(57)【要約】  本発明は、単子葉植物において５’ＵＴＲバリアントを考慮した真に高翻訳能を有する５'ＵＴＲを特定し、当該５'ＵＴＲコードするＤＮＡ分子及び単子葉植物において効率的に組み換えタンパク質を製造する技術を提供することを目的とする。  外来タンパク質をコードするポリヌクレオチドに、配列番号１〜４のいずれかに示す塩基配列からなる５'ＵＴＲ又はその改変体を連結した核酸構築物を使用することにより、単子葉植物において組み換えタンパク質を効率的に製造することが可能になる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(i)〜(iii)のいずれかに示すポリヌクレオチドからなることを特徴とする、５'ＵＴＲをコードするＤＮＡ分子：
(i)配列番号１〜４のいずれかに示す塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(ii)配列番号１〜４のいずれかに示す塩基配列において、１又は数個の塩基が置換、欠失若しくは付加された塩基配列からなり、且つ配列番号１〜４のいずれかに示す塩基配列からなるポリヌクレオチドと同等の５'ＵＴＲ活性を示すポリヌクレオチド、
(iii)配列番号１〜４のいずれかに示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ配列番号１〜４のいずれかに示す塩基配列からなるポリヌクレオチドと同等の５'ＵＴＲ活性を示すポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡ分子が、外来タンパク質をコードするポリヌクレオチドの５'末端側に連結されている、核酸構築物。
【請求項３】
請求項２の記載の核酸構築物を含む、ベクター。
【請求項４】
請求項３に記載のベクターを単子葉植物又は単子葉植物細胞に導入する、形質転換体の製造方法。
【請求項５】
請求項３に記載のベクターで、単子葉植物又は単子葉植物細胞が形質転換されてなる、形質転換体。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換体を培養又は栽培する、組み換えタンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単子葉植物において組み換えタンパク質の高発現を可能にする５'ＵＴＲをコードするＤＮＡ分子に関する。また、本発明は、当該ＤＮＡ分子がタンパク質をコードするポリヌクレオチドに連結してなる核酸構築物、当該核酸構築物を含む発現ベクター、当該発現ベクターを有する形質転換体、並びに当該形質転換体を利用した組み換えタンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、植物に対する外来遺伝子の導入技術が確立され、また、その高発現システムも構築されており、植物を用いた組み換えタンパク質の製造が盛んに行われている。植物における遺伝子発現は、転写過程と翻訳過程に大別されるが、翻訳の開始反応がタンパク質の製造の律速になっていることが知られている（非特許文献１）。翻訳過程は、ｍＲＮＡの５'末端に位置するＣａｐ構造に翻訳開始因子が結合し、リボソームの４０Ｓサブユニットが５'非翻訳領域(５'ＵＴＲ)にリクルートされることによって開始される。リボソームのｍＲＮＡへのリクルート効率が翻訳効率に大きく影響するため、その足場となる５'ＵＴＲはｍＲＮＡの翻訳効率を規定する非常に重要な要因になっている。【０００３】
植物は、単子葉植物と双子葉植物とに大別される。このうち、双子葉植物のタバコ及びシロイヌナズナから単離されたａｌｃｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＡＤＨ）遺伝子の５’ＵＴＲ配列（ＮｔＡＤＨ  ５’ＵＴＲ、ＡｔＡＤＨ  ５’ＵＴＲ）を組み込んだ発現ベクターが、非常に高い翻訳能力を示し、シロイヌナズナ及びタバコのプロトプラストを用いた一過性発現実験において、市販されているｐＢＩ２２１ベクターと比べ８７〜１５０倍も翻訳段階で発現量が向上したことが報告されている（非特許文献２）。また、複数のゲノムワイド解析から見出された、様々な状況下でも高い翻訳能力を持つＡｔ１ｇ２０４４０（ＡｔＣＯＲ４７）の５’ＵＴＲ配列が、シロイヌナズナとタバコの植物体において、その能力を示すとともに、植物体の成長、発達や熱ストレスによる翻訳の抑制を回避し、恒常的で活発な翻訳に寄与することが報告されている（非特許文献３）。このように、シロイヌナズナやタバコといった双子葉植物では、高い翻訳能力を持つ５’ＵＴＲ配列が取得されている。【０００４】
一方、単子葉植物においては、双子葉植物とは異なり、上述のように取得された高い翻訳能力を持つ５’ＵＴＲ配列であってもその翻訳能力が発揮されなくなることが報告されている。具体的には、双子葉植物から単離されたＡｔＡＤＨ  ５’ＵＴＲが双子葉植物で発現量向上効果を発揮しても、イネの培養細胞における発現量向上効果はわずか２倍程度であり、また、イネから単離されたＡＤＨの５’ＵＴＲ配列（ＯｓＡＤＨ  ５’ＵＴＲ）を用いた場合でも、イネの培養細胞における発現量向上効果はせいぜい９倍であったことが報告されている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Gebauer, F. and Hentze, M.W. (2004). Molecular mechanisms of translational control，Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 5: 827-835
【非特許文献２】Sugio, T., Satoh, J., Matsuura, H., Shinmyo, A., Kato, K. (2008). The 5'-untranslated region of the Oryza sativa alcohol dehydrogenase gene functions as a translational enhancer in monocotyledonous plant cells. J. Biosci. Bioeng. 105: 300-302.
【非特許文献３】Yamasaki, S., Sanada, Y., Imase, R., Matsuura, H., Ueno, D., Demura, T., Kato, K.（2018）. Arabidopsis thaliana cold-regulated 47 gene 5′-untranslated region enables stable high-level expression of transgenes. J. Biosci. Bioeng. 125: 124-130.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
イネ、コムギ、トウモロコシに代表されるイネ科の単子葉植物は、人類の主食、養鶏及び畜産の飼料、並びにバイオエタノールの原料等、その用途は多岐に渡っており、最も多く生産されている植物種といえる。したがって、単子葉植物での導入遺伝子高発現に資する高い翻訳能力を持つ５’ＵＴＲ配列を取得することは、非常に重要な意義があると考えられる。【０００７】
本発明者は、これまで単子葉植物では高い翻訳効率を有する５’ＵＴＲ配列を取得できなかったことの要因として、それらの解析に用いられたデータセットのデータ数及び精度に着眼した。従来の５’ＵＴＲ探索の方法論は、イネ内在ｍＲＮＡの翻訳状態をポリソーム／マイクロアレイ解析により網羅的に評価し、翻訳状態の良いｍＲＮＡの５’ＵＴＲを単離するというものである。ここで、翻訳状態の評価ではマイクロアレイを用いて遺伝子単位で解析しており、また、５’ＵＴＲ配列の同定ではデータベースに登録されている完全長ｃＤＮＡライブラリーの配列を利用している。【０００８】
しかしながら、そもそも１遺伝子に由来するｍＲＮＡには、異なる転写開始点（ＴＳＳ）からそれぞれ開始する複数の５’ＵＴＲバリアントが存在している。そうすると、従来の５’ＵＴＲ探索の方法論で、翻訳状態が良いものと評価されたｍＲＮＡの５’ＵＴＲは、バリアントの集合体として評価されたものである。このため、従来では、翻訳状態が良いものと評価されたｍＲＮＡの５’ＵＴＲ（バリアントの集合体）を、データベースに登録されている情報に基づいて単離していたにすぎない。つまり、従来ではＴＳＳごとのバリアントを考慮した５’ＵＴＲの翻訳状態が評価されていなかったため、データ数及び精度に問題があり、単子葉植物で高翻訳能を有する５’ＵＴＲが見出されてこなかった。【０００９】
そこで本発明の目的は、単子葉植物において５’ＵＴＲバリアントを考慮した真に高翻訳能を有する５'ＵＴＲを特定し、当該５'ＵＴＲコードするＤＮＡ分子及び単子葉植物において効率的に組み換えタンパク質を製造する技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、ポリソーム解析とCap Analysis of Gene Expression（ＣＡＧＥ）解析とを組み合わせ、単子葉植物細胞であるイネ培養細胞について、通常条件及び熱処理条件で細胞内の全ｍＲＮＡ種の翻訳状態を解析し、両条件で翻訳状態が良く活発に翻訳されているｍＲＮＡのランキング化を行い、ランキング上位のｍＲＮＡの５’ＵＴＲについてそれぞれレポーター遺伝子に連結した発現ベクターを構築してそれらのイネにおける翻訳能力を調べた。その結果、単子葉植物であっても異種タンパク質の高発現を可能にする５’ＵＴＲの取得に至った。その翻訳能力は、これまで単子葉植物で発現量向上効果が報告されているＯｓＡＤＨ  ５’ＵＴＲの翻訳能力を凌駕していた。さらに、取得した５’ＵＴＲは、レポーター遺伝子を変更した場合も、他の単子葉植物であるライムギに適用した場合も、高い翻訳能力を発揮した。本発明は、かかる知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。【００１１】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．  以下の(i)〜(iii)のいずれかに示すポリヌクレオチドからなることを特徴とする、５'ＵＴＲをコードするＤＮＡ分子：
(i)配列番号１〜４のいずれかに示す塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(ii)配列番号１〜４のいずれかに示す塩基配列において、１又は数個の塩基が置換、欠失若しくは付加された塩基配列からなり、且つ配列番号１〜４のいずれかに示す塩基配列からなるポリヌクレオチドと同等の５'ＵＴＲ活性を示すポリヌクレオチド、
(iii)配列番号１〜４のいずれかに示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ配列番号１〜４のいずれかに示す塩基配列からなるポリヌクレオチドと同等の５'ＵＴＲ活性を示すポリヌクレオチド。
項２．  項１に記載のＤＮＡ分子が、外来タンパク質をコードするポリヌクレオチドの５'末端側に連結されている、核酸構築物。
項３．  項２の記載の核酸構築物を含む、ベクター。
項４．  項３に記載のベクターを単子葉植物又は単子葉植物細胞に導入する、形質転換体の製造方法。
項５．  項３に記載のベクターで、単子葉植物又は単子葉植物細胞が形質転換されてなる、形質転換体。
項６．  項５に記載の形質転換体を培養又は栽培する、組み換えタンパク質の製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、単子葉植物を利用した組み換えタンパク質の製造において、５'ＵＴＲによる翻訳効率が向上しており、効率的に組み換えタンパク質を製造することが可能になる。また、本発明によれば、レポーター遺伝子を変更しても、単子葉植物種を変更しても、同様の翻訳効率向上効果が発揮されるため、汎用性高く組み換えタンパク質を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＣＡＧＥ解析の概念図を示す。
【図２】ポリソーム／ＣＡＧＥ解析の概念図を示す。
【図３】候補５’ＵＴＲを含んで構築された発現ベクターの概略を示す。
【図４】候補５’ＵＴＲを連結したベクターを用いた一過性発現実験の結果を示す。
【図５】翻訳能力の高い５’ＵＴＲについての再現実験の結果を示す。
【図６】イネで高い翻訳能力が確認された５’ＵＴＲのシロイヌナズナにおける翻訳能力を検証した結果を示す。
【図７】５’ＵＴＲ性能評価用ベクターの概略を示す。
【図８】レポーター遺伝子を変更した際の５’ＵＴＲの性能評価を示す。
【図９】ライムギのプロトプラストを用いた一過性発現実験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明について、さらに詳細に説明する。なお、本明細書におけるアミノ酸、ペプチド、塩基配列、核酸などの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ、ＩＵＢの規定、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書などの作成のためのガイドライン」（特許庁編）及び当該分野における慣用記号に従うものとする。特に、ＤＮＡはデオキシリボ核酸を表し、ＲＮＡはリボ核酸を表し、ｍＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡを表す。
【００１５】
また、遺伝子操作等の分子生物学的操作については、適宜公知の方法を用いることができる。例えば、特に断りのない限り、Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition（Cold Spring Harbor Laboratory Press）等に記載の方法に従って行うことができる。
【００１６】
（１）５'ＵＴＲをコードするＤＮＡ分子
本発明のＤＮＡ分子は、５'ＵＴＲをコードするＤＮＡ分子であって、以下の(i)〜(iii)のいずれかに示すポリヌクレオチドからなることを特徴とする。
(i)配列番号１〜４のいずれかに示す塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(ii)配列番号１〜４のいずれかに示す塩基配列において、１又は数個の塩基が置換、欠失若しくは付加された塩基配列からなり、且つ配列番号１〜４のいずれかに示す塩基配列からなるポリヌクレオチドと同等の５'ＵＴＲ活性を示すポリヌクレオチド、
(iii)配列番号１〜４のいずれかに示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ配列番号１〜４のいずれかに示す塩基配列からなるポリヌクレオチドと同等の５'ＵＴＲ活性を示すポリヌクレオチド。
【００１７】
前記(i)のポリヌクレオチドの内、配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドは、イネのＯｓ０４ｔ０５８３６００−０１遺伝子において５'ＵＴＲをコードするＤＮＡ分子である。前記(i)のポリヌクレオチドの内、配列番号２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドは、イネのＯｓ０８ｔ０１３６８００−０１遺伝子において５'ＵＴＲをコードするＤＮＡ分子である。前記(i)のポリヌクレオチドの内、配列番号３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドは、イネのＯｓ０２ｔ０６８４５００−００遺伝子において５'ＵＴＲをコードするＤＮＡ分子である。前記(i)のポリヌクレオチドの内、配列番号４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドは、イネのＯｓ０６ｔ０３４２２００−０１遺伝子において５'ＵＴＲをコードするＤＮＡ分子である。
【００１８】
前記(ii)のポリヌクレオチドにおいて、置換、欠失若しくは付加される塩基の数については、１又は数個であればよいが、具体的には１〜１５個、好ましくは１〜１０個、更に好ましくは１〜８個、特に好ましくは１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１又は２個、或いは１個が挙げられる。
【００１９】
前記(iii)のポリヌクレオチドにおいて、「ストリンジェントな条件」とは、配列類似性が高い一対のポリヌクレオチドが特異的にハイブリダイズできる条件を意味する。配列類似性が高い一対のポリヌクレオチドとは、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するポリヌクレオチドを意味する。一対のポリヌクレオチド間の同一性は、Blastの相同性検索ソフトウェアをデフォルトの設定で利用して算出することができる。また、「ストリンジェントな条件」とは、具体的には、５×ＳＳＣ（８３ｍＭ ＮａＣｌ、８３ｍＭクエン酸ナトリウム）を用いて４２℃での温度条件下でハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
【００２０】
また、前記(ii)及び(iii)のポリヌクレオチドにおいて、「配列番号１〜４のいずれかに示す塩基配列からなるポリヌクレオチドと同等の５'ＵＴＲ活性を示す」とは、(ii)のポリヌクレオチドを５'ＵＴＲとして使用して単子葉植物（単子葉植物細胞を含む）による組み換えタンパク質の製造を行った場合に、配列番号１〜４のいずれかに示す塩基配列からなるポリヌクレオチドを５'ＵＴＲとして使用した場合に比べて、組み換えタンパク質の発現量が同等であることを意味する。具体的には、配列番号１〜４のいずれかに示す塩基配列からなるポリヌクレオチドを５'ＵＴＲとして使用して組み換えタンパク質の製造を行った際の組み換えタンパク質の発現量を１００％とすると、前記(ii)及び(iii)のポリヌクレオチドを５'ＵＴＲとして使用して組み換えタンパク質の製造を行った場合に、組み換えタンパク質の発現量が、８０％以上、好ましくは８５〜１２０％、更に好ましくは９０〜１２０％、特に好ましくは９５〜１２０％であることを指す。
【００２１】
前記(i)のポリヌクレオチドは、イネから公知の手法に従って取得することができるが、化学合成によって得ることもできる。また、前記(ii)及び(iii)のポリヌクレオチドは、前記(i)のポリヌクレオチドを公知の遺伝子工学的手法を用いて改変することによって得ることができ、また化学合成によって得ることもできる。
【００２２】
前記(i)〜(iii)のポリヌクレオチドは、単子葉植物における組み換えタンパク質の製造において、５'ＵＴＲとして、組み換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドの５'末端側に連結して使用される。
【００２３】
（２）前記ＤＮＡ分子を含む核酸構築物
本発明の核酸構築物は、前記(i)〜(iii)のポリヌクレオチドが、外来タンパク質をコードするポリヌクレオチドに連結してなることを特徴とする。
【００２４】
本発明の核酸構築物において、前記(i)〜(iii)のポリヌクレオチドは、５'ＵＴＲとして機能するため、外来タンパク質をコードするポリヌクレオチドの５'末端側に連結されていればよい。
【００２５】
本発明の核酸構築物において、コードされている外来タンパク質の種類については、特に制限されず、組み換えタンパク質として製造が求められるものであればよいが、例えば、薬理活性を有するタンパク質が挙げられる。具体的には、酵素、転写因子、サイトカイン、膜結合タンパク質、各種ペプチドホルモン（例えば、インスリン、成長ホルモン、ソマトスタチン）、ワクチンや抗体などの医療用タンパク質等が挙げられる。また、本発明の核酸構築では、必要に応じて、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドに、ＧＦＰやルシフェラーゼ等のレポータータンパク質、ＨｉｓタグやＦＬＡＧ（登録商標）タグ等のタグペプチド等をコードするポリヌクレオチドが連結されていてもよい。
【００２６】
本発明の核酸構築物において、外来タンパク質をコードしているポリヌクレオチドは公知のものを用いることができる。このようなポリヌクレオチドの塩基配列は、例えばＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）が運営する配列データベースＧｅｎＢａｎｋ等のデータベースから入手することができる。当該塩基配列情報を基に、例えばＰＣＲ等の常法により各種生物から、タンパク質をコードしているポリヌクレオチドを単離できる。また、各販社から例えばｃＤＮＡライブラリー等の形態で当該ポリヌクレオチドが販売されており、これを購入して用いることもできる。
【００２７】
本発明の核酸構築物において、コードされている外来タンパク質の由来については、特に制限されず、導入される宿主と同種又は異種の外来タンパク質であればよい。また、本発明の核酸構築物において、導入される宿主のコドン使用頻度が公知であれば、外来タンパク質をコードしているポリヌクレオチドの塩基配列を当該宿主に好適なコドン使用頻度に適合するよう変更してもよい。
【００２８】
（３）前記核酸構築物を含むベクター
本発明のベクター（発現ベクター）は、前記核酸構築物を、ベクター内で発現可能に連結することによって得ることができる。より具体的には、本発明のベクターは、プロモーター配列を備えたベクターに、前記核酸構築物をプロモーターの転写開始点直後に連結することにより得ることができる。
【００２９】
前記核酸構築物を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能であることを限度として特に制限されないが、例えば、プラスミドベクター、コスミドベクター、ウイルスベクター、人工染色体ベクター（例えばＹＡＣ、ＢＡＣ、ＰＡＣ）等が挙げられる。これらの中でも、好ましくは、プラスミドベクター、ウイルスベクターが挙げられる。とりわけ、単子葉植物（単子葉植物細胞含む）において組み換えタンパク質をより一層効率的に発現させるという観点から、より好ましくはアグロバクテリウム由来のプラスミド、特に好ましくはアグロバクテリウム由来でＴ−ＤＮＡを有するプラスミド（Ｔｉ−プラスミド）が挙げられる。
【００３０】
本発明において、ベクターはプロモーター配列を有するものを用いる。プロモーター配列は、宿主の種類に応じて、適宜適切なものを選択して用いればよいが、例えば、カリフラワーモザイクウイルス由来のプロモーターであるＣａＭＶ３５Ｓプロモーター等が挙げられる。
【００３１】
また、前記核酸構築物を挿入するためのベクターには、薬剤耐性遺伝子等の選抜マーカーとして利用できる遺伝子が含まれていてもよい。
【００３２】
前記核酸構築物を挿入するためのベクターは、公知のもの、各販社から市販されているもの等を用いることができる。
【００３３】
前記核酸構築物をベクターに組み込んで連結するには、公知の遺伝子工学的手法に従って行うことができる。例えば、前記核酸構築物を、制限酵素サイトを付加したプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅させ、これを制限酵素で処理し、制限酵素処理済みベクターへと連結させて導入することができる。
【００３４】
なお、本発明のベクターは、プロモーターの転写開始点直後に前記核酸構築物を連結させたものであるが、例えば上記制限酵素を利用したクローニング手法では、プロモーター配列と前記核酸構築物との連結部に制限酵素サイトが存在することになる。このような場合は、例えば当該制限酵素サイトを除くようインバースＰＣＲを行い、得られる増幅産物をセルフライゲーションさせることにより、連結部に存在する制限酵素サイトを除いたベクターを作製してもよい。なお、この場合、当該インバースＰＣＲに用いるプライマーセットは、ＰＣＲ増幅産物がセルフライゲーションできるように設計することが好ましい。また、セルフライゲーションには例えばリガーゼを用いればよい。
【００３５】
なお、前記核酸構築物をプロモーター配列の「転写開始点直後に連結する」とは、宿主内で、前記核酸構築物においてタンパク質をコードしているポリヌクレオチドを転写させた際に、生成するｍＲＮＡの５'端（即ち５'ＵＴＲ末端）に、０、１、２、又は３塩基（好ましくは０、１、又は２塩基）のプロモーター配列から転写された塩基が結合した転写産物が得られるように、前記核酸構築物とプロモーター配列を連結させることをいう。即ち、プロモーター配列と前記核酸構築物の間に余分な塩基配列が存在しないように連結させる、ともいえる。このようにプロモーター配列と前記核酸構築物とが直接連結していても、遺伝子発現の際にはプロモーター配列の塩基が少数（例えば１、２、又は３塩基）転写される場合があり、このような転写が起こるベクターも本発明のベクターに含まれる。
【００３６】
（４）前記ベクターを含む形質転換体
本発明の形質転換体は、本発明のベクターを単子葉植物又は単子葉植物細胞に導入することによって得ることができる。
【００３７】
宿主として使用される単子葉植物の種類については、特に制限されないが、例えば、イネ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、モロコシ、セイヨウヤマカモジ、サトウキビ、タマネギなどが挙げられ、好ましくはイネ、オオムギ、コムギ、トウモロコシが挙げられ、さらに好ましくはイネ、オオムギが挙げられる。
【００３８】
また、宿主として使用される単子葉植物細胞の種類についても、特に制限されないが、例えば、イネ由来細胞、オオムギ由来細胞、コムギ由来細胞、トウモロコシ由来細胞、モロコシ由来細胞、セイヨウヤマカモジ由来細胞、サトウキビ由来細胞、タマネギ由来細胞などが挙げられ、好ましくはイネ由来細胞、オオムギ由来細胞、コムギ由来細胞、トウモロコシ由来細胞が挙げられ、さらに好ましくはイネ由来細胞、オオムギ由来細胞が挙げられる。また、単子葉植物細胞由来のプロトプラストも、単子葉植物細胞に含まれる。また、形質転換された単子葉植物細胞を培養して得られる単子葉植物体も本発明の形質転換体に含まれる。
【００３９】
なお、形質転換の結果腫瘍組織やシュート、毛状根などが得られる場合は、そのまま細胞培養、組織培養又は器官培養に用いることが可能である。また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン、例えば、オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライド等の投与などにより植物体に再生させることができる。また、形質転換植物細胞を用いることにより、形質転換植物体を再生することもできる。再生方法としては、カルス状の形質転換細胞をホルモンの種類、濃度を変えた培地へ移して培養し、不定胚を形成させ、完全な植物体を得る方法が採用される。使用する培地としては、ＬＳ培地、ＭＳ培地等が挙げられる。
【００４０】
また、前記ベクターを宿主に導入する方法は、特に制限されず、宿主及びベクターの種類に応じて適宜適切な公知の方法を選択して用いることができるが、例えば、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、Ｔｉプラスミドを用いた方法（例えばバイナリーベクター法、リーフディスク法）等挙げられる。
【００４１】
ベクターが宿主に組み込まれたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換体からＤＮＡを調製し、ベクター特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、SYBR Green液等により染色し、そして増幅産物を1本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認する。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用してもよい。
【００４２】
本発明の形質転換体は、前記ベクターで形質転換されているため、外来タンパク質をコードしているポリヌクレオチドから、そのｍＲＮＡの転写、当該外来タンパク質の翻訳が行われる。上述の通り、前記(i)〜(iii)のポリヌクレオチドを５'ＵＴＲとして使用することにより、単子葉植物又は単子葉植物細胞において組み換えタンパク質の効率的な発現が可能になっているので、本発明の形質転換体を培養又は栽培することによって、組み換えタンパク質を効率的に製造することができる。本発明の形質転換体を培養又は栽培した後に、公知の手法で、組み換えタンパク質を回収、精製等することにより、組み換えタンパク質が得られる。
【実施例】
【００４３】
以下、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。先ず、実験に用いた材料について記述し、その次に具体的な実験内容及び結果を記載する。【００４４】
１．使用植物及び培養細胞
以下の検討には、次の植物体及び培養細胞を用いた。【００４５】
１−１．イネ培養細胞
イネ培養細胞（Oryza sativa cv. Nipponbare）を以下のポリソーム／ＣＡＧＥ解析に用いた。培養は、３０℃、暗期、攪拌速度９０ｒｐｍ（EYELA, MULTI SHAKER, Tokyo）の条件で行い、９５ｍＬのＲ２Ｓ培地を３００ｍＬ容の三角フラスコに入れて使用した。一週間ごとに定常期に達した細胞８ｍＬを新しい培地９５ｍＬに移植して継代培養を行った。【００４６】
また、イネ培養細胞（Oryza sativa L. C5924）Ｏｃ細胞をプロトプラストの作製に用いた。培養は、３０℃、暗期、攪拌速度９０ｒｐｍ（EYELA, MULTI SHAKER, Tokyo）の条件で行い、９５ｍｌのＲ２Ｓ培地を３００ｍＬ容の三角フラスコに入れて使用した。一週間ごとに定常期に達した細胞１０ｍＬから古い培地成分を除去した後、新しい２０ｍＬのＲ２Ｓ培地を加えて１００ｍＬ容フラスコで継代培養を行った。【００４７】
１−２．シロイヌナズナＴ−８７培養細胞
シロイヌナズナ培養細胞（Arabidopsis thaliana T87）は理化学研究所ジーンバンク室植物開発銀行より分与していただいたものを使用した。培養は２２℃で、１８時間明期／６時間暗期、攪拌速度１２０ｒｐｍ（SLK-3-FS, NK system, Osaka）の条件で行い、９５ｍＬの改変ＬＳ培地（Nagata, T., Nemoto, Y., Hasezawa, S. (1992). Tobacco BY-2 cell line as the HeLa cell in the cell biology of higher plants. Int. Rev. Cytol. 132, 1-30.）を３００ｍＬ容の三角フラスコに入れ使用した。一週間ごとに定常期に達した細胞４ｍＬを新しい培地９５ｍＬに移植し継代培養を行った。また、一過性発現実験を行う際は、一週間ごとに定常期に達した細胞８ｍｌを新しい培地９５ｍｌに移植し継代培養を行った。【００４８】
２．ライムギ植物体
ライムギ (Secale cereal)の種子を、キムワイプを敷き詰めた９ｃｍシャーレに播種後、人工気象器LH-241/411RF（PID）T-Sで（２５℃、明期１１時間、暗期１３時間）生育させた。【００４９】
３．実験内容及び結果
３−１．ｍＲＮＡの翻訳状態の評価法としてのポリソーム／ＣＡＧＥ解析
一般的にｍＲＮＡの翻訳状態は、ｍＲＮＡに多数のリボソームが結合していれば翻訳が活発に行われており（ポリソーム）、リボソームが結合していなければ翻訳が行われていない（ノンポリソーム）というように、ｍＲＮＡに結合するリボソームの数を指標として判断されている(Bailey-Serres, J., Sorenson, R., Juntawong, O. (2009). Getting the message across: cytoplasmic ribonucleoprotein complex. Trends Plant Sci. 14:443-453)。このような手法はポリソーム解析と呼ばれており、ＤＮＡマイクロアレイ解析と組み合わせることでｍＲＮＡの翻訳状態をゲノムスケールで評価することができる。【００５０】
結合したリボソームの数でｍＲＮＡを分画した後、Cap Analysis of Gene Expression（ＣＡＧＥ）解析を行った。ＣＡＧＥ解析は、転写開始点（ＴＳＳ）の同定と、ＴＳＳ毎の転写産物量の定量とが可能な方法である。ＣＡＧＥ解析の概念図を図１に示す。図１に示すように、細胞や組織から抽出した全ＲＮＡから、ランダムプライマーを用いて相補鎖ｃＤＮＡを合成し、キャップ・トラッピング法によりｃＤＮＡの５’末端を選別する。ＲＮＡ鎖を除去して得られる一本鎖ｃＤＮＡの５’末端にアダプター（クローニングに必要な認識部位、目印になる短い特異的塩基配列およびエンドヌクレアーゼ認識部位を含む）を結合する。第２鎖ｃＤＮＡを合成した後、制限酵素で５’末端から２０塩基（Ｔａｇ配列）を切り出す。切り出されたＴａｇ配列の３’側に二本のリンカー（別の制限酵素認識部位を含む）を結合する。ｃＤＮＡタグを精製し、両端のリンカーにある認識部位を制限酵素で切断し、リンカーの間に挟まれたＴａｇ配列を切り出す。このようにして得られたＴａｇのＤＮＡ配列を次世代シークエンサーで決定し、ゲノム上にマッピングする。これによって、様々なｍＲＮＡの転写開始点の特定つまり５’ＵＴＲの推定を行うことができる。さらにｍＲＮＡ量の定量も行うことができる。なお、図１においては、転写開始点が異なる３種のバリアント（mRNA A、mRNA B、及びmRNA C）を例示しており、代表してmRNA Bの５’ＵＴＲ領域を表示している。【００５１】
３−２．翻訳状態の指標としてのＰＲ値
本発明では、ポリソーム／ＣＡＧＥ解析を行うことにより、それぞれの遺伝子の各ＴＳＳから転写されたｍＲＮＡでのポリソームの形成度合（ＰＲ値）を評価した。その概念図を図２に示す。図２に示すように、まず、ポリソーム解析でPolysomal RNA画分（つまりリボソームが2個以上結合しているPolysomeのｍＲＮＡ）とTotal RNA（つまりNonpolysome及びPolysomeを含む全てのｍＲＮＡ）とについてＣＡＧＥ解析した。ＣＡＧＥ解析で得られたTotal RNA画分及びPolysomal RNA画分のデータのＴａｇ数が両画分で等しくなるように、Polysomal RNA画分のＴａｇ数を補正した。転写開始点（ＴＳＳ）ごとのＴａｇ数（ｍＲＮＡ量）を比較して、Total RNA画分中に占める、Polysomal RNA画分のＴａｇ数の割合であるPolysome Ratio値（ＰＲ値）を算出した。図２の例では、ＰＲ値が高い順から［１］、［２］となる。【００５２】
ＰＲ（Polysome Ratio）値とは、それぞれのｍＲＮＡの全ｍＲＮＡ量に対してのポリソーム画分に存在する量の比を数値化した値であり、翻訳状態を表す指標の一つである。ｍＲＮＡのＰＲ値が高い程、活発に翻訳されているものと予想される。解析にはイネ培養細胞を用いた。イネ培養細胞は、実際の単子葉での物質生産として実用に向けた実績もあり、夾雑物が植物体より少なく正確な翻訳状態の評価が可能である。また、イネ培養細胞は、翻訳状態が環境ストレス等で大きく抑制されることが知られており、これは導入遺伝子も同様であると推測される。そこで、通常条件下の細胞に加え、非常に強い翻訳の抑制が起きることが知られている熱ストレス下の細胞も解析することによって、環境ストレスなどの幅広い状況下でも活発な翻訳を行う５’ＵＴＲ配列の探索を目指した。【００５３】
３−３．ショ糖密度勾配遠心を利用したポリソーム解析
培養３日目の細胞（通常条件、３０℃、９０ｒｐｍ）とウォーターバスで熱処理した細胞（熱条件、４１℃、１５ｍｉｎ、９０ｒｐｍ）とをそれぞれ回収し、液体窒素で急冷した。急冷したサンプルは乳鉢を用いて破砕し、２ｍｌ容チューブに３００ｍｇずつ分注した。ショ糖密度勾配遠心を利用したポリソーム分画は、若干の改変を加えた以外は基本的にDaviesらの方法に従って行った（Davies E, Abe S. Chapter 15 Methods for Isolation and Analysis of Polyribosomes. Methods in Cell Biology, Volume 50, 1995, Pages 209-222）。サンプル破砕粉末におおよそ４倍量（ｗ／ｖ）の Extraction Buffer（200 mM Tris-HCl, pH8.5, 50 mM KCl, 25 mM MgCl2, 2 mM EGTA, 100 μg/ml heparin, 100 μg/ml cycloheximide, 2% polyoxyethylene 10-tridecyl ether, 1% sodium deoxycholate）を加え、緩やかに懸濁させた。遠心（14,000×g, 15 min, 4℃）により細胞残さを除き、さらに遠心（14,000×g, 10 min, 4℃）し、その上清をＲＮＡ粗抽出液とした。この粗抽出液をExtraction Buffer によりＲＮＡ濃度３３３ｎｇ／μｌに調整し、予め作製した２６．２５〜７１．２５％ショ糖密度勾配液（ショ糖, 200 mM Tris-HCl, 200 mM KCl, 200 mM MgCl2）４．８５ｍＬ上に３００μＬ重層し、超遠心を行った（SW55Ti rotor, 55,000 rpm, 50 min, 4℃, brake-off）（Optima, Beckman Coulter, California, USA）。ピストン・グラジェント・フラクショネーター（BioComp, Churchill Row, Canada）によってショ糖密度勾配の上部より約１ｍＬ／ｍｉｎの速さで吸引すると同時に、BIO-MINI UV MONITOR AC-5200 （ATTO, Tokyo, Japan）を用いて２５４ｎｍの吸光度を記録した。【００５４】
３−４．ＣＡＧＥ解析用ＲＮＡの抽出
超遠心後のショ糖密度勾配溶液からポリソームを形成したｍＲＮＡが存在する画分約２ｍＬと全画分約４ｍＬとを終濃度５．５Ｍになるように８Ｍグアニジン塩酸塩を予め加えておいた遠心管にそれぞれ回収した。各遠心管へ混合液と等量の１００％エタノールを加え、−２０℃にて一晩冷却した後、遠心操作（40,000× rpm, 45 min, 4℃）を行った。得られたペレットを８５％エタノールにて一度洗浄し（40,000× rpm, 30 min, 4℃）た後、RNeasy kit（Qiagen, Hilden, Germany）に含まれるbuffer RLT １ｍＬにてペレットを溶解し、以降は付属のプロトコールに従いRNeasy kitを用いてＲＮＡ精製を行い、Polysomal RNA画分とTotal RNA画分とを得た。【００５５】
３−５．ＣＡＧＥライブラリーの作製および次世代シークエンサーによる解析
抽出したＲＮＡをCap Analysis of Gene Expression（ＣＡＧＥ）ライブラリーの作製に供した。ＣＡＧＥライブラリーの作製手法は、MurataらのnAnT-iCAGEライブラリーの作製手法に従った（Murata, M., Nishiyori-Sueki, H., Kojima-Ishiyama, M., Carninci, P., Hayashizaki, Y., Itoh, M.（2014）. Detecting expressed genes using CAGE. Methods Mol. Biol. 1164: 67-85.）。概要は次の通りである。Ｎ１５ランダムプライマーを用いて相補鎖ｃＤＮＡを合成し、キャップ・トラッピング法によりｃＤＮＡの５’末端を選別した。ついで、RNase Iを用いてＲＮＡ鎖を除去して得られた一本鎖ｃＤＮＡの５’末端と３’末端側とにリンカーを結合させ、ＣＡＧＥライブラリーとした。Illumina(R)HiSeq 2500を用い、５’末端に結合させたリンカー内に存在するシークエンスプライマー認識部位を用いたシングルリードにて、付属のプロトコールに従ってシーケンスを行った。また、解析は各ＲＮＡ試料について細胞の回収時点から独立した２反復のサンプル（つまり、計８サンプル）を用いて行った。【００５６】
３−６．データ処理とマッピング
シークエンスによって得られたrawデータのそれぞれのＴａｇからＣＡＧＥリンカー配列を除去した。その後、正確に読み取れていないことを示すＮが配列中に存在するＴａｇ、混入したｒＲＮＡ由来のＴａｇ、及び５’末端にＣａｐ由来のＧが存在していないＴａｇを除去し、Ｃａｐを有するｍＲＮＡの５’末端由来と考えられるＴａｇを抽出した。その後、Os-Nipponbare-Reference-IRGSP-1.0（http://rapdb.dna.affrc.go.jp/）の情報を基にマッピングを行った。この際に、複数個所にマッピングされたマッピングクオリティが低いＴａｇ、及び５’末端にミスマッチが存在し末端位置がずれている可能性があるＴａｇは除去した。Ｔａｇがマッピングされたゲノム上の位置を取得し、それぞれの位置におけるＴａｇ数をカウントした。なお、独立して行った２つのサンプル間で、共にＴａｇが存在し、再現性が確認できているゲノム上の位置についてのみＴａｇ数をカウントし、Tag per million（ＴＰＭ）値に変換した。その後、Os-Nipponbare-Reference-IRGSP-1.0に登録されているいずれかの遺伝子の５’末端の上流５００ｎｔからＣＤＳ（Coding DNA Sequence）のＡＵＧまでの間に存在し、ストランド方向が一致しているＴａｇを、その遺伝子の転写開始点（ＴＳＳ： Transcription Start Site）を示すものとしてアノテーションした。遺伝子が存在しない領域またはＣＤＳ領域にマッピングされ、遺伝子のアノテーションができなかったＴａｇは除去した。最終的に得られたＴａｇの位置におけるＴＰＭ値をそのＴＳＳ由来のｍＲＮＡ量を示すＴＰＭ＿ＴＳＳ値とした。続いて、Polysomal RNA画分のＴＰＭ＿ＴＳＳ値をTotal RNA画分の値で割ることによって、各ＴＳＳから転写されたｍＲＮＡがポリソームを形成している比率をＰＲ＿ＴＳＳ値として算出した。【００５７】
３−７．翻訳状態のランキングの作成
イネでのポリソーム／ＣＡＧＥ解析によって、非常に大規模な各ＴＳＳレベルの翻訳状態（ＰＲ＿ＴＳＳ値）とＴＳＳから推測される５’ＵＴＲの配列情報を取得した。これらのデータセットを用いて、ランキングを作成し、翻訳状態の良いｍＲＮＡの５’ＵＴＲを候補として選抜した。ランキングには、様々な条件下でも活発な翻訳が行われている５’ＵＴＲの候補を取得するために通常条件と熱条件とでのＰＲ＿ＴＳＳ値をＺ−Ｓｃｏｒｅ化してから平均した値（Mean of Normarized ＰＲ値）を使用した。Ｚ−Ｓｃｏｒｅ化は補正法の一つであり、今回のように分布が大きく異なるデータセット間での重要性の偏りを減らして平均する場合には有用な手法である。また、ランキングを作成する際には、ｕＡＵＧ及びイントロンを有する５’ＵＴＲ配列は翻訳エンハンサーとして用いた場合に、対象となる遺伝子を正しく翻訳できない可能性があるために除外した。また、ポリソーム解析は手法上、ＣＤＳ長が長いほど翻訳途中のリボソームが存在する確率が上がるため、ＰＲ値が高くなる傾向がある。そのため、長いＣＤＳを有する場合は、高いＰＲ＿ＴＳＳ値が５’ＵＴＲに起因するのかＣＤＳの長さに起因するのかが区別できない。よってＣＤＳ長が中央値（８６４ｎｔ）以上の場合は除去した。【００５８】
最終的に両条件で共通する２９０７個の遺伝子由来の１０，０９９個のＴＳＳに由来するｍＲＮＡのランキングを作成し、その中で上位１５個の５’ＵＴＲを候補として選抜した（表１）。表１においては、Os-Nipponbare-Reference-IRGSP-1.0における名称（Gene Name）、５’ＵＴＲ長（5'UTR length）、通常条件による細胞のＰＲ＿ＴＳＳ値（PR_Con）、熱条件による細胞のＰＲ＿ＴＳＳ値（PR_Heat）、通常条件及び熱条件による細胞のＰＲ＿ＴＳＳ値のＺ−Ｓｃｏｒｅ後平均値（Mean of Normarized PR）、通常条件による細胞のＰＲ＿ＴＳＳ値ランキング（PR_Rank_Con）、及び熱条件による細胞のＰＲ＿ＴＳＳ値ランキング（PR_Rank_Heat）を示す。さらに、表２に各５’ＵＴＲの配列情報を示す。【００５９】
【表１】
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【００６０】
【表２】
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【００６１】
３−８．ＤＮＡ一過性発現実験による候補５’ＵＴＲの翻訳能力の評価
一過性発現実験に用いる基本ベクターとして、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター支配下にOryza sativa Indica Group（long-grained rice）のＯｓＡＤＨ  ５’ＵＴＲ、Firefly luciferase遺伝子（Ｆ−ｌｕｃ）、ターミネーター（Heat Shock Protein18.2遺伝子由来）で構成される発現ベクター（pBluescript）を使用した。このベクター内に存在する制限酵素サイトAatII及びClaIを制限酵素処理し、ベクターＤＮＡを線状化した。次に、候補５’ＵＴＲを遺伝子特異的に増幅させるために、Os-Nipponbare-Reference-IRGSP-1.0（http://rapdb.dna.affrc.go.jp/）の情報を基にプライマーを設計した。設計したプライマーには、基本ベクター内の制限酵素サイトであるAatII及びClaIを付加した。イネゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、目的断片を増幅した。候補５’ＵＴＲの１５種類のＤＮＡ断片と線状化した基本ベクターをIn-Fusionクローニング（TaKaRa）のプロトコールに従って連結した（図３）。導入効率を補正するためのＲ−ｌｕｃ遺伝子については、35Sプロモーター、Ｒ−ｌｕｃ遺伝子、ＨＳＰターミネーターよりなる発現カセットを持つpBluescriptII KS+を用いた。【００６２】
ＤＮＡ（Ｆ−ｌｕｃが１μｇ、Ｒ−ｌｕｃが０．４μｇ、全量１０μｌ前後）を、イネ培養細胞（Ｏｃ細胞）から調製したプロトプラストにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法（Kovtun, Y., Chiu, W. L., Tena, G., Sheen, J. (2000). Functional analysis of oxidative stress-activated mitogen-activated protein kinase cascade in plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 6: 2940-2945.）により共導入し、３０℃で１６時間静置した後、遠心操作を行い、上清を除いた。その後、液体窒素で凍結して−８０℃にて保存した。その後、passive lysis buffer (Promega Wisconsin, USA)を用い細胞を溶解させ、Dual-luciferase reporter assay system (Promega)とプレートリーダー（TriStar LB 941, BERTHOLD TECHNOLOGIES）とによって溶解液中のＦ−ｌｕｃ活性値及びＲ−ｌｕｃ活性値を測定し、相対活性値（Ｆ−ｌｕｃ活性値／Ｒ−ｌｕｃ活性値）を算出した。【００６３】
また、比較対象として、高い翻訳能力を持つとして報告されているＯｓＡＤＨ  ５’ＵＴＲ（Sugio, T., Satoh, J., Matsuura, H., Shinmyo, A., Kato, K. (2008). The 5'-untranslated region of the Oryza sativa alcohol dehydrogenase gene functions as a translational enhancer in monocotyledonous plant cells. J. Biosci. Bioeng. 105: 300-302.）についても同様に評価し、それぞれの候補５’ＵＴＲの相対活性値（Relative F/R activity）を、ＯｓＡＤＨ  ５’ＵＴＲの相対活性値を１とした場合の相対値（候補５’ＵＴＲ相対活性値／ＯｓＡＤＨ  ５’ＵＴＲの相対活性値）として算出した。【００６４】
それぞれの候補についての相対活性値（Relative F/R activity）を、ＯｓＡＤＨ  ５’ＵＴＲとともに図４に示す。なお、図４では、プロトプラストへのベクターの導入から独立に３回行った実験それぞれにおいて測定されたＦ−ｌｕｃ活性値及びＲ−ｌｕｃ活性値に基づく相対活性値の平均値と標準誤差とを示した。さらに、ＯｓＡＤＨ  ５’ＵＴＲを連結したＦ−ｌｕｃ発現ベクターとの差をWelch’s t-testによって評価した。図中、*はp<0.05を示し、**はp<0.01を示す。図４に示すように、翻訳能力が高いとして選抜された候補１５種の５’ＵＴＲには、比較対象のＯｓＡＤＨ  ５’ＵＴＲの翻訳能力より低い翻訳能力を示す５’ＵＴＲとより高い翻訳能力を示す５’ＵＴＲとが混在していたことが確認された。特に、同一遺伝子由来の異なる５’ＵＴＲバリアントであるＲａｎｋ１２とＲａｎｋ１５との間では、２倍以上の翻訳能力の違いを示した。【００６５】
１５種の候補のうち、比較対象のＯｓＡＤＨ  ５’ＵＴＲの翻訳能力を顕著に超えるＲａｎｋ８、Ｒａｎｋ１２、Ｒａｎｋ１３、及びＲａｎｋ１４を選抜し、再度一過性発現実験を行い、その再現性を確認した。その結果を同様に図５に示す。なお、図５でも、プロトプラストへのベクターの導入から独立に３回行った実験それぞれにおいて測定されたＦ−ｌｕｃ活性値及びＲ−ｌｕｃ活性値に基づく相対活性値の平均値と標準誤差とを示した。さらに、ＯｓＡＤＨ  ５’ＵＴＲを連結したＦ−ｌｕｃ発現ベクターとの差をWelch’s t-testによって評価した。図中、*はp<0.05を示し、**はp<0.01を示す。【００６６】
３−９．シロイヌナズナ培養細胞（Arabidopsis thaliana T87）由来のプロトプラストを用いた一過性発現実験よる候補５’ＵＴＲ配列の性能評価
ＯｓＡＤＨ  ５’ＵＴＲの翻訳能力を超える相対活性値を示したＲａｎｋ８、Ｒａｎｋ１２、Ｒａｎｋ１３及びＲａｎｋ１４の５’ＵＴＲを組み込んだ発現ベクターを、双子葉植物であるシロイヌナズナのプロトプラストに導入し、一過的にレポーターであるＦ−ｌｕｃを発現させることで相対活性値（Ｆ−ｌｕｃ活性値／Ｒ−ｌｕｃ活性値）を測定した。また、比較対象として、双子葉植物で翻訳能力の高いＡｔＣＯＲ４７  ５’ＵＴＲ又はＡｔＡＤＨ  ５’ＵＴＲを連結させたベクターを使用し、同様にＲ−ｌｕｃ活性値及びＦ−ｌｕｃ活性値から相対活性値（Ｆ−ｌｕｃ活性値／Ｒ−ｌｕｃ活性値）を算出した。算出されたそれぞれの相対活性値（Relative F/R activity）を、ＯｓＡＤＨ  ５’ＵＴＲの相対活性値を１とした場合の相対値（候補５’ＵＴＲ相対活性値／ＯｓＡＤＨ  ５’ＵＴＲの相対活性値）として算出した。【００６７】
Ｒａｎｋ８、Ｒａｎｋ１２、Ｒａｎｋ１３、及びＲａｎｋ１４並びに比較対象についての相対活性値（Relative F/R activity）を、ＯｓＡＤＨ  ５’ＵＴＲとともに図６に示す。なお、図６では、プロトプラストへのベクターの導入から独立に３回行った実験それぞれにおいて測定されたＦ−ｌｕｃ活性値及びＲ−ｌｕｃ活性値に基づく相対活性値の平均値と標準誤差とを示した。さらに、ＯｓＡＤＨ  ５’ＵＴＲを連結したＦ−ｌｕｃ発現ベクターとの差をWelch’s t-testによって評価した。図中、*はp<0.05を示し**はp<0.01を示す。【００６８】
図６に示すように、Ｒａｎｋ８、Ｒａｎｋ１２、Ｒａｎｋ１３、及びＲａｎｋ１４の５’ＵＴＲは、ＡｔＡＤＨ  ５’ＵＴＲ及びＡｔＣＯＲ４７  ５’ＵＴＲと比較するとＦ−ｌｕｃ発現量は顕著に低いものであった。このことから、単子葉植物で翻訳能力の高い５’ＵＴＲ配列は双子葉植物では高い翻訳能力を発揮できないことが示された。つまり、ＯｓＡＤＨ  ５’ＵＴＲの翻訳能力を上回る、Ｒａｎｋ８、Ｒａｎｋ１２、Ｒａｎｋ１３、及びＲａｎｋ１４の５’ＵＴＲの優れた翻訳能力向上効果は、単子葉植物特異的に発揮されることが示された。【００６９】
３−１０．レポーター遺伝子を変更した際の５’ＵＴＲの性能評価
実際に導入遺伝子発現を行う際には、目的遺伝子が多様であることを考慮し、遺伝子領域の置換による５’ＵＴＲの高い翻訳能力への影響の有無を検証した。まず、レポーター遺伝子をＦ−ｌｕｃからＲ−ｌｕｃに置換したベクターを構築した。このベクターに、ＯｓＡＤＨ、Ｒａｎｋ１２、及びＲａｎｋ１３の各５’ＵＴＲを連結した（図７）。ＯｓＡＤＨ  ５’ＵＴＲは比較対象として用いた。これらのＲ−ｌｕｃ発現ベクターをイネ培養細胞（Ｏｃ細胞）のプロトプラストに導入し、一過的にレポーターであるＲ−ｌｕｃを発現させた。また、プロトプラストへの導入効率の補正のため、ＯｓＡＤＨ  ５’ＵＴＲを挿入したＦ−ｌｕｃ発現ベクターも共導入し、Ｆ−ｌｕｃ活性値に対するＲ−ｌｕｃ活性値（Ｒ−ｌｕｃ活性値／Ｆ−ｌｕｃ活性値）を算出した。算出されたそれぞれの相対活性値（Relative R/F activity）を、ＯｓＡＤＨ  ５’ＵＴＲの相対活性値を１とした場合の相対値（候補５’ＵＴＲ相対活性値／ＯｓＡＤＨ  ５’ＵＴＲの相対活性値）として算出した。【００７０】
Ｒａｎｋ１２及びＲａｎｋ１３についての相対活性値（Relative R/F activity）を、ＯｓＡＤＨ  ５’ＵＴＲとともに図８に示す。なお、図８では、プロトプラストへのベクターの導入から独立に３回行った実験それぞれにおいて測定されたＲ−ｌｕｃ活性値及びＦ−ｌｕｃ活性値に基づく相対活性値の平均値と標準誤差とを示した。さらに、ＯｓＡＤＨ  ５’ＵＴＲを連結したＲ−ｌｕｃ発現ベクターとの差をWelch’s t-testによって評価した。図中、*はp<0.05を示し**はp<0.01を示す。【００７１】
図８に示すように、レポーター遺伝子としてＲ−ｌｕｃを用いた場合においても（つまり、遺伝子領域を置換した場合においても）、ＯｓＡＤＨ  ５’ＵＴＲに比べ、Ｒａｎｋ１２及びＲａｎｋ１３の５’ＵＴＲはいずれも高い翻訳能力を発揮した。【００７２】
３−１１．ライムギプロトプラストを用いた一過性発現実験での５’ＵＴＲの性能評価
実際の有用物質生産はイネ以外の宿主で行われることを考慮し、同じ単子葉植物イネ科のライムギ由来のプロトプラストを用いた一過性発現実験を行うことで、翻訳能力の高い５’ＵＴＲが植物種を超えて汎用できることの検証を行った。ＯｓＡＤＨの５’ＵＴＲの翻訳能力を超える相対活性値を示すＲａｎｋ８、Ｒａｎｋ１２、Ｒａｎｋ１３、及びＲａｎｋ１４をライムギプロトプラストに導入し、一過的にレポーター遺伝子であるＦ−ｌｕｃを発現させた。また、プロトプラストへの導入効率の補正のため、ＯｓＡＤＨ  ５’ＵＴＲを挿入したＲ−ｌｕｃ発現ベクターも共導入し、Ｒ−ｌｕｃ活性値に対するＦ−ｌｕｃ活性値（Ｆ−ｌｕｃ活性値／Ｒ−ｌｕｃ活性値）を算出した。算出されたそれぞれの相対活性値（Relative F/R activity）を、ＯｓＡＤＨ  ５’ＵＴＲの相対活性値を１とした場合の相対値（候補５’ＵＴＲ相対活性値／ＯｓＡＤＨ  ５’ＵＴＲの相対活性値）として算出した。【００７３】
Ｒａｎｋ８、Ｒａｎｋ１２、Ｒａｎｋ１３、及びＲａｎｋ１４についての相対活性値（Relative F/R activity）を、ＯｓＡＤＨ  ５’ＵＴＲとともに図９に示す。なお、図９では、プロトプラストへのベクターの導入から独立に３回行った実験それぞれにおいて測定されたＦ−ｌｕｃ活性値及びＲ−ｌｕｃ活性値に基づく相対活性値の平均値と標準誤差とを示した。さらに、ＯｓＡＤＨ  ５’ＵＴＲを連結したＦ−ｌｕｃ発現ベクターとの差をWelch’s t-testによって評価した。図中、*はp<0.05を示す。【００７４】
図９に示すように、Ｒａｎｋ８、Ｒａｎｋ１２、Ｒａｎｋ１３、及びＲａｎｋ１４は、ライムギでもＯｓＡＤＨを超える活性値を有していた。つまり、Ｒａｎｋ８、Ｒａｎｋ１２、Ｒａｎｋ１３、及びＲａｎｋ１４は、ライムギにおいても高い翻訳能力を発揮うする５’ＵＴＲ配列であることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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