(57)【要約】【解決課題】  ＴＩＣＴ状態を生成する新たな無蛍光性ローダミン色素を提供すること。【解決手段】    以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。2019168198.tif 000048
2019168198.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。
2019168198.tif 000047
（式中、
Ｒ１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する１ないし３個の同一又は異なる一価の置換基を示し：
Ｒ２及びＲ３は、各々独立に、水素原子又はベンゼン環上に存在する一価の置換基を示し；
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、水素原子、置換又は無置換の炭素数１〜６個のアルキル基、カルボキシル基、エステル基、アミド基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子、置換又は無置換の炭素数１〜６個のアルキル基、カルボキシル基、エステル基、アミド基又はハロゲン原子を示し；
ただし、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７のうちいずれか１以上は水素原子以外の置換基であり；
Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、水素原子、又は、置換又は無置換の炭素数１〜１４個のアルキル基を示し、
Ｒ８及びＲ９は一緒になってＲ８及びＲ９が結合している窒素原子を含む４〜７員のヘテロシクリルを形成してもよく；
Ｘは、酸素原子、Ｓｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｇｅ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｐ（＝Ｏ）Ｒｃ、ＳＯ２又はＳｅから選択され、
ここで、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に、炭素数１〜６個のアルキル基又は置換されていてもよいアリール基であり、Ｒｃは、炭素数１〜６個のアルキル基又は置換されていてもよいフェニル基であり；
Ｙは、−ＮＲ１０Ｒ１１又は−ＯＨであり、
ここで、Ｒ１０及びＲ１１は、それぞれ独立に、水素原子、又は、置換又は無置換の炭素数１〜１４個のアルキル基を示し、
Ｒ１０及びＲ１１は一緒になってＲ１０及びＲ１１が結合している窒素原子を含む４〜７員のヘテロシクリルを形成してもよく；
（ｉ）Ｙが−ＮＲ１０Ｒ１１の場合は、
Ｒ８とＲ９の組、Ｒ１０とＲ１１の組のいずれか１以上の組において、当該組を構成する２つの基がいずれも水素原子以外の置換基であり、
ここで、
（ａ）Ｒ８とＲ９の組を構成する２つの基がいずれも水素原子以外の置換基であり、Ｒ１０とＲ１１の組を構成する少なくとも１つの基が水素原子である場合は、Ｒ４、Ｒ６のいずれか１以上は水素原子以外の置換基であり、
（ｂ）Ｒ１０とＲ１１の組を構成する２つの基がいずれも水素原子以外の置換基であり、Ｒ８とＲ９の組を構成する少なくとも１つの基が水素原子である場合は、Ｒ５、Ｒ７のいずれか１以上は水素原子以外の置換基であり、
（ｃ）Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１のいずれも水素原子以外の置換基である場合は、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７のうちいずれか１以上は水素原子以外の置換基であり；
（２）Ｙが−ＯＨの場合は、
Ｒ８及びＲ９のいずれもが水素原子以外の置換基であり、かつ、Ｒ４、Ｒ６のいずれか１以上は置換又は無置換の炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子である。）
【請求項２】
Ｙが−ＮＲ１０Ｒ１１である、請求項１に記載の化合物又はその塩。
【請求項３】
Ｒ８とＲ９、Ｒ１０とＲ１１のいずれかの組において、当該組を構成する２つの基がいずれも水素原子以外の置換基である、請求項２に記載の化合物又はその塩。
【請求項４】
Ｒ８とＲ９、Ｒ１０とＲ１１の両方の組において、当該組を構成する２つの基がいずれも水素原子以外の置換基である、請求項２に記載の化合物又はその塩。
【請求項５】
Ｒ４とＲ５のうちいずれか１以上は水素原子以外の置換基であり、Ｒ６とＲ７のうちいずれか１以上は水素原子以外の置換基である、請求項４に記載の化合物又はその塩。
【請求項６】
Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１は、同一又は異なる、置換又は無置換の炭素数１〜６個のアルキル基であって、Ｒ４及びＲ６のうちいずれか１以上、及び／又は、Ｒ５及びＲ７のうちいずれか１以上は、水素原子以外の置換基であり、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１のアルキル基の少なくとも１つが水酸基又はアルコキシ基で置換されているアルキル基である、請求項２〜５のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
【請求項７】
Ｒ８とＲ９、Ｒ１０とＲ１１のいずれかの組において、いずれもが同一又は異なる置換又は無置換の炭素数１〜１４個のアルキル基であり、当該アルキル基の少なくとも１つが水酸基又はアルコキシ基で置換されているアルキル基である、［３］に記載の化合物又はその塩。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含むＰ４５０活性検出用蛍光プローブ。
【請求項９】
細胞内のＰ４５０を検出する方法であって、（ａ）請求項８に記載の蛍光プローブを細胞内に導入する工程、及び（ｂ）当該蛍光プローブが細胞内で発する蛍光を測定する工程、を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の無蛍光性ローダミン類に関わり、より詳しくはＴＩＣＴ機構に基づく新規無蛍光性ローダミン類に関わる。
【背景技術】
【０００２】
ローダミン類は、キサンテン環の３、６位に窒素原子が結合した色素の総称であり、高い蛍光量子収率、強い光退色耐性とともに水溶性を併せ持つ色素として蛍光イメージングにおいて汎用されてきた(図１)。
一方で、ローダミン類の一部には何らかの消光メカニズムによって無蛍光性を示すものが存在する。このような「無蛍光性ローダミン類」は、ＦＲＥＴのアクセプターとしてドナー分子の蛍光を消光させるクエンチャーとして利用されているだけでなく、その無蛍光性のメカニズムを解明し、特定の生命現象をスイッチに無蛍光性を解除する適切な分子設計を行うことで、新たな蛍光制御原理に基づく蛍光プローブの開発が可能となる。【０００３】
代表的な無蛍光性ローダミンであるＱＳＹ類は、ローダミンのキサンテン環上のＮ原子に芳香環が結合した色素である（以下「Ｎ−フェニルローダミン類」とも言う）。このＮ−フェニルローダミン類がなぜ無蛍光性となるのか、という理由についての詳細な解析はこれまで行われてこなかったが、本発明者らの先行研究により、この消光が励起状態におけるＴＩＣＴ（Ｔｗｉｓｔｅｄ  ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒｇｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）状態の生成によって起こることが示唆された（図２（ａ）参照）。ＴＩＣＴとは、励起状態において分子内の電荷の偏り（ＩＣＴ）が起こると同時に分子構造のねじれが生じる現象である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】The Molecular Probes Handbook.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、Ｎ−フェニルローダミン類のようなアリール基をキサンテン環上Ｎ原子に結合させるというアプローチとは異なる方法で、同様のＴＩＣＴ状態を生成する新たな無蛍光性ローダミン色素を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前述したように、Ｎ−フェニルローダミン類は励起状態においてキサンテン環−Ｎ原子間結合が約９０°ねじれるＴＩＣＴ状態を形成することで無蛍光性となることが示唆されている。本発明者らは、このねじれを伴う消光機構に着目し、Ｎ原子へのアリール基の導入とは異なるアプローチでの無蛍光性化が可能なのではないかと考えた。
具体的には、強蛍光性を示す一般的なローダミンであるテトラメチルローダミン（ＴＭＲ）（図２（ｂ））のキサンテン環上ジメチルアミノ基のオルト位に立体障害を引き起こすような置換基を導入し、基底状態である程度のねじれを与えることで、励起状態でのＴＩＣＴ状態の形成が促進され、無蛍光性を示すのではないかと考え、計算化学的手法を用いた検討を行ったところ、分子設計した種々の化合物がＴＩＣＴ状態に起因する無蛍光性を示す可能性が示唆された。この知見を基に、本発明者らは、キサンテン環上のアミノ基の置換基、及び当該置換基と立体障害を引き起こすことができるオルト位における置換基等について種々検討した結果、本発明を完成させるに至った。【０００７】
即ち、本発明は、
［１］以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。
2019168198.tif 000003
（式中、
Ｒ１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する１ないし３個の同一又は異なる一価の置換基を示し：
Ｒ２及びＲ３は、各々独立に、水素原子又はベンゼン環上に存在する一価の置換基を示し；
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、水素原子、置換又は無置換の炭素数１〜６個のアルキル基、カルボキシル基、エステル基、アミド基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子、置換又は無置換の炭素数１〜６個のアルキル基、カルボキシル基、エステル基、アミド基又はハロゲン原子を示し；
ただし、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７のうちいずれか１以上は水素原子以外の置換基であり；
Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、水素原子、又は、置換又は無置換の炭素数１〜１４個のアルキル基を示し、
Ｒ８及びＲ９は一緒になってＲ８及びＲ９が結合している窒素原子を含む４〜７員のヘテロシクリルを形成してもよく；
Ｘは、酸素原子、Ｓｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｇｅ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｐ（＝Ｏ）Ｒｃ、ＳＯ２又はＳｅから選択され、
ここで、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に、炭素数１〜６個のアルキル基又は置換されていてもよいアリール基であり、Ｒｃは、炭素数１〜６個のアルキル基又は置換されていてもよいフェニル基であり；
Ｙは、−ＮＲ１０Ｒ１１又は−ＯＨであり、
ここで、Ｒ１０及びＲ１１は、それぞれ独立に、水素原子、又は、置換又は無置換の炭素数１〜１４個のアルキル基を示し、
Ｒ１０及びＲ１１は一緒になってＲ１０及びＲ１１が結合している窒素原子を含む４〜７員のヘテロシクリルを形成してもよく；
（ｉ）Ｙが−ＮＲ１０Ｒ１１の場合は、
Ｒ８とＲ９の組、Ｒ１０とＲ１１の組のいずれか１以上の組において、当該組を構成する２つの基がいずれも水素原子以外の置換基であり、
ここで、
（ａ）Ｒ８とＲ９の組を構成する２つの基がいずれも水素原子以外の置換基であり、Ｒ１０とＲ１１の組を構成する少なくとも１つの基が水素原子である場合は、Ｒ４、Ｒ６のいずれか１以上は水素原子以外の置換基であり、
（ｂ）Ｒ１０とＲ１１の組を構成する２つの基がいずれも水素原子以外の置換基であり、Ｒ８とＲ９の組を構成する少なくとも１つの基が水素原子である場合は、Ｒ５、Ｒ７のいずれか１以上は水素原子以外の置換基であり、
（ｃ）Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１のいずれも水素原子以外の置換基である場合は、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７のうちいずれか１以上は水素原子以外の置換基であり；
（２）Ｙが−ＯＨの場合は、
Ｒ８及びＲ９のいずれもが水素原子以外の置換基であり、かつ、Ｒ４、Ｒ６のいずれか１以上は置換又は無置換の炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子である。）
［２］Ｙが−ＮＲ１０Ｒ１１である、［１］に記載の化合物又はその塩。
［３］Ｒ８とＲ９、Ｒ１０とＲ１１のいずれかの組において、いずれもが水素原子以外の置換基である、［２］に記載の化合物又はその塩。
［４］Ｒ８とＲ９、Ｒ１０とＲ１１の両方の組において、いずれもが水素原子以外の置換基である、［２］に記載の化合物又はその塩。
［５］Ｒ４とＲ５のうちいずれか１以上は水素原子以外の置換基であり、Ｒ６とＲ７のうちいずれか１以上は水素原子以外の置換基である、［４］に記載の化合物又はその塩。
［６］Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１は、同一又は異なる、置換又は無置換の炭素数１〜６個のアルキル基であって、Ｒ４及びＲ６のうちいずれか１以上、及び／又は、Ｒ５及びＲ７のうちいずれか１以上は、水素原子以外の置換基であり、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１のアルキル基の少なくとも１つが水酸基又はアルコキシ基で置換されているアルキル基である、［２］〜［５］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
［７］Ｒ８とＲ９、Ｒ１０とＲ１１のいずれかの組において、いずれもが同一又は異なる置換又は無置換の炭素数１〜６個のアルキル基であり、当該アルキル基の少なくとも１つが水酸基又はアルコキシ基で置換されているアルキル基である、［３］に記載の化合物又はその塩。
［８］［１］〜［７］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含むＰ４５０活性検出用蛍光プローブ。
［９］細胞内のＰ４５０を検出する方法であって、（ａ）［８］に記載の蛍光プローブを細胞内に導入する工程、及び（ｂ）当該蛍光プローブが細胞内で発する蛍光を測定する工程、を含む方法。
を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、ＴＩＣＴ状態を生成する新たな無蛍光性ローダミン色素を提供することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】種々のローダミン色素の化学構造
【図２】本発明の研究の概念図
【図３】Ｂ３ＬＹＰ／６−３１Ｇ＊で計算したＴＭＲ、４−Ｃｌ  ＴＭＲ、４，５−ｄｉＣｌ  ＴＭＲのＳ０（ａ）及びＳ１（ｂ）状態の最適化構造を示す。
【図４】テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）、４−Ｃｌ  ＴＭＲ及び４，５−ｄｉＣｌ  ＴＭＲの化学構造と光学特性を示す。
【図５】４−Ｃｌ  ＴＭＲの各種溶媒中での光学特性を示す。
【図６】２−Ｃｌ  ＴＭＲ、２−Ｍｅ  ＴＭＲ及び２−Ｆ  ＴＭＲの化学構造及び光学特性を示す。
【図７】２−ＣｌトリＭｅローダミンの光学特性を示す。
【図８】Ｄａｂｃｙｌの化学構造と吸収スペクトルを示す。
【図９】ＢＨＱ１、ＢＨＱ２及びＢＨＱ３の化学構造と規格化吸収スペクトルを示す。
【図１０】ＱＳＹ７、ＱＳＹ９、ＱＳＹ２１及びＱＳＹ３５の化学構造とＱＳＹ３５、ＱＳＹ７、ＱＳＹ２１の規格化吸収スペクトルを示す。
【図１１】４−Ｃｌ  ＴＭＳｉＲ及び４，５−ｄｉＣｌ  ＴＭＳｉＲの化学構造と光学特性を示す。
【図１２】本発明におけるＰ４５０活性蛍光プローブの設計戦略を示す。
【図１３】１１種のＰ４５０サブタイプを用いたローダミン誘導体の時間依存性蛍光変化を示す。
【図１４】１１種のＰ４５０サブタイプを用いた化合物２３〜２６の時間依存性蛍光変化を示す。
【図１５】１１種のＰ４５０サブタイプを用いたローダミン誘導体の時間依存性蛍光変化を示す。
【図１６】化合物２９をＣＹＰ３Ａ４と反応させたときの、吸収、蛍光スペクトル変化を示す。
【図１７】ヒト肝ミクロソームとＮＡＤＰＨ生成系を用いた化合物２９の時間依存性蛍光変化を示す。
【図１８】化合物２９を用いた分化済みＨｅｐａＲＧの蛍光イメージング。
【図１９】図１８の実験において、各群からそれぞれ２０個の細胞を選び、それらの蛍光強度の分布を示した箱ひげ図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書において、「アルキル基」又はアルキル部分を含む置換基（例えばアルコキシ基など）のアルキル部分は、特に言及しない場合には例えば炭素数１〜１４個、好ましくは炭素数１〜１２個、更に好ましくは炭素数１〜６個程度の直鎖、分枝鎖、環状、又はそれらの組み合わせからなるアルキル基を意味している。炭素数を指定した場合は、その数の範囲の炭素数を有する「アルキル」を意味する。より具体的には、アルキル基として、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、シクロプロピルメチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基などを挙げることができる。
【００１１】
本明細書において「ハロゲン原子」という場合には、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれでもよく、好ましくはフッ素原子、塩素原子、又は臭素原子である。
【００１２】
１．一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩
本発明の１つの実施態様は、以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩である。
2019168198.tif 000004
【００１３】
一般式（Ｉ）において、Ｒ１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する１ないし３個の同一又は異なる一価の置換基を示す。
【００１４】
Ｒ１が示す一価の置換基の種類は特に限定されないが、例えば、炭素数１〜１４個（好ましくは、１〜１２個、更に好ましくは、１〜６個）のアルキル基、炭素数１〜６個のアルケニル基、炭素数１〜６個のアルキニル基、炭素数１〜１４個（好ましくは、１〜１２個、更に好ましくは、１〜６個）個のアルコキシ基、水酸基、カルボキシ基、スルホニル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、アミノ基、アミド基、アルキルアミド基からなる群から選ばれることが好ましい。
これらの一価の置換基は更に任意の置換基を１個又は２個以上有していてもよい。例えば、Ｒ１が示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ１が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基、又はアミノアルキル基などであってもよい。
【００１５】
また、例えばＲ１が示すアミノ基には１個又は２個のアルキル基が存在していてもよく、Ｒ１が示すアミノ基はモノアルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基であってもよい。更に、Ｒ１が示すアルコキシ基が置換基を有する場合としては、例えば、カルボキシ置換アルコキシ基又はアルコキシカルボニル置換アルコキシ基などが挙げられ、より具体的には４−カルボキシブトキシ基又は４−アセトキシメチルオキシカルボニルブトキシ基などを挙げることができる。
また、例えばＲ１が示すアミド基、アルキルアミド基、スルホニル基、アルコキシカルボニル基には１個又は２個のアルキル基が存在していてもよい。
【００１６】
本発明の１つの好ましい側面においては、Ｒ１は何れも水素原子である。
【００１７】
一般式（Ｉ）において、Ｒ２及びＲ３は、各々独立に、水素原子又はベンゼン環上に存在する一価の置換基を示す。
Ｒ２、Ｒ３の一価の置換基としては、好ましくは、炭素数１〜６個のアルキル基、炭素数１〜６個のアルコキシ基、カルボキシル基又はエステル基から選択される。
また、Ｒ２、Ｒ３がアルキル基を示す場合には、該アルキル基にはハロゲン原子、スルホニル基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよい。
【００１８】
一般式（Ｉ）において、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、水素原子、置換又は無置換の炭素数１〜６個のアルキル基、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、エステル基（ＣＯＯＲ）、アミド基（ＣＯＮＲ）又はハロゲン原子を示す（Ｒはアルキル基である）。
Ｒ４又はＲ５のアルキル基の置換基としては、ハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが挙げられ、これらは１個又は２個以上存在していてもよい。Ｒ４又はＲ５が示す置換アルキル基には、例えば、ハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などが挙げられる。
【００１９】
一般式（Ｉ）において、Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子、置換又は無置換の炭素数１〜６個のアルキル基、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、エステル基（ＣＯＯＲ）、アミド基（ＣＯＮＲ）又はハロゲン原子を示す（Ｒはアルキル基である）。Ｒ６及びＲ７の詳細については、Ｒ４及びＲ５について説明したものと同様である。
【００２０】
本発明においては、一般式（Ｉ）におけるＲ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７のうちいずれか１以上は水素原子以外の置換基であることが重要である。
理論に拘束されることを意図するものではないが、本発明においては、キサンテン環上のアミノ基の置換基と立体障害を引き起こすことができる置換基を当該アミノ基に対してオルト位に導入することにより、基底状態である程度のねじれを与えることで、励起状態でのＴＩＣＴ状態の形成が促進され、式（Ｉ）の化合物は無蛍光性を示すものと考えられる。立体障害を引き起こすことができる置換基としては、置換又は無置換の炭素数１〜６個のアルキル基、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、エステル基（ＣＯＯＲ）、アミド基（ＣＯＮＲ）又はハロゲン原子である（Ｒはアルキル基である）。好ましくは、置換又は無置換の炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子であり、より好ましくは、メチル基、エチル基、ｉ−プロピル基、三フッ化メチル基、塩素原子、フルオロ基等が挙げられる。
【００２１】
一般式（Ｉ）において、Ｘは、酸素原子、Ｓｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｇｅ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｐ（＝Ｏ）Ｒｃ、ＳＯ２又はＳｅから選択される。
本発明の１つの好ましい側面においては、Ｘは、酸素原子又はＳｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）である。
【００２２】
Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に、炭素数１〜６個のアルキル基又は置換されていてもよいアリール基である。Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に、炭素数１〜３個のアルキル基であることが好ましく、Ｒａ及びＲｂがともにメチル基であることがより好ましい。
Ｒａ及びＲｂが示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲａ及びＲｂが示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。
Ｒａ及びＲｂがアリール基を示す場合には、アリール基は単環の芳香族基又は縮合芳香族基のいずれであってもよく、アリール環は１個又は２個以上の環構成ヘテロ原子（例えば窒素原子、酸素原子、又は硫黄原子など）を含んでいてもよい。アリール基としてはフェニル基が好ましい。アリール環上には１個又は２個以上の置換基が存在していてもよい。置換基としては、例えばハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよい。
【００２３】
Ｒｃは、炭素数１〜６個のアルキル基又は置換されていてもよいフェニル基である。フェニル基の置換基としては、メチル基、ヒドロキシ基、メトキシ基などが挙げられる。
合成上の導入のし易さの点から、Ｒｃは、好ましくはメチル基又はフェニル基である。また、Ｒｃがメチル基である方が水溶性は高いため、より好ましい。
【００２４】
Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、水素原子、又は、置換又は無置換の炭素数１〜１４個、好ましくは、１〜１２個、更に好ましくは、１〜６個のアルキル基を示す。
アルキル基の置換基としては、ハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが挙げられる。
また、Ｒ８及びＲ９は一緒になってＲ８及びＲ９が結合している窒素原子を含む４〜７員（好ましくは５員）のヘテロシクリルを形成してもよい。
【００２５】
一般式（Ｉ）においてＹは、−ＮＲ１０Ｒ１１又は−ＯＨである。
【００２６】
Ｙが−ＮＲ１０Ｒ１１である場合は、一般式（Ｉ）の化合物は以下の式で表すことができる。
2019168198.tif 000005
【００２７】
一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）において、Ｒ１０及びＲ１１は、それぞれ独立に、水素原子、又は、置換又は無置換の炭素数１〜１４個、好ましくは１〜１２個、更に好ましくは１〜６個のアルキル基を示す。
アルキル基の置換基としては、ハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが挙げられる。
また、Ｒ１０及びＲ１１は一緒になってＲ１０及びＲ１１が結合している窒素原子を含む４〜７員（好ましくは５員）のヘテロシクリルを形成してもよい。
【００２８】
一般式（Ｉ）においてＹが−ＮＲ１０Ｒ１１の場合は、Ｒ８とＲ９の組、Ｒ１０とＲ１１の組のいずれか１以上の組において、当該組を構成する２つの基がいずれも水素原子以外の置換基である。
ここで、（ａ）Ｒ８とＲ９の組を構成する２つの基がいずれも水素原子以外の置換基であり、Ｒ１０とＲ１１の組を構成する少なくとも１つの基が水素原子である場合は、Ｒ４、Ｒ６のいずれか１以上は水素原子以外の置換基である。
また、（ｂ）Ｒ１０とＲ１１の組を構成する２つの基がいずれも水素原子以外の置換基であり、Ｒ８とＲ９の組を構成する少なくとも１つの基が水素原子である場合は、Ｒ５、Ｒ７のいずれか１以上は水素原子以外の置換基である。
また、（ｃ）Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１のいずれも水素原子以外の置換基である場合は、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７のうちいずれか１以上は水素原子以外の置換基である。
【００２９】
本発明においては、一般式（Ｉ）においてＹが−ＮＲ１０Ｒ１１の場合は、キサンテン環上のアミノ基の置換基であるＲ８とＲ９、Ｒ１０とＲ１１の少なくとも１つの組が、それらのオルト位の置換基と立体障害を引き起こすように分子設計をすることが重要である。このように分子設計を行うことにより、基底状態である程度のねじれを与えることで、励起状態でのＴＩＣＴ状態の形成が促進され、式（Ｉ）の化合物は無蛍光性を示すものと考えられる。
【００３０】
本発明の１つの好ましい実施態様は、一般式（Ｉ）において、Ｒ８とＲ９、Ｒ１０とＲ１１の両方の組において、これらの組を構成するいずれの基も水素原子以外の置換基であり、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７のうちいずれか１以上は水素原子以外の置換基である。
【００３１】
また、本発明のもう１つの好ましい実施態様は、一般式（Ｉ）において、Ｒ８とＲ９、Ｒ１０とＲ１１の両方の組において、これらの組を構成するいずれの基も水素原子以外の置換基であり、Ｒ４とＲ５のうちいずれか１以上は水素原子以外の置換基であり、Ｒ６とＲ７のうちいずれか１以上は水素原子以外の置換基である。
この実施態様では、キサンテン環上の両方のアミノ基において、アミノ基の置換基と各アミノ基に対してオルト位にある置換基との間で立体障害が引き起こされ、無蛍光性のレベルが非常に高くなり、優れた消光団として用いることができる。
【００３２】
本発明のもう１つの好ましい実施態様は、一般式（Ｉ）において、Ｒ８とＲ９、Ｒ１０とＲ１１のいずれかの組において、当該組を構成するいずれの基（即ち、Ｒ８及びＲ９、又は、Ｒ１０及びＲ１１）も水素原子以外の置換基である。この場合、（ａ）Ｒ８とＲ９の組を構成する２つの基がいずれも水素原子以外の置換基である場合は、Ｒ４、Ｒ６のいずれか１以上は水素原子以外の置換基であり、また、Ｒ１０とＲ１１の組を構成する２つの基がいずれも水素原子以外の置換基である場合は、Ｒ５、Ｒ７のいずれか１以上は水素原子以外の置換基である。
この実施態様では、キサンテン環上の一方のアミノ基において、アミノ基の置換基と当該アミノ基に対してオルト位にある置換基との間で立体障害が引き起こされる。
このような実施態様は、高い無蛍光性のレベルを有し、また、例えば、Ｐ４５０を作用させてそのＮ−脱アルキル活性によってアミノ基上のアルキル基が外れることによって立体障害の緩和が起こり、蛍光性を回復させるような場合は、反応点が１点であることからＰ４５０の検出に有効に用いることができる。
【００３３】
本発明の１つの好ましい側面においては、一般式（Ｉ）において、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１は、同一又は異なる、置換又は無置換の炭素数１〜６個のアルキル基であり、Ｒ４及びＲ６のうちいずれか１以上、及び／又は、Ｒ５及びＲ７のうちいずれか１以上は、水素原子以外の置換基、即ち、置換又は無置換の炭素数１〜６個のアルキル基、ハロゲン原子、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、エステル基（ＣＯＯＲ）、アミド基（ＣＯＮＲ）又はハロゲン原子であり（Ｒはアルキル基である）、好ましくは、置換又は無置換の炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子であり、更に好ましくは、メチル基、エチル基、ｉ−プロピル基、三フッ化メチル基、塩素原子、フッ素原子等である。
ここで、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１の置換又は無置換のアルキル基としては、好ましくは、メチル基、エチル基、プロピル基である。
また、Ｒ８及びＲ９、及び／又は、Ｒ１０及びＲ１１は、一緒になってＲ８及びＲ９、又は、Ｒ１０及びＲ１１が結合している窒素原子を含む４〜７員（好ましくは５員）のヘテロシクリルを形成してもよい。
【００３４】
本発明のもう１つの好ましい側面においては、一般式（Ｉ）においてＹが−ＮＲ１０Ｒ１１であり、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１は、同一又は異なる、置換又は無置換の炭素数１〜６個のアルキル基であって、Ｒ４及びＲ６のうちいずれか１以上、及び／又は、Ｒ５及びＲ７のうちいずれか１以上は、水素原子以外の置換基であり、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１のアルキル基の少なくとも１つが水酸基で置換されているアルキル基である。
この場合、水酸基で置換されているアルキル基が結合しているキサンテン環上のアミノ基に対してオルト位にある置換基（即ち、Ｒ８及び／又はＲ９が水酸基で置換されているアルキル基である場合はＲ４、Ｒ６を、Ｒ１０及び／又はＲ１１が水酸基で置換されているアルキル基である場合はＲ５、Ｒ７を意味する）の少なくとも１つは水素原子以外の置換基であることが好ましい。水素原子以外の置換基は、上記と同様に、置換又は無置換の炭素数１〜６個のアルキル基、ハロゲン原子、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、エステル基（ＣＯＯＲ）、アミド基（ＣＯＮＲ）又はハロゲン原子であり（Ｒはアルキル基である）、好ましくは、置換又は無置換の炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子であり、更に好ましくは、メチル基、エチル基、ｉ−プロピル基、三フッ化メチル基、塩素原子、フッ素原子等である。
水酸基で置換されているアルキル基としては、例えば、ヒドロキシエチル基等が挙げられるが、これらに限定されない。
また、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１のうち、水酸基で置換されているアルキル基以外のアルキル基は無置換であっても置換されていてもよい。無置換のアルキル基としては、好ましくは、メチル基、エチル基、プロピル基である。
Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１のアルキル基の少なくとも１つが水酸基で置換されているアルキル基である場合は、本発明の化合物の構造の他の部分（オルト位の置換基や、キサンテン骨格に結合したベンゼン環の置換基等）の組み合わせによって、無蛍光性ローダミンが、主要なＰ４５０分子種の中でもＣＹＰ３Ａに対して選択性を示す場合があり、好ましい。
【００３５】
本発明のもう１つの好ましい側面においては、一般式（Ｉ）においてＹが−ＮＲ１０Ｒ１１であり、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１は、同一又は異なる、置換又は無置換の炭素数１〜６個のアルキル基であって、Ｒ４及びＲ６のうちいずれか１以上、及び／又は、Ｒ５及びＲ７のうちいずれか１以上は、水素原子以外の置換基であり、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１のアルキル基の少なくとも１つがアルコキシ基で置換されているアルキル基（アルコキシアルキル基）である。
この場合、アルコキシ基で置換されているアルキル基が結合しているキサンテン環上のアミノ基に対してオルト位にある置換基（即ち、Ｒ８及び／又はＲ９がアルコキシ基で置換されているアルキル基である場合はＲ４、Ｒ６を、Ｒ１０及び／又はＲ１１がアルコキシ基で置換されているアルキル基である場合はＲ５、Ｒ７を意味する）の少なくとも１つは水素原子以外の置換基であることが好ましい。水素原子以外の置換基は、上記と同様に、置換又は無置換の炭素数１〜６個のアルキル基、ハロゲン原子、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、エステル基（ＣＯＯＲ）、アミド基（ＣＯＮＲ）又はハロゲン原子であり（Ｒはアルキル基である）、好ましくは、置換又は無置換の炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子であり、更に好ましくは、メチル基、エチル基、ｉ−プロピル基、三フッ化メチル基、塩素原子、フッ素原子等である。
また、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１のうち、アルコキシ基で置換されているアルキル基以外のアルキル基は無置換であっても置換されていてもよい。無置換のアルキル基としては、好ましくは、メチル基、エチル基、プロピル基である。
アルコキシ基で置換されているアルキル基の炭素数の合計は２〜１２、好ましくは２〜１０である。
アルコキシ基で置換されているアルキル基としては、例えば、メトキシエチル基、エトキシエチル基、プロポキシエチル基、ブトキシエチル基、ペンタキシエチル基等が挙げられるが、これらに限定されない。
Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１のアルキル基の少なくとも１つがアルコキシ基で置換されているアルキル基である場合は、本発明の化合物の構造の他の部分（オルト位の置換基や、キサンテン骨格に結合したベンゼン環の置換基等）の組み合わせによって、無蛍光性ローダミンが、主要なP４５０分子種の中でもＣＹＰ３Ａに対して選択性を示す場合があり、好ましい。
【００３６】
本発明の別の好ましい側面においては、一般式（Ｉ）において、Ｒ８とＲ９、Ｒ１０とＲ１１のいずれかの組において、いずれもが同一又は異なる置換又は無置換の炭素数１〜６個のアルキル基であり、当該アルキル基の少なくとも１つが水酸基又はアルコキシ基で置換されているアルキル基である。
ここで、Ｒ８及びＲ９のいずれもが、同一又は異なる、置換又は無置換の炭素数１〜６個のアルキル基である場合は、Ｒ４及びＲ６のうちいずれか１以上は、置換又は無置換の炭素数１〜６個のアルキル基、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、エステル基（ＣＯＯＲ）、アミド基（ＣＯＮＲ）又はハロゲン原子であり（Ｒはアルキル基である）、好ましくは、置換又は無置換の炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子であり、更に好ましくは、メチル基、エチル基、ｉ−プロピル基、三フッ化メチル基、塩素原子、フルオロ基等である。
また、Ｒ１０及びＲ１１のいずれもが、同一又は異なる、置換又は無置換の炭素数１〜６個のアルキル基である場合は、Ｒ５及びＲ７のうちいずれか１以上は、置換又は無置換の炭素数１〜６個のアルキル基、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、エステル基（ＣＯＯＲ）、アミド基（ＣＯＮＲ）又はハロゲン原子である（Ｒはアルキル基である）。好ましくは、置換又は無置換の炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子であり、より好ましくは、メチル基、エチル基、ｉ−プロピル基、三フッ化メチル基、塩素原子、フルオロ基等である。
ここで、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１の置換又は無置換の炭素数１〜１４個のアルキル基のうち、水酸基又はアルコキシ基で置換されているアルキル基以外のアルキル基は無置換であっても置換されていてもよい。無置換のアルキル基としては、好ましくは、メチル基、エチル基、プロピル基である。
【００３７】
本発明の別の好ましい側面においては、一般式（Ｉ）において、Ｒ８とＲ９、Ｒ１０とＲ１１のいずれかの組において、Ｒ８及びＲ９、又は、Ｒ１０及びＲ１１のいずれもが、同一又は異なる、置換又は無置換の炭素数１〜６個のアルキル基である。
ここで、Ｒ８及びＲ９のいずれもが、同一又は異なる、置換又は無置換の炭素数１〜６個のアルキル基である場合は、Ｒ４及びＲ６のうちいずれか１以上は、置換又は無置換の炭素数１〜６個のアルキル基、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、エステル基（ＣＯＯＲ）、アミド基（ＣＯＮＲ）又はハロゲン原子であり（Ｒはアルキル基である）、好ましくは、置換又は無置換の炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子であり、更に好ましくは、メチル基、エチル基、ｉ−プロピル基、三フッ化メチル基、塩素原子、フルオロ基等である。
また、Ｒ１０及びＲ１１のいずれもが、同一又は異なる、置換又は無置換の炭素数１〜６個のアルキル基である場合は、Ｒ５及びＲ７のうちいずれか１以上は、置換又は無置換の炭素数１〜６個のアルキル基、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、エステル基（ＣＯＯＲ）、アミド基（ＣＯＮＲ）又はハロゲン原子である（Ｒはアルキル基である）。好ましくは、置換又は無置換の炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子であり、より好ましくは、メチル基、エチル基、ｉ−プロピル基、三フッ化メチル基、塩素原子、フルオロ基等である。
ここで、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１の置換又は無置換のアルキル基としては、好ましくは、メチル基、エチル基、プロピル基である。
また、Ｒ８及びＲ９、及び／又は、Ｒ１０及びＲ１１は、一緒になってＲ８及びＲ９、又は、Ｒ１０及びＲ１１が結合している窒素原子を含む４〜７員（好ましくは５員）のヘテロシクリルを形成してもよい。
【００３８】
一般式（Ｉ）においてＹが−ＯＨである場合は、一般式（Ｉ）の化合物は以下の式で表すことができる。
2019168198.tif 000006
【００３９】
一般式（Ｉ）においてＹが−ＯＨの場合は、Ｒ８及びＲ９のいずれもが水素原子以外の置換基であり、かつ、Ｒ４、Ｒ６のいずれか１以上は置換又は無置換の炭素数１〜６個のアルキル基、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、エステル基（ＣＯＯＲ）、アミド基（ＣＯＮＲ）又はハロゲン原子である（Ｒはアルキル基である）。好ましくは、置換又は無置換の炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子である。）
【００４０】
本発明の１つの好ましい側面においては、上記一般式（ＩＩＩ）において、Ｒ８、Ｒ９は、同一又は異なる、置換又は無置換の炭素数１〜６個のアルキル基であり、Ｒ４及びＲ６のうちいずれか１以上は、置換又は無置換の炭素数１〜６個のアルキル基、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、エステル基（ＣＯＯＲ）、アミド基（ＣＯＮＲ）又はハロゲン原子であり（Ｒはアルキル基である）、好ましくは、置換又は無置換の炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子であり、更に好ましくは、メチル基、エチル基、ｉ−プロピル基、三フッ化メチル基、塩素原子、フルオロ基等である。
ここで、Ｒ８、Ｒ９の置換又は無置換のアルキル基としては、好ましくは、メチル基、エチル基、プロピル基である。
【００４１】
本発明の一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の化合物は、酸付加塩又は塩基付加塩として存在することができる。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、又はメタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩などの有機酸塩などを挙げることができ、塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩などの有機アミン塩などを挙げることができる。これらのほか、グリシンなどのアミノ酸との塩を形成する場合もある。本発明の一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の化合物又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質も本発明の範囲内である。
【００４２】
本発明の一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の化合物は、置換基の種類により、１個又は２個以上の不斉炭素を有する場合があるが、１個又は２個以上の不斉炭素に基づく光学活性体や２個以上の不斉炭素に基づくジアステレオ異性体などの立体異性体のほか、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などは、いずれも本発明の範囲に包含される。
【００４３】
本発明の一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の化合物の代表的化合物の製造方法を本明細書の実施例に具体的に示した。従って、当業者は、これらの説明をもとにして、反応原料、反応条件、反応試薬などを適宜選択して、必要に応じてこれらの方法に修飾や改変を加えることにより、一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）で表される化合物を製造することができる。
【００４４】
本発明の化合物又はその塩の非限定的例を以下に示す。
2019168198.tif 000007
2019168198.tif 000008
【００４５】
２．シトクロムＰ４５０活性検出用蛍光プローブ
本発明のもう１つの実施態様は、一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の化合物又はその塩を含むＰ４５０活性検出用蛍光プローブである。
シトクロムＰ４５０は薬物代謝の第Ｉ相反応における酸化還元反応を担う代謝酵素であり、薬物の体内からの消失において重要な役割を担っている。通常、体に入った薬物の多くは、肝臓においてＰ４５０を含む代謝酵素によって水溶性の高い化合物となり、体外へと排出される。一方、薬物の中にはＰ４５０の特定のサブタイプに対する阻害や、酵素誘導といった作用を有するものも少なくなく、薬物の併用投与時に、治療効果の変化や重篤な副作用の発現といった薬物間相互作用を引き起こす原因となる。従って、医薬品開発の初期段階において医薬品候補化合物のＰ４５０阻害、誘導活性を測定することは極めて重要である。
医薬品開発におけるＰ４５０阻害、誘導活性の測定には、例えば、テストステロンやミダゾラムのようなＰ４５０基質の代謝産物をＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて定量する方法が用いられているが、これらの方法はサンプル調整や測定に手間と時間を要する。一方、Ｐ４５０分子種によって代謝されることで初めて蛍光、生物発光を示すプローブを用いた手法は、マルチウェルプレート上で多数サンプルを同時に測定が可能であり、創薬初期における多数の薬品候補化合物のＰ４５０に対する阻害作用、誘導作用をハイスループットな測定を可能にすることから、様々な蛍光、生物発光基質がこれまでに開発されてきた。しかしながら、これらのプローブの大部分は、特定のＰ４５０サブタイプに対する特異性を示さず、その使用はリコンビナントＰ４５０に対する阻害活性の検出に限られている。従って、特定のサブタイプに特異的に代謝され、蛍光上昇を示すプローブは、ヒト肝ミクロソームや生細胞中でのＰ４５０活性の阻害、及び誘導の検出を可能にする有用なツールとなる。
ところで、既存のＰ４５０蛍光検出プローブのほとんどは、Ｏ−脱アルキル化を蛍光スイッチング部位として用いるものであり、Ｎ−脱アルキル化を直接蛍光検出するような蛍光プローブの報告はごくわずかである。これは、Ｏ−脱アルキル化に比べＮ−脱アルキル化を蛍光変化に結びつけることが難しいためと考えられる。
【００４６】
本発明の一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の化合物は、Ｎ原子上のアルキル基とオルト位上の置換基の立体障害により無蛍光性を示すと考えられることから、Ｐ４５０のＮ−脱アルキル活性によってアミノ基上のアルキル基が外れることによって立体障害の緩和が起こり、蛍光性を回復すると考えられ、これによりＰ４５０の活性を検出することが可能である。
また、本発明の一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の化合物は、反応前後で高いＳ／Ｎが期待できることに加え、ローダミン色素自体が水溶性や波長の長さ、細胞応用といった観点で優れた蛍光母核であるため、この母核を用いたＰ４５０活性検出プローブを開発できれば、既存のプローブの性能を上回る蛍光プローブとなることが期待される。
【００４７】
本発明のＰ４５０活性検出用蛍光プローブは、幅広いＰ４５０の検出に適用することが可能である。例えば、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ２Ｃ８等に適用することができる。
【００４８】
ここで、ＣＹＰ３Ａ４は人体に存在するＰ４５０種の中で最も主要な薬物代謝酵素であり、現在臨床で使用されている医薬品の約５０％の代謝に関わる。従って、ＣＹＰ３Ａ４に対する薬物の阻害、誘導作用を調べることは薬物間相互作用を知るうえで非常に重要であり、生細胞でＣＹＰ３Ａ４の活性を選択的に検出するプローブが開発できれば、ＣＹＰ３Ａ４の阻害、誘導といった薬物間相互作用を生細胞レベルで検出可能なツールになることが期待される。ＣＹＰ３Ａに対して選択性が高い蛍光プローブはこれまでいくつか報告がなされている。７−ベンジルオキシ−４−トリフルオロメチルクマリン（ＢＦＣ）や７−ベンジルオキシキノリン（ＢＱ）はＣＹＰ３Ａによって代謝される蛍光プローブであるが、これらのプローブはＣＹＰ１Ａ２によってもある程度代謝を受けることが知られている（Stresser, D. M.; Turner, S. D.; Blanchard, A. P.; Miller, V. P.; Crespi, C. L. Drug Metab. Dispos. 2002, 30(7), 845-852.）。また、特許文献（ＷＯ２０１７／０６８６１２）には以下の化合物がＣＹＰ３Ａ選択的蛍光プローブとして報告されているが、その利用は今のところ精製Ｐ４５０酵素を用いた検討にとどまっている。
2019168198.tif 000009
【００４９】
本発明のもう１つの実施態様は一般式（Ｉ）においてＹが−ＮＲ１０Ｒ１１であり、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１は、同一又は異なる、置換又は無置換の炭素数１〜６個のアルキル基であって、Ｒ４及びＲ６のうちいずれか１以上、及び／又は、Ｒ５及びＲ７のうちいずれか１以上は、水素原子以外の置換基であり、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１のアルキル基の少なくとも１つが水酸基又はアルコキシ基で置換されているアルキル基）である化合物又はその塩を含む、
Ｐ４５０活性検出用蛍光プローブ、好ましくは、ＣＹＰ３Ａ活性検出用蛍光プローブである。
当該プローブにおいては、水酸基又はアルコキシ基で置換されているアルキル基が結合しているキサンテン環上のアミノ基に対してオルト位にある置換基（即ち、Ｒ８及び／又はＲ９が水酸基又はアルコキシ基で置換されているアルキル基である場合はＲ４、Ｒ６を、Ｒ１０及び／又はＲ１１が水酸基又はアルコキシ基で置換されているアルキル基である場合はＲ５、Ｒ７を意味する）の少なくとも１つは水素原子以外の置換基であることが好ましい。
また、当該プローブにおいては、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１のうち、アルコキシ基で置換されているアルキル基以外のアルキル基は無置換であっても置換されていてもよい。無置換のアルキル基としては、好ましくは、メチル基、エチル基、プロピル基である。
本発明のＣＹＰ３Ａ活性検出用蛍光プローブは、ＣＹＰ３Ａを選択的に検出することが可能であり、その有用性は高い。
【００５０】
本発明のもう１つの実施態様は、細胞内のＰ４５０を検出する方法であって、（ａ）本発明の蛍光プローブを細胞内に導入する工程、及び（ｂ）当該蛍光プローブが細胞内で発する蛍光を測定すること含む方法である。
【００５１】
本発明の蛍光プローブの使用方法は特に限定されず、従来公知の蛍光プローブと同様に用いることが可能である。通常は、生理食塩水や緩衝液などの水性媒体、又はエタノール、アセトン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどの水混合性の有機溶媒と水性媒体との混合物などに一般式（Ｉ）で表される化合物又はそれらの塩を溶解し、細胞や組織を含む適切な緩衝液中にこの溶液を添加して、蛍光スペクトルを測定すればよい。本発明の蛍光プローブを適切な添加物と組み合わせて組成物の形態で用いてもよい。例えば、緩衝剤、溶解補助剤、ｐＨ調節剤などの添加物と組み合わせることができる。
【００５２】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれに限定されるものではない
【実施例】
【００５３】
［予備検討］
本発明者らは、強蛍光性を示す一般的なローダミンであるテトラメチルローダミン（ＴＭＲ）（図２（ｂ））のキサンテン環上ジメチルアミノ基のオルト位に立体障害を引き起こすような置換基を導入し、基底状態である程度のねじれを与えることで、励起状態でのＴＩＣＴ状態の形成が促進され、無蛍光性を示すのではないかと考えた。そこで、本発明者らは、まず計算化学を用いてこの仮説を検証することとした。図３に示すように、一般的に強蛍光性を示すことで知られるＴＭＲに加え、キサンテン環４位、または４，５位にＣｌ基を置換することでジメチルアミノ基との立体障害を生じさせた４−Ｃｌ  ＴＭＲ及び４，５−ｄｉＣｌ  ＴＭＲについて計算化学的手法を用いた検討を行った。
分子軌道計算には市販のソフトウェアであるＧａｕｓｓｉａｎ０９を用い、基底関数は６−３１Ｇ＊として計算を行った。それぞれの基底状態での再安定構造を計算した後に時間依存密度半関数法（ＴＤ−ＤＦＴ）によって励起状態での再安定構造の計算を行った。【００５４】
得られた基底状態、及び励起状態における最安定構造とＨＯＭＯ、ＬＵＭＯに相当する軌道を図３に示す。ここで、図３のそれぞれの構造式中の原子ａ，ｂ，ｃを通る平面及びｂ，ｃ，ｄを通る平面がなす二面角をφと表す。ジメチルアミノ基のオルト位に置換基の導入されていないＴＭＲでは、基底状態、励起状態共に最安定構造における二面角φはほぼ０ｏとなり、平面構造をとっていることがわかる。
また、ＨＯＭＯ、ＬＵＭＯに相当する軌道はキサンテン環とジメチルアミノ基の両方に分布しており、励起状態において二つの軌道が十分に重なることでＳ１→Ｓ０遷移が電子遷移となることが支持された。
また、電子遷移の起こりやすさの指標となる振動子強度ｆが、ｆ＝０．４９となったことからも、ＴＭＲにおいてＳ１→Ｓ０遷移が電子遷移となり、蛍光性を示すことが計算化学から支持された。【００５５】
一方で、キサンテン環にＣｌ基が導入された４−Ｃｌ  ＴＭＲおよび４，５−ｄｉＣｌ  ＴＭＲでは、基底状態において二面角が３５ｏ前後となっておりキサンテン環とジメチルアミノ基の間に立体障害に起因する分子内ねじれが生じていることが示唆された。さらに、励起状態において二面角φは約９０ｏとなり、キサンテン環とジメチルアミノ基が直交するようなｔｗｉｓｔ（ねじれ）構造が安定であるという結果になった。また、励起状態においてＨＯＭＯに相当する軌道がジメチルアミノ基に、ＬＵＭＯの軌道がキサンテン環部位に局在化することで二つの軌道の重なり合いが非常に小さくなり、振動子強度ｆはどちらの化合物も０と計算されたことから、これらの化合物がＳ１→Ｓ０遷移において蛍光として遷移せず、無輻射失活で基底状態に戻ることによって無蛍光性になることが示唆された。【００５６】
誘導体合成による検討
上記の計算化学による検討から、今回設計した化合物がＴＩＣＴ状態に起因する無蛍光性を示す可能性が示唆されたことから、次に本発明者らは、実際にこれらの化合物を合成し、その光学特性を評価することとした。【００５７】
［合成実施例１］
（１）３，６−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）キサンテン（化合物１）の合成
2019168198.tif 000010
【００５８】
文献１（Kenmoku, S.; Urano, Y.; Kojima, H.; Nagano, T. J. Am. Chem. Soc. 2007, 129 (23), 7313-7318）に従って、上記化合物１を合成した。【００５９】
（２）テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）（化合物２）の合成
2019168198.tif 000011
【００６０】
化合物１（２９．１ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を二径ナスフラスコ中テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解し、アルゴン置換した後、氷冷下でｏ−トリルマグネシウムクロライド（０．９Ｍ  ＴＨＦ溶液）（６．０ｍＬ、５．４ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、６０℃で７０分攪拌した。反応液が酸性になるまで２Ｎ塩酸を加え、反応液をＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、有機層を減圧除去した。残渣をＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔ、Ａ／Ｂ＝４０／６０→０／１００、２５分；Ａ：Ｈ２Ｏ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ０．１％ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（ＴＦＡ）（ｖ／ｖ）、Ｂ：ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ＝８０／２０  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ０．１  ％ＴＦＡ（ｖ／ｖ））で精製し、更にＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔ、Ａ／Ｂ＝４０／６０→０／１００、２５分；Ａ：Ｈ２Ｏ，Ｂ：ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ＝８０／２０）で精製し、化合物２（１７．２ｍｇ、収率３５％）を得た。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 2.04 (s, 3H), 3.38 (s, 12H), 6.90 (d, 2H, J = 2.2 Hz), 6.97 (dd, 2H, J = 9.5 Hz, 2.2 Hz), 7.15-7.20 (m, 3H), 7.38-7.45 (m, 2H), 7.50-7,54 (m, 1H).
13C-NMR (75 MHz, CDCL3) δ 19.5, 41.1, 96.8, 113.5, 114.5, 126.1, 128.7, 130.1, 130.7, 131.3, 131.4, 135.7, 157.4, 157.7, 158.3.
HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 357.1967, Found, 357.1938 (-2.9 mmu).【００６１】
（３）４−Ｃｌ−３，６−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）キサントン（化合物３）の合成
2019168198.tif 000012
【００６２】
化合物１（１１８．１ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（２２ｍＬ）に懸濁させ、攪拌しながら氷冷下で０．１Ｎ  ＮａＯＨａｑ．に溶解させたＮａＯＣｌ・５Ｈ２Ｏ（７２．６ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間攪拌した。さらにＮａＯＣｌ・５Ｈ２Ｏ（５２．１ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）を加え、６時間室温で攪拌した。反応液からＭｅＯＨを減圧除去し、Ｈ２Ｏを加えＡｃＯＥｔで抽出したのち、有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧除去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン／ＣＨ２Ｃｌ２＝５０／５０）で精製し、化合物３（５８．２ｍｇ、収率３０％）を得た。
1H-NMR (300 MHz, CD2Cl2) δ 2.99 (s, 6H), 3.09 (s, 6H), 6.56 (d, 1H, J = 2.2 Hz), 6.69 (dd, 1H, J = 8.8 Hz, 2.2 Hz), 6.99 (d, 1H, J = 8.8 Hz) 8.10 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 8.12 (d, 1H, J = 8.8Hz).
13C-NMR (75 MHz, CDCl3) δ40.2, 43.3, 97.1, 109.7, 111.2, 112.6, 114.3, 117.3, 124.9, 127.7, 153.3, 154.7, 155.1, 158.1, 174.9.
HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 317.1057, Found, 317.1072 (+1.5 mmu).【００６３】
（４）４−ＣｌＴＭＲ（化合物４）の合成
2019168198.tif 000013
【００６４】
化合物３（１７．０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）を二径ナスフラスコ中ＴＨＦに溶解し、アルゴン置換した後、氷冷下でｏ−トリルマグネシウムクロライド（０．９Ｍ  ＴＨＦ溶液）（２．８ｍＬ、２．５２ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、６０℃で２．５時間攪拌した。反応液が酸性になるまで２Ｎ塩酸を加え、反応液をＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧除去した。残渣をＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔ、Ａ／Ｂ＝８０／２０→０／１００、２０分；Ａ：Ｈ２Ｏ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ），Ｂ：ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ＝８０／２０  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ））で精製し化合物４（２４．６ｍｇ、収率９１％）を得た。
1H-NMR (300 MHz, CD3OD) δ2.06 (s, 3H), 3.35 (s, 6H), 3.46 (s, 6H), 7.14-7.17 (m, 1H), 7.20-7.31, (m, 5H), 7.45-7.61 (m, 3H).
13C-NMR (75 MHz, CDCl3) δ19.7, 41.5, 43.9, 97.9, 108.1, 116.5, 116.6, 117.7, 118.8, 127.3, 129.7, 130.2, 131.5, 132.0, 132.8, 132.9, 137.4, 154.6, 158.3, 159.7, 160.1, 160.3.
HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 391.1577, Found, 391.1607 (+3.0 mmu).【００６５】
（５）４，５−ジＣｌ−３，６−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）キサントン（化合物５）の合成
2019168198.tif 000014
【００６６】
化合物１（１４５ｍｇ、０．５１ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（５ｍＬ）に溶解させ、攪拌しながら氷冷下で０．１Ｎ  ＮａＯＨａｑ．（２．５ｍＬ）に溶解させたＮａＯＣｌ・５Ｈ２Ｏ（４６９ｍｇ、２．８６ｍｍｏｌ）を加え、室温で８時間攪拌した。反応液をＡｃＯＥｔで抽出し、飽和ＮａＨＣＯ３ａｑ．で洗浄した後、有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧除去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン／ＣＨ２Ｃｌ２＝１０／９０）で精製し、化合物５（９３ｍｇ、収率５２％）を得た。
1H-NMR (300 MHz, CD2Cl2) δ3.28 (s, 12H), 7.29 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 8.29 (d, 2H, J = 8.8 Hz).
13C-NMR (100 MHz, CD2Cl2) δ43.4, 112.7, 115.4, 116.5, 125.1, 153.8, 156.1, 174.9..
HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 351.0667, Found, 351.0620 (-4.7 mmu).【００６７】
（６）４，５−ｄｉＣｌＴＭＲ（化合物６）の合成
2019168198.tif 000015
【００６８】
化合物５（１８．８ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）を二径ナスフラスコ中ＴＨＦに溶解し、アルゴン置換した後、氷冷下でｏ−トリルマグネシウムクロライド（０．９Ｍ  ＴＨＦ溶液）（３．０ｍＬ、２．７ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、６０℃で１時間攪拌した。反応液が酸性になるまで２Ｎ塩酸を加え、反応液をＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧除去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ＝１００／０→８０／２０）で粗精製し、ＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔ、Ａ／Ｂ＝８０／２０→０／１００、２０分；Ａ：Ｈ２Ｏ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）、Ｂ：ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ＝８０／２０  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ））で精製し化合物６（２６．７ｍｇ、収率９２％）を得た。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 2.06 (s, 3H), 3.47 (s, 12H), 7.25 (d, 2H, J = 9.5 Hz), 7.29 (m, 1H), 7.33 (d, 2H, J = 9.5Hz), 7.45-7.62 (m, 3H).
13C-NMR (75 MHz, CDCL3) δ 19.7, 44.4, 107.4, 117.4, 120.1, 127.3, 130.2, 130.3, 131.7, 132.0, 132.5, 137.5, 155.5, 159.0, 161.0.
HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 425.1187, Found, 425.1217 (+3.0 mmu).【００６９】
［合成実施例２］
（１）２−（４−（ジメチルアミノ）−２−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸（化合物７）の合成
2019168198.tif 000016
【００７０】
文献２（Sauers, R. R.; Husain, S. N.; Piechowski, A. P.; Bird, G. R. Dye. Pigment. 1987, 8 (1), 35-53.）に従って、化合物７を合成した。【００７１】
（２）２’−クロロ−６’−（ジメチルアミノ）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−３’−イル  トリフルオロメタンスルフォネート（化合物８）の合成
2019168198.tif 000017
【００７２】
化合物７（８６３ｍｇ、３．０ｍｍｏｌ）、４−クロロレゾルシノール（４４２ｍｇ、３．１ｍｍｏｌ）を８５％リン酸（５ｍＬ）に溶解させ、１７０℃で３時間攪拌した。室温まで反応液を冷ました後、６０％ＨＣｌＯ４ａｑ．（８ｍＬ）を加え、１００℃でさらに２０分間攪拌した。反応液に氷水を加えたのち、桐山ろ取した。残渣をＭｅＯＨに溶解させた後、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧除去した。残渣をＤＭＦ（８ｍＬ）に溶解させ、さらにＮ−フェニルビス（トリフルオロメタンスルホンイミド）（１．４５ｇ、４．１ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．０４ｇ、８．１ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン雰囲気下室温で１時間４０分間攪拌した。反応液にｓａｔ．  ＮＨ４Ｃｌａｑ．を加え、ＡｃＯＥｔ＋ヘキサンの混合溶媒で抽出し、有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧除去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＣＨ２Ｃｌ２）で粗精製し、化合物８の粗精製体（１．１２ｇ）を得た。【００７３】
（３）２−ＣｌＴＭＲ（化合物９）の合成
2019168198.tif 000018
【００７４】
化合物８の粗精製体（１０５ｍｇ）、ジメチルアミン塩酸塩（１６４ｍｇ、２．０１ｍｍｏｌ）、Ｃｓ２ＣＯ３（１９６７ｍｇ、２．１３ｍｍｏｌ）をシュレンク管中でトルエン（１９ｍＬ）に溶解させアルゴン置換した後、Ｐｄ２（ｄｂａ）３（２２ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）とキサントフォス（１２ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）を加え再度アルゴン置換を行い１００℃で１２時間攪拌した。反応液を室温に戻し、桐山ろ過を行った後、溶媒を減圧除去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ＝９５／５→０／１００で粗精製し、さらにＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔ、Ａ／Ｂ＝８０／２０→０／１００、２０分；Ａ：Ｈ２Ｏ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）、Ｂ：ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ＝８０／２０  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ））で精製し化合物９（１１ｍｇ）を得た。
1H-NMR (300 MHz, CD2Cl2) δ3.18(s, 6H), 3.26 (s, 6H), 6.78 (s, 1H), 6.86 (dd, 1H, J = 9.5Hz, 3.0 Hz), 7.03 (s, 1H), 7.15 (d, 1H, J = 9.5 Hz), 7.13 (s, 1H), 7.25-7.28 (m, 1H), 7.75-7.77 (m, 2H), 8.30-8.32 (m, 1H).
13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ 41.3, 43.7, 97.7, 105.2, 116.1, 116.6, 117.0, 124.2, 130.9, 131.8, 132.0, 132.0, 132.2, 132.5, 134.3, 136.0, 156.1, 158.1, 159.4, 159.8, 168.2.
HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 421.1319, Found, 421.1281 (-3.8 mmu).【００７５】
［合成実施例３］
（１）２−ＭｅＴＭＲ（化合物１０）の合成
2019168198.tif 000019
【００７６】
化合物７（２９９．２ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ）、３−ジメチルアミノ−４−メチルフェノール（１５２．９ｍｇ、１．０１ｍｍｏｌ）を８５％リン酸（３ｍＬ）に加え、１７０℃で４時間攪拌した。反応液を室温まで冷ました後、Ｓｅｐ−Ｐａｋ（登録商標）（Ｖａｃ  ３５ｃｃ（１０ｇ）Ｃ１８  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ）を用いてＨ２Ｏで洗浄し、その後ＭｅＯＨで溶出した。溶媒を減圧除去し、ＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔ、Ａ／Ｂ＝７０／３０→０／１００、４０分；Ａ：Ｈ２Ｏ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）、Ｂ：ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ＝８０／２０  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ））で精製し化合物９（２８．５ｍｇ、収率５％）を得た。
1H-NMR (300 MHz, CD2Cl2) δ 2.30 (s, 3H), 3.13 (s, 6H), 3.24 (s, 6H), 6.77 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 6.84 (dd, 1H, J = 9.5 Hz, J = 2.7 Hz), 6.94 (s, 1H), 6.97 (s, 1H), 7.11 (d, 1H, J = 9.3Hz), 7.23-7.25 (m, 1H), 7.71-7.77 (m, 2H), 8.32-8.35 (m, 1H). 
13C-NMR (75 MHz, CD3OD) δ 17.4, 30.7, 40.8, 94.8, 97.3, 114.7, 115.1, 115.3, 126.8, 130.1, 131.4, 131.5, 131.7, 132.3, 132.5, 133.9, 135.5, 158.4, 158.7, 159.3, 159.5, 161.2, 168.1.
HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 401.1865, Found, 401.1863 (-0.2 mmu).【００７７】
［合成実施例４］
（１）６’−ジメチルアミノ−２’−フルオロ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ（イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン）−３’−イル  トリフルオロメタンスルフォネート（化合物１１）の合成
2019168198.tif 000020
【００７８】
化合物７（２８８．７ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）、４−フルオロレゾルシノール（１３０．１ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）を８５％リン酸（３ｍＬ）に溶解させ、１７０℃で４時間攪拌した。室温まで反応液を冷ました後、６０％ＨＣｌＯ４ａｑ．（３ｍＬ）を加え、１００℃でさらに２５分間攪拌した。反応液に氷水を加えたのち、桐山ろ取した。残渣をＭｅＯＨに溶解させた後、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧除去した。残渣をＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解させ、さらにＮ−フェニルビス（トリフルオロメタンスルホンイミド）（５４８．１ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３８８．１ｍｇ、３．０ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン雰囲気下室温で３時間攪拌した。反応液にｓａｔ．  ＮＨ４Ｃｌａｑ．を加え、ＡｃＯＥｔとヘキサンの混合溶媒で抽出し、有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧除去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＣＨ２Ｃｌ２）で精製し、化合物１１（２０７．８ｍｇ、収率４０％）を得た。
1H-NMR (300 MHz, CD2Cl2) δ 2.98 (s, 6H), 6.47 (dd, 1H), 6.51 (d, 1H, J = 2.2 Hz), 6.63 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 6.74 (d, 1H, J = 10.3 Hz), 7.22 (m, 1H), 7.34 (d, 1H, J = 6.6 Hz), 7.71 (m, 2H), 8.04 (m, 1H). 
13C-NMR (75 MHz, CD2Cl2) δ 40.3, 82.7, 98.4, 104.8, 110.0, 112.9, 116.4 (d, J = 20.4 Hz), 119.1 (q, J = 318.3 Hz), 121.6 (d, J = 5.5 Hz), 124.3, 125.6, 127.0, 128.8, 130.7, 135.8, 137.8 (d, J = 15.4 Hz),148.4, 148.5, 149.7 (d, J = 217.8 Hz), 152.5 152.7 (d, J = 28.4 Hz), 169.1. 
HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 510.0635, Found, 510.0626 (-0.9 mmu).【００７９】
（２）２−ＦＴＭＲ（化合物１２）の合成
2019168198.tif 000021
【００８０】
化合物１１（１０２ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）、ジメチルアミン塩酸塩（１２７ｍｇ、１．５６ｍｍｏｌ）、Ｃｓ２ＣＯ３（１１３７ｍｇ、３．４９ｍｍｏｌ）をシュレンク管中でトルエン（１５ｍＬ）に溶解させアルゴン置換した後、Ｐｄ２（ｄｂａ）３（１０３．５ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）とキサントホス（５８．４ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を加え再度アルゴン置換を行い１００℃で１７．５時間攪拌した。反応液を室温に戻し、桐山ろ過を行った後、溶媒を減圧除去した。残渣をＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔ、Ａ／Ｂ＝７０／３０→０／１００、４０分；Ａ：Ｈ２Ｏ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）、Ｂ：ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ＝８０／２０  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ））で精製し化合物１２（１１ｍｇ、収率１１％）を得た。
1H-NMR (300 MHz, CD3CN) δ 3.15 (m, 12H), 6.70 (d, 1H, J = 9.5 Hz), 6.73 (d, 1H, J = 2.9 Hz), 6.80-6.86 (m, 2H), 6.94 (d, 1H, J = 9.5 Hz), 7.26-7.29 (m, 1H), 7.72-7.78 (m, 2H), 8.17-8.20 (m, 1H). 
13C-NMR (75 MHz, CD3OD) δ 41.1, 43.3 (d, J = 8.1 Hz), 97.3, 101.8 (d, J = 5.0 Hz), 114.6, 114.7, 114.9, 115.2, 115.8, 116.5, 131.3, 131.7, 132.1 (d, J = 8.1 Hz), 132.6, 134.0, 135.0, 150.0, (d, J = 11.2 Hz), 152.1 (d, J = 250.5 Hz), 155.6, 159.4, (d, J = 3.1 Hz), 161.3, 168.0.
HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 405.1615, Found, 405.1590 (-2.5 mmu).【００８１】
［合成実施例４］
（１）２−Ｃｌ ｔｒｉＭｅローダミン（化合物１３）の合成
2019168198.tif 000022
【００８２】
化合物８の粗精製体（１０８．２ｍｇ）、メチルアミン塩酸塩（１４０ｍｇ、２．０８ｍｍｏｌ）、Ｃｓ２ＣＯ３（２０６２ｍｇ、６．３３ｍｍｏｌ）をシュレンク管中でトルエン（１８ｍＬ）に溶解させアルゴン置換した後、Ｐｄ２（ｄｂａ）３（１９．５ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）とキサントホス（１３．５ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）を加え再度アルゴン置換を行い１００℃で一晩攪拌した。反応液を室温に戻し、桐山ろ過を行った後、溶媒を減圧除去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ＝９５／５）で粗精製し、さらにＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔ、Ａ／Ｂ＝７０／３０→０／１００、２５分；Ａ：Ｈ２Ｏ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）、Ｂ：ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ＝８０／２０  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ））で精製し化合物１３（１６ｍｇ）を得た。【００８３】
［合成実施例５］
（１）３，６−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）Ｓｉ−キサントン（化合物１４）の合成
2019168198.tif 000023
【００８４】
文献３（Lukinavicius, G.; Umezawa, K.; Olivier, N.; Honigmann, A.; Yang, G.; Plass, T.; Mueller, V.; Reymond, L.; Correa, I. R.; Luo, Z. G.; Schultz, C.; Lemke, E. A.; Heppenstall, P.; Eggeling, C.; Manley, S.; Johnsson, K. Nat. Chem. 2013, 5 (2), 132-139.）に従って、化合物１４を合成した。【００８５】
（２）ＳｉＲ６５０（化合物１５）の合成
2019168198.tif 000024
【００８６】
化合物１５（６１．１．ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）を二径ナスフラスコ中ＴＨＦに溶解し、アルゴン置換した後、氷冷下でｏ−トリルマグネシウムクロライド（１．０Ｍ  ＴＨＦ溶液）（９．５ｍＬ、９．５ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、６０℃で６０分間攪拌した。反応液が酸性になるまで２Ｎ塩酸を加え、反応液をＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、有機層をＨ２Ｏで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた後、減圧除去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ＝９３／７→８５／１５）で精製し、化合物１５（７５．４ｍｇ、収率９１％）を得た。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.63 (s, 3H), 0.65 (s, 3H), 2.03 (s, 3H), 3.42 (s, 12H), 6.64 (dd, 2H, J = 9.5 Hz, 2.9 Hz), 7.06-7.09 (m, 3H), 7.21 (d, J = 2.9 Hz, 2H), 7.31-7.35 (m, 2H), 7.42-7,44 (m, 1H).
13C-NMR (75 MHz, CDCl3) δ -0.3, 0.0, 20.0, 41.8, 114.6, 121.4, 126.2, 128.2, 129.5, 130.9, 136.2, 139.0, 142.1, 149.1, 154.7, 170.5.
HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 399.2257, Found, 399.2266 (+0.9 mmu).【００８７】
（３）４−Ｃｌ  ＴＭＳｉＲ（化合物１６）の合成
2019168198.tif 000025
【００８８】
化合物１４（８０．９ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１０ｍＬ）に溶解させ、攪拌しながら氷冷下で４ｍＬ０．１Ｎ  ＮａＯＨａｑ．に溶解させた１．５Ｍ  ＮａＯＣｌ溶液（２８０μＬ、０．４２ｍｍｏｌ）を加えた。これを室温で３０分間攪拌し、反応液からＭｅＯＨを減圧除去した後２Ｎ塩酸を加え、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧除去した。残渣をＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔ、Ａ／Ｂ＝７０／３０→０／１００，４０分；Ａ：Ｈ２Ｏ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）、Ｂ：ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ＝８０／２０  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ））で精製し化合物１６（５．４ｍｇ、収率５％）を得た。
1H-NMR (400 MHz, CD2Cl2): δ 0.74 (s, 3H), 0.75 (s, 3H), 2.00 (s, 3H), 3.13 (s, 6H), 3.48 (br s, 6H), 6.92 (dd, J = 10.1, 2.7 Hz, 1H), 6.96 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 7.05 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 7.11 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.14 (d, J = 10.1 Hz, 1H), 7.32-7.43 (m, 2H), 7.46 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.48 (d, J = 2.3 Hz, 1H).
HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 433.1867; found, 433.1867 (+0.0 mmu).
The HPLC chromatogram after purification is shown below. (A/B = 70/30→0/100, 40 min; A: H2O containing 0.1% TFA (v/v), B: MeCN/H2O = 80/20 containing 0.1% TFA (v/v). 1.0 mL/min flow rate. Detection at 650 nm).
2019168198.tif 000026
【００８９】
［合成実施例６］
（１）４，５−ｄｉＣｌ−３，６−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）Ｓｉ−キサントン（化合物１７）の合成
2019168198.tif 000027
【００９０】
化合物１４（３３３ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（９０ｍＬ）に溶解させ、攪拌しながら氷冷下で６ｍＬ  ０．１Ｎ  ＮａＯＨａｑ．に溶解させた１．５Ｍ  ＮａＯＣｌ溶液（４．０ｍＬ、６．００ｍｍｏｌ）を加えた。これを室温で１．５時間攪拌し、反応液からＭｅＯＨを減圧除去した後ｓａｔ．  ＮａＨＣＯ３  ａｑ．を加え、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧除去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＣＨ２Ｃｌ２）で精製し、化合物１７（２２４．１ｍｇ、収率５６％）を得た。
1H-NMR (400 MHz,CD2Cl2): δ 0.79 (s, 6H), 2.89 (s, 12H), 7.20 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 8.31 (d, J = 8.7 Hz, 2H)
13C-NMR (100 MHz, CD2Cl2): δ-1.3, 43.2, 121.0. 129.7, 132.4, 134.6, 140.6, 153.9, 184.7.
HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 393.0957; found, 393.0954 (-0.3 mmu).【００９１】
（２）４，５−ｄｉＣｌ  ＴＭＳｉＲ（化合物１８）の合成
2019168198.tif 000028
【００９２】
２−ブロモ−１，３−ジメトキシベンゼン（５９９．６ｍｇ、２．７６ｍｍｏｌ）をＡｒ置換下、ＴＨＦ（１０ｍＬ）に溶解し、−７８℃でｓｅｃ−ＢｕＬｉ（１．０Ｍヘキサン溶液）（２．７０ｍＬ、２．７０ｍｍｏｌ）を加え、３０分間攪拌した。これに化合物１７（１０８．６ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５ｍＬ）に溶解したものを加え、室温で２時間攪拌した。これに２Ｎ塩酸を加え、反応を終了させた。反応液をＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧除去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ＝９５／５  ｔｏ  ８５／１５）で精製し、さらにＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔ、Ａ／Ｂ＝７０／３０→０／１００、４０分；Ａ：Ｈ２Ｏ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）、Ｂ：ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ＝８０／２０  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ））で精製し化合物１８（１９．３  ｍｇ、収率１１％）を得た。
1H-NMR (400 MHz, CD2Cl2): δ 0.91 (s, 6H), 3.31 (s, 12H), 3.63 (s, 6H), 6.71 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.79 (d, J = 9.6 Hz, 2H), 7.25 (d, J = 9.1 Hz, 2H),7.50 (t, J = 8.5 Hz, 1H)
13C-NMR (100 MHz, CD2Cl2): δ -2.1, 44.5, 56.4, 104.4, 115.9, 119.3, 131.2, 131.8, 132.0, 140.4, 148.7, 156.9, 157.7, 170.0.
HRMS (ESI+): Calcd for [M]+,513.1532; found, 513.1533 (+0.1 mmu).【００９３】
［合成実施例７］
（１）５’−クロロ−３’−ジメチルアミノ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ（イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン）−６’−イル  トリフルオロメタンスルフォネート（化合物１９）の合成
2019168198.tif 000029
【００９４】
化合物７（５７４ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）、２−クロロレゾルシノール（２８７ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）を８５％リン酸（４ｍＬ）に溶解させ、１７０℃で３時間攪拌した。室温まで反応液を冷ました後、６０％ＨＣｌＯ４  ａｑ．（５．０ｍＬ）を加え、１００℃でさらに２０分間攪拌した。反応液に氷水を加えたのち、桐山ろ取した。残渣をＭｅＯＨに溶解させた後、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧除去した。乾燥させた残渣をＤＭＦ（８．０ｍＬ）、に溶解させ、さらにＮ−フェニルビス（トリフルオロメタンスルホンイミド）（１２６４ｍｇ、３．５ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（８９０ｍｇ、６．８ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン雰囲気下、室温で１４時間攪拌した。反応液にｓａｔ．  ＮＨ４Ｃｌａｑ．を加え、ＡｃＯＥｔとヘキサンの混合溶媒で抽出し、有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧除去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＣＨ２Ｃｌ２）で精製し、化合物１９（９９０ｍｇ、収率９５％）を得た。
1H-NMR (400 MHz, CD2Cl2) δ 3.89 (s, 6H), 6.38 (dd, 1H, J = 8.8 Hz, 2.4 Hz), 6.50-6.54 (m, 2H), 6.71 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 6.94 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 7.07-7.10 (m, 1H), 7.56-7.61 (m, 2H) 7.90-7.92 (m, 1H).  
13C-NMR (100 MHz, CD2Cl2) δ 40.4, 82.7, 98.7, 105.3, 110.3, 116.6, 117.1, 119.0, (q, J = 322 Hz), 122.0, 124.3, 125.5, 127.1, 127.6, 128.8, 130.6, 135.7, 147.0, 149.6, 152.3, 152.7, 153.0, 169.2.
HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 526.0339, Found, 526.0307 (-3.2 mmu).【００９５】
（２）２’−ＣＯＯＨ−４−Ｃｌ  ＴＭＲ（化合物２０）の合成
2019168198.tif 000030
【００９６】
化合物１９（１０５ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）、ジメチルアミン塩酸塩（１６３ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ）、Ｃｓ２ＣＯ３（２０９２ｍｇ、６．４２ｍｍｏｌ）をシュレンク管中でトルエン（１５ｍＬ）に溶解させアルゴン置換した後、Ｐｄ２（ｄｂａ）３（２２ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）とキサントホス（１３ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）を加え再度アルゴン置換を行い１００℃で１２時間攪拌した。反応液を室温に戻し、桐山ろ過を行った後、溶媒を減圧除去した。残渣に２Ｎ塩酸を加え、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層をＨ２Ｏで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ溶媒を減圧除去した。残渣をＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔ、Ａ／Ｂ＝７０／３０→０／１００、２５分；Ａ：Ｈ２Ｏ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）、Ｂ：ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ＝８０／２０  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ））で精製し化合物９（８ｍｇ、収率７％）を得た。
1H-NMR (300 MHz, CD2Cl2) δ 3.11 (s, 6H), 3.20 (s, 6H), 6.76 (dd, 1H, J = 8.8 Hz, 2.9 Hz), 6.82 (d, 1H, J = 2.9 Hz), 6.87-6.94 (m, 2H), 6.97 (d, 1H, J = 9.5 Hz), 7.20-7.23 (m, 1H), 7.68-7.76 (m, 2H), 8.20-8.23 (m, 1H).
13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ 41.2, 43.8, 98.1, 109.7, 114.8, 116.2, 116.8, 118.0, 129.0, 130.3, 131.4, 131.6, 132.1, 134.4, 153.5, 157.4, 158.6, 159.1, 168.6.
HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 421.1319, Found, 421.1290 (-2.9 mmu).【００９７】
［実施例１］
上記の合成例で合成した化合物について光学特性を評価した。結果を図４に示す。
図４の（ａ〜ｃ）は、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）（ａ）、４−Ｃｌ  ＴＭＲ（ｂ）及び４，５−ｄｉＣｌ  ＴＭＲ（ｃ）についての化学構造、０．１％ＴＦＡ含有ＭｅＯＨ中での蛍光量子収率（Φｆｌ）、吸収極大（λａｂｓ及び発光極大（λｅｍ）を示す。Φｆｌは、ＥｔＯＨのローダミンＢ（Φｆｌ＝０．６５）を基準にして決定した相対蛍光量子収率である。
図４の（ｄ〜ｆ）は、０．１％ＴＦＡ及び０．１％ＤＭＳＯ含有ＭｅＯＨ中での１μＭのＴＭＲ（ｄ）、４−Ｃｌ  ＴＭＲ（ｅ）及び４，５−ｄｉＣｌ  ＴＭＲ（ｆ）の吸収スペクトル及び発光スペクトルである。【００９８】
合成した３種類の化合物は、いずれも同じような吸収スペクトルの形状を示した。一方で、ＴＭＲがΦｆｌ＝０．３９９と強蛍光性を示したのに対し、ジメチルアミノ基のオルト位にＣｌ基を置換した４−Ｃｌ  ＴＭＲ及び４，５−ｄｉＣｌ  ＴＭＲは蛍光量子収率がそれぞれ０．００３、０．００１となり、ほぼ無蛍光性を示すことが分かった。この結果から、計算化学による検討から予想された通りキサンテン環状ジメチルアミノ基のオルト位にかさ高い置換基を導入することで強蛍光性のローダミン色素を無蛍光性化させることが可能であることが明らかとなった。【００９９】
［実施例２］
次に、今回開発した無蛍光性ローダミンの無蛍光性がＴＩＣＴ状態の生成によるものかを検討するために、蛍光量子収率の溶媒粘度依存性について検討した。具体的には、吸収、蛍光スペクトルおよび蛍光量子収率をＭｅＯＨ（εｒ＝３２．６、η＝０．６１ｃＰ）、エチレングリコール（εｒ＝３８．７、η＝１９．９ｃＰ）、グリセロール（εｒ＝４２．５、η＝１４１２ｃＰ）の３種の溶媒中で測定した。これら３種の溶媒は誘電率εｒが近い一方で粘度ηが大きく異なるため化合物の光学特性の粘度依存性を検討することができる。置換基の導入による立体障害によりＴＩＣＴ状態の形成が促進されるならば、ＭｅＯＨ中ではＴＩＣＴ状態の形成により消光する一方で、グリセロール等の粘度の高い溶媒中では分子内ねじれの速度が遅くなりＴＩＣＴ状態への移行が抑制されるため蛍光量子収率が上昇すると予想した。【０１００】
実際に４−Ｃｌ  ＴＭＲの光学特性の溶媒粘度依存性を図５に示す。
図５の（ａ）は、グリセロール、エチレングリコール及びＭｅＯＨ中での４−Ｃｌ  ＴＭＲのΦｆｌである。Φｆｌは、ＥｔＯＨのローダミンＢ（Φｆｌ＝０．６５）を基準にして決定した相対蛍光量子収率である。図５の（ｂ、ｃ）は、グリセロール、エチレングリコール及びＭｅＯＨ中での１μＭの４−Ｃｌ  ＴＭＲの吸収スペクトル（ｂ）及び発光スペクトル（ｃ）である。【０１０１】
実験の結果、４−Ｃｌ  ＴＭＲは粘度の低いＭｅＯＨ中ではΦｆｌ＝０．００３と消光しているのに対し、粘度が大きいエチレングリコール及びグリセロール中においてはΦｆｌがそれぞれ０．０１、０．０９となり蛍光量子収率の上昇が観察された。従って、今回開発した無蛍光性ローダミンは、溶媒粘度に応じて蛍光強度が増大する性質を有することから、実際にＴＩＣＴ機構によって消光していることが支持された。【０１０２】
［実施例３］
次に、今回開発した無蛍光性ローダミン類の消光が立体障害に起因するものであることを確かめるため、立体障害の程度の異なる誘導体を合成し、その光学特性の評価を行った。ここで、本検討では、キサンテン環に直結したベンゼン環の２’位の置換基をＭｅ基からＣＯＯＨ基へ変更し、さらに、立体障害を引き起こす置換基の置換位置をキサンテン環４位から２位へと変更した誘導体で検討を行った。
まず、キサンテン環２位にＣｌ基を導入した化合物の光学特性を取得した。その結果、２−Ｃｌ  ＴＭＲにおいても４−Ｃｌ  ＴＭＲと同様に無蛍光性を示したことから、立体障害を引き起こす置換基であるＣｌ基はキサンテン環２位に置換された場合もＴＩＣＴ状態の形成による消光が起きることが明らかとなった。
次に、キサンテン環上２位の置換基をＣｌ基以外の置換基に変更した誘導体を合成し、その光学特性を検討することとした。具体的には、置換基の立体的な大きさを表すパラメータとして知られるｔａｆｔの立体因子（文献４：藤田稔夫. 有機合成化学 1978, 36 (10), 832-833.）を参考に、Ｃｌ基と同等の立体的な大きさを示すＭｅ基、及びＣｌ基、Ｍｅ基に比べ立体的に小さいＦ基をキサンテン環２位に置換した誘導体を合成し、蛍光量子収率が置換基の大きさに依存して変化するかを検討した。その結果、Ｃｌ基と同等の立体的な大きさ有するＣＨ３基を置換した２−Ｍｅ  ＴＭＲでは蛍光量子収率が約１％とほぼ無蛍光性を示したのに対し、より立体障害の影響が緩和されると考えられるＦ基を置換した２−Ｆ  ＴＭＲは蛍光量子収率が約１０％と蛍光性を示した。この結果から、今回開発した無蛍光性ローダミンの消光は、キサンテン環上ジメチルアミノ基とオルト位上置換基との立体障害によって引き起こされることが強く示唆された。【０１０３】
図６の（ａ〜ｃ）は、２−Ｃｌ  ＴＭＲ（ａ）、２−Ｍｅ  ＴＭＲ（ｂ）及び２−Ｆ  ＴＭＲ（ｃ）の化学構造、０．１％ＴＦＡ含有ＭｅＯＨ中での蛍光量子収率（Φｆｌ）、吸収極大（λａｂｓ）及び発光極大（λｅｍ）を示す。Φｆｌは、ＥｔＯＨのローダミンＢ（Φｆｌ＝０．６５）を基準にして決定した相対蛍光量子収率である。
図６の（ｄ〜ｆ）は、０．１％ＴＦＡ及び０．１％ＤＭＳＯ含有ＭｅＯＨ中での１μＭの２−Ｃｌ  ＴＭＲ（ａ）、２−Ｍｅ  ＴＭＲ（ｂ）及び２−Ｆ  ＴＭＲ（ｃ）の吸収スペクトル及び発光スペクトルである。【０１０４】
［実施例４］
次に、アミノ基上の置換基をジメチル基からモノメチル基へと変更した化合物を合成し、その光学特性を評価した。この化合物は、消光の原因となるアミノ基上アルキル基とオルト位上置換基との立体障害が緩和されると考えられるため、蛍光性が回復するのではないかと予想した。図７にその結果を示す。【０１０５】
図７の（ａ）は、０．１％ＴＦＡ含有ＭｅＯＨ中での２−ＣｌトリＭｅローダミンのΦｆｌ、λａｂｓ及びλｅｍを示す。図７の（ｂ）は、０．１％ＴＦＡ含有ＭｅＯＨ中での１μＭの２−ＣｌトリＭｅローダミンの吸収スペクトル及び発光スペクトルを示す。【０１０６】
開発した化合物は、蛍光量子収率が１５％と蛍光性を示し、実際にアミノ基上置換基をモノメチル基にすることで立体障害が緩和され、蛍光性が回復することが明らかとなった。
以上の結果から、計算化学に基づく論理的な分子設計を行うことで、従来の分子設計とは異なる構造修飾によるローダミンの無蛍光性化に成功した。次に、これら新規無蛍光性ローダミンを利用することで可能になると考えられる応用例について示す。【０１０７】
応用例：新規蛍光消光団としての応用
本発明の無蛍光性ローダミン類を応用し、新規蛍光消光団（ｄａｒｋ  ｑｕｅｎｃｈｅｒ）の開発が可能であると考えられる。蛍光消光団は、光によって励起された後に蛍光以外のプロセスで失活する化合物のことであり、代表的な用途としてはＦＲＥＴのアクセプターとしての利用が挙げられる。既存の蛍光消光団で、市販もされている代表的なものとしては、Ｄａｂｃｙｌ、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（ＢＨＱ）、ＱＳＹシリーズ等がある。【０１０８】
Ｄａｂｃｙｌは、分子内にアゾ構造を有することにより無蛍光性になると考えられている蛍光消光団であり、図８に示すようにシンプルな構造をしているため汎用性が高いと考えられるが、消光できる波長が５００ｎｍ以下とやや短波長である（文献５：Johansson, M. K. Methods Mol. Biol. 2006, 335, 17-29.）。【０１０９】
Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（ＢＨＱ）シリーズ（文献６：M. Cook, R.; Lyttle, M.; Dick, D. ,. U.S. Patent 7019129, 2006.）も分子内のアゾ構造により無蛍光性になると考えられている消光団であり、こちらはｄａｂｃｙｌよりも長波長の蛍光を消光することが可能である。これらアゾ構造を有するｑｕｅｎｃｈｅｒは、幅広い波長帯に対応した消光団が存在するものの（図９）、アゾ構造は還元されやすい構造であり、生体内や細胞内で不安定な場合がある。【０１１０】
ＱＳＹシリーズ（文献７：The Molecular Probes Handbook.
）も、Ｄａｂｃｙｌより長波長の蛍光を消光することができる消光団であり、ＱＳＹ７、ＱＳＹ９、ＱＳＹ２１はローダミンのキサンテン環上Ｎ原子にアリール基が結合したジアリールローダミン類である（図１０）。【０１１１】
本発明の新規消光団はアゾ構造を有していないため、ＤａｂｃｙｌやＢＨＱに比べて還元状態でも安定であると考えられる。
ＱＳＹシリーズと今回の消光団の違いは、Ｎ原子にアリール基を導入して消光させるか、オルト位にＣｌ基やＭｅ基といった置換基を導入して消光させるかの違いであるが、この違いによってもたらされる利点としては、以下のようなものが可能性として挙げられる。
・消光に脂溶性の高いアリール基の導入を必要としないため、水溶性が上がりハンドリングの向上が期待される。
・分子サイズがＱＳＹシリーズに比べコンパクトであるためＦＲＥＴ等のアクセプターとして使用する場合に、酵素認識の向上が期待される。
よって、今回開発した無蛍光性ローダミンは、既存の蛍光消光団に比べてより実用的な蛍光消光団になることが期待される。【０１１２】
［実施例５］
ＴＩＣＴ機構に基づく近赤外蛍光消光団の開発
新規無蛍光性ローダミン類を応用した蛍光消光団の開発において、幅広い波長帯で使用可能な蛍光消光団が開発できることが望ましい。ローダミン類は、キサンテン環１０位のＯ原子をＳｉ原子、Ｃ原子、Ｇｅ原子、Ｐ原子、ＳＯ２へと置換することで、様々な吸収波長を示すことが知られており、本発明の分子設計による無蛍光性化が他の１０位置換ローダミンにおいても可能であれば、様々な波長にわたる蛍光消光団を開発可能であると考えられる。そこで本発明者らは、これら１０位置換ローダミンの一例として、キサンテン環１０位にＳｉ原子を置換したＳｉ−ローダミン（ＳｉＲ）類について本分子設計による無蛍光性化が可能であるかを検討した。ＳｉＲはＯ−ローダミンに比べ約９０ｎｍ長波長化することが知られており、組織透過性に優れ、光毒性の少ない近赤外領域に吸収を示すローダミン類である。
具体的には、ＳｉＲのキサンテン環上４位にＣｌ基を置換した化合物及び４，５位にＣｌ基を置換した化合物を合成し、その光学特性を測定した。なお、４，５−ｄｉＣｌ  ＴＭＳｉＲは求核種によるキサンテン間９位への求核攻撃を防ぐためにベンゼン環の２’，６’位にＯＭｅ基を置換した。【０１１３】
図１１の（ａ、ｂ）は、（ａ）４−Ｃｌ  ＴＭＳｉＲ及び（ｂ）４，５−ｄｉＣｌ  ＴＭＳｉＲの化学構造を示す。また、同図の（ｃ、ｄ）は、４−Ｃｌ  ＴＭＳｉＲ（ｃ）及び４，５−ｄｉＣｌ  ＴＭＳｉＲ（ｄ）の規格化した吸収スペクトル（実戦）と発光スペクトル（破線）を示す。【０１１４】
４−Ｃｌ  ＴＭＳｉＲは蛍光量子収率が１％、４，５−ｄｉＣｌ  ＴＭＳｉＲは０．１％以下となり、いずれの化合物もほぼ無蛍光性を示した。この結果から、本分子設計による消光はＳｉＲ類においても応用可能であることが明らかとなり、様々な波長のバリエーションを持つ新規蛍光消光団の開発ができることが示された。【０１１５】
［実施例６］
Ｐ４５０のＮ−脱アルキル活性を検出可能な新規蛍光プローブの開発（１）
本発明の新規無蛍光性ローダミン類を利用して、Ｐ４５０のＮ−脱アルキル反応を検出可能な新たな蛍光プローブの開発が可能である。
Ｐ４５０は薬物代謝の第Ｉ相反応における酸化還元反応を担う代謝酵素であるが、薬物によるＰ４５０の阻害や誘導は、薬物間相互作用の原因となるため、創薬プロセスの初期段階において医薬品候補化合物のＰ４５０阻害、誘導活性を測定することは極めて重要である。多検体を迅速に調べるためには、医薬品候補化合物のＰ４５０に対する阻害作用、誘導作用をハイスループットに測定する必要があるが、このような手法としてＰ４５０活性を蛍光で測定する蛍光法が用いられている。
既にＰ４５０に代謝されることによって蛍光性を回復する蛍光プローブが開発されているが、多くの蛍光プローブはＰ４５０のサブタイプ選択性に乏しく、精製酵素でのＰ４５０活性評価にしか用いることができない（文献８：Jurica, J.; Sulcova, A. In Vivo (Brooklyn). 2011.）。また、それらの多くは波長の短さや水溶性の低さから、生細胞や動物個体での応用に適さない場合が多い。
従って、ローダミンをベースとした新たなＰ４５０の酵素活性検出蛍光プローブが開発できれば、長波長、高い水溶性、高い光褪色耐性といった優れた特性を有するＰ４５０活性検出蛍光プローブとなりうる。【０１１６】
具体的なデザインを図１２に示す。今回開発した無蛍光性ローダミンは、前述したようにＮ原子上アルキル基とオルト位上置換基の立体障害が無蛍光性の原因である。従って、Ｐ４５０のＮ−脱アルキル活性によってアミノ基上のアルキル基が外れることによって立体障害の緩和が起こり、蛍光性を回復すると考えられる。
既存のＰ４５０活性検出プローブのほとんどはＯ−脱アルキル反応を蛍光ＯＦＦ／ＯＮのスイッチに用いている一方で、今回検討したＮ−脱アルキル化をスイッチとする新たな蛍光プローブは、これまでのプローブと異なる反応性やサブタイプ選択性を示す可能性が考えられる。
実際に初期検討として、今回開発した無蛍光性ローダミン類がＰ４５０によって代謝されることで蛍光上昇が観察されるかの検討を行った。結果を図１３に示す。【０１１７】
図１３は、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中でＮＡＤＰＨ生成系（ＭｇＣｌ２：１．５ｍＭ、グルコース−６−リン酸：３ｍＭ、ＮＡＤＰ＋：０．３ｍＭ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ：０．５Ｕ／ｍＬ）及び１１種のＰ４５０サブタイプを用いた１μＭのローダミン誘導体の時間依存性蛍光変化を示す（Ｅｘ．５４４ｎｍ／Ｅｍ．５９０ｎｍ）。【０１１８】
開発した無蛍光性ローダミン類はいくつかのＰ４５０サブタイプに代謝され、蛍光上昇を示した。特にこれらの無蛍光性ローダミン類は、いくつかのＰ４５０サブタイプに認識されることで蛍光上昇を示し、中でもＣＹＰ３Ａ４によく認識される傾向にあることが明らかとなった。ＣＹＰ３Ａ４は、ＣＹＰによる酸化反応において寄与が最も大きいサブタイプであり、肝臓に存在するＣＹＰのうちの大部分を占める。ＣＹＰ３Ａ４は多くの薬物の代謝に関わる代謝酵素であるため、細胞や動物個体においてＣＹＰ３Ａ４の酵素活性を蛍光検出する蛍光プローブは、創薬における薬物間相互作用の予測に有用なツールとなりうる。【０１１９】
［合成実施例８］
（１）化合物２１の合成
2019168198.tif 000031
【０１２０】
化合物７（１．１５ｇ、４．０２ｍｍｏｌ）、３−ブロモ−４−メチルフェノール（１．０２ｇ、５．４６ｍｍｏｌ）をメタンスルホン酸（６ｍＬ）に溶解させ、１００℃で１時間攪拌した。反応液を１０Ｎ  ＮａＯＨ水溶液で中和し、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧除去した。残渣をＭｅＯＨで洗浄することで、化合物を得た。（１．５６ｇ）
1H-NMR (400 MHz, CD2Cl2): δ 2.20 (s, 3H), 2.95 (s, 6H), 6.39 (dd, J = 8.8 Hz, 2.9 Hz, 1H), 6.45 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 6.58-6.61 (m, 2H), 7.13-7.16 (m, 1H), 7.46 (s, 1H), 7.60-7.66 (m, 2H), 8.01-8.04 (m, 1H).
13C-NMR (100 MHz, CD2Cl2): δ 22.0, 40.1, 83.2, 98.3, 105.5, 108.9, 118.4, 120.5, 123.8, 124.9, 126.0, 126.6, 128.5, 129.0, 129.6, 132.7, 134.9, 149.9, 152.0, 152.1, 153.1, 169.5.
HRMS (ESI+): Calcd for [M]+,436.0548; found, 436.0589 (+4.1 mmu).【０１２１】
（２）化合物２２の合成
2019168198.tif 000032
【０１２２】
化合物２１（４４４ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）、２−（メチルアミノ）メタノール（７９９μＬ、１０．０ｍｍｏｌ）、Ｃｓ２ＣＯ３（１６５０ｍｇ、５．０６ｍｍｏｌ）、Ｐｄ２（ｄｂａ）３（４５．５ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）、キサントホス（８７．７ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）をトルエン（２０ｍＬ）に加えアルゴン置換を行い、１００℃で２０時間攪拌した。反応液を室温に戻し、水を加え、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧除去した。残渣を逆相中圧分取（ｅｌｕｅｎｔ、Ａ／Ｂ＝９０／１０→０／１００；Ａ：Ｈ２Ｏ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）、Ｂ：ＭｅＣＮ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ））で精製し化合物２２（１３８ｍｇ、収率２５％）を得た。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.32-8.34 (m, 1H), 7.77-7.86 (m, 2H), 7.38-7.40 (m, 1H), 7.23 (s, 1H), 7.17 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 7.11 (dd, J = 9.6, 2.3 Hz, 1H), 7.01 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.96 (d, J = 0.9 Hz, 1H), 3.81 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.62 (t, J = 5.5 Hz, 2H), 3.32 (s, 6H), 3.21 (s, 3H), 2.33 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, CD2Cl2): d 18.1, 40.4, 41.8, 57.8, 59.4, 98.5, 106.6, 108.4, 109.2, 114.1, 124.3, 125.1, 127.5, 128.8, 129.0, 129.9, 130.2, 135.1, 150.9, 152.7, 153.0, 153.3, 154.7, 169.7; HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 431.1971; found, 431.1978 (+0.7 mmu). 【０１２３】
［合成実施例９］
化合物２３の合成
2019168198.tif 000033
【０１２４】
化合物２１（５９．６ｍｇ、０．１４７ｍｍｏｌ）、Ｎ−エチルメチルアミン（２１４μＬ、２５．１ｍｍｏｌ）、Ｃｓ２ＣＯ３（２０２ｍｇ、０．６２０ｍｍｏｌ）、Ｐｄ２（ｄｂａ）３（１０．９ｍｇ、０．０１１９ｍｍｏｌ）、キサントホス（１０．３ｍｇ、０．０１７８ｍｍｏｌ）をトルエン（５ｍＬ）に加え、マイクロ波合成装置（Ａｎｔｏｎ  Ｐａａｒ社製、Ｍｏｎｏｗａｖｅ３００）にて、１１０℃で３時間、その後１３０℃で１時間攪拌した。反応液を室温に戻し、水を加え、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧除去した。残渣をＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔ、Ａ／Ｂ＝７０／３０→０／１００；Ａ：Ｈ２Ｏ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）、Ｂ：ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ＝８０／２０  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ））で精製し化合物２３（９．６ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ，収率１２％）を得た。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.33 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.82 (dtd, J = 20.2, 7.5, 1.3 Hz, 2H), 7.39 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.17-7.19 (m, 2H), 7.11 (dd, J = 9.6, 2.3 Hz, 1H), 7.01 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 6.97 (s, 1H), 3.49 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.32 (s, 6H), 3.14 (s, 3H), 2.31 (s, 3H), 1.29 (t, J = 7.1 Hz, 3H); HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 415.2022; found, 415.2041 (+1.89 mmu). 
The HPLC chromatogram after purification is shown below. (A/B = 80/20→0/100, 25 min; A: H2O containing 0.1% TFA (v/v), B: MeCN/H2O = 80/20 containing 0.1% TFA (v/v). 1.0 mL/min flow rate. Detection at 560 nm).
2019168198.tif 000034
【０１２５】
［合成実施例１０］
化合物２４の合成      
2019168198.tif 000035
【０１２６】
化合物２１（１０８ｍｇ、０．２４８ｍｍｏｌ）、Ｎ−メチルプロピルアミン（５００μＬ、４．９７ｍｍｏｌ）、Ｃｓ２ＣＯ３（４２９ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ）、ＲｕＰｈｏｓ  Ｐｄ  Ｇ３（４１．８ｍｇ、０．０５５０ｍｍｏｌ）をトルエン（４ｍＬ）に加え、アルゴン置換を行い、マイクロ波合成装置（Ａｎｔｏｎ  Ｐａａｒ社製、Ｍｏｎｏｗａｖｅ３００）にて、１１０℃で１時間攪拌した。反応液を室温に戻し、水を加え、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧除去した。残渣をＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔ、Ａ／Ｂ＝７０／３０→０／１００、４０分；Ａ：Ｈ２Ｏ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）、Ｂ：ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ＝８０／２０  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ））で精製し化合物２４（９．４ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ，収率７％）を得た。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.33 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.77-7.86 (m, 2H), 7.39 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.17 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 7.15 (s, 1H), 7.11 (dd, J = 9.6, 2.3 Hz, 1H), 7.00 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.96 (s, 1H), 3.43 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 3.31 (s, 6H), 3.16 (s, 3H), 2.31 (s, 3H), 1.69-1.78 (m, 2H), 0.93 (t, J = 7.3 Hz, 3H); HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 429.2178; found, 429.2194 (+1.6 mmu). 
The HPLC chromatogram after purification is shown below. (A/B = 80/20→0/100, 25 min; A: H2O containing 0.1% TFA (v/v), B: MeCN/H2O = 80/20 containing 0.1% TFA (v/v). 1.0 mL/min flow rate. Detection at 560 nm).
2019168198.tif 000036
【０１２７】
［合成実施例１１］
化合物２５の合成
2019168198.tif 000037
【０１２８】
化合物２１（１０９ｍｇ、０．２５０ｍｍｏｌ）、Ｎ−メチルブチルアミン（５８８μＬ、５．００ｍｍｏｌ）、Ｃｓ２ＣＯ３（４２３ｍｇ、１．３０ｍｍｏｌ）、Ｐｄ２（ｄｂａ）３（１４．６ｍｇ、０．０１５９ｍｍｏｌ）とキサントホス（２６．５ｍｇ、０．０４５８ｍｍｏｌ）をトルエン（１０ｍＬ）に加え、アルゴン置換を行い１００℃で２２時間攪拌した。反応液を室温に戻し、水を加え、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧除去した。残渣をＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔ、Ａ／Ｂ＝７０／３０→０／１００；Ａ：Ｈ２Ｏ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）、Ｂ：ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ＝８０／２０  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ））で精製し化合物２５（９．３ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ，収率７％）を得た。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.34-8.37 (m, 1H), 7.81-7.87 (m, 2H), 7.40-7.43 (m, 1H), 7.20 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.17 (s, 1H), 7.13 (dd, J = 10.0, 2.4 Hz, 1H), 7.03 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.99 (s, 1H), 3.49 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 3.34 (s, 6H), 3.18 (s, 3H), 2.33 (s, 3H), 1.68-1.76 (m, 2H), 1.33-1.42 (m, 2H), 0.96 (t, J = 7.2 Hz, 3H); HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 443.2335; found, 443.2364 (+3.0 mDa). 
The HPLC chromatogram after purification is shown below. (A/B = 80/20→0/100, 25 min; A: H2O containing 0.1% TFA (v/v), B: MeCN/H2O = 80/20 containing 0.1% TFA (v/v). 1.0 mL/min flow rate. Detection at 560 nm).
2019168198.tif 000038
【０１２９】
［合成実施例１２］
化合物２６の合成
2019168198.tif 000039
【０１３０】
化合物２１（５６．３ｍｇ、０．１２９ｍｍｏｌ）、Ｎ−メチルイソブチルアミン（７４５μＬ、６．２１ｍｍｏｌ）、Ｃｓ２ＣＯ３（１１６ｍｇ、０．３５６ｍｍｏｌ）、ＲｕＰｈｏｓ  Ｐｄ  Ｇ３（２３．６ｍｇ、０．０２８２ｍｍｏｌ）をトルエン（５ｍＬ）に加えアルゴン置換を行い、マイクロ波合成装置（Ａｎｔｏｎ  Ｐａａｒ社製、Ｍｏｎｏｗａｖｅ３００）にて、１００℃で３０分間攪拌した。反応液を室温に戻し、水を加え、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧除去した。残渣をＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔ、Ａ／Ｂ＝７０／３０→０／１００、４０分；Ａ：Ｈ２Ｏ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）、Ｂ：ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ＝８０／２０  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ））で精製し化合物２６（２．６ｍｇ、０．００４７ｍｍｏｌ，収率４％）を得た。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.33 (dd, J = 7.8, 1.4 Hz, 1H), 7.82 (dtd, J = 20.1, 7.5, 1.5 Hz, 2H), 7.39 (dd, J = 7.3, 1.4 Hz, 1H), 7.16-7.19 (m, 2H), 7.11 (dd, J = 9.6, 2.3 Hz, 1H), 7.01 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.97 (s, 1H), 3.34 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 3.32 (s, 6H), 3.17 (s, 3H), 2.30 (s, 3H), 2.03-2.13 (m, 1H), 0.90 (dd, J = 6.6, 1.6 Hz, 6H); HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 443.2335; found, 443.2354 (+1.9 mmu). 
The HPLC chromatogram after purification is shown below. (A/B = 80/20→0/100, 25 min; A: H2O containing 0.1% TFA (v/v), B: MeCN/H2O = 80/20 containing 0.1% TFA (v/v). 1.0 mL/min flow rate. Detection at 560 nm).
2019168198.tif 000040
【０１３１】
［合成実施例１３］
化合物２７の合成
2019168198.tif 000041
【０１３２】
化合物２２（１４．５ｍｇ、０．２６７ｍｍｏｌ）、水素化ナトリウム（油性、含量５０〜７２％）（４．３ｍｇ）をＤＭＦ（８００μＬ）に加えアルゴン置換を行い、０℃で３０分間攪拌した。ヨードエタン（１０．９μＬ、０．１３６ｍｍｏｌ）、を反応液に加え、更に１６．５時間室温で攪拌した。反応液に水を加え、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧除去した。残渣を逆相中圧分取（ｅｌｕｅｎｔ、Ａ／Ｂ＝８０／２０→１０／９０；Ａ：Ｈ２Ｏ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  酢酸トリエチルアミン（１００ｍＭ）、Ｂ：ＭｅＣＮ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ酢酸トリエチルアミン（１００ｍＭ）、及びＡ／Ｂ＝８０／２０→１０／９０；Ａ：Ｈ２Ｏ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）、Ｂ：ＭｅＣＮ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ））で精製し、化合物２７（５．８ｍｇ、０．０１０ｍｍｏｌ，収率３８％）を得た。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.34 (dd, J = 7.3 Hz, 1.4 Hz, 1H), 7.77-7.87 (m, 2H), 7.39 (dd, J = 7.3 Hz, 1.4 Hz, 1H), 7.23 (s, 1H), 7.18 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 7.12 (dd, J = 9.6 Hz, 2.3 Hz, 1H), 7.02 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.95 (s, 1H), 3.69 (s, 4H), 3.44 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 3.32 (s, 6H), 3.21 (s, 3H), 2.31 (s, 3H), 1.07 (t, J = 6.9 Hz, 3H); HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 459.2284; found, 459.2234 (-5.0 mmu).
The HPLC chromatogram after purification is shown below. (A/B = 80/20→0/100, 25 min; A: H2O containing 0.1% TFA (v/v), B: MeCN/H2O = 80/20 containing 0.1% TFA (v/v). 1.0 mL/min flow rate. Detection at 560 nm).
2019168198.tif 000042
【０１３３】
［合成実施例１４］
化合物２８の合成
2019168198.tif 000043
【０１３４】
化合物２２（３５．５ｍｇ、０．０６５２ｍｍｏｌ）、水素化ナトリウム（油性、含量５０〜７２％）（１５．７ｍｇ）をＤＭＦ（１ｍＬ）に加えアルゴン置換を行い、０℃で３０分間攪拌した。ヨードプロパン（３２μＬ、０．３２９ｍｍｏｌ）、を反応液に加え、更に１４．５時間室温で攪拌した。反応液に水を加え、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧除去した。残渣を逆相中圧分取（ｅｌｕｅｎｔ、Ａ／Ｂ＝９０／１０→１０／９０；Ａ：Ｈ２Ｏ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  酢酸トリエチルアミン（１００ｍＭ）、Ｂ：ＭｅＣＮ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ酢酸トリエチルアミン（１００ｍＭ））、及びＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔ，Ａ／Ｂ＝７０／３０→０／１００；Ａ：Ｈ２Ｏ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）、Ｂ：ＭｅＣＮ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ））で精製し、化合物２８（１３．０ｍｇ、０．０２２２ｍｍｏｌ，収率３４％）を得た。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.33 (dd, J = 7.8, 1.4 Hz, 1H), 7.77-7.86 (m, 2H), 7.38 (dd, J = 7.5 Hz, 1.1 Hz, 1H), 7.22 (s, 1H), 7.18 (d, J = 9.6, 1H), 7.11 (dd, J = 9.6 Hz, 2.3 Hz, 1H), 7.01 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.95 (s, 1H), 3.66-3.72 (m, 4H), 3.32-3.35 (m, 8H), 3.21 (s, 3H), 2.31 (s, 3H), 1.42-1.51 (m, 2H), 0.81 (t, J = 7.6 Hz, 3H); 13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ 168.0, 162.9, 161.4, 159.5, 159.5, 157.1, 135.4, 133.9, 133.0, 132.5, 132.3, 132.3, 131.6, 131.4, 130.3, 116.6, 116.2, 104.2, 97.3, 73.9, 69.3, 55.5, 41.7, 41.1, 23.9, 21.8, 10.9; HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 473.2440; found, 473.2407(-3.3 mmu).【０１３５】
［合成実施例１５］
化合物２９の合成
2019168198.tif 000044
【０１３６】
化合物２２（８９．７ｍｇ、０．１６５ｍｍｏｌ）、水素化ナトリウム（油性、含量５０〜７２％）（４６．３ｍｇ）をＤＭＦ（１ｍＬ）に加えアルゴン置換を行い、０℃で３０分間攪拌した。ヨードペンタン（１３５μＬ、１．０４ｍｍｏｌ）、を反応液に加え、更に１７時間室温で攪拌した。２Ｎ塩酸で中和し、飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧除去した。残渣を逆相中圧分取（ｅｌｕｅｎｔ、Ａ／Ｂ＝９０／１０→０／１００；Ａ：Ｈ２Ｏ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）、Ｂ：ＭｅＣＮ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）で精製し、化合物２９（５８．３ｍｇ、０．０９４９ｍｍｏｌ，収率５８％）を得た。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.36 (dd, J = 7.5, 1.1 Hz, 1H), 7.79-7.89 (m, 2H), 7.40 (dd, J = 7.3, 0.9 Hz, 1H), 7.23 (s, 1H), 7.20 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 7.13 (dd, J = 9.6, 2.3 Hz, 1H), 7.00 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.98 (s, 1H), 3.67-3.78 (m, 4H), 3.39 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.32 (s, 6H), 3.23 (s, 3H), 2.33 (s, 3H), 1.43-1.50 (m, 2H), 1.22-1.27 (m, 4H), 0.82 (t, J = 7.1 Hz, 3H); 13C-NMR (101 MHz, CD3OD) δ 167.5, 162.5, 161.3, 159.0, 159.0, 156.7, 134.8, 133.5, 132.6, 132.2, 131.9, 131.8, 131.2, 131.0, 129.8, 116.2, 116.1, 115.8, 103.7, 96.9, 71.8, 68.9, 55.1, 41.2, 40.7, 30.1, 29.1, 23.1, 21.5, 14.0; HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 501.2753; found, 501.2734 (-1.9 mDa).【０１３７】
［実施例７］
Ｐ４５０のＮ−脱アルキル活性を検出可能な新規蛍光プローブの開発（２）
合成実施例８〜１５で合成した化合物について、実施例６と同様の条件で、Ｐ４５０によって代謝されることで蛍光上昇が観察されるかの検討を行った。結果を図１４及び１５に示す。【０１３８】
図１４は、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中でＮＡＤＰＨ生成系（ＭｇＣｌ２：１．５ｍＭ、グルコース−６−リン酸：３ｍＭ、ＮＡＤＰ＋：０．３ｍＭ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ：０．５Ｕ／ｍＬ）及び１１種のＰ４５０サブタイプを用いた１μＭのローダミン誘導体（化合物２３〜２６）の時間依存性蛍光変化を示す（励起波長:５４４ｎｍ／検出波長:５９０ｎｍ）。
図１４に示されるように、これらの化合物は、実施例６の結果と同様に、ＣＹＰ３Ａに代謝されるものの、他のＰ４５０分子種にも代謝を受けることが分かる。【０１３９】
図１５は、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中でＮＡＤＰＨ生成系（ＭｇＣｌ２：１．５ｍＭ、グルコース−６−リン酸：３ｍＭ、ＮＡＤＰ＋：０．３ｍＭ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ：０．５Ｕ／ｍＬ）及び１１種のＰ４５０サブタイプを用いた１μＭのローダミン誘導体（化合物２２、２７〜２９）の時間依存性蛍光変化を示す（励起波長：５４４ｎｍ／検出波長：５９０ｎｍ）。
図１５に示されるように、いくつかの無蛍光性ローダミンが、主要なＰ４５０分子種の中でもＣＹＰ３Ａによって選択的に代謝されることが見出された。【０１４０】
［実施例８］
次に、図１５に示した化合物の代表として、化合物２９（下図）をＣＹＰ３Ａ４と反応させたときの、吸収、蛍光スペクトル変化を示す（図１６）。ＲｈｏｄａｍｉｎｅのＮ−脱アルキル化に伴う吸収波長の短波長化（ａ）、及び蛍光強度の大きな上昇が観察された（ｂ、ｃ）。
2019168198.tif 000045
【０１４１】
ここで、図１６は、ＣＹＰ３Ａ４（１０ｎＭ）及びＮＡＤＰＨ生成系（ＭｇＣｌ２：１．５ｍＭ、グルコース−６−リン酸：３ｍＭ、ＮＡＤＰ＋：０．３ｍＭ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ：０．５Ｕ／ｍＬ）を用いた０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中の１μＭ化合物２９の経時的吸収（ａ）および蛍光（ｂ、ｃ）変化を示す（励起波長：５２０ｎｍ）。【０１４２】
また、化合物２９はヒト肝ミクロソーム（ＸＥＮＯＴＥＣＨ：ＸＴｒｅｍｅ  ２００  Ｈｕｍａｎ  Ｌｉｖｅｒ  Ｍｉｃｒｏｓｏｍｅｓ）との反応によっても蛍光上昇を示し、その上昇はＣＹＰ３Ａを強く阻害する阻害剤であるｋｅｔｏｃｏｎａｚｏｌｅの添加によって抑制された（図１７）。従って、化合物２９はヒト肝ミクロソーム中でもＣＹＰ３Ａの活性を蛍光検出可能であることが明らかとなった。
ここで、図１７は、ＮＡＤＰＨ生成系（ＭｇＣｌ２：１．５ｍＭ、グルコース−６−リン酸：３ｍＭ、ＮＡＤＰ＋：０．３ｍＭ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ：０．５Ｕ／ｍＬ）およびヒト肝臓ミクロソーム（０．０５ｍｇ／ｍＬ）を用いた０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中の化合物２９（１μＭ）の時間依存性蛍光変化を示す（Ｅｘ５４４ｎｍ／Ｅｍ．５９０ｎｍ）。ヒト肝臓ミクロソーム及びＮＡＤＰＨ生成系を、化合物２９を添加する前に３０分間０．１％ＤＭＳＯまたは１０μＭケトコナゾールとプレインキュベートし、そして化合物２９を添加した直後に測定を開始した。【０１４３】
［実施例９］
次に化合物２９が生細胞でのＣＹＰ３Ａ活性を検出可能か検討した。
株式会社ケー・エー・シーより購入したＨｅｐａＲＧ（登録商標）凍結バイアル  ８Ｍ（ＨＰＲ１１６−８Ｍ）をメーカーのプロトコルに従い融解、播種し８ウェルチャンバー（松浪：ＳＣＣ−０３８  コラーゲンコート）にて六日間培養した後、化合物２９でＨｅｐａＲＧのＣＹＰ３Ａ活性が検出可能か検討した。
イメージングはコントロール群、阻害剤添加群、誘導体添加群の３種類について行った。
阻害剤としては、ケトコナゾールを用いた。ＣＹＰ３Ａ活性の誘導剤としてはリファンピシンを用い、イメージングの直前３日間、誘導体添加群にはリファンピシン２０μＭを添加し、コントロール群、阻害剤添加群にはｖｅｈｉｃｌｅとして０．１％ＤＭＳＯを添加した。【０１４４】
イメージングは以下のプロトコルに従って行った。
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【０１４５】
イメージング画像を図１８に示す。
また、それぞれの群から２ウェル×２視野×５細胞の計２０細胞をＲＯＩで囲い、その蛍光強度の分布を示したグラフを図１９に示す。【０１４６】
ここで、図１８は、０．１％ＤＭＳＯを三日間添加したＨｅｐａＲＧに、０．１％のＤＭＳＯで３０分間前処理をしたのち、１μＭの化合物２９を加え、３７℃で３０分間インキュベートした後のＨｅｐａＲＧの蛍光画像（コントロール）、０．１％ＤＭＳＯを三日間添加し、イメージング前に３０分間１μＭのケトコナゾールで前処理後、更に化合物２９を添加し37℃で30分間インキュベートした後のＨｅｐａＲＧの蛍光画像、（＋阻害剤）、及び、２０μＭのリファンピシンを三日間添加し、０．１％のＤＭＳＯで３０分間前処理をしたのち、化合物２９を加えてさらに３７℃で３０分間インキュベートした後のＨｅｐａＲＧの蛍光画像である。
Ａｒレーザーおよび対物レンズを備えた共焦点顕微鏡を用いて画像を撮影した（４０倍）。条件：励起波長５１４ｎｍ、検出波長５４０〜５９０ｎｍ（ＰＭＴ１）。【０１４７】
図１９は、図１８の実験において、各群からそれぞれ２０個の細胞を選び、それらの蛍光強度の分布を示した箱ひげ図である。【０１４８】
阻害剤添加群に比べコントロール群、誘導体添加群において強い蛍光が観察されたことから、化合物２９は生細胞においてもＣＹＰ３Ａ活性の検出が可能であることが明らかとなった。【０１４９】
創薬プロセスにおける薬物代謝試験には現在ヒト初代凍結肝細胞が使用されているが、この細胞はドナー由来の差異や、安定供給の難しさという問題を有している。一方、ヒトｉＰＳ細胞由来肝細胞はヒト初代凍結肝細胞の代替細胞となると考えられており、現在ヒトｉＰＳ細胞を肝細胞へと分化誘導させる研究が盛んに行われている。肝細胞への分化誘導研究において、ＣＹＰ３Ａ４の活性はｉＰＳ細胞から肝細胞への成熟化の指標として用いられることがあり、生細胞で使用可能なＣＹＰ３Ａ活性選択的蛍光プローブの開発はこれらｉＰＳ由来肝細胞の成熟化を可視化するツールとなると考えられ、より実用的なｉＰＳ細胞由来肝細胞の開発へと貢献することが期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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