(57)【要約】  簡便で、毒素収率が高く、且つ比活性の高い毒素が得られる、ボツリヌス毒素の製造方法を提供する。（Ａ）培地中でボツリヌス毒素産生菌からボツリヌス毒素を産生させ、前記ボツリヌス毒素由来の菌体成分及び核酸成分とボツリヌス毒素とを含む混合物ａを得る工程と；（Ｂ）前記混合物ａを前記菌体成分の除去に供し、核酸成分とボツリヌス毒素とを含む混合物ｂを得る工程と；（Ｃ）前記混合物ｂにエンドヌクレアーゼを添加し、核酸分解物とボツリヌス毒素とを含む混合物ｃを得る工程と；（Ｄ）前記混合物ｃを核酸分解物の除去に供し、ボツリヌス毒素単離液ｄを得る工程と、を含む、ボツリヌス毒素の製造方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）培地中でボツリヌス毒素産生菌からボツリヌス毒素を産生させ、前記ボツリヌス毒素由来の菌体成分及び核酸成分とボツリヌス毒素とを含む混合物ａを得る工程と、
（Ｂ）前記混合物ａを前記菌体成分の除去に供し、核酸成分とボツリヌス毒素とを含む混合物ｂを得る工程と、
（Ｃ）前記混合物ｂにエンドヌクレアーゼを添加し、核酸分解物とボツリヌス毒素とを含む混合物ｃを得る工程と、
（Ｄ）前記混合物ｃを核酸分解物の除去に供し、ボツリヌス毒素単離液ｄを得る工程と、
を含む、ボツリヌス毒素の製造方法。
【請求項２】
前記（Ｃ）工程において、前記エンドヌクレアーゼがセラチア菌Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ由来のエンドヌクレアーゼである、請求項１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【請求項３】
前記（Ｃ）工程を、ｐＨ５．８〜６．５の条件下で行う、請求項１又は２に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【請求項４】
前記（Ｃ）工程において、前記エンドヌクレアーゼを複数回添加する、請求項１〜３のいずれかに記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【請求項５】
前記（Ｄ）工程において、前記核酸分解物の除去が膜による除去を含む、請求項１〜４のいずれかに記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【請求項６】
さらに、（Ｅ）前記ボツリヌス毒素単離液ｄを、陽イオン交換クロマトグラフィーに供し、ボツリヌス毒素複合体の精製物を得る工程を含む、請求項１〜５のいずれかに記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【請求項７】
さらに、（Ｆ）前記ボツリヌス毒素複合体の精製物を、前記ボツリヌス毒素複合体から無毒性非ＨＡタンパク質が乖離する条件下で陰イオン交換クロマトグラフィーに供し、ボツリヌス毒素非複合体の精製物を得る工程を含む、請求項６に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【請求項８】
少なくとも前記（Ａ）工程が前培養工程と本培養工程とを含み、少なくとも前記前培養工程を静置培養で行う、請求項１〜７のいずれかに記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【請求項９】
前記前培養工程と前記本培養工程との両方を静置培養で行う、請求項１〜８に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【請求項１０】
前記（Ａ）工程が、
（Ａ１）ｐＨ６．８〜８．０の培地中で前記ボツリヌス毒素産生菌の菌体増殖を行う工程と、
（Ａ２）ｐＨ５．０〜６．５の培地中で前記ボツリヌス毒素産生菌の発酵を行う工程と、
をこの順番で含む、請求項８又は９に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【請求項１１】
前記（Ａ）工程において、前記ボツリヌス毒素産生菌が、芽胞の形態で保存された菌体の発芽体である、請求項１〜１０のいずれかに記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【請求項１２】
前記（Ｂ）工程において、前記菌体成分の除去がフィルターろ過を含む、請求項１〜１１のいずれかに記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【請求項１３】
前記（Ｆ）工程において、前記条件がｐＨ７．３〜８．５である、請求項７〜１２のいずれかに記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【請求項１４】
前記（Ｆ）工程において、陰イオン交換クロマトグラフィーが弱陰イオン交換クロマトグラフィーである、請求項７〜１３のいずれかに記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【請求項１５】
比活性が３．０×１０7Ｕ／ｍｇ以上であることを特徴とする、精製ボツリヌス毒素。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれかに記載のボツリヌス毒素の製造方法によって製造される、精製ボツリヌス毒素。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はボツリヌス毒素の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ボツリヌス菌は、芽胞を形成する偏性嫌気性グラム陽性桿菌であり、全身性麻痺をきたす神経毒素（ボツリヌス毒素）を産生する。ボツリヌス菌から産生されるボツリヌス毒素は、神経毒成分ＮＴＸに無毒成分が結合した複合体を成している。この複合体は、分子量の違いによって、ＬＬ毒素（９００ＫＤａ）、Ｌ毒素（５００ＫＤａ）、Ｍ毒素（３００ＫＤａ）に分類される。Ｍ毒素は、ＮＴＸに無毒性且つ赤血球凝集活性のないタンパク質（無毒性非ＨＡタンパク質）であるＮＴＮＨが結合しており、Ｌ毒素はＭ毒素に無毒性且つ赤血球凝集活性のあるＨＡタンパク質が結合しており、ＬＬ毒素はＬ毒素が２分子結合している。ＮＴＸのみで構成される毒素はＳ毒素（１５０ＫＤａ）と呼ばれる。ＮＴＸのみからなるＳ毒素は、複合体毒素をアルカリ条件に供してＮＴＸとＮＴＮＨとを乖離させることによって単離することができる。【０００３】
ボツリヌス毒素は、Ａ〜Ｇ型の血清型に分類され、さらに、同じ血清型の毒素の中でも、毒素遺伝子の構造の違いによりいくつかの亜型に分類されている。例えばＡ型ボツリヌス菌は、Ａ１型〜Ａ５型の亜型に分類され、Ａ１型ボツリヌス菌は、ＬＬ毒素、Ｌ毒素及びＭ毒素を産生するが、Ａ２型ボツリヌス菌は、Ｍ毒素のみを産生する。Ｂ型、Ｃ型及びＤ型ボツリヌス菌はＬＬ毒素及びＭ毒素を産生する。Ｅ型及びＦ型ボツリヌス菌はＭ毒素のみを産生し、Ｇ型ボツリヌス菌はＬ毒素のみを産生する。【０００４】
ボツリヌス毒素は、その神経遮断作用を利用して臨床で応用されている。適用例としては、脳卒中後上肢／下肢痙縮、ジストニア、半側顔面痙攣、脳血管障害後後遺症、美容整形等が挙げられる。【０００５】
このような臨床上の有用性から、ボツリヌス菌からボツリヌス毒素を製造する方法が種々提案されている。ボツリヌス毒素の製造方法においては、ボツリヌス菌の培養後の培地を酸で処理することで、ボツリヌス毒素を酸沈殿させる手法が以前より用いられ、改良されている。例えば、特許文献１には、ボツリヌス毒素を含む発酵培養物を酸沈殿に供して酸沈殿物を得て、濃縮された酸沈殿物のサンプルを得ること；サンプルをヌクレアーゼ消化に供した後に疎水性相互作用カラムにローディングしてボツリヌス毒素複合体を捕捉すること；ボツリヌス毒素複合体を溶出し解離して、粗非複合ボツリヌス毒素を含む混合物を得ること；及びアニオン交換カラム及びカチオン交換カラムに供することを含む、非複合ボツリヌス毒素を精製するための方法が記載されている。また、特許文献２には、ボツリヌス毒素生産菌株培養液を酸で処理して、ボツリヌス毒素を酸沈殿させる工程；沈殿したボツリヌス毒素に緩衝溶液を添加した後、プロテアーゼ抑制剤および核酸分解酵素で処理したボツリヌス毒素を抽出する工程；抽出されたボツリヌス毒素を酸で処理してボツリヌス毒素を酸沈殿させた後、沈殿物を緩衝溶液に溶解させる工程；および陰イオン交換クロマトグラフィーを利用してボツリヌス毒素を精製する工程を含む、ボツリヌス毒素の製造方法が開示されている。【０００６】
一方で、ボツリヌス毒素の製造方法においては、上述のような酸沈殿を行わない手法も用いられる。例えば、特許文献３には、ボツリヌス菌を培養及び発酵するステップと；発酵培地に存在する細胞残屑を除去して発酵培地を採取するステップと；採取した培地を陰イオン交換媒体に接触させてボツリヌス神経毒素を捕捉するステップと；陰イオン交換媒体から溶出させた溶離液を陽イオン交換媒体に接触させるステップとを含む、Ａ型ボツリヌス神経毒素複合体を得るプロセスが開示されている。また、特許文献４には、膜ろ過法により、ボツリヌス菌培養液からボツリヌス菌体を除去する工程；ボツリヌス菌体が除去されたボツリヌス毒素溶液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに展開する工程；陰イオン交換クロマトグラフィーカラムの回収画分を陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに展開してボツリヌス毒素成分を吸着させる工程、及びボツリヌス毒素を溶出する工程を含む、ボツリヌス毒素の製造方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２０１３−５０８３８８号公報
【特許文献２】特表２０１６−５２１９６８号公報
【特許文献３】特表２０１２−５３２９３２号公報
【特許文献４】特開２０１１−７４０２５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
酸沈殿を行うボツリヌス毒素の製造方法では、酸沈殿物には細胞成分（菌体成分）と核酸成分とが共沈しており、この酸沈殿物に対してヌクレアーゼ消化が行われることで、核酸成分が断片化される。なお、酸沈殿によって菌体を酸性条件に晒すことにより菌体から毒素が溶出され、当該毒素も菌体成分及び核酸成分と共に沈殿する。断片化された核酸成分と細胞成分とは、その後のクロマトグラフィー等を用いた精製操作によって除去される。しかしながら、酸沈殿を用いる手法は、酸沈殿の操作が煩雑であること；ボツリヌス毒素と共に断片化された核酸成分と細胞成分（菌体成分）とが大量に共存した状態で精製に供されるため、クロマトグラフィー等における分離が鋭敏でなく分離性能が低いこと；及び夾雑物が大量に共沈している不溶物に対してヌクレアーゼ消化が行われることで未消化の核酸が残存するリスク等が想定される。一方で、酸沈殿を行わないボツリヌス毒素の製造方法では、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを用いて核酸除去が行われる。しかしながら、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによる核酸除去を用いる手法も、毒素と核酸との両方が陰イオン交換担体に吸着することにより毒素の収率に限界があり、また、得られる毒素の比活性も満足できるレベルにない。【０００９】
そこで本発明は、簡便で、毒素収率が高く、且つ比活性の高い毒素が得られる、ボツリヌス毒素の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は鋭意検討の結果、これまで菌体成分がボツリヌス毒素と不可避的に共存する酸沈殿物に対してしか適用されてこなかったヌクレアーゼ処理を、ボツリヌス菌培養発酵物から菌体成分を除去したボツリヌス毒素混合物に対して施すことで、酸沈殿も、核酸除去のための陰イオン交換クロマトグラフィーも用いることなく、毒素収率が高く、且つ比活性の高いボツリヌス毒素を製造できることを見出した。本発明は、この知見に基づいて、さらに検討を重ねることにより完成された発明である。【００１１】
すなわち、本発明は以下に掲げる態様の発明を提供する。
項１．（Ａ）培地中でボツリヌス毒素産生菌からボツリヌス毒素を産生させ、前記ボツリヌス毒素由来の菌体成分及び核酸成分とボツリヌス毒素とを含む混合物ａを得る工程と、
（Ｂ）前記混合物ａを前記菌体成分の除去に供し、核酸成分とボツリヌス毒素とを含む混合物ｂを得る工程と、
（Ｃ）前記混合物ｂにエンドヌクレアーゼを添加し、核酸分解物とボツリヌス毒素とを含む混合物ｃを得る工程と、
（Ｄ）前記混合物ｃを核酸分解物の除去に供し、ボツリヌス毒素単離液ｄを得る工程と、
を含む、ボツリヌス毒素の製造方法。
項２．  前記（Ｃ）工程において、前記エンドヌクレアーゼがセラチア菌Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ由来のエンドヌクレアーゼである、項１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
項３．  前記（Ｃ）工程を、ｐＨ５．８〜６．５の条件下で行う、項１又は２に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
項４．  前記（Ｃ）工程において、前記エンドヌクレアーゼを複数回添加する、項１〜３のいずれかに記載のボツリヌス毒素の製造方法。
項５．  前記（Ｄ）工程において、前記核酸分解物の除去が膜による除去を含む、項１〜４のいずれかに記載のボツリヌス毒素の製造方法。
項６．  さらに、（Ｅ）前記ボツリヌス毒素単離液ｄを、陽イオン交換クロマトグラフィーに供し、ボツリヌス毒素複合体の精製物を得る工程を含む、項１〜５のいずれかに記載のボツリヌス毒素の製造方法。
項７．  さらに、（Ｆ）前記ボツリヌス毒素複合体の精製物を、前記ボツリヌス毒素複合体から無毒性非ＨＡタンパク質が乖離する条件下で陰イオン交換クロマトグラフィーに供し、ボツリヌス毒素非複合体の精製物を得る工程を含む、項６に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
項８．  少なくとも前記（Ａ）工程が前培養工程と本培養工程とを含み、少なくとも前記前培養工程を静置培養で行う、項１〜７のいずれかに記載のボツリヌス毒素の製造方法。
項９．  前記前培養工程と前記本培養工程との両方を静置培養で行う、項１〜８に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
項１０．  前記（Ａ）工程が、
（Ａ１）ｐＨ６．８〜８．０の培地中で前記ボツリヌス毒素産生菌の菌体増殖を行う工程と、
（Ａ２）ｐＨ５．０〜６．５の培地中で前記ボツリヌス毒素産生菌の発酵を行う工程と、
をこの順番で含む、項８又は９に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
項１１．  前記（Ａ）工程において、前記ボツリヌス毒素産生菌が、芽胞の形態で保存された菌体の発芽体である、項１〜１０のいずれかに記載のボツリヌス毒素の製造方法。
項１２．  前記（Ｂ）工程において、前記菌体成分の除去がフィルターろ過を含む、項１〜１１のいずれかに記載のボツリヌス毒素の製造方法。
項１３．  前記（Ｆ）工程において、前記条件がｐＨ７．３〜８．５である、項７〜１２のいずれかに記載のボツリヌス毒素の製造方法。
項１４．  前記（Ｆ）工程において、陰イオン交換クロマトグラフィーが弱陰イオン交換クロマトグラフィーである、項７〜１３のいずれかに記載のボツリヌス毒素の製造方法。
項１５．  比活性が３．０×１０7Ｕ／ｍｇ以上であることを特徴とする、精製ボツリヌス毒素。
項１６．  項１〜１４のいずれかに記載のボツリヌス毒素の製造方法によって製造される、精製ボツリヌス毒素。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、簡便で、毒素収率が高く、且つ比活性の高い毒素が得られる、ボツリヌス毒素の製造が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１におけるボツリヌス毒素精製を示す電気泳動ゲルの染色像を示す。
【図２】比較例１におけるボツリヌス毒素精製を示す電気泳動ゲルの染色像を示す。
【図３】実施例２におけるボツリヌス毒素精製を示す電気泳動ゲルの染色像を示す。
【図４】実施例３におけるボツリヌス毒素精製を示す電気泳動ゲルの染色像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のボツリヌス毒素の製造方法は、（Ａ）培地中でボツリヌス毒素産生菌からボツリヌス毒素を産生させ、前記ボツリヌス毒素由来の菌体成分及び核酸成分とボツリヌス毒素とを含む混合物ａを得る工程と；（Ｂ）前記混合物ａを前記菌体成分の除去に供し、核酸成分とボツリヌス毒素とを含む混合物ｂを得る工程と；（Ｃ）前記混合物ｂにエンドヌクレアーゼを添加し、核酸分解物とボツリヌス毒素とを含む混合物ｃを得る工程と；（Ｄ）前記混合物ｃを核酸分解物の除去に供し、ボツリヌス毒素単離液ｄを得る工程と、を含む。さらに、本発明のボツリヌス毒素の製造方法は、（Ｅ）前記ボツリヌス毒素単離液ｄを、陽イオン交換クロマトグラフィーに供し、ボツリヌス毒素複合体の精製物を得る工程、又は更に（Ｆ）前記ボツリヌス毒素複合体の精製物を、前記ボツリヌス毒素複合体から無毒性非ＨＡタンパク質が乖離する条件下で陰イオン交換クロマトグラフィーに供し、ボツリヌス毒素非複合体の精製物を得る工程を含んでもよい。
【００１５】
本発明におけるボツリヌス毒素は、血清型として、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型、Ｆ型、およびＧ型の血清型のものが挙げられる。また、ボツリヌス毒素には、ボツリヌス毒素複合体及びボツリヌス毒素非複合体が含まれる。ボツリヌス毒素複合体には、ＬＬ毒素（９００ＫＤａ）、Ｌ毒素（５００ＫＤａ）、及びＭ毒素（３００ＫＤａ）が挙げられる。また、ボツリヌス毒素非複合体は、ＮＴＸのみからなるＳ毒素（１５０ＫＤａ）を指す。ＮＴＸは、５０ＫＤａの軽鎖と１００ＫＤａの重鎖とがジスルフィドを介して結合した２本鎖フラグメント構造を有する。
【００１６】
（Ａ）ボツリヌス毒素産生菌からのボツリヌス毒素の産生
（Ａ）工程では、培地中でボツリヌス毒素産生菌からボツリヌス毒素を産生させ、前記ボツリヌス毒素由来の菌体成分及び核酸成分とボツリヌス毒素とを含む混合物ａを得る。
【００１７】
本工程において産生されるボツリヌス毒素としては、天然ボツリヌス毒素及び修飾ボツリヌス毒素が挙げられる。修飾ボツリヌス毒素は、天然ボツリヌス毒素と比較して、そのアミノ酸のうちの少なくとも１つが欠失、修飾、付加、挿入または置換されたボツリヌス毒素を意味する。修飾ボツリヌス毒素は、組換え的に産生された神経毒であってよい。修飾ボツリヌス毒素は、ボツリヌス毒素受容体に結合する能力、ニューロンからの神経伝達物質の放出を阻害する能力等の、天然ボツリヌス毒素の生物学的活性を少なくとも１つ有していればよい。修飾ボツリヌス毒素の例としては、ボツリヌス毒素血清型（血清型Ａ等）由来の軽鎖と、異なるボツリヌス毒素血清型（血清型Ｂ等）由来の重鎖とを有するボツリヌス毒素が挙げられる。また、本工程においては、１種のボツリヌス毒素が産生されてもよいし、複数種のボツリヌス毒素が産生されてもよい。精製効率等の観点からは、１種のボツリヌス毒素が産生されることが好ましい。
【００１８】
ボツリヌス毒素産生菌（以下、ボツリヌス菌とも記載する）は、上記のボツリヌス毒素を産生する菌であればよく、例えば、クロストリジウム・ボツリナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、及びその組換え体が挙げられる。より具体的には、ＬＬ毒素、Ｌ毒素及びＭ毒素を産生するＡ１型ボツリヌス菌；Ｍ毒素のみを産生するＡ２型ボツリヌス菌；ＬＬ毒素及びＭ毒素を産生するＢ型、Ｃ型及びＤ型ボツリヌス菌；Ｍ毒素のみを産生するＥ型及びＦ型ボツリヌス菌；及びＬ毒素のみを産生するＧ型ボツリヌス菌が挙げられる。好ましくは、Ｍ毒素のみを産生するＡ２型、Ｅ型及びＦ型ボツリヌス菌が挙げられ、より好ましくはＡ２型ボツリヌス菌が挙げられる。具体的には、Ａ２型ボツリヌス菌株として、乳児ボツリヌス症原因菌が挙げられ、より具体的には、Ｋｙｏｙｏ−Ｆ、Ｃｈｉｂａ−Ｈ、Ｙ−８０３６、７Ｉ０３−Ｈ、７Ｉ０５−Ｈ、ＫＺ１８２８等が挙げられ、好ましくはＣｈｉｂａ−Ｈが挙げられる。また、ボツリヌス毒素産生菌は、芽胞の形態で保存されたボツリヌス菌体の発芽体であることが好ましい。これによって、シード菌株としての安定性が向上し、効率的に毒素を産生させることができる。
【００１９】
培地中でボツリヌス毒素産生菌からボツリヌス毒素を産生する方法としてはどのような方法を用いてもよい。例えば、Ｓａｋａｇｕｃｈｉらの方法（Sakaguchi G., Biomedical aspects of botulism: Purification and oral toxicities of Clostridium botulinum progenitor toxins.,21-34,Lewis GE.,1981, Academic Press,New York）が挙げられる。（Ａ）工程には、前培養工程と本培養工程とを含むことができる。前培養工程は好ましくは静置培養にて行うことができ、本培養工程は好ましくは撹拌培養又は静置培養にて行うことができる。さらに好ましくは、前培養工程と本培養工程との両方を静置培養で行うことができる。
【００２０】
前培養工程は菌体の拡大培養を行う工程であり、本培養工程は菌体の生産培養を行う工程である。本培養工程は、（Ａ１）ボツリヌス毒素産生菌の菌体増殖を行う工程と、（Ａ２）ボツリヌス毒素産生菌の発酵を行う工程とを、この順番で含むことが好ましい。（Ａ２）工程では、ボツリヌス毒素の溶出（溶菌）と菌の増殖との両方が進行する。
【００２１】
さらに、（Ａ１）工程における培地のｐＨは、菌の増殖をより良好に進行させる観点から、６．８〜８．０であることが好ましい。具体的には、ｐＨ７．０〜８．０、好ましくはｐＨ７．１〜８．０、より好ましくはｐＨ７．２〜８．０、さらに好ましくはｐＨ７．２〜７．８に調整された培地を用意し、当該培地を用いて（Ａ１）工程を開始することができる。
【００２２】
また、（Ａ２）工程における培地のｐＨは、ボツリヌス毒素の溶出（溶菌）と菌の増殖とをより良好に進行させる観点から、５．０〜６．５であることが好ましい。
【００２３】
（Ａ２）工程において上記ｐＨへ調整する方法の一例としては、（Ａ２）工程においてｐＨ調整剤を培地に添加することで人為的にｐＨを下げる方法が挙げられる。人為的にｐＨを下げる操作は、（Ａ１）工程による菌の増殖がピークに達したことを確認した後に行うことができる。このような人為的にｐＨを下げる方法は、好ましくは撹拌培養の場合に行われる。
【００２４】
（Ａ２）工程において上記ｐＨへ調整する方法の他の例としては、（Ａ１）工程から人為的に制御することなく自然にｐＨが下がる現象を利用する方法が挙げられる。自然にｐＨが下がる現象を利用した調整は、好ましくは静置培養の場合に行うことができる。なお、自然にｐＨが下がることによって（Ａ１）工程から（Ａ２）工程に移行させた場合、（Ａ）工程が進行し完了したことの確認は、培地のｐＨが、好ましくは５．５〜６．５まで下がっていることを確認することにより行うことができる。
【００２５】
（Ａ）工程で用いられる培地は特に限定されず、当業者によって適宜選択される。好ましくは、培地には、植物性ペプトン及び動物由来ペプトンの少なくともいずれかが含まれる。植物性ペプトンは、植物から得たタンパク質の分解産物であり、エンドウ豆、大豆、綿実、小麦グルテン等に由来するものが挙げられ、好ましくはエンドウ豆由来ペプトンが挙げられる。動物由来ペプトンは、動物組織由来のタンパク質分解産物であり、豚、牛、羊等に由来するものが挙げられ、好ましくは豚由来ペプトンが挙げられる。前培養工程で用いられる培地中の、植物性ペプトン及び動物由来ペプトンの総含有量としては、例えば１〜１２ｗ／ｖ％、好ましくは２〜１０ｗ／ｖ％が挙げられ、本培養工程で用いられる培地中の、植物性ペプトン及び動物由来ペプトンの総含有量としては、前培養工程で用いられる培地における植物性ペプトン及び動物由来ペプトンの総含有量よりも少ないことが好ましく、例えば植物性ペプトン及び動物由来ペプトンの総含量として、０．１〜５ｗ／ｖ％、好ましくは１〜３ｗ／ｖ％が挙げられる。なお、本明細書において、単位「ｗ／ｖ％」とは、第十七改正日本薬局方における質量対容量百分率を指す。
【００２６】
また、培地には、炭素源及び培地還元剤を含むことができる。炭素源としては、単糖類（例えば、グルコース、フルクトースなど）、二糖類（例えば、マルトース、スクロースなど）、オリゴ糖、多糖類（例えば、デキストリン、シクロデキストリン、澱粉など）または糖アルコール（例えば、キシリトール、ソルビトール、エリスリトールなど）が挙げられ、好ましくは単糖類が挙げられ、より好ましくはグルコースが挙げられる。培地還元剤としては、チオグリコール酸ナトリウム、システイン、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム等が挙げられ、好ましくはチオグリコール酸ナトリウムが挙げられる。
【００２７】
（Ａ）工程終了時の培地には、ボツリヌス毒素産生菌が産生したボツリヌス毒素が、ボツリヌス毒素産生菌由来の菌体成分及び核酸成分と共存している。従って、（Ａ）工程によって、ボツリヌス毒素産生菌由来の菌体成分及び核酸成分とボツリヌス毒素とを含む混合物ａが得られる。混合物ａには、菌体成分、核酸成分及びボツリヌス毒素以外に、培地成分も含まれる。
【００２８】
（Ｂ）菌体成分の除去
（Ｂ）工程では、（Ａ）工程で得られた混合物ａを前記菌体成分の除去に供し、核酸成分とボツリヌス毒素とを含む混合物ｂを得る。本発明では、例えば酸沈殿のような混合物ａからボツリヌス毒素とともに菌体成分と核酸成分とを沈殿させる手法は行わず、先に核酸成分を除去する手法も行わない。このため、本発明は、酸沈殿等の沈殿処理のような煩雑な操作が不要となる。また、酸沈殿を行わないため、ボツリヌス毒素のロスが少なく、優れた収率を達成することができる。さらに、ボツリヌス毒素が強い酸性条件に晒されないため、ボツリヌス毒素の毒素活性を良好に保つことができる。なお、本発明では、（Ｂ）工程による菌体成分の除去を行う前に、混合物ａにヌクレアーゼを加えることも行わない。
【００２９】
菌体成分の除去のための手法としては特に限定されず、具体的には、孔径が０．２２μｍ以下のフィルターにて混合物をろ過した場合の溶出液と同等以上の菌体成分の分離能を有する手法であればよい。つまり、本発明において菌体成分の除去における除去精度としては、少なくとも、孔径が０．２２μｍ以下のフィルターによって達成される場合と同等以上の除去精度が満たされていればよい。
【００３０】
菌体成分の除去のための手法のより具体的な例としては、例えば、フィルターろ過、遠心分離、膜ろ過が挙げられ、好ましくはフィルターろ過が挙げられる。フィルターろ過に用いられるフィルターの孔径としては、例えば１０μｍ以下が挙げられる。フィルターろ過は、孔径が異なるフィルターを用い、ろ過対象が供されるフィルターの孔径が段階的に小さくなるように複数段階に亘って行ってもよい。この場合、フィルターろ過は、２〜４段階、好ましくは３〜４段階に亘って行うことができる。フィルターろ過を複数段階に亘って行う場合、最終段階において用いられるフィルターの孔径は、菌体成分を一層適格に除去する観点から、０．２２μｍ以下であることが好ましい。使用するフィルターの材質としては、セルロース、パーライト、レジン、珪藻土、ポリエーテルスルホン、酢酸セルロース、ポリフッ化ビニリデン等が挙げられる。
【００３１】
（Ｂ）工程で除去されるものは、主に、菌体成分である。また、（Ｂ）工程では、菌体成分とともに核酸成分も部分的に除去されてもかまわない。フィルターろ過を行う場合は、フィルター上に菌体成分がとどまり、溶出液を混合物ｂとして回収する。
【００３２】
このように混合物ａから菌体成分を除去することで、核酸成分とボツリヌス毒素とを含む混合物ｂが得られる。また、混合物ｂは、適宜、濃縮されたものとして得てもよい。例えば、上記のフィルターを通過した溶出液を更に濃縮することで得てもよい。濃縮の手法としては特に限定されず、好ましくは膜濃縮が挙げられる。この場合、限外ろ過膜を用い、リン酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液等の、ボツリヌス毒素を溶解できる緩衝液で緩衝液置換をすることが好ましい。限外ろ過膜の孔径（分画分子量）としては、２０〜４０ＫＤａ、好ましくは２５〜３５ＫＤａが挙げられる。
【００３３】
混合物ｂは菌体成分が除去されており、実質的に澄明な液体として得ることができる。より好ましくは、混合物ｂは、核酸成分とボツリヌス毒素とを、上述の緩衝液とともに含む態様で得ることができる。また、混合物ｂには、上記の培地成分も引き続き含みうる。
【００３４】
（Ｃ）エンドヌクレアーゼ処理
（Ｃ）工程では、混合物ｂにエンドヌクレアーゼを添加し、核酸分解物とボツリヌス毒素とを含む混合物ｃを得る。上述のとおり、本発明では、ボツリヌス毒素の製造でよく行われる、ボツリヌス毒素とともに菌体成分と核酸成分とを沈殿させる酸沈殿等の手法は行わない。まず、核酸成分を除去するため、菌体成分が予め除去された混合物ｂに対してエンドヌクレアーゼを添加する。エンドヌクレアーゼの作用によって、混合物ｂ中の核酸成分が断片化され、核酸分解物を生じる。これによって、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを用いなくとも、後述の（Ｄ）工程において優れた効率で核酸分解物を除去すること（残存する核酸種がより少なくなるように核酸種が除去されること）が可能になる。また、本発明では、混合物ｂで予め菌体成分が除去されているため、菌体成分に邪魔されることなくエンドヌクレアーゼが核酸成分に対して作用しやすい。従って未消化核酸の残存を抑制して効率的に断片化することも可能となる。この点も、後述の（Ｄ）工程において優れた効率で核酸分解物を除去することに寄与する。
【００３５】
エンドヌクレアーゼとしては、エンドヌクレアーゼ活性を有している酵素を特に制限なく用いることができる。また、エンドヌクレアーゼの基質となる核酸成分は、ＤＮＡ及びＲＮＡが挙げられ、好ましくは、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方を分解可能な酵素が挙げられる。具体的なエンドヌクレアーゼとしては、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐ．由来のエンドヌクレアーゼ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ由来のエンドヌクレアーゼ、セラチア菌Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ由来のエンドヌクレアーゼが挙げられ、これらのエンドヌクレアーゼの中でも、セラチア菌由来のエンドヌクレアーゼが特に好ましい。
【００３６】
セラチア菌由来のエンドヌクレアーゼの具体例としては、ベンゾナーゼ（メルク・カー・ゲー・アー・アー登録商標）、デナラーゼ（シーレクターゲーエムベーハー登録商標）、及びカネカエンドヌクレアーゼ（カネカ社製）が挙げられ、好ましくはベンゾナーゼ及びデナラーゼが挙げられ、より好ましくはベンゾナーゼが挙げられる。セラチア菌由来のエンドヌクレアーゼの至適ｐＨは、一般のエンドヌクレアーゼに比べて高く、具体的には７．５〜９．２程度である。より具体的には、ベンゾナーゼの至適ｐＨが８．０〜９．２、デナラーゼの至適ｐＨが８．０〜９．０、カネカエンドヌクレアーゼの至適ｐＨが７．５〜９．０である。
【００３７】
（Ｃ）工程では、ボツリヌス毒素の乖離及び／又は分解を抑制する観点から、好ましくはｐＨ５．８〜６．５、より好ましくはｐＨ５．９〜６．３の条件下でエンドヌクレアーゼを作用させることが好ましい。上述の好ましいエンドヌクレアーゼであるセラチア菌由来のエンドヌクレアーゼを用いる場合も、それらの至適ｐＨからは大きく外れるものの、上述のｐＨ条件下で作用させることが好ましい。本発明においては、セラチア菌由来のエンドヌクレアーゼをｐＨ５．８〜６．５の条件下で作用させても、後述の工程（Ｄ）において核酸成分を効率的に除去することが可能になる。
【００３８】
（Ｃ）工程で混合物ｂにエンドヌクレアーゼを添加する回数としては特に限定されず、１回であってもよいし複数回であってもよい。セラチア菌由来のエンドヌクレアーゼを用いる場合、核酸をより効率的に断片化する観点から、複数回添加することが好ましい。好ましくは、当該エンドヌクレアーゼを２〜４回、より好ましくは２〜３回添加することができる。複数回添加における各回の添加のタイミングとしては特に制限はないが、例えば１〜１２時間、好ましくは２〜９時間、さらに好ましくは３〜７時間間隔で添加することができる。なお、エンドヌクレアーゼを作用させる温度としては、例えば２５〜４０℃、好ましくは２８〜３８℃が挙げられる。また、エンドヌクレアーゼ処理に係る総時間としては、例えば１０〜２４時間、好ましくは１２〜２０時間が挙げられる。なお、セラチア菌由来のエンドヌクレアーゼを用いる場合、本（Ｃ）工程と後述の（Ｄ）工程との一連の工程を複数回繰り返してもよい。この場合は、１回当たりの（Ｃ）工程において混合物ｂにエンドヌクレアーゼを添加する回数は１回が好ましい。（Ｃ）工程及び（Ｄ）工程の一連の工程を繰り返す場合の具体的な繰り返し回数としては、例えば２〜４回、好ましくは２〜３回が挙げられる。例えば当該一連の工程を２回繰り返す場合は、本発明は、（Ａ）工程、（Ｂ）工程、（Ｃ）工程、（Ｄ）工程、（Ｃ）工程、（Ｄ）工程をこの順で含むこととなる。
【００３９】
このように混合物ｂをエンドヌクレアーゼ処理することで、核酸分解物とボツリヌス毒素とを含む混合物ｃが得られる。また、混合物ｃは、適宜、分解しきれなかった核酸を除去する等の目的で、フィルターろ過等のろ過処理を経たろ液として得てもよい。具体的には、混合物ｃは、核酸分解物とボツリヌス毒素とともにエンドヌクレアーゼ残渣及び緩衝液を含む態様で得ることができる。また、混合物ｃは、上記の培地成分も引き続き含みうる。
【００４０】
（Ｄ）核酸分解物の除去
工程（Ｄ）では、混合物ｃを核酸分解物の除去に供し、ボツリヌス毒素単離液ｄを得る。核酸分解物の除去の手法としては、核酸分解物とボツリヌス毒素とを分離できる手段であれば特に限定されないが、陰イオン交換担体は用いない。陰イオン交換担体を用いた場合には、毒素収率に限界があり、最初に毒素と核酸種との両方を捕捉した後にｐＨグラジエント溶離で毒素を溶出させる場合のみならず、最初から核酸種のみを捕捉して毒素を捕捉せずに溶離させる場合であっても、毒素の回収が不十分となる。また、陰イオン交換担体を用いると、比活性が十分な毒素を得ることもできない。さらに、陰イオン交換担体を用いると、作業員による作業時間が長く、コンタミネーションの機会も増える。従って、本発明では、毒素収率、毒素の比活性、作業性等の観点から、核酸分解物の除去に陰イオン交換担体は用いない。
【００４１】
また、本発明では、酸沈殿等の、混合物ａからボツリヌス毒素とともに菌体成分と核酸成分とを沈殿させる処理を行わず、且つ、菌体を除去した後に残存核酸成分を分解するため、ボツリヌス毒素の分離に供される対象（本発明では混合物ｃ）においては、除去されるべき夾雑物が少なく且つ低分子化もされている。このため、夾雑物（つまり核酸分解物）の除去を分離性能良く行うことができる。
【００４２】
核酸分解物の除去の手法としては、陰イオン交換担体を用いないことを限度として、核酸分解物とボツリヌス毒素とを分離できる手段を特に制限なく用いることができる。具体的には、膜による除去が挙げられ、好ましくは膜ろ過が挙げられる。これによって、核酸分解物等の低分子物質を膜透過させ、膜透過しないボツリヌス毒素と分離することができる。膜による除去で用いられる膜の孔径としては、分画分子量として例えば２０〜４０ＫＤａ、好ましくは２５〜３５ＫＤａが挙げられる。膜分離液としては、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液等の、ボツリヌス毒素を溶解できる緩衝液を用いることが好ましい。
【００４３】
このように混合物ｃから核酸分解物を除去することによって、核酸等の夾雑物が良好に除去されたボツリヌス毒素単離液ｄを得ることができる。ボツリヌス毒素単離液ｄ中のボツリヌス毒素は、（Ａ）工程において産生された形態を維持した状態で得られる。例えば、（Ａ）工程においてＡ１型ボツリヌス菌をボツリヌス毒素産生菌として用いた場合は、（Ｄ）工程で得られるボツリヌス毒素単離液ｄ中のボツリヌス毒素は、ＬＬ毒素、Ｌ毒素及びＭ毒素の形態で含まれ、（Ａ）工程においてＡ２型ボツリヌス菌をボツリヌス毒素産生菌として用いた場合は、（Ｄ）工程で得られるボツリヌス毒素単離液ｄ中のボツリヌス毒素は、Ｍ毒素の形態で含まれる。ボツリヌス毒素単離液ｄは、澄明な液体として得ることができる。より好ましくは、ボツリヌス毒素単離液ｄは、ボツリヌス毒素を上述の緩衝液と共に含む態様で得ることができる。また、ボツリヌス毒素単離液ｄには、上記の培地成分も引き続き含んでいる場合もある。
【００４４】
ボツリヌス毒素単離液ｄは、さらにボツリヌス毒素を精製可能な任意の精製工程に供されることができる。ボツリヌス毒素精製の手法としては特に限定されず、ボツリヌス毒素の形態に応じて当業者が適宜選択することができる。優れた純度を得る観点から、カラムクロマトグラフィーによる精製が挙げられ、より好ましくはイオン交換カラムクロマトグラフィーが挙げられる。イオン交換カラムクロマトグラフィーの具体的な手法は、ボツリヌス毒素のｐＨ依存性に応じて適宜決定することができる。なお、ボツリヌス毒素は、酸性条件、好ましくはｐＨ４．０〜５．０、好ましくはｐＨ４．０程度で陽イオンを形成し、ｐＨ７．０以上、好ましくはｐＨ７．５程度で陰イオンを形成する性質を有する。また、ボツリヌス毒素複合体は、弱酸性条件、好ましくはｐＨ５．５〜６．５、好ましくはｐＨ６．０程度で複合体として安定的に存在し、ｐＨ上昇、例えばｐＨ７．３〜８．０により、乖離して非複合体を形成する性質を有する。好ましくは、以下の（Ｅ）工程によるボツリヌス毒素複合体の精製、又はさらに以下の（Ｆ）工程によるボツリヌス毒素非複合体の精製が挙げられる。
【００４５】
（Ｅ）ボツリヌス毒素複合体の精製
（Ｅ）工程では、ボツリヌス毒素単離液ｄを、陽イオン交換クロマトグラフィーに供し、ボツリヌス毒素複合体の精製物を得る。ボツリヌス毒素複合体は、酸性条件で陽イオンを形成するため、陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製は、ボツリヌス毒素複合体を安定的に捕捉し精製できる点で優れている。また、陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製は、ボツリヌス毒素複合体の乖離を抑制できるｐＨ条件で精製できる点でも優れている。
【００４６】
陽イオン交換担体は、予め、好ましくはｐＨ４．０〜４．５、具体例としてｐＨ４．２の緩衝液で平衡化しておくことができる。当該平衡化のための緩衝液の塩濃度としては、例えば０．３ｍｏｌ／Ｌ以下、好ましくは０．２ｍｏｌ／Ｌ以下、具体例として０．２ｍｏｌ／Ｌが挙げられる。緩衝液の種類としては特に限定されず、例えば、酢酸緩衝液、コハク酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ギ酸緩衝液、バルビツール酸緩衝液が挙げられ、好ましくは酢酸緩衝液が挙げられる。このように平衡化した陽イオン交換担体に、ボツリヌス毒素単離液ｄをアプライすることで、ボツリヌス毒素（ボツリヌス毒素複合体）を陽イオン交換担体に捕捉させる。
【００４７】
捕捉したボツリヌス毒素（ボツリヌス毒素複合体）の溶出は、平衡化のための緩衝液と同じ緩衝液を、平衡化のための緩衝液の塩濃度から例えば０．５〜０．８ｍｏｌ／Ｌ、具体例として０．７ｍｏｌ／Ｌまでのグラジエント条件で流すことによって行うことができる。これによって、精製されたボツリヌス毒素複合体を溶出物として得ることができる。
【００４８】
陽イオン交換担体としては特に限定されないが、例えば、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア）、ＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア）、Ｓ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア）、ＳＰ  トヨパール（東ソー）等の市販の陽イオン交換樹脂が挙げられる。緩衝液中の塩の種類は限定されず、イオン強度が上記濃度の塩化ナトリウムに相当する濃度となるように使用すればよい。好ましくは、緩衝液中の塩としては塩化ナトリウムが挙げられる。
【００４９】
このように陽イオン交換クロマトグラフィーを用いた精製によって、ボツリヌス毒素複合体を得ることができる。ボツリヌス毒素複合体は、安定化させることを目的とし、必要に応じて、ｐＨを５．５〜６．５、具体例としてｐＨ６．０に調整することができる。必要に応じて、濃縮及びろ過等の処理が行われたものとして得ることもできる。濃縮の具体的な手法としては、上記（Ｂ）工程で述べた手法から選択することができる。ろ過の具体的な手法としては、滅菌又は最終ろ過の目的で用いられる手法が挙げられ、例えば、孔径０．１５〜０．３μｍ、具体例として０．２２μｍのフィルターを用いる手法が挙げられる。また、ボツリヌス毒素複合体の形態でボツリヌス毒素製剤を提供する場合は、ろ過の前に、さらに、保存剤などの添加物を配合してもよい。
【００５０】
（Ｆ）ボツリヌス毒素非複合体の精製
（Ｆ）工程では、ボツリヌス毒素複合体の精製物を、ボツリヌス毒素複合体から無毒性非ＨＡタンパク質が乖離する条件下で陰イオン交換クロマトグラフィーに供し、ボツリヌス毒素非複合体の精製物を得る。
【００５１】
ボツリヌス毒素複合体の精製物は、陰イオン交換クロマトグラフィーに供する前に、予めボツリヌス毒素複合体から無毒性非ＨＡタンパク質が乖離する条件に供してもよい。ボツリヌス毒素複合体から無毒性非ＨＡタンパク質が乖離する条件としては、好ましくはｐＨ７．３〜８．５、より好ましくはｐＨ７．４〜８．０、具体例として７．５が挙げられる。温度は、１０℃以下であることが好ましい。具体的には、限外ろ過膜を用い、当該ｐＨに調整された、塩濃度が０．１ｍｏｌ／Ｌ以下、好ましくは０.０５ｍｏｌ／Ｌ以下のリン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、等の緩衝液、好ましくはリン酸緩衝液で緩衝液置換することによって無毒性非ＨＡタンパク質を乖離させることができる。限外ろ過膜の孔径（分画分子量）としては、５〜３０ＫＤａ、好ましくは８〜２０ＫＤａ、より好ましくは９〜１５ＫＤａが挙げられる。
【００５２】
陰イオン交換担体は、予め、ボツリヌス毒素複合体から無毒性非ＨＡタンパク質が乖離する条件（好ましくはｐＨ７．３〜８．５、具体例としてｐＨ７．５）に調整された緩衝液で平衡化しておくことができる。また、当該平衡化のための緩衝液の塩濃度としては、０．１ｍｏｌ／Ｌ以下、好ましくは０.０５ｍｏｌ／Ｌ以下が挙げられる。緩衝液の種類としては特に限定されず、例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液が挙げられ、好ましくはリン酸緩衝液が挙げられる。このように平衡化した陰イオン交換担体に、ボツリヌス毒素複合体の精製物又はそれを無毒性非ＨＡタンパク質が乖離する条件に予め供した処理物をアプライすることにより、接触環境のｐＨにより陰イオン化したボツリヌス毒素（ボツリヌス毒素非複合体）が捕捉される。
【００５３】
捕捉したボツリヌス毒素非複合体の溶出は、平衡化のための緩衝液と同じ緩衝液を、平衡化のための緩衝液の塩濃度から例えば０．１〜０．５ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．２〜０．４ｍｏｌ／Ｌ、具体例として０．３ｍｏｌ／Ｌまでのグラジエント条件で行うことができる。これによって、精製されたボツリヌス毒素非複合体を溶出物として得ることができる。
【００５４】
なお、乖離した無毒性非ＨＡタンパク質も担体に捕捉されうるが、移動相の塩濃度勾配等によって溶出タイミングが異なること等を利用した手法によりボツリヌス毒素非複合体と分離することができる。
【００５５】
陰イオン交換担体としては特に限定されないが、ボツリヌス毒素非複合体の溶出をより容易とすることでボツリヌス毒素非複合体と乖離した無毒性非ＨＡタンパク質との分離をより容易とする観点から、弱陰イオン交換担体であることが好ましい。例えば、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア）、ＤＥＡＥ  トヨパール（東ソー）、ダイヤイオンＷＡ１０（三菱ケミカル）、フラクトゲルＤＥＡＥ（メルク）等の市販の陰イオン交換樹脂が挙げられる。緩衝液中の塩の種類は限定されず、イオン強度が上記濃度の塩化ナトリウムに相当する濃度となるように使用すればよい。好ましくは、緩衝液中の塩としては塩化ナトリウムが挙げられる。
【００５６】
このように陰イオン交換クロマトグラフィーを用いた精製によって、ボツリヌス毒素非複合体を得ることができる。ボツリヌス毒素非複合体は必要に応じて、濃縮及び／又はろ過等の処理が行われたものとして得ることもできる。また、ボツリヌス毒素非複合体をボツリヌス毒素製剤として提供するために、さらに、保存剤などの添加物を配合してもよい。濃縮及びろ過の具体的手法としては、上述の（Ｅ）工程で述べた手法から選択することができる。
【００５７】
精製ボツリヌス毒素
本発明の方法で得られるボツリヌス毒素の精製体（精製ボツリヌス毒素とも記載する）は、比活性に優れる。具体的な比活性としては、例えば３．０×１０7Ｕ／ｍｇ以上、好ましくは４．０×１０7Ｕ／ｍｇ以上、より好ましくは５．０×１０7Ｕ／ｍｇ以上、更に好ましくは６．０×１０7Ｕ／ｍｇ以上、一層好ましくは７．０×１０7Ｕ／ｍｇ以上、より一層好ましくは８．０×１０7Ｕ／ｍｇ以上、特に好ましくは９．０×１０7Ｕ／ｍｇ以上、最も好ましくは１０．０×１０7Ｕ／ｍｇ以上が挙げられる。
【００５８】
ここで、比活性は、タンパク質１ｍｇ当たりの力価（Ｕ／ｍｇ）である。ここでいう力価は、マウス腹腔内投与法により算出したマウスに対する致死活性（腹腔内投与によるＬＤ５０値）であり、１Ｕ＝１ＬＤ５０である。また、力価は、マウスの尾静脈投与法により算出してもよい。マウス尾静脈投与法による精製ボツリヌス毒素の力価測定法は、一般的に使用されるマウス腹腔内投与法の代替法であり、高濃度の精製ボツリヌス毒素をマウスの尾静脈に投与し生存時間を調べ、あらかじめ検証したマウスの生存時間と腹腔内投与によるＬＤ５０値との回帰直線から、力価を算出することができる。タンパク質は、紫外吸収測定法（２８０ｎｍ）、Ｌｏｗｒｙ法またはＢＣＡ法等によって測定することができる。比活性の具体的な測定方法としては、例えばボツリヌス毒素を液体（ボツリヌス毒素液）として得る場合、ボツリヌス毒素液１ｍＬ当たりのＬＤ５０値（Ｕ）を測定し、得られた測定値を、当該ボツリヌス毒素液１ｍＬ中のタンパク質量（ｍｇ）で除して導出することができる。
【００５９】
ボツリヌス毒素製剤
本発明の製造方法によって得られる精製ボツリヌス毒素は、ボツリヌス製剤の有効成分として有用である。ボツリヌス製剤の用途としては、臨床応用されているあらゆる用途が挙げられ、例えば、脳卒中後上肢／下肢痙縮、ジストニア、半側顔面痙攣、脳血管障害後後遺症、美容整形などが挙げられる。
【００６０】
ボツリヌス製剤には、有効成分である精製ボツリヌス毒素に、薬学的に許容される追加の成分が含まれてよい。このような追加の成分としては賦形剤、安定化剤、緩衝剤等が挙げられ、賦形剤としては、スクロース、トレハロース、ラクトース、ポリサッカロイドが等が挙げられ、好ましくはスクロースが挙げられる。安定化剤としては、ヒト血清アルブミン、組換えヒト血清アルブミン、カプリル酸、アセチルトリプトファン、塩化ナトリウム、ポリソルベート８０、オクタノン酸、アルギニン（Ｌ−アルギニン塩酸塩）等が挙げられ、好ましくは組換えヒト血清アルブミン、Ｌ−アルギニン塩酸塩が挙げられる。緩衝剤としては、リン酸二水素ナトリウム水和物、リン酸水素二ナトリウム水和物等が挙げられる。これらの追加の成分としては１又は複数種を用いることができる。
【００６１】
ボツリヌス製剤の形態としては特に限定されず、液体であってもよいし固体であってもよい。固体のボツリヌス製剤は、液体製剤の凍結乾燥物、真空乾燥物又は噴霧乾燥物であってよく、使用時に、食塩水または水に溶かして液体製剤として復元することができる。
【実施例】
【００６２】
以下、実施例及び比較例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００６３】
［試験例１］
［１］ボツリヌス毒素の製造【００６４】
＜実施例１＞
以下の手順で、ボツリヌス毒素を製造した。
（Ａ）ボツリヌス菌の産生
静置培養１及び静置培養２からなる前培養工程と、撹拌培養による菌体増殖段階及び発酵段階からなる本培養工程とを行った。つまり、前培養工程と（Ａ１）本培養工程の菌体増殖段階を行った後、（Ａ２）本培養工程の発酵段階を行った。【００６５】
静置培養１では、Ｂａｃｔｏ  Ｐｒｏｔｅｏｓｅ  Ｐｅｐｔｏｎｅ  Ｎｏ．３（ブタペプトン、ベクトン・ディッキンソン社製）（終濃度８ｗ／ｖ％）、酵母エキス（終濃度１ｗ／ｖ％）、チオグリコール酸ナトリウム（終濃度０．０２５ｗ／ｖ％）、及びグルコース（終濃度０．５ｗ／ｖ％）を含む、ｐＨ７．３に調整した培地２０ｍLに、芽胞状態の乳児ボツリヌス症原因菌Ｃｈｉｂａ−Ｈ（Ａ２型ボツリヌス菌Ｃｈｉｂａ−Ｈ株）より作製したシード菌体を０．５ｍＬ播種し、３５℃で、ＯＤ６６０が０．５以上となるまで培養した。静置培養２では、上記組成且つ上記ｐＨの培地４００ｍＬに、静置培養１の培養物２０ｍＬを播種し、ＯＤ６６０が２．５以上となるまで３５℃で培養した。【００６６】
本培養工程の菌体増殖段階では、Ｂａｃｔｏ  Ｐｒｏｔｅｏｓｅ  Ｐｅｐｔｏｎｅ  Ｎｏ．３（ブタペプトン、ベクトン・ディッキンソン社製）（終濃度２ｗ／ｖ％）、酵母エキス（終濃度１ｗ／ｖ％）、チオグリコール酸ナトリウム（終濃度０．０２５ｗ／ｖ％）、及びグルコース（終濃度０．５ｗ／ｖ％）を含む、ｐＨ７．３の培地１０Ｌに、静置培養２の培養物約１５０ｍＬを播種し、窒素ガス雰囲気下、３５℃で撹拌培養し、菌の増殖がピークに達した後、１ｍｏｌ／ＬのＨＣｌを加えることで培地のｐＨを５．８に下げて、発酵段階を行った。発酵段階では必要に応じて１ｍｏｌ／ＬのＨＣｌを加え、終了まで培地のｐＨを５．８に維持した。なお、本培養工程に要した時間は、約４４時間であった。【００６７】
（Ｂ）菌体成分の除去
上記本培養工程によって得られた培養物を、以下のフィルターと膜を用いて、粗ろ過及び膜濃縮した。フィルターろ過は、本培養工程によって得られた培養物を、フィルター１［３Ｍ社製ゼータプラスフィルター（０５ＳＰ）／１０２０ｃｍ2；孔径１．０〜１０μｍ相当］、フィルター２［３Ｍ社製ゼータプラスフィルターマキシマイザー（６０ＳＰ０３Ａ）／１０２０ｃｍ2；孔径０．１〜１．０μｍ相当］、及びフィルター３［ザルトリウス社製ザルトポア２（孔径０．４５μｍ＋０．２μｍ）／０．１ｍ2］の順に通すフィルターろ過により行った。膜ろ過で得られたろ液を０．１ｍｏｌ／ＬＮａＣｌと２０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸とを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）及び孔径（分画分子量）３０ＫＤａの膜（ザルトリウス社製Ｓａｒｔｏｃｏｎ Ｓｌｉｃｅ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ  ３０ｋＤ）を用いて膜濃縮した。これによって得られた０．９Ｌの膜濃縮液をハーベスト液１１とも記載する。続いて０．９Ｌの半量（０．４５Ｌ）を、１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）及び孔径（分画分子量）３０ＫＤａの膜（ザルトリウス社製Ｓａｒｔｏｃｏｎ Ｓｌｉｃｅ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ  ３０ｋＤ）を用いて膜濃縮した。これによって得られた膜濃縮液を、ハーベスト液１２とも記載する。【００６８】
（Ｃ）エンドヌクレアーゼ処理
終濃度が１ｍｍｏｌ／ＬとなるＭｇＣｌ2と、終濃度が２０Ｕ／ｍＬとなるベンゾナーゼ（メルク・カー・ゲー・アー・アー登録商標）とをハーベスト液１２へ添加し、ｐＨ６．０の条件下で撹拌しながら３０℃で約１５時間反応させた。ベンゾナーゼの添加回数は１回であった。その後、エンドヌクレアーゼ処理物を、３Ｍ社製Ｚｅｔａ Ｐｌｕｓ  Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ Ｆｉｌｔｅｒを用いてフィルターろ過した。【００６９】
（Ｄ）核酸分解物の除去
得られたろ液を、１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）及び孔径（分画分子量）３０ＫＤａの膜（ザルトリウス社製Ｓａｒｔｏｃｏｎ Ｓｌｉｃｅ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ  ３０ｋＤ）を用いて膜濃縮し、核酸分解物を除去した。なお、この膜による核酸分解物の除去には、タンジェンシャルフローろ過を用いた。これによって膜濃縮液を得た。
得られた膜濃縮液を、０．２ｍｏｌ／ＬＮａＣｌを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．２）び孔径（分画分子量）３０ＫＤａの膜（ザルトリウス社製Ｓａｒｔｏｃｏｎ Ｓｌｉｃｅ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ  ３０ｋＤ）を用いて膜濃縮した。これらによって得られた膜濃縮液をボツリヌス毒素単離液１とも記載する。【００７０】
（Ｅ）ボツリヌス毒素複合体の精製
ボツリヌス毒素単離液１を、陽イオン交換クロマトグラフィーに供した。陽イオン交換担体としてはＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−ｆａｓｔ  ｆｌｏｗを用い、７０×５５０ｍｍサイズのカラムに担体を３０ｃｍ充填した。洗浄液として０．２ｍｏｌ／ＬＮａＣｌを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．２）を用いてカラムを平衡化し、ボツリヌス毒素単離液１をアプライし、溶出液として０．７ｍｏｌ／ＬＮａＣｌを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．２）を用い、０．７ｍｏｌ／ＬＮａＣｌまで８カラムボリュームのグラジエント条件で溶出させた。流速は約１５ｍＬ／分であった。得られた溶出液を、０．２ｍｏｌ／ＬＮａＣｌを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）及び孔径（分画分子量）３０ＫＤａの膜（ザルトリウス社製Ｓａｒｔｏｃｏｎ Ｓｌｉｃｅ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ  ３０ｋＤ）を用いて膜濃縮し、得られた濃縮液をさらに、孔径０．２２μｍフィルター（コーニング社製ボトルトップフィルター、ＰＥＳ製）を用いてろ過し、ボツリヌス毒素複合体（Ｍ毒素）の精製物を得た。【００７１】
（Ｆ）ボツリヌス毒素非複合体の精製
得られたボツリヌス毒素複合体（Ｍ毒素）の精製物を、１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）及び孔径（分画分子量）１０ＫＤａの膜（ザルトリウス社製Ｓａｒｔｏｃｏｎ Ｓｌｉｃｅ  ５０  Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ  １０ｋＤ、及びミリポア社製ペリコンＸＬウルトラセル１０ｋＤ）を用いて膜濃縮した。その後、膜濃縮物を、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに供した。陰イオン交換カラム担体としては、弱陰イオン交換担体であるＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−ｆａｓｔ  ｆｌｏｗを用い、１０×４５０ｍｍのカラムに担体を３０ｃｍ充填した。洗浄液として１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用いてカラムを平衡化し、膜濃縮物をアプライし、溶出液として０．３ｍｏｌ／ＬＮａＣｌを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用い、０．３ｍｏｌ／ＬＮａＣｌまで１０カラムボリュームのグラジエント条件で溶出させた。流速は約１ｍＬ／分であった。得られた溶出液を孔径０．２２μｍフィルター（Ｓｔａｒｌａｂ社製ＰＥＳ製シリンジフィルター）を用いてろ過し、保存剤（Ｌ−アルギニン塩酸塩）を終濃度が１ｗ／ｖ％になるよう添加し、ボツリヌス毒素非複合体（Ｓ毒素）の精製物（以下、Ｓ毒素精製物１とも記載する）を得た。【００７２】
＜比較例１＞
上記（Ｃ）工程及び（Ｄ）工程を、以下の方法に置き換えたことを除いて、実施例１と同様にしてボツリヌス毒素非複合体（Ｓ毒素）の精製物を得た。具体的には、実施例１の（Ｂ）工程で得られたハーベスト液１１（フィルターろ液）の残りの半量０．４５Ｌを用いて、以下の陰イオン交換クロマトグラフィー、膜濃縮及びろ過を行い、その後、実施例１の（Ｅ）工程及び（Ｆ）工程を行った。【００７３】
ハーベスト液１１を、陰イオン交換クロマトグラフィーに供した。陰イオン交換担体としてはＱｓｅｐｈａｒｏｓｅ−ｆａｓｔ  ｆｌｏｗを用い、１４０×５００ｍｍのカラムに担体を１０ｃｍ充填した。洗浄液として０．１ｍｏｌ／ＬＮａＣｌと２０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸とを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用いてカラムを平衡化し、実施例１の（Ｂ）工程で得られたハーベスト液１１をアプライし、同じ洗浄液を流速約１５０ｍＬ／分で流し、毒素画分を吸着させることなくパススルー画分として回収した。回収液を、０．２ｍｏｌ／ＮａＣｌを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．２）及び孔径（分画分子量）３０ＫＤａの膜（Ｓａｒｔｏｃｏｎ Ｓｌｉｃｅ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ  ３０ｋＤ）を用いて膜濃縮した。得られた膜濃縮液を、ボツリヌス毒素単離液１’とも記載する。さらに実施例１と同様の（Ｅ）工程及び（Ｆ）工程を行って、ボツリヌス毒素非複合体（Ｓ毒素）の精製物（以下、Ｓ毒素精製物１’とも記載する）を得た。【００７４】
［２］精製の確認
実施例１については、ハーベスト液１２、ボツリヌス毒素単離液１、及びＳ毒素精製物１をそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥ展開し、比較例１については、ハーベスト液１１、ボツリヌス毒素単離液１’、及びＳ毒素精製物１’をＳＤＳ−ＰＡＧＥ展開し、それぞれＣＢＢ染色を行い、ボツリヌス毒素の精製を確認した。得られた染色ゲルを図１（実施例１）及び図２（比較例１）に示す。図中、Ａ２−ＮＴＸ（Ｈ）は約１００ＫＤａの重鎖を示し、Ａ２−ＮＴＸ（Ｌ）は約５０ＫＤａの軽鎖を示す。【００７５】
また、図１において、マーカーの右隣のレーンは本培養液の培養上清を表し、ボツリヌス毒素単離液１とＳ毒素精製物１との間のレーンは、左から、ボツリヌス毒素複合体（Ｍ毒素）の精製物、ＤＥＡＥマトグラフィー後の毒素含有液、ＤＥＡＥクロマトグラフィー後の不純物液１、ＤＥＡＥクロマトグラフィー後の不純物液２を表す。図２において、マーカーの右隣のレーンは本培養液の培養上清を表し、ボツリヌス毒素単離液１’とＳ毒素精製物１’との間のレーンは、左から、陰イオン交換クロマトグラフィー後の不純物液、ボツリヌス毒素複合体（Ｍ毒素）の精製物、陽イオン交換クロマトグラフィー後の不純物液１、陽イオン交換クロマトグラフィー後の不純物液２、ＤＥＡＥマトグラフィー後の毒素含有液、ＤＥＡＥクロマトグラフィー後の不純物液1、ＤＥＡＥクロマトグラフィー後の不純物液２、ＤＥＡＥクロマトグラフィー後の不純物液３、ＤＥＡＥクロマトグラフィー後の不純物液４を表す。【００７６】
図１及び図２の対比に示されるように、比較例１では、約７５ｋＤａ付近の不純物が残存していることに対し、実施例１では当該不純物がほぼ除かれていることが分かった。【００７７】
［３］精製効率の測定
核酸除去操作による精製効率を測定した。具体的には、実施例１における精製効率は、（Ｂ）工程で得られたハーベスト液１２（膜濃縮液）中の核酸量に対する（Ｄ）工程で得られたボツリヌス毒素単離液１中の核酸量の比率（％）を算出し、１００％から当該比率を減じて得た。比較例１における精製効率は、（Ｂ）工程で得られたハーベスト液１１（フィルターろ液）中の核酸量に対するボツリヌス毒素単離液１’中の核酸量の比率を算出し、１００％から当該比率を減じて得た。【００７８】
【数１】
2020129986.tif 000002
【００７９】
なお、核酸量は、Ｑｕｂｉｔ３．０フルオロメーター（サーモフィッシャー社製）を用いたｄｓ  ＤＮＡ  ＨＳ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔによって測定されたＤＮＡ量と、同機器を用いたＲＮＡ  ＨＳ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔによって測定されたＲＮＡ量との総量として導出した。【００８０】
その結果、ボツリヌス毒素単離液１’中の核酸量はボツリヌス毒素単離液１中の核酸量の約２倍であった。従って、実施例１での核酸除去操作により、比較例１での核酸除去操作と比較して顕著に高い精製効率が達成された。【００８１】
［４］ボツリヌス毒素収率の測定
核酸除去操作によるボツリヌス毒素収率を測定した。具体的には、実施例１におけるボツリヌス毒素収率は、（Ｂ）工程で得られたハーベスト液１２（膜濃縮液）中の総毒素量に対する（Ｄ）工程で得られたボツリヌス毒素単離液１中の総毒素量の比率として算出し；比較例１におけるボツリヌス毒素収率は、（Ｂ）工程で得られたハーベスト液１１（フィルターろ液）中の総毒素量に対するボツリヌス毒素単離液１’中の総毒素量の比率として算出した。【００８２】
【数２】
2020129986.tif 000003
【００８３】
なお、総毒素量は、ハーベスト液１１、ハーベスト液１２、ボツリヌス毒素単離液１、ボツリヌス毒素単離液１’それぞれを用いて後述の力価測定法に準拠して検体の調製及びマウスへの接種を行い、単位Ｕ（１Ｕ＝１ＬＤ５０）とする値として得た。【００８４】
その結果、実施例１での核酸除去操作による毒素収率は５３．１８％、比較例１での核酸除去操作による毒素収率は５０．４６％であり、実施例１は比較例１と比較して、高い毒素収率であった。【００８５】
［５］ボツリヌス毒素の測定
以下のようにして、単位Ｕ／ｍＬとする力価を導出した。
得られたＳ毒素精製物を適宜希釈し、マウスの尾静脈より、１匹あたり０．１ｍＬを接種した後、マウスの生存時間を確認した。あらかじめ検証した生存時間と腹腔内投与によるＬＤ５０値との回帰直線より、Ｓ毒素精製物１ｍＬ当たりのＬＤ５０値（Ｕ／ｍＬ）を算出した。また、２８０ｎｍの赤外線吸収からＳ毒素精製物１ｍＬ当たりのタンパク質質量（ｍｇ／ｍＬ）を測定した。Ｓ毒素精製物１ｍＬ当たりのＬＤ５０値（Ｕ／ｍＬ）をＳ毒素精製物１ｍＬ当たりのタンパク質質量（ｍｇ／ｍＬ）で除して、比活性（Ｕ／ｍｇ）を導出した。【００８６】
その結果、実施例１で得られたＳ毒素精製物１の比活性は８．２１×１０7Ｕ／ｍｇ、比較例１で得られたＳ毒素精製物１’の比活性は２．５９×１０7Ｕ／ｍｇであり、実施例１は比較例１と比較して、比活性の高い精製物を得ることができた。。【００８７】
［試験例２］
［１］ボツリヌス毒素の製造【００８８】
＜実施例２＞
本実施例では、ボツリヌス毒素産生工程でアニマルフリーの培地を用い、エンドヌクレアーゼとしてデナラーゼを用いた点を主な変更点としたことを除いて、実施例１と同様にしてボツリヌス毒素を製造した。具体的には、以下の手順でボツリヌス毒素を製造した。【００８９】
（Ａ）ボツリヌス菌の産生
前培養工程及び本培養工程における培地として、Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ  Ｐｅｐｔｏｎｅ  Ｎｏ．１（植物ペプトン、サーモフィッシャー社）を用いたこと、前培養工程（静置培養１及び静置培養２）における培養量を半量にし、静置培養１の培養物約１０ｍＬを静置培養２の培地に播種したことを除き、実施例１と同様にしてボツリヌス菌を産生した。【００９０】
（Ｂ）菌体成分の除去
上記本培養工程によって得られた培養物を、以下のフィルターと膜を用いて、粗ろ過及び膜濃縮した。フィルターろ過は、本培養工程によって得られた培養物を、フィルター１［３Ｍ社製ゼータプラスフィルター（０５ＳＰ）／１０２０ｃｍ2；孔径１．０〜１０μｍ相当］、フィルター２［３Ｍ社製ゼータプラスフィルターマキシマイザー（６０ＳＰ０３Ａ）／１０２０ｃｍ2；孔径０．１〜１．０μｍ相当］、及びフィルター３［ザルトリウス社製ザルトポア２（孔径０．４５μｍ＋０．２μｍ）／０．１ｍ2］の順に通すフィルターろ過により行った。膜ろ過で得られたろ液を０．１ｍｏｌ／ＬＮａＣｌと２０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸とを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）及び孔径（分画分子量）３０ＫＤａの膜（ザルトリウス社製Ｓａｒｔｏｃｏｎ Ｓｌｉｃｅ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ  ３０ｋＤ）を用いて膜濃縮した。さらに、１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）及び孔径（分画分子量）３０ＫＤａの膜（ザルトリウス社製Ｓａｒｔｏｃｏｎ Ｓｌｉｃｅ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ  ３０ｋＤ）を用いて膜濃縮した。これらによって得られた膜濃縮液を、ハーベスト液２２とも記載する。【００９１】
（Ｃ）エンドヌクレアーゼ処理
エンドヌクレアーゼとしてデナラーゼ（シーレクターゲーエムベーハー登録商標）を用い、反応時間を約１９時間としたことを除いて、実施例１と同様にしてエンドヌクレアーゼ処理及びろ過を行い、ろ液を得た。【００９２】
（Ｄ）核酸分解物の除去
得られたろ液を、１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）及び孔径（分画分子量）３０ＫＤａの膜（ザルトリウス社製Ｓａｒｔｏｃｏｎ Ｓｌｉｃｅ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ  ３０ｋＤ）を用いて約１時間膜ろ過し、核酸分解物を除去した。なお、この膜による核酸分解物の除去には、タンジェンシャルフローろ過を用いた。これによって膜濃縮液を得た。得られた膜濃縮液を、０．２ｍｏｌ／ＬＮａＣｌを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．２）び孔径（分画分子量）３０ＫＤａの膜（ザルトリウス社製Ｓａｒｔｏｃｏｎ Ｓｌｉｃｅ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ  ３０ｋＤ）を用いて約２０分間膜濃縮した。これらによって得られた膜濃縮液をボツリヌス毒素単離液２とも記載する。【００９３】
（Ｅ）ボツリヌス毒素複合体の精製
ボツリヌス毒素単離液２を、実施例１と同様にして陽イオン交換クロマトグラフィーに供した。得られた溶出液を、０．２ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）及び孔径（分画分子量）３０ＫＤａの膜（ザルトリウス社製Ｓａｒｔｏｃｏｎ Ｓｌｉｃｅ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ  ３０ｋＤ）を用いて膜濃縮し、さらに、孔径０．２２μｍフィルター（コーニング社製ボトルトップフィルター、ＰＥＳ製）を用いてろ過し、ボツリヌス毒素複合体（Ｍ毒素）の精製物を得た。【００９４】
（Ｆ）ボツリヌス毒素非複合体の精製
ボツリヌス毒素複合体（Ｍ毒素）の精製物から、実施例１と同様にして、ボツリヌス毒素非複合体（Ｓ毒素）の精製物（以下、Ｓ毒素精製物２とも記載する）を得た。【００９５】
＜実施例３＞
本実施例では、ボツリヌス毒素産生工程の本培養工程で静置培養を行い、エンドヌクレアーゼの添加を２回行ったことを主な変更点としたことを除いて、実施例１と同様にしてボツリヌス毒素を製造した。具体的には、以下の手順でボツリヌス毒素を製造した。【００９６】
（Ａ）ボツリヌス菌の産生
シード菌体を０．４ｍＬ播種したこと、静置培養１における培養量を１０ｍLにしたこと、静置培養２における培養量を２５０ｍLにしたこと、静置培養１の培養物約１０ｍLを静置培養２の培地に播種したことを除いて、実施例１と同様にして前培養工程（静置培養１及び静置培養２）を行った。本培養工程の菌体増殖段階では、Ｂａｃｔｏ  Ｐｒｏｔｅｏｓｅ  Ｐｅｐｔｏｎｅ  Ｎｏ．３（ブタペプトン、ベクトン・ディッキンソン社製）（終濃度２ｗ／ｖ％）、酵母エキス（終濃度１ｗ／ｖ％）、チオグリコール酸ナトリウム（終濃度０．０２５ｗ／ｖ％）、及びグルコース（終濃度１．０ｗ／ｖ％）を含む、ｐＨ７．３の培地１０Ｌに、静置培養２の培養物約１５０ｍＬを播種し、密封条件下、３５℃で静置培養し、ｐＨ調整を行うことなく静置培養のまま自然に発酵段階に移行させた。本培養工程に要した時間は、約４４時間であり、培養終了時の培地のｐＨは約６．０であった。【００９７】
（Ｂ）菌体成分の除去
上記本培養工程によって得られた培養物について、０．１ｍｏｌ／ＬＮａＣｌと２０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸とを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）及び孔径（分画分子量）３０ＫＤａの膜（ザルトリウス社製Ｓａｒｔｏｃｏｎ Ｓｌｉｃｅ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ  ３０ｋＤ）を用いて膜濃縮しなかった点を除いて、実施例１と同様にして、ハーベスト液１２に対応するハーベスト液３２を得た。【００９８】
（Ｃ）エンドヌクレアーゼ処理
終濃度が１ｍｍｏｌ／ＬとなるＭｇＣｌ2と、終濃度が５０Ｕ／ｍＬとなるベンゾナーゼ（１回目添加分）とをハーベスト液３２を加え、ｐＨ６．０の条件下で撹拌しながら３０℃で約５時間反応させた。その後、ベンゾナーゼ（２回目添加分）を更に５０Ｕ／ｍＬ添加することで、１回目と２回目とのベンゾナーゼの合計量が１００Ｕ／ｍＬとなるようにし、更に約１２時間（合計約１３時間）反応させた。その後、エンドヌクレアーゼ処理物を、３Ｍ社製Ｚｅｔａ Ｐｌｕｓ  Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ Ｆｉｌｔｅｒを用いてフィルターろ過した。【００９９】
（Ｄ）核酸分解物の除去
得られたろ液を、０．２ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．２）及び孔径（分画分子量）３０ＫＤａの膜（ザルトリウス社製Ｓａｒｔｏｃｏｎ Ｓｌｉｃｅ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ  ３０ｋＤ）を用いて膜濃縮し、核酸分解物を除去した。なお、この膜による核酸分解物の除去には、タンジェンシャルフローろ過を用いた。これによって得られた膜濃縮液をボツリヌス毒素単離液３とも記載する。【０１００】
（Ｅ）ボツリヌス毒素複合体の精製
得られたボツリヌス毒素単離液３を、実施例１と同様にして陽イオン交換クロマトグラフィーに供した。溶出液として０．７ｍｏｌ／ＬＮａＣｌを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．２）を用い、０．７ｍｏｌ／ＬＮａＣｌまで８カラムボリュームのグラジエント条件で溶出させた。得られた溶出液を、１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）及び孔径（分画分子量）１０ＫＤａの膜（ザルトリウス社製Ｓａｒｔｏｃｏｎ Ｓｌｉｃｅ ５０  Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ  １０ｋＤ）を用いて膜濃縮し、ボツリヌス毒素複合体（Ｍ毒素）の精製物を得た。【０１０１】
（Ｆ）ボツリヌス毒素非複合体の精製
得られたボツリヌス毒素複合体（Ｍ毒素）の精製物を、１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）及び孔径（分画分子量）１０ＫＤａの膜（ミリポア社製ペリコンＸＬウルトラセル１０ｋＤ）を用いて膜濃縮し、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに供した。陰イオン交換カラム担体としては、弱陰イオン交換担体であるＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−ｆａｓｔ  ｆｌｏｗを用い、１０×４５０ｍｍのカラムに担体を３０ｃｍ充填した。洗浄液として１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用いてカラムを平衡化し、ボツリヌス毒素複合体（Ｍ毒素）の精製物をアプライし、溶出液として０．３ｍｏｌ／ＬＮａＣｌを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用い、０．３ｍｏｌ／ＬＮａＣｌまで１０カラムボリュームのグラジエント条件で溶出させた。流速は約１ｍＬ／分であった。得られた溶出液に保存剤（Ｌ−アルギニン塩酸塩）を終濃度が１ｗ／ｖ％になるよう添加し、孔径０．２２μｍフィルター（Ｓｔａｒｌａｂ社製ＰＥＳ製シリンジフィルター）を用いてろ過し、ボツリヌス毒素非複合体（Ｓ毒素）の精製物（以下、Ｓ毒素精製物３とも記載する）を得た。【０１０２】
［２］精製の確認
実施例２については、ハーベスト液２２、ボツリヌス毒素単離液２、及びＳ毒素精製物２をそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥ展開し、実施例３については、ハーベスト液３２、ボツリヌス毒素単離液３、及びＳ毒素精製物３をＳＤＳ−ＰＡＧＥ展開し、それぞれＣＢＢ染色を行い、ボツリヌス毒素の精製を確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び染色の方法は、試験例１と同様である。得られた染色ゲルを図３（実施例２）及び図４（実施例３）に示す。図中、Ａ２−ＮＴＸ（Ｈ）は約１００ＫＤａの重鎖を示し、Ａ２−ＮＴＸ（Ｌ）は約５０ＫＤａの軽鎖を示す。【０１０３】
また、図３において、ボツリヌス毒素単離液２とＳ毒素精製物２との間のレーンは、左から、ボツリヌス毒素複合体（Ｍ毒素）の精製物、ＤＥＡＥクロマトグラフィー後の毒素含有液を表す。図４において、ハーベスト液３２の左隣のレーンは本培養液の培養上清を表し、ボツリヌス毒素単離液３とＳ毒素精製物３との間のレーンは、左から、ＳＰクロマトグラフィー後の毒素含有液、ボツリヌス毒素複合体（Ｍ毒素）の精製物、ＤＥＡＥクロマトグラフィー後の毒素含有液、ＤＥＡＥクロマトグラフィー後の不純物液１、ＤＥＡＥクロマトグラフィー後の不純物液２を表す。【０１０４】
図３及び図４に示されるように、実施例２及び３では不純物がほぼ除かれていることが分かった。【０１０５】
［３］ボツリヌス毒素収率の測定
核酸除去操作によるボツリヌス毒素収率を測定した。具体的には、実施例２，３におけるボツリヌス毒素収率は、（Ｂ）工程で得られたハーベスト液２２，３２（膜濃縮液）中の総毒素量に対する（Ｄ）工程で得られたボツリヌス毒素単離液２，３中の総毒素量の比率として算出した。【０１０６】
【数３】
2020129986.tif 000004
【０１０７】
なお、総毒素量は、ハーベスト液２２，３２、ボツリヌス毒素単離液２，３それぞれを用いて前述の力価測定法に準拠して検体の調製及びマウスへの接種を行い、単位Ｕ（１Ｕ＝１ＬＤ５０）とする値として得た。【０１０８】
その結果、実施例２での核酸除去操作による毒素収率は５９．７１％、実施例３での核酸除去操作による毒素収率は８９．６８％であった。【０１０９】
［４］ボツリヌス毒素の測定
タンパク質含量をＢＣＡ法で測定したことを除いて、試験例１と同様に、得られたボツリヌス毒素（Ｓ毒素精製物２，３）の比活性を測定した。その結果、実施例２で得られたＳ毒素精製物２の比活性は１０．０６×１０7Ｕ／ｍｇであり、実施例３で得られたＳ毒素精製物３の比活性は６．４６×１０7Ｕ／ｍｇであった。
【図１】
2020129986.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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2020129986.tif 000011
2020129986.tif 000012
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