(57)【要約】  本発明の課題は、硝子軟骨の再生を可能とするゲル形成キット、上記ゲル形成キットを用いて形成されるゲル、および上記ゲル形成キットを用いたゲルの製造方法を提供することである。本発明によれば、アミノ基と共有結合できる官能基と親水性連結基とを含む鎖を少なくとも２本以上有する架橋剤、およびリコンビナントペプチドを含む、ゲル形成キット；アミノ基と共有結合できる官能基と親水性連結基とを含む鎖を少なくとも２本以上有する架橋剤により、リコンビナントペプチドが架橋されてなる、ゲル；および上記ゲルの製造方法が提供される。
2020050205.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ基と共有結合できる官能基と親水性連結基とを含む鎖を少なくとも２本以上有する架橋剤、およびリコンビナントペプチドを含む、ゲル形成キット。
【請求項２】
架橋剤およびリコンビナントペプチドがそれぞれ、注入可能な形態である、請求項１に記載のゲル形成キット。
【請求項３】
架橋剤およびリコンビナントペプチドの組み合わせが、時間依存的なゲル化能を示す、請求項１または２に記載のゲル形成キット。
【請求項４】
架橋剤の重量平均分子量が５０００〜３００００である、請求項１から３の何れか一項に記載のゲル形成キット。
【請求項５】
アミノ基と共有結合できる官能基と親水性連結基とを含む鎖が、下記式１で示される、請求項１から４の何れか一項に記載のゲル形成キット。
Ｚ−（Ａ１）ｗ−（Ｂ１）ｘ−（Ｃ１）ｙ−        式１
式中、Ｚはアミノ基と共有結合できる官能基であり、Ａ１は疎水性の連結基であり、Ｂ１は親水性の連結基であり、Ｃ１は疎水性の連結基であり、ｗは１以上の整数であり、ｘは１以上の整数であり、ｙは０以上の整数である。
【請求項６】
アミノ基と共有結合できる官能基が、イソシアネート、イソチオシアネート、スルホニルクロリド、アルデヒド、アシルアジド、酸無水物、イミドエステル、エポキシドまたは活性エステルである、請求項１から５の何れか一項に記載のゲル形成キット。
【請求項７】
親水性連結基が、エチレンオキシド単位を含む、請求項１から６の何れか一項に記載のゲル形成キット。
【請求項８】
リコンビナントペプチドが、リコンビナントゼラチンである、請求項１から７の何れか一項に記載のゲル形成キット。
【請求項９】
リコンビナントゼラチンが、下記式で示される、請求項８に記載のゲル形成キット。
Ａ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ］ｍ−Ｂ
式中、Ａは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎは３〜１００の整数を示し、ｍは２〜１０の整数を示す。なお、ｎ個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
【請求項１０】
リコンビナントゼラチンが、
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；または
配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；
の何れかである、請求項８または９に記載のゲル形成キット。
【請求項１１】
軟骨修復剤として使用するための、請求項１から１０の何れか一項に記載のゲル形成キット。
【請求項１２】
骨髄刺激を行った後に軟骨再生を促すための軟骨修復剤として使用するための、請求項１から１１の何れか一項に記載のゲル形成キット。
【請求項１３】
さらに細胞を含む、請求項１から１２の何れか一項に記載のゲル形成キット。
【請求項１４】
細胞が滑膜由来細胞である、請求項１３に記載のゲル形成キット。
【請求項１５】
移植の際のゲルに対する細胞の濃度としては、１×１０３〜１．０×１０７ｃｅｌｌｓ／４０μＬである、請求項１３または１４に記載のゲル形成キット。
【請求項１６】
アミノ基と共有結合できる官能基と親水性連結基とを含む鎖を少なくとも２本以上有する架橋剤により、リコンビナントペプチドが架橋されてなる、ゲル。
【請求項１７】
架橋剤の重量平均分子量が５０００〜３００００である、請求項１６に記載のゲル。
【請求項１８】
アミノ基と共有結合できる官能基と親水性連結基とを含む鎖が、下記式１で示される、請求項１６または１７に記載のゲル。
Ｚ−（Ａ１）ｗ−（Ｂ１）ｘ−（Ｃ１）ｙ−        式１
式中、Ｚはアミノ基と共有結合できる官能基であり、Ａ１は疎水性の連結基であり、Ｂ１は親水性の連結基であり、Ｃ１は疎水性の連結基であり、ｗは１以上の整数であり、ｘは１以上の整数であり、ｙは０以上の整数である。
【請求項１９】
アミノ基と共有結合できる官能基が、イソシアネート、イソチオシアネート、スルホニルクロリド、アルデヒド、アシルアジド、酸無水物、イミドエステル、エポキシドまたは活性エステルである、請求項１６から１８の何れか一項に記載のゲル。
【請求項２０】
親水性連結基が、エチレンオキシド単位を含む、請求項１６から１９の何れか一項に記載のゲル。
【請求項２１】
リコンビナントペプチドが、リコンビナントゼラチンである、請求項１６から２０の何れか一項に記載のゲル。
【請求項２２】
リコンビナントゼラチンが、下記式で示される、請求項２１に記載のゲル。
Ａ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ］ｍ−Ｂ
式中、Ａは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎは３〜１００の整数を示し、ｍは２〜１０の整数を示す。なお、ｎ個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
【請求項２３】
リコンビナントゼラチンが、
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；または
配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；
の何れかである、請求項２１または２２に記載のゲル。
【請求項２４】
ゲル中における架橋剤の濃度が、０．７５質量％〜３．０質量％である、請求項１６から２３の何れか一項に記載のゲル。
【請求項２５】
軟骨修復剤として使用するための、請求項１６から２４の何れか一項に記載のゲル。
【請求項２６】
骨髄刺激を行った後に軟骨再生を促すための軟骨修復剤として使用するための、請求項１６から２５の何れか一項に記載のゲル。
【請求項２７】
さらに細胞を含む、請求項１６から２６の何れか一項に記載のゲル。
【請求項２８】
細胞が、幹細胞または軟骨細胞である、請求項２７に記載のゲル。
【請求項２９】
細胞が、間葉系幹細胞である、請求項２７または２８に記載のゲル。
【請求項３０】
細胞が、滑膜由来細胞である、請求項２７から２９の何れか一項に記載のゲル。
【請求項３１】
アミノ基と共有結合できる官能基と親水性連結基とを含む鎖を少なくとも２本以上有する架橋剤と、リコンビナントペプチドとを混合して架橋反応を行うことを含む、請求項１６から３０の何れか一項に記載のゲルの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、架橋剤およびリコンビナントペプチドを含むゲル形成キットに関する。本発明はさらに、架橋剤によりリコンビナントペプチドが架橋されてなるゲル、および上記ゲルの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節軟骨は、衝撃を緩和するクッションの役目を果たしている。過度な負荷等によって関節軟骨が損傷を受けると、痛みを伴うようになり、生活の質が著しく低下する。軟骨は重要な組織にも関わらず、一度損傷を受けると自然には修復しない。【０００３】
軟骨の自己修復能が十分でないことから、軟骨の修復を促すためには、通常、損傷軟骨切除、骨髄刺激または骨軟骨柱移植等の外科的処置が必要である。骨髄刺激は、骨髄から出血を促すことで骨髄中の幹細胞や各種の成長因子を患部に誘導するものであり、鏡視下で低侵襲的に実施可能であることから、第一選択として用いられることが多い。しかし、骨髄刺激で再生される組織は、自然な軟骨である「硝子軟骨」とは組織学・力学的性質が異なる「線維軟骨」である。線維軟骨で再生が生じると、この組織は耐久性に乏しいものとなり、やがて変形性膝関節症に至る例が報告されている。これは骨髄成分からなる血餅が早期に分解してしまい、細胞にとっての足場が失われることが原因の一つである。【０００４】
骨髄刺激の欠点を補うためには、低侵襲的に細胞の足場を患部に形成させることが考えられる。軟骨欠損部の形状は様々であるため、液体成分により患部が充填されてから、患部の形に合った足場が形成されることが望ましい。組織再建の主役である細胞の足場として機能するよう、注射する材料は細胞接着性を有していることが重要である。このような目的には、注射可能なゲルを用いることが考えられる。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の生体適合性高分子をゲル化させる試みは広く知られており、生体用シーラント剤として用いられることがある。【０００５】
一方、多くの合成高分子は細胞接着性を有さないため、組織再建の足場としては好ましくない。開創手術で用いられることのあるコラーゲン足場材は通常、水に不溶であり、注射先の患部に密着させてゲル化させることは困難である。一方、コラーゲン由来のゼラチンは水溶性であるため、多官能性ＰＥＧ等の架橋剤を用いて注射後に所望の形でゲルを形成させることが可能である。【０００６】
特許文献１には、ヒドロゲルを含む移植物であって、このヒドロゲルは、求電子基を有するマルチアームポリエーテルを含む、第一反応性前駆体と； 求核基を含む、第二反応性前駆体と； 少なくとも一つのビニル基を含む、少なくとも一つの開始性前駆体とを含む、移植物が記載されている。【０００７】
特許文献２には、コラーゲンおよびゼラチンなどから選択される天然成分を含む第一のヒドロゲル前駆体；ならびにＮ−ヒドロキシスクシンイミドなどからなる群より選択される求電子性官能基を含む第二のヒドロゲル前駆体を備える組織足場であって、第一のヒドロゲル前駆体と第二のヒドロゲル前駆体とが反応して、組織足場を形成する、組織足場が記載されている。【０００８】
特許文献３には、ポリエチレングリコールのカルボキシル末端に２個以上の求電子性脱離基を有する多官能性架橋剤によって生理的条件下で均一に架橋形成した組織再生マトリックス用グリコサミノグリカン−ポリカチオン複合体が記載されている。【０００９】
特許文献４には、ａ）１００ＥＵ／ｇ以下のエンドトキシン含有量である低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩、および、（ｂ）ＳＤＦ−１を組み合わせて用い、投与時に流動性を有する軟骨再生用組成物（ただし、ＴＧＦ−βを用いるものを除く）が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２０１１−２４５３１１号公報
【特許文献２】特開２０１１−７８７６４号公報
【特許文献３】特開２００３−５５４０１号公報
【特許文献４】特許第６１１６００９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
特許文献１および２などに記載されているゼラチンは通常、分子量分布が大きく、ゲル形成には高濃度の架橋剤が必要である。高濃度の架橋剤は細胞にとって毒性を与えることが多く、生体向け移植材料としては好ましくない。また、高濃度の架橋剤は生体内での分解に時間を要し、組織再生の妨げとなることがあることも問題である。特許文献３および４においてはヒアルロン酸またはアルギン酸塩が使用されているが、ヒアルロン酸およびアルギン酸塩も、生体由来の材料であり、未知のウイルス混入やエンドトキシン残留の可能性を完全には排除しきれないという問題がある。【００１２】
本発明の課題は、硝子軟骨の再生を可能とするゲル形成キットを提供することである。本発明の別の課題は、上記ゲル形成キットを用いて形成されるゲル、および上記ゲル形成キットを用いたゲルの製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、アミノ基と共有結合できる官能基と親水性連結基とを含む鎖を少なくとも２本以上有する架橋剤と、リコンビナントペプチドとを架橋することにより形成されるゲルが、欠損部で良好な接着性を示すこと、そして、これにより異種成分を用いることなく低侵襲的に硝子軟骨の再生が可能となることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。【００１４】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）  アミノ基と共有結合できる官能基と親水性連結基とを含む鎖を少なくとも２本以上有する架橋剤、およびリコンビナントペプチドを含む、ゲル形成キット。
（２）  架橋剤およびリコンビナントペプチドがそれぞれ、注入可能な形態である、（１）に記載のゲル形成キット。
（３）  架橋剤およびリコンビナントペプチドの組み合わせが、時間依存的なゲル化能を示す、（１）または（２）に記載のゲル形成キット。
（４）  架橋剤の重量平均分子量が５０００〜３００００である、（１）から（３）の何れか一に記載のゲル形成キット。
（５）  アミノ基と共有結合できる官能基と親水性連結基とを含む鎖が、下記式１で示される、（１）から（４）の何れか一に記載のゲル形成キット。
Ｚ−（Ａ１）ｗ−（Ｂ１）ｘ−（Ｃ１）ｙ−        式１
式中、Ｚはアミノ基と共有結合できる官能基であり、Ａ１は疎水性の連結基であり、Ｂ１は親水性の連結基であり、Ｃ１は疎水性の連結基であり、ｗは１以上の整数であり、ｘは１以上の整数であり、ｙは０以上の整数である。
（６）  アミノ基と共有結合できる官能基が、イソシアネート、イソチオシアネート、スルホニルクロリド、アルデヒド、アシルアジド、酸無水物、イミドエステル、エポキシドまたは活性エステルである、（１）から（５）の何れか一に記載のゲル形成キット。
（７）  親水性連結基が、エチレンオキシド単位を含む、（１）から（６）の何れか一に記載のゲル形成キット。
（８）  リコンビナントペプチドが、リコンビナントゼラチンである、（１）から（７）の何れか一に記載のゲル形成キット。
（９）  リコンビナントゼラチンが、下記式で示される、（８）に記載のゲル形成キット。
Ａ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ］ｍ−Ｂ
式中、Ａは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎは３〜１００の整数を示し、ｍは２〜１０の整数を示す。なお、ｎ個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
（１０）  リコンビナントゼラチンが、
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；または
配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；
の何れかである、（８）または（９）に記載のゲル形成キット。
（１１）  軟骨修復剤として使用するための、（１）から（１０）の何れか一に記載のゲル形成キット。
（１２）  骨髄刺激を行った後に軟骨再生を促すための軟骨修復剤として使用するための、（１）から（１１）の何れか一に記載のゲル形成キット。
（１３）  さらに細胞を含む、（１）から（１２）の何れか一に記載のゲル形成キット。
（１４）  細胞が滑膜由来細胞である、（１３）に記載のゲル形成キット。
（１５）  移植の際のゲルに対する細胞の濃度としては、１×１０３〜１．０×１０７ｃｅｌｌｓ／４０μＬである、（１３）または（１４）に記載のゲル形成キット。【００１５】
（１６）  アミノ基と共有結合できる官能基と親水性連結基とを含む鎖を少なくとも２本以上有する架橋剤により、リコンビナントペプチドが架橋されてなる、ゲル。
（１７）  架橋剤の重量平均分子量が５０００〜３００００である、（１６）に記載のゲル。
（１８）  アミノ基と共有結合できる官能基と親水性連結基とを含む鎖が、下記式１で示される、（１６）または（１７）に記載のゲル。
Ｚ−（Ａ１）ｗ−（Ｂ１）ｘ−（Ｃ１）ｙ−        式１
式中、Ｚはアミノ基と共有結合できる官能基であり、Ａ１は疎水性の連結基であり、Ｂ１は親水性の連結基であり、Ｃ１は疎水性の連結基であり、ｗは１以上の整数であり、ｘは１以上の整数であり、ｙは０以上の整数である。
（１９）  アミノ基と共有結合できる官能基が、イソシアネート、イソチオシアネート、スルホニルクロリド、アルデヒド、アシルアジド、酸無水物、イミドエステル、エポキシドまたは活性エステルである、（１６）から（１８）の何れか一に記載のゲル。
（２０）  親水性連結基が、エチレンオキシド単位を含む、（１６）から（１９）の何れか一に記載のゲル。
（２１）  リコンビナントペプチドが、リコンビナントゼラチンである、（１６）から（２０）の何れか一に記載のゲル。
（２２）  リコンビナントゼラチンが、下記式で示される、（２１）に記載のゲル。
Ａ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ］ｍ−Ｂ
式中、Ａは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎは３〜１００の整数を示し、ｍは２〜１０の整数を示す。なお、ｎ個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
（２３）  リコンビナントゼラチンが、
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；または
配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；
の何れかである、（２１）または（２２）に記載のゲル。
（２４）  ゲル中における架橋剤の濃度が、０．７５質量％〜３．０質量％である、（１６）から（２３）の何れか一に記載のゲル。
（２５）  軟骨修復剤として使用するための、（１６）から（２４）の何れか一に記載のゲル。
（２６）  骨髄刺激を行った後に軟骨再生を促すための軟骨修復剤として使用するための、（１６）から（２５）の何れか一に記載のゲル。
（２７）  さらに細胞を含む、（１６）から（２６）の何れか一に記載のゲル。
（２８）  細胞が、幹細胞または軟骨細胞である、（２７）に記載のゲル。
（２９）  細胞が、間葉系幹細胞である、（２７）または（２８）に記載のゲル。
（３０）  細胞が、滑膜由来細胞である、（２７）から（２９）の何れか一に記載のゲル。
（３１）  アミノ基と共有結合できる官能基と親水性連結基とを含む鎖を少なくとも２本以上有する架橋剤と、リコンビナントペプチドとを混合して架橋反応を行うことを含む、（１６）から（３０）の何れか一に記載のゲルの製造方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のゲル形成キット、ゲルおよびゲルの製造方法によれば、硝子軟骨の再生が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、各種物質の電気泳動パターンを示す。リコンビナントペプチドはＣＢＥ３である。
【図２】図２は、リン酸緩衝液濃度とゲル化時間の関係を示す。黒丸は低濃度、黒三角は中濃度、黒四角は高濃度を示す。
【図３】図３は、ブタ軟骨片と接触させたゲルの染色評価の結果を示す。
【図４】図４は、ゲル上に播種されたヒト骨髄由来間葉系幹細胞の様子を示す。
【図５】図５は、各種ゲル中で培養されたヒト骨髄由来間葉系幹細胞のｌｉｖｅ／ｄｅａｄ  ａｓｓａｙの結果を示す．緑：生細胞／赤：死細胞．中濃度ＣＢＥ３ゲル：ＣＢＥ３（３７．２３ｍｇ／ｍＬ）およびＰＥＧ（３０ｍｇ／ｍＬ），低濃度ＣＢＥ３ゲル：ＣＢＥ３（１８．６２ｍｇ／ｍＬ）およびＰＥＧ（１５ｍｇ／ｍＬ）
【図６】図６は、軟骨修復のスコアリング結果を示す。
【図７】図７は、軟骨組織のＩＩ型コラーゲン（ＣｏｌII）免疫染色像を示す。茶色はＣｏｌII陽性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
［ゲル形成キット］
本発明のゲル形成キットは、アミノ基と共有結合できる官能基と親水性連結基とを含む鎖を少なくとも２本以上有する架橋剤、およびリコンビナントペプチドを含む。
【００１９】
本発明においては、リコンビナントペプチドを、アミノ基と共有結合できる官能基と親水性連結基とを含む鎖を少なくとも２本以上有する架橋剤で架橋させることにより製造されるゲルが、欠損部で良好な軟骨修復作用を示すことが実証された。本発明はリコンビナントペプチドを使用するものであることから、異種成分を用いることなく低侵襲的に硝子軟骨を再生することができる。
【００２０】
本発明のゲル形成キットにおいては、架橋剤およびリコンビナントペプチドはそれぞれ、注入可能な形態としてキットに含めることができる。注入可能とはシリンジ針を通過可能な物質であり、好ましくは流動性のある溶液または懸濁液であり、特に好ましくは均質な水溶液である。注入可能な形態としては、溶液、懸濁液、粉末などが挙げられるが、特に限定されない。粉末の場合には、使用時に液体に溶解または懸濁してから使用することができる。
【００２１】
架橋剤およびリコンビナントペプチドの組み合わせは、時間依存的なゲル化能を示す組み合わせでもよい。時間依存的なゲル化能とは、注入された先で即時〜６０分の間でゲル化することを意味し、５〜１０分の間であることがより好ましい。
架橋剤およびリコンビナントペプチドは、動物の体温でゲル化することの観点から、３０℃〜５０℃でゲル化が進むことが好ましく、３０℃〜４０℃でゲル化が進むことが更に好ましく、３５℃〜４０℃でゲル化が進むことが最も好ましい。
【００２２】
（架橋剤）
本発明で用いる架橋剤は、アミノ基と共有結合できる官能基と親水性連結基とを含む鎖を少なくとも２本以上有する。アミノ基と共有結合できる官能基と親水性連結基とを含む鎖の数（即ち、枝分かれ構造の数）は、２本以上であれば特に限定されず、２本、３本、４本、５本、６本、７本、８本、９本、１０本またはそれ以上でもよいが、好ましくは２本〜８本であり、より好ましくは２本〜６本である。４分岐の高分子を用いると均一な三次元網目構造ができることから、最も好ましくは４本である。
上記の鎖を２本以上有することにより、架橋剤は、アミノ基と共有結合できる官能基を２個以上有することになる。
【００２３】
架橋剤の重量平均分子量は特に限定されないが、均一な網目構造を形成できることから、好ましくは５０００〜４００００であり、より好ましくは５０００〜３００００であり、さらに好ましくは１００００〜３００００であり、特に好ましくは１５０００〜２５０００であり、一例としては２００００を挙げることができる。
【００２４】
アミノ基と共有結合できる官能基と親水性連結基とを含む鎖は、好ましくは下記式１で示される。
Ｚ−（Ａ１）ｗ−（Ｂ１）ｘ−（Ｃ１）ｙ−        式１
式中、Ｚはアミノ基と共有結合できる官能基であり、Ａ１は疎水性の連結基であり、Ｂ１は親水性の連結基であり、Ｃ１は疎水性の連結基であり、ｗは１以上の整数であり、ｘは１以上の整数であり、ｙは０以上の整数である。
【００２５】
架橋剤は、好ましくは下記式２で表される。
［Ｚ−（Ａ１）ｗ−（Ｂ１）ｘ−（Ｃ１）ｙ−］ｖ−ＣＨｎ      式２
式中、Ｚはアミノ基と共有結合できる官能基であり、Ａ１は疎水性の連結基であり、Ｂ１は親水性の連結基であり、Ｃ１は疎水性の連結基であり、ｗは１以上の整数であり、ｘは１以上の整数であり、ｙは０以上の整数であり、ｖは２から４の整数であり、ｎは０から２の整数である。但し、ｖ＋ｎは４である。
【００２６】
Ｚ、Ａ１、Ｂ１、Ｃ１は各枝の中、また枝間で同じでも異なっていてもよく、ｗ、ｘ、ｙ同士は枝間で同じでも異なっていてもよい。
【００２７】
ｗは、好ましくは１〜１０の整数であり、より好ましくは１〜５の整数である。
ｘは、好ましくは１０〜３００の整数であり、より好ましくは２０〜２００の整数である。
ｙは、好ましくは０〜５の整数であり、より好ましくは０〜３の整数である。
ｖは好ましくは４であり、ｎは好ましくは０である。
【００２８】
アミノ基と共有結合できる官能基としては、イソシアネート、イソチオシアネート、スルホニルクロリド、アルデヒド、アシルアジド、酸無水物、イミドエステル、エポキシドまたは活性エステルを挙げることができるが、特に限定されない。生体ｐＨで容易に反応が進行するという観点から、より好ましくはアミノ基と共有結合できる官能基は、スクシンイミジル基である。架橋剤は、アミノ基と共有結合できる官能基を２個以上有するが、官能基は同一のものでもよいし、異なるものでもよい。
【００２９】
親水性連結基としては、エチレンオキシド基（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）、またはエチレンオキシド単位を含む基を挙げることができるが、特に限定されない。親水性連結基がエチレンオキシド基（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）、またはエチレンオキシド単位を含む基である場合における架橋剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）架橋剤とも言う。架橋剤としては、ＰＥＧ架橋剤が好ましい。なお、ＰＥＧ架橋剤を使用する場合、ＰＥＧ架橋剤以外の他の架橋剤を併用してもよい。
【００３０】
Ａ１が示す疎水性の連結基としては、炭素数１〜３の炭化水素基を挙げることができ、好ましくはメチレン基またはエチレン基である。Ａ１が示す疎水性の連結基は、末端に−Ｏ−、−ＣＯ−または−ＣＯＯ−などの連結基を有していてもよい。
Ｃ１が示す疎水性の連結基としては、炭素数１〜３の炭化水素基を挙げることができ、好ましくはメチレン基またはエチレン基である。Ｃ１が示す疎水性の連結基は、末端に−Ｏ−、−ＣＯ−または−ＣＯＯ−などの連結基を有していてもよい。
【００３１】
本発明で用いる架橋剤は、好ましくは、組織接着性を有する。組織接着性とは、設置時に架橋剤が設置部組織との間に化学結合または物理結合しうることを意味する。好ましくは、架橋剤と組織表面タンパク質のアミノ基との化学結合である。
【００３２】
（リコンビナントペプチド）
本発明で用いるリコンビナントペプチドとしては、生体親和性を有するものが好ましい。生体親和性とは、生体に接触した際に、長期的かつ慢性的な炎症反応などのような顕著な有害反応を惹起しないことを意味する。
【００３３】
リコンビナントペプチドには細胞接着性を高める工夫がなされていてもよい。具体的には、「基材表面に対する細胞接着基質（フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン）や細胞接着配列（アミノ酸一文字表記で表される、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、およびＨＡＶ配列）ペプチドによるコーティング」、「基材表面のアミノ化、カチオン化」、または「基材表面のプラズマ処理、コロナ放電による親水性処理」といった方法を使用できる。
【００３４】
アミノ基と共有結合できる官能基（スクシンイミジル基など）が反応できるためには、リコンビナントペプチドとしては、リジンを含むペプチドが好ましく、リジンを５％以上含むペプチドがより好ましい。
【００３５】
リコンビナントペプチドの種類は特に限定されないが、例えば、ゼラチン、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、プロネクチン、ラミニン、テネイシン、フィブリン、フィブロイン、エンタクチン、トロンボスポンジン、レトロネクチンが好ましく、より好ましくはゼラチン、コラーゲン、アテロコラーゲンであり、最も好ましくはゼラチンである。リコンビナントゼラチンについては、本明細書中後記する。
【００３６】
本発明で用いるリコンビナントペプチドの親水性値「１／ＩＯＢ」値は、０から１．０が好ましい。より好ましくは、０から０．６であり、さらに好ましくは０から０．４である。ＩＯＢとは、藤田穆により提案された有機化合物の極性/非極性を表す有機概念図に基づく、親疎水性の指標であり、その詳細は、例えば、"Pharmaceutical Bulletin", vol.2, 2, pp.163-173（1954）、「化学の領域」vol.11, 10, pp.719-725（1957）、「フレグランスジャーナル」, vol.50, pp.79-82（1981）等で説明されている。簡潔に言えば、全ての有機化合物の根源をメタン（ＣＨ４）とし、他の化合物はすべてメタンの誘導体とみなして、その炭素数、置換基、変態部、環等にそれぞれ一定の数値を設定し、そのスコアを加算して有機性値（ＯＶ）、無機性値（ＩＶ）を求め、この値を、有機性値をＸ軸、無機性値をＹ軸にとった図上にプロットしていくものである。有機概念図におけるＩＯＢとは、有機概念図における有機性値（ＯＶ）に対する無機性値（ＩＶ）の比、すなわち「無機性値（ＩＶ）／有機性値（ＯＶ）」をいう。有機概念図の詳細については、「新版有機概念図−基礎と応用−」（甲田善生等著、三共出版、２００８）を参照されたい。本明細書中では、ＩＯＢの逆数をとった「１／ＩＯＢ」値で親疎水性を表している。「１／ＩＯＢ」値が小さい（０に近づく）程、親水性であることを表す表記である。
【００３７】
本発明で用いるリコンビナントペプチドの「１／ＩＯＢ」値を上記範囲とすることにより、親水性が高く、かつ、吸水性が高くなる。
【００３８】
本発明で用いるリコンビナントペプチドは、Grand average of hydropathicity（GRAVY）値で表される親疎水性指標において、０．３以下、マイナス９．０以上であることが好ましく、０．０以下、マイナス７．０以上であることがさらに好ましい。Grand average of hydropathicity（GRAVY）値は、『Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins M.R., Appel R.D., Bairoch A.;Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server;(In) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005). pp. 571-607』および『Gasteiger E., Gattiker A., Hoogland C., Ivanyi I., Appel R.D., Bairoch A.; ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.; Nucleic Acids Res. 31:3784-3788(2003).』の方法により得ることができる。
本発明で用いるリコンビナントペプチドのＧＲＡＶＹ値を上記範囲とすることにより、親水性が高く、かつ、吸水性が高くなる。
【００３９】
（リコンビナントゼラチン）
リコンビナントペプチドとしては、リコンビナントゼラチンが好ましい。
リコンビナントゼラチンとは、遺伝子組み換え技術により作られたゼラチン類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくは蛋白様物質を意味する。本発明で用いることができるリコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列（ＸおよびＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す）の繰り返しを有するものが好ましい。ここで、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。好ましくは、細胞接着シグナルが一分子中に２配列以上含まれている。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとしては、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するゼラチンを用いることができる。例えばＥＰ１０１４１７６、米国特許第６９９２１７２号、国際公開ＷＯ２００４／８５４７３、国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１等に記載のものを用いることができるが、これらに限定されるものではない。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとして好ましいものは、以下の態様のゼラチンである。
【００４０】
リコンビナントゼラチンは、天然のゼラチン本来の性能から、生体親和性に優れ、且つ天然由来ではないことで牛海綿状脳症（ＢＳＥ）などの懸念がなく、非感染性に優れている。また、リコンビナントゼラチンは天然ゼラチンと比べて均一であり、配列が決定されているので、強度および分解性においても架橋等によってブレを少なく精密に設計することが可能である。
【００４１】
リコンビナントゼラチンの分子量は、特に限定されないが、好ましくは２０００以上１０００００以下（２ｋＤａ以上１００ｋＤａ以下）であり、より好ましくは２５００以上９５０００以下（２．５ｋＤａ以上９５ｋＤａ以下）であり、さらに好ましくは５０００以上９００００以下（５ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下）であり、最も好ましくは１００００以上９００００以下（１０ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下）である。
リコンビナントゼラチンの分子量分布は特に限定されないが、分子量分布測定における最大の分子量ピークの面積が、全ての分子量ピークの合計面積の７０％以上であるリコンビナントゼラチンを含むことが好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上が最も好ましい。リコンビナントゼラチンの分子量分布は、PCT/JP2017/012284に記載の方法で測定することができる。
【００４２】
リコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列の繰り返しを有することが好ましい。ここで、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ において、Ｇｌｙはグリシンを表し、ＸおよびＹは、任意のアミノ酸（好ましくは、グリシン以外の任意のアミノ酸）を表す。コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列とは、ゼラチン・コラーゲンのアミノ酸組成および配列における、他のタンパク質と比較して非常に特異的な部分構造である。この部分においてはグリシンが全体の約３分の１を占め、アミノ酸配列では３個に１個の繰り返しとなっている。グリシンは最も簡単なアミノ酸であり、分子鎖の配置への束縛も少なく、ゲル化に際してのヘリックス構造の再生に大きく寄与している。ＸおよびＹで表されるアミノ酸にはイミノ酸（プロリン、オキシプロリン）が多く含まれ、全体の１０％〜４５％を占めることが好ましい。好ましくは、リコンビナントゼラチンの配列の８０％以上、更に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上のアミノ酸が、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙの繰り返し構造である。
【００４３】
一般的なゼラチンは、極性アミノ酸のうち電荷を持つものと無電荷のものが１：１で存在する。ここで、極性アミノ酸とは具体的にシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシンおよびアルギニンを指し、このうち極性無電荷アミノ酸とはシステイン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニンおよびチロシンを指す。本発明で用いるゼラチンにおいては、構成する全アミノ酸のうち、極性アミノ酸の割合が１０〜４０％であり、好ましくは２０〜３０％である。且つ上記極性アミノ酸中の無電荷アミノ酸の割合が５％以上２０％未満、好ましくは５％以上１０％未満であることが好ましい。さらに、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシンおよびシステインのうちいずれか１種のアミノ酸、好ましくは２種以上のアミノ酸を配列上に含まないことが好ましい。
【００４４】
一般にポリペプチドにおいて、細胞接着シグナルとして働く最小アミノ酸配列が知られている（例えば、株式会社永井出版発行「病態生理」Ｖｏｌ．９、Ｎｏ．７（１９９０年）５２７頁）。本発明で用いるゼラチンは、これらの細胞接着シグナルを１分子中に２以上有することが好ましい。具体的な配列としては、接着する細胞の種類が多いという点で、アミノ酸一文字表記で表される、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、およびＨＡＶ配列の配列が好ましい。さらに好ましくはＲＧＤ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＩＫＶＡＶ配列およびＨＡＶ配列、特に好ましくはＲＧＤ配列である。ＲＧＤ配列のうち、好ましくはＥＲＧＤ配列である。細胞接着シグナルを有するゼラチンを用いることにより、細胞の基質産生量を向上させることができる。例えば、細胞として、間葉系幹細胞を用いた軟骨分化の場合には、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の産生を向上させることができる。
【００４５】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおけるＲＧＤ配列の配置としては、ＲＧＤ間のアミノ酸数が０〜１００の間、好ましくは２５〜６０の間で均一でないことが好ましい。
この最小アミノ酸配列の含有量は、細胞接着・増殖性の観点から、タンパク質１分子中３〜５０個が好ましく、さらに好ましくは４〜３０個、特に好ましくは５〜２０個である。最も好ましくは１２個である。
【００４６】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおいて、アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は少なくとも０．４％であることが好ましい。リコンビナントゼラチンが３５０以上のアミノ酸を含む場合、３５０のアミノ酸の各ストレッチが少なくとも１つのＲＧＤモチーフを含むことが好ましい。アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は、更に好ましくは少なくとも０．６％であり、更に好ましくは少なくとも０．８％であり、更に好ましくは少なくとも１．０％であり、更に好ましくは少なくとも１．２％であり、最も好ましくは少なくとも１．５％である。ペプチド内のＲＧＤモチーフの数は、２５０のアミノ酸あたり、好ましくは少なくとも４、更に好ましくは少なくとも６、更に好ましくは少なくとも８、更に好ましくは１２以上１６以下である。ＲＧＤモチーフの０．４％という割合は、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも１つのＲＧＤ配列に対応する。ＲＧＤモチーフの数は整数であるので、少なくとも０．４％の特徴を満たすには、２５１のアミノ酸からなるリコンビナントゼラチンは、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含まなければならない。好ましくは、リコンビナントゼラチンは、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含み、より好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも３つのＲＧＤ配列を含み、さらに好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも４つのＲＧＤ配列を含む。本発明におけるリコンビナントゼラチンのさらなる態様としては、少なくとも４つのＲＧＤモチーフ、好ましくは少なくとも６つ、より好ましくは少なくとも８つ、さらに好ましくは１２以上１６以下のＲＧＤモチーフを含む。
【００４７】
リコンビナントゼラチンは部分的に加水分解されていてもよい。
【００４８】
好ましくは、本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、Ａ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ］ｍ−Ｂで示されるものである。ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。ｍは好ましくは２〜１０の整数を示し、より好ましくは３〜５の整数を示す。ｎは３〜１００の整数が好ましく、１５〜７０の整数がさらに好ましく、５０〜６５の整数が最も好ましい。Ａは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示す。なお、ｎ個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
【００４９】
より好ましくは、本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、  式：Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）６３］３−Ｇｌｙ（式中、６３個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、６３個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、６３個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）で示されるものである。
【００５０】
繰り返し単位には天然に存在するコラーゲンの配列単位を複数結合することが好ましい。ここで言う天然に存在するコラーゲンとは天然に存在するものであればいずれでも構わないが、好ましくはＩ型、II型、III型、IV型、またはV型コラーゲンである。より好ましくは、I型、II型、またはIII型コラーゲンである。別の形態によると、上記コラーゲンの由来は好ましくは、ヒト、ウシ、ブタ、マウスまたはラットであり、より好ましくはヒトである。
【００５１】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンの等電点は、好ましくは５〜１０であり、より好ましくは６〜１０であり、さらに好ましくは７〜９．５である。リコンビナントゼラチンの等電点の測定は、等電点電気泳動法（Ｍａｘｅｙ，Ｃ．Ｒ．（１９７６；Ｐｈｉｔｏｇｒ．Ｇｅｌａｔｉｎ ２，Ｅｄｉｔｏｒ Ｃｏｘ，Ｐ．Ｊ．Ａｃａｄｅｍｉｃ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌ．参照）に従って、１質量％リコンビナントゼラチン溶液をカチオンおよびアニオン交換樹脂の混晶カラムに通したあとのｐＨを測定することで実施することができる。
【００５２】
好ましくは、リコンビナントゼラチンは脱アミン化されていない。
好ましくは、リコンビナントゼラチンはテロペプタイドを有さない。
好ましくは、リコンビナントゼラチンは、アミノ酸配列をコードする核酸により調製された実質的に純粋なポリペプチドである。
【００５３】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンとして特に好ましくは、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；または
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上（さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；
の何れかである
【００５４】
「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」における「１若しくは数個」とは、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個を意味する。
【００５５】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、当業者に公知の遺伝子組み換え技術によって製造することができ、例えばＥＰ１０１４１７６Ａ２号公報、米国特許第６９９２１７２号公報、国際公開ＷＯ２００４／８５４７３号、国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号等に記載の方法に準じて製造することができる。具体的には、所定のリコンビナントゼラチンのアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得し、これを発現ベクターに組み込んで、組み換え発現ベクターを作製し、これを適当な宿主に導入して形質転換体を作製する。得られた形質転換体を適当な培地で培養することにより、リコンビナントゼラチンが産生されるので、培養物から産生されたリコンビナントゼラチンを回収することにより、本発明で用いるゼラチンを調製することができる。
【００５６】
（軟骨修復剤）
本発明のゲル形成キットは、軟骨修復剤として使用することができ、特に骨髄刺激を行った後に軟骨再生を促すための軟骨修復剤として使用することができる。
【００５７】
本発明のゲル形成キットは、軟骨形成促進効果が有効に利用できる限り、種々の用途に使用することができる。
【００５８】
軟骨は、関節、胸郭壁、椎間板、半月板や、喉頭、気道、耳などの管状構造にみられ、硝子軟骨、弾性軟骨、線維軟骨の３種に分類できる。例えば、関節軟骨は硝子軟骨であり、軟骨細胞、コラーゲン性の細胞外マトリックス、プロテオグリカンおよび水からなり、血管が分布していない。硝子軟骨は、タイプＩＩコラーゲンに富み、抗タイプＩＩコラーゲン抗体により染色される、プロテオグリカンを染色するサフラニン−０染色で赤色に染色される、などの特徴を有する。
【００５９】
本発明のゲル形成キットは、例えば、軟骨の変性または破壊による軟骨機能不全を伴う軟骨疾患、外傷や手術による軟骨の損傷・切除、先天的な軟骨の低形成や奇形の治療に有用である。また細胞移植による軟骨欠損修復においては、未分化前駆細胞からの軟骨誘導、または軟骨細胞の形質維持に有用である。このような軟骨疾患の例としては、例えば、変形性関節症、慢性関節リウマチ、離断性骨軟骨炎、外傷による関節軟骨の損傷、椎間板ヘルニアなどが挙げられる。また先天的な軟骨の低形成や奇形の例としては、例えば、無耳症、小耳症などがあげられる。本発明のゲル形成キットは、軟骨関連疾患の治療または予防剤として使用することができる。
【００６０】
本発明のゲル形成キットは、軟骨修復剤として使用する場合、架橋剤およびリコンビナントペプチドを混合して、対象者に局所的に投与することができる。
【００６１】
本発明のゲル形成キットにはさらに、アミノ基と共有結合できる官能基と親水性連結基とを含む鎖を少なくとも２本以上有する架橋剤、およびリコンビナントペプチドを対象に投与するための指示書を含めてもよい。
【００６２】
本発明によれば、アミノ基と共有結合できる官能基と親水性連結基とを含む鎖を少なくとも２本以上有する架橋剤、およびリコンビナントペプチドの混合物を、軟骨の修復を必要とする対象に投与することを含む、軟骨を修復する方法が提供される。
本発明によれば、アミノ基と共有結合できる官能基と親水性連結基とを含む鎖を少なくとも２本以上有する架橋剤、およびリコンビナントペプチドを同時にまたは逐次に、軟骨の修復を必要とする対象に投与することを含む、軟骨を修復する方法が提供される。
【００６３】
本発明によれば、アミノ基と共有結合できる官能基と親水性連結基とを含む鎖を少なくとも２本以上有する架橋剤、およびリコンビナントペプチドの混合物を、対象に投与することを含む、軟骨関連疾患の治療または予防方法が提供される。
本発明によれば、アミノ基と共有結合できる官能基と親水性連結基とを含む鎖を少なくとも２本以上有する架橋剤、およびリコンビナントペプチドを同時にまたは逐次に、対象に投与することを含む、軟骨関連疾患の治療または予防方法が提供される。
【００６４】
本発明によれば、軟骨の修復において使用するための、アミノ基と共有結合できる官能基と親水性連結基とを含む鎖を少なくとも２本以上有する架橋剤、およびリコンビナントペプチドを含む、ゲル形成キットが提供される。
本発明によれば、軟骨関連疾患の治療または予防において使用するための、アミノ基と共有結合できる官能基と親水性連結基とを含む鎖を少なくとも２本以上有する架橋剤、およびリコンビナントペプチドを含む、ゲル形成キットが提供される。
【００６５】
本発明によれば、軟骨の修復において使用するための、アミノ基と共有結合できる官能基と親水性連結基とを含む鎖を少なくとも２本以上有する架橋剤により、リコンビナントペプチドが架橋されてなる、ゲルが提供される。
本発明によれば、軟骨関連疾患の治療または予防において使用するための、アミノ基と共有結合できる官能基と親水性連結基とを含む鎖を少なくとも２本以上有する架橋剤により、リコンビナントペプチドが架橋されてなる、ゲルが提供される。
【００６６】
本発明によれば、軟骨修復剤の製造のための、アミノ基と共有結合できる官能基と親水性連結基とを含む鎖を少なくとも２本以上有する架橋剤、およびリコンビナントペプチドを含む、ゲル形成キットの使用が提供される。
本発明によれば、軟骨関連疾患の治療または予防剤の製造のための、アミノ基と共有結合できる官能基と親水性連結基とを含む鎖を少なくとも２本以上有する架橋剤、およびリコンビナントペプチドを含む、ゲル形成キットの使用が提供される。
【００６７】
本発明によれば、軟骨修復剤の製造のための、アミノ基と共有結合できる官能基と親水性連結基とを含む鎖を少なくとも２本以上有する架橋剤により、リコンビナントペプチドが架橋されてなる、ゲルの使用が提供される。
本発明によれば、軟骨関連疾患の治療または予防剤の製造のための、アミノ基と共有結合できる官能基と親水性連結基とを含む鎖を少なくとも２本以上有する架橋剤により、リコンビナントペプチドが架橋されてなる、ゲルの使用が提供される。
【００６８】
＜ゲルおよびゲルの製造方法＞
本発明によれば、アミノ基と共有結合できる官能基と親水性連結基とを含む鎖を少なくとも２本以上有する架橋剤により、リコンビナントペプチドが架橋されてなる、ゲルが提供される。
架橋剤およびリコンビナントペプチドについての詳細および好ましい態様は、本明細書中において上記した通りである。
【００６９】
本発明のゲルは、好ましくは軟骨修復剤として使用することができ、より好ましくは骨髄刺激を行った後に軟骨再生を促すための軟骨修復剤として使用することができる。軟骨修復剤についての詳細は、本明細書中において上記した通りである。
【００７０】
本発明のゲル中における架橋剤の濃度（最終濃度）は、好ましくは０．７５質量％〜６質量％であり、好ましくは０．７５質量％〜３．０質量％であり、さらに好ましくは０．７５質量％〜１．５質量％である。また、リコンビナントペプチドの質量濃度に対する架橋剤の質量濃度は０．８倍〜６．５倍であることが好ましく、細胞毒性の観点からは、０．８倍〜１．６倍であることが好ましく、０．８倍がより好ましい。
【００７１】
本発明のゲルは、アミノ基と共有結合できる官能基と親水性連結基とを含む鎖を少なくとも２本以上有する架橋剤と、リコンビナントペプチドとを混合して架橋反応を行うことにより製造することができる。
架橋反応溶液における架橋剤の濃度は、好ましくは１５〜６０ｇ／Ｌの範囲であり、より好ましくは２０〜５０ｇ／Ｌであり、さらに好ましくは２５〜４０ｇ／Ｌであり、特に好ましくは２５〜３５ｇ／Ｌであり、一例としては３０ｇ／Ｌである。活性末端モル濃度比である［アミノ基（−ＮＨ２）］：［アミノ基と共有結合できる官能基］は１：２〜４：１の範囲であり、好ましくは４：１である。
架橋反応溶液におけるリコンビナントペプチドの濃度は、好ましくは１．９質量％〜１５質量％であり、より好ましくは１．９質量％〜７．４質量％であり、さらに好ましくは１．９質量％〜３．７質量％である。
ゲルは溶媒を含んでいても良い。溶媒は水系のものが好ましく、水系緩衝液が好ましく、リン酸緩衝液が最も好ましい。
【００７２】
本発明のゲルは、細胞を含んでいてもよい。
細胞は、細胞移植を行えるものであれば任意の細胞を使用することができ、その種類は特に限定されない。また、使用する細胞は１種でもよいし、複数種の細胞を組合せて用いてもよい。また、使用する細胞として、好ましくは、動物細胞であり、より好ましくは脊椎動物由来細胞、特に好ましくはヒト由来細胞である。脊椎動物由来細胞（特に、ヒト由来細胞）の種類は、幹細胞、前駆細胞、または成熟細胞の何れでもよく、幹細胞が最も好ましい。移植細胞としては幹細胞が好ましく、間葉系幹細胞がより好ましく、滑膜由来幹細胞が最も好ましい。
【００７３】
幹細胞としては、例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、生殖幹（ＧＳ）細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、造血幹細胞、羊膜細胞、臍帯血細胞、骨髄由来細胞、心筋幹細胞、脂肪由来幹細胞、滑膜由来幹細胞または神経幹細胞を使用することができる。
【００７４】
前駆細胞および成熟細胞としては、例えば、皮膚、真皮、表皮、筋肉、心筋、神経、骨、軟骨、内皮、脳、上皮、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、口腔内、角膜、骨髄、臍帯血、羊膜、または毛に由来する細胞を使用することができる。
【００７５】
ヒト由来細胞としては、例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、ＭＳＣ、軟骨細胞、骨芽細胞、骨芽前駆細胞、間充織細胞、筋芽細胞、心筋細胞、心筋芽細胞、神経細胞、肝細胞、ベータ細胞、線維芽細胞、角膜内皮細胞、血管内皮細胞、角膜上皮細胞、羊膜細胞、臍帯血細胞、骨髄由来細胞、滑膜由来細胞、または造血幹細胞を使用することができる。また、細胞の由来は、自家細胞または他家細胞の何れでも構わない。
【００７６】
また本発明においては、血管系細胞を使用することもできる。本明細書において、血管系細胞とは、血管形成に関連する細胞を意味し、血管および血液を構成する細胞、およびその細胞に分化することができる前駆細胞、体性幹細胞である。ここで、血管系細胞には、ＥＳ細胞、ＧＳ細胞、またはｉＰＳ細胞等の万能細胞および間葉系幹細胞（ＭＳＣ）のような、血管および血液を構成する細胞に自然には分化しない細胞は含まれない。血管系細胞として、好ましくは血管を構成する細胞である。脊椎動物由来細胞（特に、ヒト由来細胞）では、血管を構成する細胞の具体例としては、血管内皮細胞および血管平滑筋細胞を挙げることができる。血管内皮細胞は、静脈内皮細胞および動脈内皮細胞の何れでもよい。血管内皮細胞の前駆細胞としては、血管内皮前駆細胞を使用することができる。好ましくは血管内皮細胞および血管内皮前駆細胞である。血液を構成する細胞としては、血球細胞が使用でき、リンパ球や好中球などの白血球細胞、単球細胞、それらの幹細胞である造血幹細胞を使用できる。
【００７７】
本明細書において、非血管系細胞とは、上記の血管系細胞以外の細胞を意味する。例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、心筋幹細胞、心筋細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、軟骨細胞、滑膜由来細胞、肝細胞または神経細胞を使用することができる。
本発明における細胞としては、好ましくは、幹細胞、軟骨細胞または滑膜由来細胞を使用することができる。
【００７８】
移植の際のゲルに対する細胞の濃度としては、１×１０３〜１．０×１０７ｃｅｌｌｓ／４０μＬが好ましく、１×１０４〜１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／４０μＬがより好ましく、１×１０５〜５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／４０μＬが最も好ましい。
移植細胞数としては細胞が入っていればよいが、欠損（直径５ｍｍ×深さ２ｍｍ）あたり、１×１０３〜１．０×１０７ｃｅｌｌｓが好ましく、１×１０４〜１．０×１０６ｃｅｌｌｓがより好ましく、１×１０５〜５．０×１０５ｃｅｌｌｓが最も好ましい。
【００７９】
本発明のゲルは、サイトカインを含むものでもよいし、サイトカインを含まないものでもよい。
サイトカインの種類は特に限定されないが、例えば、造血因子（例えば、コロニー刺激因子（Ｃｏｌｏｎｅｙ−Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ  （ＣＳＦ））、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−（Ｇ−）ＣＳＦ）、エリスロポエチン（Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ（ＥＰＯ）など）、細胞増殖因子（例えば、上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ））、線維芽細胞成長因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＦＧＦ））、血小板由来成長因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＰＤＧＦ））、肝細胞成長因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｏ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＨＧＦ））、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）など）、および神経栄養因子（例えば、神経成長因子（ＮＧＦ）など）を挙げることができる。
本発明のゲルは弾性率としては強度の面からは、１ｋＰａ以上が好ましく、３ｋＰａ以上がより好ましく、５ｋＰａ以上が最も好ましい。
本発明のゲルは周囲の組織を傷つけないようにする点から１５ｋＰａ以下が好ましく、１０ｋＰａ以下が好ましく、６ｋＰａ以下が最も好ましい。
本発明のゲルは圧縮破断強度としては強度の面からは０．０１ＭＰａ以上が好ましく、０．１ＭＰａ以上がより好ましく、０．２ＭＰａ以上が最も好ましい。
本発明のゲルの一例としては、ＳＤＦ−１（Ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  １）を含まないゲルを挙げることができる。
ゲルを調整する緩衝液は、緩衝液であればよく、アミノ基を遮蔽できるものであれば好ましく、リン酸緩衝液が最も好ましい。
緩衝液の濃度としては、いくらでもよいが、ゲル化時間を制御する点で０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌが好ましく、１０〜３００ｍｍｏｌ／Ｌがより好ましく、２５〜７５ｍｍｏｌ／Ｌが最も好ましい。
【００８０】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００８１】
［参考例１］リコンビナントペプチド（リコンビナントゼラチン）
リコンビナントペプチド（リコンビナントゼラチン）として以下のＣＢＥ３を用意した（国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号公報に記載）。
ＣＢＥ３：
分子量：５１．６ｋＤ
構造：ＧＡＰ［（ＧＸＹ）６３］３Ｇ
アミノ酸数：５７１個
ＲＧＤ配列：１２個
イミノ酸含量：３３％
ほぼ１００％のアミノ酸がＧＸＹの繰り返し構造である。ＣＢＥ３のアミノ酸配列には、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシンおよびシステインは含まれていない。ＣＢＥ３はＥＲＧＤ配列を有している。
等電点：９．３４
ＧＲＡＶＹ値：−０．６８２
１／ＩＯＢ値：０．３２３
アミノ酸配列（配列表の配列番号１）（国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号公報の配列番号３と同じ。但し末尾のＸは「Ｐ」に修正）
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G【００８２】
［実施例１］
１．ゲルの調製
ＣＢＥ３（質量平均分子量（Ｍｗ）＝５１．２ｋｇ／ｍｏｌ，１８．６２〜１４８．９２ｇ／Ｌ，［−ＮＨ２］１２〜９６ｍｍｏｌ／Ｌ）および市販のＰＥＧ架橋剤（Ｍｗ＝２０ｋｇ／ｍｏｌ，１２０ｇ／Ｌ，［−ＯＳｕ］２４ｍｍｏｌ／Ｌ，商品名：日油株式会社ＰＴＥ−２００ＨＳ）を、それぞれ別の容器でリン酸緩衝生理食塩水（商品名：ＰＢＳ  ｐＨ７．４）（ThermoFisher Scientific社製）に溶解させた。Ｓｕは、スクシンイミジル基を示す。このとき、構成高分子の末端のアミノ基とスクシンイミジル基の比が１：２から４：１になるよう、予め複数の濃度のＣＢＥ３溶液を調製した。なお、ＣＢＥ３の分子量は約５１ｋＤａであり、図１に示す各種物質の電気泳動パターンからもわかる通り、ブタ由来ゼラチンに比べ均一な分子量分布を持っている。【００８３】
使用したＰＥＧ架橋剤（ＰＴＥ−２００ＨＳ，日油株式会社）の化学構造（製造元ウェブサイトより転載）を以下に示す。Ｍｗは２０，０００であり、式中のｎは１１４程度である。
【化１】
2020050205.tif 000003
【００８４】
上記で得られたＣＢＥ３溶液とＰＥＧ架橋剤溶液とを同体積で混合し、ＣＢＥ３とＰＥＧ架橋剤の化学反応および三次元網目形成を行った。上記反応の模式図を以下に示す。
【化２】
2020050205.tif 000004
【００８５】
いずれの場合においても、透明なゲル（ハイドロゲル）が形成された。ゲル化前駆体液が入ったバイアルを傾斜させ、流動性が無くなった時間をゲル化時間とした。活性末端モル濃度比とゲル化時間の関係を下記表に示す。ゲル化時間は各前駆体の濃度条件によって変化した。最も良好な反応性が得られた濃度条件（［−ＮＨ２］：［−ＯＳｕ］  ＝  ４：１）を以降の実験に供した。【００８６】
【表１】
2020050205.tif 000005
【００８７】
溶質濃度が異なる水溶液を複数調製し(低／中／高濃度)、常温にて各濃度の対を同体積で混合した。ゲル調製に使用した前駆体水溶液と緩衝液濃度を表２に示す。いずれの場合においても、ゲルを得ることができた。なお、ゲル化時間は緩衝液濃度の調節によって制御可能であった(図２)。緩衝液が高濃度であるほど架橋反応種であるアミノ基が遮蔽され、架橋反応の遅延に至ったものと考えられる。リン酸緩衝液５０ｍｍｏｌ／Ｌの低濃度ＣＢＥ水溶液（１８．６ｍｇ／ｍＬ）、ＰＥＧ架橋剤水溶液（１５ｇ／Ｌ）の組み合わせを低濃度ゲル化液として、リン酸緩衝液５０ｍｍｏｌ／Ｌの中濃度ＣＢＥ水溶液（３７．２３ｇ／Ｌ）、ＰＥＧ架橋剤水溶液（３０ｇ／Ｌ）の組み合わせを中濃度ゲル化液とし、リン酸緩衝液５０ｍｍｏｌ／Ｌの高濃度ＣＢＥ水溶液（７４．４６ｇ／Ｌ）、ＰＥＧ架橋剤水溶液（６０ｇ／Ｌ）の組み合わせを高濃度ゲル化液とし、それぞれ一晩置いてゲル化したものを、低濃度ゲル、中濃度ゲル、高濃度ゲルとした。【００８８】
【表２】
2020050205.tif 000006
【００８９】
なお、既存材料との比較のため、表２と同程度の質量濃度領域で、被架橋体をＣＢＥ３から医療用ゼラチン（商品名：ハイグレードゼラチンＡＰＡＴ，株式会社ニッピ，中分子量Ｍｗ＝約６０，０００）に置換して実験したところ、常温で１時間おいても全ての条件においてゲル化を認めなかった（表３）。これは医療用ゼラチンの分子量分布が比較的大きく、網目構造に組み込まれない程度の低分子量フラグメントが架橋反応をクエンチしたためと考えられる。一方、ＣＢＥ３は分子量分布が比較的小さく、相対的に効率的な網目形成が実現できたものと考えられる。【００９０】
【表３】
2020050205.tif 000007
【００９１】
２．ゲルの特性評価
シリコーン鋳型にゲル化液を流し込み、一晩、室温で静置した。作製された低／中／高濃度ゲルについて圧縮試験を行い、弾性率および圧縮破断強度を評価した。結果を表４に示す。圧縮破断強度の測定は、ＥｌｅｃｔｒｏＦｏｒｃｅ  ５５００（ＴＡ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いてシリンダー状の低／中／高濃度試験片（φ＝１０ｍｍ，ｈ＝５ｍｍ）を、圧縮速度０．１ｍｍ／ｓｅｃで圧縮し、変位と力のデータを取得した、そこから、応力―ひずみ曲線を描き、低ひずみ線形域の傾きから弾性率を算出した。破断時の応力を圧縮破断強度とした。【００９２】
【表４】
2020050205.tif 000008
【００９３】
ブタ関節より採取した軟骨片をシリコーンの鋳型に設置し、その上から中濃度ゲル化液を流し込んだ。ゲル化を確認した後、ゲルと軟骨片がマクロに接着していることを確認し、更に一晩、室温の水中でインキュベートした。得られたサンプルを凍結および薄切し、ヘマトキシリン・エオシン染色を行った(図３)。水中で長時間経過した後でも、ゲルと軟骨片間の接着がマイクロメートルスケールで維持されることがわかった。これは、軟骨片表面タンパク質由来のアミノ基と、ゲル形成途中の表面の未反応PEGの間で強固な化学結合が形成されたためと思われる。【００９４】
９６ｗｅｌｌプレートにゲルを作成し、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を播種した（５ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）。５日後にはゲル表面に細胞が接着・伸展している様子が観測された（図４）。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のみからなるゲルは細胞非接着性であることが広く知られていることを鑑みると、本発明のゲルの細胞接着性はＣＢＥ３の細胞接着能が発現した結果と考えられる。【００９５】
ヒト骨髄由来幹細胞を各種のゲルに含有させ、２１日間培養し、ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ  ａｓｓａｙを行った。低濃度／中濃度ゲルにおいては多くの細胞が生存していた（図５）。
Ｌｉｖｅ／ｄｅａｄアッセイ用のＣｅｌｌｓｔａｉｎ（登録商標）Ｄｏｕｂｌｅ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＣＳ０１、同仁化学研究所）はプロトコール通り使用し、蛍光顕微鏡（ＢＺ−Ｘ、キーエンス）にて観察した。【００９６】
［実施例２］
＜滑膜由来幹細胞含有ゲル化液の調製＞
滑膜由来幹細胞（日本白色家兎から単離）（５．０×１０５ｃｅｌｌｓ、または５．０×１０６ｃｅｌｌｓ）を中濃度ゲル化液２００μＬと混合し、低濃度（１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／４０μＬ）細胞含有ゲル化液と高濃度（１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／４０μＬ）細胞含有ゲル化液を調製した。【００９７】
＜ウサギ膝骨軟骨欠損モデル評価＞
日本白色家兎（２５週齢、体重３．５〜４．１ｋｇ）を使用し、滑車部に直径５ｍｍ、深さ２ｍｍの骨軟骨欠損を作製し、欠損に対してキルシュナー鋼線（直径０．８ｍｍ、ＭＩＺＵＨＯ社製）を用いて５カ所、深さ４ｍｍの骨髄刺激（ＢＭＳ）有りまたは無しを実施後、中濃度ゲル化液を移植した。また、骨髄刺激と中濃度ゲル化液の移植に加えて、ＣＢＥ３熱架橋体顆粒を移植した実験を行った。また、同様に骨軟骨欠損を作製した後にＢＭＳは行わずに、調製した低濃度細胞含有ゲル化液を移植した実験および高濃度細胞含有ゲル化液を移植する実験を実施した。各ゲル化液は１０分静置した後にゲルになったことを確認し、患部を閉創した。術後１２週で剖検し、組織学的評価から軟骨修復度合いのスコアリングを実施した（表５〜表１２および図６）。表８および表１２に記載の細胞含有ゲル移植群は、低濃度細胞含有ゲル移植群である。また、図６に記載の細胞含有ゲル移植群は、低濃度細胞含有ゲル移植群である。【００９８】
その結果、ＢＭＳ＋中濃度ゲル化液移植群では、既存治療であるＢＭＳに比べて、バラつきが少なく治療効果の指標であるスコアリングの平均値が高いことが示されたことから、安定な治療効果が得られていることが示唆された。また、硝子軟骨の成分であるII型コラーゲン（ＣｏｌII）の免疫染色像から、ＢＭＳ＋本発明のゲル化液移植部位では、表層近くまでＣｏｌII陽性組織を確認した。これは正常部位に近い組織構造であることが分かり、良好な修復軟骨組織であることが示唆された（図７）。ＢＭＳ＋中濃度ゲル化液＋ＣＢＥ３熱架橋顆粒移植群においても、修復組織スコアリング、免疫染色像から既存治療のＢＭＳ以上に良好な修復組織であることが示唆された。また、細胞含有ゲル移植群では、ＢＭＳ＋中濃度ゲル化液移植群、ＢＭＳ＋中濃度ゲル化液＋ＣＢＥ３熱架橋顆粒移植群の修復組織スコアリングよりも高い値を示され、高い軟骨修復能であることが示唆された。【００９９】
＜スコアリング値の処理＞
１．各膝の左/右端スコアの平均を、各膝の処置の実力として点数化。
２．群ごとに実力の平均を求め、各群の実力値として設定。
３．各群の実力値をプロット。
４．各群において、各膝の実力の標準偏差を求めてエラーバーとして追加。【０１００】
＜スコアリング値のグレード定義＞
(1)平方向（被覆率（％））
１００％：３
≧７５％：２
≧５０％：１
＜５０％：０【０１０１】
(2)分化層の整合
０〜４＋：３
５＋：２
６＋〜１０＋：１
１１＋以上：０【０１０２】
(3)厚さ（正常との逸脱の程度）
正常範囲：３
薄い／厚い（軽度）：２
薄い／厚い（中程度）：１
薄い／厚い（高度）：０【０１０３】
【表５】
2020050205.tif 000009
【０１０４】
【表６】
2020050205.tif 000010
【０１０５】
【表７】
2020050205.tif 000011
【０１０６】
【表８】
2020050205.tif 000012
【０１０７】
【表９】
2020050205.tif 000013
【０１０８】
【表１０】
2020050205.tif 000014
【０１０９】
【表１１】
2020050205.tif 000015
【０１１０】
【表１２】
2020050205.tif 000016
【図１】
2020050205.tif 000017
【図２】
2020050205.tif 000018
【図３】
2020050205.tif 000019
【図４】
2020050205.tif 000020
【図５】
2020050205.tif 000021
【図６】
2020050205.tif 000022
【図７】
2020050205.tif 000023
【配列表】
2020050205000001.app
【国際調査報告】
2020050205.tif 000024
2020050205.tif 000025
2020050205.tif 000026
2020050205.tif 000027
2020050205.tif 000028