(57)【要約】  本発明は、クモ糸タンパク質及び溶媒を含有する紡糸原液を凝固液に接触させ、クモ糸タンパク質を凝固させる工程を含み、凝固液が、ケトンを含有する、タンパク質繊維の製造方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
クモ糸タンパク質及び溶媒を含有する紡糸原液を凝固液に接触させ、前記クモ糸タンパク質を凝固させる工程を含み、
前記凝固液が、ケトンを含有する、タンパク質繊維の製造方法。
【請求項２】
前記ケトンが、水溶性ケトンである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記ケトンが、アセトンである、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記凝固液中の前記ケトンの含有量が、前記凝固液全量に対して、６０質量％以上である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記凝固液が、前記溶媒、溶解促進剤及び水からなる群より選択される少なくとも１種を更に含有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記溶媒が、ギ酸を含有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記凝固液が、ギ酸を更に含み、
前記ギ酸の含有量が、前記ケトンと前記ギ酸の合計含有量を１００質量％として、４０質量％以下である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項８】
前記紡糸原液が、溶解促進剤を更に含有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項９】
前記クモ糸タンパク質が、親水性クモ糸タンパク質である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記凝固液中の前記ケトンの含有量が、前記凝固液全量に対して、７０質量％以上である、請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
凝固させたクモ糸タンパク質を延伸する工程を更に含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質繊維の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、人造繊維の製造方法として、ノズルから吐出させた紡糸原液を凝固浴液中で凝固させて繊維を形成する湿式紡糸法及び乾湿式紡糸法が知られている。湿式紡糸法及び乾湿式紡糸法は、タンパク質を主成分として含むタンパク質繊維を製造する際にも利用されている（例えば、特許文献１参照）。【０００３】
湿式紡糸法及び乾湿式紡糸法等によってタンパク質繊維を製造する方法として、タンパク質を溶媒に溶解させたタンパク質溶液をドープ液（紡糸原液）として使用し、ドープ液を口金から脱溶媒槽の凝固液に押し出し、ドープ液から溶媒を脱離させるとともに繊維形成して未延伸糸とし、タンパク質繊維を得ることが知られている（例えば、特許文献２参照）。【０００４】
タンパク質を溶解する溶媒としては、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド及びギ酸等が知られている。また、湿式紡糸法及び乾湿式紡糸法によるタンパク質繊維の製造の際、溶媒を除去し、繊維形成させるためにメタノール、エタノール、２−プロパノール等の低級アルコールが凝固液として汎用されている。例えば、非特許文献１及び非特許文献２には、再生絹フィブロインをギ酸に溶解し、メタノールの凝固液に導入し、良好な凝固及び繊維形成能が得られたことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第５５４０１５４号公報
【特許文献２】国際公開第２０１３／０６５６５１号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．，４１巻，２００７年，ｐｐ．１６８−１７２
【非特許文献２】Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．，３４巻，２００４年，ｐｐ．８９−１０５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
将来的に利用価値の高い素材である高分子量の構造タンパク質、例えば、シルクフィブロイン及びクモ糸フィブロイン等を用いて、湿式紡糸法及び乾湿式紡糸法によりタンパク質繊維を製造する際、タンパク質繊維を形成させるための凝固液は極めて限られている。その中で、メタノール、エタノール、２−プロパノール等の低級アルコールは、比較的安価に入手でき、繊維形成能を有することから、構造タンパク質の凝固液として汎用されている。しかしながら、これまで構造タンパク質の凝固液について、充分な検討がなされていたとはいえない。【０００８】
本発明は、上記従来技術の問題点に鑑み、クモ糸タンパク質に対して優れた繊維形成能（製糸性）を有する、タンパク質繊維の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、クモ糸タンパク質を含有する紡糸原液と、ケトンを含有する凝固液とを組み合わせることにより、上述の目的を達成することができることを見出した。本発明はこの新規な知見に基づく。【００１０】
本発明は、例えば、以下の各発明に関する。
［１］
クモ糸タンパク質及び溶媒を含有する紡糸原液を凝固液に接触させ、上記クモ糸タンパク質を凝固させる工程を含み、
上記凝固液が、ケトンを含有する、タンパク質繊維の製造方法。
［２］
上記ケトンが、水溶性ケトンである、［１］に記載の製造方法。
［３］
上記ケトンが、アセトンである、［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］
上記凝固液中の上記ケトンの含有量が、上記凝固液全量に対して、６０質量％以上である、［１］〜［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］
上記凝固液が、上記溶媒、溶解促進剤及び水からなる群より選択される少なくとも１種を更に含有する、［１］〜［４］のいずれかに記載の製造方法。
［６］
上記溶媒が、ギ酸を含有する、［１］〜［５］のいずれかに記載の製造方法。
［７］
上記凝固液が、ギ酸を更に含み、
上記ギ酸の含有量が、上記ケトンと上記ギ酸の合計含有量を１００質量％として、４０質量％以下である、［１］〜［６］のいずれかに記載の製造方法。
［８］
上記紡糸原液が、溶解促進剤を更に含有する、［１］〜［７］のいずれかに記載の製造方法。
［９］
上記クモ糸タンパク質が、親水性クモ糸タンパク質である、［１］〜［８］のいずれかに記載の製造方法。
［１０］
上記凝固液中の上記ケトンの含有量が、上記凝固液全量に対して、７０質量％以上である、［９］に記載の製造方法。
［１１］
凝固させたクモ糸タンパク質を延伸する工程を更に含む、［１］〜［１０］のいずれかに記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のタンパク質繊維の製造方法は、クモ糸タンパク質に対して優れた繊維形成能（製糸性）を有する。加えて、本発明のタンパク質繊維の製造方法は、繊維形成能（製糸性）が確保できる上、従来のメタノール凝固液と比べて、ノズルとローラー間で引き取り可能な最大延伸倍率が上がるため、より高速な製糸条件を採用することができる。本発明のタンパク質繊維の製造方法により、より細いタンパク質繊維を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】クモ類フィブロインのドメイン配列の一例を示す模式図である。
【図２】クモ類フィブロインのドメイン配列の一例を示す模式図である。
【図３】クモ類フィブロインのドメイン配列の一例を示す模式図である。
【図４】タンパク質繊維を製造するための紡糸装置の一例を概略的に示す説明図である。
【図５】製造例１で製造したタンパク質繊維の外観写真である。
【図６】製造例２で製造したタンパク質繊維の外観写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、場合により図面を参照しつつ、本発明を実施するための形態について詳細に説明するが、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１４】
〔タンパク質繊維の製造方法〕
本実施形態のタンパク質繊維の製造方法は、クモ糸タンパク質及び溶媒を含有する紡糸原液を凝固液に接触させ、クモ糸タンパク質を凝固させる工程（紡糸工程）を含む。ここで、凝固液は、ケトンを含有する。本実施形態のタンパク質繊維の製造方法は、湿式紡糸、乾湿式紡糸等の公知の紡糸方法に準じて実施することができる。
【００１５】
＜紡糸原液＞
本発明の製造方法で使用する紡糸原液（ドープ液）は、クモ糸タンパク質及び溶媒を含有する。
【００１６】
（クモ糸タンパク質）
原料となるクモ糸タンパク質は、特に限定されるものではなく、遺伝子組換え技術により微生物等で製造したタンパク質であってもよく、合成により製造されたタンパク質であってもよく、また天然由来のタンパク質であってもよい。
【００１７】
本実施形態のクモ糸タンパク質は、天然由来のクモ糸タンパク質と改変クモ糸タンパク質（以下、「改変フィブロイン」ともいう。）とを含む。本明細書において「天然由来のクモ糸タンパク質」とは、天然由来のクモ糸タンパク質（クモ類フィブロイン等）と同一のアミノ酸配列を有するクモ糸タンパク質を意味し、「改変クモ糸タンパク質」又は「改変フィブロイン」とは、天然由来のクモ糸タンパク質とは異なるアミノ酸配列を有するクモ糸タンパク質を意味する。
【００１８】
天然由来のクモ糸タンパク質としては、例えば、大吐糸管しおり糸タンパク質、横糸タンパク質、及び小瓶状腺タンパク質等のクモ類が産生するクモ類フィブロインが挙げられる。大吐糸管しおり糸は、結晶領域と非晶領域（無定形領域とも言う。）からなる繰り返し領域を持つため、高い応力と伸縮性を併せ持つ。クモ糸の横糸は、結晶領域を持たず、非晶領域からなる繰り返し領域を持つという特徴を有する。横糸は、大吐糸管しおり糸に比べると応力は劣るが、高い伸縮性を持つ。
【００１９】
大吐糸管しおり糸タンパク質は、クモの大瓶状腺で産生され、強靭性に優れるという特徴を有する。大吐糸管しおり糸タンパク質としては、例えば、アメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ）に由来する大瓶状腺スピドロインＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２、並びに二ワオニグモ（Ａｒａｎｅｕｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）に由来するＡＤＦ３及びＡＤＦ４が挙げられる。ＡＤＦ３は、ニワオニグモの２つの主要なしおり糸タンパク質の一つである。クモ糸タンパク質は、これらのしおり糸タンパク質に由来するクモ糸タンパク質であってもよい。ＡＤＦ３に由来するクモ糸タンパク質は、比較的合成し易く、また、強伸度及びタフネスの点で優れた特性を有する。
【００２０】
横糸タンパク質は、クモの鞭毛状腺（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍ  ｇｌａｎｄ）で産生される。横糸タンパク質としては、例えばアメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ）に由来する鞭毛状絹タンパク質（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍ  ｓｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が挙げられる。
【００２１】
クモ類が産生するクモ類フィブロインの更なる例として、例えば、オニグモ、ニワオニグモ、アカオニグモ、アオオニグモ及びマメオニグモ等のオニグモ属（Ａｒａｎｅｕｓ属）に属するクモ、ヤマシロオニグモ、イエオニグモ、ドヨウオニグモ及びサツマノミダマシ等のヒメオニグモ属（Ｎｅｏｓｃｏｎａ属）に属するクモ、コオニグモモドキ等のコオニグモモドキ属（Ｐｒｏｎｕｓ属）に属するクモ、トリノフンダマシ及びオオトリノフンダマシ等のトリノフンダマシ属（Ｃｙｒｔａｒａｃｈｎｅ属）に属するクモ、トゲグモ及びチブサトゲグモ等のトゲグモ属（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ属）に属するクモ、マメイタイセキグモ及びムツトゲイセキグモ等のイセキグモ属（Ｏｒｄｇａｒｉｕｓ属）に属するクモ、コガネグモ、コガタコガネグモ及びナガコガネグモ等のコガネグモ属（Ａｒｇｉｏｐｅ属）に属するクモ、キジロオヒキグモ等のオヒキグモ属（Ａｒａｃｈｎｕｒａ属）に属するクモ、ハツリグモ等のハツリグモ属（Ａｃｕｓｉｌａｓ属）に属するクモ、スズミグモ、キヌアミグモ及びハラビロスズミグモ等のスズミグモ属（Ｃｙｔｏｐｈｏｒａ属）に属するクモ、ゲホウグモ等のゲホウグモ属（Ｐｏｌｔｙｓ属）に属するクモ、ゴミグモ、ヨツデゴミグモ、マルゴミグモ及びカラスゴミグモ等のゴミグモ属（Ｃｙｃｌｏｓａ属）に属するクモ、及びヤマトカナエグモ等のカナエグモ属（Ｃｈｏｒｉｚｏｐｅｓ属）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質、並びにアシナガグモ、ヤサガタアシナガグモ、ハラビロアシダカグモ及びウロコアシナガグモ等のアシナガグモ属（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、オオシロカネグモ、チュウガタシロカネグモ及びコシロカネグモ等のシロカネグモ属（Ｌｅｕｃａｕｇｅ属）に属するクモ、ジョロウグモ及びオオジョロウグモ等のジョロウグモ属（Ｎｅｐｈｉｌａ属）に属するクモ、キンヨウグモ等のアズミグモ属（Ｍｅｎｏｓｉｒａ属）に属するクモ、ヒメアシナガグモ等のヒメアシナガグモ属（Ｄｙｓｃｈｉｒｉｏｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、クロゴケグモ、セアカゴケグモ、ハイイロゴケグモ及びジュウサンボシゴケグモ等のゴケグモ属（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ属）に属するクモ、及びユープロステノプス属（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ属）に属するクモ等のアシナガグモ科（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈｉｄａｅ科）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質が挙げられる。
【００２２】
クモ類が産生するスパイダーシルクタンパク質のより具体的な例としては、例えば、ｆｉｂｒｏｉｎ−３（ａｄｆ−３）［Ａｒａｎｅｕｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１０（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５５（塩基配列））、ｆｉｂｒｏｉｎ−４（ａｄｆ−４）［Ａｒａｎｅｕｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１１（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ  ｓｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｐｉｄｒｏｉｎ  １［Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ０４５０４（アミノ酸配列）、Ｕ３７５２０（塩基配列））、ｍａｊｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｐｉｄｒｏｉｎ  １［Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ  ｈｅｓｐｅｒｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ６８８５６（アミノ酸配列）、ＥＦ５９５２４６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ  ｓｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｐｉｄｒｏｉｎ  ２［Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖａｔａ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＬ３２４７２（アミノ酸配列）、ＡＦ４４１２４５（塩基配列））、ｍａｊｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｐｉｄｒｏｉｎ  １［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＪ００４２８（アミノ酸配列）、ＡＪ９７３１５５（塩基配列））、及びｍａｊｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｐｉｄｒｏｉｎ  ２［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＭ３２２４９．１（アミノ酸配列）、ＡＭ４９０１６９（塩基配列））、ｍｉｎｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １［Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５８９．１（アミノ酸配列））、ｍｉｎｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２［Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５９１．１（アミノ酸配列））、ｍｉｎｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｐｉｄｒｏｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｎｅｐｈｉｌｅｎｇｙｓ  ｃｒｕｅｎｔａｔａ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ３７２７８．１（アミノ酸配列）等が挙げられる。
【００２３】
本実施形態のクモ糸タンパク質は、例えば、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質であってもよい。本実施形態のクモ糸タンパク質は、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側のいずれか一方又は両方に更にアミノ酸配列（Ｎ末端配列及びＣ末端配列）が付加されていてもよい。Ｎ末端配列及びＣ末端配列は、これに限定されるものではないが、典型的には、フィブロインに特徴的なアミノ酸モチーフの反復を有さない領域であり、１００残基程度のアミノ酸からなる。
【００２４】
本明細書において「ドメイン配列」とは、フィブロイン特有の結晶領域（典型的には、アミノ酸配列の（Ａ）ｎモチーフに相当する。）と非晶領域（典型的には、アミノ酸配列のＲＥＰに相当する。）を生じるアミノ酸配列であり、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるアミノ酸配列を意味する。ここで、（Ａ）ｎモチーフは、アラニン残基を主とするアミノ酸配列を示し、アミノ酸残基数は２〜２７である。（Ａ）ｎモチーフのアミノ酸残基数は、２〜２０、４〜２７、４〜２０、８〜２０、１０〜２０、４〜１６、８〜１６、又は１０〜１６であってもよい。また、（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数の割合は４０％以上であればよく、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８３％以上、８５％以上、８６％以上、９０％以上、９５％以上、又は１００％（アラニン残基のみで構成されることを意味する。）であってもよい。ドメイン配列中に複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、少なくとも７つがアラニン残基のみで構成されてもよい。ＲＥＰは２〜２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ＲＥＰは、１０〜２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列であってもよい。ｍは２〜３００の整数を示し、１０〜３００の整数であってもよい。複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。
【００２５】
改変クモ糸タンパク質（改変フィブロイン）は、例えば、天然由来のクモ類フィブロインのアミノ酸配列に依拠してそのアミノ酸配列を改変したもの（例えば、クローニングした天然由来のクモ類フィブロインの遺伝子配列を改変することによりアミノ酸配列を改変したもの）であってもよく、また天然由来のクモ類フィブロインに依らず人工的に設計及び合成したもの（例えば、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより所望のアミノ酸配列を有するもの）であってもよい。
【００２６】
改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のクモ類フィブロインの遺伝子配列に対し、例えば、１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行うことで得ることができる。アミノ酸残基の置換、欠失、挿入及び／又は付加は、部分特異的突然変異誘発法等の当業者に周知の方法により行うことができる。具体的には、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１０，６４８７（１９８２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００，４４８（１９８３）等の文献に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００２７】
改変フィブロインの具体的な例として、クモの大瓶状腺で産生される大吐糸管しおり糸タンパク質に由来する改変フィブロイン（第１の改変フィブロイン）、グリシン残基の含有量が低減された改変フィブロイン（第２の改変フィブロイン）、（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロイン（第３の改変フィブロイン）、グリシン残基の含有量、及び（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロイン（第４の改変フィブロイン）、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むドメイン配列を有する改変フィブロイン（第５の改変フィブロイン）、及びグルタミン残基の含有量が低減されたドメイン配列を有する改変フィブロイン（第６の改変フィブロイン）が挙げられる。
【００２８】
クモの大瓶状腺で産生される大吐糸管しおり糸タンパク質に由来する改変フィブロイン（第１の改変フィブロイン）としては、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質が挙げられる。第１の改変フィブロインは、式１中、ｎは３〜２０の整数が好ましく、４〜２０の整数がより好ましく、８〜２０の整数が更に好ましく、１０〜２０の整数が更により好ましく、４〜１６の整数が更によりまた好ましく、８〜１６の整数が特に好ましく、１０〜１６の整数が最も好ましい。第１の改変フィブロインは、式１中、ＲＥＰを構成するアミノ酸残基の数は、１０〜２００残基であることが好ましく、１０〜１５０残基であることがより好ましく、２０〜１００残基であることが更に好ましく、２０〜７５残基であることが更により好ましい。第１の改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるアミノ酸配列中に含まれるグリシン残基、セリン残基及びアラニン残基の合計残基数がアミノ酸残基数全体に対して、４０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、７０％以上であることが更に好ましい。
【００２９】
第１の改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるアミノ酸配列の単位を含み、かつＣ末端配列が配列番号１〜３のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は配列番号１〜３のいずれかに示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列である、タンパク質であってもよい。
【００３０】
配列番号１に示されるアミノ酸配列は、ＡＤＦ３（ＧＩ：１２６３２８７、ＮＣＢＩ）のアミノ酸配列のＣ末端の５０残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列と同一であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＣ末端から２０残基取り除いたアミノ酸配列と同一であり、配列番号３に示されるアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＣ末端から２９残基取り除いたアミノ酸配列と同一である。
【００３１】
第１の改変フィブロインのより具体的な例として、（１−ｉ）配列番号４で示されるアミノ酸配列、又は（１−ｉｉ）配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
【００３２】
配列番号４で示されるアミノ酸配列は、Ｎ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎ  ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ  ３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号５）を付加したＡＤＦ３のアミノ酸配列において、第１〜１３番目の反復領域をおよそ２倍になるように増やすとともに、翻訳が第１１５４番目アミノ酸残基で終止するように変異させたものである。配列番号４で示されるアミノ酸配列のＣ末端のアミノ酸配列は、配列番号３で示されるアミノ酸配列と同一である。
【００３３】
（１−ｉ）の改変フィブロインは、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００３４】
グリシン残基の含有量が低減された改変フィブロイン（第２の改変フィブロイン）は、そのドメイン配列が、天然由来のクモ類フィブロインと比較して、グリシン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有する。第２の改変フィブロインは、天然由来のクモ類フィブロインと比較して、少なくともＲＥＰ中の１又は複数のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有するものということができる。
【００３５】
第２の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のクモ類フィブロインと比較して、ＲＥＰ中のＧＧＸ及びＧＰＧＸＸ（但し、Ｇはグリシン残基、Ｐはプロリン残基、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）から選ばれる少なくとも一つのモチーフ配列において、少なくとも１又は複数の当該モチーフ配列中の１つのグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
【００３６】
第２の改変フィブロインは、上述のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたモチーフ配列の割合が、全モチーフ配列に対して、１０％以上であってもよい。
【００３７】
第２の改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含み、上記ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列中の全ＲＥＰに含まれるＸＧＸ（但し、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をｚとし、上記ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列中の総アミノ酸残基数をｗとしたときに、ｚ／ｗが３０％以上、４０％以上、５０％以上又は５０．９％以上であるアミノ酸配列を有するものであってもよい。（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数は８３％以上であってよいが、８６％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることが更に好ましく、１００％であること（アラニン残基のみで構成されることを意味する）が更により好ましい。
【００３８】
第２の改変フィブロインは、ＧＧＸモチーフの１つのグリシン残基を別のアミノ酸残基に置換することにより、ＸＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合を高めたものであることが好ましい。第２の改変フィブロインは、ドメイン配列中のＧＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合が３０％以下であることが好ましく、２０％以下であることがより好ましく、１０％以下であることが更に好ましく、６％以下であることが更により好ましく、４％以下であることが更によりまた好ましく、２％以下であることが特に好ましい。ドメイン配列中のＧＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合は、下記ＸＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合（ｚ／ｗ）の算出方法と同様の方法で算出することができる。
【００３９】
ｚ／ｗの算出方法を更に詳細に説明する。まず、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むクモ類フィブロイン（改変フィブロイン又は天然由来のクモ類フィブロイン）において、ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列に含まれる全てのＲＥＰから、ＸＧＸからなるアミノ酸配列を抽出する。ＸＧＸを構成するアミノ酸残基の総数がｚである。例えば、ＸＧＸからなるアミノ酸配列が５０個抽出された場合（重複はなし）、ｚは５０×３＝１５０である。また、例えば、ＸＧＸＧＸからなるアミノ酸配列の場合のように２つのＸＧＸに含まれるＸ（中央のＸ）が存在する場合は、重複分を控除して計算する（ＸＧＸＧＸの場合は５アミノ酸残基である）。ｗは、ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列に含まれる総アミノ酸残基数である。例えば、図１に示したドメイン配列の場合、ｗは４＋５０＋４＋１００＋４＋１０＋４＋２０＋４＋３０＝２３０である（最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフは除いている。）。次に、ｚをｗで除すことによって、ｚ／ｗ（％）を算出することができる。
【００４０】
第２の改変フィブロインにおいて、ｚ／ｗは、５０．９％以上であることが好ましく、５６．１％以上であることがより好ましく、５８．７％以上であることが更に好ましく、７０％以上であることが更により好ましく、８０％以上であることが更によりまた好ましい。ｚ／ｗの上限に特に制限はないが、例えば、９５％以下であってもよい。
【００４１】
第２の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のクモ類フィブロインの遺伝子配列から、グリシン残基をコードする塩基配列の少なくとも一部を置換して別のアミノ酸残基をコードするように改変することにより得ることができる。このとき、改変するグリシン残基として、ＧＧＸモチーフ及びＧＰＧＸＸモチーフにおける１つのグリシン残基を選択してもよいし、またｚ／ｗが５０．９％以上になるように置換してもよい。また、例えば、天然由来のクモ類フィブロインのアミノ酸配列から上記態様を満たすアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のクモ類フィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中のグリシン残基を別のアミノ酸残基に置換したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。
【００４２】
上記の別のアミノ酸残基としては、グリシン残基以外のアミノ酸残基であれば特に制限はないが、バリン（Ｖ）残基、ロイシン（Ｌ）残基、イソロイシン（Ｉ）残基、メチオニン（Ｍ）残基、プロリン（Ｐ）残基、フェニルアラニン（Ｆ）残基及びトリプトファン（Ｗ）残基等の疎水性アミノ酸残基、グルタミン（Ｑ）残基、アスパラギン（Ｎ）残基、セリン（Ｓ）残基、リシン（Ｋ）残基及びグルタミン酸（Ｅ）残基等の親水性アミノ酸残基が好ましく、バリン（Ｖ）残基、ロイシン（Ｌ）残基、イソロイシン（Ｉ）残基及びグルタミン（Ｑ）残基がより好ましく、グルタミン（Ｑ）残基が更に好ましい。
【００４３】
第２の改変フィブロインのより具体的な例として、（２−ｉ）配列番号６、配列番号７、配列番号８若しくは配列番号９で示されるアミノ酸配列、又は（２−ｉｉ）配列番号６、配列番号７、配列番号８若しくは配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
【００４４】
（２−ｉ）の改変フィブロインについて説明する。配列番号６で示されるアミノ酸配列は、天然由来のクモ類フィブロインに相当する配列番号１０で示されるアミノ酸配列のＲＥＰ中の全てのＧＧＸをＧＱＸに置換したものである。配列番号７で示されるアミノ酸配列は、配列番号６で示されるアミノ酸配列から、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）ｎモチーフを欠失させ、更にＣ末端配列の手前に［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］を１つ挿入したものである。配列番号８で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列の各（Ａ）ｎモチーフのＣ末端側に２つのアラニン残基を挿入し、更に一部のグルタミン（Ｑ）残基をセリン（Ｓ）残基に置換し、配列番号７の分子量とほぼ同じとなるようにＮ末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。配列番号９で示されるアミノ酸配列は、配列番号１１で示されるアミノ酸配列中に存在する２０個のドメイン配列の領域（但し、当該領域のＣ末端側の数アミノ酸残基が置換されている。）を４回繰り返した配列のＣ末端にＨｉｓタグが付加されたものである。
【００４５】
配列番号１０で示されるアミノ酸配列（天然由来のクモ類フィブロインに相当）におけるｚ／ｗの値は、４６．８％である。配列番号６で示されるアミノ酸配列、配列番号７で示されるアミノ酸配列、配列番号８で示されるアミノ酸配列、及び配列番号９で示されるアミノ酸配列におけるｚ／ｗの値は、それぞれ５８．７％、７０．１％、６６．１％及び７０．０％である。また、配列番号１０、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９で示されるアミノ酸配列のギザ比率（後述する）１：１．８〜１１．３におけるｘ／ｙの値は、それぞれ１５．０％、１５．０％、９３．４％、９２．７％及び８９．３％である。
【００４６】
（２−ｉ）の改変フィブロインは、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００４７】
（２−ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（２−ｉｉ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
【００４８】
（２−ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＲＥＰ中に含まれるＸＧＸ（但し、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をｚとし、上記ドメイン配列中のＲＥＰの総アミノ酸残基数をｗとしたときに、ｚ／ｗが５０．９％以上であることが好ましい。
【００４９】
第２の改変フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。これにより、改変フィブロインの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。
【００５０】
タグ配列として、例えば、他の分子との特異的親和性（結合性、アフィニティ）を利用したアフィニティタグを挙げることができる。アフィニティタグの具体例として、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を挙げることができる。Ｈｉｓタグは、ヒスチジン残基が４から１０個程度並んだ短いペプチドで、ニッケル等の金属イオンと特異的に結合する性質があるため、金属キレートクロマトグラフィー（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ｍｅｔａｌ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）による改変フィブロインの単離に利用することができる。タグ配列の具体例として、例えば、配列番号１２で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含むアミノ酸配列）が挙げられる。
【００５１】
また、グルタチオンに特異的に結合するグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースに特異的に結合するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）等のタグ配列を利用することもできる。
【００５２】
さらに、抗原抗体反応を利用した「エピトープタグ」を利用することもできる。抗原性を示すペプチド（エピトープ）をタグ配列として付加することにより、当該エピトープに対する抗体を結合させることができる。エピトープタグとして、ＨＡ（インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのペプチド配列）タグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ等を挙げることができる。エピトープタグを利用することにより、高い特異性で容易に改変フィブロインを精製することができる。
【００５３】
さらにタグ配列を特定のプロテアーゼで切り離せるようにしたものも使用することができる。当該タグ配列を介して吸着したタンパク質をプロテアーゼ処理することにより、タグ配列を切り離した改変フィブロインを回収することもできる。
【００５４】
タグ配列を含む第２の改変フィブロインのより具体的な例として、（２−ｉｉｉ）配列番号１３、配列番号１１、配列番号１４若しく配列番号１５で示されるアミノ酸配列、又は（２−ｉｖ）配列番号１３、配列番号１１、配列番号１４若しく配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
【００５５】
配列番号１６、配列番号１７、配列番号１３、配列番号１１、配列番号１４及び配列番号１５で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１０、配列番号１８、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１２で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。
【００５６】
（２−ｉｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１３、配列番号１１、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００５７】
（２−ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号１３、配列番号１１、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（２−ｉｖ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
【００５８】
（２−ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号１３、配列番号１１、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＲＥＰ中に含まれるＸＧＸ（但し、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をｚとし、上記ドメイン配列中のＲＥＰの総アミノ酸残基数をｗとしたときに、ｚ／ｗが５０．９％以上であることが好ましい。
【００５９】
第２の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
【００６０】
（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロイン（第３の改変フィブロイン）は、そのドメイン配列が、天然由来のクモ類フィブロインと比較して、（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減されたアミノ酸配列を有する。第３の改変フィブロインのドメイン配列は、天然由来のクモ類フィブロインと比較して、少なくとも１又は複数の（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有するものということができる。
【００６１】
第３の改変フィブロインは、天然由来のクモ類フィブロインから（Ａ）ｎモチーフを１０〜４０％欠失させたことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
【００６２】
第３の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のクモ類フィブロインと比較して、少なくともＮ末端側からＣ末端側に向かって１〜３つの（Ａ）ｎモチーフ毎に１つの（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
【００６３】
第３の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のクモ類フィブロインと比較して、少なくともＮ末端側からＣ末端側に向かって２つ連続した（Ａ）ｎモチーフの欠失、及び１つの（Ａ）ｎモチーフの欠失がこの順に繰り返されたことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
【００６４】
第３の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、少なくともＮ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
【００６５】
第３の改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含み、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットのＲＥＰのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないＲＥＰのアミノ酸残基数を１としたとき、他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比が１．８〜１１．３となる隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値をｘとし、ドメイン配列の総アミノ酸残基数をｙとしたときに、ｘ／ｙが２０％以上、３０％以上、４０％以上又は５０％以上であるアミノ酸配列を有するものであってもよい。（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数は８３％以上であってよいが、８６％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることが更に好ましく、１００％であること（アラニン残基のみで構成されることを意味する）が更により好ましい。
【００６６】
ｘ／ｙの算出方法を図１を参照しながら更に詳細に説明する。図１には、クモ類フィブロインからＮ末端配列及びＣ末端配列を除いたドメイン配列を示す。当該ドメイン配列は、Ｎ末端側（左側）から（Ａ）ｎモチーフ−第１のＲＥＰ（５０アミノ酸残基）−（Ａ）ｎモチーフ−第２のＲＥＰ（１００アミノ酸残基）−（Ａ）ｎモチーフ−第３のＲＥＰ（１０アミノ酸残基）−（Ａ）ｎモチーフ−第４のＲＥＰ（２０アミノ酸残基）−（Ａ）ｎモチーフ−第５のＲＥＰ（３０アミノ酸残基）−（Ａ）ｎモチーフという配列を有する。
【００６７】
隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットは、重複がないように、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、順次選択する。このとき、選択されない［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットが存在してもよい。図１には、パターン１（第１のＲＥＰと第２のＲＥＰの比較、及び第３のＲＥＰと第４のＲＥＰの比較）、パターン２（第１のＲＥＰと第２のＲＥＰの比較、及び第４のＲＥＰと第５のＲＥＰの比較）、パターン３（第２のＲＥＰと第３のＲＥＰの比較、及び第４のＲＥＰと第５のＲＥＰの比較）、パターン４（第１のＲＥＰと第２のＲＥＰの比較）を示した。なお、これ以外にも選択方法は存在する。
【００６８】
次に各パターンについて、選択した隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニット中の各ＲＥＰのアミノ酸残基数を比較する。比較は、よりアミノ酸残基数の少ない方を１としたときの、他方のアミノ酸残基数の比を求めることによって行う。例えば、第１のＲＥＰ（５０アミノ酸残基）と第２のＲＥＰ（１００アミノ酸残基）の比較の場合、よりアミノ酸残基数の少ない第１のＲＥＰを１としたとき、第２のＲＥＰのアミノ酸残基数の比は、１００／５０＝２である。同様に、第４のＲＥＰ（２０アミノ酸残基）と第５のＲＥＰ（３０アミノ酸残基）の比較の場合、よりアミノ酸残基数の少ない第４のＲＥＰを１としたとき、第５のＲＥＰのアミノ酸残基数の比は、３０／２０＝１．５である。
【００６９】
図１中、よりアミノ酸残基数の少ない方を１としたときに、他方のアミノ酸残基数の比が１．８〜１１．３となる［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットの組を実線で示した。以下このような比をギザ比率と呼ぶ。よりアミノ酸残基数の少ない方を１としたときに、他方のアミノ酸残基数の比が１．８未満又は１１．３超となる［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットの組は破線で示した。
【００７０】
各パターンにおいて、実線で示した隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットの全てのアミノ酸残基数を足し合わせる（ＲＥＰのみではなく、（Ａ）ｎモチーフのアミノ酸残基数もである。）。そして、足し合わせた合計値を比較して、当該合計値が最大となるパターンの合計値（合計値の最大値）をｘとする。図１に示した例では、パターン１の合計値が最大である。
【００７１】
次に、ｘをドメイン配列の総アミノ酸残基数ｙで除すことによって、ｘ／ｙ（％）を算出することができる。
【００７２】
第３の改変フィブロインにおいて、ｘ／ｙは、５０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、６５％以上であることが更に好ましく、７０％以上であることが更により好ましく、７５％以上であることが更によりまた好ましく、８０％以上であることが特に好ましい。ｘ／ｙの上限に特に制限はなく、例えば、１００％以下であってよい。ギザ比率が１：１．９〜１１．３の場合には、ｘ／ｙは８９．６％以上であることが好ましく、ギザ比率が１：１．８〜３．４の場合には、ｘ／ｙは７７．１％以上であることが好ましく、ギザ比率が１：１．９〜８．４の場合には、ｘ／ｙは７５．９％以上であることが好ましく、ギザ比率が１：１．９〜４．１の場合には、ｘ／ｙは６４．２％以上であることが好ましい。
【００７３】
第３の改変フィブロインが、ドメイン配列中に複数存在する（Ａ）ｎモチーフの少なくとも７つがアラニン残基のみで構成される改変フィブロインである場合、ｘ／ｙは、４６．４％以上であることが好ましく、５０％以上であることがより好ましく、５５％以上であることが更に好ましく、６０％以上であることが更により好ましく、７０％以上であることが更によりまた好ましく、８０％以上であることが特に好ましい。ｘ／ｙの上限に特に制限はなく、１００％以下であればよい。
【００７４】
第３の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のクモ類フィブロインの遺伝子配列から、ｘ／ｙが６４．２％以上になるように（Ａ）ｎモチーフをコードする配列の１又は複数を欠失させることにより得ることができる。また、例えば、天然由来のクモ類フィブロインのアミノ酸配列から、ｘ／ｙが６４．２％以上になるように１又は複数の（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のクモ類フィブロインのアミノ酸配列から（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。
【００７５】
第３の改変フィブロインのより具体的な例として、（３−ｉ）配列番号１８、配列番号７、配列番号８若しくは配列番号９で示されるアミノ酸配列、又は（３−ｉｉ）配列番号１８、配列番号７、配列番号８若しくは配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
【００７６】
（３−ｉ）の改変フィブロインについて説明する。配列番号１８で示されるアミノ酸配列は、天然由来のクモ類フィブロインに相当する配列番号１０で示されるアミノ酸配列から、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）ｎモチーフを欠失させ、更にＣ末端配列の手前に［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］を１つ挿入したものである。配列番号７で示されるアミノ酸配列は、配列番号１８で示されるアミノ酸配列のＲＥＰ中の全てのＧＧＸをＧＱＸに置換したものである。配列番号８で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列の各（Ａ）ｎモチーフのＣ末端側に２つのアラニン残基を挿入し、更に一部のグルタミン（Ｑ）残基をセリン（Ｓ）残基に置換し、配列番号７の分子量とほぼ同じとなるようにＮ末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。配列番号９で示されるアミノ酸配列は、配列番号１１で示されるアミノ酸配列中に存在する２０個のドメイン配列の領域（但し、当該領域のＣ末端側の数アミノ酸残基が置換されている。）を４回繰り返した配列のＣ末端にＨｉｓタグが付加されたものである。
【００７７】
配列番号１０で示されるアミノ酸配列（天然由来のクモ類フィブロインに相当）のギザ比率１：１．８〜１１．３におけるｘ／ｙの値は１５．０％である。配列番号１８で示されるアミノ酸配列、及び配列番号７で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙの値は、いずれも９３．４％である。配列番号８で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙの値は、９２．７％である。配列番号９で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙの値は、８９．３％である。配列番号１０、配列番号１８、配列番号７、配列番号８及び配列番号９で示されるアミノ酸配列におけるｚ／ｗの値は、それぞれ４６．８％、５６．２％、７０．１％、６６．１％及び７０．０％である。
【００７８】
（３−ｉ）の改変フィブロインは、配列番号１８、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００７９】
（３−ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１８、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（３−ｉｉ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
【００８０】
（３−ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１８、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＮ末端側からＣ末端側に向かって、隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットのＲＥＰのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないＲＥＰのアミノ酸残基数を１としたとき、他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比が１．８〜１１．３（ギザ比率が１：１．８〜１１．３）となる隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値をｘとし、ドメイン配列の総アミノ酸残基数をｙとしたときに、ｘ／ｙが６４．２％以上であることが好ましい。
【００８１】
第３の改変フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方に上述したタグ配列を含んでいてもよい。
【００８２】
タグ配列を含む第３の改変フィブロインのより具体的な例として、（３−ｉｉｉ）配列番号１７、配列番号１１、配列番号１４若しくは配列番号１５で示されるアミノ酸配列、又は（３−ｉｖ）配列番号１７、配列番号１１、配列番号１４若しくは配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
【００８３】
配列番号１６、配列番号１７、配列番号１３、配列番号１１、配列番号１４及び配列番号１５で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１０、配列番号１８、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１２で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。
【００８４】
（３−ｉｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１７、配列番号１１、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００８５】
（３−ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号１７、配列番号１１、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（３−ｉｖ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
【００８６】
（３−ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号１７、配列番号１１、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＮ末端側からＣ末端側に向かって、隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットのＲＥＰのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないＲＥＰのアミノ酸残基数を１としたとき、他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比が１．８〜１１．３となる隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値をｘとし、ドメイン配列の総アミノ酸残基数をｙとしたときに、ｘ／ｙが６４．２％以上であることが好ましい。
【００８７】
第３の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
【００８８】
グリシン残基の含有量、及び（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロイン（第４の改変フィブロイン）は、そのドメイン配列が、天然由来のクモ類フィブロインと比較して、（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減されたことに加え、グリシン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有するものである。第４の改変フィブロインのドメイン配列は、天然由来のクモ類フィブロインと比較して、少なくとも１又は複数の（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに加え、更に少なくともＲＥＰ中の１又は複数のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有するものということができる。すなわち、第４の改変フィブロインは、上述したグリシン残基の含有量が低減された改変フィブロイン（第２の改変フィブロイン）と、（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロイン（第３の改変フィブロイン）の特徴を併せ持つ改変フィブロインである。具体的な態様等は、第２の改変フィブロイン、及び第３の改変フィブロインで説明したとおりである。
【００８９】
第４の改変フィブロインのより具体的な例として、（４−ｉ）配列番号７、配列番号８若しくは配列番号９で示されるアミノ酸配列、（４−ｉｉ）配列番号７、配列番号８若しくは配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。配列番号７、配列番号８若しくは配列番号９で示されるアミノ酸配列を含む改変フィブロインの具体的な態様は上述のとおりである。
【００９０】
局所的に疎水性指標の大きい領域を含むドメイン配列を有する改変フィブロイン（第５の改変フィブロイン）は、そのドメイン配列が、天然由来のクモ類フィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むアミノ酸配列を有するものであってよい。
【００９１】
局所的に疎水性指標の大きい領域は、連続する２〜４アミノ酸残基で構成されていることが好ましい。
【００９２】
上述の疎水性指標の大きいアミノ酸残基は、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）及びアラニン（Ａ）から選ばれるアミノ酸残基であることがより好ましい。
【００９３】
第５の改変フィブロインは、天然由来のクモ類フィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する改変に加え、更に、天然由来のクモ類フィブロインと比較して、１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変があってもよい。
【００９４】
第５の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のクモ類フィブロインの遺伝子配列からＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がマイナスであるアミノ酸残基）を疎水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がプラスであるアミノ酸残基）に置換すること、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入することにより得ることができる。また、例えば、天然由来のクモ類フィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基を疎水性アミノ酸残基に置換したこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のクモ類フィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基を疎水性アミノ酸残基に置換したこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。
【００９５】
第５の改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含み、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を上記ドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域に含まれるアミノ酸残基の総数をｐとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を上記ドメイン配列から除いた配列に含まれるアミノ酸残基の総数をｑとしたときに、ｐ／ｑが６．２％以上であるアミノ酸配列を有してもよい。
【００９６】
アミノ酸残基の疎水性指標については、公知の指標（Ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ  ｉｎｄｅｘ：Ｋｙｔｅ  Ｊ，＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  Ｒ（１９８２）“Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７，ｐｐ．１０５−１３２）を使用する。具体的には、各アミノ酸の疎水性指標（ハイドロパシー・インデックス、以下「ＨＩ」とも記す。）は、下記表１に示すとおりである。
【００９７】
【表１】
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【００９８】
ｐ／ｑの算出方法を更に詳細に説明する。算出には、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列（以下、「配列Ａ」とする）を用いる。まず、配列Ａに含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値を算出する。疎水性指標の平均値は、連続する４アミノ酸残基に含まれる各アミノ酸残基のＨＩの総和を４（アミノ酸残基数）で除して求める。疎水性指標の平均値は、全ての連続する４アミノ酸残基について求める（各アミノ酸残基は、１〜４回平均値の算出に用いられる。）。次いで、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域を特定する。あるアミノ酸残基が、複数の「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」に該当する場合であっても、領域中には１アミノ酸残基として含まれることになる。そして、当該領域に含まれるアミノ酸残基の総数がｐである。また、配列Ａに含まれるアミノ酸残基の総数がｑである。
【００９９】
例えば、「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」が２０カ所抽出された場合（重複はなし）、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域には、連続する４アミノ酸残基（重複はなし）が２０含まれることになり、ｐは２０×４＝８０である。また、例えば、２つの「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」が１アミノ酸残基だけ重複して存在する場合、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域には、７アミノ酸残基含まれることになる（ｐ＝２×４−１＝７。「−１」は重複分の控除である。）。例えば、図２に示したドメイン配列の場合、「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」が重複せずに７つ存在するため、ｐは７×４＝２８となる。また、例えば、図２に示したドメイン配列の場合、ｑは４＋５０＋４＋４０＋４＋１０＋４＋２０＋４＋３０＝１７０である（Ｃ末端側の最後に存在する（Ａ）ｎモチーフは含めない）。次に、ｐをｑで除すことによって、ｐ／ｑ（％）を算出することができる。図２の場合２８／１７０＝１６．４７％となる。
【０１００】
第５の改変フィブロインにおいて、ｐ／ｑは、６．２％以上であることが好ましく、７％以上であることがより好ましく、１０％以上であることが更に好ましく、２０％以上であることが更により好ましく、３０％以上であることが更によりまた好ましい。ｐ／ｑの上限は、特に制限されないが、例えば、４５％以下であってもよい。
【０１０１】
第５の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のクモ類フィブロインのアミノ酸配列を、上記のｐ／ｑの条件を満たすように、ＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がマイナスであるアミノ酸残基）を疎水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がプラスであるアミノ酸残基）に置換すること、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入することにより、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むアミノ酸配列に改変することにより得ることができる。また、例えば、天然由来のクモ類フィブロインのアミノ酸配列から上記のｐ／ｑの条件を満たすアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のクモ類フィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当する改変を行ってもよい。
【０１０２】
疎水性指標の大きいアミノ酸残基としては、特に制限はないが、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）及びアラニン（Ａ）が好ましく、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）及びイソロイシン（Ｉ）がより好ましい。
【０１０３】
第５の改変フィブロインの具体的な例として、（５−ｉ）配列番号１９、配列番号２０若しくは配列番号２１で示されるアミノ酸配列、又は（５−ｉｉ）配列番号１９、配列番号２０若しくは配列番号２１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
【０１０４】
（５−ｉ）の改変フィブロインについて説明する。配列番号２２で示されるアミノ酸配列は、天然由来のクモ類フィブロインの（Ａ）ｎモチーフ中のアラニン残基が連続するアミノ酸配列をアラニン残基が連続する数を５つになるよう欠失したものである。配列番号１９で示されるアミノ酸配列は、配列番号２２で示されるアミノ酸配列に対し、ＲＥＰ一つ置きにそれぞれ３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（ＶＬＩ）を２カ所挿入し、かつ配列番号２２で示されるアミノ酸配列の分子量とほぼ同じとなるようにＣ末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。配列番号２３で示されるアミノ酸配列は、配列番号２２で示されるアミノ酸配列に対し、各（Ａ）ｎモチーフのＣ末端側に２つのアラニン残基を挿入し、更に一部のグルタミン（Ｑ）残基をセリン（Ｓ）残基に置換し、かつ配列番号２２で示されるアミノ酸配列の分子量とほぼ同じとなるようにＣ末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。配列番号２０で示されるアミノ酸配列は、配列番号２３で示されるアミノ酸配列に対し、ＲＥＰ一つ置きにそれぞれ３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（ＶＬＩ）を１カ所挿入したものである。配列番号２１で示されるアミノ酸配列は、配列番号２３で示されるアミノ酸配列に対し、ＲＥＰ一つ置きにそれぞれ３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（ＶＬＩ）を２カ所挿入したものである。
【０１０５】
（５−ｉ）の改変フィブロインは、配列番号１９、配列番号２０又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【０１０６】
（５−ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１９、配列番号２０又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（５−ｉｉ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
【０１０７】
（５−ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１９、配列番号２０又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域に含まれるアミノ酸残基の総数をｐとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれるアミノ酸残基の総数をｑとしたときに、ｐ／ｑが６．２％以上であることが好ましい。
【０１０８】
第５の改変フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。
【０１０９】
タグ配列を含む第５の改変フィブロインのより具体的な例として、（５−ｉｉｉ）配列番号２４、配列番号２５若しくは配列番号２６で示されるアミノ酸配列、又は（５−ｉｖ）配列番号２４、配列番号２５若しくは配列番号２６で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
【０１１０】
配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１２で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。
【０１１１】
（５−ｉｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号２４、配列番号２５若しくは配列番号２６で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【０１１２】
（５−ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号２４、配列番号２５若しくは配列番号２６で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（５−ｉｖ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
【０１１３】
（５−ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号２４、配列番号２５若しくは配列番号２６で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域に含まれるアミノ酸残基の総数をｐとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれるアミノ酸残基の総数をｑとしたときに、ｐ／ｑが６．２％以上であることが好ましい。
【０１１４】
第５の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
【０１１５】
グルタミン残基の含有量が低減されたドメイン配列を有する改変フィブロイン（第６の改変フィブロイン）は、天然由来のクモ類フィブロインと比較して、グルタミン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有する。
【０１１６】
第６の改変フィブロインは、ＲＥＰのアミノ酸配列中に、ＧＧＸモチーフ及びＧＰＧＸＸモチーフから選ばれる少なくとも一つのモチーフが含まれていることが好ましい。
【０１１７】
第６の改変フィブロインが、ＲＥＰ中にＧＰＧＸＸモチーフを含む場合、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率は、通常１％以上であり、５％以上であってもよく、１０％以上であるのが好ましい。ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の上限に特に制限はなく、５０％以下であってよく、３０％以下であってもよい。
【０１１８】
本明細書において、「ＧＰＧＸＸモチーフ含有率」は、以下の方法により算出される値である。
式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むクモ類フィブロインにおいて、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、その領域に含まれるＧＰＧＸＸモチーフの個数の総数を３倍した数（即ち、ＧＰＧＸＸモチーフ中のＧ及びＰの総数に相当）をｓとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除き、更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｔとしたときに、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率はｓ／ｔとして算出される。
【０１１９】
ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出において、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としているのは、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列」（ＲＥＰに相当する配列）には、クモ類フィブロインに特徴的な配列と相関性の低い配列が含まれることがあり、ｍが小さい場合（つまり、ドメイン配列が短い場合）、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出結果に影響するので、この影響を排除するためである。なお、ＲＥＰのＣ末端に「ＧＰＧＸＸモチーフ」が位置する場合、「ＸＸ」が例えば「ＡＡ」の場合であっても、「ＧＰＧＸＸモチーフ」として扱う。
【０１２０】
図３は、クモ類フィブロインのドメイン配列を示す模式図である。図３を参照しながらＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出方法を具体的に説明する。まず、図３に示したクモ類フィブロインのドメイン配列（「［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフ」タイプである。）では、全てのＲＥＰが「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」（図３中、「領域Ａ」で示した配列。）に含まれているため、ｓを算出するためのＧＰＧＸＸモチーフの個数は７であり、ｓは７×３＝２１となる。同様に、全てのＲＥＰが「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」（図３中、「領域Ａ」で示した配列。）に含まれているため、当該配列から更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数ｔは５０＋４０＋１０＋２０＋３０＝１５０である。次に、ｓをｔで除すことによって、ｓ／ｔ（％）を算出することができ、図３のフィブロインの場合２１／１５０＝１４．０％となる。
【０１２１】
第６の改変フィブロインは、グルタミン残基含有率が９％以下であることが好ましく、７％以下であることがより好ましく、４％以下であることが更に好ましく、０％であることが特に好ましい。
【０１２２】
本明細書において、「グルタミン残基含有率」は、以下の方法により算出される値である。
式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むクモ類フィブロインにおいて、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列（図３の「領域Ａ」に相当する配列。）に含まれる全てのＲＥＰにおいて、その領域に含まれるグルタミン残基の総数をｕとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除き、更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｔとしたときに、グルタミン残基含有率はｕ／ｔとして算出される。グルタミン残基含有率の算出において、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としている理由は、上述した理由と同様である。
【０１２３】
第６の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のクモ類フィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、又は他のアミノ酸残基に置換したことに相当するアミノ酸配列を有するものであってよい。
【０１２４】
「他のアミノ酸残基」は、グルタミン残基以外のアミノ酸残基であればよいが、グルタミン残基よりも疎水性指標の大きいアミノ酸残基であることが好ましい。アミノ酸残基の疎水性指標は表１に示すとおりである。
【０１２５】
表１に示すとおり、グルタミン残基よりも疎水性指標の大きいアミノ酸残基としては、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、プロリン（Ｐ）及びヒスチジン（Ｈ）から選ばれるアミノ酸残基を挙げることができる。これらの中でも、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）及びアラニン（Ａ）から選ばれるアミノ酸残基であることがより好ましく、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）及びフェニルアラニン（Ｆ）から選ばれるアミノ酸残基であることが更に好ましい。
【０１２６】
第６の改変フィブロインは、ＲＥＰの疎水性度が、−０．８以上であることが好ましく、−０．７以上であることがより好ましく、０以上であることが更に好ましく、０．３以上であることが更により好ましく、０．４以上であることが特に好ましい。ＲＥＰの疎水性度の上限に特に制限はなく、１．０以下であってよく、０．７以下であってもよい。
【０１２７】
本明細書において、「ＲＥＰの疎水性度」は、以下の方法により算出される値である。
式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むクモ類フィブロインにおいて、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列（図３の「領域Ａ」に相当する配列。）に含まれる全てのＲＥＰにおいて、その領域の各アミノ酸残基の疎水性指標の総和をｖとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除き、更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｔとしたときに、ＲＥＰの疎水性度はｖ／ｔとして算出される。ＲＥＰの疎水性度の算出において、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としている理由は、上述した理由と同様である。
【０１２８】
第６の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のクモ類フィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、及び／又はＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変があってもよい。
【０１２９】
第６の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のクモ類フィブロインの遺伝子配列からＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失させること、及び／又はＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換することにより得ることができる。また、例えば、天然由来のクモ類フィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、及び／又はＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。
【０１３０】
第６の改変フィブロインのより具体的な例として、（６−ｉ）配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３若しくは配列番号４３で示されるアミノ酸配列を含む、改変フィブロイン、又は（６−ｉｉ）配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３若しくは配列番号４３で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
【０１３１】
（６−ｉ）の改変フィブロインについて説明する。
【０１３２】
配列番号７で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ−ＰＲＴ４１０）は、天然由来のフィブロインであるＮｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｐ４６８０４．１、ＧＩ：１１７４４１５）の塩基配列及びアミノ酸配列に基づき、（Ａ）ｎモチーフ中のアラニン残基が連続するアミノ酸配列をアラニン残基が連続する数を５つにする等の生産性を向上させるためのアミノ酸の改変を行ったものである。一方、Ｍｅｔ−ＰＲＴ４１０は、グルタミン残基（Ｑ）の改変は行っていないため、グルタミン残基含有率は、天然由来のフィブロインのグルタミン残基含有率と同程度である。
【０１３３】
配列番号２７で示されるアミノ酸配列（Ｍ＿ＰＲＴ８８８）は、Ｍｅｔ−ＰＲＴ４１０（配列番号７）中のＱＱを全てＶＬに置換したものである。
【０１３４】
配列番号２８で示されるアミノ酸配列（Ｍ＿ＰＲＴ９６５）は、Ｍｅｔ−ＰＲＴ４１０（配列番号７）中のＱＱを全てＴＳに置換し、かつ残りのＱをＡに置換したものである。
【０１３５】
配列番号２９で示されるアミノ酸配列（Ｍ＿ＰＲＴ８８９）は、Ｍｅｔ−ＰＲＴ４１０（配列番号７）中のＱＱを全てＶＬに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。
【０１３６】
配列番号３０で示されるアミノ酸配列（Ｍ＿ＰＲＴ９１６）は、Ｍｅｔ−ＰＲＴ４１０（配列番号７）中のＱＱを全てＶＩに置換し、かつ残りのＱをＬに置換したものである。
【０１３７】
配列番号３１で示されるアミノ酸配列（Ｍ＿ＰＲＴ９１８）は、Ｍｅｔ−ＰＲＴ４１０（配列番号７）中のＱＱを全てＶＦに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。
【０１３８】
配列番号３４で示されるアミノ酸配列（Ｍ＿ＰＲＴ５２５）は、Ｍｅｔ−ＰＲＴ４１０（配列番号７）に対し、アラニン残基が連続する領域（Ａ５）に２つのアラニン残基を挿入し、Ｍｅｔ−ＰＲＴ４１０の分子量とほぼ同じになるよう、Ｃ末端側のドメイン配列２つを欠失させ、かつグルタミン残基（Ｑ）１３箇所をセリン残基（Ｓ）又はプロリン残基（Ｐ）に置換したものである。
【０１３９】
配列番号３２で示されるアミノ酸配列（Ｍ＿ＰＲＴ６９９）は、Ｍ＿ＰＲＴ５２５（配列番号３４）中のＱＱを全てＶＬに置換したものである。
【０１４０】
配列番号３３で示されるアミノ酸配列（Ｍ＿ＰＲＴ６９８）は、Ｍ＿ＰＲＴ５２５（配列番号３４）中のＱＱを全てＶＬに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。
【０１４１】
配列番号４３で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ−ＰＲＴ９６６）は、配列番号９で示されるアミノ酸配列（Ｃ末端に配列番号４２で示されるアミノ酸配列が付加される前のアミノ酸配列）中のＱＱを全てＶＦに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。
【０１４２】
配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３及び配列番号４３で示されるアミノ酸配列は、いずれもグルタミン残基含有率は９％以下である（表２）。
【０１４３】
【表２】
2019151429.tif 000003
【０１４４】
（６−ｉ）の改変フィブロインは、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３又は配列番号４３で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【０１４５】
（６−ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３又は配列番号４３で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（６−ｉｉ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
【０１４６】
（６−ｉｉ）の改変フィブロインは、グルタミン残基含有率が９％以下であることが好ましい。また、（６−ｉｉ）の改変フィブロインは、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率が１０％以上であることが好ましい。
【０１４７】
第６の改変フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。これにより、改変フィブロインの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。
【０１４８】
タグ配列を含む第６の改変フィブロインのより具体的な例として、（６−ｉｉｉ）配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１若しくは配列番号４４で示されるアミノ酸配列を含む、改変フィブロイン、又は（６−ｉｖ）配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１若しくは配列番号４４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
【０１４９】
配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１及び配列番号４４で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３及び配列番号４３で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１２で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。Ｎ末端にタグ配列を付加しただけであるため、グルタミン残基含有率に変化はなく、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１及び配列番号４４で示されるアミノ酸配列は、いずれもグルタミン残基含有率が９％以下である（表３）。
【０１５０】
【表３】
2019151429.tif 000004
【０１５１】
（６−ｉｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１又は配列番号４４で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【０１５２】
（６−ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１又は配列番号４４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（６−ｉｖ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
【０１５３】
（６−ｉｖ）の改変フィブロインは、グルタミン残基含有率が９％以下であることが好ましい。また、（６−ｉｖ）の改変フィブロインは、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率が１０％以上であることが好ましい。
【０１５４】
第６の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
【０１５５】
改変フィブロインは、第１の改変フィブロイン、第２の改変フィブロイン、第３の改変フィブロイン、第４の改変フィブロイン、第５の改変フィブロイン、及び第６の改変フィブロインが有する特徴のうち、少なくとも２つ以上の特徴を併せ持つ改変フィブロインであってもよい。
【０１５６】
クモ糸タンパク質は、親水性クモ糸タンパク質であってもよく、疎水性クモ糸タンパク質であってもよい。疎水性クモ糸タンパク質とは、クモ糸タンパク質を構成する全てのアミノ酸残基の疎水性指標（ＨＩ）の総和を求め、次にその総和を全アミノ酸残基数で除した値（平均ＨＩ）が０以上であるクモ糸タンパク質である。疎水性指標は表１に示したとおりである。また、親水性クモ糸タンパク質とは、上記の平均ＨＩが０未満であるクモ糸タンパク質である。
【０１５７】
疎水性クモ糸タンパク質としては、例えば、上述した第６の改変フィブロインを挙げることができる。疎水性クモ糸タンパク質のより具体的な例としては、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３又は配列番号４３で示されるアミノ酸配列、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１又は配列番号４４で示されるアミノ酸配列を含むクモ糸タンパク質が挙げられる。
【０１５８】
親水性クモ糸タンパク質としては、例えば、上述した第１の改変フィブロイン、第２の改変フィブロイン、第３の改変フィブロイン、第４の改変フィブロイン、及び第５の改変フィブロインを挙げることができる。親水性クモ糸タンパク質のより具体的な例としては、配列番号４で示されるアミノ酸配列、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列、配列番号１３、配列番号１１、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列、配列番号１８、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列、配列番号１７、配列番号１１、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列、配列番号１９、配列番号２０又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列を含むクモ糸タンパク質が挙げられる。
【０１５９】
上述したクモ糸タンパク質は、１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【０１６０】
クモ糸タンパク質は、例えば、当該クモ糸タンパク質をコードする核酸配列と、当該核酸配列に作動可能に連結された１又は複数の調節配列とを有する発現ベクターで形質転換された宿主により、当該核酸を発現させることにより生産することができる。
【０１６１】
クモ糸タンパク質をコードする核酸の製造方法は、特に制限されない。例えば、天然のクモ糸タンパク質をコードする遺伝子を利用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等で増幅しクローニングする方法、又は、化学的に合成する方法によって、当該核酸を製造することができる。核酸の化学的な合成方法も特に制限されず、例えば、ＮＣＢＩのウェブデータベースなどより入手したクモ糸タンパク質のアミノ酸配列情報をもとに、ＡＫＴＡ  ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ  ｐｌｕｓ  １０／１００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）等で自動合成したオリゴヌクレオチドをＰＣＲ等で連結する方法によって遺伝子を化学的に合成することができる。この際に、クモ糸タンパク質の精製及び／又は確認を容易にするため、Ｎ末端に開始コドン及びＨｉｓ１０タグからなるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなるクモ糸タンパク質をコードする核酸を合成してもよい。
【０１６２】
調節配列は、宿主における組換えタンパク質の発現を制御する配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合配列、転写終結配列等）であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。プロモーターとして、宿主細胞中で機能し、目的とするクモ糸タンパク質を発現誘導可能な誘導性プロモーターを用いてもよい。誘導性プロモーターは、誘導物質（発現誘導剤）の存在、リプレッサー分子の非存在、又は温度、浸透圧若しくはｐＨ値の上昇若しくは低下等の物理的要因により、転写を制御できるプロモーターである。
【０１６３】
発現ベクターの種類は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、人工染色体ベクター等、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能、又は宿主の染色体中への組込みが可能で、クモ糸タンパク質をコードする核酸を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが好適に用いられる。
【０１６４】
宿主として、原核生物、並びに酵母、糸状真菌、昆虫細胞、動物細胞及び植物細胞等の真核生物のいずれも好適に用いることができる。
【０１６５】
細菌等の原核生物を宿主として用いる場合は、発現ベクターは、原核生物中で自立複製が可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、クモ糸タンパク質をコードする核酸、及び転写終結配列を含むベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【０１６６】
原核生物としては、エシェリヒア属、ブレビバチルス属、セラチア属、バチルス属、ミクロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属及びシュードモナス属等に属する微生物を挙げることができる。エシェリヒア属に属する微生物として、例えば、エシェリヒア・コリ等を挙げることができる。ブレビバチルス属に属する微生物として、例えば、ブレビバチルス・アグリ等を挙げることができる。セラチア属に属する微生物として、例えば、セラチア・リクエファシエンス等を挙げることができる。バチルス属に属する微生物として、例えば、バチルス・サチラス等を挙げることができる。ミクロバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム等を挙げることができる。ブレビバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ブレビバクテリウム・ディバリカタム等を挙げることができる。コリネバクテリウム属に属する微生物として、例えば、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス等を挙げることができる。シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物として、例えば、シュードモナス・プチダ等を挙げることができる。
【０１６７】
原核生物を宿主とする場合、クモ糸タンパク質をコードする核酸を導入するベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２（ベーリンガーマンハイム社製）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＥＴ２２ｂ、ｐＣｏｌｄ、ｐＵＢ１１０、ｐＮＣＯ２（特開２００２−２３８５６９号公報）等を挙げることができる。
【０１６８】
真核生物の宿主としては、例えば、酵母及び糸状真菌（カビ等）を挙げることができる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス属、ピキア属、シゾサッカロマイセス属等に属する酵母を挙げることができる。糸状真菌としては、例えば、アスペルギルス属、ペニシリウム属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属等に属する糸状真菌を挙げることができる。
【０１６９】
真核生物を宿主とする場合、クモ糸タンパク質をコードする核酸を導入するベクターとしては、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）等を挙げることができる。上記宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、コンピテント法等を挙げることができる。
【０１７０】
発現ベクターで形質転換された宿主による核酸の発現方法としては、直接発現のほか、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。
【０１７１】
クモ糸タンパク質は、例えば、形質転換された宿主を培養培地中で培養し、培養培地中にクモ糸タンパク質を生成蓄積させ、該培養培地から採取することにより製造することができる。形質転換された宿主を培養培地中で培養する方法は、宿主の培養に通常用いられる方法に従って行うことができる。
【０１７２】
宿主が、大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物である場合、培養培地として、該宿主が資化し得る炭素源、窒素源及び無機塩類等を含有し、該宿主の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【０１７３】
炭素源としては、該宿主が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、及びこれらを含有する糖蜜、デンプン及びデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸及びプロピオン酸等の有機酸、並びにエタノール及びプロパノール等のアルコール類を用いることができる。
【０１７４】
窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物を用いることができる。
【０１７５】
無機塩類としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅及び炭酸カルシウムを用いることができる。
【０１７６】
大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物の培養は、例えば、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことができる。培養温度は、例えば、１５〜４０℃である。培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中の培養培地のｐＨは３．０〜９．０に保持することが好ましい。培養培地のｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム及びアンモニア等を用いて行うことができる。
【０１７７】
また、培養中必要に応じて、アンピシリン及びテトラサイクリン等の抗生物質を培養培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【０１７８】
形質転換された宿主により生産されたクモ糸タンパク質は、タンパク質の単離精製に通常用いられている方法で単離及び精製することができる。例えば、クモ糸タンパク質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、宿主細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁した後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー及びダイノミル等により宿主細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、タンパク質の単離精製に通常用いられている方法、すなわち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の方法を単独又は組み合わせて使用し、精製標品を得ることができる。
【０１７９】
上記クロマトグラフィーとしては、フェニル−トヨパール（東ソー）、ＤＥＡＥ−トヨパール（東ソー）、セファデックスＧ−１５０（ファルマシアバイオテク）を用いたカラムクロマトグラフィーが好ましく用いられる。
【０１８０】
また、クモ糸タンパク質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に宿主細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分としてクモ糸タンパク質の不溶体を回収する。回収したクモ糸タンパク質の不溶体は蛋白質変性剤で可溶化することができる。該操作の後、上記と同様の単離精製法によりクモ糸タンパク質の精製標品を得ることができる。
【０１８１】
クモ糸タンパク質が細胞外に分泌された場合には、培養上清からクモ糸タンパク質を回収することができる。すなわち、培養物を遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
【０１８２】
クモ糸タンパク質の含有量は、紡糸原液全量に対して、１質量％以上、２質量％以上、４質量％以上、７質量％以上、１０質量％以上、又は１５質量％以上であってよく、４０質量％以下、３５質量％以下、３０質量％以下、又は２５質量％以下であってよい。
【０１８３】
＜溶媒＞
紡糸原液に使用する溶媒は、クモ糸タンパク質を溶解又は分散させることができるものであれば、特に制限なく使用することができる。
【０１８４】
溶媒としては、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）、へキサフルオロアセトン（ＨＦＡ）、ギ酸等の有機溶媒であってよい。また、溶媒は、水に後述する溶解促進剤を添加したものであってもよい。溶媒は、１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【０１８５】
溶媒としては、ジメチルスルホキシド、ギ酸、及びこれらに溶解促進剤を添加したものからなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。
【０１８６】
（溶解促進剤）
紡糸原液（ドープ液）は、溶解促進剤を更に含有するものであってよい。溶解促進剤を含むことにより、紡糸原液の調製が容易になる。
【０１８７】
溶解促進剤は、例えば、以下に示すルイス酸とルイス塩基とからなる無機塩であってよい。ルイス塩基としては、例えば、オキソ酸イオン（硝酸イオン、過塩素酸イオン等）、金属オキソ酸イオン（過マンガン酸イオン等）、ハロゲン化物イオン、チオシアン酸イオン、シアン酸イオン等が挙げられる。ルイス酸としては、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン等の金属イオン、アンモニウムイオン等の多原子イオン、錯イオン等が挙げられる。無機塩としては、例えば、塩化リチウム、臭化リチウム、ヨウ化リチウム、硝酸リチウム、過塩素酸リチウム、及びチオシアン酸リチウム等のリチウム塩、塩化カルシウム、臭化カルシウム、ヨウ化カルシウム、硝酸カルシウム、過塩素酸カルシウム、及びチオシアン酸カルシウム等のカルシウム塩、塩化鉄、臭化鉄、ヨウ化鉄、硝酸鉄、過塩素酸鉄、及びチオシアン酸鉄等の鉄塩、塩化アルミニウム、臭化アルミニウム、ヨウ化アルミニウム、硝酸アルミニウム、過塩素酸アルミニウム、及びチオシアン酸アルミニウム等のアルミニウム塩、塩化カリウム、臭化カリウム、ヨウ化カリウム、硝酸カリウム、過塩素酸カリウム、及びチオシアン酸カリウム等のカリウム塩、塩化ナトリウム、臭化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、硝酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、及びチオシアン酸ナトリウム等のナトリウム塩、塩化亜鉛、臭化亜鉛、ヨウ化亜鉛、硝酸亜鉛、過塩素酸亜鉛、及びチオシアン酸亜鉛等の亜鉛塩、塩化マグネシウム、臭化マグネシウム、ヨウ化マグネシウム、硝酸マグネシウム、過塩素酸マグネシウム、及びチオシアン酸マグネシウム等のマグネシウム塩、塩化バリウム、臭化バリウム、ヨウ化バリウム、硝酸バリウム、過塩素酸バリウム、及びチオシアン酸バリウム等のバリウム塩、並びに塩化ストロンチウム、臭化ストロンチウム、ヨウ化ストロンチウム、硝酸ストロンチウム、過塩素酸ストロンチウム、及びチオシアン酸ストロンチウム等のストロンチウム塩が挙げられる。これらの無機塩は、ギ酸に対するクモ糸タンパク質の溶解促進剤として用いられる。紡糸原液が溶解促進剤（上記の無機塩）を含有することにより、クモ糸タンパク質が紡糸原液中に高い濃度で溶解可能となる。これにより、タンパク質繊維の生産効率がより一層向上し、かつタンパク質繊維の高品質化と応力等の物性の向上等が期待される。無機塩は、塩化リチウム及び塩化カルシウムからなる群より選択される少なくとも１種であってよい。溶解促進剤は、１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【０１８８】
溶解促進剤の含有量は、紡糸原液全量に対して、０．１質量％以上、１質量％以上、４質量％以上、７質量％以上、１０質量％以上、又は１５質量％以上であってよく、２０質量％以下、１６質量％以下、１２質量％以下、又は９質量％以下であってよい。
【０１８９】
（各種添加剤）
紡糸原液は、必要に応じて、各種の添加剤を更に含有していてよい。添加剤としては、例えば、可塑剤、レベリング剤、架橋剤、結晶核剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、着色剤、フィラー、合成樹脂が挙げられる。添加剤の含有量は、紡糸原液中のタンパク質全量１００質量部に対して、５０質量部以下であってよい。
【０１９０】
紡糸原液は、クモ糸タンパク質を溶媒に溶解させて得られる。紡糸原液は、本発明による効果を損なわない範囲で、更にアルコールを含んでいてもよい。
【０１９１】
紡糸原液の粘度は、紡糸方法に応じて適宜設定すればよく、例えば、３５℃において１００〜１５，０００ｃＰ（センチポイズ）とすることができる。紡糸原液の粘度は、例えば京都電子工業社製の商品名“ＥＭＳ粘度計”を使用して測定することができる。
【０１９２】
＜凝固液＞
凝固液は、ケトンを含む。これにより、優れた光沢が実現できる。また、洗浄浴延伸の最大延伸倍率が向上して、洗浄浴槽内等で走行する糸が弛まずに安定し、以って、隣接して走行する糸に干渉することがなく、工程通過性を向上させることができ、また、応力の向上が期待できる。凝固液は、紡糸原液に含まれる溶媒、溶解促進剤及び水からなる群より選択される少なくとも１種を更に含有していてもよい。
【０１９３】
本明細書において、「ケトン」とは、式（１）：Ｒ１−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ２で表される化合物である。式（１）中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に炭素原子数１〜６の直鎖又は分岐のアルキル基を示す。Ｒ１及びＲ２は、互いに単結合を介して環を形成していてもよい。ケトンの具体例としては、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、ジイソブチルケトン、シクロヘキサノンが挙げられる。ケトンは、１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【０１９４】
凝固液に含まれるケトンは、水溶性ケトンであってよい。本明細書において、「水溶性ケトン」とは、水１００ｍＬ中に１５ｇ以上溶解する（２０℃）ケトンを意味する。
【０１９５】
水溶性ケトンとしては、例えば、アセトン及びメチルエチルケトンが挙げられる。水溶性ケトンとしては、製造コストをより低減できるため、安価なアセトンを使用するのが好ましい。また、凝固溶媒の蒸留回収がより容易になるため、沸点が低いアセトンを使用するのが好ましい。
【０１９６】
ケトンの含有量は、凝固液全量に対して、６０質量％以上であるのが好ましく、７０質量％以上であるのがより好ましく、８０質量％以上であるのが更に好ましく、９０質量％以上であるのが更により好ましく、９５質量％以上であるのが特に好ましい。特に、紡糸原液が親水性クモ糸タンパク質を含む場合、ケトンの含有量は、凝固液全量に対して、７０質量％以上であるのが好ましく、８０質量％以上であるのがより好ましく、９０質量％以上であるのが更に好ましく、９５質量％以上であるのが特に好ましい。凝固液は、ケトンのみからなるものであってもよい。
【０１９７】
凝固液が水を含む場合、水の含有量は、凝固液全量に対して、３０質量％以下であるのが好ましい。水の含有量は、凝固液全量に対して、２０質量％以下であってもよく、１０質量％以下であってもよい。
【０１９８】
凝固液がギ酸を含む場合、ギ酸の含有量は、ケトンとギ酸の合計含有量を１００質量％として、４０質量％以下であるのが好ましい。ギ酸の含有量は、ケトンとギ酸の合計含有量を１００質量％として、３０質量％以下であってもよく、２０質量％以下であってもよく、１０質量％以下であってもよい。ギ酸の含有量が、上述の範囲内である場合、製造されるタンパク質繊維の応力がより一層大きくなる。なお、本明細書における応力とは、タンパク質繊維が繊維軸方向の引張外力により破断するまでの最大荷重（Ｎ）を、タンパク質繊維の断面積（タンパク質繊維の直径から算出する）（ｍ２）（単位：ＭＰａ）を意味する。
【０１９９】
凝固液は、溶解促進剤を含んでいてよい。凝固液における溶解促進剤として、例えば、上述の無機塩を用いてもよい。また、凝固液は、溶解促進剤を含有する溶媒を用いることにより、溶解促進剤を含んでいてよい。凝固液は、無機塩を含んでいてよく、塩化リチウム及び塩化カルシウムからなる群より選択される少なくとも１種を含んでいてよい。凝固液における溶解促進剤は、１種単独で、又は２種以上を組み合わせて用いたものであってもよい。
【０２００】
＜紡糸工程＞
紡糸工程では、上述した紡糸原液を上述した凝固液に接触させ、クモ糸タンパク質を凝固させる。紡糸工程を含め、本実施形態のタンパク質繊維の製造方法は、例えば、図４に示す紡糸装置を使用して実施することができる。
【０２０１】
図４は、タンパク質繊維を製造するための紡糸装置の一例を概略的に示す説明図である。図４に示す紡糸装置１０は、乾湿式紡糸用の紡糸装置の一例であり、押出し装置１と、凝固浴槽２０と、洗浄浴槽（延伸浴槽）２１と、乾燥装置４とを上流側から順に有している。
【０２０２】
押出し装置１は貯槽７を有しており、ここに紡糸原液（ドープ液）６が貯留される。凝固浴槽２０に凝固液１１が貯留される。紡糸原液６は、貯槽７の下端部に取り付けられたギアポンプ８により、凝固液１１との間にエアギャップ１９を開けて設けられたノズル９から押し出される。押し出された紡糸原液６は、エアギャップ１９を経て、凝固浴槽２０の凝固液１１内に供給（導入）される。凝固液１１内で紡糸原液から溶媒が除去されてクモ糸タンパク質が凝固する。凝固したクモ糸タンパク質は、洗浄浴槽２１に導かれ、洗浄浴槽２１内の洗浄液１２により洗浄された後、洗浄浴槽２１内に設置された第一ニップローラ１３と第二ニップローラ１４により、乾燥装置４へと送られる。このとき、例えば、第二ニップローラ１４の回転速度を第一ニップローラ１３の回転速度よりも速く設定すると、回転速度比に応じた倍率で延伸されたタンパク質繊維３６が得られる。洗浄液１２中で延伸されたタンパク質繊維は、洗浄浴槽２１内を離脱してから、乾燥装置４内を通過する際に乾燥され、その後、ワインダーにて巻き取られる。このようにして、タンパク質繊維が、紡糸装置１０により、最終的にワインダーに巻き取られた巻回物５として得られる。なお、１８ａ〜１８ｇは糸ガイドである。
【０２０３】
凝固液１１の温度は、特に限定されないが、４０℃以下、３０℃以下、２５℃以下、２０℃以下、１０℃以下、又は５℃以下であってよい。作業性、冷却コスト等の観点から、０℃以上であることが好ましい。なお、凝固液１１の温度は、例えば、熱交換器を内部に備える凝固浴槽２０と、冷却循環装置と、を有する紡糸装置１０を用いることにより調整することができる。例えば、凝固浴槽内に設置した熱交換器に冷却循環装置で所定の温度まで冷却した媒体を流すことにより、凝固液１１と熱交換器間での熱交換により温度を上記範囲内に調整することができる。この場合、媒体として凝固液１１に用いる溶媒を循環することでより効率的な冷却が可能となる。
【０２０４】
凝固液が貯留される凝固浴槽は複数設けられていてもよい。
【０２０５】
凝固したクモ糸タンパク質は、凝固浴槽又は洗浄浴槽を離脱してから、そのままワインダーにて巻き取られてもよいし、乾燥装置を通過し、乾燥され、その後、ワインダーにて巻き取られてもよい。
【０２０６】
凝固したクモ糸タンパク質が凝固液中を通過する距離は、脱溶媒が効率的に行えればよく、ノズルからの紡糸原液の押出速度（吐出速度）等に応じて決定されるものであってよい。凝固したクモ糸タンパク質（又は紡糸原液）の凝固液中での滞留時間は、凝固したクモ糸タンパク質が凝固液中を通過する距離、ノズルからの紡糸原液の押出速度等に応じて決定されるものであってよい。
【０２０７】
＜延伸工程＞
本実施形態のタンパク質繊維の製造方法は、凝固させたクモ糸タンパク質を延伸する工程（延伸工程）を更に含むものであってよい。延伸工程は、例えば、凝固浴槽２０内で実施してもよく、洗浄浴槽２１内で実施してもよい。延伸工程はまた、空気中で実施することもできる。
【０２０８】
洗浄浴槽２１内で実施される延伸は、温水中、温水に有機溶剤等を加えた溶液中等で行う、いわゆる湿熱延伸であってもよい。湿熱延伸の温度は５０〜９０℃であることが好ましい。該温度が５０℃以上であると、糸の細孔径を安定的に小さくすることができる。また、温度が９０℃以下であると、温度設定が容易であり紡糸安定性が向上する。温度は７５〜８５℃がより好ましい。
【０２０９】
延伸工程における凝固させたクモ糸タンパク質の延伸倍率が高いほど、槽内で走行する糸が弛まずに安定することから、隣接して走行する糸に干渉することなく工程通過性が向上する。なお、本実施形態のタンパク質繊維の製造方法では、最大延伸倍率を向上することができ、延伸倍率を制御する範囲が広げられるため、タンパク質繊維の繊維径を制御することができる。
【０２１０】
最終的な延伸倍率は、その下限値が、未延伸糸（又は前延伸糸）に対して、好ましくは、１倍超、２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上のうちのいずれかであり、上限値が、好ましくは４０倍以下、３０倍以下、２０倍以下、１５倍以下、１４倍以下、１３倍以下、１２倍以下、１１倍以下、１０倍以下である。
【実施例】
【０２１１】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【０２１２】
〔（１）クモ糸タンパク質をコードする核酸の合成、及び発現ベクターの構築〕
ネフィラ・クラビぺス（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ）由来のフィブロイン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｐ４６８０４．１、ＧＩ：１１７４４１５）の塩基配列及びアミノ酸配列に基づき、配列番号１５及び配列番号４４で示されるアミノ酸配列を有するクモ糸タンパク質（以下、それぞれ「ＰＲＴ７９９」及び「ＰＲＴ９６６」ともいう。）を設計した。【０２１３】
配列番号９で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ−ＰＲＴ７９９）は、ネフィラ・クラビペス由来のフィブロインのアミノ酸配列に対して、生産性の向上を目的としてアミノ酸残基の置換、挿入及び欠失を施し、Ｃ末端に配列番号４２で示されるアミノ酸配列（ヒンジ配列とＨｉｓタグ）を付加したアミノ酸配列である。配列番号４３で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ−ＰＲＴ９６６）は、疎水度の向上を目的として、配列番号９で示されるアミノ酸配列（Ｃ末端に配列番号４２で示されるアミノ酸配列が付加される前のアミノ酸配列）中のＱＱを全てＶＦに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。配列番号１５で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ７９９）は、配列番号９で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１２で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含むアミノ酸配列）を付加したものである。配列番号４４で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ９６６）は、配列番号４３で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１２で示されるアミノ酸配列を付加したものである。【０２１４】
設計した配列番号１５及び配列番号４４で示されるアミノ酸配列を有するクモ糸タンパク質をコードする核酸を合成した。当該核酸には、５’末端にＮｄｅＩサイト、終止コドン下流にＥｃｏＲＩサイトを付加した。これら２種類の核酸をクローニングベクター（ｐＵＣ１１８）にクローニングした。その後、同核酸をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理して切り出した後、タンパク質発現ベクターｐＥＴ−２２ｂ（＋）に組換えて発現ベクターを得た。【０２１５】
〔（２）クモ糸タンパク質の発現〕
（１）で得られた発現ベクターで、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）を形質転換した。当該形質転換大腸菌を、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養した。当該培養液をアンピシリンを含む１００ｍＬのシード培養用培地（表４）にＯＤ６００が０．００５となるように添加した。培養液温度を３０℃に保ち、ＯＤ６００が５になるまでフラスコ培養を行い（約１５時間）、シード培養液を得た。【０２１６】
【表４】
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【０２１７】
当該シード培養液を５００ｍＬの生産培地（表５）を添加したジャーファーメンターにＯＤ６００が０．０５となるように添加して形質転換大腸菌を植菌した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにした。【０２１８】
【表５】
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【０２１９】
生産培地中のグルコースが完全に消費された直後に、フィード液（グルコース４５５ｇ／１Ｌ、Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  １２０ｇ／１Ｌ）を１ｍＬ／分の速度で添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにし、２０時間培養を行った。その後、１Ｍのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培養液に対して終濃度１ｍＭになるよう添加し、目的のクモ糸タンパク質を発現誘導させた。ＩＰＴＧ添加後２０時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製した菌体を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＩＰＴＧ添加に依存した目的とするクモ糸タンパク質サイズのバンドの出現により、目的とするクモ糸タンパク質の発現を確認した。【０２２０】
〔（３）クモ糸タンパク質の精製〕
ＩＰＴＧを添加してから２時間後に回収した菌体を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の菌体を約１ｍＭのＰＭＳＦを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁させ、高圧ホモジナイザー（ＧＥＡ  Ｎｉｒｏ  Ｓｏａｖｉ社）で細胞を破砕した。破砕した細胞を遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、高純度になるまで２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の沈殿物を１００ｍｇ／ｍＬの濃度になるように８Ｍ  グアニジン緩衝液（８Ｍ  グアニジン塩酸塩、１０ｍＭ  リン酸二水素ナトリウム、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０）で懸濁し、６０℃で３０分間、スターラーで撹拌し、溶解させた。溶解後、透析チューブ（三光純薬株式会社製のセルロースチューブ３６／３２）を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質を遠心分離により回収し、凍結乾燥機で水分を除き、凍結乾燥粉末を回収した。【０２２１】
〔（４）紡糸液（ドープ液）の調製〕
（３）で得られたクモ糸タンパク質（ＰＲＴ７９９）の凍結乾燥粉末を、濃度２６質量％となるように、ギ酸（株式会社朝日化学社製）に添加した後、４０℃で１時間溶解させた。その後、ゴミと泡を取り除き、ドープ液１とした。【０２２２】
同様に、（３）で得られたクモ糸タンパク質（ＰＲＴ９６６）の凍結乾燥粉末を、濃度２６質量％となるように、ギ酸（株式会社朝日化学社製）に添加した後、７０℃で１時間溶解させた。その後、ゴミと泡を取り除き、ドープ液２とした。【０２２３】
〔（５）繊維形成能の評価〕
（４）で得られたドープ液１又はドープ液２を１０ｍＬのシリンジに充填し、卓上紡糸装置を使用して、ノズル径０．２μｍのノズルから凝固液中に吐出して紡糸し、繊維形成能を目視で判定した。押出速度は０．０７５ｍＬ／分であった。凝固した原糸は、線速度２．３９ｍ／分で巻き取った。使用した凝固液の種類は、表６に示すとおりである。【０２２４】
【表６】
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【０２２５】
繊維形成能の評価結果を表６に併せて示した。繊維形成能の評価基準は以下に示すとおりである。
◎（ＶＧ）：繊維が形成される。得られた繊維は可撓性があり、かつ均質である。
○（Ｇ）：繊維が形成される。得られた繊維は可撓性がある。
△（Ｓ）：繊維が形成される。
×（Ｐ）：繊維が形成されない。【０２２６】
凝固液をケトン（アセトン）とすることで、ＰＲＴ９６６（疎水性タンパク質）及びＰＲＴ７９９（親水性タンパク質）のいずれの場合も、極めて良好な繊維形成能を示した（試験例３及び試験例１１）。また、アセトンに水又はギ酸を混合した凝固液でも良好な繊維形成能を示した（試験例４〜試験例９、試験例１２及び試験例１３）。【０２２７】
〔（６）応力の評価〕
ドープ液２を用いて、（５）と同様の条件で、タンパク質繊維を紡糸した。また、巻き取り速度（線速度）を変更することで、延伸倍率の異なるタンパク質繊維を紡糸した。紡糸したタンパク質繊維のモノフィラメントをロの字型（Ｈｏｌｌｏｗ  ｓｑｕａｒｅ）の台紙に１本づつ貼り付け、側面から顕微鏡で繊維の直径を測定した。次いで、台紙ごと引張試験機（引張試験機３３４２，インストロン社製）にセットし、台紙の側部を切除してから測定を開始した。測定条件は、引張速度１０ｃｍ／分、ロードセル容量１０Ｎ、つかみ冶具間距離２０ｍｍとした。【０２２８】
測定した試験力と、繊維の直径から算出した面積とから、応力を算出した。なお、応力は、試験例３−１を１００％とした相対値で算出した。結果を併せて表７に示す。【０２２９】
【表７】
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【０２３０】
アセトンにギ酸を混合した凝固液を用いた場合、得られたタンパク質繊維の応力が向上する傾向があった。【０２３１】
〔（７）ＢＤ最大延伸倍率の評価〕
ドープ液１又はドープ液２を１０ｍＬのシリンジに充填し、卓上紡糸装置を使用して、ノズル径０．２μｍのノズルから凝固液中に吐出した。押出速度は０．０７５ｍＬ／分であった。凝固した原糸は、ワインダーで巻き取った。使用した凝固液の種類は、表８に示すとおりである。ワインダーの回転速度を上昇させていき、繊維が破断した時の回転速度を読み取り、ＢＤ最大延伸倍率とした。なお、ＢＤ（Ｂａｔｈ  Ｄｒａｆｔ）とは、ノズルから紡出した原液の吐出線速度に対する第一凝固浴槽内の１番目のローラーの回転速度の比であり、ＢＤ最大延伸倍率とは、ノズル〜１番目のローラー間で引き取り可能な最大延伸倍率である。結果を表８に示す。表８中、「比率」は、試験例４−１〜４−３については、試験例４−２（凝固液：メタノール）のＢＤ最大延伸倍率を１としたときのＢＤ最大延伸倍率の相対値であり、試験例４−４〜４−５については、試験例４−４（凝固液：メタノール）のＢＤ最大延伸倍率を１としたときのＢＤ最大延伸倍率の相対値である。【０２３２】
【表８】
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【０２３３】
凝固液としてアセトンを用いた場合、ＢＤ最大延伸倍率が最も高くなった（試験例４−３及び試験例４−５）。【０２３４】
〔（８）製造例１〕
（３）で得られたクモ糸タンパク質（ＰＲＴ７９９）の凍結乾燥粉末を、濃度２８質量％となるように、ギ酸（株式会社朝日化学社製）に添加した後、撹拌しながら４０℃で１時間溶解させた。その後、ゴミと泡を取り除き、紡糸原液（ドープ液Ａ）とした。ドープ液Ａの粘度は、１５，０００〜２０，０００ｃＰであった。【０２３５】
同様に、（３）で得られたクモ糸タンパク質（ＰＲＴ９６６）の凍結乾燥粉末を、濃度２４質量％となるように、ギ酸（株式会社朝日化学社製）に添加した後、撹拌しながら７０℃で１時間溶解させた。その後、ゴミと泡を取り除き、紡糸原液（ドープ液Ｂ）とした。ドープ液Ｂの粘度は、１０，０００〜１５，０００ｃＰであった。【０２３６】
上記条件で得られた紡糸原液を用いて、図４に示す紡糸装置に準じた紡糸装置を用いた乾湿式紡糸によって、紡糸及び延伸されたタンパク質繊維を製造した。用いた紡糸装置は、図４に示す紡糸装置において、第１凝固浴槽及び湿熱延伸装置（洗浄浴槽）の間に、第２凝固浴槽及び第３凝固浴槽を備えるものである。凝固液として、メタノール又はアセトンを用いた。また、洗浄浴槽の洗浄液には、水を用いた。その他の条件は下記のとおりである。
吐出部のノズル径：０．１ｍｍ
吐出量：３ｃｃ／分【０２３７】
最大延伸倍率は、図４に示した紡糸装置で評価した。評価した箇所は、洗浄浴延伸である。評価方法としては１倍ずつ延伸倍率を上昇させていき、断糸した際の延伸倍率を最大延伸倍率とした。結果を表９に示す。【０２３８】
【表９】
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【０２３９】
凝固液としてアセトンを使用した場合、メタノールを使用した場合と比べて、洗浄浴中の最大延伸倍率が上がった。このことから、アセトン使用により形成される繊維の応力が向上することが期待される。【０２４０】
図５に、製造例１で製造したタンパク質繊維の外観写真を示す。凝固液としてアセトンを使用した場合は、メタノールを使用した場合と比べて、より光沢のあるタンパク質繊維が得られた。【０２４１】
〔（９）製造例２〕
製造例１で調製した紡糸原液（ドープ液Ｂ）を使用し、製造例１と同様の方法でタンパク質繊維を製造した。得られたタンパク質繊維の光沢を目視で判定した。光沢の評価基準は以下に示すとおりである。
◎（ＶＳ）：非常に強い。
○（Ｓ）：強い。
△（Ｗ）：弱い。
×（Ｎ）：光沢なし。【０２４２】
評価結果を表１０及び図６に示す。なお、表１０には、製造例１で製造したタンパク質繊維（クモ糸タンパク質：ＰＲＴ９６６，ドープ溶媒：メタノール）の光沢を評価した結果を併せて示す。【０２４３】
【表１０】
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【０２４４】
図６は、製造例２で製造したタンパク質繊維の外観写真である。左から順に製造例２−１〜２−４のタンパク質繊維が並んでいる。アセトンにギ酸を添加した凝固液を使用した場合であっても、１００％アセトンを凝固液として使用した場合と同様に、メタノールを凝固液として使用した場合に比して、強い光沢があった。
【符号の説明】
【０２４５】
１…押出し装置、２…未延伸糸製造装置、３…湿熱延伸装置、４…乾燥装置、６…紡糸原液、１０…紡糸装置、２０…凝固浴槽、２１…洗浄浴槽、３６…タンパク質繊維。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2019151429.tif 000019
2019151429.tif 000020