(57)【要約】  高濃度でＥＰＡを含有し、ＥＰＡの機能を効果的に発揮可能な微生物油を提供するエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）及びドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）を含み、エイコサペンタエン酸の含有率が、全脂肪酸に対して３８面積％以上であり、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される少なくともひとつの脂肪酸比を有する、微生物油：（ａ）１．７以上の、ＤＨＡの含有率に対するＥＰＡの含有率の比、（ｂ）０．３以下の、炭素数２０の脂肪酸の含有率に対する炭素数１８の脂肪酸の含有率の比、（ｃ）１．５以下の、炭素数２２の脂肪酸の含有率に対する炭素数１８の脂肪酸の含有率の比。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）及びドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）を含み、
エイコサペンタエン酸の含有率が、全脂肪酸に対して３８面積％以上であり、
以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される少なくともひとつの脂肪酸比を有する、微生物油：
（ａ）  １．７以上の、ＤＨＡの含有率に対するＥＰＡの含有率の比、
（ｂ）  ０．３以下の、炭素数２０の脂肪酸の含有率に対する炭素数１８の脂肪酸の含有率の比、
（ｃ）  １．５以下の、炭素数２２の脂肪酸の含有率に対する炭素数１８の脂肪酸の含有率の比。
【請求項２】
トリグリセリド含有率が、微生物油の全重量に対して７０重量％以上である請求項１記載の微生物油。
【請求項３】
飽和脂肪酸の含有率が、全脂肪酸に対して４０面積％以下である請求項１又は請求項２記載の微生物油。
【請求項４】
アラキドン酸（ＡＲＡ）の含有率が、全脂肪酸に対して１０．０面積％以下である請求項１〜請求項３のいずれか１項記載の微生物油。
【請求項５】
アラキドン酸（ＡＲＡ）の含有率が、ＥＰＡの含有率に対して５．０以下である請求項１〜請求項４のいずれか１項記載の微生物油。
【請求項６】
ドコサヘキサエン酸の含有率が、エイコサペンタエン酸の含有率よりも低い請求項１〜請求項５のいずれか１項記載の微生物油。
【請求項７】
ドコサヘキサエン酸の含有率が、全脂肪酸に対して０．５面積％以上２５面積％以下である請求項１〜請求項６のいずれか１項記載の微生物油。
【請求項８】
ｎ−６ドコサペンタエン酸（ｎ−６ＤＰＡ）の含有率が、ｎ−３ドコサペンタエン酸（ｎ−３ＤＰＡ）の含有率に対して２．０以下である請求項１〜請求項７のいずれか１項記載の微生物油。
【請求項９】
ｎ−３ドコサペンタエン酸（ｎ−３ＤＰＡ）の含有率が、全脂肪酸に対して０．３面積％以上である請求項１〜請求項８のいずれか１項記載の微生物油。
【請求項１０】
エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）の含有率が、全脂肪酸に対して０．１面積％以上である請求項１〜請求項９のいずれか１項記載の微生物油。
【請求項１１】
炭素数１８の不飽和脂肪酸の合計含有率が、それぞれ全脂肪酸に対して２．０面積％以下である請求項１〜請求項１０のいずれか１項記載の微生物油。
【請求項１２】
粗油である請求項１〜請求項１１のいずれか１項記載の微生物油。
【請求項１３】
エイコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸双方の生成能を有する微生物を用意すること、
用意された微生物を、３０ｍＬ／分以上１５００ｍＬ／分以下の通気環境下において、グリセロールを含有する培養培地中で培養すること、
培養により得られたバイオマスから、請求項１〜請求項１２のいずれか１項記載の微生物油を得ること、
を含む、微生物油の製造方法。
【請求項１４】
前記微生物が、ストラメノパイル（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）に属する微生物からなる群より選択される少なくとも１種の微生物である請求項１３記載の微生物油の製造方法。
【請求項１５】
前記微生物が、グルコースを含有する培地中では、増殖しないか、ドコサヘキサエン酸を、エイコサペンタエン酸よりも多く生成し得る微生物である請求項１３又は請求項１４記載の微生物油の製造方法。
【請求項１６】
前記培養の環境が、３０℃で１０日間放置したときに０．５ｍＬの水分蒸発量に相当する環境である請求項１３〜請求項１５のいずれか１項記載の微生物油の製造方法。
【請求項１７】
請求項１３〜請求項１６のいずれか１項記載の製造方法により得られる微生物油。
【請求項１８】
グルコースを含有する培地中では、増殖しないか、ドコサヘキサエン酸を、エイコサペンタエン酸よりも多く含む微生物油を生成し得る微生物を用意すること、
用意された微生物を、３０ｍＬ／分以上１５００ｍＬ／分以下の通気環境下において、グリセロールを含有する培養培地中で培養すること、
培養により得られたバイオマスから、エイコサペンタエン酸を、ドコサヘキサエン酸よりも多く含有する微生物油を得ること、
を含む、微生物油の脂肪酸含有比を制御する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、微生物油及び微生物油の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｎ−３系多価不飽和脂肪酸であるエイコサペンタエン酸（以下、ＥＰＡと略すことがある）、ドコサヘキサエン酸（以下、ＤＨＡと略すことがある）等は、様々な生理作用を持ち、医薬品、健康食品、食品素材などとして利用されている。ＥＰＡを含む油を添加した飲料は、特定保健用食品としても認可されている。ｎ−３系多価不飽和脂肪酸は、国内外においてサプリメントとしての需要も非常に高い。これに伴い、高純度で大量に多価不飽和脂肪酸を生産することが求められている。【０００３】
このようなｎ−３系多価不飽和脂肪酸のひとつであるＥＰＡを工業的に効率よく得るには、蒸留技術等を用いてＥＰＡ含有油中のＥＰＡを高濃度に濃縮する手法が用いられている。またこのような濃縮手法を適用する前の原料油としても、ＥＰＡを高濃度に含有する油を得ることが提案されている。【０００４】
たとえば特許文献１には、遺伝子組み換え技術により不飽和脂肪酸含量が増加した微生物油を生産可能なストラメノパイルの形質転換方法が開示されている。
特許文献２には、不飽和脂肪酸を含有する油脂をリパーゼによる加水分解反応に付す工程、及び、不飽和脂肪酸が濃縮されたグリセリド画分を分離する工程、を含む不飽和脂肪酸濃縮油の製造方法において、リパーゼによる加水分解反応の反応添加物として水酸化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸アンモニウム、炭酸カルシウム、リン酸二水素カリウム、塩化アンモニウムのいずれかを添加することを特徴とする方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１６−１８９７８７号公報
【特許文献２】特開２０１３−５５８９３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＥＰＡを高濃度で含有する微生物油であっても、微生物中にＥＰＡ以外の他の飽和又は不飽和脂肪酸が存在すると、純度の高いＥＰＡを得るために多量の微生物油が必要となり、生産性に劣る傾向がある。たとえば、ＥＰＡとＤＨＡの双方を生成する微生物には、ＥＰＡよりもＤＨＡを多く生成する傾向が高い微生物も存在する。このような微生物を、ＥＰＡを含む微生物油を得るために利用することは工業的に不利である。また、脂肪酸には特定の機能性が備わっていることが多いが、複数種の脂肪酸が、必ずしも互いに相乗的に作用するとは限らない。【０００７】
本開示の目的は、高濃度でＥＰＡを含有し、ＥＰＡの機能を効果的に発揮可能な微生物油及びその製造方法を提供することにある。本開示の他の目的は、ＥＰＡ含有微生物油のようなＥＰＡ含有組成物を効率よく得るために利用可能な微生物種の選択範囲を拡大することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示は以下を含む。
［１］  エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）及びドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）を含み、  エイコサペンタエン酸の含有率が、全脂肪酸に対して３８面積％以上であり、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される少なくともひとつの脂肪酸比を有する、微生物油：
（ａ）  １．７以上の、ＤＨＡの含有率に対するＥＰＡの含有率の比、
（ｂ）  ０．３以下の、炭素数２０の脂肪酸の含有率に対する炭素数１８の脂肪酸の含有率の比、
（ｃ）  １．５以下の、炭素数２２の脂肪酸の含有率に対する炭素数１８の脂肪酸の含有率の比。
［２］  トリグリセリド含有率が、微生物油の全重量に対して７０重量％以上である［１］に記載の微生物油。
［３］  飽和脂肪酸の含有率が、全脂肪酸に対して４０面積％以下である［１］又は［２］に記載の微生物油。
［４］  アラキドン酸（ＡＲＡ）の含有率が、全脂肪酸に対して１０．０面積％以下である［１］〜［３］のいずれか１に記載の微生物油。
［５］  アラキドン酸（ＡＲＡ）の含有率が、ＥＰＡの含有率に対して５．０以下である［１］〜［４］のいずれか１に記載の微生物油。
［６］  ドコサヘキサエン酸の含有率が、エイコサペンタエン酸の含有率よりも低い［１］〜［５］のいずれか１に記載の微生物油。
［７］  ドコサヘキサエン酸の含有率が、全脂肪酸に対して０．５面積％以上２５面積％以下である［１］〜［６］のいずれか１に記載の微生物油。
［８］  ｎ−６ドコサペンタエン酸（ｎ−６ＤＰＡ）の含有率が、ｎ−３ドコサペンタエン酸（ｎ−３ＤＰＡ）の含有率に対して２．０以下である［１］〜［７］のいずれか１に記載の微生物油。
［９］  ｎ−３ドコサペンタエン酸（ｎ−３ＤＰＡ）の含有率が、全脂肪酸に対して０．３面積％以上である［１］〜［８］のいずれか１に記載の微生物油。
［１０］  エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）の含有率が、全脂肪酸に対して０．１面積％以上である［１］〜［９］のいずれか１に記載の微生物油。
［１１］  炭素数１８の不飽和脂肪酸の合計含有率が、それぞれ全脂肪酸に対して２．０面積％以下である［１］〜［１０］のいずれか１に記載の微生物油。
［１２］  粗油である［１］〜［１１］のいずれか１に記載の微生物油。
［１３］  エイコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸双方の生成能を有する微生物を用意すること、用意された微生物を、３０ｍＬ／分以上１５００ｍＬ／分以下の通気環境下において、グリセロールを含有する培養培地中で培養すること、培養により得られたバイオマスから、請求項１〜請求項１２のいずれか１に記載の微生物油を得ること、を含む、微生物油の製造方法。
［１４］  前記微生物が、ストラメノパイル（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）に属する微生物からなる群より選択される少なくとも１種の微生物である［１３］に記載の微生物油の製造方法。
［１５］  前記微生物が、グルコースを含有する培地中では、増殖しないか、ドコサヘキサエン酸を、エイコサペンタエン酸よりも多く生成し得る微生物である［１３］又は［１４］のいずれか１に記載の微生物油の製造方法。
［１６］  前記培養の環境が、３０℃で１０日間放置したときに０．５ｍＬの水分蒸発量に相当する環境である［１３］〜［１５］のいずれか１に記載の微生物油の製造方法。
［１７］  ［１３］〜［１６］のいずれか１に記載の製造方法により得られる微生物油。
［１８］  グルコースを含有する培地中では、増殖しないか、ドコサヘキサエン酸を、エイコサペンタエン酸よりも多く含む微生物油を生成し得る微生物を用意すること、用意された微生物を、３０ｍＬ／分以上１５００ｍＬ／分以下の通気環境下において、グリセロールを含有する培養培地中で培養すること、培養により得られたバイオマスから、エイコサペンタエン酸を、ドコサヘキサエン酸よりも多く含有する微生物油を得ること、を含む、微生物油の脂肪酸含有比を制御する方法。
【発明の効果】
【０００９】
本開示によれば、高濃度でＥＰＡを含有し、ＥＰＡの機能を効果的に発揮可能な微生物油及びその製造方法を提供することができる。本開示によれば、ＥＰＡ含有微生物油のようなＥＰＡ含有組成物を効率よく得るために利用可能な微生物種の選択範囲を拡大することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本開示による微生物油は、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）及びドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）を含み、エイコサペンタエン酸の含有率が、全脂肪酸に対して３８面積％以上であり、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくともひとつの脂肪酸比を有する、微生物油である：
（ａ）  １．７以上の、ＤＨＡの含有率に対するＥＰＡの含有率の比、
（ｂ）  ０．３以下の、炭素数２０の脂肪酸の含有率に対する炭素数１８の脂肪酸の含有率の比、
（ｃ）  １．５以下の、炭素数２２の脂肪酸の含有率に対する炭素数１８の脂肪酸の含有率の比。
【００１１】
本開示に係る微生物油は、ＥＰＡを、全脂肪酸に対して３８面積％以上であると共に、上記（ａ）〜（ｃ）の脂肪酸比の少なくともひとつを有しているので、ＥＰＡの所望の機能が、効果的に発揮可能となる。
これを更に説明すれば、本開示の微生物油がＤＨＡの含有率に対するＥＰＡの含有率の比を一定以上の場合、ＥＰＡの所望の機能を効果的に発揮することができる。また、ＥＰＡと共にＤＨＡも含むので、ＤＨＡとＥＰＡとの相乗効果も期待できる。
炭素数１８の飽和又は不飽和脂肪酸は、炭素数２０以上の多価不飽和脂肪酸の前駆体として知られている。このため、本開示の微生物油において、このような炭素数１８の飽和又は不飽和脂肪酸の含有率が、炭素数２０の脂肪酸又は炭素数２２の脂肪酸の含有率に対して一定以下の比となる場合、ＥＰＡ及びＤＨＡを得るために効率よく利用されて、微生物油中に高純度にＥＰＡ及びＤＨＡを含むことができる。本開示の微生物油は、炭素数１８の脂肪酸の含有率が所定の範囲に抑えられているか、共に生成され得るＤＨＡの含有率が所定範囲となっているので、ＥＰＡのより効率よい機能発揮が期待できる。
本明細書では、ＥＰＡ及びＤＨＡを含み、ＥＰＡの含有率が全脂肪酸に対して３８面積％以上であり、所定の要件を備えた本開示に係る微生物油を「ＥＰＡ高含有微生物油」と称する場合がある。
【００１２】
本開示に係る微生物油の製造方法は、エイコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸双方の生成能を有する微生物を用意すること、用意された微生物を、３０ｍＬ／分以上１５００ｍＬ／分以下の通気環境下において、グリセロールを含有する培地中で培養すること、培養後に得られたバイオマスから、本開示に係るＥＰＡ高含有微生物油を得ること、を含む製造方法である。
本開示に係る微生物油の製造方法では、ＥＰＡとＤＨＡとを生成可能な微生物を、所定の通気環境下でかつグリセロールを含有する培地中で培養することを含む。これより、本開示に係るＥＰＡ高含有微生物油を効率よく得ることができる。
本開示にかかる微生物油の製造方法において用いるグリセロールを含有する培養培地は、微生物が増殖し、微生物油のエイコサペンタエン酸の含有率がドコサヘキサエン酸の含有率よりも高くなるグルコース濃度でグルコースを含んでもよい。
【００１３】
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、その前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示すものとする。本明細書において、混合物中の各成分の含有率は、混合物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、混合物中に存在する当該複数の物質の合計の含有率を意味する。本明細書において、パーセントに関して「以下」又は「未満」との用語は、下限値を特に記載しない限り０％、即ち「含有しない」場合を含み、又は、現状の手段では検出不可の値を含む範囲を意味する。
【００１４】
「バイオマス」という用語は、所定の領域又は生態系で成長した所定の時点の微生物又は細胞の集合物又は塊を指す。この領域又は生態系は、天然に存在する環境（たとえば、水域）でもよいし、合成環境（たとえば、（たとえば、開放型又は密閉型の）発酵槽又はバイオリアクタ）でもよい。
【００１５】
本開示において「微生物油」とは、微生物バイオマスを起源として得られ、常温常圧、すなわち２５℃１気圧下で水に不溶の有機物の混合物である。微生物油には、飽和又は不飽和脂肪酸、リン脂質、ステロール、グリセロール、セラミド、スフィンゴ脂質、テルペノイド、フラボノイド、トコフェロール等の油性成分が含まれ、飽和又は不飽和脂肪酸は、他の油性成分における構成脂肪酸として存在する場合もある。本明細書において「油」とは、これらの脂質及び油性成分を含む組成物を意味する。
【００１６】
用語「脂肪酸」には、遊離の飽和若しくは不飽和脂肪酸それら自体だけでなく、遊離の飽和若しくは不飽和脂肪酸、飽和若しくは不飽和脂肪酸アルキルエステル、トリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、リン脂質、ステリルエステル等中に含まれる構成単位としての脂肪酸も含まれ、構成脂肪酸とも言い換えられ得る。本明細書において、特に断らない限り、脂肪酸を含む化合物の形態については省略する場合がある。脂肪酸を含む化合物の形態としては、遊離脂肪酸形態、脂肪酸アルキルエステル形態、グリセリルエステル形態、リン脂質の形態、ステリルエステル形態等を挙げることができる。同一の脂肪酸を含む化合物は、油中、単一の形態で含まれていてもよく、２つ以上の形態の混合物として含まれていてもよい。
【００１７】
脂肪酸の加水分解又はアルコール分解の反応効率は高いことが経験的に判明しており、加水分解又はアルコール分解後には、主として遊離脂肪酸形態又はそれらの低級アルコールエステル形態の脂肪酸を含む組成物が得られる。このため、加工工程後の脂肪酸については、特に断らない限り、組成物であること、及び、脂肪酸が遊離脂肪酸形態又は低級アルコールエステル形態の脂肪酸であることを省略して表記することがある。ただし、遊離脂肪酸形態又は低級アルコールエステル形態以外の形態の脂肪酸が含まれることを完全に排除するものではない。
【００１８】
脂肪酸を表記する際に、炭素数、二重結合の数及び二重結合の場所を、それぞれ数字とアルファベットを用いて簡略的に表した数値表現を用いることがある。たとえば、炭素数２０の飽和脂肪酸は「Ｃ２０：０」と表記され、炭素数２０で炭素鎖に二重結合を３つ有する三価不飽和脂肪酸は「Ｃ２０：３」と表記される。たとえば、エイコサペンタエン酸は「Ｃ２０：５，ｎ−３」、ドコサヘキサエン酸は「Ｃ２２：６，ｎ−３」等と表記され得る。「ｎ−」は、脂肪酸のメチル末端から数えた最初の二重結合の位置を示し、たとえば「ｎ−６」であれば、二重結合の位置が脂肪酸のメチル末端から数えて６番目であることを示し、「ｎ−３」であれば、二重結合の位置が脂肪酸のメチル末端から数えて３番目であることを示す。この方法は当業者には周知であり、この方法に従って表記された脂肪酸については、当業者であれば容易に特定することができる。
この文脈において、「炭素数２０の脂肪酸」のように炭素数と用語「脂肪酸」との組み合わせによる表現は、当該炭素数を有する飽和脂肪酸と、当該炭素数を有する一価以上の飽和脂肪酸との総称を意味するために用いられる場合がある。たとえば「炭素数２０の脂肪酸」の用語には、炭素数２０の飽和脂肪酸、炭素数２０の一価の不飽和脂肪酸、炭素数２０の二価以上の不飽和脂肪酸が含まれる。
【００１９】
本明細書において、炭素数２０以上の多価不飽和脂肪酸を、特に断らない限り、「ＰＵＦＡ」と称する場合がある。ＰＵＦＡにおける炭素数２０以上の多価不飽和脂肪酸には、二価以上、好ましくは三価以上の不飽和脂肪酸が含まれる。多価不飽和脂肪酸の炭素数は、構成脂肪酸の炭素数を意味する。炭素数２０以上の多価不飽和脂肪酸としては、例えば、炭素数２０以上２２以下の多価不飽和脂肪酸を挙げることができ、具体的には、エイコサジエン酸（Ｃ２０：２，ｎ−６、ＥＤＡ）、ジホモ−γ−リノレン酸（Ｃ２０：３，ｎ−６、ＤＧＬＡ）、ミード酸（Ｃ２０：３，ｎ−９、ＭＡ）、エイコサテトラエン酸（Ｃ２０：４，ｎ−３、ＥＴＡ）、アラキドン酸（Ｃ２０：４，ｎ−６、ＡＲＡ）、エイコサペンタエン酸（Ｃ２０：５，ｎ−３、ＥＰＡ）、ドコサテトラエン酸（Ｃ２２：４，ｎ−６、ＤＴＡ）、ドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５，ｎ−３、ＤＰＡ）、ドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５，ｎ−６、ＤＰＡ）及びドコサヘキサエン酸（Ｃ２２：６，ｎ−３、ＤＨＡ）等を挙げることができる。本明細書において、ＰＵＦＡの中でも、ｎ−３系ＰＵＦＡを特に「ｎ−３ＰＵＦＡ」、ｎ−６系ＰＵＦＡを「ｎ−６ＰＵＦＡ」と称する場合がある。
【００２０】
本明細書における油中の脂肪酸の合計重量に対する脂肪酸の含有量は、脂肪酸組成に基づいて決定する。脂肪酸組成は、常法にしたがって求めることができる。具体的には、測定対象となる油を、低級アルコールと触媒を用いてエステル化し、脂肪酸低級アルコールエステルを得る。次いで、得られた脂肪酸低級アルコールエステルを、ガスクロマトグラフィーを用いて分析する。得られたガスクロマトグラフィーのチャートにおいて各脂肪酸に相当するピークを同定し、Agilent ChemStation積分アルゴリズム（リビジョンC.01.03[37]、Agilent Technologies）を用いて、各脂肪酸のピーク面積を求める。ピーク面積とは、各種脂肪酸を構成成分とする油をガスクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー／水素炎イオン化検出器（ＴＬＣ／ＦＩＤ）等を用いて分析したチャートのそれぞれの成分のピーク面積の全ピーク面積に対する割合（面積％）であり、そのピークの成分の含有比率を示すものである。上述の測定方法により得られた面積％による値は、試料中の各脂肪酸の重量％による値と同一として互換可能に使用できる。日本油化学会（ＪＯＣＳ）制定  基準油脂分析試験法  ２０１３版  ２．４．２．１−２０１３  脂肪酸組成（ＦＩＤ恒温ガスクロマトグラフ法)及び、同２．４．２．２−２０１３  脂肪酸組成（ＦＩＤ昇温ガスクロマトグラフ法）を参照のこと。
以下、本開示について説明する。
【００２１】
＜微生物油＞
本開示の一実施形態であるＥＰＡ高含有微生物油は、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）及びドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）を含み、エイコサペンタエン酸の含有率が、全脂肪酸に対して３８面積％以上であり、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくともひとつの脂肪酸比を有する、微生物油：
（ａ）  １．７以上の、ＤＨＡの含有率に対するＥＰＡの含有率の比、
（ｂ）  ０．３以下の、炭素数２０の脂肪酸の含有率に対する炭素数１８の脂肪酸の含有率の比、
（ｃ）  １．５以下の、炭素数２２の脂肪酸の含有率に対する炭素数１８の脂肪酸の含有率の比。
【００２２】
ＥＰＡ高含有微生物油におけるＥＰＡの含有率は、ＥＰＡの機能性発揮、精製効率等の観点から３８面積以上であり、３８．５面積％以上、３９面積％以上、３９．５面積％以上、４０面積％以上、４０．５面積％以上、４１面積％、４１．５面積％以上、４２面積％以上、４２．５面積％以上、４３面積％以上、４３．５面積％以上、４４面積％、４４．５面積％以上、４５面積％以上、４５．５面積％以上、４６面積％、４６．５面積％以上、４７面積％以上、４７．５面積％以上、４８面積％以上、４８．５面積％以上、４９面積％、４９．５面積％以上、又は５０面積％以上とすることができる。ＥＰＡ高含有微生物油におけるＥＰＡの上限値については特に制限はなく、たとえば、９９．５面積％以下、９９．３面積％以下、９９面積％以下、９８．５面積％以下、９８面積％以下、又は９７面積％以下とすることができる。ＥＰＡ高含有微生物においてＥＰＡの含有率の範囲は、これらの上限値及び下限値の任意の組み合わせとすることができる。
【００２３】
ＥＰＡ高含有微生物油では、ＥＰＡと共にＤＨＡを含有するものであり、ＥＰＡ高含有微生物油におけるＥＰＡの機能性発揮及びＥＰＡの精製効率などの観点から、ＤＨＡの含有率は、ＥＰＡの含有率よりも低いことが好ましい。
【００２４】
ＥＰＡ高含有微生物油におけるＤＨＡの含有率は、ＥＰＡの機能の発揮、ＤＨＡの機能の発揮及びＥＰＡとＤＨＡの相乗効果の発揮等の観点から０．５面積以上、０．７面積％以上、１面積％以上、１．５面積％以上、２面積％以上、又は３面積％以上とすることができる。ＥＰＡ高含有微生物油におけるＤＨＡの上限値については、ＥＰＡの精製効率の点で、２５面積％以下、２２面積％以下、２０面積％以下、１８面積％以下、１５面積％以下、１３面積％以下、１２面積％以下、１１．５面積％以下、又は１１面積％以下とすることができる。ＥＰＡ高含有微生物においてＤＨＡの含有率の範囲は、これらの上限値及び下限値の任意の組み合わせとすることができ、たとえば、０．５面積％以上２５面積％以下、又は１．５面積％以上１５面積％以下とすることができる。
【００２５】
ＥＰＡ高含有微生物油は、ＥＰＡ及びＤＨＡ以外の他の飽和又は不飽和脂肪酸を含むものであってもよく、含まないものであってもよい。ＥＰＡ高含有微生物油におけるＥＰＡ及びＤＨＡ以外の他の飽和又は不飽和脂肪酸の含有率は、それぞれの脂肪酸の機能、特性などの観点から、又はＥＰＡ高含有微生物油の機能性発揮の観点から、それぞれ０面積％の含有率であってもよく、０面積％を超える含有率であってもよい。ＥＰＡ及びＤＨＡ以外の他の飽和又は不飽和脂肪酸としては、たとえば、炭素数を限定しない飽和脂肪酸、炭素数１８の一価不飽和脂肪酸、炭素数１８の二価不飽和脂肪酸、ＥＰＡ以外の炭素数２０の不飽和脂肪酸、炭素数２１の不飽和脂肪酸、ＤＨＡ以外の炭素数２２の不飽和脂肪酸、その他の不飽和脂肪酸を挙げることができる。
【００２６】
本開示の一実施形態に係るＥＰＡ高含有微生物油は、ＥＰＡの機能を効果的に発揮する観点、高純度のＥＰＡ含有組成物の精製効率の観点、後述する利点の少なくともひとつ以上を得る観点から、以下の脂肪酸の含有率及び比からなる群より選択される少なくともひとつを有することができる。
【００２７】
（ａ）  ＥＰＡ高含有微生物油において、ＤＨＡの含有率に対するＥＰＡの含有率の比（ＥＰＡ／ＤＨＡ）は、ＥＰＡの機能性発揮、精製効率などの観点から、１．７以上、１．８以上、１．９以上、２．０以上、２．２以上、２．５以上、２．７以上、３．０以上、３．２以上、３．５以上、３．７以上、４．０以上、４．２以上、４．４以上、４．５以上、４．７以上、又は５．０以上であってもよい。ＥＰＡ／ＤＨＡ比の上限値については特に制限はなく、たとえば、１０．０以下、又は８．０以下とすることができる。ＥＰＡ高含有微生物においてＥＰＡ／ＤＨＡ比の範囲は、これらの上限値及び下限値の任意の組み合わせとすることができ、たとえば、１．７以上１０．０以下、又は３．０以上８．０以下とすることができる。
【００２８】
（ｂ）  ＥＰＡ高含有微生物油において、炭素数１８の脂肪酸の含有率は、ＥＰＡの純度、ＥＰＡの機能発揮などの観点から、炭素数２０の脂肪酸の含有率に対して０．３以下、０．１以下、０．０５以下、０．０３以下、又は０．０２以下とすることができる。
（ｃ）  ＥＰＡ高含有微生物油において、炭素数１８の脂肪酸の含有率は、ＤＨＡのＥＰＡに対する相乗効果の効果的な発揮の観点からの観点から、炭素数２２の脂肪酸の含有率に対して１．５以下、１．０以下、０．５以下、０．１以下、０．０８以下、又は０．０５以下とすることができる。
ＥＰＡ高含有微生物において、炭素数１８の脂肪酸は含まれてなくてもよく、したがって、炭素数１８の脂肪酸の含有率の下限値は０面積％であってもよい。
【００２９】
ＥＰＡ高含有微生物は、上記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される少なくともひとつの脂肪酸比を有することで、たとえば、ＥＰＡの純度、ＥＰＡの機能性発揮、精製効率などの利点を有することができる。
ＥＰＡ高含有微生物は、（ａ）〜（ｃ）に加えて、更に以下（ｄ）〜（ｎ）からなる群より選択される少なくともひとつの脂肪酸含有率又は比を有してもよい。
【００３０】
（ｄ）  炭素数を限定しない飽和脂肪酸（以下、単に飽和脂肪酸という）の含有率は、全脂肪酸に対して４０面積％以下、３０面積％以下、２５面積％以下、２０面積％以下、１９面積％以下、１８面積％以下、１７面積％以下又は１５面積％以下とすることができる。この範囲の飽和脂肪酸の含有率を有するＥＰＡ高含有微生物油は、たとえば低温での安定性がより良好であり、取り扱い性により優れる等の利点を有することができる。
（ｄ’）  ＥＰＡ高含有微生物油において、ＰＵＦＡの安定性が良好である低温での取り扱い性が優れるという観点から、ＥＰＡに対する飽和脂肪酸の含有率の比は、１．５以下、１．１以下、０．８以下、０．５以下、又は０．４以下とすることができる。
ＥＰＡ高含有微生物油に含まれうる飽和脂肪酸としては、たとえば、炭素数１２以上の飽和脂肪酸を挙げることができる。炭素数１２以上の飽和脂肪酸としては、たとえばラウリン酸（Ｃ１２：０）、ミリスチン酸（Ｃ１４：０）、パルミチン酸（Ｃ１６：０）、ステアリン酸（Ｃ１８：０）、アラキジン酸（Ｃ２０：０）、ベヘン酸（Ｃ２２：０）、リグノセリン酸（Ｃ２４：０）を挙げることができる。
【００３１】
（ｅ）  炭素数２０の多価不飽和脂肪酸のうち、特にアラキドン酸（Ｃ２０：４，ｎ−６、ＡＲＡ）の含有率は、全脂肪酸に対して１０．０面積％以下、５．０面積％以下、３．０面積％以下、２．５面積％以下又は２．０面積％以下とすることができる。ＥＰＡ高含有微生物油におけるアラキドン酸の含有率がこの範囲内であれば、ＥＰＡ高含有微生物油は、ｎ−６ＰＵＦＡによる拮抗作用以上の効果を得ることができる。
（ｅ’）  ＥＰＡ高含有微生物油において、ｎ−６ＰＵＦＡによる拮抗作用の観点から、ＥＰＡに対するＡＲＡの含有率の比は、５．０以下、１．０以下、０．５以下、０．１以下、０．０８以下、０．０５以下、又は０．０４以下とすることができる。
【００３２】
（ｆ）  炭素数２０の多価不飽和脂肪酸のうち、特にエイコサテトラエン酸（Ｃ２０：４，ｎ−３、ＥＴＡ）の含有率は、全脂肪酸に対して０．１面積％以上、０．５面積％以上、又は１．０面積％以上であってもよい。エイコサテトラエン酸がこの含有率でＥＰＡ高含有微生物油に含まれることによって、ＥＰＡの機能の発揮、ＤＨＡの機能の発揮、ＥＴＡの機能の発揮、並びにＥＰＡ、ＤＨＡ及びＥＴＡの相乗効果を得ることができる。ＥＴＡの含有率の上限値は、ＥＰＡの含有率との関係で１０．０面積％以下、５．０面積％以下、３．０面積％以下、２．０面積％以下、又は１．８面積％以下とすることができる。
ＥＰＡ高含有微生物においてＥＴＡの含有率の範囲は、これらの上限値及び下限値の任意の組み合わせとすることができ、たとえば、０．１面積％以上１０．０面積％以下、又は０．５面積％以上５．０面積％以下とすることができる。
【００３３】
（ｆ’）  ＥＰＡ高含有微生物油において、ＥＰＡの機能性発揮、精製効率等の観点から、ＥＰＡに対するＥＴＡの含有率の比は、１．６以下、１．０以下、又は０．０５以下とすることができる。ＥＴＡ／ＥＰＡ比の下限値は、特に制限はなく、たとえば０．００１以上、０．００５以上とすることができる。
ＥＰＡ高含有微生物においてＥＴＡ／ＥＰＡ比の範囲は、これらの上限値及び下限値の任意の組み合わせとすることができ、たとえば、０．００１以上１．６以下、又は０．００１以上１．０以下とすることができる。
【００３４】
（ｇ）  ＥＰＡ高含有微生物油は、ＤＨＡ以外に炭素数２２以上の二価以上、好ましくは三価以上のｎ−３不飽和脂肪酸を含むことができる。本明細書では、炭素数２２以上の二価以上のｎ−３不飽和脂肪酸を、ｎ−３Ｃ２２ＰＵＦＡを称する場合がある。ｎ−３Ｃ２２ＰＵＦＡとしては、ドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５，ｎ−３、ｎ−３ＤＰＡ）及び、ＤＨＡが挙げられる。ＥＰＡ高含有微生物油におけるｎ−３Ｃ２２ＰＵＦＡの合計含有率は、ＥＰＡの機能の発揮、ＤＨＡの機能の発揮、ｎ−３Ｃ２２ＰＵＦＡの機能の発揮、及びＥＰＡ、ＤＨＡ及びｎ−３ＰＵＦＡの相乗効果の観点から、全脂肪酸の０．３面積％以上、０．５面積％以上、１．０面積％以上、５．０面積％以上、８．０面積％以上、１０面積％以上、１５面積％以上、又は１９面積％以上とすることができ、３５面積％以下、３０面積％以下、２５面積％以下、２３面積％以下、又は２０面積％以下とすることができる。ＥＰＡ高含有微生物においてＰＵＦＡの合計含有率の範囲は、これらの上限値及び下限値の任意の組み合わせとすることができ、たとえば、０．５面積％以上３５面積％以下、又は１０面積％以上２５面積％以下とすることができる。
【００３５】
（ｇ’）  ＥＰＡ高含有微生物油において、ＥＰＡに対するｎ−３Ｃ２２ＰＵＦＡの含有率の比（ｎ−３Ｃ２２ＰＵＦＡ／ＥＰＡ）は、ＥＰＡの機能の発揮、ＤＨＡの機能の発揮、ｎ−３Ｃ２２ＰＵＦＡの機能の発揮、及びＥＰＡ、ＤＨＡ及びｎ−３ＰＵＦＡの相乗効果の観点から、３．０以下、２．０以下、１．０以下、又は０．６以下とすることができる。ＥＰＡ高含有微生物油においてｎ−３Ｃ２２ＰＵＦＡ／ＥＰＡ比の下限値としては、たとえば０．０１以上とすることができる。
【００３６】
（ｈ）  ＥＰＡ高含有微生物油におけるｎ−３ＤＰＡの含有率は、全脂肪酸に対して０．３％面積％以上、１．０面積％以上、３．０面積％以上、５．０面積％以上、又は８．０面積％以上であってもよい。ｎ−３ＤＰＡがこの含有率でＥＰＡ高含有微生物油に含まれることによって、ＥＰＡの機能の発揮、ＤＨＡの機能の発揮、ｎ−３ＤＰＡの機能の発揮、及びＥＰＡ、ＤＨＡ及びｎ−３ＤＰＡの相乗効果を得ることができる。ｎ−３ＤＰＡの含有率の上限値は、ＥＰＡの含有率との関係で２０．０面積％以下、１５．０面積％、又は１２．０面積％以下とすることができる。ＥＰＡ高含有微生物においてｎ−３ＤＰＡの含有率の範囲は、これらの上限値及び下限値の任意の組み合わせとすることができ、たとえば、０．３面積％以上２０．０面積％以下、又は８．０面積％以上１５．０面積％以下とすることができる。
（ｈ’）  ＥＰＡ高含有微生物油において、ＥＰＡの機能性発揮、精製効率等の観点から、ＥＰＡに対するｎ−３ＤＰＡの含有率の比は、８．０以下、６．０以下、又は５．０以下とすることができる。
【００３７】
（ｉ）  ＥＰＡ高含有微生物油におけるｎ−６ＤＰＡの含有率は、全脂肪酸に対して２．０面積％以下、１．０面積％以下、０．５面積％以下、又は０．１面積％以下とすることができる。ＥＰＡ高含有微生物油におけるｎ−６ＤＰＡの含有率がこの範囲内であれば、ＥＰＡ高含有微生物油は、ｎ−６ＰＵＦＡによる拮抗作用以上の効果を得ることができる。
（ｉ’）  ＥＰＡ高含有微生物油において、ｎ−６ＰＵＦＡによる拮抗作用の観点から、ＥＰＡに対するｎ−６ＰＤＡの含有率の比は、１．０以下、０．１以下、又は０．０１以下とすることができる。
【００３８】
（ｊ）  ＥＰＡ高含有微生物油において、ｎ−６ＰＵＦＡによる拮抗作用の観点から、ｎ−６ＤＰＡの含有率は、ｎ−３ＤＰＡの含有率に対して２．０以下、１．０以下、０．１以下、又は０．０１以下とすることができる。
【００３９】
（ｋ）  ＥＰＡ高含有微生物油は、炭素数１８の一価以上の不飽和脂肪酸を含むことができる。ＥＰＡ高含有微生物油における炭素数１８の不飽和脂肪酸の合計含有率は、ＥＰＡの機能性発揮、精製効率向上等の観点から、全脂肪酸に対して２．０面積％以下、１．０面積％以下、０．５面積％以下、又は０．２面積％以下とすることができる。
（ｋ’）  ＥＰＡ高含有微生物油において、ＥＰＡの機能性発揮、精製効率向上等の観点から、ＥＰＡに対する炭素数１８の不飽和脂肪酸の合計含有率の比は、２．０以下、１．０以下、０．１以下、０．０５以下、０．０２以下又は０．０１以下とすることができる。
【００４０】
（ｌ）  ＥＰＡ高含有微生物油において、炭素数２１の脂肪酸の含有率は、全脂肪酸に対して２．０面積％以下、１．５面積％以下、又は１．０面積％以下とすることができる。炭素数２１の脂肪酸の含有率が上記範囲のＥＰＡ高含有微生物油は、たとえば低温での安定性がより良好であり、取り扱い性により優れる等の利点を有することができる。
（ｌ’）  ＥＰＡ高含有微生物油において、低温での安定性及び取り扱い性の観点から、ＥＰＡに対する炭素数２１の脂肪酸の含有率の比は、１．０以下、０．１以下、又は０．０２以下とすることができる。
【００４１】
（ｍ）  炭素数２０の多価不飽和脂肪酸のうち、特にジホモ−γ−リノレン酸（Ｃ２０：３，ｎ−６、ＤＧＬＡ）の含有率は、全脂肪酸に対して５．０面積％以下、１．０面積％以下、０．５面積％以下、又は０．１面積％以下とすることができる。ＥＰＡ高含有微生物油におけるＤＧＬＡの含有率がこの範囲内であれば、ＥＰＡ高含有微生物油は、ｎ−６ＰＵＦＡによる拮抗作用以上の効果を得ることができる。
（ｍ’）  ＥＰＡ高含有微生物油において、ｎ−６ＰＵＦＡによる拮抗作用の観点から、ＥＰＡに対するＤＧＬＡの脂肪酸の含有率の比は、１．０以下、０．１以下、０．０５以下、又は０．０１以下とすることができる。
【００４２】
（ｎ）  炭素数２２の多価不飽和脂肪酸のうち、特にドコサテトラエン酸（Ｃ２２：４，ｎ−６、ＤＴＡ）の含有率は、全脂肪酸に対して２．０面積％以下、１．５面積％以下、又は１．０面積％以下とすることができる。ＥＰＡ高含有微生物油におけるＤＴＡの含有率がこの範囲内であれば、ＥＰＡ高含有微生物油は、ｎ−６ＰＵＦＡによる拮抗作用以上の効果を得ることができる。
（ｎ’）  ＥＰＡ高含有微生物油において、ｎ−６ＰＵＦＡによる拮抗作用の観点から、ＥＰＡに対するＤＴＡの脂肪酸の含有率の比は、１．０以下、０．１以下、０．０５以下、又は０．０２以下とすることができる。
【００４３】
ＥＰＡ高含有微生物油は、（ａ）〜（ｎ’）の脂肪酸含有率又は比の少なくともひとつを有することができ、高濃度でＥＰＡを含有し、ＥＰＡの機能を効果的に発揮するという観点から、（ａ）〜（ｎ’）からなる群より選択される少なくともひとつの脂肪酸含有率又は比を有することができる。
【００４４】
ＥＰＡ高含有微生物油は、粗油であってもよく、精製油であってもよい。ＥＰＡ高含有微生物油は、粗油であることが、たとえば組成物におけるＥＰＡの高純度化の観点から好ましい。本明細書において「微生物油の粗油」とは、微生物のバイオマスから抽出され、後述する精製工程を経ていない状態の組成物を指す。本明細書において、「抽出」とは、バイオマス中の微生物の構造を破壊し、微生物内の油成分を取り出すことを意味する。抽出の方法等については、後述する。本明細書において「微生物の精製油」とは、微生物の粗油に対して脱ガム工程、脱酸工程、活性白土又は活性炭を用いた脱色工程、水洗工程、水蒸気蒸留等による脱臭工程などを行って、リン脂質及びステロールなどの目的物以外の物質を除去する粗油精製工程を経て得た組成物を指す。
【００４５】
ＥＰＡ高含有微生物油において各脂肪酸は、トリグリセリド、ジグリセリド及びモノグリセリドのいずれの形態で存在してもよい。ＥＰＡ高含有微生物油のトリグリセリド含有率は、微生物の全重量に対して７０重量％以上、７５重量％以上、８０重量％以上、９０重量％以上、又は９５重量％以上とすることができる。ＥＰＡ高含有微生物油のトリグリセリド含有率が７０重量％以上の場合、微生物油としての吸湿性が低すぎることがなく、たとえば良好な流動性を得ることができる。ＥＰＡ高含有微生物油中のトリグリセリドの含有率の上限値については特に制限はなく、一般に、ＥＰＡ高含有微生物油中のトリグリセリド含有率は、ＥＰＡ高含有微生物油の全重量の９９重量％以下である。本開示の他の態様では、ＥＰＡ高含有微生物油中のトリグリセリド含有率は、ＥＰＡ高含有微生物油の全重量に対して１００重量％、すなわち、ＥＰＡ高含有微生物油が、トリグリセリド以外の成分を実質的に含まなくてもよい。ＥＰＡ高含有微生物油におけるトリグリセリド含有率は、AOCS Recommended Practice Cd 11c-93 (1997), SAMPLING AND ANALYSIS OF COMMERCIAL FATS AND OILS, (American Oil Chemists’Society）に準じて測定する。
【００４６】
ＥＰＡ高含有微生物油は、微生物油に特有の他の成分を含むことができ、微生物に特有な脂肪酸組成を示すことができ、又は微生物に特有な他の成分を含み且つ特有な脂肪酸組成を示すことができる。微生物油に特有な他の成分として、リン脂質、遊離脂肪酸、脂肪酸エステル、モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、トリアシルグリセロール、ステロール及びステロールエステル、カロテノイド、キサントフィル、ユビキノン、炭化水素、イソプレノイド誘導化合物及びこれらいずれかが代謝された化合物等を挙げることができる。
【００４７】
ＥＰＡ高含有微生物油は、化学合成の工程を経ずに得ることができるため、有機溶媒の含有量が低いものであることができる。本明細書における有機溶媒は、脂肪酸以外のものであって、少なくとも１つの炭素原子を有する疎水性又は親水性の溶媒を意味し、極性溶媒、非極性溶媒、水混和性溶媒、水不混和性溶媒、及びそれらの２以上の組み合わせが挙げられる。有機溶媒としては、置換又は未置換の、飽和若しくは不飽和脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、アルコール、エーテル、ケトン、アルデヒド、カルボン酸、エステル、ニトリル、アミド等を挙げることができ、これらは単独で又は２つ以上の組み合わせであってもよい。
【００４８】
ＥＰＡ高含有微生物油における残留有機溶媒の総含有量は、５０００ｐｐｍ以下、３０００ｐｐｍ以下、２０００ｐｐｍ以下、又は１０００ｐｐｍ以下とすることができる。
ＥＰＡ高含有微生物油において、含有量が低い有機溶媒としては、メタノール、エタノール、アセトン及びヘキサンからなる群より選択される少なくとも１つを挙げることができる。これらの有機溶媒は、それぞれ独立に、５００ｐｐｍ以下、３００ｐｐｍ以下、又は２００ｐｐｍ以下とすることができる。たとえば、高濃度ＤＨＡ含有油におけるメタノール、エタノール、アセトン及びヘキサンの含有量のいずれもが、５００ｐｐｍ以下、３００ｐｐｍ以下、又は２００ｐｐｍ以下とすることができる。
【００４９】
＜微生物油の製造方法＞
本開示の一実施形態に係る微生物油の製造方法は、エイコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸双方の生成能を有する微生物を用意すること、用意された微生物を、３０ｍＬ／分以上１５００ｍＬ／分以下の通気環境下において、グリセロールを含有する培地中で培養すること、培養後に得られたバイオマスから、本開示のＥＰＡ高含有微生物油を得ることを含み、必要に応じて他の工程を含む。
本明細書では、エイコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸双方の生成能を有する微生物を用意する工程を、単に、「微生物用意工程」と称する場合がある。３０ｍＬ／分以上１５００ｍＬ／分以下の通気環境下において、グリセロールを含有する培地中で培養する工程を、単に「培養工程」という場合がある。培養後に得られたバイオマスから、本開示のＥＰＡ高含有微生物油を得る工程を、単に、「微生物油取得工程」という場合がある。
【００５０】
微生物用意工程では、ＥＰＡ及びＤＨＡ双方の生産能を有する微生物が用意される。ＥＰＡ及びＤＨＡ双方の生産能を有する微生物としては、微生物の内部でＥＰＡ及びＤＨＡを生成可能な微生物であれば特に制限はない。微生物としては培養可能な微生物とすることができ、培養可能な微生物であれば、天然採取後の微生物であってよく、培養後の微生物であってもよい。これらの微生物は１種単独で用いてもよく、２種以上の組み合わせであってもよい。本開示の一実施形態にかかるＥＰＡ及びＤＨＡ双方の生産能を有する微生物は、遺伝子組換え体であってもよい。
【００５１】
適用可能な微生物としては、たとえば、菌類（ｆｕｎｇｉ）に属する微生物、緑藻類（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａ）の微生物、ユーグレナ藻類（Ｅｕｇｌｅｎｉｄａ）の微生物、ＳＡＲの微生物からなる群より選択される少なくとも１種を挙げることができる。
【００５２】
菌類としては、酵母（Ｙｅａｓｔ）、糸状菌（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｉ）等を挙げることができる。酵母としては、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属微生物、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属微生物、サッカロミケス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属微生物、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属微生物及びトリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｎ）属微生物からなる群より選択される少なくとも１種の微生物を挙げることができる。糸状菌としては、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属微生物、フィチウム（Ｐｙｔｈｉｕｍ）属微生物及びフィトフトラ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）属微生物からなる群より選択される少なくとも１種の微生物を挙げることができる。モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属に属する微生物が更に好ましい。モルティエレラ属に属する微生物としては、たとえば、モルティエレラ・エロンガタ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｅｌｏｎｇａｔａ）、モルティエレラ・エキシグア（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｅｘｉｇｕａ）、モルティエレラ・ヒグロフィラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ）及びモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）を挙げることができる。
【００５３】
緑藻類の微生物としては、たとえばボトリオコッカス（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ）属、シュードコリシスティス（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ）、イカダモ（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ及びＤｅｓｍｏｄｅｓｍｕｓ）に属する微生物を挙げることができる。
【００５４】
ユーグレナ藻類の微生物としては、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａｃｅａｅ）科に属する微生物等を挙げることができる。ミドリムシ科に属する微生物としては、たとえば、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ）属に属する微生物を挙げることができる。
【００５５】
ＳＡＲは、Ａｄｌらの提唱する分類体系（Adl et.al., Jornal of Eukaryotic Microbiology, 59(5):429-493(2012)）におけるＳＰＲを意味し、具体的には、ストラメノパイル、アルベオラータ及びリザリア（Ｒｈｉｚａｒｉａ）の微生物が該当する。ストラメノパイルに属する微生物からなる群より選択される少なくとも１種の微生物が好ましい。ストラメノパイルとしては、ビコソエカ類（Ｂｉｃｏｓｏｅｃｉｄａ）、ラビリンチュラ類（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｅａ）、ブラストシスチス（Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｉｓ）、無殻太陽虫（Ａｃｔｉｎｏｐｈｙｉｄａ）、オパリナ類（Ｏｐａｌｉｎａｔａ）、プラシディア類（Ｐｌａｃｉｄｉｄａ）、卵菌類（Ｏｏｍｙｃｅｔｅｓ）、サカゲツボカビ類（Ｈｙｐｈｏｃｈｙｔｒｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ヴェロパイエラ（Ｄｅｖｅｌｏｐａｙｅｌｌａ）、黄金色藻（Ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｃｅａｅ）、真正眼点藻（Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｃｅａｅ）、ファエオタムニオン藻（Ｐｈａｅｏｔｈａｍｎｉｏｐｈｙｃｅａｅ）、ピングイオ藻（Ｐｉｎｇｕｉｏｐｈｙｃｅａｅ）、ラフィド藻（Ｒａｐｈｉｄｏｐｈｙｃｅａｅ）、シヌラ藻（Ｓｙｎｕｒｏｐｈｙｃｅａｅ）、黄緑藻（Ｘａｎｔｅｘｙｏｐｈｙｃｅａｅ）、褐藻（Ｐｈａｅｏｐｈｙｃｅａｅ）、シゾクラディア藻（Ｓｃｈｉｚｏｃｌａｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）、クリソメリス藻（Ｃｈｒｙｓｏｍｅｒｏｐｈｙｃｅａｅ）、ディクチオカ藻（Ｄｉｃｔｙｏｃｈｏｐｈｙｃｅａｅ）、ボリド藻（Ｂｏｌｉｄｏｐｈｉｃｅａｅ）、ペラゴ藻（Ｐｅｌａｇｏｐｈｙｃｅａｅ）及び珪藻（Ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｃｅａｅ）微生物からなる群より選択される少なくとも１種の微生物を挙げることができる。
【００５６】
アルベオラータとしては、繊毛虫（Ｃｉｌｉｏｐｈｏｒａ）、アピコンプレクサ（Ａｐｉｃｏｍｐｌｅｘａ）及び渦鞭毛藻類（Ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅ）に属する微生物を挙げることができる。渦鞭毛藻類としては、たとえばクリプテコデニィウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）属に属する微生物を挙げることができる。クリプテコデニィウム属に属する微生物としては、たとえば、クリプテコディニウム・コーニイ（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ）を挙げることができる。
【００５７】
微生物としては、ラビリンチュラ類に属する微生物が好ましく、その中でも、ヤブレツボカビ科（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｔｒｉｄ）に属する微生物が特に好ましい。ヤブレツボカビ科に属する微生物としては、たとえば、アプラノキトリウム属（Ａｐｌａｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、イァポノキトリウム属（Ｊａｐｏｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、ラビリンチュロイデス属（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｉｄｅｓ）、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｙｔｒｉｕｍ）、ヤブレツボカビ属（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、ウルケニア属（Ｕｌｋｅｎｉａ）、アウランティオキトリウム属（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、オブロンギキトリウム属（Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）、ボトリオキトリウム属（Ｂｏｔｒｙｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、パリエティキトリウム属（Ｐａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）及びシクヨイドキトリウム属（Ｓｉｃｙｏｉｄｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）に属する微生物が好ましく、その中でも特にシゾキトリウム属及びヤブレツボカビ属微生物からなる群より選択された少なくとも１種の微生物が好ましい。
【００５８】
本開示の一実施形態では、ＥＰＡ及びＤＨＡ双方の生産能を有する微生物は、上述した微生物の中でも、グルコースを含有する培地中では、増殖しないか、ＤＨＡをＥＰＡよりも多く生成し得る微生物である。グルコースは培地中で炭素源として又はその他の用途として、使用され得る糖類である。グルコースを含有する場合において、増殖しないか、ＤＨＡをＥＰＡよりも多く生成し得る微生物が、後述する特定の培養工程で、グルコースを含有する培地で培養する場合と異なる挙動を示し、その結果、ＤＨＡよりもＥＰＡを多く生成することができる。これにより、これまで微生物油におけるＥＰＡの含有率の観点から、ＥＰＡの生産効率が劣ると思われていた微生物を、ＥＰＡの生産効率に優れる微生物として利用することができる。
【００５９】
「グルコースを含有する培地」とは、培地におけるグルコースの含有率が、培地の全重量に対して１重量％〜５０重量％、好ましくは１０重量％〜３０重量％である培地を意味する。培地については後述する。「グルコースを含有する培地では増殖しない」とは、微生物の増殖が可能な条件とした上で、培養液中のグルコース濃度が一定期間経過後、たとえば２４時間後に、培地に添加した濃度と比較して減少していないことを意味する。したがって、「グルコースを含有する培地では増殖しない」とは、炭素源としてグルコースのみを含有する場合に増殖することができないことを意味する。「ＤＨＡをＥＰＡよりも多く生成」し得ることの確認方法としては、培養により得られる微生物油において、脂肪酸含有率に基づいて行うことができる。
【００６０】
培養工程では、用意された微生物が、３０ｍＬ／分以上１５００ｍＬ／分以下の通気環境下において、グリセロールを含有する培地中で培養される。培養に用いられる培養器については、特に制限はなく、１ｍＬ〜１０Ｌ、又は１００ｍＬ〜１Ｌのスケールの液体培養が可能な培養器から微生物の種類に基づいて適宜選択できる。培養器は、撹拌又は浸透機能を備えることができる。培養器としては、試験管、フラスコ、坂口フラスコ、バッフル付きフラスコ、チューブ型培養器、レースウェイ型培養器、パネル型培養器等を用いることができる。
【００６１】
培養工程では、３０ｍＬ／分以上１５００ｍＬ／分以下の通気環境下で培養を行うことにより、完全な密閉条件ではなく、適度な通気条件に該当し、また、過剰な水分蒸発を抑制することができる。この通気環境は、培養器の通気口を栓で塞ぎ、２６ｍｍ水柱時（２５５Ｐａ）の流量を浮遊式流量計で測定することにより、確認することができる。培養工程の通気環境は、３０ｍＬ／分以上１５００ｍＬ／分以下の通気量が確認できる環境であればよく、ＥＰＡの生産効率等の観点から、３０ｍＬ／分以上１０００ｍＬ分以下、３０ｍＬ／分以上５００ｍＬ分以下、３０ｍＬ／分以上２００ｍＬ分以下、又は３０ｍＬ／分以上１２０ｍＬ分以下の通気量が確認できる環境であることが好ましい。
【００６２】
この通気環境は、たとえば、培養器の通気口を、本明細書で規定する通気環境を提供可能な栓で塞ぐことにより達成することができる。この通気環境を提供可能な栓は、５００ｍＬの三角フラスコの通気口を塞ぎ、２６ｍｍ水柱時の流量を浮遊式流量計で測定することにより選択することができる。本明細書では、培養器の通気口を塞ぐことができる栓を「培養栓」と称することがある。本通気環境は、好ましくは、３０℃下で１０日間放置したときに０．５ｍＬの水分蒸発量となる環境に相当するものであることが、培養液の過剰な濃縮を抑制する観点から、好ましい。培養工程における通気環境を提供可能な培養栓としては、たとえば、シリコーンゴム製の「シンエツ  シリコセン  Ｔタイプ」（Ｔ−４２、信越ポリマー株式会社）を挙げることができる。
【００６３】
微生物の培養工程で適用される培養培地は、グリセロールを含有する。培養培地におけるグリセロールは、通常炭素源として作用するが、その他の機能を有してもよい。培養条件等については、当該微生物について従来から適用されている培養培地、培養条件等をそのまま適用することができる。
【００６４】
培養培地におけるグリセロールの含有量は、微生物の増殖維持又は促進の点で、０．１重量％〜５０重量％、好ましくは１重量％〜３０重量％とすることができる。炭素源は、微生物の増殖に伴って、回数に制限なく適当量で培養液中に追加することができる。炭素源を追加する場合、一回に添加する炭素源の量は、微生物の増殖維持又は促進の観点から適宜設定することができる。
【００６５】
培養培地は、本開示に係るＥＰＡ高含有微生物油の製造方法の趣旨を損なわない範囲で、主成分をグリセロールとして、炭素源として、たとえば、フルクトース、キシロース、スクロース、マルトース、デンプン、可溶性デンプン、糖蜜、グルコース、トレハロース、マンニトール、その他の炭素源として利用可能な化合物を含有してもよい。グリセロールに加えて、これらの炭素源を併用する場合には、培養培地中におけるこれらの炭素源の合計の含有率は、グリセロールの含有率に対して、０．０１以上であって、０．５以下、好ましくは０．３以下とすることができる。グリセロールを含有する培養培地は、微生物が増殖し、微生物油のエイコサペンタエン酸の含有率がドコサヘキサエン酸の含有率よりも高くなるグルコース濃度でグルコースを含んでもよい。
【００６６】
一般に、菌株の胞子、菌糸、又は予め微生物を培養して得た前培養液を、液体培地又は固形培地に接種することにより、培養を開始する。培地としては、たとえば窒素源として酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、魚肉エキス、コーンスティープリカー、ペプトン、ポリペプトン、大豆粉、脱脂大豆粉、カザミノ酸、尿素、グルタミン酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム等；無機塩として塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム等；ビタミンその他、必要な成分を適宜組み合わせた培地を挙げることができる。塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム等を含む培地とすることで、海洋性微生物の培養にも適用可能となる。
【００６７】
培養培地における窒素源は、微生物の増殖維持又は促進の点で、０．０１重量％〜１０重量％、好ましくは０．１重量％〜４重量％とすることができる。窒素源は、微生物の増殖に伴って、回数に制限なく適当量で培養液中に追加することができる。窒素源を追加する場合、一回に添加する窒素源の量は、微生物の増殖維持又は促進の観点から適宜設定することができる。
【００６８】
培養培地としては、広く多くのＥＰＡ高含有微生物油を生成し得る微生物の増殖可能性の点で、たとえば、グリセロール・酵母エキス寒天培地（ＧｌｙＹ培地）が用いることができる。液体培地の基材となる水性媒体は、基本的に水であり、蒸留水や精製水を用いることができる。培地は調製後、ｐＨを３．０〜９．０の範囲内に調整した後、オートクレーブ等により殺菌して用いる。
【００６９】
培養培地のｐＨは、微生物の増殖、脂肪酸の合成、ＥＰＡの生成能の維持又は促進の観点から適宜選択することができ、たとえば、３．０〜９．５、好ましくは３．５〜９．５、より好ましくは４．５〜９．０とすることができる。培養培地のｐＨは培地中の成分が微生物によって代謝されることにより変動する場合、水酸化ナトリウム、硫酸等のｐＨ調整剤によって適宜制御することができる。
【００７０】
培養温度については、ＥＰＡの生産効率の観点から、たとえば、４０℃以下、３５℃以下、３０℃以下、２８℃以下、又は２５℃以下とすることができ、一方、微生物の成育の観点から、８℃以上、１０℃以上、又は１５℃以上とすることができる。培養温度の上限値又は下限値はいずれの組み合わせでもよく、たとえば、８℃〜４０℃、８℃〜２８℃、１０℃〜４０℃、１０℃〜２５℃、１５℃〜２５℃とすることができる。このような温度範囲での培養を行う場合、ＥＰＡ高含有微生物油中のＥＰＡの濃度をより高くすることができる。
【００７１】
培養工程における培養期間は、微生物の種類、成育状態、脂肪酸の蓄積効率等により異なり、特に制限はないが、培養液１リットルあたりの乾燥バイオマス量が１ｇ〜１００ｇとなった場合に終了することができる。培養工程における培養期間は、通常、１日間〜３０日間、又は３日間〜１０日間とすることができる。
【００７２】
微生物油取得工程では、培養により得られたバイオマスから、本開示のＥＰＡ高含有微生物油が得られる。微生物油取得工程は、培養期間後のバイオマスを回収する回収工程と、回収されたバイオマスから微生物油を抽出する抽出工程を含むことができる。
【００７３】
回収工程では、培養後のバイオマスは、生物の種類及び培地の種類に応じて、当業界で既知の方法により培地から回収することができる。回収工程により、ＥＰＡ高含有微生物油を含むバイオマスが得られる。回収の処理は、たとえば、液体培養を用いて培養した場合には、一般に、培養終了後、培養液より、遠心分離及び濾過等の固液分離手段を用いて行うことができる。固体培地で培養した場合には、バイオマスと培地とを分離することなく、固体培地とバイオマスとをホモジナイザー等で破砕し、得られた破砕物を、後段の抽出工程に供することができる。
【００７４】
抽出工程では、回収工程後のバイオマスから油を抽出して抽出油を得る。抽出処理には、通常、有機溶媒を用いる常法による抽出方法を適用することができる。回収後のバイオマスが乾燥バイオマスの場合には、抽出処理は、超臨界二酸化炭素による抽出であってもよく、窒素気流下での有機溶媒による抽出処理であってもよい。抽出処理の用いられる有機溶媒としては、ジメチルエーテル、ジエチルーテル等のエーテル；石油エーテル、ヘキサン、ヘプタン等の炭素数１０以下の炭化水素；メタノール、エタノール等のアルコール；クロロホルム；ジクロロメタン；オクタン酸等の脂肪酸又はそのアルキルエステル；植物油等の油脂などを用いることができる。抽出処理としては、メタノールと石油エーテルの交互抽出又はクロロホルム−メタノール−水の一層系の溶媒を用いた抽出を適用することができる。この場合には、より良好な抽出処理の結果を得ることができる。抽出物から減圧下で有機溶媒を留去することにより、抽出油を得ることができる。トリアシルグリセロールを採取する場合又は微生物から抽出油を抽出する場合には、有機溶媒としては、一般にヘキサンが用いられる。粗油は、上述のとおり、抽出処理直後に得られる抽出油を指す。
【００７５】
抽出処理に湿菌体を用いる場合には、湿菌体を圧搾してもよく、溶媒を使用してもよい。使用可能な溶媒としては、メタノール、エタノール等の水に対して相溶性の溶媒、又は、水に対して相溶性の溶媒と水及び／又は他の溶媒との混合溶媒を挙げることができる。その他の手順は上記と同様である。
【００７６】
ＥＰＡ高含有微生物油が精製油である場合、ＥＰＡ高含有微生物油の製造方法は、抽出工程の後に、得られた抽出油、即ち粗油に対して、脱ガム工程、脱酸工程、脱色工程及び脱臭工程を含む精製処理を含むことができる。精製処理によって、精製油であるＥＰＡ高含有微生物を得ることができる。微生物バイオマス由来の抽出油に対して精製処理を行うことによって、主として、トリアシルグリセロールの濃度が粗油よりも高いトリアシルグリセロール濃縮物が得られる。
【００７７】
精製工程では、粗油に対して、植物油、魚油等の精製に用いられる方法で、脱ガム、脱酸、脱色及び脱臭を当業者に既知の方法によって行う。脱ガム処理は、たとえば水洗処理等により行われる。脱酸処理は、たとえば蒸留処理により行われる。脱色処理は、たとえば、活性白土、活性炭、シリカゲル等を用いた脱色処理により行われる。脱臭処理は、たとえば水蒸気蒸留により行われる。
【００７８】
ＥＰＡ高含有微生物油の製造方法により得られたＥＰＡ高含有微生物油は、微生物油取得工程中の抽出工程、場合により抽出工程及び精製工程の後に、粗油又は精製油に対して加水分解、アルキルエステル化等の加工を行う加工工程に付されてもよい。加工工程により、ＥＰＡ高含有微生物油に由来する遊離型ＥＰＡを含有する組成物、ＥＰＡ高含有微生物油に由来する低級アルキルエステル型ＥＰＡを含有する組成物等を得ることができる。特に、抽出工程後に、精製工程及び加工工程をこの順で実施する場合、精製工程で得られたトリアシルグリセロール濃縮物に由来する遊離脂肪酸を含有する組成物、脂肪酸低級アルキルエステルを含有する組成物を得ることができる。加工工程におけるアルキルエステル化処理及び加水分解処理は、当業者に既知の条件によって行うことができる。
【００７９】
アルキルエステル化処理には低級アルコールが用いられる。低級アルコールとしては、炭素数１〜３のアルコールを挙げることができ、メタノール、エタノール、プロパノール等が挙げられる。たとえば、脂肪酸メチルエステルを得るには、抽出油を、体積基準で、無水メタノール−塩酸５％〜１０％、ＢＦ３−メタノール１０％〜５０％等により、室温にて１時間〜２４時間処理することにより得られる。脂肪酸のエチルエステルを得るには、抽出油を、１％〜２０％硫酸エタノール等により、２５℃〜１００℃にて１５分〜６０分処理することにより得られる。その反応液からヘキサン、ジエチルエーテル、酢酸エチル等の有機溶媒でメチルエステル、又はエチルエステルを抽出することができる。この抽出液を無水硫酸ナトリウム等により乾燥し、有機溶媒を留去することにより脂肪酸アルキルエステルを主成分とする組成物が得られる。
【００８０】
加水分解処理は、当業者には公知の条件で行えばよく、たとえば、抽出油を、５％水酸化ナトリウムにより室温にて２時間〜３時間でアルカリ分解処理を行った後、得られた分解液から、脂肪酸の抽出又は精製に常用されている方法を用いて、遊離脂肪酸を含有する組成物を得ることができる。
【００８１】
遊離脂肪酸を得るには、アルキルエステル化処理と加水分解処理との双方を行ってもよい。アルキルエステル化処理及び加水分解処理を連続して行うことにより、より純度の高い遊離脂肪酸を得ることができる。脂肪酸アルキルエステルから遊離脂肪酸を得るには、たとえば、アルカリ触媒で加水分解した後、エーテル、酢酸エチル等の有機溶媒を用いた抽出処理を実施すればよい。
【００８２】
ＥＰＡ高含有微生物油又はこれに由来する組成物は、上述した精製工程後、又は加工処理後に、ＥＰＡ以外の脂肪酸を構成脂肪酸とする脂肪酸の濃度を低下させ、且つ、ＥＰＡの濃度を高めるために、濃縮処理を含むことができる。濃縮処理には、蒸留、精留、カラムクロマトグラフィー、低温結晶化法、尿素包接法、液々向流分配クロマトグラフィー等を、１種単独で、又は２種以上を組み合わせて適用することができる。蒸留又は精留とカラムクロマトグラフィー又は液々向流分配クロマトグラフィーの組み合わせが好ましい。カラムクロマトグラフィーとしては逆相分配系のカラムクロマトグラフィーが好ましい。ＥＰＡを濃縮又は単離する工程を経た場合には、ＥＰＡ高含有微生物油中に最終的に含まれ得るＥＰＡの脂肪酸中の含有量を高め、かつ、ＥＰＡ以外の他の脂肪酸の脂肪酸中の含有量を低減させることができる。
【００８３】
たとえば、精留を用いる場合、精留工程としては、蒸留塔の塔上部の圧力を１０ｍｍＨｇ（１３３３Ｐａ）以下の減圧とし、塔底温度を１６５℃〜２１０℃、好ましくは１７０℃〜１９５℃とする条件で蒸留することが、熱による脂肪酸の変性を抑え、精留効率を高める点で好ましい。蒸留塔の塔上部の圧力は、低いほどよく、０．１ｍｍＨｇ（１３．３３Ｐａ）以下であることがより好ましい。塔上部の温度については特に制限はなく、たとえば、１６０℃以下とすることができる。精留工程によって、より高い含有量のＥＰＡを含む組成物を得ることができる。
【００８４】
逆相カラムクロマトグラフィーとしては、当業界で公知の逆相カラムクロマトグラフィーを挙げることができ、特にオクタデシルシリル基（ＯＤＳ）で修飾された基材を固定相とした高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が好ましく挙げられる。
このような濃縮処理を行うことによって、ＥＰＡ濃度が、たとえば、油中の脂肪酸の合計重量の９０重量％〜９８重量％、９５重量％〜９８重量％、９６重量％〜９８重量％又は９７重量％〜９８重量％のＥＰＡ濃縮油を得ることができる。
【００８５】
本発明の他の態様は、微生物油の脂肪酸含有比を制御する方法を含む。本開示に係る微生物油の脂肪酸含有比の制御方法は、グルコースを含有する培地中では、増殖しないか、ドコサヘキサエン酸を、エイコサペンタエン酸よりも多く含む微生物油を生成し得る微生物を用意すること、用意された微生物を、３０ｍＬ／分以上１５００ｍＬ／分以下の通気環境下において、グリセロールを含有する培養培地中で培養すること、培養により得られたバイオマスから、エイコサペンタエン酸を、ドコサヘキサエン酸よりも多く含有する微生物油を得ること、を含み、必要に応じて他の工程を含む。
【００８６】
本制御方法によれば、特定の微生物が生成する微生物油の脂肪酸組成を簡便に制御することができる。これにより、ＥＰＡ高含有微生物油のようなＥＰＡ含有組成物を効率よく得るために利用可能な微生物種の選択範囲を拡大することができる。本実施形態における「微生物油の脂肪酸組成の制御」とは、微生物が生成し得る微生物油の脂肪酸組成を、微生物を培養する条件に応じて変えることを意味する。なお、本実施形態における増殖しない微生物が、所定の脂肪酸組成を有する微生物油生成可能な状態に変化する態様も、「微生物油の脂肪酸組成の制御」の一態様に含まれる。
【００８７】
本開示に係る脂肪酸含有比の制御方法では、グルコースを含有する培地中では、増殖しないか、ドコサヘキサエン酸を、エイコサペンタエン酸よりも多く含む微生物油を生成し得る微生物が用意される。この工程で用いられる「グルコースを含有する培地中では、増殖しないか、ドコサヘキサエン酸を、エイコサペンタエン酸よりも多く含む微生物油を生成し得る微生物」は、本開示の他の実施形態に係る微生物油の製造方法における「微生物用意工程」で記述した微生物が該当する。
【００８８】
用意された微生物は、次に、３０ｍＬ／分以上１５００ｍＬ／分以下、好ましくは３０ｍＬ／分以上１２０ｍＬ／分以下の通気環境下において、グリセロールを含有する培養培地中で培養される。この工程に関する事項には、本開示の他の実施形態に係る微生物油の製造方法における「培養工程」で記述した事項を適用することができる。
【００８９】
次いで、培養により得られたバイオマスから、エイコサペンタエン酸を、ドコサヘキサエン酸よりも多く含有する微生物油が得られる。ここで得られる微生物油は、グルコースを含有する培養培地で培養したときに得られる微生物油とは、ＤＨＡとＥＰＡのそれぞれの含有比が異なる微生物油である。この工程に関する事項には、本開示の他の実施形態に係る微生物油の製造方法における「微生物油取得工程」で記述した事項を適用することができる。
【００９０】
ＥＰＡ高含有微生物油は、ＥＰＡの各種機能を効率よく摂取することが求められる用途に適用することができる。ＥＰＡ高含有微生物油を含有する製品としては、たとえば、食品、サプリメント、医薬品、化粧品、飼料等を挙げることができる。ＥＰＡ高含有微生物油は、これらの製品の製造方法において使用することができる。ＥＰＡ高含有微生物油の用途としては、特に、ＥＰＡを有効成分として含む、動脈硬化、脳梗塞、心筋梗塞、血栓症、高脂血症等の生活習慣病予防、メタボリックシンドローム改善、抗アレルギー、抗炎症、抗がん、認知症等の作用が期待できる食品、サプリメント、医薬品、化粧品、飼料等が挙げられる。医薬品としては、皮膚外用剤、経口剤等が挙げられる。
【００９１】
ＥＰＡ高含有微生物油の使用の形態については、特に制限はなく、液体成分として、又は固体成分として、使用することができる。たとえば、ＥＰＡ高含有微生物油を、食品、サプリメント、医薬品、化粧品、飼料等の製品に適用する場合には、ＥＰＡ高含有微生物油そのものを、他の任意成分と組み合わせて製品化してもよく、他の成分と組み合わせる前又は後に、任意の追加的な処理を行い、製品化することができる。このような追加的な処理としては、粉末化、ペレット化、カプセル化、錠剤化等を挙げることができる。
【００９２】
ＥＰＡ高含有微生物油を医薬品として用いる場合、医薬品は、ＥＰＡ高含有微生物油と、医薬的に許容可能な担体と、必要に応じて他の成分とを含む。投与形態は、経口投与又は非経口投与が都合よく行われるものであればどのような形態であってもよい。投与形態としては、たとえば注射液、輸液、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、腸溶剤、トローチ、内用液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、外用液剤、湿布剤、点鼻剤、点耳剤、点眼剤、吸入剤、軟膏剤、ローション剤、坐剤等を挙げることができ、これらを症状に応じてそれぞれ単独で、又は組み合わせて使用することができる。
【００９３】
これら各種製剤は、常法に従って目的に応じて主薬に賦刑剤、結合剤、防腐剤、安定剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤などの医薬の製剤技術分野において通常使用しうる既知の補助剤を用いて製剤化することができる。またその投与量は、投与の目的、投与対象者の状況、たとえば性別、年齢、体重等によって異なるが、通常、成人に対して経口投与の場合、構造脂質としてのＥＰＡの総量として、１日あたり０．０１ｍｇ〜１０ｇ、好ましくは０．１ｍｇ〜２ｇ、さらに好ましくは１ｍｇ〜２００ｍｇの範囲で、また非経口投与の場合、構造脂質としてのＥＰＡの総量として、１日あたり０．００１ｍｇ〜１ｇ、好ましくは０．０１ｍｇ〜２００ｍｇ、さらに好ましくは０．１ｍｇ〜１００ｍｇの範囲で適宜調節して投与することができる。
【００９４】
また、本明細書において、本開示の各態様（aspect）に関して一実施形態（embodiment）中で説明された各発明特定事項（feature）は、任意に組み合わせて新たな実施形態としてもよく、このような新たな実施形態も、本開示の各態様に包含され得るものとして理解されるべきである。
本明細書において、同一の対象について言及された１若しくは複数の上限値のみを規定する数値範囲と１若しくは複数の下限値のみを規定する数値範囲とが記載されている場合、特に断らない限り、１又は複数の上限値から任意に選択された上限値と、１又は複数の下限値から任意に選択された下限値とを組み合わせて成立する数値範囲も、本発明の一形態に含まれる。
【実施例】
【００９５】
以下、本開示を実施例にて詳細に説明する。しかしながら、本発明はそれらに何ら限定されるものではない。なお、特に断りのない限り、「部」又は「％」は質量基準である。
以下の実施例の項において「細胞」又は「菌体」とは、特に断りのない限り、細胞又は菌体の集合物を意味し、本明細書におけるバイオマスに相当する。【００９６】
［実施例１］
ヤブレツボカビ科であるスラウストキトリウム属（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍｓｐ．）ＡＲ２−１  ＡＢ８１０９５９の類縁種である「ＳＥＫ  ７０４  ＡＢ９７３５６０株」（Aquat. Microb. Ecol., 2015, Vol.74, pp.187-204）を、独立行政法人製品評価技術基盤機構  バイオテクノロジーセンターより入手した（未同定Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ５、ＮＢＲＣ１１０８５８、以下微生物Ａという）。【００９７】
微生物Ａを、後述する５０％人工海水に懸濁後、この微生物懸濁液０．１ｍｌを、以下の組成のヤブレツボカビ用液体培地１００ｍＬ（ｐＨは６．８）を含有する無菌の５００ｍＬひだ付き振盪フラスコ中に接種した。５０％人工海水は、表４に示すＨｅｒｂｓｔ処方物と精製水とを体積比１：１で混合して、調製した。
菌を接種した後のフラスコの口を、シリコーンゴム製の培養栓「シンエツ  シリコセン  Ｔタイプ」（信越ポリマー株式会社）を用いて塞いだ。「シンエツ  シリコセン  Ｔタイプ」は、５００ｍＬの三角フラスコの通気口を塞ぎ、２６ｍｍ水柱時の流量を浮遊式流量計で測定した場合に３０〜１２０ｍＬ／分の通気量を示し、また、中試験管に水５ｍＬを注入し、培養栓を付して放置し、水分蒸発による重量の増減を経時的に測定した場合に、３０℃１０日で０．５ｍＬ以下の水分蒸発量を示す。培養装置には、Ｂｉｏ−Ｓｈａｋｅｒ  ＢＲ−３００ＬＦ（タイテック株式会社）を使用し、このフラスコを３日間、２８℃、１３０ｒｐｍで振とうした。【００９８】
【表１】
2019208803.tif 000002
【００９９】
【表２】
2019208803.tif 000003
【０１００】
【表３】
2019208803.tif 000004
【０１０１】
【表４】
2019208803.tif 000005
【０１０２】
振盪フラスコ中で培養して得られた培養細胞懸濁液２０ｍｌを、無菌の５０ｍｌ試験管に採取し、遠心分離し、細胞を回収した。回収した細胞を人工海水で２度洗浄した。次いで、−８０℃で凍結した後に凍結乾燥機（ＴＡＩＴＥＣ社製ＶＡ−１４０Ｓ）に供し、凍結乾燥菌体Ａを得た。
得られた凍結乾燥菌体から、以下のようにして、総脂質、即ち微生物油Ａ（Ｔタイプ）を得て、その後さらに、得られた微生物油Ａ（Ｔタイプ）を脂肪酸メチルエステルへと変換した。【０１０３】
Ｆｏｌｃｈらの方法（J.Biological and Chemistory.226:497-509(1957)）に従って、
クロロホルム：メタノール（２：１、v/v）で凍結乾燥菌体から総脂質を抽出した。得られた総脂質に対し、メチルエステル化して、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）を得た。得られたＦＡＭＥに対して、ガスクロマトグラフィーによりＦＡＭＥ分析を行った。ガスクロマトグラフの条件は以下のとおりに設定した。
・カラム    ＤＢ−ＷＡＸ  ０．５３０ｍｍ×３０ｍ、フィルム厚１．００μｍ（アジレント・テクノロジー株式会社）
・キャリアーガス条件    ヘリウム  １．０ｍｌ／分、分離比１００：１
・カラム温度条件    １４０℃で５分、２４０℃まで４℃／分で昇温、２４０℃で１０分・検出    ＦＩＤ
・検出器温度    ２６０℃
・注入口温度    ２５０℃
・注入量    １μＬ【０１０４】
その結果、微生物油Ａ（Ｔタイプ）は、ＥＰＡを全脂肪酸に対して４０．３面積％、ＤＨＡを全脂肪酸に対して２１．３面積％含有していた。ＤＨＡの含有率の対するＥＰＡの含有率の比は、１．８９であった。【０１０５】
比較対照として、シリコーンゴム製の培養栓「シンエツ  シリコセン  Ｔタイプ」（信越ポリマー株式会社）の代わりに、「シンエツ  シリコセン  Ｃタイプ」（信越ポリマー株式会社）を用いた以外は、上述した条件と同じ条件で微生物Ａの培養を行った。「シンエツ  シリコセン  Ｃタイプ」は、５００ｍＬの三角フラスコの通気口を塞ぎ、２６ｍｍ水柱時の流量を浮遊式流量計で測定した場合に２０００〜４５００ｍＬ／分の通気量を示し、また、中試験管に水５ｍＬを注入し、培養栓を付して放置し、水分蒸発による重量の増減を経時的に測定した場合に、３０℃１０日で０．５ｍＬを超える水分蒸発量を示す。培養後に微生物油Ａ（Ｃタイプ）を得て、実施例１と同様にして、微生物油Ａ（Ｃタイプ）をＦＡＭＥに変換させた後、脂肪酸分析に供した。
その結果、微生物Ａから得られた微生物油Ａ（Ｃタイプ）は、ＥＰＡを全脂肪酸に対して１１．６面積％、ＤＨＡを全脂肪酸に対して５２．１面積％含有していた。ＤＨＡの含有率の対するＥＰＡの含有率の比は、０．２２であった。【０１０６】
このように、微生物Ａは、３０〜１２０ｍＬ／分の通気量となる通気環境下において、グルコースの代わりにグリセロールを含む培養培地で培養することによって、ＤＨＡよりもＥＰＡを多く含有する微生物油Ａ（Ｔタイプ）を生成することがわかった。
これにより、ＥＰＡを３８面積％以上の高含有率で含み、ＤＨＡの含有率に対するＥＰＡの含有率の比が１．７以上の微生物油を得ることができた。【０１０７】
［実施例２］
以下に挙げる実施例１で用いた微生物Ａと微生物Ｂ〜Ｇを使用し、培養日数を５日間とした以外は、実施例１と同様にして各微生物を培養して微生物油Ａ（Ｇｌｙ）〜Ｇ（Ｇｌｙ）を得た。
微生物Ａ：未同定Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ５（ＮＢＲＣ１１０８５８）
微生物Ｂ：Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．（ＮＢＲＣ１０２６１５）
微生物Ｃ：Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｕｒｅｕｍ（ＡＴＣＣ３４３０４）
微生物Ｄ：Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ（ＡＴＣＣ２８２０９）
微生物Ｅ：未同定 Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ１（ＮＢＲＣ１１０８４６）
微生物Ｆ：Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ（ＡＴＣＣ２８２１０）
微生物Ｇ：Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｔｒｉａｔｕｍ（ＡＴＣＣ２４４７３）【０１０８】
微生物油Ａ（Ｇｌｙ）〜Ｇ（Ｇｌｙ）の脂肪酸組成を表５及び表６に示す。
また、微生物油Ａ（Ｇｌｙ）〜Ｇ（Ｇｌｙ）については、トリグリセリド含有率はいずれも７０重量％以上であった。【０１０９】
表５及び表６に示されるように、微生物油Ａ（Ｇｌｙ）〜Ｇ（Ｇｌｙ）はいずれも、ＥＰＡを３８面積％以上含有し、ＥＰＡをＤＨＡよりも多く含有する微生物油であり、表５及び表６に示す脂肪酸組成比を有する微生物油であった。このことから、微生物油Ａ（Ｇｌｙ）〜Ｇ（Ｇｌｙ）は、高濃度でＥＰＡを含有し、ＥＰＡの機能を効果的に発揮可能である利点を有する。【０１１０】
比較対照として、微生物Ａ〜Ｇを、グリセロールの代わりにグルコースを同量含む以外は同一の成分によるヤブレツボカビ用液体培地（ｐＨ６．８）を用いた以外は、上述した微生物油Ａ（Ｇｌｙ）〜Ｇ（Ｇｌｙ）を得た培養と同様にして培養を行い、微生物油Ａ（Ｇｌｕ）〜Ｇ（Ｇｌｕ）を得た。【０１１１】
結果を表７及び表８に示す。なお表中「−」は、対応する微生物油がないこと、又は計算の対象となる脂肪酸の含有量が「０」のため、対応する数値がないことを意味する。
表７及び表８に示すとおり、微生物Ｂ、微生物Ｃ、微生物Ｅ及び微生物Ｆは、いずれもグルコースを炭素源とする培養培地では、ＥＰＡよりもＤＨＡを多く含む微生物油Ｂ（Ｇｌｕ）、微生物油Ｃ（Ｇｌｕ）、微生物油Ｅ（Ｇｌｕ）及び微生物油Ｆ（Ｇｌｕ）を生成することが確認された。なお、微生物Ａ、微生物Ｄ及び微生物Ｇは、グルコースを炭素源とする培養培地では、増殖しないことが確認された。【０１１２】
また、微生物Ａ〜Ｇはいずれも、グルコースを炭素源とする培養培地では増殖しないか、ＤＨＡをＥＰＡよりも多く含む微生物油を生成する微生物であった。上述のように、微生物油Ａ（Ｇｌｙ）〜Ｇ（Ｇｌｙ）は、ＥＰＡをＤＨＡよりも多く含有していた。
このように、所定の培養条件を選択することによって、異なる脂肪酸含有比を有する微生物油を得ることができることがわかった。これにより、ＥＰＡ含有組成物を効率よく得るために利用可能な微生物種の選択範囲を、簡便に拡大することができることがわかった。
この微生物油を用いることによって、ＥＰＡをより効率よく得ることができ、また、ＥＰＡを含有する各種製品を効率よく提供することができる。【０１１３】
【表５】
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【０１１４】
【表６】
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【０１１５】
【表７】
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【０１１６】
【表８】
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【国際調査報告】
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