(57)【要約】  目的分子を含む導入液と標的細胞とを接触させて、前記標的細胞に前記目的分子を導入する導入工程を含み、前記導入工程では、前記目的分子はエンドサイトーシスを介して前記標的細胞に導入され、前記目的分子の導入により形質が付与、欠失または維持された後に、外部から加えられたベクター等の目的分子が樹立された細胞に残存しない形質転換細胞を製造する方法を提供する。
2019244895.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的分子を含む導入液と標的細胞とを接触させて、前記標的細胞に前記目的分子を導入する導入工程を含み、
前記目的分子の導入により形質が付与、欠失または維持された形質転換細胞を製造する、形質転換細胞の製造方法。
【請求項２】
前記目的分子は、核酸およびタンパク質からなる群より選ばれる少なくとも１つである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記核酸はベクターである、請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記ベクターは、細胞に形質を付与、欠失または維持させるタンパク質を発現する、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
前記形質転換細胞の８０％以上の細胞において、前記核酸が染色体に挿入されない、請求項２〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記導入工程では、前記目的分子はエンドサイトーシスを介して前記標的細胞に導入される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記導入工程では、前記標的細胞への沿面放電またはプラズマ照射によって、前記目的分子を導入する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項８】
前記導入工程後に前記標的細胞を培養する後培養工程を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項９】
前記後培養工程では、前記標的細胞の培地は細胞を死滅させることができる選択分子を含む、請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記目的分子は、選択分子に対して耐性となる選択マーカー分子を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、形質転換細胞の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内に核酸やタンパク質などの目的分子を導入する手法としては、ウイルスを用いた生物学的手法、エレクトロポレーションやマイクロインジェクションなどの物理学的手法、リポフェクションなどの化学的手法、プラズマを用いた方法（特許文献１：特開２０１３−２５５４７５号公報）などが知られている。近年、再生医療や遺伝子治療などの先端医療のために細胞や組織に目的分子を導入して、新たな形質を獲得した細胞を樹立し、それらの細胞を用いた治療などが行われようとしている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１３−２５５４７５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、エレクトロポレーションを用いて目的分子を導入した場合、細胞膜に細孔を開けることから高い細胞障害性を有し、また、障害を受けた染色体は、修復過程で目的分子を取り込みやすいことが知られている。細胞内に残存した目的分子は細胞自身が保持する形質を損ねたり、免疫異常や細胞の癌化を引き起こすといった問題が生じるため、再生医療や遺伝子治療などの先端医療の実用化の妨げとなっている。一般に目的分子の導入方法として用いられているウイルスを用いた導入方法の場合でも、導入できる細胞種に制限があり、導入された核酸や、遺伝子を導入するために用いたウイルスベクターが染色体に組み込まれることがある。【０００５】
そのため、新たな形質が付与された細胞、例えばｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ（ｉＰＳ細胞）等を用いた再生医療や細胞医療のような先端医療を、実用化できる医療技術として確立するために、外来遺伝子が残存しない導入方法を用いたｉＰＳ細胞や分化細胞等の形質転換細胞の簡便な製造方法の確立が望まれている。【０００６】
そこで本発明は、外部から導入された目的分子を残存させない形質転換細胞の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
［１］目的分子を含む導入液と標的細胞とを接触させて、前記標的細胞に前記目的分子を導入する導入工程を含み、
前記目的分子の導入により形質が付与、欠失または維持された形質転換細胞を製造する、形質転換細胞の製造方法。
［２］目的分子は、核酸およびタンパク質からなる群より選ばれる少なくとも１つである、［１］に記載の製造方法。
［３］核酸はベクターである、［２］に記載の製造方法。
［４］ベクターは、細胞に形質を付与、欠失または維持させるタンパク質を発現する、［３］に記載の製造方法。
［５］形質転換細胞の８０％以上の細胞において、核酸が染色体に挿入されない、［２］〜［４］のいずれかに記載の製造方法。
［６］導入工程では、目的分子はエンドサイトーシスを介して標的細胞に導入される、［１］〜［５］のいずれかに記載の製造方法。
［７］導入工程では、標的細胞への沿面放電またはプラズマ照射によって、目的分子を導入する、［１］〜［６］のいずれかに記載の製造方法。
［８］導入工程後に標的細胞を培養する後培養工程を含む、［１］〜［７］のいずれかに記載の製造方法。
［９］後培養工程では、標的細胞の培地は細胞を死滅させることができる選択分子を含む、［８］に記載の製造方法。
［１０］目的分子は、選択分子に対して耐性となる選択マーカー分子を含む、［１］〜［９］のいずれかに記載の製造方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、外部から導入された目的分子を残存させない形質転換細胞の製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】目的分子の導入に用いた装置の一例を説明する概略図である。
【図２】実施例１の目的分子の導入に用いた装置の一部を説明する概略側面図および上面図である。
【図３】試験例１における標的細胞への目的分子の導入方法を説明するフロー図である。
【図４】試験例１において、沿面放電によってｐＣＸＬＥ−ＥＧＦＰおよびｐｍＣｈｅｒｒｙ−Ｃ１のプラスミドを共トランスフェクションしたＨＤＦ細胞の（Ａ）ＧＦＰおよび（Ｂ）ｍＣｈｅｒｒｙの発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図５】（Ａ）目的分子の導入前のＨＤＦ細胞および（Ｂ）導入後のｉＰＳ細胞の明視野顕微鏡写真である。
【図６】エピゾーマルベクターのコピー数をｑＰＣＲにより測定したグラフである。ゲノムＤＮＡ量を１とした相対量を示す。
【図７】試験例３を説明する概略図である。
【図８】試験例３において、ｐｍＣｈｅｒｒｙ−Ｃ１プラスミドをエレクトロポレーションにより導入したＬ−９２９細胞の（Ａ）ｍＣｈｅｒｒｙの発現を示す蛍光顕微鏡写真、（Ｂ）明視野顕微鏡写真である。
【図９】Ｌ−９２９−ｍＣｈｅｒｒｙ細胞の（Ａ）ｍＣｈｅｒｒｙの発現を示す蛍光顕微鏡写真、（Ｂ）明視野顕微鏡写真である。
【図１０】プラズマ照射によってｐｓｇＲＮＡ１−２プラスミドを導入したＬ−９２９−ｍＣｈｅｒｒｙ細胞の（Ａ）ｍＣｈｅｒｒｙの発現を示す蛍光顕微鏡写真、（Ｂ）明視野顕微鏡写真、（Ｃ）ＧＦＰの発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図１１】プラズマ照射によってｐｓｇＲＮＡ１−２プラスミドを導入したＬ−９２９−ｍＣｈｅｒｒｙ細胞を長期培養した後の（Ａ）ＧＦＰの発現を示す蛍光顕微鏡写真、（Ｂ）ｍＣｈｅｒｒｙの発現を示す蛍光顕微鏡写真、（Ｃ）明視野顕微鏡写真、（Ｄ）これらの合成写真である。図中に丸で示した部分に、緑色蛍光を示すが、赤色蛍光を示さない細胞が存在する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明の実施形態について、図面を参照して説明する。
本発明の製造方法は、目的分子を含む導入液と標的細胞とを接触させて、標的細胞に目的分子を導入する導入工程を含み、目的分子の導入により形質が付与、欠失または維持された形質転換細胞を製造する。
【００１１】
本発明において、形質転換細胞とは、目的分子の導入により形質が付与、欠失または維持される細胞をいい、例えば遺伝子発現が変化した細胞、形態が変化した細胞、酵素活性が変化した細胞、分子の局在が変化した細胞等が挙げられる。形質転換細胞は、標的細胞のゲノムに変異を伴ってもよいし、伴わなくてもよい。ＤＮＡのメチル化、ヒストンのメチル化およびアセチル化等のエピジェネティックな変異を伴ってもよい。新たな形質が付与された形質転換細胞には、例えば特定の１または２以上の遺伝子を発現するようになった細胞、幹細胞（多能性幹細胞を含む）、前駆細胞、脱分化細胞、分化誘導された細胞などが含まれる。形質が欠失された細胞には、例えば特定の１または２以上の遺伝子の発現が抑制された細胞、遺伝子変異をもつ細胞から変異遺伝子を欠失した細胞などが含まれる。また、形質転換細胞としては、そのままでは形質が変化してしまう細胞を目的分子により形質を維持させた細胞、形質を欠失後に形質を付与された細胞等も含まれ、例えば遺伝病の患者の幹細胞から原因遺伝子を欠失させ、正常遺伝子を導入した細胞も含まれる。形質転換細胞であるかは、顕微鏡による形態観察、ＲＮＡまたはタンパク質の発現量を定量する方法、免疫染色などの当業者に公知の方法によって判断することができる。
【００１２】
形質転換細胞において、目的分子が残存しないとは、目的分子の導入から一定期間培養した後に、公知の方法により測定された目的分子の量が検出限界以下または一定の検出値以下であることをいう。標的細胞内の目的分子の濃度や安定度によるが、例えば導入から１週間、好ましくは２週間以上培養した後に、細胞のクローニングを行い、目的分子の残存確認を行うとよい。核酸を目的分子として用いた場合、目的分子が残存しないとは、例えば形質転換細胞の染色体に導入した核酸が挿入されていないことをいう。目的分子が形質転換細胞の染色体に挿入されていないとは、例えば製造された形質転換細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、目的分子の核酸配列を標的とするｑＰＣＲを行って、ゲノムＤＮＡのコピー数を１としたときの目的分子の相対量が０．１以下である場合をいう。得られた形質転換細胞のうち、染色体に核酸が挿入されていない細胞の割合は、好ましくは８０％以上であり、より好ましくは９０％以上であり、最も好ましくは１００％である。
【００１３】
（標的細胞）
本発明の製造方法において用いる標的細胞とは、目的分子を導入する標的となる細胞のことを示し、特定の種類の細胞に限定されるものではない。このような標的細胞の具体例としては、ヒトを含む動物細胞が挙げられる。動物細胞としては、例えば組織を作る細胞（線維芽細胞、表皮細胞、乳腺細胞、脂肪細胞、筋芽細胞、骨芽細胞、肝細胞、心筋細胞、血管内皮細胞またはそれらの前駆細胞等）、免疫系の細胞（Ｂ細胞、Ｔ細胞、単球系の細胞等）、神経細胞、幹細胞（多能性幹細胞、血球系幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞を含む）、腫瘍細胞等が挙げられる。細胞は接着細胞であってもよく、浮遊細胞であってもよい。標的細胞は、例えばＡＴＣＣ、ＪＣＲＢ、ＲＩＫＥＮ  ＢＲＣなどの保存機関または市販のメーカーから購入することによって得ることができる。標的細胞は、単一の種類を用いてもよいし、２種以上を混合して用いて、複数の標的細胞に同時に目的分子の導入を行うこともできる。
【００１４】
標的細胞には、生物の個体または組織から採取された細胞、および生物の個体または組織内の細胞が含まれる。生物の個体または組織から採取された細胞には、医薬品の研究開発などに用いられる生物の個体に戻すことを前提としない細胞と、再生医療などに用いられる生物の個体に戻すことを前提とする細胞とが含まれる。生物の個体または組織から採取された細胞には、生物の個体または組織から採取された細胞から培養された細胞も含まれる。
【００１５】
本発明に用いる標的細胞には、大腸菌、放線菌、枯草菌などの原核細胞、酵母などの微生物細胞、昆虫細胞、マウス、ウサギ、ラット、ヤギ、イヌ、サルなどの哺乳類細胞、植物細胞などの真核細胞が含まれる。
【００１６】
また、本発明に用いる標的細胞は、特に処理を施されていないものであってもよいが、目的分子の導入効率を向上するためには、遺伝子導入の際に一般的に用いられる、コンピテントセルとしての処理を施されたものであってもよい。具体例としては、塩化カルシウムで処理され、細胞膜の構造が変化してＤＮＡ分子を透過しやすくなった大腸菌のコンピテントセルなどが挙げられる。
【００１７】
本発明において、標的細胞は、目的分子を導入する標的となる標的組織も含む。本発明における組織とは、何種類かの異なった性質や機能を有する細胞が一定の様式で集合した構造の単位である。標的組織としては、特定の種類の組織に限定されるものではない。このような標的組織の具体例としては、生体から回収した組織、生体内の組織、移植に用いられるドナーからの臓器、培養により再構成された組織、カルス培養で構築された植物の分化前の組織などが挙げられる。標的組織としては、例えば胎生組織、胚組織、皮膚組織、骨組織、軟骨組織、筋肉組織、脂肪組織、心筋組織、神経系組織、肺組織、膵臓組織、肝臓組織、毛乳頭組織、歯髄、腫瘍組織などの組織が例示できる。これらの標的組織は、単一の種類を用いてもよいし、２種以上を混合して用いてもよい。標的細胞として組織を用いた場合、目的分子の導入により、形質が付与または欠損された組織が製造される。
【００１８】
（目的分子）
本発明において目的分子とは、標的細胞に導入する対象となる分子のことを示し、特に特定の種類の分子に限定されるものではないが、好ましくは（ａ）核酸および（ｂ）タンパク質からなる群より選ばれる少なくとも１つである。
【００１９】
（ａ）核酸
核酸の具体例としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、その他の核酸分子またはそれらの誘導体が挙げられる。ＤＮＡまたはＲＮＡは、一本鎖または二本鎖であってもよく、また線状または環状であってもよい。核酸の分子量は特に限定されない。ＲＮＡには、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボザイム、ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ｓｍａｌｌ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、その他のｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡなどが含まれる。核酸としては、これらのＲＮＡとして転写される核酸（ＤＮＡ）を含んでいてもよい。また、核酸は、下記のタンパク質をコードする核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含んでいてもよい。これらの核酸は、１つまたは２つ以上を組み合わせて導入してもよい。
【００２０】
核酸は、好ましくはベクターである。ベクターとは、核酸を増幅、維持、導入させるための核酸分子の媒体である。本発明において、ベクターは好ましくは発現ベクターであり、目的のＲＮＡまたはタンパク質を発現する核酸配列が挿入されている。発現ベクターとしては、例えばプラスミドベクター、コスミドベクター、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）および他の非プラスミドベクターを使用できる。発現ベクターはＲＮＡまたはタンパク質を効率的に発現するための構造（配列）を有する。このような配列としては、例えばプロモーター配列、コザック配列、シャイン・ダルガノ配列、イントロン、スペーサー配列、エンハンサー配列、ターミネーター配列、内部リボソーム導入部位（ＩＲＥＳ）などが含まれる。
【００２１】
（ｂ）タンパク質
タンパク質としては、ペプチド、ポリペプチドおよびその誘導体などのアミノ酸が重合した高分子化合物が挙げられる。タンパク質は、特に限定されないが公知の多様なタンパク質を含み、シグナル伝達物質、遺伝子発現制御因子（転写、翻訳、輸送を含む）、ＤＮＡメチル化調節因子、ヒストン修飾調節因子、ゲノム編集に用いられる因子、構造タンパク質、成長因子、ホルモン、酵素、リガンド、受容体、抗体または抗体のＦａｂ部分、経口投与ができないタンパク質医薬品などが含まれる。
【００２２】
目的分子として導入されたタンパク質、または、導入された核酸またはベクターから発現したタンパク質は、好ましくは細胞に形質を付与、欠失または維持させるタンパク質であり、より好ましくは一過的な発現によって、細胞に恒常的な形質を付与、欠失または維持させるタンパク質である。このようなタンパク質としては、転写調節因子（例えばＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｌ−Ｍｙｃ、ＯＣＴ３／４等）、翻訳調節因子（例えばＬｉｎ２８等）、ＤＮＡメチル化調節因子（例えばＴＥＴ１等）、ゲノム編集に用いられる因子（例えばＣａｓ９等）、増殖因子（例えばＡｃｔｉｖｉｎ、ＢＭＰ４等）が挙げられる。これらのタンパク質は１つまたは２つ以上を組み合わせて導入してもよい。
【００２３】
他の目的分子としては、糖、脂質、低分子生理活性物質、薬剤候補品などが挙げられ、これらの中でも医薬品などの生理活性な低分子化合物（例えば分子量が１００ｋＤａ以下）であって、他の導入方法では組織内あるいは細胞内に導入されづらい低分子化合物が好ましい。他の導入方法では組織内あるいは細胞内に導入されづらい低分子化合物とは、分子量が１０００Ｄａ以上の低分子、膜透過性の低い分子などである。上述の各種目的分子は、単一の種類を用いてもよいし、２種以上を混合して用いてもよい。
【００２４】
目的分子として、ゲノム編集システムを用いてもよい。ゲノム編集システムとは、配列特異的に遺伝情報を変換するシステムであり、塩基配列の欠失、アミノ酸配列の置換、外来遺伝子の導入等が可能である。ゲノム編集システムとしては、例えば配列特異的なＤＮＡ切断が可能なジンクフィンガーヌクレアーゼ（Ｚｉｎｃ−Ｆｉｎｇｅｒ、ＺＦＮ）、ターレン（ＴＡＬＥＮ）、クリスパー・キャスナイン（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）、クリスパー・シーピーエフ１（ＣＲＩＳＰＥＲ／Ｃｐｆ１）、メガヌクレアーゼ（Ｍｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅ）、ＣＡＳ９ニッカーゼ及びＴａｒｇｅｔ−ＡＩＤ等が挙げられる。
【００２５】
一般的に、ゲノム編集システムを細胞内に導入する方法としては、ウイルスに必要な遺伝子をコードしたゲノム編集システムをウイルスの感染力により細胞に導入させる、またはプラスミドに必要な遺伝子をコードしたゲノム編集システムをエレクトロポレーション法により細胞に導入させる、等の方法が用いられている。
【００２６】
ウイルスを用いて導入する方法では、遺伝子の導入効率は良いが、（１）実験操作ができる施設が限定される、（２）ウイルスゲノムが細胞内に導入される、（３）レトロウイルス等を用いた場合にはウイルスゲノムをはじめ導入された遺伝子等が染色体にインテグレーションされる、（４）用いるウイルスによって感染できる細胞が限定される等の問題がある。エレクトロポレーション法によって導入する方法では、（１）実施には１×１０６細胞という大量の細胞が必要であり、細胞の死滅の割合が高く、生体由来の細胞や生体への直接導入は難しい、（２）プラスミドの大きさ（サイズ）によっては導入効率の大幅な低下が見られる、（３）導入された遺伝子等が染色体にインテグレーションされる等の問題がある。
【００２７】
また、ゲノム編集技術の大きな問題点としては、標的とする遺伝子以外の遺伝子にも変異を起こすこと（オフターゲッティング）が指摘され、医療などへの実用化の阻害要因になっている。オフターゲットの原因の１つとして、導入されたゲノム編集システムおよびウイルスゲノムやベクターのＤＮＡ等が染色体にインテグレートされ、細胞内で恒常的にゲノム編集システムが発現し続けていることが挙げられる。
【００２８】
本発明によれば、ゲノム編集システムを高効率に導入することにより標的遺伝子を編集し、ゲノム編集が完了した後はゲノム編集システムが細胞内に残存しない形質転換細胞を簡便に得ることができる。
【００２９】
（導入液）
目的分子を含む導入液は、特に限定されるものではないが、水、水溶液、培地などの適当な媒体に目的分子を懸濁させることが好ましい。該水溶液または懸濁液の溶媒または分散媒としては、たとえば生理食塩水やｐＨ緩衝溶液などが挙げられる。
【００３０】
［導入工程］
本発明の導入工程では、目的分子を含む導入液と標的細胞とを接触させて、標的細胞に目的分子を導入する。標的細胞に目的分子を導入するとは、例えば細胞質基質内または核内に目的分子が入り、機能を発揮できる状態になることをいう。導入工程では、目的分子はエンドサイトーシスを介して標的細胞に導入されることが好ましい。エンドサイトーシスは本来生物が保有する機能であり、エレクトロポレーション法のように細胞膜や染色体遺伝子を傷つけないため、細胞障害性や染色体遺伝子の変性・組換えを抑制することができるためである。導入工程では、目的分子を含む導入液と標的細胞とを接触させるステップを少なくとも含む。
【００３１】
＜目的分子を含む導入液と標的細胞とを接触させるステップ＞
目的分子を含む導入液と標的細胞とを接触させるステップは、標的細胞を前培養するステップおよび目的分子を含む導入液を添加するステップを含むことが好ましい。
【００３２】
標的細胞を前培養するステップでは、標的細胞を適切な条件で培養する。標的細胞を前培養する方法は、特に限定されないが、シャーレ、プレートなどの細胞培養容器中で接着細胞を培養する方法や、培養液中に懸濁した状態で浮遊細胞を培養する方法が挙げられる。培養に用いる培地は、標的細胞の培養に通常用いられる培地であれば特に限定されるものではないが、たとえば寒天培地をはじめとする固体培地やＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ  １６４０  Ｍｅｄｉｕｍ、Ｇｌａｓｇｏｗ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＭＥＭ）などの液体培地が挙げられる。また、培地は公知の添加物を含むことができる。培養に適したフィーダー細胞を用いることもできる。培養時間、培養温度およびＣＯ２濃度等の培養条件は、適宜設定することができる。
【００３３】
次に、前培養した液体培地を除去する。接着細胞の場合は、培地をアスピレーターなどで除けばよい。浮遊細胞の場合は、培地中に懸濁している標的細胞を遠心分離または濾過などの操作により分離して、培地を除去する。
【００３４】
次に、目的分子を含む導入液を添加するステップを行う。導入液は標的細胞を薄く覆うように添加することが好ましい。なお、標的細胞の代わりに標的組織を用いる場合は、例えば切除してきた組織切片または組織上に直接目的分子を含む微量の導入液を添加する。
【００３５】
なお、標的細胞に目的分子を含む導入液を接触させる際には、例えば標的細胞に目的分子を含む導入液を滴下する方法、標的細胞と導入液とを混合する方法などを用いることができる。また、別の方法としては、標的細胞を含む分散液または懸濁液等に目的分子を含む導入液を添加する方法も用いることができる。
【００３６】
＜目的分子を導入するステップ＞
続いて、目的分子を導入するステップを行う。本発明の導入工程では、標的細胞への沿面放電またはプラズマ照射によって目的分子を導入することが好ましい。これらの方法は、細胞障害性がある試薬を使わないために、細胞死を抑制することができる。また、沿面放電またはプラズマ照射による導入方法は、一般に遺伝子導入が困難な分子量の大きいベクター（例えば５ｋＤａ以上、好ましくは１０ｋＤａ以上）でも高い遺伝子導入効率を維持することができると同時に、細胞あたりの目的分子の導入数も多くすることができるため、これまで一般に行われている方法よりも効率よく、形質転換細胞を得ることができる。さらに、エンドサイトーシスにより染色体を傷つけずに目的分子を導入できるため、目的分子が染色体に組み込まれることを抑制でき、染色体に外来遺伝子が挿入されていない細胞を得ることができる。例えばエレクトロポレーションによる遺伝子導入を行った場合、最終的に目的の形質転換された細胞の４０〜９０％で染色体への組み込みが起きているのに対し、本方法によればその割合を有意に下げることができ、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下にすることができる。なお、沿面放電またはプラズマ放電による導入方法によっても、自然発生的にランダムに起こる染色体の組み換え、突然変異等を防ぐことはできないため、外来の目的分子が染色体に組み込まれた細胞が稀に生じる。
【００３７】
沿面放電を用いた目的分子の導入方法としては、特開２０１０−２２０５１７号公報に記載の方法を、プラズマ照射を用いた目的分子の導入方法としては、国際公開第２００２／０６４７６７号、特開２０１３−２５５４７５号公報または特開２０１３−２５５４７４号公報に記載の方法等を適宜用いることができる。
【００３８】
なお、導入液には、エンドサイトーシスを利用した汎用のトランスフェクション試薬（例えばリポフェクション試薬）を用いることもできる。この場合は、目的分子の導入工程において、沿面放電またはプラズマ照射を併用することも可能であるし、併用しなくてもよい。
【００３９】
［沿面放電］
沿面放電を用いた目的分子の導入方法について、以下詳細に説明する。沿面放電を用いた目的分子の導入方法は、目的分子を含む導入液と標的細胞とを接触させる上記のステップと、導入液から離間して設けられた複数の電極から標的細胞および導入液に放電を作用させるステップと、を備える。
【００４０】
＜標的細胞および導入液に放電を作用させるステップ＞
標的細胞および導入液に放電を作用させるステップは、特に電極の本数に限定されるものではないが、目的分子を含む導入液から離間して設けられた複数の電極から導入液に放電を作用させる。これにより、例えば導入液またはその表層に電流が流れたり、電界が生じたりする。本ステップは、好ましくは目的分子を含む導入液へ放電を行うことができる領域に複数の電極を設置するステップ、複数の電極の間に電圧を印加するステップおよび複数の電極と目的分子を含む導入液との間で放電を発生させるステップを含む。これらのステップにより標的細胞に目的分子が導入される。
【００４１】
電極を設置するステップにおいては、シャーレ等の細胞培養容器中に標的細胞と目的分子を含む導入液とが保持された状態で、導入液に放電を作用させることのできる領域に複数の電極が設置されることが好ましい。
【００４２】
ここで、上記容器は、標的細胞と目的分子を含む導入液を保持することのできる構造であれば特に限定されるものではないが、たとえばプレート、シャーレ、チューブ、試験管、フラスコなどが挙げられる。
【００４３】
複数の電極の間に電圧を印加（供給）するステップにおいては、複数の電極の間に数ｋＶｐｐ〜数十ｋＶｐｐ程度の電圧を印加することが好ましく、より好ましくは１ｋＶｐｐ〜３０ｋＶｐｐであり、さらに好ましくは３ｋＶｐｐ〜１０ｋＶｐｐである。数十ｋＶｐｐよりも高い電圧を印加すると、標的細胞の死滅率が高くなってしまい、一方、数ｋＶｐｐよりも低い電圧では目的分子の導入率を向上させる効果を得ることができない。
【００４４】
複数の電極から放電を発生させるステップは、上記複数の電極の間に電圧を供給するステップにより、ほぼ同時に達成されるステップである。かかる電圧の印加により、目的分子を含む導入液に離間して設けられた電極と目的分子を含む導入液との間で放電を行わせることで目的分子の導入が達成できる。
【００４５】
放電時間は、好ましくは０．１ｍｓｅｃ〜１００ｍｓｅｃであり、より好ましくは０．５ｍｓｅｃ〜２０ｍｓであり、さらに好ましくは１ｍｓｅｃ〜５ｍｓｅｃである。１００ｍｓｅｃよりも長い時間電流を流すと、標的細胞の死滅率が高くなってしまい、一方、０．１ｍｓｅｃよりも短い時間の通電では目的分子の導入率を向上させる効果を十分に得ることができない。
【００４６】
目的の形質転換細胞を得るためには、通常の目的分子の導入を行う際よりも電圧を高くし、放電時間を長くすることが好ましい。標的細胞の細胞障害性は大きくなるが、目的分子が導入された細胞数を増やし、また１細胞あたりの目的分子の導入量を多くすることができるため、形質転換細胞の製造効率を上げることができる。
【００４７】
＜沿面放電用の導入装置＞
沿面放電用の導入装置の一例を図１に示す。導入装置は、２本の針状の電極１と電源（電圧供給手段）２と、容器３とを備えている。該電源２により、２本の電極間に電圧を印加することができる。なお、導入装置の構造は、図１に示す構造に限定されるものではない。
【００４８】
図１に記載される導入装置に備えられた複数の電極１は、目的分子を含む導入液５に離間して設けられており、複数の電極間に電圧を印加することにより該電極と目的分子を含む導入液との間で放電を行わせることで、目的分子を細胞内に導入する。
【００４９】
なお、導入装置は、本発明の目的分子の導入方法において、標的細胞４と接触した目的分子を含む導入液５上に複数の電極１が離間して設置されていることを特徴としている。図１においては、電極１は目的分子を含む導入液５と離間して設けられており、電極１は目的分子を含む導入液５との間に放電６を生じさせることにより、電極間で目的分子が導入される。電極１と目的分子を含む導入液５とは、両者の間の最短距離が１０ｍｍ以下であり、かつ両者が接触しないように設置されている。電極１と目的分子を含む導入液５との間の距離は、好ましくは０．１〜５ｍｍであり、さらに好ましくは０．５ｍｍ〜１ｍｍである。このように、電極１と目的分子を含む導入液５とを互いに接触しないように設置することにより適切な放電が行われる。
【００５０】
また、本発明においては、直接的に電極間でプラズマ放電が発生しないように複数の電極間の距離や電極間に印加される電圧が調整されることが好ましい。電極間でプラズマ放電が発生すると、大気圧でのプラズマが不安定であるために目的分子を含む導入液中への架電も不安定となり、目的分子の導入効率等も不安定となるためである。なお、このような複数の電極間の距離や電極間に印加される電圧の好適な範囲は、目的分子を含む導入液の電気抵抗などに影響されるものであり一概に決定することはできないが、通常の目的分子を含む水溶液を用いる場合、複数の電極のうち任意の２対の電極間の距離が１０〜１００ｍｍであることが好ましく、任意の２対の電極間に印加される電圧は１〜３０ｋＶであることが好ましい。
【００５１】
上記電極から上記目的分子を含む導入液に放電させるための電圧を上記電極に供給する電圧供給手段は、特に限定されるものではないが、たとえば高圧電源ＦＰ１０００（パール工業株式会社製）などの電源供給装置が挙げられる。電極に供給される波形は、正弦波、半波整流、全波整流、パルスのいずれも用いることができる。
【００５２】
本発明の導入装置に用いられる電極の形状は、特に限定されるものではないが、電極から目的分子を含む導入液に放電するために必要以上の電圧を印加する必要がないようにするために、目的分子を含む導入液５側を先端とする針形状等の形状であることが好ましい。また、電極の材質は、特に限定されるものではないが、タングステン、モリブデンなどが挙げられ、腐食しにくい材質や、金、銀、プラチナ等の殺菌効果のある材質であることが好ましい。
【００５３】
導入装置に用いられる電極の数は２つであることに限定されることはなく、電極の数は２以上であることが好ましい。電極の数を２以上とすることにより、試料回転等の操作を必要とせずに導入を均一化することが可能となり、より目的分子の導入率が向上し、標的細胞の死滅率も低減される。
【００５４】
また、導入装置に用いられる電極の数は、正電極と負電極の数が同じとなるようにしてもよく、正電極と負電極の数が異なるようにしてもよい。なお、複数の電極を配置する場合においては、特定の電極に電流が集中してしまい均一な目的分子の導入が妨げられないよう、電源２と電極１の間に抵抗２２を設けて、電流が均一に流れるように調整することが好ましい。なお、抵抗２２の代わりにコイルやコンデンサ等を使用してよい。
【００５５】
なお、本導入装置の構造は、本実施の形態で説明した構造に限定されるものではなく、たとえば電極の数や設置形態は、本実施の形態と同様の効果が得られるのであれば、互いに異なる他の形状であってもよい。また、電源２は整流器を備えていることが好ましい。
【００５６】
本方法によれば、ガスの噴きつけ等を必要としないため標的細胞がほとんど乾燥せず、余計な緩衝液等の添加が不要となる。また、短時間での処理が可能となり、電極構成も特別な構成を必要とせず簡素化することができる。
【００５７】
［プラズマ照射］
プラズマ照射を用いた目的分子の導入方法について、以下詳細に説明する。プラズマ照射を用いた目的分子の導入方法は、目的分子を含む導入液と標的細胞とを接触させる上記のステップと、荷電粒子、励起原子および励起分子からなる群から選択される一種または複数種からなる集合体を、導入液および標的細胞に接触させるステップと、を備える。
【００５８】
＜荷電粒子、励起原子および励起分子からなる群から選択される一種または複数種からなる集合体を、導入液および標的細胞に接触させるステップ＞
本ステップでは、例えば上部微細電極から、目的分子を含む導入液および標的細胞に集合体すなわちプラズマを照射する。本ステップでは、まず、導入液の所望の位置に、上部微細電極の位置を調節する。底面電極は、標的細胞を収容した容器を挟んで上部微細電極の反対側に設置してもよい。続いて、上部微細電極に電圧を印加し、プラズマを発生させる。中空パイプ状で噴出口を有する上部微細電極を用いる場合には、噴出口から導入液および標的細胞に向けて集合体前駆体を噴出してもよい。
【００５９】
集合体前駆体とは、荷電粒子、励起原子および励起分子からなる群から選択される一種または複数種からなる集合体を生成させるための前駆体であり、例えば空気、窒素ガス、酸素ガス、二酸化炭素ガス、ヘリウムガス、ネオンガス、アルゴンガス、クリプトンガス、キセノンガスからなる群より選ばれる１種以上を含むガスが挙げられる。ガスの組み合わせはこれらに限定されるものではなく、また、固体や液体を前駆体に含んでもよい。集合体前駆体に、例えば電圧が印加されることにより、荷電粒子と励起原子および励起分子からなる群から選択される一種または複数種を構成要素とする集合体が生成される。集合体は、集合体前駆体にエネルギーが与えられることにより生成されたものであればよく、エネルギーを与える方法は電圧印加でなくてもよい。
【００６０】
集合体前駆体は、例えば中空パイプ状の上部微細電極の内孔と接続された集合体前駆体供給装置により、上部微細電極の内孔に集合体前駆体が所定流量で供給され、噴出口から噴出される。上部微細電極の外径は、好ましくは１ｍｍ以下であり、より好ましくは１００μｍ以下である。また、上部微細電極ごとの前記集合体前駆体の噴出量は、１００ｓｃｃｍ以下であることが好ましい。
【００６１】
次に、上部微細電極と底面電極との間に電圧を印加することにより、集合体前駆体(例えばＨｅガス)から集合体が生成する。この集合体（荷電粒子、励起原子および励起分子からなる群から選択される一種または複数種からなる集合体）が導入液および標的細胞に接触し、作用を及ぼすことにより、目的分子が標的細胞に導入される。
【００６２】
電圧を印加するステップにおいては、印加される電圧は、数ｋＶ〜数十ｋＶ程度であることが好ましく、より好ましくは２ｋＶ〜３０ｋＶであり、さらに好ましくは５〜２０ｋＶである。数十ｋＶよりも高い電圧で電流を流すと、標的細胞の死滅率が高くなってしまい、逆に、数ｋＶよりも低い電圧で電流を流すと目的分子の導入率を向上させる効果を得ることができない。
【００６３】
集合体が生成するステップは、上記電圧を印加するステップにより、ほぼ同時に達成されるステップである。このようにして、目的分子を含む液体（導入液）および標的細胞に集合体（荷電粒子、励起原子および励起分子からなる群から選択される一種または複数種からなる集合体）が作用することにより、目的分子の導入率を著しく向上させ、標的細胞の死滅率を格段に低減することが可能となる。
【００６４】
電圧を印加する時間は、好ましくは０．１ｍｓｅｃ〜１００ｍｓｅｃであり、より好ましくは０．５ｍｓｅｃ〜５０ｍｓｅｃであり、さらに好ましくは１．０ｍｓｅｃ〜２０ｍｓｅｃである。１００ｍｓｅｃよりも長い時電圧を印加すると、標的細胞の死滅率が高くなってしまい、一方、０．１ｍｓｅｃよりも短い時間の印加では目的分子の導入率を向上させる効果を十分に得ることができない。
【００６５】
本導入方法によれば、細胞に目的のタンパク質を効率的に発現かつ安定して存在させることができ、これにより形質転換細胞を効率的に樹立することができ、細胞機能の改善による動物個体の健康維持、体質改善、疾病の予防などにおいてその効果を発揮できる。また、本導入方法は、本実施形態および実施例に記載される用途に限られず、細胞に機能を付与する用途に用いることができる。
【００６６】
＜プラズマ放電用の導入装置＞
プラズマ放電用の導入装置の一例を以下に説明するが、導入装置の構造は、これに限定されるものではない。プラズマ放電による目的分子導入装置は、上述した目的分子導入方法に好適に用いられる構造および機能を有しており、好ましくは容器と、該容器の開口部側に、導入液から離間して設けられた上部微細電極と、電圧供給手段（電源）と、容器の上部微細電極とは反対側に設けられた底面電極とを備えている。電圧供給手段により、上部微細電極と底面電極との間に所定の電圧を印加することができる。中空パイプ状の上部微細電極を用いた場合、集合体前駆体を噴出する機構を備えていることが好ましい。
【００６７】
電圧供給手段は、信号発生器、リニアアンプ、整合回路および昇圧トランスを備えている。電圧供給手段としては、特に限定されるものではないが、例えば高圧電源ＦＰ１０００（パール工業株式会社製）などの電源供給装置が挙げられる。電極に供給される波形は、正弦波、半波整流、全波整流、パルスのいずれも用いることができる。
【００６８】
導入装置は、基本的に、電源（電圧供給機構）と、電極と、電源と電極を接続する導電線とを備えている。また、電源は、信号発生器、リニアアンプ、整合回路、昇圧トランスなどを備えており、それらと上部微細電極または底面電極とは導電線で互いに電気的に接続されているため、電極間電圧、電極距離、周波数、パルス周期（パルス周波数）、Ｄｕｔｙなどのパラメータを種々の条件に設定することができる。これにより、種々の性質の集合体を発生させることができる。なお、電源供給手段と電極（上部微細電極または対向電極）とを接続する接続回路に整流器、抵抗、コイルまたはコンデンサを有することが好ましい。
【００６９】
導入装置においては、標的細胞の種類および目的分子の種類に応じて、標的細胞に照射される集合体の条件を変化させることができるように、上記の電極間電圧、電極距離、周波数、パルス周期、Ｄｕｔｙ等のパラメータを変化させることができる。
【００７０】
上部微細電極の形状は、好ましくは針状である。上部微細電極および底面電極の材質は、特に限定されるものではないが、タングステン、モリブデンなどが挙げられ、腐食しにくい材質や、金、銀、プラチナ等の殺菌効果のある材質であることが好ましい。
【００７１】
本発明においては、単数または複数の上部微細電極を鉛直方向に上下することで、目的分子が導入される標的細胞の範囲を調節することができる。このために、上部微細電極と、導入液および標的細胞との最短の距離は、５ｍｍ以下に設定されることが好ましい。
【００７２】
上部微細電極の数は、単数であっても複数であってもよい。多数の上部微細電極を具備する場合、多数の標的細胞へ同時に目的分子の導入が可能となる。また、多数の上部微細電極により、広範囲の標的細胞に対して目的分子の導入が可能となる。
【００７３】
また、導入液および標的細胞を収容する容器は、この標的細胞を保持するための単数または複数の試料保持部を有していてもよく、この場合、この試料保持部に対応する位置に単数または複数の上部微細電極が設置される。
【００７４】
導入装置は、上部微細電極と容器とを相対的に上下に駆動させる上下駆動機構を含むことが好ましい。すなわち、導入液の収容容器の位置調節手段、および／または上部微細電極の位置調節手段を含んでいることが好ましい。これにより、上部微細電極と導入液との間の距離を最適化することができる。
【００７５】
［後培養工程］
本発明の製造方法は、上記の導入工程の後に、標的細胞の後培養工程を含むことが好ましい。後培養工程では、目的分子が導入された標的細胞を導入から、例えば４時間以上２月以内、好ましくは３日以上１月以内培養を行う。この間、数日毎に適切な培地交換を行うことが好ましい。培養温度およびＣＯ２濃度などの培養条件は適宜設定することができる。
【００７６】
後培養工程では、標的細胞の培地は選択分子を含むことが好ましい。選択分子は、目的分子が導入されなかった細胞を、細胞増殖の抑制、死滅、アポトーシス誘導などにより排除する分子であれば特に限定されない。これにより、目的分子が導入された細胞のみを選択および培養することができるため、目的の形質転換細胞の製造効率を向上させることができる。例えば下記に挙げられる抗生物質耐性遺伝子を目的分子として含む場合、選択分子としては、ネオマイシン、ネオマイシン類似体Ｇ４１８、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ブラストサイジン、その他の抗生物質等を用いることができる。選択分子の濃度および培養時間は細胞により異なるが、例えばヒト皮膚線維芽細胞ＨＤＦ細胞に対してＧ４１８で選択培養する場合、１００〜１０００μｇ／ｍＬの濃度で１〜３日間培養することが好ましい。選択分子を長期間にわたり添加すると、目的分子が標的細胞の染色体に組み込まれた細胞が選択される可能性が高くなるためである。なお、目的分子の導入効率が８０％を超す場合には、選択分子の存在下での培養は行わなくてもよい。
【００７７】
目的分子は、選択分子に対して耐性となる選択マーカー分子を含むことが好ましい。選択マーカー分子は、目的分子が導入された標的細胞をスクリーニングするための分子である。選択マーカー分子としては、例えばネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子等が挙げられる。選択マーカー分子は、標的細胞に形質を付与、欠失または維持させる遺伝子が挿入されたベクターと同一のベクター上に挿入されていてもよい。この場合、目的分子が導入された標的細胞をより的確に選択することができる。標的細胞に形質を付与、欠失または維持させる遺伝子が挿入されたベクターとは異なるベクター上に選択マーカー分子が挿入されている場合、形質を付与、欠失または維持させる遺伝子が挿入されたベクターに対して、選択マーカー分子が挿入されたベクターの量を十分に少なくして（例えば重量比で１０：１）、共に導入することで、標的細胞に形質を付与、欠失または維持させる遺伝子が挿入されたベクターが導入されたと想定される標的細胞を選別することができる。
【００７８】
［形質転換細胞の単離工程］
本発明の製造方法は、好ましくは形質転換細胞の単離工程を含む。本工程では、目的分子が導入された標的細胞または後培養した細胞をクローン化する。単クローン化する方法としては、当業者に公知の方法を用いることができるが、例えば限外希釈法や単一コロニーのピックアップなどによって細胞をクローン化することができる。その形態によって目的の形質転換細胞を判断できる場合は、視覚的に判断した目的の細胞をピックアップすることができる。単離された細胞が目的の形質を得ているかは、公知の方法によって確認することができる。
【実施例】
【００７９】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００８０】
（試験例１：細胞への高分子の導入）
ｉＰＳ細胞等の形質転換細胞を効率よく樹立するには、１０ｋｂｐ以上（約７００万Ｄａ以上）のエピゾーマルプラスミドの導入が望ましく、巨大分子の導入効率の低さがｉＰＳ細胞の製造効率の低さの一因となっている。そこで、沿面放電法を用いた巨大分子の導入効率について検証した。【００８１】
試験例１では、図１に示した導入装置を用いて沿面放電による遺伝子導入を行った。上部微細電極を用いたプラズマ照射では、放電範囲が小さく、遺伝子導入できる細胞の数が少ないため、本試験例では沿面放電を用いて大量の細胞への遺伝子導入を試みた。本試験例の容器には３．５ｃｍプラスチックシャーレを用い、標的細胞としてヒト皮膚線維芽細胞ＨＤＦ細胞を用いた。図２に示すように、本試験例では、正電極１１、負電極１２を２本ずつ配置し、計４本の電極を配置した導入装置を使用した。正電極と負電極間の距離は約２７ｍｍである。【００８２】
図３を用いて、本試験例の手順を説明する。まず、ラミニンでコーティング処理された３．５ｃｍプラスチックシャーレに２ｍＬのＤ−ＭＥＭ高グルコース培地（富士フィルム和光純薬株式会社：０４５−３０２８５）を加え、ヒト皮膚線維芽細胞ＨＤＦ細胞を約３．０×１０５ｃｅｌｌｓ／シャーレとなるように播種し、２４時間ＣＯ２インキュベーターで培養した（図３のＳ１０１）。培地をアスピレーターで吸引除去し、１２０μｇのｐＣＸＬＥ−ＥＧＦＰ（１０．９ｋｂｐ）および１２μｇのｐｍＣｈｅｒｒｙ−Ｃ１（４．７ｋｂｐ）を含む１２０μＬの導入液（塩分濃度０．０５質量％）を滴下した（図３のＳ１０２）。滴下後５分間室温にて放置し（図３のＳ１０３）、シャーレを沿面放電装置にセット、放電した（図３のＳ１０４）。印加電圧は５．２ｋＶ（半波整流）、電源周波数２０ｋＨｚ、電圧印加時間は２ｍｓｅｃ×２回（インターバル３０秒）であった。その後、速やかに培養液を２ｍＬ加え、ＣＯ２インキュベーターに戻して２４時間培養した（図３のＳ１０５〜１０６）。【００８３】
導入から２４時間後のＨＤＦ細胞を蛍光顕微鏡によって観察した。図４（Ａ）はＧＦＰが発現している細胞を、図４（Ｂ）はｍＣｈｅｒｒｙが発現している細胞を示す。一般に、サイズの大きなプラスミドは細胞への導入が困難であるが、沿面放電法では、約１０．９ｋｂｐ（７００万Ｄａ以上）の巨大プラスミドも、４．７ｋｂｐの小さなプラスミドの量を減らすことにより同程度の効率で標的細胞に導入できることがわかった。【００８４】
（試験例２：形質転換細胞の製造）
ラミニンでコーティング処理された３．５ｃｍプラスチックシャーレに２ｍＬのＤ−ＭＥＭ高グルコース培地（富士フィルム和光純薬株式会社：０４５−３０２８５）を加え、ヒト皮膚線維芽細胞ＨＤＦ細胞を約３．０×１０５ｃｅｌｌｓ／シャーレとなるように播種し、２４時間ＣＯ２インキュベーターで培養した。培地をアスピレーターで吸引除去し、表１に記載のプラスミド溶液を１２０μＬ滴下した。５分間室温にて静置後、３．５ｃｍプラスチックシャーレを沿面放電装置にセットし、３．９ｋＶで２ｍｓｅｃ放電した。沿面放電装置は試験例１と同様の装置を用いた。その後、速やかに培養液を２ｍＬ加え、ＣＯ２インキュベーターに戻して２４時間培養した。培養後の細胞を顕微鏡下で観察し、選択マーカーが導入されている細胞を確認し、その後、１００〜１０００μｇ／ｍＬのＧ４１８を含むＤ−ＭＥＭ高グルコース培地を２ｍＬ加え、２４時間〜７２時間培養した。【００８５】
【表１】
2019244895.tif 000003
【００８６】
Ｇ４１８含有Ｄ−ＭＥＭ高グルコース培地を除去し、２ｍＬのＥｓｓｅｎｔｉａｌ８培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：Ａ１５１７００１）を加え、ＣＯ２インキュベーターで培養した。２〜３日毎に培地を交換し、３〜４週間培養を続けた。プラスミド導入前のＨＤＦ細胞を図５（Ａ）に示す。プラスミドを導入し３〜４週間後に、図５（Ｂ）に示すｉＰＳ様細胞が出現した。プラスミド導入後初期化された細胞は、もとのＨＤＦ細胞とは形態が異なり、ｉＰＳ細胞に典型的にみられる形態(例えばドーム状のコロニーで、コロニーの境界面が滑らかで、白っぽく光る形状等)を示した。出現したｉＰＳ細胞をピックアップし、ラミニンでコーティング処理された３．５ｃｍプラスチックシャーレで継代を行ない、増殖した単一コロニーを凍結保存した。【００８７】
＜ｑＰＣＲによる目的分子の残存確認方法および結果＞
凍結保存時に剥がしたｉＰＳ細胞の一部をＰＢＳ（ナカライテスク株式会社、ｃａｔ．Ｎｏ．１４２４９−２４）で洗浄し、遠心操作で細胞ペレットにした。ＰＢＳをアスピレーターで除去し、−８０℃で保存した。【００８８】
凍結した細胞ペレットを室温の２００μＬのＰＢＳに懸濁した。ゲノムＤＮＡ抽出キット：ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、ｃａｔ．Ｎｏ．６９５０４）を用いて、プロトコルに従って細胞のゲノムＤＮＡを抽出した。具体的には、付属のｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｋを２０μＬ加え、軽くボルテッックスミキサー（サイエンティフィックインダストリーズ、Ｄｉｇｉｔａｌ  ＶＯＲＴＥＸ−ＧＥＮＩＥ  ２）にかけ、均一に混ぜた。スピンダウンして、室温で５分間静置した。別売の４μＬのＲＮａｓｅ  Ａ（ＱＩＡＧＥＮ、ｃａｔ．Ｎｏ．１９１０１）を加え、軽くボルテックスミキサーにかけ、均一に混ぜた。卓上遠心機（ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、ｍｙＦＵＧＥ  ｍｉｎｉ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ、Ｃ１００８−Ｂ）でスピンダウンして、室温で２−５分間静置した。キットに付属のＢｕｆｆｅｒ  ＡＬを２００μＬ加え、すぐにボルテックスミキサーに１５秒間、断続的にかけた。スピンダウンして、ヒートブロック（ＡＳＴＥＣ、Ｂｌｏｃｋ  Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ  ＢＩ−５２５）で、５６℃で１０分間、インキュベートした。スピンダウンして、２００μＬの１００％エタノールを加え、すぐに１５秒間、断続的にボルテックスミキサーにかけた。スピンダウンして、キットに付属のＱＩＡａｍｐ  Ｍｉｎｉ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎにライセートを移した。６０００ｇ、室温で１分間の遠心操作（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＳＴ８ＦＲ）にかけて、ライセートをカラムに通した。キットに付属の新しい２ｍＬ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｔｕｂｅへカラムを移し、５００μＬのＢｕｆｆｅｒ  ＡＷ１を添加した。６０００ｇで１分間、室温の遠心操作にかけて、ライセートをカラムに通した。キットに付属の新しい２ｍＬ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｔｕｂｅへカラムを移し、５００μＬのＢｕｆｆｅｒ  ＡＷ２を添加した。２０，０００ｇ、３分間、室温で遠心操作を行い、新しい２ｍＬチューブ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｓａｆｅ−Ｌｏｃｋ  Ｔｕｂｅｓ）へ移した。２０，０００ｇで１分間、室温で遠心操作を行い、新しい１．５ｍＬチューブ（ＷＡＴＳＯＮ、１３１−７１５Ｃ）へカラムを移した。１００〜２００μＬのＢｕｆｆｅｒ  ＡＥを添加し、６０℃で１０分間、静置した。６，０００ｇで１分間、遠心操作を行い、ゲノムＤＮＡを抽出した。【００８９】
微量分光光度計（ＩＭＰＬＥＮ、ＮａｎｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒ  Ｐ−Ｃｌａｓｓ）で、ゲノムＤＮＡを定量し、ＤＤＷで１０ｎｇ／μＬに希釈した。１反応あたり、２０ｎｇのゲノムＤＮＡを用いて、ｑＰＣＲを行った。ｑＰＣＲ試薬は、ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ  ＳＹＢＲ  ｑＰＣＲ  ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ）を使用した。１０μＬの反応系において、１０ｎｇ／μＬのゲノムＤＮＡを２μＬ使用した。反応条件は、９５℃−６０秒：１サイクル、（９５℃−１５秒、６０℃−４５秒）：４０サイクルで行った。解析システムはＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ解析システム（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いた。１細胞株ごとに、エピソーマルベクター検出用プライマーセットと染色体遺伝子ＣＦＴＲ遺伝子検出用プライマーセットでｑＰＣＲを行った。エピソーマルベクターのＣｙｃｌｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（Ｃｔ）値を、ＣＦＴＲ遺伝子（染色体遺伝子）のＣｔ値で補正した。使用したプライマー配列は以下の通りである。
エピソーマルベクター（ｏｒｉＰ）検出用（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２４．２００９）
ｐＥＰ４−ＳＦ１：ＴＴＣＣＡＣＧＡＧＧＧＴＡＧＴＧＡＡＣＣ
ｐＥＰ４−ＳＲ２：ＣＡＧＧＣＧＡＡＧＡＴＴＣＡＧＧＡＧＡＧ
ＣＦＴＲ遺伝子の検出用（Ｕｅｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｎ  Ｃｌｉｎ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｎｅｕｒｏｌ．，３６１−３６９．２０１４）
ＣＦＴＲｅｘｏｎ２４−Ｆ：ＧＧＣＡＧＴＡＣＧＡＴＴＣＣＡＴＣＣＡＧ
ＣＦＴＲｅｘｏｎ２４−Ｒ：ＧＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＴＣＧ
本発明で樹立されたヒトｉＰＳ細胞株について、エピソーマルベクター（目的分子）の残存確認を行った。ｑＰＣＲは同一検体で２回実施した。染色体遺伝子であるＣＦＴＲに対するエピソーマルベクターの相対量を２倍して、コピー数を算出した。エピソーマルベクター／ＣＦＴＲ比が０．１コピー以下の細胞株を目的分子が細胞内に残存していない細胞とする。【００９０】
結果を図６に示す。検討した１１株中、１０株（９０．９％）が、エピソーマルベクター／ＣＦＴＲ比が０．１以下のコピー数であり、ベクター配列がゲノムＤＮＡに組み込まれていないと考えられる。なお、ベクター配列が検出された株１１については、低確率でおこるランダムな組込みによってベクターが組み込まれたと考えられる。＃５８  ｓｕｂ６はエピソーマルベクターをエレクトロポレーションによって導入した結果、ベクターがゲノムＤＮＡに挿入された細胞株であり、ポジティブコントロールとして使用した。ネガティブコントロールとして、ｉＰＳ細胞の樹立に使用したヒト皮膚線維芽細胞ＨＤＦ細胞（Ｍａｌｅ  ＨＤＦ，Ｐ９）のゲノムＤＮＡを用いた。【００９１】
また、本願の導入方法によって製造したｉＰＳ細胞と、エレクトロポレーターのＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ２ｂ（Ｌｏｎｚａ）を用いて樹立したｉＰＳ細胞で、細胞内にベクターが残存した細胞株の割合を比較した。表２に示すように、沿面放電によって樹立したｉＰＳ細胞株のエピソーマルベクター残存率は、エレクトロポレーターを用いて樹立したｉＰＳ細胞と比較して、非常に低い値を示した。本願の導入方法によって染色体に核酸が挿入されていない形質転換細胞を効率よく得ることができた。【００９２】
エピソーマルベクターの残存量は、培養期間の長さに依存する可能性もある。しかし、凍結細胞ストックの作製時におけるエピソーマルベクター残存量は、本発明を用いて製造したｉＰＳ細胞の約９０％の細胞で０．１コピー以下であった。この結果は、本発明が外来遺伝子の染色体組込みを起こしにくい、従来法に比べて安全な技術であることを示している。【００９３】
【表２】
2019244895.tif 000004
【００９４】
（試験例３：形質転換細胞の製造）
図７に示す方法に従って、ゲノム編集システムを用いて標的遺伝子をノックアウトし、ゲノム編集が完了した後はゲノム編集システムが細胞内に残存しない形質転換細胞を製造した。この方法によれば、遺伝子のノックアウトやプラスミドの脱落を蛍光により確認することができる。【００９５】
（１）蛍光を示さない細胞１０１の染色体に赤色蛍光タンパク質遺伝子をインテグレーションし、恒常的に赤色蛍光を示す細胞（標的細胞）１０２を樹立する。【００９６】
（２）赤色蛍光タンパク質をノックアウトする配列と、緑色蛍光タンパク質遺伝子配列とを有するゲノム編集用プラスミド（目的分子）を構築する。【００９７】
（３）赤色蛍光を示す細胞１０２に、構築したプラスミドを導入する。プラスミドが導入された細胞は、赤色および緑色蛍光を示す細胞１０３となる。【００９８】
（４）プラスミドを導入した細胞を２週間程度培養する。赤色蛍光タンパク質遺伝子がノックアウトされると赤色蛍光タンパク質が徐々に分解され、緑色蛍光のみを示す細胞１０４が生じる。【００９９】
（５）さらに培養を継続する。細胞に導入したプラスミドが分解・脱落することより、細胞は緑色蛍光を示さなくなり、核酸が染色体に挿入されない形質転換細胞１０５を製造することができる。【０１００】
以下に実際に行った実験を詳細に説明する。
（１）エレクトロポレーション法によるｍＣｈｅｒｒｙタンパク質の恒常的発現細胞の樹立
Ｌ−９２９細胞（１×１０６ｃｅｌｌｓ）を９０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭに懸濁し、１０μＬのｐｍＣｈｅｒｒｙ−Ｃ１プラスミド（１μｇ／μＬ）を加えて混合した。混合液をエレクトロポレーション用キュベットに移し、エレクトロポレーター（ＮＥＰＡ２１、ネッパジーン株式会社）に装着して、表３の条件にて印加した。【０１０１】
【表３】
2019244895.tif 000005
【０１０２】
印加後の細胞が含まれる反応液を４．９ｍＬの血清入りＭＥＭ培地に懸濁して、９６ｗｅｌｌプレートに１００μＬずつ播種し、ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で４８時間培養した。ｐｍＣｈｅｒｒｙ−Ｃ１プラスミドの導入効率は３０％、細胞生存率は６５％であった。ウェルから細胞を回収し、１０ｃｍシャーレにて１０ｍＬの血清入りＭＥＭ培地（２００μｇ／ｍＬのＧ−４１８を含む）で１ヶ月培養した。図８（Ａ）に、ｍＣｈｅｒｒｙが発現して赤色蛍光を示す細胞を、図８（Ｂ）に明視野顕微鏡下での細胞を示す。その後、９６ｗｅｌｌプレートを用いた限界希釈法により、ｐｍＣｈｅｒｒｙ−Ｃ１プラスミドが導入されたＬ−９２９細胞のシングルコロニーを得た。得られたシングルコロニーを２ｍＬの血清入りＭＥＭ培地に懸濁し、３．５ｃｍシャーレに播種して、ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で継続的に１ヶ月間培養した。得られたコロニーからホワイトクローン（ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子が脱落したクローン）が出現しないこと（０．０１％以下）を確認し、恒常的ｍＣｈｅｒｒｙ発現細胞（Ｌ−９２９−ｍＣｈｅｒｒｙ細胞）とした（図９（Ａ）および（Ｂ））。Ｌ−９２９−ｍＣｈｅｒｒｙ細胞は、ゲノムにｐｍＣｈｅｒｒｙ−Ｃ１プラスミドが挿入されていると考えられる。【０１０３】
（２）ゲノム編集用ベクターの構築
Ｇｕｉｄｅ−ｉｔ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用い、キットに付属のマニュアルに従ってｍＣｈｅｒｒｙノックアウト用ベクターを構築した。キットに含まれるｐＧｕｉｄｅ−ｉｔプラスミドベクターは、緑色の蛍光を示すＺｓＧｒｅｅｎ１遺伝子を有する。ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子をノックアウトするためのガイドＲＮＡ用のプライマー塩基配列は以下の通りである。【０１０４】
ｇＲＮＡ−１−Ｆｗｄ：ＣＣＧＧＡＣＣＣＡＧＡＣＣＧＣＣＡＡＧＣＴＧＡＡＧＧ
ｇＲＮＡ−１−Ｒｅｖ：ＡＡＡＣＣＣＴＴＣＡＧＣＴＴＧＧＣＧＧＴＣＴＧＧＧＴ
上記ガイドＲＮＡ配列を含むｍＣｈｅｒｒｙノックアウト用ベクターの塩基配列を確認し、目的の配列を保持するゲノム編集用プラスミドｐｓｇＲＮＡ１−２を得た。【０１０５】
（３）ゲノム編集用プラスミドｐｓｇＲＮＡ１−２の導入
Ｌ−９２９−ｍＣｈｅｒｒｙ細胞（１．３×１０４ｃｅｌｌｓ）を９６ｗｅｌｌプレートに播種し、ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で２４時間培養した。ウェルから培地を吸引後、ｐｓｇＲＮＡ１−２プラスミド（１μｇ／μＬ）を５μＬ加え、プラズマ照射装置にセットし、３０ｋＶ、３０ｍｓｅｃの条件でプラズマを照射した。プラズマ照射装置は、特開２０１３−２５５４７５号公報に記載の装置と同様の装置を用いた。照射後、１００μＬの血清入りＭＥＭ培地を加え、ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で４８時間培養した。Ｌ−９２９−ｍＣｈｅｒｒｙ細胞は恒常的に赤色蛍光を示す（図１０（Ａ）および（Ｂ））が、ｐｓｇＲＮＡ１−２プラスミドが導入された細胞はさらに緑色蛍光も示した（図１０（Ｃ））。【０１０６】
（４）ｐｓｇＲＮＡ１−２プラスミドの導入によるｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子のノックアウト
ウェルから細胞を回収し、１０ｃｍシャーレに播種して、ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で２週間培養した。その結果、赤色および緑色の蛍光を示していた細胞の一部は、ｐｓｇＲＮＡ１−２プラスミドの導入によって赤色蛍光を示さなくなり、緑色蛍光のみを示すようになった（図１１（Ａ）〜（Ｄ）、丸で囲んだ部分）。一般的に、偶発的な遺伝子の変異が起こる頻度は１／１０５と低頻度であるため、一定数以上の細胞において赤色蛍光が見られなくなったことは、ゲノム編集システムにより、ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子がノックアウトされたことを示唆している。【０１０７】
（５）ｐｓｇＲＮＡ１−２導入細胞の継続培養
限界希釈法によって緑色の蛍光を示す細胞のシングルコロニーを得た。得られたシングルコロニーを１０ｃｍシャーレに播種し、ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で約１ヶ月間培養すると、緑色蛍光を発していた細胞のほとんど全ての細胞は蛍光を示さない細胞となった。これは、ゲノム編集用プラスミドｐｓｇＲＮＡ１−２が、ゲノムに組み込まれずに細胞増殖の途中で脱落または分解されたことを示唆している。【０１０８】
今回開示された実施形態および実施例はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて請求の範囲によって示され、請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
【産業上の利用可能性】
【０１０９】
これまで、再生医療や遺伝子治療に用いる形質転換された細胞（例えばｉＰＳ細胞、ｉＰＳ細胞から分化した細胞など）には導入遺伝子やウイルスなどのベクターが残存しており、それらが再生医療や遺伝子治療の実用化の妨げになっていた。また、それらの形質転換された細胞を取得するために高いレベルのバイオハザード実験室での実施や高度に熟練した研究者が必要とされていた。本発明によれば、簡便に目的分子を導入することができ、その結果、形質が付与あるいは欠失した細胞を容易に製造できる。更に、樹立された細胞には外来遺伝子などの目的分子が保持されることがないので、実用に際しこれまでのような問題が生ずる可能性が限りなく低い。これにより、特定の分子の生体内での働きを解析する研究や、医療、農業および環境を含む広い分野での応用が可能となる。医療分野では、例えば再生医療、細胞医療および遺伝子治療などに、農業分野や環境分野では、例えば育種や品種改良などに用いることができる。
【符号の説明】
【０１１０】
１  電極、１１  正電極、１２  負電極、２  電源、２２  抵抗、３  容器、４  標的細胞、５  目的分子を含む導入液、６  放電、１０１  蛍光を示さない細胞、１０２  赤色蛍光を示す細胞、１０３  赤色および緑色蛍光を示す細胞、１０４  緑色蛍光を示す細胞、１０５  形質転換細胞。
【図１】
2019244895.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年12月15日(2020.12.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2019244895.tif 000017
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2019244895.tif 000019
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