(57)【要約】  本発明は酵母によるグルタチオンの安価で効率的な製造方法を目的とする。  本発明は、酵母を、塩基性アミノ酸濃度が０．８ｇ／Ｌ以上である培地中で培養することを特徴とする、グルタチオンの製造方法、並びに、酵母によるグルタチオンの生産を促進する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母を、塩基性アミノ酸濃度が０．８ｇ／Ｌ以上である培地中で培養することを特徴とする、グルタチオンの製造方法。
【請求項２】
前記酵母が、還元型グルタチオン重量を１００としたとき、酸化型グルタチオン重量が２０以上となるように、還元型グルタチオンおよび酸化型グルタチオンを含有する酵母である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵母が、親株と比較してグルタチオンレダクターゼの活性が低下した酵母である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記酵母が、グルタチオンレダクターゼをコードする遺伝子が欠損した酵母である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記グルタチオンレダクターゼが下記（１ａ）〜（１ｅ）：
（１ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、
（１ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルタチオンレダクターゼ活性を有するタンパク質、
（１ｃ）配列番号１に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつグルタチオンレダクターゼ活性を有するタンパク質、
（１ｄ）配列番号２と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつグルタチオンレダクターゼ活性を有するタンパク質、および、
（１ｅ）配列番号２に示す塩基配列において１もしくは複数個の塩基が置換、欠矢、挿入および／または付加されたＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつグルタチオンレダクターゼ活性を有するタンパク質、
からなる群から選択される、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記酵母が、親株と比較してγ−グルタミルシステイン合成酵素および／またはグルタチオン合成酵素の活性が増大した酵母である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記酵母が、γ−グルタミルシステイン合成酵素をコードする塩基配列を含むＤＮＡ、および／またはグルタチオン合成酵素をコードする塩基配列を含むＤＮＡにより形質転換された酵母である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記γ−グルタミルシステイン合成酵素が下記（２ａ）〜（２ｅ）：
（２ａ）配列番号３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、
（２ｂ）配列番号３に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつγ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有するタンパク質、
（２ｃ）配列番号３に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつγ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有するタンパク質、
（２ｄ）配列番号４と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつγ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有するタンパク質、および、
（２ｅ）配列番号４に示す塩基配列において１もしくは複数個の塩基が置換、欠矢、挿入および／または付加されたＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつγ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有するタンパク質、
からなる群から選択される、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記グルタチオン合成酵素が下記（３ａ）〜（３ｅ）：
（３ａ）配列番号５に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、
（３ｂ）配列番号５に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルタチオン合成酵素活性を有するタンパク質、
（３ｃ）配列番号５に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつグルタチオン合成酵素活性を有するタンパク質、
（３ｄ）配列番号６と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつグルタチオン合成酵素活性を有するタンパク質、および、
（３ｅ）配列番号６に示す塩基配列において１もしくは複数個の塩基が置換、欠矢、挿入および／または付加されたＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつグルタチオン合成酵素活性を有するタンパク質、
からなる群から選択される、請求項６または７に記載の方法。
【請求項１０】
前記酵母が、親株と比較してグルタチオン輸送酵素の活性が増大した酵母である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記酵母が、グルタチオン輸送酵素をコードする塩基配列を含むＤＮＡにより形質転換された酵母である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記グルタチオン輸送酵素が下記（４ａ）〜（４ｅ）：
（４ａ）配列番号７に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、
（４ｂ）配列番号７に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルタチオン輸送酵素活性を有するタンパク質、
（４ｃ）配列番号７に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつグルタチオン輸送酵素活性を有するタンパク質、
（４ｄ）配列番号８と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつグルタチオン輸送酵素活性を有するタンパク質、および、
（４ｅ）配列番号８に示す塩基配列において１もしくは複数個の塩基が置換、欠矢、挿入および／または付加されたＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつグルタチオン輸送酵素活性を有するタンパク質、
からなる群から選択される、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記酵母が、サッカロマイセス属、キャンディダ属、またはピキア属の酵母である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記酵母が、塩基性アミノ酸非要求性の酵母である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記培地が炭素源として糖蜜を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
培養開始時において、前記培地中の塩基性アミノ酸濃度が０．８ｇ／Ｌ以上である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記培地中の塩基性アミノ酸濃度が２ｇ／Ｌ以上である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記培地中の塩基性アミノ酸濃度が４ｇ／Ｌ以上である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記塩基性アミノ酸がリジンである、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
酵母を、塩基性アミノ酸濃度が０．８ｇ／Ｌ以上である培地中で培養することを特徴とする、酵母によるグルタチオンの生産を促進する方法。
【請求項２１】
塩基性アミノ酸を含む、酵母によるグルタチオンの生産の促進剤。
【請求項２２】
塩基性アミノ酸濃度が０．８ｇ／Ｌ以上であり、炭素源として糖蜜を含む、酵母用培地組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母によるグルタチオンの製造方法、酵母によるグルタチオンの生産を促進する方法、酵母によるグルタチオンの生産の促進剤、および、酵母によるグルタチオンの生産に適した培地組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビール酵母やパン酵母を始めとするサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属菌に属する酵母は、天然のビタミンＢ群、アミノ酸、およびミネラル等をバランス良く含有しており、ビールやパンの製造に使われる以外にも有効活用されている。例えば、乾燥酵母は我が国において長年にわたって医薬品、食品原料、および調味料などとして使われており、栄養価と安全性の高い素材として認知されている。また、近年は酵母エキスの原料酵母としても広く用いられている。 【０００３】
酵母エキスとは、酵母の培養物から調製され、アミノ酸等を豊富に含むものであり、従来から、旨味やコクを付与するための調味料等のような食品添加剤として使用されている。特に昨今の天然志向の高まりから、調味料としての酵母エキスの需要は増加傾向にある。呈味成分を豊富に含む酵母から調製された酵母エキスは、より優れた調味料として使用し得ることが期待できるため、呈味成分をより多く含む酵母の開発が盛んに行われている。【０００４】
酵母菌体内の代表的な含硫化合物として、グルタチオンとＳ−アデノシルメチオニンがあげられる。一般にグルタチオンは酵母および動物の肝臓等に広く分布しており、生体内の酸化還元反応に深く関与しているトリペプチドであり、肝機能回復作用や解毒作用さらには活性酸素の消去による細胞の老化を防ぐ作用などの重要な役割を果たすものとして、極めて有用な物質である。グルタチオンにはその形態として還元型グルタチオン（以下、ＧＳＨと略称する。）と、２つの還元型グルタチオンがシステイン残基でジスルフィド結合した酸化型グルタチオン（以下、ＧＳＳＧと略称する。）が存在する。両者とも生体内で生合成されており、酸化還元反応において重要な働きをしている。ＧＳＳＧは生体内ではグルタチオン還元酵素により一旦ＧＳＨになり、リサイクルしながら働いている。従って、ＧＳＳＧを投与した場合はＧＳＨと同様の作用が見込まれるといわれている（例えば、ジャーナルオブ  ニュートリショナル  サイエンス  アンド  ビタミノロジー  ４４巻、６１３ページ、１９９８年、等）。【０００５】
含硫化合物は、通常、メチオニンやシステイン等の含硫アミノ酸を用いて、ＭＥＴ遺伝子（メチオニン合成遺伝子）群をはじめとする多くの遺伝子の転写および翻訳産物により合成される。そこで、より含硫化合物を高生産する酵母を得るために、酵母が有しているこれらの含硫化合物の合成に係る遺伝子に変異を生じさせ、含硫化合物高含有酵母変異株を製造することが広く行われている。例えば、グルタチオン高含有酵母を製造する方法として、グルタチオン生産に使用する酵母への突然変異処理（特許文献１〜３）やグルタチオンの合成に関与する酵素を遺伝子組換えにより導入すること（特許文献４〜８）、また、培地中にグルタチオンを構成する３種のアミノ酸であるＬ−グルタミン酸、Ｌ−システイン、グリシンを添加すること（特許文献９〜１２）により、培養菌体内のグルタチオン含量を向上させ生産性を改善させる試みがなされてきた。【０００６】
更に、特許文献１３には、キャンディダ属あるいはブレタノマイセス属に属するメチオニンとＬ−リジン要求性の微生物を、メチオニンとリジンを含有する培地で培養することを特徴とする、発酵法によるグルタチオンの製造方法が開示されている。特許文献１３では、メチオニンとリジンを含有する培地として、メチオニンを２００〜５００μｇ／ｍＬ、および、Ｌ−リジンを３００〜７５０μｇ／ｍＬ含有する培地が記載されている。【０００７】
一方、特許文献１４には、ＹＰＤ培地と同程度又はそれ以上の増殖能力を酵母に付与する培地として、炭素源としての糖類と、窒素源としてのアミノ酸類と、ビタミン類と、イノシトールと、亜鉛イオンと、カリウムイオンと、マグネシウムイオンが含まれ、かつ、イノシトール濃度が５０〜１００ｍｇ／Ｌである酵母用培地が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開昭５９−１５１８９４号公報
【特許文献２】特公平０３−１８８７２号公報
【特許文献３】特開平１０−１９１９６３号公報
【特許文献４】特開昭６１−５２２９９号公報
【特許文献５】特開昭６２−２７５６８５号公報
【特許文献６】特開昭６３−１２９９８５号公報
【特許文献７】特開昭６４−５１０９８号公報
【特許文献８】特開平４−１７９４８４号公報
【特許文献９】特開昭４７−１６９９０号公報
【特許文献１０】特開昭４８−９２５７９号公報
【特許文献１１】特開昭５１−１３９６８６号公報
【特許文献１２】特開昭５３−９４０８９号公報
【特許文献１３】特開昭４８−６１６８９号公報
【特許文献１４】ＷＯ２０１４／０３０７７４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
グルタチオン自体やグルタチオンを豊富に含む酵母エキス等を、より低コストで効率よく工業上量産するためには、グルタチオン含有量の高い酵母を利用することが重要である。特許文献１に記載の方法のように、変異処理等を行い遺伝的な改変が施された酵母の中から、よりグルタチオン含有量の高い酵母をスクリーニングする方法によっても、グルタチオン高含有酵母を得ることができるが、変異処理およびスクリーニングは手間と労力を要し、また、必ずしもグルタチオン高含有酵母を得ることができない場合も多い。【００１０】
本発明は、酵母によるグルタチオンの生産性を高めるための安価で効率的な手段を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、サッカロマイセス属酵母等の酵母を培養する際に、培地に所定量以上のリジン等の塩基性アミノ酸を添加することにより、当該酵母のグルタチオン含有量が高められ、グルタチオンを効率よく生産できることを見出し、本発明を完成させた。【００１２】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
［１］酵母を、塩基性アミノ酸濃度が０．８ｇ／Ｌ以上である培地中で培養することを特徴とする、グルタチオンの製造方法。
[２]前記酵母が、還元型グルタチオン重量を１００としたとき、酸化型グルタチオン重量が２０以上となるように、還元型グルタチオンおよび酸化型グルタチオンを含有する酵母である、［１］に記載の方法。
［３］前記酵母が、親株と比較してグルタチオンレダクターゼの活性が低下した酵母である、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記酵母が、グルタチオンレダクターゼをコードする遺伝子が欠損した酵母である、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記グルタチオンレダクターゼが下記（１ａ）〜（１ｅ）：
（１ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、
（１ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルタチオンレダクターゼ活性を有するタンパク質、
（１ｃ）配列番号１に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつグルタチオンレダクターゼ活性を有するタンパク質、
（１ｄ）配列番号２と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつグルタチオンレダクターゼ活性を有するタンパク質、および、
（１ｅ）配列番号２に示す塩基配列において１もしくは複数個の塩基が置換、欠矢、挿入および／または付加されたＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつグルタチオンレダクターゼ活性を有するタンパク質、
からなる群から選択される、［３］または［４］に記載の方法。
［６］前記酵母が、親株と比較してγ−グルタミルシステイン合成酵素および／またはグルタチオン合成酵素の活性が増大した酵母である、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］前記酵母が、γ−グルタミルシステイン合成酵素をコードする塩基配列を含むＤＮＡ、および／またはグルタチオン合成酵素をコードする塩基配列を含むＤＮＡにより形質転換された酵母である、［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］前記γ−グルタミルシステイン合成酵素が下記（２ａ）〜（２ｅ）：
（２ａ）配列番号３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、
（２ｂ）配列番号３に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつγ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有するタンパク質、
（２ｃ）配列番号３に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつγ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有するタンパク質、
（２ｄ）配列番号４と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつγ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有するタンパク質、および、
（２ｅ）配列番号４に示す塩基配列において１もしくは複数個の塩基が置換、欠矢、挿入および／または付加されたＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつγ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有するタンパク質、
からなる群から選択される、［６］または［７］に記載の方法。
［９］前記グルタチオン合成酵素が下記（３ａ）〜（３ｅ）：
（３ａ）配列番号５に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、
（３ｂ）配列番号５に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルタチオン合成酵素活性を有するタンパク質、
（３ｃ）配列番号５に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつグルタチオン合成酵素活性を有するタンパク質、
（３ｄ）配列番号６と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつグルタチオン合成酵素活性を有するタンパク質、および、
（３ｅ）配列番号６に示す塩基配列において１もしくは複数個の塩基が置換、欠矢、挿入および／または付加されたＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつグルタチオン合成酵素活性を有するタンパク質、
からなる群から選択される、［６］または［７］に記載の方法。
［１０］前記酵母が、親株と比較してグルタチオン輸送酵素の活性が増大した酵母である、［１］〜［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］前記酵母が、グルタチオン輸送酵素をコードする塩基配列を含むＤＮＡにより形質転換された酵母である、［１］〜［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］前記グルタチオン輸送酵素が下記（４ａ）〜（４ｅ）：
（４ａ）配列番号７に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、
（４ｂ）配列番号７に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルタチオン輸送酵素活性を有するタンパク質、
（４ｃ）配列番号７に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつグルタチオン輸送酵素活性を有するタンパク質、
（４ｄ）配列番号８と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつグルタチオン輸送酵素活性を有するタンパク質、および、
（４ｅ）配列番号８に示す塩基配列において１もしくは複数個の塩基が置換、欠矢、挿入および／または付加されたＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつグルタチオン輸送酵素活性を有するタンパク質、
からなる群から選択される、［１０］または［１１］に記載の方法。
［１３］前記酵母が、サッカロマイセス属、キャンディダ属、またはピキア属の酵母である、［１］〜［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］前記酵母が、塩基性アミノ酸非要求性の酵母である、［１］〜［１３］のいずれかに記載の方法。
［１５］前記培地が炭素源として糖蜜を含む、［１］〜［１４］のいずれかに記載の方法。
［１６］培養開始時において、前記培地中の塩基性アミノ酸濃度が０．８ｇ／Ｌ以上である、［１］〜［１５］のいずれかに記載の方法。
［１７］前記培地中の塩基性アミノ酸濃度が２ｇ／Ｌ以上である、［１］〜［１６］のいずれかに記載の方法。
［１８］前記培地中の塩基性アミノ酸濃度が４ｇ／Ｌ以上である、［１］〜［１６］のいずれかに記載の方法。
［１９］前記塩基性アミノ酸がリジンである、［１］〜［１８］のいずれかに記載の方法。
［２０］酵母を、塩基性アミノ酸濃度が０．８ｇ／Ｌ以上である培地中で培養することを特徴とする、酵母によるグルタチオンの生産を促進する方法。
［２１］前記酵母が、［２］〜［１４］のいずれかで規定する特徴を有する酵母である、［２０］に記載の方法。
［２２］前記培地が炭素源として糖蜜を含む、［２０］又は［２１］に記載の方法。
［２３］培養開始時において、前記培地中の塩基性アミノ酸濃度が０．８ｇ／Ｌ以上である、［２０］〜［２２］のいずれかに記載の方法。
［２４］前記培地中の塩基性アミノ酸濃度が２ｇ／Ｌ以上である、［２０］〜［２３］のいずれかに記載の方法。
［２５］前記培地中の塩基性アミノ酸濃度が４ｇ／Ｌ以上である、［２０］〜［２３］のいずれかに記載の方法。
［２６］前記塩基性アミノ酸がリジンである、［２０］〜［２５］のいずれかに記載の方法。
［２７］塩基性アミノ酸を含む、酵母によるグルタチオンの生産の促進剤。
［２８］前記酵母が、［２］〜［１４］のいずれかで規定する特徴を有する酵母である、［２７］に記載の剤。
［２９］前記塩基性アミノ酸がリジンである、［２７］又は［２８］に記載の剤。
［３０］塩基性アミノ酸濃度が０．８ｇ／Ｌ以上であり、炭素源として糖蜜を含む、酵母用培地組成物。
［３１］［２］〜［１４］のいずれかで規定する特徴を有する酵母の培養のための、［３０］に記載の酵母用培地組成物。
［３２］塩基性アミノ酸濃度が２ｇ／Ｌ以上である、［３０］又は［３１］に記載の酵母用培地組成物。
［３３］塩基性アミノ酸濃度が４ｇ／Ｌ以上である、［３０］又は［３１］に記載の酵母用培地組成物。
［３４］前記塩基性アミノ酸がリジンである、［３０］〜［３３］のいずれかに記載の酵母用培地組成物。【００１３】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１８−１６７６５５号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、酵母を、十分量のリジン等の塩基性アミノ酸を含む培地中で培養するという簡単な工程によって、酵母によるグルタチオンの生産を促進し、グルタチオンを効率的に製造することができる。また、使用する酵母としては、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）重量を１００としたとき、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）重量が好ましくは２０以上、より好ましくは４０以上、より好ましくは６０以上、より好ましくは１００以上、より好ましくは１２０以上となる菌体内含量比でＧＳＨ及びＧＳＳＧを含有する酵母であることが好ましい。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の方法を詳細に説明する。
本発明の方法は、酵母を、リジン等の塩基性アミノ酸の濃度が０．８ｇ／Ｌ以上である培地中で培養することを特徴とする。この条件で酵母を培養することにより、酵母によるグルタチオンの生産を促進することができ、グルタチオン高含有酵母（グルタチオン含有量が高い酵母）を得ることが可能になる。０．８ｇ／Ｌ以上の濃度の塩基性アミノ酸の存在により酵母によるグルタチオンの生産が促進され、グルタチオン高含有効果（酵母のグルタチオン含有量を高める効果）が達成される理由は明らかではない。
【００１６】
本発明の方法で培養される酵母（本発明の酵母）は特に限定されず、野生株（天然の酵母）であってもよいし、変異処理により得られた変異株であってもよいが、好ましくは、変異処理により得られた変異株である。なお、本発明および本願明細書において、「野生株」とは、自然界に元々存在していた酵母、すなわち、遺伝子に対して人工的な変異処理を施していない酵母を意味する。これに対して、「変異株」とは、遺伝子に対して人工的な変異処理を施して得られた酵母を意味する。
【００１７】
なお、本発明において、変異処理とは、酵母等の生物が有する遺伝子の一部を変異させ得る処理であれば、特に限定されるものではなく、酵母等の微生物の変異株を作製する場合に通常用いられるいずれの手法を用いて行ってもよい。例えば、変異原として、紫外線、電離放射線、亜硝酸、ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホネート（Ｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｎｅ  ｓｕｌｕｆｏｎａｔｅ、以下ＥＭＳと略記する）等を用いて酵母を処理することにより、酵母に変異処理を行うことができる。
【００１８】
また、本発明の酵母は、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）重量を１００としたとき、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）重量が好ましくは２０以上、より好ましくは４０以上、より好ましくは６０以上、より好ましくは１００以上、より好ましくは１２０以上となるように、ＧＳＨおよびＧＳＳＧを含有する酵母、すなわちＧＳＳＧ高含有酵母であることが好ましい。ＧＳＳＧ高含有酵母は、更に好ましくは、ＧＳＨ重量を１００としたとき、ＧＳＳＧ重量が好ましくは３００以下、より好ましくは２００以下、より好ましくは１５０以下となるように、ＧＳＨおよびＧＳＳＧを含有する。
【００１９】
また本発明の酵母は、特にグルタチオンレダクターゼ活性が低下および／またはγ−グルタミルシステイン合成酵素（ＧＳＨ１）および／またはグルタチオン合成酵素（ＧＳＨ２）および／またはグルタチオン輸送酵素（ＹＣＦ１）の活性が増大した酵母であってもよい。
【００２０】
本発明において「酵素活性が増大する」とは、目的の酵素（活性を増大させようとする酵素）の活性が野性株等の親株と比較して増大していることを意味する。また、「酵素活性が増大する」とは、もともと目的の酵素活性を有する酵母株において目的の酵素活性を増大させることだけでなく、もともと目的の酵素活性を有さない酵母株に目的の酵素活性を付与することを含む。本発明において活性を増大させようとする酵素としては、γ−グルタミルシステイン合成酵素、グルタチオン合成酵素、グルタチオン輸送酵素が例示できる。
【００２１】
酵素活性の増大は、例えば、酵母の遺伝子を人為的に改変することにより達成できる。そのような改変は、例えば、目的の酵素をコードする遺伝子の発現を増大させることにより達成できる。
【００２２】
遺伝子の発現の増大は、例えば、染色体上の遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターに置換することにより達成できる。「より強力なプロモーター」とは、遺伝子の転写が、もともと存在している野生型のプロモーターよりも向上するプロモーターを意味する。より強力なプロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得してもよい。また、より強力なプロモーターとしては、公知の高発現プロモーター、例えば、ＰＧＫ１、ＰＤＣ１、ＴＤＨ３、ＴＥＦ１、ＨＸＴ７、ＡＤＨ１等の遺伝子のプロモーターを用いてもよい。なお、強力なプロモーターへの置換は、後述する遺伝子のコピー数の増加と組み合わせて利用できる。より強力なプロモーターを利用した例としては、染色体ＤＮＡ上のγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子のプロモーターを強転写プロモーターで置換することによりγ−グルタミルシステイン合成酵素活性を増大させる方法が開示されている（大竹康之ら、バイオサイエンスとインダストリー、第５０巻第１０号、第９８９〜９９４頁、１９９２年）。
【００２３】
また、遺伝子の発現の増大は、例えば、遺伝子のコピー数を増加させることによっても達成できる。
【００２４】
遺伝子のコピー数の増加は、活性を増大しようとする目的の酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡにより酵母を形質転換することにより達成することができる。前記ＤＮＡによる酵母の形質転換は、前記ＤＮＡを含むベクターを用いて行うことができる。前記ＤＮＡを含むベクターは、酵母のゲノムＤＮＡに組み込まれるベクターであってもよいし、酵母細胞内で自律複製可能なベクターであってもよい。
【００２５】
前記ベクターは、目的の酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列と作動可能に連結されたプロモーター等の制御因子を更に含んでもよい。ここで制御因子とは、機能的プロモーター、任意の関連する転写要素（例えばエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）等を有する塩基配列をいう。また、作動可能に連結とは、遺伝子の発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントと、目的の酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列とが、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。制御因子のタイプが、宿主に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。前記ベクターは、選択マーカー遺伝子の塩基配列を更に含むことが好ましい。
【００２６】
目的の酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡを含むベクターの、酵母のゲノムＤＮＡへの組み込みは、例えば相同的組み換えを利用して行うことができる。例えば、酵母の染色体のゲノムＤＮＡ中に多数のコピーが存在する配列を標的として相同的組み換えを行うことで、ゲノムＤＮＡへ遺伝子の多数のコピーを導入することができる。ゲノムＤＮＡ中に多数のコピーが存在する配列としては、特有の短い繰り返し配列からなる自律複製配列（ＡＲＳ）や、約１５０コピー存在するｒＤＮＡ配列が挙げられる。ＡＲＳを含むプラスミドを用いて酵母の形質転換を行った例が、国際公開９５／３２２８９号パンフレットに記載されている。また、トランスポゾンに遺伝子を組み込み、それをゲノムＤＮＡへ遺伝子の多数のコピーを導入するよう転移させてもよい。
【００２７】
また、遺伝子のコピー数の増加を、前記自律複製可能なベクターを酵母に導入することによって達成する場合に用いる、前記自律複製可能なベクターとしては、例えば、ＣＥＮ４の複製開始点を持つプラスミドや２μｍ  ＤＮＡの複製開始点を持つ多コピー型プラスミドを好適に用いることができる。目的遺伝子（目的の酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡ）を好適なプロモーターと組み合わせて挿入したベクターを宿主酵母に導入し、目的遺伝子を発現させてもよい。また、目的遺伝子を発現させるのに好適なプロモーターを含むベクターを用いる場合には、ベクター中のプロモーターを利用して目的遺伝子を発現させてもよい。
【００２８】
目的の酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡを含むベクターを取得して宿主酵母を形質転換する方法の一例として次の方法が例示できる。宿主酵母のゲノムＤＮＡ配列のうち、目的の酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列の上流領域と相同な塩基配列に制限酵素Ａの切断配列を付加した塩基配列をもつＤＮＡ−Ｆ２を合成する。一方で、前記塩基配列の下流領域の相補塩基配列と相同な塩基配列に制限酵素Ｂの切断配列を付加した塩基配列をもつＤＮＡ−Ｒ２を合成する。次に、宿主酵母のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ＤＮＡ−Ｆ２およびＤＮＡ−Ｒ２をプライマーとして、ＰＣＲ増幅を行い、増幅されたＤＮＡを制限酵素Ａおよび制限酵素Ｂで切断し、同様に制限酵素Ａおよび制限酵素Ｂで切断した、選択マーカーをもつベクターに連結して組換えベクターを作製し、該組換えベクターを宿主酵母に導入し形質転換体を得る。また、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（タカラバイオ社製）、Ｇｉｂｓｏｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙシステム、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）等の説明書に基づいてプライマー設計および実験操作を行い、目的の酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡのＰＣＲ断片をベクターへシームレスに連結して組換えベクターを作製し、該組換えベクターを宿主酵母に導入して形質転換体を得ても良い。組み換えベクターの宿主酵母への導入の方法は特に限定されず、例えば、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、アグロバクテリウム感染法、パーティクルガン法、ポリエチレングリコール法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、形質導入または感染等が使用できる。目的の酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡにより形質転換された酵母株は、組換えベクターの中の選択マーカーを指標に選抜することが可能である。
【００２９】
また、酵素活性が増大するような改変は、例えば、目的の酵素の比活性を増大させることによっても達成できる。比活性が増大した酵素は、例えば、種々の生物を探索し取得することができる。また、在来の酵素に変異を導入することで高比活性型のものを取得してもよい。比活性の増大は、単独で用いてもよく、上記のような遺伝子の発現を増大させる手法と任意に組み合わせて用いてもよい。
【００３０】
目的の酵素活性が増大したことの確認は、同酵素の活性を測定することによって行うことが出来る。γ−グルタミルシステイン合成酵素活性は、Jacksonの方法（Jackson, R. C., Biochem.J., 111, 309 (1969)）によって測定することができる。グルタチオン合成酵素活性は、Gushimaらの方法（Gushima, T. et al., J. Appl. Biochem., 5, 210 (1983)）によって測定することができる。グルタチオン輸送酵素活性はTHE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 273, No. 50, Issue of December 11, pp. 33449-33454, 1998を参考にすることによって測定することができる。
【００３１】
目的の酵素をコードする遺伝子の転写量が増大したことの確認は、同遺伝子から転写されるｍＲＮＡの量を親株と比較することによって行うことが出来る。ｍＲＮＡの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲ等が挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。ｍＲＮＡの量は、親株と比較して、例えば、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に増大しているのが好ましい。
【００３２】
目的の酵素の量が増大したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。目的の酵素の量は、親株と比較して、例えば、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に増大しているのが好ましい。
【００３３】
本発明の酵母が２倍体以上の倍数性を有する場合であって、染色体の改変により酵素活性が増大している場合には、本発明の酵母は、グルタチオンを蓄積できる限り、酵素活性が増大するように改変された染色体と野生型染色体とをヘテロで有していてもよく、酵素活性が増大するように改変された染色体のホモ型であってもよい。
【００３４】
本発明において「酵素活性が低下する」とは、目的の酵素活性が野性株等の親株と比較して低下していることを意味し、活性が完全に消失している場合を含む。酵素活性が低下した酵母は、目的の酵素（活性を低下させようとする酵素）をコードする遺伝子の機能が失われている状態、または、当該機能が減少している状態にある酵母であり、具体的には、前記遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡや翻訳産物であるタンパク質の発現量が低下している状態や、前記ｍＲＮＡまたは前記タンパク質が、ｍＲＮＡまたはタンパク質として正常に機能しない状態にある酵母が挙げられる。本発明において活性を低下させようとする酵素としては、グルタチオンレダクターゼが例示できる。
【００３５】
酵素活性の低下は、例えば、酵母の遺伝子を人為的に改変することにより達成できる。そのような改変は、例えば、突然変異処理、遺伝子組換え技術、ＲＮＡｉを用いた遺伝子発現抑制処理等により達成できる。
【００３６】
突然変異処理としては、紫外線照射、または、Ｎ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）、メチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の通常変異処理に用いられている変異剤による処理が挙げられる。
【００３７】
遺伝子組換え技術としては、例えば、公知の技術（FEMS Microbiology Letters 165 (1998) 335-340、JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Dec. 1995, p7171-7177、Curr Genet 1986; 10(8):573-578、WO 98/14600等）を利用できる。
【００３８】
酵素活性が低下するような改変は、例えば、目的の酵素をコードする遺伝子の発現を低下させることにより達成できる。ここで目的の酵素をコードする遺伝子は、典型的には宿主酵母のゲノムＤＮＡに含まれる。目的の酵素をコードする遺伝子とは、目的の酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子を指し、特に限定しない限り、アミノ酸配列のコード領域だけでなく、その発現調節配列（プロモーター配列等）、エクソン配列、イントロン配列等を区別することなく示す。発現調節配列を改変する場合には、発現調節配列は、好ましくは１塩基以上、より好ましくは２塩基以上、特に好ましくは３塩基以上が改変される。
【００３９】
酵素活性が低下するような改変は、より好ましくは、宿主酵母のゲノムＤＮＡにおける、目的の酵素をコードする遺伝子の欠損を含む。前記遺伝子の欠損としては、発現調節配列の一部または全部の欠損であってもよいし、目的の酵素のアミノ酸配列のコード領域の一部または全部の欠損であってもよい。ここで「欠損」とは、欠失または損傷を意味し、好ましくは欠失である。
【００４０】
宿主酵母のゲノムＤＮＡにおける前記遺伝子の前後の配列を含めて、遺伝子全体を欠失させてもよい。目的の酵素のアミノ酸配列のコード領域の一部または全部を欠失させる場合、酵素活性の低下が達成できる限り、Ｎ末端領域、内部領域、Ｃ末端領域等のいずれの領域を欠失させてもよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、欠失させる領域の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。好ましい実施形態では、ゲノムＤＮＡにおいて、目的の酵素をコードする遺伝子のうちアミノ酸配列のコード領域および／または発現調節配列の少なくとも一部、例えば、コード領域および／または発現調節配列の全体の塩基数に対して好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは１００％の塩基数からなる領域、が欠失した酵母を用いる。
【００４１】
また、酵素活性が低下するような、目的の酵素のアミノ酸配列をコードする遺伝子の欠損の他の例としては、ゲノムＤＮＡ上の目的の酵素をコードする遺伝子のコード領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、終止コドンを導入すること（ナンセンス変異）、あるいは１〜２塩基を付加または欠失するフレームシフト変異を導入すること等の、前記遺伝子の損傷が例示できる。
【００４２】
また、酵素活性が低下するような、目的の酵素のアミノ酸配列をコードする遺伝子の欠損は、例えば、ゲノムＤＮＡ上の目的の酵素をコードする遺伝子の発現調節配列またはコード領域に他の配列を挿入することによっても達成できる。挿入部位は、遺伝子のいずれの領域であってもよいが、挿入する配列は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。他の配列としては、コードされるタンパク質の機能を低下または消失させるものであれば特に制限されないが、例えば、マーカー遺伝子やグルタチオン等のγ−グルタミル化合物の生産に有用な遺伝子が挙げられる。
【００４３】
ゲノムＤＮＡ上の遺伝子を上記のように欠損させることは、例えば、目的の酵素のアミノ酸配列をコードする遺伝子を、正常に機能するタンパク質を産生しないように改変した不活性遺伝子を作製し、該不活性遺伝子を含む組換えＤＮＡで酵母を形質転換して、不活性遺伝子とゲノムＤＮＡ上の遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、ゲノムＤＮＡ上の遺伝子を不活性遺伝子に置換することによって達成できる。その際、組換えＤＮＡには、宿主の栄養要求性等の形質にしたがって、マーカー遺伝子を含ませておくと操作がしやすい。また、前記組換えＤＮＡは、制限酵素で切断する等により直鎖状にしておくと、ゲノムＤＮＡに組換えＤＮＡが組み込まれた株を効率よく取得することができる。不活性遺伝子によってコードされるタンパク質は、生成したとしても、野生型タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下または消失する。
【００４４】
用いる組換えＤＮＡの構造によっては、相同組換えの結果として、野生型遺伝子と不活性遺伝子とが組換えＤＮＡの他の部分（例えば、ベクター部分およびマーカー遺伝子）を挟んだ状態でゲノムＤＮＡに挿入される場合がある。この状態では野生型遺伝子が機能するため、当該２個の遺伝子間で再度相同組換えを起こさせ、１コピーの野生型遺伝子を、ベクター部分およびマーカー遺伝子とともにゲノムＤＮＡから脱落させ、不活性遺伝子が残ったものを選抜することを必要に応じて行う。
【００４５】
また、例えば、任意の配列を含む線状ＤＮＡであって、当該任意の配列の両端にゲノムＤＮＡ上の置換対象部位（典型的には、目的の酵素をコードする遺伝子の一部または全部）の上流および下流の配列を備える線状ＤＮＡで酵母を形質転換して、置換対象部位の上流および下流でそれぞれ相同組換えを起こさせることにより、１ステップで置換対象部位を当該任意の配列に置換することができる。当該任意の配列としては、例えば、マーカー遺伝子を含む配列を用いればよい。マーカー遺伝子は、その後、必要により除去してもよい。マーカー遺伝子を除去する場合には、マーカー遺伝子を効率的に除去できるよう、相同組み換え用の配列をマーカー遺伝子の両端に付加しておいてもよい。
【００４６】
目的の酵素活性が低下したことの確認は、同酵素の活性を測定することによって行うことが出来る。例えば、グルタチオンレダクターゼの活性は、公知の手法（コスモバイオ社製Glutathione Reductase Assay Kit品番7510-100-K等）により測定することができる。
【００４７】
目的の酵素をコードする遺伝子の転写量が低下したことの確認は、同遺伝子から転写されるｍＲＮＡの量を親株と比較することによって行うことが出来る。ｍＲＮＡの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲ等が挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。ｍＲＮＡの量は、親株と比較して、例えば、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下しているのが好ましい。
【００４８】
目的の酵素の量が低下したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。目的の酵素の量は、親株と比較して、例えば、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下しているのが好ましい。
【００４９】
酵母の形質転換法としては、プロトプラスト法、ＫＵ法（H.Ito et al., J. Bacteriol., 153,163-168 (1983)）、ＫＵＲ法（発酵と工業 vol.43, p.630-637 (1985)）、エレクトロポレーション法（Luis et al., FEMS Micro biology Letters 165 (1998) 335-340）、キャリアＤＮＡを用いる方法（Gietz R.D. and Schiestl R.H., Methods Mol.Cell. Biol. 5:255-269 (1995)）等、通常酵母の形質転換に用いられる方法を採用することができる。また、酵母の胞子形成、１倍体酵母の分離、等の操作については、「化学と生物 実験ライン３１ 酵母の実験技術」、初版、廣川書店；「バイオマニュアルシリーズ１０ 酵母による遺伝子実験法」初版、羊土社等に記載されている。
【００５０】
本発明の酵母が２倍体以上の倍数性を有する場合には、本発明の酵母は、グルタチオン等のγ−グルタミル化合物を蓄積できる限り、酵素活性が低下するように改変された遺伝子と野生型遺伝子とをヘテロで有していてもよいが、通常は、酵素活性が低下するように改変された遺伝子のホモ型であるのが好ましい。
【００５１】
（１）グルタチオンレダクターゼ
グルタチオンレダクターゼとは、下記式（２）に示すような酸化型グルタチオンを、ＮＡＤＰＨ（還元型ニコチンアミドジヌクレオチドリン酸）を利用して還元する活性を有する酵素である。
【００５２】
グルタチオンレダクターゼ活性の抑制された酵母は、ＧＳＳＧをＧＳＨに変換する活性が低いため、ＧＳＳＧを蓄積し易い。このようなグルタチオンレダクターゼ活性の抑制された酵母は、特に好ましくは、ＧＳＨ重量を１００としたとき、ＧＳＳＧ重量が好ましくは２０以上、より好ましくは４０以上、より好ましくは６０以上、より好ましくは１００以上、より好ましくは１２０以上となるように、ＧＳＨおよびＧＳＳＧを含有するＧＳＳＧ高含有酵母である。グルタチオンレダクターゼ活性の抑制された酵母は、更に好ましくは、ＧＳＨ重量を１００としたとき、ＧＳＳＧ重量が好ましくは３００以下、より好ましくは２００以下、より好ましくは１５０以下となるように、ＧＳＨおよびＧＳＳＧを含有する。
【００５３】
【化１】
2020050273.tif 000002
【００５４】
本発明におけるグルタチオンレダクターゼは、ＮＡＤＰＨもしくはＮＡＤＨを利用してジスルフィド結合を還元する活性（即ち、グルタチオンレダクターゼ活性）を有する酵素であれば良く、特に限定されないが、例えば、以下の（１ａ）〜（１ｅ）：
（１ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、
（１ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルタチオンレダクターゼ活性を有するタンパク質、
（１ｃ）配列番号１に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつグルタチオンレダクターゼ活性を有するタンパク質、
（１ｄ）配列番号２と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつグルタチオンレダクターゼ活性を有するタンパク質、ならびに、
（１ｅ）配列番号２に示す塩基配列において１もしくは複数個の塩基が置換、欠矢、挿入および／または付加されたＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつグルタチオンレダクターゼ活性を有するタンパク質、
のいずれかであることが好ましい。
【００５５】
ここで、上記（１ａ）〜（１ｅ）のいずれかのタンパク質は、上記（１ａ）〜（１ｅ）で規定するアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖のみからなる形態には限定されず、該ポリペプチド鎖が糖鎖等で化学修飾された形態であってもよいし、該ポリペプチド鎖が他のポリペプチド鎖と融合された融合タンパク質の形態であってもよい。
【００５６】
上記（１ｂ）に記載の、配列番号１に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質は、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  １９８９）」等に記載の公知の方法に準じて調製することができ、グルタチオンレダクターゼ活性を有する限り上記タンパクに包含される。
【００５７】
置換、挿入、欠失および／または付加により改変されたアミノ酸配列としては、１種類の改変（例えば置換）のみを含むものであっても良いし、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。また、置換の場合には、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸（同族アミノ酸）であることが好ましい。ここでは、以下に挙げる各群の同一群内のアミノ酸を同族アミノ酸とする。
（第１群：中性非極性アミノ酸）Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｍｅｔ，Ｃｙｓ，Ｐｒｏ，Ｐｈｅ
（第２群：中性極性アミノ酸）Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｇｌｎ，Ａｓｎ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ
（第３群：酸性アミノ酸）Ｇｌｕ，Ａｓｐ
（第４群：塩基性アミノ酸）Ｈｉｓ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ
【００５８】
上記（１ｂ）において、「１もしくは複数個」のアミノ酸とは、例えば、１〜６０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１５個、さらに好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、１〜４個、１〜３個、または１〜２個のアミノ酸を意味する。
【００５９】
上記（１ｃ）において、配列番号１に示すアミノ酸配列との配列同一性は、６０％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、８０％以上がさらに好ましく、８５％以上がさらに好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上がさらに好ましく、９７％以上がさらに好ましく、９８％以上がさらに好ましく、９９％以上が最も好ましい。アミノ酸配列の配列同一性は、配列番号１または２に示すアミノ酸配列と、評価したいアミノ酸配列とを比較し、両方の配列でアミノ酸が一致した位置の数を比較総アミノ酸数で除して、さらに１００を乗じた値で表される。
【００６０】
上記（１ｄ）において、配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして、ストリンジェントな条件下にコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。
【００６１】
ハイブリダイゼーションは、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）」等に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより取得できるＤＮＡを挙げることができる。好ましくは６５℃で１倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、より好ましくは６５℃で０．５倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、さらに好ましくは６５℃で０．２倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、最も好ましくは６５℃で０．１倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄することにより取得できるＤＮＡである。
【００６２】
以上のようにハイブリダイゼーション条件を記載したが、ハイブリダイゼーション条件はこれらの条件に特に制限されない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００６３】
上記の条件にてハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、配列番号２に示されるＤＮＡとの配列同一性が７０％以上、好ましくは７４％以上、より好ましくは７９％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらにより好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９７％以上、さらにより好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上のＤＮＡを挙げることができる。
【００６４】
ＤＮＡの配列同一性（％）とは、対比される２つのＤＮＡを最適に整列させ、核酸塩基(例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ)が両方の配列で一致した位置の数を比較塩基総数で除し、そして、この結果に１００を乗じた数値で表される。
【００６５】
ＤＮＡの配列同一性は、例えば、以下の配列分析用ツールを用いて算出し得る: ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｖｅｒｓｉｏｎ８，  １９９４年９月，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  ５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ  Ｍｅｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，  ＵＳＡ  ５３７１１；  Ｒｉｃｅ，  Ｐ．  （１９９６）  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ＥＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｐｅｔｅｒ  Ｒｉｃｅ，  Ｔｈｅ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｃｅｎｔｒｅ，  Ｈｉｎｘｔｏｎ  Ｈａｌｌ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＣＢ１０  １ＲＱ，  Ｅｎｇｌａｎｄ）、および、ｔｈｅ．ｅ．ｘＰＡＳｙ  Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ分子生物学用サーバー（Ｇｅｎｅｖａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ａｎｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｖａ，  Ｇｅｎｅｖａ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。
【００６６】
上記（１ｅ）において、配列番号２に示す塩基配列において１もしくは複数個の塩基が置換、欠矢、挿入および／または付加されたＤＮＡは、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  １９８９）」等に記載の公知の方法に準じて調製することができる。
【００６７】
置換、挿入、欠失および／または付加により改変された塩基配列としては、１種類の改変（例えば置換）のみを含むものであっても良いし、２種類以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。
【００６８】
上記（１ｅ）において、「１もしくは複数個」の塩基とは、該ＤＮＡによりコードされるタンパク質がグルタチオンレダクターゼ活性を有する限り特に限定されないが、例えば１〜１５０個、好ましくは１〜１００個、より好ましくは１〜５０個、さらに好ましくは１〜２０個、さらにより好ましくは１〜１０個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、または１〜２個の塩基、を意味する。
【００６９】
上記（１ａ）〜（１ｅ）のタンパク質がグルタチオンレダクターゼ活性を有するタンパク質であることを確認する手段としては、例えばＤＮＡ組換え法を用いて活性を確認したいタンパク質を発現する形質転換体を作製し、該形質転換体を用いて該タンパク質を製造した後、該タンパク質、ならびに酸化型グルタチオン、ＮＡＤＰＨを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に還元型グルタチオンまたはＮＡＤＰが生成、蓄積するか否かをＨＰＬＣ等により分析する方法を挙げることができる。
【００７０】
本発明において、グルタチオンレダクターゼ活性は、親株と比較して、好ましくは５０％以下、より好ましくは２０％以下、さらに好ましくは１０％以下、特に好ましくは５％以下に低下している。また、グルタチオンレダクターゼ活性は、実質的に消失していることが特に好ましい。
【００７１】
本発明におけるグルタチオンレダクターゼとしては、上記タンパク質のうち、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるＧＬＲ１が好ましい。配列番号２に、配列番号１に示すＧＬＲ１のアミノ酸配列をコードするＧＬＲ１遺伝子の塩基配列を示す。
【００７２】
上記（１ｂ）、（１ｃ）、（１ｄ）または（１ｅ）のタンパク質のグルタチオンレダクターゼ活性は、好ましくは、上記（１ａ）のタンパク質のグルタチオンレダクターゼ活性と同程度又はそれ以上であり、より好ましくは、上記（１ａ）のタンパク質のグルタチオンレダクターゼ活性の５０％以上、８０％以上、９０％以上または１００％以上であり、より好ましくは、２００％以下又は１５０％以下である。
【００７３】
（２）γ−グルタミルシステイン合成酵素
本発明におけるγ−グルタミルシステイン合成酵素は、グルタミン酸とシステインとを縮合させγ−グルタミルシステインを合成する活性（即ち、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性）を有する酵素であれば良く、特に限定されないが、例えば、以下の（２ａ）〜（２ｅ）：
（２ａ）配列番号３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、
（２ｂ）配列番号３に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつγ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有するタンパク質、
（２ｃ）配列番号３に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつγ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有するタンパク質、
（２ｄ）配列番号４と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつγ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有するタンパク質、ならびに、
（２ｅ）配列番号４に示す塩基配列において１もしくは複数個の塩基が置換、欠矢、挿入および／または付加されたＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつγ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有するタンパク質、
のいずれかであることが好ましい。
【００７４】
ここで、上記（２ａ）〜（２ｅ）のいずれかのタンパク質は、上記（２ａ）〜（２ｅ）で規定するアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖のみからなる形態には限定されず、該ポリペプチド鎖が糖鎖等で化学修飾された形態であってもよいし、該ポリペプチド鎖が他のポリペプチド鎖と融合された融合タンパク質の形態であってもよい。
【００７５】
上記（２ｂ）に記載の、配列番号３に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質は、上記（１）に記載の方法に準じて調製することができ、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有する限り上記タンパクに包含される。
【００７６】
置換、挿入、欠失および／または付加により改変されたアミノ酸配列としては、１種類の改変（例えば置換）のみを含むものであっても良いし、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。また、置換の場合には、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸（同族アミノ酸）であることが好ましい。同族アミノ酸については（１）において上述した通りである。
【００７７】
上記（２ｂ）において、「１もしくは複数個」のアミノ酸とは、例えば、１〜６０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１５個、さらに好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、１〜４個、１〜３個、または１〜２個のアミノ酸を意味する。
【００７８】
上記（２ｃ）において、配列番号３に示すアミノ酸配列との配列同一性は、６０％以上が好ましいが、７０％以上がより好ましく、８０％以上がさらに好ましく、８５％以上がさらに好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上がさらに好ましく、９７％以上がさらに好ましく、９８％以上がさらに好ましく、９９％以上が最も好ましい。アミノ酸配列の配列同一性は、（１）において上述した方法により算出できる。
【００７９】
上記（２ｄ）において、配列番号４に示す塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、配列番号４に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして、ストリンジェントな条件下にコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。ハイブリダイゼーションの条件等は（１）において上述した通りである。
【００８０】
上記の条件にてハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、配列番号４に示されるＤＮＡとの配列同一性が７０％以上、好ましくは７４％以上、より好ましくは７９％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらにより好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９７％以上、さらにより好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上のＤＮＡを挙げることができる。ＤＮＡの配列同一性（％）は（１）において上述した通りである。
【００８１】
上記（２ｅ）において、配列番号４に示す塩基配列において１もしくは複数個の塩基が置換、欠矢、挿入および/または付加されたＤＮＡは、（１）において上述した方法に準じて調製することができる。
【００８２】
置換、挿入、欠失および／または付加により改変された塩基配列としては、１種類の改変（例えば置換）のみを含むものであっても良いし、２種類以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。
【００８３】
上記（２ｅ）において、「１もしくは複数個」の塩基とは、該ＤＮＡがコードするタンパク質がγ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有する限り特に限定されないが、例えば１〜１５０個、好ましくは１〜１００個、より好ましくは１〜５０個、さらに好ましくは１〜２０個、さらにより好ましくは１〜１０個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、または１〜２個の塩基、を意味する。
【００８４】
上記（２ａ）〜（２ｅ）のタンパク質がγ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有するタンパク質であることを確認する手段としては、例えばＤＮＡ組換え法を用いて活性を確認したいタンパク質を発現する形質転換体を作製し、該形質転換体を用いて該タンパク質を製造した後、該タンパク質、ならびにＬ−グルタミン酸およびＬ−システインを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にγ−グルタミルシステインが生成、蓄積するか否かをＨＰＬＣ等により分析する方法を挙げることができる。前記水性媒体中には必要に応じ更にＡＴＰを存在させることが好ましい。
【００８５】
本発明におけるγ−グルタミルシステイン合成酵素としては、上記タンパク質のうち、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるＧＳＨ１が好ましい。配列番号４に、配列番号３に示すＧＳＨ１のアミノ酸配列をコードするＧＳＨ１遺伝子の塩基配列を示す。
【００８６】
上記（２ｂ）、（２ｃ）、（２ｄ）または（２ｅ）のタンパク質のγ−グルタミルシステイン合成酵素活性は、好ましくは、上記（２ａ）のタンパク質のγ−グルタミルシステイン合成酵素活性と同程度又はそれ以上であり、より好ましくは、上記（２ａ）のタンパク質のγ−グルタミルシステイン合成酵素活性の５０％以上、８０％以上、９０％以上または１００％以上であり、より好ましくは、２００％以下又は１５０％以下である。
【００８７】
（３）グルタチオン合成酵素
本発明におけるグルタチオン合成酵素は、γ−グルタミルシステインとグリシンを縮合させグルタチオンを合成する活性（即ち、グルタチオン合成酵素活性）を有する酵素であれば良く、特に限定されないが、例えば、以下の（３ａ）〜（３ｅ）：
（３ａ）配列番号５に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、
（３ｂ）配列番号５に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルタチオン合成酵素活性を有するタンパク質、
（３ｃ）配列番号５に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつグルタチオン合成酵素活性を有するタンパク質、
（３ｄ）配列番号６と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつグルタチオン合成酵素活性を有するタンパク質、ならびに、
（３ｅ）配列番号６に示す塩基配列において１もしくは複数個の塩基が置換、欠矢、挿入および／または付加されたＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつグルタチオン合成酵素活性を有するタンパク質、
のいずれかであることが好ましい。
【００８８】
ここで、上記（３ａ）〜（３ｅ）のいずれかのタンパク質は、上記（３ａ）〜（３ｅ）で規定するアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖のみからなる形態には限定されず、該ポリペプチド鎖が糖鎖等で化学修飾された形態であってもよいし、該ポリペプチド鎖が他のポリペプチド鎖と融合された融合タンパク質の形態であってもよい。
【００８９】
上記（３ｂ）に記載の、配列番号５に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質は、上記（１）に記載の方法に準じて調製することができ、グルタチオン合成酵素活性を有する限り上記タンパクに包含される。
【００９０】
置換、挿入、欠失および／または付加により改変されたアミノ酸配列としては、１種類の改変（例えば置換）のみを含むものであっても良いし、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。また、置換の場合には、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸（同族アミノ酸）であることが好ましい。同族アミノ酸については（１）において上述した通りである。
【００９１】
上記（３ｂ）において、「１もしくは複数個」のアミノ酸とは、例えば、１〜６０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１５個、さらに好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、１〜４個、１〜３個、または１〜２個のアミノ酸を意味する。
【００９２】
上記（３ｃ）において、配列番号５に示すアミノ酸配列との配列同一性は、６０％以上が好ましいが、７０％以上がより好ましく、８０％以上がさらに好ましく、８５％以上がさらに好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上がさらに好ましく、９７％以上がさらに好ましく、９８％以上がさらに好ましく、９９％以上が最も好ましい。アミノ酸配列の配列同一性は、（１）において上述した方法により算出できる。
【００９３】
上記（３ｄ）において、配列番号６に示す塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、配列番号６に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして、ストリンジェントな条件下にコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。ハイブリダイゼーションの条件等は（１）において上述した通りである。
【００９４】
上記の条件にてハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、配列番号６に示されるＤＮＡとの配列同一性が７０％以上、好ましくは７４％以上、より好ましくは７９％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらにより好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９７％以上、さらにより好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上のＤＮＡを挙げることができる。ＤＮＡの配列同一性（％）は（１）において上述した通りである。
【００９５】
上記（３ｅ）において、配列番号６に示す塩基配列において１もしくは複数個の塩基が置換、欠矢、挿入および/または付加されたＤＮＡは、（１）において上述した方法に準じて調製することができる。
【００９６】
置換、挿入、欠失および/または付加により改変された塩基配列としては、１種類の改変（例えば置換）のみを含むものであっても良いし、２種類以上の改変（例えば、置換と挿入） を含んでいても良い。
【００９７】
上記（３ｅ）において、「１もしくは複数個」の塩基とは、該ＤＮＡがコードするタンパク質がグルタチオン合成酵素活性を有する限り特に限定されないが、例えば１〜１５０個、好ましくは１〜１００個、より好ましくは１〜５０個、さらに好ましくは１〜２０個、さらにより好ましくは１〜１０個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、または１〜２個の塩基、を意味する。
【００９８】
上記（３ａ）〜（３ｅ）のタンパク質がグルタチオン合成酵素活性を有するタンパク質であることを確認する手段としては、例えばＤＮＡ組換え法を用いて活性を確認したいタンパク質を発現する形質転換体を作製し、該形質転換体を用いて該タンパク質を製造した後、該タンパク質ならびにγ−グルタミルシステインおよびグリシンを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にグルタチオンが生成、蓄積するか否かをＨＰＬＣ等により分析する方法を挙げることができる。前記水性媒体中には必要に応じ更にＡＴＰを存在させることが好ましい。
【００９９】
本発明におけるグルタチオン合成酵素としては、配列番号５に示すアミノ酸配列からなるＧＳＨ２が好ましい。配列番号６に、配列番号５に示すＧＳＨ２のアミノ酸配列をコードするＧＳＨ２遺伝子の塩基配列を示す。
【０１００】
上記（３ｂ）、（３ｃ）、（３ｄ）または（３ｅ）のタンパク質のグルタチオン合成酵素活性は、好ましくは、上記（３ａ）のタンパク質のグルタチオン合成酵素活性と同程度又はそれ以上であり、より好ましくは、上記（３ａ）のタンパク質のグルタチオン合成酵素活性の５０％以上、８０％以上、９０％以上または１００％以上であり、より好ましくは、２００％以下又は１５０％以下である。
【０１０１】
（４）グルタチオン輸送酵素
本発明において、グルタチオン輸送酵素とは、細胞質のグルタチオンを液胞に輸送する機能（即ち、グルタチオン輸送酵素活性）を有する酵素を意味し、当該機能を有する限り特に限定されない。
グルタチオン輸送酵素は、以下の（４ａ）〜（４ｅ）：
（４ａ）配列番号７に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、
（４ｂ）配列番号７に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルタチオン輸送酵素活性を有するタンパク質、
（４ｃ）配列番号７に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつグルタチオン輸送酵素活性を有するタンパク質、
（４ｄ）配列番号８と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつグルタチオン輸送酵素活性を有するタンパク質、ならびに、
（４ｅ）配列番号８に示す塩基配列において１もしくは複数個の塩基が置換、欠矢、挿入および／または付加されたＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつグルタチオン輸送酵素活性を有するタンパク質、
のいずれかであることが好ましい。
【０１０２】
ここで、上記（４ａ）〜（４ｅ）のいずれかのタンパク質は、上記（４ａ）〜（４ｅ）で規定するアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖のみからなる形態には限定されず、該ポリペプチド鎖が糖鎖等で化学修飾された形態であってもよいし、該ポリペプチド鎖が他のポリペプチド鎖と融合された融合タンパク質の形態であってもよい。
【０１０３】
上記（４ｂ）に記載の、配列番号７に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質は、上記（１）に記載の方法に準じて調製することができ、グルタチオン輸送酵素活性を有する限り上記タンパクに包含される。
【０１０４】
置換、挿入、欠失および／または付加により改変されたアミノ酸配列としては、１種類の改変（例えば置換）のみを含むものであっても良いし、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。また、置換の場合には、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸（同族アミノ酸）であることが好ましい。同族アミノ酸については（１）において上述した通りである。
【０１０５】
上記（４ｂ）において、「１もしくは複数個」のアミノ酸とは、例えば、１〜６０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１５個、さらに好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、１〜４個、１〜３個、または１〜２個のアミノ酸を意味する。
【０１０６】
上記（４ｃ）において、配列番号７に示すアミノ酸配列との配列同一性は、６０％以上が好ましいが、７０％以上がより好ましく、８０％以上がさらに好ましく、８５％以上がさらに好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上がさらに好ましく、９７％以上がさらに好ましく、９８％以上がさらに好ましく、９９％以上が最も好ましい。アミノ酸配列の配列同一性は、（１）において上述した方法により算出できる。
【０１０７】
上記（４ｄ）において、配列番号８に示す塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、配列番号８に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして、ストリンジェントな条件下にコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。ハイブリダイゼーションの条件等は（１）において上述した通りである。
【０１０８】
上記の条件にてハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、配列番号８に示されるＤＮＡとの配列同一性が７０％以上、好ましくは７４％以上、より好ましくは７９％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらにより好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９７％以上、さらにより好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上のＤＮＡを挙げることができる。ＤＮＡの配列同一性（％）は（１）において上述した通りである。
【０１０９】
上記（４ｅ）において、配列番号８に示す塩基配列において１もしくは複数個の塩基が置換、欠矢、挿入および/または付加されたＤＮＡは、（１）において上述した方法に準じて調製することができる。
【０１１０】
置換、挿入、欠失および/または付加により改変された塩基配列としては、１種類の改変（例えば置換）のみを含むものであっても良いし、２種類以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。
【０１１１】
上記（４ｅ）において、「１もしくは複数個」の塩基とは、該ＤＮＡがコードするタンパク質がグルタチオン輸送酵素活性を有する限り特に限定されないが、例えば１〜１５０個、好ましくは１〜１００個、より好ましくは１〜５０個、さらに好ましくは１〜２０個、さらにより好ましくは１〜１０個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、または１〜２個の塩基、を意味する。
【０１１２】
本発明におけるグルタチオン輸送酵素としては、配列番号７に示すアミノ酸配列からなるＹＣＦ１が好ましい。配列番号８に、配列番号７に示すＹＣＦ１のアミノ酸配列をコードするＹＣＦ１遺伝子の塩基配列を示す。
【０１１３】
上記（４ｂ）、（４ｃ）、（４ｄ）または（４ｅ）のタンパク質のグルタチオン輸送酵素活性は、好ましくは、上記（４ａ）のタンパク質のグルタチオン輸送酵素活性と同程度又はそれ以上であり、より好ましくは、上記（４ａ）のタンパク質のグルタチオン輸送酵素活性の５０％以上、８０％以上、９０％以上または１００％以上であり、より好ましくは、２００％以下又は１５０％以下である。
【０１１４】
（５）本発明の酵母
本発明の酵母は、グルタチオン生産能を有する酵母であれば、特に制限はなく、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロマイセス・カールスベルゲンシス(Saccharomyces carlsbergensis)、サッカロマイセス・フラギリス(Saccharomyces fragilis)、サッカロマイセス・ルーキシー(Saccharomyces rouxii)などのサッカロマイセス属、キャンディダ・ユーティリス(Candida utilis)、キャンディダ・トロピカリス(Candida tropicalis)などのキャンディダ属、シゾサッカロマイセス・ポンべ(Schizosaccharomyces pombe)などのシゾサッカロミセス属、トルロプシス・バーサティリス(Torulopsis versatilis)、トルロプシス・ペトロフィラム(Torulopsis petrophilum)などのトルロプシス属、ピキア（Pichia）属、ブレタノマイセス(Brettanomyces)属、マイコトルラ(Mycotorula)属、ロードトルラ(Rhodotorula)属、ハンゼニュラ(Hansenula)属、エンドマイセス(Endomyces)属などの酵母が挙げられる。中でも、サッカロマイセス属、キャンディダ属、またはピキア属の酵母が好ましく、更にはサッカロマイセス属のサッカロマイセス・セレビシエ、キャンディダ属のキャンディダ・ユーティリスが好ましい。例えば、親株として、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ２４−５１−７８（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１９０７２）を好適に使用することができる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ２４−５１−７８は、２００２年１０月１８日付で独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２０号室）に国際寄託されている（寄託者が付した識別のための表示：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ２４−５１−７８、受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１９０７２）。
【０１１５】
（６）塩基性アミノ酸を含有する培地
本発明において「塩基性アミノ酸」とは、典型的には、リジン、アルギニンおよびヒスチジンから選択される１以上であり、より好ましくは、リジンおよびアルギニンから選択される１以上であり、最も好ましくはリジンである。塩基性アミノ酸は好ましくはＬ体である。
【０１１６】
本発明で用いる培地は、塩基性アミノ酸の濃度が０．８ｇ／Ｌ以上であり、好ましくは１ｇ／Ｌ以上であり、より好ましくは２ｇ／Ｌ以上であり、特に好ましくは４ｇ／Ｌ以上である。２種以上の塩基性アミノ酸が含まれる場合、塩基性アミノ酸の合計濃度が上記の範囲であればよいが、より好ましくは、各塩基性アミノ酸の濃度がそれぞれ０．８ｇ／Ｌ以上であり、好ましくは１ｇ／Ｌ以上であり、より好ましくは２ｇ／Ｌ以上であり、特に好ましくは４ｇ／Ｌ以上である。
【０１１７】
本発明で用いる培地の塩基性アミノ酸の濃度の上限は特に限定されないが、通常は１００ｇ／Ｌ以下であり、好ましくは５０ｇ／Ｌ以下であり、より好ましくは２０ｇ／Ｌ以下である。２種以上の塩基性アミノ酸が含まれる場合、各塩基性アミノ酸の濃度が、それぞれ、通常は１００ｇ／Ｌ以下であり、好ましくは５０ｇ／Ｌ以下であり、より好ましくは２０ｇ／Ｌ以下である。
【０１１８】
塩基性アミノ酸は、塩の形態で存在してもよい。
【０１１９】
本発明で用いる培地は、酵母の培養開始時において、塩基性アミノ酸を上記の濃度範囲となるように含有することが好ましい。本発明者らは、驚くべきことに、培養開始時に塩基性アミノ酸を上記の濃度範囲で含む培地中で酵母を培養する場合に、グルタチオン高含有効果が特に高いことを見出した。この場合、酵母の培養中に塩基性アミノ酸の培地中の濃度が０．８ｇ／Ｌを下回ることも本実施形態の範囲内である。
【０１２０】
本発明で用いる培地は、塩基性アミノ酸を含有する培地であればよく、その他の成分は特に限定されない。すなわち炭素源、窒素源、無機物その他の栄養等を適宜含有していれば、合成培地、半合成培地、天然（複合）培地のいずれも使用可能である。
【０１２１】
本発明で用いる培地は液体培地であってもよいし、固形培地であってもよいが、液体培地であることが特に好ましい。
【０１２２】
塩基性アミノ酸を含有する培地に含まれる炭素源としては糖蜜、グルコース、グリセロール、フラクトース、シュクロース、マルトース、マンノース、マニトール、キシロース、ガラクトース、デンプン、デンプン加水分解物液などの種々の炭水化物原料が使用できる。またピルビン酸、酢酸、乳酸などの各種有機酸、アスパラギン酸、アラニンなどの各種アミノ酸類も使用可能である。
【０１２３】
塩基性アミノ酸を含有する培地の特に好ましい実施形態は、炭素源として糖蜜を含む。糖蜜とは、サトウキビ、テンサイ等の原料から砂糖を精製する際に生じる、糖を主成分とする粘状で黒褐色の液体副産物である。塩基性アミノ酸を含有する培地は、より好ましくは、糖蜜中に含まれる糖として１重量％以上、より好ましくは２重量％以上、より好ましくは３重量％以上となる量の糖蜜を含む液体培地であり、糖蜜の含有量の上限は特に限定されないが、例えば、糖蜜中に含まれる糖として１０重量％以下、５重量％以下、４重量％以下となる量の糖蜜を含む液体培地である。塩基性アミノ酸を含有する培地は、糖蜜以外の炭素源を更に含んでもよいが、より好ましくは、糖蜜を炭素源全体の少なくとも１０重量％以上とする培地（糖蜜培地）である。糖蜜中に含まれる糖は酸加水分解後ベルトラン法によって測定することができる。
【０１２４】
塩基性アミノ酸を含有する培地に含まれる窒素源としてはアンモニアあるいは塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの各種の無機または有機アンモニウム塩類、あるいは尿素その他の窒素含有化合物、あるいはペプトン、ＮＺアミン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、フィシュミールあるいはその消化物、脱脂大豆あるいはその消化物や加水分解物などの窒素性有機物質、あるいはアスパラギン酸、グルタミン酸、スレオニンなどの各種アミノ酸が使用可能である。
【０１２５】
塩基性アミノ酸を含有する培地に含まれる無機物としてはリン酸第一水素カリウム、リン酸第二水素カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムなどが使用できる。
【０１２６】
（７）酵母によるグルタチオンの生産
本発明の方法は、酵母を所定濃度の塩基性アミノ酸を含む培地中で培養することを含む。
培養は振とう培養、通気攪拌深部培養などの好気的培養条件下で実施する。培養時ｐＨは、好ましくは３．０〜８．０、より好ましくは４．０〜６．０、最も好ましくは５．０に制御される。ｐＨ制御の中和剤としてはアンモニア水、水酸化ナトリウム、炭酸アンモニウムなどが使用可能である。好気的培養時の培地への空気供給量は、培地１Ｌに対し、好ましくは０．２Ｌ／分以上、より好ましくは０．５Ｌ／分以上、さらに好ましくは１Ｌ／分以上である。また、ジャーファーメンターを使用して培養する場合、攪拌数は好ましくは２００ｒｐｍ以上、より好ましくは３００ｒｐｍ以上、さらに好ましくは４００ｒｐｍ以上である。ジャーファーメンターの容量は特に限定されないが例えば総容量２Ｌのジャーファーメンターが例示できる。また、培養時の温度は、通常２０〜４５℃、好ましくは２５〜３５℃、最も好ましくは２８〜３２℃である。培養期間は、通常１６時間〜７２時間、好ましくは２４時間〜４８時間である。培地中への初期細胞濃度（仕込み濃度）は酵母の種類、培地組成などにより異なるが、初発濁度（ＯＤ６００）は好ましくは０．０１〜２．０、より好ましくは０．０２〜１．０、さらに好ましくは０．１〜０．４である。グルコースなどの上記炭素源に関しては培養初期に一括に仕込んで培養する回分方式、培養期間を通じて少しずつ添加する半回分方式のいずれの方式も適用可能であるが、本発明者らの検討結果によれば、使用する微生物にもよるが、半回分方式によれば、増殖速度が向上し、最終菌濃度もより高位となり、菌体内のグルタチオン合成関連酵素の活性も高まるのでより好ましい。半回分方式でグルコースなどの炭素源の流加速度を決定する指標としては、培養液の濁度、酸素消費速度、二酸化炭素発生速度、ｐＨ調整用中和剤の消費量などが利用でき、使用する酵母に合わせて適切な指標を選び、その変化に対応させて炭素源の流加速度を変化させることにより、酵母培養の最適化が図れ、最終菌濃度およびグルタチオン合成関連酵素の活性向上、その結果グルタチオンの生産性向上が実現できる。ただし上記の通り塩基性アミノ酸に関しては、培養初期に一括に回分方式により培地に添加することが好ましい。
【０１２７】
本発明の酵母を培地中で培養することで、高濃度のグルタチオンを主として菌体内に含有する酵母と培地とからなる培養混合物が得られる。本発明のグルタチオンの製造方法は、好ましくは、得られた培養混合物から、グルタチオンを回収することを更に含む。
【０１２８】
培養混合物からグルタチオンを回収するためには、例えば、培養混合物中の酵母菌体を、濾過や遠心分離操作により培地と分離し、得られた酵母菌体から熱水抽出、アルカリ抽出法、酵素分解法、自己消化法、物理的な破砕操作などを必要に応じて適宜組み合わせてグルタチオンを抽出することができる。また、培養後の培養混合物に対し、直接に上記の抽出操作を実施してもよく、あるいは、酵素分解法、自己消化法、物理的な破砕操作を行って、酵母菌体中のグルタチオンを培地中に溶出させた後に、上記抽出操作を行って、グルタチオンを抽出しても良い。このようにして得られるグルタチオンから、一般的な方法によりグルタチオンを精製することによりグルタチオンを高度に含有する分画、またはグルタチオン粉末を得ることが出来る。
【０１２９】
また、上記の手順で得られたグルタチオンに含まれる酸化型グルタチオンを還元することにより、還元型の割合が高められたグルタチオンを得ることもできる。還元する方法としては特に限定しないが、好ましくはグルタチオンレダクターゼによる還元が挙げられる
【実施例】
【０１３０】
以下、実施例などを挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例などにより限定されない。なお、以下の実施例において、「乾燥菌体重量当たりの還元型グルタチオン含有量（％（ｗ／ｗ））」は、「ＧＳＨ含有率（％）」と言い換え、「乾燥菌体重量当たりの酸化型グルタチオン含有量（％（ｗ／ｗ））」は、「ＧＳＳＧ含有率（％）」と言い換えることがある。「％」は特に明示の無い限り「％（ｗ／ｗ）」を意味する。【０１３１】
［製造例１］ＧＬＲ１遺伝子を破壊した酵母（ＧＬＲ１破壊株）の作製
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｃｉａｅ用ｖｅｃｔｏｒ  ｐＤ１５１１（ＡＴＵＭ社）のｇＲＮＡ部分の配列を5′-GATTACCTCGTCATCGGGGG-3′（配列番号９）としたプラスミドを調製し、更にＤＮＡ配列5′-ACACTTCTGGTTTTTCTCATGCGCTTCTCACTCTCAGTATATTTTGCTGCTTTCCTTCATATGTATATATATCTATTTACATATTAGTTTACAGAACTTTAGCAACGAAACTAGACGTCCAATCTGCTGTTGCTATACTGGACTTTTGTACTCTTGTAAACAATCTTATATAGCATCCTGAAATACGTAGTAATTTTGTC-3′（配列番号１０）およびその相補ＤＮＡからなる２本鎖ＤＮＡ断片を用意し、これら両者を用いてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ２４−５１−７８（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１９０７２）を宿主として形質転換を行い、配列番号１に示すアミノ酸配列をコードするグルタチオンレダクターゼ（ＧＬＲ１）遺伝子を破壊した、ＧＬＲ１破壊株を得た。このＧＬＲ１破壊株では、宿主酵母のゲノムＤＮＡにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列をコードするＧＬＲ１遺伝子のコード領域の一部または全体が破壊されている。【０１３２】
［製造例２］ＧＬＲ１遺伝子を破壊し、さらにＹＣＦ１、ＧＳＨ１、ＧＳＨ２の発現を強化した酵母（ＧＬＲ１破壊＋ＹＣＦ１強化＋ＧＳＨ１強化＋ＧＳＨ２強化株）の作製
製造例１で作製したＧＬＲ１破壊株を宿主とし、非特許文献（Hara KY, Kiriyama K, Inagaki A, Nakayama H, Kondo A. (2012) Improvement of glutathione production by metabolic engineering the sulfate assimilation pathway of Saccharomyces cerevisiae. Appl Microbiol Biotechnol, 426(2):129-33.）に記載の方法で、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるγ−グルタミルシステイン合成酵素（ＧＳＨ１）および配列番号５に示すアミノ酸配列からなるグルタチオン合成酵素（ＧＳＨ２）の発現を強化して、ＧＬＲ１破壊＋ＧＳＨ１強化＋ＧＳＨ２強化株を得た。前記非特許文献に記載のＧＳＨ１およびＧＳＨ２の発現の強化は、宿主酵母のゲノムＤＮＡに、それぞれ複数コピーの、強発現プロモーターと制御可能に連結されたＧＳＨ１遺伝子および強発現プロモーターと制御可能に連結されたＧＳＨ２遺伝子を組み込むことによるものである。更にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ４９９株のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、プライマーとして、5'- AAAAGGATCCATGGCTGGTAATCTTGTTTCATGGGCC-3'（配列番号１１）および5'- AAAACTCGAGTTAATTTTCATTGACCAAACCAGCCTCC-3'(配列番号１２)を用いてＰＣＲ増幅を行い、増幅物をＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化して、配列番号７に示すアミノ酸配列をコードする、配列番号８に示す塩基配列を含むグルタチオン輸送酵素（ＹＣＦ１）遺伝子ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片を得た。この断片をｐ４２７ＴＥＦ（コスモバイオ社製）のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ消化部位に連結し、ＹＣＦ１発現プラスミドｐ４２７−ＹＣＦ１を得た。このプラスミドを用いて、上記で得たＧＬＲ１破壊＋ＧＳＨ１強化＋ＧＳＨ２強化株を、更に形質転換した（ＧＬＲ１破壊＋ＹＣＦ１強化＋ＧＳＨ１強化＋ＧＳＨ２強化株）。【０１３３】
［実施例１］
酵母として、製造例２に記載のＧＬＲ１破壊＋ＹＣＦ１強化＋ＧＳＨ１強化＋ＧＳＨ２強化株をＹＰＤ培地（１０ｇ／Ｌ酵母エキストラクト（Ｄｉｆｃｏ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）、２０ｇ／Ｌポリペプトン（和光純薬（株）製）、２０ｇ／Ｌグルコース（ナカライテスク（株）製））７ｍｌで３０℃、１６〜２４時間振盪することにより種母培養を行った。【０１３４】
次に糖蜜リジン培地５０ｍｌ（糖蜜４％（糖蜜中のグルコース量として）、尿素０．３％、硫酸アンモニウム０．０８％、リン酸２％、アンモニウム０．０４％、リジン０．１％、０．２％または０．４％）を含む坂口フラスコに種母培養液３ｍｌとなるよう植菌し、３０℃、攪拌１３０ｒｐｍの条件で４０時間培養を行い、培養液を１ｍｌ回収した。また、同時に糖蜜培地５０ｍｌ（糖蜜４％（糖蜜中のグルコース量として）、尿素０．３％、硫酸アンモニウム０．０８％、リン酸２％、アンモニウム０．０４％）でも比較対照として培養を行った。【０１３５】
培養液１ｍｌを遠心分離して集めた菌体を滅菌水にて２度洗い、８０℃で５分間熱処理することで、菌体内のグルタチオンを溶出した。この溶出液を、２５℃、２００００ｘｇにて５分間遠心した上清のグルタチオン濃度をＨＰＬＣ法にて分析し、培養液１ｍｌあたりの還元型グルタチオン（ＧＳＨ）量および酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）量を決定した。同様に培養液１ｍｌを滅菌水にて２度洗い、８０℃デシケーター内で一晩静置することで、培養液１ｍｌあたりの乾燥菌体重量を得る。ＧＳＨ量およびＧＳＳＧ量をそれぞれ乾燥菌体重量で除することで、ＧＳＨ含有率（％）およびＧＳＳＧ含有率（％）を算出した。リジンを添加しない糖蜜培地を用いた比較対照試験でのＧＳＨ含有率（％）を１００％とし、糖蜜培地を用いた比較対照試験でのＧＳＳＧ含有率（％）、ならびに、糖蜜リジン培地を用いた実施例１の試験でのＧＳＨ含有率（％）およびＧＳＳＧ含有率（％）の相対値を求めた。結果を次表に示す。【０１３６】
【表１】
2020050273.tif 000003
【０１３７】
表から分かるように、培地中のリジン濃度を高めることで、ＧＳＨ含有率およびＧＳＳＧ含有率を飛躍的に高めることができる。【０１３８】
［実施例２］
酵母として、製造例２に記載のＧＬＲ１破壊＋ＹＣＦ１強化＋ＧＳＨ１強化＋ＧＳＨ２強化株をＹＰＤ培地（１０ｇ／Ｌ酵母エキストラクト（Ｄｉｆｃｏ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）、２０ｇ／Ｌポリペプトン（和光純薬（株）製）、２０ｇ／Ｌグルコース（ナカライテスク（株）製））７ｍｌで３０℃、１６〜２４時間振盪することにより種母培養を行った。【０１３９】
次に糖蜜アルギニン培地５０ｍｌ（糖蜜４％（糖蜜中のグルコース量として）、尿素０．３％、硫酸アンモニウム０．０８％、リン酸２％、アンモニウム０．０４％、アルギニン０．１％）を含む坂口フラスコに種母培養液３ｍｌとなるよう植菌し、３０℃、攪拌１３０ｒｐｍの条件で４０時間培養を行い、培養液を１ｍｌ回収した。また、同時に糖蜜培地５０ｍｌ（糖蜜（糖蜜中のグルコース量として）４％、尿素０．３％、硫酸アンモニウム０．０８％、リン酸２％、アンモニウム０．０４％）でも比較対照として培養を行った。【０１４０】
培養液１ｍｌを遠心分離して集めた菌体を滅菌水にて２度洗い、８０℃で５分間熱処理することで、菌体内のグルタチオンを溶出した。この溶出液を、２５℃、２００００ｘｇにて５分間遠心した上清のグルタチオン濃度をＨＰＬＣ法にて分析し、培養液１ｍｌあたりのグルタチオン量（ＧＳＨ量とＧＳＳＧ量の合計）を決定した。同様に培養液１ｍｌを滅菌水にて２度洗い、８０℃デシケーター内で一晩静置することで、培養液１ｍｌあたりの乾燥菌体重量を得る。グルタチオン量を乾燥菌体重量で除することで、グルタチオン含有率（％）を算出した。アルギニンを添加しない糖蜜培地を用いた比較対照試験でのグルタチオン含有率（％）を１００％とし、糖蜜アルギニン培地を用いた実施例２の試験でのグルタチオン含有率（％）の相対値を求めた。結果を次表に示す。【０１４１】
【表２】
2020050273.tif 000004
【０１４２】
表から分かるように、糖蜜培地にアルギニンを添加することで、酵母のグルタチオン含有率を飛躍的に高めることができる。【０１４３】
［実施例３］
実施例２において、糖蜜アルギニン培地の代わりに糖蜜ヒスチジン培地５０ｍｌ（糖蜜４％（糖蜜中のグルコース量として）、尿素０．３％、硫酸アンモニウム０．０８％、リン酸２％、アンモニウム０．０４％、ヒスチジン０．１％）を用いた以外は、実施例２と同じ条件及び手順で、製造例２で調製したＧＬＲ１破壊＋ＹＣＦ１強化＋ＧＳＨ１強化＋ＧＳＨ２強化株を糖蜜ヒスチジン培地およびヒスチジンを添加しない糖蜜培地にて培養し、グルタチオン含有率（％）を測定した。実施例２と同様に、ヒスチジンを添加しない糖蜜培地を用いた比較対照試験でのグルタチオン含有率（％）を１００％とし、糖蜜ヒスチジン培地を用いた実施例３の試験でのグルタチオン含有率（％）の相対値を求めた。【０１４４】
【表３】
2020050273.tif 000005
【０１４５】
アルギニン及びリジンと同様に、ヒスチジンを添加した糖蜜培地中での培養により、酵母のグルタチオン含有率を飛躍的に高めることができる。【０１４６】
［実施例４］
酵母としてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ２４−５１−７８（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１９０７２）をＹＰＤ培地（１０ｇ／Ｌ酵母エキストラクト（Ｄｉｆｃｏ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）、２０ｇ／Ｌポリペプトン（和光純薬（株）製）、２０ｇ／Ｌグルコース（ナカライテスク（株）製））７ｍｌで３０℃、１６〜２４時間振盪することにより種母培養を行った。【０１４７】
次に糖蜜リジン培地５０ｍｌ（糖蜜４％（糖蜜中のグルコース量として）、尿素０．３％、硫酸アンモニウム０．０８％、リン酸２％、アンモニウム０．０４％、リジン０．１％）、糖蜜アルギニン培地（リジン０．１％に代えてアルギニン０．１％を含有する以外は糖蜜リジン培地と同じ組成を有する）、又は、糖蜜ヒスチジン培地（リジン０．１％に代えてヒスチジン０．１％を含有する以外は糖蜜リジン培地と同じ組成を有する）を含む坂口フラスコに種母培養液３ｍｌとなるよう植菌し、３０℃、攪拌１３０ｒｐｍの条件で４０時間培養を行い、培養液を１ｍｌ回収した。また、同時に糖蜜培地５０ｍｌ（糖蜜（糖蜜中のグルコース量として）４％、尿素０．３％、硫酸アンモニウム０．０８％、リン酸２％、アンモニウム０．０４％）でも比較対照として培養を行った。【０１４８】
実施例２に記載の手順で各培地での培養物のグルタチオン含有率（％）を測定した。実施例２と同様に、リジン、アルギニン及びヒスチジンを添加しない糖蜜培地を用いた比較対照試験でのグルタチオン含有率（％）を１００％とし、糖蜜リジン培地、糖蜜アルギニン培地又は糖蜜ヒスチジン培地を用いた実施例４の試験でのグルタチオン含有率（％）の相対値を求めた。【０１４９】
【表４】
2020050273.tif 000006
【０１５０】
酵母としてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ２４−５１−７８（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１９０７２）を、塩基性アミノ酸を添加した培地中で培養した場合でも、酵母のグルタチオン含有率を飛躍的に高めることができる。【０１５１】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【配列表】
2020050273000001.app
【国際調査報告】
2020050273.tif 000007
2020050273.tif 000008
2020050273.tif 000009
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