(57)【要約】  本発明の課題は、ヒト抗体を産生する細胞の培養上清から、特定抗原特異的抗体を産生する細胞を含む培養上清を効率的にスクリーニングする方法を提供することである。本発明によれば、ヒト抗体を産生する細胞の培養上清から、抗体依存性細胞障害活性を指標として、特定抗原特異的抗体を産生する細胞を含む培養上清をスクリーニングする方法であって、明細書に規定する所定の条件を満たす培養上清を、特定抗原特異的抗体を産生する細胞を含む培養上清として選択する方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト抗体を産生する細胞の培養上清から、抗体依存性細胞障害活性を指標として、特定抗原特異的抗体を産生する細胞を含む培養上清をスクリーニングする方法であって、下記の条件を満たす培養上清を、特定抗原特異的抗体を産生する細胞を含む培養上清として選択する方法：
特定抗原を発現する標的細胞、攻撃細胞、及び前記培養上清を混合して培養する場合における抗体依存性細胞障害活性が、特定抗原を発現しない標的細胞、攻撃細胞、及び前記培養上清を混合して培養する場合における抗体依存性細胞障害活性よりも高く、かつ
特定抗原を発現する標的細胞、攻撃細胞、及び前記培養上清を混合して培養する場合における抗体依存性細胞障害活性が、特定抗原を発現する標的細胞、及び前記培養上清を混合して培養する場合における抗体依存性細胞障害活性よりも高い。
【請求項２】
ヒト抗体を産生する細胞の培養上清が、ヒトＢ細胞の培養上清である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ヒトＢ細胞の培養上清が、ヒトＢ細胞を、抗原を発現するフィーダー細胞上において培養した後の培養上清である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ヒトＢ細胞の培養上清が、ヒトＢ細胞を、Ｆａｓを介した刺激の存在下において培養した後の培養上清である、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
ヒトＢ細胞の培養上清が、ヒトＢ細胞を、ＩＬ−２及びＩＬ−２１の存在下において培養した後の培養上清である、請求項２から４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
特定抗原が、標的細胞の細胞膜表面に発現する膜抗原である、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
特定抗原が、膜貫通型受容体である、請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
特定抗原が、Ｇタンパク質共役受容体である、請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
ヒト抗体が、ヒトＩｇＧである、請求項１から８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
抗体依存性細胞障害活性を、死細胞が放出する酵素の検出による測定する、請求項１から９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１から１０の何れか一項に記載の方法により特定抗原特異的抗体を産生する細胞を含む培養上清をスクリーニングすることを含む、特定抗原特異的抗体を産生する細胞を含む培養上清の製造方法。
【請求項１２】
請求項１から１０の何れか一項に記載の方法により特定抗原特異的抗体を産生する細胞を含む培養上清をスクリーニングすることを含む、特定抗原特異的抗体を産生する細胞の製造方法。
【請求項１３】
請求項１から１０の何れか一項に記載の方法により特定抗原特異的抗体を産生する細胞を含む培養上清をスクリーニングすることを含む、特定抗原特異的抗体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト抗体を産生する細胞の培養上清から、抗体依存性細胞障害活性を指標として、特定抗原特異的抗体を産生する細胞を含む培養上清をスクリーニングする方法に関する。本発明はさらに、上記の通りスクリーニングすることを含む、特定抗原特異的抗体を産生する細胞を含む培養上清の製造方法に関する。本発明はさらに、上記の通りスクリーニングすることを含む、特定抗原特異的抗体を産生する細胞の製造方法に関する。本発明はさらに、上記の通りスクリーニングすることを含む、特定抗原特異的抗体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特定の抗原に対して高い選択性を示すモノクローナル抗体は、抗体医薬としての開発が期待され、特にがん細胞を標的とする抗体医薬の開発が進んでいる。抗体医薬を開発するためには、特定抗原特異的抗体をスクリーニングすることにより所望の抗体を取得することが必要である。【０００３】
特許文献１には、細胞表面抗原に特異的に結合し得るイムノバインダー（例えば、ｓｃＦｖ抗体）を同定するための方法が記載されている、特許文献１に記載の方法は、標識された抗原発現細胞と、標識されたイムノバインダー発現細胞とを接触させる工程および上記抗原発現細胞に結合するイムノバインダー発現細胞を、セルソーターを使用して単離する工程を包含する。【０００４】
また特許文献２には、Ｂ細胞集団を捕捉剤に接触させるステップと、捕捉されたＢ細胞を捕捉されていないＢ細胞から分離するステップと、捕捉された複数のＢ細胞を培養するステップであって、前記Ｂ細胞は培養の直前に一様なＢ細胞に選別されていないステップと、複数の培養細胞をスクリーニングして、所望の機能を有する抗体を産生することができる細胞を同定するステップと、それらから所望の抗体を得るステップとを含む、所望の機能を有する抗体を得る方法が記載されている。【０００５】
一方、特許文献３には、標的細胞に、これを認識するヒト抗体、ヒト化抗体、及びヒトキメラ抗体からなる群より選択される抗体を接触する工程；細胞表面にヒトＦｃ受容体を発現したＮＫ細胞由来細胞株を、前記抗体に接触する工程；前記標的細胞に細胞傷害が生じているか否かを検出する工程を含み、前記抗体が蛍光標識されており、前記工程（ｃ）を、標的細胞またはエフェクタ細胞の少なくとも一方を蛍光標識して、蛍光顕微鏡を用いた観察において両細胞を識別して観察・カウントすることにより行う、抗体依存性細胞傷害のアッセイ方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第５７６４０７１号公報
【特許文献２】特許第４６２４３５７号公報
【特許文献３】特許第５２８２０４０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
抗体のスクリーニングを行うための細胞の培養上清としては、ハイブリドーマの培養上清が汎用されている。ハイブリドーマの作製においては、大量に作製した抗原を用いて動物を免疫する。このように、ハイブリドーマの作製においては抗原が大量に作製されていることから、ハイブリドーマの培養上清のスクリーニングは、この抗原を用いたＥＬＩＳＡ法（(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay：酵素結合免疫吸着アッセイ）により行うことが一般的である。ＥＬＩＳＡによるスクリーニングにおいては、抗原の精製が必要であり、精製が困難な抗原に対する抗体をスクリーニングするための方法が望まれている。【０００８】
また、動物への免疫には、抗原を発現させた細胞や、目的の抗原を発現させるためのプラスミドＤＮＡを用いた免疫法も知られており、そのような場合の評価法（スクリーニング法）においては、cell-based ELISA（CELISA）と呼ばれる抗原を発現させた細胞を用いた方法を用いている場合もある（特許文献１を参照）。この方法を用いる場合は、抗原の精製を行う必要がない。しかし、この方法では抗原を発現させた細胞を細胞培養プレート上に播種した後に、１％パラホルムアルデヒドで固定しており、抗原タンパクを変性させている。抗原を変性させていることにより、抗原の立体構造に変化が生じてしまう可能性がある。また、この方法は細胞の固定処理等、複雑な工程を含むため、ハイスループットのスクリーニングには適していない。【０００９】
本発明は、ヒト抗体を産生する細胞の培養上清から、特定抗原特異的抗体を産生する細胞を含む培養上清を効率的にスクリーニングする方法を提供することを解決すべき課題とする。本発明はさらに、培養上清の濃縮および蛍光色素の標識を必要とすることなく、特定抗原特異的抗体を産生する細胞を含む培養上清をスクリーニングする方法を提供することを解決すべき課題とする。本発明はさらに、抗原の精製を必要とすることなく、特定抗原特異的抗体を産生する細胞を含む培養上清をスクリーニングする方法を提供することを解決すべき課題とした。本発明はさらに、上記の通りスクリーニングすることを含む、特定抗原特異的抗体を産生する細胞を含む培養上清の製造方法を提供することを解決すべき課題とする。本発明はさらに、上記の通りスクリーニングすることを含む、特定抗原特異的抗体を産生する細胞の製造方法、並びに上記の通りスクリーニングすることを含む、特定抗原特異的抗体の製造方法を提供することを解決すべき課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、特定抗原を発現する標的細胞、攻撃細胞、及び前記培養上清を混合して培養する場合における抗体依存性細胞障害活性が、特定抗原を発現しない標的細胞、攻撃細胞、及び前記培養上清を混合して培養する場合における抗体依存性細胞障害活性よりも高く、かつ特定抗原を発現する標的細胞、攻撃細胞、及び前記培養上清を混合して培養する場合における抗体依存性細胞障害活性が、特定抗原を発現する標的細胞、及び前記培養上清を混合して培養する場合における抗体依存性細胞障害活性よりも高いことを指標とすることによって、ヒト抗体を産生する細胞の培養上清から、特定抗原特異的抗体を産生する細胞を含む培養上清をスクリーニングできることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１１】
即ち、本発明によれば以下の発明が提供される。
（１）  ヒト抗体を産生する細胞の培養上清から、抗体依存性細胞障害活性を指標として、特定抗原特異的抗体を産生する細胞を含む培養上清をスクリーニングする方法であって、下記の条件を満たす培養上清を、特定抗原特異的抗体を産生する細胞を含む培養上清として選択する方法：
特定抗原を発現する標的細胞、攻撃細胞、及び前記培養上清を混合して培養する場合における抗体依存性細胞障害活性が、特定抗原を発現しない標的細胞、攻撃細胞、及び前記培養上清を混合して培養する場合における抗体依存性細胞障害活性よりも高く、かつ
特定抗原を発現する標的細胞、攻撃細胞、及び前記培養上清を混合して培養する場合における抗体依存性細胞障害活性が、特定抗原を発現する標的細胞、及び前記培養上清を混合して培養する場合における抗体依存性細胞障害活性よりも高い。
（２）  ヒト抗体を産生する細胞の培養上清が、ヒトＢ細胞の培養上清である、（１）に記載の方法。
（３）  ヒトＢ細胞の培養上清が、ヒトＢ細胞を、抗原を発現するフィーダー細胞上において培養した後の培養上清である、（２）に記載の方法。
（４）  ヒトＢ細胞の培養上清が、ヒトＢ細胞を、Ｆａｓを介した刺激の存在下において培養した後の培養上清である、（２）又は（３）に記載の方法。
（５）  ヒトＢ細胞の培養上清が、ヒトＢ細胞を、ＩＬ−２及びＩＬ−２１の存在下において培養した後の培養上清である、（２）から（４）の何れか一に記載の方法。
（６）特定抗原が、標的細胞の細胞膜表面に発現する膜抗原である、（１）から（５）の何れか一に記載の方法。
（７）特定抗原が、膜貫通型受容体である、（１）から（６）の何れか一に記載の方法。
（８）特定抗原が、Ｇタンパク質共役受容体である、（１）から（７）の何れか一に記載の方法。
（９）  ヒト抗体が、ヒトＩｇＧである、（１）から（８）の何れか一に記載の方法。
（１０）  抗体依存性細胞障害活性を、死細胞が放出する酵素の検出による測定する、（１）から（９）の何れか一に記載の方法。
（１１）  （１）から（１０）の何れか一に記載の方法により特定抗原特異的抗体を産生する細胞を含む培養上清をスクリーニングすることを含む、特定抗原特異的抗体を産生する細胞を含む培養上清の製造方法。
（１２）  （１）から（１０）の何れか一に記載の方法により特定抗原特異的抗体を産生する細胞を含む培養上清をスクリーニングすることを含む、特定抗原特異的抗体を産生する細胞の製造方法。
（１３）  （１）から（１０）の何れか一に記載の方法により特定抗原特異的抗体を産生する細胞を含む培養上清をスクリーニングすることを含む、特定抗原特異的抗体の製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、ヒト抗体を産生する細胞の培養上清から、特定抗原特異的抗体を産生する細胞を含む培養上清を効率的にスクリーニングすることができる。本発明のスクリーニング方法においては、培養上清の濃縮および蛍光色素の標識は必要とされないことからハイスループット（９６ウェルや３８４ウェルなど）での検出が可能である。また本発明のスクリーニング方法においては、抗原の精製も必要とされず、精製が困難である複雑な構造の膜抗原に対する抗体のスクリーニングにおいて特に有効である。本発明によれば、特定抗原特異的抗体を産生する細胞を含む培養上清、特定抗原特異的抗体を産生する細胞、および特定抗原特異的抗体を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ＡＤＣＣ活性を用いたスクリーニング方法の概要を示す。
【図２】図２は、Ｔｒａｓｔｓｕｚｕｍａｂ型抗体を用いたＡＤＣＣ活性測定の結果を示す。
【図３】図３は、抗ＣＸＣＲ２抗体発現細胞の培養上清を用いたＡＤＣＣ活性測定の結果を示す。
【図４】図４は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で作製した抗体の抗原結合能の検討結果を示す。
【図５】図５は、抗ＣＸＣＲ２抗体発現細胞の培養上清を用いたＡＤＣＣ活性測定の結果を示す。
【図６】図６は、抗ＣＸＣＲ２抗体発現細胞の培養上清を用いたＡＤＣＣ活性測定の結果を示す。
【図７】図７は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で作製した抗体の抗原結合能の検討結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、ヒト抗体を産生する細胞の培養上清から、抗体依存性細胞障害活性を指標として、特定抗原特異的抗体を産生する細胞を含む培養上清をスクリーニングする方法であって、下記の条件を満たす培養上清を、特定抗原特異的抗体を産生する細胞を含む培養上清として選択する方法に関する。
特定抗原を発現する標的細胞、攻撃細胞、及び前記培養上清を混合して培養する場合における抗体依存性細胞障害活性が、特定抗原を発現しない標的細胞、攻撃細胞、及び前記培養上清を混合して培養する場合における抗体依存性細胞障害活性よりも高く、かつ
特定抗原を発現する標的細胞、攻撃細胞、及び前記培養上清を混合して培養する場合における抗体依存性細胞障害活性が、特定抗原を発現する標的細胞、及び前記培養上清を混合して培養する場合における抗体依存性細胞障害活性よりも高い。
【００１５】
本発明はさらに、上記した本発明の方法によりスクリーニングすることを含む、特定抗原特異的抗体を産生する細胞を含む培養上清の製造方法に関する。本発明はさらに、上記した本発明の方法によりスクリーニングすることを含む、特定抗原特異的抗体を産生する細胞の製造方法に関する。本発明はさらに、上記した本発明の方法によりスクリーニングすることを含む、特定抗原特異的抗体の製造方法に関する。
【００１６】
本発明においては、抗体依存性細胞障害活性を指標としてスクリーニングを行うことから、高い抗体依存性細胞障害活性を有する抗体を取得することができる。高い抗体依存性細胞障害活性を有する抗体は、がん、炎症性疾患、自己免疫疾患、アレルギーなどの免疫疾患、循環器疾患、またはウィルスあるいは細菌感染をはじめとする各種疾患の予防および治療において有用である。
【００１７】
本発明による培養上清の製造方法は、ヒト抗体を産生する細胞を培養することにより培養上清を生成させること、及び上記で得られた培養上清を回収することを含んでいてもよい。
【００１８】
本発明による特定抗原特異的抗体を産生する細胞の製造方法は、ヒト抗体を産生する細胞を準備する工程、上記で準備したヒト抗体を産生する細胞の培養上清から、抗体依存性細胞障害活性を指標として、特定抗原特異的抗体を産生する細胞を含む培養上清をスクリーニングする工程、およびスクリーニングにより選別された培養上清に対応する細胞を選別する工程を含んでいてもよい。
【００１９】
本発明による特定抗原特異的抗体の製造方法は、ヒト抗体を産生する細胞を準備する工程、上記で準備したヒト抗体を産生する細胞の培養上清から、抗体依存性細胞障害活性を指標として、特定抗原特異的抗体を産生する細胞を含む培養上清をスクリーニングする工程、およびスクリーニングにより選別された培養上清から特定抗原特異的抗体を得る工程を含んでいてもよい。
【００２０】
また、本発明による特定抗原特異的抗体の製造方法は、ヒト抗体を産生する細胞を準備する工程、上記で準備したヒト抗体を産生する細胞の培養上清から、抗体依存性細胞障害活性を指標として、特定抗原特異的抗体を産生する細胞を含む培養上清をスクリーニングする工程、スクリーニングにより選別された培養上清に対応する細胞を選別する工程、上記で選別された細胞を培養して特定抗原特異的抗体を製造する工程を含んでいてもよい。
【００２１】
本発明においては、細胞の培養上清をそのまま用いることができ、培養上清の濃縮、濃度測定、蛍光色素の標識は必要としない。本発明においては培養上清の調製が必要ないことから、ハイスループット（９６ウェルや３８４ウェルなど）の検出が可能である。また、本発明においては、目的抗原は細胞に直接発現させているため、抗原を精製する必要がない。対象となる抗原は生細胞上に発現しており、膜表面に安定発現しているため、抗原としての立体構造は維持されており、変性していない。従って、本発明の方法は、精製が困難である複雑な構造の膜抗原（例えば、Ｇタンパク共役型受容体（7回膜貫通型受容体）など）に対する抗体のスクリーニングを行う際に特に有効である。
【００２２】
＜抗体依存性細胞障害活性を指標とすること＞
本発明においては、ヒト抗体を産生する細胞の培養上清から、抗体依存性細胞障害活性を指標として、特定抗原特異的抗体を産生する細胞を含む培養上清をスクリーニングする。具体的には下記の条件を満たす培養上清を、特定抗原特異的抗体を産生する細胞を含む培養上清として選択する。
【００２３】
特定抗原を発現する標的細胞、攻撃細胞、及び前記培養上清を混合して培養する場合における抗体依存性細胞障害活性が、特定抗原を発現しない標的細胞、攻撃細胞、及び前記培養上清を混合して培養する場合における抗体依存性細胞障害活性よりも高く、かつ
特定抗原を発現する標的細胞、攻撃細胞、及び前記培養上清を混合して培養する場合における抗体依存性細胞障害活性が、特定抗原を発現する標的細胞、及び前記培養上清を混合して培養する場合における抗体依存性細胞障害活性よりも高い。
【００２４】
（特定抗原）
本発明において、特定抗原は特に限定されないが、好ましくは、膜抗原であり、より好ましくは標的細胞の細胞膜表面に発現する膜抗原である。
【００２５】
特定抗原としては、がん特異的膜抗原でもよく、例えば、ＨＥＲ２（ｈｕｍａｎ  ＥＧＦＲ−ｒｅｌａｔｅｄ  ２の略）、ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  （ＣＥＡ）、ｍｕｃｉｎ  １（ＭＵＣ−１）、ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  （ＥｐＣＡＭ）、ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）、ｃａｎｃｅｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  １２５（ＣＡ１２５）などが挙げられる。
【００２６】
特定抗原としては、膜貫通型受容体でもよい。膜貫通型受容体としては、例えば、イオンチャンネル連結型受容体、又は、イオンチャンネルと連結していない受容体を挙げることができる他、例えば、キナーゼタイプ受容体又は非キナーゼタイプ受容体を挙げることができる。
【００２７】
イオンチャンネル連結型受容体は、細胞膜を貫通している小孔状の受容体であり、シグナルであるリガンド分子の結合により、小孔が開閉して細胞内部と細胞外部のＮａ+、Ｋ+、又はＣａ2+などのイオン輸送を行う。イオンチャンネル連結型受容体としては、例えば、アセチルコリン、グルタミン酸、セロトニン、ＧＡＢＡａ、又はグリシンをリガンドとする各受容体を挙げることができる。例えば、アセチルコリン、グルタミン酸、又はセロトニンをリガンドとするイオンチャンネル型受容体はＮａ+を、ＧＡＢＡａやグリシンをリガンドとするイオンチャンネル型受容体はＣｌ-の輸送を行う。
【００２８】
キナーゼタイプ受容体は、膜一回貫通型の構造を有し、細胞膜内にキナーゼが結合している受容体である。キナーゼタイプ受容体としては、例えば、増殖因子型受容体ファミリー又はＴＧＦ（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）−β受容体ファミリーを挙げることができる。
【００２９】
増殖因子型受容体ファミリーは、細胞膜内側にチロシンキナーゼを保有しており、リガンドが結合すると細胞膜内ドメインのチロシンがリン酸化されることで活性化する受容体である。増殖因子型受容体ファミリーとしては、例えば、インシュリン受容体、Ｍ−ＣＳＦ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）受容体、ＥＧＦ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）受容体、ＰＤＧＦ（ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）受容体、ＦＧＦ（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）受容体、ＩＧＦ（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）受容体、又はＨＧＦ（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）受容体などを挙げることができる。
【００３０】
ＴＧＦ−β受容体ファミリーは    細胞膜内部にセリンスレオニンキナーゼを保有しており、セリン又はスレオニンがリン酸化されることで活性化する受容体である。ＴＧＦ−β受容体ファミリーとしては、例えば、ＴＧＦ受容体、アクチビン（ａｃｔｉｖｉｎ）受容体、又はＢＭＰ（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）受容体などを挙げることができる。
【００３１】
非キナーゼタイプの受容体としては、例えば、サイトカイン受容体（Ｉ型サイトカイン受容体）スーパーファミリー、ＩＦＮ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）受容体（ＩＩ型サイトカイン受容体）ファミリー、ＴＮＦ（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ）受容体（ＩＩＩ型サイトカイン受容体）ファミリー、免疫グロブリンスーパーファミリー、又はＧタンパク質共役型受容体ファミリーを挙げることができる。
【００３２】
サイトカイン受容体スーパーファミリーは、膜一回貫通型受容体であり、Ｎ末端側に４つのシステイン残基の繰り返し又はＷＳボックスと呼ばれる特徴的なアミノ酸配列を有し、細胞外には、ファイブロネクチン（ＦＮ）様構造の繰り返し配列を有する受容体である。サイトカイン受容体スーパーファミリーとしては、例えば、ＩＬ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）−２受容体、ＩＬ−３受容体、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−５受容体、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−９受容体、ＩＬ−１１受容体、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１３受容体、ＩＬ−１５受容体、ＧＭ−ＣＳＦ（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）受容体、ＣＮＴＦ（ｃｉｌｉａｒｙ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）受容体、ＥＰＯ（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）受容体、ＬＩＦ（Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）受容体、ＯＳＭ（ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ  Ｍ）受容体、又はＧ−ＣＳＦ（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）受容体などを挙げることができる。多くの場合、２〜３個のサブユニットにより構成されているが、シグナル伝達に関与するサブユニットは、複数の受容体間で共有されている。
【００３３】
ＩＦＮ受容体ファミリーは、ＷＳボックスはもたないが、膜一回貫通型の構造やシステイン残基の繰り返しなど、サイトカイン受容体スーパーファミリーと構造上類似した受容体である。ＩＦＮ受容体ファミリーとしては、例えば、ＩＦＮα受容体、ＩＦＮβ受容体、ＩＦＮγ受容体、又はＩＬ−１０受容体などを挙げることができる。
【００３４】
ＴＮＦ受容体ファミリーは、その細胞外ドメインが、システイン残基の豊富なユニットにより構成された受容体である。このユニットには各ＴＮＦ受容体ファミリーの受容体間で相同性がある。ＴＮＦ受容体Ｉ及びＦａｓの細胞内ドメインにはデスドメイン（ｄｅａｔｈ  ｄｏｍａｉｎ）と呼ばれる配列が存在している。ＴＮＦ受容体ファミリーとしては、例えば、ＴＮＦ受容体、ＮＧＦ（ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）受容体、Ｆａｓ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＨＶＥＭ（Ｈｅｒｐｅｓ  ｖｉｒｕｓ  ｅｎｔｒｙ  ｍｅｄｉａｔｏｒ）、ＬＴＢ（Ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎβ）受容体、ＯＸ４０、ＲＡＮＫ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ＮＦ−κＢ）、又はＣＤ１３７などを挙げることができ、多くが細胞活性化や細胞死に関連している。
【００３５】
免疫グロブリンスーパーファミリーは、細胞外に免疫グロブリン様ドメインを３つ保有した構造を有する受容体である。免疫グロブリンスーパーファミリーとしては、例えば、ＩＬ−１受容体又はＩＬ−１８受容体などを挙げることができる。また、構造的に類似したＴｏｌｌ又はＴｏｌｌ様受容体などを挙げることができる。これらはＴＬＲ１〜ＴＬＲ１２などがあり、エンドトキシンが細胞に作用する時にその情報を伝達するＴＬＲ４もこのファミリーの受容体である。
【００３６】
Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）ファミリーは、Ｇタンパク質と共役して働き、細胞膜を７回貫通する構造を有する受容体である。ＧＰＣＲファミリーとしては、例えば、ロドプシン受容体（Ｇｔ）、カテコールアミン受容体［β1、β2、β3（以上、Ｇｓ）、α1（Ｇｑ）、α2（Ｇｓ、Ｇｉ、Ｇｚ、Ｇｑ）］、ドーパミン受容体［Ｄ１、Ｄ５（以上、Ｇｓ）、Ｄ２（Ｇｉ）］、ムスカリン受容体［ｍ１、ｍ３（以上、Ｇｑ）、ｍ２、ｍ４、ｍ５（以上、Ｇｉ、Ｇｏ］、アデノシン受容体［Ａ１、Ａ３（以上、Ｇｉ）、Ａ２（Ｇｓ）］、ＰＧＥ受容体［ＥＰ２、ＥＰ４（以上、Ｇｓ）、ＥＰ３（Ｇｉ）、ＥＰ１］、ロイコトリエン受容体［ＢＬＴ、Ｃｙｓ−ＬＴ１（以上、Ｇｉ、Ｇｑ）］、スフィンゴシン１−リン酸受容体［Ｓ１Ｐ1（Ｇｉ）、Ｓ１Ｐ2、Ｓ１Ｐ3（以上、Ｇｉ、Ｇｑ、Ｇ13］、リゾホスファチジン酸受容体［ＬＰＡ1（Ｇｉ、Ｇ12/13）、ＬＰＡ2、ＬＰＡ3（以上、Ｇｓ、Ｇｑ）］、ノシセプチン受容体、ｈＧＰＣＲ４４（Ｇｉ）、ｈＧＰＣＲ４、ｈＧＰＣＲ１０、ｈＧＰＣＲ１７、ｈＧＰＣＲ１９、ｈＧＰＣＲ３９、又はｈＧＰＣＲ４８などを挙げることができる。なお、各受容体の後に続く括弧内の記載は、受容体サブタイプと、共役して働くＧタンパク質αサブユニットの種類を示す。
【００３７】
（標的細胞）
本発明においては、特定抗原を発現する標的細胞、および特定抗原を発現しない標的細胞を使用する。同一のスクリーニングにおける標的細胞としては、特定抗原を発現する標的細胞、および特定抗原を発現しない標的細胞について、同一の細胞を使用することが好ましい。
【００３８】
標的細胞の種類は特に限定されず、特定抗原を発現する動物細胞を用いることができる。標的細胞としては、例えば、フィーダー細胞を使用することができる。
フィーダー細胞の由来としては、哺乳動物の霊長類、有蹄類、小型哺乳類の齧歯類、鳥類などが挙げられ、好ましくは、齧歯類及び哺乳類由来のものであり、マウス、ヒトなどを例示することができる。フィーダー細胞として使用可能な細胞としては、線維芽細胞、上皮細胞（例えばＨｅＬａ細胞）、胎児腎臓細胞（例えば、ＨＥＫ２９３など）、濾胞樹状細胞などを挙げることができる。なかでも、増殖速度が速く、細胞表面積が大きい、フィーダー細胞の除去が簡便であるとの観点から、線維芽細胞が好ましい。
【００３９】
フィーダー細胞としては、好ましくは、ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ、及び所望によりＦａｓＬを細胞表面に提示されたフィーダー細胞を使用することができる。上記のフィーダー細胞は、ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ、及びＦａｓＬの既知の配列に基づいて、当業者であれば遺伝子組み換え技術等を用いて作製することができる。
【００４０】
ＣＤ４０Ｌは、ＣＤ４０に対するリガンドであり、ＣＤ４０Ｌのアミノ酸配列は公知となっている（例えば、Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３５７，ｐｐ．８０−８２（１９９２）及び、ＥＭＢＯ  Ｊ．，Ｖｏｌ．１１，ｐｐ．４３１３−４３２１（１９９２）参照）。ＣＤ４０Ｌの配列のうち、受容体結合能に関与する活性ドメインの結合能が失われない程度に保存されていればよく、例えば、活性ドメインの８０％以上のアミノ酸配列相同性があれば、本発明において利用可能である。このようなＣＤ４０Ｌは、自然に発現する細胞から単離したものであってもよく、既知のアミノ酸配列に基づいて合成したものであってもよい。また、ＣＤ４０Ｌは、培養系中のＢ細胞に対してＣＤ４０Ｌの存在に対応したシグナルを与えることができる形態であればよく、遊離型であっても、膜結合型であってもよい。
【００４１】
ＢＡＦＦ（Ｂ細胞活性化因子：Ｂ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｌｏｎｇｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｆａｍｉｌｙ）は、ＴＮＦ類縁分子であって抗原と反応したＢ細胞の増殖、分化等に関与していることが知られている分子であり、ＢＡＦＦのアミノ酸配列は既に公知となっている（例えば、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，Ｖｏｌ．１８９，ｐｐ．１７４７−１７５６（１９９９）及び、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｖｏｌ．２８５，ｐｐ．２６０−２６３（１９９９）及び、Ｊ  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ，  Ｖｏｌ．２７４，  ｐｐ．１５９７８−１５９８１（１９９９））。ＢＡＦＦの配列のうち、受容体結合能に関与する活性ドメインの結合能が失われない程度に保存されていればよく、例えば、活性ドメインの８０％以上のアミノ酸配列相同性があれば、本発明において利用可能である。このようなＢＡＦＦは、自然に発現する細胞から単離したものであってもよく、既知のアミノ酸配列に基づいて合成したものであってもよい。また、ＢＡＦＦは、培養系中のＩｇＧ陽性Ｂ細胞に対してＢＡＦＦの存在に対応したシグナルを与えることができる形態であればよく、遊離型（即ち、分泌型）であっても、膜結合型であってもよい。
【００４２】
Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）は、ＴＮＦファミリーに属するデス因子、即ちアポトーシス誘導活性を示すサイトカインであり、そのアミノ酸配列は公知となっている（例えば、Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．７５，  ｐｐ．１１６９−１１７８  （１９９３））参照。本発明では、ＦａｓＬの配列のうち、受容体結合能に関与する活性ドメインの結合能が失われない程度に保存されていればよく、例えば、活性ドメインの８０％以上のアミノ酸配列相同性があれば、本発明において利用可能である。このようなＦａｓＬは、自然に発現する細胞から単離したものであってもよく、既知のアミノ酸配列に基づいて合成したものであってもよい。また、ＦａｓＬは、培養系中のＩｇＧ陽性Ｂ細胞に対してＦａｓの存在に対応したシグナルを与えることができる形態であればよく、細胞内シグナルを生じさせることができれば遊離型であっても、膜結合型であってもよい。  ＦａｓＬは、一般的にＢ細胞に対してアポトーシスを誘導可能な濃度で培養系に存在していればよい。
【００４３】
ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ及びＦａｓＬの由来としては、哺乳動物の霊長類、有蹄類、小型哺乳類の齧歯類、鳥類などが挙げられ、好ましくは、齧歯類及び哺乳類由来のものであり、ヒト、マウスを例示することができる。
【００４４】
（攻撃細胞）
本発明において使用する攻撃細胞（エフェクター細胞とも言う）は、抗体を認識するＦｃγＲ（Ｆｃγレセプター）を発現する細胞であれば特に限定されず、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、マクロファージ、単球（末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）など）、樹状細胞、好中球、肥満（マスト）細胞などを使用することができる。上記の中でも、好ましくは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を使用することができる。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞としては、ＫＨＹＧ−１、ｉＮＫ−９２、ＮＫ−ＹＳ、ＮＫ−ＹＴ、ＭＯＴＮ−１、ＮＫＬ、ＨＡＮＫ−１またはＮＫＧ細胞株などが挙げられるが、特に限定されない。特に好ましくは、ＫＨＹＧ−１を使用できる。
【００４５】
（抗体依存性細胞障害活性）
本発明においては、
攻撃細胞、及び前記培養上清を混合して培養する場合における抗体依存性細胞障害活性が、特定抗原を発現しない標的細胞、攻撃細胞、及び前記培養上清を混合して培養する場合における抗体依存性細胞障害活性よりも高く、かつ
特定抗原を発現する標的細胞、攻撃細胞、及び前記培養上清を混合して培養する場合における抗体依存性細胞障害活性が、特定抗原を発現する標的細胞、及び前記培養上清を混合して培養する場合における抗体依存性細胞障害活性よりも高い；
ことを指標とする。
【００４６】
抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ活性）とは、標的細胞の細胞表面抗原に特異的抗体が付着した際、そのＦｃ部分に攻撃細胞（Ｆｃγ受容体を保有するエフェクター細胞）がＦｃγ受容体を介して結合し、標的細胞に傷害を与える活性を意味する。
【００４７】
抗体依存性細胞障害活性は、公知の方法により測定することができる。具体的には、以下の方法により行うことが可能である。
特定抗原を発現しない標的細胞、特定抗原を発現する標的細胞、攻撃細胞、及び培養上清を準備する。
特定抗原を発現しない標的細胞、及び特定抗原を発現する標的細胞を、９６ウェルプレートに播種する。次いで、培地をスクリーニング用の培養上清に交換し、培養を行う。その後、攻撃細胞を各ウェルに添加する。特定抗原を発現する標的細胞と、攻撃細胞と、培養上清とを使用する実験系、特定抗原を発現しない標的細胞と、攻撃細胞と、培養上清とを使用する実験系、並びに特定抗原を発現する標的細胞と、培養上清とを使用する実験系とを行う。適当な時間培養した後に、培養上清を用いてＡＤＣＣ活性を、死細胞が放出する酵素（例えば、ＬＤＨなど）を測定することで評価することができる。
【００４８】
「攻撃細胞、及び前記培養上清を混合して培養する場合における抗体依存性細胞障害活性が、特定抗原を発現しない標的細胞、攻撃細胞、及び前記培養上清を混合して培養する場合における抗体依存性細胞障害活性よりも高く、かつ特定抗原を発現する標的細胞、攻撃細胞、及び前記培養上清を混合して培養する場合における抗体依存性細胞障害活性が、特定抗原を発現する標的細胞、及び前記培養上清を混合して培養する場合における抗体依存性細胞障害活性よりも高い」における「高く」および「高い」とは、上記のようにして死細胞が放出する酵素（例えば、ＬＤＨなど）を測定することによって評価した抗体依存性細胞障害活性が高いことを意味する。その度合いは、酵素の測定における吸光度の比率が１．１倍以上、１．２倍以上、１．３倍以上、１．４倍以上、１．５倍以上、１．６倍以上、１．７倍以上、１．８倍以上、１．９倍以上、または２．０倍以上であればよい。
【００４９】
＜ヒト抗体を産生する細胞の培養上清＞
本発明においては、ヒト抗体を産生する細胞の培養上清をスクリーニングする。
ヒト抗体の種類は、特に限定されず、ヒトＩｇＧ、ヒトＩｇＡ、ヒトＩｇＭ、ヒトＩｇＤ、ヒトＩｇＥの何れでもよいが、好ましくはヒトＩｇＧである。
【００５０】
ヒト抗体を産生する細胞の培養上清としては、特に限定されないが、例えば、ヒトＢ細胞の培養上清、または樹立された動物細胞株（ＣＨＯ−Ｋ１細胞など）の培養上清を使用することができる。
ヒトＢ細胞の培養上清としては、好ましくは、ヒトＢ細胞を、抗原を発現するフィーダー細胞上において培養した後の培養上清を使用することができる。
ヒトＢ細胞の培養上清としては、好ましくは、ヒトＢ細胞を、Ｆａｓを介した刺激の存在下において培養した後の培養上清を使用することができる。
ヒトＢ細胞の培養上清としては、好ましくは、ヒトＢ細胞を、ＩＬ−２及びＩＬ−２１の存在下において培養した後の培養上清を使用することができる。
【００５１】
ヒトＢ細胞としては、Ｂａｃｈ２遺伝子の発現が上昇しているＢ細胞を使用してもよい。Ｂａｃｈ２遺伝子の発現が上昇しているＢ細胞としては、Ｂ細胞にＢａｃｈ２遺伝子を導入することによって得られる細胞、またはＢ細胞が元々有しているＢａｃｈ２遺伝子の発現量又は存在量を増大させることにより得られる細胞の何れでもよい。Ｂａｃｈ２遺伝子の発現が上昇しているＢ細胞については、国際公開ＷＯ２０１６／００２７６０号公報の段落００２０〜００３５に記載されており、国際公開ＷＯ２０１６／００２７６０号公報に記載の内容は本明細書により援用される。
【００５２】
Ｂ細胞が元々有しているＢａｃｈ２遺伝子の発現量又は存在量を増大させる手法としては、Ｍｅｎｉｎ遺伝子（Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，  ５：３５５５，  ＤＯＩ：１０：１０３８．ｎｃｏｍｍｓ４５５５）をＢ細胞に導入する方法、レプトマイシンＢ（ＬＭＢ）の添加によりＢａｃｈ２の核外輸送を阻害して核に局在化させる方法、またはＢａｃｈ２のユビキチン化とプロテアソ−ムによる分解の阻害剤を添加する方法などが挙げられるが、特に限定されない。
【００５３】
Ｂ細胞にＢａｃｈ２遺伝子を導入する場合におけるＢａｃｈ２遺伝子は、国際公開ＷＯ２０１６／００２７６０号公報の段落００２２〜００３１に記載されている通りである。
Ｂ細胞にＢａｃｈ２遺伝子を導入するためには、Ｂａｃｈ２遺伝子を有する組み換えベクターを構築し、この組み換えベクターをＢ細胞に導入すればよい。
【００５４】
Ｂａｃｈ２遺伝子の発現の上昇のレベルについては特に限定されないが、元々のＢ細胞と比べて、Ｂａｃｈ２遺伝子の発現量が１．５倍以上であることが好ましく、２倍以上であることがさらに好ましい。
【００５５】
ヒト抗体を産生する細胞(好ましくはＢ細胞)は、好ましくは、細胞表面にヒト抗体を有する細胞である。細胞表面にヒト抗体を有する細胞は、細胞集団からヒト抗体の有無に基づいて得ることができる。
【００５６】
ヒト抗体を産生する細胞を含有する細胞集団は、一般には末梢血細胞、骨髄細胞又はリンパ系臓器、例えば脾臓細胞などに由来する細胞集団であればよく、特に限定されない。またＩｇＧ陽性Ｂ細胞としては、抗原未反応のナイーブＢ細胞であっても、抗原接触後のＢ細胞であってもよい。ここで本明細書における「ナイーブＢ細胞」とは、抗原と未反応の成熟Ｂ細胞を一般に指し、ＣＸＣＲ５陽性且つＣＤ４０陽性の表面抗原を示す細胞が該当する。
【００５７】
分化段階における他のステージのＢ細胞や多種の細胞が含まれていてもよい。培養による選択の効率の観点から、ＩｇＧ陽性Ｂ細胞以外のＢ細胞、例えば、ＩｇＥ陽性細胞、ＣＤ１３８陽性（プラズマ）細胞や、Ｂ細胞以外の細胞、例えば、Ｔ細胞、単球、ＮＫ細胞を除去することが好ましい。
【００５８】
Ｂ細胞集団は、免疫系が確立された生物由来の細胞集団であればよく、哺乳動物の霊長類、例えばヒト、サルなど、有蹄類、例えばブタ、ウシ、ウマなど、小型哺乳類の齧歯類、例えばマウス、ラット、ウサギなど、鳥類、例えはニワトリ、ウズラなどが含まれる。本細胞集団の由来としては、齧歯類及び霊長類であることが好ましく、マウス、ヒトを例示することができる。脾臓等の生体組織から細胞集団を調製する方法は、通常のＢ細胞集団を調製する条件をそのまま適用すればよい。また、生体由来の細胞集団に限定されず、確立されたＢ細胞株であってもよい。
【００５９】
Ｂ細胞を含む細胞集団の培養は、通常、Ｂ細胞の培養に用いられる培地による通常の培養条件であればよい。このような培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）や、ＲＰＭＩ１６４０などを挙げることができる。これらの培地に対しては、通常、血清、各種ビタミン、各種抗生物質等、通常の細胞培養に適用可能な各種添加剤を添加してもよい。  培養温度などの培養条件は、一般的なＢ細胞に対して用いられる培養条件をそのまま適用することができ、例えば、３７℃５％ＣＯ2の条件が挙げられる。  細胞集団の培地への播種密度は、細胞集団の由来や組織から調製した細胞の状態、また同一培養系内で行う培養日数によって異なるが、一般に、１×１０2個〜１×１０7個／ｃｍ2、好ましくは１×１０3個〜１×１０7個／ｃｍ2とすればよく、特にヒトＢ細胞は高密度で培養を開始した方が増殖率が良いことから、好ましくは１×１０4個〜１×１０7個／ｃｍ2とすればよい。この範囲内であれば、４日間程度の培養後に、過増殖状態になることを予防できる。
【００６０】
Ｂ細胞は、ＩＬ−２１の存在下で、ＣＤ４０、ＢＡＦＦ受容体を介した刺激により細胞内シグナルを生じさせる場合には、ＩＬ−２１受容体（ＩＬ−２１Ｒ）、ＣＤ４０、及びＢＡＦＦ受容体（ＢＡＦＦ−Ｒ）を有することが好ましい。これらの分子に対する刺激は、これらの分子を外部から認識してＣＤ４０及びＢＡＦＦ受容体を有するＩｇＧ陽性Ｂ細胞の内部に細胞内シグナルを生じさせるものであれば制限はない。
【００６１】
本発明において好ましくは、Ｂａｃｈ２遺伝子の発現が上昇しているＢ細胞を、ＣＤ４０及び／又は ＢＡＦＦ受容体に対する作用手段の存在下において培養する際に、ＩＬ−２１受容体に対する作用手段の存在下において培養を行う。
【００６２】
ＩＬ−２１受容体に対する作用手段としては、ＩＬ−２１または抗ＩＬ−２１受容体抗体を使用することができる。
ＩＬ−２１は、天然由来のものであってもよく、生物工学的に得られた組換え体のものであってもよい。ＩＬ−２１の由来としては、上述した細胞集団と同様に、哺乳動物の霊長類、有蹄類、小型哺乳類の齧歯類、鳥類などが挙げられる。これらの分子はそれぞれ、好ましくは、齧歯類及び哺乳類由来のものであり、例えばマウス、ヒトなどを挙げることができる。また、提示対象となる上記細胞集団と同一の種に由来する分子であってもよく、異なる種に由来する細胞であってもよい。
【００６３】
Ｂ細胞を培養する培地中に含まれるＩＬ−２１及び／又は抗ＩＬ−２１受容体抗体の濃度は、特定抗原に対して親和性を有するＩｇＧ陽性Ｂ細胞を増殖可能な量であればよく、一般に、１ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌとすることが好ましく、５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌとすることが更に好ましい。
【００６４】
本発明において好ましくは、Ｂａｃｈ２遺伝子の発現が上昇しているＢ細胞を、ＣＤ４０及び／又は ＢＡＦＦ受容体に対する作用手段の存在下において培養する際に、ＩＬ−４及び／又はＩＬ−２の存在下において培養してもよい。
【００６５】
本発明におけるＩＬ−２１受容体（ＩＬ−２１Ｒ）、ＣＤ４０、ＢＡＦＦ受容体（ＢＡＦＦ−Ｒ）を有するＩｇＧ陽性Ｂ細胞は、これらの分子の存在を、例えば抗体等を用いたときの反応性等に基づいて得てもよいが、調製時間及び目的とするＩｇＧ陽性Ｂ細胞の細胞密度の観点から、Ｂ細胞を含む細胞集団を、ＣＤ４０及びＢＡＦＦ受容体を介した刺激を付与しながら、ＩＬ−４の存在下で培養する一次培養工程及びＩＬ−２１の存在下で培養する二次培養工程により培養すること（培養工程）を含む方法によって得たものでもよい。
【００６６】
上記培養工程では、一次培養及び二次培養とも、ＣＤ４０及びＢＡＦＦ受容体を介した刺激を付与しながら行うことができる。ＣＤ４０及びＢＡＦＦ受容体を介した刺激としては、選別工程と同様に、これらの分子に対する抗体を用いて行ってもよく、ＣＤ４０Ｌ及びＢＡＦＦを用いてもよい。またこれらの抗体及び分子からの刺激を確実に培養対象となる細胞集団に対して付与する観点から、これらの抗体またはＣＤ４０Ｌ及びＢＡＦＦを有する担体、例えばフィーダー細胞等を用いてもよい。ＣＤ４０Ｌ及びＢＡＦＦと、担体等については、選別工程において記載した事項をそのまま適用することができる。培養工程で用いられる担体又はフィーダー細胞については、それぞれ培養用担体または培養用フィーダー細胞とよぶことがある。
【００６７】
一次培養に用いられるＩＬ−４は、天然由来のものであってもよく、生物工学的に得られた組換え体のものであってもよい。ＩＬ−４の濃度は、Ｂ細胞の効果的な増殖の観点から１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌとすることが好ましく、５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌとすることがより好ましく、１０ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌとすることがさらに好ましい。
【００６８】
また一次培養では、培養対象となるＢ細胞集団の種類や由来に応じて、ＩＬ−４とともに他のサイトカインも使用してもよい。例えばＩＬ−２をＩＬ−４と併用する場合には、ＩＬ−２の濃度は１ｕｎｉｔ／ｍｌ〜１０００ｕｎｉｔ／ｍｌであることが好ましく、２．５ｕｎｉｔ／ｍｌ〜１０００ｕｎｉｔ／ｍｌであることがより好ましく、２．５ｕｎｉｔ／ｍｌ〜５００ｕｎｉｔ／ｍｌであることがさらに好ましく、１０ｕｎｉｔ／ｍｌ〜１００ｕｎｉｔ／ｍｌであることが特に好ましい。
【００６９】
一次培養を開始するときの細胞の播種密度は、特に制限はないが、細胞集団の由来や組織から調製した細胞の状態、また同一培養系内で行う培養日数によって異なるが、一般に、１×１０2個〜１×１０6個／ｃｍ2、好ましくは１×１０3個〜１×１０6個／ｃｍ2とすればよい。  また一次培養は、播種密度によって異なる場合もあるが、Ｂ細胞集団の増殖速度の観点から一般に培養開始後２日〜８日としてもよく、細胞集団中のＩｇＧ陽性Ｂ細胞の密度の観点から３日〜６日とすることが好ましく、３日〜５日とすることがより好ましい。
【００７０】
二次培養を開始する際には、一次培養後の培養系に所定量のＩＬ−２１を添加してもよく、一次培養後の培養系から細胞を回収して、ＩＬ−４を含まないＩＬ−２１含有培地に移して開始してもよい。二次培養におけるＩｇＧ陽性Ｂ細胞の増殖速度及び得られた細胞集団中におけるＩｇＥ陽性Ｂ細胞の混入を抑制する観点から、ＩＬ−２１を含有し且つＩＬ−４を含まない培地により二次培養を行うことが最も好ましい。
【００７１】
なお、本発明で用いられるＩＬ−４及びＩＬ−２１の由来としては、上述した細胞集団と同様に、哺乳動物の霊長類、有蹄類、小型哺乳類の齧歯類、鳥類などが挙げられる。これらの分子はそれぞれ、好ましくは、齧歯類及び哺乳類由来のものであり、マウス、ヒトなどを例示することができる。また、提示対象となる上記細胞集団と同一の種に由来する分子であってもよく、異なる種に由来する細胞であってもよい。
【００７２】
二次培養終了後には、目的とするＢ細胞の濃度を確実に高めるために、ＩｇＧ陽性Ｂ細胞以外の細胞を除去することが好ましい。除去対象となる細胞としては、ＩｇＥ陽性Ｂ細胞、ＣＤ１３８陽性の形質細胞、フィーダー細胞（存在する場合）などを挙げることができる。これらの細胞は、表面に存在する固有の表面抗原に対する抗体等を用いた既知の技術で除去することができる。
【００７３】
また二次培養では、培養対象となるＢ細胞集団の種類や由来に応じて、ＩＬ−２１とともに他のサイトカインも使用してもよい。例えば、ＩＬ−２をＩＬ−２１と併用する場合には、ＩＬ−２の濃度は１ｕｎｉｔ／ｍｌ〜１０００ｕｎｉｔ／ｍｌであることが好ましく、２．５ｕｎｉｔ／ｍｌ〜１０００ｕｎｉｔ／ｍｌであることがより好ましく、２．５ｕｎｉｔ／ｍｌ〜５００ｕｎｉｔ／ｍｌであることがさらに好ましく、１０ｕｎｉｔ／ｍｌ〜１００ｕｎｉｔ／ｍｌであることが特に好ましい。
【００７４】
本発明のＢ細胞集団の製造方法では、目的とする抗原特異的ＩｇＧ陽性細胞を選別するために必要な期間行えばよく、選別工程を開始するときのＩｇＧ陽性Ｂ細胞の数、用いられる抗原の種類又はフィーダー細胞の状態などによって適宜変更することができる。例えば、効率よく目的とする細胞集団を得るために、選別工程を１日〜２日間としてもよく、培養工程を含む場合には、一次培養を３日〜５日間、二次培養を２日〜５日間とし、選別工程を１日〜２日間としてもよい。
【００７５】
本発明の製造方法では、選別工程の後に、選別された抗原特異的ＩｇＧ陽性Ｂ細胞を更に増殖させるための増殖工程を含んでもよい。この増殖工程は、選別工程で選別された特定抗原に対して抗原特異的ＩｇＧ陽性Ｂ細胞を増殖させることができる培養条件で行えばよいが、選別されたＩｇＧ陽性Ｂ細胞の効率よい増殖の観点から、ＩＬ−２１の存在下で、ＣＤ４０Ｌ及びＢＡＦＦと共に培養するものであることが好ましい。増殖工程で好ましく用いられるＩＬ−２１については、前述した二次培養又は選別工程で適用した条件をそのまま適用することができる。また、増殖工程に好ましく用いられるＣＤ４０Ｌ及びＢＡＦＦについても、前述した事項をそのまま適用することができる。
【００７６】
増殖工程は、得られた細胞集団中の目的とするＩｇＧ陽性Ｂ細胞の数に応じた期間継続すればよく、一般に１日以上、好ましくは３日以上とすることができるが、培養系に含まれる細胞集団の増殖速度及び密度に応じて適宜調整すればよい。
【００７７】
以下に本発明の実施例について説明するが、これに限定されるものではない。
本明細書で用いられるもの等の従来方法に関する詳細な説明は、引用文献において見出すことができる。以下に別途示されない限り、関心対象の特異性ならびにそれらの組換え発現および抗ＣＸＣＲ２抗体の分子クローニングは、国際公開ＷＯ２００８／０８１００８号として公開された国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００００５３号、およびＷＯ２０１０／０６９６０３号として公開された国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２００９／００９１８６号の実施例および捕捉方法に記載されるように行われてきたか、または行うことができ、その開示内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
また、抗原特異的Ｂ細胞選択法（ＦＡＩＳ法）については、特許第５５５０１３２号公報及び国際公開ＷＯ２０１８／１３１６９８号公報に記載の方法を参照することができ、その開示内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００７８】
（１）細胞の培養
Ｂ細胞の培養は、特に断らない限り、ＲＰＭＩ−１６４０（１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ（ウシ胎児血清）、ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、５５ｎＭ  ２−メルカプトエタノール、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び１ｍＭピルビン酸ナトリウム添加）をＢ細胞培養培地として用いて、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ2、３７℃の条件下で行った。【００７９】
Ｂ細胞の培養時に用いる、ＣＤ４０Ｌ及びＢＡＦＦを細胞表面に提示するフィーダー細胞である４０ＬＢ細胞（特許第５５５０１３２号に記載の細胞を用いた）の培養は、特に断らない限り、Ｄ−ＭＥＭ（１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン添加）を４０ＬＢ細胞培養培地として用いて、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ2、３７℃の条件下で行った。【００８０】
ＫＨＹＧ−１細胞の培養は、特に断らない限り、ＲＰＭＩ−１６４０（１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ（ウシ胎児血清）、ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、５５ｎＭ  ２−メルカプトエタノール、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び１ｍＭピルビン酸ナトリウム添加）、及び１００Ｕ／ｍＬ  ＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）をＫＨＹＧ−１細胞培養培地として用いて、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ2、３７℃の条件下で行った。【００８１】
Ｂ細胞培養実験時には、９６ウェルプレート（Thermo Fisher製）に、４０ＬＢ細胞を2×１０4個／ウェル播種し、２４時間培養して単一層を形成させた後、１２０ＧｙのＸ線を照射してから使用した。【００８２】
Ｂ細胞播種時は、予め４０ＬＢ細胞を播種していた３８４ウェルプレートから培地を除去したうえで、２０個／ウェルになるようにマルチピペットを用いて播種した。【００８３】
（２）フィーダー細胞の調製
ＡＤＣＣ活性を利用したスクリーニング法を行うため、抗原発現細胞として４０ＬＢ−Ｈｅｒ２細胞及び４０ＬＢ−ＣＸＣＲ２細胞を用い、抗原非発現細胞として４０ＬＢ細胞を用いた。【００８４】
４０ＬＢ−Ｈｅｒ２細胞及び４０ＬＢ−ＣＸＣＲ２細胞は、４０ＬＢ細胞にヒトＨｅｒ２またはヒトＣＸＣＲ２を、それぞれ常法に従ってレンチウィルスベクターにより導入し、恒常的に発現させてクローン作製した。【００８５】
（３）モデル抗原を用いたＡＤＣＣ活性を利用したスクリーニング法の検討
ＡＤＣＣ活性を利用したスクリーニング法の検討には４０ＬＢ細胞、４０ＬＢ−Ｈｅｒ２細胞、ＫＨＹＧ−１細胞を用いた。また抗原特異性を持つ抗体としてトラスツズマブ型抗体を、抗原非特異的抗体として市販のヒトＩｇＧ抗体を１μｇ／ｍＬに調製して用いた。この時用いたトラスツズマブ型抗体は、レンチウィルスベクターであるＣＳＩＶ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＩＲＥＳ２−Ｖｅｎｕｓベクター（Cancer Science, Vol.105, pp.402-408（2014））を組み換え、Ｈｅｒ２抗原特異的Ｂ細胞受容体（トラスツズマブ抗体遺伝子）の重鎖及び軽鎖を組み込んだＣＳＩＶ−ＣＭＶ−ｍＧＫ（トラスツズマブ抗体ｋａｐｐａ軽鎖遺伝子発現ベクター）−ＩＲＥＳ２−ｍＧＨ（トラスツズマブ抗体重鎖遺伝子発現ベクター）を作製し、トラスツズマブ型抗体遺伝子発現ベクターを構築し、ＣＨＯ−Ｋ１細胞に遺伝子導入することで抗体生産細胞を作製した後、その培養上清をＰｒｏｔｅｉｎＡ担体（ＫＡＮＥＫＡ社製）で精製したものを使用した。ＡＤＣＣ活性を測定する１２時間前に４０ＬＢ細胞及び４０ＬＢ−Ｈｅｒ２細胞を９６ウェルプレートに１×１０4個／ウェルになるよう播種した。細胞播種１２時間後に、ＫＨＹＧ−１細胞培養培地で１μｇ／ｍＬに調製した抗体溶液５０μＬに培地交換を行い、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ2、３７℃の条件下で３０分間培養を行った。その後、ＫＨＹＧ−１細胞培養培地で１×１０4個／５０μＬに調製したＫＨＹＧ−１細胞を各ウェルに添加した。この時、コントロール群としてＫＨＹＧ−１細胞を添加しないウェルには培地のみを等量添加した。添加１２時間後、培養上清を用いてＡＤＣＣ活性を死細胞が放出するＬＤＨを測定することで評価した。ＬＤＨの測定にはＬＤＨ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（（Ｄｏｊｉｎｄｏ社製））を用いた。培養プレートを２５０×ｇで２分間遠心し、４０μＬの培養上清を回収し、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ社製）に分注した。次いでＷｏｒｋｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを４０μＬ添加し、常温暗所にて３０分間振とう培養を行った。３０分後、２０μＬのＳｔｏｐ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加し反応を停止させ、４９０ｎｍの吸光度を測定した。図１で示すように、抗原を発現する細胞と攻撃細胞に加え、抗原特異的抗体が存在する場合のみ細胞死が誘導されＬＤＨが放出され、図２で示すように高い吸光度が測定できることが確認できた。【００８６】
（４）ＣＸＣＲ２抗原特異的Ｂ細胞受容体発現Ｂ細胞を含むＢ細胞小集団の調製
ＣＸＣＲ２抗原特異的受容体発現Ｂ細胞を含むＢ細胞小集団は以下のようにして得た。
ヒトＢ細胞の調製は以下のように行った。
即ち、健常人のヒト末梢血からＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐチューブ（ＡＸＩＳ  ＳＨＩＥＬＤ社製）を用いて単核球を分離し、ＦｃＲ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用いた後、さらにＣＤ２陰性細胞及びＣＤ２３５ａ陰性細胞を、ビオチン−抗ヒトＣＤ２抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、ビオチン−抗ヒトＣＤ２３５ａ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｐｌｕｓ−ＤＭ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を使用し、ＢＤ  ｉＭａｇ  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍａｇｎｅｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）及びＭＡＣＳ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用いて回収した。回収した細胞の内ＣＤ１９陽性細胞を、ＰＥ−抗ヒトＣＤ１９抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）を使用し、セルソーター（ＢＤ  ＦＡＣＳ  ＡｒｉａIII）を用いて回収した。さらに、取得したＢ細胞に長期生存遺伝子を導入することで、長期に培養できるＢ細胞を作製した。長期培養Ｂ細胞は以下のようにして得た。【００８７】
即ち、ＣＳＩＶ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＩＲＥＳ２−Ｖｅｎｕｓベクター（Cancer Science, Vol.105, pp.402-408（2014））を組み換え、プロモーターとしてβａｃｔｉｎを、導入遺伝子としてＢａｃｈ２を組み込んだＣＳＩＶ−βａｃｔｉｎ−Ｂａｃｈ２を作製し、Ｂａｃｈ２発現ベクターを構築した。この発現レンチウィルスベクターを用いて、回収したＣＤ１９陽性Ｂ細胞に、常法に従いＢａｃｈ２を発現させたＢ細胞集団を得た。【００８８】
（５）ヒトＢ細胞の調製（培養工程）
上記で得られた抗原特異的Ｂ細胞を含む集団は、単一層を形成させた４０ＬＢ細胞上で、７日間一次培養した。培養時はヒトＩＬ−４（５０ｎｇ／ｍＬ、ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ  社製）、ヒトＩＬ−２（５０ｕｎｉｔ／ｍＬ、ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ  社製）を含有するＢ細胞培地を用いて、１×１０5個／ｃｍ2の細胞密度でＣＯ2インキュベーターにて培養した。【００８９】
培養７日目に全細胞を、２ｍＭのＥＤＴＡと０．５質量％のＢＳＡを含むＤ−ＰＢＳを用いてフィーダー細胞ごと回収した。回収した培養Ｂ細胞は、ビオチン−抗マウスＨ−２Ｋd抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）及びビオチン抗ヒトＣＤ１３８抗体（Ｄｉａｃｌｏｎｅ社製）とＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｐｌｕｓ−ＤＭ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を使用し、ＢＤ  ｉＭａｇ  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍａｇｎｅｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）及びＭＡＣＳ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用いてフィーダー細胞及び抗体産生細胞を除去した。フィーダー細胞を除去したＢ細胞は、新たに準備された４０ＬＢ細胞が播種された９０ｍｍディッシュに、ヒトＩＬ−２１（１０ｎｇ／ｍＬ、ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ  社製）、ヒトＩＬ−２（５０ｕｎｉｔ／ｍＬ、ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ  社製）を含有するＢ細胞培地を用いて５×１０4個／ｃｍ2以下の細胞密度で播種して培養を行った。【００９０】
（６）抗原特異的Ｂ細胞の選択培養（選択工程）
培養１０日目に、ＣＸＣＲ２抗原特異的Ｂ細胞の選択培養を行うため、回収した培養Ｂ細胞から（５）と同様にしてフィーダー細胞及び抗体産生細胞を除去した。フィーダー細胞を除去したＢ細胞は、新たに準備された４０ＬＢ細胞が播種された９０ｍｍディッシュに、ヒトＩＬ−２４（１００ｎｇ／ｍＬ、ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ  社製）、ヒトＩＬ−２（５０ｕｎｉｔ／ｍＬ、ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ  社製）を含有するＢ細胞培地を用いて２×１０5個／ｃｍ2の細胞密度で播種し、抗原刺激前培養を行った。【００９１】
４８時間後（即ち、培養１２日目）、全細胞をビオチン−抗マウスＨ−２Ｋd抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）及びビオチン抗ヒトＣＤ１３８抗体（Ｄｉａｃｌｏｎｅ社製）とＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｐｌｕｓ−ＤＭ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を使用し、ＢＤ  ｉＭａｇ  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍａｇｎｅｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）及びＭＡＣＳ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用いてフィーダー細胞及び抗体産生細胞を除去した。フィーダー細胞及び抗体産生細胞を除去した抗原刺激前培養を行ったＢ細胞集団は、引き続き同じ条件のサイトカインを含有するＢ細胞培地に懸濁し、単一層を形成させた４０ＬＢ−ＣＸＣＲ２細胞と共に培養することで抗原特異的なＢ細胞に抗原刺激を与えた。【００９２】
４８時間後（即ち、培養１４日目）、全細胞を上記と同様の方法によりフィーダー細胞及び抗体産生細胞を除去した。４０ＬＢ−ＣＸＣＲ２細胞及び抗体産生細胞を除去した抗原刺激培養を行った各条件のＢ細胞は、ヒトＩＬ−２１（１０ｎｇ／ｍＬ、ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ  社製）及びヒトＩＬ−２（５０ｕｎｉｔ／ｍＬ、ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ  社製）を含有するＢ細胞培地に懸濁し、単一層を形成させた４０ＬＢ−ＦａｓＬ細胞と共に培養することで培養Ｂ細胞集団全てに細胞死刺激を与えた。【００９３】
２４時間後（即ち、培養１５日目）、全細胞をビオチン化抗マウスＨ−２Ｋd抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）及びビオチン化抗ヒトＣＤ１７８（ＦａｓＬ）抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）とＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｐｌｕｓ−ＤＭ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を使用し、ＢＤ  ｉＭａｇ  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍａｇｎｅｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）及びＭＡＣＳ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用いて４０ＬＢ−ＦａｓＬ細胞を除去した。さらに４０ＬＢ−ＦａｓＬ細胞を除去したＢ細胞集団は、ＣｌｉｏＣｅｌｌ  Ｐｒｏ  Ｋｉｔ（ＣｌｉｏＣｅｌｌ社製）を用いて死細胞を除去した。フィーダー細胞及び死細胞を除去したＢ細胞集団は、ヒトＩＬ−２１（１０ｎｇ／ｍＬ、ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ  社製）及びヒトＩＬ−２（５０ｕｎｉｔ／ｍＬ、ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ  社製）を含有するＢ細胞培地に懸濁し、新たな４０ＬＢ細胞上で回復培養を行った。【００９４】
細胞死刺激後に回復培養を行い、６日間培養した細胞を回収し、２０個／ウェル／３８４ウェルプレートになるよう細胞を播種し、１４日間希釈培養を行った。【００９５】
１４日後に希釈培養を行った細胞の培養上清を用いてＥＬＩＳＡ法による抗体産生の確認を行った。ＥＬＩＳＡ法は、抗ヒトＩｇＧ＋ＩｇＭ＋ＩｇＡ抗体（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＫＰＬ）社製）を炭酸−重炭酸バッファー（ｐＨ９．０）を用いて１μｇ／ｍＬに調製し、３８４ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレートにコーティングした。抗体溶液添加後、常温で２時間静置することでコーティングを行った。２時間後、０．５％ＴＷｅｅｎ２０（ＳＩＧＭＡ社製）含有ＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）を用いてプレートの洗浄を行った。プレートの洗浄にはプレートウォッシャーを用いた。プレート洗浄後、ＴＢＳ溶液に懸濁した１０％スキムミルク溶液（Ｗａｋｏ社製）を各ウェルに添加し、常温で１時間静置することでブロッキングを行った。１時間後、プレートの洗浄を行った後に、上記のＢ細胞培養上清を各ウェルに添加し、常温で１時間静置することで抗体反応を行った。１時間後、プレートの洗浄を行った後に、２次抗体としてＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ抗体（Ｊａｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社製）をＴＢＳ溶液で１００００倍希釈した抗体溶液を用いて、常温で１時間静置することで抗体反応を行った。１時間後、プレートの洗浄を行った後に、ＴＭＢ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を添加し、発色を行った。添加２分後、１Ｎ  Ｈ2ＳＯ4を添加し酵素反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。【００９６】
ＥＬＩＳＡ法により抗体の産生が認められたウェル中の細胞を、４０ＬＢ細胞を新たに播種した９６ウェルプレートに再播種し、拡大培養を行った。この時Ｂ細胞はヒトＩＬ−２１（１０ｎｇ／ｍＬ、ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ  社製）及びヒトＩＬ−２（５０ｕｎｉｔ／ｍＬ、ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ  社製）を含有するＢ細胞培地に懸濁し、７日間培養を行った。【００９７】
７日間培養を行ったＢ細胞小集団培養上清を用いて、ＡＤＣＣ活性の測定を行った。まず測定を行う１２時間前に１×１０4個／ウェルになるよう９６ウェルプレートに抗原発現細胞として４０ＬＢ−ＣＸＣＲ２細胞を播種した。１２時間後、４０ＬＢ−ＣＸＣＲ２細胞培養上清を回収し、４０μLのＢ細胞小集団培養上清を各ウェルに添加した。この時同一ウェルから回収したＢ細胞小集団培養上清を、ＡＤＣＣ誘導用とコントロール培養用の２ウェルに添加した。【００９８】
ＡＤＣＣを誘導するためのＫＨＹＧ−１細胞は、ＣｌｉｏＣｅｌｌ  Ｐｒｏ  Ｋｉｔ（ＣｌｉｏＣｅｌｌ社製）を用いて死細胞を除去した後、ＲＰＭＩ−１６４０（１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ（ウシ胎児血清）、ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、５５ｎＭ  ２−メルカプトエタノール、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び１ｍＭピルビン酸ナトリウム添加）、及び２００Ｕ／ｍＬ  ＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）に懸濁し、培養を行う際のＩＬ−２の最終濃度が１００Ｕ／ｍＬ、ＫＨＹＧ−１細胞が１×１０4個／４０μLになるように調製した。またコントロール培養用に、ＫＨＹＧ−１細胞非存在の２００Ｕ／ｍＬ  ＩＬ−２含有ＲＰＭＩ−１６４０（１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ（ウシ胎児血清）、ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、５５ｎＭ  ２−メルカプトエタノール、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び１ｍＭピルビン酸ナトリウム添加）も調整した。【００９９】
Ｂ細胞小集団培養上清が添加された４０ＬＢ−ＣＸＣＲ２細胞に、ＡＤＣＣ誘導用ウェルにＫＨＹＧ−１細胞を１×１０4個／４０μＬ、コントロール培養用に培地のみを４０μＬ添加した。添加後、ＣＯ2インキュベーターにて１２時間培養した。【０１００】
１２時間後、培養上清を用いてＡＤＣＣ活性を死細胞が放出するＬＤＨを測定することで評価した。ＬＤＨの測定にはＬＤＨ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｄｏｊｉｎｄｏ社製）を用いた。培養プレートを２５０×ｇで２分間遠心し、４０μＬの培養上清を回収し、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ社製）に分注した。次いでＷｏｒｋｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを４０μＬ添加し、常温暗所にて３０分間振とう培養を行った。３０分後、２０μＬのＳｔｏｐ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加し反応を停止させ、４９０ｎｍの吸光度を測定した。測定結果を図３に示す。【０１０１】
ＡＤＣＣ誘導用とコントロール培養用のそれぞれから得た吸光度値を比較し、その差が正に大きいウェル中に、抗原特異的抗体が含まれていると判断し、中でも一番正に差が大きかったウェル中のＢ細胞から抗体遺伝子の取得を行った。９６ウェルで培養していた細胞を回収し、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてｍＲＮＡの抽出及び精製を行った。次に精製したｍＲＮＡから抗体遺伝子特異的逆転写プライマー及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔIII（インビトロジェン社製）を用いてｃＤＮＡの合成を行った。【０１０２】
反応組成はＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔIII添付の説明書に従い混合液を作製後、逆転写反応ＰＣＲ（６５℃／５分、５５℃／６０分、７０℃／１５分）を行った。その後添付の説明書に従いＲＮａｓｅＨ（インビトロジェン社製）を添加し、反応を行った（３７℃／２０分）。合成したｃＤＮＡはＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ核酸精製キット（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ社製）を用いて精製を行った。精製したｃＤＮＡは、Ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｅｏｘｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（インビトロジェン社製）とｄＧＴＰ（インビトロジェン社製）を用いて、添付の説明書に従い３’−ｔａｉｌｉｎｇ反応（３７℃／３０分）を行った。【０１０３】
抗体遺伝子可変領域の増幅には５’ＲＡＣＥ法を用いた。まず３’−ｔａｉｌｉｎｇ  ｃＤＮＡを用いてＩｇγ重鎖、Ｉｇκ軽鎖及びＩｇλ軽鎖それぞれに対して、ＫＯＤ−ＦＸ−ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて１ｓｔ−ＰＣＲ（９４℃／２分；１サイクル、９８℃／１０秒、６０℃／１０秒、６８℃／４０秒；２５サイクル、６８℃／２分；１サイクル）を行った。【０１０４】
その後それぞれのＤＮＡ溶液を用いてＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いたＮｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ（９４℃／２分；１サイクル、９４℃／１５秒、６０℃／１０秒、６８℃／４０秒；３５サイクル、６８℃／２分；１サイクル）を行った。【０１０５】
ＰＣＲ後反応液を全量１００Ｖ、３５分間の電気泳動を行い、Ｉｇγ重鎖、Ｉｇκ軽鎖及びＩｇλ軽鎖それぞれの増幅画分をＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて抽出を行った。【０１０６】
抗体遺伝子一過性発現用のプラスミドは、ヒト抗体定常領域を組み込んであるプラスミドを用いた。Ｉｇγ重鎖、Ｉｇκ軽鎖用プラスミドは制限酵素ＰｖｕＩＩを用いて、Ｉｇλ軽鎖は制限酵素ＳｔｕＩを用いて切り出しを行った。切り出したプラスミドＤＮＡは脱リン酸化酵素ＢＡＰＣ７５（タカラバイオ社製）を用いて６５℃、３０分間反応することで脱リン酸化を行った。【０１０７】
脱リン酸化したＩｇγ重鎖、Ｉｇκ軽鎖及びＩｇλ軽鎖と、Ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ法を用いて増幅した抗体遺伝子可変領域は  酵素ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ  ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて１６℃、６０分間反応させることで接合させた。接合したＤＮＡは大腸菌ＪＭ１０９（タカラバイオ社製）へと形質転換を行った。形質転換後得られたＩｇγ重鎖、Ｉｇκ軽鎖及びＩｇλ軽鎖の各プラスミドを、ＣＭＶプライマー及びＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ１．１ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、配列の解析を行ったところ、Ｉｇγ重鎖３種類、Ｉｇκ軽鎖２種類、Ｉｇλ軽鎖１種類を取得した。重鎖・軽鎖の組合せをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に発現させ、９種類の抗体を作製した。重鎖・軽鎖の抗体遺伝子は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（インビトロジェン社製）を用いて発現させた。【０１０８】
作製した抗体を用いて、抗原結合能をフローサイトメーター（ＢＤ  ＦＡＣＳ  ＡｒｉａIII）を用いて検出した。抗原発現細胞として４０ＬＢ−ＣＸＣＲ２細胞を、抗原無発現細胞として４０ＬＢ細胞を用いた。それぞれの細胞３×１０5個に対し、作製抗体を添加し、常温で３０分間反応させた。その後ＦＡＣＳバッファー（０．５％ＢＳＡ及び２００ｍＭ ＥＤＴＡ含有Ｄ−ＰＢＳ（−））を用いて洗浄し、２次抗体としてＡＰＣ標識抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）を用いて常温で２０分間反応させた。その後ＦＡＣＳバッファーを用いて２回洗浄し、フローサイトメトリー解析を行った。結果を図４に示す。結果から得られた抗体は、ＣＸＣＲ２抗原ではない４０ＬＢ細胞上の何らかの抗原を認識する抗体であることが分かった。【０１０９】
前述の結果から、得られた抗体はＣＸＣＲ２抗原ではない４０ＬＢ細胞上の何らかの抗原を認識する抗体であることが分かった。この原因は図５の結果から評価方法に問題があったと考えられる。前述の評価の際、攻撃細胞としてのＫＨＹＧ−１の有無でＡＤＣＣ活性（ＬＤＨの吸光度差）が高い細胞集団を選別し、抗体遺伝子の取得を行った。しかしながらこの時のＡＤＣＣ活性を抗原の有無の視点で評価し直すと、ＫＨＹＧ−１の有無でＡＤＣＣ活性が高かった細胞集団は、抗原の有無ではＡＤＣＣ活性は低い細胞集団であることが分かった。この結果から、抗原発現細胞に対してだけではなく抗原を発現していない細胞に対してもＡＤＣＣ活性測定を行う必要があると考えられた。【０１１０】
ＡＤＣＣ活性を測定する１２時間前に１×１０4個／ウェルになるよう９６ウェルプレートに抗原発現細胞として４０ＬＢ−ＣＸＣＲ２細胞を、抗原を発現していない細胞として４０ＬＢ細胞をそれぞれ播種した。１２時間後、各細胞培養上清を回収し、新たに４０μLのＢ細胞小集団培養上清を各ウェルに添加した。この時同一ウェルから回収したＢ細胞小集団培養上清を、４０ＬＢ−ＣＸＣＲ２細胞と４０ＬＢ細胞のそれぞれに対し、ＡＤＣＣ誘導用とコントロール培養用の２ウェル、合計４ウェルに添加した。その後先述の方法と同様に、Ｂ細胞小集団培養上清が添加された４０ＬＢ−ＣＸＣＲ２細胞及び４０ＬＢ細胞のそれぞれに対し、ＡＤＣＣ誘導用ウェルにはＫＨＹＧ−１細胞を１×１０4個／４０μＬ、コントロール培養用には培地のみを４０μＬ添加した。添加後、ＣＯ2インキュベーターにて１２時間培養した。１２時間後、培養上清を用いてＡＤＣＣ活性を死細胞が放出するＬＤＨの測定は前述と同様の方法を用い、４９０ｎｍの吸光度を測定した。結果を図６に示す。【０１１１】
測定して得られた吸光度は、まず抗原発現細胞及び抗原非発現細胞のそれぞれで差を算出した。次に抗原の有無で得られた差を比較し、差が正に大きいものを抗原特異性が高いものと判断した。先述のような細胞特異性があるものに関しては、抗原発現細胞及び抗原非発現細胞のどちらでも差が生じることになり、両者の比を取ると１に近づくと考えられる。これにより、この手法で得られた結果はノイズが省かれ易くなり、抗原特異的な抗体を含むウェルを選別しやすくなっていると考えられた。【０１１２】
上述の結果から差が大きかったウェルから、前回と同様の方法でｍＲＮＡを抽出し、抗体遺伝子可変領域の増幅を行い、抗体遺伝子発現用プラスミドを作製した。ＣＭＶプライマーにより配列の解析を行ったところ、Ｉｇγ重鎖４種類、Ｉｇκ軽鎖３種類を取得した。重鎖・軽鎖の組合せをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に発現させ、１２種類の抗体を作製した。【０１１３】
作製した抗体を用いて、抗原結合能をフローサイトメーター（ＢＤ  ＦＡＣＳ  ＡｒｉａIII）を用いて検出した。結果を図７に示す。その結果、前述のような細胞特異的抗体は存在せず、抗原特異的抗体を取得が確認できた。
【図１】
2020129838.tif 000002
【図２】
2020129838.tif 000003
【図３】
2020129838.tif 000004
【図４】
2020129838.tif 000005
【図５】
2020129838.tif 000006
【図６】
2020129838.tif 000007
【図７】
2020129838.tif 000008
【国際調査報告】
2020129838.tif 000009
2020129838.tif 000010
2020129838.tif 000011
2020129838.tif 000012