(57)【要約】【課題】  内部に吸液部材を備えた固相反応チップの欠点を克服し、迅速に且つ簡便な操作で検体液中に含まれる測定対象物質を精度よく検出することが可能な固相反応チップ及びこれを用いた測定方法を提供する。【解決手段】  上蓋部材と下蓋部材とが嵌合一体化することにより回転体として形成される固相反応チップであって、上蓋部材又は下蓋部材の何れかの内側底面側に設けられ、検体液に含まれる測定対象物質に対して特異的結合能を有する複数の結合物質を固定化する固定化部と、上蓋部材に設けられ、固定化部表面に検体液を供給する開口部と、固定化部外側に設けられ、開口部を介して供給された検体液を吸液する吸液部とを有し、固定化部は、対峙する内側底面方向側に隆起した隆起部により区分された複数の固定化領域を有し、各固定化領域の外縁部には少なくとも１つの頂点が含まれる固相反応チップ及びこれを用いた測定方法。【選択図】  図１
2020171158.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
上蓋部材と下蓋部材とが嵌合一体化することにより回転体として形成される固相反応チップであって、
前記上蓋部材又は前記下蓋部材の何れかの内側底面側に設けられ、検体液に含まれる測定対象物質に対して特異的結合能を有する複数の結合物質を固定化する固定化部と、
前記上蓋部材に設けられ、前記固定化部表面に前記検体液を供給する開口部と、
前記固定化部外側に設けられ、前記開口部を介して供給された前記検体液を吸液する吸液部とを有し、
前記固定化部は、対峙する内側底面方向側に隆起した隆起部により区分された複数の固定化領域を有し、
各固定化領域の外縁部には少なくとも１つの頂点が含まれること
を特徴とする固相反応チップ。
【請求項２】
各固定化領域の平面視形状は全て同形状に形成されること
を特徴とする請求項１に記載の固相反応チップ。
【請求項３】
各固定化領域は回転対称に形成されること
を特徴とする請求項１又は請求項２に記載の固相反応チップ。
【請求項４】
前記結合物質はＩ型アレルギー反応を誘発するアレルゲンであること
を特徴とする請求項１乃至請求項３の何れか１項に記載の固相反応チップ。
【請求項５】
前記測定対象物質はアレルゲン特異的抗体であること
を特徴とする請求項４に記載の固相反応チップ。
【請求項６】
前記アレルゲン特異的抗体はＩｇＥ抗体であること
を特徴とする請求項５に記載の固相反応チップ。
【請求項７】
前記結合物質はヒトパピローウィルスに由来するゲノムＤＮＡプローブであること
を特徴とする請求項１乃至請求項３の何れか１項に記載の固相反応チップ。
【請求項８】
前記測定対象物質はヒトパピローウィルスに由来する遺伝子型であること
を特徴とする請求項７に記載の固相反応チップ。
【請求項９】
前記測定対象物質は、Ｓｙｐｈｉｌｉｓ ＴＰ，ＨＩＶ Ａｇ/Ａｂ ｃｏｍｂｏ，Ａｎｔｉ−ＨＣＶ，ＨＢｓＡｇから選択される手術前感染症検査マーカーであること
を特徴とする請求項１乃至請求項３の何れか１項に記載の固相反応チップ。
【請求項１０】
前記測定対象物質は、Ａｎｔｉ−ＨＢｃ，Ａｎｔｉ−ＨＢｓ，Ａｎｔｉ−ＨＢｅ，ＨＢｅＡｇ，Ａｎｔｉ−ＨＢｃ ＩｇＭから選択される肝機能検査マーカーであること
を特徴とする請求項１乃至請求項３の何れか１項に記載の固相反応チップ。
【請求項１１】
前記測定対象物質は、ＢＵＮ，ＣＲＥ，ＵＡから選択される腎機能検査マーカーであること
を特徴とする請求項１乃至請求項３の何れか１項に記載の固相反応チップ。
【請求項１２】
前記測定対象物質は、ＩｇＧ，抗核抗体から選択される自己免疫性肝炎マーカーであること
を特徴とする請求項１乃至請求項３の何れか１項に記載の固相反応チップ。
【請求項１３】
前記測定対象物質は、トロポニン, ミオグロビン,生化学的心筋マーカー, 心臓型脂肪酸結合蛋白から選択される心疾患マーカーであること
を特徴とする請求項１乃至請求項３の何れか１項に記載の固相反応チップ。
【請求項１４】
前記測定対象物質は、Ｐｒｏｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ，Ｐｒｅｓｅｐｓｉｎから選択される敗血症マーカーであること
を特徴とする請求項１乃至請求項３の何れか１項に記載の固相反応チップ。
【請求項１５】
前記測定対象物質は、ＴＳＨ，Ｆｒｅｅ Ｔ４，ＴＲＡｂから選択される甲状腺マーカーであること
を特徴とする請求項１乃至請求項３の何れか１項に記載の固相反応チップ。
【請求項１６】
前記測定対象物質は、ＶＣＭ，ＴＥＩＣ，ＡＢＫから選択される血中薬物であること
を特徴とする請求項１乃至請求項３の何れか１項に記載の固相反応チップ。
【請求項１７】
請求項１乃至請求項１６の何れか1項に記載の固相反応チップに対して、
前記開口部を介して前記検体液を導入し、前記測定対象物質と前記結合物質とを結合させる結合ステップと、
前記結合物質に結合した前記測定対象物質に対して特異的結合能を有し酵素活性を備えた生理活性物質を含む反応液を添加する添加ステップと、
前記開口部を介して洗浄液を導入後、固相反応チップを所定の回転数で回転させることで前記洗浄液を除去する除去ステップと、
前記生理活性物質における前記酵素活性を測定する測定ステップとを備えること
を特徴とする測定方法。
【請求項１８】
請求項１乃至請求項１６の何れか１項に記載の固相反応チップに対して、
前記開口部を介して前記検体液を導入し、前記測定対象物質と前記固定化部に固定化された前記結合物質とを結合させる第１の結合ステップと、
前記測定対象物質に対して特異的結合能を有し、シグナル生成物質により標識された標識化物質を前記第１の結合ステップにて前記結合物質に結合した前記測定対象物質に結合させる第２の結合ステップと、
前記シグナル生成物質により生じたシグナルを測定する測定ステップとを備えること
を特徴とする測定方法。
【請求項１９】
前記シグナル生成物質は、放射性同位元素、ランタノイド元素、フリーラジカル誘導体、化学発光物質又は蛍光発光物質の何れかであること
を特徴とする請求項１８に記載の測定方法。
【請求項２０】
前記蛍光発光物質は、蛍光色素、量子ドット、又は蛍光色素若しくは量子ドットと粒子とからなる蛍光性粒子の何れかであること
を特徴とする請求項１９に記載の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固相反応チップ及びこれを用いた測定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
気管支喘息、アレルギー性鼻炎、蕁麻疹、又はアナフィラキシーショック等の疾患を引き起こすＩ型アレルギーは、特定の抗原（アレルゲン）とそれに対するＩｇＥ抗体との過剰反応により引き起こされることが知られている。病院等の各診療現場においては、アレルギー疾患の原因である原因アレルゲンを特定する上で、検体液中に含まれるＩｇＥ抗体を検出する検査がなされている。現在、検体液中に含まれるアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体を検出する手法としては、免疫蛍光法を測定原理とするＣＡＰや、免疫化学発光法を測定原理とするＭＡＳＴと呼ばれる手法等が用いられている。【０００３】
ところで、従来から、検体液中に含まれる、核酸、タンパク質、糖脂質といった測定対象物質を効率良く検出するために、当該測定対象物質と特異的結合能を有する結合物質を固相上に固定化し、当該固相上において結合物質に結合した測定対象物質の検出までを行う固相反応チップが用いられている。固相反応チップは、生化学の分野では、バイオチップとも呼ばれ、例えば、ｍＲＮＡチップ、ｃＤＮＡチップ、マイクロＰＣＲチップ、プロテインチップ等が知られている。【０００４】
近年、アレルギー疾患の診断に対しても、抗原抗体反応を用いた免疫分析マイクロチップが提案されており、例えば、特許文献１には、多種のアレルゲンの抗原を互いに独立した即ち隔置したスポットとして搭載したバイオチップを用いて、検体液の採取後に、検体液と抗原との反応検出過程を自動化し、且つ迅速に測定結果を得ることができるとするバイオチップの分析方法が開示されている。【０００５】
従来技術であるＣＡＰは、原則的に１種のアレルゲンごとに測定を行う単項目法であり、測定ごとに検体液が必要となるため、被験者の肉体的負担が大きく、また測定に係るスループットも良くない。一方、ＭＡＳＴは、例えば、３０種程度のアレルゲンに対して一度に測定を行う多項目法である。単項目法に比べて同時に測定可能なアレルゲン数は多いものの、操作が煩雑であり、測定結果が得られるまでに５時間程度の時間を要するものである。【０００６】
また、上記特許文献１に記載の技術では、洗浄ノズル、抗体ノズル、試薬ノズルといった各ノズルから供給された各液を吸引するための吸引ノズルが必要であり、各液の吸引が完了するまでに時間を要するとともに、吸引ポンプの不調による吸引力不足や、吸引ノズルに付着した付着物がバイオチップに付着しコンタミネーションを引き起こす恐れもあった。【０００７】
このような実状に鑑み、本願出願人は、第１の基台部と第２の基台部とが積層されることにより形成される回転体の外周に吸液部材を備え、これを収容するカバー部材からなる固相反応チップを開発し、これを特許出願した（特許文献２）。特許文献２に係る発明は、第２の基台部の第１の基台部に対峙する面に、検体液に含まれる測定対象物質に対して特異的結合能を有する複数の結合物質を固定化することにより、少量の検体液での同時多項目測定を実現可能としたものであり、特許文献２に係る発明によれば、迅速に且つ簡便な操作で検体液中に含まれる測定対象物質を検出することが可能となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１１−１３０００号公報
【特許文献２】特開２０１６−２００４３１号公報
【特許文献３】特許第６１０７２４４号
【特許文献４】国際公開ＷＯ２０１８／０５６４５４号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
特許文献２に係る固相反応チップでは、第１の基台部と第２の基台部とが積層されることにより形成される回転体を収容するカバー部材が必要となる。カバー部材は、固相反応チップ外形を形成するとともに、吸液部材を介して回転体を保持する役目を担っている。しかしながら、実験を重ねた結果、回転体は高速での回転に伴いカバー部材内部において変位し、測定精度に影響を与えていることが明らかとなった。加えて、円形の回転体は円環状に形成された吸液部材と面接触しているため、その接触面において液だまりが発生し、吸液能力が低下するといった問題もあった。【００１０】
本発明はこのような問題を解決するためになされたものであり、本発明の課題は、内部に吸液部材を備えた固相反応チップの欠点を克服し、迅速に且つ簡便な操作で検体液中に含まれる測定対象物質を精度よく検出することが可能な固相反応チップ及びこれを用いた測定方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するために、本発明に係る固相反応チップは、上蓋部材と下蓋部材とが嵌合一体化することにより回転体として形成される固相反応チップであって、前記上蓋部材又は前記下蓋部材の何れかの内側底面側に設けられ、検体液に含まれる測定対象物質に対して特異的結合能を有する複数の結合物質を固定化する固定化部と、前記上蓋部材に設けられ、前記固定化部表面に前記検体液を供給する開口部と、前記固定化部外側に設けられ、前記開口部を介して供給された前記検体液を吸液する吸液部とを有し、前記固定化部は、対峙する内側底面方向側に隆起した隆起部により区分された複数の固定化領域を有し、各固定化領域の外縁部には少なくとも１つの頂点が含まれることを特徴としている。【００１２】
また、本発明に係る測定方法は、上記固相反応チップに対して、前記開口部を介して前記検体液を導入し、前記測定対象物質と前記結合物質とを結合させる結合ステップと、前記結合物質に結合した前記測定対象物質に対して特異的結合能を有し酵素活性を備えた生理活性物質を含む反応液を添加する添加ステップと、前記開口部を介して洗浄液を導入後、固相反応チップを所定の回転数で回転させることで前記洗浄液を除去する除去ステップと、前記生理活性物質における前記酵素活性を測定する測定ステップとを備えることを特徴としている。【００１３】
さらに、本発明に係る測定方法は、上記固相反応チップに対して、前記開口部を介して前記検体液を導入し、前記測定対象物質と前記固定化部に固定化された前記結合物質とを結合させる第１の結合ステップと、前記測定対象物質に対して特異的結合能を有し、シグナル生成物質により標識された標識化物質を前記第１の結合ステップにて前記結合物質に結合した前記測定対象物質に結合させる第２の結合ステップと、前記シグナル生成物質により生じたシグナルを測定する測定ステップとを備えることを特徴としている。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、内部に吸液部材を備えた固相反応チップの欠点を克服し、迅速に且つ簡便な操作で検体液中に含まれる測定対象物質を精度よく検出することが可能な固相反応チップ及びこれを用いた測定方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本実施形態に係る固相反応チップ１００の概観を説明するための斜視図である。
【図２】固相反応チップ１００を構成する各部材の部品図である。
【図３】（ａ）は上蓋部材１０を内側底面１１側に見た場合の平面図であり、（ｂ）は上蓋部材１０の側面断面図である。
【図４】（ａ）は下蓋部材２０を内側底面２１側に見た場合の平面図であり、（ｂ）は下蓋部材２０の側面断面図である。
【図５】図１で示した固相反応チップ１００の側面断面図である。
【図６】本実施形態に係る測定方法を説明するフローチャートである。
【図７】自動測定装置２００の構成例を説明するブロック図である。
【図８】（ａ）は変形例に係る上蓋部材１０１を説明する平面図であり、（ｂ）は変形例に係る下蓋部材３０１を説明する平面図である。
【図９】（ａ）は変形例に係る上蓋部材１０２を説明する平面図であり、（ｂ）は変形例に係る下蓋部材３０２を説明する平面図である。
【図１０】（ａ）は変形例に係る固相反応チップ５０を説明する斜視図であり、（ｂ）は変形例に係る固相反応チップ６０を説明する斜視図である。
【図１１】本実施形態に係る測定方法にて測定した比色スポットの発色状態を示す図である。
【図１２】本実施形態に係る測定方法にて測定した比色スポットの発色状態を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を実施するための形態について図面を参照して説明する。なお、本発明は、以下の記述に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において適宜変更可能である。また、図面は模式的なものであり、各寸法の比率等は現実のものとは異なることがある。具体的な寸法は以下の説明を参酌して判断すべきものである。また、図面相互間においても互いの寸法の関係や比率が異なる部分が含まれていることは無論である。
【００１７】
本発明に係る固相反応チップは、上蓋部材と下蓋部材とが嵌合一体化することにより回転体として形成される固相反応チップであって、上蓋部材又は下蓋部材の何れかの内側底面側に設けられ、検体液に含まれる測定対象物質に対して特異的結合能を有する複数の結合物質を固定化する固定化部と、上蓋部材に設けられ、固定化部表面に検体液を供給する開口部と、固定化部外側に設けられ、開口部を介して供給された検体液を吸液する吸液部とを有し、固定化部は、対峙する内側底面方向側に隆起した隆起部により区分された複数の固定化領域を有し、各固定化領域の外縁部には少なくとも１つの頂点が含まれるものである。以下詳細に説明する。
【００１８】
図１は、本実施形態に係る固相反応チップ１００の概観を説明するための斜視図であり、図２は、固相反応チップ１００を構成する各部材の部品図である。本実施形態に係る固相反応チップ１００は、上蓋部材１０と、上蓋部材１０と嵌合一体化し、上蓋部材１０とともに回転体を形成する下蓋部材２０とを備え、上蓋部材１０と下蓋部材２０とが嵌合することにより形成される内部空間３０には、開口部１４を介して供給された検体液、反応液、洗浄液等（以下、単に液体と称することがある）を回収する吸液部材４０が、後述する固定化部２３の外周２７に沿って設けられている。なお、以下の説明では、下蓋部材２０の内側底面２１側に固定化部２３が設けられた構成について説明するが、これとは逆に、上蓋部材１０の内側底面１１側に固定化部２３を設ける構成としても構わない。
【００１９】
図３（ａ）は、上蓋部材１０を内側底面１１側に見た場合の平面図であり、図３（ｂ）は、上蓋部材１０の側面断面図である。本実施形態に係る上蓋部材１０は、略正円の形状を有し、内側底面１１の周縁（円周）に沿って、下蓋部材２０との嵌合が可能となるように上蓋嵌合壁１２が立設されている。上蓋部材１０の内側底面１１には、下蓋部材２０の固定化部２３の平面視形状と同じ四角形状を有し、固定化部表面２４に対峙する固定化部対峙面１３が形成されている。固定化部対峙面１３は、後述する固定化部表面２４上に設けられた隆起部２６が当接することにより、固定化部表面２４との間で空隙を形成し、開口部１４を介して供給された液体を固定化部表面２４上に展開可能とする。なお、固定化部対峙面１３は、図３（ｂ）に示すように、内側底面１１から所定の突出幅ａを持って形成することも可能であるし、内側底面１１表面上に平滑面として直接形成することも可能である。また、固定化部対峙面１３の平面視形状は固定化部２３全体の平面視形状と同一形状とすることも可能であるし、異なる形状としても構わない。開口部１４は、上蓋部材１０の表面略中央であって、下蓋部材２０の回転軸と同軸上に設けられている。開口部１４は、テーパー形状に形成された開口部分を有し、固定化部対峙面１３の面上に導通している。
【００２０】
図４（ａ）は、下蓋部材２０を内側底面２１側に見た場合の平面図であり、図４（ｂ）は、下蓋部材２０の側面断面図である。本実施形態に係る下蓋部材２０は、上蓋部材１０と同形状の略正円の形状を有し、内側底面２１の周縁（円周）よりも内側に、上蓋部材１０との嵌合が可能となるように下蓋嵌合壁２２が立設されている。下蓋部材２０の内側底面２１には、平面視形状が四角形状の固定化部２３が形成されている。固定化部２３の固定化部表面２４には、測定対象物質に対して特異的結合能を有する複数の結合物質を固定化する固定化領域２５が形成されている。本実施形態においては、固定化部表面２４は対峙する上蓋部材１０の内側底面１１方向側に隆起した隆起部２６によって４つの固定化領域２５に区分されている。前述したように、固定化部表面２４上に設けられた隆起部２６が上蓋部材１０の固定化部対峙面１３に当接することにより、固定化部表面２４と固定化部対峙面１３との間で空隙が形成され、開口部１４を介して供給された液体は当該空隙（固定化領域２５）に導入されることになる。隆起部２６によって区切られた各固定化領域２５の外縁部２８には少なくとも１つの頂点２３０が含まれる。本実施形態においては、各固定化領域２５の外縁部２８に内角度が９０°を示す１つの頂点２３０が設けられ、固定化部２３の全体の平面視形状として四角形状を有する固定化部２３の例について示している。なお、固定化領域２５の外縁部２８に含まれる頂点は３０°〜１６２°の内角度を示すものとし、頂点数は１つ以上であれば特に限定はされることない。そして、固定化部２３に含まれる４つの固定化領域２５の平面視形状は全て同一形状とし、回転対象となるように構成されることが好ましい。固定化部２３に含まれる４つの固定化領域２５をこのような形状とすることにより、固相反応チップ１００を回転させた際に安定した回転状態を得ることができ、開口部１４を介して供給された液体を均一に固定化部表面２４と固定化部対峙面１３との間の空隙に展開することができる。固定化領域２５には、１領域当たり、直径１００μｍ〜１ｍｍ程度の大きさのスポット２５０が１領域当たり４×４列（１６スポット）で形成されている。なお、固定化領域２５に固定化される結合物質の数は、上記６４種に限定されるものではなく、例えば、２×２列（合計１６種）〜６×６列（合計１４４種）というように測定種目に応じて適宜変更することができる。また、結合物質の固定化方法も上記スポットによるものではなく、各固定化位置に対応する箇所に設けた、例えば、Ｕ底（球面状）、Ｖ底、平底（丸型、角型）状等の底部を有する窪み（ウェル）に結合物質を直接的又は間接的に固定化させる方法を採用しても構わない。
【００２１】
下蓋部材２０の内側底面２１上に設けた固定化部２３の固定化領域２５の外縁部２８を上記形状とすることで、吸液部材４０との接触面積を低減することが可能となり、その結果、液だまりの発生を軽減することができる。ところで、図４（ｂ）に示すように、固定化部２３の内側底面２１からの突出幅ｂは、固定化部対峙面１３との間に形成される空隙が所定の空隙幅となればその制限はなく、隆起部２６の高さを考慮するとともに、上蓋部材１０に形成された固定化部対峙面１３の突出幅ａに応じて適宜設定すればよい。
【００２２】
図５は、図１で示した固相反応チップ１００の側面断面図である。本実施形態においては、固定化部表面２４と固定化部対峙面間１３との間に形成される空隙の空隙幅ｃは、０．０５ｍｍ〜０．３０ｍｍの間とすることが好ましく、この中でも、空隙幅ｃを０．０８ｍｍ〜０．１５ｍｍの間とするのがより好ましい。なお、前述したように、空隙幅ｃは、固定化部２３の突出幅ｂ、固定化部対峙面１３の突出幅ａ、及び隆起部２６高さを調整することにより適宜変更することが可能であり、これにより空隙に供給される液体の液量を所望の液量とすることができる。
【００２３】
上記構成を有する上蓋部材１０及び下蓋部材２０は、液体を透過させず、タンパク質等に対して非吸着性を有するものであれば特に限定されるものではなく、例えば、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、塩化ビニル、ポリスチレン、ＡＢＳ樹脂、ポリアミド、四フッ化エチレン、ポリプロピレン、不飽和ポリエステル、エポキシ等のプラスチック原料を用い、例えば、射出成形、インサート成形、ブロー成形、押出成形、圧縮成形、又はトランファー成形といった成形方法にて製造することができる。材質の色彩・透過性ついては特に限定はないが、上蓋部材１０は透明性を有し、下蓋部材２０は測定時の反射等を抑えるために非透過性であることが好ましい。そして、上蓋部材１０と下蓋部材２０との嵌合一体化は、特に制限はないが、上蓋部材１０の上蓋嵌合壁１２と下蓋部材２０の下蓋嵌合壁２２とを、超音波溶着、振動溶着、熱板溶着、高周波溶着、熱風溶着、レーザー溶着、溶接等の溶着・溶接、接着剤、接着テープ等の接着、タッピングネジ、ボルト及びナットを用いた機械締結等により接合することで嵌合一体化を図ることができる。
【００２４】
ところで、上蓋部材１０と下蓋部材２０とが嵌合することにより形成される内部空間３０に収容される吸液部材４０は、細板状に形成された部材をそれぞれの両端部同士で接合した円環部材として形成することができ、固定化部２３の外側（外周２７）に沿って設けられる。吸液部材４０は、回転に伴い発生する遠心力によって除去され液体を吸液するために設けられる。このような吸液部材４０の製造に用いる材質としては、例えば、ポリエチレンテレフタレートやポリエチレンテレブチレート等のポリエステル系繊維、ポリエチレン、ポリプロピレン等のポリオレフィン系繊維、ポリウレタン、あるいはこれらを複合した複合繊維や、パルプ繊維、木綿繊維、麻繊維等の植物繊維、絹繊維、レーヨン繊維等の再生繊維といった繊維、織布、不織布、紙等の吸水・保水性に優れた材質を用いることができる。また、パルプ繊維やレーヨン繊維といったセルロースを主成分とするもの、木材パルプに酢酸を作用させて製したアセテート（アセチルセルロース）といった多糖類からなる多孔質マトリックスを用いることができる。
【００２５】
次に、本実施形態に係る固相反応チップ１００を用いた測定方法について図６のフローチャートを用いて説明する。本測定法では、固相反応チップ１００に対して、開口部１４を介して検体液を導入し、測定対象物質と結合物質とを結合させる結合ステップと、結合物質に結合した測定対象物質に対して特異的結合能を有し酵素活性を備えた生理活性物質を含む反応液を添加する添加ステップと、固相反応チップを所定の回転速度で回転させることで反応液を除去する除去ステップと、生理活性物質における酵素活性を測定する測定ステップとを備えるものである。
【００２６】
本実施形態に係る測定法では、測定対象物質をアレルゲンに特異的に結合するＩｇＥ抗体とした例について説明する。固定化部２３の固定化部表面２４の固定化領域２５に結合物質として固定化される結合物質としてのアレルゲンとしては、特に限定されることはないが、例えば、ハウスダスト１（２）、ヤケヒョウヒダニ、スギ、ヒノキ、ハンノキ（属）、シラカンバ（属）、カモガヤ、ブタクサ、ヨモギ、アルテルナリア、アスペルギルス、マラセチア（属）、ネコ（フケ）、イヌ（フケ）、ゴキブリ、ガ、ラテックス等の吸入系・その他のアレルゲン、牛乳、卵白、オポムコイド、米、コムギ（実）、ソバ、大豆、ピーナッツ、リンゴ、キウイ、ゴマ、牛肉、鶏肉、エビ、カニ、サバ、サケ、マグロ等の食物系アレルゲンといった、医療機関等でアレルゲン検査項目として受診可能なものであれば如何なるアレルゲンも選択可能である。
【００２７】
固定化領域２５へのアレルゲンの固定化は、一般的に用いられる物理的吸着又は化学的結合によって行うことができる。例えば、測定項目のアレルゲンを含むアレルゲン溶液を固定化領域２５の所望の位置、又は例えば、Ｕ底（球面状）、Ｖ底、平底（丸型、角型）状等の底部を有する窪み（ウェル）にスポッティング又はスタンプすることで当該アレルゲンを固定化領域２５に固定化する。この場合、アレルゲンを直接固定化領域２５に固定させてもよいし、スペーサ物質を介してアレルゲンを固定化する形態としてもよい。本実施形態に係る固定化領域２５には、合計で６４か所のスポット位置が設けられているため、各スポットに異なるアレルゲンを固定化することで、６４種の測定項目を一度に測定することができる。
【００２８】
また、測定対象物質としてのＩｇＥ抗体に対して特異的結合能の有し酵素活性を備えた生理活性物質としては、特に限定はされないが、例えば、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、クレアチンキナーゼ、ウリカーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ等で標識した抗ＩｇＥ抗体を用いるのが好ましい。本実施形態では、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で抗ＩｇＥ抗体を標識したＨＲＰ標識抗体を用いた例について説明する。ＨＲＰ標識抗体を用いた場合、生成されるシグナルは基質に依存して比色シグナル、化学発光シグナルとして得ることができる。比色シグナルの生成に用いられる基質としては、例えば、テトラメチルベンジジン及びその誘導体、ｏ−フェニレンジアミン、トリアリールメタン類、イミダゾールロイコ色素類等を用いることができる。また、化学発光シグナルの生成には、例えば、アクリジニウム塩類、ジオキセタン類、ルシフェリン、ルシゲニン、塩化オキザリル等を挙げることができる。
【００２９】
固定化領域２５にアレルゲンが固定化された下蓋部材２０と上蓋部材１０とから形成される内部空間３０に吸液部材４０を収納後、下蓋部材２０と上蓋部材１０とを嵌合一体化することで固相反応チップ１００を構成する。
【００３０】
そして、上蓋部材１０の開口部１４を介して検体液（３０μｌ〜６０μｌ）を供給する（ステップＳ１００）。検体液としては、全血、血清、血漿、涙液、尿、唾液、髄液等の生体試料から適宜選択することができる。開口部１４に検体液が供給されると、当該検体液は、固定化領域２５全域に展開され、各スポットに固定化された結合物質たるアレルゲンに特異的結合能を有するＩｇＥ抗体が結合する。このとき、固相反応チップ１００は、３５℃〜４０℃の範囲の温度環境下に置かれることが好ましい。例えば、３７℃前後の温度維持が可能な恒温槽内において一連の操作を行うことで、アレルゲンに対しＩｇＥ抗体を効率良く結合させることができる。
【００３１】
次に、例えば、ｔｗｅｅｎ２０等の界面活性剤を含む洗浄液（３０μｌ〜６０μｌ）を開口部１４を介して供給した後、所定の回転数（２０００〜２５００ｒｐｍ／ｍｉｎ）にて回転させることで洗浄液を除去する（ステップＳ１０１）。
【００３２】
次に、ステップＳ１０２において、ＨＲＰ標識抗体を含む反応液（３０μｌ〜６０μｌ）を開口部１４を介して供給する（ステップＳ１０２）。アレルゲンに結合したＩｇＥ抗体にＨＲＰ標識抗体を結合させた後、例えば、ｔｗｅｅｎ２０等の界面活性剤を含む洗浄液（３０μｌ〜６０μｌ）を開口部１４を介して供給した後、所定の回転数（２０００〜２５００ｒｐｍ／ｍｉｎ）にて回転させることで洗浄液を除去する（ステップＳ１０３）。
【００３３】
ステップＳ１０３での洗浄が完了後、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）等の基質を加え、比色シグナルを発したスポットをＣＣＤ等の撮像手段を用いて測定する（ステップＳ１０４）。
【００３４】
ところで、図６のフローチャートで説明した測定方法は手動によるものであるが、例えば、図７に示す構成を備えた自動測定装置２００を用いることにより当該測定を自動的に行わせることができる。自動測定装置２００は、少なくともセットされた試薬カートリッジから溶液を吸引・吐出することが可能な分注ユニット２０１と、固相反応チップ１００を保持した状態で１分間当たり所定の回転数で回転させる遠心分離部２０２と、ＣＣＤ等の撮像手段を備えた撮像部２０３と、タッチパネル等の入力手段や、装置情報若しくは測定結果等を表示するＬＣＤ（Liquid Crystal Display）等の表示手段を備えた操作部２０４と、撮像部２０３により撮像された画像（比色シグナル発光スポット等）を解析する画像解析部２０５と、画像解析部２０５による解析結果から測定結果を生成する測定結果生成部２０６と、これらを統括的に制御する制御部２０７とを備え、試薬カートリッジ又は固相反応チップ１００の装置へのセット以外、検査員による実動作が不要となるように構成されている。
【００３５】
上記構成の自動測定装置２００によれば、約２０分程度で最終的な測定結果が得られるためスループットが高く、また、操作部２０４を介して表示される画面に従い直感的に操作を行うことができるため、熟練の技術を必要としないといった利点がある。また、装置自体も小型化することが可能であるため、臨床現場即時検査用の装置として適用させることも可能である。
【００３６】
なお、上記測定方法の説明においては、測定対象物質をアレルゲンに特異的に結合するＩｇＥ抗体とした例とし、固定化領域２５に結合物質として固定化するものとしてアレルゲンの例について説明したが、本発明はこれに限定されるものではなく、測定対象物質を、例えば、ヒトパピローウィルス（ＨＰＶ）に由来する遺伝子型とし、第２の基台部３２の固定化領域３２ｃに結合物質として固定化するものとしてＨＰＶに由来するゲノムＤＮＡプローブとすることも可能である。この場合、１６型、１８型、３１型、３３型、３５型、３９型、４５型、５１型、５２型、５６型、５８型、５９型、６８型等の１３種の高リスク型として分類されるＨＰＶを検出する測定系として構築することも可能である。
【００３７】
また、本発明は、例えば、手術前感染症検査マーカー、肝機能検査マーカー、腎機能検査マーカー、自己免疫性肝炎マーカー、心疾患マーカー、敗血症マーカー、甲状腺マーカー、又は血中に含まれる特定の薬物等を測定対象物質とすることも可能である。
【００３８】
ここで、表１には、（１）手術前感染症検査マーカーとして、Ｓｙｐｈｉｌｉｓ ＴＰ， ＨＩＶ Ａｇ/Ａｂ ｃｏｍｂｏ，Ａｎｔｉ−ＨＣＶ，ＨＢｓＡｇを、（２）肝機能検査マーカーとして、Ａｎｔｉ−ＨＢｃ，Ａｎｔｉ−ＨＢｓ，Ａｎｔｉ−ＨＢｅ，ＨＢｅＡｇ，Ａｎｔｉ−ＨＢｃ ＩｇＭを、（３）腎機能検査マーカーとして、ＢＵＮ，ＣＲＥ，ＵＡを、（４）自己免疫性肝炎マーカーとして、ＩｇＧ，抗核抗体を、（５）心疾患マーカーとして、トロポニン，ミオグロビン，ＣＫ−ＭＢ等の生化学的心筋マーカー, 心臓型脂肪酸結合蛋白を、（６）敗血症マーカーとして、Ｐｒｏｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ，Ｐｒｅｓｅｐｓｉｎを、（７）アレルギー（アレルゲン）の典型例として、ハウスダスト，ヤケヒョウダニ，ネコ皮膚，卵白，コナヒョウダニ，ミルク，小麦，大豆，ヒノキ，スギを、（８）甲状腺マーカーとして、ＴＳＨ，Ｆｒｅｅ Ｔ４， ＴＲＡｂを、（９）血中に含まれる特定の薬物として、ＶＣＭ，ＴＥＩＣ，ＡＢＫを上記測定法にて評価した結果を示している。表１中において、コントロール（測定対象物質が無い状態）と比較して優位な比色シグナルが認められた測定対象物質を「陽性」として評価し、「陽性」とまではいかないまでもコントロールに対して優位差が認められた測定対象物質を「疑陽性」として評価した。
【００３９】
また、図１１には、（１）手術前感染症検査マーカー（１．Ｓｙｐｈｉｌｉｓ ＴＰ， ２．ＨＩＶ Ａｇ/Ａｂ ｃｏｍｂｏ，３．Ａｎｔｉ−ＨＣＶ，４．ＨＢｓＡｇ）、（２）肝機能検査マーカー（１．Ａｎｔｉ−ＨＢｃ，２．Ａｎｔｉ−ＨＢｓ，３．Ａｎｔｉ−ＨＢｅ，４．ＨＢｅＡｇ，５．Ａｎｔｉ−ＨＢｃ ＩｇＭ）、（３）腎機能検査マーカー（１．ＢＵＮ，２．ＣＲＥ，３．ＵＡ）、（４）自己免疫性肝炎マーカー（１．ＩｇＧ，２．抗核抗体）、及び（５）心疾患マーカー（１．トロポニン，２．ミオグロビン，３．ＣＫ−ＭＢ等の生化学的心筋マーカー，４．心臓型脂肪酸結合蛋白）のそれぞれを測定した際に得られた比色スポットの発色状態を示した。図１２には、（６）敗血症マーカー（１．Ｐｒｏｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ，２．Ｐｒｅｓｅｐｓｉｎ）、（７）アレルギー（アレルゲン）の典型例（１．ハウスダスト，２．ヤケヒョウダニ，３．ネコ皮膚，４．卵白，５．コナヒョウダニ，６．ミルク，７．小麦，８．大豆，９．ヒノキ，１０．スギ）、（８）甲状腺マーカー（１．ＴＳＨ，２．Ｆｒｅｅ Ｔ４， ３．ＴＲＡｂ）、及び（９）血中に含まれる特定の薬物（１．ＶＣＭ，２．ＴＥＩＣ，３．ＡＢＫ）のそれぞれを測定した際に得られた比色スポットの発色状態を示した。
【００４０】
【表１】
2020171158.tif 000003
【００４１】
表１及び図１１並びに図１２に示されるように、（１）手術前感染症検査マーカーにおける２．ＨＩＶ Ａｇ/Ａｂ ｃｏｍｂｏ及び４．ＨＢｓＡｇと、（７）アレルギー（アレルゲン）の典型例における、４．卵白、６．ミルク、７．小麦、８．大豆、及び９．ヒノキ等の一部のものについては疑陽性との結果であったが、今回測定対象としたその他全ての項目については、コントロールと比較して優位な比色シグナルが認められた。これらの結果から、本発明に係る固相反応チップを用いた測定系は、測定対象の適用種目を選ばず、所謂、スクリーニング検査に適した測定系であることが示された。
【００４２】
このような広範囲な適用範囲を備えた本発明に係る固相反応チップによれば、肝機能検査マーカーとして用いられる、ＡＳＴ（ＧＯＴ），ＡＬＴ（ＧＰＴ），γ−ＧＴＰのような上記検査マーカー以外の同一疾患に対する検査マーカーへの適用や、肝臓がん、胃がん、子宮がん、食道がん、腎がん、すい臓がん、前立腺がん、大腸がん、肺がんといった各種癌マーカー、出血熱、重症急性呼吸器症候群、中東呼吸器症候群、鳥インフルエンザ、細菌性赤痢、Ｅ型肝炎、Ａ型肝炎、インフルエンザ、ウィルス性肝炎、急性膜炎等の１種感染症から５種感染症、新型インフルエンザ等感染症、指定感染症、新感染症等の感染症マーカー、又は白血球、Ｃ型反応性蛋白質、血清アミロイドＡ蛋白質といった炎症マーカー等の上記以外の疾患検査マーカーへの応用も期待することができる。
【００４３】
更には、上記疾患関連の検査マーカーのみならず、本発明は、例えば、殺虫剤、殺ダニ剤、殺線虫剤、殺菌剤、除草剤、殺虫殺菌剤、殺そ剤、植物成長調整剤、忌避剤、誘引剤、展着剤といった農薬や、興奮剤、麻薬性鎮痛剤、蛋白質同化剤、利尿剤、ペプチド及び糖蛋白ホルモンとその同族体、血液ドーピング、アルコール、マリファナ、局所麻酔剤、コルチコステロイド（副腎皮質ステロイド）、ベータ遮断剤といったドーピング薬物の検査・測定への展開も考えられる。
【００４４】
これまでの説明においては、本発明に係る固相チップを用いた測定方法の好適な例として、測定対象物質に対して特異的結合能の有し酵素活性を備えた生理活性物質を用いた例について説明した。酵素標識を用いた測定系は、反応特異性及びシグナル増幅といった観点からしても優れた測定系である。しかしながら、酵素は分子量が大きい為、例えば抗原−抗体反応に影響を与えたり、酵素が失活すると測定系として機能しなくなるといった問題があり、これらが要因となってシグナル強度が安定せず、測定の再現性が低下することがあった。本発明に係る固相反応チップは、酵素以外のシグナル生成物質により標識された標識化物質を用いた測定系を構築することも可能であるため、以下に説明する。
【００４５】
酵素以外のシグナル生成物質により標識された標識化物質を用いた測定方法は、固相反応チップに対して、開口部を介して検体液を導入し、測定対象物質と固定化部に固定化された結合物質とを結合させる第１の結合ステップと、測定対象物質に対して特異的結合能を有し、シグナル生成物質により標識された標識化物質を第１の結合ステップにて結合物質に結合した測定対象物質に結合させる第２の結合ステップと、シグナル生成物質により生じたシグナルを測定する測定ステップとを備えることを特徴とするものである。この場合、各ステップ間又は何れかのステップ間に洗浄液を添加し固相反応チップを所定の回転数で回転させることで当該洗浄液を除去する洗浄ステップを設けてもよい。ここで、測定対象物質に対して特異的結合能を有し、シグナル生成物質により標識された標識化物質としては、放射性同位元素、ランタノイド元素、フリーラジカル誘導体、化学発光物質又は蛍光発光物質の何れかで標識された抗体、プロテインＡ／Ｇ、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン等のタンパク質、核酸、又はこれらの断片を用いることができる。シグナル生成物質の標識化物質への結合は、特に限定されず、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着又は化学吸着等を挙げることができる。また、シグナル生成物質と標識化物質との間での非特異的吸着を防ぐために、例えば、ポリエチレングリコール鎖等の有機分子からなるリンカーを設けてもよい。なお、先の説明と同様に、測定対象物質がＩｇＥ抗体である場合、標識化抗体は、放射性同位元素、ランタノイド元素、フリーラジカル誘導体、化学発光物質又は蛍光発光物質の何れかで標識された抗ＩｇＥ抗体を用いることが好ましい。
【００４６】
シグナル生成物質として放射性同位元素を用いる場合、例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３Ｈ等を挙げることでき、感度、半減期の観点から１２５Ｉを用いることが好ましい。ヨウ素は酸化すると新電子試薬として抗体（タンパク質）中のチロシン残基、ヒスチジン残基等と容易に結合するため、標識化には好適である。
【００４７】
シグナル生成物質としてランタノイド元素を用いる場合、原子番号５７〜７１までの元素（Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、Ｌｕ）を挙げることができる。この中でも、原子番号６３番のＥｕ（ユーロピウム）のキレートは、励起光（３４０ｎｍ）と放射光（６１５ｎｍ）との波長差が大きく、また放射光（蛍光）寿命が長いため時間分解蛍光測定を行うことができる。
【００４８】
シグナル生成物質としてフリーラジカル誘導体を用いる場合、例えば、ピペリジン−Ｎ−オキシド誘導体、ピロリヂン−Ｎ−オキシド誘導体、オキサゾリジン−Ｎ−オキシド誘導体等を挙げることができ、これらのフリーラジカル誘導体で標識した標識化抗体のＥＳＲスペクトル変化を指標として測定する。
【００４９】
シグナル生成物質として化学発光物質を用いる場合、例えば、ルミノール誘導体、アクリジニウム塩類、ジオキセタン類、ルシフェリン、ルシゲニン、塩化オキザリル、インドキシル誘導体等を挙げることができ、これらの化学発光物質で標識した標識化抗体を、例えば、マイクロペルオキシダーゼ、ペルオキシターゼといった酵素、Ｈ２Ｏ２共存下又はアルカリ条件、Ｈ２Ｏ２共存下で化学発光反応させ、これを測定する。
【００５０】
シグナル生成物質として蛍光発光物質を用いる場合、蛍光色素、量子ドット、又は蛍光色素若しくは量子ドットと粒子とからなる蛍光性粒子（ビーズ）の何れかを挙げることができる。なお、ここでいう蛍光発光物質は、２００ｎｍ〜７００ｎｍの範囲内の波長の紫外光〜近赤外光により励起されたときに、４００ｎｍ〜１１００ｎｍの範囲内の波長の可視光〜近赤外光の放射光（発光）を示すものである。
【００５１】
蛍光色素の例としては、フルオレセイン系色素分子、ローダミン系色素分子、ＡＬｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（インビトロジェン社製）系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ（インビトロジェン社製）系色素分子、カスケード系色素分子、クマリン系色素分子、エオジン系色素分子、ＮＢＤ系色素分子、ピレン系色素分子、シアニン系色素分子、芳香族炭化水素系分子等を挙げることができる。
【００５２】
具体的には、５−カルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−フルオレセイン、５，６−ジカルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、ナフトフルオレセイン、５−カルボキシ−ローダミン、６−カルボキシ−ローダミン、５，６−ジカルボキシ−ローダミン、ローダミン  ６Ｇ，テトラメチルローダミン、Ｘ−ローダミン、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、及びＡＬｅｘ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、ＡＬｅｘ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５、ＡＬｅｘ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０、ＡＬｅｘ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、ＡＬｅｘ  Ｆｌｕｏｒ  ５００、ＡＬｅｘ  Ｆｌｕｏｒ  ５１４、ＡＬｅｘ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、ＡＬｅｘ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、ＡＬｅｘ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、ＡＬｅｘ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、ＡＬｅｘ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、ＡＬｅｘ  Ｆｌｕｏｒ  ６１０、ＡＬｅｘ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、ＡＬｅｘ  Ｆｌｕｏｒ  ６３５、ＡＬｅｘ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、ＡＬｅｘ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、ＡＬｅｘ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、ＡＬｅｘ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、ＡＬｅｘ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ  ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ  ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ  ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５（以上、インビトロジェン社製）、メトキシクマリン、エオジン、ＮＢＤ、ピレン、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標、アナスペック社製）、Ｄｙｌｉｇｈｔ  ５９４（登録商標、サーモサイエンティフィック社製）系色素分子、ＡＴＴＯ  ５９４（登録商標、ＡＴＴＯ−ＴＥＣ社製）、ＭＦＰ  ５９４（登録商標、Ｍｏｂｉｔｅｃ社製）、５，１０，１５，２０−テトラフェニルポルフィンテトラスルホン酸、亜鉛５，１０，１５，２０−テトラフェニルポルフィンテトラスルホン酸、フタロシアニンテトラスルホン酸、亜鉛フタロシアニンテトラスルホン酸、Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（２，６−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｅｎｙｌ）−１，６，７，１２−（４−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ−ｐｈｅｎｏｘｙ）−ｐｅｒｙｌｅｎ−３，４，９，１０−ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｎａｃｉｄ  ｄｉｉｍｉｄｅ、Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（２，６−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｅｎｙｌ）−１，６，７，１２−（４−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ−ｐｈｅｎｏｘｙ）−ｐｅｒｙｌｅｎ−３，４，９，１０−ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｄｉｉｍｉｄｅ、Ｂｅｎｚｅｎｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ、４，４‘，４’‘，４’‘’−［（１，３，８，１０−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−１，３，８，１０−ｔｅｔｒａｏｘｏｐｅｒｙｌｏ［３，４−ｃｄ：９，１０−ｃ‘ｄ’］ｄｉｐｙｒａｎ−５，６，１２，１３−ｔｅｔｒａｙｌ）ｔｅｔｒａｌｉｓ（ｏｘｙ）］ｔｅｔｒａｋｉｓ等に加え、メロシアニン、有機窒素化合物であるアクリジン、ピラニン、ピロメテン、ルシフェリン、ＤＣＭ（４−（ジシアノメチレン）−２−メチ���−６−（４−ジメチルアミノスチリル）−４Ｈ−ピラン）、スチルベンといったものも挙げることができる。なお、これらの蛍光色素は単独で使用してもよいし、複数種を組み合わせてもよい。
【００５３】
量子ドットの例としては、ＩＩ−ＶＩ族化合物、ＩＩＩ−Ｖ族化合物、ＩＶ族元素等を含有する量子ドットを用いることができ、これらの化合物は単独で使用してもよいし、複数種を組み合わせてもよい。
【００５４】
具体的には、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳｅ、ＺｎＳ、ＺｎＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＩｎＡｓ、ＩｎＧａＰ、ＧａＡｓ、Ｓｉ、Ｇｅ等を挙げることができる。なお、これらの量子ドットをコアとし、他のナノ材料でシェル化したコア／シェル型量子ドットを調整し、さらにその表面をポリエチレングリコールや両親媒性のポリマー等の生体親和性の高い有機物質で被覆したものも本発明では用いることが可能である。
【００５５】
蛍光色素若しくは量子ドットと粒子とからなる蛍光性粒子の例としては、シリカ、アルミナといった無機粒子又はポリスチレン、ポリ（メタ）アクリル酸エステルといった有機ポリマーからなる樹脂粒子（樹脂重合体）に上記例示した蛍光色素、量子ドットの何れかが結合、一部結合、又は粒子内部に封入されたものを挙げることができる。樹脂粒子に対する蛍光色素等の導入方法については、特に限定はなく、樹脂の原料であるモノマーに蛍光色素を結合させた後にモノマーを重合させる方法、重合体を形成した後に該重合体に蛍光色素を結合させる方法、モノマーと蛍光色素とを混合して重合と蛍光色素の結合を同時に行う方法、蛍光色素自体に樹脂重合性を持たせる方法等を採用することができる。蛍光性粒子の平均粒子径は、免疫反応時に影響を与えることなく、又十分な輝度が得られるサイズであれば、特に限定はないが、１ｎｍ〜１００μｍの範囲とすることが好ましい。なお、蛍光性粒子の例としては、紫外光〜近赤外光により励起されたときに、可視光〜近赤外光の放射光（発光）を放射する性質の蛍光物質と粒子との組合せであれば、特に制限されることはなく、例えば、上記のランタノイド元素と樹脂粒子との組み合わせであっても構わない。
【００５６】
本発明で用いることができる蛍光性粒子は、公知の方法により作成することが可能であるし、市販されている蛍光性粒子を用いてもよい。例えば、特許文献３には、樹脂からなる樹脂粒子に蛍光色素が共有結合以外で結合された蛍光色素標識用樹脂粒子の合成方法について記載がなされており、所望の蛍光色素を用いることで種々の蛍光性粒子を作成することができる。
【００５７】
また、近年、樹脂粒子に封入された蛍光色素の自己消光（濃度消光）に対する解決策として凝集誘発発光活性を有する物質に注目が集まっている。特許文献４には、１，１−ジメチル−２，３，４，５−テトラフェニルシロール内包ポリスチレン微粒子、１，１，２，３，４，５−ヘキサフェニルシロール内包ポリスチレン微粒子、１，１−ジメチル−２，５−ジアニシル−３，４−ジフェニルシロール内包ポリスチレン微粒子、１，１，２，３，４，５−ヘキサフェニルシロール内包ポリスチレン微粒子といった網状ポリマーからなる粒子であって、凝集誘発発光活性化合物（シロール）を包含する蛍光樹脂微粒子について記載がなされている。凝集誘発発光活性化合物としては、シロール以外にも、例えば、テトラフェニルエチレン誘導体等も知られており、これらの化合物が網状ポリマーに内包されて構成された蛍光樹脂微粒子を本発明に係る蛍光性粒子として用いることで、従来のπ共役系蛍光物質を用いた場合よりも高効率に測定が可能となることが期待される。
【００５８】
このように、放射性同位元素、ランタノイド元素、フリーラジカル誘導体、化学発光物質又は蛍光発光物質の何れかのシグナル生成物質により標識された標識化物質を用いることにより、酵素活性を測定する系と同程度又はそれ以上の高効率な測定系を構築することができる。また、シグナル生成物質として放射性同位元素、ランタノイド元素、フリーラジカル誘導体、又は蛍光発光物質を用いた場合、酵素活性を測定する系とは異なり、測定ステップにて基質（溶液）を添加する手間を省くことが可能であるため、より迅速で再現性の高い測定を行うことができる。
【００５９】
［変形例］
上記実施形態の説明においては、固定化部２３が備える４つの固定化領域２５の外縁部２８において、内角度が９０°である１つの頂点を有し、固定化部２３全体の平面視形状が四角形状の例について説明した。しかしながら、本発明は当該形状に限定されるものではなく、例えば、固定化部全体の平面視形状として三角形状のもの、八角形状のものといった他の多角形状等の変形例が可能である。図８（ａ）は、開口部１４１及び固定化部対峙面１３１が形成された上蓋部材１０１の例であり、図８（ｂ）は上蓋部材１０１と嵌合可能であり、３つの固定化領域２５１のそれぞれの外縁部に内角度が６０°である１つの頂点２３２が設けられ、全体の平面視形状として三角形状を有する固定化部２３１を備えた下蓋部材３０１の構成例である。また、図９（ａ）は、開口部１４２及び固定化部対峙面１３２が形成された上蓋部材１０２の例であり、図９（ｂ）は上蓋部材１０２と嵌合可能であり、４つの固定化領域２５２のそれぞれの外縁部に内角度が１３５°である２つの頂点２３４が設けられ、全体の平面視形状として八角形状を有する固定化部２３３を備えた下蓋部材３０２の構成例である。なお、図４、図８、及び図９で示した例は一例に過ぎず、本発明では、頂点内角度、頂点数、当該頂点を構成する辺数、辺長さの比、直線又曲線といった辺の線種等は適宜選択可能であり、これらの選択に基づき固定化部表面に形成される固定化領域の個数にも制限はない。
【００６０】
さらに、本発明では、上蓋部材及び下蓋部材が嵌合一体化した形状も適宜変更可能である。例えば、図１０（ａ）に示すように、平面視形状が四角形状の上蓋部材１０３及び下蓋部材３０３が嵌合一体化した固相反応チップ５０や、図１０（ｂ）で示すように、平面視形状が六角形の上蓋部材１０４及び下蓋部材３０４が嵌合一体化した固相反応チップ６０といった組み合わせも可能である。これらの固定化部並びに蓋部材の組合せについては、測定精度の高さ、再現性、製造の容易さ、製造コスト等の諸条件を鑑み適宜選択することが可能である。
【００６１】
以上のように、本発明によれば、従来必要であったカバー部材を廃し、結合物質を固定化する固定化領域の外縁部において少なくとも１つの頂点を有するように構成することで、内部に吸液部材を備えた固相反応チップの欠点を克服し、迅速に且つ簡便な操作で検体液中に含まれる測定対象物質を精度よく検出することが可能な固相反応チップ及びこれを用いた測定方法を提供することができる。
【符号の説明】
【００６２】
１０、１０１、１０２、１０３、１０４  上蓋部材，１１、２１  内側底面，１２  上蓋嵌合壁，１３、１３１、１３２  固定化部対峙面，１４、１４１，１４２  開口部，２０、３０１、３０２，３０３、３０４  下蓋部材，２２  下蓋嵌合壁，２３、２３１、２３３  固定化部，２４  固定化部表面，２５、２５１、２５２  固定化領域，２６  隆起部，２７  外周，２８  外縁部，３０  内部空間，４０  吸液部材，５０、６０、１００  固相反応チップ，２００  自動測定装置，２０１  分注ユニット，２０２  遠心分離部，２０３  撮像部，２０４  操作部，２０５  画像解析部，２０６  測定結果生成部，２０７  制御部，２３０、２３２、２３４  頂点，２５０  スポット
【図１】
2020171158.tif 000004
【図２】
2020171158.tif 000005
【図３】
2020171158.tif 000006
【図４】
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【図５】
2020171158.tif 000008
【図６】
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【図７】
2020171158.tif 000010
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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