(57)【要約】  本発明は、抗体の修飾、特に、抗体の位置選択的な修飾を可能にする技術を提供する。より具体的には、本発明は、抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物またはその塩であって、  下記式（Ｉ）：Ａ−Ｌ−Ｂ−Ｒ      （Ｉ）〔式中、  Ａは、抗体に対する親和性物質であり、  Ｌは、切断性部分を含む２価の基である切断性リンカーであり、  Ｂは、（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基、または（ｂ）生体直交性官能基を含まない２価の基であり、  Ｒは、前記抗体に対する反応性基である。〕で表されるものであり、かつ  抗体に対する親和性物質が、所定のペプチドである、化合物またはその塩を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物またはその塩であって、
前記化合物が、下記式（Ｉ）：
Ａ−Ｌ−Ｂ−Ｒ      （Ｉ）
〔式中、
Ａは、抗体に対する親和性物質であり、
Ｌは、切断性部分を含む２価の基である切断性リンカーであり、
Ｂは、（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基、または（ｂ）生体直交性官能基を含まない２価の基であり、
Ｒは、前記抗体に対する反応性基である。〕で表されるものであり、かつ
抗体に対する親和性物質が、
式１−１：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｉ−Ｉ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号５８）
式１−２：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｉ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号５９）
式１−３：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｖ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６０）
式１−４：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ａ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６１）
式１−５：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｌ−Ｌ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６２）
式１−６：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｌ−Ｉ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６３）
式１−７：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６４）
式１−８：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｑ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６５）
式１−９：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｅ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６６）
〔式中、
（Ｘ０−３）ａは、なし、または１〜３個の連続する同一または異なる任意のアミノ酸残基（リジン残基およびシステイン残基以外）であり、
（Ｘ０−３）ｂは、なし、または１〜３個の連続する同一または異なる任意のアミノ酸残基（リジン残基およびシステイン残基以外）であり、
Ｘａａ１は、アラニン残基、グリシン残基、ロイシン残基、プロリン残基、アルギニン残基、バリン残基、アスパラギン残基、グルタミン酸残基、またはフェニルアラニン残基であり、
Ｘａａ２は、チロシン残基、トリプトファン残基、ヒスチジン残基、またはフェニルアラニン残基であり、
Ｘａａ３は、ヒスチジン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、トリプトファン残基、アルギニン残基、またはグリシン残基であり、
Ｘａａ４は、リジン残基であり、
Ｘａａ５は、グリシン残基、セリン残基、アスパラギン残基、グルタミン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、トリプトファン残基、ヒスチジン残基、スレオニン残基、ロイシン残基、アラニン残基、バリン残基、イソロイシン残基、またはアルギニン残基であり、
Ｘａａ６は、グルタミン残基、グルタミン酸残基、アスパラギン残基、アスパラギン酸残基、プロリン残基、グリシン残基、アルギニン残基、フェニルアラニン残基、またはヒスチジン残基である。〕、あるいは
式２−１：（Ｘ０−３’）ａ−Ｃ−Ｘａａ１’−Ｘａａ２’−Ｘａａ３’−Ｘａａ４’−Ｘａａ５’−Ｘａａ６’−Ｌ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３’）ｂ（配列番号６７）
〔式中、
（Ｘ０−３’）ａおよび（Ｘ０−３’）ｂはそれぞれ、前記（Ｘ０−３）ａおよび（Ｘ０−３）ｂと同じであり、
Ｘａａ１’、Ｘａａ２’、Ｘａａ３’、Ｘａａ４’、Ｘａａ５’、Ｘａａ６’はそれぞれ、前記Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６と同じである。
但し、（Ｘ０−３’）ａが１〜３個の連続する同一または異なる任意のアミノ酸残基、（Ｘ０−３’）ｂが１〜３個の連続する同一または異なる任意のアミノ酸残基、Ｘａａ３’がヒスチジン残基、かつ、Ｘａａ５’がグリシン残基の場合を除く。〕のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドである、化合物またはその塩。
【請求項２】
（Ｘ０−３）ａは、なし、アルギニン残基−グリシン残基−アスパラギン残基、アスパラギン酸残基、またはアスパラギン残基であり、
（Ｘ０−３）ｂは、なし、スレオニン残基−チロシン残基−ヒスチジン残基、またはスレオニン残基であり、
Ｘａａ１は、アラニン残基であり、
Ｘａａ２は、チロシン残基、トリプトファン残基、またはヒスチジン残基であり、
Ｘａａ６は、グルタミン残基、グルタミン酸残基、アスパラギン残基、またはアスパラギン酸残基である、請求項１記載の化合物またはその塩。
【請求項３】
（Ｘ０−３）ａは、グリシン残基−アスパラギン残基、グリシン残基、グリシン残基−グリシン残基、またはグリシン残基−グリシン残基−グリシン残基であり、
（Ｘ０−３）ｂは、スレオニン残基−チロシン残基、グリシン残基、グリシン残基−グリシン残基、またはグリシン残基−グリシン残基−グリシン残基であり、
Ｘａａ１は、グリシン残基、ロイシン残基、プロリン残基、アルギニン残基、バリン残基、アスパラギン残基、グルタミン酸残基、またはフェニルアラニン残基であり、
Ｘａａ２は、フェニルアラニン残基であり、
Ｘａａ６は、プロリン残基、グリシン残基、アルギニン残基、フェニルアラニン残基、またはヒスチジン残基である、請求項１記載の化合物またはその塩。
【請求項４】
抗体に対する親和性物質が、下記からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項１〜３のいずれか一項記載の化合物またはその塩：
（１）  ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号５）；
（２）  ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＩＶＷＣＴＹＨ（配列番号８）；
（３）  ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＶＶＷＣＴＹＨ（配列番号９）；
（４）  ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＡＶＷＣＴＹＨ（配列番号１０）；
（５）  ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＬＬＷＣＴＹＨ（配列番号１１）；
（６）  ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＬＩＷＣＴＹＨ（配列番号１２）；
（７）      ＤＣＡＹＨＫＧＱＩＶＷＣＴ    （配列番号１３）；
（８）      ＤＣＡＹＨＫＧＱＶＶＷＣＴ    （配列番号１４）；
（９）      ＤＣＡＹＨＫＧＱＡＶＷＣＴ    （配列番号１５）；
（１０）ＲＧＮＣＡＹＨＫＳＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号１６）；
（１１）ＲＧＮＣＡＹＨＫＮＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号１７）；
（１２）ＲＧＮＣＡＹＨＫＤＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号１８）；
（１３）ＲＧＮＣＡＹＨＫＱＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号１９）；
（１４）ＲＧＮＣＡＹＨＫＥＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号２０）；
（１５）ＲＧＮＣＡＹＨＫＦＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号２１）；
（１６）ＲＧＮＣＡＹＨＫＹＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号２２）；
（１７）ＲＧＮＣＡＹＨＫＷＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号２３）；
（１８）ＲＧＮＣＡＹＨＫＨＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号２４）；
（１９）ＲＧＮＣＡＹＨＫＴＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号２５）；
（２０）ＲＧＮＣＡＹＨＫＬＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号２６）；
（２１）      ＣＡＹＨＫＬＱＩＶＷＣ      （配列番号２７）；
（２２）      ＣＡＹＨＫＬＱＬＩＷＣ      （配列番号２８）；
（２３）      ＣＡＹＨＫＳＱＩＶＷＣ      （配列番号２９）；
（２４）ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＬＶＦＣＴＹＨ（配列番号３０）；
（２５）ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＱＶＷＣＴＹＨ（配列番号３１）；
（２６）ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＥＶＷＣＴＹＨ（配列番号３２）；
（２７）      ＣＡＹＨＫＧＱＬＶＷＣ      （配列番号３３）；
（２８）ＲＧＮＣＡＹＨＫＡＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号３４）；
（２９）ＲＧＮＣＡＹＨＫＶＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号３５）；
（３０）ＲＧＮＣＡＹＨＫＬＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号３６）；
（３１）ＲＧＮＣＡＹＨＫＩＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号３７）；
（３２）ＲＧＮＣＡＹＨＫＳＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号３８）；
（３３）ＲＧＮＣＡＹＨＫＴＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号３９）；
（３４）ＲＧＮＣＡＹＨＫＮＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号４０）；
（３５）ＲＧＮＣＡＹＨＫＤＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号４１）；
（３６）ＲＧＮＣＡＹＨＫＱＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号４２）；
（３７）ＲＧＮＣＡＹＨＫＥＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号４３）；
（３８）ＲＧＮＣＡＹＨＫＦＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号４４）；
（３９）ＲＧＮＣＡＹＨＫＲＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号４５）；
（４０）ＲＧＮＣＡＹＨＫＨＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号４６）；
（４１）ＲＧＮＣＡＹＨＫＷＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号４７）；
（４２）ＲＧＮＣＡＹＨＫＹＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号４８）；
（４３）ＲＧＮＣＡＹＦＫＧＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号４９）；
（４４）ＲＧＮＣＡＹＹＫＧＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号５０）；
（４５）ＲＧＮＣＡＹＷＫＧＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号５１）；
（４６）ＲＧＮＣＡＹＲＫＧＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号５２）；
（４７）ＲＧＮＣＡＹＧＫＧＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号５３）；
（４８）    ＤＣＡＹＨＫＧＱＬＶＷＣ      （配列番号５４）；
（４９）    ＮＣＡＹＨＫＧＱＬＶＷＣ      （配列番号５５）；
（５０）      ＣＡＹＨＫＧＱＬＶＷＣＴ    （配列番号５６）；
（５１）      ＣＡＹＨＫＳＱＬＶＷＣ      （配列番号５７）；
（５２）ＲＧＮＣＡＷＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号６８）；
（５３）ＲＧＮＣＡＦＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号６９）；
（５４）ＲＧＮＣＡＨＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号７０）；
（５５）ＲＧＮＣＧＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号７１）；
（５６）ＲＧＮＣＬＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号７２）；
（５７）ＲＧＮＣＰＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号７３）；
（５８）ＲＧＮＣＲＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号７４）；
（５９）ＲＧＮＣＶＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号７５）；
（６０）ＲＧＮＣＮＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号７６）；
（６１）ＲＧＮＣＥＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号７７）；
（６２）ＲＧＮＣＦＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号７８）；
（６３）ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＥＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号７９）；
（６４）ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＮＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号８０）；
（６５）ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＰＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号８１）；
（６６）ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＧＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号８２）；
（６７）ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＤＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号８３）；
（６８）ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＲＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号８４）；
（６９）ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＦＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号８５）；
（７０）ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＨＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号８６）；
（７１）    ＤＣＡＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴ（配列番号８７）；
（７２）    ＮＣＡＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴ（配列番号８８）；
（７３）  ＧＮＣＡＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹ（配列番号８９）；
（７４）    ＧＣＡＹＨＫＧＱＩＩＷＣＧ（配列番号９０）；
（７５）  ＧＧＣＡＹＨＫＧＱＩＩＷＣＧＧ（配列番号９１）；および
（７６）ＧＧＧＣＡＹＨＫＧＱＩＩＷＣＧＧＧ（配列番号９２）。
【請求項５】
Ｌが、（ｉ）切断により生体直交性官能基を反応性基側に生成する能力を有する切断性部分を含む２価の基である切断性リンカー、または（ｉｉ）切断により生体直交性官能基を反応性基側に生成する能力を有しない切断性部分を含む２価の基である切断性リンカーである、請求項１〜４のいずれか一項記載の化合物またはその塩。
【請求項６】
前記切断性部分が、（ａ）酸性物質、塩基性物質、還元剤、酸化剤、酵素からなる群より選ばれる１種以上の物質による処理、（ｂ）光からなる群より選ばれる物理化学的刺激による処理、または（ｃ）自己分解性の切断性部分を含む切断性リンカーを用いた場合の放置のいずれかにより切断可能な部分である、請求項１〜５のいずれか一項記載の化合物またはその塩。
【請求項７】
前記切断性部分が、ジスルフィド残基、アセタール残基、ケタール残基、エステル残基、カルバモイル残基、アルコキシアルキル残基、イミン残基、三級アルキルオキシカルバメート残基、シラン残基、ヒドラゾン含有残基、フォスフォルアミデート残基、アコニチル残基、トリチル残基、アゾ残基、ビシナルジオール残基、セレン残基、電子吸引基を有する芳香族環含有残基、クマリン含有残基、スルホン含有残基、不飽和結合含有鎖残基、グリコシル残基からなる群より選ばれる、請求項１〜６のいずれか一項記載の化合物またはその塩。
【請求項８】
前記（ｉ）の切断性部分が、ジスルフィド残基、エステル残基、アセタール残基、ケタール残基、イミン残基、ビシナルジオール残基からなる群より選ばれる、請求項５〜７のいずれか一項記載の化合物またはその塩。
【請求項９】
前記（ｉｉ）の切断性部分が、エステル残基、カルバモイル残基、アルコキシアルキル残基、イミン残基、三級アルキルオキシカルバメート残基、シラン残基、ヒドラゾン含有残基、フォスフォルアミデート残基、アコニチル残基、トリチル残基、アゾ残基、ビシナルジオール残基、セレン残基、電子吸引基を有する芳香族環含有残基、クマリン含有残基、スルホン含有残基、不飽和結合含有鎖残基、グリコシル残基からなる群より選ばれる、請求項５〜７のいずれか一項記載の化合物またはその塩。
【請求項１０】
生体直交性官能基が、アジド残基、アルデヒド残基、チオール残基、アルキン残基、アルケン残基、ハロゲン残基、テトラジン残基、ニトロン残基、ヒドロキシルアミン残基、ニトリル残基、ヒドラジン残基、ケトン残基、ボロン酸残基、シアノベンゾチアゾール残基、アリル残基、ホスフィン残基、マレイミド残基、ジスルフィド残基、チオエステル残基、α−ハロカルボニル残基、イソニトリル残基、シドノン残基、およびセレン残基からなる群より選ばれる、請求項１〜９のいずれか一項記載の化合物またはその塩。
【請求項１１】
反応性基が、リジン残基、チロシン残基、またはトリプトファン残基のいずれか一つの側鎖に対して特異的な反応性基である、請求項１〜１０のいずれか一項記載の化合物またはその塩。
【請求項１２】
反応性基が、リジン残基の側鎖に対して特異的な反応性基である、請求項１１記載の化合物またはその塩。
【請求項１３】
以下から選ばれる１以上の特徴を有する、請求項１〜１２のいずれか一項記載の化合物またはその塩：
（ａ）ＡおよびＲを連結する主鎖の原子数が４〜２０個である；
（ｂ）ＡおよびＲを連結する主鎖が環構造を含まない；
（ｃ）Ｌ−Ｂで表される部分構造がペプチド部分を含まない。
【請求項１４】
抗体の位置選択的修飾試薬であって、
下記式（Ｉ）：
Ａ−Ｌ−Ｂ−Ｒ      （Ｉ）
〔式中、
Ａは、抗体に対する親和性物質であり、
Ｌは、切断性部分を含む２価の基である切断性リンカーであり、
Ｂは、（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基、または（ｂ）生体直交性官能基を含まない２価の基であり、
Ｒは、前記抗体に対する反応性基である。〕で表される、抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物またはその塩を含み、かつ
抗体に対する親和性物質が、
式１−１：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｉ−Ｉ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号５８）
式１−２：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｉ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号５９）
式１−３：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｖ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６０）
式１−４：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ａ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６１）
式１−５：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｌ−Ｌ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６２）
式１−６：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｌ−Ｉ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６３）
式１−７：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６４）
式１−８：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｑ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６５）
式１−９：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｅ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６６）
〔式中、
（Ｘ０−３）ａは、なし、または１〜３個の連続する同一または異なる任意のアミノ酸残基（リジン残基およびシステイン残基以外）であり、
（Ｘ０−３）ｂは、なし、または１〜３個の連続する同一または異なる任意のアミノ酸残基（リジン残基およびシステイン残基以外）であり、
Ｘａａ１は、アラニン残基、グリシン残基、ロイシン残基、プロリン残基、アルギニン残基、バリン残基、アスパラギン残基、グルタミン酸残基、またはフェニルアラニン残基であり、
Ｘａａ２は、チロシン残基、トリプトファン残基、ヒスチジン残基、またはフェニルアラニン残基であり、
Ｘａａ３は、ヒスチジン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、トリプトファン残基、アルギニン残基、またはグリシン残基であり、
Ｘａａ４は、リジン残基であり、
Ｘａａ５は、グリシン残基、セリン残基、アスパラギン残基、グルタミン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、トリプトファン残基、ヒスチジン残基、スレオニン残基、ロイシン残基、アラニン残基、バリン残基、イソロイシン残基、またはアルギニン残基であり、
Ｘａａ６は、グルタミン残基、グルタミン酸残基、アスパラギン残基、アスパラギン酸残基、プロリン残基、グリシン残基、アルギニン残基、フェニルアラニン残基、またはヒスチジン残基である。〕、あるいは
式２−１：（Ｘ０−３’）ａ−Ｃ−Ｘａａ１’−Ｘａａ２’−Ｘａａ３’−Ｘａａ４’−Ｘａａ５’−Ｘａａ６’−Ｌ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３’）ｂ（配列番号６７）
〔式中、
（Ｘ０−３’）ａおよび（Ｘ０−３’）ｂはそれぞれ、前記（Ｘ０−３）ａおよび（Ｘ０−３）ｂと同じであり、
Ｘａａ１’、Ｘａａ２’、Ｘａａ３’、Ｘａａ４’、Ｘａａ５’、Ｘａａ６’はそれぞれ、前記Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６と同じである。
但し、（Ｘ０−３’）ａが１〜３個の連続する同一または異なる任意のアミノ酸残基、（Ｘ０−３’）ｂが１〜３個の連続する同一または異なる任意のアミノ酸残基、Ｘａａ３’がヒスチジン残基、かつ、Ｘａａ５’がグリシン残基の場合を除く。〕のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドである、試薬。
【請求項１５】
抗体に対する親和性物質、および切断性部分を有する抗体またはその塩であって、
下記式（ＩＩ）：
Ａ−Ｌ−Ｂ−Ｒ’−Ｔ      （ＩＩ）
〔式中、
Ａは、抗体に対する親和性物質であり、
Ｌは、切断性部分を含む２価の基である切断性リンカーであり、
Ｂは、（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基、または（ｂ）生体直交性官能基を含まない２価の基であり、
Ｒ’は、抗体と反応性基との間の反応により生成する部分であり、
Ｔは、抗体である。〕で表されるものであり、かつ
抗体に対する親和性物質が、
式１−１：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｉ−Ｉ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号５８）
式１−２：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｉ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号５９）
式１−３：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｖ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６０）
式１−４：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ａ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６１）
式１−５：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｌ−Ｌ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６２）
式１−６：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｌ−Ｉ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６３）
式１−７：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６４）
式１−８：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｑ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６５）
式１−９：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｅ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６６）
〔式中、
（Ｘ０−３）ａは、なし、または１〜３個の連続する同一または異なる任意のアミノ酸残基（リジン残基およびシステイン残基以外）であり、
（Ｘ０−３）ｂは、なし、または１〜３個の連続する同一または異なる任意のアミノ酸残基（リジン残基およびシステイン残基以外）であり、
Ｘａａ１は、アラニン残基、グリシン残基、ロイシン残基、プロリン残基、アルギニン残基、バリン残基、アスパラギン残基、グルタミン酸残基、またはフェニルアラニン残基であり、
Ｘａａ２は、チロシン残基、トリプトファン残基、ヒスチジン残基、またはフェニルアラニン残基であり、
Ｘａａ３は、ヒスチジン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、トリプトファン残基、アルギニン残基、またはグリシン残基であり、
Ｘａａ４は、リジン残基であり、
Ｘａａ５は、グリシン残基、セリン残基、アスパラギン残基、グルタミン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、トリプトファン残基、ヒスチジン残基、スレオニン残基、ロイシン残基、アラニン残基、バリン残基、イソロイシン残基、またはアルギニン残基であり、
Ｘａａ６は、グルタミン残基、グルタミン酸残基、アスパラギン残基、アスパラギン酸残基、プロリン残基、グリシン残基、アルギニン残基、フェニルアラニン残基、またはヒスチジン残基である。〕、あるいは
式２−１：（Ｘ０−３’）ａ−Ｃ−Ｘａａ１’−Ｘａａ２’−Ｘａａ３’−Ｘａａ４’−Ｘａａ５’−Ｘａａ６’−Ｌ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３’）ｂ（配列番号６７）
〔式中、
（Ｘ０−３’）ａおよび（Ｘ０−３’）ｂはそれぞれ、前記（Ｘ０−３）ａおよび（Ｘ０−３）ｂと同じであり、
Ｘａａ１’、Ｘａａ２’、Ｘａａ３’、Ｘａａ４’、Ｘａａ５’、Ｘａａ６’はそれぞれ、前記Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６と同じである。
但し、（Ｘ０−３’）ａが１〜３個の連続する同一または異なる任意のアミノ酸残基、（Ｘ０−３’）ｂが１〜３個の連続する同一または異なる任意のアミノ酸残基、Ｘａａ３’がヒスチジン残基、かつ、Ｘａａ５’がグリシン残基の場合を除く。〕のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドである、抗体またはその塩。
【請求項１６】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項１５記載の抗体またはその塩。
【請求項１７】
抗体がＩｇＧ抗体である、請求項１５または１６記載の抗体またはその塩。
【請求項１８】
抗体がヒト由来である、請求項１５〜１７のいずれか一項記載の抗体またはその塩。
【請求項１９】
抗体が、下記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれるいずれか一つのＦｃ領域タンパク質を含み、かつ抗原結合能を有する、請求項１５〜１８のいずれか一項記載の抗体またはその塩：
（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＦｃ領域タンパク質；
（Ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が挿入、付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を含むＦｃ領域タンパク質；または
（Ｃ）配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含むＦｃ領域タンパク質。
【請求項２０】
抗体が、連続する１〜５０個のアミノ酸残基からなる標的領域中において特定のアミノ酸残基を１個以上含み、かつ、前記標的領域以外の非標的領域中において前記特定のアミノ酸残基を５個以上含み、
Ａ−Ｌ−Ｂ−Ｒ’で表される構造単位が、前記標的領域中に含まれる１個以上の特定のアミノ酸残基に対して３０％以上の位置選択性で結合している、請求項１５〜１９のいずれか一項記載の抗体またはその塩。
【請求項２１】
前記標的領域が、連続する１〜１０個のアミノ酸残基からなる領域である、請求項２０記載の抗体またはその塩。
【請求項２２】
前記標的領域が、連続する１〜３個のアミノ酸残基からなる領域である、請求項２１記載の抗体またはその塩。
【請求項２３】
前記標的領域が、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域における２４６〜２４８位のアミノ酸残基からなる領域である、請求項２２記載の抗体またはその塩。
【請求項２４】
前記位置選択性が５０％以上である、請求項２０〜２３のいずれか一項記載の抗体またはその塩。
【請求項２５】
前記位置選択性が７０％以上である、請求項２４記載の抗体またはその塩。
【請求項２６】
前記位置選択性が９０％以上である、請求項２５記載の抗体またはその塩。
【請求項２７】
抗体と反応性基との間の反応により生成する部分が、リジン残基、チロシン残基、またはトリプトファン残基に対する、リジン残基、チロシン残基、またはトリプトファン残基のいずれか一つの側鎖に対して特異的な反応性基の反応により生成する部分である、請求項１５〜２６のいずれか一項記載の抗体またはその塩。
【請求項２８】
抗体と反応性基との間の反応により生成する部分が、リジン残基と、リジン残基の側鎖に対して特異的な反応性基との間の反応により生成する部分である、請求項１５〜２７のいずれか一項記載の抗体またはその塩。
【請求項２９】
生体直交性官能基を有する抗体またはその塩の製造方法であって、
下記式（ＩＩ）：
Ａ−Ｌ−Ｂ−Ｒ’−Ｔ      （ＩＩ）
〔式中、
Ａは、抗体に対する親和性物質であり、
Ｌは、切断性部分を含む２価の基である切断性リンカーであり、
Ｂは、（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基、または（ｂ）生体直交性官能基を含まない２価の基であり、
Ｒ’は、抗体と反応性基との間の反応により生成する部分であり、
Ｔは、抗体である。〕で表される、抗体に対する親和性物質、および切断性部分を有する抗体またはその塩の切断性部分を切断して、
下記式（ＩＶ）：
Ｌ１−Ｂ−Ｒ’−Ｔ      （ＩＶ）
〔式中、
Ｂ、Ｒ’およびＴは、前記式（ＩＩ）のものと同じであり、
Ｌ１は、（ｉ’）生体直交性官能基を含む１価の基、または（ｉｉ’）生体直交性官能基を含まない１価の基である。〕で表される、生体直交性官能基を有する抗体またはその塩を生成することを含み、かつ
抗体に対する親和性物質が、
式１−１：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｉ−Ｉ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号５８）
式１−２：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｉ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号５９）
式１−３：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｖ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６０）
式１−４：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ａ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６１）
式１−５：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｌ−Ｌ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６２）
式１−６：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｌ−Ｉ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６３）
式１−７：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６４）
式１−８：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｑ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６５）
式１−９：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｅ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６６）
〔式中、
（Ｘ０−３）ａは、なし、または１〜３個の連続する同一または異なる任意のアミノ酸残基（リジン残基およびシステイン残基以外）であり、
（Ｘ０−３）ｂは、なし、または１〜３個の連続する同一または異なる任意のアミノ酸残基（リジン残基およびシステイン残基以外）であり、
Ｘａａ１は、アラニン残基、グリシン残基、ロイシン残基、プロリン残基、アルギニン残基、バリン残基、アスパラギン残基、グルタミン酸残基、またはフェニルアラニン残基であり、
Ｘａａ２は、チロシン残基、トリプトファン残基、ヒスチジン残基、またはフェニルアラニン残基であり、
Ｘａａ３は、ヒスチジン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、トリプトファン残基、アルギニン残基、またはグリシン残基であり、
Ｘａａ４は、リジン残基であり、
Ｘａａ５は、グリシン残基、セリン残基、アスパラギン残基、グルタミン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、トリプトファン残基、ヒスチジン残基、スレオニン残基、ロイシン残基、アラニン残基、バリン残基、イソロイシン残基、またはアルギニン残基であり、
Ｘａａ６は、グルタミン残基、グルタミン酸残基、アスパラギン残基、アスパラギン酸残基、プロリン残基、グリシン残基、アルギニン残基、フェニルアラニン残基、またはヒスチジン残基である。〕、あるいは
式２−１：（Ｘ０−３’）ａ−Ｃ−Ｘａａ１’−Ｘａａ２’−Ｘａａ３’−Ｘａａ４’−Ｘａａ５’−Ｘａａ６’−Ｌ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３’）ｂ（配列番号６７）
〔式中、
（Ｘ０−３’）ａおよび（Ｘ０−３’）ｂはそれぞれ、前記（Ｘ０−３）ａおよび（Ｘ０−３）ｂと同じであり、
Ｘａａ１’、Ｘａａ２’、Ｘａａ３’、Ｘａａ４’、Ｘａａ５’、Ｘａａ６’はそれぞれ、前記Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６と同じである。
但し、（Ｘ０−３’）ａが１〜３個の連続する同一または異なる任意のアミノ酸残基、（Ｘ０−３’）ｂが１〜３個の連続する同一または異なる任意のアミノ酸残基、Ｘａａ３’がヒスチジン残基、かつ、Ｘａａ５’がグリシン残基の場合を除く。〕のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドである、方法。
【請求項３０】
機能性物質を有する抗体またはその塩の製造方法であって、
下記式（ＩＩＩ）：
Ａ−Ｌ−Ｂ’（−Ｆ）−Ｒ’−Ｔ      （ＩＩＩ）
〔式中、
Ａは、抗体に対する親和性物質であり、
Ｌは、切断性部分を含む２価の基である切断性リンカーであり、
Ｂ’は、機能性物質と生体直交性官能基との間の反応により生成する部分を含む３価の基であり、
Ｆは、機能性物質であり、
Ｒ’は、抗体と反応性基との間の反応により生成する部分であり、
Ｔは、抗体である。〕で表される、抗体に対する親和性物質、切断性部分、機能性物質および抗体を有する複合体またはその塩の切断性部分を切断して、
下記式（Ｖ１）：
Ｌ１−Ｂ’（−Ｆ）−Ｒ’−Ｔ      （Ｖ１）
〔式中、
Ｌ１は、（ｉ’）生体直交性官能基を含む１価の基、または（ｉｉ’）生体直交性官能基を含まない１価の基であり、
Ｂ’、Ｆ、Ｒ’およびＴは、前記式（ＩＩＩ）のものと同じである。〕で表される、機能性物質を有する抗体またはその塩を生成することを含み、かつ
抗体に対する親和性物質が、
式１−１：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｉ−Ｉ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号５８）
式１−２：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｉ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号５９）
式１−３：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｖ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６０）
式１−４：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ａ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６１）
式１−５：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｌ−Ｌ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６２）
式１−６：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｌ−Ｉ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６３）
式１−７：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６４）
式１−８：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｑ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６５）
式１−９：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｅ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６６）
〔式中、
（Ｘ０−３）ａは、なし、または１〜３個の連続する同一または異なる任意のアミノ酸残基（リジン残基およびシステイン残基以外）であり、
（Ｘ０−３）ｂは、なし、または１〜３個の連続する同一または異なる任意のアミノ酸残基（リジン残基およびシステイン残基以外）であり、
Ｘａａ１は、アラニン残基、グリシン残基、ロイシン残基、プロリン残基、アルギニン残基、バリン残基、アスパラギン残基、グルタミン酸残基、またはフェニルアラニン残基であり、
Ｘａａ２は、チロシン残基、トリプトファン残基、ヒスチジン残基、またはフェニルアラニン残基であり、
Ｘａａ３は、ヒスチジン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、トリプトファン残基、アルギニン残基、またはグリシン残基であり、
Ｘａａ４は、リジン残基であり、
Ｘａａ５は、グリシン残基、セリン残基、アスパラギン残基、グルタミン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、トリプトファン残基、ヒスチジン残基、スレオニン残基、ロイシン残基、アラニン残基、バリン残基、イソロイシン残基、またはアルギニン残基であり、
Ｘａａ６は、グルタミン残基、グルタミン酸残基、アスパラギン残基、アスパラギン酸残基、プロリン残基、グリシン残基、アルギニン残基、フェニルアラニン残基、またはヒスチジン残基である。〕、あるいは
式２−１：（Ｘ０−３’）ａ−Ｃ−Ｘａａ１’−Ｘａａ２’−Ｘａａ３’−Ｘａａ４’−Ｘａａ５’−Ｘａａ６’−Ｌ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３’）ｂ（配列番号６７）
〔式中、
（Ｘ０−３’）ａおよび（Ｘ０−３’）ｂはそれぞれ、前記（Ｘ０−３）ａおよび（Ｘ０−３）ｂと同じであり、
Ｘａａ１’、Ｘａａ２’、Ｘａａ３’、Ｘａａ４’、Ｘａａ５’、Ｘａａ６’はそれぞれ、前記Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６と同じである。
但し、（Ｘ０−３’）ａが１〜３個の連続する同一または異なる任意のアミノ酸残基、（Ｘ０−３’）ｂが１〜３個の連続する同一または異なる任意のアミノ酸残基、Ｘａａ３’がヒスチジン残基、かつ、Ｘａａ５’がグリシン残基の場合を除く。〕のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドである、方法。
【請求項３１】
機能性物質を有する抗体またはその塩の製造方法であって、
（Ａ）下記式（ＩＩ）：
Ａ−Ｌ−Ｂ−Ｒ’−Ｔ      （ＩＩ）
〔式中、
Ａは、抗体に対する親和性物質であり、
Ｌは、切断性部分を含む２価の基である切断性リンカーであり、
Ｂは、（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基、または（ｂ）生体直交性官能基を含まない２価の基であり、
Ｒ’は、抗体と反応性基との間の反応により生成する部分であり、
Ｔは、抗体である。〕で表される、抗体に対する親和性物質、および切断性部分を有する抗体またはその塩の切断性部分を切断して、
下記式（ＩＶ）：
Ｌ１−Ｂ−Ｒ’−Ｔ      （ＩＶ）
〔式中、
Ｂ、Ｒ’およびＴは、前記式（ＩＩ）のものと同じであり、
Ｌ１は、（ｉ’）生体直交性官能基を含む１価の基、または（ｉｉ’）生体直交性官能基を含まない１価の基である。〕で表される、生体直交性官能基を有する抗体またはその塩を生成すること、ならびに
（Ｂ）前記生体直交性官能基を有する抗体またはその塩を、１種または２種以上の機能性物質と反応させて、
下記式（Ｖ２）
Ｆ−Ｌ１’−Ｂ−Ｒ’−Ｔ      （Ｖ２）
〔式中、
Ｂ、Ｒ’およびＴは、前記式（ＩＶ）のものと同じであり、
Ｌ１’は、機能性物質と、（ｉ’）生体直交性官能基を含む１価の基との間の反応により生成する部分を含む２価の基であり、
Ｆは、機能性物質である。〕、または
下記式（Ｖ３）：
Ｆａ−Ｌ１’−Ｂ’（−Ｆｂ）−Ｒ’−Ｔ      （Ｖ３）
〔式中、
Ｒ’およびＴは、前記式（ＩＶ）のものと同じであり、
Ｌ１’は、前記式（Ｖ２）のものと同じであり、
Ｂ’は、機能性物質と生体直交性官能基との間の反応により生成する部分を含む３価の基であり、
ＦａおよびＦｂは、それぞれ、同一または異なる機能性物質である。〕で表される、機能性物質を有する抗体またはその塩を生成することを含み、かつ
抗体に対する親和性物質が、
式１−１：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｉ−Ｉ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号５８）
式１−２：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｉ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号５９）
式１−３：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｖ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６０）
式１−４：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ａ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６１）
式１−５：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｌ−Ｌ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６２）
式１−６：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｌ−Ｉ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６３）
式１−７：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６４）
式１−８：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｑ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６５）
式１−９：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｅ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６６）
〔式中、
（Ｘ０−３）ａは、なし、または１〜３個の連続する同一または異なる任意のアミノ酸残基（リジン残基およびシステイン残基以外）であり、
（Ｘ０−３）ｂは、なし、または１〜３個の連続する同一または異なる任意のアミノ酸残基（リジン残基およびシステイン残基以外）であり、
Ｘａａ１は、アラニン残基、グリシン残基、ロイシン残基、プロリン残基、アルギニン残基、バリン残基、アスパラギン残基、グルタミン酸残基、またはフェニルアラニン残基であり、
Ｘａａ２は、チロシン残基、トリプトファン残基、ヒスチジン残基、またはフェニルアラニン残基であり、
Ｘａａ３は、ヒスチジン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、トリプトファン残基、アルギニン残基、またはグリシン残基であり、
Ｘａａ４は、リジン残基であり、
Ｘａａ５は、グリシン残基、セリン残基、アスパラギン残基、グルタミン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、トリプトファン残基、ヒスチジン残基、スレオニン残基、ロイシン残基、アラニン残基、バリン残基、イソロイシン残基、またはアルギニン残基であり、
Ｘａａ６は、グルタミン残基、グルタミン酸残基、アスパラギン残基、アスパラギン酸残基、プロリン残基、グリシン残基、アルギニン残基、フェニルアラニン残基、またはヒスチジン残基である。〕、あるいは
式２−１：（Ｘ０−３’）ａ−Ｃ−Ｘａａ１’−Ｘａａ２’−Ｘａａ３’−Ｘａａ４’−Ｘａａ５’−Ｘａａ６’−Ｌ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３’）ｂ（配列番号６７）
〔式中、
（Ｘ０−３’）ａおよび（Ｘ０−３’）ｂはそれぞれ、前記（Ｘ０−３）ａおよび（Ｘ０−３）ｂと同じであり、
Ｘａａ１’、Ｘａａ２’、Ｘａａ３’、Ｘａａ４’、Ｘａａ５’、Ｘａａ６’はそれぞれ、前記Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６と同じである。
但し、（Ｘ０−３’）ａが１〜３個の連続する同一または異なる任意のアミノ酸残基、（Ｘ０−３’）ｂが１〜３個の連続する同一または異なる任意のアミノ酸残基、Ｘａａ３’がヒスチジン残基、かつ、Ｘａａ５’がグリシン残基の場合を除く。〕のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドである、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物またはその塩などに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、抗体薬物複合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ：ＡＤＣ）の研究開発が盛んに行われている。ＡＤＣはその名の通り、抗体に薬物（例、抗がん剤）をコンジュゲーションした薬剤であり、がん細胞などに対して直接的な殺細胞活性を有する。代表的なＡＤＣとしては、Ｔ−ＤＭ１（商品名：カドサイラ（登録商標））がある（非特許文献１〜３）。【０００３】
Ｔ−ＤＭ１を始めとするＡＤＣは、開発当初からその不均一性が問題となっている。すなわち、抗体中に７０〜８０程度あるＬｙｓ残基に対して、低分子薬物をランダムに反応させているため、薬物抗体比（Ｄｒｕｇ／Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｒａｔｉｏ：ＤＡＲ）やコンジュゲーション位置が一定ではない。通常このようなランダムコンジュゲーション法になるとＤＡＲが０〜８の範囲となり、薬物の結合数が異なる複数の薬剤が生じることが分かっている。近年ＡＤＣの薬物の結合数および結合位置を変化させると、体内動態や薬物の放出速度、効果が変化することが報告されている。これらのことから次世代型ＡＤＣではコンジュゲーションする薬物の個数と位置を制御することが求められている。個数および位置が一定であると、期待通りのｅｆｆｉｃａｃｙ、コンジュゲーション薬剤のバリエーション、ロット差いわゆるレギュレーションの問題が解決すると考えられている（非特許文献４）。【０００４】
抗体の位置選択的修飾法は世界中で研究されているが、そのほとんどが遺伝子工学的手法もしくは酵素を用いた修飾法である。遺伝子工学的修飾法に関しては、位置選択性、個数選択性は制御できるものの、抗体自体の発現効率が低下（ＡＤＣを調製する際の総収率が低下）するなどの問題が指摘されている。また、抗体発現系の構築などに長い年月を要することが問題となっている（非特許文献５〜７）。【０００５】
また、小分子プローブを利用して細胞内のような夾雑な環境下でタンパク質を化学修飾する方法が近年報告されている。本手法は、イメージングや低分子薬物のリポジショニングを行う上で受容体の同定などに利用されている。また、ケミカルバイオロジー分野において、合成小分子プローブを用いた有機化学的なタンパク質修飾法が注目されている（非特許文献８〜１０）。【０００６】
最近、ＣＣＡＰ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅ）法が開発された。本方法は、親和性ペプチド（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅ）に対してＮＨＳ活性化エステルおよび薬物が連結されたペプチド試薬を抗体と反応させる方法（すなわち、ペプチド部分を含むリンカーを介したＡＤＣの作製方法）により、抗体の位置選択的な修飾に成功している。本方法は世界で初めて、化学合成的手法により、薬物で抗体Ｆｃ領域を位置選択的に修飾することに成功したものであり、しかも実用上も良好な結果〔反応時間３０分、収率７０％（ＤＡＲ  １の場合）、位置選択性１００％〕が確認されている。ペプチド試薬を５等量程度加えることで、ＤＡＲを２で制御できることが実証されており、修飾位置も制御できる点で画期的である（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２０１６／１８６２０６号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｒｅｉｃｈｅｒｔ  ＪＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００５；２３：１０７３−８
【非特許文献２】Ｋｕｂｏｔａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ  ２００９；１００：１５６６−７２
【非特許文献３】Ｗｕ  ＡＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００５；２３：１１３７−４６
【非特許文献４】Ｊｕｎｕｔｕｌａ  ＪＲ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００８；２６：９２５−３２
【非特許文献５】Ｓｈｅｎ  ＢＱ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０１２；３０：１８４−９
【非特許文献６】Ｈｏｆｅｒ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００９；４８：１２０４７−５７
【非特許文献７】Ｌｉｕ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００７；４：２３９−４４
【非特許文献８】Ｓ．Ｔ．Ｌａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００８；３２０，６６４
【非特許文献９】Ａ．Ｅ．Ｓｐｅｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ２００４；５，４１
【非特許文献１０】Ｙ．Ｔａｋａｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．  ２０１３；５２，４０８８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、抗体の修飾、特に、抗体の位置選択的な修飾を可能にする技術を開発することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、鋭意検討した結果、（１）抗体に対する親和性物質、および（２）その抗体を構成するアミノ酸残基に対する反応性基、ならびに（３）当該親和性物質と当該反応性基との間に切断性部分を含み、（４）切断性部分での切断により生体直交性官能基を反応性基側に有する構造単位（すなわち、生体直交性官能基および反応性基を含む構造単位）を生成できるという構造的特徴を有する、新規かつ独創的な設計思想に基づき開発された化合物が、抗体の位置特異的な修飾に有用であることを見出した（例、図１−１、図１−２、図１−３、図２）。本発明者らはまた、このような化合物を用いることにより、ペプチド部分をリンカーとして含まない、機能性物質（例、薬物）を位置選択的に有する抗体（例、抗体薬物複合体（ＡＤＣ））を調製できることなどを見出した。潜在的な免疫原性を有し、また血中で加水分解され易いペプチド部分を含むリンカーの使用の回避は、ＡＤＣの臨床応用において望ましいものである。すなわち、本発明者らの開発した方法は世界で初めて、化学合成的手法により、しかもペプチド部分を含むリンカーを使用することなく、薬物で抗体Ｆｃ領域を位置選択的に修飾することに成功したということができる。本発明者らはまた、上記（１）〜（４）のような構造的特徴を具備する種々の化合物の開発などに成功し（例、図１−１、図１−２、図１−３、図２）、本発明を完成するに至った。【００１１】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。【００１２】
第１の実施形態では、本発明は、抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物またはその塩、ならびに当該化合物またはその塩を含む、抗体の位置選択的修飾試薬を提供する。
〔１〕抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物またはその塩であって、
前記化合物が、下記式（Ｉ）：
Ａ−Ｌ−Ｂ−Ｒ      （Ｉ）
〔式中、
Ａは、抗体に対する親和性物質であり、
Ｌは、切断性部分を含む２価の基である切断性リンカーであり、
Ｂは、（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基、または（ｂ）生体直交性官能基を含まない２価の基であり、
Ｒは、前記抗体に対する反応性基である。〕で表されるものであり、かつ
抗体に対する親和性物質が、
式１−１：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｉ−Ｉ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号５８）
式１−２：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｉ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号５９）
式１−３：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｖ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６０）
式１−４：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ａ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６１）
式１−５：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｌ−Ｌ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６２）
式１−６：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｌ−Ｉ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６３）
式１−７：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６４）
式１−８：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｑ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６５）
式１−９：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｅ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６６）
〔式中、
（Ｘ０−３）ａは、なし、または１〜３個の連続する同一または異なる任意のアミノ酸残基（リジン残基およびシステイン残基以外）であり、
（Ｘ０−３）ｂは、なし、または１〜３個の連続する同一または異なる任意のアミノ酸残基（リジン残基およびシステイン残基以外）であり、
Ｘａａ１は、アラニン残基、グリシン残基、ロイシン残基、プロリン残基、アルギニン残基、バリン残基、アスパラギン残基、グルタミン酸残基、またはフェニルアラニン残基であり、
Ｘａａ２は、チロシン残基、トリプトファン残基、ヒスチジン残基、またはフェニルアラニン残基であり、
Ｘａａ３は、ヒスチジン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、トリプトファン残基、アルギニン残基、またはグリシン残基であり、
Ｘａａ４は、リジン残基であり、
Ｘａａ５は、グリシン残基、セリン残基、アスパラギン残基、グルタミン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、トリプトファン残基、ヒスチジン残基、スレオニン残基、ロイシン残基、アラニン残基、バリン残基、イソロイシン残基、またはアルギニン残基であり、
Ｘａａ６は、グルタミン残基、グルタミン酸残基、アスパラギン残基、アスパラギン酸残基、プロリン残基、グリシン残基、アルギニン残基、フェニルアラニン残基、またはヒスチジン残基である。〕、あるいは
式２−１：（Ｘ０−３’）ａ−Ｃ−Ｘａａ１’−Ｘａａ２’−Ｘａａ３’−Ｘａａ４’−Ｘａａ５’−Ｘａａ６’−Ｌ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３’）ｂ（配列番号６７）
〔式中、
（Ｘ０−３’）ａおよび（Ｘ０−３’）ｂはそれぞれ、前記（Ｘ０−３）ａおよび（Ｘ０−３）ｂと同じであり、
Ｘａａ１’、Ｘａａ２’、Ｘａａ３’、Ｘａａ４’、Ｘａａ５’、Ｘａａ６’はそれぞれ、前記Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６と同じである。
但し、（Ｘ０−３’）ａが１〜３個の連続する同一または異なる任意のアミノ酸残基、（Ｘ０−３’）ｂが１〜３個の連続する同一または異なる任意のアミノ酸残基、Ｘａａ３’がヒスチジン残基、かつ、Ｘａａ５’がグリシン残基の場合を除く。〕のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドである、化合物またはその塩。
〔２〕（Ｘ０−３）ａは、なし、アルギニン残基−グリシン残基−アスパラギン残基、アスパラギン酸残基、またはアスパラギン残基であり、
（Ｘ０−３）ｂは、なし、スレオニン残基−チロシン残基−ヒスチジン残基、またはスレオニン残基であり、
Ｘａａ１は、アラニン残基であり、
Ｘａａ２は、チロシン残基、トリプトファン残基、またはヒスチジン残基であり、
Ｘａａ６は、グルタミン残基、グルタミン酸残基、アスパラギン残基、またはアスパラギン酸残基である、〔１〕の化合物またはその塩。
〔３〕（Ｘ０−３）ａは、グリシン残基−アスパラギン残基、グリシン残基、グリシン残基−グリシン残基、またはグリシン残基−グリシン残基−グリシン残基であり、
（Ｘ０−３）ｂは、スレオニン残基−チロシン残基、グリシン残基、グリシン残基−グリシン残基、またはグリシン残基−グリシン残基−グリシン残基であり、
Ｘａａ１は、グリシン残基、ロイシン残基、プロリン残基、アルギニン残基、バリン残基、アスパラギン残基、グルタミン酸残基、またはフェニルアラニン残基であり、
Ｘａａ２は、フェニルアラニン残基であり、
Ｘａａ６は、プロリン残基、グリシン残基、アルギニン残基、フェニルアラニン残基、またはヒスチジン残基である、〔１〕の化合物またはその塩。
〔４〕抗体に対する親和性物質が、下記からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含むペプチドである、〔１〕〜〔３〕のいずれかの化合物またはその塩：
（１）  ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号５）；
（２）  ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＩＶＷＣＴＹＨ（配列番号８）；
（３）  ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＶＶＷＣＴＹＨ（配列番号９）；
（４）  ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＡＶＷＣＴＹＨ（配列番号１０）；
（５）  ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＬＬＷＣＴＹＨ（配列番号１１）；
（６）  ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＬＩＷＣＴＹＨ（配列番号１２）；
（７）      ＤＣＡＹＨＫＧＱＩＶＷＣＴ    （配列番号１３）；
（８）      ＤＣＡＹＨＫＧＱＶＶＷＣＴ    （配列番号１４）；
（９）      ＤＣＡＹＨＫＧＱＡＶＷＣＴ    （配列番号１５）；
（１０）ＲＧＮＣＡＹＨＫＳＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号１６）；
（１１）ＲＧＮＣＡＹＨＫＮＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号１７）；
（１２）ＲＧＮＣＡＹＨＫＤＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号１８）；
（１３）ＲＧＮＣＡＹＨＫＱＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号１９）；
（１４）ＲＧＮＣＡＹＨＫＥＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号２０）；
（１５）ＲＧＮＣＡＹＨＫＦＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号２１）；
（１６）ＲＧＮＣＡＹＨＫＹＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号２２）；
（１７）ＲＧＮＣＡＹＨＫＷＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号２３）；
（１８）ＲＧＮＣＡＹＨＫＨＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号２４）；
（１９）ＲＧＮＣＡＹＨＫＴＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号２５）；
（２０）ＲＧＮＣＡＹＨＫＬＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号２６）；
（２１）      ＣＡＹＨＫＬＱＩＶＷＣ      （配列番号２７）；
（２２）      ＣＡＹＨＫＬＱＬＩＷＣ      （配列番号２８）；
（２３）      ＣＡＹＨＫＳＱＩＶＷＣ      （配列番号２９）；
（２４）ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＬＶＦＣＴＹＨ（配列番号３０）；
（２５）ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＱＶＷＣＴＹＨ（配列番号３１）；
（２６）ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＥＶＷＣＴＹＨ（配列番号３２）；
（２７）      ＣＡＹＨＫＧＱＬＶＷＣ      （配列番号３３）；
（２８）ＲＧＮＣＡＹＨＫＡＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号３４）；
（２９）ＲＧＮＣＡＹＨＫＶＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号３５）；
（３０）ＲＧＮＣＡＹＨＫＬＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号３６）；
（３１）ＲＧＮＣＡＹＨＫＩＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号３７）；
（３２）ＲＧＮＣＡＹＨＫＳＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号３８）；
（３３）ＲＧＮＣＡＹＨＫＴＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号３９）；
（３４）ＲＧＮＣＡＹＨＫＮＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号４０）；
（３５）ＲＧＮＣＡＹＨＫＤＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号４１）；
（３６）ＲＧＮＣＡＹＨＫＱＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号４２）；
（３７）ＲＧＮＣＡＹＨＫＥＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号４３）；
（３８）ＲＧＮＣＡＹＨＫＦＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号４４）；
（３９）ＲＧＮＣＡＹＨＫＲＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号４５）；
（４０）ＲＧＮＣＡＹＨＫＨＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号４６）；
（４１）ＲＧＮＣＡＹＨＫＷＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号４７）；
（４２）ＲＧＮＣＡＹＨＫＹＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号４８）；
（４３）ＲＧＮＣＡＹＦＫＧＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号４９）；
（４４）ＲＧＮＣＡＹＹＫＧＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号５０）；
（４５）ＲＧＮＣＡＹＷＫＧＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号５１）；
（４６）ＲＧＮＣＡＹＲＫＧＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号５２）；
（４７）ＲＧＮＣＡＹＧＫＧＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号５３）；
（４８）    ＤＣＡＹＨＫＧＱＬＶＷＣ      （配列番号５４）；
（４９）    ＮＣＡＹＨＫＧＱＬＶＷＣ      （配列番号５５）；
（５０）      ＣＡＹＨＫＧＱＬＶＷＣＴ    （配列番号５６）；
（５１）      ＣＡＹＨＫＳＱＬＶＷＣ      （配列番号５７）；
（５２）ＲＧＮＣＡＷＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号６８）；
（５３）ＲＧＮＣＡＦＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号６９）；
（５４）ＲＧＮＣＡＨＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号７０）；
（５５）ＲＧＮＣＧＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号７１）；
（５６）ＲＧＮＣＬＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号７２）；
（５７）ＲＧＮＣＰＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号７３）；
（５８）ＲＧＮＣＲＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号７４）；
（５９）ＲＧＮＣＶＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号７５）；
（６０）ＲＧＮＣＮＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号７６）；
（６１）ＲＧＮＣＥＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号７７）；
（６２）ＲＧＮＣＦＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号７８）；
（６３）ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＥＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号７９）；
（６４）ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＮＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号８０）；
（６５）ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＰＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号８１）；
（６６）ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＧＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号８２）；
（６７）ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＤＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号８３）；
（６８）ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＲＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号８４）；
（６９）ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＦＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号８５）；
（７０）ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＨＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号８６）；
（７１）    ＤＣＡＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴ（配列番号８７）；
（７２）    ＮＣＡＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴ（配列番号８８）；
（７３）  ＧＮＣＡＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹ（配列番号８９）；
（７４）    ＧＣＡＹＨＫＧＱＩＩＷＣＧ（配列番号９０）；
（７５）  ＧＧＣＡＹＨＫＧＱＩＩＷＣＧＧ（配列番号９１）；および
（７６）ＧＧＧＣＡＹＨＫＧＱＩＩＷＣＧＧＧ（配列番号９２）。
〔５〕Ｌが、（ｉ）切断により生体直交性官能基を反応性基側に生成する能力を有する切断性部分を含む２価の基である切断性リンカー、または（ｉｉ）切断により生体直交性官能基を反応性基側に生成する能力を有しない切断性部分を含む２価の基である切断性リンカーである、〔１〕〜〔４〕のいずれかの化合物またはその塩。
〔６〕Ｌが前記（ｉ）の切断性リンカーである、〔５〕の化合物またはその塩。
〔７〕Ｌが前記（ｉ）の切断性リンカーであり、かつ、Ｂが前記（ｂ）の２価の基である、〔５〕または〔６〕の化合物またはその塩。
〔８〕Ｌが前記（ｉｉ）の切断性リンカーであり、かつ、Ｂが前記（ａ）の２価の基である、〔５〕の化合物またはその塩。
〔９〕ペプチドが、モノクローナル抗体のＦｃ領域に対する結合性ペプチドである、〔１〕〜〔８〕のいずれかの化合物またはその塩。
〔１０〕ペプチドが、ＩｇＧのＦｃ領域に対する結合性ペプチドである、〔９〕の化合物またはその塩。
〔１１〕前記親和性物質が、下記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれるいずれか一つのＦｃ領域タンパク質を含み、かつ抗原結合能を有する抗体に対する親和性物質である、〔１〕〜〔１０〕のいずれかの化合物またはその塩：
（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＦｃ領域タンパク質；
（Ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が挿入、付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を含むＦｃ領域タンパク質；または
（Ｃ）配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含むＦｃ領域タンパク質。
〔１２〕ペプチドが、ヒトＩｇＧと結合可能であることを特徴とする、〔１〕〜〔１１〕のいずれかの化合物またはその塩。
〔１３〕切断性部分が、（ａ）酸性物質、塩基性物質、還元剤、酸化剤、酵素からなる群より選ばれる１種以上の物質による処理、（ｂ）光からなる群より選ばれる物理化学的刺激による処理、または（ｃ）自己分解性の切断性部分を含む切断性リンカーを用いた場合の放置のいずれかにより切断可能な部分である、〔１〕〜〔１２〕のいずれかの化合物またはその塩。
〔１４〕前記切断性部分が、ジスルフィド残基、アセタール残基、ケタール残基、エステル残基、カルバモイル残基、アルコキシアルキル残基、イミン残基、三級アルキルオキシカルバメート残基、シラン残基、ヒドラゾン含有残基、フォスフォルアミデート残基、アコニチル残基、トリチル残基、アゾ残基、ビシナルジオール残基、セレン残基、電子吸引基を有する芳香族環含有残基、クマリン含有残基、スルホン含有残基、不飽和結合含有鎖残基、グリコシル残基からなる群より選ばれる、〔１〕〜〔１３〕のいずれかの化合物またはその塩。
〔１５〕前記（ｉ）の切断性部分が、ジスルフィド残基、エステル残基、アセタール残基、ケタール残基、イミン残基、ビシナルジオール残基からなる群より選ばれる、〔５〕〜〔１４〕のいずれかの化合物またはその塩。
〔１６〕前記（ｉｉ）の切断性部分が、エステル残基、カルバモイル残基、アルコキシアルキル残基、イミン残基、三級アルキルオキシカルバメート残基、シラン残基、ヒドラゾン含有残基、フォスフォルアミデート残基、アコニチル残基、トリチル残基、アゾ残基、ビシナルジオール残基、セレン残基、電子吸引基を有する芳香族環含有残基、クマリン含有残基、スルホン含有残基、不飽和結合含有鎖残基、グリコシル残基からなる群より選ばれる、〔５〕〜〔１４〕のいずれかの化合物またはその塩。
〔１７〕切断性部分が、下記：
【化１】
2019240287.tif 000002
〔ここで、結合に直交する波線は、切断部位を示し、
複数のＲ２ａ、複数のＲ２ｂ、および複数のＲ２ｃは、同一または異なって、
（ｉ）水素原子、またはハロゲン原子；
（ｉｉ）１価の炭化水素基；
（ｉｉｉ）アラルキル；
（ｉｖ）１価の複素環基；
（ｖ）Ｒｃ−Ｏ−、Ｒｃ−Ｃ（＝Ｏ）−、Ｒｃ−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、もしくはＲｃ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（Ｒｃは、水素原子、もしくは一価の炭化水素基を示す。）；
（ｖｉ）ＮＲｄＲｅ−、ＮＲｄＲｅ−Ｃ（＝Ｏ）−、ＮＲｄＲｅ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、もしくはＲｄ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲｅ−（ＲｄおよびＲｅは、同一もしくは異なって、水素原子、もしくは一価の炭化水素基を示す。）；または
（ｖｉｉ）ニトロ基、硫酸基、スルホン酸基、シアノ基、もしくはカルボキシル基
からなる群より選ばれ、
Ｊは、−ＣＨ２−、−Ｏ−、または−Ｓ−であり、
ｒは、１〜４の任意の整数であり、
○（白丸）はＡに対する結合を示し、●（黒丸）はＢに対する結合を示す。
化学構造が、切断部位を中心にして非対称である場合、●がＡに対する結合を示し、○がＢに対する結合を示していてもよい。〕からなる群より選ばれるいずれか一つの化学構造に対応する、〔１〕〜〔１６〕のいずれかの化合物またはその塩。
〔１８〕前記（ｉ）の切断性部分が、以下：
【化２】
2019240287.tif 000003
〔ここで、結合に直交する波線は、切断部位を示し、
Ｒ２ａは、〔２３〕と同じであり、
○（白丸）はＡに対する結合を示し、●（黒丸）はＢに対する結合を示す。
化学構造が、切断部位を中心にして非対称である場合、●がＡに対する結合を示し、○がＢに対する結合を示していてもよい。〕からなる群より選ばれるいずれか一つの化学構造に対応する、〔５〕〜〔１３〕、〔１５〕、〔１７〕のいずれかの化合物またはその塩。
〔１９〕前記（ｉｉ）の切断性部分が、以下：
【化３】
2019240287.tif 000004
〔ここで、結合に直交する波線は、切断部位を示し、
Ｒ２ｂ、Ｒ２ｃ、Ｊ、ｒは、〔２３〕と同じであり、
○（白丸）はＡに対する結合を示し、●（黒丸）はＢに対する結合を示す。
化学構造が、切断部位を中心にして非対称である場合、●がＡに対する結合を示し、○がＢに対する結合を示していてもよい。〕からなる群より選ばれるいずれか一つの化学構造に対応する、〔５〕〜〔１３〕、〔１６〕、〔１７〕のいずれかの化合物またはその塩。
〔２０〕Ｌが、下記式（Ｌ１）〜（Ｌ３）：
Ｌａ−Ｃ−Ｌｂ      （Ｌ１）
Ｌａ−Ｃ            （Ｌ２）
Ｃ−Ｌｂ      （Ｌ３）
〔式中、
ＬａおよびＬｂは、それぞれ、２価の基であり、
Ｃは、切断性部分である。〕のいずれか一つで表される、〔１〕〜〔１９〕のいずれかの化合物またはその塩。
〔２１〕前記ＬａおよびＬｂが、それぞれ、下記（Ｌａ’）および（Ｌｂ’）：
【化４】
2019240287.tif 000005
〔式中、
ｐおよびｐ’は、同一または異なって、０〜１０の任意の整数であり、
ｑおよびｑ’は、同一または異なって、０〜１０の任意の整数であり、
ＸおよびＸ’は、同一または異なって、炭素原子、窒素原子、または単結合（ここで、Ｘが窒素原子である場合、Ｒ１ｂは存在せず、Ｘ’が窒素原子である場合、Ｒ１ｂ’は存在しない。Ｘが単結合である場合、Ｒ１ａおよびＲ１ｂは存在せず、Ｘ’が単結合である場合、Ｒ１ａ’およびＲ１ｂ’は存在しない）であり、
Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ａ’およびＲ１ｂ’は、同一または異なって、前記（ｉ）〜（ｖｉｉ）からなる群より選ばれる原子または基である。〕で表される、〔２０〕の化合物またはその塩。
〔２２〕生体直交性官能基を含む２価の基が、アジド残基、アルデヒド残基、チオール残基、アルキン残基、アルケン残基、テトラジン残基、ニトロン残基、ヒドロキシルアミン残基、ニトリル残基、ヒドラジン残基、ケトン残基、ボロン酸残基、シアノベンゾチアゾール残基、アリル残基、ホスフィン残基、マレイミド残基、ジスルフィド残基、チオエステル残基、α−ハロカルボニル残基、イソニトリル残基、シドノン残基、セレン残基からなる群より選ばれる生体直交性官能基を主鎖に含む２価の基である、〔１〕〜〔２１〕のいずれかの化合物またはその塩。
〔２３〕生体直交性官能基を含む２価の基が、アジド残基、アルデヒド残基、チオール残基、アルキン残基、アルケン残基、ハロゲン残基、テトラジン残基、ニトロン残基、ヒドロキシルアミン残基、ニトリル残基、ヒドラジン残基、ケトン残基、ボロン酸残基、シアノベンゾチアゾール残基、アリル残基、ホスフィン残基、マレイミド残基、ジスルフィド残基、α−ハロカルボニル残基、イソニトリル残基、シドノン残基、セレン残基からなる群より選ばれる生体直交性官能基を側鎖に含む２価の基である、〔１〕〜〔２１〕のいずれかの化合物またはその塩。
〔２４〕生体直交性官能基が、下記：
【化５】
2019240287.tif 000006
〔式中、
Ｒ１ｆ、単一もしくは複数のＲ１ｇおよび単一もしくは複数のＲ１ｈは、同一もしくは異なって、前記（ｉ）〜（ｖｉｉ）からなる群より選ばれる原子もしくは基、または電子吸引基であり、
・は、結合手である。）で表されるいずれか一つである、〔１〕〜〔２３〕のいずれかの化合物またはその塩。
〔２５〕前記（ｂ）の２価の基が、置換されていてもよいアルキレン、置換されていてもよいシクロアルキレン、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよい２価の複素環基、−ＮＲａ−（Ｒａは水素原子、または置換基を示す）、−Ｏ−、またはこれらの２以上の組み合わせからなる群より選ばれる、〔１〕〜〔２４〕のいずれかの化合物またはその塩。
〔２６〕Ｂが、下記式（Ｂ−１）：
【化６】
2019240287.tif 000007
〔式中、
Ｙは、−ＮＨ−、−Ｏ−、−ＣＨ２−、または下記式（Ｂ−２）：
【化７】
2019240287.tif 000008
（式中、
ＶおよびＶ’は、同一または異なって、−ＮＨ−、−Ｏ−、−ＣＨ２−、または単結合であり、
Ｖ１は、生体直交性官能基を含む２価の基であり、
ｓは、０〜１０の任意の整数であり、
式（Ｂ−２）における○および●は、それぞれ、式（Ｂ−１）における○および●と同じ配向である。）であり、
Ｚは、酸素原子、硫黄原子、または水素原子（Ｚが水素原子である場合、−Ｃ（＝Ｚ）−は、−ＣＨ２−を示す。）であり、
式（Ｂ−１）における○（白丸）は、Ｌ側の部分に対する結合を示し、●（黒丸）はＲ側の部分に対する結合を示す。〕で表される、〔１〕〜〔２５〕のいずれかの化合物またはその塩。
〔２７〕反応性基が、リジン残基、チロシン残基、またはトリプトファン残基のいずれか一つの側鎖に対して特異的な反応性基である、〔１〕〜〔２６〕のいずれかの化合物またはその塩。
〔２８〕反応性基が、リジン残基の側鎖に対して特異的な反応性基である、〔２７〕の化合物またはその塩。
〔２９〕反応性基が、下記：
【化８】
2019240287.tif 000009
〔ここで、
Ｒ５ａおよびＲ５cは、前記（ｉ）〜（ｖｉｉ）からなる群より選ばれる原子または基であり、
Ｒ５ｂは、電子吸引基であり、
ｊは、１〜５の任意の整数であり、
ｋは、１〜４の任意の整数である。〕からなる群より選ばれるいずれか一つの化学構造に対応する、〔１〕〜〔２８〕のいずれかの化合物またはその塩。
〔３０〕ＡおよびＲを連結する主鎖の原子数が４〜２０個である、〔１〕〜〔２９〕のいずれかの化合物またはその塩。
〔３１〕ＡおよびＲを連結する主鎖が環構造を含まない、〔１〕〜〔３０〕のいずれかの化合物またはその塩。
〔３２〕Ｌ−Ｂで表される部分構造がペプチド部分を含まない、〔１〕〜〔３１〕のいずれかの化合物またはその塩。
〔３３〕前記式（Ｉ）で表される化合物が、下記（Ｉ’）：
Ａ−Ｂ２−Ｌ’−Ｂ１−Ｒ      （Ｉ’）
〔式中、
ＡおよびＲは、前記式（Ｉ）のものと同じであり
Ｌ’は、切断性部分を含む２価の基である切断性リンカーであり、
Ｂ１およびＢ２は、同一または異なって、（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基、または（ｂ）生体直交性官能基を含まない２価の基であり、
Ｂ１およびＢ２は、Ｌ’を中心にした対称構造を有していてもよい。〕で表される化合物である、〔１〕〜〔３２〕のいずれかの化合物またはその塩。
〔３４〕前記式（Ｉ’）で表される化合物が、下記（Ｉ’’）：
【化９】
2019240287.tif 000010
〔式中、
ＡおよびＲは、〔１〕記載の式（Ｉ）のものと同じであり、
Ｃは、切断性部分であり、
ｐ、ｐ’、ｑ、ｑ’、Ｘ、Ｘ’、Ｒ１ａ、Ｒ１ａ’、Ｒ１ｂ、およびＲ１ｂ’は、〔１９〕記載の式（Ｌａ’）および（Ｌｂ’）のものと同じであり、
ＹおよびＹ’は、同一または異なって、〔２４〕記載の式（Ｂ−１）のＹと同じであり、
ＺおよびＺ’は、同一または異なって、前記式（Ｂ−１）のＺと同じである。〕で表される、〔３３〕の化合物またはその塩。
〔３５〕抗体の位置選択的修飾試薬であって、
下記式（Ｉ）：
Ａ−Ｌ−Ｂ−Ｒ      （Ｉ）
〔式中、
Ａは、抗体に対する親和性物質であり、
Ｌは、切断性部分を含む２価の基である切断性リンカーであり、
Ｂは、（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基、または（ｂ）生体直交性官能基を含まない２価の基であり、
Ｒは、前記抗体に対する反応性基である。〕で表される、抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物またはその塩を含み、かつ
抗体に対する親和性物質が、上記式１−１〜１−９、および式２−１のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド〔好ましくは、上記（１）〜（７６）からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含むペプチド。以下同様〕である、試薬。
〔３６〕抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物またはその塩であって、
下記式（Ｉ）：
Ａ−Ｌ−Ｂ−Ｒ      （Ｉ）
〔式中、
Ａは、抗体に対する親和性物質であり、
Ｌは、切断性部分を含む２価の基である切断性リンカーであり、
Ｂは、（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基、または（ｂ）生体直交性官能基を含まない２価の基であり、
Ｒは、リジン残基の側鎖に対して特異的な反応性基である。〕で表されるものであり、かつ
抗体に対する親和性物質が、上記式１−１〜１−９、および式２−１のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドである、化合物またはその塩。
〔３７〕抗体の位置選択的修飾試薬であって、
下記式（Ｉ）：
Ａ−Ｌ−Ｂ−Ｒ      （Ｉ）
〔式中、
Ａは、抗体に対する親和性物質であり、
Ｌは、切断性部分を含む２価の基である切断性リンカーであり、
Ｂは、（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基、または（ｂ）生体直交性官能基を含まない２価の基であり、
Ｒは、リジン残基の側鎖に対して特異的な反応性基である。〕で表される、抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物またはその塩を含み、かつ
抗体に対する親和性物質が、上記式１−１〜１−９、および式２−１のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドである、試薬。【００１３】
第２に、本発明は、抗体に対する親和性物質、および切断性部分を有する抗体またはその塩、およびその製造方法を提供する。
（抗体に対する親和性物質、および切断性部分を有する抗体またはその塩）
〔３８〕抗体に対する親和性物質、および切断性部分を有する抗体またはその塩であって、
下記式（ＩＩ）：
Ａ−Ｌ−Ｂ−Ｒ’−Ｔ      （ＩＩ）
〔式中、
Ａは、抗体に対する親和性物質であり、
Ｌは、切断性部分を含む２価の基である切断性リンカーであり、
Ｂは、（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基、または（ｂ）生体直交性官能基を含まない２価の基であり、
Ｒ’は、抗体と反応性基との間の反応により生成する部分であり、
Ｔは、抗体である。〕で表されるものであり、かつ
抗体に対する親和性物質が、上記式１−１〜１−９、および式２−１のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドである、抗体またはその塩。
〔３９〕抗体がモノクローナル抗体である、〔３８〕の抗体またはその塩。
〔４０〕抗体がＩｇＧ抗体である、〔３８〕または〔３９〕の抗体またはその塩。
〔４１〕抗体がヒト由来である、〔３８〕〜〔４０〕のいずれかの抗体またはその塩。
〔４２〕抗体が、下記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれるいずれか一つのＦｃ領域タンパク質を含み、かつ抗原結合能を有する抗体である、〔３８〕〜〔４１〕のいずれかの抗体またはその塩：
（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＦｃ領域タンパク質；
（Ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が挿入、付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を含むＦｃ領域タンパク質；または
（Ｃ）配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含むＦｃ領域タンパク質。
〔４３〕抗体が、連続する１〜５０個のアミノ酸残基からなる標的領域中において特定のアミノ酸残基を１個以上含み、かつ、前記標的領域以外の非標的領域中において前記特定のアミノ酸残基を５個以上含み、
Ａ−Ｌ−Ｂ−Ｒ’で表される構造単位が、前記標的領域中に含まれる１個以上の特定のアミノ酸残基に対して３０％以上の位置選択性で結合している、〔３８〕〜〔４２〕のいずれかの抗体またはその塩。
〔４４〕前記標的領域が、連続する１〜１０個のアミノ酸残基からなる領域である、〔４３〕の抗体またはその塩。
〔４５〕前記標的領域が、連続する１〜３個のアミノ酸残基からなる領域である、〔４４〕の抗体またはその塩。
〔４６〕前記標的領域が、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域における２４６〜２４８位のアミノ酸残基からなる領域である、〔４５〕の抗体またはその塩。
〔４７〕前記位置選択性が５０％以上である、〔４３〕〜〔４６〕のいずれかの抗体またはその塩。
〔４８〕前記位置選択性が７０％以上である、〔４７〕の抗体またはその塩。
〔４９〕前記位置選択性が９０％以上である、〔４８〕の抗体またはその塩。
〔５０〕前記特定のアミノ酸残基が、特定の位置に存在する特定のアミノ酸を中心としてそれぞれＮ末端側およびＣ末端側に対してａ個（ここで、ａは、１〜１０の任意の整数である）のアミノ酸残基の遠隔位置までの領域において、前記特定の位置に存在する特定のアミノ酸残基以外に、特定のアミノ酸残基と同種のアミノ酸残基を含まない、〔４３〕〜〔４９〕のいずれかの抗体またはその塩。
〔５１〕前記抗体が、複数個の重鎖を含む抗体であり、
Ｔが、複数個の重鎖中の対応する複数個の標的領域において、Ａ−Ｌ−Ｂ−Ｒ’で表される構造単位を有する結果、前記抗体がＡ−Ｌ−Ｂ−Ｒ’で表される構造単位を複数個有する、〔３８〕〜〔５０〕のいずれかの抗体またはその塩。
〔５２〕重鎖の個数が２個である、〔５１〕の抗体またはその塩。
〔５３〕抗体と反応性基との間の反応により生成する部分が、リジン残基、チロシン残基、またはトリプトファン残基に対する、リジン残基、チロシン残基、またはトリプトファン残基のいずれか一つの側鎖に対して特異的な反応性基の反応により生成する部分である、〔３８〕〜〔５２〕のいずれかの抗体またはその塩。
〔５４〕抗体と反応性基との間の反応により生成する部分が、リジン残基と、リジン残基の側鎖に対して特異的な反応性基との間の反応により生成する部分である、〔３８〕〜〔５３〕のいずれかの抗体またはその塩。
〔５５〕前記反応により生成する部分が、下記：
【化１０】
2019240287.tif 000011
〔ここで、●（黒丸）は、Ｔ側の部分に対する結合を示し、○（白丸）は、Ｂ側の部分に対する結合を示す。結合に直交する直線は、反応により生成する結合を示す。〕からなる群より選ばれるいずれか一つの化学構造に対応する、〔３８〕〜〔５４〕のいずれかの抗体またはその塩。
〔５６〕ＡおよびＲ’を連結する主鎖の原子数が４〜２０個である、〔３８〕〜〔５５〕のいずれかの抗体またはその塩。
〔５７〕ＡおよびＲを連結する主鎖が環構造を含まない、〔３８〕〜〔５６〕のいずれかの抗体またはその塩。
〔５８〕Ｌ−Ｂで表される部分構造がペプチド部分を含まない、〔３８〕〜〔５７〕のいずれかの抗体またはその塩。
〔５９〕前記式（ＩＩ）で表される化合物が、下記（ＩＩ’）：
Ａ−Ｂ２−Ｌ’−Ｂ１−Ｒ’−Ｔ      （ＩＩ’）
〔式中、
Ａ、Ｒ’およびＴは、前記式（ＩＩ）のものと同じであり
Ｌ’は、切断性部分を含む２価の基である切断性リンカーであり、
Ｂ１およびＢ２は、同一または異なって、（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基、または（ｂ）生体直交性官能基を含まない２価の基であり、
Ｂ１およびＢ２は、Ｌ’を中心にした対称構造を有していてもよい。〕で表される化合物である、〔３８〕〜〔５８〕のいずれかの抗体またはその塩。
〔６０〕前記式（ＩＩ’）で表される化合物が、下記（ＩＩ’’）：
【化１１】
2019240287.tif 000012
〔式中、
Ａ、Ｒ’およびＴは、〔３６〕記載の式（ＩＩ）のものと同じであり、
Ｃは、切断性部分であり、
ｐおよびｐ’は、同一または異なって、０〜１０の任意の整数であり、
ｑおよびｑ’は、同一または異なって、０〜１０の任意の整数であり、
ＸおよびＸ’は、同一または異なって、炭素原子、窒素原子、または単結合（ここで、Ｘが窒素原子である場合、Ｒ１ｂは存在せず、Ｘ’が窒素原子である場合、Ｒ１ｂ’は存在しない。Ｘが単結合である場合、Ｒ１ａおよびＲ１ｂは存在せず、Ｘ’が単結合である場合、Ｒ１ａ’およびＲ１ｂ’は存在しない）であり、
Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ａ’およびＲ１ｂ’は、同一または異なって、
（ｉ）水素原子、またはハロゲン原子；
（ｉｉ）１価の炭化水素基；
（ｉｉｉ）アラルキル；
（ｉｖ）１価の複素環基；
（ｖ）Ｒｃ−Ｏ−、Ｒｃ−Ｃ（＝Ｏ）−、Ｒｃ−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、もしくはＲｃ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（Ｒｃは、水素原子、もしくは一価の炭化水素基を示す。）；
（ｖｉ）ＮＲｄＲｅ−、ＮＲｄＲｅ−Ｃ（＝Ｏ）−、ＮＲｄＲｅ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、もしくはＲｄ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲｅ−（ＲｄおよびＲｅは、同一もしくは異なって、水素原子、もしくは一価の炭化水素基を示す。）；または
（ｖｉｉ）ニトロ基、硫酸基、スルホン酸基、シアノ基、もしくはカルボキシル基
からなる群より選ばれ、
ＹおよびＹ’は、同一または異なって、〔２４〕記載の式（Ｂ−１）のＹと同じであり、
ＺおよびＺ’は、同一または異なって、前記式（Ｂ−１）のＺと同じである。〕で表される、〔５９〕の抗体またはその塩。
〔６１〕抗体に対する親和性物質、および切断性部分を有する抗体またはその塩であって、
下記式（ＩＩ）：
Ａ−Ｌ−Ｂ−Ｒ’−Ｔ      （ＩＩ）
〔式中、
Ａは、抗体に対する親和性物質であり、
Ｌは、切断性部分を含む２価の基である切断性リンカーであり、
Ｂは、（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基、または（ｂ）生体直交性官能基を含まない２価の基であり、
Ｒ’は、抗体と、リジン残基の側鎖に対して特異的な反応性基との間の反応により生成する部分であり、
Ｔは、抗体である。〕表されるものであり、かつ
抗体に対する親和性物質が、上記式１−１〜１−９、および式２−１のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドである、抗体またはその塩。【００１４】
（抗体に対する親和性物質、および切断性部分を有する抗体またはその塩の製造方法）
〔６２〕抗体に対する親和性物質、および切断性部分を有する抗体またはその塩の製造方法であって、
下記式（Ｉ）：
Ａ−Ｌ−Ｂ−Ｒ      （Ｉ）
〔式中、
Ａは、抗体に対する親和性物質であり、
Ｌは、切断性部分を含む２価の基である切断性リンカーであり、
Ｂは、（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基、または（ｂ）生体直交性官能基を含まない２価の基であり、
Ｒは、前記抗体に対する反応性基である。〕で表される、抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物またはその塩を、抗体と反応させて、
下記式（ＩＩ）：
Ａ−Ｌ−Ｂ−Ｒ’−Ｔ      （ＩＩ）
〔式中、
Ａ、Ｌ、およびＢは、前記式（Ｉ）のものと同じであり、
Ｒ’は、抗体と反応性基との間の反応により生成する部分であり、
Ｔは、抗体である。〕で表される、抗体に対する親和性物質、および切断性部分を有する抗体またはその塩を生成することを含み、かつ
抗体に対する親和性物質が、上記式１−１〜１−９、および式２−１のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドである、方法。
〔６３〕反応性基が、リジン残基の側鎖に対して特異的な反応性基である、〔６２〕の方法。【００１５】
第３に、本発明は、抗体に対する親和性物質、切断性部分、機能性物質および抗体を有する複合体またはその塩、およびその製造方法を提供する。
（抗体に対する親和性物質、切断性部分、機能性物質および抗体を有する複合体またはその塩）
〔６４〕抗体に対する親和性物質、切断性部分、機能性物質および抗体を有する複合体またはその塩であって、
下記式（ＩＩＩ）：
Ａ−Ｌ−Ｂ’（−Ｆ）−Ｒ’−Ｔ      （ＩＩＩ）
〔式中、
Ａは、抗体に対する親和性物質であり、
Ｌは、切断性部分を含む２価の基である切断性リンカーであり、
Ｂ’は、機能性物質と生体直交性官能基との間の反応により生成する部分を含む３価の基であり、
Ｆは、機能性物質であり、
Ｒ’は、抗体と反応性基との間の反応により生成する部分であり、
Ｔは、抗体である。〕で表されるものであり、かつ
抗体に対する親和性物質が、上記式１−１〜１−９、および式２−１のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドである、複合体またはその塩。
〔６５〕抗体がモノクローナル抗体である、〔６４〕の複合体またはその塩。
〔６６〕抗体がＩｇＧ抗体である、〔６４〕または〔６５〕の複合体またはその塩。
〔６７〕抗体がヒト由来である、〔６４〕〜〔６６〕のいずれかの複合体またはその塩。
〔６８〕抗体が、下記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれるいずれか一つのＦｃ領域タンパク質を含み、かつ抗原結合能を有する抗体である、〔６４〕〜〔６７〕のいずれかの複合体またはその塩：
（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＦｃ領域タンパク質；
（Ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が挿入、付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を含むＦｃ領域タンパク質；または
（Ｃ）配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含むＦｃ領域タンパク質。
〔６９〕抗体が、連続する１〜５０個のアミノ酸残基からなる標的領域中において特定のアミノ酸残基を１個以上含み、かつ、前記標的領域以外の非標的領域中において前記特定のアミノ酸残基を５個以上含み、
Ａ−Ｌ−Ｂ’（−Ｆ）−Ｒ’で表される構造単位が、前記標的領域中に含まれる１個以上の特定のアミノ酸残基に対して３０％以上の位置選択性で結合している、〔６４〕〜〔６８〕のいずれかの複合体またはその塩。
〔７０〕前記特定のアミノ酸残基が、特定の位置に存在する特定のアミノ酸を中心としてそれぞれＮ末端側およびＣ末端側に対してａ個（ここで、ａは、１〜１０の任意の整数である）のアミノ酸残基の遠隔位置までの領域において、前記特定の位置に存在する特定のアミノ酸残基以外に、特定のアミノ酸残基と同種のアミノ酸残基を含まない、〔６９〕の複合体またはその塩。
〔７１〕前記抗体が、複数個の重鎖を含む抗体であり、
Ｔが、複数個の重鎖中の対応する複数個の標的領域において、Ａ−Ｌ−Ｂ’（−Ｆ）−Ｒ’で表される構造単位を有する結果、前記抗体がＡ−Ｌ−Ｂ’（−Ｆ）−Ｒ’で表される構造単位を複数個有する、〔６４〕〜〔７０〕のいずれかの複合体またはその塩。
〔７２〕前記機能性物質が、生体直交性官能基と反応し易い官能基を有する場合、または、生体直交性官能基と反応し易い官能基を有するように誘導体化されている場合、前記生体直交性官能基と反応し易い官能基が、アジド残基、アルデヒド残基、チオール残基、アルキン残基、アルケン残基、ハロゲン残基、テトラジン残基、ニトロン残基、ヒドロキシルアミン残基、ニトリル残基、ヒドラジン残基、ケトン残基、ボロン酸残基、シアノベンゾチアゾール残基、アリル残基、ホスフィン残基、マレイミド残基、ジスルフィド残基、チオエステル残基、α−ハロカルボニル残基、イソニトリル残基、シドノン残基、セレン残基からなる群より選ばれる基である、〔６４〕〜〔７１〕のいずれかの複合体またはその塩。
〔７３〕前記機能性物質が、生体直交性官能基と反応し易い官能基を有する場合、または、生体直交性官能基と反応し易い官能基を有するように誘導体化されている場合、前記生体直交性官能基と反応し易い官能基が、下記：
【化１２】
2019240287.tif 000013
〔式中、
Ｒ１ｆ、単一もしくは複数のＲ１ｇおよび単一もしくは複数のＲ１ｈは、同一もしくは異なって、前記（ｉ）〜（ｖｉｉ）からなる群より選ばれる原子もしくは基、または電子吸引基であり、・は、機能性物質に対する結合手である。）で表される基からなる群より選ばれる基である、〔６４〕〜〔７１〕のいずれかの複合体またはその塩。
〔７４〕抗体と反応性基との間の反応により生成する部分が、リジン残基、チロシン残基、またはトリプトファン残基と、リジン残基、チロシン残基、またはトリプトファン残基のいずれか一つの側鎖に対して特異的な反応性基との間の反応により生成する部分である、〔６４〕〜〔７３〕のいずれかの複合体またはその塩。
〔７５〕抗体と反応性基との間の反応により生成する部分が、リジン残基と、リジン残基の側鎖に対して特異的な反応性基との間の反応により生成する部分である、〔６４〕〜〔７４〕のいずれかの複合体またはその塩。
〔７６〕前記反応により生成する部分が、下記：
【化１３】
2019240287.tif 000014
〔ここで、●（黒丸）は、Ｔ側の部分に対する結合を示し、○（白丸）は、Ｂ側の部分に対する結合を示す。〕からなる群より選ばれるいずれか一つの化学構造に対応する、〔６４〕〜〔７５〕のいずれかの複合体またはその塩。
〔７７〕機能性物質が薬物または標識物質である、〔６４〕〜〔７６〕のいずれかの複合体またはその塩。
〔７８〕機能性物質が低分子化合物である、〔６４〕〜〔７７〕のいずれかの複合体またはその塩。
〔７９〕薬物が抗癌剤である、〔７７〕または〔７８〕の複合体またはその塩。
〔８０〕ＡおよびＲ’を連結する主鎖の原子数が４〜２０個である、〔６４〕〜〔７９〕のいずれかの複合体またはその塩。
〔８１〕ＡおよびＲを連結する主鎖が環構造を含まない、〔６４〕〜〔８０〕のいずれかの複合体またはその塩。
〔８２〕Ｌ−Ｂで表される部分構造がペプチド部分を含まない、〔６４〕〜〔８１〕のいずれかの複合体またはその塩。
〔８３〕前記式（ＩＩＩ）で表される化合物が、下記式（ＩＩＩ’）：
Ａ−Ｂ２’（−Ｆ２）−Ｌ’−Ｂ１’（−Ｆ１）−Ｒ’−Ｔ      （ＩＩＩ’）
〔式中、
Ａ、Ｒ’およびＴは、前記式（ＩＩ）のものと同じであり、
Ｌ’は、切断性部分を含む２価の基である切断性リンカーであり、
Ｂ１’およびＢ２’は、同一または異なって、機能性物質と生体直交性官能基との間の反応により生成する部分を含む３価の基であり、
Ｆ１およびＦ２は、同一または異なって、機能性物質であり、
Ｂ１’（−Ｆ１）およびＢ２’（−Ｆ２）は、Ｌ’を中心にした対称構造を有していてもよい。〕で表される、〔６４〕〜〔８２〕のいずれかの複合体またはその塩。
〔８４〕前記式（ＩＩＩ’）で表される化合物が、下記（ＩＩＩ’’）：
【化１４】
2019240287.tif 000015
〔式中、
Ａ、Ｒ’およびＴは、〔６２〕記載の式（ＩＩＩ）のものと同じであり、
Ｃは、切断性部分であり、
ｐおよびｐ’は、同一または異なって、０〜１０の任意の整数であり、
ｑおよびｑ’は、同一または異なって、０〜１０の任意の整数であり、
ＸおよびＸ’は、同一または異なって、炭素原子、窒素原子、または単結合（ここで、Ｘが窒素原子である場合、Ｒ１ｂは存在せず、Ｘ’が窒素原子である場合、Ｒ１ｂ’は存在しない。Ｘが単結合である場合、Ｒ１ａおよびＲ１ｂは存在せず、Ｘ’が単結合である場合、Ｒ１ａ’およびＲ１ｂ’は存在しない）であり、
Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ａ’およびＲ１ｂ’は、同一または異なって、前記（ｉ）〜（ｖｉｉ）からなる群より選ばれ、
ＹおよびＹ’は、同一または異なって、前記式（Ｂ−１）のＹから水素原子を一つ除いた残基であり、
ＺおよびＺ’は、同一または異なって、前記式（Ｂ−１）のＺと同じであり、
ＦおよびＦ’は、同一または異なって、機能性物質である。〕で表される、〔８３〕の複合体またはその塩。
〔８５〕親和性物質、機能性物質および抗体を有する複合体またはその塩であって、
下記式（ＩＩＩ）：
Ａ−Ｌ−Ｂ’（−Ｆ）−Ｒ’−Ｔ      （ＩＩＩ）
〔式中、
Ａは、抗体に対する親和性物質であり、
Ｌは、切断性部分を含む２価の基である切断性リンカーであり、
Ｂ’は、機能性物質と生体直交性官能基との間の反応により生成する部分を含む３価の基であり、
Ｆは、機能性物質であり、
Ｒ’は、抗体と、リジン残基の側鎖に対して特異的な反応性基との間の反応により生成する部分であり、
Ｔは、抗体である。〕で表されるものであり、かつ
抗体に対する親和性物質が、上記式１−１〜１−９、および式２−１のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドである、複合体またはその塩。【００１６】
（抗体に対する親和性物質、切断性部分、機能性物質および抗体を有する複合体またはその塩の製造方法）
〔８６〕抗体に対する親和性物質、切断性部分、機能性物質および抗体を有する複合体またはその塩の製造方法であって、
下記式（ＩＩ）：
Ａ−Ｌ−Ｂ−Ｒ’−Ｔ      （ＩＩ）
〔式中、
Ａは、抗体に対する親和性物質であり、
Ｌは、切断性部分を含む２価の基である切断性リンカーであり、
Ｂは、（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基であり、
Ｒ’は、抗体と反応性基との間の反応により生成する部分であり、
Ｔは、抗体である。〕で表される、抗体に対する親和性物質、および切断性部分を有する抗体またはその塩を、機能性物質と反応させて、
下記式（ＩＩＩ）：
Ａ−Ｌ−Ｂ’（−Ｆ）−Ｒ’−Ｔ      （ＩＩＩ）
〔式中、
Ａ、Ｌ、Ｒ’およびＴは、前記式（ＩＩ）のものと同じであり、
Ｂ’は、機能性物質と生体直交性官能基との間の反応により生成する部分を含む３価の基であり、
Ｆは、機能性物質である。〕で表される、抗体に対する親和性物質、切断性部分、機能性物質および抗体を有する複合体またはその塩を生成することを含み、かつ
抗体に対する親和性物質が、上記式１−１〜１−９、および式２−１のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドである、方法。
〔８７〕反応性基が、リジン残基の側鎖に対して特異的な反応性基である、〔８６〕の方法。
〔８８〕抗体に対する親和性物質、切断性部分、機能性物質および抗体を有する複合体またはその塩の製造方法であって、
（Ａ）下記式（Ｉ）：
Ａ−Ｌ−Ｂ−Ｒ      （Ｉ）
〔式中、
Ａは、抗体に対する親和性物質であり、
Ｌは、切断性部分を含む２価の基である切断性リンカーであり、
Ｂは、（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基であり、
Ｒは、前記抗体に対する反応性基である。〕で表される化合物またはその塩を、抗体と反応させて、
下記式（ＩＩ）：
Ａ−Ｌ−Ｂ−Ｒ’−Ｔ      （ＩＩ）
〔式中、
Ａ、Ｌ、およびＢは、前記式（Ｉ）のものと同じであり
Ｒ’は、抗体と反応性基との間の反応により生成する部分であり、
Ｔは、抗体である。〕で表される、抗体に対する親和性物質、および切断性部分を有する抗体またはその塩を生成すること、ならびに
（Ｂ）前記抗体に対する親和性物質、および切断性部分を有する抗体またはその塩を、機能性物質と反応させて、
下記式（ＩＩＩ）：
Ａ−Ｌ−Ｂ’（−Ｆ）−Ｒ’−Ｔ      （ＩＩＩ）
〔式中、
ＡおよびＬは、前記式（Ｉ）のものと同じであり、
Ｒ’およびＴは、前記式（ＩＩ）のものと同じであり、
Ｂ’は、機能性物質と生体直交性官能基との間の反応により生成する部分を含む３価の基であり、
Ｆは、機能性物質である。〕で表される、抗体に対する親和性物質、切断性部分、機能性物質および抗体を有する複合体またはその塩を生成することを含み、かつ
抗体に対する親和性物質が、上記式１−１〜１−９、および式２−１のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドである、方法。【００１７】
第４に、本発明は、生体直交性官能基を有する抗体の製造方法を提供する。
〔８９〕生体直交性官能基を有する抗体またはその塩の製造方法であって、
下記式（ＩＩ）：
Ａ−Ｌ−Ｂ−Ｒ’−Ｔ      （ＩＩ）
〔式中、
Ａは、抗体に対する親和性物質であり、
Ｌは、切断性部分を含む２価の基である切断性リンカーであり、
Ｂは、（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基、または（ｂ）生体直交性官能基を含まない２価の基であり、
Ｒ’は、抗体と反応性基との間の反応により生成する部分であり、
Ｔは、抗体である。〕で表される、抗体に対する親和性物質、および切断性部分を有する抗体またはその塩の切断性部分を切断して、
下記式（ＩＶ）：
Ｌ１−Ｂ−Ｒ’−Ｔ      （ＩＶ）
〔式中、
Ｂ、Ｒ’およびＴは、前記式（ＩＩ）のものと同じであり、
Ｌ１は、（ｉ’）生体直交性官能基を含む１価の基、または（ｉｉ’）生体直交性官能基を含まない１価の基である。〕で表される、生体直交性官能基を有する抗体またはその塩を生成することを含み、かつ
抗体に対する親和性物質が、上記式１−１〜１−９、および式２−１のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドである、方法。
〔９０〕Ｌが、（ｉ）切断により生体直交性官能基を反応性基側に生成する能力を有する切断性部分を含む２価の基である切断性リンカー、または（ｉｉ）切断により生体直交性官能基を反応性基側に生成する能力を有しない切断性部分を含む２価の基である切断性リンカーである、〔８９〕の方法。
〔９１〕Ｌが前記（ｉ）の切断性リンカーであり、
Ｌ１が、（ｉ’）生体直交性官能基を含む１価の基であり、
Ｂが、前記（ａ）または（ｂ）の２価の基である、〔８９〕の方法。
〔９２〕Ｌが前記（ｉ）の切断性リンカーであり、
Ｌ１が（ｉ’）生体直交性官能基を含む１価の基であり、
Ｂが前記（ｂ）の２価の基である、〔９０〕または〔９１〕の方法。
〔９３〕Ｌが前記（ｉｉ）の切断性リンカーであり、
Ｌ１が（ｉ’）生体直交性官能基を含まない１価の基であり、
Ｂが前記（ａ）の２価の基である、〔９０〕の方法。
〔９４〕反応性基が、リジン残基の側鎖に対して特異的な反応性基である、〔８９〕〜〔９３〕のいずれかの方法。
〔９５〕生体直交性官能基を有する抗体またはその塩の製造方法であって、
（Ａ）下記式（Ｉ）：
Ａ−Ｌ−Ｂ−Ｒ      （Ｉ）
〔式中、
Ａは、抗体に対する親和性物質であり、
Ｌは、切断性部分を含む２価の基である切断性リンカーであり、
Ｂは、（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基、または（ｂ）生体直交性官能基を含まない２価の基であり、
Ｒは、前記抗体に対する反応性基である。〕で表される化合物またはその塩を、抗体と反応させて、
下記式（ＩＩ）：
Ａ−Ｌ−Ｂ−Ｒ’−Ｔ      （ＩＩ）
〔式中、
Ａ、Ｌ、およびＢは、前記式（Ｉ）のものと同じであり
Ｒ’は、抗体と反応性基との間の反応により生成する部分であり、
Ｔは、抗体である。〕で表される、抗体に対する親和性物質、および切断性部分を有する抗体またはその塩を生成すること、ならびに
（Ｂ）前記抗体に対する親和性物質、および切断性部分を有する抗体またはその塩の切断性部分を切断して、
下記式（ＩＶ）：
Ｌ１−Ｂ−Ｒ’−Ｔ      （ＩＶ）
〔式中、
Ｂ、Ｒ’およびＴは、前記式（ＩＩ）のものと同じであり、
Ｌ１は、（ｉ’）生体直交性官能基を含む１価の基、または（ｉｉ’）生体直交性官能基を含まない１価の基である。〕で表される、生体直交性官能基を有する抗体またはその塩を生成することを含み、かつ
抗体に対する親和性物質が、上記式１−１〜１−９、および式２−１のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドである、方法。【００１８】
第５に、本発明は、機能性物質を有する抗体またはその塩の製造方法を提供する。
〔９６〕機能性物質を有する抗体またはその塩の製造方法であって、
下記式（ＩＩＩ）：
Ａ−Ｌ−Ｂ’（−Ｆ）−Ｒ’−Ｔ      （ＩＩＩ）
〔式中、
Ａは、抗体に対する親和性物質であり、
Ｌは、切断性部分を含む２価の基である切断性リンカーであり、
Ｂ’は、機能性物質と生体直交性官能基との間の反応により生成する部分を含む３価の基であり、
Ｆは、機能性物質であり、
Ｒ’は、抗体と反応性基との間の反応により生成する部分であり、
Ｔは、抗体である。〕で表される、抗体に対する親和性物質、切断性部分、機能性物質および抗体を有する複合体またはその塩の切断性部分を切断して、
下記式（Ｖ）：
Ｆ−（Ｌ１−Ｂ）’−Ｒ’−Ｔ      （Ｖ）
〔式中、
Ｌ１は、（ｉ’）生体直交性官能基を含む１価の基、または（ｉｉ’）生体直交性官能基を含まない１価の基であり、
Ｂは、（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基、または（ｂ）生体直交性官能基を含まない２価の基であり、
（Ｌ１−Ｂ）’で表される構造単位は、機能性物質と、（ｉ’）および（ａ）における生体直交性官能基のいずれか一方または双方との間の反応により生成する部分を含む２価の構造単位であり、
Ｆは、機能性物質であり、
Ｒ’は、抗体と反応性基との間の反応により生成する部分であり、
Ｔは、抗体である。〕で表される、機能性物質を有する抗体またはその塩を生成することを含み、かつ
抗体に対する親和性物質が、上記式１−１〜１−９、および式２−１のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドである、方法。
〔９７〕前記抗体に対する親和性物質、切断性部分、機能性物質および抗体を有する複合体またはその塩の切断性部分を切断して、
下記式（Ｖ１）：
Ｌ１−Ｂ’（−Ｆ）−Ｒ’−Ｔ      （Ｖ１）
〔式中、
Ｌ１は、（ｉ’）生体直交性官能基を含む１価の基、または（ｉｉ’）生体直交性官能基を含まない１価の基であり、
Ｂ’、Ｆ、Ｒ’およびＴは、前記式（ＩＩＩ）のものと同じである。〕で表される、機能性物質を有する抗体またはその塩を生成することを含む方法である、〔９６〕の方法。
〔９８〕前記生体直交性官能基を有する抗体またはその塩を、１種または２種の機能性物質と反応させて、
下記式（Ｖ２）：
Ｆ−Ｌ１’−Ｂ−Ｒ’−Ｔ      （Ｖ２）
〔式中、
Ｂ、Ｒ’およびＴは、前記式（ＩＶ）のものと同じであり、
Ｌ１’は、機能性物質と、（ｉ’）生体直交性官能基を含む１価の基との間の反応により生成する部分を含む２価の基であり、
Ｆは、機能性物質である。〕、または
下記式（Ｖ３）：
Ｆａ−Ｌ１’−Ｂ’（−Ｆｂ）−Ｒ’−Ｔ      （Ｖ３）
〔式中、
Ｒ’およびＴは、前記式（ＩＶ）のものと同じであり、
Ｌ１’は、前記式（Ｖ２）のものと同じであり、
Ｂ’は、機能性物質と生体直交性官能基との間の反応により生成する部分を含む３価の基であり、
ＦａおよびＦｂは、それぞれ、同一または異なる機能性物質である。〕で表される、機能性物質を有する抗体またはその塩を生成することを含む方法である、〔９６〕の方法。
〔９９〕反応性基が、リジン残基の側鎖に対して特異的な反応性基である、〔９６〕〜〔９８〕のいずれかの方法。
〔１００〕機能性物質を有する抗体またはその塩の製造方法であって、
（Ａ）下記式（ＩＩ）：
Ａ−Ｌ−Ｂ−Ｒ’−Ｔ      （ＩＩ）
〔式中、
Ａは、抗体に対する親和性物質であり、
Ｌは、切断性部分を含む２価の基である切断性リンカーであり、
Ｂは、（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基であり、
Ｒ’は、抗体と反応性基との間の反応により生成する部分であり、
Ｔは、抗体である。〕で表される、抗体に対する親和性物質、および切断性部分を有する抗体またはその塩を、機能性物質と反応させて、
下記式（ＩＩＩ）：
Ａ−Ｌ−Ｂ’（−Ｆ）−Ｒ’−Ｔ      （ＩＩＩ）
〔式中、
Ａ、Ｌ、Ｒ’およびＴは、前記式（ＩＩ）のものと同じであり、
Ｂ’は、機能性物質と生体直交性官能基との間の反応により生成する部分を含む３価の基であり、
Ｆは、機能性物質である。〕で表される、抗体に対する親和性物質、切断性部分、機能性物質および抗体を有する複合体またはその塩を生成すること、ならびに
（Ｂ）前記抗体に対する親和性物質、切断性部分、機能性物質および抗体を有する複合体またはその塩の切断性部分を切断して、
下記式（Ｖ１）：
Ｌ１−Ｂ’（−Ｆ）−Ｒ’−Ｔ      （Ｖ１）
〔式中、
Ｌ１は、（ｉ’）生体直交性官能基を含む１価の基、または（ｉｉ’）生体直交性官能基を含まない１価の基であり、
Ｂ’、Ｆ、Ｒ’およびＴは、前記式（ＩＩＩ）のものと同じである。〕で表される、機能性物質を有する抗体またはその塩を生成することを含み、かつ
抗体に対する親和性物質が、上記式１−１〜１−９、および式２−１のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドである、方法。
〔１０１〕機能性物質を有する抗体またはその塩の製造方法であって、
（Ａ）下記式（Ｉ）：
Ａ−Ｌ−Ｂ−Ｒ      （Ｉ）
〔式中、
Ａは、抗体に対する親和性物質であり、
Ｌは、切断性部分を含む２価の基である切断性リンカーであり、
Ｂは、（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基であり、
Ｒは、前記抗体に対する反応性基である。〕で表される、抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物またはその塩を、抗体と反応させて、
下記式（ＩＩ）：
Ａ−Ｌ−Ｂ−Ｒ’−Ｔ      （ＩＩ）
〔式中、
Ａ、Ｌ、およびＢは、前記式（Ｉ）のものと同じであり
Ｒ’は、抗体と反応性基との間の反応により生成する部分であり、
Ｔは、抗体である。〕で表される、抗体に対する親和性物質、および切断性部分を有する抗体またはその塩を生成すること、
（Ｂ）前記抗体に対する親和性物質、および切断性部分を有する抗体またはその塩を、機能性物質と反応させて、
下記式（ＩＩＩ）：
Ａ−Ｌ−Ｂ’（−Ｆ）−Ｒ’−Ｔ      （ＩＩＩ）
〔式中、
ＡおよびＬは、前記式（Ｉ）のものと同じであり、
Ｒ’およびＴは、前記式（ＩＩ）のものと同じであり、
Ｂ’は、機能性物質と生体直交性官能基との間の反応により生成する部分を含む３価の基であり、
Ｆは、機能性物質である。〕で表される、抗体に対する親和性物質、切断性部分、機能性物質および抗体を有する複合体またはその塩を生成すること、ならびに
（Ｃ）前記抗体に対する親和性物質、切断性部分、機能性物質および抗体を有する複合体またはその塩の切断性部分を切断して、
下記式（Ｖ１）：
Ｌ１−Ｂ’（−Ｆ）−Ｒ’−Ｔ      （Ｖ１）
〔式中、
Ｌ１は、（ｉ’）生体直交性官能基を含む１価の基、または（ｉｉ’）生体直交性官能基を含まない１価の基であり、
Ｂ’、Ｆ、Ｒ’およびＴは、前記式（ＩＩＩ）のものと同じである。〕で表される、機能性物質を有する抗体またはその塩を生成することを含み、かつ
抗体に対する親和性物質が、上記式１−１〜１−９、および式２−１のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドである、方法。
〔１０２〕機能性物質を有する抗体またはその塩の製造方法であって、
（Ａ）下記式（ＩＩ）：
Ａ−Ｌ−Ｂ−Ｒ’−Ｔ      （ＩＩ）
〔式中、
Ａは、抗体に対する親和性物質であり、
Ｌは、切断性部分を含む２価の基である切断性リンカーであり、
Ｂは、（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基、または（ｂ）生体直交性官能基を含まない２価の基であり、
Ｒ’は、抗体と反応性基との間の反応により生成する部分であり、
Ｔは、抗体である。〕で表される、抗体に対する親和性物質、および切断性部分を有する抗体またはその塩の切断性部分を切断して、
下記式（ＩＶ）：
Ｌ１−Ｂ−Ｒ’−Ｔ      （ＩＶ）
〔式中、
Ｂ、Ｒ’およびＴは、前記式（ＩＩ）のものと同じであり、
Ｌ１は、（ｉ’）生体直交性官能基を含む１価の基、または（ｉｉ’）生体直交性官能基を含まない１価の基である。〕で表される、生体直交性官能基を有する抗体またはその塩を生成すること、ならびに
（Ｂ）前記生体直交性官能基を有する抗体またはその塩を、１種または２種以上の機能性物質と反応させて、
下記式（Ｖ２）
Ｆ−Ｌ１’−Ｂ−Ｒ’−Ｔ      （Ｖ２）
〔式中、
Ｂ、Ｒ’およびＴは、前記式（ＩＶ）のものと同じであり、
Ｌ１’は、機能性物質と、（ｉ’）生体直交性官能基を含む１価の基との間の反応により生成する部分を含む２価の基であり、
Ｆは、機能性物質である。〕、または
下記式（Ｖ３）：
Ｆａ−Ｌ１’−Ｂ’（−Ｆｂ）−Ｒ’−Ｔ      （Ｖ３）
〔式中、
Ｒ’およびＴは、前記式（ＩＶ）のものと同じであり、
Ｌ１’は、前記式（Ｖ２）のものと同じであり、
Ｂ’は、機能性物質と生体直交性官能基との間の反応により生成する部分を含む３価の基であり、
ＦａおよびＦｂは、それぞれ、同一または異なる機能性物質である。〕で表される、機能性物質を有する抗体またはその塩を生成することを含み、かつ
抗体に対する親和性物質が、上記式１−１〜１−９、および式２−１のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドである、方法。
〔１０３〕機能性物質を有する抗体またはその塩の製造方法であって、
（Ａ）下記式（Ｉ）：
Ａ−Ｌ−Ｂ−Ｒ      （Ｉ）
〔式中、
Ａは、抗体に対する親和性物質であり、
Ｌは、切断性部分を含む２価の基である切断性リンカーであり、
Ｂは、（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基、または（ｂ）生体直交性官能基を含まない２価の基であり、
Ｒは、前記抗体に対する反応性基である。〕で表される化合物またはその塩を、抗体と反応させて、
下記式（ＩＩ）：
Ａ−Ｌ−Ｂ−Ｒ’−Ｔ      （ＩＩ）
〔式中、
Ａ、Ｌ、およびＢは、前記式（Ｉ）のものと同じであり
Ｒ’は、抗体と反応性基との間の反応により生成する部分であり、
Ｔは、抗体である。〕で表される、抗体に対する親和性物質、および切断性部分を有する抗体またはその塩を生成すること、
（Ｂ）前記抗体に対する親和性物質、および切断性部分を有する抗体またはその塩の切断性部分を切断して、
下記式（ＩＶ）：
Ｌ１−Ｂ−Ｒ’−Ｔ      （ＩＶ）
〔式中、
Ｂ、Ｒ’およびＴは、前記式（ＩＩ）のものと同じであり、
Ｌ１は、（ｉ’）生体直交性官能基を含む１価の基、または（ｉｉ’）生体直交性官能基を含まない１価の基である。〕で表される、生体直交性官能基を有する抗体またはその塩を生成すること、ならびに
（Ｃ）前記生体直交性官能基を有する抗体またはその塩を、１種または２種以上の機能性物質と反応させて、
下記式（Ｖ２）
Ｆ−Ｌ１’−Ｂ−Ｒ’−Ｔ      （Ｖ２）
〔式中、
Ｂ、Ｒ’およびＴは、前記式（ＩＶ）のものと同じであり、
Ｌ１’は、機能性物質と、（ｉ’）生体直交性官能基を含む１価の基との間の反応により生成する部分を含む２価の基であり、
Ｆは、機能性物質である。〕、または
下記式（Ｖ３）：
Ｆａ−Ｌ１’−Ｂ’（−Ｆｂ）−Ｒ’−Ｔ      （Ｖ３）
〔式中、
Ｒ’およびＴは、前記式（ＩＶ）のものと同じであり、
Ｌ１’は、前記式（Ｖ２）のものと同じであり、
Ｂ’は、機能性物質と生体直交性官能基との間の反応により生成する部分を含む３価の基であり、
ＦａおよびＦｂは、それぞれ、同一または異なる機能性物質である。〕で表される、機能性物質を有する抗体またはその塩を生成することを含み、かつ
抗体に対する親和性物質が、上記式１−１〜１−９、および式２−１のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドである、方法。
【発明の効果】
【００１９】
（Ｉ）抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する本発明の化合物またはその塩は、例えば、抗体の位置選択的な修飾に有用である。
（Ｉ）本発明の化合物またはその塩、（ＩＩ）抗体に対する親和性物質、および切断性部分を（位置選択的に）有する本発明の抗体またはその塩、（ＩＩＩ）抗体に対する親和性物質、切断性部分、機能性物質および抗体を（位置選択的に）有する本発明の複合体またはその塩は、例えば、生体直交性官能基を（位置選択的に）有する抗体またはその塩、および機能性物質を（位置選択的に）有する抗体またはその塩の調製のための中間体として有用である。機能性物質を（位置選択的に）有する抗体またはその塩は、例えば、医薬、または試薬（例、診断薬、研究用試薬）として有用である。生体直交性官能基を（位置選択的に）有する抗体またはその塩は、機能性物質を（位置選択的に）有する抗体またはその塩の調製のための中間体として有用である。したがって、（Ｉ）本発明の化合物またはその塩、（ＩＩ）本発明の抗体またはその塩、および（ＩＩＩ）本発明の複合体またはその塩は、例えば、医薬、または試薬の合成中間体として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１−１】図１−１は、本発明の化合物〔抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物：Ａ−Ｌ−Ｂ−Ｒ（Ｉ）〕による抗体の位置選択的修飾のコンセプトを示す模式図（その１）である。先ず、本発明の化合物は、抗体に対する親和性物質（Ａ）を介して、抗体（Ｔ）に会合する。次に、本発明の化合物は、反応性基（Ｒ）（図中では活性化エステル）を介して、親和性物質と抗体との会合部位の近傍に存在する標的領域中の特定のアミノ酸残基の側鎖（図中ではリジン残基の側鎖）と反応して、本発明の化合物と抗体とのコンジュゲート〔抗体に対する親和性物質、および切断性部分を含む構造単位を位置選択的に有する抗体：Ａ−Ｌ−Ｂ−Ｒ’−Ｔ（ＩＩ）〕を生成する。
【図１−２】図１−２は、本発明の化合物による抗体の位置選択的修飾のコンセプトを示す模式図（その２）である。リンカー（Ｌ）中の切断性部分の切断により、生体直交性官能基で位置特異的に修飾された抗体が生成する。
【図１−３】図１−３は、本発明の化合物による抗体の位置選択的修飾のコンセプトを示す模式図（その３）である。生体直交性官能基と機能性物質（例、薬物）との反応により、機能性物質で位置特異的に修飾された抗体が生成する。
【図２】図２は、本発明の各発明の関連性を示す図である（塩については表記を省略）。反応（１）では、抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物を抗体と反応させて、抗体に対する親和性物質、および切断性部分を有する抗体を生成する。反応（２）では、抗体に対する親和性物質、および切断性部分を有する抗体を機能性物質と反応させて、抗体に対する親和性物質、切断性部分、機能性物質および抗体を有する複合体を生成する。反応（３）では、抗体に対する親和性物質、切断性部分、機能性物質および抗体を有する複合体の切断性部分を切断して、機能性物質を有する抗体を生成する（このとき、親和性物質の含有部分が副産物として生成する）。反応（４）では、抗体に対する親和性物質、および切断性部分を有する抗体の切断性部分を切断して、生体直交性官能基を有する抗体を生成する（このとき、親和性物質の含有部分が副産物として生成する）。反応（５）では、生体直交性官能基を有する抗体を機能性物質と反応させて、機能性物質を有する抗体を生成する。反応（２）および（５）は同様に行うことができる。反応（３）および（５）もまた、同様に行うことができる。
【図３】図３は、トラスツズマブの重鎖中のＦｃ領域、およびＩｇＧ１  Ｆｃ領域のコンセンサスアミノ酸配列（配列番号１）を示す図である。
【図４】図４は、（１）トラスツズマブの重鎖のアミノ酸配列（配列番号２）、（２）糖鎖をＰＮＧａｓｅで切断したＩｇＧ１  Ｆｃ領域のアミノ酸配列（配列番号３）、および（３）トラスツズマブの軽鎖のアミノ酸配列（配列番号４）を示す図である。
【図５】図５は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ（Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（疎水性相互作用クロマトグラフィー））−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例１）。縦軸のＡＵは、吸光度を示す（以降の図面において同様）。
【図６】図６は、トラスツズマブのトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位（ヨードアセトアミドによるＣａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ化を受けたチオール導入体（＋１４５．０１９Ｄａ））を含むアミノ酸３３残基からなるペプチド、ＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号６）のペプチドフラグメントのＭＳスペクトル（実測値：ｍ／ｚ  １２６９．３０７１７、理論値：１２６９．３０２７３、３価）を示す図である（実施例２）。
【図７−１】図７−１は、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるヒトＩｇＧ重鎖の２４８位のリジン残基の修飾を示す、２価のｙ９に相当するｍ／ｚ  ６０３．２９（理論値：６０３．３０）のプロダクトイオンのＣＩＤスペクトルを示す図である（実施例２）。
【図７−２】図７−２は、トラスツズマブのトリプシン消化物に対し、リジン残基への修飾（ヨードアセトアミドによるＣａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ化を受けたチオール導入体（＋１４５．０１９Ｄａ）を含むペプチドフラグメントをＰｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて検索した結果を示す図である（実施例２）。横軸は同定されたリジン残基を示し、縦軸はＰｅｐｔｉｄｅ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｍａｔｃｈｅｓ（ＰＳＭｓ）を示す。なお、リジン残基の残基番号に関して、重鎖ＶＨドメインおよび軽鎖上については配列中の番号（すなわち、Ｎ末のアミノ酸を１番目とする。以下同様）で、重鎖ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３ドメイン上についてはＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇを用いて表記した。
【図８】図８は、トラスツズマブのＧｌｕ−Ｃプロテアーゼ消化によるリジン残基への修飾部位（ヨードアセトアミドによるＣａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ化を受けたチオール導入体（＋１４５．０１９Ｄａ））を含むアミノ酸１６残基からなるペプチド、ＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤ（配列番号７）のペプチドフラグメントのＭＳスペクトル（実測値：ｍ／ｚ  ６１９．６７２９９、理論値：６１９．６７１１２、３価）を示す図である（実施例２）。
【図９−１】図９−１は、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるヒトＩｇＧ重鎖の２４６位もしくは２４８位のリジン残基の修飾を示す、１価のｙ５に相当するｍ／ｚ  ７２９．４９（理論値：７２９．３６）のプロダクトイオンのＣＩＤスペクトルを示す図である（実施例２）。
【図９−２】図９−２は、トラスツズマブのＧｌｕ−Ｃプロテアーゼ消化物に対し、リジン残基への修飾（ヨードアセトアミドによるＣａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ化を受けたチオール導入体（＋１４５．０１９Ｄａ）を含むペプチドフラグメントをＰｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて検索した結果を示す図である（実施例２）。横軸は同定されたリジン残基を示し、縦軸はＰｅｐｔｉｄｅ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｍａｔｃｈｅｓ（ＰＳＭｓ）を示す。なお、リジン残基の残基番号に関して、重鎖ＶＨドメインおよび軽鎖上については配列中の番号で、重鎖ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３ドメイン上についてはＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇを用いて表記した。
【図１０】図１０は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例３）。
【図１１】図１１は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例４）。
【図１２】図１２は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例５）。
【図１３】図１３は、トラスツズマブのトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位（ヨードアセトアミドによるＣａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ化を受けたチオール導入体（＋１４５．０１９Ｄａ））を含むアミノ酸３３残基からなるペプチド、ＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号６）のペプチドフラグメントのＭＳスペクトル（実測値：ｍ／ｚ  ９５２．２３１７０、理論値：９５２．２２９００、４価）を示す図である（実施例６）。
【図１４−１】図１４−１は、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるヒトＩｇＧ重鎖の２４６位もしくは２４８位のリジン残基の修飾を示す、２価のｙ２０に相当するｍ／ｚ  １１６６．８８（理論値：１１６６．６１）のプロダクトイオンのＣＩＤスペクトルを示す図である（実施例６）。
【図１４−２】図１４−２は、トラスツズマブのトリプシン消化物に対し、リジン残基への修飾（ヨードアセトアミドによるＣａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ化を受けたチオール導入体（＋１４５．０１９Ｄａ）を含むペプチドフラグメントをＰｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて検索した結果を示す図である（実施例６）。横軸は同定されたリジン残基を示し、縦軸はＰｅｐｔｉｄｅ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｍａｔｃｈｅｓ（ＰＳＭｓ）を示す。なお、リジン残基の残基番号に関して、重鎖ＶＨドメインおよび軽鎖上については配列中の番号で、重鎖ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３ドメイン上についてはＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇを用いて表記した。
【図１５】図１５は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例７）。
【図１６】図１６は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例８）。
【図１７】図１７は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例９）。
【図１８】図１８は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例１０）。
【図１９】図１９は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例１１）。
【図２０】図２０は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例１２）。
【図２１】図２１は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例１３）。
【図２２】図２２は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例１４）。
【図２３】図２３は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例１５）。
【図２４】図２４は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例１６）。
【図２５】図２５は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例１７）。
【図２６】図２６は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例１８）。
【図２７】図２７は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例１９）。
【図２８】図２８は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例２０）。
【図２９】図２９は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例２１）。
【図３０】図３０は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例２２）。
【図３１】図３１は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例２３）。
【図３２】図３２は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例２４）。
【図３３】図３３は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例２５）。
【図３４】図３４は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例２６）。
【図３５】図３５は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例２７）。
【図３６】図３６は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例２８）。
【図３７】図３７は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例２９）。
【図３８】図３８は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例３０）。
【図３９】図３９は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例３１）。
【図４０】図４０は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例３２）。
【図４１】図４１は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例３３）。
【図４２】図４２は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例３４）。
【図４３】図４３は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例３５）。
【図４４】図４４は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例３６）。
【図４５】図４５は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例３７）。
【図４６】図４６は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例３８）。
【図４７】図４７は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例３９）。
【図４８】図４８は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例４０）。
【図４９】図４９は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例４１）。
【図５０】図５０は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例４２）。
【図５１】図５１は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例４３）。
【図５２】図５２は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例４４）。
【図５３】図５３は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例４５）。
【図５４】図５４は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例４６）。
【図５５】図５５は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例４７）。
【図５６】図５６は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例４８）。
【図５７】図５７は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例４９）。
【図５８】図５８は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例５０）。
【図５９】図５９は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例５１）。
【図６０】図６０は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例５２）。
【図６１】図６１は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例５３）。
【図６２】図６２は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例５４）。
【図６３】図６３は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例５５）。
【図６４】図６４は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例５６）。
【図６５】図６５は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例５７）。
【図６６】図６６は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例５８）。
【図６７】図６７は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例５９）。
【図６８】図６８は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例６０）。
【図６９】図６９は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例６１）。
【図７０】図７０は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例６２）。
【図７１】図７１は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例６３）。
【図７２】図７２は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例６４）。
【図７３】図７３は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例６５）。
【図７４】図７４は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例６６）。
【図７５】図７５は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例６７）。
【図７６】図７６は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例６８）。
【図７７】図７７は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例６９）。
【図７８】図７８は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例７０）。
【図７９】図７９は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例７１）。
【図８０】図８０は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例７２）。
【図８１】図８１は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例７３）。
【図８２】図８２は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例７４）。
【図８３】図８３は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例７５）。
【図８４】図８４は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例７６）。
【図８５】図８５は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例７７）。
【図８６】図８６は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例７８）。
【図８７】図８７は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例７９）。
【図８８】図８８は、トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認を示す図である（実施例８０）。
【図８９】図８９は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例８０）。
【図９０】図９０は、トラスツズマブ・チオール導入体の特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認を示す図である（実施例８０）。
【図９１】図９１は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例８０）。
【図９２】図９２は、トラスツズマブ蛍光標識体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認を示す図である（実施例８０）。
【図９３】図９３は、ＡＤＣ  ｍｉｍｉｃの還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認を示す図である（実施例８０）。
【図９４】図９４は、実施例８０の結果のまとめを示す図である。
【図９５】図９５は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例８１）。
【図９６】図９６は、トラスツズマブのトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位（ヨードアセトアミドによるＣａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ化を受けたチオール導入体（＋１４５．０１９Ｄａ））を含むアミノ酸３３残基からなるペプチド、ＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号６）のペプチドフラグメントのＭＳスペクトル（実測値：ｍ／ｚ  １２６９．３０３５９、理論値：１２６９．３０２７３、３価）を示す図である（実施例８１）。
【図９７−１】図９７−１は、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるヒトＩｇＧ重鎖の２４６位もしくは２４８位のリジン残基の修飾を示す、１価のｙ９に相当するｍ／ｚ  １２０５．８６（理論値：１２０５．６０）のプロダクトイオンのＣＩＤスペクトルを示す図である（実施例８１）。
【図９７−２】図９７−２は、トラスツズマブのトリプシン消化物に対し、リジン残基への修飾（ヨードアセトアミドによるＣａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ化を受けたチオール導入体（＋１４５．０１９Ｄａ）を含むペプチドフラグメントをＰｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて検索した結果を示す図である（実施例８１）。横軸は同定されたリジン残基を示し、縦軸はＰｅｐｔｉｄｅ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｍａｔｃｈｅｓ（ＰＳＭｓ）を示す。なお、リジン残基の残基番号に関して、重鎖ＶＨドメインおよび軽鎖上については配列中の番号で、重鎖ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３ドメイン上についてはＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇを用いて表記した。
【図９８】図９８は、抗体−核酸コンジュゲートのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果を示す図である（実施例８２）。
【図９９】図９９は、トラスツズマブ・アジド導入体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認を示す図である（実施例８３）。
【図１００】図１００は、ＡＤＣ  ｍｉｍｉｃの還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認を示す図である（実施例８３）。
【図１０１】図１０１は、トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認を示す図である（実施例８４）。
【図１０２】図１０２は、トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例８４）。
【図１０３】図１０３は、トラスツズマブ・アジド導入体の特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認を示す図である（実施例８４）。
【図１０４】図１０４は、トラスツズマブ・アジド導入体の特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析の結果（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例８４）。
【図１０５】図１０５は、トラスツズマブのトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位（アジドカルボン酸導入体（＋２４０．０８６））を含むアミノ酸３３残基からなるペプチド、ＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号６）のペプチドフラグメントのＭＳスペクトル（実測値：ｍ／ｚ  １３００．９９２４１、理論値：１３００．９９１７３、３価）を示す図である（実施例８４）。
【図１０６−１】図１０６−１は、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおける２４６位もしくは２４８位のリジン残基の修飾を示す、１価のｙ１２に相当するｍ／ｚ  １６２２．９２（理論値：１６２２．８７）のプロダクトイオンのＣＩＤスペクトルを示す図である（実施例８４）。
【図１０６−２】図１０６−２は、トラスツズマブのトリプシン消化物に対し、リジン残基への修飾（アジド導入体（＋２５５．０９７Ｄａ）、アミン導入体（＋２２９．１０６）、アジドカルボン酸導入体（＋２４０．０８６）、アミンカルボン酸導入体（＋２１４．０９５））を含むペプチドフラグメントをＰｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて検索した結果を示す図である（実施例８４）。横軸は同定されたリジン残基を示し、縦軸はＰｅｐｔｉｄｅ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｍａｔｃｈｅｓ（ＰＳＭｓ）を示す。なお、リジン残基の残基番号に関して、重鎖ＶＨドメインおよび軽鎖上については配列中の番号で、重鎖ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３ドメイン上についてはＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇを用いて表記した。
【図１０７】図１０７は、ＡＤＣ  ｍｉｍｉｃの還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認を示す図である（実施例８５）。
【図１０８】図１０８は、トラスツズマブ・アジド導入体の特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例８５）。
【図１０９】図１０９は、トラスツズマブのトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位（ＤＢＣＯ−Ａｃｉｄカルボン酸導入体（＋５５９．２０７））を含むアミノ酸３３残基からなるペプチド、ＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号６）のペプチドフラグメントのＭＳスペクトル（実測値：ｍ／ｚ  １０５５．７７６３１、理論値：１０５５．７７６００、４価）を示す図である（実施例８５）。
【図１１０−１】図１１０−１は、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおける２４６位もしくは２４８位のリジン残基の修飾を示す、２価のｙ１２に相当するｍ／ｚ  ９７１．７１（理論値：９７１．５０）のプロダクトイオンのＣＩＤスペクトルを示す図である（実施例８５）。
【図１１０−２】図１１０−２は、トラスツズマブのトリプシン消化物に対し、リジン残基への修飾（ＤＢＣＯ−Ａｃｉｄ導入体（＋５７４．２１８）、ＤＢＣＯ−Ａｃｉｄカルボン酸導入体（＋５５９．２０７）、アジド導入体（＋２５５．０９７）、アジドカルボン酸導入体（＋２４０．０８６））を含むペプチドフラグメントをＰｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて検索した結果を示す図である（実施例８５）。横軸は同定されたリジン残基を示し、縦軸はＰｅｐｔｉｄｅ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｍａｔｃｈｅｓ（ＰＳＭｓ）を示す。なお、リジン残基の残基番号に関して、重鎖ＶＨドメインおよび軽鎖上については配列中の番号で、重鎖ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３ドメイン上についてはＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇを用いて表記した。
【図１１１】図１１１は、抗ＴＮＦ−α  ＩｇＧ１抗体アダリムマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析を示す図である（実施例８６）。
【図１１２】図１１２は、アダリムマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例８６）。
【図１１３】図１１３は、アダリムマブ・ペプチド複合体のリンカー切断を示す図である（実施例８６）。
【図１１４】図１１４は、アダリムマブ・チオール導入体のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例８６）。
【図１１５】図１１５は、アダリムマブ・チオール導入体への蛍光標識を示す図である（実施例８６）。
【図１１６】図１１６は、抗ＲＡＮＫＬ  ＩｇＧ２抗体デノスマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析を示す図である（実施例８７）。
【図１１７】図１１７は、デノスマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例８７）。
【図１１８】図１１８は、デノスマブ・ペプチド複合体のリンカー切断を示す図である（実施例８７）。
【図１１９】図１１９は、デノスマブ・チオール導入体のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例８７）。
【図１２０】図１２０は、デノスマブ・チオール導入体への蛍光標識を示す図である（実施例８７）。
【図１２１】図１２１は、抗ＩＬ−４／１３受容体  ＩｇＧ４抗体デュピルマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析を示す図である（実施例８８）。
【図１２２】図１２２は、デュピルマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例８８）。
【図１２３】図１２３は、デュピルマブ・ペプチド複合体のリンカー切断を示す図である（実施例８８）。
【図１２４】図１２４は、デュピルマブ・チオール導入体のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析（検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ）を示す図である（実施例８８）。
【図１２５】図１２５は、デュピルマブ蛍光標識体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認を示す図である（実施例８８）。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
１．抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を含む化合物またはその塩
１−１．概要
本発明は、式（Ｉ）で表される、抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を含む化合物またはその塩を提供する。
Ａ−Ｌ−Ｂ−Ｒ      （Ｉ）
〔式中、
Ａは、抗体に対する親和性物質であり、
Ｌは、切断性部分を含む２価の基である切断性リンカーであり、
Ｂは、（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基、または（ｂ）生体直交性官能基を含まない２価の基であり、
Ｒは、前記抗体に対する反応性基である。〕
【００２２】
本発明に関連して提示される式（Ｉ）および他の式において、−（ハイフン）は、その両側に存在する２つの単位が共有結合していることを示す。したがって、式（Ｉ）では、Ａは、Ｌと共有結合しており、Ｌは、ＡおよびＢと共有結合しており、Ｂは、ＬおよびＲと共有結合しており、Ｒは、Ｂと共有結合している。
【００２３】
１−２．抗体に対する親和性物質（Ａ）
式（Ｉ）において、Ａは、抗体に対する親和性物質である。親和性物質とは、抗体に対して非共有結合による結合能を有する物質である。
【００２４】
本発明で用いられる親和性物質は、抗体を標的とする。抗体は、生体分子（例、糖）で修飾されたタンパク質（例、糖タンパク質）であっても、生体分子で未修飾のタンパク質であってもよい。抗体としては、生物由来成分、ウイルス由来成分、および環境中に見出される成分等の任意の成分に対する任意の抗体を用いることができるが、生物由来成分またはウイルス由来成分に対する抗体が好ましい。生物由来成分としては、例えば、哺乳動物、鳥類（例、ニワトリ）等の動物、昆虫、微生物、植物、菌類、および魚類由来の成分（例、タンパク質）が挙げられる。好ましくは、生物由来成分は、哺乳動物由来の成分である。哺乳動物としては、例えば、霊長類（例、ヒト、サル、チンパンジー）、齧歯類（例、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ）、愛玩動物（例、イヌ、ネコ）、家畜（例、ウシ、ブタ、ヤギ）、使役動物（例、ウマ、ヒツジ）が挙げられる。生物由来成分は、より好ましくは、霊長類または齧歯類由来の成分（例、タンパク質）であり、さらにより好ましくは、本発明の臨床応用の観点から、ヒト由来の成分（例、タンパク質）である。ウイルス由来成分としては、例えば、インフルエンザウイルス（例、トリインフルエンザウイルス、ブタインフルエンザウイルス）、エイズウイルス、エボラウイルス、ファージウイルスに由来する成分（例、タンパク質）が挙げられる。
【００２５】
抗体はまた、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり、好ましくはモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体としては、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、所定の糖鎖が付加された抗体（例、Ｎ型糖鎖結合コンセンサス配列等の糖鎖結合コンセンサス配列を有するように改変された抗体）、二重特異性抗体、ｓｃＦｖ抗体、Ｆａｂ抗体、Ｆ（ａｂ‘）２抗体、ＶＨＨ抗体、Ｆｃ領域タンパク質、Ｆｃ融合タンパク質が挙げられる。抗体はまた、２価の抗体（例、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ）、または４価以上の抗体（例、ＩｇＡ抗体、ＩｇＭ抗体）であってもよい。
【００２６】
親和性物質の標的である抗体はまた、任意のアミノ酸残基から構成されていてもよいが、好ましくは、タンパク質を通常構成する天然の２０種のＬ−α−アミノ酸残基から構成される。このようなアミノ酸残基としては、例えば、Ｌ−アラニン（Ａ）、Ｌ−アスパラギン（Ｎ）、Ｌ−システイン（Ｃ）、Ｌ−グルタミン（Ｑ）、Ｌ−イソロイシン（Ｉ）、Ｌ−ロイシン（Ｌ）、Ｌ−メチオニン（Ｍ）、Ｌ−フェニルアラニン（Ｆ）、Ｌ−プロリン（Ｐ）、Ｌ−セリン（Ｓ）、Ｌ−スレオニン（Ｔ）、Ｌ−トリプトファン（Ｗ）、Ｌ−チロシン（Ｙ）、Ｌ−バリン（Ｖ）、Ｌ−アスパラギン酸（Ｄ）、Ｌ−グルタミン酸（Ｅ）、Ｌ−アルギニン（Ｒ）、Ｌ−ヒスチジン（Ｈ）、またはＬ−リジン（Ｋ）、及びグリシン（Ｇ）が挙げられる（以下、Ｌの表記を省略）。抗体は、例えば１００個以上、好ましくは１２０個以上、より好ましくは１５０個以上、さらにより好ましくは１８０個以上、特に好ましくは２００個以上のアミノ酸残基から構成されていてもよい。抗体はまた、例えば１０００個以下、好ましくは９００個以下、より好ましくは８００個以下、さらにより好ましくは７００個以下、特に好ましくは６００個以下であってもよい。より具体的には、抗体は、例えば１００〜１０００個、好ましくは１２０〜９００個、より好ましくは１５０〜８００個、さらにより好ましくは１８０〜７００個以上、特に好ましくは２００〜６００個のアミノ酸残基から構成されていてもよい。抗体が抗体（例、上述したようなモノクローナル抗体）である場合、上記個数のアミノ酸残基は、抗体の重鎖のアミノ酸残基に相当するものであってもよい。
【００２７】
親和性物質の標的である抗体はさらに、後述するような反応性基が反応できる側鎖または末端（Ｎ末端および/またはＣ末端）、好ましくは側鎖を有する特定のアミノ酸残基を１つの位置または複数の位置（好ましくは複数の位置）で含むタンパク質である。このような特定のアミノ酸残基としては、例えば、後述するような１４種のアミノ酸残基が挙げられるが、好ましくは、リジン残基、チロシン残基、トリプトファン残基、およびシステイン残基からなる群より選ばれるアミノ酸残基である。本発明の化合物が抗体を位置選択的に修飾できることに鑑みると、このような特定のアミノ酸残基を複数の位置で含む抗体が好ましい。複数の位置としては、２以上の位置である限り特に限定されないが、例えば３以上の位置、好ましくは５以上の位置、より好ましくは１０以上の位置、さらにより好ましくは２０以上の位置、特に好ましくは３０以上の位置であってもよい。複数の位置はまた、例えば２００以下の位置、好ましくは１８０以下の位置、より好ましくは１５０以下の位置、さらにより好ましくは１２０以下の位置、特に好ましくは１００以下の位置であってもよい。より具体的には、複数の位置は、例えば３〜２００の位置、好ましくは５〜１８０の位置、より好ましくは１０〜１５０の位置、さらにより好ましくは２０〜１２０の位置、特に好ましくは３０〜１００の位置であってもよい。このような特定のアミノ酸残基を複数の位置で含む抗体であっても、本発明の化合物は、特定の一の位置に存在する特定のアミノ酸残基を位置選択的に修飾することができる。例えば、ヒトＩｇＧ１のリジン残基数は、可変領域中のアミノ酸組成にもよるが、一般的には７０〜９０個程度と言われている。本発明では、このようなヒトＩｇＧ１の特定の位置に存在するリジン残基を位置選択的に修飾することに成功している。
【００２８】
より具体的には、本発明では、抗体の機能を維持しつつ（すなわち、抗体を変性させずにネイティブなフォールディングを維持しつつ）、抗体中の特定の位置に存在するアミノ酸残基を修飾する観点から、抗体の表面に露出しているアミノ酸残基の位置選択的な修飾が好ましい。例えば、ヒトＩｇＧ１等のヒトＩｇＧでは、露出リジン残基および露出チロシン残基は、以下の位置に存在する（ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇによる；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｈａｒｔ／Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ／Ｈｕ＿ＩＧＨＧｎｂｅｒ．ｈｔｍｌを参照）。なお、本願においては、説明上の便宜のため、重鎖ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３ドメイン上についてはＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇを用いて表記し、重鎖ＶＨドメインおよび軽鎖上については配列中の番号（すなわち、Ｎ末端のアミノ酸を１番目）を用いて表記することがある。
（１）露出リジン残基
ＣＨ２ドメイン（２４６位、２４８位、２７４位、２８８位、２９０位、３１７位、３２０位、３２２位、３３８位）
ＣＨ３ドメイン（３６０位、４１４位、４３９位）
（２）露出チロシン残基
ＣＨ２ドメイン（２７８位、２９６位、３００位）
ＣＨ３ドメイン（４３６位）
したがって、ヒトＩｇＧ１等のヒトＩｇＧがリジン残基またはチロシン残基で修飾される場合、上記位置での修飾が好ましい。
【００２９】
好ましくは、ヒトＩｇＧ１等のヒトＩｇＧがリジン残基またはチロシン残基で修飾される場合、上記（１）および（２）の位置のなかでも、表面への露出性が高い以下の位置に存在するリジン残基またはチロシン残基が修飾されてもよい。
（１’）露出リジン残基
ＣＨ２ドメイン（２４６位、２４８位、２７４位、２８８位、２９０位、３１７位、３２０位、３２２位）
ＣＨ３ドメイン（３６０位、４１４位、４３９位）
（２’）露出チロシン残基
ＣＨ２ドメイン（２７８位、２９６位、３００位）
ＣＨ３ドメイン（４３６位）
したがって、ヒトＩｇＧ１等のヒトＩｇＧがリジン残基またはチロシン残基で修飾される場合、上記位置での修飾がより好ましい。
【００３０】
より好ましくは、ヒトＩｇＧ１等のヒトＩｇＧがリジン残基で修飾される場合、上記（１）の位置のなかでも、本発明において効率的に修飾することができるＣＨ２ドメイン中の所定の位置（例、２４６位、２４８位、２８８位、２９０位、３１７位）に存在するリジン残基が修飾されてもよい。
【００３１】
特定の実施形態では、親和性物質の標的である抗体は、上述したように特定のアミノ酸残基を複数の位置で含む場合、連続する１〜５０個のアミノ酸残基からなる標的領域中において特定のアミノ酸残基を１個以上含み、かつ、前記標的領域以外の非標的領域中において特定のアミノ酸残基を５個以上含むものであってもよい。標的領域は、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらにより好ましくは１〜１０個、１〜５個、または１〜３個（すなわち、１個、２個、もしくは３個）のアミノ酸残基からなるものであってもよい。特に好ましくは、標的領域は、特定の位置に存在する特定のアミノ酸残基からなる領域であってもよい。このような特定の位置は、標的タンパク質および親和性物質の種類などによっても変動するが、例えば、抗体の定常領域中の特定領域（例、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）中の特定の位置であってもよく、好ましくは抗体のＣＨ２中の位置であってもよい。より具体的には、標的領域は、ヒトＩｇＧ  ＦｃにおけるＥｕ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従う下記残基であってもよい：
（１）Ｌｙｓ２４８残基（以下、本明細書では単に「Ｌｙｓ２４８」とも表記し、ヒトＩｇＧ  ＣＨ２領域（配列番号１）の１８番目の残基に相当する）またはＬｙｓ２４６残基（以下、本明細書では単に「Ｌｙｓ２４６」とも表記し、ヒトＩｇＧ  ＣＨ２領域（配列番号１）の１６番目の残基に相当する）；
（２）Ｌｙｓ２８８残基（以下、本明細書では単に「Ｌｙｓ２８８」とも表記し、ヒトＩｇＧ  ＣＨ２領域（配列番号１）の５８番目の残基に相当する）またはＬｙｓ２９０残基（以下、本明細書では単に「Ｌｙｓ２９０」とも表記し、ヒトＩｇＧ  ＣＨ２領域（配列番号１）の６０番目の残基に相当する）；
（３）Ｌｙｓ３１７残基（以下、本明細書では単に「Ｌｙｓ３１７」とも表記し、ヒトＩｇＧ  ＣＨ２領域（配列番号１）の８７番目の残基に相当する）。
【００３２】
本発明によれば、上記標的領域における特定のアミノ酸残基を高度に位置選択的に修飾することができる。このような位置選択性は、例えば３０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上、さらにより好ましくは６０％以上、特に好ましくは７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％以上であってもよい。
【００３３】
標的領域はまた、特定の位置に存在する特定のアミノ酸残基が、当該特定の位置を中心としてそれぞれＮ末端側およびＣ末端側に対してａ個（ここで、ａは、１〜１０の任意の整数である）のアミノ酸残基の遠隔位置までの領域において、当該特定の位置に存在する特定のアミノ酸残基以外に、特定のアミノ酸残基と同種のアミノ酸残基を含まないものであってもよい。ａは、好ましくは１〜５の整数であり、より好ましくは１〜３の整数であり、さらにより好ましくは１または２であり、特に好ましくは１である。
【００３４】
好ましい実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体等の抗体のアイソタイプとしては、例えば、ＩｇＧ（例、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＹが挙げられる。モノクローナル抗体は、全長抗体、または抗体断片（例、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、単鎖抗体）であるが、全長抗体が好ましい。
【００３５】
抗体は、任意の抗原に対する抗体である。例えば、このような抗原は、上述したような生物またはウイルスにおいて見出される成分であってもよい。このような抗原としてはまた、例えば、タンパク質〔オリゴペプチド、ポリペプチドを含む。糖等の生体分子で修飾されたタンパク質（例、糖タンパク質）であってもよい〕、糖鎖、核酸、低分子化合物が挙げられる。
【００３６】
好ましくは、抗体は、タンパク質を抗原とする抗体であってもよい。タンパク質としては、例えば、細胞膜受容体、細胞膜受容体以外の細胞膜タンパク質（例、細胞外基質タンパク質）、リガンド、可溶性受容体が挙げられる。
【００３７】
より具体的には、抗体の抗原であるタンパク質は、疾患標的タンパク質であってもよい。疾患標的タンパク質としては、例えば、以下が挙げられる。
【００３８】
（１）がん領域
ＰＤ−Ｌ１、ＧＤ２、ＰＤＧＦＲα（血小板由来成長因子受容体）、ＣＤ２２、ＨＥＲ２、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ＥｐＣＡＭ、フィブロネクチン、ＰＤ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＣＤ３３、ＨＧＦ、ｇｐＮＭＢ、ＣＤ２７、ＤＥＣ−２０５、葉酸受容体、ＣＤ３７、ＣＤ１９、Ｔｒｏｐ２、ＣＥＡＣＡＭ５、Ｓ１Ｐ、ＨＥＲ３、ＩＧＦ−１Ｒ、ＤＬＬ４、ＴＮＴ−１／Ｂ、ＣＰＡＡｓ、ＰＳＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ１０５（エンドグリン）、ＩＣＡＭ−１、ＣＤ３０、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ３８、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＫＩＲ２ＤＬ１，２，、ＮＫＧ２Ａ、ｔｅｎａｓｃｉｎ−Ｃ、ＩＧＦ（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＣＴＬＡ−４、ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＣＤ１３８、ｃ−Ｍｅｔ、Ａｎｇ２、ＶＥＧＦ−Ａ、ＣＤ７９ｂ、ＥＮＰＤ３、葉酸受容体α、ＴＥＭ−１、ＧＭ２、グリピカン３、ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ、ＣＤ７４、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、ＣＤ３７、ＴＬＲ−２、ＣＤ３、ＣＳＦ−１Ｒ、ＦＧＦＲ２ｂ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥｐｈＡ３、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ１２３、ｇｐＡ３３、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７受容体、ＤＬＬ４、ＶＥＧＦ、ＲＳＰＯ、ＬＩＶ−１、ＳＬＩＴＲＫ６、Ｎｅｃｔｉｎ−４、ＣＤ７０、ＣＤ４０、ＣＤ１９、ＳＥＭＡ４Ｄ（ＣＤ１００）、ＣＤ２５、ＭＥＴ、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒ、ＩＬ−８、ＥＧＦＲ、ｃＭｅｔ、ＫＩＲ３ＤＬ２、Ｂｓｔ１（ＣＤ１５７）、Ｐ−カドヘリン、ＣＥＡ、ＧＩＴＲ、ＴＡＭ（ｔｕｍｏｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）、ＣＥＡ、ＤＬＬ４、Ａｎｇ２、ＣＤ７３、ＦＧＦＲ２、ＣＸＣＲ４、ＬＡＧ−３、ＧＩＴＲ、Ｆｕｃｏｓｙｌ  ＧＭ１、ＩＧＦ−１、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ  ２、ＣＳＦ−１Ｒ、ＦＧＦＲ３、ＯＸ４０、ＢＣＭＡ、ＥｒｂＢ３、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＰＴＫ７、ＥＦＮＡ４、ＦＡＰ、ＤＲ５、ＣＥＡ、Ｌｙ６Ｅ、ＣＡ６、ＣＥＡＣＡＭ５、ＬＡＭＰ１、ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ、ＥＰＨＡ２、ＤＲ５、Ｂ７−Ｈ３、ＦＧＦＲ４、ＦＧＦＲ２、α２−ＰＩ、Ａ３３、ＧＤＦ１５、ＣＡＩＸ、ＣＤ１６６、ＲＯＲ１、ＧＩＴＲ、ＢＣＭＡ、ＴＢＡ、ＬＡＧ−３、ＥｐｈＡ２、ＴＩＭ−３、ＣＤ−２００、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ３２Ｂ、ＰＩＧＦ、Ａｘｌ、ＭＩＣＡ／Ｂ、Ｔｈｏｍｓｅｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ、ＣＤ３９、ＣＤ３７、ＣＤ７３、ＣＬＥＣ１２Ａ、Ｌｇｒ３、トランスフェリン受容体、ＴＧＦβ、ＩＬ−１７、５Ｔ４、ＲＴＫ、Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＮａＰｉ２ｂ、ルイス血液型Ｂ抗原、Ａ３４、Ｌｙｓｉｌ−Ｏｘｉｄａｓｅ、ＤＬＫ−１、ＴＲＯＰ−２、α９インテグリン、ＴＡＧ−７２（ＣＡ７２−４）、ＣＤ７０
【００３９】
（２）自己免疫疾患・炎症性疾患
ＩＬ−１７、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＮＦ−α、ＩＬ−５Ｒ、ＩＬ−１３、ＩＬ−２３、ＩＬ−６、ＡｃｔＲＩＩＢ、β７−Ｉｎｔｅｇｒｉｎ、ＩＬ−４αＲ、ＨＡＳ、Ｅｏｔａｘｉｎ−１、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１５、ＣＤ３ε、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、ＩＬ−１β、ＩＬ−１α、ＩＬ−１７、ＴＳＬＰ（Ｔｈｙｍｉｃ  Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ）、ＬＡＭＰ（Ａｌｐｈａ４  Ｂｅｔａ  ７  Ｉｎｔｅｇｒｉｎ）、ＩＬ−２３、ＧＭ−ＣＳＦＲ、ＴＳＬＰ、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＴＬＲ−３、ＢＡＦＦ−Ｒ、ＭＡｄＣＡＭ、ＩＬ−３１Ｒ、ＩＬ−３３、ＣＤ７４、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ７９Ｂ、ＩｇＥ（免疫グロブリンＥ）、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、Ｃ５、ＦｃＲｎ、ＣＤ２８、ＴＬＲ４、ＭＣＡＭ、Ｂ７ＲＰ１、ＣＸＣＲ１，２  Ｌｉｇａｎｄｓ、ＩＬ−２１、Ｃａｄｈｅｒｉｎ−１１、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＣＬ２０、ＩＬ−３６Ｒ、ＩＬ−１０Ｒ、ＣＤ８６、ＴＮＦ−α、ＩＬ−７Ｒ、Ｋｖ１．３、α９インテグリン、ＬＩＦＨＴ
【００４０】
（３）脳神経疾患
ＣＧＲＰ、ＣＤ２０、βアミロイド、βアミロイドプロトフィブリン、Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  Ｇｅｎｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＬＩＮＧＯ（Ｉｇ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ１）、αシヌクレイン、細胞外ｔａｕ、ＣＤ５２、インスリン受容体、ｔａｕタンパク、ＴＤＰ−４３、ＳＯＤ１、ＴａｕＣ３、ＪＣウイルス
【００４１】
（４）感染症
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  Ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｔｏｘｉｎ  Ｂ、サイトメガロウイルス、ＲＳウイルス、ＬＰＳ、Ｓ．Ａｕｒｅｕｓ  Ａｌｐｈａ−ｔｏｘｉｎ、Ｍ２ｅタンパク、Ｐｓｌ、ＰｃｒＶ、Ｓ．Ａｕｒｅｕｓ  ｔｏｘｉｎ、インフルエンザＡ、Ａｌｇｉｎａｔｅ、黄色ブドウ球菌、ＰＤ−Ｌ１、インフルエンザＢ、アシネトバクター、Ｆ−ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｅｎｖ、ＣＤ３、病原性大腸菌、クレブシエラ、肺炎球菌
【００４２】
（５）遺伝性・希少疾患
アミロイドＡＬ、ＳＥＭＡ４Ｄ（ＣＤ１００）、インスリン受容体、ＡＮＧＰＴＬ３、ＩＬ４、ＩＬ１３、ＦＧＦ２３、副腎皮質刺激ホルモン、トランスサイレチン、ハンチンチン
【００４３】
（６）眼疾患
Ｆａｃｔｏｒ  Ｄ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＰＧＤＦＲ、Ａｎｇ２、ＶＥＧＦ−Ａ、ＣＤ−１０５（Ｅｎｄｏｇｌｉｎ）、ＩＧＦ−１Ｒ、βアミロイド
【００４４】
（７）骨・整形外科領域
Ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ、Ｍｙｏｓｔａｔｉｎ、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−１、ＧＤＦ８、ＲＮＡＫＬ、ＨＡＳ、Ｓｉｇｌｅｃ−１５
【００４５】
（８）血液疾患
ｖＷＦ、Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸａ、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘ、ＩＦＮγ、Ｃ５、ＢＭＰ−６、Ｆｅｒｒｏｐｏｒｔｉｎ、ＴＦＰＩ
【００４６】
（９）その他の疾患
ＢＡＦＦ（Ｂ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）、ＩＬ−１β、ＰＣＳＫ９、ＮＧＦ、ＣＤ４５、ＴＬＲ−２、ＧＬＰ−１、ＴＮＦＲ１、Ｃ５、ＣＤ４０、ＬＰＡ、プロラクチン受容体、ＶＥＧＦＲ−１、ＣＢ１、Ｅｎｄｏｇｌｉｎ、ＰＴＨ１Ｒ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ８、ＩＬ−１β、ＡＴ２−Ｒ、ＩＡＰＰ
【００４７】
より好ましい実施形態では、抗体に対する親和性物質は、モノクローナル抗体に対する親和性物質である。モノクローナル抗体のアイソタイプは、抗体について上述したものと同様であるが、ＩｇＧ（例、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）が好ましい。好ましくは、モノクローナル抗体は、全長モノクローナル抗体である。
【００４８】
さらにより好ましい実施形態では、抗体に対する親和性物質は、全長モノクローナル抗体であるキメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体（例、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等のＩｇＧ）に対する親和性物質である。
【００４９】
特に好ましい実施形態では、抗体に対する親和性物質は、下記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれるいずれか一つのＦｃ領域タンパク質を含み、かつ抗原結合能を有する抗体に対する親和性物質である：
（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＦｃ領域タンパク質；
（Ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が挿入、付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を含むＦｃ領域タンパク質；または
（Ｃ）配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含むＦｃ領域タンパク質。
【００５０】
配列番号１のアミノ酸配列は、Ｆｃ領域タンパク質である。このようなＦｃ領域タンパク質は、分泌能を有することが知られている。したがって、上記（Ａ）〜（Ｃ）のＦｃ領域タンパク質は、分泌能を有することができる。また、このようなＦｃ領域タンパク質を含む抗体は、抗原結合能を有することができる。配列番号１における１８位のアミノ酸残基は、任意のアミノ酸残基であるが、好ましくは中性アミノ酸残基であり、より好ましくは後述するような非極性側鎖を有するアミノ酸残基であり、さらにより好ましくはロイシン、イソロイシンまたはアラニンであり、特に好ましくはロイシンまたはアラニンである。配列番号１における１９位のアミノ酸残基は、任意のアミノ酸残基であるが、好ましくは中性アミノ酸残基または酸性アミノ酸残基であり、より好ましくは非極性側鎖を有するアミノ酸残基または酸性アミノ酸残基であり、さらにより好ましくはロイシンまたはグルタミン酸である。配列番号１における２１位のアミノ酸残基は、任意のアミノ酸残基であるが、好ましくは中性アミノ酸残基であり、より好ましくは非極性側鎖を有するアミノ酸残基であり、さらにより好ましくはグリシンまたはアラニンである。配列番号１における１４０位のアミノ酸残基は、任意のアミノ酸残基であるが、好ましくは酸性アミノ酸残基であり、より好ましくはグルタミン酸またはアスパラギン酸である。配列番号１における１４２位のアミノ酸残基は、任意のアミノ酸残基であるが、好ましくは中性アミノ酸残基であり、より好ましくは非極性側鎖を有するアミノ酸残基であり、さらにより好ましくはメチオニン、ロイシンまたはイソロイシンであり、特に好ましくはメチオニンまたはロイシンである。配列番号１における１７７位のアミノ酸残基は、任意のアミノ酸残基であるが、好ましくは中性アミノ酸残基であり、より好ましくは後述するような非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸残基または非極性側鎖を有するアミノ酸残基であり、さらにより好ましくはスレオニン、アラニンまたはグリシンであり、特に好ましくはスレオニンまたはアラニンである。
【００５１】
好ましい実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列における２２０〜４４９位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であってもよい。
【００５２】
別の好ましい実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列は、配列番号３のアミノ酸配列における７〜２３６位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であってもよい。
【００５３】
特定の実施形態では、上述したようなアミノ酸配列を含むＦｃ領域タンパク質を含む抗体は、上述したようなアミノ酸配列を含むＦｃ領域タンパク質、および抗体の定常領域を含む抗体であってもよい。このような抗体の定常領域としては、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体（例、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等のＩｇＧ）の定常領域であってもよい。
【００５４】
Ｆｃ領域タンパク質（Ｂ）では、アミノ酸残基の欠失、置換、付加および挿入からなる群より選ばれる１、２、３または４種の変異により、１個または数個のアミノ酸残基が改変され得る。アミノ酸残基の変異は、アミノ酸配列中の１つの領域に導入されてもよいが、複数の異なる領域に導入されてもよい。用語「１個または数個」は、タンパク質の活性を大きく損なわない個数を示す。用語「１個または数個」が示す数は、例えば、１〜１００個、好ましくは１〜８０個、より好ましくは１〜５０個、１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個または１〜５個（例、１個、２個、３個、４個、または５個）である。
【００５５】
Ｆｃ領域タンパク質（Ｃ）では、配列番号１のアミノ酸配列との同一性％は、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であってもよい。本発明では、ペプチドまたはポリペプチド（タンパク質）の同一性％の算出は、アルゴリズムｂｌａｓｔｐにより行うことができる。より具体的には、ポリペプチドの同一性の算定％は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）において提供されているアルゴリズムｂｌａｓｔｐにおいて、デフォルト設定のＳｃｏｒｉｎｇ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ（Ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｇａｐ  Ｃｏｓｔｓ：Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ＝１１  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ＝１；Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  Ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｓ：Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｓｃｏｒｅ  ｍａｔｒｉｘ  ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）を用いて行うことができる。また、ポリヌクレオチド（遺伝子）の同一性％の算出は、アルゴリズムｂｌａｓｔｎにより行うことができる。より具体的には、ポリヌクレオチドの同一性％の算定は、ＮＣＢＩにおいて提供されているアルゴリズムｂｌａｓｔｎにおいて、デフォルト設定のＳｃｏｒｉｎｇ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ（Ｍａｔｃｈ／Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｓｃｏｒｅｓ＝１，−２；Ｇａｐ  Ｃｏｓｔｓ＝Ｌｉｎｅａｒ）を用いて行うことができる。
【００５６】
分泌能における分泌は、分泌タンパク質の分泌（いわゆる可溶性）と同じ意味である。したがって、「分泌能を有する」とは、通常の抗体と同様に、抗体として機能することを意味する。
【００５７】
上記Ｆｃ領域タンパク質を含む抗体は、目的の特性（例、分泌能、抗原結合能）を保持する限り、特定の部位に、変異が導入されていてもよい。目的の特性を保持し得る、変異が導入されてもよいアミノ酸残基の位置は、当業者に明らかである。具体的には、当業者は、１）同種の特性を有する複数のタンパク質のアミノ酸配列を比較し、２）相対的に保存されている領域、および相対的に保存されていない領域を明らかにし、次いで、３）相対的に保存されている領域および相対的に保存されていない領域から、それぞれ、機能に重要な役割を果たし得る領域および機能に重要な役割を果たし得ない領域を予測できるので、構造・機能の相関性を認識することができる。したがって、当業者は、上記Ｆｃ領域タンパク質を含む抗体のアミノ酸配列において変異が導入されてもよいアミノ酸残基の位置を特定できる。
【００５８】
アミノ酸残基が置換により変異される場合、アミノ酸残基の置換は、保存的置換であってもよい。本明細書中で用いられる場合、用語「保存的置換」とは、所定のアミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することをいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で周知である。例えば、このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β位分岐側鎖を有するアミノ酸（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基（例、アルコール性、フェノール性）含有側鎖を有するアミノ酸（例、セリン、スレオニン、チロシン）、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（例、システイン、メチオニン）が挙げられる。好ましくは、アミノ酸の保存的置換は、アスパラギン酸とグルタミン酸との間での置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルアラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイシンとアラニンとの間での置換、およびグリシンとアラニンとの間での置換であってもよい。
【００５９】
上記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれるいずれか一つのＦｃ領域を含む抗体としては、例えば、キメラ抗体（例、リツキシマブ、バシリキシマブ、インフリキシマブ、セツキシマブ、シルツキシマブ、ディヌツキシマブ、オルタトキサシマブ）、ヒト化抗体（例、ダクリヅマブ、パリビズマブ、トラスツズマブ、アレンツズマブ、オマリヅマブ、エファリヅマブ、ベバシヅマブ、ナタリヅマブ（ＩｇＧ４）、トシリヅマブ、エクリヅマブ（ＩｇＧ２）、モガムリヅマブ、ペルツヅマブ、オビヌツヅマブ、ベドリヅマブ、ペンプロリヅマブ（ＩｇＧ４）、メポリヅマブ、エロツヅマブ、ダラツムマブ、イケセキヅマブ（ＩｇＧ４）、レスリヅマブ（ＩｇＧ４）、アテゾリヅマブ）、ヒト抗体（例、アダリムマブ（ＩｇＧ１）、パニツムマブ、ゴリムマブ、ウステキヌマブ、カナキヌマブ、オファツムマブ、デノスマブ（ＩｇＧ２）、イピリムマブ、ベリムマブ、ラキシバクマブ、ラムシルマブ、ニボルマブ、デュピルマブ（ＩｇＧ４）、セクキヌマブ、エボロクマブ（ＩｇＧ２）、アリロクマブ、ネシツムマブ、ブロダルマブ（ＩｇＧ２）、オララツマブ）が挙げられる（ＩｇＧサブタイプに言及していない場合、ＩｇＧ１であることを示す）。
【００６０】
本発明で用いられる抗体に対する親和性物質は、以下のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドである。
式１−１：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｉ−Ｉ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号５８）
式１−２：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｉ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号５９）
式１−３：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｖ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６０）
式１−４：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ａ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６１）
式１−５：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｌ−Ｌ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６２）
式１−６：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｌ−Ｉ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６３）
式１−７：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６４）
式１−８：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｑ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６５）
式１−９：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｅ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号６６）
〔式中、
（Ｘ０−３）ａは、なし、または１〜３個の連続する同一または異なる任意のアミノ酸残基（リジン残基およびシステイン残基以外）であり、
（Ｘ０−３）ｂは、なし、または１〜３個の連続する同一または異なる任意のアミノ酸残基（リジン残基およびシステイン残基以外）であり、
Ｘａａ１は、アラニン残基、グリシン残基、ロイシン残基、プロリン残基、アルギニン残基、バリン残基、アスパラギン残基、グルタミン酸残基、またはフェニルアラニン残基であり、
Ｘａａ２は、チロシン残基、トリプトファン残基、ヒスチジン残基、またはフェニルアラニン残基であり、
Ｘａａ３は、ヒスチジン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、トリプトファン残基、アルギニン残基、またはグリシン残基であり、
Ｘａａ４は、リジン残基であり、
Ｘａａ５は、グリシン残基、セリン残基、アスパラギン残基、グルタミン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、トリプトファン残基、ヒスチジン残基、スレオニン残基、ロイシン残基、アラニン残基、バリン残基、イソロイシン残基、またはアルギニン残基であり、
Ｘａａ６は、グルタミン残基、グルタミン酸残基、アスパラギン残基、アスパラギン酸残基、プロリン残基、グリシン残基、アルギニン残基、フェニルアラニン残基、またはヒスチジン残基である。〕、あるいは
式２−１：（Ｘ０−３’）ａ−Ｃ−Ｘａａ１’−Ｘａａ２’−Ｘａａ３’−Ｘａａ４’−Ｘａａ５’−Ｘａａ６’−Ｌ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３’）ｂ（配列番号６７）
〔式中、
（Ｘ０−３’）ａおよび（Ｘ０−３’）ｂはそれぞれ、前記（Ｘ０−３）ａおよび（Ｘ０−３）ｂと同じであり、
Ｘａａ１’、Ｘａａ２’、Ｘａａ３’、Ｘａａ４’、Ｘａａ５’、Ｘａａ６’はそれぞれ、前記Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６と同じである。
但し、（Ｘ０−３’）ａが１〜３のアミノ酸残基、（Ｘ０−３’）ｂが１〜３のアミノ酸残基、Ｘａａ３’がヒスチジン残基、かつ、Ｘａａ５’がグリシン残基の場合を除く。〕のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドである。
【００６１】
（Ｘ０−３）ａ、（Ｘ０−３）ｂ、（Ｘ０−３’）ａおよび（Ｘ０−３’）ｂは、それぞれ独立して、なし、または同一または異なる１〜３個の連続する任意のアミノ酸残基（リジン残基およびシステイン残基以外）である。したがって、このような任意のアミノ酸残基は、アラニン残基、アスパラギン残基、グルタミン残基、グリシン残基、イソロイシン残基、ロイシン残基、メチオニン残基、フェニルアラニン残基、プロリン残基、セリン残基、スレオニン残基、トリプトファン残基、チロシン残基、バリン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、アルギニン残基、またはヒスチジン残基である。
【００６２】
特定の実施形態では、（Ｘ０−３）ａは、なし、アルギニン残基−グリシン残基−アスパラギン残基、アスパラギン酸残基、アスパラギン残基、グリシン残基−アスパラギン残基、グリシン残基、グリシン残基−グリシン残基、またはグリシン残基−グリシン残基−グリシン残基であってもよい。
【００６３】
特定の実施形態では、（Ｘ０−３）ｂは、なし、スレオニン残基−チロシン残基−ヒスチジン残基、スレオニン残基、スレオニン残基−チロシン残基、グリシン残基、グリシン残基−グリシン残基、またはグリシン残基−グリシン残基−グリシン残基であってもよい。
【００６４】
特定の実施形態では、上記式１−１〜１−９、および式２−１で表されるアミノ酸配列において、以下のとおりであってもよい：
（Ｘ０−３）ａは、なし、アルギニン残基−グリシン残基−アスパラギン残基、アスパラギン酸残基、またはアスパラギン残基であり；
（Ｘ０−３）ｂは、なし、スレオニン残基−チロシン残基−ヒスチジン残基、またはスレオニン残基であり；
Ｘａａ１は、アラニン残基であり；
Ｘａａ２は、チロシン残基、トリプトファン残基、またはヒスチジン残基であり；
Ｘａａ６は、グルタミン残基、グルタミン酸残基、アスパラギン残基、またはアスパラギン酸残基である。
【００６５】
別の特定の実施形態では、上記式１−１〜１−９、および式２−１で表されるアミノ酸配列において、以下のとおりであってもよい：
（Ｘ０−３）ａは、グリシン残基−アスパラギン残基、グリシン残基、グリシン残基−グリシン残基、またはグリシン残基−グリシン残基−グリシン残基であり、
（Ｘ０−３）ｂは、スレオニン残基−チロシン残基、グリシン残基、グリシン残基−グリシン残基、またはグリシン残基−グリシン残基−グリシン残基であり、
Ｘａａ１は、グリシン残基、ロイシン残基、プロリン残基、アルギニン残基、バリン残基、アスパラギン残基、グルタミン酸残基、またはフェニルアラニン残基であり、
Ｘａａ２は、フェニルアラニン残基であり、
Ｘａａ６は、プロリン残基、グリシン残基、アルギニン残基、フェニルアラニン残基、またはヒスチジン残基である。
【００６６】
上記式１−１〜１−９、および式２−１で表されるアミノ酸配列において、Ｘａａ３は、ヒスチジン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、トリプトファン残基、アルギニン残基、またはグリシン残基であり、好ましくは、ヒスチジン残基である。
【００６７】
上記式１−１〜１−９、および式２−１で表されるアミノ酸配列において、Ｘａａ５は、グリシン残基、セリン残基、アスパラギン残基、グルタミン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、トリプトファン残基、ヒスチジン残基、スレオニン残基、ロイシン残基、アラニン残基、バリン残基、イソロイシン残基、またはアルギニン残基であり、好ましくは、グリシン残基、スレオニン残基、ロイシン残基である。
【００６８】
好ましくは、上記式１−１〜１−９、および式２−１で表されるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドは、下記からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含むペプチドである：
（１）  ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号５）；
（２）  ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＩＶＷＣＴＹＨ（配列番号８）；
（３）  ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＶＶＷＣＴＹＨ（配列番号９）；
（４）  ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＡＶＷＣＴＹＨ（配列番号１０）；
（５）  ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＬＬＷＣＴＹＨ（配列番号１１）；
（６）  ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＬＩＷＣＴＹＨ（配列番号１２）；
（７）      ＤＣＡＹＨＫＧＱＩＶＷＣＴ    （配列番号１３）；
（８）      ＤＣＡＹＨＫＧＱＶＶＷＣＴ    （配列番号１４）；
（９）      ＤＣＡＹＨＫＧＱＡＶＷＣＴ    （配列番号１５）；
（１０）ＲＧＮＣＡＹＨＫＳＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号１６）；
（１１）ＲＧＮＣＡＹＨＫＮＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号１７）；
（１２）ＲＧＮＣＡＹＨＫＤＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号１８）；
（１３）ＲＧＮＣＡＹＨＫＱＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号１９）；
（１４）ＲＧＮＣＡＹＨＫＥＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号２０）；
（１５）ＲＧＮＣＡＹＨＫＦＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号２１）；
（１６）ＲＧＮＣＡＹＨＫＹＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号２２）；
（１７）ＲＧＮＣＡＹＨＫＷＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号２３）；
（１８）ＲＧＮＣＡＹＨＫＨＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号２４）；
（１９）ＲＧＮＣＡＹＨＫＴＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号２５）；
（２０）ＲＧＮＣＡＹＨＫＬＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号２６）；
（２１）      ＣＡＹＨＫＬＱＩＶＷＣ      （配列番号２７）；
（２２）      ＣＡＹＨＫＬＱＬＩＷＣ      （配列番号２８）；
（２３）      ＣＡＹＨＫＳＱＩＶＷＣ      （配列番号２９）；
（２４）ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＬＶＦＣＴＹＨ（配列番号３０）；
（２５）ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＱＶＷＣＴＹＨ（配列番号３１）；
（２６）ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＥＶＷＣＴＹＨ（配列番号３２）；
（２７）      ＣＡＹＨＫＧＱＬＶＷＣ      （配列番号３３）；
（２８）ＲＧＮＣＡＹＨＫＡＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号３４）；
（２９）ＲＧＮＣＡＹＨＫＶＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号３５）；
（３０）ＲＧＮＣＡＹＨＫＬＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号３６）；
（３１）ＲＧＮＣＡＹＨＫＩＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号３７）；
（３２）ＲＧＮＣＡＹＨＫＳＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号３８）；
（３３）ＲＧＮＣＡＹＨＫＴＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号３９）；
（３４）ＲＧＮＣＡＹＨＫＮＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号４０）；
（３５）ＲＧＮＣＡＹＨＫＤＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号４１）；
（３６）ＲＧＮＣＡＹＨＫＱＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号４２）；
（３７）ＲＧＮＣＡＹＨＫＥＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号４３）；
（３８）ＲＧＮＣＡＹＨＫＦＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号４４）；
（３９）ＲＧＮＣＡＹＨＫＲＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号４５）；
（４０）ＲＧＮＣＡＹＨＫＨＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号４６）；
（４１）ＲＧＮＣＡＹＨＫＷＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号４７）；
（４２）ＲＧＮＣＡＹＨＫＹＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号４８）；
（４３）ＲＧＮＣＡＹＦＫＧＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号４９）；
（４４）ＲＧＮＣＡＹＹＫＧＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号５０）；
（４５）ＲＧＮＣＡＹＷＫＧＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号５１）；
（４６）ＲＧＮＣＡＹＲＫＧＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号５２）；
（４７）ＲＧＮＣＡＹＧＫＧＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号５３）；
（４８）    ＤＣＡＹＨＫＧＱＬＶＷＣ      （配列番号５４）；
（４９）    ＮＣＡＹＨＫＧＱＬＶＷＣ      （配列番号５５）；
（５０）      ＣＡＹＨＫＧＱＬＶＷＣＴ    （配列番号５６）；
（５１）      ＣＡＹＨＫＳＱＬＶＷＣ      （配列番号５７）；
（５２）ＲＧＮＣＡＷＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号６８）；
（５３）ＲＧＮＣＡＦＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号６９）；
（５４）ＲＧＮＣＡＨＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号７０）；
（５５）ＲＧＮＣＧＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号７１）；
（５６）ＲＧＮＣＬＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号７２）；
（５７）ＲＧＮＣＰＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号７３）；
（５８）ＲＧＮＣＲＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号７４）；
（５９）ＲＧＮＣＶＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号７５）；
（６０）ＲＧＮＣＮＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号７６）；
（６１）ＲＧＮＣＥＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号７７）；
（６２）ＲＧＮＣＦＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号７８）；
（６３）ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＥＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号７９）；
（６４）ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＮＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号８０）；
（６５）ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＰＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号８１）；
（６６）ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＧＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号８２）；
（６７）ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＤＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号８３）；
（６８）ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＲＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号８４）；
（６９）ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＦＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号８５）；
（７０）ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＨＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号８６）；
（７１）    ＤＣＡＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴ（配列番号８７）；
（７２）    ＮＣＡＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴ（配列番号８８）；
（７３）  ＧＮＣＡＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹ（配列番号８９）；
（７４）    ＧＣＡＹＨＫＧＱＩＩＷＣＧ（配列番号９０）；
（７５）  ＧＧＣＡＹＨＫＧＱＩＩＷＣＧＧ（配列番号９１）；および
（７６）ＧＧＧＣＡＹＨＫＧＱＩＩＷＣＧＧＧ（配列番号９２）。
【００６９】
上記ペプチドの各アミノ酸配列の中に離間した少なくとも２つのシステイン残基は、ジスルフィド結合により環状ペプチドを形成することができる。あるいは、上記ペプチドにおいて、２つのシステイン残基中のスルフィド基は、以下で表されるカルボニル基含有リンカーにより連結されていてもよい。
【００７０】
【化１５】
2019240287.tif 000016
【００７１】
上記で表されるカルボニル基含有リンカーの破線部分は、スルフィド基との結合部分を意味する。当該リンカーは、通常のジスルフィド結合よりも、還元反応等に対して安定である。このようなペプチドは、例えば、国際公開第２０１６／１８６２０６号に記載される方法により、調製することができる。
【００７２】
このような特定の構造を有する新規ペプチドは、ヒトＩｇＧ  ＦｃにおけるＥｕ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従うＬｙｓ２４８残基またはＬｙｓ２４６残基、あるいはＬｙｓ２４８残基またはＬｙｓ２４６残基以外の他のアミノ酸残基の位置選択的な修飾に有用である（実施例）。上記ペプチドを構成するアミノ酸はＬ体またはＤ体のいずれであってもよいが、Ｌ体が好ましい（実施例ではペプチドを構成するアミノ酸残基は全てＬ体である）。
【００７３】
上記ペプチドは、架橋剤により特定のアミノ酸残基が修飾されてもよい。このような特定のアミノ酸残基としては、例えば、リジン残基、アスパラギン酸残基、およびグルタミン酸残基が挙げられるが、好ましくは、リジン残基である。架橋剤としては、例えば、ＤＳＧ（ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｇｌｕｔａｒａｔｅ、ジスクシンイミジルグルタレート）、ＤＳＳ（ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｓｕｂｅｒａｔｅ、ジスクシンイミジルスベレート）等のスクシンイミジル基を好ましくは２以上含む架橋剤、ＤＭＡ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ａｄｉｐｉｍｉｄａｔｅ・２ＨＣｌ、アジプイミド酸ジメチル二塩酸塩）、ＤＭＰ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｐｉｍｅｌｉｍｉｄａｔｅ・２  ＨＣｌ、ピメルイミド酸ジメチル二塩酸塩）、及びＤＭＳ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｂｅｒｉｍｉｄａｔｅ・２  ＨＣｌ、スベルイミド酸ジメチル二塩酸塩）等のイミド酸部分を好ましくは２以上含む架橋剤、並びにＤＴＢＰ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ３，３’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓｐｒｏｐｉｏｎｉｍｉｄａｔｅ・２ＨＣｌ、３，３’−ジチオビスプロピオンイミド酸ジメチル二塩酸塩）及びＤＳＰ（ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、ジチオビススクシンイミジルプロピオン酸）等のＳＳ結合を有する架橋剤が挙げられる（例、国際公開第２０１６／１８６２０６号）。
【００７４】
上記ペプチドは、末端にあるアミノ基およびカルボキシ基が保護されていてもよい。Ｎ−末端アミノ基の保護基としては、例えば、アルキルカルボニル基（アシル基）（例、アセチル基、プロポキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基等のブトキシカルボニル基）、アルキルオキシカルボニル基（例、フルオレニルメトキシカルボニル基）、アリールオキシカルボニル基、アリールアルキル（アラルキル）オキシカルボニル基（例、ベンジルオキシカルボニル基）が挙げられる。Ｎ−末端アミノ基の保護基としては、アセチル基が好ましい。Ｃ−末端カルボキシ基の保護基としては、例えば、エステルまたはアミドを形成可能な基が挙げられる。エステルまたはアミドを形成可能な基としては、例えば、アルキルオキシ基（例、メチルオキシ、エチルオキシ、プロピルオキシ、ブチルオキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ）、アリールオキシ基（例、フェニルオキシ、ナフチルオキシ）、アラルキルオキシ基（例、ベンジルオキシ）、アミノ基が挙げられる。Ｃ−末端カルボキシ基の保護基としては、アミノ基が好ましい。
【００７５】
１−３．リンカー（Ｌ）
式（Ｉ）において、Ｌは、切断性部分を含む２価の基である切断性リンカーである。
【００７６】
Ｌで表される切断性リンカーは、切断性部分を含む２価の基である。切断性部分は、タンパク質の変性・分解（例、アミド結合の切断）を引き起こし得ない条件（温和な条件）下での特定の処理により切断可能な部位である。したがって、切断性部分は、温和な条件下での特定の切断処理により切断可能な部位（アミド結合以外の結合）であるということができる。このような特定の処理としては、例えば、（ａ）酸性物質、塩基性物質、還元剤、酸化剤、酵素からなる群より選ばれる１種以上の物質による処理、（ｂ）光からなる群より選ばれる物理化学的刺激による処理、または（ｃ）自己分解性の切断性部分を含む切断性リンカーを用いた場合の放置が挙げられる。このような切断性リンカーおよびその切断条件は、当該分野における技術常識である（例、Ｇ．Ｌｅｒｉｃｈｅ，Ｌ．  Ｃｈｉｓｈｏｌｍ，Ａ．Ｗａｇｎｅｒ，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０，５７１（２０１２）；Ｆｅｎｇ  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ．１３２，１５００（２０１０）．；Ｂｅｓｓｏｄｅｓ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  ９９，４２３（２００４）．；ＤｅＳｉｍｏｎｅ，Ｊ．Ｍ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ．１３２，１７９２８（２０１０）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｄ．Ｈ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，９１，１８７（２００３）；Ｓｃｈｏｅｎｍａｒｋｓ，Ｒ．Ｇ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，９５，２９１（２００４））。このような切断性部分としては、例えば、ジスルフィド残基、アセタール残基、ケタール残基、エステル残基、カルバモイル残基、アルコキシアルキル残基、イミン残基、三級アルキルオキシカルバメート残基（例、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルバメート残基）、シラン残基、ヒドラゾン含有残基（例、ヒドラゾン残基、アシルヒドラゾン残基、ビスアリールヒドラゾン残基）、フォスフォルアミデート残基、アコニチル残基、トリチル残基、アゾ残基、ビシナルジオール残基、セレン残基、電子吸引基を有する芳香族環含有残基、クマリン含有残基、スルホン含有残基、不飽和結合含有鎖残基、グリコシル残基が挙げられる。
【００７７】
電子吸引基を有する芳香族環基は、アリール、アラルキル、芳香族複素環基、芳香族複素環基を有するアルキルからなる群より選ばれる芳香族環基を有するものが好ましく、アラルキル、芳香族複素環基を有するアルキルがより好ましい。電子吸引基は、環の２位に結合していることが好ましい。さらにより好ましくは、電子吸引基を有する芳香族環含有残基は、例えば、２位に電子吸引基を有するアラルキル（例、ベンジル）である。電子吸引基としては、例えば、ハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されたアルキル（例、トリフルオロメチル）、ボロン酸残基、メシル、トシル、トリフレート、ニトロ、シアノ、フェニル基、ケト基（例、アシル）が挙げられる。
【００７８】
切断性部分としての残基の名称に関連して接頭語、接尾語等の用語として見出されるアルキル、アシル（すなわち、アルキルカルボニル）、アルコキシ（すなわち、アルキルオキシ）、アリール、アラルキル等の基の定義、例、および好ましい例は、後述するものと同様である。
【００７９】
エステル残基としては、例えば、炭素原子および酸素原子から構成される通常のエステル残基〔例、アルキルエステル（例、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル等の三級アルキルオキシカルボニル）、アリールエステル（例、フェナシルエステル、２−（ジフェニルホスフィノ）ベンゾエート）、グリコシルエステル残基、オルトエステル残基〕、硫黄原子および酸素原子を含むエステル残基（例、α−チオフェニルエステル残基、アルキルチオエステル残基等のチオエステル残基）、リン原子および酸素原子を含むエステル残基（例、ホスホジエステル残基、ホスホトリエステル残基）、活性化エステル残基（例、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド残基）が挙げられる。
【００８０】
スルホン含有残基としては、例えば、スルホン残基、キノリニルベンゼンスルフォナート残基が挙げられる。
【００８１】
シラン残基は、好ましくは、アルキル、アリール、アラルキル、およびアルコキシからなる群より選ばれる基を有するシラン残基である。このようなシラン残基としては、例えば、ジアルキルジアルコキシシラン残基（例、ジメチルジアルコキシシラン、ジエチルジアルコキシシラン）、またはジアリールジアルコキシシラン残基（例、ジフェニルジアルコキシシラン）が挙げられる。
【００８２】
アルコキシアルキル（すなわち、アルキルオキシアルキル）残基としては、後述するアルキルオキシおよびアルキルを組み合せた基であり（アルキルオキシおよびアルキルの定義、例および好ましい例は、後述するものと同様）、例えば、メトキシメチル残基、エトキシメチル残基、メトキシエチル残基、エトキシエチル残基が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８３】
不飽和結合含有鎖残基は、炭素原子のみからなる不飽和結合部分を含む残基（例、炭素原子間二重結合を有する最小単位であるビニル（エテニル）、または炭素原子間三重結合を有する最小単位であるアセチレニル（エチニル））、または炭素原子およびヘテロ原子（例、窒素原子、硫黄原子、酸素原子）からなる不飽和結合部分（例、アルデヒド、シアノ）を含む残基である。不飽和結合含有鎖残基としては、例えば、ビニルエーテル残基、シアノエチル残基、エチレン残基、マロンジアルデヒド残基が挙げられる。
【００８４】
酸性物質（求電子試薬とも称される）としては、例えば、塩酸、硫酸、硝酸等の無機酸性物質、およびギ酸、酢酸、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンプロパンスルホン酸、３−モルホリノプロパンスルホン酸、リン酸二水素ナトリウム、クエン酸、ドデシル硫酸、Ｎ−ドデカノイルサルコシン酸、トリフルオロ酢酸等の有機酸性物質が挙げられる。酸性物質により切断可能な部位としては、例えば、アルキルオキシアリールアルキル残基、三級アルキルオキシカルバメート残基、アセタール残基、シラン残基、イミン残基、ビニルエーテル残基、β―チオプロピオネート残基、トリチル残基、ヒドラゾン残基、アコニチル残基、オルトエステル残基、カルバモイル残基、２−（ジフェニルホスフィノ）ベンゾエート残基が挙げられる。
【００８５】
塩基性物質（求核試薬とも称される）としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム等の無機塩基性物質、およびヒドロキシルアミン、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ‘−ジイソプロピルアミン等の有機塩基性物質が挙げられる。塩基性物質により切断可能な部位としては、例えば、シラン残基、シアノエチル残基、スルホン残基、エチレン残基、グリコシルジスクシネート残基、α−チオフェニルエステル残基、不飽和ビニルスルフィド残基、マロンジアルデヒド残基、アシルヒドラゾン残基、アルキルチオエステル残基が挙げられる。
【００８６】
還元剤としては、例えば、システイン、ジチオトレイトール、還元型グルタチオン、β−メルカプトエタノールが挙げられる。還元剤により切断可能な部位としては、例えば、ジスルフィド残基、アルコキシアルキル残基、アゾ残基が挙げられる。
【００８７】
酸化剤としては、例えば、過ヨウ素酸ナトリウム、酸化型グルタチオンが挙げられる。酸化剤により切断可能な部位としては、例えば、ビシナルジオール残基、セレン残基が挙げられる。
【００８８】
酵素としては、例えば、トリプシン、パパイン、ＴＥＶ、トロンビン、カテプシンＢ、カテプシンＤ、カテプシンＫ、カスパーゼ、プロテアーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ、リパーゼ、エンドグリコシターゼ、ＰＮガーゼＦが挙げられる。酵素により切断可能な部位としては、例えば、エステル残基、ホスホジエステル残基、グリコシル残基が挙げられる。
【００８９】
光により切断可能な部位としては、例えば、２−ニトロベンジル残基、フェナシルエステル残基、８−キノリンベンゼンスルホナート残基、クマリン残基、ホスホトリエステル残基、ビスアリールヒドラゾン残基、ビマンジチオプロピオン酸残基が挙げられる。
【００９０】
自己分解性の切断性部分としては、例えば、活性化エステル残基（例、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド残基）が挙げられる。
【００９１】
より具体的には、切断性部分は、下記からなる群より選ばれるいずれか一つの化学構造に対応していてもよい。
【化１６】
2019240287.tif 000017
〔ここで、結合に直交する波線は、切断部位を示し、
複数のＲ２ａ、複数のＲ２ｂ、および複数のＲ２ｃは、同一または異なって、水素原子、または後述する置換基からなる群より選ばれ、
Ｊは、−ＣＨ２−、−Ｏ−、または−Ｓ−であり、
ｒは、１〜４の任意の整数であり、
○（白丸）はＡ（または後述するＬａ）に対する結合を示し、●（黒丸）はＢ（または後述するＬｂ）に対する結合を示す。
化学構造が、切断部位を中心にして非対称である場合、●がＡ（または後述するＬａ）に対する結合を示し、○がＢ（または後述するＬｂ）に対する結合を示していてもよい。〕
【００９２】
Ｊは、−ＣＨ２−、−Ｏ−、または−Ｓ−である。ｊは、好ましくは−ＣＨ２−または−Ｏ−であり、より好ましくは好ましくは−ＣＨ２−である。
【００９３】
ｒは、１〜４の任意の整数であり、好ましくは１〜３の任意の整数であり、より好ましくは１または２である。
【００９４】
一実施形態では、切断性リンカーは、（ｉ）切断により生体直交性官能基を反応性基側に生成する能力を有する切断性部分を含む２価の基である切断性リンカー、もしくは（ｉｉ）切断により生体直交性官能基を反応性基側に生成する能力を有しない切断性部分を含む２価の基である切断性リンカーであってもよい。
【００９５】
（ｉ）の切断性部分としては、例えば、ジスルフィド残基、エステル残基、アセタール残基、ケタール残基、イミン残基、ビシナルジオール残基が挙げられる。
【００９６】
より具体的には、（ｉ）の切断性部分は、例えば、以下：
【化１７】
2019240287.tif 000018
〔ここで、結合に直交する波線は、切断部位を示し、
複数のＲ２ａは、同一または異なって、水素原子、または後述する置換基からなる群より選ばれ、
○（白丸）はＡ（または後述するＬａ）に対する結合を示し、●（黒丸）はＢ（または後述するＬｂ）に対する結合を示す。
化学構造が、切断部位を中心にして非対称である場合、●がＡ（または後述するＬａ）に対する結合を示し、○がＢ（または後述するＬｂ）に対する結合を示していてもよい。〕からなる群より選ばれるいずれか一つの化学構造に対応していてもよい。
【００９７】
（ｉｉ）の切断性部分としては、例えば、エステル残基、カルバモイル残基、アルコキシアルキル残基、イミン残基、三級アルキルオキシカルバメート残基、シラン残基、ヒドラゾン含有残基、フォスフォルアミデート残基、アコニチル残基、トリチル残基、アゾ残基、ビシナルジオール残基、セレン残基、電子吸引基を有する芳香族環含有残基、クマリン含有残基、スルホン含有残基、不飽和結合含有鎖残基、グリコシル残基が挙げられる。
【００９８】
より具体的には、（ｉｉ）の切断性部分は、例えば、以下：
【化１８】
2019240287.tif 000019
〔ここで、結合に直交する波線は、切断部位を示し、
複数のＲ２ｂ、複数のＲ２ｃ、Ｊ、ｒは、水素原子、または後述する置換基からなる群より選ばれ、
○（白丸）はＡ（または後述するＬａ）に対する結合を示し、●（黒丸）はＢ（または後述するＬｂ）に対する結合を示す。
化学構造が、切断部位を中心にして非対称である場合、●がＡ（または後述するＬａ）に対する結合を示し、○がＢ（または後述するＬｂ）に対する結合を示していてもよい。〕からなる群より選ばれるいずれか一つの化学構造に対応していてもよい。
【００９９】
特定の実施形態では、切断性リンカー（Ｌ）は、下記式（Ｌ１）〜（Ｌ３）のいずれか一つで表されてもよい：
Ｌａ−Ｃ−Ｌｂ      （Ｌ１）
Ｌａ−Ｃ            （Ｌ２）
Ｃ−Ｌｂ      （Ｌ３）
〔式中、
ＬａおよびＬｂは、それぞれ、２価の基であり、
Ｃは、切断性部分である。〕
【０１００】
２価の基としては、例えば、置換基を有していてもよい２価の炭化水素基、置換基を有していてもよい２価の複素環基、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＮＲａ−（Ｒａは水素原子、または置換基を示す）、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｓ）−、およびこれらの２以上（例えば２〜８、好ましくは２〜６、より好ましくは２〜４）の組み合わせからなる基が挙げられる。
【０１０１】
２価の炭化水素基としては、直鎖、分岐鎖、または環状の２価の炭化水素基であり、好ましくは直鎖または分岐鎖の２価の炭化水素基である。２価の炭化水素基としては、例えば、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリーレンが挙げられる。
【０１０２】
アルキレンとしては、炭素原子数１〜１２のアルキレンが好ましく、炭素原子数１〜６のアルキレンがより好ましく、炭素原子数１〜４のアルキレンが特に好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。アルキレンは、直鎖、分岐鎖、または環状のいずれであってもよいが、直鎖のアルキレンが好ましい。このようなアルキレンとしては、例えば、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、へキシレンが挙げられる。
【０１０３】
アルケニレンとしては、炭素原子数２〜１２のアルケニレンが好ましく、炭素原子数２〜６のアルケニレンがより好ましく、炭素原子数２〜４のアルケニレンが特に好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。アルケニレンは、直鎖、分岐鎖、または環状のいずれであってもよいが、直鎖のアルケニレンが好ましい。このようなアルケニレンとしては、例えば、エチレニレン、プロピニレン、ブテニレン、ペンテニレン、へキセニレンが挙げられる。
【０１０４】
アルキニレンとしては、炭素原子数２〜１２のアルキニレンが好ましく、炭素原子数２〜６のアルキニレンがより好ましく、炭素原子数２〜４のアルキニレンが特に好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。アルキニレンは、直鎖、分岐鎖、または環状のいずれであってもよいが、直鎖のアルキニレンが好ましい。このようなアルキニレンとしては、例えば、エチニレン、プロピニレン、ブチニレン、ペンチニレン、へキシニレンが挙げられる。
【０１０５】
アリーレンとしては、炭素原子数６〜２４のアリーレンが好ましく、炭素原子数６〜１８のアリーレンがより好ましく、炭素原子数６〜１４のアリーレンがさらに好ましく、炭素原子数６〜１０のアリーレンがさらにより好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。アリーレンとしては、例えば、フェニレン、ナフチレン、アントラセニレンが挙げられる。
【０１０６】
２価の複素環基は、２価の芳香族複素環基、または２価の非芳香族複素環基である。複素環を構成するヘテロ原子として、酸素原子、硫黄原子、窒素原子、リン原子、ホウ素原子およびケイ素原子からなる群から選択される１種以上を含むことが好ましく、酸素原子、硫黄原子および窒素原子からなる群から選択される１種以上を含むことがより好ましい。
【０１０７】
２価の芳香族複素環基としては、炭素原子数１〜２１の２価の芳香族複素環基が好ましく、炭素原子数１〜１５の２価の芳香族複素環基がより好ましく、炭素原子数１〜９の２価の芳香族複素環基がさらに好ましく、炭素原子数１〜６の２価の芳香族複素環基がさらにより好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。より具体的には、２価の芳香族複素環基としては、例えば、ピロールジイル、フランジイル、チオフェンジイル、ピリジンジイル、ピリダジンジイル、ピリミジンジイル、ピラジンジイル、トリアジンジイル、ピラゾールジイル、イミダゾールジイル、チアゾールジイル、イソチアゾールジイル、オキサゾールジイル、イソオキサゾールジイル、トリアゾールジイル、テトラゾールジイル、インドールジイル、プリンジイル、アントラキノンジイル、カルバゾールジイル、フルオレンジイル、キノリンジイル、イソキノリンジイル、キナゾリンジイル、およびフタラジンジイルが挙げられる。
【０１０８】
２価の非芳香族複素環基としては、炭素原子数２〜２１の非芳香族複素環基が好ましく、炭素原子数２〜１５の非芳香族複素環基がより好ましく、炭素原子数２〜９の非芳香族複素環基がさらに好ましく、炭素原子数２〜６の非芳香族複素環基がさらにより好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。より具体的には、２価の非芳香族複素環基としては、例えば、ピロールジオンジイル、ピロリンジオンジイル、オキシランジイル、アジリジンジイル、アゼチジンジイル、オキセタンジイル、チエタンジイル、ピロリジンジイル、ジヒドロフランジイル、テトラヒドロフランジイル、ジオキソランジイル、テトラヒドロチオフェンジイル、ピロリンジイル、イミダゾリジンジイル、オキサゾリジンジイル、ピペリジンジイル、ジヒドロピランジイル、テトラヒドロピランジイル、テトラヒドロチオピランジイル、モルホリンジイル、チオモルホリンジイル、ピペラジンジイル、ジヒドロオキサジンジイル、テトラヒドロオキサジンジイル、ジヒドロピリミジンジイル、およびテトラヒドロピリミジンジイルが挙げられる。
【０１０９】
ＬａおよびＬｂで表される２価の基は、例えば１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１もしくは２個の置換基を有していてもよい。このような置換基は、上記ＲａおよびＲｂで表される置換基と同様である。このような置換基としては、例えば、以下が挙げられる：
（ｉ）ハロゲン原子；
（ｉｉ）１価の炭化水素基；
（ｉｉｉ）アラルキル；
（ｉｖ）１価の複素環基；
（ｖ）Ｒｃ−Ｏ−、Ｒｃ−Ｃ（＝Ｏ）−、Ｒｃ−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、もしくはＲｃ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（Ｒｃは、水素原子、もしくは一価の炭化水素基を示す。）；または
（ｖｉ）ＮＲｄＲｅ−、ＮＲｄＲｅ−Ｃ（＝Ｏ）−、ＮＲｄＲｅ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、もしくはＲｄ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲｅ−（ＲｄおよびＲｅは、同一もしくは異なって、水素原子、もしくは一価の炭化水素基を示す。）；
（ｖｉｉ）ニトロ基、硫酸基、スルホン酸基、シアノ基、およびカルボキシル基。
【０１１０】
ハロゲン原子としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。
【０１１１】
１価の炭化水素基としては、例えば、１価の鎖状炭化水素基、１価の脂環式炭化水素基、および１価の芳香族炭化水素基が挙げられる。
【０１１２】
１価の鎖状炭化水素基とは、鎖状構造のみで構成された炭化水素基を意味し、主鎖に環状構造を含まない。ただし、鎖状構造は直鎖状であっても分岐状であってもよい。１価の鎖状炭化水素基としては、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニルが挙げられる。アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、直鎖状、または分岐状のいずれであってもよい。
【０１１３】
アルキルとしては、炭素原子数１〜１２のアルキルが好ましく、炭素原子数１〜６のアルキルがより好ましく、炭素原子数１〜４のアルキルがさらに好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。炭素原子数１〜１２のアルキルとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ドデシルが挙げられる。
【０１１４】
アルケニルとしては、炭素原子数２〜１２のアルケニルが好ましく、炭素原子数２〜６のアルケニルがより好ましく、炭素原子数２〜４のアルケニルがさらに好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。炭素原子数２〜１２のアルケニルとしては、例えば、ビニル、プロペニル、ｎ−ブテニルが挙げられる。
【０１１５】
アルキニルとしては、炭素原子数２〜１２のアルキニルが好ましく、炭素原子数２〜６のアルキニルがより好ましく、炭素原子数２〜４のアルキニルがさらに好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。炭素原子数２〜１２のアルキニルとしては、例えば、エチニル、プロピニル、ｎ−ブチニルが挙げられる。
【０１１６】
１価の鎖状炭化水素基としては、アルキルが好ましい。
【０１１７】
１価の脂環式炭化水素基とは、環構造として脂環式炭化水素のみを含み、芳香族環を含まない炭化水素基を意味し、脂環式炭化水素は単環、多環のいずれであってもよい。ただし、脂環式炭化水素のみで構成されている必要はなく、その一部に鎖状構造を含んでいてもよい。１価の脂環式炭化水素基としては、例えば、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニルが挙げられ、これらは、単環、多環のいずれであってもよい。
【０１１８】
シクロアルキルとしては、炭素原子数３〜１２のシクロアルキルが好ましく、炭素原子数３〜６のシクロアルキルがより好ましく、炭素原子数５〜６のシクロアルキルがさらに好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。炭素原子数３〜１２のシクロアルキルとしては、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルが挙げられる。
【０１１９】
シクロアルケニルとしては、炭素原子数３〜１２のシクロアルケニルが好ましく、炭素原子数３〜６のシクロアルケニルがより好ましく、炭素原子数５〜６のシクロアルケニルがさらに好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。炭素原子数３〜１２のシクロアルケニルとしては、例えば、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニルが挙げられる。
【０１２０】
シクロアルキニルとしては、炭素原子数３〜１２のシクロアルキニルが好ましく、炭素原子数３〜６のシクロアルキニルがより好ましく、炭素原子数５〜６のシクロアルキニルがさらに好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。炭素原子数３〜１２のシクロアルキニルとしては、例えば、シクロプロピニル、シクロブチニル、シクロペンチニル、シクロヘキシニルが挙げられる。
【０１２１】
１価の脂環式炭化水素基としては、シクロアルキルが好ましい。
【０１２２】
１価の芳香族炭化水素基とは、芳香族環構造を含む炭化水素基を意味する。ただし、芳香族環のみで構成されている必要はなく、その一部に鎖状構造や脂環式炭化水素を含んでいてもよく、芳香族環は単環、多環のいずれであってもよい。１価の芳香族炭化水素基としては、炭素原子数６〜１２のアリールが好ましく、炭素原子数６〜１０のアリールがより好ましく、炭素原子数６のアリールがさらに好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。炭素原子数６〜１２のアリールとしては、例えば、フェニル、ナフチルが挙げられる。
【０１２３】
１価の芳香族炭化水素基としては、フェニルが好ましい。
【０１２４】
これらの中でも、１価の炭化水素基としては、アルキル、シクロアルキル、アリールが好ましく、アルキルがより好ましい。
【０１２５】
アラルキルとは、アリールアルキルをいう。アリールアルキルにおけるアリールおよびアルキルの定義、例および好ましい例は、上述したとおりである。アラルキルとしては、炭素原子数３〜１５のアラルキルが好ましい。このようなアラルキルとしては、例えば、ベンゾイル、フェネチル、ナフチルメチル、ナフチルエチルが挙げられる。
【０１２６】
１価の複素環基とは、複素環式化合物の複素環から水素原子１個を除いた基をいう。１価の複素環基は、１価の芳香族複素環基、または１価の非芳香族複素環基である。複素環基を構成するヘテロ原子として、酸素原子、硫黄原子、窒素原子、リン原子、ホウ素原子及びケイ素原子からなる群から選択される１種以上を含むことが好ましく、酸素原子、硫黄原子及び窒素原子からなる群から選択される１種以上を含むことがより好ましい。
【０１２７】
１価の芳香族複素環基としては、炭素原子数１〜１５の芳香族複素環基が好ましく、炭素原子数１〜９の芳香族複素環基がより好ましく、炭素原子数１〜６の芳香族複素環基がさらに好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。１価の芳香族複素環基としては、例えば、ピロリル、フラニル、チオフェニル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、ピラゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、インドリル、プリニル、アントラキノリル、カルバゾニル、フルオレニル、キノリニル、イソキノリニル、キナゾリニル、及びフタラジニルが挙げられる。
【０１２８】
１価の非芳香族複素環基としては、炭素原子数２〜１５の非芳香族複素環基が好ましく、炭素原子数２〜９の非芳香族複素環基がより好ましく、炭素原子数２〜６の非芳香族複素環基がさらに好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。１価の非芳香族複素環基としては、例えば、オキシラニル、アジリジニル、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、ピロリジニル、ジヒドロフラニル、テトラヒドロフラニル、ジオキソラニル、テトラヒドロチオフェニル、ピロリニル、イミダゾリジニル、オキサゾリジニル、ピペリジニル、ジヒドロピラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ピペラジニル、ジヒドロオキサジニル、テトラヒドロオキサジニル、ジヒドロピリミジニル、及びテトラヒドロピリミジニルが挙げられる。
【０１２９】
これらの中でも、１価の複素環基としては、５員または６員の複素環基が好ましい。
【０１３０】
好ましくは、置換基は、以下であってもよい：
（ｉ’）ハロゲン原子；
（ｉｉ’）炭素原子数１〜１２のアルキル、フェニル、もしくはナフチル；
（ｉｉｉ’）炭素原子数３〜１５のアラルキル；
（ｉｖ’）５員または６員の複素環；
（ｖ’）Ｒｃ−Ｏ−、Ｒｃ−Ｃ（＝Ｏ）−、Ｒｃ−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、もしくはＲｃ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（Ｒｃは、水素原子、もしくは炭素原子数１〜１２のアルキルを示す。）；または
（ｖｉ’）ＮＲｄＲｅ−、ＮＲｄＲｅ−Ｃ（＝Ｏ）−、ＮＲｄＲｅ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、もしくはＲｄ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲｅ−（ＲｄおよびＲｅは、同一もしくは異なって、水素原子、もしくは炭素原子数１〜１２のアルキルを示す。）；
（ｖｉｉ’）上記（ｖｉｉ）で列挙したものと同じ基。
【０１３１】
より好ましくは、置換基は、以下であってもよい：
（ｉ’’）ハロゲン原子；
（ｉｉ’’）炭素原子数１〜１２のアルキル；
（ｉｉｉ’’）Ｒｃ−Ｏ−、Ｒｃ−Ｃ（＝Ｏ）−、Ｒｃ−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、もしくはＲｃ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（Ｒｃは、水素原子、もしくは炭素原子数１〜１２のアルキルを示す。）；または
（ｉｖ’’）ＮＲｄＲｅ−、ＮＲｄＲｅ−Ｃ（＝Ｏ）−、ＮＲｄＲｅ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、もしくはＲｄ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲｅ−（ＲｄおよびＲｅは、同一もしくは異なって、水素原子、もしくは炭素原子数１〜１２のアルキルを示す。）；
（ｖ’’）上記（ｖｉｉ）で列挙したものと同じ基。
【０１３２】
さらにより好ましくは、置換基は、以下であってもよい：
（ｉ’’’）ハロゲン原子；
（ｉｉ’’’）炭素原子数１〜６のアルキル；
（ｉｉｉ’’’）Ｒｃ−Ｏ−、Ｒｃ−Ｃ（＝Ｏ）−、Ｒｃ−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、もしくはＲｃ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（Ｒｃは、水素原子、もしくは炭素原子数１〜６のアルキルを示す。）；または
（ｉｖ’’’）ＮＲｄＲｅ−、ＮＲｄＲｅ−Ｃ（＝Ｏ）−、ＮＲｄＲｅ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、もしくはＲｄ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲｅ−（ＲｄおよびＲｅは、同一もしくは異なって、水素原子、もしくは炭素原子数１〜６のアルキルを示す。）；
（ｖ’’’）上記（ｖｉｉ）で列挙したものと同じ基。
【０１３３】
特に好ましくは、置換基は、以下であってもよい：
（ｉ’’’’）ハロゲン原子；
（ｉｉ’’’’）炭素原子数１〜４のアルキル；
（ｉｉｉ’’’’）Ｒｃ−Ｏ−、Ｒｃ−Ｃ（＝Ｏ）−、Ｒｃ−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、もしくはＲｃ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（Ｒｃは、水素原子、もしくは炭素原子数１〜４のアルキルを示す。）；または
（ｉｖ’’’’）ＮＲｄＲｅ−、ＮＲｄＲｅ−Ｃ（＝Ｏ）−、ＮＲｄＲｅ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、もしくはＲｄ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲｅ−（ＲｄおよびＲｅは、同一もしくは異なって、水素原子、もしくは炭素原子数１〜４のアルキルを示す。）；
（ｖ’’’’）上記（ｖｉｉ）で列挙したものと同じ基。
【０１３４】
特定の実施形態では、ＬａおよびＬｂは、それぞれ、下記（Ｌａ’）および（Ｌｂ’）：
【化１９】
2019240287.tif 000020
〔式中、
ｐおよびｐ’は、同一または異なって、０〜１０の任意の整数であり、
ｑおよびｑ’は、同一または異なって、０〜１０の任意の整数であり、
ＸおよびＸ’は、同一または異なって、炭素原子、窒素原子、または単結合（ここで、Ｘが窒素原子である場合、Ｒ１ｂは存在せず、Ｘ’が窒素原子である場合、Ｒ１ｂ’は存在しない。Ｘが単結合である場合、Ｒ１ａおよびＲ１ｂは存在せず、Ｘ’が単結合である場合、Ｒ１ａ’およびＲ１ｂ’は存在しない）であり、
Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ａ’およびＲ１ｂ’は、同一または異なって、水素原子、または上述する置換基からなる群より選ばれる。〕で表されてもよい。
【０１３５】
ｐおよびｐ’は、同一または異なって、０〜１０の任意の整数であり、好ましくは０〜８の整数であり、より好ましくは０〜６の整数であり、さらにより好ましくは０〜４の整数であり、特に好ましくは０、１または２である。好ましくは、ｐおよびｐ’は、同一である。
【０１３６】
ｑおよびｑ’は、同一または異なって、０〜１０の任意の整数であり、好ましくは０〜８の整数であり、より好ましくは０〜６の整数であり、さらにより好ましくは０〜４の整数であり、特に好ましくは０、１または２である。好ましくは、ｑおよびｑ’は、同一である。
【０１３７】
ＸおよびＸ’は、同一または異なって、炭素原子、窒素原子、または単結合であり、好ましくは炭素原子または単結合である。好ましくは、ＸおよびＸ’は、同一である。
【０１３８】
Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ａ’およびＲ１ｂ’は、同一または異なって、水素原子、または後述する置換基からなる群より選ばれる。置換基の定義、例、および好ましい例は、上述したとおりである。好ましくは、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ａ’およびＲ１ｂ’は、水素原子である。
【０１３９】
１−４．（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基、または（ｂ）生体直交性官能基を含まない２価の基（Ｂ）
式（Ｉ）において、Ｂは、（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基、または（ｂ）生体直交性官能基を含まない２価の基である。
【０１４０】
生体直交性官能基とは、生体構成成分（例、アミノ酸、核酸、脂質、糖、リン酸）とは反応しない、もしくは生体構成成分に対する反応の速度が遅いが、生体構成成分以外の成分に対して選択的に反応する基をいう。生体直交性官能基は、当該技術分野において周知である（例、Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ  Ｋ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４０，２００４（２０１５）；Ｂｅｒｔｏｚｚｉ  Ｃ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９１，２３５７（２００１）；Ｂｅｒｔｏｚｚｉ  Ｃ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １，１３（２００５）を参照）。
【０１４１】
親和性物質の標的が抗体である場合、生体直交性官能基は、タンパク質に対する生体直交性官能基である。タンパク質に対する生体直交性官能基とは、タンパク質を構成する天然の２０種のアミノ酸残基の側鎖と反応せずに、所定の官能基と反応する基である。タンパク質を構成する天然の２０種のアミノ酸は、アラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、バリン（Ｖ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、およびリジン（Ｌ）である。これらの天然の２０種のアミノ酸のうち、側鎖がない（すなわち、水素原子である）グリシン、ならびに側鎖が炭化水素基である（すなわち、硫黄原子、窒素原子、および酸素原子からなる群より選ばれるヘテロ原子を側鎖に含まない）アラニン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、およびバリンは、通常の反応に対して不活性である。したがって、タンパク質に対する生体直交性官能基は、通常の反応に対して不活性である側鎖を有するこれらのアミノ酸の側鎖に加えて、アスパラギン、グルタミン、メチオニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン、およびリジンの側鎖に対しても反応できない官能基である。
【０１４２】
タンパク質に対して反応できないこのような生体直交性官能基としては、例えば、アジド残基、アルデヒド残基、チオール残基、アルケン残基（換言すれば、炭素原子間二重結合を有する最小単位であるビニレン（エテニレン）部分を有していればよい。以下同様）、アルキン残基（換言すれば、炭素原子間三重結合を有する最小単位であるエチニレン部分を有していればよい。以下同様）、ハロゲン残基、テトラジン残基、ニトロン残基、ヒドロキシルアミン残基、ニトリル残基、ヒドラジン残基、ケトン残基、ボロン酸残基、シアノベンゾチアゾール残基、アリル残基、ホスフィン残基、マレイミド残基、ジスルフィド残基、チオエステル残基、α−ハロカルボニル残基（例、α位にフッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子を有するカルボニル残基。以下同様）、イソニトリル残基、シドノン残基、セレン残基が挙げられる。タンパク質としては、遊離のチオール（システイン）を含み得るタンパク質（例、抗体以外のタンパク質）、および遊離のチオールを含み得ないタンパク質（例、抗体）が存在する。遊離のチオールを含み得ないタンパク質においては、チオールが生体直交性官能基として機能する。したがって、親和性物質の標的が、遊離のチオールを含み得ない抗体であることから、生体直交性官能基にはチオールが含まれる。１種または２種以上（例、２種、３種、４種）の生体直交性官能基が２価の基に含まれていてもよいが、好ましくは、１種の生体直交性官能基が２価の基に含まれていてもよい。
【０１４３】
一実施形態では、生体直交性官能基を含む２価の基は、アジド残基、アルデヒド基、チオール残基、アルキン残基、アルケン残基、テトラジン残基、ニトロン残基、ヒドロキシルアミン残基、ニトリル残基、ヒドラジン残基、ケトン残基、ボロン酸残基、シアノベンゾチアゾール残基、アリル残基、ホスフィン残基、マレイミド残基、ジスルフィド残基、チオエステル残基、α−ハロカルボニル残基、イソニトリル残基、シドノン残基、セレン残基からなる群より選ばれる生体直交性官能基を主鎖に含む２価の基であってもよい。
【０１４４】
別の実施形態では、生体直交性官能基を含む２価の基は、アジド残基、アルデヒド残基、チオール残基、アルキン残基、アルケン残基、ハロゲン残基、テトラジン残基、ニトロン残基、ヒドロキシルアミン残基、ニトリル残基、ヒドラジン残基、ケトン残基、ボロン酸残基、シアノベンゾチアゾール残基、アリル残基、ホスフィン残基、マレイミド残基、ジスルフィド残基、α−ハロカルボニル残基、イソニトリル残基、シドノン残基、セレン残基からなる群より選ばれる生体直交性官能基を側鎖に含む２価の基であってもよい。
【０１４５】
より具体的には、生体直交性官能基は、下記からなる群より選ばれるいずれか一つの化学構造に対応していてもよい。
【化２０】
2019240287.tif 000021
〔式中、
Ｒ１ｆ、単一もしくは複数のＲ１ｇおよび単一もしくは複数のＲ１ｈは、同一もしくは異なって、前記（ｉ）〜（ｖｉｉ）からなる群より選ばれる原子もしくは基、または電子吸引基であり、
・は、結合手である。）
【０１４６】
電子吸引基としては、例えば、上述したものが挙げられるが、ハロゲン原子、ボロン酸残基、メシル、トシル、トリフレートが好ましい。
【０１４７】
一実施形態では、Ｂは、（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基であってもよい。２価の基に含まれる生体直交性官能基の数は、単一または複数であり、例えば１〜５、好ましくは１〜３、より好ましくは１または２、さらにより好ましくは１である。２価の基に含まれる生体直交性官能基の数が複数である場合、複数の生体直交性官能基は、同種であっても異種であってもよいが、単純な構造の採用等の観点では、同種であることが好ましい。
【０１４８】
特定の実施形態では、Ｂは、（ａ１）生体直交性官能基を主鎖に含む２価の基であってもよい。生体直交性官能基を主鎖に含む２価の基は、アジド残基、アルデヒド基、チオール残基、アルキン残基、アルケン残基、テトラジン残基、ニトロン残基、ヒドロキシルアミン残基、ニトリル残基、ヒドラジン残基、ケトン残基、ボロン酸残基、シアノベンゾチアゾール残基、アリル残基、ホスフィン残基、マレイミド残基、ジスルフィド残基、チオエステル残基、α−ハロカルボニル残基、イソニトリル残基、シドノン残基、セレン残基からなる群より選ばれる生体直交性官能基自体を２価の基とするもの、またはこのような２価の生体直交性官能基のいずれか一方の末端または両端に上述した２価の基が連結されている基である。連結されるべき２価の基の定義、例および好ましい例は、上述した２価の基と同様である。
【０１４９】
別の特定の実施形態では、Ｂは、（ａ２）生体直交性官能基を側鎖に含む２価の基であってもよい。生体直交性官能基を側鎖に含む２価の基は、アジド残基、アルデヒド残基、チオール残基、アルキン残基、アルケン残基、ハロゲン残基、テトラジン残基、ニトロン残基、ヒドロキシルアミン残基、ニトリル残基、ヒドラジン残基、ケトン残基、ボロン酸残基、シアノベンゾチアゾール残基、アリル残基、ホスフィン残基、マレイミド残基、ジスルフィド残基、α−ハロカルボニル残基、イソニトリル残基、シドノン残基、セレン残基からなる群より選ばれる生体直交性官能基またはそれを含む基で置換された２価の基である。置換されるべき２価の基の定義、例および好ましい例は、上述した２価の基と同様である。
【０１５０】
別の実施形態では、Ｂは、（ｂ）生体直交性官能基を含まない２価の基であってもよい。このような２価の基は、置換されていてもよいアルキレン、置換されていてもよいシクロアルキレン、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよい２価の複素環基、−ＮＲａ−（Ｒａは水素原子、または置換基を示す）、−Ｏ−、およびこれらの２以上の組み合わせ（例えば２〜８、好ましくは２〜６、より好ましくは２〜４）からなる基であってもよい。置換されていてもよい場合の置換基、およびＲａの置換基は、生体直交性官能基以外の置換基である。このような置換基としては、例えば、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、１価の複素環基、ヒドロキシル、アミノ、アルキルオキシ（アルコキシ）、シクロアルキルオキシ、アラルキルオキシが挙げられる。このような置換基の数は、例えば１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１もしくは２個、さらにより好ましくは１個である。
【０１５１】
生体直交性官能基以外の置換基について、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、１価の複素環基の定義、例および好ましい例は、上述したとおりである。
【０１５２】
生体直交性官能基以外の置換基について、アルキルオキシ（アルコキシ）におけるアルキル、シクロアルキルオキシにおけるシクロアルキル、およびアラルキルオキシにおけるアラルキルの定義、例および好ましい例は、上述したとおりである。より具体的には、アルキルオキシとしては、例えば、メチルオキシ、エチルオキシ、プロピルオキシ（例、ｎ−プロピルオキシ、ｉｓｏ−プロピルオキシ）、ブチルオキシ（例、ｎ−ブチルオキシ、ｉｓｏ−ブチルオキシ、ｓｅｃ−ブチルオキシ、ｔｅｒｔ−ブチルオキシ）、ペンチルオキシ（例、ｎ−ペンチルオキシ）、ヘキシルオキシ（例、ｎ−ヘキシルオキシ）が挙げられる。シクロアルキルオキシとしては、例えば、シクロプロピルオキシ、シクロブチルオキシ、シクロペンチルオキシ、シクロヘキシルオキシが挙げられる。アラルキルオキシとしては、例えば、ベンゾイルオキシ、フェネチルオキシ、ナフチルメチルオキシ、ナフチルエチルオキシが挙げられる。
【０１５３】
生体直交性官能基を含まない２価の基はまた、反応に対して高度に不活性な基であってもよい。したがって、このような２価の基は、炭素原子および水素原子のみから構成される基であってもよい。このような２価の基は、アルキレン、シクロアルキレン、またはアリール、およびこれらの２以上の組み合わせ（例えば２または３）である。生体直交性官能基を含まない２価の基が反応に対して高度に不活性な基である場合、このような２価の基は、反応に対して高度に不活性な置換基として、アルキレン、シクロアルキレン、およびアリールからなる群より選ばれる置換基を有していてもよい。反応に対して高度に不活性な置換基の数は、例えば１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１もしくは２個である。
【０１５４】
特定の実施形態では、Ｂは、下記式（Ｂ−１）：
【化２１】
2019240287.tif 000022
〔式中、
Ｙは、−ＮＨ−、−Ｏ−、−ＣＨ２−、または下記式（Ｂ−２）：
【化２２】
2019240287.tif 000023
（式中、
ＶおよびＶ’は、同一または異なって、−ＮＨ−、−Ｏ−、−ＣＨ２−、または単結合であり、
Ｖ１は、（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基、または（ｂ）生体直交性官能基を含まない２価の基であり、
ｓは、０〜１０の任意の整数であり、
式（Ｂ−２）における○および●は、それぞれ、式（Ｂ−１）における○および●と同じ配向である。）であり、
Ｚは、酸素原子、硫黄原子、または水素原子（Ｚが水素原子である場合、−Ｃ（＝Ｚ）−は、−ＣＨ２−を示す。）であり、
式（Ｂ−１）における○（白丸）は、Ｌ側の部分に対する結合を示し、●（黒丸）はＲ側の部分に対する結合を示す。〕で表されてもよい。
【０１５５】
Ｙは、−ＮＨ−、−Ｏ−、−ＣＨ２−、または上記式（Ｂ−２）で表される基である。構造の簡便化等の観点から、Ｙは、−ＮＨ−、−Ｏ−、または−ＣＨ２−であってもよい。あるいは、炭素原子を基調とした構造の設計等の観点からは、Ｙは、−ＣＨ２−、または上記式（Ｂ−２）で表される基であってもよい。
【０１５６】
Ｚは、酸素原子、硫黄原子、または水素原子であるが、好ましくは酸素原子または硫黄原子である。
【０１５７】
ＶおよびＶ’は、−ＮＨ−、−Ｏ−、−ＣＨ２−、または単結合であり、好ましくは−ＣＨ２−、または単結合である。
【０１５８】
Ｖ１は、（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基、または（ｂ）生体直交性官能基を含まない２価の基である。このような２価の基は、上述したものと同様である。
【０１５９】
好ましくは、Ｖ１における２価の基は、置換されていてもよい２価の炭化水素基、または置換されていてもよい２価の複素環基である。２価の炭化水素基の定義、例および好ましい例は、上述したものと同様であるが、Ｖ１の場合、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、シクロアルキレン、シクロアルケニレン、シクロアルキニレン、アリーレンが好ましい。例えば、生体直交性官能基を含有する部分で置換されていない場合、アルケニレン、アルキニレン、シクロアルケニレン、シクロアルキニレンが好ましい。一方、生体直交性官能基を含有する部分で置換されている場合、アルキレン、シクロアルキレン、アリーレンが好ましい。これらの基の例および好ましい例は、上述したとおりである。２価の複素環基の定義、例および好ましい例は、上述したものと同様であるが、Ｖ１の場合、５員または６員の複素環基が好ましい。５員または６員の複素環基の例および好ましい例は、上述したものと同様である。置換基の定義、例および好ましい例は、上述したとおりである。Ｖ１は、（ａ）生体直交性官能基を、例えば１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１個または２個、さらにより好ましくは１個有していてもよい。２価の基に含まれる生体直交性官能基の数が複数である場合、複数の生体直交性官能基は、同種であっても異種であってもよい。単純な構造の採用、および反応性の向上等の観点では、同種であることが好ましい。差別化された反応の確保等の観点では、異種であることが好ましい。Ｖ１はまた、（ｂ）置換基を１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１もしくは２個を有していてもよい。
【０１６０】
ｓは、０〜１０の任意の整数であり、好ましくは０〜８の整数であり、より好ましくは０〜６の整数であり、さらにより好ましくは０〜４の整数であり、特に好ましくは０、１または２である。
【０１６１】
さらに特定の実施形態では、Ｖ１は、下記式（Ｂ−３）：
【化２３】
2019240287.tif 000024
〔式中、
ＧおよびＧ’は、同一または異なって、−ＮＨ−、−Ｏ−、−ＣＨ２−、単結合、または下記式（Ｂ−４）：
【化２４】
2019240287.tif 000025
（式中、
ＷおよびＷ’は、同一または異なって、−ＮＨ−、−Ｏ−、−ＣＨ２−、または単結合であり、
Ｗ１は、（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基、または（ｂ）生体直交性官能基を含まない２価の基であり、
ｔは、０〜１０の任意の整数である。
式（Ｂ−４）における○（白丸）は、式（Ｂ−３）における結合手（・）の方向に対する結合を示し、●（黒丸）はｂ側の方向に対する結合を示す。）で表される基であり、
Ｈは、−ＣＨ２−、−Ｃ＝Ｏ−、−Ｃ＝Ｓ−、−ＮＨ−、または単結合であり、
Ｉは、２価の炭化水素基、２価の複素環、または単結合であり、
ｂは、下記：
【化２５】
2019240287.tif 000026
（式中、
Ｒ１ｆ、単一もしくは複数のＲ１ｇおよび単一もしくは複数のＲ１ｈは、同一もしくは異なって、前記（ｉ）〜（ｖｉｉ）からなる群より選ばれる原子もしくは基、または電子吸引基であり、
・は、結合手である。）で表されるいずれか一つの基である。〕で表される基を側鎖として有する２価の基であってもよい。このような２価の基は、２価の炭化水素基、または２価の複素環基であり、好ましくは、置換されていてもよい２価の炭化水素基であり、より好ましくは、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、シクロアルキレン、シクロアルケニレン、シクロアルキニレン、またはアリーレンであり、さらより好ましくは、アルキレン、シクロアルキレン、またはアリーレンであり、特に好ましくはアルキレンである。これらの基の例および好ましい例は、上述したとおりである。これらの基は、上記側鎖以外の置換基で置換されていてもよい。このような置換基の数は、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１もしくは２個である。置換基の例および好ましい例は、上述したとおりである。
【０１６２】
ＧおよびＧ’は、同一または異なって、−ＮＨ−、−Ｏ−、−ＣＨ２−、単結合、または上記式（Ｂ−４）で表される基である。構造の簡便化等の観点から、ＧおよびＧ’は、−ＮＨ−、−Ｏ−、−ＣＨ２−、または単結合であってもよい。あるいは、炭素原子を基調とした構造の設計等の観点からは、ＧおよびＧ’は、−ＣＨ２−、単結合、または上記式（Ｂ−４）で表される基であってもよい。
【０１６３】
Ｈは、−ＣＨ２−、−Ｃ＝Ｏ−、−Ｃ＝Ｓ−、−ＮＨ−、または単結合である。好ましくは、Ｈは、−ＣＨ２−、または単結合である。
【０１６４】
Ｉは、２価の炭化水素基、２価の複素環、または単結合である。２価の炭化水素基、および２価の複素環は、置換基で置換されていても、置換されていなくてもよい。２価の炭化水素基、２価の複素環、および置換基の定義、例および好ましい例は、Ｖ１において上述したものと同様である。
【０１６５】
ＷおよびＷ’は、同一または異なって、−ＮＨ−、−Ｏ−、−ＣＨ２−、または単結合であり、好ましくは−ＣＨ２−、または単結合である。
【０１６６】
Ｗ１は、（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基、または（ｂ）生体直交性官能基を含まない２価の基である。このような２価の基は、上述したものと同様である。
【０１６７】
ｔは、０〜１０の任意の整数であり、好ましくは０〜８の整数であり、より好ましくは０〜６の整数であり、さらにより好ましくは０〜４の整数であり、特に好ましくは０、１または２である。
【０１６８】
１−５．反応性基（Ｒ）
式（Ｉ）において、Ｒは、抗体に対する反応性基である。このような反応性基は、当該技術分野において技術常識である。
【０１６９】
反応性基は、生体直交性官能基と同種または異種の基である。
【０１７０】
例えば、Ｂが、（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基である場合、反応性基は、その生体直交性官能基と異種の基であってもよい。反応性基が生体直交性官能基と同種の基であれば、抗体に対する反応性基の反応特異性が確保されないためである。また、そもそも生体直交性官能基は、抗体を構成する天然の２０種のアミノ酸残基の側鎖と反応し得ない基のためである。
【０１７１】
より具体的には、タンパク質を構成する上述したような天然の２０種のアミノ酸のうち、側鎖がないグリシン、ならびに側鎖が炭化水素基であるアラニン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、およびバリンは、通常の反応に対して不活性である。したがって、タンパク質に対する反応性基は、アスパラギン、グルタミン、メチオニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン、およびリジンからなる１４種のアミノ酸のいずれか１種または２種以上（例、２種、３種、４種）の側鎖に対して反応できる基である。タンパク質のアミノ酸組成等の条件に応じて、１種または２種以上（例、２種、３種、４種）の反応性基が式（Ｉ）で表される化合物に含まれていてもよいが、好ましくは、１種の反応性基が式（Ｉ）で表される化合物に含まれていてもよい。
【０１７２】
好ましくは、反応性基は、タンパク質を構成する上述したような１４種のアミノ酸のうちのいずれか１種のアミノ酸の側鎖と反応できる基である。
【０１７３】
より好ましくは、反応性基は、リジン、チロシン、トリプトファン、またはシステインのいずれか１種のアミノ酸の側鎖に対して特異的な反応性基であってもよい。
【０１７４】
さらにより好ましくは、反応性基は、リジン、チロシン、またはトリプトファンのいずれか１種のアミノ酸の側鎖に対して特異的な反応性基であってもよい。
【０１７５】
また、タンパク質がヒトＩｇＧ１等のヒトＩｇＧである場合、反応性基は、リジンまたはチロシンの側鎖に対して特異的な反応性基であることが好ましい。
【０１７６】
リジン残基の側鎖に対して特異的な反応性基は、リジン残基の側鎖中に存在するアミノ基（ＮＨ２）と特異的に反応できる基であり、例えば、活性化エステル残基（例、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド残基）、ビニルスルホン残基、スルホニルクロライド残基、イソシアネート残基、イソチオシアネート残基、アルデヒド残基、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸残基、２−イミノ−２−メトキシエチル残基、ジアゾニウムテレフタル酸残基が挙げられる。
【０１７７】
リジン残基の側鎖に対して特異的な上述の反応性基と、リジン残基の側鎖中に存在するアミノ基（ＮＨ２）との間の反応により生成する連結部分としては、例えば、アミド残基、ウレア残基、ピリジン残基、カルバメート残基、スルホンアミド残基が挙げられる。
【０１７８】
より具体的には、リジン残基の側鎖に対して特異的な反応性基は、下記からなる群より選ばれるいずれか一つの化学構造に対応していてもよい。
【化２６】
2019240287.tif 000027
〔ここで、
Ｒ５ａおよびＲ５cは、水素原子、または上述した置換基であり、
Ｒ５ｂは、電子吸引基であり、
ｊは、１〜５の任意の整数であり、
ｋは、１〜４の任意の整数である。〕
【０１７９】
Ｒ５ａおよびＲ５cは、水素原子、または上述した置換基である。置換基の定義、例、および好ましい例は、上述したものと同様である。
【０１８０】
Ｒ５ｂは、電子吸引基である。このような電子吸引基としては、例えば、上述したものが挙げられるが、ハロゲン原子、ボロン酸残基、メシル、トシル、トリフレートが好ましい。
【０１８１】
ｊは、１〜５の任意の整数であり、好ましくは１〜３の整数であり、より好ましくは１または２である。
【０１８２】
ｋは、１〜４の任意の整数であり、好ましくは１〜３の整数であり、より好ましくは１または２である。
【０１８３】
リジン残基の側鎖に対して特異的な反応性基である上記化学構造と、リジン残基の側鎖中に存在するアミノ基（ＮＨ２）との間の反応により生成する連結部分は、下記からなる群より選ばれるいずれか一つの化学構造に対応していてもよい。
【化２７】
2019240287.tif 000028
〔ここで、●（黒丸）は、Ｔ側の部分に対する結合を示し、○（白丸）は、Ｂ側の部分に対する結合を示す。結合に直交する直線は、反応により生成する結合を示す。〕
【０１８４】
チロシン残基の側鎖に対して特異的な反応性基は、チロシン残基の側鎖中に存在するフェノール性ヒドロキシル基（ＯＨ）のオルト位の原子と特異的に反応できる基であり、例えば、ジアゾニウム残基、ジアゾジカルボキレート残基、２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピラジン−６−オン残基が挙げられる。
【０１８５】
より具体的には、チロシン残基の側鎖に対して特異的な反応性基は、下記からなる群より選ばれるいずれか一つの化学構造に対応していてもよい。
【化２８】
2019240287.tif 000029
〔ここで、Ｒ４ａは、水素原子、または上述した置換基であり、○は、Ｂに対する結合を示す。〕
【０１８６】
Ｒ４ａは、水素原子、または上述した置換基である。置換基の定義、例、および好ましい例は、上述したものと同様である。
【０１８７】
チロシン残基の側鎖に対して特異的な反応性基である上記化学構造と、チロシン残基の側鎖中に存在するフェノール性ヒドロキシル基（ＯＨ）のオルト位の原子との間の反応により生成する連結部分は、下記からなる群より選ばれるいずれか一つの化学構造に対応していてもよい。
【化２９】
2019240287.tif 000030
〔ここで、Ｒ４ａは、水素原子、または上述した置換基であり、●は、Ｔに対する結合を示し、○は、Ｂに対する結合を示す。〕
【０１８８】
Ｒ４ａは、水素原子、または上述した置換基である。置換基の定義、例、および好ましい例は、上述したものと同様である。
【０１８９】
トリプトファン残基の側鎖に対して特異的な反応性基は、トリプトファン残基の側鎖中に存在するインドール基の３位の環構成原子と特異的に反応できる基であり、例えば、９−アザビシクロ［３．３．１］ノナン−３−オン−Ｎ−オキシル残基が挙げられる。
【０１９０】
より具体的には、トリプトファン残基の側鎖に対して特異的な反応性基は、下記からなる群より選ばれるいずれか一つの化学構造に対応していてもよい。
【化３０】
2019240287.tif 000031
〔ここで、○は、Ｂに対する結合を示す。〕
【０１９１】
トリプトファン残基の側鎖に対して特異的な反応性基である上記化学構造と、トリプトファン残基の側鎖中に存在するインドール基の３位の環構成原子との間の反応により生成する連結部分は、下記からなる群より選ばれるいずれか一つの化学構造に対応していてもよい。
【化３１】
2019240287.tif 000032
〔ここで、●は、Ｔに対する結合を示し、○は、Ｂに対する結合を示す。〕
【０１９２】
特に好ましくは、反応性基は、リジンの側鎖に対して特異的な反応性基であってもよい。
【０１９３】
１−６．部分構造「Ｌ−Ｂ」
１−６−１．ＡおよびＲを連結する部分構造「Ｌ−Ｂ」中の主鎖の長さ
式（Ｉ）において、Ａ（親和性物質）およびＲ（反応性基）を連結する主鎖（Ｌ−Ｂ中の直鎖部分）の長さは、抗体および親和性物質の種類、ならびに抗体における親和性物質の標的部位と、Ｒが反応して結合すべきである、上述したような標的領域（例、特定の位置）中の特定のアミノ酸残基の位置および数との関係などの種々の因子に応じて、適宜設計することができる。式（Ｉ）で表される化合物は、親和性物質が抗体に会合し、次いで、Ｌ−Ｂを介して親和性物質と共有結合している反応性基が、上記標的部位の近傍に存在する特定のアミノ酸残基の側鎖中の基（例、リジン残基の側鎖中のアミノ基）と反応することにより、抗体と共有結合することができる。このとき、Ｒが反応して結合すべきである特定のアミノ酸残基の近傍領域、上記標的部位の近傍領域、および当該特定のアミノ酸残基と上記標的部位との間の領域において当該特定のアミノ酸残基が他に存在しない場合、主鎖の長さを厳密に制御せずとも、反応性基は、当該特定のアミノ酸残基に対して位置選択的に結合することができる。勿論、このような領域において当該特定のアミノ酸残基が他に存在する場合であっても、主鎖の長さを制御することにより、反応性基は、当該特定のアミノ酸残基に対して位置選択的に結合することができる。
【０１９４】
ＡおよびＲを連結する主鎖の長さは、抗体およびそれに対する親和性物質の種類、ならびに抗体中の標的部位中の特定のアミノ酸残基の位置および数の関係などの因子に応じて変動し得るが、約５Å以上、好ましくは約７．５Å、より好ましくは約１０．５Å以上であってもよい。このような主鎖の長さはまた、例えば約３０Å以下、好ましくは約２３Å以下、より好ましくは約１６．５Å以下であってもよい。より具体的には、このような主鎖の長さは、例えば約５．０〜３０Å、好ましくは約７．５〜２３Å、より好ましくは約１０．５〜１６．５Åであってもよい。
【０１９５】
ところで、原子間の長さ（距離）の関係については、下表のとおりであることが、当該技術分野における技術常識である。したがって、当業者であれば、下表の原子間の長さを参考にして、上述したような主鎖の長さ（Å）に対応する個数の原子を有する主鎖を適宜設計することができる。
【０１９６】
【表１】
2019240287.tif 000033
【０１９７】
より具体的には、ＡおよびＲを連結する主鎖の長さは、主鎖（水素原子および置換基を除く）を構成する原子数として規定することもできる。主鎖を構成する原子数は、例えば４個（約５．０Å）以上、好ましくは６個（約７．５Å）、より好ましくは８個（約１０．５Å）以上であってもよい。主鎖の原子数はまた、例えば２０個（約３０Å）以下、好ましくは１６個（約２３Å）以下、より好ましくは１２個（約１６．５Å）以下であってもよい。より具体的には、主鎖の原子数は、例えば４〜２０個、好ましくは６〜１６個、より好ましくは８〜１２個であってもよい。
【０１９８】
主鎖が環構造を含まない構造である場合、主鎖の原子数は、鎖状構造中の原子数を数えることにより決定することができる。
【０１９９】
一方、主鎖が環構造を含む構造である場合、主鎖の原子数と上述した長さとは必ずしも対応せず、主鎖の原子数により規定され得る長さは、上述した長さよりも短くなる傾向がある。このような場合であっても、主鎖の長さを規定する観点から、主鎖の原子数を便宜的に数えることができる。具体的には、このような場合における主鎖の原子数は、主鎖において２価の環構造を含まない鎖状構造中の原子数に加えて、環構造中の２つの結合手を連絡する最短経路の原子数を数えることにより決定することができる（例えば、以下（ａ）〜（ｄ）の太字経路を参照）。
【化３２】
2019240287.tif 000034
・は、結合手である。
（ａ）の場合、最短経路は太字経路であるため、主鎖の原子数として数えられる２価の環構造中の原子数は、２である。
（ｂ）の場合、最短経路は太字経路であるため、主鎖の原子数として数えられる２価の環構造中の原子数は、３である。
（ｃ）の場合、いずれの経路も最短経路（等距離）であるため、主鎖の原子数として数えられる２価の環構造中の原子数は、４である。
（ｄ）の場合、縮合部位の経路が最短経路であるため、主鎖の原子数として数えられる２価の環構造中の原子数は、４である。
【０２００】
好ましくは、Ｌ−Ｂで表されるＡとＲとの連結部分（側鎖を除く）は、２価の環構造を含まない鎖状構造であってもよい。この場合、Ｌ−Ｂで表されるＡとＲとの連結鎖部分において２価の環基が含まれないようにＬおよびＢを適宜設計することができる。
【０２０１】
１−６−２．部分構造「Ｌ−Ｂ」の具体的構造
上記式（Ｉ）において、ＬおよびＢは、互いに連関し得る構造である。したがって、上記式（Ｉ）において、ＬおよびＢは、「Ｌ−Ｂ」で表される部分構造として規定することができる。
【０２０２】
一実施形態では、切断性リンカーは、（ｉ）切断により生体直交性官能基を反応性基側に生成する能力を有する切断性部分を含む２価の基である切断性リンカー、もしくは（ｉｉ）切断により生体直交性官能基を反応性基側に生成する能力を有しない切断性部分を含む２価の基である切断性リンカーであってもよい。
【０２０３】
特定の実施形態では、Ｌが上記（ｉ）の切断性リンカーである場合、Ｂは、（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基、または（ｂ）生体直交性官能基を含まない２価の基である。
【０２０４】
好ましくは、Ｌが上記（ｉ）の切断性リンカーである場合、Ｂは、（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基である。この場合、（ｉ）において生成される生体直交性官能基は、（ａ）における生体直交性官能基と同種であっても異種であってもよい。より単純な構造の採用、および/または単一の機能性物質に対する反応性の向上等の観点では、（ｉ）において生成される生体直交性官能基は、（ａ）における生体直交性官能基と同種であってもよい。一方、２種以上の機能性物質に対する差別化された反応性の確保、および反応における一部の生体直交性官能基の不使用等の観点では、（ｉ）において生成される生体直交性官能基は、（ａ）における生体直交性官能基と異種であってもよい。
【０２０５】
あるいは、Ｌが上記（ｉ）の切断性リンカーである場合、Ｂは、（ｂ）生体直交性官能基を含まない２価の基であってもよい。この場合、式（Ｉ）で表される化合物またはその塩は、より単純な構造を有することになるので、合成が容易である。
【０２０６】
別の特定の実施形態では、Ｌが上記（ｉｉ）の切断性リンカーである場合、Ｂは、（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基である。
【０２０７】
特定の実施形態では、Ｌ−Ｂで表される部分構造は、好ましくは、ペプチド部分を含まない。この場合、本発明の化合物を用いて得られる本発明の機能性物質を有する抗体（例、抗体薬物複合体）は、免疫原性を有し得るペプチド部分をリンカーとして含み得ないという利点がある。
【０２０８】
特定の実施形態では、「Ｌ−Ｂ」で表される部分構造は、ＡおよびＲを連結する主鎖（Ｌ−Ｂ中の直鎖部分）の中心位置に存在する原子（例、主鎖を構成する原子数が奇数の場合）、または当該主鎖の中心位置に存在する結合部位（例、主鎖を構成する原子数が偶数の場合）を基準として、対称構造〔例、シス型（すなわち、Ｚ）、トランス型（すなわち、Ｅ）〕を有していてもよい。例えば、中心位置に存在する結合部位を、上述したような切断リンカー中の切断性部分として設計することもできる。「Ｌ−Ｂ」で表される部分構造が対称構造を有する場合、「Ｌ−Ｂ」で表される部分構造は、容易に合成することができる。例えば、反応して切断性部分を形成できる官能基を一方の末端に有する同じ２価の基（例、ＳＨ基を一方の末端に有する鎖状の２価の基）を互いに反応させることにより、主鎖の中心位置に切断性部分を含む対称構造（鎖状の２価の基−Ｓ−Ｓ−鎖状の２価の基）を実現することができる。
【０２０９】
したがって、「Ｌ−Ｂ」で表される部分構造は、「Ｂ２−Ｌ’−Ｂ１」で表される部分構造（すなわち、Ｌが、Ｂ２−Ｌ’で表される２価の基であり、ＢがＢ１である。）であってもよい。この場合、上記式（Ｉ）で表される化合物は、下記式（Ｉ’）で表される化合物として規定することができる。
Ａ−Ｂ２−Ｌ’−Ｂ１−Ｒ      （Ｉ’）
〔式中、
ＡおよびＲは、前記式（Ｉ）のものと同じであり
Ｌ’は、切断性部分を含む２価の基である切断性リンカーであり、
Ｂ１およびＢ２は、同一または異なって、（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基、または（ｂ）生体直交性官能基を含まない２価の基であり、
Ｂ１およびＢ２は、Ｌ’を中心にした対称構造を有していてもよい。〕
【０２１０】
Ｂ１およびＢ２は、同一または異なって、Ｂの定義、例および好ましい例と同様である。
【０２１１】
特定の実施形態では、Ｌ’は、下記式（Ｌ１’）〜（Ｌ３’）のいずれか一つで表されてもよい：
Ｌａ’−Ｃ’−Ｌｂ’      （Ｌ１’）
Ｌａ’−Ｃ’              （Ｌ２’）
Ｃ’−Ｌｂ’      （Ｌ３’）
〔式中、
Ｌａ’およびＬｂ’は、それぞれ、２価の基であり、
Ｃ’は、切断性部分である。〕
【０２１２】
Ｌａ’およびＬｂ’で表される２価の基は、それぞれ、Ｌａ’およびＬｂ’で表される２価の基の定義、例および好ましい例と同様である。
【０２１３】
Ｃ’で表される切断性部分は、Ｃで表される切断性部分の定義、例および好ましい例と同様である。
【０２１４】
別の特定の実施形態では、Ｌ−Ｂで表される構造単位は、下記式（ＬＢ’）で表されてもよい。
【化３３】
2019240287.tif 000035
〔式中、
Ｃ、ｐ、ｐ’、ｑ、ｑ’、Ｘ、Ｘ’、Ｒ１ａ、Ｒ１ａ’、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｂ’、Ｙ、Ｙ’、ＺおよびＺ’の定義、例および好ましい例は、上述したものと同じであり、
○（白丸）は、Ａに対する結合を示し、●（黒丸）は、Ｒに対する結合を示す。〕
【０２１５】
したがって、上記式（Ｉ）は、下記式（Ｉ’’）として規定することができる。
【化３４】
2019240287.tif 000036
〔式中、
Ａ、Ｒ、Ｃ、ｐ、ｐ’、ｑ、ｑ’、Ｘ、Ｘ’、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ａ’、Ｒ１ｂ’、Ｙ、Ｙ’、ＺおよびＺ’の定義、例および好ましい例は、上述したものと同じである。〕
【０２１６】
上記式（ＬＢ’）および（Ｉ’’）において、Ｃ＝ＺにおけるＣ（炭素原子）からＣ＝Ｚ’におけるＣ（炭素原子）までの長さは、ＡおよびＲを連結する主鎖の長さと同様である。これらの式において、Ｃ＝ＺにおけるＣからＣ＝Ｚ’におけるＣまでの長さはまた、Ｃ＝ＺにおけるＣからＣ＝Ｚ’におけるＣを連結する部分構造の連結鎖（水素原子および置換基を除く）を構成する原子数として規定することもできる。このような原子数は、ＡおよびＲを連結する主鎖を構成する原子数と同様である。Ｃ＝ＺにおけるＣからＣ＝Ｚ’におけるＣを連結する部分構造の連結鎖（水素原子および置換基を除く）は、環構造を含んでいなくても含んでいてもよいが、環構造を含んでいないことが好ましい。当該連結鎖（水素原子および置換基を除く）は、好ましくは、ペプチド部分を含まないものであってもよい。
【０２１７】
１−７．製造方法
抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を含む化合物またはその塩は、適宜調製することができる。抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を含む化合物は、式（Ｉ）、好ましくは式（Ｉ’）、より好ましくは式（Ｉ’’）で表される。
【０２１８】
親和性物質としては、任意の官能基を有するものを適宜選択することができる。したがって、当該官能基と反応することができる反応性基を利用することにより、親和性物質を、Ｌ−Ｂ−Ｒで表される構造単位、またはＲ−Ｌ−Ｂ−Ｒで表される構造単位（２つの反応性基は同一または異なる）と反応させて、Ａ−Ｌ−Ｂ−Ｒで表される構造単位を調製することができる。例えば、このような反応は、適切な反応系、例えば有機溶媒系または水溶液系において、適温（例、約１５〜２００℃）で行うことができる。反応系は、適切な触媒を含んでいてもよい。反応時間は、例えば１分〜２０時間、好ましくは１０分〜１５時間、より好ましくは２０分〜１０時間、さらにより好ましくは３０分〜８時間である。
【０２１９】
反応系において、親和性物質（Ｘ）に対する、Ｌ−Ｂ−Ｒで表される構造単位、またはＲ−Ｌ−Ｂ−Ｒで表される構造単位（Ｙ）のモル比率（Ｙ／Ｘ）は、当該構造単位および親和性物質の種類、当該構造単位によって修飾されるべき親和性物質中の部位の数等に応じて変動することから特に限定されないが、例えば０．１〜５０であり、好ましくは０．５〜４０であり、より好ましくは１〜３５であり、さらにより好ましくは２〜２５であり、特に好ましくは３〜１５である。
【０２２０】
抗体に対する親和性物質、および切断性部分を含む抗体またはその塩の生成の確認は、その具体的な原料および生成物の分子量にもよるが、例えば、電気泳動法、クロマトグラフィー（例、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ）、または質量分析により、好ましくは、質量分析により行うことができる。抗体に対する親和性物質、および切断性部分を含む抗体またはその塩は、クロマトグラフィー（例、上述したクロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィー）等の任意の方法により適宜精製することができる。
【０２２１】
１−８．その他
後述の発明〔例、式（ＩＩ）〜（ｖ）およびその下位概念の式、ならびに部分構造式（例、（Ｌ１）〜（Ｌ３）、（Ｌａ’）、（Ｌｂ’）、（Ｂ−１）〜（Ｂ−４））で表される発明〕では、任意の記号（例、Ａ、Ｌ、Ｂ、Ｒ）、当該記号で表される用語、およびそれらの詳細（例えば、定義、例および好ましい例）は、上記式（Ｉ）で表される化合物またはその塩の発明と共通する。また、後述の発明を規定することができる特定の部分（例、切断性部分、切断により生体直交性官能基を反応性基側に生成する能力を有する部分）、特定の基（例、生体直交性官能基、２価の基、アルキル基、置換基、電子吸引基）、および特定の数値、ならびに塩等の任意の技術要素（例、定義、例および好ましい例）についても、上記で説明したものと共通にすることができる。したがって、これらの事項は、特に言及することなく、後述の発明において適宜援用することができる。同様に、後述の発明で述べた特定の発明の技術要素は、本発明および他の発明の技術要素として、適宜援用することができる。
【０２２２】
２．抗体に対する親和性物質、および切断性部分を含む抗体またはその塩
２−１．概要
本発明は、式（ＩＩ）で表される、抗体に対する親和性物質、および切断性部分を含む抗体またはその塩を提供する。
Ａ−Ｌ−Ｂ−Ｒ’−Ｔ      （ＩＩ）
〔式中、
Ａは、抗体に対する親和性物質であり、
Ｌは、切断性部分を含む２価の基である切断性リンカーであり、
Ｂは、（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基、または（ｂ）生体直交性官能基を含まない２価の基であり、
Ｒ’は、抗体と反応性基との間の反応により生成する部分であり、
Ｔは、抗体である。〕
【０２２３】
２−２．抗体と反応性基との間の反応により生成する部分（Ｒ’）
抗体と反応性基との間の反応により生成する部分において、抗体および反応性基の定義、例および好ましい例は、上述したとおりである。抗体と反応性基との間の反応により生成する部分は、当該技術分野において技術常識であり、抗体および反応性基の種類に応じて適宜決定することができる。
【０２２４】
好ましくは、抗体と反応性基との間の反応により生成する部分は、抗体に含まれ得る１４種のアミノ酸（アスパラギン、グルタミン、メチオニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン、およびリジン）のうちのいずれか１種のアミノ酸の側鎖と、それに対する反応性基との間の反応により生成する部分である。
【０２２５】
より好ましくは、抗体と反応性基との間の反応により生成する部分は、リジン、チロシン、トリプトファン、またはシステインのいずれか１種のアミノ酸の側鎖と、それに対して特異的な反応性基との間の反応により生成する部分であってもよい。
【０２２６】
さらにより好ましくは、抗体と反応性基との間の反応により生成する部分は、リジン、チロシン、またはトリプトファンのいずれか１種のアミノ酸の側鎖と、それに対して特異的な反応性基との間の反応により生成する部分であってもよい。リジン、チロシン、またはトリプトファンのいずれか１種のアミノ酸の側鎖と、それに対して特異的な反応性基との間の反応により生成する部分としては、例えば、上記「１−５．反応性基（Ｒ）」で述べた連結部分および/または化学構造が挙げられる。
【０２２７】
さらに一層より好ましくは、抗体と反応性基との間の反応により生成する部分は、リジンまたはチロシンの側鎖と、それに対して特異的な反応性基との間の反応により生成する部分であってもよい（特に、抗体がヒトＩｇＧ１等のヒトＩｇＧである場合）。リジンまたはチロシンの側鎖と、それに対して特異的な反応性基との間の反応により生成する部分としては、例えば、上記「１−５．反応性基（Ｒ）」で述べた連結部分および／または化学構造が挙げられる。
【０２２８】
特に好ましくは、抗体と反応性基との間の反応により生成する部分は、リジンの側鎖と、それに対して特異的な反応性基との間の反応により生成する部分であってもよい。
【０２２９】
２−３．部分構造「Ｌ−Ｂ」
部分構造「Ｌ−Ｂ」の詳細は、上記「１−６．部分構造「Ｌ−Ｂ」」で述べたとおりである。
【０２３０】
特定の実施形態では、「Ｌ−Ｂ」で表される部分構造は、「Ｂ２−Ｌ’−Ｂ１」で表される部分構造（すなわち、Ｌが、Ｂ２−Ｌ’で表される２価の基であり、ＢがＢ１である。）であってもよい。この場合、上記式（ＩＩ）で表される、抗体に対する親和性物質、および切断性部分を含む抗体またはその塩は、下記式（ＩＩ’）で表されることができる。
Ａ−Ｂ２−Ｌ’−Ｂ１−Ｒ’−Ｔ      （ＩＩ’）
〔式中、
Ａ、Ｒ’およびＴは、前記式（ＩＩ）のものと同じであり
Ｌ’は、切断性部分を含む２価の基である切断性リンカーであり、
Ｂ１およびＢ２は、同一または異なって、（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基、または（ｂ）生体直交性官能基を含まない２価の基であり、
Ｂ１およびＢ２は、Ｌ’を中心にした対称構造を有していてもよい。〕
【０２３１】
上記式（ＩＩ’）において、Ｌ’は、上述した式（Ｌ１’）〜（Ｌ３’）のいずれか一つで表されてもよい。
【０２３２】
別の特定の実施形態では、Ｌ−Ｂで表される構造単位は、下記式（ＬＢ’）で表されてもよい。
【化３５】
2019240287.tif 000037
〔式中、
Ｃ、ｐ、ｐ’、ｑ、ｑ’、Ｘ、Ｘ’、Ｒ１ａ、Ｒ１ａ’、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｂ’、Ｙ、Ｙ’、ＺおよびＺ’の定義、例および好ましい例は、上述したものと同じであり、
○（白丸）は、Ａに対する結合を示し、●（黒丸）は、Ｒ’に対する結合を示す。〕
【０２３３】
したがって、上記式（ＩＩ）は、下記式（ＩＩ’’）として規定することができる。
【化３６】
2019240287.tif 000038
〔式中、
Ａ、Ｒ’、Ｔ、Ｃ、ｐ、ｐ’、ｑ、ｑ’、Ｘ、Ｘ’、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ａ’、Ｒ１ｂ’、Ｙ、Ｙ’、ＺおよびＺ’の定義、例および好ましい例は、上述したものと同じである。〕
【０２３４】
上記式（ＬＢ’）および（ＩＩ’’）において、Ｃ＝ＺにおけるＣ（炭素原子）からＣ＝Ｚ’におけるＣ（炭素原子）までの長さは、上述したようなＡおよびＲを連結する主鎖の長さと同様である。これらの式において、Ｃ＝ＺにおけるＣからＣ＝Ｚ’におけるＣまでの長さはまた、Ｃ＝ＺにおけるＣからＣ＝Ｚ’におけるＣを連結する部分構造の連結鎖（水素原子および置換基を除く）を構成する原子数として規定することもできる。このような原子数は、ＡおよびＲを連結する主鎖を構成する原子数と同様である。Ｃ＝ＺにおけるＣからＣ＝Ｚ’におけるＣを連結する部分構造の連結鎖（水素原子および置換基を除く）は、環構造を含んでいなくても含んでいてもよいが、環構造を含んでいないことが好ましい。当該連結鎖（水素原子および置換基を除く）は、好ましくは、ペプチド部分を含まないものであってもよい。
【０２３５】
２−４．抗体が有する、抗体以外の部分構造の結合部位（位置選択性）
抗体以外の部分構造（例、Ａ−Ｌ−Ｂ−Ｒ’）は、抗体（Ｔ）における上述したような標的領域に位置選択的に結合させることができる。
【０２３６】
本明細書において、「位置選択的」または「位置選択性」とは、抗体において特定のアミノ酸残基が特定の領域に偏在していないにもかかわらず、抗体中の特定のアミノ酸残基と結合できる所定の構造単位が、抗体中の特定の領域に偏在することをいう。したがって、「位置選択的に有する」、「位置選択的な結合」、「位置選択性での結合」等の位置選択性に関連する表現は、１個以上の特定のアミノ酸残基を含む標的領域における所定の構造単位の保有率または結合率が、標的領域における当該特定のアミノ酸残基と同種である複数個のアミノ酸残基を含む非標的領域における当該構造単位の保有率または結合率よりも有意なレベルで高いことを意味する。このような位置選択的な結合または保有は、抗体中の特定のアミノ酸残基に対して所定の構造単位をランダムに反応させるのではなく、抗体中の標的領域における特定のアミノ酸残基に対して所定の構造単位を優先的に反応させることができる本発明により達成することができる。
【０２３７】
具体的には、Ｔが、連続する１〜５０個のアミノ酸残基からなる標的領域中において特定のアミノ酸残基を１個以上含み、かつ、前記標的領域以外の非標的領域中において前記特定のアミノ酸残基を５個以上含む場合、抗体以外の部分構造は、当該標的領域中に含まれる１個以上の特定のアミノ酸残基に対して３０％以上の位置選択性で結合させることができる。標的領域および位置選択性の定義、例、および好ましい例は、上述したとおりである。
【０２３８】
２−５．抗体が有する、抗体以外の部分構造の個数
抗体（Ｔ）が保有する、抗体以外の部分構造（例、Ａ−Ｌ−Ｂ−Ｒ’）の個数は、変動することができる。例えば、Ｔが複数の単量体タンパク質を含む多量体タンパク質である場合、Ｔは、複数個の単量体タンパク質中の対応する複数個の標的領域において、Ｔ以外の部分構造を有することができる。その結果、Ｔは、Ｔ以外の部分構造を複数個有することができる。したがって、式（ＩＩ）、（ＩＩ’）、または（ＩＩ’’）で表される構造は、Ｔが、Ｔ以外の部分構造を１個または複数個有していてもよいことを示す。Ｔが有する、Ｔ以外の部分構造の個数は、抗体の種類、および抗体とそれに対して導入される構造単位との反応比率等の条件を適宜設定することで調節することができる。このような個数は、抗体の種類によっても異なるが、例えば１〜８、好ましくは１〜４、より好ましくは１または２であってもよい。
【０２３９】
特定の実施形態では、抗体が保有する、抗体以外の部分構造の個数は、抗体が、複数個の単量体タンパク質から構成される多量体タンパク質である場合、複数個であってもよい。本発明によれば、複数個の単量体タンパク質の同一標的領域に対して抗体以外の部分構造を複数個導入することができる。
【０２４０】
好ましい実施形態では、抗体は、複数個の重鎖を含む抗体であってもよい。抗体の定義、例、および好ましい例は、上述したとおりである。重鎖の個数は、抗体の種類によって異なる。例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、およびＩｇＤは、２個の重鎖を有することができる。ＩｇＡは、２個または４個の重鎖を有することができる。ＩｇＭは、８個の重鎖を有することができる。抗体（抗体）が保有する、抗体以外の部分構造の個数は、ＤＡＲと同義のものとして考慮することができる。本発明では、抗体が保有する、抗体以外の部分構造の個数は、ＩｇＧ、ＩｇＥ、およびＩｇＤについては１個または２個（好ましくは２個）であり、ＩｇＡについては１〜４個（好ましくは４個）であり、ＩｇＭについては１〜８個（好ましくは８個）であってもよい。
【０２４１】
２−６．製造方法
本発明は、以下を含む、抗体に対する親和性物質、および切断性部分を含む抗体またはその塩の製造方法を提供する：
（Ａ１）抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を含む化合物またはその塩を抗体と反応させて、抗体に対する親和性物質、および切断性部分を含む抗体またはその塩を生成すること。
【０２４２】
抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を含む化合物は、式（Ｉ）、好ましくは式（Ｉ’）、より好ましくは式（Ｉ’’）で表される。抗体に対する親和性物質、および切断性部分を含む抗体は、式（ＩＩ）、好ましくは式（ＩＩ’）、より好ましくは式（ＩＩ’’）で表される。
【０２４３】
抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を含む化合物またはその塩は、反応性基を有するため、抗体と反応することができる。このような反応は、タンパク質の変性・分解（例、アミド結合の切断）を引き起こし得ない条件（温和な条件）下で適宜行うことができる。例えば、このような反応は、適切な反応系、例えば緩衝液中において、室温（例、約１５〜３０℃）で行うことができる。緩衝液のｐＨは、例えば５〜９であり、好ましくは５．５〜８．５であり、より好ましくは６．０〜８．０である。緩衝液は、適切な触媒を含んでいてもよい。反応時間は、例えば１分〜２０時間、好ましくは１０分〜１５時間、より好ましくは２０分〜１０時間、さらにより好ましくは３０分〜８時間である。このような反応の詳細については、例えば、Ｇ．Ｊ．Ｌ．Ｂｅｒｎａｒｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，１１５，２１７４（２０１５）；Ｇ．Ｊ．Ｌ．Ｂｅｒｎａｒｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ａｓｉａｎ．Ｊ．，４，６３０（２００９）；Ｂ．Ｇ．Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，５，４７４０（２０１４）；Ａ．Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ．Ｃｈｅｍ．，２５，８２５（２０１４）を参照のこと。
【０２４４】
反応系において、抗体（Ｘ）に対する、抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を含む化合物またはその塩（Ｙ）のモル比率（Ｙ／Ｘ）は、抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を含む化合物および抗体の種類、抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を含む化合物によって修飾されるべき抗体中の部位の数（例、ＤＡＲ）等に応じて変動することから特に限定されないが、例えば０．１〜１００であり、好ましくは０．５〜８０であり、より好ましくは１〜７０であり、さらにより好ましくは２〜５０であり、特に好ましくは３〜３０である。
【０２４５】
抗体に対する親和性物質、および切断性部分を含む抗体またはその塩の生成の確認は、その具体的な原料および生成物の分子量にもよるが、例えば、電気泳動法、クロマトグラフィー（例、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ）、または質量分析により、好ましくは、質量分析により行うことができる。位置選択性の確認は、例えば、ペプチドマッピングにより行うことができる。ペプチドマッピングは、例えば、プロテアーゼ（例、トリプシン、キモトリプシン、）処理および質量分析により行うことができる。プロテアーゼとしては、エンドプロテアーゼが好ましい。このようなエンドプロテアーゼとしては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、Ｇｌｕ−Ｃ、Ｌｙｓ−Ｎ、Ｌｙｓ−Ｃ、Ａｓｐ−Ｎが挙げられる。抗体が有する、抗体以外の部分構造の個数の確認は、例えば、電気泳動法、クロマトグラフィー、または質量分析により、好ましくは、質量分析により行うことができる。抗体に対する親和性物質、および切断性部分を含む抗体またはその塩は、クロマトグラフィー（例、上述したクロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィー）等の任意の方法により適宜精製することができる。
【０２４６】
３．抗体に対する親和性物質、切断性部分、機能性物質および抗体を有する複合体またはその塩
３−１．概要
本発明は、式（ＩＩＩ）で表される、抗体に対する親和性物質、切断性部分、機能性物質および抗体を有する複合体またはその塩を提供する。
Ａ−Ｌ−Ｂ’（−Ｆ）−Ｒ’−Ｔ      （ＩＩＩ）
〔式中、
Ａは、抗体に対する親和性物質であり、
Ｌは、切断性部分を含む２価の基である切断性リンカーであり、
Ｂ’は、機能性物質と生体直交性官能基との間の反応により生成する部分を含む３価の基であり、
Ｆは、機能性物質であり、
Ｒ’は、抗体と反応性基との間の反応により生成する部分であり、
Ｔは、抗体である。〕で表される、抗体に対する親和性物質、切断性部分、機能性物質および抗体を有する複合体またはその塩。
【０２４７】
式（ＩＩＩ）または他の式において、Ｒ’は、Ｆではなく、Ｂ’に共有結合している。
【０２４８】
３−２．機能性物質（Ｆ）
機能性物質としては、抗体に任意の機能を付与する物質である限り特に限定されず、例えば、薬物、標識物質、安定化剤が挙げられるが、好ましくは薬物または標識物質である。機能性物質はまた、単一の機能性物質であってもよく、または２以上の機能性物質が連結された物質であってもよい。
【０２４９】
薬物としては、任意の疾患に対する薬物であってもよい。このような疾患としては、例えば、癌（例、肺癌、胃癌、大腸癌、膵臓癌、腎臓癌、肝臓癌、甲状腺癌、前立腺癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮癌、骨癌、皮膚癌、脳腫瘍、黒色腫）、自己免疫疾患・炎症性疾患（例、アレルギー疾患、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス）、脳神経疾患（例、脳梗塞、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症）、感染症（例、細菌感染症、ウイルス感染症）、遺伝性・希少疾患（例、遺伝性球状赤血球症、非ジストロフィー筋緊張症）、眼疾患（例、加齢黄斑変性症、糖尿病網膜症、網膜色素変性症）、骨・整形外科領域の疾患（例、変形性関節症）、血液疾患（例、白血病、紫斑病）、その他の疾患（例、糖尿病、高脂血症等の代謝異常症、肝臓疾患、腎疾患、肺疾患、循環器系疾患、消化器官系疾患）が挙げられる。抗体が所定の疾患の標的タンパク質に対する抗体である場合、薬物は、当該所定の疾患に関連する薬物（例、当該所定の疾患を治療する薬物、当該所定の疾患の標的タンパク質に対する抗体の使用に伴う副作用を緩和する薬物）であってもよい。
【０２５０】
より具体的には、薬物は、抗癌剤である。抗癌剤としては、例えば、化学療法剤、毒素、放射性同位体またはそれを含む物質が挙げられる。化学療法剤としては、例えば、ＤＮＡ損傷剤、代謝拮抗薬、酵素阻害剤、ＤＮＡインターカレート剤、ＤＮＡ切断剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＡ結合阻害剤、チューブリン結合阻害剤、細胞傷害性ヌクレオシド、白金化合物が挙げられる。毒素としては、例えば、細菌毒素（例、ジフテリア毒素）、植物毒素（例、リシン）が挙げられる。放射性同位体としては、例えば、水素原子の放射性同位体（例、３Ｈ）、炭素原子の放射性同位体（例、１４Ｃ）、リン原子の放射性同位体（例、３２Ｐ）、硫黄原子の放射性同位体（例、３５Ｓ）、イットリウムの放射性同位体（例、９０Ｙ）、テクネチウムの放射性同位体（例、９９ｍＴｃ）、インジウムの放射性同位体（例、１１１Ｉｎ）、ヨウ素原子の放射性同位体（例、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１２９Ｉ、１３１Ｉ)、サマリウムの放射性同位体（例、１５３Ｓｍ）、レニウムの放射性同位体（例、１８６Ｒｅ）、アスタチンの放射性同位体（例、２１１Ａｔ）、ビスマスの放射性同位体（例、２１２Ｂｉ）が挙げられる。更に具体的には、薬物として、オーリスタチン（ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ）、メイタンシン（ＤＭ１、ＤＭ４）、ＰＢＤ（ピロロベンゾジアゼピン）、ＩＧＮ、カンプトテシン類縁体、カリケアミシン、デュオカルミシン、エリブリン、アントラサイクリン、ｄｍＤＮＡ３１、ツブリシンが挙げられる。
【０２５１】
標識物質としては、例えば、酵素（例、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ）、親和性物質（例、ストレプトアビジン、ビオチン、ジゴキシゲニン、アプタマー）、蛍光物質（例、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質）、発光物質（例、ルシフェリン、エクオリン、アクリジニウムエステル、トリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム、ルミノール）、放射性同位体（例、上述したもの）またはそれを含む物質が挙げられる。
【０２５２】
機能性物質はまた、高分子化合物、中分子化合物、または低分子化合物であり、好ましくは、低分子化合物である。低分子化合物とは、分子量１５００以下の化合物をいう。低分子化合物は、天然化合物または合成化合物である。低分子化合物の分子量は、１２００以下、１０００以下、９００以下、８００以下、７００以下、６００以下、５００以下、４００以下、または３００以下であってもよい。低分子化合物の分子量はまた、３０以上、４０以上、または５０以上であってもよい。低分子化合物は、上述したような薬物または標識物質であってもよい。また、低分子化合物としては、例えば、アミノ酸、オリゴペプチド、ビタミン、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、単糖、オリゴ糖、脂質、脂肪酸、およびそれらの塩が挙げられる。
【０２５３】
３−３．機能性物質と生体直交性官能基との間の反応により生成する部分を含む３価の基（Ｂ’）
Ｂ’は、（ａ）の生体直交性官能基が機能性物質と反応していることを除き、上述したＢにおける（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基と同様である。したがって、Ｂ’における３価の基および直交性官能基の定義、例および好ましい例は、（ａ）の生体直交性官能基が機能性物質と反応していることを除き、Ｂにおけるものと同様である。
【０２５４】
機能性物質は、その構造に応じた種々の官能基を有する。機能性物質が、生体直交性官能基と反応し易い官能基を有する場合、機能性物質の当該官能基と生体直交性官能基とを適宜反応させることができる。生体直交性官能基と反応し易い官能基は、生体直交性官能基の具体的な種類によっても異なり得る。当業者であれば、適切な官能基を、生体直交性官能基と反応し易い官能基として適宜選択することができる（例、Ｂｏｕｔｕｒｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．，２０１５，１１５，２１７４−２１９５）。生体直交性官能基と反応し易い官能基としては、例えば、生体直交性官能基がチオール残基の場合はマレイミド残基およびジスルフィド残基が挙げられ、生体直交性官能基がアルキン残基の場合はアジド残基が挙げられ、生体直交性官能基がアルデヒド残基またはケトン残基の場合はヒドラジン残基が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、生体直交性官能基がチオール残基であり、かつ生体直交性官能基と反応し易い官能基がマレイミド残基またはジスルフィド残基である場合（またはその逆である場合）、機能性物質と生体直交性官能基との間の反応により生成する部分を含む３価の基は、チオスクシンイミド残基を含む３価の基、またはジスルフィド残基を含む３価の基であってもよい；生体直交性官能基がアルキン残基であり、かつ生体直交性官能基と反応し易い官能基がアジド残基である場合（またはその逆である場合）、機能性物質と生体直交性官能基との間の反応により生成する部分を含む３価の基は、トリアゾール残基（他の環と縮合していても縮合していなくてもよい）を含む３価の基であってもよい；生体直交性官能基がアルデヒド残基またはケトン残基であり、かつ生体直交性官能基と反応し易い官能基がヒドラジン残基である場合（またはその逆である場合）、機能性物質と生体直交性官能基との間の反応により生成する部分を含む３価の基は、ヒドラゾン残基を含む３価の基であってもよい（例、Ｂｏｕｔｕｒｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．，２０１５，１１５，２１７４−２１９５）。チオスクシンイミド残基を含む３価の基、ジスルフィド残基を含む３価の基、トリアゾール残基（他の環と縮合していても縮合していなくてもよい）を含む３価の基、またはヒドラゾン残基を含む３価の基は、機能性物質と生体直交性官能基との間の反応により生成する部分を含む３価の基の好ましい例である。
【０２５５】
一方、機能性物質が、生体直交性官能基と反応し易い官能基を有しない場合、機能性物質として、所望の官能基を有するように誘導体化されたものを使用することができる。例えば、機能性物質が抗体である場合、抗体が天然に有しない官能基を有するように誘導体化されたものを使用することができる。この場合、抗体の誘導体化は、本発明の方法により行われてもよい。この場合、所望の生体直交性官能基を位置選択的に有するように誘導体化された抗体を、機能性物質として使用することができる。
【０２５６】
誘導体化は、当該分野における技術常識である（例、国際公開第２００４／０１０９５７号、米国特許出願公開第２００６／００７４００８号明細書、米国特許出願公開第２００５／０２３８６４９号明細書）。例えば、誘導体化は、上述したような架橋剤を用いて行われてもよい。あるいは、誘導体化は、所望の官能基を有する特定のリンカーを用いて行われてもよい。例えば、このようなリンカーは、適切な環境（例、細胞内または細胞外）において機能性物質と抗体とをリンカーの切断により分離可能なものであってもよい。このようなリンカーとしては、例えば、特定のプロテアーゼ〔例、細胞内プロテアーゼ（例、リソソーム、またはエンドソーム中に存在するプロテアーゼ）、細胞外プロテアーゼ（例、分泌性プロテアーゼ）〕で分解されるペプチジルリンカー（例、米国特許第６，２１４，３４５号；Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ８３：６７−１２３（１９９９））、生体内に存在する局所酸性部位で切断され得るリンカー（例、米国特許第５，６２２，９２９号、同第５，１２２，３６８号；同第５，８２４，８０５号）が挙げられる。リンカーは、自壊的（ｓｅｌｆ−ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ）であってもよい（例、国際公開第０２／０８３１８０号、国際公開第０４／０４３４９３号、国際公開第０５／１１２９１９号）。本発明では、誘導体化された機能性物質も、単に「機能性物質」と呼称することができる。
【０２５７】
機能性物質と生体直交性官能基との間の反応により生成する部分を含む３価の基において、機能性物質および生体直交性官能基の定義、例および好ましい例は、上述したとおりである。機能性物質と生体直交性官能基との間の反応により生成する部分は、当該技術分野において技術常識であり、機能性物質（機能性物質が誘導体化されている場合、その誘導体化部分）および生体直交性官能基の種類に応じて適宜決定することができる。
【０２５８】
機能性物質と生体直交性官能基との間の反応により生成する部分を含む３価の基は、（１）上述の好ましい例において言及した残基である、チオスクシンイミド残基、トリアゾール残基、またはヒドラゾン残基を含む３価の基であってもよく、あるいは、（２）特に限定されるわけではないが、例えば、ジスルフィド残基（この残基は、上述の好ましい例において言及した残基である）、アセタール残基、ケタール残基、エステル残基、カルバモイル残基、アルコキシアルキル残基、イミン残基、三級アルキルオキシカルバメート残基、シラン残基、ヒドラゾン含有残基、フォスフォルアミデート残基、アコニチル残基、トリチル残基、アゾ残基、ビシナルジオール残基、セレン残基、電子吸引基を有する芳香族環含有残基、クマリン含有残基、スルホン含有残基、不飽和結合含有鎖残基、グリコシル残基からなる群より選ばれる残基を含む３価の基であってもよい。
【０２５９】
機能性物質と生体直交性官能基との間の反応により生成する部分を含む３価の基はまた、特に限定されるわけではないが、例えば、下記：
【化３７】
2019240287.tif 000039
〔ここで、黒四角は機能性物質側の部分に対する結合を示し、
○（白丸）はＬ側の部分に対する結合を示し、●（黒丸）はＲ’側の部分に対する結合を示す。
化学構造が、切断性部分を中心にして非対称である場合、●がＬ側の部分に対する結合を示し、○がＲ’側の部分に対する結合を示していてもよい。〕からなる群より選ばれるいずれか一つの化学構造に対応する残基を含む３価の基であってもよい。
【０２６０】
３−４．部分構造「Ｌ−Ｂ’（−Ｆ）」
部分構造「Ｌ−Ｂ’（−Ｆ）」の詳細は、ＢがＢ’（−Ｆ）に変更されていることを除き、上記「１−６．部分構造「Ｌ−Ｂ」」で述べたとおりである。
【０２６１】
一実施形態では、切断性リンカーは、（ｉ）切断により生体直交性官能基を反応性基側に生成する能力を有する切断性部分を含む２価の基である切断性リンカー、もしくは（ｉｉ）切断により生体直交性官能基を反応性基側に生成する能力を有しない切断性部分を含む２価の基である切断性リンカーであってもよい。
【０２６２】
特定の実施形態では、切断性リンカーは、上記（ｉｉ）の切断性リンカーであってもよい。既にＢ’は機能性物質（Ｆ）と結合しているため、生体直交性官能基を反応性基側に生成する必要がないためである。
【０２６３】
別の特定の実施形態では、Ｌ−Ｂ’（−Ｆ）で表される部分構造は、Ｂ２’（−Ｆ２）−Ｌ’−Ｂ１’（−Ｆ１）で表される部分構造（すなわち、Ｌは、Ｂ２’（−Ｆ２）−Ｌ’であり、Ｂ’は、Ｂ１’である。）であってもよい。この場合、上記式（ＩＩＩ）で表される、抗体に対する親和性物質、切断性部分、機能性物質および抗体を有する複合体またはその塩は、下記式（ＩＩＩ’）で表されることができる。
Ａ−Ｂ２’（−Ｆ２）−Ｌ’−Ｂ１’（−Ｆ１）−Ｒ’−Ｔ      （ＩＩＩ’）
〔式中、
Ａ、Ｒ’およびＴは、前記式（ＩＩＩ）のものと同じであり、
Ｌ’は、切断性部分を含む２価の基である切断性リンカーであり、
Ｂ１’およびＢ２’は、同一または異なって、機能性物質と生体直交性官能基との間の反応により生成する部分を含む３価の基であり、
Ｆ１およびＦ２は、同一または異なって、機能性物質であり、
Ｂ１’（−Ｆ１）およびＢ２’（−Ｆ２）は、Ｌ’を中心にした対称構造を有していてもよい。〕。
【０２６４】
Ｂ１’およびＢ２’は、同一または異なって、Ｂ’の定義、例および好ましい例と同様である。
【０２６５】
上記式（ＩＩＩ’）において、Ｌ’は、上述した式（Ｌ１’）〜（Ｌ３’）のいずれか一つで表されてもよい。
【０２６６】
別の特定の実施形態では、Ｌ−Ｂ’（−Ｆ）で表される構造単位は、下記式（ＬＢ’（Ｆ）’）で表されてもよい。
【化３８】
2019240287.tif 000040
〔式中、
Ｃ、Ｆ１、Ｆ２、ｐ、ｐ’、ｑ、ｑ’、Ｘ、Ｘ’、Ｒ１ａ、Ｒ１ａ’、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｂ’、ＺおよびＺ’の定義、例および好ましい例は、上述したものと同じであり、
ＹおよびＹ’は、同一または異なって、前記式（Ｂ−１）のＹから水素原子を一つ除いた残基であり、
○（白丸）は、Ａに対する結合を示し、●（黒丸）は、Ｒ’に対する結合を示す。〕
【０２６７】
より具体的には、ＹおよびＹ’における、前記式（Ｂ−１）のＹから水素原子を一つ除いた残基は、−Ｎ（−）−、−ＣＨ（−）−、または上記式（Ｂ−２）から水素原子を一つ除いた基である。構造の簡便化等の観点から、Ｙは、−Ｎ（−）−、または−ＣＨ（−）−であってもよい。あるいは、炭素原子を基調とした構造の設計等の観点からは、Ｙは、−ＣＨ（−）−、または上記式（Ｂ−２）から水素原子を一つ除いた基であってもよい。
【０２６８】
上記式（Ｂ−２）から水素原子を一つ除いた基は、下記式（Ｂ−２’）：
【化３９】
2019240287.tif 000041
（式中、
ＶおよびＶ’は、同一または異なって、−ＮＨ−、−Ｏ−、−ＣＨ２−、または単結合であり、
Ｖ１は、（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基、または（ｂ）生体直交性官能基を含まない２価の基であり、
ｓは、０〜１０の任意の整数であり、
式（Ｂ−２’）における○および●は、それぞれ、式（Ｂ−１）における○および●と同じ配向である。）である。〕から水素原子を一つ除いた基である。式（Ｂ−２’）におけるｓの定義、例および好ましい例は、式（Ｂ−２）のものと同様である。したがって、式（Ｂ−２’）では、ＶおよびＶ’の一方が、−Ｎ（−）−、または−ＣＨ（−）−であってもよい。あるいは、式（Ｂ−２’）では、Ｖ１は、上記（ａ）または（ｂ）の２価の基から水素原子が一つ除かれた３価の基であってもよい。あるいは、式（Ｂ−２’）では、ｓ個の−ＣＨ２−のうちの一つが−ＣＨ（−）−であってもよい。
【０２６９】
この場合、上記式（ＩＩＩ）は、下記式（ＩＩＩ’’）として規定することができる。
【化４０】
2019240287.tif 000042
〔式中、
Ａ、Ｒ、Ｃ、Ｆ１、Ｆ２、ｐ、ｐ’、ｑ、ｑ’、Ｘ、Ｘ’、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ａ’、Ｒ１ｂ’、Ｙ、Ｙ’、ＺおよびＺ’の定義、例および好ましい例は、上述したものと同じである。〕
【０２７０】
上記式（ＬＢ’（Ｆ）’）および（ＩＩＩ’’）において、Ｃ＝ＺにおけるＣ（炭素原子）からＣ＝Ｚ’におけるＣ（炭素原子）までの長さは、上述したようなＡおよびＲを連結する主鎖の長さと同様である。これらの式において、Ｃ＝ＺにおけるＣからＣ＝Ｚ’におけるＣまでの長さはまた、Ｃ＝ＺにおけるＣからＣ＝Ｚ’におけるＣを連結する部分構造の連結鎖（水素原子および置換基を除く）を構成する原子数として規定することもできる。このような原子数は、ＡおよびＲを連結する主鎖を構成する原子数と同様である。Ｃ＝ＺにおけるＣからＣ＝Ｚ’におけるＣを連結する部分構造の連結鎖（水素原子および置換基を除く）は、環構造を含んでいなくても含んでいてもよいが、環構造を含んでいないことが好ましい。当該連結鎖（水素原子および置換基を除く）は、好ましくは、ペプチド部分を含まないものであってもよい。
【０２７１】
３−５．抗体が有する、抗体以外の部分構造の結合部位（位置選択性）
抗体以外の部分構造（例、Ａ−Ｌ−Ｂ’（−Ｆ）−Ｒ’）は、抗体（Ｔ）における上述したような標的領域に位置選択的に結合させることができる。具体的には、Ｔが、連続する１〜５０個のアミノ酸残基からなる標的領域中において特定のアミノ酸残基を１個以上含み、かつ、前記標的領域以外の非標的領域中において前記特定のアミノ酸残基を５個以上含む場合、抗体以外の部分構造は、当該標的領域中に含まれる１個以上の特定のアミノ酸残基に対して３０％以上の位置選択性で結合させることができる。標的領域および位置選択性の定義、例、および好ましい例は、上述したとおりである。
【０２７２】
３−６．抗体が有する、抗体以外の部分構造の個数
抗体（Ｔ）が保有する、抗体以外の部分構造（例、Ａ−Ｌ−Ｂ’（−Ｆ）−Ｒ’）の個数は、変動することができる。例えば、Ｔが複数の単量体タンパク質を含む多量体タンパク質である場合、Ｔは、複数個の単量体タンパク質中の対応する複数個の標的領域において、Ｔ以外の部分構造を有することができる。その結果、Ｔは、Ｔ以外の部分構造を複数個有することができる。したがって、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩ’）、または（ＩＩＩ’’）で表される構造は、Ｔが、Ｔ以外の部分構造を１個または複数個有していてもよいことを示す。Ｔが有する、Ｔ以外の部分構造の個数は、抗体の種類、および抗体とそれに対して導入される構造単位との反応比率等の条件を適宜設定することで調節することができる。このような個数は、抗体の種類によっても異なるが、例えば１〜８、好ましくは１〜４、より好ましくは１または２であってもよい。
【０２７３】
特定の実施形態では、抗体が保有する、抗体以外の部分構造の個数は、抗体が、複数個の単量体タンパク質から構成される多量体タンパク質である場合、複数個であってもよい。本発明によれば、複数個の単量体タンパク質の同一標的領域に対して抗体以外の部分構造を複数個導入することができる。
【０２７４】
好ましい実施形態では、抗体は、複数個の重鎖を含む抗体であってもよい。抗体の定義、例、および好ましい例は、上述したとおりである。本発明では、抗体が保有する、抗体以外の部分構造の個数は、ＩｇＧ、ＩｇＥ、およびＩｇＤについては１個または２個（好ましくは２個）であり、ＩｇＡについては１〜４個（好ましくは４個）であり、ＩｇＭについては１〜８個（好ましくは８個）であってもよい。
【０２７５】
３−７．製造方法
本発明は、以下を含む、抗体に対する親和性物質、切断性部分、機能性物質および抗体を有する複合体またはその塩の製造方法を提供する：
（Ｂ１）抗体に対する親和性物質、および切断性部分を含む抗体またはその塩を機能性物質と反応させて、抗体に対する親和性物質、切断性部分、機能性物質および抗体を有する複合体またはその塩を生成すること。
【０２７６】
抗体に対する親和性物質、および切断性部分を含む抗体は、式（ＩＩ）、好ましくは式（ＩＩ’）、より好ましくは式（ＩＩ’’）で表される。抗体に対する親和性物質、切断性部分、機能性物質および抗体を有する複合体は、式（ＩＩＩ）、好ましくは式（ＩＩＩ’）、より好ましくは式（ＩＩＩ’’）で表される。
【０２７７】
抗体に対する親和性物質、および切断性部分を含む抗体またはその塩は、機能性物質に対して反応することができる生体直交性官能基を有するため、機能性物質と反応することができる。このような反応は、上記「２−６．製造方法」で述べたような、タンパク質の変性・分解（例、アミド結合の切断）を引き起こし得ない条件（温和な条件）下で適宜行うことができる。
【０２７８】
反応系において、抗体に対する親和性物質、および切断性部分を含む抗体またはその塩（Ｘ）に対する機能性物質（Ｙ）のモル比率（Ｙ／Ｘ）は、抗体および機能性物質の種類、機能性物質によって修飾されるべき抗体中の部位の数（例、ＤＡＲ）等に応じて変動することから特に限定されないが、例えば０．１〜１００であり、好ましくは０．５〜８０であり、より好ましくは１〜７０であり、さらにより好ましくは２〜５０であり、特に好ましくは３〜３０である。
【０２７９】
抗体に対する親和性物質、切断性部分、機能性物質および抗体を有する複合体またはその塩の生成の確認は、その具体的な原料および生成物の分子量にもよるが、例えば、電気泳動法、クロマトグラフィー（例、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ）、または質量分析により、好ましくは、質量分析により行うことができる。位置選択性の確認、抗体以外の部分構造の個数の確認、および精製は、上記「２−６．製造方法」で述べた方法により適宜行うことができる。
【０２８０】
本発明はまた、以下を含む、抗体に対する親和性物質、切断性部分、機能性物質および抗体を有する複合体またはその塩の製造方法を提供する：
（Ｂ２）抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を含む化合物またはその塩を抗体と反応させて、抗体に対する親和性物質、および切断性部分を含む抗体またはその塩を生成すること；および
（Ｂ３）抗体に対する親和性物質、および切断性部分を含む抗体またはその塩を機能性物質と反応させて、抗体に対する親和性物質、切断性部分、機能性物質および抗体を有する複合体またはその塩を生成すること。
【０２８１】
上記（Ｂ２）の工程は、上記「２−６．製造方法」で述べた上記（Ａ１）の工程と同様にして行うことができる。上記（Ｂ３）の工程は、上記（Ｂ１）の工程と同様にして行うことができる。上記（Ｂ２）および（Ｂ３）の工程は、別々に行うことができる。あるいは、上記（Ｂ２）および（Ｂ３）の工程は、抗体中の反応標的である特定のアミノ酸残基と反応性基との反応対、および機能性物質中の官能基と生体直交性官能基との反応対の組合せに応じて、同時に行うことができる。すなわち、上記（Ｂ２）および（Ｂ３）の工程が同時に行われる場合、上記（Ｂ２）の工程で得られる生成物を単離することなく、上記（Ｂ２）の工程で得られる生成物含有反応液が、上記（Ｂ３）の工程に付されてもよい。
【０２８２】
４．生体直交性官能基を有する抗体またはその塩
４−１．製造方法の概要
本発明は、式（ＩＶ）で表される、生体直交性官能基を有する抗体またはその塩の製造方法を提供する。
Ｌ１−Ｂ−Ｒ’−Ｔ      （ＩＶ）
〔式中、
Ｌ１は、（ｉ’）生体直交性官能基を含む１価の基、または（ｉｉ’）生体直交性官能基を含まない１価の基であり、
Ｂは、（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基、または（ｂ）生体直交性官能基を含まない２価の基であり、
Ｒ’は、抗体と反応性基との間の反応により生成する部分であり、
Ｔは、抗体である。〕
【０２８３】
４−２．（ｉ’）生体直交性官能基を含む１価の基、または（ｉｉ’）生体直交性官能基を含まない１価の基（Ｌ１）
式（ＩＶ）において、Ｌ１は、（ｉ’）生体直交性官能基を含む１価の基、または（ｉｉ’）生体直交性官能基を含まない１価の基である。このような１価の基は、上述したような切断性部分を含む２価の基である切断性リンカーの切断により生成し得る１価の基である。したがって、Ｌ１は、上述したような切断性部分の残基または化学構造の切断により生成し得る１価の基であってもよい。より具体的には、（ｉ’）生体直交性官能基を含む１価の基は、上述した（ｉ）切断により生体直交性官能基を反応性基側に生成する能力を有する切断性部分を含む２価の基である切断性リンカーの切断により生成し得る１価の基であってもよく、（ｉｉ’）生体直交性官能基を含まない１価の基は、（ｉｉ）切断により生体直交性官能基を反応性基側に生成する能力を有しない切断性部分を含む２価の基である切断性リンカーの切断により生成し得る１価の基であってもよい。
【０２８４】
特定の実施形態では、Ｌ１は、下記式（Ｌ１−１）または（Ｌ１−２）のいずれか一つで表されてもよい：
Ｃ１−Ｌｂ      （Ｌ１−１）
Ｃ１            （Ｌ１−２）
〔式中、
Ｌｂは、２価の基であり、
Ｃ１は、生体直交性官能基、または生体直交性官能基以外の基である。〕
【０２８５】
２価の基としては、例えば、置換基を有していてもよい２価の炭化水素基、置換基を有していてもよい２価の複素環基、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＮＲａ−（Ｒａは水素原子、または置換基を示す）、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｓ）−、およびこれらの２以上（例えば２〜８、好ましくは２〜６、より好ましくは２〜４）の組み合わせからなる基が挙げられる。２価の炭化水素基、２価の複素環基、および置換基の定義、例、および好ましい例は、上述したとおりである。
【０２８６】
生体直交性官能基の定義、例、および好ましい例は、上述したとおりである。
【０２８７】
生体直交性官能基以外の基としては、例えば、上述した置換基のうち、生体直交性官能基以外のものが挙げられる。生体直交性官能基以外のこのような基としては、例えば、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、１価の複素環基、ヒドロキシル、アミノ、アルキルオキシ（アルコキシ）、シクロアルキルオキシ、アラルキルオキシ）が挙げられる。これらの基およびこれらの基の構成要素（例、アルキルオキシ（アルコキシ）におけるアルキル、シクロアルキルオキシにおけるシクロアルキル、およびアラルキルオキシにおけるアラルキル）の定義、例および好ましい例については、上述したものと同様である。
【０２８８】
特定の実施形態では、Ｌｂは、下記（Ｌｂ’）：
【化４１】
2019240287.tif 000043
〔式中、
ｐは、０〜１０の任意の整数であり、
ｑは、０〜１０の任意の整数であり、
Ｘは、炭素原子、窒素原子、または単結合（ここで、Ｘが窒素原子である場合、Ｒ１ｂは存在しない。Ｘが単結合である場合、Ｒ１ａおよびＲ１ｂは存在しない）であり、
Ｒ１ａ、およびＲ１ｂは、同一または異なって、水素原子、または上述する置換基からなる群より選ばれる。
○（白丸）は、Ｃ１に対する結合を示し、●（黒丸）はＢに対する結合を示す。〕で表されてもよい。
【０２８９】
ｐ、ｑ、およびＸ、ならびにＲ１ａ、およびＲ１ｂ（置換基）の定義、例、および好ましい例は、上述したとおりである。
【０２９０】
４−３．部分構造「Ｌ１−Ｂ」
４−３−１．Ｌ１末端部分およびＲ’を連結する部分構造「Ｌ１−Ｂ」の長さ
式（ＩＶ）において、切断により生成したＬ１末端部分（またはＣ１末端部分）およびＲ’を連結する部分構造（「Ｌ１−Ｂ」中の直鎖部分）の長さ（あるいは、式（ＩＶ）等の特定の式に限定されない、生体直交性官能基を位置選択的に有する抗体またはその塩における、生体直交性官能基および特定のアミノ酸残基の側鎖を連結する主鎖の原子数。以下同様）は、上記「１−６−１．ＡおよびＲを連結する部分構造「Ｌ−Ｂ」中の主鎖の長さ」で述べたような種々の因子に応じて、適宜設計することができる。
【０２９１】
切断により生成したＬ１末端部分（またはＣ１末端部分）およびＲ’を連結する部分構造の長さは、例えば約２．５Å以上、好ましくは約４Å以上、より好ましくは約５Å以上であってもよい。部分構造の長さはまた、例えば約１５Å以下、好ましくは約１２Å以下、より好ましくは約８Å以下であってもよい。より具体的には、部分構造の長さは、例えば約２．５〜１５Å、好ましくは約４〜１２Å、より好ましくは約５〜８Åであってもよい。
【０２９２】
より具体的には、切断により生成したＬ１末端部分（またはＣ１末端部分）およびＲ’を連結する部分構造の長さは、部分構造の連結鎖（水素原子および置換基を除く）を構成する原子数として規定することもできる。連結鎖を構成する原子数は、例えば２個（約２．５Å）以上、好ましくは３個（約４Å）以上、より好ましくは４個（約５Å）以上であってもよい。連結鎖を構成する原子数はまた、例えば１０個（約１５Å）以下、好ましくは８個（約１２Å）以下、より好ましくは６個（約８Å）以下であってもよい。より具体的には、連結鎖を構成する原子数は、例えば２〜１０個、好ましくは３〜８個、より好ましくは４〜６個であってもよい。
【０２９３】
切断により生成したＬ１末端部分（またはＣ１末端部分）およびＲ’を連結する部分構造の連結鎖が２価の環構造を含まない鎖状構造である場合、連結鎖の原子数は、連結鎖中の原子数を数えることにより決定することができる。
【０２９４】
一方、切断により生成したＬ１末端部分（またはＣ１末端部分）およびＲ’を連結する部分構造の連結鎖が２価の環構造を含む構造である場合、連結鎖の原子数と上述した長さとは必ずしも対応せず、連結鎖の原子数により規定され得る長さは、上述した長さよりも短くなる傾向がある。このような場合であっても、原子数により連結鎖の長さを規定する観点から、連結鎖の原子数を便宜的に数えることができる。具体的には、このような場合における連結鎖の原子数は、上述したように、連結鎖において２価の環構造を含まない鎖状構造中の原子数に加えて、２価の環構造中の２つの結合手を連絡する最短経路の原子数を数えることにより決定してもよい。
【０２９５】
好ましくは、切断により生成したＬ１末端部分（またはＣ１末端部分）およびＲ’を連結する部分構造の連結鎖は、２価の環構造を含まない鎖状構造であってもよい。この場合、切断により生成した末端部分およびＲ’を連結する部分構造の連結鎖において２価の環基が含まれないようにＬ１−Ｂを適宜設計することができる。
【０２９６】
特定の実施形態では、Ｌ１−Ｂで表される部分構造は、好ましくは、ペプチド部分を含まない。この場合、本発明の生体直交性官能基を有する抗体を用いて得られる本発明の機能性物質を有する抗体（例、抗体薬物複合体）は、免疫原性を有し得るペプチド部分をリンカーとして含み得ないという利点がある。
【０２９７】
４−３−２．部分構造「Ｌ１−Ｂ」の具体的構造
上記式（ＩＶ）において、Ｌ１およびＢは、互いに連関し得る構造である。したがって、上記式（ＩＶ）において、Ｌ１およびＢは、「Ｌ１−Ｂ」で表される部分構造として規定することができる。
【０２９８】
特定の実施形態では、Ｌ１が（ｉ’）生体直交性官能基を含む１価の基である場合、Ｂは、（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基、または（ｂ）生体直交性官能基を含まない２価の基である。
【０２９９】
好ましくは、Ｌ１が（ｉ’）生体直交性官能基を含む１価の基である場合、Ｂは、（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基である。この場合、（ｉ’）における生体直交性官能基は、（ａ）における生体直交性官能基と同種であっても異種であってもよい。より単純な構造の採用、および/または単一の機能性物質に対する反応性の向上等の観点では、（ｉ’）における生体直交性官能基は、（ａ）における生体直交性官能基と同種であってもよい。一方、２種以上の機能性物質に対する差別化された反応性の確保等、および反応における一部の生体直交性官能基の不使用の観点では、（ｉ’）における生体直交性官能基は、（ａ）における生体直交性官能基と異種であってもよい。
【０３００】
あるいは、Ｌ１が（ｉ’）生体直交性官能基を含む１価の基である場合、Ｂは、（ｂ）生体直交性官能基を含まない２価の基であってもよい。この場合、式（ＩＶ）で表される、生体直交性官能基を有する抗体またはその塩は、より単純な構造を有することになるので、合成が容易である。
【０３０１】
別の特定の実施形態では、Ｌ１が（ｉｉ’）生体直交性官能基を含まない１価の基である場合、Ｂは、（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基である。
【０３０２】
特定の実施形態では、Ｌ１−Ｂで表される構造単位は、下記式（Ｌ１Ｂ’）で表されてもよい。
【化４２】
2019240287.tif 000044
〔式中、
Ｃ１、ｐ、ｑ、Ｘ、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｙ、およびＺの定義、例および好ましい例は、上述したものと同じであり、
●（黒丸）は、Ｒ’に対する結合を示す。〕
【０３０３】
したがって、上記式（ＩＶ）は、下記式（ＩＶ’）として規定することができる。
【化４３】
2019240287.tif 000045
〔式中、
Ｃ１、ｐ、ｑ、Ｘ、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｙ、Ｚ、Ｒ’、およびＴの定義、例および好ましい例は、上述したものと同じである。〕
【０３０４】
上記式（Ｌ１Ｂ’）および（ＩＶ’）において、Ｃ＝ＺにおけるＣからＣ１までの長さは、切断により生成したＬ１末端部分（またはＣ１末端部分）およびＲ’を連結する部分構造の長さと同様である。これらの式において、Ｃ＝ＺにおけるＣからＣ１までの長さはまた、Ｃ＝ＺにおけるＣからＣ１までの部分構造の連結鎖（水素原子および置換基を除く）を構成する原子数として規定することもできる。このような原子数は、切断により生成したＬ１末端部分（またはＣ１末端）およびＲ’を連結する部分構造（水素原子および置換基を除く）を構成する原子数と同様である。Ｃ＝ＺにおけるＣからＣ１を連結する部分構造の連結鎖（水素原子および置換基を除く）は、環構造を含んでいなくても含んでいてもよいが、環構造を含んでいないことが好ましい。当該連結鎖（水素原子および置換基を除く）は、好ましくは、ペプチド部分を含まないものであってもよい。
【０３０５】
４−４．抗体が有する、抗体以外の部分構造の結合部位（位置選択性）
抗体以外の部分構造（例、Ｌ１−Ｂ−Ｒ’）は、抗体（Ｔ）における上述したような標的領域に位置選択的に結合させることができる。具体的には、Ｔが、連続する１〜５０個のアミノ酸残基からなる標的領域中において特定のアミノ酸残基を１個以上含み、かつ、前記標的領域以外の非標的領域中において前記特定のアミノ酸残基を５個以上含む場合、抗体以外の部分構造は、当該標的領域中に含まれる１個以上の特定のアミノ酸残基に対して３０％以上の位置選択性で結合させることができる。標的領域および位置選択性の定義、例、および好ましい例は、上述したとおりである。
【０３０６】
４−５．抗体が有する、抗体以外の部分構造の個数
抗体（Ｔ）が保有する、抗体以外の部分構造（例、Ｌ１−Ｂ−Ｒ’）の個数は、変動することができる。例えば、Ｔが複数の単量体タンパク質を含む多量体タンパク質である場合、Ｔは、複数個の単量体タンパク質中の対応する複数個の標的領域において、Ｔ以外の部分構造を有することができる。その結果、Ｔは、Ｔ以外の部分構造を複数個有することができる。したがって、式（ＩＶＩ）、（ＩＶ’）、またはＩＶ’’）で表される構造は、Ｔが、Ｔ以外の部分構造を１個または複数個有していてもよいことを示す。Ｔが有する、Ｔ以外の部分構造の個数は、抗体の種類、および抗体とそれに対して導入される構造単位との反応比率等の条件を適宜設定することで調節することができる。このような個数は、抗体の種類によっても異なるが、例えば１〜８、好ましくは１〜４、より好ましくは１または２であってもよい。
【０３０７】
特定の実施形態では、抗体が保有する、抗体以外の部分構造の個数は、抗体が、複数個の単量体タンパク質から構成される多量体タンパク質である場合、複数個であってもよい。本発明によれば、複数個の単量体タンパク質の同一標的領域に対して抗体以外の部分構造を複数個導入することができる。
【０３０８】
好ましい実施形態では、抗体は、複数個の重鎖を含む抗体であってもよい。抗体の定義、例、および好ましい例は、上述したとおりである。本発明では、抗体が保有する、抗体以外の部分構造の個数は、ＩｇＧ、ＩｇＥ、およびＩｇＤについては１個または２個（好ましくは２個）であり、ＩｇＡについては１〜４個（好ましくは４個）であり、ＩｇＭについては１〜８個（好ましくは８個）であってもよい。
【０３０９】
４−６．製造方法
本発明は、以下を含む、生体直交性官能基を有する抗体またはその塩の製造方法を提供する：
（Ｃ１）抗体に対する親和性物質、および切断性部分を含む抗体またはその塩の切断性部分を切断して、生体直交性官能基を有する抗体またはその塩を生成すること。
【０３１０】
抗体に対する親和性物質、および切断性部分を含む抗体は、式（ＩＩ）、好ましくは式（ＩＩ’）、より好ましくは式（ＩＩ’’）で表される。生体直交性官能基を有する抗体は、式（ＩＶ）、好ましくは式（ＩＶ’）、より好ましくは式（ＩＶ’’）で表される。
【０３１１】
抗体に対する親和性物質、および切断性部分を含む抗体またはその塩は、上述したような切断処理により切断することができる切断性部分を有するため、切断することができる。このような切断反応は、上記「２−６．製造方法」で述べたような、タンパク質の変性・分解（例、アミド結合の切断）を引き起こし得ない条件（温和な条件）下で適宜行うことができる。
【０３１２】
切断処理としては、例えば、（ａ）酸性物質、塩基性物質、還元剤、酸化剤、酵素からなる群より選ばれる１種以上の物質による処理、（ｂ）光からなる群より選ばれる物理化学的刺激による処理、または（ｃ）自己分解性の切断性部分を含む切断性リンカーを用いた場合の放置が挙げられる。このような切断処理の条件は、当該分野における技術常識である（例、Ｇ．Ｌｅｒｉｃｈｅ，Ｌ．  Ｃｈｉｓｈｏｌｍ，Ａ．Ｗａｇｎｅｒ，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０，５７１（２０１２）；Ｆｅｎｇ  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ．１３２，１５００（２０１０）．；Ｂｅｓｓｏｄｅｓ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  ９９，４２３（２００４）．；ＤｅＳｉｍｏｎｅ，Ｊ．Ｍ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ．１３２，１７９２８（２０１０）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｄ．Ｈ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，９１，１８７（２００３）；Ｓｃｈｏｅｎｍａｒｋｓ，Ｒ．Ｇ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，９５，２９１（２００４））。
【０３１３】
生体直交性官能基を有する抗体またはその塩の生成の確認は、その具体的な原料および生成物の分子量にもよるが、例えば、電気泳動法、クロマトグラフィー（例、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ）、または質量分析により、好ましくは、質量分析により行うことができる。位置選択性の確認、抗体以外の部分構造の個数の確認、および精製は、上記「２−６．製造方法」で述べた方法により適宜行うことができる。
【０３１４】
本発明はまた、以下を含む、生体直交性官能基を有する抗体またはその塩の製造方法を提供する：
（Ｃ２）抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を含む化合物またはその塩を抗体と反応させて、抗体に対する親和性物質、および切断性部分を含む抗体またはその塩を生成すること；および
（Ｃ３）抗体に対する親和性物質、および切断性部分を含む抗体またはその塩の切断性部分を切断して、生体直交性官能基を有する抗体またはその塩を生成すること。
【０３１５】
上記（Ｃ２）の工程は、上記「２−６．製造方法」で述べた上記（Ａ１）の工程と同様にして行うことができる。上記（Ｃ３）の工程は、上記（Ｃ１）の工程と同様にして行うことができる。上記（Ｃ２）および（Ｃ３）の工程は、別々に行うことができる。あるいは、上記（Ｃ２）および（Ｃ３）の工程は、反応性基と、切断により生成され得る生体直交性官能基との組合せ（非反応性）等の因子に応じて、同時に行うことができる。すなわち、上記（Ｃ２）および（Ｃ３）の工程が同時に行われる場合、上記（Ｃ２）の工程で得られる生成物を単離することなく、上記（Ｃ２）の工程で得られる生成物含有反応液が、上記（Ｃ３）の工程に付されてもよい〔例、上記（Ｃ２）の工程で得られる生成物含有反応液に対して、生成物に存在する切断性リンカー中の切断性部分を切断するために塩基性物質（求核剤であるヒドロキシルアミン）が添加されている実施例（８１−９）および（８４−８）を参照〕。
【０３１６】
５．機能性物質を有する抗体またはその塩の製造方法
５−１．概要
本発明は、式（Ｖ）で表される、機能性物質を有する抗体またはその塩の製造方法を提供する。
Ｆ−（Ｌ１−Ｂ）’−Ｒ’−Ｔ      （Ｖ）
〔式中、
Ｌ１は、（ｉ’）生体直交性官能基を含む１価の基、または（ｉｉ’）生体直交性官能基を含まない１価の基であり、
Ｂは、（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基、または（ｂ）生体直交性官能基を含まない２価の基であり、
（Ｌ１−Ｂ）’で表される構造単位は、機能性物質と、（ｉ’）および（ａ）における生体直交性官能基のいずれか一方または双方との間の反応により生成する部分を含む２価の構造単位であり、
Ｆは、機能性物質であり、
Ｒ’は、抗体と反応性基との間の反応により生成する部分であり、
Ｔは、抗体である。〕
【０３１７】
５−２．部分構造「Ｆ−（Ｌ１−Ｂ）’」
５−２−１．ＦおよびＲ’を連結する部分構造「Ｌ１−Ｂ」の長さ
式（Ｖ）において、ＦおよびＲ’を連結する部分構造「Ｌ１−Ｂ」（「Ｌ１−Ｂ」中の直鎖部分）の長さ（あるいは、式（Ｖ）等の特定の式に限定されない、機能性物質を位置選択的に有する抗体またはその塩における、機能性物質および特定のアミノ酸残基の側鎖を連結する主鎖の原子数、または機能性物質が生体直交性官能基を介して抗体に結合している場合には、生体直交性官能基および特定のアミノ酸残基の側鎖を連結する主鎖の原子数。以下同様）は、上記「１−６−１．ＡおよびＲを連結する部分構造「Ｌ−Ｂ」中の主鎖の長さ」で述べたような種々の因子に応じて、適宜設計することができる。
【０３１８】
ＦおよびＲ’を連結する部分構造の長さは、例えば約２．５Å以上、好ましくは約４Å以上、より好ましくは約５Å以上であってもよい。部分構造の長さはまた、例えば約１５Å以下、好ましくは約１２Å以下、より好ましくは約８Å以下であってもよい。より具体的には、部分構造の長さは、例えば約２．５〜１５Å、好ましくは約４〜１２Å、より好ましくは約５〜８Åであってもよい。
【０３１９】
より具体的には、ＦおよびＲ’を連結する部分構造の長さは、部分構造の連結鎖（水素原子および置換基を除く）を構成する原子数として規定することもできる。連結鎖を構成する原子数は、例えば２個（約２．５Å）以上、好ましくは３個（約４Å）以上、より好ましくは４個（約５Å）以上であってもよい。連結鎖を構成する原子数はまた、例えば１０個（約１５Å）以下、好ましくは８個（約１２Å）以下、より好ましくは６個（約８Å）以下であってもよい。より具体的には、連結鎖を構成する原子数は、例えば２〜１０個、好ましくは３〜８個、より好ましくは４〜６個であってもよい。
【０３２０】
ＦおよびＲ’を連結する部分構造の連結鎖が２価の環構造を含まない鎖状構造である場合、連結鎖の原子数は、連結鎖中の原子数を数えることにより決定することができる。
【０３２１】
一方、ＦおよびＲ’を連結する部分構造の連結鎖が２価の環構造を含む構造である場合、連結鎖の原子数と上述した長さとは必ずしも対応せず、連結鎖の原子数により規定され得る長さは、上述した長さよりも短くなる傾向がある。このような場合であっても、原子数により連結鎖の長さを規定する観点から、連結鎖の原子数を便宜的に数えることができる。具体的には、このような場合における連結鎖の原子数は、上述したように、連結鎖において２価の環構造を含まない鎖状構造中の原子数に加えて、２価の環構造中の２つの結合手を連絡する最短経路の原子数を数えることにより決定してもよい。
【０３２２】
好ましくは、ＦおよびＲ’を連結する部分構造の連結鎖は、２価の環構造を含まない鎖状構造であってもよい。ＦおよびＲ’を連結する部分構造の連結鎖において２価の環基が含まれないようにＬ１−Ｂを適宜設計することができる。
【０３２３】
特定の実施形態では、Ｌ１−Ｂで表される部分構造は、好ましくは、ペプチド部分を含まない。この場合、本発明の機能性物質を有する抗体（例、抗体薬物複合体）は、免疫原性を有し得るペプチド部分をリンカーとして含まないという利点がある。
【０３２４】
５−２−２．部分構造「Ｆ−（Ｌ１−Ｂ）’」の具体的構造
式（Ｖ）において、Ｆ−（Ｌ１−Ｂ）’におけるＬ１およびＢは、互いに連関し得る構造である。したがって、上記式（Ｖ）において、Ｌ１およびＢは、「Ｌ１−Ｂ」で表される部分構造として規定することができる。
【０３２５】
また、Ｆ−（Ｌ１−Ｂ）’で表される構造単位は、機能性物質と、（ｉ’）および（ａ）における生体直交性官能基のいずれか一方または双方との間の反応により生成する部分である。反応に供された生体直交性官能基は、式（Ｖ）において、存在しない。したがって、式（Ｖ）において、（ｉ’）および（ａ）における生体直交性官能基のいずれか一方または双方は、存在しない。機能性物質と、（ｉ’）および（ａ）における生体直交性官能基のいずれか一方または双方との間の反応により生成する部分は、機能性物質と生体直交性官能基との間の反応により生成する部分と同じである。したがって、本明細書において、機能性物質と、（ｉ’）および（ａ）における生体直交性官能基のいずれか一方または双方との間の反応により生成する部分の例（残基の名称）および具体例（化学構造式）は、機能性物質と生体直交性官能基との間の反応により生成する部分について上述したものと同じである。
【０３２６】
一実施形態では、Ｌ１が（ｉ’）生体直交性官能基を含む１価の基である場合、Ｂは、（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基、または（ｂ）生体直交性官能基を含まない２価の基である。
【０３２７】
好ましい実施形態では、Ｌ１が（ｉ’）生体直交性官能基を含む１価の基である場合、Ｂは、（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基である。この場合、（ｉ’）における生体直交性官能基は、（ａ）における生体直交性官能基と同種であっても異種であってもよい。より単純な構造の採用、および/または単一の機能性物質に対する反応性の向上等の観点では、（ｉ’）における生体直交性官能基は、（ａ）における生体直交性官能基と同種であってもよい。一方、２種以上の機能性物質に対する差別化された反応性の確保、および反応における一部の生体直交性官能基の不使用等の観点では、（ｉ’）における生体直交性官能基は、（ａ）における生体直交性官能基と異種であってもよい。
【０３２８】
別の好ましい実施形態では、Ｌ１が（ｉ’）生体直交性官能基を含む１価の基である場合、Ｂは、（ｂ）生体直交性官能基を含まない２価の基であってもよい。この場合、式（Ｖ）で表される、機能性物質を有する抗体またはその塩は、より単純な構造を有することになるので、合成が容易である。
【０３２９】
別の実施形態では、Ｌ１が（ｉｉ’）生体直交性官能基を含まない１価の基である場合、Ｂは、（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基である。
【０３３０】
特定の実施形態では、（ｉ’）および（ａ）における生体直交性官能基が異種である場合、式（Ｖ）で表される、機能性物質を有する抗体またはその塩は、式（Ｖ１）または（Ｖ２）で表されてもよい。
【０３３１】
Ｌ１−Ｂ’（−Ｆ）−Ｒ’−Ｔ      （Ｖ１）
〔式中、
Ｌ１は、（ｉ’）生体直交性官能基を含む１価の基、または（ｉｉ’）生体直交性官能基を含まない１価の基であり、
Ｂ’は、機能性物質と生体直交性官能基との間の反応により生成する部分を含む３価の基であり、
Ｆは、機能性物質であり、
Ｒ’は、抗体と反応性基との間の反応により生成する部分であり、
Ｔは、抗体である。〕
【０３３２】
Ｆ−Ｌ１’−Ｂ−Ｒ’−Ｔ      （Ｖ２）
〔式中、
Ｌ１’は、機能性物質と、（ｉ’）生体直交性官能基を含む１価の基との間の反応により生成する部分を含む２価の基であり、
Ｂは、（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基、または（ｂ）生体直交性官能基を含まない２価の基であり、
Ｆは、機能性物質であり、
Ｒ’は、抗体と反応性基との間の反応により生成する部分であり、
Ｔは、抗体である。〕
【０３３３】
Ｌ１’は、機能性物質と、（ｉ’）生体直交性官能基を含む１価の基との間の反応により生成する部分を含む２価の基である。機能性物質と、（ｉ’）生体直交性官能基を含む１価の基との間の反応により生成する部分は、機能性物質と生体直交性官能基との間の反応により生成する部分と同じである。したがって、本明細書において、機能性物質と、（ｉ’）生体直交性官能基を含む１価の基との間の反応により生成する部分の例（残基の名称）および具体例（化学構造式）は、機能性物質と生体直交性官能基との間の反応により生成する部分について上述したものと同じである。したがって、機能性物質が生体直交性官能基と反応するので、機能性物質と、（ｉ’）生体直交性官能基を含む１価の基との間の反応により生成する部分を含む２価の基（Ｌ１’）は、機能性物質と生体直交性官能基との間の反応により生成する部分を含む２価の基と表現することもできる（以下同様）。より具体的には、機能性物質と生体直交性官能基との間の反応により生成する部分を含む２価の基は、（１）上述の好ましい例において言及した残基である、チオスクシンイミド残基、トリアゾール残基、またはヒドラゾン残基を含む２価の基であってもよく、あるいは、（２）特に限定されるわけではないが、例えば、ジスルフィド残基（この残基は、上述の好ましい例において言及した残基である）、アセタール残基、ケタール残基、エステル残基、カルバモイル残基、アルコキシアルキル残基、イミン残基、三級アルキルオキシカルバメート残基、シラン残基、ヒドラゾン含有残基、フォスフォルアミデート残基、アコニチル残基、トリチル残基、アゾ残基、ビシナルジオール残基、セレン残基、電子吸引基を有する芳香族環含有残基、クマリン含有残基、スルホン含有残基、不飽和結合含有鎖残基、グリコシル残基からなる群より選ばれる残基を含む２価の基であってもよいが、（１）チオスクシンイミド残基、トリアゾール残基、またはヒドラゾン残基を含む２価の基が好ましい。
【０３３４】
別の特定の実施形態では、（ｉ’）および（ａ）における生体直交性官能基が同種または異種である場合、式（Ｖ）で表される、機能性物質を有する抗体またはその塩は、式（Ｖ３）で表されてもよい。
【０３３５】
Ｆａ−Ｌ１’−Ｂ’（−Ｆｂ）−Ｒ’−Ｔ      （Ｖ３）
〔式中、
Ｌ１’は、機能性物質と、（ｉ’）生体直交性官能基を含む１価の基との間の反応により生成する部分を含む２価の基であり、
Ｂ’は、機能性物質と生体直交性官能基との間の反応により生成する部分を含む３価の基であり、
ＦａおよびＦｂは、それぞれ、同一または異なる機能性物質であり、
Ｒ’は、抗体と反応性基との間の反応により生成する部分であり、
Ｔは、抗体である。〕
【０３３６】
特定の実施形態では、上記式（Ｖ１）において、Ｌ１−Ｂ’（−Ｆ）で表される構造単位は、下記式（Ｌ１Ｂ’(Ｆ））で表されてもよい。
【化４４】
2019240287.tif 000046
〔式中、
Ｆ、Ｃ１、ｐ、ｑ、Ｘ、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、およびＺの定義、例および好ましい例は、上述したものと同じであり、
Ｙ’は、前記式（Ｂ−１）のＹから水素原子を一つ除いた残基であり、
●（黒丸）は、Ｒ’に対する結合を示す。〕
【０３３７】
前記式（Ｂ−１）のＹから水素原子を一つ除いた残基の定義、例および好ましい例は、上述したものと同様である。
【０３３８】
したがって、上記式（Ｖ１）は、下記式（Ｖ１’）として規定することができる。
【化４５】
2019240287.tif 000047
〔式中、
Ｆ、Ｃ１、ｐ、ｑ、Ｘ、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｚ、Ｒ’、およびＴの定義、例および好ましい例は、上述したものと同じであり、
Ｙ’は、前記式（Ｂ−１）のＹから水素原子を一つ除いた残基である。〕
【０３３９】
特定の実施形態では、上記式（Ｖ２）において、Ｆ−Ｌ１’−Ｂで表される構造単位は、下記式（ＦＬ１’Ｂ）で表されてもよい。
【化４６】
2019240287.tif 000048
〔式中、
Ｆ、ｐ、ｑ、Ｘ、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｙ、およびＺの定義、例および好ましい例は、上述したものと同じであり、
Ｃ１’は、機能性物質と生体直交性官能基との間の反応により生成する部分であり、
●（黒丸）は、Ｒ’に対する結合を示す。〕
【０３４０】
Ｃ１’は、機能性物質と生体直交性官能基との間の反応により生成する部分である。Ｃ１’における、機能性物質と生体直交性官能基との間の反応により生成する部分の定義、例および好ましい例は、上記「機能性物質と生体直交性官能基との間の反応により生成する部分を含む２価の基」で述べたものと同様である（以下同様）。
【０３４１】
したがって、上記式（Ｖ２）は、下記式（Ｖ２’）として規定することができる。
【化４７】
2019240287.tif 000049
〔式中、
Ｆ、ｐ、ｑ、Ｘ、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｙ、Ｚ、Ｒ’、およびＴの定義、例および好ましい例は、上述したものと同じであり、
Ｃ１’は、機能性物質と生体直交性官能基との間の反応により生成する部分である。〕
【０３４２】
特定の実施形態では、上記式（Ｖ３）において、Ｆａ−Ｌ１’−Ｂ’（−Ｆｂ）で表される構造単位は、下記式（ＦａＬ１’Ｂ’（Ｆｂ））で表されてもよい。
【化４８】
2019240287.tif 000050
〔式中、
Ｆａ、Ｆｂ、ｐ、ｑ、Ｘ、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、およびＺの定義、例および好ましい例は、上述したものと同じであり、
Ｃ１’は、機能性物質と生体直交性官能基との間の反応により生成する部分であり、
Ｙ’は、前記式（Ｂ−１）のＹから水素原子を一つ除いた残基であり、
●（黒丸）は、Ｒ’に対する結合を示す。〕
【０３４３】
したがって、上記式（Ｖ３）は、下記式（Ｖ３’）として規定することができる。
【化４９】
2019240287.tif 000051
〔式中、
Ｆａ、Ｆｂ、ｐ、ｑ、Ｘ、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｚ、Ｒ’、およびＴの定義、例および好ましい例は、上述したものと同じであり、
Ｃ１’は、機能性物質と生体直交性官能基との間の反応により生成する部分であり、
Ｙ’は、前記式（Ｂ−１）のＹから水素原子を一つ除いた残基である。〕
【０３４４】
上記式（Ｌ１Ｂ’（Ｆ））、（ＦＬ１’Ｂ）、および（ＦａＬ１’Ｂ’（Ｆ２））、ならびに（Ｖ１’）、（Ｖ２’）および（Ｖ３’）において、Ｃ＝ＺにおけるＣからＣ１までの長さは、切断により生成したＬ１末端部分（またはＣ１末端部分）およびＲ’を連結する部分構造の長さと同様である。これらの式において、Ｃ＝ＺにおけるＣからＣ１までの長さはまた、Ｃ＝ＺにおけるＣからＣ１までの部分構造の連結鎖（水素原子および置換基を除く）を構成する原子数として規定することもできる。このような原子数は、切断により生成したＬ１末端部分（またはＣ１末端）およびＲ’を連結する部分構造（水素原子および置換基を除く）を構成する原子数と同様である。Ｃ＝ＺにおけるＣからＣ１を連結する部分構造の連結鎖（水素原子および置換基を除く）は、環構造を含んでいなくても含んでいてもよいが、環構造を含んでいないことが好ましい。当該連結鎖（水素原子および置換基を除く）は、好ましくは、ペプチド部分を含まないものであってもよい。
【０３４５】
５−３．抗体が有する、抗体以外の部分構造の結合部位（位置選択性）
抗体以外の部分構造（例、Ｆ−（Ｌ１−Ｂ）’−Ｒ’）は、抗体（Ｔ）における上述したような標的領域に位置選択的に結合させることができる。具体的には、Ｔが、連続する１〜５０個のアミノ酸残基からなる標的領域中において特定のアミノ酸残基を１個以上含み、かつ、前記標的領域以外の非標的領域中において前記特定のアミノ酸残基を５個以上含む場合、抗体以外の部分構造は、当該標的領域中に含まれる１個以上の特定のアミノ酸残基に対して３０％以上の位置選択性で結合させることができる。標的領域および位置選択性の定義、例、および好ましい例は、上述したとおりである。
【０３４６】
５−４．抗体が有する、抗体以外の部分構造の個数
抗体（Ｔ）が保有する、抗体以外の部分構造（例、Ｆ−（Ｌ１−Ｂ）’−Ｒ’）の個数は、変動することができる。例えば、Ｔが複数の単量体タンパク質を含む多量体タンパク質である場合、Ｔは、複数個の単量体タンパク質中の対応する複数個の標的領域において、Ｔ以外の部分構造を有することができる。その結果、Ｔは、Ｔ以外の部分構造を複数個有することができる。したがって、式（Ｖ）、（Ｖ１）、（Ｖ２）、（Ｖ３）、（Ｖ１’）、（Ｖ２’）、または（Ｖ３’）で表される構造は、Ｔが、Ｔ以外の部分構造を１個または複数個有していてもよいことを示す。Ｔが有する、Ｔ以外の部分構造の個数は、抗体の種類、および抗体とそれに対して導入される構造単位との反応比率等の条件を適宜設定することで調節することができる。このような個数は、抗体の種類によっても異なるが、例えば１〜８、好ましくは１〜４、より好ましくは１または２であってもよい。
【０３４７】
特定の実施形態では、抗体が保有する、抗体以外の部分構造の個数は、抗体が、複数個の単量体タンパク質から構成される多量体タンパク質である場合、複数個であってもよい。本発明によれば、複数個の単量体タンパク質の同一標的領域に対して抗体以外の部分構造を複数個導入することができる。
【０３４８】
好ましい実施形態では、抗体は、複数個の重鎖を含む抗体であってもよい。抗体の定義、例、および好ましい例は、上述したとおりである。本発明では、抗体が保有する、抗体以外の部分構造の個数は、ＩｇＧ、ＩｇＥ、およびＩｇＤについては１個または２個（好ましくは２個）であり、ＩｇＡについては１〜４個（好ましくは４個）であり、ＩｇＭについては１〜８個（好ましくは８個）であってもよい。
【０３４９】
５−５．製造方法
本発明は、機能性物質を有する抗体またはその塩の製造方法を提供する。本製造方法は、（Ｄ）抗体に対する親和性物質、切断性部分、機能性物質および抗体を有する複合体またはその塩を原料として使用する方法（図２の反応（３）を参照）、および（Ｅ）生体直交性官能基を有する抗体またはその塩を原料として使用する方法（図２の反応（５）を参照）に分類することができる。
【０３５０】
（Ｄ）抗体に対する親和性物質、切断性部分、機能性物質および抗体を有する複合体またはその塩を原料として使用する方法は、以下を含む：
（Ｄ１）抗体に対する親和性物質、切断性部分、機能性物質および抗体を有する複合体またはその塩の切断性部分を切断して、機能性物質を有する抗体またはその塩を生成すること。
【０３５１】
抗体に対する親和性物質、切断性部分、機能性物質および抗体を有する複合体は、式（ＩＩＩ）、好ましくは式（ＩＩＩ’）、より好ましくは式（ＩＩＩ’’）で表される。機能性物質を有する抗体は、式（Ｖ）、好ましくは式（Ｖ１）、（Ｖ２）、または（Ｖ３）、より好ましくは式（Ｖ１’）、（Ｖ２’）、または（Ｖ３’）で表される。
【０３５２】
抗体に対する親和性物質、切断性部分、機能性物質および抗体を有する複合体またはその塩は、上述したような切断処理により切断することができる切断性部分を有するため、切断することができる。このような切断反応は、上記「４−６．製造方法」で述べたような様式において行うことができる。
【０３５３】
機能性物質を有する抗体またはその塩の生成の確認は、その具体的な原料および生成物の分子量にもよるが、例えば、電気泳動法、クロマトグラフィー（例、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ）、または質量分析により、好ましくは、質量分析により行うことができる。位置選択性の確認、抗体以外の部分構造の個数の確認、および精製は、上記「２−６．製造方法」で述べた方法により適宜行うことができる。
【０３５４】
本発明はまた、以下を含む、機能性物質を有する抗体またはその塩の製造方法を提供する：
（Ｄ２）抗体に対する親和性物質、および切断性部分を含む抗体またはその塩を機能性物質と反応させて、抗体に対する親和性物質、切断性部分、機能性物質および抗体を有する複合体またはその塩を生成すること；および
（Ｄ３）抗体に対する親和性物質、切断性部分、機能性物質および抗体を有する複合体またはその塩の切断性部分を切断して、機能性物質を有する抗体またはその塩を生成すること。
【０３５５】
上記（Ｄ２）の工程は、上記「３−７．製造方法」で述べた上記（Ｂ１）の工程と同様にして行うことができる。上記（Ｄ３）の工程は、上記（Ｄ１）の工程と同様にして行うことができる。上記（Ｄ２）および（Ｄ３）の工程は、別々に行うことができる。あるいは、上記（Ｄ２）および（Ｄ３）の工程は、切断性部分、機能性物質および生体直交性官能基との組合せ等の因子に応じて、同時に行うことができる。すなわち、上記（Ｄ２）および（Ｄ３）の工程が同時に行われる場合、上記（Ｄ２）の工程で得られる生成物を単離することなく、上記（Ｄ２）の工程で得られる生成物含有反応液が、上記（Ｄ３）の工程に付されてもよい。
【０３５６】
本発明はさらに、以下を含む、機能性物質を有する抗体またはその塩の製造方法を提供する：
（Ｄ４）抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を含む化合物またはその塩を抗体と反応させて、抗体に対する親和性物質、および切断性部分を含む抗体またはその塩を生成すること；
（Ｄ５）抗体に対する親和性物質、および切断性部分を含む抗体またはその塩を機能性物質と反応させて、抗体に対する親和性物質、切断性部分、機能性物質および抗体を有する複合体またはその塩を生成すること；および
（Ｄ６）抗体に対する親和性物質、切断性部分、機能性物質および抗体を有する複合体またはその塩の切断性部分を切断して、機能性物質を有する抗体またはその塩を生成すること。
【０３５７】
上記（Ｄ４）の工程は、上記「２−６．製造方法」で述べた上記（Ａ１）の工程と同様にして行うことができる。上記（Ｄ５）および（Ｄ６）の工程は、上記（Ｄ２）および（Ｄ３）の工程と同様にして行うことができる。上記（Ｄ５）の工程は、上記「３−７．製造方法」で述べた上記（Ｂ１）の工程と同様にして行うことができる。上記（Ｄ６）の工程は、上記（Ｄ１）の工程と同様にして行うことができる。上記（Ｄ４）〜（Ｄ６）の工程は、別々に行うことができる。あるいは、上記（Ｄ４）〜（Ｄ６）の工程の少なくとも一部は、反応性基、切断性部分、機能性物質および生体直交性官能基との組合せ等の因子に応じて、同時に行うことができる。すなわち、上記（Ｄ４）〜（Ｄ６）の工程のうち２以上の工程が同時に行われる場合、先の工程で得られる生成物を単離することなく、先の工程で得られる生成物含有反応液が、次の工程に付されてもよい。
【０３５８】
（Ｅ）生体直交性官能基を有する抗体またはその塩を原料として使用する方法は、以下を含む：
（Ｅ１）生体直交性官能基を有する抗体またはその塩を機能性物質と反応させて、機能性物質を有する抗体またはその塩を生成すること。
【０３５９】
生体直交性官能基を有する抗体は、式（ＩＶ）、好ましくは式（ＩＶ’）で表される。機能性物質を有する抗体は、式（Ｖ）、好ましくは式（Ｖ１）、（Ｖ２）、または（Ｖ３）、より好ましくは式（Ｖ１’）、（Ｖ２’）、または（Ｖ３’）で表される。
【０３６０】
生体直交性官能基を有する抗体はまたはその塩は、生体直交性官能基を有するため、機能性物質と反応することができる。このような反応は、上記「３−７．製造方法」で述べたような様式において行うことができる。
【０３６１】
機能性物質を有する抗体またはその塩の生成の確認は、上述したような方法により行うことができる。位置選択性の確認、抗体以外の部分構造の個数の確認、および精製は、上記「２−６．製造方法」で述べた方法により適宜行うことができる。
【０３６２】
本発明はまた、以下を含む、機能性物質を有する抗体またはその塩の製造方法を提供する：
（Ｅ２）抗体に対する親和性物質、および切断性部分を含む抗体またはその塩の切断性部分を切断して、生体直交性官能基を有する抗体またはその塩を生成すること；および
（Ｅ３）生体直交性官能基を有する抗体またはその塩を機能性物質と反応させて、機能性物質を有する抗体またはその塩を生成すること。
【０３６３】
上記（Ｅ２）の工程は、上記「４−６．製造方法」で述べた上記（Ｃ１）の工程と同様にして行うことができる。上記（Ｅ３）の工程は、上記（Ｅ１）の工程と同様にして行うことができる。上記（Ｅ２）および（Ｅ３）の工程は、別々に行うことができる。あるいは、上記（Ｅ２）および（Ｅ３）の工程は、切断性部分、機能性物質および生体直交性官能基との組合せ等の因子に応じて、同時に行うことができる。すなわち、上記（Ｅ２）および（Ｅ３）の工程が同時に行われる場合、上記（Ｅ２）の工程で得られる生成物を単離することなく、上記（Ｅ２）の工程で得られる生成物含有反応液が、上記（Ｅ３）の工程に付されてもよい。
【０３６４】
本発明はさらに、以下を含む、機能性物質を有する抗体またはその塩の製造方法を提供する：
（Ｅ４）抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を含む化合物またはその塩を抗体と反応させて、抗体に対する親和性物質、および切断性部分を含む抗体またはその塩を生成すること；
（Ｅ５）抗体に対する親和性物質、および切断性部分を含む抗体またはその塩の切断性部分を切断して、生体直交性官能基を有する抗体またはその塩を生成すること；および
（Ｅ６）生体直交性官能基を有する抗体またはその塩を機能性物質と反応させて、機能性物質を有する抗体またはその塩を生成すること。
【０３６５】
上記（Ｅ４）の工程は、上記「２−６．製造方法」で述べた上記（Ａ１）の工程と同様にして行うことができる。上記（Ｅ５）および（Ｅ６）の工程は、上記（Ｅ２）および（Ｅ３）の工程と同様にして行うことができる。上記（Ｅ４）〜（Ｅ６）の工程は、別々に行うことができる。あるいは、上記（Ｅ４）〜（Ｅ６）の工程の少なくとも一部は、反応性基、切断性部分、機能性物質および生体直交性官能基との組合せ等の因子に応じて、同時に行うことができる。すなわち、上記（Ｅ４）〜（Ｅ６）の工程のうち２以上の工程が同時に行われる場合、先の工程で得られる生成物を単離することなく、先の工程で得られる生成物含有反応液が、次の工程に付されてもよい。
【０３６６】
６．塩
本発明において、塩としては、例えば、無機酸との塩、有機酸との塩、無機塩基との塩、有機塩基との塩、およびアミノ酸との塩が挙げられる。無機酸との塩としては、例えば、塩化水素、臭化水素、リン酸、硫酸、硝酸との塩が挙げられる。有機酸との塩としては、例えば、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、乳酸、酒石酸、フマル酸、シュウ酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸との塩が挙げられる。無機塩基との塩としては、例えば、アルカリ金属（例、ナトリウム、カリウム）、アルカリ土類金属（例、カルシウム、マグネシウム）、および亜鉛、アルミニウム等の他の金属、ならびにアンモニウムとの塩が挙げられる。有機塩基との塩としては、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、プロピレンジアミン、エチレンジアミン、ピリジン、エタノールアミン、モノアルキルエタノールアミン、ジアルキルエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミンとの塩が挙げられる。アミノ酸との塩としては、例えば、塩基性アミノ酸（例、アルギニン、ヒスチジン、リジン、オルニチン）、および酸性アミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）との塩が挙げられる。塩は、好ましくは、無機酸（例、塩化水素）との塩、または有機酸（例、トリフルオロ酢酸）との塩である。
【０３６７】
７．用途
抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する本発明の化合物またはその塩は、例えば、抗体の位置選択的な修飾に有用である。したがって、本発明は、抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物またはその塩を含む、抗体の位置選択的修飾試薬を提供する。
【０３６８】
本発明の位置選択的修飾試薬は、他の成分をさらに含む組成物の形態で提供されてもよい。このような他の成分としては、例えば、溶液、安定化剤（例、酸化防止剤、保存剤）が挙げられる。溶液としては、水溶液が好ましい。水溶液としては、例えば、水（例、蒸留水、滅菌蒸留水、精製水、生理食塩水）、緩衝液（例、リン酸水溶液、Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液、炭酸−重炭酸緩衝液、ホウ酸水溶液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、クエン酸緩衝液）が挙げられるが、緩衝液が好ましい。溶液のｐＨは、例えば５．０〜９．０、好ましくは５．５〜８．５である。本発明の位置選択的修飾試薬は、液状または粉末状（例、凍結乾燥粉末）において提供することができる。
【０３６９】
抗体に対する親和性物質、および切断性部分を（位置選択的に）有する本発明の抗体またはその塩、抗体に対する親和性物質、切断性部分、機能性物質および抗体を（位置選択的に）有する本発明の複合体またはその塩、ならびに生体直交性官能基を（位置選択的に）有する本発明の抗体またはその塩は、例えば、機能性物質を（位置選択的に）有する抗体またはその塩の調製のための中間体として有用である。
【０３７０】
機能性物質を（位置選択的に）有する本発明の抗体またはその塩は、例えば、医薬、または試薬（例、診断薬、研究用試薬）として有用である。
【０３７１】
特に、機能性物質を（位置選択的に）有する本発明の抗体またはその塩は、医薬として有用である。抗体薬物複合体（ＡＤＣ）の薬物の結合数および結合位置を変化させると、体内動態や薬物の放出速度、効果が変化することが上記のとおり報告されている。これらのことから次世代型ＡＤＣではコンジュゲーションする薬物の個数と位置を制御することが求められている。個数および位置が一定であると、期待通りのｅｆｆｉｃａｃｙ、コンジュゲーション薬剤のバリエーション、ロット差いわゆるレギュレーションの問題が解決すると考えられている。機能性物質を有する本発明の抗体またはその塩は、このようなレギュレーションの問題を解決することができる。したがって、機能性物質を有する本発明の抗体またはその塩は、医薬組成物の形態において提供されてもよい。このような医薬組成物は、機能性物質を有する抗体またはその塩に加えて、医薬上許容され得る担体を含んでいてもよい。医薬上許容され得る担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。機能性物質を有する本発明の抗体またはその塩はまた、安定性を実現する任意の修飾（例、ＰＥＧ化）を有していてもよい。
【０３７２】
経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水、オレンジジュースのような希釈液に有効量のリガンドを溶解させた液剤、有効量のリガンドを固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤または錠剤、適当な分散媒中に有効量の有効成分を懸濁させた懸濁液剤、有効量の有効成分を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。
【０３７３】
医薬組成物は、非経口的な投与（例、静脈内注射、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与）に好適である。このような非経口的な投与に好適な医薬組成物としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。
【０３７４】
医薬組成物の投与量は、有効成分の種類・活性、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、適宜設定することができる。
【実施例】
【０３７５】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【０３７６】
［実施例１：抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（１−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号５）のペプチドをＦｍｏｃ固相合成法により合成した。ペプチド合成装置はＣＥＭ社製Ｌｉｂｅｒｔｙ  Ｂｌｕｅを使用した。試薬は全て渡辺化学工業製のものを使用した。ＲｅｓｉｎはＦｍｏｃ−ＮＨ−ＳＡＬ−ＰＥＧ  Ｒｅｓｉｎ，ＨＬ、アルギニン（Ｒ）、システイン（Ｃ）、ヒスチジン（Ｈ）はダブルカップリングを行った。Ｒｅｓｉｎからの切り出しはトリフルオロ酢酸：水：トリイソプロピルシラン：エタンジチオール＝９４：２．５：１．０：２．５の溶液中３時間攪拌の条件で行った。切り出し後Ｒｅｓｉｎをフィルトレーションにより除去し、トリフルオロ酢酸を除去した。生成した結晶中にジエチルエーテルを加えエーテル沈殿を行い、生成した白色結晶をフィルトレーションにより回収した。これを０．１％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．１％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルのみ除去した後、凍結乾燥を行った。目的物（２１５ｍｇ，１０３μｍｏｌ）を得た。【０３７７】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ６９８．００［Ｍ＋３Ｈ］３＋,  ｚ＝４  ５３２．８０［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０３７８】
（１−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号５）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化５０】
2019240287.tif 000052
上記アミノ酸配列は、配列番号５である。【０３７９】
（１−１）で合成したペプチド（２１５ｍｇ，１０３μｍｏｌ）をＤＭＳＯに溶解し１００ｍＭとした後、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨを２等量、過酸化水素水を１等量加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（３３．３ｍｇ，１５．９μｍｏｌ）を得た。【０３８０】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ６９７．４５［Ｍ＋３Ｈ］３＋,  ｚ＝４  ５２３．３５［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０３８１】
（１−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化５１】
2019240287.tif 000053
上記アミノ酸配列は、配列番号５である。【０３８２】
（１−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号５）（３３．３ｍｇ，１５．９μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．００ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（２５７ｍｇ，６３６μｍｏｌ）をアセトニトリル（１．００ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（９．２０ｍｇ，３．８７μｍｏｌ）を得た。【０３８３】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７９３．７５［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：７９％【０３８４】
（１−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（１−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液をＮＡＰ−５カラムに添加し、反応を停止させ２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５２６００にピークが確認された。【０３８５】
（１−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（１−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８２、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【０３８６】
（１−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ（Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（疎水性相互作用クロマトグラフィー））−ＵＰＬＣ解析
（１−５）で生成した糖鎖切断を行っていない抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【０３８７】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料；
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【０３８８】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １１．３９１３分はペプチドがトラスツズマブに２個導入された化合物であると考えられる（図５）。【０３８９】
［実施例２：トラスツズマブのチオール導入体のペプチドマッピング］
（２−１）トラスツズマブのチオール導入体の消化酵素による処理
実施例１の（１−３）で得られた抗体・ペプチド複合体をＰＮＧａｓｅＦ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社製）により糖鎖切断を行った後、ペプチドマッピングを行った。１．５ｍＬ低吸着マイクロテストチューブにサンプル溶液を１０μＬ、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液、４０％トリフルオロエタノールに溶解した２０ｍＭのジチオスレイトール水溶液１０μＬを加えて６５℃で１時間加温後、５０ｍＭのヨードアセトアミド水溶液１０μＬを添加し、遮光下室温で３０分間３００ｒｐｍで振盪し反応させた。反応後、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液を４０μＬ加えて撹拌し、２０ｎｇ／μＬのトリプシン水溶液１０μＬ、もしくは２００ｎｇ／μＬのＧｌｕ−Ｃプロテアーゼ水溶液１２．５μＬを添加して３７℃で１８時間酵素消化した。消化後、２０％トリフルオロ酢酸水溶液をトリプシン消化サンプルには２μＬ、Ｇｌｕ−Ｃプロテアーゼ消化サンプルには２．１２μＬ添加し反応を止め、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定を実施した。【０３９０】
（２−２）トラスツズマブのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定条件
（分析装置）
ナノＨＰＬＣ：ＥＡＳＹ−ｎＬＣ  １０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）
質量分析計：トライブリッド質量分析計Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｆｕｓｉｏｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）【０３９１】
（ＨＰＬＣ分析条件）
トラップカラム：Ａｃｃｌａｉｍ  ＰｅｐＭａｐ（登録商標）  １００，７５μｍｘ２ｃｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）
分析カラム：ＥＳＩ−ｃｏｌｕｍｎ（ＮＴＣＣ−３６０／７５−３−１２５，７５μｍ×１２．５ｃｍ，３μｍ（日京テクノス株式会社））
移動相Ａ：０．１％ギ酸水溶液
移動相Ｂ：０．１％ギ酸、アセトニトリル溶液
ローディング溶液：０．１％トリフルオロ酢酸水溶液
流速：３００ｎＬ／ｍｉｎ
サンプル注入量：１μＬ
グラジエント条件（Ｂ％）：２％（０．０−０．５分）、２％→３０％（０．５−２３．５分）、３０％→７５％（２３．５−２５．５分）、７５％（２５．５−３５.０分）【０３９２】
（質量分析計分析条件）
イオン化法：ＥＳＩ，  Ｐｏｓｉｔｉｖｅモード
スキャンタイプ：Ｄａｔａ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ａｑｕｉｓｉｔｉｏｎ
Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｔｙｐｅ：Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＣＩＤ）
データの取得は付属ソフトであるＸｃａｌｉｂｕｒ  ３．０（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）およびＴｈｅｒｍｏ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｔｕｎｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ２．０（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて行った。【０３９３】
（２−３）トラスツズマブの修飾部位の解析条件
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定結果に対する修飾部位解析については、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．４（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて行った。【０３９４】
Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒでの解析は、Ｓｅｑｕｅｓｔ  ＨＴを検索エンジンとして使用し、プリカーサーイオンの範囲を３５０〜５０００Ｄａとした。また、トリプシンもしくはＧｌｕ−Ｃプロテアーゼを消化酵素として設定し、Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｍｉｓｓｅｄ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｓｉｔｅｓは３とした。また、プリカーサーおよびフラグメントイオンのＭａｓｓ  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅは、それぞれ５ｐｐｍおよび０．５Ｄａとした。Ｓｔａｔｉｃ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎにはヨードアセトアミドによるシステイン残基の修飾として、Ｃａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ（＋５７．０２１Ｄａ）を設定した。Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓについては、メチオニンの酸化（＋１５．９９５Ｄａ）およびリジン残基への修飾体（ヨードアセトアミドによるＣａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ化を受けたチオール導入体（＋１４５．０１９Ｄａ））を設定した。さらに、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＣｏｎｆｉｄｅｎｃｅがＨｉｇｈのもののみとなるようフィルターをかけた。【０３９５】
また、修飾部位の検索対象のアミノ酸配列のデータとして、図４に示される（１）、（３）を用いた。【０３９６】
（２−４）トラスツズマブのＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる修飾部位の解析結果
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた解析の結果、トラスツズマブのトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位（ヨードアセトアミドによるＣａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ化を受けたチオール導入体（＋１４５．０１９Ｄａ））を含むアミノ酸３３残基からなるペプチド、ＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号６）のペプチドフラグメントのＭＳスペクトル（実測値：ｍ／ｚ  １２６９．３０７１７、理論値：１２６９．３０２７３、３価）が観測され（図６）、ＣＩＤスペクトルより重鎖のＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおける２４８位のリジン残基の修飾を示す、２価のｙ９に相当するｍ／ｚ  ６０３．２９（理論値：６０３．３０）のプロダクトイオンが確認された（図７−１）。また、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒでの解析により、２４６位もしくは２４８位のリジン残基への修飾が高選択的に起こっていることが示された（図７−２）。
また、トラスツズマブのＧｌｕ−Ｃプロテアーゼ消化によるリジン残基への修飾部位（ヨードアセトアミドによるＣａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ化を受けたチオール導入体（＋１４５．０１９Ｄａ））を含むアミノ酸１６残基からなるペプチド、ＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤ（配列番号７）のペプチドフラグメントのＭＳスペクトル（実測値：ｍ／ｚ  ６１９．６７２９９、理論値：６１９．６７１１２、３価）が観測され（図８）、ＣＩＤスペクトルより重鎖のＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおける２４６位もしくは２４８位のリジン残基の修飾を示す、１価のｙ５に相当するｍ／ｚ  ７２９．４９（理論値：７２９．３６）のプロダクトイオンが確認された（図９−１）。また、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒでの解析により、２４６位もしくは２４８位のリジン残基への修飾が高選択的に起こっていることが示された（図９−２）。
この結果より、実施例１の（１−３）では抗体上、重鎖のＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にコンジュゲーションが進行していることが分かった。【０３９７】
［実施例３：トラスツズマブ・ペプチド複合体のジスルフィドリンカー切断、および再酸化、蛍光標識化およびそれらの生成物の解析］
（３−１）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化、およびそれらの生成物のＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
先ず、実施例１の（１−４）で合成したトラスツズマブ・ペプチド複合体１．９ｍｇを６０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）に溶解し、１８μＭとした後、１０ｍＭ  トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン  ５１．４μＬ（トラスツズマブ・ペプチド複合体に対して４０等量）を添加し室温で１時間攪拌して、リンカー中のジスルフィド結合を切断した。【０３９８】
次に、リンカー中のジスルフィド結合とともに切断された抗体中のジスルフィド結合を再度結合させるため、再酸化の工程を行った（Ｊａｇａｔｈ  Ｒ  Ｊｕｎｕｔｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＴＵＲＥ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，２６（８），９２５−９３２（２００８））。具体的には、反応液をＡｍｉｃｏｎ  １０Ｋにより９．５７ｍＭ  ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．０）へと溶媒置換し、トラスツズマブ・ペプチド複合体の濃度を１８μＭとした後、１０ｍＭ  デヒドロアスコルビン酸  ４８．６μＬ（トラスツズマブ・ペプチド複合体に対して４０等量）加えて３時間攪拌することにより、再酸化を行った。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、生成物はチオプロピオニル基が二つ導入された１４５３２９にピークが観測された。【０３９９】
次に、位置選択的に導入されたチオプロピオニル基に対して蛍光標識を行った。チオプロピオニル基が導入されたトラスツズマブを９．５７ｍＭ  ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．０）へと溶媒置換し、トラスツズマブ・ペプチド複合体の濃度を１８μＭとした後、５ｍＭ  フルオレセイン−５−マレイミド  ６．８μＬ（トラスツズマブ・チオプロピオニル基導入体に対して１０等量）加えて２時間攪拌することにより、蛍光標識化を行った。生成したトラスツズマブ蛍光標識体に７ｍＭトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌し、ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定した。原料のトラスツズマブ・チオプロピニルは５０６８２、５０８４４に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖に蛍光標識体が導入された５１１０９、５１２７２および、原料と同じ２３４４０に軽鎖ピークが観測された。なお、生成物の測定の際には重鎖原料の５０６８２、５０８４４のピークは消失したことから、フルオレセイン−５−マレイミドは全ての重鎖と反応したと考えられる。本結果より実際のＡＤＣを合成した際もＤＡＲ（Ｄｒｕｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｒａｔｉｏ、抗体薬物比）２．０で制御できると考えられる。【０４００】
（３−２）リンカー切断、再酸化後のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（３−１）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【０４０１】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；
ｂ：トラスツズマブ＋リンカー切断、再酸化後サンプル；【０４０２】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １２．７１５７分はペプチドがトラスツズマブに２個ペプチドが導入された化合物であり、１１．２９０９分はペプチドがトラスツズマブに２個チオプロピオニル基が導入された化合物である（図１０）。【０４０３】
［実施例４：抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（４−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＩＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号８）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（６３．２ｍｇ，３０．４μｍｏｌ）を得た。【０４０４】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ６９３．３５［Ｍ＋３Ｈ］３＋,  ｚ＝４  ５２０．３０［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０４０５】
（４−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＩＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号８）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化５２】
2019240287.tif 000054
上記アミノ酸配列は、配列番号８である。【０４０６】
（４−１）で合成したペプチド（６３．２ｍｇ，３０．４μｍｏｌ）をＤＭＳＯに溶解し１００ｍＭとした後、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨを２等量、過酸化水素水を１等量加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（２５．３ｍｇ，１２．２μｍｏｌ）を得た。【０４０７】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ６９２．７０［Ｍ＋３Ｈ］３＋,  ｚ＝４  ５２０．３０［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０４０８】
（４−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化５３】
2019240287.tif 000055
上記アミノ酸配列は、配列番号８である。【０４０９】
（４−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＩＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号８）（２５．３ｍｇ，１２．２μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．００ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（１９７ｍｇ，４８８μｍｏｌ）をアセトニトリル（１．５０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（６．０ｍｇ，２．５４μｍｏｌ）を得た。【０４１０】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７８９．２０［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：８９％【０４１１】
（４−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（４−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液をＮＡＰ−５カラムに添加し、反応を停止させ２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１５０３１４にピークが確認され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５２５６８にピークが確認された。【０４１２】
（４−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（４−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８２、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【０４１３】
（４−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（４−５）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【０４１４】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【０４１５】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １０．６９４４分はペプチドが１個導入された化合物１１．３２８７分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図１１）。【０４１６】
（４−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（４−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【０４１７】
［実施例５：抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（５−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＶＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号９）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（６９．３ｍｇ，３３．６μｍｏｌ）を得た。【０４１８】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ６８８．８０［Ｍ＋３Ｈ］３＋,  ｚ＝４  ５１６．８５［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０４１９】
（５−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＶＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号９）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化５４】
2019240287.tif 000056
上記アミノ酸配列は、配列番号９である。【０４２０】
（５−１）で合成したペプチド（６９．３ｍｇ，３３．６μｍｏｌ）をＤＭＳＯに溶解し１００ｍＭとした後、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨを２等量、過酸化水素水を１等量加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（３５．８ｍｇ，１７．３μｍｏｌ）を得た。【０４２１】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ６８８．０５［Ｍ＋３Ｈ］３＋,  ｚ＝４  ５１６．３０［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０４２２】
（５−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化５５】
2019240287.tif 000057
上記アミノ酸配列は、配列番号９である。【０４２３】
（５−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＶＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号９）（３５．８ｍｇ，１７．３μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．００ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（２８０ｍｇ，６９２μｍｏｌ）をアセトニトリル（２．００ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（５．５ｍｇ，２．３４μｍｏｌ）を得た。【０４２４】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７８４．５５［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：７１％【０４２５】
（５−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（５−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液をＮＡＰ−５カラムに添加し、反応を停止させ２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１５０３１４にピークが確認され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５２５６８にピークが確認された。【０４２６】
（５−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（５−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８３、５０８４５および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【０４２７】
（５−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（５−５）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【０４２８】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【０４２９】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １０．１４１０分はペプチドが１個導入された化合物１０．７０９１分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図１２）。【０４３０】
（５−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（５−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【０４３１】
［実施例６：トラスツズマブのチオール導入体のペプチドマッピング］
（６−１）トラスツズマブのチオール導入体のトリプシン処理
実施例５の（５−３）で得られた抗体・ペプチド複合体をＰＮＧａｓｅＦ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社製）により糖鎖切断を行った後、ペプチドマッピングを行った。１．５ｍＬ低吸着マイクロテストチューブにサンプル溶液を１０μＬ、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液、４０％トリフルオロエタノールに溶解した２０ｍＭのジチオスレイトール水溶液１０μＬを加えて６５℃で１時間加温後、５０ｍＭのヨードアセトアミド水溶液１０μＬを添加し、遮光下室温で３０分間３００ｒｐｍで振盪し反応させた。反応後、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液を４０μＬ加えて撹拌し、２０ｎｇ／μＬのトリプシン水溶液を１０μＬ添加して３７℃で１８時間酵素消化した。消化後、２０％トリフルオロ酢酸水溶液を２μＬ添加し反応を止め、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定を実施した。【０４３２】
（６−２）トラスツズマブのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定条件
（分析装置）
ナノＨＰＬＣ：ＥＡＳＹ−ｎＬＣ  １０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）
質量分析計：トライブリッド質量分析計Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｆｕｓｉｏｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）【０４３３】
（ＨＰＬＣ分析条件）
トラップカラム：Ａｃｃｌａｉｍ  ＰｅｐＭａｐ（登録商標）  １００，７５μｍｘ２ｃｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）
分析カラム：ＥＳＩ−ｃｏｌｕｍｎ（ＮＴＣＣ−３６０／７５−３−１２５，７５μｍ×１２．５ｃｍ，３μｍ（日京テクノス株式会社））
移動相Ａ：０．１％ギ酸水溶液
移動相Ｂ：０．１％ギ酸、アセトニトリル溶液
ローディング溶液：０．１％トリフルオロ酢酸水溶液
流速：３００ｎＬ／ｍｉｎ
サンプル注入量：１μＬ
グラジエント条件（Ｂ％）：２％（０．０−０．５分）、２％→３０％（０．５−２３．５分）、３０％→７５％（２３．５−２５．５分）、７５％（２５．５−３５.０分）【０４３４】
（質量分析計分析条件）
イオン化法：ＥＳＩ，  Ｐｏｓｉｔｉｖｅモード
スキャンタイプ：Ｄａｔａ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ａｑｕｉｓｉｔｉｏｎ
Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｔｙｐｅ：Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＣＩＤ）
データの取得は付属ソフトであるＸｃａｌｉｂｕｒ  ３．０（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）およびＴｈｅｒｍｏ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｔｕｎｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ２．０（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて行った。【０４３５】
（６−３）トラスツズマブの修飾部位の解析条件
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定結果に対する修飾部位解析については、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．４（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて行った。【０４３６】
Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒでの解析は、Ｓｅｑｕｅｓｔ  ＨＴを検索エンジンとして使用し、プリカーサーイオンの範囲を３５０〜５０００Ｄａ、Ｔｏｔａｌ  Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄを５００００とした。また、トリプシンを消化酵素として設定し、Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｍｉｓｓｅｄ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｓｉｔｅｓは３とした。また、プリカーサーおよびフラグメントイオンのＭａｓｓ  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅは、それぞれ５ｐｐｍおよび０．５Ｄａとした。Ｓｔａｔｉｃ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎにはヨードアセトアミドによるシステイン残基の修飾として、Ｃａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ（＋５７．０２１Ｄａ）を設定した。Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓについては、メチオニンの酸化（＋１５．９９５Ｄａ）およびリジン残基への修飾体（ヨードアセトアミドによるＣａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ化を受けたチオール導入体（＋１４５．０１９Ｄａ））を設定した。さらに、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＣｏｎｆｉｄｅｎｃｅがＨｉｇｈのもののみとなるようフィルターをかけた。【０４３７】
また、修飾部位の検索対象のアミノ酸配列のデータとして、図４に示される（１）、（３）を用いた。【０４３８】
（６−４）トラスツズマブのＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる修飾部位の解析結果
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた解析の結果、トラスツズマブのトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位（ヨードアセトアミドによるＣａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ化を受けたチオール導入体（＋１４５．０１９Ｄａ））を含むアミノ酸３３残基からなるペプチド、ＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号６）のペプチドフラグメントのＭＳスペクトル（実測値：ｍ／ｚ  ９５２．２３１７０、理論値：９５２．２２９００、４価）が観測され（図１３）、ＣＩＤスペクトルより重鎖のＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおける２４６位もしくは２４８位のリジン残基の修飾を示す、２価のｙ２０に相当するｍ／ｚ  １１６６．８８（理論値：１１６６．６１）のプロダクトイオンが確認された（図１４−１）。また、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒでの解析により、２４６位もしくは２４８位のリジン残基への修飾が高選択的に起こっていることが示された（図１４−２）。この結果より、実施例５の（５−３）では抗体上、重鎖上ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にコンジュゲーションが進行していることが分かった。【０４３９】
［実施例７：抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（７−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＡＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号１０）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（７３．１ｍｇ，３５．９μｍｏｌ）を得た。【０４４０】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ６７４．７０［Ｍ＋３Ｈ］３＋,  ｚ＝４  ５０６．３０［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０４４１】
（７−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＡＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号１０）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化５６】
2019240287.tif 000058
上記アミノ酸配列は、配列番号１０である。【０４４２】
（７−１）で合成したペプチド（７３．１ｍｇ，３５．９μｍｏｌ）をＤＭＳＯに溶解し１００ｍＭとした後、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨを２等量、過酸化水素水を１等量加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（３０．５ｍｇ，１５．０μｍｏｌ）を得た。【０４４３】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ６７８．７５［Ｍ＋３Ｈ］３＋,  ｚ＝４  ５０９．３０［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０４４４】
（７−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化５７】
2019240287.tif 000059
上記アミノ酸配列は、配列番号１０である。【０４４５】
（７−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＡＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号１０）（３０．５ｍｇ，１５．０μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．００ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（２４３ｍｇ，６００μｍｏｌ）をアセトニトリル（１．５０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（５．４ｍｇ，２．３２μｍｏｌ）を得た。【０４４６】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７７５．１５［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：８９％【０４４７】
（７−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（７−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液をＮＡＰ−５カラムに添加し、反応を停止させ２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１５０２６８にピークが確認され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５２６３０にピークが確認された。【０４４８】
（７−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（７−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８３、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【０４４９】
（７−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（７−５）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【０４５０】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【０４５１】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １０．２５０５分はペプチドが１個導入された化合物１０．７６２１分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図１５）。【０４５２】
（７−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（７−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【０４５３】
［実施例８：抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（８−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＬＬＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号１１）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（３０．３ｍｇ，１４．５μｍｏｌ）を得た。【０４５４】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ６９８．０５［Ｍ＋３Ｈ］３＋,  ｚ＝４  ５３２．８０［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０４５５】
（８−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＬＬＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号１１）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化５８】
2019240287.tif 000060
上記アミノ酸配列は、配列番号１１である。【０４５６】
（８−１）で合成したペプチド（３０．３ｍｇ，１４．５μｍｏｌ）をＤＭＳＯに溶解し１００ｍＭとした後、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨを２等量、過酸化水素水を１等量加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（１１．９ｍｇ，５．７０μｍｏｌ）を得た。【０４５７】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ６９７．３５［Ｍ＋３Ｈ］３＋,  ｚ＝４  ５２３．３０［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０４５８】
（８−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化５９】
2019240287.tif 000061
上記アミノ酸配列は、配列番号１１である。【０４５９】
（８−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＬＬＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号１１）（１１．９ｍｇ，５．７０μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．００ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（９２ｍｇ，２２８μｍｏｌ）をアセトニトリル（１．００ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（６．０ｍｇ，２．５２μｍｏｌ）を得た。【０４６０】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７９３．８５［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：７５％【０４６１】
（８−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（８−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液をＮＡＰ−５カラムに添加し、反応を停止させ２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは１４８０７３にピークが観測され、結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１５０４９５にピークが観測され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５２７５２にピークが確認された。【０４６２】
（８−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（８−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８２、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【０４６３】
（８−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（８−５）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【０４６４】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【０４６５】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １０．４２００分はペプチドが１個導入された化合物１１．０３０３分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図１６）。【０４６６】
（８−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（８−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【０４６７】
［実施例９：抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（９−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＬＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号１２）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（４０．０ｍｇ，１９．１μｍｏｌ）を得た。【０４６８】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ６９８．１０［Ｍ＋３Ｈ］３＋,  ｚ＝４  ５３２．８０［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０４６９】
（９−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＬＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号１２）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化６０】
2019240287.tif 000062
上記アミノ酸配列は、配列番号１２である。【０４７０】
（９−１）で合成したペプチド（４０．０ｍｇ，１９．１μｍｏｌ）をＤＭＳＯに溶解し１００ｍＭとした後、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨを２等量、過酸化水素水を１等量加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（１３．５ｍｇ，６．４６μｍｏｌ）を得た。【０４７１】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ６９７．４０［Ｍ＋３Ｈ］３＋,  ｚ＝４  ５２３．３０［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０４７２】
（９−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化６１】
2019240287.tif 000063
上記アミノ酸配列は、配列番号１２である。【０４７３】
（９−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＬＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号１２）（１３．５ｍｇ，６．４６μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．００ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（１０４ｍｇ，２５８μｍｏｌ）をアセトニトリル（１．００ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（５．５ｍｇ，２．３１μｍｏｌ）を得た。【０４７４】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７９３．７５［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：９０％【０４７５】
（９−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（９−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液をＮＡＰ−５カラムに添加し、反応を停止させ２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５２７５８にピークが確認された。【０４７６】
（９−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（９−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８２、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【０４７７】
（９−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（９−５）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【０４７８】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【０４７９】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １１．２８８３分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図１７）。【０４８０】
（９−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（９−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【０４８１】
［実施例１０：抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（１０−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＤＣＡＹＨＫＧＱＩＶＷＣＴ−ＮＨ２（配列番号１３）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（３１４ｍｇ，２００μｍｏｌ）を得た。【０４８２】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝２  ７８３．３０［Ｍ＋２Ｈ］２＋【０４８３】
（１０−２）Ａｃ−ＤＣＡＹＨＫＧＱＩＶＷＣＴ−ＮＨ２（配列番号１３）２位と１２位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化６２】
2019240287.tif 000064
上記アミノ酸配列は、配列番号１３である。【０４８４】
（１０−１）で合成したペプチド（３１４ｍｇ，２００μｍｏｌ）をＤＭＳＯに溶解し１００ｍＭとした後、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨを２等量、過酸化水素水を１等量加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（４７．８ｍｇ，３０．６μｍｏｌ）を得た。【０４８５】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝２  ７８２．２０［Ｍ＋２Ｈ］２＋【０４８６】
（１０−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化６３】
2019240287.tif 000065
上記アミノ酸配列は、配列番号１３である。【０４８７】
（１０−２）で合成したＡｃ−ＤＣＡＹＨＫＧＱＩＶＷＣＴ−ＮＨ２（配列番号１３）（４７．８ｍｇ，３０．６μｍｏｌ、ただし２番目と１２番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．００ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（４９３ｍｇ，１．２２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２．００ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（１４．０ｍｇ，７．５９μｍｏｌ）を得た。【０４８８】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝２  ９２６．７０［Ｍ＋２Ｈ］２＋
ＨＰＬＣ純度：９０％【０４８９】
（１０−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（１０−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液をＮＡＰ−５カラムに添加し、反応を停止させ２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５２０５３にピークが確認された。【０４９０】
（１０−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（１０−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８２、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【０４９１】
（１０−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（１０−５）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【０４９２】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【０４９３】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １２．９６０９分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図１８）。【０４９４】
（１０−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（１０−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【０４９５】
［実施例１１：抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（１１−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＤＣＡＹＨＫＧＱＶＶＷＣＴ−ＮＨ２（配列番号１４）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（１８０ｍｇ，１１６μｍｏｌ）を得た。【０４９６】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝１  １５５１．０［Ｍ＋Ｈ］＋，ｚ＝２  ７７６．３０［Ｍ＋２Ｈ］２＋【０４９７】
（１１−２）Ａｃ−ＤＣＡＹＨＫＧＱＶＶＷＣＴ−ＮＨ２（配列番号１４）２位と１２位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化６４】
2019240287.tif 000066
上記アミノ酸配列は、配列番号１４である。【０４９８】
（１１−１）で合成したペプチド（１８０ｍｇ，１１６μｍｏｌ）をＤＭＳＯに溶解し１００ｍＭとした後、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨを２等量、過酸化水素水を１等量加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（３６．４ｍｇ，２３．５μｍｏｌ）を得た。【０４９９】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝１  １５４９．９５［Ｍ＋Ｈ］＋，ｚ＝２  ７７５．３０［Ｍ＋２Ｈ］２＋【０５００】
（１１−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化６５】
2019240287.tif 000067
上記アミノ酸配列は、配列番号１４である。【０５０１】
（１１−２）で合成したＡｃ−ＤＣＡＹＨＫＧＱＶＶＷＣＴ−ＮＨ２（配列番号１４）（３６．４ｍｇ，２３．５μｍｏｌ、ただし２番目と１２番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．５０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（３８０ｍｇ，０．９４ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２．５０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（１６．０ｍｇ，８．７０μｍｏｌ）を得た。【０５０２】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝２  ９１９．９５［Ｍ＋２Ｈ］２＋
ＨＰＬＣ純度：９０％【０５０３】
（１１−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（１１−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液をＮＡＰ−５カラムに添加し、反応を停止させ２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１４９２２０にピークが確認され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５１８６１にピークが確認された。【０５０４】
（１１−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（１１−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８２、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【０５０５】
（１１−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（１１−５）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【０５０６】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【０５０７】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １１．１０７１分はペプチドがトラスツズマブに１個導入された化合物、１２．５１１４分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図１９）。【０５０８】
（１１−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（１１−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【０５０９】
［実施例１２：抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（１２−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＤＣＡＹＨＫＧＱＡＶＷＣＴ−ＮＨ２（配列番号１５）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（１５８ｍｇ，１０４μｍｏｌ）を得た。【０５１０】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝１  １５２３．９５［Ｍ＋Ｈ］＋，ｚ＝２  ７６２．２５［Ｍ＋２Ｈ］２＋【０５１１】
（１２−２）Ａｃ−ＤＣＡＹＨＫＧＱＡＶＷＣＴ−ＮＨ２（配列番号１５）２位と１２位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化６６】
2019240287.tif 000068
上記アミノ酸配列は、配列番号１５である。【０５１２】
（１２−１）で合成したペプチド（１５８ｍｇ，１０４μｍｏｌ）をＤＭＳＯに溶解し１００ｍＭとした後、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨを２等量、過酸化水素水を１等量加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（２６．７ｍｇ，１７．６μｍｏｌ）を得た。【０５１３】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝１  １５２１．８０［Ｍ＋Ｈ］＋，ｚ＝２  ７６１．２０［Ｍ＋２Ｈ］２＋【０５１４】
（１２−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化６７】
2019240287.tif 000069
上記アミノ酸配列は、配列番号１５である。【０５１５】
（１２−２）で合成したＡｃ−ＤＣＡＹＨＫＧＱＡＶＷＣＴ−ＮＨ２（配列番号１５）（２６．７ｍｇ，１７．６μｍｏｌ、ただし２番目と１２番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．５０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（３８０ｍｇ，０．９４ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２．００ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（６．５０ｍｇ，３．５９μｍｏｌ）を得た。【０５１６】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝２  ９０６．１０［Ｍ＋２Ｈ］２＋
ＨＰＬＣ純度：９３％【０５１７】
（１２−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（１２−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液をＮＡＰ−５カラムに添加し、反応を停止させ２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１４８８９７にピークが確認され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５１６１９にピークが確認された。【０５１８】
（１２−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（１２−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８４、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【０５１９】
（１２−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（１２−５）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【０５２０】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【０５２１】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １０．８４８９分はペプチドがトラスツズマブに１個導入された化合物、１１．７６４９分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図２０）。【０５２２】
（１２−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（１２−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【０５２３】
［実施例１３：抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（１３−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＳＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号１６）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（２０．０ｍｇ，９．４３μｍｏｌ）を得た。【０５２４】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７０８．００［Ｍ＋３Ｈ］３＋,  ｚ＝４  ５３１．３５［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０５２５】
（１３−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＳＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号１６）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化６８】
2019240287.tif 000070
上記アミノ酸配列は、配列番号１６である。【０５２６】
（１３−１）で合成したペプチド（２０．０ｍｇ，９．４３μｍｏｌ）をＤＭＳＯに溶解し１００ｍＭとした後、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨを２等量、過酸化水素水を１等量加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（１２．０ｍｇ，５．６６μｍｏｌ）を得た。【０５２７】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７０７．５０［Ｍ＋３Ｈ］３＋,  ｚ＝４  ５３０．８５［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０５２８】
（１３−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化６９】
2019240287.tif 000071
上記アミノ酸配列は、配列番号１６である。【０５２９】
（１３−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＳＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号１６）（１２．０ｍｇ，５．６６μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．４０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（４５．７ｍｇ，１１３μｍｏｌ）をアセトニトリル（０．４０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（３．２０ｍｇ，１．３３μｍｏｌ）を得た。【０５３０】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ８０３．８０［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：９２％【０５３１】
（１３−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（１３−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液をＮＡＰ−５カラムに添加し、反応を停止させ２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５２８６４にピークが確認された。【０５３２】
（１３−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（１３−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８２、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【０５３３】
（１３−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（１３−５）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【０５３４】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【０５３５】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １１．１８８５分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図２１）。【０５３６】
（１３−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（１３−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【０５３７】
［実施例１４：抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（１４−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＮＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号１７）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（２６．４ｍｇ，１２．３μｍｏｌ）を得た。【０５３８】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７１７．００［Ｍ＋３Ｈ］３＋,  ｚ＝４  ５３７．９５［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０５３９】
（１４−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＮＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号１７）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化７０】
2019240287.tif 000072
上記アミノ酸配列は、配列番号１７である。【０５４０】
（１４−１）で合成したペプチド（２６．４ｍｇ，１２．３μｍｏｌ）をＤＭＳＯに溶解し１００ｍＭとした後、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨを２等量、過酸化水素水を１等量加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（１３．０ｍｇ，６．０６μｍｏｌ）を得た。【０５４１】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７１６．１５［Ｍ＋３Ｈ］３＋,  ｚ＝４  ５３７．５５［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０５４２】
（１４−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化７１】
2019240287.tif 000073
上記アミノ酸配列は、配列番号１７である。【０５４３】
（１４−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＮＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号１７）（１３．０ｍｇ，６．０６μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．４０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（４９．０ｍｇ，１２１μｍｏｌ）をアセトニトリル（０．４０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（１．３０ｍｇ，０．５３μｍｏｌ）を得た。【０５４４】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ８１２．８５［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：１００％【０５４５】
（１４−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（１４−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液をＮＡＰ−５カラムに添加し、反応を停止させ２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１５０５４９にピークが確認され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５２８６９にピークが確認された。【０５４６】
（１４−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（１４−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８２、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【０５４７】
（１４−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（１４−５）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【０５４８】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【０５４９】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  ９．８２９５分はトラスツズマブ原料、１０．７１０７分はペプチドがトラスツズマブに１個導入された化合物、１１．４４０７分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図２２）。【０５５０】
（１４−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（１４−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【０５５１】
［実施例１５：抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（１５−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＤＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号１８）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（３７．２ｍｇ，１７．３μｍｏｌ）を得た。【０５５２】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝４  ５３８．２０［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０５５３】
（１５−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＤＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号１８）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化７２】
2019240287.tif 000074
上記アミノ酸配列は、配列番号１８である。【０５５４】
（１５−１）で合成したペプチド（３７．２ｍｇ，１７．３μｍｏｌ）をＤＭＳＯに溶解し１００ｍＭとした後、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨを２等量、過酸化水素水を１等量加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（１７．２ｍｇ，８．０１μｍｏｌ）を得た。【０５５５】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７１６．７５［Ｍ＋３Ｈ］３＋,  ｚ＝４  ５３７．８０［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０５５６】
（１５−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化７３】
2019240287.tif 000075
上記アミノ酸配列は、配列番号１８である。【０５５７】
（１５−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＤＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号１８）（１７．２ｍｇ，８．０１μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．３０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（６５．０ｍｇ，１６０μｍｏｌ）をアセトニトリル（０．４０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（３．００ｍｇ，１．２３μｍｏｌ）を得た。【０５５８】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ８１３．０５［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：１００％【０５５９】
（１５−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（１５−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液をＮＡＰ−５カラムに添加し、反応を停止させ２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５２８６４にピークが確認された。【０５６０】
（１５−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（１５−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８２、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【０５６１】
（１５−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（１５−５）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【０５６２】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【０５６３】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １１．２１０８分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図２３）。【０５６４】
（１５−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（１５−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【０５６５】
［実施例１６：抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（１６−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＱＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号１９）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（３２．２ｍｇ，１４．９μｍｏｌ）を得た。【０５６６】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ５４１．５５［Ｍ＋３Ｈ］３＋【０５６７】
（１６−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＱＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号１９）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化７４】
2019240287.tif 000076
上記アミノ酸配列は、配列番号１９である。【０５６８】
（１６−１）で合成したペプチド（３２．２ｍｇ，１４．９μｍｏｌ）をＤＭＳＯに溶解し１００ｍＭとした後、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨを２等量、過酸化水素水を１等量加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（１４．３ｍｇ，６．６２μｍｏｌ）を得た。【０５６９】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７２１．２０［Ｍ＋３Ｈ］３＋,  ｚ＝４  ５４１．００［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０５７０】
（１６−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化７５】
2019240287.tif 000077
上記アミノ酸配列は、配列番号１９である。【０５７１】
（１６−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＱＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号１９）（１４．３ｍｇ，６．６２μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．３０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（５３．０ｍｇ，１３２μｍｏｌ）をアセトニトリル（０．３０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（４．００ｍｇ，１．６３μｍｏｌ）を得た。【０５７２】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ８１７．５０［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：８９％【０５７３】
（１６−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（１６−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液をＮＡＰ−５カラムに添加し、反応を停止させ２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１５０２１２にピークが確認され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５２８９７にピークが確認された。【０５７４】
（１６−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（１６−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８６、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【０５７５】
（１６−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（１６−５）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【０５７６】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【０５７７】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １０．７２３０分はペプチドがトラスツズマブに１個導入された化合物、１１．４２５９分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図２４）【０５７８】
（１６−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（１６−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【０５７９】
［実施例１７：抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（１７−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＥＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号２０）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（３８．０ｍｇ，１７．６μｍｏｌ）を得た。【０５８０】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７２２．００［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ｚ＝４  ５４１．７５［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０５８１】
（１７−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＥＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号２０）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化７６】
2019240287.tif 000078
上記アミノ酸配列は、配列番号２０である。【０５８２】
（１７−１）で合成したペプチド（３８．０ｍｇ，１７．６μｍｏｌ）をＤＭＳＯに溶解し１００ｍＭとした後、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨを２等量、過酸化水素水を１等量加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（１６．０ｍｇ，７．４０μｍｏｌ）を得た。【０５８３】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７２１．４０［Ｍ＋３Ｈ］３＋,  ｚ＝４  ５４１．２５［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０５８４】
（１７−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化７７】
2019240287.tif 000079
上記アミノ酸配列は、配列番号２０である。【０５８５】
（１７−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＥＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号２０）（１６．０ｍｇ，７．４０μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．３０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（６０．０ｍｇ，１４８μｍｏｌ）をアセトニトリル（０．３０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（４．５０ｍｇ，１．８４μｍｏｌ）を得た。【０５８６】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ８１７．８０［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：１００％【０５８７】
（１７−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（１７−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液をＮＡＰ−５カラムに添加し、反応を停止させ２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５２９００にピークが確認された。【０５８８】
（１７−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（１７−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８６、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【０５８９】
（１７−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（１７−５）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【０５９０】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【０５９１】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １１．１８４３分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図２５）。【０５９２】
（１７−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（１７−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【０５９３】
［実施例１８：抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（１８−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＦＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号２１）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（２３．０ｍｇ，１０．５μｍｏｌ）を得た。【０５９４】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７２８．０５［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ｚ＝４  ５４６．４０［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０５９５】
（１８−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＦＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号２１）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化７８】
2019240287.tif 000080
上記アミノ酸配列は、配列番号２１である。【０５９６】
（１８−１）で合成したペプチド（２３．０ｍｇ，１０．５μｍｏｌ）をＤＭＳＯに溶解し１００ｍＭとした後、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨを２等量、過酸化水素水を１等量加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（９．８０ｍｇ，４．５０μｍｏｌ）を得た。【０５９７】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７２７．３５［Ｍ＋３Ｈ］３＋,  ｚ＝４  ５４５．８５［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０５９８】
（１８−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化７９】
2019240287.tif 000081
上記アミノ酸配列は、配列番号２１である。【０５９９】
（１８−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＦＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号２１）（９．８０ｍｇ，４．５０μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．３０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（３６．０ｍｇ，９０．０μｍｏｌ）をアセトニトリル（０．３０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（２．５０ｍｇ，１．０１μｍｏｌ）を得た。【０６００】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ８２３．８５［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：９３％【０６０１】
（１８−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（１８−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液をＮＡＰ−５カラムに添加し、反応を停止させ２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５３３１７にピークが確認された。【０６０２】
（１８−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（１８−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８６、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【０６０３】
（１８−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（１８−５）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【０６０４】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【０６０５】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １３．８０１３分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図２６）。【０６０６】
トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（１８−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【０６０７】
［実施例１９：抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（１９−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＹＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号２２）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（３０．８ｍｇ，１４．０μｍｏｌ）を得た。【０６０８】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７３３．２０［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ｚ＝４  ５５０．４０［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０６０９】
（１９−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＹＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号２２）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化８０】
2019240287.tif 000082
上記アミノ酸配列は、配列番号２２である。【０６１０】
（１９−１）で合成したペプチド（３０．８ｍｇ，１４．０μｍｏｌ）をＤＭＳＯに溶解し１００ｍＭとした後、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨを２等量、過酸化水素水を１等量加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（１７．５ｍｇ，７．９７μｍｏｌ）を得た。【０６１１】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７３２．７５［Ｍ＋３Ｈ］３＋,  ｚ＝４  ５４９．９０［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０６１２】
（１９−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化８１】
2019240287.tif 000083
上記アミノ酸配列は、配列番号２２である。【０６１３】
（１９−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＹＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号２２）（１７．５ｍｇ，７．９７μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．３０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（９７．０ｍｇ，２３９μｍｏｌ）をアセトニトリル（０．３０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（３．５０ｍｇ，１．４１μｍｏｌ）を得た。【０６１４】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ８２９．１５［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：８９％【０６１５】
（１９−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（１９−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液をＮＡＰ−５カラムに添加し、反応を停止させ２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５２９６５にピークが確認された。【０６１６】
（１９−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（１９−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８６、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【０６１７】
（１９−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（１９−５）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【０６１８】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【０６１９】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １３．７６２８分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図２７）。【０６２０】
（１９−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（１９−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【０６２１】
［実施例２０：抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（２０−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＷＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号２３）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（２３．０ｍｇ，１０．４μｍｏｌ）を得た。【０６２２】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７４１．１５［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ｚ＝４  ５５６．００［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０６２３】
（２０−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＷＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号２３）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化８２】
2019240287.tif 000084
上記アミノ酸配列は、配列番号２３である。【０６２４】
（２０−１）で合成したペプチド（２３．０ｍｇ，１０．４μｍｏｌ）をＤＭＳＯに溶解し１００ｍＭとした後、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨを２等量、過酸化水素水を１等量加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（８．２０ｍｇ，３．７０μｍｏｌ）を得た。【０６２５】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７４０．４０［Ｍ＋３Ｈ］３＋,  ｚ＝４  ５５５．６５［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０６２６】
（２０−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化８３】
2019240287.tif 000085
上記アミノ酸配列は、配列番号２３である。【０６２７】
（２０−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＷＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号２３）（８．２０ｍｇ，３．７０μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．３０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（６０．０ｍｇ，１４８μｍｏｌ）をアセトニトリル（０．３０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（２．２ｍｇ，０．８８μｍｏｌ）を得た。【０６２８】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ８３６．８０［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：９３％【０６２９】
（２０−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（２０−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液をＮＡＰ−５カラムに添加し、反応を停止させ２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５３１２１にピークが確認された。【０６３０】
（２０−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（２０−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８２、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【０６３１】
（２０−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（２０−５）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【０６３２】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【０６３３】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １４．８２０３分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図２８）。【０６３４】
（２０−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（２０−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【０６３５】
［実施例２１：抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（２１−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＨＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号２４）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（６８．７ｍｇ，３１．６μｍｏｌ）を得た。【０６３６】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７２４．７０［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ｚ＝４  ５４３．８５［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０６３７】
（２１−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＨＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号２４）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化８４】
2019240287.tif 000086
上記アミノ酸配列は、配列番号２４である。【０６３８】
（２１−１）で合成したペプチド（６８．７ｍｇ，３１．６μｍｏｌ）をＤＭＳＯに溶解し１００ｍＭとした後、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨを２等量、過酸化水素水を１等量加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（４４．９ｍｇ，２０．７μｍｏｌ）を得た。【０６３９】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝４  ５４３．５５［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０６４０】
（２１−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化８５】
2019240287.tif 000087
上記アミノ酸配列は、配列番号２４である。【０６４１】
（２１−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＨＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号２４）（４４．９ｍｇ，２０．７μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．４０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（６０．０ｍｇ，１４８μｍｏｌ）をアセトニトリル（０．６０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（３．３０ｍｇ，１．３４μｍｏｌ）を得た。【０６４２】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝４  ６１５．５５［Ｍ＋３Ｈ］４＋
ＨＰＬＣ純度：６８％【０６４３】
（２１−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（２１−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液をＮＡＰ−５カラムに添加し、反応を停止させ２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５２９０９にピークが確認された。【０６４４】
（２１−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（２１−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８４、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【０６４５】
（２１−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（２１−５）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【０６４６】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【０６４７】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １２．５５７９分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図２９）。【０６４８】
（２１−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（２１−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【０６４９】
［実施例２２：抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（２２−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＴＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号２５）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（４６．５ｍｇ，２１．８μｍｏｌ）を得た。【０６５０】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７１２．８０［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ｚ＝４  ５３４．８５［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０６５１】
（２２−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＴＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号２５）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化８６】
2019240287.tif 000088
上記アミノ酸配列は、配列番号２５である。【０６５２】
（２２−１）で合成したペプチド（４６．５ｍｇ，２１．８μｍｏｌ）をＤＭＳＯに溶解し１００ｍＭとした後、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨを２等量、過酸化水素水を１等量加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（３１．６ｍｇ，１４．８μｍｏｌ）を得た。【０６５３】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７１１．９５［Ｍ＋３Ｈ］３＋,  ｚ＝４  ５３４．３０［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０６５４】
（２２−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化８７】
2019240287.tif 000089
上記アミノ酸配列は、配列番号２５である。【０６５５】
（２２−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＴＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号２５）（３１．６ｍｇ，１４．８μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．４０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（１２０ｍｇ，２９６μｍｏｌ）をアセトニトリル（０．６０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（５．５０ｍｇ，２．２７μｍｏｌ）を得た。【０６５６】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ８０８．４５［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：８９％【０６５７】
（２２−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（２２−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液をＮＡＰ−５カラムに添加し、反応を停止させ２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５２８３７にピークが確認された。【０６５８】
（２２−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（１９−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８６、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【０６５９】
（２２−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（２２−５）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【０６６０】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【０６６１】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １２．５２３１分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図３０）。【０６６２】
（２２−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（２２−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【０６６３】
［実施例２３：抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（２３−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＬＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号２６）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（３２．２ｍｇ，１５．０μｍｏｌ）を得た。【０６６４】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７１６．７０［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ｚ＝４  ５３７．８５［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０６６５】
（２３−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＬＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号２６）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化８８】
2019240287.tif 000090
上記アミノ酸配列は、配列番号２６である。【０６６６】
（２３−１）で合成したペプチド（３２．２ｍｇ，１５．０μｍｏｌ）をＤＭＳＯに溶解し１００ｍＭとした後、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨを２等量、過酸化水素水を１等量加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（９．４０ｍｇ，４．３８μｍｏｌ）を得た。【０６６７】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７１６．１０［Ｍ＋３Ｈ］３＋,  ｚ＝４  ５３７．３５［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０６６８】
（２３−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化８９】
2019240287.tif 000091
上記アミノ酸配列は、配列番号２６である。【０６６９】
（２３−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＬＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号２６）（９．４０ｍｇ，４．３８μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．４０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（７０．７ｍｇ，１７５μｍｏｌ）をアセトニトリル（０．４０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（２．８０ｍｇ，１．１５μｍｏｌ）を得た。【０６７０】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ８１２．４０［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：８０％【０６７１】
（２３−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（２３−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液をＮＡＰ−５カラムに添加し、反応を停止させ２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５３０５３にピークが確認された。【０６７２】
（２３−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（２３−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８５、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【０６７３】
（２３−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（２３−５）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【０６７４】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【０６７５】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １３．５７１７分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図３１）。【０６７６】
（２３−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（２３−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【０６７７】
［実施例２４：抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（２４−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＣＡＹＨＫＬＱＩＶＷＣ−ＮＨ２（配列番号２７）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（６５．３ｍｇ，４８．４μｍｏｌ）を得た。【０６７８】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝２  ６７５．２０［Ｍ＋２Ｈ］２＋【０６７９】
（２４−２）Ａｃ−ＣＡＹＨＫＬＱＩＶＷＣ−ＮＨ２（配列番号２７）１位と１１位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化９０】
2019240287.tif 000092
上記アミノ酸配列は、配列番号２７である。【０６８０】
（２４−１）で合成したペプチド（６５．３ｍｇ，４８．４μｍｏｌ）をＤＭＳＯに溶解し１００ｍＭとした後、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨを２等量、過酸化水素水を１等量加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（３６．８ｍｇ，２７．３μｍｏｌ）を得た。【０６８１】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝２  ６７４．３５［Ｍ＋２Ｈ］２＋【０６８２】
（２４−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化９１】
2019240287.tif 000093
上記アミノ酸配列は、配列番号２７である。【０６８３】
（２４−２）で合成したＡｃ−ＣＡＹＨＫＬＱＩＶＷＣ−ＮＨ２（配列番号２７）（３６．８ｍｇ，２７．３μｍｏｌ、ただし１番目と１１番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．４０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（４４２ｍｇ，１．０９ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（０．４０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（２４．５ｍｇ，１５．０μｍｏｌ）を得た。【０６８４】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝２  ８１８．８５［Ｍ＋２Ｈ］２＋
ＨＰＬＣ純度：８５％【０６８５】
（２４−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（２４−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液をＮＡＰ−５カラムに添加し、反応を停止させ２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１４９５９０にピークが確認され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５１２７０にピークが確認された。【０６８６】
（２４−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（２４−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８５、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【０６８７】
（２４−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（２４−５）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【０６８８】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【０６８９】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １１．５０５３分はペプチドがトラスツズマブに１個導入された化合物、１２．９４１０分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図３２）。【０６９０】
（２４−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（２４−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【０６９１】
［実施例２５：抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（２５−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＣＡＹＨＫＬＱＬＩＷＣ−ＮＨ２（配列番号２８）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（５４．３ｍｇ，３９．８μｍｏｌ）を得た。【０６９２】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝２  ６８２．２５［Ｍ＋２Ｈ］２＋【０６９３】
（２５−２）Ａｃ−ＣＡＹＨＫＬＱＬＩＷＣ−ＮＨ２（配列番号２８）１位と１１位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化９２】
2019240287.tif 000094
上記アミノ酸配列は、配列番号２８である。【０６９４】
（２５−１）で合成したペプチド（５４．３ｍｇ，３９．８μｍｏｌ）をＤＭＳＯに溶解し１００ｍＭとした後、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨを２等量、過酸化水素水を１等量加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（３４．６ｍｇ，２５．４μｍｏｌ）を得た。【０６９５】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝２  ６８１．２０［Ｍ＋２Ｈ］２＋【０６９６】
（２５−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化９３】
2019240287.tif 000095
上記アミノ酸配列は、配列番号２８である。【０６９７】
（２５−２）で合成したＡｃ−ＣＡＹＨＫＬＱＬＩＷＣ−ＮＨ２（配列番号２８）（３４．６ｍｇ，２５．４μｍｏｌ、ただし１番目と１１番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．４０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（４１１ｍｇ，１．０２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（０．４０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（２２．０ｍｇ，１３．３μｍｏｌ）を得た。【０６９８】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝２  ８３５．８５［Ｍ＋２Ｈ］２＋
ＨＰＬＣ純度：８８％【０６９９】
（２５−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（２５−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液をＮＡＰ−５カラムに添加し、反応を停止させ２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１４９７５６にピークが確認され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５１１３１にピークが確認された。【０７００】
（２５−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（２５−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８５、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【０７０１】
（２５−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（２５−５）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【０７０２】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【０７０３】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １１．４２７１分はペプチドがトラスツズマブに１個導入された化合物、１２．７９３９分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図３３）。【０７０４】
（２５−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（２５−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【０７０５】
［実施例２６：抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（２６−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＣＡＹＨＫＳＱＩＶＷＣ−ＮＨ２（配列番号２９）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（５３．３ｍｇ，３８．７μｍｏｌ）を得た。【０７０６】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝２  ６９０．０５［Ｍ＋２Ｈ］２＋【０７０７】
（２６−２）Ａｃ−ＣＡＹＨＫＳＱＩＶＷＣ−ＮＨ２（配列番号２９）１位と１１位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化９４】
2019240287.tif 000096
上記アミノ酸配列は、配列番号２９である。【０７０８】
（２６−１）で合成したペプチド（５３．３ｍｇ，３８．７μｍｏｌ）をＤＭＳＯに溶解し１００ｍＭとした後、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨを２等量、過酸化水素水を１等量加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（２２．８ｍｇ，１６．６μｍｏｌ）を得た。【０７０９】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝２  ６８９．２０［Ｍ＋２Ｈ］２＋【０７１０】
（２６−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化９５】
2019240287.tif 000097
上記アミノ酸配列は、配列番号２９である。【０７１１】
（２６−２）で合成したＡｃ−ＣＡＹＨＫＳＱＩＶＷＣ−ＮＨ２（配列番号２９）（２２．８ｍｇ，１６．６μｍｏｌ、ただし１番目と１１番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．４０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（１３４ｍｇ，３３２μｍｏｌ）をアセトニトリル（０．４０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（８．５０ｍｇ，５．１０μｍｏｌ）を得た。【０７１２】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝２  ８３３．７５［Ｍ＋２Ｈ］２＋
ＨＰＬＣ純度：９２％【０７１３】
（２６−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（２６−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液をＮＡＰ−５カラムに添加し、反応を停止させ２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、合性ペプチドが一つ導入された生成物が１４９７７２にピークが確認され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５１３２３にピークが確認された。【０７１４】
（２６−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（２６−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８５、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【０７１５】
（２６−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（２６−５）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【０７１６】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【０７１７】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １１．８３０１分はペプチドがトラスツズマブに１個導入された化合物、１３．２５６５分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図３４）。【０７１８】
（２６−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（２６−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【０７１９】
［実施例２７：抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（２７−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＬＶＦＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号３０）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（１６８ｍｇ，８２．４μｍｏｌ）を得た。【０７２０】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ６８０．３０［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ｚ＝４  ５１０．５５［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０７２１】
（２７−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＬＶＦＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号３０）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化９６】
2019240287.tif 000098
上記アミノ酸配列は、配列番号３０である。【０７２２】
（２７−１）で合成したペプチド（１６８ｍｇ，８２．４μｍｏｌ）をＤＭＳＯに溶解し１００ｍＭとした後、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨを２等量、過酸化水素水を１等量加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（２２．１ｍｇ，１０．９μｍｏｌ）を得た。【０７２３】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ６７９．５５［Ｍ＋３Ｈ］３＋,  ｚ＝４  ５１０．１０［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０７２４】
（２７−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化９７】
2019240287.tif 000099
上記アミノ酸配列は、配列番号３０である。【０７２５】
（２７−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＬＶＦＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号３０）（２２．１ｍｇ，１０．９μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．００ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（１７６ｍｇ，４３６μｍｏｌ）をアセトニトリル（１．００ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（８．００ｍｇ，３．３４μｍｏｌ）を得た。【０７２６】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７７６．０５［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：８９％【０７２７】
（２７−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（２７−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液をＮＡＰ−５カラムに添加し、反応を停止させ２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは１４８０６９にピークが観測され、結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１５０２７９にピークが確認され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５２４９０にピークが確認された。【０７２８】
（２７−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（２７−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８５、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【０７２９】
（２７−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（２７−５）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【０７３０】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【０７３１】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  ９．６４０８分はトラスツズマブ原料、１０．３６６４分はペプチドがトラスツズマブに１個導入された化合物、１０．９７５９分はペプチドがトラスツズマブに２個であると考えられる（図３５）。【０７３２】
（２７−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（２７−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【０７３３】
［実施例２８：抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（２８−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＱＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号３１）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（５１．３ｍｇ，２４．５μｍｏｌ）を得た。【０７３４】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ６８９．４５［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ｚ＝４  ５２４．０５［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０７３５】
（２８−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＱＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号３１）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化９８】
2019240287.tif 000100
上記アミノ酸配列は、配列番号３１である。【０７３６】
（２８−１）で合成したペプチド（５１．３ｍｇ，２４．５μｍｏｌ）をＤＭＳＯに溶解し１００ｍＭとした後、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨを２等量、過酸化水素水を１等量加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（３１．６ｍｇ，１５．１μｍｏｌ）を得た。【０７３７】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ６９７．６０［Ｍ＋３Ｈ］３＋,  ｚ＝４  ５２３．６０［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０７３８】
（２８−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化９９】
2019240287.tif 000101
上記アミノ酸配列は、配列番号３１である。【０７３９】
（２８−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＱＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号３１）（３１．６ｍｇ，１５．１μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．４０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（２４４ｍｇ，６０４μｍｏｌ）をアセトニトリル（１．００ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（６．００ｍｇ，２．５２μｍｏｌ）を得た。【０７４０】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７９４．４０［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：９１％【０７４１】
（２８−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（２８−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液をＮＡＰ−５カラムに添加し、反応を停止させ２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは１４８０５７にピークが観測され、結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１５０４８４にピークが確認され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５２５８７にピークが確認された。【０７４２】
（２８−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（２８−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８５、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【０７４３】
（２８−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（２８−５）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【０７４４】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【０７４５】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  ９．８９５４分はペプチドがトラスツズマブに１個導入された化合物、１０．１１１６分はペプチドがトラスツズマブに２個導入された化合物であると考えられる（図３６）。【０７４６】
（２８−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（２８−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【０７４７】
［実施例２９：抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（２９−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＥＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号３２）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（５４．０ｍｇ，２５．８μｍｏｌ）を得た。【０７４８】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ６９８．８０［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ｚ＝４  ５２４．４０［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０７４９】
（２９−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＥＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号３２）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化１００】
2019240287.tif 000102
上記アミノ酸配列は、配列番号３２である。【０７５０】
（２９−１）で合成したペプチド（５４．０ｍｇ，２５．８μｍｏｌ）をＤＭＳＯに溶解し１００ｍＭとした後、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨを２等量、過酸化水素水を１等量加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（２２．２ｍｇ，１０．６μｍｏｌ）を得た。【０７５１】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ６９８．００［Ｍ＋３Ｈ］３＋,  ｚ＝４  ５２３．８５［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０７５２】
（２９−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化１０１】
2019240287.tif 000103
上記アミノ酸配列は、配列番号３２である。【０７５３】
（２９−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＥＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号３２）（２２．２ｍｇ，１０．６μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．００ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（１７１ｍｇ，４２４μｍｏｌ）をアセトニトリル（０．５０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（４．５０ｍｇ，１．８９μｍｏｌ）を得た。【０７５４】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７９４．４５［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：９２％【０７５５】
（２９−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（２９−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液をＮＡＰ−５カラムに添加し、反応を停止させ２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１５００３６にピークが確認され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５２５９９にピークが確認された。【０７５６】
（２９−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（２９−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８５、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【０７５７】
（２９−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（２９−５）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【０７５８】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【０７５９】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  ９．８０６０分はペプチドがトラスツズマブに１個導入された化合物、１１．１９４０分はペプチドがトラスツズマブに２個導入された化合物であると考えられる（図３７）。【０７６０】
（２９−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（２９−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【０７６１】
［実施例３０：抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（３０−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＣＡＹＨＫＧＱＬＶＷＣ−ＮＨ２（配列番号３３）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（１７１ｍｇ，１１８μｍｏｌ）を得た。【０７６２】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２  ６７５．２０  ［Ｍ＋２Ｈ］２＋【０７６３】
（３０−２）Ａｃ−ＣＡＹＨＫＧＱＬＶＷＣ−ＮＨ２（配列番号３３）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化１０２】
2019240287.tif 000104
上記アミノ酸配列は、配列番号３３である。【０７６４】
（３０−１）で合成したペプチド（１７１ｍｇ，１１８μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５．００ｍＬ）に溶解し、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨ（１１８μＬ，２３６ｍｍｏｌ）、過酸化水素水（２４１μＬ，２．３６ｍｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（２３．２ｍｇ，１７．２μｍｏｌ）を得た。【０７６５】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝１  １３４７．８［Ｍ＋Ｈ］＋，ｚ＝２  ６７４．１５［Ｍ＋２Ｈ］２＋【０７６６】
（３０−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化１０３】
2019240287.tif 000105
上記アミノ酸配列は、配列番号３３である。【０７６７】
（３０−２）で合成したＡｃ−ＣＡＹＨＫＧＱＬＶＷＣ−ＮＨ２（配列番号３３）２３．２ｍｇ，１７．２μｍｏｌ、ただし１番目と１１番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．５０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（２７８ｍｇ，６８８μｍｏｌ）をアセトニトリル（２．００ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（９．００ｍｇ，５．５０μｍｏｌ）を得た。【０７６８】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２  ８１８．６５［Ｍ＋２Ｈ］２＋
ＨＰＬＣ純度：９２％【０７６９】
（３０−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（３０−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液をＮＡＰ−５カラムに添加し、反応を停止させ２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１４９５９１にピークが確認され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５１１１２にピークが確認された。【０７７０】
（３０−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（３０−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８５、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【０７７１】
（３０−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（３０−５）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【０７７２】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【０７７３】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １１．７１７１分はペプチドがトラスツズマブに１個導入された化合物、１３．０６４６分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図３８）。【０７７４】
（３０−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（３０−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【０７７５】
［実施例３１：抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（３１−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＡＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号３４）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（５８．８ｍｇ，２８．１μｍｏｌ）を得た。【０７７６】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ６９７．９０［Ｍ＋３Ｈ］３＋【０７７７】
（３１−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＡＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号３４）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化１０４】
2019240287.tif 000106
上記アミノ酸配列は、配列番号３４である。【０７７８】
（３１−１）で合成したペプチド（５８．８ｍｇ，２８．１μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５．００ｍＬ）に溶解し、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨ（２８．１μＬ，５６．２μｍｏｌ）、過酸化水素水（５７．４μＬ，５６２μｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（２１．２ｍｇ，１０．１μｍｏｌ）を得た。【０７７９】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ６９７．５０［Ｍ＋３Ｈ］３＋【０７８０】
（３１−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化１０５】
2019240287.tif 000107
上記アミノ酸配列は、配列番号３４である。【０７８１】
（３１−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＡＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号３４）（２１．２ｍｇ，１０．１μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．００ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（１６３ｍｇ，４０４μｍｏｌ）をアセトニトリル（１．５０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（８．００ｍｇ，３．３６μｍｏｌ）を得た。【０７８２】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７９４．００［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：９１％【０７８３】
（３１−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（３１−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液をＮＡＰ−５カラムに添加し、反応を停止させ２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは１４８０５７にピークが観測され、結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１５０４９２にピークが確認され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５２７５５にピークが確認された。【０７８４】
（３１−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（３１−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８５、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【０７８５】
（３１−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（３１−５）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【０７８６】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【０７８７】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １０．５６１３分はペプチドがトラスツズマブに１個導入された化合物、１１．２２１９分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図３９）。【０７８８】
（３１−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（３１−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【０７８９】
［実施例３２：抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（３２−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＶＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号３５）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（５２．２ｍｇ，２４．６μｍｏｌ）を得た。【０７９０】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４  ５３０．６０［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０７９１】
（３２−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＶＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号３５）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化１０６】
2019240287.tif 000108
上記アミノ酸配列は、配列番号３５である。【０７９２】
（３２−１）で合成したペプチド（５２．２ｍｇ，２４．６μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５．００ｍＬ）に溶解し、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨ（２４．６μＬ，４９．２μｍｏｌ）、過酸化水素水（５０．２μＬ，４９２μｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（１７．３ｍｇ，８．１７μｍｏｌ）を得た。【０７９３】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４  ５３０．３０［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０７９４】
（３２−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化１０７】
2019240287.tif 000109
上記アミノ酸配列は、配列番号３５である。【０７９５】
（３２−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＶＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号３５）（１７．３ｍｇ，８．１７μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．００ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（１３２ｍｇ，３２７μｍｏｌ）をアセトニトリル（１．００ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（６．８０ｍｇ，２．８３μｍｏｌ）を得た。【０７９６】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ８０３．４５［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：８２％【０７９７】
（３２−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（３２−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液をＮＡＰ−５カラムに添加し、反応を停止させ２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは１４８０５７にピークが観測され、原料のトラスツズマブは１４８０６２にピークが観測され、結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１５０５１７にピークが確認され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５２９９８にピークが確認された。【０７９８】
（３２−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（３２−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８５、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【０７９９】
（３２−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（３２−５）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【０８００】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【０８０１】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  ９．８５５１分はトラスツズマブ原料、１１．０５６４分はペプチドがトラスツズマブに１個導入された化合物、１１．９８５４分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図４０）。【０８０２】
（３２−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（３２−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【０８０３】
［実施例３３：抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（３３−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＬＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号３６）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（１５５ｍｇ，７２．７μｍｏｌ）を得た。【０８０４】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７１２．４０［Ｍ＋３Ｈ］３＋【０８０５】
（３３−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＬＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号３６）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化１０８】
2019240287.tif 000110
上記アミノ酸配列は、配列番号３６である。【０８０６】
（３３−１）で合成したペプチド（１５５ｍｇ，７２．７μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５．００ｍＬ）に溶解し、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨ（７２．７μＬ，１４５μｍｏｌ）、過酸化水素水（１４８μＬ，１．４５ｍｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（１３．３ｍｇ，６．２４μｍｏｌ）を得た。【０８０７】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７１１．５０［Ｍ＋３Ｈ］３＋【０８０８】
（３３−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化１０９】
2019240287.tif 000111
上記アミノ酸配列は、配列番号３６である。【０８０９】
（３３−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＬＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号３６）（１３．３ｍｇ，６．２４μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．００ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（１０１ｍｇ，２５０μｍｏｌ）をアセトニトリル（１．００ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（７．００ｍｇ，２．８９μｍｏｌ）を得た。【０８１０】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ８０７．８０［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：８９％【０８１１】
（３３−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（３３−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液をＮＡＰ−５カラムに添加し、反応を停止させ２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは１４８０５７にピークが観測され、結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１５０８９９にピークが確認され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５３０２５にピークが確認された。【０８１２】
（３３−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（３３−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８５、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【０８１３】
（３３−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（３３−５）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【０８１４】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【０８１５】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １１．２０７９分はペプチドがトラスツズマブに１個導入された化合物、１２．２３７７分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図４１）。【０８１６】
（３３−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（３３−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【０８１７】
［実施例３４：抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（３４−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＩＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号３７）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（１５３ｍｇ，７１．７μｍｏｌ）を得た。【０８１８】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７１２．１０［Ｍ＋３Ｈ］３＋【０８１９】
（３４−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＩＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号３７）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化１１０】
2019240287.tif 000112
上記アミノ酸配列は、配列番号３７である。【０８２０】
（３４−１）で合成したペプチド（１５３ｍｇ，７１．７μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５．００ｍＬ）に溶解し、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨ（７１．７μＬ，１４３μｍｏｌ）、過酸化水素水（１４６μＬ，１．４３ｍｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（１５．７ｍｇ，７．３７μｍｏｌ）を得た。【０８２１】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７１１．４０［Ｍ＋３Ｈ］３＋【０８２２】
（３４−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化１１１】
2019240287.tif 000113
上記アミノ酸配列は、配列番号３７である。【０８２３】
（３４−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＩＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号３７）（１５．７ｍｇ，７．３７μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．００ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（１１９ｍｇ，２９５μｍｏｌ）をアセトニトリル（１．００ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（５．００ｍｇ，２．０７μｍｏｌ）を得た。【０８２４】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ８０７．７５［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：９４％【０８２５】
（３４−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（３４−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液をＮＡＰ−５カラムに添加し、反応を停止させ２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１５０７２０にピークが確認され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５３２１０にピークが確認された。【０８２６】
（３４−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（３４−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８５、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【０８２７】
（３４−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（３４−５）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【０８２８】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【０８２９】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  ９．８３５５分はトラスツズマブ原料、１１．２６４５分はペプチドがトラスツズマブに１個導入された化合物、１２．４３８８分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図４２）。【０８３０】
（３４−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（３４−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【０８３１】
［実施例３５：抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（３５−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＳＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号３８）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（１６７ｍｇ，７９．２μｍｏｌ）を得た。【０８３２】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７０３．４５［Ｍ＋３Ｈ］３＋【０８３３】
（３５−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＳＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号３８）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化１１２】
2019240287.tif 000114
上記アミノ酸配列は、配列番号３８である。【０８３４】
（３５−１）で合成したペプチド（１６７ｍｇ，７９．２μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５．００ｍＬ）に溶解し、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨ（７９．２μＬ，１５８μｍｏｌ）、過酸化水素水（１６１μＬ，１．５８ｍｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（１９．６ｍｇ，９．３１μｍｏｌ）を得た。【０８３５】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７０２．９０［Ｍ＋３Ｈ］３＋【０８３６】
（３５−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化１１３】
2019240287.tif 000115
上記アミノ酸配列は、配列番号３８である。【０８３７】
（３５−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＳＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号３８）（１９．６ｍｇ，９．３１μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．００ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（１５０ｍｇ，３７２μｍｏｌ）をアセトニトリル（１．５０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（７．５０ｍｇ，３．１３μｍｏｌ）を得た。【０８３８】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７９９．１０［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：９２％【０８３９】
（３５−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（３５−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液をＮＡＰ−５カラムに添加し、反応を停止させ２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１５０５０５にピークが確認され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５２７８４にピークが確認された。【０８４０】
（３５−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（３５−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８５、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【０８４１】
（３５−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（３５−５）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【０８４２】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【０８４３】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １０．３８３４分はペプチドがトラスツズマブに１個導入された化合物、１０．９７２３分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図４３）。【０８４４】
（３５−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（３５−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【０８４５】
［実施例３６：抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（３６−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＴＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号３９）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（１６４ｍｇ，７７．３μｍｏｌ）を得た。【０８４６】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７０８．４０［Ｍ＋３Ｈ］３＋【０８４７】
（３６−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＴＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号３９）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化１１４】
2019240287.tif 000116
上記アミノ酸配列は、配列番号３９である。【０８４８】
（３６−１）で合成したペプチド（１６４ｍｇ，７７．３μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５．００ｍＬ）に溶解し、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨ（７７．３μＬ，１５５μｍｏｌ）、過酸化水素水（１５８μＬ，１．５５ｍｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（１６．３ｍｇ，７．６９μｍｏｌ）を得た。【０８４９】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７０７．６０［Ｍ＋３Ｈ］３＋【０８５０】
（３６−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化１１５】
2019240287.tif 000117
上記アミノ酸配列は、配列番号３９である。【０８５１】
（３６−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＴＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号３９）（１６．３ｍｇ，７．６９μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．００ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（１２５ｍｇ，３０８μｍｏｌ）をアセトニトリル（１．５０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（４．５０ｍｇ，１．８７μｍｏｌ）を得た。【０８５２】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ８０３．７０［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：８９％【０８５３】
（３６−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（３６−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液をＮＡＰ−５カラムに添加し、反応を停止させ２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５２８１４にピークが確認された。【０８５４】
（３６−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（３６−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８５、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【０８５５】
（３６−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（３６−５）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【０８５６】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【０８５７】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １０．５１１５分はペプチドがトラスツズマブに１個導入された化合物、１１．１１４３分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図４４）。【０８５８】
（３６−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（３６−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【０８５９】
［実施例３７：抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（３７−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＮＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号４０）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（５１．４ｍｇ，２４．１μｍｏｌ）を得た。【０８６０】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７１２．４０［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ｚ＝４  ５３４．６５［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０８６１】
（３７−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＮＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号４０）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化１１６】
2019240287.tif 000118
上記アミノ酸配列は、配列番号４０である。【０８６２】
（３７−１）で合成したペプチド（５１．４ｍｇ，２４．１μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５．００ｍＬ）に溶解し、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨ（２４．１μＬ，４８．２μｍｏｌ）、過酸化水素水（４９．２μＬ，４８２μｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（２０．０ｍｇ，９．３８μｍｏｌ）を得た。【０８６３】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７１１．７５［Ｍ＋３Ｈ］３＋，  ｚ＝４  ５３４．１０［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０８６４】
（３７−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化１１７】
2019240287.tif 000119
上記アミノ酸配列は、配列番号４０である。【０８６５】
（３７−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＮＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号４０）（２０．０ｍｇ，９．３８μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．００ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（１５２ｍｇ，３７５μｍｏｌ）をアセトニトリル（０．５０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（８．７ｍｇ，３．５９μｍｏｌ）を得た。【０８６６】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ８０８．１０［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：９３％【０８６７】
（３７−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（３７−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液をＮＡＰ−５カラムに添加し、反応を停止させ２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１５０３７０にピークが確認され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５２６７８にピークが確認された。【０８６８】
（３７−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（３７−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８５、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【０８６９】
（３７−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（３７−５）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【０８７０】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【０８７１】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １０．５２８７分はトラスツズマブ原料、１１．０４９０分はペプチドがトラスツズマブに１個導入された化合物であると考えられる（図４５）。【０８７２】
（３７−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（３７−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【０８７３】
［実施例３８：抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（３８−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＤＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号４１）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（５０．８ｍｇ，２３．７μｍｏｌ）を得た。【０８７４】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７１２．５５［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ｚ＝４  ５３４．７５［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０８７５】
（３８−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＤＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号４１）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化１１８】
2019240287.tif 000120
上記アミノ酸配列は、配列番号４１である。【０８７６】
（３８−１）で合成したペプチド（５０．８ｍｇ，２３．７μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５．００ｍＬ）に溶解し、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨ（２３．８μＬ，４７．４μｍｏｌ）、過酸化水素水（４８．６μＬ，４７４μｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（３６．８ｍｇ，１７．２μｍｏｌ）を得た。【０８７７】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７１２．０５［Ｍ＋３Ｈ］３＋，  ｚ＝４  ５３４．３５［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０８７８】
（３８−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化１１９】
2019240287.tif 000121
上記アミノ酸配列は、配列番号４１である。【０８７９】
（３８−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＤＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号４１）（３６．８ｍｇ，１７．２μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．７０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（２７８ｍｇ，６８８μｍｏｌ）をアセトニトリル（１．００ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（５．８０ｍｇ，２．３９μｍｏｌ）を得た。【０８８０】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ８０８．４５［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：９１％【０８８１】
（３８−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（３８−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液をＮＡＰ−５カラムに添加し、反応を停止させ２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１５０３６７にピークが確認され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５２８３１にピークが確認された。【０８８２】
（３８−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（３８−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８５、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【０８８３】
（３８−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（３８−５）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【０８８４】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【０８８５】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １０．１３６５分はトラスツズマブ原料、１０．５１５６分はペプチドがトラスツズマブに１個導入された化合物であると考えられる（図４６）。【０８８６】
（３８−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（３８−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【０８８７】
［実施例３９：抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（３９−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＱＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号４２）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（４２．１ｍｇ，１９．６μｍｏｌ）を得た。【０８８８】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７１６．９５［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ｚ＝４  ５３８．１０［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０８８９】
（３９−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＱＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号４２）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化１２０】
2019240287.tif 000122
上記アミノ酸配列は、配列番号４２である。【０８９０】
（３９−１）で合成したペプチド（４２．１ｍｇ，１９．６μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５．００ｍＬ）に溶解し、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨ（１９．６μＬ，３９．２μｍｏｌ）、過酸化水素水（４０．０μＬ，３９２μｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（１８．１ｍｇ，８．３９μｍｏｌ）を得た。【０８９１】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７１６．３０［Ｍ＋３Ｈ］３＋，  ｚ＝４  ５３７．５０［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０８９２】
（３９−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化１２１】
2019240287.tif 000123
上記アミノ酸配列は、配列番号４２である。【０８９３】
（３９−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＱＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号４２）（１８．１ｍｇ，８．３９μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．５０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（３４．０ｍｇ，８３．９μｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．５０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（３．７０ｍｇ，１．５２μｍｏｌ）を得た。【０８９４】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ８１２．７５［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：９１％【０８９５】
（３９−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（３９−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液をＮＡＰ−５カラムに添加し、反応を停止させ２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１５０５４０にピークが確認され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５２８６２にピークが確認された。【０８９６】
（３９−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（３９−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８５、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【０８９７】
（３９−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（３９−５）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【０８９８】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【０８９９】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １０．８６３７分はペプチドがトラスツズマブに１個導入された化合物、１１．３４４５分はペプチドがトラスツズマブに２個導入された化合物であると考えられる（図４７）。【０９００】
（３９−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（３９−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【０９０１】
［実施例４０：抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（４０−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＥＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号４３）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（３８．３ｍｇ，１７．８μｍｏｌ）を得た。【０９０２】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７１７．３０［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ｚ＝４  ５３８．３０［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０９０３】
（４０−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＥＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号４３）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化１２２】
2019240287.tif 000124
上記アミノ酸配列は、配列番号４３である。【０９０４】
（４０−１）で合成したペプチド（３８．３ｍｇ，１７．８μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５．００ｍＬ）に溶解し、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨ（１７．８μＬ，３５．６μｍｏｌ）、過酸化水素水（３６．４μＬ，３５６μｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（１８．６ｍｇ，８．７０μｍｏｌ）を得た。【０９０５】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７１６．６５［Ｍ＋３Ｈ］３＋，  ｚ＝４  ５３７．８０［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０９０６】
（４０−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化１２３】
2019240287.tif 000125
上記アミノ酸配列は、配列番号４３である。【０９０７】
（４０−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＥＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号４３）（１８．６ｍｇ，８．７０μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．５０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（３４．０ｍｇ，８７．０μｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．５０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（５．５０ｍｇ，２．２６μｍｏｌ）を得た。【０９０８】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ８１３．１５［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：１００％【０９０９】
（４０−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（４０−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液をＮＡＰ−５カラムに添加し、反応を停止させ２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１５０５３５にピークが確認され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５２８６５にピークが確認された。【０９１０】
（４０−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（４０−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８５、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【０９１１】
（４０−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（４０−５）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【０９１２】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【０９１３】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １０．４８９１分はペプチドがトラスツズマブに１個導入された化合物、１０．８４４４分はペプチドがトラスツズマブに２個導入された化合物であると考えられる（図４８）。【０９１４】
（４０−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（４０−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【０９１５】
［実施例４１：抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（４１−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＦＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号４４）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（１９．５ｍｇ，９．００μｍｏｌ）を得た。【０９１６】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７２３．２５［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ｚ＝４  ５４２．９０［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０９１７】
（４１−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＦＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号４４）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化１２４】
2019240287.tif 000126
上記アミノ酸配列は、配列番号４４である。【０９１８】
（４１−１）で合成したペプチド（１９．５ｍｇ，９．００μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５．００ｍＬ）に溶解し、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨ（９．００μＬ，１８．０μｍｏｌ）、過酸化水素水（１８．４μＬ，１８０μｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（８．６０ｍｇ，３．９７μｍｏｌ）を得た。【０９１９】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７２２．７５［Ｍ＋３Ｈ］３＋，  ｚ＝４  ５４２．３０［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０９２０】
（４１−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化１２５】
2019240287.tif 000127
上記アミノ酸配列は、配列番号４４である。【０９２１】
（４１−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＦＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号４４）（８．６０ｍｇ，３．９７μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．５０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（３２．０ｍｇ，７９．４μｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．５０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（２．５０ｍｇ，１．０２μｍｏｌ）を得た。【０９２２】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ８１９．２０［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：９０％【０９２３】
（４１−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（４１−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液をＮＡＰ−５カラムに添加し、反応を停止させ２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１５０９７２にピークが確認され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５３４５４にピークが確認された。【０９２４】
（４１−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（４１−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８５、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【０９２５】
（４１−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（４１−５）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【０９２６】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【０９２７】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １１．６６６２分はペプチドがトラスツズマブに１個導入された化合物、１３．０５３７分はペプチドがトラスツズマブに２個導入された化合物であると考えられる（図４９）。【０９２８】
（４１−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（４１−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【０９２９】
［実施例４２：抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（４２−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＲＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号４５）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（４６．２ｍｇ，２１．２μｍｏｌ）を得た。【０９３０】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７２６．３０［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ｚ＝４  ５４５．１０［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０９３１】
（４２−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＲＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号４５）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化１２６】
2019240287.tif 000128
上記アミノ酸配列は、配列番号４５である。【０９３２】
（４２−１）で合成したペプチド（４６．２ｍｇ，２１．２μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５．００ｍＬ）に溶解し、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨ（２１．２μＬ，４２．４μｍｏｌ）、過酸化水素水（４３．４μＬ，４２４μｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（２９．６ｍｇ，１３．６μｍｏｌ）を得た。【０９３３】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７２５．１０［Ｍ＋３Ｈ］３＋，  ｚ＝４  ５４４．６５［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０９３４】
（４２−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化１２７】
2019240287.tif 000129
上記アミノ酸配列は、配列番号４５である。【０９３５】
（４２−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＲＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号４５）（２９．６ｍｇ，１３．６μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．５０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（５５．０ｍｇ，１３６μｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．５０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（６．００ｍｇ，２．４４μｍｏｌ）を得た。【０９３６】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４  ６１６．８５［Ｍ＋４Ｈ］４＋
ＨＰＬＣ純度：１００％【０９３７】
（４２−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（４２−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液をＮＡＰ−５カラムに添加し、反応を停止させ２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１５０５７７にピークが確認され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５２９２３にピークが確認された。【０９３８】
（４２−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（４２−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８５、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【０９３９】
（４２−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（４２−５）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【０９４０】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【０９４１】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １０．６９１８分はペプチドがトラスツズマブに２個導入された化合物であると考えられる（図５０）。【０９４２】
（４２−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（４２−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【０９４３】
［実施例４３：抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（４３−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＨＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号４６）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（４４．３ｍｇ，２０．５μｍｏｌ）を得た。【０９４４】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７２０．０５［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ｚ＝４  ５４０．３０［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０９４５】
（４３−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＨＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号４６）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化１２８】
2019240287.tif 000130
上記アミノ酸配列は、配列番号４６である。【０９４６】
（４３−１）で合成したペプチド（４４．３ｍｇ，２０．５μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５．００ｍＬ）に溶解し、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨ（２０．５μＬ，４１．０μｍｏｌ）、過酸化水素水（４１．９μＬ，４１０μｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（２６．０ｍｇ，１２．０μｍｏｌ）を得た。【０９４７】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７１９．６０［Ｍ＋３Ｈ］３＋，  ｚ＝４  ５４０．１０［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０９４８】
（４３−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化１２９】
2019240287.tif 000131
上記アミノ酸配列は、配列番号４６である。【０９４９】
（４３−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＨＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号４６）（２６．０ｍｇ，１２．０μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．５０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（４９．０ｍｇ，１２０μｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．５０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（５．００ｍｇ，２．０５μｍｏｌ）を得た。【０９５０】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４  ６１２．１５［Ｍ＋４Ｈ］４＋
ＨＰＬＣ純度：６９％【０９５１】
（４３−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（４３−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液をＮＡＰ−５カラムに添加し、反応を停止させ２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１５０５４９にピークが確認され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５２８７９にピークが確認された。【０９５２】
（４３−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（４３−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８５、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【０９５３】
（４３−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（４３−５）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【０９５４】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【０９５５】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １０．８２５７分はペプチドがトラスツズマブに１個導入された化合物、１１．４６３０分はペプチドがトラスツズマブに２個導入された化合物であると考えられる（図５１）。【０９５６】
（４３−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（４３−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【０９５７】
［実施例４４：抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（４４−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＷＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号４７）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（２９．０ｍｇ，１３．１μｍｏｌ）を得た。【０９５８】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７３６．２５［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ｚ＝４  ５５２．６５［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０９５９】
（４４−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＷＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号４７）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化１３０】
2019240287.tif 000132
上記アミノ酸配列は、配列番号４７である。【０９６０】
（４４−１）で合成したペプチド（２９．０ｍｇ，１３．１μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５．００ｍＬ）に溶解し、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨ（１３．１μＬ，２６．２μｍｏｌ）、過酸化水素水（２６．８μＬ，２６２μｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（１１．５ｍｇ，５．２２μｍｏｌ）を得た。【０９６１】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７３５．８０［Ｍ＋３Ｈ］３＋，  ｚ＝４  ５５２．１０［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０９６２】
（４４−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化１３１】
2019240287.tif 000133
上記アミノ酸配列は、配列番号４７である。【０９６３】
（４４−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＷＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号４７）（１１．５ｍｇ，５．２２μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．４０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（２１．０ｍｇ，５２．０μｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．４０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（３．００ｍｇ，１．２０μｍｏｌ）を得た。【０９６４】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ８３２．０５［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：９３％【０９６５】
（４４−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（４４−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液をＮＡＰ−５カラムに添加し、反応を停止させ２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１５．０５９５にピークが確認され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５．３１３３にピークが確認された。【０９６６】
（４４−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（４４−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８５、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【０９６７】
（４４−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（４４−５）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【０９６８】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【０９６９】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １２．３０４９分はペプチドがトラスツズマブに１個導入された化合物、１４．１３６５分はペプチドがトラスツズマブに２個導入された化合物であると考えられる（図５２）。【０９７０】
（４４−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（４４−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【０９７１】
［実施例４５：抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（４５−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＹＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号４８）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（２５．５ｍｇ，１１．７μｍｏｌ）を得た。【０９７２】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７２８．６５［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ｚ＝４  ５４６．８５［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０９７３】
（４５−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＹＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号４８）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化１３２】
2019240287.tif 000134
上記アミノ酸配列は、配列番号４８である。【０９７４】
（４５−１）で合成したペプチド（２５．５ｍｇ，１１．７μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５．００ｍＬ）に溶解し、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨ（１１．７μＬ，２３．４μｍｏｌ）、過酸化水素水（２３．９μＬ，２３４μｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（１３．０ｍｇ，６．００μｍｏｌ）を得た。【０９７５】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７２８．０５［Ｍ＋３Ｈ］３＋，  ｚ＝４  ５４６．３５［Ｍ＋４Ｈ］４＋【０９７６】
（４５−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化１３３】
2019240287.tif 000135
上記アミノ酸配列は、配列番号４８である。【０９７７】
（４５−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＹＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号４８）（１３．０ｍｇ，６．００μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．４０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（２４．０ｍｇ，６０．０μｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．４０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（３．８０ｍｇ，１．５４μｍｏｌ）を得た。【０９７８】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ８２４．５０［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：１００％【０９７９】
（４５−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（４５−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液をＮＡＰ−５カラムに添加し、反応を停止させ２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１５０５６９にピークが確認され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５３０８６にピークが確認された。【０９８０】
（４５−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（４５−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８５、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【０９８１】
（４５−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（４５−５）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【０９８２】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【０９８３】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １１．５４８３分はペプチドがトラスツズマブに１個導入された化合物、１２．８９４８分はペプチドがトラスツズマブに２個導入された化合物であると考えられる（図５３）。【０９８４】
（４５−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（４５−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【０９８５】
［実施例４６：抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（４６−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＦＫＧＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号４９）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（１９．５ｍｇ，９．３５μｍｏｌ）を得た。【０９８６】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ６９６．７０［Ｍ＋３Ｈ］３＋【０９８７】
（４６−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＦＫＧＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号４９）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化１３４】
2019240287.tif 000136
上記アミノ酸配列は、配列番号４９である。【０９８８】
（４６−１）で合成したペプチド（１９．５ｍｇ，９．３５μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５．００ｍＬ）に溶解し、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨ（９．３５μＬ，１８．７μｍｏｌ）、過酸化水素水（１９．１μＬ，１８７μｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（９．２０ｍｇ，４．４１μｍｏｌ）を得た。【０９８９】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ６９６．０５［Ｍ＋３Ｈ］３＋【０９９０】
（４６−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化１３５】
2019240287.tif 000137
上記アミノ酸配列は、配列番号４９である。【０９９１】
（４６−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＹＦＫＧＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号４９）（９．２０ｍｇ，４．４１μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．４０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（７１．４ｍｇ，１７６μｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．４０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（１．５０ｍｇ，０．６３μｍｏｌ）を得た。【０９９２】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７９２．４０［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：７５％【０９９３】
（４６−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（４６−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液をＮＡＰ−５カラムに添加し、反応を停止させ２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１５０６６１にピークが確認され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５３０５９にピークが確認された。【０９９４】
（４６−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（４６−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８５、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【０９９５】
（４６−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（４６−５）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【０９９６】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【０９９７】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １０．７２３８分はトラスツズマブ原料、１１．４６９７分はペプチドがトラスツズマブに１個導入された化合物、１２．０７１３分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図５４）。【０９９８】
（４６−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（４６−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【０９９９】
［実施例４７：抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（４７−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＹＫＧＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号５０）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（２９．６ｍｇ，１４．１μｍｏｌ）を得た。【１０００】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７０２．０５［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１００１】
（４７−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＹＫＧＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号５０）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化１３６】
2019240287.tif 000138
上記アミノ酸配列は、配列番号５０である。【１００２】
（４７−１）で合成したペプチド（２９．６ｍｇ，１４．１μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５．００ｍＬ）に溶解し、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨ（１４．１μＬ，２８．２μｍｏｌ）、過酸化水素水（２８．８μＬ，２８２μｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（１２．１ｍｇ，５．７６μｍｏｌ）を得た。【１００３】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７０１．４０［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１００４】
（４７−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化１３７】
2019240287.tif 000139
上記アミノ酸配列は、配列番号５０である。【１００５】
（４７−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＹＹＫＧＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号５０）（１２．１ｍｇ，５．７６μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．４０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（７０．０ｍｇ，１７３μｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．４０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（２．７０ｍｇ，１．１３μｍｏｌ）を得た。【１００６】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７９７．６５［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：７７％【１００７】
（４７−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（４７−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液をＮＡＰ−５カラムに添加し、反応を停止させ２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１５０４９７にピークが確認され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５２７７９にピークが確認された。【１００８】
（４７−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（４７−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８５、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【１００９】
（４７−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（４７−５）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【１０１０】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【１０１１】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １０．６８４５分はトラスツズマブ原料、１１．２９５１分はペプチドがトラスツズマブに１個導入された化合物、１２．１５６２分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図５５）。【１０１２】
（４７−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（４７−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【１０１３】
［実施例４８：抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（４８−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＷＫＧＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号５１）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（３６．５ｍｇ，１７．２μｍｏｌ）を得た。【１０１４】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７０９．６５［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１０１５】
（４８−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＷＫＧＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号５１）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化１３８】
2019240287.tif 000140
上記アミノ酸配列は、配列番号５１である。【１０１６】
（４８−１）で合成したペプチド（３６．５ｍｇ，１７．２μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５．００ｍＬ）に溶解し、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨ（１７．２μＬ，３４．４μｍｏｌ）、過酸化水素水（３５．１μＬ，３４４μｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（１５．９ｍｇ，７．４８μｍｏｌ）を得た。【１０１７】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ８０５．６０［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１０１８】
（４８−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化１３９】
2019240287.tif 000141
上記アミノ酸配列は、配列番号５１である。【１０１９】
（４８−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＹＷＫＧＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号５１）（１５．９ｍｇ，７．４８μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．３０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（６０．７ｍｇ，１５０μｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．６０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（６．０ｍｇ，２．４９μｍｏｌ）を得た。【１０２０】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７９５．３５［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：９７％【１０２１】
（４８−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（４８−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液をＮＡＰ−５カラムに添加し、反応を停止させ２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１５０５２９にピークが確認され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５２８１９にピークが確認された。【１０２２】
（４８−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（４８−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８５、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【１０２３】
（４８−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（４８−５）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【１０２４】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【１０２５】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １１．６７１４分はペプチドがトラスツズマブに１個導入された化合物、１２．３７７６分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図５６）。【１０２６】
（４８−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（４８−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【１０２７】
［実施例４９：抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（４９−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＲＫＧＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号５２）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（４６．６ｍｇ，２２．２μｍｏｌ）を得た。【１０２８】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ６９９．６５［Ｍ＋３Ｈ］３＋，  ｚ＝４  ５２５．１５［Ｍ＋４Ｈ］４＋【１０２９】
（４９−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＲＫＧＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号５２）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化１４０】
2019240287.tif 000142
上記アミノ酸配列は、配列番号５２である。【１０３０】
（４９−１）で合成したペプチド（４６．６ｍｇ，２２．２μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５．００ｍＬ）に溶解し、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨ（２２．２μＬ，４４．４μｍｏｌ）、過酸化水素水（４５．４μＬ，４４４μｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（３２．２ｍｇ，１５．４μｍｏｌ）を得た。【１０３１】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ６９９．００［Ｍ＋３Ｈ］３＋、ｚ＝４  ５２４．５０［Ｍ＋４Ｈ］４＋【１０３２】
（４９−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化１４１】
2019240287.tif 000143
上記アミノ酸配列は、配列番号５２である。【１０３３】
（４９−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＹＲＫＧＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号５２）（３２．２ｍｇ，１５．４μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．３０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（１２５ｍｇ，３０８μｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．６０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（１０．２ｍｇ，４．２８μｍｏｌ）を得た。【１０３４】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７９５．３５［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：９７％【１０３５】
（４９−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（４９−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液をＮＡＰ−５カラムに添加し、反応を停止させ２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは１４８２２２にピークが観測され、結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１５０４９２にピークが確認され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５２７６１にピークが確認された。【１０３６】
（４９−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（４９−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８５、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【１０３７】
（４９−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（４９−５）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【１０３８】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【１０３９】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １０．７２４６分はトラスツズマブ原料、１１．４９４４分はペプチドがトラスツズマブに１個導入された化合物、１２．１６４５分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図５７）。【１０４０】
（４９−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（４９−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【１０４１】
［実施例５０：抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（５０−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＧＫＧＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号５３）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（３１．９ｍｇ，１６．０μｍｏｌ）を得た。【１０４２】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ６６６．７０［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１０４３】
（５０−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＧＫＧＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号５３）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化１４２】
2019240287.tif 000144
上記アミノ酸配列は、配列番号５３である。【１０４４】
（５０−１）で合成したペプチド（３１．９ｍｇ，１６．０μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５．００ｍＬ）に溶解し、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨ（１６．０μＬ，３２．０μｍｏｌ）、過酸化水素水（３２．７μＬ，３２０μｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（１７．４ｍｇ，８．７２μｍｏｌ）を得た。【１０４５】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ６６５．９５［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１０４６】
（５０−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化１４３】
2019240287.tif 000145
上記アミノ酸配列は、配列番号５３である。【１０４７】
（５０−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＹＧＫＧＱＬＶＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号５３）（１７．４ｍｇ，８．７２μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．３０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（７０．３ｍｇ，１７４μｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．６０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（４．７０ｍｇ，２．０６μｍｏｌ）を得た。【１０４８】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７６２．３０［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：９４％【１０４９】
（５０−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（５０−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液をＮＡＰ−５カラムに添加し、反応を停止させ２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは１４８２１９にピークが観測され、結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１５０４０２にピークが確認され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５２５６１にピークが確認された。【１０５０】
（５０−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（５０−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８５、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【１０５１】
（５０−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（５０−５）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【１０５２】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【１０５３】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １０．６９６５分はトラスツズマブ原料、１１．３６２４分はペプチドがトラスツズマブに１個導入された化合物、１１．９４４１分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図５８）。【１０５４】
（５０−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（５０−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【１０５５】
［実施例５１：抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（５１−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＤＣＡＹＨＫＧＱＬＶＷＣ−ＮＨ２（配列番号５４）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（７６．９ｍｇ，５２．５μｍｏｌ）を得た。【１０５６】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２  ７３２．６５［Ｍ＋２Ｈ］２＋【１０５７】
（５１−２）Ａｃ−ＤＣＡＹＨＫＧＱＬＶＷＣ−ＮＨ２（配列番号５４）２位と１２位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化１４４】
2019240287.tif 000146
上記アミノ酸配列は、配列番号５４である。【１０５８】
（５１−１）で合成したペプチド（７６．９ｍｇ，５２．５μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５．００ｍＬ）に溶解し、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨ（５２．５μＬ，１０５μｍｏｌ）、過酸化水素水（１０７μＬ，１．０５ｍｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（３５．９ｍｇ，２４．６μｍｏｌ）を得た。【１０５９】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２  ７３１．６０［Ｍ＋２Ｈ］２＋【１０６０】
（５１−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化１４５】
2019240287.tif 000147
上記アミノ酸配列は、配列番号５４である。【１０６１】
（５１−２）で合成したＡｃ−ＤＣＡＹＨＫＧＱＬＶＷＣ−ＮＨ２（配列番号５４）（３５．９ｍｇ，２４．６μｍｏｌ、ただし２番目と１２番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．００ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（３９８ｍｇ，９８４μｍｏｌ）をアセトニトリル（１．５０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（１６．０ｍｇ，９．１４μｍｏｌ）を得た。【１０６２】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２  ８７６．５０［Ｍ＋２Ｈ］２＋
ＨＰＬＣ純度：８９％【１０６３】
（５１−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（５１−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液をＮＡＰ−５カラムに添加し、反応を停止させ２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５１４８７にピークが確認された。【１０６４】
（５１−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（５１−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８５、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【１０６５】
（５１−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（５１−５）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【１０６６】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【１０６７】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １２．５８０２分はペプチドがトラスツズマブに２個導入された化合物であると考えられる（図５９）。【１０６８】
（５１−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（５１−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【１０６９】
［実施例５２：抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（５２−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＮＣＡＹＨＫＧＱＬＶＷＣ−ＮＨ２（配列番号５５）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（７８．６ｍｇ，５３．７μｍｏｌ）を得た。【１０７０】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２  ７３２．２５［Ｍ＋２Ｈ］２＋【１０７１】
（５２−２）Ａｃ−ＮＣＡＹＨＫＧＱＬＶＷＣ−ＮＨ２（配列番号５５）２位と１２位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化１４６】
2019240287.tif 000148
上記アミノ酸配列は、配列番号５５である。【１０７２】
（５２−１）で合成したペプチド（７８．６ｍｇ，５３．７μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５．００ｍＬ）に溶解し、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨ（５３．７μＬ，１０７μｍｏｌ）、過酸化水素水（１０９μＬ，１．０７ｍｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（２８．０ｍｇ，１９．２μｍｏｌ）を得た。【１０７３】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２  ７３１．２０［Ｍ＋２Ｈ］２＋【１０７４】
（５２−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化１４７】
2019240287.tif 000149
上記アミノ酸配列は、配列番号５５である。【１０７５】
（５２−２）で合成したＡｃ−ＮＣＡＹＨＫＧＱＬＶＷＣ−ＮＨ２（配列番号５５）（２８．０ｍｇ，１９．２μｍｏｌ、ただし２番目と１２番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．００ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（３１１ｍｇ，７６８μｍｏｌ）をアセトニトリル（１．５０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（１１．５ｍｇ，６．５７μｍｏｌ）を得た。【１０７６】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２  ８７５．７５［Ｍ＋２Ｈ］２＋
ＨＰＬＣ純度：９３％【１０７７】
（５２−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（５２−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液をＮＡＰ−５カラムに添加し、反応を停止させ２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５１３２２にピークが確認された。【１０７８】
（５２−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（５２−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８５、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【１０７９】
（５２−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（５２−５）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【１０８０】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【１０８１】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １０．９７８５分はペプチドがトラスツズマブに１個導入された化合物、１１．９５７５分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図６０）。【１０８２】
（５２−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（５２−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【１０８３】
［実施例５３：抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（５３−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＣＡＹＨＫＧＱＬＶＷＣＴ−ＮＨ２（配列番号５６）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（６３．８ｍｇ，４４．０μｍｏｌ）を得た。【１０８４】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２  ７２５．７０［Ｍ＋２Ｈ］２＋【１０８５】
（５３−２）Ａｃ−ＣＡＹＨＫＧＱＬＶＷＣＴ−ＮＨ２（配列番号５６）１位と１１位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化１４８】
2019240287.tif 000150
上記アミノ酸配列は、配列番号５６である。【１０８６】
（５３−１）で合成したペプチド（６３．８ｍｇ，４４．０μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５．００ｍＬ）に溶解し、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨ（４４．０μＬ，８８．０μｍｏｌ）、過酸化水素水（８９．９μＬ，８８０ｍｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（２４．７ｍｇ，１７．１μｍｏｌ）を得た。【１０８７】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２  ７２４．３５［Ｍ＋２Ｈ］２＋【１０８８】
（５３−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化１４９】
2019240287.tif 000151
上記アミノ酸配列は、配列番号５６である。【１０８９】
（５３−２）で合成したＡｃ−ＣＡＹＨＫＧＱＬＶＷＣＴ−ＮＨ２（配列番号５６）（２４．７ｍｇ，１７．１μｍｏｌ、ただし１番目と１１番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．００ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（２７７ｍｇ，６８４μｍｏｌ）をアセトニトリル（１．５０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（９．００ｍｇ，５．１８μｍｏｌ）を得た。【１０９０】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２  ８６９．３０［Ｍ＋２Ｈ］２＋
ＨＰＬＣ純度：７７％【１０９１】
（５３−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（５３−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液をＮＡＰ−５カラムに添加し、反応を停止させ２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５１３０５にピークが確認された。【１０９２】
（５３−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（５３−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８５、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【１０９３】
（５３−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（５３−５）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【１０９４】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【１０９５】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １１．６３５９分はペプチドがトラスツズマブに１個導入された化合物、１３．００５１分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図６１）。【１０９６】
（５３−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（５３−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【１０９７】
［実施例５４：抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（５４−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＣＡＹＨＫＳＱＬＶＷＣ−ＮＨ２（配列番号５７）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（６８．３ｍｇ，４９．５μｍｏｌ）を得た。【１０９８】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２  ６９０．２０［Ｍ＋２Ｈ］２＋【１０９９】
（５４−２）Ａｃ−ＣＡＹＨＫＳＱＬＶＷＣ−ＮＨ２（配列番号５７）１位と１１位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化１５０】
2019240287.tif 000152
上記アミノ酸配列は、配列番号５７である。【１１００】
（５４−１）で合成したペプチド（６８．３ｍｇ，４９．５μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５．００ｍＬ）に溶解し、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨ（４９．５μＬ，９９．０μｍｏｌ）、過酸化水素水（１０１μＬ，９９０ｍｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（３０．４ｍｇ，２２．１μｍｏｌ）を得た。【１１０１】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２  ６８９．１５［Ｍ＋２Ｈ］２＋【１１０２】
（５４−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化１５１】
2019240287.tif 000153
上記アミノ酸配列は、配列番号５７である。【１１０３】
（５４−２）で合成したＡｃ−ＣＡＹＨＫＳＱＬＶＷＣ−ＮＨ２（配列番号５７）（３０．４ｍｇ，２２．１μｍｏｌ、ただし１番目と１１番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．５０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（１７９ｍｇ，４４２μｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．５０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（１２．０ｍｇ，７．２０μｍｏｌ）を得た。【１１０４】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２  ８３３．８５［Ｍ＋２Ｈ］２＋
ＨＰＬＣ純度：９６％【１１０５】
（５４−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（５４−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液をＮＡＰ−５カラムに添加し、反応を停止させ２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１４９７７１にピークが確認され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５１３２６にピークが確認された。【１１０６】
（５４−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（５４−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８５、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【１１０７】
（５４−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（５４−５）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【１１０８】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【１１０９】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １１．７１９４分はペプチドがトラスツズマブに１個導入された化合物、１３．０６５１分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図６２）。【１１１０】
（５４−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（５４−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【１１１１】
［実施例５５：可溶性タンパク質に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（５５−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＡＷＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号６８）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（５８．４ｍｇ，２７．６μｍｏｌ）を得た。【１１１２】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４  ５２９．６５［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１１１３】
（５５−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＡＷＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号６８）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化１５２】
2019240287.tif 000154
上記アミノ酸配列は、配列番号６８である。【１１１４】
（５５−１）で合成したペプチド（５８．４ｍｇ，２７．６μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５．００ｍＬ）に溶解し、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨ（２７．６μＬ，５５．２μｍｏｌ）、過酸化水素水（５６．４μＬ，５５２μｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（２９．３ｍｇ，１３．９μｍｏｌ）を得た。【１１１５】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４  ５２９．０５［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１１１６】
（５５−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化１５３】
2019240287.tif 000155
上記アミノ酸配列は、配列番号６８である。【１１１７】
（５５−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＷＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号６８）（２９．３ｍｇ，１３．９μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．４０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（１１２ｍｇ，２７８μｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．６０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（１４．５ｍｇ，６．０４ｍｏｌ）を得た。【１１１８】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ８０１．４０［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：８８％【１１１９】
（５５−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（５５−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液を１００ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ２．９）に置換して反応を停止させ、さらに２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１５０６９０にピークが観測され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５２７９６にピークが確認された。【１１２０】
（５５−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（５５−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８２、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【１１２１】
（５５−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（５５−４）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【１１２２】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【１１２３】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １２．３９１８分はペプチドが１個導入された化合物、１３．５１７８分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図６３）。【１１２４】
（５５−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（５５−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【１１２５】
［実施例５６：可溶性タンパク質に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（５６−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＡＦＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号６９）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（７８．２ｍｇ，３７．７μｍｏｌ）を得た。【１１２６】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４  ５１９．８０［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１１２７】
（５６−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＡＦＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号６９）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化１５４】
2019240287.tif 000156
上記アミノ酸配列は、配列番号６９である。【１１２８】
（５６−１）で合成したペプチド（７８．２ｍｇ，３７．７μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５．００ｍＬ）に溶解し、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨ（３７．７μＬ，７５．４μｍｏｌ）、過酸化水素水（７７．０μＬ，７５４μｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（４６．９ｍｇ，２２．６μｍｏｌ）を得た。【１１２９】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４  ５１９．４０［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１１３０】
（５６−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化１５５】
2019240287.tif 000157
上記アミノ酸配列は、配列番号６９である。【１１３１】
（５６−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＦＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号６９）（４６．９ｍｇ，２２．６μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．４０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（１８３ｍｇ，４５２μｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．８０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（１８．５ｍｇ，７．８３ｍｏｌ）を得た。【１１３２】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７８８．６０［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：８９％【１１３３】
（５６−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（５６−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液を１００ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ２．９）に置換して反応を停止させ、さらに２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１５０３６８にピークが観測され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５２７１７にピークが確認された。【１１３４】
（５６−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（５６−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８２、５０８４５および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【１１３５】
（５６−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（５６−４）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【１１３６】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【１１３７】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １２．２４９８分はペプチドが１個導入された化合物、１３．１８２９分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図６４）。【１１３８】
（５６−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（５６−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【１１３９】
［実施例５７：可溶性タンパク質に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（５７−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＡＨＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号７０）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（９８．６ｍｇ，４７．７μｍｏｌ）を得た。【１１４０】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４  ５１７．２５［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１１４１】
（５７−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＡＨＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号７０）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化１５６】
2019240287.tif 000158
上記アミノ酸配列は、配列番号７０である。【１１４２】
（５７−１）で合成したペプチド（９８．６ｍｇ，４７．７μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５．００ｍＬ）に溶解し、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨ（４７．７μＬ，９５．４μｍｏｌ）、過酸化水素水（９７．４μＬ，９５４μｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（９０．３ｍｇ，４３．７μｍｏｌ）を得た。【１１４３】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４  ５１６．８５［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１１４４】
（５７−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化１５７】
2019240287.tif 000159
上記アミノ酸配列は、配列番号７０である。【１１４５】
（５７−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＨＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号７０）（９０．３ｍｇ，４３．７μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．４０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（３５３ｍｇ，８７４μｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．２０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（２２．５ｍｇ，９．５６ｍｏｌ）を得た。【１１４６】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４  ５８９．１０［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：６０％【１１４７】
（５７−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（５７−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液を１００ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ２．９）に置換して反応を停止させ、さらに２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは１４８２３６にピークが観測され、結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１５０４６６にピークが観測され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５２７０２にピークが確認された。【１１４８】
（５７−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（５７−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８２、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【１１４９】
（５７−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（５７−４）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【１１５０】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【１１５１】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １１．０７５３分はトラスツズマブ原料、１１．６４２０分はペプチドが１個導入された化合物、１２．１１１８分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図６５）。【１１５２】
（５７−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（５７−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【１１５３】
［実施例５８：可溶性タンパク質に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（５８−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＧＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号７１）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（８８．７ｍｇ，４２．７μｍｏｌ）を得た。【１１５４】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４  ５２０．２５［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１１５５】
（５８−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＧＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号７１）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化１５８】
2019240287.tif 000160
上記アミノ酸配列は、配列番号７１である。【１１５６】
（５８−１）で合成したペプチド（８８．７ｍｇ，４２．７μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５．００ｍＬ）に溶解し、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨ（４２．７μＬ，８５．４μｍｏｌ）、過酸化水素水（８７．２μＬ，８５４μｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（６６．３ｍｇ，３１．９μｍｏｌ）を得た。【１１５７】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４  ５１９．７５［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１１５８】
（５８−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化１５９】
2019240287.tif 000161
上記アミノ酸配列は、配列番号７１である。【１１５９】
（５８−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＧＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号７１）（６６．３ｍｇ，３１．９μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．４０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（２５８ｍｇ，６３８μｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．８０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（２４．５ｍｇ，１０．４ｍｏｌ）を得た。【１１６０】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７８９．２５［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：８５％【１１６１】
（５８−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（５８−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液を１００ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ２．９）に置換して反応を停止させ、さらに２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは１４８２２９にピークが観測され、結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１５０４７７にピークが観測され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５２８９２にピークが確認された。【１１６２】
（５８−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（５８−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５７に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８５、５０８４５および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【１１６３】
（５８−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（５８−４）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【１１６４】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【１１６５】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １０．４２４６分はトラスツズマブ原料、１１．４２８１分はペプチドが１個導入された化合物、１２．２９２０分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図６６）。【１１６６】
（５８−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（５８−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【１１６７】
［実施例５９：可溶性タンパク質に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（５９−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＬＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号７２）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（５４．８ｍｇ，２５．７μｍｏｌ）を得た。【１１６８】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４  ５３４．４５［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１１６９】
（５９−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＬＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号７２）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化１６０】
2019240287.tif 000162
上記アミノ酸配列は、配列番号７２である。【１１７０】
（５９−１）で合成したペプチド（５４．８ｍｇ，２５．７μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５．００ｍＬ）に溶解し、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨ（２５．７μＬ，５１．４μｍｏｌ）、過酸化水素水（５２．５μＬ，５１４μｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（２７．８ｍｇ，１３．０μｍｏｌ）を得た。【１１７１】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４  ５３３．８５［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１１７２】
（５９−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化１６１】
2019240287.tif 000163
上記アミノ酸配列は、配列番号７２である。【１１７３】
（５９−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＬＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号７２）（２７．８ｍｇ，１３．０μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．４０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（１０５ｍｇ，２６０μｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．６０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（１８．８ｍｇ，７．７７ｍｏｌ）を得た。【１１７４】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ８０７．８０［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：８４％【１１７５】
（５９−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（５９−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液を１００ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ２．９）に置換して反応を停止させ、さらに２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１５０６９１にピークが観測され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５２８３８にピークが確認された。【１１７６】
（５９−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（５９−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５７に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８２、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【１１７７】
（５９−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（５９−４）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【１１７８】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【１１７９】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １１．４５９２分はペプチドが１個導入された化合物、１２．２１４６分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図６７）。【１１８０】
（５９−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（５９−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【１１８１】
［実施例６０：可溶性タンパク質に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（６０−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＰＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号７３）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（８３．０ｍｇ，３９．２μｍｏｌ）を得た。【１１８２】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４  ５３０．４５［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１１８３】
（６０−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＰＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号７３）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化１６２】
2019240287.tif 000164
上記アミノ酸配列は、配列番号７３である。【１１８４】
（６０−１）で合成したペプチド（８３．０ｍｇ，３９．２μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５．００ｍＬ）に溶解し、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨ（３９．２μＬ，７８．４μｍｏｌ）、過酸化水素水（８０．１μＬ，７８４μｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（４９．１ｍｇ，２３．２μｍｏｌ）を得た。【１１８５】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４  ５２９．９５［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１１８６】
（６０−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化１６３】
2019240287.tif 000165
上記アミノ酸配列は、配列番号７３である。【１１８７】
（６０−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＰＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号７３）（４９．１ｍｇ，２３．２μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．４０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（１８８ｍｇ，４６４μｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．８０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（１９．４ｍｇ，８．０７ｍｏｌ）を得た。【１１８８】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ８０２．４５［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：８７％【１１８９】
（６０−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（６０−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液を１００ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ２．９）に置換して反応を停止させ、さらに２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは１４８２２５にピークが観測され、結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１５０５１３にピークが観測され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５３３９８にピークが確認された。【１１９０】
（６０−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（６０−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８４、５０８４５および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【１１９１】
（６０−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（６０−４）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【１１９２】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【１１９３】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １０．５８４２分はトラスツズマブ原料、１１．６０２４分はペプチドが１個導入された化合物、１２．４６１３分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図６８）。【１１９４】
（６０−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（６０−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【１１９５】
［実施例６１：可溶性タンパク質に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（６１−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＲＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号７４）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（４７．８ｍｇ，２２．０μｍｏｌ）を得た。【１１９６】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４  ５４５．００［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１１９７】
（６１−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＲＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号７４）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化１６４】
2019240287.tif 000166
上記アミノ酸配列は、配列番号７４である。【１１９８】
（６１−１）で合成したペプチド（４７．８ｍｇ，２２．０μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５．００ｍＬ）に溶解し、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨ（２２．０μＬ，４４．０μｍｏｌ）、過酸化水素水（４４．９μＬ，４４０μｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（５２．５ｍｇ，２４．１μｍｏｌ）を得た。【１１９９】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４  ５４４．６５［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１２００】
（６１−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化１６５】
2019240287.tif 000167
上記アミノ酸配列は、配列番号７４である。【１２０１】
（６１−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＲＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号７４）（５２．５ｍｇ，２４．１μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．４０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（１９５ｍｇ，４８２μｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．６０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（２０．０ｍｇ，８．１２ｍｏｌ）を得た。【１２０２】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４  ６１７．１０［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：７４％【１２０３】
（６１−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（６１−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液を１００ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ２．９）に置換して反応を停止させ、さらに２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは１４８３８７にピークが観測され、結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１５０７３０にピークが観測され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５３０８９にピークが確認された。【１２０４】
（６１−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（６１−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５７に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８２、５０８４５および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【１２０５】
（６１−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（６１−４）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【１２０６】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【１２０７】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １０．７０１４分はトラスツズマブ原料、１１．４２３９分はペプチドが１個導入された化合物、１２．０２５０分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図６９）。【１２０８】
（６１−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（６１−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【１２０９】
［実施例６２：可溶性タンパク質に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（６２−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＶＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号７５）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（７１．０ｍｇ，３３．５μｍｏｌ）を得た。【１２１０】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４  ５３０．９５［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１２１１】
（６２−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＶＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号７５）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化１６６】
2019240287.tif 000168
上記アミノ酸配列は、配列番号７５である。【１２１２】
（６２−１）で合成したペプチド（７１．０ｍｇ，３３．５μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５．００ｍＬ）に溶解し、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨ（３３．５μＬ，６７．０μｍｏｌ）、過酸化水素水（６８．０μＬ，６７０μｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（３８．９ｍｇ，１８．４μｍｏｌ）を得た。【１２１３】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４  ５３０．３５［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１２１４】
（６２−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化１６７】
2019240287.tif 000169
上記アミノ酸配列は、配列番号７５である。【１２１５】
（６２−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＶＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号７５）（３８．９ｍｇ，１８．４μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．４０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（１４９ｍｇ，３６８μｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．６０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（１１．２ｍｇ，４．６５ｍｏｌ）を得た。【１２１６】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ８０３．０５［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：８８％【１２１７】
（６２−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（６２−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液を１００ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ２．９）に置換して反応を停止させ、さらに２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１５０３５８にピークが観測され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５２９６１にピークが確認された。【１２１８】
（６２−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（６２−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８４、５０８４６および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【１２１９】
（６２−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（６２−４）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【１２２０】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【１２２１】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １０．９０６５分はペプチドが１個導入された化合物、１１．７１５７分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図７０）。【１２２２】
（６２−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（６２−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【１２２３】
［実施例６３：可溶性タンパク質に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（６３−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＮＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号７６）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（１０２ｍｇ，４７．７μｍｏｌ）を得た。【１２２４】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４  ５３４．５５［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１２２５】
（６３−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＮＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号７６）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化１６８】
2019240287.tif 000170
上記アミノ酸配列は、配列番号７６である。【１２２６】
（６３−１）で合成したペプチド（１０２ｍｇ，４７．７μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５．００ｍＬ）に溶解し、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨ（４７．７μＬ，９５．４μｍｏｌ）、過酸化水素水（９７．４μＬ，９５４μｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（５１．０ｍｇ，２３．９μｍｏｌ）を得た。【１２２７】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４  ５３３．９０［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１２２８】
（６３−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化１６９】
2019240287.tif 000171
上記アミノ酸配列は、配列番号７６である。【１２２９】
（６３−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＮＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号７６）（５１．０ｍｇ，２３．９μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．４０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（１９３ｍｇ，４７８μｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．００ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（１９．５ｍｇ，８．０５ｍｏｌ）を得た。【１２３０】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ８０８．１５［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：１００％【１２３１】
（６３−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（６３−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液を１００ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ２．９）に置換して反応を停止させ、さらに２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１５０５３０にピークが観測され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５２８３９にピークが確認された。【１２３２】
（６３−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（６３−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８２、５０８４５および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【１２３３】
（６３−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（６３−４）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【１２３４】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【１２３５】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １０．８３４８分はペプチドが１個導入された化合物、１１．５３７９分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図７１）。【１２３６】
（６３−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（６３−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【１２３７】
［実施例６４：可溶性タンパク質に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（６４−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＥＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号７７）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（７７．７ｍｇ，３６．１μｍｏｌ）を得た。【１２３８】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４  ５３８．２０［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１２３９】
（６４−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＥＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号７７）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化１７０】
2019240287.tif 000172
上記アミノ酸配列は、配列番号７７である。【１２４０】
（６４−１）で合成したペプチド（７７．７ｍｇ，３６．１μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５．００ｍＬ）に溶解し、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨ（３６．１μＬ，７２．２μｍｏｌ）、過酸化水素水（７３．７μＬ，７２２μｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（４７．５ｍｇ，２２．１μｍｏｌ）を得た。【１２４１】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４  ５３７．７０［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１２４２】
（６４−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化１７１】
2019240287.tif 000173
上記アミノ酸配列は、配列番号７７である。【１２４３】
（６４−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＥＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号７７）（４７．５ｍｇ，２２．１μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．４０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（１７９ｍｇ，４４２μｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．６０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（２０．０ｍｇ，８．２１ｍｏｌ）を得た。【１２４４】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ８１３．１５［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：８３％【１２４５】
（６４−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（６４−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液を１００ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ２．９）に置換して反応を停止させ、さらに２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは１４８０７３にピークが観測され、結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１５０６６７にピークが観測され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５３０３１にピークが確認された。【１２４６】
（６４−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（６４−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８２、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【１２４７】
（６４−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（６４−４）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【１２４８】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【１２４９】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １０．９７６０分はペプチドが１個導入された化合物、１１．７３１７分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図７２）。【１２５０】
（６４−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（６４−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【１２５１】
［実施例６５：可溶性タンパク質に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（６５−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＦＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号７８）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（６１．９ｍｇ，２８．６μｍｏｌ）を得た。【１２５２】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４  ５４２．８５［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１２５３】
（６５−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＦＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号７８）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化１７２】
2019240287.tif 000174
上記アミノ酸配列は、配列番号７８である。【１２５４】
（６５−１）で合成したペプチド（６１．９ｍｇ，２８．６μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５．００ｍＬ）に溶解し、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨ（２８．６μＬ，５７．２μｍｏｌ）、過酸化水素水（５８．４μＬ，５７２μｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（３０．２ｍｇ，１３．９μｍｏｌ）を得た。【１２５５】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４  ５４２．３５［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１２５６】
（６５−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化１７３】
2019240287.tif 000175
上記アミノ酸配列は、配列番号７８である。【１２５７】
（６５−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＦＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号７８）（３０．２ｍｇ，１３．９μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．４０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（１１２ｍｇ，２７８μｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．６０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（１２．０ｍｇ，４．８９ｍｏｌ）を得た。【１２５８】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ８１９．０５［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：７８％【１２５９】
（６５−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（６５−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液を１００ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ２．９）に置換して反応を停止させ、さらに２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは１４８１６４にピークが観測され、結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１５０７２５にピークが観測され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５３０７２にピークが確認された。【１２６０】
（６５−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（６５−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５６に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６７８、５０８４５および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【１２６１】
（６５−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（６５−４）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【１２６２】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【１２６３】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  ９．９２９８分はトラスツズマブ原料、１０．８７５７分はペプチドが１個導入された化合物、１１．６８７５分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図７３）。【１２６４】
（６５−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（６５−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【１２６５】
［実施例６６：可溶性タンパク質に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（６６−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＥＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号７９）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（８２．３ｍｇ，３９．３μｍｏｌ）を得た。【１２６６】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４  ５２３．９０［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１２６７】
（６６−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＥＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号７９）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化１７４】
2019240287.tif 000176
上記アミノ酸配列は、配列番号７９である。【１２６８】
（６６−１）で合成したペプチド（８２．３ｍｇ，３９．３μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５．００ｍＬ）に溶解し、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨ（３９．３μＬ，７８．６μｍｏｌ）、過酸化水素水（８０．３μＬ，７８６μｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（４８．７ｍｇ，２３．３μｍｏｌ）を得た。【１２６９】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４  ５２３．６０［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１２７０】
（６６−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化１７５】
2019240287.tif 000177
上記アミノ酸配列は、配列番号７９である。【１２７１】
（６６−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＥＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号７９）（４８．７ｍｇ，２３．３μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．４０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（１８８ｍｇ，４６６μｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．６０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（１８．０ｍｇ，７．５６ｍｏｌ）を得た。【１２７２】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７９４．１０［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：８８％【１２７３】
（６６−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（６６−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液を１００ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ２．９）に置換して反応を停止させ、さらに２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５２７５３にピークが確認された。【１２７４】
（６６−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（６６−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９４、５０７５６に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８２、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【１２７５】
（６６−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（６６−４）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【１２７６】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【１２７７】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ１１．４１１９分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図７４）。【１２７８】
（６６−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（６６−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【１２７９】
［実施例６７：可溶性タンパク質に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（６７−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＮＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号８０）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（８５．２ｍｇ，４１．０μｍｏｌ）を得た。【１２８０】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４  ５２０．３５［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１２８１】
（６７−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＮＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号８０）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化１７６】
2019240287.tif 000178
上記アミノ酸配列は、配列番号８０である。【１２８２】
（６７−１）で合成したペプチド（８５．２ｍｇ，４１．０μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５．００ｍＬ）に溶解し、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨ（４１．０μＬ，８２．０μｍｏｌ）、過酸化水素水（８３．８μＬ，８２０μｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（１００ｍｇ，４８．２μｍｏｌ）を得た。【１２８３】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４  ５１９．６５［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１２８４】
（６７−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化１７７】
2019240287.tif 000179
上記アミノ酸配列は、配列番号８０である。【１２８５】
（６７−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＮＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号８０）（１００ｍｇ，４８．２μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．６０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（３９０ｍｇ，９６４μｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．２０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（１８．５ｍｇ，７．８２ｍｏｌ）を得た。【１２８６】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７８９．２０［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：８９％【１２８７】
（６７−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（６７−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液を１００ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ２．９）に置換して反応を停止させ、さらに２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５２８８６にピークが確認された。【１２８８】
（６７−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（６７−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９４、５０７５６に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８２、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【１２８９】
（６７−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（６７−４）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【１２９０】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【１２９１】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １１．５３８２分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図７５）。【１２９２】
（６７−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（６７−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【１２９３】
［実施例６８：可溶性タンパク質に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（６８−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＰＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号８１）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（８６．８ｍｇ，４２．１μｍｏｌ）を得た。【１２９４】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４  ５１６．１０［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１２９５】
（６８−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＰＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号８１）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化１７８】
2019240287.tif 000180
上記アミノ酸配列は、配列番号８１である。【１２９６】
（６８−１）で合成したペプチド（８６．８ｍｇ，４２．１μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５．００ｍＬ）に溶解し、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨ（４２．１μＬ，８４．２μｍｏｌ）、過酸化水素水（８６．０μＬ，８４２μｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（４４．１ｍｇ，２１．４μｍｏｌ）を得た。【１２９７】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４  ５１５．５５［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１２９８】
（６８−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化１７９】
2019240287.tif 000181
上記アミノ酸配列は、配列番号８１である。【１２９９】
（６８−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＰＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号８１）（４４．１ｍｇ，２１．４μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．４０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（１７３ｍｇ，４２８μｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．６０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（１２．５ｍｇ，５．３２ｍｏｌ）を得た。【１３００】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７８３．４０［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：８９％【１３０１】
（６８−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（６８−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液を１００ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ２．９）に置換して反応を停止させ、さらに２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは１４８３９４にピークが観測された。【１３０２】
（６８−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（６８−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９４、５０７５６に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測され、生成物は原料と同じく５０５９４、５０７５６に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【１３０３】
（６８−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（６８−４）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【１３０４】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【１３０５】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  ９．９２１６分はトラスツズマブ原料であると考えられる（図７６）。【１３０６】
（６８−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（６８−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【１３０７】
［実施例６９：可溶性タンパク質に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（６９−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＧＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号８２）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（６８．９ｍｇ，３４．１μｍｏｌ）を得た。【１３０８】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４  ５０６．００［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１３０９】
（６９−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＧＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号８２）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化１８０】
2019240287.tif 000182
上記アミノ酸配列は、配列番号８２である。【１３１０】
（６９−１）で合成したペプチド（６８．９ｍｇ，３４．１μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５．００ｍＬ）に溶解し、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨ（３４．１μＬ，６８．２μｍｏｌ）、過酸化水素水（６９．７μＬ，６８２μｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（３４．６ｍｇ，１７．１μｍｏｌ）を得た。【１３１１】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４  ５０６．００［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１３１２】
（６９−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化１８１】
2019240287.tif 000183
上記アミノ酸配列は、配列番号８２である。【１３１３】
（６９−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＧＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号８２）（３４．６ｍｇ，１７．１μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．４０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（１３８ｍｇ，３４２μｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．６０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（１０．５ｍｇ，４．５５ｍｏｌ）を得た。【１３１４】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７７０．１５［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：９１％【１３１５】
（６９−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（６９−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液を１００ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ２．９）に置換して反応を停止させ、さらに２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１５００７５にピークが観測され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５２６１２にピークが確認された。【１３１６】
（６９−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（６９−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９４、５０７５７に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８３、５０８４５および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【１３１７】
（６９−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（６９−４）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【１３１８】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【１３１９】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １１．２０７３分はペプチドが１個導入された化合物、１２．１１８１分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図７７）。【１３２０】
（６９−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（６９−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【１３２１】
［実施例７０：可溶性タンパク質に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（７０−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＤＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号８３）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（７８．１ｍｇ，３７．６μｍｏｌ）を得た。【１３２２】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４  ５２０．６５［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１３２３】
（７０−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＤＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号８３）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化１８２】
2019240287.tif 000184
上記アミノ酸配列は、配列番号８３である。【１３２４】
（７０−１）で合成したペプチド（７８．１ｍｇ，３７．６μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５．００ｍＬ）に溶解し、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨ（３７．６μＬ，７５．２μｍｏｌ）、過酸化水素水（７６．８μＬ，７５２μｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（３８．８ｍｇ，１８．７μｍｏｌ）を得た。【１３２５】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４  ５２０．２０［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１３２６】
（７０−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化１８３】
2019240287.tif 000185
上記アミノ酸配列は、配列番号８３である。【１３２７】
（７０−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＤＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号８３）（３８．８ｍｇ，１８．７μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．４０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（１５１ｍｇ，３７４μｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．６０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（１７．５ｍｇ，７．４０ｍｏｌ）を得た。【１３２８】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７８９．６０［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：８８％【１３２９】
（７０−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（７０−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液を１００ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ２．９）に置換して反応を停止させ、さらに２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１５０６８２にピークが観測され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５３０８５にピークが確認された。【１３３０】
（７０−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（７０−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９４、５０７５７に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８２、５０８４５および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【１３３１】
（７０−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（７０−４）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【１３３２】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【１３３３】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １０．５７２９分はペプチドが１個導入された化合物、１１．１５７７分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図７８）。【１３３４】
（７０−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（７０−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【１３３５】
［実施例７１：可溶性タンパク質に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（７１−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＲＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号８４）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（７０．１ｍｇ，３３．１μｍｏｌ）を得た。【１３３６】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４  ５３０．７５［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１３３７】
（７１−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＲＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号８４）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化１８４】
2019240287.tif 000186
上記アミノ酸配列は、配列番号８４である。【１３３８】
（７１−１）で合成したペプチド（７０．１ｍｇ，３３．１μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５．００ｍＬ）に溶解し、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨ（３３．１μＬ，６６．２μｍｏｌ）、過酸化水素水（６７．６μＬ，６６２μｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（３６．８ｍｇ，１７．４μｍｏｌ）を得た。【１３３９】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４  ５３０．４０［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１３４０】
（７１−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化１８５】
2019240287.tif 000187
上記アミノ酸配列は、配列番号８４である。【１３４１】
（７１−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＲＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号８４）（３６．８ｍｇ，１７．４μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．４０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（１４１ｍｇ，３４８μｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．６０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（６．９０ｍｇ，２．８７ｍｏｌ）を得た。【１３４２】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ８０３．１０［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：８１％【１３４３】
（７１−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（７１−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液を１００ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ２．９）に置換して反応を停止させ、さらに２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１５０６７４にピークが観測され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５３３３８にピークが確認された。【１３４４】
（７１−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（７１−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９４、５０７５７に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８２、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【１３４５】
（７１−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（７１−４）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【１３４６】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【１３４７】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １０．７３１９分はペプチドが１個導入された化合物、１１．３８１６分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図７９）。【１３４８】
（７１−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（７１−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【１３４９】
［実施例７２：可溶性タンパク質に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（７２−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＦＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号８５）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（６１．２ｍｇ，２９．０μｍｏｌ）を得た。【１３５０】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４  ５２８．６５［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１３５１】
（７２−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＦＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号８５）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化１８６】
2019240287.tif 000188
上記アミノ酸配列は、配列番号８５である。【１３５２】
（７２−１）で合成したペプチド（６１．２ｍｇ，２９．０μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５．００ｍＬ）に溶解し、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨ（２９．０μＬ，５８．０μｍｏｌ）、過酸化水素水（５９．２μＬ，５８０μｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（３３．３ｍｇ，１５．８μｍｏｌ）を得た。【１３５３】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４  ５２８．００［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１３５４】
（７２−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化１８７】
2019240287.tif 000189
上記アミノ酸配列は、配列番号８５である。【１３５５】
（７２−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＦＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号８５）（３３．３ｍｇ，１５．８μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．４０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（１２８ｍｇ，３１６μｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．６０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（１４．０ｍｇ，５．８４ｍｏｌ）を得た。【１３５６】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ８００．２０［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：８３％【１３５７】
（７２−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（７２−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液を１００ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ２．９）に置換して反応を停止させ、さらに２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１５０７０６にピークが観測され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５２９７９にピークが確認された。【１３５８】
（７２−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（７２−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９４、５０７５７に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８２、５０８４５および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【１３５９】
（７２−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（７２−４）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【１３６０】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【１３６１】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  ９．８２９５分はトラスツズマブ原料、１２．２４９８分はペプチドが１個導入された化合物、１３．１８２９分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図８０）。【１３６２】
（７２−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（７２−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【１３６３】
［実施例７３：可溶性タンパク質に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（７３−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＨＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号８６）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（９４．０ｍｇ，４４．８μｍｏｌ）を得た。【１３６４】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４  ５２６．２０［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１３６５】
（７３−２）Ａｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＨＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号８６）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化１８８】
2019240287.tif 000190
上記アミノ酸配列は、配列番号８６である。【１３６６】
（７３−１）で合成したペプチド（９４．０ｍｇ，４４．８μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５．００ｍＬ）に溶解し、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨ（４４．８μＬ，８９．６μｍｏｌ）、過酸化水素水（９１．５μＬ，８９６μｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（５６．０ｍｇ，２６．７μｍｏｌ）を得た。【１３６７】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４  ５２５．７０［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１３６８】
（７３−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化１８９】
2019240287.tif 000191
上記アミノ酸配列は、配列番号８６である。【１３６９】
（７３−２）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＨＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号８６）（５６．０ｍｇ，２６．７μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．４０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（２１６ｍｇ，５３４μｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．６０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（１６．８ｍｇ，７．０４ｍｏｌ）を得た。【１３７０】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７９６．７５［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：１００％【１３７１】
（７３−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（７３−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液を１００ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ２．９）に置換して反応を停止させ、さらに２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１５０６８６にピークが観測され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５２９５１にピークが確認された。【１３７２】
（７３−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（７３−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９４、５０７５７に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８２、５０８４５および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【１３７３】
（７３−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（７３−４）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【１３７４】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【１３７５】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １０．８４５０分はペプチドが１個導入された化合物、１１．５５４２分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図８１）。【１３７６】
（７３−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（７３−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【１３７７】
［実施例７４：可溶性タンパク質に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（７４−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＤＣＡＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴ−ＮＨ２（配列番号８７）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（６６．７ｍｇ，４２．２μｍｏｌ）を得た。【１３７８】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２  ７９０．２０［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１３７９】
（７４−２）Ａｃ−ＤＣＡＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴ−ＮＨ２（配列番号８７）２位と１２位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化１９０】
2019240287.tif 000192
上記アミノ酸配列は、配列番号８７である。【１３８０】
（７４−１）で合成したペプチド（６６．７ｍｇ，４２．２μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５．００ｍＬ）に溶解し、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨ（４２．２μＬ，８４．４μｍｏｌ）、過酸化水素水（８６．２μＬ，８４４μｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（２５．０ｍｇ，１５．９μｍｏｌ）を得た。【１３８１】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２  ７８８．９５［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１３８２】
（７４−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化１９１】
2019240287.tif 000193
上記アミノ酸配列は、配列番号８７である。【１３８３】
（７４−２）で合成したＡｃ−ＤＣＡＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴ−ＮＨ２（配列番号８７）（２５．０ｍｇ，１５．９μｍｏｌ、ただし２番目と１２番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．４０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（１２９ｍｇ，３１８μｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．６０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（１１．０ｍｇ，５．８９ｍｏｌ）を得た。【１３８４】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２  ９３３．８０［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：９２％【１３８５】
（７４−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（７４−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液を１００ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ２．９）に置換して反応を停止させ、さらに２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１４９４６２にピークが観測され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５２０８４にピークが確認された。【１３８６】
（７４−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（７４−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９４、５０７５７に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８２、５０８４５および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【１３８７】
（７４−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（７４−５）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【１３８８】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【１３８９】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １２．０５４３分はペプチドが１個導入された化合物、１３．５００９分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図８２）。【１３９０】
（７４−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（７４−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【１３９１】
［実施例７５：可溶性タンパク質に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（７５−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＮＣＡＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴ−ＮＨ２（配列番号８８）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（７５．１ｍｇ，４７．６μｍｏｌ）を得た。【１３９２】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２  ７８９．６５［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１３９３】
（７５−２）Ａｃ−ＮＣＡＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴ−ＮＨ２（配列番号８８）２位と１２位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化１９２】
2019240287.tif 000194
上記アミノ酸配列は、配列番号８８である。【１３９４】
（７５−１）で合成したペプチド（７５．１ｍｇ，４７．６μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５．００ｍＬ）に溶解し、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨ（４７．６μＬ，９５．２μｍｏｌ）、過酸化水素水（９７．２μＬ，９５２μｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（２７．７ｍｇ，１７．６μｍｏｌ）を得た。【１３９５】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２  ７８８．９０［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１３９６】
（７５−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化１９３】
2019240287.tif 000195
上記アミノ酸配列は、配列番号８８である。【１３９７】
（７５−２）で合成したＡｃ−ＮＣＡＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴ−ＮＨ２（配列番号８８）（２７．７ｍｇ，１７．６μｍｏｌ、ただし２番目と１２番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．４０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（１４２ｍｇ，３５２μｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．６０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（１０．０ｍｇ，５．３６ｍｏｌ）を得た。【１３９８】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２  ９３３．１０［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：８９％【１３９９】
（７５−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（７５−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液を１００ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ２．９）に置換して反応を停止させ、さらに２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１４９６６２にピークが観測され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５２２６６にピークが確認された。【１４００】
（７５−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（７５−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９４、５０７５７に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８２、５０８４５および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【１４０１】
（７５−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（７５−４）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【１４０２】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【１４０３】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １１．８８０７分はペプチドが１個導入された化合物、１３．２４６７分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図８３）。【１４０４】
（７５−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（７５−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【１４０５】
［実施例７６：可溶性タンパク質に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（７６−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＧＮＣＡＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹ−ＮＨ２（配列番号８９）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（４４．７ｍｇ，２４．９μｍｏｌ）を得た。【１４０６】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２  ８９９．７０［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１４０７】
（７６−２）Ａｃ−ＧＮＣＡＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹ−ＮＨ２（配列番号８９）３位と１３位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化１９４】
2019240287.tif 000196
上記アミノ酸配列は、配列番号８９である。【１４０８】
（７６−１）で合成したペプチド（４４．７ｍｇ，２４．９μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５．００ｍＬ）に溶解し、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨ（２４．９μＬ，４９．８μｍｏｌ）、過酸化水素水（５０．９μＬ，４９８μｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（２０．０ｍｇ，１１．１μｍｏｌ）を得た。【１４０９】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２  ８９９．００［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１４１０】
（７６−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化１９５】
2019240287.tif 000197
上記アミノ酸配列は、配列番号８９である。【１４１１】
（７６−２）で合成したＡｃ−ＧＮＣＡＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹ−ＮＨ２（配列番号８９）（２０．０ｍｇ，１１．１μｍｏｌ、ただし３番目と１３番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．２０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（９０ｍｇ，２２２μｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．６０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（９．４０ｍｇ，４．５１ｍｏｌ）を得た。【１４１２】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ６９６．００［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：９５％【１４１３】
（７６−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（７６−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液を１００ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ２．９）に置換して反応を停止させ、さらに２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５２１６５にピークが確認された。【１４１４】
（７６−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（７６−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９４、５０７５７に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８２、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【１４１５】
（７６−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（７６−４）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【１４１６】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【１４１７】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １４．１３６４分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図８４）。【１４１８】
（７６−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（７６−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【１４１９】
［実施例７７：可溶性タンパク質に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（７７−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＧＣＡＹＨＫＧＱＩＩＷＣＧ−ＮＨ２（配列番号９０）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（５３．５ｍｇ，３６．２μｍｏｌ）を得た。【１４２０】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２  ７３９．２０［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１４２１】
（７７−２）Ａｃ−ＧＣＡＹＨＫＧＱＩＩＷＣＧ−ＮＨ２（配列番号９０）２位と１２位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化１９６】
2019240287.tif 000198
上記アミノ酸配列は、配列番号９０である。【１４２２】
（７７−１）で合成したペプチド（５３．５ｍｇ，３６．２μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５．００ｍＬ）に溶解し、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨ（３６．２μＬ，７２．４μｍｏｌ）、過酸化水素水（７４．０μＬ，７２４μｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（２８．７ｍｇ，１９．５μｍｏｌ）を得た。【１４２３】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２  ７３８．２０［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１４２４】
（７７−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化１９７】
2019240287.tif 000199
上記アミノ酸配列は、配列番号９０である。【１４２５】
（７７−２）で合成したＡｃ−ＧＣＡＹＨＫＧＱＩＩＷＣＧ−ＮＨ２（配列番号９０）（２８．７ｍｇ，１９．５μｍｏｌ、ただし２番目と１２番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．４０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（１５８ｍｇ，３９０μｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．６０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（１１．０ｍｇ，６．２４ｍｏｌ）を得た。【１４２６】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２  ８８２．９０［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：８５％【１４２７】
（７７−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（７７−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液を１００ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ２．９）に置換して反応を停止させ、さらに２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは１４８３９８にピークが観測され、結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１４９８７４にピークが観測され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５１５２２にピークが確認された。【１４２８】
（７７−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（７７−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９４、５０７５７に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８２、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【１４２９】
（７７−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（７７−４）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【１４３０】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【１４３１】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １０．０２９３分はトラスツズマブ原料、１１．９１０７分はペプチドが１個導入された化合物、１３．５０５４分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図８５）。【１４３２】
（７７−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（７７−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【１４３３】
［実施例７８：可溶性タンパク質に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（７８−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＧＧＣＡＹＨＫＧＱＩＩＷＣＧＧ−ＮＨ２（配列番号９１）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（１６．５ｍｇ，１０．４μｍｏｌ）を得た。【１４３４】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２  ７９６．２０［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１４３５】
（７８−２）Ａｃ−ＧＧＣＡＹＨＫＧＱＩＩＷＣＧＧ−ＮＨ２（配列番号９１）３位と１３位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化１９８】
2019240287.tif 000200
上記アミノ酸配列は、配列番号９１である。【１４３６】
（７８−１）で合成したペプチド（１６．５ｍｇ，１０．４μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５．００ｍＬ）に溶解し、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨ（１０．４μＬ，２０．８μｍｏｌ）、過酸化水素水（２１．２μＬ，２０８μｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（３．７０ｍｇ，２．３３μｍｏｌ）を得た。【１４３７】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２  ７９５．３５［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１４３８】
（７８−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化１９９】
2019240287.tif 000201
上記アミノ酸配列は、配列番号９１である。【１４３９】
（７８−２）で合成したＡｃ−ＧＧＣＡＹＨＫＧＱＩＩＷＣＧＧ−ＮＨ２（配列番号９１）（３．７０ｍｇ，２．３３μｍｏｌ、ただし３番目と１３番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．４０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（１９．０ｍｇ，４６．６μｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．２０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（１．２０ｍｇ，０．６４ｍｏｌ）を得た。【１４４０】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２  ９３９．９５［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：６０％【１４４１】
（７８−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（７８−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液を１００ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ２．９）に置換して反応を停止させ、さらに２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは１４８７９０にピークが観測され、結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１５０５６１にピークが観測され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５２３０５にピークが確認された。【１４４２】
（７８−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（７８−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９４、５０７５６に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８２、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【１４４３】
（７８−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（７８−５）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【１４４４】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【１４４５】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １０．２１２２分はトラスツズマブ原料、１１．６８５８分はペプチドが１個導入された化合物、１２．９５４６分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図８６）。【１４４６】
（７８−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（７８−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【１４４７】
［実施例７９：可溶性タンパク質に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（７９−１）ＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドの合成
Ａｃ−ＧＧＧＣＡＹＨＫＧＱＩＩＷＣＧＧＧ−ＮＨ２（配列番号９２）のペプチドを実施例１（１−１）と同様の方法で合成、精製を行い、目的物（６９．９ｍｇ，４１．０μｍｏｌ）を得た。【１４４８】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２  ８５３．２５［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１４４９】
（７９−２）Ａｃ−ＧＧＧＣＡＹＨＫＧＱＩＩＷＣＧＧＧ−ＮＨ２（配列番号９２）４位と１４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
【化２００】
2019240287.tif 000202
上記アミノ酸配列は、配列番号９２である。【１４５０】
（７９−１）で合成したペプチド（６９．９ｍｇ，４１．０μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５．００ｍＬ）に溶解し、２Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨ（４１．０μＬ，８２．０μｍｏｌ）、過酸化水素水（８３．８μＬ，８２０μｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌を行った。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド（２８．３ｍｇ，１６．６μｍｏｌ）を得た。【１４５１】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２  ８５２．３０［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１４５２】
（７９−３）ジスルフィドリンカーとペプチドの連結
【化２０１】
2019240287.tif 000203
上記アミノ酸配列は、配列番号９２である。【１４５３】
（７９−２）で合成したＡｃ−ＧＧＧＣＡＹＨＫＧＱＩＩＷＣＧＧＧ−ＮＨ２（配列番号９２）（２８．３ｍｇ，１６．６μｍｏｌ、ただし４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．８０ｍＬ）に溶解し、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（１３４ｍｇ，３３２μｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．６０ｍＬ）に溶解した溶液を加え、室温で２４時間攪拌した。これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ−ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体（２．００ｍｇ，１．００ｍｏｌ）を得た。【１４５４】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ６６４．７５［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ純度：６２％【１４５５】
（７９−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（７９−３）で合成したペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液を１００ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ２．９）に置換して反応を停止させ、さらに２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは１４８２２５にピークが観測され、結合性ペプチドが一つ導入された生成物が１５０１０２にピークが観測され、結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５１９７７にピークが確認された。【１４５６】
（７９−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（７９−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９５、５０７５７に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８２、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【１４５７】
（７９−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（７９−４）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【１４５８】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【１４５９】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １０．０５９９分はトラスツズマブ原料、１１．３７９４分はペプチドが１個導入された化合物、１２．４８０４分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図８７）。【１４６０】
（７９−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化
実施例３の（３−１）記載の方法により、（７９−４）で得られた抗体・ペプチド複合体のリンカー切断と再酸化を行えば、ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にチオプロピオニル基が導入された抗体を得ることが可能である。【１４６１】
［実施例８０：切断性リンカーの合成とＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドとの連結］
（８０）切断性リンカーの合成とペプチドとの連結
（８０−１）チオエステルリンカーの合成とペプチドとの連結
（８０−１−１）チオエステルリンカーの合成
【化２０２】
2019240287.tif 000204
【１４６２】
３，３’−ジチオプロピオン酸（１．０ｇ，５．０ｍｍｏｌ）をＴＨＦ１０ｍＬ、ＤＭＦ１００μＬに溶解させ、ピリジン（４．０ｍＬ，５０ｍｍｏｌ）とオキサリルクロライド（１．５ｍＬ，１５．０ｍｍｏｌ）を氷冷下滴下し、２時間室温にて攪拌した。２時間後、メチルチオグリコレート（１．１ｍＬ，１５．０ｍｍｏｌ）を滴下し、さらに室温で２時間攪拌した。反応液を減圧濃縮し、ヘキサン／酢酸エチルの順相クロマトグラフィーにより精製することで目的とするメチル  ２−［３−［［３−（２−メトキシ−２−オキソ−エチル）スルファニル−３−オキソ−プロピル］ジスルファニル］プロパノイルスルファニル］アセテート（１．７４ｇ，４．５ｍｍｏｌ）を得た。【１４６３】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：３８７．０［Ｍ＋Ｈ］＋
【化２０３】
2019240287.tif 000205
【１４６４】
メチル  ２−［３−［［３−（２−メトキシ−２−オキソ−エチル）スルファニル−３−オキソ−プロピル］ジスルファニル］プロパノイルスルファニル］アセテート（１．７４ｇ，４．５ｍｍｏｌ）をＨ２Ｏ５．０ｍＬ、ＤＭＳＯ１．０ｍＬに溶解させ、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（１．９３ｇ，６．７５ｍｍｏｌ）を加え２時間室温にて攪拌した。２時間後、酢酸エチルにより抽出することで、目的とするメチル  ２−（３−スルファニルプロパノイルスルファニル）アセテート（１．２０ｇ，６．２ｍｍｏｌ）を得た。【１４６５】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１９５．０［Ｍ＋Ｈ］＋
【化２０４】
2019240287.tif 000206
【１４６６】
メチル  ２−（３−スルファニルプロパノイルスルファニル）アセテート（１．２０ｇ，６．２ｍｍｏｌ）にアセトニトリル２．７ｍＬ，ピリジン０．３ｍＬを加え溶解した。その後、無水コハク酸（０．６５ｇ，６．５ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン（１２．２ｍｇ，  ０．１ｍｍｏｌ）を加え１時間攪拌した。１Ｍ塩酸水溶液２０ｍＬを加え、酢酸エチルにより抽出した。減圧濃縮することで、４−［３−（２−メトキシ−２−オキソ−エチル）スルファニル−３−オキソ−プロピル］スルファニル−４−オキソ−ブタン酸（１．１８ｇ，４．０ｍｍｏｌ）を得た。【１４６７】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：２９５．０［Ｍ＋Ｈ］＋【１４６８】
（８０−１−２）チオエステルリンカーとペプチドの連結
【化２０５】
2019240287.tif 000207
上記アミノ酸配列は、配列番号５である。【１４６９】
（８０−１）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号５）（３０ｍｇ，１４．４μｍｏｌ、ただし、４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している。）をＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド１ｍＬに溶解し、４−［３−（２−メトキシ−２−オキソ−エチル）スルファニル−３−オキソ−プロピル］スルファニル−４−オキソ−ブタン酸（６５ｍｇ，０．２２ｍｍｏｌ），ＷＳＣ・ＨＣｌ（４１ｍｇ，０．２２ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１２時間攪拌した後、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液を加え逆相分取クロマトグラフィーにより溶出した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルのみ除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド−リンカー連結物−チオフェノール活性化体（２４．１ｍｇ，１０．２μｍｏｌ）を得た。【１４７０】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７８９［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ｚ＝４  ５９２［Ｍ＋４Ｈ］４＋【１４７１】
（８０−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（８０−３）で合成したペプチド−リンカー連結物−チオフェノール活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して１０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液を１００ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ２．９）に置換して反応を停止させ、さらに２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。【１４７２】
（８０−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（８０−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９４、５０７５６に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にペプチド−リンカー連結物が導入された５２８５５、５３０１７および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された（図８８）。【１４７３】
（８０−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（８０−４）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【１４７４】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチド−リンカー連結物−チオフェノール活性化体１０等量；【１４７５】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １０．６２１６分はペプチドが１個導入された化合物、１１．１９４１分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図８９）。【１４７６】
（８０−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断
（８０−４）で得られたトラスツズマブ・ペプチド複合体（２０ｍＭ  ＰＢＳバッファー）をＡｍｉｃｏｎ３Ｋにより、０．５Ｍヒドロキシルアミン、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ５．５）溶液へと置換し、室温で２時間静置した。２時間後、２０ｍＭ  ＰＢＳバッファー、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）へと置換し、トラスツズマブ・チオール導入体を得た。【１４７７】
（８０−８）トラスツズマブ・チオール導入体の特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（８０−７）で生成したトラスツズマブ・チオール導入体に７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９４、５０７５６に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８２、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された（図９０）。【１４７８】
（８０−９）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（８０−４）で生成したトラスツズマブ・チオール導入体とトラスツズマブ・ペプチド複合体の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【１４７９】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ・ペプチド複合体
ｂ：トラスツズマブ・チオール導入体；【１４８０】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １０．２９５０分はチオプロピオニル基が２個導入された化合物であると考えられる（図９１）。【１４８１】
（８０−１０）トラスツズマブ・チオール導入体への蛍光標識
（８０−７）で得られたトラスツズマブ・チオール導入体（２０ｍＭＰＢＳバッファー、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）に対して、フルオレセイン−５−マレイミド（１０ｍＭ、ＤＭＳＯに溶解）を５等量加えた。室温にて１時間静置後、２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換し、トラスツズマブ蛍光標識体（ＡＤＣ  ｍｉｍｉｃ）を得た。【１４８２】
（８０−１１）トラスツズマブ蛍光標識体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（８０−１０）で生成したトラスツズマブ蛍光標識体（ＡＤＣ  ｍｉｍｉｃ）に７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブ・チオール導入体は５０６８２、５０８４４に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にフルオレセインが導入された５１１１０、５１２７２および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された（図９２）。【１４８３】
（８０−１２）トラスツズマブ・チオール導入体からのクリック反応を利用したＡＤＣ  ｍｉｍｉｃの合成
（８０−７）で得られたトラスツズマブ・チオール導入体（２０ｍＭ  ＰＢＳバッファー、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）に対して、Ｎ−（４−アジドフェニル）−２−ヨード−アセトアミド（１０ｍＭ、ＤＭＳＯに溶解）を１０等量加えた。室温にて１時間静置後、２０ｍＭ  ＰＢＳバッファーに置換し、ジベンゾシクロオクチン酸（ＤＢＣＯ−Ａｃｉｄ、１０ｍＭ、ＤＭＳＯに溶解）を５等量加えてクリック反応を行い、ＡＤＣ  ｍｉｍｉｃを得た。【１４８４】
（８０−１３）ＡＤＣ  ｍｉｍｉｃの還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（８０−１２）で生成したＡＤＣ  ｍｉｍｉｃに７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブ・チオール導入体は５０６８２、５０８４４に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にクリック反応生成物が導入された５１１７６、５１３３８および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された（図９３）。【１４８５】
（８０−１４）まとめ
トラスツズマブ、（８０−５）、（８０−８）、（８０−１０）、（８０−１２）の結果をまとめる（図９４）。【１４８６】
［実施例８１：切断性リンカーの合成とＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドとの連結］
（８１）切断性リンカーの合成とペプチドとの連結
（８１−１）チオエステルリンカーの合成とペプチドとの連結
（８１−１−１）チオエステルリンカーの合成
【化２０６】
2019240287.tif 000208
【１４８７】
３，３’−ジチオプロピオン酸（１．０ｇ，５．０ｍｍｏｌ）をＴＨＦ１０ｍＬ、ＤＭＦ１００μＬに溶解させ、ピリジン（４．０ｍＬ，５０ｍｍｏｌ）とオキサリルクロライド（１．５ｍＬ，１５．０ｍｍｏｌ）を氷冷下滴下し、２時間室温にて攪拌した。２時間後、チオフェノール（１．５３ｍＬ，１５．０ｍｍｏｌ）を滴下し、さらに室温で２時間攪拌した。反応液を減圧濃縮し、ヘキサン／酢酸エチルの順相クロマトグラフィーにより精製することで目的とするＳ−フェニル  ３−［（３−オキソ−３−フェニルスルファニル−プロピル）ジスルファニル］プロパンチオエート（１．７７ｇ，４．５ｍｍｏｌ）を得た。【１４８８】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：３９５．１［Ｍ＋Ｈ］＋
【化２０７】
2019240287.tif 000209
【１４８９】
Ｓ−フェニル  ３−［（３−オキソ−３−フェニルスルファニル−プロピル）ジスルファニル］プロパンチオエート（１．７７ｇ，４．５ｍｍｏｌ）をＨ２Ｏ５．０ｍＬ、ＤＭＳＯ１．０ｍＬに溶解させ、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（１．９３ｇ，６．７５ｍｍｏｌ）を加え２時間室温にて攪拌した。２時間後、酢酸エチルにより抽出することで、目的とするＳ−フェニル  ３−スルファニルプロパンチオエート（１．２９ｇ，６．５ｍｍｏｌ）を得た。【１４９０】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１９９．２［Ｍ＋Ｈ］＋
【化２０８】
2019240287.tif 000210
【１４９１】
Ｓ−フェニル  ３−スルファニルプロパンチオエート（１．２９ｇ，６．５ｍｍｏｌ）にアセトニトリル２．７ｍＬ，ピリジン０．３ｍＬを加え溶解した。その後、無水コハク酸（０．６５ｇ，６．５ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン（１２．２ｍｇ，  ０．１ｍｍｏｌ）を加え１時間攪拌した。１Ｍ塩酸水溶液２０ｍＬを加え、酢酸エチルにより抽出した。減圧濃縮することで、（４−オキソ−４−（３−オキソ−３−フェニルスルファニル−プロピル）スルファニル−ブタン酸（１．２５ｇ，４．２ｍｍｏｌ）を得た。【１４９２】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：２９９．０［Ｍ＋Ｈ］＋【１４９３】
（８１−１−２）チオエステルリンカーとペプチドの連結
【化２０９】
2019240287.tif 000211
上記アミノ酸配列は、配列番号５である。【１４９４】
（８１−１）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号５）（３０ｍｇ，１４．４μｍｏｌ、ただし、４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している。）をＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド１ｍＬに溶解し、（（４−オキソ−４−（３−オキソ−３−フェニルスルファニル−プロピル）スルファニル−ブタン酸（６４ｍｇ，０．２２ｍｍｏｌ），ＷＳＣ・ＨＣｌ（４１ｍｇ，０．２２ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１２時間攪拌した後、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液を加え逆相分取クロマトグラフィーにより溶出した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルのみ除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド−リンカー連結物−チオフェノール活性化体（２２．３ｍｇ，９．４μｍｏｌ）を得た。【１４９５】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３  ７９０［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ｚ＝４  ５９３［Ｍ＋４Ｈ］４＋【１４９６】
（８１−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（８１−３）で合成したペプチド−リンカー連結物−チオフェノール活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．７）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液を１００ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ２．９）に置換して反応を停止させ、さらに２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。【１４９７】
（８１−５）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（８１−４）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９４、５０７５６に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にペプチド−リンカー連結物が導入された５２８５５、５３０１７および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【１４９８】
（８１−６）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（８１−４）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【１４９９】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドジスルフィドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体３０等量；【１５００】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １０．５５８０分はペプチドが１個導入された化合物、１１．１３３１分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図９５）。【１５０１】
（８１−７）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断
（８１−４）で得られたトラスツズマブ・ペプチド複合体（２０ｍＭ  ＰＢＳバッファー）をＡｍｉｃｏｎ３Ｋにより、０．５Ｍヒドロキシルアミン、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ５．５）溶液へと置換し、室温で２時間静置した。２時間後、２０ｍＭ  ＰＢＳバッファー、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）へと置換し、トラスツズマブ・チオール導入体を得た。【１５０２】
（８１−８）トラスツズマブ・チオール導入体の特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（８１−７）で生成したトラスツズマブ・チオール導入体に７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９４、５０７５６に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０６８２、５０８４４および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。【１５０３】
（８１−９）Ｏｎｅ−ｐｏｔ法によるトラスツズマブ・チオール導入体の合成
（８１−３）で合成したペプチド−リンカー連結物−チオフェノール活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ５．５）４６．９μＬに溶解させ、２１．６ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して３０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。その後、０．５Ｍヒドロキシルアミン、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ５．５）溶液を酢酸ナトリウムと同量添加し、室温で２時間静置した。２時間後、２０ｍＭ  ＰＢＳバッファー、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）へと置換し、トラスツズマブ・チオール導入体を得た。【１５０４】
（８１−１０）トラスツズマブ・チオール導入体のトリプシン処理
（８１−９）で得られたトラスツズマブ・チオール導入体をＰＮＧａｓｅＦ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社製）により糖鎖切断を行った後、ペプチドマッピングを行った。１．５ｍＬ低吸着マイクロテストチューブにサンプル溶液を１０μＬ、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液、４０％トリフルオロエタノールに溶解した２０ｍＭのジチオスレイトール水溶液１０μＬを加えて６５℃で１時間加温後、５０ｍＭのヨードアセトアミド水溶液１０μＬを添加し、遮光下室温で３０分間反応させた。反応後、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液を４０μＬ加えて撹拌し、２０ｎｇ／μＬのトリプシン水溶液を１０μＬ添加して３７℃で１６時間酵素消化した。消化後、２０％トリフルオロ酢酸水溶液を２μＬ添加し反応を止め、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定を実施した。【１５０５】
（８１−１１）トリプシン消化物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定条件
（分析装置）
ナノＨＰＬＣ：ＥＡＳＹ−ｎＬＣ  １０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）
質量分析計：トライブリッド質量分析計Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｆｕｓｉｏｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）【１５０６】
（ＨＰＬＣ分析条件）
トラップカラム：Ａｃｃｌａｉｍ  ＰｅｐＭａｐ（登録商標）  １００，７５μｍｘ２ｃｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）
分析カラム：ＥＳＩ−ｃｏｌｕｍｎ（ＮＴＣＣ−３６０／７５−３−１２５，７５μｍ×１２．５ｃｍ，３μｍ（日京テクノス株式会社））
移動相Ａ：０．１％ギ酸水溶液
移動相Ｂ：０．１％ギ酸、アセトニトリル溶液
ローディング溶液：０．１％トリフルオロ酢酸水溶液
流速：３００ｎＬ／ｍｉｎ
サンプル注入量：１μＬ
グラジエント条件（Ｂ％）：２％（０．０−０．５分）、２％→３０％（０．５−２３．５分）、３０％→７５％（２３．５−２５．５分）、７５％（２５．５−３５．０分）【１５０７】
（質量分析計分析条件）
イオン化法：ＥＳＩ，  Ｐｏｓｉｔｉｖｅモード
スキャンタイプ：Ｄａｔａ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ａｑｕｉｓｉｔｉｏｎ
Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｔｙｐｅ：Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＣＩＤ）
データの取得は付属ソフトであるＸｃａｌｉｂｕｒ  ３．０（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）およびＴｈｅｒｍｏ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｔｕｎｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ２．０（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて行った。【１５０８】
（８１−１２）トラスツズマブの修飾部位の解析条件
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定結果に対する修飾部位解析については、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．４（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて行った。【１５０９】
Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒでの解析は、Ｓｅｑｕｅｓｔ  ＨＴを検索エンジンとして使用し、プリカーサーイオンの範囲を３５０〜５０００Ｄａ、Ｔｏｔａｌ  Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄをピークトップの強度の０．０１％となるように設定した。また、トリプシンを消化酵素として設定し、Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｍｉｓｓｅｄ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｓｉｔｅｓは３とした。また、プリカーサーおよびフラグメントイオンのＭａｓｓ  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅは、それぞれ５ｐｐｍおよび０．５Ｄａとした。Ｓｔａｔｉｃ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎにはヨードアセトアミドによるシステイン残基の修飾として、Ｃａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ（＋５７．０２１Ｄａ）を設定した。Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓについては、メチオニン残基の酸化（＋１５．９９５Ｄａ）およびリジン残基への修飾体（ヨードアセトアミドによるＣａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ化を受けたチオール導入体（＋１４５．０１９Ｄａ））を設定した。さらに、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＣｏｎｆｉｄｅｎｃｅがＨｉｇｈのもののみとなるようフィルターをかけた。【１５１０】
また、修飾部位の検索対象のアミノ酸配列のデータとして、図４に示される（１）、（３）を用いた。【１５１１】
（８１−１３）トラスツズマブのＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる修飾部位の解析結果
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた解析の結果、トラスツズマブのトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位（ヨードアセトアミドによるＣａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ化を受けたチオール導入体（＋１４５．０１９Ｄａ））を含むアミノ酸３３残基からなるペプチド、ＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号６）のペプチドフラグメントのＭＳスペクトル（実測値：ｍ／ｚ  １２６９．３０３５９、理論値：１２６９．３０２７３、３価）が観測され（図９６）、ＣＩＤスペクトルより重鎖のＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおける２４６位もしくは２４８位のリジン残基の修飾を示す、１価のｙ９に相当するｍ／ｚ  １２０５．８６（理論値：１２０５．６０）のプロダクトイオンが確認された（図９７−１）。また、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒでの解析により、２４６位もしくは２４８位のリジン残基への修飾が高選択的に起こっていることが示された（図９７−２）。【１５１２】
この結果より、（８１−９）では抗体上、重鎖上ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にコンジュゲーションが進行していることが分かった。【１５１３】
実施例８２：抗体−核酸コンジュゲートの合成
（８２−１−１）核酸へのリンカーの導入
【化２１０】
2019240287.tif 000212
【１５１４】
ｓｉＲＮＡ（ｐＨ７．４  ＰＢＳバッファー）に対して、３−（２，５−ジオキソピロール−１−イル）プロパン酸（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）（２００ｍＭ、ＤＭＦに溶解）を１００等量加えた。４℃にて２０時間静置後、ＮＡＰ−５  Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて精製した。【１５１５】
以下の配列のｓｉＲＮＡを使用した。
センス鎖：５’−６−ＦＡＭ−Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）ＡＧＣ（Ｍ）ＡＡＡＵ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）ＡＵ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）ＧＵ（Ｍ）ＧＵ（Ｍ）−Ｎ（６）（配列番号９３）
アンチセンス鎖：５’−ｐ−ＡＣ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）ＧＡＵ（Ｆ）ＧＧＡＡＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＧＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）ＵＵ（配列番号９４）
・ｐ：Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ、（Ｆ）：２’−Ｆｌｕｏｒｏ、（Ｍ）：２’−Ｏ−Ｍｅ（ｍｅｔｈｙｌ）、Ｎ（６）：ａｍｉｎｏ  Ｃ６  ｌｉｎｋｅｒを３’末端に付加【１５１６】
（８２−１−２）トラスツズマブ・チオール導入体−核酸コンジュゲートの合成
【化２１１】
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【１５１７】
（８１−７）で得られたトラスツズマブ・チオール導入体（２０ｍＭ  ＰＢＳバッファー、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）に対して、（２１０−１−１）で得たリンカー導入ｓｉＲＮＡ
を１０等量加え、４℃にて４０時間静置した。混合液をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５ｍＬ３ｋＤａ（メルクミリポア社製）を用いて精製した後、ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒ（ＧＥヘルスケア社製）を用いてさらに精製した。精製したコンジュゲートはＳＤＳ−ＰＡＧにより分析した。【１５１８】
ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒ（ＧＥヘルスケア社製）による精製は下記の条件で行った。
カラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅ１０／３００ＧＬ（ＧＥヘルスケア社製）
バッファー：ｐＨ７．４のＰＢＳバッファー
流速：０．４ｍｌ／ｍｉｎ
検出器：２１５及び２８０ｎｍの波長で検出した。【１５１９】
（８２−２）抗体−核酸コンジュゲートのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析
（８２−１−２）で合成したコンジュゲートをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。スタンダードとしてプレシジョンＰｌｕｓプロテインＴＭプレステインドスタンダード（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用い、染色はバレットＣＢＢステイン  ワン（ナカライテスク社製）で行った（図９８）。【１５２０】
その結果、ＳＤＳ−ＰＡＧＥより、非改変抗体に対し、位置選択的に核酸をコンジュゲートできることが分かった。すなわち、Ｐａｙｌｏａｄとして、低分子に限らず、核酸も導入可能であることが示された。【１５２１】
実施例８３：トラスツズマブ・チオール導入体へのアジド基の導入とクリック反応を利用したＡＤＣ  ｍｉｍｉｃの合成
（８３−１）トラスツズマブ・チオール導入体へのアジド基の導入とＡＤＣ  ｍｉｍｉｃの合成
（８３−１−１）トラスツズマブ・チオール導入体へのアジド基の導入
（８１−７）で得られたトラスツズマブ・チオール導入体（２０ｍＭ  ＰＢＳバッファー、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）に対して、Ｎ−［２−［２−（２−アジドエトキシ）エトキシ］エチル］−２−ヨード−アセトアミド（５０ｍＭ、ＤＭＦに溶解）を５０等量加えた。３７℃にて３時間静置後、２０ｍＭ  ＰＢＳバッファーに置換し、トラスツズマブ・アジド導入体を得た。【１５２２】
（８３−１−２）トラスツズマブ・アジド導入体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（８３−１−１）で生成したトラスツズマブ・アジド導入体に７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブ・チオール導入体は５０６８２、５０８４４に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にクリック反応生成物が導入された５０８９５、５１０５７および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された（図９９）。【１５２３】
（８３−１−３）トラスツズマブ・アジド導入体のＡＤＣ  ｍｉｍｉｃへの変換
（８３−１−１）で得られたトラスツズマブ・アジド導入体（２０ｍＭ  ＰＢＳバッファー、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）に、ジベンゾシクロオクチン酸（ＤＢＣＯ−Ａｃｉｄ、１０ｍＭ、ＤＭＦに溶解）を１０等量加えてクリック反応を行い、ＡＤＣ  ｍｉｍｉｃを得た。【１５２４】
（８３−１−４）ＡＤＣ  ｍｉｍｉｃの還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（８３−１−３）で生成したＡＤＣ  ｍｉｍｉｃに７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブ・アジド導入体は５０８９６、５１０５８に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にクリック反応生成物が導入された５１２１６、５１３７８および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された（図１００）。【１５２５】
その結果、トラスツズマブ・チオール導入体とＰａｙｌｏａｄの間にリンカーを挿入してもＡＤＣ  ｍｉｍｉｃが合成できることが示された。【１５２６】
［実施例８４：切断性リンカーの合成とＩｇＧ１  Ｆｃ結合性ペプチドとの連結］
（８４）含アジド切断性リンカーの合成とペプチドとの連結
（８４−１）含アジドチオエステルリンカーの合成とペプチドとの連結
（８４−１−１）含アジドチオエステルリンカーの合成
【化２１２】
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【１５２７】
５−アジドペンタン酸（２００ｍｇ，１．４０ｍｍｏｌ）をＴＨＦ溶媒（７．０ｍＬ）に溶解させ、０℃にてクロロギ酸イソブチル（０．２２０ｍＬ，１．６８ｍｍｏｌ）、Ｎ−メチルモルホリン（０．２３０ｍＬ，２．１０ｍｍｏｌ）を加え３０分攪拌し、５−アジドペンタン酸の混合酸無水物を調整した。（３Ｓ）−３−アミノ−４−ｔｅｒｔ−ブトキシ−４−オキソ−ブタン酸（０．３９７ｍｇ、２．１０ｍｍｏｌ）を１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（７．０ｍＬ）に溶解させ、混合液を前述の５−アジドペンタン酸の混合酸無水物のＴＨＦ溶液に室温にて滴下した。室温にて１６時間攪拌した後、６Ｍ塩酸水溶液を加え、系内のｐＨを３．０に調整した。調整後、酢酸エチルによる分液抽出を行い、有機相を減圧下濃縮することにより得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン：メタノール＝１０：１）にて精製した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することにより、（３Ｓ）−３−（５−アジドペンタノイルアミノ）−４−ｔｅｒｔ−ブトキシ−４−オキソ−ブタン酸（０．３８０ｇ，１．２１ｍｍｏｌ）を得た。【１５２８】
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：３３７［Ｍ＋Ｎａ］＋
【化２１３】
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【１５２９】
（３Ｓ）−３−（５−アジドペンタノイルアミノ）−４−ｔｅｒｔ−ブトキシ−４−オキソ−ブタン酸（０．３８０ｇ，１．２１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン６．０ｍＬに溶解させ、オキサリルクロライド（０．１２５ｍＬ，１．４５ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（４．６８μＬ、０．０６０５ｍｍｏｌ）を氷冷下滴下し、３０分間攪拌した。３０分後、ピリジン（０．１９６ｍＬ、２．４２ｍｍｏｌ）及びチオフェノール（０．１８５ｍＬ，１．８１ｍｍｏｌ）とジメチルアミノピリジン（１４．８ｍｇ、０．１２１ｍｍｏｌ）の混合液を滴下し、室温にて２時間攪拌した。２時間後、０．１Ｍ塩酸水溶液６．０ｍＬを加え、ジクロロメタンによる分液抽出を行った後、有機層を減圧濃縮し、カラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）にて精製した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することにより得られた残渣にジクロロメタン３．０ｍＬ及びトリフルオロ酢酸３．０ｍＬを加え、室温下１時間撹拌した。１時間後、反応液を減圧濃縮することで（２Ｓ）−２−（５−アジドペンタノイルアミノ）−４−オキソ−４−フェニルスルファニル−ブタン酸（１５０ｍｇ，０．４２８ｍｍｏｌ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：３５１［Ｍ＋Ｈ］＋
【化２１４】
2019240287.tif 000216
【１５３０】
（２Ｓ）−２−（５−アジドペンタノイルアミノ）−４−オキソ−４−フェニルスルファニル−ブタン酸（０．１５０ｇ，０．４２８ｍｍｏｌ）をＴＨＦ溶媒（４．３ｍＬ）に溶解させ、０℃にてクロロギ酸イソブチル（  ０．０６７４ｍＬ，０．５１４ｍｍｏｌ）、Ｎ−メチルモルホリン（０．０７０６ｍＬ，０．６４２ｍｍｏｌ）を加え３０分攪拌し、混合酸無水物を調整した。ピリジン（０．０６９５ｍＬ、０．８５７ｍｍｏｌ）及び３−スルファニルプロパン酸  ｔｅｒｔ−ブチル（０．１３９ｍＬ，０．８５７ｍｍｏｌ）とジメチルアミノピリジン（５．２０ｍｇ、０．０４２８ｍｍｏｌ）をＴＨＦ溶媒（１．０ｍＬ）に溶解させ、混合液を前述の混合酸無水物のＴＨＦ溶液に室温にて滴下した。室温にて３時間攪拌した後、０．１Ｍ塩酸水溶液４．３ｍＬを加え、酢酸エチルによる分液抽出を行った後、有機層を減圧濃縮し、カラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）にて精製した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することにより得られた残渣にジクロロメタン２．０ｍＬ及びトリフルオロ酢酸２．０ｍＬを加え、室温下１時間撹拌した。１時間後、反応液を減圧濃縮することで３−［（２Ｓ）−２−（５−アジドペンタノイルアミノ）−４−オキソ−４−フェニルスルファニル−ブタノイル］スルファニルプロパン酸（４３．８ｍｇ，０．１００ｍｍｏｌ）を得た。【１５３１】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４３９［Ｍ＋Ｈ］＋【１５３２】
（８４−１−２）チオエステルリンカーとペプチドの連結
【化２１５】
2019240287.tif 000217
上記アミノ酸配列は、配列番号５である。【１５３３】
（８４−１）で合成したＡｃ−ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ−ＮＨ２（配列番号５）（９．８ｍｇ，４．７μｍｏｌ、ただし、４番目と１４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している。）をＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド１ｍＬに溶解し、３−［（２Ｓ）−２−（５−アジドペンタノイルアミノ）−４−オキソ−４−フェニルスルファニル−ブタノイル］スルファニルプロパン酸（３０．９ｍｇ，０．０７０４ｍｍｏｌ），ＷＳＣ・ＨＣｌ（１３．５ｍｇ，０．０７０４ｍｍｏｌ）を加えた。室温で３時間攪拌した後、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液を加え逆相分取クロマトグラフィーにより溶出した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルのみ除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチド−リンカー連結物−チオフェノール活性化体（３．７６ｍｇ，１．５０μｍｏｌ）を得た。【１５３４】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２  １２５５［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｚ＝３  ８３７［Ｍ＋３Ｈ］３＋【１５３５】
（８４−２）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（８４−１）で合成したペプチド−リンカー連結物−チオフェノール活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し５．０１ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）７０７μｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ５．５）２２０μＬに溶解させ、５．０１ｍＭのペプチド試薬を１９．１μＬ（抗体に対して１０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液を１００ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ２．９）に置換して反応を停止させ、さらに２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。【１５３６】
（８４−３）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（８４−２）で生成した抗体・ペプチド複合体に７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９４、５０７５６に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にペプチド−リンカー連結物が導入された５２９９６、５３１５８および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された（図１０１）。【１５３７】
（８４−４）抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（８４−２）で生成した抗体・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【１５３８】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ原料
ｂ：トラスツズマブ＋ペプチドアジドリンカー連結物−ＮＨＳ活性化体１０等量；【１５３９】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １１．２７６５分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図１０２）。【１５４０】
（８４−５）トラスツズマブ・ペプチド複合体のリンカー切断
（８４−２）で得られたトラスツズマブ・ペプチド複合体（２０ｍＭ  ＰＢＳバッファー）をＡｍｉｃｏｎ１０Ｋにより、０．５Ｍヒドロキシルアミン、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ６．０）溶液へと置換し、室温で２時間静置した。２時間後、２０ｍＭ  ＰＢＳバッファー、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）へと置換し、トラスツズマブ・チオール導入体を得た。【１５４１】
（８４−６）トラスツズマブ・アジド導入体の特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（８４−５）で生成したトラスツズマブ・チオール導入体に７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９４、５０７５６に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にチオプロピオニル基が導入された５０８５０、５１０１２および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された（図１０３）。【１５４２】
（８４−７）トラスツズマブ・アジド導入体の特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（８４−５）で生成した抗体・アジド導入体と原料の抗体・ペプチド複合体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【１５４３】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ・ペプチド複合体
ｂ：トラスツズマブ・アジド導入体；【１５４４】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  ９．８５８８分はアジドが２個導入された化合物であると考えられる（図１０４）。【１５４５】
（８４−８）Ｏｎｅ−ｐｏｔ法によるトラスツズマブ・アジド導入体の合成
（８４−１）で合成したペプチド−リンカー連結物−チオフェノール活性化体をＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．１ｍＭとした。抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）１．２９ｍｇを６０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ５．５）１２３．８μＬに溶解させ、２１．１ｍＭのペプチド試薬を１０．８μＬ（抗体に対して１５等量）加えて、室温で１時間攪拌した。その後、０．５Ｍヒドロキシルアミン、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ５．５）溶液を酢酸ナトリウムと同量添加し、室温で２時間静置した。２時間後、２０ｍＭ  ＰＢＳバッファー、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）へと置換し、トラスツズマブ・アジド導入体を得た。【１５４６】
（８４−９）トラスツズマブ・アジド導入体のトリプシン処理
（８４−８）で得られたトラスツズマブ・アジド導入体を、上記（８１−１０）と同様に処理し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定を実施した。【１５４７】
（８４−１０）トリプシン消化物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定条件
分析装置、ＨＰＬＣ分析条件、質量分析計分析条件は、上記（８１−１１）と同様である。【１５４８】
（８４−１１）トラスツズマブの修飾部位の解析条件
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定結果に対する修飾部位解析については、Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓの設定を除き、上記（８１−１２）と同様である。Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓについては、メチオニン残基の酸化（＋１５．９９５Ｄａ）およびリジン残基への修飾体（アジド導入体（＋２５５．０９７Ｄａ）、アミン導入体（＋２２９．１０６）、アジドカルボン酸導入体（＋２４０．０８６）、アミンカルボン酸導入体（＋２１４．０９５））を設定した。さらに、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＣｏｎｆｉｄｅｎｃｅがＨｉｇｈのもののみとなるようフィルターをかけた。【１５４９】
（８４−１２）トラスツズマブのＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる修飾部位の解析結果
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた解析の結果、トラスツズマブのトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位（アジドカルボン酸導入体（＋２４０．０８６））を含むアミノ酸３３残基からなるペプチド、ＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号６）のペプチドフラグメントのＭＳスペクトル（実測値：ｍ／ｚ  １３００．９９２４１、理論値：１３００．９９１７３、３価）が観測され（図１０５）、ＣＩＤスペクトルより重鎖のＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおける２４６位もしくは２４８位のリジン残基の修飾を示す、１価のｙ１２に相当するｍ／ｚ  １６２２．９２（理論値：１６２２．８７）のプロダクトイオンが確認された（図１０６−１）。また、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒでの解析により、２４６位もしくは２４８位のリジン残基への修飾が高選択的に起こっていることが示された（図１０６−２）。【１５５０】
この結果より、（８４−８）では抗体上、重鎖上ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にコンジュゲーションが進行していることが分かった。【１５５１】
実施例８５：トラスツズマブ・アジド導入体へのクリック反応を利用したＡＤＣ  ｍｉｍｉｃの合成
（８５−１）トラスツズマブ・アジド導入体への低分子導入
（８４−５）で得られたトラスツズマブ・アジド導入体（２０ｍＭ  ＰＢＳバッファー、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）に対して、ジベンゾシクロオクチン酸（ＤＢＣＯ−Ａｃｉｄ、１０ｍＭ、ＤＭＦに溶解）を１０等量加えてクリック反応を行い、ＡＤＣ  ｍｉｍｉｃを得た。【１５５２】
（８５−２）ＡＤＣ  ｍｉｍｉｃの還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（８５−１）で生成したＡＤＣ  ｍｉｍｉｃに７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブ・アジド導入体は５０８５０、５１０１２に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にクリック反応生成物が導入された５１１６９、５１３３０および、原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された（図１０７）。【１５５３】
（８５−３）トラスツズマブ・アジド導入体の特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（８５−１）で生成した抗体・アジド導入体と原料の抗体・ペプチド複合体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【１５５４】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：トラスツズマブ・アジド導入体
ｂ：ＡＤＣ  ｍｉｍｉｃ；【１５５５】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １０．３２１６分は低分子が２個導入された化合物であると考えられる（図１０８）。【１５５６】
（８５−４）ＡＤＣ  ｍｉｍｉｃのトリプシン処理
（８５−１）で得られたＡＤＣ  ｍｉｍｉｃを、上記（８１−１０）と同様に処理し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定を実施した。【１５５７】
（８５−５）トラスツズマブのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定条件
分析装置、ＨＰＬＣ分析条件、質量分析計分析条件は、上記（８１−１１）と同様である。【１５５８】
（８５−６）トラスツズマブの修飾部位の解析条件
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定結果に対する修飾部位解析については、Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓの設定を除き、上記（８１−１２）と同様である。Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓについては、メチオニン残基の酸化（＋１５．９９５Ｄａ）およびリジン残基への修飾体（ＤＢＣＯ−Ａｃｉｄ導入体（＋５７４．２１８）、ＤＢＣＯ−Ａｃｉｄカルボン酸導入体（＋５５９．２０７）、アジド導入体（＋２５５．０９７）、アジドカルボン酸導入体（＋２４０．０８６））を設定した。さらに、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＣｏｎｆｉｄｅｎｃｅがＨｉｇｈのもののみとなるようフィルターをかけた。【１５５９】
（８５−７）トラスツズマブのＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる修飾部位の解析結果
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた解析の結果、トラスツズマブのトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位（ＤＢＣＯ−Ａｃｉｄカルボン酸導入体（＋５５９．２０７））を含むアミノ酸３３残基からなるペプチド、ＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号６）のペプチドフラグメントのＭＳスペクトル（実測値：ｍ／ｚ  １０５５．７７６３１、理論値：１０５５．７７６００、４価）が観測され（図１０９）、ＣＩＤスペクトルより重鎖のＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおける２４６位もしくは２４８位のリジン残基の修飾を示す、２価のｙ１２に相当するｍ／ｚ  ９７１．７１（理論値：９７１．５０）のプロダクトイオンが確認された（図１１０−１）。また、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒでの解析により、２４６位もしくは２４８位のリジン残基への修飾が高選択的に起こっていることが示された（図１１０−２）。【１５６０】
この結果より、（８５−１）では抗体上、重鎖上ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にコンジュゲーションが進行していることが分かった。【１５６１】
実施例８６：  抗ＴＮＦ−α  ＩｇＧ１抗体アダリムマブの特異的修飾
（８６−１）抗ＴＮＦ−α  ＩｇＧ１抗体アダリムマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（８１−３）で合成したペプチド−リンカー連結物−チオフェノール活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＴＮＦ−α  ＩｇＧ１抗体アダリムマブ（エーザイ）５００μｇを５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）２００μＬに溶解させ、４ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して１０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液を１００ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ２．９）に置換して反応を停止させ、さらに２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のアダリムマブは１４８０８６にピークが観測され、反応物は結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５２６０５にピークが確認された（図１１１）。【１５６２】
（８６−２）抗ＴＮＦ−α  ＩｇＧ１抗体アダリムマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（８６−１）で生成したアダリムマブ・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【１５６３】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：アダリムマブ原料
ｂ：アダリムマブ＋ペプチド−リンカー連結物−チオフェノール活性化体１０等量；【１５６４】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １０．５１３７分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図１１２）。【１５６５】
（８６−３）アダリムマブ・ペプチド複合体のリンカー切断
（８６−２）で得られたアダリムマブ・ペプチド複合体（２０ｍＭ  ＰＢＳバッファー）をＡｍｉｃｏｎ３Ｋにより、０．５Ｍヒドロキシルアミン、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ５．５）溶液へと置換し、室温で２時間静置した。２時間後、２０ｍＭ  ＰＢＳバッファー、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）へと置換し、アダリムマブ・チオール導入体を得た。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のアダリムマブ・ペプチド複合体は１５２６０６にピークが観測され、反応物のアダリムマブ・チオール導入体は１４８２６４にピークが確認された（図１１３）。【１５６６】
（８６−４）アダリムマブ・チオール導入体のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（８６３）で生成したアダリムマブ・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【１５６７】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：アダリムマブ・ペプチド−リンカー連結物
ｂ：アダリムマブ・チオール導入体；【１５６８】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  ８．９０３９分はチオールが２個導入された化合物であると考えられる（図１１４）。【１５６９】
（８６−５）アダリムマブ・チオール導入体への蛍光標識
（８６−３）で得られたアダリムマブ・チオール導入体（２０ｍＭＰＢＳバッファー、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）に対して、フルオレセイン−５−マレイミド（１０ｍＭ、ＤＭＳＯに溶解）を５等量加えた。室温にて１時間静置後、２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換し、アダリムマブ蛍光標識体（ＡＤＣ  ｍｉｍｉｃ）を得た。【１５７０】
（８６−６）アダリムマブ蛍光標識体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（８６−５）で生成したアダリムマブ蛍光標識体（ＡＤＣ  ｍｉｍｉｃ）に７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料、生成物ともに軽鎖は同じピークが観測され、原料のアダリムマブは５０７３０に重鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にフルオレセインが導入された５１１５６ピークが観測された（図１１５）。【１５７１】
実施例８７：  抗ＲＡＮＫＬ  ＩｇＧ２抗体デノスマブの特異的修飾
（８７−１）抗ＲＡＮＫＬ  ＩｇＧ２抗体デノスマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（８１−３）で合成したペプチド−リンカー連結物−チオフェノール活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＲＡＮＫＬ  ＩｇＧ２抗体デノスマブ（第一三共）５００μｇを５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）２００μＬに溶解させ、４ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して１０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液を１００ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ２．９）に置換して反応を停止させ、さらに２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のデノスマブは１４７３５８．９７にピークが観測され、反応物は結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５１８７８．６１にピークが確認された（図１１６）。【１５７２】
（８７−２）抗ＲＡＮＫＬ  ＩｇＧ２抗体デノスマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（８７−１）で生成したデノスマブ・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【１５７３】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：デノスマブ原料
ｂ：デノスマブ＋ペプチド−リンカー連結物−チオフェノール活性化体１０等量；【１５７４】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １０．１３１４分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図１１７）。【１５７５】
（８７−３）デノスマブ・ペプチド複合体のリンカー切断
（８７−２）で得られたデノスマブ・ペプチド複合体（２０ｍＭ  ＰＢＳバッファー）をＡｍｉｃｏｎ３Ｋにより、０．５Ｍヒドロキシルアミン、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ５．５）溶液へと置換し、室温で２時間静置した。２時間後、２０ｍＭ  ＰＢＳバッファー、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）へと置換し、デノスマブ・チオール導入体を得た。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のデノスマブ・ペプチド複合体は１５１８７８にピークが観測され、反応物のデノスマブ・チオール導入体は１４７５３５にピークが確認された（図１１８）。【１５７６】
（８７−４）デノスマブ・チオール導入体のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（８７−３）で生成したデノスマブ・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【１５７７】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：デノスマブ・ペプチド−リンカー連結物
ｂ：デノスマブ・チオール導入体；【１５７８】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  ８．６３６８分はチオールが２個導入された化合物であると考えられる（図１１９）。【１５７９】
（８７−５）デノスマブ・チオール導入体への蛍光標識
（８７−３）で得られたデノスマブ・チオール導入体（２０ｍＭＰＢＳバッファー、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）に対して、フルオレセイン−５−マレイミド（１０ｍＭ、ＤＭＳＯに溶解）を５等量加えた。室温にて１時間静置後、２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換し、デノスマブ蛍光標識体（ＡＤＣ  ｍｉｍｉｃ）を得た。【１５８０】
（８７−６）デノスマブ蛍光標識体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（８７−５）で生成したデノスマブ蛍光標識体（ＡＤＣ  ｍｉｍｉｃ）に７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料、生成物ともに軽鎖は同じピークが観測され、原料のデノスマブは５０２９２に重鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にフルオレセインが導入された５０７１７ピークが観測された（図１２０）。【１５８１】
実施例８８：  抗ＩＬ−４／１３受容体  ＩｇＧ４抗体デュピルマブの特異的修飾
（８８−１）抗ＩＬ−４／１３受容体  ＩｇＧ４抗体デュピルマブの特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（８１−３）で合成したペプチド−リンカー連結物−チオフェノール活性化体はＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２１．６ｍＭとした。抗ＩＬ−４／１３受容体  ＩｇＧ４抗体デュピルマブ（Ｓａｎｏｆｉ・Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）５００μｇを５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）２００μＬに溶解させ、４ｍＭのペプチド試薬を４．７μＬ（抗体に対して１０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液を１００ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ２．９）に置換して反応を停止させ、さらに２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のデュピルマブは１４９７９６にピークが観測され、反応物は結合性ペプチドが二つ導入された生成物が１５４３１５にピークが確認された（図１２１）。【１５８２】
（８８−２）抗ＩＬ−４／１３受容体  ＩｇＧ４抗体デュピルマブの特異的修飾のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（８８−１）で生成したデュピルマブ・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【１５８３】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：デュピルマブ原料
ｂ：デュピルマブ＋ペプチド−リンカー連結物−チオフェノール活性化体１０等量；【１５８４】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １２．５５６９分はペプチドが２個導入された化合物であると考えられる（図１２２）。【１５８５】
（８８−３）デュピルマブ・ペプチド複合体のリンカー切断
（８８−２）で得られたデュピルマブ・ペプチド複合体（２０ｍＭ  ＰＢＳバッファー）をＡｍｉｃｏｎ３Ｋにより、０．５Ｍヒドロキシルアミン、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ５．５）溶液へと置換し、室温で２時間静置した。２時間後、２０ｍＭ  ＰＢＳバッファー、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）へと置換し、デュピルマブ・チオール導入体を得た。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のデュピルマブ・ペプチド複合体は１５４３１５にピークが観測され、反応物のデュピルマブ・チオール導入体は１４９９７５にピークが確認された（図１２３）。【１５８６】
（８８−４）デュピルマブ・チオール導入体のＨＩＣ−ＵＰＬＣ解析
（８８−３）で生成したデュピルマブ・ペプチド複合体と原料の抗体をＨＩＣにより解析した。カラムはＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）４．６ｘ１００ｍｍ  ２．５μｍを使用した。Ａ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，２．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ７．０、Ｂ＿Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＰｉＮａ，ｐＨ７．０にて流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、グラジエントをＡ６０％  Ｂ４０％→Ａ０％  Ｂ１００％，１６ｍｉｎ（データ採取２０ｍｉｎ）、カラム温度は４０℃、サーモスタット温度は４０℃、検出器は２８０ｎｍの波長で検出した。【１５８７】
サンプルについては以下の条件で反応させた。
ａ：デュピルマブ・ペプチド−リンカー連結物
ｂ：デュピルマブ・チオール導入体；【１５８８】
Ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  １１．４９４１分はチオールが２個導入された化合物であると考えられる（図１２４）。【１５８９】
（８８−５）デュピルマブ・チオール導入体への蛍光標識
（８８−３）で得られたデュピルマブ・チオール導入体（２０ｍＭＰＢＳバッファー、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）に対して、フルオレセイン−５−マレイミド（１０ｍＭ、ＤＭＳＯに溶解）を５等量加えた。室温にて１時間静置後、２０ｍＭＰＢＳバッファーに置換し、デュピルマブ蛍光標識体（ＡＤＣ  ｍｉｍｉｃ）を得た。【１５９０】
（８８−６）デュピルマブ蛍光標識体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（８８−５）で生成したデュピルマブ蛍光標識体（ＡＤＣ  ｍｉｍｉｃ）に７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液５μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料、生成物ともに軽鎖は同じピークが観測され、原料のデュピルマブ・チオール導入体は５０９７３に重鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にフルオレセインが導入された５１３９９ピークが観測された（図１２５）。【１５９１】
（まとめ）
以上の結果をまとめると、以下のとおりである。【１５９２】
【表２】
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【１５９３】
【表３】
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【１５９４】
【表４】
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【１５９５】
また、抗体について、２４６位及び／又は２４８位のリジン残基（例、実施例２、６、８１、８４、８５）を始めとする特定のアミノ酸残基の位置選択的な修飾が可能であることが示された。【１５９６】
さらに、下記式（Ｉ）で表される、抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する下記の化合物について、実施例の一部を例に挙げて説明すると以下の表５のとおりである。
Ａ−Ｌ−Ｂ−Ｒ    （Ｉ）
〔式中、
Ａは、抗体に対する親和性物質であり、
Ｌは、切断性部分を含む２価の基である切断性リンカーであり、
Ｂは、（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基、または（ｂ）生体直交性官能基を含まない２価の基であり、
Ｒは、前記抗体に対する反応性基である。〕
Ｌは、（ｉ）切断により生体直交性官能基を反応性基側に生成する能力を有する切断性部分を含む２価の基である切断性リンカー、または（ｉｉ）切断により生体直交性官能基を反応性基側に生成する能力を有しない切断性部分を含む２価の基である切断性リンカーである。【１５９７】
【表５】
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【１５９８】
抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する種々の化合物は、上述のように、抗体に対する親和性物質（Ａ）、切断性部分を含む２価の基である切断性リンカー（Ｌ）、（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基、または（ｂ）生体直交性官能基を含まない２価の基（Ｂ）、抗体に対する反応性基（Ｒ）の種類を適宜変更することにより、周知の有機合成方法にしたがって調製することができる。本発明において調製することができる、抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物のさらなる例と、それにより製造することができる生体直交性官能基を有する抗体との関係は、以下のとおりである。【１５９９】
【表６】
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【１６００】
【表７】
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【１６０１】
【表８】
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【１６０２】
【表９】
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【１６０３】
【表１０】
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【１６０４】
以上より、抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物において、親和性物質の種類、親和性物質と反応性基との間のリンカーの長さ、およびリンカーが導入される親和性物質中の位置等の因子を適宜調節することにより、抗体を位置選択的に修飾できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【１６０５】
本発明は、例えば、位置選択的に修飾された抗体の製造に有用である。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１】
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【図９２】
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【図９３】
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【図９４】
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【図９５】
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【図９６】
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【図９７−１】
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【図９７−２】
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【図９８】
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【図９９】
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【図１００】
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【図１０１】
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【図１０２】
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【図１０３】
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【図１０４】
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【図１０５】
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【図１０６−１】
2019240287.tif 000338
【図１０６−２】
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【図１０７】
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【図１０８】
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【図１０９】
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【図１１０−１】
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【図１１０−２】
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【図１１１】
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【図１１２】
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【図１１３】
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【図１１４】
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【図１１５】
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【図１１６】
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【図１１７】
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【図１１８】
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【図１１９】
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【図１２０】
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【図１２１】
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【図１２２】
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【図１２３】
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【図１２４】
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【図１２５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年12月2日(2020.12.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物またはその塩であって、
前記化合物が、下記式（Ｉ）：
Ａ−Ｌ−Ｂ−Ｒ      （Ｉ）
〔式中、
Ａは、抗体に対する親和性物質であり、
Ｌは、切断性部分を含む２価の基である切断性リンカーであり、
Ｂは、（ａ）生体直交性官能基を含む２価の基、または（ｂ）生体直交性官能基を含まない２価の基であり、
Ｒは、前記抗体に対する反応性基である。〕で表されるものであり、かつ
抗体に対する親和性物質が、
式１−１：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｉ−Ｉ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号５８）
式１−２：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｉ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号５９）
式１−３：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｖ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（볯㲸畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯銈볯㲓猯扵覼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰芽⼼畳㹢볯超裥ꪕ迥隼볯覼戼㹲込볯銈볯骼볯뢼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰邼裢鎼⼼畳㹢볯㲉畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢뷯㲁猯扵銈볯銈볯膽뷯醼裢뢼뷯膽볯銈볯膽뷯鎼裢뢼뷯膽볯銈볯膽뷯閼裢뢼뷯膽볯銈볯銈볯銈볯銈볯銈볯뢼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰邼裢鎼⼼畳㹢볯㲉畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢뷯㲂猯扵袼藩鞈闧랏볯醼볯㲉牢ਾ볥醼裢閼볯袼볯㲸畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯銈볯㲓猯扵覼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰膽⼼畳㹢裢ꎼ裢뢼뷯膽볯銈볯膽뷯銼裢뢼뷯膽볯銈볯膽뷯钼裢뢼뷯膽볯銈볯膽뷯隼裢겼裢겼裢랼裢ꎼ裢袼볯㲸畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯銈볯㲓猯扵覼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰芽⼼畳㹢볯超裥ꪕ迥隼볯覼戼㹲込볯銈볯骼볯뢼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰邼裢鎼⼼畳㹢볯㲉畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢뷯㲁猯扵銈볯銈볯膽뷯醼裢뢼뷯膽볯銈볯膽뷯鎼裢뢼뷯膽볯銈볯膽뷯閼裢뢼뷯膽볯銈볯銈볯銈볯銈볯銈볯뢼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰邼裢鎼⼼畳㹢볯㲉畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢뷯㲂猯扵袼藩鞈闧랏볯鎼볯㲉牢ਾ볥醼裢鞼볯袼볯㲸畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯銈볯㲓猯扵覼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰膽⼼畳㹢裢ꎼ裢뢼뷯膽볯銈볯膽뷯銼裢뢼뷯膽볯銈볯膽뷯钼裢뢼뷯膽볯銈볯膽뷯隼裢겼裢뚼裢ꚼ裢ꎼ裢袼볯㲸畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯銈볯㲓猯扵覼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰芽⼼畳㹢볯超裥ꪕ迥隼볯覼戼㹲込볯銈볯骼볯뢼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰邼裢鎼⼼畳㹢볯㲉畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢뷯㲁猯扵銈볯銈볯膽뷯醼裢뢼뷯膽볯銈볯膽뷯鎼裢뢼뷯膽볯銈볯膽뷯閼裢뢼뷯膽볯銈볯銈볯銈볯銈볯銈볯뢼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰邼裢鎼⼼畳㹢볯㲉畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢뷯㲂猯扵袼藩鞈闧랏볯閼볯㲉牢ਾ볥醼裢馼볯袼볯㲸畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯銈볯㲓猯扵覼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰膽⼼畳㹢裢ꎼ裢뢼뷯膽볯銈볯膽뷯銼裢뢼뷯膽볯銈볯膽뷯钼裢뢼뷯膽볯銈볯膽뷯隼裢ꖼ裢뚼裢랼裢ꎼ裢袼볯㲸畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯銈볯㲓猯扵覼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰芽⼼畳㹢볯超裥ꪕ迥隼볯覼戼㹲钀볥궸胣㲁牢ਾ†볯뢼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰邼裢鎼⼼畳㹢볯㲉畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢뷯㲁猯扵꾁胣ꪁ臣膀臣龁臣醼胣鎼胥꺁胩骶臣讂郥肸臣龁臣낕臣讂믤辄臣ꊂ菣躃藩议鿥袼菣뢂菣议鿥誁苣뎁苣릂菣ꒂ菣议鿥ꖻꓥ覼臣芁苣膀戼㹲 袼볯㲸畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯銈볯㲓猯扵覼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰芽⼼畳㹢臣膀臣鞁胣뺁臣꾁볯鲀볯讀臣ꎀ뛧馁苣貐룤뺁臣꾁闧ꪁ苣뮻蓦꺁苣龃菣뢅껦몟볯ꪃ苣뎃껦몟臣袂臣랂苣蚃苣뎃껦몟믤隤볯ꞁ臣誂胣㲁牢ਾ†볯膽뷯醼臣膀苣ꦃ菣뎃껦몟胣낂菣랂菣议鿥膀菣ꒂ苣뎃껦몟胣鞃菣ꪃ菣议鿥膀苣ꮃ苣讃菣议鿥膀菣ꪃ菣议鿥膀苣릂菣ꦃ苣뎃껦몟胣낂菣뾂菣뎃藩议鿥膀臣龁臣閃苣讃菣ꊂ菣讃菣议鿥ꞁ臣誂胣㲁牢ਾ†볯膽뷯銼臣膀菣궃苣뎃껦몟胣袃菣鞃菣閃苣뎃껦몟胣銃苣膃苣뎃껦몟胣뺁臣꾁菣Ꞃ菣ꮃ苣ꦃ菣뎃껦몟臣芁苣膀戼㹲 뢼뷯膽볯꾁胣銃苣膃苣뎃껦몟胣閃苣讃菣ꊂ菣讃菣议鿥膀菣궃苣뎃껦몟胣袃菣鞃菣閃苣뎃껦몟胣ꊂ菣꺂菣뎃껦몟胣뺁臣꾁苣ꪃ苣뎃껦몟臣芁苣膀戼㹲 뢼뷯膽볯꾁胣ꪃ苣뎃껦몟臣芁苣膀戼㹲 뢼뷯膽볯꾁胣낂菣랂菣议鿥膀苣ꪃ菣议鿥膀苣릂菣ꦃ苣뎃껦몟胣낂菣뾂菣뎃껦몟胣ꊂ苣醃菣꺂菣뢅껦몟胣낂菣뾂菣뎃藩议鿥膀菣Ꞃ菣ꮃ苣ꦃ菣뎃껦몟胣膃菣랂菣议鿥膀菣ꪃ菣袃菣ꆂ菣议鿥膀菣릂菣뢂菣议鿥膀苣것苣讃菣议鿥膀菣ꒂ苣뎃껦몟胣ꊂ菣讃菣议鿥膀菣ꪃ菣议鿥膀苣붂菣ꒂ苣뎃껦몟胣뺁臣꾁苣ꮃ苣讃菣议鿥ꞁ臣誂胣㲁牢ਾ†볯膽뷯隼臣膀苣ꮃ苣龃菣议鿥膀苣ꮃ苣龃菣뢅껦몟胣ꊂ苣醃菣꺂菣议鿥膀苣릂菣ꦃ苣뎃藩议鿥膀菣궃菣뎃껦몟胣낂菣랂菣议鿥膀苣ꮃ苣讃菣议鿥膀菣Ꞃ菣ꮃ苣ꦃ菣뎃껦몟胣뺁臣꾁菣릂菣뢂菣议鿥ꞁ臣讂胣門胣芁苣蒁臣㲯牢ਾ볥銼裢醼볯袼볯㲸畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯銈볯㲓猯扵馀볯㲉畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢뷯㲁猯扵銈볯銈볯膽뷯醼胢銈볯膽뷯銼胢銈볯膽뷯鎼胢銈볯膽뷯钼胢銈볯膽뷯閼胢銈볯膽뷯隼胢銈볯銈볯銈볯銈볯銈볯뢼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰邼裢鎼⼼畳㹢胢覼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰芽⼼畳㹢볯超裥ꪕ迥隼볯覼戼㹲钀볥궸胣㲁牢ਾ†볯뢼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰邼裢鎼⼼畳㹢胢覼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰膽⼼畳㹢臣袂臣袼볯㲸畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯銈볯㲓猯扵馀볯㲉畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢뷯㲂猯扵꾁臣貂臣貂胣趉꣨袼볯㲸畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯銈볯㲓猯扵覼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰膽⼼畳㹢臣袂臣袼볯㲸畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯銈볯㲓猯扵覼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰芽⼼畳㹢臣貐臣ꞁ臣誂胣㲁牢ਾ†볯膽뷯醼胢膀볯膽뷯銼胢膀볯膽뷯鎼胢膀볯膽뷯钼胢膀볯膽뷯閼胢膀볯膽뷯隼胢꾁臣貂臣貂胣趉꣨뢼뷯膽볯膀볯膽뷯銼胣뢼뷯膽볯膀볯膽뷯钼胣뢼뷯膽볯膀볯膽뷯隼臣貐臣ꞁ臣讂胣㲂牢ਾ†뷤鞁胣袼볯㲸畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯銈볯㲓猯扵馀볯㲉畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢뷯㲁猯扵貁볯鲀볯讀臣ꎀ뛧馁苣貐룤뺁臣꾁闧ꪁ苣뮻蓦꺁苣龃菣뢅껦몟胣袼볯㲸畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯銈볯㲓猯扵馀볯㲉畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢뷯㲂猯扵貁볯鲀볯讀臣ꎀ뛧馁苣貐룤뺁臣꾁闧ꪁ苣뮻蓦꺁苣龃菣뢅껦몟胣뢼뷯膽볯馀臣銃苣膃苣뎃껦몟胣讁臣膀볯膽뷯閼胢貁苣ꪃ苣뎃껦몟臣뒠郥銂駩辁胣門臣蒁臣貂臣꺁苣龃菣뢅藩鞈苣ꮐ苣骃菣膃菣ꞁ臣讂胣隌郥ꦉ臣龁臣鶁臣ꦡ胣ં⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀ꯨ花ꃩ銼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉ਾ†볯뢼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰邼裢鎼⼼畳㹢볯㲉畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢뷯㲁猯扵꾁胣ꪁ臣膀苣ꮃ苣讃菣议鿥銈苣ꪃ苣뎃껦몟裢ꊂ苣醃菣꺂菣议鿥膀苣릂菣ꦃ苣뎃藩议鿥膀臣龁臣ꊂ苣醃菣꺂菣议鿥ꞁ臣誂胣㲁牢ਾ†볯뢼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰邼裢鎼⼼畳㹢볯㲉畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢뷯㲂猯扵꾁胣ꪁ臣膀苣것苣讃菣议鿥銈菣궃苣뎃껦몟裢銃苣膃苣뎃껦몟胣뺁臣꾁苣것苣讃菣议鿥ꞁ臣誂胣㲁牢ਾ†볯膽뷯醼臣膀苣ꦃ菣뎃껦몟臣芁苣膀戼㹲 뢼뷯膽볯꾁胣膃菣랂菣议鿥膀菣ꪃ菣袃菣ꆂ菣议鿥膀臣龁臣銃苣膃苣뎃껦몟臣芁苣膀戼㹲 뢼뷯膽볯꾁胣낂菣뾂菣뎃껦몟胣낂菣뾂菣뎃藩议鿥膀苣릂菣ꦃ苣뎃껦몟胣뺁臣꾁苣릂菣ꦃ苣뎃藩议鿥ꞁ臣讂胣讫뇦薠볯風볨꺁賥袐觧뺁臣꾁臣꺁ꇥ芀㰊䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣讫뇦薠볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖 袼볯㲸畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯銈볯㲓猯扵覼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰膽⼼畳㹢臣膀苣ꪃ苣뎃껦몟裢ꊂ苣醃菣꺂菣议鿥膀苣ꪃ苣뎃껦몟胣낂菣랂菣议鿥銈苣ꪃ苣뎃껦몟胣뺁臣꾁苣ꪃ苣뎃껦몟裢낂菣랂菣议鿥銈苣ꪃ苣뎃껦몟臣芁苣膀戼㹲 袼볯㲸畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯銈볯㲓猯扵覼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰芽⼼畳㹢臣膀苣것苣讃菣议鿥銈菣궃苣뎃껦몟胣낂菣랂菣议鿥膀苣ꪃ苣뎃껦몟裢낂菣랂菣议鿥膀臣龁臣낂菣랂菣议鿥銈苣ꪃ苣뎃껦몟裢낂菣랂菣议鿥ꞁ臣誂胣㲁牢ਾ†볯膽뷯醼臣膀苣ꪃ苣뎃껦몟胣궃苣랂菣议鿥膀菣궃菣뎃껦몟胣ꊂ菣꺂菣뎃껦몟胣邃菣뎃껦몟胣ꊂ苣醃菣꺂菣议鿥膀苣ꮃ苣龃菣뢅껦몟胣뺁臣꾁菣Ꞃ菣ꮃ苣ꦃ菣뎃껦몟臣芁苣膀戼㹲 뢼뷯膽볯꾁胣閃苣讃菣ꊂ菣讃菣议鿥ꞁ臣誂胣㲁牢ਾ†볯膽뷯隼臣膀菣궃菣뎃껦몟胣낂菣랂菣议鿥膀苣ꮃ苣讃菣议鿥膀菣Ꞃ菣ꮃ苣ꦃ菣뎃껦몟胣뺁臣꾁菣릂菣뢂菣议鿥ꞁ臣讂胣讫뇦薠볯風볨꺁賥袐觧뺁臣꾁臣꺁ꇥ芀㰊䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣讫뇦薠볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖 鞊뷤ꮁ꿥馁苣ꪦ鋥Ꞁ觧ꪳ臣膀룤風臣覂臣讂뻧袂苣뢁臣貂苣ꊂ菣躃藩超裥銂郥肂菣鞃菣覃臣芁苣膀ꯨ花ꃩ醼胣鎼臣蒁臣貂臣肸ꃩ風볨꺁賥袐觧뺁臣꾁臣꺁ꇥ骼戼㹲袼볯覼†볯Ꞽ볯ꎼ볯림볯ꮼ볯놼볯ꦼ볯ꎼ볯림볯袼藩鞈闧랏볯覼볯㲛牢ਾ볯銼볯₉늼볯꺼볯ꆼ볯ꢼ볯Ꞽ볯ꦼ볯랼볯뒼볯ꢼ볯超裥ꪕ迥颼볯鮼戼㹲袼볯覼†볯Ꞽ볯ꎼ볯림볯ꮼ볯놼볯뚼볯ꎼ볯림볯袼藩鞈闧랏볯覼볯㲛牢ਾ볯钼볯₉늼볯꺼볯ꆼ볯ꢼ볯Ꞽ볯ꆼ볯랼볯뒼볯ꢼ볯超裥ꪕ迥醼볯覼볯㲛牢ਾ볯閼볯₉늼볯꺼볯ꆼ볯ꢼ볯Ꞽ볯겼볯랼볯뒼볯ꢼ볯超裥ꪕ迥醼볯覼볯㲛牢ਾ볯隼볯₉늼볯꺼볯ꆼ볯ꢼ볯Ꞽ볯겼볯랼볯뒼볯ꢼ볯超裥ꪕ迥醼볯覼볯㲛牢ਾ볯鞼볯₉††꒼볯ꆼ볯ꢼ볯Ꞽ볯ꦼ볯랼볯뒼††볯超裥ꪕ迥醼볯覼볯㲛牢ਾ볯颼볯₉††꒼볯ꆼ볯ꢼ볯Ꞽ볯뚼볯랼볯뒼††볯超裥ꪕ迥醼볯覼볯㲛牢ਾ볯馼볯₉††꒼볯ꆼ볯ꢼ볯Ꞽ볯ꆼ볯랼볯뒼††볯超裥ꪕ迥醼볯覼볯㲛牢ਾ볯醼볯覼볯Ꞽ볯ꎼ볯림볯ꮼ볯놼볯ꦼ볯ꎼ볯림볯袼藩鞈闧랏볯隼볯鮼戼㹲袼볯醼볯늼볯꺼볯ꆼ볯ꢼ볯꺼볯ꦼ볯랼볯뒼볯ꢼ볯超裥ꪕ迥醼볯覼볯㲛牢ਾ볯醼볯覼볯Ꞽ볯ꎼ볯림볯ꮼ볯놼볯ꦼ볯ꎼ볯림볯袼藩鞈闧랏볯颼볯鮼戼㹲袼볯鎼볯늼볯꺼볯ꆼ볯ꢼ볯놼볯ꦼ볯랼볯뒼볯ꢼ볯超裥ꪕ迥醼볯覼볯㲛牢ਾ볯醼볯覼볯Ꞽ볯ꎼ볯림볯ꮼ볯놼볯ꦼ볯ꎼ볯림볯袼藩鞈闧랏볯邼볯鮼戼㹲袼볯閼볯늼볯꺼볯ꆼ볯ꢼ볯ꚼ볯ꦼ볯랼볯뒼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