(57)【要約】  本発明の課題は、新規な抗Ｂ型肝炎ウイルス剤として有用な医薬組成物、およびスクリーニング方法を提供することである。本発明によれば、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質の産生を阻害する医薬組成物であって、ＹＴＨＤＣファミリーに属するタンパク質の発現または機能を阻害することを特徴とする医薬組成物が提供される。
2020196738.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質の産生を阻害する医薬組成物であって、ＹＴＨＤＣファミリーに属するタンパク質の発現または機能を阻害することを特徴とする医薬組成物。
【請求項２】
Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質が、ＨＢｓ抗原タンパク質である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
ＹＴＨＤＣファミリーに属するタンパク質が、ＹＴＨＤＣ１およびＹＴＨＤＣ２のうち少なくとも１つのタンパク質である、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
ＹＴＨＤＣファミリーに属するタンパク質が、ＹＴＨＤＣ１である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
さらに、Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡの発現量を低下することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
さらに、完全二本鎖ＤＮＡの発現量を低下することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
対象におけるＢ型肝炎を処置するための医薬組成物であって、ＹＴＨＤＣファミリーに属するタンパク質の発現または機能に対する阻害剤を含む、医薬組成物。
【請求項８】
ＹＴＨＤＣファミリーに属するタンパク質の発現または機能に対する阻害剤が、有効量の、抗体、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、アンチセンス核酸、二本鎖ＲＮＡ、アデノ随伴ウイルスベクターおよびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓベクター系からなる群から選択される、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
二本鎖ＲＮＡが、ＲＮＡ干渉剤である、請求項７または８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
Ｂ型肝炎ウイルスタンパクの産生を阻害する物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）Ｂ型肝炎ウイルスに感染した細胞またはＢ型肝炎ウイルスを発現する細胞に対し、ＹＴＨＤＣファミリーに属するタンパク質の発現量を低下させる被験物質、または同タンパク質の機能もしくは活性を阻害する被験物質を接触させる工程、
（ｂ）Ｂ型肝炎ウイルスに感染した細胞またはＢ型肝炎ウイルスを発現する細胞におけるＢ型肝炎ウイルスタンパク質の産生能を測定する工程、および
（ｃ）（ｂ）のＢ型肝炎ウイルスタンパク質の産生を阻害する活性を有する物質を選択する工程
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗Ｂ型肝炎ウイルス活性を有する医薬組成物およびＢ型肝炎ウイルスタンパク質の産生を阻害する医薬品候補化合物をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ型肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ、ＨＢＶ）は、ヘパドナウイルス属に属するウイルスで、直径約４２ｎｍの球状のＤＮＡウイルスである。ウイルスそのものは、外被（エンベロープ、ｅｎｖｅｌｏｐｅ）、不完全二重鎖のＤＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素などを含む、直径２７ｎｍの芯（コア、ｃｏｒｅ）からなるＤＮＡウイルスであり、Ｄａｎｅ粒子と呼ばれている。二重構造を形成し、外側はＨＢｓ抗原（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ、ＨＢｓＡｇ）、内側はＨＢｃ抗原（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｃｏｒｅ  ａｎｔｉｇｅｎ、ＨＢｃＡｇ）と遺伝子ＤＮＡからなっている（非特許文献１）。
ＨＢｓ抗原は、Ｄａｎｅ粒子以外に、中空粒子、小型球形粒子または桿状粒子として存在する。ＨＢＶのゲノムＤＮＡには、ｐｒｅ−Ｓ／Ｓ遺伝子領域、Ｐ遺伝子領域、Ｘ遺伝子領域、ｐｒｅ−Ｃ／Ｃ遺伝子領域の４種類の転写解読枠（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ、ＯＲＦ）がある。Ｘ遺伝子領域のｃｏｒｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ、Ｃ遺伝子領域のｐｒｅｃｏｒｅ領域は、ＨＢｅ抗原（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ａｎｔｉｇｅｎ、ＨＢｅＡｇ）構成蛋白の産生に関与し、この領域のｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎによりＨＢｅ抗原構成蛋白が産生されなくなり、ＨＢｅ抗原陰性となる。
ＨＢＶは肝細胞に侵入すると、不完全環状二本鎖ＤＮＡが肝細胞の核内に取り込まれ、完全閉鎖二本鎖ＤＮＡ（ｃｏｖａｌｅｎｔｙ  ｃｌｏｓｅｄ  ｃｉｒｃｕｌａｒ  ＤＮＡ、ｃｃｃＤＮＡ）に転換される。ＨＢＶの慢性感染状態では、ｃｃｃＤＮＡは肝細胞１個あたり５〜５０個、ミニ染色体として存在する。肝細胞核内のｃｃｃＤＮＡからは４種のｍＲＮＡが転写され、それらより構造蛋白であるＨＢｓ抗原、ＨＢｃ抗原およびＨＢｅ抗原、Ｘタンパク質ならびに逆転写酵素を含むポリメラーゼが翻訳される。ｍＲＮＡの１つはｐｒｅｇｅｎｏｍｉｃ  ＲＮＡとしてコア粒子に取り込まれ、逆転写酵素の働きによりマイナス鎖ＤＮＡが合成され、次にプラス鎖ＤＮＡが合成され不完全環状二本鎖ＤＮＡとなる。さらに、ＨＢｓ抗原より形成されるエンベロープに包まれてウイルス粒子（Ｄａｎｅ粒子）となり血中に放出される。ｍＲＮＡにより翻訳されたＨＢｓ抗原、ＨＢｃ抗原およびｐ２２ｃｒ抗原を含む中空粒子（ＤＮＡの核が無い粒子）や肝細胞膜を通過するＨＢｅ抗原などは、Ｄａｎｅ粒子の血中放出ルートとは別に多量に血中に放出、分泌される。この作用は、ＨＢＶ感染における宿主免疫機構の攻撃から逃れている作用と考えられる。ＨＢｅ抗原、ＨＢｃ抗原およびｐ２２ｃｒ抗原は、ＨＢｃｒ抗原（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｃｏｒｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ、ＨＢｃｒＡｇ）として測定可能であり、ウイルス複製のマーカーとして使用されている。【０００３】
Ｂ型肝炎とは、ＨＢＶに感染することで発症するウイルス性肝炎の一つであり、感染者数は全世界で約２億４０００万人であるとされている。先述のように、ＨＢＶに感染すると、Ｄａｎｅ粒子が血中に放出されるとともに、Ｄａｎｅ粒子の放出ルートとは別にウイルスタンパク質が血中に大量に分泌される。ウイルスタンパク質のうち、とくにＨＢｓ抗原は宿主であるヒトの免疫機構による感染細胞の排除を妨害している可能性が指摘されている（非特許文献２、３）。したがって、Ｂ型肝炎の治療には、Ｄａｎｅ粒子を減らすこと、すなわちウイルスの増殖を抑制するとともに、ＨＢｓ抗原をはじめとするウイルスタンパク質を減らすことが重要であると考えられている。
Ｂ型肝炎の第一選択薬には、エンテカビルやテノホビル等の核酸アナログが使用されている。核酸アナログ製剤はＨＢＶポリメラーゼタンパク質の活性を阻害、不完全環状二本鎖ＤＮＡの生成を阻害することにより、血中のＤａｎｅ粒子を減少、すなわちウイルスの増殖を抑制することが可能である。しかしながら、核酸アナログ製剤はＨＢｓ抗原を減少させることができないため、宿主免疫機構による感染細胞の排除を達成することは困難である。そのため、ＨＢｓ抗原の減少を達成可能な医薬品の開発が望まれている。【０００４】
ＹＴ−５２１Ｂ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ（ＹＴＨ）ドメイン含有タンパク質ファミリーは、ＹＴＨＤＣ１、ＹＴＨＤＣ２、ＹＴＨＤＦ１、ＹＴＨＤＦ２、ＹＴＨＤＦ３から構成されるタンパク質群である。いずれのタンパク質もＲＮＡ上のメチル化アデノシン（ｍ６Ａ）を含む認識配列を介してＲＮＡに結合し、ＲＮＡのスプライシングやタンパク質への翻訳などの生命現象を制御することが明らかにされている（非特許文献４）。ＹＴＨファミリー分子の機能に注目し、それらを阻害する化合物が感染症やがんの治療に有用であることが開示されている（特許文献１、２）。また、近年ＨＢＶのＲＮＡにもｍ６Ａが存在することが報告され、ＹＴＨＤＦ２およびＹＴＨＤＦ３がＨＢＶ  ＲＮＡに結合すること、ＨＢｓ抗原やＨＢｃ抗原の量を制御することが明らかにされた（非特許文献５）。しかしながら、非特許文献５で開示されたデータはＹＴＨＤＦ２およびＹＴＨＤＦ３を阻害することによりＨＢｓ抗原やＨＢｃ抗原が増加することを示すものであり、抗ＨＢＶ活性を示すものではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２０１８−５０３６６３号公報
【特許文献２】国際公開第２０１０／１３４９３９号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】田中ら、モダンメディア、５４巻、１２号、３４７〜３５２頁
【非特許文献２】Ｂｒｏｕｗら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１２６巻、２８０〜２８９頁、２００８年
【非特許文献３】Ｖａｎｌａｎｄｓｃｈｏｏｔら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、８３巻、１２８１〜１２８９頁、２００２年
【非特許文献４】Ｌｉａｏら、（２０１８）  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、１６巻、９９〜１０７頁
【非特許文献５】Ｉｍａｍら、（２０１８）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１１５巻、３５号、８８２９〜８８３４頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、抗Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）活性を有する新規の医薬組成物を提供することである。本発明はまた、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質の産生を阻害する医薬組成物、Ｂ型肝炎を処置するための医薬組成物を提供することである。本発明はさらに、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質の産生を阻害する医薬品候補化合物をスクリーニングする方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題に対し鋭意研究を重ねた結果、ＹＴＨＤＣファミリーに属するタンパク質の発現を阻害する医薬組成物が、ＨＢＶタンパク質の産生阻害能を有することを見出し、本発明を完成するに至った。【０００９】
すなわち、本発明は、以下を提供する。
＜１＞
Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質（ＨＢＶタンパク質）の産生を阻害する医薬組成物であって、ＹＴＨＤＣファミリーに属するタンパク質の発現または機能を阻害することを特徴とする医薬組成物。
＜２＞
ＨＢＶタンパク質が、ＨＢｓ抗原（ＨＢｓＡｇ）タンパク質である、＜１＞に記載の医薬組成物。
＜３＞
ＹＴＨＤＣファミリーに属するタンパク質が、ＹＴＨＤＣ１およびＹＴＨＤＣ２のうち少なくとも１つのタンパク質である、＜１＞または＜２＞のいずれか一つに記載の医薬組成物。
＜４＞
ＹＴＨＤＣファミリーに属するタンパク質が、ＹＴＨＤＣ１である、＜１＞〜＜３＞のいずれか一つに記載の医薬組成物。
＜５＞
さらに、ＨＢＶ  ＤＮＡの発現量を低下することを特徴とする、＜１＞〜＜４＞のいずれか一つに記載の医薬組成物。
＜６＞
さらに、完全二本鎖ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）の発現量を低下することを特徴とする、＜１＞〜＜５＞のいずれか一つに記載の医薬組成物。
＜７＞
対象におけるＢ型肝炎を処置するための医薬組成物であって、ＹＴＨＤＣファミリーに属するタンパク質の発現または機能に対する阻害剤を含む、医薬組成物。
＜８＞
ＹＴＨＤＣファミリーに属するタンパク質の発現または機能に対する阻害剤が、有効量の、抗体、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、アンチセンス核酸、二本鎖ＲＮＡ、アデノ随伴ウイルスベクターおよびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓベクター系からなる群から選択される、＜７＞に記載の医薬組成物。
＜９＞
二本鎖ＲＮＡが、ＲＮＡ干渉剤である、＜７＞または＜８＞に記載の医薬組成物。
＜１０＞
ＨＢＶタンパク質の産生を阻害する物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）ＨＢＶに感染した細胞またはＨＢＶを発現する細胞に対し、ＹＴＨＤＣファミリーに属するタンパク質の発現量を低下させる被験物質、または同タンパク質の機能もしくは活性を阻害する被験物質を接触させる工程、
（ｂ）ＨＢＶに感染した細胞もしくはＨＢＶを発現する細胞におけるＨＢＶタンパク質の産生能を測定する工程、および
（ｃ）（ｂ）のＨＢＶタンパク質の産生を阻害する活性を有する物質を選択する工程
を含む、方法。
＜１１＞
（ａ）の被験物質が、抗体、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、アンチセンス核酸、二本鎖ＲＮＡ、アデノ随伴ウイルスベクターまたはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓベクター系である、＜１０＞に記載の方法。
＜１２＞
（ｂ）が、ＨＢＶに感染した細胞もしくはＨＢＶを発現する細胞の培養上清中のＨＢＶタンパク質を測定する工程を含む、＜１０＞に記載の方法。
＜１３＞
（ｃ）の物質が、抗体、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、アンチセンス核酸、二本鎖ＲＮＡ、アデノ随伴ウイルスベクターまたはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓベクター系である、＜１０＞に記載の方法。【００１０】
また、本発明は、以下を提供する。
＜ａ＞
＜１＞〜＜６＞のいずれか一つに記載の医薬組成物を、ＨＢＶに感染しているか、または、ＨＢＶ感染が関連する疾病にかかっている対象に投与することを含む、処置方法。
＜ｂ＞
ＨＢＶ感染が関連する疾病が、Ｂ型肝炎、それらによる肝硬変、またはそれらによる肝がんである、＜ａ＞に記載の処置方法。
＜ｃ＞
＜１＞〜＜６＞のいずれか一つに記載の医薬組成物；および
ＨＢＶ感染が関連する疾病の処置方法が記載されている指示書
を含む、ＨＢＶ感染が関連する疾病の処置用キット。
＜ｄ＞
前記ＨＢＶ感染が関連する疾病の処置方法が、前記医薬組成物を、ＨＢＶに感染しているか、または、ＨＢＶ感染が関連する疾病にかかっている対象に投与することを含む、＜ｃ＞に記載のＨＢＶ感染が関連する疾病の処置用キット。
＜ｅ＞  Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質（ＨＢＶタンパク質）の産生を阻害する処置において使用するための、ＹＴＨＤＣファミリーに属するタンパク質の発現または機能を阻害する物質。
＜ｆ＞  Ｂ型肝炎の処置において使用するための、ＹＴＨＤＣファミリーに属するタンパク質の阻害剤。
＜ｇ＞  Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質（ＨＢＶタンパク質）の産生を阻害する医薬組成物の製造のための、ＹＴＨＤＣファミリーに属するタンパク質の発現または機能を阻害する物質の使用。
＜ｈ＞  対象におけるＢ型肝炎を処置するための医薬組成物の製造のための、ＹＴＨＤＣファミリーに属するタンパク質の阻害剤の使用。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の医薬組成物は、優れた抗ＨＢＶ活性を有し、抗ＨＢＶ剤として有用である。また、本発明のスクリーニング方法は、ＨＢＶタンパク質の産生を阻害する物質のスクリーニングに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、細胞生存率について、各濃度の陰性対照ｄｓＲＮＡ添加ウェルに対するｄｓＲＮＡ  １および２添加ウェルの相対値（％）を示す。
【図２】図２は、ＨＢｓ抗原（ＨＢｓＡｇ）について、各濃度の陰性対照ｄｓＲＮＡ添加ウェルに対するｄｓＲＮＡ  １および２添加ウェルの相対値（％）を示す。
【図３】図３は、ＨＢＶのＤＮＡ（ＨＢＶ  ＤＮＡ）について、各濃度の陰性対照ｄｓＲＮＡ添加ウェルに対するｄｓＲＮＡ  １および２添加ウェルの相対値（％）を示す。
【図４】図４は、陰性対照ｄｓＲＮＡ添加ウェル中のＹＴＨＤＣ１発現量に対するｄｓＲＮＡ  １および２添加ウェル中のＹＴＨＤＣ１発現量の相対値（％）を示す。
【図５】図５は、細胞生存率について、各濃度の陰性対照ｄｓＲＮＡ添加ウェルに対するｄｓＲＮＡ  ３および４添加ウェルの相対値（％）を示す。
【図６】図６は、ＨＢｓ抗原（ＨＢｓＡｇ）について、各濃度の陰性対照ｄｓＲＮＡ添加ウェルに対するｄｓＲＮＡ  ３および４添加ウェルの相対値（％）を示す。
【図７】図７は、ＨＢＶのＤＮＡ（ＨＢＶ  ＤＮＡ）について、各濃度の陰性対照ｄｓＲＮＡ添加ウェルに対するｄｓＲＮＡ  ３および４添加ウェルの相対値（％）を示す。
【図８】図８は、陰性対照ｄｓＲＮＡ添加ウェル中のＹＴＨＤＣ１発現量に対するｄｓＲＮＡ  ３および４添加ウェル中のＹＴＨＤＣ１発現量の相対値（％）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書において、特に断らない限り、各用語は、次の意味を有する。
【００１４】
予防とは、発症の阻害、発症リスクの低減または発症の遅延などを意味する。
治療とは、疾患または状態の改善または進行の抑制などを意味する。
処置とは、各種疾患に対する予防または治療などを意味する。
有効量とは、治療有効量または予防有効量などを意味する。
治療有効量とは、感染した対象におけるＨＢＶ感染の安定化、ＨＢＶ感染の低減またはＨＢＶ感染の根絶に十分な量である。また、予防有効量とは、感染するリスクのある対象におけるＨＢＶ感染の予防に十分な量である。
対象とは、ヒトを含む哺乳動物を意味する。
【００１５】
＜Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）＞
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、Ｂ型肝炎を発症させる能力を有するウイルスを意味する。ＨＢＶは遺伝子変異に由来する塩基配列の違いにより、現在Ａ型〜Ｈ型までの８つの遺伝子型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）に分類されている。本発明の医薬組成物における予防または治療の対象となるＨＢＶとしては、全ての遺伝子型を含む。
本発明において、ＨＢＶ感染が関連する疾病としては、Ｂ型肝炎が挙げられ、急性肝炎、慢性肝炎および劇症肝炎が挙げられる。また、ヒトを含む生体へのＨＢＶの感染により引き起こされる疾患であれば、肝硬変、肝線維化、肝細胞がんなどの肝がんも含まれる。
【００１６】
＜Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質（ＨＢＶタンパク質）＞
Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質（ＨＢＶタンパク質）は、ＨＢＶを構成するタンパク質であり、ＨＢｓ抗原、ＨＢｃ抗原、ＨＢｅ抗原などが挙げられる。
本発明において、ＨＢＶタンパク質は、特に限定されないが、ＨＢｓ抗原であることが好ましい。
【００１７】
＜医薬組成物＞
本発明の医薬組成物は、「物質」、具体的には「ＨＢＶタンパク質の産生を阻害する物質」と、薬学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物である。
本発明の医薬組成物は、ＨＢＶタンパク質の産生を阻害する物質として、ＹＴＨＤＣファミリーに属するタンパク質の発現または機能を阻害する物質を含む。
【００１８】
本発明の医薬組成物は、ＨＢＶタンパク質の産生を阻害する物質が好ましく、ＨＢｓ抗原の産生を阻害する物質がより好ましい。
【００１９】
「物質」としては、抗体、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、アンチセンス核酸、二本鎖ＲＮＡ、アデノ随伴ウイルスベクターまたはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓベクター系などが挙げられる。
【００２０】
「アンチセンス核酸」とは、あるタンパク質をコードする「センス」核酸、例えば二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖、ｍＲＮＡ配列または遺伝子のコード鎖の塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸であって、標的とする塩基配列と特異的かつ安定した二重鎖を形成して結合することにより、タンパク質合成を抑制する機能を有するものである。
「二本鎖ＲＮＡ」は、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）またはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって標的遺伝子の発現を干渉または阻害する核酸を含むが、それらに限定されない。
「ＲＮＡ干渉剤」は、ＲＮＡ干渉を介して標的遺伝子の発現を干渉または阻害する核酸である。
ＲＮＡ干渉は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を用いてｄｓＲＮＡと同じ配列を含むｍＲＮＡを分解する、転写後標的遺伝子サイレンシング技術である（Ｓｈａｒｐら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８７巻，２４３１〜２４３２頁、２０００年；Ｚａｍｏｒｅら、Ｃｅｌｌ、１０１巻、２５〜３３頁、２０００年；Ｔｕｓｃｈｌら、Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１３巻、３１９１〜３１９７、１９９９年）。内因性リボヌクレアーゼが長いｄｓＲＮＡを切断し、より短い２１または２２ヌクレオチド長の短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれるＲＮＡを生成する場合に生じる。このｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの分解を仲介する。ＲＮＡｉの合成のためのキットは、例えばＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｌａｂｓおよびＡｍｂｉｏｎから商業的に入手可能である。一つの態様において、アンチセンスＲＮＡに使用するための上記化学の一つ以上が使用できる。
本発明の医薬組成物に含まれる物質としては、アンチセンス核酸または二本鎖ＲＮＡが好ましく、二本鎖ＲＮＡがより好ましい。
また、二本鎖ＲＮＡの場合、ＲＮＡ干渉剤であることが特に好ましい。
【００２１】
「アデノ随伴ウイルス」は、パルボウイルス科に属する約４７００塩基からなる一本鎖ＤＮＡウイルスであり、エンベロープをもたず直径２０〜３０ｎｍの正二十面体構造のキャプシドを有しており、細胞膜も普遍的成分であるヘパラン硫酸プロテオグリカンを認識して感染するため、宿主域は広い。
アデノ随伴ウイルスのゲノム内には、任意の遺伝子、核酸を挿入することができる。したがって、遺伝子改変を行ったアデノ随伴ウイルスを標的となる細胞に感染させることで目的の遺伝子、核酸を導入することができることから、アデノ随伴ウイルスは遺伝子導入のためのベクターとして用いることができる。さらに、「アデノ随伴ウイルスベクター」は、病原性がなく、終末分化した非分裂細胞にも遺伝子導入できるため、遺伝子治療への応用が期待されている。
アデノ随伴ウイルスは血清型の違いにより、組織および細胞への感染指向性が異なることが知られている（小澤ら、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、２２巻、６号、６４３〜６５０頁、２００７年）。
本発明の医薬組成物に含まれる物質としては、アデノ随伴ウイルス５型、アデノ随伴ウイルス７型、アデノ随伴ウイルス８型またはアデノ随伴ウイルス９型が好ましく、アデノ随伴ウイルス８型がより好ましい。
【００２２】
「ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系」は、真性細菌や古細菌が有する獲得免疫として発見されたＣｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ／ＣＲＩＳＰＲ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）システムをゲノム編集に転用したシステムである（Ｊｉｎｅｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３３７巻、８１６〜８２１頁、２０１２年）。具体的には、上記細菌のＣＲＩＳＰＲ領域と呼ばれるゲノム領域には、断片化された外来ＤＮＡ（２０ｂｐ）が取り込まれたカセットが複数リピートしており、各カセットには、異なる外来ＤＮＡが取り込まれている。
各カセットは、外来生物（例えば、ファージなど）のＤＮＡが細胞内に取り込まれた場合にこれを断片化してＣＲＩＳＰＲ領域に組み込むことで生じると考えられる。
各カセットは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）をコードしている。ｃｒＲＮＡは、プロトスペーサー配列と後述するｔｒａｎｓ―ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と相補的な配列とを有する。プロトスペーサー配列は、２０ヌクレオチド長であり、標的となるＤＮＡ配列と相補的な配列を有する。プロトスペーサー配列は、標的配列と１００％の相補性を有している必要はなく、５’末端から６ヌクレオチドの領域ではミスマッチが許容される。ｃｒＲＮＡは、相補的部分を介して別に転写されるｔｒａｎｓ―ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と複合体を形成する。ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの複合体は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼとさらなる複合体を形成する。ｃｒＲＮＡ中のプロトスペーサー部分は、外来ＤＮＡと相補的にハイブリッド形成を行い、これによりＣａｓ９エンドヌクレアーゼを外来ＤＮＡの標的配列に先導する。外来ＤＮＡは標的配列の部位においてＣａｓ９エンドヌクレアーゼにより切断され、ＣＲＩＳＰＲ―Ｃａｓ９システムは、外来ＤＮＡから宿主を防御する。
このようにＣＲＩＳＰＲ―Ｃａｓ９システムは、真性細菌や古細菌が新しい外来ＤＮＡに対する獲得免疫として機能することで発見されたものであるが、外来ＤＮＡからなるプロトスペーサーを設計することで、哺乳動物のゲノムを配列依存的に切断できること、およびそれにより、哺乳動物のゲノムを編集することができる。
「ＣＲＩＳＰＲ―Ｃａｓベクター系」とは、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの機能を併せ持つガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、およびＣａｓ遺伝子配列を含んでなるベクター系である。現在主に使用されているシステムは、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来する第２種のＣＲＩＳＰＲ―Ｃａｓ９システムであるが、これに限定されない。
【００２３】
また、薬学的に許容され得る担体とは、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤などが挙げられる。そのような担体の一つ以上を用いることにより、錠剤、カプセル剤、散剤、シロップ剤、顆粒剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、粉体製剤、坐剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、貼付剤、軟膏剤、注射剤、液剤、トローチ剤あるいはエリキシル剤などの形態の医薬組成物を調製することができる。
これらの医薬組成物は、経口あるいは非経口的に投与することができる。非経口投与のためのその他の形態としては、一つまたはそれ以上の活性物質を含み、定法により処方される外用液剤、腸溶内投与のための坐剤などが含まれる。
また、本発明の医薬組成物の投与量および投与回数は、患者の性別、体重、年齢、重症度および症状などに応じて適宜選択することができる。通常、成人に対しては、経口または非経口（例えば、注射、点滴および直腸部位への投与など）投与により、１日当たり０．０１〜１０００ｍｇ／ｋｇを１回から数回に分割して投与すればよい。
【００２４】
＜ＹＴＨＤＣファミリーに属するタンパク質＞
ＹＴ−５２１Ｂ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ（ＹＴＨ）ドメイン含有タンパク質ファミリーは、ＹＴＨＤＣ１、ＹＴＨＤＣ２、ＹＴＨＤＦ１、ＹＴＨＤＦ２およびＹＴＨＤＦ３から構成されるタンパク質群である。いずれのタンパク質もＲＮＡ上のメチル化アデノシン（ｍ６Ａ）を含む認識配列を介してＲＮＡに結合し、ＲＮＡのスプライシングやタンパク質への翻訳などの生命現象を制御することが明らかにされている（非特許文献４）。
また、ＹＴＨＤＣ（ＹＴＨ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）ファミリーに属するタンパク質は、ＹＴＨＤＣ１およびＹＴＨＤＣ２が挙げられる。
本発明の医薬組成物は、ＹＴＨＤＣファミリーに属するタンパク質の発現または機能を阻害することが好ましい。ＹＴＨＤＣファミリーに属するタンパク質は、ＹＴＨＤＣ１およびＹＴＨＤＣ２のうち少なくとも１つのタンパク質であることが好ましく、ＹＴＨＤＣ１であることがより好ましい。
【００２５】
本発明の医薬組成物は、対象におけるＢ型肝炎を処置するための医薬組成物であって、ＹＴＨＤＣファミリーに属するタンパク質の発現または機能に対する阻害剤を含む、医薬組成物として有用である。
【００２６】
＜スクリーニング方法＞
本発明のスクリーニング方法は、ＨＢＶタンパク質の産生を阻害する物質をスクリーニングする方法として有用である。
本発明のスクリーニング方法としては、
（ａ）ＨＢＶに感染した細胞またはＨＢＶを発現する細胞に対し、ＹＴＨＤＣファミリーに属するタンパク質の発現量を低下させる被験物質、または同タンパク質の機能もしくは活性を阻害する被験物質を接触させる工程、
（ｂ）ＨＢＶに感染した細胞もしくはＨＢＶを発現する細胞におけるＨＢＶタンパク質の産生能を測定する工程、および
（ｃ）（ｂ）のＨＢＶタンパク質の産生を阻害する活性を有する物質を選択する工程
を含む方法が挙げられる。
【００２７】
（ａ）ＨＢＶに感染した細胞もしくはＨＢＶを発現する細胞に対し、ＹＴＨＤＣファミリーに属するタンパク質の発現量を低下させる被験物質、または同タンパク質の機能もしくは活性を阻害する被験物質を接触させる工程
ＨＢＶに感染した細胞としては、例えば、ＨＢＶクローンＣ＿ＪＰＮＡＴ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ２４６３４５．１）に感染したヒト初代培養肝細胞、あるいはｓｏｄｉｕｍ  ｔａｕｒｏｃｈｏｌａｔｅ  ｃｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（ＮＴＣＰ）を強制発現させたＨｅｐＧ２細胞であって、ＨＢＶクローンＣ＿ＪＰＮＡＴ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ２４６３４５．１）に感染した細胞が挙げられる。上記のＨＢＶクローンと細胞の組み合わせについては、とくに限定されない。
ＨＢＶを発現する細胞としては、例えば、ＨｅｐＧ２．２．１５細胞、あるいはＨＢＶクローンＣ＿ＪＰＮＡＴ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ２４６３４５．１）のゲノム配列を１．２４倍長化した配列を含んでなるプラスミドを強制発現させたＨｅｐＧ２細胞、Ｈｕｈ−７細胞、ＨｅｐａＲＧ細胞、あるいはヒト初代培養肝細胞が挙げられる。上記のＨＢＶクローンについては、とくに限定されない。また、上記のＨＢＶクローンのゲノム配列を含んでなるプラスミドに挿入されるＨＢＶゲノム由来の配列の長さについては、ＨＢＶクローンのゲノム配列の１．２４倍長以上であれば、とくに限定されない。
ＹＴＨＤＣファミリーに属するタンパク質の発現量を低下させる被験物質、または同タンパク質の機能もしくは活性を阻害する被験物質としては、例えば、抗体、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、アンチセンス核酸、二本鎖ＲＮＡ、アデノ随伴ウイルスベクターまたはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓベクター系などから選ばれた物質が挙げられる。
本発明のスクリーニング方法に用いる被験物質としては、アンチセンス核酸または二本鎖ＲＮＡが好ましく、二本鎖ＲＮＡがより好ましい。
【００２８】
（ｂ）ＨＢＶに感染した細胞もしくはＨＢＶを発現する細胞におけるＨＢＶタンパク質の産生能を測定する工程
ＨＢＶタンパク質の産生能を測定する工程としては、ＨＢＶに感染した細胞もしくはＨＢＶを発現する細胞の培養上清中のＨＢＶタンパク質を測定する方法が挙げられる。
例えば、回収した培養上清を用いて化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）、あるいは酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）などの方法またはこれらに準じる方法で、ＨＢＶタンパク質を測定することできる。
【００２９】
（ｃ）（ｂ）のＨＢＶタンパク質の産生を阻害する活性を有する物質を選択する工程
例えば、（ｂ）において被験物質を作用させることにより、陰性対照に比べて、ＨＢＶタンパク質の産生を、３０％以上、好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７０％以上、よりさらに好ましくは９０％以上抑制する物質を選択することができる。
【００３０】
＜医薬組成物の用途＞
本発明の医薬組成物は、ＨＢＶ感染の治療または予防において有用である。
【００３１】
本発明の医薬組成物は、ＨＢＶタンパク質の産生、特にＨＢｓ抗原の産生を阻害することができる。また、ＨＢＶ遺伝子発現（ＨＢＶのＤＮＡ産生）を阻害することができる。したがって、本発明の医薬組成物は、ＨＢＶ感染の治療または予防のために有用である。
【００３２】
本発明は、ＨＢｓ抗原の産生の阻害のための、本発明の医薬組成物の使用に関する。
本発明は、ＨＢＶのＤＮＡ産生の阻害のための、本発明の医薬組成物の使用に関する。
本発明は、ＨＢＶの遺伝子発現の阻害のための、本発明の医薬組成物の使用に関する。
【００３３】
本発明は、ＨＢＶ感染の治療または予防のための、本発明の医薬組成物の使用に関する。
ＨＢＶ感染に関連する疾病には、進行性肝線維症、炎症および壊死が含まれ、これらは肝硬変、末期肝疾患および肝細胞がんに進行する。
【００３４】
次に、本発明について試験例を挙げて説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００３５】
［試験例１］
（抗ＨＢＶアッセイ）
肝芽細胞腫（ｈｅｐａｔｏｂｌａｓｔｏｍａ）細胞株ＨｅｐＧ２にＨＢＶゲノムが導入された、持続的にウイルスを産生する細胞であるＨｅｐＧ２．２．１５細胞（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８４巻  １００５頁〜１００９頁  １９８７年）を用いて、ＹＴＨＤＣ１の阻害による抗ＨＢＶ活性を以下の手順で評価した。
細胞培養用培地として、以下を用いた。
ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）＋５μｇ／ｍＬインスリン（Ｗａｋｏ社製）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ社製）＋１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ社製）＋５０μｍｏｌ／Ｌヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ社製）＋１０％ＦＢＳ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ−Ｂｉｏ社製）【００３６】
トランスフェクションに用いたｄｓＲＮＡは、以下に示す配列（配列番号１〜配列番号４に指定した）を有する（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）。
ｄｓＲＮＡ  １はヒトＹＴＨＤＣ１遺伝子の第１の配列に相補的である。
５’−ＧＧＡ  ＡＵＵ  ＵＣＡ  ＵＡＡ  ＣＡＵ  ＧＧＧ  Ａｔｔ−３’（配列番号１）
５’−ＵＣＣ  ＣＡＵ  ＧＵＵ  ＡＵＧ  ＡＡＡ  ＵＵＣ  Ｃｃｔ−３’（配列番号２）
ｄｓＲＮＡ  ２はヒトＹＴＨＤＣ１遺伝子の第２の配列に相補的である。
５’−ＣＡＧ  ＵＡＡ  ＡＧＡ  ＵＣＧ  ＧＡＣ  ＧＵＧ  Ａｔｔ−３’（配列番号３）
５’−ＵＣＡ  ＣＧＵ  ＣＣＧ  ＡＵＣ  ＵＵＵ  ＡＣＵ  Ｇｇｔ−３’（配列番号４）
また、Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｎｏ．１  ｓｉＲＮＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を陰性対照ｄｓＲＮＡとして用いた。
（１）ＨｅｐＧ２．２．１５細胞を上記培地に懸濁し、２×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬのＨｅｐＧ２．２．１５細胞懸濁液を調製した。ｄｓＲＮＡをＮｕｃｌｅａｓｅ−Ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒ（ｎｏｔ  ＤＥＰＣ−Ｔｒｅａｔｅｄ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて希釈し、０．２２９〜５００ｎｍｏｌ／Ｌ、３倍希釈系列のｄｓＲＮＡ溶液を調製した。１μＬの調製済みｄｓＲＮＡ溶液および０．３μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍiｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を、８．７μＬの無血清培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で希釈し、室温で５分インキュベートした。このｄｓＲＮＡ−Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ混合液１０μＬを細胞培養用培地４０μＬで希釈し、５０μＬとした。これを前述のＨｅｐＧ２．２．１５細胞懸濁液５０μＬと混合し、９６穴マイクロタイタープレートに播種し、５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で３日間インキュベートした。次に前述の細胞培養用培地１００μＬ／ウェルにて培地交換し、５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃でさらに３日間インキュベートした。そして培養上清を回収するとともに、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて細胞生存率を測定した（図１）。培養上清中のＨＢｓ抗原量を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ（ＨＢｓＡｇ）Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて測定した。また、回収した培養上清をＢｕｆｆｅｒ  ＡＬ（Ｑｉａｇｅｎ社製）およびＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）の混合物で処理し、得られた溶液中のＨＢＶのＤＮＡ（ＨＢＶ  ＤＮＡ）を、リアルタイムＰＣＲ法にて定量した。各マーカーについて、各濃度の陰性対照ｄｓＲＮＡ添加ウェルに対する各ｄｓＲＮＡ添加ウェルの相対値（％）を算出した（図２および図３）。
（２）ＨｅｐＧ２．２．１５細胞を上記培地に懸濁し、２×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬのＨｅｐＧ２．２．１５細胞懸濁液を調製した。１０μＬのｄｓＲＮＡ（５００ｎＭ）および３μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｉｍｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を、８７μＬの無血清培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で希釈し、室温で５分インキュベートした。このｄｓＲＮＡ−Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ混合液１００μＬを細胞培養用培地４００μＬで希釈し、５００μＬとした。これを前述のＨｅｐＧ２．２．１５細胞懸濁液５００μＬと混合し、１２穴マイクロタイタープレートに播種し、５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で３日間インキュベートした。次に前述の細胞培養用培地１０００μＬ／ウェルにて培地交換し、５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃でさらに３日間インキュベートした。そして培養上清を廃棄し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（１０００μＬ／ウェル、富士フイルム和光純薬社製）で洗浄、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎi  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。抽出したトータルＲＮＡ１μｇを、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  ｇＤＮＡ  Ｅｒａｓｅｒ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて逆転写し、ｃＤＮＡを作製した。作製したｃＤＮＡ中のＹＴＨＤＣ１およびハウスキーピング遺伝子であるＧｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）をリアルタイムＰＣＲ法にて定量し、ＧＡＰＤＨで補正したＹＴＨＤＣ１発現量を算出、陰性対照ｄｓＲＮＡ添加ウェル中のＹＴＨＤＣ１発現量に対する各ｄｓＲＮＡ添加ウェル中のＹＴＨＤＣ１発現量の相対値（％）を算出した（図４）。【００３７】
ＹＴＨＤＣ１の発現量を減少させることにより、細胞生存率に影響は見られない一方で、ＨＢｓ抗原量が減少することが明らかとなった。また、ＨＢＶ  ＤＮＡも減少することが明らかとなった。【００３８】
［試験例２］
（異なるメーカー由来のｄｓＲＮＡを用いた抗ＨＢＶアッセイ）
ＨｅｐＧ２．２．１５細胞を用いて、ＹＴＨＤＣ１の阻害による抗ＨＢＶ活性を以下の手順で評価した。
細胞培養用培地として、以下を用いた。
ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）＋５μｇ／ｍＬインスリン（富士フイルム和光純薬社製）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン（富士フイルム和光純薬社製）＋１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ（富士フイルム和光純薬社製）＋５０μｍｏｌ／Ｌヒドロコルチゾン（富士フイルム和光純薬社製）＋１０％ＦＢＳ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ−Ｂｉｏ社製）
トランスフェクションに用いたｄｓＲＮＡは、以下に示す配列（配列番号５〜配列番号８に指定した）を有する。
ｄｓＲＮＡ  ３はヒトＹＴＨＤＣ１遺伝子の第３の配列に相補的である（Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社製）。
５’−ＵＣＵ  ＡＧＡ  ＵＧＣ  ＵＧＡ  ＵＣＧ  ＧＡＡ  Ａｔｔ−３’（配列番号５）
５’−ＵＵＵ  ＣＣＧ  ＡＵＣ  ＡＧＣ  ＡＵＣ  ＵＡＧ  Ａｔｔ−３’（配列番号６）
ｄｓＲＮＡ  ４はヒトＹＴＨＤＣ１遺伝子の第４の配列に相補的である（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）。
５’−ＧＡＡ  ＵＧＡ  ＡＣＡ  ＵＡＡ  ＡＣＣ  ＡＧＵ  Ａｔｔ−３’（配列番号７）
５’−ＵＡＣ  ＵＧＧ  ＵＵＵ  ＡＵＧ  ＵＵＣ  ＡＵＵ  Ｃｔｔ−３’（配列番号８）
また、Ｏｎ−ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ  Ｎｏｎ−Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｐｏｏｌ（Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社製）またはＭｉｓｓｉｏｎ＿Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ＳＩＣ−００２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を陰性対照ｄｓＲＮＡとして用いた。
（１）ＨｅｐＧ２．２．１５細胞を上記培地に懸濁し、２×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬのＨｅｐＧ２．２．１５細胞懸濁液を調製した。ｄｓＲＮＡをＮｕｃｌｅａｓｅ−Ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒ（ｎｏｔ  ＤＥＰＣ−Ｔｒｅａｔｅｄ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）または１ｘｓｉＲＮＡ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社製）を用いて希釈し、０．４５７〜１０００ｎｍｏｌ／Ｌ、３倍希釈系列のｄｓＲＮＡ溶液を調製した。３μＬの調製済みｄｓＲＮＡ溶液および０．３μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍiｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を、６．７μＬの無血清培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で希釈し、室温で５分インキュベートした。このｄｓＲＮＡ−Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ混合液１０μＬを細胞培養用培地４０μＬで希釈し、５０μＬとした。これを前述のＨｅｐＧ２．２．１５細胞懸濁液５０μＬと混合し、９６穴マイクロタイタープレートに播種し、５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で３日間インキュベートした。次に前述の細胞培養用培地１００μＬ／ウェルにて培地交換し、５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃でさらに３日間インキュベートした。そして培養上清を回収するとともに、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて細胞生存率を測定した（図５）。培養上清中のＨＢｓ抗原量を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ（ＨＢｓＡｇ）Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて測定した。また、回収した培養上清をＢｕｆｆｅｒ  ＡＬ（Ｑｉａｇｅｎ社製）およびＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）の混合物で処理し、得られた溶液中のＨＢＶのＤＮＡ（ＨＢＶ  ＤＮＡ）を、リアルタイムＰＣＲ法にて定量した。各マーカーについて、各濃度の陰性対照ｄｓＲＮＡ添加ウェルに対する各ｄｓＲＮＡ添加ウェルの相対値（％）を算出した（図６および図７）。
（２）ＨｅｐＧ２．２．１５細胞を上記培地に懸濁し、２×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬのＨｅｐＧ２．２．１５細胞懸濁液を調製した。３０μＬのｄｓＲＮＡ（１０００ｎＭ）および３μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｉｍｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を、６７μＬの無血清培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で希釈し、室温で５分インキュベートした。このｄｓＲＮＡ−Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ混合液１００μＬを細胞培養用培地４００μＬで希釈し、５００μＬとした。これを前述のＨｅｐＧ２．２．１５細胞懸濁液５００μＬと混合し、１２穴マイクロタイタープレートに播種し、５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で３日間インキュベートした。次に前述の細胞培養用培地１０００μＬ／ウェルにて培地交換し、５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃でさらに３日間インキュベートした。そして培養上清を廃棄し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（１０００μＬ／ウェル、富士フイルム和光純薬社製）で洗浄、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎi  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。抽出したトータルＲＮＡ１μｇを、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  ｇＤＮＡ  Ｅｒａｓｅｒ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて逆転写し、ｃＤＮＡを作製した。作製したｃＤＮＡ中のＹＴＨＤＣ１およびハウスキーピング遺伝子であるＧｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）をリアルタイムＰＣＲ法にて定量し、ＧＡＰＤＨで補正したＹＴＨＤＣ１発現量を算出、陰性対照ｄｓＲＮＡ添加ウェル中のＹＴＨＤＣ１発現量に対する各ｄｓＲＮＡ添加ウェル中のＹＴＨＤＣ１発現量の相対値（％）を算出した（図８）。【００３９】
ｄｓＲＮＡ  ３および４によってＹＴＨＤＣ１の発現量を減少させることにより、細胞生存率に影響は見られない一方で、ＨＢｓ抗原量が減少することが明らかとなった。また、ＨＢＶ  ＤＮＡも減少することが明らかとなった。【００４０】
ＹＴＨＤＣ１の阻害により、ＨＢＶタンパク質の産生阻害やＨＢＶ  ＤＮＡ発現量の低下効果などの優れた抗ＨＢＶ効果を得られることが明らかとなった。【００４１】
ｄｓＲＮＡ等を用いたＲＮＡｉ実験では、標的分子を阻害していないにもかかわらず、目的とする作用が発現する例が知られている（オフターゲット効果）。そのため、ＲＮＡｉ実験で得られた結果を正しく解釈するためには、それがオフターゲット効果によるものではないことを示すことが重要である。一般的に、ｄｓＲＮＡによる作用がオフターゲット効果であることを否定するためには、１つの標的遺伝子について２種類以上の複数のｄｓＲＮＡを使用して同じ作用が発現することを確認することが有効とされている（Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ５巻  ４８９頁〜４９０頁  ２００３年）。本発明の試験例では、４種類の異なるｄｓＲＮＡによって抗ＨＢＶ効果を得られることを明らかにした。従って、上記の試験例の結果より、ＹＴＨＤＣファミリーに属するタンパク質の発現を阻害する医薬組成物が、ＨＢＶタンパク質の産生阻害能を有することが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明の医薬組成物は、優れた抗ＨＢＶ活性を示し、抗Ｂ型肝炎ウイルス剤として有用である。
【図１】
2020196738.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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