(57)【要約】  ３’，３’−ｃＧＡＭＰ酵素合成においては、他種の環状ジヌクレオチドであるｃ−ｄｉ−ＧＭＰやｃ−ｄｉ−ＡＭＰが副生物として生じる。これらの他種環状ジヌクレオチドの合成段階での副生抑制が、３’，３’−ｃＧＡＭＰの実践的な酵素合成法の確立に向けた課題である。本願発明者らは鋭意検討を行った結果、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰやｃ−ｄｉ−ＡＭＰの副生を抑制する３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼの変異を見出し、当該変異酵素を用いた３’，３’−ｃＧＡＭＰ酵素合成系を確立することで、本発明を完成させた。本発明の酵素は、野生型の３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼと比較して、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰおよびｃ−ｄｉ−ＡＭＰの副生が著しく抑制されているものである。したがって当該酵素を用いた製造法では、従来の酵素合成法に比べて、他種の環状ジヌクレオチドの副生を低減し、効率的に３’，３’−ｃＧＡＭＰを合成することが可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼにおいて下記より選ばれる１又は複数のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基に変異を有する変異型３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼ：
Ｙ１１７、Ｎ１２１、Ｍ１３０、Ｋ１７７、Ａ２９２、Ｋ３５０。
【請求項２】
前記変異が、下記より選ばれる１又は複数の変異に相当する変異を含む、請求項１に記載の変異型３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼ：
Ｙ１１７（Ｈ, Ｒ, Ｋ）、
Ｎ１２１（Ｉ, Ｇ, Ａ, Ｖ, Ｌ, Ｐ）、
Ｍ１３０（Ｖ, Ｉ, Ｇ, Ａ, Ｌ, Ｐ, Ｆ, Ｈ, Ｙ, Ｗ）、
Ｋ１７７（Ｍ, Ｈ, Ｃ, Ｆ, Ｙ, Ｗ）、
Ａ２９２（Ｔ, Ｋ, Ｙ, Ｓ, Ｆ, Ｗ, Ｒ, Ｈ）、
Ｋ３５０（Ｅ, Ｄ, Ｍ, Ｎ, Ｑ, Ｃ）。
【請求項３】
前記変異が、下記より選ばれる１又は複数の変異に相当する変異を含む、請求項１に記載の変異型３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼ：
Ｙ１１７（Ｈ）、
Ｎ１２１（Ｉ）、
Ｍ１３０（Ｖ, Ｆ）、
Ｋ１７７（Ｍ, Ｈ, Ｃ）、
Ａ２９２（Ｔ, Ｋ, Ｙ）、
Ｋ３５０（Ｅ, Ｄ, Ｍ）。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の変異型３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼをコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項４に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項６】
請求項４に記載のポリヌクレオチド、又は請求項５に記載の発現ベクターによって形質転換された、形質転換体。
【請求項７】
酵素を用いて１分子のＡＴＰおよび１分子のＧＴＰから３’，３’−ｃＧＡＭＰを製造する方法において、酵素として、請求項６に記載の形質転換体を培養して産生させた３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼを用いる、３’，３’−ｃＧＡＭＰの製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３’，３’−ｃＧＡＭＰの合成に好適な３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼの変異体および当該酵素を用いた実践的な３’，３’−ｃＧＡＭＰ合成法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
３’，３’−ｃＧＡＭＰは細菌の病原因子の発現などに関与するシグナル伝達物質であり、近年その生理活性やシグナル伝達機構等が注目を集めている。例えば最近では、３’，３’−ｃＧＡＭＰが免疫賦活作用を有することが明らかなり、アジュバント、抗ウイルス剤、抗がん剤としての応用が期待されている（特許文献１）。
３’，３’−ｃＧＡＭＰ合成法としては、化学合成法や酵素合成法が報告されているが、実用的な合成法は開発されておらず、研究用試薬として著しく限定された量しか入手できないのが実情である（非特許文献１、２、３）。【０００３】
代表的な３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼであるＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ由来ＤｎｃＶ（Ｖｃ ＤｎｃＶ）は、１分子のＡＴＰおよび１分子のＧＴＰから３’，３’−ｃＧＡＭＰを合成するのみならず、２分子のＧＴＰからｃｙｃｌｉｃ−ｄｉ−ＧＭＰ（ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ）を、２分子のＡＴＰからｃｙｃｌｉｃ−ｄｉ−ＡＭＰ（ｃ−ｄｉ−ＡＭＰ）を合成する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１６／０７９８９９号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｍｉｎｇ  Ｃ．  Ｈａｍｍｏｎｄ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，２０１６，１１３（７），１７９０−１７９５
【非特許文献２】Ｊｏｈｎ  Ｊ．  Ｍｅｋａｌａｎｏｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１２,１４９，  ３５８−３７０
【非特許文献３】Ｄｉｎｓｈａｗ  Ｊ．  Ｐａｔｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１３，１５３（５），１０９４−１１０７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前記の３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼの特性から、３’，３’−ｃＧＡＭＰ酵素合成においては、類似の環状ジヌクレオチドであるｃ−ｄｉ−ＧＭＰやｃ−ｄｉ−ＡＭＰが副生物として生じる。一般的に、物理化学的特性が類似する化合物同士は分離が難しく、３’，３’−ｃＧＡＭＰ酵素合成において、他種の環状ジヌクレオチドが著量副生した場合、医薬品として求められる高純度な製品の取得は困難である。
従って、これらの類似の環状ジヌクレオチドの合成段階での副生が抑制された３’，３’−ｃＧＡＭＰの実践的な酵素合成法の確立が課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明者らは鋭意検討を行った結果、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰやｃ−ｄｉ−ＡＭＰの副生を抑制する３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼの変異を見出し、当該変異酵素を用いた３’，３’−ｃＧＡＭＰ酵素合成系を確立することで、本発明を完成させた。【０００８】
即ち本発明によれば、以下の［１］〜［７］に記載のとおりである。
［１］
野生型３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼにおいて下記より選ばれる１又は複数のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基に変異を有する変異型３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼ：
Ｙ１１７、Ｎ１２１、Ｍ１３０、Ｋ１７７、Ａ２９２、Ｋ３５０。
［２］
前記変異が、下記より選ばれる１又は複数の変異に相当する変異を含む、［１］に記載の変異型３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼ：
Ｙ１１７（Ｈ, Ｒ, Ｋ）、
Ｎ１２１（Ｉ, Ｇ, Ａ, Ｖ, Ｌ, Ｐ）、
Ｍ１３０（Ｖ, Ｉ, Ｇ, Ａ, Ｌ, Ｐ, Ｆ, Ｈ, Ｙ, Ｗ）、
Ｋ１７７（Ｍ, Ｈ, Ｃ, Ｆ, Ｙ, Ｗ）、
Ａ２９２（Ｔ, Ｋ, Ｙ, Ｓ, Ｆ, Ｗ, Ｒ, Ｈ）、
Ｋ３５０（Ｅ, Ｄ, Ｍ, Ｎ, Ｑ, Ｃ）。
［３］
前記変異が、下記より選ばれる１又は複数の変異に相当する変異を含む、［１］に記載の変異型３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼ：
Ｙ１１７（Ｈ）、
Ｎ１２１（Ｉ）、
Ｍ１３０（Ｖ, Ｆ）、
Ｋ１７７（Ｍ, Ｈ, Ｃ）、
Ａ２９２（Ｔ, Ｋ, Ｙ）、
Ｋ３５０（Ｅ, Ｄ, Ｍ）。
［４］
［１］〜［３］のいずれか１項に記載の変異型３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼをコードするポリヌクレオチド。
［５］
［４］に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
［６］
［４］に記載のポリヌクレオチド、又は［５］に記載の発現ベクターによって形質転換された、形質転換体。
［７］
酵素を用いて１分子のＡＴＰおよびＧＴＰから３’，３’−ｃＧＡＭＰを製造する方法において、酵素として、［６］に記載の形質転換体を培養して産生させた変異型３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼを用いる、３’，３’−ｃＧＡＭＰの製造法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の酵素は、野生型の３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼと比較して、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰおよびｃ−ｄｉ−ＡＭＰの副生が著しく抑制されているものである。したがって当該酵素を用いた製造法では、従来の酵素合成法に比べて、類似の環状ジヌクレオチドの副生を低減し、効率的に３’，３’−ｃＧＡＭＰを合成することが可能である。このように、本発明の酵素及び当該酵素を用いた３’，３’−ｃＧＡＭＰの合成法は、３’，３’−ｃＧＡＭＰの実践的製造法としてきわめて有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお、同様な内容については繰り返しの煩雑を避けるために、適宜説明を省略する。
【００１１】
（１）活性の定義
３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼは、ＧＴＰとＡＴＰがともに存在する条件で、１分子のＡＴＰおよび１分子のＧＴＰから３’，３’−ｃＧＡＭＰを生成する反応を触媒する活性を有する。本発明において、同活性を「３’，３’−ｃＧＡＭＰ合成活性」とする。
また、当該酵素は２分子のＧＴＰからｃ−ｄｉ−ＧＭＰを、２分子のＡＴＰからｃ−ｄｉ−ＡＭＰを生成する反応を触媒する活性を有する。従って、ＧＴＰとＡＴＰがともに存在する条件においても、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰあるいはｃ−ｄｉ−ＡＭＰが副生成物として生成する。こうしたｃ−ｄｉ−ＧＭＰを副生する活性を「ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ副生活性」、ｃ−ｄｉ−ＡＭＰを副生する活性を「ｃ−ｄｉ−ＡＭＰ副生活性」とする。
また、３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼにおいて、３’，３’−ｃＧＡＭＰ合成活性（比活性）に対するｃ−ｄｉ−ＧＭＰ副生活性（比活性）の比率（％）を「ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ副生比率（％）」、３’，３’−ｃＧＡＭＰ合成活性（比活性）に対するｃ−ｄｉ−ＡＭＰ副生活性（比活性）の比率（％）を「ｃ−ｄｉ−ＡＭＰ副生比率（％）」とする。
【００１２】
本発明においては、常法により調製した酵素液を用いて、活性測定を行う。
２０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ  ＧＴＰおよび１ｍＭ  ＡＴＰを含有する５０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に酵素液を添加し、３７℃で３０分間保温することで反応を行った後、１００℃、３０秒の熱処理により反応を停止させる。
【００１３】
本発明の活性測定においては、上記の方法で得られた反応液中に含まれる３’，３’−ｃＧＡＭＰ、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ、ｃ−ｄｉ−ＡＭＰ等の物質量を、ＨＰＬＣ等の公知の方法を用いて定量する。
ＨＰＬＣ条件は以下の通りである。カラムには、ＹＭＣ社製Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ  Ｃ１８（粒子径５μｍ、内径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍ）を用いた。移動相としては、０，１Ｍ  トリエチルアミンリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）＋５％  アセトニトリルを使用し、流速は０．６ｍＬ／ｍｉｎ、移動相温度は常温とする。検出においては、上記反応液を移動相にて１０倍希釈したサンプル１０μＬをカラムに供し、波長２６０ｎｍの吸光を測定する。
上記測定条件にあっては、３’，３’−ｃＧＡＭＰは２５．０分、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰは１６．９分、ｃ−ｄｉ−ＡＭＰは４０．５分の保持時間を示す。
【００１４】
（２）野生型３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼ
本発明において、「野生型３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼ」とは、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに該当し、かつ、後述する「副生低減変異」を有しない３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼのことをいう。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列において、１もしくは４０個以下のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質。
【００１５】
配列番号１に記載する３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼは、ビブリオ・コレラの３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼ遺伝子（Ｖｃ ｄｎｃｖ）にコードされるＶｃ ＤｎｃＶである。
【００１６】
本明細書において「アミノ酸」とは、アミノ基とカルボキシル基を持つ有機化合物の総称である。特に限定されないが、例えばＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌを含む。
【００１７】
本発明における野生型３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼは、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質に該当する例としては、精製等の目的のため、３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼ活性を失わない範囲内で標識配列を付加したものなどが含まれる。
【００１８】
本発明における野生型３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼは、「副生低減変異」および「高活性変異」を有しない限り、（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質であってよい。
３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼのアミノ酸配列の同一性を表すときに用いる「９０％以上」は、例えば９０、９５、９８、９９、又は１００％であってもよい。又はそれらいずれかの値以上、又は範囲内であってもよい。この数は大きいほど好ましい。なぜならば、上記数が大きいほど、Ｖｃ ＤｎｃＶに近い特性を有していると考えられるためである。
【００１９】
本明細書において「同一性」とは、一般的に２つもしくは複数間のアミノ酸配列において同一なアミノ酸数の割合を、当該技術分野で公知の方法に従って算定したものである。割合を算定する前には、比較するアミノ酸配列群のアミノ酸配列を整列させ、同一の割合を最大にするために必要である場合はアミノ酸配列の一部に間隙を導入する。整列のための方法、割合の算定方法、比較方法、及びそれらに関連するコンピュータプログラムは、当該技術分野で従来からよく知られている（例えばＢＬＡＳＴ、ＧＥＮＥＴＹＸ等）。
本明細書において「相同性」は、特に断りのない限りＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ／）のＢＬＡＳＴによって測定された値で表すことができる。ＢＬＡＳＴでアミノ酸配列を比較するときのＡｌｇｏｒｉｔｈｍには、Ｂｌａｓｔｐをデフォルト設定で使用できる。測定結果はＰｏｓｉｔｉｖｅｓ又はＩｄｅｎｔｉｔｉｅｓとして数値化される。
【００２０】
野生型３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼは、（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列において、１もしくは４０個以下のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質であってよい。
【００２１】
野生型３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼの１もしくは４０個以下のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加している場合、この数は少ないほど好ましい。なぜならば、アミノ酸配列の欠失等が少ないほど、欠失等を受けていない場合の３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼに近い特性を有していることになるからである。
【００２２】
一般に、１もしくは数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入、又は他のアミノ酸による置換を受けたポリペプチドが、その生物学的活性を維持することは知られている(Mark et al., Proc Natl Acad Sci U S A.1984 Sep;81(18):5662-5666.、Zoller et al., Nucleic Acids Res. 1982 Oct 25;10(20):6487-6500.、Wang et al., Science. 1984 Jun 29;224(4656):1431-1433.)。
【００２３】
野生型３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼの１もしくは４０個以下のアミノ酸が別のアミノ酸に置換している場合には、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に置換していることが好ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、及び芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。これらの各グループ内のアミノ酸同士の置換は「保存的置換」と総称される。
【００２４】
（３）変異型３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼ
変異型３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼは、野生型３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼのアミノ酸配列において、特定の「副生低減変異」を有する３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼである。また、変異型３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼは、後述の「高活性変異」を有していてもよい。
【００２５】
以下に「副生低減変異」について説明する。
「副生低減変異」とは、野生型３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼに導入することで、３’，３’−ｃＧＡＭＰ合成活性に対するｃ−ｄｉ−ＧＭＰ副生活性あるいはｃ−ｄｉ−ＡＭＰ副生活性の比率が低下する性質を付与する変異である。
「副生低減変異」を有する変異型３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼにあっては、３’，３’−ｃＧＡＭＰ合成反応におけるｃ−ｄｉ−ＧＭＰおよびｃ−ｄｉ−ＡＭＰの副生が低減される。
「副生が低減される」とは、具体的には、前述の活性測定法で測定した３’，３’−ｃＧＡＭＰ合成活性（比活性）に対するｃ−ｄｉ−ＧＭＰ副生活性（比活性）の比率（ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ副生比率）あるいは３’，３’−ｃＧＡＭＰ合成活性（比活性）に対するｃ−ｄｉ−ＡＭＰ副生活性（比活性）の比率（ｃ−ｄｉ−ＡＭＰ副生比率）が、実験例１〜３に記載の方法で取得された、配列番号２にコードされるＶｃ  ＤｎｃＶのｃ−ｄｉ−ＧＭＰ副生比率あるいはｃ−ｄｉ−ＡＭＰ副生比率に対して、０．８倍以下であることを言う。
【００２６】
副生低減変異としては、下記より選ばれる１または複数のアミノ酸残基における変異に相当する変異が挙げられる。
Ｙ１１７、Ｎ１２１、Ｍ１３０、Ｋ１７７、Ａ２９２、Ｋ３５０。
上記の表記において、数字は配列番号１に示す野生型３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼのアミノ酸配列における位置を表し、数字の左側の文字は配列番号１に示す野生型３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼのアミノ酸配列における当該位置のアミノ酸残基（一文字表記）を示す。
上記の変異において、置換後のアミノ酸残基は、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰおよびｃ−ｄｉ−ＡＭＰの副生が抑制される限り、もとのアミノ酸残基以外のいずれのアミノ酸残基であってよい。
【００２７】
上記に示す副生低減変異の中でも、下記より選ばれる１又は複数の変異に相当する変異を含むことが好ましい。
なお、以下の表記において、数字および左側の文字は前述の通りであるが、数字の右側のカッコ内の文字は、変異後のアミノ酸残基（一文字表記）を示す。すなわち、たとえばＹ１１７（Ｈ, Ｒ, Ｋ）は、野生型３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼのアミノ酸配列における１１７位のＴｙｒ残基がＨｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓのいずれかのアミノ酸残基に置換されている変異を示す。
【００２８】
Ｙ１１７に変異がある場合、その変異はＹ１１７（Ｈ, Ｒ, Ｋ）であることが好ましく、中でもＹ１１７（Ｈ）であることが好ましい。上記変異が好ましい理由については定かではないが、Ｙ１１７が塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｒ，Ｋ，Ｈ）のいずれかに置換されることで、基質特異性が変化しているのだと考えられる。
【００２９】
Ｎ１２１に変異がある場合、その変異はＮ１２１（Ｉ，Ｇ，Ａ，Ｖ，Ｌ，Ｐ）であることが好ましく、中でもＮ１２１（Ｉ）であることが好ましい。上記変異が好ましい理由については定かではないが、Ｎ１２１が脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｉ，Ｇ，Ａ，Ｖ，Ｌ，Ｐ）のいずれかに置換されることで、基質特異性が変化しているのだと考えられる。
【００３０】
Ｍ１３０に変異がある場合、その変異はＭ１３０（Ｖ, Ｉ, Ｇ, Ａ, Ｌ, Ｐ, Ｆ, Ｈ, Ｙ, Ｗ）であることが好ましく、中でもＭ１３０（Ｖ, Ｆ）であることが好ましい。上記変異が好ましい理由については定かではないが、Ｍ１３０が、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ，Ａ，Ｖ，Ｌ，Ｉ，Ｐ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ，Ｆ，Ｙ，Ｗ）のいずれかに置換されることで、基質特異性が変化しているのだと考えられる。
【００３１】
Ｋ１７７に変異がある場合、その変異はＫ１７７（Ｍ, Ｈ, Ｃ, Ｆ, Ｙ, Ｗ）であることが好ましく、中でもＫ１７７（Ｍ, Ｈ, Ｃ）であることが好ましい。上記変異が好ましい理由については定かではないが、Ｋ１７７が硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ，Ｍ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ，Ｆ，Ｙ，Ｗ）のいずれかに置換されることで、基質特異性が変化しているのだと考えられる。
【００３２】
Ａ２９２に変異がある場合、その変異はＡ２９２（Ｔ, Ｋ, Ｙ, Ｓ, Ｆ, Ｗ, Ｒ, Ｈ）であることが好ましく、中でもＡ２９２（Ｔ, Ｋ, Ｙ）であることが好ましい。上記変異が好ましい理由については定かではないが、Ａ２９２が水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ，Ｔ）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｒ，Ｋ，Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ，Ｆ，Ｙ，Ｗ）のいずれかに置換されることで、基質特異性が変化しているのだと考えられる。
【００３３】
Ｋ３５０に変異がある場合、その変異はＫ３５０（Ｅ, Ｄ, Ｍ, Ｎ, Ｑ, Ｃ）であることが好ましく、中でもＫ３５０（Ｅ, Ｄ, Ｍ）であることが好ましい。上記変異が好ましい理由については定かではないが、Ｋ３５０が硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ，Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ，Ｎ，Ｅ，Ｑ）のいずれかに置換されることで、基質特異性が変化しているのだと考えられる。
【００３４】
（４）高活性変異について
変異型３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼは、「高活性変異」を有していてもよい。
以下に「高活性変異」について説明する。
「高活性変異」を有する変異型３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼにあっては、３’，３’−ｃＧＡＭＰ合成活性（比活性）が向上される。
「活性が向上される」とは、具体的には、前述の活性測定法で測定した３’，３’−ｃＧＡＭＰ合成活性（比活性）が、該当する「高活性変異」導入前後で少なくとも１．２倍以上（例えば１．２、１．５、１．８、２．０、３．０、５．０、又は１０．０倍であってもよく、それらの値以上、又はそれらの値の範囲内であってもよい）となることを言う。
【００３５】
高活性変異としては、具体的には、下記より選ばれる１または複数のアミノ酸残基における変異に相当する変異が挙げられる。つまり、「高活性変異」は、下記より選ばれるいずれかの変異に相当する変異であってもよいし、２または複数の変異の組み合わせに相当する変異であってもよい。
Ｒ４４、Ｅ１４６、Ｈ１７０、Ｌ２１１、Ｅ３４２、Ｓ３４６。
上記に示す高活性変異の中でも、下記より選ばれる１又は複数の変異に相当する変異を含むことが好ましい。
Ｒ４４Ｈ、Ｅ１４６Ｄ、Ｈ１７０Ｐ、Ｌ２１１Ｐ、Ｅ３４２Ｋ、Ｓ３４６Ｐ。
この変異の組み合わせは特に制限はないが、３’，３’−ｃＧＡＭＰ合成活性向上の観点から、中でもＥ１４６Ｄを有しているものが好ましく、更にＬ４１３Ｐの変異を有しているものが好ましい。Ｌ４１３Ｐの変異については、単独では３’，３’−ｃＧＡＭＰ合成活性向上効果を有さないが、Ｅ１４６Ｄの変異と組み合わせることで、より一層の３’，３’−ｃＧＡＭＰ合成活性向上効果を示す。上記の表記において、数字および左右の文字は前述の通りである。
また、本発明において副生低減変異と活性向上変異とを組み合わせる場合には、その変異の組合せは特に制限されないが、副生低減と高活性を両立するという観点から、Ｅ１４６Ｄ、Ｌ４１３Ｐ、Ｋ１７７Ｍ、Ｎ１２１Ｉの４変異を有することが好ましく、中でもＥ１４６Ｄ、Ｌ４１３Ｐ、Ｒ４４Ｈ、Ｈ１７０Ｐ、Ｌ２１１Ｐ、Ｋ１７７Ｍ、Ｎ１２１Ｉ、Ｍ１３０Ｖ、Ａ２９２Ｔ、Ｋ３５０Ｅの１０変異を有していることが好ましい。
【００３６】
（５）変異型３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼの製造
変異型３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼは、変異型３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼをコードする遺伝子を有する大腸菌等の微生物に当該遺伝子を発現させ、これをもとにした精製酵素又は粗酵素液の形態として利用することができる。
【００３７】
変異型３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼ遺伝子は、野生型３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼ遺伝子に対して、コードされる３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼに副生低減変異が導入されるように改変することにより得られる。なお、野生型３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼ遺伝子は、当該遺伝子を有する生物からクローニングや化学合成により取得される。遺伝子改変の方法については、公知の方法（Nucleic Acids Res.2004 Aug 10;32(14):e115等）に従えばよい。
【００３８】
粗酵素液として菌体の処理物を、又は精製酵素として当該処理物から得られる酵素を例示することができる。微生物の菌体の調製は、当該微生物が生育可能な培地を用い、常法により培養後、遠心分離等で集菌する方法で行うことができる。具体的に、大腸菌類に属する細菌を例に挙げ説明すれば、培地としてはブイヨン培地、ＬＢ培地（１．０％  トリプトン、０．５％  イーストエキス、０．５％  食塩）又は２ｘＹＴ培地（１．６％  トリプトン、１．０％  イーストエキス、０．５％  食塩）などを使用することができ、当該培地に種菌を接種後、３０〜５０℃で１〜１００時間程度必要により撹拌しながら培養し、得られた培養液を遠心分離して微生物菌体を回収することができる。
【００３９】
粗酵素液としては、上記微生物菌体を機械的破壊（ワーリングブレンダー、フレンチプレス、ホモジナイザー、乳鉢などによる）、凍結融解、自己消化、乾燥（凍結乾燥、風乾などによる）、酵素処理（リゾチームなどによる）、超音波処理、化学処理（酸、アルカリ処理などによる）などの一般的な処理法に従って処理し、当該破砕菌体を遠心分離して得られる上清を例示することができる。
【００４０】
精製酵素としては、上記菌体処理物から所望の酵素活性を有する画分を通常の酵素の精製手段（塩析処理、等電点沈澱処理、有機溶媒沈澱処理、透析処理、各種クロマトグラフィー処理など）を施して得られるものを例示することができる。
【００４１】
（６）変異型３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼを用いた３’，３’−ｃＧＡＭＰの合成
３’，３’−ｃＧＡＭＰの合成系では、原料としてＡＴＰおよびＧＴＰ、酵素として本発明の実施形態に係る３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼを添加する。添加量としては、ＡＴＰおよびＧＴＰが０．１〜１００ｍＭ、好ましくは０．１〜２０ｍＭの範囲、上記３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼが０．００１〜５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬの範囲とすることが好ましいが、この条件に限定されるものではない。なお、各基質のモル比は通常ＡＴＰ：ＧＴＰ＝１：１とすることが好ましいが、任意の基質の比率に変化させてもよい。また、反応系には、さらに金属塩としてマグネシウム塩、マンガン塩などを添加しても良い。金属塩の具体例としては、塩化マグネシウム、塩化マンガンなどを挙げることができる。当該反応系を１５℃以上、好ましくは３０〜５０℃で０．５〜１００時間、必要により攪拌しながら反応させることにより３’，３’−ｃＧＡＭＰを合成することができる。
【００４２】
（７）その他
本発明の一実施形態は、本発明の実施形態に係る３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼを含む、３’，３’−ｃＧＡＭＰ製造用材料である。この３’，３’−ｃＧＡＭＰ製造用材料は、例えば、本発明の実施形態に係る３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼの水溶液又はゾルを含んでいてもよい。
【００４３】
本発明の一実施形態は、本発明の実施形態に係る３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼをコードするポリヌクレオチドである。また本発明の一実施形態は、そのポリヌクレオチドを含む、ベクターである。また本発明の一実施形態は、そのポリヌクレオチド又はベクターによって形質転換された、形質転換体である。このポリヌクレオチド、ベクター、又は形質転換体を用いれば、本発明の実施形態に係る３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼを製造することができる。なお形質転換体は、細胞又は生物個体を含む。
【００４４】
本発明の実施形態に係る３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼが特定のアミノ酸配列を含むとき、そのアミノ酸配列中のいずれかのアミノ酸が化学修飾を受けていてもよい。そのような場合でも、本発明の実施形態に係る３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼは、特定のアミノ酸配列を含むといえる。一般的に、蛋白質に含まれるアミノ酸が生体内で受ける化学修飾としては、例えばＮ末端修飾（例えば、アセチル化 、ミリストイル化等）、Ｃ末端修飾（例えば、アミド化、グリコシルホスファチジルイノシトール付加等）、又は側鎖修飾（例えば、リン酸化、糖鎖付加等）等が知られている。
【００４５】
本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドもしくは塩基、又はそれらの等価物が、複数結合した形態で構成されているものを含む。ヌクレオチド及び塩基は、ＤＮＡ塩基又はＲＮＡ塩基を含む。上記の等価物は、例えばＤＮＡ塩基又はＲＮＡ塩基がメチル化等の化学修飾を受けているもの、又はヌクレオチドアナログを含む。ヌクレオチドアナログは、非天然のヌクレオチドを含む。
「ＤＮＡ鎖」とは、ＤＮＡ塩基又はそれらの等価物が２個以上連結した形態のことを表す。
「ＲＮＡ鎖」とは、ＲＮＡ塩基又はそれらの等価物が２個以上連結した形態のことを表す。
「塩基配列」とは、ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチド又はその等価物の配列である。一般的に塩基配列は、Ａ（アデニン）、Ｇ（グアニン）、Ｃ（シトシン）、Ｔ（チミン）によって表すことができる。また、ＴとＵ（ウラシル）は、用途に合わせて互いに読み替えることが可能である。また、ポリヌクレオチドがＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、又はＵからなる特定の塩基配列を含むとき、その塩基配列中のいずれかの塩基がその等価物に置き換わっていてもよい。そのような場合でも、上記ポリヌクレオチドは、上記特定の塩基配列を含むといえる。なお、ポリヌクレオチドはＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を用いて合成可能である。その他、ＤＮＡ塩基又はＲＮＡ塩基合成の受託会社（例えば、インビトロジェン社やタカラバイオ社等）から購入することもできる。
【００４６】
本明細書において「ベクター」は、例えば大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１２、ｐＥＴ−Ｂｌｕｅ−２）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５）、酵母由来プラスミド（例えばｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）、動物細胞発現プラスミド（例えばｐＡ１−１１、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ）、λファージなどのバクテリオファージ、アデノウイルス、レトロウイルス、バキュロウイルスなどのウイルス由来のベクターなどを用いることができる。これらのベクターは、プロモーター、複製開始点、又は抗生物質耐性遺伝子など、蛋白質発現に必要な構成要素を含んでいてもよい。ベクターは発現ベクターであってもよい。
以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。また、上記実施形態に記載の構成を組み合わせて採用することもできる。
【実施例】
【００４７】
＜実験例１＞ 野生型Ｖｃ ｄｎｃｖ遺伝子発現プラスミドｐＥＴＢｌｕｅ２−Ｋｍ‐ＤｎｃＶの構築
ｐＥＴＢｌｕｅ２−Ｋｍ−ＤｎｃＶの構築方法は以下の通りである。ビブリオ・コレラ由来３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼ遺伝子（Ｖｃ ｄｎｃｖ）を人工合成し、ｐＵＣＦａに挿入したプラスミドｐＵＣＦａ−Ｖｃ ＤｎｃＶを作製した。なお、Ｖｃ ｄｎｃｖ遺伝子において、２番目のアミノ酸残基（Ｒ）に相当する塩基配列はＡＧＡであるが、人工合成遺伝子においては、５’末端に制限酵素ＮｃｏＩの認識配列を付加し、当該塩基配列をＧＧＡとしたため、２番目のアミノ酸残基に変異（Ｒ２Ｇ）が導入された。また、人工合成の際に、大腸菌での発現に向けて、配列番号２に示すように配列を最適化した。以降の実施例においては、当該最適化された配列を野生型Ｖｃ ｄｎｃｖ遺伝子とし、当該遺伝子配列より取得される３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼを野生型ＤｎｃＶとする。当該プラスミドを制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで切断し、同じくプラスミドｐＥＴ−Ｂｌｕｅ−２−Ｋｍを制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで消化した後、２つのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼにて連結し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株のｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ （ｃｄｄ）遺伝子欠損株（ＪＭ１０９Δｃｄｄ）に導入した。得られたカナマイシン耐性形質転換体よりプラスミドｐＥＴＢｌｕｅ２−Ｋｍ−ＤｎｃＶを単離した。なお、ｐＥＴ−Ｂｌｕｅ−２−Ｋｍは、ｐＥＴ−Ｂｌｕｅ−２（Ｎｏｖａｇｅｎ社より入手）と発現プラスミドｐＴｒｃ １２−６（特開２００１−１０３９７３）を基に構築され、ｐＥＴ−Ｂｌｕｅ−２のβ−ラクタマーゼ遺伝子が完全に欠失し、その欠失部位にＴｎ９０３由来のカナマイシン耐性遺伝子が挿入されたものである。【００４８】
＜実験例２＞ 変異型Ｖｃ ｄｎｃｖ伝子発現プラスミドの構築
変異型Ｖｃ ｄｎｃｖ遺伝子の作製においては、いずれもＳＯＥ−ＰＣＲ（Gene. 1989 Apr 15;77(1):51-9.）の手法を用いた。具体的には、プライマー（配列Ｆ）と（配列ｒ−１〜２１）およびプライマー（配列Ｒ）と（配列ｆ−１~２１）を用いたＰＣＲにより２つの断片を得た後に、２つの断片を鋳型として、対応するプライマー（配列Ｆ）及び（配列Ｒ）を用いたＰＣＲを行い、変異型Ｖｃ ｄｎｃｖ遺伝子断片を得た。各変異とプライマーの関係を表１に示す。表中の下線で示した配列が変異の導入されるアミノ酸残基に相当する。【００４９】
【表１】
2020179714.tif 000002
【００５０】
得られたＤＮＡ断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）にてｐＥＴＢｌｕｅ２−Ｋｍに挿入し、ＪＭ１０９Δｃｄｄに導入した。得られたカナマイシン耐性形質転換体より変異型Ｖｃ ｄｎｃｖ遺伝子発現プラスミドを単離した。各変異が導入されたプラスミドは、ｐＥＴＢｌｕｅ２−Ｋｍ−ＤｎｃＶに各変異種を付加して命名した。具体的には、Ｋ１７７Ｍ変異を有する変異型Ｖｃ ＤｎｃＶをコードする変異型Ｖｃ ｄｎｃｖ遺伝子発現プラスミドは、ｐＥＴＢｌｕｅ２−Ｋｍ−ＤｎｃＶ Ｋ１７７Ｍと命名した。つづいて、取得された変異型Ｖｃ ｄｎｃｖ遺伝子発現プラスミドを鋳型として、同様の手順でさらに変異を導入することで、多重変異を有する変異型Ｖｃ ｄｎｃｖ遺伝子発現プラスミドを作製し、同様に命名した。具体的には、ｐＥＴＢｌｕｅ２−Ｋｍ−ＤｎｃＶ Ｋ１７７Ｍを鋳型として、さらにＥ１４６ＤおよびＬ４１３Ｐ変異を導入することで、３重変異を有するプラスミドを取得し、ｐＥＴＢｌｕｅ２−Ｋｍ−ＤｎｃＶ Ｋ１７７Ｍ／Ｅ１４６Ｄ／Ｌ４１３Ｐと命名した。なお、ｐＥＴＢｌｕｅ２−Ｋｍ−ＤｎｃＶで２番目のアミノ酸残基に相当する塩基配列を置換したため、変異型Ｖｃ ｄｎｃｖ遺伝子発現プラスミドにおいても同様の置換が導入されている。【００５１】
＜実験例３＞ 野生型および変異型ＤｎｃＶの調製【００５２】
（１）ＤｎｃＶ酵素液の調製
上記の野生型および各種の変異型Ｖｃ ｄｎｃｖ遺伝子発現プラスミドを保持する大腸菌Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ株を、２５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ培地（１．０％（ｗ／ｖ）ペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）５ｍＬに植菌し、３７℃で１６時間振とう培養した。得られた前培養液１ｍＬを２５μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび０．３６％マンノースを含有するＬＢ培地１００ｍＬに植菌し、３７℃で振とう培養した。ＯＤ６００が３．５に達した時点で、終濃度０．５ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、培養液を２５℃に冷却後、さらに一晩振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離（７，０００ｘｇ，１０分）により菌体を回収し、１０ｍＬの緩衝液（５０ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ジチオトレイトール）に懸濁した後、超音波処理を行い、菌体を破砕した。さらに遠心分離（１２，０００ｘｇ、１０分）により菌体残さを除去し、得られた上清を無細胞抽出液とした。【００５３】
（２）ＤｎｃＶの精製
得られた無細胞抽出液を、あらかじめ緩衝液（５０ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ジチオトレイトール）で平衡化したＨｉｔｒａｐ Ｑ ＦＦ（ＧＥヘルスケア社製）にアプライし、溶離緩衝液（５０ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ジチオトレイトール、１Ｍ ＮａＣｌ）にてグラジエント溶出し、活性画分を得た。当該画分を、あらかじめ緩衝液（１０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ジチオトレイトール）で平衡化したＰＤ−１０（ＧＥヘルスケア社製）にアプライし、バッファー交換した。当該酵素液を、あらかじめ緩衝液（１０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ジチオトレイトール）で平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）にアプライし、溶離緩衝液（１０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ジチオトレイトール、１Ｍ  ＮａＣｌ）にてグラジエント溶出し、活性画分を得た。当該画分を、あらかじめ緩衝液（５０ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ジチオトレイトール、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で平衡化したＰＤ−１０（ＧＥヘルスケア社製）にアプライしてバッファー交換し、当該酵素液を精製Ｖｃ ＤｎｃＶとして、以降の実験に用いた。【００５４】
＜実験例４＞野生型および変異型ＤｎｃＶの活性評価
実験例３で取得した精製Ｖｃ ＤｎｃＶについて、以下に示す方法で３’，３’−ｃＧＡＭＰ合成活性を測定し、加えて当該反応にて副生するｃ−ｄｉ−ＧＭＰおよびｃ−ｄｉ−ＡＭＰの合成活性を測定、算出した。すなわち、２０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ  ＧＴＰおよび１ｍＭ  ＡＴＰを含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に上記の精製酵素液を添加し、３７℃で３０分間保温することで反応を行った後、１００℃、３０秒の熱処理により反応を停止させた。【００５５】
ＨＰＬＣにて生成した３’，３’−ｃＧＡＭＰおよび直鎖状中間体であるｐｐｐＡｐＧ、また、副生したｃ−ｄｉ−ＧＭＰ／ｃ−ｄｉ−ＡＭＰおよび直鎖状中間体ｐｐｐＧｐＧ／ｐｐｐＡｐＡを定量した。
ＨＰＬＣ条件は以下の通りである。カラムには、ＹＭＣ社製Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ  Ｃ１８（粒子径５μｍ、内径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍ）を用いた。移動相としては、０，１Ｍ  トリエチルアミンリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）＋５％  アセトニトリルを使用し、流速は０．６ｍＬ／ｍｉｎ、移動相温度は常温とした。検出においては、上記反応液を移動相にて１０倍希釈したサンプル１０μＬをカラムに供し、波長２６０ｎｍの吸光を測定した。
上記測定条件にあっては、３’，３’−ｃＧＡＭＰは２５．０分、ｐｐｐＡｐＧは１９．７分、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰは１６．９分、ｐｐｐＧｐＧは１２．６分、ｃ−ｄｉ−ＡＭＰは４０．５分、ｐｐｐＡｐＡは３２．４分の保持時間を示す。【００５６】
３７℃で１分間に１μｍｏｌの直鎖状中間体および対応する環状ジヌクレオチドを生成する活性を１単位（ユニット）として、比活性を算出した。
結果を表２に示す。
表中、「（Ａ）３’，３’−ｃＧＡＭＰ（Ｕ／ｍｇ）」は３’，３’−ｃＧＡＭＰ合成活性の比活性、「（Ｂ）ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ（Ｕ／ｍｇ）」はｃ−ｄｉ−ＧＭＰ副生活性の比活性、「（Ｃ）ｃ−ｄｉ−ＡＭＰ（Ｕ／ｍｇ）」はｃ−ｄｉ−ＡＭＰ副生活性の比活性、「（Ｂ）／（Ａ）比」は、野生型ＤｎｃＶ（比較例１）のｃ−ｄｉ−ＧＭＰ副生比率に対する各変異株のｃ−ｄｉ−ＧＭＰ副生比率比を、「（Ｃ）／（Ａ）」は、野生型ＤｎｃＶのｃ−ｄｉ−ＡＭＰ副生比率に対する各変異株のｃ−ｄｉ−ＡＭＰ副生比率比をそれぞれ示す。
なお、副生低減変異を１つ導入した変異株を実施例１−１〜１−１３、活性向上変異を１つ導入しかつ副生低減変異を１つ導入した変異株を実施例２−１〜２−５、活性向上変異（Ｅ１４６Ｄ／Ｌ４１３Ｐの組合せ）を導入しかつ副生低減変異を１つ導入した変異株を実施例３−１〜３−６、副生低減変異及び活性向上変異を複数導入した変異株を４−１〜４−２、配列番号２によってコードされる人工合成ＤｎｃＶを比較例１、活性向上変異（Ｅ１４６Ｄ／Ｌ４１３Ｐの組合せ）のみを導入した変異株を比較例２とする。
また、変異を導入した３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼにおいて、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ副生比率あるいはｃ−ｄｉ−ＡＭＰ副生比率が野生型（人工合成ＤｎｃＶ）３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼのｃ−ｄｉ−ＧＭＰ副生比率あるいはｃ−ｄｉ−ＡＭＰ副生比率の０．８倍以下である場合は、表中に塗りつぶしで表記した。【００５７】
【表２】
2020179714.tif 000003
【００５８】
上記表２より、Ｙ１１７、Ｎ１２１、Ｍ１３０、Ｋ１７７、Ａ２９２、Ｋ３５０の各位置に変異を導入した３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼにおいては、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ副生比率およびｃ−ｄｉ−ＡＭＰ副生比率が低下することが明らかとなった。
具体的には、該当する変異を有する実施例１−１〜１−１３、実施例２−１〜２−５、実施例３−１〜３−６、実施例４−１〜４−２において、副生が低減されていることが明らかとなった。
また、変異型３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼについて、活性向上変異を導入した３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼ（具体的には実施例２−１〜２−５、比較例２、実施例３−１〜３−６、実施例４−１〜４−２）においては、３’，３’−ｃＧＡＭＰ合成活性の比活性が向上することが判明した。
さらに、変異型３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼについて、副生低減変異及び活性向上変異を複数導入した３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼ（具体的には実施例４−１〜４−２）においては、より高い副生低減効果及び／又は活性向上効果が奏されることが明らかとなった。【００５９】
＜実験例５＞変異型ＤｎｃＶによる３’，３’−ｃＧＡＭＰの合成
実験例３で取得した精製Ｖｃ ＤｎｃＶについて、以下に示す方法で３’，３’−ｃＧＡＭＰ合成反応を行い、加えて当該反応にて副生するｃ−ｄｉ−ＧＭＰおよびｃ−ｄｉ−ＡＭＰを定量することで、本発明の変異型３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼを用いて、実用的な３’，３’−ｃＧＡＭＰの合成が可能であるか、検討を行った。
すなわち、１０（ｖ／ｖ）％グリセロール、２０ｍＭ  塩化マグネシウム、５ｍＭ  ＧＴＰおよび５ｍＭ  ＡＴＰを含有する５０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に上記の精製酵素液を添加し、３０℃で２１時間保温することで反応を行った後、１００℃、３０秒の熱処理により反応を停止させた。添加精製酵素量は、実験例４での活性測定結果をもとに、３’，３’−ｃＧＡＭＰ合成活性が０．０４Ｕ／ｍＬとなる酵素量を添加した。ＨＰＬＣにて生成した３’，３’−ｃＧＡＭＰおよび副生したｃ−ｄｉ−ＧＭＰ／ｃ−ｄｉ−ＡＭＰを定量した。結果を表３に示す。表中、「（ａ）３’，３’−ｃＧＡＭＰ（ｍＭ）」は３’，３’−ｃＧＡＭＰの生成濃度、「（ｂ）ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ（ｍＭ）」はｃ−ｄｉ−ＧＭＰの生成濃度、「（ｃ）ｃ−ｄｉ−ＡＭＰ（ｍＭ）」はｃ−ｄｉ−ＡＭＰの生成濃度、「（ｂ）／（ａ）比」は、野生型ＤｎｃＶ（比較例３）の３’，３’−ｃＧＡＭＰ合成活性の生成濃度に対するｃ−ｄｉ−ＧＭＰの生成濃度に対する各変異株の３’，３’−ｃＧＡＭＰ合成活性の生成濃度に対するｃ−ｄｉ−ＧＭＰの生成濃度比を３’，３’−ｃＧＡＭＰ、「（ｃ）／（ａ）」は、野生型ＤｎｃＶ（比較例３）の３’，３’−ｃＧＡＭＰ合成活性の生成濃度に対するｃ−ｄｉ−ＡＭＰの生成濃度に対する各変異株の３’，３’−ｃＧＡＭＰ合成活性の生成濃度に対するｃ−ｄｉ−ＡＭＰの生成濃度比３’，３’−ｃＧＡＭＰをそれぞれ示す。
なお、副生低減変異を１つ導入した変異株を実施例５−１〜５−５、活性向上変異（Ｅ１４６Ｄ／Ｌ４１３Ｐの組合せ）を導入しかつ副生低減変異を１つ導入した変異株を実施例６−１〜６−６、副生低減変異及び活性向上変異を複数導入した変異株を７−１〜７−２、配列番号２によってコードされる人工合成ＤｎｃＶを比較例３、活性向上変異（Ｅ１４６Ｄ／Ｌ４１３Ｐの組合せ）のみを導入した変異株を比較例４とする。
また、変異型３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼにおいて、「（ｂ）／（ａ）」あるいは「（ｃ）／（ａ）」が野生型３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼの「（ｂ）／（ａ）」あるいは「（ｃ）／（ａ）」の０．８倍以下である場合は、表中に塗りつぶしで表記した。【００６０】
【表３】
2020179714.tif 000004
【００６１】
上記表３より、本発明の変異型３’，３’−ｃＧＡＭＰシンターゼは、実用的な３’，３’−ｃＧＡＭＰ合成に利用した場合であっても、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ及びｃ−ｄｉ−ＡＭＰの副生を低減可能であることが明らかとなった。
具体的には、該当する変異を有する実施例５−１〜５−５、実施例６−１〜６−６、実施例７−１〜７−２において、副生が低減されていることが明らかとなった。
このことから、本発明の酵素及び当該酵素を用いた３’，３’−ｃＧＡＭＰの合成法は、３’，３’−ｃＧＡＭＰの実践的製造法としてきわめて有用であることが明らかとなった。【００６２】
以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。
【配列表】
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【国際調査報告】
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