(57)【要約】  本発明は、ドレブリンの細胞内イメージングに応用可能な、ドレブリンと特異的に結合するペプチド及びマーカータンパク質の提供、さらにそのマーカータンパク質を用いたドレブリンの検出方法を提供することを課題とする。ドレブリンに特異的に結合するアミノ酸配列を有するペプチド及びそのペプチドを含む各種マーカータンパク質、さらに、そのマーカータンパク質を利用したドレブリンの検出方法を提供することにより、本発明に係るペプチドをドレブリンの細胞内イメージングに応用可能にする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）若しくは（２）に記載のアミノ酸配列を含むことを特徴とするドレブリン結合ペプチド又はその機能性断片。
（１）配列番号１６〜２４のいずれかで示されるアミノ酸配列；
（２）配列番号１６〜２４のいずれかで示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が挿入、欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列；
【請求項２】
マーカータンパク質及び／若しくはペプチドタグを融合したことを特徴とする請求項１に記載のペプチド又はその機能性断片。
【請求項３】
マーカータンパク質が蛍光タンパク質であり、ペプチドタグがＦｌａｇであることを特徴とする請求項２に記載のペプチド又はその機能性断片。
【請求項４】
検出可能な標識を付加したことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のペプチド又はその機能性断片。
【請求項５】
標識が、酵素、蛍光物質、ジゴキシゲニン、若しくはビオチンであることを特徴とする請求項４に記載のペプチド又はその機能性断片。
【請求項６】
細胞内移行ペプチドを付加したことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のペプチド又はその機能性断片。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載のペプチド又はその機能性断片に、ＩｇＧ−Ｆｃ領域を融合させたことを特徴とする抗体。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかに記載のペプチド又はその機能性断片、或いは請求項７に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項９】
配列番号８〜１１のいずれかで示される塩基配列を含むか、又は配列番号８〜１１のいずれかで示される塩基配列の相補配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とする請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１１】
請求項８又は９に記載のポリヌクレオチド、或いは請求項１０に記載のベクターが導入されたことを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載のペプチド又はその機能性断片、或いは請求項７に記載の抗体を発現する細胞。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれかに記載のペプチド又はその機能性断片、或いは請求項７に記載の抗体を用いた、被検試料中のドレブリンの検出方法であって、前記ペプチド又は抗体を前記被検試料に添加又は導入する工程を含む方法。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれかに記載のペプチド又はその機能性断片、或いは請求項７に記載の抗体を、発色又は発光により検出する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
検出する工程が、発光に基づく画像解析法であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ドレブリンに特異的に結合するペプチド、及びそのペプチドを用いたドレブリンの検出方法に関する。本願は、２０１８年５月８日に出願された日本国特許出願第２０１８−０８９９２９号に対し優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
ドレブリンは、脳に多く存在するシナプスタンパク質であり、神経細胞の発達にとって重要な役割を担っているタンパク質である。ドレブリンには成熟型アイソフォームのＡタイプ（ドレブリンＡ）と幼弱型アイソフォームのＥタイプ（ドレブリンＥ）が存在する。神経細胞の発達に伴い、ドレブリンＥの発現が減少し、ドレブリンＡが発現する。このドレブリンＡの発現が正常に行われることにより、神経細胞において樹状突起スパインの形成が促進され、神経回路が正常に形成される。【０００３】
発明者らは、アルツハイマー病等の痴呆性疾患において、樹状突起スパインのドレブリンが広範囲に消失していることを報告している（非特許文献１）。また、ドレブリンの定量的な解析から、ドレブリンの集積量と認知能力との相関が認められている（非特許文献２）。つまり、ドレブリンは神経科学分野において、非常に有用な生体内物質であることがわかっている。【０００４】
さらに、近年では、ドレブリンは神経科学分野のみならず、癌や感染症分野にまで広く関与していることがわかっており（非特許文献３、４）、それらの分野の疾患においても、疾患の初期発生過程から疾患の進行状態を把握するためのバイオマーカーとしての役割への期待が高まっている。【０００５】
これまでに、抗ドレブリン抗体を用いて、ドレブリンを特異的に検出し定量することについては既に行われており、そのようなドレブリンを特異的に検出し定量する方法としては、組織切片染色法やウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)法等が用いられている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１６−４４１２８
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】J Neurosci Res., 43, 1, 87-92(1996)
【非特許文献２】J Neuropathol Exp Neurol., 27, 4, 796-807(2006)
【非特許文献３】Oncotarget, 6, 13, 10825-10839(2015)
【非特許文献４】PNAS, 114, 18, E3642-E3651(2017)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、これまでドレブリンに特異的に結合できるペプチドのアミノ酸配列はわかっておらず、既存の市販されている抗ドレブリン抗体はＩｇＧ抗体であり、約１６０ｋＤａの分子量を有する。そのため、分子量の大きさに起因して、抗体の細胞内移行性が悪く、ドレブリンの細胞内イメージングが困難であるという問題点があり、既存の抗ドレブリン抗体のみを用いた場合において、ドレブリンの動態を探るのには限界があった。【０００９】
また、既存の抗ドレブリン抗体は、組織切片染色法やウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法といった検出方法に利用できるが、これらの検出方法では生体から採取した試料中のドレブリンを検出及び定量することに留まっており、細胞内におけるドレブリンの動態を探ることはできなかった。【００１０】
ここで、細胞内で発現させることができるドレブリン結合ペプチドを用いることができれば、そのペプチドを用いた細胞内イメージングによりドレブリンの細胞内動態を探ることが可能となる。その結果、シナプスの作動メカニズムを解明することができ、神経細胞の成熟におけるドレブリンの役割を詳細に知ることができる。そしてそれは、神経科学分野における神経難病の病態解明のみならず、癌及び感染症の分野においてもそれらの病態解明に寄与することが可能である。【００１１】
かかる状況に鑑みて、本発明は、ドレブリンと特異的に結合できるアミノ酸配列を有するペプチドであって、ドレブリンの細胞内イメージングにも応用可能であるペプチドを提供すること、及び当該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供すること、さらにそのペプチドを用いたドレブリンの検出方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するためにＶＨＨ抗体作成法を用いて、鋭意研究を行った結果、細胞内イメージングに応用可能である、ドレブリンに特異的に結合するアミノ酸配列を有するペプチドを同定することに成功した。さらに、そのペプチドを利用することで、ドレブリンを効率よく検出できることを見いだし、発明を完成させた。【００１３】
すなわち、本発明は以下の事項により特定されるとおりのものである。
〔１〕以下の（１）若しくは（２）に記載のアミノ酸配列を含むことを特徴とするドレブリン結合ペプチド又はその機能性断片。
（１）配列番号１６〜２４のいずれかで示されるアミノ酸配列；
（２）配列番号１６〜２４のいずれかで示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が挿入、欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列；
〔２〕マーカータンパク質及び／若しくはペプチドタグを融合したことを特徴とする上記〔１〕に記載のペプチド又はその機能性断片。
〔３〕マーカータンパク質が蛍光タンパク質であり、ペプチドタグがＦｌａｇであることを特徴とする上記〔２〕に記載のペプチド又はその機能性断片。
〔４〕検出可能な標識を付加したことを特徴とする上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のペプチド又はその機能性断片。
〔５〕標識が、酵素、蛍光物質、ジゴキシゲニン、若しくはビオチンであることを特徴とする上記〔４〕に記載のペプチド又はその機能性断片。
〔６〕細胞内移行ペプチドを付加したことを特徴とする上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のペプチド又はその機能性断片。
〔７〕上記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のペプチド又はその機能性断片に、ＩｇＧ−Ｆｃ領域を融合させたことを特徴とする抗体。
〔８〕上記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のペプチド又はその機能性断片、或いは上記〔７〕に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
〔９〕配列番号８〜１１のいずれかで示される塩基配列を含むか、又は配列番号８〜１１のいずれかで示される塩基配列の相補配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とする上記〔７〕に記載のポリヌクレオチド。
〔１０〕上記〔８〕又は〔９〕に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
〔１１〕上記〔８〕又は〔９〕に記載のポリヌクレオチド、或いは上記〔１０〕に記載のベクターが導入されたことを特徴とする、上記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のペプチド又はその機能性断片、或いは上記〔７〕に記載の抗体を発現する細胞。
〔１２〕上記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のペプチド又はその機能性断片、或いは上記〔７〕に記載の抗体を用いた、被検試料中のドレブリンの検出方法であって、前記ペプチド又は抗体を前記被検試料に添加又は導入する工程を含む方法。
〔１３〕上記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のペプチド又はその機能性断片、或いは上記〔７〕に記載の抗体を、発色又は発光により検出する工程をさらに含むことを特徴とする上記〔１２〕に記載の方法。
〔１４〕検出する工程が、発光に基づく画像解析法であることを特徴とする上記〔１３〕に記載の方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、ドレブリンに特異的に結合できるペプチド、当該ペプチドと蛍光タンパク質等のマーカータンパク質やペプチドタグを含む融合ペプチド、及びそれらのペプチドや融合タンパク質を利用したドレブリンの検出方法が提供される。
本発明に係るペプチドはシングルドメイン構造であるため、マーカータンパク質、ペプチドタグ、及び抗体のＦｃ領域等の他の分子を結合させることが容易に行える。
本発明に係るペプチドは低分子量であり、細胞内で効率よく発現させることができるので、ドレブリンの細胞内イメージングにも応用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の一実施態様である、実施例２におけるウェスタンブロット法の結果を表す画像である（写真）。
【図２】本発明の一実施態様である、実施例３におけるウェスタンブロット法の結果を表す画像である（写真）。
【図３】ドレブリン結合ペプチド（＃４Ｆｃ）（左）又は抗ドレブリンモノクローナル抗体（Ｍ２Ｆ６）（右）を用いた海馬神経細胞の免疫蛍光染色結果を表す画像である（写真）。
【図４】ＧＦＰ−融合ドレブリン結合ペプチドを神経細胞に強制発現させたときの当該ペプチドの分布を内在ドレブリンと比較した蛍光染色結果を表す画像である（写真）。ＡがＧＦＰ−融合ドレブリン結合ペプチドによる蛍光を示し、Ｂが内在ドレブリンを抗ドレブリンモノクローナル抗体（Ｍ２Ｆ６）で染色したときの蛍光を示し、ＣがＡとＢの重ねあわせ画像を示す。
【図５】実施例６（Ｂ）の、ＥＬＩＳＡによる結合活性測定の結果を示す図である。
【図６】実施例６（Ｃ）の、ＥＬＩＳＡによる結合活性測定の結果を示す図である。
【図７】（Ａ）実施例７の、ＧＦＰ・Ｆｃ−融合ドレブリン結合ペプチドによるドレブリンの細胞内イメージングの結果を示す図である。（Ｂ）実施例７の、ＧＦＰ−融合ドレブリン結合ペプチドによるドレブリンの細胞内イメージングの結果を示す図である。左は、Ｆｃ領域が融合したドレブリン結合ペプチド、右は、Ｆｃ領域を融合していないドレブリン結合ペプチドによる結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の第一の態様は、ドレブリンに特異的に結合できるペプチド（以下、「ドレブリン結合ペプチド」ともいう）であって、以下の（１）若しくは（２）から選択されるペプチド又はその機能性断片である。
（１）配列番号１６〜２４のいずれかで示されるアミノ酸配列を含むペプチド；
（２）配列番号１６〜２４のいずれかで示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が挿入、欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むペプチド；
ここで、機能性断片とは、ドレブリン結合能を失わない範囲で、ペプチドのＮ末端側及び／又はＣ末端側のアミノ酸残基を除去して得られたペプチドをいう。
【００１７】
ここで、１若しくは数個とは、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個である。１若しくは数個のアミノ酸が挿入、欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むペプチドとは、そのペプチドがドレブリンに特異的に結合できる機能を有する限り、特に限定されない。
【００１８】
ここで、これらの挿入、欠失、置換、及び／又は付加等のアミノ酸変異は天然に生じる変異でもよいし、人工的に導入される変異でもよい。
例えば、アミノ酸変異は部位特異的変異導入法や、Error prone PCR法等のランダム変異導入法により導入することができる。また、変異導入された配列を有するペプチドがドレブリン結合能を有していることは、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットやアフィニティクロマトグラフィー等の方法で確認できる。変異が導入される部位は抗体におけるフレームワーク領域（ＦＲ）に相当する領域でもよいし、相補性決定領域（以下、ＣＤＲという）に相当する領域でもよい。ＣＤＲに相当する領域における変異が結合性を増加させる場合もある。
【００１９】
また、前記アミノ酸配列は、ペプチドがドレブリンと特異的に結合できる限り、前記配列番号１６〜２４のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の同一性を有するものであってよい。
【００２０】
本発明の第二の態様は、前記第一の態様のペプチドに、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグを融合させたペプチドである。これらは前記第一の態様のペプチドのＮ末端側に融合させてもよいし、Ｃ末端側に融合させてもよい。
【００２１】
前記マーカータンパク質としては、特に限定されないが、例えば、アルカリフォスファターゼ（以下、ＡＰという）、西洋わさび過酸化酵素（以下、ＨＲＰという）等の酵素、抗体のＦｃ領域、緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)等の蛍光タンパク質を挙げることができる。また、前記ペプチドタグとしては、特に限定されないが、例えば、ＨＡ（ヘマグルチニン）、Ｆｌａｇ、Ｍｙｃ等のエピトープタグ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アビジン、Ｖ５（GKPIPNPLLGLDST：配列番号５）のペプチドタグが挙げられる。
【００２２】
上記マーカータンパク質及び／又はペプチドタグの融合は、制限酵素やＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）等を利用した通常の遺伝子組み換え技術により行うことができる。なお、上記マーカータンパク質及び／又はペプチドタグは前記第一の態様のペプチドに直接融合させてもよいが、融合タンパク質においてドレブリン結合能が維持される限り、他のアミノ酸配列（例えば、１〜１０アミノ酸又は１〜５アミノ酸）を介して融合させてもよい。
【００２３】
本発明の第三の態様に係るペプチドは、前記マーカータンパク質が蛍光タンパク質であり、前記ペプチドタグがＦｌａｇである、前記ペプチドである。
【００２４】
本発明の第四の態様に係るペプチドは、前記第一の態様乃至第三の態様のペプチドに検出可能な標識を付加したペプチドである。
【００２５】
上記標識としては、特に限定されないが、例えば、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼ又はβガラクトシダーゼ等）、蛍光物質（フルオレセイン、ルシフェラーゼ等）、ジゴキシゲニン、ビオチンが挙げられる。
【００２６】
すなわち、本発明の第五の態様に係るペプチドは、前記標識が、酵素、蛍光物質、ジゴキシゲニン又はビオチンである、前記ペプチドである。
【００２７】
本発明の第六の態様は、前記第一の態様乃至第五の態様のペプチドにＩｇＧ−Ｆｃ領域を融合させた抗体である。具体的には、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインをこの順で含む哺乳類（好ましくはヒト）ＩｇＧ−Ｆｃ領域のヒンジドメインに、前記第一の態様又は第二の態様のペプチドをそのＣ末端を介して融合させた抗体のことである。
また、前記抗体は二量体化させることも可能である。
本発明の第六の態様に係るＩｇＧ−Ｆｃ領域を融合させた抗体及びその二量体化抗体は、後述の実施例のようにして作製することができる。
【００２８】
本発明の第七の態様は、前記第一の態様乃至第五の態様のペプチド又は前記第六の態様の抗体をコードするポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドとしては、ＤＮＡやＲＮＡが例示されるが、好ましくはＤＮＡである。
【００２９】
本発明の第七の態様に係るポリヌクレオチドとしては、配列番号１６〜２４の何れかのアミノ酸配列、又は、配列番号１６〜２４のいずれかで示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が挿入、欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列、をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドが好ましく、例えば、配列番号８〜１１のいずれかで示される塩基配列を含むポリヌクレオチド、又は、配列番号８〜１１のいずれかで示される塩基配列の相補配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドが挙げられる。
ここで、ストリンジェントな条件としては、例えば、サザンブロット法におけるハイブリダイゼーション後の洗浄に使用される条件が挙げられ、具体的には、０．１×ＳＳＣの塩濃度及び摂氏６０度の温度で洗浄を行う条件が挙げられる。
【００３０】
本発明の第八の態様は、前記第七の態様に係るポリヌクレオチドを含むベクターである。ベクターとしては、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター等が例示され、前記ポリヌクレオチドを導入する宿主の種類によって適宜選択される。ベクターはヒト細胞等の哺乳動物で発現させるためのベクターであってもよいし、大腸菌等の原核細胞や酵母等の真核細胞で発現させるためのベクターであってもよい。
ベクターは、必要に応じて、宿主細胞における発現のためのプロモーター配列、エンハンサー配列、ターミネーター配列等を含んでもよい。
【００３１】
本発明の第九の態様は、前記第七の態様に係るポリヌクレオチド又は前記第八の態様に係るベクターが導入された細胞である。細胞は、真核細胞でもよいし、原核細胞でもよいが、内在性のドレブリンを発現する細胞が好ましく、内在性のドレブリンを発現する、神経細胞等の哺乳動物細胞が好ましい。
【００３２】
ここで、前記第七の態様に係るポリヌクレオチド又は前記第八の態様に係るベクターの細胞内への導入は、公知のマイクロインジェクション法、又はリポフェクション法やエレクトロポレーション法等の形質転換法によって行うことができる。
【００３３】
本発明の第十の態様は、前記第一乃至第五の態様に係るペプチド、又は第六の態様に係る抗体を用いた、被検試料中のドレブリンの検出方法である。この検出方法は、前記ペプチド又は抗体を前記被検試料に添加又は導入する工程を含む。
【００３４】
検出対象のドレブリンは哺乳動物由来のドレブリンが挙げられ、ヒト由来のドレブリンであることが好ましい。
【００３５】
被検試料はドレブリンを含む限り特に限定されないが、哺乳動物由来の被検対象が挙げられ、ヒト由来であることが好ましい。例えば、脳組織の生検試料、神経細胞、脳脊髄液、血液、血漿、血清、組織液、リンパ液、体腔液、尿、又はそれらのタンパク質抽出液が挙げられる。
【００３６】
前記ペプチド又は抗体を前記被検試料に添加する態様について、例を挙げて説明する。
例えば、免疫組織染色法により検出を行う態様として、前記ペプチド又は抗体を含む溶液を適当な倍率に希釈し、被検試料である組織切片や固定化培養細胞に添加する態様が挙げられる。
また、ウェスタンブロット法により検出を行う態様として、前記被検試料であるタンパク質抽出液を用いてゲル電気泳動等でタンパク質を分離し、分離されたタンパク質に対して前記ペプチド又は抗体を含む溶液を適当な倍率に希釈して添加する態様が挙げられる。
【００３７】
前記ペプチド又は抗体を前記被検試料である細胞に導入する態様について、例を挙げて説明する。
前記ペプチド又は抗体を細胞内に導入するには、マイクロインジェクション等で直接細胞内に注入してもよいが、前記ペプチド又は抗体をコードするポリヌクレオチドを、ベクター等を用いて細胞内に導入し、前記ペプチド又は抗体を細胞内で発現させることによって導入してもよい。発現は一過的な発現でも恒常的な発現でもよい。
【００３８】
また、一態様において、前記ペプチド又は抗体は、低分子量の一本鎖ペプチドであるため、細胞内移行ペプチドを用いて細胞内に導入してもよい。細胞内移行ペプチドとしては、ＨＩＶ−１  Ｔａｔ蛋白質のアミノ酸配列４８−６０位に対応するペプチド配列（Ｔａｔペプチド）やオリゴアルギニン、ショウジョウバエのアンテナペディア蛋白質由来ペプチド（penetratin）、神経ペプチドgalaninとハチ毒mastoparanのキメラペプチドであるtransportan、分泌シグナルペプチド由来ペプチドＭＴＳ（Mitochondrial targeting signal）等が挙げられる。細胞内移行ペプチドは、ドレブリン結合ペプチドのＮ末端又はＣ末端にペプチド結合により結合してもよく、非共有結合により複合体を形成させてもよい。
【００３９】
本発明の第十一の態様は、本発明の第十の態様に係る被検試料中のドレブリンの検出方法において、さらに被検試料中のドレブリンに結合したペプチド又は抗体を発色又は発光により検出する工程を含む、方法である。
【００４０】
この態様において、ドレブリンの検出は、例えば、以下のようにして行うことができる。
前記ペプチドが蛍光タンパク質と融合されている場合は、前記ペプチドが被検試料中のドレブリンと結合することで、被検試料中のドレブリンの量に依存した蛍光が発せられるので、当該蛍光強度に基づいて被検試料中のドレブリンを検出し、定量することができる。特に、前記ペプチドを細胞内に導入する態様においては、蛍光タンパク質と融合されている前記ペプチドを用いることで細胞内のドレブリンの挙動を検出することができる。
【００４１】
また、前記ペプチドがＦｌａｇ等のペプチドタグと融合されている場合は、前記ペプチドを被検試料中のドレブリンと結合させた後、当該ペプチドタグに対する抗体であって、発色物質や発光物質又はそれらの物質を生じさせる酵素等で標識された抗体を反応させることで、被検試料中のドレブリンを検出し、定量することができる。
【００４２】
また、前記ペプチドがＩｇＧ−Ｆｃ領域を融合させた抗体である場合は、前記抗体を被検試料中のドレブリンと結合させた後、当該Ｆｃ領域に対する抗体であって、発色物質や発光物質又はそれらの物質を生じさせる酵素等で標識された抗体を反応させることで、被検試料中のドレブリンを検出し、定量することができる。
【００４３】
なお、前記ペプチド自体が発色物質や発光物質又はそれらの物質を生じさせる酵素等で標識されていてもよい。
定量の際は、例えば、予め既知の濃度の試料で検量線（標準曲線）を作成しておき、測定値を検量線に照合して試料中のドレブリン濃度を算出することができる。
【００４４】
本発明の第十二の態様は、本発明の第十一の態様に係る被検試料中のドレブリンの検出方法において、前記検出方法が蛍光に基づく画像解析法である、方法である。
この態様においては、前記ペプチド又は抗体が蛍光タンパク質との融合タンパク質として細胞内に導入されるので、前記ペプチド又は抗体が細胞内の内在性ドレブリンと結合することで、蛍光タンパク質が発する蛍光を画像解析することにより内在性ドレブリンの挙動をリアルタイムでモニターすることができる。内在性ドレブリンの挙動としては、ドレブリンの細胞内局在性、細胞内での量の変動等が挙げられる。内在性ドレブリンの挙動をリアルタイムでモニターすることにより、シナプスの作動メカニズムを解明することができ、神経細胞の成熟におけるドレブリンの役割を詳細に知ることができる。
【００４５】
蛍光に基づく画像解析法は特に制限されないが、蛍光顕微鏡等を用いた画像解析が挙げられる。健常人由来の神経細胞と神経疾患患者由来の神経細胞において、内在性ドレブリンの挙動を蛍光に基づく画像解析により比較することで、神経疾患におけるドレブリンの関与を調べることができる。また、細胞に薬剤を加えて、内在性ドレブリンの挙動を蛍光に基いて画像解析することで、神経疾患に対する薬剤の評価等を行うこともできる。
【００４６】
以下実施例により、本発明をより詳細に説明するが、本発明の範囲が実施例のみに限定されないことは言うまでもない。
【実施例１】
【００４７】
１．ドレブリン結合ペプチドの単離
（Ａ）ＶＨＨ抗体提示ファージライブラリーの調製
実施例２及び３に用いたドレブリン結合ペプチドを以下の手順で作成した。
市販されているプラスミドｐＵＣ１１９（例えば、タカラバイオ株式会社より入手可能）由来のＶｅｃｔｏｒ１に、制限酵素ＳｆｉＩ切断サイトを挿入し、制限酵素ＳｆｉＩによりＶｅｃｔｏｒ１を処理し、ベクターの断片を得た。制限酵素ＳｆｉＩ切断サイトは、GGCCCAGCCGGCC（配列番号６）又はGGCCTCTGCGGCC（配列番号７）により表されるＤＮＡ配列からなる。【００４８】
同様に、ＰＣＲ法によって獲得したラクダのＶＨＨ抗体遺伝子ライブラリも制限酵素ＳｆｉＩにより処理し、ＶＨＨ抗体の遺伝子断片を得た。【００４９】
制限酵素処理したＶｅｃｔｏｒ１及びＶＨＨ抗体の遺伝子断片を、１：２の割合で混合し、ライゲーション試薬（東洋紡株式会社より入手、商品名：Ligation High ver.2、以下同じ）を注入した。この混合液を摂氏１６度の温度で２時間静置することで、ＶＨＨ抗体の遺伝子断片をＶｅｃｔｏｒ１にライゲーションした。【００５０】
このＶＨＨ抗体の遺伝子断片をライゲーションしたＶｅｃｔｏｒ１を用いて、大腸菌（タカラバイオ株式会社より入手、商品名：HST02）にトランスフェクションした。【００５１】
次いで、このトランスフェクションした大腸菌を、１００μｇ／ｍＬの濃度を有するアンピシリン含有２ＹＴ培地で１５時間培養した。このようにして、ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリに含まれる遺伝子断片由来のペプチドを提示するファージのライブラリを得た。【００５２】
（Ｂ）ドレブリン抗原の固定化
ドレブリン（群馬大学神経薬理学分野から入手）をリン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳという）と混合し、ドレブリン溶液を調製した。ドレブリンの濃度は１μｇ／ｍＬであった。３ｍＬのドレブリン溶液を、イムノチューブ（Nunc社より購入）に注入し、ドレブリン溶液をイムノチューブ内で摂氏４度の温度で一晩静置することで、イムノチューブ内部にドレブリンを固定した。【００５３】
次いで、イムノチューブ内部を、ＰＢＳを用いて３回洗浄した。【００５４】
３％スキムミルク（和光純薬株式会社より入手）含有ＰＢＳをイムノチューブに満たすことで、イムノチューブ内部のブロッキング処理を行った。【００５５】
イムノチューブを、室温にて１時間静置し、イムノチューブの内部を、ＰＢＳを用いて３回洗浄した。【００５６】
（Ｃ）パニング
ＶＨＨ抗体を提示するファージのライブラリ（濃度：およそ１０Ｅ＋１１/ｍＬ）を、３ｍＬの３％スキムミルク含有ＰＢＳと混合し、混合液を調製した。この混合液を、ドレブリン抗原を固定化したイムノチューブに注入した。【００５７】
イムノチューブにパラフィルムからなる蓋を取り付け、ローテーターを用いて１０分間転倒しながら回転した。【００５８】
イムノチューブを、室温にて３０分間静置した。【００５９】
イムノチューブ内部を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（以下、「ＰＢＳＴ」という）で１０回洗浄した。【００６０】
ドレブリン抗原に結合したＶＨＨ抗体を提示するファージを抽出するために、１ｍＬの１００ｍＭトリメチルアミン溶液をイムノチューブに注入した。【００６１】
イムノチューブにパラフィルムからなる蓋を取り付け、ローテーターを用いて、１０分間転倒しながら回転した。【００６２】
溶液を中和するため、溶液を１ｍＬの０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ：６．８）を注入したチューブに移した。再度、１ｍＬの１００ｍＭトリメチルアミン溶液を用いたファージの抽出を繰り返し、３ｍＬの抽出液を得た。【００６３】
３ｍＬの抽出液を、１２ｍＬの大腸菌ＴＧ−１と混合した。混合液を、摂氏３０度の温度で１時間静置した。【００６４】
コロニーを計数するため、大腸菌ＴＧ−１を含有する１５ｍＬの混合液１５μＬを、２ＹＴＡＧ培地（Bacto Tryptone 1.6%、Bacto Yeast Extract 1.0%、NaCl 0.5%、Glucose 2.0%、Ampicillin 0.01%）を含むアガープレート（１０ｍＬ/プレート）に播種した。摂氏３０度の温度で一晩静置し、コロニー数を計数することで抽出液に含まれていたファージのタイターを測定した。【００６５】
残りの混合液を遠心分離した。上澄み液を捨て、沈殿物を小プレート３枚（５ｍＬ／プレート）の２ＹＴＡＧ培地に播種した。これらの３枚のプレートを、摂氏３０度の温度で一晩静置した。このようにして、１回目のパニングを行った。【００６６】
１回目のパニングの手順と全く同様に、２回目、３回目とパニングを繰り返し行った。このようにして、ＶＨＨ抗体を提示するモノクローナルファージを精製した。【００６７】
３回目のパニングの後、大腸菌のコロニーを爪楊枝でピックアップした。ピックアップした１つのコロニーを、２００μＬの２ＹＴＡＧ培地を注入した９６穴平底プレートの１つのウェルに置き、この操作を繰り返した。【００６８】
ウェル内の溶液を、摂氏３０度の温度で１６０ｒｐｍの回転数で撹拌した。【００６９】
５０μＬの増殖した大腸菌を含む溶液を回収し、この溶液をプレート上で５０μＬの２ＹＴＡＧ培地と混合した。２ＹＴＡＧ培地には、感染多重度（ＭＯＩ）が２０になるようなヘルパーファージを含有させた。そして、溶液を、摂氏３０度の温度で４５分間静置した。【００７０】
２ＹＴＡＧ培地を含むプレートを、４０００ｒｐｍにて５分間遠心分離し、上清を捨てた。大腸菌を含む沈殿物を、２００μＬの２ＹＴＡＧ培地と混合した。混合液を、摂氏３０度の温度で一晩１６０ｒｐｍの回転数で撹拌した。【００７１】
その後、混合液は、４０００ｒｐｍにて５分間遠心分離し、大腸菌を含む上清を回収した。【００７２】
（Ｄ）ＥＬＩＳＡによるファージ提示ＶＨＨ抗体及び抗原の定性評価
９６ウェルプレート（Thermo Fisher Scientific社より購入、商品名：Maxisorp（登録商標））の各ウェルに、１μｇ／ｍＬの濃度を有するドレブリン溶液を抗原として５０μＬずつ添加した。９６ウェルプレートを、摂氏４度の温度で一晩静置し、ドレブリン抗原を各ウェルに固定した。【００７３】
各ウェルを、ＰＢＳで３回洗浄した。次いで、３％スキムミルク（和光純薬株式会社より入手）含有ＰＢＳを各ウェルに注入し（２００μＬ／ウェル）、９６ウェルプレートを、室温で１時間放置することで、各ウェルのブロッキング処理を行った。その後、各ウェルを、ＰＢＳで３回洗浄した。【００７４】
ＶＨＨ抗体を提示するモノクローナルファージ（Ｍ１３バクテリオファージ）を、各ウェルに注入し（５０μＬ／ウェル）、９６ウェルプレートを１時間静置した。このようにして、ファージをドレブリン抗原と反応させた後、各ウェルを、 ＰＢＳＴで５回洗浄し、抗Ｍ１３抗体（GEヘルスケア社より入手、型番：27942101、10000倍希釈）を各ウェルに添加した（５０μＬ／ウェル）。次いで、各ウェルをＰＢＳＴで６回洗浄した。【００７５】
各ウェルに発色剤（和光純薬工業社より入手、型番：155-02161）を注入し（５０μＬ／ウェル）、９６ウェルプレートを１０分間静置することで、発色剤を抗体と反応させた。反応後、硫酸水溶液（１規定）を５０μＬ／ウェルの濃度で各ウェルに添加し、反応を停止させ、４９０ｎｍの波長での溶液の吸光度を測定した。【００７６】
良好な吸光度測定の結果を有する４つのウェルを選択し、それらのウェル上のファージに含まれるＤＮＡ配列を解析した。ＤＮＡ配列の解析結果は以下の通りであり、４つのＤＮＡ配列を見いだすことができた。【００７７】
CAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGTTTGGTGCGCGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCACTGGACGCACCTTCAGTGCCTATACCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGAAAGGAGCGTGAGTTTGTGGCAGCGGTTACCAGGAGTAGTACCAGCACATACTATGCAGGCTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACATGGTGTATCTGCAAATGAACAACCTGGAACCTGAGGACACAGCCGTCTATTACTGCCATGCCCGCAGGCCTTCGACAACGGGGCACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGAACCCAAGACACCAAAACCACAATCGGCC（配列番号８）【００７８】
GAGTTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAAACTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTACAGCCACTGGAAGCATCTTCAGCTTCAGCGCCGTGGGCTGGTACCGCCAGGTTCCAGGGAAGCAGCGCGAAATGGTCGCATCTGTTACTAAGACCACTGGCACGAACTATGGAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGGGAGCGCCAAGAACCAGATCCACCTCCGGATGAACGACCTCAAACCTGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTAGCGCGAACAGTTGGATGAGGCCAGACTACTACTATTGGGGCCCGGGGGTCCAGGTCACCGTTTCTTCAGCGCACCACAGCGAAGACCCCACGGCC（配列番号９）【００７９】
CAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTGCAGACCGGGGGGTCTCTACGACTCTCCTGTGTAACTTCTGTCCGAATTACCAGTATCTTTGCCATGGGCTGGTATCGCCAGACTCCAGGGAAGAAGCGCGAGGTAGTCGCGGCGATGTATTCTGATGGTAGAGGTACTGTTGCAAACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAACCTGAAACCAGAGGACACGGCCGTGTACTACTGTACGAACGTTAGATGGCACGAACCCCGGGGCCAGGGGACCCAGGTTACCGTCTCTTCGGAACCCAAGACACCAAAACCACAATCGGCC（配列番号１０）【００８０】
GAGTTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGATTGGCGCAGGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTGAAGCCTCTGGATTCAGCTTCGGACTCTTTGGCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGAAAGGGGCCCGAGTGGGTCTCAGCTACTAATAGTGGTGGCGATAGAACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCTAGAGACAACGCCAAGAACACGATGTATCTGCAAATGAACAGCCTGGAACCTGAGGACACAGCCGTCTATTACTGTCATGCAGATCGACTGAATAGAGACTATACCATATCGCAATACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGAACCCAAGACACCAAAACCACAATCGGCC（配列番号１１）【００８１】
配列番号８により表されるＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列は、以下のとおりである。
QVQLVESGGGLVRAGGSLRLSCAATGRTFSAYTMGWFRQAPGKEREFVAAVTRSSTSTYYAGSVKGRFTISRDNAKNMVYLQMNNLEPEDTAVYYCHARRPSTTGHWGQGTQVTVSSEPKTPKPQSA（配列番号１）【００８２】
配列番号９により表されるＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列は、以下のとおりである。
ELQLVESGGGLVQTGGSLRLSCTATGSIFSFSAVGWYRQVPGKQREMVASVTKTTGTNYGDSVKGRFTISRGSAKNQIHLRMNDLKPEDTAVYYCSANSWMRPDYYYWGPGVQVTVSSAHHSEDPTA（配列番号２）【００８３】
配列番号１０により表されるＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列は、以下のとおりである。
QVQLVESGGGVVQTGGSLRLSCVTSVRITSIFAMGWYRQTPGKKREVVAAMYSDGRGTVANSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNNLKPEDTAVYYCTNVRWHEPRGQGTQVTVSSEPKTPKPQSA（配列番号３）【００８４】
配列番号１１により表されるＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列は、以下のとおりである。
ELQLVESGGGLAQAGGSLRLSCEASGFSFGLFGMSWVRQAPGKGPEWVSATNSGGDRTYYADSVKGRFTISRDNAKNTMYLQMNSLEPEDTAVYYCHADRLNRDYTISQYWGQGTQVTVSSEPKTPKPQSA（配列番号４）【００８５】
配列番号１〜４のうち、Ｃ末端側から約１０残基にある「ＳＳ」に引き続く配列は、Ｆｃのヒンジ領域の一部であり、ドレブリンの結合に関わる配列ではない。したがって、ドレブリン結合ペプチドは、以下の配列番号１６〜１９で表されるアミノ酸配列を含むペプチドである。【００８６】
配列番号１６は、配列番号１のＮ末端側１１７アミノ酸残基である。
QVQLVESGGGLVRAGGSLRLSCAATGRTFSAYTMGWFRQAPGKEREFVAAVTRSSTSTYYAGSVKGRFTISRDNAKNMVYLQMNNLEPEDTAVYYCHARRPSTTGHWGQGTQVTVSS（配列番号１６）【００８７】
配列番号１７は、配列番号２のＮ末端側１１８アミノ酸残基である。
ELQLVESGGGLVQTGGSLRLSCTATGSIFSFSAVGWYRQVPGKQREMVASVTKTTGTNYGDSVKGRFTISRGSAKNQIHLRMNDLKPEDTAVYYCSANSWMRPDYYYWGPGVQVTVSS（配列番号１７）【００８８】
配列番号１８は、配列番号３のＮ末端側１１４アミノ酸残基である。
QVQLVESGGGVVQTGGSLRLSCVTSVRITSIFAMGWYRQTPGKKREVVAAMYSDGRGTVANSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNNLKPEDTAVYYCTNVRWHEPRGQGTQVTVSS（配列番号１８）【００８９】
配列番号１９は、配列番号４のＮ末端側１２１アミノ酸残基である。
ELQLVESGGGLAQAGGSLRLSCEASGFSFGLFGMSWVRQAPGKGPEWVSATNSGGDRTYYADSVKGRFTISRDNAKNTMYLQMNSLEPEDTAVYYCHADRLNRDYTISQYWGQGTQVTVSS（配列番号１９）【００９０】
（Ｅ）ドレブリン結合ペプチドの発現
市販されているｐＥＴ２２ｂ（＋）（Merck Millipore株式会社より入手可能）由来のプラスミドＶｅｃｔｏｒ２に、制限酵素ＳｆｉＩ切断サイトと３ｘＦｌａｇタグを挿入し、Ｖｅｃｔｏｒ２を制限酵素ＳｆｉＩで処理した。制限酵素ＳｆｉＩ切断サイトは、GGCCCAGCCGGCC（配列番号６）若しくはGGCCTCTGCGGCC（配列番号７）により表されるＤＮＡ配列からなる。【００９１】
一方、配列番号８〜１１により表されるＤＮＡ配列を有するドレブリン結合ペプチドをコードする遺伝子断片をライゲーションしたプラスミドＶｅｃｔｏｒ１を制限酵素ＳｆｉＩにより処理した。【００９２】
制限酵素処理した遺伝子断片を、電気泳動法により回収した。回収した遺伝子断片（配列番号１２〜１５）を、制限酵素ＳｆｉＩにより処理したＶｅｃｔｏｒ２断片に、１：２の割合で混合した。混合液に、ライゲーション試薬を注入した。混合液を摂氏１６度の温度で２時間静置し、ドレブリン結合ペプチドをコードする遺伝子断片をＶｅｃｔｏｒ２断片にライゲーションした。【００９３】
5’-CGGCCATGGCTCAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGTTTGGTGCGCGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCACTGGACGCACCTTCAGTGCCTATACCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGAAAGGAGCGTGAGTTTGTGGCAGCGGTTACCAGGAGTAGTACCAGCACATACTATGCAGGCTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACATGGTGTATCTGCAAATGAACAACCTGGAACCTGAGGACACAGCCGTCTATTACTGCCATGCCCGCAGGCCTTCGACAACGGGGCACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGAACCCAAGACACCAAAACCACAATCGGCCTCTG-3’ （配列番号１２）【００９４】
5’-CGGCCATGGCTGAGTTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAAACTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTACAGCCACTGGAAGCATCTTCAGCTTCAGCGCCGTGGGCTGGTACCGCCAGGTTCCAGGGAAGCAGCGCGAAATGGTCGCATCTGTTACTAAGACCACTGGCACGAACTATGGAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGGGAGCGCCAAGAACCAGATCCACCTCCGGATGAACGACCTCAAACCTGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTAGCGCGAACAGTTGGATGAGGCCAGACTACTACTATTGGGGCCCGGGGGTCCAGGTCACCGTTTCTTCAGCGCACCACAGCGAAGACCCCACGGCCTCTG-3’ （配列番号１３）【００９５】
5’-CGGCCATGGCTCAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTGCAGACCGGGGGGTCTCTACGACTCTCCTGTGTAACTTCTGTCCGAATTACCAGTATCTTTGCCATGGGCTGGTATCGCCAGACTCCAGGGAAGAAGCGCGAGGTAGTCGCGGCGATGTATTCTGATGGTAGAGGTACTGTTGCAAACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAACCTGAAACCAGAGGACACGGCCGTGTACTACTGTACGAACGTTAGATGGCACGAACCCCGGGGCCAGGGGACCCAGGTTACCGTCTCTTCGGAACCCAAGACACCAAAACCACAATCGGCTCTG-3’ （配列番号１４）【００９６】
5’-CGGCCATGGCTGAGTTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGATTGGCGCAGGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTAAGCCTCTGGATTCAGCTTCGGACTCTTTGGCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGAAAGGGGCCCGAGTGGGTCTCAGCTACTAATAGTGGTGGCGATAGAACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCTAGAGACAACGCCAAGAACACGATGTATCTGCAAATGAACAGCCTGGAACCTGAGGACACAGCCGTCTATTACTGTCATGCAGATCGACTGAATAGAGACTATACCATATCGCAATACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGAACCCAAGACACCAAAACCACAATCGGCCTCTG-3’ （配列番号１５）【００９７】
このようにしてライゲーションしたプラスミドＶｅｃｔｏｒ２を用いて、大腸菌（Competent Cell BL21 (DE3) ,New England Biolabsより入手）にトランスフェクションした。【００９８】
次いで、大腸菌をプレート上に１００μｇ／ｍＬの濃度を有するアンピシリン含有２ＹＴ（２ＹＴＡ）培地で１５時間培養して、ドレブリン結合ペプチドを発現する大腸菌株を得た。【００９９】
２ＹＴＡＧ培地を含むアガープレートに形成されたコロニーの中から、１つのコロニーを選択し、爪楊枝でピックアップした。ピックアップしたコロニーを、２ｍＬの２ＹＴＡ培地中で、６００ｎｍの波長での混合液の吸光度が２．０になるまで２００ｒｐｍで振とうしながら摂氏３７度の温度で培養した。【０１００】
さらに、２ｍＬの培養液を２００ｍＬの２ＹＴＡ培地に混合した。６００ｎｍの波長での混合液の吸光度が０．８になるまで、混合液を２００ｒｐｍで振とうしながら摂氏３７度の温度で培養した。【０１０１】
吸光度が０．８になった後、イソプロピルチオガラクトシド溶液を混合液に添加した。イソプロピルチオガラクトシド溶液の最終濃度は１０μＭであった。混合液に含有される大腸菌を、摂氏２５度の温度で１５時間培養した。培養した大腸菌を回収するため、混合液を８０００ｒｐｍで５分間遠心した。【０１０２】
回収した大腸菌を、４５ｍＬのＰＢＳに混合し、ボルテックスミキサーを用いて撹拌した。このようにして、大腸菌を洗浄し、混合液に含有される大腸菌を、超音波を用いて破砕した。大腸菌を含む破砕液を、８０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を回収した。回収した上清を、０．８μｍフィルタを用いて濾過した。【０１０３】
濾液を、Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（GE Healthcare社より入手）を用いて推奨プロトコルに従って精製した。精製は４５ｍＬの濾液に対して、３ｍＬの溶出液を用いた。溶出液に含有される緩衝液を、透析によってＰＢＳに置換した。置換は３ｍＬの溶出液に対して、１．５ＬのＰＢＳを用いた。このようにして、ドレブリン結合ペプチドを含有する溶液を得た。【０１０４】
このようにして得られた溶液に含有されるドレブリン結合ペプチドを、吸光度計（島津製作所より入手、商品名：BioSpec-nano）を用いて、２８０ｎｍでの波長での吸収測定値に基づいて定量した。【０１０５】
（Ｆ）ドレブリン結合ペプチド−ヒトＩｇＧ Ｆｃ融合抗体の発現
市販されているｐｃＤＮＡ３．１（＋）（例えば、Thermo Fisher Scientific株式会社より入手可能）由来のプラスミドＶｅｃｔｏｒ３に、制限酵素ＳｆｉＩ切断サイトとヒトＩｇＧ−Ｆｃ領域を挿入し、Ｖｅｃｔｏｒ３を制限酵素ＳｆｉＩにより処理した。制限酵素ＳｆｉＩ切断サイトは、GGCCCAGCCGGCC（配列番号６）若しくはGGCCTCTGCGGCC（配列番号７）により表されるＤＮＡ配列からなる。また、このヒトＩｇＧ−Ｆｃ領域は、Ｎ末端側がヒンジ領域の一部をなしており、このヒンジ領域の一部がＶＨＨと結合する。【０１０６】
一方、ドレブリン結合ペプチドをコードする遺伝子断片をライゲーションしたプラスミドＶｅｃｔｏｒ１を、制限酵素ＳｆｉＩで処理し電気泳動法により遺伝子断片を回収した。遺伝子断片（配列番号１２〜１５）を、制限酵素ＳｆｉＩにより処理したＶｅｃｔｏｒ３に、１：２の割合で混合した。混合液に、ライゲーション試薬を注入した。混合液を摂氏１６度の温度で２時間静置し、ドレブリン結合ペプチドをコードする遺伝子断片をプラスミドＶｅｃｔｏｒ３にライゲーションした。【０１０７】
このようにしてライゲーションしたプラスミドＶｅｃｔｏｒ３を用いて、ヒト培養細胞株（ＨＥＫ２９３Ｔ）にトランスフェクションした。【０１０８】
トランスフェクションは、遺伝子導入試薬（ＨｉｌｙＭａｘ、同人化学社製）を用いて推奨プロトコルに従って行われた。培養液中に、ドレブリン結合ペプチド−ヒトＩｇＧ  Ｆｃ融合抗体を産生した。このようにして、ドレブリン結合ペプチド−ヒトＩｇＧ  Ｆｃ融合抗体を含有する溶液を得た。
【実施例２】
【０１０９】
２．配列番号１のアミノ酸配列を有するドレブリン結合ペプチド−ヒトＩｇＧ  Ｆｃ融合抗体を用いたウェスタンブロット法によるドレブリン検出
図１は、Ｍｙｃ−ｄｒｅｂｒｉｎ Ａ（エピトープタグであるＭｙｃが融合したドレブリン、以下同じ）を発現しているＨＥＫ２９３細胞抽出物についてのウェスタンブロット法によるドレブリン検出の結果を示している。なお、マーカーの単位はｋＤａ（キロダルトン）である。ＨＥＫ２９３細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、アクリルアミドゲルからＰＶＤＦ膜へタンパク質の転写を行った後、各種抗体又はペプチドを用いてドリブレンを検出した。【０１１０】
一次抗体には、以下の抗体又はペプチドを用いた。図１の左から第１レーン〜第８レーンとして説明する。
第１レーン：抗Ｍｙｃ抗体（抗Ｍｙｃ）
第２、５、６レーン：抗ドレブリンモノクローナル抗体（Ｍ２Ｆ６、株式会社医学生物学研究所より入手）
第３レーン：配列番号１のアミノ酸配列を有するドレブリン結合ペプチド（＃１、以下＃１ペプチドという）
第４、７、８レーン：＃１ペプチドをヒトのＩｇＧ抗体のＦｃ領域と融合したドレブリン結合ペプチド−ヒトＩｇＧ  Ｆｃ融合抗体（＃１Ｆｃ、以下＃１Ｆｃ抗体という）【０１１１】
＃１ペプチドは配列番号１のアミノ酸配列を有するドレブリン結合ペプチドに３つのＦｌａｇ配列を融合して発現させたものであり、２次抗体としてＨＲＰ標識抗Ｆｌａｇ抗体を用いることにより検出できる。＃１Ｆｃ抗体は配列番号１のアミノ酸配列を有するドレブリン結合ペプチドにヒト免疫グロブリンＧのＦｃ領域が融合してあり二量体を形成している。＃１Ｆｃ抗体は、２次抗体としてＨＲＰ標識抗ヒト免疫グロブリンＧ抗体を用いることによって検出できる。【０１１２】
抗Ｍｙｃ抗体及びＭ２Ｆ６がドレブリンに特異的に結合することは既に証明されており、ドレブリンの分子量が１４０ｋＤａであることが分かった(図１の第１レーン及び第２レーンを参照)。そして、＃１ペプチド及び＃１Ｆｃ抗体を一次抗体としてＭｙｃ−ｄｒｅｂｒｉｎ  Ａと反応させた結果、１４０ｋＤａの位置でバンドを確認できたため、＃１ペプチド及び＃１Ｆｃ抗体がドレブリンに特異的に結合することが分かった。【０１１３】
さらに、ドレブリンノックアウトマウス（以下、ＫＯ。図１同じ）、野生型マウス（以下、ＷＴ。図１同じ）の大脳皮質抽出物を用いてウェスタンブロット法を行った。そうしたところ、＃１Ｆｃ抗体を一次抗体として反応させた結果、Ｍ２Ｆ６を一次抗体として反応させた場合と同様に、ＷＴの１４０ｋＤａの位置にのみバンドが現れることが確認できた。また、ＫＯにおいては同位置にバンドが確認できなかったため、＃１Ｆｃ抗体が特異的に野生型マウスのドレブリンを認識していることが分かった（第５〜８レーン）。
【実施例３】
【０１１４】
３．配列番号２〜４により表されるアミノ酸配列を有するドレブリン結合ペプチドを用いたウェスタンブロット法によるドレブリン検出
図２は、実施例２と同様に、Ｍｙｃ−ｄｒｅｂｒｉｎ Ａを発現しているＨＥＫ２９３細胞抽出物についてウェスタンブロット法によりドレブリン検出を行った結果を示している。なお、マーカーの単位はｋＤａ（キロダルトン）である。ＨＥＫ２９３細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、アクリルアミドゲルからＰＶＤＦ膜へタンパク質の転写を行った後、各種抗体又はペプチドを用いてドリブレンを検出した。【０１１５】
一次抗体には、以下の抗体又はペプチドを用いた。図２の左から第１レーン〜第８レーンとして説明する。
第１レーン：抗Ｍｙｃ抗体（抗Ｍｙｃ）
第２レーン：抗ドレブリンモノクローナル抗体（Ｍ２Ｆ６）
第３レーン：配列番号２のアミノ酸配列を有するドレブリン結合ペプチド（＃２、以下＃２ペプチドという）
第４レーン：配列番号３のアミノ酸配列を有するドレブリン結合ペプチド（＃３、以下＃３ペプチドという）
第５レーン：配列番号４のアミノ酸配列を有するドレブリン結合ペプチド（＃４、以下＃４ペプチドという）
第６レーン：＃２ペプチドをヒトのＩｇＧ抗体のＦｃ領域と融合した抗体（＃２Ｆｃ、以下＃２Ｆｃ抗体という）
第７レーン：＃３ペプチドをヒトのＩｇＧ抗体のＦｃ領域と融合した抗体（＃３Ｆｃ、以下＃３Ｆｃ抗体という）
第８レーン：＃４ペプチドをヒトのＩｇＧ抗体のＦｃ領域と融合した抗体（＃４Ｆｃ、以下＃４Ｆｃ抗体という）【０１１６】
＃２ペプチド〜＃４ペプチドは、それぞれ配列番号２、３、４のアミノ酸配列を有するドレブリン結合ペプチドに３つのＦｌａｇ配列を融合して発現させたものであり、２次抗体としてＨＲＰ標識抗Ｆｌａｇ抗体を用いることにより検出できる。＃２Ｆｃ抗体〜＃４Ｆｃ抗体は、それぞれ配列番号２、３、４のアミノ酸配列を有するドレブリン結合ペプチドにヒト免疫グロブリンＧのＦｃ領域が融合してあり二量体を形成している。＃２Ｆｃ抗体〜＃４Ｆｃ抗体は、２次抗体としてＨＲＰ標識抗ヒト免疫グロブリンＧ抗体を用いることによって検出できる。【０１１７】
抗Ｍｙｃ抗体及びＭ２Ｆ６がドレブリンに特異的に結合することは既に証明されており、図２よりドレブリンの分子量が１４０ｋＤａであることが分かった(図２の第１レーン及び第２レーンを参照)。そして、Ｍｙｃ−ｄｒｅｂｒｉｎ  Ａを＃２ペプチド〜＃４ペプチド及び＃２Ｆｃ抗体〜＃４Ｆｃ抗体を一次抗体として反応させた結果、１４０ｋＤａの位置でバンドを確認できたため、＃２ペプチド〜＃４ペプチド及び＃２Ｆｃ抗体〜＃４Ｆｃ抗体がドレブリンに特異的に結合することが分かった。
【実施例４】
【０１１８】
４．ドレブリン結合ペプチドを用いた海馬神経細胞の免疫蛍光染色
固定後の初代培養海馬神経細胞にドレブリン結合ペプチド（＃４Ｆｃ）を特異的に結合させ、ヒト抗体を認識する二次抗体（蛍光標識：画像上では白で表示）を使って本ペプチドの分布を同定した（図３左）。蛍光がスパインに局在していることから本ペプチドがドレブリンに特異的に結合していることがわかる。このことよりドレブリンの局在の検出法として、現在市販のマウスモノクローナル抗体Ｍ２Ｆ６（図３右）と比べて、同等であることがわかる。
【実施例５】
【０１１９】
５．ＧＦＰ・Ｆｃ−融合ドレブリン結合ペプチドによる、ドレブリンの神経細胞内イメージング
初代培養海馬神経細胞に、Ｎ末端にＧＦＰを融合したＧＦＰ・Ｆｃ−融合ドレブリン結合ペプチド（ＧＦＰ−＃４Ｆｃ）を強制発現させた。図４の蛍光画像により、発現したペプチドの集積部位（Ａの矢印）とマウスモノクローナル抗体Ｍ２Ｆ６により明らかとされた内在性ドレブリンの集積部位（Ｂの矢印）が一致していることがわかる。【０１２０】
なお、ＧＦＰ・Ｆｃ−融合ドレブリン結合ペプチドの強制発現は、以下のようにして作製したｐＥＧＦＰ−Ｃ１−＃４Ｆｃを初代培養海馬神経細胞に導入することにより行った。
ｐＥＧＦＰ−Ｃ１ベクター（GenBank Accession #: U55763  Clontech社より入手）のマルチクローニングサイトに存在するBglII、EcoRIサイトを制限酵素で切断後、アガロースゲルで電気泳動を行い、クローニングベクターの精製を行った。また、当該ペプチド＃４Ｆｃをコードする、配列番号１１で示される配列を含む核酸フラグメントをBglII、EcoRIサイトを有するプライマーを用いたＰＣＲで増幅し、同様に制限酵素処理及びアガロースゲル電気泳動を行い、挿入核酸の精製を行った。上記のクローニングベクターと挿入核酸のライゲーションを行い、目的のＧＦＰ融合ペプチド発現ベクターを作製した。
【実施例６】
【０１２１】
６．ランダム変異ライブラリによるドレブリン結合ペプチドの作製
実施例１で得られたドレブリン結合ペプチド遺伝子に対するランダム変異により、ドレブリン結合ペプチドのスクリーニングを行った。【０１２２】
（Ａ）ランダム変異ライブラリの構築
配列番号１９（配列番号４から、Ｃ末端側Ｆｃヒンジ領域を除去したもの）のドレブリン結合ペプチドをコードする配列番号１１の遺伝子に対してError Prone PCRを行ってランダム変異を挿入し、ファージミドベクターへと連結させた。作製したファージミドベクターを大腸菌へと形質転換することで約１．０×１０８の多様性を有するランダム変異ライブラリを構築した。【０１２３】
（Ｂ）ランダム変異ライブラリを用いたドレブリン結合ペプチドのスクリーニング
実施例１（Ｃ）に記載の方法により、２ラウンドのパニングを行った。単離した８６クローンの結合活性を配列番号１９のドレブリン結合ペプチドと比較するため、実施例１（Ｄ）に記載の方法によりＥＬＩＳＡを行ったところ、ほぼ全てのクローンで結合活性の上昇が確認できた。特に結合活性の高かった１０クローン（Ｚ０１〜Ｚ１０）の結合活性を図５に示す。１０クローンのうち、Ｚ０２〜Ｚ１０の９クローンは独立していた。【０１２４】
（Ｃ）ランダム変異により得られたドレブリン結合ペプチド−ヒトＩｇＧ  Ｆｃ融合抗体の、ＥＬＩＳＡ法によるドレブリン結合活性評価
実施例１（Ｆ）に記載の方法により、Ｚ０２〜Ｚ１０を有するドレブリン結合ペプチド−ヒトＩｇＧ  Ｆｃ融合抗体発現ベクターを作製した。作製した発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、ドレブリン結合ペプチド−ヒトＩｇＧ  Ｆｃ融合抗体を一過性に培養上清中に発現させ、ＥＬＩＳＡで結合活性を評価した。【０１２５】
結果を図６に示す。オリジナルである配列番号１９のアミノ酸配列を含むペプチドの結合活性に比べて、ランダム変異クローンはどれも結合活性が低く、上記実施例６（Ｂ）とは異なる結果が得られた。この理由は明らかではなく、ランダム変異クローンは大腸菌内での発現に適した変異が加えられて生産性が高まり、ＶＨＨ提示ファージにおけるＶＨＨの提示量が増加した結果、実施例６（Ｂ）のＥＬＩＳＡでは結合活性が高く測定されたのみであって、ペプチドの結合活性自体は低下した可能性がある。一方で、ランダム変異クローンは、Ｆｃ融合抗体にすると結合活性が低下するが、ペプチドの結合活性自体は上がっている可能性もあるため、ランダム変異クローン全てについてさらなる解析を行った。なお、Ｚ０３、Ｚ０７は、ｃＤＮＡを単離することができなかった。
【実施例７】
【０１２６】
７．ドレブリン結合ペプチドによる、ドレブリンの神経細胞内イメージング
上記実施例６（Ｃ）で得られた各クローンについて、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクター（GenBank Accession #: U55762  Clontech社より入手）に組み入れてＣ末端側にＧＦＰを融合したコンストラクトを作製し、実施例５と同様の方法により初代培養海馬神経細胞にＧＦＰ・Ｆｃ−融合ドレブリン結合ペプチドを発現させ、蛍光画像を取得した。また、ヒトのＩｇＧ抗体のＦｃ領域と融合していないドレブリン結合ペプチドについても、同様の方法でＣ末端側にＧＦＰを融合したコンストラクトを作製し、実施例５と同様の方法により初代培養海馬神経細胞にＧＦＰ−融合ドレブリン結合ペプチドを発現させ、蛍光画像を取得した。【０１２７】
結果を図７に示す。図７Ａは、ＧＦＰ・Ｆｃ−融合ドレブリン結合ペプチドによりドレブリンの細胞内イメージングを行った結果を示す。Ｚ０４、Ｚ１０以外のクローンにおいて、ＧＦＰ・Ｆｃ−融合ドレブリン結合ペプチドが細胞内に発現し、親クローンである配列番号１９と同程度に、内在性ドレブリンの集積部位を検出することができた。【０１２８】
また、Ｚ０２、Ｚ０６について、ヒトのＩｇＧ抗体のＦｃ領域と融合していない、ＧＦＰ−融合ドレブリン結合ペプチドを用いて同様の試験を行ったところ、Ｆｃ領域を融合した場合と同程度に、内在性ドレブリンの集積部位を検出することができた（図７Ｂ）。
【実施例８】
【０１２９】
８．取得クローンのアミノ酸配列
実施例７で、内在性ドレブリンの集積部位を検出することができた５クローンのアミノ酸配列を決定した。得られた配列を以下に示す。なお、下線は配列番号１９からの変異箇所である。【０１３０】
Ｚ０２
ELQLVESGGGLAQAGGSLRLSCETSGFRFGLFGMSWVRQAPGKGPEWVSATNSGGDRTYYADSVKGRFTISRDNAKNTMYLQMNSLEPEDTAVYYCHANRLNRDYTISQYWGQGTQVTVSS（配列番号２０）
Ｚ０５
EVQLVESGGGLAQAGGSLRLSCEASGFSFGLFGMSWLRQAPGKGPEWVSATNSGGHRTYYADSVKGRFTISRDNAKNTMYLQMNSLEPEDTAVYYCHADRLNRDYTISQYWGQGTQVTVSS（配列番号２１）
Ｚ０６
EVQLVESGGGLAQAGGSLRLSCEASGFSFGLFGMSWVRLAPGKGPEWVSATNSGGDRTYYADSVKGRFTISRDNAKNTMYLQMNSLEPEDTAVYYCHANRLNRDYTISQYWGQGTQVTVSS（配列番号２２）
Ｚ０８
EVQLVESGGGLAQAGGSLRLSCEASGFSFGLFGMSWVRQAPGKGPEWVSATNSGGDRTYYAVSVKGRFTTSRDNAKNTMYLQMNSLEPEDTAVYYCHANRLNRDYTISQYWGQGTQVTVSS（配列番号２３）
Ｚ０９
EVQLVESGGGLVQAGGSVRLSCEASGFSFGLFGMSWVRQAPGKGPEWVSATNSGGDRTYYADSVKGRFTVSRDNAKNTMYLQMNSLEPEDTAVYYCHANRLNRDYTISQYWGQGTQVTVSS（配列番号２４）
【産業上の利用可能性】
【０１３１】
本発明のドレブリン結合ペプチドの用途は、ドレブリンの検出や定量のみに限られない。例えばＧＦＰを付加したドレブリン結合ペプチドを作成すれば、ドレブリンの細胞内イメージングが可能となる。これにより、神経科学分野のみならず癌や感染症の分野においても種々の疾患の病態解明に寄与することが可能となるため、産業上非常に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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