(57)【要約】  新規な筋修復促進用組成物を提供することを課題とする。  ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する菌の菌体及び／又はその培養物を有効成分とすることにより、筋修復促進作用を有する飲食品および飼料を提供することが可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する菌の菌体及び／又はその培養物を有効成分とする筋修復促進用組成物。
【請求項２】
ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する菌が、ラクトバチルス  ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス  デルブルッキー  サブスピーシーズ  デルブルッキー  （Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス  ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス  ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）から選択されるひとつ以上であることを特徴とする請求項１に記載の筋修復促進用組成物。
【請求項３】
ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する乳酸菌が、ラクトバチルス  ガセリＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５３）、ラクトバチルス  デルブルッキー  サブスピーシーズ  デルブルッキー  ＳＢＴ０４１３（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６４２）、ラクトバチルス  ロイテリ  ＳＢＴ１９２６（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６４３）、ラクトバチルス  ヘルベティカス  ＳＢＴ１１３８０（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６４４）から選択されるひとつ以上であることを特徴とする請求項１に記載の筋修復促進用組成物。
【請求項４】
前記菌体及び／又はその培養物が、死菌体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の筋修復促進用組成物。
【請求項５】
前記死菌体が、菌体破砕物の不溶性画分である、請求項４に記載の筋修復促進用組成物。
【請求項６】
新規乳酸菌ラクトバチルス  デルブルッキー  サブスピーシーズ  デルブルッキー  ＳＢＴ０４１３。
【請求項７】
新規乳酸菌ラクトバチルス  ロイテリ  ＳＢＴ１９２６。
【請求項８】
新規乳酸菌ラクトバチルス  ヘルベティカス  ＳＢＴ１１３８０。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は筋修復促進用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨格筋はヒトの体重の４０％程度を占める最大の器官であり、その機能は全身運動以外にも姿勢の維持やエネルギー代謝、内臓器官の保護と多岐にわたる。【０００３】
骨格筋は修復機能を有しており、物理的、化学的な損傷を受けると、筋繊維周囲に位置する筋衛星細胞が働くことで損傷部位が修復される。筋衛星細胞は通常静止した状態であるが、骨格筋に損傷が起きると活性化し、筋芽細胞に分化する。筋芽細胞は増殖後、筋管に分化し、損傷部位に融合することで骨格筋が修復される。【０００４】
骨格筋の修復を促進する化合物として顆粒球コロニー刺激因子（特許文献１）やβ−ヒドロキシ−β−メチルブチレート（特許文献２）、レチノイン酸受容体γ（ＲＡＲγ）アゴニスト（特許文献３）が報告されている。【０００５】
乳酸菌は代謝の過程で乳酸を産生する細菌であり、古くから様々な発酵食品に利用されている。近年は、プロバイオティクス（生きて腸まで届くことで宿主に有益な効果をもたらす）として、乳酸菌の機能性が注目されている。【０００６】
これまでに、乳酸菌を有効成分とする筋修復促進用組成物はいずれの文献にも開示も示唆もされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開２０１０／１３１３８２号
【特許文献２】特表２０１６−５２００５０号
【特許文献３】特表２０１３−５３６８５５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、乳酸菌を有効成分とする新規の筋修復促進用組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討した結果、筋修復促進作用を有する乳酸菌を見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は乳酸菌を有効成分とする新規の筋修復促進用組成物を提供するものである。また、本発明は産業上利用可能な新規の乳酸菌株を提供するものである。
したがって、本発明は以下の構成を有する。
（１）ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する菌の菌体及び／又はその培養物を有効成分とする筋修復促進用組成物。
（２）ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する菌が、ラクトバチルス  ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス  デルブルッキー  サブスピーシーズ  デルブルッキー  （Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス  ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス  ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）から選択されるひとつ以上であることを特徴とする（１）に記載の筋修復促進用組成物。
（３）ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する乳酸菌が、ラクトバチルス  ガセリＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５３）、ラクトバチルス  デルブルッキー  サブスピーシーズ  デルブルッキー  ＳＢＴ０４１３（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６４２）、ラクトバチルス  ロイテリ  ＳＢＴ１９２６（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６４３）、ラクトバチルス  ヘルベティカス  ＳＢＴ１１３８０（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６４４）から選択されるひとつ以上であることを特徴とする（１）に記載の筋修復促進用組成物。
（４）前記菌体及び／又はその培養物が、死菌体である、（１）〜（３）のいずれか一項に記載の筋修復促進用組成物。
（５）前記死菌体が、菌体破砕物の不溶性画分である、（４）に記載の筋修復促進用組成物。
（６）新規乳酸菌ラクトバチルス  デルブルッキー  サブスピーシーズ  デルブルッキー  ＳＢＴ０４１３。
（７）新規乳酸菌ラクトバチルス  ロイテリ  ＳＢＴ１９２６。
（８）新規乳酸菌ラクトバチルス  ヘルベティカス  ＳＢＴ１１３８０。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する菌の菌体及び／又はその培養物を有効成分とする筋修復促進用組成物を提供することができる。また、本発明によれば、産業上利用可能な新規の乳酸菌株を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】筋損傷剤反応後（２４時間）のマウス筋芽細胞から筋損傷剤を除去し、様々な乳酸菌加熱菌体を添加して、４８時間培養後に筋芽細胞の増殖率を比較したグラフである。
【図２】筋損傷剤反応後（２４時間）のマウス筋芽細胞から筋損傷剤を除去し、乳酸菌加熱菌体（ラクトバチルス  ガセリ）を異なる濃度で添加して、４８時間培養後に筋芽細胞の増殖率を比較したグラフである。
【図３】筋損傷剤反応後（２４時間）のマウス筋芽細胞から筋損傷剤を除去し、乳酸菌加熱菌体（ラクトバチルス  ガセリ）の破砕物の画分を添加して、４８時間培養後に筋芽細胞の増殖率を比較したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌）
本発明のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌は、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に分類される乳酸菌であればどのようなものでも用いることができる。
具体的には、ラクトバチルス  ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス  デルブルッキー  サブスピーシーズ  デルブルッキー  （Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス  ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス  ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）等を例示できるが、これらに限定されるものではない。
本発明のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌は、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する乳酸菌が、ラクトバチルス  ガセリＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５３）、ラクトバチルス  デルブルッキー  サブスピーシーズ  デルブルッキー  ＳＢＴ０４１３（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６４２）、ラクトバチルス  ロイテリ  ＳＢＴ１９２６（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６４３）、ラクトバチルス  ヘルベティカス  ＳＢＴ１１３８０（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６４４）であることが好ましい。
（ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌の調製）
ラクトバチルス属に属する乳酸菌は、乳酸菌培養の常法に従って培養し、所望の量を調製すればよい。調製の一態様を以下に示す。ＭＲＳ（ＤＩＦＣＯ）培地を用いてラクトバチルス属に属する乳酸菌を培養し、得られた培養物を遠心分離により集菌することにより菌体を得る。得られた菌体をそのまま用いてもよいし、濃縮、乾燥、凍結乾燥処理に供した菌体を用いることもできる。菌体は加熱乾燥などにより死菌体にしたものを用いることもできる。
（ラクトバチルス属に属する乳酸菌の不溶性画分（沈渣））
本発明のラクトバチルス属に属する乳酸菌の不溶性画分（沈渣）の調製法の一態様を以下に示す。ラクトバチルス属の菌体の凍結乾燥末を緩衝液に懸濁し、８０℃、３０分間程度加熱して加熱菌体を得る。この加熱菌体をフレンチプレスにより破砕する。破砕液を遠心分離して上清を除き、ラクトバチルス属に属する乳酸菌の沈渣を得る。
本発明の筋修復促進用組成物では、有効成分は菌体破砕物の不溶性画分であることができ、詳細には菌体破砕物の緩衝液（例えば、リン酸緩衝液）への不溶性画分であることができる。菌体破砕物の可溶性画分を追加で含んでもよく、含まなくともよい。
（新規乳酸菌株）
本発明は、新規乳酸菌株に関するものである。これらの乳酸菌株とはラクトバチルスに属するラクトバチルス  デルブルッキー  サブスピーシーズ  デルブルッキー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）ＳＢＴ０４１３（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６４２）、ラクトバチルス  ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＳＢＴ１９２６（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６４３）、ラクトバチルス  ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＳＢＴ１１３８０（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６４４）である。以下、同乳酸菌株を「本発明の乳酸菌」、「本発明の乳酸菌株」、又は単にＳＢＴ０４１３、ＳＢＴ１９２６、ＳＢＴ１１３８０株と記載することがある。
これらの乳酸菌株は、２０１８年３月１５日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（郵便番号２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２２号室）に、ＳＢＴ０４１３はＮＩＴＥ  Ｐ−０２６４２、ＳＢＴ１９２６はＮＩＴＥ  Ｐ−０２６４３、ＳＢＴ１１３８０はＮＩＴＥ  Ｐ−０２６４４の受託番号で寄託されている。
本発明の乳酸菌は、上記乳酸菌株に制限されず、これらの寄託乳酸菌株と実質的に同等の乳酸菌株であってもよい。実質的に同等の乳酸菌株とは、ラクトバチルス  デルブルッキー  サブスピーシーズ  デルブルッキー、ラクトバチルス  ロイテリ、ラクトバチルス  ヘルベティカスに属する乳酸菌株であって、寄託乳酸菌株と同程度の高い筋修復促進作用を有する乳酸菌株を言う。
また、実質的に同等の乳酸菌株は、さらに、その１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、上記寄託乳酸菌株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列と９８％以上、好ましくは９９％以上、より好ましくは１００％の相同性を有し、且つ、好ましくは上記寄託乳酸菌株と同一の菌学的性質を有する。さらに、本発明の乳酸菌は、本発明の効果が損なわれない限り、寄託乳酸菌株、又はそれと実質的に同等の乳酸菌株から、変異処理、遺伝子組換え、自然変異株の選択等によって育種された乳酸菌株であってもよい。
（利用方法）
上記の通り、本発明の組成物は濃縮、乾燥、凍結乾燥処理に供した菌体、加熱乾燥などにより得られる死菌体も有効成分とすることができることから、製剤、飲食品、飼料の原料として広く用いることができる。  
本発明の組成物の投与対象は特に限定されず、ヒトに対して投与することができるが、投与対象はヒト以外の動物（例えば、イヌ、ネコ、ウマ又はウサギ等）であっても良い。投与対象がヒトである場合は、２０歳未満の未成年、成人、又は６５歳以上の高齢者などに投与することができる。
本発明の組成物の摂取量は、投与対象者の症状、年齢などを考慮してそれぞれ個別に決定されるが、通常成人の場合、０．５−５０００ｍｇであればよく、０．５−５００ｍｇが望ましく、０．５−５０ｍｇが最も望ましい。
（筋修復促進効果の評価方法）
実施例に記載の方法で評価が可能である。すなわち、以下の方法で評価が可能である。
１０ｍｇ/ｍｌラクトバチルス  ガセリＳＢＴ２０５５加熱菌体をフレンチプレス（Ａｍｉｎｃｏ）で１,２００ｐｓｉＧで３回破砕する。破砕後に、遠心分離（４℃、７０００ｒｐｍ、１５分間）をして上清と沈渣を得る。さらに、上清を０．２２μｍフィルターで濾過した。沈渣は除去した上清と等量のＰＢＳ（−）を添加して、ボルテックス後に遠心分離（４℃、７０００ｒｐｍ、１５分間）し、上清を除去する。これを３回繰り返し、上清と等量のＰＢＳ（−）を添加したものを沈渣として使用する。フレンチプレスに供した１０ｍｇ／ｍｌラクトバチルス  ガセリＳＢＴ２０５５加熱菌体から得られた破砕物上清と沈渣の濃度を、それぞれ１０ｍｇ／ｍｌ相当量とする。１００μｇ/ｍｌ相当量になるように１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）、１％ペニシリンーストレプトマイシン（ＳＩＧＭＡ）を含有したＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ）で希釈し、破砕物上清の懸濁液または沈渣の懸濁液を得る。Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞をコラーゲンコートした９６ｗｅｌｌプレートに５，０００ｃｅｌｌｓ/ｗｅｌｌずつ播種して、５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃、２４時間培養後に、０．５μＭブピバカイン塩酸塩（和光純薬）を２４時間反応させる。その後、ブピバカインを取り除き、未破砕の加熱菌体、破砕物上清、または破砕物沈渣を添加して筋芽細胞を４８時間培養する。培養後、滅菌ＰＢＳ（−）による洗浄を２回行ってから、ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ―８（同仁化学）を添加して３７℃、２時間反応させて４５０ｎｍの吸光度を測定する。得られた吸光度の値を（加熱菌体−ブランク）／（加熱菌体非添加−ブランク）×１００の計算式に当てはめて、増殖率を算出する。乳酸菌菌体による筋芽細胞の増殖促進効果は加熱菌体非添加と比べて、増殖率の増加が認められれば、損傷後の筋芽細胞の増殖を促進したと判断することができる。
【００１３】
以下、本発明の実施例をもとにさらに詳細に説明するが、本発明は係る実施例に限定して解釈されるものではない。なお、特に説明のない限り、本明細書において％は重量％を示す。
【実施例】
【００１４】
＜実施例品１＞乳酸菌加熱菌体
下記（１）の各供試菌をＭＲＳ培地（ＤＩＦＣＯ）に植菌し、３７℃にて１６時間静置培養を行った。培養物を、遠心分離（４℃、７０００ｒｐｍ、１５分間）した後、滅菌水による洗浄と遠心分離を３回繰り返して行い、洗浄菌体を得た。この洗浄菌体を凍結乾燥処理して菌体粉末を得た。菌体粉末を１０ｍｇ/ｍｌになるように滅菌ＰＢＳ（−）で希釈し、８０℃、３０分間加熱して加熱菌体を得た。加熱菌体は１００μｇ/ｍｌになるように１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（ＳＩＧＭＡ）を含有したＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ）で希釈した。
（１）供試菌
ラクトバチルス属の下記７株を供試菌とした。
ラクトバチルス  ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）ＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ  ＢＰ―１０９５３）、ラクトバチルス  デルブルッキー  サブスピーシーズ  ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）ＳＢＴ２１１５、ラクトバチルス  デルブルッキー  サブスピーシーズ  デルブルッキー  （Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）ＳＢＴ０４１３（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６４２）、ラクトバチルス  デルブルッキー  サブスピーシーズ  ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｌａｃｔｉｓ）ＳＢＴ２０８０、ラクトバチルス  ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＳＢＴ１９２６（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６４３）、ラクトバチルス  ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＳＢＴ１１３８０（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６４４）、ラクトバチルス  ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＳＢＴ２０３５
なお、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５３は、独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターに寄託されている。
＜試験例１＞筋修復を促進する乳酸菌のスクリーニング
実施例品１を以下の試験に供した。
（１）試験方法
Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞を１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（ＳＩＧＭＡ）を含有したＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ）で培養した。Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞をコラーゲンコートした９６ｗｅｌｌプレートに５，０００ｃｅｌｌｓ/ｗｅｌｌずつ播種して、５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃、２４時間培養後に、０．５μＭブピバカイン塩酸塩（和光純薬）を２４時間反応させた。
その後、ブピバカインを取り除き、各加熱菌体を添加して筋芽細胞を４８時間培養した。培養後、滅菌ＰＢＳ（−）による洗浄を２回行ってから、ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ―８（同仁化学）を添加して３７℃、２時間反応させて４５０ｎｍの吸光度を測定した。得られた吸光度の値を（加熱菌体添加−ブランク）／（加熱菌体非添加−ブランク）×１００の計算式に当てはめて、増殖率を算出した。乳酸菌菌体による筋芽細胞の増殖促進効果は加熱菌体非添加と比べて、増殖率の増加が認められれば、損傷後の筋芽細胞の増殖を促進したと判断することができる。【００１５】
（２）試験結果
乳酸菌株ごとの筋芽細胞の増殖率を図１に示した。吸光度を測定した結果、７菌株中４菌株の加熱菌体において、筋芽細胞の増殖率の増加が認められた。したがって、特定の株の乳酸菌加熱菌体に損傷後の筋芽細胞の増殖を促進する作用が認められた。【００１６】
＜試験例２＞ラクトバチルス  ガセリＳＢＴ２０５５加熱菌体の濃度依存的な効果
（乳酸菌菌体の調製）
実施例品１について、菌体の濃度依存的な筋修復促進効果を調べた。
（１）試験方法
１０ｍｇ/ｍｌラクトバチルス  ガセリＳＢＴ２０５５加熱菌体を１、１０、１００μｇ/ｍｌになるように１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）、１％ペニシリンーストレプトマイシン（ＳＩＧＭＡ）を含有したＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ）で希釈した。Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞をコラーゲンコートした９６ｗｅｌｌプレートに５，０００ｃｅｌｌｓ/ｗｅｌｌずつ播種して、５％ＣＯ２インキュベーターに３７℃、２４時間培養後に、０．５μＭブピバカイン塩酸塩（和光純薬）を２４時間反応させた。その後、ブピバカインを取り除き、各濃度加熱菌体を添加して筋芽細胞を４８時間培養した。培養後、滅菌ＰＢＳ（−）による洗浄を２回行ってから、ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ―８（同仁化学）を添加して３７℃、２時間反応させて４５０ｎｍの吸光度を測定した。得られた吸光度の値を（加熱菌体−ブランク）／（加熱菌体非添加−ブランク）×１００の計算式に当てはめて、増殖率を算出した。乳酸菌菌体による筋芽細胞の増殖促進効果は加熱菌体非添加と比べて、増殖率の増加が認められれば、損傷後の筋芽細胞の増殖を促進したと判断することができる。【００１７】
（２）試験結果
ラクトバチルス  ガセリＳＢＴ２０５５加熱菌体濃度ごとの筋芽細胞の増殖率を図２に示した。吸光度を測定した結果、ラクトバチルス  ガセリＳＢＴ２０５５加熱菌体の濃度依存的に、筋芽細胞の増殖率の増加が認められた。したがって、損傷後の筋芽細胞の増殖を促進する作用にはラクトバチルス  ガセリＳＢＴ２０５５加熱菌体の濃度依存性が認められた。【００１８】
＜試験例３＞ ラクトバチルス  ガセリＳＢＴ２０５５加熱菌体の有効成分の探索
（乳酸菌菌体の調製）
実施例品１について、菌体破砕物の可溶性画分（上清）と不溶性画分（沈渣）の筋修復促進効果を調べた。
（１）試験方法
１０ｍｇ/ｍｌラクトバチルス  ガセリＳＢＴ２０５５加熱菌体をフレンチプレス（Ａｍｉｎｃｏ）で１,２００ｐｓｉＧで３回破砕した。破砕後に、遠心分離（４℃、７０００ｒｐｍ、１５分間）をして上清と沈渣を得た。さらに、上清は０．２２μｍフィルターで濾過した。沈渣は除去した上清と等量のＰＢＳ（−）を添加して、ボルテックス後に遠心分離（４℃、７０００ｒｐｍ、１５分間）し、上清を除去した。これを３回繰り返し、上清と等量のＰＢＳ（−）を添加したものを沈渣として使用した。フレンチプレスに供した１０ｍｇ／ｍｌラクトバチルス  ガセリＳＢＴ２０５５加熱菌体から得られた破砕物上清と沈渣の濃度を、それぞれ１０ｍｇ／ｍｌ相当量とした。１００μｇ/ｍｌ相当量になるように１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）、１％ペニシリンーストレプトマイシン（ＳＩＧＭＡ）を含有したＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ）で希釈し、破砕物上清の懸濁液または沈渣の懸濁液を得た。Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞をコラーゲンコートした９６ｗｅｌｌプレートに５，０００ｃｅｌｌｓ/ｗｅｌｌずつ播種して、５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃、２４時間培養後に、０．５μＭブピバカイン塩酸塩（和光純薬）を２４時間反応させた。その後、ブピバカインを取り除き、未破砕の加熱菌体、破砕物上清、または破砕物沈渣を添加して筋芽細胞を４８時間培養した。培養後、滅菌ＰＢＳ（−）による洗浄を２回行ってから、ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ―８（同仁化学）を添加して３７℃、２時間反応させて４５０ｎｍの吸光度を測定した。得られた吸光度の値を（加熱菌体−ブランク）／（加熱菌体非添加−ブランク）×１００の計算式に当てはめて、増殖率を算出した。乳酸菌菌体による筋芽細胞の増殖促進効果は加熱菌体非添加と比べて、増殖率の増加が認められれば、損傷後の筋芽細胞の増殖を促進したと判断することができる。【００１９】
（２）試験結果
画分ごとの筋芽細胞の増殖率を図３に示した。吸光度を測定した結果、ラクトバチルス  ガセリＳＢＴ２０５５加熱菌体の破砕物沈渣が未破砕の菌体と同様に、筋芽細胞の増殖率を増加させた。したがって、ラクトバチルス  ガセリＳＢＴ２０５５加熱菌体の不溶性画分に、損傷後の筋芽細胞の増殖を促進する効果が認められた。【００２０】
＜実施例品２＞乳酸菌培養物の調製
ラクトバチルス  ガセリＳＢＴ２０５５をＭＲＳ液体培地（ＤＩＦＣＯ）にて培養した。対数増殖期にある各培養液を、０．３％の酵母エキスを添加した１０％還元脱脂乳（１１５℃、２０分滅菌）に１％接種し、各々マザーカルチャーを作製した。これに１０％の還元脱脂乳を添加して、１００℃にて１０分間加熱したヨーグルトミックスに２．５％添加して調製した。３７℃で発酵を行い、乳酸酸度０．８５に到達した時点で冷却し、発酵を終了させた。得られた発酵乳を凍結乾燥してラクトバチルス  ガセリＳＢＴ２０５５菌体培養物の粉末を得た。得られた菌体培養物をリン酸緩衝液に再懸濁し、１×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整した。【００２１】
＜実施例品３＞乳酸菌菌体の調製
ラクトバチルス  ガセリＳＢＴ２０５５をＭＲＳ液体培地（ＤＩＦＣＯ）に植菌し、３７℃にて１６時間静置培養を行った。培養物を、４℃、７０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後、滅菌水による洗浄と遠心分離を３回繰り返して行い、洗浄菌体を得た。この洗浄菌体を凍結乾燥処理して菌体粉末を得た。【００２２】
＜実施例品４＞錠剤の製造
実施例品３にて調製した菌体粉末１部に脱脂粉乳４部を混合し、この混合粉末を打錠機により１ｇずつ常法により打錠して、本発明のラクトバチルス  ガセリＳＢＴ２０５５の菌体２００ｍｇを含む錠剤をそれぞれ調製した。【００２３】
＜実施例品５＞散剤の製造
ラクトバチルス  ガセリＳＢＴ２０５５をＭＲＳ液体培地（ＤＩＦＣＯ）５Ｌに摂取後、３７℃、１８時間静置培養を行った。培養終了後、７０００ｒｐｍで１５分間遠心分離を行い、培養液の１／５０量の濃縮菌体を得た。次いで、この濃縮菌体を、脱脂粉乳１０重量％、グルタミン酸ソーダ１重量％を含む分散媒と同量混合し、ｐＨ７に調整後、凍結乾燥を行った。得られた凍結乾燥物を６０メッシュのふるいで整粒化し、凍結乾燥菌末を製造した。第１３改正日本薬局方解説書製剤総則「散剤」の規定に準拠し、この凍結乾燥菌末１ｇにラクトース（日局）４００ｇ、バレイショデンプン（日局）６００ｇを加えて均一に混合し、散剤を得た。【００２４】
＜実施例品６＞カプセル剤の製造
表１に示した配合により原料を混合し、造粒により顆粒状とした後、空カプセルに１０ｍｇずつ充填して、カプセル剤を製造した。【００２５】
【表１】
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【００２６】
＜実施例品７＞スティック状健康食品の製造
実施例品１の粉末３０ｇに、ビタミンＣとクエン酸の等量混合物４０ｇ、グラニュー糖１００ｇ、コーンスターチと乳糖の等量混合物６０ｇを加えて混合した。混合物をスティック状袋に詰め、スティック健康食品を製造した。【００２７】
＜実施例品８＞飲料の製造
表２に示した配合により原料を混合し、容器に充填した後、加熱殺菌して、果汁飲料を製造した。
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明によれば、ラクトバチルスに属する乳酸菌菌体及び／又は乳酸菌培養物を有効成分とする筋修復促進剤を提供することができる。
【受託番号】
【００２９】
＜寄託生物材料への言及＞
（１）ラクトバチルス  ガセリＳＢＴ２０５５
イ  当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人  製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター
日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２０号室（郵便番号２９２−０８１８）
ロ  イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
１９９６年３月２７日
２００８年２月２６日（原寄託によりブダペスト条約に基づく寄託への移管日）
ハ  イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５３
（２）ラクトバチルス  デルブルッキー  サブスピーシーズ  デルブルッキーＳＢＴ０４１３
イ  当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人  製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター
日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室（郵便番号２９２−０８１８）
ロ  イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
２０１８年２月２１日
ハ  イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６４２（なお、原寄託日後、原寄託に基づくブダペスト条約に基づく寄託への移管申請を２０１９年５月２７日に行い、生存確認試験の完了後に、受領番号を通知する書面を受領した。受領番号は、ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２６４２である。）
（３）ラクトバチルス  ロイテリＳＢＴ１９２６
イ  当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人  製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター
日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室（郵便番号２９２−０８１８）
ロ  イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
２０１８年２月２１日
ハ  イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６４３（なお、原寄託日後、原寄託に基づくブダペスト条約に基づく寄託への移管申請を２０１９年５月２７日に行い、生存確認試験の完了後に、受領番号を通知する書面を受領した。受領番号は、ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２６４３である。）
（４）ラクトバチルス  ヘルベティカスＳＢＴ１１３８０
イ  当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人  製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター
日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室（郵便番号２９２−０８１８）
ロ  イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
２０１８年２月２１日
ハ  イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６４４（なお、原寄託日後、原寄託に基づくブダペスト条約に基づく寄託への移管申請を２０１９年５月２７日に行い、生存確認試験の完了後に、受領番号を通知する書面を受領した。受領番号は、ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２６４４である。）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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