(57)【要約】  本発明はキシロースを含む新規ステビオール配糖体を提供するものである。本発明によれば、式（１）：    【化１】2021020516.tif 000032（式中、（ｉ）Ｒ１が、Xyl(1-2)Glc1-を表し、かつ、Ｒ２がGlc(1-2)[Glc(1-3)]Glc1-を表す；または（ｉｉ）Ｒ１が、Glc(1-2)[Glc(1-3)]Glc1-を表し、かつ、Ｒ２が、Xyl(1-2)[Glc(1-3)]Glc1-を表し、Glcはグルコースを表し、Xylはキシロースを表す）で示される化合物、またはその塩、もしくは水和物が提供される。
2021020516.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）：
【化１】
2021020516.tif 000029
（式中、
（ｉ）Ｒ１が、Xyl(1-2)Glc1-を表し、かつ、Ｒ２がGlc(1-2)[Glc(1-3)]Glc1-を表す；または
（ｉｉ）Ｒ１が、Glc(1-2)[Glc(1-3)]Glc1-を表し、かつ、Ｒ２が、Xyl(1-2)[Glc(1-3)]Glc1-を表し、
Glcはグルコースを表し、Xylはキシロースを表す）
で示される化合物、またはその塩、もしくは水和物。
【請求項２】
下記式（２）または（３）：
【化２】
2021020516.tif 000030
で示される請求項１に記載の化合物、またはその塩、もしくは水和物。
【請求項３】
下記式（４）または（５）：
【化３】
2021020516.tif 000031
で示される請求項１または２に記載の化合物、またはその塩、もしくは水和物。
【請求項４】
植物由来物、化学合成物、または生合成物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物を含む、飲食品。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物の含有量が１質量ｐｐｍ〜６００質量ｐｐｍである、請求項５に記載の飲食品。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物を含む、甘味料組成物。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物の含有量が１重量％〜９９重量％である、請求項７に記載の甘味料組成物。
【請求項９】
レバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＢ、レバウディオサイドＣ、レバウディオサイドＤ、レバウディオサイドＥ、レバウディオサイドＦ、レバウディオサイドＩ、レバウディオサイドＪ、レバウディオサイドＫ、レバウディオサイドＮ、レバウディオサイドＭ、レバウディオサイドＯ、レバウディオサイドＱ、レバウディオサイドＲ、ズルコサイドＡ、ズルコサイドＣ、ルブソシド、ステビオール、ステビオールモノシド、ステビオールビオシドおよびステビオシドからなる群から選択される一種以上のステビオール配糖体をさらに含む、請求項７または８に記載の甘味料組成物。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれか一項に記載の甘味料組成物を含む飲食品。
【請求項１１】
飲料である、請求項１０に記載の飲食品。
【請求項１２】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物の甘味料としての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ステビオール配糖体およびその製造方法、ならびにそれを含む甘味料組成物に関する。本発明はさらに、新規ステビオール配糖体を含む飲食品、植物体およびその抽出物、ならびに風味調整剤にも関する。
【背景技術】
【０００２】
キク科ステビア(Stevia rebaudiana)の葉にはジテルペノイドの一種であるステビオール(Steviol)とよばれる二次代謝産物が含まれており、ステビオール配糖体は砂糖の約300倍もの甘味を呈することからカロリーレスの甘味料として食品産業に利用されている。肥満が深刻な社会問題として国際的に発展しており、健康増進および医療費削減の観点からもカロリーレスの甘味料の要望は日々大きくなっている。現在では人工的に合成されたアミノ酸誘導体のアスパルテーム(Aspartame)やアセスルファムカリウム(Acesulfame Potassium)が人工甘味料として利用されているが、ステビオール配糖体のように天然に存在するカロリーレス甘味料はより安全で消費者理解（Public Acceptance）が得られやすいと期待される。【０００３】
ステビアの主要なステビオール配糖体は最終的には4つの糖が付いたレバウディオサイドA  (Rebaudioside A; Reb.A)と呼ばれる配糖体にまで糖で修飾される（図1）。その前駆体であるステビオール3糖配糖体のステビオシド(Stevioside)が量的に最も多く、これら2つがステビアの甘味の中心的な物質である。ステビオシドは、ステビア葉で最も含有量が多く、砂糖の250〜300倍程の甘味を呈することが知られている。Reb.Aは、甘味が高く（砂糖の350〜450倍）、且つ味質が良いとされるステビオール4糖配糖体であり、これらはカロリーレス甘味料として注目されている。これら以外に反応中間体と思われる配糖体や糖の種類が異なる類縁体の存在が知られている。例えば、Reb.Aの4つの配糖体糖はすべてグルコースであるが、このうち13位のグルコースの2位にグルコースではなくラムノースが付加されたレバウディオサイドC(Reb.C)や、同位置にキシロースが付加されたレバウディオサイドF(Reb.F)が知られている。【０００４】
これまで４つの配糖体糖がすべてグルコースであるReb.Aの味質が良好であるとして、野生型のステビア植物よりもReb.Aの含有量の多いステビア植物を品種改良等によって得ようという試みがなされている（例えば、特許文献１）。また、味質が良好であるレバウディオサイドＭ（Ｒｅｂ．Ｍ（Ｒｅｂ．Ｘとも称される））などの既知のステビオール配糖体を酸で分解することで、新たなステビオール配糖体を得る試みもなされている（例えば、特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第３４３６３１７号公報
【特許文献２】国際公開第２０１４/１４６１３５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ステビオール配糖体は骨格となるジテルペン構造に付加する糖分子の数や種類の違いによって甘味度や味質が大きく異なることがあるため、新規なステビオール配糖体が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、次に示す、キシロースを含む新規ステビオール配糖体、これを含む甘味料組成物および飲食品などを提供する。
［１］
式（１）：
【化１】
2021020516.tif 000003
（式中、
（ｉ）Ｒ１が、Xyl(1-2)Glc1-を表し、かつ、Ｒ２がGlc(1-2)[Glc(1-3)]Glc1-を表す；または
（ｉｉ）Ｒ１が、Glc(1-2)[Glc(1-3)]Glc1-を表し、かつ、Ｒ２が、Xyl(1-2)[Glc(1-3)]Glc1-を表し、
Glcはグルコースを表し、Xylはキシロースを表す）
で示される化合物、またはその塩、もしくは水和物。
［２］
下記式（２）または（３）：
【化２】
2021020516.tif 000004
で示される［１］に記載の化合物、またはその塩、もしくは水和物。
［３］
下記式（４）または（５）：
【化３】
2021020516.tif 000005
で示される［１］または［２］に記載の化合物、またはその塩、もしくは水和物。
［４］
植物由来物、化学合成物、または生合成物である、［１］〜［３］のいずれかに記載の化合物。
［５］
［１］〜［４］のいずれかに記載の化合物を含む、飲食品。
［６」
［１］〜［４］のいずれかに記載の化合物の含有量が１質量ｐｐｍ〜６００質量ｐｐｍである、［５］に記載の飲食品。
［７］
［１］〜［４］のいずれかに記載の化合物を含む、甘味料組成物。
［８］
［１］〜［４］のいずれかに記載の化合物の含有量が１重量％〜９９重量％である、［７］に記載の甘味料組成物。
［９］
レバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＢ、レバウディオサイドＣ、レバウディオサイドＤ、レバウディオサイドＥ、レバウディオサイドＦ、レバウディオサイドＩ、レバウディオサイドＪ、レバウディオサイドＫ、レバウディオサイドＮ、レバウディオサイドＭ、レバウディオサイドＯ、レバウディオサイドＱ、レバウディオサイドＲ、ズルコサイドＡ、ズルコサイドＣ、ルブソシド、ステビオール、ステビオールモノシド、ステビオールビオシドおよびステビオシドからなる群から選択される一種以上のステビオール配糖体をさらに含む、［７］または［８］に記載の甘味料組成物。
［１０］
［７］〜［９］のいずれかに記載の甘味料組成物を含む飲食品。
［１１］
飲料である、［１０］に記載の飲食品。
［１２］
［１］〜［３］のいずれかに記載の化合物の甘味料としての使用。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、キシロースを含む新規ステビオール配糖体、その製造方法、ならびに新規ステビオール配糖体を含む甘味料組成物、飲食品、植物およびその抽出物、ならびに風味調整剤を提供することができる。本発明の好ましい態様のステビオール配糖体は優れた味質と高い甘味度を有する。本発明の他の態様の甘味料組成物は、優れた味質を有する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ステビオール配糖体の構造と名称を示す図である。
【図２】開発品種Ａのm/z 1097.4の選択イオンクロマトグラムを示す図である。
【図３】開発品種Ａのm/z 1259.5の選択イオンクロマトグラムを示す図である。
【図４】新規ステビオール配糖体１ＥのMS/MSおよびMS3断片化マススペクトルを示す図である。
【図５】新規ステビオール配糖体２ＥのMS/MSおよびMS3断片化マススペクトルを示す図である。
【図６】化合物１５の1H-NMRスペクトル(400MHz, Pyr-d5)を示す図である。
【図７】化合物１５の13C-NMRスペクトル(100MHz, Pyr-d5)を示す図である。
【図８】化合物１７の1H-NMRスペクトル(400MHz, Pyr-d5)を示す図である。
【図９】化合物１７の13C-NMRスペクトル(100MHz, Pyr-d5)を示す図である。
【図１０】新規ステビオール配糖体１Ｅ（ステビア葉抽出物）と化学合成品（化合物１５のβ体）の抽出イオンクロマトグラムを示す図である。
【図１１】新規ステビオール配糖体１Ｅ（ステビア葉抽出物）と化学合成品（化合物１５のβ体）のMS/MSおよびMS3断片化マススペクトルを示す図である。
【図１２】新規ステビオール配糖体２Ｅ（ステビア葉抽出物）と化学合成品（化合物１７のβ体）の抽出イオンクロマトグラムを示す図である。
【図１３】新規ステビオール配糖体２Ｅ（ステビア葉抽出物）と化学合成品（化合物１７のβ体）のMS/MSおよびMS3断片化マススペクトルを示す図である。
【図１４】新規ステビオール配糖体Ａを、砂糖(sugar)、レバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＤおよびレバウディオサイドＭとを比較した官能評価の結果を示す図である。
【図１５】新規ステビオール配糖体Ｂを、砂糖(sugar)、レバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＤおよびレバウディオサイドＭとを比較した官能評価の結果を示す図である。
【図１６】実施例における遺伝的特徴の同定に関して行った発現解析結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、２０１９年７月３１日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願（特願２０１９−１４１６２７号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
【００１１】
本明細書において、「レバウディオサイド」、「Reb」および「Reb.」は同じ意味を表すものであり、いずれも「rebaudioside」を意味するものである。同様に、本明細書において、「ズルコサイド」は「dulcoside」を意味するものである。
【００１２】
１.  新規ステビオール配糖体
本発明者らは、キシロースを含む新規ステビオール配糖体の構造を初めて特定した。本発明の新規ステビオール配糖体（本明細書中、「本発明の配糖体」ともいう）は、式（１）：
【化４】
2021020516.tif 000006
（式中、
（ｉ）Ｒ１が、Xyl(1-2)Glc1-を表し、かつ、Ｒ２がGlc(1-2)[Glc(1-3)]Glc1-を表すか：（ｉｉ）Ｒ１が、Glc(1-2)[Glc(1-3)]Glc1-を表し、かつ、Ｒ２が、Xyl(1-2)[Glc(1-3)]Glc1-を表し、
Glcはグルコースを表し、Xylはキシロースを表す）
で示される化合物、またはその塩、もしくは水和物である。なお、糖鎖中のグルコース分子とキシロース分子は、それぞれグルコピラノシルとキシロピラノシルとも称される。
【００１３】
本発明の配糖体は、上記のとおり、ステビオールの第１３位に３分子のグルコースを含む糖鎖を有し、第１９位に１分子のグルコースと１分子のキシロースを有するステビオール配糖体（本明細書中、「本発明の配糖体Ａ」ともいう）と、ステビオールの第１３位に２分子のグルコースと１分子のキシロースを含む糖鎖を有し、第１９位に３分子のグルコースを含む糖鎖を有するステビオール配糖体（本明細書中、「本発明の配糖体Ｂ」ともいう）を包含する。
【００１４】
また、上記のとおり、Glcはグルコースを表し、Xylはキシロースを表す。本明細書において、Glcはα-グルコースまたはβ-グルコースであってよく、Xylはα-キシロースまたはβ-キシロースであってよい。あるいは本明細書において、Glcはα-グルコースおよびβ-グルコースであってよく、Xylはα-キシロースおよびβ-キシロースであってよい。そして、「Glc1-」はグルコースの１位の炭素原子がステビオールとグリコシド結合していることを示し、「Glc(1-3)-Glc1-」は「Glc1-」で示されるグルコースの３位の炭素原子に更なるグルコースの１位の炭素原子がグリコシド結合していることを示す。また、「Xyl(1-2)-Glc1-」は「Glc1-」で示されるグルコースの２位の炭素原子にキシロースの１位の炭素原子がグリコシド結合していることを示す。さらに、「Xyl(1-2)[Glc(1-3)]Glc1-」は、「Glc1-」で示されるグルコースの２位の炭素原子にキシロースの１位の炭素原子がグリコシド結合し、かつ、「Glc1-」で示されるグルコースの３位の炭素原子にグルコースの１位の炭素原子がグリコシド結合していることを示す。
【００１５】
配糖体Ａとしては例えば、式（２）、式（２）’、式（４）および式（４）’で示される構造を有する配糖体が含まれる。
【化５】
2021020516.tif 000007
式（２）で示される配糖体Ａは、ステビオールの１９位のカルボキシル基にグルコースがβグルコシド結合しており、そのグルコースにキシロースがβ１−２結合しており、式（２）’で示される配糖体Ａは、ステビオールの１９位のカルボキシル基にグルコースがβグルコシド結合しており、そのグルコースにキシロースがα１−２結合している。式（４）と式（４）’は、それぞれ式（２）と式（２）’の配糖体Ａの立体配座をさらに特定した構造を示す。
【００１６】
配糖体Ｂとしては例えば、式（３）、式（３）’、式（５）および式（５）’で示される構造を有する配糖体が含まれる。
【化６】
2021020516.tif 000008
式（３）で示される配糖体Ｂは、ステビオールの１３位のヒドロキシ基にグルコースがβグルコシド結合しており、そのグルコースに他のグルコースがβ１−３結合しており、かつ、キシロースがβ１−２結合している。式（３）’で示される配糖体Ｂは、ステビオールの１３位のヒドロキシ基にグルコースがβグルコシド結合しており、そのグルコースに他のグルコースがβ１−３結合しており、かつ、キシロースがα１−２結合している。式（５）と式（５）’は、それぞれ式（３）と式（３）’の配糖体Ｂの立体配座をさらに特定した構造を示す。
【００１７】
本発明の配糖体には上記のようにα体やβ体等の異性体も包含される。したがって、本発明の配糖体はα体のみ、β体のみ、またはα体とβ体の混合物のいずれであってもよい。本発明の配糖体は、β体の割合が、８０％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましく、９９％以上であることが特に好ましい。なお、α体とβ体は高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＨＰＬＣ）、超高性能液体クロマトグラフィー (Ultra （High）Performance Liquid chromatography：UPLC)等の公知の方法を用いることにより、単離・精製することができる。
【００１８】
本発明の配糖体は、式（１）で示される化合物だけではなく、その誘導体、塩、若しくは水和物であってもよい。本明細書において、「誘導体」とは、化合物中の小部分の構造上の変化があってできる化合物をいい、例えば、ヒドロキシ基の一部が他の置換基に置換されているような化合物を意味する。したがって、式（１）で示される化合物の誘導体としては、該化合物に含まれるヒドロキシ基の一部が、水素、ハロゲン、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アミノ基、シアノ基などから選択される置換基で置換された化合物を含む。本明細書において、「式（１）の化合物の塩」とは式（１）の化合物の生理学的に許容可能な塩、例えばナトリウム塩、を意味する。また、本明細書について「式（１）の化合物の水和物」とは、式（１）の化合物に水分子が付加された化合物を意味する。
【００１９】
本発明の配糖体は、特に限定されないが、植物由来物、化学合成物、または生合成物であってもよい。例えば、本発明の配糖体を多く含む植物体から単離、精製してもよいが、化学合成や生合成によって得てもよい。本発明の配糖体の製造方法の詳細については本明細書において後述する。
【００２０】
本発明の配糖体は、砂糖（ショ糖、スクロース）よりも高い甘味を有し、飲食品等に少量含まれるだけで甘みに影響を与えることができる。したがって、本発明の配糖体は新規な甘味料として使用することができる。
【００２１】
本発明の好ましい態様の配糖体は、配糖体Ａまたは配糖体Ｂから選択される。配糖体Ａは、砂糖よりも高い甘味度を有し、甘味と苦味の後引きが少なく、苦味は砂糖を含めた他の成分に比べ少ない。配糖体Ｂも、砂糖よりも高い甘味度を有し、他のステビオール配糖体よりも苦みが弱い。したがって、本発明のステビオール配糖体、後述のように甘味料として様々な用途に好適に使用することができる。
【００２２】
２.  新規ステビオール配糖体を含む甘味料組成物
本発明の一態様によれば、式（１）で示される化合物、またはその誘導体、塩、もしくは水和物を含む甘味料組成物（本明細書中、「本発明の甘味料組成物」ともいう）が提供される。本発明の甘味料組成物は、式（１）で示される化合物、またはその誘導体、塩、もしくは水和物を含んでいれば特に限定されず、式（１）で示される化合物、またはその誘導体、塩、もしくは水和物を含む抽出物を含む組成物であってもよい。
【００２３】
本発明の甘味料組成物に含まれる本発明の配糖体の量は特に限定されないが、例えば、甘味料組成物の総量に対して、１重量％〜９９重量％、５重量％〜９５重量％、１０重量％〜９０重量％、１５重量％〜８５重量％、２０重量％〜８０重量％、２５重量％〜７５重量％、３０重量％〜７０重量％、３５重量％〜６５重量％、４０重量％〜６０重量％、４５重量％〜５５重量％、１重量％〜５重量％、１重量％〜１０重量％、１重量％〜１５重量％、１重量％〜２０重量％、１重量％〜２５重量％、１重量％〜３０重量％、１重量％〜３５重量％、１重量％〜４０重量％、１重量％〜４５重量％または１重量％〜５０重量％であってもよい。
【００２４】
本発明の甘味料組成物は、さらに他のステビオール配糖体を含んでいてもよい。例えば、本発明の甘味料組成物は、本発明の配糖体に加え、レバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＢ、レバウディオサイドＣ、レバウディオサイドＤ、レバウディオサイドＥ、レバウディオサイドＦ、レバウディオサイドＩ、レバウディオサイドＪ、レバウディオサイドＫ、レバウディオサイドＮ、レバウディオサイドＭ、レバウディオサイドＯ、レバウディオサイドＱ、レバウディオサイドＲ、ズルコサイドＡ、ズルコサイドＣ、ルブソシド、ステビオール、ステビオールモノシド、ステビオールビオシドおよびステビオシドからなる群から選択される一種以上のステビオール配糖体をさらに含んでいてもよい。
【００２５】
他のステビオール配糖体が含まれる場合、本発明の配糖体と他のステビオール配糖体との組成比は、質量比で１：９９〜９９：１、５：９５〜９５：５、１０：９０〜９０：１０、１５：８５〜８５：１５、２０：８０〜８０：２０、２５：７５〜７５：２５、３０：７０〜７０：３０、３５：６５〜６５：３５、４０：６０〜６０：４０、４５：６５〜６５：４５または５０：５０であってよい。また、本発明の配糖体は、一種類のみ用いてもよく、また複数種類を用いてもよい。
【００２６】
本発明の甘味料組成物は、さらにステビオール配糖体以外の甘味料を含んでいてもよい。そのような甘味料としては、果糖、砂糖、果糖ぶどう糖液糖、ぶどう糖、麦芽糖、高果糖液糖、糖アルコール、オリゴ糖、はちみつ、サトウキビ搾汁液（黒糖蜜）、水飴、羅漢果末、羅漢果抽出物、甘草末、甘草抽出物、ソーマトコッカスダニエリ種子末、ソーマトコッカスダニエリ種子抽出物などの天然甘味料や、アセスルファムカリウム、スクラロース、ネオテーム、アスパルテーム、サッカリンなどの人工甘味料などが挙げられる。中でもすっきりさ、飲みやすさ、自然な味わい、適度なコク味の付与の観点から、天然甘味料を用いることが好ましく、特に、果糖、ぶどう糖、麦芽糖、ショ糖、砂糖が好適に用いられる。これら甘味成分は一種類のみ用いてもよく、また複数種類を用いてもよい。
【００２７】
本発明の甘味料組成物の製造方法は、上記の組成を有する甘味料組成物が得られれば特に限定されない。本発明の一態様によれば、本発明の甘味料組成物の製造方法であって、本発明の配糖体を得る工程と、前記配糖体と他のステビオール配糖体またはステビオール配糖体以外の甘味料とを混合する工程とを含む製造方法が提供される。本発明の配糖体を得る工程は、植物体からの単離・精製、化学合成または生合成によって行ってもよく、この工程によって得られる本発明の配糖体は、他のステビオール配糖体（例えば、Ｒｅｂ．ＡやＲｅｂ．Ｄ）との混合物として得られてもよい。
【００２８】
３．新規ステビオール配糖体を含む飲食品、香料及び医薬品
本発明の一態様によれば、式（１）で示される化合物、またはその誘導体、塩、もしくは水和物または本発明の甘味料組成物を含む飲食品、香料及び医薬品（本明細書中それぞれ「本発明の飲食品」、「本発明の香料」及び「本発明の医薬品」ともいう）が提供される。本発明の飲食品、香料及び医薬品は、式（１）で示される化合物、またはその誘導体、塩、もしくは水和物を含んでいれば特に限定されず、式（１）で示される化合物、またはその誘導体、塩、もしくは水和物を含む抽出物や甘味料組成物を含む飲食品、香料及び医薬品であってもよい。ここで飲食品とは、飲料および食品を意味する。したがって、ある実施態様では、本発明は新規な飲料又は食品を提供し、また、当該飲料又は食品の製造方法を提供する。
【００２９】
本発明の飲食品、香料及び医薬品に含まれる本発明の配糖体の量は、具体的な飲食品によって異なるが、飲料の場合、おおむね１質量ｐｐｍ〜６００質量ｐｐｍであるのが好ましく、例えば、２０質量ｐｐｍ〜５５０質量ｐｐｍ、２５質量ｐｐｍ〜５５０質量ｐｐｍ、３０質量ｐｐｍ〜５５０質量ｐｐｍ、３５質量ｐｐｍ〜５５０質量ｐｐｍ、４０質量ｐｐｍ〜５５０質量ｐｐｍ、４５質量ｐｐｍ〜５５０質量ｐｐｍ、５０質量ｐｐｍ〜５５０質量ｐｐｍ、５５質量ｐｐｍ〜５５０質量ｐｐｍ、２０質量ｐｐｍ〜５４０質量ｐｐｍ、２５質量ｐｐｍ〜５４０質量ｐｐｍ、３０質量ｐｐｍ〜５４０質量ｐｐｍ、３５質量ｐｐｍ〜５４０質量ｐｐｍ、４０質量ｐｐｍ〜５４０質量ｐｐｍ、４５質量ｐｐｍ〜５４０質量ｐｐｍ、５０質量ｐｐｍ〜５４０質量ｐｐｍ、５５質量ｐｐｍ〜５４０質量ｐｐｍ、２０質量ｐｐｍ〜５３０質量ｐｐｍ、２５質量ｐｐｍ〜５３０質量ｐｐｍ、３０質量ｐｐｍ〜５３０質量ｐｐｍ、３５質量ｐｐｍ〜５３０質量ｐｐｍ、４０質量ｐｐｍ〜５３０質量ｐｐｍ、４５質量ｐｐｍ〜５３０質量ｐｐｍ、５０質量ｐｐｍ〜５３０質量ｐｐｍ、５５質量ｐｐｍ〜５３０質量ｐｐｍ、２０質量ｐｐｍ〜５２０質量ｐｐｍ、２５質量ｐｐｍ〜５２０質量ｐｐｍ、３０質量ｐｐｍ〜５２０質量ｐｐｍ、３５質量ｐｐｍ〜５２０質量ｐｐｍ、４０質量ｐｐｍ〜５２０質量ｐｐｍ、４５質量ｐｐｍ〜５２０質量ｐｐｍ、５０質量ｐｐｍ〜５２０質量ｐｐｍ、５５質量ｐｐｍ〜５２０質量ｐｐｍ、２０質量ｐｐｍ〜５１０質量ｐｐｍ、２５質量ｐｐｍ〜５１０質量ｐｐｍ、３０質量ｐｐｍ〜５１０質量ｐｐｍ、３５質量ｐｐｍ〜５１０質量ｐｐｍ、４０質量ｐｐｍ〜５１０質量ｐｐｍ、４５質量ｐｐｍ〜５１０質量ｐｐｍ、５０質量ｐｐｍ〜５１０質量ｐｐｍ、５５質量ｐｐｍ〜５１０質量ｐｐｍ、２０質量ｐｐｍ〜５０５質量ｐｐｍ、２５質量ｐｐｍ〜５０５質量ｐｐｍ、３０質量ｐｐｍ〜５０５質量ｐｐｍ、３５質量ｐｐｍ〜５０５質量ｐｐｍ、４０質量ｐｐｍ〜５０５質量ｐｐｍ、４５質量ｐｐｍ〜５０５質量ｐｐｍ、５０質量ｐｐｍ〜５０５質量ｐｐｍ、５５質量ｐｐｍ〜５０５質量ｐｐｍ、２０質量ｐｐｍ〜５００質量ｐｐｍ、２５質量ｐｐｍ〜５００質量ｐｐｍ、３０質量ｐｐｍ〜５００質量ｐｐｍ、３５質量ｐｐｍ〜５００質量ｐｐｍ、４０質量ｐｐｍ〜５００質量ｐｐｍ、４５質量ｐｐｍ〜５００質量ｐｐｍ、５０質量ｐｐｍ〜５００質量ｐｐｍ、５５質量ｐｐｍ〜５００質量ｐｐｍ、２０質量ｐｐｍ〜４９５質量ｐｐｍ、２５質量ｐｐｍ〜４９５質量ｐｐｍ、３０質量ｐｐｍ〜４９５質量ｐｐｍ、３５質量ｐｐｍ〜４９５質量ｐｐｍ、４０質量ｐｐｍ〜４９５質量ｐｐｍ、４５質量ｐｐｍ〜４９５質量ｐｐｍ、５０質量ｐｐｍ〜４９５質量ｐｐｍ、５５質量ｐｐｍ〜４９５質量ｐｐｍ、２０質量ｐｐｍ〜４９０質量ｐｐｍ、２５質量ｐｐｍ〜４９０質量ｐｐｍ、３０質量ｐｐｍ〜４９０質量ｐｐｍ、３５質量ｐｐｍ〜４９０質量ｐｐｍ、４０質量ｐｐｍ〜４９０質量ｐｐｍ、４５質量ｐｐｍ〜４９０質量ｐｐｍ、５０質量ｐｐｍ〜４９０質量ｐｐｍ、５５質量ｐｐｍ〜４９０質量ｐｐｍ、１００質量ｐｐｍ〜４００質量ｐｐｍ、１５０質量ｐｐｍ〜４００質量ｐｐｍ、２００質量ｐｐｍ〜４００質量ｐｐｍ、２５０質量ｐｐｍ〜４００質量ｐｐｍ、３００質量ｐｐｍ〜４００質量ｐｐｍ、１００質量ｐｐｍ〜１５０質量ｐｐｍ、１００質量ｐｐｍ〜２００質量ｐｐｍ、１００質量ｐｐｍ〜２５０質量ｐｐｍまたは１００質量ｐｐｍ〜３００質量ｐｐｍであってもよい。含有量をこの範囲とすることで適度な甘みを付与することができるという利点がある。含有量をこの範囲とすることで後引きを抑えることができるという利点がある。本明細書において「ｐｐｍ」とは、特に明記しない限り、「質量ｐｐｍ」を意味する。
【００３０】
本発明の飲食品、香料及び医薬品は、さらに他のステビオール配糖体を含んでいてもよい。例えば、本発明の甘味料組成物は、本発明の配糖体に加え、レバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＢ、レバウディオサイドＣ、レバウディオサイドＤ、レバウディオサイドＥ、レバウディオサイドＦ、レバウディオサイドＩ、レバウディオサイドＪ、レバウディオサイドＫ、レバウディオサイドＮ、レバウディオサイドＭ、レバウディオサイドＯ、レバウディオサイドＱ、レバウディオサイドＲ、ズルコサイドＡ、ズルコサイドＣ、ルブソシド、ステビオール、ステビオールモノシド、ステビオールビオシドおよびステビオシドからなる群から選択される一種以上のステビオール配糖体をさらに含んでいてもよい。
【００３１】
他のステビオール配糖体が含まれる場合、本発明の配糖体と他のステビオール配糖体との組成比は、質量比で１：９９〜９９：１、５：９９〜９５：５、１０：９０〜９０：１０、１５：８５〜８５：１５、２０：８０〜８０：２０、２５：７５〜７５：２５、３０：７０〜７０：３０、３５：６５〜６５：３５、４０：６０〜６０：４０、４５：６５〜６５：４５または５０：５０であってよい。
【００３２】
本発明の飲食品、香料及び医薬品は、さらにステビオール配糖体以外の甘味料を含んでいてもよい。そのような甘味料としては、果糖、砂糖、果糖ぶどう糖液糖、ぶどう糖、麦芽糖、ショ糖、高果糖液糖、糖アルコール、オリゴ糖、はちみつ、サトウキビ搾汁液（黒糖蜜）、水飴、羅漢果末、羅漢果抽出物、甘草末、甘草抽出物、ソーマトコッカスダニエリ種子末、ソーマトコッカスダニエリ種子抽出物などの天然甘味料や、アセスルファムカリウム、スクラロース、ネオテーム、アスパルテーム、サッカリンなどの人工甘味料などが挙げられる。中でもすっきりさ、飲みやすさ、自然な味わい、適度なコク味の付与の観点から、天然甘味料を用いることが好ましく、特に、果糖、ぶどう糖、麦芽糖、ショ糖、砂糖が好適に用いられる。これら甘味成分は一種類のみ用いてもよく、また複数種類を用いてもよい。
【００３３】
本発明の食品の例としては、特に限定されるものではないが、食品としては、製菓、製パン類、穀粉、麺類、飯類、農産・林産加工食品、畜産加工品、水産加工品、乳・乳製品、油脂・油脂加工品、調味料またはその他の食品素材等が挙げられる。
【００３４】
本発明の飲料の例としては、特に限定されるものではないが、例えば炭酸飲料、非炭酸飲料、アルコール飲料、非アルコール飲料、ビールやノンアルコールビール等のビールテイスト飲料、コーヒー飲料、茶飲料、ココア飲料、栄養飲料、機能性飲料などが挙げられる。
【００３５】
本発明の飲料は、加熱殺菌をされ、容器に詰められた状態の容器詰飲料として調製してもよい。容器としては、特に限定されず、例えば、ＰＥＴボトル、アルミ缶、スチール缶、紙パック、チルドカップ、瓶などを挙げることができる。加熱殺菌を行う場合、その種類は特に限定されず、例えばＵＨＴ殺菌およびレトルト殺菌等の通常の手法を用いて行うことができる。加熱殺菌工程の温度は特に限定されないが、例えば６５〜１３０℃、好ましくは８５〜１２０℃で、１０〜４０分である。ただし、上記の条件と同等の殺菌価が得られれば適当な温度で数秒、例えば５〜３０秒での殺菌でも問題はない。
【００３６】
本発明の飲食品、香料及び医薬品の製造方法は、上記の成分を有する飲食品、香料及び医薬品が得られれば特に限定されない。本発明の一態様によれば、本発明の飲食品、香料及び医薬品の製造方法であって、本発明の抽出物、配糖体または甘味料組成物を得る工程と、前記抽出物、配糖体または甘味料組成物を飲食品、香料及び医薬品又はその原料に添加する工程とを含む製造方法が提供される。本発明の配糖体または甘味料組成物を得る工程は、「２.  新規ステビオール配糖体を含む甘味料組成物」に、本発明の抽出物を得る工程は、「４．新規ステビオール配糖体を含むステビア植物体およびその抽出物」に、それぞれ記載のとおりである。本発明の抽出物、配糖体または甘味料組成物を飲食品、香料及び医薬品又はその原料に添加する工程は飲食品、香料及び医薬品の製造工程の任意の工程で行うことができ、例えば、飲食品、香料及び医薬品の原料を混合する際や、飲食品、香料及び医薬品の味質の最終調整の際に行ってもよい。
【００３７】
４．新規ステビオール配糖体を含むステビア植物体およびその抽出物
本発明の一態様によれば、式（１）で示される化合物、またはその誘導体、塩、もしくは水和物を含むを含むステビア植物体およびその抽出物（本明細書中、「本発明の植物体およびその抽出物」ともいう）が提供される。また本発明の他の一態様によれば、本発明の植物体またはその抽出物を含む、飲食品、香料及び医薬品、好ましくは飲料、が提供される。本発明の植物体に含まれる本発明の配糖体の量は、特に限定されないが、乾燥葉中に０．００１重量％〜１．０００重量％、０．００５重量％〜０．９５０重量％、０．００８重量％〜０．９００重量％、０．０１０重量％〜０．８５０重量％、０．０１５重量％〜０．８００重量％であってもよい。
【００３８】
本発明の一態様において、本発明の植物体は、以下の（１）〜（８）の少なくとも１つの遺伝的特徴を有する。
（１）配列番号１の２９８位、配列番号３の１１位、配列番号５の２１位または配列番号７の２６位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性またはヘテロ接合性である。
（２）配列番号１の３２８位、配列番号９の１１位、配列番号１１の２１位、配列番号１３の２６位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてホモ接合性またはヘテロ接合性である。
（３）配列番号１の３６０位、配列番号１５の１１位、配列番号１７の２１位、配列番号１９の２６位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性またはヘテロ接合性である。
（４）配列番号１の３８６位、配列番号２１の１１位、配列番号２３の２１位、配列番号２５の２６位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性またはヘテロ接合性である。
（５）配列番号１の３９３位、配列番号２７の１１位、配列番号２９の１８位、配列番号３１の２３位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性またはヘテロ接合性である。
（６）配列番号１の４１１位、配列番号３３の１１位、配列番号３５の１８位、配列番号３７の２３位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性またはヘテロ接合性である。
（７）配列番号１の４２７位、配列番号３９の１１位、配列番号４１の１８位、配列番号４３の２３位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてホモ接合性またはヘテロ接合性である。
（８）配列番号１の４５３位、配列番号４５の１１位、配列番号４７の１８位、配列番号４９の２３位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性またはヘテロ接合性である。
【００３９】
本発明の他の態様において、本発明の植物体は、遺伝的特徴（１）〜（８）の少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つまたは８つ全ての遺伝的特徴を有する。
【００４０】
「〜に相当する位置（又は部分）」とは、ゲノム中に基準配列（例えば、配列番号１など）と同一の配列が存在する場合は、ゲノム中に存在するその配列中の位置又は部分（例えば、２９８位、３２８位、３６０位、３８６位、３９３位、４１１位、４２７位および４５３位など）を意味し、ゲノム中に基準配列と同一の配列が存在しない場合は、ゲノム中の基準配列に相当する配列中の、基準配列中の位置又は部分に相当する位置又は部分を意味する。ゲノム中に基準配列と同一又はそれに相当する配列が存在するかどうかは、例えば、基準配列をＰＣＲで増幅し得るプライマーで、対象となるステビア植物体のゲノムＤＮＡを増幅し、増幅産物のシーケンシングを行い、得られた配列と基準配列とのアラインメント解析を行うことで決定することができる。基準配列に相当する配列の非限定例としては、例えば、基準配列に対し６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９８．１％以上、９８．４％以上、９８．７％以上、９９％以上、９９．２％以上、９９．５％以上又は９９．８％以上の配列同一性を有する塩基配列が挙げられる。ゲノム中の基準配列に相当する配列中の、基準配列中の位置又は部分に相当する位置又は部分は、基準配列中の位置又は部分の前後の塩基配列等を考慮して決定することができる。例えば、基準配列とゲノム中の基準配列に相当する配列とのアライメント解析により、ゲノム中の基準配列に相当する配列中の、基準配列中の位置又は部分に相当する位置又は部分を決定することができる。
【００４１】
例えば、本発明の遺伝的特徴（１）の「配列番号１の２９８位に相当する位置」を例にとると、ステビア植物体のゲノムが配列番号１と同一の塩基配列からなる部分を有している場合、「配列番号１の２９８位に相当する位置」はゲノム中の配列番号１と同一の塩基配列からなる部分の５’側から２９８位である。一方、ステビア植物体のゲノムが配列番号１と同一ではないがこれに相当する塩基配列からなる部分を有している場合、ゲノムは配列番号１と同一の塩基配列からなる部分を有しないため、「配列番号１の２９８位に相当する位置」は、必ずしも配列番号１に相当する部分の５’側から２９８位に該当するわけではないが、配列番号１の２９８位の前後の塩基配列等を考慮し、かかるステビア植物体のゲノムにおける「配列番号１の２９８位に相当する位置」を特定することができる。例えば、ステビア植物体のゲノムにおける配列番号１に相当する部分の塩基配列と、配列番号１の塩基配列とのアライメント解析により、ステビア植物体のゲノムにおける「配列番号１の２９８位に相当する位置」を特定することができる。
【００４２】
上記の遺伝的特徴は、ＰＣＲ法、TaqMan PCR法、シーケンス法、マイクロアレイ法、インベーダー法、TILLING法、ＲＡＤ（random amplified polymorphic DNA）法、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＡＦＬＰ（amplified fragment length polymorphism）法、ＳＳＬＰ（simple sequence length polymorphism）法、ＣＡＰＳ（cleaved amplified polymorphic sequence）法、ｄＣＡＰＳ（derived cleaved amplified polymorphic sequence）法、アレル特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）法、ＡＲＭＳ法、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）法、ＣＣＭ（chemical cleavage of mismatch）法、ＤＯＬ法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法、ＴＤＩ法、パドロックプローブ法、分子ビーコン法、ＤＡＳＨ（dynamic allele specific hybridization）法、ＵＣＡＮ法、ＥＣＡ法、ＰＩＮＰＯＩＮＴ法、ＰＲＯＢＥ（primer oligo base extension）法、ＶＳＥＴ（very short extension）法、Survivor assay、Sniper assay、Luminex assay、ＧＯＯＤ法、ＬＣｘ法、ＳＮａＰｓｈｏｔ法、Mass ARRAY法、パイロシークエンス法、ＳＮＰ−ＩＴ法、融解曲線分析法等により検出することが可能であるが、検出方法はこれらに限定されるものではない。
【００４３】
特定の態様において、「配列番号１に相当する塩基配列からなる部分」には、例えば、配列番号５１の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号５２の塩基配列を含むリバースプライマーとを用いたＰＣＲにより増幅され得るステビア植物体のゲノムの部分が含まれる。
【００４４】
特定の態様において、「配列番号１の２９８位に相当する位置の塩基がＴであるアレル」は、配列番号４、６または８の塩基配列を含む。
特定の態様において、「配列番号１の３２８位に相当する位置の塩基がＣであるアレル」は、配列番号１０、１２または１４の塩基配列を含む。
特定の態様において、「配列番号１の３６０位に相当する位置の塩基がＴであるアレル」は、配列番号１６、１８または２０の塩基配列を含む。
特定の態様において、「配列番号１の３８６位に相当する位置の塩基がＴであるアレル」は、配列番号２２、２４または２６の塩基配列を含む。
特定の態様において、「配列番号１の３９３位に相当する位置の塩基がＴであるアレル」は、配列番号２８、３０または３２の塩基配列を含む。
特定の態様において、「配列番号１の４１１位に相当する位置の塩基がＴであるアレル」は、配列番号３４、３６または３８の塩基配列を含む。
特定の態様において、「配列番号１の４２７位に相当する位置の塩基がＣであるアレル」は、配列番号４０、４２または４４の塩基配列を含む。
特定の態様において、「配列番号１の４５３位に相当する位置の塩基がＴであるアレル」は、配列番号４６、４８または５０の塩基配列を含む。
【００４５】
本発明の植物体の作出方法は、特に限定されないが、交雑や、ステビア植物体のゲノムに、本発明の変異を導入することで作出することも可能である。変異の導入は、遺伝子組換え的手法により行っても、非遺伝子組換え的手法により行ってもよい。「非遺伝子組換え的手法」の例としては、外来遺伝子の導入を行わずに宿主細胞（又は宿主植物体）の遺伝子に変異を誘発する方法が挙げられる。そのような方法としては植物細胞の変異誘発剤を作用させる方法が挙げられる。そのような変異誘発剤としては、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）及びアジ化ナトリウム等が挙げられる。例えば、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）は、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％などの濃度で植物細胞を処理することができる。処理時間は１〜４８時間、２〜３６時間、３〜３０時間、４〜２８時間、５〜２６時間、６〜２４時間である。処理の手順自体は公知であるが、吸水過程を経た吸水種子を上記濃度で変異誘発剤を含む処理液に、上記処理時間浸漬することで行うことができる。
【００４６】
あるいは、非遺伝子組換え的手法の例としてＸ線、γ線、紫外線などの放射線や光線を植物細胞に照射する方法もできる。この場合、適当な紫外線の照射量（紫外線ランプ強さ、距離、時間）を用いて照射した細胞を、選択培地などで培養させた後、目的の形質を有する細胞、カルス、植物体を選択できる。その際の照射強度は０．０１〜１００Ｇｒ、０．０３〜７５Ｇｒ、０．０５〜５０Ｇｒ、０．０７〜２５Ｇｒ、０．０９〜２０Ｇｒ、０．１〜１５Ｇｒ、０．１〜１０Ｇｒ、０．５〜１０Ｇｒ、１〜１０Ｇｒであり、照射距離は１ｃｍ〜２００ｍ、５ｃｍ〜１００ｍ、７ｃｍ〜７５ｍ、９ｃｍ〜５０ｍ、１０ｃｍ〜３０ｍ、１０ｃｍ〜２０ｍ、１０ｃｍ〜１０ｍであり、照射時間は１分〜２年、２分〜１年、３分〜０．５年、４分〜１か月、５分〜２週間、１０分〜１週間である。照射の強度、距離及び時間は、放射線の線種や照射対象となる状態（細胞、カルス、植物体）により異なるが、当業者であれば適宜調整することができる。
【００４７】
また、「葉に含まれる総ステビオール配糖体量に対して０．０５０重量％以上である」とは本発明のステビア植物体の乾燥葉から得られた抽出液に存在する総ステビオール配糖体量に対して本発明の配糖体が０．０５０重量％以上の比率で存在することを意味する。ここで、総ステビオール配糖体とは、未知のステビオール配糖体を含むものではなく、また検出限界未満で存在するステビオール配糖体も含まない。好ましくは、総ステビオール配糖体とは、レバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＢ、レバウディオサイドＣ、レバウディオサイドＤ、レバウディオサイドＥ、レバウディオサイドＦ、レバウディオサイドＧ、レバウディオサイドＩ、レバウディオサイドＭ、レバウディオサイドＮ、ステビオシド、ズルコサイドＡ、ステビオールビオシドおよびルブソシド、ならびに新規ステビオール配糖体（新規ステビオール配糖体Ａおよび／または新規ステビオール配糖体Ｂ）からなる。本発明のステビア植物体は、葉に含まれる新規ステビオール配糖体Ａまたは新規ステビオール配糖体Ｂの含有量が、総ステビオール配糖体量に対して０．０５５重量％以上、０．０６０重量％以上、０．０６５重量％以上、０．０７０重量％以上、０．０７５重量％以上、０．０８０重量％以上、０．０８５重量％以上、０．０９０重量％以上、０．０９５重量％以上、０．１０重量％以上、０．１５重量％以上、０．２０重量％以上、０．３０重量％以上、０．５０重量％以上、０．６０重量％以上、０．８０重量％以上、１．００重量％以上、２．００重量％以上、４．００重量％以上、６．００重量％以上、８．００重量％以上、１０．００重量％以上の量であってよく、かつ、１０．００重量％以下、８．００重量％以下、６．００重量％以下、４．００重量％以下、２．００重量％以下、１．００重量％以下、０．８０重量％以下、０．６０重量％以下、０．３０重量％以下であってもよい。
【００４８】
あるいは、本発明のステビア植物体は、葉に含まれる新規ステビオール配糖体Ａまたは新規ステビオール配糖体Ｂの含有量が、葉に含まれるレバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＢ、レバウディオサイドＣ、レバウディオサイドＤ、レバウディオサイドＦ、レバウディオサイドＮ、レバウディオサイドＭおよびステビオシドの合計含有量に対して、０．０５０重量％以上、０．０５５重量％以上、０．０６０重量％以上、０．０６５重量％以上、０．０７０重量％以上、０．０７５重量％以上、０．０８０重量％以上、０．０８５重量％以上、０．０９０重量％以上、０．０９５重量％以上、０．１０重量％以上、０．１５重量％以上、０．２０重量％以上、０．３０重量％以上、０．５０重量％以上、０．６０重量％以上、０．８０重量％以上、１．００重量％以上、２．００重量％以上、４．００重量％以上、６．００重量％以上、８．００重量％以上、１０．００重量％以上の量であってよく、かつ、１０．００重量％以下、８．００重量％以下、６．００重量％以下、４．００重量％以下、２．００重量％以下、１．００重量％以下、０．８０重量％以下、０．６０重量％以下、０．３０重量％以下であってもよい。
【００４９】
ここで本発明の植物体の乾燥葉とは、本発明の植物体の新鮮葉を乾燥させることにより含水量を１０重量％以下、７重量％以下、５重量％以下、４重量％以下、３重量％以下、２重量％以下、１重量％以下にまで減らしたものをいう。好ましくは、本発明の植物体の乾燥葉の含水量は３〜４重量％である。
【００５０】
本発明の植物体には植物体全体のみならず、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子など）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織など）あるいは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれ得る。
【００５１】
また、本発明の植物体には、組織培養物又は植物培養細胞も含まれ得る。このような組織培養物又は植物培養細胞を培養することにより、植物体を再生することができるからである。本発明の植物体の組織培養物又は植物培養細胞の例としては、胚、分裂組織細胞、花粉、葉、根、根端、花弁、プロトプラスト、葉の切片およびカルス等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５２】
本発明の植物体の抽出物は、本発明の植物体の新鮮葉または乾燥葉に適切な溶媒（水等の水性溶媒又はアルコール、エーテルおよびアセトン等の有機溶媒）を反応させることにより得ることができる。抽出条件等は国際公開２０１６／０９０４６０号に記載の方法や、後述の実施例に記載の方法を参照することができる。
【００５３】
本発明の植物体の抽出物は、総ステビオール配糖体量に対して０．０５０重量％以上の本発明の配糖体を含むことが好ましい。本発明の他の態様において、本発明の配糖体の含有量は、総ステビオール配糖体量に対して０．０５５重量％以上、０．０６０重量％以上、０．０６５重量％以上、０．０７０重量％以上、０．０７５重量％以上、０．０８０重量％以上、０．０８５重量％以上、０．０９０重量％以上、０．０９５重量％以上、０．１０重量％以上、０．１５重量％以上、０．２０重量％以上、０．３０重量％以上、０．５０重量％以上、０．６０重量％以上、０．８０重量％以上、１．００重量％以上、２．００重量％以上、４．００重量％以上、６．００重量％以上、８．００重量％以上、１０．００重量％以上の量であってよく、かつ、１０．００重量％以下、８．００重量％以下、６．００重量％以下、４．００重量％以下、２．００重量％以下、１．００重量％以下、０．８０重量％以下、０．６０重量％以下、０．３０重量％以下であってもよい。
【００５４】
あるいは、本発明の植物体の抽出物は、新規ステビオール配糖体Ａまたは新規ステビオール配糖体Ｂの含有量が、レバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＢ、レバウディオサイドＣ、レバウディオサイドＤ、レバウディオサイドＦ、レバウディオサイドＮ、レバウディオサイドＭおよびステビオシドの合計含有量に対して、０．０５０重量％以上、０．０５５重量％以上、０．０６０重量％以上、０．０６５重量％以上、０．０７０重量％以上、０．０７５重量％以上、０．０８０重量％以上、０．０８５重量％以上、０．０９０重量％以上、０．０９５重量％以上、０．１０重量％以上、０．１５重量％以上、０．２０重量％以上、０．３０重量％以上、０．５０重量％以上、０．６０重量％以上、０．８０重量％以上、１．００重量％以上、２．００重量％以上、４．００重量％以上、６．００重量％以上、８．００重量％以上、１０．００重量％以上の量であってよく、かつ、１０．００重量％以下、８．００重量％以下、６．００重量％以下、４．００重量％以下、２．００重量％以下、１．００重量％以下、０．８０重量％以下、０．６０重量％以下、０．３０重量％以下であってもよい。
【００５５】
本発明の一態様において、本発明の植物体の抽出物を含む飲食品が提供される。さらに本発明の他の態様において、飲食品は飲料である。飲食品の種類としては、「３．新規ステビオール配糖体を含む飲食品」に記載のものが挙げられる。
【００５６】
５．新規ステビオール配糖体を含む風味調整剤
本発明の一態様によれば、上記式（１）で示される化合物またはその誘導体、塩、もしくは水和物を含む風味調整剤が提供される。本発明の一態様において、「２.  新規ステビオール配糖体を含む甘味料組成物」に記載の組成を有する組成物を風味調整剤として使用することもできる。
【００５７】
本明細書において、「風味調整剤」とは、飲食品に添加された場合に、その飲食品の風味を調整する物質のことをいう。本発明の風味調整剤は、好ましくは、飲食品に添加された際に、風味調整剤自体の味を消費者が認識することなく、その飲食品自体の風味を調整することができる。例えば、本発明のステビオール配糖体は、従来のステビオール配糖体に比べて苦味が弱いという特徴を有するため、風味調整剤として使用することで飲食品の苦味を調整することができる。
【００５８】
本発明の風味調整剤は、上記式（１）で示される化合物またはその誘導体、塩、もしくは水和物に加え、一種以上の他の甘味料を含んでいることが好ましい。そのような甘味料としては、レバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＢ、レバウディオサイドＣ、レバウディオサイドＤ、レバウディオサイドＥ、レバウディオサイドＦ、レバウディオサイドＩ、レバウディオサイドＪ、レバウディオサイドＫ、レバウディオサイドＮ、レバウディオサイドＭ、レバウディオサイドＯ、レバウディオサイドＱ、レバウディオサイドＲ、ズルコサイドＡ、ズルコサイドＣ、ルブソシド、ステビオール、ステビオールモノシド、ステビオールビオシドおよびステビオシドからなる群から選択される一種以上のステビオール配糖体や、果糖、砂糖、果糖ぶどう糖液糖、ぶどう糖、麦芽糖、ショ糖、高果糖液糖、糖アルコール、オリゴ糖、はちみつ、サトウキビ搾汁液（黒糖蜜）、水飴、羅漢果末、羅漢果抽出物、甘草末、甘草抽出物、ソーマトコッカスダニエリ種子末、ソーマトコッカスダニエリ種子抽出物などの天然甘味料や、アセスルファムカリウム、スクラロース、ネオテーム、アスパルテーム、サッカリンなどの人工甘味料などが挙げられる。
【００５９】
６.新規ステビオール配糖体の製造方法
上述のとおり、本発明のステビオール配糖体は、（Ａ）植物体からの単離・精製、（Ｂ）化学合成、または（Ｃ）生合成によって製造することができる。それぞれについて以下に説明する。
【００６０】
（Ａ）植物体からの単離・精製
新規ステビオール配糖体を含有する植物体は、例えば、上記の遺伝的特徴を有する植物体を公知の任意のスクリーニング方法を用いて入手することができる。そして、該植物体から新規ステビオール配糖体を単離・精製することができる。新規ステビオール配糖体は、本発明の植物体の新鮮葉または乾燥葉に適切な溶媒（水等の水性溶媒又はアルコール、エーテルおよびアセトン等の有機溶媒）を反応させることにより抽出液の状態で抽出することができる。抽出条件等は国際公開第２０１６／０９０４６０号に記載の方法や、後述の実施例に記載の方法を参照することができる。
【００６１】
さらに、このようにして得られた抽出液に対し、酢酸エチルその他の有機溶媒：水の勾配、高速液体クロマトグラフィー（High Performance Liquid Chromatography：HPLC）、超高性能液体クロマトグラフィー (Ultra （High）Performance Liquid chromatography：UPLC) 等の公知の方法を用いることにより新規ステビオール配糖体を単離・精製することができる。
【００６２】
植物体中の新規ステビオール配糖体含有量は、国際公開２０１６／０９０４６０号に記載の方法や、後述の実施例に記載の方法で測定することができる。具体的には本発明の植物体から新鮮葉をサンプリングし、LC-MS/MSを行うことにより測定することができる。
【００６３】
（２）化学合成
本発明のステビオール配糖体は、例えば、国際公開第２０１８／１８１５１５号に記載の公知の化学合成法によって合成することができる。より具体的には、本発明のステビオール配糖体は、後述の実施例に記載の方法によって製造することができる。
【００６４】
（３）生合成
本発明のステビオール配糖体は、配糖化酵素などの所定のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、細菌、植物、昆虫、ヒトを除く哺乳動物などに由来する宿主細胞に導入して、ステビオールやステビオール配糖体、UDP-グルコースおよび/またはUDP-キシロースを基質として生成することもできる。基質であるステビオール、ステビオール配糖体、UDP-グルコース、UDP-キシロースは、与えてもよいし、細胞内で生合成させてもよい。
【００６５】
所定のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、好ましくは、適切な発現ベクターに挿入された状態で宿主に導入される。そのようなポリヌクレオチドは、個々に別のベクターに挿入されてもよい。
【００６６】
適切な発現ベクターは、通常、
（ｉ）宿主細胞内で転写可能なプロモーター；
（ｉｉ）該プロモーターに結合した、本発明のポリヌクレオチド；および
（ｉｉｉ）ＲＮＡ分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、宿主細胞内で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセット
を含むように構成される。
【００６７】
発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージまたはコスミドなどを用いる方法、あるいは必要な構成要素を有するDNA分子が挙げられるが特に限定されない。
【００６８】
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明のポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明のポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。
【００６９】
発現ベクターは、導入されるべき宿主の種類に依存して、発現制御領域（例えば、プロモーター、ターミネーターおよび／または複製起点等）を含有する。細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、慣用的なプロモーター（例えば、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター等）が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えば、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨ０５プロモーター、GAL1/10プロモーター等が挙げられ、糸状菌用プロモーターとしては、例えば、アミラーゼ、ｔｒｐＣ等が挙げられる。また、植物細胞内で目的遺伝子を発現させるためのプロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター、ｒｄ２９Ａ遺伝子プロモーター、ｒｂｃＳプロモーター、前記カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓ  ＲＮＡプロモーターのエンハンサー配列をアグロバクテリウム由来のマンノピン合成酵素プロモーター配列の５’側に付加したｍａｃ−１プロモーター等が挙げられる。動物細胞宿主用プロモーターとしては、ウイルス性プロモーター（例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター等）が挙げられる。外的な刺激によって誘導性に活性化されるプロモーターの例としては、mouse mammary tumor virus（MMTV）プロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター、メタロチオネインプロモーターおよびヒートショックプロテインプロモーター等が挙げられる。
発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、栄養要求性マーカー（LEU2、URA3、HIS3、TRP1、ｕｒａ５、ｎｉａＤ）、薬剤耐性マーカー（ハイグロマイシン、ゼオシン）、ジェネチシン耐性遺伝子（Ｇ４１８ｒ）、銅耐性遺伝子（ＣＵＰ１）（Ｍａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，ｖｏｌ．  ８１，ｐ．３３７，１９８４）、セルレニン耐性遺伝子（ｆａｓ２ｍ、ＰＤＲ４）（それぞれ、猪腰淳嗣ら，生化学，ｖｏｌ．６４，ｐ．６６０，１９９２；Ｈｕｓｓａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．１０１，ｐ．１４９，１９９１）などが利用可能である。
【００７０】
宿主細胞の形質転換方法としては一般に用いられる公知の方法が利用できる。例えば、エレクトロポレーション法（Mackenxie, D. A. et al., Appl. Environ. Microbiol., vol. 66, p. 4655-4661, 2000）、パーティクルデリバリー法（特開2005-287403）、スフェロプラスト法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 75, p. 1929, 1978）、酢酸リチウム法（J. Bacteriology, vol. 153, p. 163, 1983）、Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manualなどに記載の方法）で実施可能であるが、これらに限定されない。
【００７１】
その他、一般的な分子生物学的な手法に関しては、"Sambrook ＆ Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001"、"Methods in Yeast Genetics、A laboratory manual （Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, NY）"等を参照することができる。
【００７２】
このようにして得られた非ヒト形質転換体を培養することにより、非ヒト形質転換体にステビオール配糖体を生産させることが可能である。このような非ヒト形質転換体は、好ましくは酵母である。また、非ヒト形質転換体の培養は、ステビオールを含む培地で行うことが好ましい。蓄積されたステビオール配糖体を抽出・精製することにより、本発明のステビオール配糖体を得ることができる。
【実施例】
【００７３】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明の内容がこれにより限定されるものではない。【００７４】
［新規ステビオール配糖体の単離］
サントリーグローバルイノベーションセンター株式会社(SIC)で開発した、２系統の新規ステビア植物体(開発品種Ａ（ＥＭ３−４）および開発品種Ｂ（ＥＭ２−２７−１５）)を用意した。これらの開発品種は以下のようにして得た。まず、市販ステビア種子を播種、育苗し、得られた種子に対して０．２％（開発品種Ｂ）又は０．３％（開発品種Ａ）のエチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）処理による遺伝子改変を行った。ＥＭＳ処理済み種子を、サントリーワールドリサーチセンター内温室で播種し、ＥＭＳ処理当代（Ｍ０世代）苗を得た。処理濃度間での発芽率差異は見られなかった。開発品種Ａは、このＭ０世代の個体に由来する。さらに、Ｍ０世代全個体の自殖により処理第一代（Ｍ１世代）種子を採種し、サントリーワールドリサーチセンター内の温室内で播種し、Ｍ１世代苗を得た。開発品種Ｂは、このＭ１世代の個体に由来する。【００７５】
開発品種Ａおよび開発品種Ｂの葉から得られた抽出物の高速液体クロマトグラフィー(HPLC)分離-質量分析(MS)を行い、D-グルコピラノシル（Glc）、キシロピラノシル（Xyl）を含む糖鎖で構成されたステビオール配糖体の分子量をもとに、ステビア植物体に含有されるステビオール配糖体のスクリーニング分析を行った。ここで、開発品種Ａおよび開発品種Ｂは後述の遺伝的特徴１〜８を有する植物体である。【００７６】
検液の調製方法は、凍結乾燥処理を行ったステビア乾燥葉それぞれ10.0 mgをガラスバイアルに秤量し、抽出溶媒として水/メタノール(1/1 vol/vol) を1.0 mL添加し、その後超音波洗浄器(AS ONE, AS52GTU)にて20分間、25℃の設定温度にて超音波を照射し、ステビア葉からステビオール配糖体の抽出液を得た。さらにHPLC-MSに供するために、水/メタノールで10倍希釈を行い、細孔サイズ0.45 μmのフィルター(ナカライテスク、コスモナイスフィルターS(溶媒系))にてろ過を行った。【００７７】
HPLC - MSのHPLCは、送液ユニットLCポンプにはNexera LC-30AD(島津製作所)、分離カラムにはSM-C18 (4.6×250 mm)(インタクト社製)を用いた。LC移動相の送液は、移動相Aは0.2%酢酸含有ミリＱ水、移動相Bはメタノールを用い、バイナリーグラジエント勾配を0-5分間は移動相B濃度10%で一定にし、その後15分間で移動相B濃度を10%から70%まで変化させ、さらに5分間でB濃度を70%から100%まで変化させ、最後に5分間移動相B濃度を100%に維持して終了した。移動相の流速は0.4 mL/分で行い、希釈後フィルターろ過されたステビア葉抽出液は５μＬ注入した。【００７８】
MSは、エレクトロスプレーイオン化(ESI)イオン源を取り付けた三連四重極型質量分析計LCMS-8030 (島津製作所)を用いた。質量分析測定は、負イオン測定モード、m/z値を選択して測定を行う選択イオンモニタリング(SIM)モードで測定を行った。選択するm/z値は、D-グルコピラノシル（Glc）、キシロピラノシル（Xyl）を含む糖鎖に構成されたステビオール配糖体の分子量をもとに計算したm/z値を選択した。したがって、m/z = 965.3 (Glc (4))、1097.4 (Glc (4)、Xyl (1)), 1127.4 (Glc (5))、1259.5 (Glc (5)、 Xyl (1))、および1289.5 (Glc (6))を選択した。さらに、入手可能な高純度試薬、レバウディオサイドA、DおよびMの測定も同条件にて行うことにより、HPLCの負イオンm/z値、保持時間の確認を行った。検出された主なステビオール配糖体のピーク面積値（任意の単位：arbitrary unit）を表１に示す。【００７９】
【表１】
2021020516.tif 000009
【００８０】
図２に開発品種Ａのm/z 1097.4の選択イオンクロマトグラムを示す。ステビオール配糖体の修飾されている糖鎖が４個のグルコース(Glc)と１個のキシロース（Xyl）を含むステビオール配糖体（m/z 1097.4）の選択イオンクロマトグラム中にこれまでに報告の無い分子量を持つピークが観測された。つまり、図２に示される、Rt29.05分のピークについては未知の物質である。この物質を仮に「新規ステビオール配糖体１Ｅ」とした。開発品種Ｂについても同様のピークが検出された。【００８１】
図３に開発品種Ａのm/z 1259.5の選択イオンクロマトグラムを示す。ステビオール配糖体の修飾されている糖鎖が５個のグルコース(Glc)と１個の キシロース(Xyl)を含むステビオール配糖体（m/z 1259.5）の選択イオンクロマトグラム中にこれまでに報告の無い分子量を持つピークが観測された。つまり、図３に示される、Rt 29.30分のピークについては未知の物質である。この物質を仮に「新規ステビオール配糖体２Ｅ」とした。開発品種Ｂについても同様のピークが検出された。【００８２】
［新規ステビオール配糖体の構造解析］
本発明において、開発品種から検出された新規ステビオール配糖体１Ｅおよび２Ｅの構造解析は次の手順で行った。
（ｉ）高速液体クロマトグラフィー（HPLC）− 高分解能質量分析（MS）およびMS/MS、3段階までのイオンの断片化（MS3断片化）のフラグメント化解析による構造推定、
（ｉｉ）化学反応による推定ステビオール配糖体標準品の化学合成、
（ｉｉｉ）化学合成標準品のHPLC− 高分解能MSおよびMS3断片化の保持時間と断片化パターンの一致による構造確認【００８３】
上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の工程のそれぞれについて、以下に詳細に説明する。【００８４】
（ｉ）高速液体クロマトグラフィー（HPLC）− 高分解能質量分析（MS）およびMS/MS、3段階までのイオンの断片化（MS3断片化）のフラグメント化解析による構造推定
検液の調製は、凍結乾燥処理を行ったステビア乾燥葉それぞれ10.0mgをガラスバイアルに秤量し、抽出溶媒として水/メタノール(1/1 vol/vol) を1.0 mL添加し、その後超音波洗浄器(AS ONE, AS52GTU)にて20分間、25℃の設定温度にて超音波を照射し、ステビア葉からステビオール配糖体の抽出液を得た。さらにHPLC-MSに供するために、水/メタノールで10倍希釈を行い、細孔サイズ０．４５μｍのフィルター(ナカライテスク、コスモナイスフィルターS(溶媒系))にてろ過を行った。【００８５】
高速液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレーイオン化精密質量分析(HPLC-ESI-HRMS)の機器構成において、HPLCの機器構成は、送液ユニットLCポンプにはProminence LC-20AD(島津製作所)を用い、分離カラムにはSM-C18(4.6×250 mm)(インタクト社製)を用いた。LC移動相の送液は、移動相Aとしては0.2% 酢酸含有ミリＱ水を用い、移動相Bとしてはメタノールを用い、バイナリーグラジエント勾配を0-5分間は移動相B濃度10%で一定とし、その後15分間で移動相B濃度を10%から70%まで変化させ、さらに5分間でB濃度を70%から100%まで変化させた。最後に5分間、移動相B濃度を100%に維持して終了した。移動相の流速は0.4 mL/分で行い、希釈後フィルターろ過されたステビア葉抽出液は２０μＬ注入した。質量分析部は、ESIイオン源を取り付けたOrbitrap Elite MS(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)を用いた。質量分析測定は、負イオン測定モード、m/z 150 - 2000の範囲、設定分解能60,000で測定を行った。MS/MS測定は、ターゲットのm/z 1095.4または1257.5を選択し、不活性ガスとの衝突によって断片化を行うCIDモードで行った。MS3のターゲットイオンはMS/MSスペクトルで最も強度の強いイオンとした。断片化に必要なエネルギーの照射は装置固有の衝突エネルギー基準である35で行った。【００８６】
新規ステビオール配糖体１Ｅおよび２Ｅの断片化パターンを理解するために構造既知である標品レバウディオサイド Aおよび D、MのMS/MSおよびMS3断片化パターン解析を行った。その結果、新規ステビオール配糖体のMS/MSでは19位にエステル結合している糖鎖の全てが脱離したピークのイオン強度が最も強く現れるデータが得られた。この結果は19位の炭素にエステル結合している、糖鎖の分子量の合計を示している。【００８７】
図４に新規ステビオール配糖体１Ｅ（m/z 1097.4、Rt:29.05に相当する）のMS/MSおよびMS3断片化マススペクトルを示す。新規ステビオール配糖体のMS/MSスペクトルからはGlc 1個分とXyl１個分の脱離に相当するm/z 803.37にピークが主ピークとして検出された。この結果から19位の炭素にエステル結合している糖鎖数がGlc1個分とXyl１個であることが分かる。さらに構造情報を得るために、MS/MSで得られた主ピークm/z 803.4を断片化するMS3スペクトルを取得した。その結果、レバウディオサイド AのMS3スペクトル (965.4→803.4→)と同様のピークパターンを持つスペクトルが得られた。このことから、13位に結合した糖鎖は、レバウディオサイドAと同じであると推測出来る。推定される構造を図４中に示す。【００８８】
図５に新規ステビオール配糖体２Ｅ（m/z 1259.5、Rt:29.30に相当する）のMS/MSおよびMS3断片化マススペクトルを示す。新規ステビオール配糖体のMS/MSスペクトルからはGlc３個分の脱離に相当するm/z 773.36にピークが主ピークとして検出された。この結果から19位の炭素にエステル結合している糖鎖数がGlc３個分であることが分かる。さらに構造情報を得るために、MS/MSで得られた主ピークm/z 773.4を断片化するMS3スペクトルを取得した。その結果、レバウディオサイドFのMS3スペクトル (935.4→773.4→)と同様のピークパターンを持つスペクトルが得られた。このことから、13位に結合した糖鎖は、レバウディオサイドFと同じであると推測出来る。推定される構造を図５中に示す。【００８９】
（ｉｉ）化学反応による推定ステビオール配糖体標準品（新規ステビオール配糖体１Ｓおよび２Ｓ）の化学合成
［新規ステビオール配糖体１Ｓの合成］
（１）合成経路の概要
【化７】
2021020516.tif 000010
スキーム１に示したように、新規ステビオール配糖体１Ｓ（目的化合物１５）の合成では、中間体（３）と２糖ヘミアセタール体（８）を、光延反応で縮合することで、新規ステビオール配糖体１Ｓ（目的化合物１５）の骨格を得る事とした。中間体（３）の合成では、既知の天然物であるレバウディオサイドＡ（１）のステビオール１９位のエステル結合をアルカリ加水分解後、糖鎖のヒドロキシ基をアセチル（Ａｃ）基で保護することで、中間体（３）を得た。２糖ヘミアセタール体（８）の合成では、適切に保護されたグルコースアクセプター（４）とキシロースドナー（５）の縮合反応によって、２糖骨格を作り、還元末端１位の保護基を脱保護することで、２糖ヘミアセタール体（８）を得た。得られた中間体（３）と２糖ヘミアセタール体（８）を、光延反応で縮合したところ、７９％（βのみ）と高収率且つ完全なβ選択性で反応が進行した。得られた化合物の保護基を脱保護することで、新規ステビオール配糖体１Ｓ（目的化合物１５）を得た。
次に、各合成工程について説明する。【００９０】
（２）中間体（３）の合成
中間体（３）は国際公開第２０１８／１８１５１５号に記載の方法で行った。【００９１】
（３）２糖ヘミアセタール体の合成
【化８】
2021020516.tif 000011
スキーム２に示したように、２糖ヘミアセタール体（８）の合成では、グルコースアクセプター（４）（４０．０ｇ、１１５ｍｍｏｌ）とキシロースドナー（５）（５３．４ｇ、１２７ｍｍｏｌ）、モレキュラーシーブス４Å（６０ｇ）をジクロロメタン（１．２Ｌ）に溶解させ、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体（１．４６ｍＬ、１１．５ｍｍｏｌ）を−２０℃で加え、−２０℃にて１時間攪拌した。反応終了をＴＬＣ（酢酸エチル／ヘキサン＝１／１、Ｒｆ値＝０．２）にて確認後、トリエチルアミン（２．０ｍＬ）で中和（ｐＨ  ８）し、モレキュラーシーブス４Åを濾別し、減圧濃縮して得られたシラップをシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、溶出液（酢酸エチル／ヘキサン＝１／１）にて化合物７（６１．２ｇ、８８％）を得た。
ＮＭＲスペクトルは、「AVANCE III HD 400 spectrometer」、Bruker社製を用い、1H-NMRと13C-NMRとを測定した。測定に用いた溶媒および周波数は以下のとおりである。ＮＭＲスペクトルの測定は、後述の他の化合物についても同じ装置を用いて行った。
[化合物7]
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 2.01-2.10 (complex, 18H, OAc), 3.35 (dd, 1H), 3.68 (m, 1H), 3.73 (t, 1H), 4.13-4.27 (complex, 4H), 4.38 (m, 1H), 4.48 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.74 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 4.86 (t, 1H), 4.90-4.99 (complex, 2H), 5.09 (t, 1H), 5.35 (d, 1H), 5.91 (m, 1H); 13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 20.6×2, 20.7×2, 20.8×2, 61.9, 62.0, 68.7, 68.9, 70.5, 70.7, 71.2, 71.5, 74.5, 98.9, 100.3, 117.8, 133.4, 169.4, 169.7, 170.0, 170.7.【００９２】
化合物７（２．３ｇ、３．８ｍｍｏｌ）を酢酸（１００ｍＬ）と水（１０ｍＬ）に溶解させ、塩化パラジウム（１．２ｇ、６．８ｍｍｏｌ）を室温で加え、アルゴン雰囲気下、室温にて１８時間攪拌した。反応終了をＴＬＣ（クロロホルム／酢酸エチル＝２／１、Ｒｆ値＝０．２）にて確認後、塩化パラジウムを濾別し、減圧濃縮して得られたシラップをシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、溶出液（クロロホルム／酢酸エチル＝２／１）にて２糖ヘミアセタール体（８）（１．６ｇ、７５％）を得た。
[２糖ヘミアセタール体（８）]
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 2.00-2.15 (complex, 27H, OAc), 3.31-3.39 (complex, 2H), 3.53-3.79 (complex, 3H), 3.86 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 4.06-4.33 (complex, 6H), 4.58 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 4.83-5.06 (complex, 5H), 5.09-5.22 (complex, 2H), 5.35 (m, 1H), 5.45 (t, 1H); 13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 20.4, 20.5, 20.6×2, 20.7×2, 61.9, 62.2, 67.2, 68.3×2, 68.5, 68.7, 70.7, 71.4, 71.5, 76.7, 92.0, 101.6, 169.5, 169.7, 169.8×2, 170.1, 170.7.
【００９３】
（４）化合物１５の合成
【化９】
2021020516.tif 000012
スキーム３に示したように、化合物１４の合成では、２糖ヘミアセタール体（８）（９．４ｇ、１６．７ｍｍｏｌ）と中間体（３）（１８．６ｇ、１５．１ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン（１５０ｍＬ）に溶解させ、トリブチルホスフィン（１４．９ｍＬ、６０．６ｍｍｏｌ）、１，１’−アゾビス（Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド）（ＴＭＡＤ）（１０．４ｇ、６０．６ｍｍｏｌ）を室温で加え、６０℃にて１時間攪拌した。反応終了をＴＬＣ（トルエン／酢酸エチル＝３／２、Ｒｆ値＝０．２）にて確認後、酢酸エチルで希釈し、有機層を水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。硫酸マグネシウムを濾別し、減圧濃縮して得られたシラップをシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、溶出液（トルエン／酢酸エチル＝３／２）にて化合物１４（２１．１ｇ、７９％）を得た。
[化合物１４]
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 0.75-1.32 (complex, 13H), 1.37-2.32 (complex, 77H), 3.36 (t, 1H), 3.50-3.72 (complex, 4H), 3.75-4.29 (complex, 14H), 4.41 (m, 1H), 4. 52-4.65 (complex, 2H), 4.77-5.27 (complex, 20H), 5.62 (d, J = 7.6 Hz, 1H); 13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 16.3, 19.3, 20.3, 20.4, 20.5×2, 20.6×3, 20.7×3, 20.9, 21.2, 21.3, 28.9, 36.5, 36.8, 39.3, 40.3, 41.1, 42.6, 43.3, 43.8, 45.1, 47.2, 53.5, 57.3, 60.3, 61.1, 61.7, 62.0, 62.6, 67.9, 68.0, 68.1, 68.3, 68.7, 70.6, 71.4, 71.6, 71.7, 71.8, 72.1, 72.9, 73.0, 74.7, 80.1, 85.8, 85.9, 91.2, 96.2, 98.9, 99.2, 100.9, 104.5, 125.2, 128.1, 128.7, 152.7, 168.9, 169.2, 169.3×2, 169.6, 169.7, 169.9, 170.0×2, 170.3×2, 170.5, 170.7, 174.5.【００９４】
化合物（１４）（２０．０ｇ、１１．３ｍｍｏｌ）をメタノール（１００ｍＬ）、ＴＨＦ（１００ｍＬ）に溶解させ、ナトリウムメトキサイド（メタノール中０．５Ｍ）（２５ｍＬ）を４℃で加え、室温にて１時間攪拌した。反応終了をＴＬＣ（クロロホルム／メタノール／水＝５／４／０．１、Ｒｆ値＝０．１）にて確認後、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ１２０Ｂ（Ｈ）を加え中和し、減圧濃縮して得られたシラップをゲルろ過カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ−２０、エタノール）に供し、化合物１５（１０．２ｇ、６９％）を得た。
[化合物１５]
1H-NMR (pyridine-d5, 400 MHz) δ 0.70 (m, 1H), 0.88 (m, 1H), 0.91-1.40 (complex, 10H), 1.51-2.21 (complex, 14H), 2.43-2.55 (complex, 2H), 3.59-3.70 (complex, 2H), 3.77-4.51 (complex, 36H), 4.91 (s, 1H), 5.03 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 5.20 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 5.35 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 5.52 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 5.61 (m, 1H), 6.16 (d, J = 7.6 Hz, 1H); 13C-NMR (pyridine-d5, 100 MHz) δ 17.1, 20.4, 21.0, 22.9, 29.4, 38.1, 38.6, 40.2, 41.1, 42.3, 42.6, 44.4, 44.8, 45.9, 48.2, 54.5, 57. 9, 62.6, 62.8×2, 63.8, 67.9, 70.4, 71.3, 71.6, 72.1, 72.8, 75.9, 76.3, 76.9, 77.9, 78.5, 78.7, 78.8, 79.0, 79.1, 79.5, 81.5, 82.3, 87.3, 88.6, 94.1, 98.2, 105. 0, 105.1, 105.3, 107.1, 154.4, 176.4.【００９５】
［新規ステビオール配糖体２Ｓの合成］
（１）合成経路の概要
【化１０】
2021020516.tif 000013
スキーム４に示したように、新規ステビオール配糖体２Ｓ（１７）の合成では、中間体（９）と３糖ヘミアセタール体（１３）を、光延反応で縮合することで、新規ステビオール配糖体２Ｓ（１７）の骨格を得る事とした。中間体（９）の合成では、既知の天然物であるレバウディオサイドＦ（２）のステビオール１９位のエステル結合をアルカリ加水分解後、糖鎖の水酸基をアセチル（Ａｃ）基で保護することで、中間体（９）を得た。得られた中間体（９）と３糖ヘミアセタール体（１３）を、光延反応で縮合したところ、５３％（βのみ）と高収率且つ完全なβ選択性で反応が進行した。得られた化合物の保護基を脱保護することで、新規ステビオール配糖体２Ｓ（１７）を得た。
次に、各合成工程について説明する。【００９６】
（２）中間体（９）の合成
【化１１】
2021020516.tif 000014
スキーム５に示したように、中間体（９）の合成では、レバウディオサイドＦ（２）（１．８ｇ、１．９ｍｍｏｌ）を、メタノール（２０ｍＬ）と水（１０ｍＬ）に溶解させ、２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム（１０ｍＬ）を室温で加え、１００℃にて３時間還流した。反応終了をＴＬＣ（クロロホルム／メタノール＝４／１、Ｒｆ値＝０．２）で確認後、反応液をＡｍｂｅｒｌｉｔｅ１２０Ｂ（Ｈ）で中和（ｐＨ７）し、樹脂を濾別後、減圧濃縮して、化合物６（２．１ｇ）を得た。【００９７】
化合物６（２．１ｇ）をピリジン（２０ｍＬ）に溶解させ、無水酢酸（３．６ｍＬ）を室温で加え、室温にて２４時間攪拌した。反応終了をＴＬＣ（クロロホルム／メタノール＝５０／１、Ｒｆ値＝０．２）にて確認後、飽和の炭酸水素ナトリウム水溶液（４０ｍＬ）を０℃で加え、酢酸エチルで３回抽出した。有機層を減圧濃縮して得られたシラップをシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、溶出液（クロロホルム／メタノール＝５０／１）にて中間体９（２．０ｇ、９０％（２工程））を得た。
[中間体9]  
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 0.81 (m, 1H), 0.89-1.12 (complex, 8H), 1.22 (s, 3H), 1.41-2.22 (complex, 50H), 3.49 (dd, 1H), 3.58 (m, 1H), 3.65 (m, 1H), 3.85 (t, 1H), 3.96-4.15 (complex, 4H), 4.42 (m, 2H), 4.56 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.81-4.94 (complex, 6H), 5.00 (t, 1H), 5.04-5.14 (complex, 3H), 5.25 (t, 1H); 13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 16.0, 17.3, 19.1, 20.5, 20.6, 20.7, 20.8×2, 20.9, 21.8, 29.1, 29. 8, 37.9, 38.0, 39.5, 40.7, 41.5, 42.2, 43.8, 44.0, 48.4, 53.8, 56.8, 61.7, 63.1, 66.8, 68.0, 68.7, 68.8, 69.7, 71.0, 71.6, 71.9, 72.4, 72.8, 81.3, 87.3, 96.6, 96.8, 99.2, 105.6, 151.9, 169.0, 169.5, 169.6, 170.1×2, 170.3, 170.6, 170.9, 171.0, 182.5.
【００９８】
（３）３糖ヘミアセタール体の合成
３糖ヘミアセタール体の合成は、国際公開第２０１８／１８１５１５号に記載の方法で行った。【００９９】
（４）化合物１７の合成
【化１２】
2021020516.tif 000015
スキーム６に示したように、化合物１６の合成では、３糖ヘミアセタール体（１３）（２．４ｇ、２．６ｍｍｏｌ）と中間体（９）（２．０ｇ、１．７ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン（２０ｍＬ）に溶解させ、トリブチルホスフィン（４．３ｍＬ、１７．３ｍｍｏｌ）、１，１’−アゾビス（Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド）（ＴＭＡＤ）（３．０ｇ、１７．３ｍｍｏｌ）を室温で加え、６０℃にて２時間攪拌した。反応終了をＴＬＣ（酢酸エチル／ヘプタン＝２／１、Ｒｆ値＝０．１）にて確認後、酢酸エチルで希釈し、有機層を水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。硫酸マグネシウムを濾別し、減圧濃縮して得られたシラップをシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、溶出液（酢酸エチル／ヘプタン＝２／１）にて化合物１６（１．９ｇ、５３％、βのみ）を得た。
[化合物16]
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 0.78-1.05 (complex, 9H), 1.25 (t, 4H), 1.36-2.31 (complex, 86H), 3.51 (dd, 1H), 3.59 (m, 1H), 3.61-3.78 (complex, 4H), 3.81 (t, 1H), 3.91-4.21 (complex, 11H), 4.31 (dd, 1H), 4.40-4.59 (complex, 4H), 4.73-5.29 (complex, 21H), 5.60 (d, J = 7.2 Hz, 1H); 13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 16.8, 17.5, 19.5, 20.5, 20.7×3, 20.8×3, 20.9×3, 21.0, 21.1×2, 21.5, 29.2, 37.4, 37.5, 39.6, 40.5, 41.6, 42.5, 43.8, 44.2, 48.1, 53.8, 57.4, 61.7, 62.0, 62.1, 62.3, 63.1, 66.7, 67.4, 68.0, 68.3, 68.4, 68.6, 68.8, 69.7, 71.1, 71.5, 71.8, 71.9, 72.0, 72.2, 72.3, 72.4, 72.9, 73.1, 75.0, 80.1, 81.5, 86.8, 91.3, 96.4, 97.0, 99.2, 99.3, 99.6, 104.9, 152.8, 169.0, 169.1, 169.3, 169.5×2, 169.6, 170.1×2, 170.2×3, 170.5, 170.6, 170.9, 174.8.
【０１００】
化合物（１６）（２．２ｇ、１．１ｍｍｏｌ）をメタノール（１０ｍＬ）、ＴＨＦ（１０ｍＬ）に溶解させ、ナトリウムメトキサイド（ＭｅＯＨ中０．５Ｍ）（２．５ｍＬ）を室温で加え、室温にて３時間攪拌した。反応終了をＴＬＣ（クロロホルム／メタノール／水＝５／４／１、Ｒｆ値＝０．４）にて確認後、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ１２０Ｂ（Ｈ）で中和（ｐＨ７）し、樹脂を濾別後、減圧濃縮して得られたシラップをＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ＝１／２に溶解し、凍結乾燥を行った。これにより化合物１７（１．０ｇ、７０％）を得た。
[化合物17]
1H-NMR (pyridine-d5, 400 MHz) δ 0.78 (m, 1H), 0.91 (m, 1H), 1.08 (m, 1H), 1.31-1.48 (complex, 9H), 1.62-1.80 (complex, 3H), 1.81-1.89 (complex, 3H), 2.00-2.06 (complex, 2H), 2.29 (m, 3H), 2.47 (m, 1H), 2.69 (m, 1H), 2.80 (m, 1H), 3.41 (t, 1H), 3.81 (m, 1H), 3.90-4.41 (complex, 33H), 4.53-4.61 (complex, 2H), 4.70 (m, 1H), 4.88-5.22 (complex, 14H), 5.30 (d, J = 8.0 Hz,1H), 5.37 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 5.51-5.57 (complex, 2H), 5.61 (s, 1H), 5.77 (s, 2H), 5.84 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 6.46 (d, J = 8.0 Hz, 1H); 13C-NMR (pyridine-d5, 100 MHz) δ 18.3, 21.2, 21.7, 25.1, 29.8, 39.9, 41.3, 41.7, 42.5, 44.2, 44.7, 45.8, 47.9, 55.9, 58.9, 63.3, 63.5, 63.6, 64.2, 65.6, 68.5, 71.7, 72.2, 72.6, 72.9, 75.2, 76.9, 77.0, 77.2, 78.4, 79.2, 79.3, 79.4, 79.5, 79.6, 79.9, 80.0, 80.6, 83.7, 89.2, 89.5, 90.2, 96.5, 97.7, 105.4, 105.7, 105.9, 106.4, 107.3, 154.9, 178.5.【０１０１】
（ｉｉｉ）化学合成標準品のＨＰＬＣ− 高分解能MS/MSおよびMS3断片化の保持時間と断片化パターンの一致による構造決定
（ｉ）に記載の条件で、HPLC-ESIイオン源を取り付けたOrbitrap Elite MS (サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)を用いて、ＨＰＬＣ− 高分解能MS/MSおよびMS3断片化による新規ステビオール配糖体１の化学合成品（化合物１５のβ体）とステビア葉抽出液の比較を行った結果、保持時間29.34分または29.37分のピークで化学合成品とステビア葉抽出液からのピークが検出された（図１０）。なお、図１０における保持時間29.34分または29.37分のピークが、図２における保持時間29.05分のピークに相当することは、化学合成品を用いて図２において使用した装置（LCMS-8030）における保持時間を測定することで確認した。また、それぞれのMS/MSおよびMS3断片化マススペクトル（図１１）も一致した。この結果から、植物体の抽出液から得られた新規ステビオール配糖体１Ｅは化合物１５のβ体と同じ構造を有することが確認された。【０１０２】
さらに、（ｉ）に記載の条件で、HPLC-ESIイオン源を取り付けたOrbitrap Elite MS (サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)を用いて、ＨＰＬＣ− 高分解能MS/MSおよびMS3断片化による新規ステビオール配糖体２の化学合成品（化合物１７のβ体）とステビア葉抽出液の比較を行った結果、保持時間29.67分または29.68分のピークで化学合成品とステビア葉抽出液からのピークが検出された（図１２）。なお、図１２における保持時間29.67分または29.68分のピークが、図３における保持時間29.30分のピークに相当することは、化学合成品を用いて図３において使用した装置（LCMS-8030）における保持時間を測定することで確認した。また、それぞれのMS/MSおよびMS3断片化マススペクトル（図１３）も一致した。この結果から、植物体の抽出液から得られた新規ステビオール配糖体２Ｅは化合物１７のβ体と同じ構造を有することが確認された。【０１０３】
新規ステビオール配糖体の甘味度評価
新規ステビオール配糖体ＡとＢの甘味度を評価するため、Brix３．０から５．０まで０．５刻となるよう砂糖を純水に添加したサンプルを調製した。新規ステビオール配糖体ＡとＢとしては、それぞれ化学合成によって得た化合物１５と１７を用い、４００ｍＬの純水中に４８ｍｇの試料を溶解させて試験した。また、対比用にＲｅｂ．Ａ、Ｒｅｂ．ＤおよびＲｅｂ．Ｍをそれぞれ４８ｍｇずつ４００ｍＬの純水に溶解させた試料も作成した。【０１０４】
（１）新規ステビオール配糖体Ａの甘味度評価
評価は新規ステビオール配糖体を添加されたサンプルと同等の甘味強度を持つ砂糖添加サンプルを選択することによって行われ、甘味料の官能に関して訓練を受けた者（７名）がパネラーとなって官能評価を行った。その結果、本発明の新規ステビオール配糖体Ａは砂糖に対し平均で３５４倍程度の甘味度を持つことがわかった。
【表２】
2021020516.tif 000016
【０１０５】
（２）新規ステビオール配糖体Ｂの甘味度評価
新規ステビオール配糖体Ａと同様に甘味度を評価した。その結果、本発明の新規ステビオール配糖体Ｂは砂糖に対し平均で２５０倍程度の甘味度を持つことがわかった。結果を下表に示す。
【表３】
2021020516.tif 000017
【０１０６】
新規ステビオール配糖体Ａ（化合物１５）の官能評価
各種ステビオール配糖体の味質の評価を行うため、Ｒｅｂ．Ａと、Ｒｅｂ．Ｄと、Ｒｅｂ．Ｍと、砂糖と、新規ステビオール配糖体Ａ（化合物１５）とをそれぞれ純水に添加して、飲料サンプルを調製した。飲料サンプルは全て、甘味度をＲｅｂ．Ａについては３１２、Ｒｅｂ．Ｄについては３１７、Ｒｅｂ．Ｍについては３４１、新規ステビオール配糖体Ａ（化合物１５）については３５４として、砂糖（スクロース）換算の甘味度（Ｂｒｉｘ）が最終的に５となるように調整した。【０１０７】
得られた飲料サンプルについて、甘味立ち上がり、甘味後引き、苦味、および苦味後引きの指標で官能評価を行った。甘味料の官能に関して訓練を受けた者（７名）がパネラーとなって評価を行い、評価基準は次の通りとした。各評価項目において砂糖を３点とし、各ステビオール配糖体の点数を０．５点刻みで点数付けした。数値が高いほど、甘味立ち上がりが速く、甘味後引きが短く、苦味が少なく、苦み後引きが短い。結果を図１４に示す。図中に示す評点は８名のパネラーによる評点の平均値である。官能評価の結果、新規ステビオール配糖体Ａは、他の配糖体と比べ、甘味と苦味後引きが少なく、苦味は砂糖を含めた他の成分に比べ少ないことが分かった。【０１０８】
新規ステビオール配糖体Ｂ（化合物１７）の官能評価
各種ステビオール配糖体の味質の評価を行うため、Ｒｅｂ．Ａと、Ｒｅｂ．Ｄと、Ｒｅｂ．Ｍと、砂糖と、新規ステビオール配糖体Ｂ（化合物１７）とをそれぞれ純水に添加して、飲料サンプルを調製した。飲料サンプルは全て、甘味度をＲｅｂ．Ａについては２８８、Ｒｅｂ．Ｄについては３１０、Ｒｅｂ．Ｍについては３２４、新規配糖体Ｂ（化合物１７）については２５０として、砂糖（スクロース）換算の甘味度（Ｂｒｉｘ）が最終的に５となるように調整した。【０１０９】
得られた飲料サンプルについて、甘味立ち上がり、甘味後引き、苦味、および苦味後引きの指標で官能評価を行った。甘味料の官能に関して訓練を受けた者（７名）がパネラーとなって評価を行い、評価基準は次の通りとした。各評価項目において砂糖を３点とし、各ステビオール配糖体の点数を０．５点刻みで点数付けした。数値が高いほど、甘味立ち上がりが速く、甘味後引きが短く、苦味が少なく、苦み後引きが短い。結果を図１５に示す。図中に示す評点は６名のパネラーによる評点の平均値である。官能評価の結果、新規ステビオール配糖体Ｂは、他の配糖体に比べ苦味が低いことが分かった。【０１１０】
新規ステビオール配糖体ＡおよびＢを含む植物体に含まれる遺伝的特徴の同定
新規ステビオール配糖体ＡおよびＢを豊富に含む系統（変異型：開発系統Ａおよび開発系統Ｂ）と新規配糖体ＡおよびＢの含有量が少ない系統（野生型：開発系統Ｘおよび開発系統Ｙ）を用いて、新規配糖体ＡおよびＢを豊富に含む系統に特異的な遺伝的特徴の特定を検討した。各系統のゲノムをシーケンスしたところ、新規配糖体ＡおよびＢを豊富に含む系統は、野生型（ＷＴ）に対して、配列番号１の２９８番目、３２８番目、３６０番目、３８６番目、３９３番目、４１１番目、４２７番目および４５３番目の塩基における置換、配列番号５７の９０番目の塩基と９１番目の塩基との間における１５塩基の挿入、配列番号５９の９８番目、１０２番目、１１１番目、１１３番目、１１６番目、１１９番目および１２２番目の塩基における置換を有することが分かった（配列番号１、５７および５９に対応する変異型系統の塩基配列を配列番号２、５８および６０にそれぞれ示す）。また、配列番号１における置換、配列番号５７における挿入、および配列番号５９における置換は、それぞれ配列番号５３、６１および６３のアミノ酸配列を含むタンパク質（本明細書中、それぞれＰ１、Ｐ２およびＰ３と称することがある）をコードする遺伝子のイントロン領域に存在することも分かった。次に、これらの変異が各遺伝子の発現量に影響を及ぼすか否かを検討した。開発品種Ａ、Ｂ、Ｘ（ＳＲ００１）、Ｙ（ＳＳ０７５−４９）の展開葉１００ｍｇを液体窒素で凍結粉砕後、QIAGEN社のRNAeasy Plant mini kitを用い、製造者のプロトコルに従いtotalRNAを抽出した。抽出したtotalRNA ５００ｎｇを逆転写に用いた。逆転写にはThermo Fisher Scientific社製のSuperScript IV VILOを用い、製造者のプロトコルに従いｃＤＮＡを合成した。逆転写反応液を１／１０に希釈した溶液１μＬを用いて半定量ＰＣＲを行った。半定量ＰＣＲは島津製作所社製のAmpdirectを用い、製造者のプロトコルに従いＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は９５℃  １０分で熱変性させた後、９４℃  ３０秒、５５℃  ３０秒、７２℃  ２５秒の反応をＰ３は３２サイクル、Ｐ１、Ｐ２は３３サイクル、対照区のアクチン、ユビキチンは２８サイクル行った。ＰＣＲ反応後の電気泳動はPerkinElmer社製のLabChip GX Touchを用い、製造者のプロトコルに従い行った。【０１１１】
半定量ＰＣＲには以下のプライマーを使用した。
Ｐ１
フォワード: CCTGTTCATTACAAATTCAACCCG（配列番号５５）
リバース: AACCCTAACATGTTCAATGTCCCTA（配列番号５６）
Ｐ２
フォワード: ATCAGATTTATCATCTTGCATGCCC（配列番号６５）
リバース: TGCCAATTACATTCGTCTTAATCGT（配列番号６６）
Ｐ３
フォワード: AAAAGTTGCTGGTTGAAGTTGATCA（配列番号６７）
リバース: CACACTAAATATGCTTGGTCTTGC（配列番号６８）
アクチン
フォワード: CGCCATCCTCCGTCTTGATCTTGC（配列番号６９）
リバース: CCGTTCGGCGGTGGTGGTAA（配列番号７０）
ユビキチン
フォワード: TCACTCTTGAAGTGGAGAGTTCCGA（配列番号７１）
リバース: GCCTCTGTTGGTCCGGTGGG（配列番号７２）【０１１２】
発現解析結果を図１６および表４に示す。表４に示す数値は、図１６に示す電気泳動像において、ユビキチン遺伝子のバンド強度を１００としたときのＰ１〜Ｐ３遺伝子のバンド強度の相対値を表す。
【表４】
2021020516.tif 000018
これらの結果から新規配糖体ＡおよびＢを含有する２系統において、Ｐ１遺伝子が高発現していることが確認された。Ｐ１遺伝子中に見出された変異はイントロン領域に存在するものであるが、これらの変異のいずれか１つ以上の存在によりＰ１の発現量が増加することで、新規配糖体ＡおよびＢの合成が植物中で促進されているものと推察される。【０１１３】
遺伝的特徴１〜８を有する植物体中の新規配糖体Ａ含有量の同定
上記「新規ステビオール配糖体ＡおよびＢを含む植物体に含まれる遺伝的特徴の同定」において用いた開発品種Ａ、Ｂ、ＸおよびＹの個体より、適量の新鮮葉をサンプリングし、ＬＣ／ＭＳ−ＭＳ（島津LCMS8050）にて甘味成分の濃度を定量した。具体的には、所定量の新鮮葉をフリーズドライにより乾燥し、破砕物乾物を純水中に投入した。超音波処理２０分にて抽出し、遠心・濾過した後に５ｍＬの抽出液を得た。この抽出液をLCMS8050イオンモード（島津LCMS8050）にてＬＣ／ＭＳ−ＭＳ分析を行い、Ｒｅｂ．Ａ、Ｒｅｂ．Ｂ、Ｒｅｂ．Ｃ、Ｒｅｂ．Ｄ、Ｒｅｂ．Ｅ、Ｒｅｂ．Ｆ、Ｒｅｂ．Ｇ、Ｒｅｂ．Ｉ、Ｒｅｂ．Ｍ、Ｒｅｂ．Ｎ、ステビオシド、ズルコサイドＡ、ステビオールビオシド、ルブソシドおよび新規ステビオール配糖体Ａの濃度を定量し、その合計を甘味成分の濃度とした（本実施例における総ステビオール配糖体量（ＴＳＧ））。乾燥葉の水分量はいずれも約３％未満であった。結果を表５〜９に示す。下記の結果はそれぞれ２回の測定の平均値である。
【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【０１１４】
遺伝的特徴１〜８を有する植物体中の新規配糖体Ｂ含有量の同定
上記「新規ステビオール配糖体ＡおよびＢを含む植物体に含まれる遺伝的特徴の同定」において用いた開発品種ＢおよびＸの個体より、適量の新鮮葉をサンプリングし、ＬＣ／ＭＳ−ＭＳ（島津LCMS8050）にて甘味成分の濃度を定量した。具体的には、所定量の新鮮葉をフリーズドライにより乾燥し、破砕物乾物を純水中に投入した。超音波処理２０分にて抽出し、遠心・濾過した後に５ｍＬの抽出液を得た。この抽出液をLCMS8050イオンモード（島津LCMS8050）にてＬＣ／ＭＳ−ＭＳ分析を行い、Ｒｅｂ．Ａ、Ｒｅｂ．Ｂ、Ｒｅｂ．Ｃ、Ｒｅｂ．Ｄ、Ｒｅｂ．Ｅ、Ｒｅｂ．Ｆ、Ｒｅｂ．Ｇ、Ｒｅｂ．Ｉ、Ｒｅｂ．Ｍ、Ｒｅｂ．Ｎ、ステビオシド、ズルコサイドＡ、ステビオールビオシド、ルブソシドおよび新規ステビオール配糖体Ｂの濃度を定量し、その合計を甘味成分の濃度とした（本実施例における総ステビオール配糖体量（ＴＳＧ））。乾燥葉の水分量はいずれも約３％未満であった。結果を表１０〜１４に示す。
【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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