(57)【要約】  新規の角膜上皮細胞走化促進剤を提供することを課題とし、ＰＡＣＡＰ若しくはＰＡＣＡＰ誘導体又はそれらの薬学的に許容し得る塩を有効成分として含有する角膜上皮細胞走化促進剤によって上記課題を解決し、ＰＡＣＡＰ若しくはＰＡＣＡＰ誘導体又はそれらの薬学的に許容し得る塩よりなる群に属する１種以上のペプチドを含有する角膜上皮細胞走化促進剤であることが好ましく、また、上記ＰＡＣＡＰ若しくはＰＡＣＡＰ誘導体又はそれらの薬学的に許容し得る塩の濃度が、１×１０−１３ｍｏｌ／Ｌ以上１×１０−７ｍｏｌ／Ｌ以下であることが特に好ましく、本発明の角膜上皮細胞走化促進剤は、ドライアイ等の眼疾患の症状改善のための医薬等として広く利用可能である。
2019150734.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＡＣＡＰ若しくはＰＡＣＡＰ誘導体又はそれらの薬学的に許容し得る塩を有効成分として含有することを特徴とする角膜上皮細胞走化促進剤。
【請求項２】
前記ＰＡＣＡＰ若しくはＰＡＣＡＰ誘導体又はそれらの薬学的に許容し得る塩の濃度が１×１０−１３ｍｏｌ／Ｌ以上１×１０−７ｍｏｌ／Ｌ以下である請求項１に記載の角膜上皮細胞走化促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＡＣＡＰ若しくはＰＡＣＡＰ誘導体又はそれらの薬学的に許容し得る塩を有効成分として含有する角膜上皮細胞走化促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＡＣＡＰ（Pituitary Adenylate Cyclase-Activating Polypeptide：下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド）は、神経ペプチドの１種であり、２７又は３８アミノ酸残基からなるペプチドである。ＰＡＣＡＰはこれまでに、神経突起誘発剤、抗炎症剤、慢性肺疾患治療剤、眼疾患治療剤、涙液分泌促進剤としての用途が報告されている（特許文献１〜５、非特許文献１〜２）。【０００３】
また、特許文献６には、ＰＡＣＡＰ投与による角膜上皮細胞の増殖促進効果や、角膜剥離されたウサギの眼にＰＡＣＡＰを投与することにより角膜上皮の修復が対照に比べて早かったことが記載されている。
しかしながら、ＰＡＣＡＰ投与による角膜上皮細胞の増殖促進効果に対する詳細なメカニズムや、角膜内皮細胞へのＰＡＣＡＰの効果等については解明されておらず、角膜に対するＰＡＣＡＰの作用効果等の更なる研究開発が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００１−２２６２８４号公報
【特許文献２】特開２００４−２２４７７５号公報
【特許文献３】特開２００４−３１５４３６号公報
【特許文献４】特開２００６−３０６７７０号公報
【特許文献５】特開２００９−２６９８１８号公報
【特許文献６】国際公開第２００５／１０２３７５号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Vaudry D，et al.，Pituitary Adenylate Cyclase-Activating Polypeptide and Its Receptors：20 years after the Discovery．Pharmacol Rev 2009；61(3)；283-357.
【非特許文献２】Nakamachi T, et al., PACAP suppresses dry eye signs by stimulating tear secretion. Nat Commun. 2016;7:12034
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記背景技術に鑑みてなされたものであり、その課題は、ＰＡＣＡＰの新たな用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、ＰＡＣＡＰが角膜上皮細胞増殖促進効果に関与していることに加え、角膜上皮細胞の走化性促進効果にも関与していることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００８】
すなわち、本発明は、ＰＡＣＡＰ若しくはＰＡＣＡＰ誘導体又はそれらの薬学的に許容し得る塩を有効成分として含有することを特徴とする角膜上皮細胞走化促進剤を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、上記問題点や上記課題を解決し、角膜障害等の眼疾患を予防又は治療のために用いることができる角膜上皮細胞走化促進剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】細胞スクラッチアッセイの結果を示す写真である。
【図２】ＰＡＣＡＰ添加してから１８時間後の損傷部位の面積比を示すグラフである。
【図３】ＭＴＴアッセイによるＰＡＣＡＰ添加後１日目（左）及び４日目の細胞数測定結果を示すグラフである。
【図４】ＢｒａＵ標識による分裂細胞を示す写真である。
【図５】ＢｒａＵ標識による分裂細胞数の定量結果を示すグラフである。
【図６】ＰＡＣＡＰ単独またはＰＡＣＡＰとＡｒａＣを添加してから１８時間後の損傷部位の面積比を示すグラフである。
【図７】脳、角膜及び角膜上皮におけるＲＴ−ＰＣＲ反応の結果を示す写真である。
【図８】角膜におけるＰＡＣ１Ｒ免疫陽性反応を示す写真である。
【図９】（Ａ）角膜障害部位の蛍光像を示す写真である。（Ｂ）角膜障害０時間後と１２時間後のＨＥ染色像を示す写真である。（Ｃ）ＰＡＣＡＰ投与後の角膜障害部位（蛍光面積）の変化を示すグラフである。
【図１０】（Ａ）ＰＡＣＡＰ６−３８投与後の角膜障害部位（蛍光面積）の変化を示すグラフである。（Ｂ）ＶＩＰ６−２８投与後の角膜障害部位（蛍光面積）の変化を示すグラフである。
【図１１】ＰＡＣＡＰ投与後の涙液除去マウスの角膜障害部位（蛍光面積）の変化を示すグラフである。
【図１２】（Ａ）ヒト角膜培養細胞単層シートでのインビトロスクラッチアッセイの結果を示す写真である。（Ｂ）細胞をスクラッチしてから６時間後のスクラッチ部位の変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明について説明するが、本発明は、以下の具体的態様に限定されるものではなく、技術的思想の範囲内で任意に変形することができる。
【００１２】
本発明の角膜上皮細胞走化促進剤は、ＰＡＣＡＰ若しくはＰＡＣＡＰ誘導体又はそれらの薬学的に許容し得る塩を有効成分として含有することを特徴とする。
【００１３】
ＰＡＣＡＰ（Pituitary Adenylate Cyclase-Activating Polypeptide：下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド）は、２７又は３８アミノ酸残基からなる神経ペプチドで、中枢・末梢神経系に強く発現し、精巣、副腎、腸管等の末梢組織にも広く分布する。
本発明の効果を十分に発揮できる点等で、ＰＡＣＡＰ３８（３８アミノ酸残基から構成されるＰＡＣＡＰ）を用いることが好ましい。ＰＡＣＡＰ３８のアミノ酸配列は例えば、特許文献６に記載されている。
【００１４】
ＰＡＣＡＰの受容体には、ＶＩＰ（Vasoactive intestinal polypeptide：血管作動性腸管ポリペプチド）に対しても同等の親和性で結合し、ｃＡＭＰの産生を促進させるＶＰＡＣ受容体（ＶＰＡＣ１受容体、ＶＰＡＣ２受容体）と、ＰＡＣＡＰに選択的に結合し、ｃＡＭＰ産生の他にもホスファチジルイノシトール代謝回転やＭＡＰキナーゼを活性化させるＰＡＣ１受容体が存在する。
【００１５】
本発明は、実施例等に示した通り、ＰＡＣＡＰ投与により角膜上皮細胞の走化性が促進されることを初めて見出してなされたものである。
また、実施例に示したように、本発明は、ＰＡＣＡＰ若しくはＰＡＣＡＰ誘導体又はそれらの薬学的に許容し得る塩を有効成分として含有する角膜内ＰＡＣ１受容体（ＰＡＣ１Ｒ）作用剤でもある。
【００１６】
また、本発明の角膜上皮細胞走化促進剤は、「ＰＡＣＡＰ及びその薬学的に許容し得る塩よりなる群」に属する１種以上のペプチドを含有することが好ましい。
【００１７】
本発明に用いるＰＡＣＡＰの合成法は、特に限定されないが、公知のペプチド合成法に従って合成することができる。例えば、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、カルボイミダゾール法、酸化還元法、ＤＣＣ−ａｄｄｉｔｉｖｅ法等が挙げられる。これらの合成方法は、固相合成及び液相合成の何れにも適用することができる。
【００１８】
ＰＡＣＡＰの薬学的に許容し得る塩としては、例えば、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩；カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属との塩；アルミニウム塩；アンモニウム塩等の無機塩基との塩；トリメチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン等の有機塩基との塩；塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸等の無機酸との塩；ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマール酸、シュウ酸、酒石酸、乳酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸との塩；タンニン酸、カルボキシメチルセルロース、ポリ乳酸、ポリグリコール酸等の重合酸との塩；等を挙げることができる。
【００１９】
本発明の角膜上皮細胞走化促進剤は、ＰＡＣＡＰ若しくはＰＡＣＡＰ誘導体又はそれらの薬学的に許容し得る塩を有効成分として含有する。
「ＰＡＣＡＰ誘導体」とは、例えば、ＰＡＣＡＰのポリペプチド構造中における一部のアミノ酸が削除若しくは置換されたもの、又は、ＰＡＣＡＰのポリペプチド構造中に他のアミノ酸が挿入されたものであって、角膜上皮細胞走化促進作用を有するものを言う。
また、ＰＡＣＡＰのポリペプチド構造に糖鎖等の修飾基が付加されたものであって、角膜上皮細胞走化促進作用を有するものも「ＰＡＣＡＰ誘導体」の例として挙げられる。
【００２０】
ＰＡＣＡＰ誘導体の薬学的に許容し得る塩、合成法等は、上記したＰＡＣＡＰのものと同様のものが使用又は適用できる。
ＰＡＣＡＰ若しくはＰＡＣＡＰ誘導体又はそれらの塩は、抽出したものや合成したものが好ましく、単離されたものや精製されたものが好ましい。
【００２１】
角膜上皮細胞走化促進剤中のＰＡＣＡＰ若しくはＰＡＣＡＰ誘導体又はそれらの薬学的に許容し得る塩の含有量は、角膜上皮細胞走化性を促進することができれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
ＰＡＣＡＰ若しくはＰＡＣＡＰ誘導体又はそれらの薬学的に許容し得る塩の合計量が、角膜上皮細胞走化促進剤全体に対して、１０−１３ｍｏｌ／Ｌ〜１０−７ｍｏｌ／Ｌ含有されていることが好ましく、１０−１２ｍｏｌ／Ｌ〜１０−８ｍｏｌ／Ｌ含有されていることがより好ましく、１０−１１ｍｏｌ／Ｌ〜１０−９ｍｏｌ／Ｌ含有されていることが更に好ましく、１０−１１ｍｏｌ／Ｌ〜１０−１０ｍｏｌ／Ｌ含有されていることが特に好ましい。
後述するように、特に、点眼剤、洗眼剤、眼軟膏剤等の眼科用剤として使用する場合には、該眼科用剤には、「ＰＡＣＡＰ若しくはＰＡＣＡＰ誘導体又はそれらの薬学的に許容し得る塩の合計量」が上記範囲内で含有されていることが望ましい。
【００２２】
本発明の角膜上皮細胞走化促進剤中に含有される有効成分である「ＰＡＣＡＰ若しくはＰＡＣＡＰ誘導体又はそれらの薬学的に許容し得る塩」の含有濃度は、上記のように極めて低くても前記した本発明の効果を発揮する。
【００２３】
上記したＰＡＣＡＰ若しくはＰＡＣＡＰ誘導体又はそれらの薬学的に許容し得る塩は、何れか１つを角膜上皮細胞走化促進剤に含有させてもよいし、２種以上を併用してもよい。２種以上併用されている場合、上記含有量（範囲）はそれらの合計量の含有量である。
２種以上併用する場合の、上記角膜上皮細胞走化促進剤中の各々の化合物の含有比については、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２４】
また、本発明の角膜上皮細胞走化促進剤は、ＰＡＣＡＰ若しくはＰＡＣＡＰ誘導体又はそれらの薬学的に許容し得る塩に加えて、「その他の成分」を含有することができる。
【００２５】
上記角膜上皮細胞走化促進剤における、上記「その他の成分」としては、特に制限はなく、本発明の効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、薬学的に許容し得る担体や他の薬学的有効成分等が挙げられる。
かかる担体としては、特に制限はなく、例えば、後述する剤形等に応じて適宜選択することができる。また、該角膜上皮細胞走化促進剤中の上記「その他の成分」の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２６】
本発明の角膜上皮細胞走化促進剤の剤形としては、特に制限はなく、例えば、後述するような所望の投与方法に応じて適宜選択することができる。
具体的には、例えば、錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、注射剤（溶剤、懸濁剤等）、点眼剤、洗眼剤、軟膏剤、眼軟膏剤、貼付剤、ゲル剤、クリーム剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散布剤等が挙げられる。
【００２７】
本発明の効果を損なわない範囲内で、本発明の角膜上皮細胞走化促進剤を上記剤形とする際に通常使用される他の添加剤を含んでいてもよい。添加剤の例として、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤、緩衝剤、安定化剤、ｐＨ調節剤、等張化剤、保存剤、等が挙げられる。
【００２８】
本発明の効果を十分に発揮できる点等で、本発明の角膜上皮細胞走化促進剤の剤形は、点眼剤、洗眼剤、眼軟膏剤等の眼科用剤が好ましく、点眼剤がより好ましい。
眼科用剤は、公知の方法に従って所望の剤形に製剤化することができる。
【００２９】
本発明の角膜上皮細胞走化促進剤は、例えば、角膜障害の予防や治療を必要とする個体に投与することにより使用することができる。
【００３０】
本発明の角膜上皮細胞走化促進剤の投与対象動物としては、特に制限はないが、例えば、ヒト；マウス；ラット；サル；ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、ニワトリ等の家畜；ネコ、イヌ、ウサギ等のペット；等が挙げられる。
【００３１】
また、上記角膜上皮細胞走化促進剤の投与方法としては、特に制限はなく、例えば、上記角膜上皮細胞走化促進剤の剤形等に応じ、適宜選択することができ、経口投与、血液中への注射、眼への投与等が挙げられる。
また、該角膜上皮細胞走化促進剤の投与量としては、特に制限はなく、投与対象である個体の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができるが、例えば成人への１日の投与量は、１ｍｇ〜３０ｇが好ましく、１０ｍｇ〜１０ｇがより好ましく、１００ｍｇ〜３ｇが特に好ましい。
また、該角膜上皮細胞走化促進剤の投与時期としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、予防的に投与されてもよいし、治療的に投与されてもよい。
【００３２】
本発明の角膜上皮細胞走化促進剤の剤形が点眼剤であるとき、該点眼剤を、１回当たり１０〜５０μＬで、１日１回〜１０回（特に好ましくは２回〜５回）点眼することが好ましい。
【００３３】
本発明の角膜上皮細胞走化促進剤は、角膜上皮細胞の走化性を促進することにより、角膜細胞の損傷治癒促進効果を発揮する。したがって、角膜細胞損傷治療薬として有用であり、例えば、角膜障害や角膜潰瘍の予防及び／又は治療に有用である。
角膜障害の原因として、例えば、角膜損傷、ドライアイ等による涙液減少、異物、コンタクトレンズ装用、感染、角膜屈折矯正手術、白内障手術、シェーグレン症候群や結膜炎等の罹患、等が挙げられる。
【００３４】
また、本発明の角膜上皮細胞走化促進剤は、角膜内皮細胞にＰＡＣＡＰの受容体が発現しているため、角膜内皮細胞の増殖効果及び／又は走化性の促進効果にも関与している可能性が考えられる。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例及び試験例に基づき本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例等の具体的範囲に限定されるものではない。「％」は、特に断りのない限り「質量％」を示し、「Ｍ」は「ｍｏｌ／Ｌ」を示す。【００３６】
＜材料と方法＞
［ＰＡＣＡＰ］
ＰＡＣＡＰはＰＡＣＡＰ３８（ペプチド研究所、大阪）を用いた。【００３７】
［培養細胞］
正常ヒト角膜上皮細胞ＨＣＥＣ−II（倉敷紡績株式会社製）をＯｃｕＬｉｆｅＬｉｆｅＦａｃｔｏｒ含有ＯｃｕＬｉｆｅＢＭ培地（何れも倉敷紡績株式会社製）にて３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。【００３８】
［細胞増殖能の解析］
ＨＣＥＣ−II細胞を９６ウェルプレートに播種し、２４時間培養した後、ＰＡＣＡＰ単独又はＰＡＣＡＰと細胞増殖阻害剤であるＡｒａＣ（シタラビン）を添加した。添加後、ＭＴＴ細胞増殖キットＩ（ロシュライフサイエンス社製）を用い、リファレンス波長６５０ｎｍとし、５７０ｎｍの吸光度の値から生細胞数を測定することで細胞増殖能の解析を行った。【００３９】
［スクラッチアッセイ］
ＰＡＣＡＰによる創傷治癒促進効果はスクラッチアッセイにて評価した。ＨＣＥＣ−II細胞を２４ウェルプレートに播種し、培養後、CELL Scratcherスクラッチスティック（旭硝子株式会社製）にて創傷した（図１中の点線間）。
創傷後直ちにＰＡＣＡＰ３８のみ又はＰＡＣＡＰ３８とＡｒａＣを添加し、創傷部に浸潤する細胞を観察した。【００４０】
［ＢｒｄＵ標識］
創傷後の分裂細胞はＢｒｄＵラベリング＆ディテクションキットＩ（ロシュ社）を用い標識して観察した。【００４１】
［画像解析］
スクラッチアッセイ及びＢｒｄＵ標識の結果は、ＢＺ−Ｘ７００（キーエンス社）にて画像を取得した後、同社の解析アプリケーション（ハイブリッドセルカウント、マクロセルカウント）にて定量解析した。【００４２】
試験例１
＜角膜細胞に対するＰＡＣＡＰの創傷治癒促進効果＞
ＰＡＣＡＰに角膜細胞創傷治癒効果があるかを調べるため、ＨＣＥＣ−II細胞を用いてスクラッチアッセイを行った。その結果、創傷後４日目において１０−９ＭのＰＡＣＡＰ存在下では、コントロールに比べて創傷部位（図１中の点線間）への細胞浸潤が多く認められた（図１Ａ、Ｂ）。
また、同様の実験を行い、各時間における創傷部位の面積を定量したところ、１０−９ＭのＰＡＣＡＰ存在下ではコントロールに比して創傷部位の面積が減少した（図２）。このことから、ＰＡＣＡＰには角膜細胞に対し創傷治癒促進効果があることが示唆された。【００４３】
試験例２
＜ＰＡＣＡＰによる細胞増殖促進活性＞
スクラッチアッセイの結果、ＰＡＣＡＰは角膜細胞に対し創傷治癒促進効果を有することが示唆された。このＰＡＣＡＰの効果は、１）細胞増殖を促進、２）細胞の走化性促進、又は３）細胞増殖促進及び走化性促進の双方を促進、の何れかによるかを明らかにするため、種々の濃度（１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）のＰＡＣＡＰ添加後１日目、４日目の細胞増殖をＭＴＴアッセイにて解析した。【００４４】
図３に示すように、何れの濃度においてもＰＡＣＡＰ添加後１日目の細胞は、未添加の細胞に比べて増殖しており、４日後ではその効果は顕著であった。
また、図４は損傷及びＰＡＣＡＰ添加してから１８時間後のＢｒｄＵ標識による分裂細胞を示す。分裂細胞数測定においても、ＰＡＣＡＰ添加によりＢｒｄＵ陽性細胞数の増加が認められた（図４Ａ〜Ｂ、図５）。
以上の結果からＰＡＣＡＰによる創傷治癒促進効果の一端は細胞増殖促進効果によるものであることが示された。【００４５】
試験例３
＜ＰＡＣＡＰによる細胞走化性促進活性＞
次にＰＡＣＡＰが角膜細胞に対し細胞走化性促進活性を有するかを細胞増殖阻害剤ＡｒａＣ（シタラビン）共存下で解析を行った。
まず、ＨＣＥＣ−II細胞の増殖を阻害するＡｒａＣ濃度を検討したところ、１５μＭではＰＡＣＡＰによる細胞増殖促進効果をほぼ完全に抑制させたため、以降の実験ではＡｒａＣ濃度は１５μＭで行った（図１、図４Ｃ）。【００４６】
ＨＣＥＣ−II細胞を用いてスクラッチアッセイを行ったところ、１０−９ＭのＰＡＣＡＰと１５μＭのＡｒａＣ存在下では細胞浸潤が１０−９ＭのＰＡＣＡＰ単独時より少なかったが、コントロールよりは増加していた（図１Ａ〜Ｃ）。【００４７】
また、同様の実験を行い、１８時間後における創傷部位の面積を定量したところ、１０−９ＭのＰＡＣＡＰ添加時で１５μＭのＡｒａＣ共存下では創傷部位の面積はコントロールに比べて増加したが、１０−１１ＭのＰＡＣＡＰ添加時では、１５μＭのＡｒａＣ共存下でも創傷部位の面積が減少した（図６）。
以上の結果から、ＰＡＣＡＰには、細胞増殖促進効果だけでは無く、細胞走化性に対しても促進することが明らかになった。【００４８】
＜試験例１〜３のまとめ＞
ＰＡＣＡＰには角膜細胞に対し創傷治癒促進効果があることが示唆された。この効果は、ＰＡＣＡＰが有する細胞増殖促進効果及び細胞走化性促進効果の双方が関与していることが明らかになった。【００４９】
試験例４
＜マウス角膜におけるＰＡＣＡＰ及びＰＡＣＡＰ受容体の発現の検討＞
角膜におけるＰＡＣＡＰ及びＰＡＣＡＰ受容体の発現をＲＴ−ＰＣＲ法と蛍光免疫染色法により評価した。
まずマウスの角膜（Cornea）、角膜上皮（Corneal epithelium）、脳（Brain）からＴｒｉｓｏｌ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを作成した。その後、ＰＡＣＡＰ、ＰＡＣ１受容体（ＰＡＣ１Ｒ）、ＶＰＡＣ１受容体（ＶＰＡＣ１Ｒ）、ＶＰＡＣ２受容体（ＶＰＡＣ２Ｒ）遺伝子に対する特異的プライマーを用いてＰＣＲを行い、アガロースゲル電気泳動によりバンドを確認した。【００５０】
ＲＴ−ＰＣＲ法の結果より、角膜と角膜上皮では、ＰＡＣ１ＲとＶＰＡＣ１Ｒ ｍＲＮＡの発現が確認されたが、ＰＡＣＡＰ及びＶＰＡＣ２Ｒ ｍＲＮＡの発現は認められなかった（図７）。図７中の「Ｂｒａｉｎ（脳）」は、ＰＡＣＡＰ及びその受容体全てが発現するポジティブコントロールであり、「β−ａｃｔｉｎ（β−アクチン）」は、内部標準として用いている。【００５１】
次に、マウスの角膜を摘出後にホルマリン溶液にて固定し、常法に従いパラフィン包埋を行った。厚さ４μｍのパラフィン切片を作製し、脱パラフィン及び５％ウマ正常血清によるブロッキングを行った。一次抗体としてウサギ抗ＰＡＣ１Ｒ抗体、二次抗体としてＡｌｅｘａ５４６標識抗ウサギＩｇＧを用いて免疫染色を行い、ＤＡＰＩにより核を追染色した。一次抗体を反応させない切片をネガティブコントロールとして用いた。スライドを封入後、蛍光顕微鏡にてＰＡＣ１Ｒ免疫陽性反応を観察した。【００５２】
蛍光免疫染色の結果を図８に示す。図８の上部の層は角膜内皮層、下部の層は角膜上皮層を示す。角膜上皮基底部や角膜内皮でＰＡＣ１Ｒ免疫陽性反応が観察された（例えば、図８矢印）。一次抗体を反応させなかったネガティブコントロールでは陽性反応は認められなかった。
以上の結果から、ＰＡＣＡＰは角膜上皮や角膜内皮に存在するＰＡＣ１Ｒに作用する可能性が示唆された。【００５３】
試験例５
＜マウス角膜障害モデルに対するＰＡＣＡＰ点眼による治癒促進効果の検討＞
ＰＡＣＡＰ点眼による角膜障害部位への治癒効果について検討するため、マウス角膜障害モデルを作成した。マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、オス、８〜１２週齢）の角膜に直径１ｍｍのバイオプシーパンチで傷跡をつけ、ピンセットで傷跡内の角膜上皮を剥離することにより傷害を作成した。その傷害部位に、ＰＡＣＡＰ １０−９、１０−１１、１０−１３Ｍ又は生理食塩水（saline）、それぞれ２μＬを、２時間ごとに１２時間後まで計７回点眼した。また、０、１２、２４時間後の計３回、蛍光着色剤の０．１％フルオレセイン２μＬを点眼することにより傷害部位を可視化し、写真撮影を行った。【００５４】
更に、０、１２時間後の眼球を取り出し、パラフィン包埋後に組織切片を作成し、ヘマトキシリン・エオシン染色（ＨＥ染色）を行った。また、撮影した蛍光像から、画像解析ソフトウェア（ＩｍａｇｅＪ）を用いて生理食塩水とＰＡＣＡＰ各濃度の角膜障害部位の面積と外周を測定した。【００５５】
図９Ａは、傷をつけてから０、１２、２４時間後の角膜障害部位の大きさの変化を示す。傷害部位は角膜中央部の円形の蛍光で示されている。生理食塩水群では時間経過とともに傷害部位が小さくなった。また、生理食塩水点眼群よりＰＡＣＡＰ点眼群の方が１２、２４時間後の傷害部位がより小さくなり治癒が促進した。【００５６】
図９Ｂは、傷をつけてから０、１２時間後のＨＥ染色の結果を示す。傷害直後（immediately after injury）のＨＥ染色像より、傷害部位では角膜上皮（図９Ｂ上図中、上層の濃いグレー層）のみが除去され、角膜固有質（図９Ｂ上図中、角膜上皮層直下の層）には傷害が認められなかった。また生理食塩水点眼１２時間後（ｓａｌｉｎｅ  １２ｈ）では角膜上皮が少し修復し（図９Ｂ、中央の図）、ＰＡＣＡＰ点眼１２時間（ＰＡＣＡＰ  １２ｈ）では角膜上皮の修復が促進した（図９Ｂ、下図）。【００５７】
図９Ｃは角膜障害部位の蛍光像から蛍光面積を測定した結果を示している。角膜を傷付けた直後（０時間）の角膜障害面積を１００％とし、縦軸の数字が小さくなる程、角膜障害部位が治癒されたことを示す。
角膜傷害１２時間後では生理食塩水群（ｓａｌｉｎｅ）と比較してＰＡＣＡＰ１０−１１と１０−９Ｍ点眼群で有意に角膜傷害面積が低値を示し、２４時間後ではＰＡＣＡＰ全濃度群で有意に低値を示した（＊＊：ｐ＜０．０１（生理食塩水群に対して））。ＰＡＣＡＰ１０−１１Ｍが最も有効な濃度であった。
また、角膜障害部位の外周も面積と同様に、傷害１２時間後では生理食塩水群と比較してＰＡＣＡＰ１０−１１と１０−９Ｍ点眼群で有意に傷害面積が低値を示し、２４時間後ではＰＡＣＡＰ全濃度群で有意に低値を示した（図示せず）。【００５８】
試験例６
＜マウス角膜障害モデルに対するＰＡＣＡＰ受容体アンタゴニスト点眼による治癒促進効果＞
次に、ＰＡＣＡＰの角膜障害治癒促進効果にどのタイプの受容体が関与しているのか検討するため、ＰＡＣＡＰ受容体アンタゴニスト（ＰＡＣＡＰ６−３８、ＶＩＰ６−２８）の点眼実験を行った。ＰＡＣＡＰ６−３８は、ＰＡＣ１Ｒ、ＶＰＡＣ２Ｒアンタゴニスト、ＶＩＰ６−２８は、ＶＰＡＣ１Ｒ、ＶＰＡＣ２Ｒアンタゴニストである。
試験例５の点眼実験と同様の操作に加え、２時間ごとのＰＡＣＡＰと生理食塩水点眼の直前にアンタゴニストのＰＡＣＡＰ６−３８（１０−９Ｍ）又はＶＩＰ６−２８（１０−９Ｍ）を点眼した。生理食塩水単独点眼群、ＰＡＣＡＰ単独点眼群、生理食塩水とアンタゴニスト同時点眼群、ＰＡＣＡＰとアンタゴニスト同時点眼群の４群を作成した。【００５９】
ＰＡＣＡＰ受容体アンタゴニスト（ＰＡＣＡＰ６−３８、ＶＩＰ６−２８）の同時点眼実験の結果を図１０に示す。図１０ＡがＰＡＣＡＰ６−３８、図１０ＢがＶＩＰ６−２８の結果である。図１０中、「ｓａｌｉｎｅ」は「生理食塩水単独点眼群」、「ＰＡＣＡＰ」は「ＰＡＣＡＰ単独点眼群」、「ＰＡＣＡＰ６−３８」又は「ＶＩＰ６−２８」は「生理食塩水とアンタゴニスト同時点眼群」、「ＰＡＣＡＰ６−３８＋ＰＡＣＡＰ」又は「ＶＩＰ６−２８＋ＰＡＣＡＰ」は「ＰＡＣＡＰとアンタゴニスト同時点眼群」を示す。【００６０】
図９Ｃと同様に、角膜を傷付けた直後（０時間）の角膜障害面積を１００％とし、縦軸の数字が小さくなる程、角膜障害部位が治癒されたことを示す。
ＰＡＣＡＰ単独点眼群と比較して、ＰＡＣＡＰとＰＡＣＡＰ６−３８同時点眼群では、角膜障害１２時間後におけるＰＡＣＡＰ誘導性の角膜障害治癒が有意に抑制された（＊：ｐ＜０．０５）。しかし、ＰＡＣＡＰとＶＩＰ６−２８同時点眼群では角膜障害治癒は抑制されなかった。また、ＰＡＣＡＰ６−３８と生理食塩水同時投与、又はＶＩＰ６−２８と生理食塩水同時投与は、生理食塩水単独投与の結果とほぼ同じになった。【００６１】
試験例７
＜涙腺除去マウスに対するＰＡＣＡＰの角膜治癒効果＞
これまでにＰＡＣＡＰを点眼することにより、涙腺を介した涙液促進剤として機能することが報告されている。よって、ＰＡＣＡＰの角膜治癒効果は、ＰＡＣＡＰによる涙液量の上昇によってもたらされる可能性がある。ＰＡＣＡＰの角膜治癒経路を確認するために、涙腺除去マウスの角膜に傷を付け、ＰＡＣＡＰの効果を検証することにした。
まずは、涙腺除去マウスを作製した。セボフルランによる吸入麻酔下で、マウスの眼窩外涙腺及び涙管をまず除去した。涙管を除去して眼窩内涙腺を露出させてから、両方の涙腺を除去した。次に皮膚を縫合し、マウスを麻酔から覚めるまで保温した。涙腺除去前後のマウスの涙液分泌量は綿糸法によって確認した。
涙腺除去前に比べて、涙腺除去マウスの涙液分泌量は約９０％減少し、ＰＡＣＡＰを点眼しても涙液分泌は促進されなかった（図示せず）。【００６２】
図１１は、マウスの角膜を傷付けてから０、１２、２４時間後の生理食塩水又はＰＡＣＡＰを投与した時の角膜障害部位の面積（蛍光面積）の測定結果を示すグラフである。生理食塩水又はＰＡＣＡＰの投与方法及び回数は試験例５と同様に行った。
角膜を傷付けた直後（０時間）の角膜障害部位の面積（蛍光面積）を１００％とし、縦軸の数字が小さくなる程、角膜障害部位が治癒されたことを示す。
図１１中、「ＬＧ＋ｓａｌｉｎｅ」は「涙腺除去されていないマウスに生理食塩水を投与した結果」、「ＬＧ＋ＰＡＣＡＰ」は「涙腺除去されていないマウスにＰＡＣＡＰを投与した結果」、「ＬＧ−ｓａｌｉｎｅ」は「涙腺除去したマウスに生理食塩水を投与した結果」、「ＬＧ−ＰＡＣＡＰ」は「涙腺除去したマウスにＰＡＣＡＰを投与した結果」を示す。ＰＡＣＡＰの濃度は１０−１１Ｍである。【００６３】
「ＬＧ−ｓａｌｉｎｅ」は、「ＬＧ＋ｓａｌｉｎｅ」の結果と比較して、角膜障害部位の面積（蛍光面積）が小さくならず、涙腺除去により角膜治癒効果が抑制されたことが分かった（＊＊：ｐ＜０．０１）。
一方、「ＬＧ−ＰＡＣＡＰ」では、角膜を傷付けてから１２時間後に、「ＬＧ−ｓａｌｉｎｅ」の結果と比較して、角膜障害部位の面積（蛍光面積）は有意に小さくなり（＊：ｐ＜０．０５）、ＰＡＣＡＰは涙液分泌を介さず角膜治癒効果に直接関与していることが示唆された。【００６４】
試験例８
＜ヒト角膜培養細胞単層シートでのインビトロスクラッチアッセイ＞
インビトロでのＰＡＣＡＰの角膜治癒効果を評価するために、ヒト角膜上皮細胞株を用いてスクラッチアッセイを行った。
ＳＶ４０−ヒト角膜上皮細胞株（human corneal epithelium cell line；ＨＣＥＣ）をヒューマンサイエンス研究資源バンク（Health Science Research Resources Bank）から購入した。細胞をＤＭＥＭ、１×抗生物質−抗真菌剤（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）、及び、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む培地で培養した。培養は５％ＣＯ２下で３７℃にて行った。
浸潤アッセイにおいて、１０６細胞数の浮遊ＨＣＥＣを１２ウェルプレートに播種した。２日間のインキュベーション後、コンフルエント細胞層をプラスチックのスティックで十字に傷を付けた。ＰＢＳ又は様々な種類のＰＡＣＡＰ（最終濃度：１０−１５、１０−１３、１０−１１、１０−９、１０−７Ｍ）を１０μＬウェルに添加し、一定時間ごとにNicon Biostation CT（株式会社ニコン製）でスクラッチ部位（傷を付けた部位）を撮影した。スクラッチ部位は、ＣＬ−Ｑｕａｎｔソフトウェア（株式会社ニコン製）を用いて面積を測定した。【００６５】
結果を図１２Ａ及びＢに示す。図１２Ａは、細胞をスクラッチしてから（傷を付けてから）０時間後及び６時間後のスクラッチ部位を示す。各写真の中央部の細胞が密集していない箇所がスクラッチ部位である。
図１２Ｂは、細胞をスクラッチしてから６時間後のスクラッチ部位の面積を示す。スクラッチ直後（０時間）のスクラッチ部位の面積を１００％とし、縦軸の数字が小さくなる程、スクラッチ部位が治癒されたことを示す。
図１２中、「control」は、「ＰＢＳ投与群（対照群）」の結果を示す。【００６６】
細胞をスクラッチしてから６時間後、濃度が１０−１１ＭのＰＡＣＡＰが対照群（ＰＢＳ投与群）と比較して有意にスクラッチ部位が減少した。
よって、ＰＡＣＡＰはインビトロにおいてヒト角膜上皮細胞の治癒効果を発揮することが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明の角膜上皮細胞走化促進剤は、角膜障害等の眼疾患の症状改善のための医薬等として広く利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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