(57)【要約】  本発明は、タウタンパク質の免疫学的測定において感度を向上させる技術を提供する。具体的には、本発明は、２種以上の抗タウタンパク質抗体を担体に結合させた抗体コンジュゲートなどを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２種以上の抗タウタンパク質抗体を担体に結合させた抗体コンジュゲート。
【請求項２】
前記２種以上の抗タウタンパク質抗体が、２種以上の抗ヒトタウタンパク質抗体である、請求項１に記載の抗体コンジュゲート。
【請求項３】
２種以上の抗タウタンパク質抗体が、配列番号１のアミノ酸配列において１５３位〜１６９位の間に存在するエピトープを認識する第１の抗体、および配列番号１のアミノ酸配列において１８８位〜２０７位の間に存在するエピトープを認識する第２の抗体を含む、請求項２に記載の抗体コンジュゲート。
【請求項４】
前記第１の抗体が認識するエピトープが、ＰＰＧＱＫ（配列番号２）であり、前記第２の抗体が認識するエピトープが、ＤＲＳＧＹＳ（配列番号３）である、請求項３に記載の抗体コンジュゲート。
【請求項５】
担体が、標識担体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲート。
【請求項６】
以下を含む、キット：
（ｉ）２種以上の抗タウタンパク質抗体を担体に結合させた抗体コンジュゲート；および
（ｉｉ）抗体コンジュゲートに含まれる抗タウタンパク質抗体とは別のエピトープを認識する抗タウタンパク質抗体。
【請求項７】
前記別のエピトープが、配列番号１のアミノ酸配列において１７０位〜１８７位の間または２０９位〜２３３位の間に存在するエピトープである、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
前記別のエピトープが、ＰＰＡＰＫＴＰ（配列番号４）またはＰＰＴＲＥＰＫ（配列番号５）である、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
２種以上の抗タウタンパク質抗体を担体に結合させた抗体コンジュゲートを用いて、サンプル中のタウタンパク質を検出することを含む、タウタンパク質の検出方法。
【請求項１０】
サンプルが、ヒトから採取された体液サンプルである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
抗体コンジュゲートに含まれる抗タウタンパク質抗体とは別のエピトープを認識する抗タウタンパク質抗体にサンプルを接触させることをさらに含む、請求項９または１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体コンジュゲートなどに関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、最も一般的な認知症の一つであり、大脳皮質や大脳辺縁系にわたる神経細胞内の神経原線維変化、および細胞外のアミロイド班の蓄積によって組織学的に特徴づけられる神経変性疾患である。神経原線維変化の超微形態は、主に異常リン酸化されたタウタンパク質（ｐＴａｕ）からなるＰａｉｒｅｄ  Ｈｅｌｉｃａｌ  Ｆｉｌａｍｅｎｔｓ（ＰＨＦ）で構成される。タウタンパク質（リン酸化タウタンパク質を含む）のアルツハイマー病等の神経変性疾患の診断マーカーとしての有用性、および体液中のタウタンパク質の免疫学的測定方法が、報告されている（特許文献１および２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表平８−５０２８９８号公報
【特許文献２】特表平９−５０６７７１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
体液等のサンプル中のタウタンパク質の免疫学的測定において、従来よりもさらに感度を向上させることが求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、鋭意検討した結果、免疫学的測定において、２種以上の抗タウタンパク質抗体を担体に結合させた抗体コンジュゲートを用いることにより、個別の抗タウタンパク質抗体を用いた場合に比してタウタンパク質の検出感度が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。【０００６】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
〔１〕２種以上の抗タウタンパク質抗体を担体に結合させた抗体コンジュゲート。
〔２〕前記２種以上の抗タウタンパク質抗体が、２種以上の抗ヒトタウタンパク質抗体である、〔１〕の抗体コンジュゲート。
〔３〕２種以上の抗タウタンパク質抗体が、配列番号１のアミノ酸配列において１５３位〜１６９位の間に存在するエピトープを認識する第１の抗体、および配列番号１のアミノ酸配列において１８８位〜２０７位の間に存在するエピトープを認識する第２の抗体を含む、〔２〕の抗体コンジュゲート。
〔４〕前記第１の抗体が認識するエピトープが、ＰＰＧＱＫ（配列番号２）であり、前記第２の抗体が認識するエピトープが、ＤＲＳＧＹＳ（配列番号３）である、〔３〕の抗体コンジュゲート。
〔５〕担体が、標識担体である、〔１〕〜〔４〕のいずれかの抗体コンジュゲート。
〔６〕以下を含む、キット：
（ｉ）２種以上の抗タウタンパク質抗体を担体に結合させた抗体コンジュゲート；および
（ｉｉ）抗体コンジュゲートに含まれる抗タウタンパク質抗体とは別のエピトープを認識する抗タウタンパク質抗体。
〔７〕前記別のエピトープが、配列番号１のアミノ酸配列において１７０位〜１８７位の間または２０９位〜２３３位の間に存在するエピトープである、〔６〕のキット。
〔８〕前記別のエピトープが、ＰＰＡＰＫＴＰ（配列番号４）またはＰＰＴＲＥＰＫ（配列番号５）である、〔７〕のキット。
〔９〕２種以上の抗タウタンパク質抗体を担体に結合させた抗体コンジュゲートを用いて、サンプル中のタウタンパク質を検出することを含む、タウタンパク質の検出方法。
〔１０〕サンプルが、ヒトから採取された体液サンプルである、〔９〕の方法。
〔１１〕抗体コンジュゲートに含まれる抗タウタンパク質抗体とは別のエピトープを認識する抗タウタンパク質抗体にサンプルを接触させることをさらに含む、〔９〕または〔１０〕の方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の抗体コンジュゲートを用いることにより、サンドイッチイムノアッセイ等の免疫学的測定において、個別の抗タウタンパク質抗体を用いた場合に比してタウタンパク質の検出感度が向上する。本発明の抗体コンジュゲートを用いたタウタンパク質の検出は、アルツハイマー病等の神経変性疾患の高精度な診断に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、ハイブリッドコンジュゲートを用いた総タウタンパク質の測定における、各標準溶液の平均カウント値と濃度から作成した標準曲線に基づいて算出した各サンプル（ＬｏＱ１〜ＬｏＱ５）の濃度と、各サンプル（ＬｏＱ１〜ＬｏＱ５）を１０回（ｎ＝１０）測定した際のカウント値の変動係数（ＣＶ）をプロットしたグラフ、および精度プロファイル（ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅ）に基づいて求めた定量限界値（ＬｏＱ（ＣＶ２０％））を示す図である。
【図２】図２は、抗体混合物を用いた総タウタンパク質の測定における、各標準溶液の平均カウント値と濃度から作成した標準曲線に基づいて算出した各サンプル（ＬｏＱ１〜ＬｏＱ５）の濃度と、各サンプル（ＬｏＱ１〜ＬｏＱ５）を１０回（ｎ＝１０）測定した際のカウント値の変動係数（ＣＶ）をプロットしたグラフ、および精度プロファイルに基づいて求めた定量限界値（ＬｏＱ（ＣＶ２０％））を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、２種以上の抗タウタンパク質抗体を担体に結合させた抗体コンジュゲート（「ハイブリッドコンジュゲート」とも呼ぶ）を提供する。
【００１０】
タウタンパク質は、ヒトタウタンパク質が好ましい。ヒトタウタンパク質は、複数のアイソフォームを含み、４〜６つのアイソフォームが成人脳で検出され、胎生期の脳では１つのアイソフォームのみが検出されることが知られている。このアイソフォームの多様性は、ヒト第１７番染色体に存在する一遺伝子からの選択的ｍＲＮＡスプライシングにより生じる。これらのアイソフォームは、Ｃ末端部分における３つまたは４つのリピートドメインと、Ｎ末端部分における２９個または５８個のアミノ酸残基からなる領域の挿入の有無において、互いに異なる。本明細書では、タウタンパク質におけるアミノ酸番号を、配列番号１に示す最も長いアイソフォーム（４４１アミノ酸）に対応するアミノ酸番号として表す。タウタンパク質には、修飾タウタンパク質を含む。修飾タウタンパク質としては、例えば、リン酸化タウタンパク質が挙げられる。リン酸化タウタンパク質とは、水酸基含有アミノ酸残基（セリン残基、スレオニン残基、チロシン残基）がリン酸化されたタウタンパク質をいう。
【００１１】
抗タウタンパク質抗体は、タウタンパク質のアミノ酸配列の少なくとも一部をエピトープとして認識する抗体である。２種以上の抗タウタンパク質抗体は、例えば２〜５種、好ましくは２〜４種、より好ましくは２〜３種、特に好ましくは２種の抗タウタンパク質抗体であってもよい。２種以上の抗タウタンパク質抗体は、それぞれタウタンパク質中の重複しないエピトープを認識することが好ましい。
【００１２】
２種以上の抗タウタンパク質抗体は、第１の抗体および第２の抗体を含む。第１の抗体が認識するエピトープは、配列番号１のアミノ酸配列において好ましくは１５３位〜１６９位の間、より好ましくは１５５位〜１６７位の間、さらにより好ましくは１５７位〜１６５位の間に存在するエピトープであってもよく、特に好ましくはＰＰＧＱＫ（１５９位〜１６３位の間、配列番号２）であってもよい。第２の抗体が認識するエピトープは、配列番号１のアミノ酸配列において好ましくは１８８位〜２０７位の間、より好ましくは１９０位〜２０４位の間、さらにより好ましくは１９２位〜２０１位の間に存在するエピトープであってもよく、特に好ましくはＤＲＳＧＹＳ（１９３位〜１９８位の間、配列番号３）であってもよい。
【００１３】
配列番号１のアミノ酸配列における第１の抗体が認識するエピトープと第２の抗体が認識するエピトープと間のアミノ酸残基数は、例えば１８アミノ酸以上、好ましくは２０アミノ酸以上、より好ましくは２２アミノ酸以上、さらにより好ましくは２４アミノ酸以上、特に好ましくは２６アミノ酸以上であってもよい。前記エピトープ間のアミノ酸残基数は、例えば４４アミノ酸以下、好ましくは４１アミノ酸以下、より好ましくは３８アミノ酸以下、さらにより好ましくは３５アミノ酸以下、特に好ましくは３３アミノ酸以下であってもよい。より具体的には、前記エピトープ間のアミノ酸残基数は、例えば１８〜４４アミノ酸、好ましくは２０〜４１アミノ酸、より好ましくは２２〜３８アミノ酸、さらにより好ましくは２４〜３５アミノ酸、特に好ましくは２６〜３３アミノ酸であってもよい。
【００１４】
２種以上の抗タウタンパク質抗体が認識するエピトープは、非修飾ペプチドまたは修飾ペプチドのいずれであってもよい。修飾ペプチドとしては、例えば、リン酸化ペプチドが挙げられる。リン酸化タウタンパク質とは、水酸基含有アミノ酸残基（セリン残基、スレオニン残基、チロシン残基）がリン酸化されたペプチドをいう。
【００１５】
抗タウタンパク質抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれであってもよい。抗タウタンパク質抗体は、免疫グロブリン（例、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＹ）のいずれのアイソタイプであってもよい。抗タウタンパク質抗体はまた、全長抗体であってもよい。全長抗体とは、可変領域および定常領域を各々含む重鎖および軽鎖を含む抗体（例、２つのＦａｂ部分およびＦｃ部分を含む抗体）をいう。抗タウタンパク質抗体はまた、このような全長抗体に由来する抗体断片であってもよい。抗体断片は、全長抗体の一部であり、例えば、定常領域欠失抗体（例、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ）が挙げられる。抗タウタンパク質抗体はまた、単鎖抗体等の改変抗体であってもよい。
【００１６】
抗タウタンパク質抗体は、従前公知の方法を用いて作製することができる。例えば、抗タウタンパク質抗体は、上記のエピトープを抗原として用いて作製することができる。また、上述したようなエピトープを認識する多数の抗タウタンパク質抗体が市販されているので、このような市販品を使用することもできる。
【００１７】
担体は、リンカー化合物または固相であってもよい。リンカー化合物とは、複数の抗体（例、全長抗体、抗体断片）と結合する能力を有する化合物をいう。リンカー化合物は、標識と結合する能力を有するリンカー化合物、標識と結合したリンカー化合物、またはそれ自体が標識であるリンカー化合物であってもよい。リンカー化合物としては、例えば、マレイミド、ハロアセチル、イソチオシアネート、スルホニルクロリド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、アジド、多糖類（例、デキストラン）、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質（例、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、およびポリエチレングリコールが挙げられる。固相としては、例えば、液相中に懸濁または分散可能な固相（例、粒子、ビーズ等の固相担体）、ならびに液相を収容または搭載可能な固相（例、プレート、メンブレン、試験管等の支持体、およびウェルプレート、マイクロ流路、ガラスキャピラリー、ナノピラー、モノリスカラム等の容器）が挙げられる。担体のための固相は、液相中に懸濁または分散可能な固相が好ましい。固相の材料としては、例えば、ガラス、シリカ、高分子化合物（例、ポリスチレン、プラスチック）、金属、およびカーボンが挙げられる。固相の材料としてはまた、非磁性材料、または磁性材料を用いることができる。
【００１８】
抗体のリンカー化合物への結合方法としては、従前公知の方法を利用することができる。このような方法としては、例えば、物理的吸着法、共有結合法、親和性物質（例、ビオチン、ストレプトアビジン）を利用する方法、およびイオン結合法が挙げられる。共有結合法を利用する場合、例えば、過ヨウ素酸法、グルタルアルデヒド法、マレイミド法、またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド法を用いて、抗体をリンカー化合物に共有結合させることができる。抗体の固相への結合方法としては、抗体のリンカー化合物への結合方法と同様の方法を利用することができる。
【００１９】
本発明の抗体コンジュゲートは、標識を含んでいてもよい。本発明の抗体コンジュゲートが標識を含む場合、担体が標識担体であってもよく、または、抗体が標識と結合していてもよく、あるいは、これらの両方の場合であってもよい。標識担体とは、標識と結合した担体、またはそれ自体が標識である担体をいう。標識としては、例えば、酵素（例、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ）、親和性物質（例、ストレプトアビジンおよびビオチンのうちの一方、互いに相補的なセンス鎖およびアンチセンス鎖の核酸のうちの一方）、蛍光物質（例、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質）、発光物質（例、ルシフェリン、エクオリン、アクリジニウムエステル、トリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム、ルミノール）、放射性物質（例、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ）、および金コロイドが挙げられる。標識と結合した担体は、例えば、蛍光物質を内部に含む粒子またはビーズ（例、蛍光ビーズ）であってもよい。粒子およびビーズの材料としては、担体のための固相と同様の材料を用いることができる。それ自体が標識である担体としては、例えば、酵素（例、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ）、親和性物質（例、ストレプトアビジンおよびビオチンのうちの一方、互いに相補的なセンス鎖およびアンチセンス鎖の核酸のうちの一方）、蛍光物質（例、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質）、および金コロイドが挙げられる。標識を含む抗体コンジュゲートは、標識を抗体コンジュゲートに結合させることにより作製してもよく、抗体を標識担体に結合させることにより作製してもよい。これらの結合方法としては、従前公知の方法を利用することができる。
【００２０】
本発明の抗体コンジュゲートは、イムノアッセイによるタウタンパク質の検出に用いることができる。このようなイムノアッセイとしては、例えば、直接競合法、間接競合法、サンドイッチ法、ウエスタンブロット法、および免疫組織化学的染色法が挙げられる。このようなイムノアッセイは、好ましくはサンドイッチ法であってもよい。また、このようなイムノアッセイとしては、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）（例、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ））、免疫比濁法（ＴＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、およびサンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射イムノアッセイ（ＲＩＡ）、ラテックス凝集反応法、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、イムノクロマトグラフィー法が挙げられる。サンドイッチ法において、本発明の抗体コンジュゲートは、検出抗体または捕捉抗体として用いてもよく、好ましくは検出抗体として用いてもよい。本発明の抗体コンジュゲートを検出抗体として用いる場合、標識を抗体コンジュゲートに結合させ、抗体コンジュゲートに結合した標識を検出することによりタウタンパク質を検出することができる。あるいは、担体が標識担体である抗体コンジュゲートを検出抗体として用いる場合、タウタンパク質に結合した抗体コンジュゲート中の標識を検出することによりタウタンパク質を検出することができる。
【００２１】
標識の検出は、標識の種類に応じて公知の手法から適宜選択した手法に基づいて行うことができる。標識が酵素である場合、シグナル発生基質（例、蛍光基質、発光基質、発色基質）を用いて酵素活性を検出することにより、標識を検出することができる。標識が親和性物質である場合、親和性物質と結合する能力を有する酵素またはシグナル発生物質を用いて、親和性物質に結合した酵素またはシグナル発生物質を検出することにより、標識を検出することができる。そのような親和性物質と結合する能力を有する酵素またはシグナル発生物質は、親和性物質と結合する能力を有する物質を結合した酵素またはシグナル発生物質であってもよい。標識が蛍光物質、発光物質、または放射性物質である場合、これらの標識から発生するシグナルを検出することにより、標識を検出することができる。
【００２２】
本発明の抗体コンジュゲートは、組成物の形態（例、溶液）で提供されてもよい。あるいは、本発明の抗体コンジュゲートは、デバイスの形態（例、抗体コンジュゲートがデバイス中に収容された形態）で提供されてもよい。
【００２３】
本発明はまた、以下を含む、キットを提供する：
（ｉ）２種以上の抗タウタンパク質抗体を担体に結合させた抗体コンジュゲート；および
（ｉｉ）抗体コンジュゲートに含まれる抗タウタンパク質抗体とは別のエピトープを認識する抗タウタンパク質抗体。
【００２４】
「２種以上の抗タウタンパク質抗体を担体に結合させた抗体コンジュゲート」は、上述したとおりである。
【００２５】
「抗体コンジュゲートに含まれる抗タウタンパク質抗体とは別のエピトープを認識する抗タウタンパク質抗体」（以下、「別の抗タウタンパク質抗体」と呼ぶ）が認識するエピトープ（以下、「別のエピトープ」と呼ぶ）は、例えば、抗体コンジュゲートに含まれる抗タウタンパク質抗体が認識するエピトープと重複しないエピトープであってもよく、配列番号１のアミノ酸配列において好ましくは１７０位〜１８７位の間または２０９位〜２３３位の間、より好ましくは１７２位〜１８５位の間または２１２位〜２３０位の間、より好ましくは１７４位〜１８３位の間または２１５位〜２２７位の間に存在するエピトープであってもよく、特に好ましくはＰＰＡＰＫＴＰ（１７６位〜１８２位の間、好ましくは、Ｔはリン酸化スレオニン残基である、配列番号４）またはＰＰＴＲＥＰＫ（２１８位〜２２４位の間、配列番号５）であってもよい。別のエピトープは、非修飾ペプチドまたは修飾ペプチドのいずれであってもよい。修飾ペプチドとしては、例えば、上述したものが挙げられる。別のエピトープ中の修飾アミノ酸残基としては、例えば、配列番号１のアミノ酸配列における１８１位のリン酸化スレオニンが挙げられる。別のエピトープが修飾ペプチドである場合、本発明のキットは、修飾タウタンパク質の検出に用いることができる。
【００２６】
別の抗タウタンパク質抗体は、固相へ固定されてもよい。抗体の固相への固定化（結合）方法としては、上述した、抗体のリンカー化合物への結合方法と同様の方法を利用することができる。
【００２７】
本発明のキットは、タウタンパク質に対するイムノアッセイにおいて利用することができる。このようなイムノアッセイとしては、例えば、上述した方法が挙げられ、好ましくはサンドイッチ法であってもよい。サンドイッチ法において、好ましくは、抗体コンジュゲートおよび別の抗タウタンパク質抗体をそれぞれ、検出抗体および捕捉抗体として用いてもよい。
【００２８】
本発明のキットは、（ｉ）２種以上の抗タウタンパク質抗体を担体に結合させた抗体コンジュゲート（抗体コンジュゲート）；および（ｉｉ）抗体コンジュゲートに含まれる抗タウタンパク質抗体とは別のエピトープを認識する抗タウタンパク質抗体（別の抗タウタンパク質抗体）を、互いに隔離された形態で含むことが好ましい。具体的には、抗体コンジュゲートと別の抗タウタンパク質抗体はそれぞれ異なる容器（例、チューブ、プレート）に収容されてもよい。あるいは、抗体コンジュゲートおよび別の抗タウタンパク質抗体は組成物の形態（例、溶液）で提供されてもよい。あるいは、本発明のキットは、デバイスの形態で提供されてもよい。具体的には、抗体コンジュゲートと別の抗タウタンパク質抗体を含む、その構成成分の全部がデバイス中に収容されてもよい。あるいは、構成成分の一部がデバイス中に収容され、残りのものがデバイス中に必ずしも収容されていなくてもよい（例、異なる容器に収容された形態）。この場合、デバイス中に収容されない構成成分は、タウタンパク質の検出の際に、デバイス中に注入されてもよい。
【００２９】
好ましい実施形態では、本発明のキットは、採用されるべきイムノアッセイの種類に応じた構成を有していてもよい。例えば、サンドイッチ法が採用される場合、本発明のキットは、任意の構成成分として、標識、希釈液（緩衝液）、標識と反応する基質、およびタウタンパク質標品を含んでいてもよい。好ましくは、抗体コンジュゲートまたは別の抗タウタンパク質抗体は、磁性粒子に固相化されていてもよい。本発明のキットの構成の具体例は、標識担体を含む抗体コンジュゲート、固相（例、磁性粒子、支持体、容器）に固定化された別の抗タウタンパク質抗体、標識と反応する基質、およびタウタンパク質標品である。
【００３０】
本発明はまた、タウタンパク質の検出方法を提供する。本発明の方法は、２種以上の抗タウタンパク質抗体を担体に結合させた抗体コンジュゲートを用いて、サンプル中のタウタンパク質を検出することを含む。「２種以上の抗タウタンパク質抗体を担体に結合させた抗体コンジュゲート」は、上述したとおりである。
【００３１】
サンプル中のタウタンパク質の検出は、イムノアッセイによって行われてもよい。このようなイムノアッセイとしては、例えば、上述したものが挙げられ、好ましくはサンドイッチ法であってもよい。本発明の方法において、抗体コンジュゲートは、検出抗体または捕捉抗体として用いてもよく、好ましくは検出抗体として用いてもよい。
【００３２】
タウタンパク質の検出は、例えば、サンプルを抗体コンジュゲートで処理して抗体コンジュゲートをサンプル中のタウタンパク質に結合させる工程（例、サンプルと抗体コンジュゲートを接触させる工程）、およびタウタンパク質に結合した抗体コンジュゲートを検出する工程により行われてよい。タウタンパク質の検出は、タウタンパク質に結合していない抗体コンジュゲートを除去する工程（例、洗浄工程）をさらに含んでもよい。タウタンパク質に結合した抗体コンジュゲートの検出は、標識を抗体コンジュゲートに結合させる工程、および抗体コンジュゲートに結合した標識を検出する工程により行われてよい。抗体コンジュゲートが標識を含む場合、タウタンパク質に結合した抗体コンジュゲートの検出は、抗体コンジュゲート中の標識を検出する工程により行われてよい。
【００３３】
本発明の方法は、抗体コンジュゲートに含まれる抗タウタンパク質抗体とは別のエピトープを認識する抗タウタンパク質抗体（「別の抗タウタンパク質抗体」）にサンプルを接触させることをさらに含んでもよい。「別の抗タウタンパク質抗体」は、上述したとおりである。この場合において、タウタンパク質の検出は、例えば、サンプルを別の抗タウタンパク質抗体で処理してサンプル中のタウタンパク質を別の抗タウタンパク質抗体に結合（捕捉）させる工程（例、サンプルと別の抗タウタンパク質抗体を接触させる工程）、別の抗タウタンパク質抗体に結合したタウタンパク質を抗体コンジュゲートで処理して、抗体コンジュゲートを、別の抗タウタンパク質抗体に結合したタウタンパク質に結合させる工程（例、別の抗タウタンパク質抗体に結合したタウタンパク質と抗体コンジュゲートを接触させる工程）、およびタウタンパク質に結合した抗体コンジュゲートを検出する工程により行われてよい。タウタンパク質の検出は、遊離のタウタンパク質または別の抗タウタンパク質抗体を除去する工程（Ｂ／Ｆ分離または洗浄工程）、もしくはタウタンパク質に結合していない抗体コンジュゲートを除去する工程（例、洗浄工程）、またはその両方の工程をさらに含んでもよい。タウタンパク質に結合した抗体コンジュゲートの検出は、上述したとおりである。
【００３４】
サンプルは、例えば、液体サンプル（例、体液、標品）、組織サンプル、ブロッティングサンプルであってもよい。特に、サンプルは、ヒトから採取された体液サンプルであってもよい。体液サンプルとしては、例えば、血液サンプル（例、全血、血漿、血清）、脳脊髄液、尿、および唾液が挙げられ、好ましくは、脳脊髄液、血漿、または血清であってもよい。
【００３５】
タウタンパク質の検出としては、例えば、タウタンパク質の存在もしくは非存在または量の評価、修飾タウタンパク質（例、リン酸化タウタンパク質）の存在もしくは非存在または量の評価、タウタンパク質の修飾（例、リン酸化）の程度の評価が挙げられる。これらのタウタンパク質の評価に基づいて、アルツハイマー病等の神経変性疾患を診断することができる。タウタンパク質の評価に基づくアルツハイマー病等の神経変性疾患の診断は、公知の手法（例、特表平８−５０２８９８号公報、特表平９−５０６７７１号公報）に基づいて行うことができる。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例を参照して本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００３７】
実施例１：アルカリホスファターゼ標識ハイブリッドコンジュゲートの作製
タウタンパク質を特異的に認識するモノクローナル抗体ＢＴ２（エピトープ：ＤＲＳＧＹＳ（配列番号３）、フジレビオヨーロッパ社製）とペプシンをクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）中で混合し、３７℃で１時間インキュベートしてペプシン消化を行った。反応を停止させた後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）によりゲルろ過精製を行い、Ｆ（ａｂ’）２断片を得た。次に、精製したＦ（ａｂ’）２断片の濃度を決定し、必要に応じて、２．５ｍｇ／ｍＬの濃度になるように調整した。
タウタンパク質を特異的に認識するモノクローナル抗体ＨＴ７（エピトープ：ＰＰＧＱＫ（配列番号２）、フジレビオヨーロッパ社製）とブロメラインを混合し、３７℃で１時間インキュベートしてブロメライン消化を行った。反応を停止させた後、ゲルろ過精製を行い、Ｆ（ａｂ’）２断片を得た。次に、精製したＦ（ａｂ’）２断片の濃度を決定し、必要に応じて、２．５ｍｇ／ｍＬの濃度になるように調整した。
得られたＢＴ２のＦ（ａｂ’）２断片およびＨＴ７のＦ（ａｂ’）２断片を重量比１：１で混合し、２−メルカプトエチルアミン（２−ＭＥＡ）塩酸塩を添加して、３７℃で９０分間インキュベートして、両断片を還元（チオール化）した。さらに脱塩処理し、ＢＴ２のＦａｂ’断片とＨＴ７のＦａｂ’断片の混合物を得た。【００３８】
一方、脱塩したアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）とＮ−（４−マレイミドブチリロキシ）−スクシンイミド（ＧＭＢＳ）をモル比１：１０で混合し、３０℃で１時間インキュベートして、ＡＬＰのマレイミド化を行った。脱塩した後、ＢＴ２のＦａｂ’断片とＨＴ７のＦａｂ’断片の混合物と、マレイミド化ＡＬＰとを、モル比２：１で混合し、２５℃で１時間インキュベートしてカップリングを行った。カップリング反応は、２−ＭＥＡ塩酸塩を添加することによって停止し、さらに２５℃で３０分間インキュベートした。次いで、０．５Ｍヨードアセトアミドを添加し、２５℃で３０分間インキュベートすることで、反応をクエンチし、コンジュゲート反応混合物を得た。【００３９】
得られたコンジュゲート反応混合物を脱塩、精製した後、ＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に添加し、抗体のゲルろ過精製を行った。得られた画分の吸光度２８０ｎｍにおける複数のピークのうち、ＡＬＰ１つに対し２つ以上のＦａｂ’が結合している画分をプールし、ハイブリッドコンジュゲートとした。ハイブリッドコンジュゲートを精製後、０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液（１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  ＺｎＣｌ２、０．１％ＮａＮ３、０．１％ＢＳＡ、ｐＨ６．８）中に、０．１  ｍｇ／ｍＬの濃度になるように調整した。【００４０】
比較例１：アルカリホスファターゼ標識単一モノクローナル抗体の作製
モノクローナル抗体ＢＴ２とペプシンをクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）中で混合し、３７℃で１時間インキュベートしてペプシン消化を行った。反応を停止させた後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）によりゲルろ過精製を行い、Ｆ（ａｂ’）２断片を得た。次に、精製したＦ（ａｂ’）２断片の濃度を決定し、必要に応じて、２．５ｍｇ／ｍＬの濃度になるように調整した。
得られたＢＴ２のＦ（ａｂ’）２断片を、２−ＭＥＡ塩酸塩を用いて、３７℃で９０分間インキュベートし、還元して、ＢＴ２のＦａｂ’断片を得た。【００４１】
一方、脱塩したアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）とＮ−（４−マレイミドブチリロキシ）−スクシンイミド（ＧＭＢＳ）をモル比１：１０で混合し、３０℃で１時間インキュベートして、ＡＬＰのマレイミド化を行った。脱塩した後、ＢＴ２のＦａｂ’断片と、マレイミド化ＡＬＰとを、モル比１：１の割合で混合し、２５℃で１時間インキュベートしてカップリングを行った。カップリング反応は、２−ＭＥＡ塩酸塩を添加し、２５℃で３０分間インキュベートすることで停止し、ＡＬＰ標識ＢＴ２  Ｆａｂ’断片を得た。【００４２】
得られたＡＬＰ標識ＢＴ２  Ｆａｂ’断片をＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いてゲルろ過精製を行った。得られた画分の吸光度２８０ｎｍにおける複数ピークのうち、１つのＡＬＰに対し２つ以上のＦａｂ’が結合している画分について低分子側と高分子側の二つのグループに分けてプールした。低分子側の画分を第１のＡＬＰ標識ＢＴ２  Ｆａｂ’断片（１：Ｘ）とし、高分子側の画分を第２のＡＬＰ標識ＢＴ２  Ｆａｂ’断片（１：ＸＸ）とした。各ＡＬＰ標識ＢＴ２  Ｆａｂ’断片を精製後、それぞれ、０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液（１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  ＺｎＣｌ２、０．１％ＮａＮ３、０．１％ＢＳＡ、ｐＨ６．８）中に、０．０５ｍｇ／ｍＬの濃度になるようよう調整した。
第１および第２のＡＬＰ標識ＨＴ７  Ｆａｂ’断片は、第１および第２のＡＬＰ標識ＢＴ２  Ｆａｂ’断片と同様に調製した。
上記にて調製した第１のＡＬＰ標識ＢＴ２  Ｆａｂ’断片溶液と、第１のＡＬＰ標識ＨＴ７  Ｆａｂ’断片溶液とを容量比１：１で混合して、第１のＡＬＰ標識Ｆａｂ’断片混合物を得た。また、上記にて調製した第２のＡＬＰ標識ＢＴ２  Ｆａｂ’断片溶液と、第２のＡＬＰ標識ＨＴ７  Ｆａｂ’断片溶液とを容量比１：１で混合して、第２のＡＬＰ標識Ｆａｂ’断片混合物を得た。【００４３】
実施例２：抗体結合磁性粒子の作製
固相結合抗体として、１８１番目のスレオニンがリン酸化されたタウタンパク質を特異的に認識するマウスモノクローナル抗体ＡＴ２７０（エピトープ：ＰＰＡＰＫＴ（ｐ）Ｐ（配列番号４）、Ｔ（ｐ）はリン酸化スレオニン残基を示す）、およびタウタンパク質を特異的に認識するマウスモノクローナル抗体ＡＴ１２０（エピトープ：ＰＰＴＲＥＰＫ（配列番号５））をそれぞれ磁性フェライト粒子に結合した。
具体的には、カルボキシル化された磁性フェライト粒子（富士レビオ社製）にエチル(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（ＥＤＣ）、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を添加し、２５℃で３０分ゆるやかに撹拌しながらインキュベートした。洗浄後、マウスモノクローナル抗体ＡＴ２７０を添加し、２５℃で１時間ゆるやかに攪拌しながらインキュベートした。反応後、トリスヒドロキシメチルアミノメタンを添加し、２５℃で３０分ゆるやかに撹拌しながらインキュベートして反応停止させた。反応停止後、磁性フェライト粒子を磁石で集めて反応液から分離し、粒子を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３％ＢＳＡを含む、ｐＨ７．２）にて洗浄し、ＡＴ２７０結合磁性粒子を得た。得られたＡＴ２７０結合磁性粒子を０．２５ｍｇ／ｍＬの濃度になるように５０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液に懸濁してＡＴ２７０結合磁性粒子液を得た。
ＡＴ１２０結合磁性粒子も、ＡＴ２７０結合磁性粒子と同様の方法で作製した。【００４４】
実施例３：リン酸化タウペプチドの測定
タウタンパク質の１８１番目のスレオニンがリン酸化されているリン酸化タウペプチド抗原を、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液を用いて希釈し、各濃度が０、４．５、９、１８、３６、７２、１５０ｐＭになるようにリン酸化タウ標準溶液を調製した。
実施例２で作製したＡＴ２７０結合磁性粒子液１５０μＬと、希釈したリン酸化タウ標準溶液１００μＬを反応槽に分注し、撹拌後３７℃で１０分間インキュベートした。その後、Ｂ／Ｆ分離および洗浄を行った。洗浄は、「Ｌｕｍｉｐｕｌｓｅ  Ｇ（登録商標）」専用洗浄液（Ｌｕｍｉｐｕｌｓｅ  Ｇ  Ｗａｓｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、富士レビオ社製）を用いた。洗浄後、反応槽に、実施例１で作製したハイブリッドコンジュゲートを５０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（１％ＢＳＡを含む、ｐＨ６．８）で０．２μｇ／ｍＬに希釈した溶液２５０μＬを分注し、３７℃で１０分間インキュベートした。その後、Ｂ／Ｆ分離および洗浄を行った。洗浄後、反応槽に、化学発光基質である３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３’’−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン・２ナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ）を含む基質液（Ｌｕｍｉｐｕｌｓｅ  Ｇ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、富士レビオ社製）２００μＬを分注し、撹拌後、３７℃で５分間反応させ、発光量をルミノメーターで測定し、カウント値を得た。実際の測定は全自動化学発光酵素免疫測定システム「Ｌｕｍｉｐｕｌｓｅ  Ｇ」（富士レビオ社製）を用いて行った。【００４５】
対照として、ハイブリッドコンジュゲート溶液の代わりに、比較例１で作製したＡＬＰ標識単一抗体（第１のＡＬＰ標識Ｆａｂ’断片混合物および第２のＡＬＰ標識Ｆａｂ’断片混合物）を用いて、同様に標準溶液を測定し、カウント値を求めた。【００４６】
結果を表１に示す。各リン酸化タウ標準溶液のカウント値は、二重で測定したカウント値の平均値として示す。また、０ｐＭにおけるカウント値に対する４．５ｐＭにおけるカウント値の比率（Ｓ／Ｎ比）をそれぞれ求めた。その結果、第１のＡＬＰ標識Ｆａｂ’断片混合物は、低いカウントを生じていた。第２のＡＬＰ標識Ｆａｂ’断片混合物は、高濃度の標準溶液でのみハイブリッドコンジュゲートと同様のカウント値を生じていた。一方で、ハイブリッドコンジュゲートのみが低濃度の標準溶液に対しても非常に高いカウント値を示した。結果として、ブランク（０ｐＭ）のカウント値に対する、最も低い標準溶液（４．５ｐＭ）のカウント値の比（Ｓ／Ｎ比）は、ハイブリッドコンジュゲートを用いた場合、ＡＬＰ標識Ｆａｂ’断片混合物（ＡＬＰ標識単一抗体）を用いた場合に比べて約６倍高いことが明らかとなった。【００４７】
高いＳ／Ｎ比は、安定したアッセイシステムを得るために、かつ高い感度を得るために重要な要素であり、ハイブリッドコンジュゲートを用いることで、高感度かつ安定したアッセイシステムを構築できることが示された。【００４８】
【表１】
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【００４９】
実施例４：総タウタンパク質の測定
実施例２で作製したＡＴ１２０結合磁性粒子液１５０μＬと、総タウタンパク質測定用のキャリブレータ試薬（「ＬＵＭＩＰＵＬＳＥ  Ｇ  Ｔｏｔａｌ  Ｔａｕ  Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒｓ  ｓｅｔ」、富士レビオ社製）または当該キャリブレータ試薬を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液を用いて希釈して調製したタウタンパク質標準溶液７５μＬと、実施例１で作製したハイブリッドコンジュゲートを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液を用いて０．２μｇ／ｍＬに希釈した溶液５０μＬを反応槽に分注し、撹拌後３７℃で２０分間インキュベートした。その後、Ｂ／Ｆ分離および洗浄を行った。洗浄後、反応槽に、ＡＭＰＰＤを含む基質液（Ｌｕｍｉｐｕｌｓｅ  Ｇ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、富士レビオ社製）２００μＬを分注し、撹拌後、３７℃で５分間反応させ、発光量をルミノメーターで測定し、カウント値を得た。実際の測定は全自動化学発光酵素免疫測定システム「Ｌｕｍｉｐｕｌｓｅ  Ｇ」（富士レビオ社製）を用いて行った。【００５０】
対照として、ハイブリッドコンジュゲート溶液の代わりに、ビオチン化モノクローナル抗体ＢＴ２（フジレビオヨーロッパ社製）、ビオチン化モノクローナル抗体ＨＴ７（フジレビオヨーロッパ社製）、およびストレプトアビジン標識ＡＬＰを用いて、以下のとおり、標準溶液を測定した。
実施例２で作製したＡＴ１２０結合磁性粒子液１５０μＬと、上記タウタンパク質標準溶液７５μＬと、ビオチン化モノクローナル抗体ＢＴ２およびビオチン化モノクローナル抗体ＨＴ７を含む溶液（抗体混合物）５０μＬ（総抗体８μｇ／ｍＬ）を反応槽に分注し、撹拌後３７℃で１０分間インキュベートした。その後、Ｂ／Ｆ分離および洗浄を行った。洗浄後、反応槽に、０．０８μｇ／ｍＬストレプトアビジン標識ＡＬＰ（ＳＡ−ＡＬＰ）溶液２５０μＬを分注し、３７℃で１０分間インキュベートした。その後、Ｂ／Ｆ分離および洗浄を行った。洗浄後、反応槽に、ＡＭＰＰＤを含む基質液（Ｌｕｍｉｐｕｌｓｅ  Ｇ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、富士レビオ社製）２００μＬを分注し、撹拌後、３７℃で５分間反応させ、発光量をルミノメーターで測定し、カウント値を得た。【００５１】
また、脳脊髄液検体を緩衝液で希釈したサンプル（ＬｏＢ、ＬｏＱ１〜ＬｏＱ５）についても同様に測定し、カウント値を得た。【００５２】
結果を表２に示す。表２は、両アッセイ系で決定された、測定カウント値、Ｓ／Ｎ比、ＬｏＱ（定量限界値）を示す。各標準溶液（ＣＡＬ）のカウント値は、二重で標準溶液を測定したカウント値の平均値として示す。サンプルのカウント値は、ｎ＝１０でサンプルを測定したカウント値の平均値として示す。Ｓ／Ｎ比は、ブランク（０ｐｇ／ｍＬ）のカウント値に対する６００ｐｇ／ｍＬのカウント値の比として求めた。なお、６００ｐｇ／ｍＬのカウント値は、標準溶液のカウント値から算出した。【００５３】
図１（ハイブリッドコンジュゲート）および図２（抗体混合物）は、各標準溶液の平均カウント値と濃度から作成した標準曲線に基づいて算出した各サンプル（ＬｏＱ１〜ＬｏＱ５）の濃度と、各サンプル（ＬｏＱ１〜ＬｏＱ５）をｎ＝１０で測定した際のカウント値の変動係数（ＣＶ）をプロットしている。図１および２において、精度プロファイル（ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅ）に基づいて、両アッセイ系に対してＬｏＱ（ＣＶ２０％）を求めた。【００５４】
その結果、総タウタンパク質に関して、ハイブリッドコンジュゲートの使用は、各標識抗体の混合物よりも、非常に高いカウント値を生じ、Ｓ／Ｎ比もハイブリッドコンジュゲートの方が、各標識抗体の混合物よりも約６倍増加した。さらに、ハイブリッドコンジュゲートを用いた場合のＬｏＱは、各標識抗体の混合物を用いた場合のＬｏＱと比べて約１／１０であった。よって、ハイブリットコンジュゲートの使用により低濃度の総タウタンパク質を定量できることが分かった。【００５５】
以上の結果から、総タウタンパク質アッセイ系においても、ハイブリッドコンジュゲートを使用することによって、高感度かつ安定したアッセイシステムを構築できることが示された。【００５６】
【表２】
2020105700.tif 000003
【００５７】
実施例５：  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）リンカーハイブリッドコンジュゲートの作製１
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とＧＭＢＳをモル比１：１０で混合し、３０℃で１時間インキュベートして、ＢＳＡのマレイミド化を行った。脱塩した後、実施例１で得られたＢＴ２のＦａｂ’断片とＨＴ７のＦａｂ’断片の混合物と、マレイミド化ＢＳＡとを、モル比２：１で混合し、２５℃で１時間インキュベートしてカップリングを行った。カップリング反応は、２−ＭＥＡ塩酸塩を添加することによって停止し、さらに２５℃で３０分間インキュベートした。次いで、０．５Ｍヨードアセトアミドを添加し、２５℃で３０分間インキュベートすることで、反応をクエンチし、コンジュゲート反応混合物を得た。【００５８】
得られたコンジュゲート反応混合物を、リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に添加し、抗体のゲルろ過精製を行った。得られた画分の吸光度２８０ｎｍにおける複数のピークのうち、ＢＳＡ１つに対し２つ以上のＦａｂ’が結合している画分をプールし、ＢＳＡリンカーハイブリッドコンジュゲートを得た。【００５９】
得られたＢＳＡリンカーハイブリッドコンジュゲートとＮＨＳ−ＰＥＧ４−Ｂｉｔｉｏｎ（サーモフィッシャー社製）をモル比１：３０で混合し、２５℃４５分インキュベートしてＢＳＡリンカーハイブリッドコンジュゲートのビオチン化を行った。さらに脱塩処理し、ビオチン化ＢＳＡリンカーハイブリッドコンジュゲート１を得た。さらに、５０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１．０％ＢＳＡ、ｐＨ６．８）に０．４μｇ／ｍＬに希釈し、アルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジン（ＡＬＰ−ＳＡ）（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を０．４μｇ／ｍＬの濃度で添加し、ＡＬＰで標識されたＢＳＡリンカーハイブリッドコンジュゲート１を含む反応溶液（ハイブリッドコンジュゲート反応溶液１）を得た。【００６０】
実施例６：ＢＳＡリンカーハイブリッドコンジュゲートの作製２
ＢＳＡに２−ＭＥＡ塩酸塩を添加して、３７℃で６０分間インキュベートして、還元（チオール化）した。さらに脱塩処理し、チオール化ＢＳＡを得た。さらに、チオール化ＢＳＡとＮＨＳ−ＰＥＧ４−Ｂｉｔｉｏｎ（サーモフィッシャー社製）をモル比１：２５、チオール化ＢＳＡと１、２―ビス(マレイミド)エタン（東京化成工業社製）をモル比１：３５０で混合し、３０℃で１時間インキュベートして、ＢＳＡのビオチン化、マレイミド化を同時に行った。脱塩した後、実施例１で得られたＢＴ２のＦａｂ’断片とＨＴ７のＦａｂ’断片の混合物と、ビオチン化マレイミド化ＢＳＡとを、モル比２：１で混合し、２５℃で１時間インキュベートしてカップリングを行った。カップリング反応は、２−ＭＥＡ塩酸塩を添加することによって停止し、さらに２５℃で３０分間インキュベートした。次いで、０．５Ｍヨードアセトアミドを添加し、２５℃で３０分間インキュベートすることで、反応をクエンチし、ビオチン化ＢＳＡリンカーハイブリッドコンジュゲート２を得た。【００６１】
得られたビオチン化ＢＳＡリンカーハイブリッドコンジュゲート２を５０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１．０％ＢＳＡ、ｐＨ６．８）に０．２μｇ／ｍＬに希釈し、ＡＬＰ−ＳＡ（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を０．４μｇ／ｍＬの濃度で添加し、ＡＬＰで標識されたＢＳＡリンカーハイブリッドコンジュゲート２を含む反応溶液（ハイブリッドコンジュゲート反応溶液２）を得た。【００６２】
比較例２：ＢＳＡリンカー単一モノクローナル抗体の作製
モノクローナル抗体ＢＴ２とペプシンをクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）中で混合し、３７℃で１時間インキュベートしてペプシン消化を行った。反応を停止させた後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）によりゲルろ過精製を行い、Ｆ（ａｂ’）２断片を得た。次に、精製したＦ（ａｂ’）２断片の濃度を決定し、必要に応じて、２．５ｍｇ／ｍＬの濃度になるように調整した。
得られたＢＴ２のＦ（ａｂ’）２断片を、２−ＭＥＡ塩酸塩を用いて、３７℃で９０分間インキュベートし、還元して、ＢＴ２のＦａｂ’断片を得た。【００６３】
一方、脱塩したＢＳＡとＧＭＢＳをモル比１：１０で混合し、３０℃で１時間インキュベートして、ＢＳＡのマレイミド化を行った。脱塩した後、ＢＴ２のＦａｂ’断片と、マレイミド化ＢＳＡとを、モル比２：１の割合で混合し、２５℃で１時間インキュベートしてカップリングを行った。カップリング反応は、２−ＭＥＡ塩酸塩を添加することによって停止し、さらに２５℃で３０分間インキュベートした。次いで、０．５Ｍヨードアセトアミドを添加し、２５℃で３０分間インキュベートすることで、反応をクエンチし、ＢＳＡリンカーＢＴ２  Ｆａｂ’断片を得た。【００６４】
得られたＢＳＡリンカーＢＴ２  Ｆａｂ’断片をリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いてゲルろ過精製を行った。得られた画分の吸光度２８０ｎｍにおける複数ピークのうち、１つのＡＬＰに対し２つ以上のＦａｂ’が結合している画分についてプールした。
ＢＳＡリンカーＨＴ７  Ｆａｂ’断片は、ＢＳＡリンカーＢＴ２  Ｆａｂ’断片と同様に調製した。【００６５】
得られたＢＳＡリンカーＢＴ２  Ｆａｂ’断片およびＢＳＡリンカーＨＴ７  Ｆａｂ’断片を５０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１．０％ＢＳＡ、ｐＨ６．８）にそれぞれ０．２μｇ／ｍＬで希釈し、ＡＬＰ−ＳＡ（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を０．４μｇ／ｍＬの濃度で添加し、ＡＬＰ標識ＢＳＡリンカーＢＴ２  Ｆａｂ’断片とＡＬＰ標識ＢＳＡリンカーＢＴ２  Ｆａｂ’断片との混合物（混合コンジュゲート反応溶液）を得た。【００６６】
実施例７：リン酸化タウペプチドの測定
タウタンパク質の１８１番目のスレオニンがリン酸化されているリン酸化タウペプチド抗原を、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液を用いて希釈し、各濃度が０、４０、１００、２００、４００ｐｇ／ｍＬになるようにリン酸化タウ標準溶液を調製した。
実施例２で作製したＡＴ２７０結合磁性粒子液１５０μＬと、希釈したリン酸化タウ標準溶液３０μＬを反応槽に分注し、撹拌後３７℃で１０分間インキュベートした。その後、Ｂ／Ｆ分離および洗浄を行った。洗浄は、「Ｌｕｍｉｐｕｌｓｅ  Ｇ（登録商標）」専用洗浄液（Ｌｕｍｉｐｕｌｓｅ  Ｇ  Ｗａｓｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、富士レビオ社製）を用いた。洗浄後、反応槽に、実施例５で作製したハイブリッドコンジュゲート反応溶液１または実施例６で作製したハイブリッドコンジュゲート反応溶液２を、２５０μＬ分注し、３７℃で１０分間インキュベートした。その後、Ｂ／Ｆ分離および洗浄を行った。洗浄後、反応槽に、ＡＭＰＰＤを含む基質液（Ｌｕｍｉｐｕｌｓｅ  Ｇ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、富士レビオ社製）２００μＬを分注し、撹拌後、３７℃で５分間反応させ、発光量をルミノメーターで測定し、カウント値を得た。実際の測定は全自動化学発光酵素免疫測定システム「Ｌｕｍｉｐｕｌｓｅ  Ｇ」（富士レビオ社製）を用いて行った。【００６７】
対照として、ハイブリッドコンジュゲート反応溶液の代わりに、比較例２で作製した混合コンジュゲート反応溶液を用いて、同様に標準溶液を測定し、カウント値を求めた。【００６８】
結果を表３に示す。各リン酸化タウ標準溶液のカウント値は、二重で測定したカウント値の平均値として示す。また、０ｐｇ／ｍＬにおけるカウント値に対する４０ｐｇ／ｍＬにおけるカウント値の比率（Ｓ／Ｎ比）をそれぞれ求めた。その結果、混合コンジュゲート反応溶液を用いた場合は、低いカウントを生じていた。一方で、ハイブリッドコンジュゲート反応溶液１およびハイブリッドコンジュゲート反応溶液２を用いた場合は、低濃度の標準溶液に対しても非常に高いカウント値を示した。結果として、ブランク（０ｐｇ／ｍＬ）のカウント値に対する、最も低い標準溶液（４０ｐｇ／ｍＬ）のカウント値の比（Ｓ／Ｎ比）は、ハイブリッドコンジュゲート反応溶液１を用いた場合、混合コンジュゲート反応溶液（ＡＬＰ標識単一抗体の混合物）を用いた場合に比べて約９倍高く、また、ハイブリッドコンジュゲート反応溶液２を用いた場合、混合コンジュゲート反応溶液を用いた場合に比べて約１３倍高いことが明らかとなった。【００６９】
高いＳ／Ｎ比は、安定したアッセイシステムを得るために、かつ高い感度を得るために重要な要素であり、ハイブリッドコンジュゲートを用いることで、高感度かつ安定したアッセイシステムを構築できることが示された。【００７０】
【表３】
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
2020105700000001.app
【国際調査報告】
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