(57)【要約】  本発明の課題は、多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞から原始腸管細胞を製造する方法であって、高い品質を有する膵臓β細胞を製造することを可能とするような上記方法を提供することである。本発明によれば、多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤の非存在下において培養する工程を含む、原始腸管細胞（ＰＧＴ）の製造方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤の非存在下において培養する工程を含む、原始腸管細胞（ＰＧＴ）の製造方法。
【請求項２】
多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤の非存在下において培養する工程が、ＦＧＦ２の非存在下である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤の非存在下において培養する工程が、ヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル阻害剤の非存在下である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤の非存在下において培養する工程が、ＴＧＦβシグナル阻害剤の非存在下である、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤の非存在下において培養する工程が、前記内胚葉系細胞を、インスリン、トランスフェリン及び亜セレン酸を含む培地において培養する工程である、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
多能性幹細胞から誘導された内胚葉系細胞を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤の非存在下において培養する工程が、前記内胚葉系細胞を、Ｂ２７（登録商標）サプリメント及び／又はＦＧＦ７を含む培地において培養する工程である、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞が、多能性幹細胞集団を、ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地で培養した後、ＦＧＦ２及びＢＭＰ４を添加していない培地で培養することにより分化誘導された内胚葉系細胞である、請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞を骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤、レチノイン酸又はそのアナログ、ＴＧＦ−βシグナル阻害剤ならびにヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル阻害剤の存在下において培養することにより製造された原始腸管細胞（ＰＧＴ）と比較して、ＫＩＴ遺伝子、ＲＡＰ１Ａ遺伝子、ＦＧＦ１１遺伝子、ＦＧＦＲ４遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子発現が向上、及び／又はＭＤＭ２遺伝子、ＣＡＳＰ３遺伝子、ＣＤＫ１遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子発現が減少している、原始腸管細胞（ＰＧＴ）。
【請求項９】
前記原始腸管細胞が、多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞を骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤、レチノイン酸又はそのアナログ、ＴＧＦ−βシグナル阻害剤ならびにヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル阻害剤の存在下において培養することにより製造された原始腸管細胞（ＰＧＴ）と比較して、ＩＧＦＢＰ３遺伝子、ＰＴＧＤＲ遺伝子、ＬＯＸ遺伝子、ＰＡＰＰＡ遺伝子、ＲＡＢ３１遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子が向上している細胞である、請求項８に記載の原始腸管細胞（ＰＧＴ）。
【請求項１０】
前記原始腸管細胞が、多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞を骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤、レチノイン酸又はそのアナログ、ＴＧＦ−βシグナル阻害剤ならびにヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル阻害剤の存在下において培養することにより製造された原始腸管細胞（ＰＧＴ）と比較して、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＣＤ４７遺伝子、ＣＤＣ４２ＥＰ３遺伝子、ＣＬＤＮ１８遺伝子、ＣＬＩＣ５遺伝子、ＰＨＬＤＡ１遺伝子、ＳＫＡＰ２遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子が減少している細胞である、請求項８又は９に記載の原始腸管細胞（ＰＧＴ）。
【請求項１１】
多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞と比較して、ＩＧＦＢＰ３遺伝子、ＰＴＧＤＲ遺伝子、ＰＡＰＰＡ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子発現が向上しているか、及び／又はＡＮＧＰＴ２遺伝子及びＦＲＺＢ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が減少している、原始腸管細胞（ＰＧＴ）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、原始腸管細胞の製造方法、及び原始腸管細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療は、ドナー不足を課題とする臓器移植の代替法や難病の新たな治療法開発などにおいて大きな期待が寄せられている。胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は多能性及び無限増殖性を有しているため、再生医療に必要とされる細胞を調製するための細胞ソースとして期待されている。これらの多能性幹細胞を用いた再生医療の実用化に際しては、多能性幹細胞を効率よく目的の体細胞に分化誘導させる技術の確立が必要であり、多様な分化誘導方法について報告されている。【０００３】
例えば、膵臓β細胞は、糖尿病の細胞治療において有用であることから、多能性幹細胞から効率よく膵臓β細胞を作製する方法が検討されている。非特許文献１には、ヒトｉＰＳ細胞から機能的な膵臓β細胞を生成するためのプロセスについての総説が記載されている。非特許文献２には、ヒトｉＰＳ細胞から機能的な膵臓β細胞を効率よく生成する方法が記載されている。非特許文献２においては、ステージ１においてｉＰＳ細胞を内胚葉系細胞に分化させた後、ステージ２において、内胚葉系細胞を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤であるＤｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、ヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル阻害剤であるＳＡＮＴ１、ＴＧＦβシグナル阻害剤であるＳＢ４３１５４２、及びＦＧＦ２を含む培地中において培養することにより、原始腸管細胞（ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｇｕｔ：ＰＧＴ）へと分化誘導している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｌａｒｒｙ  Ｓａｉ  Ｗｅｎｇ  Ｌｏｏ  ＭＳｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｏｂｅｓ  Ｍｅｔａｂ．２０１８：２０−３−１３
【非特許文献２】Ｓｈｉｇｅｈａｒｕ  Ｇ．Ｙａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２０１７  Ｆｅｂ；９（２）：１６８−１７９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記した通り、多能性幹細胞から膵臓β細胞を分化誘導するための培養方法は報告されているが、細胞治療製剤としての治療効果の観点から、より分化誘導の効率を向上させ、膵臓β細胞としての細胞の品質を高める必要がある。【０００６】
従って、本発明は、多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞から原始腸管細胞を製造する方法であって、内胚葉系細胞から効率的に原始腸管細胞を製造することを可能とするような方法、及び高い品質を有する膵臓β細胞を製造することを可能とするような上記方法を提供することを解決すべき課題とした。さらに、本発明は、細胞治療製剤として、最適な膵臓β細胞へと分化可能な原始腸管細胞を提供することを、解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤の非存在下において培養することによって原始腸管細胞を製造できることを見出した。さらに、本発明者らは、得られた原始腸管細胞から分化誘導して製造した膵臓β細胞が、糖尿病モデルマウスにおいて優れた血糖値正常化作用を示したことより、本発明による原始腸管細胞が、高い治療効果を発揮できる膵臓β細胞へ分化可能であるという点において、従来の原始腸管細胞と比較して優れていることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて完成したものである。【０００８】
すなわち、本明細書によれば、以下の発明が提供される。
＜１＞  多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤の非存在下において培養する工程を含む、原始腸管細胞（ＰＧＴ）の製造方法。
＜１−１＞  多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞を、原始腸管細胞（ＰＧＴ）への分化誘導に適した培養条件下、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤の非存在下において培養する工程を含む、原始腸管細胞（ＰＧＴ）の製造方法。
＜２＞  多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤の非存在下において培養する工程が、ＦＧＦ２の非存在下である、＜１＞に記載の方法。
＜３＞  多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤の非存在下において培養する工程が、ヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル阻害剤の非存在下である、＜１＞又は＜２＞に記載の方法。
＜４＞  多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤の非存在下において培養する工程が、ＴＧＦβシグナル阻害剤の非存在下である、＜１＞から＜３＞の何れか一に記載の方法。
＜４Ａ＞  多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤の非存在下において培養する工程が、レチノイン酸又はそのアナログの存在下である、＜１＞から＜４＞の何れか一に記載の方法。
＜５＞  多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤の非存在下において培養する工程が、前記内胚葉系細胞を、インスリン、トランスフェリン及び亜セレン酸を含む培地において培養する工程である、＜１＞から＜４＞の何れか一に記載の方法。
＜６＞  多能性幹細胞から誘導された内胚葉系細胞を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤の非存在下において培養する工程が、前記内胚葉系細胞を、Ｂ２７（登録商標）サプリメント及び／又はＦＧＦ７を含む培地において培養する工程である、＜１＞から＜５＞の何れか一に記載の方法。
＜６Ａ＞  多能性幹細胞から誘導された内胚葉系細胞を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤の非存在下において培養する工程が、前記内胚葉系細胞を、ＦＧＦ受容体シグナル活性化剤を含む培地において培養する工程である、＜１＞から＜６＞の何れか一に記載の方法。
＜６Ｂ＞  ＦＧＦ受容体シグナル活性化剤がＦＧＦ７である、＜６Ａ＞に記載の方法。
＜６Ｃ＞  多能性幹細胞から誘導された内胚葉系細胞を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤の非存在下において培養する工程が、前記内胚葉系細胞を、インスリン受容体シグナル活性化剤を含む培地において培養する工程である、＜１＞から＜６＞、＜６Ａ＞及び＜６Ｂ＞の何れか一に記載の方法。
＜６Ｄ＞  インスリン受容体シグナル活性化剤がインスリンである、＜６Ｃ＞に記載の方法。
＜７＞  多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞が、多能性幹細胞集団を、ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地で培養した後、ＦＧＦ２及びＢＭＰ４を添加していない培地で培養することにより分化誘導された内胚葉系細胞である、＜１＞から＜６＞の何れか一に記載の方法。
＜７Ａ＞  多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞が、以下に示す（ａ）から（ｂ）：
（ａ）多能性幹細胞を２−メルカプトエタノールを含む培地を用いて浮遊培養し、細胞集団を調製する工程、
（ｂ）前記細胞集団を、ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地で培養した後、ＦＧＦ２及びＢＭＰ４を添加していない培地で培養する工程、
により分化誘導された内胚葉系細胞である、＜１＞から＜７＞の何れか一に記載の方法。
＜７Ｂ＞  ２−メルカプトエタノールを含む培地が、アクチビンＡを添加していない培地である、＜７Ａ＞に記載の方法。
＜７Ｃ＞  ２−メルカプトエタノールを含む培地が、ＷＮＴシグナル活性化剤を添加していない培地である、＜７Ａ＞又は＜７Ｂ＞に記載の方法。
＜７Ｄ＞  ２−メルカプトエタノールを含む培地が、ＦＧＦ２を添加していない培地である、＜７Ａ＞から＜７Ｃ＞の何れか一に記載の製造方法。
＜７Ｅ＞  ２−メルカプトエタノールを含む培地が、ＴＧＦβ１を添加していない培地である、＜７Ａ＞から＜７Ｄ＞の何れか一に記載の製造方法。
＜７Ｆ＞  ２−メルカプトエタノールを含む培地が、さらにインスリンを含む培地である＜７Ａ＞から＜７Ｅ＞の何れか一に記載の製造方法。
＜７Ｇ＞  ＦＧＦ２及びＢＭＰ４を添加していない培地が、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム及びエタノールアミンからなる群から選択される少なくとも１種類以上を含む培地である＜７Ａ＞から＜７Ｆ＞の何れか一に記載の製造方法。
＜７Ｈ＞  ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地、及び／又はＦＧＦ２及びＢＭＰ４を添加していない培地が、さらに２−メルカプトエタノールを含む培地である＜７Ａ＞から＜７Ｇ＞の何れか一に記載の方法。【０００９】
＜８＞  多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞を骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤、レチノイン酸又はそのアナログ、ＴＧＦ−βシグナル阻害剤ならびにヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル阻害剤の存在下において培養することにより製造された原始腸管細胞（ＰＧＴ）と比較して、ＫＩＴ遺伝子、ＲＡＰ１Ａ遺伝子、ＦＧＦ１１遺伝子、ＦＧＦＲ４遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子発現が向上、及び／又はＭＤＭ２遺伝子、ＣＡＳＰ３遺伝子、ＣＤＫ１遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子発現が減少している、原始腸管細胞（ＰＧＴ）。
＜９＞  前記原始腸管細胞が、多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞を骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤、レチノイン酸又はそのアナログ、ＴＧＦ−βシグナル阻害剤ならびにヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル阻害剤の存在下において培養することにより製造された原始腸管細胞（ＰＧＴ）と比較して、ＩＧＦＢＰ３遺伝子、ＰＴＧＤＲ遺伝子、ＬＯＸ遺伝子、ＰＡＰＰＡ遺伝子、ＲＡＢ３１遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子が向上している細胞である、＜８＞に記載の原始腸管細胞（ＰＧＴ）。
＜１０＞  前記原始腸管細胞が、多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞を骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤、レチノイン酸又はそのアナログ、ＴＧＦ−βシグナル阻害剤ならびにヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル阻害剤の存在下において培養することにより製造された原始腸管細胞（ＰＧＴ）と比較して、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＣＤ４７遺伝子、ＣＤＣ４２ＥＰ３遺伝子、ＣＬＤＮ１８遺伝子、ＣＬＩＣ５遺伝子、ＰＨＬＤＡ１遺伝子、ＳＫＡＰ２遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子が減少している細胞である、＜８＞又は＜９＞に記載の原始腸管細胞（ＰＧＴ）。
＜１１＞  多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞と比較して、ＩＧＦＢＰ３遺伝子、ＰＴＧＤＲ遺伝子、ＰＡＰＰＡ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子発現が向上しているか、及び／又はＡＮＧＰＴ２遺伝子及びＦＲＺＢ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が減少している、原始腸管細胞（ＰＧＴ）。【００１０】
＜２１＞  原始腸管細胞を含む細胞集団であって、以下に示す（ａ）から（ｄ）の細胞特性を有する細胞集団：
（ａ）前記細胞集団が、β−Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＦＧＦ１１遺伝子の相対発現が０．０１以上であり、
（ｂ）前記細胞集団が、β−Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＦＧＦＲ４遺伝子の相対発現量が０．０３以上であり、
（ｃ）前記細胞集団が、β−Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＣＡＳＰ３遺伝子の相対発現量が０．００６以下であり、
（ｄ）前記細胞集団が、β−Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＣＤＫ１遺伝子の相対発現量が０．０２以下である。【００１１】
＜２２＞  前記細胞集団が、β−Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＲＡＰ１Ａ遺伝子の相対発現量が０．０３以上である、＜２１＞に記載の細胞集団。
＜２３＞  前記細胞集団が、β−Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＫＩＴ遺伝子の相対発現量が０．０５以上である、＜２１＞又は＜２２＞に記載の細胞集団。
＜２４＞  前記細胞集団が、β−Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＭＤＭ２遺伝子の相対発現量が０．０３以下である、＜２１＞から＜２３＞の何れか一に記載の細胞集団。
＜２５＞  前記細胞集団が、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＩＧＦＢＰ３遺伝子の相対発現量が１０以上、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＰＴＧＤＲ遺伝子の発現量が０．６以上、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＬＯＸ遺伝子の相対発現量が０．６以上、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＰＡＰＰＡ遺伝子の相対発現量が０．０１以上、及びＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＲＡＢ３１遺伝子の相対発現量が０．２以上である、＜２１＞からに＜２４＞の何れか一項に記載の細胞集団。
＜２６＞  前記細胞集団が、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＡＮＧＰＴ２遺伝子の相対発現量が０．０００２以下、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＣＤ４７遺伝子の発現量が０．０２以下、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＣＤＣ４２ＥＰ３遺伝子の相対発現量が０．０３以下、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＣＬＤＮ１８遺伝子の相対発現量が０．００６以下、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＣＬＩＣ５遺伝子の相対発現量が０．０００１以下、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＰＨＬＤＡ１遺伝子の相対発現量が０．２以下、及びＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＳＫＡＰ２遺伝子の相対発現量が０．０１以下である、＜２１＞から＜２５＞のいずれか一に記載の細胞集団。
＜２７＞  多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤、ＴＧＦ−βシグナル阻害剤及びヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル阻害剤の存在下において培養することにより製造された原始腸管細胞（ＰＧＴ）と比較して、ＩＧＦＢＰ３遺伝子、ＰＴＧＤＲ遺伝子、ＬＯＸ遺伝子、ＰＡＰＰＡ遺伝子、及びＲＡＢ３１遺伝子のうちの１以上の遺伝子の発現が向上しているか、及び／又はＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＢＭＰＲ１Ｂ遺伝子、ＣＤ４７遺伝子、ＣＤＣ４２ＥＰ３遺伝子、ＣＬＤＮ１８遺伝子、ＣＬＩＣ５遺伝子、ＦＲＺＢ遺伝子、ＩＧＦ２遺伝子、ＰＨＬＤＡ１遺伝子、及びＳＫＡＰ２遺伝子のうちの１以上の遺伝子の発現が減少している、原始腸管細胞（ＰＧＴ）。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の製造方法は、内胚葉系細胞から効率的に原始腸管細胞を製造し、且つ、優れた血糖値正常化作用を示す膵臓β細胞へと分化可能な原始腸管細胞が得られることから、高品質な細胞治療製剤を提供することができる。また、本発明により製造された原始腸管細胞に由来する膵臓β細胞は、優れた血糖値正常化作用を示し、細胞治療製剤として優れた治療効果を有する。さらに、本発明により製造された原始腸管細胞は細胞治療製剤として最適な膵臓β細胞へと分化可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導した原始腸管細胞における原始腸管細胞マーカー遺伝子（ＨＮＦ−１β、ＨＮＦ−４α）の発現を解析した結果を示す。
【図２】図２は、ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導した膵臓β細胞における膵臓β細胞マーカー遺伝子（ＩＮＳ、ＮＫＸ６．１）の発現を解析した結果を示す。
【図３】図３は、糖尿病モデルマウスへの細胞移植実験における随時血糖値の測定結果を示す。
【図４】図４は、ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導した膵臓β細胞における膵臓β細胞マーカー遺伝子（ＩＮＳ）の発現を解析した結果を示す。
【図５】図５は、比較例５及び参考例２と比べて、実施例１で発現向上する遺伝子及び発現減少する遺伝子の定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。
【図６】図６は、比較例５と比べて実施例１でシグナル値が１０倍以上であった遺伝子のマイクロアレイ解析の結果を示す。
【図７】図７は、比較例５と比べて実施例１で発現向上する遺伝子の定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。
【図８】図８は、比較例５と比べて実施例１でシグナル値が１０分の１以下であった遺伝子のマイクロアレイ解析の結果を示す。
【図９】図９は、比較例５と比べて実施例１で発現減少する遺伝子の定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施形態について具体的に説明するが、下記の説明は本発明の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が下記の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も本発明の範囲に含まれる。
【００１５】
［用語の説明］
本発明において、「阻害剤の非存在下において」とは、「当該阻害剤を添加していない培地において」を意味する。
【００１６】
本発明の培地に関して、「を添加していない」という用語は、培養物又は馴化培地において添加していないと特定されたタンパク質、ペプチド及び化合物等の因子を外因的に加えないことを指す。なお、培養物又は馴化培地において添加していないと特定されたタンパク質、ペプチド及び化合物等の因子が培養の連続的な操作により持ち込んでいる場合は、１％未満（体積／体積）、０．５％（体積／体積）未満、０．１％（体積／体積）未満、０．０５％（体積／体積）未満、０．０１％（体積／体積）未満、０．００１％（体積／体積）未満になるように調整する。
【００１７】
遺伝子発現量に関して、「が向上している」という用語は、比較対象となる細胞集団における特定の遺伝子発現量よりも遺伝子の発現が増加していることを指し、比較対象となる細胞集団に対して、１．１倍以上、１．２倍以上、１．３倍以上、１．４倍以上、１．５倍以上、１．６倍以上、１．７倍以上、１．８倍以上、１．９倍以上、２．０倍以上、２．１倍以上、２．２倍以上、２．３倍以上、２．４倍以上、２．５倍以上、２．６倍以上、２．７倍以上、２．８倍以上、２．９倍以上、３．０倍以上、３．１倍以上、３．２倍以上、３．３倍以上、３．４倍以上、３．５倍以上、３．６倍以上、３．７倍以上、３．８倍以上、３．９倍以上、４．０倍以上、４．１倍以上、４．２倍以上、４．３倍以上、４．４倍以上、４．５倍以上、４．６倍以上、４．７倍以上、４．８倍以上、４．９倍以上、５．０倍以上、５．１倍以上、５．２倍以上、５．３倍以上、５．４倍以上、５．５倍以上、５．６倍以上、５．７倍以上、５．８倍以上、５．９倍以上、６．０倍以上、６．１倍以上、６．２倍以上、６．３倍以上、６．４倍以上、６．５倍以上、６．６倍以上、６．７倍以上、６．８倍以上、６．９倍以上、７．０倍以上、７．１倍以上、７．２倍以上、７．３倍以上、７．４倍以上、７．５倍以上、７．６倍以上、７．７倍以上、７．８倍以上、７．９倍以上、８．０倍以上、８．１倍以上、８．２倍以上、８．３倍以上、８．４倍以上、８．５倍以上、８．６倍以上、８．７倍以上、８．８倍以上、８．９倍以上、９．０倍以上、９．１倍以上、９．２倍以上、９．３倍以上、９．４倍以上、９．５倍以上、９．６倍以上、９．７倍以上、９．８倍以上、９．９倍以上、１０倍以上、１１倍以上、１２倍以上、１３倍以上、１４倍以上、１５倍以上、２０倍以上、３０倍以上、４０倍以上、５０倍以上、６０倍以上、７０倍以上、８０倍以上、９０倍以上、１００倍以上、２５０倍以上、４００倍以上、４５０倍以上、５００倍以上、７５０倍以上、１０００倍以上、５０００倍以上、１００００倍以上である。
【００１８】
遺伝子発現量に関して、「が減少している」という用語は、比較対象となる細胞集団における特定の遺伝子発現量よりも遺伝子の発現が減少していることを指し、比較対象となる細胞集団に対して、１．１倍以下、１．２倍以下、１．３倍以下、１．４倍以下、１．５倍以下、１．６倍以下、１．７倍以下、１．８倍以下、１．９倍以下、２．０倍以下、２．１倍以下、２．２倍以下、２．３倍以下、２．４倍以下、２．５倍以下、２．６倍以下、２．７倍以下、２．８倍以下、２．９倍以下、３．０倍以下、３．１倍以下、３．２倍以下、３．３倍以下、３．４倍以下、３．５倍以下、３．６倍以下、３．７倍以下、３．８倍以下、３．９倍以下、４．０倍以下、４．１倍以下、４．２倍以下、４．３倍以下、４．４倍以下、４．５倍以下、４．６倍以下、４．７倍以下、４．８倍以下、４．９倍以下、５．０倍以下、５．１倍以下、５．２倍以下、５．３倍以下、５．４倍以下、５．５倍以下、５．６倍以下、５．７倍以下、５．８倍以下、５．９倍以下、６．０倍以下、６．１倍以下、６．２倍以下、６．３倍以下、６．４倍以下、６．５倍以下、６．６倍以下、６．７倍以下、６．８倍以下、６．９倍以下、７．０倍以下、７．１倍以下、７．２倍以下、７．３倍以下、７．４倍以下、７．５倍以下、７．６倍以下、７．７倍以下、７．８倍以下、７．９倍以下、８．０倍以下、８．１倍以下、８．２倍以下、８．３倍以下、８．４倍以下、８．５倍以下、８．６倍以下、８．７倍以下、８．８倍以下、８．９倍以下、９．０倍以下、９．１倍以下、９．２倍以下、９．３倍以下、９．４倍以下、９．５倍以下、９．６倍以下、９．７倍以下、９．８倍以下、９．９倍以下、１０倍以下、２０倍以下、３０倍以下、４０倍以下、５０倍以下、６０倍以下、７０倍以下、８０倍以下、９０倍以下、１００倍以下、２５０倍以下、４００倍以下、４５０倍以下、５００倍以下、７５０倍以下、１０００倍以下、５０００倍以下、１００００倍以下である。
【００１９】
＜凝集体＞
本発明の凝集体に関して、「凝集塊」、「クラスター」又は「スフェロイド」という用語に言い換えて使用することができ、単細胞に解離していない一群の細胞の集合体を一般的に指す。
【００２０】
＜多能性幹細胞＞
本発明における多能性幹細胞とは、生体を構成する全て又は複数の種類の細胞に分化することができる多分化能（多能性）を有する細胞であって、適切な条件下のインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での培養において多能性を維持したまま無限に増殖を続けることができる細胞をいう。具体的には胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胎児の始原生殖細胞由来の多能性幹細胞（ＥＧ細胞：Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９９８，９５：１３７２６−３１）、精巣由来の多能性幹細胞（ＧＳ細胞：Ｎａｔｕｒｅ．２００８，４５６：３４４−９）、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ；ｉＰＳ細胞）、体性幹細胞（組織幹細胞）などが挙げられる。多能性幹細胞は、好ましくは、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞であり、より好ましくはｉＰＳ細胞である。なお、「胚（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ）」とは、配偶子融合によって導出された胚に加えて、体細胞核移植によって、導出された胚も指す。
【００２１】
ＥＳ細胞としては、任意の温血動物、好ましくは哺乳動物に由来する細胞を使用できる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル、又はヒトが挙げられる。好ましくはヒトに由来する細胞を使用できる。
【００２２】
ＥＳ細胞の具体例としては、着床以前の初期胚を培養することによって樹立した哺乳動物等のＥＳ細胞、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立したＥＳ細胞、及びこれらのＥＳ細胞の染色体上の遺伝子を遺伝子工学の手法を用いて改変したＥＳ細胞が挙げられる。各ＥＳ細胞は当分野で通常実施されている方法や、公知文献に従って調製することができる。 マウスのＥＳ細胞は、１９８１年にエバンスら（Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１５４−６）や、マーチンら（Ｍａｒｔｉｎ  ＧＲ．ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ７８：７６３４−８）によって樹立されている。 ヒトのＥＳ細胞は、１９９８年にトムソンら（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２８２：１１４５−７）によって樹立されており、ＷｉＣｅｌｌ研究施設（ＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｉｃｅｌｌ．ｏｒｇ／、マジソン、ウイスコンシン州、米国）、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）、京都大学などから入手可能であり、例えばＣｅｌｌａｒｔｉｓ社（ウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｌａｒｔｉｓ．ｃｏｍ／、スウェーデン）から購入可能である。
【００２３】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、体細胞を初期化することによって得られる多能性を有する細胞である。ｉＰＳ細胞の作製は、京都大学の山中伸弥教授らのグループ、マサチューセッツ工科大学のルドルフ・ヤニッシュ(Ｒｕｄｏｌｆ Ｊａｅｎｉｓｃｈ)らのグループ、ウイスコンシン大学のジェームス・トムソン（Ｊａｍｅｓ Ｔｈｏｍｓｏｎ）らのグループ、ハーバード大学のコンラッド・ホッケドリンガー（Ｋｏｎｒａｄ Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ）らのグループなどを含む複数のグループが成功している。例えば、国際公開ＷＯ２００７／０６９６６６号公報には、Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子及びＭｙｃファミリー遺伝子の遺伝子産物を含む体細胞の核初期化因子、並びにＯｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、Ｓｏｘファミリー遺伝子及びＭｙｃファミリー遺伝子の遺伝子産物を含む体細胞の核初期化因子が記載されており、さらに体細胞に上記核初期化因子を接触させる工程を含む、体細胞の核初期化により誘導多能性幹細胞を製造する方法が記載されている。
【００２４】
ｉＰＳ細胞の製造に用いる体細胞の種類は特に限定されず、任意の体細胞を用いることができる。即ち、体細胞とは、生体を構成する細胞の内生殖細胞以外の全ての細胞を包含し、分化した体細胞でもよいし、未分化の幹細胞でもよい。体細胞の由来は、哺乳動物、鳥類、魚類、爬虫類、両生類の何れでもよく特に限定されないが、好ましくは哺乳動物（例えば、マウスなどのげっ歯類、又はヒトなどの霊長類）であり、特に好ましくはマウス又はヒトである。また、ヒトの体細胞を用いる場合、胎児、新生児又は成人の何れの体細胞を用いてもよい。体細胞の具体例としては、例えば、線維芽細胞（例えば、皮膚線維芽細胞）、上皮細胞（例えば、胃上皮細胞、肝上皮細胞、肺胞上皮細胞）、内皮細胞（例えば血管、リンパ管）、神経細胞（例えば、ニューロン、グリア細胞）、膵臓細胞、白血球細胞（Ｂ細胞、Ｔ細胞等）、骨髄細胞、筋肉細胞（例えば、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞）、肝実質細胞、非肝実質細胞、脂肪細胞、骨芽細胞、歯周組織を構成する細胞（例えば、歯根膜細胞、セメント芽細胞、歯肉線維芽細胞、骨芽細胞）、腎臓・眼・耳を構成する細胞などが挙げられる。
【００２５】
ｉＰＳ細胞は、所定の培養条件下（例えば、ＥＳ細胞を培養する条件下）において長期にわたって自己複製能を有し、また所定の分化誘導条件下において外胚葉系細胞、中胚葉系細胞又は内胚葉系細胞への何れにも多分化能を有する幹細胞である。また、ｉＰＳ細胞はマウスなどの試験動物に移植した場合にテラトーマを形成する能力を有する幹細胞でもよい。
【００２６】
体細胞からｉＰＳ細胞を製造するためには、まず、少なくとも１種類以上の初期化遺伝子を体細胞に導入する。初期化遺伝子とは、体細胞を初期化してｉＰＳ細胞とする作用を有する初期化因子をコードする遺伝子である。初期化遺伝子の組み合わせの具体例としては、以下の組み合わせをあげることができるが、これらに限定されるものではない。
（ｉ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子、Ｍｙｃ遺伝子
（ｉｉ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子、ＮＡＮＯＧ遺伝子、ＬＩＮ２８遺伝子
（ｉｉｉ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子、Ｍｙｃ遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子、ＳＶ４０  ｌａｒｇｅＴ遺伝子
（ｉｖ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子
【００２７】
上記以外にも、導入遺伝子をさらに減らした方法（Ｎａｔｕｒｅ．２００８  Ｊｕｌ  ３１；４５４（７２０４）：６４６−５０）、低分子化合物を利用した方法（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２００９  Ｊａｎ  ９；４（１）：１６−９、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２００９  Ｎｏｖ  ６；５（５）：４９１−５０３）、遺伝子の代わりに転写因子タンパク質を利用した方法（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２００９  Ｍａｙ  ８；４（５）：３８１−４）などが報告されており、いずれの方法で製造されたｉＰＳ細胞でもよい。
【００２８】
初期化因子の細胞への導入形態は特に限定されないが、例えば、プラスミドを用いた遺伝子導入、合成ＲＮＡの導入、タンパク質として直接導入などが挙げられる。また、ｍｉｃｒｏＲＮＡやＲＮＡ、低分子化合物等を用いた方法で作製されたｉＰＳ細胞を用いてもよい。ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞を始めとする多能性幹細胞は、市販品又は分譲を受けた細胞を用いてもよいし、新たに作製したものを用いてもよい。
【００２９】
ｉＰＳ細胞として、例えば２５３Ｇ１株、２５３Ｇ４株、２０１Ｂ６株、２０１Ｂ７株、４０９Ｂ２株、４５４Ｅ２株、６０６Ａ１株、６１０Ｂ１株、６４８Ａ１株、１２０１Ｃ１株、１２０５Ｄ１株、１２１０Ｂ２株、１２３１Ａ３株、１３８３Ｄ２株、１３８３Ｄ６株、ｉＰＳ−ＴＩＧ１２０−３ｆ７株、ｉＰＳ−ＴＩＧ１２０−４ｆ１株、ｉＰＳ−ＴＩＧ１１４−４ｆ１株、ＲＰＣｈｉＰＳ７７１−２株、１５Ｍ６３株、１５Ｍ６６株、ＨｉＰＳ−ＲＩＫＥＮ−１Ａ株、ＨｉＰＳ−ＲＩＫＥＮ−２Ａ株、ＨｉＰＳ−ＲＩＫＥＮ−１２Ａ株、Ｎｉｐｓ−Ｂ２株、ＴｋＤＮ４−Ｍ株、ＴｋＤＡ３−１株、ＴｋＤＡ３−２株、ＴｋＤＡ３−４株、ＴｋＤＡ３−５株、ＴｋＤＡ３−９株、ＴｋＤＡ３−２０株、ｈｉＰＳＣ ３８−２株、ＭＳＣ−ｉＰＳＣ１株、ＢＪ−ｉＰＳＣ１株等を使用することができる。
【００３０】
ＥＳ細胞として、例えばＫｈＥＳ−１株、ＫｈＥＳ−２株、ＫｈＥＳ―３株、ＫｈＥＳ−４株、ＫｈＥＳ−５株、ＳＥＥＳ１株、ＳＥＥＳ２株、ＳＥＥＳ３株、ＨＵＥＳ８株、ＣｙＴ４９株、Ｈ１株、Ｈ９株、ＨＳ−１８１株等を使用することができる。新たに作製された臨床グレードのｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞を用いてもよい。
【００３１】
＜シグナル及び因子＞
（骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤）
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナルとは、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）リガンドにより媒介されるシグナルであり、脊椎動物において多様な役割を果たす。胚形成の間に、背腹軸は、リガンド、受容体、補助受容体及び可溶性アンタゴニストの協調発現により形成されるＢＭＰシグナル伝達の勾配によって確立される。ＢＭＰは、原腸形成、中胚葉誘導、器官形成及び軟骨性骨形成の重要なレギューレータであり、多能性幹細胞集団の運命を制御する。
【００３２】
ＢＭＰ受容体はＩ型受容体（ａｃｔｉｖｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｋｉｎａｓｅ；ＡＬＫ−１、ＡＬＫ−２、ＡＬＫ−３又はＡＬＫ−６）とＩＩ型受容体（ＡｃｔＲＩＩ、ＡｃｔＲＩＩＢ又はＢＭＰＲＩＩ）の複合体から成り、活性化したＩ型受容体キナーゼはＲ−Ｓｍａｄ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｓｍａｄ）タンパク質のＣ末端に存在する２個のセリン残基をリン酸化する。リガンド（ＢＭＰ）が受容体に結合することによりリン酸化を受けるＲ−Ｓｍａｄ（Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ５、Ｓｍａｄ８）をＢＲ−Ｓｍａｄ（ＢＭＰ Ｒ−Ｓｍａｄ）と呼ばれており、リン酸化を受けた２分子のＲ−ＳｍａｄはＳｍａｄ４とヘテロ三量体を形成し，核内に移行することで標的遺伝子の転写を調節する。
【００３３】
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤とは、リガンド（ＢＭＰ−４など）による受容体への結合から始まるＢＭＰシグナルを阻害する物質であれば特に限定しないが、好ましくはＡＬＫ−１、ＡＬＫ−２、ＡＬＫ−３及びＡＬＫ−６の少なくとも１つを阻害する物質である。また、リガンドが受容体へと結合するのを妨げる物質（アンタゴニスト抗体など）をＢＭＰシグナル阻害剤として用いることができる。
【００３４】
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤としては、特に限定しないが、例えばドルソモルフィン（Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ）、ＬＤＮ１９３１８９、ＬＤＮ−２１４１１７、ＬＤＮ−２１２８５４、Ｋ０２２８８、ＭＬ３４７などを挙げることができる。
【００３５】
（ヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル阻害剤）
ヘッジホッグ（ＨＨ；Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）シグナルは胎児期の細胞増殖因子，形態形成因子として知られている。加えて，成体でのホメオスタシスや組織再生，組織幹細胞の制御にも機能し得ることが示されている。胎児期のＨＨシグナルの異常は，全前脳症などの先天性疾患の原因となり，成体でのＨＨシグナルの持続的活性は皮膚基底細胞癌や髄芽細胞腫を含む様々な癌に関連すると言われている。ヘッジホッグシグナルのリガンドとしては、哺乳類では３種類のＨＨリガンド（ＳＨＨ；Ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ，ＩＨＨ；Ｉｎｄｉａｎ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ，ＤＨＨ；Ｄｅｓｅｒｔ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ）が知られている。ヘッジホッグリガンドが無い状態（オフ状態）では、ヘッジホッグファミリーリガンドに対する受容体のＰａｔｃｈｅｄは、Ｇタンパク質共役型膜貫通タンパク質であるＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（Ｓｍｏ）に正常に結合し、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄの膜への会合を阻害する。このオフ状態では、ＳｕＦｕ及び（脊椎動物におけるＫｉｆ７である）ＣＯＳ２が、第一繊毛において、微小管に結合している転写因子のＧｌｉの集団を隔離する。ＧｌｉはＰＫＡ、ＣＫＩ及びＧＳＫ−３によってリン酸化され、β−ＴｒＣＰを介したＧｌｉ活性化因子（哺乳動物におけるＧｌｉ１及びＧｌｉ２）の分解が起こるか、あるいは、保存された経路においてＧｌｉの抑制因子（ショウジョウバエにおけるＧｌｉ３あるいは短縮されたＣｉ）を産生するが、これがヘッジホッグの標的遺伝子の抑制につながる。活性化状態（オン状態）では、ヘッジホッグリガンドがＰａｔｃｈｅｄに結合することによってβ−Ａｒｒｅｓｔｉｎを介したＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄの第一繊毛への移動が可能になるが、そこでは、これに会合していたＧタンパク質活性が、Ｇｌｉに作用する抑制性のキナーゼ活性を阻害するため、Ｇｌｉを自由に核に移行させて、サイクリンＤ（Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ）、サイクリンＥ（Ｃｙｃｌｉｎ  Ｅ）、Ｍｙｃ及びＰａｔｃｈｅｄなどのヘッジホッグ標的遺伝子を活性化する。
【００３６】
ヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル阻害剤とは、上記ヘッジホッグシグナルを阻害する物質であれば特に限定しないが、例えば、Ｓｍｏに作用してシグナルを阻害する物質などがある。また、ヘッジホッグリガンドがＰａｔｃｈｅｄ等の受容体に結合するのを阻害するアンタゴニスト抗体などもヘッジホッグシグナル阻害剤として使用することができる。
【００３７】
ヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル阻害剤としては、特に限定しないが、例えばＳＡＮＴ１、Ｃｙｃｌｏｐａｍｉｎｅ、Ｓｏｎｉｄｅｇｉｂ、ＰＦ−５２７４８５７、Ｇｌａｓｄｅｇｉｂ、Ｔａｌａｄｅｇｉｂ、ＢＭＳ−８３３９２３、ＭＫ−４１０１、Ｖｉｓｍｏｄｅｇｉｂ、ＧＡＮＴ６１、Ｊｅｒｖｉｎｅ、ＨＰＩ−４などを挙げることができる。例えばＳＡＮＴ−１は細胞透過性の強力なＨＨシグナルのアンタゴニストであり、Ｓｍｏレセプターに直接結合することにより阻害するため、好適に用いることができる。
【００３８】
（ＴＧＦβシグナル阻害剤）
ＴＧＦ−β受容体（ＴＧＦβ）シグナルとは、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）のリガンドが関与するシグナル伝達であり、例えば、細胞の成長、増殖、分化及びアポトーシスなどの細胞プロセスにおいて中心的な役割を担う。ＴＧＦβシグナルは、Ｉ型受容体（ＡＬＫ５）を漸増してリン酸化する、ＩＩ型受容体（セリン／トレオニンキナーゼ）へのＴＧＦβリガンドの結合が関与する。次いで、このＩ型受容体が、ＳＭＡＤ４に結合する受容体制御ＳＭＡＤ（Ｒ−ＳＭＡＤ；例えば、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ８、又はＳＭＡＤ９）をリン酸化し、次いで、このＳＭＡＤ複合体が転写調節において役割を果たす核に入る。
【００３９】
ＴＧＦβシグナル阻害剤とは、上記ＴＧＦβシグナルを阻害する物質であれば特に限定しないが、例えば、ＡＬＫ５に作用してそのリン酸化を阻害するような物質である。また、ＴＧＦβが受容体へと結合するのを阻害するアンタゴニスト抗体などもＴＧＦβシグナル阻害剤として用いることができる。
【００４０】
ＴＧＦβシグナル阻害剤としては、特に限定しないが、例えばＳＢ４３１５４２、Ｇａｌｕｎｉｓｅｒｔｉｂ、ＬＹ２１０９７６１、ＳＢ５２５３３４、ＳＢ５０５１２４、ＧＷ７８８３８８、ＬＹ３６４９４７、ＲｅｐＳｏｘ、ＳＤ−２０８、Ｖａｃｔｏｓｅｒｔｉｂ、ＬＤＮ−２１２８５４などを挙げることができる。
【００４１】
（レチノイン酸）
レチノイン酸とは、ビタミンＡのカルボン酸誘導体で、ａｌｌ−ｔｒａｎｓ ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  (tretinoinトレチノインとも呼ばれる)、９−ｃｉｓ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ （ａｌｉｔｒｅｔｉｎｏｉｎ とも呼ばれる;  ９シスレチノイン酸)、１３−ｃｉｓ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ （ｉｓｏｔｒｅｔｉｎｏｉｎとも呼ばれる; １３シスレチノイン酸)などいくつかの立体異性体が存在する。レチノイン酸は核内受容体の一つであるレチノイン酸受容体（ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ; ＲＡＲ）の天然リガンドとして、生体内におけるレチノイド、カロテノイドの生理活性の主役を担っている。ＲＡＲはレチノイドＸ受容体（ｒｅｔｉｎｏｉｄ Ｘ ｒｅｃｅｐｔｏｒ; ＲＸＲ：リガンドは９ｃｉｓレチノイン酸）とヘテロ二量体を形成し、リガンド誘導性転写因子として、特異的な標的遺伝子群のプロモーターに結合することで標的遺伝子群の発現を正負に転写レベルで制御することが知られている。ビタミンＡとは全く類似しない化学構造を持つ化合物でも、これら特異的な受容体と非常に高い結合親和性を示す合成化合物を含めて、レチノイドと称されている。
【００４２】
（レチノイン酸のアナログ）
レチノイン酸のアナログとしては、レチノイン酸と同様にレチノイン酸受容体（ＰＡＲ）を活性化する物質であれば特に限定しないが、例えば、ＥＣ２３、ＥＣ１９、ＡＣ ２６１０６６、ＡＣ ５５６４９、Ａｄａｐａｌｅｎｅ、ＡＭ ５８０、ＡＭ ８０、ＢＭＳ ７５３、ＢＭＳ ９６１、ＣＤ １５３０、ＣＤ ２３１４、ＣＤ ４３７、Ｃｈ ５５、Ｉｓｏｔｒｅｔｉｎｏｉｎ、Ｔａｚａｒｏｔｅｎｅ、ＴＴＮＰＢなどを挙げることができる。
【００４３】
（インスリン受容体シグナル活性化剤）
インスリン受容体は、肝臓、骨格筋、脂肪組織、神経細胞などに発現しており、インスリン受容体シグナルは、神経回路網の形成、維持、修復に関与することが知られている。インスリンはグルコースや脂質代謝のような重要なエネルギー機能を調節する重要なホルモンであり、インスリン受容体チロシンキナーゼ（ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＩＲ）を活性化し、ＩＲＳ（ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）ファミリーのような異なる基質アダプターのリクルートとリン酸化を行う。チロシンリン酸化されたＩＲＳは多くのシグナルパートナーに結合部位を呈示する。中でも、ＰＩ３Ｋ （ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ  ３−ｋｉｎａｓｅ）は、主に Ａｋｔ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｂ）とＰＫＣ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ）の活性化を介してインスリン機能において重要な役割を果たす。活性化されたＡｋｔは、ＧＳＫ−３（ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ）の阻害を介したｇｌｙｃｏｇｅｎ合成、ｍＴＯＲ（ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｒａｐａ）と下流因子を介したタンパク合成、プロアポトーシス因子（Ｂａｄ、転写因子：Ｆｏｒｋｈｅａｄファミリー、ＧＳＫ−３等）の阻害による細胞生存などを引き起こす。インスリン受容体シグナルはまた、細胞の成長と細胞分裂効果を持ち、それらの効果にはＲａｓ／ＭＡＰＫ経路の活性化と同様に、主にＡｋｔカスケードも関与している。
【００４４】
インスリン受容体シグナル活性化剤とは、上記インスリン受容体シグナルを活性化する物質であれば特に限定しないが、例えば、インスリン受容体並びにＩＧＦ受容体に結合するリガンドが挙げられる。また、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＣ又はＡｋｔを直接又は間接的に活性化するような物質であってもよい。
【００４５】
インスリン受容体シグナル活性化剤としては、好ましくはインスリン、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、ＩＧＦ−２などを挙げることができる。また、ＰＩ３Ｋ活性化剤であるＰＩ３−ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社、製品番号：ｓｃ−３０３６）、７４０  Ｙ−Ｐなどもインスリン受容体シグナル活性化剤として用いることができる。
【００４６】
（ＦＧＦ受容体シグナル活性化剤）
ＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子）受容体シグナルは、ＦＧＦ受容体を介するシグナル伝達であり、ＲＡＳ−ＭＡＰＫ経路やＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ経路に流れ、細胞増殖、細胞死、血管新生、上皮間葉転換（ＥＭＴ）などの様々な細胞機能に関与しており、また、胚発生  及び生後の骨格系の発生の制御において重要な役割を果たす。
【００４７】
ＦＧＦ受容体シグナル活性化剤とは、上記のようなシグナル伝達を活性化するような物質であればよく、ＦＧＦ受容体に結合するリガンド（ＦＧＦファミリー）がその代表例である。またＲＡＳ−ＭＡＰＫ経路やＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ経路の活性化剤もＦＧＦ受容体シグナル活性化剤として用いることができる。
【００４８】
ＦＧＦ受容体シグナル活性化剤としては、ＦＧＦファミリーを挙げることができ、好ましくは、ＦＧＦ７、ＦＧＦ３、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ２２、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５，ＦＧＦ６、ＦＧＦ８、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２３など挙げられ、特に好ましくはＦＧＦ７である。
【００４９】
（ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤）
ＴＧＦβスーパーファミリーシグナルとは、細胞増殖の調節、分化、広汎な生物学的システムでの発達において大変重要な役割を演じている。一般的に、リガンドにより惹起されるセリン／スレオニン受容体キナーゼの多量体形成と、骨形態発生蛋白（ＢＭＰ）経路についてはＳｍａｄ１／５／８ といった細胞内シグナル分子のリン酸化によって、また、ＴＧＦβ／アクチビン経路ならびにＮＯＤＡＬ／アクチビン経路についてはＳｍａｄ２/３のリン酸化によってシグナルは開始される。活性化受容体によるＳｍａｄｓのカルボキシル基末端のリン酸化は、それらと共通のシグナルトランスデューサーであるＳｍａｄ４とのパートナーを形成し、核への移行を促す。活性化Ｓｍａｄｓは、転写因子とパートナーを組むことで様々な生物学的効果を制御し、細胞の状態に特異的な転写調節を行うが知られている。
【００５０】
ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル経路に関与する遺伝子としては、Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ遺伝子、ＢＭＰ２遺伝子、ＢＭＰ３遺伝子、ＢＭＰ４遺伝子、ＢＭＰ５遺伝子、ＢＭＰ６遺伝子、ＢＭＰ７遺伝子、ＢＭＰ８遺伝子、ＢＭＰ１３遺伝子、ＧＤＦ２（Ｇｒｏｗｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２）遺伝子、ＧＤＦ３遺伝子、ＧＤＦ５遺伝子、ＧＤＦ６遺伝子、ＧＤＦ７遺伝子、ＧＤＦ８遺伝子、ＧＤＦ１１遺伝子、ＴＧＦ−β１遺伝子、ＴＧＦ−β２遺伝子、ＴＧＦ−β３遺伝子、ＡＭＨ（ａｎｔｉ−ｍｕｌｌｅｒｉａｎ  ｈｏｒｍｏｎｅ）遺伝子、ｐａｉｒｅｄ  ｌｉｋｅ  ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ  ２（ＰＩＴＸ２）遺伝子、及びＮＯＤＡＬ遺伝子などが挙げられる。
【００５１】
ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤としては、骨形態発生タンパク質（ＢＭＰ）経路、ＴＧＦβ／アクチビン経路、及び／又はＮＯＤＡＬ／アクチビン経路のシグナルを活性化する物質であれば特に限定されないが、例えば、アクチビンＡ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８、ＢＭＰ１３、ＧＤＦ２、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＡＭＨ、ＰＩＴＸ２、及び／又はＮＯＤＡＬなどを用いることができる。特に、ＴＧＦβ／アクチビン経路のシグナルを活性化する物質を好適に用いることができ、具体的には、アクチビンＡ及びＢＭＰ４からなる群から選択される少なくとも１種類を使用することが好ましく、アクチビンＡ及びＢＭＰ４の全てを使用することが特に好ましい。
【００５２】
（ＷＮＴシグナル活性化剤）
ＷＮＴシグナルとは、β−カテニンの核移行を促し、転写因子としての機能を発揮する一連の作用をいう。ＷＮＴシグナルは細胞間相互作用に起因し、例えば、ある細胞から分泌されたＷＮＴ３Ａというタンパクがさらに別の細胞に作用し、細胞内のβ−カテニンが核移行し、転写因子として作用する一連の流れが含まれる。一連の流れは上皮間葉相互作用を例とする器官構築の最初の現象を引き起こす。ＷＮＴシグナルはβ−カテニン経路、ＰＣＰ経路、Ｃａ2+経路の三つの経路を活性化することにより、細胞の増殖や分化、器官形成や初期発生時の細胞運動など各種細胞機能を制御することで知られる。
ＷＮＴシグナル経路に関与する遺伝子としては、ＷＮＴ３Ａ遺伝子などがある。
【００５３】
ＷＮＴシグナル活性化剤としては、特に限定されないが、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ−３）の阻害活性を示すものであればいかなるものでもよく、例えばビス−インドロ（インジルビン）化合物（ＢＩＯ）（（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−オキシム）、そのアセトキシム類似体ＢＩＯ−アセトキシム（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−アセトキシム）、チアジアゾリジン（ＴＤＺＤ）類似体（４−ベンジル−２−メチル−１，２，４−チアジアゾリジン−３，５−ジオン）、オキソチアジアゾリジン―３−チオン類似体（２，４−ジベンジル−５−オキソチアジアゾリジン−３−チオン）、チエニルα−クロロメチルケトン化合物（２−クロロ−１−（４，４−ジブロモ−チオフェン−２−イル）−エタノン）、フェニルαブロモメチルケトン化合物（α−４−ジブロモアセトフェノン）、チアゾール含有尿素化合物（Ｎ−（４−メトキシベンジル）−Ｎ’−（５−ニトロ−１，３−チアゾール−２−イル）ユレア）やＧＳＫ−３βペプチド阻害剤、例えばＨ−ＫＥＡＰＰＡＰＰＱＳｐＰ−ＮＨ2、などを使用することができ、特に好ましくは、ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＡＳ：２５２９１７−０６−９）を使用することができる。ＷＮＴ３Ａも好適に用いることができる。
【００５４】
［１］原始腸管細胞（ＰＧＴ）の製造方法
本発明による原始腸管細胞（ＰＧＴ）の製造方法は、多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞を、原始腸管細胞（ＰＧＴ）への分化誘導に適した培養条件下、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤の非存在下において培養する工程を含む方法である。多能性幹細胞から内胚葉系細胞への分化誘導については後記する。
【００５５】
原始腸管細胞（ＰＧＴ）への分化誘導に適した培養条件とは、多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞を原始腸管細胞（ＰＧＴ）へ好適に分化誘導できる培養条件であれば、特に限定されない。
分化誘導培地としては、内胚葉系細胞を原始腸管細胞（ＰＧＴ）へ分化誘導させる培地であれば特に限定されるものではないが、一つの実施態様として、後述する分化誘導培地にて培養することが挙げられる。
【００５６】
用いる細胞の種類に応じて、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、又はＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ６TM培地（Tｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）等を用いることができる。また、必要に応じて前述した培地から任意に選択した２種以上の培地を混合した培地などが使用できる。なお、動物細胞の培地に用いることのできる培地であれば特に限定されない。
【００５７】
分化誘導培地にはさらに、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又はヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）が含まれていてもよい。好ましくはＢＳＡ又はＨＳＡに含まれる脂質が２ｍｇ／ｇ以下、遊離脂肪酸が０．２ｍｇ／ｇ以下である。
【００５８】
前記培地におけるＢＳＡの添加量の下限は、好ましくは０．０１％（重量％）、より好ましくは０．０５％、より好ましくは０．１０％、より好ましくは０．１５％、より好ましくは０．２０％、より好ましくは０．２５％である。培地におけるＢＳＡの添加量の上限は、好ましくは１．００％、より好ましくは０．９０％、より好ましくは０．８０％、より好ましくは０．７０％、より好ましくは０．６０％、より好ましくは０．５０％、より好ましくは０．４０％、より好ましくは０．３０％、より好ましくは０．２５％である。
【００５９】
分化誘導培地にはさらに、ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅが含まれていてもよい。
前記前記培地におけるｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅの添加量の下限は、好ましくは０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．１ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．２ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．６ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．７ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．８ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．９ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１ｍｍｏｌ／Ｌである。培地におけるｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅの添加量の上限は、好ましくは２０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは４ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは３ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは２ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００６０】
分化誘導培地にはさらに、ＮＥＡＡ（例えば、１×ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（ＮＥＡＡ；Ｗａｋｏ社）など）が含まれていてもよい。
培地におけるＮＥＡＡの含有量の下限は、好ましくは０．０５×ＮＥＡＡ、より好ましくは０．１×ＮＥＡＡ、より好ましくは０．５×ＮＥＡＡ、より好ましくは０．６×ＮＥＡＡ、より好ましくは０．７×ＮＥＡＡ、より好ましくは０．８×ＮＥＡＡ、より好ましくは０．９×ＮＥＡＡ、より好ましくは１×ＮＥＡＡである。培地におけるＮＥＡＡの含有量の上限は、好ましくは２０×ＮＥＡＡ、より好ましくは１５×ＮＥＡＡ、より好ましくは１０×ＮＥＡＡ、より好ましくは５×ＮＥＡＡ、より好ましくは４×ＮＥＡＡ、より好ましくは３×ＮＥＡＡ、より好ましくは２×ＮＥＡＡ、より好ましくは１×ＮＥＡＡである。
【００６１】
分化誘導培地にはさらに、ペニシリン及びストレプトマイシンなどの抗生物質が含まれていてもよい。
前記培地におけるペニシリン含有量の下限は、好ましくは１ｕｎｉｔ／ｍＬ、より好ましくは５ｕｎｉｔ／ｍＬ、より好ましくは１０ｕｎｉｔ／ｍＬ、より好ましくは２０ｕｎｉｔ／ｍＬ、より好ましくは３０ｕｎｉｔ／ｍＬ、より好ましくは４０ｕｎｉｔ／ｍＬ、より好ましくは５０ｕｎｉｔ／ｍＬ、より好ましくは６０ｕｎｉｔ／ｍＬ、より好ましくは７０ｕｎｉｔ／ｍＬ、より好ましくは８０ｕｎｉｔ／ｍＬ、より好ましくは９０ｕｎｉｔ／ｍＬ、より好ましくは１００ｕｎｉｔ／ｍＬである。上限は、好ましくは１０００ｕｎｉｔ／ｍＬ、より好ましくは５００ｕｎｉｔ／ｍＬ、より好ましくは４００ｕｎｉｔ／ｍＬ、より好ましくは３００ｕｎｉｔ／ｍＬ、より好ましくは２００ｕｎｉｔ／ｍＬ、より好ましくは１００ｕｎｉｔ／ｍＬある。
【００６２】
また、ストレプトマイシン含有量の下限は、好ましくは１０μｇ／ｍＬ、より好ましくは２０μｇ／ｍＬ、より好ましく３０μｇ／ｍＬ、より好ましく４０μｇ／ｍＬ、より好ましく５０μｇ／ｍＬ、より好ましく６０μｇ／ｍＬ、より好ましく７０μｇ／ｍＬ、より好ましく８０μｇ／ｍＬ、より好ましく９０μｇ／ｍＬ、より好ましく１００μｇ／ｍＬである。上限は、好ましくは１０００μｇ／ｍＬ、より好ましく５００μｇ／ｍＬ、より好ましく４００μｇ／ｍＬ、より好ましく３００μｇ／ｍＬ、より好ましく２００μｇ／ｍＬ、より好ましく１００μｇ／ｍＬである。
【００６３】
［２］原始腸管細胞（ＰＧＴ）への分化誘導に用いる分化誘導因子、及びその他の添加物
本発明による原始腸管細胞（ＰＧＴ）の製造方法は、多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞を、原始腸管細胞（ＰＧＴ）への分化誘導に適した培養条件下、上述した骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤の非存在下であれば、その他の分化誘導因子やその他の添加物については特に限定されないが、分化誘導効率の向上及び、より優れた膵臓β細胞へと分化可能な原始腸管細胞（ＰＧＴ）を製造する観点から、多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤の非存在下において培養する工程は、ＦＧＦ２の非存在下であることが好ましい。
【００６４】
また、多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞を、多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞を、原始腸管細胞（ＰＧＴ）への分化誘導に適した培養条件下、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤の非存在下において培養する工程は、ヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル阻害剤の非存在下であることも好ましい。ヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル阻害剤の非存在下において前記内胚葉系細胞を培養することにより、分化誘導効率の向上及び、より優れた膵臓β細胞へと分化可能な原始腸管細胞（ＰＧＴ）を製造することができる。
【００６５】
さらに、多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤の非存在下において培養する工程は、ＴＧＦβシグナル阻害剤の非存在下であることも好ましい。ＴＧＦβシグナル阻害剤の非存在下において前記内胚葉系細胞を培養することにより、分化誘導効率の向上及び、より優れた膵臓β細胞へと分化可能な原始腸管細胞（ＰＧＴ）を製造することができる。
【００６６】
さらに、多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤の非存在下において培養する工程は、レチノイン酸又はそのアナログの存在下であることも好ましい。レチノイン酸及びそのアナログの存在下において前記内胚葉系細胞を培養することにより、分化誘導効率の向上及び、より優れた膵臓β細胞へと分化可能な原始腸管細胞（ＰＧＴ）を製造することができる。
【００６７】
一方で、分化誘導効率を向上させ、優れた膵臓β細胞へと分化可能な原始腸管細胞（ＰＧＴ）を製造する観点においては、多能性幹細胞から誘導された内胚葉系細胞を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤の非存在下において培養する工程においては、好ましくは、内胚葉系細胞を、インスリン受容体シグナル活性化剤を含む培地において培養する工程であることが好ましい。
【００６８】
分化誘導培地におけるインスリン受容体シグナル活性化剤の添加量の下限は、好ましくは０．００１ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．０１ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．１ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１ｍｇ／Ｌ、より好ましくは２ｍｇ／Ｌ、より好ましくは３ｍｇ／Ｌである。培地におけるインスリン受容体シグナル活性化剤の添加量の上限は、好ましくは１０００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは５００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは９０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは８０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは７０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは６０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは５０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは４０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは３０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは２０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１０ｍｇ／Ｌである。
【００６９】
また、多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤の非存在下において培養する工程は、内胚葉系細胞を、インスリン、トランスフェリン及び亜セレン酸を含む培地において培養することが好ましい。
インスリン、トランスフェリン及び亜セレン酸は、Ｂ２７サプリメントなど市販の混合物の形態で培地に含まれていてもよい。また、インスリン、トランスフェリン及び亜セレン酸に加えてエタノールアミンが含まれていてもよい。
【００７０】
培地におけるトランスフェリンの添加量の下限は、好ましくは、０．００１ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．０１ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．１ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１．１ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１．２ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１．３ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１．４ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１．５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１．６ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１．６５ｍｇ／Ｌである。培地におけるトランスフェリンの添加量の上限は、好ましくは、１０００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは５００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは９０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは８０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは７０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは６０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは５０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは４０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは３０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは２０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは９ｍｇ／Ｌ、より好ましくは８ｍｇ／Ｌ、より好ましくは７ｍｇ／Ｌ、より好ましくは６ｍｇ／Ｌ、より好ましくは５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは４ｍｇ／Ｌ、より好ましくは３ｍｇ／Ｌ、より好ましくは２ｍｇ／Ｌである。
【００７１】
培地における亜セレン酸の添加量の下限は、好ましくは、０．００１μｇ／Ｌ、より好ましくは０．０１μｇ／Ｌ、より好ましくは０．１μｇ／Ｌ、より好ましくは１μｇ／Ｌ、より好ましくは１．１μｇ／Ｌ、より好ましくは１．２μｇ／Ｌ、より好ましくは１．３μｇ／Ｌ、より好ましくは１．４μｇ／Ｌ、より好ましくは１．５μｇ／Ｌ、より好ましくは１．６μｇ／Ｌ、より好ましくは１．７μｇ／Ｌ、より好ましくは１．８μｇ／Ｌ、より好ましくは１．９μｇ／Ｌ、より好ましくは２μｇ／Ｌである。培地における亜セレン酸の添加量の上限は、好ましくは、１０００μｇ／Ｌ、より好ましくは５００μｇ／Ｌ、より好ましくは１００μｇ／Ｌ、より好ましくは９０μｇ／Ｌ、より好ましくは８０μｇ／Ｌ、より好ましくは７０μｇ／Ｌ、より好ましくは６０μｇ／Ｌ、より好ましくは５０μｇ／Ｌ、より好ましくは４０μｇ／Ｌ、より好ましくは３０μｇ／Ｌ、より好ましくは２０μｇ／Ｌ、より好ましくは１０μｇ／Ｌ、より好ましくは９μｇ／Ｌ、より好ましくは８μｇ／Ｌ、より好ましくは７μｇ／Ｌである。
【００７２】
多能性幹細胞から誘導された内胚葉系細胞を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤の非存在下において培養する工程においては、内胚葉系細胞を、ＦＧＦ受容体シグナル活性化剤を含む培地において培養することが好ましく、中でもＦＧＦ７を含む分化誘導培地にて内胚葉系細胞を培養することが好ましい。但し、本明細書中上記した通り、より効率的な分化誘導の達成、及び優れた膵臓β細胞に分化誘導可能な原始腸管細胞（ＰＧＴ）製造の達成という観点からは、ＦＧＦ２の非存在下において培養することが好ましい。
【００７３】
培地におけるＦＧＦ受容体シグナル活性化剤の添加量の下限は、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは３０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは４０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬである。培地におけるＦＧＦ受容体シグナル活性化剤の添加量の上限は、好ましくは５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは４００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは３００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは９０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは８０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは７０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは６０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬである。
【００７４】
好ましくは、多能性幹細胞から誘導された内胚葉系細胞を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤の非存在下において培養する工程は、内胚葉系細胞を、Ｂ２７（登録商標）サプリメント及び／又はＦＧＦ７を含む培地において培養する工程である。
【００７５】
培地におけるＢ２７（登録商標）サプリメントの添加量の下限は、好ましくは０．０１％、より好ましくは０．１％、より好ましくは０．２％、より好ましくは０．３％、より好ましくは０．４％、より好ましくは０．５％、より好ましくは０．６％、より好ましくは０．７％、より好ましくは０．８％、より好ましくは０．９％である。培地におけるＢ２７（登録商標）サプリメントの添加量の上限は、好ましくは１０％、より好ましくは９％、より好ましくは８％、より好ましくは７％、より好ましくは６％、より好ましくは５％、より好ましくは４％、より好ましくは３％、より好ましくは２％、より好ましくは１％である。
【００７６】
培地におけるＦＧＦ７の添加量の下限は、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは３０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは４０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬである。培地におけるＦＧＦ７の添加量の上限は、好ましくは５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは４００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは３００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは９０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは８０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは７０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは６０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬである。
【００７７】
また、分化誘導培地は、上述した以外の血清成分又は血清代替成分を含んでいてもよい。血清成分又は血清代替成分としては、例えば、アルブミン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素（例えば亜鉛、セレン）、Ｎ２サプリメント、Ｎ２１サプリメント（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、ＮｅｕｒｏＢｒｅｗ−２１サプリメント（Ｍｉｌｔｅｎｙｉｂｉｏｔｅｃ社）、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）、２−メルカプトエタノール、３’チオールグリセロール、並びにこれらの均等物が挙げられる。
【００７８】
分化誘導培地には、さらに各種の添加物、抗生物質、抗酸化剤などを加えてもよい。例えば、０．１ｍＭから５ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．１から２％（体積／体積）の非必須アミノ酸、０．１から２％（体積／体積）のペニシリン、０．１から２％（体積／体積）のストレプトマイシン、０．１から２％（体積／体積）のアンフォテリシンＢ、カタラーゼ、グルタチオン、ガラクトース、レチノイン酸（ビタミンＡ）、スーパーオキシドディスムターゼ、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、Ｄ−α−トコフェロール（ビタミンＥ）などを添加してもよい。
【００７９】
内胚葉系細胞から原始腸管細胞への分化誘導における培養温度は、使用する多能性幹細胞の培養に適した培養温度であれば、特に限定されないが、一般的には３０℃から４０℃であり、好ましくは約３７℃である。
ＣＯ2インキュベーターなどを利用して、約１から１０％、好ましくは５％のＣＯ2濃度雰囲気下で培養を行うことが好ましい。
【００８０】
内胚葉系細胞から原始腸管細胞（ＰＧＴ）への分化誘導は、接着培養又は浮遊培養のいずれでも実施するができるが、浮遊培養が好ましい。浮遊培養は、後述する浮遊培養の条件によって行うことができ、さらに、予めマイクロキャリア等に接着させて浮遊培養しても良いし、細胞のみで構成された細胞凝集塊の状態で浮遊培養しても良いし、細胞凝集塊の中にコラーゲン等の高分子が混在していても良く、形態は特に限定しない。
【００８１】
浮遊培養は、培地の粘性等や凹凸を有するマイクロウェル等を用いた静置培養であってもよいし、スピナー等を利用して液体培地が流動する条件での培養であってもよいが、好ましくは液体培地が流動する条件での培養である。液体培地が流動する条件での培養としては、細胞の凝集を促進するように液体培地が流動する条件での培養が好ましい。細胞の凝集を促進するように液体培地が流動する条件での培養としては、例えば、旋回流、揺動流等の流れによる応力（遠心力、求心力）により細胞が一点に集まるように液体培地が流動する条件での培養や、直線的な往復運動により液体培地が流動する条件での培養が挙げられ、旋回流及び／又は揺動流を利用した培養が特に好ましい。
【００８２】
浮遊培養に用いる培養容器は、好ましくは容器内面への細胞の接着性が低い容器が好ましい。このような容器内面への細胞の接着性が低い容器としては、例えば生体適合性がある物質で親水性表面処理されているようなプレートが挙げられる。例えば、ＮｕｎｃｌｏｎTMＳｐｈｅｒａ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を使用できるが特に限定はされない。また、  培養容器の形状は特に限定されないが、例えば、ディッシュ状、フラスコ状、ウェル状、バッグ状、スピナーフラスコ状等の形状の培養容器が挙げられる。
【００８３】
凝集体を形成させる期間としては、６時間を超える期間であれば特に限定されないが、具体的には、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、又は２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間の期間において凝集体を形成させることが好ましい。
【００８４】
浮遊培養培地としては、多能性幹細胞を増殖可能な成分が含まれるのであれば特に限定されないが、１から１００μＭのＹ−２７６３２（Ｃａｙｍａｎ社）を含むｍＴｅＳＲ１（Ｖｅｒｉｔａｓ社）培地、又は１から１００μＭのＹ−２７６３２（Ｃａｙｍａｎ社）、１から１００ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡを含むＥｓｓｅｎｔｉａｌ８TMなどを使用することができる。
【００８５】
浮遊培養における攪拌又は旋回の条件としては、懸濁液中において多能性幹細胞が凝集体を形成し得る範囲であれば特に限定されないが、上限は、好ましくは２００ｒｐｍ、より好ましくは１５０ｒｐｍ、さらに好ましくは１２０ｒｐｍ、より好ましくは１００ｒｐｍ、より好ましくは９０ｒｐｍ、より好ましくは８０ｒｐｍ、もっと好ましくは７０ｒｐｍ、より好ましくは６０ｒｐｍ、特に好ましくは５０ｒｐｍ、最も好ましくは４５ｒｐｍとすることができる。下限は好ましくは１ｒｐｍ、より好ましくは１０ｒｐｍ、さらに好ましくは２０ｒｐｍ、より好ましくは３０ｒｐｍ、より好ましくは４０ｒｐｍ、特に好ましくは４５ｒｐｍとすることができる。旋回培養の際の旋回幅は特に限定されないが、下限は、例えば１ｍｍ、好ましくは１０ｍｍ、より好ましくは２０ｍｍ、最も好ましくは２５ｍｍとすることができる。旋回幅の上限は、例えば２００ｍｍ、好ましくは１００ｍｍ、好ましくは５０ｍｍ、より好ましくは３０ｍｍ、最も好ましくは２５ｍｍとすることができる。旋回培養の際の回転半径もまた特に限定されないが、好ましくは旋回幅が前記の範囲となるように設定される。回転半径の下限は例えば５ｍｍ、好ましくは１０ｍｍであり、上限は例えば１００ｍｍ、好ましくは５０ｍｍとすることができる。旋回培養の条件をこの範囲とすることで、適切な寸法の細胞凝集体を製造することが容易となるため好ましい。
【００８６】
また、浮遊培養は、揺動（ロッキング）撹拌により液体培地を流動させながら行う揺動培養であってもよい。揺動培養は、液体培地と細胞を収容した培養容器を概ね水平面に垂直な平面内で揺動させることにより行う。揺動速度は特に限定されないが、例えば１分間に２から５０回、好ましくは４から２５回（一往復を１回とする）揺動させることができる。揺動角度は特に限定されないが、例えば０．１°から２０°、より好ましくは２°から１０°とすることができる。揺動培養の条件をこの範囲とすることで、適切な寸法の細胞凝集塊を製造することが可能となるため好ましい。
【００８７】
更に、上記のような旋回と揺動とを組み合わせた運動により撹拌しながら培養することもできる。
【００８８】
スピナーフラスコ状の培養容器を用いた浮遊培養は、培養容器の中に攪拌翼を使用して、液体培地を攪拌しながら行う培養である。回転数や培地量は特に限定されない。市販のスピナーフラスコ状の培養容器であれば、メーカー推奨の培養液量を好適に使用することができ、例えばＡＢＬＥ社のスピナーフラスコ等も好適に用いることができる。
【００８９】
本発明において、浮遊培養における細胞の播種密度は、細胞が凝集体を形成する播種密度であれば特に限定されないが、１×１０5から１×１０7ｃｅｌｌｓ／ｍＬであることが好ましい。細胞の播種密度は、２×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、３×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、４×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、又は５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上が好ましく、９×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、８×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、７×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、６×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、５×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、４×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、３×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、２×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、１．９×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、１．８×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、１．７×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、１．６×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、１．５×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下が好ましい。特に、５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬから１．５×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬの範囲の細胞密度が好適である。
【００９０】
細胞の凝集体は、凝集体当たり数百から数千の細胞を含む。本発明において、細胞凝集体の大きさ（直径）は、特に限定されないが、例えば、５０μｍ以上、５５μｍ以上、６０μｍ以上、６５μｍ以上、７０μｍ以上、８０μｍ以上、９０μｍ以上、１００μｍ以上、１１０μｍ以上、１２０μｍ以上、１３０μｍ以上、１４０μｍ以上、１５０μｍ以上、であり、且つ、１０００μｍ以下、９００μｍ以下、８００μｍ以下、７００μｍ以下、６００μｍ以下、５００μｍ以下、４００μｍ以下が挙げられる。１５０μｍから４００μｍの範囲の直径を有する細胞凝集体は本発明で好適である。上記範囲以外の直径を有する細胞凝集体が混在していても良い。
ここでいう「細胞凝集体の大きさ（直径）」は、例えば、顕微鏡で観察したとき、観察像での最も細胞凝集塊の幅の広い部分の寸法をいうことができる。
【００９１】
浮遊培養の際の培養液量は使用する培養容器によって適宜調整することができるが、例えば１２ウェルプレート（１ウェルあたりの平面視でのウェル底面の面積が３．５ｃｍ2）を使用する場合は０．５ｍｌ／ウェル以上、１．５ｍｌ／ウェル以下とすることができ、より好ましくは１ｍｌ／ウェルとすることができる。例えば６ウェルプレート（１ウェルあたりの平面視でのウェル底面の面積が９．６ｃｍ2）を使用する場合は、１．５ｍＬ／ウェル以上、好ましくは２ｍＬ／ウェル以上、より好ましくは３ｍＬ／ウェル以上とすることができ、６．０ｍＬ／ウェル以下、好ましくは５ｍＬ／ウェル以下、より好ましくは４ｍＬ／ウェル以下とすることができる。例えば１２５ｍＬ三角フラスコ（容量が１２５ｍＬの三角フラスコ）を使用する場合は、１０ｍＬ／容器以上、好ましくは１５ｍＬ／容器以上、より好ましくは２０ｍＬ／容器以上、より好ましくは２５ｍＬ／容器以上、より好ましくは２０ｍＬ／容器以上、より好ましくは２５ｍＬ／容器以上、より好ましくは３０ｍＬ／容器以上とすることができ、５０ｍＬ／容器以下、より好ましくは４５ｍＬ／容器以下、より好ましくは４０ｍＬ／容器以下とすることができる。例えば５００ｍＬ三角フラスコ（容量が５００ｍＬの三角フラスコ）を使用する場合は、１００ｍＬ／容器以上、好ましくは１０５ｍＬ／容器以上、より好ましくは１１０ｍＬ／容器以上、より好ましくは１１５ｍＬ／容器以上、より好ましくは１２０ｍＬ／容器以上とすることができ、１５０ｍＬ／容器以下、より好ましくは１４５ｍＬ／容器以下、より好ましくは１４０ｍＬ／容器以下、より好ましくは１３５ｍＬ／容器以下、より好ましくは１３０ｍＬ／容器以下、より好ましくは１２５ｍＬ／容器以下とすることができる。例えば１０００ｍＬ三角フラスコ（容量が１０００ｍＬの三角フラスコ）を使用する場合は、２５０ｍＬ／容器以上、好ましくは２６０ｍＬ／容器以上、より好ましくは２７０ｍＬ／容器以上、より好ましくは２８０ｍＬ／容器以上、より好ましくは２９０ｍＬ／容器以上とすることができ、３５０ｍＬ／容器以下、より好ましくは３４０ｍＬ／容器以下、より好ましくは３３０ｍＬ／容器以下、より好ましくは３２０ｍＬ／容器以下、より好ましくは３１０ｍＬ／容器以下とすることができる。例えば２０００ｍＬ三角フラスコ（容量が２０００ｍＬの三角フラスコ）の場合は、５００ｍＬ／容器以上、より好ましくは５５０ｍＬ／容器以上、より好ましくは６００ｍＬ／容器以上とすることができ、１０００ｍＬ／容器以下、より好ましくは９００ｍＬ／容器以下、より好ましくは８００ｍＬ／容器以下、より好ましくは７００ｍＬ／容器以下とすることができる。例えば３０００ｍＬ三角フラスコ（容量が３０００ｍＬの三角フラスコ）の場合は、１０００ｍＬ／容器以上、好ましくは１１００ｍＬ／容器以上、より好ましくは１２００ｍＬ／容器以上、より好ましくは１３００ｍＬ／容器以上、より好ましくは１４００ｍＬ／容器以上、より好ましくは１５００ｍＬ／容器以上とすることができ、２０００ｍＬ／容器以下、より好ましくは１９００ｍＬ／容器以下、より好ましくは１８００ｍＬ／容器以下、より好ましくは１７００ｍＬ／容器以下、より好ましく���１６００ｍＬ／容器以下とすることができる。例えば２Ｌ培養バッグ（容量が２Ｌのディスポーザブル培養バッグ）の場合は、１００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは２００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは３００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは４００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは５００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは６００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは７００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは８００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは９００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは１０００ｍＬ／バッグ以上とすることができ、２０００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１９００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１８００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１７００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１６００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１５００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１４００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１３００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１２００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１１００ｍＬ／バッグ以下とすることができる。例えば１０Ｌ培養バッグ（容量が１０Ｌのディスポーザブル培養バッグ）の場合は、５００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは１Ｌ／バッグ以上、より好ましくは２Ｌ／バッグ以上、より好ましくは３Ｌ／バッグ以上、より好ましくは４Ｌ／バッグ以上、より好ましくは５Ｌ／バッグ以上とすることができ、１０Ｌ／バッグ以下、より好ましくは９Ｌ／バッグ以下、より好ましくは８Ｌ／バッグ以下、より好ましくは７Ｌ／バッグ以下、より好ましくは６Ｌ／バッグ以下とすることができる。例えば、２０Ｌ培養バッグ（容量が２０Ｌのディスポーザブル培養バッグ）の場合は、１Ｌ／バッグ以上、より好ましくは２Ｌ／バッグ以上、より好ましくは３Ｌ／バッグ以上、より好ましくは４Ｌ／バッグ以上、より好ましくは５Ｌ／バッグ以上、より好ましくは６Ｌ／バッグ以上、より好ましくは７Ｌ／バッグ以上、より好ましくは８Ｌ／バッグ以上、より好ましくは９Ｌ／バッグ以上、より好ましくは１０Ｌ／バッグ以上とすることができ、２０Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１９Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１８Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１７Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１６Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１５Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１４Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１３Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１２Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１１Ｌ／バッグ以下とすることができる。例えば５０Ｌ培養バッグ（容量が５０Ｌのディスポーザブル培養バッグ）の場合は、１Ｌ／バッグ以上、より好ましくは２Ｌ／バッグ以上、より好ましくは５Ｌ／バッグ以上、より好ましくは１０Ｌ／バッグ以上、より好ましくは１５Ｌ／バッグ以上、より好ましくは２０Ｌ／バッグ以上、より好ましくは２５Ｌ／バッグ以上とすることができ、５０Ｌ／バッグ以下、より好ましくは４５Ｌ／バッグ以下、より好ましくは４０Ｌ／バッグ以下、より好ましくは３５Ｌ／バッグ以下、より好ましくは３０Ｌ／バッグ以下とすることができる。培養液量がこの範囲であるとき、適切な大きさの細胞凝集体が形成され易い。
【００９２】
使用する培養容器の容量は適宜選択することができ特に限定されないが、液体培地を収容する部分の底面を平面視したときの面積として、下限が、例えば０．３２ｃｍ2、好ましくは０．６５ｃｍ2、より好ましくは０．９５ｃｍ2、さらに好ましくは１．９ｃｍ2、もっと好ましくは３．０ｃｍ2、３．５ｃｍ2、９．０ｃｍ2、又は９．６ｃｍ2の培養容器を用いることができ、上限としては、例えば１０００ｃｍ2、好ましくは５００ｃｍ2、より好ましくは３００ｃｍ2、より好ましくは１５０ｃｍ2、より好ましくは７５ｃｍ2、もっと好ましくは５５ｃｍ2、さらに好ましくは２５ｃｍ2、さらにより好ましくは２１ｃｍ2、さらにもっと好ましくは９．６ｃｍ2、又は３．５ｃｍ2の培養容器を用いることができる。
【００９３】
内胚葉系細胞から原始腸管細胞への分化誘導の培養期間は、一般的には２４時間から１２０時間であり、好ましく４８時間から９６時間程度である。例えば、７２時間である。
【００９４】
［３］原始腸管細胞（Ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  Ｇｕｔ  Ｔｕｂｅ：ＰＧＴ）
原始腸管細胞は、前腸、中腸、後腸を形成する。中腸は卵黄嚢とつながっており、後腸からは胚体外の尿膜が分岐している。また、前腸からは呼吸器系の咽頭も形成される。
胃や腸のように腸管がそのまま分化するものと、肝臓、胆嚢、膵臓、（脾臓（リンパ性器官））などのように腸管から出芽するような形で形成されるものがある。内胚葉系細胞から原始腸管細胞への分化は、原始腸管細胞に特異的な遺伝子の発現量を測定することにより確認することができる。原始腸管細胞に特異的な遺伝子としては、例えば、ＨＮＦ−１β、ＨＮＦ−４αなどを挙げることができる。
【００９５】
原始腸管細胞は、一般的に、ＨＮＦ−１β又はＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１つを発現する。
ＨＮＦ−１β（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ １  ｂｅｔａ）の遺伝子配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎの遺伝子データベースに登録されている（ＩＤ：６９２８を参照）。
ＨＮＦ−４α（ｏｃｔａｍｅｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ４）の遺伝子配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎの遺伝子データベースに登録されている（ＩＤ：３１７２を参照）。
【００９６】
本発明の原始腸管細胞においては、パスウェイ名「Biosynthesis of amino acids」（http://www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway?map=hsa04015&show_description=show）に関する遺伝子発現が向上していることが好ましい。例えば、N-acetylglutamate synthase(NAGS)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000161653）、aldolase, fructose-bisphosphate A(ALDOA)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000149925）、aldolase, fructose-bisphosphate C(ALDOC)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000109107）、aminoadipate aminotransferase(AADAT)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000109576）、argininosuccinate synthase 1(ASS1)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000130707）、branched chain amino acid transaminase 1(BCAT1)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000060982）、enolase 1(ENO1)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000074800）、enolase 2(ENO2)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000111674）、glutamate-ammonia ligase(GLUL)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000135821）、phosphofructokinase, liver type(PFKL)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000141959）、phosphofructokinase, platelet(PFKP)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000067057）、phosphoglycerate kinase 1(PGK1)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000102144）、phosphoserine phosphatase(PSPH)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000146733）、pyrroline-5-carboxylate reductase 1(PYCR1)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000183010）、pyruvate kinase, muscle(PKM)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000067225）、serine hydroxymethyltransferase 2(SHMT2)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000182199）、transketolase(TKT)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000163931）などの遺伝子の発現量が既存の方法で調製した原始腸管細胞と比較して向上していることが好ましい。これらの遺伝子の発現量が多いことは、細胞内のアミノ酸合成に関与する酵素が増加し、分化に必要なタンパク質の材料となるアミノ酸の生合成が活発になることから、分化誘導により好適な状態の細胞であることを意味する。
【００９７】
本発明の原始腸管細胞においては、パスウェイ名「Rap1 signaling pathway」（http://www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway?map=hsa04015&show_description=show）に関する遺伝子発現が向上していることが好ましい。例えば、KIT proto-oncogene receptor tyrosine kinase(KIT)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000157404）、RAP1A, member of RAS oncogene family(RAP1A)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000116473）、Rap guanine nucleotide exchange factor 4(RAPGEF4)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000091428）、adenylate cyclase 7(ADCY7)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000121281）、adenylate cyclase 8(ADCY8)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000155897）、afadin, adherens junction formation factor(AFDN)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000130396）、amyloid beta precursor protein binding family B member 1 interacting protein(APBB1IP)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000077420）、angiopoietin 1(ANGPT1)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000154188）、calmodulin 1(CALM1)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000198668）、ephrin A1(EFNA1)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000169242）、ephrin A3(EFNA3)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000143590）、ephrin A5(EFNA5)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG0000018434）、fibroblast growth factor 11(FGF11)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000161958）、fibroblast growth factor receptor 3(FGFR3)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000068078）、fibroblast growth factor receptor 4(FGFR4)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000160867）、glutamate ionotropic receptor NMDA type subunit 2A(GRIN2A)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000183454）、insulin like growth factor 1(IGF1)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000017427）、membrane associated guanylate kinase, WW and PDZ domain containing 3(MAGI3)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000081026）、phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 1(PIK3R1) 遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000145675）、phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 5(PIK3R5)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000141506）、phospholipase C beta 1(PLCB1)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000182621）、phospholipase C epsilon 1(PLCE1)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000138193）、placental growth factor(PGF)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG0000011963）、platelet derived growth factor D(PDGFD)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000170962）、platelet derived growth factor receptor alpha(PDGFRA)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000134853）、regulator of G-protein signaling 14(RGS14)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000169220）、signal induced proliferation associated 1 like 2(SIPA1L2)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000116991）、talin 2(TLN2)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000171914）、vascular endothelial growth factor C(VEGFC)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000150630）などの遺伝子の発現量が既存の方法で調製した原始腸管細胞と比較して向上していることが好ましい。これらの遺伝子の発現量が多いことは、細胞接着の増加や組織の３次元構造化などに寄与することが考えられ、分化誘導により好適な状態の細胞であると考えられる。
【００９８】
本発明の原始腸管細胞においては、パスウェイ名「Pathways in cancer」（http://www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway?map=hsa05200&show_description=show）に関する遺伝子発現が向上していることが好ましい。例えば、A-Raf proto-oncogene, serine/threonine kinase(ARAF)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000078061）、BCR, RhoGEF and GTPase activating protein(BCR)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG0000018671）、C-X-C motif chemokine receptor 4(CXCR4)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG0000012196）、CCAAT/enhancer binding protein alpha(CEBPA)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000245848）、Cbl proto-oncogene C(CBLC)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000142273）、KIT proto-oncogene receptor tyrosine kinase(KIT)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000157404）、MDS1 and EVI1 complex locus(MECOM)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000085276）、SMAD family member 3(SMAD3)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000166949）、adenylate cyclase 7(ADCY7)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000121281）、adenylate cyclase 8(ADCY8)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000155897）、catenin alpha 3(CTNNA3)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000183230）、collagen type IV alpha 3 chain(COL4A3)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000169031）、collagen type IV alpha 5 chain(COL4A5)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000188153）、collagen type IV alpha 6 chain(COL4A6)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000197565）、cyclin D1(CCND1)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000110092）、egl-9 family hypoxia inducible factor 1(EGLN1)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG0000013576）、endothelial PAS domain protein 1(EPAS1)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000116016）、endothelin receptor type A(EDNRA)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000151617）、fibronectin 1(FN1)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000115414）、frizzled class receptor 1(FZD1)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000157240）、frizzled class receptor 2(FZD2)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000180340）、laminin subunit beta 1(LAMB1)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000091136）、lysophosphatidic acid receptor 6(LPAR6)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000139679）、mitogen-activated protein kinase 10(MAPK10)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000109339）、patched 1(PTCH1)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000185920）、peroxisome proliferator activated receptor gamma(PPARG) 遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000132170）、phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 1(PIK3R1) 遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000145675）、phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 5(PIK3R5)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000141506）、phospholipase C beta 1(PLCB1)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000182621）、phospholipase C gamma 2(PLCG2)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000197943）、prostaglandin E receptor 2(PTGER2)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000125384）、protein inhibitor of activated STAT 2(PIAS2)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000078043）、retinoid X receptor alpha(RXRA)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000186350）、solute carrier family 2 member 1(SLC2A1)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000117394）、transforming growth factor beta 1(TGFB1)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000105329）、transforming growth factor beta receptor 2(TGFBR2)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000163513）、tropomyosin 3(TPM3)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000143549）、vascular endothelial growth factor C(VEGFC)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000150630）などの遺伝子の発現量が既存の方法で調製した原始腸管細胞と比較して向上していることが好ましい。これらの遺伝子の発現量が多いことは、分化に必要な様々なシグナルパスウェイが活性化される可能性があり、分化誘導により好適な状態の細胞であると考えられる。
【００９９】
本発明の原始腸管細胞においては、パスウェイ名「p53 signaling pathway」（http://www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway?map=hsa04115&show_description=show）に関する遺伝子発現が減少していることが好ましい。例えば、BCL2 associated X, apoptosis regulator(BAX)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000087088）、Fas cell surface death receptor(FAS)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000026103）、MDM2 proto-oncogene(MDM2)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000135679）、PERP, TP53 apoptosis effector(PERP)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000112378）、STEAP3 metalloreductase(STEAP3)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000115107）、caspase 3(CASP3)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000164305）、caspase 8(CASP8)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000064012）、cyclin D2(CCND2)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000118971）、cyclin E2(CCNE2)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000175305）、cyclin dependent kinase 1(CDK1)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000170312）、cyclin dependent kinase 6(CDK6)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000105810）、cyclin dependent kinase inhibitor 1A(CDKN1A)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000124762）、damage specific DNA binding protein 2(DDB2)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000134574）、phorbol-12-myristate-13-acetate-induced protein 1(PMAIP1)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000141682）、protein phosphatase, Mg2+/Mn2+ dependent 1D(PPM1D)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000170836）、reprimo, TP53 dependent G2 arrest mediator candidate(RPRM)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000177519）、ribonucleotide reductase regulatory TP53 inducible subunit M2B(RRM2B)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000048392）、serpin family B member 5(SERPINB5)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000206075）、serpin family E member 1(SERPINE1)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000106366）、sestrin 2(SESN2)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000130766）、stratifin(SFN)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000175793）、zinc finger matrin-type 3(ZMAT3)遺伝子（ENSEMBL_GENE_ID：ENSG00000172667）などの遺伝子の発現量が既存の方法で調製した原始腸管細胞と比較して減少していることが好ましい。これらの遺伝子の発現量が少ないことは、細胞死が抑制される可能性があり、分化誘導により好適な状態の細胞であると考えられる。
【０１００】
本発明の原始腸管細胞（ＰＧＴ）としては、後記する比較例５の方法（即ち、多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞を骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤、レチノイン酸又はそのアナログ、ＴＧＦ−βシグナル阻害剤ならびにヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル阻害剤の存在下において培養する）により製造された原始腸管細胞（ＰＧＴ）と比較して、ＫＩＴ遺伝子、ＲＡＰ１Ａ遺伝子、ＦＧＦ１１遺伝子、ＦＧＦＲ４遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子発現が向上、及び／又はＭＤＭ２遺伝子、ＣＡＳＰ３遺伝子、ＣＤＫ１遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子発現が減少している細胞を挙げることができる。
【０１０１】
本発明の原始腸管細胞（ＰＧＴ）においては、好ましくは、比較例５の方法により製造された原始腸管細胞（ＰＧＴ）と比較して、ＩＧＦＢＰ３遺伝子、ＰＴＧＤＲ遺伝子、ＬＯＸ遺伝子、ＰＡＰＰＡ遺伝子、ＲＡＢ３１遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子が向上している。
本発明の原始腸管細胞（ＰＧＴ）においては、好ましくは、比較例５の方法により製造された原始腸管細胞（ＰＧＴ）と比較して、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＣＤ４７遺伝子、ＣＤＣ４２ＥＰ３遺伝子、ＣＬＤＮ１８遺伝子、ＣＬＩＣ５遺伝子、ＰＨＬＤＡ１遺伝子、ＳＫＡＰ２遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子が減少している。
【０１０２】
本発明の原始腸管細胞（ＰＧＴ）の別の例としては、多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞と比較して、ＩＧＦＢＰ３遺伝子、ＰＴＧＤＲ遺伝子、ＰＡＰＰＡ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子発現が向上しているか、及び／又はＡＮＧＰＴ２遺伝子及びＦＲＺＢ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が減少している、原始腸管細胞（ＰＧＴ）を挙げることができる。
【０１０３】
本発明の原始腸管細胞（ＰＧＴ）のさらに別の例としては、多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤、ＴＧＦ−βシグナル阻害剤及びヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル阻害剤の存在下において培養することにより製造された原始腸管細胞（ＰＧＴ）と比較して、ＩＧＦＢＰ３遺伝子、ＰＴＧＤＲ遺伝子、ＬＯＸ遺伝子、ＰＡＰＰＡ遺伝子、及びＲＡＢ３１遺伝子のうちの１以上の遺伝子の発現が向上しているか、及び／又はＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＢＭＰＲ１Ｂ遺伝子、ＣＤ４７遺伝子、ＣＤＣ４２ＥＰ３遺伝子、ＣＬＤＮ１８遺伝子、ＣＬＩＣ５遺伝子、ＦＲＺＢ遺伝子、ＩＧＦ２遺伝子、ＰＨＬＤＡ１遺伝子、及びＳＫＡＰ２遺伝子のうちの１以上の遺伝子の発現が減少している、原始腸管細胞（ＰＧＴ）を挙げることができる。
【０１０４】
さらに本発明によれば、原始腸管細胞を含む細胞集団であって、以下に示す（ａ）から（ｄ）の細胞特性を有する細胞集団が提供される：
（ａ）前記細胞集団が、β−Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＦＧＦ１１遺伝子の相対発現が０．０１以上であり、
（ｂ）前記細胞集団が、β−Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＦＧＦＲ４遺伝子の相対発現量が０．０３以上であり、
（ｃ）前記細胞集団が、β−Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＣＡＳＰ３遺伝子の相対発現量が０．００６以下であり、
（ｄ）前記細胞集団が、β−Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＣＤＫ１遺伝子の相対発現量が０．０２以下である。
【０１０５】
前記細胞集団においては、
β−Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＲＡＰ１Ａ遺伝子の相対発現量が０．０３以上である；
β−Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＫＩＴ遺伝子の相対発現量が０．０５以上である；又は
β−Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＭＤＭ２遺伝子の相対発現量が０．０３以下である；
の何れか一以上が満たされていてもよい。
【０１０６】
前記細胞集団においては、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＩＧＦＢＰ３遺伝子の相対発現量が１０以上、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＰＴＧＤＲ遺伝子の発現量が０．６以上、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＬＯＸ遺伝子の相対発現量が０．６以上、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＰＡＰＰＡ遺伝子の相対発現量が０．０１以上、及びＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＲＡＢ３１遺伝子の相対発現量が０．２以上であってもよい。
前記細胞集団においては、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＡＮＧＰＴ２遺伝子の相対発現量が０．０００２以下、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＣＤ４７遺伝子の発現量が０．０２以下、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＣＤＣ４２ＥＰ３遺伝子の相対発現量が０．０３以下、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＣＬＤＮ１８遺伝子の相対発現量が０．００６以下、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＣＬＩＣ５遺伝子の相対発現量が０．０００１以下、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＰＨＬＤＡ１遺伝子の相対発現量が０．２以下、及びＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＳＫＡＰ２遺伝子の相対発現量が０．０１以下であってもよい。
【０１０７】
β−Ａｃｔｉｎ（ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ；６０）遺伝子の発現量に対するＦＧＦ１１（ＥＮＳＥＭＢＬ  ＧＥＮＥ  ＩＤ：ＥＮＳＧ０００００１６１９５８）遺伝子の相対発現量は０．０１以上であるが、好ましくは０．０２以上、０．０３以上、０．０４以上、０．０５以上、０．０６以上、０．０７以上、０．０８以上、０．０９以上、０．１以上であってもよい。ＦＧＦ１１遺伝子は、「Ｒａｐ１ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ」に関与する遺伝子であることから、β−Ａｃｔｉｎ遺伝子に対するＦＧＦ１１遺伝子の相対発現量が０．０１以上であることは、細胞接着の増加や組織の３次元構造化などに寄与することが考えられ、分化誘導により好適な状態の細胞であると考えられる。
【０１０８】
β−Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＦＧＦＲ４（ＥＮＳＥＭＢＬ  ＧＥＮＥ  ＩＤ：ＥＮＳＧ０００００１６０８６７）遺伝子の相対発現量は０．０３以上であるが、好ましくは０．０４以上、０．０５以上、０．１以上であってもよい。ＦＧＦＲ４遺伝子は、「Ｒａｐ１ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ」に関与することから、β−Ａｃｔｉｎ遺伝子に対するＦＧＦＲ４遺伝子の相対発現量が０．０３以上であることは、細胞接着の増加や組織の３次元構造化などに寄与することが考えられ、分化誘導により好適な状態の細胞であると考えられる。
【０１０９】
β−Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＣＡＳＰ３（ＥＮＳＥＭＢＬ  ＧＥＮＥ  ＩＤ：ＥＮＳＧ０００００１６４３０５）遺伝子の相対発現量は０．００６以下であるが、好ましくは０．００５以下、０．００４以下、０．００３以下、０．００２以下、０．００１以下、０．０００５以下、０．０００１以下であってもよい。ＣＡＳＰ３遺伝子は、「ｐ５３ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ」に関与することから、β−Ａｃｔｉｎ遺伝子に対するＣＡＳＰ３遺伝子の相対発現量が０．００６以下であることは、細胞死が抑制される可能性があり、分化誘導により好適な状態の細胞であると考えられる。
【０１１０】
β−Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＣＤＫ１（ＥＮＳＥＭＢＬ  ＧＥＮＥ  ＩＤ：ＥＮＳＧ０００００１７０３１２）遺伝子の相対発現量は０．０２以下であるが、好ましくは０．０１以下、０．００５以下、０．００１以下であってもよい。ＣＤＫ１遺伝子は、「ｐ５３ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ」に関与することから、β−Ａｃｔｉｎ遺伝子に対するＣＤＫ１遺伝子の相対発現量が０．０２以下であることは、細胞死が抑制される可能性があり、分化誘導により好適な状態の細胞であると考えられる。
【０１１１】
β−Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＲＡＰ１Ａ（ＥＮＳＥＭＢＬ  ＧＥＮＥ  ＩＤ：ＥＮＳＧ０００００１１６４７３）遺伝子の相対発現量は０．０３以上であるが、好ましくは０．０４以上、０．０５以上、０．０６以上、０．０７以上、０．０８以上、０．０９以上、０．１以上であってもよい。ＲＡＰ１Ａ遺伝子は、「Ｒａｐ１ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ」に関与することから、β−Ａｃｔｉｎ遺伝子に対するＲＡＰ１Ａ遺伝子の相対発現量が０．０３以上であることは、細胞接着の増加や組織の３次元構造化などに寄与することが考えられ、分化誘導により好適な状態の細胞であると考えられる。
【０１１２】
β−Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＫＩＴ（ＥＮＳＥＭＢＬ  ＧＥＮＥ  ＩＤ：ＥＮＳＧ０００００１５７４０４）遺伝子の相対発現量は０．０５以上であるが、好ましくは０．０６以上、０．０７以上、０．０８以上、０．０９以上、０．１以上、０．５以上であってもよい。ＫＩＴ遺伝子は、「Ｒａｐ１ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ」に関与することから、β−Ａｃｔｉｎ遺伝子に対するＫＩＴ遺伝子の相対発現量が０．０５以上であることは、細胞接着の増加や組織の３次元構造化などに寄与することが考えられ、分化誘導により好適な状態の細胞であると考えられる。
【０１１３】
β−Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＭＤＭ２（ＭＤＭ２ ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ＥＮＳＥＭＢＬ＿ＧＥＮＥ＿ＩＤ：ＥＮＳＧ０００００１３５６７９）遺伝子の相対発現量は０．０３以下であるが、好ましくは０．０２以下、０．０１以下、０．００５以下、０．００１以下であってもよい。ＭＤＭ２遺伝子は、「ｐ５３ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ」に関与することから、β−Ａｃｔｉｎ遺伝子に対するＭＤＭ２遺伝子の相対発現量が０．０３以下であることは、細胞死が抑制される可能性があり、分化誘導により好適な状態の細胞であると考えられる。
【０１１４】
ＯＡＺ１（ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ａｎｔｉｚｙｍｅ  １, 遺伝子配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎの遺伝子データベースに登録されているＩＤ：４９４６を参照）遺伝子の発現量に対するＩＧＦＢＰ３（Ｉｎｓｕｌｉｎ  ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ；３４８６）遺伝子の相対発現量は１０以上であるが、好ましくは１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、１００以上であってもよい。ＩＧＦＢＰ３遺伝子は、本発明の原始腸管細胞において高発現していることから、原始腸管細胞の陽性マーカー遺伝子になると考えられる。
【０１１５】
ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＰＴＧＤＲ（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｄ２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ；５７２９）遺伝子の相対発現量は０．６以上であるが、好ましくは０．７以上、０．８以上、０．９以上、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、１００以上であってもよい。ＰＴＧＤＲ遺伝子は、本発明の原始腸管細胞において高発現していることから、原始腸管細胞の陽性マーカー遺伝子になると考えられる。
【０１１６】
ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＬＯＸ（Ｌｙｓｙｌ  ｏｘｉｄａｓｅ、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ；４０１５）遺伝子の相対発現量は０．６以上であるが、好ましくは０．７以上、０．８以上、０．９以上、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、１００以上であってもよい。ＬＯＸ遺伝子は、本発明の原始腸管細胞において高発現していることから、原始腸管細胞の陽性マーカー遺伝子になると考えられる。
【０１１７】
ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＰＡＰＰＡ（Ｐａｐｐａｌｙｓｉｎ  １、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ；５０６９）遺伝子の相対発現量は０．０１以上であるが、好ましくは０．０２以上、０．０３以上、０．０４以上、０．０５以上、０．０６以上、０．０７以上、０．０８以上、０．０９以上、０．１以上、０．２以上、０．３以上、０．４以上、０．５以上、０．６以上、０．７以上、０．８以上、０．９以上、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、１００以上であってもよい。ＰＡＰＰＡ遺伝子は、本発明の原始腸管細胞において高発現していることから、原始腸管細胞の陽性マーカー遺伝子になると考えられる。
【０１１８】
ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＲＡＢ３１（ＲＡＢ３１、ｍｅｍｂｅｒ  ＲＡＳ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ；１１０３１）遺伝子の相対発現量は０．２以上であるが、好ましくは０．３以上、０．４以上、０．５以上、０．６以上、０．７以上、０．８以上、０．９以上、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、１００以上であってもよい。ＲＡＢ３１遺伝子は、本発明の原始腸管細胞において高発現していることから、原始腸管細胞の陽性マーカー遺伝子になると考えられる。
【０１１９】
ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＡＮＧＰＴ２（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ  ２、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ；２８５）遺伝子の相対発現量は０．０００２以下であるが、好ましくは０．０００１以下、０．００００９以下、０．００００８以下、０．００００７以下、０．００００６以下、０．００００５以下、０．００００４以下、０．００００３以下、０．００００２以下、０．００００１以下であってもよい。ＡＮＧＰＴ２遺伝子は、本発明の原始腸管細胞において発現が低いことから、原始腸管細胞の陰性マーカー遺伝子になると考えられる。
【０１２０】
ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＣＤ４７（ＣＤ４７  ｍｏｌｅｃｕｌｅ、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ；９６１）遺伝子の相対発現量は０．０２以下であるが、好ましくは０．０１以下、０．００９以下、０．００８以下、０．００７以下、０．００６以下、０．００５以下、０．００４以下、０．００３以下、０．００２以下、０．００１以下であってもよい。ＣＤ４７遺伝子は、本発明の原始腸管細胞において発現が低いことから、原始腸管細胞の陰性マーカー遺伝子になると考えられる。
【０１２１】
ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＣＤＣ４２ＥＰ３（ＣＤＣ４２  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ；１０６０２）遺伝子の相対発現量は０．０３以下であるが、好ましくは０．０２以下、０．０１以下、０．００９以下、０．００８以下、０．００７以下、０．００６以下、０．００５以下、０．００４以下、０．００３以下、０．００２以下、０．００１以下であってもよい。ＣＤＣ４２ＥＰ３遺伝子は、本発明の原始腸管細胞において発現が低いことから、原始腸管細胞の陰性マーカー遺伝子になると考えられる。
【０１２２】
ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＣＬＤＮ１８（Ｃｌａｕｄｉｎ  １８、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ；５１２０８）遺伝子の相対発現量は０．００６以下であるが、好ましくは０．００５以下、０．００４以下、０．００３以下、０．００２以下、０．００１以下、０．０００９以下、０．０００８以下、０．０００７以下、０．０００６以下、０．０００５以下、０．０００４以下、０．０００３以下、０．０００２以下、０．０００１以下であってもよい。ＣＬＤＮ１８遺伝子は、本発明の原始腸管細胞において発現が低いことから、原始腸管細胞の陰性マーカー遺伝子になると考えられる。
【０１２３】
ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＣＬＩＣ５（Ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｈａｎｎｅｌ  ５、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ；５３４０５）遺伝子の相対発現量は０．０００１以下であるが、好ましくは０．００００９以下、０．００００８以下、０．００００７以下、０．００００６以下、０．００００５以下、０．００００４以下、０．００００３以下、０．００００２以下、０．００００１以下であってもよい。ＣＬＩＣ５遺伝子は、本発明の原始腸管細胞において発現が低いことから、原始腸管細胞の陰性マーカー遺伝子になると考えられる。
【０１２４】
ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＰＨＬＤＡ１（Ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｆａｍｉｌｙ  Ａ  ｍｅｍｂｅｒ  １、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ；２２８２２）遺伝子の相対発現量は０．２以下であるが、好ましくは０．１以下、０．０９以下、０．０８以下、０．０７以下、０．０６以下、０．０５以下、０．０４以下、０．０３以下、０．０２以下、０．０１以下、０．００９以下、０．００８以下、０．００７以下、０．００６以下、０．００５以下、０．００４以下、０．００３以下、０．００２以下、０．００１以下であってもよい。ＰＨＬＤＡ１遺伝子は、本発明の原始腸管細胞において発現が低いことから、原始腸管細胞の陰性マーカー遺伝子になると考えられる。
【０１２５】
ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＳＫＡＰ２（Ｓｒｃ  ｋｉｎａｓｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ  ２、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ；８９３５）遺伝子の相対発現量は０．０１以下であるが、好ましくは０．００９以下、０．００８以下、０．００７以下、０．００６以下、０．００５以下、０．００４以下、０．００３以下、０．００２以下、０．００１以下、０．０００９以下、０．０００８以下、０．０００７以下、０．０００６以下、０．０００５以下、０．０００４以下、０．０００３以下、０．０００２以下、０．０００１以下であってもよい。ＳＫＡＰ２遺伝子は、本発明の原始腸管細胞において発現が低いことから、原始腸管細胞の陰性マーカー遺伝子になると考えられる。
【０１２６】
ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＦＲＺＢ（ｆｉｚｚｌｅｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ；２４８７）遺伝子の相対発現量は０．０８５以下であるが、好ましくは０．０８以下、０．０７以下、０．０６以下、０．０５以下、０．０４以下、０．０３以下、０．０２以下、０．０１以下、０．００９以下、０．００８以下、０．００７以下、０．００６以下、０．００５以下、０．００４以下、０．００３以下、０．００２以下、０．００１以下であってもよい。ＦＲＺＢ遺伝子は、本発明の原始腸管細胞において発現が低いことから、原始腸管細胞の陰性マーカー遺伝子になると考えられる。
【０１２７】
［４］膵臓β細胞への分化誘導
＜膵臓β細胞＞
膵臓β細胞は、膵内分泌前駆細胞から分化した細胞であり、インスリンを分泌する細胞である。膵内分泌前駆細胞から膵臓β細胞への分化は、膵臓β細胞に特異的な遺伝子の発現量を測定することにより確認することができる。膵臓β細胞に特異的な遺伝子としては、インスリン、ＮＫＸ６．１、ＭＡＦＡ、ＰＤＸ１などを挙げることができる。
【０１２８】
＜膵臓β細胞への分化誘導＞
内胚葉系細胞から膵臓β細胞への分化誘導は、一般的に内胚葉系細胞（胚体内胚葉：Ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ：ＤＥ）→原始腸管細胞（Ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  Ｇｕｔ  Ｔｕｂｅ：ＰＧＴ）→後前腸細胞（Ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ Ｆｏｒｅｇｕｔ：ＰＦＧ）→膵臓前駆細胞（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ：ＰＰ）→内分泌前駆細胞（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ：ＥＰ）→膵臓β細胞（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃβｃｅｌｌ：β）という順番で行うことができる。
【０１２９】
内胚葉系細胞から膵臓β細胞への分化誘導における培養温度は、使用する多能性幹細胞の培養に適した培養温度であれば、特に限定されないが、一般的には３０℃から４０℃であり、好ましくは約３７℃である。
ＣＯ2インキュベーターなどを利用して、約１から１０％、好ましくは５％のＣＯ2濃度雰囲気下で培養を行うことが好ましい。
【０１３０】
内胚葉系細胞から原始腸管細胞への分化誘導については、本明細書において上記した通りである。
【０１３１】
原始腸管細胞から後前腸細胞への分化誘導に用いる培地としては、基礎培地（例えば、ＤＭＥＭ培地など）に、抗生物質（ペニシリン及びストレプトマイシン）、ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸）、Ｂ２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ＥＣ２３、及びＳＡＮＴ１を添加した培地を用いることができる。
【０１３２】
原始腸管細胞から後前腸細胞への分化誘導の培養期間は、一般的には、一般的には４８時間から１４４時間であり、好ましく７２時間から１２０時間程度である。
【０１３３】
後前腸細胞から膵臓前駆細胞への分化誘導に用いる培地としては、基礎培地（例えば、ＤＭＥＭ培地など）に、抗生物質（ペニシリン及びストレプトマイシン）、ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸）、ＦＧＦ−１０、Ｂ２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ＥＣ２３、ＡＬＫ５インヒビターＩＩ、及びインドラクタムＶを添加した培地を用いることができる。
【０１３４】
後前腸細胞から膵臓前駆細胞への分化誘導の培養期間は、一般的には、一般的には２４時間から１２０時間であり、好ましく４８時間から９６時間程度である。
【０１３５】
膵臓前駆細胞から内分泌前駆細胞への分化誘導に用いる培地としては、基礎培地（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ−ＤＭＥＭ培地など）に、抗生物質（ペニシリン及びストレプトマイシン）、Ｂ２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ＥＣ２３、ＳＡＮＴ１、ＡＬＫ５インヒビターＩＩ、及びＥｘｃｅｄｉｎ−４を添加した培地を用いることができる。
【０１３６】
膵臓前駆細胞から内分泌前駆細胞への分化誘導の培養期間は、一般的には、一般的には２４時間から１２０時間であり、好ましく４８時間から９６時間程度である。
【０１３７】
内分泌前駆細胞から膵臓β細胞への分化誘導に用いる培地としては、基礎培地（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ−ＤＭＥＭ培地など）に抗生物質（ペニシリン及びストレプトマイシン）、Ｂ２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ＢＭＰ−４、ＨＧＦ、ＩＧＦ−１、ＡＬＫ５インヒビターＩＩ、Ｅｘｃｅｄｉｎ−４、ニコチンアミド、及びＦｏｒｓｋｏｌｉｎを添加した培地を用いることができる。
【０１３８】
膵臓β細胞への分化は、膵臓β細胞に特異的な遺伝子の発現量を測定することにより確認することができる。膵臓β細胞に特異的な遺伝子としては、例えばＩＮＳ（Ｉｎｓｕｌｉｎ）、ＮＫＸ６．１（ＮＫ６  ｈｏｍｅｏｂｏｘ  １）などを挙げることができる。
ＩＮＳの遺伝子配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎの遺伝子データベースに登録されている（ＩＤ：３６３０）、またＮＫＸ６．１の遺伝子配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎの遺伝子データベースに登録されている（ＩＤ：４８２５）。
【０１３９】
内分泌前駆細胞から膵臓β細胞への分化誘導の培養期間は、一般的には９６時間から２４０時間程度である。
【０１４０】
上記の方法により得られる膵臓β細胞は、インスリン分泌能が高く、糖尿病に対して高い治療効果を発揮できる。即ち、本発明の方法を利用して膵臓β細胞（インスリン産生細胞と言い換える場合がある）を得た場合には、これをカテーテルなどであるいは免疫隔離デバイス等に封入して移植することにより、糖尿病の治療へ利用できる。また、膵臓β細胞などの物質代謝が可能な膵臓系の細胞を得ることにより、その膵臓β細胞が産生したインスリンを直接注射することにより、Ｉ型糖尿病の治療に用いることもできる。
【０１４１】
以下、多能性幹細胞から内胚葉系細胞の製造方法について説明する。多能性幹細胞から内胚葉系細胞への分化誘導方法については、通常知られている方法であれば何でもよく、下記の具体的態様には特に限定されない。
【０１４２】
［５］多能性幹細胞の維持培養
本発明の製造方法においては、多能性幹細胞を培養することによって分化誘導された内胚葉系細胞を使用する。
内胚葉系細胞への分化誘導を行う前の多能性幹細胞は、未分化維持培地を用いて未分化性を維持したものとすることが好ましい。未分化維持培地を用いて多能性幹細胞の未分化性を維持する培養のことを、多能性幹細胞の維持培養ともいう。
【０１４３】
未分化維持培地は、多能性幹細胞の未分化性を維持できる培地であれば特に限定されないが、例えば、マウス胚性幹細胞及びマウス人工多能性幹細胞の未分化性を維持する性質を有していることが知られているｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒを含む培地や、ヒトｉＰＳの未分化性を維持する性質を有していることが知られているｂａｓｉｃ  ＦＧＦ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）を含む培地等が挙げられる。例えば、ヒトｉＰＳ細胞培地（２０％Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ；Ｇｉｂｃｏ社）、１×ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（ＮＥＡＡ；Ｗａｋｏ社）、５５μｍｏｌ／Ｌ  ２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ；Ｇｉｂｃｏ社）、７．５ｎｇ／ｍＬ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ２（ＦＧＦ２；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、０．５×Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ａｎｄ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＰＳ；Ｗａｋｏ社）を含むＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（Ｗａｋｏ社）、又はＥｓｓｅｎｔａｉｌ８培地（Tｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、ＳＴＥＭＰＲＯ（登録商標）  ｈＥＳＣ  ＳＦＭ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ｍＴｅＳＲ１（Ｖｅｒｉｔａｓ社）、ＴｅＳＲ２（Ｖｅｒｉｔａｓ社）、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）等を使用することができるが、特に限定されない。
【０１４４】
多能性幹細胞の維持培養は、好適なフィーダー細胞（例えば、ＳＬ１０フィーダー細胞、ＳＮＬフィーダー細胞等）上において上記の未分化維持培地を用いて行うことができる。また、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン又はマトリゲル等の細胞接着タンパク質や細胞外マトリックスをコートした細胞培養用ディッシュ上においても上記した未分化維持培地を用いて行うことができる。
【０１４５】
培養温度は、使用する多能性幹細胞の培養に適した培養温度であれば、特に限定されないが、一般的には３０℃から４０℃であり、好ましくは約３７℃である。
ＣＯ2インキュベーターなどを利用して、約１から１０％、好ましくは５％のＣＯ2濃度雰囲気下で培養を行うことが好ましい。
【０１４６】
多能性幹細胞の維持培養は継代しながら所望の期間行うことができ、例えば、維持培養後の継代数１から１００、好ましくは継代数１０から５０、より好ましくは継代数２５から４０の多能性幹細胞を用いて、凝集体の形成や分化誘導を行うことが好ましい。
【０１４７】
［６］多能性幹細胞の浮遊培養による凝集体の形成
多能性幹細胞の凝集体を形成するための実施形態の一つとしては、未分化で維持培養している細胞を、ａｃｃｕｍａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）等によりフィーダー細胞から剥がし、３から４回ヒトｉＰＳ細胞培地でリンスをしてフィーダー細胞を除くことができる。次いで、ピペッティングにより小さな細胞塊又はシングルセルに砕き、それら細胞を培地中に懸濁した後に、懸濁液中の多能性幹細胞が凝集体を形成するまでの期間にわたって攪拌又は旋回させながら浮遊培養する。浮遊培養についての好ましい態様は、内胚葉系細胞を浮遊培養にて原始腸管細胞（ＰＧＴ）へ分化誘導させる際の態様と同様である。
【０１４８】
培養温度は、使用する多能性幹細胞の培養に適した培養温度であれば、特に限定されないが、一般的には３０℃から４０℃であり、好ましくは約３７℃である。
ＣＯ2インキュベーターなどを利用して、約１から１０％、好ましくは５％のＣＯ2濃度雰囲気下で培養を行うことが好ましい。
【０１４９】
［７］多能性幹細胞の前培養
上記多能性幹細胞の凝集体又は多能性幹細胞を内胚葉系細胞に分化誘導する前に、２−メルカプトエタノールを含む培地を用いて浮遊培養し、細胞集団を調製することができる。
前培養に用いる培地は、細胞の種類に応じて、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、又はＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ６TM培地（Tｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）等を用いることができる。
【０１５０】
多能性幹細胞の前培養は、浮遊培養にて実施する。上述した浮遊培養の条件によって行うことができ、さらに、予めマイクロキャリア等に接着させて浮遊培養しても良いし、細胞のみで構成された細胞凝集塊の状態で浮遊培養しても良いし、細胞凝集塊の中にコラーゲン等の高分子が混在していても良く、形態は特に限定しない。
【０１５１】
前培養に用いる培地中における２−メルカプトエタノールの濃度としては、分化誘導の効率が向上する範囲であれば特に限定されないが、例えば、２−メルカプトエタノールの濃度として、１μＭ以上、２μＭ以上、５μＭ以上、１０μＭ以上、２０μＭ以上、３０μＭ以上、４０μＭ以上、又は５０μＭ以上が好ましく、２００μＭ以下、１５０μＭ以下、１２０μＭ以下、１００μＭ以下、９０μＭ以下、８０μＭ以下、７０μＭ以下、又は６０μＭ以下が好ましい。
【０１５２】
前培養に用いる培地は、ＦＧＦ２（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ  ２）を添加していない培地であることも好ましい。ＦＧＦ２を添加していない培地を使用することにより、内胚葉系細胞への分化効率をより向上することができる場合がある。
前培養に用いる培地は、ＴＧＦβ１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β１）を添加していない培地であることも好ましい。ＴＧＦβ１を添加していない培地を使用することにより、内胚葉系細胞への分化効率をより向上することができる場合がある。
【０１５３】
前培養に用いる培地は、ＷＮＴシグナル活性化剤を添加していない培地であることも好ましい。ＷＮＴシグナル活性化剤を添加していない培地を使用することにより、内胚葉系細胞への分化効率をより向上することができる場合がある。
前培養に用いる培地は、アクチビンＡ（本明細書中において「ＡＣＴＩＶＩＮ  Ａ」と言い換える場合がある）を添加していない培地であることも好ましい。アクチビンＡを添加していない培地を使用することにより、内胚葉系細胞への分化効率をより向上することができる場合がある。
【０１５４】
前培養用の培地には、アミノ酸、抗生物質、抗酸化剤、その他の添加物を加えてもよい。例えば０．１から２％（体積／体積）のＮＥＡＡ（非必須アミノ酸）、０．１から２％（体積／体積）のペニシリン／ストレプトマイシン、０．１から２０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ又は１から２５％（体積／体積）（好ましくは１から２０％（体積／体積））のＫｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ （ＫＳＲ）などを添加してもよい。
【０１５５】
培養温度は、使用する多能性幹細胞の培養に適した培養温度であれば、特に限定されないが、一般的には３０℃から４０℃であり、好ましくは約３７℃である。
ＣＯ2インキュベーターなどを利用して、約１から１０％、好ましくは５％のＣＯ2濃度雰囲気下で培養を行うことが好ましい。
【０１５６】
多能性幹細胞の前培養の培養期間は、多分化能が向上するまで培養する日数であれば特に限定されないが、例えば１週間を超えない期間であれば良い。より具体的には、６日未満、５日未満、４日未満、３日未満、又は、６時間から４８時間であり、１２時間から３６時間程度であり、１８時間から２４時間である。
【０１５７】
［８］内胚葉系細胞への分化誘導
本発明においては、上記の前培養で得られた細胞集団を、内胚葉系細胞に分化誘導できる条件下で培養することによって、内胚葉系細胞を製造することができる。
【０１５８】
内胚葉系細胞は、消化管、肺、甲状腺、膵臓、肝臓などの器官の組織、消化管に開口する分泌腺の細胞、腹膜、胸膜、喉頭、耳管、気管、気管支、尿路（膀胱、尿道の大部分、尿管の一部）などへと分化する能力を有し、一般的に、胚体内胚葉（DE）と言われることがある。多能性幹細胞から内胚葉系細胞への分化は、内胚葉系細胞に特異的な遺伝子の発現量を測定することにより確認することができる。内胚葉系細胞に特異的な遺伝子としては、例えば、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＣＸＣＲ４、ＡＦＰ、ＧＡＴＡ４、ＥＯＭＥＳ等を挙げることができる。なお、本明細書中において、内胚葉系細胞を胚体内胚葉と言い換えて使用することがある。
【０１５９】
多能性幹細胞を内胚葉系細胞に分化誘導する際には、分化誘導化培地を使用して多能性幹細胞の培養を行う。
分化誘導化培地としては、多能性幹細胞を分化誘導させる培地であれば特に限定されるものではないが、例えば、血清含有培地や、血清代替成分を含有した無血清培地等が挙げられる。
【０１６０】
用いる細胞の種類に応じて、霊長類ＥＳ／ｉＰＳ細胞用培地（リプロセル培地）、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ  １０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９培地、Ｅａｇｌｅ  ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ハム培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、及びこれらの培地から任意に選択した２種以上の培地を混合した培地などが使用できる。なお、動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。
【０１６１】
分化誘導培地は、血清成分又は血清代替成分を含んでいてもよい。血清成分又は血清代替成分としては、例えば、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素（例えば亜鉛、セレン）、Ｂ−２７サプリメント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、Ｎ２サプリメント、Ｎ２１サプリメント（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、ＮｅｕｒｏＢｒｅｗ−２１サプリメント（Ｍｉｌｔｅｎｙｉｂｉｏｔｅｃ社）、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）、２−メルカプトエタノール、３’チオールグリセロール、並びにこれらの均等物が挙げられる。
【０１６２】
分化誘導培地には、さらに各種の添加物、抗生物質、抗酸化剤などを加えてもよい。例えば、０．１ｍＭから５ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．１から２％（体積／体積）の非必須アミノ酸、０．１から２％（体積／体積）のペニシリン、０．１から２％（体積／体積）のストレプトマイシン、０．１から２％（体積／体積）のアンフォテリシンＢ、カタラーゼ、グルタチオン、ガラクトース、レチノイン酸（ビタミンＡ）、スーパーオキシドディスムターゼ、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、Ｄ−α−トコフェロール（ビタミンＥ）などを添加してもよい。
【０１６３】
分化誘導培地にはさらに、分化誘導因子を添加する。分化誘導因子の詳細については後記する。
【０１６４】
分化誘導時における多能性幹細胞の培養は、浮遊培養であることが好ましい。細胞はマイクロキャリア等に接着させて浮遊培養しても良いし、細胞のみで構成された細胞凝集塊の状態で浮遊培養しても良いし、細胞凝集塊の中にコラーゲン等の高分子が混在していても良く、形態は特に限定しない。
【０１６５】
分化誘導のための培養における培養温度は、使用する多能性幹細胞の培養に適した培養温度であれば、特に限定されないが、一般的には３０℃から４０℃であり、好ましくは約３７℃である。
ＣＯ2インキュベーターなどを利用して、約１から１０％、好ましくは５％のＣＯ2濃度雰囲気下で培養を行うことが好ましい。
【０１６６】
多能性幹細胞から内胚葉系細胞への分化培養の培養期間は、内胚葉系列の細胞特性が呈する細胞型になっているのであれば特に限定されないが、例えば、2週間以内であればよく、より具体的には２日以上８日以内であり、より好ましくは２日以上７日以内であり、さらに好ましくは３日以上６日以内であり、一例としては４日又は５日である。
【０１６７】
［９］内胚葉系細胞への分化誘導に用いる分化誘導因子、及びその他の添加物
好ましくは、内胚葉系細胞は、多能性幹細胞集団を、ＴＧＦβ(Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β)スーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地で培養した後、ＦＧＦ２及びＢＭＰ４（Ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４）を添加していない培地で培養することにより分化誘導された内胚葉系細胞である。
【０１６８】
ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地においてアクチビンＡを使用する場合、アクチビンＡの添加初期濃度は、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ以上、２ｎｇ／ｍＬ以上、３ｎｇ／ｍＬ以上、５ｎｇ／ｍＬ以上、１０ｎｇ／ｍＬ以上、２０ｎｇ／ｍＬ以上、３０ｎｇ／ｍＬ以上、４０ｎｇ／ｍＬ以上、又は５０ｎｇ／ｍＬ以上であり、好ましくは１,０００ｎｇ／ｍＬ以下、９００ｎｇ／ｍＬ以下、８００ｎｇ／ｍＬ以下、７００ｎｇ／ｍＬ以下、６００ｎｇ／ｍＬ以下、５００ｎｇ／ｍＬ以下、４００ｎｇ／ｍＬ以下、３００ｎｇ／ｍＬ以下、２００ｎｇ／ｍＬ以下、１５０ｎｇ／ｍＬ以下又は１００ｎｇ／ｍＬ以下である。
【０１６９】
ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地においてＦＧＦ２を使用する場合、ＦＧＦ２の添加初期濃度は、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ以上、２ｎｇ／ｍＬ以上、３ｎｇ／ｍＬ以上、５ｎｇ／ｍＬ以上、１０ｎｇ／ｍＬ以上、２０ｎｇ／ｍＬ以上、３０ｎｇ／ｍＬ以上、又は４０ｎｇ／ｍＬ以上であり、好ましくは１,０００ｎｇ／ｍＬ以下、９００ｎｇ／ｍＬ以下、８００ｎｇ／ｍＬ以下、７００ｎｇ／ｍＬ以下、６００ｎｇ／ｍＬ以下、５００ｎｇ／ｍＬ以下、４００ｎｇ／ｍＬ以下、３００ｎｇ／ｍＬ以下、２００ｎｇ／ｍＬ以下、１５０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ以下、９０ｎｇ／ｍＬ以下、８０ｎｇ／ｍＬ以下、又は７０ｎｇ／ｍＬ以下である。
【０１７０】
ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地においてＢＭＰ４を使用する場合、ＢＭＰ４の添加初期濃度は、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ以上、２ｎｇ／ｍＬ以上、３ｎｇ／ｍＬ以上、５ｎｇ／ｍＬ以上、６ｎｇ／ｍＬ以上、７ｎｇ／ｍＬ以上、８ｎｇ／ｍＬ以上、９ｎｇ／ｍＬ以上、１０ｎｇ／ｍＬ以上、１１ｎｇ／ｍＬ以上、１２ｎｇ／ｍＬ以上、１３ｎｇ／ｍＬ以上、１４ｎｇ／ｍＬ以上、又は１５ｎｇ／ｍＬ以上であり、好ましくは１,０００ｎｇ／ｍＬ以下、９００ｎｇ／ｍＬ以下、８００ｎｇ／ｍＬ以下、７００ｎｇ／ｍＬ以下、６００ｎｇ／ｍＬ以下、５００ｎｇ／ｍＬ以下、４００ｎｇ／ｍＬ以下、３００ｎｇ／ｍＬ以下、２００ｎｇ／ｍＬ以下、１５０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ以下、９０ｎｇ／ｍＬ以下、８０ｎｇ／ｍＬ以下、７０ｎｇ／ｍＬ以下、６０ｎｇ／ｍＬ以下、５０ｎｇ／ｍＬ以下、４０ｎｇ／ｍＬ以下、又は３０ｎｇ／ｍＬ以下である。
【０１７１】
ＦＧＦ２及びＢＭＰ４を添加していない培地は、アクチビンＡを含むことが好ましい。
ＦＧＦ２及びＢＭＰ４を添加していない培地がアクチビンＡを含む場合におけるアクチビンＡの添加初期濃度は、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ以上、２ｎｇ／ｍＬ以上、３ｎｇ／ｍＬ以上、５ｎｇ／ｍＬ以上、１０ｎｇ／ｍＬ以上、２０ｎｇ／ｍＬ以上、３０ｎｇ／ｍＬ以上、４０ｎｇ／ｍＬ以上、又は５０ｎｇ／ｍＬ以上であり、好ましくは１,０００ｎｇ／ｍＬ以下、９００ｎｇ／ｍＬ以下、８００ｎｇ／ｍＬ以下、７００ｎｇ／ｍＬ以下、６００ｎｇ／ｍＬ以下、５００ｎｇ／ｍＬ以下、４００ｎｇ／ｍＬ以下、３００ｎｇ／ｍＬ以下、２００ｎｇ／ｍＬ以下、１５０ｎｇ／ｍＬ以下又は１００ｎｇ／ｍＬ以下である。
【０１７２】
ＦＧＦ２及びＢＭＰ４を添加していない培地は、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム及びエタノールアミンからなる群から選択される少なくとも１種類以上を含むことが好ましい。
インスリンの添加濃度は、好ましくは０．００１μｇ／ｍＬ以上、０．０１μｇ／ｍＬ以上、０．０５μｇ／ｍＬ以上、０．１μｇ／ｍＬ以上、０．２μｇ／ｍＬ以上であり、好ましくは１０，０００μｇ／ｍＬ以下、１，０００μｇ／ｍＬ以下、１００μｇ／ｍＬ以下、１０μｇ／ｍＬ以下、９μｇ／ｍＬ以下、８μｇ／ｍＬ以下、７μｇ／ｍＬ以下、６μｇ／ｍＬ以下、５μｇ／ｍＬ以下、４μｇ／ｍＬ以下、３μｇ／ｍＬ以下、２μｇ／ｍＬ以下である。トランスフェリンの添加濃度は、好ましくは０．００１μｇ／ｍＬ以上、０．０１μｇ／ｍＬ以上、０．０５μｇ／ｍＬ以上、０．０６μｇ／ｍＬ以上、０．０７μｇ／ｍＬ以上、０．０８μｇ／ｍＬ以上、０．０９μｇ／ｍＬ以上、０．１μｇ／ｍＬ以上、０．１１μｇ／ｍＬ以上であり、好ましくは１０，０００μｇ／ｍＬ以下、１，０００μｇ／ｍＬ以下、１００μｇ／ｍＬ以下、１０μｇ／ｍＬ以下、９μｇ／ｍＬ以下、８μｇ／ｍＬ以下、７μｇ／ｍＬ以下、６μｇ／ｍＬ以下、５μｇ／ｍＬ以下、４μｇ／ｍＬ以下、３μｇ／ｍＬ以下、２μｇ／ｍＬ以下、１．９μｇ／ｍＬ以下、１．８μｇ／ｍＬ以下、１．７μｇ／ｍＬ以下、１．６μｇ／ｍＬ以下、１．５μｇ／ｍＬ以下、１．４μｇ／ｍＬ以下、１．３μｇ／ｍＬ以下、１．２μｇ／ｍＬ以下、１．１μｇ／ｍＬ以下である。亜セレン酸ナトリウムの添加濃度は、好ましくは０．００１ｎｇ／ｍＬ以上、０．０１ｎｇ／ｍＬ以上、０．１ｎｇ／ｍＬ以上であり、好ましくは１０，０００ｎｇ／ｍＬ以下、１，０００ｎｇ／ｍＬ以下、１００ｎｇ／ｍＬ以下、１０ｎｇ／ｍＬ以下、１ｎｇ／ｍＬ以下である。エタノールアミンの添加濃度は、好ましくは０．００１μｇ／ｍＬ以上、０．０１μｇ／ｍＬ以上、０．０２μｇ／ｍＬ以上、０．０３μｇ／ｍＬ以上、０．０４μｇ／ｍＬ以上であり、好ましくは１０，０００μｇ／ｍＬ以下、１，０００μｇ／ｍＬ以下、１００μｇ／ｍＬ以下、１０μｇ／ｍＬ以下、１μｇ／ｍＬ以下、０．９μｇ／ｍＬ以下、０．８μｇ／ｍＬ以下、０．７μｇ／ｍＬ以下、０．６μｇ／ｍＬ以下、０．５μｇ／ｍＬ以下、０．４μｇ／ｍＬ以下である。
【０１７３】
ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地、及び／又はＦＧＦ２及びＢＭＰ４を添加していない培地は、さらに２−メルカプトエタノールを含むことが好ましい。２−メルカプトエタノールを作用することにより、内胚葉系細胞への分化誘導効率を高めることができる。
【０１７４】
ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地は、さらにＷＮＴシグナル活性化剤を含むことが好ましい。
【０１７５】
ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地においてＣＨＩＲ９９０２１を使用する場合、添加初期濃度は、好ましくは０．０１μＭ以上、０．０２μＭ以上、０．０３μＭ以上、０．０４μＭ以上、０．０５μＭ以上、０．１μＭ以上、０．２μＭ以上、０．３μＭ以上、０．４μＭ以上、０．５μＭ以上、０．６μＭ以上、０．７μＭ以上、０．８μＭ以上、０．９μＭ以上、１μＭ以上、又は２μＭ以上であり、好ましくは１００μＭ以下、９０μＭ以下、８０μＭ以下、７０μＭ以下、６０μＭ以下、５０μＭ以下、４５μＭ以下、４０μＭ以下、３５μＭ以下、３０μＭ以下、２５μＭ以下、２０μＭ以下、１５μＭ以下、１０μＭ以下又は５μＭ以下である。より好ましくは３μＭ又は４μＭである。
【０１７６】
ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地、及び／又はＦＧＦ２及びＢＭＰ４を添加していない培地は、少なくともグルコースを含む。前記培地中に含まれるグルコース濃度の下限は、細胞が増殖できる濃度であれば特に限定されないが、０．０１ｇ／Ｌ以上が好ましい。また、前記培地中に含まれるグルコース濃度の上限は、細胞が死滅しない濃度であれば特に限定されないが、例えば１０ｇ／Ｌ以下が好ましい。他の実施態様として、内胚葉系列の体細胞に効率的に分化させる観点においては、グルコースを２．０ｇ／Ｌ未満で含有する培地が好ましい。ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地、及び／又はＦＧＦ２及びＢＭＰ４を添加していない培地におけるグルコースの濃度は、１．０ｇ／Ｌ以下でもよく、０．９ｇ／Ｌ以下でもよく、０．８ｇ／Ｌ以下、０．７ｇ／Ｌ以下、０．６ｇ／Ｌ以下でもよい。ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地、及び／又はＦＧＦ２及びＢＭＰ４を添加していない培地がグルコースを含む場合における、グルコースの濃度の下限は特に限定されないが、０．０１ｇ／Ｌ以上でもよく、０．０２ｇ／Ｌ以上、０．０５ｇ／Ｌ以上、０．１ｇ／Ｌ以上、０．２ｇ／Ｌ以上、０．３ｇ／Ｌ以上、０．４ｇ／Ｌ以上、０．５ｇ／Ｌ以上でもよい。
【０１７７】
以下の実施例にて本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【０１７８】
［実施例１］
＜多能性幹細胞の維持培養＞
ヒトｉＰＳ細胞株ＴＫＤＮ４−Ｍ(東京大学医科学研究所)はＭＩＴＯＭＹＣＩＮ−Ｃ(ＷＡＫＯ社)で処理をしたＳＮＬ ＦＥＥＤＥＲ細胞上でヒトｉＰＳ細胞培地(２０％ ＫＮＯＣＫＯＵＴ ＳＥＲＵＭ ＲＥＰＬＡＣＥＭＥＮＴ（ＫＳＲ；ＧＩＢＣＯ社)、１×ＮＯＮ−ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ（ＮＥＡＡ；ＷＡＫＯ社)、５５μｍｏＬ／Ｌ  ２−ＭＥＲＣＡＰＴＥＴＨＡＮＯＬ（２−ＭＥ；ＧＩＢＣＯ社)、７．５ＮＧ／ＭＬ  ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ  ＨＵＭＡＮ  ＦＩＢＲＯＢＬＡＳＴ  ＧＲＯＷＴＨ  ＦＡＣＴＯＲ（ＦＧＦ２；ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社）、０．５×ＰＥＮＩＣＩＬＬＩＮ  ＡＮＤ ＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＩＮ  （ＰＳ；ＷＡＫＯ社）を含むＤＭＥＭ／ＨＡＭ‘Ｓ  Ｆ１２（ＷＡＫＯ社））で未分化維持培養を行った。又は、ＶＩＴＲＯＮＥＣＴＩＮ（ＧＩＢＣＯ）でコーティングしたプレート上で、１×ＰＥＮＩＣＩＬＬＩＮ  ＡＮＤ  ＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＩＮ  ＡＮＤ  ＡＭＰＨＯＴＥＲＩＣＩＮ  Ｂ（ＷＡＫＯ社）を含むＥＳＳＥＮＴＩＡＬ  ８培地（Ｅ８；ＧＩＢＣＯ社）で未分化維持培養した。なお、播種時のみ最終濃度１０μＭとなるように Ｙ−２７６３２を添加して培養した。培養は、３７℃、５％のＣＯ2濃度雰囲気下で行った。【０１７９】
＜凝集体の作製＞
ヒトｉＰＳ細胞株ＴｋＤＮ４−Ｍ（東京大学医科学研究所）は、１回ＰＢＳでリンスを行い、ａｃｃｕｍａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）にて３７℃で５分から１５分インキュベートしてからピペッティングによりシングルセルまで分散して回収した。３×１０7個の細胞を１０μＭのＹ−２７６３２を含むｍＴｅＳＲ１の培地３０ｍＬ中に懸濁し、３０ｍＬシングルユースバイオリアクター（ＡＢＬＥ社）へ移し６チャネルマグネチックスターラー（ＡＢＬＥ社）に装着して４５ｒｐｍの速度で攪拌しながら３７℃の５％ＣＯ2インキュベーター内で浮遊培養を１日間行った。【０１８０】
＜多能性幹細胞の前培養＞
維持培養にて得られた凝集体を形成した細胞集団を、２０％（体積／体積）  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ；Ｇｉｂｃｏ社）、１×ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（ＮＥＡＡ；Ｗａｋｏ社）、５５μｍｏｌ／Ｌ  ２−メルカプトエタノール（２−ｍｅｒｃａｐｔｅｔｈａｎｏｌ；Ｇｉｂｃｏ社）、０．５×Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ａｎｄ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＰＳ；Ｗａｋｏ社）を含むＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（Ｗａｋｏ社）に懸濁し、３０ｍＬシングルユースバイオリアクター（ＡＢＬＥ社）へ移し、６チャネルマグネチックスターラー（ＡＢＬＥ社）に装着して４５ｒｐｍの速度で攪拌しながら３７℃の５％ＣＯ2インキュベーター内で浮遊培養を１日間行った。【０１８１】
＜内胚葉系細胞への分化誘導＞
前培養にて得られた凝集体を形成した細胞集団を、最初の１から２日目は、０．５％Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ；  ｓｉｇｍａ）、０．４×ＰＳ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ（Ｗａｋｏ社）、１×ＮＥＡＡ、８０ｎｇ／ｍＬ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  アクチビンＡ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、５０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、２０ｎｇ／ｍＬ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４（ＢＭＰ４；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、３μｍｏｌ／Ｌ  ＣＨＩＲ９９０２１（Ｗａｋｏ社）を含むＲＰＭＩ１６４０（Ｗａｋｏ社）で浮遊培養した。３日目はこの培地からＢＭＰ４、ＦＧＦ２、ＣＨＩＲ９９０２１を除いて浮遊培養を行い、４日目はさらに１％ＫＳＲを加えた培地で浮遊培養を１日間行った。なお、浮遊培養は３０ｍＬシングルユースバイオリアクター（ＡＢＬＥ社）を６チャネルマグネチックスターラー（エイブル社）に装着し、４５ｒｐｍの速度で攪拌しながら３７℃の５％ＣＯ2インキュベーター内で浮遊培養を行った。【０１８２】
＜内胚葉系細胞から原始腸管細胞（ＰＧＴ）への分化誘導方法の検討＞
上記で得られた内胚葉系細胞から原始腸管細胞（Ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  Ｇｕｔ  Ｔｕｂｅ；ＰＧＴ）へ分化誘導した。具体的には、０．２５％ＢＳＡ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ、１×ＮＥＡＡ、０．４×ＰＳ、５０ｎｇ／ｍＬ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ＦＧＦ７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、１％Ｂ２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ社）、０．３％ＩＴＳ−Ｘ（Ｗａｋｏ社）を含むＲＰＭＩ１６４０培地で３日間浮遊培養した。浮遊培養は３０ｍＬシングルユースバイオリアクター（ＡＢＬＥ社）を６チャネルマグネチックスターラー（エイブル社）に装着し、５５ｒｐｍの速度で攪拌しながら３７℃の５％ＣＯ2インキュベーター内で浮遊培養を行った。【０１８３】
[参考例１]
＜内胚葉系細胞から原始腸管細胞（ＰＧＴ）への分化誘導方法の検討＞
実施例１と同様の方法でで得られた内胚葉系細胞から原始腸管細胞（Ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  Ｇｕｔ  Ｔｕｂｅ；ＰＧＴ）へ分化誘導した。具体的には、０．２５％ＢＳＡ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ、１×ＮＥＡＡ、０．４×ＰＳ、５０ｎｇ／ｍＬ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ＦＧＦ７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、０．３％（Ｖ/Ｖ）ＩＴＳ−Ｘ（Ｗａｋｏ社）、１％Ｂ２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ社）、0.2μＭ  ＬＤＮ１９３１８９（Ｃａｙｍａｎ社）を含むＲＰＭＩ１６４０培地で３日間浮遊培養した。なお、浮遊培養は３０ｍＬシングルユースバイオリアクター（ＡＢＬＥ社）を６チャネルマグネチックスターラー（エイブル社）に装着し、５５ｒｐｍの速度で攪拌しながら３７℃の５％ＣＯ2インキュベーター内で浮遊培養を行った。【０１８４】
[参考例２]
＜内胚葉系細胞から原始腸管細胞（ＰＧＴ）への分化誘導方法の検討＞
実施例１と同様の方法で得られた内胚葉系細胞から原始腸管細胞（Ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  Ｇｕｔ  Ｔｕｂｅ；ＰＧＴ）へ分化誘導した。具体的には、０．２５％ＢＳＡ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ、１×ＮＥＡＡ、０．４×ＰＳ、５０ｎｇ／ｍＬ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ＦＧＦ７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、１％Ｂ２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ社）、０．６７μＭ  ＥＣ２３、１μＭ  Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、１０μＭ  ＳＢ４３１５４２、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ１を含むＲＰＭＩ１６４０培地で３日間浮遊培養した。なお、浮遊培養は３０ｍＬシングルユースバイオリアクター（ＡＢＬＥ社）を６チャネルマグネチックスターラー（エイブル社）に装着し、５５ｒｐｍの速度で攪拌しながら３７℃の５％ＣＯ2インキュベーター内で浮遊培養を行った。【０１８５】
[実施例２]
＜内胚葉系細胞から原始腸管細胞（ＰＧＴ）への分化誘導方法の検討＞
実施例１と同様の方法でで得られた内胚葉系細胞から原始腸管細胞（Ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  Ｇｕｔ  Ｔｕｂｅ；ＰＧＴ）へ分化誘導した。具体的には、０．２５％ＢＳＡ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ、１×ＮＥＡＡ、０．４×ＰＳ、５０ｎｇ／ｍＬ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ＦＧＦ７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、０．３％（Ｖ/Ｖ）ＩＴＳ−Ｘ（Ｗａｋｏ社）、１％Ｂ２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ社）、０．６７μＭ  ＥＣ２３、１０μＭ  ＳＢ４３１５４２、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ１を含むＲＰＭＩ１６４０培地で３日間浮遊培養した。なお、浮遊培養は３０ｍＬシングルユースバイオリアクター（ＡＢＬＥ社）を６チャネルマグネチックスターラー（エイブル社）に装着し、５５ｒｐｍの速度で攪拌しながら３７℃の５％ＣＯ2インキュベーター内で浮遊培養を行った。【０１８６】
[比較例１]
＜内胚葉系細胞から原始腸管細胞（ＰＧＴ）への分化誘導方法の検討＞
実施例１と同様の方法でで得られた内胚葉系細胞から原始腸管細胞（Ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  Ｇｕｔ  Ｔｕｂｅ；ＰＧＴ）へ分化誘導した。具体的には、０．２５％ＢＳＡ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ、１×ＮＥＡＡ、０．４×ＰＳ、５０ｎｇ／ｍＬ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ＦＧＦ７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、０．３％（Ｖ/Ｖ）ＩＴＳ−Ｘ（Ｗａｋｏ社）、１％Ｂ２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ社）、0.2μＭ  ＬＤＮ１９３１８９（Ｃａｙｍａｎ社）、１０μＭ  ＳＢ４３１５４２、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ１、０．６７μＭ  ＥＣ２３を含むＲＰＭＩ１６４０培地で３日間浮遊培養した。なお、浮遊培養は３０ｍＬシングルユースバイオリアクター（ＡＢＬＥ社）を６チャネルマグネチックスターラー（エイブル社）に装着し、５５ｒｐｍの速度で攪拌しながら３７℃の５％ＣＯ2インキュベーター内で浮遊培養を行った。【０１８７】
[比較例２]
＜内胚葉系細胞から原始腸管細胞（ＰＧＴ）への分化誘導方法の検討＞
実施例１と同様の方法でで得られた内胚葉系細胞から原始腸管細胞（Ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  Ｇｕｔ  Ｔｕｂｅ；ＰＧＴ）へ分化誘導した。具体的には、０．２５％ＢＳＡ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ、１×ＮＥＡＡ、０．４×ＰＳ、５０ｎｇ／ｍＬ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ＦＧＦ７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、０．３％（Ｖ/Ｖ）ＩＴＳ−Ｘ（Ｗａｋｏ社）、１％Ｂ２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ社）、0.2μＭ  ＬＤＮ１９３１８９（Cayman社）、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ１、０．６７μＭ  ＥＣ２３を含むＲＰＭＩ１６４０培地で３日間浮遊培養した。なお、浮遊培養は３０ｍＬシングルユースバイオリアクター（ＡＢＬＥ社）を６チャネルマグネチックスターラー（エイブル社）に装着し、５５ｒｐｍの速度で攪拌しながら３７℃の５％ＣＯ2インキュベーター内で浮遊培養を行った。【０１８８】
[比較例３]
＜内胚葉系細胞から原始腸管細胞（ＰＧＴ）への分化誘導方法の検討＞
実施例１と同様の方法でで得られた内胚葉系細胞から原始腸管細胞（Ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  Ｇｕｔ  Ｔｕｂｅ；ＰＧＴ）へ分化誘導した。具体的には、０．２５％ＢＳＡ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ、１×ＮＥＡＡ、０．４×ＰＳ、５０ｎｇ／ｍＬ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ＦＧＦ７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、０．３％（Ｖ/Ｖ）ＩＴＳ−Ｘ（Ｗａｋｏ社）、１％Ｂ２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ社）、0.2μＭ  ＬＤＮ１９３１８９（Ｃａｙｍａｎ社）、１０μＭ  ＳＢ４３１５４２、０．６７μＭ  ＥＣ２３を含むＲＰＭＩ１６４０培地で３日間浮遊培養した。なお、浮遊培養は３０ｍＬシングルユースバイオリアクター（ＡＢＬＥ社）を６チャネルマグネチックスターラー（エイブル社）に装着し、５５ｒｐｍの速度で攪拌しながら３７℃の５％ＣＯ2インキュベーター内で浮遊培養を行った。【０１８９】
[比較例４]
＜内胚葉系細胞から原始腸管細胞（ＰＧＴ）への分化誘導方法の検討＞
実施例１と同様の方法でで得られた内胚葉系細胞から原始腸管細胞（Ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  Ｇｕｔ  Ｔｕｂｅ；ＰＧＴ）へ分化誘導した。具体的には、０．２５％ＢＳＡ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ、１×ＮＥＡＡ、０．４×ＰＳ、５０ｎｇ／ｍＬ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ＦＧＦ７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、０．３％（Ｖ/Ｖ）ＩＴＳ−Ｘ（Ｗａｋｏ社）、１％Ｂ２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ社）、０．２μＭ  ＬＤＮ１９３１８９（Ｃａｙｍａｎ社）、１０μＭ  ＳＢ４３１５４２、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ１を含むＲＰＭＩ１６４０培地で３日間浮遊培養した。なお、浮遊培養は３０ｍＬシングルユースバイオリアクター（ＡＢＬＥ社）を６チャネルマグネチックスターラー（エイブル社）に装着し、５５ｒｐｍの速度で攪拌しながら３７℃の５％ＣＯ2インキュベーター内で浮遊培養を行った。【０１９０】
[比較例５]
＜内胚葉系細胞から原始腸管細胞（ＰＧＴ）への分化誘導方法の検討＞
実施例１と同様の方法でで得られた内胚葉系細胞から原始腸管細胞（Ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  Ｇｕｔ  Ｔｕｂｅ；ＰＧＴ）へ分化誘導した。具体的には、０．２５％ＢＳＡ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ、１×ＮＥＡＡ、０．４×ＰＳ、５０ｎｇ／ｍＬ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ＦＧＦ７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、０．３％（Ｖ/Ｖ）ＩＴＳ−Ｘ（Ｗａｋｏ社）、１％Ｂ２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ社）、１μＭ  Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、１０μＭ  ＳＢ４３１５４２、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ１を含むＲＰＭＩ１６４０培地で３日間浮遊培養した。なお、浮遊培養は３０ｍＬシングルユースバイオリアクター（ＡＢＬＥ社）を６チャネルマグネチックスターラー（エイブル社）に装着し、５５ｒｐｍの速度で攪拌しながら３７℃の５％ＣＯ2インキュベーター内で浮遊培養を行った。【０１９１】
＜膵臓β細胞への分化誘導＞
実施例１、参考例１、参考例２、実施例２、比較例１、比較例２、比較例３、及び比較例４に記載の方法にて得られた原始腸管細胞から膵臓β細胞への分化誘導は、Yabe SG, Fukuda S, Takeda F, Nashiro K, Shimoda M, Okochi H. Efficient generation of functional pancreatic β-cells from human induced pluripotent stem cells. J Diabetes. 2017 Feb;9(2):168-179に記載の方法に基づいて実施した。【０１９２】
具体的にはＰｏｓｔｅｒｉｏｒ  Ｆｏｒｅ  Ｇｕｔ（ＰＦＧ）分化はＰＳ、ＮＥＡＡ、Ｂ２７、ＥＣ２３、ＳＡＮＴ１を含むＤＭＥＭ培地（Ｗａｋｏ社）で４日間培養した。
Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ（ＰＰ）分化はＰＳ、ＮＥＡＡ、５０ｎｇ／ｍＬ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ＦＧＦ１０（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、Ｂ２７、ＥＣ２３、ＳＡＮＴ１、Ａｌｋ５  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＩＩ（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ社）、ｉｎｄｏｌａｃｔａｍ  Ｖ（ＩＬＶ；Ｃａｙｍａｎ社）を含むＤＭＥＭ培地で３日間浮遊培養した。【０１９３】
Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ分化はＰＳ、Ｂ２７、ＥＣ２３、ＳＡＮＴ１、Ａｌｋ５  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＩＩ、５０ｎｇ／ｍＬ  Ｅｘｅｎｄｉｎ４（Ｓｉｇｍａ社）を含むＤＭＥＭ系培地（Ｇｉｂｃｏ社）で３から７日間浮遊培養した。【０１９４】
膵臓β細胞分化は、ＰＳ、Ｂ２７、１０ｎｇ／ｍＬ  ＢＭＰ４、５０ｎｇ／ｍＬ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＨＧＦ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、５０ｎｇ／ｍＬ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  １（ＩＧＦ１；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、Ａｌｋ５  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＩＩ、５０ｎｇ／ｍＬ  Ｅｘｅｎｄｉｎ４、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ社）、５μｍｏｌ／Ｌ  ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（Ｗａｋｏ社）を含むＤＭＥＭ系培地で６から１０日間浮遊培養した。これにより得られた細胞をｉＰＳ−β細胞と称する。
なお、浮遊培養は３０ｍＬシングルユースバイオリアクター（ＡＢＬＥ社）を６チャネルマグネチックスターラー（エイブル社）に装着し、６５ｒｐｍの速度で攪拌しながら３７℃の５％ＣＯ2インキュベーター内で浮遊培養を行った。【０１９５】
［分化効率の解析］
実施例１、参考例１、参考例２、実施例２、比較例１、比較例２、比較例３、及び比較例４にて作製した原始腸管細胞集団の分化効率及びｉＰＳ−β細胞への分化効率を調べるために、以下に示す手順にて、定量的ＲＴ−ＰＣＲにて分析した。
＜定量的ＲＴ−ＰＣＲ＞
分化誘導した原始腸管細胞及びｉＰＳ−β細胞のｔｏｔａｌＲＮＡをＩＳＯＧＥＮ（Ｗａｋｏ社）により単離・精製し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＩＩ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社）を用いてｃＤＮＡの合成を行った。ここで合成したｃＤＮＡを鋳型とし、ＧｏＴａｑ  ｑＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使いＭｙｉＱ  ｑＰＣＲ  ｍａｃｈｉｎｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）により定量ＰＣＲを実行した。検出はＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎによるインターカレーション法で、遺伝子発現量比較は比較Ｃｔ法による相対定量法で行った。各遺伝子の発現レベルはハウスキーピング遺伝子であるＯＡＺ１又はβ−Ａｃｔｉｎにより標準化した。【０１９６】
定量ＰＣＲに使用したプライマーの塩基配列は次のとおりである。
HNF-1β F：GAG ATC CTC CGA CAA TTC AAC C（配列番号１）
HNF-1β R：AAA CAG CAG CTG ATC CTG ACT G（配列番号２）
HNF-4α F：AAG AGA TCC ATG GTG TTC AAG GAC（配列番号３）
HNF-4α R：AGG TAG GCA TAC TCATTG TCA TCG（配列番号４）
OAZ1 F：GTC AGA GGG ATC ACA ATC TTT CAG（配列番号５）
OAZ1 R：GTC TTG TCG TTG GAC GTT AGT TC（配列番号６）
INS F：TTG TGA ACC AAC ACC TGT GC（配列番号７）
INS R：GTG TGT AGA AGA AGC CTC GTT CC（配列番号８）
NKX6.1 F：ATC TTC GCC CTG GAG AAG AC（配列番号９）
NKX6.1 R：CGT GCT TCT TCC TCC ACT TG（配列番号１０）
KIT F：GCC ATC ATG GAG GAT GAC GA（配列番号１１）
KIT R：TGC CAT CCA CTT CAC AGG TAG（配列番号１２）
RAP1A F：GCC AAC AGT GTA TGC TCG AA（配列番号１３）
RAP1A R：TCC GTG TCC TTA ACC CGT AA（配列番号１４）
FGF11 F：GGC ATG ACT GAA CCT GCA TC（配列番号１５）
FGF11 R：CGT ATG AGG TCT GGA GTG CAA（配列番号１６）
FGFR4 F：TCC TTG ACC TCC AGC AAC GA（配列番号１７）
FGFR4 R：GGC CTG TCC ATC CTT AAG CC（配列番号１８）
MDM2 F：CCC GGA TTA GTG CGT ACG AG（配列番号１９）
MDM2 R：GCA ATG GCT TTG GTC TAA CCA G（配列番号２０）
CASP3 F：ACT GTG GCA TTG AGA CAG AC（配列番号２１）
CASP3 R：TTT CGG TTA ACC CGG GTA AG（配列番号２２）
CDK1 F：AGG TCA AGT GGT AGC CAT GA（配列番号２３）
CDK1 R：TGT ACT GAC CAG GAG GGA TAG（配列番号２４）
β-Actin F：CCT CAT GAA GAT CCT CAC CGA（配列番号２５）
β-Actin R：TTG CCA ATG GTG ATG ACC TGG（配列番号２６）【０１９７】
＜測定の結果＞
遺伝子発現量を測定した結果を図１及び図２に示す。
図１及び図２の結果は、下記表にまとめて示す。【０１９８】
【表１】
2019208787.tif 000002
【０１９９】
【表２】
2019208787.tif 000003
【０２００】
実施例１及び参考例１のそれぞれにおいて、原始腸管細胞への分化誘導が認められた。また、参考例１に記載の方法にて得られた原始腸管細胞に対して、実施例１に記載の方法にて得られた原始腸管細胞では、ＰＧＴマーカー（ＨＮＦ−１β及びＨＮＦ−４α）遺伝子の発現量が向上しており（図１）、実施例１における原始腸管細胞への分化誘導が参考例１と比較して高いことが明らかとなった。すなわち、内胚葉系細胞を骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤の非存在下において培養すると、原始腸管細胞への分化誘導効率が向上することが明らかとなった。【０２０１】
参考例１及び参考例２に記載の方法にて得られた原始腸管細胞をさらにｉＰＳ−β細胞まで分化誘導した細胞に対して、実施例１に記載の方法にて得られた原始腸管細胞をさらにｉＰＳ−β細胞まで分化誘導した細胞では、ＩＮＳ遺伝子、ＮＫＸ６．１遺伝子の発現が向上していた（図２）。また、比較例１から比較例４に記載の方法にて得られた原始腸管細胞をさらにｉＰＳ−β細胞まで分化誘導した細胞に対して、実施例２に記載の方法にて得られた原始腸管細胞をさらにｉＰＳ−β細胞まで分化誘導した細胞では、ＩＮＳ遺伝子の発現が向上していた（図４）。
これにより、実施例１又は実施例２における原始腸管細胞への分化誘導効率が参考例１及び参考例２と比較して高いことが明らかとなった。すなわち、内胚葉系細胞を骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤の非存在下において培養すると、原始腸管細胞への分化誘導効率が向上することが明らかとなった。また、比較例４に記載の方法にて得られた原始腸管細胞をさらにｉＰＳ−β細胞まで分化誘導した細胞ではＩＮＳ遺伝子の発現が減少したことから、内胚葉系細胞をＢＭＰシグナル阻害剤非存在下かつレチノイン酸アナログ等をさらに添加することでよりＩＮＳ遺伝子の発現が向上すると考えられる（図４）。【０２０２】
［実施例３］
＜糖尿病モデルマウスへの移植実験（糖尿病モデルｎｏｎ−ｏｂｅｓｅ  ｄｉａｂｅｔｉｃ（ＮＯＤ）−ｓｅｖｅｒｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｄｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ（ＳＣＩＤ）マウス実験）＞
実施例１及び参考例２の方法で得られた原始腸管細胞からそれぞれ膵臓β細胞への分化誘導において得られたｉＰＳ−β細胞を、ＨＢＳＳで一回リンスした後に、３．３３μｇ／ｍＬのｉＭａｔｒｉｘ−５１１（Ｗａｋｏ社）を含むＨＢＳＳに懸濁し、懸濁した細胞をハミルトンシリンジ（ハミルトン社）により糖尿病モデルＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（日本クレア社）の左腎被膜下に移植した（６×１０6個の細胞を投与）。糖尿病モデルＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスは１３０ｍｇ／ｋｇのｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ（ＳＴＺ；Ｓｉｇｍａ社）を尾静脈より投与し血糖値が２５０ｍｇ／ｄＬ以上となった個体を使用した。移植（０日）はＳＴＺ投与（−１４日）から１４日後に行った。随時血糖値は尾静脈より血液を採取しグルテストＮｅｏアルファ（三和化学社）を用いて測定した。【０２０３】
糖尿病モデルマウスの随時血糖を測定した結果を図３に示す。
実施例１の方法で調製した原始腸管細胞から分化誘導して得られたｉＰＳ−β細胞を移植したマウス個体（図３実施例１）では、移植後４０日程度で血糖値が正常値（２００ｍｇ／ｄＬ以下）まで低下しており、ｉＰＳ−β細胞が血糖値を制御していることがわかる。一方、参考例２の方法で調製した原始腸管細胞から分化誘導して得られたｉＰＳ−β細胞を移植したマウス個体（図３参考例２）では、移植後７１日が経過しても血糖値が正常値（２００ｍｇ／ｄＬ以下）まで低下することはなかった。これらの結果より、本発明の方法により得られた原始腸管細胞から分化誘導して得られた体細胞（膵臓β細胞）は、糖尿病の治療応用などにおいて、効果的であることが期待できる。また、本発明の方法により製造された原始腸管細胞は細胞治療剤として最適な膵臓β細胞へと分化可能であるといえる。【０２０４】
［実施例４］原始腸管細胞集団の網羅的遺伝子発現解析
原始腸管細胞集団の網羅的遺伝子発現解析を下記の方法にて実施した。
＜ＲＮＡ抽出＞
実施例１に記載の方法で培養して分化誘導した内胚葉系細胞、実施例１、参考例２及び比較例５に記載の方法で培養して分化誘導した原始腸管細胞からｔｏｔａｌＲＮＡをＩＳＯＧＥＮ（Ｗａｋｏ社）により単離・精製した。【０２０５】
＜ＤＮＡマイクロアレイ解析＞
抽出したｔｏｔａｌＲＮＡを用いて、ＤＮＡマイクロアレイ解析を行った。
（１）ｃＲＮＡ合成
３’ＩＶＴ  ＰＬＵＳ  ＲｅａｇｅｎｔＫｉｔを用いてｃＲＮＡ合成を行った。方法はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）推奨プロトコールに準ずる。ｔｏｔａｌＲＮＡ（１００ｎｇ）から逆転写反応によりｃＤＮＡを作製した。作製したｃＤＮＡからｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎにより、ｃＲＮＡに転写してビオチン標識を行った。【０２０６】
（２）ハイブリダイゼーション
標識ｃＲＮＡ（１２．５μｇ）をハイブリダイゼーションバッファーに加え、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０  Ａｒｒａｙ上で１６時間のハイブリダイゼーションを行った。ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ４５０にて洗浄・フィコエリスリン染色後、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｓｃａｎｎｅｒ  ３０００  ７Ｇでスキャンを行い、ＡＧＣＣ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｃｏｍｍａｎｄ  Ｃｏｎｓｏｌｅ（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅ）にて画像解析、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＣｏｎｓｏｌｅTMを用いて数値化を行った。【０２０７】
なお、上記（１）、（２）の各工程については、株式会社理研ジェネシスが提供する、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製ＤＮＡマイクロアレイ「ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）：Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０  Ａｒｒａｙ」を使用した受託解析サービスを利用した（https://rikengenesis.jp/contents/ja_JPY/microarray_affymetrix.html）。本受託解析サービスは、サンプル（トータルＲＮＡ等）を提供するだけで、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）を使用した網羅的遺伝子発現解析を行ってくれるものである。【０２０８】
＜ＤＮＡマイクロアレイデータを用いたエンリッチメント解析＞
データの統計解析はＲ  ｖｅｒｓｉｏｎ３．４．２及びＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｖｅｒｓｉｏｎ３．６（Ｔｈｅ  Ｒ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，２０１７）を用いて実施した。また、エンリッチメント解析はＴｈｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ，Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＤＡＶＩＤ）６．８（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ（ＮＩＡＩＤ），ＮＩＨ）を利用した (https://david.ncifcrf.gov/home.jsp) 。【０２０９】
上記ＤＮＡマイクロアレイ解析によって得られたＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ａｒｒａｙデータ（ＣＥＬファイル）並びに参考例２に記載の方法で培養して分化誘導した原始腸管細胞集団由来のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ａｒｒａｙデータ（ＣＥＬファイル）を  ＲｅａｄＡｆｆｙ（）関数でＲに読み込んだ。その後、ｒｍａ（）  関数を用いてマイクロアレイデータの正規化を行った。この  ｒｍａ（）  関数はＲｏｂｕｓｔ  Ｍｕｌｔｉ−ａｒｒａｙ  Ａｖｅｒａｇｅ（ＲＭＡ）法を実施する関数である  (Irizarry R, Hobbs B, Collin F, Beazer-Barclay Y, Antonellis K, Scherf U, Speed T. Exploration, normalization, and summaries of high density oligonucleotide array probe level data. Biostatistics. 2003;4:249.) 。ＲＭＡ法は現在、最も一般的に用いられている正規化方法のひとつであり、Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｎｇ、Ｎｏｒｍａｌｉｚｉｎｇ、Ｃａｌｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  を一括して行う。なお、ＲＭＡ法は  ｐｅｒｆｅｃｔ  ｍａｔｃｈ  （ＰＭ）  値に対して底が２の対数変換を施して正規化処理を実施するため、正規化後の結果も底が２の対数変換値で出力される。【０２１０】
次に、正規化後のシグナルについて、実施例１に記載の方法で培養して分化誘導した原始腸管細胞集団由来のシグナル値と参考例２に記載の方法で培養して分化誘導した原始腸管細胞集団由来のシグナル値の差分を計算した。【０２１１】
ＲＭＡ法による正規化後のシグナルは底が２の対数変換が成されている。ゆえに、シグナルの差分は  ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅに対する底が２の対数変換値である（ｌｏｇ2（ｘ）−ｌｏｇ2（ｙ）＝ｌｏｇ2（ｘ／ｙ））。よって、差分に対して逆変換を行うことで、ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅを計算した。その後、ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅが２以上の転写産物と、０．５以下の転写産物を抽出して、それぞれ発現変動遺伝子とした。今回の実験では各条件のサンプルの反復はないこと、及びサンプル数が１であることから、ｔ検定やそれに関連する、仮説検定手法に基づく発現変動遺伝子の選択ができない。そのため、一般的に使用されている基準として、ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅが２以上及び０．５以下という基準を採用した。Ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅが２以上あるいは０．５以下の転写産物をエンリッチメント解析の対象とした。【０２１２】
エンリッチメント解析とは、発現変動遺伝子のうち、機能の多いものを解析する手法であり、アノテーション解析のひとつである。例えば、発現変動遺伝子は確率論的に転写因子が相対的に多いのか、細胞周期が多いのか、等を解析することが可能である。上記の解析で選択された転写産物リストを、発現量などの情報は除いてＤＡＶＩＤに読み込ませ、エンリッチメント解析を実施した。ＤＡＶＩＤでは様々なエンリッチメント解析が可能であるが、多数の解析を実施することによる多重性のリスクを低減するために、今回はＫＥＧＧ  ｐａｔｈｗａｙ解析に限定して解析を実施した。【０２１３】
ＫＥＧＧ  ｐａｔｈｗａｙ解析は、ＤＡＶＩＤがＫｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓ（ＫＥＧＧ）データベース  (www.genome.jp/kegg/) にアクセスし、転写産物リストと相関が高い  ｐａｔｈｗａｙ  を統計的に抽出することで実施される。Ｐａｔｈｗａｙ  毎に相関性に対するｐ値が表示されるが、一度に多数のｐａｔｈｗａｙに対して仮説検定を実施するため、ＤＡＶＩＤでは様々な多重性調整ｐ値を算出することが可能である。今回の解析では、その中でも、マイクロアレイ解析で最も一般的に用いられているＢｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法を用いることとした (Benjamini, Y; Hochberg, Y (1995). "Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing". Journal of the Royal Statistical Society, Series B. 57 (1): 289-300.) 。Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ-Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法で算出された調整ｐ値を用いて、シグナルセットと相関の高いｐａｔｈｗａｙを選択した。Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法でさらに多重性を調整して、調整ｐ値が０．０５／２０＞０．００３３＝３．３−Ｅ３未満であるときに、当該ｐａｔｈｗａｙを統計的に有意なｐａｔｈｗａｙであると判断することとした。【０２１４】
エンリッチメント解析の結果、参考例２に記載の方法で培養して分化誘導した原始腸管細胞集団に比べて、実施例１に記載の方法で培養して分化誘導した原始腸管細胞集団では、パスウェイ名「Biosynthesis of amino acids」（http://www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway?map=hsa04015&show_description=show）、パスウェイ名「Rap1 signaling pathway」（http://www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway?map=hsa04015&show_description=show）及びパスウェイ名「Pathways in cancer」（http://www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway?map=hsa05200&show_description=show）に関する遺伝子発現が向上し、パスウェイ名「p53 signaling pathway」（http://www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway?map=hsa04115&show_description=show）に関する遺伝子発現が減少していた。発現が変動していた遺伝子については、表３から６に示す。上記に含まれる遺伝子について定量的ＲＴ−ＰＣＲによる発現解析を上記の方法で行ったところ、例えば、ＫＩＴ遺伝子、ＲＡＰ１Ａ遺伝子、ＦＧＦ１１遺伝子、及びＦＧＦＲ４遺伝子については、参考例２又は比較例５と比較して実施例１で発現が向上しており、またＭＤＭ２遺伝子、ＣＡＳＰ３遺伝子、及びＣＤＫ１遺伝子については、参考例２又は比較例５と比較して実施例１で発現が減少していた（図５)。図５で示したグラフの数値は表７に示した。したがって、エンリッチメント解析の結果から得られたこれらの遺伝子の発現量が変動することにより、原始腸管細胞及びｉＰＳ−β細胞への分化効率が向上したと考えらえる。なお、図５及び表７におけるハウスキーピング遺伝子は、β−Ａｃｔｉｎである。【０２１５】
＜ＤＮＡマイクロアレイデータを用いた分化マーカー遺伝子の抽出＞
上記ＤＮＡマイクロアレイ解析によって得られたＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ａｒｒａｙデータ（ＣＥＬファイル）をＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＣｏｎｓｏｌｅTMソフトウェアを用いて変換して得られたデータ（ＣＨＰファイル）をＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ＣｏｎｓｏｌｅTMソフトウェアにて読み込み、シグナル値を得た（底が２の対数変換値）。このシグナル値を整数に変換した。比較例５に記載の方法で培養した原始腸管細胞集団から得られた各遺伝子（各プローブ）のシグナル値と比べて、実施例１に記載の方法で培養した原始腸管細胞集団から得られた各遺伝子（各プローブ）のシグナル値が10倍以上又は10分の1以下となった遺伝子を抽出し、図６及び図８に示した。図６で示したグラフの数値を表８に、図８で示したグラフの数値を表９に示した。これらの遺伝子は分化誘導培養における好適な遺伝子マーカーとなりうると考えられる。【０２１６】
【表３】
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【０２１７】
【表４】
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【０２１８】
【表５】
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【０２１９】
【表６】
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【０２２０】
【表７】
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【０２２１】
【表８】
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【０２２２】
【表９】
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【０２２３】
＜定量的ＲＴ−ＰＣＲ＞
実施例１、参考例２及び比較例５に記載の方法で培養して分化誘導した原始腸管細胞について、上記した＜定量的ＲＴ−ＰＣＲ＞と同様の方法により、ＩＧＦＢＰ３遺伝子、ＰＴＧＤＲ遺伝子、ＬＯＸ遺伝子、ＰＡＰＰＡ遺伝子、ＲＡＢ３１遺伝子の発現量を測定した。各遺伝子の情報及びプライマー配列を表１０（配列は配列表の配列番号２７〜３６に記載した）に示す。測定結果を図７に示す。
実施例１、参考例２及び比較例５に記載の方法で培養して分化誘導した原始腸管細胞について、上記した＜定量的ＲＴ−ＰＣＲ＞と同様の方法により、ＡＢＧＰＴ２遺伝子、ＣＤ４７遺伝子、ＣＤＣ４２ＥＰ３遺伝子、ＣＬＩＤＮ１８遺伝子、ＣＬＩＣ５遺伝子、ＰＨＬＤＡ１遺伝子、ＳＫＡＰ２遺伝子の発現量を測定した。各遺伝子の情報及びプライマー配列を表１１（配列は配列表の配列番号３７〜５０に記載した）に示す。測定結果を図９に示す。図７及び図９で示したグラフの数値を表１２に示した。実施例５に記載の方法で培養して分化誘導した原始腸管細胞における遺伝子発現と比較して、実施例１に記載の方法で培養して分化誘導した原始腸管細胞における遺伝子発現はＤＮＡマイクロアレイデータの結果と同様の傾向を示すことを確認できた。【０２２４】
【表１０】
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【０２２５】
【表１１】
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【０２２６】
【表１２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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