(57)【要約】  測定装置は、第１流路と、第１流路の少なくとも一部と連通する連通部分を有する第２流路と、培養された複数の細胞が結合された状態で配列された細胞シートであって、連通部分において第１流路と第２流路とを仕切る細胞シートとを含む流路デバイスが着脱自在に装着される装着部と、細胞シートのバリア性を評価するための評価液であって、サイズが異なる複数種類のトレーサが混在する評価液が第１流路に送液された場合において、細胞シートに生じる欠陥を通じて第１流路から第２流路に漏出する複数のトレーサのそれぞれの漏出状況を光学的に区別して検出する検出部と、を備える。
2020195458.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１流路と、前記第１流路の少なくとも一部と連通する連通部分を有する第２流路と、培養された複数の細胞が結合された状態で配列された細胞シートであって、前記連通部分において前記第１流路と前記第２流路とを仕切る細胞シートとを含む流路デバイスが着脱自在に装着される装着部と、
前記細胞シートのバリア性を評価するための評価液であって、サイズが異なる複数種類のトレーサが混在する評価液が前記第１流路に送液された場合において、前記細胞シートに生じる欠陥を通じて前記第１流路から前記第２流路に漏出する前記複数のトレーサのそれぞれの漏出状況を光学的に区別して検出する検出部と、
を備えた測定装置。
【請求項２】
前記複数種類のトレーサのそれぞれは、波長域が異なる蛍光を発する蛍光トレーサであり、
前記検出部は、前記複数種類のトレーサがそれぞれ発する複数種類の蛍光を検出する請求項１に記載の測定装置。
【請求項３】
前記検出部は、前記複数種類のトレーサのそれぞれに前記蛍光を励起させる励起光を照射する励起光源と、
前記複数種類の蛍光を分離するための光学フィルタと、
前記光学フィルタで分離された前記蛍光を受光する受光部とを有している請求項２に記載の測定装置。
【請求項４】
前記励起光源は１つであり、
前記受光部は、前記複数種類の蛍光毎に設けられている請求項３に記載の測定装置。
【請求項５】
前記励起光源は、前記装着部に装着された前記流路デバイスにおいて、前記連通部分から漏出する前記トレーサの流れ方向の下流側であって、前記第１流路及び前記第２流路のうち、前記第２流路にのみ入射する位置に励起光を照射する請求項４に記載の測定装置。
【請求項６】
前記漏出状況には、漏出量の時間変化が含まれる請求項１から５のうちのいずれか１項に記載の測定装置。
【請求項７】
前記検出部が出力する検出信号に対して、データ処理を施すデータ処理部を備えている請求項１から６のうちのいずれか１項に記載の測定装置。
【請求項８】
前記データ処理部は、前記検出部の暗電流を補正する補正処理、前記複数種類の光の波長域がオーバーラップする部分を、それぞれの光に対応する検出信号から除去する除去処理、及び電圧信号として出力される前記検出信号を光強度に変換する変換処理のうちの少なくとも１つの処理を実行する信号処理部を有している請求項７に記載の測定装置。
【請求項９】
前記データ処理部は、前記検出部が出力する前記検出信号に基づいて、前記第１流路から前記第２流路に漏出した前記複数種類のトレーサのそれぞれの濃度を導出する濃度導出部を有している請求項７又は８に記載の測定装置。
【請求項１０】
前記データ処理部は、前記複数種類のトレーサのそれぞれの前記濃度に基づいて、前記細胞シートに生じている欠陥の状態を導出する欠陥状態導出部を有している請求項９に記載の測定装置。
【請求項１１】
前記検出部によって検出された前記漏出状況を、リアルタイムでディスプレイに出力する出力制御部を備えている請求項１から１０のうちのいずれか１項に記載の測定装置。
【請求項１２】
前記細胞シートは、支持体上で培養されており、
前記支持体は、直径が１μｍ以上の孔を有する透過膜である請求項１から１１のうちのいずれか１項に記載の測定装置。
【請求項１３】
前記複数種類のトレーサのそれぞれの粒径は、１ｎｍ以上１００μｍ以下の範囲に含まれる請求項１２に記載の測定装置。
【請求項１４】
前記複数種類のトレーサは、１ｎｍから数百ｎｍのオーダの粒径のトレーサと、１μｍから数十μｍのオーダの粒径のトレーサとを含む請求項１３に記載の測定装置。
【請求項１５】
前記評価液を前記第１流路に供給する供給機構を備えている請求項１から１４のうちのいずれか１項に記載の測定装置。
【請求項１６】
第１流路と、前記第１流路の少なくとも一部と連通する連通部分を有する第２流路と、培養された複数の細胞が結合された状態で配列された細胞シートであって、前記連通部分において前記第１流路と前記第２流路とを仕切る細胞シートとを含む流路デバイスを用いて、細胞シートのバリア性を評価するための測定装置の作動プログラムであって、
前記細胞シートのバリア性を評価するための評価液であって、サイズが異なる複数種類のトレーサが混在する評価液が前記第１流路に送液された場合において、前記細胞シートに生じる欠陥を通じて前記第１流路から前記第２流路に漏出する前記複数のトレーサのそれぞれの漏出状況を光学的に区別して検出する検出部からの検出信号を取得する取得部と、
取得された前記検出信号に基づいて前記漏出状況を出力する出力制御処理を実行する処理部として、
コンピュータを機能させる測定装置の作動プログラム。
【請求項１７】
第１流路と、前記第１流路の少なくとも一部と連通する連通部分を有する第２流路と、培養された複数の細胞が結合された状態で配列された細胞シートであって、前記連通部分において前記第１流路と前記第２流路とを仕切る細胞シートとを含む流路デバイスを用い、
前記細胞シートのバリア性を評価するための評価液であって、サイズが異なり、複数種類のトレーサが混在する評価液を前記第１流路に送液する送液ステップと、
前記細胞シートに生じる欠陥を通じて前記第１流路から前記第２流路に漏出する前記複数のトレーサのそれぞれの漏出状況を光学的に区別して検出する検出ステップと、
を備えた測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示の技術は、測定装置、測定装置の作動プログラム及び測定方法。
に関する。
【背景技術】
【０００２】
液体を送液可能な微細な流路と、培養された複数の細胞が結合された状態で配列された細胞シートとを備えた流路デバイスが知られている（特表２０１８−５２２５８６号公報参照）。こうした流路デバイスは、例えば、細胞シートのバリア性を評価するために用いられる。【０００３】
細胞シートのバリア性の評価には、トレーサを含む評価液が使用される。細胞シートに欠陥が生じている場合は、欠陥を通じて、評価液に含まれるトレーサが漏出する。この場合、細胞シートのバリア性は、欠陥が無い状態と比較して低下したと評価される。このように、細胞シートのバリア性の評価は、細胞シートの欠陥を検出することを通じて行われる。【０００４】
細胞シートのバリア性の評価は、一例として、薬剤の効能又は副作用を調べるために行われる。すなわち、薬剤と細胞シートとを接触させた場合の細胞シート上の欠陥を検出することにより、薬剤の効能又は副作用が調べられる。また、別の例として、細胞シートのバリア性の評価は、流路デバイスを製造するメーカが、製品出荷前の検査において、流路デバイス内の細胞シートに欠陥が生じていないことを確認するために行われる。また、細胞シートのバリア性の評価は、流路デバイス１１の開発において、細胞シートが仕様等に合致しているか否かの検査のために行われる。【０００５】
特表２０１８−５２２５８６号公報において、細胞シートのバリア性を評価する方法は、次のとおりである。まず、特表２０１８−５２２５８６号公報に記載の流路デバイスは、第１流路（灌流チャネル）と、第２流路（ゲルチャネル）の２つの流路を有している（段落０１５５、図１Ａ、図１Ｂ）。第１流路と第２流路とは一部が連通しており、連通部分は、細胞シートによって仕切られている。【０００６】
特表２０１８−５２２５８６号公報に記載の方法では、こうした流路デバイスの第１流路に、細胞シートのバリア性を評価するための評価液が注入される。評価液には、トレーサの一例として蛍光プローブが用いられ、蛍光プローブの溶媒として培地が使用される。細胞シートに欠陥がなく、バリア性が完全であれば、蛍光プローブは第２流路には漏出しない。一方、細胞シートに欠陥がある場合は、蛍光プローブは第２流路に流出する。こうした漏出状況が蛍光顕微鏡を使用して観察される（段落０１５５、図１から図３）。また、特表２０１８−５２２５８６号公報には、トレーサ（蛍光プローブ）として、サイズが異なる複数種類のトレーサ（蛍光プローブ）を用いてもよいことが記載されている（段落０１５５、図１６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
細胞シートの欠陥の種類には、例えば、死滅した細胞などの一部の細胞が細胞シートから脱落することにより生じる欠陥、隣接する細胞間の密着結合（タイトジャンクション）が破壊されることにより生じる欠陥、及び細胞シートの一部が剥離することにより生じる欠陥など、様々なものがある。また、これらの欠陥のサイズも様々である。例えば、密着結合の破壊により生じる欠陥は、１ｎｍ（nanometer）から数十ｎｍのオーダであるのに対して、細胞の脱落及び細胞シートの部分的な剥離により生じる欠陥は、１μｍ（micrometer）から数十μｍのオーダである。【０００８】
細胞シートのバリア性の評価に際しては、単に欠陥の有無を検出するだけでなく、例えば、細胞シートに生じた欠陥のおおよそのサイズ、及びサイズが異なる欠陥のそれぞれがおおよそどの程度の割合で存在するか、といったより詳細な欠陥の状態を検出することが要望されている。というのも、こうしたより詳細な欠陥状態を検出することで、単に欠陥の有無を検出する場合と比較して、細胞シートのバリア性をより詳細に評価できるためである。【０００９】
上述したとおり、特表２０１８−５２２５８６号公報には、トレーサ（蛍光プローブ）としては、サイズが異なる複数種類のトレーサを使用してもよい旨が記載されている。ただし、特表２０１８−５２２５８６号公報には、サイズが異なる複数種類のトレーサの使用目的、及び使用方法について明確な記載はない。【００１０】
こうしたサイズが異なる複数種類のトレーサを次のように使用することにより、複数種類のサイズの欠陥を検出することが考えられる。すなわち、まず、比較的大きなサイズ（大サイズ）のトレーサを含む評価液を使用して、大サイズの欠陥を検出する。大サイズのトレーサは、大サイズの欠陥のみ透過する。そのため、大サイズのトレーサの漏出は、大サイズの欠陥が存在することを示している。【００１１】
また、細胞シートに大サイズの欠陥が存在しない場合において、比較的小さなサイズの小サイズのトレーサを含む評価液を使用して、小サイズの欠陥を検出する。細胞シートに大サイズの欠陥が存在しない場合、徐々にトレーサのサイズを小さくすることにより、小サイズの欠陥を検出することができる。【００１２】
このようにサイズが異なるトレーサをそれぞれ含む複数種類の評価液を用いて、これらを順番に流路デバイスに入れ替えながら欠陥の検出を行うことで、細胞シートにどのようなサイズの欠陥が生じているかを検出することができる。【００１３】
しかしながら、このようにサイズが異なるトレーサを含有する複数種類の評価液を使い分ける方法は、評価液の入れ替えが必要となるため、時間と手間が掛るという問題があった。【００１４】
本開示の技術は、従来と比べて、時間と手間を掛けることなく、細胞シートに生じるサイズが異なる複数種類の欠陥を検出することが可能な細胞シートのバリア性評価に用いられる測定装置、測定装置の作動プログラム及び測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記目的を達成するために、本開示の技術に係る測定装置は、第１流路と、第１流路の少なくとも一部と連通する連通部分を有する第２流路と、培養された複数の細胞が結合された状態で配列された細胞シートであって、連通部分において第１流路と第２流路とを仕切る細胞シートとを含む流路デバイスが着脱自在に装着される装着部と、細胞シートのバリア性を評価するための評価液であって、サイズが異なる複数種類のトレーサが混在する評価液が第１流路に送液された場合において、細胞シートに生じる欠陥を通じて第１流路から第２流路に漏出する複数のトレーサのそれぞれの漏出状況を光学的に区別して検出する検出部と、を備えている。【００１６】
複数種類のトレーサのそれぞれは、波長域が異なる蛍光を発する蛍光トレーサであり、検出部は、複数種類のトレーサがそれぞれ発する複数種類の蛍光を検出することが好ましい。【００１７】
検出部は、複数種類のトレーサのそれぞれに蛍光を励起させる励起光を照射する励起光源と、複数種類の蛍光を分離するための光学フィルタと、光学フィルタで分離された蛍光を受光する受光部とを有していることが好ましい。【００１８】
励起光源は１つであり、受光部は、複数種類の蛍光毎に設けられていることが好ましい。【００１９】
励起光源は、装着部に装着された流路デバイスにおいて、連通部分から漏出するトレーサの流れ方向の下流側であって、第１流路及び第２流路のうち、第２流路にのみ入射する位置に励起光を照射することが好ましい。【００２０】
漏出状況には、漏出量の時間変化が含まれることが好ましい。【００２１】
検出部が出力する検出信号に対して、データ処理を施すデータ処理部を備えていることが好ましい。【００２２】
データ処理部は、検出部の暗電流を補正する補正処理、複数種類の光の波長域がオーバーラップする部分を、それぞれの光に対応する検出信号から除去する除去処理、及び電圧信号として出力される検出信号を光強度に変換する変換処理のうちの少なくとも１つの処理を実行する信号処理部を有していることが好ましい。【００２３】
データ処理部は、検出部が出力する検出信号に基づいて、第１流路から第２流路に漏出した複数種類のトレーサのそれぞれの濃度を導出する濃度導出部を有していることが好ましい。【００２４】
データ処理部は、複数種類のトレーサのそれぞれの濃度に基づいて、細胞シートに生じている欠陥の状態を導出する欠陥状態導出部を有していることが好ましい。【００２５】
検出部によって検出された漏出状況を、リアルタイムでディスプレイに出力する出力制御部を備えていることが好ましい。【００２６】
細胞シートは、支持体上で培養されており、支持体は、直径が１μｍ以上の孔を有する透過膜であることが好ましい。【００２７】
複数種類のトレーサのそれぞれの粒径は、１ｎｍ以上１００μｍ以下の範囲に含まれることが好ましい。【００２８】
複数種類のトレーサは、１ｎｍから数百ｎｍのオーダの粒径のトレーサと、１μｍから数十μｍのオーダの粒径のトレーサとを含むことが好ましい。【００２９】
評価液を第１流路に供給する供給機構を備えていることが好ましい。【００３０】
本開示の技術に係る測定装置の作動プログラムは、第１流路と、第１流路の少なくとも一部と連通する連通部分を有する第２流路と、培養された複数の細胞が結合された状態で配列された細胞シートであって、連通部分において第１流路と第２流路とを仕切る細胞シートとを含む流路デバイスを用いて、細胞シートのバリア性を評価するための測定装置の作動プログラムであって、細胞シートのバリア性を評価するための評価液であって、サイズが異なる複数種類のトレーサが混在する評価液が第１流路に送液された場合において、細胞シートに生じる欠陥を通じて第１流路から第２流路に漏出する複数のトレーサのそれぞれの漏出状況を光学的に区別して検出する検出部からの検出信号を取得する取得部と、取得された検出信号に基づいて漏出状況を出力する出力制御処理を実行する処理部として、コンピュータを機能させる。【００３１】
本開示の技術に係る測定方法は、第１流路と、第１流路の少なくとも一部と連通する連通部分を有する第２流路と、培養された複数の細胞が結合された状態で配列された細胞シートであって、連通部分において第１流路と第２流路とを仕切る細胞シートとを含む流路デバイスを用い、細胞シートのバリア性を評価するための評価液であって、サイズが異なり、複数種類のトレーサが混在する評価液を第１流路に送液する送液ステップと、細胞シートに生じる欠陥を通じて第１流路から第２流路に漏出する複数のトレーサのそれぞれの漏出状況を光学的に区別して検出する検出ステップと、を備えている。
【発明の効果】
【００３２】
本開示の技術によれば、従来と比べて、時間と手間を掛けることなく、細胞シートに生じるサイズが異なる複数種類の欠陥を検出することが可能な細胞シートのバリア性評価に用いられる測定装置、測定装置の作動プログラム及び測定方法を提供するができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】細胞シートのバリア性評価装置の全体構成図である。
【図２】流路デバイスの分解斜視図である。
【図３】流路デバイスの横断面図である。
【図４】流路デバイスの縦断面図である。
【図５】第１流路及び第２流路の重なりを示す平面図である。
【図６】透過膜の説明図である。
【図７】透過膜の孔の直径とトレーサの粒径の説明図である。
【図８】透過膜に形成された細胞シートの説明図である。
【図９】細胞シートに生じる欠陥の説明図である。
【図１０】評価液を第１流路に送液した状態の説明図である。図１０Ａは、細胞シートに欠損が無い場合の評価液の流れを示す説明図であり、図１０Ｂは、細胞シートに欠損が生じた場合の評価液の流れを示す説明図である。
【図１１】検出部の外観斜視図である。
【図１２】検出部の光学部品の構成を示す説明図である。図１２Ａは、平面図であり、図１２Ｂは、側面図である。
【図１３】図１３は、フィルタの特性を示す説明図である。図１３Ａは、第１フィルタの特性を示し、図１３Ｂは、第２フィルタの特性を示し、図１３Ｃは、第３フィルタの特性を示す。
【図１４】各トレーサが発する蛍光の波長を示す説明図である。図１４Ａは、第１トレーサの蛍光の波長を示し、図１４Ｂは、第２トレーサの蛍光の波長を示し、図１４Ｃは、第３トレーサの蛍光の波長を示す。
【図１５】各トレーサが発する蛍光の波長と各フィルタの特性との関係を示す説明図である。
【図１６】各受光部が出力する検出信号の説明図である。
【図１７】制御装置として機能するコンピュータの概略構成図を示す。
【図１８】制御装置の機能ブロックの説明図である。
【図１９】信号処理の説明図である。
【図２０】濃度導出処理の説明図である。
【図２１】各トレーサが透過可能な欠損のサイズとの対応関係を示す説明図である。
【図２２】細胞シート上の欠陥の総面積と各トレーサの漏出量の指標（濃度）との関係を示すグラフである。
【図２３】欠陥状態導出処理の概要の説明図である。
【図２４】欠陥状態導出処理の詳細の説明図である。
【図２５】測定結果表示画面の説明図である。
【図２６】測定処理の手順を示すフローチャートである。
【図２７】比較例の測定処理の手順を示すフローチャートである。
【図２８】透過膜の両面に細胞シートを形成する例を示す説明図である。
【図２９】図２８の例において、細胞シートに欠陥が生じた状態を示す説明図である。
【図３０】回転フィルタユニットを有する検出部の例を示す説明図である。
【図３１】図３０の回転フィルタユニットの各フィルタの特性を示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
図１に一例として示すように、測定装置１０は、流路デバイス１１内に形成された細胞シート２０（図８及び図９も参照）のバリア性の評価に用いられる。細胞シート２０は、流路デバイス１１内において、播種及び培養されることによって形成される。測定装置１０には、細胞シート２０が形成された流路デバイス１１が着脱自在にセットされる。そして、測定装置１０は、セットされた流路デバイス１１内の細胞シート２０のバリア性を評価するために、その評価の指標となるデータを測定する。バリア性の評価の指標となるデータとしては、例えば、細胞シート２０に生じる欠陥の有無に加えて、サイズ違いの欠陥の割合などを含む欠陥の状態等がある。
【００３５】
測定装置１０は、一例として、流路デバイス１１を製造するメーカが、流路デバイス１１を開発する際に、流路デバイス１１内に形成された細胞シート２０のバリア性を評価するために用いられる。
【００３６】
測定装置１０は、検出装置１２と、制御装置１３とを備えている。検出装置１２は、装着部１６と、検出部１７とを備えている。装着部１６は、流路デバイス１１が着脱自在に装着される。
【００３７】
検出部１７は、後に詳述するように、流路デバイス１１に対して、細胞シート２０のバリア性を評価するための評価液２１が送液された場合において、細胞シート２０に生じる欠陥を通じて漏出する蛍光トレーサＴＲ（図８及び図９参照）の漏出状況を光学的に検出する。評価液２１は、蛍光トレーサＴＲを、バッファなどの溶媒に含有させたものである。トレーサとは、液体など流体の流れ、又は特定の物質を追跡するために使われる物質をいう。蛍光トレーサＴＲは、蛍光を発するトレーサをいい、具体的には、蛍光トレーサＴＲとしては、蛍光物質そのもの又は蛍光物質で標識された物質などが使用される。検出部１７は、漏出した蛍光トレーサＴＲが発する蛍光ＦＬを検出することを通じて、漏出状況を検出する。
【００３８】
制御装置１３は、検出部１７の動作を制御する。さらに、制御装置１３は、検出部１７が出力する検出信号を取得し、取得した検出信号にデータ処理を施す。これにより、検出信号に基づく種々の測定結果を出力する。制御装置１３は、例えばコンピュータで構成される。
【００３９】
測定装置１０は、さらに、装着部１６に装着された流路デバイス１１に対して、評価液２１などの液体を供給するための供給機構２２を備えている。供給機構２２は、供給チューブ２２Ａと、排出チューブ２２Ｂと、ポンプ２２Ｃとを備えている。供給チューブ２２Ａ及び排出チューブ２２Ｂは、装着部１６に装着された流路デバイス１１に対して取り付けられる。
【００４０】
流路デバイス１１は、第１流路２５及び第２流路２６の２つの流路を備えている。供給チューブ２２Ａ及び排出チューブ２２Ｂは、それぞれ２本ずつ設けられており、第１流路２５及び第２流路２６のそれぞれに取り付けられる。
【００４１】
第１流路２５に取り付けられる供給チューブ２２Ａには、ポンプ２２Ｃが接続される。ポンプ２２Ｃは、例えば、シリンジポンプである。ポンプ２２Ｃは、供給チューブ２２Ａを通じて、第１流路２５に評価液２１を供給する。後述するように、第１流路２５と第２流路２６とは、一部が連通しており、細胞シート２０は、この連通部分において第１流路２５と第２流路２６とを仕切る。
【００４２】
細胞シート２０に欠損が生じていない場合は、第１流路２５及び第２流路２６の連通部分は、細胞シート２０によって封止される。そのため、細胞シート２０に欠損が生じていない場合は、第１流路２５に評価液２１が送液された場合において、評価液２１に含まれる蛍光トレーサＴＲが第２流路２６に漏出することはない。第１流路２５に供給された評価液２１は、第１流路２５を通過した後、排出チューブ２２Ｂから排出される。
【００４３】
これに対して、細胞シート２０に欠損が生じている場合は、第１流路２５に供給された評価液２１内の蛍光トレーサＴＲは、欠損を通じて第２流路２６に漏出する。細胞シート２０に欠損が生じている場合は、評価液２１の一部である漏出液２１Ａが第２流路２６に流入する。漏出液２１Ａには蛍光トレーサＴＲが含まれている。漏出液２１Ａは、第２流路２６を通過した後、排出チューブ２２Ｂから排出される。
【００４４】
なお、第２流路２６に取り付けられる供給チューブ２２Ａは、第２流路２６に、バッファ３０（図３等参照）を供給するために用いられる。バッファ３０としては、例えば、ＴＢＳ（Tris Buffered Saline：トリス緩衝生理食塩水）、及びＨＢＳＳ（Hanks' Balanced Salt Solution：平衡塩溶液）等が用いられる。バッファ３０は、例えば、上述した評価液２１の溶媒として使用されるバッファと同様である。
【００４５】
図２に示すように、流路デバイス１１は、第１流路部材３１と、第２流路部材３２と、保持プレート３３と、補強板３４と、透過膜３６とを備えている。第１流路部材３１には、図２において下側の下面に第１流路２５が形成されている。第２流路部材３２には、図２において上側の上面に第２流路２６が形成されている。第１流路部材３１と第２流路部材３２とは、第１流路２５と第２流路２６とが対向して配置されるように組み立てられる。
【００４６】
第１流路部材３１は、一例としてＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）等の弾性を有する透明な樹脂材料で構成されており、第２流路部材３２は、一例としてＣＯＰ（シクロオレフィンポリマー）等の剛性を有する透明な樹脂材料で構成されている。
【００４７】
第１流路部材３１には、第１流路２５に接続する注入路３７及び排出路３８が形成されている。また、第１流路部材３１には、第２流路２６に接続する注入路３７及び排出路３８も形成されている。すなわち、注入路３７及び排出路３８は、第１流路２５及び第２流路２６のそれぞれに対応して２つずつ設けられている。注入路３７及び排出路３８は、第１流路部材３１の上下方向、すなわち、厚み方向に貫通する貫通路である。
【００４８】
保持プレート３３は、第１流路部材３１の上面に配置される。保持プレート３３には、第１流路部材３１の注入路３７及び排出路３８のそれぞれに対応する位置に、注入口３３Ａ及び排出口３３Ｂが形成されている。注入口３３Ａ及び排出口３３Ｂには、供給チューブ２２Ａ及び排出チューブ２２Ｂのそれぞれが接続される。
【００４９】
補強板３４は、流路デバイス１１の剛性を補強する。補強板３４は、第１流路部材３１及び第２流路部材３２の間に配置される。補強板３４において、第１流路２５及び第２流路２６に対応する位置には、第１流路２５において評価液２１が流れる方向に沿って細長く形成されたスリット３４Ａが形成されている。スリット３４Ａは、第１流路２５と第２流路２６との連通部分に配置される。また、補強板３４には、開口３４Ｂが形成されている。開口３４Ｂは、第２流路部材３２の第２流路２６の両端に形成された接続部２６Ｂ（図５参照）に対応する位置に配置されている。また、開口３４Ｂは、第１流路部材３１において、第２流路２６用に形成された注入路３７及び排出路３８と接続する。
【００５０】
透過膜３６は、第１流路部材３１と補強板３４との間に配置され、かつ、スリット３４Ａに対応する位置に配置される。透過膜３６は、細胞シート２０の支持体として機能し、細胞シート２０は、透過膜３６上で播種及び培養される。また、透過膜３６は、評価液２１に含まれる蛍光トレーサＴＲ（図８及び図９等参照）を透過する。
【００５１】
保持プレート３３、第１流路部材３１、補強板３４、及び第２流路部材３２には、それぞれボルト４１を挿通するためのネジ穴４２が形成されている。保持プレート３３、第１流路部材３１、補強板３４、及び第２流路部材３２は、この順で積層されることにより、流路デバイス１１として組み立てられる。そして、流路デバイス１１は、組み立てられた状態で、ボルト４１とナット４３とによって締結される。
【００５２】
図３から図５に示すように、流路デバイス１１が組み立てられた状態において、第１流路２５及び第２流路２６は、それぞれの直線部分２５Ａ及び２６Ａ（図５参照）が対向する。図３は、流路デバイス１１の横断面図であり、図４は、流路デバイス１１の縦断面図であり、図５は、第１流路２５及び第２流路２６の重なりを示す平面図である。
【００５３】
図４に示すように、第１流路２５の直線部分２５Ａの幅Ｗ１は、一例として、約２００μｍ程度であり、第２流路２６の直線部分２６Ａの幅Ｗ２は、一例として、約４００μｍである。図５に示すように、直線部分２５Ａ及び直線部分２６Ａの一部は重なる。この位置にスリット３４Ａが配置されており、このスリット３４Ａに対応する部分が、第１流路２５及び第２流路２６のそれぞれの連通部分となる。また、第１流路２５及び第２流路２６は、ミクロンオーダの幅の流路を有することから、流路デバイス１１は、マイクロ流路デバイス又はマイクロ流体デバイスなどとも呼ばれる。
【００５４】
細胞シート２０は、透過膜３６の第１流路２５側の面に形成される。細胞シート２０は、直線部分２５Ａ及び直線部分２６Ａの連通部分に形成され、直線部分２５Ａ及び２６Ａにおいて第１流路２５及び第２流路２６を仕切る。
【００５５】
図３において、二点鎖線の矢印で示すように、細胞シート２０に欠陥が生じた場合は、第１流路２５内の評価液２１の一部が透過膜３６及びスリット３４Ａを通じて第２流路２６に蛍光トレーサＴＲ（図８及び図９等）を含む漏出液２１Ａが漏出する。
【００５６】
図５において、第１流路２５の直線部分２５Ａの上流端と下流端には、注入路３７及び排出路３８に接続する接続部２５Ｂが形成されている。また、第２流路２６の直線部分２６Ａの上流端と下流端には、注入路３７及び排出路３８に接続する接続部２６Ｂが形成されている。
【００５７】
図６に示すように、透過膜３６は、多数の孔３６Ａが形成された多孔質膜である。透過膜３６は、一例として疎水性の有機溶媒に溶解可能な疎水性ポリマーから成る。疎水性ポリマーとしては、ポリスチレン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリカーボネート、ポリプロピレンなどのポリマーが挙げられる。これらのポリマーは、１種単独で又は２種以上を混合して使用してよい。また、透過膜３６の素材は疎水性ポリマーには限られず、細胞の接着性の観点等から種々の素材を選択することが可能である。
【００５８】
図７に示すように、透過膜３６の孔３６Ａの直径Ｄは、評価液２１に含まれる蛍光トレーサＴＲを透過可能なサイズである。本例では、直径Ｄは１μｍ以上である。本例の透過膜３６は、複数の孔３６Ａがハニカム配列されたハニカムフィルムである。もちろん、複数の孔３６Ａが正方配列されたフィルムを用いてもよい。孔３６Ａの直径Ｄは、一例として、約５μｍから約２０μｍであり、本例では約２０μｍである。開口率は、一例として、約２０％から約５０％であり、本例においては約５０％である。なお、開口率は、５０％以上でもよい。
【００５９】
評価液２１には、サイズ、具体的には粒径が異なる複数種類の蛍光トレーサＴＲが含まれる。本例では、サイズ違いの３種類の蛍光トレーサＴＲ１、ＴＲ２、及びＴＲ３が含有されている。本明細書において、サイズ違いの３種類の蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３のそれぞれを区別する必要がある場合は、ＴＲ１からＴＲ３のように、符号ＴＲに数字を付した符号を用いるが、サイズ違いの３種類の蛍光トレーサＴＲを区別する必要が無い場合は、数字を省略して単に符号ＴＲを使用する。
【００６０】
蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３のそれぞれは、励起光の照射により蛍光を発するトレーサである。蛍光の波長域は、後述するように、サイズが異なる３種類の蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３毎に異なる。
【００６１】
また、３種類の蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３のそれぞれのサイズ（粒径）は、一例として、１ｎｍ以上１００μｍ以下の範囲に含まれる。本例においては、孔３６Ａの直径Ｄが２０μｍなので、蛍光トレーサＴＲも２０μｍ未満のものが使用される。
【００６２】
具体的には、蛍光トレーサＴＲ１は、数ｎｍから数十ｎｍ程度のサイズであり、３種類の中では最小である。蛍光トレーサＴＲ３は、６μｍから８μｍ程度のサイズであり、３種類の中では最大である。蛍光トレーサＴＲ２は、２００ｎｍから３００ｎｍ程度のサイズであり、蛍光トレーサＴＲ１と蛍光トレーサＴＲ２の中間のサイズである。このように、サイズ違いの蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３としては、本例においては、１ｎｍから数十ｎｍのオーダのサイズ（粒径）の蛍光トレーサＴＲ１と、数百ｎｍのオーダのサイズ（粒径）の蛍光トレーサＴＲ２と、１μｍから１０μｍのオーダのサイズ（粒径）の蛍光トレーサＴＲ３とが含まれる。
【００６３】
蛍光トレーサＴＲとしては、例えば、１ｎｍのサイズ（粒径）の蛍光分子、数ｎｍから１００ｎｍの各種のサイズ（粒径）のデキストラン、及び１０ｎｍから１００μｍの各種のサイズ（粒径）の蛍光ビーズなどを使用することができる。デキストランとしては、例えば、フルオレセイン、アレクサ、及びテトラメチルローダミン等がある。また、蛍光トレーサＴＲとしては、蛍光色素で標識された赤血球を使用してもよい。赤血球のサイズ（粒径）は、約６μｍから約８μｍである。評価液２１に含有される蛍光トレーサＴＲのサイズの組み合わせは、これらの蛍光トレーサの中から適宜選択される。
【００６４】
図８に示すように、細胞シート２０は、透過膜３６上に複数の細胞２０Ａが結合された状態で配列されたものである。細胞シート２０は、例えば次のように形成される。まず、流路デバイス１１の製造時において、第１流路２５を通じて培地及び細胞２０Ａを透過膜３６に供給する。これにより、透過膜３６上で細胞が培養され、透過膜３６上に複数の細胞２０Ａが結合された状態で配列される。培養された細胞シート２０は透過膜３６に吸着する。
【００６５】
流路デバイス１１の第１流路２５は、例えば、血管としてシミュレートされる。この場合は、細胞シート２０としては、例えば、血管の内壁を構成する内皮細胞が形成される。内皮細胞には、細胞２０Ａ間に密着結合（タイトジャンクション）２０Ｂが形成される。密着結合は、細胞２０Ａ同士が接着したときに発現するタンパク質である。細胞シート２０のように密着結合がある細胞シートは、細胞２０Ａ間が隙間なく形成される。このような密着結合２０Ｂを有する細胞シート２０は、欠陥が生じていない場合は高いバリア性を有している。
【００６６】
図９に示すように、細胞シート２０の欠陥ＤＦの種類には、例えば、隣接する細胞２０Ａ間の密着結合２０Ｂが破壊されることにより生じる欠陥ＤＦ１、死滅した細胞などの一部の細胞２０Ａが細胞シート２０から脱落することにより生じる欠陥ＤＦ２、細胞シート２０の一部が剥離することにより生じる欠陥ＤＦ３というように様々なものがある。  細胞シート２０の部分的な剥離による欠陥ＤＦ３は、例えば、細胞２０Ａの透過膜３６に対する吸着が不完全な部分が、第１流路２５を流れる液体と接触することによって引き起こされる。
【００６７】
流路デバイス１１のように、微細な第１流路２５内に細胞シート２０が設けられる場合は、第１流路２５内を流れる液体の流体抵抗は大きい。そのため、液体と細胞シート２０とが接触した場合、細胞シート２０の剥離が生じやすい。
【００６８】
これらの欠陥ＤＦ１からＤＦ２３のサイズは様々である。例えば、密着結合２０Ｂの破壊により生じる欠陥ＤＦ１のサイズは、数ｎｍから数十ｎｍのオーダであるのに対して、細胞２０Ａの脱落により生じる欠陥ＤＦ２のサイズは、数百ｎｍのオーダであり、細胞シート２０の部分的な剥離により生じる欠陥ＤＦ３は、１μｍから１００μｍのオーダである。欠陥ＤＦ１からＤＦ３のうち、欠陥ＤＦ１は、サイズが最も小さい（小サイズ）。欠陥ＤＦ３は、サイズが最大である（大サイズ）。欠陥ＤＦ２は、中サイズである。ここで、欠陥ＤＦ１からＤＦ３についても、蛍光トレーサＴＲと同様に、各欠陥ＤＦ１からＤＦ３を区別することなく、総称する場合は、数字を付すこと無く、単に欠陥ＤＦと呼ぶ。
【００６９】
小サイズの欠陥ＤＦ１は、小サイズの蛍光トレーサＴＲ１が透過可能なサイズであり、中サイズの欠陥ＤＦ２は、中サイズの蛍光トレーサＴＲ２が透過可能なサイズであり、大サイズの欠陥ＤＦ３は、大サイズの蛍光トレーサＴＲ３が透過可能なサイズである。
【００７０】
図１０に示すように、第１流路２５に対して、３種類のサイズの蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３が混在する評価液２１を流すと、図１０Ａに示すように、細胞シート２０に欠陥ＤＦが生じていない場合は、第２流路２６への蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３を含む漏出液２１Ａの漏出はない。これに対して、図１０Ｂに示すように、細胞シート２０に欠陥ＤＦが生じると、欠陥ＤＦのサイズに応じて、３種類のサイズの蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３のうち、少なくとも小サイズの蛍光トレーサＴＲ１を含む漏出液２１Ａが漏出する。
【００７１】
符号４６は、検出部１７が、蛍光トレーサＴＲを含む漏出液２１Ａの漏出状況を検出する検出位置を示す。検出位置４６は、連通部分であるスリット３４Ａに対応する位置から漏出する蛍光トレーサＴＲの流れ方向の下流側であって、第１流路２５及び第２流路２６のうち、第２流路２６にのみ励起光が入射する位置に設定される。
【００７２】
後述するように、検出部１７は、励起光を照射する励起光源５６（図１１参照）を有している。すなわち、励起光源５６は、装着部１６に装着された流路デバイス１１において、連通部分に対応するスリット３４Ａ及び細胞シート２０の欠陥ＤＦから漏出する評価液２１の流れ方向の下流側であって、第１流路２５及び第２流路２６のうち、第２流路２６にのみ入射する位置に励起光を照射する。
【００７３】
図１１に示すように、検出部１７は、第1検出器５１と、第２検出器５２と、第３検出器５３と、第１鏡胴部５４と、第２鏡胴部５５と、励起光源５６と、シャッタ部５７と、対物レンズ５８とを備えている。励起光源５６は、例えば半導体レーザなどのレーザ光源であり、励起光として、例えば、中心波長が４７６ｎｍの励起光ＬＢ（図１２参照）を発する。
【００７４】
シャッタ部５７は、励起光源５６の照射方向の前方に配置される。シャッタ部５７は、励起光を遮蔽するシャッタ５７Ａを開き位置と閉じ位置との間で移動させる。一例として、シャッタ５７Ａは、電動で動作する電動シャッタである。シャッタ５７Ａが開き位置にあるときに、励起光ＬＢが第１鏡胴部５４内に入射する。一方、シャッタ５７Ａが閉じ位置にあるときはシャッタ５７Ａによって励起光ＬＢが遮蔽されて、励起光ＬＢの入射が禁止される。
【００７５】
図１２は、主として第１鏡胴部５４内の光学部品の構成を示す。図１２Ａは、第１鏡胴部５４の内部を平面視した平面図である。図１２Ｂは、第１鏡胴部５４の内部を側面視した側面図である。第１鏡胴部５４内には、ダイクロイックミラーＤＭ０からＤＭ３、及び集光レンズ５９などの光学部品が設けられている。ダイクロイックミラーＤＭ０からＤＭ３は特定の波長域の光を反射又は透過させる光学フィルタである。
【００７６】
図１３において、図１３Ａに示すように、ダイクロイックミラーＤＭ１は、５０５ｎｍ未満の波長の光を反射し、５０５ｎｍ以上の波長の光を透過する透過特性を有する。図１３Ｂに示すように、ダイクロイックミラーＤＭ２は、５６７ｎｍ未満の波長の光を反射し、５６７ｎｍ以上の波長の光を透過する透過特性を有する。図１３Ｃに示すように、ダイクロイックミラーＤＭ３は、６５０ｎｍ未満の波長の光を反射し、６５０ｎｍ以上の波長の光を透過する透過特性を有する。
【００７７】
なお、図１３においては、図示を省略するが、ダイクロイックミラーＤＭ０は、９００ｎｍ未満の波長の光を反射し、９００ｎｍ以上の波長の光を透過する透過特性を有する（図１５参照）。ダイクロイックミラーＤＭ０は、蛍光ＦＬ１からＦＬ３及びＬＢに対しては、波長選択制は不要であるため、鏡面反射する反射ミラーを用いてもよい。しかし、反射ミラーを使用すると、９００ｎｍ以上の波長域の赤外線も反射してしまう。第１検出器５１から第３検出器５３に赤外線が入射すると、温度上昇の原因となるため、好ましくない。そのため、反射ミラーではなく、ダイクロイックミラーＤＭ０が使用される。
【００７８】
図１２Ａに示すように、シャッタ５７Ａを通過して第１鏡胴部５４に入射する励起光ＬＢは、中心波長が４７６ｎｍなので、ダイクロイックミラーＤＭ１で反射する。ダイクロイックミラーＤＭ１は、励起光ＬＢをダイクロイックミラーＤＭ０に向けて反射する。ダイクロイックミラーＤＭ０は、入射した励起光ＬＢを、第２鏡胴部５５の下流端に配置される対物レンズ５８に向けて反射する。
【００７９】
対物レンズ５８は、装着部１６に装着された流路デバイス１１の検出位置４６（図１０参照）に励起光ＬＢを入射させる。対物レンズ５８は、第２流路２６の幅Ｗ２（本例では４００ｎｍ）に、励起光ＬＢのスポット径が収まるように励起光ＬＢを集光する。
【００８０】
第２流路２６内に蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３の漏出がある場合は、検出位置４６に励起光ＬＢが照射されることにより、蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３のそれぞれから、それぞれの波長域の蛍光ＦＬ１からＦＬ３が発光する。本例において、励起光源５６は１つであり、各蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３は、１種類の励起光ＬＢによって、それぞれ異なる波長域の蛍光ＦＬ１からＦＬ３を発する。
【００８１】
図１４において、各蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３のそれぞれの蛍光ＦＬ１からＦＬ３の波長域の一例を示す。図１４Ａに示すように、小サイズの蛍光トレーサＴＲ１が発光する蛍光ＦＬ１は、約５００ｎｍから約７００ｎｍの範囲の波長域を有している。図１４Ｂに示すように、中サイズの蛍光トレーサＴＲ２が発光する蛍光ＦＬ２は、約５７０ｎｍから約６４０ｎｍの範囲の波長域を有している。図１４Ｃに示すように、大サイズの蛍光トレーサＴＲ３が発光する蛍光ＦＬ３は、約６６０ｎｍから約８５０ｎｍの範囲の波長域を有している。
【００８２】
図１５に示すように、ダイクロイックミラーＤＭ１は、これらの３種類の蛍光ＦＬ１からＦＬ３をすべて透過する。ダイクロイックミラーＤＭ２は、３種類の蛍光ＦＬ１からＦＬ３のうち、蛍光ＦＬ２及びＦＬ３を透過する。ダイクロイックミラーＤＭ３は、蛍光ＦＬ３を透過する。
【００８３】
図１２に戻って、ダイクロイックミラーＤＭ０には、各蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３が発する蛍光ＦＬ１からＦＬ３が入射する。また、蛍光ＦＬ１からＦＬ３に加えて、流路デバイス１１において反射して対物レンズ５８に再入射する励起光ＬＢも再入射する。
【００８４】
蛍光ＦＬ１からＦＬ３、及び励起光ＬＢは、ダイクロイックミラーＤＭ０で反射して、ダイクロイックミラーＤＭ１に入射する。ダイクロイックミラーＤＭ１は、励起光ＬＢを反射して、蛍光ＦＬ１からＦＬ３を透過する。本例においては、ダイクロイックミラーＤＭ１は、２枚構成になっており、１枚目のダイクロイックミラーＤＭ１を透過した蛍光ＦＬ１からＦＬ３は、２枚目のダイクロイックミラーＤＭ１も透過する。ダイクロイックミラーＤＭ１が２枚構成になっている理由は、励起光ＬＢとして、光強度の高いレーザ光を使用しているため、このレーザ光を確実にカットするためである。
【００８５】
ダイクロイックミラーＤＭ１の後段には、ダイクロイックミラーＤＭ２が配置されている。ダイクロイックミラーＤＭ２は、蛍光ＦＬ２及びＦＬ３を透過する一方、蛍光ＦＬ１を、第１検出器５１に向けて反射する。反射された蛍光ＦＬ１は、集光レンズ５９によって集光される。集光された光束は、第１検出器５１内の受光部５１Ａに入射する。このように、ダイクロイックミラーＤＭ２によって、蛍光ＦＬ１と、蛍光ＦＬ２及びＦＬ３とが分離される。
【００８６】
ダイクロイックミラーＤＭ２を通過した蛍光ＦＬ２及びＦＬ３は、ダイクロイックミラーＤＭ３に入射する。ダイクロイックミラーＤＭ３は、蛍光ＦＬ３を透過する一方、蛍光ＦＬ２を、第２検出器５２に向けて反射する。反射された蛍光ＦＬ２は、集光レンズ５９によって集光される。集光された光束は、第２検出器５２内の受光部５２Ａに入射する。このように、ダイクロイックミラーＤＭ３によって、蛍光ＦＬ２と、蛍光ＦＬ３とが分離される。
【００８７】
ダイクロイックミラーＤＭ３を透過した蛍光ＦＬ３は、集光レンズ５９によって集光される。集光された光束は、第３検出器５３内の受光部５３Ａに入射する。
【００８８】
このように、ダイクロイックミラーＤＭ２及びＤＭ３は、３種類の蛍光ＦＬ１からＦＬ３をそれぞれ分離するための光学フィルタとして機能する。第１検出器５１から第３検出器５３の各受光部５１Ａから５３Ａは、蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３及びそれぞれに対応する蛍光ＦＬ１からＦＬ３毎に３つ設けられている。第１検出器５１から第３検出器５３の各受光部５１Ａから５３Ａは、ダイクロイックミラーＤＭ２及びＤＭ３によって分離された３種類の蛍光ＦＬ１からＦＬ３のそれぞれを受光する。
【００８９】
第１検出器５１から第３検出器５３の各受光部５１Ａから５３Ａは、一例としてフォトマルチプライヤーが用いられる。フォトマルチプライヤーは、蛍光顕微鏡と比較して、感度が約１００倍程度高いため、Ｓ／Ｎ（Signal/Noise）比の高い検出信号が得られる。第１検出器５１から第３検出器５３のそれぞれは、各蛍光ＦＬ１からＦＬ３の光強度に応じた電圧信号（電圧［Ｖ：Volt］）を検出信号として出力する。
【００９０】
図１６は、各検出器５１から５３のそれぞれが出力する、各蛍光ＦＬ１からＦＬ３の検出信号の一例である。図１６において、横軸は時間であり、図１６に示すグラフは、各検出器５１から５３が出力する各蛍光ＦＬ１からＦＬ３のそれぞれの検出信号の時間変化を示す。検出信号は、各蛍光ＦＬ１からＦＬ３の光強度を表す信号である。蛍光ＦＬの光強度は、蛍光トレーサＴＲの漏出量を表すものであるため、検出信号の時間変化は、蛍光トレーサＴＲの漏出量の時間変化を表すものである。蛍光トレーサＴＲの漏出量は、各蛍光トレーサＴＲの漏出状況の一例である。
【００９１】
また、各検出器５１から５３は、例えば、検出信号の出力間隔を最大で約１ｍｓという短い間隔に設定することが可能である。出力間隔は、目的に応じて適宜設定される。
【００９２】
図１７に示すように、制御装置１３を構成するコンピュータは、ストレージデバイス６０、メモリ６１、ＣＰＵ（Central Processing Unit）６２、通信部６３、ディスプレイ６４、および入力デバイス６５を備えている。これらはデータバス６６を介して相互接続されている。
【００９３】
ストレージデバイス６０は、制御装置１３を構成するコンピュータに内蔵、またはケーブル及びネットワークなどを通じて接続されたハードディスクドライブである。もしくはストレージデバイス６０は、ハードディスクドライブを複数台連装したディスクアレイである。また、ストレージデバイス６０は、コンピュータの外部に配置されて、制御装置１３とネットワーク接続されていてもよい。ストレージデバイス６０には、オペレーティングシステム等の制御プログラム、各種アプリケーションプログラム（ＡＰ：Application Program）６０Ａ、およびこれらのプログラムに付随する各種データ等が記憶されている。
【００９４】
メモリ６１は、ＣＰＵ６２が処理を実行するためのワークメモリである。ＣＰＵ６２は、ストレージデバイス６０に記憶されたプログラムをメモリ６１へロードして、プログラムにしたがった処理を実行することにより、コンピュータの各部を統括的に制御する。
【００９５】
通信部６３は、ＬＡＮ(Local Area Network)、インターネット、又は公衆通信網等のＷＡＮ（Wide Area Network）といったネットワークを介した各種情報の伝送制御を行うネットワークインターフェースである。ディスプレイ６４は各種画面を表示する。各種画面にはＧＵＩ(Graphical User Interface)による操作機能が備えられる。制御装置１３を構成するコンピュータは、各種画面を通じて、入力デバイス６５からの操作指示の入力を受け付ける。入力デバイス６５は、キーボード、マウス、及びタッチパネル等である。
【００９６】
ＡＰ６０Ａには、測定装置１０の作動プログラムが含まれている。作動プログラムは、コンピュータを測定装置１０の制御装置１３として機能させるためのプログラムである。ストレージデバイス６０には、作動プログラムに加えて、作動プログラムを実行する際に必要な各種のデータが格納されている。
【００９７】
図１８に示すように、作動プログラムが起動されると、制御装置１３を構成するコンピュータのＣＰＵ６２は、メモリ６１等と協働して、検出制御部６２１、データ処理部６２２、及び出力制御部６２３として機能する。また、データ処理部６２２は、信号処理部６２２Ａ、濃度導出部６２２Ｂ、及び欠陥状態導出部６２２Ｃとして機能する。
【００９８】
検出制御部６２１は、検出部１７に対して制御信号を送信することで、検出部１７の各部、具体的には、励起光源５６、シャッタ部５７、第１検出器５１から第３検出器５３のそれぞれの動作を制御する。また、検出制御部６２１は、各検出器５１から５３の検出信号を取得して、取得した検出信号をデータ処理部６２２に出力する。検出制御部６２１は、検出部１７からの検出信号を取得する取得部として機能する。
【００９９】
データ処理部６２２は、各検出部１７が出力する検出信号に対して、データ処理を施す。データ処理部６２２において、検出制御部６２１から出力される検出信号は、信号処理部６２２Ａに入力される。
【０１００】
信号処理部６２２Ａは、検出信号に対して信号処理を施す。信号処理には、補正処理、オーバーラップ部分を除去する除去処理、及び変換処理などが含まれる。補正処理は、受光部５１Ａから５３Ａのそれぞれの暗電流の補正処理などが含まれる。
【０１０１】
オーバーラップ部分の除去処理は、複数種類の光の波長域がオーバーラップする部分を、それぞれの光に対応する検出信号から除去する処理である。本例においては、複数種類の蛍光ＦＬ１からＦＬ３の波長域がオーバーラップする部分を、各蛍光ＦＬ１からＦＬ３に対応する検出信号から除去する。図１５においてハッチングで示したように、蛍光ＦＬ１の波長域の一部は、蛍光ＦＬ２及びＦＬ３のそれぞれの波長域と一部オーバーラップしている。そのため、蛍光ＦＬ２及びＦＬ３に対応するそれぞれの検出信号には、蛍光ＦＬ１のオーバーラップ部分が含まれている。除去処理においては、蛍光ＦＬ２及びＦＬ３の検出信号から、蛍光ＦＬ１のオーバーラップ部分が除去される。
【０１０２】
例えば、蛍光ＦＬ２及びＦＬ３に対応する第２検出器５２及び第３検出器５３に対して、蛍光ＦＬ１が入射する入射光量と、蛍光ＦＬ１が第１検出器５１に入射する入射光量との対応関係が予め測定される。信号処理部６２２Ａは、この対応関係に基づいて、第１検出器５１が出力する検出信号の値に応じて、オーバーラップ部分を算出する。そして、算出したオーバーラップ部分を、第２検出器５２及び第３検出器５３の検出信号から除去する。
【０１０３】
また、変換処理は、電圧値を表す検出信号を、光強度を表す検出信号である光強度データに変換する処理である。
【０１０４】
図１９において、こうした信号処理部６２２Ａの処理の概要を示す。信号処理部６２２Ａは、上述のとおり、暗電流補正等の補正処理（補正）、オーバーラップ部分の除去処理（オーバーラップ部分除去）、変換処理（変換）の各処理を実行する。変換処理によって、電圧値の時間変化が、光強度の時間変化に変換される。信号処理部６２２Ａは、光強度データを濃度導出部６２２Ｂに出力する。
【０１０５】
図２０に示すように、濃度導出部６２２Ｂは、信号処理部６２２Ａから、光強度データを取得する。濃度導出部６２２Ｂは、検出信号としての光強度データに基づいて、第１流路２５から第２流路２６に漏出した複数種類の蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３のそれぞれの濃度を導出する。
【０１０６】
濃度導出には、検量線ＣＲが用いられる。ストレージデバイス６０内には各種データとして、検量線ＣＲが格納されている。検量線ＣＲは、評価液２１に含まれる各蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３のそれぞれの濃度と、各蛍光ＦＬ１からＦＬ３のそれぞれの光強度との関係を示す。濃度は、第１流路２５に供給される評価液２１に含まれる各蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３のそれぞれの濃度を１００とした場合の濃度である。各蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３の第１流路２５から第２流路２６への漏出が多いほど、濃度は高い。こうした検量線ＣＲは、予め測定され、測定されたデータが、ストレージデバイス６０内に格納される。
【０１０７】
濃度導出部６２２Ｂは、光強度データ及び検量線ＣＲを用いて、図２０に一例として示すように、蛍光トレーサＴＲ１の濃度は１５％、蛍光トレーサＴＲ２の濃度は１０％、蛍光トレーサＴＲ３の濃度は５％といった濃度を導出する。検量線ＣＲは、テーブルとして格納されていてもよいし、関数として格納されていてもよい。濃度導出部６２２Ｂは、導出した濃度を欠陥状態導出部６２２Ｃに出力する。
【０１０８】
図１８において、欠陥状態導出部６２２Ｃは、濃度導出部６２２Ｂが導出した、各蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３の濃度に基づいて、細胞シート２０に生じている欠陥の状態を導出する。
【０１０９】
図２１は、蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３のサイズと、細胞シート２０に生じる欠陥ＤＦのサイズ毎の透過の可否との関係を示す。小サイズの蛍光トレーサＴＲ１は、図９で示した、小サイズの欠陥ＤＦ１、中サイズの欠陥ＤＦ２、及び大サイズの欠陥ＤＦ３のすべての欠陥ＤＦを透過可能である。中サイズの蛍光トレーサＴＲ２は、小サイズの欠陥ＤＦ１を透過することできないが、中サイズの欠陥ＤＦ２及び大サイズの欠陥ＤＦ３を透過可能である。大サイズの蛍光トレーサＴＲ３は、小サイズの欠陥ＤＦ１及び中サイズの欠陥ＤＦ２を透過することはできず、大サイズの欠陥ＤＦ３のみ透過可能である。
【０１１０】
このように、小サイズの蛍光トレーサＴＲ１は、小サイズ、中サイズ及び大サイズのすべてのサイズの欠陥ＤＦ１からＤＦ３を透過可能であり、また、中サイズの蛍光トレーサＴＲ２は、中サイズ及び大サイズの欠陥ＤＦ２及びＤＦ３を透過可能である。このため、各サイズの蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３の濃度だけでは、細胞シート２０に生じる欠陥状態、例えば、サイズが異なる複数種類の欠陥ＤＦ１からＤＦ３のおおよその割合などを把握することができない。つまり、小サイズの蛍光トレーサＴＲ１は、小サイズの欠陥ＤＦ１だけでなく、中サイズの欠陥ＤＦ２及び大サイズの欠陥ＤＦ３を透過するため、蛍光トレーサＴＲ１の濃度が、小サイズの欠陥ＤＦ１の面積にのみ依存しているわけではないからである。
【０１１１】
そこで、欠陥状態導出部６２２Ｃは、次のような手順で欠陥状態を導出する。まず、図２２に示すように、細胞シート２０上の欠陥ＤＦの総面積と、各蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３のそれぞれの漏出量の指標である濃度との関係Ｇを予め測定する。関係Ｇは、各蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３を１種類ずつ、評価液２１に含有させた状態で測定される。図９に示したように、欠陥ＤＦのサイズは種々のサイズが考えられるが、関係Ｇにおける欠陥ＤＦの総面積は、例えば、各蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３のそれぞれが透過可能なサイズの欠陥ＤＦの総面積である。
【０１１２】
すなわち、図２２に示す関係Ｇは、細胞シート２０に生じる欠陥ＤＦの総面積がどの程度のときに、各蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３がそれぞれどの程度、第２流路２６に漏出するかを表す。この関係Ｇを示すデータは、関数又はテーブルの形態で、ストレージデバイス６０内に格納される。
【０１１３】
図２３及び図２４に示すように、欠陥状態導出部６２２Ｃは、濃度導出部６２２Ｂが導出した濃度の測定値と、関係Ｇとを用いて、欠陥状態導出処理を実行する。
【０１１４】
図２４に示すように、欠陥状態導出処理において、欠陥状態導出部６２２Ｃは、まず、第１処理を実行する。第１処理は、各蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３のそれぞれの濃度から、個別に欠陥ＤＦの仮総面積を導出する処理である。第１処理において、欠陥状態導出部６２２Ｃは、各蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３のそれぞれの濃度に基づいて、関係Ｇを参照して、濃度に対応する総面積を求める。この総面積を仮総面積とする。
【０１１５】
図２４において一例として示すように、小サイズの蛍光トレーサＴＲ１の濃度が１５％の場合は、細胞シート２０の欠陥ＤＦの仮総面積は、１０００である。そして、中サイズの蛍光トレーサＴＲ２の濃度が１０％の場合は、欠陥ＤＦの仮総面積は、７００であり、大サイズの蛍光トレーサＴＲ３の濃度が５％の場合は、欠陥ＤＦの仮総面積は、２００である。なお、図２４において、仮総面積は、一例として規格化された値であり、単位は無い。
【０１１６】
欠陥状態導出部６２２Ｃは、第１処理の後、第２処理を実行する。第２処理は、仮総面積から、サイズ毎の欠陥ＤＦ１からＤＦ３の面積を導出する。欠陥状態導出部６２２Ｃは、サイズが異なる欠陥ＤＦ１からＤＦ３のうち、大きい方から順に面積を求める。まず、図２１に示したとおり、大サイズの蛍光トレーサＴＲ３は、大サイズの欠陥ＤＦ３しか透過しない。そのため、大サイズの蛍光トレーサＴＲ３に基づいて求めた、欠陥ＤＦの仮総面積の２００は、大サイズの欠陥ＤＦ３のみの総面積と考えられる。そのため、大サイズの蛍光トレーサＴＲ３に基づいて求めた仮総面積の２００は、そのまま大サイズの欠陥ＤＦ３の面積として求められる。
【０１１７】
次に、欠陥状態導出部６２２Ｃは、中サイズの欠陥ＤＦ２の面積を求める。中サイズの蛍光トレーサＴＲ２は、中サイズの欠陥ＤＦ２に加えて、大サイズの欠陥ＤＦ３も透過する。そのため、中サイズの蛍光トレーサＴＲ２に基づいて求めた、欠陥ＤＦの仮総面積の７００には、大サイズの欠陥ＤＦ３の面積が含まれていると考えられる。そのため、中サイズの蛍光トレーサＴＲ２に基づいて求めた、仮総面積の７００から、大サイズの欠陥ＤＦ３の面積である２００を控除する。欠陥状態導出部６２２Ｃは、これにより求めた５００という値を、中サイズの欠陥ＤＦ２の面積とする。
【０１１８】
最後に、欠陥状態導出部６２２Ｃは、小サイズの欠陥ＤＦ１の面積を求める。小サイズの蛍光トレーサＴＲ１は、小サイズの欠陥ＤＦ１に加えて、中サイズ及び大サイズの欠陥ＤＦ２及びＤＦ３も透過する。そのため、小サイズの蛍光トレーサＴＲ１に基づいて求めた、欠陥ＤＦの仮総面積の１０００には、中サイズの欠陥ＤＦ２の面積及び大サイズの欠陥ＤＦ３の面積が含まれていると考えられる。そのため、小サイズの蛍光トレーサＴＲ１に基づいて求めた、仮総面積１０００から、中サイズの欠陥ＤＦ２の面積である５００と、大サイズの欠陥ＤＦ３の面積である２００とを控除する。欠陥状態導出部６２２Ｃは、これにより求めた３００という値を、小サイズの欠陥ＤＦ１の面積とする。
【０１１９】
欠陥状態導出部６２２Ｃは、このように、サイズが異なる蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３のそれぞれの濃度と、関係Ｇとに基づいて、細胞シート２０に生じたサイズが異なる欠陥ＤＦ１からＤＦ３のおおよその割合を、欠陥状態として導出する。
【０１２０】
図２５に示す測定結果表示画面６９は、ディスプレイ６４に表示される画面の一例である。図１８に示す出力制御部６２３は、こうした測定結果表示画面６９を生成し、測定結果表示画面６９の内容をリアルタイムで更新する。図１８に示したように、出力制御部６２３には、信号処理部６２２Ａが処理した光強度データ、濃度導出部６２２Ｂが導出した濃度、及び欠陥状態導出部６２２Ｃが導出した欠陥状態といった測定データが入力される。こうした測定データは、蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３の漏出状況を表すものであり、細胞シート２０のバリア性を評価するための指標となる。
【０１２１】
出力制御部６２３は、測定結果表示画面６９にこうした測定データを測定結果として表示する。光強度データ、濃度、及び欠陥状態といった測定データは、リアルタイムで取得される検出信号に基づいて更新される。出力制御部６２３は、測定データをリアルタイムで表示する。これにより、蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３の漏出状況がリアルタイムでディスプレイ６４に出力される。出力制御部６２３は、漏出状況を出力する出力制御処理を実行する処理部として機能する。
【０１２２】
以下、上記構成による作用について、図２６に示すフローチャートを参照しながら説明する。本例において、測定装置１０のユーザは、流路デバイス１１の製造メーカである。ユーザは、製造した流路デバイス１１の細胞シート２０のバリア性を評価する場合に、測定装置１０を用いる。
【０１２３】
まず、ステップＳ１１００において、流路デバイス１１は、測定装置１０にセットされる。具体的には、流路デバイス１１は、装着部１６に装着される。そして、図１に示すように、流路デバイス１１に対して、供給チューブ２２Ａ及び排出チューブ２２Ｂが取り付けられる。さらに、３種類の蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３が混在した評価液２１が予め調整され、調整された評価液２１がポンプ２２Ｃのタンクにセットされる。
【０１２４】
ステップＳ１２００において、測定開始ボタンなどの操作指示により、測定開始指示が入力されると、測定装置１０は測定を開始する。具体的には、検出制御部６２１は、検出部１７の励起光源５６及び第１検出器５１から第３検出器５３等の各部の動作を開始させる。これにより、第１検出器５１から第３検出器５３のそれぞれから検出信号の出力が開始される。
【０１２５】
ステップＳ１３００において、ポンプ２２Ｃの動作が開始されると、複数種類のトレーサとして、３種類の蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３が混在した評価液２１が流路デバイス１１に供給される。これにより、評価液２１の第１流路２５への送液が開始される。
【０１２６】
ステップＳ１４００において、検出部１７の第１検出器５１から第３検出器５３は、それぞれ検出信号を出力する。細胞シート２０に欠陥ＤＦが生じていない場合は、第２流路２６への蛍光トレーサＴＲの漏出はない。この場合、第１検出器５１から第３検出器５３は、ベースラインを示す検出信号を出力する。
【０１２７】
一方、細胞シート２０に欠陥ＤＦが生じている場合は、評価液２１に混在する３種類の蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３のうちの少なくとも１種類が、欠陥ＤＦを透過して、第１流路２５から第２流路２６に漏出する。検出部１７からは、第２流路２６の検出位置４６に励起光ＬＢが照射されている。励起光ＬＢは、第２流路２６に蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３が漏出されると、蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３に励起光ＬＢが照射されることにより、蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３の各蛍光ＦＬ１からＦＬ３を発する。検出部１７の第１鏡胴部５４内のダイクロイックミラーＤＭ１からＤＭ３によって、各蛍光ＦＬ１からＦＬ３は、光学的に分離されて、第１検出器５１から第３検出器５３のそれぞれに入射する。
【０１２８】
第１検出器５１から第３検出器５３は、３種類の蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３のそれぞれに対応する蛍光ＦＬ１からＦＬ３のそれぞれの光強度に応じて、漏出した蛍光トレーサＴＲ毎の検出信号を出力する。すなわち、各蛍光ＦＬ１からＦＬ３のそれぞれの光強度は、蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３のそれぞれの漏出状況を表している。すなわち、検出部１７は、各蛍光ＦＬ１からＦＬ３の光強度を区別して検出することにより、各蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３の漏出状況を光学的に区別して検出する。検出制御部６２１は、検出部１７から、検出信号を取得し、データ処理部６２２に出力する。
【０１２９】
ステップＳ１５００において、データ処理部６２２は、検出信号に対してデータ処理を施す。信号処理部６２２Ａは、図１９に示すように、検出信号に対して、補正処理、オーバーラップ除去処理、及び変換処理などを実行する。濃度導出部６２２Ｂは、信号処理が施された光強度データに対して、図２０に示す濃度導出処理を実行して、濃度を導出する。欠陥状態導出部６２２Ｃは、濃度導出部６２２Ｂが導出した濃度に基づいて、図２３及び図２４に示す欠陥状態導出処理を実行して、欠陥状態を導出する。
【０１３０】
ステップＳ１６００において、出力制御部６２３は、データ処理部６２２によって処理された測定データを測定結果として測定結果表示画面６９を生成し、測定結果をディスプレイ６４にリアルタイムで表示する。ユーザは、測定結果表示画面６９の測定結果に基づいて、各蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３の漏出の有無、漏出量及び漏出量の時間変化などを含む漏出状況、さらには、細胞シート２０の欠陥状態を確認することができる。こうした測定結果は、細胞シート２０のバリア性を評価するための指標であるので、ユーザは、こうした測定結果に基づいて細胞シート２０のバリア性を評価する。
【０１３１】
ステップＳ１７００において、予め設定された時間が未経過の場合は（Ｓ１７００でＮ）、ステップＳ１４００からＳ１６００の測定処理が継続される。ステップＳ１７００において、予め設定された時間が経過した場合は（Ｓ１７００でＹ）、ステップＳ１８００に進む。ステップＳ１８００において、評価液の送液、検出部１７の動作が停止されることにより、測定が終了される。
【０１３２】
本開示の技術に係る測定装置１０は、サイズが異なる複数種類のトレーサとして、３種類の蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３が混在する評価液２１が、第１流路２５に送液された場合において、細胞シート２０に生じる欠陥ＤＦを通じて第１流路２５から第２流路２６に漏出する複数の蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３のそれぞれの漏出状況を光学的に区別して検出する検出部１７を有している。そのため、従来と比べて、時間と手間をかけることなく、細胞シート２０に生じるサイズが異なる複数種類の欠陥ＤＦを検出することができる。
【０１３３】
このような本開示の技術に係る測定装置１０の効果について、図２７に示す比較例を用いてより詳細に説明する。図２７に示す比較例は、３種類の蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３を用いる点は、測定装置１０と同様である。相違点は、これらの各蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３を混在させた評価液２１を用いずに、各蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３を１種類ずつ使用して測定を行う点である。
【０１３４】
より詳しくは、比較例は、小サイズの蛍光トレーサＴＲ１のみを含む第１評価液、中サイズの蛍光トレーサＴＲ２のみを含む第２評価液、及び大サイズの蛍光トレーサＴＲ３のみを含む第３評価液の３種類の評価液を使用する。そして、比較例では、これらの第１評価液から第３評価液を入れ替えながら３回に分けて測定を行う。
【０１３５】
すなわち、まず、ステップＳ２１００において、小サイズの蛍光トレーサＴＲ１のみを含む第１評価液を使用して第１測定を行う。第１測定を行うことにより、小サイズの蛍光トレーサＴＲ１の漏出状況が検出される。
【０１３６】
次の測定を行う前に、ステップＳ２２００において、第１流路２５にバッファを流して、第１流路２５を洗浄する。
【０１３７】
ステップＳ２３００において、中サイズの蛍光トレーサＴＲ２のみを含む第２評価液を使用して第２測定を行う。第２測定を行うことにより、中サイズの蛍光ＦＬ２の漏出状況が検出される。
【０１３８】
次の測定を行う前に、ステップＳ２４００において、第１流路２５にバッファを流して、第１流路２５を洗浄する。
【０１３９】
最後に、ステップＳ２３００において、大サイズの蛍光トレーサＴＲ３のみを含む第３評価液を使用して第３測定を行う。第３測定を行うことにより、大サイズの蛍光ＦＬ３の漏出状況が検出される。
【０１４０】
比較例のように３種類の評価液を入れ替えながら使い分ける方法によっても、各蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３の漏出状況を検出することができる。
【０１４１】
しかしながら、比較例においては、３種類の評価液を入れ替えながら、３回の測定を行う必要があるため、本開示の技術に係る測定装置１０及び測定方法と比較して、時間と手間が掛る。また、比較例では、３種類の評価液を入れ替えながら、３回の測定を行うため、各蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３の漏出状況を、同一の条件で検出することが困難である。というのも、評価液を送液する度に、細胞シート２０には少なからずダメージが生じてしまう。このダメージにより、各測定において、細胞シート２０の欠陥状態が変化してしまうからである。
【０１４２】
さらに、比較例のように、異なる種類の評価液を入れ替える場合には、評価液を入れ替える度に、第１流路２５の洗浄が必要となる。洗浄においても、細胞シート２０とバッファが接触するため、洗浄によっても細胞シート２０に対してダメージが生じる。また、洗浄が必要になる分、さらに、時間と手間も増加する。
【０１４３】
本開示の技術に係る測定装置１０は、複数種類のトレーサが混在する評価液を用いて、１回の測定で各トレーサの漏出状況を検出する。そのため、時間と手間を軽減できるばかりでなく、比較例と比べて、各トレーサの漏出状況を同一の条件で検出することができるという効果が得られる。
【０１４４】
また、複数種類のトレーサとして、波長域が異なる蛍光を発する蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３を使用している。蛍光トレーサＴＲは、サイズ及び蛍光の色などの種類も豊富であるため、適切なトレーサを選択しやすい。
【０１４５】
また、蛍光を検出する検出部１７は、励起光源５６と、複数種類の蛍光ＦＬ１からＦＬ３を分離するための光学フィルタとしてのダイクロイックミラーＤＭ１からＤＭ３と、各ダイクロイックミラーＤＭ１からＤＭ３で分離された蛍光ＦＬ１からＦＬ３を受光する受光部５１Ａから受光部５３Ａとを有する。こうした蛍光を検出する構成は、一般的なので、検出部１７を簡単に製造しやすい。
【０１４６】
また、測定装置１０は、励起光源５６として、レーザ光源を使用しているため、光強度が強い蛍光ＦＬ１からＦＬ３を検出することができる。このため、検出信号のＳ／Ｎ比が向上する。また、第１検出器５１から第３検出器５３として、フォトマルチプライヤーを使用している。このため、蛍光顕微鏡と比較して検出信号のＳ／Ｎ比が向上する。
【０１４７】
また、測定装置１０は、励起光源５６が１つであり、３種類の蛍光ＦＬ１からＦＬ３毎に受光部５１Ａから受光部５３Ａの３つの受光部が設けられている。励起光源５６を１つにすることで、複数の励起光源５６を設ける場合と比べて、構成の簡略化、小型化、及び製造コストの低減が可能となる。また、３つの受光部が設けられているため、例えば、各蛍光ＦＬ１からＦＬ３の波長域に合わせた調整がしやすい。
【０１４８】
また、本開示の技術に係る測定装置１０は、装着部１６に装着された流路デバイス１１において、検出位置４６に励起光ＬＢを照射する。検出位置４６は、スリット３４Ａに対応する連通部分から漏出するトレーサの一例である蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３の流れ方向の下流側であって、第１流路２５及び第２流路２６のうち、第２流路２６にのみ入射する位置の一例である。第１流路２５には励起光ＬＢが入射しないため、第２流路２６に漏出したトレーサのみを確実に検出することができる。
【０１４９】
本開示の技術に係る測定装置１０が検出する漏出状況には、トレーサの一例である蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３の漏出量の時間変化も含まれる。そのため、細胞シート２０の欠陥状態の時間変化を観察することができる。
【０１５０】
また、本開示の技術に係る測定装置１０は、検出部１７が出力する検出信号に対して、データ処理を施すデータ処理部６２２を備えている。これにより、電圧値を表す検出信号を光強度データに変換するなど、観察に適した形態に加工することができる。また、データ処理部６２２によって、濃度及び欠陥状態など、種々の測定結果を得ることができる。
【０１５１】
また、測定装置１０において、信号処理部６２２Ａは、検出信号に対する補正処理、複数種類の光としての蛍光ＦＬ１からＦＬ３の波長域がオーバーラップする部分を、検出信号から除去する除去処理を実行するので、より精度の高い検出信号が得られる。
【０１５２】
例えば、図１９において上段に示すグラフは、オーバーラップ部分の除去処理が実行される前の電圧値の時間変化を示すグラフである。また、図１９において下段に示すグラフは、オーバーラップ部分の除去処理が実行された後の光強度の時間変化を示すグラフである。上段のグラフにおいては、蛍光ＦＬ１から蛍光ＦＬ３の３種類の蛍光ＦＬがすべて単調に増加しているように見える。
【０１５３】
しかしながら、図１９において下段に示すグラフでは、蛍光ＦＬ１の光強度は単調に増加していない。具体的には、蛍光ＦＬ１の光強度は、最初は増加しているが、ピークに達した後、低下している。このように、オーバーラップ部分の除去処理を施すことで、蛍光トレーサＴＲの漏出状況を表す各検出信号の正確な時間変化を把握することができる。
【０１５４】
また、測定装置１０において、濃度導出部６２２Ｂは、複数種類のトレーサの一例である各蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３のそれぞれの濃度を導出する。そのため、蛍光トレーサＴＲの漏出状況を電圧値で表示する場合と比べて、濃度で示すことにより、漏出状況を直感的に把握しやすい。
【０１５５】
測定装置１０において、欠陥状態導出部６２２Ｃは、複数種類のトレーサの一例である各蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３のそれぞれの濃度に基づいて、細胞シート２０に生じている欠陥ＤＦの状態である欠陥状態を導出する。欠陥状態には、例えば、サイズが異なる複数種類の欠陥ＤＦ１からＤＦ３のそれぞれのおおよその割合などが含まれる。こうした欠陥状態を導出することにより、単に欠陥ＤＦの有無を検出する場合と比べて、細胞シート２０のバリア性を詳細に評価することができる。
【０１５６】
測定装置１０において、出力制御部６２３は、検出部１７によって検出された、トレーサの一例である蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３のそれぞれの漏出状況を、リアルタイムでディスプレイ６４に表示する。これにより、蛍光トレーサＴＲの漏出状況の時間変化、及び細胞シート２０の欠陥状態の時間変化をリアルタイムで観察することができる。
【０１５７】
また、流路デバイス１１において、細胞シート２０の支持体として機能する透過膜３６は、直径が１μｍ以上の孔を有する。従来の特表２０１８−５２２５８６号公報においては、細胞シート２０の支持体としてはゲルが用いられている。ゲルは１μｍ以上の大サイズのトレーサを透過しにくい。そのため、透過膜３６を使用することにより、細胞シート２０に生じる１μｍ以上の大サイズの欠陥ＤＦを検出することができる。
【０１５８】
なお、細胞シート２０の支持体として、透過膜３６の代わりにゲルを用いてもよい。細胞シート２０の支持体としてゲルを用いる場合は、ゲルの性質に応じてトレーサのサイズを選択すればよい。しかし、透過膜３６には上述のメリットがあるため、透過膜３６を使用することが好ましい。
【０１５９】
また、複数種類のトレーサの一例である蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３のそれぞれのサイズ（粒径）は、１ｎｍ以上１００μｍ以下の範囲に含まれる。これにより、細胞シート２０の様々なサイズの欠陥ＤＦを検出することができる。
【０１６０】
複数種類のトレーサの一例である蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３は、１ｎｍから数百ｎｍのオーダのサイズ（粒径）のトレーサと、１μｍから数十μｍのオーダのサイズ（粒径）のトレーサとを含む。サイズが異なる欠陥ＤＦの検出を目的とした場合、サイズに大差の無い複数種類のトレーサを使用するメリットは少ない。オーダが異なる程、サイズ（粒径）に大きな違いがあるトレーサを使用することで、サイズが異なる欠陥ＤＦの検出を効率的に行うことができる。
【０１６１】
測定装置１０は、評価液２１を第１流路２５に供給する供給機構２２を備えている。そのため、供給機構を別に用意する場合と比べて、評価液２１の送液がしやすい。なお、測定装置１０には、供給機構２２が設けられていなくてもよい。シリンジ及びピペットなどで供給機構２２を代用することも可能である。
【０１６２】
（変形例１：透過膜の両面に細胞シートを形成）
図８及び図９に示すように、上記例の流路デバイス１１においては、透過膜３６の片面、すなわち、第１流路２５側の面にのみ、細胞シート２０を形成した例で説明した。図２８及び図２９に示すように、透過膜３６のもう１つの面、すなわち、第２流路２６側の面にも、細胞シート８０を形成してもよい。つまり、図２８及び図２９に示す例は、透過膜３６の両面に細胞シートを形成する例である。
【０１６３】
細胞シート８０は、例えば、細胞８０Ａが配列されたものであり、細胞８０Ａは、平滑筋細胞（ＳＭＣ：Smooth Muscle Cell)である。血管の内壁を構成する組織は、基底膜の一方の面に形成される内皮細胞と、他方の面に形成される平滑筋細胞とを含む。そのため、流路デバイス１１を用いて血管をシミュレートする場合は、図２８及び図２９に示すように、透過膜３６を基底膜と見立てて、透過膜３６の一方の面に細胞シート２０を形成し、他方の面に細胞シート８０を形成することで、より実際の血管の組織の構成に近づけることができる。
【０１６４】
平滑筋細胞である細胞８０Ａは、内皮細胞である細胞２０Ａと異なり、密着結合が無い。そのため、図２９に示すように、細胞シート８０は、複数の細胞８０Ａが配列された状態でも、小サイズの蛍光トレーサＴＲ１であれば、細胞８０Ａの隙間を透過することができる。また、細胞シート８０は、細胞シート２０と比較して、剥離もしやすい。
【０１６５】
（変形例２：回転フィルタ）
上記例では、各蛍光トレーサＴＲ１からＴＲ３の各蛍光ＦＬ１からＦＬ３に対応して複数の第１検出器５１から第３検出器５３を設けた例で説明した。しかし、図３０及び図３１に示すように、回転フィルタ９２を用いることで、１つの検出器９１で３種類の蛍光ＦＬ１からＦＬ３を検出することが可能である。
【０１６６】
回転フィルタ９２には、透過特性が異なる光学フィルタとして、複数種類のダイクロイックミラーＤＭ２１からＤＭ２３が設けられている。回転フィルタ９２は、例えば、図示しないモータの駆動によって回転する。この回転により、各ダイクロイックミラーＤＭ２１からＤＭ２３は、蛍光ＦＬ１からＦＬ３の光路内に選択的に挿入される。
【０１６７】
図３１において、図３１Ａに示すように、ダイクロイックミラーＤＭ２１は、蛍光ＦＬ１の波長域のみを透過する透過特性を有するバンドパスフィルタである。図３１Ｂに示すように、ダイクロイックミラーＤＭ２２は、蛍光ＦＬ２の波長域のみを透過する透過特性を有するバンドパスフィルタである。図３１Ｃに示すように、ダイクロイックミラーＤＭ２３は、蛍光ＦＬ３の波長域のみを透過する透過特性を有するバンドパスフィルタである。
【０１６８】
上記例において示した蛍光の波長域と蛍光トレーサのサイズとの組み合わせは一例であり、これらの組み合わせは適宜選択される。例えば、蛍光トレーサのサイズは、細胞シートに生じる欠陥ＤＦのサイズなど、欠陥ＤＦの特性等に応じて選択される。また、蛍光の波長域も、検出部１７の光学フィルタ及び検出器の受光部などの特性に応じて適宜選択される。
【０１６９】
複数種類のトレーサとして、３種類の蛍光トレーサＴＲを使用した例で説明したが、トレーサの数は３種類に限定されず、２種類でもよいし、４種類以上でもよい。
【０１７０】
また、上記例において、トレーサの一例として蛍光トレーサを使用し、蛍光トレーサが発する蛍光を利用して、各トレーサの漏出状況を光学的に区別する例で説明したが、蛍光の代わりに、ラマン散乱光を利用してもよい。光を物質に照射すると、光が物質と相互作用することで入射光と異なる波長を持つラマン散乱光と呼ばれる光がでる。ラマン散乱光は、物質固有のスペクトルを持つ光である。ラマン散乱光を利用する場合は、複数種類のトレーサとして、異なるスペクトルのラマン散乱光を発する、サイズ違いの複数種類のトレーサを使用する。そして、このような複数種類のトレーサがそれぞれ発するラマン散乱光に基づいて、各トレーサの漏出状況が光学的に区別される。
【０１７１】
なお、このようなラマン散乱光は非常に微弱であり、蛍光を検出する検出部１７の構成と比較して、装置構成も複雑になる。そのため、測定装置１０は、蛍光を利用することが好ましい。
【０１７２】
上記各実施形態において、例えば、検出制御部６２１及びデータ処理部６２２といった各種の処理を実行する処理部（Processing Unit）のハードウェア的な構造としては、次に示す各種のプロセッサ（Processor）を用いることができる。各種のプロセッサには、ソフトウェアを実行して各種の処理部として機能する汎用的なプロセッサであるＣＰＵ（Central Processing Unit)に加えて、ＦＰＧＡ（Field Programmable Gate Array）等の製造後に回路構成を変更可能なプロセッサであるプログラマブルロジックデバイス（Programmable Logic Device :ＰＬＤ）、及び／又はＡＳＩＣ（Application Specific Integrated Circuit）等の特定の処理を実行させるために専用に設計された回路構成を有するプロセッサである専用電気回路等が含まれる。
【０１７３】
１つの処理部は、これらの各種のプロセッサのうちの１つで構成されてもよいし、同種または異種の２つ以上のプロセッサの組み合わせ（例えば、複数のＦＰＧＡの組み合わせ、及び／又は、ＣＰＵとＦＰＧＡとの組み合わせ）で構成されてもよい。また、複数の処理部を１つのプロセッサで構成してもよい。
【０１７４】
複数の処理部を１つのプロセッサで構成する例としては、１つ以上のＣＰＵとソフトウェアの組み合わせで１つのプロセッサを構成し、このプロセッサが複数の処理部として機能する形態がある。第２に、システムオンチップ（System On Chip:ＳｏＣ）等に代表されるように、複数の処理部を含むシステム全体の機能を１つのＩＣ（Integrated Circuit）チップで実現するプロセッサを使用する形態がある。このように、各種の処理部は、ハードウェア的な構造として、上記各種のプロセッサの１つ以上を用いて構成される。
【０１７５】
さらに、これらの各種のプロセッサのハードウェア的な構造としては、より具体的には、半導体素子等の回路素子を組み合わせた電気回路（circuitry）を用いることができる。
【０１７６】
また、本開示の技術は、測定装置の作動プログラムに加えて、測定装置の作動プログラムを非一時的に記憶するコンピュータで読み取り可能な記憶媒体（ＵＳＢ（Universal Serial Bus）メモリ又はＤＶＤ（Digital Versatile Disc）−ＲＯＭ（Read Only Memory）など）にもおよぶ。
【０１７７】
本明細書において、「Ａ及び／又はＢ」は、「Ａ及びＢのうちの少なくとも１つ」と同義である。つまり、「Ａ及び／又はＢ」は、Ａだけであってもよいし、Ｂだけであってもよいし、Ａ及びＢの組み合わせであってもよい、という意味である。また、本明細書において、３つ以上の事柄を「及び／又は」で結び付けて表現する場合も、「Ａ及び／又はＢ」と同様の考え方が適用される。
【０１７８】
以上に示した記載内容および図示内容は、本開示の技術に係る部分についての詳細な説明であり、本開示の技術の一例に過ぎない。例えば、上記の構成、機能、作用、および効果に関する説明は、本開示の技術に係る部分の構成、機能、作用、および効果の一例に関する説明である。よって、本開示の技術の主旨を逸脱しない範囲内において、以上に示した記載内容および図示内容に対して、不要な部分を削除したり、新たな要素を追加したり、置き換えたりしてもよいことはいうまでもない。また、錯綜を回避し、本開示の技術に係る部分の理解を容易にするために、以上に示した記載内容および図示内容では、本開示の技術の実施を可能にする上で特に説明を要しない技術常識等に関する説明は省略されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【国際調査報告】
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