(57)【要約】  アンチセンス鎖中のPS修飾の数を減らし、かつ、アンチセンス効果の維持させた二本鎖核酸複合体を提供することを目的とする。  二本鎖核酸複合体の最適PS修飾パターンが開示される。そのような最適PS修飾パターンを有するアンチセンス鎖を含む核酸複合体は、毒性が低く、かつbioavailabilityが高いという特徴がある。本発明の最適PS修飾パターンを有するアンチセンス鎖を含む二本鎖核酸複合体を、特定の遺伝子の発現の阻害（ノックアウト）、特定の遺伝子のコーティングまたは非コーディングRNAの機能を変化させる活性、もしくは特定の遺伝子のプレｍRNAのプロセシング中にエクソンスキッピングを誘導することによりRNAの機能を変化させる活性を利用する核酸医薬として用いる際に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
７〜３０のヌクレオチドからなるアンチセンス鎖を含む第１のオリゴヌクレオチドと、第１のオリゴヌクレオチドと相補的である配列を有し、第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした第２のオリゴヌクレオチドを含む核酸複合体であって、第１のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合の修飾パターンが、（POPOPS）ｎにPO、PS、POPO、PSPS、POPSおよびPSPOのいずれかのヌクレオチド間結合を追加したパターン[PSはホスホロチオエート化されているＰＳ修飾ヌクレオチド間結合を示し、POはホスホロチオエート化されていない天然のヌクレオチド間結合を示し、ｎは自然数を表す]を含むか、または第１のオリゴヌクレオチドの５’端側から３’端に向かって連続するｍ個のPS修飾ヌクレオチド間結合（ｍ＝第１のオリゴヌクレオチドに含まれる核酸数の２／３以下の自然数）を有するパターンを含む、二本鎖核酸複合体。
【請求項２】
７〜３０のヌクレオチドからなるアンチセンス鎖を含む第１のオリゴヌクレオチドと、第１のオリゴヌクレオチドと相補的である配列を有し、第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした第２のオリゴヌクレオチドを含む核酸複合体であって、第１のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合の修飾パターンが、（POPOPS）ｎにPO、PS、POPO、PSPS、POPSおよびPSPOのいずれかのヌクレオチド間結合を追加したパターン[PSはホスホロチオエート化されているＰＳ修飾ヌクレオチド間結合を示し、POはホスホロチオエート化されていない天然のヌクレオチド間結合を示し、ｎは１〜９である]を含む、請求項１記載の二本鎖核酸複合体。
【請求項３】
第１のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合の修飾パターンが、以下のいずれかである、請求項２記載の二本鎖核酸複合体：
POPOPS（ｎ＝１）
POPOPSPO
POPOPSPS
POPOPSPOPO
POPOPSPSPS
POPOPSPOPS
POPOPSPSPO
POPOPSPOPOPS（ｎ＝２）
POPOPSPOPOPSPO
POPOPSPOPOPSPS
POPOPSPOPOPSPOPO
POPOPSPOPOPSPSPS
POPOPSPOPOPSPOPS
POPOPSPOPOPSPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPS（ｎ＝３）
POPOPSPOPOPSPOPOPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPS（ｎ＝４）
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPS（ｎ＝５）
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPS（ｎ＝６）
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPS（ｎ＝７）
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPS（ｎ＝８）
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPS（ｎ＝９）
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPSPO。
【請求項４】
第１のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合の修飾パターンが、POPOPSPOPOPSPOPOPSである、請求項３記載の二本鎖核酸複合体。
【請求項５】
７〜３０のヌクレオチドからなるアンチセンス鎖を含む第１のオリゴヌクレオチドと、第１のオリゴヌクレオチドと相補的である配列を有し、第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした第２のオリゴヌクレオチドを含む核酸複合体であって、第１のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合の修飾パターンが、第１のオリゴヌクレオチドの５’端側から３’端に向かって連続するｍ個のPS修飾ヌクレオチド間結合（ｍ＝第１のオリゴヌクレオチドに含まれる核酸数の２／３以下の自然数）を有するパターンを含む、二本鎖核酸複合体。
【請求項６】
７〜２８のヌクレオチドからなるアンチセンス鎖を含む第１のオリゴヌクレオチドと、第１のオリゴヌクレオチドと相補的である配列を有し、第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした第２のオリゴヌクレオチドを含む核酸複合体であって、第１のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合の修飾パターンが、第１のオリゴヌクレオチドの５’端側から３’端に向かって連続するｍ個のPS修飾ヌクレオチド間結合（ｍ＝第１のオリゴヌクレオチドに含まれる核酸数の２／３以下の自然数であり、１〜１３の範囲である）を有するパターンを含む、二本鎖核酸複合体。
【請求項７】
第１のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合の修飾パターンが、以下のいずれかである、請求項６記載の二本鎖核酸複合体：
PSPOPOPO
PSPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO 
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPO
PSPSPOPOPO
PSPSPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO 
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO 
PSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPOPOPOPO
PSPSPSPSPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO 
PSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPO 
PSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPO 
PSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
【請求項８】
第１のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合の修飾パターンが、PsPsPsPOPOPOPOPOPOである、請求項７記載の二本鎖核酸複合体。
【請求項９】
第１のオリゴヌクレオチドがギャップ領域と、ギャップ領域の両端に位置するウィング領域によって構成され、第１のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合の修飾パターンがギャップ領域のヌクレオチド間結合の修飾パターンである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の二本鎖核酸複合体。
【請求項１０】
第２のオリゴヌクレオチドにリガンドが結合されている、請求項１〜９のいずれか１項に記載の二本鎖核酸複合体。
【請求項１１】
第１のオリゴヌクレオチドのウィング領域が１〜４個の核酸から構成される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の二本鎖核酸複合体。
【請求項１２】
第１のオリゴヌクレオチドが(第１のウィング領域)ｒ-(ギャップ領域)ｓ-(第２のウィング領域)ｒ[ｒは１〜１０であり、ｓは４〜２８である]で表される構造を有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の二本鎖核酸複合体。
【請求項１３】
第１のオリゴヌクレオチドのウィング領域が１個以上のPS修飾ヌクレオチド間結合を含むことを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の二本鎖核酸複合体。
【請求項１４】
第１のオリゴヌクレオチドのウィング領域の全てのヌクレオチド間結合がPS修飾ヌクレオチド間結合である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の二本鎖核酸複合体。
【請求項１５】
第１のオリゴヌクレオチドの第１のウィング領域の５’末端側のヌクレオチド間結合および第２のウィング領域の３’末端側のヌクレオチド間結合がPS修飾ヌクレオチド間結合である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の二本鎖核酸複合体。
【請求項１６】
第１のオリゴヌクレオチドのギャップ領域がＤＮＡまたはＤＮＡ修飾ヌクレオチドで構成され、第２のオリゴヌクレオチドがＲＮＡまたはＲＮＡ修飾ヌクレオチドで構成されている、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の二本鎖核酸複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンチセンス効果によって標的遺伝子の発現を阻害または抑制する活性を有する二本鎖核酸の副作用を減じる構造に関し、より詳しくは、アンチセンス鎖に最適なPS修飾パターンを構成することにより、アンチセンス効果の維持と毒性等の副作用低減の両立を可能とした二本鎖核酸に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、オリゴヌクレオチドは、核酸医薬と称される医薬品としての開発が進められており、特に標的遺伝子の選択性の高さの観点から、アンチセンス法を利用した核酸医薬の開発が精力的に進められている。アンチセンス法は、標的遺伝子のｍＲＮＡ（センス鎖）の部分配列に相補的なオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ））を細胞内に導入することにより、標的遺伝子がコードするタンパク質の発現を選択的に阻害または制御する方法である。一本鎖のアンチセンスオリゴヌクレオチド(Antisense Oligonucleotide、以下「ASO」)は、例えば標的メッセンジャーRNAにハイブリダイズして二本鎖を形成した後、RNase  HによりRNA鎖が分解されて標的メッセンジャーRNAの発現が抑制される作用機序を有すものや、ASOが標的プレメッセンジャーRNAのエクソン（コーディング領域）またはイントロン（非コーディング領域）にハイブリダイズすることにより、プレｍRNAのプロセシング中にエクソンスキッピングを誘導することにより正常な作用下ではASOが存在しない場合エクソン部としてスプライシングされて完全長ｍRNAが生じる部分を除去する作用機序を利用するものがある。【０００３】
ASOは、核酸医薬として機能するために、ヌクレアーゼ耐性を向上させることが求められる。天然のオリゴヌクレオチドの核酸間結合であるホスホジエステル結合のリン酸基の酸素原子の一つを硫黄原子に置換しホスホロチオエート化（ＰＳ化）することでヌクレアーゼ耐性の大幅な向上を成し遂げられることが特許文献１に記載されている。しかしながら、過剰数のホスホロチオエート化核酸を含むASOは核酸医薬として、配列に異存しない副作用として肝毒性が強く出ることが知られている（非特許文献１、非特許文献２）。そのため、肝毒性が強く出る副作用は抑えた上でホスホジエステル結合のオリゴマーに比較してヌクレアーゼ耐性を向上させ、かつ、標的ｍRNAに対し結合活性を向上させることが求められている。これを解決する一つの手段として、ASOの核酸間結合をホスホジエステル結合（PO）、ホスホロチオエート結合（PS）を交互に繰り返す構成とするものが提案されている（特許文献１）。【０００４】
また、標的メッセンジャーRNAにハイブリダイズ可能な配列を持つASOと、ASOと相補的な核酸鎖から構成される二本鎖で、ASOの核酸間結合をホスホジエステル結合（PO）、ホスホロチオエート結合（PS）を交互に繰り返す構造とした核酸医薬が特許文献２に記載されている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】WO00/03720 A1
【特許文献２】WO2018/051762 A1
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６，ｐｐ．３２０９−３２２１（１９９８）
【非特許文献２】Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９６  Ｏｃｔ；１４（１０）：３７６−８７．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、ヘテロ二本鎖核酸(Hetero-duplex Oligonucleotide)は種々の臓器で高い遺伝子発現抑制効果を有するが、（１）投与急性期の出血傾向の副作用や、（２）皮下投与での低いbioavailabilityといった課題があると認識している。【０００８】
従来からアンチセンス鎖中のPS修飾の数を減らすと毒性等の副作用が減少することは分かっているが、PS修飾は核酸の安定性を維持する上で必須であるため、PSの数を減らすとヘテロ核酸は不安定になり、有効性が損なわれる。【０００９】
本発明の目的は、アンチセンス鎖中のPS修飾の数を減らし（つまり毒性等の副作用は低減されるということ）、かつ、アンチセンス効果を維持させた二本鎖核酸複合体を提供することである。【００１０】
また、本発明の目的は、従来から提案されているPS、POを繰り返す構成以外の構造でアンチセンス鎖中のPS修飾の数を減らし（つまり毒性等の副作用は低減されるということ）、かつ、アンチセンス効果を維持させた二本鎖核酸複合体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、二本鎖核酸複合体の第１のヌクレオチドであるアンチセンス鎖が、（POPOPS）ｎ[ＰＳはホスホロチオエート化されているＰＳ修飾ヌクレオチド間結合を示し、ＰＯはホスホロチオエート化されていない天然のヌクレオチド間結合を示し、ｎは自然数を表す]であるか、または第１のオリゴヌクレオチドの５’端側から３’端に向かって連続するｍ個のPS修飾ヌクレオチド間結合（ｍ＝第１のオリゴヌクレオチドに含まれる核酸数の２／３以下、好ましくは１／２以下の自然数）を有するPS修飾パターンを構成することにより、アンチセンス効果を維持したまま毒性の副作用を低減する効果を見出した。【００１２】
従って、本発明は以下に関する。
１．  ７〜３０のヌクレオチドからなるアンチセンス鎖を含む第１のオリゴヌクレオチドと、第１のオリゴヌクレオチドと相補的である配列を有し、第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした第２のオリゴヌクレオチドを含む核酸複合体であって、第１のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合の修飾パターンが、（POPOPS）ｎにPO、PS、POPO、PSPS、POPSおよびPSPOのいずれかのヌクレオチド間結合を追加したパターン[PSはホスホロチオエート化されているＰＳ修飾ヌクレオチド間結合を示し、POはホスホロチオエート化されていない天然のヌクレオチド間結合を示し、ｎは自然数を表す]を含むか、または第１のオリゴヌクレオチドの５’端側から３’端に向かって連続するｍ個のPS修飾ヌクレオチド間結合（ｍ＝第１のオリゴヌクレオチドに含まれる核酸数の２／３以下の自然数）を有するパターンを含む、二本鎖核酸複合体。
２．  ７〜３０のヌクレオチドからなるアンチセンス鎖を含む第１のオリゴヌクレオチドと、第１のオリゴヌクレオチドと相補的である配列を有し、第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした第２のオリゴヌクレオチドを含む核酸複合体であって、第１のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合の修飾パターンが、（POPOPS）ｎにPO、PS、POPO、PSPS、POPSおよびPSPOのいずれかのヌクレオチド間結合を追加したパターン[PSはホスホロチオエート化されているＰＳ修飾ヌクレオチド間結合を示し、POはホスホロチオエート化されていない天然のヌクレオチド間結合を示し、ｎは１〜９である]を含む、上記１記載の二本鎖核酸複合体。
３．  第１のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合の修飾パターンが、以下のいずれかである、上記２記載の二本鎖核酸複合体：
POPOPS（ｎ＝１）
POPOPSPO
POPOPSPS
POPOPSPOPO
POPOPSPSPS
POPOPSPOPS
POPOPSPSPO
POPOPSPOPOPS（ｎ＝２）
POPOPSPOPOPSPO
POPOPSPOPOPSPS
POPOPSPOPOPSPOPO
POPOPSPOPOPSPSPS
POPOPSPOPOPSPOPS
POPOPSPOPOPSPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPS（ｎ＝３）
POPOPSPOPOPSPOPOPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPS（ｎ＝４）
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPS（ｎ＝５）
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPS（ｎ＝６）
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPS（ｎ＝７）
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPS（ｎ＝８）
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPS（ｎ＝９）
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPSPO。
４．  第１のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合の修飾パターンが、POPOPSPOPOPSPOPOPSである、上記３記載の二本鎖核酸複合体。
５．  ７〜３０のヌクレオチドからなるアンチセンス鎖を含む第１のオリゴヌクレオチドと、第１のオリゴヌクレオチドと相補的である配列を有し、第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした第２のオリゴヌクレオチドを含む核酸複合体であって、第１のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合の修飾パターンが、第１のオリゴヌクレオチドの５’端側から３’端に向かって連続するｍ個のPS修飾ヌクレオチド間結合（ｍ＝第１のオリゴヌクレオチドに含まれる核酸数の２／３以下の自然数）を有するパターンを含む、二本鎖核酸複合体。
６．  ７〜２８のヌクレオチドからなるアンチセンス鎖を含む第１のオリゴヌクレオチドと、第１のオリゴヌクレオチドと相補的である配列を有し、第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした第２のオリゴヌクレオチドを含む核酸複合体であって、第１のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合の修飾パターンが、第１のオリゴヌクレオチドの５’端側から３’端に向かって連続するｍ個のPS修飾ヌクレオチド間結合（ｍ＝第１のオリゴヌクレオチドに含まれる核酸数の２／３以下の自然数であり、１〜１３の範囲である）を有するパターンを含む、二本鎖核酸複合体。
７．  第１のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合の修飾パターンが、以下のいずれかである、上記６記載の二本鎖核酸複合体：
PSPOPOPO
PSPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO 
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPO
PSPSPOPOPO
PSPSPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO 
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO 
PSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPOPOPOPO
PSPSPSPSPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO 
PSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPO 
PSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPO 
PSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
８．  第１のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合の修飾パターンが、PsPsPsPOPOPOPOPOPOである、上記７記載の二本鎖核酸複合体。
９．  第１のオリゴヌクレオチドがギャップ領域と、ギャップ領域の両端に位置するウィング領域によって構成され、第１のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合の修飾パターンがギャップ領域のヌクレオチド間結合の修飾パターンである、上記１〜８のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
１０．  第２のオリゴヌクレオチドにリガンドが結合されている、上記１〜９のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
１１．  第１のオリゴヌクレオチドのウィング領域が１〜４個の核酸から構成される、上記１〜１０のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
１２．  第１のオリゴヌクレオチドが(第１のウィング領域)ｒ-(ギャップ領域)ｓ-(第２のウィング領域)ｒ[ｒは１〜１０であり、ｓは４〜２８である]で表される構造を有する、上記１〜１１のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
１３．  第１のオリゴヌクレオチドのウィング領域が１個以上のPS修飾ヌクレオチド間結合を含むことを特徴とする、上記１〜１２のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
１４．  第１のオリゴヌクレオチドのウィング領域の全てのヌクレオチド間結合がPS修飾ヌクレオチド間結合である、上記１〜１２のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
１５．  第１のオリゴヌクレオチドの第１のウィング領域の５’末端側のヌクレオチド間結合および第２のウィング領域の３’末端側のヌクレオチド間結合がPS修飾ヌクレオチド間結合である、上記１〜１２のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
１６．  第１のオリゴヌクレオチドのギャップ領域がＤＮＡまたはＤＮＡ修飾ヌクレオチドで構成され、第２のオリゴヌクレオチドがＲＮＡまたはＲＮＡ修飾ヌクレオチドで構成されている、上記１〜１５のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2019-030635号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【００１３】
二本鎖核酸複合体において、第１のオリゴヌクレオチドであるアンチセンス鎖が、（POPOPS）ｎ[ＰＳはホスホロチオエート化されているＰＳ修飾ヌクレオチド間結合を示し、ＰＯはホスホロチオエート化されていない天然のヌクレオチド間結合を示し、ｎは自然数を表す]であるか、または第１のオリゴヌクレオチドの５’端側から３’端に向かって連続するｍ個のPS修飾ヌクレオチド間結合（ｍ＝第１のオリゴヌクレオチドに含まれる核酸数の２／３以下、好ましくは１／２以下の自然数）を有するPS修飾パターンを有することにより、アンチセンス効果を維持したまま毒性の副作用を低減する効果を得ることが可能である。
また、本発明によれば、投与急性期の出血傾向の副作用を回避することができるし、また、皮下投与でのbioavailability の向上を達成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】アンチセンス鎖のPS修飾パターンが異なる7種類のPTEN HDO (14 mer)をマウスに投与した時の肝臓におけるノックダウン作用の比較（n=4）を示す図である。
【図２】アンチセンス鎖のPS修飾パターンが異なる7種類のPTEN HDO (14 mer)を投与したときのマウス肝重量の変化（n=4）を示す図である。
【図３】アンチセンス鎖のPS修飾パターンが異なる7種類のPTEN HDO (14 mer)をマウスに投与したときの血中ALT活性の変化（n=4）を示す図である。
【図４】PS修飾パターンが異なる2種類のMALAT1 HDO (16 mer)によるマウス肝臓におけるノックダウン作用の比較の結果を示す図である。
【図５】PS修飾数の異なるMALAT1 HDOを投与した時血中ALT活性の変化を示す図である。
【図６】PS修飾パターンが異なる2種類のMALAT1 HDO (16 mer)によるマウス肝臓におけるノックダウン作用の比較の結果を示す図である。
【図７】PS修飾数の異なるApoB HDOを投与した時血中ALT活性の変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、第１のオリゴヌクレオチドと、第１のオリゴヌクレオチドと相補的である配列を有する第２のオリゴヌクレオチドを含み、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズしている核酸複合体であり、第１のオリゴヌクレオチド配列が、（POPOPS）ｎ（ｎ＝自然数）、もしくは第１のオリゴヌクレオチドの５’端側から３’端に向かって連続するｍ個のPS修飾ヌクレオチド（ｍ＝第１のオリゴヌクレオチドに含まれる核酸数の２／３以下、好ましくは１／２以下の自然数）を有する二本鎖核酸複合体である。
【００１６】
第１のオリゴヌクレオチドはアンチセンス鎖を含むアンチセンス核酸でありアンチセンス効果を有する。第１のオリゴヌクレオチドをアンチセンス鎖と呼び、第２のオリゴヌクレオチドをセンス鎖と呼ぶ。
【００１７】
アンチセンス核酸とは、標的遺伝子の転写産物等の標的転写産物に相補的な核酸であり、標的遺伝子に対するアンチセンス効果を有する。「アンチセンス効果」とは、標的転写産物（ＲＮＡセンス鎖）と、例えば、その部分配列に相補的なＤＮＡ鎖、または通常アンチセンス効果が生じるように設計された鎖等とがハイブリダイズすることによって生じる、標的遺伝子の発現または標的転写産物レベルの抑制を意味する。ある場合において、ハイブリダイゼーション産物により前記転写産物を被覆することによって生じ得る翻訳の阻害またはエクソンスキッピング等のスプライシング機能変換効果、および/または、ハイブリダイズした部分が認識されることにより生じ得る前記転写産物の分解によって生じる、前記抑制を意味する。
【００１８】
アンチセンス効果によって発現が抑制される「標的遺伝子」または「標的転写産物」としては、特に制限はなく、各種疾患において発現が亢進している遺伝子が挙げられる。また「標的遺伝子の転写産物」とは、標的遺伝子をコードするゲノムＤＮＡから転写されたｍＲＮＡのことであり、塩基の修飾を受けていないｍＲＮＡや、スプライシングを受けていないｍＲＮＡ前駆体等も含まれる。通常、「転写産物」は、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって合成される、いかなるＲＮＡでもよい。
【００１９】
「相補的」という文言は、ここでは水素結合を介して、いわゆるワトソン−クリック型塩基対（天然型塩基対）や非ワトソン−クリック型塩基対（フーグスティーン型塩基対等）を形成できる関係のことを意味する。アンチセンス鎖の十分な数の核酸塩基が、標的核酸の対応する核酸塩基と水素結合し得る場合、アンチセンス鎖および標的核酸は互いに相補的である。アンチセンス鎖と標的核酸との間の非相補的核酸塩基は、アンチセンス鎖が標的核酸に特異的にハイブリダイズできるという条件で許容され得る。さらに、アンチセンス化合物は目的核酸の１つ以上のセグメントに対してハイブリダイズでき、それにより介入するまたは隣接するセグメント（例えば、ループ構造、ミスマッチまたはヘアピン構造）はハイブリダイゼーション事象に関与しない。
【００２０】
特定の実施形態において、第１のオリゴヌクレオチドであるアンチセンス鎖は、標的核酸に対して８０〜１００％、好ましくは９０〜１００％、より好ましくは９５〜１００％、９６〜１００％、９７〜１００％、９８〜１００％、９９〜１００％、もしくは１００％相補的である。標的核酸に対するアンチセンス鎖の相補性の割合は慣例の方法を使用して求められ得る。
【００２１】
例えば、アンチセンス鎖の２０核酸塩基のうちの１６が標的領域に対して相補的であり、したがって特異的にハイブリダイズするアンチセンス鎖は８０パーセントの相補性を表す。この例において、残りの非相補的核酸塩基には、相補的核酸塩基が集まり得るまたは散在し得、これらの非相補的核酸塩基は互いにまたは相補的核酸塩基に隣接している必要はない。
【００２２】
本明細書において、「核酸」とは、天然型核酸、非天然型核酸および／または核酸類似体をいうが、「核酸」はモノマーヌクレオチドを意味する場合もあり、複数のモノマーから構成されるオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドを意味する場合もある。「核酸鎖」という文言は、ここではオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドを称するためにも用いられる。核酸鎖は、その全部または一部を、自動合成機の使用といった化学合成法によって調製してもよく、ポリメラーゼ、ライゲースまたは制限酵素反応に限定されるわけではないが、酵素処理により調製してもよい。本発明の１つの実施態様において、本発明のアンチセンス核酸におけるポリヌクレオチド（および相補鎖におけるポリヌクレオチド）は、化学合成または酵素的反応によって人工的に調製されたものである。
【００２３】
本明細書において、「ヌクレオチド」とはヌクレオシドの糖部分がリン酸とエステルをつくっている化合物を意味し、ここで「ヌクレオシド」とは、プリン塩基またはピリミジン塩基のような窒素を含む有機塩基と糖の還元基とがグリコシド結合によって結合した配糖体化合物を意味する。
【００２４】
また、「デオキシリボヌクレオチド」は、糖部分がＤ−２−デオキシリボースからなるヌクレオチドであり、「ＤＮＡヌクレオチド」ともいう。また、「リボヌクレオチド」は、糖部分がＤ−リボースからなるヌクレオチドであり、「ＲＮＡヌクレオチド」ともいう。そして「デオキシリボヌクレオシド」は、糖部分がＤ−２−デオキシリボースからなるヌクレオシドであり、「ＤＮＡヌクレオチド」ともいう。また、「リボヌクレオシド」は、糖部分がＤ−リボースからなるヌクレオシドであり、「ＲＮＡヌクレオシド」ともいう。
【００２５】
「オリゴヌクレオチド」とは、ヌクレオチドを基本単位とし、リン酸が各ヌクレオチド間で糖の３’と５’位炭素の間にジエステル結合の橋をつくって結ばれた、複数のヌクレオチドが重合した鎖状の物質を意味する。オリゴヌクレオチドをポリヌクレオチドと呼ぶこともある。なお、本明細書では、このようなオリゴヌクレオチドにその構成単位として含まれるヌクレオチド（重合した状態にある）についても同様に「ヌクレオチド」と呼ぶことがある。
【００２６】
本明細書において、「天然型核酸」とは、ヌクレオチドを基本単位とし、リン酸が各ヌクレオチド間で糖の３’と５’位炭素の間にジエステル結合の橋をつくって結ばれ重合した自然界に存在するポリヌクレオチドをいう。通常は、アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルのいずれかの塩基を有するリボヌクレオチドが連結したＲＮＡおよび／またはアデニン、グアニン、シトシンおよびチミンのいずれかの塩基を有するデオキシリボヌクレオチドが連結したＤＮＡが該当する。なお、本明細書では、上記の各ヌクレオチド間の結合を「核酸間結合」ともいう。
【００２７】
本明細書において、「非天然型核酸」とは、非天然型ヌクレオチドを含むまたはそれからなる核酸をいう。ここで「非天然型ヌクレオチド」とは、人工的に構築されたまたは人工的に化学修飾された自然界に存在しないヌクレオチドであって、前記天然に存在するヌクレオチドに類似の性質および／または構造を有するヌクレオチド、または天然に存在するヌクレオシドもしくは塩基に類似の性質および／または構造を有するヌクレオシドもしくは塩基を含むヌクレオチドをいう。例えば、脱塩基ヌクレオシド、アラビノヌクレオシド、２’−デオキシウリジン、α−デオキシリボヌクレオシド、β−Ｌ−デオキシリボヌクレオシド、その他の糖修飾を有するヌクレオチドが挙げられる。さらに、置換五炭糖（２’−Ｏ−メチルリボース、２’−デオキシ−２’−フルオロリボース、３’−Ｏ−メチルリボース、１’，２’−デオキシリボース）、アラビノース、置換アラビノース糖；置換六炭糖およびアルファ−アノマーの糖修飾を有するヌクレオチドが含まれる。また、非天然型ヌクレオチドは、人工的に構築された塩基類似体または人工的に化学修飾された塩基（修飾塩基）を包含するヌクレオチドも含む。また、修飾の例として、シトシンの5-メチル化、5-フッ素化、5-臭素化、5-ヨウ素化およびN4-メチル化；チミジンの5-脱メチル化、5-フッ素化、5-臭素化および5-ヨウ素化；アデニンのN6-メチル化および8-臭素化；グアニンのN2-メチル化および8-臭素化；メチルホスホン化、メチルチオホスホン化、キラルメチルホスホン化、ホスホロジチオエート化、ホスホロアミデート化、2'-O-メチル化、2'-メトキシエチル(MOE)化、2'-アミノプロピル(AP)化、および2'-フッ素化等が挙げられる。「塩基類似体」には、例えば、２−オキソ（１Ｈ）−ピリジン−３−イル基、５位置換−２−オキソ（１Ｈ）−ピリジン−３−イル基、２−アミノ−６−（２−チアゾリル）プリン−９−イル基、２−アミノ−６−（２−チアゾリル）プリン−９−イル基、２−アミノ−６−（２−オキサゾリル）プリン−９−イル基等が挙げられる。「修飾塩基」には、例えば、修飾化ピリミジン（例えば、５−ヒドロキシシトシン、５−フルオロウラシル、４−チオウラシル）、修飾化プリン（例えば、６−メチルアデニン、６−チオグアノシン）および他の複素環塩基等が挙げられる。また、非天然型ヌクレオチドは、メチルホスホネート型ＤＮＡ／ＲＮＡ、ホスホロチオエート型ＤＮＡ／ＲＮＡ（すなわち、チオリン酸結合を有するＤＮＡ／ＲＮＡ）、ホスホルアミデート型ＤＮＡ／ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル型ＤＮＡ／ＲＮＡ等の修飾ヌクレオチドや核酸類似体も含むこともできる。ただし、第１のオリゴヌクレオチドについては、ホスホロチオエート化されたヌクレオチド間結合の存在に一定のパターンがある。ホスホロチオエート化されたヌクレオチド間結合の存在パターンについては後述する。また、非天然型ヌクレオチドは、天然型核酸に類似の構造および／または性質を有する人工的に構築された化合物であるヌクレオチドアナログを含む。「ヌクレオチドアナログ」は、修飾(架橋基、置換基等)によって、相補鎖または標的転写産物の部分配列に対する親和性および/またはヌクレアーゼに対する核酸の抵抗性が増強された任意の核酸であり、ペプ���ド核酸（ＰＮＡ：Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ホスフェート基を有するペプチド核酸（ＰＨＯＮＡ）、架橋化核酸（ＢＮＡ／ＬＮＡ：Ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ／Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、モルフォリノ核酸、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ)、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、トリシクロ−ＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）、２’−Ｏ−メチル化核酸、２’−ＭＯＥ（２’−Ｏ−メトキシエチル）化核酸、２’−ＡＰ（２’−Ｏ−アミノプロピル）化核酸、２’−フルオロ化核酸、２’Ｆ‐アラビノ核酸（２'−Ｆ−ＡＮＡ）、塩基性ポリアミノ酸（Ｐｏｌｙ  Ｌ−Ｌｙｓ、Ｐｏｌｙ  Ｌ−Ａｒｇ）等を含むことができる。本明細書では、これらをまとめて「修飾ヌクレオチド」とも呼ぶ。修飾ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドアナログは、本明細書中に例示される修飾ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドアナログに限定されない。
【００２８】
ある実施形態において、ヌクレオチドアナログは下記式（１）で表わされるＬＮＡである。
【００２９】
【化１】
2020171149.tif 000002
（式（１）中、Ｂａｓｅは、置換基を有していてもよい芳香族複素環基もしくは芳香族炭化水素環基、例えば、天然型ヌクレオシドの塩基部位（プリン塩基、ピリミジン塩基）又は非天然型（修飾）ヌクレオシドの塩基部位を示す。なお、塩基部位の修飾の例は、前述の通りである。
Ｒ１、Ｒ２は、同一または異なっていてもよく、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、シリル基、リン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、または、−Ｐ（Ｒ４）Ｒ５［ここで、Ｒ４およびＲ５は、同一または異なっていてもよく、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数１〜５のアルキルチオ基、炭素数１〜６のシアノアルコキシ基、または、炭素数１〜５のアルキル基で置換されたアミノ基を示す。］を示す。）
【００３０】
なお、前記化学式において示されている化合物はヌクレオシドであるが、ある実施形態における「ＬＮＡ」および通常ＢＮＡには、当該ヌクレオシドにリン酸基が結合した形態（ヌクレオチド）も含まれる。すなわち、ＬＮＡといったＢＮＡは、二重鎖核酸複合体を含む核酸鎖に、ヌクレオチドとして組み込まれる。
【００３１】
特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは修飾ヌクレオチドを含む。ある実施形態において、アンチセンス鎖を含むオリゴヌクレオチドがホスホロチオエート化されたヌクレオチド間結合の一定の存在パターンを有する限り、オリゴヌクレオチドはヌクレオチドと任意に修飾ヌクレオチドとを含んだ構成でよいし、全て修飾ヌクレオチドであってもよい。生体内で酵素による消化作用により核酸鎖の切断を防止するため、核酸間の結合を天然型の核酸よりも強固にする目的で、アンチセンスオリゴヌクレオチドは修飾ヌクレオチドを任意の場所に任意の数だけ含んでよい。
【００３２】
本発明の二本鎖核酸複合体における第１のオリゴヌクレオチドの長さは限定されないが、５〜１００ヌクレオチド、好ましくは７〜５０ヌクレオチド、さらに好ましくは７〜３０ヌクレオチド、さらに好ましくは７〜２５ヌクレオチド、さらに好ましくは７〜２０ヌクレオチドである。
【００３３】
第２のオリゴヌクレオチドの長さも、第１のオリゴヌクレオチドとアニールする限り限定されず、第２のオリゴヌクレオチドと第１のオリゴヌクレオチドの長さは同一でも、異なっていてもよいが、好ましくは第１のオリゴヌクレオチドと同じ長さである。
【００３４】
第１のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、ギャップ(Gap)領域、該ギャップ領域の５’末端に連結された５’ウィング(Wing)領域と前記ギャップ領域の３’末端に連結された３’ウィング領域を含む。すなわち、ギャップ領域の両端にウィング領域を有し、これらの領域で構成される。ウィング領域は、好ましくはアンチセンス核酸の５’末端および／または３’末端に配置される。ギャップ領域を中央ヌクレオチド領域ともいう。５’ウィング領域を第１のウィング領域といい、３’ウィング領域を第２のウィング領域ということがある。
【００３５】
ギャップ領域は、ＲＮＡｓｅ  Ｈが認識し得る４つ以上の連続したヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドを含み、好ましくは４つ以上の連続したＤＮＡヌクレオチドまたは修飾ＤＮＡヌクレオチドを含む。ギャップ領域の長さは４〜２８塩基であり、好ましくは４〜２０塩基、さらに好ましくは５〜１６塩基、さらに好ましくは６〜１６塩基である。
【００３６】
５’ウィング領域および３’ウィング領域は、それぞれ独立したものであり、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。好ましい、修飾ヌクレオチドとして、例えば、ＬＮＡが挙げられ、５’ウィング領域および３’ウィング領域のすべてのヌクレオチドがＬＮＡであってもよい。第１のオリゴヌクレオチドにおいて、中央に少なくとも４塩基以上の鎖長のＤＮＡが配置され、さらにＲＮＡ（すなわち、標的転写産物）と強い結合能力を持つＬＮＡ（または他のＢＮＡ）が両端に配置されることによって、このような複合鎖は、ＲＮａｓｅＨによる標的ＲＮＡの切断を促進することとなる。
【００３７】
５’ウィング領域および３’ウィング領域の長さは独立的に、１〜１０塩基であり、好ましくは１〜７塩基、さらに好ましくは１〜４塩基、さらに好ましくは２〜４塩基である。あるいは、２〜５塩基である。
【００３８】
ウィング領域は、主に、アンチセンス核酸のヌクレアーゼ耐性と、標的となるｍＲＮＡに対する当該核酸の親和性とを高めるために、化学修飾ヌクレオチドを配置したセグメントである。
【００３９】
本発明の１つの実施態様において、アンチセンス鎖を含む第１のオリゴヌクレオチドは、(第１のウィング領域)ｒ-(ギャップ（Gap）領域)ｓ-(第２のウィング領域)ｒで表される配列を有する。ここで、第１のウィング領域は５’ウィング領域であり、第２のウィング領域は３’ウィング領域である。また、ｒおよびｓはそれぞれ、ウィング領域およびギャップ領域を構成する塩基の数を表し、ｒ＝１〜１０であり、好ましくは１〜７、さらに好ましくは１〜４、さらに好ましくは２〜４である。あるいは、２〜５もしくは１〜４である。ｓ＝４〜２８であり、好ましくは４〜２０、さらに好ましくは５〜１６、さらに好ましくは６〜１６である。
【００４０】
第２のオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）およびＢＮＡ（例えば、ＬＮＡ）からなる群から選択される少なくとも１種の核酸からなるオリゴヌクレオチドである。第２のオリゴヌクレオチドがＲＮＡオリゴヌクレオチドである場合、二本鎖核酸複合体をヘテロ二本鎖核酸複合体という。二本鎖核酸複合体が細胞内のＲＮａｓｅＨに認識され、第２のオリゴヌクレオチドが分解されることにより、第１のオリゴヌクレオチドのアンチセンス効果が発揮し易くなる観点からは、第２のオリゴヌクレオチドはＲＮＡが好ましいが、ＲＮＡに限定されない。ＲＮＡは修飾されていてもよく、２’−Ｏ−メチルリボース（２’−Ｏ−メチル修飾ＲＮＡ）であってもよい。例えば、第１のオリゴヌクレオチドの５’ウィング領域および３’ウィング領域に相補的なヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル修飾ＲＮＡであってもよい。
【００４１】
ギャップ領域、該ギャップ領域の５’末端に連結された５’ウィング領域と前記ギャップ領域の３’末端に連結された３’ウィング領域を含むオリゴヌクレオチドをギャップマー(Gapmer)と呼ぶ。例えば、５’ウィング領域の塩基がｒ個、ギャップ領域の塩基がｓ個、３’ウィング領域の塩基がｒ個であるオリゴヌクレオチドをr-s-rのギャップマー構造を有するオリゴヌクレオチドという。
【００４２】
本発明の１つの実施態様において、アンチセンス鎖は、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡヌクレオチド）または化学修飾されていてよいデオキシリボヌクレオチド（修飾ＤＮＡヌクレオチド）を含む。ギャップ領域のヌクレオチドがＤＮＡヌクレオチドであってもよいし、すべてのヌクレオチドがＤＮＡヌクレオチドであってもよい。
【００４３】
本発明の１つの実施態様において、第１のオリゴヌクレオチドと相補的である配列を有する第２のオリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド（ＲＮＡヌクレオチド）または化学修飾されていてよいリボヌクレオチド（修飾ＲＮＡヌクレオチド）を含む。一部のヌクレオチドがＲＮＡヌクレオチドであってもよいし、すべてのヌクレオチドがＲＮＡヌクレオチドであってもよい。
【００４４】
本明細書において、修飾ヌクレオチドの一形態であって、ホスホロチオエート化が施されたヌクレオチド間結合、すなわちホスホロチオエート型ＤＮＡ／ＲＮＡ（すなわち、チオリン酸結合を有するＤＮＡ／ＲＮＡ）をＰＳ修飾ヌクレオチド間結合という。ホスホロチオエート化が施されたヌクレオチド間結合とは、ホスホジエステル結合を有するオリゴヌクレオチドのリン酸基の酸素原子を硫黄原子で置換したものをいう。また、ホスホロチオエート化が施されていないヌクレオチド間結合を天然型（ＰＯ）ヌクレオチド間結合という。当業者であれば、ヌクレオチドの種類（例えば、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド）や核酸類似体の種類に応じて、適宜、それぞれにおいて可能な化学修飾を選択して施すことが可能である。
【００４５】
第１のオリゴヌクレオチドおけるＰＳ修飾ヌクレオチド間結合、特に第１のオリゴヌクレオチドのギャップ領域におけるＰＳ修飾ヌクレオチド間結合は、一定のパターンで存在する。ＰＳ修飾ヌクレオチド間結合のパターンをＰＳ修飾パターンまたは単に修飾パターンという。ここで、ＰＳ修飾ヌクレオチド間結合はヌクレオチドとその３’側のヌクレオチドの間の結合がホスホロチオエート化されていることをいうが、ホスホロチオエート化されているヌクレオチド間結合で連結された２つのヌクレオチドの５’側のヌクレオチドをＰＳ修飾ヌクレオチドという。
【００４６】
第１のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合の修飾パターンは、例えば、（POPOPS)ｎにPO、PS、POPO、PSPS、POPSおよびPSPOのいずれかのヌクレオチド間結合を追加したパターンを含む。好ましくは、第１のオリゴヌクレオチドのギャップ領域の配列のヌクレオチド間結合の修飾パターンは、例えば、（POPOPS)ｎにPO、PS、POPO、PSPS、POPSおよびPSPOのいずれかのヌクレオチド間結合を追加したパターンで表される。ここで、ＰＳはホスホロチオエート化されているＰＳ修飾ヌクレオチド間結合を示し、ＰＯはホスホロチオエート化されていない天然のヌクレオチド間結合を示し、ｎは自然数を表し、好ましくは１〜９である。第１のオリゴヌクレオチドのギャップ領域の配列のヌクレオチド間結合の数がｐの場合、第１のオリゴヌクレオチドのギャップ領域の塩基の数はｐ＋１となる。例えば、具体的には、オリゴヌクレオチドのギャップ領域の塩基の数が１０個の場合、ヌクレオチド間結合の数は９である。または、第１のオリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチドの５’端側から３’端に向かって連続するｍ個のＰＳ修飾ヌクレオチド間結合（ｍ＝第１のオリゴヌクレオチドに含まれる核酸数の２／３以下、好ましくは１／２以下の自然数）を有するパターンを含む。好ましくは、第１のオリゴヌクレオチドのギャップ領域の配列のヌクレオチド間結合は、第１のオリゴヌクレオチドの５’端側から３’端側に向かって連続するｍ個のＰＳ修飾ヌクレオチド間結合（ｍ＝第１のオリゴヌクレオチドに含まれる核酸数の２／３、好ましくは１／２以下の自然数）を有するパターンを有する。
【００４７】
第１のオリゴヌクレオチドの５’ウィング領域および３’ウィング領域のヌクレオチド間結合は、ＰＳ修飾ヌクレオチド間結合であっても、ＰＯヌクレオチド間結合であってもよく、ＰＳ修飾ヌクレオチド間結合とＰＯヌクレオチド間結合が混在していてもよい。例えば、１個以上のＰＳ修飾ヌクレオチド間結合を含んでいてもよく、すべてがＰＳ修飾ヌクレオチド間結合であってもよい。また、５’ウィング領域の５’末端側のヌクレオチド間結合および３’ウィング領域の３‘末端側のヌクレオチド間結合がＰＳ修飾ヌクレオチド間結合である。
【００４８】
第１のオリゴヌクレオチドの配列、好ましくはギャップ領域の配列の５’側からのヌクレオチド間結合の修飾パターンの例を以下に示す。
POPOPS（ｎ＝１）
POPOPSPO
POPOPSPS
POPOPSPOPO
POPOPSPSPS
POPOPSPOPS
POPOPSPSPO
POPOPSPOPOPS（ｎ＝２）
POPOPSPOPOPSPO
POPOPSPOPOPSPS
POPOPSPOPOPSPOPO
POPOPSPOPOPSPSPS
POPOPSPOPOPSPOPS
POPOPSPOPOPSPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPS（ｎ＝３）
POPOPSPOPOPSPOPOPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPS（ｎ＝４）
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPS（ｎ＝５）
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPS（ｎ＝６）
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPS（ｎ＝７）
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPS（ｎ＝８）
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPS（ｎ＝９）
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPO
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPSPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPS
POPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPOPOPSPSPO
PSPOPOPO
PSPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO 
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPO
PSPSPOPOPO
PSPSPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO 
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO 
PSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
PSPSPSPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPO
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【００４９】
ある実施形態における二本鎖核酸複合体において、第２のオリゴヌクレオチドに機能性部分が結合していてもよい。第２のオリゴヌクレオチドと機能性部分との結合は、直接的な結合であってもよく、他の物質を介した間接的な結合であってもよいが、ある実施形態において、共有結合、イオン結合、水素結合等で第２のオリゴヌクレオチドと機能性部分とが直接的に結合していることが好ましく、より安定した結合が得られるという観点から、共有結合がより好ましい。
【００５０】
ある実施形態において、「機能性部分」の構造上、特に制限はなく、それを結合する二本鎖核酸複合体および/または核酸鎖に所望の機能を付与する。所望の機能としては、標識機能、精製機能および標的への送達機能が挙げられる。標識機能を付与する部分の例としては、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ等の化合物が挙げられる。精製機能を付与する部分の例としては、ビオチン、アビジン、Ｈｉｓタグペプチド、ＧＳＴタグペプチド、ＦＬＡＧタグペプチド等の化合物が挙げられる。
【００５１】
また、第１のオリゴヌクレオチドを特異性高く効率的に標的部位に送達し、かつ当該核酸によって標的遺伝子の発現を非常に効果的に抑制するという観点から、第２のオリゴヌクレオチドに機能性部分として、ある実施形態における二本鎖核酸複合体を標的部位に送達させる活性を有する分子が結合していることが好ましい。
【００５２】
「標的への送達機能」を有する部分として、例えば、肝臓等に特異性高く効率的にある実施形態における二重鎖核酸複合体を送達できるという観点から、脂質が挙げられる。このような脂質としては、コレステロール、脂肪酸等の脂質（例えば、ビタミンＥ（トコフェロール類、トコトリエノール類）、ビタミンＡ，ビタミンＤ）、ビタミンＫ等の脂溶性ビタミン（例えば、アシルカルニチン）、アシルＣｏＡ等の中間代謝物、糖脂質、グリセリド、ならびにそれらの誘導体等を例示することができるが、これらの中では、より安全性が高いという観点から、ある実施形態において、コレステロール、ビタミンＥ（トコフェロール類、トコトリエノール類）を利用することが好ましい。また、脳に特異性高く効率的に本発明の二本鎖核酸を送達できるという観点から、ある実施形態における「機能性部分」としては、糖（例えば、グルコース、スクロース）が挙げられる。また、各臓器の細胞表面にある各種タンパク質に結合することにより、当該臓器に特異性高く効率的にある実施形態における二本鎖核酸複合体を送達できるという観点から、受容体のリガンドや抗体、および／またはそれらの断片等のペプチドまたはタンパク質が、ある実施形態における「機能性部分」として挙げられる。
【００５３】
いくつかの実施形態における二本鎖核酸複合体は、後述の実施例において示す通り、特異性高く効率良く標的部位に送達され、かつ標的遺伝子の発現または標的転写産物レベルを非常に効果的に抑制することができる。従って、いくつかの実施形態における二本鎖核酸複合体を有効成分として含有する、例えば、標的遺伝子の発現をアンチセンス効果によって抑制するための組成物を、本発明は提供することができる。特に、いくつかの実施形態における二本鎖核酸複合体は、低濃度の投与により高い薬効を得ることができ、かつアンチセンス核酸の送達標的領域以外の臓器における分布を抑制することにより、副作用も低減できるため、代謝性疾患、腫瘍、感染症といった標的遺伝子の発現亢進に伴う疾患を治療、予防するための医薬組成物も、いくつかの実施形態において提供することができる。
【００５４】
いくつかの実施形態における二本鎖核酸複合体を含む組成物は、公知の製剤学的方法により製剤化することができる。例えば、カプセル剤、錠剤、丸剤、液剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、トローチ剤、舌下剤、咀嚼剤、バッカル剤、ペースト剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤、乳剤、塗布剤、軟膏剤、硬膏剤、パップ剤、経皮吸収型製剤、ローション剤、吸引剤、エアゾール剤、注射剤、坐剤等として、経腸管的（経口的等）または非経腸管的に使用することができる。
【００５５】
これら製剤化においては、薬理学上もしくは飲食品として許容される担体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、ｐＨ調節剤、安定剤、香味剤、芳香剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、無痛化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等と適宜組み合わせることができる。
【００５６】
いくつかの実施形態における二本鎖核酸複合体においては、カイロミクロンやカイロミクロンレムナント等のリポタンパク質との複合体を形成させてもよい。さらに、経腸投与の効率を高めるという観点から、前記リポタンパク質に加え、大腸粘膜上皮透過性亢進作用を有する物質（例えば、中鎖脂肪酸、長鎖不飽和脂肪酸またはそれらの誘導体（塩、エステル体またはエーテル体））および界面活性剤（非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤）との複合体（混合ミセル、エマルジョン）であってもよい。
【００５７】
いくつかの実施形態における組成物の好ましい投与形態としては特に制限はなく、経腸管的（経口的等）または非経腸管的、より具体的には、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、気道内投与、直腸投与および筋肉内投与、輸液による投与が挙げられる。
【００５８】
いくつかの実施形態における組成物は、ヒトを含む動物を対象として使用することができるが、ヒト以外の動物としては特に制限はなく、種々の家畜、家禽、ペット、実験用動物等を対象とすることができる。
【００５９】
いくつかの実施形態における組成物を投与または摂取する場合、その投与量または摂取量は、対象の年齢、体重、症状、健康状態、組成物の種類（医薬品、飲食品など）等に応じて、適宜選択されるが、ある実施形態にかかる組成物の有効摂取量は、ヌクレオチド換算で０．００１ｍｇ／ｋｇ／日〜５０ｍｇ／ｋｇ／日であることが好ましい。
【００６０】
いくつかの実施形態における二本鎖核酸は、後述の実施例において示す通り、特異性高く効率的に標的部位に送達され、かつ標的遺伝子の発現または標的転写産物レベルを非常に効果的に抑制することができる。従って、いくつかの実施形態においては、対象に対して、いくつかの実施形態における二重鎖核酸複合体を投与し、標的遺伝子の発現または標的転写産物をアンチセンス効果によって抑制する方法を提供することができる。また、いくつかの実施形態における組成物を対象に投与することによって、標的遺伝子の発現亢進等を伴う各種疾患を治療、予防するための方法をも提供することができる。
【実施例】
【００６１】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。【００６２】
鎖長14merで構成されるヘテロ核酸のギャップマー（Gapmer）構造を含む第１のオリゴヌクレオチドであるアンチセンス鎖における13箇所のヌクレオチド間結合におけるPS（ホスホロチオエート化修飾）の導入部位の中で、６箇所のPSを天然型（PO）にしても、有効性を減弱しない７箇所のPSの導入部位のパターンを２種類見出した。これにより、投与急性期の出血傾向の副作用の回避と皮下投与でのbioavailabilityの向上が達成された。【００６３】
本発明ではPTEN遺伝子より選択された2-10-2のギャップマー構造を持ち、かつPS修飾のパターンが異なるアンチセンス鎖を含む7種類のヘテロ2本鎖核酸（Heteroduplex oligonucleotide: HDO）をデザインした。尚、これらのHDOの第２のオリゴヌクレオチドであるセンス鎖のウィング部分には2’-O-メチル修飾RNAを含ませ、かつギャップ領域にはRNAを配置した。さらに、センス鎖の両端から2箇所ずつの核酸間結合にはPS修飾を施し、5’末端にはコレステロール（Chol）をリガンドとして付与した。オリゴの合成はGene Design Inc.に依頼した。【００６４】
【表１】
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【００６５】
小文字はDNA、大文字はRNA、N(L)はLNA修飾 [例：A(L)、T(L)、G(L)、mC（LNAメチルシトシン）は5(L)]、^ (山形マーク）はPS修飾ヌクレオチド間結合、大文字(M)は2’-O-メチル修飾RNA [例：A(M)、G(M)、C(M)、U(M)]、Cholはコレステロールを示す。【００６６】
上記の表の１〜７のアンチセンス鎖の配列は、それぞれ配列表の配列番号１〜７の配列であり、センス鎖の配列は配列番号８の配列である。【００６７】
7種類のHDOのアンチセンス鎖の１３箇所のヌクレオチド間結合におけるPS修飾は下記のようにデザインした。本発明においては、ギャップ領域のヌクレオチド間結合、すなわち下記の３番目〜１１番目のヌクレオチド間結合のPS修飾パターンが重要である。【００６８】
PTEN-1  PsPs PsPsPsPsPsPsPsPsPs PsPs (Ps:PO=13:0)
PTEN-2  PsPO PsPsPsPsPsPsPsPsPs POPs (Ps:PO=11:2)
PTEN-3  PsPs POPOPOPOPOPOPsPsPs PsPs (Ps:PO= 7:6)
PTEN-4  PsPs PsPsPsPOPOPOPOPOPO PsPs (Ps:PO= 7:6)
PTEN-5  PsPs POPOPsPOPOPsPOPOPs PsPs (Ps:PO= 7:6)
PTEN-6  PsPs PsPsPOPsPsPOPsPsPO PsPs (Ps:PO=10:3)
PTEN-7  PsPO PsPsPOPsPsPOPsPsPO POPs (Ps:PO= 8:5)【００６９】
[実施例１]  アンチセンス鎖のPS修飾パターンが異なる7種類のPTEN HDO (14 mer)をマウスに投与した時の肝臓におけるノックダウン作用の比較
c57BL/6マウスにアンチセンス鎖のPS修飾パターンが異なる7種類のPTEN HDO (14 mer)を投与したときの肝臓におけるノックダウン作用を調べた。ネガティブコントロールはVehicle（Saline）、ポジティブコントロールはオールPS修飾のPTEN-1を用いた。PTEN HDOの投与量は100 nmol/kgに設定し、マウスの尾静脈より単回投与（10 ml/kg）を行った。投与３日、マウスをイソフルラン麻酔下で心内採血を行い、肝臓を摘出した。SV Total RNA Isolation System (Promega)を用いて肝組織からTotal RNAを抽出し、PrimeScript(登録商標）RT Master Mix（Takara Bio）を用いて逆転写反応を行った後、LightCycler(登録商標）480 System II（Roche）を用いて定量PCRを行った。PTENおよび18SrRNAのプライマー、プローブはTaqMan Gene Expression Assays（Thermo Fisher Scientific）の試薬を使用し、mRNA発現量はΔΔCt法により算出した。【００７０】
図１に示すように、ギャップ領域内5’端から3個の核酸間結合のみがPS修飾であるPTEN-4（PS=7個）はVehicleと比べて24%のノックダウン作用を示した。また、ギャップ領域内POPOPS修飾の３回繰り返し配列を有するPTEN-5（PS=7個）はVehicle投与群と比べて33%のノックダウン作用を示した。PTEN-5のノックダウン率はオールPS修飾のPTEN-1（PS=13個）と同程度であった。PTEN-5は、PSPSPO修飾パターンの３回繰り返し配列を有するPTEN-6、PTEN-7よりも一層強いノックダウン活性を示したことは大変興味深い。以上の結果より、PTEN-5はPTEN-1と比べてノックダウン活性を低下させずにPS修飾数を減らすことができることが明らかとなった。【００７１】
[実施例２]  アンチセンス鎖のPS修飾パターンが異なる7種類のPTEN HDO (14 mer)をマウスに投与したときの肝重量の変化
実施例１でPTEN-4とPTEN-5がノックダウン活性を示したため、実施例１と同じPTEN HDOの投与量：100 nmol/kgで毒性の副作用を示すか否かを確認した。
実施例１に記載の処置を施したマウスを投与３日後にイソフルランで麻酔した後、事前にヘパリンナトリウム処理を施したシリンジを用いて心内採血を行った後、肝臓を摘出した。図２は、アンチセンス鎖のPS修飾パターンが異なる7種類のPTEN HDO (14 mer)を投与した３日後におけるマウスの肝臓重量の変化を示す。肝臓重量はVehicle投与群に比べ、いずれのPS修飾パターンのPTEN HDO投与群においても有意な差は認められなかった。【００７２】
[実施例３]  アンチセンス鎖のPS修飾パターンが異なる7種類のPTEN HDO (14 mer)をマウスに投与したときの血中ALT活性の変化
実施例1に記載の処置を施したマウスを投与３日後にイソフルランで麻酔した後、事前にヘパリンナトリウム処理を施したシリンジを用いて心内採血を行った後、肝臓を摘出した。血液は遠心分離し、上清を用いて血中肝臓逸脱酵素（ALT）活性をトランスアミナーゼCII-テストワコー（富士フイルム和光純薬）を用いて計測した。図３は、アンチセンス鎖のPS修飾パターンが異なる7種類のPTEN HDO (14 mer)を投与した３日後におけるマウスの血中ALT活性の変化を示す。血中ALT活性は、いずれのPS修飾のPTEN HDO投与群においてもVehicle投与群と比べて有意な変化は認められなかった。【００７３】
[実施例４]  PTEN-1とは別の遺伝子及び鎖長でのパターンの有効性
本実施例では、MALAT1およびApoB遺伝子より選択された3-10-3のGapmer構造を持ち、かつPS修飾のパターンが異なるアンチセンス鎖を含む３種類のヘテロ2本鎖核酸（Hetero-duplex oligonucleotide: HDO）、つまり、オールPS修飾と、PS修飾パターンが異なる２種類のパターン：（POPOPS）ｎ、5’端側から連続するｍ個（ｍ＝アンチセンス鎖の鎖長の2/3以下、好ましくは1/2以下の自然数）のPS修飾ヌクレオチドをデザインした。尚、これらのHDOのセンス鎖のwing部分には2’-O-メチル修飾RNAを含み、かつgap部分にはRNAを配置した。さらに、センス鎖の両端から3か所ずつの核酸間結合にはPS修飾を施し、5’末端にはコレステロール（Chol）をリガンドとして付与した。オリゴの合成はGene Design Inc.に依頼した。【００７４】
【表２】
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【００７５】
表２中、nはDNA、NはRNA、N(L)はLNA修飾 [A(L)、T(L)、G(L)、mCは5(L)]、^ はPS修飾、N(M)は2’-O-メチル修飾RNA [A(M)、G(M)、C(M)、U(M)]、Cholはコレステロールを示す。【００７６】
表２のMALAT1のアンチセンス鎖およびセンス鎖の配列を、それぞれ配列表の配列番号９および１０に示し、ApoBのアンチセンス鎖およびセンス鎖の配列を、それぞれ配列表の配列番号１１および１２に示す。【００７７】
MALAT1遺伝子、ApoB遺伝子より選択された3-10-3のギャップマー３種類、HDOのアンチセンス鎖及び一本鎖アンチセンスオリゴマー（ASO）のアンチセンス鎖におけるPS修飾は下記のようにデザインした。【００７８】
MALAT1(1)  PsPsPs PsPsPsPsPsPsPsPsPs PsPsPs (Ps:PO=15:0)
MALAT1(2)  PsPsPs PsPsPsPoPoPoPoPoPo PsPsPs (Ps:Po=9:6)
MALAT1(3)  PsPsPs PoPoPsPoPoPsPoPoPs PsPsPs (Ps:Po=9:6)
ApoB (1)  PsPsPs PsPsPsPsPsPsPsPsPs PsPsPs (Ps:PO=15:0)
ApoB (2)  PsPsPs PsPsPsPoPoPoPoPoPo PsPsPs (Ps:Po=9:6)
ApoB (3)  PsPsPs PoPoPsPoPoPsPoPoPs PsPsPs (Ps:Po=9:6)
[実施例５]  １）MALAT1のアンチセンス鎖のPS修飾パターンが異なる2種類のHDOのノックダウン作用
c57BL/6マウスを用いてMALAT1 HDO (MALAT1(2)およびMALAT1(3)、16 mer) の肝臓のMALAT1  mRNAに対するノックダウン作用を調べた。ネガティブコントロールはVehicle（Saline）、ポジティブコントロールはオールPS修飾のMLAT1(1)を用いた。MALAT1 HDOの投与量は100 nmol/kgに設定し、マウスをイソフルランで麻酔した後、尾静脈より単回投与（10 ml/kg）を行った。投与３日後にマウス肝臓からSV Total RNA Isolation System (Promega) を用いてTotal RNAを抽出し、PrimeScript RT Master Mix（Takara Bio）を用いて逆転写反応を行った後、LightCycler(登録商標） 480 System II（Roche）を用いて定量PCRを行った。qPCR検出用のプライマー、プローブはTaqMan Gene Expression Assays（Thermo Fisher Scientific）の試薬を使用し、mRNA発現量はΔΔCt法により算出した。【００７９】
図４に示すように、オールPS修飾のMALAT1(1)（PS=15個）は最も強いノックダウン活性を示した（93％）。それに比べ、MALAT1(2)とMALAT1(3)（PS=9個）は肝臓のMALAT1 mRNA発現をそれぞれ70％、62％抑制した。【００８０】
MALAT1 HDO投与三日後の血中ALT活性は、Vehicle投与群に比べ、いずれも有意な変化は認められなかった。ALT活性の測定結果を図５に示す。【００８１】
[実施例６]ApoBのアンチセンス鎖のPS修飾パターンが異なる2種類のHDO (16 mer)のノックダウン作用
c57BL/6マウスを用いてApoB HDO (ApoB(2)およびApoB(3)、16 mer)の肝臓ApoB mRNA発現に対するノックダウン作用を調べた。ネガティブコントロールはVehicle（Saline）、ポジティブコントロールはオールPS修飾のApoB(1)を用いた。 ApoB HDOの投与量は100 nmol/kgに設定し、マウスをイソフルランで麻酔した後、尾静脈より単回投与（10 ml/kg）を行った。投与３日後にマウス肝臓からSV Total RNA Isolation System (Promega) を用いてTotal RNAを抽出し、PrimeScript RT Master Mix（Takara Bio）を用いて逆転写反応を行った後、LightCycler（登録商標） 480 System II（Roche）を用いて定量PCRを行った。qPCR検出用のプライマー、プローブはTaqMan Gene Expression Assays（Thermo Fisher Scientific）の試薬を使用し、mRNA発現量はΔΔCt法により算出した。【００８２】
図６に示すように、オールPS修飾のApoB(1)（PS=15個）は肝臓のApoB mRNA発現を50％ノックダウンした。それに比べ、ApoB(2)とApoB(3)（PS=9個）は肝臓のApoB mRNA発現をそれぞれ39％、38％抑制した。【００８３】
ApoB HDO投与三日後の血中ALT活性は、Vehicle投与群に比べ、いずれも有意な変化は認められなかった。ALT活性の測定結果を図７に示す。【００８４】
[実施例７]  オールPS修飾オリゴによる血液凝固時間の延長に対するPS修飾パターンが異なる2種類のHDOの血液凝固時間の短縮効果
PS修飾オリゴの投与急性期の出血傾向への影響を活性化部分トロンボプラスチン時間（Activated Partial Thromboplastin Time: APTT）を用いて調べた。ポジティブコントロールとして、オールPS修飾のMALAT1 ASO（16mer、1本鎖）を用いた。試験管を血漿検体数分用意し、各試験管にAPTT試薬0.1mL取り，37℃で1分間加温した。次に、正常マウスからの血漿検体及びASO  MALAT1(1)、HDO  MALAT1(1)、(2)、(3)、HDO  ApoB(1)、(2)、(3)を投与したマウスからの血漿検体各0.1mLをそれぞれ加えて混和し、37℃で2分間加温した。次に各試験管にあらかじめ37℃に加温した塩化カルシウム液0.1mLを加え調整した血漿の活性化部分トロンボプラスチン時間（activated partial thromboplastin time; aPTT)を自動血液凝固測定装置  CA-50(シスメックス社)を用いて測定した。【００８５】
結果は表３に示す。未処理血液（正常）のAPTTは24.3秒、それに対し、オールPS修飾のMALAT1 HDOのAPTTは59.7秒、PS修飾の少ないMALAT1(2)およびMALAT1(3)のAPTT時間は48.6秒で、約20%短縮した。オールPS修飾のApoB(1)のAPTTは55.3秒、ApoB(2)およびApoB(3)のAPTT時間はそれぞれ45.6秒と45.8秒で、約20%短縮した。ポジティブコントロールのオールPS修飾のMALAT1 ASO(1)のAPTTは75.8秒に達し、未処理血液（正常）のAPTT24.3秒より約3倍延長した。APTTは、基準値（正常値）が25.0〜40.0秒であり、基準値から外れるほど、肝機能障害が疑われる指標である。ApoB(2)およびApoB(3)のAPTT時間は、ApoB(1)のAPTT時間に比べ短縮した、つまり、投与急性期の出血傾向の副作用である肝機能障害が改善された。【００８６】
【表３】
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【００８７】
実施例４、５、６、７によれば、鎖長16 merで構成されるヘテロ核酸のGapmer構造を含むアンチセンス鎖における15箇所のPSを含むオールPS修飾パターンであるMALAT1(1)、ApoB(2)に対し、部分的にPSをPOに変更しても有効性を減弱することなく、かつAPTT時間が短縮される２種類のパターン：MALAT1(2)、MALAT1(3)、ApoB(2)、ApoB(3)を見出した。これにより、投与急性期の出血傾向の副作用の回避と皮下投与でのbioavailability の向上が達成された。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明の二本鎖核酸複合体は、核酸医薬として利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【００８９】
配列番号１〜１２  合成
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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