(57)【要約】  ＲＮＡ干渉やＡＳＯに基づく標的ＲＮＡの作用抑制剤を提供する。ＲＮＡ干渉剤につき、標的ＲＮＡに対するパッセンジャー鎖及びガイド鎖を備え、  前記パッセンジャー鎖と前記ガイド鎖とが対合した二本鎖ＲＮＡの両端はブラントエンドを構成し、  以下の（ａ）及び（ｂ）；（ａ）前記パッセンジャー鎖の５’末端側及び３’末端側（ｂ）前記ガイド鎖の３’末端側に、以下の式（１）及び（２）で表されるユニットからなる群から選択される１種又は２種以上を備えるようにする。【化２６】2021039598.tif 000031（ただし、Ｘは、酸素原子又は硫黄原子を表す。）【化２７】2021039598.tif 000032（ただし、Ｘは、酸素原子又は硫黄原子を表す。）
2021039598.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ＲＮＡに対するパッセンジャー鎖及びガイド鎖を備え、
前記パッセンジャー鎖と前記ガイド鎖とが対合した二本鎖ＲＮＡの両端はブラントエンドを構成し、
以下の（ａ）及び（ｂ）；
（ａ）前記パッセンジャー鎖の５’末端側及び３’末端側
（ｂ）前記ガイド鎖の３’末端側
に、以下の式（１）及び（２）で表されるユニットからなる群から選択される１個又は２個以上を備える、ＲＮＡ干渉剤。
【化１８】
2021039598.tif 000023
（ただし、Ｘは、酸素原子又は硫黄原子を表す。）
【化１９】
2021039598.tif 000024
（ただし、Ｘは、酸素原子又は硫黄原子を表す。）
【請求項２】
前記（ａ）に式（２）で表されるユニットを備え、
前記（ｂ）に式（１）で表されるユニットを備える、請求項１に記載のＲＮＡ干渉剤。
【請求項３】
前記ユニットは、ＲＮａｓｅ耐性、オンターゲット活性及びオフターゲット抑制活性からなる群から選択される１種又は２種以上を向上できる種類及び個数を備える、請求項１又は２に記載のＲＮＡ干渉剤。
【請求項４】
ＮｅＫ２遺伝子の発現の抑制を目的とする、請求項１〜３のいずれかに記載のＲＮＡ干渉剤。
【請求項５】
標的ＲＮＡに対するパッセンジャー鎖及びガイド鎖を備え、
前記パッセンジャー鎖と前記ガイド鎖とが対合した二本鎖ＲＮＡの両端はブラントエンドを構成し、
以下の（ａ）及び（ｂ）；
（ａ）前記パッセンジャー鎖の５’末端側及び３’末端側
（ｂ）前記ガイド鎖の３’末端側
に、以下の式（１）及び（２）で表されるユニットからなる群から選択される１個又は２個以上を備える、ＲＮＡ二本鎖を用いて、標的遺伝子の発現を抑制する方法。
【請求項６】
標的ＲＮＡに対するアンチセンス鎖を備え、
前記アンチセンス鎖は、
以下の式（１）及び式（２）で表されるユニットからなる群から選択される１個又は２個以上を含み、前記標的ＲＮＡと特異的にハイブリダイズ可能なハイブリダイズ領域と、
を備える、アンチセンス核酸。
【化２０】
2021039598.tif 000025
（ただし、Ｘは、酸素原子又は硫黄原子を表す。）
【化２１】
2021039598.tif 000026
（ただし、Ｘは、酸素原子又は硫黄原子を表す。）
【請求項７】
前記標的ＲＮＡは、ｍｉＲＮＡである、請求項６に記載のアンチセンス核酸。
【請求項８】
標的ＲＮＡに対するアンチセンス鎖と、
前記アンチセンス鎖の両末端に、以下の式（１）及び式（２）で表されるユニットからなる群から選択される１個又は２個以上をそれぞれ含む２つの側鎖と、
を備える、アンチセンス核酸。
【化２２】
2021039598.tif 000027
（ただし、Ｘは、酸素原子又は硫黄原子を表す。）
【化２３】
2021039598.tif 000028
（ただし、Ｘは、酸素原子又は硫黄原子を表す。）
【請求項９】
以下の式（１）及び式（２）で表されるユニットからなる群から選択される１個又は２個以上を含み、標的ＲＮＡと特異的にハイブリダイズ可能なハイブリダイズ領域を有するプローブ鎖と、
を備え、
前記標的ＲＮＡに前記プローブ鎖がハイブリダイズしたことを示すシグナル要素と、
を備える、標的ＲＮＡの検出剤。
【化２４】
2021039598.tif 000029
（ただし、Ｘは、酸素原子又は硫黄原子を表す。）
【化２５】
2021039598.tif 000030
（ただし、Ｘは、酸素原子又は硫黄原子を表す。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(関連出願の相互参照)
本願は、２０１９年８月２３日付けで出願された日本国特許出願である特願２０１９−１５３２３５に基づく優先権を主張するものであり、この出願の全ての内容は、引用により本願に組み込まれるものとする。
本明細書は、ＲＮＡを標的としたより実用的なＲＮＡの作用抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡを標的としたｓｉＲＮＡやアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）などの小分子ＲＮＡを有効成分とするＲＮＡ薬剤の開発が進んでいる。こうしたＲＮＡ薬剤の生体内における安定性やデリバリー性等を高めるために、ＲＮＡに対する種々の化学修飾が試みられている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１９−３０３１２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、ヌクレアーゼ耐性やＲＮＡ薬剤のノックダウン効果に対して実効性のある化学修飾の態様は未だ十分に検討されているとはいえない。ｓｉＲＮＡについては、オフターゲット効果を抑制する必要もある。本明細書は、ＲＮＡ干渉やＡＳＯに基づく標的ＲＮＡの作用抑制剤等としてのより有用性のある化学修飾形態を有するオリゴヌクレオチド及びその利用等を提供する。【０００５】
本発明者らは、オリゴヌクレオチドにおけるリボース／デオキシリボースに替わる骨格要素として、炭素原子数が３個の鎖状部分を有するＬ−トレオニノールにアミド結合を介して塩基アナログを有する構成単位及び／又はセリノールにアミド結合を介して塩基アナログを有する構成単位を用いることとし、当該構成単位を、ｓｉＲＮＡとしての二本鎖オリゴヌクレオチドの３’末端及び５’末端に導入することにより、そのヌクレアーゼ耐性を向上させると同時にオフターゲット効果を抑制し、さらにオンターゲット活性を高めることも見出した。【０００６】
また、本発明者らは、アンチｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＡＭＯ）としての一本鎖ＲＮＡにおいても上記構成単位を有するオリゴヌクレオチドが、高いアンチセンス効果を発揮することも見出した。【０００７】
さらに、本発明者らは、上記構成単位を有するギャップマーとして有用であることも見出した。【０００８】
さらにまた、本発明者らは、上記構成単位等を有するビーコンプローブが、ｍｉＲＮＡの検出に有用であることも見出した。【０００９】
本明細書は、以上の知見に基づき、以下の手段を提供する。【００１０】
［１］標的ＲＮＡに対するパッセンジャー鎖及びガイド鎖を備え、
前記パッセンジャー鎖と前記ガイド鎖とが対合した二本鎖ＲＮＡの両端はブラントエンドを構成し、
以下の（ａ）及び（ｂ）；
（ａ）前記パッセンジャー鎖の５’末端側及び３’末端側
（ｂ）前記ガイド鎖の３’末端側
に、以下の式（１）及び（２）で表されるユニットのいずれかを備える、ＲＮＡ干渉剤。
【化１】
2021039598.tif 000003
（ただし、Ｘは、酸素原子又は硫黄原子を表す。）
【化２】
2021039598.tif 000004
（ただし、Ｘは、酸素原子又は硫黄原子を表す。）
［２］前記（ａ）に式（２）で表されるユニットを備え、
前記（ｂ）に式（１）で表されるユニットを備える、［１］に記載のＲＮＡ干渉剤。
［３］前記ユニットは、ＲＮａｓｅ耐性、オンターゲット活性及びオフターゲット抑制活性からなる群から選択される１種又は２種以上を向上できる種類及び個数を備える、［１］又は［２］に記載のＲＮＡ干渉剤。
［４］ＮｅＫ２遺伝子の発現の抑制を目的とする、［１］〜［３］のいずれかに記載のＲＮＡ干渉剤。
［５］標的ＲＮＡに対するパッセンジャー鎖及びガイド鎖を備え、
前記パッセンジャー鎖と前記ガイド鎖とが対合した二本鎖ＲＮＡの両端はブラントエンドを構成し、
以下の（ａ）及び（ｂ）；
（ａ）前記パッセンジャー鎖の５’末端側及び３’末端側
（ｂ）前記ガイド鎖の３’末端側
に、以下の式（１）及び（２）で表されるユニットからなる群から選択される１個又は２個以上を備える、ＲＮＡ二本鎖を用いて、標的遺伝子の発現を抑制する方法。
【化３】
2021039598.tif 000005
（ただし、Ｘは、酸素原子又は硫黄原子を表す。）
【化４】
2021039598.tif 000006
（ただし、Ｘは、酸素原子又は硫黄原子を表す。）
［６］標的ＲＮＡに対するアンチセンス鎖を備え、
前記アンチセンス鎖は、
以下の式（１）及び式（２）で表されるユニットからなる群から選択される１個又は２個以上を含み、前記標的ＲＮＡと特異的にハイブリダイズ可能なハイブリダイズ領域と、
を備える、アンチセンス核酸。
【化５】
2021039598.tif 000007
（ただし、Ｘは、酸素原子又は硫黄原子を表す。）
【化６】
2021039598.tif 000008
（ただし、Ｘは、酸素原子又は硫黄原子を表す。）
［７］前記標的ＲＮＡは、ｍｉＲＮＡである、［６］に記載のアンチセンス核酸。
［８］標的ＲＮＡに対するアンチセンス鎖と、
前記アンチセンス鎖の両末端に、以下の式（１）及び（２）で表されるユニットからなる群から選択される１個又は２個以上をそれぞれ含む２つの側鎖と、
を備える、アンチセンス核酸。
【化７】
2021039598.tif 000009
（ただし、Ｘは、酸素原子又は硫黄原子を表す。）
【化８】
2021039598.tif 000010
（ただし、Ｘは、酸素原子又は硫黄原子を表す。）
［９］以下の式（１）及び式（２）で表されるユニットから選択される１個又は２個以上を含み、標的ＲＮＡと特異的にハイブリダイズ可能なハイブリダイズ領域を有するプローブ鎖と、
を備え、
前記標的ＲＮＡに前記プローブ鎖がハイブリダイズしたことを示すシグナル要素と、
を備える、標的ＲＮＡの検出剤。
【化９】
2021039598.tif 000011
（ただし、Ｘは、酸素原子又は硫黄原子を表す。）
【化１０】
2021039598.tif 000012
（ただし、Ｘは、酸素原子又は硫黄原子を表す。）
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＲＮＡ干渉剤の一例を示す図である。
【図２】実施例１で作製したＲＮＡ干渉剤のＲＮＡ干渉（ルシフェラーゼアッセイ）の評価結果を示す図である。
【図３】実施例１で作製したＲＮＡ干渉剤のオフターゲット効果の評価結果を示す図である。
【図４】実施例１で作製したＲＮＡ干渉剤のＲＮＡ干渉（ＮｅＫ２タンパク質のウェスタンブロッティング）の評価結果を示す図である。
【図５】実施例１で作製したＲＮＡ干渉剤のＭＴＴアッセイによる細胞増殖能の評価結果を示す図である。
【図６】実施例１で作製したＲＮＡ干渉剤の酵素耐性能の評価結果を示す図である。
【図７】実施例２で作製したギャップマー型アンチセンス核酸を用いたマウス投与実験のプロトコールの概要を示す図である。
【図８】実施例２で作製したギャップマー型アンチセンス核酸によるＳＧＬＴ２のノックダウン活性（ｍＲＮＡ量）の評価結果を示す図である。
【図９】実施例２で作製したギャップマー型アンチセンス核酸によるＳＧＬＴ２のノックダウン活性（タンパク質量）の評価結果を示す図である。
【図１０】実施例２で作製したギャップマー型アンチセンス核酸によるオフターゲット効果の評価結果を示す図である。
【図１１】実施例２で作製したギャップマー型アンチセンス核酸による尿糖排泄増進の評価結果を示す図である。
【図１２】実施例４で作製したモレキュラービーコン型プローブの標的ＲＮＡとのハイブリダイズ時の蛍光スペクトルを示す図である。
【図１３】実施例４で作製したモレキュラービーコン型プローブによる標的ＲＮＡの検量を示す図である。
【図１４】実施例５で作製したギャップマー型アンチセンス核酸を用いたマウス投与実験のプロトコールの概要を示す図である。
【図１５】実施例５で作製したギャップマー型アンチセンス核酸によるＳＧＬＴ２のノックダウン活性（ｍＲＮＡ量）の評価結果を示す図である。
【図１６】実施例５で作製したギャップマー型アンチセンス核酸によるＳＧＬＴ２のノックダウン活性（タンパク質量）の評価結果を示す図である。
【図１７】実施例５で作製したギャップマー型アンチセンス核酸による尿糖排せつ増進の評価結果を示す図である。
【図１８】実施例５で作製したギャップマー型アンチセンス核酸による肝蔵における副作用の評価結果（ＡＳＴ）を示す図である。
【図１９】実施例５で作製したギャップマー型アンチセンス核酸による肝蔵における副作用の評価結果（ＡＬＴ）を示す図である。
【図２０】実施例５で作製したギャップマー型アンチセンス核酸による肝蔵における副作用の評価結果（ＡＬＰ）を示す図である。
【図２１】実施例６で作製したギャップマー型アンチセンス核酸を用いたマウス投与実験のプロトコールの概要を示す図である。
【図２２】実施例６で作製したギャップマー型アンチセンス核酸による腎臓におけるＳＧＬＴ２のｍＲＮＡ量（０Ｗ）の評価結果を示す図である。
【図２３】実施例６で作製したギャップマー型アンチセンス核酸による腎臓におけるＳＧＬＴ２のｍＲＮＡ量（１Ｗ）の評価結果を示す図である。
【図２４】実施例６で作製したギャップマー型アンチセンス核酸による腎臓におけるＳＧＬＴ２のｍＲＮＡ量（２Ｗ）の評価結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書の開示は、ＲＮＡを標的としたより実用的なＲＮＡの作用抑制剤に関する。本明細書に開示されるＲＮＡ干渉剤によれば、ヌクレアーゼ耐性とオンターゲット活性の向上と同時にオフターゲット効果を抑制するという、実用性に優れるＲＮＡ干渉剤を提供できる。
【００１３】
また、本明細書に開示されるＡＳＯ剤によれば、例えば、ｍｉＲＮＡを標的ＲＮＡとするＡＳＯであるＡＭＯやギャップマーの実用性の向上に貢献できる。
【００１４】
また、本明細書に開示される標的ＲＮＡの検出剤によれば、標的のＲＮＡを検出することに関しての実用性の向上に貢献できる。
【００１５】
以下、本開示の代表的かつ非限定的な具体例について、適宜図面を参照して詳細に説明する。この詳細な説明は、本開示の好ましい例を実施するための詳細を当業者に示すことを単純に意図しており、本開示の範囲を限定することを意図したものではない。また、以下に開示される追加的な特徴ならびに開示は、さらに改善されたＲＮＡ作用抑制剤及びその利用を提供するために、他の特徴や開示とは別に、又は共に用いることができる。
【００１６】
また、以下の詳細な説明で開示される特徴や工程の組み合わせは、最も広い意味において本開示を実施する際に必須のものではなく、特に本開示の代表的な具体例を説明するためにのみ記載されるものである。さらに、上記及び下記の代表的な具体例の様々な特徴、ならびに、独立及び従属クレームに記載されるものの様々な特徴は、本開示の追加的かつ有用な実施形態を提供するにあたって、ここに記載される具体例のとおりに、あるいは列挙された順番のとおりに組合せなければならないものではない。
【００１７】
本明細書及び／又はクレームに記載された全ての特徴は、実施例及び／又はクレームに記載された特徴の構成とは別に、出願当初の開示ならびにクレームされた特定事項に対する限定として、個別に、かつ互いに独立して開示されることを意図するものである。さらに、全ての数値範囲及びグループ又は集団に関する記載は、出願当初の開示ならびにクレームされた特定事項に対する限定として、それらの中間の構成を開示する意図を持ってなされている。
【００１８】
以下、本明細書の開示について詳細に説明する。
【００１９】
（ＲＮＡ干渉剤）
本明細書に開示されるＲＮＡ干渉剤（以下、単に、本ＲＮＡ干渉剤ともいう。）は、標的ＲＮＡに対するパッセンジャー鎖及びガイド鎖を備えており、これらのハイブリダイズによる二本鎖ＲＮＡの両末端は、ブラントエンドを構成することができる。本剤としては、例えば、図１に示す構造を採用することができる。図１において、各サークルは、ヌクレオチドを示し、濃色のサークルは、特に、３’末端側及び５’末端側として言及されるヌクレオチドである。
【００２０】
本ＲＮＡ干渉剤の標的ＲＮＡは、特に限定されないで、ＲＮＡ干渉によりその作用を抑制されうるＲＮＡであればよい。典型的には、ｍＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどのノンコーディングＲＮＡ等が挙げられる。標的ＲＮＡとの認識部位の長さも特に限定されないが、例えば、１５ｍｅｒ〜２５ｍｅｒ程度とすることができる。なお、パッセンジャー鎖の５’末端及び３’末端並びにガイド鎖の３’末端は水酸基であり、ガイド鎖の５’末端はリン酸基又は水酸基となる。
【００２１】
標的ＲＮＡとしては、例えば、ガンや種々の遺伝子疾患の原因遺伝子又は当該遺伝子の発現制御に関連する遺伝子のほか各種の領域を適宜選択することができる。例えば、ガンの治療標的となる遺伝子として、膵臓ガンに関連するＮｅＫ２遺伝子が挙げられる。
【００２２】
（パッセンジャー鎖）
本ＲＮＡ干渉剤のパッセンジャー鎖は、標的ＲＮＡに対して概して同一の塩基配列、すなわち、センスストランド（ＳＳ）を構成することができる。パッセンジャー鎖の鎖長は、特に限定するものではないが、例えば、１７ｍｅｒ〜２７ｍｅｒ程度の、標的ＲＮＡに応じた鎖長を備えることができる。パッセンジャー鎖の鎖長は、また例えば、１８ｍｅｒ〜２５ｍｅｒであり、また例えば、１９ｍｅｒ〜２４ｍｅｒであり、また例えば、２０ｍｅｒ〜２３ｍｅｒである。ガイド鎖とハイブリダイズしてブラントエンドを構成する場合には、ガイド鎖長と同一とすることができる。
【００２３】
（パッセンジャー鎖の３’末端側）
パッセンジャー鎖の３’末端側の塩基配列は、典型的には、ＴＴ（チミン−チミン）など、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）及びシトシン（Ｃ）などのピリミジン塩基若しくはその誘導体を塩基として備えるが、これに限定するものではなく、ＲＮＡ干渉剤として機能する範囲であれば、他の種類の塩基又は修飾塩基を適宜組み合わせることもできる。本ＲＮＡ干渉剤が、パッセンジャー鎖の３’末端においてブラントエンドとなる場合には、ガイド鎖の５’末端側の塩基配列との相補性が考慮される。なお、ガイド鎖の５’末端側の塩基配列については、後段で説明する。
【００２４】
パッセンジャー鎖における３’末端側の骨格部分としては、例えば、以下の式（１）又は式（２）で表されるユニット（以下、双方のユニットについてまとめて言及するときには、式（１）等のユニットという。）からなる群から選択される１個又は２個以上備えることができる。
【００２５】
【化１１】
2021039598.tif 000013
【化１２】
2021039598.tif 000014
【００２６】
式（１）及び式（２）における、Ｂａｓｅ（塩基）は、適宜、公知の天然又は人工的な種々の塩基を備えることができる。また、式（１）及び式（２）におけるＸが酸素原子のとき、ホスホジエステル結合により３’末端側と結合し、Ｘがイオウ原子のとき、ホスホロチオエート結合により３’末端側と結合する。
【００２７】
パッセンジャー鎖の３'末端側においては、式（１）等で表されるユニットを例えば、１個〜４個、また例えば、１個〜３個、また例えば、１個〜２個、また例えば、２個備えることができる。当該３’末端側に備えられる２個以上のユニットは、単一種類のユニット、すなわち、全てが式（１）又は式（２）で表されるユニットであってもよいが、式（１）及び式（２）で表されるユニットの組合せであってもよいし、式（１）又は式（２）で表されるユニットと、天然のヌクレオチドや他のヌクレオシド誘導体との組合せであってもよい。
【００２８】
パッセンジャー鎖の３’末端側においては、その端末において１個の式（１）等で表されるユニットを備えることができる。また、２個以上の式（１）等で表されるユニットをそなえるときには、当該末端のユニットに連続して５’末端側に、（１）等で表されるユニットを１個又は２個程度備えることができる。
【００２９】
（パッセンジャー鎖の５’末端側）
パッセンジャー鎖の５’末端側の塩基配列は、特に限定するものではないが、本ＲＮＡ干渉剤がパッセンジャー鎖の５’末端においてブラントエンドを構成する場合には、ガイド鎖の３’末端側の塩基配列との相補性が考慮される。ガイド鎖の３’末端側の塩基配列については、後段で説明する。
【００３０】
パッセンジャー鎖の５’末端側の骨格部分としては、式（１）等で表されるユニットを１個又は２個以上備えることができる。当該５'末端側においては、式（１）等で表されるユニットを例えば、１個〜４個、また例えば、１個〜３個、また例えば、１個〜２個、また例えば、２個備えることができる。当該５’末端側に備えられる２個以上のユニットは、当該５’末端側においては、単一種類のユニット、すなわち、全てが式（１）又は式（２）で表されるユニットであってもよいが、式（１）及び式（２）で表されるユニットの組合せであってもよいし、式（１）又は式（２）で表されるユニットと、天然のヌクレオチドや他のヌクレオシド誘導体との組合せであってもよい。
【００３１】
パッセンジャー鎖の５’末端側においては、その端末において１個の式（１）等で表されるユニットを備えることができる。また、２個以上の式（１）等で表されるユニットをそなえるときには、当該末端のユニットに連続して３’末端側に、（１）等で表されるユニットを１個又は２個程度備えることができる。
【００３２】
（ガイド鎖）
本ＲＮＡ干渉剤のガイド鎖は、標的ＲＮＡとハイブリダイズ可能に、概して、標的ＲＮＡの塩基配列に対して相補的な塩基配列、すなわち、アンチセンスストランド（ＡＳ）を構成することができる。ガイド鎖の鎖長は、特に限定するものではないが、例えば、１７ｍｅｒ〜２７ｍｅｒ程度の、標的ＲＮＡに応じた鎖長を備えることができる。ガイド鎖の鎖長は、また例えば、１８ｍｅｒ〜２５ｍｅｒであり、また例えば、１９ｍｅｒ〜２４ｍｅｒであり、また例えば、２０ｍｅｒ〜２３ｍｅｒである。
【００３３】
（ガイド鎖の３’末端側）
ガイド鎖の３’末端側の塩基配列は、典型的には、ＴＴ（チミン−チミン）など、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）及びシトシン（Ｃ）などのピリミジン塩基若しくはその誘導体を備えることができるが、ＲＮＡ干渉剤として機能する範囲であって、他の種類の塩基又は修飾塩基を適宜組み合わせることもできる。
【００３４】
ガイド鎖の３’末端側の塩基配列は、標的とするｍＲＮＡに相補的な配列とすることができる。その結果、例えば、塩基としては、チミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）若しくはその誘導体を有するように構成される場合がある。ガイド鎖の３’末端側では、パッセンジャー鎖の５’末端側との間で、塩基対としてＴＡ、ＵＡ等の天然型塩基対やそれに類する塩基対が形成されるようにすることもできる。例えば、ガイド鎖の３’末端側には、Ｔ又はＵを備えることができる。より具体的には、例えば、ガイド鎖の３’末端にＴを備えることができ、さらに、その５’末端側にＴを備えたり（ＴＴ、ただし、３’末端から２塩基を示す。）、同様にＵを備えたり(ＴＵ、ただし、３’末端から２塩基を示す。）することができる。
【００３５】
本ＲＮＡ干渉剤のガイド鎖における３’末端側における骨格部分としては、例えば、式（１）等で表されるユニットからなる群から選択される１個又は２個以上を備えることができる。ガイド鎖の３'末端においては、式（１）等で表されるユニットを例えば、１個〜４個、また例えば、１個〜３個、また例えば、１個〜２個、また例えば、２個備えることができる。当該３’末端に備えられる２個以上のユニットは、単一種類のユニット、すなわち、全てが式（１）又は式（２）で表されるユニットであってもよいが、式（１）及び式（２）で表されるユニットの組合せであってもよいし、式（１）又は式（２）で表されるユニットと、天然のヌクレオチドや他のヌクレオシド誘導体との組合せであってもよい。
【００３６】
ガイド鎖の３’末端側においては、その端末において１個の式（１）等で表されるユニットからなる群から選択される１個又は２個以上を備えることができる。また、２個以上の式（１）等で表されるユニットをそなえるときには、当該末端のユニットに連続して５’末端側に、（１）等で表されるユニットを１個又は２個程度備えることができる。
【００３７】
（ガイド鎖の５’末端側）
ガイド鎖の５’末端側の塩基配列は、特に限定するものではなく、ＲＮＡ干渉剤として機能する範囲であって、他の種類の塩基又は修飾塩基を適宜組み合わせることもできる。
【００３８】
ガイド鎖の５’末端側の塩基配列は、例えば、塩基としては、シトシン（Ｃ）又はウラシル（Ｕ）若しくはその誘導体を有するように構成される。ガイド鎖の５’末端側では、パッセンジャー鎖の３’末端側の塩基配列に相補的に設定される。したがって、当該５’末端側においては、塩基対としてＡＵ、ＣＧ等の天然型塩基対やそれに類する塩基対が形成する場合がある。例えば、ガイド鎖の５’末端側には、Ｃ又はＵを備えることができる。より具体的には、例えば、ガイド鎖の５’末にＵを備えることができ、さらに、その３’末端側にＣを備えたりすることができる（ＵＣ、ただし、５’末端から２塩基を示す。）。
【００３９】
ガイド鎖における５’末端側における骨格部分としては、天然のリボヌクレオチド又はその誘導体などに由来するユニットを備えることができる。こうすることで、ガイド鎖５’末端が選択的にＲＩＳＣに取り込まれやすくなり、オフタ−ゲット効果を抑制することができる。なお、３’末端側と同様に、式（１）等で表されるユニットを備えることもできる。ガイド鎖の５'末端は、リン酸化されていることが好ましい。
【００４０】
本ＲＮＡ干渉剤のパッセンジャー鎖及びガイド鎖は、上記した両末端側の構造以外の部分においては、適宜、天然又は化学修飾された塩基や、天然のリボースやその２’位が化学修飾された骨格を有するヌクレオシド又はその誘導体を備えることができる。また、各ヌクレオシド又はその誘導体の結合は、ホスホジエステル結合やホスホロチオエート結合であってもよい。そのほか、パッセンジャー鎖及びガイド鎖は、公知の化学修飾を適宜備えることができる。
【００４１】
本ＲＮＡ干渉剤のブラントエンドを構成する３’末端側及び／又は５’末端側に、式（１）等で表されるユニットを備えることで、ＲＮａｓｅ耐性、オンターゲット活性及びオフターゲット効果の抑制活性を効果的に向上させることができる。なかでも、パッセンジャー鎖の３’及び５’末端側及びガイド鎖の３’末端側に式（１）等で表されるユニットを備えることで、効率的に上記活性をいずれも向上させることができる。
【００４２】
本ＲＮＡ干渉剤においては、好適には、パッセンジャー鎖及びガイド鎖が、それぞれ２２ｍｅｒ〜２４ｍｅｒであって、両末端ブラントエンド構造を形成しており、パッセンジャー鎖の３’末端側及び５’末端側は、いずれも、その端末から、式（１）等で表されるユニット（例えば、式（２）で表されるユニットのみで構成され、また例えば、式（１）で表されるユニットのみから構成され、また例えば、式（１）で表されるユニット及び式（２）で表されるユニットの組み合わせから構成される。）を１個又は連続して２個備えている。また、パッセンジャー鎖の３’末端側の塩基配列はその端末から、例えばＡＧであり、５’末端側の塩基配列はその端末から、例えばＡＡである。また、ガイド鎖の３’末端側は、その端末から式（１）等で表されるユニットを１個又は連続して２個備えている。また、ガイド鎖の３’末端側の塩基配列はその端末から、例えばＴＴ又はＴＵであり、５’末端側の塩基配列はその端末から、例えばＵＣである。
【００４３】
また例えば、本ＲＮＡ干渉剤の各鎖の末端側における式（１）で表されるユニット及び式（２）で表されるユニットについて、いずれか一方のユニットのみを備える形態のほか、双方のユニットを組み合わせた形態を採ることができる。例えば、パッセンジャー鎖及びガイド鎖間で式（１）で表されるユニット及び式（２）で表されるユニットが対合するように配置されるハイブリッド型、パッセンジャー鎖又はガイド鎖において双方のユニットが存在するキメラ型、ハイブリッド型とキメラ型とを組み合わせた混合型などの各種形態を採ることができる。
【００４４】
本ＲＮＡ干渉剤は、例えば、疾患に関連する遺伝子の発現を抑制するための医薬として用いることができるほか、研究用途としても用いることができる。医薬用途として用いる場合には、疾患の種類や標的部位に応じて、適宜、ＤＤＳのための要素を用いて、静脈内投与、皮下投与、脳室内投与、経鼻腔投与及び腹腔内投与等の適切な投与経路が選択される。
【００４５】
（遺伝子発現の抑制方法）
本明細書によれば、本ＲＮＡ干渉剤を構成する二本鎖ＲＮＡを用いて、遺伝子の発現を抑制する方法も提供される。本ＲＮＡ干渉剤を、インビトロ又はインビボで投与すると、哺乳動物細胞の細胞内において、本ＲＮＡ干渉剤は、標的ＲＮＡに作用して、ＲＮＡ干渉により標的ＲＮＡを分解等する。これにより、当該標的ＲＮＡの作用ー典型的には、ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳−を抑制して、結果として遺伝子の発現が抑制されることになる。本抑制方法は、インビボにおいて用いられる場合には、例えば、非ヒト哺乳動物に用いられる。
【００４６】
本ＲＮＡ干渉剤を構成する二本鎖ＲＮＡは、公知のＲＮＡ合成方法によって取得することができる。式（１）及び式（２）で表されるユニット及び当該ユニットを有するオリゴヌクレオチドは、例えば、特開２０１６−１３０２３２号公報、特開２０１１−１３５８２４号公報等に従い合成することができる。
【００４７】
（標的核酸の検出剤）
本明細書に開示される標的核酸の検出剤（以下、本検出剤ともいう。）は、式（１）等で表されるユニットからなる群から選択される１個又は２個以上含み標的核酸と特異的にハイブリダイズ可能なハイブリダイズ領域を有するプローブ鎖と、標的核酸にプローブ鎖がハイブリダイズしたことを示すシグナル要素と、を備えることができる。本検出剤によれば、感度よく細胞内の標的核酸を検出することができる。
【００４８】
本検出剤の標的核酸は、特に限定されない。ＤＮＡであってもよいし、ＲＮＡであってもよい。標的核酸をＤＮＡとするとき、特定遺伝子の特定領域、ＳＮＰｓなどの変異などを標的とすることができる。標的核酸をＲＮＡとするとき、ｍＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどのノンコーディングＲＮＡ等が挙げられる。標的核酸の配列の長さも特に限定するものではないが、例えば、４ｍｅｒ〜２５ｍｅｒ程度とすることができる。
【００４９】
本検出剤におけるプローブ鎖は、標的核酸に特異的にハイブリダイズするハイブリダイズ領域を有している。ハイブリダイズ領域は、標的核酸の配列に応じた長さを有することができる。プローブ鎖の全体は、例えば、１５ｍｅｒ〜３５ｍｅｒ程度とすることができる。例えば、ハイブリダイズ領域を構成する骨格部分は、式（１）等で表されるユニットで構成されている。こうすることで、高い特異性で、標的ＲＮＡとハイブリダイズさせることができ、例えば、ＳＮＰｓ等の変異であっても高い精度で検出することができる。ハイブリダイズ領域に加えて、例えば、後述するように、ステム形成領域も、式（１）等で表されるユニットで構成されている。
【００５０】
プローブ鎖は１種又は２種以上のシグナル要素を備えている。シグナル要素は、特に限定するものではないが、例えば、蛍光色素と消光色素との組み合わせから構成して、プローブ鎖が標的核酸にハイブリダイズしていないときには、消光色素により蛍光色素が消光され、プローブ鎖が標的核酸にハイブリダイズしたときは、蛍光色素によるシグナルが提示されるようになっている。こうした蛍光色素と消光色素との組み合わせは、例えば、特開２０１２−１７０３７３号公報、再表２０１１／１０５６１０号公報、特開２０１３−７８２９８号公報等に記載の化合物ほか、公知の化合物を適宜組み合せて用いることができる。
【００５１】
例えばこうした蛍光色素と消光色素とは、ハイブリダイズ領域に対して種々の形態で備えることができる。例えば、ハイブリダイズ領域の少なくとも一部をループに有し、蛍光色素と消光色素とをステム形成領域に有するモレキュラービーコンが挙げられる。なお、ハイブリダイズ領域は、ステム形成領域の一部に及んでいてもよい。この場合、一本鎖であるプローブ鎖の一方の端部のステム形成領域に蛍光色素を配し、他方の端部のステム形成領域の消光色素を配することができる。なお、ステム形成領域に蛍光色素と消光色素とを備える場合、ステム形成領域の各端末にこれらを備えることができる。
【００５２】
また例えば、全体として、定常時には、ヘアピン状部とその一端が延出して一本鎖領域とを有するプローブ鎖であって、ハイブリダイズ領域が標的核酸とハイブリダイズ時には、ヘアピン状部が開放されるように構成されるとき、プローブ鎖のヘアピン形成領域に、蛍光色素と消光色素とを配することもできる。
【００５３】
本検出剤は、例えば、標的ＤＮＡあるいはＲＮＡを認識する部位に、アデニン（Ａ）に替えて、２，６−ジアミノプリンを塩基として備えるユニットを１個又は２個以上備えることができる。かかる塩基を配することにより、標的ＤＮＡあるいはＲＮＡ認識の際に二重鎖を安定化させることでヘアピンを開きやすくなり蛍光強度が上がることでシグナル（Ｓ）／バックグラウンド（Ｂ）比を向上させることができるほか、本検出剤による検出感度（検出限界）を向上させることができる。当該塩基を備える場合には、Ｓ／Ｂ比を、例えば、１００以上、また例えば、１５０以上、また例えば、１８０以上、また例えば、１９０以上、また例えば、２００以上などとすることができる。当該塩基を有するユニットは、例えば１個又は４個以下、また例えば、１個以上３個以下、また例えば、１個以上２個以下備えることができる。
【００５４】
プローブ鎖が、モレキュラービーコンやヘアピン状部を有するプローブを構成するときには、蛍光色素及び消光色素を備える二つのステム形成領域やヘアピン形成領域の近傍に、当該塩基を備えることが好適である。なお、当該塩基を有するユニットは、ハイブリダイズ領域におけるハイブリダイズを妨げないように配置される。
【００５５】
本検出剤は、本ＲＮＡ干渉剤と同様、公知のＤＮＡ合成方法によって取得することができる。式（１）及び式（２）で表されるユニット及び当該ユニットを有するオリゴヌクレオチドは、例えば、特開２０１６−１３０２３２号公報、特開２０１１−１３５８２４号公報等に従い合成することができる。
【００５６】
（ギャップマー型アンチセンスオリゴヌクレオチド剤）
本明細書に開示されるギャップマー型アンチセンスオリゴヌクレオチド剤（以下、単に、本アンチセンス剤ともいう。）は、標的ＲＮＡに対するアンチセンス鎖と、前記アンチセンス鎖の両末端に、それぞれ、式（１）等で表されるユニットからなる群から選択される１個又は２個以上含む側鎖と、を備えることができる。
【００５７】
本アンチセンス剤の標的ＲＮＡは、特に限定されないが、ｍＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどのノンコーディングＲＮＡ等が挙げられる。標的核酸との認識部位の長さも特に限定するものではないが、例えば、６ｍｅｒ〜３０ｍｅｒ程度とすることができる。
【００５８】
アンチセンス鎖は、標的ＲＮＡに対して特異的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有することができる。かかるアンチセンス鎖の骨格部分は、ＤＮＡで構成することができる。また、このアンチセンス鎖の骨格部分のヌクレオチドは、ホスホジエステル結合を含んでいてもよいが、例えば、ホスホロチオエートで結合されていてもよい。なお、アンチセンス鎖に、ＣＧを含む場合には、ＴＬＲ９の活性化を抑制するために、Ｃ(シトシン）は、５位をメチル化することもできる。
【００５９】
本アンチセンス剤は、アンチセンス鎖の両側に式（１）等で表されるユニットを１個又は２個以上含む側鎖を備えることができる。かかる側鎖の長さは特に限定するものではないが、例えば、１ｍｅｒから１５ｍｅｒ程度とすることができ、また例えば、1ｍｅｒから１０ｍｅｒ程度、また例えば、1ｍｅｒから８ｍｅｒ程度、また例えば、1ｍｅｒから６ｍｅｒ程度、また例えば、1ｍｅｒから４ｍｅｒ程度とすることができる。これらの側鎖における式（１）等で表されるユニットの個数は特に限定するものではなく、他のヌクレオチドユニットを備えていてもよい。
【００６０】
側鎖の塩基構成は、特に限定するものではないが、例えば、標的ＲＮＡの両末端の塩基配列に相補的な塩基配列を採用することができる。また、側鎖とアンチセンス鎖との間は、ホスホロチオエートで結合されていることができるほか、側鎖におけるユニット間もホスホロチオエートで結合されていることができる。
【００６１】
本アンチセンス剤は、本ＲＮＡ干渉剤と同様、公知のＤＮＡ等の合成方法によって取得することができる。式（１）及び式（２）で表されるユニット及び当該ユニットを有するオリゴヌクレオチドは、例えば、特開２０１６−１３０２３２号公報、特開２０１１−１３５８２４号公報等に従い合成することができる。
【実施例】
【００６２】
以下、本明細書の開示を具現化した実施例について開示するが、これらは本明細書の開示を説明するためのものであって、その範囲を限定する意図で記載されるものではない。
【実施例１】
【００６３】
（ＮｅＫ２−ＲＮＡ干渉剤の作製及び評価）
セリン-スレオニンキナーゼであるＮｅｋ２は細胞増殖に関わるタンパク質であり、膵臓がん細胞で過剰発現することが知られている。このことから、ＮｅＫ２は膵臓癌の治療標的として期待されている。本実施例では、Ｎｅｋ２遺伝子のｍＲＮＡを標的ＲＮＡとするＲＮＡ干渉剤を作製した。【００６４】
ＲＮＡ干渉剤の標的ＲＮＡの配列は既報の論文（Kokuryo et al., Cancer Sci., 2016, 107, 1315-1320）で用いられている塩基配列に基づいた。ＲＮＡ干渉剤の設計は、ブラントエンド型ＲＮＡ干渉剤とし、ガイド鎖の５’末端以外の３ヵ所の末端を以下の式（３）で表されるユニット（ＳＮＡ）及び（４）で表されるユニット（Ｌ−αＴＮＡ）で置換した。塩基配列及びユニットによる置換形態を以下の表に示す。【００６５】
【表１】
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【００６６】
【化１３】
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【００６７】
【化１４】
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【００６８】
作製したＲＮＡ干渉剤を、ｐｍｉＲ−Ｎｅｋ２ プラスミドとともに、Lipofectamin2000を用いて９６ウェルプレートに播種したＨＥＬＡ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後、Dual-Glo luciferase assay system(promega)を用いてルシフェラーゼアッセイを行った。結果を、図２に示す。図２に示すように、作製したＲＮＡ干渉剤は、いずれも、天然のヌクレオチドで構成したＲＮＡ干渉剤（ＳｉＮｅｋ２）と同程度のＲＮＡｉ活性を示した。【００６９】
次いで、パッセンジャー鎖（センス鎖）によるオフターゲット効果について、パッセンジャー鎖に対して相補的な配列をもつように作製したプラスミドを用いて上記と同様にしてルシフェラーゼアッセイにより確認した。結果を図３に示す。図３に示すように、パッセンジャー鎖によるオフターゲット効果は、天然ｓｉＲＮＡよりも抑制されていることがわかった。なかでも、ＴＮＡを導入したＲＮＡ干渉剤が、高いオフターゲット効果の抑制能を示した。【００７０】
次いで、作製したＲＮＡ干渉剤を、ＫＬＭ１細胞にLipofectamin2000を用いてトランスフェクションし、４８時間後に、細胞を回収し、内在性のＮｅｋ２遺伝子の発現をanti-NeK2抗体を用いてウェスタンブロッティングにより解析した。結果を図４に示す。図４に示すように、ＳＮＡ又はＴＮＡを導入したＲＮＡ干渉剤は、天然のｓｉＲＮＡに比べて高いＲＮＡ干渉能を示すことがわかった。【００７１】
さらに、Ｎｅｋ２は、細胞増殖に関わるタンパク質であることから、ｓｉＲＮＡ−Ｎｅｋ２（１０ｎＭ）を作用させた細胞の増殖能を評価することでＲＮＡ干渉剤の効果を、ＭＴＴアッセイにより評価した。すなわち、トランスフェクション後に、ＷＳＴ−１試薬を細胞と所定時間混合し、その後、４６５ｎｍの吸光度を解析した。結果を、図５に示す。図５に示すように、天然のｓｉＲＮＡと比較して、ｓｉＮｅｋ２−Ｔ２が最も効果的であることがわかった。【００７２】
さらにまた、末端にＳＮＡを導入したＲＮＡ干渉剤（ｓｉＮｅｋ２−Ｓ２）（１μＭ）を、３７℃下４０％ヒト血清中で保存したとき、その分解物を２０％変性ＰＡＧＥにて解析した。結果を、図６に示す。図６に示すように、ＳＮＡを末端に導入したＲＮＡ干渉剤は、高い酵素耐性を有していることがわかった。
【実施例２】
【００７３】
（ギャップマー型アンチセンス核酸の作製及び評価）
ＳＧＬＴ２(sodium glucose cotransporter2, SLC5A2)は腎・近位尿細管細胞に発現するグルコースのトランスポーターであり、原尿中に濾過されたグルコースの再吸収を担っている分子である。また、糖尿病において、その発現が亢進することが知られている。本実施例では、ヒトＳＧＬＴ２遺伝子のｍＲＮＡを標的とするギャップマー型アンチセンス核酸を作製し、そのノックダウン活性、尿糖排泄および副作用（肝機能障害・オフターゲット効果（ＳＧＬＴ１・ＳＧＬＴ５などの他の近位尿細管に発現するトランスポーター）等について評価した。【００７４】
本実施例では、以下の構成のアンチセンス核酸を作製した。具体的には、大文字部分の骨格部分をホスホロチオエート結合によるデオキシリボヌクレオチドで構成し、（）内の骨格部分を、ホスホロチオエート結合によって、２’ＭＯＥ（２’−Ｏ−メトキシエチルリボヌクレオチド）、ＳＮＡ（式（５））及びＬ−α−ＴＮＡ（式（６））のいずれかで全て置換した合計３種類のアンチセンス核酸を作製した。【００７５】
【化１５】
2021039598.tif 000018
【化１６】
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【００７６】
図７に示すプロトコールに従い、マウス（Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ、オス、９〜１０週齢、日本ＳＬＣ株式会社より購入）に対して、作製したアンチセンス核酸を１０ｍｇ／ｋｇ／回・３回/週にて計１０回、皮下注射（背部）にて投与した。皮下注射はイソフルランでの吸入麻酔下に施行した。最終投与の翌日に採尿、２日後に屠殺し腎臓、肝臓、血清を採取した。【００７７】
採取したマウスの腎臓におけるＳＧＬＴ２のｍＲＮＡ量及び発現タンパク質量を測定した。結果を図８及び図９に示す。図８及び図９に示すように、ＳＮＡ及びＬ−ａＴＮＡを導入したアンチセンス核酸の皮下投与は、いずれも、腎臓におけるＳＧＬＴ２のｍＲＮＡレベルおよびＳＧＬＴ２タンパク量を著明に低下させることがわかった。なお、同時に、ＳＧＬＴ１及びＳＧＬＴ５のｍＲＮＡレベルについても測定した。結果を図１０に示す。いずれのアンチセンス核酸においても、これらの遺伝子のｍＲＮＡレベルが低下していないことを確認した。すなわち、使用したアンチセンス核酸について、標的としたＳＧＬＴ2以外の分子に対する非特異的な（塩基配列に依存しない）発現抑制効果（オフターゲット効果）は、観察されなかった。【００７８】
採取した尿を用い、尿糖排せつを評価した。結果を図１１に示す。図１１に示すように、ＰＢＳ投与群では尿糖は認めなかったが、いずれのアンチセンス核酸投与群においても尿糖の排泄を認めた。これらの結果から、ＳＧＬＴ２の作用が大きく減弱し、尿細管におけるグルコースの再吸収能が低下していることがわかった。
【実施例３】
【００７９】
（モレキュラービーコン型プローブの作製及び評価）
本実施例では、標的ＲＮＡをＥＧＦＲ遺伝子のＴ７９０を含む３０ｍｅｒ（野生型及び変異型（一塩基置換））とし、それに対応するモレキュラービーコン型プローブを、標的ＲＮＡの認識部位の長さを１４ｍｅｒ〜１８ｍｅｒと異なるように設計するとともに、他方のステム形成領域を含んだ全てをＳＮＡ（式（１））を骨格部分とするプローブ鎖とし、蛍光色素及び消光色素を両末端に導入して作製した（表２）。なお、蛍光色素及び消光色素は、野生型検出用モレキュラービーコンにおいては、ペリレン及びアントラキノンであり、変異型検出用モレキュラービーコン（Ｔ７９０Ｍ）においては、Ｃｙ３及びニトロメチルレッドとした。【００８０】
【表２】
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【００８１】
これらの野生型検出用及び変異型検出用モレキュラービーコン型プローブを、３７℃、プローブ（０．２μＭ）及び標的ＲＮＡ（０．２μＭ、野生型又は異常型のＥＧＦＲ遺伝子のｍＲＮＡ）の存在下、１００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭ リン酸バッファ（ｐＨ７．０）で、励起波長４４０ｎｍ、発光波長４７２ｎｍ（以上、ペリレン）又は励起波長５４６ｎｍ、発光波長５６５ｎｍ（以上、Ｃｙ３）として、種々の温度でインキュベーション（５分）したときの蛍光強度を測定した。なお、Ｓ／Ｂを算出するため、標的ＲＮＡなしでプローブのみの場合の蛍光強度も測定した。以下に、３７℃における蛍光強度を以下の表に示す。【００８２】
【表３】
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【００８３】
以上の表に示すように、全てのモレキュラービーコンプローブにおいて、標的ＲＮＡとして野生型及び変異型のＲＮＡを検出可能であり、どのプローブにおいても、Ｓ／Ｂは１５以上を示し、野生型と変異型の識別が可能であることがわかった。
【実施例４】
【００８４】
（高感度モレキュラービーコン型プローブの作製）
本実施例では、図１２に示すように、ｍｉＲ２１を標的ＲＮＡとし、これにハイブリダイズするハイブリダイズ領域の両末端側にステム形成領域を配置して、さらに、ステム形成領域近傍のアデニンが配置される部位を２，６−ジアミノプリンとするほか、蛍光色素としてＣｙ３を消光色素としてメチルレッドを導入したヌクレオチドをプローブ鎖とするモレキュラービーコン型プローブを作製した。なお、全ての骨格部分に、ＳＮＡ（式（１））を採用した。【００８５】
このモレキュラービーコン型プローブを、２０℃、プローブ（１μＭ）及び標的ＲＮＡ（２μＭ）の存在下、１００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭ リン酸バッファ（ｐＨ７．０）で、励起波長５４６ｎｍ、発光波長５６５ｎｍとして、８０℃から１℃／分で降温したときの蛍光スペクトルを測定した。プローブ濃度を０．５μＭ及び標的ＲＮＡ濃度を０〜２０００ｐＭとし、発光波長を５６４ｎｍとする以外は、同様の条件で、各標的ＲＮＡ濃度にて蛍光強度を測定した。結果を図１２及び図１３に示す。【００８６】
図１２に示すように、Ｓ（シグナル）／Ｂ（バックグランド）比は、２０５倍となり、１００倍を超えたものとなった。また、図１３に示すように、標的ＲＮＡの検出限界は、２００ｐＭであった。以上のように、ＳＮＡを骨格部分とし、ステム形成領域の近傍に２，６−ジアミノプリンを備えるモレキュラービーコン型プローブは、優れた検出性能を発揮できることがわかった。なお、２，６−ジアミノプリンに変更しない以外は上記と同様にして作製したモレキュラービーコンについて、同様にＳ／Ｂ比及び検出限界を確認したところ、いずれも、２，６−ジアミノプリンを備えるモレキュラービーコンよりは低いものの良好な数値を示した。
【実施例５】
【００８７】
（ギャップマー型アンチセンス核酸の作製及び評価その２）
実施例２に準じてヒトＳＧＬＴ２遺伝子のｍＲＮＡを標的とするギャップマー型アンチセンス核酸を作製し、そのノックダウン活性、尿糖排泄および副作用（肝機能障害）について評価した。【００８８】
本実施例では、以下の構成のアンチセンス核酸を作製した。具体的には、大文字部分の骨格部分をホスホロチオエート結合によるデオキシリボヌクレオチドで構成し、（）内の骨格部分を、ホスホロチオエート結合によって、２’ＭＯＥ（２’−Ｏ−メトキシエチルリボヌクレオチド）、ＳＮＡ、５メチルｄＣのいずれかで全て置換した合計４種類のアンチセンス核酸を作製した。【００８９】
【化１７】
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【００９０】
これらのアンチセンス核酸につき、図１４に示すプロトコールに従い、マウス（Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ、オス、９〜１０週齢、日本ＳＬＣ株式会社より購入）に対して、作製したアンチセンス核酸を１０ｍｇ／Ｋｇ／回・３回／週にて皮下注射より計１０回投与した。最終投与の翌日に採尿、２日後に屠殺し、血液・腎組織を採取した。【００９１】
実施例２に準じて、採取したマウスの腎臓におけるＳＧＬＴ２のｍＲＮＡ量及び発現タンパク質量を測定した結果を図１５及び図１６に示す。図１５及び図１６に示すように、ＳＮＡを両端に１個だけ導入したアンチセンス核酸の皮下投与は、いずれも、腎臓におけるＳＧＬＴ２のｍＲＮＡレベルおよびＳＧＬＴ２タンパク量を低下させることがわかった。一方で、両端それぞれより２つ目のホスホロチオエートをリン酸ジエステル結合としたＳＮＡのアンチセンス核酸では、１５％程しか腎臓におけるＳＧＬＴ２のｍＲＮＡレベルが低下せず、ＳＧＬＴ２タンパク量は１０％程しか低下しなかった。【００９２】
また、実施例２に準じて、採取した尿を用い、尿糖排泄を評価した結果を図１７に示す。図１７に示すように、ＰＢＳ投与群では尿糖を認めなかったが、最端から２つ目のホスホロチオエートをリン酸ジエステル結合としたＳＮＡのギャップマーを除き、いずれのアンチセンス核酸投与群においても尿糖の排泄を認め、ＳＧＬＴ２の作用が減弱し、尿細管におけるグルコースの再吸収能が低下していることがわかった。【００９３】
また、採取した血液を用い、ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＡLＰを評価した。結果を図１６及び図１９及び図２０に示す。図１９及び図２０に示すように、実施例２の結果と比較して、肝機能に対する副作用はいずれも軽減されていることがわかった。
【実施例６】
【００９４】
（ギャップマー型アンチセンス核酸の作製及び評価その３）
実施例２に準じて、SGLT2遺伝子のmRNAを標的とするギャップマー型アンチセンス核酸を作製し、そのノックダウン活性と効果の持続性について評価した。本実施例では、以下の構成のアンチセンス核酸を作製した。具体的には、大文字部分の骨格部分をホスホロチオエート結合によるデオキシリボヌクレオチドで構成し、（）内の骨格部分をホスホロチオエート結合によってSNAですべて置換した合計3種類のアンチセンス核酸を作製した。【００９５】
DNA：G*G*c*A*T*G*A*G*c*T*T*C
大文字 = DNA
c = 5メチルdC
* = S化
SNA2：(G)*G*c*A*T*G*A*G*c*T*T*(C)
( ) = SNA
c = 5メチルdC
* = S化
SNA4：(G*G)*c*A*T*G*A*G*c*T*(T*C)
( ) = SNA
c = 5メチルdC
* = S化【００９６】
これらのアンチセンス核酸につき、図２１に示すプロトコールに従い、マウス（Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ、オス、９〜１０週齢、日本ＳＬＣ株式会社より購入）に対して、作成した各アンチセンス核酸をＤａｙ０において、１０ｍｇ／Ｋｇで２回皮下注射により投与した。最終投与の２日後、９日後、１６日後に屠殺し、腎組織を採取した。実施例２に準じて、採取したマウスの腎臓におけるＳＧＬＴ２のｍＲＮＡ量を測定した結果を、それぞれ図２２、２３、２４に示す。【００９７】
図２２に示すように、最終投与から２日後では、ＳＮＡを両側に１個ずつ、または２個ずつ導入したアンチセンス核酸、およびＤＮＡにより構成されたアンチセンス核酸の皮下投与は、いずれも腎臓におけるＳＧＬＴ２のｍＲＮＡレベルを低下させることがわかった。さらに、図２３に示すように、最終投与から９日後では、ＳＮＡを両側に１個ずつ、または２個ずつ導入したアンチセンス核酸の皮下投与は、ＳＧＬＴ２のｍＲＮＡレベルがそれぞれ７０％、７５％低下し、一方でＤＮＡにより構成されたアンチセンス核酸の皮下投与は３０％しか低下しなかった。さらに、図２４に示すように、最終投与から１６日後では、ＳＮＡを両側に１個ずつ、または２個ずつ導入したアンチセンス核酸の皮下投与は、ＳＧＬＴ２のｍＲＮＡレベルがともに６３％低下し、一方でＤＮＡにより構成されたアンチセンス核酸の皮下投与は４２％しか低下しなかった。【００９８】
これらの結果から、ＳＮＡを両側に１個ずつ、または２個ずつ導入したアンチセンス核酸の皮下投与は、ＤＮＡにより構成されたアンチセンス核酸の皮下投与と比較して、ＳＧＬＴ２の作用の減弱を持続していることがわかった。以上のことから、こうしたアンチセンス核酸は、ヌクレアーゼ耐性やノックダウン効果に対して実効性のある薬剤となることがわかった。
【配列表フリーテキスト】
【００９９】
配列番号１〜１０：ｓｉＲＮＡ
配列番号１１：Gapmer Type Antisense Nucleic acid
配列番号１４〜２１: Molecular Beacon Probe
【図１】
2021039598.tif 000033
【図２】
2021039598.tif 000034
【図３】
2021039598.tif 000035
【図４】
2021039598.tif 000036
【図５】
2021039598.tif 000037
【図６】
2021039598.tif 000038
【図７】
2021039598.tif 000039
【図８】
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【図９】
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【図１０】
2021039598.tif 000042
【図１１】
2021039598.tif 000043
【図１２】
2021039598.tif 000044
【図１３】
2021039598.tif 000045
【図１４】
2021039598.tif 000046
【図１５】
2021039598.tif 000047
【図１６】
2021039598.tif 000048
【図１７】
2021039598.tif 000049
【図１８】
2021039598.tif 000050
【図１９】
2021039598.tif 000051
【図２０】
2021039598.tif 000052
【図２１】
2021039598.tif 000053
【図２２】
2021039598.tif 000054
【図２３】
2021039598.tif 000055
【図２４】
2021039598.tif 000056
【配列表】
2021039598000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和3年2月25日(2021.2.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ＲＮＡに対するパッセンジャー鎖及びガイド鎖を備え、
前記パッセンジャー鎖と前記ガイド鎖とが対合した二本鎖ＲＮＡの両端はブラントエンドを構成し、
以下の（ａ）及び（ｂ）；
（ａ）前記パッセンジャー鎖の５’末端側及び３’末端側
（ｂ）前記ガイド鎖の３’末端側
に、以下の式（２）で表されるユニットを１個又は２個備える、ＲＮＡ干渉剤。
【化１８】
2021039598.tif 000057
（ただし、Ｘは、酸素原子又は硫黄原子を表す。）
【請求項２】
前記パッセンジャー鎖の５’末端及び３’末端には、それぞれ式（２）で表されるユニットを２個備え、
前記ガイド鎖の３’末端には、式（２）で表されるユニットを２個備える、請求項１に記載のＲＮＡ干渉剤。
【請求項３】
ＮｅＫ２遺伝子の発現の抑制を目的とする、請求項１又は２に記載のＲＮＡ干渉剤。
【請求項４】
前記パッセンジャー鎖は、配列番号９で表される塩基配列を有し、前記ガイド鎖は、配列番号１０で表される塩基配列を有する、請求項３に記載のＲＮＡ干渉剤。
【請求項５】
標的ＲＮＡに対するパッセンジャー鎖及びガイド鎖を備え、
前記パッセンジャー鎖と前記ガイド鎖とが対合した二本鎖ＲＮＡの両端はブラントエンドを構成し、
以下の（ａ）及び（ｂ）；
（ａ）前記パッセンジャー鎖の５’末端側及び３’末端側
（ｂ）前記ガイド鎖の３’末端側
に、以下の式（２）で表されるユニットを１個又は２個備える、ＲＮＡ二本鎖を用いて、標的遺伝子の発現を抑制する方法。
【化１９】
2021039598.tif 000058
【請求項６】
標的ＲＮＡに対して相補的なオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス鎖と、
前記アンチセンス鎖の３’末端及び５’末端に、以下の式（１）及び式（２）で表されるユニットからなる群から選択される１個又は２個をそれぞれ含む２つの側鎖と、
を備え、
前記アンチセンス鎖と前記２つの側鎖を構成するヌクレオシドの全てのヌクレオシド間は、ホスホロチオエート結合で連結されている、アンチセンス核酸。
【化２２】
2021039598.tif 000059
（ただし、Ｘは、酸素原子又は硫黄原子を表す。）
【化２３】
2021039598.tif 000060
（ただし、Ｘは、酸素原子又は硫黄原子を表す。）
【請求項７】
前記２つの側鎖は、いずれも、式（１）で表されるユニットを１個備える、請求項６に記載のアンチセンス核酸。
【請求項８】
前記２つの側鎖は、いずれも、式（１）で表されるユニットを２個備える、請求項６に記載のアンチセンス核酸。
【請求項９】
前記２つの側鎖は、いずれも、式（２）で表されるユニットを１個備える、請求項６に記載のアンチセンス核酸。
【請求項１０】
前記２つの側鎖は、いずれも、式（２）で表されるユニットを２個備える、請求項６に記載のアンチセンス核酸。
【請求項１１】
前記標的ＲＮＡは、ヒトＳＬＧＴ２遺伝子のｍＲＮＡである、請求項６〜１０のいずれかに記載のアンチセンス核酸。
【請求項１２】
前記アンチセンス鎖及び前記２つの側鎖は、全体として、ＧＧＣＡＴＧＡＧＣＴＴＣで表される塩基配列を構成する、請求項６〜１１のいずれかに記載のアンチセンス核酸。
【請求項１３】
以下の式（１）で表されるユニットからなり標的ＲＮＡと特異的にハイブリダイズ可能なハイブリダイズ領域と、
以下の式（１）で表されるユニットからなり、前記ハイブリダイズ領域の３’末端及び５’末端にそれぞれ連結され、前記ハイブリダイズ領域をループ化可能にハイブリダイズするステム領域と、
前記標的ＲＮＡに前記プローブ鎖がハイブリダイズしたことを示すシグナル要素と、
を備える、標的ＲＮＡの検出剤。
【化２４】
2021039598.tif 000061
（ただし、Ｘは、酸素原子又は硫黄原子を表す。）
【請求項１４】
前記標的ＲＮＡは、ｍｉＲ２１である、請求項１３に記載の標的ＲＮＡ検出剤。
【請求項１５】
前記ハイブリダイズ領域と前記ステム領域とは、配列番号２１で表される一続きの塩基配列を有する、請求項１４に記載の標的ＲＮＡ検出剤。
【請求項１６】
前記標的ＲＮＡはＥＧＦＲ遺伝子であり、前記遺伝子の一塩基置換を検出するための請求項１３に記載の標的ＲＮＡ検出剤。
【請求項１７】
前記ハイブリダイズ領域と前記ステム領域とは、配列番号１４〜２０で表される塩基配列から選択される一続きの塩基配列を有する、請求項１６に記載の標的ＲＮＡ検出剤。
【国際調査報告】
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