(57)【要約】  本発明は、所望の作用を発揮することができる新規な医薬や食品を提供する。より具体的には、本発明は、Ｄ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌；Ｄ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌を含む、医薬または食品；Ｄ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌を含む、生体機能改善剤；Ｄ−プシコースを含有する培地中で腸内細菌を培養することを含む、腸内細菌の培養方法；Ｄ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌を用いる、生体機能改善剤のスクリーニング方法などを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌。
【請求項２】
アトポビアセア（Ａｔｏｐｏｂｉａｃｅａｅ）科に属する腸内細菌である、請求項１記載の腸内細菌。
【請求項３】
配列番号１の塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する、請求項１または２記載の腸内細菌。
【請求項４】
前記腸内細菌が、Ｄ−プシコースを投与された哺乳動物の糞便から回収される腸内細菌である、請求項１〜３のいずれか一項記載の腸内細菌。
【請求項５】
アトポビアセア（Ａｔｏｐｏｂｉａｃｅａｅ）科に属する腸内細菌が、アトポビアセア・パルブラム（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ  ｐａｒｖｕｌｕｍ）である、請求項２記載の腸内細菌。
【請求項６】
Ｄ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌を含む、医薬または食品。
【請求項７】
Ｄ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌を含む、生体機能改善剤。
【請求項８】
生体機能改善剤が代謝障害の予防または治療剤である、請求項７記載の剤。
【請求項９】
生体機能改善剤が抗肥満剤である、請求項７または８記載の剤。
【請求項１０】
生体機能改善剤が抗糖尿病剤である、請求項７または８記載の剤。
【請求項１１】
生体機能改善剤が経口用組成物または経直腸投与用組成物である、請求項７〜１０のいずれか一項記載の剤。
【請求項１２】
Ｄ−プシコースを含有する培地中で腸内細菌を培養することを含む、腸内細菌の培養方法。
【請求項１３】
Ｄ−プシコースを含有する培地。
【請求項１４】
Ｄ−プシコース、および腸内細菌を含有する腸内細菌培養物。
【請求項１５】
以下を含む、生体機能改善作用を有する物質のスクリーニング方法：
（１）被験物質を、Ｄ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌に接触させること；
（２）Ｄ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌数を評価すること；および
（３）Ｄ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌数を増加させる被験物質を、生体機能改善作用を有する物質として選択すること。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
人工甘味料は多くの飲料に含まれ、ゼロカロリーなどのフレーズから消費者は健康効果を期待している。しかし、人工甘味料は腸内細菌叢の組成と機能を変化させ耐糖能異常を引き起こす可能性が示唆されるなど、その安全性や効果が懸念されている（非特許文献１）。したがって、人工甘味料に代わる機能的な甘味料が求められている。【０００２】
希少糖の一つであるＤ−プシコース（別名  Ｄ−アルロース）は、スクロースの７割程度の甘味を持ちながらもカロリー量はゼロに近く、耐糖能の改善や抗肥満効果等の生体機能の改善作用をもたらすことなどが報告されている（非特許文献２、３）。また、Ｄ−プシコースは一部が吸収されずに消化管を通過し大腸に到達することが報告されている（非特許文献４、５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｓｕｅｚ  Ｊ，  Ｋｏｒｅｍ  Ｔ，  Ｚｅｅｖｉ  Ｄ，  Ｚｉｌｂｅｒｍａｎ−Ｓｃｈａｐｉｒａ  Ｇ，  Ｔｈａｉｓｓ  ＣＡ，  Ｍａｚａ  Ｏ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｓｗｅｅｔｅｎｅｒｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｉｎｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｂｙ  ａｌｔｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ２０１４；５１４（７５２１）：１８１−６．
【非特許文献２】Ｉｗａｓａｋｉ  Ｙ，  Ｓｅｎｄｏ  Ｍ，  Ｄｅｚａｋｉ  Ｋ，  Ｈｉｒａ  Ｔ，  Ｓａｔｏ  Ｔ，  Ｎａｋａｔａ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  ＧＬＰ−１  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｎｄ  ｖａｇａｌ  ａｆｆｅｒｅｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｔｈｅ  ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｄ−ａｌｌｕｌｏｓｅ．  Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２０１８；９（１）：１１３．
【非特許文献３】Ｈｏｓｓａｉｎ  Ａ，  Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  Ｆ，  Ｈｉｒｏｓｅ  Ｋ，  Ｍａｔｓｕｎａｇａ  Ｔ，  Ｓｕｉ  Ｌ，  Ｈｉｒａｔａ  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｒａｒｅ  ｓｕｇａｒ  Ｄ−ｐｓｉｃｏｓｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｉｎ  Ｔ２ＤＭ  ｍｏｄｅｌ  Ｏｔｓｕｋａ  Ｌｏｎｇ−Ｅｖａｎｓ  Ｔｏｋｕｓｈｉｍａ  Ｆａｔｔｙ  ｒａｔｓ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ  Ｄｅｖｅｌ  Ｔｈｅｒ．  ２０１５；９：５２５−３５．
【非特許文献４】Ｍａｔｓｕｏ  Ｔ，  Ｔａｎａｋａ  Ｔ，  Ｈａｓｈｉｇｕｃｈｉ  Ｍ，  Ｉｚｕｍｏｒｉ  Ｋ，  Ｓｕｚｕｋｉ  Ｈ．  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｄ−ｐｓｉｃｏｓｅ  ｉｎ  ｒａｔｓ：  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｆａｅｃａｌ  ａｎｄ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃａｅｃａｌ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．  Ａｓｉａ  Ｐａｃ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ．  ２００３；１２（２）：２２５−３１．
【非特許文献５】Ｉｉｄａ  Ｔ，  Ｈａｙａｓｈｉ  Ｎ，  Ｙａｍａｄａ  Ｔ，  Ｙｏｓｈｉｋａｗａ  Ｙ，  Ｍｉｙａｚａｔｏ  Ｓ，  Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｆａｉｌｕｒｅ  ｏｆ  ｄ−ｐｓｉｃｏｓｅ  ａｂｓｏｒｂｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  ｔｏ  ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅ  ｉｎｔｏ  ｅｎｅｒｇｙ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｌｏｗ  ｌａｒｇｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｆｅｒｍｅｎｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ．  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．  ２０１０；５９（２）：２０６−１４．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、所望の作用を発揮することができる新規な医薬や食品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、鋭意検討した結果、腸内に存在する特定の細菌がＤ−プシコースによる生体機能の改善作用を担い得ることなどを見出し、本発明を完成するに至った。【０００６】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕Ｄ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌。
〔２〕アトポビアセア（Ａｔｏｐｏｂｉａｃｅａｅ）科に属する腸内細菌である、〔１〕の腸内細菌。
〔３〕配列番号１の塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する、〔１〕または〔２〕の腸内細菌。
〔４〕前記腸内細菌が、Ｄ−プシコースを投与された哺乳動物の糞便から回収される腸内細菌である、〔１〕〜〔３〕のいずれかの腸内細菌。
〔５〕アトポビアセア（Ａｔｏｐｏｂｉａｃｅａｅ）科に属する腸内細菌が、アトポビアセア・パルブラム（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ  ｐａｒｖｕｌｕｍ）である、〔２〕の腸内細菌。
〔６〕Ｄ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌を含む、医薬または食品。
〔７〕Ｄ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌を含む、生体機能改善剤。
〔８〕生体機能改善剤が代謝障害の予防または治療剤である、〔７〕の剤。
〔９〕生体機能改善剤が抗肥満剤である、〔７〕または〔８〕の剤。
〔１０〕生体機能改善剤が抗糖尿病剤である、〔７〕または〔８〕の剤。
〔１１〕生体機能改善剤が経口用組成物または経直腸投与用組成物である、〔７〕〜〔１０〕のいずれかの剤。
〔１２〕Ｄ−プシコースを含有する培地中で腸内細菌を培養することを含む、腸内細菌の培養方法。
〔１３〕Ｄ−プシコースを含有する培地。
〔１４〕Ｄ−プシコース、および腸内細菌を含有する腸内細菌培養物。
〔１５〕以下を含む、生体機能改善作用を有する物質のスクリーニング方法：
（１）被験物質を、Ｄ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌に接触させること；
（２）Ｄ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌数を評価すること；および
（３）Ｄ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌数を増加させる被験物質を、生体機能改善作用を有する物質として選択すること。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の腸内細菌は、例えば、医薬または食品として、あるいは生体機能改善剤（例、抗肥満剤、抗糖尿病剤）として有用である。
本発明の培養方法は、例えば、Ｄ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌の増殖または維持に有用である。
本発明のスクリーニング方法は、例えば、Ｄ−プシコース様の生体機能改善作用を有する新規医薬または食品の開発、ならびに既存の作用に加え、Ｄ−プシコース様の生体機能改善作用をさらに有する複合的な作用を発揮できる医薬または食品の開発のために有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、動物実験のスケジュールを示す図である。８週齢（０  ｗｅｅｋ）の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（計４群，ｎ＝７）に、それぞれ高脂肪食および水道水（Ｃｏｎｔｒｏｌ）またはＤ−プシコース（Ｄ−ｐｓｉｃｏｓｅ）含有水、またはそれらに加えて抗生物質を摂取させた（Ｃｏｎｔｒｏｌ＋Ａｂｘ，Ｄ−ｐｓｉｃｏｓｅ＋Ａｂｘ）。実験期間中は毎週、マウスの体重、摂水量、摂食量を測定し、糞便を採取した。解析には０および５週目のサンプルを用いた。９週目には、空腹時血糖値の測定を行った。１１週後には、マウスを解剖した。
【図２】図２は、Ｄ−プシコース摂取による体重増加の抑制、および抗生物質処理による抑制効果の減少を示す図である。飼育開始（８週齢）から５週目（１３週齢）における、体重の増加の平均（ｇ）を示した（ｎ＝７）。エラーバーには標準偏差（ＳＤ）を用いた。Ｃｏｎｔｒｏｌ（ｗｈｉｔｅ）：高脂肪食＋水道水，Ｄ−ｐｓｉｃｏｓｅ（ｂｌａｃｋ）：高脂肪食＋５．０％  Ｄ−ｐｓｉｃｏｓｅ、Ａｂｘ−：抗生物質処理なし、Ａｂｘ＋：抗生物質処理あり。抗生物質は０．１％  アンピシリンナトリウム、０．１％  ネオマイシン硫酸塩、０．０５％  バンコマイシン塩酸塩。有意差検定は、スチューデントのｔ検定を用いて行った。Ｐ値が０．０５以下の場合を有意とし、＊で図示した。
【図３】図３は、Ｄ−プシコース摂取による空腹時血糖の上昇の抑制、および抗生物質処理による抑制効果の減少を示す図である。飼育開始から９週目における、１５時間の絶食時の血糖値（ｍｇ／ｄｌ）を示した（ｎ＝７）。エラーバーには標準偏差（ＳＤ）を用いた。Ｃｏｎｔｒｏｌ（ｗｈｉｔｅ）：高脂肪食＋水道水、Ｄ−ｐｓｉｃｏｓｅ（ｂｌａｃｋ）：高脂肪食＋５．０％  Ｄ−ｐｓｉｃｏｓｅ、Ａｂｘ−：抗生物質処理なし、Ａｂｘ＋：抗生物質処理あり。抗生物質は０．１％  アンピシリンナトリウム、０．１％  ネオマイシン硫酸塩、０．０５％  バンコマイシン塩酸塩。有意差検定は、スチューデントのｔ検定を用いて行った。Ｐ値が０．０５以下の場合を有意とし、＊で図示した。
【図４】図４は、Ｄ−プシコース摂取によるＡｔｏｐｏｂｉｕｍ属菌の増加を示す図である。飼育開始から５週目における糞便サンプル中のＡｔｏｐｏｂｉｕｍ属菌の相対存在量を示した。相対存在量は、全体のリード数におけるＡｔｏｐｏｂｉｕｍ属菌が占める割合として算出した。Ｃｏｎｔｒｏｌ（ｗｈｉｔｅ）：高脂肪食＋水道水、Ｄ−ｐｓｉｃｏｓｅ（ｂｌａｃｋ）：高脂肪食＋５．０％  Ｄ−ｐｓｉｃｏｓｅ。有意差検定は、マンホイットニーのＵ検定を用いて行った。Ｐ値が０．０５以下の場合を有意とし、Ｐ＜０．００１：＊＊＊と図示した。
【図５】図５は、今回見出された腸内細菌ＯＴＵ（ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ  ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  ｕｎｉｔ）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（配列番号１）を示す図である。２度の動物試験において（合計ｎ＝１２）、本塩基配列と同一のＯＴＵが検出された。
【図６】図６は、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ  ｐａｒｖｕｌｕｍ定着による体重増加の抑制を示す図である。飼育開始（８週齢）から９週間における，体重の平均（ｇ）を示した（ｎ＝５）。エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を示す。ＧＦ（白・丸）：無菌マウス，Ｂ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ（黒・三角）：Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ  （ＪＣＭ  ５８２７）定着マウス，Ａ．ｐａｒｖｕｌｕｍ（黒・丸）：Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ  ｐａｒｖｕｌｕｍ（ＪＣＭ  １０３００）定着マウス．二元配置分散分析（ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）でＰ＜０．０５の有意差が認められた場合，Ｔｕｋｅｙ法による多重比較検定を行った．Ｐ＜０．００１を＊＊＊で図示した。
【図７】図７は、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ  ｐａｒｖｕｌｕｍ定着による精巣上体脂肪組織量の抑制を示す図である。飼育開始（８週齢）から９週間における，精巣上体脂肪組織の重量の平均（ｇ）を示した（ｎ＝５）。エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を示す。ＧＦ（白）：無菌マウス，Ｂ．  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ（グレー）：Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ  （ＪＣＭ  ５８２７）定着マウス，Ａ．ｐａｒｖｕｌｕｍ（黒）：Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ  ｐａｒｖｕｌｕｍ（ＪＣＭ  １０３００）定着マウス．二元配置分散分析  （ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）でＰ＜０．０５の有意差が認められた場合，Ｔｕｋｅｙ法による多重比較検定を行った．Ｐ＜０．０１を＊＊で図示した。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
１．Ｄ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌
本発明は、Ｄ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌を提供する。
【００１０】
Ｄ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌とは、Ｄ−プシコースを摂取した哺乳動物の腸内において、Ｄ−プシコースの摂取に伴い有意に数が増加する腸内細菌をいう。
【００１１】
本発明の腸内細菌は、アトポビアセア（Ａｔｏｐｏｂｉａｃｅａｅ）科に属する腸内細菌であり得る。アトポビアセア（Ａｔｏｐｏｂｉａｃｅａｅ）科に属する腸内細菌としては、例えば、アトポビウム（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ）属細菌〔例、アポトビウム・パルブラム（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ  ｐａｒｖｕｌｕｍ）〕、オルセネラ属（Ｏｌｓｅｎｅｌｌａ）細菌〔例、オルセネラ・ウムボナタ（Ｏｌｓｅｎｅｌｌａ  ｕｍｂｏｎａｔａ）〕が知られている。
【００１２】
本発明の腸内細菌はまた、配列番号１の塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有することにより特徴付けることができる。好ましくは、塩基配列の同一性は、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または１００％であってもよいが、好ましくは９７％以上、９８％以上、９９％以上または１００％である。ＯＴＵ（例、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列）が９７％以上の同一性を示す場合、ＯＴＵは進化的に同一の菌種から構成されるといわれている。したがって、配列番号１の塩基配列に対して９７％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する腸内細菌は、同一の菌種であると考えることができる。
【００１３】
ポリヌクレオチド（遺伝子）の同一性％の算出は、アルゴリズムｂｌａｓｔｎにより行うことができる。より具体的には、ポリヌクレオチドの同一性％の算定は、ＮＣＢＩにおいて提供されているアルゴリズムｂｌａｓｔｎにおいて、デフォルト設定のＳｃｏｒｉｎｇ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ（Ｍａｔｃｈ／Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｓｃｏｒｅｓ＝１，−２；Ｇａｐ  Ｃｏｓｔｓ＝Ｌｉｎｅａｒ）を用いて行うことができる。
【００１４】
本発明の腸内細菌はさらに、生体機能改善作用を示すことができる。本発明の腸内細菌が示す生体機能改善作用は、Ｄ−プシコースの生体機能改善作用と同様である。Ｄ−プシコースの生体機能改善作用としては、例えば、代謝障害の予防または治療作用（例、抗肥満作用、グルコース耐性の促進作用）、抗動脈硬化作用が挙げられる。したがって、本発明の腸内細菌は、このような作用からも特徴付けることができる。
【００１５】
本発明の腸内細菌は、例えば、哺乳動物の糞便から得ることができる。哺乳動物としては、例えば、霊長類（例、ヒト、サル）、齧歯類（例、マウス、ラット、モルモット、ウサギ）、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタが挙げられる。哺乳動物としては、霊長類または齧歯類が好ましく、ヒトまたはマウスがより好ましい。臨床応用のし易さの観点からは、ヒトがさらにより好ましい。本発明の腸内細菌は、このような哺乳動物の腸内に存在する細菌であるということができる。哺乳動物の糞便からの腸内細菌の回収方法は、周知である〔例、（ｉ）Ｆｕｋｕｄａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｅｔ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ．，２００２  Ｎｏｖ；６４（１１）：９８７−９２、（ｉｉ）Ｆｕｋｕｄａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｇｅｎ  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００５  Ａｐｒ；５１（２）：１０５−１３、（ｉｉｉ）Ｓａｓａｋｉ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．，２０１８  Ｊａｎ  １１；８（１）：４３５〕。
【００１６】
また、本発明の腸内細菌を効率的に入手する観点からは、本発明の腸内細菌は、例えば、Ｄ−プシコースを摂取（または投与）した哺乳動物の糞便から得ることができる。Ｄ−プシコースの摂取量は、本発明の腸内細菌を増殖させることができる量（換言すれば、Ｄ−プシコースの作用を発揮することができる量）である限り特に限定されず、対象となる哺乳動物種、摂取頻度および摂取期間などの因子によって変動し得るが、一日あたりの摂取量として、例えば０．０５〜１００ｇ／ｋｇ（体重）であり、好ましくは０．１〜５０ｇ／ｋｇ（体重）であり、より好ましくは０．２〜５０ｇ／ｋｇ（体重）である。
【００１７】
２．Ｄ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌を含む、医薬または食品、および生体機能改善剤
本発明は、医薬または食品、および生体機能改善剤（以下、必要に応じて、本発明の製品と称する）を提供する。本発明の製品は、Ｄ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌を含む。
【００１８】
本発明の製品に含まれる、Ｄ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌数は、摂取した哺乳動物に有益な作用をもたらし得る限り、特に限定されない。Ｄ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌は元々腸内に存在していた細菌であるので、たとえ哺乳動物の摂取量が少量であったとしても、腸内環境や個人差等の因子にもよるが、腸内で定着し増殖することができ、その作用を発揮することができる。したがって、本発明の製品に含まれる、Ｄ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌は、少量でもその作用を発揮することができる。しかし、腸内への定着可能性の向上や速やかな作用の発現等の観点からは、本発明の製品に含まれる、Ｄ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌は、一定量以上であることが好ましい。Ｄ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌について、１回単位あたりの摂取数は、例えば１×１０５〜１×１０９細胞／ｋｇ（体重）であり、好ましくは５×１０５〜５×１０８細胞／ｋｇ（体重）であり、より好ましくは１×１０６〜１×１０８細胞／ｋｇ（体重）である。本発明の製品では、このような数の腸内細菌を、１個または複数個（例、２〜６個）の固形物（例、カプセル、錠剤）に含有することができる。
【００１９】
本発明の製品は、組成物の形態で提供されてもよい。Ｄ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌を含む本発明の組成物は、さらにＤ−プシコースを含んでいてもよい。
【００２０】
例えば、本発明の製品は、医薬組成物の形態で提供される場合、Ｄ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌に加えて、医薬上許容され得る担体を含んでいてもよい。医薬上許容され得る担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。本発明の医薬はまた、Ｄ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌に加えて、他の生体機能改善剤を含んでいてもよい。このような生体機能改善剤としては、代謝障害の予防または治療剤（例、抗肥満剤、グルコース耐性の促進作用剤）、抗動脈硬化剤が挙げられる。
【００２１】
本発明の製品が食品組成物の形態で提供される場合、Ｄ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌は、食品に添加された形態で提供されてもよく、あるいは、サプリメントのように主成分として用いられてもよい。食品としては、例えば、液状物（例、飲料、アルコール類）、半固形物（例、ヨーグルト、ゼリー）、固形物（例、スナック、チョコレート）が挙げられる。
【００２２】
本発明の製品はまた、経口用組成物または経直腸投与用組成物であってもよい。経口用組成物としては、例えば、カプセル剤、錠剤、散剤、液剤が挙げられる。経直腸投与用組成物としては、例えば、液体製剤が挙げられる。経口用組成物は、好ましくは、腸への送達性に優れるように処方されてもよい。したがって、経口用組成物は、好ましくは、腸溶性の形態（例、腸陽性カプセル）において提供することができる。
【００２３】
好ましくは、本発明の製品は、代謝障害の予防または治療剤である。Ｄ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌が有効に作用し得る代謝障害としては、例えば、肥満、糖尿病、動脈硬化、心不全が挙げられる。したがって、本発明の生体機能改善剤は、例えば、抗肥満剤、抗糖尿病剤、抗動脈硬化剤、抗心不全剤として有用である。
【００２４】
３．腸内細菌の培養方法
本発明は、腸内細菌の培養方法を提供する。本発明の培養方法は、Ｄ−プシコースを含有する培地中で腸内細菌を培養することを含む。
【００２５】
腸内細菌としては、Ｄ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌を含むものが好ましい。Ｄ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌は、他の腸内細菌との混合物の形態において、または他の腸内細菌との非混合物の形態において、培養することができる。例えば、Ｄ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌が他の腸内細菌との混合物の形態において培養される場合、このような混合物は、哺乳動物の糞便から上述のとおり回収することにより入手することができる。
【００２６】
本発明の培養方法は、Ｄ−プシコースを含有することを除き、腸内細菌の培養に用いられる一般的な培地と同様の培地を用いて、腸内細菌の一般的な培養条件下で行うことができる。本発明の培養方法に用いられるＤ−プシコースの濃度は、例えば０．０１〜１０％（ｗ／ｖ）であり、好ましくは０．０５〜５％（ｗ／ｖ）であり、より好ましくは０．１〜１％（ｗ／ｖ）である。腸内細菌の一般的な培地および培養条件は、周知である（例、（ｉ）Ｆｕｋｕｄａ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｅｔ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ．，２００２  Ｎｏｖ；６４（１１）：９８７−９２、（ｉｉ）Ｆｕｋｕｄａ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｇｅｎ  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００５  Ａｐｒ；５１（２）：１０５−１３、（ｉｉｉ）Ｆｕｋｕｄａ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．，２０１８  Ｊａｎ  １１；８（１）：４３５）。
【００２７】
例えば、培地は、炭素源、窒素源、有機微量栄養源、ビタミン、無機イオン等の成分を含むことができる。炭素源としては、例えば、単糖類（例、グルコース）、二糖類、オリゴ糖類、多糖類等の炭水化物；ショ糖を加水分解した転化糖；グリセロール；メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸塩、一酸化炭素、二酸化炭素等の炭素数が１の化合物；コーン油、パーム油、大豆油等のオイル；酢酸、プロピオン酸、酪酸等の短鎖脂肪酸；コハク酸、乳酸などの有機酸；動物油脂；動物オイル；飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸等の脂肪酸；脂質；リン脂質；グリセロ脂質；モノグリセライド、ジグリセライド、トリグリセライド等のグリセリン脂肪酸エステル；微生物性タンパク質、植物性タンパク質等のポリペプチド；加水分解されたバイオマス炭素源等の再生可能な炭素源；酵母エキス；馬血清；糞便抽出物；肉エキス；野菜エキス；胃内容物抽出物；又はこれらを組み合わせたものが挙げられる。窒素源としては、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水が挙げられる。有機微量栄養源としては、例えば、Ｌ−ホモセリンなどの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。ビタミンとしては、例えば、ビタミンＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ６、Ｂ１２、Ｃ、Ｋ１が挙げられる。無機イオンとしては、例えば、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオンが挙げられる。
【００２８】
培養条件について説明すると、例えば、培地における腸内細菌密度は、例えば１×１０６〜１×１０１１細胞／ｍＬであり、好ましくは１×１０７〜１×１０１０細胞／ｍＬであり、より好ましくは１×１０８〜１×１０９細胞／ｍＬである。培養温度は、例えば３０〜４０℃である。培養期間は、例えば１〜７日である。嫌気的培養条件または好気的培養条件のいずれも利用することができるが、嫌気的培養条件が好ましい。嫌気的培養条件下の酸素濃度は、例えば０〜５％、好ましくは０〜３％、より好ましくは０〜２％、さらにより好ましくは０〜１％である。
【００２９】
本発明の培養方法は、例えば、Ｄ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌の増殖または維持に有用である。
【００３０】
本発明はまた、本発明の培養方法に好適に用いることができる培地を提供する。本発明の培地は、Ｄ−プシコースを含有する培地である。Ｄ−プシコースの濃度は、上述したとおりである。また、このような培養培地がＤ−プシコースの他に含んでいてもよい成分については、上述の培地の成分と同様である。
【００３１】
本発明はさらに、本発明の培養方法に好適に用いることができる、または本発明の培養方法により得られる腸内細菌培養物を提供する。本発明の腸内細菌培養物は、Ｄ−プシコース、および腸内細菌を含有する。Ｄ−プシコースの濃度は、上述したものと同様である。腸内細菌の密度は、培地における上述の腸内細菌密度と同様である。本発明の腸内細菌培養物がＤ−プシコース、および腸内細菌の他に含んでいてもよい成分については、上述の培地の成分と同様である。
【００３２】
４．生体機能改善作用を有する物質のスクリーニング方法
本発明は、生体機能改善作用を有する物質のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、以下を含む：
（１）被験物質を、Ｄ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌に接触させること；
（２）Ｄ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌数を評価すること；および
（３）Ｄ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌数を増加させる被験物質を、生体機能改善作用を有する物質として選択すること。
【００３３】
工程（１）では、被験物質は、公知物質および新規物質を含む任意の物質である。このような被験物質としては、例えば、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、核酸（例、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド）、糖質（例、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖）、脂質（例、飽和または不飽和の直鎖、分岐鎖および／または環を含む脂肪酸）、アミノ酸、蛋白質（例、オリゴペプチド、ポリペプチド、抗体またはその断片）、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。
【００３４】
被験物質とＤ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌との接触は、インビトロ方法またはインビボ方法等の任意の様式で行うことができる。
【００３５】
例えば、インビトロ方法における被験物質とＤ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌との接触は、被験物質を含有する培地中におけるＤ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌の培養により達成することができる。培地中の被験物質の濃度は、適宜調整することができる。例えば、効力が強い生体機能改善剤のスクリーニングが特に所望される場合、培地中の被験物質の濃度は、低濃度（例、１ｎＭ〜１０μＭ）に設定することができる。あるいは、特に効力が強い生体機能改善剤のスクリーニングが所望されない場合には、培地中の被験物質の濃度は、より高濃度（例、１００ｎＭ〜１０ｍＭ）に設定されてもよい。培地中の腸内細菌の密度は、適宜設定することができる（例、１×１０５〜１×１０８細胞／ｍＬ）。腸内細菌の培養培地および培養条件は、本発明の培養方法において上述したものと同様にして行うことができる。
【００３６】
また、インビボ方法における被験物質とＤ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌との接触は、被験物質の哺乳動物への投与により達成することができる。被験物質の哺乳動物への投与により、哺乳動物の腸内において被験物質がＤ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌と接触するためである。投与されるべき被験物質の量は、適宜調整することができる。例えば、効力が強い生体機能改善剤のスクリーニングが特に所望される場合、投与されるべき被験物質の量は、低量（例、０．０５〜１０ｇ／ｋｇ）に設定することができる。あるいは、特に効力が強い生体機能改善剤のスクリーニングが所望されない場合には、投与されるべき被験物質の量は、より高量（例、１０〜１００ｇ／ｋｇ）に設定されてもよい。哺乳動物としては、上述したものを用いることができるが、霊長類または齧歯類が好ましく、ヒトまたはマウスがより好ましい。臨床応用のし易さの観点からは、ヒトがさらにより好ましい。
【００３７】
工程（２）では、Ｄ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌数が評価される。このような腸内細菌数の評価は、例えば、腸内細菌数を直接カウントすることにより、または腸内細菌数を反映する別の指標を測定することにより、行うことができる。別の指標としては、このような腸内細菌に特異的なマーカー（例、１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、またはそれが産生する特異的な物質）を利用することができる。例えば、１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子量を定量的ＰＣＲ等の定量方法で解析することにより、このような腸内細菌数を評価することができる。
【００３８】
工程（３）では、Ｄ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌数を増加させる被験物質が、生体機能改善作用を有する物質として選択される。選択された被験物質は、Ｄ−プシコース様の生体機能改善作用を示すことができる。このような生体機能改善作用としては、上述の生体機能改善剤について述べたものと同様である。
【００３９】
特定の実施形態は、本発明のスクリーニング方法は、以下を含むインビトロ方法であってもよい：
（１）被験物質を、培地中において、Ｄ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌に接触させること；
（２）Ｄ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌数を評価すること；および
（３）Ｄ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌数を増加させる被験物質を、生体機能改善作用を有する物質として選択すること。
【００４０】
別の特定の実施形態は、本発明のスクリーニング方法は、以下を含むインビボ方法であってもよい：
（１）被験物質を投与された哺乳動物の糞便中に含まれるＤ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌数を評価すること；および
（２）Ｄ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌数を増加させる被験物質を、生体機能改善作用を有する物質として選択すること。
【００４１】
さらに別の特定の実施形態は、本発明のスクリーニング方法は、以下を含むインビボ方法であってもよい：
（１’）被験物質を哺乳動物（例、非ヒト哺乳動物）に投与すること；
（２’）被験物質を投与された哺乳動物の糞便を回収すること；
（３’）糞便中に含まれるＤ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌数を評価すること；および
（４’）Ｄ−プシコース応答性増殖能を有する腸内細菌数を増加させる被験物質を、生体機能改善作用を有する物質として選択すること。
【００４２】
本発明のスクリーニング方法は、例えば、Ｄ−プシコース様の生体機能改善作用を有する新規医薬または食品の開発、ならびに既存の作用に加え、Ｄ−プシコース様の生体機能改善作用をさらに有する複合的な作用を発揮できる医薬または食品の開発のために有用である。
【実施例】
【００４３】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００４４】
実施例１：Ｄ−プシコース応答性増殖能を有する特異な腸内細菌の発見
（１）実験手法
（ａ）動物実験
６週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本クレア）を２８匹用意し、通常食であるＣＥ−２（日本クレア）と水道水を２週間摂取させ順化したのち、７匹ずつ４群（（ｉ）水道水投与群、（ｉｉ）Ｄ−プシコース水投与群、（ｉｉｉ）水道水および抗生物質投与群、（ｉｖ）Ｄ−プシコース水および抗生物質投与群）に分け、８週齢で実験を開始した。エサは、全ての群において高脂肪食であるＨＦＤ３２（日本クレア）を自由摂取させた。飲水は、水道水投与群は実験室の水道水とし、Ｄ−プシコース水投与群は実験室の水道水にＤ−プシコース（松谷化学工業）を５．０％（ｗ／ｖ）添加したものを用いた。抗生物質投与群には、０．１％（ｗ／ｖ）  アンピシリンナトリウム、０．１％（ｗ／ｖ）  ネオマイシン硫酸塩、０．０５％（ｗ／ｖ）  バンコマイシン塩酸塩（いすれも和光純薬）を飲水に混合して投与した。実験期間中は毎週、マウスの体重、摂水量、摂食量を測定し、糞便を採取した。抗生物質の効果により腸内細菌を除去できていることを確認するため、抗生物質投与群から採取した糞便をＰＢＳに懸濁してＧＡＭ培地（ニッスイ）に塗布し、アネロパックを使用した嫌気条件において３７℃で一晩静置し、培地上にコロニーが観察されないことを確認した。このことから、抗生物質の効果により腸内細菌を除去できていたと考えられる。実験開始から９週目（１７週齢）において、糖尿病の指標となる空腹時血糖値の測定を行った。１５時間の絶食後、尾の側面にシリンジ用のニードル（テルモ）で傷をつけ、血糖値測定器（ニプロ  スタットストリップＸＰ３）を用いて血糖値を測定した。実験開始から１１週間後（１９週齢）には、マウスを解剖した。動物実験の概要を図示した（図１）。【００４５】
（ｂ）ＤＮＡ抽出
糞便サンプルを２４時間以上凍結乾燥し、４個のφ３ｍｍジルコニアビーズ（ＴＯＭＹ）を２ｍＬ破砕チューブに加え、Ｓｈａｋｅ  ｍａｓｔｅｒ  Ｎｅｏ（バイオメディカルサイエンス）を用いて１５００ｒｐｍ、１０分間の条件で破砕した。そこから１０ｍｇの糞便サンプルを計り取り、φ０．１ｍｍジルコニアビーズ（ＴＯＭＹ）をおよそ１００ｍｇ、４００μＬの１％  ＳＤＳと４００μＬのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）を加え、Ｓｈａｋｅ  ｍａｓｔｅｒ  Ｎｅｏを用いて、１５００ｒｐｍ、５分間の条件で攪拌した後に、１７，８００×ｇ、５分間、室温の条件で遠心分離を行った。上清に再びフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）を加え、Ｍｉｃｒｏ  ｍｉｘｅｒ  Ｅ−３６（ＴＡＩＴＥＣ）を用いて１分間攪拌した後に、１７，８００×ｇ、５分間、室温の条件で遠心分離を行った。上清に４０μＬの３Ｍ  ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅと８００μＬの１００％  ＥｔＯＨを加えた後に、−８０℃で１時間静置した。１７，８００×ｇ、１０分間、４℃の条件で遠心分離した後に、ＥｔＯＨを除き５００μＬの７０％  ＥｔＯＨを加えた。再度１７，８００×ｇ、１０分間、４℃の条件で遠心分離した後に、Ｍｉｃｒｏ  Ｖａｃ（トミー精工）を用いて乾燥させ、ＴＥ１０を１００μＬ加えて攪拌した。そのうち８０μＬのＤＮＡ溶液にＲｎａｓｅ（１０ｍｇ／ｍｌ）を１μＬ加え、３７℃の条件でオーバーナイトインキュベートした。その後、１２０μＬのＰｕｒｅ  Ｗａｔｅｒ、２００μＬのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを加え、Ｍｉｃｒｏ  ｍｉｘｅｒ  Ｅ−３６で１分間攪拌し、１７，８００×ｇ、５分間、室温の条件で遠心分離を行った。上清に２０μＬの３Ｍ  ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ５．２）と４００μＬの１００％  ＥｔＯＨを加えて氷上で１５分静置した後に、１７，８００×ｇ、１０分間、４℃の条件で遠心分離を行った。上清を除いた後に７０％  ＥｔＯＨを５００μＬ加え、１７，８００×ｇ、１０分間、４℃の条件で遠心分離を２度行い、上清を除いた後に５０μＬの１×ＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒを加え、Ｍｉｃｒｏ  ｍｉｘｅｒ  Ｅ−３６を用いて１分間攪拌し、ＤＮＡを溶解した。【００４６】
（ｃ）ユニバーサルプライマーを用いたＰＣＲおよびＰＣＲ産物の精製、濃度定量
１０ｎｇ／μＬに希釈したＤＮＡ溶液サンプル１μＬをテンプレートとして、細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１領域からＶ２領域を特異的に増幅するユニバーサルプライマー２７Ｆｍｏｄ：５’−ＡＧＲＧＴＴＴＧＡＴＹＭＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’（配列番号２）および３３８Ｒ：５’−ＴＧＣＴＧＣＣＴＣＣＣＧＴＡＧＧＡＧＴ−３’（配列番号３）を用いてＰＣＲを行った。初期変性反応を９８℃で１分間、その後９８℃を１０秒間、５５℃を１５秒間、６８℃を３０秒間の３ステップを２０回繰り返し、最終伸張反応を６８℃で３分間行った。ポリメラーゼはＴｋｓ  Ｇｆｌｅｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）を用いた。その後、ＰＣＲ産物４５μＬに対して８１μＬのＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ（ベックマン・コールター）を加えて精製を行い、Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いてＤＮＡ濃度を測定した。【００４７】
（ｄ）インデックスＰＣＲおよびＰＣＲ産物の精製、濃度定量、およびシークエンス
（３）の結果からＰＣＲ産物のモル濃度を算出した。インデックスＰＣＲで用いるテンプレートの濃度が１ｎＭになるよう、各サンプルを希釈した。ＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）でのシークエンスに必要なアダプター配列およびインデックス配列を付加するため、インデックスＰＣＲを行った。プライマーは、５’−ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣ−ＮＮＮＮＮＮＮＮ−ＴＡＴＧＧＴＡＡＴＴＧＴＡＧＲＧＴＴＴＧＡＴＹＭＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’（配列番号４）および５’−ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ−ＮＮＮＮＮＮＮＮ−ＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＣＣＴＣＣＣ  ＧＴＡＧＧＡＧＴ−３’（配列番号５）を用いた。なお、Ｎで記載した塩基配列がインデックス配列であり、サンプルごとに異なる配列を用いた。インデックスＰＣＲ条件は初期変性反応を９８℃で１分間、その後９８℃を１０秒間、５５℃を１５秒間、６８℃を３０秒間の３ステップを８回繰り返し、最終伸張反応を６８℃で３分間行った。ポリメラーゼはＴｋｓ  Ｇｆｌｅｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いた。その後、ＰＣＲ産物５０μＬに対して９０μＬのＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰを加えて精製を行い、Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎを用いてＤＮＡ濃度を測定した。この結果から、各サンプルを４ｎＭに希釈した。その後、前処理行程を終えたサンプルを等量ずつ混合し、ＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）の標準プロトコルに従いシークエンスを実施した。【００４８】
（ｅ）データ解析
まず、ペアエンドでシークエンスされた塩基配列をＦＬＡＳＨ（ｖｅｒｓｉｏｎ  １．２．１１）によってアセンブルした。平均Ｑ−ｖａｌｕｅが２５以下の塩基配列は解析の対象から除外した。得られたデータは、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｅｃｏｌｏｇｙ（Ｑｉｉｍｅ）（ｖｅｒｓｉｏｎ  １．９．１）を用いて解析した。その塩基配列のうち、相同性が９７％以上でＯｐｅｒａｔｉｏｎａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  Ｕｎｉｔｓ（ＯＴＵｓ）を作成しＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＲＤＰ）のデータベースおよびＮＣＢＩのデータベース（１６Ｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（Ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  Ａｒｃｈａｅａ））と比較し、各ＯＴＵの近縁種を推定した。【００４９】
（ｆ）統計
統計解析は統計ソフトウェアのＲ（ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．４．１）を用いた。まず、データが正規分布に従うことを確かめた後、２群間に等分散性が仮定できる場合にはスチューデントのｔ検定、できない場合にはウェルチのｔ検定を行った。正規分布に従わない場合には、マンホイットニーのＵ検定（ウィルコクソンの順位和検定）を行った。いずれもＰ値が０．０５以下の場合に有意とした。【００５０】
（２）結果
体重測定の結果から、高脂肪食の摂取による体重増加がＤ−プシコースによって有意に抑制されることを明らかにした。３種混合の抗生物質を用いて腸内細菌を全て除去した２群においては、Ｄ−プシコースによる体重増加の抑制が見られなかった（図２）。また、糖尿病の指標となる空腹時血糖値の結果でも同様に、高脂肪食の摂取によって増加した血糖値が、Ｄ−プシコースの摂取によって有意に低下することが明らかになった。抗生物質を用いた群では、体重の結果と同様に有意差が見られなかった（図３）。以上から、Ｄ−プシコースの抗肥満効果は腸内細菌を介してもたらされている可能性が示唆された。さらに、次世代シーケンサーであるＭｉＳｅｑを用いて糞便サンプル中の腸内細菌叢を解析した結果、Ｄ−プシコースの摂取によって今回見出された腸内細菌が有意に増加することが認められた（図４）。【００５１】
今回見出された腸内細菌は、ＯＴＵとして１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（配列番号１）を有していた。そこで、この塩基配列をＮＣＢＩのｂｌａｓｔｎにより、「１６Ｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  （Ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  Ａｒｃｈａｅａ）」データベースを対象として解析したところ、最も類似性が高い細菌種はＡｔｏｐｏｂｉｕｍ  ｐａｒｖｕｌｕｍであった（同一性：８９％）。また、Ｏｌｓｅｎｅｌｌａ  ｕｍｂｏｎａｔａも同スコアであった（同一性：８９％）。Ｏｌｓｅｎｅｌｌａ属菌は、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ属菌と同じ科に属する近縁種であり、また、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ属菌およびＯｌｓｅｎｅｌｌａ属菌はいずれもＡｔｏｐｏｂｉａｃｅａｅ科に属する腸内細菌である。本解析手法においては一般的に９７％以上の同一性をもって「同種」と判断するが、今回見出された腸内細菌はいずれも同一性が最高で８９％であった。このことは、今回の研究で得られた腸内細菌種がＡｔｏｐｏｂｉａｃｅａｅ科に属する未登録の腸内細菌種である可能性を示唆する。【００５２】
実施例２：Ｄ−プシコース応答性増殖能を有する特異な腸内細菌の培養
Ｄ−プシコース応答性増殖能を有する特異な腸内細菌を含む腸内細菌群を、参考文献（Ｆｕｋｕｄａ  Ｓ．，Ｊ  Ｖｅｔ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ．，２００２  Ｎｏｖ；６４（１１）：９８７−９２）にしたがい、Ｄ−プシコース投与マウス（実施例１）の糞便から回収した。回収した腸内細菌群を、Ｄ−プシコース含有培地中において嫌気的条件（酸素濃度：０％）下で３７℃、２日間培養した。培養開始時の培地における腸内細菌密度は約１×１０６細胞／ｍＬであった。培地中のＤ−プシコースの濃度は、０．３％（ｗ／ｖ）であった。Ｄ−プシコース以外の培地成分としては、Ｆｕｋｕｄａ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｇｅｎ  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２００５  Ａｐｒ；５１（２）：１０５−１３に記載される培地の基礎成分、およびＯｈｋａｗａｒａ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｕｔｒ．  ２００５  Ｄｅｃ；１３５（１２）：２８７８−８３に記載される短鎖脂肪酸およびビタミンを用いた（ｐＨ７．０）。
その結果、配列番号１の塩基配列を利用したメタゲノム解析により、Ｄ−プシコース応答性増殖能を有する特異な腸内細菌の存在が確認された。
したがって、Ｄ−プシコース含有培地において、Ｄ−プシコース応答性増殖能を有する特異な腸内細菌を培養できることが示された。【００５３】
実施例３：Ｄ−プシコース応答性増殖能を有する特異な腸内細菌の培養
（１）概要
実施例１、２の結果から、希少糖摂取による体重増加の抑制、及びＡｔｏｐｏｂｉｕｍ属近縁菌の特徴的な増加が見出されている。そこで、無菌マウスにＡｔｏｐｏｂｉｕｍ属近縁菌を経口投与し定着させたノトバイオートマウスを作製することにより、Ｄ−プシコース投与試験で特徴的に増加した腸内細菌による抗肥満効果の詳細な検討を試みた。【００５４】
（２）手法
（ａ）菌液
本試験では、Ｄ−プシコース投与で増加した腸内細菌に近縁であるＡｔｏｐｏｂｉｕｍ  ｐａｒｖｕｌｕｍ（ＪＣＭ１０３００）を用いた。また、比較対照群として無投与群とＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ（ＪＣＭ５８２７）投与群を用いた。ＧＡＭ液体培地１０ｍＬを用いて、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎは１日、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ  ｐａｒｖｕｌｕｍは２日、嫌気条件下で培養した。【００５５】
（ｂ）動物試験
８週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統・無菌マウスを５匹ずつ３群に分けた〔ｉ）無菌群，ｉｉ）Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ定着群，ｉｉｉ）Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ  ｐａｒｖｕｌｕｍ定着群〕。直前に用意した菌液を２００μＬずつ経口投与した。全ての群において、エサはγ線滅菌された高脂肪食であるＤ１２４９２（リサーチダイエット社：６０ｋｃａｌ％脂肪含有量、ラード使用、（高脂肪食  Ｈｉｇｈ  Ｆａｔ  Ｄｉｅｔ））、飲水は滅菌した水道水を自由摂取させた。実験期間中は毎週、マウスの体重、摂水量、摂食量を測定し、糞便サンプルを採取した。菌液投与３、５、７、１４、２１日後には，糞便サンプルをＧＡＭプレート培地で培養し、菌が定着したことを確認した。試験開始９週後（１７週齢）には、イソフルラン麻酔下で解剖した。【００５６】
（ｃ）統計
統計解析は統計ソフトウェアのＲ（ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．４．１）を用いた。二元配置分散分析（ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）でＰ＜０．０５の有意差が認められた場合、Ｔｕｋｅｙ法による多重比較検定を行った。【００５７】
（３）結果
体重測定の結果から、高脂肪食の摂取による体重増加量は、無菌群やＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ定着マウスと比較して、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ  ｐａｒｖｕｌｕｍ定着マウスで有意に抑制されることが明らかとなった（図６）。また、解剖時の精巣上体脂肪組織の重量においても、同様の傾向が認められた（図７）。このことから、プシコース摂取によって腸内で増加するＡｔｏｐｏｂｉｕｍ属近縁菌が、抗肥満効果を有することが明らかとなった。
【図１】
2020013239.tif 000002
【図２】
2020013239.tif 000003
【図３】
2020013239.tif 000004
【図４】
2020013239.tif 000005
【図５】
2020013239.tif 000006
【図６】
2020013239.tif 000007
【図７】
2020013239.tif 000008
【配列表】
2020013239000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和3年2月2日(2021.2.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄ−プシコースを含む、アトポビアセア（Ａｔｏｐｏｂｉａｃｅａｅ）科に属する腸内細菌増殖促進剤。
【請求項２】
前記アトポビアセア（Ａｔｏｐｏｂｉａｃｅａｅ）科に属する腸内細菌が、アトポビアセア・パルブラム（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ  ｐａｒｖｕｌｕｍ）である、請求項１記載の剤。
【請求項３】
前記腸内細菌増殖促進剤が経口用組成物または経直腸投与用組成物である、請求項１または２記載の剤。
【請求項４】
Ｄ−プシコースと、アトポビアセア（Ａｔｏｐｏｂｉａｃｅａｅ）科に属する腸内細菌を含む、生体機能改善剤。
【請求項５】
前記生体機能改善剤が代謝障害の予防または治療剤である、請求項４記載の剤。
【請求項６】
前記生体機能改善剤が抗肥満剤である、請求項４記載の剤。
【請求項７】
前記生体機能改善剤が抗糖尿病剤である、請求項４記載の剤。
【請求項８】
前記生体機能改善剤が経口用組成物または経直腸投与用組成物である、請求項４ないし７記載の剤。
【国際調査報告】
2020013239.tif 000009
2020013239.tif 000010
2020013239.tif 000011
2020013239.tif 000012