(57)【要約】  神経外胚葉マーカー陽性の細胞凝集塊を、濃度１０体積％を超える細胞外マトリクスを含む培地中で培養する工程を有する、脳オルガノイドの製造方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経外胚葉マーカー陽性の細胞凝集塊を、濃度１０体積％を超える細胞外マトリクスを含む培地中で培養する工程を有する、脳オルガノイドの製造方法。
【請求項２】
前記培地中の前記細胞外マトリクスの濃度が２０体積％〜５０体積％である、請求項１に記載の脳オルガノイドの製造方法。
【請求項３】
前記培地が、Ｗｎｔシグナル増強物質を更に含む、請求項１又は請求項２に記載の脳オルガノイドの製造方法。
【請求項４】
前記培地が、形質転換成長因子βファミリーシグナル伝達経路阻害物質を更に含む、請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の脳オルガノイドの製造方法。
【請求項５】
前記工程が、神経外胚葉マーカー陽性の細胞凝集塊を、細胞外マトリクスに挿入せず、濃度１０体積％を超える細胞外マトリクスを含む培地中に分散した状態で培養する工程である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の脳オルガノイドの製造方法。
【請求項６】
前記工程の後に、細胞外マトリクスを実質的に含まない培地中で培養する工程を更に含む、請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の脳オルガノイドの製造方法。
【請求項７】
細胞外マトリクスを実質的に含まない培地中で培養する前記工程を浮遊培養で行う、請求項６に記載の脳オルガノイドの製造方法。
【請求項８】
細胞外マトリクスを実質的に含まない培地中で培養する前記工程を高酸素分圧条件下で行う、請求項６又は７に記載の脳オルガノイドの製造方法。
【請求項９】
細胞外マトリクスを実質的に含まない培地中で培養する前記工程を、撹拌しながら行う、請求項６〜請求項８のいずれか一項に記載の脳オルガノイドの製造方法。
【請求項１０】
前記神経外胚葉マーカー陽性の細胞凝集塊がヒト由来である、請求項１〜請求項９のいずれか一項に記載の脳オルガノイドの製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜請求項１０のいずれか一項に記載の製造方法により製造された、脳オルガノイド。
【請求項１２】
前記脳オルガノイドが、少なくとも、終脳マーカー陽性の細胞を含む、請求項１１に記載の脳オルガノイド。
【請求項１３】
前記脳オルガノイドが、終脳部分様組織マーカー陽性の細胞を更に含む、請求項１２に記載の脳オルガノイド。
【請求項１４】
前記終脳部分様組織マーカー陽性の細胞が、大脳皮質、大脳基底核、海馬及び脈絡叢からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１３に記載の脳オルガノイド。
【請求項１５】
請求項１１〜請求項１４のいずれか一項に記載の脳オルガノイドを含む、被験物質の薬効評価用キット。
【請求項１６】
請求項１１〜請求項１４のいずれか一項に記載の脳オルガノイドに被験物質を接触させる工程と、
前記被験物質が前記脳オルガノイドに及ぼす影響を検定する工程と、を含む、
被験物質の薬効評価方法。
【請求項１７】
請求項１１〜請求項１４のいずれか一項に記載の脳オルガノイドを含む、神経系細胞又は神経組織の障害に基づく疾患の治療薬。
【請求項１８】
請求項１１〜請求項１４のいずれか一項に記載の脳オルガノイドを有効成分として含有する、神経系細胞又は神経組織の障害に基づく疾患の治療用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳オルガノイドの製造方法に関する。より詳細には、本発明は、脳オルガノイドの製造方法、脳オルガノイド、被験物質の薬効評価用キット、被験物質の薬効評価方法、神経系細胞又は神経組織の障害に基づく疾患の治療薬、及び、神経系細胞又は神経組織の障害に基づく疾患の治療用医薬組成物に関する。本願は、２０１８年１１月１５日に、日本に出願された特願２０１８−２１４９３０号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類の大脳皮質は多層構造（Ｉ−ＶＩ層）を有し、これは胎児の大脳皮質形成期から徐々に形成される。大脳皮質は背側終脳（外套）の神経上皮から生み出され、徐々に外転しながら両側に半球状の脳胞を形成する。大脳皮質の後尾側は皮質ヘムが隣接し、一方、吻腹側は古皮質を介して外側基底核原基（ＬＧＥ、線条体原基）や隔膜が隣接している。成体の大脳皮質の多層構造の中には、その大部分が皮質ヘムや隔膜等の隣接する組織に由来し、主にリーリン陽性のカハールレチウス細胞から形成される最表層のＩ層（胎生時期の原基は辺縁帯と呼ばれる）が存在する（ヒトの大脳皮質の場合、リーリン陽性細胞の一部は大脳皮質神経上皮からも直接生み出される）。残りの皮質板の層は、時間及び空間的に規則正しく神経細胞が生み出され配置される特徴的なパターンを有していている。これはインサイド−アウトパターンと呼ばれ、より深い層の神経細胞がより早く神経前駆細胞から生みだされる。【０００３】
多くの情報を得ることができるマウスの大脳皮質の発生とは異なり、ヒトの大脳皮質の発生はヒト胎児の脳組織の利用が限られるために詳しくは理解されていない。これまでにマウス及びヒトのＥＳ細胞を用いた３次元培養法（ＳＦＥＢｑ法）が樹立され、この凝集塊が大脳皮質の発生の初期過程を再現することが示されている。この方法はヒトｉＰＳ細胞の適応も可能であることが報告されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１５／０７６３８８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、終脳マーカー陽性の脳オルガノイドの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は以下の実施形態を含む。
［１］神経外胚葉マーカー陽性の細胞凝集塊を、濃度１０体積％を超える細胞外マトリクスを含む培地中で培養する工程を有する、脳オルガノイドの製造方法。
［２］前記培地中の前記細胞外マトリクスの濃度が２０体積％〜５０体積％である、［１］に記載の脳オルガノイドの製造方法。
［３］前記培地が、Ｗｎｔシグナル増強物質を更に含む、［１］又は［２］に記載の脳オルガノイドの製造方法。
［４］前記培地が、形質転換成長因子βファミリーシグナル伝達経路阻害物質を更に含む、［１］〜［３］のいずれかに記載の脳オルガノイドの製造方法。
［５］前記工程が、神経外胚葉マーカー陽性の細胞凝集塊を、細胞外マトリクスに挿入せず、濃度１０体積％を超える細胞外マトリクスを含む培地中に分散した状態で培養する工程である、［１］〜［４］のいずれかに記載の脳オルガノイドの製造方法。
［６］前記工程の後に、細胞外マトリクスを実質的に含まない培地中で培養する工程を更に含む、［１］〜［５］のいずれかに記載の脳オルガノイドの製造方法。
［７］細胞外マトリクスを実質的に含まない培地中で培養する前記工程を浮遊培養で行う、［６］に記載の脳オルガノイドの製造方法。
［８］細胞外マトリクスを実質的に含まない培地中で培養する前記工程を高酸素分圧条件下で行う、［６］又は［７］に記載の脳オルガノイドの製造方法。
［９］細胞外マトリクスを実質的に含まない培地中で培養する前記工程を、撹拌しながら行う、［６］〜［８］のいずれかに記載の脳オルガノイドの製造方法。
［１０］前記神経外胚葉マーカー陽性の細胞凝集塊がヒト由来である、［１］〜［９］のいずれかに記載の脳オルガノイドの製造方法。
［１１］［１］〜［１０］のいずれかに記載の製造方法により製造された、脳オルガノイド。
［１２］前記脳オルガノイドが、少なくとも、終脳マーカー陽性の細胞を含む、［１１］に記載の脳オルガノイド。
［１３］前記脳オルガノイドが、終脳部分様組織マーカー陽性の細胞を更に含む、［１２］に記載の脳オルガノイド。
［１４］前記終脳部分様組織マーカー陽性の細胞が、大脳皮質、大脳基底核、海馬及び脈絡叢からなる群より選ばれる少なくとも１種である、［１３］に記載の脳オルガノイド。
［１５］［１１］〜［１４］のいずれかに記載の脳オルガノイドを含む、被験物質の薬効評価用キット。
［１６］［１１］〜［１４］のいずれかに記載の脳オルガノイドに被験物質を接触させる工程と、前記被験物質が前記脳オルガノイドに及ぼす影響を検定する工程と、を含む、被験物質の薬効評価方法。
［１７］［１１］〜［１４］のいずれかに記載の脳オルガノイドを含む、神経系細胞又は神経組織の障害に基づく疾患の治療薬。
［１８］［１１］〜［１４］のいずれかに記載の脳オルガノイドを有効成分として含有する、神経系細胞又は神経組織の障害に基づく疾患の治療用医薬組成物。【０００７】
本発明は以下の実施形態を含むものであるということもできる。
［Ｐ１］神経外胚葉マーカー陽性の細胞凝集塊を、１０体積％を超える細胞外マトリクス成分を含む第１の培地中で培養することを含み、その結果、脳オルガノイドが形成される、脳オルガノイドの製造方法。
［Ｐ２］前記第１の培地中の前記細胞外マトリクス成分の濃度が３０〜５０体積％である、［Ｐ１］に記載の脳オルガノイドの製造方法。
［Ｐ３］前記第１の培地が、Ｗｎｔシグナル増強物質を更に含む、［Ｐ１］又は［Ｐ２］に記載の脳オルガノイドの製造方法。
［Ｐ４］前記第１の培地が、ＴＧＦ−βファミリーシグナル伝達経路阻害物質を更に含む、［Ｐ１］〜［Ｐ３］のいずれかに記載の脳オルガノイドの製造方法。
［Ｐ５］前記脳オルガノイドを第２の培地中で浮遊培養することを更に含む、［Ｐ１］〜［Ｐ４］のいずれかに記載の脳オルガノイドの製造方法。
［Ｐ６］前記第２の培地が細胞外マトリクス成分を実質的に含まない、［Ｐ５］に記載の脳オルガノイドの製造方法。
［Ｐ７］前記浮遊培養を高酸素分圧条件下で行う、［Ｐ５］又は［Ｐ６］に記載の脳オルガノイドの製造方法。
［Ｐ８］前記浮遊培養を撹拌培養で行う、［Ｐ５］〜［Ｐ７］のいずれかに記載の脳オルガノイドの製造方法。
［Ｐ９］前記神経外胚葉マーカー陽性の細胞凝集塊がヒト由来である、［Ｐ１］〜［Ｐ８］のいずれかに記載の脳オルガノイドの製造方法。
［Ｐ１０］前記脳オルガノイドが、前脳、終脳又は終脳部分様組織を含む、［Ｐ１］〜［Ｐ９］のいずれかに記載の脳オルガノイドの製造方法。
［Ｐ１１］前記終脳部分様組織が、大脳皮質、大脳基底核、海馬又は脈絡叢である、［Ｐ１０］に記載の脳オルガノイドの製造方法。
［Ｐ１２］［Ｐ１］〜［Ｐ１１］のいずれかに記載の製造方法により製造された、脳オルガノイド。
［Ｐ１３］［Ｐ１２］に記載の脳オルガノイドを含む、被験物質の毒性・薬効評価用キット。
［Ｐ１４］［Ｐ１２］に記載の脳オルガノイドに被験物質を接触させることと、前記被験物質が前記脳オルガノイドに及ぼす影響を検定することと、を含む、被験物質の毒性・薬効評価方法。
［Ｐ１５］［Ｐ１２］に記載の脳オルガノイドを含む、神経系細胞又は神経組織の障害に基づく疾患の治療薬。
［Ｐ１６］［Ｐ１２］に記載の脳オルガノイドを有効成分として含有する、神経系細胞又は神経組織の障害に基づく疾患の治療用医薬組成物。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、終脳マーカー陽性の脳オルガノイドの製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、実験例１の結果を示す顕微鏡写真である。
【図２】図２は、実験例１の結果を示す顕微鏡写真である。
【図３】図３は、実験例３において、培養１４日目の細胞凝集塊を明視野観察した結果を示す顕微鏡写真である。
【図４】図４は、実験例３における免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図５】図５は、実験例３における免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図６】図６は、実験例３及び４において、基礎培地が異なる細胞凝集塊を明視野観察した結果を示す代表的な顕微鏡写真である。
【図７】図７は、図６の結果を数値化したグラフである。
【図８】図８は、実験例５において、培養４０日目の細胞凝集塊を明視野観察した結果を示す顕微鏡写真である。
【図９】図９は、実験例５において、培養４０日目の脳オルガノイドの免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である（マトリゲル濃度５０体積％）。
【図１０】図１０は、実験例５において、培養４０日目の脳オルガノイドの免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である（マトリゲル濃度３０体積％）。
【図１１】図１１は、実験例５において、培養４０日目の脳オルガノイドの免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である（マトリゲル濃度１０体積％）。
【図１２】図１２は、実験例５において、培養４０日目の脳オルガノイドの免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である（マトリゲル濃度２体積％）。
【図１３】図１３は、実験例５において、培養７０日目の脳オルガノイドの免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である（マトリゲル濃度５０体積％）。
【図１４】図１４は、実験例５において、培養７０日目の脳オルガノイドの免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である（マトリゲル濃度３０体積％）。
【図１５】図１５は、実験例５において、培養７０日目の脳オルガノイドの免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である（マトリゲル濃度１０体積％）。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、実施形態を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施形態に何ら限定されるものではない。
【００１１】
［遺伝子名及びタンパク質名の表記］
本明細書では、ヒト遺伝子及びヒトタンパク質は、大文字のアルファベットで表すものとする。また、マウス遺伝子は、先頭文字を大文字のアルファベットで、それ以降を小文字のアルファベットで表すものとする。また、マウスタンパク質は大文字のアルファベットで表すものとする。しかしながら、場合により、ヒト遺伝子、マウス遺伝子、その他の種の遺伝子、ヒトタンパク質、マウスタンパク質、その他の種のタンパク質を厳密に区別せずに表記する場合がある。
【００１２】
本明細書において、「Ａ〜Ｂ」等の数値範囲を表す表記は、「Ａ以上、Ｂ以下」と同義であり、Ａ及びＢをその数値範囲に含むものとする。
本明細書で例示する各物質、例えば、培地中に含まれる物質や各工程で用いられる物質は、特に言及しない限り、それぞれ１種用いることができ、または２種以上を併用して用いることができる。
【００１３】
本明細書において、「物質Ｘを含む培地」、「物質Ｘの存在下」とは、外来性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）の物質Ｘが添加された培地、外来性の物質Ｘを含む培地、又は外来性の物質Ｘの存在下を意味する。すなわち、当該培地中に存在する細胞又は組織が当該物質Ｘを内在的（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）に発現、分泌又は産生する場合、内在的な物質Ｘは外来性の物質Ｘとは区別され、外来性の物質Ｘを含んでいない培地は内在的な物質Ｘを含んでいても「物質Ｘを含む培地」の範疇には該当しないものとする。
【００１４】
本明細書において、「細胞凝集塊」とは、細胞同士が接着している塊をいう。細胞塊、胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙ）、スフェア（Ｓｐｈｅｒｅ）、及びスフェロイド（Ｓｐｈｅｒｏｉｄ）、並びに脳オルガノイドも細胞凝集塊に包含される。細胞凝集塊は、細胞同士が面接着している。面接着するとは、ある細胞の表面積のうち別の細胞の表面と接着している割合が、例えば、１％以上、好ましくは３％以上、より好ましくは５％以上であることをいう。細胞の表面は、膜を染色する試薬（例えばＤｉＩ）による染色や、細胞接着因子（例えば、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎやＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）の免疫染色により、観察できる。また、膜に占める接着領域を定量することも可能である。細胞凝集塊は、細胞凝集塊の一部分又は全部において、細胞同士が細胞−細胞間結合（ｃｅｌｌ−ｃｅｌｌ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）又は接着結合（ａｄｈｅｒｅｎｃｅ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）等の細胞接着（ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ）を形成している場合がある。
【００１５】
［脳オルガノイドの製造方法］
脳オルガノイドの製造は、神経外胚葉マーカー陽性の細胞凝集塊をゲル状のマトリゲル粒子に挿入し、浮遊培養する方法が広く知られている。しかし、ゲル状のマトリゲル粒子は挿入時に崩れやすいため、崩さない為には熟練した手技が必要であり、自動化装置による大量生産には向かないという問題がある。加えて、ゲル状のマトリゲル粒子の中心部に挿入できない場合、浮遊培養で、ゲル状のマトリゲル粒子から前述の細胞凝集塊が脱離し、脳オルガノイドを形成できなくなる。また、固形状のマトリゲル粒子の形成や前述の細胞凝集塊の挿入は、時間がかかるため、より簡便に脳オルガノイドを製造できる方法が求められている。そこで、本実施形態は、神経外胚葉マーカー陽性の細胞凝集塊を、濃度１０体積％を超える細胞外マトリクスを含む培地（「第１の培地」ともいう。）中で培養する工程を含み、好ましくは、神経外胚葉マーカー陽性の細胞凝集塊を、細胞外マトリクスに挿入せず、濃度１０体積％を超える細胞外マトリクスを含む第１の培地中に分散した状態で培養する工程を含み、その結果、脳オルガノイドが形成される、脳オルガノイドの製造方法を提供する。実施例において後述するように、本実施形態の製造方法によれば、脳オルガノイドを簡便に製造することができる。
【００１６】
本実施形態において、脳オルガノイドは、少なくとも、終脳マーカー陽性の細胞を含有する細胞凝集塊を意味する。終脳マーカーとしては、ＦＯＸＧ１（ＢＦ１とも呼ばれる）、ＳＩＸ３等を挙げることができるが、これらに限定されない。なお、ＦＯＸＧ１及びＳＩＸ３は前脳マーカーでもある。本実施形態の脳オルガノイドは、少なくとも１種の終脳マーカーを発現する細胞を含有する。好ましい態様において、脳オルガノイドは、ＦＯＸＧ１陽性の細胞を含有する細胞凝集塊である。脳オルガノイドの切片を作製し、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）と抗ＦＯＸＧ１抗体を用いて免疫染色を行い、脳オルガノイドに占めるＦＯＸＧ１陽性の細胞の割合を算出することも可能である。脳オルガノイドは、脳オルガノイドに含まれる細胞の個数で５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上が、終脳マーカー陽性であることが好ましい。
【００１７】
本実施形態の製造方法により製造される脳オルガノイドは、終脳マーカー陽性の細胞以外に、前脳マーカー陽性の細胞及び終脳部分様組織マーカー陽性の細胞から選ばれる少なくとも１種を含むことが好ましい。終脳部分様組織マーカー陽性の細胞としては、大脳皮質、大脳基底核、海馬、及び脈絡叢等の終脳部分様組織マーカー陽性の細胞が挙げられる。脳オルガノイドが、終脳マーカー陽性の細胞以外に、前脳マーカー陽性の細胞及び終脳部分様組織マーカー陽性の細胞を含むか否かは、形態的に判断することができる。あるいは、各細胞に特徴的なマーカー遺伝子又はマーカータンパク質の発現を測定して判断することもできる。
【００１８】
前脳マーカーとしては、例えば、ＦＯＸＧ１、ＳＩＸ３等が挙げられる。また、大脳皮質マーカーとしては、例えば、神経幹細胞・神経前駆細胞マーカーであるＰＡＸ６、大脳皮質の第Ｖ層マーカーであるＣＴＩＰ２、大脳皮質の第ＩＩ／ＩＩＩ層マーカーであるＳＡＴＢ２等が挙げられる。また、大脳基底核マーカーとしては、例えば、ＮＫＸ２．１、ＧＳＨ２等が挙げられる。また、海馬マーカーとしては、例えば、ＫＡ１、ＺＢＴＢ２等が挙げられる。また、脈絡叢マーカーとしては、例えば、ＴＴＲ、ＬＭＸ１Ａ等が挙げられる。
【００１９】
神経外胚葉マーカー陽性の細胞凝集塊は、幹細胞から誘導されたものが好ましく、幹細胞としては、多能性幹細胞又は多能性幹細胞から誘導されたものが好ましい。
【００２０】
《多能性幹細胞》
多能性幹細胞は、インビトロにおいて培養することが可能で、かつ、三胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）及び／又は胚体外組織に属する細胞系譜すべてに分化しうる能力（分化多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ））を有する幹細胞をいう。
【００２１】
多能性幹細胞は、遺伝子改変していない多能性幹細胞であっても、遺伝子改変された多能性幹細胞であってもよい。遺伝子改変された多能性幹細胞から得られる脳オルガノイドは、神経変性症等の脳疾患を有する脳のモデルとして使用することができることから、例えば、本実施形態の被験物質の毒性又は薬効評価方法に用いる脳オルガノイドとして好適に使用することができる。
【００２２】
多能性幹細胞は、受精卵、クローン胚、生殖幹細胞、組織内幹細胞、及び体細胞等から誘導することができる。多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞：Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、ＥＧ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞：ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）等を挙げることができる。
【００２３】
なお、多能性幹細胞には、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ；ＭＳＣ）から得られるＭｕｓｅ細胞（Ｍｕｌｔｉ−ｌｉｎｅａｇｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ  ｓｔｒｅｓｓ  ｅｎｄｕｒｉｎｇ  ｃｅｌｌ）や、始原生殖細胞から樹立されるＥＧ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｇｅｒｍ  Ｃｅｌｌ、胚性生殖幹細胞）も包含される。
【００２４】
ＥＳ細胞は、１９８１年に初めて樹立され、１９８９年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。１９９８年にはヒトＥＳ細胞が樹立されており、再生医療にも利用されつつある。ＥＳ細胞は、内部細胞塊をフィーダー細胞上又はＬｅｕｋｅｍｉａ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ）を含む培地中で培養することにより製造することができる。ＥＳ細胞の製造方法は、例えば、ＷＯ９６／２２３６２、ＷＯ０２／１０１０５７、ＵＳ５，８４３，７８０、ＵＳ６，２００，８０６、ＵＳ６，２８０，７１８等に記載されている。ＥＳ細胞は、所定の機関より入手でき、また、市販品を購入することもできる。例えば、ヒトＥＳ細胞であるＫｈＥＳ−１、ＫｈＥＳ−２及びＫｈＥＳ−３は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。ヒトＥＳ細胞であるＲｘ：：ＧＦＰ株（ＫｈＥＳ−１由来）は国立研究開発法人理化学研究所より入手可能である。また、マウスＥＳ細胞であるＥＢ５細胞は国立研究開発法人理化学研究所より入手可能である。また、マウスＥＳ細胞であるＤ３株はＡＴＣＣより入手可能である。
【００２５】
ＥＳ細胞の１つである核移植ＥＳ細胞（ｎｔＥＳ細胞）は、細胞核を取り除いた卵子に体細胞の細胞核を移植して作ったクローン胚から樹立することができる。
【００２６】
ＥＧ細胞は、始原生殖細胞をｍＳＣＦ、ＬＩＦ及びｂＦＧＦを含む培地中で培養することにより製造することができる（例えば、Matsui Y., et al., Derivation of pluripotential embryonic stem cells from murine primordial germ cells in culture, Cell, 70 (5), 841-847, 1992を参照）。
【００２７】
本実施形態において、「ｉＰＳ細胞」とは、体細胞を、公知の方法等により初期化（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）することにより、多能性を誘導した細胞を意味する。具体的には、線維芽細胞や末梢血単核球あるいはリンパ球等の分化した体細胞をＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｍｙｃ（ｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃ）、Ｇｌｉｓ１、Ｎａｎｏｇ、Ｓａｌｌ４、Ｌｉｎ２８、Ｅｓｒｒｂ等を含む初期化遺伝子群から選ばれる複数の遺伝子の組合せのいずれかの発現により初期化して多分化能を誘導した細胞が挙げられる。
【００２８】
好ましい初期化遺伝子群の組み合わせとしては、例えば、（１）Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びＭｙｃ（ｃ−Ｍｙｃ又はＬ−Ｍｙｃ）の組み合わせ、又は（２）Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｌｉｎ２８及びＬ−Ｍｙｃ（Okita K., et al., An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells, Stem Cells, 31 (3), 458-466, 2013 を参照。）の組み合わせ、を挙げることができる。
【００２９】
ｉＰＳ細胞は、２００６年、山中らによりマウス細胞で樹立された（Takahashi K. and Yamanaka S., Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors, Cell, 126 (4), 663-676, 2006）。ｉＰＳ細胞は、２００７年にヒト線維芽細胞でも樹立され、ＥＳ細胞と同様に多能性と自己複製能を有する（例えば、Takahashi K., et al., Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors, Cell, 131 (5), 861-872, 2007; Yu J., et al., Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells, Science, 318 (5858), 1917-1920, 2007; Nakagawa M., et al., Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts, Nat Biotechnol, 26 (1), 101-106, 2008 等を参照。）。
【００３０】
遺伝子発現による初期化により、体細胞からｉＰＳ細胞を製造する方法以外に、化合物の添加等により、体細胞からｉＰＳ細胞を誘導することもできる（Hou P., et al., Pluripotent stem cells induced from mouse somatic cells by small-molecule compounds, Science, 341 (6146), 651-654, 2013）。
【００３１】
本実施形態では、株化されたｉＰＳ細胞を用いることも可能である。例えば、京都大学で樹立された２０１Ｂ７細胞、２０１Ｂ７−Ｆｆ細胞、２５３Ｇ１細胞、２５３Ｇ４細胞、１２０１Ｃ１細胞、１２０５Ｄ１細胞、１２１０Ｂ２細胞、１２３１Ａ３細胞等のヒトｉＰＳ細胞株が、京都大学及びｉＰＳアカデミアジャパン株式会社より入手可能である。さらに、株化されたｉＰＳ細胞として、例えば、株式会社リプロセルから販売されているＰＣＰｈｉＰＳ７７１が挙げられる。他にも、株化されたｉＰＳ細胞として、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｌｏｓ  ＩＩＩで樹立されたＸＦｉＰＳ−Ｆ４４−３Ｆ−２が挙げられる。
【００３２】
ｉＰＳ細胞を製造する際に用いられる体細胞としては、組織由来の線維芽細胞、血球系細胞（例えば、末梢血単核球やＴ細胞）、肝細胞、膵臓細胞、腸上皮細胞、及び平滑筋細胞等が挙げられる。
【００３３】
ｉＰＳ細胞を製造する際に、数種類の遺伝子の発現により初期化する場合、遺伝子を発現させるための手段は特に限定されない。前記手段としては、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルスベクター）を用いた感染法、プラスミドベクター（例えば、プラスミドベクター、及びエピソーマルベクター）を用いた遺伝子導入法（例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、レトロネクチン法、及びエレクトロポレーション法）、ＲＮＡベクターを用いた遺伝子導入法（例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、及びエレクトロポレーション法）、並びにタンパク質やｍＲＮＡの直接注入法等が挙げられる。
【００３４】
本実施形態の製造方法に用いられる多能性幹細胞は、好ましくはＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞であり、より好ましくはｉＰＳ細胞である。
【００３５】
遺伝子改変された多能性幹細胞は、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、及びＣＲＩＳＰＲ等の人工ヌクレアーゼを、多能性幹細胞にトランスフェクションすることにより、簡単に作製することができる。人工ヌクレアーゼは、標的遺伝子に二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ：ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ）を導入し、ＤＳＢ修復機構の一つである非相同末端結合（ＮＨＥＪ：ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｎｄ  ｊｏｉｎｉｎｇ）により挿入欠失変異が導入されることで、標的遺伝子が破壊された遺伝子改変された細胞株、つまり、ノックアウト細胞株が作製される。従来の遺伝子改変技術よりも短期間、低費用かつ効率的にノックアウト細胞株を作製することが可能なことから、遺伝子改変細胞の作製技術として広く利用されるようになっている（例えば、Hsu PD et al., Development and Applications of CRISPR-Cas9 for Genome Engineering, Cell, 157 (6), 1262-1278, 2014等を参照。）。
【００３６】
人工ヌクレアーゼを利用して、標的とするゲノム領域（あるいは遺伝子）にＧＦＰ等の遺伝子を導入するノックインの試みも行われている。ＧＦＰ等のノックイン配列の両端に、標的とするゲノム領域の相同配列約５００ｂｐ−１ｋｂｐを有するドナープラスミドを利用する。ドナープラスミドを人工ヌクレアーゼと一緒に多能性幹細胞に導入することで、人工ヌクレアーゼが標的配列にＤＳＢを導入し、ドナープラスミドの相同配列を利用して、もう一つのＤＳＢ修復機構である相同組換え（ＨＲ：ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）により、ＧＦＰ等の遺伝子が標的配列にノックインされる。
【００３７】
また、ドナープラスミドを使わない方法として、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＯＤＮ：ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）を用いることで、標的遺伝子の一塩基置換や、ＨｉｓタグやＬｏｘＰ等の数十ｂｐ以下の短いＤＮＡ配列を導入することができる。導入したい塩基配列を挟んで、両端に４０−６０ｂｐの相同配列を含むｓｓＯＤＮを人工的に合成して、人工ヌクレアーゼと一緒に受精卵に導入することで、高効率なＤＳＢ修復機構であるＳｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ａｎｎｅａｌｉｎｇ（ＳＳＡ）を利用して、簡単かつ効率的にノックイン細胞株を作製することが可能である。
【００３８】
ドナープラスミドを利用してノックインを行う際には、ノックインしたい遺伝子を含むプラスミドに、標的とするゲノム領域の相同配列を付加する必要がある。相同配列をＰＣＲ等で増幅して、ライゲーションおよび大腸菌でクローニングしてドナープラスミドを作製する。また、ノックイン細胞株の選別方法としては、ポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、ポリＡ選択等の方法を用いることができる。選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法等が挙げられる。
【００３９】
多能性幹細胞としては、好ましくは哺乳動物由来の多能性幹細胞であり、哺乳動物としては、好ましくはげっ歯類及び霊長類、より好ましくは霊長類であり、霊長類としては、好ましくはヒトである。
【００４０】
「哺乳動物」には、げっ歯類、有蹄類、ネコ目、霊長類等が包含される。げっ歯類には、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等が包含される。有蹄類には、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等が包含される。ネコ目には、イヌ、ネコ等が包含される。「霊長類」とは、霊長目に属する哺乳類動物をいい、霊長類としては、キツネザル、ロリス、ツバイ等の原猿亜目と、サル、類人猿、ヒト等の真猿亜目が挙げられる。
【００４１】
《多能性幹細胞の増殖》
本実施形態の脳オルガノイドの製造方法では、多能性幹細胞を増殖させて用いることができる。多能性幹細胞を増殖する際には、フィーダー細胞存在下又はフィーダー細胞非存在下（フィーダーフリー）で増殖することができる。
【００４２】
フィーダー細胞存在下でｉＰＳ細胞を増殖する際には、公知の方法で、未分化維持因子存在下でｉＰＳ細胞を増殖できる。フィーダー細胞非存在下でｉＰＳ細胞を増殖する際に用いられる増殖用培地としては、例えば、公知のＥＳ細胞及び／又はｉＰＳ細胞の維持培地や、フィーダーフリーでｉＰＳ細胞を樹立するための培地を用いることができる。フィーダーフリーでｉＰＳ細胞を樹立するためのフィーダーフリー用培地としては、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８培地や、ＴｅＳＲ培地、ｍＴｅＳＲ培地、及びｍＴｅＳＲ−Ｅ８培地（いずれも、ステムセルテクノロジーズ社製）、並びにＳｔｅｍＦｉｔ培地（味の素社製）等を挙げることができる。
【００４３】
多能性幹細胞を増殖させる際に用いられる培養器は、「接着培養する」ことが可能なものであれば、適宜培養のスケール、培養条件及び培養期間に応じた培養器を選択することが可能である。このような培養器としては、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、培養皿（ディッシュ）、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、マイクロキャリア、ビーズ、スタックプレート、スピナーフラスコ又はローラーボトルが挙げられる。
【００４４】
これらの培養器は、接着培養を可能とするために、細胞接着性であることが好ましい。細胞接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理された培養器が挙げられ、具体的には表面加工された培養器、又は、内部がコーティング剤で被覆された培養器が挙げられる。コーティング剤としては、例えば、ラミニン（ラミニンα５β１γ１（以下、「ラミニン５１１」という場合がある。）、ラミニンα１β１γ１（以下、「ラミニン１１１」という場合がある。）、ラミニン断片（ラミニン５１１Ｅ８等）等を含む）、エンタクチン、コラーゲン、ゼラチン、ビトロネクチン（Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ）、シンセマックス（コーニング社）、マトリゲル等の細胞外マトリクス等；ポリリジン、ポリオルニチン等の高分子等が挙げられる。表面加工された培養器としては、正電荷処理等の表面加工された培養容器が挙げられる。
【００４５】
多能性幹細胞の増殖は、培地にＲＯＣＫ（Ｒｈｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｋｉｎａｓｅ／Ｒｈｏ結合キナーゼ）阻害剤を添加して培養することが好ましい。ＲＯＣＫ阻害剤を添加することで、多能性幹細胞、特にヒトｉＰＳ／ＥＳ細胞の細胞分散時に細胞死を抑制することができる。細胞を剥離させた場合、ＲＯＣＫ阻害剤を適宜、剥離後に添加して培養することが好ましい。ＲＯＣＫ阻害剤を添加する場合、添加後少なくとも１日間培養すればよく、培養後は除去することが好ましい。また、多能性幹細胞の増殖は、培地に多能性幹細胞を剥離させる１日以上前、好ましくは１日前より、ＲＯＣＫ阻害剤を含有する培地で培養することもできる。
【００４６】
ＲＯＣＫ阻害剤としては、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）の機能を抑制できるものであれば特に限定されず、例えば、Ｙ−２７６３２（例えば、Ishizaki T., et al., Pharmacological properties of Y-27632, a specific inhibitor of rho-associated kinases, Mol Pharmacol, 57 (5), 976-983, 2000; Narumiya S., et al., Use and properties of ROCK-specific inhibitor Y-27632, Methods Enzymol 325, 273-284, 2000 等を参照。）、Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ１０７７（例えば、Uehata M., et al., Calcium sensitization of smooth muscle mediated by a Rho-associated protein kinase in hypertension, Nature, 389 (6654), 990-994, 1997 を参照。）、Ｈ−１１５２（例えば、Sasaki Y., et al., The novel and specific Rho-kinase inhibitor (S)-(+)-2-methyl-1-[(4-methyl-5-isoquinoline)sulfonyl]-homopiperazine as a probing molecule for Rho-kinase-involved pathway, Pharmacol Ther., 93 (2-3), 225-232, 2002 を参照。）、Ｗｆ−５３６（例えば、Nakajima M., et al., Effect of Wf-536, a novel ROCK inhibitor, against metastasis of B16 melanoma, Cancer Chemotherapy and Pharmacology, 52 (4), 319-324, 2003 を参照。）及びこれらの誘導体、並びに、ＲＯＣＫに対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びこれらの発現ベクターが挙げられる。
【００４７】
《神経外胚葉マーカー陽性の細胞凝集塊》
続いて、増殖させた多官能幹細胞を培養して、神経外胚葉マーカー陽性の細胞凝集塊を製造する。
【００４８】
神経外胚葉マーカー陽性の細胞凝集塊の培養に使用する培地（以下、「凝集用培地」という場合がある。）について説明する。
【００４９】
凝集用培地の基礎培地としては、動物細胞の培養に通常用いられる培地を使用できる。基礎培地としては、例えば、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ  １０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ（ＧＭＥＭ）培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９培地、Ｅａｇｌｅ  ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｆ−１２培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ／Ｆ１２培地、ハム培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、又はこれらの混合培地等、動物細胞の培養に用いることのできる培地を挙げることができる。
【００５０】
神経外胚葉マーカー陽性の細胞凝集塊の培養においては、無血清培地も使用できる。「無血清培地」とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味する。精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、増殖因子）が混入している培地も、無調整又は未精製の血清を含まない限り無血清培地に含まれる。無血清培地は、血清代替物を含有していてもよい。血清代替物としては、例えば、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール又はチオグリセロール、これらの均等物等を適宜含有するものを挙げることができる。
【００５１】
血清代替物は、例えば、ＷＯ９８／３０６７９に記載の方法により調製することができる。血清代替物としては市販品を利用してもよい。市販の血清代替物としては、例えば、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（ＴＭ）  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製：以下、「ＫＳＲ」という場合がある。）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ−ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（ＴＭ）（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、Ｂ２７（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、Ｎ２サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、１×Ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）等が挙げられる。
【００５２】
凝集用培地は、骨形成タンパク質（Ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害物質、又は、形質転換因子β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−β、／ＴＧＦ−β）ファミリーシグナル伝達経路阻害物質を含むことが好ましい。
【００５３】
ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質としては、ＢＭＰに起因するシグナル伝達経路を阻害する物質であれば特に限定されず、核酸、タンパク質、及び低分子有機化合物のいずれであってもよい。ここでＢＭＰとしては、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、及びＧＤＦ７等が挙げられる。
【００５４】
ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質として、例えば、ＢＭＰに直接作用する物質（Ｎｏｇｇｉｎタンパク質、抗体、及びアプタマー等）、ＢＭＰをコードする遺伝子の発現を抑制する物質（アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ等）、ＢＭＰ受容体（ＢＭＰＲ）とＢＭＰの結合を阻害する物質、並びにＢＭＰ受容体によるシグナル伝達に起因する生理活性を阻害する物質を挙げることができる。ＢＭＰＲとしては、ＡＬＫ２及びＡＬＫ３等を挙げることができる。
【００５５】
ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質としては、ＬＤＮ１９３１８９、及びＤｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ等が挙げられる。ＬＤＮ１９３１８９（４−［６−（４−ピペラジン−１−イルフェニル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル］キノリン）は、ＢＭＰＲ（ＡＬＫ２／３）阻害剤（以下、ＢＭＰＲ阻害剤）であり、通常は塩酸塩の形態で市販されている。また、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質として知られるタンパク質（Ｃｈｏｒｄｉｎ、又はＮｏｇｇｉｎ等）を使用してもよい。
【００５６】
ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質としては、好ましくはＤｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎである。
【００５７】
凝集用培地中に含まれるＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の終濃度は、０．５〜１０μＭであることが好ましく、０．７５〜５μＭであることがより好ましく、１〜３μＭであることが更に好ましい。上記の数値の範囲内であると、脳オルガノイド内で層構造を形成する神経細胞が空間的に規則正しく配置されるため、好ましい。
【００５８】
ＴＧＦ−βファミリーシグナル伝達経路阻害物質とは、ＴＧＦ−βファミリーシグナル伝達経路、すなわちＳｍａｄファミリーにより伝達されるシグナル伝達経路を阻害する物質を表し、具体的にはＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害物質、Ｎｏｄａｌ／Ａｃｔｉｖｉｎシグナル伝達経路阻害物質を挙げることができる。
【００５９】
ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害物質としては、ＴＧＦ−βに起因するシグナル伝達経路を阻害する物質であれば特に限定されず、核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。
【００６０】
ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害物質として、例えば、ＴＧＦ−βに直接作用する物質（例えば、タンパク質、抗体、アプタマー等）、ＴＧＦ−βをコードする遺伝子の発現を抑制する物質（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ等）、ＴＧＦ−β受容体とＴＧＦ−βの結合を阻害する物質、ＴＧＦ−β受容体によるシグナル伝達に起因する生理活性を阻害する物質（例えば、ＴＧＦ−β受容体の阻害剤、Ｓｍａｄの阻害剤等）を挙げることができる。
【００６１】
ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害物質として知られているタンパク質として、Ｌｅｆｔｙ等が挙げられる。ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害物質として、当業者に周知の化合物を使用することができ、具体的には、ＳＢ４３１５４２、ＬＹ−３６４９４７、ＳＢ−５０５１２４、及びＡ−８３−０１等が挙げられる。ここでＳＢ４３１５４２（４−（５−ベンゾール［１，３］ジオキソール−５−イル−４−ピリジン−２−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−ベンズアミド）及びＡ−８３−０１（３−（６−メチル−２−ピリジニル）−Ｎ−フェニル−４−（４−キノリニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボチオアミド）は、ＴＧＦ−β受容体（ＡＬＫ５）及びＡｃｔｉｖｉｎ受容体（ＡＬＫ４／７）の阻害剤（すなわちＴＧＦ−βＲ阻害剤）として公知の化合物である。ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害物質は、好ましくはＳＢ４３１５４２又はＡ−８３−０１であり、Ａ−８３−０１のほうが、初期の終脳への分化が進みやすい点で好ましい。
【００６２】
凝集用培地中に含まれる、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害物質の終濃度は、０．５〜１０μＭであることが好ましく、０．７５〜５μＭであることがより好ましく、１〜３μＭであることが更に好ましい。
【００６３】
凝集用培地として、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質がＤｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎで、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害物質がＡ−８３−０１である場合、多能性幹細胞から神経外胚葉マーカー陽性の細胞凝集塊への誘導期間は、３〜１４日が好ましく、４〜１２日がより好ましく、５〜１０日が更に好ましい。上記の数値の範囲内であると、神経上皮細胞を含んだ脳胞の誘導効率が向上するため、好ましい。
【００６４】
凝集用培地での培養方法としては、浮遊培養が好ましく、浮遊培養は凝集用培地を攪拌しながら行うことが好ましい。なお、浮遊培養とは、細胞凝集塊が培養液に浮遊して存在する状態を維持しつつ培養すること、及び当該培養を行う方法をいう。浮遊培養は、細胞又は細胞凝集塊を培養器材等に接着させない条件で行われ、培養器材等に接着させる条件で行われる培養（接着培養又は接着培養法）は、浮遊培養の範疇に含まれない。この場合、細胞が接着するとは、細胞又は細胞凝集塊と培養器材との間に、強固な細胞−基質間結合（ｃｅｌｌ−ｓｕｂｓｔｒａｔｕｍ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）ができることをいう。より詳細には、浮遊培養とは、細胞又は細胞凝集塊と培養器材等との間に強固な細胞−基質間結合を作らせない条件での培養をいい、接着培養とは、細胞又は細胞凝集塊と培養器材等との間に強固な細胞−基質間結合を作らせる条件での培養をいう。
【００６５】
多能性幹細胞を凝集用培地で培養する際、多能性幹細胞を分散させておくことができる。多能性幹細胞を分散させることにより、均一性に優れた神経外胚葉マーカー陽性の細胞凝集塊を得ることができる。分散とは、細胞や組織を酵素処理や物理処理等の分散処理により、小さな細胞片（２細胞以上１００細胞以下、好ましくは５０細胞以下）又は単一細胞まで分離させることをいう。一定数の分散した細胞とは、細胞片又は単一細胞を一定数集めたもののことをいう。多能性幹細胞を分散させる方法としては、例えば、機械的分散処理、細胞分散液処理、及び細胞保護剤添加処理が挙げられる。これらの処理を組み合わせて行ってもよい。好ましくは、細胞分散液処理を行い、次いで機械的分散処理をするとよい。機械的分散処理の方法としては、ピペッティング処理又はスクレーパーでの掻き取り操作が挙げられる。
【００６６】
細胞分散液処理に用いられる細胞分散液としては、例えば、トリプシン、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、プロナーゼ、ＤＮａｓｅ、及びパパイン等の酵素類や、エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤のいずれかを含む溶液を挙げることができる。市販の細胞分散液、例えば、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）やＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いることもできる。
【００６７】
多能性幹細胞を分散する際に、細胞保護剤で処理することにより、多能性幹細胞の細胞死を抑制してもよい。細胞保護剤処理に用いられる細胞保護剤としては、繊維芽細胞増殖因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ／ＦＧＦ）シグナル伝達経路作用物質、ヘパリン、インスリン様成長因子（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ／ＩＧＦ）シグナル伝達経路作用物質、血清、及び血清代替物等を挙げることができる。
【００６８】
分散により誘導される細胞死（特に、ヒト多能性幹細胞の細胞死）を抑制するために、分散の際に、ＲＯＣＫ阻害物質又はＭｙｏｓｉｎ阻害物質を添加してもよい。ＲＯＣＫ阻害物質としては、Ｙ−２７６３２、Ｆａｓｕｄｉｌ（ＨＡ１０７７）、Ｈ−１１５２等を挙げることができる。Ｍｙｏｓｉｎ阻害物質としてはＢｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎを挙げることができる。好ましい細胞保護剤としては、ＲＯＣＫ阻害物質が挙げられる。
【００６９】
神経外胚葉マーカー陽性の細胞凝集塊の培養では、分散した多能性幹細胞を迅速に狭いスペースに採取し、培養することが好ましい。このように培養すると、形成された細胞凝集塊から分化誘導される脳オルガノイドにおいて上皮様構造を再現性よく形成させることができる。狭いスペースを有する培養プレートとしては、例えば、狭いウェルを有するプレート（例えば、ウェルの底面積が平底換算で０．１〜２．０ｃｍ２程度のプレート）、マイクロポア、及び小さな遠心チューブが挙げられる。
【００７０】
狭いウェルを有するプレートとしては、例えば、２４ウェルプレート（面積が平底換算で１．８８ｃｍ２程度）、４８ウェルプレート（面積が平底換算で１．０ｃｍ２程度）、９６ウェルプレート（面積が平底換算で０．３ｃｍ２程度、内径６〜８ｍｍ程度）、３８４ウェルプレートが挙げられる。これらの中でも好ましくは９６ウェルプレートである。
【００７１】
狭いウェルを有するプレートの形状として、ウェルを上から見たときの底面の形状としては、多角形、長方形、楕円、真円が挙げられ、好ましくは真円が挙げられる。狭いウェルを有するプレートの形状として、ウェルを横から見たときの底面の形状としては、平底構造でもよく、外周部が高く内凹部が低くくぼんだ構造でもよい。底面の形状として、例えば、Ｕ底、Ｖ底、Ｍ底が挙げられ、好ましくはＵ底又はＶ底、更に好ましくはＶ底が挙げられる。狭いウェルを有するプレートとして、細胞培養皿（例えば、６０〜１５０ｍｍディッシュ、カルチャーフラスコ）の底面に凹凸、又は、くぼみがあるものを用いてもよい。狭いウェルを有するプレートの底面として、細胞非接着性の底面、好ましくは細胞非接着性コートした底面を用いることが好ましい。
【００７２】
細胞凝集塊が形成されたこと、及びその均一性は、細胞凝集塊のサイズ及び細胞数、巨視的形態、組織染色解析による微視的形態及びその均一性等に基づき判断することが可能である。また、細胞凝集塊において上皮様構造が形成されたこと、及びその均一性は、細胞凝集塊の巨視的形態、組織染色解析による微視的形態及びその均一性、分化及び未分化マーカーの発現及びその均一性、分化マーカーの発現制御及びその同期性、分化効率の細胞凝集塊間の再現性等に基づき判断することが可能である。
【００７３】
神経外胚葉マーカー陽性の細胞凝集塊が形成されたことは、神経外胚葉マーカーが陽性であることにより判断することが可能である。神経外胚葉マーカーとしては、ＮＥＳＴＩＮ、βＩＩＩ−ＴＵＢＵＬＩＮ、等が挙げられる。
【００７４】
《神経外胚葉マーカー陽性の細胞凝集塊の培養》
本実施形態の製造方法は、神経外胚葉マーカー陽性の細胞凝集塊を、濃度１０体積％を超える細胞外マトリクスを含む第１の培地中で培養する工程を含む。好ましくは、神経外胚葉マーカー陽性の細胞凝集塊を、細胞外マトリクスに挿入せず、濃度１０体積％を超える細胞外マトリクスを含む第１の培地中に分散した状態で培養する工程を含む。神経外胚葉マーカー陽性の細胞凝集塊を第１の培地中で培養することにより、脳オルガノイドが形成される。
【００７５】
「細胞外マトリクス成分」とは、細胞外マトリクス中に通常見出される各種成分をいう。本実施形態においては、基底膜成分を用いることが好ましい。基底膜成分としては、例えば、ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン、及びニドゲン等が挙げられる。培地に添加する細胞外マトリクス成分としては市販のものが利用でき、例えば、マトリゲル（コーニング社製）、ヒト型ラミニン（シグマ社製）等が挙げられる。マトリゲルは、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ  Ｈｏｌｍ  Ｓｗａｒｎ（ＥＨＳ）マウス肉腫由来の基底膜調製物である。マトリゲルの主成分は、ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン、及びニドゲンであるが、これらに加えて、ＴＧＦ−β、ＦＧＦ、組織プラスミノゲン活性化因子、ＥＨＳ腫瘍が天然に産生する増殖因子が含まれる。マトリゲルのｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｄｕｃｅｄ製品は、通常のマトリゲルよりも増殖因子の濃度が低く、その標準的な濃度は上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ／ＥＧＦ）が＜０．５ｎｇ／ｍＬ、神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ／ＮＧＦ）が＜０．２ｎｇ／ｍＬ、血小板由来成長因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ／ＰＤＧＦ）が＜５ｐｇ／ｍＬ、ＩＧＦ−１が≦５ｎｇ／ｍＬ、ＴＧＦ−βが≦１．７ｎｇ／ｍＬである。細胞外マトリクス成分としては、マトリゲルのｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｄｕｃｅｄ製品の使用が好ましい。
【００７６】
第１の培地中の細胞外マトリクス成分の濃度は、神経管様構造体の形成に寄与する。また、長期培養における大脳皮質様階層構造の構築において、上層神経細胞の作出時期や、上層の厚さにも影響する。
【００７７】
細胞外マトリクス成分としてマトリゲルを使用する場合、マトリゲルと第１の培地を氷浴上でピペッティングすることで混和させる。ピペッティングを１５回以上行うと、マトリゲルが培地中に分散する。分散とは、目視で培地中に細胞外マトリクスの塊が目視で観察できない状態を意味する。マトリゲルが培地中に分散できないと、得られる脳オルガノイド間での凝集が生じる。
【００７８】
第１の培地と細胞外マトリクスとを合わせた体積を１００体積％として、細胞外マトリクスの濃度の上限値は７０体積％であることが好ましく、６０体積％であることがより好ましく、５０体積％であることが更に好ましい。一方で、細胞外マトリクスの濃度の下限値は１０体積％であることが好ましく、２０体積％であることがより好ましく、３０体積％であることが更に好ましい。１０体積％以下であると、培養７０日目における脳オルガノイド切片の免疫染色を行った場合に、大脳皮質の第ＩＩ／ＩＩＩ層マーカーであるＳＡＴＢ２の発現がほとんど観察されない。また、３０〜５０体積％の範囲内であると、培養７０日目における脳オルガノイド切片では、大脳皮質の第ＩＩ／ＩＩＩ層マーカーであるＳＡＴＢ２の発現が明瞭に観察される。また、３０〜５０体積％の範囲内であると、ＳＡＴＢ２が発現するまでの期間が短いため好ましい。
【００７９】
第１の培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ１０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９培地、Ｅａｇｌｅ  ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ハム培地、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、及びＦｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、これらの混合培地等、動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。
【００８０】
第１の培地は、Ｎ２サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製品名）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ、血清、血清代替物、ヘパリン等を含有することができる。血清代替物については上述したものと同様である。
【００８１】
本実施形態の製造方法は、神経外胚葉マーカー陽性の細胞凝集塊を第１の培地で培養する工程を含んでいればよく、第１の培地を使用しない別の工程を有することもできる。例えば、神経外胚葉マーカー陽性の細胞凝集塊を、第１の培地以外の培地（Ｎ２サプリメント及びＣｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅを含み、血清、ヘパリン、細胞外マトリクス成分を含有しない培地）を用いて培養する工程を行った後、途中から（例えば、Ｆｏｘｇ１陽性細胞凝集塊中に、脳室様の空洞を有した半球状の神経管様構造が形成された段階以降において）第１の培地へ切り替えて、第１の培地で培養する工程を行うことができる。
【００８２】
第１の培地は、Ｗｎｔシグナル増強剤を更に含んでいてもよい。Ｗｎｔシグナル増強剤としては、Ｗｎｔタンパク質、ＧＳＫ−３β阻害剤及びＲ−Ｓｐｏｎｄｉｎ等のＷｎｔ  ａｇｏｎｉｓｔ、並びにＤｋｋ（Ｗｎｔ阻害タンパク質の阻害剤）等が挙げられる。これらの中でも、Ｗｎｔシグナル増強剤としては、Ｗｎｔタンパク質及びＧＳＫ−３β阻害剤が好ましい。
【００８３】
ＧＳＫ−３β阻害剤としては、ＣＨＩＲ９９０２１（６−［［２−［［４−（２，４−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−（５−ｍｅｔｈｙｌ−１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２−ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｅｔｈｙｌ］ａｍｉｎｏ］−３−ｐｙｒｉｄｉｎｅｃａｒｂｏｎｉｔｒｉｌｅ）、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ、及び６−Ｂｒｏｍｏｉｎｄｉｒｕｂｉｎ−３’−ｏｘｉｍｅ（ＢＩＯ）等を挙げることができる。これらの中でも、ＧＳＫ−３β阻害剤としてはＣＨＩＲ９９０２１が好ましい。
【００８４】
Ｗｎｔタンパク質としては、各種生物由来のＷｎｔタンパク質を用いることができる。生物由来のＷｎｔタンパク質中でも、哺乳類動物由来のＷｎｔタンパク質であることが好ましい。哺乳類動物のＷｎｔタンパク質としては、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、及びＷｎｔ１６等が挙げられる。中でもＷｎｔ３ａが好ましく、Ｗｎｔ３ａはアファミンとの複合体であることがより好ましい。
【００８５】
Ｗｎｔシグナル増強剤としてＣＨＩＲ９９０２１を用いる場合、培地中に含まれるその終濃度は、０．１μＭ〜３０μＭが好ましく、０．５μＭ〜１０μＭがより好ましく、１μＭ〜５μＭが更に好ましい。上記の数値の範囲内であると、神経上皮細胞を含んだ脳胞の誘導効率が向上するため、好ましい。
【００８６】
Ｗｎｔシグナル増強剤としてＷｎｔ３ａを用いる場合、培地中に含まれるその終濃度は、０．１ｎｇ／ｍＬ〜２０ｎｇ／ｍＬが好ましく、０．５ｎｇ／ｍＬ〜１５ｎｇ／ｍＬがより好ましく、１ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬが更に好ましい。上記の数値の範囲内であると、神経上皮細胞を含んだ脳胞の誘導効率が向上するため、好ましい。
【００８７】
第１の培地は、ＴＧＦ−βファミリーシグナル伝達経路阻害物質を更に含むことができる。ＴＧＦ−βファミリーシグナル伝達経路阻害物質の詳細については上述したものと同様である。ＴＧＦ−βファミリーシグナル伝達経路阻害物質として、ＳＢ４３１５４２を用いる場合、培地中の終濃度で、０．５μＭ〜１０μＭであることが好ましく、０．７５μＭ〜５μＭであることがより好ましく、１μＭ〜３μＭであることが更に好ましい。
【００８８】
神経外胚葉マーカー陽性の細胞凝集塊の第１の培地中での培養は、終脳マーカー陽性の脳オルガノイドを得るのに必要な期間実施される。終脳マーカーについては上述したものと同様である。
【００８９】
例えば、第１の培地がＷｎｔシグナル増強剤及びＴＧＦ−βファミリーシグナル伝達経路阻害物質を含み、Ｗｎｔシグナル増強剤がＷｎｔ３ａ及びＣＨＩＲ９９０２１であり、ＴＧＦ−βファミリーシグナル伝達経路阻害物質がＳＢ４３１５４２である場合、神経外胚葉マーカー陽性の細胞凝集塊の第１の培地中での培養期間は、３日〜１４日が好ましく、４日〜１２日がより好ましく、５日〜１０日が更に好ましく、６日〜８日が特に好ましい。
【００９０】
《細胞外マトリクス成分を実質的に含まない培地中で培養する工程》
本実施形態の製造方法は、細胞外マトリクス成分を実質的に含まない培地（以下、「第２の培地」ともいう。）中で培養する工程を有することができる。具体的には、神経外胚葉マーカー陽性の細胞凝集塊を第１の培地中で培養して得られた細胞凝集塊を、細胞外マトリクス成分を実質的に含まない培地中で培養する工程を更に含むことが好ましい。前記工程を有することで、終脳マーカー陽性の細胞に加え、前脳マーカー陽性の細胞及び終脳部分様組織マーカー陽性の細胞を含む細胞凝集塊（脳オルガノイド）を得ることができる。前記培養は浮遊培養で行うことが好ましい。
【００９１】
浮遊培養中の細胞凝集塊では、細胞と細胞が面接着する。浮遊培養中の細胞凝集塊では、細胞−基質間結合が培養器材等との間にはほとんど形成されないか、あるいは、形成されていてもその寄与が小さい。一部の態様では、浮遊培養中の細胞凝集塊では、内在の細胞−基質間結合が凝集塊の内部に存在するが、培養器材等との間には細胞−基質間結合がほとんど形成されないか、又は、形成されていてもその寄与が小さい。
【００９２】
浮遊培養を行う際に用いられる培養器は、「浮遊培養する」ことが可能なものであれば特に限定されず、当業者であれば適宜決定することが可能である。このような培養器としては、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、培養皿（ディッシュ）、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、スピナーフラスコ、三角フラスコ、ローラーボトル等が挙げられる。
【００９３】
これらの培養器は、浮遊培養を可能とするために、細胞非接着性であることが好ましい。細胞非接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、基底膜標品、ラミニン、エンタクチン、コラーゲン、ゼラチン等の細胞外マトリクス等、又は、ポリリジン、ポリオルニチン等の高分子等によるコーティング処理、又は、正電荷処理等の表面加工）されていないもの等を使用できる。細胞非接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を低下させる目的で人工的に処理（例えば、ＭＰＣポリマー等の超親水性処理、タンパク低吸着処理等）されたもの等を使用できる。スピナーフラスコ、ローラーボトル、撹拌羽つきの小型バイオリアクター等を用いて撹拌してもよい。培養器の培養面は、平底でもよいし、凹凸があってもよい。
【００９４】
浮遊培養は、高酸素分圧条件下で行うことが好ましい。高酸素分圧条件下で浮遊培養することにより、脳オルガノイドに含まれる脳室帯の長期間の維持培養が達成され、終脳マーカー陽性の細胞だけでなく、少なくとも、前脳マーカー陽性の細胞及び終脳部分様組織マーカー陽性の細胞から選ばれる１種以上の細胞を有する細胞凝集塊の形成が可能となる。
【００９５】
高酸素分圧条件とは、空気中の酸素分圧（２０％）を上回る酸素分圧条件を意味する。高酸素分圧条件として、３０％〜６０％で培養することも可能である。
【００９６】
第２の培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ１０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９培地、Ｅａｇｌｅ  ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ハム培地、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、これらの混合培地等、動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。
【００９７】
第２の培地は、Ｎ２サプリメント、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ、血清、血清代替物、ヘパリン等を更に含有していてもよい。血清代替物については上述したものと同様である。
【００９８】
第２の培地は、細胞外マトリクス成分を実質的に含まない。ここで、「細胞外マトリクス成分を実質的に含まない」とは、第２の培地に細胞外マトリクス成分を意図的に添加しないことを意味し、第１の培地に添加した細胞外マトリクス成分の一部又は全部が第２の培地中に混入すること、第２の培地中に脳オルガノイド自体が産生する細胞外マトリクス成分が含まれること等は許容される。一態様において、第２の培地における細胞外マトリクス成分の濃度は、第２の培地とマトリゲルとを合わせた体積を１００体積％として、１体積％以下であることが好ましく、０．５体積％以下であることがより好ましく、０．１体積％以下であることが更に好ましい。
【００９９】
第２の培地が細胞外マトリクス成分を実質的に含まないことにより、終脳マーカー陽性の細胞だけでなく、少なくとも、前脳マーカー陽性の細胞及び終脳部分様組織マーカー陽性の細胞のいずれか１種以上の細胞を有する細胞凝集塊を製造することができる。
【０１００】
第２の培地中での培養期間は、７〜１５４日が好ましく、１４〜１４７日がより好ましく、２１日〜１４０日が更に好ましい。第２の培地中で７７日以上培養すると、大脳皮質の階層構造（インサイド−アウトパターン）が明瞭な脳オルガノイドを得やすくなる傾向にある。
【０１０１】
［脳オルガノイド］
１実施形態において、本発明は、本実施形態の脳オルガノイドの製造方法により製造された脳オルガノイドを提供する。本実施形態の脳オルガノイドと、本実施形態の脳オルガノイドの製造方法とは異なる製造方法により製造された脳オルガノイドは、遺伝子発現パターン等に相違が存在する可能性がある。しかしながら、そのような相違が存在するか否かは定かではなく、また、そのような相違を特定して、遺伝子発現パターン等により本実施形態の脳オルガノイドを特定するためには、著しく多くの試行錯誤を重ねることが必要であり、実質的に不可能である。したがって、本実施形態の脳オルガノイドは、上述した製造方法により製造されたことにより特定することが実際的であるといえる。
【０１０２】
実施例において後述するように、本実施形態の脳オルガノイドは、神経幹細胞・神経前駆細胞マーカーであるＰＡＸ６、大脳皮質の第Ｖ層マーカーであるＣＴＩＰ２、大脳皮質の第ＩＩ/ＩＩＩ層マーカーであるＳＡＴＢ２について免疫染色を行った場合に、インサイド−アウトパターンが認められる。また、長期培養することで、本実施形態の脳オルガノイドは、アストロサイトマーカーであるＳ１００βやＧＦＡＰ陽性細胞を有することを免疫染色で確認できる。
【０１０３】
［被験物質の毒性・薬効評価方法及びキット］
１実施形態において、本発明は、本実施形態の脳オルガノイドに被験物質を接触させることと、前記被験物質が前記脳オルガノイドに及ぼす影響を検定することと、を含む、被験物質の毒性・薬効評価方法を提供する。
【０１０４】
本実施形態の方法により、被験物質の脳に対する薬効評価を再現性よく行うことが可能となる。また、ヒト由来の脳オルガノイドを用いることにより、被験物質のヒトにおける薬効を正確に評価することが可能となる。
【０１０５】
被験物質としては、天然化合物ライブラリ、合成化合物ライブラリ、及び既存薬ライブラリ等が挙げられる。
【０１０６】
被験物質が脳オルガノイドに及ぼす影響の検定方法としては、被験物質の存在下及び非存在下における、直径の測定、形態の解析、細胞生存率の解析、遺伝子発現パターンの解析、切片の免疫染色、及び神経活動の測定等が挙げられる。
【０１０７】
［神経系細胞又は神経組織の障害に基づく疾患の治療薬及び治療用医薬組成物］
本実施形態の脳オルガノイドは、例えば、アルツハイマー病、小頭症、自閉症等の神経系細胞又は神経組織の障害に基づく疾患の患者の脳に移植して疾患を治療する、治療薬として利用することができる。
【０１０８】
また、本実施形態の治療薬は、本実施形態の脳オルガノイドを有効成分として含有し、脳オルガノイドを懸濁する緩衝液、神経系細胞又は神経組織の障害に基づく疾患に対する既存の治療薬等を更に含む、治療用医薬組成物の形態に調製されていてもよい。ここで、「有効成分として含有する」とは、脳オルガノイドを、神経系細胞又は神経組織の障害に基づく疾患の治療効果が得られる程度の量含有することを意味し、その含有量は特に限定されない。
【実施例】
【０１０９】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。【０１１０】
［実験例１］
ヒトｉＰＳ細胞（ＰＣｈｉＰＳ７７１株、Ｌｏｔ．Ａ０１ＱＭ２８、リプロセル社製）を、「Nakagawa M., et al., A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells, Scientific Reports, 4, 3594, 2014」に記載の方法に準じてフィーダーフリー培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０２Ｎ（味の素社製）、又はフィーダーフリー足場にはｉＭａｔｒｉｘ−５１１（ニッピ社製）を用いた。【０１１１】
具体的な拡大培養操作としては、まず６０〜８０％コンフルエント（培養面積の６〜８割が細胞に覆われる程度）になったヒトｉＰＳ細胞（ＰＣｈｉＰＳ７７１株、Ｌｏｔ．Ａ０１ＱＭ２８、リプロセル社製）をリン酸緩衝生理食塩水（以下「ＰＢＳ」と略す。）にて洗浄後、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて単一細胞へ分散した。その後、前記単一細胞へ分散されたヒトｉＰＳ細胞を、ｉＭａｔｒｉｘ−５１１（ニッピ社製）にてコートしたプラスチック培養ディッシュに播種し、Ｙ２７６３２（ＲＯＣＫ阻害物質、終濃度１０μＭ）を添加した、ＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０２Ｎ培地にてフィーダーフリー培養した。前記プラスチック培養ディッシュとして、６０ｍｍ  ｄｉｓｈ（イワキ社製、細胞培養用）を用い、前記単一細胞へ分散されたヒトｉＰＳ細胞の播種細胞数は３×１０４個とした。【０１１２】
細胞を播種してから１日後に、Ｙ２７６３２を含まないＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０２Ｎ培地に交換した。以降、１〜２日に一回Ｙ２７６３２を含まないＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０２Ｎ培地にて培地交換した。その後、細胞を播種してから６日後に８０％コンフルエントになった。図１は、細胞を播種してから７日後のｉＰＳ細胞を明視野で観察した顕微鏡写真を示す。【０１１３】
［実験例２］
８０％コンフルエントのヒトｉＰＳ細胞（ＰＣｈｉＰＳ７７１株、Ｌｏｔ．Ａ０１ＱＭ２８、リプロセル社製）を、Ｙ２７６３２（ＲＯＣＫ阻害物質、１０μＭ）存在下で、２時間処理し、ヒトｉＰＳ細胞を得た。【０１１４】
前記２時間処理後のヒトｉＰＳ細胞を、細胞分散液（製品名「ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いてピペッティング操作により単一細胞処理した。単一細胞にしたヒトｉＰＳ細胞を非細胞接着性の９６穴培養プレート（製品名「ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ  ９６Ｖ底プレート」、住友ベークライト社製）の１ウェルあたり２×１０４個になるように１００μＬの凝集用培地中、３７℃、容器内に５体積％ＣＯ２存在下で浮遊培養した。【０１１５】
凝集用培地としては、ＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０２Ｎ（味の素社製）に、Ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、希釈濃度２００倍）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ナカライテスク社製、希釈濃度１００倍）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、希釈濃度１００倍）、１×２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、希釈濃度１０００倍）、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（シグマ社製、終濃度２μＭ）、Ａ−８３−０１（終濃度２μＭ）を添加したものを用いた。【０１１６】
浮遊培養開始時（培養０日目、以下、特に断らない限り、培養日数は、浮遊培養開始時からの培養日数で表す。）に、前記凝集用培地にＹ２７６３２（終濃度３０μＭ）を添加した。また、浮遊培養開始後１日目に、前記凝集用培地と同じ組成の培地にＹ２７６３２（終濃度１０μＭ）を含んだ培地を１５０μＬ加え、浮遊培養開始後７日目まで培地交換せずに浮遊培養を続けた。図２は、浮遊培養開始後７日目の細胞凝集塊を、倒立顕微鏡（オリンパス社）で明視野観察した結果を示す顕微鏡写真である。【０１１７】
浮遊培養開始後７日目の細胞凝集塊を免疫染色し、神経外胚葉マーカーの発現を検討した。具体的には、細胞凝集塊を、４質量％パラホルムアルデヒド水溶液で固定後、スクロース溶液で置換し、Ｌｅｉｃａ  ＣＭ３０５０  Ｓ（Ｌｅｉｃａ社製）を用いて凍結切片を作製した。続いて、これらの凍結切片について、神経外胚葉マーカーを免疫染色した。【０１１８】
神経外胚葉マーカーとしては、βＩＩＩ−ＴＵＢＵＬＩＮを検討した。その結果、浮遊培養開始後７日目の細胞凝集塊は、神経外胚葉マーカー陽性であることが明らかとなった。【０１１９】
［実験例３］
実験例２における浮遊培養開始後７日目に、各ウェルから凝集用培地を２３０μＬ取り除いた。続いて、第１の培地を１５０μＬ／ウェルずつ添加し、細胞外マトリクスとその他成分が均一に分散するように氷浴上で混合し、３７℃、容器内に５体積％ＣＯ２存在下で攪拌せずに浮遊培養した。【０１２０】
第１の培地としては、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に、１×Ｎ２  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、希釈濃度２００倍）、Ｈｅｐａｒｉｎ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｓａｌｔ（シグマ社製、終濃度１０μｇ／ｍＬ）、Ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、希釈濃度２００倍）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ナカライテスク社、希釈濃度１００倍）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、希釈濃度１００倍）、Ｗｎｔ−３ａ（Ｈｕｍａｎ、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ、Ｒ＆Ｄシステムズ社製、終濃度４ｎｇ／ｍＬ）、ＣＨＩＲ９９０２１（Ａｘｏｎ社製、終濃度１μＭ）、及びＳＢ−４３１５４２（シグマ社製、終濃度１μＭ）を添加し、更に、２体積％、１０体積％、３０体積％又は５０体積％のマトリゲル（コーニング社製）を添加した、細胞外マトリックスの含有濃度が異なる第１の培地を各種準備した。【０１２１】
図３は、実験例３の浮遊培養開始後１４日目の各細胞凝集塊を明視野観察した結果を示す顕微鏡写真である。【０１２２】
続いて、実験例３における浮遊培養開始後１４日目の各細胞凝集塊について、実験例２と同様にして凍結切片を作製し、免疫染色し、脳マーカーを評価した。【０１２３】
具体的には、前脳及び終脳マーカーであるＦＯＸＧ１（抗ＦＯＸＧ１抗体、ＡＢＣＡＭ社、ウサギ）、幼弱な神経細胞マーカーであるβＩＩＩ−ＴＵＢＵＬＩＮ（抗βＩＩＩ−ＴＵＢＵＬＩＮ抗体、ＳＩＧＭＡ社、マウス）、神経幹細胞及び神経前駆細胞マーカーであるＰＡＸ６（抗ＰＡＸ６抗体、ＭＢＬ社、ラビット）の発現を検討した。免疫染色後の各試料を、共焦点顕微鏡（ＺＥＩＳＳ社製）を用いて蛍光顕微鏡観察した。【０１２４】
図４及び図５は、マトリゲル濃度３０体積％で培養した細胞凝集塊の免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図４中、「ＤＡＰＩ」はＤＡＰＩで細胞凝集塊の凍結切片を染色した結果であることを示し、「βＩＩＩ−ＴＵＢＵＬＩＮ」は抗βＩＩＩ−ＴＵＢＵＬＩＮ抗体で細胞凝集塊の凍結切片を染色した結果であることを示し、「ＰＡＸ６」は抗ＰＡＸ６抗体で細胞凝集塊の凍結切片を染色した結果であることを示し、「ＭＥＲＧＥ」は上記の結果を合成した結果であることを示す。【０１２５】
図５中、「ＤＡＰＩ」と「ＭＥＲＧＥ」は図４におけるものと同様の意味を示し、「ＳＯＸ２」は抗ＳＯＸ２抗体で細胞凝集塊の凍結切片を染色した結果であることを示し、「ＦＯＸＧ１」は抗ＦＯＸＧ１抗体で細胞凝集塊の凍結切片を染色した結果であることを示す。【０１２６】
その結果、マトリゲル濃度３０体積％で培養した細胞凝集塊（実験例３の浮遊培養開始後１４日目）は、ＦＯＸＧ１、βＩＩＩ−ＴＵＢＵＬＩＮ、ＰＡＸ６が陽性であり、少なくとも前脳及び終脳マーカー陽性の脳オルガノイドであることが明らかとなった。【０１２７】
［実験例４］
実験例３の第１の培地において、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）の代わりにＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０２Ｎ（味の素社製）を用いた点以外は実験例３と同様のマトリゲルを濃度５０体積％含有する培地（実験例４の第１の培地）を準備し実験例２の浮遊培養開始後７日目の細胞凝集塊を培養した。【０１２８】
図６は、浮遊培養開始後７日目、９日目、１１日目及び１４日目の各細胞凝集塊を明視野観察した結果を示す顕微鏡写真である。図７は、図６の写真から各細胞凝集塊の二次元投影面積を計測した結果を示すグラフである。【０１２９】
図６及び図７中、「ＤＭＥＭ  Ｆ１２」は、マトリゲル濃度５０体積％の実験例３の第１の培地を用いた結果であり、「ＡＫ０２Ｎ」は、実験例４の第１の培地を用いた結果である。【０１３０】
実験例３と同様に実験例４の第１の培地を用いて培養した細胞凝集塊についても、実験例３と同様に、凍結切片を作製し、免疫染色し、脳マーカーを評価した。その結果、実験例４の第１の培地を用いて培養した細胞凝集塊も、ＦＯＸＧ１、βＩＩＩ−ＴＵＢＵＬＩＮ、ＰＡＸ６が陽性であり、少なくとも前脳及び終脳マーカー陽性の脳オルガノイドであることが明らかとなった。【０１３１】
［実験例５］
実験例３において、細胞外マトリクスの含有濃度が異なる各種第１の培地で培養した培養１４日目の各細胞凝集塊を各ウェルから回収し、１０ｍＬのＰＢＳが入ったＦａｌｃｏｎ（登録商標）コニカルチューブ５０ｍＬ（コーニング社製）に移した。続いて、５回転倒混和し、上清を除去することにより、マトリゲル（細胞外マトリクス）を除去した。【０１３２】
続いて、Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）コニカルチューブ５０ｍＬから各細胞凝集塊を回収し、３０ｍＬシングルユースバイオリアクターに移した。続いて、第２の培地を２０ｍＬ加え、撹拌を行いながら浮遊培養を開始した。撹拌速度は５０ｒｐｍに設定し、培地交換は３〜４日に１回行った。【０１３３】
第２の培地としては、細胞外マトリクスを含有しない培地を用いた。具体的には、第２の培地として、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に、１×Ｎ２  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、希釈濃度２００倍）、Ｂ−２７  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、希釈濃度１００倍）、１×Ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、希釈濃度２００倍）、１×Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ナカライテスク社製、希釈濃度１００倍）、１×２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、希釈濃度１０００倍）、及びＩｎｓｕｌｉｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｈｕｍａｎ、ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ、和光純薬社製、２．５μｇ／ｍＬ）を添加したものを用いた。【０１３４】
浮遊培養開始後４０日目及び７０日目の各細胞凝集塊について、実験例３と同様に、凍結切片を作製し、免疫染色し、脳マーカーを評価した。具体的には、神経幹細胞・神経前駆細胞マーカーであるＰＡＸ６（抗ＰＡＸ６抗体、ヒツジ）、大脳皮質の第Ｖ層マーカーであるＣＴＩＰ２（抗ＣＴＩＰ２抗体、ＡＢＣＡＭ社、ラット）、大脳皮質の第ＩＩ／ＩＩＩ層マーカーであるＳＡＴＢ２（抗ＳＡＴＢ２抗体、、マウス）について免疫染色を行い、共焦点顕微鏡（ＺＥＩＳＳ社製）を用いて蛍光顕微鏡観察した。【０１３５】
図８は、マトリゲル濃度が異なる各細胞凝集塊を、浮遊培養開始後４０日目に明視野観察した結果を示す顕微鏡写真である。その結果、マトリゲルの濃度が高くなるにつれ、細胞凝集塊のサイズが大きくなることが明らかとなった。また、マトリゲル濃度が１０体積％以上で、神経管様な構造体を有する凝集体が形成できることが明らかとなった。【０１３６】
図９は、浮遊培養開始後４０日目に、マトリゲル濃度が５０体積％の第１の培地を用いて得られた細胞凝集塊から凍結切片を作製し、免疫染色し、脳マーカーを評価した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。その結果、浮遊培養開始後４０日目に得られた細胞凝集塊は、神経管様構造を有し、神経幹細胞・神経前駆細胞マーカーであるＰＡＸ６陽性の細胞密度が高い領域が存在することが明らかとなった。また、ＰＡＸ６陽性の細胞密度が高い領域の外側には、大脳皮質の第Ｖ層マーカーであるＣＴＩＰ２陽性細胞が配置されているものの、大脳皮質の第ＩＩ/ＩＩＩ層マーカーであるＳＡＴＢ２陽性細胞は観察されなかった。以上の結果より、得られた細胞凝集塊は、少なくとも神経幹細胞・神経前駆細胞及び大脳皮質の第Ｖ層マーカー陽性の脳オルガノイドであることが明らかとなった。【０１３７】
なお、図９中、「ＤＡＰＩ」はＤＡＰＩで染色した結果であることを示し、「ＳＡＴＢ２」は抗ＳＡＴＢ２抗体で染色した結果であることを示し、「ＰＡＸ６」は抗ＰＡＸ６抗体で染色した結果であることを示し、「ＣＴＩＰ２」は抗ＣＴＩＰ２抗体で染色した結果であることを示し、「ＭＥＲＧＥ」は上記の結果を合成した結果であることを示す。以下、図１０〜１５についても同様である。【０１３８】
図１０は、浮遊培養開始後４０日目に、マトリゲル濃度が３０体積％の第１の培地を用いて得られた細胞凝集塊から凍結切片を作製し、免疫染色し、脳マーカーを評価した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。その結果、浮遊培養開始後４０日目に得られた細胞凝集塊は、神経管様構造を有し、神経幹細胞・神経前駆細胞マーカーであるＰＡＸ６陽性の細胞密度が高い領域が存在することが明らかとなった。また、ＰＡＸ６陽性の細胞密度が高い領域の外側には、大脳皮質の第Ｖ層マーカーであるＣＴＩＰ２陽性細胞が配置されているものの、大脳皮質の第ＩＩ／ＩＩＩ層マーカーであるＳＡＴＢ２陽性細胞は観察されなかった。以上の結果より、得られた細胞凝集塊は、少なくとも神経幹細胞・神経前駆細胞及び大脳皮質の第Ｖ層マーカー陽性の脳オルガノイドであることが明らかとなった。【０１３９】
図１１は、浮遊培養開始後４０日目に、マトリゲル濃度が１０体積％の第１の培地を用いて得られた細胞凝集塊から凍結切片を作製し、免疫染色し、脳マーカーを評価した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。その結果、浮遊培養開始後４０日目に得られた細胞凝集塊は、神経管様構造を有し、神経幹細胞・神経前駆細胞マーカーであるＰＡＸ６陽性の細胞密度が高い領域が存在することが明らかとなった。また、ＰＡＸ６陽性の細胞密度が高い領域の外側には、大脳皮質の第Ｖ層マーカーであるＣＴＩＰ２陽性細胞が配置されているものの、大脳皮質の第ＩＩ/ＩＩＩ層マーカーであるＳＡＴＢ２陽性細胞は観察されなかった。以上の結果より、得られた細胞凝集塊は、少なくとも神経幹細胞・神経前駆細胞及び大脳皮質の第Ｖ層マーカー陽性の脳オルガノイドであることが明らかとなった。【０１４０】
図１２は、浮遊培養開始後４０日目に、マトリゲル濃度が２体積％の第１の培地を用いて得られた細胞凝集塊から凍結切片を作製し、免疫染色し、脳マーカーを評価した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。その結果、浮遊培養開始後４０日目に得られた細胞凝集塊は、神経幹細胞・神経前駆細胞マーカーであるＰＡＸ６陽性の細胞がマトリゲル濃度１０〜５０体積％の細胞凝集塊に比べ、少なかった。また、大脳皮質の第Ｖ層マーカーであるＣＴＩＰ２陽性細胞、大脳皮質の第ＩＩ／ＩＩＩ層マーカーであるＳＡＴＢ２陽性細胞は観察されなかった。以上の結果より、得られた細胞凝集塊は、少なくとも神経幹細胞・神経前駆細胞及び大脳皮質の第Ｖ層マーカー陽性の脳オルガノイドであることが明らかとなった。【０１４１】
図１３は、浮遊培養開始後７０日目に、マトリゲル濃度が５０体積％の第１の培地を用いて得られた細胞凝集塊から凍結切片を作製し、免疫染色し、脳マーカーを評価した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。その結果、浮遊培養開始後７０日目に得られた細胞凝集塊は、神経管様構造を有し、神経幹細胞・神経前駆細胞マーカーであるＰＡＸ６陽性の細胞密度が高い領域が存在することが明らかとなった。また、ＰＡＸ６陽性の細胞密度が高い領域の外側には、大脳皮質の第Ｖ層マーカーであるＣＴＩＰ２陽性細胞層が存在し、さらにその外側には大脳皮質の第ＩＩ／ＩＩＩ層マーカーであるＳＡＴＢ２陽性細胞が配置されており、大脳皮質様の階層構造が形成されたことが示された。以上の結果より、得られた細胞凝集塊は、少なくとも神経幹細胞・神経前駆細胞及び大脳皮質の第Ｖ層、並びに大脳皮質の第ＩＩ/ＩＩＩ層マーカー陽性の脳オルガノイドであることが明らかとなった。【０１４２】
図１４は、浮遊培養開始後７０日目に、マトリゲル濃度が３０体積％の第１の培地を用いて得られた細胞凝集塊から凍結切片を作製し、免疫染色し、脳マーカーを評価した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。その結果、浮遊培養開始後７０日目に得られた細胞凝集塊は、神経管様構造を有し、神経幹細胞・神経前駆細胞マーカーであるＰＡＸ６陽性の細胞密度が高い領域が存在することが明らかとなった。また、ＰＡＸ６陽性の細胞密度が高い領域の外側には、大脳皮質の第Ｖ層マーカーであるＣＴＩＰ２陽性細胞層が存在し、さらにその外側には大脳皮質の第ＩＩ／ＩＩＩ層マーカーであるＳＡＴＢ２陽性細胞が配置されており、大脳皮質様の階層構造が形成されたことが示された。以上の結果より、得られた細胞凝集塊は、少なくとも神経幹細胞・神経前駆細胞及び大脳皮質の第Ｖ層、並びに大脳皮質の第ＩＩ/ＩＩＩ層マーカー陽性の脳オルガノイドであることが明らかとなった。【０１４３】
図１５は、浮遊培養開始後７０日目に、第マトリゲル濃度が１０体積％の第１の培地を用いて得られた細胞凝集塊から凍結切片を作製し、免疫染色し、脳マーカーを評価した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。その結果、浮遊培養開始後７０日目に得られた細胞凝集塊は、神経管様構造を有し、神経幹細胞・神経前駆細胞マーカーであるＰＡＸ６陽性の細胞密度が高い領域が存在することが明らかとなった。また、ＰＡＸ６陽性の細胞密度が高い領域の外側には、大脳皮質の第Ｖ層マーカーであるＣＴＩＰ２陽性細胞が配置されていた。一方、大脳皮質の第ＩＩ／ＩＩＩ層マーカーであるＳＡＴＢ２陽性細胞はほとんど観察されなかった。以上の結果より、得られた細胞凝集塊は、少なくとも神経幹細胞・神経前駆細胞及び大脳皮質の第Ｖ層マーカー陽性の脳オルガノイドであることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１４４】
本発明によれば、終脳マーカー陽性の脳オルガノイドの製造方法を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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