(57)【要約】  本開示は、生体サンプルのラベル化方法であって、当該方法は、  （a）細胞含有生体サンプルに固定化剤を適用する工程、および  （b）前記細胞含有生体サンプルにラベル化剤を適用する工程、（工程(a)と工程(b)は、いずれを先に行ってもよく、工程(a)と工程(b)を同時に行ってもよい。）を含み、  ここで、  前記ラベル化剤は、細胞表面受容体に対するリガンド、標識物質及び固定化剤と反応する少なくとも１種の反応性基を有し、  前記細胞含有生体サンプルに含まれる一部の細胞は、前記細胞表面受容体を含み、  前記細胞表面受容体は、前記固定化剤と反応する少なくとも１種の反応性基とリガンド結合部位を有し、  前記固定化剤は、前記ラベル化剤の反応性基及び前記細胞表面受容体の反応性基と反応して共有結合を形成し、それにより前記ラベル化剤と前記細胞表面受容体を連結する、生体サンプルのラベル化方法を提供するものである。
2019168125.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体サンプルのラベル化方法であって、当該方法は、
（a）細胞含有生体サンプルに固定化剤を適用する工程、および
（b）前記細胞含有生体サンプルにラベル化剤を適用する工程、
を含み、
ここで、
工程(a)と工程(b)は、いずれを先に行ってもよく、工程(a)と工程(b)を同時に行ってもよく、
前記ラベル化剤は、細胞表面受容体に対するリガンド、標識物質及び固定化剤と反応する少なくとも１種の反応性基を有し、
前記細胞含有生体サンプルに含まれる一部の細胞は、前記細胞表面受容体を含み、
前記細胞表面受容体は、前記固定化剤と反応する少なくとも１種の反応性基とリガンド結合部位を有し、
前記固定化剤は、前記ラベル化剤の反応性基及び前記細胞表面受容体の反応性基と反応して共有結合を形成し、それにより前記ラベル化剤と前記細胞表面受容体を連結する、生体サンプルのラベル化方法。
【請求項２】
前記固定化剤との共有結合に関与するラベル化剤の反応性基の数と前記細胞表面受容体の反応性基の数は同じである、請求項１に記載の生体サンプルのラベル化方法。
【請求項３】
前記細胞表面受容体の反応性基が、NH2、OH及びSHからなる群から選ばれ、前記ラベル化剤の反応性基が、NH2、NHNH2、CONHNH2、OH及びSHからなる群から選ばれる、請求項１〜２のいずれか１項に記載の生体サンプルのラベル化方法。
【請求項４】
前記工程(a)が、前記工程(b)と同時に行なわれる、請求項１〜３のいずれか1項に記載の生体サンプルのラベル化方法。
【請求項５】
前記固定化剤で予め固定された細胞含有生体サンプルを提供すること、または、当該固定化剤で予め固定された細胞含有生体サンプルとともに前記固定化剤をさらに共存させることのいずれかによって、前記工程(a)が達成され、
前記工程(b)において、前記固定化剤で固定された生体サンプルと前記ラベル化剤が反応する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の生体サンプルのラベル化方法。
【請求項６】
前記細胞表面受容体の反応性基、前記ラベル化剤の反応性基と前記固定化剤の反応が、可逆的である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の生体サンプルのラベル化方法。
【請求項７】
細胞表面受容体が、神経伝達物質の受容体である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の生体サンプルのラベル化方法。
【請求項８】
前記固定化剤が、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、グリオキサール、メチルグリオキサール及びスベリイミド酸ジメチルからなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項１〜７のいずれか1項に記載の生体サンプルのラベル化方法。
【請求項９】
前記細胞含有生体サンプルが、脳、心臓、肝臓、胆嚢、腎臓、副腎、膵臓、肺、甲状腺、食道、胃、十二指腸、小腸、大腸、尿管、膀胱、前立腺、子宮、乳房、気管支、血管、リンパ管、皮膚、骨、関節、筋肉、口腔粘膜、鼻粘膜からなる群から選ばれる少なくとも１種を含む、請求項１〜８のいずれか1項に記載の生体サンプルのラベル化方法。
【請求項１０】
ラベル化剤でラベル化された細胞含有生体サンプルであって、前記ラベル化剤は、生体サンプルの細胞表面受容体と固定化剤により共有結合で連結されている、ラベル化された細胞含有生体サンプル。
【請求項１１】
細胞表面受容体に対するリガンド、標識物質及び固定化剤と反応する少なくとも１種の反応性基を有し、前記固定化剤により細胞含有生体サンプルの細胞表面受容体と連結するために使用される、ラベル化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、生体サンプルのラベル化方法、ラベル化された細胞含有生体サンプル及びラベル化剤を開示する。
【背景技術】
【０００２】
細胞表面受容体は、細胞認識、シグナル伝達、細胞内外への物質輸送、薬物の作用点として重要であるが、細胞膜に埋め込まれた疎水性のタンパク質であるために分離精製が困難であり、細胞表面受容体に対する抗体を用いて標識することが行われている。【０００３】
生体サンプルの表面に露出した細胞の標識の場合には、抗体を用いた細胞の標識が可能であるが、細胞層が厚い場合、抗体のような大きな分子は深部まで浸透させ難いために、深部の標識は難しかった。【０００４】
特許文献１は、神経伝達物質受容体に対するリガンドと標識基を有する化合物により神経伝達物質受容体を標識する技術を開示しているが、前記化合物を用いた標識は化合物の安定性、組織深部や動物全体の標識の点で改良の余地があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】再表2015/125851
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来技術には上記で例示された課題があるが、組織の深部又は動物全体をラベル化可能であり、長期間保存しても安定な生体内受容体可視化技術を提供することが、本開示により解決され得る課題の一つである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示の一側面としては、以下の生体サンプルのラベル化方法、ラベル化された細胞含有生体サンプル及びラベル化剤（Labeling reagent）が提供される。
項１．  生体サンプルのラベル化方法であって、当該方法は、
（a）細胞含有生体サンプルに固定化剤を適用する工程、および
（b）前記細胞含有生体サンプルにラベル化剤を適用する工程、
（工程(a)と工程(b)は、いずれを先に行ってもよく、工程(a)と工程(b)を同時に行ってもよい。）を含み、
ここで、
前記ラベル化剤は、細胞表面受容体に対するリガンド、標識物質及び固定化剤と反応する少なくとも１種の反応性基を有し、
前記細胞含有生体サンプルに含まれる一部の細胞は、前記細胞表面受容体を含み、
前記細胞表面受容体は、前記固定化剤と反応する少なくとも１種の反応性基とリガンド結合部位を有し、
前記固定化剤は、前記ラベル化剤の反応性基及び前記細胞表面受容体の反応性基と反応して共有結合を形成し、それにより前記ラベル化剤と前記細胞表面受容体を連結する、生体サンプルのラベル化方法。
項２．  前記固定化剤との共有結合に関与するラベル化剤の反応性基の数と前記細胞表面受容体の反応性基の数は同じである、項１に記載の生体サンプルのラベル化方法。
項３．  前記細胞表面受容体の反応性基が、NH2、OH及びSHからなる群から選ばれ、前記ラベル化剤の反応性基が、NH2、NHNH2、CONHNH2、OH及びSHからなる群から選ばれる、項１〜２のいずれか１項に記載の生体サンプルのラベル化方法。
項４．  前記工程(a)が、前記工程(b)と同時に行なわれる、項１〜３のいずれか1項に記載の生体サンプルのラベル化方法。
項５．  前記固定化剤で予め固定された細胞含有生体サンプルを提供すること、または、当該固定化剤で予め固定された細胞含有生体サンプルとともに前記固定化剤をさらに共存させることのいずれかによって、前記工程(a)が達成され、
前記工程(b)において、前記固定化剤で固定された生体サンプルと前記ラベル化剤が反応する、項１〜４のいずれか１項に記載の生体サンプルのラベル化方法。
項６．  前記細胞表面受容体の反応性基、前記ラベル化剤の反応性基と前記固定化剤の反応が、可逆的である、項１〜５のいずれか１項に記載の生体サンプルのラベル化方法。
項７．  細胞表面受容体が、神経伝達物質の受容体である、項１〜６のいずれか１項に記載の生体サンプルのラベル化方法。
項８．  前記固定化剤が、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、グリオキサール、メチルグリオキサール及びスベリイミド酸ジメチルからなる群から選ばれる少なくとも１種である、項１〜７のいずれか1項に記載の生体サンプルのラベル化方法。
項９．  前記細胞含有生体サンプルが、脳、心臓、肝臓、胆嚢、腎臓、副腎、膵臓、肺、甲状腺、食道、胃、十二指腸、小腸、大腸、尿管、膀胱、前立腺、子宮、乳房、気管支、血管、リンパ管、皮膚、骨、関節、筋肉、口腔粘膜、鼻粘膜からなる群から選ばれる少なくとも１種を含む、項１〜８のいずれか1項に記載の生体サンプルのラベル化方法。
項１０．  ラベル化剤でラベル化された細胞含有生体サンプルであって、前記ラベル化剤は、生体サンプルの細胞表面受容体と固定化剤により共有結合で連結されている、ラベル化された細胞含有生体サンプル。
項１１．  細胞表面受容体に対するリガンド、標識物質及び固定化剤と反応する少なくとも１種の反応性基を有し、前記固定化剤により細胞含有生体サンプルの細胞表面受容体と連結するために使用される、ラベル化剤。
【発明の効果】
【０００８】
神経伝達物質などのリガンドを受け取る受容体は、重要な薬剤標的である。【０００９】
本開示の一側面によれば、生体の深部或いは動物全体をラベル化することができるので、例えば、神経伝達物質の受容体のような細胞表面受容体を網羅的にラベル化及び可視化することができる。【００１０】
また、本開示の別の側面によれば、固定化剤で固定された生体サンプルについてラベル化を行うことができるため、例えば、固定化された疾患部位を含む膨大な固定化生体サンプルのストックを活用してこの実施態様でラベル化することにより、疾患と細胞表面受容体との関係を明らかにすることに貢献し得る。【００１１】
また、本開示のさらに別の側面によれば、複数の細胞表面受容体を同時にラベル化できるので、これらの相互の関係を明らかにすることに貢献し得る。本開示の方法によれば、培養神経細胞、脳スライス（brain slice）、脳全体（whole brain）、動物全体（whole animal）などのサンプルの可視化、カルシウムチャネルの可視化などを行うことができる。【００１２】
さらに、本開示のラベル化方法は、通常の免疫染色法と併用可能である。【００１３】
一実施形態による生体サンプルのラベル化は、例えば、がんの形成・転移メカニズムの解明、記憶のメカニズムの解明（脳コネクトーム研究）などに貢献し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、特許文献1に開示されたリガンド指向型化学（Ligand-directed chemistry）を模式的に示す。
【図２】図２は、本開示の１つの例示的な実施形態におけるラベル化の模式図を示す。図２の下欄（a）および（b）は、上欄の反応式との関係で、次のことを模式的に示す：(a)ラベル化剤が分解しない→組織深部に適用可、(b) 組織及び個体の固定化時にラベル化。
【図３】図３は、生細胞のAMPAR (AMPA型グルタミン酸受容体)のラベル化の一例を示す。図３上欄は、試験例１における過程を模式的に示した。図３中欄は、試験例１で使用したラベル化剤の化学構造を示す。丸印で、当該ラベル化剤に含まれる、標識物質を示す。図３下欄は、試験例１で使用したラベル化剤のそれぞれについて、共焦点顕微鏡観察の結果を示す。具体的には、図３下欄（a）は、化合物１（Fluorescein）をラベル化剤として用いた際に得た画像を示す。並置された画像は、AMPARが緑色表示され、その細胞の内側が赤色表示されることでAMPARの存在が可視化された結果を例示している。他方、図３下欄(b)は、化合物１（Alexa 647）をラベル化剤として用いた際に得た画像を示す。並置された画像は、AMPARが赤色表示され、その細胞の内側が緑色表示されることでAMPARの存在が可視化された結果を例示している。
【図４】図４は、(a)生細胞のmGlu1 (代謝型グルタミン酸受容体)のラベル化、(b)GABAAR（GABAA受容体）のラベル化を例示したものである。図４（a）は、その左側に、使用したラベル化剤の化学構造を示し、右側に可視化により得られた画像を示す。当該画像において、赤色で可視化されたmGlu1(細胞表面が着色)、緑色で可視化されたmGlu1発現細胞(細胞全体が着色)が把握される。他方、図４（b）も、その左側に、使用したラベル化剤の化学構造を示し、右側に可視化により得られた画像を示す。当該画像において、赤色で可視化されたGABAAR（細胞表面が着色）、緑色で可視化されたGABAAR発現細胞(細胞全体が着色)が把握される。
【図５】図５は、ラベル化剤（Labeling Reagent）と固定化剤を使用するタイミングの一例を示す模式図である。この図は、プロトコル１および２を例示しており、本開示の技術の手順の柔軟性が示されている。
【図６】図６は、本開示の手法を使用した、小脳スライスにおけるmGlu1の可視化の一例を示す。 図６(a)小脳スライス（厚さ300μm) の可視化の手順と、用いたラベル化剤の化学構造を示す。図６(b)は、小脳スライスにおける可視化した結果の一例を示し、図６(c)は、模式的に示した小脳スライスを示し、図６(d)は、その小脳スライスにおいて、mGlu1は分子層に局在している(矢印は分子層を示す)ことを示している。
【図７】図７は、細胞固定化剤と本開示の一実施形態に係るラベル化の組み換え反応の模式図を示す。
【図８】図８は、海馬神経細胞における本開示の固定化駆動ラベル化方法のプロトコルと結果を示す。赤色はAlexa647が結合したスパインを示し、緑色は免疫染色された樹状突起に存在するMAP2タンパク質を示す。
【図９】図９は、小脳スライスにおける複数の受容体の同時染色の一例を示す。図９上欄は本試験の手順を模式的に示す。図９中欄は、本試験で用いたｍGlu1用ラベル化剤およびAMPAR用ラベル化剤の化学構造を示す。図９下欄には、上述の受容体の機能上の位置づけを示す模式図とともに、当該受容体の染色結果を示した画像（ｍGlu1（FL）、AMPAR(Alexa647)、これらの重ね合わせ（Merge））と、ラベル化剤にインヒビターを併用した場合の画像（＋FITM、＋NBQX、これらの重ね合わせ（Merge）））を示す。
【図１０】図１０は、小脳スライスにおける電位依存性カルシウムチャネル(VDCC: Voltage-dependent Ca2+ channel)に対するラベル化の一例を示す。図１０上欄には、VDCCのサブユニット構成とともに、VDCC用のペプチドによるラベル化剤（peptide-based labeling reagent for VDCC）の立体構造および一次配列を示している。また、図１０下欄には、小脳スライスにおける当該チャネルの可視化した結果（ラベル化剤（Labeling reagent）用いた場合の共焦点顕微鏡）と同様の系で競合阻害剤の存在下で撮像した結果を示す
【図１１】図１１は、全小脳におけるmGlu1へのラベル化のプロトコルと結果を示す。図１１上欄に、当該プロコトルとともに、その処置後に取り出したマウス全小脳の写真を示す。また、図１１下欄には、ラベル化剤の注入点（injection point）から距離（単位ｍｍ）と、スライスした組織切片におけるmGlu1の可視化した結果（画像）との関係性を示した。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本開示の一態様で使用する固定化剤は、組織、臓器の固定に用いられているものを使用することができる。具体的には、例えば、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、グリオキサール、メチルグリオキサール、スベリイミド酸ジメチルなどのスベリイミド酸ジアルキルエステルが挙げられ、これらを1種単独で或いは2種以上を併用して使用することができる。臓器又は組織、動物全体(whole animal)の固定化の具体的な条件(固定化剤の濃度、温度、時間など)は、公知の条件を適用できる。
【００１６】
ラベル化の対象となる細胞表面受容体は、代表的には、細胞膜の外表面にその一部又は全部が露出し、細胞膜外の物質と相互作用し得るものであり、細胞内部例えば核内の受容体は含まない。これらの細胞表面受容体は、細胞認識、シグナル伝達、細胞内外への物質輸送、薬物の作用点として機能し得る。本明細書で使用される場合、細胞表面受容体との用語は、イオンチャネルを含む。イオンチャネルとしては、電位依存性カルシウムチャネル(VDCC: Voltage-dependent Ca2+ channel)、電位依存性カリウムチャネル、電位依存性ナトリウムチャネル、カルシウム活性化型カリウムチャネル、HCN(Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated)チャネル、CNG(cyclic nucleotide-gated)チャネル、電位依存性プロトンチャネル、Two-poreチャネル、内向き整流性カリウムチャネル、酸感受性イオンチャネル(Acid-sensing ion channel; ASIC)、上皮型ナトリウムチャネル(epithelial Na+channel; ENaC)、塩素チャネル、リガンド依存性チャネル（Cys-loopチャネル、グルタミン酸受容体、P2X受容体）などが挙げられる。
【００１７】
本開示における一態様において、蛍光標識される細胞表面受容体としては、任意の受容体、イオンチャネルが標識の対象となり、特に限定されないが、例えば、神経伝達物質の受容体、Gタンパク質共役型受容体（GPCR）、チロシンキナーゼ受容体、電位依存性カルシウムチャネル(VDCC: Voltage-dependent Ca2+ channel)などが挙げられ、具体的には、以下の受容体が挙げられるが、これらに限定されない：
ＧＡＢＡ受容体、ＮＭＤＡＲ１受容体、ＮＧＦ受容体、葉酸受容体、グリシン受容体、セレクチン受容体、エリスロポエチン受容体、グルカゴン受容体、ムスカリン性アセチルコリン受容体（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５）、ニコチン性アセチルコリン受容体、アデノシン受容体（Ａ１、Ａ２Ａ、Ａ２Ｂ、Ａ３）、アドレナリン受容体（α１Ａ、α１Ｂ、α１Ｄ、α２Ａ、α２Ｂ、α２Ｃ、β１、β２、β３）、アンギオテンシン受容体（ＡＴ１、ＡＴ２）、ボンベシン受容体（ＢＢ１、ＢＢ２、ＢＢ３）、ブラジキニン受容体（Ｂ１、Ｂ２）、カルシトニン・アイニリン・ＣＧＲＰ及びアドレノメズリン受容体、カンナビノイド受容体（ＣＢ１、ＣＢ２）、ケモカイン受容体（ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸ３ＣＲ１、ＸＣＲ１）、ケニオタクチックペプチド受容体（Ｃ３ａ、Ｃ５ａ、ｆＭＬＰ）、コレシストキニン及びガストリン受容体（ＣＣＫ１、ＣＣＫ２）、コルチコトロピン放出因子受容体（ＣＲＦ１、ＣＲＦ２）、ドーパミン受容体（Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５）、エンドセリン受容体（ＴＡ、ＥＴＢ）、ガラニン受容体（ＧＡＬ１、ＧＡＬ２、ＧＡＬ３）、グルタミン酸受容体（ｍＧｌｕ１、ｍＧｌｕ２、ｍＧｌｕ３、ｍＧｌｕ４、ｍＧｌｕ５、ｍＧｌｕ６、ｍＧｌｕ７、ｍＧｌｕ８）、グリコプロテインホルモン受容体（ＦＳＨ、ＬＳＨ、ＴＳＨ）、ヒスタミン受容体（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４）、５−ＨＴ（セロトニン）受容体（５−ＨＴ１Ａ、５−ＨＴ１Ｂ、５−ＨＴ１Ｄ、５−ｈｔ１Ｂ、５−ｈｔ１Ｆ、５−ＨＴ２Ａ、５−ＨＴ２Ｆ、５−ＨＴ２Ｃ、５−ＨＴ３、５−ＨＴ４、５−ｈｔ５Ａ、５−ｈｔ５Ｂ、５−ＨＴ６、５−ＨＴ７）、ロイコトリエン受容体（ＢＬＴ、ＣｙｓＬＴ１、ＣｙｓＬＴ２）、リソフォスフォリピッド受容体（ｅｄｇ１、ｅｄｇ２、ｅｄｇ３、ｅｄｇ４）、メラノコルチン受容体（ＭＣ１、ＭＣ２、ＭＣ３、ＭＣ４、ＭＣ５）、メラトニン受容体（ＭＴ１、ＭＴ２、ＭＴ３）、ニューロペプチドＹ受容体：Ｙ１、Ｙ２、Ｙ４、Ｙ５、Ｙ６）、ニューロテンシン受容体（ＮＴＳ１、ＮＴＳ２）、オピオイド受容体（ＤＯＰ、ＫＯＰ、ＭＯＰ、ＮＯＰ）、Ｐ２Ｙ 受容体（Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、Ｐ２Ｙ６、Ｐ２Ｙ１１、Ｐ２Ｙ１２）、プロスタノイド受容体（ＤＰ、ＦＰ、ＩＰ、ＴＰ、ＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３、ＥＰ４）、プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、ＰＡＲ４）、ソマトスタチン受容体（ｓｓｔ１、ｓｓｔ２、ｓｓｔ３、ｓｓｔ４、ｓｓｔ５）、タヒキニン受容体（ＮＫ１、ＮＫ２、ＮＫ３）、チロトロピン放出ホルモン受容体（ＴＲＨ１、ＴＲＨ２）、ウロテンシン−ＩＩ受容体、バソプレシン及びオキシトシン受容体（Ｖ１ａ、Ｖ１ｂ、Ｖ２、ＯＴ）、チロシンリン酸化酵素受容体、インスリン受容体、電位依存性カルシウムチャネル(VDCC: Voltage-dependent Ca2+ channel)及びＥＧＦ受容体。
【００１８】
リガンドとしては、上記の細胞表面受容体のリガンド結合部位に結合するリガンドが挙げられる。リガンドは受容体の本来の結合対象である完全アゴニスト（例えばアセチルコリン受容体に対するアセチルコリン）だけでなく、リガンド結合部位に結合する限り、他のアゴニスト、部分アゴニスト、アンタゴニストなども含まれる。完全アゴニストとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
・ムスカリン性アセチルコリン受容体：アセチルコリン、ムスカリン
・アデノシン受容体：アデノシン、カフェイン
・アドレナリン受容体：アドレナリン、ノルアドレナリン
・GABA受容体：GABA
・アンギオテンシン受容体：アンギオテンシン
・カンナビノイド受容体：大麻成分およびアナンダミド
・コレシストキニン受容体：コレシストキニン
・ドーパミン受容体：ドーパミン
・グルカゴン受容体：グルカゴン
・ヒスタミン受容体：ヒスタミン
・オピオイド受容体：コカイン、モルヒネ、ヘロインなどのアヘン成分および内在性ペプチド性リガンド（エンケファリン、エンドルフィン等）
・セクレチン受容体：セクレチン
・セロトニン受容体：セロトニン
・ソマトスタチン受容体：ソマトスタチン
・ガストリン受容体：ガストリン
・エリスロポエチン受容体：エリスロポエチン
・インスリン受容体
・ニコチン性アセチルコリン受容体：アセチルコリン、ニコチン
・グリシン受容体：神経伝達物質としてのグリシン、ストリキニン
・葉酸受容体(FR)：葉酸
・EGF受容体(EGFR)：上皮成長因子（EGF）
【００１９】
細胞含有生体サンプル（以下、「生体サンプル」と略すことがある）は、生物体（単細胞生物、多細胞生物）自体、多細胞生物体にあってはそれを構成する単位（すなわち、多細胞生物の体を構成する単位であって、形態的に周囲と区別され、当該単位全体として機能を担うもの、例えば、組織（複数の細胞が集合して構成される構造単位）、器官（複数の組織が集合して構成される構造単位）をいう。）であり得る。多細胞生物の例としては、一実施形態において、動物（一般に運動能力と感覚を持つ多細胞生物）が挙げられるが、これらに限定されない。動物には、例えば、哺乳動物が挙げられるが、これらに限定されない。そのような動物に由来する細胞含有生体サンプルとしては、動物自体(whole animal)、動物の組織、器官などが挙げられるが、これらに限定されない。哺乳動物としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、チンパンジーなどが挙げられるが、これらに限定されない。また、特定の実施形態において、そのような哺乳動物としては、ヒト、マウス、ラットが挙げられ、ヒトがさらに好ましい場合もあり得る。一態様において、ラベル化剤を生きた哺乳動物の全身に投与した場合には、全身の細胞表面受容体をラベル化することができ、ラベル化剤を生きた哺乳動物の局所に投与した場合には、その局所投与部位の周辺をラベル化することができる。
【００２０】
本開示の一態様において、２種以上のラベル化剤を生体サンプルに適用した場合、複数の細胞表面受容体を同時に可視化できる。この場合、２種以上のラベル化剤の標識物質は異なる波長の蛍光を有するものが好ましく、２種以上の標識物質の蛍光波長の差は、30nm以上が好ましく、40nm以上がより好ましい。
【００２１】
動物の器官、組織の一例としては、中枢神経系の各部位(小脳、大脳皮質、扁桃体、海馬、線条体、黒質、視床、視床下部、中脳、橋、延髄、脊髄など)、角膜、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、前立腺、睾丸、精巣、卵巣、胎盤、子宮、乳房、歯、骨、関節、骨格筋など、あるいはそれらの一部が挙げられるが、それらに限定されない。組織、器官は、スライスされた切片のような薄いサンプルも含まれるが、本開示の方法を用いれば、厚みのある生体サンプルであっても深部までラベル化することができる場合もある。
【００２２】
標識物質(Fl)としては、例えば、蛍光物質が挙げられるがこれらに限定されない。標識物質のさらなる具体例としては、次のものが挙げられるが、これらに限定されない：ビオチン、5-カルボキシフルオレセインまたは6-カルボキシフルオレセイン(FAM)、VIC、NED、IRD-700/800、Alexa-350、Alexa-405、Alexa-430、Alexa-488、Alexa-500、Alexa-514、Alexa-532、Alexa-546、Alexa-555、Alexa-568、Alexa-594、Alexa-610、Alexa-633、Alexa-647、Alexa-660、Alexa-680、Alexa-700、Alexa-750、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、BODIPY 505/515、Atto390、Atto425、Atto465、Atto488、Atto495、Atto520、Atto532、Atto550、Atto565、Atto590、Atto594、Atto620、Atto633、Atto  647N、Atto655、Atto  RhoG6、Atto  Rho11、Atto  Rho12、Atto  Rho101、BMN-5、BMN-6、CEQ8000  D2、CEQ8000  D3、CEQ8000  D4、DY-480XL、DY-485XL、DY-495、DY-505、DY-510XL、DY-521XL、DY-521XL、DY-530、DY-547、DY-550、DY-555、DY-610、DY-615、DY-630、DY-631、DY-633、DY-635、DY-647、DY-651、DY-675、DY-676、DY-680、DY-681、DY-700、DY-701、DY-730、DY-731、DY-732、DY-750、DY-751、DY-776、DY-780、DY-781、DY-782、臭化エチジウム、アクリジニウム色素、カルバゾール色素、フェノキサジン色素、ポルフィリン色素、ポリメチン色素、PET、フルオレセイン、インチオシアン酸フルオレセイン（FITC）、キサンテン、6-カルボキシ-2’,4’,7’,4,7-ヘキサクロロフルオレセイン(HEX)、6-カルボキシ-1,4-ジクロロ-2’,7’-ジクロロフルオレセイン(TET)、6-カルボキシ-4’,5’-ジクロロ-2’,7’-ジメトキシフルオレセイン(JOE)、N,N,N’,N’-テトラメチル-6-カルボキシローダミン(TAMRA)、6-カルボキシ-X-ローダミン(ROX)、5-カルボキシローダミン-6G(R6G5)、6-カルボキシローダミン-6G(RG6)、ローダミン、ローダミングリーン、ローダミンレッド、ローダミン110、Rhodamin  6G、Oregon green、ウンベリフェロン、イソチオシアン酸エオシン、PE、ATTO655、CypHer5E、Rhordamine B、BODIPY 580/605、Texas Red、California Red、Yakima Yellow、APC、TET、CAL  FluorOrange560、CAL FluorGold540、CAL Fluor RED590、CAL Fluor Red610、CAL Fluor Red635、IRDye700Dx、IRDye800CW、Marina Blue、Pacific Blue、LC Red610、LC Red640、LC Red670、LC Red705、インドシアニングリーン、ユウロピウムやサマリウムなどのランタノイド錯体など。特定の実施形態においては、その標識物質としては、Alexa-488、Oregon green、Alexa-546、Alexa-568、ATTO655、CypHer5Eが好ましい場合もあり得る。
【００２３】
固定化剤と反応するラベル化剤の少なくとも１種の反応性基としては、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＮＨＮＨ２、およびＣＯ−ＮＨＮＨ２が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態においては、その反応性基は、ＮＨ２、またはＣＯ−ＮＨＮＨ２であり、別の実施形態では、その反応性基は、ＮＨ２である。
【００２４】
固定化剤と反応する細胞表面受容体の反応性基としては、ＯＨ、ＳＨ、およびＮＨ２が挙げられる。
【００２５】
ラベル化剤は、細胞表面受容体に対するリガンド（Ｌｇ；ligand）、標識物質（Ｆｌ）及び固定化剤と反応する少なくとも１種の反応性基（●）を有する。ラベル化剤は通常１個のリガンドを有する。
【００２６】
本開示のラベル化剤の例示的実施形態において、リガンド（Ｌｇ）と標識物質（Ｆｌ）は２価の連結基（Ｚ）を介して結合され、前記連結基には反応性基（●）がさらに結合される。
【００２７】
固定化剤と反応する細胞表面受容体の反応性基（図２の「●」）の数（ｎ）は１個であってもよく２個以上（例えば２個、３個又は４個）であってもよい。細胞表面受容体の反応性基（●）の数とラベル化剤の反応性基（●）の数（ｎ）は、通常同じである。これは、固定化剤は細胞表面受容体の反応性基（●）とラベル化剤の反応性基（●）を１対１で連結する機能を有するためである（図２）。
【００２８】
本開示の例示的な実施形態において、ラベル化剤は、例えば下記の式（Ｉ）で表されるものであってもよい。
【００２９】
【化１】
2019168125.tif 000003
【００３０】
（式中、Lgはリガンドを示し、Flは標識物質を示す。●は反応性基を意味する。Ｚは２価の連結基を示す。ｎは１〜４の整数を示す。Ｙａ、Ｙｂは同一又は異なって、ＣＯＮＨ又はＮＨＣＯを示す。）
Ｚで表される２価の連結基は特に限定されず任意の２価の連結基が使用可能である。
【００３１】
Ｚで表される２価の連結基としては、例えば、炭素数２〜２０の直鎖又は分岐を有するアルキレン基、アリーレン基、アラルキレン基、エーテル基、アミノ酸もしくはオリゴペプチドに由来する基又はこれらの組み合わせが挙げられ、これらの基は、１個又は２個以上の２価のヘテロ基（ＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、Ｏ、Ｓ、ＣＯ、ＮＨ）で介在されていてもよい。Ｚで表される２価の連結基の具体例を以下に示す。
【００３２】
【化２】
2019168125.tif 000004
【００３３】
（式中、ｍ１は１〜２０の整数を示し、ｍ２は１〜１０の整数を示す。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、同一又は異なって、タンパク質を構成する２０種の天然アミノ酸の側鎖を示す。）
タンパク質を構成する２０種の天然アミノ酸としては、Glu、Asp、Gln、Asn、Gly、Ala、Ser、Thr、Cys、Met、Leu、Ile、Val、Phe、Tyr、Trp、His、Arg、Lys、Proが挙げられる。
【００３４】
アリーレン基、アラルキレン基は置換基を有していてもよい。置換基としては、アルキル、シクロアルキル、アルコキシ、ハロゲン原子（Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉ）、ＯＨ、ＣＮ、ＮＯ２、ＣＯＯＨ、ＮＨ２、フェニル、ベンジル、アセチルアミノ、アセチル、アセチルオキシ、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ブトキシカルボニル、トリフルオロメチルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
アルキルとしては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、tert−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ヘキシルなどの直鎖状又は分枝鎖状のＣ１−１８アルキルが挙げられる。
【００３６】
シクロアルキルとしては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル及びシクロヘプチルなどのＣ３−１０シクロアルキルが挙げられる。環の一部がヘテロ元素で置換されていたり、置換基を持っていてもよい。
【００３７】
アルコキシとしては、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、tert−ブトキシ、ｎ−ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、ポリエチレングリコール誘導体などの直鎖状又は分枝鎖状のＣ１−１８アルコシキが挙げられる。
【００３８】
本開示のラベル化剤は、以下のScheme A〜Scheme Fに従い合成することができる。
【００３９】
【化３】
2019168125.tif 000005
【００４０】
【化４】
2019168125.tif 000006
【００４１】
（式中、Ｌｇ、Ｆｌ、Ｚ、Ｙａ、Ｙｂ、●、ｎは前記の定義されるとおりである。Ｚ１、Ｚ２は、同一又は異なって２価の連結基を示す。ｎ１は０以上の整数を示し、ｎ２は０以上の整数を示し、ｎ１＋ｎ２＝ｎである。Ｐｒｏは保護基を示す。Ｒは、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、フェノキシ、ベンジルオキシ又はシアノメチルオキシを示す。ｎ３は●がＮＨ２、ＮＨＮＨ２、ＣＯ−ＮＨＮＨ２の場合１であり、●がＯＨ，ＳＨの場合０である。）
Ｐｒｏで表される保護基としては、Ｂｏｃ（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）、Ｃｂｚ（ベンジルオキシカルボニル）、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）、Ａｌｌｏｃ（アリルオキシカルボニル）、Ｔｒｏｃ（２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル）、ＴＭＳ-エチルカルボニル、シアノエチルカルボニルなどが挙げられる。
【００４２】
Scheme A〜Fの最初の反応は、いずれもアミド結合（ＣＯＮＨ）の形成反応である。この反応は、化合物（１，３，５，７，９又は１１）１モルに対し、化合物（２，４，６，８，１０又は１２）を０．８〜１．２モル程度使用し、溶媒中、必要に応じて縮合剤の存在下に室温から溶媒の沸騰する温度において、１〜２４時間程度反応させることにより有利に進行し、式（Ｉａ）、（Ｉｂ）又は（Ｉｄ）の化合物を得る。溶媒としては、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテルなどのエーテル類、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタンなどのハロゲン化炭化水素、ベンゼン、トルエン、キシレンなどの芳香族炭化水素、ヘキサンなどの脂肪族炭化水素、アセトニトリル、メタノール、エタノールなどが挙げられる。縮合剤としては、ＤＣＣ、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）、ＤＩＣ、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、ＤＭＴ−ＭＭなどが挙げられ、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）などを併用してもよい。縮合剤は、化合物（１，３，５，７，９又は１１）１モルに対し、１モルから過剰量使用すればよい。
【００４３】
Scheme B〜Dで得られた式（Ｉａ）の化合物は、スキーム１と同様に脱保護することで、目的とする式（Ｉ）の化合物を得ることができる。
【００４４】
Scheme A，E，Fにおける脱保護反応（Deprotection）は、各保護基の周知の脱保護条件にしたがい脱保護することができる。例えばBoc基は、トリフルオロ酢酸やＨＣｌ−酢酸エチル溶液、ＨＣｌ−ジオキサン溶液などの強酸性条件下脱保護でき、Cbz は、Pd/Cによる水素添加反応、バーチ還元などで脱保護でき、Fmocは、ピペリジンなどの二級アミンによって脱保護でき、Trocは、亜鉛粉末-酢酸などにより脱保護でき、Allocは、パラジウム触媒存在下、アミンなどを加えて脱保護できる。これら以外の保護基も常法にしたがい脱保護できる。
【００４５】
・ラベル化剤による生体サンプルのラベル化方法
受容体を発現した細胞を含む生体サンプルにラベル化剤と固定化剤を作用させることにより生体サンプルをラベル化することができる。
【００４６】
生体サンプルのラベル化方法は、以下の工程(a)、工程(b)を含む。
（a）細胞含有生体サンプルに固定化剤を適用する工程、および
（b）前記細胞含有生体サンプルにラベル化剤を適用する工程、
ここで、工程(a)の次に工程(b)を行ってもよく、工程(b)の次に工程(a)を行ってもよく、工程(a)と工程(b)を同時に行ってもよい。
【００４７】
生体含有サンプル100gに対する固定化剤の使用量は、1 mg〜300 ｇ程度である。
【００４８】
生体含有サンプル100gに対するラベル化剤の使用量は、1 ng〜10 ｍｇ程度である。
【００４９】
生体含有サンプルに対し、固定化剤とラベル化剤は過剰量使用してもよい。
【００５０】
工程(a)は、未固定の生体サンプルで行ってもよく、固定化された生体サンプルで行ってもよい。
【００５１】
工程(a)で使用する細胞含有生体サンプルが未固定の場合、生体サンプルに固定化剤を適用する。生体サンプルへの固定化剤の適用は、常法に従い行うことができ、例えば、生体サンプルを固定化剤溶液に浸漬することで工程(a)を実施することができる。固定化剤の適用時の温度は０℃〜３７℃程度であり、固定化剤の適用時間は１〜４８時間程度である。
【００５２】
既に固定化された生体サンプルを使用する場合、工程(a)は固定化剤で予め固定された細胞含有生体サンプルを提供すること、または、当該固定化剤で予め固定された生体サンプルとともに前記固定化剤をさらに共存させることのいずれかによって実施することができる。
【００５３】
工程(b)は、ラベル化剤を溶媒に溶解し、生体サンプルに適用することで実施することができる。固定化されていない生体サンプルについて工程(b)を行う場合、ラベル化剤を含む溶液に生体サンプルを浸漬し、０℃〜３７℃程度の温度下に１〜４８時間程度反応させることにより、ラベル化剤のリガンドを細胞表面受容体のリガンド結合部位に結合させることができる。過剰なラベル化剤は、生体サンプルから洗浄により除去される。工程(b)を工程(a)の前に行う場合、固定化剤がないので工程(b)の段階ではラベル化剤は細胞表面受容体に共有結合していないが、工程(b)の後に固定化剤を適用する工程(a)を行うことで、ラベル化剤を細胞表面受容体に共有結合できる。
【００５４】
未固定の生体サンプルを固定化剤とラベル化剤の両方を含む溶液に浸漬し、０℃〜３７℃程度の温度下に１〜４８時間程度反応させることにより、工程(a)と工程(b)を同時に行うことができる。
【００５５】
固定化剤による生体サンプルの固定化は可逆的な平衡反応であるので、固定化された生体サンプルにラベル化剤を作用させた場合、受容体の反応性基と結合した固定化剤の一部が生体サンプルから分離し、新たに露出した受容体の反応性基とラベル化剤の反応性基が固定化剤と共有結合することで、ラベル化剤による受容体のラベル化が可能になる。なお、図７に示されるように、ラベル化剤は、リガンドにより受容体（図７中、“Protein”）と強く結合しているので、また、固定化剤はラベル化剤との反応がエネルギー的に有利であるので、このような置換又は組み換え反応が起こる（図７）。ラベル化剤と必要に応じて固定化剤を含む溶液は、ｐＨ４〜７程度の緩衝液を使用することもできる。ラベル化剤は受容体に対し過剰量使用するのが好ましい。ラベル化剤は、受容体とリガンド(Lg)が結合した場合に受容体をラベル化するが、非特異的な標識化は抑制されている。ラベル化反応終了後は、ラベル化剤を含まない溶液にラベル化された生体サンプルを浸漬することにより過剰なラベル化剤を除去することができる。ラベル化剤が除去されるまで、この洗浄操作を繰り返すことができる。
【００５６】
生体サンプルを透明化する手法については、数多くの文献が公開されており、例えば下記の文献を参照することができる。
文献名： Tainaka K et al, Cell. 2014;159:911-24、Chung K et al, Nature. 2013;497:332-7、Hama H et al, Nat Neurosci. 2011;14:1481-8、Renier N et al, Cell. 2014;159:896-910、Hama H et al, Nat Neurosci. 2015;18:1518-29.
生体サンプルを透明化することで、ラベル化の状況をより理解しやすくなる。また、波長などで別々に認識可能な標識物質により複数の受容体をラベル化することも可能である。生体サンプルの透明化は、ラベル化前に行ってもよく、ラベル化後に行ってもよい。
【００５７】
溶媒は、水あるいは化合物（Ｉ）が溶解し得る溶媒、例えば、メタノール、エタノール、プロパノールなどの低級アルコール、アセトン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン、Ｎ-メチルピロリドン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトニトリル、ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの水混和性溶媒が挙げられるが、これらに限定されない。緩衝液の一例としては、HEPES緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液などが挙げられるが、これらに限定されない。
【実施例】
【００５８】
以下、実施例を用いて、本明細書において開示される事項をより詳細に説明する。
実施例１【００５９】
【化５】
2019168125.tif 000007
スキーム１. 化合物1 (Fluorescein)の合成【００６０】
化合物7
化合物 6 (30 mg, 67 μmol)(ref. 1)を乾燥DMF 1.5 mlに溶解させた。窒素雰囲気下で、WSC-HCl(166 mg, 870 μmol)、HOBt-H2O(120 mg, 870 μmol)、4-(tert-Butoxycarbonyl)aminobutyric acid  17.7 mg (87 μmol)、DIEA 221 μl (1.27 mmol)を加えて、室温で5時間撹拌した。溶媒を留去した後に、カラムクロマトグラフィー（シリカ、CHCl3 / MeOH =15/1）で精製を行い、3.4 mg (5.7 μmol)の化合物7を得た。核プロトン磁気共鳴分光法（1H NMR spectroscopy） (400 MHz, CD3OD) δ 7.61 (s, 1H), 7.30 (s, 1H), 6.81-6.79 (m, 2H), 6.24-6.23 (m, 1H), 5.04 (s, 2H), 4,26-4.21 (m, 4H), 3.08-3.05 (m, 2H), 2.22 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.76 (t, J= 7.2 Hz, 2H), 1.42 (s, 9H), 1.27 (t, J= 7.2 Hz, 3H).【００６１】
化合物8
化合物 7(3.4mg, 5.7μmol)をジクロロメタン 1.2 mlに懸濁させた。TFA 0.24 mlを加えて、室温で１時間撹拌した。溶媒を留去した後に、トルエンとの共沸により念入りにTFAを除いて、化合物8(4.3 mg, 7.1μmol)を得た。1H NMR spectroscopy (400 MHz, CD3OD) δ 7.61 (s, 1H), 7.27 (s, 1H), 6.81-6.80 (m, 2H), 6.24-6.23 (m, 1H), 5.04 (s, 2H), 4,27-4.21 (m, 4H), 2.99-2.96 (m, 2H), 2.39-2.36 (m, 2H), 1.95-1.91 (m, 2H), 1.27 (t, J = 7.2 Hz, 3H).【００６２】
化合物9
5-Carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester (50 mg, 90 μmol)(ref. 2)をジクロロメタン 2.7 mlに溶解させた。窒素雰囲気下で、N6-(tert-Butoxycarbonyl)-L-lysine (26.4 mg, 107 μmol)、TEA 37.8 μl (269 μmol)を加えて、室温で4時間撹拌した。次いで、N6-(tert-Butoxycarbonyl)-L-lysine (6.6 mg, 27 mmol) をこの溶液に加え、窒素雰囲気下、室温で2時間撹拌した。その後、ジクロロメタン (30 mL)を加え、有機層を0.01 M HCl及び10 mL 飽和食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、減圧下に留去して、粗化合物を48.3 mg得た。得られた生成物は、そのまま次の反応に用いた。【００６３】
粗化合物 (48.3 mg)をTHF 1.4 mlに溶解させ、0.5 M 水酸化リチウム水溶液 0.42 ml (210 μmol)を加えて室温で3時間撹拌した。次いで、0.5 M 水酸化リチウム水溶液 0.42 ml (210 μmol)をこの溶液に加え、室温で5時間撹拌した。1N 塩酸を加えて中和した後に減圧乾固した。得られた固体をHPLC(アセトニトリル(0.1% TFA)/水(0.1% TFA))で精製し、乾燥して、化合物9 (9.8 mg, 16.2 μmol)を得た。1H NMR spectroscopy (400 MHz, CD3OD) δ 8.55 (s, 1H), 8.27-8.24 (m, 1H), 7.36 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.80 (s, 2H), 6.75 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.75 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.65 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 4.64 (t, J = 4.8 Hz, 1H), 3.07-3.05 (m, 2H), 1.79-1.75 (m, 2H), 1.57-1.53 (m, 4H), 1.40 (s, 9H).【００６４】
化合物1 (Fluorescein)
化合物 8 (4.3 mg, 7.1 μmol)を乾燥DMF 0.5 mlに溶解させた。HBTU 3.96 mg (10.6 μmol)、化合物9 (6.4 mg, 10.6 μmol)、DIEA 4.98 μl (28.4 μmol)を加えて、室温で10時間撹拌した。溶媒を留去して19.5 mgの粗化合物を得た。【００６５】
得られた粗化合物(19.5 mg)をTHF 0.14 mlに溶解させ、0.5 M 水酸化リチウム水溶液 0.14 ml (71μmol)を加えて室温で8.5時間撹拌した。1N 塩酸を加えて中和した後に減圧乾固し、27.7 mgの粗化合物を得た。【００６６】
粗化合物(27.7 mg)をジクロロメタン1.5 mlに懸濁させた。TFA 0.3 mlを加えて、室温で１時間撹拌した。溶媒を留去した後に、トルエンとの共沸により念入りにTFAを除いた。得られた粗化合物をHPLC(アセトニトリル(0.1% TFA)/水(0.1% TFA))で精製し、乾燥して、化合物1 (Fluorescein)(1.29 mg, 1.21 μmol)を得た。1H NMR spectroscopy (400 MHz, CD3OD) δ 8.52 (d, J = 0.8 Hz, 1H), 8.26-8.23 (m, 1H), 7.59 (m, 1H), 7.31-7.29 (m, 1H), 7.23 (m, 1H), 6.70-6.69 (m, 2H), 6.59-6.56 (m, 2H), 6.52-6.50 (m, 2H), 6.21-6.20 (m, 1H), 5.01 (s, 1H), 4.57-4.53 (m, 1H), 4.22 (s, 2H), 2.96-2.94 (m, 2H), 2.86-2.85 (m, 2H), 2.28 (t, J =7.6 Hz, 2H), 1.93 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.89-1.82 (m, 2H), 1.74-1.72 (m, 2H), 1.59-1.51 (m, 2H).【００６７】
【化６】
2019168125.tif 000008
スキーム2. 化合物1 (Alexa647)の合成【００６８】
化合物10
N-α-Benzyloxycarbonyl-N-ε-tert-butoxycarbonyl-L-lysine (0.5 g, 1.31 μmol)を乾燥DMF 13 mlに溶解させた。WSC-HCl 330 mg ( 1.71 μmol)、HOBt-H2O 260 mg (1.71 μmol)、4-Aminobutyric acid methyl ester hydrochloride 240 mg (1.58 μmol)、DIEA 183 μl (5.26 μmol)を加えて、室温で10時間撹拌した。溶媒を留去した後に、AcOEt (60 mL)を粗化合物に加えた。有機層を0.01 M HCl (20 ml x2)、飽和NaHCO3水溶液 (20 mL x2)及び飽和食塩水(20ml)で洗浄し、Na2SO4 で乾燥して化合物 10 (546 mg, 1.14 μmol)を無色オイルとして得た。1H NMR spectroscopy (400 MHz, CD3OD) δ 7.38-7.29 (m, 5H), 5.08 (s, 2H), 4.02-4.00 (m, 1H), 3.65 (s, 3H), 3.32-3.19 (m, 2H), 3.03-2.99 (m, 2H), 2.37-2.33 (m, 2H), 1.80-1.72 (m, 2H), 1.63-1.60 (m, 2H), 1.42 (s, 9H), 1.37-1.32 (m, 4H).【００６９】
化合物11
化合物10 (393 mg, 0.82 mmol)をTHF 8.2 mlに溶解させ、1 M 水酸化ナトリウム水溶液 0.82 ml (0.82 mmol)を加えて室温で1時間撹拌した。次いで、1 M 水酸化ナトリウム水溶液 0.82 ml (0.82 mmol)をこの溶液に加え、室温で1時間撹拌した。次いで、1 M 水酸化ナトリウム水溶液 0.82 ml (0.82 mmol)をこの溶液に加え、室温で1時間撹拌した。次いで、1 M 水酸化ナトリウム水溶液 0.82 ml (0.82 mmol)をこの溶液に加え、室温で1時間撹拌した。1N 塩酸を加えて中和した後に減圧乾固した。得られた固体にクロロホルム(60 ml)を加え生成物を有機層に抽出した。有機層を0.1 M HCl (20 ml x2)、飽和食塩水(20 mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥した。得られた粗化合物をカラムクロマトグラフィー（シリカ、CHCl3 / MeOH =30/1+1% AcOH）で精製を行い、化合物11(64mg, 0.13 mmol)を得た。1H NMR spectroscopy (400 MHz, CD3OD) δ 7.38-7.27 (m, 5H), 5.08 (s, 2H), 4.04-4.01 (m, 1H), 3.24-3.21 (m, 2H), 3.03-2.98 (m, 2H), 2.34-2.30 (m, 2H), 1.82-1.71 (m, 3H), 1.65-1.62 (m, 1H), 1.42 (s, 9H), 1.37-1.32 (m, 4H).【００７０】
化合物12
化合物 6 (30 mg, 67 μmol)(ref. 1)を乾燥DMF 2.0 mlに溶解させた。窒素雰囲気下で、WSC-HCl 16.7 mg (87 μmol)、HOBt-H2O 13.4 mg (87 μmol)、化合物11  (42.5 mg , 87 μmol)、DIEA 94 μl (269 μmol)を加えて、室温で8時間撹拌した。次いで、化合物11 (6.75 mg, 13.4 μmol)をこの溶液に加え、室温で2時間撹拌した。溶媒を留去した後に、クロロホルム(60 mL)を粗化合物に加えた。有機層を0.01 M HCl (20 ml x2)、飽和NaHCO3水溶液 (20 mL x2)及び飽和食塩水(20ml)で洗浄し、Na2SO4 で乾燥し、カラムクロマトグラフィー（シリカ、CHCl3 / MeOH =12/1, 10/1）で精製を行い、28.6 mg (33 μmol)の化合物12を得た。1H NMR spectroscopy (400 MHz, CD3OD) δ 7.59 (s, 1H), 7.33-7.26 (m, 6H), 6.81-6.78 (m, 2H), 5.05-5.04 (m, 2H), 4.26 (s, 2H), 4.25-4.20 (m, 2H), 4.01-3.98 (m, 1H), 3.21-3.19 (m, 2H), 3.03-2.99 (m, 2H), 2.23-2.20 (m, 2H), 1.83-1.72 (m, 3H), 1.66-1.57 (m, 1H), 1.45 (s, 1H), 1.37-1.32 (m, 4H), 1.24 (t, J = 7.2 Hz, 3H).【００７１】
化合物13
化合物12 (25.3 mg, 29.4 μmol)を乾燥メタノール1.0 mlに溶解させた。窒素雰囲気下で、10% Pd/C 10 mgを加えて、水素雰囲気下、室温で4時間撹拌した。パラジウム炭素を濾別で除いた後に、溶媒を留去し、28.3 mg の化合物12を得た。1H NMR spectroscopy (400 MHz, CD3OD) δ 7.61 (s, 1H), 7.24 (s, 1H), 6.80-6.78 (m, 2H), 6.23-6.22 (m, 1H), 5.04 (s, 2H), 4.26-4.20 (m, 4H), 4.14-4.06 (m, 1H), 3.23-3.19 (m, 2H), 3.04-3.00 (m, 2H), 2.27-2.22 (m, 2H), 1.82-1.79 (m, 2H), 1.67-1.54 (m, 1H), 1.51-1.47 (m, 2H), 1.45 (s, 9H), 1.38-1.34 (m, 2H), 1.24 (t, J = 7.2 Hz, 3H).【００７２】
化合物14
化合物 13(28.3 mg, 39 μmol)をTHF 1.1 mlに溶解させ、0.5 M 水酸化リチウム水溶液0.32 ml (117 μmol)を加えて室温で3.5時間撹拌した。1N 塩酸を加えて中和した後に減圧乾固した。得られた固体をCHCl3 / MeOH =2/1に溶解させ、濾過し溶媒を留去し32.8 mgの化合物14を得た。1H NMR spectroscopy (400 MHz, CD3OD) δ 7.62 (s, 1H), 7.06 (s, 1H), 6.81-6.77 (m, 2H), 6.19-6.18 (m, 1H), 4.76 (s, 2H), 3.28-3.27 (m, 1H), 3.25-3.21 (m, 2H), 3.04-3.00 (m, 2H), 2.28-2.22 (m, 2H), 1.84-1.81 (m, 2H), 1.64-1.49 (m, 2H), 1.45 (s, 9H), 1.37-1.28 (m, 4H). 【００７３】
化合物1(Alexa647)
化合物14(1.0 mg, 1.46 μmol)を乾燥DMF 0.1 mlに溶解させた。窒素雰囲気下で、Alexa647-NHS-ester (1 mg)、DIEA 1.09 μl (3.13 μmol)を加えて、室温で4時間撹拌した。次いで、DIEA 1.09 μl (3.13 μmol)をこの溶液に加え、室温で4.5時間撹拌した。溶媒を留去し、3.0 mgの粗化合物を得た。得られた生成物は、そのまま次の反応に用いた。【００７４】
3.0 mgの粗化合物をジクロロメタン1.0 mlに懸濁させた。TFA 0.2 mlを加えて、室温で１時間撹拌した。溶媒を留去した後に、トルエンとの共沸により念入りにTFAを除いた。得られた生成物をHPLC(アセトニトリル/10 mM 酢酸アンモニウム水溶液)で精製し、凍結乾燥して、目的化合物1(Alexa647)を得た。ESI-Mass ([M-2H]=716.6962(obs.), 716.6977(calc.))【００７５】
【化７】
2019168125.tif 000009
スキーム3. 化合物2(Fluorescein)の合成【００７６】
化合物15
3-(tert-Butoxycarbonylamino)propionic acid(0.5 g, 4.8 mmol)を乾燥DMF48.4 mLに溶解させた。窒素雰囲気下で、WSC-HCl 1.2 g (6.3 mmol)、HOBt-H2O 0.87 g (6.3 mmol)、β-Alanine methyl ester(0.6 g, 5.8 mmol)、DIEA 4.2 ml (24 mmol)を加えて、室温で5時間撹拌した。溶媒を留去した後に、AcOEt (100 mL)を粗化合物に加えた。有機層を10% クエン酸 (30 ml x2)、飽和NaHCO3水溶液 (20 mL x2)及び飽和食塩水(30 ml)で洗浄し、Na2SO4 で乾燥して化合物15(0.43 g, 1.57 mmol)を白色固体として得た。1H NMR spectroscopy (400 MHz, CD3OD) δ 6.14 (s, 1H), 5.15 (s, 1H), 3.71 (s, 3H), 3.51 (q, J = 6.0 Hz, 2H), 3.39 (q, J= 6.0 Hz, 2H), 2.55 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.37 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 1.43 (s, 9H).【００７７】
化合物16
化合物15(0.35 g, 1.3 mmol)をジクロロメタン 10 mlに懸濁させた。TFA 3.0 mlを加えて、室温で１時間撹拌した。溶媒を留去した後に、トルエンとの共沸により念入りにTFAを除いて、493 mgの粗化合物(1.3 mmolの化合物16を含む)を得た。得られた化合物をそのまま次の反応に用いた。1H NMR spectroscopy (400 MHz, CD3OD) δ 11.3 (s, 1H), 7.95-7.79 (m. 2H), 4.10 (s, 1H), 3.55 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.35-3.26 (m, 2H), 2.67 (t, J = 5.6 Hz), 2.55 (t, J = 6.0 Hz, 2H).【００７８】
化合物17
粗化合物473 mgを乾燥DMF 20 mLに溶解させた。窒素雰囲気下で、WSC-HCl 27 mg (0.14 mmol)、HOBt-H2O 20 mg (0.14 mmol)、 N4-[(Benzyloxy)carbonyl]-N2-[(tert-butyloxy)-  carbonyl]-L-2,4-diaminobutyric acid(0.6 g, 5.8 mmol)、DIEA 189 μl (5.4 mmol)を加えて、室温で30分間撹拌した。次いで、窒素雰囲気下で、WSC-HCl 27 mg (0.14 mmol)、HOBt-H2O 20 mg (0.14 mmol)をこの溶液に加え、室温で13時間撹拌した。溶媒を留去した後に、AcOEt (90 mL)を粗化合物に加えた。有機層を10% クエン酸 (30 ml)、飽和NaHCO3水溶液 (30 mL)及び飽和食塩水(30 ml)で洗浄し、Na2SO4 で乾燥して化合物17(195 mg, 0.39 mmol)を白色固体として得た。1H NMR spectroscopy (400 MHz, CD3OD) δ 7.35-7.28 (m. 5H), 5.07 (s, 1H), 4.01 (s, 1H), 3.67 (s, 3H), 3.44-3.38 (m, 4H), 3.24-3.14 (m, 2H), 2.53 (t, J = 6.8 Hz), 2.36 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 1.94-1.69 (m, 2H), 1.44 (s, 9H).【００７９】
化合物18
化合物17(51 mg, 0.1 mmol)をTHF 1.0 mlに溶解させ、1 M 水酸化ナトリウム水溶液 0.5 mlを加えて室温で5時間撹拌した。反応溶液にクロロホルム5.0 ml、純水5.0 ml、1 M HCl  0.5 ml加えた。次いで、クロロホルム10 ml、純水10 ml、飽和食塩水5.0 mlを加え有機層と水層に分けた。水層をクロロホルム(15 ml x2)で抽出し、有機層を回収した。Na2SO4 で乾燥して化合物18(44.9 mg, 0.09 mmol)を得た。1H NMR spectroscopy (400 MHz, CD3OD) δ 7.35-7.30 (m. 5H), 5.07 (s, 1H), 4.03-3.99 (m, 1H), 3.45-3.39 (m, 4H), 3.23-3.14 (m, 2H), 2.50 (t, J = 6.8 Hz), 2.37 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 1.92-1.69 (m, 2H), 1.44 (s, 9H).【００８０】
化合物19
化合物18(40 mg, 72.6 μmol)を乾燥DMF 0.5 mlに溶解させた。窒素雰囲気下で、WSC-HCl 13.9 mg (72.6 μmol)、HOBt-H2O 11.1 mg (72.6 μmol)、化合物6(20 mg, 48.4 μmol)、DIEA 12.6 μl (0.36 mmol)を加えて、室温で3.5時間撹拌した。溶媒を留去した後に、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ、CHCl3 / MeOH =8/1）で精製して、20.3mg (23 μmol)の化合物19を得た。1H NMR spectroscopy (400 MHz, CD3OD) δ 7.60 (s, 1H), 7.27-6.86 (m. 6H), 6.84-6.78 (m, 2H), 6.24-6.23 (m, 1H), 5.04 (s, 4H), 4.24 (q, J = 7.2 Hz, 4H), 4.02 (s, 1H), 3.44-3.41 (m, 4H), 3.21-3.13 (m, 2H), 2.40 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.34 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 1.92-1.70 (m, 2H), 1.43 (s, 9H), 1.26 (t, J = 6.8 Hz, 3H).【００８１】
化合物20
化合物19(18.7 mg, 21 μmol)をメタノール 0.5 mlに溶解させた。窒素雰囲気下で、10% Pd/C 10 mgを加えて、水素雰囲気下、室温で4.5時間撹拌した。次いで、メタノール1.5 mlを追加し、窒素雰囲気下で、10% Pd/C 10 mgを加えて、水素雰囲気下、室温で6.5時間撹拌した。パラジウム炭素を濾別で除いた後に、溶媒を留去し、18.9 mg の粗生成物を得た。18.9 mgの粗生成物を乾燥メタノール2.0 mlに溶解させた。窒素雰囲気下で、10% Pd/C 10 mgを加えて、水素雰囲気下、室温で10時間撹拌した。パラジウム炭素を濾別で除いた後に、溶媒を留去し、化合物20 (15.4 mg, 20.4 μmol) を得た。1H NMR spectroscopy (400 MHz, CD3OD) δ 7.61 (s, 1H), 7.29 (s. 1H), 6.81 (s, 2H), 6.24 (s, 1H), 5.05 (s, 2H), 4.28-4.21 (m, 4H), 4.13 (s, 1H), 3.48-3.42 (m, 4H), 3.14-3.13 (m, 2H), 2.44-2.35 (m, 4H), 2.08-1.92 (m, 2H), 1.49-1.45 (m, 9H), 1.27 (t, J = 7.2 Hz, 3H).【００８２】
化合物2(Fluorescein)
化合物20(15.4 mg, 20.4 μmol)を乾燥DMF 0.6 mlに溶解させた。窒素雰囲気下、5-Carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester (12.5 mg, 22.4 μmol)(ref. 2)、TEA (8.6 μL, 61 μmol)を加えて、室温で5時間撹拌した。次いで、窒素雰囲気下、5-Carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester (2.27 mg, 4.1 μmol)(ref. 2)、を加えて、室温で5時間撹拌した。溶媒を留去し、35.3 mg の粗生成物を得た。得られた化合物をそのまま次の反応に用いた。【００８３】
35.3 mgの粗生成物をメタノール 0.5 mlに溶解させ、0.5 M水酸化リチウム水溶液 0.4 mlを加えて室温で8.5時間撹拌した。1 M 塩酸を加えて中和した後に減圧乾固し、37.5 mgの粗生成物を得た。得られた化合物をそのまま次の反応に用いた。【００８４】
37.5 mgの粗化合物をジクロロメタン 4.0 mlに懸濁させた。TFA 0.8 mlを加えて、室温で3時間撹拌した。溶媒を留去した後に、トルエンとの共沸により念入りにTFAを除いた。得られた粗化合物をHPLC(アセトニトリル(0.1% TFA)/水(0.1% TFA))で精製し、乾燥して、化合物2(Fluorescein)(1.37 mg, 1.25 μmol)を得た。1H NMR spectroscopy (400 MHz, CD3OD) δ 8.48 (s, 1H), 8.22-8.21 (m, 2H), 7.58 (s, 1H), 7.19 (s, 1H), 6.77-6.75 (m, 2H), 6.59-6.49 (m, 6H), 6.19-6.16 (m, 1H), 4.92 (s, 2H), 4.22 (s, 2H), 3.89 (t, J = 6.8 Hz, 1H),3.49-3.45 (m, 4H), 3.14-3.12 (m, 2H), 2.44-2.40 (m, 4H), 2.30-2.13 (m, 2H). 【００８５】
【化８】
2019168125.tif 000010
スキーム4. 化合物3(Fluorescein)の合成【００８６】
化合物21
Methyl N-benzyloxycarbonyl-L-glutamate(0.5 g, 1.7 mmol)を乾燥DMF 17 mlに溶解させた。窒素雰囲気下で、WSC-HCl 0.42 g (2.2 mmol)、HOBt-H2O 0.34 g (2.2 mmol)、Boc-hydrazine(0.25 g, 2.0 mmol)、DIEA 236 μl (6.77 mmol)を加えて、室温で5時間撹拌した。溶媒を留去した後に、AcOEt (60 mL)を粗化合物に加えた。有機層を0.01 M HCl (20 ml x2)、飽和NaHCO3水溶液 (20 mL x2)及び飽和食塩水(20ml)で洗浄し、Na2SO4 で乾燥して、化合物21(635 mg, 1.55 mmol)を白色粉末として得た。1H NMR spectroscopy (400 MHz, CD3OD) δ 7.36-7.29 (m, 5H), 5.09 (s, 2H), 4.22-4.20 (m, 1H), 3.72 (s, 3H), 2.32-2.30 (m, 2H), 2.19-2.16 (m, 1H), 1.98-1.92 (m, 1H), 1.46 (s, 9H).【００８７】
化合物22
化合物21(635 mg, 1.55 mmol)をTHF 15.5 mlに溶解させ、1 M水酸化ナトリウム水溶液を7.7 ml加えて、室温で45分間撹拌した。1 M塩酸を加えて中和した後に減圧乾固した。得られた粗生成物をクロロホルム(60 ml)に溶解させた。有機層を0.1 M HCl(20 ml,x2)及び飽和食塩水(20 ml)で洗浄し、Na2SO4 で乾燥して化合物22(492 mg, 1.18 mmol)を白色粉末として得た。1H NMR spectroscopy (400 MHz, CD3OD) δ 7.38-7.27 (m, 5H), 5.09 (s, 2H), 4.22-4.18 (m, 1H), 2.36-2.34 (m, 2H), 2.24-2.19 (m, 1H), 1.99-1.94 (m, 1H), 1.46 (s, 9H).【００８８】
化合物23
化合物22(492 mg, 1.18 mmol)を乾燥DMF 12 mlに溶解させた。窒素雰囲気下で、WSC-HCl 293 mg (1.53 mmol)、HOBt-H2O 234 mg (1.53 mmol)、4-Aminobutyric acid methyl ester hydrochloride(217 mg, 1.41 mmol)、DIEA 165 μl (4.72 mmol)を加えて、室温で6時間撹拌した。溶媒を留去した後に、AcOEt (60 mL)を粗化合物に加えた。有機層を0.01 M HCl (20 ml x2)、飽和NaHCO3水溶液 (20 mL x2)及び飽和食塩水(20ml)で洗浄し、Na2SO4 で乾燥して、化合物23(550 mg, 1.11 mmol)を白色結晶として得た。1H NMR spectroscopy (400 MHz, CD3OD) δ 7.36-7.29 (m, 5H), 5.09 (s, 2H), 4.11-4.06 (m, 1H), 3.65 (s, 3H), 3.25-3.21 (m, 2H), 2.38-2.35 (m, 2H), 2.32-2.28 (m, 2H), 2.06-1.93 (m, 2H), 1.82-1.78 (m, 2H), 1.46 (s, 9H).【００８９】
化合物24
化合物23(550 mg, 1.11 mmol)をTHF 11 mlに溶解させ、1 M水酸化ナトリウム水溶液を1.1 ml加えて、室温で2時間撹拌した。次いで、1 M水酸化ナトリウム水溶液を1.1 ml加えて、室温で1.5時間撹拌した。1 M塩酸を加えて中和した後に減圧乾固した。得られた粗生成物をクロロホルム(60 ml)に溶解させた。有機層を0.01 M HCl(20 ml,x2)及び飽和食塩水(20 ml)で洗浄し、Na2SO4で乾燥した。得られた粗化合物をカラムクロマトグラフィー（シリカ、CHCl3 / MeOH =10/1+1% AcOH → CHCl3 / MeOH =8/1+1% AcOH→CHCl3 / MeOH =5/1+1% AcOH）で精製して、366 mg (0.73 mmol)の化合物24を得た。1H NMR spectroscopy (400 MHz, CD3OD) δ 7.35-7.28 (m, 5H), 5.08 (s, 2H), 4.13-4.11 (m, 1H), 3.25-3.22 (m, 2H), 2.35-2.30 (m, 4H), 2.15-2.00 (m, 1H), 1.95-1.94 (m, 1H), 1.83-1.77 (m, 2H), 1.45 (s, 9H).【００９０】
化合物25
化合物24(43.7 mg, 87 μmol)を乾燥DMF 2.0 mlに溶解させた。窒素雰囲気下で、WSC-HCl 16.7 mg (87 μmol)、HOBt-H2O 13.3 mg (87 μmol)、化合物6(30 mg, 67 μmol)、DIEA 94 μl (269 μmol)を加えて、室温で5時間撹拌した。溶媒を留去した後に、クロロホルム(60 mL)を粗化合物に加えた。有機層を0.01 M HCl (20 ml x2)、飽和NaHCO3水溶液 (20 mL x2)及び飽和食塩水(20ml)で洗浄し、Na2SO4 で乾燥し、カラムクロマトグラフィー（シリカ、CHCl3 / MeOH =10/1）で精製を行い、16.1 mg (18.4 μmol)の化合物25を得た。1H NMR spectroscopy (400 MHz, CD3OD) δ 7.60 (s, 1H), 7.36-7.27 (m, 6H), 6.81-6.77 (m, 2H), 6.24-6.23 (m, 1H), 5.04-5.02 (m, 4H), 4.27-4.20 (m, 4H), 4.08-4.05 (m, 1H), 2.32-2.21 (m, 4H), 1.83-1.80 (m, 2H), 1.45 (s, 9H), 1.23 (t, J = 7.2 Hz, 3H).【００９１】
化合物26
化合物25(16.1 mg,18.4 μmol)を乾燥メタノール1.0 mlに溶解させた。窒素雰囲気下で、10% Pd/C 10 mgを加えて、水素雰囲気下、室温で13時間撹拌した。パラジウム炭素を濾別で除いた後に、溶媒を留去し、12.7mg の化合物26(17.2 μmol)を得た。1H NMR spectroscopy (400 MHz, CD3OD) δ 7.60 (s, 1H), 7.11 (s, 1H), 6.79-6.77 (m, 2H), 6.21 (s, 1H), 5.05 (s, 2H), 4.27-4.18 (m, 4H), 4.00-3.98 (m, 1H), 3.27-3.22 (m, 2H), 2.26-2.23 (m, 4H), 1.83-1.82 (m, 2H), 1.46 (s, 9H), 1.24 (t, J= 7.2 Hz, 3H).【００９２】
化合物3(Fluorescein)
化合物26(12.7 mg, 17.2 μmol)を乾燥DMF 1.0 mlに溶解させた。窒素雰囲気下、5-Carboxyfluorescein N-succinimidyl ester(10.6 mg, 22.3 μmol)、DIEA(23.9 μL, 68.8 μmol)を加えて、室温で19時間撹拌した。溶媒を留去し、29.6 mg の粗生成物を得た。得られた化合物をそのまま次の反応に用いた。【００９３】
29.6 mgの粗生成物をTHF 1.0 mlに溶解させ、0.5 M水酸化リチウム水溶液 235 μlを加えて室温で6時間撹拌した。1 M 塩酸を加えて中和した後に減圧乾固した。得られた粗生成物を再度THF 1.0 mlに溶解させ、0.5 M水酸化リチウム水溶液235 μlを加えて室温で4.5時間撹拌した。1 M 塩酸を加えて中和した後に減圧乾固し,41 mgの粗化合物を得た。得られた化合物をそのまま次の反応に用いた。【００９４】
41 mgの粗化合物をジクロロメタン2.0 mlに懸濁させた。TFA 0.4 mlを加えて、室温で40 分間撹拌した。溶媒を留去した後に、トルエンとの共沸により念入りにTFAを除いた。得られた粗化合物をHPLC(アセトニトリル(0.1% TFA)/水(0.1% TFA))で精製し、乾燥して、化合物3(Fluorescein)(1.91 mg, 1.76 μmol)を得た。ESI-MS ([M+H]=969.2640(obs.), 969.2661(calc.) ).【００９５】
【化９】
2019168125.tif 000011
スキーム5. 化合物4(Fluorescein)の合成【００９６】
化合物27
Nε-[(tert-Butoxy)carbonyl]-Nα-[(benzyloxy)carbonyl]-L-lysine(12.6 mg, 33.6 μ mol)を乾燥DMF 1.0 mlに溶解させた。窒素雰囲気下で、HBTU(16.3 mg, 43 μmol)、化合物6(15 mg, 33.6 μmol)、DIEA 23.5 μl (134 μmol)を加えて、室温で2時間撹拌した。溶媒を留去した後に、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ、CHCl3 / MeOH =25/1）で精製して、18.4 mg (24 μmol)の化合物27を得た。1H NMR spectroscopy (400 MHz, CD3OD) δ 7.60 (s, 1H), 7.38-7.25 (m, 6H), 6.80-6.78 (m, 2H), 6.22 (s, 1H), 5.09 (s, 2H), 5.02 (s, 2H), 4.85-4.25 (s, 2H), 4.22 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 4.08-4.05 (m, 1H), 3.03-2.99 (m, 2H), 1.76-1.62 (m, 2H), 1.49-1.45 (m, 4H), 1.41 (s, 9H), 1.25 (t, J = 7.2 Hz, 3H).【００９７】
化合物28
化合物25(16.6 mg,20 μmol)をメタノール0.5 mlに溶解させた。窒素雰囲気下で、10% Pd/C 5 mgを加えて、水素雰囲気下、室温で2.5時間撹拌した。パラジウム炭素を濾別で除いた後に、溶媒を留去し、11 mg の化合物28(17 μmol)を得た。1H NMR spectroscopy (400 MHz, CD3OD) δ 7.61 (s, 1H), 7.26-7.21 (m, 1H), 6.82-6.79 (m, 2H), 6.24-6.23 (m, 1H), 5.04 (s, 2H), 4.34-4.14 (m, 4H), 4.11-4.06 (m, 1H), 3.02-2.99 (m, 4H), 2.86-2.82 (m, 2H), 1.70-1.57 (m, 2H), 1.42 (s, 9H), 1.26 (t, J = 7.2 Hz, 3H).【００９８】
化合物4(Fluorescein)
化合物28(6.6 mg, 10.3 μmol)を乾燥DMF 0.3 mlに溶解させた。窒素雰囲気下、5-Carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester (6.13 mg,11.3 μmol)、TEA(4.22 μL, 30.9 μmol)を加えて、室温で1.5時間撹拌した。溶媒を留去し、得られた化合物をそのまま次の反応に用いた。【００９９】
得られた化合物をメタノール0.2 mlに溶解させ、0.5 M水酸化リチウム水溶液0.2 mlを加えて室温で終夜撹拌した。1 M 塩酸を加えて中和した後に減圧乾固し,得られた化合物をそのまま次の反応に用いた。【０１００】
粗化合物をジクロロメタン1.0 mlに懸濁させた。TFA 0.2 mlを加えて、室温で2時間撹拌した。溶媒を留去した後に、トルエンとの共沸により念入りにTFAを除いた。得られた粗化合物をHPLC(アセトニトリル(0.1% TFA)/水(0.1% TFA))で精製し、乾燥して、化合物4(Fluorescein)(1.32 mg, 1.34 μmol)を得た。1H NMR spectroscopy (400 MHz, CD3OD) δ 8.78 (s, 1H), 8.24-8.22 (m, 1H), 7.72-7.66 (m, 1H), 7.60 (s, 1H), 7.25 (s, 1H), 6.85-6.75 (m, 2H), 6.57-6.52 (m, 6H), 6.26 (s, 1H), 5.06 (s, 2H), 4.75-4.68 (m, 2H), 4.34 (s, 1H), 2.97-2.89 (m, 2H), 1.81-1.51 (m, 2H), 1.36-1.31 (m, 4H).【０１０１】
【化１０】
2019168125.tif 000012
スキーム6. 化合物4(Alexa647)の合成【０１０２】
化合物29
化合物28(14.7 mg, 23 mmol)をメタノール0.46 mlに溶解させ、0.5 M水酸化リチウム水溶液 0.46 mlを加えて室温で4.5時間撹拌した。1 M 塩酸を加えて中和した後に減圧乾固した。得られた化合物をHPLC(アセトニトリル(0.1% TFA)/水(0.1% TFA))で精製し、乾燥して、8.1 mgの化合物29(11.2 μmol)を得た。1H NMR spectroscopy (400 MHz, CD3OD) δ 7.61 (s, 1H), 7.23 (s, 1H), 6.86-6.82 (m, 2H), 6.27-6.26 (m, 1H), 5.00 (s, 2H), 4.40-4.28 (m, 2H), 3.81 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 3.02 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.86-1.82 (m, 2H), 1.52-1.46 (m, 2H), 1.42 (s, 9H), 1.41-1.37 (m, 2H).【０１０３】
化合物4(Alexa647)
化合物29(0.81 mg, 1.12 μmol)を乾燥DMF 0.1 mlに溶解させた。窒素雰囲気下で、Alexa647-NHS-ester (1 mg)、TEA 0.46 μl (3.3 μmol)を加えて、室温で10.5時間撹拌した。次いで、TEA 0.46 μl (3.3 μmol)をこの溶液に加え、室温で14時間撹拌した。溶媒を留去し、4.1 mgの粗化合物を得た。得られた生成物は、そのまま次の反応に用いた。【０１０４】
4.1 mgの粗化合物をジクロロメタン 0.2 mlに懸濁させた。TFA 40 μlを加えて、室温で１時間撹拌した。溶媒を留去した後に、トルエンとの共沸により念入りにTFAを除いた。得られた生成物をHPLC(アセトニトリル/10 mM 酢酸アンモニウム水溶液)で精製し、凍結乾燥して、目的化合物4(Alexa647)(0.39 mg, 0.27 μmol)を得た。ESI-MS ([M-3H]=449.4459 (obs.), 449.4475 (calc.)).【０１０５】
【化１１】
2019168125.tif 000013
スキーム7. 化合物5(Fluorescein)及び化合物5(Alexa647)の合成【０１０６】
化合物 31
化合物 30 (4.7 mg, 13.3 μmol) (ref. 3)を乾燥DMF 0.1 mlに溶解させた。N-(tert-ブトキシカルボニル)-2,2'-(エチレンジオキシ)ジエチルアミン 16.5 mg (66.7 μmol)、炭酸カリウム 5.5 mg (40.0 μmol)を加えて、50°Cで加熱撹拌した。溶媒を留去した後に、分取薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン／醋酸エチル = 1/4）で精製を行い、6.2 mg (11.0 μmol)の化合物31を得た。【０１０７】
化合物 32
化合物 31 (2.8 mg, 5.0 μmol)をジクロロメタン 0.5 mlに溶解させ、トリフルオロ酢酸 0.5 mlを加え室温で15分間撹拌した。溶媒を留去した後に得られた粗生成物を乾燥DMF 0.1 mlに溶解させた。FmocHN-Lys(Boc)-COOH 3.5 mg (7.5 μmol)、HBTU 2.8 mg (7.5 μmol)、DIEA 2.6 μl (15 μmol)を加えて、室温で３時間撹拌した。ピペリジン 10 μlを加えて室温で10分間撹拌した後に溶媒を留去し、分取薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、CHCl3 / MeOH =10/1(NH31%)））で精製を行い、3.4 mg (5.0 μmol)の化合物32を得た。【０１０８】
化合物 5(Fluorescein)
化合物32 (7.2 mg, 1.0 μmol)を乾燥DMF 50 μlに溶解させた。Fluorescein-NHS 1.0 mg (2.0 μmol)、 DIEA 1.0 μl (6.3 μmol)を加えて、室温で5時間撹拌した。溶媒を留去した後に、ジクロロメタン 0.5 mlに溶解させ、トリフルオロ酢酸 0.5 mlを加え室温で15分間撹拌した。溶媒を留去した後、水に溶解させ、HPLC(アセトニトリル/水(0.1% TFA))で精製し、凍結乾燥して、目的化合物5(Fluorescein)を得た。 【０１０９】
化合物 5(Alexa647)
化合物32 (7.2 mg, 1.0 μmol)を乾燥DMF 50 μlに溶解させた。Alexa647-NHS 1.0 mg (1.0 μmol)、 DIEA 1.0 μl (6.3 μmol)を加えて、室温で5時間撹拌した。溶媒を留去した後に、ジクロロメタン 0.5 mlに溶解させ、トリフルオロ酢酸 0.5 mlを加え室温で15分間撹拌した。溶媒を留去した後、水に溶解させ、HPLC(アセトニトリル/水(0.1% TFA))で精製し、凍結乾燥して、目的化合物5(Alexa647)を得た。 【０１１０】
【化１２】
2019168125.tif 000014
スキーム8. 化合物6(sulfoCy3)の合成【０１１１】
化合物 34
化合物 33 (20.0 mg, 69.3 μmol) (ref. 4)を乾燥DMF 1.0 mlに溶解させた。氷冷下で水素化ナトリウム(40%ミネラルオイル含有) 5.5 mg (139 μmol)を加えて、氷冷下で30分撹拌した。4-ブロモ酪酸メチル10.5 μl (83.1 μmol)、ヨウ化ナトリウム10.4 mg (69.3 μmol)を加えて、50°Cで２時間加熱撹拌した。飽和食塩水を加え、酢酸エチルで３回抽出操作をおこなった後、有機層の溶媒を留去し、分取薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン／醋酸エチル = 1/1）で精製を行い、10.4 mg (27.0 μmol)の化合物34を得た。【０１１２】
化合物 35
化合物 34 (10.4 mg, 26.8 μmol)をTHF 0.5 ml、水 0.5 mlに溶解させ、一水和水酸化リチウム 3.4 mg (80.3 μmol)を加え室温で終夜撹拌した。1N 塩酸を加えて中和した後、酢酸エチルで３回抽出操作をおこなった。有機層の溶媒を留去した後に得られた粗生成物を乾燥DMF 0.3 mlに溶解させた。N-(tert-ブトキシカルボニル)-2,2'-(エチレンジオキシ)ジエチルアミン 6.6 mg (32.1 μmol)、HBTU 15.2 mg (40.1 μmol)、DIEA 14 μl (80.2 μmol)を加えて、室温で撹拌した。飽和食塩水を加え、酢酸エチルで３回抽出操作をおこなった後、有機層の溶媒を留去し、分取薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、醋酸エチル）で精製を行い、7.2 mg (12.9 μmol)の化合物35を得た。【０１１３】
化合物 36
化合物 35 (7.2 mg, 12.8 μmol)をジクロロメタン 0.5 mlに溶解させ、トリフルオロ酢酸 0.5 mlを加え室温で15分間撹拌した。溶媒を留去した後に得られた粗生成物を乾燥DMF 0.15 mlに溶解させた。FmocHN-Lys(Boc)-COOH 7.2 mg (15.4 μmol)、HBTU 7.3 mg (19.3 μmol)、DIEA 6.7 μl (38.5 μmol)を加えて、室温で３時間撹拌した。ピペリジン 15 μlを加えて室温で10分間撹拌した後に溶媒を留去し、分取薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、CHCl3 / MeOH =10/1(NH31%)））で精製を行い、6.7 mg (9.7 μmol)の化合物36を得た。【０１１４】
化合物6(sulfoCy3)
化合物36 (1.0 mg, 1.5 μmol)を乾燥DMF 0.1 mlに溶解させた。sulfoCy3-NHS 1.0 mg (1.3 μmol)、 DIEA 0.8 μl (4.0 μmol)を加えて、室温で5時間撹拌した。溶媒を留去した後に、ジクロロメタン 0.5 mlに溶解させ、トリフルオロ酢酸 0.5 mlを加え室温で15分間撹拌した。溶媒を留去した後、水に溶解させ、HPLC(アセトニトリル/水(0.1% TFA))で精製し、凍結乾燥して、目的化合物6(sulfoCy3)を得た。 【０１１５】
参考文献(ref)
1.  Coleman, S. K. et al. J. Biol. Chem. 291, 8784-8794 (2016) 
2.  Brunet, A. et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 24, 3186-3188 (2014)
3.  Satoh, A. et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 19, 5464-5468 (2009)
4.  Yamaura. K. et al. Nat. Chem. Biol. 12, 822-830 (2016)【０１１６】
生物化学実験:共焦点レーザー顕微鏡は、LSM800(カールツァイス社)を用いた。【０１１７】
細胞培養および遺伝子導入
(1)HEK293T細胞は10% FBS、ペニシリン (100 units/mL) 及び ストレプトマイシン(100 μg/mL)を添加したDulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM, グルコース4.5 g/L)培地中で、5% CO2の湿潤雰囲気下に培養した全ての実験について、細胞はサブコンフルエント(< 80%)からトリプシン-EDTA 溶液で回収し、新鮮な培地に再懸濁した。継代培養は2-3日毎に行った。AMPA型グルタミン酸受容体(GluR2)の遺伝子導入は、lipofectamine 2000(Invitrogen)を用い、添付のマニュアルに従って遺伝子導入した。ラベル化には、遺伝子導入36-48時間後の細胞を用いた。
(2)AMPA型グルタミン酸受容体(GluR2)遺伝子に代えて代謝型グルタミン酸受容体（mGlu1）遺伝子を用いた以外は上記と同様にしてmGlu1を遺伝子導入したHEK293T細胞を作製した。
(3)AMPA型グルタミン酸受容体(GluR2)遺伝子に代えてGABAA受容体（GABAAR）遺伝子を用いた以外は上記と同様にしてGABAARを遺伝子導入したHEK293T細胞を作製した。【０１１８】
試験例１
HEK293T細胞におけるAMPAR(AMPA型グルタミン酸受容体)のラベル化および可視化（図３）
前述したGluR2遺伝子導入済のHEK293T細胞をPBS(-)で２回洗浄した。PBS(-)に化合物1(1 μM)を添加し、細胞に加え、室温で10分間インキュベートした。前述した化合物1添加PBS(-)の10倍量の４%PFAリン酸緩衝溶液を細胞に加え、室温で30分間インキュベートした。PBS(-)で3回洗浄し、共焦点顕微鏡（confocal microscopy）観察を行った。【０１１９】
試験例2
HEK293T細胞におけるmGlu1のラベル化および可視化（図4a）
mGlu1遺伝子導入済のHEK293T細胞をPBS(-)で２回洗浄した。PBS(-)に化合物5(0.1 μM)を添加し、細胞に加え、室温で10分間インキュベートした。前述した化合物5添加PBS(-)の10倍量の４%PFAリン酸緩衝溶液を細胞に加え、室温で30分間インキュベートした。PBS(-)で3回洗浄し、共焦点顕微鏡観察を行った。【０１２０】
試験例3
HEK293T細胞におけるGABAARのラベル化および可視化（図4b）
GABAAR遺伝子導入済のHEK293T細胞をPBS(-)で２回洗浄した。PBS(-)に化合物6(1 μM)を添加し、細胞に加え、室温で10分間インキュベートした。前述した化合物6添加PBS(-)の10倍量の４%PFAリン酸緩衝溶液を細胞に加え、室温で30分間インキュベートした。PBS(-)で3回洗浄し、共焦点顕微鏡観察を行った。【０１２１】
試験例4
脳スライスにおけるmGlu1のラベル化および可視化（図6）
三週齢のICR マウスから単離した急性脳スライスに化合物5(0.1 μM)を添加したACSF溶液(125 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1.25 mM NaH2PO4, 26 mM NaHCO3, 10 mM D-glucose)を加え、95%O2/5%CO2雰囲気下、室温で30分間インキュベートした。前述した化合物5添加ACSF溶液の10倍量の４%PFAリン酸緩衝溶液を小脳スライスに加え、室温で１時間インキュベートした。PBS(-)で3回洗浄し、共焦点顕微鏡観察を行った。【０１２２】
プロトコル1（図５）
前述したGluR2遺伝子導入済のHEK293T細胞をPBS(-)で２回洗浄した。1%PFAリン酸緩衝溶液にラベル化剤(1 μM)を添加し、細胞に加え、室温で１時間インキュベートした。PBS(-)で3回洗浄し、共焦点顕微鏡観察を行った。【０１２３】
プロトコル2（図５）
前述したGluR2遺伝子導入済のHEK293T細胞をPBS(-)で２回洗浄した。1%PFAリン酸緩衝溶液を細胞に加え、室温で30分間インキュベートした。PBS(-)で3回洗浄し、1%PFAリン酸緩衝溶液にラベル化剤(1 μM)を添加したものを細胞に加え、室温で１時間インキュベートした。PBS(-)で3回洗浄し、共焦点顕微鏡観察を行った。【０１２４】
試験例５
1.海馬神経細胞における固定化駆動ラベル化（図８）
実験方法
従来法(Wakayama, S.; Kiyonaka, S.; Arai, I.; Kakegawa, W.; Matsuda, S.; Ibata, K.; Nemoto, Y. L.; Kusumi, A.; Yuzaki, M.; Hamachi, I. Nat. Commun. 2017, 8, 14850.)に従い調製した海馬の培養神経細胞をPBS(-)で２回洗浄した。PBS(-)に、スキーム2で得たラベル化剤である化合物1 (Alexa647)(2 μM)を添加し、細胞に加え、室温で5分間インキュベートした。前述したラベル化剤入りPBS(-)と同量の2%PFAリン酸緩衝溶液を細胞に加え、室温で30分インキュベートした。PBS(-)で3回洗浄した後、免疫染色を行い、共焦点顕微鏡観察を行った。結果を図８に示す。【０１２５】
内在のAMPA型グルタミン酸受容体が存在するスパインを選択的に染色可能であること、通常の免疫染色法と併用可能であることが明らかになった。【０１２６】
2.小脳スライスにおける複数同時染色（図９）
従来法(Tamura, T.; Song, Z.; Amaike, K.; Lee, S.; Yin, S.; Kiyonaka, S.; Hamachi, I. J. Am. Chem. Soc. 2017, 139, 14181.)に従いマウス小脳スライスを調製した。ACSF (125 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1.25 mM NaH2PO4, 26 mM NaHCO3, 10 mM D-glucose)にスキーム2、7で各々得たラベル化剤である、化合物1 (Alexa647) (2 μM)、および化合物5 (Fluorescein) (0.2 μM)を添加し、それをマウス小脳スライスに対して加え、95%O2／5%CO2雰囲気下、室温で30分間インキュベートした。前述したラベル化剤入りACSFと同量の2%PFAリン酸緩衝溶液を細胞に加え、室温で60分間インキュベートした。PBS(-)で3回洗浄し,共焦点顕微鏡（confocal microscopy）観察を行った。結果を図９に示す。【０１２７】
小脳スライスに内在する複数の受容体（mGlu1およびAMPAR）を同時に可視化可能であることが明らかになった。また、インヒビター(FITM：4-Fluoro-N-[4-[6-(isopropylamino)pyrimidin-4-yl]-1,3-thiazol-2-yl]-N-methylbenzamide (4 μM)およびNBQX : 2,3-dioxo-6-nitro-1,2,3,4- tetrahydrobenzo[f]quinoxaline-7-sulfonamide (40 μM))を化合物1 (Alexa647) (2 μM)、および化合物5 (Fluorescein) (0.2 μM)と併用した場合、フルオレセイン(Fl)のmGlu1への結合、Alexa647のAMPARへの結合は阻害されることが明らかになった（図７下欄の画像を参照）。【０１２８】
3.小脳スライスにおける電位依存性カルシウムチャネル(VDCC: Voltage-dependent Ca2+ channel)に対するラベル化（図１０）
(1)VDCC可視化のためのラベル化剤合成【０１２９】
【化１３】
2019168125.tif 000015
スキーム9. Fluorophore-AgTx[1-48]の合成【０１３０】
N3-AgTx[1-24]-CONHNH2  （AgTX：ω-agatoxin IVA from Funnel Web Spider, Agelenopsis aperta）
2-クロロトリチルクロリド樹脂(1.51 mmol/g, 750 mg, 1.13 mmol)を5% H2NNH2/NMP (v/v) (4 mL)に加え、30分間撹拌した。溶液を除去し、NMPで樹脂を洗浄したのち、再び5% H2NNH2/NMP (v/v) (4 mL)を樹脂に30分間作用させた。溶液を除去し、NMPで樹脂を洗浄したのち、固相合成法にて、対応するペプチドフラグメントを合成し、逆相HPLCにより精製を行ないN3-AgTx[1-24]-CONHNH2を得た。AgTx[1-24]を配列番号２に示す。【０１３１】
Cys-AgTx[26-48]
NovaSyn(登録商標)TGA resinを用いて、固相合成法にて、対応するペプチドフラグメントを合成し、逆相HPLCにより精製を行ないCys-AgTx[26-48]を得た。配列番号３に示されるCys-AgTx[26-48]は、配列番号1の25番目から48番目のペプチドである。【０１３２】
N3-AgTx[1-48]
N3-AgTx[1-24]-CONHNH2(11.2 mg, 3 μmol)を0.2 M リン酸緩衝液/6 M 塩化グアニジニウム (pH 3.15) (500 μL)に加え、-20 °Cに冷却する。0.5 M NaNO2水溶液(60 μL, 30 μmol, 10 eq.)を加え、-20 °Cで30分攪拌した。その後、4-メルカプトフェニル酢酸 (MPAA) (51 mg, 0.3 mmol, 100 eq.) の0.2 M リン酸緩衝液/6 M 塩化グアニジニウム (pH 6.90) (500 μL)溶液、及びCys-AgTx[26-48] (8.4 mg, 3 μmol, 1.0 eq.)の0.2 M リン酸緩衝液/6 M 塩化グアニジニウム (pH 6.90) (500 μL)溶液を加え、5 Mおよび1 Mの水酸化ナトリウム水溶液でpH6.8-7.0に合わせた。室温で5時間反応させた後、100 mM DTTの0.2 M リン酸緩衝液/6 M 塩化グアニジニウム (pH 6.90) (500 μL)溶液を加え30分間攪拌後、30%酢酸 (500 μL)を加え、逆相HPLCにより精製を行いN3-AgTx[1-48]linearを得た。【０１３３】
得られたN3-AgTx[1-48]linear(2.0 mg, 0.375 μmol)、還元型グルタチオン (11.5 mg, 37.5 μmol, 100 eq.)、酸化型グルタチオン (2.3 mg, 3.75 μmol, 10 eq.)を1 M酢酸アンモニウム緩衝液 (pH 7.9) / 20v/v%グリセロール / 0.1 M EDTA (37.5 mL)に溶解させ、4 °Cで終夜攪拌した。その後、逆相HPLCにより精製を行ないN3-AgTx[1-48]を得た。AgTx[1-48]のアミノ酸配列を配列番号1に示す。【０１３４】
Fluorophore-AgTx[1-48]
106.8 μM N3-AgTx[1-48] (50 mM HEPES buffer (pH7.4))溶液に対して、1.5 eq.のClick-iTTM Alexa FluorTM 555 sDIBO alkyne (Thermo Fisher Scientific)、もしくはClick-iTTM Alexa FluorTM 647 DIBO alkyne (Thermo Fisher Scientific)を加えて、室温で3時間攪拌した。その後、酢酸を加え、30%酢酸溶液に調整後、逆相HPLCにより精製を行ないFluorophore-AgTx[1-48]を得た。
ESI-MS: Alexa Fluro 555-AgTx[1-48]: [M+2Na++2H+]4+ = 1705.24, Alexa Fluro 647-AgTx[1-48]: [M-3H+]3- = 1160.1【０１３５】
(2)小脳スライスにおけるVDCC可視化
従来法(Tamura, T.; Song, Z.; Amaike, K.; Lee, S.; Yin, S.; Kiyonaka, S.; Hamachi, I. J. Am. Chem. Soc. 2017, 139, 14181.)に従いマウス小脳スライスを調製した。ACSF (125 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1.25 mM NaH2PO4, 26 mM NaHCO3, 10 mM D-glucose)にラベル化剤Fluorophore-AgTx[1-48] (0.2 μM)を添加し、それをマウス小脳スライスに対して加え、95%O2／5%CO2雰囲気下、室温で30分間インキュベートした。前述したラベル化剤入りACSFと同量の2%PFAリン酸緩衝溶液を細胞に加え、室温で６０分インキュベートした。PBS(-)で3回洗浄し,共焦点顕微鏡観察を行った。または、上述と同様の系において、上述ラベル化剤（0.2 μM)単独ではなく、競合阻害剤（ω―agatoxion(P／Q型電位依存性カルシウムチャネルCac2.1ブロッカー)：濃度4 μM)）を併用した系においても共焦点顕微鏡観察を行った。結果を図１０に示す。【０１３６】
細胞表層の受容体だけでなく、イオンチャネルに対しても適用可能であること、小分子だけでなく中分子(ペプチド)をリガンドとして用いることも可能であることが明らかになった。【０１３７】
本開示のようなペプチドをリガンドとして用いる際、そのペプチドにリジンなどの求核性アミノ酸残基が含まれていれば、ラベル化剤にクロスリンクのためのアミンを組み入れる必要はない。ペプチドリガンドに存在する求核性アミノ酸残基がかわりに受容体とのクロスリンクに利用されるためである。【０１３８】
4.全小脳におけるmGlu1へのラベル化（図１１）
マウスを三種混合麻酔薬により昏睡させ、頭皮を切開し、大脳縦裂の延長線上の小脳部分の頭蓋骨に穴を開ける。その場所にラベル化剤として化合物5 (Alexa647)(10 μM)入りPBS(-)を6 μL、マイクロインジェクターを用いてインジェクトする。その後、頭皮を縫合し、拮抗薬を打ち込み、ケージにマウスを戻す。３時間後、4%PFAを用いて還流固定（４%PFA perfusion for fixation）をおこない、脳を取り出したのち、脳を4%PFA中で1時間浸した。脳はPBS(-)で洗浄後、凍結切片にし、共焦点顕微鏡観察を行った。結果を図１１に示す。【０１３９】
生きた状態（live condition）にある動物個体中にてラベル化剤を作用させ、還流固定のタイミングで目的の受容体をラベル化可能であることが明らかになった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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