(57)【要約】抗体の精製において製造コストを低減し、精製期間を短縮した上で、前記溶液に含まれる不純物を効率的に除去し、抗体をヒト治療用として使用するに充分な純度まで確実に精製する方法の提供。活性炭材料により、混在する不純物の量又は種類によらず安定的に高純度に精製され、さらに確実に高いウイルスクリアランス能を達成できることを見出し、ＣＨＯ細胞を用いた抗体医薬品の精製工程においてウイルスクリアランス能を有するＡＥＸクロマトグラフィー工程の代替として活性炭材料による処理を可能とした。これにより従来の精製方法と比較し、ヒト治療用として使用するに充分な純度まで、しかも製造コストを低減し、単純で効率的に抗体を精製することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体を一又は複数の不純物を含む組成物から精製するための手法であって、
ａ１．抗体を含有する細胞培養上清を用意し、
ｂ１．前記細胞培養上清をアフィニティークロマトグラフィー樹脂により処理して、抗体を含むアフィニティークロマトグラフィープール液を得、
ｃ１．前記アフィニティークロマトグラフィープール液においてウイルスを不活化して、ウイルス不活化液を得、
ｄ１．前記ウイルス不活化液を活性炭材料により処理して、活性炭材料プール液を得、
ｅ１．前記活性炭材料プール液を陽イオン交換材料により処理して、陽イオン交換材料プール液を得る、
のａ１．乃至ｅ１．の工程を含む方法。
【請求項２】
抗体を一又は複数の不純物を含む組成物から精製するための手法であって、
ａ２．抗体を含有する細胞培養上清を用意し、
ｂ２．前記細胞培養上清をアフィニティークロマトグラフィー樹脂により処理して、抗体を含むアフィニティークロマトグラフィープール液を得、
ｃ２．前記アフィニティークロマトグラフィープール液においてウイルスを不活化して、ウイルス不活化液を得、
ｄ２．前記ウイルス不活化液をデプスフィルターにより処理して、デプスフィルターろ過プール液を得、
ｅ２．前記デプスフィルターろ過プール液を活性炭材料により処理して、活性炭材料プール液を得、
ｆ２．前記活性炭材料プール液を陽イオン交換材料により処理して、陽イオン交換材料プール液を得る、
のａ２．乃至ｆ２．の工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アフィニティークロマトグラフィー樹脂がプロテインＡ樹脂である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
プロテインＡ樹脂が、ＫａｎＣａｐＡ、ＫａｎＣａｐＡ３Ｇ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ ｐｃｃ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＰｒｉｓｍＡ、又はＡｍｓｐｈｅｒｅ  Ａ３である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ウイルス不活化が、酸、界面活性剤、化学物質、核酸架橋剤、紫外線、ガンマ線及び熱での処理からなる群から選択される少なくともいずれか一つである、請求項１乃至４のいずれか一つに記載の方法。
【請求項６】
ウイルス不活化が、アフィニティークロマトグラフィープール液のｐＨを３〜４に低下させることを含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ウイルス不活化中に、アフィニティークロマトグラフィープール液を６０〜１２０分間インキュベートする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ウイルス不活化中に、アフィニティークロマトグラフィープール液を１５〜３０℃でインキュベートする請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
活性炭材料にロードする溶液、活性炭材料の平衡化バッファー及び洗浄バッファーのｐＨが、４．５〜７．５である請求項１乃至８のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１０】
活性炭材料にロードする溶液、活性炭材料の平衡化バッファー及び洗浄バッファーのｐＨが、４．５〜５．５である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
活性炭材料にロードする溶液、活性炭材料の平衡化バッファー及び洗浄バッファーの電気伝導度が、２〜１０ｍＳ／ｃｍである請求項１乃至１０のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１２】
活性炭材料にロードする溶液、活性炭材料の平衡化バッファー及び洗浄バッファーの電気伝導度が、２〜５ｍＳ／ｃｍである請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
活性炭材料による処理が、活性炭材料を含むフィルターを用いて行われる、請求項１乃至１２のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１４】
フィルターが、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋  Ｐｏｄ  ＣＲ４０、Ｚｅｔａ  Ｐｌｕｓ  活性炭吸着デプスフィルター、又はＳＵＰＲＡｃａｐ  ５０  Ｓｅｉｔｚ  ＡＫＳ  ｆｉｌｔｅｒである請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
陽イオン交換材料に対し、活性炭材料プール液が、該陽イオン交換材料の吸着容量を超えてロードされる請求項１乃至１４のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１６】
陽イオン交換材料に対する活性炭材料プール液のローディング密度が、５００〜２０００ｇ／Ｌである請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
陽イオン交換材料に対する活性炭材料プール液のローディング密度が１０００〜１５００ｇ／Ｌである請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
陽イオン交換材料が、樹脂、モノリスカラム、又は膜である請求項１乃至１７のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１９】
陽イオン交換材料の官能基が、スルホプロピル、スルホエチル、スルホイソブチル、又はカルボキシルである請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
陽イオン交換材料が、ＰＯＲＯＳ  ＸＳ、Ｅｓｈｍｕｎｏ  ＣＰＸ、Ｅｓｈｍｕｎｏ  ＣＰ−ＦＴ、又はＣａｐｔｏＳ  ＩｍｐＡｃｔである請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
陽イオン交換材料にロードする溶液のｐＨが、４〜６である請求項１乃至２０のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２２】
陽イオン交換材料にロードする溶液のｐＨが、４．５〜５．５である請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
陽イオン交換材料にロードする溶液の電気伝導度が、３〜７ｍＳ/ｃｍである請求項１乃至２２のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２４】
陽イオン交換材料にロードする溶液の電気伝導度が、３〜５ｍＳ/ｃｍである請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
陽イオン交換材料プール液を、さらに疎水性相互作用クロマトグラフィーにより処理して、プール液を得る請求項１乃至２４のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２６】
疎水性相互作用クロマトグラフィーが、フロースルーモードである請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
疎水性相互作用クロマトグラフィーが、樹脂又は膜を用いて実施される請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂又は膜が、Ｐｈｅｎｙｌ基、Ｂｅｎｚｙｌ基又はＨｅｘｙｌ基を有する請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
疎水性相互作用クロマトグラフィー材料が、ＰＯＲＯＳ  Ｂｅｎｚｙｌ  Ｕｌｔｒａ  、ＰＯＲＯＳ  Ｂｅｎｚｙｌ、  Ｈｅｘｙｌ−６５０Ｃ  、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、  Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、  Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｐｈｅｎｙｌ又はＲｅａｄｙＴｏＰｒｏｃｅｓｓ  Ａｄｓｏｒｂｅｒ  Ｐｈｅｎｙｌである請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
活性炭材料プール液を、疎水性相互作用クロマトグラフィーにより処理して、プール液を得、さらに陽イオン交換材料により処理して、プール液を得る請求項１乃至１４のいずれか一つに記載の方法。
【請求項３１】
疎水性相互作用クロマトグラフィーが、フロースルーモードである請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
疎水性相互作用クロマトグラフィーが、樹脂又は膜を用いて実施される請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂又は膜が、Ｐｈｅｎｙｌ基、Ｂｅｎｚｙｌ基又はＨｅｘｙｌ基を有する請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
疎水性相互作用クロマトグラフィー材料が、ＰＯＲＯＳ  Ｂｅｎｚｙｌ  Ｕｌｔｒａ  、ＰＯＲＯＳ  Ｂｅｎｚｙｌ、  Ｈｅｘｙｌ−６５０Ｃ  、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、  Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、  Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｐｈｅｎｙｌ又はＲｅａｄｙＴｏＰｒｏｃｅｓｓ  Ａｄｓｏｒｂｅｒ  Ｐｈｅｎｙｌである請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
陽イオン交換材料に対し、疎水性相互作用クロマトグラフィープール液が、該陽イオン交換材料の吸着容量を超えてロードされる請求項３０乃至３４のいずれか一つに記載の方法。
【請求項３６】
陽イオン交換材料に対する疎水性相互作用クロマトグラフィープール液のローディング密度が、５００〜２０００ｇ／Ｌである請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
陽イオン交換材料に対する疎水性相互作用クロマトグラフィープール液のローディング密度が１０００〜１５００ｇ／Ｌである請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
陽イオン交換材料が、樹脂、モノリスカラム、又は膜である請求項３０乃至３７のいずれか一つに記載の方法。
【請求項３９】
陽イオン交換材料の官能基が、スルホプロピル、スルホエチル、スルホイソブチル、又はカルボキシルである請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
陽イオン交換材料が、ＰＯＲＯＳ  ＸＳ、Ｅｓｈｍｕｎｏ  ＣＰＸ、Ｅｓｈｍｕｎｏ  ＣＰ−ＦＴ、又はＣａｐｔｏＳ  ＩｍｐＡｃｔである請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
陽イオン交換材料にロードする溶液のｐＨが、４〜６である請求項３０乃至４０のいずれか一つに記載の方法。
【請求項４２】
陽イオン交換材料にロードする溶液のｐＨが、４．５〜５．５である請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
陽イオン交換材料にロードする溶液の電気伝導度が、３〜７ｍＳ/ｃｍである請求項３０乃至４２のいずれか一つに記載の方法。
【請求項４４】
陽イオン交換材料にロードする溶液の電気伝導度が、３〜５ｍＳ/ｃｍである請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
少なくとも一つの不純物が、宿主細胞由来タンパク質（Ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＨＣＰ）、ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ｂ−ｌｉｋｅ  ２（ＰＬＢＬ２）、ウイルス、ウイルス様粒子、高分子量体（ｈｉｇｈ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｓｐｅｃｉｅｓ；ＨＭＷＳ）、低分子量体（ｌｏｗｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｓｐｅｃｉｅｓ；ＬＭＷＳ）、培地成分、浸出プロテインＡ及び／又はＤＮＡからなる群から選択される請求項１乃至４４のいずれか一つに記載の方法。
【請求項４６】
工程が連続的である請求項１乃至４５のいずれか一つに記載の方法。
【請求項４７】
請求項１乃至４６のいずれか一つに記載の方法によって精製された抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体を高純度に精製する方法に係わる。
【背景技術】
【０００２】
近年、医薬品としてのモノクローナル抗体への注目・期待が著しい。抗体は、標的抗原に対して特異的に結合することから、高い薬効と少ない副作用が期待され、特に抗がん剤として注目されている。【０００３】
多くの抗体医薬品はＣＨＯ細胞を宿主とした生産系によって製造されている（非特許文献１）が、培養上清には、目的物質である抗体の他に、宿主細胞由来不純物（タンパク質、ＤＮＡ等）、目的物質由来不純物（凝集体、類縁物質等）、及びウイルス様粒子が含まれている。宿主細胞由来タンパク質（Ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＨＣＰ）は、ヒトに対して異種タンパク質として認識され抗原性を呈すだけでなく、造腫瘍性リスクも存在することが知られている。また、宿主細胞由来ＤＮＡにも造腫瘍性の懸念がある。目的物質由来不純物である凝集体は、免疫原性の原因となる可能性があり、断片体及び目的タンパク質の翻訳後修飾体には安全性や薬効に悪影響を及ぼす懸念がある。加えて、内在性ウイルス及び内在性ウイルス由来のＤＮＡには感染性の懸念もある。また、外来性ウイルスの混入に対する対策も必要である。多くの場合、細胞基材（例えば主として生産に使用されるＣＨＯ細胞）、培地原材料、調製培地からの外来性ウイルス混入リスクの回避に様々な工夫を凝らし、各種ｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルス試験、ｉｎ  ｖｉｖｏウイルス試験等で製造工程に混入する可能性のある代表的ウイルスの混入を否定することが重要となる。さらに、代表的モデルウイルスの精製プロセスにおける減衰率及び除去性能を評価することによって、最終的に得られる原薬中のウイルス混入リスクを限りなく低減し、安全な医薬品の製造を行うことが必要である。そのため、精製プロセスにおいては、目的物質である抗体を高収率で回収することに加え、不純物を再現性良く効果的に除去できる精製方法として完成させることが必要である。【０００４】
抗体の精製方法は、上記の目的のために、複数のクロマトグラフィーを含む工程を組み合わせて構築される。一般的には、プロテインＡをはじめとしたアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、セラミックハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー等が用いられる。これらのクロマトグラフィーは、目的物質と不純物の電荷、疎水性の度合い、若しくは分子サイズ、又は目的物質と固定化されたリガンドとの間の特異的結合作用に基づき、宿主細胞由来不純物、目的物質由来不純物、浸出プロテインＡ、ウイルス様粒子等を効率良く分離し、除去できる。【０００５】
特に、抗体精製法の一般的なクロマトグラフィー手法として、プロテインＡクロマトグラフィー、陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィー及び陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーの３ステップを組合せて抗体を高純度に精製する例が多く報告されている。これらのクロマトグラフィーは、一般的に結合／溶出（Ｂ／Ｅ）モード又はフロースルー（Ｆ／Ｔ）モードを用いて実施される。中でも、プロテインＡクロマトグラフィー及びＣＥＸクロマトグラフィーにおいては、目的物質である抗体を樹脂等に吸着させた後、適切な条件で不純物との分離を行うＢ／Ｅモードが汎用され、上記の不純物のうち内在性ウイルスを含むウイルスの除去能以外は高度に目的物質を精製することを可能にした。しかし、Ｂ／Ｅモードでは目的物質を樹脂等に吸着させるため、大量の樹脂及び大型のカラムが必要となり、製造コスト高の一因となっていた。【０００６】
一方で、技術の進展とともに近年ＣＥＸクロマトグラフィーでは、オーバーロードモードを含むＦ／Ｔモードによる精製手法の例が報告されている。目的物質と比較して混入量が少ない不純物を樹脂等に吸着させた状態で目的物質である抗体を素通りさせることにより、カラムの小型化と作業工程の簡素化、効率化を実現し、その結果、クロマトグラフィー樹脂の使用量の低減によるコスト削減も達成できる可能性が示されている。実際に、これまでのＢ／Ｅモードでは高性能樹脂を使用したとしても１００ｇ／Ｌ樹脂以下での使用条件であったのに対し、Ｆ／Ｔモードではその１０倍量の１０００ｇ／Ｌ樹脂を超える条件によっても目的物質の精製に利用できる。すなわち、１／１０以下の樹脂容量で同等の精製性能を引き出せることから、カラムの小型化、低コスト化につながることが期待される。このようなカラムの小型化は、使用バッファー量の削減及び各種タンク容量のサイズダウンにもつながり、作業負荷の大幅低減による製造効率化に寄与すると報告されている（特許文献１、非特許文献２及び非特許文献３）。しかし、高効率精製工程として期待されるＣＥＸクロマトグラフィーのＦ／Ｔモードは、混在する不純物を少量の樹脂等に吸着させ分離除去することから、Ｂ／Ｅモードと比較して、混在する不純物の量あるいは種類によって分離能が影響を受けることが課題であった。【０００７】
さらに近年、培養工程における生産性の向上により、多くの生成物がクロマトグラフィーカラムにロードされ、クロマトグラフィーカラムへの負担が増加している。これに対して、高効率精製工程として期待されるＡＥＸクロマトグラフィー及びＣＥＸクロマトグラフィーのＦ／Ｔモードに活性炭材料を組合せることによって、ＨＣＰを含む複数の不純物が低減され、結果としてクロマトグラフィーカラムの使用期間を延ばすことが報告されている（特許文献２）。【０００８】
しかし、これらの報告は、一般的な宿主細胞由来不純物（タンパク質、ＤＮＡ）及び目的物質由来不純物（凝集体、類縁物質等）を除去できる可能性のみに限定されており、本来の精製プロセスとして望まれる宿主細胞由来不純物及び目的物質由来不純物のより確実な除去、並びに内在性及び外来性ウイルスのより確実かつ安価な除去を実現する具体的な精製プロセスが望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第WO2011/150110号
【特許文献２】国際公開第WO2013/028330号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Reichert, J. (2012). Marketed therapeutic antibodies compendium. MABs 4:3, 413-415.
【非特許文献２】Brown, A., Bill, J., Tully, T., Radhamohan, A., & Dowd, C. (2010). Overloading ion-exchange membranes as a purification step for monoclonal antibodies. Biotechnol. Appl. Biochem., 56:59-70.
【非特許文献３】Liu, H.F., McCooey, B., Duarte, T., Myers, D.E., Hudson, T., Amanullah, A., van Reis, R., & Kelley, B.D. (2011). Exploration of overloaded cation exchange chromatography for monoclonal antibody purification. J. Chromatogr. A., 1218, 6943-6952.
【発明の概要】
【発明の解決しようとしている課題】
【００１１】
高効率精製工程として期待されるＣＥＸクロマトグラフィーのＦ／Ｔモードでは、Ｂ／Ｅモードと比較して、混在する不純物の量や種類が分離能へ影響を与えることが課題であった。また、ＡＥＸクロマトグラフィー及びＣＥＸクロマトグラフィーのＦ／Ｔモードに活性炭材料を組合せた抗体精製方法は、クロマトグラフィーカラムの使用期間を延ばすことはできるが、精製ステップ数が多いことが課題であった。すなわち、プロテインＡクロマトグラフィー、ＡＥＸクロマトグラフィー及びＣＥＸクロマトグラフィーの３ステップのクロマトグラフィーに加え、活性炭材料による処理を実施することから、精製ステップ数が多く、それにより製造コストが高くなり、また精製期間が長くなる。また、低コスト化を目指した精製プロセスの工程簡略化においては、宿主細胞由来不純物及び目的物質由来不純物の除去能の低下のみでなく、内在性及び外来性ウイルスクリアランス能の低下が懸念される。したがって、より確実な不純物の除去、特に内在性、外来性ウイルスクリアランスは重要な課題である。上記課題の解決は低コストかつ高効率な抗体医薬品の製造方法の提供だけでなく、高品質な抗体医薬品の安定供給につながり、結果として患者の安全性の確保が達成されるため、産業上、非常に重要である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本願発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、従来の精製方法と同等の品質を維持した上で、精製のステップ数を低減する効率的な精製方法を見出した。すなわち、ＣＥＸクロマトグラフィーのＦ／Ｔモードに活性炭材料による処理を組合せることによって、活性炭材料により不純物が低減され、安価で利用できることが期待される一方で混在する不純物の量又は種類によって分離能が低下することが課題であったＣＥＸクロマトグラフィーのＦ／Ｔモードにおいて、安定的かつ高純度に目的抗体医薬品等が精製できることを見出した。また、本願発明者らは、活性炭材料によりウイルスが確実に除去されることを見出し、ＣＨＯ細胞を用いた抗体医薬品の精製工程において高いウイルスクリアランス能を有するＡＥＸクロマトグラフィー工程の機能を補完し、結果としてＡＥＸクロマトグラフィー工程の省略を可能とする製造プロセスを構築した。すなわち、本願発明者らは、プロテインＡクロマトグラフィー及びＣＥＸクロマトグラフィーのＦ／Ｔモードの２ステップのクロマトグラフィーに活性炭材料による処理を組合せた効率的な精製方法を見出し、従来の精製方法と比較して精製ステップ数及び製造コストを低減し、抗体をヒト治療用途に十分な品質まで効率的に精製することを可能として、本発明を完成させた。【００１３】
すなわち本発明は以下の通りである。
［１］  抗体を一又は複数の不純物を含む組成物から精製するための手法であって、
ａ１．抗体を含有する細胞培養上清を用意し、
ｂ１．前記細胞培養上清をアフィニティークロマトグラフィー樹脂により処理して、抗体を含むアフィニティークロマトグラフィープール液を得、
ｃ１．前記アフィニティークロマトグラフィープール液においてウイルスを不活化して、ウイルス不活化液を得、
ｄ１．前記ウイルス不活化液を活性炭材料により処理して、活性炭材料プール液を得、
ｅ１．前記活性炭材料プール液を陽イオン交換材料により処理して、陽イオン交換材料プール液を得る、
のａ１．乃至ｅ１．の工程を含む方法。
［２］  抗体を一又は複数の不純物を含む組成物から精製するための手法であって、
ａ２．抗体を含有する細胞培養上清を用意し、
ｂ２．前記細胞培養上清をアフィニティークロマトグラフィー樹脂により処理して、抗体を含むアフィニティークロマトグラフィープール液を得、
ｃ２．前記アフィニティークロマトグラフィープール液においてウイルスを不活化して、ウイルス不活化液を得、
ｄ２．前記ウイルス不活化液をデプスフィルターにより処理して、デプスフィルターろ過プール液を得、
ｅ２．前記デプスフィルターろ過プール液を活性炭材料により処理して、活性炭材料プール液を得、
ｆ２．前記活性炭材料プール液を陽イオン交換材料により処理して、陽イオン交換材料プール液を得る、
のａ２．乃至ｆ２．の工程を含む［１］に記載の方法。
［３］  アフィニティークロマトグラフィー樹脂がプロテインＡ樹脂である［１］又は［２］に記載の方法。
［４］  プロテインＡ樹脂が、ＫａｎＣａｐＡ、ＫａｎＣａｐＡ３Ｇ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  ｐｃｃ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＰｒｉｓｍＡ、又はＡｍｓｐｈｅｒｅ  Ａ３である［３］に記載の方法。
［５］  ウイルス不活化が、酸、界面活性剤、化学物質、核酸架橋剤、紫外線、ガンマ線及び熱での処理からなる群から選択される少なくともいずれか一つである、［１］乃至［４］のいずれか一つに記載の方法。
［６］  ウイルス不活化が、アフィニティークロマトグラフィープール液のｐＨを３〜４に低下させることを含む［５］に記載の方法。
［７］  ウイルス不活化中に、アフィニティークロマトグラフィープール液を６０〜１２０分間インキュベートする［６］に記載の方法。
［８］  ウイルス不活化中に、アフィニティークロマトグラフィープール液を１５〜３０℃でインキュベートする［６］又は［７］に記載の方法。
［９］  活性炭材料にロードする溶液、活性炭材料の平衡化バッファー及び洗浄バッファーのｐＨが、４．５〜７．５である［１］乃至［８］のいずれか一つに記載の方法。
［１０］  活性炭材料にロードする溶液、活性炭材料の平衡化バッファー及び洗浄バッファーのｐＨが、４．５〜５．５である［９］に記載の方法。【００１４】
［１１］  活性炭材料にロードする溶液、活性炭材料の平衡化バッファー及び洗浄バッファーの電気伝導度が、２〜１０ｍＳ／ｃｍである［１］乃至［１０］のいずれか一つに記載の方法。
［１２］  活性炭材料にロードする溶液、活性炭材料の平衡化バッファー及び洗浄バッファーの電気伝導度が、２〜５ｍＳ／ｃｍである［１１］に記載の方法。
［１３］  活性炭材料による処理が、活性炭材料を含むフィルターを用いて行われる、［１］乃至［１２］のいずれか一つに記載の方法。
［１４］  フィルターが、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋  Ｐｏｄ  ＣＲ４０、Ｚｅｔａ  Ｐｌｕｓ活性炭吸着デプスフィルター、又はＳＵＰＲＡｃａｐ  ５０  Ｓｅｉｔｚ  ＡＫＳ  ｆｉｌｔｅｒである［１３］に記載の方法。
［１５］  陽イオン交換材料に対し、活性炭材料プール液が、該陽イオン交換材料の吸着容量を超えてロードされる［１］乃至［１４］のいずれか一つに記載の方法。
［１６］  陽イオン交換材料に対する活性炭材料プール液のローディング密度が、５００〜２０００ｇ／Ｌである［１５］に記載の方法。
［１７］  陽イオン交換材料に対する活性炭材料プール液のローディング密度が１０００〜１５００ｇ／Ｌである［１６］に記載の方法。
［１８］  陽イオン交換材料が、樹脂、モノリスカラム、又は膜である［１］乃至［１７］のいずれか一つに記載の方法。
［１９］  陽イオン交換材料の官能基が、スルホプロピル、スルホエチル、スルホイソブチル、又はカルボキシルである［１８］に記載の方法。
［２０］  陽イオン交換材料が、ＰＯＲＯＳ  ＸＳ、Ｅｓｈｍｕｎｏ  ＣＰＸ、Ｅｓｈｍｕｎｏ  ＣＰ−ＦＴ、又はＣａｐｔｏＳ  ＩｍｐＡｃｔである［１９］に記載の方法。【００１５】
［２１］  陽イオン交換材料にロードする溶液のｐＨが、４〜６である［１］乃至［２０］のいずれか一つに記載の方法。
［２２］  陽イオン交換材料にロードする溶液のｐＨが、４．５〜５．５である［２１］に記載の方法。
［２３］  陽イオン交換材料にロードする溶液の電気伝導度が、３〜７ｍＳ/ｃｍである［１］乃至［２２］のいずれか一つに記載の方法。
［２４］  陽イオン交換材料にロードする溶液の電気伝導度が、３〜５ｍＳ/ｃｍである［２３］に記載の方法。
［２５］  陽イオン交換材料プール液を、さらに疎水性相互作用クロマトグラフィーにより処理して、プール液を得る［１］乃至［２４］のいずれか一つに記載の方法。
［２６］  疎水性相互作用クロマトグラフィーが、フロースルーモードである［２５］に記載の方法。
［２７］  疎水性相互作用クロマトグラフィーが、樹脂又は膜を用いて実施される［２６］に記載の方法。
［２８］  疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂又は膜が、Ｐｈｅｎｙｌ基、Ｂｅｎｚｙｌ基又はＨｅｘｙｌ基を有する［２７］に記載の方法。
［２９］  疎水性相互作用クロマトグラフィー材料が、  ＰＯＲＯＳ  Ｂｅｎｚｙｌ  Ｕｌｔｒａ、  ＰＯＲＯＳ  Ｂｅｎｚｙｌ、Ｈｅｘｙｌ−６５０Ｃ  、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、  Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、  Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｐｈｅｎｙｌ又はＲｅａｄｙＴｏＰｒｏｃｅｓｓ  Ａｄｓｏｒｂｅｒ  Ｐｈｅｎｙｌである［２８］に記載の方法。
［３０］  活性炭材料プール液を、疎水性相互作用クロマトグラフィーにより処理して、プール液を得、さらに陽イオン交換材料により処理して、プール液を得る［１］乃至［１４］のいずれか一つに記載の方法。【００１６】
［３１］  疎水性相互作用クロマトグラフィーが、フロースルーモードである［３０］に記載の方法。
［３２］  疎水性相互作用クロマトグラフィーが、樹脂又は膜を用いて実施される［３１］に記載の方法。
［３３］  疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂又は膜が、Ｐｈｅｎｙｌ基、Ｂｅｎｚｙｌ基又はＨｅｘｙｌ基を有する［３２］に記載の方法。  
［３４］  疎水性相互作用クロマトグラフィー材料が、ＰＯＲＯＳ  Ｂｅｎｚｙｌ  Ｕｌｔｒａ、  ＰＯＲＯＳ  Ｂｅｎｚｙｌ、Ｈｅｘｙｌ−６５０Ｃ  、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、  Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、  Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｐｈｅｎｙｌ又はＲｅａｄｙＴｏＰｒｏｃｅｓｓ  Ａｄｓｏｒｂｅｒ  Ｐｈｅｎｙｌである［３３］に記載の方法。
［３５］  陽イオン交換材料に対し、疎水性相互作用クロマトグラフィープール液が、該陽イオン交換材料の吸着容量を超えてロードされる［３０］乃至［３４］のいずれか一つに記載の方法。
［３６］  陽イオン交換材料に対する疎水性相互作用クロマトグラフィープール液のローディング密度が、５００〜２０００ｇ／Ｌである［３５］に記載の方法。
［３７］  陽イオン交換材料に対する疎水性相互作用クロマトグラフィープール液のローディング密度が１０００〜１５００ｇ／Ｌである［３６］に記載の方法。
［３８］  陽イオン交換材料が、樹脂、モノリスカラム、又は膜である［３０］乃至［３７］のいずれか一つに記載の方法。
［３９］  陽イオン交換材料の官能基が、スルホプロピル、スルホエチル、スルホイソブチル、又はカルボキシルである［３８］に記載の方法。
［４０］  陽イオン交換材料が、ＰＯＲＯＳ  ＸＳ、Ｅｓｈｍｕｎｏ  ＣＰＸ、Ｅｓｈｍｕｎｏ  ＣＰ−ＦＴ、又はＣａｐｔｏＳ  ＩｍｐＡｃｔである［３９］に記載の方法。【００１７】
［４１］  陽イオン交換材料にロードする溶液のｐＨが、４〜６である［３０］乃至［４０］のいずれか一つに記載の方法。
［４２］  陽イオン交換材料にロードする溶液のｐＨが、４．５〜５．５である［４１］に記載の方法。
［４３］  陽イオン交換材料にロードする溶液の電気伝導度が、３〜７ｍＳ/ｃｍである［３０］乃至［４２］のいずれか一つに記載の方法。
［４４］  陽イオン交換材料にロードする溶液の電気伝導度が、３〜５ｍＳ/ｃｍである［４３］に記載の方法。
［４５］  少なくとも一つの不純物が、宿主細胞由来タンパク質（Ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＨＣＰ）、ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ｂ−ｌｉｋｅ  ２（ＰＬＢＬ２）、ウイルス、ウイルス様粒子、高分子量体（ｈｉｇｈ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｓｐｅｃｉｅｓ；ＨＭＷＳ）、低分子量体（ｌｏｗｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｓｐｅｃｉｅｓ；ＬＭＷＳ）、培地成分、浸出プロテインＡ及び／又はＤＮＡからなる群から選択される［１］乃至［４４］のいずれか一つに記載の方法。
［４６］  工程が連続的である［１］乃至［４５］のいずれか一つに記載の方法。
［４７］  ［１］乃至［４６］のいずれか一つに記載の方法によって精製された抗体。
［４８］  抗体を一又は複数の不純物を含む組成物から精製するための手法であって、
ａ１．抗体を含有する細胞培養上清を用意し、
ｂ１．前記細胞培養上清をアフィニティークロマトグラフィー樹脂により処理して、抗体を含むアフィニティークロマトグラフィープール液を得、
ｃ１．前記アフィニティークロマトグラフィープール液においてウイルスを不活化して、ウイルス不活化液を得、
ｄ１．前記ウイルス不活化液を活性炭材料により処理して、活性炭材料プール液を得る、
のａ１．乃至ｄ１．の工程を含み、工程ｄ１を実施することによりＰＬＢＬ２クリアランス能が向上する、方法。
［４９］  抗体を一又は複数の不純物を含む組成物から精製するための手法であって、
ａ２．抗体を含有する細胞培養上清を用意し、
ｂ２．前記細胞培養上清をアフィニティークロマトグラフィー樹脂により処理して、抗体を含むアフィニティークロマトグラフィープール液を得、
ｃ２．前記アフィニティークロマトグラフィープール液においてウイルスを不活化して、ウイルス不活化液を得、
ｄ２．前記ウイルス不活化液をデプスフィルターにより処理して、デプスフィルターろ過プール液を得、
ｅ２．前記デプスフィルターろ過プール液を活性炭材料により処理して、活性炭材料プール液を得る、
のａ２乃至ｅ２．の工程を含み、工程ｅ２を実施することによりＰＬＢＬ２クリアランス能が向上する、方法。
［５０］  抗体を一又は複数の不純物を含む組成物から精製するための手法であって、
ａ１．抗体を含有する細胞培養上清を用意し、
ｂ１．前記細胞培養上清をアフィニティークロマトグラフィー樹脂により処理して、抗体を含むアフィニティークロマトグラフィープール液を得、
ｃ１．前記アフィニティークロマトグラフィープール液においてウイルスを不活化して、ウイルス不活化液を得、
ｄ１．前記ウイルス不活化液を活性炭材料により処理して、活性炭材料プール液を得、
ｅ１．前記活性炭材料プール液を陽イオン交換材料により処理して、陽イオン交換材料プール液を得る、
のａ１．乃至ｅ１．の工程を含み、工程ｄ１を実施することによりＰＬＢＬ２クリアランス能が向上する、方法。
［５１］  抗体を一又は複数の不純物を含む組成物から精製するための手法であって、
ａ２．抗体を含有する細胞培養上清を用意し、
ｂ２．前記細胞培養上清をアフィニティークロマトグラフィー樹脂により処理して、抗体を含むアフィニティークロマトグラフィープール液を得、
ｃ２．前記アフィニティークロマトグラフィープール液においてウイルスを不活化して、ウイルス不活化液を得、
ｄ２．前記ウイルス不活化液をデプスフィルターにより処理して、デプスフィルターろ過プール液を得、
ｅ２．前記デプスフィルターろ過プール液を活性炭材料により処理して、活性炭材料プール液を得、
ｆ２．前記活性炭材料プール液を陽イオン交換材料により処理して、陽イオン交換材料プール液を得る、
のａ２乃至ｆ２．の工程を含み、工程ｅ２を実施することによりＰＬＢＬ２クリアランス能が向上する、方法。
【発明の効果】
【００１８】
本願発明者らは、従来までの抗体精製プロセスに活性炭材料による処理を追加することで、後段の精製工程への不純物負荷を低減し、混在する不純物の量又は種類によらず、抗体を安定的に目標とする純度にまで精製できることを見出した。さらに、本願発明者らは、活性炭材料による処理で高いウイルスクリアランス能を達成できることを見出し、ＣＨＯ細胞を用いた抗体医薬品の精製工程においてウイルスクリアランス能を有するＡＥＸクロマトグラフィー工程の機能を補完し、結果としてＡＥＸクロマトグラフィーの省略を可能とする製造プロセスを構築した。これにより従来の精製方法と比較して精製ステップ数及び製造コストを低減し、ヒト治療に使用するに充分な純度まで効率的に抗体を精製することができた。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２０】
１．定義
本明細書において、「抗体」なる用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、少なくとも２つのインタクトな抗体から形成される多重特異性抗体（二重特異性抗体）、Ｆｃ融合タンパク質、及び生物学的活性を呈する抗体断片等を意味する。なお、本発明を適用可能な抗体は、該抗体が特異的に結合する抗原によって限定されるものではない。また、本発明を適用可能な抗体は、該抗体のアミノ酸配列によって限定されるものでもない。
【００２１】
本明細書において、「結合／溶出（Ｂ／Ｅ）モード」なる用語は、試料中に含まれる少なくとも１つの生成物がクロマトグラフィー樹脂又は媒体に結合し、その後溶出される生成物分離技術を意味する。
【００２２】
本明細書において、「フロースルー（Ｆ／Ｔ）モード」なる用語は、試料中の少なくとも１つの生成物がクロマトグラフィー樹脂又は媒体を通って流動することを意図するが、少なくとも１つの潜在的な成分がクロマトグラフィー樹脂又は媒体に結合する生成物分離技術を意味する。
【００２３】
本明細書において、「オーバーロードモード」なる用語は、カラム等の吸着容量を超えてロードすることを意図し、目的物質と不純物の吸着量の強さの差を利用した生成物分離技術を意味する。本明細書においては、陽イオン交換材料に対し、抗体粗精製物が、該陽イオン交換材料の吸着容量を超えてロードされる。陽イオン交換材料への抗体粗精製物の吸着容量は、陽イオン交換材料１Ｌ当たり約１００ｇの蛋白質量である。オーバーロードモードにおけるローディング密度は、陽イオン交換材料１Ｌ当たり１５０〜４０００ｇの蛋白質量であるが、好適なローディング密度は５００〜２０００ｇ／Ｌの範囲であり、さらに好適なローディング密度は１０００〜１５００ｇ／Ｌの範囲である。
【００２４】
本明細書において、「アフィニティークロマトグラフィー」なる用語は、標的タンパク質（例えば、目的のＦｃ領域を含有するタンパク質又は抗体）が、標的タンパク質に特異的なリガンドに特異的に結合されるタンパク質分離技術を指す。抗体を精製する場合には、そのようなリガンドは、プロテインＡ若しくはプロテインＧ又はその機能的変異体であり、これはクロマトグラフィー固相材料に共有結合し、抗体溶液がクロマトグラフィー固相材料と接触する際に溶液中の抗体と結合する。
【００２５】
本明細書において、「デプスフィルター」なる用語は、抗体溶液から粒子を除去する目的で使用される、次第に減少する孔径を有する連続的に配置された一連のフィルターを意味する。デプスフィルターの三次元マトリックスは抗体溶液が通過する迷路状経路を形成し、該マトリックスの深さ全体にわたってランダムに粒子を吸着し機械的に捕捉する。種々のデプスフィルターは、巻かれた綿、ポリプロピレン、レーヨンセルロース、ガラス繊維、焼結金属、磁器、珪藻土又は他の公知成分で構成される。
【００２６】
本明細書において、「陽イオン交換材料」又は「ＣＥＸ（；ｃａｔｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅ）材料」なる用語は互換的に使用され、負に荷電し、かくして、固相上を又は固相中を通過した水性溶液中の陽イオンとの交換のための遊離陽イオンを有する固相を意味する。
【００２７】
本明細書において、「陰イオン交換材料」又は「ＡＥＸ（；ａｎｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅ）材料」なる用語は互換的に使用され、固相に結合した、第一級、第二級、第三級又は第四級アミノ基等の１又は複数の正に荷電したリガンドを有する、正に荷電した固相を意味する。
【００２８】
本明細書において、「疎水性相互作用クロマトグラフィー」又は「ＨＩＣ（；Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）」なる用語は、分子の疎水性、すなわち、水性溶液から疎水性表面に吸着する分子の能力に基づいて分子を分離するためのプロセスを意味する。疎水性相互作用クロマトグラフィー、典型的には、溶質分子の表面上の疎水性基の差異に依存する。これらの疎水性基は、不溶性マトリックスの表面上の疎水性基に結合する傾向を有する。ＨＩＣは逆相液体クロマトグラフィーよりも極性が高く、変性が少ない環境を用いるため、しばしばイオン交換又はゲル濾過クロマトグラフィーと組合せることによって、抗体精製において一般的に使用される。
【００２９】
本明細書において、「活性炭材料」なる用語は、炭素から構成された又は炭素を含有する任意の物質、活性炭を意味する。「活性炭（ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃａｒｂｏｎ）」は、その細孔構造を強化するために処理された炭素質材料を意味する。活性炭は、非常に高い表面積を有する多孔質の固体である。これらは石炭、木材、ヤシ殻、木の実の殻、泥炭をはじめとする種々の供給源から得ることができる。活性炭は、制御された環境下での加熱を伴う物理的な活性化、又は強酸、塩基、又は酸化剤を使用する化学的活性化を使用して、これらの材料から製造することができる。活性化方法は、高い不純物クリアランス能を活性炭に与えるための高い表面積を有する多孔質構造を作り出す。ほとんどの他の吸着材料とは対照的に、活性炭は、比較的弱いファンデルワールス力を使用して分子と相互作用をすると考えられている。本発明の精製方法に用いられる活性炭としては、1種類の活性炭を単独で使用しても、2種類以上の活性炭を単独で又は混合して用いても良い。
【００３０】
本明細書において、「連続的」なる用語は、直接連結された各材料間で連続的な流れを可能にする何らかの他の機構を有することを意味する。すなわち、１つのプロセスステップからの出力が、介入なくプロセス中の次のプロセスステップに直接流動するような２つ以上のプロセスステップ（又は単位操作）を含み、２つ以上のプロセスステップをその期間の少なくとも一部について同時に実施することができる、目的物質を精製するためのプロセスを意味する。
【００３１】
本明細書において、「除去」、「低減」、「クリアランス」なる用語は互換的に使用され、精製されるべき抗体を含む試料中の１つ以上の不純物量を低下させることを意味する。
【００３２】
本明細書において、「精製」、「純度を高めること」なる用語は互換的に使用され、試料から１つ以上の不純物を除去することにより、試料中の１つ以上の不純物に対する標的抗体の比を増加させることを意味する。
【００３３】
本明細書において、「電気伝導度」なる用語は、２つの電極間に電流を伝導する水溶液の能力を意味する。溶液中で、電流はイオン輸送によって流れる。よって、水溶液中に存在するイオンの量が増加すると溶液はより高い電気伝導度を有することになる。電気伝導度は、電気伝導度測定器を使用して測定することができ、電気伝導度の測定単位は１センチメートル当たりのミリジーメンス（ｍＳ／ｃｍ又はｍＳ）である。溶液の電気伝導度は、その中のイオンの濃度を変えることによって変更することができる。例えば、溶液中の緩衝液の濃度及び／又は塩の濃度は、所望の電気伝導度を達成するために変更することができる。好ましくは、種々の緩衝液の塩濃度は所望の電気伝導度を達成するように修正される。
【００３４】
本明細書において、「画分」なる用語は、例えば活性炭材料に試料を負荷する工程において、標的抗体を含む試料を供した後に収集された小容量の液体を意味する。
【００３５】
本明細書において、「ＨＣＰ；ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ」なる用語は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞培養液から誘導された宿主細胞由来タンパク質の混合物を意味する。ＨＣＰは一般的にはＣＨＯ細胞中で発現された抗体等の目的のタンパク質を含む細胞培養液中に不純物として存在する。
【００３６】
本明細書において「ＨＭＷＳ；ｈｉｇｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｓｐｅｃｉｅｓ」なる用語は、分子量の異なる抗体変異体のうち、単量体より高分子量領域側に溶出するものを意味する。
【００３７】
本明細書において「ＬＭＷＳ；ｌｏｗ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｓｐｅｃｉｅｓ」なる用語は、分子量の異なる抗体変異体のうち、単量体より低分子量領域側に溶出するものを意味する。
【００３８】
本明細書において、「ウイルス」なる用語は、生きた細胞の内部でのみ複製することができる小型の感染体又は粒子を意味する。これらは一般的に、タンパク質のキャプシドの内側に封入された核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ）、及び場合により脂質エンベロープから構成される。
【００３９】
本明細書において、「ウイルス様粒子」なる用語は、電子顕微鏡下で形態的に既知ウイルスとの関連性がうかがわれる構造体を意味する。
【００４０】
本明細書において、「レトロウイルス」なる用語は、逆転写されたＤＮＡ中間体を介して感染した細胞のゲノムＤＮＡにその遺伝情報を統合することが可能なＲＮＡウイルスを意味する。
【００４１】
本明細書において、「レトロウイルス様粒子」なる用語は、そのゲノム中にレトロウイルス由来のＤＮＡの部分を有する細胞によって生成された粒子を意味する。これらの粒子はレトロウイルスに似ているが多くの場合、非感染性である。本明細書の実施例で使用されるマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）は、モデルレトロウイルス又はレトロウイルス様粒子をあらわす。
【００４２】
本明細書において、「パルボウイルス」なる用語は、５０００ヌクレオチドの平均ゲノムサイズ及び１８から２６ｎｍの直径を有する、直鎖、非セグメント化一本鎖ＤＮＡ非エンベロープウイルスを指す。本明細書に記載されている方法において使用される典型的なパルボウイルスはマウス微小ウイルス（ＭＭＶ）である。
【００４３】
本明細書において、「対数除去値」又は「ＬＲＶ」なる用語は、既知量の不純物をカラム、フィルター等に通過させた時に、カラム、フィルター等による不純物の除去能力を表す値である。Ｃｆがフィード液中の不純物の濃度であり、Ｃｐがカラム、フィルターを通過した後の不純物の濃度であるとき、ＬＲＶ＝ｌｏｇ（Ｃｆ）−ｌｏｇ（Ｃｐ）である。
【００４４】
本明細書において、「培地成分」としては、血清、成長因子（インスリン等）、又は抗生物質等が挙げられる。
【００４５】
２．Ｆ／ＴモードＣＥＸクロマトグラフィーによるＨＣＰの除去
特許文献１、非特許文献２及び非特許文献３に示される先行技術にしたがい、プロテインＡクロマトグラフィー、ＡＥＸクロマトグラフィーに引き続き、Ｆ／ＴモードＣＥＸクロマトグラフィーで抗体培養液を精製したところ、抗体種（宿主細胞、あるいは培養方法の違いによる混在する不純物の量や種類の違いを含む）によってはＨＣＰが充分に除去できない例があることが分かった。プロテインＡクロマトグラフィー、ＡＥＸクロマトグラフィーに引き続き、Ｆ／ＴモードＣＥＸクロマトグラフィーからなるプロセスは、コスト、労力及び作業時間の面からは優れていたが、不純物、特にＨＣＰの除去という点で効果が安定していないことが明らかとなった。
【００４６】
ＨＣＰは様々な機構を介して免疫原性を誘導する可能性があることが広く知られている。実際に、ソマトロピンのバイオ後続品の治験において、ＨＣＰの残留により患者の全てで抗ＨＣＰ抗体が産生され、患者の最大６０％で非中和抗ソマトロピン抗体が産生された報告がある（M. Pavlovic et al., Horm.Res. 69:14-21(2008)）。ＨＣＰをさらに除去することにより抗ソマトロピン抗体は他の成長ホルモン抗体で報告されている程度に改善された。また、ＣＨＯ細胞で産生させた組換え第ＩＸ因子の臨床試験において、抗ＨＣＰ抗体がかなりの高い割合で産生され、有害事象は報告されなかったものの規制当局から保留命令を受けたことが報告されている
(https://www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/BloodBloodProducts/ApprovedProducts/LicensedProductsBLAs/FractionatedPlasmaProducts/UCM448429.pdf
Food and Drug Administration 
STATISTICAL REVIEW AND EVALUATION BLA FINAL, Product Name: IB1001, Indication(s): Control and prevention of bleeding episodes and perioperative management in patients with hemophilia B, CBER Receipt Date: Apr 6 2012
又はhttps://www.news-medical.net/news/20120710/Inspiration-receives-FDA-clinical-hold-order-for-IB1001-phase-III-studies-on-hemophilia-B.aspx
News-Medical.net - An AZoNetwork Site
Inspiration receives FDA clinical hold order for IB1001 phase III studies on hemophilia B, Jul 10 2012)。
【００４７】
安全性に関連した有害事象が報告される場合はもちろん、安全性に関連した有害事象が報告されない場合でも規制当局は潜在的リスクの可能性を考慮し、残留するＨＣＰをさらに低減した後、臨床試験を実施するよう指示する可能性がある。さらに近年、残留するＨＣＰ（リポプロテインリパーゼ）により製剤中のポリソルベートが分解され、医薬品の安定性に影響した例が報告されており（T Hall et al., J. Chromatogr. A 105:1633-1642(2016)）、医薬品の安定性の面からも精製工程で適切にＨＣＰを除去することが重要である。
【００４８】
ＨＣＰの残留による安全性及び安定性への影響については、宿主細胞の種類や残留するＨＣＰの種類に加え、製品の用法・用量によっても異なると考えられる。したがってＨＣＰの残留許容値については、製造工程、最大投与量、投与部位、投与頻度等を考慮し、製品毎に適切な値を設定する必要はあるが、製造工程で可能な限り低減することが望まれる。
【００４９】
以上のことから、ＣＥＸクロマトグラフィーとしてＦ／Ｔモードを用いた精製フローにおいてもＨＣＰをはじめとした不純物を低減できる、抗体種に依らない汎用的な方法が望まれた。
【００５０】
３．活性炭材料の適用による不純物の除去
本願発明者らは、製造コストを低減した上で抗体を確実に高純度に精製する方法を特定することを目指し、従来の精製工程に活性炭材料による処理を追加することで、抗体種によらず高純度に精製できることを見出した。
【００５１】
ＨＣＰは、異種タンパク質としてヒトに対して抗原性を示し得ること、また哺乳動物細胞由来タンパク質には造腫瘍性リスクが存在すること、さらには医薬品中のポリソルベート分解による安定性への観点から、充分低いレベルまで精製工程で除去する必要があることは前述のとおりである。また、ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ｂ−ｌｉｋｅ  ２（ＰＬＢＬ２）はＨＣＰの一種であるが、抗体との相互作用により残留するヒッチハイクＨＣＰとして報告されている（B. Tran et al., J. Chromatogr. A 1438:31-38(2016)）。さらに、抗体製剤中へのＰＬＢＬ２の残留により、レブリキズマブの臨床試験において抗ハムスターＰＬＢＬ２抗体が高頻度で発生した報告がある（国際公開第WO2015/038888号）。抗ハムスターＰＬＢＬ２抗体の発生についての臨床的重要性は知られておらず、レブリキズマブの臨床試験で抗ハムスターＰＬＢＬ２抗体が高頻度で発生しても安全性イベントと相関しなかった。しかし、依然として反復投与による長期曝露がアレルギー又は過敏症の患者集団において、アナフィラキシー、過敏症といった望ましくない影響を増大させる懸念があるため、製剤中のＰＬＢＬ２は可能な限り低減することが望ましいと考えられる。
【００５２】
これらの要求に対して、活性炭材料による処理を追加することにより、ＣＥＸクロマトグラフィーへのこれらの不純物負荷が低減され、その結果、ＨＣＰを充分低いレベルまで除去できた。また、抗体との相互作用により残留するヒッチハイクＨＣＰであるＰＬＢＬ２は一般的な精製方法では低減することが難しいため、活性炭材料によりロード液の約５０％が低減されること、すなわち活性炭材料によりＰＬＢＬ２の対数除去値（ＬＲＶ）０．２７が得られることには大きな意義がある。
【００５３】
さらに、活性炭材料により目的物質由来不純物であるＨＭＷＳ及びＬＭＷＳが低減された。活性炭材料によるＨＭＷＳの低減により、ＣＥＸクロマトグラフィーへの負荷を減らすことが可能となり、結果として最終精製物中のＨＭＷＳ量を安定的に低減できることとなった。また、ＬＭＷＳは一般的な精製方法では低減することが難しいため、活性炭材料による最終精製物の純度向上に対する寄与が大きい。
【００５４】
これらに加えて、活性炭材料にロードする抗体溶液のｐＨを調節することによってウイルスクリアランス能を向上させた。活性炭材料によりレトロウイルス及び/又はレトロウイルス様粒子、あるいは抗体溶液によって限定的ではあるがパルボウイルスを除去できる可能性があることが示されている（国際公開第WO2015/005961号）が、溶液ｐＨは７．０の条件である。一方、本発明ではｐＨ５．０の条件でウイルスが除去できることを見出しており、さらにｐＨ５．０の条件におけるウイルスクリアランス能は既報の条件よりも良好であることを示した。
【００５５】
一般的な抗体の精製法ではプロテインＡクロマトグラフィー、低ｐＨによるウイルス不活化処理を実施しており、不活化後にｐＨ５．０付近に中和される場合がある。また後段のＣＥＸクロマトグラフィーではｐＨ５．０付近の条件で実施される例が多いことから、これらの工程間に活性炭材料による処理を実施する際、特別なｐＨ調整や希釈操作等を実施することなく活性炭材料による処理ができることは、製造作業を単純化することに大きく寄与する。さらに、抗体によってはｐＨ変化により不安定化する場合があることから、ｐＨ調整せずに活性炭処理ができることは、抗体の安定性の維持にも大きく寄与すると考えられる。
【００５６】
ＣＨＯ細胞を用いた抗体医薬品の精製工程において、一般的にＡＥＸクロマトグラフィー工程はウイルスクリアランス能を有することが知られているが、活性炭材料がＡＥＸクロマトグラフィーと同等のウイルスクリアランス能を有することが明らかとなったことから、ＡＥＸクロマトグラフィー工程の代替として活性炭材料による処理が可能となり、これにより、ＡＥＸクロマトグラフィーを省略できる可能性が示された。ＡＥＸクロマトグラフィーをはじめとしたクロマトグラフィーはその作業性が煩雑であり、吸着フィルターとして活性炭材料を用いることで、作業性が煩雑なクロマトグラフィーを省略することができ、より単純で効率的なプロセスとなり得る。また、高価なＡＥＸ樹脂やＭｅｍｂｒａｎｅ  Ａｄｓｏｒｂｅｒ等を安価な活性炭吸着フィルターとすることで、ランニングコストの大幅な低減が達成される。さらに、高額なクロマトグラフィー装置が不要で、安価なフィルターユニットに置き換えられることから、製造設備の初期投資の低減にも大きく寄与できると考えられる。
【００５７】
４．本発明で採用される精製工程
本明細書においては、抗体を一又は複数の不純物を含む組成物から精製するための手法であって、
ａ１．抗体を含有する細胞培養上清を用意し、
ｂ１．前記細胞培養上清をアフィニティークロマトグラフィー樹脂により処理して、抗体を含むアフィニティークロマトグラフィープール液を得、
ｃ１．前記アフィニティークロマトグラフィープール液においてウイルスを不活化して、ウイルス不活化液を得、
ｄ１．前記ウイルス不活化液を活性炭材料により処理して、活性炭材料プール液を得、
ｅ１．前記活性炭材料プール液を陽イオン交換材料により処理して、陽イオン交換材料プール液を得る、
のａ１．乃至ｅ１．の工程を含む方法（以下、改良方法２）、を提供する。
【００５８】
ｂ１．工程におけるアフィニティークロマトグラフィー樹脂の好適な例として、プロテインＡ樹脂を挙げることができる。採用可能なプロテインＡ樹脂として、プロテインＡ樹脂が、ＫａｎＣａｐＡ（ＫＡＮＥＫＡ）、ＫａｎＣａｐＡ３Ｇ（ＫＡＮＥＫＡ）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  ｐｃｃ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＰｒｉｓｍＡ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、又はＡｍｓｐｈｅｒｅ  Ａ３（ＪＳＲ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ）を挙げることができるが、これらの樹脂に限定されるものではない。
【００５９】
ｃ１．の工程におけるウイルス不活化については、酸、界面活性剤、化学物質、核酸架橋剤、紫外線、ガンマ線及び熱での処理からなる群から選択されるいずれかひとつの方法を挙げることができる。ウイルス不活化処理として酸処理が選択される場合の好適なｐＨの範囲は、アフィニティークロマトグラフィープール液のｐＨを３〜４に低下させる処理であり、ウイルス不活化処理としてさらに好適なｐＨは３．５である。この場合の好適な処理時間は６０〜１２０分であり、好適な処理温度は１５〜３０℃である。
【００６０】
ｄ１．の工程における活性炭材料は、クロマトグラフィーカラム中に充填される。他の実施形態において、活性炭材料はフィルタータイプであり、ディスポーザブル形式のＭｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）Ｐｏｄ等の密閉使い捨てデバイス中に充填される。さらに他の実施形態において、活性炭材料はカートリッジ又はカプセル中に充填される。フィルタータイプの多くは、セルロースマトリックス等の強度のある構造のろ材に活性炭材料が混合される。
【００６１】
市販の活性炭フィルターの例として、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）  Ｐｏｄ  ＣＲ４０（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｚｅｔａ Ｐｌｕｓ 活性炭吸着デプスフィルター（３Ｍ）、ＳＵＰＲＡｃａｐ  ５０  Ｓｅｉｔｚ（登録商標）  ＡＫＳ  ｆｉｌｔｅｒ（ＰＡＬＬ）を挙げることができるが、これらの活性炭材料に限定されるものではない。いくつかの実施形態において、活性炭フィルターはセルロースマトリックス中に活性炭材料を保持した構造を有する。  ｄ１．の工程における活性炭材料にロードする溶液、活性炭材料の平衡化バッファー及び洗浄バッファーの好適なｐＨは４．５〜７．５であり、より好適なｐＨは４．５〜５．５であり、さらに好適なｐＨは５．０である。また、ｄ１．の工程の活性炭材料にロードする溶液、活性炭材料の平衡化バッファー及び洗浄バッファーの好適な電気伝導度は２〜１０ｍＳ／ｃｍであり、より好適な電気伝導度は２〜５ｍＳ／ｃｍである。
【００６２】
ｅ１．の工程における陽イオン交換材料は、樹脂、モノリスカラム、又は膜のいずれか一つが選択される。陽イオン交換材料の官能基は、スルホプロピル、スルホエチル、スルホイソブチル、又はカルボキシルである。市販の陽イオン交換材料の例としては、ＰＯＲＯＳＸＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｅｓｈｍｕｎｏ（登録商標）  ＣＰＸ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｅｓｈｍｕｎｏ（登録商標）  ＣＰ−ＦＴ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、又はＣａｐｔｏ  Ｓ  ＩｍｐＡｃｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を挙げることができるが、これらの陽イオン交換材料に限定されるものではない。
【００６３】
ｅ１．の工程においては、ｄ１．の工程で得られた活性炭材料プール液が陽イオン交換材料の吸着容量を超えてロードされる。ローディング密度は、陽イオン交換材料１Ｌ当たり１５０〜４０００ｇの蛋白質量の範囲で選択可能であるが、好適なローディング密度は５００〜２０００ｇ／Ｌの範囲であり、さらに好適なローディング密度は１０００〜１５００ｇ／Ｌの範囲である。ロードされる活性炭材料プール液の好適なｐＨはｐＨ４〜６であり、より好適なｐＨは４．５〜５．５であり、さらに好適なｐＨは５．０である。また、ｅ１．の工程の陽イオン交換材料にロードする溶液の好適な電気伝導度は３〜７ｍＳ/ｃｍであり、より好適な電気伝導度は３〜５ｍＳ/ｃｍである。
【００６４】
上記改良方法２においては、ａ１．乃至ｅ１．の各工程の前後に１種類以上の任意の工程が追加されていても良い。
【００６５】
例えば、改良方法２においては、ｃ１．の工程とｄ１．の工程の間にデプスフィルターによる処理が追加されていても良い。デプスフィルターは、吸着作用と通常の多孔性ろ材による機械的ろ過作用との二側面から、おおむね１  μｍを超えるサイズの粒子を捕捉することができるフィルターであり、セルロースマトリックスとケイソウ土等のろ材からなる。無数の長い流路を持つ厚みのあるろ材によって、フィルター内部で対象物をトラップできる特徴を有する。デプスフィルターは、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）Ｐｏｄ等の密閉使い捨てデバイス中に充填される。市販のデプスフィルターの例としては、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）Ａ１ＨＣ、Ｄ０ＨＣ、Ｘ０ＨＣを挙げることができるが、これらのデプスフィルターに限定されるものではない。
【００６６】
デプスフィルターを追加した具体的な例として、抗体を一又は複数の不純物を含む組成物から精製するための手法であって、
ａ２．抗体を含有する細胞培養上清を用意し、
ｂ２．前記細胞培養上清をアフィニティークロマトグラフィー樹脂により処理して、抗体を含むアフィニティークロマトグラフィープール液を得、
ｃ２．前記アフィニティークロマトグラフィープール液においてウイルスを不活化して、ウイルス不活化液を得、
ｄ２．前記ウイルス不活化液をデプスフィルターにより処理して、デプスフィルターろ過プール液を得、
ｅ２．前記デプスフィルターろ過プールを活性炭材料により処理して、活性炭材料プール液を得、
ｆ２．前記活性炭材料プール液を陽イオン交換材料により処理して、陽イオン交換材料プール液を得る、
のａ２．乃至ｆ２．の工程を含むことからなる、改良方法２のｃ１．の工程とｄ１．の工程の間にデプスフィルターによる処理が追加された方法（以下、改良方法１）、を提供する。
【００６７】
また、上記改良方法２のｃ１．の工程とｄ１．の工程の間、又は上記改良方法１のｄ２．の工程とｅ２．工程の間に陰イオン交換材料による処理が追加されていても良い。陰イオン交換材料は、樹脂、モノリスカラム、又は膜のいずれか一つが選択されるが、膜の場合はＱ膜を選択することができる。通常、陰イオン交換材料はＦ／Ｔモードで使用される。市販の陰イオン交換材料の例としては、ＮａｔｒｉＦｌｏ（登録商標）ＨＤ−Ｑ、Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｑ、又はＳａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｑを挙げることができるが、これらの陰イオン交換材料に限定されるものではない。
【００６８】
上記改良方法２のｅ１．の工程又は上記改良方法１のｆ２．の工程で得られた陽イオン交換材料プール液を、さらに疎水性相互作用クロマトグラフィーにより処理してプール液を得ても良い（以下、改良方法３）。また、上記改良方法２のｄ１．の工程又は上記改良方法１のｅ２．の工程で得られた活性炭材料プール液を、さらに疎水性相互作用クロマトグラフィーにより処理して疎水性相互作用クロマトグラフィープール液を得、さらに陽イオン交換材料により処理して陽イオン交換材料プール液を得ても良い（以下、改良方法４）。前記の疎水性相互作用クロマトグラフィーは、好ましくはＦ／Ｔモードである。また、前記の疎水性相互作用クロマトグラフィーは、Ｐｈｅｎｙｌ基、Ｂｅｎｚｙｌ基若しくはＨｅｘｙｌ基を有する樹脂又は膜を用いて実施される。市販の疎水性相互作用クロマトグラフィー材料の例としては、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｐｈｅｎｙｌ（ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、ＲｅａｄｙＴｏＰｒｏｃｅｓｓ  Ａｄｓｏｒｂｅｒ  Ｐｈｅｎｙｌ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、ＰＯＲＯＳ  Ｂｅｎｚｙｌ  Ｕｌｔｒａ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＰＯＲＯＳ  Ｂｅｎｚｙｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｈｅｘｙｌ−６５０Ｃ（東ソー）を挙げることができるが、これらの疎水性相互作用クロマトグラフィー材料に限定されるものではない。
【００６９】
ここに記載されている何れかの方法の幾つかの実施形態においては、精製された抗体を回収することを更に含む。幾つかの実施形態では、精製抗体は、ここに記載されている何れかの精製工程から回収される。
【００７０】
上記の工程によって、ＨＣＰ、ＰＬＢＬ２、ウイルス、ウイルス様粒子、ＨＭＷＳ、ＬＭＷＳ、培地成分、浸出プロテインＡ及びＤＮＡから選択される少なくとも一つの不純物が除去される。
【実施例】
【００７１】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。【００７２】
実施例１．一般方法
本実施例では、実施例２以降に示す実施例で共通して使用する一般的な方法について説明する。【００７３】
１）抗体濃度測定
抗体濃度は、ＰＡ  ＩＤ Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ  （２．１ｍｍ×３ｍｍ、  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）カラムを用いたＨＰＬＣ法により測定した。【００７４】
２）ＨＣＰ測定
Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のｔｈｉｒｄ-ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ＣＨＯ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎキットあるいはＢｉｏＧＥＮＥＳ社のＣＨＯ|３６０  ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡキットを用いて、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）により測定した。得られたＨＣＰ濃度を抗体濃度で除し、ｎｇＨＣＰ／ｍｇ抗体に換算した。【００７５】
実施例２〜５では、Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のｔｈｉｒｄ-ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ＣＨＯ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎキットを、実施例６〜８では、ＢｉｏＧＥＮＥＳ社のＣＨＯ|３６０  ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡキットを使用した。【００７６】
３）ＰＬＢＬ２測定
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｔｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ,  ＩＮＣ.のＨａｍｓｔｅｒ  Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ｂ-Ｌｉｋｅ  ２  (ＰＬＢＬ２)  ＥＬＩＳＡキットを用いて、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）により測定した。得られたＰＬＢＬ２濃度を抗体濃度で除し、ｎｇＰＬＢＬ２／ｍｇ抗体に換算した。さらに各精製工程でのＰＬＢＬ２クリアランス能（対数除去値、Ｌｏｇ  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  Ｖａｌｕｅ；ＬＲＶ）を、以下の計算により算出した。Ｃｆがフィード液中のＰＬＢＬ２の濃度であり、Ｃｐがカラム、フィルターを通過した後のＰＬＢＬ２の濃度であるとき、ＬＲＶ＝ｌｏｇ（Ｃｆ）−ｌｏｇ（Ｃｐ）とした。【００７７】
４）高分子量体（ＨＭＷＳ）、低分子量体（ＬＭＷＳ）及びＭｏｎｏｍｅｒ（単量体）含量
ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ  ｃｏｌｕｍｎ  （５μｍ、７．８ｍｍ×３００ｍｍ、Ｔｏｓｏｈ）又はＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＢＥＨ  ＳＥＣ  ｃｏｌｕｍｎ  （１．７μｍ、４．６ｍｍ×３００ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ）を用いたＨＰＬＣ法により測定した。移動相は、０．４Ｍ塩化ナトリウムを含有する０．１Ｍリン酸緩衝液を用いた。【００７８】
５）プロテインＡ測定
Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のプロテインＡ  ＥＬＩＳＡキットを用いて、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）により測定した。得られたプロテインＡ濃度を結果比較のために抗体濃度で除し、ｎｇプロテインＡ／ｍｇ抗体に換算した。【００７９】
６）ウイルス力価測定及びウイルスクリアランス能（対数除去値、Ｌｏｇ  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  Ｖａｌｕｅ；ＬＲＶ）の算出
ウイルス力価は、ウイルスに感染すると細胞の形状が変化する現象（細胞変性）を利用した、５０％の細胞に感染するウイルス量を測定する方法（組織培養感染性試験；ＴＣＩＤ５０）により測定した。対象ウイルスとしては、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、マウス微小ウイルス（ＭＭＶ）、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）、レオウイルス３型（Ｒｅｏ３）とした。また指示細胞として、ＰＧ４細胞（ＭＬＶの指示細胞）、３２４Ｋ細胞あるいはＡ９細胞（ＭＭＶの指示細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（ＰＲＶの指示細胞）、Ｌ−９２９細胞（Ｒｅｏ３の指示細胞）を用いた。ウイルスクリアランス試験の前には、緩衝液やサンプルが指示細胞に望ましくない影響を及ぼしていないかを調べるために、ウイルス力価測定法に対する毒性作用又は干渉作用を評価した。ウイルスクリアランス能（対数除去値、ＬＲＶ）を、以下の計算により算出した。Ｃｆがフィード液中のウイルスの濃度であり、Ｃｐがカラム、フィルターを通過した後のウイルスの濃度であるとき、ＬＲＶ＝ｌｏｇ（Ｃｆ）−ｌｏｇ（Ｃｐ）とした。【００８０】
７）ＤＮＡ測定
ＣＨＯに特異的なプライマー、プローブを用いたｑＰＣＲ法により測定した。得られたＤＮＡ濃度を抗体濃度で除し、ｐｇＤＮＡ／ｍｇ抗体に換算した。【００８１】
実施例２．ＣＥＸクロマトグラフィー工程をＦ／Ｔモードで精製した参考例（Ｍａｂ  Ａ）
本実施例は、以下の表１に示される精製フローにおけるＭａｂ  Ａと呼ばれるモノクローナル抗体の不純物クリアランスについて説明する。【００８２】
【表１】
2020153390.tif 000002
【００８３】
１）材料及び方法
Ｍａｂ  Ａを産生したＣＨＯ細胞培養液について、デプスフィルターろ過により細胞を除去し、清澄化して細胞培養上清を得た。細胞培養上清を、ＫａｎＣａｐＡ樹脂を用いたプロテインＡクロマトグラフィーにより精製した。２０ｍＭ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）でカラムを平衡化した後、培養上清をロードし、その後、１Ｍ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）、続いて２０ｍＭ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）で洗浄を行った。酢酸バッファー（ｐＨ３．６）でＭａｂ  Ａをカラムから溶出した。２８０ｍｍの吸光度をモニタリングし、Ｍａｂ  Ａを含む画分を取得した（アフィニティークロマトグラフィープール液）。アフィニティークロマトグラフィープール液に塩酸を加え、ｐＨを３．５に調整し、１時間、ウイルス不活化処理を行った。該工程は室温で実施した。1時間のウイルス不活化処理の後、トリス水溶液を用いてｐＨ５．０に中和した。中和液を、予め酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で洗浄したデプスフィルター（Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ（登録商標）  Ｐｏｄ  Ａ１ＨＣ）にロードし、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施し、Ｍａｂ  Ａを回収した。続いて、０．２μｍのフィルターでろ過し、保存した（デプスフィルターろ過プール液）。デプスフィルターろ過プール液をトリス水溶液でｐＨ７．５に調整し、ＡＥＸ材料ロード液とした。予め１Ｍ塩化ナトリウムを含むトリスバッファー（ｐＨ７．５）、続いてトリスバッファー（ｐＨ７．５）で平衡化したＡＥＸ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ａｄｓｏｒｂｅｒ（ＮａｔｒｉＦｌｏ（登録商標）  ＨＤ−Ｑ）にＡＥＸ材料ロード液を通液し、続いてトリスバッファー（ｐＨ７．５）で洗浄することによりＭａｂ  Ａを回収した。回収液は酢酸を用いてｐＨ５．０に調整した後、０．２μｍのフィルターでろ過し、ＡＥＸ材料プール液として保存した。予め１Ｍ塩化ナトリウムを含む酢酸バッファー（ｐＨ５．０）、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で平衡化したＰＯＲＯＳ  ＸＳを充填したＣＥＸカラムにＡＥＸ材料プール液を通液した。ＣＥＸカラムへのローディング密度は２０００ｇ／Ｌ樹脂以下と設定した。ロード後、酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施した。２８０ｍｍの吸光度をモニタリングし、Ｍａｂ  Ａを含む画分を取得し、Ｆ／ＴモードによるＣＥＸ材料プール液とした。【００８４】
２）結果
ＣＥＸクロマトグラフィー工程のＦ／ＴモードによるＭａｂ  Ａ回収率は、９２％であった。不純物クリアランスの結果（表２）を示す。【００８５】
【表２】
2020153390.tif 000003
【００８６】
実施例３．活性炭材料による不純物クリアランス（Ｍａｂ  Ａ、Ｍａｂ  Ｂ、Ｍａｂ  Ｃ、Ｍａｂ  Ｄ）
本実施例は、以下の表３に示される精製フローにおけるＭａｂ  Ａ、Ｍａｂ  Ｂ、Ｍａｂ  Ｃ、又はＭａｂ  Ｄと呼ばれる複数の抗体の活性炭材料による不純物クリアランスについて説明する。なお、Ｍａｂ  Ａ、Ｍａｂ  Ｂ、Ｍａｂ  Ｃ、又はＭａｂ  Ｄのアミノ酸配列及び結合する抗原は、それぞれ異なっている。【００８７】
【表３】
2020153390.tif 000004
【００８８】
１）活性炭材料における不純物クリアランス（ウイルス以外）
活性炭材料としてＭｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）  Ｐｏｄ  ＣＲ４０を用いて、Ｍａｂ  Ｂ及びＭａｂ  Ａについて、抗体回収率及び不純物クリアランスの評価をおこなった。実施例２に示す方法に準じて得られたＭａｂ  Ｂ及びＭａｂ  Ａのデプスフィルターろ過プール液を活性炭フィルターへのロード液（活性炭材料ロード液）として用いた。ただし、活性炭フィルターでのＨＣＰのクリアランス能を評価しやすくするために、Ｍａｂ  ＢについてはプロテインＡクロマトグラフィーにおいて、培養上清をロード後の１Ｍ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）による洗浄は実施しなかった。活性炭フィルターは予め取扱説明書にしたがって適切な洗浄を実施した後、酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で平衡化した。なお、平衡化以降の流速は、１０９ＬＭＨと設定した。平衡化後、活性炭材料ロード液をＭａｂ  Ｂでは、約３００Ｌ／ｍ２で、Ｍａｂ  Ａでは約１１７Ｌ／ｍ２で負荷し、通液後、酢酸バッファーでＭａｂ  Ｂ及びＭａｂ  Ａを回収した（活性炭材料プール液）。【００８９】
各抗体についての精製条件（表４）、抗体回収率（表５）、ＨＣＰクリアランス（表６）、ＰＬＢＬ２クリアランス（表７）、及びＨＭＷＳ，ＬＭＷＳクリアランス（表８）を示す。いずれの抗体でも、活性炭フィルターろ過によってＨＣＰ、ＰＬＢＬ２が低減された。さらにＨＭＷＳ及びＬＭＷＳが低減され、Ｍｏｎｏｍｅｒ含量の向上が確認された。特にＨＣＰに関して活性炭フィルターろ過により大幅に低減された（実施例２では、ＡＥＸクロマトグラフィー処理の前後においてＨＣＰ除去の程度が低く、ＣＥＸクロマトグラフィーに対するＨＣＰの負荷が低減されていない）。さらに、抗体との相互作用により、一般的な抗体精製フローでは低減し難いヒッチハイクＨＣＰとして報告があるＰＬＢＬ２についても（国際公開第WO2015/038888号）、活性炭フィルターろ過で低減されることが明らかになった。ヒッチハイクＨＣＰであるＰＬＢＬ２は一般的な精製方法では低減することが難しいため、活性炭材料によりロード液の約５０％が低減されること、すなわち活性炭材料によりＰＬＢＬ２の対数除去値（ＬＲＶ）０．２７が得られることには大きな意義がある。【００９０】
【表４】
2020153390.tif 000005
【００９１】
【表５】
2020153390.tif 000006
【００９２】
【表６】
2020153390.tif 000007
【００９３】
【表７】
2020153390.tif 000008
【００９４】
【表８】
2020153390.tif 000009
【００９５】
２）活性炭材料におけるウイルスクリアランス
活性炭材料としてＭｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）  Ｐｏｄ  ＣＲ４０を用いて、ウイルスクリアランスを評価した。Ｍａｂ  Ｂ、Ｍａｂ  Ｃ、及びＭａｂ  Ｄへのスパイク試験によりウイルスクリアランス能を確認した。スパイク対象ウイルスとしては、ＣＨＯ細胞を用いた抗体医薬品のウイルスクリアランス試験で一般的に用いられている４ウイルス（ＭＬＶ，ＭＭＶ，Ｒｅｏ３及びＰＲＶ）とした。活性炭フィルターろ過によるウイルスクリアランス能に影響を及ぼす可能性がある因子として、流速、ｐＨ及び抗体種類をあげ、それらの影響を確認する試験を計画した。実施例２に示す方法に準じて得られたＭａｂ  Ｂ、Ｍａｂ  Ｃ、及びＭａｂ  Ｄのデプスフィルターろ過プール液を活性炭フィルターへのロード液（活性炭材料ロード液）として用いた（ｐＨ５．０）。さらに、ｐＨ７．５の条件のロード液については、トリス水溶液によりｐＨを７．５に調整した。活性炭フィルターは予め取扱説明書にしたがって適切な洗浄を実施した後、酢酸バッファー（ｐＨ５．０）あるいはトリスバッファー（ｐＨ７．５）で平衡化した。なお、平衡化以降の流速は、１０９ＬＭＨあるいは５４．５ＬＭＨと設定した。平衡化後、活性炭材料ロードを約５５Ｌ／ｍ２あるいは約１１０Ｌ／ｍ２で負荷し、通液後、酢酸バッファー（ｐＨ５．０）あるいはトリスバッファー（ｐＨ７．５）でＭａｂ  Ｂ、Ｍａｂ  Ｃ、及びＭａｂ  Ｄを回収し（活性炭材料プール液）、活性炭材料ロード液及び活性炭材料プール液のウイルス力価からウイルス対数除去値（ＬＲＶ）を算出した（表９）。この結果、活性炭フィルターは４種のウイルスに対してクリアランス能を有することが判明した。ウイルスクリアランス能は、流速、共存する抗体種、及び負荷量によって影響を受けず、ＣＨＯ細胞を用いた抗体医薬品のウイルスクリアランス試験で用いる４種のウイルスについてＬＲＶがいずれも＞＝４と高いクリアランス能を有していた。一方、ＭＬＶの評価においてｐＨ５．０及び７．５でウイルスクリアランス能を比較した結果、ｐＨ７．５でＬＲＶが低下していることが分かり、ｐＨが活性炭材料におけるウイルスクリアランスに影響する重要パラメータであることが明らかとなった。【００９６】
【表９】
2020153390.tif 000010
【００９７】
実施例４．改良方法１による精製例（Ｍａｂ  Ａ、Ｍａｂ  Ｃ）
本実施例は、以下の表１０に示される精製フローにおけるＭａｂ  Ａ又はＭａｂ  Ｃと呼ばれるモノクローナル抗体の不純物クリアランスについて説明する。【００９８】
【表１０】
2020153390.tif 000011
【００９９】
１）材料及び方法
Ｍａｂ  Ａを産生したＣＨＯ細胞培養液について、デプスフィルターろ過により細胞を除去し、清澄化した。細胞培養上清を、ＫａｎＣａｐＡ樹脂を用いたプロテインＡクロマトグラフィーにより精製した。２０ｍＭ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）でカラムを平衡化した後、培養上清をロードし、その後、１Ｍ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）、続いて２０ｍＭ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）で洗浄を行った。酢酸バッファー（ｐＨ３．６）でＭａｂ  Ａをカラムから溶出した。２８０ｍｍの吸光度をモニタリングし、Ｍａｂ  Ａを含む画分を取得した（アフィニティークロマトグラフィープール液）。アフィニティークロマトグラフィープール液に塩酸を加え、ｐＨを３．５に調整し、１時間、ウイルス不活化処理を行った。該工程は室温で実施した。１時間のウイルス不活化処理の後、トリス水溶液を用いてｐＨ５．０に中和し、０．２μｍのフィルターでろ過し、保存した（ウイルス不活化液）。ウイルス不活化液を、予め酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で洗浄したデプスフィルター（Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）  Ｐｏｄ  Ａ１ＨＣ）に約１０９Ｌ／ｍ２で負荷し、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施し、Ｍａｂ  Ａを回収した（デプスフィルターろ過プール液）。【０１００】
デプスフィルターろ過プール液を予め酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で洗浄した活性炭フィルター（Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）  Ｐｏｄ  ＣＲ４０）に１１７Ｌ／ｍ２で負荷し、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施し、Ｍａｂ  Ａを回収した。続いて、０．２μｍのフィルターでろ過し、保存した（活性炭材料プール液）。予め１Ｍ塩化ナトリウムを含む酢酸バッファー（ｐＨ５．０）、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で平衡化したＰＯＲＯＳ  ＸＳを充填したＣＥＸカラムに活性炭材料プール液を通液した。ＣＥＸカラムへのローディング密度は約２０００ｇ／Ｌ樹脂とした。ロード後、酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施した。２８０ｍｍの吸光度をモニタリングし、Ｍａｂ  Ａを含む画分を取得し、Ｆ／ＴモードによるＣＥＸ材料プール液とした。【０１０１】
実施例３で調製したＭａｂ  Ｃのアフィニティークロマトグラフィープール液、デプスフィルターろ過プール液及び活性炭材料プール液を用いて、ウイルスクリアランスを評価した。スパイク対象ウイルスとしては、ＣＨＯ細胞を用いた抗体医薬品のウイルスクリアランス試験で一般的に用いられている４ウイルス（ＭＬＶ，ＭＭＶ，Ｒｅｏ３及びＰＲＶ）とした。ウイルス力価からウイルス対数除去値（ＬＲＶ）を算出した。【０１０２】
２）結果
改良方法１におけるＭａｂ  Ａ回収率、及び不純物クリアランスの結果を表１１及び表１２に示す。また、Ｍａｂ  Ｃについて、改良方法１におけるウイルスクリアランス能を有する工程の精製工程総クリアランスを表１３に示す。【０１０３】
改良方法１におけるＭａｂ  Ａの回収率は良好であった。ＨＭＷＳ及びＬＭＷＳが除去され、高いＭｏｎｏｍｅｒ含量の抗体が得られた。ＨＣＰ含量は適切に低減された。ＰＬＢＬ２含量についても、低減できた。また、ＤＮＡについても定量限界未満まで除去されていることが確認された。【０１０４】
改良方法１におけるＭａｂ  Ｃのウイルスクリアランス能を有する工程の精製工程総クリアランスも良好な結果を示した。【０１０５】
活性炭材料による処理と組み合わせることで、高純度に精製できること、さらに活性炭材料による処理でウイルスが除去されることが見出されたため、実施例２に示す方法からＡＥＸクロマトグラフィーを活性炭材料に置き換えることが可能となった。製造コストについては、ＣＥＸクロマトグラフィーを一般的に使用されているＢ／ＥモードからＦ／Ｔモードとすることで、樹脂へのローディング密度が約１００ｇ／Ｌ樹脂から約２０００ｇ／Ｌ樹脂へと増大し、高価なＣＥＸ樹脂コストを約１／２０とすることが可能となった。また、高価なＡＥＸ樹脂や膜を安価な活性炭材料とすることで製造コスト低減が達成された。さらにＡＥＸクロマトグラフィーを削除し、フィルターカートリッジタイプのデプスフィルターに続けて同タイプの活性炭フィルターを使用することにより、製造日数も１日短縮できた。多くの医薬品メーカーにとって製造の効率化は必須であり、年間の製造ロット数を最大化することにより製造の効率化がはかられていることから、製造日数が１日短縮できることには大きな意義がある。【０１０６】
該改良方法により、ヒト治療用として使用するに充分な純度まで、しかも製造コストを低減し、製造期間を短縮し、効率的に抗体を精製することが可能となった。【０１０７】
【表１１】
2020153390.tif 000012
【０１０８】
【表１２】
2020153390.tif 000013
【０１０９】
【表１３】
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【０１１０】
実施例５．改良方法２による精製例（Ｍａｂ  Ａ、Ｍａｂ  Ｄ）
本実施例は、実施例４の表１０の精製フローよりデプスフィルターろ過を省略した、以下の表１４に示される精製フローにおけるＭａｂ  Ａ及びＭａｂ  Ｄと呼ばれるモノクローナル抗体の不純物クリアランスについて説明する。なお、Ｍａｂ  Ｄのアミノ酸配列及び結合する抗原は、Ｍａｂ  Ａ、Ｍａｂ  Ｂ又はＭａｂ  Ｃとは異なっている。【０１１１】
【表１４】
2020153390.tif 000015
【０１１２】
１）材料及び方法
１）−１）Ｍａｂ  Ａの場合
Ｍａｂ  Ａを産生したＣＨＯ細胞培養液について、デプスフィルターろ過により細胞を除去し、清澄化した。細胞培養上清を、ＫａｎＣａｐＡ樹脂を用いたプロテインＡクロマトグラフィーにより精製した。２０ｍＭ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）でカラムを平衡化した後、培養上清をロードし、その後、１Ｍ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）、続いて２０ｍＭ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）で洗浄を行った。酢酸バッファー（ｐＨ３．６）でＭａｂ  Ａをカラムから溶出した。２８０ｍｍの吸光度をモニタリングし、各抗体を含む画分を取得した（アフィニティークロマトグラフィープール液）。アフィニティークロマトグラフィープール液に塩酸を加え、ｐＨを３．５に調整し、１時間、ウイルス不活化処理を行った。該工程は室温で実施した。1時間のウイルス不活化処理の後、トリス水溶液を用いてｐＨ５．０に中和し、０．２μｍのフィルターでろ過し、保存した（ウイルス不活化液）。ウイルス不活化液を予め酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で洗浄した活性炭フィルター（Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）  Ｐｏｄ  ＣＲ４０）に７０Ｌ／ｍ２で負荷し、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施し、各抗体を回収した。続いて、０．２μｍのフィルターでろ過し、保存した（活性炭材料プール液）。予め１Ｍ塩化ナトリウムを含む酢酸バッファー（ｐＨ５．０）、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で平衡化したＰＯＲＯＳ  ＸＳを充填したＣＥＸカラムに活性炭材料プール液を通液した。ＣＥＸカラムへのローディング密度は約２０００ｇ／Ｌ樹脂と設定した。ロード後、酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施した。２８０ｍｍの吸光度をモニタリングし、各抗体を含む画分を取得し、続いて０．２μｍのフィルターでろ過しＦ／ＴモードによるＣＥＸ材料プール液とした。【０１１３】
１）−２）Ｍａｂ  Ｄの場合
Ｍａｂ  Ｄを産生したＣＨＯ細胞培養液について、デプスフィルターろ過により細胞を除去し、清澄化した。細胞培養上清を、ＫａｎＣａｐＡ樹脂を用いたプロテインＡクロマトグラフィーにより精製した。２０ｍＭ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）でカラムを平衡化した後、培養上清をロードし、その後、１Ｍ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）、続いて２０ｍＭ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）で洗浄を行った。酢酸バッファー（ｐＨ３．６）でＭａｂ  Ｄをカラムから溶出した。２８０ｍｍの吸光度をモニタリングし、各抗体を含む画分を取得した（アフィニティークロマトグラフィープール液）。アフィニティークロマトグラフィープール液に塩酸を加え、ｐＨを３．４に調整し、１時間、ウイルス不活化処理を行った。該工程は室温で実施した。1時間のウイルス不活化処理の後、トリス水溶液を用いてｐＨ５．０に中和し、保存した（ウイルス不活化液）。ウイルス不活化液を予め酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で洗浄した活性炭フィルター（Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）  Ｐｏｄ  ＣＲ４０）に１７８Ｌ／ｍ２で負荷し、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施し、各抗体を回収した。続いて、０．２μｍのフィルターでろ過し、保存した（活性炭材料プール液）。予め１Ｍ塩化ナトリウムを含む酢酸バッファー（ｐＨ５．０）、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で平衡化したＰＯＲＯＳ  ＸＳを充填したＣＥＸカラムに活性炭材料プール液を通液した。ＣＥＸカラムへのローディング密度は約１５００ｇ／Ｌ樹脂と設定した。ロード後、酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施した。２８０ｍｍの吸光度をモニタリングし、各抗体を含む画分を取得し、続いて０．２μｍのフィルターでろ過しＦ／ＴモードによるＣＥＸ材料プール液とした。【０１１４】
２）結果
改良方法２におけるＭａｂ  Ａ回収率、及び不純物クリアランスの結果を表１５及び表１６に、Ｍａｂ  Ｄ回収率、及び不純物クリアランスの結果を表１７及び表１８に示す。なお、改良方法２におけるウイルスクリアランス能を有する工程の精製工程総クリアランスについては、実施例４の表１３と対象工程が同じであるため、同等のクリアランスが期待できる。【０１１５】
Ｍａｂ  Ａ及びＭａｂ  Ｄともに、改良方法２における回収率は良好であった。また、ＨＭＷＳ及びＬＭＷＳが除去され、高いＭｏｎｏｍｅｒ含量の抗体が得られた。ＨＣＰ含量についても、Ｍａｂ  Ｄで充分に除去された。また、ＤＮＡについても定量限界未満まで除去されていることが確認された。さらに、ＰＬＢＬ２及び浸出プロテインＡの含量も低減できた。以上の結果から、抗体によっては該精製方法によりデプスフィルターろ過を実施しなくても高純度に精製できることが明らかとなった。【０１１６】
【表１５】
2020153390.tif 000016
【０１１７】
【表１６】
2020153390.tif 000017
【０１１８】
【表１７】
2020153390.tif 000018
【０１１９】
【表１８】
2020153390.tif 000019
【０１２０】
実施例６．改良方法３による精製例（Ｍａｂ  Ｆ、Ｍａｂ  Ｇ）
本実施例は、実施例４の表１０の精製フローにおける陽イオン交換クロマトグラフィーの後に疎水性相互作用クロマトグラフィーを追加した、以下の表１９に示される精製フローによる抗体の不純物クリアランスを例示する。なお、本実施例で使用されるＭａｂ  Ｅ、Ｍａｂ  Ｆ及びＭａｂ  Ｇのアミノ酸配列及び結合する抗原は、それぞれ異なっており、Ｍａｂ  Ａ、Ｍａｂ  Ｂ、Ｍａｂ  Ｃ又はＭａｂ  Ｄとも異なっている。【０１２１】
【表１９】
2020153390.tif 000020
【０１２２】
１）疎水性相互作用クロマトグラフィーにおけるウイルスクリアランス（Ｍａｂ  Ｅ）
本実施例は、疎水性相互作用クロマトグラフィーにおけるＭａｂ  Ｅと呼ばれるモノクローナル抗体のウイルスクリアランスについて説明する。ＰＯＲＯＳ  Ｂｅｎｚｙｌ  Ｕｌｔｒａ  ＨＩＣ  樹脂を用いて、Ｍａｂ  ＥへのＭＬＶ，ＭＭＶのスパイク試験により、ウイルスクリアランスを評価した。【０１２３】
Ｍａｂ  Ｅを産生したＣＨＯ細胞培養液について、デプスフィルターろ過により細胞を除去し、清澄化した。細胞培養上清を、ＫａｎＣａｐＡ樹脂を用いたプロテインＡクロマトグラフィーにより精製した。２０ｍＭ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）でカラムを平衡化した後、培養上清をロードし、その後、１Ｍ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）、続いて２０ｍＭ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）で洗浄を行った。酢酸バッファー（ｐＨ３．６）でＭａｂ  Ｅをカラムから溶出した。２８０ｍｍの吸光度をモニタリングし、Ｍａｂ  Ｅを含む画分を取得した（アフィニティークロマトグラフィープール液）。アフィニティークロマトグラフィープール液に塩酸を加え、ｐＨを３．４に調整し、１時間、ウイルス不活化処理を行った。該工程は室温で実施した。１時間のウイルス不活化処理の後、トリス水溶液を用いてｐＨ５．０に中和した（ウイルス不活化液）。ウイルス不活化液を、予め酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で洗浄したデプスフィルター（Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）  Ｐｏｄ  Ａ１ＨＣ）に１１４Ｌ／ｍ２で負荷し、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施し、Ｍａｂ  Ｅを回収した（デプスフィルターろ過プール液）。デプスフィルターろ過プール液を、予め酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で洗浄した活性炭フィルター（Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）  Ｐｏｄ  ＣＲ４０）に１２９Ｌ／ｍ２で負荷し、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施し、０．２μｍのフィルターでろ過し、保存した（活性炭材料プール液）。予め注射用水、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で平衡化したＰＯＲＯＳ  Ｂｅｎｚｙｌ  Ｕｌｔｒａを充填したＨＩＣカラムに活性炭材料プール液を通液した。ＨＩＣカラムへのローディング密度は約１０００ｇ／Ｌ樹脂とした。ロード後、酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施した。２８０ｍｍの吸光度をモニタリングし、Ｍａｂ  Ｅを含む画分を取得し、Ｆ／ＴモードによるＨＩＣ材料プール液とした。ロード液及びプール液のウイルス力価からウイルス対数除去値（ＬＲＶ）を算出した（表２０）。この結果、疎水性相互作用クロマトグラフィーはクリアランス能を有することが判明した。【０１２４】
【表２０】
2020153390.tif 000021
【０１２５】
２）改良方法３による不純物クリアランス（Ｍａｂ  Ｆ）
本実施例は、表１９に示される精製フローにおけるＭａｂ  Ｆと呼ばれるモノクローナル抗体の不純物クリアランスについて説明する。【０１２６】
Ｍａｂ  Ｆを産生したＣＨＯ細胞培養液について、デプスフィルターろ過により細胞を除去し、清澄化した。細胞培養上清を、ＫａｎＣａｐＡ樹脂を用いたプロテインＡクロマトグラフィーにより精製した。２０ｍＭ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）でカラムを平衡化した後、培養上清をロードし、その後、１Ｍ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）、続いて２０ｍＭ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）で洗浄を行った。酢酸バッファー（ｐＨ３．６）でＭａｂ  Ｆをカラムから溶出した。２８０ｍｍの吸光度をモニタリングし、Ｍａｂ  Ｆを含む画分を取得した（アフィニティークロマトグラフィープール液）。アフィニティークロマトグラフィープール液に塩酸を加え、ｐＨを３．７に調整し、１時間、ウイルス不活化処理を行った。該工程は室温で実施した。１時間のウイルス不活化処理の後、トリス水溶液を用いてｐＨ５．０に中和した（ウイルス不活化液）。ウイルス不活化液を、予め酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で洗浄したデプスフィルター（Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）  Ｐｏｄ  Ａ１ＨＣ）に約９００ｇ／ｍ２で負荷し、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施し、Ｍａｂ  Ｆを回収した（デプスフィルターろ過プール液）。デプスフィルターろ過プール液を、予め酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で洗浄した活性炭フィルター（Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）  Ｐｏｄ  ＣＲ４０）に約８００ｇ／ｍ２で負荷し、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施し、０．２μｍのフィルターでろ過し、保存した（活性炭材料プール液）。予め１Ｍ塩化ナトリウムを含む酢酸バッファー（ｐＨ５．０）、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で平衡化したＰＯＲＯＳ  ＸＳを充填したＣＥＸカラムに活性炭材料プール液を通液した。ＣＥＸカラムへのローディング密度は約１３００ｇ／Ｌ樹脂と設定した。ロード後、酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施した。２８０ｍｍの吸光度をモニタリングし、Ｍａｂ  Ｆを含む画分を取得し、続いて０．２μｍのフィルターでろ過しＦ／ＴモードによるＣＥＸ材料プール液とした。予め注射用水、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で平衡化したＰＯＲＯＳ  Ｂｅｎｚｙｌ  Ｕｌｔｒａを充填したＨＩＣカラムにＣＥＸ材料プール液を通液した。ＨＩＣカラムへのローディング密度は約３００ｇ／Ｌ樹脂とした。ロード後、酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施した。２８０ｍｍの吸光度をモニタリングし、Ｍａｂ  Ｆを含む画分を取得し、Ｆ／ＴモードによるＨＩＣ材料プール液とした。【０１２７】
改良方法３における不純物クリアランスの結果を表２１に示す。疎水性相互作用クロマトグラフィーによってＭｏｎｏｍｅｒ含量は増加した。陽イオン交換クロマトグラフィー後に残留したＨＣＰ及びＰＬＢＬ２は、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって除去され、特にＰＬＢＬ２は定量限界未満まで除去された。【０１２８】
【表２１】
2020153390.tif 000022
【０１２９】
３）改良方法３による不純物クリアランス（Ｍａｂ  Ｇ）
本実施例は、表１９に示される精製フローにおけるＭａｂ  Ｇと呼ばれるモノクローナル抗体の不純物クリアランスについて説明する。【０１３０】
Ｍａｂ  Ｇを産生したＣＨＯ細胞培養液について、デプスフィルターろ過により細胞を除去し、清澄化した。細胞培養上清を、ＫａｎＣａｐＡ樹脂を用いたプロテインＡクロマトグラフィーにより精製した。２０ｍＭ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）でカラムを平衡化した後、培養上清をロードし、その後、１Ｍ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）、続いて２０ｍＭ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）で洗浄を行った。酢酸バッファー（ｐＨ３．６）でＭａｂ  Ｇをカラムから溶出した。２８０ｍｍの吸光度をモニタリングし、Ｍａｂ  Ｇを含む画分を取得した（アフィニティークロマトグラフィープール液）。アフィニティークロマトグラフィープール液に塩酸を加え、ｐＨを３．７に調整し、1時間、ウイルス不活化処理を行った。該工程は室温で実施した。１時間のウイルス不活化処理の後、トリス水溶液を用いてｐＨ５．０に中和した（ウイルス不活化液）。ウイルス不活化液を、予め酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で洗浄したデプスフィルター（Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）  Ｐｏｄ  Ａ１ＨＣ）に約８００ｇ／ｍ２で負荷し、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施し、Ｍａｂ  Ｇを回収した（デプスフィルターろ過プール液）。デプスフィルターろ過プール液を、予め酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で洗浄した活性炭フィルター（Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）  Ｐｏｄ  ＣＲ４０）に約７００ｇ／ｍ２で負荷し、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施し、０．２μｍのフィルターでろ過し、保存した（活性炭材料プール液）。予め１  Ｍ塩化ナトリウムを含む酢酸バッファー（ｐＨ５．０）、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で平衡化したＰＯＲＯＳ  ＸＳを充填したＣＥＸカラムに活性炭材料プール液を通液した。ＣＥＸカラムへのローディング密度は約１５００ｇ／Ｌ樹脂と設定した。ロード後、酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施した。２８０ｍｍの吸光度をモニタリングし、Ｍａｂ  Ｇを含む画分を取得し、続いて０．２μｍのフィルターでろ過しＦ／ＴモードによるＣＥＸ材料プール液とした。予め注射用水、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で平衡化したＰＯＲＯＳ  Ｂｅｎｚｙｌ  Ｕｌｔｒａを充填したＨＩＣカラムにＣＥＸ材料プール液を通液した。ＨＩＣカラムへのローディング密度は約３００ｇ／Ｌ樹脂とした。ロード後、酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施した。２８０ｍｍの吸光度をモニタリングし、Ｍａｂ  Ｇを含む画分を取得し、Ｆ／ＴモードによるＨＩＣ材料プール液とした。【０１３１】
改良方法３における不純物クリアランスの結果を表２２に示す。疎水性相互作用クロマトグラフィーによってＭｏｎｏｍｅｒ含量は増加した。陽イオン交換クロマトグラフィー後に残留したＨＣＰ及びＰＬＢＬ２は、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって除去され、特にＰＬＢＬ２は定量限界付近まで除去された。【０１３２】
【表２２】
2020153390.tif 000023
【０１３３】
実施例７．改良方法４による精製例（Ｍａｂ  Ｆ、Ｍａｂ  Ｇ）
本実施例は、実施例４の表１０の精製フローにおける陽イオン交換クロマトグラフィーの前に疎水性相互作用クロマトグラフィーを追加した、以下の表２３に示される精製フローによる抗体の不純物クリアランスを例示する。【０１３４】
【表２３】
2020153390.tif 000024
【０１３５】
１）改良方法４による不純物クリアランス（Ｍａｂ  Ｆ）
本実施例は、表２３に示される精製フローにおけるＭａｂ  Ｆと呼ばれるモノクローナル抗体の不純物クリアランスについて説明する。【０１３６】
Ｍａｂ  Ｆを産生したＣＨＯ細胞培養液について、デプスフィルターろ過により細胞を除去し、清澄化した。細胞培養上清を、ＫａｎＣａｐＡ樹脂を用いたプロテインＡクロマトグラフィーにより精製した。２０ｍＭ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）でカラムを平衡化した後、培養上清をロードし、その後、１Ｍ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）、続いて２０ｍＭ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）で洗浄を行った。酢酸バッファー（ｐＨ３．６）でＭａｂ  Ｆをカラムから溶出した。２８０ｍｍの吸光度をモニタリングし、Ｍａｂ  Ｆを含む画分を取得した（アフィニティークロマトグラフィープール液）。アフィニティークロマトグラフィープール液に塩酸を加え、ｐＨを３．７に調整し、１時間、ウイルス不活化処理を行った。該工程は室温で実施した。１時間のウイルス不活化処理の後、トリス水溶液を用いてｐＨ５．０に中和した（ウイルス不活化液）。ウイルス不活化液を、予め酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で洗浄したデプスフィルター（Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）  Ｐｏｄ  Ａ１ＨＣ）に約９００ｇ／ｍ２で負荷し、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施し、Ｍａｂ  Ｆを回収した（デプスフィルターろ過プール液）。デプスフィルターろ過プール液を、予め酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で洗浄した活性炭フィルター（Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）  Ｐｏｄ  ＣＲ４０）に約８００ｇ／ｍ２で負荷し、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施し、０．２μｍのフィルターでろ過し、保存した（活性炭材料プール液）。予め注射用水、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で平衡化したＰＯＲＯＳ  Ｂｅｎｚｙｌ  Ｕｌｔｒａを充填したＨＩＣカラムに活性炭材料プール液を通液した。ＨＩＣカラムへのローディング密度は約３００ｇ／Ｌ樹脂とした。ロード後、酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施した。２８０ｍｍの吸光度をモニタリングし、Ｍａｂ  Ｆを含む画分を取得し、Ｆ／ＴモードによるＨＩＣ材料プール液とした。予め１Ｍ塩化ナトリウムを含む酢酸バッファー（ｐＨ５．０）、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で平衡化したＰＯＲＯＳ  ＸＳを充填したＣＥＸカラムにＨＩＣ材料プール液を通液した。ＣＥＸカラムへのローディング密度は約１３００ｇ／Ｌ樹脂と設定した。ロード後、酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施した。２８０ｍｍの吸光度をモニタリングし、Ｍａｂ  Ｆを含む画分を取得し、続いて０．２μｍのフィルターでろ過しＦ／ＴモードによるＣＥＸ材料プール液とした。【０１３７】
改良方法４における不純物クリアランスの結果を表２４に示す。疎水性相互作用クロマトグラフィーによってＭｏｎｏｍｅｒ含量は増加した。活性炭材料プール液に残留したＨＣＰ及びＰＬＢＬ２は、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって除去され、特にＰＬＢＬ２は定量限界付近まで除去された。【０１３８】
【表２４】
2020153390.tif 000025
【０１３９】
２）改良方法４による不純物クリアランス（Ｍａｂ  Ｇ）
本実施例は、表２３に示される精製フローにおけるＭａｂ  Ｇと呼ばれるモノクローナル抗体の不純物クリアランスについて説明する。【０１４０】
Ｍａｂ  Ｇを産生したＣＨＯ細胞培養液について、デプスフィルターろ過により細胞を除去し、清澄化した。細胞培養上清を、ＫａｎＣａｐＡ樹脂を用いたプロテインＡクロマトグラフィーにより精製した。２０ｍＭ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）でカラムを平衡化した後、培養上清をロードし、その後、１Ｍ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）、続いて２０ｍＭ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）で洗浄を行った。酢酸バッファー（ｐＨ３．６）でＭａｂ  Ｇをカラムから溶出した。２８０ｍｍの吸光度をモニタリングし、Ｍａｂ  Ｇを含む画分を取得した（アフィニティークロマトグラフィープール液）。アフィニティークロマトグラフィープール液に塩酸を加え、ｐＨを３．７に調整し、１時間、ウイルス不活化処理を行った。該工程は室温で実施した。１時間のウイルス不活化処理の後、トリス水溶液を用いてｐＨ５．０に中和した（ウイルス不活化液）。ウイルス不活化液を、予め酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で洗浄したデプスフィルター（Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）  Ｐｏｄ  Ａ１ＨＣ）に約８００ｇ／ｍ２で負荷し、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施し、Ｍａｂ  Ｇを回収した（デプスフィルターろ過プール液）。デプスフィルターろ過プール液を、予め酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で洗浄した活性炭フィルター（Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）  Ｐｏｄ  ＣＲ４０）に約７００ｇ／ｍ２で負荷し、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施し、０．２μｍのフィルターでろ過し、保存した（活性炭材料プール液）。予め注射用水、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で平衡化したＰＯＲＯＳ  Ｂｅｎｚｙｌ  Ｕｌｔｒａを充填したＨＩＣカラムに活性炭材料プール液を通液した。ＨＩＣカラムへのローディング密度は約３００ｇ／Ｌ樹脂とした。ロード後、酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施した。２８０ｍｍの吸光度をモニタリングし、Ｍａｂ  Ｇを含む画分を取得し、Ｆ／ＴモードによるＨＩＣ材料プール液とした。予め１Ｍ塩化ナトリウムを含む酢酸バッファー（ｐＨ５．０）、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で平衡化したＰＯＲＯＳ  ＸＳを充填したＣＥＸカラムにＨＩＣ材料プール液を通液した。ＣＥＸカラムへのローディング密度は約１３００ｇ／Ｌ樹脂と設定した。ロード後、酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施した。２８０ｍｍの吸光度をモニタリングし、Ｍａｂ  Ｇを含む画分を取得し、続いて０．２μｍのフィルターでろ過しＦ／ＴモードによるＣＥＸ材料プール液とした。【０１４１】
改良方法４における不純物クリアランスの結果を表２５に示す。疎水性相互作用クロマトグラフィーによってＭｏｎｏｍｅｒ含量は増加した。活性炭材料プール液に残留したＨＣＰ及びＰＬＢＬ２は、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって除去され、特にＰＬＢＬ２は定量限界付近まで除去された。【０１４２】
【表２５】
2020153390.tif 000026
【０１４３】
実施例８．活性炭材料による不純物クリアランス（Ｍａｂ  Ａ）
本実施例は、以下の表２６に示される精製フローにおけるＭａｂ  Ａと呼ばれるモノクローナル抗体の活性炭材料による不純物クリアランスについて説明する。【０１４４】
【表２６】
2020153390.tif 000027
【０１４５】
１）材料及び方法
Ｍａｂ  Ａを産生したＣＨＯ細胞培養液について、デプスフィルターろ過により細胞を除去し、清澄化した。細胞培養上清を、ＫａｎＣａｐＡ樹脂を用いたプロテインＡクロマトグラフィーにより精製した。２０ｍＭ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）でカラムを平衡化した後、培養上清をロードし、その後、１Ｍ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）、続いて２０ｍＭ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）で洗浄を行った。酢酸バッファー（ｐＨ３．６）でＭａｂ  Ａをカラムから溶出した。２８０ｍｍの吸光度をモニタリングし、Ｍａｂ  Ａを含む画分を取得した（アフィニティークロマトグラフィープール液）。アフィニティークロマトグラフィープール液に塩酸を加え、ｐＨを３．５に調整し、１時間、ウイルス不活化処理を行った。該工程は室温で実施した。１時間のウイルス不活化処理の後、トリス水溶液を用いてｐＨ５．０に中和した（ウイルス不活化液）。ウイルス不活化液を、予め酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で洗浄したデプスフィルター（Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）  Ｐｏｄ  Ａ１ＨＣ）に１２４Ｌ／ｍ２で負荷し、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施し、Ｍａｂ  Ａを回収した（デプスフィルターろ過プール液）。デプスフィルターろ過プール液を塩酸又はトリス水溶液によりｐＨ４．５、ｐＨ５．０、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、ｐＨ７．５に調整し、０．２μｍのフィルターでろ過し、保存した（ｐＨ調整活性炭材料ロード液）。デプスフィルターろ過プール液を限外ろ過・ダイアフィルトレーションにより電気伝導度２ｍＳ／ｃｍ、４ｍＳ／ｃｍ、５ｍＳ／ｃｍ、６ｍＳ／ｃｍ、８ｍＳ／ｃｍ、１０ｍＳ／ｃｍに調整し、０．２μｍのフィルターでろ過し、保存した（電気伝導度調整活性炭材料ロード液）。【０１４６】
ｐＨ調整活性炭材料ロード液を予めロード液と同じｐＨの酢酸バッファー（ｐＨ４．５、ｐＨ５．０、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、ｐＨ７．５）でそれぞれ洗浄した活性炭フィルター（Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）  Ｐｏｄ  ＣＲ４０）に６０Ｌ／ｍ２又は１００Ｌ／ｍ２で負荷し、続いてロード液と同じｐＨの酢酸バッファー（ｐＨ４．５、ｐＨ５．０、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、ｐＨ７．５）でそれぞれ押し出しを実施し、Ｍａｂ  Ａを回収しｐＨ調整活性炭材料プール液とした。電気伝導度調整活性炭材料ロード液を酢酸バッファー（ｐＨ５．０）でそれぞれ洗浄した活性炭フィルター（Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）  Ｐｏｄ  ＣＲ４０）に６０Ｌ／ｍ２で負荷し、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）でそれぞれ押し出しを実施し、Ｍａｂ  Ａを回収し電気伝導度調整活性炭材料プール液とした。【０１４７】
２）結果
表２６に示される精製フローのうち負荷量６０Ｌ／ｍ２の活性炭フィルターろ過における不純物クリアランスの結果を表２７及び表２８に示す。ｐＨ及び電気伝導度によりＨＣＰ除去率は大きな影響を受けなかった。ＰＬＢＬ２はｐＨが低いほど、又は電気伝導度が低いほど除去率が大きくなる傾向があった。浸出Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＡはｐＨが低いほど、除去率が大きくなる傾向にあった。ＭＬＶ及びＭＭＶはｐＨが低いほど、又は電気伝導度が低いほど除去率が大きくなる傾向があった。表２６に示される精製フローで得られる活性炭材料ロード液のｐＨ及び電気伝導度の条件は、活性炭フィルターろ過において高い不純物除去率を示す条件であることが確認された。【０１４８】
【表２７】
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【０１４９】
【表２８】
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【産業上の利用可能性】
【０１５０】
本発明の抗体精製法によって、精製期間を短縮した上で不純物を効率的に除去し、抗体をヒト治療用として使用するに充分な純度まで精製し、かつ製造コストを低減することが可能となった。
【国際調査報告】
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