(57)【要約】  本発明は、エルゴチオネイン、アスコルビン酸２−グルコシド、アスコルビン酸、およびそれらの組み合わせを含む筋分化促進用培地および培地添加剤、キット、ならびに筋分化促進用医薬組成物および飲食物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エルゴチオネインを含む、筋分化を促進するための培地。
【請求項２】
さらにアスコルビン酸２−グルコシドおよび/またはアスコルビン酸を含む、請求項１記載の培地。
【請求項３】
エルゴチオネインを含む、筋分化を促進するための培地添加剤。
【請求項４】
さらにアスコルビン酸２−グルコシドおよび/またはアスコルビン酸を含む、請求項３記載の培地添加剤。
【請求項５】
エルゴチオネインを含む、筋分化を促進するためのキット。
【請求項６】
さらにアスコルビン酸２−グルコシドおよび/またはアスコルビン酸を含む、請求項５記載のキット。
【請求項７】
エルゴチオネインを含む培地にて細胞を培養することを含む、細胞の筋分化を促進する方法。
【請求項８】
培地がさらにアスコルビン酸２−グルコシドおよび/またはアスコルビン酸を含むものである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
エルゴチオネインを含む、筋分化を促進するための医薬組成物。
【請求項１０】
さらにアスコルビン酸２−グルコシドおよび/またはアスコルビン酸を含む、請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１１】
筋肉の再生を促進するための、請求項９または１０記載の医薬組成物。
【請求項１２】
エルゴチオネインを含む、筋分化を促進するための飲食物。
【請求項１３】
さらにアスコルビン酸２−グルコシドおよび/またはアスコルビン酸を含む、請求項１２記載の飲食物。
【請求項１４】
筋肉の再生を促進するための、請求項１２または１３記載の飲食物。
【請求項１５】
アスコルビン酸２−グルコシドおよび／またはアスコルビン酸を含む、筋分化を促進するための培地。
【請求項１６】
アスコルビン酸２−グルコシドおよび／またはアスコルビン酸を含む、筋分化を促進するための培地添加剤。
【請求項１７】
アスコルビン酸２−グルコシドおよび／またはアスコルビン酸を含む、筋分化を促進するためのキット。
【請求項１８】
アスコルビン酸２−グルコシドおよび／またはアスコルビン酸を含む培地にて細胞を培養することを含む、細胞の筋分化を促進する方法。
【請求項１９】
アスコルビン酸２−グルコシドおよび／またはアスコルビン酸を含む、筋分化を促進するための医薬組成物。
【請求項２０】
筋肉の再生を促進するための、請求項１９記載の医薬組成物。
【請求項２１】
アスコルビン酸２−グルコシドおよび／またはアスコルビン酸を含む、筋分化を促進するための飲食物。
【請求項２２】
筋肉の再生を促進するための、請求項２１記載の飲食物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞の分化促進に関する。詳細には、本発明は、エルゴチオネインを含む筋分化促進用培地および培地添加剤、ならびに筋分化促進用医薬組成物および飲食物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、高齢化社会が進むなかで、運動機能低下、転倒・骨折リスクの上昇、ロコモティブシンドローム等の筋量や筋力の低下に伴う様々な障害が問題となっている。これらの障害を治療、改善するためには、筋肉の再生が重要であり、筋肉の再生には筋分化が必要である。筋分化について様々な研究がなされている（例えば、非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Onitsuka Y. Investigation of an efficient culture condition for the differentiation of murine skeletal myoblasts. Jpn. J. Vet. Res . 2013. 61(1&2): 39.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ロコモティブシンドロームなどの筋肉の再生が必要な症状や状態を治療、改善するために、筋分化を促進する有効かつ安全な薬剤や方法を見出す必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ね、エルゴチオネインが筋分化を促進すること、エルゴチオネインとアスコルビン酸２−グルコシドおよび／またはアスコルビン酸を併用することにより筋分化が大幅に促進されること、アスコルビン酸２−グルコシドが単独で筋分化を促進すること、およびアスコルビン酸が単独で筋分化を促進することを初めて見出し、本発明を完成させるに至った。【０００６】
したがって、本発明は、下記のものを提供する。
（１）エルゴチオネインを含む、筋分化を促進するための培地。
（２）さらにアスコルビン酸２−グルコシドおよび／またはアスコルビン酸を含む、（１）記載の培地。
（３）エルゴチオネインを含む、筋分化を促進するための培地添加剤。
（４）さらにアスコルビン酸２−グルコシドおよび／またはアスコルビン酸を含む、（３）記載の培地添加剤。
（５）エルゴチオネインを含む、筋分化を促進するためのキット。
（６）さらにアスコルビン酸２−グルコシドおよび／またはアスコルビン酸を含む、（５）記載のキット。
（７）エルゴチオネインを含む培地にて細胞を培養することを含む、細胞の筋分化を促進する方法。
（８）培地がさらにアスコルビン酸２−グルコシドおよび／またはアスコルビン酸を含むものである、（７）記載の方法。
（９）エルゴチオネインを含む、筋分化を促進するための医薬組成物。
（１０）さらにアスコルビン酸２−グルコシドおよび／またはアスコルビン酸を含む、（９）記載の医薬組成物。
（１１）筋肉の再生を促進するための、（９）または（１０）記載の医薬組成物。
（１２）エルゴチオネインを含む、筋分化を促進するための飲食物。
（１３）さらにアスコルビン酸２−グルコシドおよび／またはアスコルビン酸を含む、（１２）記載の飲食物。
（１４）筋肉の再生を促進するための、（１２）または（１３）記載の飲食物。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、エルゴチオネインを含む筋分化促進用培地および培地添加剤、ならびに筋分化促進用医薬組成物および飲食物等が提供される。本発明の培地、培地添加剤、医薬組成物および飲食物は、優れた筋分化促進能を有する。本発明の医薬組成物および飲食物は、特に高齢者や外傷を負った人、病中・病後の人などに有益である。これらの効果は、エルゴチオネインとアスコルビン酸２−グルコシドおよび／またはアスコルビン酸を併用することによって大幅に増強される。また、アスコルビン酸２−グルコシド単独、アスコルビン酸単独、あるいはこれらを併用した場合にも上記効果が得られる。エルゴチオネインは生体内に見出される物質であり、アスコルビン酸２−グルコシドは食品添加物および医薬部外品として承認されている物質であり、アスコルビン酸は果実、野菜など自然界に広く存在している物質であるので、本発明の培地、培地添加剤、医薬組成物および飲食物は安全性が高い。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、エルゴチオネインがＣ２Ｃ１２細胞の筋分化に与える影響を示す顕微写真である。左の写真は分化前のＣ２Ｃ１２細胞、中の写真はＥＧＴ無添加の分化培地で分化したＣ２Ｃ１２細胞（対象）、右の写真は０．５ｍＭ ＥＧＴを添加した分化培地で分化したＣ２Ｃ１２細胞である。
【図２】図２は、エルゴチオネインがＣ２Ｃ１２細胞のＭｙｏＤ  ｍＲＮＡ発現レベルに与える影響を示すグラフである。
【図３】図３は、エルゴチオネインがＣ２Ｃ１２細胞のＭｙＨ２  ｍＲＮＡおよびＡＣＴＡ１  ｍＲＮＡの発現レベルに与える影響を示すグラフである。
【図４】図４は、抗酸化剤エダラボンがＣ２Ｃ１２細胞のＭｙＨ２  ｍＲＮＡ発現レベルに影響しないことを示すグラフである。
【図５】図５は、エルゴチオネインとアスコルビン酸２−グルコシドの併用、およびアスコルビン酸２−グルコシドの単独使用がＣ２Ｃ１２細胞のＭｙＨ２  ｍＲＮＡの発現レベル（上パネル）およびＡＣＴＡ１  ｍＲＮＡの発現レベル（下パネル）に与える影響を示すグラフである。図中、ＥＧＴはエルゴチオネイン添加培地、ＡＧはアスコルビン酸２−グルコシド添加培地、Ｅ＋ＡＧはエルゴチオネインおよびアスコルビン酸２−グルコシドを添加した培地を用いたことを示す。ＮＴはエルゴチオネインおよびアスコルビン酸２−グルコシドを添加しない培地を用いたことを示す。
【図６】図６は、エルゴチオネインとアスコルビン酸の併用、およびアスコルビン酸の単独使用がＣ２Ｃ１２細胞のＭｙＨ２  ｍＲＮＡの発現レベル（上パネル）およびＡＣＴＡ１  ｍＲＮＡの発現レベル（下パネル）に与える影響を示すグラフである。図中、ＥＧＴはエルゴチオネイン添加培地、ＶＣはアスコルビン酸添加培地、Ｅ＋ＶＣはエルゴチオネインおよびアスコルビンを添加した培地を用いたことを示す。ＮＴはエルゴチオネインおよびアスコルビン酸を添加しない培地を用いたことを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、第１の態様において、エルゴチオネインを含む、筋分化を促進するための培地を提供する。
【００１０】
本発明者らは、エルゴチオネインが筋分化を促進することを初めて見出した。
【００１１】
エルゴチオネイン（以下において、ＥＧＴと称する）は含硫アミノ酸の一種で、抗酸化能をはじめとする多様な生理活性を有することが知られている。また、その抗酸化能はビタミンＣ、ビタミンＥ、システイン、グルタチオンよりも高いことが示唆されている。ＥＧＴは紫外線吸収効果、メラニン産生抑制作用、活性酸素種の消去能、しわやたるみの形成を抑えるエラスターゼ活性阻害作用、シミの形成を抑えるチロシナーゼ活性阻害作用を有することも示されている。そのためＥＧＴはとりわけ美容・食品業界で注目されている化合物の１つである。しかし、ＥＧＴが筋分化を促進することは、本発明者らによって初めて見出されたことである。
【００１２】
本明細書において、筋分化とは、骨格筋へ分化する能力を有する幹細胞または筋前駆細胞から筋管細胞への分化をいう。本発明の培地はこれらの細胞の分化を促進するために用いられる。幹細胞は中胚葉系幹細胞である。中胚葉系幹細胞は、生体内に存在するものであってもよく、ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞に由来するものであってもよい。骨格筋の筋前駆細胞は公知であり、サテライト細胞および筋芽細胞が例示される。特別な態様において、筋分化とは、サテライト細胞または筋芽細胞から筋管細胞への分化をいう。サテライト細胞は、体性幹細胞様の性質を有しており、筋細胞の前駆細胞である。サテライト細胞は活性化されて筋芽細胞へと分化する。筋芽細胞は、細胞分裂により増殖した後、筋細胞へと分化する。筋細胞は互いに融合し、多核の筋管細胞を形成する。そして筋管細胞は筋繊維へと成熟し、筋肉組織を形成する。サテライト細胞、筋芽細胞、筋細胞、筋管細胞等は当業者に公知である。
【００１３】
本発明に用いられるＥＧＴは遊離の形態であってもよく、塩の形態であってもよい。ＥＧＴの塩は、ＥＧＴのカルボキシル基の負に荷電した酸素と例えば水素イオンやアルカリ金属イオンとの間で形成されてもよく、トリメチルアミノ基の正に荷電した窒素と例えばハロゲン化物イオンとの間で形成されてもよい。また、本発明に用いられるＥＧＴは水和物であってもよい。
【００１４】
筋に分化しているかどうかは、筋特異的蛋白であるミオシンをどの程度発現しているかで確認することが可能である。本明細書において、筋分化の促進とは、幹細胞または筋前駆細胞におけるミオシン遺伝子発現レベルが増大することをいう。特別な態様において、サテライト細胞または筋芽細胞がミオシンｍＲＮＡを高発現する細胞に変化することをいう。例えば、筋分化の促進とは、サテライト細胞または筋芽細胞由来の筋細胞が筋マーカーであるミオシンｍＲＮＡの遺伝子発現レベルを１．５倍以上、好ましくは２倍以上、より好ましくは３倍以上に増加させることと定義してもよい。また例えば、筋分化の促進とは、サテライト細胞または筋芽細胞におけるＭｙｏＤ  ｍＲＮＡの発現を、ＥＧＴの不存在下と比べて１．５倍以上、好ましくは２倍以上に増加させることをいう。
【００１５】
本発明の培地は、公知の培地にＥＧＴを添加したものであってもよい。好ましくは、本発明の培地は、筋分化に使用される培地にＥＧＴを添加したものである。培地へのＥＧＴの添加量は、幹細胞や筋前駆細胞（例えばサテライト細胞または筋芽細胞）の種類、培養温度、培養時間等の培養条件、培地組成などに応じて当業者が適宜決定することができる。例えば、筋分化用の公知の低血清培地に約０．００１ｍＭ〜約１．０ｍＭ、好ましくは約０．１ｍＭ〜約０．５ｍＭのＥＧＴを添加してもよいが、これらの量に限定されない。
【００１６】
本発明の培地は液体、半固形、固体等いずれの形態であってもよく、特に限定されない。通常は、本発明の培地は液体培地である。あるいは本発明の培地は組成物の形態であってもよい。例えばそのまま使用可能な液体培地組成物の形態であってもよく、水等の媒体にて希釈することにより所望の成分濃度になる濃縮液、ペースト、粉末、ペレット等の組成物の形態であってもよい。
【００１７】
本発明は、第２の態様において、ＥＧＴを含む、筋分化を促進するための培地添加剤を提供する。
【００１８】
本発明の添加剤は、培地調製時に、あるいは調製済み培地に添加される。あるいは本発明の添加剤は、培養途中の培地に添加されてもよい。
【００１９】
本発明の添加剤中のＥＧＴ量は、培地に添加された場合に所望のＥＧＴ濃度となるような量である。培地中のＥＧＴ濃度については上で説明したとおりである。本発明の添加剤は、ＥＧＴのほかに、１種またはそれ以上の成分を含んでいてもよく、例えば細胞の増殖に必要な栄養成分、あるいは線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、または肝細胞増殖因子（ｈｅｐａｔｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）（ＨＧＦ）、インスリン、インスリン様成長因子（ｉｎｓｕｌｉｎ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）（ＩＧＦ）などの筋分化を促進する成分等を含んでいてもよい。
【００２０】
本発明の添加剤の形態はいずれの形態であってもよく、粉末、顆粒、タブレットなどの固体、ペーストなどの半固体、あるいは濃縮液などの液体であってもよい。
【００２１】
本発明は、第３の態様において、ＥＧＴを含む、筋分化を促進するためのキットを提供する。
【００２２】
通常は、本発明のキットに含まれるＥＧＴは容器に入れられる。容器の形状、材質については特に限定されない。該容器にはＥＧＴ以外の成分が含まれていてもよい。本発明のキットは、ＥＧＴを含む容器のほかに、例えば細胞の増殖に必要な栄養成分、あるいは筋分化を促進する成分等を含む１つまたはそれ以上の容器を含んでいてもよい。本発明のキットは、上記培地または上記培地添加物を含んでいてもよい。通常は、本発明のキットには取扱説明書が添付される。
【００２３】
本発明は、第４の態様において、ＥＧＴを含む培地にて細胞を培養することを含む、細胞の筋分化を促進する方法を提供する。本発明の方法において、サテライト細胞または筋芽細胞を培養する。培地組成、培養温度、培養時間等の培養条件は当業者に公知である。
【００２４】
本発明は、第５の態様において、ＥＧＴを含む、筋分化を促進するための医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物の投与対象は、筋肉を再生させることによって利益を受ける動物であれば、動物種は特に限定されない。本発明の医薬組成物を投与される動物は好ましくはヒトであるが、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ等のヒト以外の動物であってもよい。
【００２５】
筋分化を促進することにより筋肉の再生を促進することができる。本明細書において、筋肉の再生とは、何らかの要因で減少した筋量を元のレベルに戻すこと、あるいは何らかの要因で減少した筋力を元のレベルに戻すことをいう。本発明の医薬組成物の具体的な用途としては、サルコペニアの抑制、損傷時の筋肉再生促進などが例示されるが、これらの用途に限定されない。サテライト細胞は、筋線維の細胞膜と基底膜の間に存在している。
筋肉が受傷などの刺激を受けるとサテライト細胞が活性化され、筋芽細胞へと分化する。
筋芽細胞は筋細胞へと分化し、筋管を形成する。筋管は筋線維を形成あるいは筋線維と融合して骨格筋を再生する。ＥＧＴはサテライト細胞または筋芽細胞の筋細胞への筋分化を促進することから、本発明の医薬組成物を筋肉の再生、とりわけ骨格筋の再生を促進するために用いてもよい。再生される筋肉はいずれの部位にあってもよい。
【００２６】
筋量、とりわけ骨格筋量の測定方法としては、ＢＩＡ法、ＣＴやＭＲＩを用いる方法、ＤＸＡ法、超音波エコー法、肉眼で観察する方法等が挙げられるがこれらに限定されない。筋力、とりわけ骨格筋力の測定方法としては、握力、背筋力、脚伸展力、歩行速度を測定する方法、上体起こし、立ち幅跳び、ボール投げ等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２７】
本発明の医薬組成物は、例えば混合、混練、撹拌、乾燥、粉砕、打錠、可溶化等の公知の手段および方法を用いて製造することができる。本発明の医薬組成物は、通常、担体または賦形剤を含む。担体または賦形剤は当業者に公知であり、投与部位、投与経路、含まれるＥＧＴの量などに応じて選択することができる。
【００２８】
本発明の医薬組成物の剤形はいずれの剤形であってもよく、特に限定されない。剤形としては、例えば注射剤、輸液剤、経口液剤、ローションなどの液体であってもよく、クリーム、パスタ、軟膏などの半固体であってもよく、錠剤、粉末、顆粒、トローチ、座薬などの固体であってもよく、用時調製可能な凍結乾燥粉末であってもよい。
【００２９】
本発明の医薬組成物の投与経路はいずれの経路であってもよく、例えば筋肉注射、皮下注射、皮内注射、静脈注射、輸液、経皮投与、ほほ粘膜からの投与、経肛門投与、経口投与などが挙げられるが特に限定されない。骨格筋の再生の場合、好ましくは本発明の医薬組成物は筋肉注射される。
【００３０】
本発明の医薬組成物によるＥＧＴの投与量は、生体内で筋分化を促進することのできる量、あるいは筋肉を再生させることができる量である。本発明の医薬組成物によるＥＧＴの投与量は、望まれる筋肉再生の程度、投与部位や投与経路等によって異なるが、例えば成人に経口投与する場合は１日あたり通常１ｍｇ〜５０００ｍｇ、好ましくは１０ｍｇ〜１０００ｍｇであってもよいが、これらの量に限定されない。ＥＧＴの投与量は、医師が、例えば筋肉のサイズや量を見ながら適宜決定することができる。
【００３１】
本発明の医薬組成物を１日１回〜数回投与してもよい。本発明の医薬組成物を、毎日あるいは１日〜数日毎に投与してもよい。本発明の医薬組成物の投与を、所望の筋肉再生効果が現れるまで継続してもよい。
【００３２】
本発明は、第６の態様において、筋分化を促進するための飲食物を提供する。本発明の飲食物は、筋肉を再生させることによって利益を受ける動物に与えられる。動物種は特に限定されないが、好ましくはヒトである。動物種はイヌ、ネコ、ウマ等のヒト以外の動物であってもよい。
【００３３】
本発明の飲食物は一般食品のほか、健康食品、特定保健食品、栄養機能食品、機能性表示食品などを包含する。
【００３４】
本発明の飲食物はサプリメントとして提供されてもよい。サプリメントの形態はいずれのものであってもよく、特に限定されない。
【００３５】
本発明の飲食物の形態はいずれの形態であってもよく、特に限定されない。例えば本発明の飲食物は、例えば既存の飲食物にＥＧＴを添加したものであってもよい。また例えば錠剤、粉末、顆粒、トローチ、キャンデイー、ジュース、ネクター、ドリンク、調味料などの形態であってもよい。サプリメントは公知の医薬組成物の製造方法に準じた方法あるいは公知の飲食物の製造方法に準じた方法により製造することができる。
【００３６】
上で説明したように、ＥＧＴはサテライト細胞または筋芽細胞の筋細胞への筋分化を促進することから、本発明の飲食物を、筋肉の再生、とりわけ骨格筋の再生を促進するために用いてもよい。本発明の飲食物の具体的な用途としては、サルコペニアの抑制、損傷時の筋肉再生促進などが例示されるが、これらの用途に限定されない。再生される筋肉はいずれの部位にあってもよい。
【００３７】
本発明の飲食物によるＥＧＴの摂取量は、生体内で筋分化を促進することのできる量、あるいは筋肉を再生させることができる量である。本発明の飲食物によるＥＧＴの摂取量は、望まれる筋肉再生の程度、筋肉再生部位等によって異なるが、例えば成人に経口投与する場合は１日あたり通常１ｍｇ〜５０００ｍｇ、好ましくは１０ｍｇ〜１０００ｍｇであってもよいが、これらの量に限定されない。
【００３８】
本発明の飲食物を１日１回〜数回摂取してもよい。本発明の飲食物を、毎日あるいは１日〜数日毎に摂取してもよい。本発明の飲食物の投与を、所望の筋肉再生効果が現れるまで継続してもよい。
【００３９】
上で述べたように、本発明者らは、ＥＧＴとアスコルビン酸２−グルコシド（以下において、ＡＧと称する）および／またはアスコルビン酸（以下において、ＶＣと称する）を併用することにより、筋分化が大幅に促進されることを初めて見出している。したがって、上で説明した本発明の培地、培地添加物、キット、医薬組成物および飲食物は、ＥＧＴに加えてＡＧおよび／またはＶＣを含むものであってもよい。また上で説明した本発明の細胞の筋分化促進方法において、ＥＧＴとＡＧおよび／またはＶＣを併用してもよい。ＥＧＴとＡＧおよび／またはＶＣを併用することにより、筋分化の促進および筋肉の再生をさらに促進することができる。
【００４０】
ＡＧは、ビタミンＣ誘導体であり、アスコルビン酸の２−位の水酸基にグルコースがα−配位で結合した物質である。ＡＧは、安定性が高く、しかも生体に対して安全性が高い物質である。ＡＧは、食品添加物や医薬部外品の有効成分として認められており、例えば美白用化粧品の主剤として、あるいは食品の栄養強化剤として用いられている。ＶＣは、ビタミンＣとしても知られ、自然界に広く見いだされる抗酸化作用を有する物質である。ＶＣは、酸化防止剤や栄養強化剤などとして食品、医薬品、医薬部外品、化粧品などに用いられている。したがって、ＡＧおよび／またはＶＣを含む本発明の培地、培地添加物、キット、医薬組成物および飲食物、ならびにＡＧおよび／またはＶＣを用いる本発明の細胞の筋分化促進方法は、細胞や生体に対する安全性が高い。なお、本発明に用いられるＶＣは遊離形態であってもよく、塩の形態であってもよい。ＶＣの塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
さらに上で述べたように、本発明者らは、ＡＧが単独でも筋分化を促進すること、ＶＣが単独でも筋分化を促進すること、およびＡＧとＶＣを併用しても筋分化が促進されること初めて見出している。したがって、本発明は以下のものを提供する。
【００４２】
（ａ）ＡＧおよび／またはＶＣを含む、筋分化を促進するための培地。
（ｂ）ＡＧおよび／またはＶＣを含む、筋分化を促進するための培地添加剤。
（ｃ）ＡＧおよび／またはＶＣを含む、筋分化を促進するためのキット。
（ｄ）ＡＧおよび／またはＶＣを含む培地にて細胞を培養することを含む、細胞の筋分化を促進する方法。
（ｅ）ＡＧおよび／またはＶＣを含む、筋分化を促進するための医薬組成物。
（ｆ）筋肉の再生を促進するための、（ｅ）記載の医薬組成物。
（ｇ）ＡＧおよび／またはＶＣを含む、筋分化を促進するための飲食物。
（ｈ）筋肉の再生を促進するための、（ｇ）記載の飲食物。
【００４３】
本発明の培地へのＡＧの添加量は、培養される幹細胞や筋前駆細胞（例えばサテライト細胞または筋芽細胞）の種類、培養温度、培養時間等の培養条件、培地組成などに応じて当業者が適宜決定することができる。例えば、筋分化用の公知の低血清培地に約０．０５ｍＭ〜約５ｍＭ、好ましくは約０．２ｍＭ〜約２ｍＭのＡＧを添加してもよい。本発明の培地へのＶＣの添加量は、ＡＧの添加量と同様である。
【００４４】
本発明の医薬組成物によるＡＧの投与量は、望まれる筋肉再生の程度、投与部位や投与経路によって異なるが、例えば成人に経口投与する場合は１日あたり通常約１０ｍｇ〜約１００００ｍｇ、好ましくは約１００ｍｇ〜約１０００ｍｇであってもよい。ＡＧの投与量は、医師が、例えば筋肉のサイズや量を見ながら適宜決定することができる。本発明の医薬組成物によるＶＣの投与量は、ＡＧの投与量と同様である。
【００４５】
本発明の飲食物によるＡＧの摂取量は、望まれる筋肉再生の程度、筋肉再生部位等によって異なるが、例えば成人が摂取する場合は１日あたり通常約１ｍｇ〜約１００００ｍｇ、好ましくは約１０ｍｇ〜約１０００ｍｇであってもよい。本発明の飲食物によるＶＣの摂取量は、ＡＧの摂取量と同様である。
【００４６】
さらに本発明は、下記のものを提供する。
（ｉ）ＥＧＴを添加することを含む、筋分化を促進するための培地の製造方法。
（ｊ）ＥＧＴを添加することを含む、筋分化を促進するための培地添加剤の製造方法。
（ｋ）ＥＧＴを添加することを含む、筋分化を促進するためのキットの製造方法。
（ｌ）ＥＧＴを含む培地で細胞を培養することを含む、細胞の筋分化を促進するための方法。
（ｍ）筋分化促進を要する対象にＥＧＴを含む医薬組成物を投与することを含む、該対象において筋分化を促進するための方法。
（ｎ）筋肉を再生するための、（ｎ）記載の方法。
（ｏ）ＥＧＴを含む飲食物を摂取することを含む、筋分化を促進するための方法。
（ｐ）筋肉を再生するための、（ｏ）記載の方法。
【００４７】
上記各方法において、ＥＧＴとＡＧおよび／またはＶＣを併用してもよい。
【００４８】
さらに本発明は、下記のものを提供する。
（ｑ）筋分化を促進するための培地の製造のためのＥＧＴの使用。
（ｒ）筋分化を促進するための培地添加剤の製造のためのＥＧＴの使用。
（ｓ）筋分化を促進するためのキットの製造のためのＥＧＴの使用。
（ｔ）培地中の細胞の筋分化を促進するための、ＥＧＴの使用。
（ｕ）対象における筋分化を促進するための医薬の製造のためのＥＧＴの使用。
（ｖ）該医薬が対象において筋肉を再生させるためのものである、上記使用。
（ｗ）対象における筋分化を促進するための飲食物の製造のためのエルゴオネインの使用。
（ｘ）該飲食物が対象において筋肉を再生させるためのものである、（ｗ）記載の使用。
（ｙ）対象において筋分化を促進するためのＥＧＴの使用。
（ｚ）対象において筋肉を再生させるための（ｙ）記載の使用。
【００４９】
上記各使用において、ＥＧＴとＡＧおよび／またはＶＣを併用してもよい。
【００５０】
さらに本発明は、下記のものを提供する。
（ａａ）ＡＧおよび／またはＶＣを添加することを含む、筋分化を促進するための培地の製造方法。
（ｂｂ）ＡＧおよび／またはＶＣを添加することを含む、筋分化を促進するための培地添加剤の製造方法。
（ｃｃ）ＡＧおよび／またはＶＣを添加することを含む、筋分化を促進するためのキットの製造方法。
（ｄｄ）ＡＧおよび／またはＶＣを含む培地で細胞を培養することを含む、細胞の筋分化を促進するための方法。
（ｅｅ）筋分化促進を要する対象にＡＧおよび／またはＶＣを含む医薬組成物を投与することを含む、該対象において筋分化を促進するための方法。
（ｆｆ）筋肉を再生するための、（ｅｅ）記載の方法。
（ｇｇ）ＡＧおよび／またはＶＣを含む飲食物を摂取することを含む、筋分化を促進するための方法。
（ｈｈ）筋肉を再生するための、（ｇｇ）記載の方法。
【００５１】
さらに本発明は、下記のものを提供する。
（ｉｉ）筋分化を促進するための培地の製造のためのＡＧおよび／またはＶＣの使用。
（ｊｊ）筋分化を促進するための培地添加剤の製造のためのＡＧおよび／またはＶＣの使用。
（ｋｋ）筋分化を促進するためのキットの製造のためのＡＧおよび／またはＶＣの使用。
（ｌｌ）培地中の細胞の筋分化を促進するための、ＡＧおよび／またはＶＣの使用。
（ｍｍ）対象における筋分化を促進するための医薬の製造のためのＡＧおよび／またはＶＣの使用。
（ｎｎ）該医薬が対象において筋肉を再生させるためのものである、上記使用。
（ｏｏ）対象における筋分化を促進するための飲食物の製造のためのＡＧおよび／またはＶＣの使用。
（ｐｐ）該飲食物が対象において筋肉を再生させるためのものである、（ｏｏ）記載の使用。
（ｑｑ）対象において筋分化を促進するためのＡＧおよび／またはＶＣの使用。
（ｒｒ）対象において筋肉を再生させるための（ｑｑ）記載の使用。
【００５２】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明する。実施例は説明のためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００５３】
Ｃ２Ｃ１２細胞を１０％牛胎児血清含有ダルベッコ改変イーグル培地（以下、増殖培地と呼ぶ）に懸濁し、６５Ｘ１０４個／ｍｌの細胞密度に調製した。その細胞懸濁液を１．５ｍｌずつ６ウェルプレートに添加し、５％ＣＯ２インキュベーターで２４時間培養を行った。増殖培地を除去した後、０．５ｍＭのＥＧＴを含んだ２％馬血清含有ダルベッコ改変イーグル培地（以下、分化培地と呼ぶ）を２ｍｌずつ添加した。分化培地は一日おきに新しいものに交換し培養を継続した。対照群は、ＥＧＴを含まないこと以外は、全く同じ操作を行った。分化培地に交換した後、６日目に顕微鏡（ニコン：エクリプスＴｓ２）で細胞の形態を観察し撮影を行った。結果を図１に示す。ＥＧＴを添加することにより、Ｃ２Ｃ１２細胞から筋細胞への分化が促進され、より多くの筋管細胞が形成された。
【実施例２】
【００５４】
Ｃ２Ｃ１２細胞を増殖培地に懸濁し、６５Ｘ１０４個／ｍｌの細胞密度に調製した。その細胞懸濁液を１．５ｍｌずつ６ウェルプレートに添加し、５％ＣＯ２インキュベーターで２４時間培養を行った。増殖培地を除去した後、ＥＧＴを０．１ｍＭもしくは０．５ｍＭ含んだ分化培地を２ｍｌずつ添加した。対照群（以下、ＮＴと略す）は、ＥＧＴを含まないこと以外は、全く同じ操作を行った。２日後、培地を除去し、ＴＲＩｚｏｌ（インビトロジェン）を１ｍｌずつ添加し細胞を溶解させた。細胞溶解液をエッペンドルフチューブに回収し、ＴＲＩｚｏｌのプロトコールに従ってＲＮＡを回収した。回収したＲＮＡを逆転写キット（タカラバイオ）によりｍＲＮＡの相補鎖ＤＮＡを得た。ＴＢ  ＧｒｅｅｎＴＭ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  ＴａｑＴＭ  ＩＩ（タカラバイオ）を用い、そのプロトコールに従い、得られた相補鎖ＤＮＡに以下のプライマーＤＮＡ（ＭｙｏＤ［ＮＭ＿０１０８６６］：フォワード５‘ＡＧＴＧＡＡＴＧＡＧＧＣＣＴＴＣＧＡＧＡ３’（配列番号：１）、リバース５‘ＧＣＡＴＣＴＧＡＧＴＣＧＣＣＡＣＴＧＴＡ３’（配列番号：２）、Ｐ
ＰＩＡ［ＮＭ＿００８９０７］：フォワード５‘ＧＴＣＴＣＣＴＴＣＧＡＧＣＴＧＴＴＴＧＣ３’（配列番号：３）、リバース５‘ＧＡＴＧＣＣＡＧＧＡＣＣＴＧＴＡＴＧＣＴ３’（配列番号：４））を添加し、ＣＦＸ９６  ＴｏｕｃｈＴＭ  リアルタイムＰＣＲ  解析システム（バイオラッド）にかけることによって、ＭｙｏＤおよびＰＰＩＡの遺伝子発現量を測定した。ＭｙｏＤは筋肉分化を誘導するマスターレギュレーターとして知られている。ＰＰＩＡはハウスキーピング遺伝子として知られており、ＰＰＩＡ遺伝子発現量を内部標準として用いた。ＭｙｏＤ  ｍＲＮＡの発現量をＰＰＩＡ  ｍＲＮＡの発現量で割ることによって補正しＭｙｏＤ  ｍＲＮＡ発現レベルを算出した。図２には、ＮＴのＭｙｏＤ  ｍＲＮＡ発現レベルを１としてＥＧＴ添加時の遺伝子発現レベル（相対値）を示した。ＭｙｏＤ  ｍＲＮＡ発現レベルはＥＧＴの濃度に依存して増加した。
【実施例３】
【００５５】
Ｃ２Ｃ１２細胞を増殖培地に懸濁し、６５Ｘ１０４個／ｍｌの細胞密度に調製した。その細胞懸濁液を１．５ｍｌずつ６ウェルプレートに添加し、５％ＣＯ２インキュベーターで２４時間培養を行った。増殖培地を除去した後、ＥＧＴを０．５ｍＭ含んだ分化培地を２ｍｌ添加した。対照群（ＮＴ）は、ＥＧＴを含まないこと以外は、全く同じ操作を行った。２日後に培地を除去し、ＴＲＩｚｏｌ（インビトロジェン）を１ｍｌずつ添加しＴＲＩｚｏｌのプロトコールに従ってＲＮＡを回収した。回収したＲＮＡを逆転写キット（タカラバイオ）により相補鎖ＤＮＡに変換した。ＴＢ  ＧｒｅｅｎＴＭ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  ＴａｑＴＭ  ＩＩ（タカラバイオ）を用い、そのプロトコールに従い、得られた相補鎖ＤＮＡに以下のプライマーＤＮＡ（ＭｙＨ２［ＮＭ＿００１０３９５４５］：フォワード５‘ＧＡＧＣＡＡＡＧＡＴＧＣＡＧＧＧＡＡＡＧ３’（配列番号：５）、リバース５‘ＴＡＡＧＧＧＴＴＧＡＣＧＧＴＧＡＣＡＣＡ３’（配列番号：６）、ＡＣＴＡ１［ＮＭ＿００１２７２０４１］：フォワード５‘ＣＧＡＣＡＴＣＡＧＧＡＡＧＧＡＣＣＴＧＴ３’（配列番号：７）、ＰＰＩＡ［ＮＭ＿００８９０７］：フォワード５‘ＧＴＣＴＣＣＴＴＣＧＡＧＣＴＧＴＴＴＧＣ３’（配列番号：３）、リバース５‘ＧＡＴＧＣＣＡＧＧＡＣＣＴＧＴＡＴＧＣＴ３’（配列番号：４））を添加し、ＣＦＸ９６  ＴｏｕｃｈＴＭ  リアルタイムＰＣＲ  解析システム（バイオラッド）にかけることによって、ＭｙＨ２、ＡＣＴＡ１およびＰＰＩＡの遺伝子発現量を測定した。ミオシン重鎖２（ＭｙＨ２）およびαアクチン（ＡＣＴＡ１）のｍＲＮＡの発現量をＰＰＩＡ  ｍＲＮＡの発現量で割ることによって補正しＭｙＨ２およびＡＣＴＡ１  ｍＲＮＡ発現レベルを算出した。図３には、ＮＴのｍＲＮＡ発現レベルを１としてＥＧＴ添加時の遺伝子発現レベル（相対値）を示した。ＥＧＴの添加により、ＭｙＨ２  ｍＲＮＡおよびＡＣＴＡ１  ｍＲＮＡの発現レベルが上昇した。【００５６】
（比較例）
Ｃ２Ｃ１２細胞を増殖培地に懸濁し、６５Ｘ１０４個／ｍｌの細胞密度に調製した。その細胞懸濁液を１．５ｍｌずつ６ウェルプレートに添加し、５％ＣＯ２インキュベーターで２４時間培養を行った。増殖培地を除去した後、ＥＧＴ０．５ｍＭもしくはエダラボン（以下、Ｅｄｖと略す）２５μＭ、Ｅｄｖ５０μＭを含んだ分化培地を２ｍｌずつ添加した。Ｅｄｖは強力な合成抗酸化剤である。培地は１日おきに新しいものに交換し培養を続けた。対照群（ＮＴ）は、ＥＧＴを含まないこと以外は、全く同じ操作を行った。４日後に、培地を除去し、ＴＲＩｚｏｌ（インビトロジェン）を１ｍｌずつ添加しＴＲＩｚｏｌのプロトコールに従ってＲＮＡを回収した。回収したＲＮＡを逆転写キット（タカラバイオ）によりｍＲＮＡの相補鎖ＤＮＡを得た。ＴＢ  ＧｒｅｅｎＴＭ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  ＴａｑＴＭ  ＩＩキット（タカラバイオ）を用い、そのプロトコールに従い、得られた相補鎖ＤＮＡに以下のプライマーＤＮＡ（ＭｙＨ２［ＮＭ＿００１０３９５４５］：フォワード５‘ＧＡＧＣＡＡＡＧＡＴＧＣＡＧＧＧＡＡＡＧ３’（配列番号：５）、リバース５‘ＴＡＡＧＧＧＴＴＧＡＣＧＧＴＧＡＣＡＣＡ３’（配列番号：６）、ＰＰＩＡ［ＮＭ＿００８９０７］：フォワード５‘ＧＴＣＴＣＣＴＴＣＧＡＧＣＴＧＴＴＴＧＣ３’（配列番号：３）、リバース５‘ＧＡＴＧＣＣＡＧＧＡＣＣＴＧＴＡＴＧＣＴ３’（配列番号：４））を添加し、ＣＦＸ９６  ＴｏｕｃｈＴＭ  リアルタイムＰＣＲ  解析システム（バイオラッド）にかけることによって、ＭｙＨ２およびＰＰＩＡの遺伝子発現量を測定した。ＭｙＨ２  ｍＲＮＡの発現量をＰＰＩＡ  ｍＲＮＡの発現量で割ることによって補正しＭｙＨ２  ｍＲＮＡ発現レベルを算出した。図４には、ＮＴのＭｙＨ２  ｍＲＮＡ発現レベルを１としてＥＧＴもしくはＥｄｖ添加時の遺伝子発現レベル（相対値）を示した。
抗酸化剤ＥｄｖはＣ２Ｃ１２のＭｙＨ２発現レベルに影響を与えなかった。この結果から、単なる抗酸化効果ではＭｙＨ２発現レベルが上昇しないことがわかった。
【実施例４】
【００５７】
ＥＧＴのみを添加した分化培地を用いた場合、ＥＧＴとＡＧを添加した分化培地を用いた場合、およびＡＧのみを添加した分化培地を用いた場合のＣ２Ｃ１２細胞のＭｙＨ２およびＡＣＴＡ１のｍＲＮＡの発現量を調べた。ＡＧとしては林原製のＡＡ２Ｇ（登録商標）を用いた。分化培地中のＥＧＴの濃度を０．５ｍＭ、ＡＧの濃度を１．０ｍＭとした。実験手順は実施例３と同様であった。対照群（ＮＴ）は、ＥＧＴおよびＡＧを含まないこと以外は、全く同じ操作を行った。結果を図５に示す。ＥＧＴとＡＧを培地に添加することによって、ＭｙＨ２  ｍＲＮＡおよびＡＣＴＡ１  ｍＲＮＡの発現が大幅に増加することが確認された。これらの結果は、ＥＧＴとＡＧを併用することによって、筋分化が大幅に促進されることを示すものである。また、ＡＧのみを培地に添加した場合にも、ＭｙＨ２  ｍＲＮＡおよびＡＣＴＡ１  ｍＲＮＡの発現が増加することが確認された。この結果は、ＡＧを単独で用いても、筋分化が促進されることを示すものである。
【実施例５】
【００５８】
ＥＧＴのみを添加した分化培地を用いた場合、ＥＧＴとＶＣを添加した分化培地を用いた場合、およびＶＣのみを添加した分化培地を用いた場合のＣ２Ｃ１２細胞のＭｙＨ２およびＡＣＴＡ１のｍＲＮＡの発現量を調べた。分化培地中のＥＧＴの濃度を０．５ｍＭ、ＶＣの濃度を０．５ｍＭとした。実験手順は実施例３と同様であった。対照群（ＮＴ）は、ＥＧＴおよびＶＣを含まないこと以外は、全く同じ操作を行った。結果を図６に示す。ＥＧＴとＶＣを培地に添加することによって、ＭｙＨ２  ｍＲＮＡおよびＡＣＴＡ１  ｍＲＮＡの発現が大幅に増加することが確認された。これらの結果は、ＥＧＴとＶＣを併用することによって、筋分化が大幅に促進されることを示すものである。また、ＶＣのみを培地に添加した場合にも、ＭｙＨ２  ｍＲＮＡおよびＡＣＴＡ１  ｍＲＮＡの発現が増加することが確認された。この結果は、ＶＣを単独で用いても、筋分化が促進されることを示すものである。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明は、医薬品、食品等の分野および研究試薬等の分野において利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【００６０】
配列番号：１はＭｙｏＤ遺伝子を増幅するためのフォワードプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：２はＭｙｏＤ遺伝子を増幅するためのリバースプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：３はＰＰＩＡ遺伝子を増幅するためのフォワードプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：４はＰＰＩＡ遺伝子を増幅するためのリバースプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：５はＭｙＨ２遺伝子を増幅するためのフォワードプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：６はＭｙＨ２遺伝子を増幅するためのリバースプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：７はＡＣＴＡ１遺伝子を増幅するためのフォワードプライマーの塩基配列を示す。
【図１】
2020004014.tif 000002
【図２】
2020004014.tif 000003
【図３】
2020004014.tif 000004
【図４】
2020004014.tif 000005
【図５】
2020004014.tif 000006
【図６】
2020004014.tif 000007
【配列表】
2020004014000001.app
【国際調査報告】
2020004014.tif 000008
2020004014.tif 000009
2020004014.tif 000010
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