(57)【要約】生体サンプル中の物質による反応の阻害またはノイズを抑制・低減する剤または材料ならびにこれを利用した生体サンプル中の物質による反応の阻害またはノイズを抑制・低減する方法およびこれを利用した生体サンプル中の特定成分（例えば、遺伝子または遺伝子産物）の検出、測定または同定方法を提供する。本開示は、ＰＶＡスポンジを用いて、生体サンプルまたはその成分による核酸ポリメラーゼの増幅活性阻害効果を抑制することに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＶＡスポンジを含む、ポリメラーゼの体液またはその成分による増幅活性阻害効果の抑制剤または抑制材料。
【請求項２】
前記ＰＶＡスポンジが、平均気孔径が８０μｍ〜２００μｍである、請求項１に記載の抑制剤または抑制材料。
【請求項３】
前記ＰＶＡスポンジが、気孔率が８９％〜９１％である、請求項１または２に記載の抑制剤または抑制材料。
【請求項４】
前記体液が、血液または唾液である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抑制剤または抑制材料。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抑制剤または抑制材料を含む、リキッドバイオプシーのサンプリング剤またはサンプリング材料。
【請求項６】
請求項５に記載のサンプリング剤またはサンプリング材料を含む、キット。
【請求項７】
核酸分析のための、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
前記核酸分析が、核酸の増幅工程を含む、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
循環核酸の分析のための、請求項７に記載のキット。
【請求項１０】
前記循環核酸が、腫瘍循環ＤＮＡまたは腫瘍循環ｍｉＲＮＡである、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
体内腫瘍量のモニタリング、薬剤耐性遺伝子の判定、がんの早期検出、または再発モニタリングのための、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
前記循環核酸が、ｃｆＤＮＡである、請求項９に記載のキット。
【請求項１３】
出生前診断のための、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
染色体異常の検出または新生児スクリーニングのための、請求項１２に記載のキット。
【請求項１５】
ウイルス感染の検出のための、請求項９に記載のキット。
【請求項１６】
核酸の絶対定量を行うための、請求項７に記載のキット。
【請求項１７】
前記絶対定量が、デジタルＰＣＲによって行われる、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
ポリメラーゼの体液またはその成分による増幅活性阻害効果を抑制する方法であって、該体液またはその成分をＰＶＡスポンジに接触させる工程を包含する、方法。
【請求項１９】
前記体液が、血液または唾液である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＰＶＡスポンジを含む、微生物または微生物の部分の捕捉剤または捕捉材料。
【請求項２１】
前記ＰＶＡスポンジが、平均気孔径が８０μｍ〜２００μｍである、請求項２０に記載の捕捉剤または捕捉材料。
【請求項２２】
前記ＰＶＡスポンジが、気孔率が８９％〜９１％である、請求項２０または２１に記載の捕捉剤または捕捉材料。
【請求項２３】
細胞培養のための、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の捕捉剤または捕捉材料を含むキット。
【請求項２４】
リキッドバイオプシーのサンプリングのための、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の捕捉剤または捕捉材料を含む、キット。
【請求項２５】
核酸分析のための、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
前記核酸分析が、核酸の増幅工程を含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
血中循環腫瘍細胞を捕捉するための、請求項２４に記載のキット。
【請求項２８】
がんの予後予測または薬物治療法の再検討のための、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
デジタルＰＣＲを用いて腫瘍細胞数を定量するための、請求項２７に記載のキット。
【請求項３０】
前記核酸分析が、デジタルＰＣＲを含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項３１】
口腔内または血液中の細菌またはウイルスの絶対定量のための、請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
微生物または微生物の部分を捕捉するための方法であって、該微生物または微生物の部分にＰＶＡスポンジを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項３３】
前記微生物が細胞である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
微生物を定量的に分析または捕捉する方法であって、
（ａ）一定体積のＰＶＡスポンジを分析または捕捉対象の微生物を含む試料に接触させる工程と、
（ｂ）該一定体積のＰＶＡスポンジから、該微生物またはその成分を分離する工程と、
（ｃ）必要に応じて、該微生物またはその成分を分析する工程と
を含む、方法。
【請求項３５】
ＰＶＡスポンジを含む、核酸安定化剤または核酸安定化材料。
【請求項３６】
前記ＰＶＡスポンジが、平均気孔径が８０μｍ〜２００μｍである、請求項３５に記載の核酸安定化剤または核酸安定化材料。
【請求項３７】
前記ＰＶＡスポンジが、気孔率が８９％〜９１％である、請求項３５または３６に記載の核酸安定化剤または核酸安定化材料。
【請求項３８】
請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の核酸安定化剤または核酸安定化材料を含む、キット。
【請求項３９】
血液由来の核酸の保存のための、請求項３８に記載のキット。
【請求項４０】
血液から血漿を分離し、保存するための、請求項３８に記載のキット。
【請求項４１】
核酸を安定化するため、または保存するための方法であって、該核酸にＰＶＡスポンジを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項４２】
ＰＶＡスポンジを含む、リキッドバイオプシーのサンプリングのためのキットであって、
該ＰＶＡスポンジを、リキッドバイオプシーと接触させる工程と、
該ＰＶＡスポンジから水中で核酸試料を分離させ、上清を得る工程と、
該上清を遺伝子分析に供する工程と
を含む方法において用いられることを特徴とする、キット。
【請求項４３】
前記方法が、前記接触させる工程の後に、前記ＰＶＡスポンジを乾燥させる工程をさらに含む、請求項４２に記載のキット。
【請求項４４】
前記上清を得る工程が、ＰＶＡスポンジを水中で加熱することを含む、請求項４２または４３に記載のキット。
【請求項４５】
リキッドバイオプシーをサンプリングするための方法であって、
ＰＶＡスポンジを、リキッドバイオプシーと接触させる工程と、
該ＰＶＡスポンジから水中で核酸試料を分離させ、上清を得る工程と、
該上清を遺伝子分析に供する工程と
を含む方法。
【請求項４６】
前記接触させる工程の後に、前記ＰＶＡスポンジを乾燥させる工程をさらに含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記上清を得る工程が、ＰＶＡスポンジを水中で加熱することを含む、請求項４５または４６に記載の方法。
【請求項４８】
ＰＶＡスポンジを含む、リキッドバイオプシーのサンプリングのためのキットであって、
該ＰＶＡスポンジを、リキッドバイオプシーと接触させる工程と、
該ＰＶＡスポンジから水中で核酸試料を分離させ、上清を得る工程と、
該上清を凍結乾燥する工程と
該凍結乾燥した上清を水に溶解させる工程と
を含む方法において用いられることを特徴とする、キット。
【請求項４９】
前記方法が、前記接触させる工程の後に、前記ＰＶＡスポンジを乾燥させる工程をさらに含む、請求項４８に記載のキット。
【請求項５０】
前記上清を得る工程が、ＰＶＡスポンジを水中で加熱することを含む、請求項４８または４９に記載のキット。
【請求項５１】
リキッドバイオプシーをサンプリングするための方法であって、
ＰＶＡスポンジを、リキッドバイオプシーと接触させる工程と、
該ＰＶＡスポンジから水中で核酸試料を分離させ、上清を得る工程と、
該上清を凍結乾燥する工程と
該凍結乾燥した上清を水に溶解させる工程と
を含む方法。
【請求項５２】
前記接触させる工程の後に、前記ＰＶＡスポンジを乾燥させる工程をさらに含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記上清を得る工程が、ＰＶＡスポンジを水中で加熱することを含む、請求項５１または５２に記載の方法。
【請求項５４】
ＰＶＡスポンジを含む、乾燥付着血のサンプリングのためのキットであって、
該ＰＶＡスポンジを、乾燥付着血と接触させる工程と、
該ＰＶＡスポンジから水中で核酸試料を分離させ、上清を得る工程と、
該上清を遺伝子分析に供する工程と
を含む方法において用いられることを特徴とする、キット。
【請求項５５】
前記上清を得る工程が、ＰＶＡスポンジを水中で加熱することを含む、請求項５４に記載のキット。
【請求項５６】
乾燥付着血をサンプリングするための方法であって、
ＰＶＡスポンジで、乾燥付着血と接触させる工程と、
該ＰＶＡスポンジから水中で核酸試料を分離させ、上清を得る工程と、
該上清を遺伝子分析に供する工程と
を含む方法。
【請求項５７】
前記上清を得る工程が、ＰＶＡスポンジを水中で加熱することを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
血漿中の循環核酸の分析のための、ＰＶＡスポンジを含むサンプリング剤またはサンプリング材料。
【請求項５９】
血漿中の循環核酸の分析のための、請求項５８に記載のサンプリング剤またはサンプリング材料を含むキット。
【請求項６０】
前記血漿中の循環核酸の分析が、定量的分析である、請求項５９に記載のキット。
【請求項６１】
前記循環核酸が、腫瘍循環核酸である、請求項５９または６０に記載のキット。
【請求項６２】
血漿中の循環核酸の分析を行う方法であって、
ＰＶＡスポンジを血漿と接触させる工程と、
該ＰＶＡスポンジを遺伝子分析に供する工程と
を含む、方法。
【請求項６３】
ＰＶＡスポンジを含む、血漿中の循環核酸の分析のためのキットであって、
該ＰＶＡスポンジを血漿と接触させる工程と、
該ＰＶＡスポンジを遺伝子分析に供する工程と
を含む、方法において用いられることを特徴とする、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、生物学的または化学的な測定のためのサンプルの調製に関する。より詳細には、生体サンプル中の遺伝子分析または薬物分析のためのサンプル調製に関する。
【背景技術】
【０００２】
医療の現場では、薬物の効果を調べる際に生体から得られるサンプルを分析することが必要とされる。例えば、薬物を投与する前に、薬物代謝酵素の遺伝子多型を被験体の生体サンプルから調べておくことにより、薬物の効果や副作用について予測することが可能になる。また、薬物の投与後にも、血中の薬物濃度をモニタリングすることにより、薬物が有効となる動態を示しているかを確認することが可能になる。【０００３】
しかしながら、生体から得られた物質（例えば、血液）には夾雑物が多く含まれており、精密な測定、測定に必要な酵素反応等を妨げることがあり、生体サンプルからの情報を分析するのには、煩雑な精製工程を踏む必要がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本開示は、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）スポンジを用いることによって、精製工程を省いた迅速な生体サンプルのサンプリング方法、およびかかる方法において用いられるサンプリング材料またはサンプリングキットを提供する。ＰＶＡスポンジの特性は、リキッドバイオプシーを含めた生体サンプルのサンプリングに有用であることを本発明者は見出した。【０００５】
ＰＶＡスポンジは、生体サンプル中のポリメラーゼ増幅活性阻害成分の阻害を抑制することができ、本開示において、ＰＶＡスポンジを含む、ポリメラーゼの体液（例えば、血液）またはその成分による増幅活性阻害効果の抑制剤または抑制材料、それらを含むキット、あるいはそれらを用いる方法が提供される。ＰＶＡスポンジは微生物（例えば、細胞）を捕捉することができ、本開示において、ＰＶＡスポンジを含む、微生物またはその部分の捕捉剤または捕捉材料、それらを含むキット、あるいはそれらを用いる方法が提供される。また、ＰＶＡスポンジは核酸の安定化に用いることができ、本開示において、ＰＶＡスポンジを含む、核酸安定化剤または核酸安定化材料、それらを含むキット、あるいはそれらを用いる核酸を安定化するため、または核酸を保存するための方法が提供される。【０００６】
本開示は、例えば、以下の実施形態を提供する：
（項目Ａ１）  ＰＶＡスポンジを含む、ポリメラーゼの体液またはその成分による増幅活性阻害効果の抑制剤または抑制材料。
（項目Ａ１−１）  前記ＰＶＡスポンジが、平均気孔径が８０μｍ〜２００μｍである、前記項目のいずれかに記載の抑制剤または抑制材料。
（項目Ａ１−２）  前記ＰＶＡスポンジが、気孔率が８９％〜９１％である、前記項目のいずれかに記載の抑制剤または抑制材料。
（項目Ａ１−３）  前記体液が、血液または唾液である、前記項目のいずれかに記載の抑制剤または抑制材料。
（項目Ａ２）  前記項目のいずれかに記載の抑制剤または抑制材料を含む、リキッドバイオプシーのサンプリング剤またはサンプリング材料。
（項目Ａ３）  前記項目のいずれかに記載のサンプリング剤またはサンプリング材料を含む、キット。
（項目Ａ４）  核酸分析のための、前記項目のいずれかに記載のキット。
（項目Ａ５）  前記核酸分析が、核酸の増幅工程を含む、前記項目のいずれかに記載のキット。
（項目Ａ６）  循環無細胞核酸の分析のための、前記項目のいずれかに記載のキット。
（項目Ａ７）  前記循環核酸が、腫瘍循環ＤＮＡまたは腫瘍循環ｍｉＲＮＡである、前記項目のいずれかに記載のキット。
（項目Ａ８）  体内腫瘍量のモニタリング、薬剤耐性遺伝子の判定、がんの早期検出、または再発モニタリングのための、前記項目のいずれかに記載のキット。
（項目Ａ９）  前記循環核酸が、ｃｆＤＮＡである、前記項目のいずれかに記載のキット。
（項目Ａ１０）  出生前診断のための、前記項目のいずれかに記載のキット。
（項目Ａ１１）  染色体異常の検出または新生児スクリーニングのための、前記項目のいずれかに記載のキット。
（項目Ａ１２）  ウイルス感染の検出のための、前記項目のいずれかに記載のキット。
（項目Ａ１３）  核酸の絶対定量を行うための、前記項目のいずれかに記載のキット。
（項目Ａ１４）  前記絶対定量が、デジタルＰＣＲによって行われる、前記項目のいずれかに記載のキット。
（項目Ａ１５）  ポリメラーゼの体液またはその成分による増幅活性阻害効果を抑制する方法であって、該体液またはその成分をＰＶＡスポンジに接触させる工程を包含する、方法。
（項目Ａ１６）  前記体液が、血液または唾液である、前記項目に記載の方法。
（項目Ｂ１）  ＰＶＡスポンジを含む、微生物または微生物の部分の捕捉剤または捕捉材料。
（項目Ｂ１−１）  前記ＰＶＡスポンジが、平均気孔径が８０μｍ〜２００μｍである、前記項目に記載の捕捉剤または捕捉材料。
（項目Ｂ１−２）  前記ＰＶＡスポンジが、気孔率が８９％〜９１％である、前記項目のいずれかに記載の捕捉剤または捕捉材料。
（項目Ｂ２）  細胞培養のための、前記項目のいずれかに記載の捕捉剤または捕捉材料を含むキット
（項目Ｂ３）  リキッドバイオプシーのサンプリングのための、前記項目のいずれかに記載の捕捉剤または捕捉材料を含む、キット。
（項目Ｂ４）  核酸分析のための、前記項目のいずれかに記載のキット。
（項目Ｂ５）  前記核酸分析が、核酸の増幅工程を含む、前記項目のいずれかに記載のキット。
（項目Ｂ６）  血中循環腫瘍細胞を捕捉するための、前記項目のいずれかに記載のキット。
（項目Ｂ７）  がんの予後予測または薬物治療法の再検討のための、前記項目のいずれかに記載のキット。
（項目Ｂ８）  デジタルＰＣＲを用いて腫瘍細胞数を定量するための、前記項目のいずれかに記載のキット。
（項目Ｂ９）  前記核酸分析が、デジタルＰＣＲを含む、前記項目のいずれかに記載のキット。
（項目Ｂ１０）  口腔内または血液中の細菌またはウイルスの絶対定量のための、前記項目のいずれかに記載のキット。
（項目Ｂ１１）  微生物または微生物の部分を捕捉する前記項目に記載の方法。
（項目Ｂ１３）  微生物を定量的に分析または捕捉する方法であって、
（ａ）一定体積のＰＶＡスポンジを分析または捕捉対象の微生物を含む試料に接触させる工程と、
（ｂ）該一定体積のＰＶＡスポンジから、該微生物またはその成分を分離する工程と、
（ｃ）必要に応じて、該微生物またはその成分を分析する工程と
を含む、方法。
（項目Ｃ１）  ＰＶＡスポンジを含む、核酸安定化剤または核酸安定化材料。
（項目Ｃ１−１）  前記ＰＶＡスポンジが、平均気孔径が８０μｍ〜２００μｍである、前記項目に記載の核酸安定化剤または核酸安定化材料。
（項目Ｃ１−２）  前記ＰＶＡスポンジが、気孔率が８９％〜９１％である、前記項目のいずれかに記載の核酸安定化剤または核酸安定化材料。
（項目Ｃ２）  前記項目のいずれかに記載の核酸安定化剤または核酸安定化材料を含む、キット。
（項目Ｃ３）  血液由来の核酸の保存のための、前記項目のいずれかに記載のキット。
（項目Ｃ４）  血液から血漿を分離し、保存するための、前記項目のいずれかに記載のキット。
（項目Ｃ５）  核酸を安定化するため、または保存するための方法であって、該核酸にＰＶＡスポンジを接触させる工程を包含する、方法。
（項目Ｄ１）  ＰＶＡスポンジを含む、リキッドバイオプシーのサンプリングのためのキットであって、
該ＰＶＡスポンジを、リキッドバイオプシーと接触させる工程と、
該ＰＶＡスポンジから水中で核酸試料を分離させ、上清を得る工程と、
該上清を遺伝子分析に供する工程と
を含む方法において用いられることを特徴とする、キット。
（項目Ｄ２）  前記方法が、前記接触させる工程の後に、前記ＰＶＡスポンジを乾燥させる工程をさらに含む、前記項目に記載のキット。
（項目Ｄ３）  前記上清を得る工程が、ＰＶＡスポンジを水中で加熱することを含む、前記項目のいずれかに記載のキット。
（項目Ｄ４）  リキッドバイオプシーをサンプリングするための方法であって、
ＰＶＡスポンジを、リキッドバイオプシーと接触させる工程と、
該ＰＶＡスポンジから水中で核酸試料を分離させ、上清を得る工程と、
該上清を遺伝子分析に供する工程と
を含む方法。
（項目Ｄ５）  前記接触させる工程の後に、前記ＰＶＡスポンジを乾燥させる工程をさらに含む、前記項目に記載の方法。
（項目Ｄ６）  前記上清を得る工程が、ＰＶＡスポンジを水中で加熱することを含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目Ｅ１）  ＰＶＡスポンジを含む、リキッドバイオプシーのサンプリングのためのキットであって、
該ＰＶＡスポンジを、リキッドバイオプシーと接触させる工程と、
該ＰＶＡスポンジから水中で核酸試料を分離させ、上清を得る工程と、
該上清を凍結乾燥する工程と
該凍結乾燥した上清を水に溶解させる工程と
を含む方法において用いられることを特徴とする、キット。
（項目Ｅ２）  前記方法が、前記接触させる工程の後に、前記ＰＶＡスポンジを乾燥させる工程をさらに含む、前記項目のいずれかに記載のキット。
（項目Ｅ３）  前記上清を得る工程が、ＰＶＡスポンジを水中で加熱することを含む、前記項目のいずれかに記載のキット。
（項目Ｅ４）  リキッドバイオプシーをサンプリングするための方法であって、
ＰＶＡスポンジを、リキッドバイオプシーと接触させる工程と、
該ＰＶＡスポンジから水中で核酸試料を分離させ、上清を得る工程と、
該上清を凍結乾燥する工程と
該凍結乾燥した上清を水に溶解させる工程と
を含む方法。
（項目Ｅ５）  前記接触させる工程の後に、前記ＰＶＡスポンジを乾燥させる工程をさらに含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目Ｅ６）  前記上清を得る工程が、ＰＶＡスポンジを水中で加熱することを含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目Ｆ１）  ＰＶＡスポンジを含む、乾燥付着血のサンプリングのためのキットであって、
該ＰＶＡスポンジを、乾燥付着血と接触させる工程と、
該ＰＶＡスポンジから水中で核酸試料を分離させ、上清を得る工程と、
該上清を遺伝子分析に供する工程と
を含む方法において用いられることを特徴とする、キット。
（項目Ｆ２）  前記上清を得る工程が、ＰＶＡスポンジを水中で加熱することを含む、前記項目に記載のキット。
（項目Ｆ３）  乾燥付着血をサンプリングするための方法であって、
ＰＶＡスポンジで、乾燥付着血と接触させる工程と、
該ＰＶＡスポンジから水中で核酸試料を分離させ、上清を得る工程と、
該上清を遺伝子分析に供する工程と
を含む方法。
（項目Ｆ４）  前記上清を得る工程が、ＰＶＡスポンジを水中で加熱することを含む、前記項目に記載の方法。
（項目Ｇ１）  血漿中の循環核酸の分析のための、ＰＶＡスポンジを含むサンプリング剤またはサンプリング材料。
（項目Ｇ１−１）  前記項目のいずれか１つまたは複数に記載の特徴を備える、前記項目に記載のサンプリング剤またはサンプリング材料。
（項目Ｇ２）  血漿中の循環核酸の分析のための、前記項目に記載のサンプリング剤またはサンプリング材料を含むキット。
（項目Ｇ２−１）  前記項目のいずれか１つまたは複数に記載の特徴を備える、前記項目に記載のキット。
（項目Ｇ３）  前記血漿中の循環核酸の分析が、定量的分析である、前記項目のいずれかに記載のキット。
（項目Ｇ４）  前記循環核酸が、腫瘍循環核酸である、前記項目のいずれかに記載のキット。
（項目Ｇ５）  血漿中の循環核酸の分析を行う方法であって、
ＰＶＡスポンジを血漿と接触させる工程と、
該ＰＶＡスポンジを遺伝子分析に供する工程と
を含む、方法。
（項目Ｇ５−１）  前記項目のいずれか１つまたは複数に記載の特徴を備える、前記項目に記載の方法。
（項目Ｇ６）  ＰＶＡスポンジを含む、血漿中の循環核酸の分析のためのキットであって、
該ＰＶＡスポンジを血漿と接触させる工程と、
該ＰＶＡスポンジを遺伝子分析に供する工程と
を含む、方法において用いられることを特徴とする、キット。
（項目Ｇ６−１）  前記項目のいずれか１つまたは複数に記載の特徴を備える、前記項目に記載のキット。【０００７】
本開示において、上記の１つまたは複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供され得ることが意図される。本開示のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
【発明の効果】
【０００８】
ＰＶＡスポンジを用いたサンプリングは、迅速、簡便かつ安価に行うことができる。工程が短縮される（工程数の減少および時間の短縮などを含む）ことによって、信頼性が高まり、人件費を削減することができる。また、サンプル間のＤＮＡ品質格差が最小化される。ＰＶＡスポンジは絶対定量に用いることも可能であり、絶対定量は、複数回の測定を行う場合（例えば、被験体のモニタリング）には重要である。加えて、ＰＶＡスポンジは乾燥後、室温でサンプルの保存、郵送が可能であり、取扱い易さにも優れる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、実施例１Ａにおいて、ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ  Ｐｒｏｂｅ  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘを使用した場合のサンプル中の核酸増幅の結果を示す図である。各数字は各サンプル中のＤＮＡコピー数を示す。ＳはＰＶＡスポンジで回収したものを指し、Ｍは水溶紙で回収したものを指す。アルファベットが無いものは溶液中のコントロールＤＮＡを指す。
【図２】図２は、実施例１Ａにおいて、ＴａｑＰａｔｈ  ｑＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを使用した場合のサンプル中の核酸増幅の結果を示す図である。各数字は各サンプル中のＤＮＡコピー数を示す。ＳはＰＶＡスポンジで回収したものを指し、Ｍは水溶紙で回収したものを指す。アルファベットが無いものは溶液中のコントロールＤＮＡを指す。
【図３】図３は、実施例１Ｂにおけるサンプリングの方法と、当該サンプリング方法によってサンプリングしたサンプル中の核酸増幅の結果を示す図である。
【図４】図４は、実施例１Ｃにおけるサンプリングの方法と、当該サンプリング方法によってサンプリングしたサンプル中の核酸増幅の結果を示す図である。
【図５】図５は、実施例１Ｄにおけるサンプリングの方法と、当該サンプリング方法によってサンプリングしたサンプル中の核酸増幅の結果を示す図である。
【図６】図６は、本開示の血清採取デバイスと、それを用いる方法の一例を示す模式図である。
【図７】図７は、本開示の血清採取デバイスと、それを用いる方法の一例を示す模式図である。
【図８】図８は、実施例２Ａにおける、ＰＶＡディスク中白血球細胞由来の核酸増幅結果を示す図である。各数字は、ＰＶＡディスクの末梢血中のインキュベーション時間である。
【図９】図９は、実施例２Ｂの核酸増幅の結果を示す図である。ＰＶＡスポンジＰＢＳ洗浄上清ＰＣＲ遺伝子増幅の結果は、Ｄｓ、Ｅｓ、Ｆｓ、Ｙｓとして示され、ＰＢＳ洗浄ＰＶＡスポンジディスク処理上清ＰＣＲ遺伝子増幅の結果が、Ｄｄ、Ｅｄ、Ｆｄ、Ｙｄとして示される。
【図１０】図１０は、実施例２Ｃの核酸増幅の結果を示す図である。それぞれの液量は、示される量の全血をＰＶＡディスクに滴下したものに由来する核酸増幅の結果に対応する。
【図１１】図１１は、実施例２Ｄにおける、ＰＶＡスポンジによる唾液中の細胞捕捉の方法を示す模式図である。
【図１２】図１２は、実施例２Ｄにおける、ＰＶＡスポンジによって捕捉された唾液の細胞に由来する核酸増幅の結果を示す図である。
【図１３】図１３は、実施例２Ｅにおける、ＰＶＡスポンジによって口腔内から直接サンプリングしたサンプルに由来する核酸増幅の結果を示す図である。
【図１４】図１４は、本開示の唾液採取デバイスと、それを用いる方法の一例を示す模式図である。
【図１５】図１５は、本開示のがん細胞採取デバイスと、それを用いる方法の一例を示す模式図である。
【図１６】図１６は、ＰＶＡスポンジを利用した固形腫瘍細胞の迅速遺伝子検査を行う方法の一例を示す模式図である。
【図１７】図１７は、ＰＶＡスポンジを利用したＰＶＡスポンジを利用した固形腫瘍細胞の薬剤選択性試験を行う方法の一例を示す模式図である。
【図１８】図１８は、実施例３における、ＤＮＡの血清中安定性試験の方法の模式図である。
【図１９】図１９は、実施例３における、ゲノムＤＮＡの安定性試験の結果を示す図である。
【図２０】図２０は、実施例３における、プラスミドＤＮＡの安定性試験の結果を示す図である。
【図２１】図２１は、実施例４における血清処理ＰＶＡスポンジ調整液の凍結乾燥実験の手順および結果を示す図である。
【図２２】図２２は、実施例５における、それぞれの試料（右パネル）と、それらからＰＶＡスポンジで拭き取った血液に由来する核酸の増幅結果（左パネル）を示す図である。
【図２３】図２３は、本開示を用いた術後早期再発診断の例を示す模式図である。
【図２４】図２４は、本開示を用いた治療効果モニタリングの例を示す模式図である。
【図２５】図２５は、実施例７Ａにおける、血漿中ｃｆＤＮＡのＰＶＡスポンジを用いたダイレクト定量の手順および結果を示す図である。
【図２６】図２６は、実施例７Ｂにおける、血漿中ｃｆＤＮＡのＰＶＡスポンジを用いたダイレクト定量の手順および結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本開示を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本開示の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００１１】
以下に本明細書において特に使用される用語の定義および／または基本的技術内容を適宜説明する。
【００１２】
（ＰＶＡスポンジ）
本開示において、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）スポンジを用いるサンプリング方法、およびかかる方法において用いられるサンプリング材料またはサンプリングキットが提供される。
【００１３】
本明細書において「サンプリング」とは、リキッドバイオプシーなどの検査法において、試料（サンプル）を抽出することをいい、そのための剤および材料は、それぞれサンプリング剤およびサンプリング材料という。
【００１４】
本明細書において「ＰＶＡスポンジ」とは、ＰＶＡを架橋した多孔質の材料であり、その構造および作製方法は当技術分野で公知である（特開２００１−３０２８４０などを参照）。架橋は、ホルムアルデヒド等で行うことができる。
【００１５】
本明細書において「ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）」とは、ビニルアルコール＜示性式  （−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）−）ｎ＞を重合させた任意の重合体をいい、ポリ酢酸ビニルを酸またはアルカリで加水分解することにより得られる、水酸基を有する水溶性の重合体である。ポバールまたはＰＶＯＨとも呼ばれる。任意のＰＶＡがＰＶＡスポンジを製造するために用いることができる。
【００１６】
ＰＶＡスポンジは、例えば、以下のようにして製造することができる。すなわち、水溶性のＰＶＡ（ポリビニルアルコール、ポバール）に酸を触媒としてホルムアルデヒドを結合させるホルマール化反応により不溶性物質のＰＶＦ（ポリビニルホルマール）を製造し、その工程で気孔生成剤を加え、気孔の形成を行い不溶性のＰＶＦが完成後この気孔生成剤を抽出し、完成したＰＶＦは多孔質体となり立体的樹枝網目状連続気孔を形成する。この多孔質体がＰＶＡスポンジである。
【００１７】
ＰＶＡスポンジは、その体積の９０％近くを空隙で構成することができ、それでも基材として使用可能な構造的な強度を維持することが可能である。また、この空隙（気孔）を形成する基質部は、立体網目構造を成し、個々の気孔は全て連続化されている。このような一体構造がＰＶＡスポンジの最大の特徴であり、これにより、数々の機能がもたらされる。加えて、ＰＶＡスポンジは、一般的なウレタンスポンジなどとは異なり、きわめて親水性が高く、また、縦横にめぐる微細気孔によって毛細管現象が生じるため、吸水性・保水性に非常に優れる。また、湿潤状態では柔軟性・弾力性があり、特に洗浄材や拭き取り材として使用する場合、対象物の表面を傷めることを防ぐことができる。
【００１８】
ＰＶＡスポンジは、市販されているもの（例えば、アイオン株式会社製）を用いることができる。ＰＶＡスポンジのパラメータとしては、スポンジの気孔径（平均気孔径）または気孔率を選択することができる。気孔率は、スポンジの体積に占める空隙の体積の割合である。
【００１９】
本明細書において「平均気孔径」は、気孔径の（算術）平均値であり、ＪＩＳ  Ｚ  ８８３１−２に基づき測定することができる。
【００２０】
本明細書において「気孔率」は、所定量の固体によって占められる、全体積に対する吸着可能な細孔及び空隙の体積の比であり、ＪＩＳ  Ｚ  ８８３１−２に基づき測定することができる。
【００２１】
以下は、アイオン株式会社にて提供されているＰＶＡスポンジの物性を示す表である。本明細書の他の箇所において、下記の品番でＰＶＡスポンジについて言及する場合は、アイオン株式会社製の当該品番のＰＶＡスポンジを指す。
【表１】
2020149301.tif 000002
【００２２】
ＦＢとＧＢとは気孔径が大きいため、他の規格のＰＶＡスポンジの方が生体試料のサンプリングにはより適していると考えられる。本開示の一つの好ましい実施形態では、ＰＶＡスポンジの気孔径は、約８０μｍ〜約２００μｍである。
【００２３】
本開示の一つの好ましい実施形態では、ＰＶＡスポンジの気孔率は、８９％〜９１％である。
【００２４】
Ｄ（Ｄ）〜ＥＢ（Ｄ）のＰＶＡスポンジでは、生体試料のサンプリングにおいて性能の差はあまりないと考えられる。機械的な特性から見るとＦ（Ｄ）が最も取り扱いやすいと考えられる。
【００２５】
１つの局面において、本開示は、ＰＶＡスポンジを含む、ポリメラーゼの体液またはその成分による増幅活性阻害効果の抑制剤または抑制材料を提供する。理論に束縛されることを望まないが、この用途は、本発明者によって、ＰＶＡスポンジに血液を吸着させることで、血液中の増幅阻害物質がトラップされ、その後の増幅反応において阻害を回避できることが見出されたことによるものである。かかる増幅阻害物質のトラップは、そのような増幅阻害物質を含む任意の体液に対して有効であると考えられる。したがって、増幅活性阻害効果の抑制剤または抑制材料の他、このような性質によって、ＰＶＡスポンジを含む血液サンプリングキット、それを用いるサンプリング方法、血清（血漿）中のガン細胞由来ｃｔＤＮＡの検出（術後モニタリング）、血清（血漿）中腫瘍マーカー循環ｍｉＲＮＡの検出、血清（血漿）中の浮遊ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の検出（出生前診断）、全血中のゲノムＤＮＡ検出（新生児スクリーニング）、血清（血漿）中がんマーカー遺伝子のモニタリング（未病）、絶対定量の可能性（リアルタイム・デジタルＰＣＲ）、全血中のゲノムＤＮＡ検出（新生児スクリーニング：遺伝病の有無）などが提供され得る。
【００２６】
本明細書においてポリメラーゼの「増幅活性阻害（効果）」とは、ポリメラーゼが通常有する増幅活性が阻害されること、すなわち、通常の活性より低下しているかまたは消失していることをいう。本明細書においてポリメラーゼの「増幅活性阻害効果」の「抑制」とは、この「増幅活性阻害効果」が抑制、すなわち、阻害の程度が低下しているか消失（すなわち、通常有する増幅活性に回復すること）のほか、通常有する増幅活性より多く活性が回復することをも包含する。
【００２７】
本発明者によって、ＰＶＡスポンジは、唾液中の白血球などの細胞を捕捉することが見出された。このような性質によって、血液中細胞の捕獲・培養の可能性、血清中のウイルス・細菌のＲＮＡ・ＤＮＡ検出、唾液サンプリングからのデジタルＰＣＲによる口腔内細菌・ウイルスの絶対定量、がん細胞サンプリングからのデジタルＰＣＲでの正常細胞とがん細胞とのコピー数の比較が提供され得る。加えて、ＰＶＡスポンジは体積当たり一定の数の微生物（細胞など）を保持することができるため、サンプル中の微生物の量に依存せず、定量的なサンプリングを可能にし得る。
【００２８】
また、ＰＶＡスポンジに試料を吸着することで核酸を安定化することができ、サンプリング後の保存・輸送にも有用である。
【００２９】
生体サンプル（例えば、血液）をＰＶＡスポンジに滴下して乾燥させることによって、生体サンプルの生物学的または化学的分析のためのサンプルを調製することができる。１つの実施形態では、生物学的分析は遺伝子分析である。
【００３０】
（試料）
本明細書において使用される「核酸含有生体材料」とは、特定の対象となる核酸を含む任意の生体材料をいい、生体組織・細胞（例えば、植物、動物の細胞）、細菌およびウイルス等の微生物など、およびこれらに由来する調製物等を含み、「核酸含有生体材料を含む試料」としては、鼻汁、鼻腔ぬぐい液、眼結膜ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、喀痰、糞便、血液、血清、血漿、髄液、唾液、尿、汗、乳、精液、口腔ぬぐい液、歯間ぬぐい液、湿性耳垢、膣腔ぬぐい液および細胞組織などの生体試料または臨床試料の他、食品などを挙げることができる。被検試料は、細胞、真菌、細菌およびウイルスからなる群より選択されるＲＮＡを包含する試料を含むものであってもよい。増幅の対象となる遺伝子または検出の対象となる特定遺伝子はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。この場合、本開示においては、ＰＶＡ担体に担持させた被検試料を反応液に直接添加してＲＮＡ増幅反応を行なうことにより、当該被検試料中に存在するＲＮＡを直に増幅させることができる。ここで、「直接添加」とは、ＲＮＡ増幅に先立って、このＲＮＡを包含する被検試料からＲＮＡを抽出する過程が不要という意味である。
【００３１】
（リキッドバイオプシー）
本明細書において、「リキッドバイオプシー」とは、液体の生体サンプルを指し、血液、尿、唾液、精液等の体液のサンプルが含まれる。リキッドバイオプシーの分析は、従来の生検の採取に比較して、低侵襲性で検査を行うことができるが、従来よりも高感度（例えば、１００〜１，０００倍）の検出を行わなければならない場合が多い。リキッドバイオプシーの分析では、液中に漏れ出た生体分子を分析することになるためである。例えば、リキッドバイオプシーの分析には、血中循環がん細胞（ＣＴＣ）、血中循環異常細胞（ＣＡＧ）、幹細胞、血中循環がん遺伝子（ＣＴＧ）、セルフリー遺伝子（ｃｆＤＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、血中微量分子、ペプチド、マイクロパーティクル等の分析が含まれる。
【００３２】
本明細書において、「微生物」とは、遺伝情報を有する分子を内包する粒子であって、（単独で可能かどうかにかかわらず）複製されることが可能である任意の粒子を指す。本明細書における「微生物」としては、単細胞生物、細菌、多細胞生物由来の細胞、真菌、ウイルスなどが包含される。
【００３３】
（遺伝子分析）
本明細書において、「遺伝子分析」とは生体サンプル中の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）の状態を調べることをいう。１つの実施形態では、遺伝子分析は、核酸増幅反応を利用するものを挙げることができる。これらを含め、遺伝子分析の例としては、配列決定、遺伝子型判定・多型分析（ＳＮＰ分析、コピー数多型、制限酵素断片長多型、リピート数多型）、発現解析、蛍光消光プローブ（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ  Ｐｒｏｂｅ：Ｑ−Ｐｒｏｂｅ）、ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ法、融解曲線分析、リアルタイムＰＣＲ、定量ＲＴ−ＰＣＲ、デジタルＰＣＲなどを挙げることができる。遺伝子分析の１つの例は、ＴａｑＭａｎプローブ法による遺伝子型の判定である。蛍光消光プローブ法については、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｉｓｔ．ｇｏ．ｊｐ／Ｐｏｒｔａｌｓ／０／ｒｅｓｏｕｒｃｅ＿ｉｍａｇｅｓ／ａｉｓｔ＿ｊ／ａｉｓｔｉｎｆｏ／ａｉｓｔ＿ｔｏｄａｙ／ｖｏｌ０８＿０２／ｖｏｌ０８＿０２＿ｐ１８＿ｐ１９．ｐｄｆ等に記載されている。
【００３４】
そのような遺伝子分析においては、核酸の増幅反応を伴うことが一般的である。生体サンプル（例えば、血液または唾液）を直接核酸増幅反応（例えば、ＰＣＲ）の反応液に添加すると、生体サンプル中の物質による作用で、増幅反応（例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼ）が阻害される場合がある。ＰＶＡスポンジに生体サンプル（例えば、血液または唾液）を滴下して調製したサンプルでは、かかる増幅反応の阻害が抑制される。理論に拘束されるものではないが、ＰＶＡスポンジが、ＰＣＲ増幅を阻害する物質（ヘム、多糖類、ポリフェノール、フルボ酸、色素、イオンなど）を除去する能力を有しているためであると考えられる。
【００３５】
（ポリメラーゼ）
本開示の一つの実施形態で使用され得る核酸増幅反応においては、核酸ポリメラーゼが用いられる。１つの実施形態では、遺伝子分析に用いられるＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに代表される、プライマー付加による核酸を合成する耐熱性に優れたポリメラーゼであれば特に制限なく用いることができる。本開示で特に利用される核酸増幅反応は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いるものである。理論に束縛されることを望まないが、KODポリメラーゼを用いると、増幅方法が異なるため、Taqman  ＤＮＡポリメラーゼのように標識で検出できず、制限酵素での切断パターンでの解析を余儀なくされるため、煩雑な手法であるがＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのような５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いることで、簡便な解析を実現することができるからである。５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼには、Ｆａｍｉｌｙ  Ａ（Ｐｏｌ  Ｉ型）のＤＮＡポリメラーゼが含まれる。
【００３６】
このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、たとえばＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの他、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、あるいは上述したＤＮＡポリメラーゼの少なくともいずれかの混合物などを挙げることができる。なお、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＣａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ由来のＣ．ｔｈｅｒｍ  ＤＮＡポリメラーゼはＲＴ活性も有しているため、ＲＴ−ＰＣＲをＯｎｅ  ｔｕｂｅ−Ｏｎｅ  ｓｔｅｐで行なうときに、１種類の酵素で賄うことができるという特徴を有している。１つの実施形態では、他のポリメラーゼを用いる方法も利用し得るが、サンプルを直接Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのような５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼに用いることが簡便な方法として推奨される。このような場合、生体サンプル（例えば、血液サンプル）中に含まれる増幅阻害が生じることが本開示において見出された。本開示のようにＰＶＡスポンジを用いることによって、このような生体サンプル（例えば、血液サンプル）中に含まれる増幅阻害という問題が予想外に解決された。これにより、血液サンプルなどの生体サンプルを直接、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いた解析法（例えば、いわゆるＴａｑｍａｎ法またはそれと同等の手法）に適用することができる。このようなことは、従来技術では達成できなかったことである。
【００３７】
ポリメラーゼを用いた反応としては、例えば、ＰＣＲ（Polymerase  Chain  Reaction：ポリメラーゼ連鎖反応）法、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated  Isothermal  Amplification：ループ介在等温増幅）法、ＳＤＡ（Strand  Displacement  Amplification：鎖置換増幅）法、ＲＴ−ＳＤＡ（Reverse  Transcription  Strand  Displacement  Amplification：逆転写鎖置換増幅）法、ＲＴ−ＰＣＲ（Reverse  Transcription  Polymerase  Chain  Reaction：逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）法、ＲＴ−ＬＡＭＰ（Reverse  Transcription  Loop-Mediated  Isothermal  Amplification：逆転写ループ介在等温増幅）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic  Acid  Sequence-Based  Amplification：核酸配列に基づいた増幅）法、ＴＭＡ（Transcription  Mediated  Amplification：転写介在増幅）法、ＲＣＡ（Rolling  Cycle  Amplification：ローリングサイクル増幅）法、ＩＣＡＮ（Isothermal  and  Chimeric  primer-initiated  Amplification  of  Nucleic  acids：等温遺伝子増幅）法、ＵＣＡＮ法、ＬＣＲ（Ligase  Chain  Reaction：リガーゼ連鎖反応）法、ＬＤＲ（Ligase  Detection  Reaction：リガーゼ検出反応）法、ＳＭＡＰ（Smart  Amplification  Process）法、ＳＭＡＰ２（Smart  Amplification  Process  Version  2）法、PCR-インベーダー(PCR-Invader)法、Multiplex  PCR-Based  Real-Time  Invader  Assay  (mPCR-RETINA)、蛍光消光プローブ(Quenching  Probe：Q−Probe)などを挙げることができる。好ましくは、いわゆるＴａｑｍａｎ法が用いられる。バッファーは特に制限されないが、ＥｚＷａｙ（商標）（ＫＯＭＡ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（登録商標）（（株）島津製作所製）、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ  Ｄｉｒｅｃｔ  ＰＣＲ  ｋｉｔバッファー（Ｎｅｗ  ＥＮＧＬＡＮＤ  Ｂｉｏ−Ｌａｂｓ）、ＭａｓｔｅｒＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）などのうち、増幅阻害の除去の効果を減弱しないものを用いることができる。
【００３８】
本開示における反応に用いられるプライマーは、増幅する対象となる遺伝子または検出する対象となる特定遺伝子を決定した時点で、適宜公知の方法で設計することができる。本開示における反応に用いられるプライマーは、増幅する対象となる遺伝子または検出する対象となる特定遺伝子を特異的に増幅することができるものであれば特に制限されない。
【００３９】
本開示における被検試料に含まれる遺伝子の増幅または被検試料に含まれる特定遺伝子の検出は、プレート状またはチューブ状の不溶性担体上で行うことが好ましい。このような不溶性担体としては、反応液に対して不溶なプラスチック、ガラスなどからなるチューブのほか、９６穴ウェルなどを挙げることができる。なお、チューブ状とは、中空状態のものをいい、底があるＰＣＲチューブや、エッペンドルフチューブのような形状であってもよい。
【００４０】
具体的には、まず、プレート状またはチューブ状の不溶性担体に反応液を投入する。チューブ状の不溶性担体である場合には、その内部にバッファー、ポリメラーゼおよびプライマー等の試薬を含有する反応液を投入し、プレート状の不溶性担体である場合には、その表面に前記反応液を置く。そして前記反応液と被検試料およびＰＶＡスポンジが直接接触するように配置し、上述したＰＣＲ法などの増幅方法を行う。
【００４１】
本明細書で用いられる定量ＰＣＲとしては、公知のリアルタイムＰＣＲ等の任意の公知の手法を用いて行うことができる。これらの手法は、蛍光試薬などの標識を用いてＤＮＡの増幅量をリアルタイムで検出する方法であり、代表的に、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計を一体化した装置を必要とする。このような装置は市販されている。用いる蛍光試薬によりいくつかの方法があり、例えば、インターカレンター法、ＴａｑＭａｎＴＭプローブ法、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ法等が挙げられる。いずれも、鋳型ゲノムＤＮＡおよび目的のＳＮＰ部位を含むゲノム領域を増幅するためのプライマー対を含むＰＣＲ反応系に、インターカレーター、ＴａｑＭａｎＴＭプローブまたはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎプローブと呼ばれる蛍光試薬または蛍光プローブを添加するというものである。本開示で好ましく用いられるＴａｑＭａｎＴＭプローブ法（ＴａｑＭａｎＴＭ法ともいう）では、ＴａｑＭａｎＴＭプローブは両端を蛍光物質と消光物質のそれぞれで修飾した、標的核酸の増幅領域にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドであり、アニーリング時に標的核酸にハイブリダイズするが消光物質の存在により蛍光を発せず、伸長反応時にＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性により分解されて蛍光物質が遊離することにより蛍光を発する。従って、蛍光強度を測定することにより増幅産物の生成量をモニタリングすることができ、それによって元の鋳型ＤＮＡ量を推定することができる。
【００４２】
Taqmanアッセイによるコピー数分析は、例えば、当該分野で公知の手法である。Taqmanアッセイは、蛍光発生５’−ヌクレアーゼアッセイとも称される５’−ヌクレアーゼアッセイによるものであり；Holland  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  88:7276-7280  (1991)；およびHeid  et  al.,  Genome  Research  6:986-994  (1996)を参照することができる。
【００４３】
ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲの手順では、ＰＣＲ反応に特異的なアンプリコンの作製のために、２つのオリゴヌクレオチドプライマーが用いられる。第三のオリゴヌクレオチド（ＴａｑＭａｎプローブ）が、２つのＰＣＲプライマーの間に位置するアンプリコン中のヌクレオチド配列とハイブリダイズするように設計される。プローブは、ＰＣＲ反応で用いられるＤＮＡポリメラーゼによって伸長できない構造を有してよく、通常は（必須ではないが）、互いに近接する蛍光レポーター染料および消光剤部分によって共標識される。レポーター染料からの発光は、蛍光体および消光剤が、プローブ上でそうであるように、近接している場合に、消光部分によって消光される。いくつかの場合では、プローブは、蛍光レポーター染料または別の検出可能部分だけで標識されてよい。
【００４４】
ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ反応では、５’−３’ヌクレアーゼ活性を持つ熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いる。ＰＣＲ増幅反応の間、ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性により、鋳型特異的な様式でアンプリコンとハイブリダイズする標識プローブを開裂する。得られるプローブ断片は、プライマー／鋳型複合体から解離し、そして、レポーター染料は、消光剤部分の消光効果から解放される。新たに合成される各アンプリコン分子に対しておよそ１分子のレポーター染料が遊離され、未消光レポーター染料を検出することで、放出される蛍光レポーター染料の量がアンプリコン鋳型の量に正比例するという形でのデータの定量的解釈のベースが提供される。
【００４５】
ＴａｑＭａｎアッセイデータの１つの尺度は、通常、閾値サイクル(threshold  cycle；ＣＴ）として表される。蛍光レベルは、各ＰＣＲサイクルの間に記録され、増幅反応にてその時点までに増幅された産物の量に比例している。蛍光シグナルが統計的に有意であるとして最初に記録された際の、または蛍光シグナルが他の何らかの任意レベル（例えば、任意蛍光レベル(arbitrary  fluorescence  level；ＡＦＬ））を超える場合のＰＣＲサイクルが、閾値サイクル（ＣＴ）である。５’−ヌクレアーゼアッセイのためのプロトコールおよび試薬は、当業者に公知であり、様々な参考文献に記載されている。例えば、５’−ヌクレアーゼ反応およびプローブは、米国特許第6,214,979号（Gelfand  et  al.）；米国特許第5,804,375号（Gelfand  et  al.）；米国特許第5,487,972号（Gelfand  et  al.）；Gelfand  et  al.第5,210,015号（Gelfand  et  al.）等を参照することができる。
【００４６】
TaqManTMPCRは、市販のキットおよび装置を用いて行うことができ、例えば、ABI  PRISM（登録商標）7700  Sequence  Detection  System（Applied  Biosystems,Foster  City，CA、USA）、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）（Roche  Applied  Sciences，Mannheim,  Germany）などである。好ましい実施形態では、５’−ヌクレアーゼアッセイ手順は、ABI  PRISM（登録商標）7700  Sequence  Detection  Systemなどのリアルタイム定量的ＰＣＲ装置上で行われるがこれに限定されない。このシステムは、代表的に、サーモサイクラー、レーザー、電荷結合デバイス（ＣＣＤ）、カメラ、およびコンピュータから構成される。このシステムは、サーモサイクラー上の９６ウェルなどのマイクロタイタープレートフォーマット中のサンプルを増幅する。増幅の間、ウェルすべてについて、レーザー誘導蛍光シグナルが光ファイバーケーブルを通してリアルタイムで集められ、ＣＣＤカメラで検出される。このシステムは、機器の運転およびデータの解析のためのソフトウェアを含む。
【００４７】
Taqman法の具体的手順の他の例としては、例えば、CYP2D6について報告されたTaqmanアッセイを使用することができる（Bodin  et  al.,  J  Biomed  Biotechnol.  3:  248-53  2005）。この場合、必要に応じて正確なデータを得るために、Primer  Express等によって新たなリバースプライマーを設計し、コピー数分析を再度実施することもできる。Taqmanプローブは５’末端がFAMで標識され、３’末端にNo  Fluorescence  Quencher  およびMGBを連結したものを用いることができる。参照遺伝子として、適切な標識（例えば、VIC）で標識したRNase  P  assay(ThermoFisher)を使用することができる。全てのTaqmanアッセイを製造業者から入手され得る、報告されたプロトコールに従って実施し、コピー数計算をΔΔCt法によって実施することができる（Bodin  et  al.,  2005）。１つの例としては、ΔCt値の中央値を有するサンプルを２コピーと仮定し、キャリブレータとして使用することができるがこれに限定されない。全てのサンプルを２連で試験し、平均コピー数値を散布プロット分析で使用することができるが、サンプル数は必要に応じて増減することができる。
【００４８】
本開示におけるリアルタイムＰＣＲ試薬として、ＴａｑＰａｔｈＴＭ  ＰｒｏＡｍｐＴＭ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを使用することができる。ＴａｑＰａｔｈＴＭ  ＰｒｏＡｍｐＴＭ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘの特長としては、並外れたデータ品質（ＰＣＲ阻害物質の存在下でも、ジェノタイピングおよびコピー数多型（ＣＮＶ）解析において、高い特異性、ダイナミックレンジ、および再現性を提供できる）や、ＰＣＲ阻害物質に対する耐性（ヒトや動物由来の調製サンプル（頬腔スワブ、血液、およびカードパンチ）に対応可能であること）が挙げられる。本開示におけるＰＶＡスポンジの、血液またはその成分による増幅活性阻害効果の抑制と併せると、何ら抽出または精製を行わずに血液を反応に供することが可能である。例えば、リキッドバイオプシー（血液、血清、血漿、唾液等）を接触させたＰＶＡスポンジを、反応液に添加することもできる。本開示において、ＰＶＡスポンジから上清または血漿を得る工程は、必要に応じて、次の反応にＰＶＡスポンジを直接供する工程とすることができる。リキッドバイオプシーとの接触後、ＰＶＡスポンジは必要に応じて乾燥させることができる。
【００４９】
デジタルＰＣＲにおいては、核酸の混合物を、あるウェルは１個のターゲット分子を含む一方、他のウェルにはターゲットを含まない程度に多数の反応ウェルに分配する。各反応液で通常のＰＣＲを実施し、ターゲット分子を含まないウェルを同定する。標準的な統計モデルで補正計算を行い最終的な濃度の値を得ることができる。デジタルＰＣＲではコピー数の定量にＣｔ値を使用しないので、絶対定量において既知のスタンダードとの比較が不要となる。
【００５０】
（分析の対象）
本明細書において、「血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）」とは、原発腫瘍組織または転移腫瘍組織から上皮間葉転換（ＥＭＴ）を経て血中へ遊離し、血流中を循環する細胞を指す。原発腫瘍部位から遊離した後、ＣＴＣは血液内を循環し、その他の臓器を侵襲して転移性腫瘍（転移巣）を形成する。ＣＴＣはがん患者の末梢血に存在するため、これを検出することで転移の過程を判断し、治療の予後予測に役立てることが可能である。
【００５１】
本明細書において、「ｃｆＤＮＡ（セルフリーＤＮＡ）」とは、血液中の細胞死によって細胞から放出された遊離ＤＮＡを指す。その中で、がん細胞由来のＤＮＡを、「血中腫瘍ＤＮＡ（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒＤＮＡ，ｃｔＤＮＡ）」と称する。
【００５２】
現在、ｃｔＤＮＡは、臨床的に有用な腫瘍マーカーとして、体内腫瘍量のモニタリング、薬剤耐性遺伝子の判定および超早期がんの発見等に使用されている。体内腫瘍量のモニタリングは、現在は血清腫瘍マーカーが最も簡便なツールとして用いられることが多い。実際、腫瘍マーカーは再発がある程度進んだ場合や時系列の変動が治療を反映している場合は有用な補助診断ツールである。がん検診などで威力を発揮する可能性がある超早期がんの発見は、採血のみで高精度のがん検診を提供できるようになる可能性がある。採血に関する制約や、０．１％以下ともいわれる超低頻度変異を正確に計測するための技術の成熟など課題もある。しかしながら、将来的にはｃｔＤＮＡによって日常のがん診断が「見るもの」から「測るもの」へ変化してゆく可能性がある。
【００５３】
しかしながら、不安定なｃｔＤＮＡ研究を標準の技術とするためには、採血後２時間以内に血漿の遠心分離を行うこと、患者間、実験者間のバイアスを最小化すること、バイアス補正のため品質管理・定量、遺伝子検査プロセスの簡略化、コントロールに対する相対定量ではなく絶対定量を可能にすること、などの課題がある。ＰＶＡスポンジを用いたサンプリングは、迅速、簡便かつ安価であり、工程短縮による高い信頼性及び人件費削減、サンプル間のＤＮＡ品質格差の最小化、絶対定量（モニタリングには必須）、乾燥後の室温でサンプルの保存および輸送を可能にすることによって上記の課題の解決に有用である。
【００５４】
（好ましい実施形態）
本開示の一つの局面において、ＰＶＡスポンジを含む、ポリメラーゼの体液（例えば、血液または唾液）またはその成分による増幅活性阻害効果の抑制剤または抑制材料が提供される。この局面において、本開示はまた、ポリメラーゼの体液（例えば、血液または唾液）またはその成分による増幅活性阻害効果を抑制する方法であって、該体液またはその成分をＰＶＡスポンジに接触させる工程を包含する、方法をも提供する。
【００５５】
本開示の他の局面において、ＰＶＡスポンジを含む、微生物の捕捉剤または捕捉材料が提供される。この局面において、本開示はまた、微生物またはその一部を捕捉するための方法であって、該微生物またはその一部にＰＶＡスポンジを接触させる工程を包含する、方法をも提供する。
【００５６】
本開示の他の局面において、ＰＶＡスポンジを含む、核酸安定化剤または核酸安定化材料、あるいは、核酸の保存剤または保存材料が提供される。この局面において、本開示はまた、核酸を安定化するため、または保存するための方法であって、該核酸にＰＶＡスポンジを接触させる工程を包含する、方法をも提供する。
【００５７】
一つの好ましい実施形態では、ＰＶＡスポンジは、平均気孔径が約８０μｍ〜約２００μｍであってよい。加えて、またはそれに換えた実施形態では、ＰＶＡスポンジは、気孔率が８９％〜９１％であってよい。
【００５８】
一つの実施形態において、本開示では、上述の抑制剤または抑制材料を含む、リキッドバイオプシーのサンプリング剤またはサンプリング材料、あるいはそれを含むキット、そのための組成物あるいはそのための方法も提供され得る。キットは、核酸分析（例えば、遺伝子分析）のためのものであってよく、核酸分析は、核酸の増幅工程を含み得る。特に、キット、組成物および方法等は、循環核酸（例えば、循環無細胞核酸）の分析のためのものであり得る。
【００５９】
本明細書において、「循環核酸」とは、生体内（特に血中）を循環する核酸を言う。循環核酸のうち、細胞を含まないものを、本明細書において「循環無細胞核酸」という。本明細書において循環核酸は、例えば、腫瘍循環ＤＮＡまたは腫瘍循環ｍｉＲＮＡであり得る。本明細書において「腫瘍循環核酸」とは、循環核酸のうち、腫瘍に関連するかまたは関連することが疑われているものをいい、核酸がＤＮＡの場合は「腫瘍循環ＤＮＡ」ともいい、核酸がｍｉＲＮＡの場合は「腫瘍循環ｍｉＲＮＡ」ともいう。
【００６０】
一つの実施形態において、本開示のキット、組成物および方法等は、体内腫瘍量のモニタリング、薬剤耐性遺伝子の判定、がんの早期検出、または再発モニタリングのために用いることができる。加えて、またはそれに換えて、循環核酸は、ｃｆＤＮＡであり得る。このような場合、本開示のキット、組成物および方法等は、出生前診断、染色体異常の検出、または新生児スクリーニングのために用いられ得る。本開示のキット、組成物および方法等は、ウイルス感染の検出のためにも使用し得る。また、本開示のキットは、核酸の絶対定量を行うためにも使用し得る。絶対定量は、デジタルＰＣＲによって行われるものであり得る。
【００６１】
本開示のキット、組成物および方法等は、血中循環腫瘍細胞を捕捉するためのものであり得る。そのようなキット、組成物および方法等は、がんの予後予測、または薬物治療法の再検討のために使用し得る。本開示のキット、組成物および方法等は、デジタルＰＣＲを用いて腫瘍細胞数を定量するためにも使用し得る。核酸分析は、デジタルＰＣＲを含み得る。
【００６２】
本明細書において「デジタルＰＣＲ」とは、核酸の検出および定量のための方法であって、内部標準または内因性コントロールに頼らず、標的分子数を直接カウントすることで実現される方法をいう。
【００６３】
本開示のキット、組成物および方法等は、口腔内または血液中の細菌またはウイルスの絶対定量のためにも用い得る。絶対定量の手法は、当技術分野において公知であり、代表的に、標準サンプルを用いて検量線を作成し、未知サンプルの絶対量を測定する方法により実現することができる。通常、絶対量（コピー数）が既知で、未知サンプルと同じ配列を持った標準サンプルが必要である。例えば、タカラバイオから入手可能なBacteria(tufgene) Quantitative PCR Kit等を用いることができるがこれらに限定されない。
【００６４】
本開示のキット、組成物および方法等は、血液由来の核酸の保存のために用いることができる。また、本開示のキット、組成物および方法等は、血液から血漿を分離し、保存するためにも用い得る。
【００６５】
一つの別の局面において、本開示では、ＰＶＡスポンジを用いることを特徴とする、リキッドバイオプシーのサンプリング方法が提供され得る。方法は、
ＰＶＡスポンジを、リキッドバイオプシーと接触させる工程と、
ＰＶＡスポンジから水中で核酸試料を分離させ、上清を得る工程と、
上清を遺伝子分析に供する工程と
を含み得る。方法は、上記接触させる工程の後に、ＰＶＡスポンジを乾燥させる工程をさらに含み得る。加えて、上記上清を得る工程は、ＰＶＡスポンジを水中で加熱し、核酸試料を分離させることを含んでもよい。ＰＶＡスポンジとリキッドバイオプシーとの接触は、ＰＶＡスポンジをリキッドバイオプシーに浸漬することによってもよい。また、かかる方法において用いるための組成物またはキットも提供され得る。
【００６６】
本開示において、サンプルの濃縮方法が提供され得る。方法は、
ＰＶＡスポンジを、リキッドバイオプシーと接触させる工程と、
ＰＶＡスポンジから水中で核酸試料を分離させ、上清を得る工程と、
上清を凍結乾燥する工程と
凍結乾燥した上清を水に溶解させる工程と
を含み得る。方法は、上記接触させる工程の後に、ＰＶＡスポンジを乾燥させる工程をさらに含み得る。加えて、上記上清を得る工程は、ＰＶＡスポンジを水中で加熱し、核酸試料を分離させることを含んでもよい。ＰＶＡスポンジとリキッドバイオプシーとの接触は、ＰＶＡスポンジをリキッドバイオプシーに浸漬することによってもよい。また、かかる方法において用いるための組成物またはキットも提供され得る。
【００６７】
また、本開示において、ＰＶＡスポンジを用いた付着血のサンプリング方法が提供される。方法は、
ＰＶＡスポンジを、乾燥付着血と接触させる工程と、
ＰＶＡスポンジから水中で核酸試料を分離させ、上清を得る工程と、
上清を遺伝子分析に供する工程と
を含み得る。加えて、上記上清を得る工程は、ＰＶＡスポンジを水中で加熱し、核酸試料を分離させることを含んでもよい。また、かかる方法において用いるための組成物またはキットも提供され得る。
【００６８】
また、本開示において、微生物を定量的に分析または捕捉する方法が提供される。方法は、
一定体積のＰＶＡスポンジを分析または捕捉対象の微生物を含む試料に接触させる工程と、
該一定体積のＰＶＡスポンジから、該微生物またはその成分を分離する工程と、
必要に応じて、該微生物またはその成分を分析する工程と
を含み得る。加えて、上記分離する工程は、ＰＶＡスポンジを水中で加熱し、微生物またはその成分を分離させることを含んでもよい。成分は、例えば、微生物中の核酸であり得る。また、かかる方法において用いるための組成物またはキットも提供され得る。さらに、行う分析は、本明細書の他の箇所に記載される任意の分析であり得る。分析により、例えば、感染症の診断、例えば、敗血症の診断などを行うことができる。
【００６９】
さらなる局面において、本開示は、血漿または血清中の循環核酸の分析のための、ＰＶＡスポンジを含むサンプリング剤またはサンプリング材料を提供し得る。また、本開示において、血漿または血清中の循環核酸の分析のための、かかるサンプリング剤またはサンプリング材料を含むキットも提供され得る。血漿または血清中の循環核酸の分析は、定量的分析であり得る。循環核酸は、腫瘍循環核酸であり得る。ＰＶＡスポンジは、血漿または血清の添加後、核酸を遊離させることなく、直接ＰＶＡスポンジをＰＣＲ等の反応液に添加し、血漿または血清中の核酸の分析（例えば、定量反応）を行うことができる。核酸を遊離させる工程を用いないことは、分析の対象となる核酸の全量をより正確に反映し、定量において非常に有利となり得る。
【００７０】
本開示において、血漿または血清中の循環核酸の分析を行う方法であって、ＰＶＡスポンジを血漿または血清と接触させる工程と、ＰＶＡスポンジを遺伝子分析に供する工程とを含む、方法が提供され得る。方法において、ＰＶＡスポンジは、直接ＰＣＲ等の反応に供することができる。また、かかる方法において用いるための組成物またはキットも提供され得る。さらに、行う分析は、本明細書の他の箇所に記載される任意の分析であり得る。分析により、腫瘍のモニタリング、超早期発見、薬剤効果モニタリングなどを行うことができる。
【００７１】
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Sambrook  J.  et  al.(1989).  Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual,  Cold  Spring  Harborおよびその3rd  Ed.(2001);  Ausubel,  F.M.(1987).Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Greene  Pub.  Associates  and  Wiley-Interscience;  Ausubel,  F.M.(1989).  Short  Protocols  in  Molecular  Biology:  A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Greene  Pub.  Associates  and  Wiley-Interscience;  Innis,  M.A.(1990).PCR  Protocols:  A  Guide  to  Methods  and  Applications,  Academic  Press;  Ausubel,  F.M.(1992).Short  Protocols  in  Molecular  Biology:  A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Greene  Pub.  Associates;  Ausubel,  F.M.  (1995).Short  Protocols  in  Molecular  Biology:  A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Greene  Pub.  Associates;  Innis,  M.A.  et  al.(1995).PCR  Strategies,  Academic  Press;  Ausubel,  F.M.(1999).Short  Protocols  in  Molecular  Biology:  A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Wiley,  and  annual  updates;  Sninsky,  J.J.  et  al.(1999).  PCR  Applications:  Protocols  for  Functional  Genomics,  Academic  Press、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、1997などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【００７２】
人工的に合成した遺伝子を作製するためのDNA合成技術および核酸化学については、例えば、Gait,  M.J.(1985).  Oligonucleotide  Synthesis:  A  Practical  Approach,  IRL  Press;  Gait,  M.J.(1990).  Oligonucleotide  Synthesis:  A  Practical  Approach,  IRL  Press;  Eckstein,  F.(1991).  Oligonucleotides  and  Analogues:  A  Practical  Approach,  IRL  Press;  Adams,  R.L.  et  al.(1992).  The  Biochemistry  of  the  Nucleic  Acids,  Chapman  &  Hall;  Shabarova,  Z.  et  al.(1994).Advanced  Organic  Chemistry  of  Nucleic  Acids,  Weinheim;  Blackburn,  G.M.  et  al.(1996).  Nucleic  Acids  in  Chemistry  and  Biology,  Oxford  University  Press;  Hermanson,  G.T.(I996).  Bioconjugate  Techniques,  Academic  Pressなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【００７３】
本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも１つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「２つの値」の「範囲内」と明記した場合、その範囲には２つの値自体も含む。
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【００７４】
以上、本開示を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本開示を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本開示を限定する目的で提供したのではない。従って、本開示の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【００７５】
（実施例１：ＰＶＡスポンジによる増幅阻害の抑制）
下記の実験により、ＰＶＡスポンジによる血液中の阻害物質による増幅阻害の抑制を実証する。【００７６】
（実施例１Ａ：マウス血清ヒトゲノムＤＮＡ添加回収実験）
［実験］
直径４ｍｍ厚み３ｍｍのＰＶＡスポンジＦ（Ｄ）又は水溶紙１２０ＭＤＰにマウス血清１０μＬを浸漬した。約１時間自然乾燥後、スポンジ又は水溶紙に１０５、１０４、１０３、１０２コピー／１０μＬのヒトゲノムＤＮＡを添加して、一昼夜、自然乾燥した。各サンプルに、ＤＷ１００μＬを加え、９５℃で５ｍｉｎ加熱した。加熱後サンプルを３０００ｒｐｍで５分間遠心した。各上清５μＬをＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘに加えて、増幅反応を行なった。【００７７】
（コントロールゲノムＤＮＡの調整）
Ｐｒｏｍｅｇａ社製  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  を購入し、ウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｃｅｌｓ．ｕｒｉ．ｅｄｕ／ｇｓｃ／ｃｎｄｎａ．ｈｔｍｌ）より原液のコピー数を算出し、１０５〜１０２コピー数のコントロール溶液を調整した。【００７８】
（マウス血清添加コントロールサンプルの作成）
直径４ｍｍのスポンジ又は水溶紙にマウス血清１０ｍＬを浸漬した。約１時間自然乾燥。マウス血清を浸漬したスポンジ又は水溶紙に１０５〜１０２コピー／１０μＬのヒトゲノムＤＮＡを添加して、一昼夜、自然乾燥した。【００７９】
（ＰＣＲ条件）
（１）ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ  Ｐｒｏｂｅ  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘ（東洋紡）使用の場合
【表２】
2020149301.tif 000003
（２）ＴａｑＰａｔｈ  ｑＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）使用の場合
【表３】
2020149301.tif 000004
【表４】
2020149301.tif 000005
【００８０】
［結果］
それぞれのサンプルの増幅の結果を、図１および図２に示す。ＰＶＡスポンジを用いた場合、血清中に添加したヒトゲノムＤＮＡはＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ、ＴａｑＰａｔｈ共にＲＮａｓｅ  Ｐ遺伝子の増幅が可能であるが、水溶紙では、遺伝子増幅阻害物質に寛容なＴａｑＰａｔｈのみ増幅可能であった。【００８１】
［考察］
ＰＶＡスポンジは、血清中のＰＣＲ反応阻害物質をトラップ（捕捉）し、ヒトゲノムＤＮＡ中のＲＮａｓｅ  Ｐ遺伝子の増幅を阻害しない。従来の血清中の浮遊ＤＮＡ抽出・精製方法を行う事なく、血清中の浮遊ＤＮＡの遺伝子増幅、ＴａｑＭａｎ  Ｐｒｏｂｅによる検出が可能である事が証明できた。【００８２】
（実施例１Ｂ：ＰＶＡスポンジ又は水溶紙サンプルの反応液直接添加）
［実験］
厚み３ｍｍのＰＶＡスポンジＦ（Ｄ）又は水溶紙１２０ＭＤＰに、それぞれに末梢血滴下またはスワブで採取した口腔内粘膜細胞を含む唾液塗布後、一昼夜乾燥した（約１６時間）。スポンジ又は水溶紙を直径２ｍｍでパンチした試料をＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘに加えて、ヒトゲノムＤＮＡ中のＲＮａｓｅ  Ｐ遺伝子増幅反応を行なった。【００８３】
サンプリングは、ＤＮＡ捕捉のために、ＰＶＡスポンジＦ（Ｄ）または１２０ＭＤＰ水溶紙のディスク径：２ｍｍΦのディスクを使用し、図３に示されるサンプリング方法にしたがって行った。ＰＣＲに供する反応液量は、２５μＬであった。
【表５】
2020149301.tif 000006
【表６】
2020149301.tif 000007
【００８４】
［結果］
増幅結果は図３に示される。ＰＶＡスポンジＦ（Ｄ）は血液・唾液共にＲＮａｓｅ  Ｐ遺伝子増幅が観察されるが、水溶紙ＭＤＰ１２０の場合、阻害の少ない唾液は遺伝子増幅しているものの、血液では全く増幅が観察されない。【００８５】
［考察］
ＰＶＡスポンジは、血液・唾液共に水溶紙１２０ＭＤＰよりもＰＣＲ反応阻害物質の捕捉、増幅反応の抑制効果が高い。さらには、ＰＶＡスポンジ小片（２ｍｍφ、厚み３ｍｍ）を反応液に加えても、増幅反応阻害ならびにＴａｑＭａｎプローブから発する蛍光を検出するリアルタイムＰＣＲ  装置システムの光路阻害が観察されない。ＰＶＡスポンジ小片を直接ＰＣＲ反応液に添加して、増幅反応の可能性が示唆された。【００８６】
（実施例１Ｃ：血清処理ＰＶＡスポンジの反応阻害試験）
［実験］
未処理ＰＶＡスポンジＦ（Ｄ）をＰＣＲ反応液に直接添加した場合の増幅反応阻害、測定系光路妨害の有無に関する実験。ＰＣＲ反応液にゲノムＤＮＡ  ５．０ｘ１０４ｃｏｐｙを添加したＭａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを調整し、２５μＬには直径２ｍｍｘ厚み３ｍｍのＰＶＡスポンジを、５０μＬ系には直径４ｍｍｘ厚み３ｍｍのＰＶＡスポンジを添加してＲＮａｓｅ  Ｐ遺伝子増幅反応を行なった。サンプリングのプロセスは図４に示される。
【表７】
2020149301.tif 000008
【表８】
2020149301.tif 000009
【００８７】
［結果］
結果を図４に示す。無添加の（１）、（３）に比べスポンジ添加により、Ｃｔ値が同レベル或は低くなる傾向が観察された。増幅曲線のＣｔ（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｃｙｃｌｅ）値をＰＶＡスポンジ無添加のコントロールと比較すると、反応液中のＰＶＡスポンジＦ（Ｄ）の存在は、ＰＣＲ反応および光路を阻害しない。【００８８】
［考察］
ＰＶＡスポンジ小片（４ｍｍまたは２ｍｍφ、厚み３ｍｍ）を反応液に加えても、増幅反応阻害ならびにＴａｑＭａｎプローブから発する蛍光を検出するリアルタイムＰＣＲ  装置システムの光路阻害が観察されない。ＰＶＡスポンジ小片を直接ＰＣＲ反応液に添加して、増幅反応の可能性が示唆された。【００８９】
（実施例１Ｄ：血清処理ＰＶＡスポンジの反応阻害試験）
［実験］
血清処理ＰＶＡスポンジＦ（Ｄ）をＰＣＲ反応液に直接添加した場合の増幅反応阻害、測定系光路妨害の有無に関する実験。ＰＣＲ反応液にゲノムＤＮＡ５．０ｘ１０４ｃｏｐｙを添加したＭａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを調整し、２５μＬには直径２ｍｍｘ厚み３ｍｍの血清処理ＰＶＡスポンジを、５０μＬ系には直径４ｍｍｘ厚み３ｍｍの血清処理ＰＶＡスポンジを添加してＲＮａｓｅ  Ｐ遺伝子増幅反応を行なった。サンプリングのプロセスは図５に示される。【００９０】
サンプリングの条件は以下のとおりであった。
時間：０、１、２、４ｈｒ
ＰＶＡ：４ｍｍΦまたは２ｍｍΦディスク
方法：ＰＶＡを血清中に浸漬
浸漬液量：約２５μＬ又は約５μＬ
乾燥：翌朝まで約１６時間
【表９】
2020149301.tif 000010
【表１０】
2020149301.tif 000011
【００９１】
［結果］
結果を図５に示す。血清処理スポンジの（２）、（４）は非添加に比べ、Ｃｔ値が大きくなり阻害が認められた。しかし、阻害レベルはディスク径を小さく（血清量小）すると低くなった。増幅曲線のＣｔ（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｃｙｃｌｅ）値をＰＶＡスポンジ無添加のコントロールと比較すると、反応液中の血清処理ＰＶＡスポンジＦ（Ｄ）の存在はＰＣＲの遺伝子増幅反応阻害が観察される。【００９２】
［考察］
血清処理ＰＶＡスポンジ小片（４ｍｍまたは２ｍｍφ、厚み３ｍｍ）を反応液に加えると増幅反応阻害が観察されたが、反応液量とＰＶＡスポンジサイズ、血清の前処理プロセスを検討する事で本反応を最適化する可能性が示された。【００９３】
（実施例１−１：血清採取デバイス１）
本開示の実施形態の１つの例が、図６に示される。親水性スポンジ（例えば、ＰＶＡスポンジ）を、一定の直径の円柱状（例えば、４ｍｍφ）にし、持ち手としてのプラスチック棒を取り付けたデバイスを提供する。スポンジの厚みを調整して、スポンジによって保持される液量を１００μＬなど一定に調整することができる。【００９４】
エッペンドルフチューブ中で血液を分離させ、血清部分にデバイスのスポンジ部分を数秒間浸漬する。その後デバイスを取り出し、乾燥させる。乾燥後、蒸留水にスポンジを浸漬する。例えば、エッペンドルフチューブ中で行うことができる。スポンジを押し下げて密封し、９５℃で５分熱処理し、５０００ｒｐｍで５分遠心分離する。その後、上清５μＬをＰＣＲに供する。【００９５】
このようにしてサンプルを提供し、腫瘍循環ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）の検出、腫瘍循環ｍｉＲＮＡの検出、ｃｆＤＮＡの検出（出生前診断）、ウイルス感染（ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶなど）の検出などを行うことができる。【００９６】
（実施例１−２：血清採取デバイス２）
本開示の好ましい実施形態の例が、図７に示される。血清（または血漿）サンプリングデバイスは、ＰＶＡスポンジを備える冶具と、それを収納するチューブ状の本体とを備え、本体は、キャップ、フィルター、ノズルを備える。全血または血清にＰＶＡスポンジを浸漬し、ＰＣＡで吸い上げる。その後、ＰＶＡを乾燥させる。乾燥は自然乾燥でも良いが、シリカゲルを用いて乾燥することもできる。乾燥させたＰＶＡを、デバイス中で蒸留水に浸漬し、キャップを閉め、９５℃で５分間加熱する。その後、冶具を押すことで、フィルターを通してノズルから、蒸留水の上清を押し出す。上清を分注、凍結乾燥、濃縮などすることができる。また、押し出される上清の体積を調整し、１０μＬ±０．５μＬ等に一定にすることができる。この一定体積の上清を、ＰＣＲ反応液に入れ、デジタルＰＣＲなどに供することができる。【００９７】
これにより、腫瘍循環ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）の検出、腫瘍循環ｍｉＲＮＡの検出、ｃｆＤＮＡの検出（出生前診断）、ウイルス感染（ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶなど）の検出などを行うことができる。【００９８】
（実施例２：ＰＶＡスポンジによる細胞の捕捉）
（実施例２Ａ：ＰＶＡディスク中白血球細胞の安定性）
［実験］
ランセットを使用して指先から採取した末梢血１０μＬをＰＢＳ＋１ｍＭＥＤＴＡ１０μＬで希釈したサンプルをＰＶＡ４ｍｍφディスクに滴下し、密封容器（エッペンドルフチューブ）内、室温でインキュベーション（０、１、２、４、８時間）した。各時間経過したＰＶＡディスクは室温で一晩乾燥後、ディスクを下記の手順で処理した。【００９９】
蒸留水５０μｌに浸漬し、９５℃，５分間加熱後、３０００ｒｐｍ，３分間、遠心分離して得られた上清５μＬをＰＣＲマスターミックスに添加してＲＮａｓｅ  Ｐ遺伝子増幅反応を実施した。【０１００】
［結果］
結果を図８に示す。増幅曲線のＣｔ（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｃｙｃｌｅ）値から、０〜２時間以内のインキュベーションではほぼ同等の遺伝子増幅（ΔＣｔ：約１サイクル）であり、４時間ではΔＣｔ：約３サイクル遅れて増幅する。８時間では全く増幅反応は観察されなかった。【０１０１】
［考察］
全血中の白血球細胞のＰＶＡスポンジへの接着は２時間で最大となり、その後、分解、８時間で消失すると考えられる。ＰＶＡスポンジに浸漬した末梢血は２時間以内に乾燥工程に入るのが望ましく、浸漬後速やかに乾燥工程に入るプロセスが好ましいことが実証できた。【０１０２】
（実施例２Ｂ：ＰＶＡスポンジの選択）
［実験］
（サンプル調整）
ＰＶＡスポンジＤ（Ｄ）、Ｅ（Ｄ）、Ｆ（Ｄ）、Ｙ（Ｄ）を使用して、各ＰＶＡの４ｍｍφＤｉｓｋに末梢血５μＬを滴下し、一晩乾燥した。【０１０３】
（ＰＶＡスポンジＰＢＳ洗浄）
乾燥した各ＰＶＡスポンジディスクをＰＢＳ２００μＬに浸漬し、ボルテックス後ディスクを取り除く。上清のＰＢＳ溶液を９５℃、５分間加熱後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分間）した上清１μＬを４μＬの蒸留水で希釈して、ＰＣＲマスターミックスに添加してＲＮａｓｅ  Ｐ遺伝子増幅反応を実施した。【０１０４】
（ＰＢＳ洗浄ＰＶＡスポンジディスク処理）
各ディスクをＤＷ２００μＬに浸漬、ボルテックス後、９５℃、５分間加熱、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分間）した上清５μＬをＰＣＲマスターミックスに添加してＲＮａｓｅ  Ｐ遺伝子増幅反応を実施した。【０１０５】
［結果］
結果を図９に示す。
ＰＶＡスポンジＰＢＳ洗浄上清ＰＣＲ遺伝子増幅：Ｄｓ、Ｅｓ、Ｆｓ、Ｙｓ
ＰＢＳ洗浄ＰＶＡスポンジディスク処理上清ＰＣＲ遺伝子増幅：Ｄｄ、Ｅｄ、Ｆｄ、Ｙｄ【０１０６】
遺伝子増幅の結果について、ＰＶＡスポンジの種類による差は見出せなかった。Ｃｔ値からＰＢＳ洗浄液に遊離した白血球細胞よりもＰＶＡスポンジに大部分の白血球細胞が接着していることが理解される。【０１０７】
［考察］
ＰＶＡスポンジは、細胞を接着する性能を持つことが証明された。【０１０８】
（実施例２Ｃ：ＰＶＡディスク全血保持量）
［実験］
ＰＶＡスポンジ（Ｆ（Ｄ）４ｍｍφｘ３ｍｍＴ）ディスクに末梢血２、５、１０、２０μＬを滴下し、一晩乾燥後、ディスクを下記の手順で処理した。【０１０９】
乾燥した各ＰＶＡスポンジディスクを蒸留水２００μＬに浸漬し、９５℃、５分間加熱後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、３分間）した上清５μＬをＰＣＲマスターミックスに添加してＲＮａｓｅ  Ｐ遺伝子増幅反応を実施した。【０１１０】
［結果］
結果を図１０に示す。ＰＶＡスポンジに滴下した末梢血液量に依存し、定量的増幅曲線のＣｔ値が観察された。【０１１１】
［考察］
ＰＶＡスポンジ（Ｆ（Ｄ）４ｍｍφｘ３ｍｍＴ）の最大血液吸収量は２５μＬまで、血液成分によるＰＣＲ遺伝子増幅反応阻害は無いことが推察される。従って、ＰＶＡスポンジの最大吸水量まで液体検体（リキッドバイオプシー）を吸収させ、検体中のＤＮＡを検出するデバイスとして適していることが証明出来た。【０１１２】
（実施例２Ｄ：ＰＶＡスポンジによる唾液中の白血球・剥離上皮細胞捕捉）
［実験］
口腔内の唾液腺付近に分泌する唾液をエッペンドルフチューブにスポイドを使用して採取し、唾液サンプル中にＰＶＡＦ（Ｄ）２ｍｍφｘ３ｍｍＴディスク４個を浸漬させた。室温でインキュベーション（それぞれ０、０．５、１および２時間）した。各時間経過したＰＶＡディスクは室温で一晩乾燥後、ディスクを下記の手順で処理した。乾燥したＰＶＡスポンジディスクは、直接、ＰＣＲ  マスターミックスに添加してＲＮａｓｅ  Ｐ遺伝子増幅反応を実施した。２ｍｍΦのＰＶＡスポンジの唾液浸透量は約５μＬであり、唾液中の細胞成分は、白血球：１０２〜１０４ｃｅｌｌｓ／μＬ、剥離上皮細胞：１０２〜１０４ｃｅｌｌｓ／μＬとされているため、捕獲量は約１０５ｃｅｌｌｓ／ＰＶＡ  ｄｉｓｋと考えられる。
【表１１】
2020149301.tif 000012
【表１２】
2020149301.tif 000013
【０１１３】
［結果］
結果を図１２に示す。増幅曲線のＣｔ（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｃｙｃｌｅ）値から、０〜２時間以内のインキュベーションで、増幅曲線のＣｔ値が小さくなっていた。０時間：３０サイクル、０．５時間：２９サイクル、１時間：２８サイクル、２時間：２７サイクル、結果から捕獲細胞数は倍々で増えていた。【０１１４】
［考察］
継時的に捕獲細胞数が増えていることから、白血球・剥離上皮細胞はＰＶＡに接着することが推察される。唾液においてもＰＶＡスポンジが細胞接着能力を有することが証明出来た。理論に拘束されるものではないが、ＰＶＡが細胞の足場になっているとも考えられる。【０１１５】
本方法は、口腔内にＰＶＡスポンジを含み、それを乾燥後に遺伝子分析に供することによって、生涯変わらない生殖細胞系列の遺伝子分析を行うのに適している。【０１１６】
血液と同様にポリメラーゼの増幅反応を阻害することが判明している唾液でも同様にＰＶＡスポンジによる抑制効果があることが分かった。【０１１７】
（実施例２Ｅ：ＰＶＡスポンジを用いた口腔内ダイレクトサンプリング）
［実験］
ボランティア８名は、ＰＶＡ  スポンジディスク（Ｆ（Ｄ）２ｍｍφｘ３ｍｍＴ）を舌下の唾液腺付近に約１分間含ませ、取り出した後、一晩乾燥した。乾燥したＰＶＡスポンジディスクは、直接、ＰＣＲ  マスターミックスに添加してＲＮａｓｅ  Ｐ遺伝子増幅反応を実施した。
【表１３】
2020149301.tif 000014
【表１４】
2020149301.tif 000015
【０１１８】
［結果］
結果を図１３に示す。８名の増幅曲線のＣｔ（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｃｙｃｌｅ）値は２９〜３２サイクルに観察され、コントロールゲノムＤＮＡとの比較から、唾液中の白血球・剥離上皮細胞からＰＶＡスポンジで捕捉できた細胞数は約１０４ｃｅｌｌｓであった。全血の場合、２ｍｍΦのＰＶＡスポンジ口腔内と水溶紙（１２０ＭＤＰ）の差は小さかった。【０１１９】
［考察］
本方法は、口腔内にＰＶＡスポンジを含み、乾燥させるという簡便なサンプリングによって、生涯変わらない生殖細胞系列の遺伝子分析に適したサンプルを調製することができることが実証できた。【０１２０】
また、通常個人ごとに唾液内の細胞量は大きく異なっているが、上述のとおり、８名の増幅曲線のＣｔ値は一定の範囲に収まった。理論に束縛されることを望まないが、ＰＶＡスポンジが、その空隙内に一定量の細胞を捕捉したことによって、唾液中の細胞量に依存せず、スポンジの体積あたり一定量の細胞を回収できたと考えられる。そのため、ＰＶＡスポンジのこのような性質は、微生物を含む試料中から、一定量の微生物を回収することを可能にし、それによって、サンプル間の比較を容易にすると考えられる。【０１２１】
（実施例２−１：唾液サンプリングプロセス）
本開示の好ましい実施形態の例が、図１４に示される。唾液サンプリングデバイスは、ＰＶＡスポンジを備える冶具と、それを収納するチューブ状の本体とを備え、本体は、キャップ、フィルター、ノズルを備える。サンプリングデバイスのＰＶＡスポンジで口腔内の唾液腺付近を軽く擦る。ＰＶＡスポンジをシリカゲルによって乾燥させる。乾燥後、デバイス内で蒸留水に浸漬し、キャップをして９５℃で５分間加熱する。冶具を押し下げ、フィルターを通してノズルから、蒸留水の上清を押し出す。上清を分注、凍結乾燥、濃縮などすることができる。また、押し出される上清の体積を調整し、１０μＬ±０．５μＬ等に一定にすることができる。この一定体積の上清を、ＰＣＲ反応液に入れ、デジタルＰＣＲなどに供することができる。【０１２２】
これにより、デジタルＰＣＲを用いた口腔内細菌・ウイルスの絶対定量、次世代シークエンサーを用いた生殖系細胞の配列解析、遺伝子変異解析によるＳＮＰまたはＣＮＶの検出などを行うことができる。【０１２３】
（実施例２−２：がん細胞サンプリングプロセス）
本開示の好ましい実施形態の例が、図１５に示される。唾液サンプリングデバイスは、ＰＶＡスポンジを備える冶具と、それを収納するチューブ状の本体とを備え、本体は、キャップ、フィルター、ノズルを備える。【０１２４】
がん細胞塊をトリプシン処理する。トリプシン処理を行った反応液にＰＶＡスポンジを浸漬する。ＰＶＡスポンジをシリカゲルによって乾燥させる。乾燥後、デバイス内で蒸留水に浸漬し、キャップをして９５℃で５分間加熱する。冶具を押し下げ、フィルターを通してノズルから、蒸留水の上清を押し出す。上清を、ＰＣＲ等の反応に供する。【０１２５】
これにより、デジタルＰＣＲを用いた正常細胞とがん細胞との間のコピー数の比較や、次世代シークエンサーによる網羅的がん関連遺伝子変異解析を行うことができる。【０１２６】
（実施例２−３：固形腫瘍細胞の迅速遺伝子検査）
本開示の好ましい実施形態の例が、図１６に示される。がん細胞塊をトリプシン処理する。トリプシン処理を行った反応液にＰＶＡスポンジを投入する。例えば、スポンジは、気孔サイズが２００μｍである。その後、ＰＶＡスポンジを取り出し、蒸留水に浸漬する。９５℃，５分間加熱後、３０００ｒｐｍ，３分間、遠心分離して上清を得る。上清を遺伝子分析に供する。例えば、上清５μＬを、ＰＣＲマスターミックスと混合し、ＰＣＲ反応などを行うことができる。【０１２７】
これにより、デジタルＰＣＲを用いた正常細胞とがん細胞との間のコピー数の比較や、次世代シークエンサーによる網羅的がん関連遺伝子変異解析を行うことができる。【０１２８】
（実施例２−４：固形腫瘍細胞の薬剤選択性試験）
本開示の好ましい実施形態の例が、図１７に示される。がん細胞塊をトリプシン処理する。トリプシン処理を行った反応液にＰＶＡスポンジを投入する。例えば、ＰＶＡスポンジは２ｍｍφのディスクである。がん細胞を付着させたディスクと、正常細胞を付着させたディスクとを抗がん剤添加培地で培養する。その後ディスクを乾燥させ、ＰＣＲ反応に供する。細胞の生死をＴａｑｍａｎ  ＰＣＲ法で判定し、腫瘍細胞の薬剤選択性を試験する。【０１２９】
（実施例３：ＤＮＡ安定性試験）
［概要］
リキッドバイオプシーを用いた遺伝子検査の場合、白血球または剥離上皮細胞などの細胞死（ネクローシス（細胞壊死）とアポトーシス（積極的、機能的細胞死）により、浮遊ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）が増加するため、２時間以内に血清（血漿）に調整することが一般的である。そこで、血清中の遊離ＤＮＡの安定性について、ゲノムＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡを添加して、ＰＶＡスポンジを用いてその安定性について検討した。検討の手法は、図１８においても図示されている。【０１３０】
［材料および方法］
（ゲノムＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡ血清溶液の調製）
ゲノムＤＮＡは市販（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ：Ｐｒｏｍｅｇａ社製）の溶液を調整して使用した。プラスミドＤＮＡは、市販のレトロウイルス由来のプラスミドにアルコール代謝酵素遺伝子ＡＤＨ１Ｂをコードした遺伝子断片を挿入し、大腸菌の遺伝子組み換え体を培養して抽出・精製した。それぞれ、以下の手順で調整した。
（１）１．０ｘ１０６ｃｏｐｙ／２０μＬ（ＤＷ）調整
（２）市販血清（正常ヒト血清・プール：コスモバイオ）又は蒸留水１８０μＬで稀釈
（３）１．０ｘ１０６ｃｏｐｙ／２００μＬを調整して安定性試験を実施した。
（４）３７℃でインキュベーション【０１３１】
（サンプリング）
ＰＶＡスポンジ：４ｍｍφディスク
方法：ＰＶＡディスクを、血清またはコントロールの蒸留水で調整した溶液に浸漬
浸漬時間：０、１、２、４ｈｒ
浸漬液量：約２０μＬ
乾燥時間：翌朝まで約１６時間【０１３２】
（ゲノムＤＮＡ抽出）
（１）ＤＷ１００μＬ中にディスク浸漬
（２）９５℃、５分間加熱
（３）５０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ
（４）５μＬをＰＣＲマスターミックスへ
（５）ＰＣＲ反応に添加された理論的ＤＮＡ添加量は計算上５ｘ１０２ｃｏｐｙ
【表１５】
2020149301.tif 000016
【表１６】
2020149301.tif 000017
【０１３３】
［結果］
結果を図１９および２０に示す。増幅曲線のＣｔ（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｃｙｃｌｅ）値から、０〜４時間以内のインキュベーションで、増幅曲線のＣｔ値の変化はいずれも殆ど観察されなかった。【０１３４】
［考察］
血清中に添加されたゲノムＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡは、４時間以内では安定に存在することが証明出来た。血清（血漿）分離後に含まれる遊離ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）は比較的安定であることが証明出来た。安定性は、プラスミドＤＮＡがゲノムＤＮＡより大きかった。【０１３５】
（実施例３−１：血漿分離・保存）
フィルター血漿分離デバイスにおけるフィルター（例えば、ろ紙）の部分をＰＶＡスポンジに置き換えたデバイスを提供する。その他の構成は、市販の血漿分離デバイス（例えば、ワトソン、深江化成）に従ったものでよい。【０１３６】
全血をフィルター部分に滴下し、血漿成分を分離させたあと、生検パンチ（貝印）で小片をパンチする。小片を反応液に添加し、ＰＣＲ等の遺伝子増幅反応に使用することができる。【０１３７】
（実施例４：血清処理ＰＶＡスポンジ調整液の凍結乾燥）
［実験］
実験の手順は、図２１に示される。より詳細には、以下の手順で実験を行った。【０１３８】
（実験条件）
（１）ゲノムＤＮＡ：２５μＬの１ｘ１０４ｃｏｐｙ／μＬ溶液をＤＷでｘ２（５０μＬ）に調整する。
（２）血清２５μＬで処理したＰＶＡスポンジを乾燥、上記調整溶液に浸漬する。
（３）９５℃，５分間処理後、３０００ｒｐｍ遠心
（４）上清１０μＬをＰＣＲへ
（５）残りの上清約３０μＬを凍結乾燥
（６）凍結乾燥後、残渣を２０μＬのＤＷで溶解
（７）１０μＬをＰＣＲに使用する。
【表１７】
2020149301.tif 000018
【表１８】
2020149301.tif 000019
【０１３９】
［結果］
結果を図２１に示す。血清処理ＰＶＡスポンジ調整液は凍結乾燥後、再溶解サンプルとしてＰＣＲに使用しても問題なく増幅が生じた。【０１４０】
［考察］
血清処理ＰＶＡスポンジ調整液の上清は凍結乾燥後、より少量のＤＷで溶解することにより、２倍〜１０倍濃縮出来ることが示唆された。ＰＶＡは固形のスポンジなので、上清を容易に分離する事が出来る。ＰＣＲ反応阻害物は、ＰＶＡスポンジトラップおよび沈殿物として容易に除去できていると考えられる。【０１４１】
（実施例５：繊維・紙・テーブル乾燥付着血の検出）
［実験］
（サンプル処理）
蒸留水を含ませたＰＶＡ４ｍｍφディスクで繊維・テーブルに付着した血液をふき取り、下記の条件で処理した。
ＤＷ２００μＬ／９５℃，５ｍｉｎ加熱／遠心（３０００ｒｐｍ，３ｍｉｎ）／Ｓａｍｐｌｅ上清５μＬ→ＰＣＲ【０１４２】
［結果］
結果を図２２に示した。【０１４３】
［考察］
ＰＶＡのスポンジという機能を活用して、血液の付着した衣服、テーブルから血液を拭き取り、乾燥して、その後、遺伝子検査を行うことができる。犯罪捜査などにも使用可能であると考えられる。【０１４４】
（実施例６：血液中のがん関連遺伝子モニタリングシステム）
（実施例６Ａ：術後早期再発診断）
本開示を用いた術後早期再発診断の例が図２３に示される。【０１４５】
がん手術時に、がん組織・細胞遺伝子変異解析を、以下の手順により次世代シークエンサ（ＮＧＳ）（例えば、Illumina社、Thermo Fisher Scientific社、Roche社などから利用可能）を用いて行う。特に、変異の生じやすいＣａｎｃｅｒ  Ｈｏｔｓｐｏｔ  Ｔａｒｇｅｔを標的とする。
１．細胞塊をＰＢＳ懸濁
２．トリプシン処理する
３．ＰＶＡスポンジに浸漬
４．乾燥
５．がん細胞ＤＮＡ溶出
６．ＮＧＳによるシークエンシング
７．Ｈｏｔｓｐｏｔ解析【０１４６】
血漿中のｃｔＤＮＡを、以下の手順によりｄＰＣＲを用いてモニタリングする。例えば、３ヶ月毎の検診時にモニタリングする。
１．採血（１ｍＬ）
２．フィルター血漿分離
３．ＰＶＡスポンジに浸漬
４．乾燥
５．ｃｔＤＮＡ溶出
６．ｄＰＣＲ
７．Ｈｏｔｓｐｏｔモニタリング【０１４７】
がん関連遺伝子が検出された場合、画像による再発検索を行う。【０１４８】
（実施例６Ｂ：治療効果モニタリング）
本開示を用いた治療効果モニタリングの例が図２４に示される。【０１４９】
再発治療中に、血漿中のｃｔＤＮＡを、以下の手順によりｄＰＣＲを用いてモニタリングする。例えば、３ヶ月毎の検診時にモニタリングする。
１．採血（１ｍＬ）
２．フィルター血漿分離
３．ＰＶＡスポンジに浸漬
４．乾燥
５．ｃｔＤＮＡ溶出
６．ｄＰＣＲ
７．Ｈｏｔｓｐｏｔモニタリング【０１５０】
ｃｔＤＮＡのコピー数が増加した場合、薬物治療法の再検討を行う。【０１５１】
新規ｍｕｔａｔｉｏｎの検索として、血中浮遊がん細胞の遺伝子変異解析を、ｄＰＣＲおよびＮＧＳを用いて行う。Ｃａｎｃｅｒ  Ｈｏｔｓｐｏｔ  Ｔａｒｇｅｔを標的とする。ＣＴＣ分離・精製を以下の手順で行う。
１．採血  １ｍＬ
２．溶血バッファー処理
３．白血球除去（ＣＤ４５）
４．ＰＢＳ懸濁  １００μＬ
５．ＰＶＡスポンジに浸漬
６．乾燥
７．ＣＴＣ  ＤＮＡ溶出
８．ｄＰＣＲ：ＣＴＣ  Ｈｏｔｓｐｏｔ確認
９．ＮＧＳ
１０．Ｈｏｔｓｐｏｔ解析【０１５２】
（実施例７Ａ：血漿中ｃｆＤＮＡのＰＶＡスポンジ・ダイレクト定量）
［実験］
実験の手順は、図２５に示される。より詳細には、以下の手順で実験を行った。
（１）血漿調整法：全血と同量のＰＢＳ＋ＥＤＴＡと加え、１５００Ｇ，  １０分間遠心分離した上清を以下の実験に使用した。
（２）ゲノムＤＮＡ：１ｘ１０２ｃｏｐｙ／μＬ（ＰＢＳ＋ＥＤＴＡ）溶液を２ｍｍΦＰＶＡスポンジに５μＬ滴下・乾燥後、ＰＣＲ反応液に添加する。
（３）各血漿５μＬを２ｍｍΦＰＶＡスポンジに滴下・乾燥後、ＰＣＲ反応液に添加する。
【表１９】
2020149301.tif 000020
【表２０】
2020149301.tif 000021
【０１５３】
［結果］
結果を図２５に示す。健常者ｃｆＤＮＡをＣＴ値３５〜３７サイクルで検出可能であった。【０１５４】
［考察］
血漿添加ＰＶＡスポンジディスクはＰＣＲ反応を阻害しないことが理解される。また、血漿を添加したＰＶＡスポンジから、核酸を遊離させる工程を行わずに反応液に添加しても循環核酸の増幅が可能であった。このことは、ＰＶＡスポンジを用いることで、循環核酸を余分な精製工程なしに定量可能であることを示唆している。正確な定量においては、溶出等の全体体積が変化する作業が少ないことは非常に有利である。【０１５５】
（実施例７Ｂ：血漿中ｃｆＤＮＡのＰＶＡスポンジ・ダイレクト定量）
［実験］
実験の手順は、図２６に示される。より詳細には、以下の手順で実験を行った。
（１）血漿調整法：全血と同量のＰＢＳ＋ＥＤＴＡと加え、１５００Ｇ，１０分間遠心分離した上清を以下の実験に使用した。
（２）ゲノムＤＮＡ：１ｘ１０２ｃｏｐｙ／μＬ（ＰＢＳ＋ＥＤＴＡ）溶液を２ｍｍΦＰＶＡスポンジに５μＬ滴下・乾燥後、ＤＷ５０μＬで９５℃、５分間処理。
（３）ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘに１０μＬを添加して、ＰＣＲを実施した。
【表２１】
2020149301.tif 000022
【表２２】
2020149301.tif 000023
【０１５６】
［結果］
結果を図２６に示す。健常者ｃｆＤＮＡをＣＴ値３５〜４０サイクルで検出可能であった。【０１５７】
［考察］
血漿添加ＰＶＡスポンジディスクはＰＣＲ反応を阻害しないことが理解される。ＰＶＡスポンジを用いることにより、血漿中のセルフリーＤＮＡを定量的に分析できることが示される。【０１５８】
（注記）
以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、本開示は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本出願は、日本国特許出願第２０１９−４４３８号（２０１９年１月１５日出願）および日本国特許出願第２０１９−６８１５２号（２０１９年３月２９日出願）に対して優先権を主張するものであり、それらの内容の全体は、本願において参考として援用される。
【産業上の利用可能性】
【０１５９】
本開示は、研究または臨床におけるサンプル調製において、例えば、遺伝子型の判定のためのサンプル調製や、薬物動態モニタリングのためのサンプル調製に利用可能である。
【図１】
2020149301.tif 000024
【図２】
2020149301.tif 000025
【図３】
2020149301.tif 000026
【図４】
2020149301.tif 000027
【図５】
2020149301.tif 000028
【図６】
2020149301.tif 000029
【図７】
2020149301.tif 000030
【図８】
2020149301.tif 000031
【図９】
2020149301.tif 000032
【図１０】
2020149301.tif 000033
【図１１】
2020149301.tif 000034
【図１２】
2020149301.tif 000035
【図１３】
2020149301.tif 000036
【図１４】
2020149301.tif 000037
【図１５】
2020149301.tif 000038
【図１６】
2020149301.tif 000039
【図１７】
2020149301.tif 000040
【図１８】
2020149301.tif 000041
【図１９】
2020149301.tif 000042
【図２０】
2020149301.tif 000043
【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
2020149301.tif 000049
【国際調査報告】
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2020149301.tif 000051
2020149301.tif 000052
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