(57)【要約】本開示において、筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）の診断を行う方法が提供される。本開示は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）レパトアを筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）の指標とする方法を提供する。対象におけるＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における１つ以上の遺伝子の使用頻度、対象におけるＢＣＲ多様性指数、および対象における１つ以上の免疫細胞亜集団量からなる群から選択される１つまたは複数の変数を、対象におけるＭＥ／ＣＦＳの指標として用いることができる。
2020040210.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象におけるＢ細胞受容体（ＢＣＲ）レパトアを、該対象における筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）の指標とする方法。
【請求項２】
対象におけるＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における１つ以上の遺伝子の使用頻度を含む１つ以上の変数を、該対象における筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）の指標とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１つ以上の変数が、前記対象が他の疾患ではなくＭＥ／ＣＦＳに罹患していることの指標であることをさらに特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記１つ以上の遺伝子が、IGHV1-2、IGHV1-3、IGHV1-8、IGHV1-18、IGHV1-24、IGHV1-38-4、IGHV1-45、IGHV1-46、IGHV1-58、IGHV1-69、IGHV1-69-2、IGHV1-69D、IGHV1/OR15-1、IGHV1/OR15-5、IGHV1/OR15-9、IGHV1/OR21-1、IGHV2-5、IGHV2-26、IGHV2-70、IGHV2-70D、IGHV2/OR16-5、IGHV3-7、IGHV3-9、IGHV3-11、IGHV3-13、IGHV3-15、IGHV3-16、IGHV3-20、IGHV3-21、IGHV3-23、IGHV3-23D、IGHV3-25、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHV3-30-5、IGHV3-33、IGHV3-35、IGHV3-38、IGHV3-38-3、IGHV3-43、IGHV3-43D、IGHV3-48、IGHV3-49、IGHV3-53、IGHV3-64、IGHV3-64D、IGHV3-66、IGHV3-72、IGHV3-73、IGHV3-74、IGHV3-NL1、IGHV3/OR15-7、IGHV3/OR16-6、IGHV3/OR16-8、IGHV3/OR16-9、IGHV3/OR16-10、IGHV3/OR16-12、IGHV3/OR16-13、IGHV4-4、IGHV4-28、IGHV4-30-2、IGHV4-30-4、IGHV4-31、IGHV4-34、IGHV4-38-2、IGHV4-39、IGHV4-59、IGHV4-61、IGHV4/OR15-8、IGHV5-10-1、IGHV5-51、IGHV6-1、IGHV7-4-1、IGHV7-81、IGHD1-1、IGHD1-7、IGHD1-14、IGHD1-20、IGHD1-26、IGHD1/OR15-1a/b、IGHD2-2、IGHD2-8、IGHD2-15、IGHD2-21、IGHD2/OR15-2a/b、IGHD3-3、IGHD3-9、IGHD3-10、IGHD3-16、IGHD3-22、IGHD3/OR15-3a/b、IGHD4-4、IGHD4-11、IGHD4-17、IGHD4-23、IGHD4/OR15-4a/b、IGHD5-5、IGHD5-12、IGHD5-18、IGHD5-24、IGHD5/OR15-5a/b、IGHD6-6、IGHD6-13、IGHD6-19、IGHD6-25、IGHD7-27、IGHJ1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4、IGHJ5、IGHJ6、IGHG1、IGHG2、IGHG3、IGHG4、およびIGHGPからなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記１つ以上の遺伝子が、IGHV3-73、IGHV1-69-2、IGHV5-51、IGHV4-31、IGHV3-23D、IGHV1/OR15-9、IGHV4-39、IGHD5-12、IGHV3-43D、IGHD4-17、IGHV5-10-1、IGHD4/OR15-4a/b、IGHG4、IGHV1/OR15-5、IGHV3/OR16-9、IGHD1-7、IGHV3-21、IGHD6-6、IGHV3-33、IGHD4-23、IGHV3-30-5、IGHV3-23、IGHD6-13、IGHV3-64D、IGHV3-48、IGHV3-64、IGHG1、IGHV3-49、IGHV3-30-3、IGHD1-26、IGHJ6、IGHV3-30、IGHGP、IGHV1-3およびIGHD3-22からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記１つ以上の遺伝子が、IGHD6-6、IGHV3-33、IGHD4-23、IGHV3-30-5、IGHV3-23、IGHD6-13、IGHV3-64D、IGHV3-48、IGHV3-64、IGHG1、IGHV3-49、IGHV3-30-3、IGHD1-26、IGHJ6、IGHV3-30、IGHGP、IGHV1-3およびIGHD3-22からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記１つ以上の遺伝子が、IGHV3-49、IGHV3-30-3、IGHD1-26、IGHJ6、IGHV3-30、IGHGP、IGHV1-3およびIGHD3-22からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記１つ以上の遺伝子が、IGHV1-3、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHV3-49、IGHD1-26およびIGHJ6からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記１つ以上の変数が、１つ以上の免疫細胞亜集団量をさらに含むことを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記１つ以上の変数が、正常対照とＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．７を示す、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記１つ以上の変数が、正常対照とＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．８を示す、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記免疫細胞亜集団量が、Ｂ細胞の量、ナイーブＢ細胞の量、メモリーＢ細胞の量、プラズマブラストの量、活性化ナイーブＢ細胞の量、トランジショナルＢ細胞の量、制御性Ｔ細胞の量、メモリーＴ細胞の量、ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  ｈｅｌｐｅｒ  Ｔ細胞の量、Ｔｆｈ１細胞の量、Ｔｆｈ２細胞の量、Ｔｆｈ１７細胞の量、Ｔｈ１細胞の量、Ｔｈ２細胞の量およびＴｈ１７細胞の量から選択される、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記１つ以上の変数が、前記対象におけるＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における２つ以上の遺伝子の使用頻度を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
前記１つ以上の変数が、正常対照とＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．７を示す、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記１つ以上の変数が、正常対照とＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．８を示す、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記１つ以上の変数が、正常対照とＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．９を示す、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記１つ以上の変数が、前記対象におけるＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における１つ以上の遺伝子の使用頻度、前記対象におけるＢＣＲ多様性指数、および前記対象における１つ以上の免疫細胞亜集団量からなる群から選択される２つ以上の変数の組み合わせを含み、該１つ以上の変数は、正常対照とＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．７を示す、請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
前記１つ以上の変数が、前記群から選択される３つ以上の変数を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記１つ以上の変数が、前記群から選択される４つ以上の変数を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記１つ以上の変数が、前記群から選択される５つ以上の変数を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記１つ以上の変数が、前記群から選択される６つ以上の変数を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記１つ以上の変数が、正常対照とＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．８を示す、請求１７〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記１つ以上の変数が、正常対照とＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．９を示す、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記１つ以上の遺伝子が、IGHV1-3、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHV3-49、IGHD1-26、およびIGHJ6を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２５】
前記１つ以上の変数が、前記対象におけるＢ細胞の量を含む、請求項２〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記１つ以上の変数が、前記対象における制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の量を含む、請求項２〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記１つ以上の遺伝子の使用頻度が、大規模高効率ＢＣＲレパトア解析を含む方法によって決定される、請求項２〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記１つ以上の変数が、IGHV3-49、IGHV3-30-3、IGHD1-26、IGHV3-30、IGHJ6、IGHGP、IGHV4-31、IGHV3-64、IGHD3-22、IGHV3-33、IGHV3-73、IGHV5-10-1およびIGHV4-34からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の使用頻度を含む、請求項２〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
（ａ）前記１つ以上の変数のうちの一部を前記対象におけるＭＥ／ＣＦＳの指標とすることと、
（ｂ）前記１つ以上の変数のうちの一部を前記対象が他の疾患ではなくＭＥ／ＣＦＳであることの指標とすることと
を含む、請求項１〜２７に記載の方法。
【請求項３０】
複数の他の疾患について（ｂ）を複数回行う、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記他の疾患が多発性硬化症（ＭＳ）を含む、請求項２９または２８に記載の方法。
【請求項３２】
対象におけるＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における１つ以上の遺伝子の使用頻度を含む１つ以上の変数を、該対象が多発性硬化症（ＭＳ）ではなく筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）に罹患していることの指標とする、方法。
【請求項３３】
前記１つ以上の遺伝子が、IGHV1-2、IGHV1-3、IGHV1-8、IGHV1-18、IGHV1-24、IGHV1-38-4、IGHV1-45、IGHV1-46、IGHV1-58、IGHV1-69、IGHV1-69-2、IGHV1-69D、IGHV1/OR15-1、IGHV1/OR15-5、IGHV1/OR15-9、IGHV1/OR21-1、IGHV2-5、IGHV2-26、IGHV2-70、IGHV2-70D、IGHV2/OR16-5、IGHV3-7、IGHV3-9、IGHV3-11、IGHV3-13、IGHV3-15、IGHV3-16、IGHV3-20、IGHV3-21、IGHV3-23、IGHV3-23D、IGHV3-25、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHV3-30-5、IGHV3-33、IGHV3-35、IGHV3-38、IGHV3-38-3、IGHV3-43、IGHV3-43D、IGHV3-48、IGHV3-49、IGHV3-53、IGHV3-64、IGHV3-64D、IGHV3-66、IGHV3-72、IGHV3-73、IGHV3-74、IGHV3-NL1、IGHV3/OR15-7、IGHV3/OR16-6、IGHV3/OR16-8、IGHV3/OR16-9、IGHV3/OR16-10、IGHV3/OR16-12、IGHV3/OR16-13、IGHV4-4、IGHV4-28、IGHV4-30-2、IGHV4-30-4、IGHV4-31、IGHV4-34、IGHV4-38-2、IGHV4-39、IGHV4-59、IGHV4-61、IGHV4/OR15-8、IGHV5-10-1、IGHV5-51、IGHV6-1、IGHV7-4-1、IGHV7-81、IGHD1-1、IGHD1-7、IGHD1-14、IGHD1-20、IGHD1-26、IGHD1/OR15-1a/b、IGHD2-2、IGHD2-8、IGHD2-15、IGHD2-21、IGHD2/OR15-2a/b、IGHD3-3、IGHD3-9、IGHD3-10、IGHD3-16、IGHD3-22、IGHD3/OR15-3a/b、IGHD4-4、IGHD4-11、IGHD4-17、IGHD4-23、IGHD4/OR15-4a/b、IGHD5-5、IGHD5-12、IGHD5-18、IGHD5-24、IGHD5/OR15-5a/b、IGHD6-6、IGHD6-13、IGHD6-19、IGHD6-25、IGHD7-27、IGHJ1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4、IGHJ5、IGHJ6、IGHG1、IGHG2、IGHG3、IGHG4、およびIGHGPからなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記１つ以上の遺伝子が、IGHV1-3、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHD1-26、IGHV3-49およびIGHJ6からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を含む、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記１つ以上の変数が、前記対象におけるＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における２つ以上の遺伝子の使用頻度を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記１つ以上の変数が、ＭＳとＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．７を示す、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記１つ以上の変数が、ＭＳとＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．８を示す、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記１つ以上の変数が、ＭＳとＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．９を示す、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記１つ以上の変数が、前記対象におけるＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における３つ以上の遺伝子の使用頻度を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項４０】
前記１つ以上の変数が、ＭＳとＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．７を示す、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記１つ以上の変数が、ＭＳとＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．８を示す、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記１つ以上の変数が、ＭＳとＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．９を示す、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記（ｂ）が、請求項３２〜４２のいずれか１項に記載の方法によって行われることを特徴とする、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、疾患、とりわけ、筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）の診断の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）は、著しい疲労、労作後の消耗、睡眠障害、認知機能障害、起立不耐症を中核症状とし、痛み、自律神経障害、光、音、食品、化学物質に対する過敏症など様々な症状が付随する疾患である。感染症の後に発症する場合もあるが、病態は未解明であり、発症を識別するバイオマーカーがないため、様々な診断基準があり、診断や研究の障害になっている。また、有効な治療法も確立されていない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本開示は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）レパトアを筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）の指標とする方法を提供する。ＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における遺伝子の使用頻度が、ＭＥ／ＣＦＳ患者において健常対照と比較して変化することが本明細書において実証され、かかる情報を用いて、ＭＥ／ＣＦＳの診断を行うことが可能である。ＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における遺伝子に加えて、対象における免疫細胞亜集団（Ｂ細胞、制御性Ｔ細胞など）の量を指標として用いることもできる。遺伝子の使用頻度が、大規模高効率ＢＣＲレパトア解析を含む方法によって決定することができる。【０００４】
本開示の実施形態の例が、以下の項目に示される。
（項目１）  対象におけるＢ細胞受容体（ＢＣＲ）レパトアを、該対象における筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）の指標とする方法。
（項目２）  対象におけるＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における１つ以上の遺伝子の使用頻度を含む１つ以上の変数を、該対象における筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）の指標とする、前記項目に記載の方法。
（項目２Ａ）  前記１つ以上の変数が、前記対象が他の疾患ではなくＭＥ／ＣＦＳに罹患していることの指標であることをさらに特徴とする、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目３）  前記１つ以上の遺伝子が、IGHV1-2、IGHV1-3、IGHV1-8、IGHV1-18、IGHV1-24、IGHV1-38-4、IGHV1-45、IGHV1-46、IGHV1-58、IGHV1-69、IGHV1-69-2、IGHV1-69D、IGHV1/OR15-1、IGHV1/OR15-5、IGHV1/OR15-9、IGHV1/OR21-1、IGHV2-5、IGHV2-26、IGHV2-70、IGHV2-70D、IGHV2/OR16-5、IGHV3-7、IGHV3-9、IGHV3-11、IGHV3-13、IGHV3-15、IGHV3-16、IGHV3-20、IGHV3-21、IGHV3-23、IGHV3-23D、IGHV3-25、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHV3-30-5、IGHV3-33、IGHV3-35、IGHV3-38、IGHV3-38-3、IGHV3-43、IGHV3-43D、IGHV3-48、IGHV3-49、IGHV3-53、IGHV3-64、IGHV3-64D、IGHV3-66、IGHV3-72、IGHV3-73、IGHV3-74、IGHV3-NL1、IGHV3/OR15-7、IGHV3/OR16-6、IGHV3/OR16-8、IGHV3/OR16-9、IGHV3/OR16-10、IGHV3/OR16-12、IGHV3/OR16-13、IGHV4-4、IGHV4-28、IGHV4-30-2、IGHV4-30-4、IGHV4-31、IGHV4-34、IGHV4-38-2、IGHV4-39、IGHV4-59、IGHV4-61、IGHV4/OR15-8、IGHV5-10-1、IGHV5-51、IGHV6-1、IGHV7-4-1、IGHV7-81、IGHD1-1、IGHD1-7、IGHD1-14、IGHD1-20、IGHD1-26、IGHD1/OR15-1a/b、IGHD2-2、IGHD2-8、IGHD2-15、IGHD2-21、IGHD2/OR15-2a/b、IGHD3-3、IGHD3-9、IGHD3-10、IGHD3-16、IGHD3-22、IGHD3/OR15-3a/b、IGHD4-4、IGHD4-11、IGHD4-17、IGHD4-23、IGHD4/OR15-4a/b、IGHD5-5、IGHD5-12、IGHD5-18、IGHD5-24、IGHD5/OR15-5a/b、IGHD6-6、IGHD6-13、IGHD6-19、IGHD6-25、IGHD7-27、IGHJ1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4、IGHJ5、IGHJ6、IGHG1、IGHG2、IGHG3、IGHG4、およびIGHGPからなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目３−１）  前記１つ以上の遺伝子が、IGHV3-73、IGHV1-69-2、IGHV5-51、IGHV4-31、IGHV3-23D、IGHV1/OR15-9、IGHV4-39、IGHD5-12、IGHV3-43D、IGHD4-17、IGHV5-10-1、IGHD4/OR15-4a/b、IGHG4、IGHV1/OR15-5、IGHV3/OR16-9、IGHD1-7、IGHV3-21、IGHD6-6、IGHV3-33、IGHD4-23、IGHV3-30-5、IGHV3-23、IGHD6-13、IGHV3-64D、IGHV3-48、IGHV3-64、IGHG1、IGHV3-49、IGHV3-30-3、IGHD1-26、IGHJ6、IGHV3-30、IGHGP、IGHV1-3およびIGHD3-22からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目３−２）  前記１つ以上の遺伝子が、IGHD6-6、IGHV3-33、IGHD4-23、IGHV3-30-5、IGHV3-23、IGHD6-13、IGHV3-64D、IGHV3-48、IGHV3-64、IGHG1、IGHV3-49、IGHV3-30-3、IGHD1-26、IGHJ6、IGHV3-30、IGHGP、IGHV1-3およびIGHD3-22からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目３−３）  前記１つ以上の遺伝子が、IGHV3-49、IGHV3-30-3、IGHD1-26、IGHJ6、IGHV3-30、IGHGP、IGHV1-3およびIGHD3-22からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目３−４）  前記１つ以上の遺伝子が、IGHV1-3、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHV3-49、IGHD1-26、およびIGHJ6からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目４−１）  前記１つ以上の変数が、１つ以上の免疫細胞亜集団量をさらに含むことを特徴とする、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目４−２）  前記１つ以上の変数が、正常対照とＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．７を示す、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目４−３）  前記１つ以上の変数が、正常対照とＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．８を示す、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目４−４）  前記免疫細胞亜集団量が、Ｂ細胞の量、ナイーブＢ細胞の量、メモリーＢ細胞の量、プラズマブラストの量、活性化ナイーブＢ細胞の量、トランジショナルＢ細胞の量、制御性Ｔ細胞の量、メモリーＴ細胞の量、ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  ｈｅｌｐｅｒ  Ｔ細胞の量、Ｔｆｈ１細胞の量、Ｔｆｈ２細胞の量、Ｔｆｈ１７細胞の量、Ｔｈ１細胞の量、Ｔｈ２細胞の量およびＴｈ１７細胞の量から選択される前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目５−１）  前記１つ以上の変数が、前記対象におけるＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における２つ以上の遺伝子の使用頻度を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目５−２）  前記１つ以上の変数が、正常対照とＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．７を示す、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目５−２）  前記１つ以上の変数が、正常対照とＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．８を示す、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目５−２）  前記１つ以上の変数が、正常対照とＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．９を示す、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目６−１）  前記１つ以上の変数が、前記対象におけるＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における１つ以上の遺伝子の使用頻度、前記対象におけるＢＣＲ多様性指数、および前記対象における１つ以上の免疫細胞亜集団量からなる群から選択される２つ以上の変数の組み合わせを含み、該１つ以上の変数は、正常対照とＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．７を示す、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目６−２）  前記１つ以上の変数が、前記群から選択される３つ以上の変数を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目６−３）  前記１つ以上の変数が、前記群から選択される４つ以上の変数を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目６−４）  前記１つ以上の変数が、前記群から選択される５つ以上の変数を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目６−５）  前記１つ以上の変数が、前記群から選択される６つ以上の変数を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目６−７）  前記１つ以上の変数が、正常対照とＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．８を示す、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目６−３）  前記１つ以上の変数が、正常対照とＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．９を示す、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目７）  前記１つ以上の遺伝子が、IGHV1-3、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHV3-49、IGHD1-26、およびIGHJ6を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目８）  前記１つ以上の変数が、前記対象におけるＢ細胞の量を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目９）  前記１つ以上の変数が、前記対象における制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の量を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１０）  前記１つ以上の遺伝子の使用頻度が、大規模高効率ＢＣＲレパトア解析を含む方法によって決定される、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１１）  前記１つ以上の変数が、IGHV3-49、IGHV3-30-3、IGHD1-26、IGHV3-30、IGHJ6、IGHGP、IGHV4-31、IGHV3-64、IGHD3-22、IGHV3-33、IGHV3-73、IGHV5-10-1およびIGHV4-34からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の使用頻度を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１２）  （ａ）前記１つ以上の変数のうちの一部を前記対象におけるＭＥ／ＣＦＳの指標とすることと、
（ｂ）前記１つ以上の変数のうちの一部を前記対象が他の疾患ではなくＭＥ／ＣＦＳであることの指標とすることと
を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１３）  複数の他の疾患について（ｂ）を複数回行う、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１４）  前記他の疾患が多発性硬化症（ＭＳ）を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１５）  対象におけるＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における１つ以上の遺伝子の使用頻度を含む１つ以上の変数を、該対象が多発性硬化症（ＭＳ）ではなく筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）に罹患していることの指標とする、方法。
（項目１５Ａ）  前記項目の１つまたは複数に記載の特徴を備える、前記項目に記載の方法。
（項目１６）  前記１つ以上の遺伝子が、IGHV1-2、IGHV1-3、IGHV1-8、IGHV1-18、IGHV1-24、IGHV1-38-4、IGHV1-45、IGHV1-46、IGHV1-58、IGHV1-69、IGHV1-69-2、IGHV1-69D、IGHV1/OR15-1、IGHV1/OR15-5、IGHV1/OR15-9、IGHV1/OR21-1、IGHV2-5、IGHV2-26、IGHV2-70、IGHV2-70D、IGHV2/OR16-5、IGHV3-7、IGHV3-9、IGHV3-11、IGHV3-13、IGHV3-15、IGHV3-16、IGHV3-20、IGHV3-21、IGHV3-23、IGHV3-23D、IGHV3-25、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHV3-30-5、IGHV3-33、IGHV3-35、IGHV3-38、IGHV3-38-3、IGHV3-43、IGHV3-43D、IGHV3-48、IGHV3-49、IGHV3-53、IGHV3-64、IGHV3-64D、IGHV3-66、IGHV3-72、IGHV3-73、IGHV3-74、IGHV3-NL1、IGHV3/OR15-7、IGHV3/OR16-6、IGHV3/OR16-8、IGHV3/OR16-9、IGHV3/OR16-10、IGHV3/OR16-12、IGHV3/OR16-13、IGHV4-4、IGHV4-28、IGHV4-30-2、IGHV4-30-4、IGHV4-31、IGHV4-34、IGHV4-38-2、IGHV4-39、IGHV4-59、IGHV4-61、IGHV4/OR15-8、IGHV5-10-1、IGHV5-51、IGHV6-1、IGHV7-4-1、IGHV7-81、IGHD1-1、IGHD1-7、IGHD1-14、IGHD1-20、IGHD1-26、IGHD1/OR15-1a/b、IGHD2-2、IGHD2-8、IGHD2-15、IGHD2-21、IGHD2/OR15-2a/b、IGHD3-3、IGHD3-9、IGHD3-10、IGHD3-16、IGHD3-22、IGHD3/OR15-3a/b、IGHD4-4、IGHD4-11、IGHD4-17、IGHD4-23、IGHD4/OR15-4a/b、IGHD5-5、IGHD5-12、IGHD5-18、IGHD5-24、IGHD5/OR15-5a/b、IGHD6-6、IGHD6-13、IGHD6-19、IGHD6-25、IGHD7-27、IGHJ1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4、IGHJ5、IGHJ6、IGHG1、IGHG2、IGHG3、IGHG4、およびIGHGPからなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１７）  前記１つ以上の遺伝子が、IGHV1-3、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHD1-26、IGHV3-49およびIGHJ6からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１８）  前記１つ以上の変数が、前記対象におけるＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における２つ以上の遺伝子の使用頻度を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１９）  前記１つ以上の変数が、ＭＳとＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．７を示す、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２０）  前記１つ以上の変数が、ＭＳとＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．８を示す、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２１）  前記１つ以上の変数が、ＭＳとＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．９を示す、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２２）  前記１つ以上の変数が、前記対象におけるＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における３つ以上の遺伝子の使用頻度を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２３）  前記１つ以上の変数が、ＭＳとＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．７を示す、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２４）  前記１つ以上の変数が、ＭＳとＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．８を示す、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２５）  前記１つ以上の変数が、ＭＳとＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．９を示す、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２６）  前記（ｂ）が、前記項目のいずれかに記載の方法によって行われることを特徴とする、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目Ａ１）  対象が筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）に罹患していることを診断する方法であって、対象におけるＢ細胞受容体（ＢＣＲ）レパトアを測定することと、該ＢＣＲレパトアに基づいて該対象が筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）に罹患していることを診断することとを含む、方法。
（項目Ａ１−１）  前記項目の１つまたは複数に記載の特徴を備える、前記項目に記載の方法。
（項目Ａ２）  筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）を処置する方法であって、対象におけるＢ細胞受容体（ＢＣＲ）レパトアを測定することと、該ＢＣＲレパトアに基づいて該対象が筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）に罹患していることを診断することと、該対象に治療を施すこととを含む、方法。
（項目Ａ２−１）  前記項目の１つまたは複数に記載の特徴を備える、前記項目に記載の方法。
（項目Ａ３）  前記対象におけるＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における１つ以上の遺伝子の使用頻度を含む１つ以上の変数に基づいて該対象が筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）に罹患していることを診断する、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目Ａ４）  前記対象について前記変数を含む式の値を算出し、該値を閾値と比較することにより、該対象が筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）に罹患していることを診断する、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目Ａ５）
（Ａ）筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）に関して、ＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における１つ以上の遺伝子の使用頻度を含む複数の変数を提供することと、
（Ｂ）該変数について多変量解析を行って生成された判別式を提供することと、
（Ｃ）対象の該変数の値を、該判別式に当てはめてＭＥ／ＣＦＳに罹患している確率を算出することと
（Ｄ）該ＭＥ／ＣＦＳに罹患している確率が、所定の値より高い場合に、該対象がＭＥ／ＣＦＳ罹患していると決定すること
を包含する、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目Ａ６）
（Ａ）筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）に関して、ＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における１つ以上の遺伝子の使用頻度を含む複数の変数を提供することと、
（Ｂ）該変数について多変量解析を行って生成された判別式を提供することであって、（Ｂ）は、
（Ｂ−１）該変数について、患者／健常人の区分を目的変数として単変量または多変量ロジスティック回帰を行うことと、
（Ｂ−２）該ロジスティック回帰において生成されたロジットモデル式の定数および偏回帰係数から、判別式の定数および係数を算出することと、
（Ｂ−３）Ｂ−２の処理で得られた定数および係数をもとに判別式を生成することとを含む、ことと、
（Ｃ）対象の該変数の値を、該判別式に当てはめてＭＥ／ＣＦＳに罹患している確率を算出することと
（Ｄ）該ＭＥ／ＣＦＳに罹患している確率が、所定の値より高い場合に、該対象がＭＥ／ＣＦＳに罹患していると決定すること
を包含する、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目Ａ６−Ａ）
（Ａ）変数の組合せを特定することであって、（Ａ）は、
（Ａ−１）筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）の患者および健常人を含む被験者について、該健常人と該ＭＥ／ＣＦＳの患者を比較し、有意な差が検出されたＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における１つ以上の遺伝子の使用頻度を含む複数の変数を提供すること；および／または
（Ａ−２）該ＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における１つの遺伝子を独立変数として単変量ロジスティック解析を行うか、または該ＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における２つ以上の遺伝子を独立変数として多変量ロジスティック解析を実施し、ロジスティック回帰モデル式を得、該ロジスティック回帰モデル式の適合度を測るROC解析を実施して、所定の値以上のＡＵＣ値を示した遺伝子を判別式用の変数として選択することを含む、
ことと、
（Ｂ）該判別式用の変数について多変量解析を行って生成された判別式を提供することであって、（Ｂ）は、
（Ｂ−１）該判別式用の変数について、患者／健常人の区分を目的変数として単変量または多変量ロジスティック回帰を行うことと、
（Ｂ−２）Ｂ−１の該ロジスティック回帰において生成されたロジットモデル式の定数および偏回帰係数から、判別式の定数および係数を算出することと、
（Ｂ−３）Ｂ−２の処理で得られた定数および係数をもとに判別式を生成することとを含む、ことと、
（Ｃ）対象の該変数の値を、該判別式に当てはめてＭＥ／ＣＦＳに罹患している確率を算出することと
（Ｄ）該ＭＥ／ＣＦＳに罹患している確率が、所定の値より高い場合に、該対象がＭＥ／ＣＦＳに罹患していると決定すること
を包含する、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目Ａ７）  
（Ａ）筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）に関して、ＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における１つ以上の遺伝子の使用頻度を含む複数の変数を提供することと、
（Ｂ）該変数について多変量解析を行って生成された判別式を提供することと、
（Ｃ）対象の該変数の値を、該判別式に当てはめてＭＥ／ＣＦＳに罹患している確率を算出することと
（ＡＡ）筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）以外の疾患のＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における１つ以上の遺伝子の使用頻度を含む複数の変数を提供することと、
（ＢＢ）該変数について多変量解析を行って生成された判別式を提供することと、
（ＣＣ）対象の該変数の値を、該判別式に当てはめてＭＥ／ＣＦＳ以外に罹患している確率を算出することと
（Ｄ）該ＭＥ／ＣＦＳに罹患している確率が、所定の値より高い場合で、かつ、該ＭＥ／ＣＦＳ以外に罹患している確率が所定の値より低い場合に、該対象がＭＥ／ＣＦＳに罹患していると決定すること
を包含する、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目Ａ８）  対象が筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）に罹患していることを診断するインビトロの方法であって、対象におけるＢ細胞受容体（ＢＣＲ）レパトアに基づいて該対象が筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）に罹患していることを診断することを含む、方法。
（項目Ａ８−１）  前記項目の１つまたは複数に記載の特徴を備える、前記項目に記載の方法。
（項目Ｂ１）  １つ以上のプロセッサによって実行されると、プロセッサに、対象のＢＣＲレパトアに関連する変数を含む１つ以上の変数を取得させ、該１つ以上の変数に基づき、該対象がＭＥ／ＣＦＳであるかを判定させる命令、を含むプログラム。
（項目Ｂ１−１）  前記項目の１つまたは複数に記載の特徴を備える、前記項目に記載のプログラム。
（項目Ｂ２）  １つ以上のプロセッサによって実行されると、プロセッサに、対象のＢＣＲレパトアに関連する変数を含む１つ以上の変数を取得させ、該１つ以上の変数に基づき、該対象がＭＥ／ＣＦＳであるかを判定させる命令、を含むプログラムを記録した記憶媒体。
（項目Ｂ２−１）  前記項目の１つまたは複数に記載の特徴を備える、前記項目に記載の記憶媒体。
（項目Ｂ２−２）  非一時的記憶媒体である、前記項目のいずれかに記載の記憶媒体。
（項目Ｃ１）  対象のＢＣＲレパトアに関連する変数を含む１つ以上の変数の情報を記録するように構成された記録部と、該情報を取得し、該対象がＭＥ／ＣＦＳであるかを判定するように構成された判定部とを備えた、システム。
（項目Ｃ１−１）  前記項目の１つまたは複数に記載の特徴を備える、前記項目に記載のシステム。
【発明の効果】
【０００５】
本開示により、筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）の的確な診断が可能となる。また、本開示は、ＭＥ／ＣＦＳの発症予測や予後診断にも活用することができ、ＭＥ／ＣＦＳの治療剤開発時のマーカーとしても活用され得る。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は、ＭＥ／ＣＦＳ疾患患者および健常人対照者試料から得られた、ＢＣＲの各ＩＧＨＶ遺伝子（ＩＧＨＶファミリー）の使用頻度の比較の結果を示す図である。縦軸は各遺伝子の使用頻度（％）であり、バーは標準誤差を示す。ＨＣ：健常人対照者、ＭＥ／ＣＦＳ：ＭＥ／ＣＦＳ疾患患者。
【図２】図２は、ＭＥ／ＣＦＳ疾患患者および健常人対照者試料から得られた、ＢＣＲの各ＩＧＨＤおよびＩＧＨＪファミリーの使用頻度の比較の結果を示す図である。縦軸は各遺伝子の使用頻度（％）であり、バーは標準誤差を示す。ＨＣ：健常人対照者、ＭＥ／ＣＦＳ：ＭＥ／ＣＦＳ疾患患者。
【図３Ａ】図３Ａは、ＭＥ／ＣＦＳ疾患患者および健常人対照者試料の、記載されるＩＧＨＶ遺伝子の使用頻度のドットプロットである。ＨＣ：健常人対照者、ＭＥ／ＣＦＳ：ＭＥ／ＣＦＳ疾患患者。
【図３Ｂ】図３Ａは、ＭＥ／ＣＦＳ疾患患者および健常人対照者試料の、記載されるＩＧＨＶ遺伝子の使用頻度のドットプロットである。ＨＣ：健常人対照者、ＭＥ／ＣＦＳ：ＭＥ／ＣＦＳ疾患患者。
【図４】図４は、ＭＥ／ＣＦＳ疾患患者および健常人対照者試料の、記載されるＢ細胞集団の量のドットプロットである。ＨＣ：健常人対照者、ＭＥ／ＣＦＳ：ＭＥ／ＣＦＳ疾患患者。
【図５】図５は、ＭＥ／ＣＦＳ疾患患者および健常人対照者試料の、制御性Ｔ細胞集団の量のドットプロットである。ＨＣ：健常人対照者、ＭＥ／ＣＦＳ：ＭＥ／ＣＦＳ疾患患者。
【図６】図６は、ＭＥ／ＣＦＳ疾患患者および健常人対照者試料の、記載されるＴ細胞集団の量のドットプロットである。ＨＣ：健常人対照者、ＭＥ／ＣＦＳ：ＭＥ／ＣＦＳ疾患患者。
【図７】図７は、IGHV1-3、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHV3-49、IGHD1-26、およびIGHJ6の使用頻度と、Ｂ細胞細胞量（％）を変数として用いた場合の、回帰分析によるＲＯＣ曲線を示す図である。
【図８】図８は、IGHV1-3、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHV3-49、IGHD1-26、およびIGHJ6の使用頻度と、Ｔｒｅｇ量（％）を変数として用いた場合の、回帰分析によるＲＯＣ曲線を示す図である。
【図９】図９は、ＭＥ／ＣＦＳ患者（ｎ＝３７）とＭＳ患者（ｎ＝１０）間のＩＧＨ遺伝子使用頻度の差異を示す図である。ＭＥ／ＣＦＳ：ＭＥ／ＣＦＳ疾患患者、ＭＳ：ＭＳ疾患患者。
【図１０】図１０は、ＭＥ／ＣＦＳ患者（ｎ＝３７）とＭＳ患者（ｎ＝１０）間の多様性指数の差異を示す図である。ＭＥ／ＣＦＳ：ＭＥ／ＣＦＳ疾患患者、ＭＳ：ＭＳ疾患患者。いずれの多様性指数についても、ＭＥ／ＣＦＳ患者（ｎ＝３７）とＭＳ患者（ｎ＝１０）間では有意差が検出されなかった。
【図１１】図１１は、ＭＥ／ＣＦＳ患者（ｎ＝３７）と非ＭＥ／ＣＦＳ患者（ｎ＝３３）のＩＧＨ遺伝子使用頻度の差異を示す図である。ＭＥ／ＣＦＳ：ＭＥ／ＣＦＳ疾患患者、ｎｏｎ−ＭＥ／ＣＦＳ：健常対照＋ＭＳ疾患患者。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
以下、本開示を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本開示の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【０００８】
以下に本明細書において特に使用される用語の定義および／または基本的技術内容を適宜説明する。
【０００９】
（ＭＥ／ＣＦＳ）
筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ｍｙａｌｇｉｃ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ／ｃｈｒｏｎｉｃ  ｆａｔｉｇｕｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＭＥ／ＣＦＳ）は６か月以上続く説明困難な高度の疲労、労作後の極端な消耗、睡眠障害、認知機能障害を中核症状とし、起立不耐症、痛み、消化器症状、光や音、匂い、化学物質に対する過敏症などをしばしば伴う深刻な慢性疾患であり、国内患者数は１０万人以上と推定されるが、病態が未解明で疾患特異的な検査法や有効な治療法がないため、適切な医療が受けられていないのが現状である。
【００１０】
近年ノルウェーからリツキシマブによるＢ細胞除去療法が有効であると報告され、世界的にＭＥ／ＣＦＳの免疫病態に注目が集まっている。獲得免疫系の中でＢ細胞は抗体産生を統括しているが、多様な抗原に対応するために遺伝子再構成によるＢ細胞受容体は極めて多様である。全身性エリテマトーデスのような自己免疫疾患やＢ細胞系の血液腫瘍においては特定のＢ細胞受容体（クローン）が増加しており、個体の多様なＢ細胞受容体の総体（レパトア）における偏りとして検出される。近年次世代シークエンサーを用いてバイアスを排除した方法によるレパトア解析が可能となり、ＭＥ／ＣＦＳのＢ細胞系の異常の検出に有用な可能性がある。
【００１１】
ＭＥ／ＣＦＳの診断は、症状・問診などから、Ｆｕｋｕｄａ  ｃｒｉｔｅｒｉａ、Ｃａｎａｄｉａｎ  ｃｒｉｔｅｒｉａおよびＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｃｒｉｔｅｒｉａなどの基準によって行われている。ＭＥ／ＣＦＳにおいては、疾患を示すバイオマーカーが今日まで開発されておらず、症状の組合せによって診断する複数の診断基準が存在している。Ｆｕｋｕｄａ  ｃｒｉｔｅｒｉａは最も古く（１９９４年）、次にカナダ基準（２００３年）、その後国際基準（２０１１年）が作成されているが、この間に、疾患の本質的な症状（中核症状）について専門家の共通理解が進み、新たな診断基準の作成が現在も検討されている。診断基準が古い基準も含め併存している理由は、１）研究を推進し疾患の病態理解・治療法開発を進めるための詳細／厳密な基準（リサーチ基準）と、２）一般内科医が診断をつけ、患者への医療的／社会的介入を推進できるようにするための簡易な基準（診療用基準）の両者が必要と考えられているからである。具体的には、Ｆｕｋｕｄａ基準はリサーチ基準として現在も研究用に必須と考えられている一方、新しい基準は診療を意識したものになっている。このようなダブルスタンダードは、通常他の疾患では認められないものだが、ＭＥ／ＣＦＳにおいては例外的に専門家の間で認知／受容されている。日本の厚生労働省が作成した診断基準はこれら海外の基準を元に、日本の実情に合わせたもの（ＰＳの設定など）となっている。本開示において、ＭＥ／ＣＦＳは、リサーチ基準であるＦｕｋｕｄａ  ｃｒｉｔｅｒｉａによって規定される疾患を指すことができるが、必要に応じて、他の診療用の基準によって規定される疾患も参照することができる。本開示において、ＭＥ／ＣＦＳであることの確認は、当技術分野で受け入れられている診断基準のいずれかによって行うことができる。
【００１２】
本開示において、ＭＥ／ＣＦＳであることが示された対象、ＭＥ／ＣＦＳである可能性が示された対象、ＭＥ／ＣＦＳを発症する可能性が示された対象、または予後不良のＭＥ／ＣＦＳに罹患していることが示された対象に対し、適切に処置を行ってもよい。ＭＥ／ＣＦＳの処置として、免疫調整剤（リツキシマブなど）、非ステロイド系抗炎症剤、抗うつ剤、および抗不安剤などが用いられ得る。
【００１３】
（ＢＣＲレパトア）
一実施形態において、本開示は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）レパトアを、対象における筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）の指標とする方法を提供する。本明細書において「Ｂ細胞レセプター（ＢＣＲ）」とは、Ｂ細胞受容体、Ｂ細胞抗原レセプター、Ｂ細胞抗原受容体とも呼ばれ、膜結合型免疫グロブリン（ｍＩｇ）分子と会合したＩｇα／Ｉｇβ（ＣＤ７９ａ／ＣＤ７９ｂ）ヘテロ二量体（α／β）から構成されるものをいう。ｍＩｇサブユニットは抗原に結合し、受容体の凝集を起こすが、一方、α／βサブユニットは細胞内に向かってシグナルを伝達する。ＢＣＲが凝集すると、チロシンキナーゼのＳｙｋ及びＢｔｋと同様に、ＳｒｃファミリーキナーゼのＬｙｎ、Ｂｌｋ、及びＦｙｎを速やかに活性化するといわれる。ＢＣＲシグナル伝達の複雑さによって多くの異なる結果が生じるが、その中には、生存、耐性（アネルギー；抗原に対する過敏反応の欠如）またはアポトーシス、細胞分裂、抗体産生細胞または記憶Ｂ細胞への分化などが含まれる。ＴＣＲの可変領域の配列が異なるＴ細胞が何億種類も生成し、またＢＣＲ（または抗体）の可変領域の配列が異なるＢ細胞が何億種類も生成する。ＴＣＲとＢＣＲの個々の配列はゲノム配列の再構成や変異導入により異なるので、Ｔ細胞やＢ細胞の抗原特異性については、ＴＣＲ・ＢＣＲのゲノム配列またはｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）の配列を決定することにより手掛かりを得ることができる。
【００１４】
本明細書において「Ｖ領域」とは、ＴＣＲ鎖またはＢＣＲ鎖の可変領域の可変部（Ｖ）領域をいう。
【００１５】
本明細書において「Ｄ領域」とは、ＴＣＲ鎖またはＢＣＲ鎖の可変領域のＤ領域をいう。
【００１６】
本明細書において「Ｊ領域」とは、ＴＣＲ鎖またはＢＣＲ鎖の可変領域のＪ領域領域をいう。
【００１７】
本明細書において「Ｃ領域」とは、ＴＣＲ鎖またはＢＣＲ鎖の定常部（Ｃ）領域をいう。
【００１８】
本明細書において「可変領域のレパトア（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）」とは、ＴＣＲまたはＢＣＲで遺伝子再構成により任意に作り出されたＶ（Ｄ）Ｊ領域の集合をいう。ＴＣＲレパトア、ＢＣＲレパトア等と熟語で使用されるが、これらは例えば、Ｔ細胞レパトア、Ｂ細胞レパトアなどと称されることもある。レパトアには、全体として多様性がどのくらいかという情報と、個々の遺伝子がどの程度の頻度で用いられているかという情報との２つの側面があるということができる。一実施形態において、対象におけるＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における１つ以上の遺伝子の使用頻度を含む１つ以上の変数を、対象における筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）の指標とする方法が提供される。ＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における１つ以上の遺伝子の使用頻度は、以下のとおり導出することが可能である。
【００１９】
ＢＣＲレパトアの決定の方法として、１つには、試料中のＢ細胞が個々のＶ鎖をどれくらい使用するかを、特定のＶβ鎖特異的抗体を用いて、個々のＶβ鎖を発現するＴ細胞の割合をフローサイトメトリーで解析する方法（ＦＡＣＳ解析）がある。その他に、ヒトゲノム配列から入手されるＴＣＲ遺伝子の情報をもとに、分子生物学的手法によるＴＣＲレパトア解析が考案されてきた。細胞試料からＲＮＡを抽出し、相補的ＤＮＡを合成後、ＴＣＲ遺伝子をＰＣＲ増幅して定量する方法がある。
【００２０】
細胞試料からの核酸の抽出は、RNeasy  Plus  Universal  Mini  Kit  (QIAGEN)などの当技術分野で公知のツールを用いて行うことができる。TRIzol  LS試薬に溶解した細胞からRNeasy  Plus  Universal  Mini  Kit  (QIAGEN)を用いて全RNAの抽出および精製を行うことができる。抽出されたRNAからの相補的DNAの合成は、Superscript  IIITM  (Invitrogen)などの、当技術分野で公知の任意の逆転写酵素を用いて行うことができる。
【００２１】
ＢＣＲ遺伝子のＰＣＲ増幅は、当技術分野で公知の任意のポリメラーゼを用いて、当業者が適宜行うことができる。しかしながら、ＢＣＲ遺伝子のような変動の大きい遺伝子の増幅においては、「非バイアス」で増幅することができれば、正確な測定のためには有利な効果があるといえる。
【００２２】
ＰＣＲ増幅のために用いるプライマーとしては、個々のＢＣＲ  Ｖ鎖特異的プライマーを多数設計して、別個にリアルタイムＰＣＲ法等で定量する方法、あるいはそれら特異的プライマーを同時に増幅する方法（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ＰＣＲ）法が用いられてきた。しかしながら、各Ｖ鎖について内在性コントロールを用いて定量する場合でも、利用するプライマーが多いと正確な解析ができない。さらに、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ＰＣＲ法ではプライマー間の増幅効率の差が、ＰＣＲ増幅時のバイアスを引き起こす欠点がある。
【００２３】
本開示の好ましい実施形態では、WO2015/075939（Repertoire  Genesis  Inc.）に記載されているような、１種のフォーワードプライマーと１種のリバースプライマーからなる１セットのプライマーですべてのアイソタイプやサブタイプ遺伝子を含むＢＣＲ遺伝子を、存在頻度を変えることなく増幅して、ＢＣＲ多様性を決定する。以下のようなプライマー設計は、非バイアス的な増幅に有利である。
【００２４】
ＢＣＲ遺伝子の遺伝子構造に着目し、高度な多様性をもつＶ領域にプライマーを設定することなく、その５’末端にアダプター配列を付加することにより、すべてのＶ領域を含む遺伝子を増幅する。このアダプターは塩基配列上において任意の長さと配列であり、２０塩基対程度が最適であるが、１０塩基から１００塩基までの配列を使用することができる。３’末端に付加されたアダプターは制限酵素により除去され、２０塩基対のアダプターと同一配列のアダプタープライマーと共通配列であるＣ領域に特異的なリバースプライマーにより増幅することですべてのＢＣＲ遺伝子を増幅する。
【００２５】
ＢＣＲ遺伝子メッセンジャーＲＮＡから逆転写酵素により相補鎖ＤＮＡを合成し、続いて二本鎖相補的ＤＮＡを合成する。逆転写反応や二本鎖合成反応によって異なる長さのＶ領域を含む二本鎖相補的ＤＮＡが合成され、それら遺伝子の５’末端部に２０塩基対と１０塩基対からなるアダプターをＤＮＡリガーゼ反応によって付加する。
【００２６】
ＢＣＲに関しては、μ鎖、α鎖、δ鎖、γ鎖、ε鎖の重鎖、κ鎖、λ鎖の軽鎖のＣ領域にリバースプライマーを設定し、これらの遺伝子を増幅することができる。Ｃ領域に設定されるリバースプライマーは、ＢＣＲに関しては各Ｃμ、Ｃα、Ｃδ、Ｃγ、Ｃε、Ｃκ、Ｃλの配列に一致し、かつ他のＣ領域配列にはプライミングしない程度のミスマッチをもつプライマーを設定する。Ｃ領域のリバースプライマーはアダプタープライマーとの増幅ができるように、塩基配列、塩基組成、ＤＮＡ融解温度（Ｔｍ）、自己相補配列の有無を考慮し、最適に作製する。Ｃ領域配列におけるアレル配列間で異なる塩基配列を除く領域にプライマーを設定することで、すべてのアレルを均一に増幅することができる。増幅反応の特異性を高めるため、複数段階のｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行う。
【００２７】
いずれのプライマーもアレル配列間で異なる配列を含まない配列に対して、プライマー候補配列の長さ（塩基数）は、特に制限されないが、１０〜１００塩基数であり、好ましくは、１５〜５０塩基数であり、より好ましくは、２０〜３０塩基数である。このような非バイアス的な増幅を用いることは、低頻度（１／１０，０００〜１／１００，０００またはそれ以下）の遺伝子の同定に有利であり、好ましい。
【００２８】
以上のように増幅したＢＣＲ遺伝子をシークエンシングすることによって、得られたリードデータからＢＣＲレパトアを決定することができる。
【００２９】
シークエンシングの手法は、核酸試料の配列を決定することができる限り限定されず、当技術分野で公知の任意のものを利用することができるが、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）を用いることが好ましい。次世代シークエンシングとしては、パイロシーケンシング、合成によるシークエンシング（シークエンシングバイシンセシス）、ライゲーションによるシーケンシング、イオン半導体シーケンシングなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３０】
得られたリードデータを、Ｖ、Ｄ、Ｊ遺伝子を含む参照配列にマッピングすることで、ユニークリード数を導出して、ＢＣＲレパトアを決定することができる。
【００３１】
１つの実施形態では、使用される参照データベースは、Ｖ、Ｄ、Ｊ、Ｃ遺伝子領域ごとに準備する。典型的にはＩＭＧＴより公開されている領域ごと、アリルごとの核酸配列データセットを使用するが、それに限らず、各配列に一意のＩＤが割り振られているデータセットであれば利用可能である。
【００３２】
得られたリードデータ（トリミングなどの適当な処理を必要に応じて行ったものを含む）を入力配列セットとして、遺伝子領域ごとの参照データベースと相同性検索し、最も近しい参照アリルおよびその配列とのアラインメントを記録する。ここで相同性検索には、Ｃを除きミスマッチ許容性の高いアルゴリズムを使用することになる。例えば相同性検索プログラムとして一般的なＢＬＡＳＴを使用する場合、ウィンドウサイズの短縮、ミスマッチペナルティの低減、ギャップペナルティの低減といった設定を、領域ごとに行うことになる。最も近しい参照アリルの選択においては、相同性スコア、アラインメント長、カーネル長（連続して一致する塩基列の長さ）、一致塩基数を指標とし、これらを定められた優先順位にしたがって適用する。本開示で使用されるＶおよびＪが確定した入力配列については、参照Ｖ上のＣＤＲ３先頭および参照Ｊ上のＣＤＲ３末尾を目印に、ＣＤＲ３配列を抽出する。これをアミノ酸配列に翻訳することで、Ｄ領域の分類に使用する。Ｄ領域の参照データベースが準備できている場合は、相同性検索結果とアミノ酸配列翻訳結果の組合せを分類結果とする。
【００３３】
上記により、入力セット中の各配列についてＶ、Ｄ、Ｊ、Ｃの各アリルがアサインされる。続いて、入力セット全体でＶ、Ｄ、Ｊ、Ｃの各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、ＢＣＲレパトアを導出する。分類に要請される精確さに応じて、出現頻度はアリル単位もしくは遺伝子名単位で算出される。後者は、各アリルを遺伝子名に翻訳することで可能となる。
【００３４】
リードデータにＶ領域、Ｄ領域、Ｊ領域、Ｃ領域がアサインされたのち、一致するリードを集計し、ユニークリード（他に同じ配列をもたないリード）別に、試料中に検出されたリード数および全リード数に占める割合（頻度）を算出することができる。
【００３５】
加えて、サンプル数、リード種類、リード数などのデータを使って、ＥＳＴＩＭＡＴＥＳあるいはＲ（ｖｅｇａｎ）などの統計解析ソフトウェアを用いて多様性指数あるいは類似性指数を算出することができる。好ましい実施形態では、ＴＣＲレパトア解析ソフトウェア（Repertoire  Genesis  Inc.）を用いる。
【００３６】
本明細書において「ＢＣＲ多様性」とは、ある被験体のＢ細胞受容体のレパートリー（レパトア）の多様性をいい、当業者は当該分野で公知の様々な手段を用いて測定することができる。ＢＣＲ多様性を示す指数を「ＢＣＲ多様性指数」という。ＢＣＲ多様性指数としては、当該分野で公知の任意のものがあり、例えば、シャノン−ウィーバー指数（Shannon-Weaver  index）、シンプソン指数（Simpson  index）、逆シンプソン指数（Inverse  Simpson  index）、Pielou’s均等度指数、標準化シャノン−ウィーバー指数（Normalized  Shannon-Weaver  index）、ＤＥ指数（例えば、ＤＥ５０指数、ＤＥ３０指数、ＤＥ８０指数）またはＵｎｉｑｕｅ指数（例えば、Ｕｎｉｑｕｅ５０指数、Ｕｎｉｑｕｅ３０指数、Ｕｎｉｑｕｅ８０指数）などの多様性指数をＢＣＲに適用したものが挙げられる。
【００３７】
（大規模高効率ＢＣＲレパトア解析）
本開示の好ましい実施形態では、大規模高効率ＢＣＲレパトア解析を用いてＢＣＲレパトアを測定する。本明細書において、「大規模高効率レパトア解析」とは、ＷＯ2015/075939（この文献の開示は本明細書においてその全体が必要に応じて参考として援用される。）に記載されており、対象がＢＣＲの場合「大規模高効率ＢＣＲレパトア解析」と称する。大規模高効率レパトア解析では、データベースを用いて被験体のレパトア（Repertoire）（Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の可変領域）を定量的に解析する方法であり、この方法は、データベースを用いて被験体のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の可変領域のレパトア（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）を定量的に解析する方法であって、該方法は、（１）該被験者から非バイアス的に増幅した、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程；（２）該核酸試料に含まれる該核酸配列を決定する工程；および（３）決定された該核酸配列にもとづいて、各遺伝子の出現頻度またはその組み合わせを算出し、該被験体のＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出する工程を包含し、該核酸試料は、複数種類のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の核酸配列を含み、該工程（２）は、共通アダプタープライマーを用いる単一の配列決定により前記核酸配列が決定される、方法によって実現することができ、好ましくは、この方法は、（１）該被験者から非バイアス的に増幅した、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程；（２）該核酸試料に含まれる該核酸配列を決定する工程；および（３）決定された該核酸配列にもとづいて、各遺伝子の出現頻度またはその組み合わせを算出し、該被験体のレパトアを導出する工程を包含し、前記（１）は、以下の工程（１−１）標的となる細胞に由来するＲＮＡ試料を鋳型として相補的ＤＮＡを合成する工程；（１−２）該相補的ＤＮＡを鋳型として二本鎖相補的ＤＮＡを合成する工程；（１−３）該二本鎖相補的ＤＮＡに共通アダプタープライマー配列を付加してアダプター付加二本鎖相補的ＤＮＡを合成する工程；（１−４）該アダプター付加二本鎖相補的ＤＮＡと、該共通アダプタープライマー配列からなる共通アダプタープライマーと、第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーとを用いて第１のＰＣＲ増幅反応を行う工程であって、該第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、該ＴＣＲまたはＢＣＲの目的とするＣ領域に十分に特異的であり、かつ、他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計される、工程；（１−５）（１−４）のＰＣＲ増幅産物と、該共通アダプタープライマーと、第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーとを用いて第２のＰＣＲ増幅反応を行う工程であって、該第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、該第１のＴＣＲのＣ領域特異的プライマーの配列より下流の配列において該ＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域に完全マッチの配列を有するが他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計される、工程；および（１−６）（１−５）のＰＣＲ増幅産物と、該共通アダプタープライマーの核酸配列に第１の追加アダプター核酸配列を含む付加共通アダプタープライマーと、第２の追加アダプター核酸配列および分子同定（ＭＩＤ  Ｔａｇ）配列を第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的配列に付加したアダプター付の第３のＴＣＲのＣ領域特異的プライマーとを用いて第３のＰＣＲ増幅反応を行う工程であって、該第３のＴＣＲのＣ領域特異的プライマーは、該第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーの配列より下流の配列において該ＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域に完全マッチの配列を有するが他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計され、該第１の追加アダプター核酸配列は、ＤＮＡ捕捉ビーズへの結合およびｅｍＰＣＲ反応に適切な配列であり、該第２の追加アダプター核酸配列は、ｅｍＰＣＲ反応に適切な配列であり、該分子同定（ＭＩＤ  Ｔａｇ）配列は、増幅産物が同定できるように、ユニークさを付与するための配列である、工程を包含する。この方法の具体的な詳細はＷＯ2015/075939に記載されており、当業者はこの文献および本明細書の実施例等を適宜参照して解析を実施することができる。
【００３８】
（診断）
本開示の一実施形態において、対象におけるＢ細胞受容体（ＢＣＲ）レパトアを、対象における筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）の指標とする方法が提供される。この方法は、対象がＭＥ／ＣＦＳを発症していることの診断を含む他、ＭＥ／ＣＦＳの発症予測または予後診断、あるいは、ＭＥ／ＣＦＳの治療剤開発時の指標を提供することを含み得る。方法は、インビトロまたはインシリコのものであってもよい。
【００３９】
方法は、ＢＣＲレパトアに関連する変数を含む１つ以上の変数を用いることを含み得る。１つ以上の変数を用いてＭＥ／ＣＦＳの指標とする場合、例えば、当該１つ以上の変数を含む適切な式を用い、ある対象についてその式の値を算出し、かかる値を適切な基準と比較することなどによって行うことができる。式は、ロジスティック回帰等によって求められたものであってよい。用いられる変数として、対象におけるＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における１つ以上の遺伝子の使用頻度、対象におけるＢＣＲ多様性指数、および対象における１つ以上の免疫細胞亜集団量から選択される１つ以上の変数、または２つ以上の変数の組合せが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４０】
本開示の実施形態において、好ましくは、対象におけるＢＣＲの１つ以上のＩＧＨ遺伝子の使用頻度を含む１つ以上の変数を、ＭＥ／ＣＦＳの指標として用い得る。これにより、当該１つ以上の変数を、対象が他の疾患ではなくＭＥ／ＣＦＳに罹患していることの指標として用いること（すなわち、鑑別診断）が可能となり得る。理論に拘束されることは望まないが、例えば、免疫細胞亜集団の量およびＢＣＲレパトア多様性指数は、免疫状態全体に影響を与える他の疾患によっても変動し得るため、対象におけるＭＥ／ＣＦＳの存在を示唆し得るものではあるが、他の疾患であることを排除することができない可能性がある。一方で、ＩＧＨ遺伝子の使用頻度は、何らかの疾患のメカニズムを反映して変化していると考えられるため、対象が他の疾患ではなくＭＥ／ＣＦＳに罹患していることの指標となり得、実臨床の診断において非常に有用であると考えられる。
【００４１】
ＭＥ／ＣＦＳに対する「他の疾患」としては、ＭＥ／ＣＦＳの症状である「６か月以上続く説明困難な高度の疲労、労作後の極端な消耗、睡眠障害、認知機能障害を中核症状とし、起立不耐症、痛み、消化器症状、光や音、匂い、化学物質に対する過敏症など」に類似した症状を呈するあらゆる疾患の他、免疫状態に影響を与え得る任意の疾患が挙げられる。例えば、精神疾患（例えば、うつ病や適応障害、身体表現性障害）、原発性睡眠障害（例えば、睡眠時無呼吸、ナルコレプシー）、内分泌疾患（例えば、下垂体機能低下症、甲状腺疾患）、感染性疾患（例えば、ＡＩＤＳ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎などの慢性感染性疾患）、自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群など）、炎症性疾患（例えば、炎症性腸疾患、慢性膵炎などの慢性炎症性疾患）、神経系疾患（例えば、多発性硬化症（ＭＳ）、自己免疫性脳炎）が挙げられる。本開示の実施形態において、対象において、ＭＥ／ＣＦＳを他の疾患と区別する方法が提供される。他の疾患の一例として、多発性硬化症（ＭＳ）が挙げられる。本明細書におけるＭＥ／ＣＦＳを他の疾患と区別する方法の実施において、必要に応じて、対象におけるＢ細胞受容体（ＢＣＲ）レパトアを対象における筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）の指標とする方法について記載されている事項を適用してもよい。
【００４２】
ＭＥ／ＣＦＳの診断は「臨床症状の組み合わせ」によって行われるが、その際、他疾患や他の原因の除外は非常に重要なプロセスである。生活習慣（不規則、過労等）によっても「臨床症状の組み合わせの基準」が満たされる場合があり、その他の原因、例えば悪性腫瘍、代謝性疾患および脳神経疾患等によっても臨床症状の基準が満たされ得る。そのため、本明細書の実施例で示されるように、疾患の原因を反映していると考えられるＢ細胞レパトアまたはその中の各遺伝子の使用頻度は臨床診断において非常に有用であると考えられる。例えば、臨床的診断プロトコルに、本明細書に記載のＢＣＲレパトア（ＩＧＨ遺伝子使用頻度）を用いた鑑別法を加えることでより正確な鑑別診断が可能になると考えられる。あるいは、本開示の方法において、必要に応じて、臨床的（臨床所見、ＭＲＩ画像所見、脳脊髄液所見等）な情報を組み合わせて使用してもよい。１つの実施形態では、ＭＥ／ＣＦＳを含めた全身症状を呈する患者について、１つ１つの疾患に罹患している可能性を、それぞれＩＧＨ遺伝子の使用頻度を用いた判別モデルまたは判別式によって判定し、最終的に１つの疾患を特定することが可能である。
【００４３】
本明細書において「感度」とは、陽性と判定されるべきものを正しく陽性と判定する確率をいい、感度が高いと偽陰性が減るという関係にある。感度が高いと除外診断(rule  out)に有用である。
【００４４】
本明細書において「特異度」とは、陰性のものを正しく陰性と判定する確率をいい、特異度が高いと偽陽性が減るという関係にある。特異度が高いと確定診断に有用である。
【００４５】
本明細書において、「ＲＯＣ曲線」とは、マーカーの回帰式に基づくカットオフ値を媒介変数として変化させた際の、（感度）および（１−特異度）をプロットした曲線を指す。ＲＯＣ曲線について、当業者は、ＡＵＣ（曲線下面積）を適切に求めることができる。ＲＯＣ曲線のＡＵＣは、予測モデルの性能を示しているものと考えられる。本明細書の実施例において、回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．７、ＡＵＣ≧０．８、およびＡＵＣ≧０．９といった高い予測性能を示す変数または変数の組合せが多数実証されている。ＡＵＣが７程度であれば、診断モデルとしての使用可能性があると考えられる。
【００４６】
本開示において、対象においてＭＥ／ＣＦＳの指標として用いる１以上の変数であって、回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．７を示す１以上の変数（必要に応じて、変数の組み合わせであり得る）を用いることによって、今まで診断が難しかったＭＥ／ＣＦＳの診断が可能になる。
【００４７】
方法は、対象においてＭＥ／ＣＦＳの指標として用いる１以上の変数を取得する工程を含み得る。１つの実施形態において、変数を取得する工程は、対象の試料を分析する工程を含み得、例えば、対象におけるＢＣＲのレパトアを測定する工程、および／または対象における細胞亜集団の量を測定する工程を含み得る。ＢＣＲのレパトアを測定する工程は、対象におけるＢＣＲ多様性を決定する工程、および／または対象のＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における１つ以上の遺伝子の使用頻度を決定する工程を含み得る。対象における細胞亜集団の量は、フローサイトメトリーを含めた当業者に公知の任意の手法によって測定してよい。また、変数として、以前に対象について決定された値についてのデータを取得することも可能である。
【００４８】
方法は、本明細書に記載される１つ以上の変数に基づき、対象がＭＥ／ＣＦＳであるかを判定する工程を含み得る。判定する工程は、当該１つ以上の変数を含む関数の従属変数の値を、適切な閾値と比較することによって行ってよい。
【００４９】
１つの実施形態において、本明細書に記載される方法はインシリコで行うことができる。方法は、対象のＢＣＲレパトアに関連する変数を含む１つ以上の変数を取得する工程と、当該１つ以上の変数に基づき、当該対象がＭＥ／ＣＦＳであるかを判定する工程を含む。本明細書に記載される任意の方法を実装するプログラム、プログラムを記録した記憶媒体、またはシステムも、本開示の範囲内である。
【００５０】
１つの実施形態において、１つ以上のプロセッサによって実行されると、プロセッサに、対象のＢＣＲレパトアに関連する変数を含む１つ以上の変数を取得させ、当該１つ以上の変数に基づき、当該対象がＭＥ／ＣＦＳであるかを判定させる命令、を含むプログラム、またはそれを記録した記憶媒体が提供される。対象のＢＣＲレパトアに関連する変数を含む１つ以上の変数の情報を記録するように構成された記録部と、かかる情報を取得し、当該対象がＭＥ／ＣＦＳであるかを判定するように構成された判定部とを備えた、システムも提供され得る。システムは、必要に応じて、コンピュータシステムであり得、本明細書において記載されるプログラムまたはそれを記録した記憶媒体を含み得る。
【００５１】
（指標）
（ＩＧＨ遺伝子）
本開示の１つの実施形態は、対象におけるＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における１つ以上の遺伝子（ＩＧＨ遺伝子）の使用頻度を含む１つ以上の変数を、対象におけるＭＥ／ＣＦＳの指標とする方法を提供する。ＩＧＨ遺伝子として、IGHV1-2、IGHV1-3、IGHV1-8、IGHV1-18、IGHV1-24、IGHV1-38-4、IGHV1-45、IGHV1-46、IGHV1-58、IGHV1-69、IGHV1-69-2、IGHV1-69D、IGHV1/OR15-1、IGHV1/OR15-5、IGHV1/OR15-9、IGHV1/OR21-1、IGHV2-5、IGHV2-26、IGHV2-70、IGHV2-70D、IGHV2/OR16-5、IGHV3-7、IGHV3-9、IGHV3-11、IGHV3-13、IGHV3-15、IGHV3-16、IGHV3-20、IGHV3-21、IGHV3-23、IGHV3-23D、IGHV3-25、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHV3-30-5、IGHV3-33、IGHV3-35、IGHV3-38、IGHV3-38-3、IGHV3-43、IGHV3-43D、IGHV3-48、IGHV3-49、IGHV3-53、IGHV3-64、IGHV3-64D、IGHV3-66、IGHV3-72、IGHV3-73、IGHV3-74、IGHV3-NL1、IGHV3/OR15-7、IGHV3/OR16-6、IGHV3/OR16-8、IGHV3/OR16-9、IGHV3/OR16-10、IGHV3/OR16-12、IGHV3/OR16-13、IGHV4-4、IGHV4-28、IGHV4-30-2、IGHV4-30-4、IGHV4-31、IGHV4-34、IGHV4-38-2、IGHV4-39、IGHV4-59、IGHV4-61、IGHV4/OR15-8、IGHV5-10-1、IGHV5-51、IGHV6-1、IGHV7-4-1、IGHV7-81、IGHD1-1、IGHD1-7、IGHD1-14、IGHD1-20、IGHD1-26、IGHD1/OR15-1a/b、IGHD2-2、IGHD2-8、IGHD2-15、IGHD2-21、IGHD2/OR15-2a/b、IGHD3-3、IGHD3-9、IGHD3-10、IGHD3-16、IGHD3-22、IGHD3/OR15-3a/b、IGHD4-4、IGHD4-11、IGHD4-17、IGHD4-23、IGHD4/OR15-4a/b、IGHD5-5、IGHD5-12、IGHD5-18、IGHD5-24、IGHD5/OR15-5a/b、IGHD6-6、IGHD6-13、IGHD6-19、IGHD6-25、IGHD7-27、IGHJ1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4、IGHJ5、IGHJ6、IGHG1、IGHG2、IGHG3、IGHG4、およびIGHGP、ならびにこれらの任意の組合せからなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を用いることができる。
【００５２】
本明細書の実施例において、種々のＩＧＨ遺伝子の使用頻度が、ＭＥ／ＣＦＳの指標となり得ることが示されている。本開示において、用いられる少なくとも１つのＩＧＨ遺伝子の数は特段制限されず、１〜１１７遺伝子の任意の遺伝子数を用いることができる。本開示において指標として用いられる１つ以上の変数は、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１５、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、またはそれら超の数のＩＧＨ遺伝子の使用頻度を含み得る。適切な場合には、１つ以上の変数は１つの変数でもあり得る。
【００５３】
１つの好ましい実施形態では、１つ以上のＩＧＨ遺伝子が、IGHV3-73、IGHV1-69-2、IGHV5-51、IGHV4-31、IGHV3-23D、IGHV1/OR15-9、IGHV4-39、IGHD5-12、IGHV3-43D、IGHD4-17、IGHV5-10-1、IGHD4/OR15-4a/b、IGHG4、IGHV1/OR15-5、IGHV3/OR16-9、IGHD1-7、IGHV3-21、IGHD6-6、IGHV3-33、IGHD4-23、IGHV3-30-5、IGHV3-23、IGHD6-13、IGHV3-64D、IGHV3-48、IGHV3-64、IGHG1、IGHV3-49、IGHV3-30-3、IGHD1-26、IGHJ6、IGHV3-30、IGHGP、IGHV1-3およびIGHD3-22からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を含む。より好ましくは、１つ以上のＩＧＨ遺伝子が、IGHD6-6、IGHV3-33、IGHD4-23、IGHV3-30-5、IGHV3-23、IGHD6-13、IGHV3-64D、IGHV3-48、IGHV3-64、IGHG1、IGHV3-49、IGHV3-30-3、IGHD1-26、IGHJ6、IGHV3-30、IGHGP、IGHV1-3およびIGHD3-22からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を含む。さらにより好ましくは、１つ以上のＩＧＨ遺伝子が、IGHV3-49、IGHV3-30-3、IGHD1-26、IGHJ6、IGHV3-30、IGHGP、IGHV1-3およびIGHD3-22からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を含む。さらなる実施形態においては、１つ以上の遺伝子が、IGHV1-3、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHV3-49、IGHD1-26、およびIGHJ6からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を含む。上述の遺伝子について、本明細書の実施例において、単独で予測に使用可能であることが示唆されている。
【００５４】
本開示のさらなる実施形態では、１つ以上の変数として、対象におけるＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における２つ以上の遺伝子の使用頻度を含む変数を用いる方法が提供される。２つ以上の遺伝子の使用頻度を用いることによって、方法の精度をさらに高めることができると考えられる。当業者は、本明細書の記載に鑑みて、適切な２つ以上の遺伝子の使用頻度の組合せを選択して用いることができる。１つ以上の変数は、回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．７、ＡＵＣ≧０．８、またはＡＵＣ≧０．９を示すように選択したものであってよい。遺伝子の組合せの一例としては、IGHV1-3、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHV3-49、IGHD1-26、およびIGHJ6を挙げることができる。当業者は、ある遺伝子の組合せの、回帰分析によるＲＯＣ曲線におけるＡＵＣを、本願明細書に記載される方法に従って適切に算出することができ、ある遺伝子の組合せが所望のＡＵＣを示すものであるかを判定することができる。回帰分析は、例えば、正常対照とＭＥ／ＣＦＳとの判別のためのものであり得る。
【００５５】
本明細書の実施例においては、２種のＩＧＨ遺伝子の組合せについて、117遺伝子のいずれも、適切な他のＩＧＨ遺伝子と組み合わせた場合に、回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．７を示す組み合わせを実現することができることが示されている。
【００５６】
（多様性指数）
本開示において、対象における筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）の診断において、他の変数に換えてもしくは加えて、対象におけるＢＣＲ多様性指数を変数として用いることができる。
【００５７】
ＢＣＲ多様性指数としては、当該分野で公知の任意のものを利用することができ、例えば、シャノン−ウィーバー指数（Shannon-Weaver  index）、シンプソン指数（Simpson  index）、逆シンプソン指数（Inverse  Simpson  index）、Pielou’s均等度指数、標準化シャノン−ウィーバー指数（Normalized  Shannon-Weaver  index）、ＤＥ指数（例えば、ＤＥ５０指数、ＤＥ３０指数、ＤＥ８０指数）などが挙げられる。
【００５８】
本明細書の実施例３−２、表７において、いくつかの多様性指数が、単回帰分析において０．１≦Ｐ＜０．２の有意性で抽出されている。また、本明細書の実施例６では、複数の変数の組み合わせにおいて、多様性指数を含むいくつかの変数の組み合わせが、ＲＯＣ解析においてＡＵＣ値０．８以上を示すことが見出されている（表１８）。
【００５９】
（細胞亜集団）
本開示において、対象における筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）の診断において、他の変数に換えてもしくは加えて、細胞亜集団量を変数として用いることができる。細胞亜集団量としては、例えば、免疫細胞亜集団量を用いることができる。本明細書において、「細胞亜集団」とは、多様な特性の細胞を含む細胞集団中の、何らかの共通する特徴を有する任意の細胞の集合を指す。特定の名称が当技術分野で知られているものについては、かかる用語を用いて特定の細胞亜集団に言及することもでき、任意の性質（例えば、細胞表面マーカーの発現）を記載して特定の細胞亜集団に言及することもできる。
【００６０】
細胞亜集団の例としては、例えば、Ｂ細胞、ナイーブＢ細胞、メモリーＢ細胞、プラズマブラスト、活性化ナイーブＢ細胞、トランジショナルＢ細胞、制御性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  ｈｅｌｐｅｒ  Ｔ細胞、Ｔｆｈ１細胞、Ｔｆｈ２細胞、Ｔｆｈ１７細胞、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、およびＴｈ１７細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
細胞亜集団の量は、当業者は、例えば、フローサイトメトリーによって決定することが可能である。例えば、サンプルを採取後、溶血法か比重遠心法にて赤血球を除いた後に蛍光標識抗体（目的とする抗原に対する抗体とそのコントロール抗体）と反応させ、十分に洗浄してからフローサイトメトリーを用いて観察することができる。検出された散乱光や蛍光は電気信号に変換されコンピュータにより解析される。その結果は、ＦＳＣの強さは細胞の大きさを表しＳＳＣの強さは細胞内構造を表すことによりリンパ球、単球、顆粒球を区別することが可能である。その後、必要に応じて目的とする細胞集団にゲートをかけて、それらの細胞における抗原発現様式を検討する。本開示の方法の実施において、当業者は、示される細胞の表面マーカーを適切に識別して、細胞を分画または計数することが可能である。
【００６２】
特に有用な細胞亜集団としては、Ｂ細胞および制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）が挙げられる。本開示において、他の変数に加えてもしくは換えて、Ｂ細胞の量および／またはＴｒｅｇの量を含む１つ以上の変数を、ＭＥ／ＣＦＳの指標として用いることができる。
【００６３】
細胞亜集団の量は、適切な基準に対する割合を用いることができる。Ｂ細胞の量は、例えば、末梢血単核球細胞におけるＢ細胞の頻度（％）である。Ｔｒｅｇの量は、例えば、全ＣＤ４陽性Ｔ細胞におけるＴｒｅｇの頻度（％）である。
【００６４】
本明細書の実施例３−２、表７において、いくつかの細胞亜集団変数が、単回帰分析において０．１≦Ｐ＜０．２の有意性で抽出されている。また、本明細書の実施例６では、複数の変数の組み合わせにおいて、細胞亜集団変数を含むいくつかの変数の組み合わせが、ＲＯＣ解析においてＡＵＣ値０．８以上を示すことが見出されている（表１８）。
【００６５】
（組み合わせ）
本明細書において示されるように、対象におけるＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における１つ以上の遺伝子の使用頻度を含む１つ以上の変数を、対象におけるＭＥ／ＣＦＳの指標として用いることができる。１つ以上の変数は、本明細書に記載される変数の任意の組合せであり得る。好ましくは、対象におけるＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における１つ以上の遺伝子の使用頻度、対象におけるＢＣＲ多様性指数、および対象における１つ以上の免疫細胞亜集団量からなる群から選択される２つ以上の変数の組み合わせを含む。２つ以上の変数は、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上またはそれら超の任意の数の変数であり得る。
【００６６】
本明細書の実施例において、多数の変数の組合せが、正常対照とＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線において高いＡＵＣを示すことが実証されており、当業者は、適切に変数を組み合わせて、特定されるＡＵＣを示す組み合わせを用いて実施することができる。１つの実施形態において、変数の組合せは、回帰分析によるＲＯＣ曲線において、ＡＵＣ≧０．７、ＡＵＣ≧０．８、ＡＵＣ≧０．８５、ＡＵＣ≧０．９、ＡＵＣ≧０．９５、またはＡＵＣ≧０．９９を示し得る。当業者は、ある変数の組合せの、回帰分析によるＲＯＣ曲線におけるＡＵＣを、本願明細書に記載される方法に従って適切に算出することができ、ある変数の組合せが所望のＡＵＣを示すものであるかを判定することができる。変数の組合せの一例としては、対象におけるIGHV1-3、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHV3-49、IGHD1-26、およびIGHJ6の使用頻度と、Ｂ細胞の量との組合せ、あるいは、対象におけるIGHV1-3、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHV3-49、IGHD1-26、およびIGHJ6の使用頻度と、Ｔｒｅｇの量との組合せなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６７】
必須ではないが、単回帰分析によって予測性能が示された変数をさらに組み合わせることは、より高い予測性能に繋がり得る。本明細書の実施例において、単回帰分析で患者群と対照群の間でＰ＜０．２の有意差を示した変数同士の組合せについて、２変数の組合せでは、組み合わせのうち４６％がＲＯＣ解析においてＡＵＣ≧０．７を示し、３変数を組み合わせた場合には、組み合わせのうち８１％がＲＯＣ解析においてＡＵＣ≧０．７を示し、４変数を組み合わせた場合には、組み合わせのうち９６％がＲＯＣ解析においてＡＵＣ≧０．７を示した。
【００６８】
本開示において、対象が筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）に罹患していることを診断するには、例えば、以下のような工程によって行い得る。筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）に関して、ＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における１つ以上の遺伝子の使用頻度を含む複数の変数を提供することができる。次いで、当該変数について多変量解析を行って生成された判別式を提供することができる。判別式の提供は、例えば、変数について、患者／健常人の区分を目的変数として単変量または多変量ロジスティック回帰を行うことと、ロジスティック回帰において生成されたロジットモデル式の定数および偏回帰係数から、判別式の定数および係数を算出することと、当該処理で得られた定数および係数をもとに判別式を生成することとを含み得る。次いで、対象の変数の値を、判別式に当てはめてＭＥ／ＣＦＳに罹患している確率を算出することができる。ＭＥ／ＣＦＳに罹患している確率が、所定の値より高い場合に、対象がＭＥ／ＣＦＳに罹患していると決定することができる。
【００６９】
より詳細に述べると、本開示において、対象が筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）に罹患していることを診断するには、例えば、以下のような工程によって行い得る。方法において、変数の組合せを特定する。変数の組合せの特定は、（１）筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）の患者および健常人を含む被験者について、該健常人と該ME/CFSの患者を比較し、有意な差が検出されたＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における１つ以上の遺伝子の使用頻度を含む複数の変数を提供すること、および／または（２）該ＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における１つの遺伝子を独立変数として単変量ロジスティック解析を行うか、または該ＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における2つ以上の遺伝子を独立変数として多変量ロジスティック解析を実施し、ロジスティック回帰モデル式を得、該ロジスティック回帰モデル式の適合度を測るROC解析を実施してより高いAUC値を示した遺伝子を判別式用の変数として選択することとを含み得る。
【００７０】
次いで、判別式用の変数について多変量解析を行って生成された判別式を提供することができる。判別式の提供は、例えば、変数について、患者／健常人の区分を目的変数として単変量または多変量ロジスティック回帰を行うことと、ロジスティック回帰において生成されたロジットモデル式の定数および偏回帰係数から、判別式の定数および係数を算出することと、当該処理で得られた定数および係数をもとに判別式を生成することとを含み得る。次いで、対象の変数の値を、判別式に当てはめてＭＥ／ＣＦＳに罹患している確率を算出することができる。ＭＥ／ＣＦＳに罹患している確率が、所定の値より高い場合に、対象がＭＥ／ＣＦＳに罹患していると決定することができる。
【００７１】
（鑑別診断）
本開示の実施形態において、対象において、ＭＥ／ＣＦＳを他の疾患と区別する方法が提供される。本開示の１つの実施形態においては、正常対照および他の疾患の患者を含む非ＭＥ／ＣＦＳ群と、ＭＥ／ＣＦＳ群との間で差が生じる指標（変数）を含む式を用いることで、鑑別診断を行う。この場合、例えば、健常人＋MS疾患を非ME/CFS群として、ME/CFS群との鑑別に有効なIGH遺伝子を選択して含めた1つの判別式を用いることができる。本明細書の実施例におけるME/CFS群と非ME/CFS群間の有意差検定から、有意差のあるIGH遺伝子が挙げられており、１つ以上の変数として、IGHV3-49、IGHV3-30-3、IGHD1-26、IGHV3-30、IGHJ6、IGHGP、IGHV4-31、IGHV3-64、IGHD3-22、IGHV3-33、IGHV3-73、IGHV5-10-1およびIGHV4-34からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の使用頻度を含む変数を使用することが可能である。
【００７２】
あるいは、他の実施形態において、正常対照とME/CFS患者とを区別する判別式で判別したあと、その他の疾患（例えば、MS）と判別する判別式をそれぞれあてはめて他の疾患である可能性を否定していくといった形が想定される。この場合、本明細書に記載されるME/CFSを正常対照と区別する判別を行い、その後（あるいはその前または同時に）、さらに別の判別式を使用して他の疾患との鑑別を行う。すなわち、（ａ）１つ以上の変数のうちの一部を前記対象におけるＭＥ／ＣＦＳの指標とすることと、（ｂ）１つ以上の変数のうちの一部を前記対象が他の疾患ではなくＭＥ／ＣＦＳであることの指標とすることとを含む、方法が提供され得る。他の疾患は多発性硬化症（ＭＳ）を含み得る。複数の他の疾患について（ｂ）を複数回行ってもよい。
【００７３】
本開示の１つの実施形態は、対象におけるＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における１つ以上の遺伝子の使用頻度を含む１つ以上の変数を、対象が他の疾患（例えば、多発性硬化症、ＭＳ）ではなく筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）に罹患していることの指標とする、方法である。このような方法を、本明細書に記載されるME/CFSを正常対照と区別する判別を行うことと必要に応じて組み合わせて行い得る。ここで、ＭＳとの区別を行うことが望まれる場合、１つ以上の遺伝子が、IGHV1-3、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHD1-26、IGHV3-49およびIGHJ6からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を含み得る。その他、前記１つ以上の遺伝子として、ＭＳとＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．７、ＡＵＣ≧０．８、またはＡＵＣ≧０．９を示すように選択したものであってよい。本開示において、ＭＳとＭＥ／ＣＦＳとの判別のために用いられる少なくとも１つのＩＧＨ遺伝子の数は特段制限されず、１〜１１７遺伝子の任意の遺伝子数を用いることができる。本開示において指標として用いられる１つ以上の変数は、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１５、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、またはそれら超の数のＩＧＨ遺伝子の使用頻度を含み得る。適切な場合には、１つ以上の変数は１つの変数でもあり得る。
【００７４】
本明細書において「対象」とは、本開示の診断または検出等の対象となる任意の生物を指す。好ましくは、対象はヒトである。
【００７５】
本明細書において「試料」とは、対象から得られた任意の物質をいい、例えば、末梢血、組織生検試料、細胞試料、リンパ液、唾液、尿等が含まれる。当業者は本明細書の記載をもとに適宜好ましい試料を選択することができる。
【００７６】
本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも１つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「２つの値」の「範囲内」と明記した場合、その範囲には２つの値自体も含む。
【００７７】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【００７８】
以上、本開示を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本開示を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本開示を限定する目的で提供したのではない。従って、本開示の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【００７９】
本明細書の以下に記載される実施例において、適宜以下の略語が用いられる。
【表Ａ】
2020040210.tif 000003
【００８０】
［実施例１］
ＭＥ／ＣＦＳ疾患患者末梢血単核球を用いた次世代Ｂ細胞受容体レパトア解析
１．材料と方法
１．１．末梢血単核球分離とＲＮＡ抽出
表１に示すＭＥ／ＣＦＳ疾患患者（３７例）および健常人対照者（２３例）から１０ｍＬの全血をヘパリン含採血管に採取し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ密度勾配遠心分離により末梢血単核球細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｃｅｌｌｓ、ＰＢＭＣｓ）を分離した。単離したＰＢＭＣからＲＮｅａｓｙ  Ｌｉｐｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、全ＲＮＡを抽出・精製した。ＲＮＡは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて定量した。
【表１】
2020040210.tif 000004
【００８１】
１．２．相補的ＤＮＡおよび二本鎖相補的ＤＮＡの合成
ＢＣＲ遺伝子の増幅はａｄａｐｔｏｒ−ｌｉｇａｔｉｏｎ  ＰＣＲ法を用いて実施した。制限酵素消化部位含Ｏｌｉｇｏ  ｄＴプライマー（ＢＳＬ−１８Ｅ：  表２）と逆転写酵素により相補鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成した。続いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＲＮａｓｅＨ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、二本鎖相補鎖ＤＮＡ（ｄｓ−ｃＤＮＡ）合成を行った。その後、Ｔ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによる５’末端平滑化反応を行い、制限酵素ＮｏｔＩで末端を切断した。ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてカラム精製した後、Ｐ２０ＥＡ／Ｐ１０ＥＡアダプターをＴ４  ＬｉｇａｓｅによるＬｉｇａｔｉｏｎ反応にて付加し、アダプター付加ｄｓ−ｃＤＮＡはＮｏｔＩ制限酵素により消化された。【００８２】
１．３．ＰＣＲ
Ｂ細胞受容体（Ｂ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＢＣＲ）の免疫グロブリンγ鎖（ＩｇＧ）の重鎖（ＩＧＨ）遺伝子を特異的に増幅するため、ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  ＨＳ  ＲｅａｄｙＭｉｘ（日本ジェネティクス）によりサーマルサイクラー  Ｔ１００（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）を用いＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを３回行った。Ｐ２０ＥＡとＣＧ１を用いて１ｓｔ  ＰＣＲを、続いてＰ２０ＥＡとＣＧ２を用いて２ｎｄ  ＰＣＲ反応を行った。さらに、Ｐ２２ＥＡ−ＳＴ１−ＲおよびＣＧ−ＳＴ１−Ｒによりシーケンスに必要なＴａｇ配列を付加した。Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅビーズを用いて、残存プライマーの持ち込みを除去した後、Ｎｅｘｔｅｒａ  ＸＴ  Ｉｎｄｅｘ  Ｋｉｔ  ｖ２  Ｓｅｔ  Ａ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いてｉｎｄｅｘを付加した。
【表２】
2020040210.tif 000005
【００８３】
１．４．次世代シーケンス解析
増幅産物は、Ｑｕｂｉｔ（登録商標）  ３．０フルオロメーター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて濃度測定し、４ｎＭに希釈後、ＰｈｉＸ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｖ３（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を一部混合して最終調製検体とした。Ｍｉｓｅｑ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  ｖ３（６００Ｃｙｃｌｅ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）および最終調製検体をｉｌｌｕｍｉｎａ社Ｍｉｓｅｑシーケンサでｐａｉｒｅｄ−ｅｎｄシーケンスを行った。【００８４】
１．５．レパトア解析ソフトウェアによる解析
Ｍｉｓｅｑシーケンスにより獲得された１対のＦａｓｔｑ塩基配列データセットを用いて、レパトア解析ソフトＲｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  Ｇｅｎｅｓｉｓにより、ＩＧＨ遺伝子Ｖ領域配列（ＩＧＨＶ）、Ｄ領域配列（ＩＧＨＤ）、Ｊ領域配列（ＩＧＨＪ）およびＣ領域配列（ＩＧＨＣ）の照合、およびＣＤＲ３配列を決定した。同一のＩＧＨＶ、ＩＧＨＤ、ＩＧＨＪ、ＩＧＨＣおよびＣＤＲ３アミノ酸配列を持つリードをユニークリードとし、各サンプルにおけるユニークリードのコピー数をカウントした。ユニークリードの集計結果から、各サンプルのＩＧＨＶ、ＩＧＨＤ、ＩＧＨＪ、ＩＧＨＣ使用頻度、ならびに多様性指数を算出した。【００８５】
２．結果
ＭＥ／ＣＦＳ疾患患者および健常人対照者試料より２０万〜３０万リードのシーケンスデータを獲得した（表３）。全リード数、アサインリード、ｉｎ−ｆｒａｍｅリード数およびユニークリード数はＭＥ／ＣＦＳ疾患患者と健常対照者間で差が見られなかった。リードデータから算出されたＩＧＨＶ、ＩＧＨＤ、ＩＧＨＪ、ＩＧＨＣ使用頻度、ならびに多様性指数について、ＭＥ／ＣＦＳ疾患患者と健常対照者間で比較した。ＩＧＨＶに関し、ＩＧＨＶ１−３、ＩＧＨＶ３−３０、ＩＧＨＶ３−３０−３およびＩＧＨＶ３−４９の使用頻度が、健常対照者に比較してＭＥ／ＣＦＳ疾患患者で有意に高かった（図１、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  ｔｅｓｔの有意水準：Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．００１およびＰ＜０．００１）。ＩＧＨＤに関してはＩＧＨＤ１−２６が、ＩＧＨＪではＩＧＨＪ６が健常対照者に比しＭＥ／ＣＦＳ疾患患者で有意に高い頻度を示した（図２、Ｐ＜０．０１およびＰ＜０．０５）。ドットプロットを図３Ａおよび図３Ｂに示した。これらの結果は、次世代ＢＣＲレパトア解析により、ＩＧＨＶ１−３、ＩＧＨＶ３−３０、ＩＧＨＶ３−３０−３、ＩＧＨＤ１−２６、ＩＧＨＶ３−４９およびＩＧＨＪ６の使用頻度の測定が、有効なバイオマーカがないＭＥ／ＣＦＳ疾患の鑑別に利用することができると示唆される（表４）。
【表３】
2020040210.tif 000006
【表４】
2020040210.tif 000007
【００８６】
［実施例２］
ＭＥ／ＣＦＳ疾患患者リンパ球のフローサイトメトリーによる比較検討
１．方法
［実施例１］で示した方法により末梢血単核球細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｃｅｌｌｓ、ＰＢＭＣｓ）を分離した。その後、各種蛍光色素標識モノクローナル抗体で染色し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ  および  ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ  （ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））にて、以下のリンパ球亜分画の頻度を算出した。（％）Ｂ細胞：ＣＤ１９＋細胞／ＰＢＭＣ；ナイーブＢ細胞（ｎＢ）：ＣＤ１９＋ＣＤ２７−／ＣＤ１９＋細胞；メモリーＢ細胞（ｍＢｓ），ＣＤ１９＋ＣＤ２７＋ＣＤ１８０＋／ＣＤ１９＋；ｐｌａｓｍａｂｌａｓｔｓ（ＰＢｓ）：ＣＤ１９＋ＣＤ２７＋ＣＤ１８０−ＣＤ３８ｈｉｇｈ／ＣＤ１９＋；ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ  Ｂ細胞（ＴｒＢ）：ＣＤ１９＋ＣＤ２７−ＣＤ２４＋Ｍｉｔｏ  ｔｒａｃｋｅｒ  ｇｒｅｅｎ  ｈｉｇｈ／ＣＤ１９＋；メモリーＣＤ４Ｔ細胞（ｍＣＤ４Ｔ）：ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ１２７＋ＣＤ４５ＲＡ−／ＣＤ３＋ＣＤ４＋；濾胞性ヘルパーＴ細胞（Ｔｆｈ）：ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ１２７＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＸＣＲ５＋／ＣＤ３＋ＣＤ４＋；ヘルパーＴ細胞１（Ｔｈ１細胞）：ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ１２７＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＸＣＲ５−ＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ６−／ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ１２７＋ＣＤ４５ＲＡ−；ヘルパーＴ細胞２（Ｔｈ２細胞）：ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ１２７＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＸＣＲ５−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ６−／ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ１２７＋ＣＤ４５ＲＡ−；ヘルパーＴ細胞１７（Ｔｈ１７細胞）：ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ１２７＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＸＣＲ５−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ６＋／ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ１２７＋ＣＤ４５ＲＡ−；濾胞性ヘルパーＴ細胞１（Ｔｆｈ１細胞）：ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ１２７＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＸＣＲ５＋ＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ６−／ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ１２７＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＸＣＲ５＋；濾胞性ヘルパーＴ細胞２（Ｔｆｈ２細胞）：ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ１２７＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＸＣＲ５＋ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ６−／ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ１２７＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＸＣＲ５＋；濾胞性ヘルパーＴ細胞１７（Ｔｆｈ１７細胞）：ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ１２７＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＸＣＲ５＋ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ６＋／ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ１２７＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＸＣＲ５＋；制御性Ｔ細胞  （Ｔｒｅｇ）：ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ１２７−ＣＤ２５＋＋／ＣＤ３＋ＣＤ４＋。得られた頻度について、ＭＥ／ＣＦＳ疾患患者と健常人対象者間でＭａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ  ｔｅｓｔを行い、２群間の有意差を検定した。ｐ＜０．０５を統計学的有意とした。【００８７】
２．結果
図４、図５および図６に示すように、疾患群において有意に（％）Ｂ細胞が高く、疾患群において有意に制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の頻度が低く、疾患群において有意に濾胞性ヘルパーＴ細胞１７（Ｔｆｈ１７）の頻度が高かった。【００８８】
［実施例３−１］
２群間で有意な差が観察されたＩＧＨ遺伝子と細胞亜集団頻度データを利用したＭＥ／ＣＦＳの予測鑑別
１．方法
ＭＥ／ＣＦＳ疾患患者（３７例）および健常人対照者（２３例）の２群間で有意な差が検出された６つのＩＧＨ遺伝子（表５）および細胞亜集団の頻度データである（％）Ｂ細胞、あるいは（％）制御性Ｔ細胞を加えて、ＭＥ／ＣＦＳの予測が可能かどうかの検討を行った。多変量ロジスティック解析をＳＰＳＳソフトウェア（ＩＢＭ）、を用いて実施し、回帰式の従属変数の予測値を用いて受信者動作特性（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ、ＲＯＣ）曲線を作出した。さらに、これら変数の予測判定の性能評価値としてＲＯＣ曲線下面積（Ａｒｅａ  Ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  Ｃｕｒｖｅ、ＡＵＣ）値を求めた。【００８９】
２．結果
ＩＧＨ遺伝子６変数と（％）Ｂ細胞ではＡＵＣ値が０．９４６と良好な評価が得られた（図７）。また、ＩＧＨ遺伝子６変数と（％）制御性Ｔ細胞を用いた回帰式に基づいた解析ではＡＵＣ値が０．９５７と極めて良好な評価が得られた（図８）。
【表５】
2020040210.tif 000008
【００９０】
［実施例３−２］
単回帰分析によるＭＥ／ＣＦＳ疾患の予測性能の高いＩＧＨ遺伝子および細胞亜集団変数の抽出
１．方法
ＩＧＨＶ７４種、ＩＧＨＤ３２種、ＩＧＨＪ６種、ＩＧＨＣ５種、多様性指数４種、細胞亜集団頻度データ１５種のうち１種を独立変数として、ＭＥ／ＣＦＳ疾患と健常人対照の２値変数を従属変数とする単回帰分析を実施した。使用した変数は表６に示す。有意水準Ｐ＜０．０５、０．０５≦Ｐ＜０．１、および０．１≦Ｐ＜０．２を満たす変数を抽出した。単回帰およびロジスティック回帰分析はＲのｇｌｍ（）、ＲＯＣ解析はＲパッケージのｐＲＯＣを利用した。
【表６】
2020040210.tif 000009
【００９１】
２．結果
ＩＧＨＶ７４種、ＩＧＨＤ３２種、ＩＧＨＪ６種、ＩＧＨＣ５種、多様性指数４種、細胞亜集団データ１５種の計１３６種の変数から、有意水準Ｐ＜０．０５を満たす変数としてＩＧＨ遺伝子８種、細胞亜集団変数２種の計８種が抽出された（表７）。０．０５≦Ｐ＜０．１を満たす変数は、ＩＧＨ遺伝子１０種、細胞亜集団頻度データ４種であった。０．１≦Ｐ＜０．２を満たす変数は、ＩＧＨ遺伝子１６種、多様性指数３種、細胞亜集団変数２種であった。有意水準Ｐ＜０．２を満たす変数については、単独でＭＥ／ＣＦＳ疾患の予測に有効であることが示唆される。とりわけ、有意水準Ｐ＜０．０５を満たす変数は単独でもＭＥ／ＣＦＳ疾患の予測に非常に有効であると示唆される（表８）。有意水準Ｐ＜０．２を満たす変数は、多変数ロジスティック回帰分析による分析に用いた。【００９２】
なお、いくつかの変数単独について、ＲＯＣ解析を行ったところそれぞれ、IGHV3-49:0.764、IGHV3-30-3:0.759、IGHD1-26:0.731、IGHJ6:0.672、IGHV3-30:0.693、IGHV1-3:0.659、B  cell:0.771、Treg:0.817、Shannon:0.617、Inverse:0.636のＡＵＣ値が得られている。
【表７】
2020040210.tif 000010
【表８】
2020040210.tif 000011
【００９３】
［実施例４］
２種のＩＧＨ遺伝子を用いたＭＥ／ＣＦＳ疾患の予測鑑別
１．方法
ＩＧＨＶ７４種、ＩＧＨＤ３２種、ＩＧＨＪ６種およびＩＧＨＣ５種の計１１７種のＩＧＨ遺伝子から任意の２種のＩＧＨ遺伝子の組み合わせについて、多変量ロジスティック回帰分析を実施し、各回帰式の従属変数の予測値を用いてＲＯＣ曲線を作成した。それらＲＯＣ曲線についてＭＥ／ＣＦＳ疾患の予測性能を示すＡＵＣ値を算出し、ＡＵＣ値が０．７あるいは０．８以上を示したＩＧＨ遺伝子の組み合わせ、およびそれら組み合わせに使用されたＩＧＨ遺伝子リストを抽出した。ロジスティック回帰分析はＲのｇｌｍ（）、ＲＯＣ解析はＲパッケージのｐＲＯＣを利用した。【００９４】
２．結果
２種の任意のＩＧＨ遺伝子を用いたＲＯＣ解析にて、ＡＵＣ値が０．８、０．７以上を示したＩＧＨ遺伝子の組み合わせはそれぞれ３０組、６３７組であった。2変数ロジスティック回帰およびROC解析によりAUC≧0.7を示す変数の組み合わせについて、表１１に示す。また、それら組み合わせに使用されたＩＧＨ遺伝子は、ＡＵＣ値が０．８以上のものは２６遺伝子、０．７以上は１１７遺伝子であった（表９）。また、ＡＵＣ値が０．８以上を示す３０組の遺伝子組み合わせのうち１０組（３３％）は単回帰分析で有意性が示された変数同士の組み合わせであり、２０組（６７％）は片方が単回帰分析で有意性が示されたＩＧＨであった（表１０）。これらの結果は、ＩＧＨ遺伝子を任意に組み合わせることでＭＥ／ＣＦＳ患者の予測鑑別が可能であることを示している。
【表９】
2020040210.tif 000012
【表１０】
2020040210.tif 000013
【表１１−１】
2020040210.tif 000014
【表１１−２】
2020040210.tif 000015
【表１１−３】
2020040210.tif 000016
【表１１−４】
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【表１１−５】
2020040210.tif 000018
【表１１−６】
2020040210.tif 000019
【表１１−７】
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【表１１−８】
2020040210.tif 000021
【表１１−９】
2020040210.tif 000022
【表１１−１０】
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【表１１−１１】
2020040210.tif 000024
【００９５】
［実施例５］
複数のＩＧＨ遺伝子を用いた多変量ロジスティック回帰分析
１．方法
ＩＧＨＶ７４種、ＩＧＨＤ３２種、ＩＧＨＪ６種およびＩＧＨＣ５種の計１１７種のＩＧＨ遺伝子から任意の２種以上のＩＧＨ遺伝子の組み合わせについて、多変量ロジスティック回帰分析を総当たりで実施した。得られた回帰式の従属変数の予測値を用いてＲＯＣ曲線を作成し、ＡＵＣ値を算出した。単回帰およびロジスティック回帰分析はＲのｇｌｍ（）、ＲＯＣ解析はＲパッケージのｐＲＯＣを利用した。【００９６】
２．結果
１１７種のＩＧＨから任意の２変数を用いた多変量ロジスティック回帰分析およびＲＯＣ分析では、ＡＵＣ値が０．８以上を示したものは６，７８６組の組み合わせ総数のうち３０組（０．４４％）であった（表１２）。この組み合わせに使用されたＩＧＨ遺伝子は２６遺伝子であった（表１３）。任意の３変数を用いた場合、ＡＵＣ値が０．８以上を示したものは２６０，１３０組のうち４，４６９組（１．７％）、０．８５以上は３４９組（０．１３％）、０．９以上は４組（０．００１５％）であった（表１２）。また、これら組み合わせに使用されたＩＧＨ遺伝子はそれぞれ１１７遺伝子（１００％）、１０２遺伝子（８７％）、および６遺伝子（５．１％）であった（表１３）。４変数を使用した場合は、ＡＵＣ値０．９以上のものは３，２６４組（０．０４４％）、０．８５以上は９９，４５８組（１．４％）、０．８以上は４８９，５２９組（６．６％）に上った。４変数を使った場合、ＡＵＣ０．８以上を示す組み合わせに１１７遺伝子すべてが少なくとも一つ使用されていた。ＭＥ／ＣＦＳ疾患の予測鑑別に活用可能なＩＧＨ遺伝子は表１４に示した。高い予測性能を示すと考えられるＡＵＣ値０．９以上の遺伝子の組み合わせについては表１５および表１６に示した。
【表１２】
2020040210.tif 000025
【表１３】
2020040210.tif 000026
【表１４−１】
2020040210.tif 000027
【表１４−２】
2020040210.tif 000028
【表１５】
2020040210.tif 000029
【表１６−１】
2020040210.tif 000030
【表１６−２】
2020040210.tif 000031
【表１６−３】
2020040210.tif 000032
【００９７】
［実施例６］
変数の組合せによる多変量ロジスティック回帰分析
１．方法
単回帰分析により有意水準Ｐ＜０．２を満たす４６種の変数（ＩＧＨ３５種、細胞亜集団８種および多様性指数３種）を用いて、２変数、３変数および４変数の組み合わせによる多変量ロジスティック回帰分析を実施した。得られた回帰式の従属変数の予測値を用いてＲＯＣ曲線を作成し、ＡＵＣ値を算出した。単回帰およびロジスティック回帰分析はＲのｇｌｍ（）、ＲＯＣ解析はＲパッケージのｐＲＯＣを利用した。【００９８】
２．結果
選抜された４６種の変数から任意の２変数を用いた多変量ロジスティック回帰分析およびＲＯＣ分析によりＡＵＣ値が０．８以上のものは１０２組（９．９％）、０．７以上０．８未満のものは３８２組（３６．９％）であった（表１７）。また、３変数を使った場合、ＡＵＣ値が０．９以上のものは８５組（０．６％）、０．８以上０．９未満は３４７２組（２２．９％）、０．７以上０．８未満のものは８８２６組（５８．１％）であった。４変数を使った場合、ＡＵＣ値が０．９以上のものは５３３０組（３．３％）、０．８以上０．９未満は６３９８１組（３９．２％）、０．７以上０．８未満のものは８７２９１組（５３．５％）であった。多くの変数を組み合わせることで、ＭＥ／ＣＦＳ疾患の予測性能が向上すると考えられる。２変数でＡＵＣ値０．８以上を示した組み合わせを表１８に、３変数でＡＵＣ値０．９以上の組み合わせを表１９に示した。Ｔｒｅｇとの組み合わせが上位を占め、変数にＴｒｅｇを用いることでより予測性能が高くなると推測された。
【表１７】
2020040210.tif 000033
【表１８−１】
2020040210.tif 000034
【表１８−２】
2020040210.tif 000035
【表１８−３】
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【表１８−４】
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【表１９−１】
2020040210.tif 000038
【表１９−２】
2020040210.tif 000039
【表１９−３】
2020040210.tif 000040
【００９９】
なお、細胞亜集団変数同士の組合せでは、AUC最高値は0.87(Treg、Tfh17)であったが、細胞亜集団変数とIGH遺伝子とを組み合わせた場合、Treg+IGHV1-3、Treg+IGHV3-23、Treg+IGHGPにおいて、0.87を上回るAUC値が得られた。また、Ｂ細胞量について、Tregとの組み合わせた場合の最大値AUC=0.84よりも、IGHV3-49、IGHV3-30-3、IGHD1-26と組み合わせた場合に高いＡＵＣ値が得られた。細胞亜集団変数に特定のIGH遺伝子を加えて用いることで、細胞亜集団変数同士の組合せによって得られるものよりも高い予測性能を得ることが可能である。【０１００】
［実施例７］
ME/CFS疾患患者と他の疾患患者からの鑑別
１．方法
実施例１で実施した３７例の筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ME/CFS）疾患患者試料に加え、新たに１０例の多発性硬化症（ＭＳ）患者から全血を採取した。実施例１の１．材料と方法に記載の方法に従ってＰＢＭＣの分離とＲＮＡの抽出を行った。次いで、相補鎖ＤＮＡおよび二本鎖相補的ＤＮＡの合成、ＰＣＲおよび次世代シーケンス解析を行った後に、レパトア解析ソフトウェアによって解析を行った。各サンプルのリードデータからＩＧＨ遺伝子Ｖ領域配列（ＩＧＨＶ）、Ｄ領域配列（ＩＧＨＤ）、Ｊ領域配列（ＩＧＨＪ）およびＣ領域配列（ＩＧＨＣ）の照合とＣＤＲ３配列を決定した。各サンプルのユニークリード数の集計とＩＧＨＶの７４種、ＩＧＨＤの３２種、ＩＧＨＪの６種およびＩＧＨＣの５種について使用頻度を算出した。リードデータ、ＩＧＨＶ、ＩＧＨＤ、ＩＧＨＪおよびＩＧＨＣ使用頻度について、ＭＥ／ＣＦＳとＭＳ群間でＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｅｎｅｙ法で有意差検定を行った。ＭＥ／ＣＦＳ患者とＭＳ患者の使用頻度データを用いて、単回帰およびロジスティック回帰分析はＲのｇｌｍ、ＲＯＣ解析はＲパッケージのｐＲＯＣを利用した。ＲＯＣ解析は回帰式の従属変数の予測値を用いて受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を作出した。これら変数の予測判定の性能評価値としてＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）値を求めた。【０１０１】
２．結果
２−１．ＭＥ／ＣＦＳ患者とＭＳ患者間のＩＧＨ遺伝子使用頻度の差異
１０例のＭＳ患者試料より１４万〜２８万リードのシーケンスデータを獲得した（表２０）。全リード数、アサインリード、in-frameリード数およびユニークリード数はＭＥ／ＣＦＳ患者とＭＳ患者間で有意な差は見られなかった。その結果、ＩＧＨＶ３−７＊＊、ＩＧＨＶ３−３３＊、ＩＧＨＶ３−７３＊、ＩＧＨＶ３−ＮＬ１＊、ＩＧＨＶ４−２８＊、ＩＧＨＶ４−３９＊、ＩＧＨＤ４−１７＊、ＩＧＨＤ５−５＊、およびＩＧＨＤ５−１８＊においてＭＥ／ＣＦＳ患者に比べＭＳ患者の方が、ＩＧＨ遺伝子使用頻度が有意に高かった（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。他方、ＩＧＨＶ３−２３＊＊およびＩＧＨＶ３−２３Ｄ＊では、ＭＥ／ＣＦＳ患者に比べＭＳ患者の方が有意に低い使用頻度を示した（図９）。同様に、ＩＧＨ遺伝子以外の変数である多様性指数（Ｓｈａｎｎｏｎ指数、逆Ｓｉｍｐｓｏｎ指数、Ｐｉｅｌｏｕ‘ｓ指数、ＤＥ50指数）について、ＭＥ／ＣＦＳ患者とＭＳ患者間で差があるかどうかを調べた（図１０）。いずれの多様性指数もＭＥ／ＣＦＳ患者とＭＳ患者間で有意な差は見られなかった。これらの結果から、多様性指数はＭＥ／ＣＦＳ患者とＭＳ患者との鑑別には有用ではない一方で、ＩＧＨ遺伝子の使用頻度は疾患特異性を反映しており、鑑別に有効であることが示された。
【表２０】
2020040210.tif 000041
【０１０２】
２−２．多変量ロジスティック解析を用いたＭＥ／ＣＦＳ患者とＭＳ患者間の鑑別
次に、ＭＥ／ＣＦＳ患者とＭＳ患者で有意な差が検出された上記１１種のＩＧＨ遺伝子について、ＭＥ／ＣＦＳ患者とＭＳ患者を鑑別できるかどうかを、多変量ロジスティック解析を用いて検証した。１１種のＩＧＨ遺伝子のうち任意の２種のＩＧＨ遺伝子、あるいは任意の３種のＩＧＨ遺伝子の使用頻度を利用してロジスティック回帰分析を行い、ＡＵＣ値を算出した。ＡＵＣ高値の組み合わせを予測性能が優れたＩＧＨ遺伝子の組み合わせとして列記した（表２１および表２２）。
【表２１】
2020040210.tif 000042
【表２２】
2020040210.tif 000043
健常人とＭＥ／ＣＦＳ患者を鑑別できることが示されたＩＧＨ遺伝子の任意の２変数および３変数を用いて、ＭＥ／ＣＦＳ患者とＭＳ患者を鑑別できるかどうかを多変数ロジスティック解析にて調べた（表２３〜表３０）。その結果、高い多変量ロジスティックモデル性能を示すＡＵＣ高値の組み合わせが多数獲得され、ＭＥ／ＣＦＳ患者とＭＳ患者を高い特異性と感度で予測できることが分かった。健常人とＭＥ／ＣＦＳ患者間でｐ＜０．２の有意差を示した３５種のＩＧＨ遺伝子の任意の２変数を使った場合、４８の組み合わせがＡＵＣ≧０．８を示し、任意の３変数を使った場合は２１の組み合わせがＡＵＣ≧０．９を示した。また、健常人とＭＥ／ＣＦＳ患者間でｐ＜０．１の有意差を示した１８種のＩＧＨ遺伝子の任意の２変数および３変数を使った場合は、それぞれ１７の組み合わせ（ＡＵＣ≧０．８）および２１の組み合わせ（ＡＵＣ≧０．８７５）が高値を示した。健常人とＭＥ／ＣＦＳ患者間でｐ＜０．０５の有意差を示した８種のＩＧＨ遺伝子の任意の２変数および３変数を使った場合は、それぞれ７の組み合わせ（ＡＵＣ≧０．８）および２２の組み合わせ（ＡＵＣ≧０．８）が高値を示した。実施例３−１において試験された６種のＩＧＨ遺伝子の任意の２変数および３変数を使った場合は、それぞれ１の組み合わせ（ＡＵＣ≧０．７）および１１の組み合わせ（ＡＵＣ≧０．７）が高値を示した。以上の結果から、単独、あるいは複数のＩＧＨ遺伝子使用頻度を用いることでＭＥ／ＣＦＳ患者とＭＳ患者を高精度に鑑別できることが明らかになった。
【表２３−１】
2020040210.tif 000044
【表２３−２】
2020040210.tif 000045
【表２４】
2020040210.tif 000046
【表２５】
2020040210.tif 000047
【表２６】
2020040210.tif 000048
【表２７】
2020040210.tif 000049
【表２８】
2020040210.tif 000050
【表２９】
2020040210.tif 000051
【表３０】
2020040210.tif 000052
【０１０３】
２−３．任意のＩＧＨ遺伝子を用いた多変量ロジスティック解析によるＭＥ／ＣＦＳ患者とＭＳ患者間の鑑別
ＩＧＨＶ７４種、ＩＧＨＤ３２種、ＩＧＨＪ６種、ＩＧＨＣ５種の計１１７種のＩＧＨ遺伝子から任意の２種のＩＧＨの組み合わせ（組み合わせ総数６７８６組）を用いて、多項ロジスティック解析を実施し、高い予測性能を示すＡＵＣ高値のものを選抜した（表３１）。ＡＵＣ≧０．９、ＡＵＣ≧０．８およびＡＵＣ≧０．７を示した組み合わせは、それぞれ４組、２５２組および１８７９組であった。ＩＧＨＤ３−３およびＩＧＨＧＰの２変数は最もＡＵＣが高く、０．９２を示した。次に、１１７種のＩＧＨ遺伝子から任意の３種のＩＧＨの組み合わせ（組み合わせ総数２６０１３０組）を用いて、多項ロジスティック解析を実施し、高い予測性能を示すＡＵＣ高値のものを選抜した（表３２）。
【表３１−１】
2020040210.tif 000053
【表３１−２】
2020040210.tif 000054
【表３２−１】
2020040210.tif 000055
【表３２−２】
2020040210.tif 000056
【０１０４】
２−４．ＭＥ／ＣＦＳ患者と非ＭＥ／ＣＦＳ患者の比較
ＭＥ／ＣＦＳ患者を非ＭＥ／ＣＦＳ患者から鑑別するＩＧＨ遺伝子を調べる目的で、健常人２３例に１０例のＭＳ患者を加え非ＭＥ／ＣＦＳ群とし、３７例のＭＥ／ＣＦＳ患者群とＩＧＨ遺伝子の指標頻度を比較した。2群間のＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定から、ＩＧＨＶ３−４９（Ｐ＝０．００１３）、ＩＧＨＶ３−３０−３（Ｐ＝０．００２２）、ＩＧＨＤ１−２６（Ｐ＝０．００５３）、ＩＧＨＶ４−３４（Ｐ＝０．０１１８）、ＩＧＨＶ３−３０（Ｐ＝０．１８６）、ＩＧＨＶ４−３１（Ｐ＝０．０２０５）、ＩＧＨＶ３−６４（Ｐ＝０．０２８６）、ＩＧＨＪ６（Ｐ＝０．０３０４）、およびＩＧＨＤ５−１０−１（Ｐ＝０．０３７３）の９種において、ＭＥ／ＣＦＳ患者が非ＭＥ／ＣＦＳ患者に比べ高いことが明らかになった。一方、ＩＧＨＧＰ（Ｐ＝０．００６１）、ＩＧＨＤ３−２２（Ｐ＝０．０３１３）、ＩＧＨＶ３−３３（Ｐ＝０．０３３２）、およびＩＧＨＶ３−７３（Ｐ＝０．０３３２）では有意に非ＭＥ／ＣＦＳ患者群が高かった（表３３、図１１）。
【表３３】
2020040210.tif 000057
【０１０５】
２−５．任意のＩＧＨ遺伝子を用いた多変量ロジスティック解析によるＭＥ／ＣＦＳ患者と非ＭＥ／ＣＦＳ患者間の鑑別
ＩＧＨＶ７４種、ＩＧＨＤ３２種、ＩＧＨＪ６種、ＩＧＨＣ５種の計１１７種のＩＧＨ遺伝子から任意のＩＧＨの２変数（組み合わせ総数６７８６組）を用いて多項ロジスティック回帰分析を行い、ＭＥ／ＣＦＳ患者と非ＭＥ／ＣＦＳ患者間の鑑別に高い予測性能を示すＡＵＣ高値のものを選抜した（表３４）。また、３変数（組み合わせ総数２６０１３０組）を用いた場合のＡＵＣ高値を示すＩＧＨも同様に選抜した（表３５）。任意の２変数では、ＡＵＣ≧０．８およびＡＵＣ≧０．７を示した組み合わせは、それぞれ５組および４６９組であった。任意の３変数を用いた場合は、ＡＵＣ≧０．８５およびＡＵＣ≧０．８を示した組み合わせは、それぞれ３７組および１１６４組であった。２変数では、ＩＧＨＧＰおよびＩＧＨ３−３０−３の組み合わせがＡＵＣ＝０．８２０と最も高く、任意の３変数では、ＩＧＨＧＰ、ＩＧＨＶ３−３０およびＩＧＨＶ３−４９の組み合わせが最も高くＡＵＣ＝０．８８９であった。
【表３４−１】
2020040210.tif 000058
【表３４−２】
2020040210.tif 000059
【表３５−１】
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【表３５−２】
2020040210.tif 000061
【０１０６】
３．ＭＥ／ＣＦＳ鑑別診断のための予測判別モデル
診断時において、ＢＣＲレパトア解析から得られるＩＧＨ遺伝子の使用頻度データを用いてＭＥ／ＣＦＳ患者を鑑別するための予測モデル式を作出した。２群間の有意差検定あるいは多項ロジスティック解析におけるＡＵＣ高値のＩＧＨ遺伝子の組み合わせを用いて、ロジスティック回帰式による判別モデルを作成した。鑑別診断の例を以下に示す。【０１０７】
変数の組み合わせは、例えば、以下のように特定され得る。
（１）健常人とＭＥ／ＣＦＳ患者を比較し、有意な差が検出された変数（例えば、ＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における遺伝子の使用頻度）を選択する；または
（２）１つの変数（例えば、ＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における１つの遺伝子）を独立変数として単変量ロジスティック解析を、または２つ以上の変数（例えば、２つ以上の遺伝子）を独立変数として多変量ロジスティック解析を実施し、ロジスティック回帰モデル式を得る。この回帰モデルの適合度を測るＲＯＣ解析を実施してより高いＡＵＣ値を示した変数を選択する。【０１０８】
変数の組み合わせが提供された場合、各変数（例えば、遺伝子の頻度データ）（x1, x2, x3,…）に対して、ME/CFS患者である（y=1)、あるいは健常人である（y=0）ことを目的変数として単変量あるいは多変量ロジスティック回帰分析を行う。（２）の場合は、複数の変数を使って総当たりでロジスティック解析を行う。【０１０９】
ロジスティック回帰分析には、Ｒパッケージの一般化線形モデル用の関数であるｇｌｍを利用できるが、分析はこのパッケージに限定されない。ロジスティック回帰分析では、ME/CFSである確率をπとして以下のロジットモデル式が得られ、同時にb0の定数およびb1〜bpに相当する偏回帰係数が求められる。すなわち、患者／健常人区分と変数（遺伝子頻度など）のデータセットを使用して、ロジットモデル式の係数を定めることができる。
【数１】
2020040210.tif 000062
【０１１０】
ME/CFSである確率πは定数および偏回帰係数が定まれば、以下の式で求めることができる。新たに頻度データが得られた場合にその値を入力することで判別予測することができる（0.5以上をME/CFSとして判別予測する等）。
【数２】
2020040210.tif 000063
【０１１１】
２ステップでは、ME/CFSと健常人を区別する判別式でME/CFSを予測し、さらにME/CFSとMSを区別する判別式でMS患者を除外するような予測方法が可能である。基本的には上記と同じロジットモデル式に頻度データを入力することでその確率を予測できる。【０１１２】
３−１．１ステップ予測モデル
ＭＥ／ＣＦＳと非ＭＥ／ＣＦＳ（健常人およびＭＳ患者）を１つの判別式により予測する。下記のいずれかの例、または他の予測変数の組み合わせにより１ステップで判別する。
【数３】
2020040210.tif 000064
【０１１３】
３−２．２ステップ予測モデル
ＭＥ／ＣＦＳを健常人より判別式１により判別し、次にＭＳなどの他の疾患患者を判別式２により除外することでＭＥ／ＣＦＳ患者を予測する。下記のいずれかの例、または他の予測変数の組み合わせにより２ステップで判別する。
１）ME/CFS患者と健常人の判別（判別式１）
【数４】
2020040210.tif 000065
２）ME/CFS患者からの他疾患（MS患者）の除外判別（判別式２）
【数５】
2020040210.tif 000066
【０１１４】
（注記）
以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、本開示は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。【０１１５】
（関連出願）
本出願は、２０１８年８月２２日に出願された特願２０１８−１５５３８０号および２０１９年３月１２日に出願された特願２０１９−４４８８５号の優先権を主張する。これら出願の内容は、その全体が全ての目的のために本明細書において参考として援用される。
【産業上の利用可能性】
【０１１６】
本開示は、筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）の診断・診断薬において利用可能である。
【配列表フリーテキスト】
【０１１７】
配列番号１：BSL18Eプライマー
配列番号２：P20EAプライマー
配列番号３：P10EAプライマー
配列番号４：CG1プライマー
配列番号５：CG2プライマー
配列番号６：P22EA-ST1-Rプライマー
配列番号７：CG-ST1-Rプライマー
【図１】
2020040210.tif 000067
【図２】
2020040210.tif 000068
【図３Ａ】
2020040210.tif 000069
【図３Ｂ】
2020040210.tif 000070
【図４】
2020040210.tif 000071
【図５】
2020040210.tif 000072
【図６】
2020040210.tif 000073
【図７】
2020040210.tif 000074
【図８】
2020040210.tif 000075
【図９】
2020040210.tif 000076
【図１０】
2020040210.tif 000077
【図１１】
2020040210.tif 000078
【配列表】
2020040210000001.app
【国際調査報告】
2020040210.tif 000079
2020040210.tif 000080
2020040210.tif 000081
2020040210.tif 000082