(57)【要約】  本発明は、クチナーゼ様酵素の分解に関与するペプチダーゼ又はプロテアーゼを探し出し、当該ペプチダーゼ又はプロテアーゼの活性を抑制することによって、クチナーゼ様酵素を効率的に製造することを目的としている。  ＰａＥの分解に関与する少なくとも１種のペプチダーゼ又はプロテアーゼの遺伝子に変異が導入されることにより、そのペプチダーゼ又はプロテアーゼの活性が抑制されている酵母が提供される。
2020100910.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シュードザイマ・アンタクティカ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）が産生するエステラーゼ（ＰａＥ）の分解に関与する少なくとも１種のペプチダーゼ又はプロテアーゼの遺伝子に変異が導入されることにより、そのペプチダーゼ又はプロテアーゼの活性が抑制されている、酵母。
【請求項２】
前記遺伝子の少なくとも１つの塩基が欠失している若しくは他の塩基で置換されているか、又は、前記遺伝子に少なくとも１つの塩基が挿入されている、請求項１に記載の酵母。
【請求項３】
前記遺伝子全体が欠失している、請求項１又は２に記載の酵母。
【請求項４】
前記ペプチダーゼ又はプロテアーゼが、ＰＡＮ１＿０１６ｆ０５３３０（配列番号１）、ＰＡＮ１＿００４ｒ０２２６６（配列番号２）、ＰＡＮ１＿００３ｒ０１８５６（配列番号３）、ＰＡＮ１＿００３ｒ０１６６８（配列番号４）、ＰＡＮ１＿００１ｆ００８４６（配列番号５）、ＰＡＮ１＿０１９ｆ０５８４５（配列番号６）、ＰＡＮ１＿０２４ｆ０６６８５（配列番号７）、ＰＡＮ１＿０１２ｒ０４５６４（配列番号８）、ＰＡＮ１＿０１０ｒ０４２２７（配列番号９）、ＰＡＮ１＿０１３ｒ０４７７９（配列番号１０）、及び、ＰＡＮ１＿０２３ｒ０６５６３（配列番号１１）からなる群から選択されるシュードザイマ・アンタクティカの遺伝子又はそのホモログ若しくはオルソログにコードされている酵素を１種以上含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の酵母。
【請求項５】
シュードザイマ属の酵母である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の酵母。
【請求項６】
前記ＰａＥを産生する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の酵母。
【請求項７】
組換えタンパク質を産生する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の酵母。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の酵母を使用して、タンパク質を製造する方法。
【請求項９】
前記タンパク質がＰａＥである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
酵母を使用してタンパク質を製造する方法であって、
前記酵母において、ＰａＥの分解に関与する少なくとも１種のペプチダーゼ又はプロテアーゼの活性を抑制する工程を含むことを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異酵母及びそれを使用したタンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
シュードザイマ・アンタクティカ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）が産生するエステラーゼ（ＰａＥ）など、生分解性プラスチックを速やかに分解するクチナーゼ様酵素が、植物常在性の酵母や糸状菌から単離同定されている。そのような酵素を生成する菌の培養条件の最適化、高生産株の選定、及び高発現遺伝子カセットの導入などにより、クチナーゼ様酵素の生産量を向上させることが研究されてきた（非特許文献１）。【０００３】
一方、菌によって生産された酵素が、当該菌に由来するプロテアーゼによって分解される現象が一般的に知られている（特許文献１）。しかしながら、クチナーゼ様酵素を分解するプロテアーゼについては知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第02/101038号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Watanabe et al., Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 100, No. 7, pp. 3207-3217, 2016.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＰａＥを産生して分泌する酵母の培養液中には、当該ＰａＥの分解物が培養経過に伴って蓄積される。ＰａＥを産業利用するためには、このような分解を抑制することが必要である。本発明は、ＰａＥの分解に関与するペプチダーゼ又はプロテアーゼを探し出し、当該ペプチダーゼ又はプロテアーゼの活性を抑制することによって、ＰａＥを効率的に製造することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ＰａＥの分解に関与するプロテアーゼを見出した。そして、それらの活性を抑制すると、意外なことに、ＰａＥの分解はもちろん、他のタンパク質の分解も抑制されることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、以下に示す変異酵母及びそれを使用してタンパク質を製造する方法、並びに、酵母を使用してタンパク質を製造する方法を提供するものである。
〔１〕シュードザイマ・アンタクティカ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）が産生するエステラーゼ（ＰａＥ）の分解に関与する少なくとも１種のペプチダーゼ又はプロテアーゼの遺伝子に変異が導入されることにより、そのペプチダーゼ又はプロテアーゼの活性が抑制されている、酵母。
〔２〕前記遺伝子の少なくとも１つの塩基が欠失している若しくは他の塩基で置換されているか、又は、前記遺伝子に少なくとも１つの塩基が挿入されている、前記〔１〕に記載の酵母。
〔３〕前記遺伝子全体が欠失している、前記〔１〕又は〔２〕に記載の酵母。
〔４〕前記ペプチダーゼ又はプロテアーゼが、ＰＡＮ１＿０１６ｆ０５３３０（配列番号１）、ＰＡＮ１＿００４ｒ０２２６６（配列番号２）、ＰＡＮ１＿００３ｒ０１８５６（配列番号３）、ＰＡＮ１＿００３ｒ０１６６８（配列番号４）、ＰＡＮ１＿００１ｆ００８４６（配列番号５）、ＰＡＮ１＿０１９ｆ０５８４５（配列番号６）、ＰＡＮ１＿０２４ｆ０６６８５（配列番号７）、ＰＡＮ１＿０１２ｒ０４５６４（配列番号８）、ＰＡＮ１＿０１０ｒ０４２２７（配列番号９）、ＰＡＮ１＿０１３ｒ０４７７９（配列番号１０）、及び、ＰＡＮ１＿０２３ｒ０６５６３（配列番号１１）からなる群から選択されるシュードザイマ・アンタクティカの遺伝子又はそのホモログ若しくはオルソログにコードされている酵素を１種以上含む、前記〔１〕〜〔３〕のいずれか一項に記載の酵母。
〔５〕シュードザイマ属の酵母である、前記〔１〕〜〔４〕のいずれか一項に記載の酵母。
〔６〕前記ＰａＥを産生する、前記〔１〕〜〔５〕のいずれか一項に記載の酵母。
〔７〕組換えタンパク質を産生する、前記〔１〕〜〔６〕のいずれか一項に記載の酵母。
〔８〕前記〔１〕〜〔７〕のいずれか一項に記載の酵母を使用して、タンパク質を製造する方法。
〔９〕前記タンパク質がＰａＥである、前記〔８〕に記載の方法。
〔１０〕酵母を使用してタンパク質を製造する方法であって、
前記酵母において、ＰａＥの分解に関与する少なくとも１種のペプチダーゼ又はプロテアーゼの活性を抑制する工程を含むことを特徴とする、方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明に従えば、ＰａＥの分解に関与する少なくとも１種のペプチダーゼ又はプロテアーゼの遺伝子に変異が導入されることにより、そのペプチダーゼ又はプロテアーゼの活性が抑制されている酵母が提供される。このような変異酵母を使用することにより、培養液中におけるＰａＥの分解を抑制することができるだけなく、意外なことに、他のタンパク質の分解も抑制することができる。また、酵母を使用してタンパク質を製造する際に、ＰａＥの分解に関与する少なくとも１種のペプチダーゼ又はプロテアーゼの遺伝子の活性を抑制すれば、培養液中におけるＰａＥの分解だけでなく他のタンパク質の分解も抑制することができる。したがって、効率的なタンパク質の生産が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】培養上清中のＰａＥ及びその分解物の電気泳動写真を示す。
【図２】各遺伝子破壊株の培養上清中のＰａＥ及びその分解物をウェスタンブロット法により解析したメンブレンの写真を示す。
【図３】ＰｒｏＡ遺伝子の相補実験の結果を示す。
【図４】異なる方法で培養した場合のＰａＥ及びその分解物のウェスタンブロット解析結果を示す。
【図５】各遺伝子破壊株の培養上清のリパーゼ活性のグラフを示す。
【図６】各遺伝子破壊株の培養上清のゼラチン分解活性を表すゲルの写真を示す。
【図７】培養時間に応じた培養液のＰａＥ活性及び乾燥菌体重量の変化のグラフを示す。
【図８】培養液中のＰａＥ及びその分解物の電気泳動写真を示す。
【図９】静置時間に応じた培養液のＰａＥの残存活性及び乾燥菌体重量の変化のグラフを示す。
【図１０】静置後の培養液中のＰａＥ及びその分解物の電気泳動写真を示す。
【図１１】静置時間に応じた培養上清のＰａＥの残存活性及び乾燥菌体重量の変化のグラフを示す。
【図１２】静置後の培養上清中のＰａＥ及びその分解物の電気泳動写真を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明の酵母は、ＰａＥの分解に関与する少なくとも１種のペプチダーゼ又はプロテアーゼの遺伝子に変異が導入されることにより、そのペプチダーゼ又はプロテアーゼの活性が抑制されていることを特徴としている。本明細書に記載の「酵母」とは、単細胞性を示す真菌類のことをいい、担子菌酵母であってもいいし、子嚢菌酵母であってもよい。ある態様では、前記酵母は、シュードザイマ属、ロドトルーラ属、クリプトコッカス属、モエスジオマイセス属、ピキア属、サッカロマイセス属、又は、シゾザッカロマイセス属の酵母であってもよい。また、前記酵母は、ＰａＥ及び／又は他の組換えタンパク質を産生してもよい。前記ＰａＥを産生する酵母は、もともとＰａＥを発現するものであってもいいし、ＰａＥを発現するように形質転換されたものであってもよい。
【００１１】
前記ＰａＥは、植物常在性の担子菌酵母であるシュードザイマ・アンタクティカ（最近分類が変更され、モエスジオマイセス・アンタクティクス（Ｍｏｅｓｚｉｏｍｙｃｅｓ ａｎｔａｒｃｔｉｃｕｓ）と呼ばれることもある。）から、生分解性プラスチックを分解する酵素として単離同定されたクチナーゼ様酵素である。具体的には、前記ＰａＥは、Ｐ．アンタクティカのＧＢ−４（０）株（独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託された酵母；受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２３９２）、ＧＢ−４（１）Ｗ株、ＧＢ−４（０）−ＨＰＭ７株（独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託された酵母；受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２２３８）及びＯＭＭ６２−２株（独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託された酵母；受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２２３９）などにより産生され得る。なお、クチナーゼ様酵素は、そのアミノ酸配列中にクチナーゼと共通するリパーゼボックスを有しているものの、必ずしもクチナーゼのようなクチン分解活性を有しているわけではないし、タンパク質全体のアミノ酸配列に関してクチナーゼとの相同性が高いわけでもない。基質特異性に関しても、クチナーゼでは、短鎖脂肪酸エステルの分解活性が高く、長鎖脂肪酸エステルの分解活性は低いのに対して、クチナーゼ様酵素は、短鎖脂肪酸エステル及び長鎖脂肪酸エステルのどちらもよく分解する。このように、クチナーゼとクチナーゼ様酵素とは、それぞれ特性が異なる別種の酵素であると認識されている。
【００１２】
前記ＰａＥの分解に関与する少なくとも１種のペプチダーゼ又はプロテアーゼは、前記ＰａＥの産生条件下で産生され得るものであるので、例えば、前記変異を導入する対象遺伝子の候補は、前記ＰａＥの産生量が高まる条件下で発現されるｍＲＮＡ又はタンパク質と、そうでない条件下で発現されるｍＲＮＡ又はタンパク質とをそれぞれ比較するトランスクリプトーム解析及びプロテオーム解析によって選出してもよい。あるいは、ゲノム解析が進んでいる子嚢菌酵母のペプチダーゼ又はプロテアーゼのオルソログを、ＰａＥをもともと発現するＰ．アンタクティカのゲノムから、前記変異を導入する対象遺伝子の候補として選出してもよい。そして、各候補遺伝子を常法によって欠失させた変異体を作製し、当該変異体が産生するＰａＥ及びその分解物をウェスタンブロット法などによって確認することによって、前記ＰａＥの分解に関与する少なくとも１種のペプチダーゼ又はプロテアーゼを同定してもよい。また、このようにして同定されたペプチダーゼ又はプロテアーゼは、前記ＰａＥを直接分解するものであってもいいし、前記ＰａＥを直接分解するペプチダーゼ又はプロテアーゼの前駆体を切断して活性化させるペプチダーゼ又はプロテアーゼであってもよい。
【００１３】
ある態様では、ＰａＥの分解に関与する少なくとも１種のペプチダーゼ又はプロテアーゼは、以下の群から選択されるシュードザイマ・アンタクティカの遺伝子又はそのホモログ若しくはオルソログにコードされている酵素を１種以上含んでもよい。
ＰＡＮ１＿０１６ｆ０５３３０（配列番号１）
ＰＡＮ１＿００４ｒ０２２６６（配列番号２）
ＰＡＮ１＿００３ｒ０１８５６（配列番号３）
ＰＡＮ１＿００３ｒ０１６６８（配列番号４）
ＰＡＮ１＿００１ｆ００８４６（配列番号５）
ＰＡＮ１＿０１９ｆ０５８４５（配列番号６）
ＰＡＮ１＿０２４ｆ０６６８５（配列番号７）
ＰＡＮ１＿０１２ｒ０４５６４（配列番号８）
ＰＡＮ１＿０１０ｒ０４２２７（配列番号９）
ＰＡＮ１＿０１３ｒ０４７７９（配列番号１０）
ＰＡＮ１＿０２３ｒ０６５６３（配列番号１１）
各遺伝子の具体的な塩基配列は、以下のとおりである。
【００１４】
＜ＰＡＮ１＿０１６ｆ０５３３０＞
5'-ATGGCGTTGGGGAAAGGACCCCTTTTTGGCTCTCTGGCTCAGCTGACCGTGGCAGGGATGGGATCGTCGCCGGCTGCCCTCCACCCTTTTCTCGAGGCGAGGCGCAGCGGCGCAGCGTACGCGGCCAGTTGGAGAGGACTGCATGCAGCCGCTCACTTACACCGCCCAGCTGCCGCTCGCTCGCCAAGCCGAGAGAGAGAGAGAACCCTGCCGCATCGAATCAGCCCAACGGCTGCTCCACACCCCGGCCGCAACTCAGCACAGCTCAGCGCTATCTCTCTCGCGGTCCATCCGCACTGGCCCGCTGCTCATCCTCTGTGGCTGGCTGCGTATAATCGGCTGAGCGCCGCTTCCCCCTCTCCTCCCTCCTCCACCATCCTCCTCAACGTCCACTCATCTCTCCCCTCTCTCCAATTTAGGAGTGGCACAATGAAGCTCAATCTCTCGCTCACGTTTGTCGCCGCACTCGCCACCGCCTTTGCCGGCGTCGAGGCGGGCGTGCACAAGGCCAAGCTGCAGAAGGTGACGCCCTCGCGCGAGCTCACCCTCGAGGGCCTCGCCGCCCAGGCCGAGGTGCTCCAGCTCAAGTACGGCGGCGGTGCCTCCAAGAAGCAGGCGCCCTTCGCCGCCAACCCGGAGCACGACTTTAGCATCCAGCCCATCGCGCCCAAGGACTCGGCCTCGGCGTGGTATGCCGAAGCCAAGAAGGGCCACGGCGTGCCCCTCACCGACTTCCTCAACGCCCAGTACTTTTGCGACATCTCGCTCGGCACCCCCGCCCAGGAGTTCAAGGTGATCCTCGACACCGGCTCCTCCAACCTCTGGGTGCCCTCCACCAAGTGCTCCTCCATCGCCTGCTTCCTCCACAAGAAGTACGACAGCTCCGCCTCGTCCAGCTACAAGAAGAACGGCACCGAGTTCAAGATCCAGTACGGCTCCGGTTCCATGGAGGGCATCGTCTCGAACGACGTGCTCAAGATCGGCGACCTCACCATCAAGGGTCAGGACTTCGCCGAGGCCACCAGCGAGCCTGGCCTGGCGTTCGCCTTTGGCAAGTTTGACGGCATCCTGGGCCTGGCGTACGACACGATCTCGGTCAACGGCATCGTGCCGCCCATGTACCAGATGATCGACCAGGGCCTGCTTGATGCGCCCCAGGTGTCGTTCTACCTCGGCTCCTCGGAGGCCGACGGCGGCGAGGCGGTGTTTGGCGGCATCGACGACTCGCACTACACGGGCAAGATCCACTGGGCGCCCGTCAAGCGCAAGGGCTACTGGGAGGTGGCGCTGGACAAGCTCGCGCTCGGAGATGAGGAGCTCGAGCTCGACAACGGCTCGGCCGCCATCGACACGGGCACCTCGCTCATCGCCATGGCCACCGACACCGCCGAGATCCTCAACGCCGAGATCGGCGCCACCAAGTCGTGGAACGGCCAGTACTCGGTGGACTGCGAAAAGGTCAAGGACCTGCCGCCGCTCACGTTCTACATTGACGGCAAGCCGTTCAAGCTCGAGGGCAAGGACTATGTGCTCGAGGTGCAGGGCTCGTGCATCTCGAGCTTCTCGGGCATCAACTTGCCCGGCCCGCTCGCCGATATGCTGATTGTCGGCGACGTCTTCCTCAGGAAGTACTACTCGGTGTATGATCTCGGCAGGAACGCTGTTGGTCTCGCCGAGGCCAAGTGA-3'（配列番号１）
【００１５】
＜ＰＡＮ１＿００４ｒ０２２６６＞
5'-ATGAAGTTCCTTTCGCTCGCTGCGGCGGCCGCCAGTGCCGGTCTGCTGCTTCTCAGCGGCGTCGAGGCCGCCAACAACCCGGCTGTCGTCGCCGGTCCCAAGCCCATCGCCGGTCCTGCTACCGCTCCCAACGCTCCTGCCACGCTCAGGAACAGCAGGGGCAAGGTCGCCCAGCTCGAGAAGGCAAACTACGTGCCGCGCGGCTACATCGTCGAGCTCGAGTCGTCGTCGTCCAAGGGCGGCAAGCGCGACAACCCGCATGCCGAGGTGCACGACCACCTCGCCAAGCGCGGCAAGTCGTACAAGACGCGCTTCGAGTACAACGACCCCGCCACCTTTGTCGGCATGTCGGTCATCCTCGACAGCGACGACGACTACCAGTCGCTCGCATCCGCCCCGGGTGTCAAGAAGGTCTACCGCACCACGCTCTACTCGATCCCCGCTTACGAGCCTACCACTGTCTCGGACGAGTTCGTCAAGGCTGCCACCGGCAAGGATGGCGCTGCCGCCGCTGGCCCCGCTAGCCGCAAGAAGCGCCGCGACGAGCCCAAGAACGCCGAGCAGGGCTACACCGACACCTTCTCCCCCCACGTCATGACTGGTGTCGACAAGGTCCATGCCAAGGGCTTCCTGGGCAAGGGCCAGACCGTCGGTATTATTGACACTGGTATCGACTACACCCACCCTGGTCTCGGCGGCAAGCCGGGCAACAAGCCCTGCTTCGGCGCTGGCTGCCTCGTCATTGGCGGATACGCCTTCGTCGACGATGCCTTCAACGGTACCAACACTCCCGTCGCTAGCGCCGACCCCTTCGACTGCAACGGTCACGGCACCCACGTCGCCGGTACCGTCGCTGCCAACGACACCACCCTCGGCTTCACTGGTGTTGCTCCCCATGCCAAGATCCGTGCCTACCGTGTCTTTGGCTGCCAGGGCAGCACTCCGGACGACATCATCATCGCCGCGCTGCAGCGTGCCTACTTTGACGGAAACGACGTGCTCAGTCTCTCGCTCGGTGGCCCCGGTGGCTGGAGCGAGGCTCCCTCGTCGGCCGTCGCCTCGCGTATCGCCAGTCTCGGAACTCCTCTCGCTATTGCTCAGTCCAACTCGGGTGCCTACGGTATGGCTTACGCTTCGTCGCCTGCCAGCGGTGATCTCGTCATGAGCGTCGGCTCGGTCCAGAACACCGACCTCACCGGTATCTCGGCCGCCATTGTCCCCAACACTCTCGACCGCAAGACCGTCACCGTGCTCAAGGGATCGCCCTTCACCTTTGCCGATGGCCAGTCCAAGACGCTCGAGGTGTACCCGACTTCGTCCAGCCTCACTGTTACCGACGACGTCTGCTCTCCCCTTCCGGACTCGACACCCGATCTGTCGAACAAGGTCGTCCTGGTCGGACGTGGCACTTGTCTCTTTGCCACAAAGTTCCAAAACATCGCAGCAAAGGGCGGCAAGTACGTGCTTGTGTACAACTCGGCGGCTTCCATCACCTACGTCGAGACCGACGTTGCCGGTCAGCAGGCTGCCTCGCTCACCCGCGACGACGGCCTCTACCTCAAGCAGCAGATCAACAACGGCGTCAAGGTCTCGCTCGACTTTAGCAACTCGCAGATCGCCACCATCAAGGACACTGCCACCGGTGGCCTCATGAGCTCCTTCTCGACCTACGGCCCCACCTACGAGAACCGTCTCGACTCGCCCACCACCTCGGCTCCCGGCGGCAACATCCTCTCGACCTACCCGATCAAGAAGGGTGCGTACGCTATCCTCTCCGGTACCTCGATGGCCACGCCGTTCATGTCGGGCTCCATCGCCGTCTTCCAGGCCGCGCGTGGAAAGTTCTCGCCCGATGCGCTCAACAGCATCTTCTCCAACACTGCCGCCCCACTCATGAACGACACAACGAGCAACCTGTACGAGACCGTCGCCAAGCAGGGTACTGGTCTGGTGGACGTCAACAAGGCGCTGTACCAGCAGATCACGCTCAGCCCCTCGGTGATCGAGCTCAACGACACGGTGCACTTCAACGGCTCGCAGACCATCACGGTCAAGAACCTGGGCAGCAAGCCGCTGGCGTATAAGCTCTCGCACCTCCCCGTCGGCACCGCCCAGTCGCAGGAGGACGACTCGATCTTCTTCAACCTCGCCCCCGTGCCGCTGAGCACCAACTACGCCAGCGTCAAGTTCAGCAAGACCAACCTCGTCGTGCCGCCCAAGGGCACTGCCAAGTTCACGGCGACCTTCACGCCGCCTGAGGGTGTGCGCACGGACAAGCTGCCCTTCTACTCGGGCTTCATCCACCTCGAGCCCCAGTCCAAGGACTACAGCGCTGCCAACATCGCCTACGGTGGCTACAAAGCCGACACGTCCAAGACGCAGATCCTTGACAACACCTCGGAACTGTTCGGCGTGGGACTGCCCGTTCTCGCCTCGGCTGATGGCAACACGTTTATCGAGTCGGATAACACCAGCTACAGCCTGAGTAACGTTGCCAACTGGCCGCAGTTTGTGTACCGCCTCAACTACGGTACGCCTTACCTGCAGATCGACCTTGTCAACGCCACCACCGACTTCAAGCCCACGTACAACGTCGACGGCTCGGCCGCCCAGAGTGCAGCTGCCAACCACAGGAGGTTCATCCACCGTCGTCAGCTCAACGGTCAGAAGACGCCTCAGCCCATGCCTGTGCCTGGTGGTCCCAAGCCTCCCGCGCCCAAGCCCGGCAACGGCCCCAAGCCCAAGCCTGGTCCCAAGCCCGGTCATGGCGGTGAGCCTGCTCCGGCTCCCAAGCCCGTCGCGGGTGCTGGCTTTGCCGACGTCAAGACGGTGGGCATGCTCGCCAACGGCTACTACAGCGGCAGGAACAGTGCGACCGGTCAGCTGGCTGACTACTCGTACAACGTTCAGCTCATCACCCCGCAGCTCCAGCTGCCCCAGAACGGAAGCACCACCCTCACTCCGGGTACTTACAAGGTGCTTCTCCGCGCCCAGCGCGTGCTCACCGAGGGCAAGCTCGAGAGCGACTACGAGTCGTACCTCTCGCACGCCTTCACCATCACCGCTTAA-3'（配列番号２）
【００１６】
＜ＰＡＮ１＿００３ｒ０１８５６＞
5'-ATGATCGCTGGATCGTTCACAGCTTCCAGACTCTCTAGGGGGAGCCTTTCGGGCATCGGCCGCCTGGCGCTGCGTGTGCCCGCAGCAGCACGTTGCTACACCGCCGGCAGCCTCAAGATCAATGCGGACCGAATGATGAAGACGCTGCACGAGACGTGCGAATGGGGCGCAGCGCACCGATACGGCGACGGACCATTCGAGACGGGTATGGCGCGTCTGACGCTTGACAAGGACGACGCGACTGCTCGACGCTGGCTGTGGAAGGAGGCGGAGAAGCTAGGCTGTTCGGTGGACGTCGACGAGATGGGCAACATGTTTATGATCCGCAAAGGCAAGAAGAACGGCAGACCCACCGCGATGGGCAGCCATCTGGACACACAGCCGACGGGTGGAAGGTACGACGGCATCCTGGGCGTGATGGCCGGACTGGAAGCGCTGCGCACGATGAACGACCACGATCTAGAGACCGAGTATCCCGTGGCGCTGGTCAACTGGACCAACGAGGAGGGCGCACGCTTCCCACAGTCGATCGTCGGCTCGGGTGTGTGGTGCCACGACGTGCCGCTGGAGAAGGCATGGAATCTGCAGGACGTGAAGGATGCGTCGCTCACGATGAAGTCGGAGCTCGCCAAGATCGGCTTCCTCGGATCGACGCGGTGCAGCCACGAAGCCACGCCACTGGCGGCACACTTTGAGCTTCATATCGAGCAGGGTCCGATCCTGGAAGCGACGGGCAAGAAGGTCGGCATCGTTCAGGGTGGACAGGCGTACAAGTGGTTTGACATCAATGTGCGCGGTCGTGAATGCCACACGGGATCCACACCGTTCGACACCCGCTCCGACGCCATGCTGTGCGCATCGCGCATCATTGTCGAGAGCAATCGCATCGCCAAGCAGCACAAAGGCCTTGCAAGCACGGTAAGTCTCGACTGTACAGACGCAGGTCTTGAAGAATCTCAGCTGACGCCTTGGCTGTGCTCCGCGTTTCGGCGGAATTGCAGGGCATCTTGCGCCTCTCGCCTGGAAGCGTCAACACATGCCCTGGCCATGTCTTTTTCACACTGGACGTTCGGCATCCTTCGACGGACAAGCTCGCGGCGCTGTGCGGTGAGATCGAAGCGGCGGCGCAGCGAATCGCGGCCGAGGAGAGCGGAAAGGGGTGCAGCCTCGAGTGGGTCGAGACGTTCGACAGCCCAGCGATCACGTTCCACCACGACTGCATCGACAGCGTGCGCAAGGCAGTCGAGGCCAACTACGGCAGCGATGCAGGCGTTGACATCTACAGCGGCGCAGGCCACGATACATGCTCGACCAGCAAGGTGTGCCCATCCTCGATGGTCTTCATCACGAGCAAGGAGGGCATCTCGCACAATCCGCGGGAGTATTCGTCGCCGCAAGACTGGTGGGTACAGCTGCGCCGTGATCTGCGTGAGAACCGGGTGGGCGTGAAAGCTGAAACTGACTTCATTTAACCTTGTGTGGCTGCGCAGTGCGACCGGTGCGCAGGTCCTCATGGATGCAGCACTGCTGTACGATTCGCAGCGCCAGCAATGAAGTGCGCGGGAAAGAAAAAGCCCCGCTCATCAGCCACAGATCGCCGACACAATGGTACCAACAGATATGAACACCGGTGATGCTGATTGTGACAGGCAGTCACGGCAACGTCCGAGGCAATGGTGGGAAGTCGCGGCAAGGCGGCTCCAAGGACTGCTGCTGCTGCTACCCTGGGTTGGTCGCGCGGGGTAAGTTGAAGTGACTTGGCGGCTGAATCCCGCTCGGCTGCAGCTGTGCATGTCTCAGCGTGGATTGGGCTAGGTGGAATTGGGACGCCACGAGAGCAGAGCTTAAATTTGCCGTGGGCGCGTGCAATTCGGCAGCTTTTGGCGCGCGTTGGAAGCGCAAGGAGGCCCGTGCTAGGTTAAACTCTCTCTGGCGCTGCAGATGCCTCTCTGCCTTCGGATGAGCTTGTGGATGGCGCATGCGGATCGTCTCGGACACCAATGAGGCGTAGAAGAGCAGAAGAGCAAGGTGGCTTGAACGGCGCTCGATTGGATGCGCATCCGAGCGTCGGCCGGCGGGCGCTAACGCAAGCCGATGCTGTGTGAACACGGCAAGGAGGTGGGAGAAGCTTGCGCAGCGCACAAAGCCTCGCTTTGCTGCAGGGAGCGACAGGGAGCGACAGGGAGCCCAAGGTGCGGATGTGCCTCGGGTTTGCGCTCGAAGCACCTCGACGCTCGGCCCTGAGCTACCCGTGGGCTGCTCGACAACCGATTGCCGAAGCTGTCGGTGCGCCCATGCATGCCTTGGTGTTGCGCAGCGCAAGAATATTGACTCGCCGCCACTCGCTGTTGAGCGCCCGCAGCTACGGCATTCCGCTAGCTCAAGCTCCGCCGCAGCCTCCAGTCCGCCAAGCTGTCCCGCACCCTATCCCCCCCACCACCCTCGCGTATAAAGCACACCCGCGCTCGTCGCCTGCGCCATCTTTGCCCGTCTTCCCAAACCCCACCCTGCTTAAGCCACTCGATTCCCCATCCATCATGGCAGCTCCCTATACCGACACGGGCGTCAAGCCCGACGACTTCACCGAGTTCGACTATGTCGTCGTTGGCGGCGGCACGGCGGGTCTGGCGGTGGCTGCGCGTCTGTCTGAAGACGCCTCCGTGTCGGTCGGTGTGATCGAAGCGGGGCTGTGGCGTCCCGAGTGCCCCAAGATCAACTACCCGGCGTTCATCGGTCAGACGCCCATGAATCCGGACTACGACTGGTGCTACGAGACCGAGCCGCAGCAGCACTCGAACGGACGCAAGTACCCGTGGCCGCGCGGCAAGGTGCTCGGCGGCAGCAGTGCGCTCAACTTTCTCGTGTGGCAGCGCGGCTACAAGGGCGAGTACGACGACATTGGCAAGCTCGGCAACTCGGGCTGGTCGTGGGACGACTTTGCCAACTTTGCGCGCAAGAGCGCCACGCTCGAAAAGCCGGCCGAGCAACTGCAAGAGGCACACCTCGCCACGTACGACGAAGAGGTTCACGGCTCCGACGGTCCGGTTCAGACCTCGTACAGCAAGTGGTACACCGAGGCGCAGCGTCCGTGGTTCGAGGCGCTCAAGAGTCTCGGCCTCGCCAATGTTAGGGACGGTCTGGCCGGCAGCAACGCCGGCTTCTGGGTCTCACCTGGTACGCTGTGCCCCAAGAACGGCGTGCGCTCGTACTCGGCCAGCGCCTACTATGCTCCCAACGCCAAGCGCTCCAACCTCAAGGTCATCACGGGCGCCCTTGCCTCCAAGATCCTCTTTGGCGAGGCCAAGAACGCTGCAGGCGAGCTCGTCGCCTCGGGTGTCGAGTATTCGGTCGACGGCGCTAGCTACACCGTCAAGGCGCGCAGGGAGGTGGTGGTGAGCGGCGGCACGATCAACAGCCCGCACCTGCTCGAGCTCTCGGGCATCGGCAAGGCGGACGTGCTCAAGGCAGCAGGCATCGAGCAGCGCATCGAGCTCGACGTGGGCGAAAACGTCCAGGACCATCTCTACACCACCACCACCTTCAAGCTCAAGCCGGGCCACACCACCTGGGACAAGATGCGCCAGGACGACTTTGCCAAGGCGGCCATGGAGCAGTACGCGGCCGGCGGCGACGATCGCGGCATCGTTGCATCGATCATCTCGGGCTTCGCCTACGTCCCGCTGAAGCAGTACCTCTCTGCGGACGAGATTGCCAAGATCAAGGACGAGGTGGCCAAGATCGACTGGAGCCAGTACTCGAACGGCGTGCGCGAGACGGTTCAGCTGCAGCTTGCGCGTCTGGACGACGAGCAGTGTCCCTTCACCGAGTTCATCTTTACACCGGGCTACTTTGCAACCTTCTCTGCGCCAGAGGAGGGTCAGGAGTACTACAGCATCCTGGCGTGTCTGCAGCAGCCCTTTTCGCGCGGCTCCATCCATGCTGCCTCGTCCGACCCCGCGCAACCGCCCAAGATCAACGCCAACTACTTTAGCGTCGACGCGGATCTCGAGATCCTCTCCAAGGCGGTCAAGTACTGCGACACCATCACCACCACTTCTCCACTCAAGGACATTACCGTGGCAAGGCAGGATCCCGATCCGGAGAAGTGCACCACGGACGACGACTTCCGCGAGTTTACAAAGGACGTCACCAGCACCGAGTACCATCCGATCGGAAGCTGCTCCATGATGCCGCGCGACAAGGGCGGCGTGGTGGATGCAAGGCTCAAGGTGTACGGTACCGCCAACGTGCGTGTGGCCGATGCCTCCATCATCCCCATCCACGTCTCGTCGCACATCCAGTCCGCCGTTTACGCCGTCGGCGAAAAGGCAGCCCACATGATCCGCGAGGATGCCAAAAAGGCCCACTAG-3'（配列番号３）
【００１７】
＜ＰＡＮ１＿００３ｒ０１６６８＞
5'-ATGCGATCCTCCTGGCTCTCCACCGCCTCGGCCGTGCTCGTGTGCGCTGCTGCGCTCGCCAACTCGGCCAAGCTCCCCGCCCCCGTCGAGCAGATCCACTACGACCAGTCGGGCAACCTCGTCTGGAACGGAGATGCCGACGCGAGTCCCGCCGTCCCTTCGCTCGGCCGTCCCGACTTTTCCGGCCTCAGCCTCAGCGACATCGCTGCTGCCGCTGCTCCCGCCAAGCAGGCCGCCCAGGACGTCTACGCCGACTCGATGAAGTACGCCGACGACGTTCTCTCCTGGGCTGAGCACGAGATCGAGCGCATCGAGGACAAGGTCCAGGAAGTCGTCGCCGGCACTCACAAGGAGATCAAGGACTGGATCCACACCGGCAAGGTCCTCGTCGATGGCCTCGAGTTCGAGCGCCTCACCCACCCCGCCTTCCCCGAGTACTCGCTCCGCCTCAACGCCAAGTCCGAGTCCTTCTGCGACCAGGACGTCGTCCAGCACAGCGGCTACCTCGACATCTCGGACTCCAAGCATCTCTGGTTCATCTTCTTCGAGTCGCGCAGCAAGCCCAAGTCCGACCCCGTCGTCCTCTGGCTCAACGGCGGTCCCGGCTGCTCCTCCTCCACCGGTCTTCTCTTCGAGCTCGGCCCCTGCCGCGTCACCGACGAGGGCCGCGCCGTCAAGAACAACCCGCACTCGTGGAACAACAACGCAAACCTCCTCTTCCTCGACCAGCCCGTCGACGTCGGTTACTCCTACTCGGACAACGACTCGGTCAACAACTCACCCGCCGCTGCCGAGGACGTCTACGCCTTCCTCCAGCTCTTCTTCACCAAGTTCCCCGAGTACTCCAAGCTCCCCTTCACCGCCTCGGGCGAGTCGTACGCAGGCACCTACCTGCCCAACATCGCCTCCACCATCTACAAGAAGAACAACAACCTCGCTCTCTCCCGCTACGCCAACCCCGAGCTCGCTCCCAAGCACATCAACCTCGACACCGTCATGATCGGCAACGGTCTCAGCTCGCCCCAGTACCAGTTCCCCTCCGTCCCCACCTACGCCTGCGGCGCCGAGAACAAGTATGCGCTCTTTGACCCTTCCAGCTCCACCTGCGCCACGCTCGAGCAGCAGGCCACCACATGCAAGTCGCTCATCGAGTCGTGCCAGAAGTACAACTCGCGCCTCACCTGCACGCCCGCCGCGCTCTACTGCTGGAGCCGCCTCTACGGCCCCGCACAGGAGACCGGCAGGAACCTGTACGATGTGCGCAAGAAGTGCGACCGCGAGAAGGACGGCCCGCTCTGCTACAAGGACATGGAGTACATCGAGACGCTCCTCAACACGCCCAGCATCAAGAAGAACCTCGGCGTGCCCGAGTCGGTGAACTTCCAGTCGTGCAACATGAACATTAACCAGGCCTTCCTCCTCCAGGGCGACTCGATGCACGACTCGGCCGCCCTCCTGCCCGAGCTCATCGAGGACGGCATCCGCGTCCTCATCTACGCCGGCGAGGCCGACTTCATGTGCAACTACATGGGCAACCTCGAGTGGATGCAGAACCTCCAGACCAGCTACCTCGACGACTTTAACAACGGCACTGCCCAGGACTGGATCGTCAACGGCAAGAAGGCCGGCTCCGTACGCAAGGGCGGCAAGGGCGCCGGTTCCGTCGCCTTTGTCAGGGTCGCAGAGGCCGGTCACATGGTCCCCTACGACCAGCCCGAGAACGCGTTGGACATGATCAACAAGTGGCTCGCCAACAAGCCTCTTGCTTGA-3'（配列番号４）
【００１８】
＜ＰＡＮ１＿００１ｆ００８４６＞
5'-ATGGAAGCAGGCAGGAGAGGCTCGGATGAGAGGCTGCCGGATGTTGCATACGGCATGGGGGGAGGGACCGGCGAGGTGTTGATGGACTGGGATTGGATCGGGCGAGGTTGAGCCGAAACGCGGCAGTCGGCGCCGCTACCGGCCACACTATGCGGCGCTTATTTGGACTTCGCTCCGATGAGCTCCCAGGCCCCAATCTCGCGCCTTGCTCGGTCAATCGCAACGGACGCTTTGTGCAAGATACCTAGCCTGGTCTTCAGAGCCGTGCCGCTCGTCTGACCAGATTCCAAAGACGAAGAAGAGAGCACTTTCGGACGTCACGGACTGTGTTTAGCGCACGGTGCACCTTGCGAAAAAAAAAGGGTCAAAAAGTCGAAGGAGACCAACACAGCTCGCCATGTCGCGTGCCGGCAGCAGAGAGAGAAAAAAAAGGGGGAGAGAGAGAGAGGAGAGCGGGTGCAGCTCAGCCGAGCGTCGACGGTGAGCTCTCTGCCTGCCCTCTTCGGACTCCTCCCGTCCGCTGCAGCCGCCTCCTCGTCGGAAGCACACCGCACTCGATGGAATGCCTGCGCTGAGCCTTCTTTAGAGCTTTGGGCGACTGGCGAAGCGTCTTCAGCGTCGCCATCAAAGTCAAGCGCTTGCTCTGCTACCACCATCACCACCATCGTCTCTCTCTCTCCCCGTCTCGATCCGTGTCTCGAGTTTTTCTCTTTGCGCGTGGCTTTCCTACTCCACTCCACCCAGCAAGGCCCGCATTGCGCATTTCAGAGGCCATCTCGCGTCGGTTGCAAAAGAAAAATCGCGTTCGTGCGTAAGTGCTTTTTGGGCTTCCCGGGCTCCGTTGGCACCGGCCGGCCACCCTTCGTCAGCCGCCGCTGTCGTCGTCCGTCGCTCGCTCGGGCCAGCCAGCGATCTGTGCGAGAGCCTGTGCATTTGGCTAACTGAGCTTTTTTCCGTTGCCTTCCCTCCCCTCTCTCGCCACCAATCCACTTTCTCTTCGCGTGCAGATGAAAGTGAACTCGCTCCTTGCCTCCTGCATTCGAGCCCAATCAGCTCCACGTTCAATCCTTCGTCCCCACACTCTCGGCGCCAACCCCACCGTCGCAAGCCTCGCTCGTGCTCACACGCCGATTCGCCCTCGTCTTCTGCAAAACCATCTTGCAAAGGTACGCTTTCTCTTCCTCTTCCCCCAGCGGTGATTTCCCAAACTTCTTCTCGCCCTCGCAGCTTCAACTCTTCTGCACACGCAGCGGCTACATGTCGCCATCTGATCCGCGCCGAGCCAGAAACACTTACATCGCATTTGCGCTCTCCATCTGTGCTGCTCTGGCTGCCGTCCTCGTCGCTCCATCCTTTGGCGATTCGATCTGGCAGTCGCTCCGCTCCTCGGTCGGCTCTACCTTCCACCGCACCCACGCAACTTGTGCCCTCGCAGACCCAGCCTTCGCGCCCGTCTCTTCCACCATGACCGACGCCACCGACGCCTCCAAGTGGTTCCGCTTGCCCCGCAATGTCGTGCCCACCCACTACGACATTACGCTCAAGTCCGACCTCGAGGCGCTCCAGTTCTCCGGAACCGCCACCATCGACCTCGACGTGCTCGAGGACACTGACTCGATCGTCTTCAACGCCGCCGAGAAGCTCGCCCTCTCCAAGTCCCTCGTCCTCAGCCAGGCGCTCAAGACCGACAACAAGAGCTTCGTCACCCTCGACATCGACGCAAAGCATGAGCGCGCAACCGCAAAGCTCCCCAACACCCTCCCCAAGGGCTCCAAGGCGCAGCTCGTCGTCGCCTTCGCCAGCGACATCGACAAGAGCATGATGGGCTTCTATCGCTCCACCTGGGAGCACGAGGGCAAGAAGGGCTACTACGCACTTACCCAGTTCGAGCCCACCGCCGCCCGCCGCGCCATCCCCACCTGGGACGAGCCCAACCTCAAGGCCACCTACACCTTCCGCATGATCCACCGCAAGGACACCACCGCCCTCGCCAACATGAACGTCGTCAGCTCCCACGACATCTCCCAGTCCGAGCAGGACAAGCTGCTCCGCGCCGCCGAGCTCGGCCTCGACGACATCCTTGCCACCACCAGCAAGACCGAGGGCAAGACCGAAGGCAAGACCGAGGGCAAGACCGAGCTCGCCTCCACCGCCTCCAACGACTGGACCGTCACCGAGTTCGCCACCACGCCCAAGGTGTCCACCTACCTCGTCGCCTGGGCCAACGGCCCCTTTGTCAGCATCGAGAGCAGCTACACCAGCCCGCTCACCGGCAACGTCATCCCCATGAAGGTCTACACCACCCCAGAGTACATCCACCAGGCCCAGTACGCGCTCGACGTCAAGGTCAAGGTGCTCCCCGAGTACGAGCGCGTCTTTGACGTCGCCTACCCGCTCCCCAAGCTCGACACGCTCGTCGCCTCCGACTTTGACGCAGGCGCCATGGAGAACTGGGGCCTCATCACCGGCCGCACCTCGGTCTACCTCTACGACCCCGAGAAGTCGGGCCTGCAGTCGCAGAAGCGCACCGCAGGCGTCCAGTCGCACGAGGTCGCGCACCAGTGGTTCGGCAACATCGCCACGCTCGACTGGTGGGACAACCTCTGGCTCAACGAGGCCTTCGCCACGCTCATGGGCGAGGTCGTCATCCTCGACCGATGCTTCCCCGAGTGGGAGTCCGCCTCCGAGTTCATCAACGTCCACCTCGACCGCGCGCTCGACCTCGACGGCAAGCGCTCCAGCCACCCCATCGAGGTGCCGCTCCAGGGCGAGAACGTCGAGGACGCCATCAACCAGGTCTTTGACGCCATCTCCTACTCCAAGGGCGCCAGTGTGCTCCGCATGCTCTCCAACATGATTGGCGAGGACGTCTTCCTCAAGGGCGTCTCGATCTACCTCAAGAAGCACCTCTACTCCAACGCCGTCACCAAGGACCTCTGGAACGGCATCAGCGAGTCGTCCGGCCGCGACATTGCCTCGATCATGGCCAACTGGGTGCTCAAGCAGGGCTTCCCCGTGCTCACCGTCACCGAGGATGCCGATGGCCTCACCGTCAAGCAGAACCGCTTCCTCTCCACCGGCGACCCCACCGCCGAGGAGGACAAGACGCTGTGGTACGTGCCGCTCATGCTCAAGACCGTCGGCGCCGACGGCAAGGTCGCCGTCGACCGCGACGCCTTCCTCAACAGCGAGCGCGAGGTCAAGATCCCGCTTGCCAACGCCAAGGACGCCACCTACAAGCTCAACGCCGAGACCATCGGCGTCTACCGCGTCGCTTACTCGCCCGAGCGCCTCGCCAAGCTCGGTGAGGAGGCTGCCAAGAAGGATTCGGCCTTCTCGCTCGAGGACCGCCTGGGTCTGGTCTCGGACGCCTTTACGCTCGCCTCGGCCGGCTACGGCAAGACGTCCGGTGGTCTGTCGCTTGCCAAGGCGCTGCGCAACGACCCCACGTACCTGGTCAACTCGGCGTCGTCGCTCAACCTCGGCACGCTCGCCAGCGCGTGGTGGGAGCAGGATGCGCAGGTGACGGGCGCGATCAAGAAGCTGCGCGCCGACATCTTTGGCCCTACGGCCAAGAAGCTCGGCTTCGAGTTTGGCGCCGACGACTCGCCCGATCTCAAGCAGCTGCGTGCGGTCGCCATCGCGGCTGCGTCTGCGGGCGAGGATGCGTGGACGCTGGGCGAGATCAAGAGGCGCTTTGACCACCTTGCCACCACGGGCGACGACAGCCAGATCCACCCGGATCTGTTGCGCACCACCATGGCGCGTGCGGTCGAGCACGGTGGCGAGAAGGAGTACGAGGCAGTGCTTGCCATTTACCGCAAGCCTTCGACGCCTACGCACAAGATTGCGGCCATGCTGGCGCTGGGTGCGTCCAAGGACGTTGCGCTGCTGGAGCGCACCGTGGACTTCCTGTTCGGTGACGAGGTCAAGGAGCAGGACTTTATGTTCTTCTTTGCGGCGCTGTCGGGCAACCCTGCTGGGCGACGTCTGATTTGGGATGCGACCAAGAGCCGCTGGGAGGCGCTGTCCAAGCGGTTCGCGGGCAACTTTTCGCTCTCGCGCATCATCGAGTACTCGTTCAGCGCCTTTTCGTCCGAGCAGGATGCGCAGGATGTGGAGCAGTTCTTCAAGGACAAGGACACCGCCAAGTTCTCCATGGGTCTCAGCCAGGGTCTCGATGCTGTGCGCGCCCGCGCTAGGTGGGTCGAGCGCGATGCCGAGGATGTCAAGCAGTGGCTCCAGGCCAACGGCTACCTTGCCTGA-3'（配列番号５）
【００１９】
＜ＰＡＮ１＿０１９ｆ０５８４５＞
5'-ATGCAGTTCAAGAGCCTCGCCGTTATCCTTGGCGCCGCCCTCATGGTGGCGTCGCCCGTCTTTGCCGCCCCCGCCACGCGCACCTGTGGTAACACCGAGGTTGCCCCCGCTGATGTGGAGCAGGCTCTCTCTGCCCGCGTCGCTGCCGCCCGCTCGGCCCGCACCTCCGGGAGTACTAGCGACCTCGCCTTCACTTCCGCCAGCATCCCCGTCTACTACCACGTGATCACCGACGGCACCAACGGCCGCCTCACCTCGAGCCAGATCAACTCTCAGATCTCGGTTCTCAACCAGGGCTACTCGGGCACTGGTGTGTCGTTCTACCTCGCCGGTACCGAGACCACCGTCAACTCGAACTGGTTCAACAACGTTAACCAGGGCACCTCTGCCGAGGCTGCCATGAAGAACACCCTCCGCAAGGGCGGTGCCAACGCGCTCAACGTCTACACCGTCAACTTCACCGGCGGTCTTCTCGGTTACGCCACTTTCCCCTGGAGCTACGCTTCGGCTCCCAAGAACGACGGTATCGTTCTCCAGTGGACTTCCTACCCCGGAGGTCCGATCTCAAACTACAACCAGGGCAAGACTCTCGTCCATGGTAAGCTTTTTTTCCATCAAACATTGTGGATTCGTTTGACCATATACTGACAATCGAACTTGATACTTTTTGATGCCAATAGAGGTCGGACACTGGGTTGGTCTTTACCACACCTTCCAGGGCGGTTGCTCCAGCCCCGGTGACTACGTCGACGACACCCCCGCTCAGGGCCAGCCCACCCAGGGCTGCCCTACTACTGCCCCCGACACATGCTCGGGCGGCGGTGCTGACGACATCAAGAACTACATGAACTACAGCTACGACGTCTGCCTCACCCGCTTCACCGCCGGTCAGGTCTCGCGCCTCCAGGCTGCCCTTGATGCCTACCGTTAAAGCAACGGGATCGACCCCAAAAGAACTCGTTCCGCAGGTCTCGTCGTCGGGCTTGCATGTCACCTTTCGCCTTCGCACCGCATCTTTTCTAGCCGCACTTTTGGAATCAACAGCTTTTACATTTGAGCGTTTCGACTGCCAGCCTGTACGGGCTTCTCGTCTTCTCAGCAACCCACAACTTTTGCAGCCTCAGTGTTTGAAGTGATCAACGACTTTGCTTCAGGATGCGAGCCGCTCGTACGAGCTCCTCCTCCGGTCTGTGGAATCGACGCGCCACCGGGGTCTGCAGCTGCAGCGCTGTCGATTTCCGCCGCGCCAAAATTCCAAATCCCGCACACTGACGTCCTGCCTGCCCGGGCAAACGCCGCGGAATTGCCCGACGCCACTTCCCGCACTTTCCGCACTTTCGGCACACCGCAGCTCCTCACGCGCGGAAGCTCGCAATCAGCTCCAACACCCCGCGAGCACATGCGGTCCGCTCCTCCGCAGCAAGACTCTCCGCGTTGA-3'（配列番号６）
【００２０】
＜ＰＡＮ１＿０２４ｆ０６６８５＞
5'-ATGCTCAAGTTCAGCCTGCTCCAGCTCACCACGCTCGCACTCGTGCTGCTTGGCAGCCAAGAAGCACTCGCCGCACCAGGCAAGAAGCGCCCTGTCGAAGCCGTGAGTTTCCTTTAGCAGGCCGTCGCGATGTTGAATCGCTCGCTCACCACCGTCCTCCTTTTGCAACAACAGAAACGCCTCCGCAACGATGTCAAGCGCAAGGATCTTCTCGACGGCGCCAAGAGGCTGCAGGAGATCGCCTACGCCACCACGGAGCGCAACCGCGTGTTTGGCTCGCCCGGCCACAAGGCGACGGTGGAGTACATCCAGAGCGAGCTGCGCAAGGCGGGCGACTACTACGACGTGTACCTGCAGCCCTTCACCGCGACGTATGCCGAGCACTCGGCCGAGGTGGCGATCGACAACAAGGCGGTCGAGTCCAACACGTTCACCTACTCGCCCAATGGCGAGTTCAACGATCTCGAACTCGTACCCGTCAACAACCTCGGTTGCGACCAGGCCGACTTCCCCGCAGGCGTCGAGGGCAAGATCGCACTGATCAAGCGAGGCACTTGCGCGTTCGGCATCAAGGTCGCTCGTGCGGGCACGGCCAAGGCGGCTGCTGTGCTCATCTACAACAATGCACCGGGCGATGTGTCGGGCACGCTCGGCAGTGCAGGACCTACGCCCGAGGGCCCCTTTGTGCCCGTCGCCGGCGTCGACCAGGAGACCGGTGACGCTCTTGCGGCTCGTCTGGCTGCGGGCGAAAAGGTGACGGCCGACATGAAGCTCGAGGGCGTCATCGAGGACCGCACCACGCACAACGTCATCGCCGAATCGCGCGGCGGCTCCAAGGATCAGGTTCTCATGCTGGGTGCGCACTCGGACAGCGTCACCGCCGGTCCCGGCATCAACGACAACGGATCCGGTTCGGTTGCGCTGCTCACCGTCGCCAAGAACCTGGCCAAGTACAGCGTGAACAACGCGGTCCGCTTTGCCTGGTGGTCGGCCGAGGAGTACGGCCTGCTGGGTGCCGAGCACTACGTCGGCGAGCTCTCGCAGCAGCAGAAGGACCAGATCCGCATCTACCTCAACTTTGACATGATCGCCTCGCCCAACTATGTGCTGAGCGTGCACGACGGCGATGGCAGCACCTTCAACACCACCGGCCCCGCCGGATCGGCGCAGGCCGAGGCGATGTTCTTTGACTACTTTAAGAACGTCGCCAAGAAGCCGCTGATCGAGGGACCCTTCGATGGCCGTAGCGACTACGGGCCGTTCCTGGACGCCGGGATTGCTGCTGGCGGTCTCGACACTGGTGCCGAGGGTCTCAAGACCGAGGAGGAGGCCAAGCTGTTTGGCGGCGAGGCGGGCATCGCGTACGACCCCAACTACCACGCGGCTGGCGACACCATCGACAACCTCGCCATGGAGGCGTTTGAGGTCAACACCAAGGCCATCTCGCACGCCGTCGCGCTCTACTCGACGTCGTTCGACAGCCTCGGCCCCCGCGCCAAGGTGGCAGCCAACCGCAGGGACGTCGCCAAGAAGGTCGACCACAGCAACCACCGATGCGGCGGCGACCTTGCGCTTCTGTGA-3'（配列番号７）
【００２１】
＜ＰＡＮ１＿０１２ｒ０４５６４＞
5'-ATGTACACGAAGCGATACCTCGGCCTCCTGGCCCTCGCTCTGAGCCTCCCGCTCGCCGCGCTCGCCGCTCCCGCTCACCAGCCCTTCGTGCCCGGTTCGAGCGCCAACGCATACTCCCCCTCGACTCAGTTTGCGCCCCTCACCGCAAACCCTGACCTCGAGACCATCCCGGGCGCCTACATGGTCGTCCTCAAGGATGGCGTCAGCTCCGCAGACTTCTTTGCCCACCAGGGCCTCATCTCGTCCGCTCAGCTCTCGGCAAACGGCTTCCACGGCGAGGATGCGGAAGGCATCCGCCACGTCTACGACCTCGAGGGCCACCTCCAGGGCTACGCCGGCAAGTTCACCGATGACGTCCTCGACTACATTCGCGCACAGCCCGAGGTCGAGTACGTCGAGATGGACTCGCGCGTCTCGATCGAGGTCATGCCTCAGGCCGAGGACAAGACCTGGGACGTTCAGTACGACGCCGACCTCGGCCAGGCCGCCCTCTCGGTCATGAACACGGACAAGGTCGGCGCCTATGACATTGAGAAGGGCGCCCCCTGGGGTCTCGCCCGCATCTCGCACCGCAAGCGCCTCGGCCTCAGCACCTTCAACAAGTACGTCTACCAGGGCGACGGCGGTGAGGGCGTCACCGCCTACATCATCGACACCGGCATCAACATCAACCACGTCGAGTTCGAGGGTCGCGCTCGCTGGGGCAAGACCATGCCCCAGAACGACGTCGACGAGGACGGCAACGGTCACGGCACCCACTGCGCCGGTACCATCGGCTCGCGCAAGTACGGCGTAGCAAAGAAGGCCGACCTCGTCGCCGTCAAGGTGCTCGGCTCCGGCGGCTCCGGCTCCATGTCGGACGTCACCGGCGGCGTCCTCTGGGCCGTCGACGACGCCAAGAAGCTCACCGCACAGTTCCGCGCCAACCCGCGCTCGGCGGCGGCCAAGAAGCACAAGGGCTTCGTCGCCAACATGTCGCTCGGCGGCGGCAAGTCGATCACGCTCGACAAGGCCGTCAACGGCGCCGTCACCGCAGGCATGCACTTTGGCGTCGCCGCAGGCAACGAGAACCAGGACGCCTGCAACGTCTCGCCCGCCGGCGCATCCAACCCCGTCACCGTCGGCGCCTCCACCGTCCAGGACGAGCGCGCCTACTTCTCCAACAAGGGCAAGTGCGTCGACATCTTTGCGCCCGGCCTCAACATCCTCTCCACCTGGAACACGGGCAACACCTCGGTCAACACCATCTCGGGCACCTCGATGGCCAGCCCGCACATTGTCGGCCTGCTCGCCTATCTGCTCTCGATCTACGGCACCGCCGACTTCAAGCTGCTCGCTGGCGGCCAGGCGGACCACCTCTCGATCGCCGCCGTCGAGGACTCGCTCGCCTCGAAGCTCTCGAGCGTGCTTCCCATCCCCGCCATGGCGCTCGACCTGGTGAGCAGCGTCGCCGGCTACTTTGCCGGTGCCGATGCCGCCAAGCCCGACATTGACGGCGTGCTGTCGCCCACCGAGCTCAAGAAGGCGCTCATCAAGCTCGCCTCGCCTGGCGTCCTCACGGGCCTCGACGCGGACACGGTCAACAAGCTCGCCTTCAACAACGCCACCTCGTCGGCCTGA-3'（配列番号８）
【００２２】
＜ＰＡＮ１＿０１０ｒ０４２２７＞
5'-ATGAAGTCCAACACGGCCTGGGCTGGCCTCGCCGCCACCGCCACCCTCACCGCGCTCGTCTCGGCAAAGCACGAGCTCGACGTCTCGCACGAGCCCATCACCTCGCTCTTCAAGGCCGACGGCACCCCTTCCCACCCGCACTTCCTCCAGTCGCGATGGGTCACCTCCGAGCTGCCCCTCGACTACCGCAAACGCGACCTCTCCGGCACCGGTTCCAAGCGCAGCTCAAAGACCTGCCGCGCCGACAAGTCCAAGCCACGCACCGACGACCGCAAGCACCACGGCCGCCACAGCGTCCTCCACACGCTCGACCACCTCGGCCACCAGGTCGCCAGCTGGATCGAGGGCGGCAAGTACCACGACCACTCGCTCGGCATCGTCATCAACAAGGCCACCGACAACTCGGCAGACAACGAGTGGCTCGTCAACGTCGGCTTTGGCTCGCCCGCCCAGACGCTCAAGATGGTCTTTGACTCGGGCAGCTCCGACACCTGGGTCTACTCGCCCCAGTGCTGCTACGCCAACAACCACACCTTCTTCGACCCCAACCAGTCCGACACCTTCCACAACCGCACCGTCGTCAACAACGTCGCCGTCCCCGCTCCCGACGGCACCCCGGGCCAGGCTTGGTCCTCCACCTACGGCTCCGGCTCCAGCGTCTCGGGCTACGTCGGCATCGACGACTTCACCTTTGGCCAGCAGAGGCTCACCGTCGACCAGCTGCCCCTCGCCCTCGTCACCTCCATCAAGGGCTCGCGCGCGGGCCGTGGCATGGAGGGCCTCGTCGGCCTTTCCGCAGGCTCCGGCTCCGAAACCCCGGGCGAGTGGACCACGCCCTTTGAGGCCATGTCGTCGCGCGGCCAGATCGACCAGACCTACCTCACTGCCACGCTGCGCAAGGCCAACCGCAACACGGGCAAGGGCGGCGGAGGCCGCTACACCTTTGGCGAGATCGACGACCGCCTGCTCGACGGCAACATCACCTGGACGCGCGCCCTCTCCCCCTACCTCTGGGCAGGTTACTTTGACCAGATGACCTTTGGCGACTCGCTCCTCGCCGCCGCACCGGGCACCCAGGAACGCCCGATCCGCTTCATGATCGACACCGGCTCCGCCGTCTTCTATCTGCCCCCACCCATCGTCAAGCAGATCAACAGCCAGATCGCCGGCTCGCTCGTCGCCAACTCGTCGAGCGGCCTCGCCTTCCCTTACCTCGTCCCCTGCGACACCGGCCTCAAGAGGCACGAGAGGACCGCCAACAACCCCAGCTTCAACCTCCAGATCGGCGGCACCAACTTCACCATCCCCAAGGAGGACTACGTCTTCTACGCCAACCAGCCCGTGCCCGCGGCGGCGGCGGGCGGCAAGACCGACATGTGCTACTCGGCCTTCCAGACCGGTCCCGCGCAGATCTCGATCATCGGCCTCAGCTTCATCAAGAACCACGTCGTCGTGCTCGACCAGGGCGGACGCAACCTCACCGTCTCCGCCAGGCGCATCGGTCTGGGCCAGCGCAAGGACGTGCGCTACGACTGA-3'（配列番号９）
【００２３】
＜ＰＡＮ１＿０１３ｒ０４７７９＞
5'-ATGCGTTCCAATTCCAGCTTCGACAACACCGCATCCCACCAGCCAGCACCCGATTCCACCACGCAAATCACCCCACCCATCGACGCAGACCCTTCATCATCACAACACTCTAGCTCCTCCTCGGCGCGCCGTCCACCACCCTCGCCGCACGCCAGCCCAGAGCACAAACCTAGCCCGCGTTTCCCCACAGCCCTCTCAGCCACGGATCACCGCAGGTCGAGCGCATACAAGCGAGCGCGCACCGCCAGCCCCATCATCGACGACAACAGCAGCGACGTCGAGAACGACAACAGGTCCGCTTACTCCCGTTCCGCTAGCGACTTGGGCGATCTCGACCTCACCGAACACGCGTCGTCCGTGCAACCTACACCGCTCCGCCAGAGCGTCTCGTCAGCCGAACTGCTCCATTCAGCACGCCCTTTCGGAAGCGGCATCGTCATGGCATCACTCGACCCCAACGTTGAGGGTCTCATGACCGAGCAGTCCCTCAGTCTCGACGACGGCGCTGTCGCCGCACCCGCCTCGGTCGCCGCCATGTCCGCCGATCTCAGCCACGACGAAGAGCCGCCCTCGTACCAGGAGGCTGTGCCTCTGCCTCCCTCGTCCTTGGCGCCTAGCAACGAGCCAAGACCCACAGGCCAACAGCAGCTCAGCATCGTTTCACCCATGAGGAACCTCCCCTTGCACGCCGGCGACACCTGGTATATCGTCAGCCGAGCGTGGTACCGTCGCTGGGATGCCGCTTGTTCGGAGCATCGCGACGCGGATCCATCAGAGAAGGCAGATCCTCCCGTCGGCCCCATCGACAACGCCGACCTCTTGGACTCCGAGGCGCCAACCGGATTCGCACAGCTGCGACAGCACATCAACGAACACATCGACTACGAGATGCTTCCCGAGCAAGGTTGGAAGCTCCTCGTCGCTTGGTACGGCTGCACTGGTCCCGTCTTTGCCAGAAACGCCATCGAAGGTCTCAGTCCCGGCCAGGAGAGTGTCGAGTTCTACCCGCCCATCATCCGACTGCTCCGCGTGGTCCAGGACGACACCAAAGACGACGTCACCCGCGCGCCCTTGTTCAGCTTGTCCGTCAGCACCGAGCTGTCCGAGCTCAAGGCCAAGGCCAAGACCACCTTCGACCTCGGCGACGTTGCCGATGTCGATCTGCGCTTCTACCACTTCCCCGAGCCCGAAGACAGCGAGCTGCAATCGGGTCGGGTGACCATCGCTCGGGTCGAGCTCGACGGCGTCGACCTCATCGATGCCAACGAAGACAAGCCCGACACCTACCGCTCCGACGTCACGCTCAAGTCGATCGGCATCGACGAGATCGAGGTCAACTTGGTCGTCGAGACGCGCAAGTCCGGAAGATGGCAATCAGAAGGACCCGCCGAGGAAGCGCCCTCGGTCAAAGGCATCTTTGCACAGCAGAGCGGCGACTTTTTCAGCAACCTGCAACAGCCCAGCGCGAGCACCACCAGCATCACCGCTGCTGGCTCCGCGGGCGATGCTCTTGGCAGAGTCACGCGTTCGCAAACAGCGACCGACCGCACCATGGGTAGGTCGCGCGGATTGCGCGGCCTCAACAACCTCGGCAACACGTGTTTCATGAACAGTGCGCTGCAGTGCCTGAGCAACACGTACGAGCTGCAGCAGTACTTTGTCTCGGGCGCGTATCGCGACGAGCTCAACACCGACAACCCGCTCGGCATGGGCGGCGCCATCGCAGAAGCCTTCGGAAACCTCATCTCCAACATCTGGAACGGCCAGGGCGGCTCGTTCTGGCCGCGCGAGTTCAAGTTCGCCCTCTCGCGATTCGCTCCCCAGTTCAGCGGCTACGCACAGCACGATAGCCAGGAGCTGCTTGCCTTCTTGCTCGACGGCCTCCACGAGGATCTCAACCGCATTCTCAAGAAGCCCTACATCGAGGCGCCCGACTGGGACGGCGGCGACGAAAAGGCGCTCGTCGCCTTTGCAAAGCGTCAGTGGGACATCTACAAGGCACGCAACGACTCGGTCATCGTCGATCTCTTCCAGGGCCAGTACCGCAGCACACTCGTGTGTCCCGAGTGCAGCAAGATCTCGATCAAGTTTGATCCATTCATGTACCTCACGCTGCCCATCCCCAACAAGAAGGTCTGGCGCGCACAGGTCTACTTTGTGCCGCTCGAGCCCACCAAGCCCTTGCAAAAGTTTCACGTCCAGCTTCCAGCCGGCAGCACCGTCAGCAAGCTTCGCCAGAAGGTGGCCGCGCAGTTTGGCGTCGAGACGCGCCAGCTGATCTGTGGCGAGGTCTGGCACCACCGCATCTACAAGTGGATCGACGATTACGAGCCGCTCGTCGACATCAAGGACGGCGACTTTGTCTACTTCTGGGAGGTGCCTGCCGCGCCGCGCTTGTCCAAGCAGCGCCACTACCGCTACCATCGCTCCGTGGAGGACGCCGAGGAGGCGCTCGACATTCCCGAGGCAGACCATGCCATCGTGCCCGTCTTTGCCAACTATGCCCAAAAGATTGCCTCCGCCTCGTCGAGCCAGGCCTTTGTCAGCCGCCGCACTCGTGGCGAGCCGGTAGGCATCCCCTTCTTCATCGCTGTGCCAAAGCAGGACATCAACGATCTCAACGCCGTGCGCAAGCTCGTCACCGACGGCTTCTCTCGCTTCGCGCGCGATCAGGACGCGTATCGGAATGTGGTTGAAGAGCAAACCGAAGATGTCGCACGCCTTGCGACAGCCGAGACATCCKCTCAGGCCCAAATCTCGGACTGGGAAATGGTCGACGACGATGCCGCAAACGAGGCCAACGTCGAGGTCGTACCACCGAGCCAACCGGTCGGCCCAGATGCGGTCACCGAGATTCACGAAGATGGGAATGCTGTTGTGGTGTCCGACGCCAGTGCATCAAGCACCGACGTTTCGCTGGCCGCCAGCAAAGCTCTCGTGCAGTCCGAGCCGTCGCTTCGCATCCGTTTCAGCGTCGCCGAAGCCGGTCAAGGTCTTCCCAAGGGCAGCGAAAGCGGCGCAGATCACCTCTCGGAGGAGATCACGGAACGACAGGCGCGCCTCGCCAAGCGTGCTCTCGCAACACCAATCGACGCGGACGAGGAGGACATGGACGAGGGCGATGACGAGTCTCAGGCCGCACCCAAAGCGTCCAAGGCGATTCCGCTGGTCTACACTGGCGGCGCGATCGTGTGCACATGGTCGTCCGCCTTCTGCGAACGCGACCTGCTGGTCGAATCCGATTCCGGCCAGCTGTGGGGAGACTACGAGCAAGTGGTCGACGAGGCCATCCGCGAGCGCGACGCGGCTGGCCCCTCGCGCCCCAAGTCGCTGTCGATCGAGGACTGCATGGACGAATTCACCAGGGAGGAGCAGCTCGGAGAGGACGATCCGTGGTACTGCCCATCGTGCAAGGAGTTCCGACAGGCGACCAAGAAGTTTGACCTTTGGAAAGCACCGGACATCCTGGTGGTGCATCTGAAGCGCTTCAGCGCGGGGCGCCACTCGCGCGACAAGCTCAACATGCTCGTCGACTTCCCGCTCGAGGGACTGGATCTGACGGATCGGGTCGAGGGCACGCAGGCGCTGCGGCGCGTGCAGGAGGAGGCCAAGCAGAGCGGCGAGGAGCTTTCGGAGAGCATGCTGGGCTCGGGCATCCTGCGTCCGCTCGAAGACAACGACGATGCGGTGGCGGTGGACAAGCCGATCTACGACCTGTACGCGGTGGACAACCACTTTGGCGGGCTTGGCGGCGGGCACTACACGGCGTTCGCAAAGAGCCCGGCAGATGGCAAGTGGTACGAATTCGACGACTCGAGCGTACGGCCGGTGGCGAACCCCGAGAGTGTTAAGAGCGCTTCGGCGTATCTGCTCTTCTATCGCCGGCGGACGACGAGGCCGATCGGTGGCAAGTCGAGGCAAAAATTCCAGGAGGCCGCCAAGTCCAAGGCGTCGAGTGCATCGCAGAGCGCCGAGGCTAGCACGTCGGGGCTGCAGAACCAGCTCACTCCGGCCGACGATGACGACTCGAGCGACTCGTCGAGTGACGAAGCACCTGAATGGTCGCTGAACCTGCGAAGCGGCGCGGGTGTTGATGCGGTAGAGCCTGCGTCTGGCTGGTCGAGCACCGGCAACTCGCCCCCATCCTCCAGTCGCGCTTCTAGTCCCGATAGCGACCGCGATCTGGACTCTCCGTGA-3'（配列番号１０）
【００２４】
＜ＰＡＮ１＿０２３ｒ０６５６３＞
5'-ATGTGCTCGCCCAACGTCCACTTTGAGCACCTTATCGGCTCGTCCAATCCATCGCCTGCATCGCCTGCATCGCCATCACAACCGTTCCGCAGCCTCTCGCACGCACGCATCGCCGGCGCATCATCCTGGCGCTCGAATAGCGACCAATCCGCATCGACAGCAGCGCCACTGAGCCACACCATCAACCACCACTCGTCCGTGCTCTCGCTCGCGGTCGATGAGCGTCGCAACCTGCTCTACTCGGGCTCCCAGGAGGGCTGCATCCACGTTTGGGACCTCGAGACATTCCAGCCAGCTGCGCGGCTACAAGGCCACACAGGGAGCGTGCTTGCGCTCGAGCTCGCTCCGGAGAAGCGCTGGCTCTTTAGCTCGTCCGGGGACAACACGATCCGCGTATGGAACACCGACACGAATTCGCCGCTCTTTGTGGTACATCCTGCCGAAGAGAACGTCGGCGACATCTTTGCACTCAAGTGGTGCGCCAGGCTCCAGACGCTGTACCTGGGATGCCAGTCCACCTCGATCCAGTGGATCTGCCTGGCGGGATTCGACAAGCAGCCCGGCCCGTCGAAGCGGCTCGACGCCAACGAGTTGCTCGCGCCGCATGCTGACGTGGGCACAGCACCAGTCGGCTTCAACCAGGCAGGCGCGGACAGTCCCATCATCTCGACGCCGGACATCGTCGCACGGCCGCACAGGTTCTTCGACTCGGTCCCCGTTGCGCTCAGCAGGTCCGGCCTCGGCAGCGCCGGAAGCTCGACTCCAGCACGTGTCCGACCACCGTCCTCGGCCCCTCTGAAATTCTCCAAGGCAACCGCTTCGACTGACGGACCGCTATCCACCGAGCTAGATTCGCATCTGAGCGACAAGGGGCCGCTGTCGACCACCCGCGCCACCGAAAAGGTTCTGCACGCCGCATCGCAACGCCTGGATAGCACGGCCGTGCGCGACGAGATGGCACGCGACGACTCGGGCGGATCGGTGCGCACGCTGCTCGTGCCGCCGAGCTCTGCAGTGCCCTCGGCGCACTTTGGCTACGTCTACTGCCTGGCGCTGCTGACGCTCGAGGGCGATGCGCAGCACCCGACCGTGCTCGCCTCGGGCTCGGGCGACGAGACCATCAAGCTGTGGCACGCCACGCGCGCCGGCCTCTCGCTGCTCGCCACGCTTGAAAGCCCAAATGCGGACGGCAACGCTGTGCTCGCGCTTGCCTCGTGGAAGACGACGCTCTTCGCCGGTCTGCAGGGCGGAGAGGTCGAGGTGTGGGATCTCGAGACGTGTACGCTCGTGCGCACCATCCGCGCGCACTCGGACGATGTCATCTGTCTAGAGACGTGTGCCGAGTCCGGCCTGCTGTTCACCGCGGGCGCGGATGGGAATGTGCACACGTGGGACCGGTCCTTTAGACGCATCAACAGGGTGCAGGCGCACAAAGGCATCGTGTTGTCCATGACCAAGGTGCGCACGCCTGCTAAAAGCGGCGAGGCAGCGAGGGTGGCACAGCTAGTCACGGGGTCCAGCGACAACTTTATCCGCATCTGGGACACGACCGCCTCGCCCGCACTGCCGTCATCGTCGCGCGAACCTGTAGCCGAACTGCGCCGCCGCGAGCTGGAGCATCTGTCGCTCGAAGAGCCCGCTATGCCCTCGCTCTCCTCGACGCCGATTGCCACGTCGTCTGCCGTCGTGACGCGCGCGCAGGGTGCCGAGCAGGCCGAGACGCCCGAGGCAGTGTCGGCGCAGTGGCCGCTGCTGCGTTCGCTGCTGCGCAGGTTCATCGCGATTCCCAGCATCAGTTCGAGCGAAGAGCACCGCGAAGACTGCCGGCAGGCGGCGCACTTTCTCAAGACGTGCTTCCAAGAGCTCGGCGCCGAGGCGCGCATCCTACCCAATCCGGTGGGCACCAATCCGCTCGTGCTCGCCACGTTCAAGGCCAACGCCTACCGCTCGCGGCGGCGCAGGACGGCGGCGAGTGGCGCGAACGAACGCTCGCGCAGTGCATCCACCTCGGCGTCGGCATCGACCGCGTCGACGAGCTCGTCCGAATCGCACACCGTGGACAACGACGACGACGACGACGAGGACGCGCAGGGCCTGAGCGGGTCCATCATGTTTGACCACCTGGACGGGCGGGATGCTGCAGCGGATGCGGACGAGGCGAGGACACCGCGCGCACGACCGCAGAAGCGGTGTCTGTTCTACGGCCACTACGACTGCATCGCCGCCGAGGGCTCGTGGGCGTCGGAGCCGTTTACGCTCGACGGGCGCGACGGCTTCCTGTACGGCCGCGGTGTGTCGGACAACAAGGGCCCCATCCTGGCGGCGGCGTGTGCGGTGCATCGGCTGCTCTCGACGCGCCGGCTGCACTCGGACGTGGTGTTCCTGATCGAGGGCGAGGAGGAGAATGGCTCGGTGGGCTTCGTAGAGGCGGTGCGCAGGTTCAAGAGCGAGATCGGACCGATCGATGTGGTGCTGCTCTCCAACTCGTACTGGTTGGACGACGAGACGCCGTGCATCACGGTCGGGCTGCGCGGGGTTGTGCGCGCCACGGTGAGTGTGGGCAGTGGCGAACGCGATGTGCACTCGGGCGTCGAGGGCGGTGCGATCCGCGAACCGATGGTCGACATGGTCAAGCTGCTTGCTGCGCTCACTGCCGAAGGTGAGCGTGTCGCGCTGCCCGGATTCTACGATGCGGTGAGGCAGACGACCGAGGACGAGGTGCAGGCGTACCGCGATATCGTGCACATCAAACAGCACGCCGGTGCGCATGCGGATACCGTGGAATCGCTCATGGCCAAGTGGAGATACCCGTCGCTATCGGTGCACAACCTGCGCGTGTCGGGCCCGGGCAACTCGACGGTGATTCCGTCGAGCGTCGAGGCGCAAGTGTCGCTGCGCATCGTTCCGGACCAACAGCTGGCGCAGATCGAGGCGTCGCTGCGCGCCCACGTCGCATCGACGTTCGACGCGCTGTATGCAACGCCTGCATCGGCGGCGGGCCGCGTGGTGCGCAACAAGGTGTGCGTCACCGTAGACCACCGTGCCGACTGGTGGCTCGGCTCGGATGCGAGCGTGTACTTTGCGCTTCTGCGCGATGCGGTGCGCCACGAGTGGAAGGCGGAGCCCATCTCGATCCGCGAGGGCGGCAGTATCCCTGCGATTGCGATTCTGGAAAAGGAGCTCGGCGCGGCGGCAGTGCACTTGCCCATGGGCCAGAGCAGCGACAGCGCACACCTGCCCAACGAACGCCTCCGCCAGTCCAACCTGGTCAAGGGCCACAACGTCGTCATGCGCTTCATCGCCGGGCTCGCTCATGTGTAG-3'（配列番号１１）
【００２５】
前記ＰａＥの分解に関与する少なくとも１種のペプチダーゼ又はプロテアーゼの遺伝子に導入される変異は、そのペプチダーゼ又はプロテアーゼの活性が抑制される限り特に制限されないが、例えば、前記遺伝子の少なくとも１つの塩基の欠失、前記遺伝子の少なくとも１つの塩基の置換、又は、前記遺伝子への少なくとも１つの塩基の挿入などであってもよい。ある態様では、本発明の酵母においては、前記遺伝子全体が欠失している。
【００２６】
別の態様では、本発明は、前記酵母を使用して、タンパク質を製造する方法にも関している。前記タンパク質としては、種々のタンパク質が採用され得るが、好ましくはＰａＥである。前記ＰａＥ以外のタンパク質を製造する場合には、製造するタンパク質の安定性向上に最適な変異対象遺伝子を選択してもよい。例えば、前記タンパク質がリパーゼＡである場合には、前記変異対象遺伝子は、ＰＡＮ１＿００１ｆ００８４６（配列番号５）及び／又はＰＡＮ１＿０１０ｒ０４２２７（配列番号９）又はそのホモログ若しくはオルソログを含んでもよい。また、ＰＡＮ１＿００４ｒ０２２６６（配列番号２）又はそのホモログ若しくはオルソログがコードするペプチダーゼ又はプロテアーゼの活性が抑制されると、タンパク質の分解が広く抑制されることから、様々なタンパク質の安定性を向上することができると期待される。
【００２７】
また別の態様では、本発明は、酵母を使用してタンパク質を製造する方法にも関しており、当該方法は、
前記酵母において、ＰａＥの分解に関与する少なくとも１種のペプチダーゼ若しくはプロテアーゼ又はその遺伝子のホモログ若しくはオルソログがコードするペプチダーゼ若しくはプロテアーゼの活性を抑制する工程を含むことを特徴としている。このような抑制手段としては、当技術分野で通用使用される手段を特に制限されることなく採用することができるが、例えば、前記ペプチダーゼ若しくはプロテアーゼの遺伝子又はそのホモログ若しくはオルソログに変異を導入して活性を抑制してもいいし、前記ペプチダーゼ若しくはプロテアーゼ又はその遺伝子のホモログ若しくはオルソログがコードするペプチダーゼ若しくはプロテアーゼに対する抗体や阻害剤を使用して活性を抑制してもよい。また、ｐＨなどの培養、分離・精製、及び保管条件を制御することで活性を抑制してもよい。
【００２８】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２９】
〔実施例１〕酵母の培養中に生じるＰａＥ分解物及び酵素活性の低下の確認
Ｐ．アンタクティカのＰａＥ高生産変異株であるＧＢ−４（０）−Ｘ１４株（要すれば非特許文献１を参照）を、キシロース存在下で常法により培養した。遠心分離によって組換え型ＰａＥを含む培養上清を回収し、室温で静置した。培養直後の培養上清及び冷蔵保存後の培養上清をＳＤＳポリアクリルアミドゲルにより電気泳動し、当該ゲルをクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）により染色した。また、培養直後の培養上清及び冷蔵保存後の培養上清のＰａＥ活性を測定した。【００３０】
その結果、ＰａＥに由来するバンドの下に、ＰａＥ分解物に由来するバンドが確認され、培養後の日数が経過するにしたがって、ＰａＥ分解物のバンドが太くなった（図１）。また、以下の表１に示すように、培養後の日数が経過するにしたがって、培養上清のＰａＥ活性が低下することが確認された。なお、ＰａＥ活性の測定は、従来の方法に従って行った。すなわち２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ６．８）に、吸光度（ＯＤ６６０）が約０．６５となるようにポリブチレンサクシネート−コ−アジペート（ＰＢＳＡ）のエマルジョンを懸濁した。その水懸濁液１．９ｍＬを口径１３ｍｍの試験管に入れ、上記培養上清を適宜希釈して１００μＬ加え、３０℃、１８０ｒｐｍで１５分間振とうし、水懸濁液の吸光度を測定した。酵素活性の単位として、１分間当たりに吸光度を１．０減少させる酵素量を１Ｕと定義した。
【表１】
2020100910.tif 000003
【００３１】
〔実施例２〕ＰａＥの分解に関与するペプチダーゼ又はプロテアーゼの候補遺伝子の探索
Ｐ．アンタクティカＧＢ−４（０）株をキシロース存在下又はグルコース存在下で培養し、Ｐ．アンタクティカのトランスクリプトームを、Ｐ．アンタクティカのゲノム情報に基づいて作製したＤＮＡアレイで経時的に解析した。キシロース存在下で培養すると、培養初期にＰａＥ遺伝子が強く発現する。これに対して、グルコース存在下での培養時と比較してキシロース存在下での培養時に特徴的に発現する遺伝子であって、かつ培養後期に向けて発現量が増加する遺伝子を、ＰａＥの分解に関与する遺伝子の候補として選定した。
また、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のゲノム情報から予測されるＰ．アンタクティカのゲノム中の推定プロテアーゼ遺伝子も、ＰａＥの分解に関与する遺伝子の候補として選定した。
そして、培養上清のプロテオーム解析を行い、グルコース存在下での培養時と比較してキシロース存在下での培養時に特徴的に産生されるタンパク質であって、かつ培養後期に向けて産生量が増加するタンパク質をコードする遺伝子を、ＰａＥの分解に関与する遺伝子の候補として選定した。【００３２】
以下の表２に、トランスクリプトーム解析、推定プロテアーゼ遺伝子探索、及びプロテオーム解析によって選定されたＰａＥの分解に関与するペプチダーゼ又はプロテアーゼの候補遺伝子を示す。
【表２】
2020100910.tif 000004
【００３３】
〔実施例３〕ＰａＥ分解物に対する候補遺伝子破壊の影響
Ｐ．アンタクティカＧＢ−４（０）株において、表２に記載の遺伝子のいずれかを常法により破壊した。簡単に説明すると、ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ耐性遺伝子を薬剤耐性マーカーとして、これを標的遺伝子の間に挿入した遺伝子破壊断片を作製し、当該遺伝子破壊断片を相同組換えによって細胞に導入することで遺伝子破壊株を作製した。遺伝子が破壊できたかどうかはコロニーＰＣＲで確認した。【００３４】
作製した各遺伝子破壊株を、キシロース含有培地を含む３００ｍＬ三角フラスコ中で５日間培養（３０℃、２００ｒｐｍ）した。各培養液から遠心分離（５０００ｒｐｍ、５分間）により菌体を除去して培養上清を取得し、これを２５℃で８日間静置した。各培養上清中のＰａＥ及びその分解物を、ウェスタンブロット法により解析した。ウェスタンブロット法では、抗ＰａＥポリクローナル抗体及びＨＲＰ−抗ウサギＩｇＧ抗体を使用し、ＥＣＬプライム（ＧＥヘルスケア社製）を用いた化学発光により、メンブレン上に転写したＰａＥ及びその分解物を検出した（露光時間６０分）。対照として、野生型のＰ．アンタクティカＧＢ−４（０）株の培養上清（ＷＴ）及び粗精製したＰａＥを使用した。【００３５】
２〜４回行った実験の代表的な結果を図２に示し、ＰａＥ分解物に由来するシグナルの強さを以下の表３にまとめる。
【表３】
2020100910.tif 000005
＋＋＋＋：毎回の実験で野生型よりも強いシグナルを検出
＋＋＋：半数回以上の実験で野生型よりも強いシグナルを検出し、他の実験では同程度あるいは弱いシグナルを検出
＋＋：半数回以上の実験で野生型と同程度のシグナルを検出したが他の実験では弱いシグナルを検出
＋：毎回の実験で弱いシグナルを検出
−：毎回の実験で検出されるシグナルなし【００３６】
各遺伝子破壊株はＰａＥを産生し、それを培養上清中に分泌した。候補遺伝子３又は１０の破壊株では、ＰａＥ分解物に由来するシグナルが、野生型と同等かそれ以上に強く観察された。一方、候補遺伝子１、２、４〜９、又は１１〜１３の破壊株では、ＰａＥ分解物に由来するシグナルが、野生型と比較して低下し、特に候補遺伝子１の破壊株及び候補遺伝子９の破壊株では、ＰａＥ分解物に由来するシグナルがほとんど確認されなかった。したがって、候補遺伝子１、２、４〜９、又は１１〜１３は、ＰａＥの分解に関与していることがわかったので、これらの遺伝子破壊株は、ＰａＥの生産に有用である。なお、遺伝子１２の破壊株については、今回の培養条件では増殖に異常が見られたが、培養条件の最適化は行わず、以降の実験では使用しなかった。【００３７】
〔実施例４〕ＰｒｏＡ遺伝子の相補実験
野生型のＰ．アンタクティカＧＢ−４（０）株又は候補遺伝子１（ＰｒｏＡ遺伝子）の破壊株（ΔＰｒｏＡ）に、ＰｒｏＡ遺伝子を含む相補用遺伝子断片（ｐＵＸＶ１−ｎｅｏ：：ＰｒｏＡ）又は対照遺伝子断片（ｐＵＸＶ１−ｎｅｏ）を導入して、形質転換体を作製した。これらの形質転換体を使用して実施例３に記載の方法で培養上清を調製した。各培養上清及び遠心分離前の菌体を含む培養液を２５℃で７日間静置した後、ウェスタンブロット法でＰａＥ分解物を検出した。その結果を図３に示す。【００３８】
ＰｒｏＡ遺伝子破壊株（ΔＰｒｏＡ）に対照遺伝子断片を導入した形質転換体の培養上清では、ＰａＥ分解物に由来するシグナルがほとんど確認されなかったが、ＰｒｏＡ遺伝子を含む相補用遺伝子断片を導入した形質転換体の培養上清では、ＰａＥ分解物に由来するシグナルが増加した。また、野生型の菌株にＰｒｏＡ遺伝子を含む相補用遺伝子断片を導入した形質転換体の培養上清でも、対照用遺伝子断片を導入した形質転換体の培養上清と比較して、ＰａＥ分解物に由来するシグナルが増加した。したがって、ＰｒｏＡ遺伝子の破壊によるＰａＥ分解物の減少は、ＰｒｏＡ遺伝子の導入により相補されることが確認された。【００３９】
〔実施例５〕ジャー培養での遺伝子破壊の影響
培養条件が異なると発現する遺伝子のプロファイルも変化し得るので、ＰａＥ分解物に対する遺伝子破壊の影響を、実施例３のようなフラスコでの培養よりもスケールの大きいジャー培養においても確認した。具体的には、候補遺伝子１（ＰｒｏＡ遺伝子）又は候補遺伝子９（ＰｒｏＢ遺伝子）の破壊株を、キシロース含有培地を含む５Ｌ容ジャーファーメンターで３日間培養（２０℃、４２３ｒｐｍ）した。各培養上清中のＰａＥ及びその分解物を、ウェスタンブロット法により解析した。その結果を図４に示す。【００４０】
ジャー培養によりＰａＥを生産した場合であっても、ＰａＥ分解物に由来するシグナルは、野生型の菌株の培養上清と比較して、ＰｒｏＡ遺伝子破壊株及びＰｒｏＢ遺伝子破壊株のいずれの培養上清においても減少していた。一方、ＰｒｏＡ遺伝子破壊株の培養上清とＰｒｏＢ遺伝子破壊株の培養上清とを比較すると、後者の培養上清の方が、前者の培養上清よりもＰａＥ分解物に由来するシグナルは少なく、全く検出されなかった。したがって、ＰａＥを大規模に製造する場合には、ＰｒｏＢ遺伝子破壊株が特に有用である可能性が示唆された。【００４１】
〔実施例６〕各遺伝子破壊株のリパーゼ活性
Ｐ．アンタクティカの培養上清中には、リパーゼＡが含まれていることが知られている。ＰａＥの分解を指標にして選択した遺伝子の破壊株が、このリパーゼＡの活性に影響を及ぼすかどうか確認した。具体的には、実施例３の方法に従って作製した各遺伝子破壊株の培養上清を使い、リパーゼキットＳ（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）で、リパーゼ活性を測定した。その結果を図５に示す。【００４２】
野生型の菌株の培養上清と比較して、候補遺伝子２〜４、６、８〜１１、又は１３の破壊株の培養上清では、リパーゼ活性が向上していた。候補遺伝子６又は１１の破壊株ではリパーゼ活性が特に高かった。したがって、これらの遺伝子破壊株では、リパーゼＡの分解が抑制されていることが示唆された。【００４３】
〔実施例７〕各遺伝子破壊株の培養上清のゼラチン分解活性
ゼラチン分解活性は、一般的なプロテアーゼ活性の指標として考えられているため、ゼラチン分解活性が低ければ、種々のタンパク質を安定して生産するために有利であると考えられる。ＰａＥの分解を指標にして選択した遺伝子の破壊株が、他のタンパク質の生産にも有用であるかどうか評価するために、代表例として、候補遺伝子１〜７の破壊株の培養上清のゼラチン分解活性を確認した。具体的には、実施例３の方法に従って作製した各遺伝子破壊株の培養上清を、サンプルバッファー（６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％ ＳＤＳ、１０％ グリセロール、０．００２％ ＢＰＢ）と混合し、０．１％ゼラチンを含むゲルに供し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。そして、泳動後のゲルを２．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で処理した後、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌに浸漬した。これを３７℃で１６時間インキュベートした後、ＣＢＢで染色した。その結果を図６に示す。【００４４】
ゲル中のゼラチンが分解されると、その部分はＣＢＢで染色されないため、ゲルが白く抜けたように見えるが、候補遺伝子２の破壊株の培養上清では、ゼラチンが分解されずゲルが白くならなかった。すなわち、これらの遺伝子破壊の培養上清では、プロテアーゼの活性が一般的に抑制されていた。ゼラチンゲルのｐＨを５．２又は９．８に調整した場合でも、同様の結果が得られた。したがって、ＰａＥの分解を指標にして選択した遺伝子の破壊株が、他のタンパク質の生産にも有用であることが示唆された。【００４５】
以上より、ＰａＥの分解に関与する少なくとも１種のペプチダーゼ又はプロテアーゼの遺伝子に変異を導入することによりそのペプチダーゼ又はプロテアーゼの活性を抑制した変異酵母を使用すれば、培養液中におけるＰａＥの分解を抑制することができるだけなく、意外なことに、他のタンパク質の分解も抑制することができることがわかった。したがって、効率的なタンパク質の生産が可能となる。【００４６】
〔実施例８〕培養中のＰａＥの安定性
Ｐ．アンタクティカＧＢ４（０）株に由来するキシラナーゼプロモーター及びＰａＥ遺伝子並びにマーカーとしてのネオマイシン耐性遺伝子を含む発現用カセットを、野生型のＰ．アンタクティカＧＢ４（０）株に導入して作製したＰａＥ高生産変異株（ＸＧ８株）又はそのＰｒｏＢ遺伝子破壊株（ΔｐｒｏＢ株）を、キシロース存在下で常法により３Ｌ容ジャーファーメンターで培養した。培養開始２４時間後、４８時間後、及び７２時間後に各培養液を採取して、その乾燥菌体重量を測定した。また、以降のＰａＥ活性測定方法は次のように行った。すなわち２５ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．３ ± ０．１）に、吸光度（ＯＤ660）が約０．５５となるようにＰＢＳＡのエマルジョンを懸濁した。その水懸濁液１．９９５ｍＬを口径１０ｍｍの試験管に入れ、上記培養上清を適宜希釈して５μＬ加え、３０℃、１５０ｒｐｍで１５分間振とうし、水懸濁液の吸光度を測定した。酵素活性の単位として、１分間当たりに吸光度を１．０減少させる酵素量を１Ｕと定義した。そして、各培養上清をＳＤＳポリアクリルアミドゲルにより電気泳動し、当該ゲルをＣＢＢにより染色した。【００４７】
その結果、乾燥菌体重量に関しては、ＸＧ８株とΔｐｒｏＢ株との間に差はなかったが、ＰａＥ活性は、ΔｐｒｏＢ株の培養上清の方が大きかった（図７）。このことは、ＣＢＢ染色の結果と一致していた。すなわち、ＸＧ８株の培養上清では、ＰａＥに由来するバンドの下に、ＰａＥ分解物に由来するバンドが確認され、培養後の日数が経過するにつれて、ＰａＥ分解物のバンドが太くなっていたが、ΔｐｒｏＢ株の培養上清では、ＰａＥ分解物はほとんど確認されなかった（図８）。【００４８】
〔実施例９〕菌体懸濁液中でのＰａＥの安定性
酵素を工業的に大容量で（例えば３００Ｌタンクで）製造する場合には、培養終了後、すべての培養液を遠心ろ過するまでに１日以上を要することがある。その間、培養液は２４時間以上菌体が入ったまま放置されることになるが、その際に溶菌が進み、培養上清中のＰａＥがプロテアーゼによって分解されてしまう危険がある。そこで、ＰｒｏＢ遺伝子の破壊が、培養終了後のＰａＥの維持に有効であるかどうか検討した。具体的には、ＸＧ８株又はΔｐｒｏＢ株を、実施例８と同様の方法で７２時間培養し、各培養液を低付着性マイクロチューブに１ｍＬずつ分注した。これらのチューブを、分注直後（０時間静置）又は２５℃で４、８、１２、２４、３６、又は４８時間静置後に、転倒混和して、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。回収した培養上清はすぐに−３０℃で保管し、残った菌体は、１０５℃で６時間乾燥させた後に、その重量（乾燥菌体重量）を測定した。また、各培養上清のＰａＥ活性を、実施例８に記載の方法で測定し、分注直後の培養上清のＰａＥ活性を基準とした残存活性（％）を求めた。そして、各培養上清をＳＤＳポリアクリルアミドゲルにより電気泳動し、当該ゲルをＣＢＢにより染色した。【００４９】
その結果、ＸＧ８株及びΔｐｒｏＢ株のどちらでも乾燥菌体重量が減少しており、静置中に溶菌が起こっていることが確認された。一方、ＸＧ８株の培養上清においては、静置時間が経過するにつれてＰａＥ活性が低下し、４８時間後には５５．１％にまで減少していたのに対して、ΔｐｒｏＢ株の培養上清においては、ＰａＥ活性の低下はほとんど起こっていなかった（図９）。このことは、ＣＢＢ染色の結果と一致していた。すなわち、ＸＧ８株の培養上清では、ＰａＥに由来するバンドの下に、ＰａＥ分解物に由来するバンドが確認され、静置時間が経過するにつれて、ＰａＥ分解物のバンドが太くなっていたが、ΔｐｒｏＢ株の培養上清では、ＰａＥ分解物はほとんど確認されなかった（図１０）。【００５０】
〔実施例１０〕培養ろ液中でのＰａＥの安定性
ＸＧ８株又はΔｐｒｏＢ株を、実施例８と同様の方法で７２時間培養し、培養直後の培養液７００ｍＬを、それぞれ８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。また、各培養液７００ｍＬを、５００ｍＬ容三角フラスコ２本に移して２５℃で２４時間静置した後に、それぞれ８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。回収した各培養上清を０．４５μｍ孔ステリカップでフィルターろ過し、それぞれ１８ｍＬずつを２０ｍＬ容のバイアル瓶３本に分注した。これらのバイアル瓶から、分注直後（０時間静置）又は２５℃で１、３、５、７、１１、又は１４日静置後に、１ｍＬずつサンプリングした。各培養上清のＰａＥ活性を、実施例８に記載の方法で測定し、分注直後の培養上清のＰａＥ活性を基準とした残存活性（％）を求めた。そして、各培養上清をＳＤＳポリアクリルアミドゲルにより電気泳動し、当該ゲルをＣＢＢにより染色した。【００５１】
その結果、ＸＧ８株及びΔｐｒｏＢ株のどちらにおいても、培養直後に回収した培養上清のＰａＥ活性は、その後の静置期間中に少なくとも８０％は維持されていたが、培養２４時間後に回収したＸＧ８株の培養上清においては、静置時間が経過するにつれてＰａＥ活性が低下し、１４日後には約３０％程度にまで減少していた（図１１）。これは、培養が終了してから培養上清を回収するまでの間に溶菌した菌体からＰａＥを分解するペプチダーゼ又はプロテアーゼが放出され、培養上清中のＰａＥを分解したものと考えられる。一方、ΔｐｒｏＢ株の培養上清においては、ＰａＥ活性の低下がほとんど起こっていなかった（図１１）。これらのことは、ＣＢＢ染色の結果と一致していた。すなわち、ＸＧ８株の培養上清では、ＰａＥに由来するバンドの下に、ＰａＥ分解物に由来するバンドが確認され、静置時間が経過するにつれて、ＰａＥ分解物のバンドが太くなっていたが、ΔｐｒｏＢ株の培養上清では、ＰａＥ分解物はほとんど確認されなかった（図１２）。【００５２】
実施例８〜１０の試験結果によれば、ＰｒｏＢ遺伝子の破壊は、培養中のＰａＥの分解の抑制だけでなく、培養後の溶菌に伴うＰａＥの分解の抑制にも有効であった。したがって、ＰａＥの分解に関与する少なくとも１種のペプチダーゼ又はプロテアーゼの遺伝子に変異を導入することによりそのペプチダーゼ又はプロテアーゼの活性を抑制した変異酵母を使用すれば、作業に時間を要する大容量での工業的製造においても、効率的なタンパク質の生産が可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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