(57)【要約】  新規な老化状態の評価方法、情報の提示方法、及び老化状態を改善又は予防する物質のスクリーニング方法を提供すること。  本発明に係る被験体の老化状態を評価する方法は、老化状態との相関性基準が作成済みである、血清中のエクソソームを含む細胞外小胞の量、細胞外小胞の表面タンパク質の終末糖化産物の量、又はこれらの量に基づくパラメータのいずれかに関する被験体の値を、相関性基準と対比する工程を有する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体の老化状態を評価する方法であって、
前記老化状態との相関性基準が作成済みである、血清中のエクソソームを含む細胞外小胞の量、前記細胞外小胞の表面タンパク質の終末糖化産物の量、又は前記量に基づくパラメータのいずれかに関する前記被験体の値を、前記相関性基準と対比する工程を有する方法。
【請求項２】
被験体に関する情報を提示する方法であって、
請求項１記載の方法により、被験体の老化状態を評価する工程と、
前記老化状態が目標状態にないと評価された場合、前記老化状態が目標状態にあるときに前記相関性基準に基づいて前記量又は前記パラメータが示す数値範囲の方に、前記量又は前記パラメータの値を誘導可能な成分としてデータベースに登録されている情報を提示する工程と、を有する方法。
【請求項３】
前記成分を摂取した後の被験体の老化状態を請求項１記載の方法により再度評価する工程と、
前記再度評価した老化状態の改善の程度に基づき、前記情報をアップデートする工程と、をさらに有する請求項２記載の方法。
【請求項４】
老化状態を改善又は予防する物質をスクリーニングする方法であって、
前記老化状態との相関性基準が作成済みである、血清中のエクソソームを含む細胞外小胞の量、前記細胞外小胞の表面タンパク質の終末糖化産物の量、又は前記量に基づくパラメータのいずれかに関する、候補物質による変化に基づいて、前記候補物質を選抜する工程を有する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、老化状態の評価方法、情報の提示方法、及び老化状態を改善又は予防する物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物は加齢に伴い生理機能が低下し、老化する。同様に、生体を構成している個々の細胞においても、細胞の形質の変化、機能の退行、それに続く増殖の停止、細胞死という過程を経た老化が起こる。【０００３】
従来、老化状態の評価方法として、例えば、被験体から採取した染色体のテロメア長に基づく方法が知られている（例えば特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００１−１６１３６４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、老化は、種々の要因が関与して進行する現象であるから、老化状態を正確に評価するマーカーの選択肢が多い程、その評価結果の精度向上が期待できる。【０００６】
そこで、本発明は、新規な老化状態の評価方法、情報の提示方法、及び老化状態を改善又は予防する物質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、血清中のエクソソームを含む細胞外小胞の量、細胞外小胞の表面タンパク質の終末糖化産物（ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ；ＡＧＥｓ）の量が、老化状態と相関することを見出し、本発明を完成するに至った。具体的に、本発明は以下を提供する。【０００８】
（１）  被験体の老化状態を評価する方法であって、
前記老化状態との相関性基準が作成済みである、血清中のエクソソームを含む細胞外小胞の量、前記細胞外小胞の表面タンパク質の終末糖化産物の量、又は前記量に基づくパラメータのいずれかに関する前記被験体の値を、前記相関性基準と対比する工程を有する方法。【０００９】
（２）  被験体に関する情報を提示する方法であって、
（１）記載の方法により、被験体の老化状態を評価する工程と、
前記老化状態が目標状態にないと評価された場合、前記老化状態が目標状態にあるときに前記相関性基準に基づいて前記量又は前記パラメータが示す数値範囲の方に、前記量又は前記パラメータの値を誘導可能な成分としてデータベースに登録されている情報を提示する工程と、を有する方法。【００１０】
（３）  前記成分を摂取した後の被験体の老化状態を請求項１記載の方法により再度評価する工程と、
前記再度評価した老化状態の改善の程度に基づき、前記情報をアップデートする工程と、をさらに有する（２）記載の方法。【００１１】
（４）  老化状態を改善又は予防する物質をスクリーニングする方法であって、
前記老化状態との相関性基準が作成済みである、血清中のエクソソームを含む細胞外小胞の量、前記細胞外小胞の表面タンパク質の終末糖化産物の量、又は前記量に基づくパラメータのいずれかに関する、候補物質による変化に基づいて、前記候補物質を選抜する工程を有する方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、新規な老化状態の評価方法、情報の提示方法、及び老化状態を改善又は予防する物質のスクリーニング方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】被験体の年齢と、血清中のエクソソームを含む細胞外小胞の量との関係を示すグラフである。なお、「ｙｏｕｎｇ」は実年齢３５歳以下の被験体を、「ｏｌｄ」は実年齢６０歳以上の被験体を指す。
【図２】（ａ）は、被験体の年齢と、血清中の終末糖化産物全量との関係を示すグラフであり、（ｂ）は、被験体の年齢と、血清中の細胞外小胞の表面タンパク質の終末糖化産物の量との関係を示すグラフである。なお、「ｙｏｕｎｇ」は実年齢３５歳以下の被験体を、「ｏｌｄ」は実年齢６０歳以上の被験体を指す。
【図３】被験体の年齢と、血清中の細胞外小胞の表面タンパク質の終末糖化産物の量との関係を示すグラフである。なお、横軸は被験体の実年齢を示す。
【図４】血清中の細胞外小胞の表面タンパク質の終末糖化産物の量と、テロメア長との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施形態を説明するが、これらに本発明が限定されるものではない。
【００１５】
本発明の一実施形態は、験体の老化状態を評価する方法であって、
前記老化状態との相関性基準が作成済みである、血清中のエクソソームを含む細胞外小胞の量、前記細胞外小胞の表面タンパク質の終末糖化産物の量、又は前記量に基づくパラメータのいずれかに関する前記被験体の値を、前記相関性基準と対比する工程を有する方法である。
これにより、老化状態を客観的に評価することができる。また、従来、一括りにされていた老化状態を、上記量又はパラメータの値によって細分化でき、これにより、被験体の老化状態の改善をより高確度に行うことが期待される。
なお、上記量又はパラメータの値は老化状態との相関性が高い一方、それ以外の老化マーカー（例えば被験体の染色体テロメア長）との相関性が極めて高い訳ではない。このため、上記量又はパラメータとともに、それ以外の老化マーカーを併用することは、老化状態を多面的で正確に評価できる点で好ましい。
【００１６】
本発明の別の実施形態は、被験体に関する情報を提示する方法であって、
上記評価方法により、被験体の老化状態を評価する工程と、
前記老化状態が目標状態にないと評価された場合、前記老化状態が目標状態にあるときに前記相関性基準に基づいて前記量又は前記パラメータが示す数値範囲の方に、前記量又は前記パラメータの値を誘導可能な成分としてデータベースに登録されている情報を提示する工程と、を有する方法。
これにより、老化状態の改善等に関する情報を、被験体にパーソナライズして提示することができる。なお、ここでいう情報は、成分または成分含有製剤の名前、成分・製剤の用法・用量、老化状態の期待される改善の仕方や程度、副作用等を指す。
【００１７】
一実施形態において、成分を摂取した後の被験体の老化状態を上記の評価方法により再度評価する工程と、
前記再度評価した身体状態の改善の程度に基づき、前記情報をアップデートする工程と、をさらに有することが好ましい。
これにより、データベース内の情報が改良され、老化状態の改善の確度等をより高めることが期待される。
【００１８】
再度評価のタイミングは、特に限定されず、例えば、成分使用後に老化状態の改善が期待される（データベース内の情報に含まれ得る）時間が経過した時であってよい。
【００１９】
本発明の別の実施形態は、老化状態を改善又は予防する物質をスクリーニングする方法であって、
前記老化状態との相関性基準が作成済みである、血清中のエクソソームを含む細胞外小胞の量、前記細胞外小胞の表面タンパク質の終末糖化産物の量、又は前記量に基づくパラメータのいずれかに関する、候補物質による変化に基づいて、前記候補物質を選抜する工程を有する方法である。
これにより、老化状態を改善または予防する物質を高確率でスクリーニングすることが期待される。
【００２０】
なお、本発明におけるスクリーニングとは、老化状態を改善又は予防する物質の存在確率が、スクリーニング後の候補物質群においてスクリーニング前の候補物質群に比べて高まっていれば足り、スクリーニング後の候補物質が必ず老化状態を改善または予防できることを要しない。したがって、スクリーニングされた候補物質が、老化状態を改善又は予防する効果を有することを確認する工程をさらに行うことが好ましい。
【００２１】
パラメータは、血清中のエクソソームを含む細胞外小胞の量、又は細胞外小胞の表面タンパク質の終末糖化産物の量に基づく限りにおいて特に限定されず、量の差、和、積、比またはそれらの組合せであってよく、中でも和、積またはその組み合わせであってよい。
【００２２】
被験体とは、生体、器官、組織、細胞のいずれであってもよい。器官、組織、細胞は、生体から採取したものであってもよいし、幹細胞から分化再生したものであってもよい。
【００２３】
細胞外小胞は、細胞間のコミュニケーションを媒介し、免疫応答や血液凝固などさまざまなプロセスに関与しており、その性質によりエクソソーム、微小小胞体、アポトーシス小体に区分される。
【００２４】
エクソソームは、細胞外小胞のうち、粒度分布・粒径測定  ナノ粒子マルチアナライザーｑＮａｎｏ（Ｉｚｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）で測定される粒子径４０〜１２０ｎｍであり、マーカー分子がＣＤ９、ＣＤ６３である。ウェスタンブロッティングによってＣＤ９、ＣＤ６３の存在を確認することで、エクソソームの存在を確認することができる。
【００２５】
エクソソームを含む細胞外小胞の量は、細胞外小胞の数であってよく、血清からエクソソームを常法で単離し、その画分に含まれる粒子数を粒度分布・粒径測定  ナノ粒子マルチアナライザーｑＮａｎｏ（Ｉｚｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）等でカウントすることによって測定することができる。
【００２６】
細胞外小胞の表面タンパク質とは、細胞外小胞の脂質二重膜上に存在するタンパク質である。
【００２７】
表面タンパク質の終末糖化産物の量は、表面タンパク質に占める終末糖化産物の割合であってよい。ここで、表面タンパク質の量は、血清から単離したエクソソームについてＢＣＡタンパク質アッセイで決定し、終末糖化産物の量は、血清から単離したエクソソームに対し、終末糖化産物の量をＥＬＩＳＡ（ＯｘｉＳｅｌｅｃｔＴＭ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  Ｅｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔ（ＡＧＥ）  Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ  （Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．）あるいは同様のキット）等の常法で決定することができる。
【００２８】
老化状態は、上記量又はパラメータとの相関性を有するものであれば特に限定されず、老化に関わる定性的または定量的な状態であり得る。具体的には、細胞老化、個体部分（例えば皮膚、血管、筋肉）年齢、老化進行に起因する症状（例えば心筋梗塞、がん、認知症、脳梗塞、動脈硬化等）の顕在又は潜在の重篤度などが挙げられる。
【００２９】
相関性基準は、上記量またはパラメータの値に基づいて、評価すべき老化状態を定性的または定量的に特定可能な基準であり、典型的には上記量またはパラメータと老化状態との相関式である。例えば、上記量またはパラメータの値と相関性基準とから求められる老化状態が、被験体の実年齢等から期待される老化状態よりも進行しているか否かは、老化状態の評価の一例である。
【００３０】
老化状態の多くは、血清中のエクソソームを含む細胞外小胞の量、前記細胞外小胞の表面タンパク質の終末糖化産物の量だけでなく、他の事象（例えば実年齢）との相関性も有する。このため、相関性基準は、老化状態と相関することが既知の事象の少なくとも１つによる影響の排除後におけるものであることが好ましい。これにより、被験体に関する上記他の事象の有無や程度に影響を抑え、血清中のエクソソームを含む細胞外小胞の量、前記細胞外小胞の表面タンパク質の終末糖化産物の量、またはパラメータの値に基づき、より正確な身体状態の評価が可能である。
また、被験体に関する情報を提示する方法においては、被験体に関する上記他の事象の有無や程度も考慮して、より適切な情報を提示することが可能である。このため、上記血清中のエクソソームを含む細胞外小胞の量、前記細胞外小胞の表面タンパク質の終末糖化産物の量又はパラメータに加え、被験体に関する上記他の事象の有無や程度のインプットが好ましいことになる。
また、老化状態を改善又は予防する物質のスクリーニング方法においては、使用者の上記他の事象にかかわらず老化状態を改善または予防可能な物質を取得しやすくなる。
【実施例】
【００３１】
１．使用した臨床検体
末梢血の採取は、広島大学ヒトゲノム・遺伝子解析研究倫理審査委員会から承認されたヒトゲノム遺伝子解析研究計画書に基づいて行った。血液は、慢性疾患および治療中の疾患がない２０名の健常者ボランティアから末梢血を得た。本実施例で解析に用いた末梢血の内訳は、高齢者１０名（男性６名、女性４名；平均６６．５歳，５８〜７５歳）、若年者１０名（男性６名、女性４名；平均２６．２歳，２２〜３３歳）である。【００３２】
２．血清の回収と保存
末梢血は、血清分離剤を含むベノジェクトＩＩ真空採血管（ＴＥＲＵＭＯ  ｃａｔ．  ＶＰ−ＡＳ１０６Ｋ５０）に採取した。採血管は、室温で３０分間のインキュベーション後、２３３０×ｇで１０分間、室温で遠心した。上層の血清を２ｍＬチューブに移し、さらに１２０００×ｇで１０分間、４℃で遠心した。上清を１．５ｍＬのチューブに約０．３ｍＬずつ分注し、−８０℃で凍結保存した。【００３３】
３．血清中のエクソソームの精製と確認
エクソソームは、２００μＬの血清からＴｏｔａｌ  Ｅｘｏｓｏｍｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｆｒｏｍ  ｓｅｒｕｍ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  ｃａｔ．４４７８３６０）を用い、キットのプロトコールに従って精製し、１００μＬの１×ＰＢＳ（−）緩衝液に懸濁した。精製した粒子の数とサイズは、ｑＮａｎｏ（Ｉｚｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて確認した。また、精製した粒子にエクソソームのマーカータンパク質であるＣＤ９、ＣＤ６３が存在することをウェスタンブロッティングにて確認した。被験体の年齢と、血清中のエクソソームを含む細胞外小胞量（粒子数）との関係を図１に示す。【００３４】
４．タンパク質の定量
エクソソームサンプルのタンパク定量は、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ  （Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  ｃａｔ．  ２３２３５）も用いて行った。【００３５】
５．終末糖化産物の定量
血清中エクソソームの表面にある終末糖化産物の定量は、上記３で得たエクソソーム含有サンプルを１×ＰＢＳ（−）緩衝液で濃度を１０ｍｇ／ｍｌまで希釈した後、ＯｘｉＳｅｌｅｃｔＴＭ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  Ｅｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔを用い、キットのプロトコールに従って行った。被験体の年齢と、血清中の細胞外小胞の表面タンパク質の終末糖化産物の量との関係を図２（ｂ）に示す。また、被験体の年齢と、血清中の細胞外小胞の表面タンパク質の終末糖化産物の量との関係を図３に示す。【００３６】
エクソソームの終末糖化産物の定量を、終末糖化産物濃度が明らかな終末糖化産物−ＢＳＡをスタンダードとして、競合阻害ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｌｖｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）で行った。マイクロプレートに、合成した終末糖化産物をＢＳＡに結合させた終末糖化産物−ＢＳＡを固相化し、複数濃度に希釈した終末糖化産物−ＢＳＡスタンダードまたはサンプル（上記２で得た血清）存在下で、マウス抗終末糖化産物抗体を固相化した終末糖化産物−ＢＳＡに反応させた。結合したマウス抗終末糖化産物抗体には、酵素標識した抗マウスＩｇＧ抗体を結合させ、基質を加えてマイクロプレート内に残った酵素の活性を測定した。終末糖化産物−ＢＳＡスタンダードの吸光度を元に、サンプル中の全終末糖化産物濃度を算出した。被験体の年齢と、血清中の終末糖化産物全量との関係を図２（ａ）に示す。【００３７】
６．テロメア長の定量
健常者ボランティアから得た細胞からＤＮＡを抽出し、特許第５５１４４０１号に記載の方法に従って、テロメア長を求めた。血清中の細胞外小胞の表面タンパク質の終末糖化産物の量と、テロメア長との関係を図４に示す。【００３８】
図１に示されるように、被験体の年齢増加とともに血清中のエクソソームを含む細胞外小胞量が増加することが確認された。
また、図２（ｂ）によると、被験体の年齢増加とともに血清中のエクソソームを含む細胞外小胞の表面タンパク質の終末糖化産物量が増加し、また図３によると、血清中のエクソソームを含む細胞外小胞の表面タンパク質の終末糖化産物量と、被験体の年齢との間には、相応の相関性が存在することが確認された。一方で、図２（ａ）によると、血清中の終末糖化産物全量は被験体の年齢との相関性を示さなかった。
このように、血清中のエクソソームを含む細胞外小胞の量、エクソソームを含む細胞外小胞の表面タンパク質の終末糖化産物の量は、年齢と強く相関する老化状態との間に相関性を有することから、上記量に関する値を相関式と対比することで老化状態を評価できることが分かった。【００３９】
図４に示されるように、血清中のエクソソームを含む細胞外小胞の表面タンパク質の終末糖化産物の量は、テロメア長との相関性も有していた。また、その相関性は、図３に示す相関性より若干低く、上記量とテロメア長とは、一部異なる側面の老化状態を反映することが示唆される。このため、上記量又はパラメータとともに、それ以外の老化マーカーを併用することで、老化状態を多面的で正確に評価できることが期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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2019098194.tif 000008
2019098194.tif 000009
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