 (dd, J = 4.5 Hz, 8.1 Hz, 1H). LRMS (ESI): m/z 401 [M+H]+.【００９１】
14-(Carboxymethyl)-2,2-dimethyl-4-oxo-3,8,11-trioxa-5,14-diazahexadecan-16-oic acid
【化３２】
2019230905.tif 000034
【００９２】
化合物17（AMGEN INC.WO2006/14645, 2006, A1） (131.1 mg, 240.7 mmol)のメタノール (5 ml)溶液に、10%パラジウム炭素 (24.1 mg, 22 .6 μmol)を加え、水素雰囲気下室温で3時間攪拌した。セライト濾過後、溶媒を減圧除去し、得られた粗生成物18 (93.3 mg, 収率quant., 無色高粘性油状)は更なる精製操作を行わずに次の反応に使用した。【００９３】
tert-Butyl (22-((3aS,4S,6aR,E)-2-((tert-butoxycarbonyl)imino)hexahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)-9-(2-((4-((5-((3aS,4S,6aR,Z)-2-((tert-butoxycarbonyl)imino)hexahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)pentyl)oxy)butyl)amino)-2-oxoethyl)-11-oxo-3,6,17-trioxa-9,12-diazadocosyl)carbamate
【化３３】
2019230905.tif 000035
【００９４】
化合物18 (6.4 mg, 17.5 μmol)のジクロロメタン (400 μl)溶液に、室温で化合物16 (12.9 mg, 32.2 μmol)と1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル) カルボジイミド塩酸塩 (6.9 mg, 36 μmol)を加えた。アルゴン雰囲気下、室温で36時間攪拌した溶媒を減圧除去した。得られた粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（アミノシリカ、クロロホルム/メタノール＝200:1 → 50:1→30:1→ 20:1 → 10:1 → 5:1 → 3:1 ）で精製し、標的化合物19 (9.6 mg, 収率49%)を得た。【００９５】
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ：1.34-1.50 (m, 35H), 1.51-1.64 (m, 14H), 1.72-1.82 (m, 2H), 2.81 (d, J = 12.6 Hz, 2H), 2.97 (dd, J = 4.9 Hz, 12.6 Hz, 2H), 3.18-3.30 (m, 10H), 3.39-3.65 (m, 20H), 4.41 (dd, J = 4.5 Hz, 8.1 Hz, 2H), 4.63 (dd, J = 4.5 Hz, 8.1 Hz, 2H). LRMS (ESI): m/z565 [M+2H]2+.【００９６】
2,2'-((2-(2-(2-Aminoethoxy)ethoxy)ethyl)azanediyl)bis(N-(4-((5-((3aS,4S,6aR)-2-iminohexahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)pentyl)oxy)butyl)acetamide) 2,2,2-trifluoroacetate
【化３４】
2019230905.tif 000036
【００９７】
化合物19 (5.2 mg, 4.6 μmol)の水溶液 (200 μl)に室温でトリフルオロ酢酸 (400 μl)を加えた。アルゴン雰囲気下、室温で18時間攪拌し、溶媒を減圧除去した。得られた粗生成物を逆相HPLC（グラジエント：0% for 5 min; 0-100% for 90 min CH3CN in 0.1% CF3COOH水溶液, YMC-Triart C18, flow rate = 3.5 ml/min）で精製し、標的化合物20 (3.5 mg, 収率59%)を得た。【００９８】
1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ：1.34-1.50 (m, 8H), 1.52-1.63 (m, 14H), 1.71-1.81 (m, 2H), 2.82 (d, J = 13.2 Hz, 2H), 2.99 (dd, J = 4.6 Hz, 13.2 Hz, 2H), 3.14 (t, J = 4.6 Hz, 4H), 3.20-3.30 (m, 6H), 3.43 (t, J = 6.3 Hz, 8H), 3.60-3.74 (m, 12H), 4.53 (dd, J = 4.0 Hz, 8.0 Hz, 2H), 4.72 (dd, J = 4.6 Hz, 8.0 Hz, 2H). LRMS (ESI): m/z415 [M+2H]2+.【００９９】
2-((4-((5-((3aS,4S,6aR)-2-Iminiohexahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)pentyl)oxy)butyl)amino)-N-(2-((4-((5-((3aS,4S,6aR)-2-iminiohexahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)pentyl)oxy)butyl)amino)-2-oxoethyl)-2-oxo-N-(2-(2-(2-(3-(trimethylstannyl)benzamido)ethoxy)ethoxy)ethyl)ethan-1-aminium formate
【化３５】
2019230905.tif 000037
【０１００】
化合物20 (3.5 mg, 2.72 μmol)のDMF (300 μl)溶液に室温で、化合物21 (1.1 mg, 2.99 μmol)とトリエチルアミン (5.7 μl, 40.8 μmol)を加えた。アルゴン雰囲気下、室温で3時間攪拌し、溶媒を減圧除去した。得られた粗生成物を逆相HPLC（グラジエント：0% for 5 min; 2-100% for 90 min CH3CN in 0.1% HCOOH水溶液, 保持時間：42.0 min, YMC-Triart C18, flow rate = 3.5 ml/min）で精製し、標的化合物22 (1.5 mg, 収率 45％)を得た。LRMS (ESI): m/z 366 [M+3H]3+.【０１０１】
2,2'-((2-(2-(2-(3-Iodobenzamido)ethoxy)ethoxy)ethyl)azanediyl)bis(N-(4-((5-((3aS,4S,6aR)-2-iminohexahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)pentyl)oxy)butyl)acetamide) 2,2,2-trifluoroacetate
【化３６】
2019230905.tif 000038
【０１０２】
ビスイミノビオチン20 (2.4 mg, 1.87 μmol)のDMF (150 μl)溶液に、室温でDMF (100 μl)に溶解した化合物23 (0.7 mg, 2.06 μmol)とトリエチルアミン (4 μl, 28.3 μmol)を加えた。アルゴン雰囲気下、室温で2時間攪拌し、溶媒を減圧除去した。得られた粗生成物を逆相HPLC（グラジエント：0% for 5 min; 2-100% for 90 min CH3CN in 0.1% CF3COOH水溶液, 保持時間：47.6 min, YMC-Triart C18, flow rate = 3.5 ml/min）で精製し、標的化合物24 (1.3 mg, 収率 50％)を得た。LRMS (ESI): m/z 354 [M+3H]3+.
標的化合物24のことをPsycheP-ヨウ素体とも称する。【０１０３】
2,2'-((2-(2-(2-(3-Iodobenzamido)ethoxy)ethoxy)ethyl)azanediyl)bis(N-(4-((5-((3aS,4S,6aR)-2-iminohexahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)pentyl)oxy)butyl)acetamide) 2,2,2- trifluoroacetate
【化３７】
2019230905.tif 000039
【０１０４】
N-Bromo-succinimide（0.00288 mg, 0.162 μmol）のメタノール（610 μl）と酢酸 (0.81 μl)の混合溶液に,メタノール（100 μl）に溶解したヨウ化ナトリウム（0.00121 mg, 0.081 μmol）を加えて室温で5分間攪拌した後、メタノール(100 μl)に溶解したビスイミノビオチン22（0.1 mg, 0.081 μmol）を加えて、室温で10分間攪拌した。反応液のLC-MS解析において、上記の方法で合成した標品（24）と保持時間および観測質量が一致した。標的化合物24のことをPsycheP-ヨウ素体とも称する。【０１０５】
＜CEA-V2122の製造＞
V2122は、国際公開ＷＯ２０１５／１２５８２０の実施例３（国際公開ＷＯ２０１５／１２５８２０の配列番号４）に記載されているストレプトアビジン変異体である。V2122のアミノ酸配列（Ｃ末端に６×Ｈｉｓタグを有する配列）を配列表の配列番号１に記載する。【０１０６】
scFv-V2122は、上記のV2122に、CEACAM5に対する一本鎖抗体（scFv）を結合したものである。このscFv型の抗CEACAM5抗体は特許文献US7626011B2に記載されているscFv配列である。scFv型の抗CEACAM5抗体のアミノ酸配列を配列表の配列番号２に記載する。また、scFv型の抗CEACAM5抗体とV2122とをアミノ酸リンカー(GGGGSGGGG)（配列番号１１）で結合したCEA-V2122のアミノ酸配列を配列表の配列番号３に記載する。【０１０７】
CEA-V2122融合タンパク質の発現のために、大腸菌にて分泌発現するためのpelBシグナルをN末端に、また6xHis-Tag配列をC末端に組み込んだCEA-V2122遺伝子配列のDNAコドンを大腸菌に最適化し人工遺伝子合成を行なった。このアミノ酸配列を配列表の配列番号４、DNA配列を配列表の配列番号５に記載する。また、ドメイン構造の概略を図１に示す。【０１０８】
具体的なタンパク質発現ベクターは、pETDuet1ベクターのMCS2にシャペロンskp遺伝子が組み込まれたベクターを使用した。skp遺伝子は配列表の配列番号６に記載されたアミノ酸配列を元にコドンを大腸菌に最適化したDNAの人工遺伝子合成を行った。合成されたskp遺伝子はプライマー（AAGGAGATATACATATGGATAAAATTGCCATTGTTAATAT（配列番号１２）, TTGAGATCTGCCATATGTTATTTCACTTGTTTCAGAACG（配列番号１３））を使用しPCRで増幅し、制限酵素NdeIで直鎖化されたpETDue1ベクターのMCS2にIn-Fusion HD Cloning Kitをもちいてクローニングを行い pETDuet_skp とした。次に、 pETDuet_skp のMCS1にCEA-V2122遺伝子を組み込んだ。具体的には、人工合成されたCEA-V2122遺伝子をプライマー（AGAAGGAGATATACCATGAAATATCTGCTGCCGAC（配列番号１４）、CGCCGAGCTCGAATTTTAATGATGGTGATGATGATG（配列番号１５））を用いPCRにて増幅した。また、 pETDuet_skp をプライマー（GGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC（配列番号１６）、AATTCGAGCTCGGCGCGCCTGCAG（配列番号１７））を使用しPCRにて直鎖化した。PCRにより増幅された CEA-V2122と直鎖化された pETDuet_skp を In-Fusion HD Cloning Kit をもちいてクローニングを行った。クローニングされたベクターはシーケンスにより組み込まれた遺伝子配列の確認を行い pETDuet_CEA-V2122_skp とした。【０１０９】
タンパク質発現のために、pETDuet_CEA-V2122_skpをBL21(DE3)(ニッポン・ジーン社)に形質転換し 2xYT培地(SIGMA-ADLRICH社)、37°Cにて一晩、前培養を行った。前培養を行った培地を 新しい培地に100倍希釈になるように添加し、OD(600nm) = 0.5〜2.0になるまで37°Cで培 養を行った。次に最終濃度0.5mM IPTGを添加し37°Cで4時間培養し培養上清を回収した後、4°Cで保存した。【０１１０】
CEA-V2122タンパク質は、C末端に付加されている6xHis-Tagを利用し バッチ法で粗精製を行った。具体的にはバッファーA(50mM TrisHCl, 0.2M NaCl, 1mM ED TA, 5mM Imidazole, pH8.0)で平衡化したcOmplete His-Tag Purification Resin を4°C で保存した培養上清へ添加し、2時間から一晩、4°Cにて撹拌しレジンへのタンパク質結 合処理を行った。次にレジンをカラムに回収し、バッファーAで20カラム容量の洗浄作業 を行った。その後、バッファーB(50mM TrisHCl, 0.2M NaCl, 1mM EDTA, 400mM Imidazol e, pH8.0)で溶出しCEA-V2122の粗精製物の回収を行った。 【０１１１】
次に、粗精製物についてProtein L カラムによる精製を行った。具体的にはCapto L (GE Healthcare Life Sciences) 1mLをPD-10カラムに充填し、10カラムボリュームのPBSで平衡化後、上述の粗精製物をアプライし、10カラムボリュームのPBSで洗浄後、10mM グリシン塩酸 pH2.0で溶出しVivaspin Turbo 15 (MWCO 100,000) による遠心濃縮を行なった。さらに PD-10 (GE Healthcare Life Sciences社) を用いてPBSへバッファー置換を行い、さらに Vivaspin Turbo 4  (MWCO 100,000) による遠心濃縮を行い最終精製物とした。SDS-PAGE電気泳動後、CBB染色により４量体CEA-V2122の純度の検定を行なった結果を図２に示す。SDS-PAGEゲルは Mini-PROTEAN TGX 4-15% (Bio-Rad社) を使用し CBB染色液はBullet CBB Stain One(Ready To Use) (ナカライテスク社）を使用した。
図２より精製されたCEA-V2122は約150kDaの４量体を主たる成分であることが確認された。【０１１２】
＜Herceptin-V2122の製造＞
V2122は、国際公開ＷＯ２０１５／１２５８２０の実施例３（国際公開ＷＯ２０１５／１２５８２０の配列番号４）に記載されているストレプトアビジン変異体である。V2122のアミノ酸配列を配列表の配列番号１に記載する。
scFv-V2122は、上記のV2122に、HER2 (ERBB2) に対する一本鎖抗体（scFv）を結合したものである。このscFv型の抗HER2抗体は、Zhang H, et al.,Therapeutic potential of an anti-HER2 single chain antibody-DM1 conjugates for the treatment of HER2-positive cancer. Signal Transduct Target Ther. 2017 May 19;2:17015. doi: 10.1038/sigtrans.2017.15に記載されているscFv配列である。scFv型の抗HER2抗体のアミノ酸配列を配列表の配列番号７に記載する。また、scFv型の抗HER2抗体とV2122とをアミノ酸リンカー(GGGGGSGGGGG)（配列番号１８）で結合したHER2-V2122の構造図を図３、アミノ酸配列を配列表の配列番号８に示す。【０１１３】
HER2-V2122融合タンパク質の発現のために、大腸菌にて分泌発現するためのpelBシグナルをN末端に、また6xHis-Tag配列をC末端に組み込んだHER2-V2122遺伝子配列のDNAコドンを大腸菌に最適化し人工遺伝子合成を行なった。このアミノ酸配列を配列表の配列番号９、DNA配列を配列表の配列番号１０に記載する。【０１１４】
具体的なタンパク質発現ベクターは、pETDuet1ベクターのMCS2にシャペロンskp遺伝子が組み込まれたベクターを使用した。skp遺伝子は配列表の配列番号６に記載されたアミノ酸配列を元にコドンを大腸菌に最適化したDNAの人工遺伝子合成を行った。合成されたskp遺伝子はプライマー（AAGGAGATATACATATGGATAAAATTGCCATTGTTAATAT（配列番号１２）, TTGAGATCTGCCATATGTTATTTCACTTGTTTCAGAACG（配列番号１３））を使用しPCRで増幅し、制限酵素NdeIで直鎖化されたpETDue1ベクターのMCS2にIn-Fusion HD Cloning Kitをもちいてクローニングを行い pETDuet_skp とした。次に、 pETDuet_skp のMCS1にHER2-V2122遺伝子を組み込んだ。具体的には、人工合成されたHER2-V2122遺伝子をプライマー（AGAAGGAGATATACCATGAAATATCTGCTGCCGAC（配列番号１４）、CGCCGAGCTCGAATTTTAATGATGGTGATGATGATG（配列番号１５））を用いPCRにて増幅した。また、 pETDuet_skp をプライマー（GGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC（配列番号１６）、AATTCGAGCTCGGCGCGCCTGCAG（配列番号１７））を使用しPCRにて直鎖化した。PCRにより増幅された CEA-V2122と直鎖化された pETDuet_skp を In-Fusion HD Cloning Kit をもちいてクローニングを行った。クローニングされたベクターはシーケンスにより組み込まれた遺伝子配列の確認を行い pETDuet_HER-V2122_skp とした。【０１１５】
タンパク質発現のために、pETDuet_HER2-V2122_skpをBL21(DE3)(ニッポン・ジーン社)に形質転換し 2xYT培地(SIGMA-ADLRICH社)、37°Cにて一晩、前培養を行った。前培養を行った培地を 新しい培地に100倍希釈になるように添加し、OD(600nm) = 0.5〜2.0になるまで37°Cで培 養を行った。次に最終濃度0.5mM IPTGを添加し37°Cで4時間培養し培養上清を回収した後、4°Cで保存した。【０１１６】
HER2-V2122タンパク質は、C末端に付加されている6xHis-Tagを利用し バッチ法で粗精製を行った。具体的にはバッファーA(50mM TrisHCl, 0.2M NaCl, 1mM ED TA, 5mM Imidazole, pH8.0)で平衡化したcOmplete His-Tag Purification Resin を4°C で保存した培養上清へ添加し、2時間から一晩、4°Cにて撹拌しレジンへのタンパク質結 合処理を行った。次にレジンをカラムに回収し、バッファーAで20カラム容量の洗浄作業 を行った。その後、バッファーB(50mM TrisHCl, 0.2M NaCl, 1mM EDTA, 400mM Imidazol e, pH8.0)で溶出しHER2-V2122の粗精製物の回収を行った。 【０１１７】
次に、粗精製物についてProtein L カラムによる精製を行った。具体的にはCapto L (GEヘルスケア)1mLをPD-10カラムに充填し、10カラムボリュームのPBSで平衡化後、上述の粗精製物をアプライし、10カラムボリュームのPBSで洗浄後、10mM グリシン塩酸 pH2.0で溶出しVivaspin Turbo 15 (MWCO 100,000) による遠心濃縮を行なった。さらに PD-10（GEヘルスケア）を用いてPBSへバッファー置換を行い、さらに Vivaspin Turbo 4  (MWCO 100,000) による遠心濃縮を行い最終精製物とした。精製物についてCBB染色により４量体HER2-V2122の純度の検定を行なった結果を図４に示す。SDS-PAGEゲルは Mini-PROTEAN TGX 4-15% (Bio-Rad社) を使用し CBB染色液は Bullet CBB Stain One(Ready To Use) (ナカライテスク社）を使用した。
図４より精製されたHER2-V2122は約150kDaの４量体を主たる成分であることが確認された。【０１１８】
試験例１：CEA-V2122とPsyche B-ヨウ素体およびPsyche P-ヨウ素体の親和性解析
CEA-V2122とPsyche B-ヨウ素体およびPsyche P-ヨウ素体の親和性データ取得は特願２０１８−２４７３６３の記載に従い実施した。簡単にまとめるとアミンカップリングキット(GE Healthcare Life Sciences社)を使用し、Sensor Chip CM5 (GE Healthcare Life Sciences社)  に目標値 5000RUとなるように設定し、精製された CEA-V2122 の固定化を行なった。アナライトの濃度は 1E-08 M から 6.25E-10 M までの２倍希釈系列５種類を使用した。BiacoreT200 (GE Healthcare Life Sciences社)を用い、測定温度25度に設定しSingle-Cycle Kinetics 解析にてカイネティクスデータ取得を行った。得られたデータを Biacore T200 Evaluation Software, version 2.0 (GE Healthcare Life Sciences社)にて Bivalent Analyze モードによるカーブフィッティングを実施し各パラメータの評価値を得た。解離定数KDは、Kd/Ka = KDより求められる。それらの結果を表１に示す。結果より、Psyche B-ヨウ素体およびPsyche P-ヨウ素体はCEA-V2122と安定な結合を形成することが確認された。【０１１９】
【表１】
2019230905.tif 000040
【０１２０】
試験例２：磁気ビーズによるPsyche Bアスタチン標識体とHerceptin-Cupidとの結合複合体確認
アスタチン標識されたPsyche BがCupidとの結合能を有するかどうかを確認するために、Herceptin-CupidとHerceptin-Cupidについている6xHisタグに結合するNi-NTA磁気ビーズ（Thermo社製）を用いた結合アッセイを実施した。ここで用いたPsyche B-At211は実施例１の（４）に従い調製し、Herceptin-Cupidは上記の通り特願２０１８−２４７３６３に記載された方法に従って調製した。具体的なアッセイ方法は以下の通りである。【０１２１】
1.5mLチューブに4μLのHerceptin-V2122溶液またはコントロール用PBSの分注をおこなった。そこへ10μL(5.8kBq相当)のPsyche-At211を添加し、室温で５分間インキュベーションをおこなった。次にPBSにて平衡化したNi-NTA磁気ビーズ10μLを添加し、室温で５分間インキュベーションをおこなった。その後、マグネットを使用し、ビーズを沈殿、固定化し上清を回収したのち、100μLのPBSにて洗浄を２回行いガンマーカウンターにより放射線量のカウントを行なった。結果は図５のグラフである。Herceptin-V2122の存在依存的にPsyche-At211が沈降しているのが確認された。【０１２２】
試験例３：卵巣癌細胞SKOV3を用いたPsyche Bアスタチン標識体とHerceptin-Cupidとの結合複合体確認
アスタチン標識されたPsyche BがHER2陽性SKOV3細胞にあらかじめ結合させたHerceptin-V2122との結合能を有するかどうかを確認を行なった。また、ネガティブコントロールとしてCEA-V2122を用いた。ここで用いたPsyche B-At211は実施例１の（４）に従い調製し、Herceptin-V2122およびCEA-V2122は上記の通り特願２０１８−２４７３６３に記載された方法に従って調製した。具体的なアッセイ方法は以下の通りである。【０１２３】
1.5mLチューブ４本用意し、各チューブに0.875x106 cells/tubeになるように細胞を分注した。N=2となるように２本のチューブにHerceptin-V2122を添加をおこない、残りの２本にはCEA-V2122の添加をおこなった。次に、氷上にて1時間インキュベーションし、10kBq/tubeとなるようにアスタチン標識されたPsyche Bの添加をおこなった。その後、室温にて30分間浸透しながらインキュベーションをおこなった。最後に遠心にて細胞を沈殿させ上清を回収し、PBSによる洗浄を２回行ない、ガンマカウンターによる放射線量のカウントを行なった。結果は図６のグラフである。Herceptin-V2122依存的な測定結果となり、SKOV3細胞にHerceptin-V2122を介し、Psyche B-At212が結合していることが確認された。【０１２４】
配列番号１
AEAGITGTWSDQLGDTFIVTAGADGALTGTYENAVGGAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNSKNAHSATTWSGQYVGGADAKINTQWLLTSGTTNANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASHHHHHH【０１２５】
配列番号２(sm3E-scFv配列)
QVKLEQSGAEVVKPGASVKLSCKASGFNIKDSYMHWLRQGPGQRLEWIGWIDPENGDTEYAPKFQGKATFTTDTSANTAYLGLSSLRPEDTAVYYCNEGTPTGPYYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSENVLTQSPSSMSVSVGDRVNIACSASSSVPYMHWLQQKPGKSPKLLIYLTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYSLTISSVQPEDAATYYCQQRSSYPLTFGGGTKLEIK【０１２６】
配列番号３
QVKLEQSGAEVVKPGASVKLSCKASGFNIKDSYMHWLRQGPGQRLEWIGWIDPENGDTEYAPKFQGKATFTTDTSANTAYLGLSSLRPEDTAVYYCNEGTPTGPYYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSENVLTQSPSSMSVSVGDRVNIACSASSSVPYMHWLQQKPGKSPKLLIYLTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYSLTISSVQPEDAATYYCQQRSSYPLTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGAEAGITGTWSDQLGDTFIVTAGADGALTGTYENAVGGAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNSKNAHSATTWSGQYVGGADAKINTQWLLTSGTTNANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASHHHHHH【０１２７】
配列番号４
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAQVKLEQSGAEVVKPGASVKLSCKASGFNIKDSYMHWLRQGPGQRLEWIGWIDPENGDTEYAPKFQGKATFTTDTSANTAYLGLSSLRPEDTAVYYCNEGTPTGPYYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSENVLTQSPSSMSVSVGDRVNIACSASSSVPYMHWLQQKPGKSPKLLIYLTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYSLTISSVQPEDAATYYCQQRSSYPLTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGAEAGITGTWSDQLGDTFIVTAGADGALTGTYENAVGGAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNSKNAHSATTWSGQYVGGADAKINTQWLLTSGTTNANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASHHHHHH【０１２８】
配列番号５
ATGAAATATCTGCTGCCGACCGCAGCAGCGGGTCTGCTGCTGCTGGCAGCACAGCCTGCAATGGCACAGGTTAAACTGGAACAGAGCGGTGCCGAAGTTGTTAAACCGGGTGCAAGCGTTAAACTGAGCTGTAAAGCAAGCGGCTTTAACATCAAAGATAGCTATATGCATTGGCTGCGTCAGGGTCCGGGTCAGCGTCTGGAATGGATTGGTTGGATTGATCCGGAAAATGGTGATACCGAATATGCACCGAAATTTCAGGGTAAAGCAACCTTTACCACCGATACCAGCGCAAATACCGCATATCTGGGTCTGAGCAGCCTGCGTCCGGAAGATACCGCAGTGTATTATTGTAATGAAGGCACCCCGACCGGTCCGTATTATTTCGATTATTGGGGTCAGGGCACCCTGGTTACCGTTAGCAGCGGTGGTGGTGGTAGTGGTGGCGGTGGTTCAGGCGGTGGCGGTAGCGAAAATGTTCTGACCCAGAGCCCGAGCAGCATGAGCGTTAGCGTTGGTGATCGTGTTAATATTGCATGTAGCGCAAGCAGCAGCGTTCCGTACATGCACTGGCTGCAGCAGAAACCGGGTAAAAGCCCGAAACTGCTGATTTATCTGACCAGCAATCTGGCAAGCGGTGTTCCGAGCCGTTTTAGCGGTAGCGGTAGTGGCACCGATTATAGCCTGACCATTAGCAGCGTGCAGCCTGAAGATGCAGCAACCTATTATTGTCAGCAGCGTAGCAGTTATCCGCTGACCTTTGGTGGTGGCACCAAACTGGAAATTAAAGGGGGTGGTGGCTCAGGTGGCGGAGGTGCAGAAGCAGGTATTACCGGTACATGGTCAGATCAGCTGGGTGATACCTTTATTGTTACCGCAGGCGCAGATGGTGCACTGACCGGCACCTATGAAAATGCAGTTGGTGGTGCAGAAAGCCGTTATGTGCTGACCGGTCGTTATGATAGCGCACCGGCAACCGATGGTAGCGGCACCGCACTGGGTTGGACCGTTGCATGGAAAAATAACAGCAAAAATGCACATAGCGCAACCACCTGGTCAGGTCAGTATGTGGGTGGTGCCGATGCCAAAATTAACACCCAGTGGCTGCTGACCAGCGGTACAACCAATGCAAATGCCTGGAAAAGTACCCTGGTTGGTCATGATACATTCACCAAAGTTAAACCGAGCGCAGCAAGCCATCATCATCACCATCATTAA【０１２９】
配列番号６
MDKIAIVNMGSLFQQVAQKTGVSNTLENEFKGRASELQRMETDLQAKMKKLQSMKAGSDRTKLEKDVMAQRQTFAQKAQAFEQDRARRSNEERGKLVTRIQTAVKSVANSQDIDLVVDANAVAYNSSDVKDITADVLKQVK【０１３０】
配列番号７
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK【０１３１】
配列番号８
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGGGGGSGGGGGAEAGITGTWSDQLGDTFIVTAGADGALTGTYENAVGGAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNSKNAHSATTWSGQYVGGADAKINTQWLLTSGTTNANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASHHHHHH【０１３２】
配列番号９
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGGGGGSGGGGGAEAGITGTWSDQLGDTFIVTAGADGALTGTYENAVGGAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNSKNAHSATTWSGQYVGGADAKINTQWLLTSGTTNANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASHHHHHH【０１３３】
配列番号１０
ATGAAATATCTGCTGCCGACCGCAGCAGCGGGTCTGCTGCTGCTGGCAGCACAGCCTGCAATGGCAGAAGTTCAGCTGGTTGAAAGCGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCTGGTGGTAGCCTGCGTCTGAGCTGTGCAGCAAGCGGTTTTAACATTAAAGATACCTATATTCATTGGGTGCGTCAGGCACCTGGTAAAGGTCTGGAATGGGTTGCACGTATTTATCCGACCAATGGTTATACCCGTTATGCCGATAGCGTTAAAGGTCGTTTTACCATTAGCGCAGATACCAGCAAAAATACCGCATACCTGCAGATGAATAGTCTGCGTGCAGAGGATACCGCAGTGTATTATTGTAGCCGTTGGGGTGGTGATGGTTTTTATGCAATGGATTATTGGGGTCAGGGCACCCTGGTTACCGTTAGCTCAGGTGGAGGCGGTTCCGGTGGCGGAGGTTCCGGTGGAGGTGGCTCCGGTGGCGGAGGTTCCGATATTCAGATGACCCAGAGTCCGAGCAGCCTGAGCGCAAGCGTTGGTGATCGTGTGACCATTACCTGTCGTGCAAGCCAGGATGTTAATACAGCAGTTGCATGGTATCAGCAGAAACCGGGTAAAGCACCGAAACTGCTGATTTATAGCGCAAGCTTTCTGTATAGCGGTGTTCCGAGCCGTTTTAGCGGTAGCCGTAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAAGATTTTGCAACCTATTATTGTCAGCAGCATTACACCACACCGCCTACCTTTGGCCAGGGCACCAAAGTTGAAATTAAAGGAGGTGGCGGTGGATCCGGCGGAGGTGGCGGAGCAGAAGCAGGTATTACCGGTACATGGTCAGATCAGCTGGGTGATACCTTTATTGTTACCGCAGGCGCAGATGGTGCACTGACCGGCACCTATGAAAATGCAGTTGGTGGTGCAGAAAGCCGTTATGTGCTGACCGGTCGTTATGATAGCGCACCGGCAACCGATGGTAGCGGCACCGCACTGGGTTGGACCGTTGCATGGAAAAATAACAGCAAAAATGCACATAGCGCAACCACCTGGTCAGGTCAGTATGTGGGTGGTGCCGATGCCAAAATTAACACCCAGTGGCTGCTGACCAGCGGTACAACCAATGCAAATGCCTGGAAAAGTACCCTGGTTGGTCATGATACATTCACCAAAGTTAAACCGAGCGCAGCAAGCCATCATCATCACCATCATTAA 
【図１】
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【図２】
2019230905.tif 000049
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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