(57)【要約】  本発明は、A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs-5(ADAMTS5)に結合するアプタマーであって、以下の式（１）または式（２）（１）ＧＧＧＧＣＣＵＣＣ−Ｎ１−ＧＧＡＣＹＡＡＡＣＣ（２）ＧＧＧＧＣＣＵＣＣ−Ｎ１−ＧＧＡＣＷＹＡＡＡＣＣ（式中、Ｎ１は、３〜２４個の長さの塩基であり、ＹはＣまたはＵを表し、ＷはＡまたはＵを表す）で表される配列（ただし、ウラシルはチミンであってもよい）を含む、アプタマーを提供する。
2019093497.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs-5(ADAMTS5)に結合するアプタマーであって、以下の式（１）または式（２）
（１）ＧＧＧＧＣＣＵＣＣ−Ｎ１−ＧＧＡＣＹＡＡＡＣＣ
（２）ＧＧＧＧＣＣＵＣＣ−Ｎ１−ＧＧＡＣＷＹＡＡＡＣＣ
（式中、Ｎ１は、３〜２４個の長さの塩基であり、ＹはＣまたはＵを表し、ＷはＡまたはＵを表す）
で表される配列（ただし、ウラシルはチミンであってもよい）を含む、アプタマー。
【請求項２】
以下の式（１）’または式（２）’で表される潜在的二次構造を有する、請求項１に記載のアプタマー：
【化１】
2019093497.tif 000018
ここで、式（１）’および式（２）’における
【化２】
2019093497.tif 000019
部分は、バルジ構造を有していてもよいステム−ループ構造を示しかつＮ１部分であり、ＹはＣまたはＵを表し、ＷはＡまたはＵを表す。
【請求項３】
ADAMTS5の活性を阻害する、請求項１または２に記載のアプタマー。
【請求項４】
塩基長が８０以下である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のアプタマー。
【請求項５】
ＷがＵである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のアプタマー。
【請求項６】
ＹがＵである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のアプタマー。
【請求項７】
Ｎ１が、式（３）
（３）Ｘ１ＣＡＧＣＮ２ＧＣＵＸ２
（式中、Ｎ２は３〜１５個の任意の数のヌクレオチドであり、Ｘ１およびＸ２はＡ／Ｕ塩基の組み合わせまたはＧ／Ｃ塩基の組み合わせである）
で表される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のアプタマー。
【請求項８】
Ｎ２のヌクレオチド数が４である、請求項７に記載のアプタマー。
【請求項９】
以下の（a）、（b）または（c）のいずれかのヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のアプタマー：
（a）配列番号１、３〜６、１０〜１４、１６〜４５のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但しウラシルはチミンであってもよい）；
（b）配列番号１、３〜６、１０〜１４、１６〜４５のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但しウラシルはチミンであってもよい）において、１〜数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入あるいは付加されたヌクレオチド；または
（c）配列番号１、３〜６、１０〜１４、１６〜４５のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但しウラシルはチミンであってもよい）と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列。
【請求項１０】
アプタマーに含まれる少なくとも一つのヌクレオチドが修飾または改変されている、請求項９に記載のアプタマー。
【請求項１１】
アプタマーに含まれる各ピリミジンヌクレオチドのリボース２’位のヒドロキシル基が、同一または異なって、無置換であるか、水素原子、フッ素原子およびメトキシ基からなる群より選ばれる原子または基で置換されている、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のアプタマー。
【請求項１２】
アプタマーに含まれる各プリンヌクレオチドのリボース２’位のヒドロキシル基が、同一または異なって、無置換であるか、水素原子、フッ素原子およびメトキシ基からなる群より選ばれる原子または基で置換されている、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のアプタマー。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のアプタマーおよび機能性物質を含む複合体。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のアプタマーあるいは請求項１３に記載の複合体を含む医薬。
【請求項１５】
アグリカンが過剰に分解されることで生じる疾患の治療薬である、請求項１４に記載の医薬。
【請求項１６】
アグリカンが過剰に分解されることで生じる疾患が、関節炎または変形性膝関節症である、請求項１５に記載の医薬。
【請求項１７】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のアプタマーあるいは請求項１３に記載の複合体を用いることを特徴とする、ADAMTS5の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ADAMTS5に対するアプタマー及びその利用方法などに関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
ADAMTS5（A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs-5）はADAMTSファミリータンパク質の一つで、軟骨細胞や滑膜細胞で発現し、アグリカン分解酵素として機能し、軟骨病変における主要な原因タンパク質であることが知られている。よってADAMTS5阻害薬は、変形性膝関節症をはじめとする軟骨病変の治療剤として有用である可能性がある（非特許文献１〜４）。【０００３】
近年、ＲＮＡアプタマーの治療薬、診断薬、試薬への応用が注目されており、いくつかのＲＮＡアプタマーが臨床段階あるいは実用化段階に入っている。２００４年１２月には、世界初のＲＮＡアプタマー医薬であるＭａｃｕｇｅｎが加齢性黄斑変性症の治療薬として米国で承認された。ＲＮＡアプタマーとはタンパク質などの標的物質に特異的に結合するＲＮＡのことで、ＳＥＬＥＸ法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）を用いて作製することができる（特許文献１〜３参照）。ＳＥＬＥＸ法とは、１０１４個程度の異なるヌクレオチド配列を持つＲＮＡのプールから、標的物質に特異的に結合するＲＮＡを選別してくる方法である。使用されるＲＮＡは４０残基程度のランダム配列をプライマー配列で挟み込んだ構造をしている。このＲＮＡプールを標的物質と会合させて、フィルターなどを用いて標的物質に結合したＲＮＡのみを回収する。回収したＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲで増幅し、これを次のラウンドの鋳型として用いる。この作業を１０回程度繰り返すことにより、標的物質と特異的に結合するＲＮＡアプタマーを取得することができる場合がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開ＷＯ９１／１９８１３号パンフレット
【特許文献２】国際公開ＷＯ９４／０８０５０号パンフレット
【特許文献３】国際公開ＷＯ９５／０７３６４号パンフレット
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】J Biol Chem. 2002 Jun 21;277(25):22201-8
【非特許文献２】Nature. 2005 Mar 31;434(7033):648-52
【非特許文献３】Nat Clin Pract Rheumatol. 2008 Aug;4(8):420-7
【非特許文献４】Osteoarthritis Cartilage. 2015 Aug;23(8):1254-66
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ADAMTS5に対するアプタマー及びその利用方法などを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討した結果、ADAMTS5に対する良質なアプタマーを作製することに成功し、もって本発明を完成するに至った。【０００８】
即ち、本発明は、以下のとおりである：
［１］A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs-5(ADAMTS5)に結合するアプタマーであって、以下の式（１）または式（２）
（１）ＧＧＧＧＣＣＵＣＣ−Ｎ１−ＧＧＡＣＹＡＡＡＣＣ
（２）ＧＧＧＧＣＣＵＣＣ−Ｎ１−ＧＧＡＣＷＹＡＡＡＣＣ
（式中、Ｎ１は、３〜２４個の長さの塩基であり、ＹはＣまたはＵを表し、ＷはＡまたはＵを表す）で表される配列（ただし、ウラシルはチミンであってもよい）を含む、アプタマー。
［２］以下の式（１）’または式（２）’で表される潜在的二次構造を有する、［１］に記載のアプタマー：【０００９】
【化１】
2019093497.tif 000003
【００１０】
ここで、式（１）’および式（２）’における【００１１】
【化２】
2019093497.tif 000004
【００１２】
部分は、バルジ構造を有していてもよいステム−ループ構造を示しかつＮ１部分であり、ＹはＣまたはＵを表し、ＷはＡまたはＵを表す。
［３］ADAMTS5の活性を阻害する、［１］または［２］に記載のアプタマー。
［４］塩基長が８０以下である、［１］〜［３］のいずれかに記載のアプタマー。
［５］ＷがＵである、［１］〜［４］のいずれかに記載のアプタマー。
［６］ＹがＵである、［１］〜［４］のいずれかに記載のアプタマー。
［７］Ｎ１が、式（３）
（３）Ｘ１ＣＡＧＣＮ２ＧＣＵＸ２
（式中、Ｎ２は３〜１５個の任意の数のヌクレオチドであり、Ｘ１およびＸ２はＡ／Ｕ塩基の組み合わせまたはＧ／Ｃ塩基の組み合わせである）
で表される、［１］〜［６］のいずれかに記載のアプタマー。
［８］Ｎ２のヌクレオチド数が４である、［７］に記載のアプタマー。
［９］以下の（a）、（b）または（c）のいずれかのヌクレオチド配列を含む、［１］に記載のアプタマー：
（a）配列番号１、３〜６、１０〜１４、１６〜４５のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但しウラシルはチミンであってもよい）；
（b）配列番号１、３〜６、１０〜１４、１６〜４５のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但しウラシルはチミンであってもよい）において、１〜数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入あるいは付加されたヌクレオチド；または
（c）配列番号１、３〜６、１０〜１４、１６〜４５のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但しウラシルはチミンであってもよい）と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列。
［１０］アプタマーに含まれる少なくとも一つのヌクレオチドが修飾または改変されている、［９］に記載のアプタマー。
［１１］アプタマーに含まれる各ピリミジンヌクレオチドのリボース２’位のヒドロキシル基が、同一または異なって、無置換であるか、水素原子、フッ素原子およびメトキシ基からなる群より選ばれる原子または基で置換されている、［１］〜［１０］のいずれかに記載のアプタマー。
［１２］アプタマーに含まれる各プリンヌクレオチドのリボース２’位のヒドロキシル基が、同一または異なって、無置換であるか、水素原子、フッ素原子およびメトキシ基からなる群より選ばれる原子または基で置換されている、［１］〜［１１］のいずれかに記載のアプタマー。
［１３］［１］〜［１２］のいずれかに記載のアプタマーおよび機能性物質を含む複合体。
［１４］［１］〜［１２］のいずれかに記載のアプタマーあるいは［１３］に記載の複合体を含む医薬。
［１５］アグリカンが過剰に分解されることで生じる疾患の治療薬である、［１４］記載の医薬。
［１６］アグリカンが過剰に分解されることで生じる疾患が、関節炎または変形性膝関節症である、［１５］に記載の医薬。
［１７］［１］〜［１２］のいずれかに記載のアプタマーあるいは［１３］に記載の複合体を用いることを特徴とする、ADAMTS5の検出方法。
［１８］［１］〜［１２］のいずれかに記載のアプタマー、［１３］に記載の複合体、または[１４]に記載の医薬を対象に投与することを含む、アグリカンが過剰に分解されることで生じる疾患の治療方法。
［１９］アグリカンが過剰に分解されることで生じる疾患の治療における使用のための、［１］〜［１２］のいずれかに記載のアプタマー、［１３］に記載の複合体、または[１４]に記載の医薬。
［２０］アグリカンが過剰に分解されることで生じる疾患の治療用の医薬の製造における、［１］〜［１２］のいずれかに記載のアプタマー、または［１３］に記載の複合体の使用。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のアプタマー又は複合体は、関節炎や、変形性膝関節症の治療薬として有用であり得る。本発明のアプタマー又は複合体はまた、ADAMTS5の精製及び濃縮、ADAMTS5の標識、並びにADAMTS5の検出及び定量に有用であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】MFOLDプログラムから予想される、配列番号１で表されるヌクレオチド配列を有するアプタマーの二次構造を示す図である。
【図２】配列番号１で表されるヌクレオチド配列を有するアプタマーがADAMTS5に結合することを示すセンサーグラムである。
【図３】MFOLDプログラムから予想される、配列番号３ないし９で表されるヌクレオチド配列を有するアプタマーの二次構造を示す図である。
【図４】MFOLDプログラムから予想される、配列番号１０ないし１２で表されるヌクレオチド配列を有するアプタマーの二次構造を示す図である。
【図５−１】MFOLDプログラムから予想される、配列番号１６ないし１９で表されるヌクレオチド配列を有するアプタマーの二次構造を示す図である。
【図５−２】MFOLDプログラムから予想される、配列番号２０、２１および２５で表されるヌクレオチド配列を有するアプタマーの二次構造を示す図である。
【図６】MFOLDプログラムから予想される、配列番号２７ないし２９で表されるヌクレオチド配列を有するアプタマーの二次構造を示す図である。
【図７−１】MFOLDプログラムから予想される、配列番号３０ないし３５で表されるヌクレオチド配列を有するアプタマーの二次構造を示す図である。
【図７−２】MFOLDプログラムから予想される、配列番号３６ないし４１で表されるヌクレオチド配列を有するアプタマーの二次構造を示す図である。
【図７−３】MFOLDプログラムから予想される、配列番号４２ないし４５で表されるヌクレオチド配列を有するアプタマーの二次構造を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、ADAMTS5に対して結合活性を有するアプタマーを提供する。本発明のアプタマーは、ADAMTS5の活性（アグリカナーゼ活性など）を阻害し得る。
【００１６】
アプタマーとは、所定の標的分子に対する結合活性を有する核酸分子をいう。アプタマーは、所定の標的分子に対して結合することにより、所定の標的分子の活性を阻害し得る。本発明のアプタマーは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾核酸又はそれらの混合物であり得る。また本発明のアプタマーは、直鎖状又は環状の形態であり得る。
【００１７】
本発明は、ADAMTS5に対して結合活性を有するアプタマーを提供する。一実施態様において、本発明のアプタマーは、ADAMTS5に結合することによって、ADAMTS5の活性を阻害し得る。
【００１８】
ADAMTS5とは、軟骨細胞や滑膜細胞などが発現するタンパク質であり、例えば、UniprotKBにおいてQ9UNA0で表されるアミノ酸配列を持つタンパク質である。本発明におけるADAMTS5は、動物体内で作られる他、マウスなどの哺乳細胞、昆虫細胞、大腸菌などの培養細胞を用いても作製することができ、更に化学合成によっても作ることができる。培養細胞や化学合成によって作製する場合は、自体公知の方法で容易に変異体を作製することができる。ここでADAMTS5の「変異体」とは、公知のADAMTS5のアミノ酸配列からアミノ酸が１〜数個置換、欠失、付加等されたものや、公知のADAMTS5のアミノ酸配列の一部分のアミノ酸配列からなるものであって、本来ADAMTS5が有している活性の少なくとも一つ以上の活性を有しているタンパク質又はペプチドを意味する。アミノ酸が置換、付加される場合、当該アミノ酸は天然のアミノ酸であってもよいし、非天然のアミノ酸であってもよい。本発明におけるADAMTS5はこれらの変異体を含む。
ADAMTS5はプロドメインが切断され活性型として分泌されるが、その後自己消化することによりC末端側Cys-richドメイン途中で切断されtruncate型としても存在する。本発明のアプタマーは、いずれのADAMTS5にも結合し、いずれのADAMTS5の活性も阻害し得る。
【００１９】
一実施態様において、本発明は、
ADAMTS5に結合し、以下の式（１）または式（２）
（１）ＧＧＧＧＣＣＵＣＣ−Ｎ１−ＧＧＡＣＹＡＡＡＣＣ
（２）ＧＧＧＧＣＣＵＣＣ−Ｎ１−ＧＧＡＣＷＹＡＡＡＣＣ
（式中、Ｎ１は３〜２４個の任意の数のヌクレオチドであり、ＹはＣまたはＵを表し、ＷはＡまたはＵを表す）
で表される配列（ただし、ウラシルはチミンであってもよい）を含む、アプタマー：
を提供する。
【００２０】
ADAMTS5に対する阻害活性とは、ADAMTS5が保有する任意の活性に対する阻害能を意味する。例えば、ADAMTS5はアグリカンを分解する活性を有することが知られている。従って、ADAMTS5に対する阻害活性とは、ADAMTS5によるアグリカンの分解を阻害する活性のことであり得る。
よって、本発明のアプタマーがADAMTS5に結合し、ADAMTS5によるアグリカン分解活性を阻害した場合、アグリカンが過剰に分解されることで生じるとされている疾患の治療に効果があると考えられる。
【００２１】
本発明のアプタマーは、任意の哺乳動物に由来するADAMTS5に対する阻害活性を有し得る。このような哺乳動物としては、例えば、霊長類（例、ヒト、サル）、げっ歯類（例、マウス、ラット、モルモット）、並びにペット、家畜及び使役動物（例、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）が挙げられる。
【００２２】
本発明のアプタマーは、ADAMTS5には結合するが、同様のアグリカン分解能を有するADAMTS4には結合しないという、ADAMTS5への特異性を有するアプタマーであり得る。
ADAMTS5はADAMTS4よりも1000倍程度のアグリカン分解活性を有するとの報告があり（J.Biol. Chem. 2007, 282:18294-18306）、またADAMTS5は関節炎の発症において重要であることも報告されている（非特許文献２）。本発明のアプタマーは、ADAMTS5によってアグリカンが過剰に分解されることで生じるとされている疾患の治療に有用である。
【００２３】
上記式（１）および式（２）中、Ｎ１は、任意の数のヌクレオチドを表す。本明細書において「塩基」とは、核酸を構成するアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）又はチミン（Ｔ）のいずれかを意味する。
Ｎ１のヌクレオチド数は、式（１）および式（２）で表わされるヌクレオチド配列を含むアプタマーがADAMTS5に結合する限り特に限定されないが、好ましくは３〜２４個、５〜１８個、６〜１５個、８〜１５個、１１〜１５個、１３〜１５個などであり得る。より好ましくは６〜１５個、８〜１５個、１１〜１５個、１３〜１５個であり、最も好ましくは１３〜１５個である。
Ｎ１のヌクレオチド数が３未満であると後述するようにＮ１部分でループ構造が形成できず、Ｎ１のヌクレオチド数が２４を超えるとＮ１部分の配列や構造がアプタマー全体の機能に影響しADAMTS5への結合活性を失う場合がある。
【００２４】
好ましい実施態様において、上記式（１）および式（２）中、Ｎ１は、ADAMTS5に結合し、ステム−ループ構造を形成するために必要な塩基数とヌクレオチド配列を有する。Ｎ１で示されるヌクレオチド配列で形成されるステム−ループ構造におけるステム部分は、バルジ構造を採っていてもよい。
ここで、上記式（１）および式（２）中、ＧＧＧＧＣＣＵＣＣ部分のＵＣＣと、ＧＧＡＣＹＡＡＡＣＣまたはＧＧＡＣＷＹＡＡＡＣＣ部分におけるＧＧＡとが塩基対を形成しステム構造を採る。本発明のアプタマーがADAMTS5に結合するには、後述するように、上記式（１）および式（２）におけるＮ１とそれに隣接するＵＣＣおよびＧＧＡでステム−ループ構造を採ることが重要である。
したがって、Ｎ１で示されるヌクレオチド配列で形成されるステム−ループ構造は、得られるアプタマーがADAMTS5に結合する限りにおいて、ループ構造だけであってもよい。すなわちループ部分の最小塩基数は３であり、ステム部分の最小塩基数は０（式（１）および式（２）中、ＧＧＧＧＣＣＵＣＣ部分のＵＣＣと、ＧＧＡＣＹＡＡＡＣＣまたはＧＧＡＣＷＹＡＡＡＣＣ部分におけるＧＧＡとがステム構造を形成し、Ｎ１はループ部分のみ形成する）である。
【００２５】
ループ部分の長さは本発明のアプタマーがADAMTS5に結合する限りにおいて特に限定されず、例えば３〜１５個、３〜１１個、４〜１１個などであってよいが、好ましくは３〜１１個であり、より好ましくは３〜８個であり、さらに好ましくは３〜５個であり、最も好ましくは３個または４個である。
またループ部分のヌクレオチド配列は、本発明のアプタマーがADAMTS5に結合する限りにおいて可変である。
【００２６】
あるいは本発明のアプタマーは、下記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）
（ａ）配列番号１、３、４〜６、１０〜４４のいずれかから選択されるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１、３、４〜６、１０〜４４のいずれかから選択されるヌクレオチド配列において、ＧＧＧＧＣＣＵＣＣ−Ｎ１−ＧＧＡＣＹＡＡＡＣＣまたはＧＧＧＧＣＣＵＣＣ−Ｎ１−ＧＧＡＣＷＹＡＡＡＣＣ（式中、Ｎ１は３〜２４個の任意の数のヌクレオチドであり、ＹはＣまたはＵを表し、ＷはＡまたはＵを表す）におけるＧＧＧＧＣＣＵＣＣおよびＧＧＡＣＹＡＡＡＣＣもしくはＧＧＡＣＷＹＡＡＡＣＣで表される配列を除く１個又は数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入または付加されたヌクレオチド配列；あるいは
（ｃ）配列番号１、３、４〜６、１０〜４４のいずれかから選択されるヌクレオチド配列と７０％以上（好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の同一性を有する（但し、ＧＧＧＧＣＣＵＣＣ−Ｎ１−ＧＧＡＣＹＡＡＡＣＣまたはＧＧＧＧＣＣＵＣＣ−Ｎ１−ＧＧＡＣＷＹＡＡＡＣＣ（式中、Ｎ１、ＹおよびＷは上記と同様である）におけるＧＧＧＧＣＣＵＣＣおよびＧＧＡＣＹＡＡＡＣＣもしくはＧＧＡＣＷＹＡＡＡＣＣで表される配列は同一である）ヌクレオチド配列；のいずれかで表わされるヌクレオチド配列を含む、ADAMTS5に結合するアプタマーであり得る。
【００２７】
より好ましい実施態様において、Ｎ１は、式（３）
（３）Ｘ１ＣＡＧＣＮ２ＧＣＵＸ２
（式中、Ｎ２は３〜１５個の任意の数のヌクレオチドであり、Ｘ１およびＸ２はＡ／Ｕ塩基の組み合わせまたはＧ／Ｃ塩基の組み合わせである）
で表される。
ここで、式（３）におけるＸ１ＣＡＧＣとＧＣＵＸ２とでステム構造（バルジ構造を含む）を形成し、Ｎ２部分がループ構造を形成する。
Ｎ２のヌクレオチド数は、通常３〜１５個であり、好ましくは３〜１１個であり、より好ましくは３〜８個であり、さらに好ましくは３〜５個であり、最も好ましくは４個である。
Ｎ２で示されるループ部分の配列は、式（３）全体としてステム−ループ構造を形成する限り特に限定されず、任意の塩基の組み合わせであってもよい。しかしながら好ましい態様において式（３）におけるＮ２は、ＧＣＵＣ、ＵＵＣＧ、ＧＵＡＡ、ＡＵＵＣのいずれかである。
またＸ１およびＸ２は、Ａ／Ｕ塩基の組み合わせまたはＧ／Ｃ塩基の組み合わせであるが、好ましくはＸ１がＡでＸ２がＵの組み合わせもしくはＸ１がＧでＸ２がＣの組み合わせである。より好ましくは、Ｘ１がＡでＸ２がＵの組み合わせである。
【００２８】
上記（１）または（２）で表される配列は、以下の式（１）’または（２）’：
【００２９】
【化３】
2019093497.tif 000005
【００３０】
で表される潜在的二次構造を形成することができる。本発明のアプタマーは、上記（１）または（２）で表される配列部分において上記構造を採ることで、種々の活性を有すると考えられる。なお式（１）’または（２）’の構造が、それぞれ上記式（１）または（２）に対応する。
また上記構造において、５’末端と３’末端それぞれに続く配列間の相互作用によって、好ましくはステム構造（バルジ構造を含む）が形成され得る。
本発明のアプタマーが種々の活性を有するためには、上記潜在的２次構造で示されるようなステム−ループ構造が維持されることが望ましい。ステム構造は相補的な塩基対によって形成されるが、塩基対の数は特に限定されない。またステム構造においては、全体としてステム構造を構成する限りにおいて、その一部において塩基対を形成しなくてもアプタマー活性は維持される。
【００３１】
式（１）’または（２）’の上部にあるステム−ループ部分ＳＬ１は、式（１）および式（２）におけるＮ１部分に相当する。
ここで、Ｎ１が上記式（３）で表される配列をとることにより、式（１）’または（２）’で表されるステム−ループ構造がより安定に維持されると考えられる。即ち、式（３）におけるＡＣＡＧＣと、ＧＣＵＵでステム構造（バルジ構造を含む）が式（１）’または（２）’におけるＳＬ１部分のステム構造を形成し、式（３）におけるＮ２がＳＬ１部分のループ構造を形成する。
また式（１）および式（２）におけるＧＧＧＧＣＣＵＣＣ部分のＵＣＣと、ＧＧＡＣＹＡＡＡＣＣまたはＧＧＡＣＷＹＡＡＡＣＣ部分におけるＧＧＡとが塩基対を形成しステム構造を形成し、さらにＧＧＧＧＣＣＵＣＣ部分における最初のＧＧとＧＧＡＣＹＡＡＡＣＣまたはＧＧＡＣＷＹＡＡＡＣＣ部分における最後のＣＣとがステム構造を形成し、残りの配列でインターナルループを形成する。
【００３２】
なお上記式（１）および式（２）における違いはＷの有無のみである。そして式（１）’または（２）’から分かるように、塩基Ｗ周辺はインターナルループを構成している。そして実施例で十分に示されるようにＷの有無が構造上および活性上の大きな違いにはならない。したがって式（１）および式（２）で表される配列を有する本発明のアプタマーは、全て同じ技術的思想に基づいて発明されたものである。
【００３３】
本発明のアプタマーの長さは特に限定されず、通常、約２５〜約２００ヌクレオチドであり得るが、例えば、約２５ヌクレオチド以上（例、３０ヌクレオチド以上、３１ヌクレオチド以上、３２ヌクレオチド以上、３３ヌクレオチド以上）であり、好ましくは２５ヌクレオチド以上であり、より好ましくは３０ヌクレオチド以上であり、さらに好ましくは３３ヌクレオチド以上であり得る。また、例えば、約１００ヌクレオチド以下、通常約８０ヌクレオチド以下、好ましくは約７０ヌクレオチド以下、より好ましくは約６０ヌクレオチド以下、さらに好ましくは約５０ヌクレオチド以下、さらに好ましくは約４５ヌクレオチド以下（例、４４ヌクレオチド以下、４３ヌクレオチド以上、４２ヌクレオチド以下、４１ヌクレオチド以下、４０ヌクレオチド以下）であり得る。総ヌクレオチド数が少なければ、化学合成及び大量生産がより容易であり、かつコスト面でのメリットも大きい。また、化学修飾も容易であり、生体内安定性も高く、毒性も低いと考えられる。
よって本発明のアプタマーの長さとしては、通常約２５〜約２００ヌクレオチドであり得、好ましくは２５〜８０ヌクレオチドであり、より好ましくは２５〜６０ヌクレオチドであり、さらに好ましくは２５〜５０ヌクレオチドであり、最も好ましくは３０〜４５ヌクレオチドである。
【００３４】
本発明のアプタマーはまた、上記式（１）で表わされるヌクレオチド配列を含むアプタマー（アプタマー（Ａ））の複数の連結物、上記式（１）で表わされるヌクレオチド配列において、１又は数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を含むアプタマー（アプタマー（Ｂ））の複数の連結物、並びに１又は複数のアプタマー（Ａ）と１又は複数のアプタマー（Ｂ）との連結物、からなる群より選ばれる連結物であり得る。これらの連結物も、ADAMTS5に結合し得る。
ここで連結はタンデム結合にて行われ得る。また、連結に際し、リンカーを利用してもよい。リンカーとしては、ヌクレオチド鎖（例、１〜約２０ヌクレオチド）、非ヌクレオチド鎖（例、−（ＣＨ２）ｎ−リンカー、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−リンカー、ヘキサエチレングリコールリンカー、ＴＥＧリンカー、ペプチドを含むリンカー、−Ｓ−Ｓ−結合を含むリンカー、−ＣＯＮＨ−結合を含むリンカー、−ＯＰＯ３−結合を含むリンカー）が挙げられる。上記複数の連結物における複数とは、２以上であれば特に限定されないが、例えば２個、３個又は４個であり得る。
【００３５】
本発明のアプタマーに含まれる各ヌクレオチドはそれぞれ、同一又は異なって、リボース（例、ピリミジンヌクレオチドのリボース、プリンヌクレオチドのリボース）の２’位においてヒドロキシ基を含むヌクレオチド（即ち、天然のリボヌクレオチド）であるか、あるいはリボースの２’位において、ヒドロキシ基が、任意の原子又は基で置換（修飾）されているヌクレオチド（本発明において、「修飾ヌクレオチド」と記載する場合がある）であり得る。
【００３６】
このような任意の原子又は基としては、例えば、水素原子、フッ素原子又は−Ｏ−アルキル基（例、−Ｏ−Ｍｅ基）、−Ｏ−アシル基（例、−Ｏ−ＣＨＯ基）、アミノ基（例、−ＮＨ２基）で置換されているヌクレオチドが挙げられる。本発明のアプタマーはまた、少なくとも１種（例、１、２、３又は４種）のヌクレオチドが、リボースの２’位において、ヒドロキシ基、又は上述した任意の原子又は基、例えば、水素原子、フッ素原子、ヒドロキシ基及び−Ｏ−Ｍｅ基からなる群より選ばれる少なくとも２種（例、２、３又は４種）の基を含む修飾ヌクレオチドであり得る。
【００３７】
本発明のアプタマーにおいてはまた、全てのピリミジンヌクレオチドが、リボースの２’位がフッ素原子であるヌクレオチドであるか、あるいは該フッ素原子が、同一又は異なって、無置換であるか、上述した任意の原子又は基、好ましくは、水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されているヌクレオチドであり得る。特に本発明のアプタマーの製造方法として、後述するＤｕｒａＳｃｒｉｂｅＴＭ  Ｔ７  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）を用いた製造方法を適用した場合、全てのピリミジンヌクレオチドのリボース２’位がフルオロ化したアプタマーが得られる。フッ素原子がその他の上記原子又は基で置換されている本発明のアプタマーは、後述の方法で製造することができる。
【００３８】
本発明のアプタマーにおいてはまた、全てのプリンヌクレオチドが、リボースの２’位がヒドロキシ基であるヌクレオチドであるか、あるいは該ヒドロキシ基が、同一又は異なって、無置換であるか、上述した任意の原子又は基、好ましくは、水素原子、メトキシ基及びフッ素原子からなる群より選ばれる原子又は基で置換されるヌクレオチドであり得る。ヒドロキシ基がその他の上記原子又は基で置換されている本発明のアプタマーは、後述の方法で製造することができる。
【００３９】
本発明のアプタマーにおいてはまた、全てのピリミジンヌクレオチドが、リボースの２’位のフッ素原子が上述した任意の原子又は基、例えば、水素原子、ヒドロキシ基及び−Ｏ−Ｍｅ基からなる群より選ばれる同一の原子又は基で置換されているヌクレオチドであり得る。
本発明のアプタマーにおいてはまた、全てのプリンヌクレオチドが、リボースの２’位のヒドロキシ基が上述した任意の原子又は基、例えば、水素原子、フッ素原子及び−Ｏ−Ｍｅ基からなる群より選ばれる同一の原子又は基で置換されているヌクレオチドであり得る。
【００４０】
好ましい実施態様において、本発明のアプタマーに含まれる各ピリミジンヌクレオチドはいずれも、リボースの２’位においてフッ素原子を含むヌクレオチドであり、かつ各プリンヌクレオチドはいずれも、リボースの２’位においてヒドロキシ基を含むヌクレオチドである。別の実施態様において、上記各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位のフッ素原子は、それぞれ独立して水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されていてもよく、かつ上記各プリンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシ基は、それぞれ独立して水素原子、メトキシ基及びフッ素原子からなる群より選ばれる原子又は基で置換されていてもよい。
【００４１】
尚、本明細書においては、アプタマーを構成するヌクレオチドをＲＮＡと仮定して（すなわち糖基をリボースと仮定して）、ヌクレオチド中の糖基への修飾の態様を説明するが、これは、アプタマーを構成するヌクレオチドからＤＮＡが除外されることを意味するものではなく、適宜ＤＮＡへの修飾として読み替えられる。例えば、アプタマーを構成するヌクレオチドがＤＮＡである場合、リボースの２’位のヒドロキシル基のＸへの置き換えは、デオキシリボースの２’位の水素原子のＸへの置き換えとして読み替えられる。
本発明のアプタマーにおいて、ウラシルをチミンに置換することによって、ADAMTS5に対する結合性、ADAMTS5のアグリカン分解を阻害する活性、アプタマーの安定性、薬物送達性、血液中での安定性等を高めることが可能である。
【００４２】
本発明のアプタマーにおいてはまた、ヌクレオチドにおけるリン酸ジエステル結合の１又は数個、例えば、１〜２個、１〜３個、１〜４個、１〜５個のヌクレオチドが任意の置換基で修飾もしくは置換されていてもよい。例えば、リン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合等に置換されていてもよい。ここで、例えば「ヌクレオチドがホスホロチオエート結合に置換されている」とは、隣接するヌクレオチド間の結合部位にあるリン酸基が硫黄化されている、すなわち、ホスホジエステル結合がホスホロチオエート結合に改変されていることを示す。
【００４３】
本発明のアプタマーにおいてはまた、アプタマーを安定化し、その活性を向上させる目的で、１又は数個、例えば、１〜２個、１〜３個、１〜４個、１〜５個のヌクレオチドが架橋化核酸Ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＢＮＡ）又はＬｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）で置換されていてもよい。ここで、「架橋化核酸」とは、核酸の自由度を分子内架橋で拘束することにより、相補配列に対する結合親和性を高め、かつヌクレアーゼ耐性を獲得する構造を持つものをいい、例えば、２’，４’−ＢＮＡ（ＬＮＡ）、２’−Ｏ，４’−Ｃ−ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＥＮＡ）などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００４４】
本発明のアプタマーはADAMTS5に結合するアプタマーであり、さらに好ましくはADAMTS5の活性を阻害することができるアプタマーである。本発明のアプタマーがADAMTS5に結合するか否かは、例えば実施例１等の表面プラズモン共鳴法を利用した試験により評価することができ、また本発明のアプタマーがADAMTS5の活性を阻害することができるか否かは、例えば実施例１等のアグリカンを利用した試験などによって評価することができる。
【００４５】
本発明のアプタマーは、ADAMTS5に対する結合性、安定性、薬物送達性等を高めるため、各ヌクレオチドの糖残基（例、リボース）が修飾されたものであってもよい。糖残基において修飾される部位としては、例えば、糖残基の２’位、３’位及び／又は４’位の酸素原子を他の原子に置き換えたものなどが挙げられる。修飾の種類としては、例えば、フルオロ化、Ｏ−アルキル化（例、Ｏ−メチル化、Ｏ−エチル化）、Ｏ−アリル化、Ｓ−アルキル化（例、Ｓ−メチル化、Ｓ−エチル化）、Ｓ−アリル化、アミノ化（例、−ＮＨ２）が挙げられる。他にも、４’位の酸素を硫黄に置き換えた４’−ＳＲＮＡ、２’位と４’位とをメチレンを介して架橋したＬＮＡ（Locked Nucleic Acid）、３’位の水酸基をアミノ基に置き換えた３’−Ｎ−ホスホロアミデート核酸などを例として挙げることができる。本発明のアプタマーは、その製造方法からピリミジンヌクレオチドのリボース２’位の酸素原子が一定の修飾をもって製造される場合があり、後述するＤｕｒａＳｃｒｉｂｅＴＭ  Ｔ７  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）を用いた製造方法を適用した場合、好ましくは全てのピリミジンヌクレオチドのリボース２’位がフルオロ化したアプタマーが製造される。したがって、得られたアプタマーに対しその後このような糖残基の改変を加えることで、塩基配列は同じであるが活性が高められた様々なバリエーションのアプタマーを製造することが可能である。以上のことから、本発明のアプタマーは、好ましくは少なくとも一つのヌクレオチドの糖残基が修飾されたアプタマーであり得る。このような糖残基の改変は、自体公知の方法により行うことができる（例えば、Ｓｐｒｏａｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１９，７３３−７３８；Ｃｏｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１９，２６２９−２６３５；Ｈｏｂｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７３），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １２，５１３８−５１４５参照）。具体的には、全てのピリミジンヌクレオチドのリボース２’位の水酸基がフルオロ基に置換されたアプタマーをベースに、リボース２’位における水酸基を、水素原子、ヒドロキシル基及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換したアプタマーを製造することができる。
【００４６】
本発明のアプタマーはまた、ADAMTS5に対する結合性、安定性、薬物送達性等を高めるため、核酸塩基（例、プリン、ピリミジン）が改変（例、化学的置換）されたものであってもよい。このような改変としては、例えば、５位ピリミジン改変、６及び／又は８位プリン改変、環外アミンでの改変、４−チオウリジンでの置換、５−ブロモ又は５−ヨード−ウラシルでの置換が挙げられる。また、ヌクレアーゼ及び加水分解に対して耐性であるように、本発明のアプタマーに含まれるリン酸基が改変されていてもよい。例えば、Ｐ（Ｏ）Ｏ基が、Ｐ（Ｏ）Ｓ（チオエート）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（ジチオエート）、Ｐ（Ｏ）ＮＲ２（アミデート）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｒ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ又はＣＨ２（ホルムアセタール）又は３’−アミン（−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−）で置換されていてもよい〔ここで各々のＲ又はＲ’は独立して、Ｈであるか、あるいは置換されているか、又は置換されていないアルキル（例、メチル、エチル）である〕。
連結基としては、−Ｏ−、−Ｎ−又は−Ｓ−が例示され、これらの連結基を通じて隣接するヌクレオチドに結合し得る。
改変はまた、キャッピングのような３’及び５’の改変を含んでもよい。
【００４７】
改変はさらに、ポリエチレングリコール、アミノ酸、ペプチド、ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄＴ、核酸、ヌクレオシド、Ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ、Ｌｉｔｈｏｃｏｌｉｃ−ｏｌｅｙｌ、Ｄｏｃｏｓａｎｙｌ、Ｌａｕｒｏｙｌ、Ｓｔｅａｒｏｙｌ、Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ、Ｏｌｅｏｙｌ、Ｌｉｎｏｌｅｏｙｌ、その他脂質、ステロイド、コレステロール、カフェイン、ビタミン、色素、蛍光物質、抗癌剤、毒素、酵素、放射性物質、ビオチンなどを末端に付加することにより行われ得る。このような改変については、例えば、米国特許第５，６６０，９８５号、同第５，７５６，７０３号を参照のこと。
【００４８】
特に、改変がＰＥＧの末端付加によって行われる場合、ＰＥＧの分子量は特に限定されないが、好ましくは１０００〜１０００００、より好ましくは３００００〜９００００である。ＰＥＧは、直鎖状であってもよいし、二つ以上の鎖に分岐したもの（マルチアームＰＥＧ）であってもよい。
このようなＰＥＧとしては特に限定されず、当業者であれば市販あるいは公知のＰＥＧを適宜選択して用いることができる（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｅｇ−ｄｒｕｇ．ｃｏｍ／ｐｅｇ＿ｐｒｏｄｕｃｔ／ｂｒａｎｃｈｅｄ．ｈｔｍｌを参照のこと）が、本発明のアプタマーに適用するＰＥＧの好適例として具体的には、分子量４００００の２分岐ＧＳ型ＰＥＧ（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−４００ＧＳ  日油製）、分子量４００００の２分岐ＴＳ型ＰＥＧ（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−４００ＴＳ  日油製）、分子量４００００の４分岐ＴＳ型ＰＥＧ（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ４−４００ＴＳ  日油製）、分子量８００００の２分岐ＴＳ型ＰＥＧ（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−８００ＴＳ  日油製）、又は分子量８００００の４分岐ＴＳ型ＰＥＧ（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ４−８００ＴＳ  日油製）などが挙げられる。この場合、本発明のアプタマーは、ＰＥＧが末端に直接付加されていてもよいが、その末端にＰＥＧと結合可能な基を有するリンカーなどが付加され、それを介してＰＥＧを本発明のアプタマーに付加することがより好ましい。
【００４９】
ＰＥＧと本発明のアプタマーのリンカーとしては特に限定されず、炭素鎖数や官能基などを結合部位やＰＥＧの種類などに応じて適宜選択することができる。このようなリンカーとしては、例えばアミノ基を有するリンカーが挙げられ、具体的には、５’末端に付加する場合は、ｓｓＨ  Ｌｉｎｋｅｒ（ＳＡＦＣ）又はＤＭＳ（Ｏ）ＭＴ−ＡＭＩＮＯ−ＭＯＤＩＦＩＥＲ（ＧＬＥＮＲＥＳＥＡＲＣＨ）が、３’末端に付加する場合は、ＴＦＡ  Ａｍｉｎｏ  Ｃ−６  ｌｃａａ  ＣＰＧ（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ）などが例示される。このリンカーを選択した場合、ＰＥＧには、例えばＮ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅの活性基を付加した上で、これをリンカー側のアミノ基と反応させることで、本発明のアプタマーとＰＥＧとをリンカーを介して結合することができる。
【００５０】
なおＰＥＧやリンカーとしては、市販のものを好ましく用いることができる。またＰＥＧ、リンカー及び本発明のアプタマーの結合に関する反応条件などは、当業者であれば適宜設定することが可能である。
【００５１】
本発明のアプタマーは、本明細書中の開示及び当該技術分野における自体公知の方法により化学合成することができる。アプタマーは、リン酸基の負電荷を利用したイオン結合、リボースを利用した疎水結合及び水素結合、核酸塩基を利用した水素結合やスタッキング結合など多様な結合様式により標的物質と結合する。特に、構成ヌクレオチドの数だけ存在するリン酸基の負電荷を利用したイオン結合は強く、タンパク質の表面に存在するリジンやアルギニンの正電荷と結合する。このため、標的物質との直接的な結合に関わっていない核酸塩基は置換することができる。特に、ステム構造の部分は既に塩基対が作られており、また、二重らせん構造の内側を向いているので、核酸塩基は、標的物質と直接結合し難い。従って、塩基対を他の塩基対に置換してもアプタマーの活性は減少しない場合が多い。ループ構造など塩基対を作っていない構造においても、核酸塩基が標的分子との直接的な結合に関与していない場合に、塩基の置換が可能である。リボースの２’位の修飾に関しては、まれにリボースの２’位の官能基が標的分子と直接的に相互作用していることがあるが、多くの場合無関係であり、他の修飾分子に置換可能である。このようにアプタマーは、標的分子との直接的な結合に関与している官能基を置換又は削除しない限り、その活性を保持していることが多い。また、全体の立体構造が大きく変わらないことも重要である。
【００５２】
アプタマーは、ＳＥＬＥＸ法及びその改良法（例えば、Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０），Ｎａｔｕｒｅ，３４６，８１８−８２２；Ｔｕｅｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，５０５−５１０）を利用することで作製することができる。ＳＥＬＥＸ法ではラウンド数を増やしたり、競合物質を使用したりすることで、標的物質に対してより結合力の強いアプタマーが濃縮され、選別されてくる。よって、ＳＥＬＥＸのラウンド数を調節したり、及び／又は競合状態を変化させたりすることで、結合力が異なるアプタマー、結合形態が異なるアプタマー、結合力や結合形態は同じであるが塩基配列が異なるアプタマーを得ることができる場合がある。また、ＳＥＬＥＸ法にはＰＣＲによる増幅過程が含まれるが、その過程でマンガンイオンを使用するなどして変異を入れることで、より多様性に富んだＳＥＬＥＸを行うことが可能となる。
【００５３】
ＳＥＬＥＸで得られるアプタマーは標的物質に対して親和性が高い核酸であり、そのことは標的物質の活性部位に結合することを意味しない。従って、ＳＥＬＥＸで得られるアプタマーは必ずしも標的物質の機能に作用するとは限らない。ADAMTS5は塩基性タンパク質であり、核酸が非特異的に結合しやすいと考えられる。活性部位に結合しないアプタマーはその標的物質の活性に影響を及ぼさないと考えられる。
【００５４】
このようにして選ばれた活性のあるアプタマーは、最適化ＳＥＬＥＸを行うことで、更に高性能化することが可能である。最適化ＳＥＬＥＸとは、ある配列が決まっているアプタマーの一部をランダム配列にしたテンプレートや１０〜３０％程度のランダム配列をドープしたテンプレートを作製して、再度ＳＥＬＥＸを行うものである。
【００５５】
ＳＥＬＥＸで得られるアプタマーは８０ヌクレオチド程度の長さがあり、これをそのまま医薬にすることは難しい。そこで、試行錯誤を繰り返し、容易に化学合成ができる長さ（例えば、化学合成ができるのは約６０ヌクレオチド以下であり、より好ましくは約５０ヌクレオチド程度以下、さらに好ましくは４５ヌクレオチド以下）まで短くすることが好ましい。
ＳＥＬＥＸで得られるアプタマーはそのプライマー設計に依存して、その後の最小化作業のしやすさが変わる。うまくプライマーを設計しないと、ＳＥＬＥＸによって活性のあるアプタマーが選別できたとしても、その後の開発が不可能となる。かかる背景に鑑み、通常のＳＥＬＥＸ法と比較して短い塩基長を有するアプタマーを得ることができるＴａｉｌｏｒｅｄ−ＳＥＬＥＸ法（Ｖａｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３１，  ２００３，ｅｌ３０；  Ｊａｒｏｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３４，  ２００６，  ｅ８６）や、Ｔａｉｌｏｒｅｄ−ＳＥＬＥＸ法をさらに改良したＰｒｉｍｅｒ−ｌｅｓｓ  ＳＥＬＥＸ法などを用いることもできる。
【００５６】
アプタマーは化学合成が可能であるので改変が容易である。アプタマーはＭＦＯＬＤプログラムを用いて二次構造を予測したり、Ｘ線解析やＮＭＲ解析によって立体構造を予測したりすることで、どのヌクレオチドを置換又は欠損することが可能か、また、どこに新たなヌクレオチドを挿入可能かある程度予測することができる。予測された新しい配列のアプタマーは容易に化学合成することができ、そのアプタマーが活性を保持しているかどうかを既存のアッセイ系により確認することができる。
【００５７】
得られたアプタマーの標的物質との結合に重要な部分が、上記のような試行錯誤を繰り返すことにより特定できた場合、その配列の両端に新しい配列を付加しても、多くの場合活性は変化しない。そして、新しい配列の長さは特に限定されるものではない。
【００５８】
さらに、既に述べたように、修飾に関しても配列と同様に高度に設計又は改変可能である。
【００５９】
以上のように、アプタマーは高度に設計又は改変可能である。本発明はまた、所定の配列（例、ステム部分、インターナルループ部分、ヘアピンループ部分及び一本鎖部分から選ばれる部分に対応する配列：以下、必要に応じて固定配列と省略する）を含むアプタマーを高度に設計又は改変可能である、アプタマーの製造方法を提供する。
【００６０】
例えば、このようなアプタマーの製造方法は、下記：
【００６１】
【化４】
2019093497.tif 000006
【００６２】
〔上記において、（Ｎ）ａはａ個のＮからなるヌクレオチド鎖を示し、（Ｎ）ｂは、ｂ個のＮからなるヌクレオチド鎖を示し、Ｎはそれぞれ、同一又は異なって、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ及びＴ（好ましくは、Ａ、Ｇ、Ｃ及びＵ）からなる群より選ばれるヌクレオチドである。ａ、ｂはそれぞれ、同一又は異なって、任意の数であり得るが、例えば１〜約１００、好ましくは１〜約５０、より好ましくは１〜約３０、さらにより好ましくは１〜約２０又は１〜約１０であり得る〕で表されるヌクレオチド配列からなる単一種の核酸分子又は複数種の核酸分子（例、ａ、ｂの数等が異なる核酸分子のライブラリー）、及びプライマー用配列（ｉ）、（ｉｉ）にそれぞれ対応するプライマー対を用いて、固定配列を含むアプタマーを製造することを含む。
【００６３】
本発明はまた、本発明のアプタマー及びそれに結合した機能性物質を含む複合体を提供する。本発明の複合体におけるアプタマーと機能性物質との間の結合は、共有結合、又は非共有結合であり得る。本発明の複合体は、本発明のアプタマーと１以上（例、２又は３個）の同種又は異種の機能性物質とが結合したものであり得る。機能性物質は、本発明のアプタマーに何らかの機能を新たに付加するもの、あるいは本発明のアプタマーが保持し得る何らかの特性を変化（例、向上）させ得るものである限り特に限定されない。機能性物質としては、例えば、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、糖質、単糖、ポリヌクレオチド、ヌクレオチドが挙げられる。機能性物質としてはまた、例えば、親和性物質（例、ビオチン、ストレプトアビジン、標的相補配列に対して親和性を有するポリヌクレオチド、抗体、グルタチオンセファロース、ヒスチジン）、標識用物質（例、蛍光物質、発光物質、放射性同位体）、酵素（例、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、薬物送達媒体（例、リポソーム、ミクロスフェア、ペプチド、ポリエチレングリコール類）、薬物（例、カリケアマイシンやデュオカルマイシンなどミサイル療法に使用されているもの、シクロフォスファミド、メルファラン、イホスファミド又はトロホスファミドなどのナイトロジェンマスタード類似体、チオテパなどのエチレンイミン類、カルムスチンなどのニトロソ尿素、テモゾロミド又はダカルバジンなどのアルキル化剤、メトトレキセート又はラルチトレキセドなどの葉酸類似代謝拮抗剤、チオグアニン、クラドリビン又はフルダラビンなどのプリン類似体、フルオロウラシル、テガフール又はゲムシタビンなどのピリミジン類似体、ビンブラスチン、ビンクリスチン又はビンオレルビンなどのビンカアルカロイド及びその類似体、エトポシド、タキサン、ドセタキセル又はパクリタキセルなどのポドフィロトキシン誘導体、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン及びミトキサントロンなどのアントラサイクリン類及び類似体、ブレオマイシン及びミトマイシンなどの他の細胞毒性抗生物質、シスプラチン、カルボプラチン及びオキザリプラチンなどの白金化合物、ペントスタチン、ミルテフォシン、エストラムスチン、トポテカン、イリノテカン及びビカルタミド）、毒素（例、リシン毒素、リア毒素及びベロ毒素）が挙げられる。これらの機能性分子は最終的に取り除かれる場合がある。更に、トロンビンやマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＦａｃｔｏｒＸなどの酵素が認識して切断することができるペプチド、ヌクレアーゼや制限酵素が切断できるポリヌクレオチドであってもよい。
【００６４】
本発明のアプタマー又は複合体は、例えば、医薬又は診断薬、検査薬、試薬として使用され得る。特に、関節炎、変形性膝関節症といった軟骨疾患の治療用又は予防用の医薬、あるいは診断薬、検査薬、試薬として有用である。
【００６５】
上記医薬の対象疾患としては、アグリカンが過剰に分解されることで生じるとされている疾患、例えば疼痛、慢性疼痛、神経因性疼痛、術後の疼痛、関節リウマチ、変形性関節症（例、変形性膝関節症等）、スポーツ外傷、関節炎（例、びらん性関節炎等）、強直性脊椎症、神経痛、神経障害、痛覚、神経損傷、虚血、神経変性、軟骨変性、脳卒中、失禁、炎症性疾患、過敏性腸症候群、歯周病、異常な血管新生、腫瘍の浸潤、および転移、角膜潰瘍、糖尿病の合併症といった、多くの疾患および病状などが挙げられる。
【００６６】
本発明の医薬は、医薬上許容される担体が配合されたものであり得る。医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００６７】
経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水、オレンジジュースのような希釈液に有効量のリガンドを溶解させた液剤、有効量のリガンドを固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤又は錠剤、適当な分散媒中に有効量の有効成分を懸濁させた懸濁液剤、有効量の有効成分を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。
【００６８】
また、本発明の医薬は必要により、味のマスキング、腸溶性あるいは持続性などの目的のため、自体公知の方法でコーティングすることができる。コーティングに用いられるコーティング剤としては、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリオキシエチレングリコール、ツイーン８０、プルロニックＦ６８、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシメチルセルロースアセテートサクシネート、オイドラギット（ローム社製、ドイツ、メタアクリル酸・アクリル酸共重合体）及び色素（例、ベンガラ、二酸化チタンなど）などが用いられる。当該医薬は、速放性製剤、徐放性製剤のいずれであってもよい。徐放性製剤の基材としては、例えば、リポソーム、アテロコラーゲン、ゼラチン、ヒドロキシアパタイト、ＰＬＧＡなどが挙げられる。
【００６９】
非経口的な投与（例えば、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、局所投与、腹腔内投与、経鼻投与、経肺投与など）に好適な製剤としては、水性及び非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性及び非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分及び医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌の溶媒に溶解又は懸濁すればよい状態で保存することもできる。更に注射液剤以外にも、吸入剤、軟膏剤も可能である。吸入剤の場合、凍結乾燥状態の有効成分を微細化し適当な吸入デバイスを用いて吸入投与する。吸入剤には、更に必要に応じて従来使用されている界面活性剤、油、調味料、シクロデキストリン又はその誘導体等を適宜配合することができる。
【００７０】
ここで界面活性剤としては、例えばオレイン酸、レシチン、ジエチレングリコールジオレエート、テトラヒドロフルフリルオレエート、エチルオレエート、イソプロピルミリステート、グリセリルトリオレエート、グリセリルモノラウレート、グリセリルモノオレエート、グリセリルモノステアレート、グリセリルモノリシノエート、セチルアルコール、ステアリルアルコール、ポリエチレングリコール４００、セチルピリジニウムクロリド、ソルビタントリオレエート（商品名Ｓｐａｎ（スパン）８５）、ソルビタンモノオレエート（商品名Ｓｐａｎ（スパン）８０）、ソルビタンモノラウエート（商品名Ｓｐａｎ（スパン）２０）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（商品名ＨＣＯ−６０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（商品名Ｔｗｅｅｎ（ツイーン）２０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート（商品名Ｔｗｅｅｎ（ツイーン）８０）、天然資源由来のレシチン（商品名Ｅｐｉｃｌｏｎ（エピクロン））、オレイルポリオキシエチレン（２）エーテル（商品名Ｂｒｉｊ（ブリジ）９２）、ステアリルポリオキシエチレン（２）エーテル（商品名Ｂｒｉｊ（ブリジ）７２）、ラウリルポリオキシエチレン（４）エーテル（商品名Ｂｒｉｊ（ブリジ）３０）、オレイルポリオキシエチレン（２）エーテル（商品名Ｇｅｎａｐｏｌ（ゲナポル）０−０２０）、オキシエチレンとオキシプロピレンとのブロック共重合体（商品名Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ（シンペロニック））等が挙げられる。Ｓｐａｎ（スパン）、Ｔｗｅｅｎ（ツイーン）、Ｅｐｉｃｌｏｎ（エピクロン）、Ｂｒｉｊ（ブリジ）、Ｇｅｎａｐｏｌ（ゲナポル）及びＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃ（シンペロニック）は商標である。
油としては、例えばトウモロコシ油、オリーブ油、綿実油、ヒマワリ油等が挙げられる。また、軟膏剤の場合、適当な医薬上許容される基剤（黄色ワセリン、白色ワセリン、パラフィン、プラスチベース、シリコーン、白色軟膏、ミツロウ、豚油、植物油、親水軟膏、親水ワセリン、精製ラノリン、加水ラノリン、吸水軟膏、親水プラスチベース、マクロゴール軟膏等）を用い、有効成分と混合し製剤化し使用する。
【００７１】
吸入剤は常法に従って製造することができる。すなわち、上記本発明のアプタマー又は複合体を粉末又は液状にして、吸入噴射剤及び／又は担体中に配合し、適当な吸入容器に充填することにより製造することができる。また上記本発明のアプタマー又は複合体が粉末の場合は通常の機械的粉末吸入器を、液状の場合はネブライザー等の吸入器をそれぞれ使用することもできる。ここで噴射剤としては従来公知のものを広く使用でき、フロン−１１、フロン−１２、フロン−２１、フロン−２２、フロン−１１３、フロン−１１４、フロン−１２３、フロン−１４２ｃ、フロン−１３４ａ、フロン−２２７、フロン−Ｃ３１８、１，１，１，２−テトラフルオロエタン等のフロン系化合物、プロパン、イソブタン、ｎ−ブタン等の炭化水素類、ジエチルエーテル等のエーテル類、窒素ガス、炭酸ガス等の圧縮ガス等を例示できる。
【００７２】
本発明の医薬を軟骨疾患の予防及び治療用医薬として用いる場合、本発明の医薬は関節の炎症部位に直接投与するだけでなく、上記した他の方法によっても投与することができる。
本発明のアプタマーは１本鎖の核酸であるため、相補配列を含むヌクレオチドの投与による解毒も可能であり、投与後の動態制御が困難な中和抗体より安全性の高い医薬品となる可能性が高い。これは、抗体医薬治療などで起こりうる、体内における抗体の長い滞留時間に起因する感染症の問題を鑑みても極めて有利な点と言える。特に本発明の医薬を関節炎の予防又は治療用医薬として用いる場合、疾患の重篤性と副作用のリスクとを考えると、体内動態を制御しやすいアプタマーを利用する方がより高い安全性を有する医薬を得られることは明白である。
【００７３】
本発明の医薬の投与量は、有効成分の種類・活性、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．０００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．０００１〜約１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．００５〜約１ｍｇ／ｋｇであり得る。
【００７４】
また本発明のアプタマー又は複合体は、薬物送達剤、インビボイメージング用プローブ、ADAMTS5の血中濃度測定用プローブ、組織染色用プローブ、ＥＬＩＳＡ用プローブ、ADAMTS5の分離精製用リガンドとしても使用され得る。
【００７５】
本発明はまた、本発明のアプタマー又は複合体が固定化された固相担体を提供する。固相担体としては、例えば、基板、樹脂、プレート（例、マルチウェルプレート）、フィルター、カートリッジ、カラム、多孔質材が挙げられる。基板は、ＤＮＡチップやプロテインチップなどに使われているものなどであり得、例えば、ニッケル−ＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）基板やガラス基板、アパタイト基板、シリコーン基板、アルミナ基板などで、これらの基板にポリマーなどのコーティングを施したものが挙げられる。樹脂としては、例えば、アガロース粒子、シリカ粒子、アクリルアミドとＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドの共重合体、ポリスチレン架橋ジビニルベンゼン粒子、デキストランをエピクロロヒドリンで架橋した粒子、セルロースファイバー、アリルデキストランとＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドの架橋ポリマー、単分散系合成ポリマー、単分散系親水性ポリマー、セファロース、トヨパールなどが挙げられ、また、これらの樹脂に各種官能基を結合させた樹脂も含まれる。本発明の固相担体は、例えば、ADAMTS5の精製、及びADAMTS5の検出、定量に有用であり得る。
【００７６】
本発明のアプタマー又は複合体は、自体公知の方法により固相担体に固定できる。例えば、親和性物質（例、上述したもの）や所定の官能基を本発明のアプタマー又は複合体に導入し、次いで当該親和性物質や所定の官能基を利用して固相担体に固定化する方法が挙げられる。本発明はまた、本発明のアプタマー又は複合体を固相担体に固定する方法、及びそうして得られる固相担体を提供する。所定の官能基は、カップリング反応に供することが可能な官能基であり得、例えば、アミノ基、チオール基、ヒドロキシ基、カルボキシル基が挙げられる。本発明はまた、このような官能基が導入されたアプタマーを提供する。
【００７７】
本発明はまた、ADAMTS5の精製及び濃縮方法を提供する。特に本発明の精製方法はADAMTS5を他のADAMTSファミリータンパク質から分離することが可能である。本発明の精製及び濃縮方法は、本発明の固相担体にADAMTS5を吸着させ、吸着したADAMTS5を溶出液により溶出させることを含み得る。本発明の固相担体へのADAMTS5の吸着は自体公知の方法により行うことができる。例えば、ADAMTS5を含有する試料（例、細菌又は細胞の培養物又は培養上清、血液）を、本発明の固相担体又はその含有物に導入する。ADAMTS5の溶出は、中性溶液等の溶出液を用いて行うことができる。中性溶出液は特に限定されるものではないが、例えばｐＨ約６〜約９、好ましくは約６．５〜約８．５、より好ましくは約７〜約８であり得る。中性溶液はまた、例えば、カリウム塩（例、ＫＣｌ）、マグネシウム塩（例、ＭｇＣｌ２）、界面活性剤（例、Ｔｗｅｅｎ（ツイーン）２０、Ｔｒｉｔｏｎ、ＮＰ４０）、グリセリンを含むものであり得る。
本発明の精製及び濃縮方法はさらに、ADAMTS5の吸着後、洗浄液を用いて当該固相担体を洗浄することを含み得る。洗浄液としては、例えば、尿素、キレート剤（例、ＥＤＴＡ）、Ｔｒｉｓ、酸、アルカリ、Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ＲＮＡ、ＤＮＡ、Ｔｗｅｅｎ（ツイーン）２０などの表面活性剤、ＮａＣｌなどの塩を含むものなどが挙げられる。本発明の精製及び濃縮方法はさらに、当該固相担体を加熱処理することを含み得る。かかる工程により、当該固相担体の再生、滅菌が可能である。
【００７８】
本発明のアプタマー又は複合体は、検出用プローブ、特にADAMTS5の検出用プローブとして利用することができる。アプタマーの標識方法としては特に限定されず、自体公知の方法が適用可能である。このような方法としては、例えば放射性同位元素による標識、蛍光色素や蛍光蛋白質による標識などが挙げられる。
【００７９】
本発明はまた、ADAMTS5の検出及び定量方法を提供する。特に本発明はADAMTS5を他のADAMTSファミリータンパク質と区別して検出及び定量することができる。本発明の検出及び定量方法は、本発明のアプタマーを利用して（例、本発明の複合体及び固相担体の使用により）ADAMTS5を測定することを含み得る。ADAMTS5の検出及び定量方法は、抗体の代わりに本発明のアプタマーを用いること以外は、免疫学的方法と同様の方法により行われ得る。従って、抗体の代わりに本発明のアプタマーを用いることにより、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、ウエスタンブロット法（例、ウエスタンブロット法における二次抗体の代わりとしての使用）、免疫組織化学的染色法、セルソーティング法等の方法と同様の方法により、検出及び定量を行うことができる。このような方法は、例えば、生体又は生物学的サンプルにおけるADAMTS5量の測定、ADAMTS5が関連する疾患の診断に有用であり得る。
【００８０】
本明細書中で挙げられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【００８１】
以下は、本発明の実施のための特定の実施形態の例である。実施例は、説明のみを目的として提供し、本発明の範囲を制限することを決して意図しない。
【実施例】
【００８２】
実施例１：ADAMTS5に特異的に結合するＲＮＡアプタマーの作製（１）
ADAMTS5に特異的に結合するＲＮＡアプタマーはＳＥＬＥＸ法を用いて作製した。ＳＥＬＥＸはＥｌｌｉｎｇｔｏｎらの方法（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４６，  ８１８−８２２，  １９９０）及びＴｕｅｒｋらの方法（Ｔｕｅｒｋ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９，  ５０５−５１０，  １９９０）を参考にして行った。標的物質としてＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社製）の担体に固相化したADAMTS5（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた。担体へのADAMTS5の固相化方法はＧＥヘルスケア社の仕様書に沿って行った。固相化量は、固相化前のADAMTS5溶液と固相化直後の上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより調べることで確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、上清からはADAMTS5のバンドは検出されず、使用したADAMTS5のほぼ全てがカップリングされたことが確認された。約７３．２  ｐｍｏｌのADAMTS5が約３μＬの樹脂に固相化されたことになる。【００８３】
最初のラウンドで用いたＲＮＡ（４０Ｎ）は、化学合成によって得られたＤＮＡをＤｕｒａＳｃｒｉｂｅＴＭ  Ｔ７  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）を用いて転写して得た。この方法によって得られたＲＮＡはピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位がフルオロ化されたものである。ＤＮＡ鋳型としては、以下に示す４０ヌクレオチドのランダム配列の両端にプライマー配列を持った長さ８０ヌクレオチドのＤＮＡを用いた。ＤＮＡ鋳型とプライマーは化学合成によって作製した。【００８４】
ＤＮＡ鋳型：５’−ＧＴＡＣＧＣＴＡＧＧＣＧＴＴＡＧＴＣＴＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＴＣＧＴＡＣＧＡＣＧＧＴＣＧＴＡＣＣＣ−３’（配列番号４６）【００８５】
プライマーＦｗｄ：５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＡＣＧＡＣＣＧＴＣＧＴＡＣＧＡＴ−３’（配列番号４７）
プライマーＲｅｖ：５’−ＧＴＡＣＧＣＴＡＧＧＣＧＴＴＡＧＴＣＴＣ−３’（配列番号４８）【００８６】
ＤＮＡ鋳型（配列番号４６）中のＮの連続は任意の組み合わせの４０個のヌクレオチド（４０Ｎ：それぞれのＮは、Ａ，Ｃ，Ｇ又はＴである）であり、得られるアプタマー独特の配列領域を生じる。プライマーＦｗｄはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含んでいる。最初のラウンドで用いたＲＮＡプールのバリエーションは理論上１０１３であった。【００８７】
ADAMTS5が固相化された担体にＲＮＡプールを加え、３０分室温で保持した後、ADAMTS5に結合しないＲＮＡを取り除くために、溶液Ａで樹脂を洗浄した。ここで溶液Ａは１４５ｍＭ  塩化ナトリウム、５．４ｍＭ  塩化カリウム、１．８ｍＭ  塩化カルシウム、０．８ｍＭ  塩化マグネシウム、２０ｍＭ  トリス（ｐＨ７．６）、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０の混合溶液である。ADAMTS5に結合したＲＮＡは、溶出液として溶液Ｂを加えて９５℃で３分間熱処理を行い、その上清から回収した。ここで溶液Ｂは７Ｍ  Ｕｒｅａ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  トリス（ｐＨ７．６）の混合溶液である。回収されたＲＮＡは逆転写ＰＣＲで増幅し、ＤｕｒａＳｃｒｉｂｅＴＭ  Ｔ７  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  で転写して次のラウンドのプールとして用いた。以上を１ラウンドとし、同様の作業を複数回繰り返し行った。ＳＥＬＥＸ終了後、次世代シーケンサーを用いて塩基配列の解析を行った。次世代シーケンサーには、Ｉｏｎ  ＰＧＭＴＭシステム（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を用い、解析はＴｈｅｒｍｏ社の仕様書に沿って行った。【００８８】
ＳＥＬＥＸを７ラウンド実施した後、次世代シーケンサーによって７８８８９種類のクローン配列を特定し、１００６８種類の配列に収束していることを確認した。それらのクローンの一部の配列を配列番号１〜２に示す。配列番号１で表される配列は６，７１１配列存在した。配列番号２で表される配列は１，３０５配列存在した。配列番号１の配列には共通配列１が含まれていた。配列番号１と２は配列中の一塩基のみが異なっており、配列番号２では共通配列中の４つの連続Ｇ塩基の一つが欠失していた。共通配列１は、１０，０６８種類の配列中、１３８種類存在した。これらの配列の二次構造をＭＦＯＬＤプログラム（Ｍ．  Ｚｕｋｋｅｒ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３１  （１３），  ３４０６−３４１５，  ２００３）を用いて予測したところ、共通配列の部分がよく似たループ構造となった。配列番号１で示されるヌクレオチド配列を有するアプタマーの二次構造を図１に示した。【００８９】
以下にそれぞれのヌクレオチド配列を示す。特に言及がなければ、以下に挙げられる個々の配列は５’から３’の方向で表すものとし、プリン塩基（Ａ及びＧ）は２’−ＯＨ体であり、ピリミジン塩基（Ｕ及びＣ）は２’−フルオロ修飾体である。また、配列中のＮ１は３〜２４個の任意の長さのヌクレオチドを示し、ＹはＣもしくはＵを示す。【００９０】
配列番号１：
ＧＧＧＵＡＣＧＡＣＣＧＵＣＧＵＡＣＧＡＵＵＧＧＧＧＣＣＵＣＣＡＣＡＧＣＵＧＣＵＣＡＧＣＵＵＧＧＡＣＵＡＡＡＣＣＡＡＵＡＡＧＡＧＡＣＵＡＡＣＧＣＣＵＡＧＣＧＵＡＣ【００９１】
配列番号２：
ＧＧＧＵＡＣＧＡＣＣＧＵＣＧＵＡＣＧＡＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＡＣＡＧＣＵＧＣＵＣＡＧＣＵＵＧＧＡＣＵＡＡＡＣＣＡＡＵＡＡＧＡＧＡＣＵＡＡＣＧＣＣＵＡＧＣＧＵＡＣ【００９２】
共通配列１
ＧＧＧＧＣＣＵＣＣ−Ｎ１−ＧＧＡＣＹＡＡＡＣ【００９３】
配列番号１と２で示されるヌクレオチド配列を有するアプタマーのADAMTS5に対する結合活性を表面プラズモン共鳴法により評価した。測定にはＧＥヘルスケア社製のＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００を用いた。センサーチップにはストレプトアビジンが固定化されているＳＡチップを用いた。これに、５’末端にビオチンが結合している１６ヌクレオチドのＰｏｌｙ  ｄＴを８００ＲＵ程度結合させた。リガンドとなる核酸は３’末端に１６ヌクレオチドのＰｏｌｙ  Ａを付加し、ＴとＡのアニーリングによりＳＡチップに固定化した。流速１０  μＬ／ｍｉｎで核酸を３０秒間インジェクトし、約３００  ＲＵの核酸を固定化した。アナライト用のADAMTS5は０．１μＭに調製し、流速３０  μＬ／ｍｉｎで６０秒間インジェクトした。ランニングバッファーには溶液Ｃを用いた。ここで溶液Ｃは３００ｍＭ  塩化ナトリウム、５．４ｍＭ  塩化カリウム、１．８ｍＭ  塩化カルシウム、０．８ｍＭ  塩化マグネシウム、２０ｍＭ  トリス（ｐＨ７．６）、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０の混合溶液である。【００９４】
測定の結果、配列番号１で示されるヌクレオチド配列を有するアプタマーはADAMTS5に結合することがわかった（表１）。ネガティブコントロールとして用いた４０ヌクレオチドのランダム配列を含む１ラウンド目に使用した核酸プール（４０Ｎ）はADAMTS5との結合が認められなかった。配列番号２で示されるヌクレオチド配列を有するアプタマーはADAMTS5との結合は認められず、４０Ｎと同程度であった。配列番号２は、共通配列中の連続した４つのＧ塩基が１塩基欠失した配列を持ち、結合活性測定の結果から、共通配列中の連続した４つのＧ塩基がアプタマーの活性に重要であることが示された。配列番号１で示されるヌクレオチド配列を有するアプタマーがADAMTS5に結合する様子を示すセンサーグラムを図２に示す。なお、表１中、“＋＋”は、アプタマーのＳＡチップへの固定化量（ＲＵ値）に対するADAMTS5結合量（ＲＵ値）の割合が４０％以上のもの、“＋”は１０％以上４０％未満のもの、“−”は１０％未満のものを表す。【００９５】
【表１】
2019093497.tif 000007
【００９６】
配列番号１で表されるヌクレオチド配列を有するアプタマーがADAMTS5の酵素活性を阻害するかどうかを、下記の方法により評価した。ADAMTS5の基質としてアグリカンのＧ１−ＩＧＤ−Ｇ２ドメイン（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を選択した。ADAMTS5はＧ１−ＩＧＤ−Ｇ２ドメイン中の３９２番目のグルタミン酸と３９３番目のアラニンの間を特異的に切断し、二つの断片を生じる。これらの断片は未切断のＧ１−ＩＧＤ−Ｇ２よりも電気泳動における移動度が速いため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を実施し、Ｇ１−ＩＧＤ−Ｇ２のバンド強度を定量することによりADAMTS5の酵素活性を測定することができる。アッセイは、反応液量を１０μＬとし、溶液Ａの緩衝液中で実施した。まず、溶液Ａで希釈した核酸とADAMTS5の混合液を１０μＬ調製し、２５℃で１５分間保温した。溶液Ａで希釈した基質液５μＬに、核酸とADAMTS5の混合液５μＬを加えて、酵素反応を開始させた。反応溶液中の最終ADAMTS5濃度は５ｎＭ、最終基質濃度は５０μｇ／ｍＬである。反応溶液を３７℃で２時間保温した後、２μＬの溶液Ｄを添加し、９５℃で２分間加熱し、ADAMTS5の酵素反応を停止した。ここで溶液Ｄは０．２５Ｍ  トリス（ｐＨ６．８）、１０％  ＳＤＳ、５０％  グリセロール、０．２５％  ブロモフェノールブルー、２０％  ２−メルカプトエタノールである。加熱処理した反応溶液を７．５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動し、ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ（シグマアルドリッチ社製）により染色した。染色はシグマアルドリッチ社の仕様書に沿って行い、ＧＥヘルスケア社製のＳＴＯＲＭ８４０を用いて検出した。検量線として、未切断の基質１０００  ｎｇ、４００  ｎｇ、１６０  ｎｇ、６４  ｎｇ、２５．６  ｎｇ、１０．２４  ｎｇ、４．１  ｎｇを電気泳動し、同様に染色と検出を行った。各反応溶液における未切断の基質量をバンド強度と検量線から定量した。この反応条件でのADAMTS5の基質切断効率は８０〜１００％であった。被験物質の阻害率は次式を用いて算出した。【００９７】
阻害率（％）＝（Ｓａｐｔ−ＳＥ）／（Ｓ０−ＳＥ）ｘ１００【００９８】
ここで、Ｓａｐｔは被験物質添加時の未切断基質量であり、ＳＥはADAMTS5添加時の残存未切断基質量、Ｓ０はADAMTS5非添加条件での未切断基質量である。【００９９】
酵素活性を５０％阻害するのに要する阻害剤の濃度（ＩＣ５０）を求めた。その結果を表２に示す。なお、ＩＣ５０は４回測定の平均値を示す。【０１００】
【表２】
2019093497.tif 000008
【０１０１】
ネガティブコントロールである４０Ｎは、最終核酸濃度３０ｎＭ条件下において阻害活性を示さなかった（阻害率５．６±４．７％）。また、ポジティブコントロールであるADAMTS5低分子阻害剤（ＣＡＳ９２９６３４−３３−３）（Ｍｅｒｃｋ社製）のＩＣ５０値は９０．５  μＭであった。
以上の結果より、配列番号１で示されるヌクレオチド配列を有するアプタマーはADAMTS5に対する優れた阻害効果を示すと言える。【０１０２】
実施例２：アプタマーの短鎖化１
配列番号１で示されるヌクレオチド配列を有するアプタマーの短鎖化を行った。短鎖化を行った配列を配列番号３〜９に示す。配列番号３〜９で表されるアプタマーの二次構造予測を図３に示す。図３中、共通配列を丸（〇）で囲った。また、共通配列の一部を欠失した配列については、その箇所を矢印（黒三角形）で記した。【０１０３】
以下に配列番号３〜９で示されるヌクレオチド配列を有するアプタマーのヌクレオチド配列を示す。特に言及がなければ、以下に挙げる個々の配列は、５’から３’の方向に表すものとし、プリン塩基（Ａ及びＧ）は２’−ＯＨ体であり、ピリミジン塩基（Ｕ及びＣ）は２’−フルオロ修飾体である。【０１０４】
配列番号３：
（配列番号１で表される配列を、共通配列を含む４４ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列）
ＧＧＡＵＵＧＧＧＧＣＣＵＣＣＡＣＡＧＣＵＧＣＵＣＡＧＣＵＵＧＧＡＣＵＡＡＡＣＣＡＡＵＣＣ【０１０５】
配列番号４：
（配列番号１で表される配列を、共通配列を含む４４ヌクレオチドの長さに短鎖化し、さらに３番目と４２番目からなるＡＵ塩基対をＣＧ塩基対に置換した配列）
ＧＧＣＵＵＧＧＧＧＣＣＵＣＣＡＣＡＧＣＵＧＣＵＣＡＧＣＵＵＧＧＡＣＵＡＡＡＣＣＡＡＧＣＣ【０１０６】
配列番号５：
（配列番号４で表される配列を、共通配列を含む４２ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列）
ＧＧＣＵＵＧＧＧＧＣＣＵＣＣＡＣＡＧＣＧＣＵＣＧＣＵＵＧＧＡＣＵＡＡＡＣＣＡＡＧＣＣ【０１０７】
配列番号６：
（配列番号４で表される配列を、共通配列を含む４３ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列）
ＧＧＣＵＵＧＧＧＧＣＣＵＣＣＡＣＡＧＣＵＧＵＣＡＧＣＵＵＧＧＡＣＵＡＡＡＣＣＡＡＧＣＣ【０１０８】
配列番号７：
（配列番号４で表される配列の共通配列中の連続した３つのＡ塩基の一つを欠失した４３ヌクレオチドからなる配列）
ＧＧＣＵＵＧＧＧＧＣＣＵＣＣＡＣＡＧＣＵＧＣＵＣＡＧＣＵＵＧＧＡＣＵＡＡＣＣＡＡＧＣＣ【０１０９】
配列番号８：
（配列番号４で表される配列の共通配列中のＣＧ塩基対（１３番目と３１番目の塩基）を欠失した４２ヌクレオチドからなる配列）
ＧＧＣＵＵＧＧＧＧＣＣＵＣＡＣＡＧＣＵＧＣＵＣＡＧＣＵＵＧＡＣＵＡＡＡＣＣＡＡＧＣＣ【０１１０】
配列番号９：
（配列番号３、５、６で表される配列を組み合わせた、共通配列を含む４１ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列）
ＧＧＡＵＵＧＧＧＧＣＣＵＣＣＡＣＡＧＣＧＵＣＧＣＵＵＧＧＡＣＵＡＡＡＣＣＡＡＵＣＣ【０１１１】
これらのアプタマーがADAMTS5の酵素活性を阻害するか、実施例１と同様の方法で検討した。ただし、核酸の最終濃度を３０ｎＭに固定して評価した。その結果を表３に示す。【０１１２】
【表３】
2019093497.tif 000009
【０１１３】
配列番号３と４で示されるヌクレオチド配列を有するアプタマーの結果より、３番目と４２番目からなるＡＵ塩基対はＣＧ塩基対でも機能することが判った。また、配列番号５、６、９で示されるヌクレオチド配列を有するアプタマーの結果から、共通配列中のＮ１（ステム−ループ構造を示す）のステム領域は９塩基に、ループ領域は３塩基にそれぞれ短鎖化しても活性に影響はないが、これらを組み合わせると活性に顕著に影響することが判明した。以上の結果より、共通配列中のＮ１は、少なくとも１３塩基まで短くすることが可能であることが示された。【０１１４】
実施例３：アプタマーの改変１
配列番号３で示されるヌクレオチド配列を有するアプタマー（ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位はフルオロ化されている）のヌクレアーゼ耐性を高めるために、２’−Ｏ−メチル基を導入した改変体を作製した。また、改変を施した配列を配列番号３（１）〜３（１６）に示す。【０１１５】
以下に配列番号３（１）〜３（１６）で示されるヌクレオチド配列を有するアプタマーそれぞれのヌクレオチド配列を修飾と共に示す。特に言及がなければ、以下に挙げられる個々の配列は、５’から３’の方向で表すものとし、大文字はＲＮＡを示す。ヌクレオチドにおける括弧はリボースの２’位の修飾を示し、Ｆはフッ素原子、ＭはＯ−メチル基を示す。【０１１６】
配列番号３（１）：
（配列番号３で示される配列の共通配列以外の配列のうち六か所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列）
Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＧＧＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）ＡＧＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＧＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＧＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＧＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＡＵ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）【０１１７】
配列番号３（２）：
（配列番号３で示される配列の共通配列を含む配列のうち六か所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列）
ＧＧＡＵ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）ＡＧＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＧＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＧＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＧＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）【０１１８】
配列番号３（３）：
（配列番号３で示される配列の共通配列以外の配列のうち六か所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列）
ＧＧＡＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＧＧＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）ＡＧ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）ＧＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＧＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＡＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）【０１１９】
配列番号３（４）：
（配列番号３で表される配列の共通配列のうち一か所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列）
ＧＧＡＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＧＧＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）ＡＧＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＧＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＧＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＧＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）ＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＡＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）【０１２０】
配列番号３（５）：
（配列番号３（１）〜３（４）で表される配列の２’−Ｏ−メチル修飾を全て組み合わせて導入した配列）
Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）ＡＧ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）ＧＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＧＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）ＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）【０１２１】
配列番号３（６）：
（配列番号３（５）で表される配列の共通配列の二か所に２’−Ｏ−メチル修飾を施した配列）
Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）ＡＧ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）ＧＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＧＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）ＡＣ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）【０１２２】
配列番号３（７）：（配列番号３（５）で表される配列の共通配列以外の配列の一か所に２’−Ｏ−メチル修飾を施した配列）
Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｍ）ＡＧ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）ＧＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＧＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）ＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）【０１２３】
配列番号３（８）：
（配列番号３（５）で表される配列の共通配列以外の配列の六か所に２’−Ｏ−メチル修飾を施した配列）
Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＧＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）ＡＣ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）【０１２４】
配列番号３（９）：
（配列番号３（８）で表される配列の共通配列に一か所、２’−Ｏ−メチル修飾を施した配列）
Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＧＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）ＡＣ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）【０１２５】
配列番号３（１０）：
（配列番号３（８）で表される配列の共通配列に一か所、２’−Ｏ−メチル修飾を施した配列）
Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ））Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＧＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）ＡＣ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）【０１２６】
配列番号３（１１）：
（配列番号３（８）で表される配列の共通配列以外の配列に一か所、２’−Ｏ−メチル修飾を施した配列）
Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＧＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）ＡＣ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）【０１２７】
配列番号３（１２）：
（配列番号３（８）で表される配列の共通配列に一か所、２’−Ｏ−メチル修飾を施した配列）
Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）ＡＣ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）【０１２８】
配列番号３（１３）：
（配列番号３（８）で表される配列の共通配列に一か所、２’−Ｏ−メチル修飾を施した配列）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＧＧ（Ｍ）ＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）ＡＣ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）【０１２９】
配列番号３（１４）：
（配列番号３（８）で表される配列の共通配列に一か所、２’−Ｏ−メチル修飾を施した配列）
Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＧＧＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）ＡＣ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）【０１３０】
配列番号３（１５）：
（配列番号３（８）で表される配列の共通配列に一か所、２’−Ｏ−メチル修飾を施した配列）
Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＧＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）ＡＣ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）【０１３１】
配列番号３（１６）：
（配列番号３（８）で表される配列の共通配列に一か所、２’−Ｏ−メチル修飾を施した配列）
Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＧＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）【０１３２】
配列番号３（１）〜３（１６）の核酸は全て化学合成により作製した。これらの核酸がADAMTS5の酵素活性を阻害するか、実施例１と同様の方法で行った。核酸の最終濃度は１０ｎＭ及び３０ｎＭにて評価した。その結果を表４に示す。表中、“ｎ．ｄ．”は未測定を表す。【０１３３】
【表４】
2019093497.tif 000010
【０１３４】
各アプタマーは、阻害活性に強弱はあるものの、阻害活性を示すことが判った。配列番号３（１）〜３（４）で示されるヌクレオチド配列を有するアプタマーの阻害活性は、配列番号３と概ね同程度に保持されており、配列番号３（１）〜３（４）の修飾を全て組み合わせた配列番号３（５）で示されるヌクレオチド配列を有するアプタマーの阻害活性は、配列番号３で示されるヌクレオチド配列を有するアプタマーのそれよりも向上することが示された。また、配列番号３（５）に更に修飾を導入した配列番号３（６）と３（８）で示されるヌクレオチド配列を有するアプタマーでは、更に阻害活性が向上したが、配列番号３（７）で示されるヌクレオチド配列を有するアプタマーでは阻害活性が低下することが示された。配列番号３（８）に更に修飾を導入した配列番号３（１１）、３（１２）、３（１６）で示されるヌクレオチド配列を有するアプタマーでは阻害活性が保持されたが、配列番号３（９）、３（１０）、３（１３）、３（１４）、３（１５）では阻害活性が低下することが示された。【０１３５】
以上の結果より、配列番号３で示されるヌクレオチド配列を有するアプタマーは安定性を向上させるため、様々な個所（少なくとも２８か所）のヌクレオチドに修飾を導入したものであっても機能することが判った。また、共通配列中の５’側２塩基（Ｇ、Ｇ）と３’側４塩基（Ａ、Ａ、Ｃ、Ｃ）は２’−Ｏ−メチルなどの修飾を導入したものであっても機能することが判った。ヌクレオチドの修飾としては、２’−Ｏ−メチル修飾以外にも、例えば２’−アミノ修飾などが挙げられる。【０１３６】
実施例４：アプタマーの短鎖化２
配列番号３（１６）で示されるヌクレオチド配列を有するアプタマーについて、さらなる短鎖化を行った。短鎖化と修飾を行った配列を配列番号１０〜１２に示す。配列番号１０〜１２で示されるヌクレオチド配列を有するアプタマーの二次構造予測を図４に示す。図４中、共通配列を丸（〇）で囲った。【０１３７】
以下に配列番号１０〜１２で示されるヌクレオチド配列を有するアプタマーそれぞれのヌクレオチド配列を示す。特に言及がなければ、以下に挙げられる個々の配列は、５’から３’の方向で表すものとし、大文字はＲＮＡを示す。ヌクレオチドにおける括弧はリボースの２’位の修飾を示し、Ｆはフッ素原子、ＭはＯ−メチル基を示す。【０１３８】
配列番号１０：
（配列番号３（１２）と配列番号３（１６）で表される配列の２’−Ｏ−メチル修飾を組み合わせ、共通配列を含む４０ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列）
Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）【０１３９】
配列番号１１：
（配列番号１０で表される配列を、共通配列を含む３８ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列）
Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）【０１４０】
配列番号１２：
（配列番号１０で表される配列を、共通配列を含む３６ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列）
Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）【０１４１】
配列番号１０〜１２の核酸は全て化学合成により作製した。これらの配列で示されるヌクレオチド配列を有するアプタマーがADAMTS5の酵素活性を阻害するか、実施例１と同様の方法で検討した。核酸の最終濃度は１０ｎＭにて評価した。その結果を表５に示す。配列番号１０〜１２の短鎖化体はいずれも阻害活性が維持されていた。【０１４２】
【表５】
2019093497.tif 000011
【０１４３】
以上の結果より、配列番号３で示されるヌクレオチド配列を有するアプタマーは、共通配列を含む３６ヌクレオチドの長さでも機能することがわかった。【０１４４】
実施例５：アプタマーの改変２
実施例４において作製した配列番号１０、１１で示されるヌクレオチド配列を有するアプタマーのヌクレアーゼ耐性を高めるために、末端修飾した改変体、２’−Ｏ−メチル基を導入した改変体、ＤＮＡを導入した改変体、その他にホスホロチオエートを導入した改変体を作製した。改変を施した配列を配列番号１０（１）〜１０（８）（配列番号１０系統）、１１（１）〜１１（３５）（配列番号１１系統）に示す。また、配列を最適化するため、配列の一部を置換した改変体を作製した。配列置換を施した配列を、配列番号１３〜１４に示す。また、ネガティブコントロールとして、共通配列の一部をランダムに置換したものを作製した。その配列を配列番号１５に示す。【０１４５】
以下に配列番号１０（１）〜１０（８）、１１（１）〜１１（３５）、１３〜１５で表されるそれぞれのヌクレオチド配列を示す。特に言及がなければ、以下に挙げられる個々の配列は、５’から３’の方向で表すものとし、大文字はＲＮＡを示し、小文字はＤＮＡを示す。ヌクレオチドにおける括弧はリボースの２’位の修飾を示し、Ｆはフッ素原子、ＭはＯ−メチル基を示す。また、配列末端におけるｉｄＴはｉｎｖｅｒｔｅｄ−ｄＴによる修飾を示し、ＰＥＧは４０ｋＤａの分岐型ポリエチレングリコールによる修飾を示す。配列中におけるｓはヌクレオチド同士を連結するリン酸基がホスホロチオエート化されたことを示す。【０１４６】
配列番号１０（１）：
（配列番号１０で表される配列の共通配列の一か所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列）
Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）【０１４７】
配列番号１０（２）：
（配列番号１０で表される配列の共通配列の一か所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列）
Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）【０１４８】
配列番号１０（３）：
（配列番号１０で表される配列の共通配列の一か所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列）
Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）【０１４９】
配列番号１０（４）：
（配列番号１０で表される配列の共通配列の一か所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列）
Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）【０１５０】
配列番号１０（５）：
（配列番号１０で表される配列の共通配列の一か所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列）
Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｍ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）【０１５１】
配列番号１０（６）：
（配列番号１０で表される配列の共通配列以外の配列の一か所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列）
Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）【０１５２】
配列番号１０（７）：
（配列番号１０で表される配列の共通配列の一か所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列）
Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）【０１５３】
配列番号１０（８）：
（配列番号１０で表される配列の共通配列の一か所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列）
Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｍ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）【０１５４】
配列番号１１（１）：
（配列番号１１で表される配列の共通配列以外の配列の一か所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列）
Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）【０１５５】
配列番号１１（２）：
（配列番号１１（１）で表される配列の共通配列に一か所、ＤＮＡを導入した配列）
Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｇＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）【０１５６】
配列番号１１（３）：
（配列番号１１（１）で表される配列の共通配列に一か所、ＤＮＡを導入した配列）
Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧｇＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）【０１５７】
配列番号１１（４）：
（配列番号１１（１）で表される配列の共通配列に一か所、ＤＮＡを導入した配列）
Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧｃＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）【０１５８】
配列番号１１（５）：
（配列番号１１（１）で表される配列の共通配列に一か所、ＤＮＡを導入した配列）
Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）ｃＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）【０１５９】
配列番号１１（６）：
（配列番号１１（１）で表される配列の共通配列に一か所、ＤＮＡを導入した配列）
Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ｔＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）【０１６０】
配列番号１１（７）：
（配列番号１１（１）で表される配列の共通配列に一か所、ＤＮＡを導入した配列）
Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｃＣ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）【０１６１】
配列番号１１（８）：
（配列番号１１（１）で表される配列の共通配列に一か所、ＤＮＡを導入した配列）
Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ｃＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）【０１６２】
配列番号１１（９）：
（配列番号１１（１）で表される配列の共通配列以外の配列に一か所、ＤＮＡを導入した配列）
Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡｃＡ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）【０１６３】
配列番号１１（１０）：
（配列番号１１（１）で表される配列の共通配列に一か所、ＤＮＡを導入した配列）
Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｇＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）【０１６４】
配列番号１１（１１）：
（配列番号１１（１）で表される配列の共通配列に一か所、ＤＮＡを導入した配列）
Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧａＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）【０１６５】
配列番号１１（１２）：
（配列番号１１（１）で表される配列の共通配列に一か所、ＤＮＡを導入した配列）
Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡｃＵ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）【０１６６】
配列番号１１（１３）：
（配列番号１１（１）で表される配列の共通配列に一か所、ＤＮＡを導入した配列）
Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）ｔＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）【０１６７】
配列番号１１（１４）：
（配列番号１１（１）で表される配列の共通配列に一か所、ＤＮＡを導入した配列）
Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ａＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）【０１６８】
配列番号１１（１５）：
（配列番号１１（１）で表される配列の共通配列以外の配列に一か所、ＤＮＡを導入した配列）
Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ａＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）【０１６９】
配列番号１１（１６）：
（配列番号１１（１）で表される配列の一か所にホスホロチオエート修飾を導入した配列）
Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｓＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）【０１７０】
配列番号１１（１７）：
（配列番号１１（１）で表される配列の一か所にホスホロチオエート修飾を導入した配列）
Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧｓＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）【０１７１】
配列番号１１（１８）：
（配列番号１１（１）で表される配列の一か所にホスホロチオエート修飾を導入した配列）
Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧｓＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）【０１７２】
配列番号１１（１９）：
（配列番号１１（１）で表される配列の一か所にホスホロチオエート修飾を導入した配列）
Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）ｓＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）【０１７３】
配列番号１１（２０）：
（配列番号１１（１）で表される配列の一か所にホスホロチオエート修飾を導入した配列）
Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ｓＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）【０１７４】
配列番号１１（２１）：
（配列番号１１（１）で表される配列の一か所にホスホロチオエート修飾を導入した配列）
Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｓＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）【０１７５】
配列番号１１（２２）：
（配列番号１１（１）で表される配列の一か所にホスホロチオエート修飾を導入した配列）
Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ｓＣ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）【０１７６】
配列番号１１（２３）：
（配列番号１１（１）で表される配列の一か所にホスホロチオエート修飾を導入した配列）
Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ｓＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）【０１７７】
配列番号１１（２４）：
（配列番号１１（１）で表される配列の一か所にホスホロチオエート修飾を導入した配列）
Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡｓＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）【０１７８】
配列番号１１（２５）：
（配列番号１１（１）で表される配列の一か所にホスホロチオエート修飾を導入した配列）
Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）ｓＡ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）【０１７９】
配列番号１１（２６）：
（配列番号１１（１）で表される配列の一か所にホスホロチオエート修飾を導入した配列）
Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｓＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）【０１８０】
配列番号１１（２７）：
（配列番号１１（１）で表される配列の一か所にホスホロチオエート修飾を導入した配列）
Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧｓＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）【０１８１】
配列番号１１（２８）：
（配列番号１１（１）で表される配列の一か所にホスホロチオエート修飾を導入した配列）
Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡｓＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）【０１８２】
配列番号１１（２９）：
（配列番号１１（１）で表される配列の一か所にホスホロチオエート修飾を導入した配列）
Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）ｓＵ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）【０１８３】
配列番号１１（３０）：
（配列番号１１（１）で表される配列の一か所にホスホロチオエート修飾を導入した配列）
Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｓＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）【０１８４】
配列番号１１（３１）：
（配列番号１１（１）で表される配列の一か所にホスホロチオエート修飾を導入した配列）
Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡｓＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）【０１８５】
配列番号１３：
（配列番号１１（１）で表される配列の両末端の各２ヌクレオチドを他の配列に置換した配列）
Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）【０１８６】
配列番号１４：
（配列番号１１（１）で表される配列のループ領域４ヌクレオチドを他の配列に置換した配列）
Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）【０１８７】
配列番号１１（３２）：
（配列番号１１（１）で表される配列の４か所にホスホロチオエート修飾を導入し、３’末端にｉｄＴを付加した配列）
Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）ｓＣ（Ｆ）ｓＵ（Ｆ）ｓＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）ｓＡ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）−ｉｄＴ【０１８８】
配列番号１１（３３）：
（配列番号１１（１）で表される配列の５’末端に４０ｋＤａポリエチレングリコール、３’末端にｉｄＴを付加した配列）
ＰＥＧ−Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）−ｉｄＴ【０１８９】
配列番号１１（３４）：
（配列番号１１（１９）で表される配列の３’末端にｉｄＴを付加した配列）
Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）ｓＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）−ｉｄＴ【０１９０】
配列番号１１（３５）：
（配列番号１１（１９）で表される配列の５’末端に４０ｋＤａポリエチレングリコール、３’末端にｉｄＴを付加した配列）
ＰＥＧ−Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）ｓＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）−ｉｄＴ【０１９１】
配列番号１５：
（配列番号１１（３４）で表される配列の共通配列をランダムに並び替えた配列）
Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）ｓＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）ＧＧＡＧ（Ｍ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＡ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）−ｉｄＴ【０１９２】
配列番号１０（１）〜１０（８）及び１１（１）〜１１（３５）、配列番号１３〜１５で表される配列を有するアプタマーは全て化学合成により作製した。これらのアプタマーがADAMTS5の酵素活性を阻害するか、配列番号１０（１）〜１０（８）及び１１（１）〜１１（３３）、配列番号１３及び１４の配列で表される配列を有するアプタマーについては、実施例１と同様の方法（評価法１）で検討した。核酸の最終濃度は１０ｎＭにて評価した。その結果を表６の評価法１に示す。【０１９３】
一方、配列番号１１（３４）〜１１（３５）及び配列番号１５の配列で表される配列を有するアプタマーについては、下記の方法（評価法２）により評価した。ADAMTS5による基質（アグリカンＧ１−ＩＧＤ−Ｇ２）の切断反応は、下記の点を除き、実施例１と同様にして行った。相違点としては、ADAMTS5及び基質の最終濃度は、それぞれ０．２ｎＭと４００ｎＭ（４８μｇ／ｍＬ）で実施した点、酵素反応時間を３０分とした点である。反応後、ADAMTS5低分子阻害剤を過剰量添加して反応を停止した。切断された基質の定量は２種類の抗アグリカン抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により実施した。抗アグリカン抗体にはＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製のＭＡＢ６４８９とビオチン化したＭＡＢ１２２０を用いた。ＭＡＢ６４８９はADAMTS5により切断されたアグリカンの切断面を特異的に認識する抗体であり、これを用いることにより切断された基質の量を定量することが可能になる。検出は、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識化ストレプトアビジンを用いた標準的なＥＬＩＳＡ検出法により実施した。この反応条件でのADAMTS5の基質切断効率は７％前後であった。被験物質の阻害率は次式を用いて算出した。【０１９４】
阻害率（％）＝（ＰＥ−Ｐａｐｔ）／（ＰＥ−Ｐ０）ｘ１００【０１９５】
ここで、ＰＥはADAMTS5添加時の切断基質量であり、Ｐａｐｔは被験物質添加時の切断基質量、Ｐ０はADAMTS5非添加条件での切断基質量である。【０１９６】
配列番号１１（３４）〜１１（３５）及び配列番号１５で表される配列を有するアプタマーの阻害活性測定の結果を表６の評価法２に示す。表中、“評価法１”では、１０ｎＭのアプタマー濃度条件下における阻害活性を示す。“評価法２”では、２ｎＭのアプタマー濃度条件下における阻害活性を示す。“ｎ．ｄ．”は未測定を表す。【０１９７】
【表６】
2019093497.tif 000012
【０１９８】
２’−Ｏ−メチル化修飾を導入した改変体のうち、配列番号１０（１）、１０（６）（配列番号１０系統）と配列番号１１（１）（配列番号１１系統）で表される配列を有するアプタマーでは、強弱はあるものの阻害活性が保持された。一方、配列番号１０（２）〜１０（５）及び１０（７）、１０（８）で表される配列を有するアプタマーについては顕著に阻害活性が低下した。以上の結果より、共通配列の５’末端から５番目のＣ並びに３’末端から１０番目のＧは２’−Ｏ−メチル化修飾を導入したものであっても機能することが判った。また、共通配列中のインターナルループの大部分において、２’−Ｏ−メチル化修飾によりアプタマーの阻害活性が顕著に低下したことから、この領域がアプタマーの活性に重要である可能性が示唆された。【０１９９】
また、ＤＮＡを導入した改変体（配列番号１１系統）のうち、配列番号１１（２）、１１（４）、１１（８）、１１（９）、１１（１０）、１１（１２）、１１（１４）、１１（１５）で表される配列を有するアプタマーについては、活性の強弱はあるものの、阻害活性が保持された。以上の結果より、共通配列の５’末端から３番目のＧ、５番目のＣ、９番目のＣ並びに３’末端から９番目のＧ、７番目のＣ、５番目のＡはＤＮＡであっても機能することが判った。ヌクレオチドの修飾としては、２’−Ｏ−メチル修飾、ＤＮＡ以外にも、例えば２’−アミノ修飾などが挙げられる。また、リン酸基にホスホロチオエート修飾を導入した配列番号１１（１６）〜１１（３２）のうち、配列番号１１（３０）で表される配列を有するアプタマーを除くすべての配列において、活性の強弱はあるものの阻害活性が維持された。中でも配列番号１１（１９）〜１１（２１）、１１（２５）で表される配列を有するアプタマーは阻害活性が向上した。配列番号１３で表される配列を有するアプタマーの結果より、末端の二つの塩基対、ＡＵ対とＵＡ対はそれぞれＧＣ対とＣＧ対に置換しても阻害活性に影響しないことが判った。また、配列番号１４で表される配列を有するアプタマーの結果より、１８番目から２１番目の塩基で構成されるループ配列をＧＣＵＣからＵＵＣＧに置換しても、阻害活性に影響しないことが判った。【０２００】
配列番号１１（３３）〜（３５）で表される配列を有するアプタマーの結果より、５’末端にＰＥＧ、３’末端にｉｄＴを付加しても阻害活性に影響しないことが判った。末端修飾としては、ＰＥＧ、ｉｄＴ以外にもペプチド、アミノ酸、糖、グリコサミノグリカン、あるいはビオチンなどが挙げられる。以上のことから、式（１）または式（１）’を含む本発明のアプタマーは様々な修飾が可能であることがわかった。【０２０１】
実施例６：ADAMTS5に特異的に結合するＲＮＡアプタマーの作製（２）
ランダム配列とプライマー配列が実施例１で用いたものとは異なる鋳型を用いて、実施例１と同様のＳＥＬＥＸを行った。ＳＥＬＥＸの標的物質としてＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社製）の担体に固相化したADAMTS5（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた。使用した鋳型とプライマーの配列を以下に示す。ＤＮＡ鋳型とプライマーは化学合成により作製した。鋳型ＤＮＡには配列番号３の配列を基に変異が導入されている。【０２０２】
ＤＮＡ鋳型：５’−ＴＧＣＴＣＧＡＴＣＴＧＧＡＣＴ（Ｇ）（Ｇ）（Ａ）（Ｔ）（Ｔ）（Ｇ）（Ｇ）（Ｔ）（Ｔ）（Ｔ）（Ａ）（Ｇ）（Ｔ）（Ｃ）（Ｃ）（Ａ）（Ａ）（Ｇ）（Ｃ）（Ｔ）（Ｇ）（Ａ）（Ｇ）（Ｃ）（Ａ）（Ｇ）（Ｃ）（Ｔ）（Ｇ）（Ｔ）（Ｇ）（Ｇ）（Ａ）（Ｇ）（Ｇ）（Ｃ）（Ｃ）（Ｃ）（Ｃ）（Ａ）（Ａ）（Ｔ）（Ｃ）（Ｃ）ＡＧＴＴＡＣＧＣＡＴＧＴＣＣＣ−３’（配列番号４９）
プライマーＦｗｄ：５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＣＡＴＧＣＧＴＡＡＣＴ−３’  （配列番号５０）
プライマーＲｅｖ：５’−ＴＧＣＴＣＧＡＴＣＴＧＧＡＣＴ−３’  （配列番号５１）【０２０３】
ＤＮＡ鋳型（配列番号４９）中の括弧は変異導入を表しており、括弧内に示されたヌクレオチドが７６％、その他の３種類のヌクレオチドが各８％ずつ含まれるようにデザインされている。プライマーＦｗｄはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含んでいる。最初のラウンドで用いたＲＮＡプールのバリエーションは理論上１０１３であった。【０２０４】
ADAMTS5が固相化された担体にＲＮＡプールを加え、３０分室温で保持した後、ADAMTS5に結合しないＲＮＡを取り除くために、溶液Ａで樹脂を洗浄した。ここで溶液Ａは１４５ｍＭ  塩化ナトリウム、５．４ｍＭ  塩化カリウム、１．８ｍＭ  塩化カルシウム、０．８ｍＭ  塩化マグネシウム、２０ｍＭ  トリス（ｐＨ７．６）、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０の混合溶液である。ADAMTS5に結合したＲＮＡは、溶出液として溶液Ｂを加えて９５℃で３分間熱処理を行い、その上清から回収した。ここで溶液Ｂは７Ｍ  Ｕｒｅａ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  トリス（ｐＨ７．６）の混合溶液である。回収されたＲＮＡは逆転写ＰＣＲで増幅し、ＤｕｒａＳｃｒｉｂｅＴＭ  Ｔ７  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  で転写して次のラウンドのプールとして用いた。以上を１ラウンドとし、同様の作業を複数回繰り返し行った。ＳＥＬＥＸ終了後、ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にクリーニングし、大腸菌株ＤＨ５α（Ｔｏｙｏｂｏ社製）をトランスフォーメーションした。シングルコロニーからプラスミドを抽出後、キャピラリーＤＮＡシーケンサー（３１３０ｘｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＡＢＩ社製）でクローンの塩基配列を調べた。また、次世代シーケンサーを用いて塩基配列の大規模解析も行った。次世代シーケンサーには、Ｉｏｎ  ＰＧＭＴＭシステム（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を用い、解析はＴｈｅｒｍｏ社の仕様書に沿って行った。【０２０５】
ＳＥＬＥＸを７ラウンド実施した後、キャピラリーＤＮＡシーケンサーによって４８クローンの配列を決定したところ、２６クローンの配列において以下に示される共通配列１または２が含まれていた。これらのクローンの一部の配列を配列番号１６〜２０に示す。【０２０６】
また、次世代シーケンサーによって４７６２３種類のクローン配列を特定し、１２７２８種類の配列に収束していることを確認した。それらのクローンの一部の配列を配列番号２１〜２５に示す。配列番号２１で表される配列は１，０４５配列存在した。配列番号２２で表される配列は５９５配列存在した。配列番号２３で表される配列は５５７配列存在した。配列番号２４で表される配列は４４２配列存在した。配列番号２５で表される配列は２８８配列存在した。これらの配列の二次構造をＭＦＯＬＤプログラム（Ｍ．  Ｚｕｋｋｅｒ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３１  （１３），  ３４０６−３４１５，  ２００３）を用いて予測したところ、共通配列の部分がよく似たループ構造となった。これらの配列の二次構造を図５−１、図５−２に示した。図５−１、図５−２中、共通配列を丸（〇）で囲んだ。また、配列番号３と配列が異なる箇所を矢印（黒三角形）で示した。【０２０７】
以下に配列番号１６〜２５で表されるそれぞれのヌクレオチド配列を示す。特に言及がなければ、以下に挙げられる個々の配列は、５’から３’の方向で表すものとし、プリン塩基（Ａ及びＧ）は２’−ＯＨ体であり、ピリミジン塩基（Ｕ及びＣ）は２’−フルオロ修飾体である。また、配列中のＮ１は６〜１５個の任意のヌクレオチドを示し、ＷはＡもしくはＵを、ＹはＣもしくはＵを示す。【０２０８】
配列番号１６：
ＧＧＧＡＣＡＵＧＣＧＵＡＡＣＵＵＧＡＵＡＧＧＧＧＣＣＵＣＣＧＣＡＧＣＵＧＡＵＣＡＧＣＵＣＧＧＡＣＵＣＡＡＡＣＣＡＵＣＡＡＧＵＣＣＡＧＡＵＣＧＡＧＣＡ【０２０９】
配列番号１７：
ＧＧＧＡＣＡＵＧＣＧＵＡＡＣＵＧＵＡＵＡＧＧＧＧＣＣＵＣＣＡＣＡＧＣＵＧＡＡＡＡＧＣＵＵＧＧＡＣＵＣＡＡＡＣＣＡＵＡＣＡＧＵＣＣＡＧＡＵＣＧＡＧＣＡ【０２１０】
配列番号１８：
ＧＧＧＡＣＡＵＧＣＧＵＡＡＣＵＧＣＡＵＣＧＧＧＧＣＣＵＣＣＧＣＡＧＣＵＧＵＵＡＡＧＣＵＣＧＧＡＣＵＣＡＡＡＣＣＡＵＧＣＡＧＵＣＣＡＧＡＵＣＧＡＧＣＡ【０２１１】
配列番号１９：
ＧＧＧＡＣＡＵＧＣＧＵＡＡＣＵＵＧＡＵＡＧＧＧＧＣＣＵＣＣＡＣＡＧＣＵＧＡＵＡＡＧＣＵＵＧＧＡＣＵＣＡＡＡＣＣＡＵＣＡＡＧＵＣＣＡＧＡＵＣＧＡＧＣＡ【０２１２】
配列番号２０：
ＧＧＧＡＣＡＵＧＣＧＵＡＡＣＵＧＵＡＵＡＧＧＧＧＣＣＵＣＣＧＣＡＧＣＵＡＵＵＣＡＧＣＵＣＧＧＡＣＡＵＡＡＡＣＣＡＵＡＣＡＧＵＣＣＡＧＡＵＣＧＡＧＣＡ【０２１３】
配列番号２１：
ＧＧＧＡＣＡＵＧＣＧＵＡＡＣＵＡＵＡＵＡＧＧＧＧＣＣＵＣＣＡＣＡＧＣＵＧＵＡＡＡＧＣＵＵＧＧＡＣＵＵＡＡＡＣＣＡＵＡＵＡＧＡＧＵＣＣＡＧＡＵＣＧＡＧＣＡ【０２１４】
配列番号２２：
ＧＧＧＡＣＡＵＧＣＧＵＡＡＣＵＧＣＡＵＡＧＧＧＧＣＣＵＣＣＡＣＡＧＣＵＡＵＵＣＡＧＣＵＵＧＧＡＣＡＣＡＡＡＣＣＡＵＧＣＡＧＵＣＣＡＧＡＵＣＧＡＧＣＡ【０２１５】
配列番号２３：
ＧＧＧＡＣＡＵＧＣＧＵＡＡＣＵＧＵＡＵＡＧＧＧＧＣＣＵＣＣＡＣＡＧＣＵＧＡＡＡＡＧＣＵＵＧＧＡＣＵＣＡＡＡＣＣＡＵＡＣＡＧＵＣＣＡＧＡＵＣＧＡＧＣＡ【０２１６】
配列番号２４：
ＧＧＧＡＣＡＵＧＣＧＵＡＡＣＵＵＧＡＵＡＧＧＧＧＣＣＵＣＣＡＣＡＧＣＣＧＧＵＡＧＧＣＵＵＧＧＡＣＵＣＡＡＡＣＣＡＵＣＡＡＧＵＣＣＡＧＡＵＣＧＡＧＣＡ【０２１７】
配列番号２５：
ＧＧＧＡＣＡＵＧＣＧＵＡＡＣＵＧＣＡＵＡＧＧＧＧＣＣＵＣＣＡＣＡＧＣＵＡＵＵＣＡＧＣＵＵＧＧＡＣＡＣＡＡＡＣＣＡＵＧＣＡＧＵＣＣＡＧＡＵＣＧＡＧＣＡ【０２１８】
共通配列１：
ＧＧＧＧＣＣＵＣＣ−Ｎ１−ＧＧＡＣＹＡＡＡＣ
共通配列２：
ＧＧＧＧＣＣＵＣＣ−Ｎ１−ＧＧＡＣＷＹＡＡＡＣ【０２１９】
配列番号１６〜２５で表される配列を有するアプタマーのADAMTS5に対する結合活性と酵素阻害活性を測定した。結合活性は表面プラズモン共鳴法により評価した。測定は実施例１で示した方法と同様の方法を用いて測定した。酵素阻害活性は実施例１で示した方法と同様の方法を用いて測定した。測定の結果を表７に示す。なお、表中、“＋＋”及び“＋”は、ネガティブコントロールの核酸よりも有意にADAMTS5に結合するものを表す。ここでネガティブコントロールの核酸とは、ＳＥＬＥＸ法の１ラウンド目に使用した核酸プールの事である。“＋＋”は、アプタマーのＳＡチップへの固定化量（ＲＵ値）に対するADAMTS5結合量（ＲＵ値）の割合が４０％以上のもの、“＋”は４０％未満のものを表す。阻害活性の数値は、表中に示した各アプタマー濃度における酵素阻害活性を表す。“ｎ．ｄ．”は未測定を表す。【０２２０】
【表７】
2019093497.tif 000013
【０２２１】
配列番号１６〜２５で表される配列を有するアプタマーは、いずれもネガティブコントロールの核酸よりも有意にADAMTS5に結合するアプタマーであることが示された。また、活性に強弱はあるものの、いずれの核酸も阻害活性を示すことが判った。【０２２２】
また、配列番号１６〜２５で表される配列を有するアプタマーの二次構造予測と結合活性、ならびに阻害活性の結果より、共通配列に隣接する末端のステム配列はバルジ構造を含んでも機能することが判った。バルジ構造とは、ステム構造内に塩基対を形成しない突出したヌクレオチド配列を持つ構造を指す。配列番号１６〜２５で表される配列を有するアプタマーのステム構造内にバルジ構造が含まれていた。【０２２３】
実施例７：アプタマーの短鎖化（３）
配列番号２１と２５で表される配列を有するアプタマーの短鎖化と塩基置換を行った。当該アプタマーの配列を配列番号２６〜２９に示す。【０２２４】
配列番号２７、２８及び２９については、配列番号１１（１）の修飾導入結果を基に、２’−Ｏ−メチル修飾を導入した上で短鎖化を実施した。配列番号２７〜２９で表される配列を有するアプタマーの二次構造予測を図６に示す。図６中、共通配列を丸（〇）で囲った。以下に配列番号２６〜２９で表されるそれぞれのヌクレオチド配列を示す。特に言及がなければ、以下に挙げられる個々の配列は、５’から３’の方向で表すものとし、大文字はＲＮＡを示す。ヌクレオチドにおける括弧はリボースの２’位の修飾を示し、Ｆはフッ素原子、ＭはＯ−メチル基を示す。“ｉｄＴ”はｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄＴを示す。【０２２５】
配列番号２６：
（配列番号２１で表される配列を、共通配列を含む４６ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列）
ＧＧＧＵ（Ｆ）ＡＵ（Ｆ）ＡＧＧＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）ＡＧＣ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）ＡＡＧＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＧＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＵ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）【０２２６】
配列番号２７：
（配列番号２１で表される配列に、配列番号１１（１）の２’位の修飾を反映させる様に２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列を含む４０ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列）
Ｕ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）ＡＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＧ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ａ（Ｍ）【０２２７】
配列番号２８：
（配列番号２７で表される配列の両末端各２ヌクレオチドを他の配列に置換した配列）
Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）ＡＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＧ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）【０２２８】
配列番号２９：
（配列番号２５で表される配列に、配列番号１１（１）の２’位の修飾を反映させる様に２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列を含む４０ヌクレオチドの長さに短鎖化して３’末端にｉｄＴを付加した配列）
Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）−ｉｄＴ【０２２９】
配列番号２６で表される配列を有するアプタマーは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによる転写により調製し、配列番号２７〜２９で表される配列を有するアプタマーについては化学合成により調製した。これらのアプタマーがADAMTS5の酵素活性を阻害するかどうかを、実施例１と同様の方法を用いて評価した。測定の結果を表８に示す。なお、表中、“ｎ．ｄ．”は未測定を表す。【０２３０】
【表８】
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【０２３１】
配列番号２６〜２９で表される配列を有するアプタマーはいずれも阻害活性が維持された。以上の結果より、配列番号２１と２５で表されるアプタマーは、共通配列を含む４０ヌクレオチドの長さで機能することが判った。配列番号２７と２８で表される配列を有するアプタマーの結果から、末端の二つの塩基対ＵＡ対とＡＵ対はそれぞれＣＧ対とＧＣ対に置き換えても活性に影響しないことが判った。【０２３２】
実施例８：アプタマーの改変３
配列番号２８、２９で表される配列を有するアプタマーのヌクレアーゼ耐性を高めるために、末端修飾した改変体、２’−フルオロ基、２’−Ｏ−メチル基を導入した改変体を導入した改変体を作製した。改変を施した配列を配列番号２８（１）〜２８（１８）（配列番号２８系統）、２９（１）〜２９（３）（配列番号２９系統）に示す。【０２３３】
以下に配列番号２８（１）〜２８（１８）、２９（１）〜２９（３）で表されるそれぞれのヌクレオチド配列を示す。特に言及がなければ、以下に挙げられる個々の配列は、５’から３’の方向で表すものとし、大文字はＲＮＡを示す。ヌクレオチドにおける括弧はリボースの２’位の修飾を示し、Ｆはフッ素原子、ＭはＯ−メチル基を示す。また、配列末端におけるｉｄＴはｉｎｖｅｒｔｅｄ−ｄＴによる修飾を示し、ＰＥＧは４０ｋＤａの分岐型ポリエチレングリコールによる修飾を示す。【０２３４】
配列番号２８（１）：
（配列番号２８で表される配列の共通配列以外の三か所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列）
Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）ＡＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）【０２３５】
配列番号２８（２）：
（配列番号２８で表される配列の共通配列以外の一か所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列）
Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＧ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）【０２３６】
配列番号２８（３）：
（配列番号２８で表される配列の共通配列の一か所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列）
Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）ＡＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＧ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）【０２３７】
配列番号２８（４）：
（配列番号２８で表される配列の共通配列の一か所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列）
Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）ＡＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＧ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｍ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）【０２３８】
配列番号２８（５）：
（配列番号２８で表される配列の共通配列の四か所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列）
Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）【０２３９】
配列番号２８（６）：
（配列番号２８で表される配列の共通配列以外の一か所に２’−フルオロ修飾を導入した配列）
Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ａ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＧ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）【０２４０】
配列番号２８（７）：
（配列番号２８で表される配列の共通配列の一か所に２’−フルオロ修飾を導入した配列）
Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）ＡＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｆ）ＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＧ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）【０２４１】
配列番号２８（８）：
（配列番号２８で表される配列の共通配列の一か所に２’−フルオロ修飾を導入した配列）
Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）ＡＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＧ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）【０２４２】
配列番号２８（９）：
（配列番号２８で表される配列の共通配列以外の一か所に２’−フルオロ修飾を導入した配列）
Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）ＡＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＧ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）【０２４３】
配列番号２８（１０）：
（配列番号２８で表される配列の共通配列の一か所に２’−フルオロ修飾を導入した配列）
Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）ＡＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＧ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）【０２４４】
配列番号２８（１１）：
（配列番号２８で表される配列の共通配列の一か所に２’−フルオロ修飾を導入した配列）
Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）ＡＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＧ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）【０２４５】
配列番号２８（１２）：
（配列番号２８で表される配列の共通配列の一か所に２’−フルオロ修飾を導入した配列）
Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）ＡＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＧ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）【０２４６】
配列番号２８（１３）：
（配列番号２８で表される配列の五か所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、３’末端にｉｄＴを付加した配列）
Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）−ｉｄＴ【０２４７】
配列番号２８（１４）：
（配列番号２８（１３）で表される配列の共通配列の一か所に２’−フルオロ修飾を導入した配列）
Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｆ）ＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）−ｉｄＴ【０２４８】
配列番号２８（１５）：
（配列番号２８で表される配列の四か所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、３’末端にｉｄＴを付加した配列）
Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）ＡＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）−ｉｄＴ【０２４９】
配列番号２８（１６）：
（配列番号２８で表される配列の四か所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、３’末端にｉｄＴを付加した配列）
Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）−ｉｄＴ【０２５０】
配列番号２８（１７）：
（配列番号２８で表される配列の三か所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、３’末端にｉｄＴを付加した配列）
Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）ＡＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）−ｉｄＴ【０２５１】
配列番号２８（１８）：
（配列番号２８（１５）で表される配列の５’末端にＰＥＧを付加した配列）
ＰＥＧ−Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）ＡＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）−ｉｄＴ【０２５２】
配列番号２９（１）：
（配列番号２９で表される配列の共通配列の一か所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列）
Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）−ｉｄＴ【０２５３】
配列番号２９（２）：
（配列番号２９で表される配列の共通配列の一か所に２’−フルオロ修飾を導入した配列）
Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｆ）ＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）−ｉｄＴ【０２５４】
配列番号２９（３）：
（配列番号２９で表される配列の共通配列の二か所に２’−フルオロ修飾を導入した配列）
Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｆ）ＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）−ｉｄＴ【０２５５】
配列番号２８（１）〜２８（１８）（配列番号２８系統）と配列番号２９（１）〜２９（３）（配列番号２９系統）で表される配列を有するアプタマーは全て化学合成により調製した。これらのアプタマーがADAMTS5の酵素活性を阻害するかどうかを、実施例１及び実施例５と同様の方法を用いて評価した。測定の結果を表９に示す。表中、“評価法１”は検出方法を電気泳動法とした酵素阻害活性評価法であり、１０ｎＭの核酸の最終濃度における阻害活性を示す。“評価法２”は検出方法をＥＬＩＳＡ法とした酵素阻害活性評価法であり、２ｎＭの核酸の最終濃度における阻害活性並びにＩＣ５０値を示す。“ｎ．ｄ．”は未測定を表す。【０２５６】
【表９】
2019093497.tif 000015
【０２５７】
配列番号２８（２）と２８（６）で表される配列を有するアプタマーの結果より、５’末端から４塩基目のＡ（ステム１でバルジ構造を形成している）はＲＮＡのほか、２’−フルオロ修飾や２’−Ｏ−メチル修飾でも機能することが判った。また、配列番号２８（３）と２９（１）で表される配列を有するアプタマーの結果より、共通配列の３’末端側から７番目のＷ（ＡまたはＵ）はＲＮＡ、２’−フルオロ修飾のほか、２’−Ｏ−メチル修飾でも機能することが判った。また、配列番号２８（７）、２８（８）、２８（１０）、２８（１２）、２９（２））で表される配列を有するアプタマーの結果より、共通配列の５’末端から３塩基目と４塩基目のＧ、３’末端から１０塩基目のＧ、５塩基目のＡはＲＮＡのほか、２’−フルオロ修飾でも機能することが判った。一方で、配列番号２８（４）、２８（１１）で表される配列を有するアプタマーの結果から、共通配列の３’末端から６番目のＹは、２’−Ｏ−メチル化修飾の導入によりアプタマーの阻害活性が著しく減弱し、また、３’末端から９番目のＡは、２’−フルオロ化修飾によりアプタマーの活性が低下することが判明した。【０２５８】
配列番号２８（１３）〜（１８）（配列番号２８系統）、２９及び２９（１）〜２９（３）（配列番号２９系統）で表される配列を有するアプタマーの結果より、５’末端にＰＥＧ、３’末端にｉｄＴを付加しても阻害活性に影響しないことが判った。末端修飾としては、ＰＥＧ、ｉｄＴ以外にもペプチド、アミノ酸、糖、グリコサミノグリカン、あるいはビオチンなどが挙げられる。【０２５９】
実施例９：ADAMTS5に特異的に結合するＲＮＡアプタマーの作製（３）
ADAMTS5に特異的に結合するＲＮＡアプタマーを、ＶａｔｅｒらのＳＥＬＥＸ法（Ｖａｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ３１、ｅ１３０、２００３）の改良法を用いて作製した。ＳＥＬＥＸの標的物質としてＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社製）の担体に固相化したADAMTS5（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた。最初のラウンドで用いたＲＮＡは、化学合成によって得られたＤＮＡを実施例１と同様の方法で転写して得た。この方法によって得られたＲＮＡはピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位がフルオロ化されたものである。使用した鋳型とプライマーの配列を以下に示す。ＤＮＡ鋳型とプライマーは化学合成により作製した。鋳型ＤＮＡは配列番号１１の配列の共通配列以外のステム−ループ領域の配列に変異が導入されたデザインを持つ。【０２６０】
ＤＮＡ鋳型：５’−ＡＴＡＴＣＴＴＴＴＧＣＴＴＡＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＴＴＧＧＴＴＴＡＧＴＣＣＡＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＴＧＧＡＧＧＣＣＣＣＡＡＴＡＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡ−３’（配列番号５２）【０２６１】
プライマーＦｗｄ：５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴ−３’  （配列番号５３）【０２６２】
プライマーＲｅｖ：５’−ＡＴＡＴＣＴＴＴＴＧＣＴＴＡＴＴＣＴＣＧＡＧ−３’  （配列番号５４）【０２６３】
ＤＮＡ鋳型（配列番号）中のＮの連続は任意の組み合わせの１０個のヌクレオチド（それぞれのＮは、Ａ、Ｃ、Ｇ又はＴである）である。プライマーＦｗｄはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含んでいる。最初のラウンドで用いたＲＮＡプールのバリエーションは理論上１０１３であった。【０２６４】
ADAMTS5が固相化された担体にＲＮＡプールを加え、３０分室温で保持した後、ADAMTS5に結合しないＲＮＡを取り除くために、溶液Ａで樹脂を洗浄した。ここで溶液Ａは１４５ｍＭ  塩化ナトリウム、５．４ｍＭ  塩化カリウム、１．８ｍＭ  塩化カルシウム、０．８ｍＭ  塩化マグネシウム、２０ｍＭ  トリス（ｐＨ７．６）、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０の混合溶液である。ADAMTS5に結合したＲＮＡは、溶出液として溶液Ｂを加えて９５℃で３分間熱処理を行い、その上清から回収した。ここで溶液Ｂは７Ｍ  Ｕｒｅａ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  トリス（ｐＨ７．６）の混合溶液である。回収されたＲＮＡは、Ｔ７  ＲＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いてプライマー配列を両末端に連結した後、逆転写ＰＣＲで増幅した。Ｒｅｖプライマーの３’末端側には制限酵素サイトＸｈｏＩが設計されており、ＰＣＲ増幅産物をＸｈｏＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で消化することでＲｅｖプライマー配列を取り除くことが可能である。制限酵素で消化したＰＣＲ増幅産物を鋳型にＤｕｒａＳｃｒｉｂｅＴＭ  Ｔ７  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  で転写し、次のラウンドのプールとして用いた。以上を１ラウンドとし、同様の作業を複数回繰り返し行った。ＳＥＬＥＸ終了後、次世代シーケンサーを用いて塩基配列の大規模解析を行った。次世代シーケンサーには、Ｉｏｎ  ＰＧＭＴＭシステム（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を用い、解析はＴｈｅｒｍｏ社の仕様書に沿って行った。【０２６５】
ＳＥＬＥＸを３ラウンド実施した後、次世代シーケンサーによって７９５６種類のクローン配列を特定し、７６７６種類の配列に収束していることを確認した。それらのクローンの一部の配列を配列番号３０〜４５に示す。配列番号３０で表される配列は４配列存在した。配列番号３１〜４５で表される配列はそれぞれ３配列存在した。【０２６６】
これらの配列の二次構造をＭＦＯＬＤプログラム（Ｍ．  Ｚｕｋｋｅｒ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３１  （１３），  ３４０６−３４１５，  ２００３）を用いて予測したところ、共通配列の部分がよく似たループ構造となった。これらの配列の二次構造を図７−１、図７−２、図７−３に示した。図７−１、図７−２、図７−３中、共通配列を丸（〇）で囲んだ。また、配列番号１１と配列が異なる箇所を矢印（黒三角形）で示した。【０２６７】
以下に配列番号３０〜４５で表されるそれぞれのヌクレオチド配列を示す。特に言及がなければ、以下に挙げられる個々の配列は、５’から３’の方向で表すものとし、プリン塩基（Ａ及びＧ）は２’−ＯＨ体であり、ピリミジン塩基（Ｕ及びＣ）は２’−フルオロ修飾体である。【０２６８】
配列番号３０：
ＧＧＧＵＡＵＵＧＧＧＧＣＣＵＣＣＡＣＡＡＵＡＧＡＵＡＡＡＵＧＧＡＣＵＡＡＡＣＣＡＡＣＵＣＧＡ【０２６９】
配列番号３１：
ＧＧＧＵＡＵＵＧＧＧＧＣＣＵＣＣＡＣＡＧＵＵＧＡＡＧＣＵＵＧＧＡＣＵＡＡＡＣＣＡＡＵＣＵＣＧＡ【０２７０】
配列番号３２：
ＧＧＧＵＡＵＵＧＧＧＧＣＣＵＣＣＡＣＡＧＡＡＡＡＡＵＣＵＵＧＧＡＣＵＡＡＡＣＣＡＡＵＣＵＣＧＡ【０２７１】
配列番号３３：
ＧＧＧＵＡＵＵＧＧＧＧＣＣＵＣＣＡＣＡＧＣＣＧＡＧＧＣＵＵＧＧＡＣＵＡＡＡＣＣＡＡＵＣＵＣＧＡ【０２７２】
配列番号３４：
ＧＧＧＵＡＵＵＧＧＧＧＣＣＵＣＣＡＣＡＧＡＡＡＡＡＡＣＵＵＧＧＡＣＵＡＡＡＣＣＡＡＣＵＣＧＡ【０２７３】
配列番号３５：
ＧＧＧＵＡＵＵＧＧＧＧＣＣＵＣＣＡＣＡＧＵＡＡＧＣＡＣＵＵＧＧＡＣＵＡＡＡＣＣＡＧＣＵＣＧＡ【０２７４】
配列番号３６：
ＧＧＧＵＡＵＵＧＧＧＧＣＣＵＣＣＡＣＡＧＵＵＵＡＡＡＣＵＵＧＧＡＣＵＡＡＡＣＣＡＡＣＵＣＧＡ【０２７５】
配列番号３７：
ＧＧＧＵＡＵＵＧＧＧＧＣＣＵＣＣＡＣＡＧＵＡＡＡＵＵＣＵＵＧＧＡＣＵＡＡＡＣＣＡＡＣＵＣＧＡ【０２７６】
配列番号３８：
ＧＧＧＵＡＵＵＧＧＧＧＣＣＵＣＣＡＣＧＣＵＡＧＡＡＧＧＣＵＧＧＡＣＵＡＡＡＣＣＡＡＣＵＣＧＡ【０２７７】
配列番号３９：
ＧＧＧＵＡＵＵＧＧＧＧＣＣＵＣＣＡＣＧＵＡＡＣＵＡＡＡＣＵＧＧＡＣＵＡＡＡＣＣＡＡＣＵＣＧＡ【０２７８】
配列番号４０：
ＧＧＧＵＡＵＵＧＧＧＧＣＣＵＣＣＡＣＧＣＡＡＵＧＧＵＧＣＵＧＧＡＣＵＡＡＡＣＣＡＡＣＵＣＧＡ【０２７９】
配列番号４１：
ＧＧＧＵＡＵＵＧＧＧＧＣＣＵＣＣＡＣＡＵＧＧＡＵＡＣＡＵＵＧＧＡＣＵＡＡＡＣＣＡＡＣＵＣＧＡ【０２８０】
配列番号４２：
ＧＧＧＵＡＵＵＧＧＧＧＣＣＵＣＣＡＣＡＧＡＵＡＡＵＵＣＵＵＧＧＡＣＵＡＡＡＣＣＡＡＣＵＣＧＡ【０２８１】
配列番号４３：
ＧＧＧＵＡＵＵＧＧＧＧＣＣＵＣＣＡＣＡＧＡＡＡＡＵＵＣＵＵＧＧＡＣＵＡＡＡＣＣＡＡＣＵＣＧＡ【０２８２】
配列番号４４：
ＧＧＧＵＡＵＵＧＧＧＧＣＣＵＣＣＡＣＡＧＡＡＣＵＵＵＣＵＵＧＧＡＣＵＡＡＡＣＣＡＡＣＵＣＧＡ【０２８３】
配列番号４５：
ＧＧＧＵＡＵＵＧＧＧＧＣＣＵＣＣＡＣＡＧＡＡＡＡＧＵＣＵＵＧＧＡＣＵＡＡＡＣＣＡＡＣＵＣＧＡ【０２８４】
配列番号３０〜４５で表される核酸のADAMTS5に対する結合活性を測定した。結合活性は表面プラズモン共鳴法により評価した。測定は実施例１で示した方法と同様の方法を用いて測定した。測定の結果を表１０に示す。表中、“＋＋”は、アプタマーのＳＡチップへの固定化量（ＲＵ値）に対するADAMTS5結合量（ＲＵ値）の割合が４０％以上のもの、“＋”は１０％以上４０％未満のもの、“−”は１０％未満のものを表す。【０２８５】
【表１０】
2019093497.tif 000016
【０２８６】
測定の結果、測定した全ての配列がADAMTS5と結合することが判った。配列番号３０〜４５の結果から、ＳＥＬＥＸ法で変異を導入した配列番号１１の１６番目のＧから２３番目のＣまでの配列は２から３つの連続した塩基対を形成する傾向があるが、ヌクレオチド配列はランダムに可変であることが示された。【０２８７】
実施例１０：滑膜細胞におけるADAMTS5アプタマーのアグリカン切断阻害活性評価
配列番号１１（３４）、２８（１３）、２８（１５）、２８（１８）で表されるアプタマーについて、滑膜細胞におけるアグリカンの切断阻害活性を測定した。測定は、下記の方法により実施した。ヒト変形性膝関節症患者由来の滑膜細胞（ＨＦＬＳ−ＯＡ細胞）（Ｃｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ社製）を１ウェルあたり２ｘ１０４細胞ずつ播種し、１６〜２４時間培養した。培養方法はＣｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ社の仕様書に従った。培養後、培地を取り除きＢａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｃｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ社製）で細胞を洗浄し、基質としてＢａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍで希釈した５００ｎｇのアグリカンＧ１−ＩＧＤ−Ｇ２（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を添加した。アプタマーによる阻害評価を実施するサンプルについては、基質と同時にアプタマーを添加した。そのまま細胞を培養し、３日後に培養上清を回収した。添加した基質は、培養の間に、ＨＦＬＳ−ＯＡ細胞から分泌されるADAMTS5を始めとする基質切断酵素により切断される。培養上清中に含まれる切断基質断片量は、実施例５に記載したＥＬＩＳＡ法によって定量した。この評価系における基質切断効率は１〜８％であった。ネガティブコントロールとして、配列番号１５で表される核酸を用いた。測定の結果を表１１に示す。【０２８８】
【表１１】
2019093497.tif 000017
【０２８９】
測定の結果、いずれのアプタマーもネガティブコントロールと比較して、顕著な阻害活性を示した。以上の結果から、本発明のアプタマーは滑膜細胞における基質切断に対して優れた阻害効果を示すと言える。
【産業上の利用可能性】
【０２９０】
本発明のアプタマー又は複合体は、変形性膝関節症などの軟骨疾患に対する医薬、あるいは診断薬、試薬として有用であり得る。本発明のアプタマー又は複合体はまた、ADAMTS5の精製及び濃縮、ADAMTS5の標識、並びにADAMTS5の検出及び定量に有用であり得る。【０２９１】
本出願は、日本で出願された特願２０１７−２１６２８０（出願日：２０１７年１１月９日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
2019093497.tif 000020
【図２】
2019093497.tif 000021
【図３】
2019093497.tif 000022
【図４】
2019093497.tif 000023
【図５−１】
2019093497.tif 000024
【図５−２】
2019093497.tif 000025
【図６】
2019093497.tif 000026
【図７−１】
2019093497.tif 000027
【図７−２】
2019093497.tif 000028
【図７−３】
2019093497.tif 000029
【配列表】
2019093497000001.app
【国際調査報告】
2019093497.tif 000030
2019093497.tif 000031
2019093497.tif 000032
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