(57)【要約】臓器等の生体材料を低温で長時間保存した場合であっても冷障害を抑制可能な方法、又は冷障害予防用組成物を提供する。生体材料のスフィンゴシン−１−リン酸(S1P)を介したシグナル伝達系を阻害することを含む生体材料の冷障害抑制方法、及びS1Pを介したシグナル伝達系を阻害する物質を有効成分として含有する冷障害予防用組成物に関する。
2019225753.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体材料のスフィンゴシン−１−リン酸(S1P)を介したシグナル伝達系を阻害することを含む、生体材料の冷障害抑制方法。
【請求項２】
前記シグナル伝達系の阻害は、前記生体材料をS1Pのシグナル伝達系を阻害する物質と接触させることを含む、請求項１記載の冷障害抑制方法。
【請求項３】
前記S1Pのシグナル伝達系を阻害する物質は、S1P受容体(S1PR)阻害化合物及びスフィンゴシンキナーゼ(SPHK)阻害化合物からなる群から選択される、請求項２記載の冷障害抑制方法。
【請求項４】
前記生体材料を低温保存することを含み、
前記シグナル伝達系の阻害は、低温保存前又は低温保存開始と同時に行うことを含む、請求項１から３のいずれかに記載の冷障害抑制方法。
【請求項５】
下記式（Ｉ）：
【化１】
2019225753.tif 000026
で表される化合物、
下記式（Ｉ’）：
【化２】
2019225753.tif 000027
で表される化合物、又はそれらの製薬上許容される塩と、生体材料とを接触させることを含む、生体材料の冷障害抑制方法であって、
式（Ｉ）及び式（Ｉ’）において、
Ｘ１は、Ｎ又はＣＲ５であり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−８アルキル基、ハロゲン原子で置換されたＣ１−８アルキル基、Ｃ１−８アルコキシ基、Ｃ２−８アルキニル基、Ｃ１−８アルキルスルホニル基又はシアノ基であるか、Ｒ１及びＲ２は、ａ及びｂで印をつけた原子と共に、置換されてもよい芳香環又は置換されてもよい芳香族複素環を形成し、
Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−８アルキル基、ハロゲン原子で置換されたＣ１−８アルキル基、Ｃ１−８アルコキシ基、Ｃ２−８アルキニル基、Ｃ１−８アルキルスルホニル基又はシアノ基であり、
Ｚは、
【化３】
2019225753.tif 000028
であり、
Ｒ６は、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１０又は−ＣＨ２Ｒ１１であり、Ｒ１０及びＲ１１は、置換されてもよいＣ２−８アルキル基、置換されてもよいフェニル基、置換されてもよいＣ２−８アルコキシ基、置換されてもよい芳香族複素環基、又は−ＮＲ１２Ｒ１３であり、Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ独立して、水素原子又は置換されてもよいＣ１−８アルキル基であるか、Ｒ１２及びＲ１３が隣接する窒素原子と一緒になって、置換されてもよい窒素含有複素環基を形成し、
Ｒ７は、置換されてもよいフェニル基、置換されてもよいピリジニル基、キノリン基又はイソキノリン基であり、
Ｒ８は、Ｏ又はＮＲ１４であり、Ｒ１４は、水素原子、置換されてもよいＣ２−８アルキル基、置換されてもよいフェニル基、置換されてもよいＣ２−８アルコキシ基、又は置換されてもよい芳香族複素環基であり、
Ｒ９は、置換されてもよいフェニル基、置換されてもよいピリジニル基、キノリン基又はイソキノリン基である、冷障害抑制方法。
【請求項６】
前記式（Ｉ）又は式（Ｉ’）で表される化合物が、
【化４】
2019225753.tif 000029
であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、メチル基、エチル基、イソプロピル基、プロピル基、トリフルオロメチル基、シアノ基、メトキシ基、アセチル基、メタンスルホニル基、又はエチニル基であり、
Ｒ７は、ハロゲン原子、トリフルオロメチル基、シアノ基、メトキシ基及びエチニル基からなる群から選択される１又は２以上の置換基で置換されたフェニル基、フェニル基、１又は２以上のハロゲン原子で置換されたピリジニル基、ピリジニル基、キノリン基又はイソキノリン基であり、
Ｒ９は、ハロゲン原子、トリフルオロメチル基、シアノ基、メトキシ基及びエチニル基からなる群から選択される１又は２以上の置換基で置換されたフェニル基、フェニル基、１又は２以上のハロゲン原子で置換されたピリジニル基、ピリジニル基、キノリン基又はイソキノリン基であり、
Ｒ１０は、ｎ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、１−エチルプロピル基、２，２−ジメチルプロピル基、置換されてもよいフェニル基、置換されてもよいフリル基、エトキシ基、又は−ＮＲ１２Ｒ１３であり、Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ独立して、水素原子又はｔｅｒｔ−ブチル基であるか、Ｒ１２及びＲ１３が隣接する窒素原子と一緒になって、ピペリジン環を形成し、
Ｒ１５及びＲ１６は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、メチル基、トリフルオロメチル基、シアノ基、メトキシ基、アセチル基、メタンスルホニル基、又はエチニル基である、請求項５記載の冷障害抑制方法。
【請求項７】
前記S1PR阻害化合物が、請求項５又は６に規定された式（Ｉ）若しくは（Ｉ’）で表される化合物又はその製薬上許容される塩である、請求項１から４のいずれかに記載の冷障害抑制方法。
【請求項８】
前記生体材料は、臓器、組織、細胞、体液、輸血製剤、及び細胞シートからなる群から選択される、請求項１から７のいずれかに記載の冷障害抑制方法。
【請求項９】
スフィンゴシン−１−リン酸(S1P)を介したシグナル伝達系を阻害する物質を有効成分として含有する、冷障害予防用組成物。
【請求項１０】
下記式（Ｉ）：
【化５】
2019225753.tif 000030
で表される化合物、
下記式（Ｉ’）：
【化６】
2019225753.tif 000031
で表される化合物、又はそれらの製薬上許容される塩を有効成分とする冷障害予防用組成物であって、
式（I）において、
Ｘ１は、Ｎ又はＣＲ５であり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−８アルキル基、ハロゲン原子で置換されたＣ１−８アルキル基、Ｃ１−８アルコキシ基、Ｃ２−８アルキニル基、Ｃ１−８アルキルスルホニル基又はシアノ基であるか、ａ及びｂで印をつけた原子と共に、置換されてもよい芳香環又は置換されてもよい芳香族複素環を形成し、
Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−８アルキル基、ハロゲン原子で置換されたＣ１−８アルキル基、Ｃ１−８アルコキシ基、Ｃ２−８アルキニル基、Ｃ１−８アルキルスルホニル基又はシアノ基であり、
Ｚは、
【化７】
2019225753.tif 000032
であり、
Ｒ６は、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１０又は−ＣＨ２Ｒ１１であり、Ｒ１０及びＲ１１は、置換されてもよいＣ２−８アルキル基、置換されてもよいフェニル基、置換されてもよいＣ２−８アルコキシ基、置換されてもよい芳香族複素環基、又は−ＮＲ１２Ｒ１３であり、Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ独立して、水素原子又は置換されてもよいＣ１−８アルキル基であるか、Ｒ１２及びＲ１３が隣接する窒素原子と一緒になって、置換されてもよい窒素含有複素環基を形成し、
Ｒ７は、置換されてもよいフェニル基、置換されてもよいピリジニル基、キノリン基又はイソキノリン基であり、
Ｒ８は、Ｏ又はＮＲ１４であり、Ｒ１４は、水素原子、置換されてもよいＣ２−８アルキル基、置換されてもよいフェニル基、置換されてもよいＣ２−８アルコキシ基、又は置換されてもよい芳香族複素環基であり、
Ｒ９は、置換されてもよいフェニル基、置換されてもよいピリジニル基、キノリン基又はイソキノリン基である、冷障害予防用組成物。
【請求項１１】
前記式（Ｉ）又は式（Ｉ’）で表される化合物が、
【化８】
2019225753.tif 000033
であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、メチル基、エチル基、イソプロピル基、プロピル基、トリフルオロメチル基、シアノ基、メトキシ基、アセチル基、メタンスルホニル基、又はエチニル基であり、
Ｒ７は、ハロゲン原子、トリフルオロメチル基、シアノ基、メトキシ基及びエチニル基からなる群から選択される１又は２以上の置換基で置換されたフェニル基、フェニル基、１又は２以上のハロゲン原子で置換されたピリジニル基、ピリジニル基、キノリン基又はイソキノリン基であり、
Ｒ９は、ハロゲン原子、トリフルオロメチル基、シアノ基、メトキシ基及びエチニル基からなる群から選択される１又は２以上の置換基で置換されたフェニル基、フェニル基、１又は２以上のハロゲン原子で置換されたピリジニル基、ピリジニル基、キノリン基又はイソキノリン基であり、
Ｒ１０は、ｎ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、１−エチルプロピル基、２，２−ジメチルプロピル基、置換されてもよいフェニル基、置換されてもよいフリル基、エトキシ基、又は−ＮＲ１２Ｒ１３であり、Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ独立して、水素原子又はｔｅｒｔ−ブチル基であるか、Ｒ１２及びＲ１３が隣接する窒素原子と一緒になって、ピペリジン環を形成し、
Ｒ１５及びＲ１６は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、メチル基、トリフルオロメチル基、シアノ基、メトキシ基、アセチル基、メタンスルホニル基、又はエチニル基である、請求項１０記載の冷障害予防用組成物。
【請求項１２】
前記S1Pを介したシグナル伝達系を阻害する物質が、請求項１０又は１１に規定された式（Ｉ）若しくは（Ｉ’）で表される化合物又はその製薬上許容される塩である、請求項９記載の冷障害予防用組成物。
【請求項１３】
生体材料のスフィンゴシン−１−リン酸(S1P)を介したシグナル伝達系を阻害することを含む、生体材料の低温保存方法。
【請求項１４】
スフィンゴシン−１−リン酸(S1P)を介したシグナル伝達系を阻害する物質を有効成分として含有する、生体材料保存液。
【請求項１５】
請求項１０又は１１に規定された式（Ｉ）若しくは（Ｉ’）で表される化合物又はその製薬上許容される塩を有効成分として含有する、生体材料保存液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、生体材料の冷障害を抑制する方法、冷障害予防用組成物、生体材料の低温保存方法及び保存液に関する。
【背景技術】
【０００２】
心臓、肺、肝臓、すい臓、腎臓及び小腸などの非代償性の臓器不全や悪性腫瘍により、臓器移植以外には予後の改善が望めない患者は数多くいるとされている。
最も移植医療が行われている北米では、毎年５万人の移植待機登録者の臓器があるが、そのうち実際に移植医療を享受できるのは１０％未満である。さらには毎年非代償性の臓器障害で死亡する患者は７０万人以上とされ、待機登録せずに死亡する患者の中にも潜在的な移植適応者がいると推察される。【０００３】
ドナー不足の最大の原因は脳死ドナーの絶対的な不足であることは疑いようがないが、ドナーの選定には組織適合度以外にも臓器へのアクセス時間なども考慮されるため、優先順位の高い適合するレシピエントがいるにもかかわらず、保存時間の上限を超えるような状況では臓器状態の悪化等により臓器が廃棄されることになり、保存時間の延長がドナー不足に対する有効で無駄のない方法であるのは間違いない。特に心臓や肺などは保存時間が数時間と短いこともあり、摘出した臓器の廃棄率は７０％を超える。
臓器保存の研究は各国で行われているが、標準的な方法は２０年以上変わらず臓器保護液を用いた冷保存であり（特許文献１及び２）、各臓器の冷保存に耐えうる時間が保存時間の上限となっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１０−２３９９６３号公報
【特許文献２】特表２０１０−５２９０５３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
臓器移植のために摘出した臓器を保存できる時間が長くなれば、多くの患者を移植対象とすることができる。このため、長時間保存しても臓器を傷めない保存方法の開発が求められている。
臓器のような生体材料を長時間保存する方法の一つとして、低温での保存が行われているが、低温保存時間が一定時間を越えると保護効果を上回る組織障害が生じる。この組織障害のことを、冷障害又はCold Storage/Rewarm障害（以下、これらを単に「冷障害」ともいう）といわれ、この冷障害のため、移植に臓器を使用できる冷保存時間の上限は臓器によって決まっている。【０００６】
本開示は、一態様において、臓器等の生体材料を低温で長時間保存した場合であっても冷障害を抑制可能な方法、冷障害予防用組成物、生体材料の低温保存方法及び保存液方法及び生体材料の冷障害予防用組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、一又は複数の実施形態において、生体材料のスフィンゴシン−１−リン酸(S1P)を介したシグナル伝達系を阻害することを含む、生体材料の冷障害抑制方法又は低温保存方法に関する。【０００８】
本開示は、一又は複数の実施形態において、S1Pを介したシグナル伝達系を阻害する物質（S1Pシグナル伝達系阻害物質）を有効成分として含有する、冷障害予防用組成物又は生体材料保存液に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、実施例1において、化合物1又は2の存在下で、ヒト肝癌由来細胞株HepG2を低温で培養した時の冷障害抑制効果を評価した結果の一例を示すグラフである。
【図２】図２は、実施例2において、化合物1の存在下で、ヒト肝癌由来細胞株HepG2、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞株HUEhT-2又はFlp-InTM CHO細胞を低温で培養した時の冷障害抑制効果を評価した結果の一例を示すグラフである。
【図３】図３は、実施例3において、低温保存する細胞と化合物1とを接触させるタイミングを変化させて冷障害抑制効果を評価した結果の一例を示す。
【図４】図４は、実施例4において、低温保存(4℃、24時間)後、移植したラットの心臓の生存心筋面積及び繊維化面積の一例を示すグラフである。
【図５】図５は、実施例5において、化合物1又は3〜7の存在下で、ヒト肝癌由来細胞株HepG2を低温で培養した時の冷障害抑制効果を評価した結果の一例を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本開示は、一態様において、S1P受容体(S1PR)阻害剤やスフィンゴシンキナーゼ(SPHK)阻害剤などのS1Pシグナル伝達系阻害物質が、細胞や臓器等の低温保存時に生じうる冷障害を抑制できる、という新しい知見に基づく。
また、本開示は、一態様において、S1PR阻害剤又はSPHK阻害剤と接触させた後又は接触させながら臓器等の生体材料を低温保存することによって、低温保存時に生じうる冷障害を抑制しつつ、該生体材料を長時間保存することができる、という知見に基づく。
【００１１】
本開示における「生体材料のS1Pを介したシグナル伝達系の阻害」としては、一又は複数の実施形態において、S1PRの機能阻害、S1PとS1PRとの相互作用の阻害、S1Pの産生阻害、S1PRの産生阻害、又はS1Pの機能阻害等が挙げられる。生体材料のS1Pを介したシグナル伝達系の阻害は、一又は複数の実施形態において、生体材料を、S1Pを介したシグナル伝達系を阻害する物質と接触させることにより行うことができる。S1Pを介したシグナル伝達系の阻害物質としては、一又は複数の実施形態において、S1PRアンタゴニスト等のS1PR阻害物質、S1P産生阻害物質、SPHK阻害物質、S1PとS1PRとの相互作用阻害物質又はS1P機能の阻害物質等が挙げられる。
【００１２】
本開示において「冷障害」とは、細胞や臓器等の生体材料が低温下に曝露されることにより細胞が受ける障害をいう。冷障害は、一又は複数の実施形態において、細胞の生存能の低下や細胞死等を引き起こす。本開示において「低温」とは、例えば、0℃を下回らない低温をいい、一又は複数の実施形態において、0〜4℃が挙げられる。本開示において「冷障害の予防」としては、一又は複数の実施形態において、冷障害を抑制すること、冷障害を防止すること、及び冷障害を低減すること等を含む。本開示において「冷障害を抑制する」こととしては、一又は複数の実施形態において、細胞の生存能の低下の抑制、細胞死の抑制等が挙げられる。本開示は、一又は複数の実施形態において、低温保存した場合に冷障害が発生する生体材料、低温保存が適さない生体材料、又は低温保存が可能であっても長時間の低温保存が難しい生体材料に好ましく適用することができる。本開示における「長時間」としては、保存する生体材料の種類等によって異なるが、一又は複数の実施形態において、従来の低温保存方法における保存可能な時間よりも長い時間をいい、特に限定されない一又は複数の実施において、従来の低温保存方法における保存可能な時間の1.5倍以上、2倍以上又は3倍以上の時間をいう。
【００１３】
生体材料としては、一又は複数の実施形態において、ヒト又はヒト以外の哺乳類等の動物又は該動物由来の生体材料が挙げられる。生体材料としては、一又は複数の実施形態において、臓器、組織、器官、個体、細胞、体液、輸血製剤、及び細胞シート等が挙げられる。器官及び臓器としては、一又は複数の実施形態において、心臓、血液、皮膚、隔膜、角膜、肝臓、血管、腎臓、脳、眼球、脾臓、卵巣、肺、腸、神経、胎盤、臍帯、又は網膜等が挙げられる。個体としては、ヒト又はヒト以外の哺乳類等の動物が挙げられる。体液としては、一又は複数の実施形態において、血液及び精液等が挙げられる。
【００１４】
［冷障害予防用組成物］
本開示は、一又は複数の実施形態において、S1Pを介したシグナル伝達系を阻害する物質を有効成分として含有する冷障害予防用組成物（本開示の冷障害予防用組成物）に関する。本開示の冷障害予防用組成物は、一又は複数の実施形態において、生体材料の低温保存時に生じうる冷障害を抑制することができる。本開示の冷障害予防用組成物は、一又は複数の実施形態において、移植に使用される臓器等の生体材料の保存液又は灌流液に使用することができる。本開示における冷障害予防は、一又は複数の実施形態において、冷障害を抑制すること、及び冷障害を防止すること等を含みうる。
本開示によれば、低温保存時における冷障害による生体材料の状態の悪化を抑制できることから、より長い時間での低温保存が可能となり、生体材料の鮮度をより長い時間保つことができる。
【００１５】
［有効成分］
本開示の冷障害予防用組成物は、有効成分として、S1Pシグナル伝達系阻害物質を含有する。S1Pシグナル伝達系阻害物質としては、上述の通りであり、限定されない一又は複数の実施形態において、S1PR阻害化合物及びSPHK阻害化合物等が挙げられる。
【００１６】
S1PR阻害化合物とは、一又は複数の実施形態において、インビトロ及びインビボの少なくとも一方における公知のS1PR阻害アッセイ系において、該化合物を加えた場合のS1PRの活性を、該化合物を加えないコントロールと比べて、例えば60%以下、50%以下、40%以下、30%以下、20%以下、又は10%以下にまで阻害できる化合物をいう。前記アッセイ系において、添加する物質の量は、一又は複数の実施形態において、0.01-10μMである。S1PR阻害化合物は、一又は複数の実施形態において、S1PRの5種類の受容体（S1PR1、S1PR2、S1PR3、S1PR4及びS1PR5）のうち少なくとも一つに対しても阻害活性を有していればよく、5種類すべてに対して阻害活性を有していてもよい。
SPHK阻害化合物とは、一又は複数の実施形態において、インビトロ及びインビボの少なくとも一方における公知のSPHK阻害アッセイ系において、該化合物を加えた場合のSPHKの活性を、該化合物を加えないコントロールと比べて、例えば60%以下、50%以下、40%以下、30%以下、20%以下、又は10%以下にまで阻害できる化合物をいう。前記アッセイ系において、添加する物質の量は、一又は複数の実施形態において、0.01-10μMである。
【００１７】
本開示の冷障害予防用組成物の有効成分として使用されるS1PR阻害化合物としては、一又は複数の実施形態において、下記式（Ｉ）又は式（Ｉ’）で表される化合物が挙げられる。よって、本開示の冷障害予防用組成物は、その他の態様として、下記式（Ｉ）若しくは式（Ｉ’）で表される化合物又はその製薬上許容される塩を有効成分として含む。
【化１】
2019225753.tif 000003
【００１８】
式（Ｉ）及び（Ｉ’）において、
Ｘ１は、Ｎ又はＣＲ５であり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−８アルキル基、ハロゲン原子で置換されたＣ１−８アルキル基、Ｃ１−８アルコキシ基、Ｃ２−８アルキニル基、Ｃ１−８アルキルスルホニル基、Ｃ１−８アルキルアミノスルホニル基、ニトロ基又はシアノ基であるか、ａ及びｂで印をつけた原子と共に、置換されてもよい芳香環又は置換されてもよい芳香族複素環を形成し、
Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−８アルキル基、ハロゲン原子で置換されたＣ１−８アルキル基、Ｃ１−８アルコキシ基、Ｃ２−８アルキニル基、Ｃ１−８アルキルスルホニル基、Ｃ１−８アルキルアミノスルホニル基、ニトロ基又はシアノ基であり、
Ｚは、
【化２】
2019225753.tif 000004
であり、
Ｒ６は、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１０又は−ＣＨ２Ｒ１１であり、Ｒ１０及びＲ１１は、置換されてもよいＣ２−８アルキル基、置換されてもよいフェニル基、置換されてもよいＣ２−８アルコキシ基、置換されてもよい芳香族複素環基、又は−ＮＲ１２Ｒ１３であり、Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ独立して、水素原子又は置換されてもよいＣ１−８アルキル基であるか、Ｒ１２及びＲ１３が隣接する窒素原子と一緒になって、置換されてもよい窒素含有複素環基を形成し、
Ｒ７は、置換されてもよいフェニル基、置換されてもよいピリジニル基、キノリン基又はイソキノリン基であり、
Ｒ８は、Ｏ又はＮＲ１４であり、Ｒ１４は、水素原子、置換されてもよいＣ２−８アルキル基、置換されてもよいフェニル基、置換されてもよいＣ２−８アルコキシ基、又は置換されてもよい芳香族複素環基であり、
Ｒ９は、置換されてもよいフェニル基、置換されてもよいピリジニル基、キノリン基又はイソキノリン基であり、
波線を付した結合手は、式（Ｉ）又は（Ｉ’）で表される化合物との結合部分を示す。
式（Ｉ’）及びＺにおいて、＊を付した炭素−窒素間の二重結合は、立体異性及び幾何異性等の構造異性体を有する二重結合を示す。この二重結合によって、式（Ｉ）及び（Ｉ’）で表される化合物又はその製薬上許容される塩には、上記炭素−窒素間の二重結合による幾何異性体として（Ｅ）のみ、（Ｚ）のみ、（Ｅ）と（Ｚ）との混合状態、又は立体不特定の状態を含みうる。
【００１９】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５におけるハロゲン原子としては、一又は複数の実施形態において、フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子が挙げられ、好ましくはフッ素原子、塩素原子又は臭素原子であり、より好ましくは塩素原子である。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５におけるＣ１−８アルキル基としては、一又は複数の実施形態において、炭素数１〜８の直鎖状又は分岐状アルキル基、又は炭素数３〜７の環状アルキル基が挙げられる。Ｃ１−８アルキル基としては、一又は複数の実施形態において、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、２−プロピルペンチル基、ｎ−ヘキシル基、シクロペンチル基又はシクロヘキシル基等が挙げられる。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５におけるハロゲン原子で置換されたＣ１−８アルキル基としては、一又は複数の実施形態において、フルオロメチル基、ジフルオロメチル基、トリフルオロメチル基、クロロメチル基、ジクロロメチル基、トリクロロメチル基、２−クロロ−１，１−ジメチルエチル基等が挙げられ、好ましくはトリフルオロメチル基である。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４におけるＣ１−８アルコキシ基としては、一又は複数の実施形態において、炭素数１〜８の直鎖状又は分岐鎖状のアルコキシ基、又は炭素数３〜６の環状アルキルオキシ基が挙げられる。Ｃ１−８アルコキシ基としては、一又は複数の実施形態において、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ｎ−ペンチルオキシ基、２−プロピルペンチルオキシ基、ｎ−ヘキシルオキシ基、シクロペンチルオキシ基又はシクロヘキシルオキシ基等が挙げられ好ましくはメトキシ基である。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５におけるＣ２−８アルキニル基としては、一又は複数の実施形態において、不飽和三重結合を有する炭素数２〜６の直鎖状、分岐鎖状又は環状の炭化水素基が挙げられる。Ｃ２−８アルキニル基としては、一又は複数の実施形態において、エチニル基、１−プロピニル基、２−プロピニル基、１−ブチニル基、２−ブチニル基、３−ブチニル基、３−メチル−１−ブチニル基又は４−メチル−１−ペンチニル基等が挙げられ、好ましくはエチニル基である。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５におけるＣ１−８アルキルスルホニル基としては、一又は複数の実施形態において、メタンスルホニル基又はエタンスルホニル基等が挙げられ、好ましくはメタンスルホニル基である。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５におけるＣ１−８アルキルアミノスルホニル基としては、一又は複数の実施形態において、ジメチルアミノスルホニル基又はジエチルアミノスルホニル基等が挙げられる。
【００２０】
Ｒ１及びＲ２は、ａ及びｂで印をつけた原子と共に、置換されてもよい芳香環又は置換されてもよい芳香族複素環を形成していてもよい。芳香環としては、一又は複数の実施形態において、ベンゼン基、又はナフタレン等基が挙げられる。芳香族複素環基としては、一又は複数の実施形態において、酸素、窒素又は硫黄原子などを１又は２個含む５〜７員の芳香環が挙げられ、例えば、フリル基、チエニル基、ピロリル基、ピリジル基、又はピリミジル基等が挙げられる。芳香環及び芳香族複素環の置換基としては、一又は複数の実施形態において、ハロゲン原子、Ｃ１−８アルキル基、ハロゲン原子で置換されたＣ１−８アルキル基、又はＣ１−８アルコキシ基等が挙げられる。
【００２１】
Ｘ１は、Ｎ又はＣＲ５であり、好ましくはＮ又はＣＨである。
【００２２】
Ｒ６は、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１０又は−ＣＨ２Ｒ１１であり、好ましくは−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１０である。Ｒ１０及びＲ１１は、置換されてもよいＣ２−８アルキル基、置換されてもよいフェニル基、置換されてもよいＣ２−８アルコキシ基、置換されてもよい芳香族複素環基、又は−ＮＲ１２Ｒ１３である。
Ｒ１０及びＲ１１における置換されてもよいＣ２−８アルキル基としては、一又は複数の実施形態において、無置換若しくは置換基を有する炭素数２〜８の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基、又は無置換若しくは置換基を有する炭素数３〜７の環状アルキル基が挙げられる。Ｃ２−８アルキル基としては、一又は複数の実施形態において、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、１−エチルプロピル基、２，２−ジメチルプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、２−プロピルペンチル基、ｎ−ヘキシル基、シクロペンチル基又はシクロヘキシル基等が挙げられ、好ましくはｎ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、１−エチルプロピル基、２，２−ジメチルプロピル基である。置換基としては、一又は複数の実施形態において、ハロゲン原子又はＣ１−８アルコキシ基等が挙げられる。
【００２３】
Ｒ１０及びＲ１１における置換されてもよいフェニル基及び置換されてもよい芳香族複素環基としては、一又は複数の実施形態において、無置換又は１〜３個の置換基を任意の位置に有するフェニル基、及び無置換又は１〜３個の置換基を任意の位置に有する芳香族複素環基が挙げられる。芳香族複素環基としては、一又は複数の実施形態において、酸素、窒素又は硫黄原子などを１又は２個含む５〜７員の芳香環を示し、例えばフリル基、チエニル基、ピロリル基、ピリジル基、ピリミジル基などが挙げられ、好ましくはフリル基、チエニル基又はピリジル基である。置換基としては、一又は複数の実施形態において、ハロゲン原子又はＣ１−８アルコキシ基等が挙げられる。
【００２４】
Ｒ１０及びＲ１１における置換されてもよいＣ２−８アルコキシ基としては、一又は複数の実施形態において、無置換若しくは置換基を有する炭素数２〜８の直鎖状又は分岐鎖状のアルコキシ基、又は無置換若しくは置換基を有する炭素数３〜６の環状アルキルオキシ基が挙げられる。Ｃ２−８アルコキシ基としては、一又は複数の実施形態において、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ｎ−ペンチルオキシ基、２−プロピルペンチルオキシ基、ｎ−ヘキシルオキシ基、シクロペンチルオキシ基又はシクロヘキシルオキシ基等が挙げられる、好ましくはエトキシ基である。置換基としては、一又は複数の実施形態において、ハロゲン原子又はＣ１−８アルコキシ基等が挙げられる。
【００２５】
Ｒ１２及びＲ１３において、置換されてもよいＣ１−８アルキル基におけるＣ１−８アルキル基は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５で示したＣ１−８アルキル基とおなじである。Ｒ１２及びＲ１３としては、一又は複数の実施形態において、水素原子又はｔｅｒｔ−ブチル基が好ましい。
Ｒ１２及びＲ１３が隣接する窒素原子と一緒になって、置換されてもよい窒素含有複素環基を形成する場合、窒素含有複素環としては、一又は複数の実施形態において、５〜７員の飽和複素環又は不飽和複素環が挙げられる。窒素含有複素環としては、一又は複数の実施形態において、ピロール環、ピロリジン環、ピラゾール環、トリアゾール環、ピペラジン環、ピペリジン環等が挙げられ、ピペリジン環が好ましい。置換基としては、一又は複数の実施形態において、ハロゲン原子、Ｃ１−８アルキル基、フェニル基又はＣ１−８アルコキシ基等が挙げられる。
【００２６】
Ｒ７は、置換されてもよいフェニル基、置換されてもよいピリジニル基、キノリン基又はイソキノリン基である。置換基としては、一又は複数の実施形態において水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−８アルキル基、Ｃ１−８アルコキシ基、Ｃ２−８アルキニル基、Ｃ１−８アルキルスルホニル基又はシアノ基等が挙げられる。Ｒ７は、一又は複数の実施形態において、ハロゲン原子、トリフルオロメチル基、シアノ基、メトキシ基若しくはエチニル基で置換されたフェニル基、フェニル基、ピリジニル基、ハロゲン原子で置換されたピリジニル基、キノリン基又はイソキノリン基が好ましく、より好ましくはハロゲン原子で置換されたフェニル基である。
【００２７】
Ｒ８は、Ｏ又はＮＲ１４であり、Ｒ１４は、水素原子、置換されてもよいＣ２−８アルキル基、置換されてもよいフェニル基、置換されてもよいＣ２−８アルコキシ基、又は置換されてもよい芳香族複素環基である。Ｒ８は、Ｏが好ましい。
【００２８】
Ｒ９は、置換されてもよいフェニル基、置換されてもよいピリジニル基、キノリン基又はイソキノリン基である。置換基としては、一又は複数の実施形態において、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−８アルキル基、Ｃ１−８アルコキシ基、Ｃ２−８アルキニル基、Ｃ１−８アルキルスルホニル基又はシアノ基等が挙げられる。Ｒ９は、一又は複数の実施形態において、ピリジニル基又はハロゲン原子で置換されたピリジニル基が好ましい。
【００２９】
本開示において「置換されてもよい」とは、無置換又は置換基で置換されていることをいう。置換基の数は特に限定されず、１個であってもよいし、同一又は異なって２個又は３個以上の複数個あってもよい。
【００３０】
上記の通り、式（Ｉ）又は式（Ｉ’）で表される化合物は、一又は複数の実施形態において、立体異性を有する炭素−窒素間の二重結合を含みうる。よって、式（Ｉ）又は式（Ｉ’）で表される化合物として、一又は複数の実施形態において、
【化３】
2019225753.tif 000005
が挙げられる。上記式において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７は、上述の通りである。
【００３１】
式（Ｉ）又は式（Ｉ’）で表される化合物は、一又は複数の実施形態において、
【化４】
2019225753.tif 000006
が挙げられる。
上記式において、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、メチル基、エチル基、イソプロピル基、プロピル基、トリフルオロメチル基、シアノ基、メトキシ基、アセチル基、メタンスルホニル基、又はエチニル基であり、好ましくは水素原子、塩素原子、フッ素原子、臭素原子、トリフルオロメチル基、エチニル基又はイソプロピル基である。
Ｒ７は、ハロゲン原子、トリフルオロメチル基、シアノ基、メトキシ基及びエチニル基からなる群から選択される１又は２以上の置換基で置換されたフェニル基、フェニル基、１又は２以上のハロゲン原子で置換されたピリジニル基、ピリジニル基、キノリン基又はイソキノリン基であり、好ましくはハロゲン原子、トリフルオロメチル基、シアノ基、メトキシ基若しくはエチニル基で置換されたフェニル基、又はフェニル基である。
Ｒ９は、ハロゲン原子、トリフルオロメチル基、シアノ基、メトキシ基及びエチニル基からなる群から選択される１又は２以上の置換基で置換されたフェニル基、フェニル基、１又は２以上のハロゲン原子で置換されたピリジニル基、ピリジニル基、キノリン基又はイソキノリン基であり。
Ｒ１０は、ｎ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、１−エチルプロピル基、２，２−ジメチルプロピル基、置換されてもよいフェニル基、置換されてもよいフリル基、エトキシ基、又は−ＮＲ１２Ｒ１３であり、Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ独立して、水素原子又はｔｅｒｔ−ブチル基であるか、Ｒ１２及びＲ１３が隣接する窒素原子と一緒になって、ピペリジン環を形成し、好ましくはｎ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、１−エチルプロピル基、又は２，２−ジメチルプロピル基である。
Ｒ１５及びＲ１６は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、メチル基、トリフルオロメチル基、シアノ基、メトキシ基、アセチル基、メタンスルホニル基、又はエチニル基であり、好ましくはメチル基である。
【００３２】
式（Ｉ）又は式（Ｉ’）で表される化合物は、一又は複数の実施形態において、
【化５】
2019225753.tif 000007
が挙げられる。
上記式において、
Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、メチル基、エチル基、イソプロピル基、プロピル基、トリフルオロメチル基、シアノ基、メトキシ基、アセチル基、メタンスルホニル基、又はエチニル基であり、好ましくは水素原子、又はハロゲン原子であり、より好ましくは水素原子又は塩素原子である。Ｒ２、Ｒ３及びＲ４のうち１つがハロゲン原子であり、残りの二つが水素原子であることが好ましい。
Ｒ１０は、置換されてもよいＣ２−８アルキル基又は置換されてもよいＣ２−８アルコキシ基であり、好ましくは、ｎ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、１−エチルプロピル基、２，２−ジメチルプロピル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、１−エチルプロピル基、２，２−ジメチルプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、２−プロピルペンチル基、ｎ−ヘキシル基であり、好ましくはｎ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、イソブチル基、又はｓｅｃ−ブチル基である。
Ｒ１７及びＲ１８は、それぞれ独立して、水素原子又はハロゲン原子であり、好ましくはハロゲン原子であり、より好ましくは塩素原子又はフッ素原子である。
【００３３】
式（Ｉ）又は式（Ｉ’）で表される化合物の一又は複数の実施形態としては、以下の化合物が挙げられる。
【化６】
2019225753.tif 000008
【００３４】
式（Ｉ）又は式（Ｉ’）で表される化合物の一又は複数の実施形態としては、以下の化合物が挙げられる。
【化７】
2019225753.tif 000009
【化８】
2019225753.tif 000010
【００３５】
式（Ｉ）又は式（Ｉ’）で表される化合物は、不斉炭素原子が存在する場合及び／又は立体異性体が存在する場合、一又は複数の実施形態において、各異性体の混合物又は単離されたものである。立体異性体の特に限定されない一又は複数の実施形態において、シス−トランス異性体が挙げられる。
【００３６】
本開示において「製薬上許容される塩」とは、薬理上及び／又は医薬上許容される塩であって、無機酸塩、有機酸塩、無機塩基塩、有機塩基塩、酸性アミノ酸塩又は塩基性アミノ酸塩などが挙げられる。無機酸塩としては、一又は複数の実施形態において、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩などが挙げられる。有機酸塩としては、一又は複数の実施形態において、酢酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、ステアリン酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩などが挙げられる。無機塩基塩としては、一又は複数の実施形態において、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。有機塩基塩としては、一又は複数の実施形態において、ジエチルアミン塩、ジエタノールアミン塩、メグルミン塩、Ｎ，Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミン塩などが挙げられる。酸性アミノ酸塩としては、一又は複数の実施形態において、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩などが挙げられる。塩基性アミノ酸塩としては、一又は複数の実施形態において、アルギニン塩、リジン塩、オルニチン塩などが挙げられる。
【００３７】
本開示において「化合物の塩」には、化合物が大気中に放置されることにより、水分を吸収して形成されうる水和物が包含され得る。また、本開示において「化合物の塩」には、化合物が他のある種の溶媒を吸収して形成されうる溶媒和物も包含され得る。
【００３８】
本開示の冷障害予防用組成物は、一又は複数の実施形態において、上記阻害化合物を有効成分として含有し、さらに、医薬的に許容される担体、防腐剤、希釈剤、賦形剤又はその他の医薬的に許容される成分を含んでよい。
【００３９】
本開示の冷障害予防用組成物は、一又は複数の実施形態において、液体であってもよいし、固体であってもよい。本開示の冷障害予防用組成物が液体である場合、一又は複数の実施形態において、生理食塩水、細胞培養液、緩衝液、輸液、臓器等の保存液又は灌流液等をさらに含んでいてもよい。細胞培養液としては、一又は複数の実施形態において、DMEM又はMEM等が挙げられる。緩衝液としては、一又は複数の実施形態において、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液又はHEPES緩衝液等が挙げられる。輸液としては、一又は複数の実施形態において、電解質輸液、栄養輸液、糖質輸液、アミノ酸輸液、ブドウ糖液、リンゲル液、酢酸リンゲル液又は乳酸リンゲル液等が挙げられる。保存液又は灌流液としては、一又は複数の実施形態において、ＵＷ液、Bretschneider液、Bretschneider's HTK液、Euro-Collins液、St. Thomas' Hospital 液、又はET-Kyoto液等が挙げられる。
【００４０】
本開示の冷障害予防用組成物は、一又は複数の実施形態において、臓器及び輸血製剤等といった生体材料の保存用組成物及び保存液として使用することができる。
よって、本開示は、その他の態様として、S1Pシグナル伝達系阻害化合物を有効成分として含有する、生体材料の保存用組成物、保存液又は灌流液に関する。本開示の保存用組成物、保存液又は灌流液は、一又は複数の実施形態において、式（Ｉ）若しくは式（Ｉ’）で表される化合物又はそれらの製薬上許容される塩を有効成分として含みうる。
【００４１】
本開示の保存液又は灌流液における有効成分であるS1Pシグナル伝達系阻害化合物の濃度としては、限定されない一又は複数の実施形態において、生体材料の冷障害を抑制できる濃度であって、0.001〜150μM、0.01〜100μM又は0.1〜100μMが挙げられる。
【００４２】
式（Ｉ）若しくは式（Ｉ’）で表される化合物又はその製薬上許容される塩は、冷障害を抑制できる。よって、本開示は、その他の態様として、有効成分として式（Ｉ）若しくは式（Ｉ’）で表される化合物又はその製薬上許容される塩を含有する冷障害予防用組成物に関する。有効成分の含有量、冷障害予防用組成物の形態、及びその他の成分等は、上述の通りである。
【００４３】
［生体材料の冷障害抑制方法］
本開示は、一又は複数の実施形態において、生体材料のS1Pを介したシグナル伝達系を阻害することを含む、生体材料の冷障害抑制方法（本開示の冷障害抑制方法）に関する。本開示の冷障害抑制方法によれば、一又は複数の実施形態において、生体材料の低温保存時に生じうる細胞の生存能の低下や細胞死等を抑制することができる。生体材料は、上述の通りである。
【００４４】
本開示の冷障害抑制方法は、一又は複数の実施形態において、生体材料を低温保存することを含む。低温保存は、一又は複数の実施形態において、０℃を下回らない低温で保存することを含み、好ましくは０〜４℃で保存することを含みうる。
【００４５】
シグナル伝達系の阻害は、一又は複数の実施形態において、生体材料をS1Pのシグナル伝達系を阻害する物質と接触させることを含む。S1Pのシグナル伝達系を阻害する物質は上述の通りであって、一又は複数の実施形態において、S1PR阻害化合物及びSPHK阻害化合物等が挙げられる。S1PR阻害化合物としては、一又は複数の実施形態において、上記式（I）又は式（Ｉ’）で表される化合物が挙げられる。
【００４６】
シグナル伝達系の阻害を行うタイミングとしては、一又は複数の実施形態において、低温保存開始前、低温保存開始と同時又は低温保存の間等が挙げられる。
【００４７】
シグナル伝達系の阻害は、一又は複数の実施形態において、S1Pシグナル伝達系阻害化合物を含む溶液に、生体材料を浸漬させることにより行ってもよいし、該溶液を生体材料に塗布、添加、滴下又は噴霧することにより行ってもよい。本開示の冷障害抑制方法は、特に限定されない一又は複数の実施形態において、上記式（Ｉ）又は式（Ｉ’）で表される化合物を含む溶液に、生体材料を浸漬することを含む。該溶液は、一又は複数の実施形態において、有効成分であるS1Pシグナル伝達系阻害化合物又は式（Ｉ）又は式（Ｉ’）で表される化合物に加え、生理食塩水、細胞培養液、緩衝液、輸液、臓器等の保存液又は灌流液等を含んでいてもよい。
生体材料が臓器又は器官である場合、本開示の冷障害抑制方法は、一又は複数の実施形態において、式（Ｉ）又は式（Ｉ’）で表される化合物を含む保存液又は灌流液による灌流、浸漬、すすぎ、注入及びこれらの組み合わせを行うことを含んでいてもよい。
【００４８】
式（Ｉ）又は式（Ｉ’）で表される化合物又はその製薬上許容される塩は、冷障害を抑制できる。よって、本開示は、その他の態様として、式（Ｉ）又は式（Ｉ’）で表される化合物若しくはその製薬上許容される塩又はそれらを含有する組成物を生体材料に接触させることを含む、生体材料の冷障害抑制方法に関する。生体材料と、式（Ｉ）又は式（Ｉ’）で表される化合物等との接触は、一又は複数の実施形態において、式（Ｉ）又は式（Ｉ’）で表される化合物等を含む溶液に、生体材料を浸漬させることにより行ってもよいし、該溶液を生体材料に塗布、添加、滴下又は噴霧することにより行ってもよい。
【００４９】
［生体材料の保存方法］
本開示は、一又は複数の実施形態において、S1Pシグナル伝達系阻害化合物の少なくとも一方と接触させた生体材料を低温で保存することを含む生体材料の保存方法（本開示の保存方法）に関する。本開示の保存方法によれば、一又は複数の実施形態において、冷障害を抑制しつつ生体材料を低温保存することができる。本開示の保存方法によれば、より長い時間での低温保存が可能となるため、生体材料の鮮度をより長い時間保つことができる。本開示の保存方法は、一又は複数の実施形態において、移植に使用される臓器等の生体材料の保存等に使用できる。
【００５０】
本開示の保存方法において、生体材料とS1Pシグナル伝達系阻害化合物との接触は、冷障害を十分抑制し、より長い時間の低温での保存を可能にする点から、一又は複数の実施形態において、低温での保存に先立ち行うか、低温での保存開始と同時に行う。本開示の保存方法は、一又は複数の実施形態において、生体材料とS1Pシグナル伝達系阻害化合物とを接触させながら低温で保存することを含んでいてもよい。保存温度は、一又は複数の実施形態において、０℃を下回らない低温であればよく、０〜４℃が挙げられる。生体材料とS1Pシグナル伝達系阻害化合物との接触は、一又は複数の実施形態において、S1Pシグナル伝達系阻害化合物を含む溶液に、生体材料を浸漬させることにより行ってもよいし、該溶液を生体材料に塗布、添加、滴下又は噴霧することにより行ってもよい。生体材料が臓器又は器官である場合、生体材料とS1Pシグナル伝達系阻害化合物との接触は、一又は複数の実施形態において、式（Ｉ）又は式（Ｉ’）で表される化合物を含む保存液又は灌流液による灌流、浸漬、すすぎ、注入及びこれらの組み合わせを行うことにより行ってもよい。
【００５１】
式（Ｉ）若しくは式（Ｉ’）で表される化合物又はその製薬上許容される塩は、冷障害を抑制できる。よって、本開示は、その他の態様として、式（Ｉ）若しくは式（Ｉ’）で表される化合物若しくはその製薬上許容される塩又はそれらを含有する組成物と接触させた生体材料を低温で保存することを含む生体材料の保存方法に関する。生体材料と式（Ｉ）又は式（Ｉ’）で表される化合物等との接触、及び生体材料の保存温度等は、上述の通りである。
【００５２】
すなわち、本開示は以下の一又は複数の実施形態に関しうる；
［Ａ１］  生体材料のS1Pを介したシグナル伝達系を阻害することを含む、生体材料の冷障害抑制方法。
［Ａ２］  前記シグナル伝達系の阻害は、前記生体材料をS1Pのシグナル伝達系を阻害する物質と接触させることを含む、［Ａ１］記載の冷障害抑制方法。
［Ａ３］  前記S1Pのシグナル伝達系を阻害する物質は、S1PR阻害化合物及びSPHK阻害化合物からなる群から選択される、［Ａ２］記載の冷障害抑制方法。
［Ａ４］  前記生体材料を低温保存することを含み、
前記シグナル伝達系の阻害は、低温保存前又は低温保存開始と同時に行うことを含む、［Ａ１］から［Ａ３］のいずれかに記載の冷障害抑制方法。
［Ａ５］  前記S1PR阻害化合物が、下記式（Ｉ）：
【化９】
2019225753.tif 000011
で表される化合物、下記式（Ｉ’）：
【化１０】
2019225753.tif 000012
で表される化合物、又はそれらの製薬上許容される塩であり、
式（Ｉ）及び（Ｉ’）において、
Ｘ１は、Ｎ又はＣＲ５であり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−８アルキル基、ハロゲン原子で置換されたＣ１−８アルキル基、Ｃ１−８アルコキシ基、Ｃ２−８アルキニル基、Ｃ１−８アルキルスルホニル基又はシアノ基であるか、Ｒ１及びＲ２は、ａ及びｂで印をつけた原子と共に、置換されてもよい芳香環又は置換されてもよい芳香族複素環を形成し、
Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−８アルキル基、ハロゲン原子で置換されたＣ１−８アルキル基、Ｃ１−８アルコキシ基、Ｃ２−８アルキニル基、Ｃ１−８アルキルスルホニル基又はシアノ基であり、
Ｚは、
【化１１】
2019225753.tif 000013
であり、
Ｒ６は、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１０又は−ＣＨ２Ｒ１１であり、Ｒ１０及びＲ１１は、置換されてもよいＣ２−８アルキル基、置換されてもよいフェニル基、置換されてもよいＣ２−８アルコキシ基、置換されてもよい芳香族複素環基、又は−ＮＲ１２Ｒ１３であり、Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ独立して、水素原子又は置換されてもよいＣ１−８アルキル基であるか、Ｒ１２及びＲ１３が隣接する窒素原子と一緒になって、置換されてもよい窒素含有複素環基を形成し、
Ｒ７は、置換されてもよいフェニル基、置換されてもよいピリジニル基、キノリン基又はイソキノリン基であり、
Ｒ８は、Ｏ又はＮＲ１４であり、Ｒ１４は、水素原子、置換されてもよいＣ２−８アルキル基、置換されてもよいフェニル基、置換されてもよいＣ２−８アルコキシ基、又は置換されてもよい芳香族複素環基であり、
Ｒ９は、置換されてもよいフェニル基、置換されてもよいピリジニル基、キノリン基又はイソキノリン基である、［Ａ３］記載の冷障害抑制方法。
［Ａ６］  前記式（Ｉ）及び式（Ｉ’）で表される化合物が、
【化１２】
2019225753.tif 000014
であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、メチル基、エチル基、イソプロピル基、プロピル基、トリフルオロメチル基、シアノ基、メトキシ基、アセチル基、メタンスルホニル基、又はエチニル基であり、
Ｒ７は、ハロゲン原子、トリフルオロメチル基、シアノ基、メトキシ基及びエチニル基からなる群から選択される１又は２以上の置換基で置換されたフェニル基、フェニル基、１又は２以上のハロゲン原子で置換されたピリジニル基、ピリジニル基、キノリン基又はイソキノリン基であり、
Ｒ９は、ハロゲン原子、トリフルオロメチル基、シアノ基、メトキシ基及びエチニル基からなる群から選択される１又は２以上の置換基で置換されたフェニル基、フェニル基、１又は２以上のハロゲン原子で置換されたピリジニル基、ピリジニル基、キノリン基又はイソキノリン基であり、
Ｒ１０は、ｎ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、１−エチルプロピル基、２，２−ジメチルプロピル基、置換されてもよいフェニル基、置換されてもよいフリル基、エトキシ基、又は−ＮＲ１２Ｒ１３であり、Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ独立して、水素原子又はｔｅｒｔ−ブチル基であるか、Ｒ１２及びＲ１３が隣接する窒素原子と一緒になって、ピペリジン環を形成し、
Ｒ１５及びＲ１６は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、メチル基、トリフルオロメチル基、シアノ基、メトキシ基、アセチル基、メタンスルホニル基、又はエチニル基である、［Ａ５］記載の冷障害抑制方法。
［Ａ７］  前記式（Ｉ）及び（Ｉ’）で表される化合物が、
【化１３】
2019225753.tif 000015
である、［Ａ５］又は［Ａ６］に記載の冷障害抑制方法。
［Ａ８］  前記生体材料は、臓器、組織、細胞、体液、輸血製剤、及び細胞シートからなる群から選択される、［Ａ１］から［Ａ７］のいずれかに記載の冷障害抑制方法。
［Ａ９］  S1Pを介したシグナル伝達系を阻害する物質を有効成分として含有する、冷障害予防用組成物。
［Ａ１０］  前記物質が、下記式（Ｉ）：
【化１４】
2019225753.tif 000016
で表される化合物、
式（Ｉ’）：
【化１５】
2019225753.tif 000017
で表される化合物又はその製薬上許容される塩であり、
式（Ｉ）及び（Ｉ’）において、
Ｘ１は、Ｎ又はＣＲ５であり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−８アルキル基、ハロゲン原子で置換されたＣ１−８アルキル基、Ｃ１−８アルコキシ基、Ｃ２−８アルキニル基、Ｃ１−８アルキルスルホニル基又はシアノ基であるか、ａ及びｂで印をつけた原子と共に、置換されてもよい芳香環又は置換されてもよい芳香族複素環を形成し、
Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−８アルキル基、ハロゲン原子で置換されたＣ１−８アルキル基、Ｃ１−８アルコキシ基、Ｃ２−８アルキニル基、Ｃ１−８アルキルスルホニル基又はシアノ基であり、
Ｚは、
【化１６】
2019225753.tif 000018
であり、
Ｒ６は、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１０又は−ＣＨ２Ｒ１１であり、Ｒ１０及びＲ１１は、置換されてもよいＣ２−８アルキル基、置換されてもよいフェニル基、置換されてもよいＣ２−８アルコキシ基、置換されてもよい芳香族複素環基、又は−ＮＲ１２Ｒ１３であり、Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ独立して、水素原子又は置換されてもよいＣ１−８アルキル基であるか、Ｒ１２及びＲ１３が隣接する窒素原子と一緒になって、置換されてもよい窒素含有複素環基を形成し、
Ｒ７は、置換されてもよいフェニル基、置換されてもよいピリジニル基、キノリン基又はイソキノリン基であり、
Ｒ８は、Ｏ又はＮＲ１４であり、Ｒ１４は、水素原子、置換されてもよいＣ２−８アルキル基、置換されてもよいフェニル基、置換されてもよいＣ２−８アルコキシ基、又は置換されてもよい芳香族複素環基であり、
Ｒ９は、置換されてもよいフェニル基、置換されてもよいピリジニル基、キノリン基又はイソキノリン基である、［Ａ９］記載の冷障害予防用組成物。
［Ａ１１］  前記式（Ｉ）及び（Ｉ’）で表される化合物が、
【化１７】
2019225753.tif 000019
であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、メチル基、エチル基、イソプロピル基、プロピル基、トリフルオロメチル基、シアノ基、メトキシ基、アセチル基、メタンスルホニル基、又はエチニル基であり、
Ｒ７は、ハロゲン原子、トリフルオロメチル基、シアノ基、メトキシ基及びエチニル基からなる群から選択される１又は２以上の置換基で置換されたフェニル基、フェニル基、１又は２以上のハロゲン原子で置換されたピリジニル基、ピリジニル基、キノリン基又はイソキノリン基であり、
Ｒ９は、ハロゲン原子、トリフルオロメチル基、シアノ基、メトキシ基及びエチニル基からなる群から選択される１又は２以上の置換基で置換されたフェニル基、フェニル基、１又は２以上のハロゲン原子で置換されたピリジニル基、ピリジニル基、キノリン基又はイソキノリン基であり、
Ｒ１０は、ｎ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、１−エチルプロピル基、２，２−ジメチルプロピル基、置換されてもよいフェニル基、置換されてもよいフリル基、エトキシ基、又は−ＮＲ１２Ｒ１３であり、Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ独立して、水素原子又はｔｅｒｔ−ブチル基であるか、Ｒ１２及びＲ１３が隣接する窒素原子と一緒になって、ピペリジン環を形成し、
Ｒ１５及びＲ１６は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、メチル基、トリフルオロメチル基、シアノ基、メトキシ基、アセチル基、メタンスルホニル基、又はエチニル基である、［Ａ１０］記載の冷障害予防用組成物。
［Ａ１２］  下記化合物：
【化１８】
2019225753.tif 000020
を有効成分として含有する、冷障害予防用組成物。
［Ａ１３］  生体材料のS1Pを介したシグナル伝達系を阻害することを含む、生体材料の低温保存方法。
［Ａ１４］  S1Pを介したシグナル伝達系を阻害する物質を有効成分として含有する、生体材料保存液。
［Ａ１５］  前記物質は、［Ａ９］〜［Ａ１１］のいずれかに規定された化合物である、［Ａ１４］記載の保存液。
［Ｂ１］  生体材料と、［Ａ９］〜［Ａ１１］のいずれかに規定された式（Ｉ）若しくは式（Ｉ’）で表される化合物若しくはその製薬上許容される塩又はそれらを含有する組成物とを接触させることを含む、生体材料の冷障害抑制方法。
［Ｂ２］  前記生体材料を低温保存することを含み、
前記接触は、低温保存前又は低温保存開始と同時に行うことを含む、［Ｂ１］記載の冷障害抑制方法。
［Ｂ３］  前記生体材料は、臓器、組織、細胞、体液、輸血製剤、及び細胞シートからなる群から選択される、［Ｂ１］又は［Ｂ２］に記載の冷障害抑制方法。
［Ｂ４］  ［Ａ９］〜［Ａ１１］のいずれかに規定された式（Ｉ）若しくは式（Ｉ’）で表される化合物若しくはその製薬上許容される塩を有効成分として含有する、冷障害予防用組成物。
［Ｂ５］  生体材料と、［Ａ９］〜［Ａ１１］のいずれかに規定された式（Ｉ）若しくは式（Ｉ’）で表される化合物若しくはその製薬上許容される塩又はそれらを含有する組成物とを接触させることを含む、生体材料の低温保存方法。
［Ｂ６］  ［Ａ９］〜［Ａ１１］のいずれかに規定された式（Ｉ）若しくは式（Ｉ’）で表される化合物若しくはその製薬上許容される塩を有効成分として含有する、生体材料保存液。
【実施例】
【００５３】
以下、実施例により本開示をさらに詳細に説明するが、これらは例示的なものであって、本開示はこれら実施例に制限されるものではない。なお、本開示中に引用された文献は、すべて本開示の一部として組み入れられる。【００５４】
［製造例］
下記スキームに従い、化合物１及び３〜７を合成した。
【化１９】
2019225753.tif 000021
【００５５】
合成した化合物１及び３〜７のスペクトルデータ（１Ｈ−ＮＭＲ及びＭＳ）は以下のとおりである。
【表１】
2019225753.tif 000022
【００５６】
下記実施例1〜4では、化合物1及び化合物2を使用した。化合物1及び2はS1PRアンタゴニストとして知られている。また、化合物1は、S1PR1、S1PR2、S1PR3、S1PR4及びS1PR5のいずれに対しても阻害活性を有し、その選択性は、S1PR3、S1PR1、S1PR4、S1PR5及びS1PR2の順に高いことが報告されている。化合物2は、公知の方法に基づき合成できる。
化合物１
【化２０】
2019225753.tif 000023
N-(4-クロロフェニル)-N'-(4-クロロフェニルアミノ)-3,3-ジメチル-2-オキソブタンアミジン（N-(4-Chlorophenyl)-N'-(4-chlorophenylamino)-3,3-dimethyl-2-oxobutanamidine
化合物２
【化２１】
2019225753.tif 000024
N-（2,6-ジクロロ-4-ピリジニル）-2-[1,3-ジメチル-4-（1-メチルエチル）-1H-ピラゾロ[3,4-b]ピリジン-6-イル]-ヒドラジンカルボキサミド（N-(2,6-dichloro-4-pyridinyl)-2-[1,3-dimethyl-4-(1-methylethyl)-1H-pyrazolo[3,4-b]pyridin-6-yl]-hydrazinecarboxamide）【００５７】
［実施例１：冷障害抑制効果の評価１］
下記の手順で、化合物1又は2の存在下でヒト肝癌由来細胞株HepG2を低温で培養した時の冷障害抑制効果を評価した。
HepG2細胞を80-90%の密度となるように37℃で培養したのち、化合物1又は2を予め添加した4℃の培地(DMEM)に交換し、低温インキュベーター内で4℃で24時間培養した。24時間の低温での培養後に再び37℃の培地で復温し、1時間後のalamarBlueTMでの酵素活性による細胞のviabilityを観察した。化合物濃度は、0M(Vehicle)から50μMとして、化合物の濃度依存性をみた。その結果の一例を図1に示す。【００５８】
図1に示すように、化合物1又は2の存在下で低温保存することによって、低温保存時における細胞の生存能の低下が濃度依存的に改善され、冷障害を抑制できた。また、S1PR受容体阻害化合物である化合物1及び2は、低温保存時以外（例えば、常温保存時）に細胞に投与しても毒性を示さなかった。【００５９】
SPHK阻害剤を加えた培地で不死化ヒト臍帯静脈血管内皮細胞株HUEhT-21を低温（４℃）で５日間培養したところ、対照（SPHK阻害剤非添加培地）で低温培養した場合と比較して、３７℃に戻した後の細胞の生存能の低下を抑制できた。【００６０】
［実施例２：冷障害抑制効果の評価２］
下記の手順で、化合物1の存在下で、ヒト肝癌由来細胞株HepG2、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞株HUEhT-2又はFlp-InTM CHO細胞を低温で培養した時の冷障害抑制効果を評価した。
細胞を80-90%の密度となるように37℃で培養したのち、Vehicle又は10μMの化合物1をあらかじめ添加した4℃の培地に交換し、低温インキュベーター内で4℃で培養した。細胞のviabilityは37℃の培地で復温し、1時間後のalamarBlueTMでの酵素活性でみたものであり、冷保存時間とviabilityの関係を観察した。その結果の一例を図2に示す。【００６１】
図2に示すように、化合物1の存在下で低温保存することによって、いずれの細胞株においても低温保存時における細胞の生存能の低下が改善され、冷障害を抑制できた。特に、HUEhT-2及びFlp-InTM CHOについては、対照(vehicle)では低温保存期間が3日間又は10日間を超えると生存率が20%を下回ったのに対し、化合物1の存在下で低温保存することによって、低温保存期間が15日間であってもその生存率が50%を超えた。つまり、化合物1の存在下で低温保存することによって、低温保存期間を大幅に延長できることが確認できた。【００６２】
［実施例３：冷障害抑制効果の評価３］
下記の手順で、低温保存する細胞と化合物1とを接触させるタイミングを変化させて冷障害抑制効果を評価した。
細胞を80-90%の密度となるように37℃で培養したのち、4℃の培地に交換し、低温インキュベーター内で4℃で培養した。Pre treat群は冷保存の1時間前から冷保存直前まで10μM 化合物1を添加した培地を使用し、Pre+CS treat群は冷保存の1時間前からCS（Cold Storage）の間の復温直前まで10μM 化合物1を添加した培地を使用し、CS treat群はCSと同時に作用させて復温直前まで10μM 化合物1を添加した培地を使用し、REW（Rewarm）は37℃に復温と同時に10μM 化合物1を添加した培地を使用した。それ以外の時間は、図3に示す組成の培地(化合物1なし)で培養した。細胞のviabilityは37℃の培地で復温し、1時間後のalamarBlueTMでの酵素活性でみた。その結果の一例を図3に示す。【００６３】
図3に示すように、低温保存後に常温(37℃)に戻すタイミングで化合物1を培地に添加した場合、冷障害(生存能の低下)を十分抑制できなかったのに対し、低温保存を行う前又は低温保存の開始と同時に化合物1を培地に添加することによって、低温保存による冷障害(生存能の低下)を抑制することができた。【００６４】
［実施例４：冷障害抑制効果の評価４］
ドナーの7-8週齢のLEWラットを全身麻酔下に開胸開腹して心臓を露出した後に、上大静脈、下大静脈を結紮し、さらに肺動脈、大動脈を切離して大動脈弓部から、Vehicle又は10μMの化合物1を加えた4℃のUW液で灌流し肺静脈を結紮切離して心臓を摘出した。Vehicle又は10μMの化合物1を加えた4℃のUW液内に浸漬し4℃で24時間の冷保存を行った。レシピエントの7-8週齢のLEWラットを全身麻酔下に開腹して腹部大動脈、大静脈を露出したところで、冷保存した心臓をUW液から取り出し、ドナー肺動脈と大動脈をそれぞれ、レシピエントの腹部大静脈と大動脈に端側吻合して異所性移植を行い閉腹した。移植後1週間の心臓を摘出してマッソン・トリクローム染色で生存心筋面積及び繊維化面積を比較した（それぞれN=5）。その結果の一例を図4に示す。【００６５】
図4に示すように、Vehicleに比較して化合物1投与群ではviableな心筋が多く、繊維化が少なかった。この結果から、冷保存を化合物1の存在下で行うことにより冷障害を抑制でき、24時間冷保存後の心臓は移植により適した状態であったといえる。【００６６】
［実施例５：冷障害抑制効果の評価５］
上記スキームに従い合成した化合物1及び3〜7を使用し、各化合物の存在下でヒト肝癌由来細胞株HepG2を低温で培養した時の冷障害抑制効果を評価した。
HepG2細胞を80-90%の密度となるように37℃で培養したのち、化合物1及び3〜7のいずれかを予め添加した4℃の培地(DMEM)に交換し、低温インキュベーター内で4℃で24時間培養した。24時間の低温での培養後に再び37℃の培地で復温し、1時間後のalamarBlueTMでの酵素活性による細胞のviabilityを観察した。化合物濃度は、0M(Vehicle)から50μMとして、化合物の濃度依存性をみた。その結果の一例を図5に示す。【００６７】
図5に示すように、化合物1及び3〜7の存在下で低温保存することによって、低温保存時における細胞の生存能の低下が濃度依存的に改善され、冷障害を抑制できた。【００６８】
［実施例６：冷障害抑制効果の評価６］
下記化合物8〜10を使用した以外は、実施例１と同様に冷障害抑制効果を評価した。
【化２２】
2019225753.tif 000025
【００６９】
その結果、化合物１と比較して若干活性は劣るものの、化合物8〜10の存在下で低温保存することによって、低温保存時における細胞の生存能の低下が濃度依存的に改善され、冷障害を抑制できた。
【図１】
2019225753.tif 000034
【図２】
2019225753.tif 000035
【図３】
2019225753.tif 000036
【図４】
2019225753.tif 000037
【図５】
2019225753.tif 000038
【国際調査報告】
2019225753.tif 000039
2019225753.tif 000040
2019225753.tif 000041