(57)【要約】  乳酸吸着剤４は、層状複水酸化物、層状複酸化物、スチレン系ジメチルアミノ基を有する弱塩基性陰イオン交換樹脂、および強塩基性陰イオン交換樹脂からなる群から選択される少なくとも一種の物質を含む。
2020050068.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
層状複水酸化物、層状複酸化物、スチレン系ジメチルアミノ基を有する弱塩基性陰イオン交換樹脂、および強塩基性陰イオン交換樹脂からなる群から選択される少なくとも一種の物質を含むことを特徴とする乳酸吸着剤。
【請求項２】
乳酸を含有する溶液に接触して、前記溶液中の乳酸を吸着する請求項１に記載の乳酸吸着剤。
【請求項３】
前記溶液は、グルコースを含有する、細胞または微生物の培養液である請求項２に記載の乳酸吸着剤。
【請求項４】
前記強塩基性陰イオン交換樹脂は、スチレン系トリメチルアンモニウム基を有する強塩基性陰イオン交換樹脂、およびスチレン系ジメチルエタノールアンモニウム基を有する強塩基性陰イオン交換樹脂の少なくとも一方を含む請求項１乃至３のいずれか１項に記載の乳酸吸着剤。
【請求項５】
前記弱塩基性陰イオン交換樹脂は、ハイポーラス型またはＭＲ型である請求項１乃至４のいずれか１項に記載の乳酸吸着剤。
【請求項６】
前記溶液への添加量は、０．０００５ｇ／ｍＬ超０．２ｇ／ｍＬ未満である請求項２または３に記載の乳酸吸着剤。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれか１項に記載の乳酸吸着剤を、乳酸に接触させることを含むことを特徴とする乳酸の除去方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸吸着剤および乳酸の除去方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医薬品製造や再生医療などの分野において、細胞や微生物を人工的に効率よく大量培養することが求められている。大量培養が求められる細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）等の抗体産生細胞、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等の多能性幹細胞等が挙げられる。これらの細胞等を長期間安定的に大量培養できれば、モノクローナル抗体等の生体物質や多能性幹細胞由来の分化誘導組織を効率よく生産することができる。【０００３】
細胞等を工業的に大量培養する方法としては、スピナーフラスコ等の培養槽を用いた浮遊攪拌培養が考えられる。一方、浮遊攪拌培養では設備規模が大きくなる傾向がある。したがって、コストの削減を図るために、細胞等の培養密度を高めることが有効である。しかしながら、培養密度を高めていくと、細胞等の増殖が抑えられることが知られている。これは、細胞等の高密度化によって培養液（液体培地）中の老廃物（代謝物）の濃度が上昇し、これにより細胞等の増殖活性が低下するためである。細胞等に影響を与える老廃物の代表的なものとしては、乳酸が知られている。【０００４】
したがって、細胞等を高密度状態で安定的に増殖させるためには、培養液中に蓄積する乳酸を除去することが望ましい。これに対し、例えば特許文献１には、濃度差に依存して成分を透過させる培養液成分調整膜を設けた送液ラインによって、細胞培養槽と成分調整液槽とを接続した細胞培養装置が開示されている。この細胞培養装置では、培養液中に蓄積した老廃物は、成分調整液側に移動することで培養液中での濃度が低下する。同時に、培養中に濃度が低下した栄養分は、成分調整液から培養液へ移動して補充される。これにより、培養液中の環境が細胞培養に適した状態に維持される。なお、成分調整液には、培養液そのものが用いられていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１５／１２２５２８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１に開示される細胞培養装置は、透析の原理を利用して培養液から老廃物を除去していた。したがって、十分な老廃物の除去を実現するために、成分調整液槽の容積を細胞培養槽の容積の１０倍以上に設定していた。このため、必要な液量が莫大でコストがかかるという課題があった。特に、成分調整液に培養液そのものを用いる場合には、高価な培地を大量に消費することになり、より一層のコストがかかってしまう。また、透析技術を利用して老廃物を除去する場合、培養装置の構造が複雑になるという課題もあった。【０００７】
また、乳酸は、細胞等の培養液に限らず、他の溶液系においても除去が望まれることが多い。このため、透析技術以外の手法を用いた新規な乳酸除去技術が強く望まれる。【０００８】
本発明はこうした状況に鑑みてなされたものであり、その目的の１つは、新規な乳酸除去技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために、本発明のある態様は乳酸吸着剤である。この乳酸吸着剤は、層状複水酸化物、層状複酸化物、スチレン系ジメチルアミノ基を有する弱塩基性陰イオン交換樹脂、および強塩基性陰イオン交換樹脂からなる群から選択される少なくとも一種の物質を含む。この態様によれば、新規な乳酸除去技術を提供することができる。【００１０】
上記態様において、乳酸吸着剤は、乳酸を含有する溶液に接触して、溶液中の乳酸を吸着してもよい。また、溶液は、グルコースを含有する、細胞または微生物の培養液であってもよい。また、強塩基性陰イオン交換樹脂は、スチレン系トリメチルアンモニウム基を有する強塩基性陰イオン交換樹脂、およびスチレン系ジメチルエタノールアンモニウム基を有する強塩基性陰イオン交換樹脂の少なくとも一方を含んでもよい。また、弱塩基性陰イオン交換樹脂は、ハイポーラス型またはＭＲ型であってもよい。また、乳酸吸着剤の溶液への添加量は、０．０００５ｇ／ｍＬ超０．２ｇ／ｍＬ未満であってもよい。【００１１】
本発明の別の態様は、乳酸の除去方法である。当該除去方法は、上記いずれかの態様の乳酸吸着剤を、乳酸に接触させることを含む。【００１２】
なお、以上の構成要素の任意の組み合わせや、本発明の構成要素や表現を方法、装置、システムなどの間で相互に置換したものもまた、本発明の態様として有効である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、新規な乳酸除去技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１（Ａ）〜図１（Ｄ）は、実施の形態に係る乳酸の除去方法を説明するための模式図である。
【図２】乳酸吸着剤として層状複水酸化物および層状複酸化物を用いた場合における、乳酸およびグルコースの水溶液での乳酸吸着剤の乳酸吸着率およびグルコース吸着率を示す図である。
【図３】乳酸吸着剤として層状複水酸化物および層状複酸化物を用いた場合における、細胞培養液での乳酸吸着剤の乳酸吸着率およびグルコース吸着率を示す図である。
【図４】図４（Ａ）は、乳酸吸着剤として層状複水酸化物を用いた場合における、乳酸およびグルコースの水溶液での乳酸吸着剤の乳酸吸着率およびグルコース吸着率を示す図である。図４（Ｂ）は、乳酸吸着剤として層状複水酸化物を用いた場合における、細胞培養液での乳酸吸着剤の乳酸吸着率およびグルコース吸着率を示す図である。
【図５】図５（Ａ）は、乳酸吸着剤として弱塩基性陰イオン交換樹脂および強塩基性陰イオン交換樹脂を用いた場合における、乳酸およびグルコースの水溶液での乳酸吸着剤の乳酸吸着率を示す図である。図５（Ｂ）は、乳酸吸着剤としてスチレン系ジメチルアミン型弱塩基性陰イオン交換樹脂および強塩基性陰イオン交換樹脂を用いた場合における、乳酸およびグルコースの水溶液での乳酸吸着剤の乳酸吸着率およびグルコース吸着率を示す図である。
【図６】乳酸吸着剤としてスチレン系ジメチルアミン型弱塩基性陰イオン交換樹脂および強塩基性陰イオン交換樹脂を用いた場合における、細胞培養液での乳酸吸着剤の乳酸吸着率およびグルコース吸着率を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を好適な実施の形態をもとに図面を参照しながら説明する。実施の形態は、発明を限定するものではなく例示であって、実施の形態に記述されるすべての特徴やその組み合わせは、必ずしも発明の本質的なものであるとは限らない。各図面に示される同一又は同等の構成要素、部材、処理には、同一の符号を付するものとし、適宜重複した説明は省略する。また、各図に示す各部の縮尺や形状は、説明を容易にするために便宜的に設定されており、特に言及がない限り限定的に解釈されるものではない。また、本明細書または請求項中に「第１」、「第２」等の用語が用いられる場合には、この用語はいかなる順序や重要度を表すものでもなく、ある構成と他の構成とを区別するためのものである。また、各図面において実施の形態を説明する上で重要ではない部材の一部は省略して表示する。
【００１６】
本発明者らは、乳酸の除去技術について鋭意検討を重ね、乳酸を高選択的に吸着することができる吸着剤を見出した。具体的には、本実施の形態に係る乳酸吸着剤は、層状複水酸化物（Layered Double Hydroxide：ＬＤＨ）、層状複酸化物（Layered Double oxide：ＬＤＯ）、スチレン系ジメチルアミノ基を有する弱塩基性陰イオン交換樹脂、および強塩基性陰イオン交換樹脂からなる群から選択される少なくとも一種の物質を含む。「スチレン系ジメチルアミノ基」とは、スチレン骨格にイオン交換基（官能基）としてジメチルアミノ基が結合した構造を意味する。以下では適宜、スチレン系ジメチルアミノ基を有する弱塩基性陰イオン交換樹脂を、スチレン系ジメチルアミン型弱塩基性陰イオン交換樹脂と称する。他の基を有する陰イオン交換樹脂についても同様である。
【００１７】
層状複水酸化物は、二価金属のＭ（ＯＨ）２におけるＭ２＋の一部がＭ３＋に置換されることにより正電荷を帯びた八面体層のホスト層と、ホスト層の正電荷を補償するアニオンおよび層間水からなるゲスト層と、で構成される。乳酸（乳酸イオン）は、ゲスト層の陰イオンとイオン交換されることで、ＬＤＨに吸着される。
【００１８】
層状複水酸化物は、以下の化学式で表される。
［Ｍ２＋１−ＸＭ３＋ｘ（ＯＨ）２］［Ａｎ−ｘ／ｎ・ｙＨ２Ｏ］
上記式中、Ｍ２＋は、Ｃｕ２＋、Ｍｎ２＋、Ｍｇ２＋、Ｆｅ２＋、Ｃａ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｏ２＋およびＣｄ２＋からなる群から選択される２価の金属イオンである。Ｍ３＋は、Ａｌ３＋、Ｃｒ３＋、Ｆｅ３＋、Ｃｏ３＋、Ｉｎ３＋、Ｍｎ３＋およびＶ３＋からなる群から選択される３価の金属イオンである。Ａｎ−は、ＣＯ３２−、ＳＯ４２−、Ｃｌ−、ＯＨ−、ＳｉＯ４４−、ＳＯ４２−およびＮＯ３−からなる群から選択されるｎ価の陰イオンである。ｘは０．２２〜０．３であり、ｎは１〜３であり、ｙは１〜１２である。
【００１９】
層状複酸化物は、ＬＤＨの酸化物である。ＬＤＯは、ＬＤＨを例えば２００℃〜５００℃で焼成して得られる。ＬＤＯを乳酸水溶液に接触させると、乳酸を層間に吸着した状態でＬＤＨ構造を再生する。
【００２０】
好ましい層状複水酸化物および層状複酸化物としては、Ｃｕ−Ａｌ系ＬＤＨ、Ｃｕ−Ａｌ系ＬＤＯ、Ｍｇ−Ａｌ系ＬＤＨ、Ｍｇ−Ａｌ系ＬＤＯ、Ｎｉ−Ａｌ系ＬＤＨが例示される。前記「系」は、上記化学式におけるＡｎ−の種類を問わないことを意味する。構成する金属イオンや陰イオンの種類が異なる複数種の層状複水酸化物および／または層状複酸化物を混合して用いてもよい。
【００２１】
スチレン系ジメチルアミノ基を有する弱塩基性陰イオン交換樹脂は、好ましくはハイポーラス型またはＭＲ（ｍａｃｒｏ−ｒｅｔｕｃｉｌａｒ：巨大網状）型である。このような弱塩基性陰イオン交換樹脂としては、ハイポーラス型のＷＡ３０（三菱ケミカル社）や、ＭＲ型のＩＲＡ９６ＳＢ（オルガノ社）等が挙げられる。
【００２２】
強塩基性陰イオン交換樹脂としては、スチレン系トリメチルアンモニウム基を有する強塩基性陰イオン交換樹脂や、スチレン系ジメチルエタノールアンモニウム基を有する強塩基性陰イオン交換樹脂が好ましい例として挙げられる。
【００２３】
スチレン系トリメチルアンモニウム型強塩基性陰イオン交換樹脂としては、ゲル型のＳＡ１０Ａ、ＳＡ１２Ａ、ＳＡ１１Ａ、ＮＳＡ１００（全て三菱ケミカル社）や、ポーラス型のＰＡ３０６Ｓ、ＰＡ３０８、ＰＡ３１２、ＰＡ３１６、ＰＡ３１８Ｌ、ＨＰＡ２５（全て三菱ケミカル社）等が挙げられる。スチレン系ジメチルエタノールアンモニウム型強塩基性陰イオン交換樹脂としては、ＳＡ２０Ａ、ＳＡ２１Ａ（全て三菱ケミカル社）や、ＰＡ４０８、ＰＡ４１２、ＰＡ４１８（全て三菱ケミカル社）等が挙げられる。
【００２４】
陰イオン交換樹脂は、その形状により、ゲル型、ポーラス型、ハイポーラス型およびＭＲ型に分類される。ゲル型は、樹脂原料（モノマー）を溶媒中で重合させた重合体であり、均一な三次元構造を有する。ゲル型は、ミクロポアのみを有する。ポーラス型やハイポーラス型は、ゲル型の三次元構造に物理的に孔（マクロポア）を設けた多孔質構造で構成される。ハイポーラス型は、ポーラス型よりも高多孔質である。ＭＲ型は、ゲル型を合成する際の重合方法を改良して作製されたものであり、ゲル型よりも比表面積、細孔容積が大きい。弱塩基性陰イオン交換樹脂は、強塩基性陰イオン交換樹脂に比べて吸着能が低いため、吸着面積の大きいハイポーラス型やＭＲ型が好ましい。一方、強塩基性陰イオン交換樹脂は、弱塩基性陰イオン交換樹脂に比べて吸着能が高いため、ゲル型、ポーラス型、ハイポーラス型およびＭＲ型のいずれの構造であってもよい。
【００２５】
弱塩基性陰イオン交換樹脂および強塩基性陰イオン交換樹脂は、遊離官能基と乳酸イオンとが電気的に相互作用するか、官能基と相互作用している交換イオンと乳酸イオンとがイオン交換することで、乳酸を吸着することができる。上記のＳＡ１０Ａ、ＳＡ１２Ａ、ＳＡ１１Ａ、ＮＳＡ１００、ＰＡ３０６Ｓ、ＰＡ３０８、ＰＡ３１２、ＰＡ３１６、ＰＡ３１８Ｌ、ＨＰＡ２５、ＳＡ２０Ａ、ＳＡ２１Ａ、ＰＡ４０８、ＰＡ４１２およびＰＡ４１８は、交換イオンＣｌ−と乳酸イオンとのイオン交換により、乳酸を吸着する。ＷＡ３０およびＩＲＡ９６ＳＢは、遊離官能基と乳酸イオンとの電気的相互作用により、乳酸を吸着する。乳酸吸着剤は、層状複水酸化物、層状複酸化物、スチレン系ジメチルアミン型弱塩基性陰イオン交換樹脂および強塩基性陰イオン交換樹脂の任意の組み合わせを含有してもよい。
【００２６】
層状複水酸化物、層状複酸化物、スチレン系ジメチルアミノ基を有する弱塩基性陰イオン交換樹脂、および強塩基性陰イオン交換樹脂からなる群から選択される少なくとも一種の物質を含む乳酸吸着剤を乳酸に接触させることで、乳酸をこれらの物質に吸着させることができる。特に、本実施の形態の乳酸吸着剤は、溶液中の乳酸を吸着除去する場合に、好適に用いることができる。この場合、乳酸吸着剤を乳酸含有溶液に接触させることで、溶液中の乳酸を吸着させることができる。これにより、溶液中の乳酸を除去することができる。
【００２７】
また、乳酸吸着剤は、溶液が、グルコースを含有する細胞または微生物の培養液であった場合に、培養液中に残すべきグルコースに比べて除去対象である乳酸を高選択的に吸着することができる。また、乳酸吸着剤は、細胞や微生物に対する毒性が低いものを選択することが好ましい。なお、培養液の種類は特に限定されない。
【００２８】
また、溶液への乳酸吸着剤の添加量、言い換えれば溶液中の乳酸吸着剤の濃度は、好ましくは０．０００５ｇ／ｍＬ超であり、より好ましくは０．００５ｇ／ｍＬ以上である。また、当該添加量は、好ましくは０．２ｇ／ｍＬ未満であり、より好ましくは０．１ｇ／ｍＬ以下である。乳酸吸着剤の添加量を０．０００５ｍｇ／ｍＬ超とすることで、乳酸吸着率をより確実に高めることができる。また、添加量を０．００５ｇ／ｍＬ以上とすることで、水系溶液中で４０％以上の乳酸吸着率を得ることができる。また、培養液中でも１０％以上の乳酸吸着率を得ることができる。これにより、より確実に溶液中の乳酸量を低減させることができる。乳酸吸着率は、溶液中の全乳酸量に対する吸着した乳酸量の割合である。
【００２９】
また、乳酸吸着剤の添加量を０．２ｇ／ｍＬ未満とすることで、グルコース吸着率をより確実に抑制することができる。また、添加量を０．１ｇ／ｍＬ以下とすることで、培養液において２０％以下のグルコース吸着率を得ることができる。また、水系溶液においては、乳酸吸着率に対してグルコース吸着率を１／３程度に抑制することができる。これにより、乳酸吸着剤に起因するグルコース量の低減をより確実に抑制することができる。よって、より効率よく細胞等を培養することができる。グルコース吸着率は、溶液中の全グルコース量に対する吸着したグルコース量の割合である。
【００３０】
培養液を用いて培養される細胞および微生物は、特に限定されない。例えば培養細胞は、ヒトｉＰＳ細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒトＭｕｓｅ細胞等の多能性幹細胞；間葉系幹細胞（ＭＳＣ細胞）、ネフロン前駆細胞等の体性幹細胞；ヒト近位尿細管上皮細胞、ヒト遠位尿細管上皮細胞、ヒト集合管上皮細胞等の組織細胞；ヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ２９３細胞）等の抗体産生細胞株；チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、昆虫細胞（ＳＦ９細胞）等のヒト以外の動物由来の抗体産生細胞株等が挙げられる。これらの細胞は、大量培養が特に望まれる細胞であるため、本実施の形態に係る乳酸吸着剤の使用対象としてより好ましい。
【００３１】
（乳酸の除去方法）
本実施の形態に係る乳酸の除去方法は、上述した乳酸吸着剤を乳酸（乳酸イオン）に接触させることを含む。好ましくは、乳酸を含有する溶液に乳酸吸着剤を接触させることを含む。乳酸吸着剤を乳酸に接触させる方法は特に限定されないが、以下の態様が例示される。図１（Ａ）〜図１（Ｄ）は、実施の形態に係る乳酸の除去方法を説明するための模式図である。以下では、培養液からの乳酸除去を例に挙げて説明するが、他の溶液からの乳酸除去についても同様に実施することができる。
【００３２】
図１（Ａ）に示すように、第１の態様では、カラム等の容器２に乳酸吸着剤４が充填された吸着モジュール６が用意される。容器２は、容器２の内外を連通する入口２ａと出口２ｂとを有する。乳酸吸着剤４は、例えば粒子状である。吸着モジュール６は、循環路８を介して、スピナーフラスコ等の培養容器１０に接続される。循環路８は、培養容器１０と容器２の入口２ａとを接続する往路８ａと、容器２の出口２ｂと培養容器１０とを接続する復路８ｂとを含む。往路８ａの途中には、ポンプ１２が接続される。培養容器１０中には、培養液１４と、細胞１６とが収容される。なお、ポンプ１２は復路８ｂに配置されてもよい。
【００３３】
ポンプ１２が駆動すると、培養液１４は培養容器１０から吸引され、往路８ａを介して吸着モジュール６の容器２内に送られる。容器２内に送り込まれた培養液１４は、復路８ｂを介して培養容器１０内に戻される。培養液１４は、培養容器１０と吸着モジュール６との間を循環する過程で、容器２に充填された乳酸吸着剤４と接触する。このとき、培養液１４中の乳酸は、乳酸吸着剤４に吸着される。この結果、培養液１４中の乳酸が除去される。往路８ａにおける培養容器１０に接続される側の端部には、図示しないフィルタが設けられる。これにより、細胞１６が吸着モジュール６側に流れることが抑制される。なお、培養容器１０と吸着モジュール６との間で培養液１４を循環させる過程で、細胞１６の培養に必要なグルコースやタンパク質等の培地成分が培養液１４に補充されてもよい。
【００３４】
つまり、第１の態様では、乳酸吸着剤４を有する吸着モジュール６と、細胞または微生物、および培養液１４が収容される培養容器１０と、吸着モジュール６と培養容器１０とをつなぎ培養液１４を循環させる循環路８と、を備える培養装置を用いることで、培養液１４中の乳酸が除去される。
【００３５】
図１（Ｂ）に示すように、第２の態様では、培養容器１０の内壁面に乳酸吸着剤４が支持されている。培養容器１０中には、培養液１４と、細胞１６とが収容されている。したがって、培養液１４は、培養容器１０の内壁面において露出する乳酸吸着剤４に接触する。これにより、培養液１４中の乳酸を乳酸吸着剤４に吸着させることができる。培養容器１０としては、スピナーフラスコ、シャーレ、ウェルプレート、セルカルチャーインサート、マイクロスフェア等が例示される。
【００３６】
培養容器１０の内壁面に乳酸吸着剤４を支持させる方法としては、例えば、乳酸吸着剤４を培養容器１０の内壁面に接着させる方法や、培養容器１０が樹脂製である場合には、予め乳酸吸着剤４を混合した樹脂で培養容器１０を成形する方法が挙げられる。つまり、第２の態様では、培養容器１０と、培養容器１０の内壁面に支持される乳酸吸着剤４と、を備える培養装置を用いることで、培養液１４中の乳酸が除去される。
【００３７】
図１（Ｃ）に示すように、第３の態様では、培養容器１０は、多孔質膜等の隔膜１８によって容器内部が上段１０ａと下段１０ｂに区切られた構造を有する。このような培養容器１０としては、セルカルチャーインサートが例示される。上段１０ａには培養液１４と細胞１６が収容され、下段１０ｂには培養液１４と乳酸吸着剤４が収容される。培養液１４は、隔膜１８を通過して上段１０ａと下段１０ｂとの間を行き来することができる。一方、細胞１６および乳酸吸着剤４は、隔膜１８を通過することができない。
【００３８】
このような構造において、培養液１４は、下段１０ｂに収容された乳酸吸着剤４に接触する。これにより、培養液１４中の乳酸を乳酸吸着剤４に吸着させることができる。つまり、第３の態様では、培養容器１０と、乳酸吸着剤４と、培養容器１０内を乳酸吸着剤４が収容される第１空間と細胞１６が収容される第２空間とに区画する隔膜１８と、を備える培養装置を用いることで、培養液１４中の乳酸が除去される。
【００３９】
図１（Ｄ）に示すように、第４の態様では、粒子状の乳酸吸着剤４を培養液１４中に分散、沈降あるいは浮遊させる。これにより、培養液１４中の乳酸を乳酸吸着剤４に吸着させることができる。なお、乳酸吸着剤４は、細胞１６に貪食されることを防ぐために、所定サイズ以上、例えば１０μｍ以上の大きさであることが好ましい。つまり、第４の態様では、培養容器１０と、培養容器１０内の培養液１４に添加される乳酸吸着剤４と、を備える培養装置を用いることで、培養液１４中の乳酸が除去される。
【００４０】
好ましくは、乳酸吸着剤は、ポリビニルアルコールやアルギン酸等の樹脂、コラーゲンやゼラチン等の生体由来ゲル等で被覆される。これにより、細胞等に影響を与え得る微粒子が乳酸吸着剤から培養液中に流出することを抑制することができる。あるいは、乳酸吸着剤は、セラミックスバインダー、樹脂バインダー、生体由来ゲル等と層状複水酸化物および／または層状複酸化物とを混練して成形される。これによっても、微粒子の流出を抑制することができる。セラミックスバインダーとしては、アルミナバインダー、コロイダルシリカ等が例示される。樹脂バインダーとしては、アルギン酸、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース等が例示される。生体由来ゲルとしては、コラーゲン、ゼラチン等が例示される。
【００４１】
溶液中の乳酸濃度を検出する場合、その検出方法は特に限定されないが、培地成分アナライザーを使用することが好ましい。また、所定の測定試薬を用いた比色法、酵素の基質特異性を利用する酵素電極法、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等を利用して、乳酸濃度を検出することができる。
【００４２】
以上説明したように、本実施の形態に係る乳酸吸着剤は、層状複水酸化物、層状複酸化物、スチレン系ジメチルアミノ基を有する弱塩基性陰イオン交換樹脂、および強塩基性陰イオン交換樹脂からなる群から選択される少なくとも一種の物質を含む。また、本実施の形態に係る乳酸の除去方法は、この乳酸吸着剤を、乳酸に接触させることを含む。これにより、従来の透析技術を用いて乳酸を除去する場合とは異なり、莫大な量の溶液を使用せずに乳酸を除去することができる。したがって、本実施の形態によれば、低コストに乳酸を除去できる新規な乳酸除去技術を提供することができる。また、乳酸吸着剤を乳酸含有溶液に接触させるだけで乳酸を除去できるため、本実施の形態によれば培養装置の構造の簡略化を図ることができる。
【００４３】
また、溶液が細胞等の培養液である場合には、従来の透析技術に比べて培養液の使用量を減らすことができる。一般的に培養液は高価であるため、より一層の低コスト化が可能である。また、乳酸の除去により細胞等を高密度に大量培養することができる。また、乳酸によって培地のｐＨが低下することも抑制できるため、この点でも細胞を高密度に大量培養することが可能となる。さらに、細胞が多能性幹細胞である場合には、乳酸の除去によって細胞の高密度大量培養が可能となることに加え、細胞が未分化の状態、つまり細胞の多分化能（分化多能性）を維持することができる。したがって、生体物質生産や分化誘導組織作製に好適な細胞を大量に得ることができる。これにより、医薬品製造や再生医療に要するコストを削減することができる。
【００４４】
また、本実施の形態の乳酸吸着剤は、有用成分であるグルコースに対して乳酸を高選択的に吸着することができる。このため、より効率的な細胞培養が可能となる。よって、本実施の形態の乳酸吸着剤は、グルコースを含有する培養液における乳酸の除去に特に有用である。なお、本実施の形態の乳酸吸着剤は、他の細胞老廃物の吸着剤と併用してもよい。
【００４５】
以上、本発明の実施の形態について詳細に説明した。前述した実施の形態は、本発明を実施するにあたっての具体例を示したものにすぎない。実施の形態の内容は、本発明の技術的範囲を限定するものではなく、請求の範囲に規定された発明の思想を逸脱しない範囲において、構成要素の変更、追加、削除等の多くの設計変更が可能である。設計変更が加えられた新たな実施の形態は、組み合わされる実施の形態および変形それぞれの効果をあわせもつ。前述の実施の形態では、このような設計変更が可能な内容に関して、「本実施の形態の」、「本実施の形態では」等の表記を付して強調しているが、そのような表記のない内容でも設計変更が許容される。以上の構成要素の任意の組み合わせも、本発明の態様として有効である。
【実施例】
【００４６】
以下、本発明の実施例を説明するが、実施例は本発明を好適に説明するための例示に過ぎず、なんら本発明を限定するものではない。【００４７】
＜層状複水酸化物および層状複酸化物＞
［乳酸吸着剤の合成］
（層状複水酸化物Ｃｕ−Ａｌ  ＬＤＨの合成）
まず、イオン交換水の入った五口丸底フラスコを用意し、窒素流通下において３０℃、３００ｒｐｍの条件で撹拌した。また、１．０ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＯＨ溶液（関東化学社）をイオン交換水に滴下し、ｐＨ８．０に上昇させた。次に、五口丸底フラスコを３０℃、３００ｒｐｍの条件で撹拌しながら、Ｃｕ−Ａｌ混合溶液２５０ｍＬを１０ｍＬ／分の速度でイオン交換水に滴下した。その際、１．０ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＯＨ溶液もフラスコ中に滴下し、水溶液のｐＨを８．０に保持した。Ｃｕ−Ａｌ混合溶液の滴下が終了した後、１時間撹拌し、懸濁液を吸引ろ過した。続いて、ろ液が中性になるまでイオン交換水で洗浄した。得られた生成物を４０℃、４０時間減圧乾燥し、粉砕してＣｕ−Ａｌ  ＬＤＨを得た。【００４８】
（層状複酸化物Ｃｕ−Ａｌ  ＬＤＯの合成）
上述の手順で作製したＣｕ−Ａｌ  ＬＤＨを電気炉で２００℃、４時間仮焼して、Ｃｕ−Ａｌ  ＬＤＯを得た。【００４９】
（層状複酸化物Ｍｇ−Ａｌ  ＬＤＯの合成）
まず、Ｎａ２ＣＯ３水溶液５００ｍＬの入った五口丸底フラスコを用意した。そして、３０℃、３００ｒｐｍの条件で撹拌した。撹拌中に、Ｍｇ−Ａｌ混合溶液５００ｍＬを１５ｍＬ／分の速度でフラスコ中の水溶液に滴下した。その際、１．２５  ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＯＨ水溶液もフラスコ中に滴下し、水溶液のｐＨを１０．５±０．１に保持した。Ｍｇ−Ａｌ混合溶液の滴下が終了した後、１時間撹拌し、懸濁液を吸引ろ過した。得られた生成物を４０℃、４０時間減圧乾燥、粉砕した後、電気炉で５００℃、２時間仮焼して、Ｍｇ−Ａｌ  ＬＤＯを得た。【００５０】
（層状複水酸化物Ｍｇ−Ａｌ  ＬＤＨの合成）
まず、イオン交換水の入った五口丸底フラスコを用意した。そして、窒素流通下において３０℃、３００ｒｐｍの条件で撹拌した。撹拌中に、Ｍｇ−Ａｌ混合溶液５００ｍＬを１５ｍＬ／分の速度でフラスコ中のイオン交換水に滴下した。その際、１．２５  ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＯＨ水溶液もフラスコ中に滴下し、水溶液のｐＨを１０．５±０．１に保持した。Ｍｇ−Ａｌ混合溶液の滴下が終了した後、１時間撹拌し、懸濁液を吸引ろ過した。得られた生成物を４０℃、４０時間減圧乾燥、粉砕して、Ｍｇ−Ａｌ  ＬＤＨを得た。【００５１】
（層状複水酸化物Ｎｉ−Ａｌ  ＬＤＨの合成）
まず、イオン交換水の入った五口丸底フラスコを用意した。そして、窒素流通下において３０℃、３００ｒｐｍの条件で撹拌した。また、１．０ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＯＨ溶液（関東化学社）をイオン交換水に滴下し、ｐＨ１０．５に上昇させた。次に、五口丸底フラスコを３０℃、３００ｒｐｍの条件で撹拌しながら、Ｎｉ−Ａｌ混合溶液２５０ｍＬを１０ｍＬ／分の速度でイオン交換水に滴下した。その際、１．０ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＯＨ溶液もフラスコ中に滴下し、水溶液のｐＨを１０．５に保持した。Ｎｉ−Ａｌ混合溶液の滴下が終了した後、１時間撹拌し、懸濁液を吸引ろ過した。続いて、ろ液が中性になるまでイオン交換水で洗浄した。得られ生成物を４０℃、４０時間減圧乾燥し、粉砕してＮｉ−Ａｌ  ＬＤＨを得た。【００５２】
［乳酸およびグルコースの水溶液（水系溶液）における吸着剤性能の解析１］
乳酸（関東化学社）とグルコース（関東化学社）とを純水に添加し、グルコース濃度１０００ｐｐｍ、乳酸濃度１０ｍＭの水溶液を作製した。さらに、この水溶液に水酸化ナトリウム水溶液を添加し、水溶液のｐＨを７．２に調整した。そして、水溶液２０ｍＬを複数の５０ｍＬ三角フラスコに分注した。また、各種の吸着剤０．５ｇを各フラスコの水溶液に添加した。したがって、吸着剤の濃度は０．０２５ｇ／ｍＬである。そして、３７℃、１５０ｒｐｍで２４時間振とうした。【００５３】
吸着剤には、球状活性炭（ＳＡＣ：クレハ社）、酸化金属（ＭｇＯ：関東化学社）、セラミックス（ＳｉＯ２：関東化学社）、Ｃｕ−Ａｌ  ＬＤＨ、Ｃｕ−Ａｌ  ＬＤＯおよびＭｇ−Ａｌ  ＬＤＯを用いた。【００５４】
２４時間経過後、０．１μｍフィルタで水溶液と吸着剤とを分離した。そして、ＨＰＬＣ（日本分光社）を用いて水溶液中の乳酸濃度およびグルコース濃度を測定した。また、以下の数式に基づいて、各吸着剤における乳酸の吸着率およびグルコースの吸着率を算出した。
吸着率（％）＝［吸着前濃度−吸着後濃度］／吸着前濃度×１００【００５５】
結果を図２に示す。図２は、乳酸吸着剤として層状複水酸化物および層状複酸化物を用いた場合における、乳酸およびグルコースの水溶液での乳酸吸着剤の乳酸吸着率およびグルコース吸着率を示す図である。図２に示すように、吸着剤濃度０．０２５ｇ／ｍＬにおいて、球状活性炭（ＳＡＣ）、酸化金属（ＭｇＯ）およびセラミックス（ＳｉＯ２）は乳酸を全く吸着しなかったのに対し、層状複水酸化物であるＣｕ−Ａｌ  ＬＤＨと、層状複酸化物であるＣｕ−Ａｌ  ＬＤＯおよびＭｇ−Ａｌ  ＬＤＯとでは５０％以上の乳酸吸着率が得られた。このことから、層状複水酸化物および層状複酸化物が優れた乳酸吸着能を有することが確認された。【００５６】
また、球状活性炭（ＳＡＣ）および酸化金属（ＭｇＯ）ではグルコース吸着率が３５％以上であったのに対し、層状複水酸化物および層状複酸化物ではグルコース吸着率が１０％以下であった。このことから、層状複水酸化物および層状複酸化物がグルコースに対して乳酸を高選択的に吸着することが確認された。【００５７】
乳酸吸着剤として好適であることが確認された層状複水酸化物および層状複酸化物のうち、Ｃｕ−Ａｌ  ＬＤＨおよびＭｇ−Ａｌ  ＬＤＯについて、水溶液への添加量を異ならせて上記の吸着試験を実施し、乳酸吸着率およびグルコース吸着率を算出した。添加量（濃度）は、０．０１ｇ（０．０００５ｇ／ｍＬ）、０．１ｇ（０．００５ｇ／ｍＬ）、０．５ｇ（０．０２５ｇ／ｍＬ）、１．０ｇ（０．０５ｇ／ｍＬ）、２．０ｇ（０．１ｇ／ｍＬ）とした。結果を図２に示す。【００５８】
図２に示すように、いずれの吸着剤濃度においても乳酸を吸着できることが確認された。また、濃度が０．０００５ｇ／ｍＬ超、さらには０．００５ｇ／ｍＬ以上のときに、より良好な乳酸吸着率が得られることが確認された。また、吸着剤の濃度が増加するにつれて乳酸吸着率は上昇するが、同時にグルコース吸着率も上昇する傾向にあることが確認された。しかしながら、Ｃｕ−Ａｌ  ＬＤＨでは、グルコース吸着率が最大の３３．７％であった吸着剤濃度０．１ｇ／ｍＬにおいても、乳酸吸着率はその３倍近い値であった。同様に、Ｍｇ−Ａｌ  ＬＤＯでも、グルコース吸着率が最大の２７．３％であった吸着剤濃度０．１ｇ／ｍＬにおいて、乳酸吸着率はその３倍近い値であった。このことから、層状複水酸化物および層状複酸化物がグルコースに対して乳酸を高選択的に吸着することが確認された。【００５９】
［細胞培養液における吸着剤性能の解析１］
多能性幹細胞用培地（ＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０２Ｎ：味の素社）に乳酸ナトリウム（富士フイルム和光純薬社）を添加し、グルコース濃度２５０ｍｇ／ｍＬ、乳酸濃度１０ｍＭの培地を作製した。この培地２０ｍＬを複数の５０ｍＬチューブ（ThermoFisher Scientific社）に分注した。また、各種の吸着剤を各チューブの培地に添加した。吸着剤には、Ｃｕ−Ａｌ  ＬＤＨ、Ｃｕ−Ａｌ  ＬＤＯおよびＭｇ−Ａｌ  ＬＤＯを用いた。吸着剤の添加量（濃度）は、０．０１ｇ（０．０００５ｇ／ｍＬ）、０．１ｇ（０．００５ｇ／ｍＬ）、０．５ｇ（０．０２５ｇ／ｍＬ）、１．０ｇ（０．０５ｇ／ｍＬ）、２．０ｇ（０．１ｇ／ｍＬ）、４．０ｇ（０．２ｇ／ｍＬ）とした。そして、３７℃、６０回／分で２４時間振とうした。【００６０】
２４時間経過後、０．２２μｍフィルタで培養液と吸着剤とを分離した。そして、血液ガス分析装置（ＡＢＬ８００  ＦＬＥＸ：ラジオメーター社）を用いて、細胞培養液中の乳酸濃度およびグルコース濃度を測定した。また、上記数式に基づいて、各吸着剤における乳酸の吸着率およびグルコースの吸着率を算出した。【００６１】
結果を図３に示す。図３は、乳酸吸着剤として層状複水酸化物および層状複酸化物を用いた場合における、細胞培養液での乳酸吸着剤の乳酸吸着率およびグルコース吸着率を示す図である。図３に示すように、水系溶液の場合に比べて多少は減少するものの、細胞培養液中でも層状複水酸化物および層状複酸化物が乳酸を吸着できることが確認された。特に、吸着剤濃度が０．０００５ｇ／ｍＬ超、さらには０．００５ｇ／ｍＬ以上のときに、より良好な乳酸吸着率が得られることが確認された。また、層状複水酸化物および層状複酸化物ではグルコース吸着率が最大でも２６％であった。このことから、層状複水酸化物および層状複酸化物がグルコースを含む培地中の乳酸除去に好適であることが確認された。【００６２】
細胞培養液中においても、吸着剤濃度が増加するにつれて乳酸吸着率は上昇するが、同時にグルコース吸着率も上昇することが確認された。これに対し、吸着剤濃度が０．２ｇ／ｍＬ未満、さらには０．１ｇ／ｍＬ以下のときに、グルコース吸着率をより良好に低減できることが確認された。【００６３】
［乳酸およびグルコースの水溶液（水系溶液）における吸着剤性能の解析２］
上述の解析１で用いなかった層状複酸化物Ｍｇ−Ａｌ  ＬＤＨおよびＮｉ−Ａｌ  ＬＤＨについて、吸着剤性能の解析を実施した。まず、乳酸ナトリウム（富士フイルム和光純薬社）とグルコース（関東化学社）とをそれぞれ純水に添加し、乳酸濃度１０ｍＭの乳酸水溶液と、グルコース濃度１０００ｐｐｍのグルコース水溶液とを作製した。そして、各水溶液２０ｍＬを別々の５０ｍＬ三角フラスコに分注した。また、各種の吸着剤０．５ｇを各フラスコの水溶液に添加した。したがって、吸着剤の濃度は０．０２５ｇ／ｍＬである。そして、３７℃、１５０ｒｐｍで２４時間振とうした。吸着剤には、Ｍｇ−Ａｌ  ＬＤＨおよびＮｉ−Ａｌ  ＬＤＨを用いた。【００６４】
２４時間経過後、０．１μｍフィルタで水溶液と吸着剤とを分離した。そして、ＨＰＬＣ（日本分光社）を用いて水溶液中の乳酸濃度およびグルコース濃度を測定した。また、上記数式に基づいて、各吸着剤における乳酸の吸着率およびグルコースの吸着率を算出した。【００６５】
結果を図４（Ａ）に示す。図４（Ａ）は、乳酸吸着剤として層状複水酸化物を用いた場合における、乳酸およびグルコースの水溶液での乳酸吸着剤の乳酸吸着率およびグルコース吸着率を示す図である。図４に示すように、吸着剤濃度０．０２５ｇ／ｍＬにおいて、Ｍｇ−Ａｌ  ＬＤＨおよびＮｉ−Ａｌ  ＬＤＨの乳酸吸着率は６７．５％以上と非常に高い値であった。また、Ｍｇ−Ａｌ  ＬＤＨおよびＮｉ−Ａｌ  ＬＤＨのグルコース吸着率は８．７％以下と非常に低い値であった。このことから、層状複水酸化物が優れた乳酸吸着能を有し、且つグルコースに対して乳酸を高選択的に吸着することが確認された。【００６６】
［細胞培養液における吸着剤性能の解析２］
多能性幹細胞用培地（ＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０２Ｎ：味の素社）に乳酸ナトリウム（富士フイルム和光純薬社）を添加し、グルコース濃度２５０ｍｇ／ｍＬ、乳酸濃度１０ｍＭの培地を作製した。この培地１０ｍＬを複数の１５ｍＬチューブ（ThermoFisher Scientific社）に分注した。また、各種の吸着剤を各チューブの培地に添加した。吸着剤には、Ｍｇ−Ａｌ  ＬＤＨおよびＮｉ−Ａｌ  ＬＤＨを用いた。吸着剤の添加量（濃度）は、０．２５ｇ（０．０２５ｇ／ｍＬ）とした。そして、３７℃、６０回／分で２４時間振とうした。【００６７】
２４時間経過後、０．２２μｍフィルタで培養液と吸着剤とを分離した。そして、血液ガス分析装置（ＡＢＬ８００  ＦＬＥＸ：ラジオメーター社）を用いて、細胞培養液中の乳酸濃度およびグルコース濃度を測定した。また、上記数式に基づいて、各吸着剤における乳酸の吸着率およびグルコースの吸着率を算出した。【００６８】
結果を図４（Ｂ）に示す。図４（Ｂ）は、乳酸吸着剤として層状複水酸化物を用いた場合における、細胞培養液での乳酸吸着剤の乳酸吸着率およびグルコース吸着率を示す図である。図４（Ｂ）に示すように、水系溶液の場合に比べて多少は減少するものの、細胞培養液中でもＭｇ−Ａｌ  ＬＤＨおよびＮｉ−Ａｌ  ＬＤＨが乳酸を吸着できることが確認された。また、Ｍｇ−Ａｌ  ＬＤＨおよびＮｉ−Ａｌ  ＬＤＨのグルコース吸着率は最大でも８．３％であった。このことから、層状複水酸化物がグルコースを含む培地中の乳酸除去に好適であることが確認された。【００６９】
＜弱塩基性陰イオン交換樹脂および強塩基性陰イオン交換樹脂＞
［乳酸およびグルコースの水溶液（水系溶液）における吸着剤性能の解析１］
乳酸リチウム（富士フィルム和光純薬社）とグルコース（関東化学社）とを純水に添加し、乳酸濃度１０ｍＭ、グルコース濃度１０００ｐｐｍの水溶液を作製した。この水溶液に水酸化ナトリウム水溶液を添加し、水溶液のｐＨを７．２に調整した。そして、水溶液２０ｍＬを複数の５０ｍＬ三角フラスコに分注した。また、各種の吸着剤０．５ｇを各フラスコの水溶液に添加した。したがって、吸着剤の濃度は０．０２５ｇ／ｍＬである。そして、３７℃、１５０ｒｐｍで２４時間振とうした。【００７０】
使用した吸着剤は、以下の通りである。
酸化金属：
α−Ｆｅ２Ｏ３（添川理化学社）
γ−Ｆｅ２Ｏ３（添川理化学社）
Ａｌ２Ｏ３（関東化学社）
Ａｌ（ＯＨ）３（関東化学社）
弱塩基性陰イオン交換樹脂：
スチレン系ポリアミン型  ＷＡ２０（三菱ケミカル社）
スチレン系ジメチルアミン型  ＷＡ３０（三菱ケミカル社）
アクリル系ジメチルアミン型  ＩＲＡ６７（オルガノ社）
スチレン系ジメチルアミン型  ＩＲＡ９６ＳＢ（オルガノ社）
強塩基性陰イオン交換樹脂：
スチレン系トリメチルアンモニウム型  ＳＡ１０Ａ（三菱ケミカル社）
スチレン系ジメチルエタノールアンモニウム型  ＳＡ２０Ａ（三菱ケミカル社）【００７１】
なお、ＷＡ２０はハイポーラス型、ＷＡ３０はハイポーラス型、ＩＲＡ６７はゲル型、ＩＲＡ９６ＳＢはＭＲ型、ＳＡ１０Ａはゲル型、ＳＡ２０Ａはゲル型である。【００７２】
２４時間経過後、０．１μｍフィルタで水溶液と吸着剤とを分離した。そして、ＨＰＬＣ（日本分光社）を用いて水溶液中の乳酸濃度およびグルコース濃度を測定した。また、上記数式に基づいて、各吸着剤における乳酸の吸着率を算出した。【００７３】
結果を図５（Ａ）に示す。図５（Ａ）は、乳酸吸着剤として弱塩基性陰イオン交換樹脂および強塩基性陰イオン交換樹脂を用いた場合における、乳酸およびグルコースの水溶液での乳酸吸着剤の乳酸吸着率を示す図である。図５（Ａ）に示すように、吸着剤濃度０．０２５ｇ／ｍＬにおいて、酸化金属（α−Ｆｅ２Ｏ３、γ−Ｆｅ２Ｏ３、Ａｌ２Ｏ３、Ａｌ（ＯＨ）３）、スチレン系ポリアミン型弱塩基陰イオン交換樹脂（ＷＡ２０）、およびアクリル系ジメチルアミン型弱塩基陰イオン交換樹脂（ＩＲＡ６７）では、乳酸はほとんど吸着されなかった。【００７４】
これに対し、スチレン系ジメチルアミン型弱塩基性陰イオン交換樹脂（ＷＡ３０およびＩＲＡ９６ＳＢ）、スチレン系トリメチルアンモニウム型強塩基性陰イオン交換樹脂（ＳＡ１０Ａ）およびスチレン系ジメチルエタノールアンモニウム型強塩基性陰イオン交換樹脂（ＳＡ２０Ａ）では、２０％以上の良好な乳酸吸着率が得られた。特に、ＷＡ３０、ＳＡ１０ＡおよびＳＡ２０Ａでは、４９％以上のより良好な乳酸吸着率が得られた。これらの結果より、スチレン系ジメチルアミン型弱塩基性陰イオン交換樹脂および強塩基性陰イオン交換樹脂が優れた乳酸吸着能を有することが確認された。【００７５】
［乳酸およびグルコースの水溶液（水系溶液）における吸着剤性能の解析２］
上述の解析１で良好な乳酸吸着能を示したＷＡ３０、ＩＲＡ９６ＳＢ、ＳＡ１０ＡおよびＳＡ２０Ａについて、水溶液への添加量（濃度）を異ならせて上記の吸着試験を実施し、乳酸吸着率およびグルコース吸着率を算出した。濃度は、０．０１ｇ（０．０００５ｇ／ｍＬ）、０．１ｇ（０．００５ｇ／ｍＬ）、０．５ｇ（０．０２５ｇ／ｍＬ）、２．０ｇ（０．１ｇ／ｍＬ）とした。【００７６】
結果を図５（Ｂ）に示す。図５（Ｂ）は、乳酸吸着剤としてスチレン系ジメチルアミン型弱塩基性陰イオン交換樹脂および強塩基性陰イオン交換樹脂を用いた場合における、乳酸およびグルコースの水溶液での乳酸吸着剤の乳酸吸着率およびグルコース吸着率を示す図である。図５（Ｂ）に示すように、いずれの吸着剤濃度においても乳酸を吸着できることが確認された。また、濃度が０．０００５ｇ／ｍＬ超、さらには０．００５ｇ／ｍＬ以上のときに、より良好な乳酸吸着率が得られることが確認された。【００７７】
また、弱塩基性陰イオン交換樹脂（ＷＡ３０およびＩＲＡ９６ＳＢ）では、吸着剤の濃度が増加するにつれて乳酸吸着率は上昇するが、同時にグルコース吸着率も上昇する傾向にあることが確認された。しかしながら、グルコース吸着率が最大の５６％であった吸着剤濃度０．２ｇ／ｍＬにおいても、乳酸吸着率はその１．５倍近い値であった。また、吸着剤濃度０．１ｇ／ｍＬでは、グルコース吸着率に対して乳酸吸着率が２．７倍以上の値に上昇した。したがって、弱塩基性陰イオン交換樹脂では、吸着剤濃度が０．２ｇ／ｍＬ未満、さらには０．１ｇ／ｍＬ以下のときに、乳酸に対する吸着選択性がより向上した。【００７８】
一方、強塩基性陰イオン交換樹脂（ＳＡ１０Ａ、ＳＡ２０Ａ）では、吸着剤の濃度が増加するにつれて乳酸吸着率は上昇するが、グルコース吸着率はほとんど上昇しないことが確認された。グルコース吸着率が最大の４％であった吸着剤濃度０．２ｇ／ｍＬにおいて、乳酸吸着率はその２０倍近い値であった。これらのことから、スチレン系ジメチルアミン型弱塩基性陰イオン交換樹脂および強塩基性陰イオン交換樹脂がグルコースに対して乳酸を高選択的に吸着することが確認された。【００７９】
［細胞培養液における吸着剤性能の解析］
多能性幹細胞用培地（ＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０２Ｎ：味の素社）に乳酸ナトリウム（富士フイルム和光純薬社）を添加し、グルコース濃度２５０ｍｇ／ｍＬ、乳酸濃度１０ｍＭの培地を作製した。この培地１０ｍＬを複数の１５ｍＬチューブ（ThermoFisher Scientific社）に分注した。また、各種の吸着剤を各チューブの培地に添加した。吸着剤には、ＷＡ３０およびＳＡ１０Ａを用いた。吸着剤の添加量（濃度）は、０．００５ｇ（０．０００５ｇ／ｍＬ）、０．０５ｇ（０．００５ｇ／ｍＬ）、０．２５ｇ（０．０２５ｇ／ｍＬ）、０．５ｇ（０．０５ｇ／ｍＬ）、１．０ｇ（０．１ｇ／ｍＬ）、２．０ｇ（０．２ｇ／ｍＬ）とした。そして、３７℃、６０回／分で２４時間振とうした。【００８０】
２４時間経過後、０．２２μｍフィルタで培養液と吸着剤とを分離した。そして、血液ガス分析装置（ＡＢＬ８００  ＦＬＥＸ：ラジオメーター社）を用いて、細胞培養液中の乳酸濃度およびグルコース濃度を測定した。また、上記数式に基づいて、各吸着剤における乳酸の吸着率およびグルコースの吸着率を算出した。【００８１】
結果を図６に示す。図６は、乳酸吸着剤としてスチレン系ジメチルアミン型弱塩基性陰イオン交換樹脂および強塩基性陰イオン交換樹脂を用いた場合における、細胞培養液での乳酸吸着剤の乳酸吸着率およびグルコース吸着率を示す図である。図６に示すように、水系溶液の場合に比べて多少は減少するものの、細胞培養液中でもスチレン系ジメチルアミン型弱塩基性陰イオン交換樹脂（ＷＡ３０）および強塩基性陰イオン交換樹脂（ＳＡ１０Ａ）が乳酸を吸着できることが確認された。特に、吸着剤濃度が０．０００５ｇ／ｍＬ超、さらには０．００５ｇ／ｍＬ以上、さらには０．０２５ｇ／ｍＬ以上のときに、より良好な乳酸吸着率が得られることが確認された。また、スチレン系ジメチルアミン型弱塩基性陰イオン交換樹脂および強塩基性陰イオン交換樹脂ではグルコース吸着率が最大でも２５％であった。このことから、スチレン系ジメチルアミン型弱塩基性陰イオン交換樹脂および強塩基性陰イオン交換樹脂がグルコースを含む培地中の乳酸除去に好適であることが確認された。【００８２】
細胞培養液中においても、吸着剤濃度が増加するにつれて乳酸吸着率は上昇するが、同時にグルコース吸着率も上昇することが確認された。これに対し、吸着剤濃度が０．２ｇ／ｍＬ未満、さらには０．１ｇ／ｍＬ以下のときに、グルコース吸着率をより良好に低減できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明は、乳酸吸着剤および乳酸の除去方法に利用することができる。
【符号の説明】
【００８４】
２  容器、  ４  乳酸吸着剤、  ６  吸着モジュール、  ８  循環路、  １０  培養容器、  １２  ポンプ、  １４  培養液、  １６  細胞、  １８  隔膜。
【図１】
2020050068.tif 000003
【図２】
2020050068.tif 000004
【図３】
2020050068.tif 000005
【図４】
2020050068.tif 000006
【図５】
2020050068.tif 000007
【図６】
2020050068.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】令和2年6月15日(2020.6.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
層状複水酸化物、層状複酸化物、スチレン系ジメチルアミノ基を有する弱塩基性陰イオン交換樹脂、およびゲル型のスチレン系トリメチルアンモニウム基を有する強塩基性陰イオン交換樹脂からなる群から選択される少なくとも一種の物質を含み、
乳酸およびグルコースを含有する溶液に接触して、前記溶液中の乳酸を吸着することを特徴とする乳酸吸着剤。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
前記溶液は、細胞または微生物の培養液である請求項１に記載の乳酸吸着剤。
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
前記弱塩基性陰イオン交換樹脂は、ハイポーラス型またはＭＲ型である請求項１または３に記載の乳酸吸着剤。
【請求項６】
前記溶液への添加量は、０．０００５ｇ／ｍＬ超０．２ｇ／ｍＬ未満である請求項１，３および５のいずれか１項に記載の乳酸吸着剤。
【請求項７】
請求項１，３，５および６のいずれか１項に記載の乳酸吸着剤を乳酸に接触させることを含むことを特徴とする乳酸の除去方法。
【手続補正書】
【提出日】令和2年10月16日(2020.10.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
層状複水酸化物および層状複酸化物からなる群から選択される少なくとも一種の物質を含み、
乳酸およびグルコースを含有する溶液に接触して、前記溶液中の乳酸を吸着することを特徴とする乳酸吸着剤。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
前記溶液は、細胞または微生物の培養液である請求項１に記載の乳酸吸着剤。
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
層状複水酸化物、層状複酸化物およびスチレン系ジメチルアミノ基を有する弱塩基性陰イオン交換樹脂からなる群から選択される少なくとも一種の物質を含み、
乳酸およびグルコースを含有する、細胞または微生物の培養液に接触して、前記培養液中の乳酸を吸着することを特徴とする乳酸吸着剤。
【請求項６】
前記弱塩基性陰イオン交換樹脂は、ハイポーラス型またはＭＲ型である請求項５に記載の乳酸吸着剤。
【請求項７】
前記溶液への添加量は、０．０００５ｇ／ｍＬ超０．２ｇ／ｍＬ未満である請求項１，３，５および６のいずれか１項に記載の乳酸吸着剤。
【請求項８】
請求項１，３，５，６および７のいずれか１項に記載の乳酸吸着剤を乳酸に接触させることを含むことを特徴とする乳酸の除去方法。
【手続補正書】
【提出日】令和3年3月1日(2021.3.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
層状複水酸化物および層状複酸化物からなる群から選択される少なくとも一種の物質を含み、
乳酸およびグルコースを含有する溶液に接触して、前記溶液中の乳酸を吸着することを特徴とする乳酸吸着剤。
【請求項２】
前記溶液は、細胞または微生物の培養液である請求項１に記載の乳酸吸着剤。
【請求項３】
層状複水酸化物、層状複酸化物およびスチレン系ジメチルアミノ基を有する弱塩基性陰イオン交換樹脂からなる群から選択される少なくとも一種の物質を含み、
乳酸およびグルコースを含有する、細胞または微生物の培養液に接触して、前記培養液中の乳酸を吸着することを特徴とする乳酸吸着剤。
【請求項４】
前記弱塩基性陰イオン交換樹脂は、ハイポーラス型またはＭＲ型である請求項３に記載の乳酸吸着剤。
【請求項５】
添加量は、０．０００５ｇ／ｍＬ超０．２ｇ／ｍＬ未満である請求項１乃至４のいずれか１項に記載の乳酸吸着剤。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれか１項に記載の乳酸吸着剤を乳酸に接触させることを含むことを特徴とする乳酸の除去方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
スチレン系ジメチルアミノ基を有する弱塩基性陰イオン交換樹脂は、好ましくはハイポーラス型またはＭＲ（ｍａｃｒｏ−ｒｅｔｉｃｕｌａｒ：巨大網状）型である。このような弱塩基性陰イオン交換樹脂としては、ハイポーラス型のＷＡ３０（三菱ケミカル社）や、ＭＲ型のＩＲＡ９６ＳＢ（オルガノ社）等が挙げられる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
また、溶液への乳酸吸着剤の添加量、言い換えれば溶液中の乳酸吸着剤の濃度は、好ましくは０．０００５ｇ／ｍＬ超であり、より好ましくは０．００５ｇ／ｍＬ以上である。また、当該添加量は、好ましくは０．２ｇ／ｍＬ未満であり、より好ましくは０．１ｇ／ｍＬ以下である。乳酸吸着剤の添加量を０．０００５ｇ／ｍＬ超とすることで、乳酸吸着率をより確実に高めることができる。また、添加量を０．００５ｇ／ｍＬ以上とすることで、水系溶液中で４０％以上の乳酸吸着率を得ることができる。また、培養液中でも１０％以上の乳酸吸着率を得ることができる。これにより、より確実に溶液中の乳酸量を低減させることができる。乳酸吸着率は、溶液中の全乳酸量に対する吸着した乳酸量の割合である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
好ましくは、乳酸吸着剤は、ポリビニルアルコール等の樹脂、コラーゲンやアルギン酸、ゼラチン等の生体由来ゲル等で被覆される。これにより、細胞等に影響を与え得る微粒子が乳酸吸着剤から培養液中に流出することを抑制することができる。あるいは、乳酸吸着剤は、セラミックスバインダー、樹脂バインダー、生体由来ゲル等と層状複水酸化物および／または層状複酸化物とを混練して成形される。これによっても、微粒子の流出を抑制することができる。セラミックスバインダーとしては、アルミナバインダー、コロイダルシリカ等が例示される。樹脂バインダーとしては、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース等が例示される。生体由来ゲルとしては、コラーゲン、アルギン酸、ゼラチン等が例示される。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
［細胞培養液における吸着剤性能の解析１］
多能性幹細胞用培地（ＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０２Ｎ：味の素社）に乳酸ナトリウム（富士フイルム和光純薬社）を添加し、グルコース濃度２５０ｍｇ／ｄＬ、乳酸濃度１０ｍＭの培地を作製した。この培地２０ｍＬを複数の５０ｍＬチューブ（ThermoFisher Scientific社）に分注した。また、各種の吸着剤を各チューブの培地に添加した。吸着剤には、Ｃｕ−Ａｌ  ＬＤＨ、Ｃｕ−Ａｌ  ＬＤＯおよびＭｇ−Ａｌ  ＬＤＯを用いた。吸着剤の添加量（濃度）は、０．０１ｇ（０．０００５ｇ／ｍＬ）、０．１ｇ（０．００５ｇ／ｍＬ）、０．５ｇ（０．０２５ｇ／ｍＬ）、１．０ｇ（０．０５ｇ／ｍＬ）、２．０ｇ（０．１ｇ／ｍＬ）、４．０ｇ（０．２ｇ／ｍＬ）とした。そして、３７℃、６０回／分で２４時間振とうした。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
［乳酸およびグルコースの水溶液（水系溶液）における吸着剤性能の解析２］
上述の解析１で用いなかった層状複水酸化物Ｍｇ−Ａｌ  ＬＤＨおよびＮｉ−Ａｌ  ＬＤＨについて、吸着剤性能の解析を実施した。まず、乳酸ナトリウム（富士フイルム和光純薬社）とグルコース（関東化学社）とをそれぞれ純水に添加し、乳酸濃度１０ｍＭの乳酸水溶液と、グルコース濃度１０００ｐｐｍのグルコース水溶液とを作製した。そして、各水溶液２０ｍＬを別々の５０ｍＬ三角フラスコに分注した。また、各種の吸着剤０．５ｇを各フラスコの水溶液に添加した。したがって、吸着剤の濃度は０．０２５ｇ／ｍＬである。そして、３７℃、１５０ｒｐｍで２４時間振とうした。吸着剤には、Ｍｇ−Ａｌ  ＬＤＨおよびＮｉ−Ａｌ  ＬＤＨを用いた。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
結果を図４（Ａ）に示す。図４（Ａ）は、乳酸吸着剤として層状複水酸化物を用いた場合における、乳酸およびグルコースの水溶液での乳酸吸着剤の乳酸吸着率およびグルコース吸着率を示す図である。図４（Ａ）に示すように、吸着剤濃度０．０２５ｇ／ｍＬにおいて、Ｍｇ−Ａｌ  ＬＤＨおよびＮｉ−Ａｌ  ＬＤＨの乳酸吸着率は６７．５％以上と非常に高い値であった。また、Ｍｇ−Ａｌ  ＬＤＨおよびＮｉ−Ａｌ  ＬＤＨのグルコース吸着率は８．７％以下と非常に低い値であった。このことから、層状複水酸化物が優れた乳酸吸着能を有し、且つグルコースに対して乳酸を高選択的に吸着することが確認された。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
［細胞培養液における吸着剤性能の解析２］
多能性幹細胞用培地（ＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０２Ｎ：味の素社）に乳酸ナトリウム（富士フイルム和光純薬社）を添加し、グルコース濃度２５０ｍｇ／ｄＬ、乳酸濃度１０ｍＭの培地を作製した。この培地１０ｍＬを複数の１５ｍＬチューブ（ThermoFisher Scientific社）に分注した。また、各種の吸着剤を各チューブの培地に添加した。吸着剤には、Ｍｇ−Ａｌ  ＬＤＨおよびＮｉ−Ａｌ  ＬＤＨを用いた。吸着剤の添加量（濃度）は、０．２５ｇ（０．０２５ｇ／ｍＬ）とした。そして、３７℃、６０回／分で２４時間振とうした。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７３】
結果を図５（Ａ）に示す。図５（Ａ）は、乳酸吸着剤として弱塩基性陰イオン交換樹脂および強塩基性陰イオン交換樹脂を用いた場合における、乳酸およびグルコースの水溶液での乳酸吸着剤の乳酸吸着率を示す図である。図５（Ａ）に示すように、吸着剤濃度０．０２５ｇ／ｍＬにおいて、酸化金属（α−Ｆｅ２Ｏ３、γ−Ｆｅ２Ｏ３、Ａｌ２Ｏ３、Ａｌ（ＯＨ）３）、スチレン系ポリアミン型弱塩基性陰イオン交換樹脂（ＷＡ２０）、およびアクリル系ジメチルアミン型弱塩基性陰イオン交換樹脂（ＩＲＡ６７）では、乳酸はほとんど吸着されなかった。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
［細胞培養液における吸着剤性能の解析］
多能性幹細胞用培地（ＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０２Ｎ：味の素社）に乳酸ナトリウム（富士フイルム和光純薬社）を添加し、グルコース濃度２５０ｍｇ／ｄＬ、乳酸濃度１０ｍＭの培地を作製した。この培地１０ｍＬを複数の１５ｍＬチューブ（ThermoFisher Scientific社）に分注した。また、各種の吸着剤を各チューブの培地に添加した。吸着剤には、ＷＡ３０およびＳＡ１０Ａを用いた。吸着剤の添加量（濃度）は、０．００５ｇ（０．０００５ｇ／ｍＬ）、０．０５ｇ（０．００５ｇ／ｍＬ）、０．２５ｇ（０．０２５ｇ／ｍＬ）、０．５ｇ（０．０５ｇ／ｍＬ）、１．０ｇ（０．１ｇ／ｍＬ）、２．０ｇ（０．２ｇ／ｍＬ）とした。そして、３７℃、６０回／分で２４時間振とうした。
【国際調査報告】
2020050068.tif 000009
2020050068.tif 000010
2020050068.tif 000011
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