(57)【要約】  本発明の課題は、グルコース脱水素酵素、該酵素をコードするポリヌクレオチド、該酵素の製造方法、該酵素を用いたグルコースの測定方法、測定試薬組成物及びバイオセンサを提供すること。  本発明は、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のアミノ酸配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質：（ａ）配列番号３、６、１５又は１６に示されるアミノ酸配列；（ｂ）配列番号３、６、１５又は１６に示されるアミノ酸配列において１〜３個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列；（ｃ）配列番号３もしくは１５に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性、又は配列番号６もしくは１６に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列、等に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のアミノ酸配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質：
（ａ）配列番号３、６、１５又は１６に示されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号３、６、１５又は１６に示されるアミノ酸配列において１〜３個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号３もしくは１５に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性、又は配列番号６もしくは１６に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項２に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【請求項４】
請求項２に記載のポリヌクレオチドを含む形質転換細胞。
【請求項５】
請求項４に記載の細胞を培養し、培養物からフラビン結合型グルコース脱水素酵素を採取することを特徴とするフラビン結合型グルコース脱水素酵素の製造方法。
【請求項６】
請求項５記載の製造方法によって得られたフラビン結合型グルコース脱水素酵素。
【請求項７】
請求項１又は６記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を使用する、グルコースの測定方法。
【請求項８】
請求項１又は６記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含む、グルコース測定試薬組成物。
【請求項９】
請求項１又は６記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含む、グルコース測定用バイオセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルコース脱水素酵素、該酵素をコードするポリヌクレオチド、該酵素の製造方法、該酵素を用いたグルコースの測定方法、測定試薬組成物及びバイオセンサ等に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液中のグルコース（血糖）濃度の測定は、主に糖尿病患者の血糖コントロールにおいて重要である。血糖測定において、酵素を利用した血糖測定機器として、バイオセンサが広く使われている。【０００３】
バイオセンサに使用可能な酵素として、グルコース酸化酵素やグルコース脱水素酵素が知られている。しかし、グルコース酸化酵素は、血中の溶存酸素により測定誤差が生じるという問題があった。グルコース脱水素酵素のうち、真核細胞由来のフラビン結合型グルコース脱水素酵素は、溶存酸素の影響を受けないこと、補酵素の添加を必要としないこと及び基質特異性に優れることから、バイオセンサ用の酵素として有用である（特許文献１〜５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開２００４／０５８９５８号パンフレット
【特許文献２】国際公開２００６／１０１２３９号パンフレット
【特許文献３】国際公開２００８／００１９０３号パンフレット
【特許文献４】国際公開２０１０／１４０４３１号パンフレット
【特許文献５】国際公開２０１３／０２２０７４号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、基質特異性の高い新規なグルコース脱水素酵素、該酵素をコードするポリヌクレオチド、該酵素の製造方法、該酵素を用いたグルコースの測定方法、測定試薬組成物及びバイオセンサを提供する。更に、測定試薬組成物及びバイオセンサの製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明者らは、種々の微生物由来のグルコース脱水素酵素を探索し、基質特異性の高いフラビン結合型グルコース脱水素酵素を見出した。更に、効率的なフラビン結合型グルコース脱水素酵素の製造方法を見出し、本発明を完成した。【０００７】
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［９］の態様に関する。
［１］以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のアミノ酸配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質：
（ａ）配列番号３、６、１５又は１６に示されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号３、６、１５又は１６に示されるアミノ酸配列において１〜３個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号３もしくは１５に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性、又は配列番号６もしくは１６に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列。
［２］［１］に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［３］［２］に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
［４］［２］に記載のポリヌクレオチドを含む形質転換細胞。
［５］［４］に記載の細胞を培養し、培養物からフラビン結合型グルコース脱水素酵素を採取することを特徴とするフラビン結合型グルコース脱水素酵素の製造方法。
［６］［５］記載の製造方法によって得られたフラビン結合型グルコース脱水素酵素。
［７］［１］又は［６］記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を使用する、グルコースの測定方法。
［８］［１］又は［６］記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含む、グルコース測定試薬組成物。
［９］［１］又は［６］記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含む、グルコース測定用バイオセンサ。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によって、基質特異性の高い新規なフラビン結合型グルコース脱水素酵素が得られ、該酵素を簡便に製造できるようになった。更に、該酵素を使用したグルコース測定が可能になり、該酵素を含むグルコース測定試薬組成物やグルコース測定用バイオセンサが製造できるようになった。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の酵素によるＤ−グルコース測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明のグルコース脱水素酵素は、下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のアミノ酸配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質である。「タンパク質」とは糖タンパク質も含む。
（ａ）配列番号３、６、１５又は１６に示されるアミノ酸配列。
（ｂ）配列番号３、６、１５又は１６に示されるアミノ酸配列において１〜３個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列。
（ｃ）配列番号３もしくは１５に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性、又は配列番号６もしくは１６に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列。
該酵素は、好ましくは（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のアミノ酸配列からなり、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質である。
【００１１】
本発明のグルコース脱水素酵素は、前記配列を有するタンパク質であれば特に限定されず、細胞を培養して得られた酵素でもよく、合成によって得られた合成酵素でもよい。好ましくは遺伝子組換えによって得られた組換え酵素である。
【００１２】
本発明のフラビン結合型グルコース脱水素酵素は、下記の性質（１）〜（４）を有する。フラビンとしては、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）が挙げられ、好ましくはＦＡＤである。
（１）作用：電子受容体存在下で、グルコースを酸化する反応を触媒する酵素である。
（２）可溶性である。
（３）酸素を実質的に電子受容体としない。
【００１３】
（４）基質特異性が高い。５０ｍＭグルコースに対する作用性を１００％とした場合に、５０ｍＭマルトースに対する作用性が、何れも好ましくは多くとも２．０％、より好ましくは多くとも１．５％、さらに好ましくは多くとも１．０％である。
【００１４】
本発明のポリヌクレオチドは、下記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）からなり、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする。
（ｉ）前記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
（ｉｉ）配列番号１、２、４又は５に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド。
（ｉｉｉ）配列番号１、２、４又は５に示される塩基配列において３、６又は９個の塩基が欠失又は付加されたポリヌクレオチド。又は配列番号１、２、４又は５に示される塩基配列において１〜１０個、好ましくは多くとも９個、８個、６個、５個、４個、３個もしくは２個の塩基が置換された塩基配列を有するポリヌクレオチド。
（ｉｖ）配列番号１、２、４又は５に示される塩基配列と同一性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチド。
前記同一性は、少なくとも９０％、９２％又は９５％が好ましく、少なくとも９７％、９８％又は９９％がより好ましい。
【００１５】
本書での同一性は、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ解析により算出されたｉｄｅｎｔｉｔｙの値とする。
【００１６】
本発明の組換えベクターは、クローニングベクター又は発現ベクターであり、ベクターは適宜選択できる。ベクターは、インサートとして本発明のポリヌクレオチドを含む。インサートとして挿入するポリヌクレオチドは、宿主細胞に対応して、コドンユーセージを最適化したポリヌクレオチドでも良い。終止コドンを宿主に最適な終止コドンに置換することで組換えタンパク質の発現量を向上させても良い。さらに、宿主で発現可能であれば、シグナル配列を含むアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであっても、シグナル配列を含まないアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであっても良い。例えば、シグナル配列を含まない配列番号１５及び１６のようなアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの場合は、開始コドンＡＴＧを付加して挿入する、又はそのまま挿入してベクター側の発現用ペプチドもしくはシグナル配列を利用することができる。又は、シグナル配列をコードする配列を例えば宿主に適切なシグナル配列をコードする配列に置換したポリヌクレオチドでも良い。尚、必要に応じて、シャペロンやリゾチームなどの発現に寄与するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、本発明のポリヌクレオチドと同一のベクターに導入する、及び／又は別のベクターに導入して同一宿主に保持させることも可能である。更に、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＧＦＰなど各種タグを付加した融合タンパク質として発現できるベクターを使用して、本発明のグルコース脱水素酵素を発現しても良い。
【００１７】
原核細胞で組換えタンパク質を発現させる場合には、イントロンを含まないｃＤＮＡ配列をインサートとし、発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システム、ｐＣｏｌｄ発現システムなどが例示できる。
【００１８】
真核細胞で組換えタンパク質を発現させる場合には、インサートとしてのポリヌクレオチドは、例えば配列番号１及び４のようなイントロンを含んだＤＮＡ配列でも良く、例えば配列番号２及び５のようなｃＤＮＡ配列でも良い。発現ベクターとしては、ｐＧＡＰＺα、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ-ＣＭＶ、ｐＢＫ-ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐＹＥ８２などが例示できる。
【００１９】
宿主細胞としては、例えば、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、真菌（酵母、糸状菌（子嚢菌、担子菌等）等）、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができ、本発明のベクターを該細胞に導入して形質転換させることで、本発明の形質転換細胞を得ることができる。前記ベクターを、プラスミドのような状態で形質転換細胞内に維持しても良く、染色体中に組み込ませて維持しても良い。又は、遺伝子編集技術を用いて、本発明のポリヌクレオチドを含む形質転換細胞を得ることができる。更に、糖鎖の要、不要、その他のペプチド修飾の必要性に応じて、適宜宿主は選択することができるが、糖鎖付加可能な宿主を選択し、糖鎖を有する酵素（糖タンパク質）を製造することが好ましい。
【００２０】
本発明の形質転換細胞を培養して得られた培養物からグルコース脱水素酵素を採取することによって、組換えグルコース脱水素酵素を製造することができる。
【００２１】
本発明で使用されるグルコース脱水素酵素生産菌の培養には、通常の微生物培養用培地が使用できる。例えば、炭素源、窒素源、ビタミン類、無機物、その他使用する微生物が必要とする微量栄養素を程よく含有するものであれば、合成培地、天然培地の何れでも使用可能である。炭素源としては、グルコース、スクロース、デキストリン、澱粉、グリセリン及び糖蜜等が使用できる。窒素源としては、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機塩類、ＤＬ−アラニン及びＬ−グルタミン酸等のアミノ酸類、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス及びコーンスティープリカー等の窒素含有天然物が使用できる。無機物としては、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム及び塩化第二鉄等が使用できる。
【００２２】
本発明のグルコース脱水素酵素を得るための培養は、通常、振盪培養や通気攪拌等の方法による好気的条件下で行うのが良い。グルコース脱水素酵素生産菌の特性を踏まえて、グルコース脱水素酵素の生産に適した培養条件に設定すれば良い。例えば、培養温度は２０℃から５０℃、かつｐＨ４からｐＨ８の範囲で行うのが好ましく、生産性を考慮して培養中にｐＨ調整をしても良い。培養期間は、２日から１０日の範囲が好ましい。この様な方法で培養することにより、培養物中にグルコース脱水素酵素を生成蓄積することができる。
【００２３】
培養物中からグルコース脱水素酵素を得る方法は、通常のタンパク質の製造方法が利用できる。例えば、最初にグルコース脱水素酵素生産菌を培養後、遠心分離により培養上清液を得る。又は培養菌体を得、適当な方法で該培養微生物を破砕し、破砕液から遠心分離等によって上清液を得る。次に、これらの上清液中に含まれるグルコース脱水素酵素を、通常のタンパク質の精製方法で精製し、精製酵素を得ることができる。例えば、限外ろ過、塩析、溶媒沈殿、熱処理、透析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィー等の精製操作を組み合わせることによって精製できる。
【００２４】
本発明のグルコース脱水素酵素は乾燥して使用することができる。酵素が失活しなければ乾燥方法は制限されないが、凍結乾燥により、凍結乾燥品を得るのが好ましい。乾燥工程で、緩衝液剤及び安定化剤を添加することができる。乾燥後に粉砕して、粉末化し、粉末品にしても良い。
【００２５】
本発明のグルコース脱水素酵素を用いて、グルコースを測定することができる。本発明のグルコース測定方法は、グルコースを含む被検試料と本発明のグルコース脱水素酵素とを接触させる工程を含むことにより、被検試料中のグルコースを定量できる。被検試料は特に限定されないが、生体試料が例示でき、具体例として血液、涙、唾液、尿又は間質液等が例示できる。本発明の酵素は、特に血糖測定に有用である。
【００２６】
本発明は、本発明のグルコース脱水素酵素を用いてグルコース測定用試薬組成物、グルコース測定用キット又はグルコース測定用バイオセンサを製造する製造方法を提供する。本発明の酵素は基質特異性が高く、酸素を実質的に電子受容体としないため、グルコース測定において、測定試料中の他の糖類及び溶存酸素の影響を受け難い。よって、他の糖類や溶存酸素の影響を受け難いグルコース測定用試薬組成物、グルコース測定用キット又はグルコース測定用バイオセンサが提供でき、測定精度の高いグルコース測定が可能である。
【００２７】
本発明のグルコース測定用試薬組成物は、酵素として本発明のグルコース脱水素酵素を含む試薬組成物であれば良い。該組成物中の酵素量は、試料中のグルコースを測定できれば特に限定されないが、１測定あたりの酵素量が０．０１から１００Ｕ程度が好ましく、０．０５から５０Ｕ程度がより好ましく、０．１から２０Ｕ程度が更に好ましい。該組成物は、緩衝剤を含むことが好ましく、安定化剤等の当業者に公知の他の任意成分を適宜含有させ、該酵素や試薬成分の熱安定性や保存安定性を高めるのがより好ましい。前記成分としては、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）若しくは卵白アルブミン、該酵素と作用性のない糖類若しくは糖アルコール類、カルボキシル基含有化合物、アルカリ土類金属化合物、アンモニウム塩、硫酸塩又はタンパク質等を例示できる。更に、被験試料中に存在する、測定に影響を与える夾雑物質の影響を抑える公知の物質を、該測定試薬に含ませても良い。本発明のグルコース測定用キットは、前記試薬組成物を含み、グルコース標準液を含ませることができる。
【００２８】
本発明のバイオセンサは、酵素として本発明のグルコース脱水素酵素を含むセンサであれば良い。例えば、酵素として本発明のグルコース脱水素酵素を反応層に含むセンサであって、例えば、電気化学式バイオセンサは、基板、対極、作用極、メディエータ及び前記酵素を備えることによって作製される。メディエータは、ヘム等のタンパク質性電子メディエータや、フェリシアン化化合物、キノン系化合物、オスミウム系化合物、フェナジン系化合物、フェノチアジン系化合物等が例示できる。この他に、イオン変化、発色強度又はｐＨ変化等を検知する方式のバイオセンサも構築可能である。該バイオセンサを用いてグルコース測定が可能である。
【００２９】
更に本発明のグルコース脱水素酵素は、バイオ電池に用いることができる。本発明のバイオ電池は、酸化反応を行うアノード極及び還元反応を行うカソード極から構成され、必要に応じてアノードとカソードを隔離する電解質層を含んで構成される。上記の電子メディエータ及びグルコース脱水素酵素を含む酵素電極をアノード電極に使用し、基質を酸化することによって生じた電子を電極に取り出すと共に、プロトンを発生させる。一方、カソード側には、一般的にカソード電極に使用される酵素を使用すれば良く、例えばラッカーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ又はビリルビンオキシダーゼを使用し、アノード側で発生させたプロトンを酸素と反応させることによって水を生成させる。電極としては、カーボン、金、白金族金属等、一般的にバイオ電池に使用される電極を用いることができる。
【００３０】
本酵素の活性測定においては、該酵素を、好ましくは終濃度０．１５−０．６Ｕ／ｍＬになるように適宜希釈して用いる。尚、該酵素の酵素活性単位（Ｕ）は１分間に１μｍｏｌのグルコースを酸化する酵素活性である。本発明のグルコース脱水素酵素の酵素活性は、次の方法で測定できる。
【００３１】
（グルコース脱水素酵素（ＧＬＤ）活性測定法）
１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１．００ｍＬ、１Ｍ  Ｄ−グルコース溶液１．００ｍＬ、３ｍＭ ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（以下ＤＣＩＰという）０．１４ｍＬ及び３ｍＭ  １−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルサルフェイト０．２０ｍＬ及び超純水０．６１ｍＬを混合し、３７℃で１０分間保温後、酵素溶液０．０５ｍＬを添加し、反応を開始した。反応開始時から５分間、酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量（ΔＡ６００）を測定し、直線部分から次式に従い酵素活性を算出した。この際、酵素活性は、３７℃、ｐＨ６．０で１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰを還元する酵素量を１Ｕと定義した。
【００３２】
グルコース脱水素酵素（ＧＬＤ）活性（Ｕ／ｍＬ）＝（−（ΔＡ６００−ΔＡ６００ｂｌａｎｋ）×３．０×酵素の希釈倍率）／（１０．８×１．０×０．０５）
尚、式中の３．０は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍＬ）、１０．８はｐＨ６．０におけるＤＣＩＰのモル吸光係数、１．０はセルの光路長（ｃｍ）、０．０５は酵素溶液の液量（ｍＬ）、ΔＡ６００ｂｌａｎｋは酵素の希釈溶液を酵素溶液の代わりに添加して反応開始した場合の６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量を表す。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。【００３４】
［実施例１］
（フラビン結合型グルコース脱水素酵素（ＧＬＤ）のクローニング）
ＧＬＤ生産菌の探索を行った結果、Ｚｙｇｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ｅｘｐｏｎｅｎｓ  Ｂｕｒｇｅｆｆ  ｖａｒ．ｅｘｐｏｎｅｎｓ  ＮＢＲＣ１００５１７及びＨｙｐｈｏｍｕｃｏｒ  ｓｐ．ＲＤ０５５４２６の培養上清にＧＬＤ活性が確認できた。Ｚ．ｅｘｐｏｎｅｎｓ  Ｂｕｒｇｅｆｆ  ｖａｒ．ｅｘｐｏｎｅｎｓ  ＮＢＲＣ１００５１７由来ＧＬＤをＺｅＧＬＤ、Ｈ．ｓｐ．ＲＤ０５５４２６由来ＧＬＤをＨｓＧＬＤとする。【００３５】
（１）菌体培養
パインデックス（松谷化学工業社製）４％（ｗ／ｖ）、脱脂大豆（昭和産業社製）１％（ｗ／ｖ）、コーンスティープリカー（サンエイ糖化社製）１％（ｗ／ｖ）、リン酸二水素カリウム（ナカライテスク社製）０．５％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム七水和物（ナカライテスク社製）０．０５％（ｗ／ｖ）及び水からなる液体培地をｐＨ６．０に調整し、各１０ｍＬを２本の太試験管に入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブした。冷却した液体培地に、前記ＧＬＤ生産菌を各々接種し、２５℃で７２時間振とう培養した後、さらしを用いて、各湿菌体を回収した。【００３６】
（２）ゲノムＤＮＡの抽出
（１）で取得した湿菌体各２００ｍｇを−８０℃で凍結した後、バイオマッシャーII（ニッピ社製）中で、２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１％  Ｎ−ｌａｕｒｏｙｌ  ｓａｒｃｏｓｉｎｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔからなるＢｕｆｆｅｒを０．５ ｍＬ添加し、菌体破砕をおこなった。菌体破砕後は破砕液上清に対し、フェノール・クロロホルム処理、エタノール沈殿を行い、各ゲノムＤＮＡを取得した。【００３７】
（３）ＧＬＤをコードするゲノムＤＮＡの取得
（２）で取得した各ゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＧＬＤ遺伝子取得用プライマー対を用いてそれぞれＰＣＲを行った。その結果、各ＧＬＤ遺伝子の内部配列と思われるＰＣＲ産物が確認された。尚、前記プライマー対は、本発明者らが、種々のＧＬＤ遺伝子取得用に設計したプライマーである。前記各ＰＣＲ産物を精製し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ  ｐＭＤ２０（タカラバイオ社製）にライゲーションした。【００３８】
得られた各プラスミドベクターを、大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（タカラバイオ社製）にそれぞれ導入して形質転換した。得られた各形質転換体を培養して、集菌した菌体から、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＱｕｉｃｋＰｕｒｅ（タカラバイオ社製）を用いて各プラスミドベクターを抽出した。各プラスミドベクター中のインサートの塩基配列をそれぞれ決定し、決定した各塩基配列を基に、ＧＬＤ遺伝子の上流及び下流配列を解明するためのプライマーを設計した。これらのプライマーを用いてＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法を行い、各ＧＬＤをコードするゲノムＤＮＡ配列を決定した。ＺｅＧＬＤをコードする開始コドンから終止コドンまでの全長ＤＮＡ配列を配列番号１、及びＨｓＧＬＤをコードする開始コドンから終止コドンまでの全長ＤＮＡ配列を配列番号４に示した。【００３９】
（４）全ＲＮＡの単離
（１）で取得した各湿菌体２００ｍｇを−８０℃で凍結した後、ＩＳＯＧＥＮＩＩ（ニッポンジーン社製）を用いて各１００μｇの全ＲＮＡを抽出した。【００４０】
（５）ｃＤＮＡライブラリーの調製
（４）で取得した各全ＲＮＡから、逆転写酵素およびアダプター配列付きオリゴｄＴプライマーを用いた逆転写反応により各ｃＤＮＡライブラリーを調製した。反応試薬は、ＳＭＡＲＴｅｒ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を使用し、反応条件は説明書記載のプロトコールに準じて行った。【００４１】
（６）ＧＬＤ遺伝子を含む発現用プラスミドベクターの調製１
公知文献１（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の異種遺伝子発現系、峰時俊貴、化学と生物、３８、１２、８３１−８３８、２０００）に記載してあるアスペルギルス・オリゼ由来のアミラーゼ系の改良プロモーターを使用してプラスミドベクターを調製した。最初に、（５）で取得したｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、各ＧＬＤ遺伝子を含むＰＣＲ産物をそれぞれ取得した。ＺｅＧＬＤ遺伝子を含むＰＣＲ産物の取得には下記のＦ６３０９−Ｏｒｉ（配列番号７）及びＦ６３０９−Ｒ−１ｓｔ（配列番号８）のプライマー対を使用した。またＨｓＧＬＤ遺伝子を含むＰＣＲ産物の取得には、下記のＦ６２９２−Ｏｒｉ（配列番号１０）及びＦ６２９２−Ｒ−１ｓｔ（配列番号１１）のプライマー対を使用した。次に、前記ＰＣＲ産物を鋳型とし、ベクター挿入用のＺｅＧＬＤ遺伝子、及びＨｓＧＬＤ遺伝子を調製した。ＺｅＧＬＤ遺伝子の調製には下記のＦ６３０９−Ｏｒｉ（配列番号７）及びＦ６３０９−Ｒ−２ｎｄ（配列番号９）のプライマー対を、ＨｓＧＬＤ遺伝子の調製には下記のＦ６２９２−Ｏｒｉ（配列番号１０）及びＦ６２９２−Ｒ−２ｎｄ（配列番号１２）のプライマー対を使用した。【００４２】
最終的に、前記プロモーターの下流に、それぞれ調製したＧＬＤ遺伝子を結合させて、各遺伝子が発現可能なプラスミドベクターを作製した。作製した各発現用プラスミドベクターを、大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセルにそれぞれ導入して形質転換した。得られた各形質転換体を培養して、集菌した菌体から、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＱｕｉｃｋＰｕｒｅを用いて各プラスミドベクターを抽出した。各プラスミドベクター中のインサートの配列解析を行ったところ、各ＧＬＤ遺伝子を含む塩基配列が確認できた。ＺｅＧＬＤをコードするｃＤＮＡ配列を配列番号２、ＺｅＧＬＤのアミノ酸配列を配列番号３、ＨｓＧＬＤをコードするｃＤＮＡ配列を配列番号５及びＨｓＧＬＤのアミノ酸配列を配列番号６に示した。【００４３】
Ｆ６３０９−Ｏｒｉ（配列番号７）：
5’−(CCGCAGCTCGTCAAA)ATGAAGATCTCTGCTGCTATCG−3’
（括弧内：転写増強因子）
Ｆ６３０９−Ｒ−１ｓｔ（配列番号８）：
5’−((GTTCATTTA))AAGATTATTTTGCTTCT−3’
（二重括弧内：ｐＳＥＮＳベクター配列）
Ｆ６３０９−Ｒ−２ｎｄ（配列番号９）：
5’−((GTTACGCTTCTAGAGCATGCGTTCATTTA))AAGATTATTTTGCTT−3’
（二重括弧内：ｐＳＥＮＳベクター配列、下線部：制限酵素部位（ＳｐｈＩ））
Ｆ６２９２−Ｏｒｉ（配列番号１０）：
5’−(CCGCAGCTCGTCAAA)ATGAAAATCTCTGCTGCTATTG−3’
（括弧内：転写増強因子）
Ｆ６２９２−Ｒ−１ｓｔ（配列番号１１）：
5’−((GTTCATTTA))GTGCTTTTTGTAAGTAGAC−3’
（二重括弧内：ｐＳＥＮＳベクター配列）
Ｆ６２９２−Ｒ−２ｎｄ（配列番号１２）：
5’−((GTTACGCTTCTAGAGCATGCGTTCATTTA))GTGCTTTTTG−3’
（二重括弧内：ｐＳＥＮＳベクター配列、下線部：制限酵素部位（ＳｐｈＩ））【００４４】
（７）形質転換体の取得１
（６）で抽出した各プラスミドベクターを用いて、公知文献２（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６１（８），１３６７−１３６９，１９９７）及び公知文献３（清酒用麹菌の遺伝子操作技術、五味勝也、醸協、４９４−５０２、２０００）に記載の方法に準じて、各ＧＬＤを生産する組換えカビ（アスペルギルス・オリゼ）をそれぞれ作製した。得られた各組換え株をＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ固体培地で純化し、ＺｅＧＬＤ生産組換えカビ及びＨｓＧＬＤ生産組換えカビを取得した。使用する宿主としては、アスペルギルス・オリゼＮＳ４株を使用した。本菌株は、独立行政法人酒類総合研究所で分譲されているものが入手可能である。【００４５】
（８）組換えカビ由来ＧＬＤの確認
パインデックス４％（ｗ／ｖ）、脱脂大豆１％（ｗ／ｖ）、コーンスティープリカー１％（ｗ／ｖ）、リン酸二水素カリウム０．５％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム七水和物０．０５％（ｗ／ｖ）及び水からなる液体培地をｐＨ７．０に調整し、各１０ｍＬを２本の太試験管（２２ｍｍ×２００ｍｍ）に入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブした。冷却した液体培地に、（７）で取得した各組換えカビを植菌し、３０℃で７２時間振とう培養した。培養終了後、遠心して各上清を回収し、前述のＧＬＤ活性測定法でＧＬＤ活性を測定したところ、何れも本発明のＧＬＤ活性が確認できた。【００４６】
（９）ＧＬＤ遺伝子を含む発現用プラスミドベクターの調製２
シグナル予測プログラムＳｉｇｎａｌＰ４．１を用いて、配列番号６に記載のＨｓＧＬＤアミノ酸配列におけるシグナル配列を予測した結果、１〜２０番目のアミノ酸がシグナル配列と予測された。予測シグナル配列を除いた配列番号１６記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子を増幅できるようにプライマー（配列番号１３及び１４）を設計し、（５）で取得したｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を分泌型プラスミドベクターｐＧＡＰＺα（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に導入し、プラスミドベクターｐＧＡＰＺα／ＨｓＧＬＤを取得した。該プラスミドベクターを大腸菌ＪＭ１０９株に導入して形質転換した。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、該プラスミドベクター中のインサートの配列解析を行ったところ、ＨｓＧＬＤ遺伝子である配列番号４記載の６１番目以降のＤＮＡ配列（１８４８ｂｐ）を含む塩基配列が確認できた。【００４７】
なお、シグナル予測プログラムＳｉｇｎａｌＰ４．１を用いて、配列番号３に記載のＺｅＧＬＤアミノ酸配列におけるシグナル配列を予測した結果、１〜２０番目のアミノ酸がシグナル配列と予測された。予測シグナル配列を除いた配列を配列番号１５に記載した。【００４８】
Ｆ６２９２−ＰＰ−Ｆ（配列番号１３）：
5’−(GCTGAAGCTGAATTC)CAATCACAAGGTACTACTAG−3’
（括弧内：ｐＧＡＰＺαベクター配列）
Ｆ６２９２−ＰＰ―Ｒ（配列番号１４）：
5’−(GAGTTTTTGTTCTAGA)TTAGTGCTTTTTGTAAGTAG−3’
（括弧内：ｐＧＡＰＺαベクター配列）【００４９】
（１０）形質転換体の取得２
（９）で抽出したプラスミドベクター（ｐＧＡＰＺα／ＨｓＧＬＤ）を酵母Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＫＭ７１Ｈに導入して形質転換した。導入は、公知文献（ｐＧＡＰＺ  Ａ，Ｂ，ａｎｄ  Ｃ，ｐＧＡＰＺα  Ａ，Ｂ，ａｎｄ  Ｃ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｅｖ．Ｄａｔｅ：２８  Ｊｕｎｅ  ２０１０、Ｍａｎｕａｌ  Ｐａｒｔ  Ｎｏ．２５−０１７４）に記載の条件に従って実施し、ＨｓＧＬＤ生産組換え酵母を作成した。【００５０】
（１１）組換え酵母由来ＧＬＤの確認
イーストエクストラクト（ＢＤ社製）１．０％、ハイポリペプトン（日本製薬社製）２．０％、１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  Ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ（Ｓｉｇｍａ社製）１．３４％、（＋）‐ビオチン（和光純薬社製）０．００００４％、グリセロール（ナカライテスク社製）１．０％からなるＢＭＧＹ培地１５０ｍＬを含む５００ｍＬ容の坂口フラスコに入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブした。冷却した液体培地に、（１０）で取得した組換え酵母を植菌し、３０℃、１２０ｒｐｍで７２時間振とう培養した。培養終了後、遠心して上清を回収し、前述のＧＬＤ活性測定法に準じ、プレートリーダー（モレキュラーデバイス社製）を用いてＧＬＤ活性を測定した結果、ＧＬＤ活性が確認できた。【００５１】
［実施例２］
（フラビン結合型グルコース脱水素酵素（ＧＬＤ）の取得）
（１）ＺｅＧＬＤ
実施例１の（８）に記載の液体培地１５０ｍＬを５００ｍＬ容の坂口フラスコに入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブした。冷却した液体培地に、実施例１の（７）で取得したＺｅＧＬＤ生産組換えカビを植菌し、３０℃で７２時間振とう培養して種培養液とした。前記と同様の培地組成にクロラムフェニコール（ナカライテスク社製）０．００５％（ｗ／ｖ）及び消泡剤を添加した培地３．５Ｌを５Ｌ容ジャーファーメンターに入れ、１２１℃、３０分間オートクレーブした。冷却した液体培地に、前記種培養液を１００ｍＬ植菌し、３０℃、４００ｒｐｍ、１ｖ／ｖ／ｍで９６時間培養した。培養終了後、培養液をろ布でろ過し、回収したろ液を遠心して上清を回収し、更にメンブレンフィルター（１０μｍ、アドバンテック社製）でろ過して粗酵素液を回収した。【００５２】
回収した粗酵素液について、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  Ａ−５００（ＪＮＣ社製）カラム及びＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  Ｂｕｔｙｌ−６５０Ｃ（東ソー社製）カラムを用いて夾雑タンパクを除去して精製した。精製サンプルを分画分子量８，０００の限外ろ過膜で濃縮後、水置換し、ＺｅＧＬＤサンプルとした。該ＺｅＧＬＤサンプルをＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に供したところ、ＺｅＧＬＤがメインバンドを示すことを確認した。【００５３】
（２）ＨｓＧＬＤ
実施例１の（１１）に記載の方法で培養した培養上清を、分画分子量１０，０００の限外ろ過膜（ザルトリウス社製）を用いて、低分子成分を除去すると共に濃縮し、ＨｓＧＬＤサンプルとした。【００５４】
［実施例３］
（本発明のＧＬＤの酵素化学的性質の検討）
実施例２で得られたＺｅＧＬＤ及びＨｓＧＬＤの諸性質を調べた。
（１）吸収スペクトルの測定
ＺｅＧＬＤ及びＨｓＧＬＤについて、Ｄ−グルコース添加前後の３００−６００ｎｍにおける吸収スペクトルをプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ３８４、モレキュラーデバイス社製）を用いて測定した。その結果、何れのＧＬＤも、波長３６０−３８０ｎｍ付近及び波長４５０−４６０ｎｍ付近に認められた吸収極大が、Ｄ−グルコース添加により消失したことから、本発明のＧＬＤはフラビン結合型タンパク質であることが明らかになった。【００５５】
（２）グルコース酸化酵素（ＧＯＤ）活性の測定
１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）０．２ｍＬ、１Ｍ  Ｄ−グルコース２．０ｍＬ、２５ｍＭ  ４−アミノアンチピリン０．２ｍＬ、４２０ｍＭフェノール０．２ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬペルオキシダーゼ０．２ｍＬ及び超純水０．２ｍＬを混合し、混合液０．１ｍＬを９６穴プレートに入れ、２５℃で５分間保温した。ＺｅＧＬＤ又はＨｓＧＬＤを０．１ｍＬ添加し、反応を開始した。反応開始時から５分間、酵素反応の進行に伴う５００ｎｍにおける吸光度変化を前記プレートリーダーで測定し、ＧＯＤ活性を調べた。尚、コントロールは、ＧＬＤの代わりに水を添加して反応を開始した。その結果、ＺｅＧＬＤ及びＨｓＧＬＤは、何れもコントロールと同様に吸光度変化は見られなかった。【００５６】
この結果から、本発明のＧＬＤにはグルコース酸化酵素活性がないことが確認された。よって、本発明のＧＬＤは酸素を電子受容体として利用しないため、Ｄ−グルコースを定量する際に反応系の溶存酸素の影響を受けにくいことが示された。【００５７】
（３）基質特異性
前記ＧＬＤ活性測定法に準じ、基質に終濃度５０ｍＭのＤ−グルコース又はマルトースをそれぞれ用いて、各基質に対するＺｅＧＬＤ又はＨｓＧＬＤの活性を測定した。Ｄ−グルコースに対する活性を１００％とした場合のマルトースに対する活性を表１に示す。【００５８】
【表１】
2019208308.tif 000003
【００５９】
本発明のＧＬＤは、Ｄ−グルコースに対する活性を１００％とした場合に、マルトースに対する活性は１．２％又は０．９％であり、何れも２．０％以下だった。【００６０】
［実施例４］
（吸光度計によるグルコースの測定）
実施例２で得られたＺｅＧＬＤ及びＨｓＧＬＤを用いて、前記ＧＬＤ活性測定法に準じ、０、１、２、５、１０、２０、５０又は１００ｍＭ  Ｄ−グルコースにおける、吸光度変化を測定した。各グルコース濃度における相対活性値を図１に示す。その結果、吸光度計を用いたＤ−グルコース測定において、Ｄ−グルコースの濃度依存的に活性の増加が見られたことから、本発明のＧＬＤを用いてＤ−グルコースの定量が可能であることが示された。
【図１】
2019208308.tif 000004
【配列表】
2019208308000001.app
【国際調査報告】
2019208308.tif 000005
2019208308.tif 000006