(57)【要約】  本発明は硬膜を除去する外科手術を施術せずにセマフォリン阻害剤を施用するための製剤を提供することを課題とした。  セマフォリン阻害剤を含む、硬膜外投与により脊髄損傷又は脳損傷を治療するためのシート製剤が提供される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
セマフォリン阻害剤を含む、硬膜外投与により脊髄損傷又は脳損傷を治療するためのシート製剤。  
【請求項２】
基材としてシリコーンを含む、請求項１に記載のシート製剤。
【請求項３】
水溶性添加剤をさらに含む、請求項１又は２に記載のシート製剤。
【請求項４】
水溶性添加剤として１種又は２種以上のアミノ酸を含む、請求項３に記載のシート製剤。
【請求項５】
１種又は２種以上のアミノ酸がアラニン又はロイシンである、請求項４に記載のシート製剤。
【請求項６】
セマフォリン阻害剤がセマフォリン３Ａ阻害剤である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のシート製剤。
【請求項７】
セマフォリン阻害剤が式（１）で表される化合物Ａである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のシート製剤。
【化１】
2020122101.tif 000014
【請求項８】
式（１）で表される化合物Ａを含有するシート製剤。
【化２】
2020122101.tif 000015
【請求項９】
基材としてシリコーンを含む、請求項８に記載のシート製剤。
【請求項１０】
水溶性添加剤をさらに含む、請求項８又は９に記載のシート製剤。
【請求項１１】
水溶性添加剤として１種又は２種以上のアミノ酸を含む、請求項１０に記載のシート製剤。
【請求項１２】
１種又は２種以上のアミノ酸がアラニン又はロイシンである、請求項１１に記載のシート製剤。
【請求項１３】
治療が必要な患者に、治療上の有効量の請求項８〜１２のいずれか一項に記載のシート製剤を硬膜外に投与することを特徴とする、脊髄損傷又は脳損傷を治療するための方法。
【請求項１４】
硬膜外に投与する脊髄損傷又は脳損傷の治療剤を製造するための、請求項８〜１２のいずれか一項に記載のシート製剤の使用。
【請求項１５】
請求項８〜１２のいずれか一項に記載のシート製剤を含有し、硬膜外に投与することを特徴とする、脊髄損傷又は脳損傷の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はセマフォリン阻害剤における新規なシート製剤及び該シート製剤を用いる新規投与方法に関する。また本発明は、セマフォリン阻害剤の新規投与方法に適したシート製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
セマフォリンはこれまで約20種類ほど見出されているが、クラス3型と呼ばれるサブファミリーの遺伝子群は神経円錐の成長を抑制する機能などを有し、特に研究が進んでいる。クラス3型のセマフォリン（Sema3A）は、10pMという低濃度で、神経細胞を退縮させることが知られ、Sema3Aを阻害する低分子化合物がセマフォリン阻害剤として知られている。例えばセマフォリン阻害剤の１つである式（１）で表される化合物Ａは、損傷部での神経の再生を促し、用途の例として脊髄損傷の改善が想定されている（特許文献１及び特許文献２）。
【化１】
2020122101.tif 000003
【０００３】
一方、セマフォリン阻害剤の投与方法は病床部位に局所的に投与する方法が好ましいことが知られている。そのためセマフォリン阻害剤を脊髄損傷治療剤として用いる場合、硬膜を除去する外科手術が必要である。
硬膜は、脳又は脊髄を覆う３層の髄膜のうち一番外に存在する膜である。硬膜は、多量の膠原線維を含む強靭な膜であり、硬膜を透過させて薬剤を投与することは、一般的に困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開２００２／００９７５６号公報
【特許文献２】国際公開２０１２／０１８０６９号公報
【特許文献３】特開昭６２−１７４００７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のとおり、そのためセマフォリン阻害剤を脊髄損傷の治療剤として用いる場合、硬膜を除去する外科手術が必要であるところ、硬膜を除去する外科手術は対象における身体的な負担が大きい。一方、硬膜を除去する外科手術を施術せずにセマフォリン阻害剤を施用する手段は、これまで存在しない。
上記現況に鑑み、本発明は硬膜を除去する外科手術を施術せずにセマフォリン阻害剤を施用するための製剤を提供することを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討を行った結果、ある種の製剤を用いることにより、外科的に硬膜を取り除くことなくセマフォリン阻害剤を施用できることを見出し、さらに研究を進めた結果本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、少なくとも以下の各発明に関する：
[１]セマフォリン阻害剤を含む、硬膜外投与により脊髄損傷又は脳損傷を治療するためのシート製剤。  
[２]基材としてシリコーンを含む上記［１］のシート製剤。
[３]水溶性添加剤をさらに含む上記[１]又は[２]のシート製剤。
[４]水溶性添加剤が１種又は２種以上のアミノ酸を含む上記[３]のシート製剤。
[５]アミノ酸がアラニン又はロイシンである上記[４]のシート製剤。
[６]セマフォリン阻害剤がセマフォリン３Ａ阻害剤である上記[１]〜 [５]のいずれか１項のシート製剤。
[７]セマフォリン阻害剤が式（１）で表される化合物Ａである上記[１]〜 [５]のいずれか１項のシート製剤。
【化２】
2020122101.tif 000004
[８]式（１）で表される化合物Ａを含有するシート製剤。
【化３】
2020122101.tif 000005
[９]基材としてシリコーンを含む、[８]に記載のシート製剤。
[１０]水溶性添加剤をさらに含む、[８]又は[９]に記載のシート製剤。
[１１]水溶性添加剤として１種又は２種以上のアミノ酸を含む、[１０]に記載のシート製剤。
[１２]１種又は２種以上のアミノ酸がアラニン又はロイシンである、[１１]に記載のシート製剤。
[１３]治療が必要な患者に、治療上の有効量の上記[８]〜 [１２]のいずれか一項に記載のシート製剤を硬膜外に投与することを特徴とする、脊髄損傷又は脳損傷を治療するための方法。
[１４]硬膜外に投与する脊髄損傷又は脳損傷の治療剤を製造するための、上記[８]〜 [１２]のいずれか一項に記載のシート製剤の使用。
[１５]上記[８]〜 [１２]のいずれか一項に記載のシート製剤を含有し、硬膜外に投与することを特徴とする、脊髄損傷又は脳損傷の治療剤。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のシート製剤によれば、外科的に硬膜を取り除くことなく、脊髄損傷又は脳損傷の患部及び／又はその近傍に施用することにより、セマフォリン阻害剤を患部に到達させることが可能になる。したがって本発明によれば、セマフォリン阻害剤を投与する際の患者の身体的負担が大幅に軽減されるという効果が奏される。
本発明のシート製剤のうち基材としてシリコーンを含むシート製剤によれば、セマフォリン阻害剤の患部への送達を一層効率的に行うことができる。
本発明のシート製剤のうち水溶性添加剤、とくに１種又は２種以上のアミノ酸、を含むシート製剤によれば、セマフォリン阻害剤の患部への送達をより一層効率的に行うことができる。上記１種又は２種以上のアミノ酸がアラニン又はロイシンである本発明のシート製剤は、セマフォリン阻害剤の患部への送達の効率がとくに優れている。【０００８】
本発明の有効成分であるセマフォリン阻害剤のような水溶性の化合物では疎水性高分子担体にほとんど溶解せず、自律的に拡散・放出され得ないことから、脂溶性薬物とは全く異なる放出機構が一般に必要である。
水溶性薬物を疎水性高分子担体から放出させる一般的な手法としては、リザーバー型製剤で細孔から放出させるものが挙げられる。他にも、担体中に薬物が分散したタイプもあり、ここではまず初めに表面に存在する薬物粒子が周囲の組織中の水分により溶け出し、次いでこれに接する薬物粒子が溶け出す、といった現象の繰り返しにより連続した水のチャンネルを形成し、チャンネル内を拡散させることにより薬物を放出させている。このとき、製剤内部で生じる浸透圧の差によりクラッキングが生じることによってもチャンネル形成が促進され、さらに膨潤による押出し効果によって放出が促進される。このため、放出を持続させるには担体中の粒子が近接していることや製剤内部で浸透圧の差を発生させることが必要であり、一定量以上の水溶性薬物又は水溶性の添加剤を含有させる必要があることを特徴とする。このような例として、アルブミンの添加によりシリコーンからの薬物放出を制御する方法が報告されている（特許文献３）。
しかし、このような水溶性薬物の放出機構による放出制御は極めて難しく、一般的に初期放出速度が著しく大きいバースト的放出を生じ、その後は経時的に放出量が低下する一次放出のプロファイルとなることから、長期間の安定した持続放出は困難である。【０００９】
これに対して、本発明のシート製剤のうち基材としてシリコーンを含み、水溶性添加剤、とくに１種又は２種以上のアミノ酸、をさらに含むシート製剤によれば、セマフォリン阻害剤の患部への送達をより一層効率的に行うことができる。上記１種又は２種以上のアミノ酸がアラニン又はロイシンである本発明のシート製剤は、セマフォリン阻害剤の患部への送達の効率がとくに優れているといった効果を奏する。
また、上記１種又は２種以上のアミノ酸をさらに含む本発明のシート製剤においては柔軟性が担保されるため患部又はその近傍への追従性に優れ、もって患部又はその近傍への密着度も高められるといった効果も奏される。かかる効果は上記１種又は２種以上のアミノ酸がアラニン又はロイシンである本発明のシート製剤において一層顕著に奏される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、製剤例１（本発明のシート製剤の例である試験製剤１−１）を用いた薬物放出試験の結果を示す（試験例１）。グラフの縦軸は化合物Ａの累積放出率を、横軸は試験開始後の経過時間を、それぞれ表す。
【図２】図２は、製剤例２（本発明のシート製剤の例である試験製剤２−１）を用いた薬物放出試験の結果を示す（試験例２）。グラフの縦軸は化合物Ａの累積放出率を、横軸は試験開始後の経過時間を、それぞれ表す。
【図３】図３は、製剤例２（本発明のシート製剤の例である試験製剤２−２）及び製剤例３（比較例：試験製剤３−２）を用いたラット脊髄損傷モデルを用いたBBBスコア評価の結果を示す（実施例１）。グラフの縦軸は化合物Ａの累積放出率を、横軸は試験開始後の経過時間を、それぞれ表す。
【図４】図４は、製剤例２（本発明のシート製剤の例である試験製剤２−３）を用いたラット脊髄硬膜外留置による薬物の脊髄移行評価試験の結果を示す（実施例２）。
【図５】図５は、製剤例１（本発明のシート製剤の例である試験製剤１−２）を用いたフランツセルを用いたイヌ及びブタ脳硬膜透過性評価試験の結果を示す（実施例３）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、セマフォリン阻害剤を含む、硬膜外投与により脊髄損傷又は脳損傷を治療するためのシート製剤にかかるものである。
セマフォリン阻害剤を含有したシート製剤を硬膜の外側に密着させることで、細胞を用いたＩｎ  ｖｉｔｒｏ試験においてセマフォリン３Ａによる神経伸長阻害作用を十分に抑制できるレベルまで脊髄中のセマフォリン阻害剤、とくに化合物Ａの濃度を高めることができ、マウスを用いたＩｎ  ｖｉｖｏ試験において薬理効果を、本発明者らは確認した。
また、本発明者らは、硬膜内に投与した製剤と同等の薬理効果が、本発明のシート製剤を用いることにより得られることを見出した。
さらに、本発明のシート製剤を用いた際には血中にセマフォリン阻害剤はほとんど移行しておらず、セマフォリン阻害剤が局所的に投薬されていることも、発明者らは確認した。さらにまた、本発明者らはセマフォリン阻害剤を長期的かつ効率的に放出可能なシート製剤を見出している。
本発明は、これらの新たな知見に基づくものである。
なお、脊髄損傷又は脳損傷のためにセマフォリン阻害剤を適用するための剤型として、シート製剤が用いられることは、これまで試されることさえなかった。
【００１２】
●本発明のシート製剤の構成
本発明のシート製剤は、有効成分としてセマフォリン阻害剤を含有し、任意にセマフォリン阻害剤以外の薬学的に許容される成分が、セマフォリン阻害剤とともに基材に担持された構成を有し、硬膜外投与により脊髄損傷又は脳損傷の治療に供しえるものであれば、その構成はとくに限定されない。
セマフォリン阻害剤はとくに限定されず、特開２０１６−０３７４７２に記載の各種化合物や化合物Ａが例示される。本発明のシート製剤におけるセマフォリン阻害剤として、化合物Ａは好ましい。化合物Ａは下記の構造を有する：
【化４】
2020122101.tif 000006
【００１３】
化合物Ａはペニシリウム・エスピー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）ＳＰＦ−３０５９株の培養、化学的な全合成、又は本培養もしくは全合成によって得られた物を原料に用いた公知の合成方法による化学的な変換によって得ることができる。
培養としては、大阪府内土壌より分離したペニシリウム属に属するカビＳＰＦ−３０５９株［本菌株は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に基づき、２００１年７月１３日に経済産業省独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６６３として寄託されている。］を培養することにより効果的に得ることができる。具体的には、国際公開第０２／０９７５６号パンフレット（特許文献１）又は国際公開第０３／０６２２４３号パンフレットに記載された方法に従って、当該化合物を得ることができる。
全合成としては、特開２００８−１３５３０号公報に記載された方法に従って化合物Ａを得ることができる。
【００１４】
本発明のシート製剤における基材は限定されないところ、該基材の成分として生体適合性の疎水性高分子が例示される。疎水性高分子は生体内非分解性のものと生体内分解性のものに大別されるところ本発明のシート製剤においてはいずれを用いてもよく、以下に例を示すが、これに限定されるものではない。すなわち、生体内非分解性高分子の例としては、シリコーン、ポリウレタンが挙げられ、生体内分解性高分子の例としてはポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン及びこれらの共重合体が挙げられる。
【００１５】
これらの疎水性高分子のうち、シリコーンは好ましい。シリコーンを基材の成分として含む本発明のシート製剤は、セマフォリン阻害剤の患部への送達を一層効率的に、及び／又は徐放的に行うことができるため好ましい。理論に拘泥するものではないが、シリコーンのような疎水性高分子を基材として用いることにより、シート製剤内部で浸透圧の差が効率的に発生し、化合物Ａのようなキサントン化合物の硬膜に対する透過性が高まることが一因であると推測される。
シリコーンを基材として用いる場合、シリコーンにセマフォリン阻害剤及び添加剤が分散され含有される。
シリコーンは生体適合性の優れた材料として古くから人工臓器や医療器具の材料として用いられている、安全性にも優れる素材である。シリコーンにはシロキサン結合の重合度や置換基の違いにより、オイル状、ゲル状、ゴム状等、さまざまな形状のものがある。本発明のシート製剤に用いられるシリコーンは限定されず、液状、オイル状、ゲル状のシリコーンを硬化させ固体としたものであってもよい。該シリコーンとしては液状のものが好ましく、液状のシリコーンとしては例えばDow Corning社製のポリジメチルシロキサンのSILASTIC Q7-4750A成分や同B成分、Nusil社製のMED-4750を用いることができる。本発明のシート製剤に用いられるシリコーンとしてQ7-4750A成分及びQ7-4750B成分は好ましく、これらを併用したものはより好ましい。
本発明のシート製剤におけるシリコーン等の基材の配合割合は限定されず、例えば３０％〜９０％であり、３５％〜７５％は好ましく、４０％〜６０％はより好ましい。本明細書において各成分の配合割合は他に記載がない限り、有効成分を含有する、シート製剤の本体全体の重量に対する各成分の重量割合を％で表したものである。
【００１６】
●その他の成分
本発明のシート製剤には薬学的に許容される他の成分を含んでよい。薬学的に許容される他の成分はとくに限定されない添加剤であるところ、前記添加剤としては、薬学的に許容される通常の担体が挙げられ、目的に応じて、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、等張剤、結合剤、流動化剤、滑沢剤、溶解剤、溶解補助剤、増粘剤、分散剤、安定化剤等を用いることができる。添加剤として、例えば、乳糖、マンニトール、結晶セルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、トウモロコシデンプン、部分α化デンプン、カルメロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ステアリン酸マグネシウム、フマル酸ステアリルナトリウム、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、酸化チタン、タルク等が挙げられる。
【００１７】
前記添加剤として、水溶性添加剤は好ましい。水溶性添加剤を用いることにより、水溶性添加剤によりセマフォリン阻害剤の放出速度を最適化し、及び／又はセマフォリン阻害剤の安定化等が達成される可能性がある。すなわち水溶性添加剤により、セマフォリン阻害剤の患部への送達をより一層効率的に行うことができる。
本発明においては、さらに放出速度を最適化するため、又は薬物安定化等の目的のために、水溶性添加剤を加えることは好ましい。
水溶性添加剤は常温で固体であり医学的・薬学的に許容されるものであればとくに限定されず、公知のものを用いてよい。本発明のシート製剤における水溶性添加剤として、水溶性添加剤は常温で固体であり医学的・薬学的に許容されるものであれば限定されず、１種又は２種以上のアミノ酸、１級アミンを持たない糖類、塩類、胆汁酸塩が好ましい。これらの好ましい水溶性添加剤として、具体的には以下のものが例示される：
・１種又は２種以上のアミノ酸として、中性アミノ酸又は疎水性アミノ酸が挙げられ、これらのアミノ酸のうちアルキル鎖を持つグリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンはより好ましく、アラニン及びロイシンはとくに好ましい。またアラニン及びロイシンのうちＬ−アラニン及びＬ−ロイシンはそれぞれ好ましい。
・１級アミンを持たない糖類として、グルコース、マンニトール、ラクトース、トレハロース、スクロース、エリスリトール、ソルビトール、キシリトール等が挙げられ、好ましくはグルコース、マンニトール、ラクトースが挙げられ、これらのうちマンニトールはとくに好ましい。
・塩類として、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等が挙げられ、好ましくは塩化ナトリウムが挙げられる。
・胆汁酸塩として、一次胆汁酸塩であるコール酸ナトリウム及びケノデオキシコール酸ナトリウム、二次胆汁酸塩であるデスオキシコール酸ナトリウム及びリトコール酸ナトリウム、複合胆汁酸塩であるグリココール酸ナトリウム及びタウロコール酸ナトリウム等が挙げられ、好ましくはコール酸ナトリウム、デスオキシコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウムが挙げられる。
【００１８】
本発明のシート製剤に用いられる水溶性添加剤として、より好ましいのは１種又は２種以上のアミノ酸、１級アミンを持たない糖類、及び塩類であり、これらの水溶性添加剤のうちとくに１種又は２種以上のアミノ酸は好ましい。１級アミンを持たない糖類又は塩類を本発明のシート製剤に用いる場合、これらを併用することは好ましい。
本発明のシート製剤に用いられる１種又は２種以上のアミノ酸は限定されないところ、中性アミノ酸又は疎水性アミノ酸は好ましい。これらのアミノ酸のうちアルキル鎖を持つグリシン・アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンはより好ましく、アラニン及びロイシンはとくに好ましい。本発明のシート製剤のうち、１種又は２種以上のアミノ酸としてアラニン又はロイシンを含むものは好ましく、アラニン及びロイシンを含む本発明のシート製剤は、より好ましい。
本発明のシート製剤に水溶性添加剤が用いられる場合、その配合割合は限定されず、例えば５重量％〜３５重量％であり、１０重量％〜２５重量％は好ましく、１５重量％〜２５重量％はより好ましい。
本発明のシート製剤における水溶性添加剤としてアラニンが用いられる場合、その配合割合は限定されず、例えば５重量％〜２５重量％であり、８重量％〜２０重量％は好ましく、１０重量％〜２０重量％はより好ましい。
本発明のシート製剤における水溶性添加剤としてロイシンが用いられる場合、その配合割合は限定されず、例えば０．５重量％〜１０重量％であり、１重量％〜１０重量％は好ましく、１重量％〜８重量％はより好ましい。
本発明のシート製剤における水溶性添加剤としてアラニン及びロイシンが用いられる場合、それらの配合比は限定されず、例えばアラニン：ロイシンの比は１０：１〜２：１であり、８：１〜２：１は好ましく、８：１〜３：１はより好ましい。
【００１９】
●成分の量
本発明のシート製剤におけるセマフォリン阻害剤の含量はとくに限定されず、０．３〜３５％であってよく、好ましくは２〜２０％であり、より好ましくは８〜１５％である。
本発明のシート製剤における基材の含量もとくに限定されず、３０％〜９０％であり、３５％〜７５％は好ましく、４０％〜６０％はより好ましい。
本発明のシート製剤において水溶性添加剤が用いられる場合、添加される水溶性添加剤の含量は限定されず、５重量％〜３５重量％であり、１０重量％〜２５重量％は好ましく、１５重量％〜２５重量％はより好ましい。
本発明のシート製剤のうち１種又は２種以上のアミノ酸をさらに含む本発明のシート製剤においては柔軟性が向上するため、セマフォリン阻害剤のような水溶性薬物による硬化を緩和することができる。そのため本発明のシート製剤のうち１種又は２種以上のアミノ酸をさらに含む本発明のシート製剤においては従来のシート製剤に比較してより多量のセマフォリン阻害剤を有効成分として含有させることができる。
【００２０】
セマフォリン阻害剤及び適宜添加される水溶性添加剤は担体中で粉末として分散しているが、これらの粒子径が放出性に影響を与える可能性がある。そのため、本発明のシート製剤の品質を安定させるために、必要に応じてセマフォリン阻害剤及び水溶性添加剤の粒子径を一定範囲にコントロールすることは好ましい。前記粒子径は、上限として３００μｍ以下であることが好ましく、より好ましくは２００μｍ以下である。これらの粒子径になるようにコントロールされることは好ましい。
【００２１】
●大きさ・厚み・形状
本発明のシート製剤の大きさや形状は限定されない。
本発明のシート製剤の大きさは、例えば縦は２〜９０ｍｍであり、横は２〜１４０ｍｍであり、損傷部位の大きさに応じて用時に切断してもよい。
本発明のシート製剤の厚みは限定されず、０．１〜２．０ｍｍが例示される。本発明のシート製剤の厚みは、好ましくは０．３〜１．５ｍｍであり、より好ましくは０．５〜１．２ｍｍである。
また本発明のシート製剤の形状としては、損傷部位近傍に載置・定着されることができる形状であれば限定されず、全体の形状として円形、楕円形、矩形が例示される。
【００２２】
本発明のシート製剤の厚さの測定方法は、実験的な小規模製造においては、シリコーン硬化後にノギス等により測定することが可能であるが、シリコーンには弾力性があることから過度の加圧による収縮、変形が起こらないように注意して測定する必要がある。加圧の影響が少ない測定法としては顕微鏡による測定や超音波厚さ計が挙げられる。製造工程において、シリコーン硬化前の成形直後、又は硬化後のいずれにおいても測定することも可能であるが、硬化前には加圧よる変形が起こりやすいので一層の注意を要する。また、成形に用いるノズル、スリット、ローラー等の金型のサイズと常圧下での膨張率を予め計算しておいて、完成品のサイズを予測して製造することもできる。
【００２３】
●製造方法
本発明のシート製剤の製造方法は限定されず、本技術分野において通常用いられる方法により製造してよい。本発明のシート製剤のうちシリコーンが基材として用いられるものについては、例えばＷＯ２０１２／０１８０６９に記載されているシリコーン製剤の製造方法を参照してよい。
【００２４】
●用途・使用方法
本発明のシート製剤は、硬膜外投与により脊髄損傷又は脳損傷を治療するために、脊髄損傷又は脳損傷の患部及び／又はその近傍に施用することにより用いられる。本明細書において「治療する」とは、完治のみならず、症状の軽減を客観的な指標及び／又は患者の主観により、測定又は認識できることも包含する。
本発明のシート製剤のうち、脊髄の湾曲形状に追従する柔軟性、可撓性及び／又は可塑性を有するものは脊髄損傷の治療においてとくに好ましい。かかる柔軟性、可撓性及び／又は可塑性を担保するために、上記１種又は２種以上のアミノ酸をさらに含む本発明のシート製剤は好ましい。
本発明のシート製剤は、支持層の上に基材を載置して用いることにより、患部への定着性をより高める構成にしてよい。また本発明のシート製剤において、前記支持層の２面のうち基材が載置される面の側には、支持層と基材との間に粘着層を有してよい。
【実施例】
【００２５】
以下に製剤例及び試験例とともに、実施例により本発明についてより詳細に説明する。本発明はいかなる意味においてもこれらの例に限定されるものではない。
〔製剤例１〕
表１に従って、化合物Ａ、マンニトール（ＰＥＡＲＬＩＴＯＬ（登録商標） ＳＤ−Ｍａｎｎｉｔｏｌ、ＲＯＱＵＥＴＴＥ製）、及び塩化ナトリウム（ナカライテスク製）を秤量し、乳鉢内で均一に混合して、混合粉末を得た。一方、表１に従って、Ｑ７−４７５０シリコーンＡ成分（ＳＩＬＡＳＴＩＣ  Ｑ７−４７５０シリコーンＡ成分、Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ製）、及びＱ７−４７５０シリコーンＢ成分（ＳＩＬＡＳＴＩＣ  Ｑ７−４７５０シリコーンＢ成分、Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ製）を秤量し、２本ロールで練合した。上記シリコーン練合後、速やかに上記混合粉末を全量加え練合した。その後二本ロールで伸展し４０℃で２５時間硬化させ、厚さ０．３ｍｍのシート製剤（製剤例１）を得た。「配合比（％）」は重量％を表す。
【表１】
2020122101.tif 000007
【００２６】
〔製剤例２〕
表２に従って、Ｌ−アラニン（ナカライテスク製）、及びＬ−ロイシン（ナカライテスク製）、化合物Ａをこれらの順番で秤量し、１２ｍＬポリプロピレン製軟膏壺に入れた。ミクロスパーテルを用いて粉末を均一に混合し、混合粉末を得た。一方、１０ｍＬポリプロピレン製シリンジに、ＭＥＤ−６２１５シリコーンＡ成分（ＮｕＳｉｌ製）６．０ｇとＭＥＤ−６２１５シリコーンＢ成分（ＮｕＳｉｌ製）０．６ｇを秤取した後、ステンレス製シリンジミキサーの片側に取り付けた。もう片側には空の１０ｍＬポリプロピレン製シリンジを取り付けた後、十分に脱気した。手動にてシリンジミキサーを介してシリンジを１５往復（３０回）ポンピングさせて混合し、シリコーン混合物とした。このシリコーン混合物を０．９３６ｇ（Ａ成分、Ｂ成分としてそれぞれ０．８５１ｇ、０．０８５ｇ相当）秤取し、上記軟膏壺に入れた。軟膏壺を自転公転ミキサー（ＡＲＥ−３１０、シンキー製）にセットし、混練モード２０００ｒｐｍで２分、遠心モード２０００ｒｐｍで１分、混練モード２０００ｒｐｍで２分の順で混練した。混練物はミクロスパーテルを用いて再度十分に混練し、 ５ｍＬポリプロピレン製シリンジに混練物の全量を回収した後、遠心機（ＣＦ７Ｄ２、日立工機製）にセットし１０００ｒｐｍで２分間の条件で脱泡した。脱泡した混練物を１．０５ｍｍ厚のＳＵＳ型枠内に注入し、手動油圧加熱プレス（井元製作所製）に設置し、０．８ｔｏｎ （９．８ ＭＰａ） の荷重を加えた状態で１００℃ 、３０分間の条件で硬化させ、厚さ１ｍｍのシート製剤（製剤例２）を得た。
【表２】
2020122101.tif 000008
【００２７】
〔製剤例３〕
表３に従って、Ｌ−アラニン（ナカライテスク製）、及びＬ−ロイシン（ナカライテスク製）をこれらの順番で秤量し、１２ｍＬポリプロピレン製軟膏壺に入れた。ミクロスパーテルを用いて粉末を均一に混合し、混合粉末を得た。一方、１０ｍＬポリプロピレン製シリンジに、ＭＥＤ−６２１５シリコーンＡ成分（ＮｕＳｉｌ製）６．０ｇとＭＥＤ−６２１５シリコーンＢ成分（ＮｕＳｉｌ製）０．６ｇを秤取した後、ステンレス製シリンジミキサーの片側に取り付けた。もう片側には空の１０ｍＬポリプロピレン製シリンジを取り付けた後、十分に脱気した。手動にてシリンジミキサーを介してシリンジを１５往復（３０回）ポンピングさせて混合し、シリコーン混合物とした。このシリコーン混合物を１．４７６ｇ（Ａ成分、Ｂ成分としてそれぞれ１．３４２ｇ、０．１３４ｇ相当）秤取し、上記軟膏壺に入れた。軟膏壺を自転公転ミキサー（ＡＲＥ−３１０、シンキー製）にセットし、混練モード２０００ｒｐｍで２分、遠心モード２０００ｒｐｍで１分、混練モード２０００ｒｐｍで２分の順で混練した。混練物はミクロスパーテルを用いて再度十分に混練し、５ｍＬポリプロピレン製シリンジに混練物の全量を回収した後、遠心機（ＣＦ７Ｄ２、日立工機製）にセットし１０００ｒｐｍで２分間の条件で脱泡した。脱泡した混練物を１．０５ｍｍ厚のＳＵＳ型枠内に注入し、手動油圧加熱プレス（井元製作所）に設置し、０．８ｔｏｎ （９．８ ＭＰａ） の荷重を加えた状態で１００℃ 、３０分間の条件で硬化させ、厚さ１ｍｍのシート製剤（製剤例３）を得た。
【表３】
2020122101.tif 000009
【００２８】
〔試験例１〕製剤例１の薬物放出試験
製剤例１のシートを５ｍｍ×７ｍｍの長方形に切り取り試験製剤１−１とした。切り取った試験製剤１−１をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１ｍＬ中に投入し、２５℃にて静置し、製剤から放出される化合物Ａを高速液体クロマトグラフィー（ＵＦＬＣ、株式会社 島津製作所製）により定量し累積放出率を求めた。
その結果、図１に示すような薬物放出が示された。【００２９】
〔試験例２〕製剤例２の薬物放出試験
製剤例２のシートを３ｍｍ×３ｍｍの正方形に切り取り試験製剤２−１とした。試験例１と同様の方法で試験し、製剤からの化合物Ａの累積放出率を求めた。
その結果、図２に示すように、９０日間におよぶ良好な持続放出が達成された。【００３０】
〔実施例１〕ラット脊髄損傷モデルを用いた後肢運動機能評価（ＢＢＢスコア評価）試験
７週齢雌性ＳＤラット脊髄損傷モデルを用いた後肢運動機能評価（ＢＢＢスコア評価、Ｂａｓｓｏ  ＤＭ，  Ｂｅａｔｔｉｅ  ＭＳ，  Ｂｒｅｓｎａｈａｎ  ＪＣ．  Ａ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｌｉａｂｌｅ  ｌｏｃｏｍｏｔｏｒ  ｒａｔｉｎｇ  ｓｃａｌｅ  ｆｏｒ  ｏｐｅｎ  ｆｉｅｌｄ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｉｎ  ｒａｔｓ．  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ  １９９５；１２：１−２１．参照）試験を行った。深麻酔下でラットの背部皮膚を切開し、第１０胸椎の棘突起及び椎弓を約２．５ ｍｍ径に除去し、ＩＨインパクター（ブレインサイエンス・イデア社）を用いて露出した脊髄を２５０ ｋｄｙｎの力で圧挫損傷させた。その後、肉眼的に硬膜の損傷がないこと、脊髄周辺組織から異常な出血が起こっていないことを確認して脊髄損傷モデルの作製とした。製剤例２のシートを３ｍｍ×３ｍｍの正方形に切り取り、試験製剤２−２とした。比較例として、製剤例３のシートを３ｍｍ×３ｍｍの正方形に切り取り、試験製剤３−２とした。脊髄損傷直後に切り出した試験製剤を損傷脊髄の硬膜上に投与（留置）した。脊髄損傷後７日目より、２０分間／日、５日／週の頻度でトレッドミルを用いてリハビリ処置を行った。ラットに前肢を通すことで前半身を保持できるジャケットを着用させ、トレッドミル（夏目製作所  ＫＮ−７３）上に軽く前肢・後肢を置ける高さで保持した。脊髄損傷後７日目からトレッドミルのベルトを０．６ ｍ／ｍｉｎの速度で動かし、ラットの後肢を強制的に２０分間動かし、後肢運動機能回復のためのリハビリとした。その２週間後にはベルト速度を１．８ ｍ／ｍｉｎに、さらにその２週間後以降は３．０ ｍ／ｍｉｎに増加させ、リハビリを継続した。脊髄損傷１週間後より週に１度、１３週目までＢＢＢスコア評価を実施した。ＢＢＢスコア評価は、Ｂａｓｓｏら１）の方法に従い実施した。脊髄損傷後２週時点において、ＢＢＢスコア９以上の動物は自然回復動物とみなし、試験から除外した。
その結果、図３に示すように本発明の実施例である化合物Ａ投与群（試験製剤２−２）は比較例（試験製剤３−２）に対して、７及び１１週間目において有意なＢＢＢスコアの改善を示した。【００３１】
〔実施例２〕ラット脊髄硬膜外留置による薬物の脊髄移行評価試験
７週齢雌性ＳＤラットを用い、脊髄硬膜外に留置したシート製剤からの脊髄組織中への薬物移行性を評価した。製剤例２のシートを３ｍｍ×３ｍｍの正方形に切り取り、試験製剤２−３とした。深麻酔下でラットの背部皮膚を切開し、第１０胸椎について棘突起及び椎弓を切除し脊髄硬膜を露出させた。直ちに試験製剤２−３を脊髄硬膜上に投与（留置）し、開創部位を閉鎖した。留置後１、１０、２８及び９１日後に脊髄を採取し、組織中の化合物Ａ濃度をＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（ＡＰＩ−４０００、ＳＣＩＥＸ）で測定した。さらに、留置後１、３、６及び２４時間ならびに１０、２８及び９１日後に採血し、血漿中の化合物Ａ濃度を上記ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより定量した。
その結果、図４に示すように硬膜外投与した薬物は、十分量が脊髄組織中に移行することが示された。一方で、血漿中濃度は、脊髄中濃度に比較して低濃度であり、薬物が血液中への移行を介さず脊髄中へ直接分布したことが示唆された。【００３２】
〔実施例３〕フランツセルを用いたイヌ及びブタ脳硬膜透過性評価試験
イヌ（Ｂｅａｇｌｅ）及びブタ（Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ  ｍｉｎｉ−ｐｉｇｓ）を深麻酔下で放血、屠殺した後、脳硬膜を採取した。フランツセル（キーストンサイエンティフィック製）のレセプターチャンバー側を６連スターラー上に固定し、恒温槽とレセプターチャンバーをチューブで接続し、３７℃の温水をウォータージャケット内に還流させた。レセプターチャンバー内に回転子を入れた後、チャンバー内を人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）で満たした。チャンバー内のＡＣＳＦの温度が安定した後、各硬膜をレセプターチャンバーの上に乗せ、さらに硬膜の上からドナーチャンバーをセットし、クランプで固定した。レセプターチャンバー内のＡＣＳＦ量は標線に合わせて５ｍＬに調整した。製剤例１を５ｍｍ×７ｍｍの長方形に切り取り試験製剤１−２とした。切り取った試験製剤１−２を、硬膜上に留置した。さらに、乾燥防止のため、ドナーチャンバーの上部をパラフィルムで密閉し、試験を開始した。サンプリングポートより経時的に３００μＬをサンプリングし、サンプリング直後には同量のＡＣＳＦをサンプリングポートより補充した。サンプリング時間は、０．５、１、２、４、６、２４及び４８時間の７ポイントとした。サンプリングした溶液中の化合物Ａ濃度を高速液体クロマトグラフィー（ＵＦＬＣ、島津製作所製）により定量し、透過量を算出した。
図５に示すように、製剤例１から得た本発明の実施例である試験製剤１−２から化合物Ａが放出され、脳硬膜を動物種の違いなく透過することが示された。【００３３】
以下に化合物Ａの合成方法を例示する。
〔合成例１〕
【化５】
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文献（ＡＣＳ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１５，６，５４２−５５０）の方法で合成される化合物Ａ保護体（１６０ｇ，１６９ｍｍｏｌ）とトルエン（８００ｇ）、水（６．１０ｇ，０．３３９ｍｍｏｌ）を反応容器に加え、２５℃に保温した。ここにトリフルオロ酢酸（１．５４ｋｇ，１３．５ｍｏｌ）を滴下し、種晶（１．６０ｇ，１．６９ｍｍｏｌ）を添加した。４０℃で1時間攪拌した後、６０℃に昇温してさらに3時間攪拌した。０℃に冷却し、エタノール（４００ｇ）を加えて終夜攪拌した後、生じた結晶を濾取した。濾上物をトルエン（３２０ｇ）、エタノール（３２０ｇ×２回）で順次洗浄し、４０℃で減圧乾燥して化合物Ａトリフルオロ酢酸和物（１０７．９ｇ，１ＴＦＡ和物として収率９２．３％）を黄色固体として得た。
ＸＲＤ：２θ＝７．５，８．４，１０．０，１２．０，１４．０，１４．２，１４．９，２１．８，２２．４，２３．９．
ＴＧＡ：３０℃から１９０℃にかけて１５．０％の重量減少【００３４】
〔合成例２〕
【化６】
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合成例１で得られた化合物Ａトリフルオロ酢酸和物（１０５ｇ，１５２ｍｍｏｌ）とアセトン（２１０ｇ）、脱イオン水（８４０ｇ）を混合し、５０℃で４時間攪拌した。０℃まで２時間かけて冷却し、さらに１時間攪拌した。生じた結晶を濾別し、アセトン／水（３１．５ｇ／１２６ｇ）の混合溶媒で２回、少量のアセトンで１回洗浄した後、４０℃で減圧乾燥し、化合物Ａ（９２．２ｇ，定量的、２工程収率９７．２％）を黄色固体として得た。
なお、核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ  ＢｉｏＳｐｉｎ製ＡＶ４００Ｍ（４００ＭＨｚ）を用いて測定した。粉末X線回折（XRD）は、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＸＳ製Ｄ８  ＡＤＶＡＮＣＥを用いて回折角度２θ５度〜４０度の範囲でCu Kα線、X線管電流４０ミリアンペア、電圧４０キロボルトステップ０．０１５度、測定時間４８秒／ステップの条件にて測定した。ＴＧＡ（熱重量分析）はティ・エイ・インスツルメント社製Ｑ５００を用いて測定温度範囲室温〜３００℃、昇温速度１０℃／分、雰囲気ガス乾燥窒素、サンプル流量約６０ｍＬ／分、バランス流量約４０ｍＬ／分の条件でプラチナパン容器にて測定した。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）δ：１１．６５（１Ｈ，ｂｒｓ），１１．４０（１Ｈ，ｂｒｓ），９．４１（２Ｈ，ｂｒｓ），８．５３（１Ｈ，ｓ），８．１７（１Ｈ，ｓ），６．９６（１Ｈ，ｓ），６．９４（１Ｈ，ｓ），２．５４（１Ｈ，ｓ），２．５３（１Ｈ，ｓ）．
ＸＲＤ：２θ＝７．５７，８．２２，１３．２，１３．７，２１．５，２２．２，２２．８２５，０，２７．９，３０．０．【００３５】
〔合成例３〕
【化７】
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合成例１で得られた化合物Ａトリフルオロ酢酸和物（１．００ｇ，１．４４ｍｍｏｌ）と5% アセトン水（５．００ｇ）を混合して得られるスラリーに３％炭酸水素ナトリウム水溶液（５２．７ｇ，１８．７ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で1時間攪拌して溶解させた。この溶液を、９％塩酸（８．２１ｇ，２０．１ｍｍｏｌ）に３０分かけて滴下した。２５℃で３時間攪拌し、生じた結晶を濾取し、水（２．００ｇ）で３回洗浄後、２５℃で３時間減圧乾燥した。飽和塩化カリウム水溶液を入れた容器内（湿度８０％以上）に結晶を静置して終夜調湿し、化合物Ａ三水和物（０．９００ｇ，収率９８．５％）を薄黄色の固体として得た。
ＸＲＤ：２θ＝１０．１，１５．５，１９．１，２４．０，２５．６．
ＴＧＡ：２５℃から１２５℃にかけて８．３５％の重量減少【００３６】
〔合成例４〕
【化８】
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合成例３で得られた化合物Ａ三水和物（１．２５ｇ，１．９８ｍｍｏｌ）と５０重量％アセトン水（３７．５ｇ）を混合し、６０℃で３時間加熱攪拌した。１時間かけて０℃まで冷却し、さらに４時間攪拌した。結晶を濾取し、５０重量％アセトン水（１．８８ｇ）で２回洗浄した後、４０℃で減圧乾燥して化合物Ａ（１．０１ｇ，収率８８．６％）を黄色固体として得た。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明によれば、外科的に硬膜を取り除くことなく、脊髄損傷又は脳損傷の患部及び／又はその近傍に施用することにより、セマフォリン阻害剤を患部に到達させることが可能になる。すなわち、本発明のシート製剤を用いることによって、患者の身体的負担が大幅に軽減された脊髄損傷又は脳損傷の治療が可能になる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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2020122101.tif 000022
2020122101.tif 000023
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