(57)【要約】  ３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬中のフェニルヒドラジン含有量を分析する方法は、フェニルヒドラジンまたはその塩、第１酸性水および第１水溶性有機溶媒を含み、０．０１μｇ／ｍＬから１０μｇ／ｍＬのフェニルヒドラジン濃度を示す標準溶液のフェニルヒドラジン含有量を測定して第１測定値を得ること、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬、第２酸性水および第２水溶性有機溶媒とを含む試料溶液のフェニルヒドラジン含有量を測定して第２測定値を得ること、前記第１測定値および前記第２測定値から前記３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬中のフェニルヒドラジン含有量を検出することを含み、前記第１酸性水は塩酸、酢酸水溶液等から選択される少なくとも一種であり、前記第１水溶性有機溶媒はアセトニトリルおよびメタノールから選択される少なくとも一種であり、前記第２酸性水は塩酸、酢酸水溶液等から選択される少なくとも一種であり、前記第２水溶性有機溶媒はアセトニトリルおよびメタノールから選択される少なくとも一種である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬中のフェニルヒドラジン含有量を分析する方法において、以下を含む方法：
フェニルヒドラジンまたはその塩、第１酸性水および第１水溶性有機溶媒を含み、０．０１μｇ／ｍＬから１０μｇ／ｍＬのフェニルヒドラジン濃度を示すフェニルヒドラジン標準溶液のフェニルヒドラジン含有量を測定して第１測定値を得ること、
３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬、第２酸性水および第２水溶性有機溶媒を含む３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン試料溶液のフェニルヒドラジン含有量を測定して第２測定値を得ること、ならびに
前記第１測定値および前記第２測定値から前記３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬中のフェニルヒドラジン含有量を検出すること、
ここに、前記第１酸性水は、塩酸、酢酸水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、ギ酸水溶液、リン酸水溶液および過塩素酸水溶液からなる群より選択される少なくとも一種の酸性水であり、前記第１水溶性有機溶媒は、アセトニトリルおよびメタノールからなる群より選択される少なくとも一種の水溶性有機溶媒であり、前記第１水溶性有機溶媒がメタノールの場合、前記第１酸性水は、塩酸、酢酸水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、ギ酸水溶液および過塩素酸水溶液からなる群より選択される少なくとも一種の酸性水であり、ならびに、
前記第２酸性水は、塩酸、酢酸水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、ギ酸水溶液、リン酸水溶液および過塩素酸水溶液からなる群より選択される少なくとも一種の酸性水であり、前記第２水溶性有機溶媒は、アセトニトリルおよびメタノールからなる群より選択される少なくとも一種の水溶性有機溶媒であり、前記第２水溶性有機溶媒がメタノールの場合、前記第２酸性水は、塩酸、酢酸水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、ギ酸水溶液および過塩素酸水溶液からなる群より選択される少なくとも一種の酸性水である。
【請求項２】
更に以下を含む請求項１記載の方法：
前記フェニルヒドラジンまたはその塩、前記第１酸性水および前記第１水溶性有機溶媒を含む前記フェニルヒドラジン標準溶液を調製すること、ならびに
前記３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬、前記第２酸性水および前記第２水溶性有機溶媒を含む前記３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン試料溶液を調製すること。
【請求項３】
前記第１測定値が、高速液体クロマトグラフィーを用いて前記フェニルヒドラジン標準溶液の前記フェニルヒドラジン含有量を測定した値であり、前記第２測定値が、高速液体クロマトグラフィーを用いて前記３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン試料溶液の前記フェニルヒドラジン含有量を測定した値である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記第１酸性水が、０．０１ｍｏｌ／Ｌから５ｍｏｌ／Ｌの塩酸を含み、前記第２酸性水が、０．０１ｍｏｌ／Ｌから５ｍｏｌ／Ｌの塩酸を含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記フェニルヒドラジン標準溶液の前記第１酸性水と前記第１水溶性有機溶媒の体積比が３：１から４：５の範囲であり、前記３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン試料溶液の前記第２酸性水と前記第２水溶性有機溶媒の体積比が３：１から４：５の範囲である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
筋萎縮性側索硬化症を治療する方法において、以下を含む方法：
フェニルヒドラジンまたはその塩、第１酸性水および第１水溶性有機溶媒を含み、０．０１μｇ／ｍＬから１０μｇ／ｍＬのフェニルヒドラジン濃度を示すフェニルヒドラジン標準溶液のフェニルヒドラジン含有量を測定して第１測定値を得ること、
３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬、第２酸性水および第２水溶性有機溶媒を含む３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン試料溶液のフェニルヒドラジン含有量を測定して第２測定値を得ること、
前記第１測定値および前記第２測定値から前記３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬中のフェニルヒドラジン含有量を検出してフェニルヒドラジン量が２０ｐｐｍ以下であることを決定すること、ならびに
前記３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬を含む薬剤を必要とする患者に投与すること、
ここに、前記第１酸性水は、塩酸、酢酸水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、ギ酸水溶液、リン酸水溶液および過塩素酸水溶液からなる群より選択される少なくとも一種の酸性水であり、前記第１水溶性有機溶媒は、アセトニトリルおよびメタノールからなる群より選択される少なくとも一種の水溶性有機溶媒であり、前記第１水溶性有機溶媒がメタノールの場合、前記第１酸性水は、塩酸、酢酸水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、ギ酸水溶液および過塩素酸水溶液からなる群より選択される少なくとも一種の酸性水であり、ならびに、
前記第２酸性水は、塩酸、酢酸水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、ギ酸水溶液、リン酸水溶液および過塩素酸水溶液からなる群より選択される少なくとも一種の酸性水であり、前記第２水溶性有機溶媒は、アセトニトリルおよびメタノールからなる群より選択される少なくとも一種の水溶性有機溶媒であり、前記第２水溶性有機溶媒がメタノールの場合、前記第２酸性水は、塩酸、酢酸水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、ギ酸水溶液および過塩素酸水溶液からなる群より選択される少なくとも一種の酸性水である。
【請求項７】
更に以下を含む請求項６記載の方法：
前記フェニルヒドラジンまたはその塩、前記第１酸性水および前記第１水溶性有機溶媒を含む前記フェニルヒドラジン標準溶液を調製すること、ならびに
前記３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬、前記第２酸性水および前記第２水溶性有機溶媒を含む前記３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン試料溶液を調製すること。
【請求項８】
前記第１測定値が、高速液体クロマトグラフィーを用いて前記フェニルヒドラジン標準溶液の前記フェニルヒドラジン含有量を測定した値であり、前記第２測定値が、高速液体クロマトグラフィーを用いて前記３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン試料溶液の前記フェニルヒドラジン含有量を測定した値である、請求項６記載の方法。
【請求項９】
前記第１酸性水が、０．０１ｍｏｌ／Ｌから５ｍｏｌ／Ｌの塩酸を含み、前記第２酸性水が、０．０１ｍｏｌ／Ｌから５ｍｏｌ／Ｌの塩酸を含む、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
前記フェニルヒドラジン標準溶液の前記第１酸性水と前記第１水溶性有機溶媒の体積比が３：１から4：５の範囲であり、前記３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン試料溶液の前記第２酸性水と前記第２水溶性有機溶媒の体積比が３：１から４：５の範囲である、請求項６記載の方法。
【請求項１１】
筋萎縮性側索硬化症の進行を抑制する方法において、以下を含む方法：
フェニルヒドラジンまたはその塩、第１酸性水および第１水溶性有機溶媒を含み、０．０１μｇ／ｍＬから１０μｇ／ｍＬのフェニルヒドラジン濃度を示すフェニルヒドラジン標準溶液のフェニルヒドラジン含有量を測定して第１測定値を得ること、
３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬、第２酸性水および第２水溶性有機溶媒を含む３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン試料溶液のフェニルヒドラジン含有量を測定して第２測定値を得ること、
前記第１測定値および前記第２測定値から前記３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬中のフェニルヒドラジン含有量を検出してフェニルヒドラジン量が２０ｐｐｍ以下であることを決定すること、ならびに
前記３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬を含む薬剤を必要とする患者に投与すること、
ここに、前記第１酸性水は、塩酸、酢酸水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、ギ酸水溶液、リン酸水溶液および過塩素酸水溶液からなる群より選択される少なくとも一種の酸性水であり、前記第１水溶性有機溶媒は、アセトニトリルおよびメタノールからなる群より選択される少なくとも一種の水溶性有機溶媒であり、前記第１水溶性有機溶媒がメタノールの場合、前記第１酸性水は、塩酸、酢酸水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、ギ酸水溶液および過塩素酸水溶液からなる群より選択される少なくとも一種の酸性水であり、ならびに、
前記第２酸性水は、塩酸、酢酸水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、ギ酸水溶液、リン酸水溶液および過塩素酸水溶液からなる群より選択される少なくとも一種の酸性水であり、前記第２水溶性有機溶媒は、アセトニトリルおよびメタノールからなる群より選択される少なくとも一種の水溶性有機溶媒であり、前記第２水溶性有機溶媒がメタノールの場合、前記第２酸性水は、塩酸、酢酸水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、ギ酸水溶液および過塩素酸水溶液からなる群より選択される少なくとも一種の酸性水である。
【請求項１２】
更に以下を含む請求項１１記載の方法：
前記フェニルヒドラジンまたはその塩、前記第１酸性水、前記第１水溶性有機溶媒を含む前記フェニルヒドラジン標準溶液を調製すること、および
前記３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬、前記第２酸性水、前記第２水溶性有機溶媒を含む前記３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン試料溶液を調製すること。
【請求項１３】
前記第１測定値が、高速液体クロマトグラフィーを用いて前記フェニルヒドラジン標準溶液の前記フェニルヒドラジン含有量を測定した値であり、前記第２測定値が、高速液体クロマトグラフィーを用いて前記３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン試料溶液の前記フェニルヒドラジン含有量を測定した値である、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
前記第１酸性水は、０．０１ｍｏｌ／Ｌから５ｍｏｌ／Ｌの塩酸を含み、前記第２酸性水は、０．０１ｍｏｌ／Ｌから５ｍｏｌ／Ｌの塩酸を含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
前記フェニルヒドラジン標準溶液の前記第１酸性水と前記第１水溶性有機溶媒の体積比が３：１から４：５の範囲であり、前記３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン試料溶液の前記第２酸性水と前記第２水溶性有機溶媒の体積比が３：１から４：５の範囲である、請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
フェニルヒドラジンの含有量が２０ｐｐｍ以下である３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬の製造方法において、以下を含む製造方法：
フェニルヒドラジンまたはその塩、第１酸性水および第１水溶性有機溶媒を含み、０．０１μｇ／ｍＬから１０μｇ／ｍＬのフェニルヒドラジン濃度を示すフェニルヒドラジン標準溶液のフェニルヒドラジン含有量を測定して第１測定値を得ること、
３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬、第２酸性水および第２水溶性有機溶媒を含む３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン試料溶液のフェニルヒドラジン含有量を測定して第２測定値を得ること、および
前記第１測定値および前記第２測定値から前記３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬中のフェニルヒドラジン含有量を検出してフェニルヒドラジン量が２０ｐｐｍ以下であることを決定すること、
ここに、前記第１酸性水は、塩酸、酢酸水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、ギ酸水溶液、リン酸水溶液および過塩素酸水溶液からなる群より選択される少なくとも一種の酸性水であり、前記第１水溶性有機溶媒は、アセトニトリルおよびメタノールからなる群より選択される少なくとも一種の水溶性有機溶媒であり、前記第１水溶性有機溶媒がメタノールの場合、前記第１酸性水は、塩酸、酢酸水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、ギ酸水溶液および過塩素酸水溶液からなる群より選択される少なくとも一種の酸性水であり、ならびに、
前記第２酸性水は、塩酸、酢酸水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、ギ酸水溶液、リン酸水溶液および過塩素酸水溶液からなる群より選択される少なくとも一種の酸性水であり、前記第２水溶性有機溶媒は、アセトニトリルおよびメタノールからなる群より選択される少なくとも一種の水溶性有機溶媒であり、前記第２水溶性有機溶媒がメタノールの場合、前記第２酸性水は、塩酸、酢酸水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、ギ酸水溶液および過塩素酸水溶液からなる群より選択される少なくとも一種の酸性水である。
【請求項１７】
フェニルヒドラジンの含有量が２０ｐｐｍ以下である３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬を含む薬剤を生産する製造方法において、以下を含む製造方法：
フェニルヒドラジンまたはその塩、第１酸性水および第１水溶性有機溶媒を含み、０．０１μｇ／ｍＬから１０μｇ／ｍＬのフェニルヒドラジン濃度を示すフェニルヒドラジン標準溶液のフェニルヒドラジン含有量を測定して第１測定値を得ること、
３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬、第２酸性水および第２水溶性有機溶媒を含む３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン試料溶液のフェニルヒドラジン含有量を測定して第２測定値を得ること、
前記第１測定値および前記第２測定値から前記３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬中のフェニルヒドラジン含有量を検出してフェニルヒドラジン量が２０ｐｐｍ以下であることを決定すること、および
前記３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬と少なくとも１つの薬理学的および製剤学的に許容される添加物を混合すること、
ここに、前記第１酸性水は、塩酸、酢酸水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、ギ酸水溶液、リン酸水溶液および過塩素酸水溶液からなる群より選択される少なくとも一種の酸性水であり、前記第１水溶性有機溶媒は、アセトニトリルおよびメタノールからなる群より選択される少なくとも一種の水溶性有機溶媒であり、前記第１水溶性有機溶媒がメタノールの場合、前記第１酸性水は、塩酸、酢酸水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、ギ酸水溶液および過塩素酸水溶液からなる群より選択される少なくとも一種の酸性水であり、ならびに、
前記第２酸性水は、塩酸、酢酸水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、ギ酸水溶液、リン酸水溶液および過塩素酸水溶液からなる群より選択される少なくとも一種の酸性水であり、前記第２水溶性有機溶媒は、アセトニトリルおよびメタノールからなる群より選択される少なくとも一種の水溶性有機溶媒であり、前記第２水溶性有機溶媒がメタノールの場合、前記第２酸性水は、塩酸、酢酸水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、ギ酸水溶液および過塩素酸水溶液からなる群より選択される少なくとも一種の酸性水である。
【請求項１８】
請求項１７の製造方法によって生産された、筋萎縮性側索硬化症を治療または進行抑制するための薬剤。
【請求項１９】
請求項１６の製造方法によって得られた、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬の分析方法、筋萎縮性側索硬化症（以下、ＡＬＳと記すこともある）の治療および進行抑制、ならびに、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬を含む薬剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
運動ニューロン疾患の一つであるＡＬＳは、手の脱力、手指の運動障害および上肢の線維束攣縮などの初期症状から、筋萎縮・筋力低下、球麻痺や筋肉の線維束攣縮を経由し、呼吸不全に至る難病である。ＡＬＳは、発症部位により上肢型、球型、下肢型および混合型に分けられ、いずれの型でも症状の進行とともに全身の筋群が侵される。ＡＬＳの治療および病勢進行の抑制に効果がある医薬品としては、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬を含む薬剤が日本や米国などで承認され、臨床において使用されている（一般名「エダラボン」、商品名「ラジカット（登録商標）」、「Ｒａｄｉｃａｖａ（登録商標）」：田辺三菱製薬株式会社製造・販売など）。【０００３】
薬剤に含まれる可能性のある不純物の１つとしてフェニルヒドラジンが挙げられる。３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン中のフェニルヒドラジンを分析する方法としては、リン酸でｐＨを２．０に調整したリン酸二水素アンモニウム溶液−メタノールを溶解液として調製し、この溶解液を、リン酸でｐＨ３．５に調整したリン酸二水素アンモニウム溶液−メタノールを移動相としてＨＰＬＣを用いて分析する方法が報告されている（非特許文献１）。この開示内容は、ここに参照することにより本明細書に組み込まれるものとする。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｓｏｕｔｈ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  Ａｕｇｕｓｔ  ２０１４，Ｖｏｌ．１２  Ｎｏ．８，  ８１４−８１６．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬中に含まれるフェニルヒドラジンを、正確かつ簡便に測定する分析方法を提供することを課題とする。
また、本発明は、フェニルヒドラジンの含有量が厳密にコントロールされた３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬を含む薬剤を用いて、筋萎縮性側索硬化症の治療および筋萎縮性側索硬化症の進行抑制を行う方法を提供することを課題とする。
さらに、本発明は、フェニルヒドラジンの含有量が厳密にコントロールされた３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬を含む薬剤の製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一態様に係る３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬中のフェニルヒドラジン含有量を分析する方法は、フェニルヒドラジンまたはその塩、第１酸性水および第１水溶性有機溶媒を含み、０．０１μｇ／ｍＬから１０μｇ／ｍＬのフェニルヒドラジン濃度を示すフェニルヒドラジン標準溶液のフェニルヒドラジン含有量を測定して第１測定値を得ること、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬、第２酸性水および第２水溶性有機溶媒を含む３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン試料溶液のフェニルヒドラジン含有量を測定して第２測定値を得ること、前記第１測定値および前記第２測定値から前記３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬中のフェニルヒドラジン含有量を検出することを含み、ここに、前記第１酸性水は、塩酸、酢酸水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、ギ酸水溶液、リン酸水溶液および過塩素酸水溶液からなる群より選択される少なくとも一種の酸性水であり、前記第１水溶性有機溶媒は、アセトニトリルおよびメタノールからなる群より選択される少なくとも一種の水溶性有機溶媒であり、前記第１水溶性有機溶媒がメタノールの場合、前記第１酸性水は、塩酸、酢酸水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、ギ酸水溶液および過塩素酸水溶液からなる群より選択される少なくとも一種の酸性水であり、ならびに、前記第２酸性水は、塩酸、酢酸水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、ギ酸水溶液、リン酸水溶液および過塩素酸水溶液からなる群より選択される少なくとも一種の酸性水であり、前記第２水溶性有機溶媒は、アセトニトリルおよびメタノールからなる群より選択される少なくとも一種の水溶性有機溶媒であり、前記第２水溶性有機溶媒がメタノールの場合、前記第２酸性水は、塩酸、酢酸水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、ギ酸水溶液および過塩素酸水溶液からなる群より選択される少なくとも一種の酸性水である。【０００７】
本発明の他の一態様に係る筋萎縮性側索硬化症を治療する方法は、フェニルヒドラジンまたはその塩、第１酸性水および第１水溶性有機溶媒を含み、０．０１μｇ／ｍＬから１０μｇ／ｍＬのフェニルヒドラジン濃度を示すフェニルヒドラジン標準溶液のフェニルヒドラジン含有量を測定して第１測定値を得ること、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬、第２酸性水および第２水溶性有機溶媒を含む３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン試料溶液のフェニルヒドラジン含有量を測定して第２測定値を得ること、前記第１測定値および前記第２測定値から前記３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬中のフェニルヒドラジン含有量を検出してフェニルヒドラジン量が２０ｐｐｍ以下であることを決定すること、前記３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬を含む薬剤を必要とする患者に投与することを含み、ここに、前記第１酸性水は、塩酸、酢酸水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、ギ酸水溶液、リン酸水溶液および過塩素酸水溶液からなる群より選択される少なくとも一種の酸性水であり、前記第１水溶性有機溶媒は、アセトニトリルおよびメタノールからなる群より選択される少なくとも一種の水溶性有機溶媒であり、前記第１水溶性有機溶媒がメタノールの場合、前記第１酸性水は、塩酸、酢酸水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、ギ酸水溶液および過塩素酸水溶液からなる群より選択される少なくとも一種の酸性水であり、ならびに、前記第２酸性水は、塩酸、酢酸水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、ギ酸水溶液、リン酸水溶液および過塩素酸水溶液からなる群より選択される少なくとも一種の酸性水であり、前記第２水溶性有機溶媒は、アセトニトリルおよびメタノールからなる群より選択される少なくとも一種の水溶性有機溶媒であり、前記第２水溶性有機溶媒がメタノールの場合、前記第２酸性水は、塩酸、酢酸水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、ギ酸水溶液および過塩素酸水溶液からなる群より選択される少なくとも一種の酸性水である。【０００８】
本発明のさらに他の一態様に係る筋萎縮性側索硬化症の進行を抑制する方法は、フェニルヒドラジンまたはその塩、第１酸性水および第１水溶性有機溶媒を含み、０．０１μｇ／ｍＬから１０  μｇ／ｍＬのフェニルヒドラジン濃度を示すフェニルヒドラジン標準溶液のフェニルヒドラジン含有量を測定して第１測定値を得ること、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬、第２酸性水および第２水溶性有機溶媒を含む３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン試料溶液のフェニルヒドラジン含有量を測定して第２測定値を得ること、前記第１測定値および前記第２測定値から前記３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬中のフェニルヒドラジン含有量を検出してフェニルヒドラジン量が２０ｐｐｍ以下であることを決定すること、前記３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬を含む薬剤を必要とする患者に投与することを含み、ここに、前記第１酸性水は、塩酸、酢酸水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、ギ酸水溶液、リン酸水溶液および過塩素酸水溶液からなる群より選択される少なくとも一種の酸性水であり、前記第１水溶性有機溶媒は、アセトニトリルおよびメタノールからなる群より選択される少なくとも一種の水溶性有機溶媒であり、前記第１水溶性有機溶媒がメタノールの場合、前記第１酸性水は、塩酸、酢酸水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、ギ酸水溶液および過塩素酸水溶液からなる群より選択される少なくとも一種の酸性水であり、ならびに、前記第２酸性水は、塩酸、酢酸水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、ギ酸水溶液、リン酸水溶液および過塩素酸水溶液からなる群より選択される少なくとも一種の酸性水であり、前記第２水溶性有機溶媒は、アセトニトリルおよびメタノールからなる群より選択される少なくとも一種の水溶性有機溶媒であり、前記第２水溶性有機溶媒がメタノールの場合、前記第２酸性水は、塩酸、酢酸水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、ギ酸水溶液および過塩素酸水溶液からなる群より選択される少なくとも一種の酸性水である。【０００９】
本発明のさらに他の一態様におけるフェニルヒドラジンの含有量が２０ｐｐｍ以下である３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬を含む薬剤の製造方法は、フェニルヒドラジンまたはその塩、第１酸性水および第１水溶性有機溶媒を含み、０．０１μｇ／ｍＬから１０μｇ／ｍＬのフェニルヒドラジン濃度を示すフェニルヒドラジン標準溶液のフェニルヒドラジン含有量を測定して第１測定値を得ること、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬、第２酸性水および第２水溶性有機溶媒を含む３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン試料溶液のフェニルヒドラジン含有量を測定して第２測定値を得ること、前記第１測定値および前記第２測定値から前記３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬中のフェニルヒドラジン含有量を検出してフェニルヒドラジン量が２０ｐｐｍ以下であることを決定すること、前記３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬と少なくとも１つの薬理学的および製剤学的に許容される添加物を混合することを含み、ここに、前記第１酸性水は、塩酸、酢酸水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、ギ酸水溶液、リン酸水溶液および過塩素酸水溶液からなる群より選択される少なくとも一種の酸性水であり、前記第１水溶性有機溶媒は、アセトニトリルおよびメタノールからなる群より選択される少なくとも一種の水溶性有機溶媒であり、前記第１水溶性有機溶媒がメタノールの場合、前記第１酸性水は、塩酸、酢酸水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、ギ酸水溶液および過塩素酸水溶液からなる群より選択される少なくとも一種の酸性水であり、ならびに、前記第２酸性水は、塩酸、酢酸水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、ギ酸水溶液、リン酸水溶液および過塩素酸水溶液からなる群より選択される少なくとも一種の酸性水であり、前記第２水溶性有機溶媒は、アセトニトリルおよびメタノールからなる群より選択される少なくとも一種の水溶性有機溶媒であり、前記第２水溶性有機溶媒がメタノールの場合、前記第２酸性水は、塩酸、酢酸水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、ギ酸水溶液および過塩素酸水溶液からなる群より選択される少なくとも一種の酸性水である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬中に含まれるフェニルヒドラジンを、正確かつ簡便に測定する分析方法を提供することができる。
また、本発明によれば、フェニルヒドラジンの含有量が厳密にコントロールされた３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬を含む薬剤を用いて、筋萎縮性側索硬化症の治療および筋萎縮性側索硬化症の進行抑制を行う方法を提供することができる。
さらに、本発明によれば、フェニルヒドラジンの含有量が厳密にコントロールされた３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬を含む薬剤の製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸／アセトニトリル混液（６：４）にて調製したフェニルヒドラジン溶液をＨＰＬＣで測定したクロマトグラムである。
【図２】図２は、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸／アセトニトリル混液（４：６）にて調製したフェニルヒドラジン溶液をＨＰＬＣで測定したクロマトグラムである。
【図３】図３は、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸／アセトニトリル混液（２：８）にて調製したフェニルヒドラジン溶液をＨＰＬＣで測定したクロマトグラムである。
【図４】図４は、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸／アセトニトリル混液（６：４）にて調製したフェニルヒドラジン溶液をＨＰＬＣで測定したクロマトグラムである。
【図５】図５は、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸／アセトニトリル混液（７：３）にて調製したフェニルヒドラジン溶液をＨＰＬＣで測定したクロマトグラムである。
【図６】図６は、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸／アセトニトリル混液（７：３）にて調製した添加試料溶液中に含まれるフェニルヒドラジンの初期値に対するピーク面積の割合（％）の経時変化を示すグラフである。
【図７】図７は、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸／メタノール混液（５：５）にて調製した添加試料溶液中に含まれるフェニルヒドラジンの初期値に対するピーク面積の割合（％）の経時変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、添付図面を参照して３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬の分析方法、筋萎縮性側索硬化症（以下、ＡＬＳと記すこともある）を治療する方法、筋萎縮性側索硬化症の進行を抑制する方法、および３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬を含む薬剤の製造方法の実施形態を詳細に説明する。
【００１３】
本発明の３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬中のフェニルヒドラジン含有量を分析する方法は、フェニルヒドラジンまたはその塩、第１酸性水および第１水溶性有機溶媒を含み、０．０１μｇ／ｍＬから１０μｇ／ｍＬのフェニルヒドラジン濃度を示すフェニルヒドラジン標準溶液のフェニルヒドラジン含有量を測定して第１測定値を得ること、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬、第２酸性水および第２水溶性有機溶媒を含む３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン試料溶液のフェニルヒドラジン含有量を測定して第２測定値を得ること、前記第１測定値および前記第２測定値から前記３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬中のフェニルヒドラジン含有量を検出することを含む。
本発明の３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬中のフェニルヒドラジン含有量を分析する方法は、必要に応じてさらに他の工程を含んでいてもよい。
【００１４】
３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンは下記構造式で表すことができる。３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンは、下記構造式で示す互変異性体が存在する。
【００１５】
【化１】
2019167974.tif 000002
【００１６】
３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬中のフェニルヒドラジン含有量は、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬の試料溶液を１種類またはそれ以上の定量性のある分析技術により分析し、得られた試験結果を、実質的に純粋なフェニルヒドラジン標準溶液の試験結果と比較することで決定することができる。
【００１７】
３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬の試料溶液およびフェニルヒドラジン標準溶液は、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬およびフェニルヒドラジンまたはその塩が、それぞれ用いる溶媒に完全に溶解することが好ましい。このような溶解液を用いることによって、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬中に含まれるフェニルヒドラジンを、正確に測定することが可能になる。
３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬およびフェニルヒドラジンまたはその塩が、完全に溶解しているか否かは、目視によって確認することができる。また、微量な溶解残渣を評価する場合は、フィルターろ過後、ＨＰＬＣで測定することによって確認することができる。
【００１８】
３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬の試料溶液およびフェニルヒドラジン標準溶液は、それぞれの溶液を調製して一定時間経過した後に分析するまでに、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンまたはその生理学的に許容される塩、および／または、フェニルヒドラジンが実質的に分解しないことが望ましい。なお、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンまたはその生理学的に許容される塩の分解物の１つとしてフェニルヒドラジンが挙げられ、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンまたはその生理学的に許容される塩の分解の程度は、溶液中のフェニルヒドラジン量の変化を測定することによって確認し得る。３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬の試料溶液、および／または、フェニルヒドラジン標準溶液中のフェニルヒドラジン含有量は、後述するＨＰＬＣを用いた分析方法により測定できる。
【００１９】
フェニルヒドラジンが実質的に分解しないこととしては、具体的には、フェニルヒドラジン標準溶液を調製して３０分以内に測定したフェニルヒドラジンの測定値と、一定時間経過した後に測定した測定値が２０％またはそれ以上変化しないことが好ましく、より好ましくは１０％またはそれ以上変化しないことであり、さらに好ましくは５％またはそれ以上変化しないことである。
また、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンまたはその生理学的に許容される塩が実質的に分解しないこととしては、具体的には、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬の試料溶液を調製して３０分以内に測定したフェニルヒドラジンの測定値と、一定時間経過した後に測定したフェニルヒドラジンの測定値が３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンの量に対して４ｐｐｍまたはそれ以上変化しないことが好ましい。より好ましくは２ｐｐｍまたはそれ以上変化しないことであり、さらに好ましくは１ｐｐｍまたはそれ以上変化しないことである。
一定時間としては、特に制限されるものではない。好ましくは、２時間、３時間、４時間、５時間、９時間、１０時間、１２時間または２４時間であり、より好ましくは、２時間、３時間、４時間、５時間、９時間、１０時間または１２時間であり、とりわけ好ましくは、２時間、３時間、４時間または５時間である。
【００２０】
３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬の試料溶液は、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬、酸性水、および水溶性有機溶媒を含む。
【００２１】
酸性水は、塩酸、酢酸水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、ギ酸水溶液、リン酸水溶液および過塩素酸水溶液からなる群より選択される少なくとも一種の酸性水である。これらの酸性水は、単独で用いてもよく、または二種以上の酸性水を適当な比率で混合して用いてもよい。好ましくは、塩酸、酢酸水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液およびギ酸水溶液からなる群より選択される少なくとも一種の酸性水であり、より好ましくは塩酸である。
【００２２】
酸性水の酸の濃度は、０．０１ｍｏｌ／Ｌから５ｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、より好ましくは０．０２ｍｏｌ／Ｌから１ｍｏｌ／Ｌであり、さらに好ましくは０．０５ｍｏｌ／Ｌから０．２ｍｏｌ／Ｌであり、とりわけ好ましくは０．１ｍｏｌ／Ｌである。
【００２３】
水溶性有機溶媒は、アセトニトリルおよびメタノールからなる群より選択される少なくとも一種である。これらの水溶性有機溶媒は、単独で用いてもよく、または適当な比率で混合して用いてもよい。好ましくは、アセトニトリルである。
【００２４】
水溶性有機溶媒がメタノールの場合、酸性水は、塩酸、酢酸水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、ギ酸水溶液および過塩素酸水溶液からなる群より選択される少なくとも一種の酸性水である。
【００２５】
酸性水と水溶性有機溶媒の比率は適宜変更することができる。体積比で、酸性水：水溶性有機溶媒を３：１から４：５とすることができ、好ましくは３：１から５：５とすることができ、より好ましくは３：１から６：４とすることができる。例えば、体積比で、酸性水：水溶性有機溶媒を、７：３、６：４、５：５とすることができる。酸性水と水溶性有機溶媒が、塩酸とアセトニトリルの場合、とりわけ好ましい体積比は７：３である。酸性水と水溶性有機溶媒が、塩酸とメタノールの場合、とりわけ好ましい体積比は５：５である。
【００２６】
試料溶液は、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬、酸性水および水溶性有機溶媒を含むものであれば、試料溶液の調製方法は特に制限されるものではない。調製した酸性水を、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬および水溶性有機溶媒と混合して試料溶液を調製してもよく、水を３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬および／または水溶性有機溶媒と混合した後に、対応する酸を添加して試料溶液を調製してもよい。
【００２７】
フェニルヒドラジン標準溶液は、フェニルヒドラジンまたはその塩、酸性水、および水溶性有機溶媒を含む。
フェニルヒドラジン標準溶液は、さらに３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬を含んでいてもよい。
【００２８】
フェニルヒドラジンの塩としては、例えば、塩酸、硫酸、臭化水素酸、リン酸等の鉱酸との塩が挙げられる。フェニルヒドラジンまたはその塩としては、フェニルヒドラジンの塩が好ましい。フェニルヒドラジンの塩としては、フェニルヒドラジン塩酸塩が好ましい。
本発明における分析方法において、フェニルヒドラジン塩酸塩は、フェニルヒドラジンに比べ、保存中に分解し難いため、本発明の標準溶液に用いるフェニルヒドラジンまたはその塩としては、最も好ましい。
【００２９】
フェニルヒドラジンまたはその塩は、実質的に純粋であることが望ましい。具体的には、少なくとも９０％以上の純度が好ましく、より好ましくは、少なくとも９５％以上、少なくとも９８％以上であり、さらに好ましくは、少なくとも９９％以上の純度である。なお、純度９８％以上や純度９９％以上のフェニルヒドラジン塩酸塩が市販されているので（例えば、フェニルヒドラジン塩酸塩、  ９９％；  Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ；コード：Ａ１４６４５）、市販品を用いてもよい。
【００３０】
酸性水は、塩酸、酢酸水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、ギ酸水溶液、リン酸水溶液および過塩素酸水溶液からなる群より選択される少なくとも一種の酸性水である。これらの酸性水は、単独で用いてもよく、または二種以上の酸性水を適当な比率で混合して用いてもよい。好ましくは、塩酸、酢酸水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液およびギ酸水溶液からなる群より選択される少なくとも一種の酸性水であり、より好ましくは塩酸である。
【００３１】
酸性水の酸の濃度は、０．０１ｍｏｌ／Ｌから５ｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、より好ましくは０．０２ｍｏｌ／Ｌから１ｍｏｌ／Ｌであり、さらに好ましくは０．０５ｍｏｌ／Ｌから０．２ｍｏｌ／Ｌであり、とりわけ好ましくは０．１ｍｏｌ／Ｌである。
【００３２】
水溶性有機溶媒は、アセトニトリルおよびメタノールからなる群より選択される少なくとも一種である。これらの水溶性有機溶媒は、単独で用いてもよく、または適当な比率で混合して用いてもよい。好ましくは、アセトニトリルである。
【００３３】
水溶性有機溶媒がメタノールの場合、酸性水は、塩酸、酢酸水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、ギ酸水溶液および過塩素酸水溶液からなる群より選択される少なくとも一種の酸性水である。フェニルヒドラジン標準溶液中のフェニルヒドラジン濃度は、分析する３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬中のフェニルヒドラジン濃度に応じて適宜調整することができる。
例えば、フェニルヒドラジン標準溶液中のフェニルヒドラジンの濃度（フェニルヒドラジン遊離体の場合にはフェニルヒドラジンの濃度、フェニルヒドラジンの塩の場合にはフェニルヒドラジン相当の濃度）を０．０１μｇ／ｍＬから１０μｇ／ｍＬとすることができ、好ましくは０．０５μｇ／ｍＬから２μｇ／ｍＬであり、とりわけ好ましくは０．１μｇ／ｍＬから１μｇ／ｍＬである。
または、フェニルヒドラジン標準溶液のフェニルヒドラジンの濃度は、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬の試料溶液の希釈率で１ｐｐｍ相当から２００ｐｐｍ相当の濃度とすることができる。ｐｐｍ相当の濃度とは、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬の試料溶液の希釈率に対応する濃度である。例えば、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン０．１０ｇを酸性水および水溶性有機溶媒と混合して１０ｍＬとすると、１ｐｐｍ相当の濃度は、０．０１μｇ／ｍＬである。好ましくは５ｐｐｍ相当から１００ｐｐｍ相当の濃度であり、より好ましくは１０ｐｐｍ相当から５０ｐｐｍ相当の濃度である。
【００３４】
本発明の一実施態様では、０．０１μｇ／ｍＬから１０μｇ／ｍＬのフェニルヒドラジン濃度を示すフェニルヒドラジン標準溶液のフェニルヒドラジン含有量を測定して第１測定値を得る。この第１測定値の数は、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン試料溶液のフェニルヒドラジン含有量を測定して得られる第２測定値との対比ができれば特に限定されるものではなく、１つまたは複数とすることができる。
【００３５】
酸性水と水溶性有機溶媒の比率は適宜変更することができる。体積比で、酸性水：水溶性有機溶媒を３：１から４：５とすることができ、好ましくは３：１から５：５とすることができ、より好ましくは３：１から６：４とすることができる。例えば、体積比で、酸性水：水溶性有機溶媒を、７：３、６：４、５：５とすることができる。とりわけ好ましくは７：３である。酸性水と水溶性有機溶媒が、塩酸とアセトニトリルの場合、とりわけ好ましい体積比は７：３である。酸性水と水溶性有機溶媒が、塩酸とメタノールの場合、とりわけ好ましい体積比は５：５である。
【００３６】
フェニルヒドラジン標準溶液は、フェニルヒドラジンまたはその塩、酸性水、および水溶性有機溶媒を含むものであれば、フェニルヒドラジン標準溶液の調製方法は特に制限されるものではない。調製した酸性水を、フェニルヒドラジンまたはその塩、および水溶性有機溶媒と混合してフェニルヒドラジン標準溶液を調製してもよく、水をフェニルヒドラジンもしくはその塩、および／または水溶性有機溶媒と混合した後に、対応する酸を添加してフェニルヒドラジン標準溶液を調製してもよい。
【００３７】
３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬の試料溶液における酸性水は、フェニルヒドラジン標準溶液における酸性水と同じであることが好ましい。３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬の試料溶液における水溶性有機溶媒は、フェニルヒドラジン標準溶液における水溶性有機溶媒と同じであることが好ましい。３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬の試料溶液における酸性水と水溶性有機溶媒の体積比と、フェニルヒドラジン標準溶液における酸性水と水溶性有機溶媒の体積比とは、同じ比率であることが好ましい。
より好ましくは、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬の試料溶液における酸性水、水溶性有機溶媒、および酸性水と水溶性有機溶媒の体積比は、それぞれフェニルヒドラジン標準溶液における酸性水、水溶性有機溶媒、および酸性水と水溶性有機溶媒の体積比と同じである。
【００３８】
定量性のある分析技術には、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ，Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）が含まれる。高速液体クロマトグラフィーには、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ，Ｕｌｔｒａ−Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）が含まれる。高速液体クロマトグラフィーを用いる場合、フェニルヒドラジンピークの理論段数は大きいほど好ましく、例えば、半値幅法により求める理論段数Ｎが１０００段以上、より好ましくは３０００段以上とすることができる。
【００３９】
式１
理論段数：  Ｎ  ＝  ５．５４×（ｔｒ／Ｗ０．５）２
ｔｒ：  保持時間
Ｗ０．５：  ピーク半分高さの幅
【００４０】
シンメトリー係数Ｓは、クロマトグラム上のピークの対称性の度合いを表す指標であり、シンメトリー係数Ｓが１に近いほど、ピークが左右対称（正規分布）であることを示す。シンメトリー係数Ｓは１に近いほど真度・精度・定量限界等の分析法としての性能が高くなるため好ましく、例えば２．０以下、より好ましくは１．５以下とすることができる。
【００４１】
式２
シンメトリー係数：  Ｓ  ＝  Ｗ０．０５ｈ／２ｆ
Ｗ０．０５ｈ：  ピークのベースラインからピークの高さの１／２０の高さにおけるピーク幅
２ｆ：  Ｗ０．０５ｈのピーク幅をピーク頂点から横軸へおろした垂線で２分したピーク立ち上がり側の距離
【００４２】
３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンまたはその生理学的に許容される塩における生理学的に許容される塩の例としては、塩酸、硫酸、臭化水素酸、リン酸等の鉱酸との塩；メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酢酸、シュウ酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸等の有機酸との塩；ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩；マグネシウム等のアルカリ土類金属との塩；アンモニア、エタノールアミン、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール等のアミンとの塩が挙げられる。また、生理学的に許容される塩には、水和物および溶媒和物が含まれる。
【００４３】
３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬は、有効成分である３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンまたはその生理学的に許容される塩を意味する。３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬に含まれ得る不純物の１つとしてフェニルヒドラジンが挙げられる。欧州特許公開公報第２０８８７４号公報（または特公平５−３１５２３号公報）に記載されている製造方法では、フェニルヒドラジンは３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンを合成するための前駆体として用いられている。
【００４４】
３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬を含む溶液製剤の保存期間中にフェニルヒドラジンが増加し得る。フェニルヒドラジンは変異原性を有する化合物であり、各国において産業衛生上の暴露許容量が設定されている。米国がフェニルヒドラジンの暴露許容濃度を最も厳しく設定しており、その値は２，８６０μｇ／ｋｇ／年である。フェニルヒドラジンは、光や酸素によって分解しやすい。
【００４５】
３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬中に含まれる不純物のフェニルヒドラジンの量は少ないほど好ましい。例えば、２０ｐｐｍ以下であることが好ましく、１０ｐｐｍ以下であることがより好ましい。
ＡＬＳの治療または進行抑制の目的で、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンを使用するときには、本薬剤の投与開始後、生涯、本薬剤による薬物治療を継続することが好ましい。そのため、フェニルヒドラジンの量は厳密に管理されることが好ましい。
【００４６】
本発明の一実施形態は、フェニルヒドラジンの含有量が２０ｐｐｍ以下である３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬の製造方法において、以下を含む製造方法である：
フェニルヒドラジンまたはその塩、第１酸性水および第１水溶性有機溶媒を含み、０．０１μｇ／ｍＬから１０μｇ／ｍＬのフェニルヒドラジン濃度を示すフェニルヒドラジン標準溶液のフェニルヒドラジン含有量を測定して第１測定値を得ること、
３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬、第２酸性水および第２水溶性有機溶媒を含む３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン試料溶液のフェニルヒドラジン含有量を測定して第２測定値を得ること、および
前記第１測定値および前記第２測定値から前記３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬中のフェニルヒドラジン含有量を検出してフェニルヒドラジン量が２０ｐｐｍ以下であることを決定すること、
ここに、前記第１酸性水は、塩酸、酢酸水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、ギ酸水溶液、リン酸水溶液および過塩素酸水溶液からなる群より選択される少なくとも一種の酸性水であり、前記第１水溶性有機溶媒は、アセトニトリルおよびメタノールからなる群より選択される少なくとも一種の水溶性有機溶媒であり、前記第１水溶性有機溶媒がメタノールの場合、前記第１酸性水は、塩酸、酢酸水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、ギ酸水溶液および過塩素酸水溶液からなる群より選択される少なくとも一種の酸性水であり、ならびに、
前記第２酸性水は、塩酸、酢酸水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、ギ酸水溶液、リン酸水溶液および過塩素酸水溶液からなる群より選択される少なくとも一種の酸性水であり、前記第２水溶性有機溶媒は、アセトニトリルおよびメタノールからなる群より選択される少なくとも一種の水溶性有機溶媒であり、前記第２水溶性有機溶媒がメタノールの場合、前記第２酸性水は、塩酸、酢酸水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、ギ酸水溶液および過塩素酸水溶液からなる群より選択される少なくとも一種の酸性水である。
【００４７】
本発明の一実施形態の薬剤は、本発明の製造方法によって製造された、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬中のフェニルヒドラジン含有量が２０ｐｐｍ以下である前記原薬を含有する、筋萎縮性側索硬化症を治療または進行抑制するための薬剤である。
【００４８】
本発明のさらなる一実施形態の薬剤は、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬中のフェニルヒドラジン量を分析して、フェニルヒドラジン量が２０ｐｐｍ以下であることを決定した筋萎縮性側索硬化症の治療または病勢進行抑制の３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬を含む薬剤である。
さらに、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬と薬理学的および製剤学的に許容される添加物を含むことができ、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬以外の原薬を１またはそれ以上含んでもよい。
本発明の一実施形態に係る薬理学的および製剤学的に許容される添加物を含む薬剤は、フェニルヒドラジンの含有量が２０ｐｐｍ以下である３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬と薬理学的および製剤学的に許容される添加物を混合することを含む製造方法により生産してもよい。
【００４９】
本発明の一実施形態に係る有効成分である３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンまたはその生理学的に許容される塩をそのまま患者に投与してもよいが、有効成分と薬理学的および製剤学的に許容される添加物を加え、上記薬剤として投与することが好ましい。
【００５０】
薬理学的および製剤学的に許容される添加物としては、例えば、賦形剤、崩壊剤ないし崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤ないし溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、噴射剤、および粘着剤等を用いてもよい。経口投与に適する薬剤の例としては、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤、またはシロップ剤等を挙げることができ、非経口投与に適する薬剤としては、例えば、注射剤、点滴剤、貼付剤または坐剤などを挙げることができる。
【００５１】
経口投与に適する薬剤には、添加物として、例えば、ブドウ糖、乳糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、または結晶セルロース等の賦形剤；カルボキシメチルセルロース、デンプン、またはカルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤または崩壊補助剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、またはゼラチン等の結合剤；ステアリン酸マグネシウムまたはタルク等の滑沢剤；ヒドロキシプロピルメチルセルロース、白糖、ポリエチレングリコールまたは酸化チタン等のコーティング剤；ワセリン、流動パラフィン、ポリエチレングリコール、ゼラチン、カオリン、グリセリン、精製水、またはハードファット等の基剤を用いてもよい。
【００５２】
注射あるいは点滴用に適する薬剤には、注射用蒸留水、生理食塩水、プロピレングリコール等の水性あるいは用時溶解型注射剤を構成し得る溶解剤または溶解補助剤；ブドウ糖、塩化ナトリウム、Ｄ−マンニトール、グリセリン等の等張化剤；無機酸、有機酸、無機塩基または有機塩基等のｐＨ調節剤等の製剤用添加物を用いてもよい。
【００５３】
３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンを有効成分とする脳保護剤およびＡＬＳの治療、病勢進行の抑制剤としてすでに臨床において使用されている一般名「エダラボン」、商品名「ラジカット（登録商標）」、「Ｒａｄｉｃａｖａ（登録商標）」：田辺三菱製薬株式会社製造・販売などは、本発明の薬剤および方法に使用する３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンまたはその生理学的に許容される塩として用いてもよい。
【００５４】
本発明の一実施形態に係る筋萎縮性側索硬化症を治療または病勢進行抑制する方法は、治療または病勢進行抑制を必要とする患者に対して有効量の３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬を含む薬剤を必要とする患者に投与することを含み、その薬剤中の３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬は、フェニルヒドラジン量を分析して、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬中のフェニルヒドラジン量が２０ｐｐｍ以下である。
【００５５】
この実施形態において、フェニルヒドラジンまたはその塩、第１酸性水および第１水溶性有機溶媒を含み、０．０１μｇ／ｍＬから１０μｇ／ｍＬのフェニルヒドラジン濃度を示すフェニルヒドラジン標準溶液中のフェニルヒドラジン含有量を測定することで第１測定値を得ること、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬、第２酸性水および第２水溶性有機溶媒を含む３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン試料溶液中のフェニルヒドラジン含有量を測定することで、第２測定値を得ることと、および第１測定値および第２測定値から、前記３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬中のフェニルヒドラジン含有量を検出して、フェニルヒドラジン量が２０ｐｐｍ以下であることを決定すること、をさらに含んでもよい。
【００５６】
本発明の一実施形態の筋萎縮性側索硬化症を治療または病勢進行抑制する方法は、薬物治療期間中に休薬期間を設けて、投薬期間および休薬期間を１単位としてこれを繰り返してもよい。例えば、薬物治療期間中に１４日間の休薬期間を２回以上設け、投薬期間および休薬期間を１単位としてこれを２回以上繰り返す。例えば、投薬期間および休薬期間を２回繰り返す場合、「投薬期間、休薬期間、投薬期間、休薬期間」となるが、最後の休薬期間を設けない、「投薬期間、休薬期間、投薬期間」も包含される。
【００５７】
休薬期間は、例えば７日間以上連続して薬物投与を行わない期間のことである。
投薬期間は、例えば１４日間、または１４日間中の１０日としてもよい。１４日間中の１０日とは、連続する１４日間のうちの任意の１０日という意味であり、この投薬される１０日は、連続する１０日間でもよいし、１日〜４日間の投薬しない期間で分断されている連続ではない１０日間でもよい。投薬期間は、患者の状態を観察しながら好ましい期間を選択してもよい。本発明の一実施形態における休薬期間は、好ましくは１４日間である。
【００５８】
１４日間の投薬期間および１４日間の休薬期間を繰り返す場合における繰り返しの回数は２回以上であれば特に限定されない。
１４日間の初回投薬期間後に１４日間の初回休薬期間を設けた後に１４日間中１０日間の投薬期間および１４日間の休薬期間を繰り返す場合における、１４日間中１０日間の投薬期間および１４日間の休薬期間を繰り返す回数は１回以上であれば特に限定されない。他の実施の形態では、休薬期間を設けずに毎日またはほぼ毎日の投薬を繰り返してもよい。
【００５９】
有効成分の１日あたりの投与量は患者の年齢や状態などの条件に応じて適宜選択可能である。一般的には成人に対して、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンの量（有効成分が３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンの場合には３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンの量、有効成分が３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンの生理的に許容される塩の場合には３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン相当の量、以下、同様）として約１５ｍｇ〜約２４０ｍｇであることが好ましく、約３０ｍｇ〜約１８０ｍｇであることがより好ましく、約６０ｍｇ〜約１２０ｍｇであることがさらにより好ましく、約６０ｍｇであることがとりわけ好ましい。
【００６０】
休薬期間を設けずに毎日またはほぼ毎日の投与を繰り返す場合において、一般的には成人に対して、１日当たりの３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンの量として約６０ｍｇ、約１２０ｍｇ、または約１８０ｍｇであることが好ましく、約６０ｍｇ、または約１２０ｍｇであることが特に好ましい。
【００６１】
投薬期間中の１日あたりの投与回数に制限はなく、患者の状態を観察しながら好ましい回数を選択してもよい。しかし、患者の負担等を考え３回、２回および１回が好ましく、１回がより好ましい。
【００６２】
有効成分を投与するにあたっては、その投与経路は特に限定されず、経口的または非経口的に投与してもよい。さらに、ボーラス（ｂｏｌｕｓ）投与および持続的投与が可能であるが、持続的投与が好ましい。持続的投与とする場合、点滴による静脈内投与、経皮投与、舌下錠を用いた経口投与並びに徐放化製剤を用いた経口および直腸内投与等が挙げられるが、点滴による静脈内投与が好ましい。注射によるボーラス（ｂｏｌｕｓ）投与や点滴による静脈内投与を行う場合には、例えば、特開昭６３−１３２８３３号公報および特開２０１１−６２５２９号公報に記載された注射剤などを用いてもよい。これらの開示内容は、ここに参照することにより本明細書に組み込まれるものとする。
【００６３】
点滴による静脈内投与とする場合、その投与速度は３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンの量で約０．５ｍｇ／分〜約１ｍｇ／分とすることが望ましく、時間に換算すると約１５分〜約４８０分、好ましくは約３０分〜約１２０分、より好ましくは約３０分〜約６０分、さらにより好ましくは約６０分である。
【００６４】
他の投与形態としては、１分あたりの３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンの投与量を約０．５ｍｇ〜約１ｍｇとする点滴による静脈内投与と実質的に同等である投与形態が挙げられる。１分あたりの３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンの投与量を約０．５ｍｇ〜約１ｍｇとする点滴による静脈内投与と実質的に同等である投与形態とは、薬物動態学的に実質的に同等であれば良い。具体例を挙げると、投与された３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンまたはその生理学的に許容される塩の血漿中の３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン未変化体濃度の経時変化が実質的に同等であると認められる投与形態である。この様な投与形態としては、例えば、経皮投与、舌下錠を用いた経口投与並びに徐放化製剤を用いた経口および直腸内投与等が挙げられる。
【００６５】
本発明の一実施形態に係る３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬中のフェニルヒドラジン含有量を分析する方法は、フェニルヒドラジンもしくはその塩、第１酸性水および第１水溶性有機溶媒を含むフェニルヒドラジン標準溶液を調製し；および／または３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬、第２酸性水および第２水溶性有機溶媒を含む３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン試料溶液を調製することを含んでもよい。
【００６６】
本発明の他の一実施形態に係る３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬中のフェニルヒドラジン含有量を分析する方法は、フェニルヒドラジンの第１測定値が高速液体クロマトグラフィーを用いてフェニルヒドラジン標準溶液を測定した値であり、および／または、フェニルヒドラジンの第２測定値が高速液体クロマトグラフィーを用いて３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン試料溶液を測定した値である。
【００６７】
本発明の他の一実施形態の筋萎縮性側索硬化症を治療または病勢進行抑制する方法は、有効量の３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬を含む薬剤を必要とする患者に投与することを含む。ここで、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬は、フェニルヒドラジン量が２０ｐｐｍ以下であることを分析、決定した３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬である。フェニルヒドラジン量の分析は、フェニルヒドラジンまたはその塩、第１酸性水および第１水溶性有機溶媒を含み、０．０１μｇ／ｍＬから１０μｇ／ｍＬのフェニルヒドラジン濃度を示すフェニルヒドラジン標準溶液中のフェニルヒドラジン含有量を測定することで第１測定値を得ること、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬、第２酸性水および第２水溶性有機溶媒を含む３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン試料溶液中のフェニルヒドラジン含有量を測定することで第２測定値を得ること、ならびに第１測定値および第２測定値から、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬中のフェニルヒドラジン含有量を検出してフェニルヒドラジン量が２０ｐｐｍ以下であること、を決定することを含む。
【００６８】
本発明の一実施形態の筋萎縮性側索硬化症を治療または病勢進行抑制するための薬剤の製造方法は、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬中のフェニルヒドラジン量を分析して、フェニルヒドラジン量が２０ｐｐｍ以下である３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬と少なくとも１つの薬理学的および製剤学的に許容される添加物を混合することを含む。ここに、フェニルヒドラジン量の分析においては、フェニルヒドラジンまたはその塩、第１酸性水および第１水溶性有機溶媒を含み、０．０１μｇ／ｍＬから１０μｇ／ｍＬのフェニルヒドラジン濃度を示すフェニルヒドラジン標準溶液中のフェニルヒドラジン含有量を測定することで第１測定値を得ること、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬、第２酸性水および第２水溶性有機溶媒を含む３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン試料溶液中のフェニルヒドラジン含有量を測定することで第２測定値を得ること、ならびに第１測定値および第２測定値から、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬中のフェニルヒドラジン含有量を検出してフェニルヒドラジン量が２０ｐｐｍ以下であること、を決定することを含む。
【００６９】
本発明の更に他の一実施形態の薬剤は、フェニルヒドラジンの含有量が２０ｐｐｍ以下である３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン原薬を含む薬剤が静脈内投与するためのものである薬剤である。
本発明の一実施形態の筋萎縮性側索硬化症を治療または病勢進行抑制するための薬剤の製造方法は、少なくとも１つの薬理学的および製剤学的に許容される添加物が注射用蒸留水または生理食塩水を含む。
【実施例】
【００７０】
以下、本発明の実施形態を、実施例を用いて説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。本実施例において、原薬である３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンをエダラボン原薬（ＥＤＶＰと記すこともある。）と記す。【００７１】
［試験例１］溶解液の検討
酸性水の濃度、酸性水と水溶性有機溶媒との比率等を変更して、エダラボン原薬およびフェニルヒドラジンまたはその塩が溶解しうる条件を検討する。また、ＨＰＬＣでの測定を行ってフェニルヒドラジンのピーク形状を確認し、最適な、酸性水の濃度、酸性水と水溶性有機溶媒との比率を検討する。【００７２】
以下の溶解液（ａ）〜（ｆ）を用いて試料溶液を調製し、エダラボン原薬の溶解の状態を検討した。次いで、エダラボン原薬が可溶な溶解液について、その溶解液にて調製したフェニルヒドラジン溶液をＨＰＬＣを用いて測定し、フェニルヒドラジンのピーク形状を検討した。【００７３】
溶解液
（ａ）  ０．１  ｍｏｌ／Ｌ塩酸試液
（ｂ）  ０．１  ｍｏｌ／Ｌ塩酸／アセトニトリル混液（８：２）
（ｃ）  ０．１  ｍｏｌ／Ｌ塩酸／アセトニトリル混液（６：４）
（ｄ）  ０．１  ｍｏｌ／Ｌ塩酸／アセトニトリル混液（４：６）
（ｅ）  ０．１  ｍｏｌ／Ｌ塩酸／アセトニトリル混液（２：８）
（ｆ）  １  ｍｏｌ／Ｌ塩酸／アセトニトリル混液（６：４）【００７４】
試料溶液の調製
エダラボン原薬約０．１０ｇを量り、溶解液（ａ）〜（ｆ）に溶かし、正確に１０ｍＬとし、試料溶液とした。【００７５】
フェニルヒドラジン溶液の調製
フェニルヒドラジン５μＬを採取し、０．１ｍｏｌ／Ｌの塩酸試液を加えて正確に１００  ｍＬとした。この液０．ｌｍＬを正確に量り、溶解液（ａ）〜（ｆ）を加えて正確に１０ｍＬとしフェニルヒドラジン溶液（０．５μｇ／ｍＬ）とした。【００７６】
試験条件
ＨＰＬＣによる測定を以下の移動相の送液条件で実施した。
移動相Ａ：  ｐＨ２．５の０．０５ｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム水溶液／アセトニトリル混液（９０：１０）
移動相Ｂ：  ｐＨ２．５の  ０．０５ｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム水溶液／アセトニトリル混液（１０：９０）
移動相の送液：移動相Ａおよび移動相Ｂの混合比を次のように変えて濃度勾配制御する。【００７７】
【表１】
2019167974.tif 000003
【００７８】
各溶解液の結果を表２、フェニルヒドラジン溶液のクロマトグラムを図１から図４に示す。  ＥＤＶＰの溶解性と、フェニルヒドラジンのピーク形状から判断し、（ｃ）０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸／アセトニトリル混液（６：４）が最も適切であり、（ｆ）１ｍｏｌ／Ｌ塩酸／アセトニトリル混液（６：４）も使用し得ることがわかる。【００７９】
【表２】
2019167974.tif 000004
【００８０】
＊５）ｐＨ試験紙で測定【００８１】
なお、本試験例において、フェニルヒドラジンに比べ、フェニルヒドラジンの塩酸塩は、保存中に分解し難く取扱いが容易であり標準物質としてより適切であることが明らかになった。
そのため、本試験例において、フェニルヒドラジン塩酸塩を用いて調製した標準溶液を測定した。フェニルヒドラジンのピークから理論段数およびシンメトリー係数を確認し得る。
また、本試験例により、ＥＤＶＰの溶解性およびフェニルヒドラジンのピーク形状という観点から、ｐＨを２に調整するだけでは、エダラボン原薬の分析に使用するための最適な溶解液を調製することができないことが明らかになった。【００８２】
［試験例２］溶解液の更なる検討
試験例１の結果より、溶解液（ｃ）０．１ｍｏｌ／Ｌの塩酸／アセトニトリル混液（６：４））が最も適した溶解液であることが明らかになったが、フェニルヒドラジン溶液のピーク形状をより好ましい形状にさせるため、０．１ｍｏｌ／Ｌの塩酸／アセトニトリル混液（７：３）の溶解液（ｇ）を用いた標準溶液を調製し、比較を行った。【００８３】
以下の溶解液（ｃ）と溶解液（ｇ）を用いて標準溶液を調製し、フェニルヒドラジンのピーク形状を更に検討した。【００８４】
溶解液
（ｃ）  ０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸／アセトニトリル混液（６：４）
（ｇ）  ０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸／アセトニトリル混液（７：３）【００８５】
標準溶液の調製
フェニルヒドラジン塩酸塩約１３．４ｍｇ（フリー体として約１０ｍｇ）を精密に量り、溶解液（ｃ）と溶解液（ｇ）にそれぞれ溶かして正確に１００ｍＬとした。この液２ｍＬを正確に量り溶解液（ｃ）と溶解液（ｇ）をそれぞれ加えて正確に２０ｍＬとした。この液２ｍＬを正確に量り、溶解液を加えて正確に２０ｍＬとし、標準溶液とした（フェニルヒドラジン：１μｇ／ｍＬ）。【００８６】
試験条件
以下の移動相の送液条件で実施した。
移動相Ａ：  ｐＨ２．５の０．０５ｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム溶液／アセトニトリル混液（９０：１０）
移動相Ｂ：  ｐＨ２．５の０．０５ｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム溶液／アセトニトリル混液（４０：６０）
移動相の送液：移動相Ａおよび移動相Ｂの混合比を次のように変えて濃度勾配制御する。【００８７】
【表３】
2019167974.tif 000005
【００８８】
溶解液（ｇ）の０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸／アセトニトリル混液（７：３）にて試料溶液を調製したところ、エダラボン原薬は可溶であった。
上記溶解液（ｃ）と溶解液（ｇ）で調製した標準溶液の測定結果を表４および図１と図５に示す。
本試験により、溶解液（ｇ）を用いることで、フェニルヒドラジン溶液のピーク形状をより良好な形状にできることが明らかになった。【００８９】
【表４】
2019167974.tif 000006
【００９０】
［実施例１］
０．１０２０ｇのエダラボン原薬を、０．１ｍｏｌ／Ｌの塩酸／アセトニトリル混液（体積比７：３；以下、溶解液と記す）に溶かして正確に１０ｍＬとした第１試料溶液を準備した。
別に、１３．６９３ｍｇのフェニルヒドラジン塩酸塩（フェニルヒドラジンとして約１０ｍｇ）を、溶解液に溶かして正確に１００ｍＬとした。得られた溶液２ｍＬを正確に量り、溶解液を加えて正確に２０ｍＬとした。得られた溶液２ｍＬを正確に量り、溶解液を加えて正確に２０ｍＬとした第１標準溶液を準備した（フェニルヒドラジン：１μｇ／ｍＬ）。
別に、５μＬのフェニルヒドラジンを、溶解液に溶かして正確に１００ｍＬとした。得られた溶液１ｍＬを精密に量り、溶解液を加えて正確に１０ｍＬとした。得られた溶液１ｍＬを精密に量り、０．１０１０ｇのエダラボン原薬と混合し、溶解液を加えて正確に１０ｍＬとした第１添加試料溶液を準備した。
一定時間経過後の第１標準溶液、第１試料溶液および第１添加試料溶液をそれぞれ正確に１０μＬずつとり、次の条件で高速液体クロマトグラフィーにより試験を行い、それぞれの溶液中のフェニルヒドラジンピークのピーク面積（フェニルヒドラジンの測定値）を自動積分法により測定した。
エダラボン原薬中のフェニルヒドラジンの量は、以下の式３により求めることができる。【００９１】
試験条件
・溶解液の脱気／窒素バブリング：なし
・調製後の第１試料溶液、第１標準溶液および第１添加試料溶液の保管温度：５℃
・容器（第１試料溶液、第１標準溶液および第１添加試料溶液の調製および保管）：褐色ガラス瓶
・検出器：紫外吸光光度計（測定波長：２２５ｎｍ）
・カラム：  オクタデシルシリル化シリカゲル充填カラム  （ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８）
・カラム温度：４０℃付近の一定温度
・移動相：移動相Ａ１００％で開始し、移動相Ｂ１００％まで濃度勾配制御
移動相Ａ：ｐＨ  ２．５の０．０５ｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム水溶液／アセトニトリル混液（体積比９：１）
移動相Ｂ：ｐＨ  ２．５の０．０５ｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム水溶液／アセトニトリル混液（体積比２：３）
＊ｐＨ２．５の０．０５  ｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム水溶液：過塩素酸ナトリウム７．０ｇを水１０００ｍＬに溶かし、過塩素酸を加えてｐＨを２．５に調整した。【００９２】
第１標準溶液、第１試料溶液および第１添加試料溶液におけるフェニルヒドラジンおよび／または３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンの安定性調査の結果を表５および図６に示す。【００９３】
【表５】
2019167974.tif 000007
【００９４】
経過時間（ｈ）は、第１標準溶液、第１試料溶液または第１添加試料溶液を調製して３０分以内に最初にＨＰＬＣへ溶液を注入した時点をそれぞれ経過時間０時間として、以降の経過時間を算出した。【００９５】
式３：エダラボン原薬中のフェニルヒドラジンの量  （ｐｐｍ）  ＝  ＭＳ／ＭＴ×ＡＴ／ＡＳ×１×０．７４８
ここで、
ＭＳ：第１標準溶液におけるフェニルヒドラジン塩酸塩の秤取量  （ｍｇ）
ＭＴ：第１試料溶液におけるエダラボン原薬の秤取量  （ｇ）
ＡＴ：第１試料溶液のフェニルヒドラジンのピーク面積  （μＶ秒）
ＡＳ：経過時間０時間における第１標準溶液のフェニルヒドラジンのピーク面積  （μＶ秒）
０．７４８：フェニルヒドラジン塩酸塩のフェニルヒドラジンへの換算係数【００９６】
第１標準溶液のフェニルヒドラジンピーク面積の初期値に対する割合は、２８時間経過した後でも９０％以上であり、溶液中のフェニルヒドラジンが安定であることがわかる。
また、第１添加試料溶液のフェニルヒドラジンピーク面積の初期値に対する割合は、５時間経過した後でも９０％以上であり、溶液中のフェニルヒドラジン、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンが安定であることがわかる。さらに、第１試料溶液では、５時間経過した後でもフェニルヒドラジンのピーク面積が変化しておらず、溶液中の３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンが安定であることがわかる。
また、０．１ｍｏｌ／Ｌの塩酸／アセトニトリル混液（体積比７：３）の溶解液を使用したことで、エダラボン原薬およびフェニルヒドラジンを完全に溶解することができ、かつ、溶液中に含まれるフェニルヒドラジン含有量を正確に測定することができた。
さらに、ＨＰＬＣを行う際に、上述の通り、移動相Ａおよび移動相Ｂを設けたことで、溶液中に含まれるエダラボン原薬を確実に分離することができた。また、移動相Ａおよび移動相Ｂの組成比を上述の比率にしたことで、フェニルヒドラジンの保持時間付近に他のピークが存在せず定量的に測定ができ、また、試料溶液中のエダラボン原薬を短い時間で溶出でき、２段階の移動相を設けるものの、効率的に、ＨＰＬＣを実施することができた。【００９７】
以上より、本方法によれば、溶解液の脱気／窒素バブリングや溶液調製後の迅速な測定などの煩雑な操作を行わずに、エダラボン原薬中のフェニルヒドラジン含有量を正確に、定量的かつ簡便に測定できることが明らかになった。【００９８】
［実施例２］
１３．５１７ｍｇのフェニルヒドラジン塩酸塩（フェニルヒドラジンとして約１０ｍｇ）を、０．１ｍｏｌ／Ｌの塩酸／アセトニトリル混液（体積比７：３；以下、溶解液と記す）に溶かして正確に１００ｍＬとする。得られた溶液２ｍＬを正確に量り、溶解液を加えて正確に２０ｍＬとする。得られた溶液２．５ｍＬを正確に量り、溶解液を加えて正確に１００ｍＬとして第２標準溶液を準備した（フェニルヒドラジン：０．２５μｇ／ｍＬ）。
第２標準溶液を正確に１０μＬとり、次の条件で高速液体クロマトグラフィーにより試験を行い、溶液中のフェニルヒドラジンピークのピーク面積（フェニルヒドラジンの測定値）を自動積分法により測定する。【００９９】
試験条件
・溶解液の脱気／窒素バブリング：なし
・調製後の第２試料溶液および第２標準溶液の保管温度：５℃
・容器（第２試料溶液および第２標準溶液の調製および保管）：褐色ガラス瓶
・検出器：紫外吸光光度計（測定波長：２２５ｎｍ）
・カラム：オクタデシルシリル化シリカゲル充填カラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８またはそれと同等なカラム）
・カラム温度：４０℃付近の一定温度
・移動相：移動相Ａ１００％で開始し、移動相Ｂ１００％まで濃度勾配制御
移動相Ａ：ｐＨ２．５の０．０５ｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム水溶液／アセトニトリル混液（体積比９：１）
移動相Ｂ：ｐＨ２．５の０．０５ｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム水溶液／アセトニトリル混液（体積比２：３）
＊ｐＨ２．５の０．０５ｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム水溶液：過塩素酸ナトリウム７．０ｇを水１０００ｍＬに溶かし、過塩素酸を加えてｐＨを２．５に調整した。【０１００】
第２標準溶液におけるフェニルヒドラジンの安定性調査の結果を表６示す。【０１０１】
【表６】
2019167974.tif 000008
【０１０２】
経過時間（ｈ）は、第２標準溶液を調製して３０分以内に最初にＨＰＬＣへ溶液を注入した時点を経過時間０時間として、以降の経過時間を算出した。【０１０３】
また、第２標準溶液を用いる場合、第１試料溶液中のエダラボン原薬中のフェニルヒドラジンの量は、式４により求めることができる。【０１０４】
式４：エダラボン原薬中のフェニルヒドラジンの量  （ｐｐｍ）  ＝  ＭＳ／ＭＴ×ＡＴ／ＡＳ×０．２５×０．７４８
ここで、
ＭＳ：第２標準溶液におけるフェニルヒドラジン塩酸塩の秤取量  （ｍｇ）
ＭＴ：第１試料溶液におけるエダラボン原薬の秤取量  （ｇ）
ＡＴ：第１試料溶液のフェニルヒドラジンのピーク面積  （μＶ秒）
ＡＳ：経過時間０時間における第２標準溶液のフェニルヒドラジンのピーク面積  （μＶ秒）
０．７４８：フェニルヒドラジン塩酸塩のフェニルヒドラジンへの換算係数【０１０５】
第２標準溶液のフェニルヒドラジンピーク面積の初期値に対する割合は、１２時間経過した後でも９０％以上であり、溶液中のフェニルヒドラジンが安定であることがわかる。また、本実施例で調製した第２標準溶液が、実施例１で調製した第１標準溶液と同様に、本発明の分析方法に使用し得ることが明らかになった。
このことから、本方法によれば、溶解液の脱気／窒素バブリングや溶液調製後の迅速な測定などの煩雑な操作を行わずに、エダラボン原薬中のフェニルヒドラジン含有量を定量的かつ簡便に測定できることが明らかになった。【０１０６】
［実施例３］
溶解液中の有機溶媒をアセトニトリルからメタノールに変更し、溶液におけるフェニルヒドラジンおよび／または３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンの安定性を確認した。
０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸試液とメタノールの混液を調製し、ＥＤＶＰが可溶な範囲で、より有機溶媒の比率が低くなるように（これまでの検討で、有機溶媒の比率を移動相の比率に近づけるとピーク形状を良くなるため）溶解液を選択する。溶解液を変更し、その他の条件は実施例１に準じて溶液におけるフェニルヒドラジンおよび／または３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンの安定性を調査した。
下記の３種類の溶解液にて試料溶液を調製した。【０１０７】
［１］０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸／メタノール混液（７：３）
［２］０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸／メタノール混液（６：４）
［３］０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸／メタノール混液（５：  ５）【０１０８】
その結果、［３］の溶解液でＥＤＶＰが可溶であった。よって、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸／メタノール混液（５：５）にて添加試料溶液（エダラボン原薬：０．１０１１１ｇ、フェニルヒドラジン：５μＬ）、標準溶液（フェニルヒドラジン塩酸塩：１３．１５４ｍｇ）、試料溶液（エダラボン原薬：０．１０２７５ｇ）を調製し、溶液の安定性の調査を実施した。
式３の計算方法に準じた方法によりエダラボン原薬中のフェニルヒドラジンの量を求めることができる。
０．１  ｍｏｌ／Ｌ塩酸／メタノール混液（５：５）溶液におけるフェニルヒドラジンの安定性調査の結果を表７および図７に示す。０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸／アセトニトリル混液（７：３）を用いて調製した実施例１の結果に比べ、フェニルヒドラジンの分解が速い傾向にあった。【０１０９】
【表７】
2019167974.tif 000009
【０１１０】
＊１５）経過時間  （ｈ）は、添加試料溶液、標準溶液および試料溶液を調製して３０分以内に最初にＨＰＬＣへ溶液を注入した時点をそれぞれ経過時間０時間として、以降の経過時間を算出した 。【０１１１】
フェニルヒドラジンは、光や酸素によって分解しやすい。その為、通常であれば、溶液中のフェニルヒドラジンの分解を防ぐために、事前に溶解液に脱気および窒素バブリングを行っておく、溶液調製後に迅速に測定を開始する等、煩雑な操作が必要である。しかし、本発明の実施形態では、事前に溶解液に脱気および窒素バブリングを行っておく必要がなく、長時間溶液中のフェニルヒドラジンの分解を抑制できることが判明した。【０１１２】
実施例１から実施例３の結果より、塩酸／アセトニトリル混液（溶解液）と塩酸／メタノール混液（溶解液）を用いた本発明の実施形態に基づく分析方法で、溶解液の脱気や窒素バブリングをすることなしに、長時間溶液中のフェニルヒドラジンの分解および３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンの分解を抑制でき、エダラボン原薬中のフェニルヒドラジン含有量を定量的かつ簡便に測定できることが明らかになった。【０１１３】
本発明のさらなる変更やバリエーションは、上記の教示に基づいて可能である。従って、添付の請求項の範囲において、本明細書中の特定の記載以外にも本発明を実施しえることを理解されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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