(57)【要約】配列番号１で表される第１のアミノ酸配列において以下の（１）〜（３）：（１）３９位、９４位、９８位、１０２位、１１０位、１１３位、１１４位、１６２位、２２４位、２２５位、２３０位、２３１位及び２３５位、（２）５３位、６１位、６８位、７４位、７６位、８０位、１３０位、１３７位、１９４位、１９５位、１９８位、２００位、２０４位、２０５位、２０９位、２１０位、２５３位及び２５４位、並びに（３）４６位、８３位、８４位、８７位、９０位、９１位、１１６位、１１７位、１２０位、１２４位、１３９位、１４２位、１４３位、１４６位、１７３位、２１４位、２１６位、２１７位、２３８位、２４２位及び２４５位からなる群から選択される１個又は２個以上に相当する位置において、前記第１のアミノ酸配列におけるのとは異なるアミノ酸残基を備えチャネル活性を有する、タンパク質は、優れた光応答性を発揮する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表される第１のアミノ酸配列において以下の（１）〜（３）：
（１）３９位、９４位、９８位、１０２位、１１０位、１１３位、１１４位、１６２位、２２４位、２２５位、２３０位、２３１位及び２３５位、
（２）５３位、６１位、６８位、７４位、７６位、８０位、１３０位、１３７位、１９４位、１９５位、１９８位、２００位、２０４位、２０５位、２０９位、２１０位、２５３位及び２５４位並びに
（３）４６位、８３位、８４位、８７位、９０位、９１位、１１６位、１１７位、１２０位、１２４位、１３９位、１４２位、１４３位、１４６位、１７３位、２１４位、２１６位、２１７位、２３８位、２４２位及び２４５位
からなる群から選択される１個又は２個以上に相当する位置において、前記第１のアミノ酸配列において備えられるアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を備え、チャネル活性を有する、タンパク質。
【請求項２】
さらに、１又は数個のアミノ酸残基の欠失、置換又は挿入を備える、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記チャネル活性は、以下からなる群から選択される１種又は２種以上を満たす、請求項１又は２に記載のタンパク質。
（ａ）チャネル活性（Ｉｐ）が１０００ｐＡ以上である
（ｂ）チャネル活性（Ｉｓ）が８００ｐＡ以上である
（ｃ）チャネル開口率（Ｉｓ／Ｉｐ）が０．８５以上である
【請求項４】
前記１個又は２個以上の位置は、前記第１のタンパク質のゲート領域、細胞外側領域及び細胞質側領域からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項５】
前記１個又は２個以上の位置は、第１のアミノ酸配列における５３位、７６位、８３位、８７位、１３７位、１４６位、１９８位、２０４位、２１６位、２３０位及び２３１位からなる群から選択される１個又は２個以上の位置に相当する位置である、請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項６】
前記タンパク質は、前記第１のアミノ酸配列において前記１個又は２個以上に相当する位置に備えられる以下のアミノ酸残基に対して、以下のいずれかの異なるアミノ酸残基を備える、請求項１〜５のいずれかに記載のタンパク質。
【表１７】
2020054868.tif 000018
【請求項７】
前記タンパク質は、前記第１のアミノ酸配列において前記１個又は２個以上に相当する位置に備えられる以下のアミノ酸残基に対して、以下のいずれかの異なるアミノ酸残基を備える、請求項１〜５のいずれかに記載のタンパク質。
【表１８】
2020054868.tif 000019
【請求項８】
前記タンパク質は、前記第１のアミノ酸配列における以下の位置に相当する位置において、以下のいずれかのアミノ酸置換を備える、請求項１〜７のいずれかに記載のタンパク質。
【表１９】
2020054868.tif 000020
【請求項９】
前記タンパク質は、前記第１のアミノ酸配列における以下の位置に相当する位置において、以下のいずれかのアミノ酸置換を備える、請求項１〜７のいずれかに記載のタンパク質。
【表２０】
2020054868.tif 000021
【請求項１０】
前記タンパク質は、前記第１のアミノ酸配列における前記１個又は２個以上に相当する位置において、Ｌ５３Ａ、Ｌ５３Ｎ、Ｅ７６Ｑ，Ｖ８３Ａ，Ｖ８３Ｔ、Ａ８７Ｓ、Ｋ１３７Ａ，Ｌ１４６Ａ，Ｋ１９８Ａ，Ｋ２０４Ａ、Ｇ２１６Ｓ、Ｓ２３０Ｅ及びＱ２３１Ｌからなる群から選択される１個又は２個以上のアミノ酸置換を備える、請求項１〜９のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項１１】
前記タンパク質のアミノ酸配列は、第１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有する、請求項１〜１０のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項１２】
配列番号３で表される第２のアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するタンパク質であってチャネル活性を有するタンパク質を含む、網膜に対する光応答性の回復剤。
【請求項１３】
配列番号３で表される第２のアミノ酸配列において以下の（１）〜（３）：
（１）３９位、９４位、９８位、１０２位、１１０位、１１３位、１１４位、１６２位、２２４位、２２５位、２３０位、２３１位及び２３５位、
（２）５３位、６１位、６８位、７４位、７６位、８０位、１３０位、１３７位、１９４位、１９５位、１９８位、２００位、２０４位、２０５位、２０９位、２１０位、２５３位及び２５４位、並びに
（３）４６位、８３位、８４位、８７位、９０位、９１位、１１６位、１１７位、１２０位、１２４位、１３９位、１４２位、１４３位、１４６位、１７３位、２１４位、２１６位、２１７位、２３８位、２４２位及び２４５位
からなる群から選択される１個又は２個以上に相当する位置において、前記第２のアミノ酸配列において備えられるアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を備え、チャネル活性を有する、タンパク質。
【請求項１４】
前記タンパク質のアミノ酸配列は、前記第２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有する、請求項１３に記載のタンパク質。
【請求項１５】
請求項１〜１１のいずれかに記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１５に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項１７】
請求項１２〜１４のいずれかに記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１８】
請求項１７に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項１９】
請求項１〜１４のいずれかに記載のタンパク質又は前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、網膜の光応答性を回復する使用方法。
【請求項２０】
請求項１〜１４のいずれかに記載のタンパク質又は前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、視覚障害を治療又は予防するための医薬組成物。
【請求項２１】
前記視覚障害は、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症又は網膜剥離である、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
配列番号１で表される第１のアミノ酸配列における１個又は２個以上の位置において第１のアミノ酸配列におけるのとは異なるアミノ酸残基を備える被験体タンパク質について、チャネル活性を評価する工程を備える、変異体タンパク質のスクリーニング方法。
【請求項２３】
配列番号３で表される第２のアミノ酸配列における１個又は２個以上の位置において第１のアミノ酸配列におけるのとは異なるアミノ酸残基を備える被験体タンパク質について、チャネル活性を評価する工程を備える、変異体タンパク質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、光応答性タンパク質又はその変異体及びその利用に関する。【０００２】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１８年９月１４日に出願された日本国特許出願である特願２０１８−１７２９９０の関連出願であり、この日本出願に基づく優先権を主張するものであり、この日本出願に記載された全ての内容をここに援用するものである。
【背景技術】
【０００３】
失明を来たす眼疾患としては、例えば網膜色素変性症、加齢黄斑変性症等がある。こうした疾患では、網膜における光受容体細胞である桿体細胞及び錐体細胞の変性ないし死滅の結果、最終的には失明に至るとされている。これらの疾患のうち、網膜色素変性症は遺伝子疾患であり、その原因遺伝子は１００種以上が報告されている。つまりこのことは、桿体細胞や錐体細胞の変性・死滅に至る作用機序が患者によって多岐にわたり臨床上の明確な治療法の確立が困難であることを意味するし、実際治療法は確立されていないのが現状である。また、加齢黄斑変性症においても遺伝的要素があるとされ複数の関連遺伝子が報告されつつある。【０００４】
外界からの光シグナルは、網膜上の桿体細胞や錐体細胞によって受信され、電気的シグナルに変換され、さらに、かかるシグナルが網膜神経細胞及び視神経、大脳皮質視覚野に到達し、画像として認知される。      【０００５】
桿体細胞や錐体細胞において光シグナルを電気シグナルへの変換を担うのはロドプシン又はオプシンである。現在、網膜色素変性症等に対して、例えば走光性の藻類であるクラミドモナス由来のチャネルロドプシン２（ＣｈＲ２）をコードする遺伝子を、残存する網膜神経節細胞に導入してこの細胞に光受容能を与えて患者の視機能を回復させる治療を目的に研究が行われている（特許文献１、特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第2007/131180号
【特許文献２】国際公開第2012/032103号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＣｈＲ２は、光を感じるとＮａ+やＣａ2+を、細胞外から細胞内に運び込む(輸送する)光受容カチオンチャネル(光受容タンパク質)である。すなわち、ＣｈＲ２は、タンパク質分子単独で光を感受すると膜電位変化を生じさせることができるタンパク質である。【０００８】
しかしながら、藻類由来のＣｈＲ２であっても、患者の視覚機能の回復には未だ十分ではない。例えば、ＣｈＲ２は概して高い光強度下において光応答するタンパク質であるため、例えば室内や曇天や夜などの低い光強度下においては、十分な視機能を回復できない場合がある。【０００９】
本明細書は、感度の高い光応答性を有する光応答性タンパク質及びその利用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、クリプト藻類であるGuillardia theta（Ｇ. Theta）由来のある種のカチオンチャネルであるチャネルロドプシンが高い光応答性を有することを見出した。また、これらのチャネルロドプシンの変異体がさらに有利な特性を有することを見出した。本明細書は、こうした知見に基づき以下の手段を提供する。【００１１】
［１］配列番号１で表される第１のアミノ酸配列において以下の（１）〜（３）：
（１）３９位、９４位、９８位、１０２位、１１０位、１１３位、１１４位、１６２位、２２４位、２２５位、２３０位、２３１位及び２３５位、
（２）５３位、６１位、６８位、７４位、７６位、８０位、１３０位、１３７位、１９４位、１９５位、１９８位、２００位、２０４位、２０５位、２０９位、２１０位、２５３位及び２５４位並びに
（３）４６位、８３位、８４位、８７位、９０位、９１位、１１６位、１１７位、１２０位、１２４位、１３９位、１４２位、１４３位、１４６位、１７３位、２１４位、２１６位、２１７位、２３８位、２４２位及び２４５位
からなる群から選択される１個又は２個以上に相当する位置において、前記第１のアミノ酸配列において備えられるアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を備え、チャネル活性を有する、タンパク質。
［２］さらに、１又は数個のアミノ酸残基の欠失、置換又は挿入を備える、［１］に記載のタンパク質。
［３］前記チャネル活性は、以下からなる群から選択される１種又は２種以上を満たす、［１］又は［２］に記載のタンパク質。
（ａ）チャネル活性（Ｉｐ）が１０００ｐＡ以上である
（ｂ）チャネル活性（Ｉｓ）が８００ｐＡ以上である
（ｃ）チャネル開口率（Ｉｓ／Ｉｐ）が０．８５以上である
［４］前記１個又は２個以上の位置は、前記第１のタンパク質のゲート領域、細胞外側領域及び細胞質側領域からなる群から選択される少なくとも１種である、［１］〜［３］のいずれかに記載のタンパク質。
［５］前記１個又は２個以上の位置は、第１のアミノ酸配列における５３位、７６位、８３位、８７位、１３７位、１４６位、１９８位、２０４位、２１６位、２３０位及び２３１位からなる群から選択される１個又は２個以上の位置に相当する位置である、［１］〜［４］のいずれかに記載のタンパク質。
［６］前記タンパク質は、前記第１のアミノ酸配列において前記１個又は２個以上に相当する位置に備えられる以下のアミノ酸残基に対して、以下のいずれかの異なるアミノ酸残基を備える、［１］〜［５］のいずれかに記載のタンパク質。
【表１】
2020054868.tif 000002
［７］前記タンパク質は、前記第１のアミノ酸配列において前記１個又は２個以上に相当する位置に備えられる以下のアミノ酸残基に対して、以下のいずれかの異なるアミノ酸残基を備える、［１］〜［５］のいずれかに記載のタンパク質。
【表２】
2020054868.tif 000003
［８］前記タンパク質は、前記第１のアミノ酸配列における以下の位置に相当する位置において、以下のいずれかのアミノ酸置換を備える、［１］〜［７］のいずれかに記載のタンパク質。
【表３】
2020054868.tif 000004
［９］前記タンパク質は、前記第１のアミノ酸配列における以下の位置に相当する位置において、以下のいずれかのアミノ酸置換を備える、［１］〜［７］のいずれかに記載のタンパク質。
【表４】
2020054868.tif 000005
［１０］前記タンパク質は、前記第１のアミノ酸配列における前記１個又は２個以上に相当する位置において、Ｌ５３Ａ、Ｌ５３Ｎ、Ｅ７６Ｑ，Ｖ８３Ａ，Ｖ８３Ｔ、Ａ８７Ｓ、Ｋ１３７Ａ，Ｌ１４６Ａ，Ｋ１９８Ａ，Ｋ２０４Ａ、Ｇ２１６Ｓ、Ｓ２３０Ｅ及びＱ２３１Ｌからなる群から選択される１個又は２個以上のアミノ酸置換を備える、［１］〜［９］のいずれかに記載のタンパク質。
［１１］前記タンパク質のアミノ酸配列は、第１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有する、［１］〜［１０］のいずれかに記載のタンパク質。
［１２］配列番号３で表される第２のアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するタンパク質であってチャネル活性を有するタンパク質を含む、網膜に対する光応答性の回復剤。
［１３］配列番号３で表される第２のアミノ酸配列において、以下の（１）〜（３）：
（１）３９位、９４位、９８位、１０２位、１１０位、１１３位、１１４位、１６２位、２２４位、２２５位、２３１位及び２３５位、
（２）５３位、６１位、６８位、７４位、７６位、８０位、１３０位、１３７位、１９４位、１９５位、１９８位、２００位、２０４位、２０５位、２０９位、２１０位、２５３位及び２５４位、並びに
（３）４６位、８３位、８４位、８７位、９０位、９１位、１１６位、１１７位、１２０位、１２４位、１３９位、１４２位、１４３位、１４６位、１７３位、２１４位、２１６位、２１７位、２３８位、２４２位及び２４５位
からなる群から選択される１個又は２個以上に相当する位置において、前記第２のアミノ酸配列において備えられるアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を備え、チャネル活性を有する、タンパク質。
［１４］前記タンパク質のアミノ酸配列は、前記第２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有する、［１３］に記載のタンパク質。
［１５］［１］〜［１１］のいずれかに記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［１６］［１５］に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
［１７］［１２］〜［１４］のいずれかに記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［１８］［１７］に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
［１９］［１］〜［１４］のいずれかに記載のタンパク質又は前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、網膜の光応答性を回復する使用方法。
［２０］［１］〜［１４］のいずれかに記載のタンパク質又は前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、視覚障害を治療又は予防するための医薬組成物。
[２１]前記視覚障害は、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症又は網膜剥離である、［２０］に記載の医薬組成物。
［２２］配列番号１で表される第１のアミノ酸配列における１個又は２個以上の位置において第１のアミノ酸配列におけるのとは異なるアミノ酸残基を備える被験体タンパク質について、チャネル活性を評価する工程を備える、変異体タンパク質のスクリーニング方法。
［２３］配列番号３で表される第２のアミノ酸配列における１個又は２個以上の位置において第１のアミノ酸配列におけるのとは異なるアミノ酸残基を備える被験体タンパク質について、チャネル活性を評価する工程を備える、変異体タンパク質のスクリーニング方法。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】光開閉型イオンチャンネルの模式図（Ａ）、光照射によるチャネル電流測定（Ｂ）、チャネル電流の成分（Ｃ）及びＣｈＲ２、ＧｔＣＣＲ４（または第一のタンパク質ともいう）、及びＧｔＣＣＲ５（または第二のタンパク質ともいう）をそれぞれ発現したＮＤ７／２３細胞におけるチャネル電流（Ｄ）及びチャネル開口率（Ｅ）を示す図である。
【図２】ＧｔＣＣＲ４において単一変異を有する単変異体を発現したＮＤ７／２３細胞におけるチャネル電流の測定結果を示す図である。
【図３】野生型ＣｈＲ２を発現したＮＤ７／２３細胞におけるチャネル活性の測定結果を示す図（Ａ）、野生型ＧｔＣＣＲ４を発現したＮＤ７／２３細胞におけるチャネル活性の測定結果を示す図（Ｂ）、ＧｔＣＣＲ４においてＶ８３Ａ変異を有する単変異体を発現したＮＤ７／２３細胞におけるチャネル活性の測定結果を示す図（Ｃ）、ＧｔＣＣＲ４においてＬ１４６Ａ変異を有する単変異体を発現したＮＤ７／２３細胞におけるチャネル活性の測定結果を示す図（Ｄ）、野生型ＧｔＣＣＲ４に比べ活性が向上した単一変異を有する単変異体を発現したＮＤ７／２３細胞におけるチャネル活性の測定結果を示す図（Ｅ、Ｆ）である。
【図４】ＧｔＣＣＲ４において二個の変異を有する二重変異体を発現したＮＤ７／２３細胞におけるチャネル電流（Ａ）及びチャネル開口率（Ｂ）を示す図である。
【図５】ＧｔＣＣＲ５において単一変異を有する単変異体を発現したＮＤ７／２３細胞におけるチャネル活性及び開口率の測定結果を示す図である。
【図６】ＧｔＣＣＲ４において単一変異を有する他の単変異体を発現したＮＤ７／２３細胞におけるチャネル電流の測定結果を示す図である。
【図７】ラット大脳上皮初代培養細胞における神経活動の光刺激実験結果（Ａ）及び（Ｂ）並びに光強度依存性の比較結果（Ｃ）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書の開示は、感度の高い光応答性を有する光応答性タンパク質に関する。本発明者らが見出した配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるＧ. Thetaに由来するカチオン光応答性タンパク質であるＧｔＣＣＲ４（以下、第１のタンパク質ともいう。）が、従来公知のクラミドモナス由来のＣｈＲ２に比較して優れた光応答性を発揮するという知見に基づいている。本発明者らによると、第１のタンパク質に変異を導入した変異体は、さらに高い感度の光応答性を発揮できる。例えば、光照射時において細胞に流れる総チャネル電流量によって評価されるチャネル活性、を増大させることができる。また、本発明者らによって新たに同定された、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる同じくＧ. Thetaに由来するカチオン光応答性タンパク質であるＧｔＣＣＲ５（以下、第２のタンパク質ともいう。）も、高い感度の光応答性を発揮し、第２のタンパク質に変異を導入した変異体は、さらに高い感度を発揮できる。
【００１４】
本明細書に開示される第１のタンパク質及び第２のタンパク質ならびにこれらの変異体（以下、これらを総称して、本タンパク質ともいう。）を、神経節細胞や双極細胞の細胞膜上に発現させることにより、細胞膜に光照射時のイオン透過性（輸送性）が付与されて、神経節細胞や双極細胞に光応答能が付与されることになる。本タンパク質によれば、本タンパク質の神経節細胞や双極細胞の細胞膜上での発現量、本タンパク質で構成されるチャネルのイオン透過性（輸送性）及びチャネルの開口率などが優れているため、高い感度の光応答能を発揮することができ、例えば光照射時において細胞に流れる総チャネル電流を増大させることができる、と考えられる。
【００１５】
本タンパク質をコードするＤＮＡなどのポリヌクレオチドを、ウイルスベクターなどを用いて、例えば神経節細胞や双極細胞に導入することで、本タンパク質を神経節細胞や双極細胞の細胞膜で発現させて、高い感度の光応答能を発揮させることができる。
【００１６】
したがって、本タンパク質又は本タンパク質をコードするヌクレオチドは、網膜変性疾患などの桿体細胞や錐体細胞の変性を生じる眼疾患の患者における視覚回復に有用である。
【００１７】
以下、本開示の代表的かつ非限定的な具体例について、適宜図面を参照して詳細に説明する。この詳細な説明は、本開示の好ましい例を実施するための詳細を当業者に示すことを単純に意図しており、本開示の範囲を限定することを意図したものではない。また、以下に開示される追加的な特徴ならびに発明は、さらに改善された「光応答性タンパク質及びその利用」を提供するために、他の特徴や開示発明とは別に、又は共に用いることができる。
【００１８】
また、以下の詳細な説明で開示される特徴や工程の組み合わせは、最も広い意味において本開示を実施する際に必須のものではなく、特に本開示の代表的な具体例を説明するためにのみ記載されるものである。さらに、上記及び下記の代表的な具体例の様々な特徴、ならびに、独立及び従属クレームに記載されるものの様々な特徴は、本開示の追加的かつ有用な実施形態を提供するにあたって、ここに記載される具体例のとおりに、あるいは列挙された順番のとおりに組合せなければならないものではない。
【００１９】
本明細書及び／又はクレームに記載された全ての特徴は、実施例及び／又はクレームに記載された特徴の構成とは別に、出願当初の開示ならびにクレームされた特定事項に対する限定として、個別に、かつ互いに独立して開示されることを意図するものである。さらに、全ての数値範囲及びグループ又は集団に関する記載は、出願当初の開示ならびにクレームされた特定事項に対する限定として、それらの中間の構成を開示する意図を持ってなされている。
【００２０】
（第１のタンパク質及びその変異体）
（第１のタンパク質）
第１のタンパク質は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる。第１のタンパク質は、好塩性古細菌由来の光駆動型プロトンポンプであるバクテリオロドプシンのＤＴＤモチーフに相当するＤＴＤ（アスパラギン酸−トレオニン−アスパラギン酸）モチーフを有する３６７アミノ酸残基からなるタンパク質であり、それまで同定されていたＧ． Theta由来のカチオンチャネルロドプシン１〜３とはアミノ酸配列の同一性が低いことがわかっている（それぞれに対して３３％、３４％及び３９％）（Biophysics and Physicobiology, Vol． １４， pp． 57-66(2017)）。また、第１のタンパク質は、既述のように、Ｇ. Thetaに由来するタンパク質であり、本発明者らより、光応答性カチオンチャネルタンパク質と同定されたものである（同上）。第１のタンパク質は、Ｎａ+とＨ+との双方を輸送させることができる（同上）。
【００２１】
第１のタンパク質におけるＤＴＤモチーフは、Ｄ１１６位、Ｔ１２０位及びＤ１２７  位である。なお、光駆動型プロトンポンプであるバクテリオロドプシンのＤＴＤモチーフは、そのアミノ酸配列のＤ８５位、Ｔ８９位及びＤ９６位である。第１のタンパク質は、また、このＤＴＤモチーフとさらに、Ｋ１１３位、Ｄ２４２位及びＫ２４６位を備えている。バクテリオロドプシンにおいてはこれらのアミノ酸は、Ｒ８２位、Ｄ２１２位、Ｋ２１６位に相当する。
【００２２】
また、第１のタンパク質は、そのアミノ酸配列等から、７本のヘリックスを有する７回膜貫通構造を有するイオンチャネルタンパク質であると考えられている。第１のタンパク質は、細胞膜から細胞外側に露出される部位又はその近傍し位置されてイオンチャネルの細胞外側領域を構成する領域（細胞外側領域）と、細胞膜の内部よりに位置されてイオンチャネルの透過経路を構成する領域（ゲート領域）と、細胞膜の細胞質側に存在しイオンチャネル細胞質側領域を構成する領域（細胞質側領域）と、を備えることができる。
【００２３】
本発明者らによれば、第１のタンパク質におけるこれらの領域は、例えば以下のアミノ酸残基の位置又は領域を割り当てることができると考えられる。第一のタンパク質はＤＴＤモチーフを持つことから、前述した同じくＤＴＤモチーフを持つバクテリオロドプシン（好塩性古細菌由来の光駆動型プロトンポンプ）とアミノ酸配列や分子構造に相関があると考えた。そこで公知のバクテリオロドプシンの分子構造をもとに、第一のタンパク質内部のイオン透過経路を推定する。なお、本明細書において、特に断りのない限り、第１のタンパク質に関して示すアミノ酸残基の位置は、配列番号１で表されるアミノ酸配列における位置を表している。
【００２４】
（細胞外側領域）
第１のタンパク質においては、細胞外側領域は以下のアミノ酸配列領域：１位〜４１位、９２位〜１１５位、１４７位〜１６５位及び２２２位〜２３７位であると考えられる。
【００２５】
（細胞質側領域）
また、第１のタンパク質においては、細胞質側領域は、以下のアミノ酸配列領域：５１位〜８２位、１２５位〜１３８位、１７４位〜２１３位及び２５０位〜３６７位であると予想される。
【００２６】
（ゲート領域）
また、第１のタンパク質においては、ゲート領域は、以下のアミノ酸配列領域：４２位〜５０位、８３位〜９１位、１１６位〜１２４位、１３９位〜１４６位、１６６位〜１７３位、２１４位〜２２１位及び２３８位〜２４９位であると推定される。
【００２７】
（チャネル活性）
第１のタンパク質は、光駆動型プロトンポンプでもある光応答性カチオンチャネル活性を有するタンパク質であり、細胞膜上に発現させたとき、例えば、５３０ｎｍの緑色光を照射すると、プロトン（Ｈ+）とカチオン（Ｎａ+）とが細胞膜を透過することによってチャネル電流が発生する。光照射によりチャネル電流が発生するという活性は、一般にチャネル活性と称される。
【００２８】
第１のタンパク質のチャネル活性は、例えば、第１のタンパク質を適当な哺乳類の細胞の細胞膜（他に光応答性カチオンチャネルも光駆動型プロトンポンプを備えないことが好ましい）に発現させた上、例えば、極大吸収波長が５３０ｎｍ近傍である一定強度の光を一定時間照射したときに、全細胞記録によるパッチクランプ法で測定することができる。全細胞記録パッチクランプ法は、単一の細胞について、その細胞膜を透過するイオン総量を電荷の移動（電流）として計測する方法である。この方法で測定できるチャネル電流量をチャネル活性とすることができる。
【００２９】
具体的には、以下の方法が例示される。すなわち、第１のタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（必要に応じて哺乳類のコドン用法を用いる。）を合成し、ｅＧＦＰが第１のタンパク質のＣ末端側にタグ付けされるように、かつ第１のタンパク質が十分量発現するように、ｐｅＧＦＰ−Ｎ１などの哺乳類細胞用のベクタープラスミドに組み込んで導入用プラスミドとし、このプラスミドを、ＮＤ／７２３細胞などの哺乳類細胞に、リポフェクション法を用いて導入して形質転換する。第１のタンパク質の導入細胞の細胞膜上での発現は、ｅＧＦＰの蛍光で確認することができる。
【００３０】
こうして細胞膜に第１のタンパク質を一過的に発現させた細胞につき、導入後、例えば２４〜４８時間以内で、第１のタンパク質が安定的に発現している状態で、全細胞記録によるパッチクランプ法などの電気生理学的測定を行う。
【００３１】
全細胞記録パッチクランプ法などによる電気生理学的測定による測定条件は、特に限定するものではないが、例えば以下の条件を採用できる。
【００３２】
【表５】
2020054868.tif 000006
【００３３】
全細胞記録パッチクランプ法などによる電気生理学的測定法では、例えば、上記の条件で、細胞に光を照射した際に発生するピーク状の最大電流値（Ｉｐ）及び光照射中に一定レベルにまで減衰した電流値（Ｉｓ）をそれぞれ第１のタンパク質のチャネル電流値とすることができる。例えば、Ｉｐ及びＩｓのいずれかまたは双方で、第１のタンパク質のチャネル活性として用いることができる。また、ＩｓをＩｐで除した値を、後述するチャネル開口率とすることができる。
【００３４】
例えば、上記した条件でチャネル電流が発生していればチャネル活性を有しているといえる。例えば、第１のタンパク質は、既述のチャネル活性の評価方法及び電気生理学記録条件（照射時間４００ｍＳ）で測定したときの、Ｉｐが１０００ｐＡ以上及び／又はＩｓが８００ｐＡ以上、また例えば、Ｉｐが１５００ｐＡ以上及び／又はＩｓが１３００ｐＡ以上であることが好ましい。
【００３５】
（チャネル開口率）
チャネル開口率は、イオンチャネルタンパク質としての、光応答性カチオンチャネルの有用な特徴である。チャネル開口率が十分に大きければ、全体としてチャネル電流量が増大するからである。
【００３６】
第１のタンパク質は、上記チャネル開口率が、クラミドモナス由来のＣｈＲ２の０．４５に比較して大きい。すなわち、チャネルの不活性化が小さい。第１のタンパク質は、上記チャネル開口率が、例えば、０．８以上であり、また例えば、０．８５以上であり、また例えば、０．９以上であり、また例えば、０．９５以上であり、また例えば、０．９７以上であり、また例えば、０．９８以上であり、また例えば、０．９９以上である。
【００３７】
（第１のタンパク質の変異体）
第１のタンパク質の変異体（以下、単に、第１の変異体ともいう。）は、配列番号１で表される第１のアミノ酸配列における１個又は２個以上の位置に相当する位置において、第１のタンパク質とは異なるアミノ酸残基を備え、チャネル活性を有するタンパク質である。
【００３８】
本明細書においては、第１の変異体は、第１のタンパク質の第１のアミノ酸配列における１個又は２個以上に相当する位置に、第１のタンパク質におけるのとは異なるアミノ酸残基を備えていればよく、第１のタンパク質を人為的に改変したタンパク質であってよいし、天然由来のタンパク質又はその改変体であってもよい。したがって、第１の変異体は、例えば、第１のアミノ酸配列と一定以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質にも適用される。すなわち、第１の変異体は、人工的なタンパク質のほか、第１のタンパク質と同じ由来の藻類ほか、近縁の藻類や微生物由来のカチオンイオンチャネルなどの天然由来タンパク質又はその改変体であってもよい。
【００３９】
ここで、第１のアミノ酸配列における１個又は２個以上の位置に相当する位置とは、第１のアミノ酸配列に対して、第１の変異体のアミノ酸配列をアライメントしたときに、第１のアミノ酸配列における１個又は２個以上の位置に対応付けられる、変異体における１個又は２個以上のアミノ酸残基の位置である。ここで、アライメントとは、後述する、アミノ酸配列及び塩基配列の同一性の測定において用いるアライメントと同義である。例えば、第１のアミノ酸配列における位置に相当する第１の変異体の位置は、ＢＬＡＳＴ（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）やＰｆａｍ（http://pfam.xfam.org/）などの公知のアミノ酸配列アラインメントプログラムを用いて、例えば、デフォルトのパラメータでアラインメントさせることにより特定することができる。
【００４０】
第１の変異体が備える変異の位置は、特に限定するものではないが、例えば、第１のタンパク質の細胞外側領域、細胞質側領域及びゲート領域などから適宜選択して１個又は２以上とすることができる。第１の変異体が備える１個又は２個以上の変異の位置は、これらの３つの領域のうち１つの領域に存在する位置のみから構成されていてもよいし、２つの領域に存在する位置のみから構成されていてもよいし、さらに、全ての領域に存在する位置で構成されていてもよい。
【００４１】
また、第１の変異体が備えるアミノ酸置換変異は、特に限定するものではなく、側鎖の疎水性相互作用、芳香族性、構造、水素結合性、荷電性、極性、等の少なくとも一部を変化させるような置換でありえる。また、置換変異は、いわゆる保存的置換であってもよいし、準保存的置換であってもよい。アミノ酸残基の種類に応じた保存的置換及び準保存的置換は例えば以下のとおりである。第１の変異体において、そのチャネル活性等に関連して有用な置換は、チャネル活性等を評価することにより適宜決定される。
【００４２】
【表６】
2020054868.tif 000007
【００４３】
例えば、以下の表７に記載の置換変異が好適である。また、表８に記載の置換変異が好適である。
【表７】
2020054868.tif 000008
【００４４】
【表８】
2020054868.tif 000009
【００４５】
（細胞外側領域における変異）
細胞外側領域は上記のとおり、１位〜４１位、９２位〜１１５位、１４７位〜１６５位及び２２２位〜２３７位と考えられるが、これらのアミノ酸領域における変異位置としては、例えば、３９位、９４位、９８位、１０２位、１１０位、１１３位、１１４位、１６２位、２２４位及び２２５位等が挙げられる。また例えば、２３０位、２３１位、２３５位が挙げられる。置換変異としては、例えば、Ｄ３９Ｎ、Ｒ９４Ｍ、Ｒ９４Ｋ、Ｒ９４Ｑ、Ｈ９８Ａ、Ｄ１０２Ｎ、Ｎ１１０Ｌ、Ｋ１１３Ａ、Ｋ１１３Ｎ、Ｙ１１４Ａ、Ｒ１６２Ａ、Ｓ２３０Ｅが挙げられ、また例えば、Ｔ２２４Ａ、Ｅ２２５Ａ、Ｅ２２５Ｑ、Ｑ２３１Ｌ、Ｈ２３５Ａ、Ｈ２３５Ｎ、Ｈ２３５Ｍが挙げられる。
【００４６】
（細胞質側領域における変異）
細胞質側領域は、上記のとおり、５１位〜８２位、１２５位〜１３８位、１７４位〜２１３位及び２５０位〜３６７位であると推定されるが、このアミノ酸領域におけるにおける変異位置としては、例えば、５３位、６１位、６８位、７４位、７６位、８０位、１３０位、１３７位、１９４位、１９５位及び１９８位等が挙げられる。また例えば、２００位、２０４位、２０５位、２０９位、２１０位、２５３位及び２５４位が挙げられる。置換変異としては、例えば、Ｋ６１Ａ、Ｒ７４Ａ、Ｅ７６Ｑ、Ｓ８０Ａ、Ｋ１３７Ｅ、Ｋ１３７Ａ、Ｋ１９８Ａ、Ｒ２００Ａ、Ｋ２０４Ａ、Ｋ２０４Ｅが挙げられ、また例えば、Ｌ５３Ａ、Ｌ５３Ｎ、Ｅ６８Ｑ、Ｗ１３０Ａ、Ｅ１９４Ｑ、Ｄ１９５Ｎ、Ｌ２０５Ａ、Ｌ２０９Ａ、Ｙ２１０Ｆ、Ｌ２５３Ｎ、Ｌ２５３Ｓ、Ｌ２５４Ｎ、Ｌ２５４Ｓが挙げられる。
【００４７】
（ゲート領域における変異）
ゲート領域は、上記のとおり、４２位〜５０位、８３位〜９１位、１１６位〜１２４位、１３９位〜１４６位、１６６位〜１７３位、２１４位〜２２１位及び２３８位〜２４９位であると推定されるが、このアミノ酸領域における変異位置としては、例えば、４６位、８３位、８４位、８７位、９０位、９１位、１１６位、１１７位、１２０位、１２４位、１３９位、１４２位、１４３位、１４６位、１７３位が挙げられる。また例えば、２１４位、２１６位、２１７位、２３８位、２４２位及び２４５位が挙げられる。置換変異としては、例えば、Ｌ４６Ａ、Ｖ８３Ａ、Ｖ８３Ｔ、Ｖ８３Ｄ、Ｖ８３Ｋ、Ｎ８４Ｐ、Ｎ８４Ｋ、Ａ８７Ｓ、Ａ８７Ｎ、Ａ８７Ｋ、Ｔ９０Ａ、Ｙ９１Ａ、Ｄ１１６Ａ、Ｄ１１６Ｔ、Ｙ１１７Ａ、Ｔ１２０Ｓ、Ｌ１２４Ｃ、Ｌ１２４Ｔ、及びＬ１２４Ａが挙げられる。また例えば、Ｔ１３９Ａ、Ｔ１３９Ｄ、Ｌ１４２Ａ、Ｆ１４３Ａ、Ｌ１４６Ａ、Ｆ１７３Ａ、Ｆ１７３Ｙ、Ｗ２１４Ａ、Ｗ２１４Ｙ、Ｇ２１６Ｓ、Ｙ２１７Ａ、Ｙ２１７Ｆ、Ｙ２１７Ｗ、Ｔ２３８Ａ、Ｔ２３８Ｋ、Ｔ２３８Ｄ、Ｄ２４２ＡおよびＤ２４２Ｎ、Ｌ２４５Ｎ及びＬ２４５Ｓが挙げられる。
【００４８】
以上のとおり、第１の変異体が有する少なくとも１つの変異位置は、例えば、７６位、８３位、８７位、１３７位、１４６位、１９８位、２０４位、２３０位及び２３１位からなる群から少なくとも一個選択されることが好ましい。また例えば、７６位、８３位、８７位、１３７位、１４６位、１９８位、２０４位及び２３１位からなる群から少なくとも１個選択されることが好ましい。また例えば、さらに、これらの２つの群の変異位置に５３位及び２１６位を加えた群から少なくとも１個選択されることが好ましい。
【００４９】
同様に少なくとも１つの置換変異は、Ｅ７６Ｑ、Ｖ８３Ａ、Ｖ８３Ｔ、Ａ８７Ｓ、Ｋ１３７Ａ、Ｌ１４６Ａ、Ｋ１９８Ａ、Ｋ２０４Ａ、Ｓ２３０Ｅ、Ｑ２３１Ｌからなる群から少なくとも１個選択されることが好ましい。また例えば、さらに、この群の置換変異にＬ５３Ａ、Ｌ５３Ｎ及びＧ２１６Ｓを加えた群から少なくとも１個選択されることが好ましい。
【００５０】
なお、本明細書において開示するアミノ酸置換変異における変異アミノ酸は、例えば、以下の観点に基づいて決定することができる。すなわち、本明細書では、イオン透過性の向上及び／又はチャネル電流の向上を目的とした変異導入を意図している。したがって、第１に、イオン透過経路を形成すると予想されたアミノ酸残基を細胞外側領域、ゲート領域、および細胞質側領域からそれぞれ選定することが好適である。次いで、アミノ酸の性質として、例えば、極性残基であるほか、正又は負に荷電していれば、イオン透過速度を促進又は低減させる可能性がある。そこで、変異導入により極性を低減する又は反対の荷電を持つアミノ酸に置換することで、イオン透過性の向上及び／又はチャネル電流の向上を目指すことができる。さらに、疎水性のアミノ酸残基であれば、そのアミノ酸残基の体積によりチャネル透過経路の大きさ（径）が決まる。そこで、アミノ酸残基の径を小さくすることでイオン透過性の向上等を期待し、体積の異なるアミノ酸残基による変異を導入することもできる。さらにまた、例えば、グルタミン（Ｑ）などの無極性アミノ酸についても、その体積がイオン透過経路の大きさに関わると考えられるので、体積の異なるアミノ酸残基による変異導入により、イオン透過性の向上及び／又はチャネル電流の向上を期待できる。
【００５１】
例えば、こうした変異としては、以下の表９に示す置換変異が挙げられる。また、表１０に示す置換変異も挙げられる。
【表９】
2020054868.tif 000010
【００５２】
【表１０】
2020054868.tif 000011
【００５３】
第１の変異体が２個以上の置換変異を備える場合、チャネル活性を考慮すると、例えば、８３位、８７位、１４６位及び２１６位などのゲート領域から選択される２個又は３個以上を組み合わせることができる。また、これら列挙した３個所に加えて細胞質側領域の例えば、５３位、７６位、１３７位、１９８位及び／又は２０４位の変異を適宜組み合わせることができる。さらにまた、細胞外側領域の２３０位及び／又は２３１位の変異を適宜組みあわせることができる。
【００５４】
第１の変異体が備える好適な２個以上の置換変異は、２個以上の変異が組み合わされた第１の変異体としては、チャネル活性を考慮すると、Ｅ７６Ｑ−Ｌ１４６Ａ、Ｖ８３Ａ−Ｌ１４６Ａ、Ｋ１３７Ａ−Ｌ１４６Ａ、Ｖ８３Ａ−Ｋ１３７Ａ、Ｅ７６Ｑ−Ｖ８３Ａ、Ｅ７６Ｑ−Ｋ１３７Ａ、Ｋ１３７Ａ−Ｋ２０４Ａが挙げられる。なかでも、Ｅ７６Ｑ−Ｌ１４６Ａ、Ｖ８３Ａ−Ｌ１４６Ａ、Ｋ１３７Ａ−Ｌ１４６Ａ、Ｖ８３Ａ−Ｋ１３７Ａ、Ｅ７６Ｑ−Ｖ８３Ａが好ましく、Ｅ７６Ｑ−Ｌ１４６Ａ、Ｖ８３Ａ−Ｌ１４６Ａ、Ｋ１３７Ａ−Ｌ１４６Ａがより好ましい。
【００５５】
なお、第１の変異体は、以上に記載した位置以外における１〜３０個以下、また例えば、２５個以下、また例えば、２０個以下、また例えば１５個以下、また例えば、１０個以下、また例えば数個以下のアミノ酸残基の置換変異や、さらに、１〜３０個以下、また例えば、２５個以下、また例えば、２０個以下、また例えば１５個以下、また例えば、１０個以下、また例えば数個以下のアミノ酸残基の置換変異、欠失変異及び／又は挿入変異を備えることもできる。
【００５６】
第１の変異体は、第１のタンパク質が有するＤＴＤモチーフを備えていることが好ましい。すなわち、第１のアミノ酸配列におけるＤ１１６位、Ｔ１２０位及びＤ１２７位に相当する位置にアミノ酸残基（それぞれＤ、Ｔ及びＤ）を備えることが好ましい。さらに、第１の変異体は、このＤＴＤモチーフとさらに、第１のアミノ酸配列におけるＫ１１３位、Ｄ２４２位及びＫ２４６位から選択される１個又は２個以上に相当するアミノ酸残基を備えることが好ましい。
【００５７】
第１の変異体が有する、第１のアミノ酸配列との同一性は、特に限定するものではないが、例えば、７５％以上であり、また例えば、８０％以上であり、また例えば、８５％以上であり、また例えば、９０％以上であり、また例えば、９５％以上であり、また例えば、９７％以上であり、また例えば、９８％以上であり、また例えば、９９％以上であり、また例えば、９９．５％以上である。また類似性は、例えば、８０％以上であり、また例えば、８５％以上であり、また例えば、９０％以上であり、また例えば、９５％以上であり、また例えば、９７％以上であり、また例えば、９８％以上であり、また例えば、９９％以上であり、また例えば、９９．５％以上である。
【００５８】
本明細書において同一性又は類似性とは、当該技術分野で知られているとおり、配列を比較することにより決定される、２以上のタンパク質あるいは２以上のポリヌクレオチドの間の関係である。当該技術で"同一性"とは、アミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きのそのような配列間のアラインメントによって決定されるような、アミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列の間の配列不変性の程度を意味する。また、類似性とは、アミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きの部分的な配列間のアラインメントによって決定されるような、アミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列の間の相関性の程度を意味する。より具体的には、配列の同一性と保存性（配列中の特定アミノ酸残基又は配列における物理化学特性を維持する置換）によって決定される。なお、類似性は、後述するＢＬＡＳＴの配列相同性検索結果においてSimilarity と称される。同一性及び類似性を決定する方法は、対比する配列間で最も長くアラインメントするように設計される方法であることが好ましい。同一性及び類似性を決定するための方法は、公衆に利用可能なプログラムとして提供されている。例えば、AltschulらによるBLAST (Basic Local Alignment Search Tool) プログラム（例えば、Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ., J. Mol. Biol., 215: p403-410 (1990), Altschul SF,
Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Miller W, Lipman DJ., Nucleic Acids Res. 25: p3389-3402 (1997))やUniProtKBのアライメント機能を利用し決定することができる。BLASTやUniProtKBのようなソフトウェアを用いる場合の条件は、特に限定するものではないが、デフォルト値を用いるのが好ましい。
【００５９】
なお、アミノ酸配列のアラインメントは、BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）などにおけるアミノ酸配列アラインメントプログラム（blastp）を用いて、例えば、デフォルトのパラメータでアラインメントさせることにより特定することができる。
【００６０】
第１の変異体は、チャネル活性を有している。チャネル活性は、第１のタンパク質について説明したのと同様の方法で確認できる。第１の変異体は、一定以上のチャネル活性を有することが好ましい。例えば、既述のチャネル活性の評価方法及び電気生理学記録条件（照射時間４００ｍＳ）で測定したときの、Ｉｐが１０００ｐＡ以上及び／又はＩｓが８００ｐＡ以上、また例えば、Ｉｐが１５００ｐＡ以上及び／又はＩｓが１３００ｐＡ以上であることが好ましい。
【００６１】
第１の変異体は、第１のタンパク質よりも高いチャネル活性、すなわち、同等の操作で同等の条件で取得した第１のタンパク質のチャネル活性と同等以上のチャネル活性を有していることが好ましい。例えば、第１のタンパク質のチャネル活性の１１０％以上、また例えば、１２０％以上、また例えば、１３０％以上、また例えば、１４０％以上である。チャネル活性の優劣及び比率は、Ｉｐ及びＩｓのいずれか又は双方のチャネル電流値で判断することができる。なお、チャネル活性は、既述の電気生理学的方法により測定することができる。
【００６２】
また、第１の変異体は、そのチャネル開口率が一定以上であることが好ましい。例えば、既述のチャネル活性の評価方法及び電気生理学記録条件（照射時間４００ｍＳ）で測定したときの、チャネル開口率が０．８以上、また例えば、０．８５以上、また例えば、０．９以上、また例えば、０．９５以上、また例えば、０．９７以上、また例えば、０．９８以上、また例えば、０．９９以上であることが好ましい。
【００６３】
第１の変異体は、同等の操作で同等の条件で取得した第１のタンパク質のチャネル開口率よりも同等以上のチャネル開口率を有していることが好ましい。例えば、第１のタンパク質のチャネル開口率の１１０％以上、また例えば、１２０％以上、また例えば、１３０％以上、また例えば、１４０％以上である。
【００６４】
当業者は、本明細書に開示される第１の変異体の変異位置及び好適な置換例に基づいて、種々の変異体及び相加体を作製、その評価を行い、意図したチャネル活性やチャネル開口率を有する第１の変異体を得ることができる。
【００６５】
当業者は、第１のタンパク質及び第１の変異体のＮ末端やＣ末端に対して、例えば、種々のタンパク質を融合することができる。
【００６６】
当業者であれば、第１のタンパク質を公知の方法に従い取得できる。また、当業者であれば、第１の変異体は、例えば、第１のタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（配列番号２）を、慣用の突然変異誘発法、部位特異的変異法、エラープローンＰＣＲを用いた分子進化的手法等によって改変することによって改変ＤＮＡを取得し、当該改変ＤＮＡ等に基づいて取得することができる。改変ＤＮＡを取得する手法としては、Kunkel法又は Gapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる方法が挙げられ、例えば、商業的に入手可能な種々の部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キットを用いて変異が導入される。
【００６７】
例えば、第１の変異体は、こうして得られた改変ＤＮＡを含むＤＮＡ構築物によってP. pastorisなどの宿主を形質転換し、この形質転換細胞を、当業者に公知の通常の方法に従って培養し、当該培養細胞または培地から第１の変異体を回収することによって得ることができる。例えば、第１の変異体は、慣用の精製技術を組み合わせて単離することができる。そのような技術には、硫安分画、有機溶媒処理、遠心分離、限外濾過、各種クロマトグラフィー（例えば、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー等）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、電気泳動等が包含される。
【００６８】
そのほか、ＧＦＰなどのシグナルタンパク質をコードするＤＮＡを融合した改変ＤＮＡを、哺乳類神経細胞ＮＤ７／２３細胞などに導入して、細胞膜に発現させて取得することもできる。
【００６９】
（第２のタンパク質及びその変異体）
（第２のタンパク質）
第２のタンパク質は、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる。第２のタンパク質は、好塩性古細菌由来の光駆動型プロトンポンプであるバクテリオロドプシンのＤＴＤモチーフに相当するＤＴＤ（アスパラギン酸−トレオニン−アスパラギン酸）モチーフを有する３７１アミノ酸残基からなるタンパク質であり、それまで同定されていたＧ. Theta由来のカチオンチャネルロドプシン１〜３とはアミノ酸配列の同一性が低い（それぞれに対して３３％、３４％及び３９％）一方、第１のタンパク質とのアミノ酸配列の同一性は、８５％である。
【００７０】
第２のタンパク質は、Ｇ. Thetaに由来するタンパク質であり、その機能は本発明者らより、光駆動型プロトンポンプであって光応答性カチオンチャネルタンパク質であると判明した。第２のタンパク質は、Ｎａ+とＨ+との双方を移動させることができることが見出された。
【００７１】
第２のタンパク質におけるＤＴＤモチーフは、そのアミノ酸配列のＤ１１６位、Ｔ１２０位及びＤ１２７位である。第２のタンパク質は、また、このＤＴＤモチーフとさらに、Ｋ１１３位、Ｄ２４２位及びＫ２４６位からなる群から選択される１又は２以上のアミノ酸残基を備えることができる。
【００７２】
また、第２のタンパク質は、そのアミノ酸配列等から、７本のヘリックスを有する７回膜貫通構造を有するイオンチャネルタンパク質であると考えられている。第２のタンパク質は、細胞膜から細胞外側に露出される部位又はその近傍し位置されてイオンチャネルの細胞外側領域を構成する領域（細胞外側領域）と、細胞膜の内部よりに位置されてイオンチャネルの透過経路を構成する領域（ゲート領域）と、細胞膜の細胞質側に存在しイオンチャネル細胞質側領域を構成する領域（細胞質側領域）と、を備えることができる。
【００７３】
本発明者らによれば、第２のタンパク質におけるこれらの領域は、例えば以下のアミノ酸の位置又は領域を割り当てることができると考えられる。なお、本明細書において、特に断りのない限り、第２のタンパク質に関して示すアミノ酸残基の位置は、配列番号３で表されるアミノ酸配列における位置を表している。
【００７４】
（細胞外側領域）
第２のタンパク質においては、例えば、そのアミノ酸配列の以下の位置：
１位〜４１位、９２位〜１１５位、１４７位〜１６５位、２２２位〜２３７位が細胞外側領域であると考えられる。
【００７５】
（細胞質側領域）
また、第２のタンパク質においては、例えば、そのアミノ酸配列の以下の位置：５１位〜８２位、１２５位〜１３８位、１７４位〜２１３位、２５０位〜３７１位が細胞質側領域であると考えられる。
【００７６】
（ゲート領域）
また、第２のタンパク質においては、例えば、そのアミノ酸配列の以下の位置：
４２位〜５０位、８３位〜９１位、１１６位〜１２４位、１３９位〜１４６位、１６６位〜１７３位、２１４位〜２２１位、２３８位〜２４９位がゲート領域であると考えられる。
【００７７】
（チャネル活性）
第２のタンパク質も、第１のタンパク質と同様、チャネル活性を有しており、第１のタンパク質に関して記載したのと同様の方法でＩｐ、Ｉｓ及びチャネル開口率を測定することができる。第２のタンパク質は、例えば、既述のチャネル活性の評価方法及び電気生理学記録条件（照射時間４００ｍＳ）で測定したときの、Ｉｐが５００ｐＡ以上及び／又はＩｓが４００ｐＡ以上、また例えば、Ｉｐが７５０以上及び／又はＩｓが６５０以上であることが好ましい。
【００７８】
第２のタンパク質は、上記チャネル開口率が、クラミドモナス由来のＣｈＲ２に比較して大きい。すなわち、チャネルの不活性化が小さい。第２のタンパク質は、上記チャネル開口率が、例えば、０．８以上であり、また例えば、０．８１以上であり、また例えば、０．８５以上であり、また例えば、０．９以上であり、また例えば、０．９５以上であり、また例えば、０．９７以上であり、また例えば、０．９８以上であり、また例えば、０．９９以上である。
【００７９】
（第２のタンパク質の変異体）
第２のタンパク質の変異体（以下、単に、第２の変異体ともいう。）は、配列番号３で表される第２のアミノ酸配列における１個又は２個以上の位置に相当する位置において、第２のタンパク質とは異なるアミノ酸残基を備え、チャネル活性を有するタンパク質である。
【００８０】
第２の変異体は、第１の変異体と同様、第２のタンパク質の第２のアミノ酸配列における１個又は２個以上に相当する位置に、第２のタンパク質におけるのとは異なるアミノ酸残基を備えていればよく、第２のタンパク質を人為的に改変したタンパク質であってよいし、天然由来のタンパク質又はその改変体であってもよく、第２の変異体は、例えば、第２のアミノ酸配列と一定以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質にも適用され、人工的なタンパク質のほか、種々の天然由来タンパク質又はその改変体であってもよい。
【００８１】
ここで、第２のアミノ酸配列における１個又は２個以上の位置に相当する位置とは、第２のアミノ酸配列に対して、第２の変異体のアミノ酸配列をアライメントしたときに、第２のアミノ酸配列における１個又は２個以上の位置に対応付けられる、変異体における１個又は２個以上のアミノ酸残基の位置である。
【００８２】
第２の変異体が備える変異の位置は、特に限定するものではないが、例えば、第１のタンパク質と同様、その細胞外側領域、細胞質側領域及びゲート領域などから適宜選択して１個又は２以上とすることができる。第２の変異体が備える１個又は２個以上の変異の位置は、これらの３つの領域のうち１つの領域に存在する位置のみから構成されていてもよいし、２つの領域に存在する位置のみから構成されていてもよいし、さらに、全ての領域に存在する位置で構成されていてもよい。
【００８３】
また、第２の変異体が備えるアミノ酸置換変異は、特に限定するものではなく、第１の変異体と同様、側鎖の種々の特徴の少なくとも一部を変化させるような置換でありえる。また、置換変異の各種態様（例えば、表７〜１０に示す各種置換変異の態様）についても、第１の変異体に適用される態様が適用される。
【００８４】
（細胞外側領域における変異）
第２のタンパク質における細胞外側領域は１位〜４１位、９２位〜１１５位、１４７位〜１６５位、２２２位〜２３７位であると考えられるが、これらのアミノ酸領域における変異位置としては、例えば、３９位、９４位、９８位、１０２位、１１０位、１１３位、１１４位、１６２位、２２４位及び２２５位等が挙げられる。また例えば、２３０位、２３１位、２３５位が挙げられる。置換変異としては、例えば、Ｄ３９Ｎ、Ｒ９４Ｍ、Ｒ９４Ｋ、Ｒ９４Ｑ、Ｈ９８Ａ、Ｄ１０２Ｎ、Ｎ１１０Ｌ、Ｋ１１３Ａ、Ｋ１１３Ｎ、Ｙ１１４Ａ、Ｒ１６２Ａ、Ｓ２３０Ｅが挙げられ、また例えば、Ｔ２２４Ａ、Ｅ２２５Ａ、Ｅ２２５Ｑ、Ｑ２３１Ｌ、Ｈ２３５Ａ、Ｈ２３５Ｎ、Ｈ２３５Ｍが挙げられる。
【００８５】
（細胞質側領域における変異）
第２のタンパク質における細胞質側領域は、５１位〜８２位、１２５位〜１３８位、１７４位〜２１３位及び２５０位〜３７１位であると推定されるが、このアミノ酸領域におけるにおける変異位置としては、例えば、５３位、６１位、６８位、７４位、７６位、８０位、１３０位、１３７位、１９４位、１９５位及び１９８位等が挙げられる。また例えば、２００位、２０４位、２０５位、２０９位、２１０位、２５３位及び２５４位が挙げられる。置換変異としては、例えば、Ｋ６１Ａ、Ｒ７４Ａ、Ｅ７６Ｑ、Ｓ８０Ａ、Ｋ１３７Ｅ、Ｋ１３７Ａ、Ｋ１９８Ａ、Ｒ２００Ａ、Ｋ２０４Ａ、Ｋ２０４Ｅが挙げられ、また例えば、Ｌ５３Ａ、Ｌ５３Ｎ、Ｅ６８Ｑ、Ｗ１３０Ａ、Ｅ１９４Ｑ、Ｄ１９５Ｎ、Ｌ２０５Ａ、Ｌ２０９Ａ、Ｙ２１０Ｆ、Ｌ２５３Ｎ及びＬ２５３Ｓ、Ｌ２５４Ｎ、Ｌ２５４Ｓが挙げられる。
【００８６】
（ゲート領域における変異）
第２のタンパク質におけるゲート領域は、４２位〜５０位、８３位〜９１位、１１６位〜１２４位、１３９位〜１４６位、１６６位〜１７３位、２１４位〜２２１位及び２３８位〜２４９位であると推定されるが、このアミノ酸領域における変異位置としては、例えば、４６位、８３位、８４位、８７位、９０位、９１位、１１６位、１１７位、１２０位、１２４位、１３９位、１４２位、１４３位、１４６位、１７３位が挙げられる。また例えば、２１４位、２１６位、２１７位、２３８位、２４２位及び２４５位が挙げられる。置換変異としては、例えば、Ｌ４６Ａ、Ｖ８３Ａ、Ｖ８３Ｔ、Ｖ８３Ｄ、Ｖ８３Ｋ、Ｎ８４Ｐ、Ｎ８４Ｋ、Ａ８７Ｓ、Ａ８７Ｎ、Ａ８７Ｋ、Ｔ９０Ａ、Ｙ９１Ａ、Ｄ１１６Ａ、Ｄ１１６Ｔ、Ｙ１１７Ａ、Ｔ１２０Ｓ、Ｌ１２４Ｃ、Ｌ１２４Ｔ、及びＬ１２４Ａが挙げられる。また例えば、Ｔ１３９Ａ、Ｔ１３９Ｄ、Ｌ１４２Ａ、Ｆ１４３Ａ、Ｌ１４６Ａ、Ｆ１７３Ａ、Ｆ１７３Ｙ、Ｗ２１４Ａ、Ｗ２１４Ｙ、Ｇ２１６Ｓ、Ｙ２１７Ａ、Ｙ２１７Ｆ、Ｙ２１７Ｗ、Ｔ２３８Ａ、Ｔ２３８Ｋ、Ｔ２３８Ｄ、Ｄ２４２Ａ、Ｄ２４２Ｎ、Ｌ２４５Ｎ及びＬ２４５Ｓが挙げられる。
【００８７】
第２の変異体が有する少なくとも１つの変異位置は、例えば、７６位、８３位、８７位、１３７位、１４６位、１９８位、２０４位、２３０位及び２３１位からなる群から選択されることが好ましい。また例えば、７６位、８３位、８７位、１３７位、１４６位、１９８位、２０４位及び２３１位からなる群から選択されることが好ましい。また例えば、さらに、これらの２つの群の変異位置に５３位及び２１６位を加えた群から少なくとも１個が選択されることが好ましい。また、同様に少なくとも１つの置換変異は、Ｅ７６Ｑ、Ｖ８３Ａ、Ｖ８３Ｔ、Ａ８７Ｓ、Ｋ１３７Ａ、Ｌ１４６Ａ、Ｋ１９８Ａ、Ｋ２０４Ａ、Ｓ２３０Ｅ、Ｑ２３１Ｌからなる群から選択されることが好ましい。また例えば、さらに、この群の置換変異にＬ５３Ａ、Ｌ５３Ｎ及びＧ２１６Ｓを加えた群から少なくとも１個が選択されることが好ましい。
【００８８】
第２の変異体が２個以上の置換変異を備える場合、チャネル活性を考慮すると、例えば、８３位、８７位、１４６位及び２１６位などのゲート領域から選択される２個又は３個以上を組み合わせることができる。また、これら列挙した３個所に加えて細胞質側領域の例えば、５３位、７６位、１３７位、１９８位及び／又は２０４位の変異を適宜組み合わせることができる。さらにまた、細胞外側領域の２３０位及び／又は２３１位の変異を適宜組みあわせることができる。
【００８９】
第２の変異体が備える好適な２個以上の置換変異としてはＶ８３Ａ、およびＬ１４６Ａ、およびＫ１９８Ａ等を組みわせることが好ましい。
【００９０】
なお、第２の変異体は、以上に記載した位置以外における１〜３０個以下、また例えば、２５個以下、また例えば、２０個以下、また例えば１５個以下、また例えば、１０個以下、また例えば数個以下のアミノ酸残基の置換変異や、さらに、１〜３０個以下、また例えば、２５個以下、また例えば、２０個以下、また例えば１５個以下、また例えば、１０個以下、また例えば数個以下のアミノ酸残基の置換変異、欠失変異及び／又は挿入変異を備えることもできる。
【００９１】
第２の変異体は、第２のタンパク質が有するＤＴＤモチーフを備えていることが好ましい。すなわち、第２のアミノ酸配列におけるＤ１１６位、Ｔ１２０位及びＤ１２７位に相当する位置にアミノ酸残基（それぞれＤ、Ｔ及びＤ）を備えることが好ましい。さらに、第２の変異体は、このＤＴＤモチーフとさらに、第１のアミノ酸配列におけるＫ１１３位、Ｄ２４２位及びＫ２４６位から選択される１個又は２個以上に相当するアミノ酸残基を備えることが好ましい。
【００９２】
第２の変異体が有する、第２のアミノ酸配列との同一性は、特に限定するものではないが、前述の第１の変異体と同様の同一性（％）の態様を採ることができる。
【００９３】
第２の変異体は、チャネル活性を有している。チャネル活性は、第１のタンパク質について説明したのと同様の方法で確認できる。第２の変異体は、一定以上のチャネル活性を有することが好ましい。例えば、既述のチャネル活性の評価方法及び電気生理学記録条件（照射時間４００ｍＳ）で測定したときの、Ｉｐが５００ｐＡ以上及び／又はＩｓが４００ｐＡ以上、また例えば、Ｉｐが７５０以上及び／又はＩｓが６５０以上であることが好ましい。
【００９４】
第２の変異体は、第２のタンパク質よりも高いチャネル活性、すなわち、同等の操作で同等の条件で取得した第２のタンパク質のチャネル活性と同等以上のチャネル活性を有していることが好ましい。例えば、第２のタンパク質のチャネル活性の１１０％以上、また例えば、１２０％以上、また例えば、１３０％以上、また例えば、１４０％以上である。チャネル活性の優劣及び比率は、Ｉｐ及びＩｓのいずれか又は双方のチャネル電流値で判断することができる。
【００９５】
また、第２の変異体は、そのチャネル開口率が一定以上であることが好ましい。例えば、既述のチャネル活性の評価方法及び電気生理学記録条件（照射時間４００ｍＳ）で測定したときの、チャネル開口率が０．８以上、また例えば、０．８５以上、また例えば、０．９以上、また例えば、０．９５以上、また例えば、０．９７以上、また例えば、０．９８以上、また例えば、０．９９以上であることが好ましい。
【００９６】
第２の変異体は、また、同等の操作で同等の条件で取得した第２のタンパク質のチャネル開口率よりも同等以上のチャネル開口率を有していることが好ましい。例えば、第２のタンパク質のチャネル開口率の１１０％以上、また例えば、１２０％以上、また例えば、１３０％以上、また例えば、１４０％以上である。
【００９７】
当業者は、本明細書に開示される第２の変異体の変異位置及び好適な置換例に基づいて、種々の変異体及び相加体を作製、その評価を行い、意図したチャネル活性やチャネル開口率を有する第２の変異体を得ることができる。
【００９８】
また、当業者は、第１のタンパク質及びその変異体と同様、第２の変異体及びその変異体のＮ末端やＣ末端に対して、例えば、種々のタンパク質を融合することができる。第２のタンパク質及びその変異体は、第１のタンパク質と同様、公知の方法で取得することができる。
【００９９】
（ポリヌクレオチド）
本明細書に開示されるポリヌクレオチド（以下、単に、本ポリヌクレオチドともいう。）は、本タンパク質のアミノ酸配列をコードすることができる。かかるポリヌクレオチドは、種々の形態を採ることができるが、当該アミノ酸配列のコード領域は、ＤＮＡ又はＲＮＡであり、典型的にはＤＮＡである。
【０１００】
本ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ断片又はＲＮＡ断片のほか、プラスミド、ベクター等の形質転換等に適した公知の形態を採ることができる。
【０１０１】
本ポリヌクレオチドは、本変異体を得るためのＤＮＡとして人工的に合成することにより得ることができるほか、既述のとおり、既述の変異体取得方法に基づいてＤＮＡとして取得することができる。
【０１０２】
（ベクター）
本明細書に開示されるベクター（以下、本ベクターともいう。）は、本ポリヌクレオチドを備えることができる。本ベクターは、宿主細胞において本タンパク質を発現させることを目的とするものである。発現ベクターは、形質転換しようとする細胞の種類や目的等に応じて種々の形態を採ることができる。
【０１０３】
本ポリヌクレオチドは、例えば、適切な調節配列および／または標的配列の付加、および／または、コーディング配列の、選択された宿主の好ましいコドン使用頻度が適宜適用される。例えば、標的配列は、細胞膜、シナプス、ポストシナプス部位、または軸索小丘、または小胞体などの、細胞内の特定の部位または区画（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）に光誘起イオンチャネルを標的化する、Ｎ末端又はＣ末端伸張部分をコードしうるものである。当業者であれば、このようなベクターを本願出願時の周知技術に基づいて容易に構築することができる。
【０１０４】
本タンパク質を発現するためのベクターの取得方法やその構成要素については、ＧＦＰを用いる分野やその他遺伝子工学的分野における当業者に周知である。例えば、T．Maniatis，J. Sambrookらの実験書（Molecular Cloning, A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、1982,1989、2001)等を適宜参照することにより当業者であれば実施することができる。
【０１０５】
本明細書に開示されるベクターは、例えば、網膜神経細胞の光応答性を回復し視覚を改善又は再生等するためなどに用いる場合には、以下の態様が適用される。
【０１０６】
本ベクターは、眼疾患の遺伝子治療に好適でありうる。特に、ウイルス媒介性の遺伝子導入に利用されうる。「ウイルス媒介性の遺伝子導入」においては、本ベクターがウイルスにパックされ、その結果、対象の部位または細胞に送達できることを意味する。遺伝子治療に好適なウイルスの例は、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、狂犬病ウイルス、セムリキ森林熱ウイルスおよびヘルペスウイルスが挙げられる。なお、遺伝子治療は、裸のＤＮＡ、リポプレックスおよびポリプレックス、およびデンドリマーの適用などの非ウイルス性の方法も包含するものである。
【０１０７】
眼疾患を意図した本ベクターとしては、例えば、既に、かかるタンパク質をコードする遺伝子の導入によって視覚機能再生を意図するのに用いられている公知のベクターを用いることができる。例えば、ＡＡＶ−２ウィルスベクターなどを用いることができ、プロモーターとしては、例えば、ＣＡＧプロモーター、ヒトギャップ接合性タンパク質（コネキシン−３６）プロモーター（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ ＫＰら、２００７，Ｉｎ ｖｉｖｏ Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ＯＮ−Ｔｙｐｅ Ｒｅｔｉｎａｌ Ｇａｎｇｌｉｏｎ Ｃｅｌｌｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｒｅｔｉｎａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ．ＡＲＶＯ ａｂｓｔｒａｃｔ，２００７）、ｍＧｌｕＲ６プロモーターが利用可能である。
【０１０８】
細胞特異的なプロモーターを用いて、特定のタイプの網膜神経細胞を標的することが可能である。桿体双極細胞を標的し得るプロモーターは、Ｐｃｐ２（Ｌ７）プロモーターである（Ｔｏｍｏｍｕｒａ，Ｍら、２００１，Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４：５７〜６３）。活性プロモーターの長さは好ましくは、２．５Ｋｂ未満であり、そのため、これは、ＡＡＶウイルスカセット中にパッケージングされ得る。
【０１０９】
（標的細胞の形質転換及び形質転換細胞）
本明細書に開示される形質転換細胞（以下、本形質転換細胞ともいう。）は、本タンパク質を発現可能に本ポリヌクレオチドを保持する。本形質転換細胞は、既述の本ベクターやnaked DNAである本ポリヌクレオチドなどを、標的細胞に導入することにより得ることができる。標的細胞への導入方法としては、従来公知の各種方法、例えば、リン酸カルシウム法、トランスフォーメーション法や、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、酢酸リチウム法または他の方法が挙げられる。
【０１１０】
形質転換細胞は、また例えば、上記のとおり、ウイルスを用いることにより、本ヌクレオチドが細胞に導入されることによっても提供される。形質転換細胞は、その作製手法や用途によって、生体外の細胞であってもよいが、生体内の細胞であってもよいし、生体外で作製され、生体内に移植されるものであってもよい。なお、形質転換細胞としての標的細胞は、後段にて説明する。
【０１１１】
（本タンパク質、本ポリヌクレオチド、本ベクター及び本形質転換細胞の視覚の再生等への利用）
本タンパク質、本ポリヌクレオチド、本ベクター及び本形質転換細胞（以下、本タンパク質等ともいう。）は、視覚障害を改善又は視覚機能再生等するためなどに用いることができる。すなわち、いずれも、眼疾患の予防又は治療のための研究及び光遺伝学用途に用いることができる。特に限定するものではないが、遺伝子治療によって、本タンパク質を所定の網膜細胞又は網膜近傍の非網膜細胞である神経細胞等において発現させることにより、網膜の光応答性を改善又は回復させることができる。当該細胞に光応答性を付与して、これにより視覚を改善又は再生することができる。
【０１１２】
本明細書において、視覚障害または眼疾患としては、例えば、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症、網膜剥離、糖尿病網膜症網膜静脈閉塞、又は緑内障等が挙げられ、好ましくは、網膜色素変性症又は加齢黄斑変性症が挙げられる。本明細書において治療とは、細胞が変性、死滅、脱落するなどして網膜の機能を失った状態に対して、神経細胞等の光応答性を改善または回復させることにより、視覚機能の改善、回復または症状の進行の抑制を図るものである。本明細書において予防とは、細胞の変性、死滅または脱落が進行する蓋然性が高くなり、視覚障害を発症する危険性の高くなった状況において、神経細胞の光応答性を改善又は回復させ、更には機能喪失を予防し、または視覚障害の発症の遅延を図るものである。本発明の「タンパク質又は前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、視覚障害を治療又は予防するための医薬」には、このような遺伝子治療のために使用されるものが含まれる。例えば、当該医薬は、標的組織における該タンパク質発現用ベクターの形態で提供してもよい。この場合には、細胞への導入効率、該細胞内での複製維持、安定性、発現効率等に優れた発現ベクターを用いることが好ましい。このようなベクターとして、これに限定されるものではないが、例えばアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどのウイルスベクター、（自立複製可能な）プラスミド、トランスポゾンなどを挙げることができる。本発明のタンパク質発現用ベクターは、例えばＴｏｍｉｔａ Ｈ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ
Ｖｉｓ Ｓｃｉ．２００７ Ａｕｇ；４８（８）：３８２１−６；及びＳｕｇａｎｏ Ｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．２００５ Ｓｅｐ；４６（９）：３３４１−８に記載される方法に従って製造し、標的組織の細胞等に遺伝子導入することができる。また、本タンパク質等は、こうした視覚再生等又は光遺伝学のために研究目的にも利用される。
【０１１３】
視覚の再生等、眼疾患の治療を意図した本ベクターは、例えば、全てのタイプの神経節細胞（ＯＮおよびＯＦＦの両方の神経節細胞）、または全てのタイプの双極細胞（桿体双極細胞、ならびにＯＮおよびＯＦＦ錐体双極細胞）を対象とするように構成することができる。
【０１１４】
したがって、本明細書によれば、本タンパク質等を含む、視覚障害を治療又は予防するための医薬組成物が提供される。なお、特に限定するものではないが、視覚障害としては、例えば、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症、網膜剥離、糖尿病網膜症、網膜静脈閉塞、又は緑内障等が挙げられる。
【０１１５】
光応答性タンパク質をコードするＤＮＡを用いる遺伝子治療は公知であり、本タンパク質等についても、同様の手法又は当該手法に準じて眼疾患の遺伝子治療や研究用途に適用可能である。
【０１１６】
（本タンパク質等の光遺伝学への利用）
また、本タンパク質等は、光遺伝学を用いて各種の神経経路の研究用途及び神経疾患の治療等への用途にも有用である。一般に、神経細胞の細胞内外には電位差（電圧差）が存在する。通常時（抑制時）細胞内が細胞外に比べておよそ−７０ｍＶ〜−８０ｍＶ程度である。この状態を過分極という。神経細胞の活性化（または発火、興奮）は、細胞膜内外の電位差が−４０ｍＶ〜−２０ｍＶまで上昇した際に（脱分極と呼ぶ）、膜電位依存性ナトリウムチャネルが活性化することで引き起こされる。第１のタンパク質は光応答性カチオンチャネルであるため、神経細胞膜に発現させると、光照射に伴い陽イオンを透過することでチャネル電流を発生させる。その結果、細胞膜を脱分極させ、結果として神経細胞を活性化（発火、興奮）させることができる。
【０１１７】
したがって、例えば、本ベクター又は本ベクターを組み込んだウイルスを用いて、標的細胞としての神経細胞を形質転換して、本タンパク質を標的細胞にて発現させる。こうすることで形質転換された神経細胞は、光照射により、チャネル電流を発生するようになる。こうした形質転換神経細胞を生体外で調製して生体に移植するかあるいは本ベクター等を生体内の神経細胞を形質転換することで、生体内に外部からの光照射に応答して活性化する神経経路を構築することができる。
【０１１８】
（標的細胞）
形質転換細胞の標的細胞としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏ−ｍｙｃｅｓ Ｐｏｍｂｅ）またはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの酵母が挙げられる。
【０１１９】
また、他の標的細胞としては、哺乳動物細胞または昆虫細胞が挙げられる。例えば、哺乳類細胞としては、メラノーマ細胞（例えば、ＢＬＭ細胞株）、ＣＯＳ細胞（「アフリカミドリザル腎臓ＣＶ１」細胞感染により生成される）、ＨＥＫ細胞（「ヒト胎児腎臓細胞」例えばＨＥＫ２９３細胞）、ＢＨＫ細胞（「ベビーハムスター腎細胞」）における一時的発現としてのエピソーマルベクターで、またはＣＨＯ細胞（「チャイニーズハムスター卵巣細胞」）、骨髄腫細胞またはＭＤＣＫ細胞（「Ｍａｄｉｎｅ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓細胞」）が挙げられ、昆虫細胞としては、バキュロウイルスに感染したＳｆ９昆虫細胞等が挙げられる。
【０１２０】
光応答性を得るための視覚再生等の観点からは、標的細胞は、哺乳動物細胞は光受容細胞；網膜桿状体細胞；網膜錐体細胞；網膜神経節細胞；双極ニューロン；神経節細胞；偽単極ニューロン；多極ニューロン；ピラミッド状ニューロン；プルキンエ細胞；または、顆粒細胞などである。
【０１２１】
光遺伝学等の観点からは、標的細胞としては、例えば、哺乳類細胞を含む動物細胞が挙げられる。哺乳類細胞は、例えば、神経芽腫細胞（例えば、NG108-15細胞）、メラノーマ細胞（例えば、BLM細胞株）、COS細胞（「アフリカミドリザル腎臓CV1細胞」より産生される）、HEK細胞（「ヒト胚性腎臓細胞」、例えば、HEK293細胞）、又はBHK-細胞（「ベビーハムスター腎臓細胞」）を用いて、あるいは、CHO細胞（「チャイニーズハムスター卵巣細胞」）、骨髄腫細胞またはMDCK細胞（「Madby-Darbyイヌ腎臓細胞」）が挙げられる。また、バキュロウイルスを感染させたＳｆ９昆虫細胞内で可能である。
【０１２２】
哺乳類細胞は、また例えば、電気的に興奮性の細胞である。例えば、海馬細胞、双極神経細胞；神経節細胞；偽単極性神経細胞；多極神経細胞；錐体神経細胞、プルキンエ細胞；又は顆粒細胞である。電気的に興奮性の細胞には、また、接触、音、光および感覚器官の細胞に影響を及ぼすその他多くの刺激に応答する感覚神経細胞、脳および脊髄からシグナルを受けて筋肉収縮を引き起こしたり腺に影響する運動神経細胞、ならびに脳または脊髄の同じ領域内で神経細胞同士を接続する介在神経細胞などの多様な神経細胞が含まれる。さらに、心筋、平滑筋及び骨格筋等も挙げられる。
【０１２３】
標的細胞は、また例えば、動物の個体内における細胞、組織及び器官であり、最終的に動物個体やその一部を作製可能な受精卵、ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞等である。動物個体としては、例えば、ハエ、線虫、マウス、ラット、サル等が挙げられる。さらに、こうして取得された結果として、こうした形質転換動物又はその一部等が挙げられる。
【０１２４】
形質転換される標的細胞は単離され（および遺伝学的に改変され）、維持され、適切な温度およびガス混合（典型的には、３７℃、５％ＣＯ2）で、任意に、当業者に既知および実施例における特定の細胞株または細胞型のために例示された、細胞培養器内で、培養され得る。培養条件は各々の細胞型により変化し得、特定の細胞型のための条件の変化は異なった表現型をもたらすことができる。温度とガス混合は別として、細胞培養系における最も一般的な変化の要素は増殖培地である。増殖培地のための組成は、ｐＨ、グルコース濃度、増殖因子、および特に他の栄養成分の存在において変化できる。増殖培地は、商業的に利用可能であるか、またはアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から入手可能な組成に従って、調製できる。補足培地に使用される増殖因子はしばしば子牛血清などの動物血液由来である。追加で、抗生物質が増殖培地に加えられ得る。一般的な操作の中で、培養細胞上で実施されるものは、培地変更および細胞通過である。
【０１２５】
（神経細胞に光応答性を付与する方法)
本タンパク質等は、神経細胞に光応答性を付与することができる。このため、本方法は、視覚障害を改善又は視覚機能を再生する方法を実施することができるほか、オプトジェネティクスに応用可能である。例えば、マウス海馬の攻撃性や記憶形成に関与すると考えられる領域に存在する神経細胞に、光応答性を付与するタンパク質又はポリヌクレオチドを導入することで、実際にその領域が攻撃性や記憶形成にどう関与するかどうか検証することができる（Lin,Dら、2011,Nature.470(7333)：221-6及びOKUYAMAら，2016，Science (6307) 1536-1541 ）。
【０１２６】
また例えば、ヒト又は非ヒト動物の、中枢又は末梢における神経細胞に光応答性を付与し、所定の波長及び強度の光の照射によってチャネル電流を発生させることができるため、これにより神経細胞を活性化することで、当該領域の神経細胞の活性化や抑制が特定の疾患に関与しているかどうかを検証することができる。また、こうした神経細胞の活性化により、中枢又は末梢の神経回路を回復させて、神経変性疾患などを治療することができる場合がある。
【０１２７】
（光応答性細胞）
本明細書によれば、光応答性が付与された上記標的細胞が、新たな光応答性細胞(光応答性材料）として提供される。かかる光応答性細胞は、例えば、光遺伝学の分野において、神経活動の活性化等が関連する研究に用いることができる。
【０１２８】
（スクリーニング方法）
本明細書に開示されるスクリーニング方法は、配列番号１で表される第１のアミノ酸配列の１個又は２個以上の位置に相当する位置に第１のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸残基を備える被験体タンパク質について、チャネル活性を評価する工程を備えることができる。また、本明細書に開示される他のスクリーニング方法は、配列番号３で表される第２のアミノ酸配列の１個又は２個以上の位置に相当する位置に第２のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸残基を備える被験体タンパク質について、チャネル活性を評価する工程を備えることができる。これらのスクリーニング方法によれば、第１のタンパク質及び第２のタンパク質について、より優れたチャネル活性を備える変異体を取得することができる。なお、ここでいうチャネル活性は、例えば、既述の電気生理学的測定法により測定することができる。また、チャネル活性は、既述のＩｐ、Ｉｓ及びチャネル開口率のいずれかあるいは２以上の組みあわせを採用することができる。いずれのチャネル活性に基づいてあるいはどのような組みあわせで被験体タンパク質のチャネル活性を評価するかは、変異体を取得する目的等によって適宜選択される。
【０１２９】
これらのスクリーニング方法で用いる被験体は、既述の変異体の作製方法に基づいて得ることができる。また、チャネル活性の評価についても既に説明した態様を適用することができる。
【０１３０】
これらのスクリーニング方法では、上記した変異位置のほか、追加の変異を備えたスクリーニング候補を用いてもよい。
【０１３１】
本明細書は、以上の記載によれば、以下の記載の実施態様を包含している。
【０１３２】
［１］配列番号１で表される第１のアミノ酸配列において以下の（１）〜（３）：
（１）３９位、９４位、９８位、１０２位、１１０位、１１３位、１１４位、１６２位、２２４位、２２５位、２３０位、２３１位及び２３５位、
（２）５３位、６１位、６８位、７４位、７６位、８０位、１３０位、１３７位、１９４位、１９５位、１９８位、２００位、２０４位、２０５位、２０９位及び２１０位、並びに
（３）４６位、８３位、８４位、８７位、９０位、９１位、１１６位、１１７位、１２０位、１２４位、１３９位、１４２位、１４３位、１４６位、１７３位、２１４位、２１６位、２１７位、２３８位及び２４２位
からなる群から選択される１個又は２個以上に相当する位置において、前記第１のアミノ酸配列におけるのとは異なるアミノ酸残基を備え、チャネル活性を有する、タンパク質。
［２］さらに、１又は数個のアミノ酸残基の欠失、置換又は挿入を備える、［１］に記載のタンパク質。
［３］前記チャネル活性は、以下から選択されるいずれかを満たす、［１］又は［２］に記載のタンパク質。
（ａ）チャネル活性（Ｉｐ）が１０００ｐＡ以上である
（ｂ）チャネル活性（Ｉｓ）が８００ｐＡ以上である
（ｃ）チャネル開口率（Ｉｓ／Ｉｐ）が０．８５以上である
［４］前記１個又は２個以上の位置は、前記第１のタンパク質のゲート領域、細胞外側領域及び細胞質側領域から選択される、［１］〜［３］のいずれかに記載のタンパク質。
［５］前記１個又は２個以上の位置は、第１のアミノ酸配列における７６位、８３位、８７位、１３７位、１４６位、１９８位、２０４位、２３０位及び２３１位からなる群から選択される１個又は２個以上の位置に相当する位置である、［１］〜［４］のいずれかに記載のタンパク質。
［６］前記タンパク質は、前記１個又は２個以上に相当する位置における前記第１のアミノ酸配列における以下のアミノ酸残基に対して、以下のいずれかのアミノ酸残基を備える、［１］〜［５］のいずれかに記載のタンパク質。
【表１１】
2020054868.tif 000012
［７］前記タンパク質は、前記１個又は２個以上に相当する位置における前記第１のアミノ酸配列における以下のアミノ酸残基に対して、以下のいずれかのアミノ酸残基を備える、［１］〜［５］のいずれかに記載のタンパク質。
【表１２】
2020054868.tif 000013
［８］前記タンパク質は、前記第１のアミノ酸配列における以下の位置に相当する位置において、以下のいずれかのアミノ酸置換を備える、［１］〜［７］のいずれかに記載のタンパク質。
【表１３】
2020054868.tif 000014
［９］前記タンパク質は、前記第１のアミノ酸配列における以下の位置に相当する位置において、以下のいずれかのアミノ酸置換を備える、［１］〜［７］のいずれかに記載のタンパク質。
【表１４】
2020054868.tif 000015
［１０］前記タンパク質は、前記第１のアミノ酸配列における前記１個又は２個以上に相当する位置において備える異なるアミノ酸残基は、Ｅ７６Ｑ，Ｖ８３Ａ，Ｖ８３Ｔ、Ａ８７Ｓ、Ｋ１３７Ａ，Ｌ１４６Ａ，Ｋ１９８Ａ，Ｋ２０４Ａ、Ｓ２３０Ｅ及びＱ２３１Ｌからなる群から選択される１個又は２個以上を備える、［１］〜［９］のいずれかに記載のタンパク質。
［１１］前記タンパク質のアミノ酸配列は、第１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有する、［１］〜［１０］のいずれかに記載のタンパク質。
［１２］配列番号３で表される第２のアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するタンパク質であってチャネル活性を有するタンパク質を含む、網膜に対する光応答性の回復剤。
［１３］配列番号３で表される第２のアミノ酸配列において、以下の（１）〜（３）：
（１）３９位、９４位、９８位、１０２位、１１０位、１１３位、１１４位、１６２位、２２４位、２２５位、２３１位及び２３５位、
（２）５３位、６１位、６８位、７４位、７６位、８０位、１３０位、１３７位、１９４位、１９５位、１９８位、２００位、２０４位、２０５位、２０９位及び２１０位、並びに
（３）４６位、８３位、８４位、８７位、９０位、９１位、１１６位、１１７位、１２０位、１２４位、１３９位、１４２位、１４３位、１４６位、１７３位、２１４位、２１６位、２１７位、２３８位及び２４２位
からなる群から選択される１個又は２個以上に相当する位置において、前記第２のアミノ酸配列におけるのとは異なるアミノ酸残基を備え、チャネル活性を有する、タンパク質。
［１４］前記タンパク質のアミノ酸配列は、前記第２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有する、［１３］に記載のタンパク質。
［１５］［１］〜［１１］のいずれかに記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［１６］［１５］に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
［１７］［１２］〜［１４］のいずれかに記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［１８］［１７］に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
［１９］［１］〜［１４］のいずれかに記載のタンパク質又は前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、網膜の光応答性を回復する使用方法。
［２０］［１］〜［１４］のいずれかに記載のタンパク質又は前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、視覚障害を治療又は予防するための医薬組成物。
[２１]前記視覚障害は、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症又は網膜剥離である、請求項［２０］に記載の医薬組成物。
［２２］配列番号１で表される第１のアミノ酸配列における１個又は２個以上の位置において第１のアミノ酸配列におけるのとは異なるアミノ酸残基を備える被験体タンパク質について、チャネル活性を評価する工程を備える、変異体タンパク質のスクリーニング方法。
［２３］配列番号３で表される第２のアミノ酸配列における１個又は２個以上の位置において第１のアミノ酸配列におけるのとは異なるアミノ酸残基を備える被験体タンパク質について、チャネル活性を評価する工程を備える、変異体タンパク質のスクリーニング方法。
【実施例】
【０１３３】
以下、本明細書の開示をより具体的に説明するために具体例としての実施例を記載する。以下の実施例は、本明細書の開示を説明するためのものであって、その範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【０１３４】
（Ｇ. Theta由来のカチオンチャネルロドプシンであるＧｔＣＣＲ４及びＧｔＣＣＲ５をコードするＤＮＡを含むベクターの作製）
配列番号１及び３でそれぞれ表されるＧｔＣＣＲ４及びＧｔＣＣＲ５のアミノ酸配列を、哺乳類での発現に適したコドン用法を用いて、それぞれ配列番号５及び６で表される塩基配列でコードするオリゴヌクレオチドＤＮＡ/４及びＤＮＡ/５を化学合成により取得した。【０１３５】
これらのＤＮＡ/4及び同5について、それぞれ、以下に示すプライマーを用いて、増幅した。また、ベクターＤＮＡ（pEGFP-N1）もインバースＰＣＲにより増幅した。増幅したＤＮＡ/4及び同５断片及びベクタ−ＤＮＡ断片を、それぞれ、In−Fusion反応により、それぞれ、ＤＮＡ／４及び同５を組み込んだpEGFP-GtCCR4及びpEGFP-GtCCR5を作製した。【０１３６】
ＤＮＡ/４（Gｔ ＣＣＲ４）を取得するためのプライマー
フォワードプライマー：5' CGAGCTCAAGCTTATGATGACAACAAGCGCCCCTAG 3'（配列番号７）
リバースプライマー：5' GACCGGTGGATCCTGAACAGCCTCAGACTCTTGCA 3'（配列番号８）
ＤＮＡ/５（Gｔ ＣＣＲ５）を取得するためのプライマー
フォワードプライマー：5'CGAGCTCAAGCTTATGGCCACATCTGCCCCTAGCCTG3'（配列番号９）
リバースプライマー：5'GACCGGTGGATCCTGCATTCTCTCGTCGTCCTGCAG3'（配列番号１０）
vector pEGFP-N1のベクター断片を取得するためのプライマーフォワードプライマー：5'CATAAGCTTGAGCTCGAGATC3'（配列番号１１）
リバースプライマー：5'CAGGATCCACCGGTCGCCACC3'（配列番号１２）
【実施例２】
【０１３７】
（ＮＤ７／２３細胞への遺伝子導入及び電気生理学的測定）
マウス神経／ラット脊髄後根神経節由来であって、マウス芽細胞腫×ラット神経由来であるＮＤ７／２３細胞を、ＤＭＥＭ（High glucose）＋ＦＢＳ５％培地を用いてＣＯ2インキュベータ中３７℃で培養した。この細胞に、実施例１で作製したベクターを、リポフェクション法(Lipofectamine 2000(Thermo Fischer社)を用いてプラスミドＤＮＡをＮＤ７／２３細胞に導入した。ＮＤ７／２３細胞におけるＧｔＣＣＲ４及びＧｔＣＣＲ５の発現は、ＧＦＰ蛍光により確認した。【０１３８】
細胞への遺伝子導入後、２４時間以降４８時間以内に以下の条件で全細胞記録パッチクランプ法により電気生理学測定を行った。【０１３９】
【表１５】
2020054868.tif 000016
【０１４０】
以上の条件で細胞に光を照射し、例えば、上記の条件で、細胞に４００ｍｓの時間光を照射した際に発生するピーク状の最大電流値（Ｉｐ）及び光照射中に一定レベルにまで減衰した定常的な電流値（Ｉｓ）をそれぞれ測定した。さらに、ＩｓをＩｐで除した値を、後述するチャネル開口率とした。測定原理等について図１のＡ〜Ｃに示し、測定結果を、同Ｄ、Ｅに示す。【０１４１】
図１のＤ、Ｅに示すように、ＧｔＣＣＲ４は、大きなチャネル電流が発生していた。また、ＧｔＣＣＲ４及びＧｔＣＣＲ５は、いずれも、高いチャネル開口率（０．８１、０．８５）を示した。これらの特性は、いずれも、神経節細胞に光応答性を付与して視覚再生するのに貢献するものと考えられる。なお、同様に操作して作製したＮＤ7/23細胞のクラミドモナス由来ＣｈＲ２によるチャネル電流値は、ＧｔＣＣＲ４の約半分であり、チャネル開口率は、０．４５であった。【０１４２】
以上のことから、ＧｔＣＣＲ４及びＧｔＣＣＲ５は、いずれも、ＣｈＲ２に比較してチャネル活性及び／又はチャネル開口率に関して有利であることがわかった。
【実施例３】
【０１４３】
（ＧｔＣＣＲ４変異体をコードするＤＮＡを含むベクターの作製及びＮＤ7/23の形質転換及び形質転換細胞の電気的生理学的測定その１）
ＧｔＣＣＲ４のアミノ酸配列（配列番号１）に基づいて、種々の単一の変異を付与した単変異体を設計した。既述のコドン用法を用いてそれらをコードする塩基配列を決定し、QuickChange法(QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit, アジレントテクノロジー株式会社)により作製した。なお、単変異体の置換変異の内容については、図２に併せて示す。【０１４４】
このＤＮＡ断片に関して、実施例１と同様に操作して、In−Fusion反応により、pEGFPベクターを作製し、さらに、実施例２と同様に操作してＮＤ7/23細胞を形質転換して、各単変異体を発現する形質転換細胞を取得した。さらに、実施例２と同様に操作して、これらの形質転換細胞につき電気生理学的測定を行った。なお、対照として、クラミドモナス由来のＣｈＲ２及び野生型ＧｔＣＣＲ４による形質転換細胞についても同様にして測定した。結果を図２に示す。【０１４５】
図２に示すように、いくつかの変異体がチャネル電流値に関し、野生型よりも優れた結果を示した。例えば、Ｅ７６Ｑ、Ｖ８３Ａ、Ｖ８３Ｔ、Ａ８７Ｓ、Ｋ１３７Ａ、Ｌ１４６Ａ、Ｋ１９８Ａ、Ｋ２０４Ａ、Ｓ２３０Ｅ及びＱ２３１Ｌが、高いＩｐ及びＩｓを示した。これらのうち、Ｅ７６Ｑ、Ｖ８３Ａ、Ｖ８３Ｔ、Ｋ１３７Ａ、Ｌ１４６Ａ、Ｋ１９８Ａ、Ｋ２０４Ａ及びＱ２３１Ｌは、野生型に対して優れたチャネル活性を示した。また、Ｅ７６Ｑ、Ｖ８３Ａ、Ｖ８３Ｔ、Ｋ１３７Ａ及びＬ１４６Ａは、チャネル開口率も約１であった。【０１４６】
以上のことから、上記した変異位置は、いずれも、ＧｔＣＣＲ４においてチャネル活性を制御するのに有用な変異位置であることがわかった。また、ＧｔＣＣＲ５においてもチャネル活性を制御するのに有用な位置であることがわかった。上記変異位置及びアミノ酸置換残基は、チャネル活性及び／又はチャネル開口率に関して有利なアミノ酸置換変異であることがわかった。【０１４７】
なお、野生型ＧｔＣＣＲ４と同等のチャネル活性を示す変異であっても、クラミドモナス由来ＣｈＲ２よりは十分に高いチャネル活性及び／又はチャネル開口率を呈しており、有用な変異位置及び置換残基であると考えられた。
【実施例４】
【０１４８】
（ＧｔＣＣＲ４変異体をコードするＤＮＡを含むベクターの作製及びＮＤ7/23の形質転換及び形質転換細胞の電気的生理学的測定その２）
実施例３で作製したＥ７６Ｑ、Ｖ８３Ａ、Ｋ１３７Ａ、Ｌ１４６Ａ、Ｋ１９８Ａ、Ｋ２０４Ａ及びＱ２３１Ｌの各単一変異を有する単変異体を発現させる形質転換細胞について、電気生理学的測定を行った。また、同時に、クラミドモナス由来ＣｈＲ２、野生型ＧｔＣＣＲ４、実施例３で作製したＶ８３Ａ変異体による形質転換細胞についても電気生理学的測定を行った。なお、光照射条件は、図３に示すとおりとした。結果を、図３に示す。【０１４９】
図３のＡ〜Ｄに、クラミドモナス由来ＣｈＲ２、野生型ＧｔＣＣＲ４、Ｖ８３Ａ変異体及びＬ１４６Ａ変異体についての結果を例示し、同Ｅ〜Ｆに、各種変異体についての結果を示す。図３のＡ〜Ｆに示すように、各種変異体はＣｈＲ２及び野生型ＧｔＣＣＲ４に比較してチャネル電流値が高いだけでなく、チャネル開口率が大きく、また、チャネルの不活性化が抑制されていることを確認できた。不活性化の抑制は、流れるチャネル電流の総量が増大することになるため、光応答性の向上に好適であると考えられる。【０１５０】
以上のことから、これらの変異体は、いずれも有用性の高い変異体であり、これらの変異位置及び置換残基がチャネル活性やチャネル開口率に貢献していると考えられた。
【実施例５】
【０１５１】
（ＧｔＣＣＲ４の二重変異体をコードするＤＮＡを含むベクターの作製及びＮＤ７／２３の形質転換及び形質転換細胞の電気的生理学的測定）
実施例３及び実施例４にて確認した単一変異のうちある種の組みあわせについて、実施例１及び２に準じてベクターを作製し、実施例３と同様にして電気生理学的測定を行った。また、同時に、クラミドモナス由来ＣｈＲ２、野生型ＧｔＣＣＲ４による形質転換細胞についても電気生理学的測定を行った。結果を、図４に示す。【０１５２】
図４のＡに示すように、二重変異体は、野生型ＧｔＣＣＲ４の２倍〜４倍程度のチャネル活性を示した。また、図４のＢに示すように、そのチャネル開口率も、野生型ＧｔＣＣＲ４を上回って概ね０．９〜１．０であった。以上のことから、これらの単一変異は、個々に有用な変異位置及び置換残基であるほか、二重変異体においても有用な変異位置及び置換残基であることがわかった。したがって、単一変異として優れた変異位置及び置換残基は、二重変異体としても有用であることがわかった。
【実施例６】
【０１５３】
（ＧｔＣＣＲ５の変異体をコードするＤＮＡを含むベクターの作製及びＮＤ７／２３の形質転換及び形質転換細胞の電気的生理学的測定）
ＧｔＣＣＲ５のアミノ酸配列（配列番号３）に基づいて、３種の単一の変異を付与した単変異体を設計し、既述のコドン用法を用いてそれらをコードする塩基配列を決定し、QuickChange法(QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit, アジレントテクノロジー株式会社)により作製した。なお、単変異体の内容については、図５に併せて示す。【０１５４】
このＤＮＡ断片に関して、実施例１と同様に操作して、In−Fusion反応により、pEGFPベクターを作製し、さらに、実施例２と同様に操作してＮＤ7/23細胞を形質転換して、各単変異体を発現する形質転換細胞を取得した。さらに、実施例２と同様に操作して、これらの形質転換細胞につき電気生理学的測定を行った。なお、対照として、クラミドモナス由来のＣｈＲ２、野生型ＧｔＣＣＲ４及び野生型ＧｔＣＣＲ５（配列番号３及びコドン最適化された塩基配列による）による形質転換細胞についても同様にして測定した。結果を図５に示す。【０１５５】
図５のＡに示すように、Ｖ８３Ａ、Ｌ１４６Ａ、Ｋ１９８Ａは、ＣｈＲ２や野生型ＧｔＣＣＲ５に比較すると高いチャネル活性を有していることがわかった。また、図５のＢに示すように、これらの変異体は、チャネル開口率も向上していた。上記した変異位置は、いずれも、ＧｔＣＣＲ５においてチャネル活性及び／又はチャネル開口率を制御するのに有用な変異位置であることがわかった。また、上記変異位置及びアミノ酸置換残基は、チャネル活性及び／又はチャネル開口率に関して有利なアミノ酸置換変異であることがわかった。
【実施例７】
【０１５６】
（ＧｔＣＣＲ４変異体をコードするＤＮＡを含むベクターの作製及びＮＤ7/23の形質転換及び形質転換細胞の電気的生理学的測定その３）
実施例３に準じて、ＧｔＣＣＲ４のアミノ酸配列（配列番号１）に基づいて、種々の単一の変異を付与した単変異体を設計し、既述のコドン用法を用いてそれらをコードする塩基配列を決定し、QuickChange法によりＤＮＡ断片を作製した。引き続き実施例３に準じて、In−Fusion反応により、pEGFPベクターを作製し、ＮＤ7/23細胞を形質転換して、各単変異体を発現する形質転換細胞を取得し、これらの形質転換細胞につき電気生理学的測定を行った。なお、対照として、野生型ＧｔＣＣＲ４による形質転換細胞についても同様にして測定した。単変異体の置換変異の内容及び電気生理学的測定結果を、併せて図６に示す。【０１５７】
図６に示すように、いくつかの変異体がチャネル電流値に関し、野生型よりも優れた結果を示した。例えば、Ｌ５３Ａ、Ｌ５３Ｎ、Ｅ７６Ｑ、Ｖ８３Ｔ、Ｇ２１６Ｓ、Ｑ２３１Ｌなどが高いＩｐ及びＩｓを示した。これらの変異体は、チャネル開口率もいずれも優れたものであり、特に、Ｌ５３Ａ、Ｌ５３Ｎ、Ｅ７６Ｑ、Ｖ８３Ｔ、Ｑ２３１Ｌは、チャネル開口率も約１であった。活性の観点からは、Ｌ５３Ａ、Ｖ８３Ｔ、Ｑ２３１Ｌが優れていた。【０１５８】
また、Ｌ４６Ａ、Ｅ６８Ｑ、Ｒ９４Ｋ、Ｆ１７３Ｙ、Ｔ２２４Ａ、Ｈ２３５Ａ、Ｈ２３５Ｎの活性は、野生型と概ね同等であったが、クラミドモナス由来ＣｈＲ２よりは十分に高いチャネル活性及び／又はチャネル開口率を呈すると考えられるため、有用な変異位置及び置換残基であると考えられた。【０１５９】
以上のことから、上記した変異位置は、いずれも、ＧｔＣＣＲ４においてチャネル活性を制御するのに有用な変異位置であることがわかった。また、ＧｔＣＣＲ５においてもチャネル活性を制御するのに有用な位置であることがわかった。上記変異位置及びアミノ酸置換残基は、チャネル活性及び／又はチャネル開口率に関して有利なアミノ酸置換変異であることがわかった。
【実施例８】
【０１６０】
（神経細胞光刺激実験）
本実施例では、光応答性タンパク質を細胞膜に発現させたラット大脳上皮初代培養細胞に、光強度を種々に変えて応答を引き起こす波長の光を照射して、その細胞膜電位を測定して、光刺激における光強度依存性を評価した。【０１６１】
神経細胞を光照射によって、活性化（発火、興奮）させることを光刺激という。本実施例では、光刺激の評価法としては、以下のような電気生理学的手法による実験を行った。すなわち、ラット大脳上皮細胞を単離し、シャーレ上で培養した。これを初代培養細胞と呼ぶ。この初代培養細胞にＧｔＣＣＲ４（ＷＴ）及びＣｈｒ２（ＷＴ）を実施例１、２等に準じて発現させた上、それぞれ極大吸収波長５３０ｎｍ及び４８８ｎｍで種々の強度の光を一定時間照射したときに、全細胞記録によるパッチクランプ法の電流固定法で単一の神経細胞についての興奮（脱分極）と過分極（抑制）を計測し、細胞膜電位の時間変化を計測した。【０１６２】
具体的には、ＧｔＣＣＲ４及びＣｈＲ２の各アミノ酸配列をコードするＤＮＡ哺乳類のコドン用法を用いた）を合成し、ｅＹＦＰがこれらのタンパク質のＣ末端側にタグ付けされるように、ＣＡＭＫ２プロモーターを持つ神経細胞用のベクタープラスミドに組み込んで導入用プラスミドとし、このプラスミドをラット大脳上皮初代培養細胞に、リン酸カルシウム法を用いて導入してトランスフェクションした。各タンパク質の導入細胞の細胞膜上での発現は、ｅＹＦＰの蛍光で確認することができた。【０１６３】
こうして初代培養細胞膜に各タンパク質を一過的に発現させた細胞につき、導入後、１６日以内で、各タンパク質が安定的に発現している状態で、全細胞記録によるパッチクランプ法などの電気生理学的測定を行った。【０１６４】
全細胞記録パッチクランプ法による電流固定法による測定条件は、以下の条件を採用した。【０１６５】
【表１６】
2020054868.tif 000017
【０１６６】
測定手順は、以下のとおりとした。準備した細胞シャーレ内の溶液を上記（６）の細胞外溶液に交換した。次に顕微鏡下で細胞を観察し、eYFP蛍光を強く発する細胞を選んだ。上記（４）で製造したガラスピペットの管内を上記（６）の細胞内溶液で満たし、（１）の電流増幅器付属のヘッドステージに接続した。ガラスピペットの位置を上記（５）のマイクロマニュピレーターで操作することでガラスピペット先端を、細胞上部約２−３ミクロンに移動させた。さらにマイクロマニュピレーター操作により徐々にガラスピペットを降下させ、細胞とピペット先端が接触する位置に移動させた。その後ガラスピペット内を減圧することで細胞膜を完全にピペット先端に密着させる。この時５〜１０ＭΩであったピペット抵抗が１ＧＭ程度まで上昇する。さらにピペット内を減圧させることで全細胞記録ができるホールセルモードとなった。【０１６７】
上記の状態に達したのち、パッチクランプ法電流固定法により細胞膜電位を計測した。神経細胞が抑制された際には膜電位はー７０〜−８０ｍＶの値を示すが、光応答活性を有するタンパク質を発現させた細胞に光照射を行うと細胞が脱分極を起こすので膜電位がー２０〜−４０ｍＶに上昇し、その後スパイク状の神経の活性化（興奮、発火）が観察された。上記の条件で測定したときの脱分極の程度、すなわち、スパイク状の神経興奮の頻度を計測することでこれらのタンパク質の光刺激の効果を検証した。結果を図７に示す。【０１６８】
図７の（Ａ）〜（Ｃ）に示すように、ＧｔＣＣＲ４は、Ｃｈｒ２に比較して、低い光強度で活性化することがわかった。ＥＣ５０を比較するとＧｔＣＣＲ４は０．０２ｍＷ/ｍｍ2，Ｃｈｒ２は０．１５ｍＷ/ｍｍ2と７倍以上の差があった。これはＧｔＣＣＲ４はＣｈｒ２の７倍以上の光感度を有することを意味する。これらのことから、ＧｔＣＣＲ４と同等以上の活性が確認されているＧｔＣＣＲ４の変異体であれば、ＧｔＣＣＲ４と同様の光強度依存性、すなわち、低強度の光でも十分に、当該タンパク質を膜で発現している細胞において光刺激可能であることがわかった。
【配列表フリーテキスト】
【０１６９】
配列番号７〜１２：プライマー
【図１】
2020054868.tif 000022
【図２】
2020054868.tif 000023
【図３】
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【図４】
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【図５】
2020054868.tif 000026
【図６】
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【図７】
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【配列表】
2020054868000001.app
【国際調査報告】
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