(57)【要約】  実施形態によれば、対象由来の試料中のｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐを定量することを含む、対象におけるがんの罹患の有無を判定する分析方法が提供される。
2021125105.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象由来の試料中のｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐを定量することを含む、前記対象におけるがんの罹患の有無を判定する分析方法。
【請求項２】
対象由来の試料中のｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐを定量することを含む、前記対象におけるがんの罹患の有無の判定を補助する分析方法。
【請求項３】
前記対象におけるｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐの存在量が、対照におけるｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐの存在量よりも多い場合、前記対象ががんに罹患していると判定する判定工程を更に含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記がんの罹患の有無の判定は、前記対象におけるがんの予後判定、又は前記対象におけるがんの再発の有無の判定を含む、請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記がんは、乳がん、大腸がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、胆管がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、膀胱がん、前立腺がん、肉腫、子宮体がん及び子宮肉腫から選択される少なくとも１つを含む、請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記定量はＬＡＭＰ法を用いて行われ、
前記がんは、乳がん、大腸がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、胆管がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、膀胱がん、前立腺がん、肉腫及び子宮体がんから選択される少なくとも１つである、請求項１〜４の何れか1項に記載の方法。
【請求項７】
前記判定において、乳がん、大腸がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、胆管がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、膀胱がん、前立腺がん、肉腫又は子宮体がんから選択される少なくとも１つの罹患の有無は、他のがんと識別されて判定される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記他のがんは、子宮肉腫を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記がんは前立腺がんであり、
前記試料中のｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ−３ｐを定量する工程を更に含み、
前記判定は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐの定量結果とｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ−３ｐの定量結果とを用いて行われる、請求項６〜８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記がんは膵臓がんであり、
前記試料中のｈｓａ−ｍｉＲ−１２２−５ｐを定量する工程を更に含み、
前記判定は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐの定量結果とｈｓａ−ｍｉＲ−１２２−５ｐの定量結果とを用いて行われる、請求項６〜８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記対象内に存在しないｍｉＲＮＡを前記試料に添加して定量することを更に含み、前記ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐの定量結果は、前記対象内に存在しないｍｉＲＮＡの定量結果と比較することにより補正される、請求項１〜１０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記試料は、血清である、請求項１〜１１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記定量は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐを逆転写するための逆転写用プライマー、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐを伸長するための伸長用プライマー、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐを増幅するための増幅用プライマーセット、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐを検出するための核酸プローブからなる群から選択される少なくとも１種の核酸を用いて行われる、請求項１〜１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記逆転写用プライマーが配列番号４を含み、前記伸長用プライマーが配列番号５を含み、前記増幅用プライマーセットが配列番号６のＦＩＰプライマー、配列番号７のＢＩＰプライマー及び配列番号８のＬＢプライマーを含むか、
前記逆転写用プライマーが配列番号９を含み、前記伸長用プライマーが配列番号１０を含み、前記増幅用プライマーセットが配列番号１１のＦＩＰプライマー、配列番号１２のＢＩＰプライマー及び配列番号８のＬＢプライマーを含むか、
前記逆転写用プライマーが配列番号１３を含み、前記伸長用プライマーが配列番号１４を含み、前記増幅用プライマーセットが配列番号１５のＦＩＰプライマー、配列番号１６のＢＩＰプライマー及び配列番号８のＬＢプライマーを含むか、
前記逆転写用プライマーが配列番号１７を含み、前記伸長用プライマーが配列番号１８を含み、前記増幅用プライマーセットが配列番号１９のＦＩＰプライマー、配列番号２０のＢＩＰプライマー及び配列番号８のＬＢプライマーを含むか、又は
前記逆転写用プライマーが配列番号４５を含み、前記伸長用プライマーが配列番号４６を含み、前記増幅用プライマーセットが配列番号４７のＦＩＰプライマー、配列番号４８のＢＩＰプライマー及び配列番号８のＬＢプライマーを含み、
前記各プライマーの塩基配列は、対応する配列番号で表される塩基配列の１又は２の塩基の欠失、置換、付加又は挿入があるものも含む、
請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐを逆転写するための逆転写用プライマー、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐを伸長するための伸長用プライマー、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐを増幅するための増幅用プライマーセット、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐを検出するための核酸プローブからなる群から選択される少なくとも１種の核酸を含む、がんを検出するためのキット。
【請求項１６】
前記逆転写用プライマーが配列番号４を含み、前記伸長用プライマーが配列番号５を含み、前記増幅用プライマーセットが配列番号６のＦＩＰプライマー、配列番号７のＢＩＰプライマー及び配列番号８のＬＢプライマーを含むか、
前記逆転写用プライマーが配列番号９を含み、前記伸長用プライマーが配列番号１０を含み、前記増幅用プライマーセットが配列番号１１のＦＩＰプライマー、配列番号１２のＢＩＰプライマー及び配列番号８のＬＢプライマーを含むか、
前記逆転写用プライマーが配列番号１３を含み、前記伸長用プライマーが配列番号１４を含み、前記増幅用プライマーセットが配列番号１５のＦＩＰプライマー、配列番号１６のＢＩＰプライマー及び配列番号８のＬＢプライマーを含むか、
前記逆転写用プライマーが配列番号１７を含み、前記伸長用プライマーが配列番号１８を含み、前記増幅用プライマーセットが配列番号１９のＦＩＰプライマー、配列番号２０のＢＩＰプライマー及び配列番号８のＬＢプライマーを含むか、又は
前記逆転写用プライマーが配列番号４５を含み、前記伸長用プライマーが配列番号４６を含み、前記増幅用プライマーセットが配列番号４７のＦＩＰプライマー、配列番号４８のＢＩＰプライマー及び配列番号８のＬＢプライマーを含み、
前記各プライマーの塩基配列は、対応する配列番号で表される塩基配列の１又は２の塩基の欠失、置換、付加又は挿入があるものも含む、
請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記がんは、乳がん、大腸がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、胆管がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、膀胱がん、前立腺がん、肉腫、子宮体がん及び子宮肉腫から選択される少なくとも１つを含む、請求項１５又は１６に記載のキット。
【請求項１８】
前記がんは、乳がん、大腸がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、胆管がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、膀胱がん、前立腺がん、肉腫及び子宮体がんから選択される少なくとも１つである、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ−３ｐ用の逆転写用プライマー、伸長用プライマー、増幅用プライマーセット及び核酸プローブからなる群から選択される少なくとも１種の核酸を更に含む、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２−５ｐ用の逆転写用プライマー、伸長用プライマー、増幅用プライマーセット及び核酸プローブからなる群から選択される少なくとも１種の核酸を更に含む、請求項１８に記載のキット。
【請求項２１】
ｃｅｌ−ｍｉＲ−３９−３ｐ、及び
ｃｅｌ−ｍｉＲ−３９−３ｐ用の逆転写用プライマー、伸長用プライマー、増幅用プライマーセット及び核酸プローブからなる群から選択される少なくとも１種の核酸を更に含む、請求項１５〜２０の何れか１項に記載のキット。
【請求項２２】
がんを検出するためのプライマーセットであって、前記プライマーセットは、
前記逆転写用プライマーが配列番号４を含み、前記伸長用プライマーが配列番号５を含み、前記増幅用プライマーセットが配列番号６のＦＩＰプライマー、配列番号７のＢＩＰプライマー及び配列番号８のＬＢプライマーを含むか、
前記逆転写用プライマーが配列番号９を含み、前記伸長用プライマーが配列番号１０を含み、前記増幅用プライマーセットが配列番号１１のＦＩＰプライマー、配列番号１２のＢＩＰプライマー及び配列番号８のＬＢプライマーを含むか、
前記逆転写用プライマーが配列番号１３を含み、前記伸長用プライマーが配列番号１４を含み、前記増幅用プライマーセットが配列番号１５のＦＩＰプライマー、配列番号１６のＢＩＰプライマー及び配列番号８のＬＢプライマーを含むか、
前記逆転写用プライマーが配列番号１７を含み、前記伸長用プライマーが配列番号１８を含み、前記増幅用プライマーセットが配列番号１９のＦＩＰプライマー、配列番号２０のＢＩＰプライマー及び配列番号８のＬＢプライマーを含むか、又は
前記逆転写用プライマーが配列番号４５を含み、前記伸長用プライマーが配列番号４６を含み、前記増幅用プライマーセットが配列番号４７のＦＩＰプライマー、配列番号４８のＢＩＰプライマー及び配列番号８のＬＢプライマーを含み、
前記各プライマーの塩基配列は、対応する配列番号で表される塩基配列の１又は２の塩基の欠失、置換、付加又は挿入があるものも含む、
プライマーセット。
【請求項２３】
前記がんは、乳がん、大腸がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、胆管がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、膀胱がん、前立腺がん、肉腫及び子宮体がんから選択される少なくとも１つを含む、請求項２２に記載のプライマーセット。
【請求項２４】
がんを検出するための検出用デバイスであって、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐを増幅し、増幅産物を検出する増幅検出部を備え、
前記増幅検出部は、基板と、前記基板の１つの面上に備えられた１つ以上の検出領域とを備える、
検出用デバイス。
【請求項２５】
前記がんは、乳がん、大腸がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、胆管がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、膀胱がん、前立腺がん、肉腫、子宮体がん及び子宮肉腫から選択される少なくとも１つを含む、請求項２４に記載の検出用デバイス。
【請求項２６】
前記検出領域の付近に固定された、前記増幅産物とハイブリダイズする核酸プローブを備える、請求項２４又は２５に記載の検出用デバイス。
【請求項２７】
前記検出領域の付近に遊離可能に固定された、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐを逆転写するための逆転写用プライマー、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐを伸長するための伸長用プライマー及び／又はｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐを増幅するための増幅用プライマーセットを更に備える、
請求項２４〜２６の何れか１項に記載の検出用デバイス。
【請求項２８】
前記逆転写用プライマーが配列番号４を含み、前記伸長用プライマーが配列番号５を含み、前記増幅用プライマーセットが配列番号６のＦＩＰプライマー、配列番号７のＢＩＰプライマー及び配列番号８のＬＢプライマーを含むか、
前記逆転写用プライマーが配列番号９を含み、前記伸長用プライマーが配列番号１０を含み、前記増幅用プライマーセットが配列番号１１のＦＩＰプライマー、配列番号１２のＢＩＰプライマー及び配列番号８のＬＢプライマーを含むか、
前記逆転写用プライマーが配列番号１３を含み、前記伸長用プライマーが配列番号１４を含み、前記増幅用プライマーセットが配列番号１５のＦＩＰプライマー、配列番号１６のＢＩＰプライマー及び配列番号８のＬＢプライマーを含むか、
前記逆転写用プライマーが配列番号１７を含み、前記伸長用プライマーが配列番号１８を含み、前記増幅用プライマーセットが配列番号１９のＦＩＰプライマー、配列番号２０のＢＩＰプライマー及び配列番号８のＬＢプライマーを含むか、又は
前記逆転写用プライマーが配列番号４５を含み、前記伸長用プライマーが配列番号４６を含み、前記増幅用プライマーセットが配列番号４７のＦＩＰプライマー、配列番号４８のＢＩＰプライマー及び配列番号８のＬＢプライマーを含み、
前記各プライマーの塩基配列は、対応する配列番号で表される塩基配列の１又は２の塩基の欠失、置換、付加又は挿入があるものも含む、
請求項２７に記載の検出用デバイス。
【請求項２９】
前記がんは、乳がん、大腸がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、胆管がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、膀胱がん、前立腺がん、肉腫及び子宮体がんから選択される少なくとも１つである、請求項２８に記載の検出用デバイス。
【請求項３０】
前記検出の結果からｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐの定量値を算出する算出部をさらに備える請求項２４〜２９のいずれか１項に記載のデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態は、分析方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と疾患との関係が注目されている。ｍｉＲＮＡは遺伝子発現を調節する機能を持ち、種々の疾患でその種類や発現量が初期の段階から変化していることが報告されている。即ち、ある疾患を持つ患者では、特定のｍｉＲＮＡ量が健常者と比較して増加又は減少している。そのため、被検者から採取された試料中の該ｍｉＲＮＡの量を調べることは、患者がその疾患に罹患しているか否かを知る手段となる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明が解決しようとする課題は、対象におけるがんの罹患の有無を簡便に判定することができる分析方法、キット、プライマーセット及び検出デバイスを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
実施形態によれば、対象由来の試料中のｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐを定量することを含む、対象におけるがんの罹患の有無を判定する分析方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】図１は、第１実施形態の分析方法の一例を示すフローチャートである。
【図２】図２は、第２実施形態の分析方法の一例を示すフローチャートである。
【図３】図３は、第３実施形態の定量工程の一例を示すフローチャートである。
【図４】図４は、第３実施形態の定量工程の一例を示す模式図である。
【図５】図５は、例１の実験結果を示す箱ひげ図である。
【図６】図６は、例１の実験結果を示す箱ひげ図である。
【図７】図７は、例２のプライマーセットＡを用いた場合の実験結果を示す箱ひげ図である。
【図８】図８は、例２の実験結果を示す箱ひげ図である。
【図９】図９は、例２の実験結果を示す箱ひげ図である。
【図１０】図１０は、例２のプライマーセットＪを用いた場合の実験結果を示す箱ひげ図である。
【図１１】図１１は、例２の実験結果を示す箱ひげ図である。
【図１２】図１２は、例２の実験結果を示す箱ひげ図である。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
以下に、図面を参照しながら実施形態の分析方法及びキットについて説明する。
【０００７】
・第１実施形態
（分析方法）
第１実施形態に従う分析方法は、図１の（ａ）に示すように、対象由来の試料中のｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐを定量すること（定量工程（Ｓ１））を含む、対象におけるがんの罹患の有無を判定する方法である。
【０００８】
がんは、悪性腫瘍、悪性新生物、癌及び肉腫をいう。がんは限定されるものではないが、例えば、前立腺がん、乳がん、大腸がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、胆管がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、膀胱がん、肉腫、子宮体がん、子宮肉腫、中皮腫、咽頭がん、上顎がん、口腔がん、舌がん、口唇がん、喉頭がん、甲状腺がん、神経腫瘍、神経謬腫、神経芽細胞腫、腎細胞がん、精巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、悪性黒色腫、骨腫瘍、白血病、悪性リンパ及び多発性骨髄腫等を含む。
【０００９】
がんは、何れの病期のものも含み、例えば、発生母地の臓器内にがんが留まった状態、更に周辺の組織までがんが及んだ状態、更にリンパ節へがんが転移した状態、及び更に離れた臓器へのがんの転移がある状態等を含む。
【００１０】
対象は、本方法において分析に供される動物、即ち、試料を提供する動物である。対象は、何らかの疾患を有する動物であってもよいし、健常な動物であってもよい。例えば、対象は、がんに罹患している可能性がある動物、或いは過去にがんに罹患したことのある動物等であってもよい。
【００１１】
対象はヒトであることが好ましい。或いは、対象は他の動物であってもよい。他の動物は、例えば哺乳動物であり、例えば、サル等の霊長類、マウス、ラット又はモルモット等の齧歯類、イヌ、ネコ又はウサギ等の伴侶動物、ウマ、ウシ又はブタ等の家畜動物、或いは展示動物等に属する動物を含む。
【００１２】
対象由来の試料とは、対象から採取された試料又はそれを適切に処理した試料等を含む。試料は、好ましくは、血清である。試料は、その他の体液、例えば、血液、血漿、白血球、間質液、尿、便、汗、唾液、口腔内粘膜、鼻腔内粘膜、鼻水、咽頭粘膜、喀痰、消化液、胃液、リンパ液、髄液、涙液、母乳、羊水、精液又は膣液等であってもよい。或いは、試料は、組織又は細胞等であってもよく、対象から採取され、培養された組織又は細胞、或いはその上清であってもよい。
【００１３】
以下、第１実施形態の分析方法の手順の一例について説明する。
【００１４】
まず、対象由来の試料を用意する。試料は、その種類に従う一般的な方法を用いて採取することができる。試料は、採取後そのまま使ってもよいし、核酸の定量のための反応を阻害しない状態又は反応により適した状態となるように処理してもよい。処理は、例えば、細切、ホモジナイズ、遠心、沈殿、抽出及び／又は分離等であり、公知の何れかの手段により行うことができる。
【００１５】
例えば、抽出は、市販の核酸抽出キットを用いて行ってもよい。核酸抽出キットとして、例えば、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）  ｍｉＲＮＡ  Ｐｌａｓｍａ（タカラバイオ製）、Ｑｕｉｃｋ−ｃｆＲＮＡ  Ｓｅｒｕｍ  ＆  Ｐｌａｓｍａ  Ｋｉｔ（ザイモリサーチ製）、ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｓｅｒｕｍ／Ｐｌａｓｍａ  キット（キアゲン製）、ｍｉＲＶａｎａ  ＰＡＲＩＳ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（サーモフィッシャー製）、ＰｕｒｅＬｉｎｋＴＭ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｋｉｔ（サーモフィッシャー製）、Ｐｌａｓｍａ／Ｓｅｒｕｍ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ｎｏｒｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製)、ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ（登録商標）  ＳＰ  Ｋｉｔ(和光純薬)、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ｍｉＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（シグマアルドリッチ製）等を用いることができる。或いは、市販のキットを使用せずに、例えば、試料を緩衝液で希釈し、８０〜１００℃の加熱処理を行い、遠心分離し、その上清を採取することによって抽出を行ってもよい。
【００１６】
次に、試料中のｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐの定量を行う（定量工程（Ｓ１））。ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐは、下記の配列：
ＵＵＧＣＡＧＣＵＧＣＣＵＧＧＧＡＧＵＧＡＣＵＵＣ（配列番号１）
を有するｍｉＲＮＡである。以下、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐを「標的ｍｉＲＮＡ」とも称する。
【００１７】
定量工程（Ｓ１）は、ＲＮＡ、特にｍｉＲＮＡ等の短鎖のＲＮＡを定量するための一般的な方法を用いて行うことができる。その方法は限定されるものではないが、例えば、標的ｍｉＲＮＡを逆転写し、ｃＤＮＡを増幅し、増幅産物を検出及び定量することが好ましい。増幅には、例えば、ＰＣＲ法、ｑＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法等を用いることができる。検出及び定量は、増幅の後に行われてもよいし、増幅中に経時的に行われてもよい。検出及び定量には、例えば、濁度若しくは吸光度に基づく信号を用いる測定法、光学的信号を用いる測定法又は電気化学的信号を用いる測定法、或いはこれらの組み合わせ等を用いることができる。例えば、増幅産物量に応じて得られる上記信号の強度又は変化量、或いは信号が閾値に達するまでの時間（立ち上がり時間）又はＰＣＲ法を用いる場合はサイクル数（立ち上がりサイクル数）等の検出結果から標的ｍｉＲＮＡの定量を行うことができる。
【００１８】
標的ｍｉＲＮＡの定量値は、上記信号の検出結果と標的ｍｉＲＮＡの存在量との関係を表す検量線を用いて決定され得る。検量線は、異なる既知の濃度で標的ｍｉＲＮＡを含む複数の標準試料について信号の検出を行うことにより作成することができる。この検量線と、対象由来の試料について得られた信号の検出結果とを比較することによって、試料中の標的ｍｉＲＮＡの存在量が算出され得る。例えば、試料中の標的ｍｉＲＮＡの存在量は、試料の単位量当たりの標的ｍｉＲＮＡのコピー数として得られ得る。
【００１９】
定量工程（Ｓ１）は、例えば、市販のキットを用いて行ってもよい。市販のキットの例は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｍｉＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓ（サーモフィッシャー製、ＩＤ：４７７８２７＿ｍｉｒ）、ｍｉＲＣＵＲＹ  ＬＮＡ  ｍｉＲＮＡ  ＰＣＲ  Ａｓｓａｙｓ（キアゲン製、カタログＮｏ．ＹＰ０２１０３１３２）、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ｑＰＣＲ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ検出システム（オリジンテクノロジーズ製）等であり、標的ｍｉＲＮＡを特異的に増幅するプライマーとともに用いられ得る。
【００２０】
より好ましい定量工程（Ｓ１）の例については、第３実施形態で説明する。
【００２１】
定量工程（Ｓ１）で得られた標的ｍｉＲＮＡの定量値は、対象におけるがんの罹患の有無を判定するために用いることができる。
【００２２】
例えば、第１実施形態の分析方法は、図１の（ｂ）に示す通り、定量工程（Ｓ１）の後に行われ得る判定工程（Ｓ２）を更に含み得る。判定工程（Ｓ２）では、標的ｍｉＲＮＡの定量値が高い場合に対象ががんに罹患していると判定する。反対に、定量値が低い場合に対象はがんに罹患していないと判定され得る。定量値の高低は、例えば、予め得られた対照における標的ｍｉＲＮＡの定量値又は閾値等を基準として判定される。例えば、定量値がそれらよりも高い場合には、対象ががんに罹患していると判定され得る。
【００２３】
対照とは、例えば、健常体である。健常体とは、少なくともがんに罹患していない個体をいう。健常体は、疾患や異常を有さない健康な個体であることが好ましい。対照として選択される個体は、本方法で分析される対象とは別の個体であってもよいが、同じ種に属する個体、即ち対象がヒトであればヒトであることが好ましい。また、対照の年齢、性別及び身長体重等の身体的条件又は人数は特に限定されるものではないが、身体的条件は、本分析方法で検査を受ける対象のものと同じ又は類似であることが好ましい。
【００２４】
対照における標的ｍｉＲＮＡの定量値は、例えば、対照由来の同じ又は類似の試料を用いて、定量工程（Ｓ１）で用いられるのと同じ方法を用いて得られた標的ｍｉＲＮＡの定量値である。
【００２５】
閾値は、例えば、がんに罹患している対象における定量値と、がんに罹患していない対照における定量値とを切り分けることができる標的ｍｉＲＮＡの定量値である。閾値は、例えば、がんに罹患しているか否かが既知である標準対象由来の同じ若しくは類似の試料又はがんの株化細胞を含む試料等を用いて、定量工程（Ｓ１）で用いられるのと同様の方法によって得られた標的ｍｉＲＮＡの定量値から決定することができる。閾値は限定されるものではなく、用いられる定量方法、試料の種類及び測定条件等に従って決定され得る。
【００２６】
或いは、閾値は対象ごとに決定されてもよい。例えば、健康診断等で定期的に測定される対象の健常なときの標的ｍｉＲＮＡ定量値をモニターしていれば、それを閾値として用いることにより、それより定量値が高いときにがんに罹患している可能性ありとしてアラームを出すことができる。閾値は個人ごとに異なり得る。例えば、通常標的ｍｉＲＮＡの定量値が約１０３コピーで推移していた対象Ａにおいて、あるとき１０４コピーとなった場合がんの可能性ありとすることができる。一方で、約１０２コピーで推移していた対象Ｂにおいては、あるとき１０３コピーとなった場合にがんの可能性ありとすることができる。
【００２７】
対照における定量値又は閾値は文献等の過去の知見から決定してもよい。
【００２８】
ここで、罹患しているとは、罹患している可能性が高いことも含む。反対に、罹患していないとは、罹患している可能性が低いことも含む。
【００２９】
更なる実施形態によれば、がんに罹患していると判定することは、対象におけるがんの予後又は再発を判定することも含む。例えば、分析方法は、図１の（ｃ）に示すように、定量工程（Ｓ１）の後、定量の結果から対象におけるがんの予後又は再発の有無を判定する判定工程（Ｓ３）を含む。判定工程（Ｓ３）においては、例えば、定量値が高い場合には、対象におけるがんの予後が不良である、又はがんが再発している、或いはその可能性が高いと判定することが可能である。予後、再発の判定にも上記対照における定量値、閾値を用いることができる。特に対象ごとに決定された閾値を用いることが好ましい場合もあり得る。
【００３０】
また、判定工程（Ｓ２）及び／又は判定工程（Ｓ３）の後、判定結果に従って対象に適用するための治療法の種類又は薬剤の種類を選択することも可能である。例えば、分析方法は、図１の（ｄ）に示すように、判定工程（Ｓ２）及び／又は判定工程（Ｓ３）の後、判定結果から対象に適用するための治療法の種類又は薬剤の種類を選択する選択工程（Ｓ４）を含む。ここで治療法又は薬剤は、がんの治療のためのものである。治療法の種類又は薬剤の種類は、治療法又は薬剤の使用量、タイミング若しくは期間を含む。
【００３１】
以上に説明した第１実施形態の分析方法によれば、１種類の標的ｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐ）を定量することにより、簡便に対象におけるがんの罹患の有無を判定することが可能である。言い換えれば、本方法によればがんに罹患した対象とがんに罹患していない対象とを簡単に識別することができる。
【００３２】
特に、実施形態の分析方法は、健康診断等で容易に採取できる血清を用いることが可能であるため、がんを早期に発見することができる。血清等を用いることで、細胞診等と比較して対象の肉体的及び経済的負担を大きく軽減することができるとともに、手順が容易であるため検査者にとっても負担が少ない。また、血清は、そこに含まれるｍｉＲＮＡ濃度が安定しているため、より正確な検査を行うことが可能である。
【００３３】
更なる実施形態によれば、対象由来の試料中の標的ｍｉＲＮＡを定量すること（定量工程（Ｓ１））を含む、対象におけるがんの罹患の有無を判定を補助するための分析方法も提供される。
【００３４】
「判定を補助する」とは、例えば、対象ががんに罹患している可能性に関する情報を取得することを含む。「情報」とは、例えば、定量工程（Ｓ１）で得られる定量値であり得る。本方法によれば、対象におけるがんの罹患の有無判定、予後判定、再発の有無判定、又は対象に適用される治療法若しくは薬剤の選択等を行うためのより精度の高い情報を取得することができる。
【００３５】
更なる実施形態によれば、本分析方法は、対象由来でない試料中におけるがん細胞の検出等にも使用することができる。例えば、がん細胞を人工的に製造する場合に、製造された細胞含有溶液中にがん細胞が存在するか否かを確かめる際等にも使用することができる。
【００３６】
（マーカー）
第１実施形態によれば、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐを含む、がん検出用マーカーが提供される。
【００３７】
ここで、「マーカー」は、試料中のその有無又は濃度を検出することで、試料及び／又はその由来となる対象が特定の状態であるか否かを判定することのできる物質をいう。
【００３８】
第１実施形態のがん検出用マーカーは、例えば、対象由来の試料中のその存在量（定量値）を測定することで、上記したように対象におけるがんの罹患の有無判定、予後判定、再発の有無判定、又は対象に適用される治療法若しくは薬剤の選択等を行うことができる。
【００３９】
（キット）
第１実施形態によれば、がん検出用キットが提供される。
【００４０】
当該キットは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐを逆転写するための逆転写用（ＲＴ）プライマー、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐを伸長するための伸長用（ＥＬ）プライマー、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐを増幅するための増幅用プライマーセット及びｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐを検出するための核酸プローブからなる群から選択される少なくとも１種の核酸を含む。
【００４１】
ＲＴプライマーは、標的ｍｉＲＮＡのｃＤＮＡを得るためのプライマーである。ＲＴプライマーは、標的ｍｉＲＮＡの少なくとも１部の配列に相補的な配列を含む。ＲＴプライマーは、標的ｍｉＲＮＡのｃＤＮＡを増幅しやすくするｃＤＮＡに付加する人工配列を更に含んでもよい。
【００４２】
ＥＬプライマーは、標的ｍｉＲＮＡのｃＤＮＡを増幅しやすくするために、ｃＤＮＡに人工配列を付加するためのプライマーである。ＥＬプライマーは、標的ｍｉＲＮＡのｃＤＮＡの少なくとも１部の配列に相補的な配列と、ｃＤＮＡの伸長用に付加する配列とを含み得る。
【００４３】
増幅用プライマーセットは、例えばＰＣＲ法用であり、少なくともフォワードプライマーとリバースプライマーとを含む。或いは増幅用プライマーセットはＬＡＭＰ法用であり、少なくともＦＩＰプライマー及びＢＩＰプライマーを含む。必要に応じて、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー及び／又はループプライマーを含んでもよい。
【００４４】
増幅用プライマーセットに含まれる各プライマーは、標的ｍｉＲＮＡのｃＤＮＡ又はその相補配列と結合するように設計されてもよいし、ＲＴプライマー及び／又はＥＬプライマーによって付加された人工配列と結合するように設計されてもよい。ＲＴプライマー、ＥＬプライマー及び増幅用プライマーセットの好ましい配列については、第３実施形態で説明する。
【００４５】
核酸プローブは、標的ｍｉＲＮＡ、そのｃＤＮＡ、或いはその増幅産物の少なくとも１部の配列又はその相補配列を有し得る。
【００４６】
キットに含まれる上記核酸は、個別に又は何れかが組み合わされて適切な担体とともに容器に収容されて提供されてもよい。適切な担体は、例えば、水、生理的溶液又は緩衝液等である。容器は、例えば、チューブ又はマイクロタイタープレート等である。或いは、これら核酸はマイクロ流体チップ等の固相に固定されて提供されてもよい。
【００４７】
キットは、上記核酸の他に、逆転写、伸長及び／又は増幅に用いられる試薬、例えば酵素、基質及び／又は検出に用いられる光学的信号又は電気的化学信号を生じる標識物質等を含んでもよい。標識物質は、例えば、ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎやＥＶＡ  Ｇｒｅｅｎ、ＳＹＴＯ  ８２などの蛍光色素、電流検出する場合はルテニウムヘキサアミンなどの金属錯体等の指示薬である。
【００４８】
キットは、例えば、上記のように対象におけるがんの罹患の有無判定、予後判定、再発の有無判定、治療法の種類又は薬剤の種類の選択等に使用することができる。
【００４９】
更なる実施形態によれば、がん検出用キットは、がんの診断用組成物又は診断薬として提供される。また、実施形態によれば、がんの診断用組成物又はがんの診断薬の製造における上記核酸の少なくとも１種の使用も提供される。
【００５０】
・第２実施形態
（分析方法）
第２実施形態の分析方法は、図２の（ａ）に示すように、対象由来の試料中のｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐを定量すること（定量工程（Ｓ１１））を含む、対象における乳がん、大腸がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、胆管がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、膀胱がん、前立腺がん、肉腫及び子宮体がんから選択される少なくとも１つの罹患の有無を判定する方法である。
【００５１】
乳がん、大腸がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、胆管がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、膀胱がん、前立腺がん、肉腫及び子宮体がんを、以下ではまとめて「標的がん」とも称する。
【００５２】
定量工程（Ｓ１１）は、第１実施形態の定量工程（Ｓ１）同様に行うことができるが、増幅はＬＡＭＰ法を用いて行われ得る。対象及び試料は、第１実施形態と同様とすることができるが、対象は標的がんの少なくとも１つに罹患している可能性がある動物、或いは過去に標的がんの少なくとも１つに罹患したことのある動物等であってもよい。
【００５３】
定量工程（Ｓ１１）で得られた標的ｍｉＲＮＡの定量結果は、対象における標的がんの少なくとも１つを検出するために用いることができる。
【００５４】
例えば、第２実施形態に従う分析方法は、図２の（ｂ）に示すように定量工程（Ｓ１１）の後に行われ得る判定工程（Ｓ１２）を更に含み得る。判定工程（Ｓ１２）では、標的ｍｉＲＮＡの定量値が高い場合に、対象は、標的がんの少なくとも１つに罹患していると判定され得る。定量値の高低は、例えば、予め得られた対照における標的ｍｉＲＮＡの定量値又は閾値等を基準として判定される。
【００５５】
第２実施形態において対照は、例えば、標的がんの何れにも罹患していない個体をいう。対照は、健常体や他の疾患を罹患する個体であってもよいが、他のがんに罹患した個体であることが好ましい。他のがんは、標的がん以外に分類されるがんである。他のがんは例えば子宮肉腫である。
【００５６】
閾値は、例えば、標的がんに罹患している対象における定量値と、標的がんに罹患していない対照における定量値とを切り分けることができる標的ｍｉＲＮＡの定量値であるが、標的がんに罹患している対象における定量値と、子宮肉腫に罹患している対照における定量値とを切り分けることができる定量値であることが好ましい。閾値は、例えば、がんに罹患しているか否か又は罹患しているがんの種類が既知である標準対象由来の同じ若しくは類似の試料又は標的がんの株化細胞を含む試料等から得られた標的ｍｉＲＮＡ定量値から決定することができる。閾値は限定されるものではなく、用いられる定量方法、試料の種類及び測定条件等に従って決定され得る。
【００５７】
対照における定量値又は閾値は文献等の過去の知見から決定してもよい。
【００５８】
定量工程（Ｓ１１）で得られた定量値が高い場合に、対象は、子宮肉腫ではなく、標的がんの少なくとも１つに罹患していると判定することができる。言い換えれば、本分析方法によれば、標的がんに罹患した対象と、子宮肉腫に罹患した対象又はがんに罹患していない対象とを識別することが可能である。
【００５９】
判定工程（Ｓ１２）を子宮肉腫の対照の定量値及び／又は標的がんと子宮肉腫とを切り分けるための閾値を基準として行うことにより、標的がんの罹患の有無を、子宮肉腫がんとより正確に識別して判定することができる。
【００６０】
以上に説明した第２実施形態の分析方法によれば、１種類の標的ｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐ）を定量することにより、簡便に対象における標的がんの少なくとも１つの罹患の有無を判定することが可能である。
【００６１】
第２実施形態の分析方法は、図２の（ｃ）に示すように、定量工程（Ｓ１１）の後、定量結果から対象における標的がんの予後又は再発の有無を判定する判定工程（Ｓ１３）を含んでもよい。また、判定工程（Ｓ１２）及び／又は判定工程（Ｓ１３）の後に、その結果に従って対象に適用するための治療法の種類又は薬剤の種類を選択する選択工程（Ｓ１４）を含んでもよい。
【００６２】
更なる実施形態によれば、対象由来の試料中の標的ｍｉＲＮＡを定量すること（定量工程（Ｓ１１））を含む、対象における標的がんの少なくとも１つの罹患の有無の判定を補助するための分析方法も提供される。本方法によれば、対象における標的がんの罹患の有無判定、予後判定、再発の有無判定、又は対象に適用される治療法若しくは薬剤の選択等を行うためのより精度の高い情報を取得することができる。
【００６３】
第２実施形態によれば、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐを含む、標的がん検出用マーカーも提供される。
【００６４】
第２実施形態によれば、標的がん検出用キットも提供される。第２実施形態に係るキットは、第１実施形態に説明したものと同様の核酸を含むが、プライマーセットはＬＡＭＰ法用のものであり得る。キットは、定量工程に必要な試薬を更に含んでもよい。第２実施形態に係るキットは、標的がんの少なくとも１つを検出するための診断用組成物又は診断薬として提供されてもよい。また第２実施形態によれば当該診断用組成物又は診断薬の製造における上記核酸の少なくとも１種の使用も提供される。
【００６５】
ＬＡＭＰ法によって得られたｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐの定量値は、標的がんをユニバーサルに検出するために用いることができる。例えば、対象から得られた細胞においてｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐの定量値が閾値以上であった場合、対象は標的がんの少なくとも１つに罹患していると判定することができる。更に各標的がんに特異的な他のマーカーを定量することにより、対象が標的がんのうち何れに罹患しているかを更に正確に判定することも可能である。
【００６６】
他のマーカーは、例えば、標的がんの少なくとも１つを検出するための、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐ以外のマーカーである。
【００６７】
例えば、前立腺がんで発現量の多いｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ−３ｐを併用することができる。ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ−３ｐは次の配列：
ＵＡＵＵＧＣＡＣＵＵＧＵＣＣＣＧＧＣＣＵＧＵ（配列番号２）
を有するｍｉＲＮＡである。標的ｍｉＲＮＡとｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ−３ｐとの両方の定量値が高いとき、対象が前立腺がんに罹患していると判定することができる。
【００６８】
また、膵臓がんで発現量の多いｈｓａ−ｍｉＲ−１２２ａ−５ｐを併用することができる。ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２ａ−５ｐは次の配列：
ＵＧＧＡＧＵＧＵＧＡＣＡＡＵＧＧＵＧＵＵＵＧ（配列番号３）
を有するｍｉＲＮＡである。標的ｍｉＲＮＡとｈｓａ−ｍｉＲ−１２２ａ−５ｐとの両方の定量値が高いとき、対象が膵臓がんに罹患していると判定することができる。
【００６９】
他のマーカーの定量値は、定量工程（Ｓ１）と同様の方法で取得することが好ましい。
【００７０】
他のマーカーは上記のものに限定されるものではなく、標的がんの何れかを検出するためのマーカーとして知られる何れのマーカーも使用することが可能である。他のマーカーはｍｉＲＮＡでなくともよく、ＤＮＡ、ペプチド又はタンパク質等であってもよい。
【００７１】
この例におけるキットは、上記他のマーカーを検出するためのＲＴプライマー、ＥＬプライマー、増幅用プライマーセット及び／又は核酸プローブを更に含んでもよい。
【００７２】
・第３実施形態
第３実施形態では、標的ｍｉＲＮＡを定量する工程の好ましい一例について説明する。この例においては、標的ｍｉＲＮＡを特異的に逆転写し、人工配列を付加して伸長し、伸長産物をＬＡＭＰ法により増幅し、得られた増幅産物を検出する。以下では、標的ｍｉＲＮＡの配列（配列番号１）を「第１の配列」とも称する。
【００７３】
定量工程（Ｓ１）は、例えば、図３に示す次の工程を含む：
（Ｓ１−１）標的ｍｉＲＮＡの第１の配列とハイブリダイズする第１プライマー部及び第１ＬＡＭＰ認識配列を含む逆転写用（ＲＴ）プライマーの、第１プライマー部を第１の配列とハイブリダイズさせ、第１の配列を逆転写し、標的ｍｉＲＮＡのｃＤＮＡ（第１ａの配列）を含む逆転写産物を得る逆転写工程、
（Ｓ１−２）逆転写産物と標的ｍｉＲＮＡとを解離させる解離工程、
（Ｓ１−３）第１ａの配列とハイブリダイズする第２プライマー部、及び第２ＬＡＭＰ認識配列を含む伸長用（ＥＬ）プライマーの第２プライマー部を逆転写産物の第１ａの配列とハイブリダイズさせ、ＥＬプライマー及び逆転写産物を、互いを鋳型として伸長させて、第１ａの配列５の相補配列（即ち、第１の配列に対応するＤＮＡ配列）を含む伸長産物を得る伸長工程、
（Ｓ１−４）伸長産物をＬＡＭＰ反応により増幅し、増幅産物を得る増幅工程、及び
（Ｓ１−５）得られた増幅産物を検出する検出工程。
【００７４】
以下、各工程について、図４を用いて詳細に説明する。
【００７５】
逆転写工程（Ｓ１−１）には、例えば、ＲＴプライマー３、逆転写酵素、塩及びデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）等の基質（必要に応じて反応試薬としての増粘剤、ｐＨ調製用緩衝材、界面活性剤、アニーリング特異性を増大するイオン及び／又は逆転写酵素の補因子となるイオン）等を含む逆転写溶液が用いられる。逆転写酵素として、例えば、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、トランスクリプター逆転写酵素、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）トランスクリプター逆転写酵素、又はＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ逆転写酵素等を用いることができる。
【００７６】
ＲＴプライマー３は、第１プライマー部４ａ及び第１ＬＡＭＰ認識配列４ｂを含む。第１プライマー部４ａは、第１の配列２とハイブリダイズして、第１の配列２を逆転写してｃＤＮＡ（第１ａの配列５）を生成するためのプライマーとして働く核酸配列である。第１プライマー部４ａは、例えば、第１の配列２の３’末端を含む連続した少なくとも５つの塩基配列の相補配列を有する。
【００７７】
第１ＬＡＭＰ認識配列４ｂは、増幅工程（Ｓ１−４）において増幅用プライマーが結合する配列（認識配列）を含む核酸塩基配列である。認識配列は、一般にＬＡＭＰ増幅用のプライマーにおいて用いられるものであってもよい。例えば、第１ＬＡＭＰ認識配列４ｂは、第１プライマー部４ａ側から５’末端に向かう順番で、Ｂ１配列、Ｂ２配列、Ｂ３配列及び／又はＬＢ配列を含んでもよい。
【００７８】
逆転写溶液中におけるＲＴプライマー３の濃度は、５〜５０ｎＭであることが好ましい。この濃度範囲であることによって反応の特異性及び効率をより向上させることができる。
【００７９】
逆転写工程（Ｓ１−１）においては、逆転写溶液と試料と混合し、例えば約１０℃〜５５℃に維持することが好ましい。それによって、第１プライマー部４ａが第１の配列２とハイブリダイズし、第１の配列２を逆転写し、標的ｍｉＲＮＡ１のｃＤＮＡ（第１ａの配列５）を含む逆転写産物６が得られる。
【００８０】
解離工程（Ｓ１−２）は、例えば、逆転写後の反応液を８０℃〜１００℃に加熱することによって行うことができる。この条件に維持することによって、逆転写産物６と標的ｍｉＲＮＡ１とが解離する。
【００８１】
伸長工程（Ｓ１−３）には、例えば、ＥＬプライマー７、ＤＮＡポリメラーゼ、塩及びｄＮＴＰ等の基質（必要に応じて増粘剤、ｐＨ調製用緩衝材、界面活性剤及びイオン）等を、逆転写産物６を含む伸長溶液が用いられる。
【００８２】
ＥＬプライマー７は、第２プライマー部８ａ、及び第２ＬＡＭＰ認識配列８ｂを含む。第２プライマー部８ａは、第１ａの配列５とハイブリダイズして、その相補配列９を生成するためのプライマーとして働く核酸配列である。第２プライマー部８ａは、例えば、第１ａの配列５の３’末端を含む連続した少なくとも５つの塩基配列の相補配列を有する。
【００８３】
第２ＬＡＭＰ認識配列８ｂは、増幅工程（Ｓ１−４）において増幅用プライマーが結合する配列（認識配列）を含む核酸塩基配列である。例えば、第２ＬＡＭＰ認識配列８ｂは、第２プライマー部８ａ側から５’末端に向かう順番で、Ｆ１配列、Ｆ２配列、Ｆ３配列及び／又はＬＦ配列を含んでもよい。
【００８４】
伸長溶液中におけるＥＬプライマー７の濃度は、５〜１００ｎＭであることが好ましい。この濃度範囲であることによって反応の特異性及び効率をより向上させることができる。
【００８５】
伸長工程（Ｓ１−３）においては、伸長溶液と解離工程後の逆転写産物６を含む反応液とを混合し約１０℃〜８０℃に維持することが好ましい。それによって、ＥＬプライマー７の第２プライマー部８ａが逆転写産物６の第１ａの配列５とハイブリダイズし、ＥＬプライマー７及び逆転写産物６が互いを鋳型として伸長し、第１ａの配列５の相補配列９（即ち、第１の配列に対応するＤＮＡ配列）を含む伸長産物１０が得られる。
【００８６】
第１プライマー部４ａ、第２プライマー部８ａは、ＤＮＡのみで構成されていてもよいし、ＬＮＡ及び／又はＰＮＡを含んでいてもよい。これらを多く含むほどハイブリダイゼーションの結合力を強くすることができる。従って、ＬＮＡ及び／又はＰＮＡの数は、ハイブリダイゼーションさせる配列との所望のＴｍ値に従って決定されればよい。例えば、ＬＮＡ及び／又はＰＮＡを含ませると、より高い温度で逆転写工程（Ｓ１−１）及び伸長工程（Ｓ１−３）を行うことができ、非特異的な結合を抑制することが可能である。その結果より精度よく標的ｍｉＲＮＡを逆転写及び伸長することが可能である。
【００８７】
第１ＬＡＭＰ認識配列４ｂ及び第２ＬＡＭＰ認識配列８ｂは、下記の（１）〜（７）の組み合わせで認識配列を含むことが好ましい。ここで、下記の各認識配列の順番は、第１プライマー部４ａ又は第２プライマー部８ａ側から５’末端に向かう順番である。「ｃ」は、その直前に記載された配列の相補配列を意味する。例えば、「ＬＢｃ配列」は、ＬＢ配列の相補配列を意味する。「ダミー配列」は、第１ａの配列、Ｆ２配列、Ｆ１配列、ＬＦ配列、Ｂ１配列、Ｂ２配列、ＬＢ配列及びその相補配列とは異なる塩基配列を有する核酸配列である。
（１）第１ＬＡＭＰ認識配列４ｂはＢ２配列を含み、
第２ＬＡＭＰ認識配列８ｂはＢ１ｃ配列、Ｆ１配列及びＦ２配列を含む。
【００８８】
（この場合、第１ａの配列の相補配列９の少なくとも１部をＬＢ配列とする。）
（２）第１ＬＡＭＰ認識配列４ｂはＬＢｃ配列及びＢ２配列を含み、
第２ＬＡＭＰ認識配列８ｂはＢ１ｃ配列、Ｆ１配列及びＦ２配列を含む。
（３）第１ＬＡＭＰ認識配列４ｂはダミー配列及びＢ２配列を含み、
第２ＬＡＭＰ認識配列８ｂはＢ１ｃ配列、Ｆ１配列及びＦ２配列を含む。
（４）第１ＬＡＭＰ認識配列４ｂはＢ１配列及びＢ２配列を含み、
第２ＬＡＭＰ認識配列８ｂはＦ１配列、ＬＦｃ配列及びＦ２配列を含む。
（５）第１ＬＡＭＰ認識配列４ｂはＢ２配列を含み、
第２ＬＡＭＰ認識配列８ｂはＦ１配列、ＬＦｃ配列及びＦ２配列を含む。
（６）第１ＬＡＭＰ認識配列４ｂはＬＢｃ配列及びＢ２配列を含み、
第２ＬＡＭＰ認識配列８ｂはＦ１配列及びＦ２配列を含む。
（７）第１ＬＡＭＰ認識配列４ｂはＢ１配列及びＢ２配列を含み、
第２ＬＡＭＰ認識配列８ｂはＬＦｃ配列及びＦ２配列を含む。
【００８９】
ＲＴプライマー３の第１プライマー部４ａと第１ＬＡＭＰ認識配列４ｂとの間、ＥＬプライマー７の第２プライマー部８ａと第２ＬＡＭＰ認識配列８ｂとの間、及び／又は各ＬＡＭＰ認識配列に含まれる各認識配列の間には、スペーサー配列が存在していてもよい。スペーサー配列は、第１ａの配列、各認識配列及びそれらの相補配列の配列とは異なり、かつ後述する伸長産物の増幅反応に悪影響を与えない核酸配列である。スペーサー配列は、ＤＮＡのみで構成されていてもよいし、ＬＮＡ及び／又はＰＮＡを含んでいてもよい。例えば、スペーサー配列は、１塩基〜１６塩基であり、ポリＴ配列又はポリＡ配列等であることが好ましい。
【００９０】
増幅工程（Ｓ１−４）は、ＬＡＭＰ法を用いて行われる。この工程においては、例えば、増幅用プライマーセット、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、塩及びｄＮＴＰ等の基質（必要に応じて増粘剤、ｐＨ調製用緩衝材、界面活性剤及びイオン）等を含む増幅溶液が用いられる。
【００９１】
増幅用プライマーセットの種類及び配列は、第１ＬＡＭＰ認識配列４ｂ及び第２ＬＡＭＰ認識配列８ｂの配列に従って選択される。例えば、増幅用プライマーセットは、第１ＬＡＭＰ認識配列４ｂ及び第２ＬＡＭＰ認識配列８ｂの配列に対応するＦＩＰプライマー及びＢＩＰプライマーを含む。必要であれば、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー及び／又はＬＦプライマー若しくはＬＢプライマー等のループプライマーを更に含んでもよい。
【００９２】
ＲＴプライマー３、及びＥＬプライマー７のＬＡＭＰ認識配列の組み合わせを上記（１）〜（７）とする場合、増幅用プライマーセットは、以下の組み合わせとすることが好ましい。なお、下記（１）〜（７）は、上記（１）〜（７）にそれぞれ対応するものである。
（１）Ｆ２配列及びＦ１ｃ配列を含むＦＩＰプライマー、
Ｂ２配列及びＢ１ｃ配列を含むＢＩＰプライマー、及び
第１ａの配列の相補配列９を含むＬＢプライマー。
（２）Ｆ２配列及びＦ１ｃ配列を含むＦＩＰプライマー
Ｂ２配列及びＢ１ｃ配列を含むＢＩＰプライマー、及び
ＬＢ配列を含むＬＢプライマー。
（３）Ｆ２配列及びＦ１ｃ配列を含むＦＩＰプライマー
Ｂ２配列及びＢ１ｃ配列を含むＢＩＰプライマー、及び
第１ａの配列の相補配列９を含むＬＢプライマー。
（４）Ｂ２配列及びＢ１ｃ配列を含むＦＩＰプライマー
Ｆ２配列及びＦ１ｃ配列を含むＢＩＰプライマー、及び
ＬＦ配列を含むＬＦプライマー。
（５）Ｆ２配列及びＦ１ｃ配列を含むＦＩＰプライマー
Ｂ２配列及び第１ａの配列の相補配列９を含むＢＩＰプライマー、及び
ＬＦ配列を含むＬＦプライマー。
（６）Ｆ２配列及びＦ１ｃ配列を含むＦＩＰプライマー
Ｂ２配列及び第１ａの配列の相補配列９を含むＢＩＰプライマー、及び
ＬＢ配列を含むＬＢプライマー。
（７）Ｆ２配列及び第１ａの配列５を含むＦＩＰプライマー
Ｂ２配列及びＢ１ｃ配列を含むＢＩＰプライマー、及び
ＬＦ配列を含むＬＦプライマー。
【００９３】
上記（１）の組み合わせとする場合がより好ましい。また、上記（１）の組み合わせとする場合、ＲＴプライマー３、ＥＬプライマー７、増幅用プライマーセットとして、例えば、以下の表１に示すプライマーセットＡ〜Ｄ又はプライマーセットＪを用いることが好ましい。
【表１−１】
2021125105.tif 000003
【表１−２】
2021125105.tif 000004
特に、プライマーセットＡ又はＪを用いることが好ましい。これらのプライマーセットは他のプライマーセットよりも特に安定性に優れている。プライマーセットＪはより安定性に優れており、より好ましい。安定性に優れているとは、複数回検出行った場合結果にずれが生じにくく、また非特異的増幅が起こりにくく、より信頼性の高い結果が得られることをいう。
【００９４】
各プライマーの配列は上記表に示すものに限定されるものではなく、上記配列のうち１又は２の塩基の欠失、置換、付加又は挿入があるものも使用することができる。
【００９５】
ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、ＬＢプライマーの増幅溶液中の濃度は、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマーは０．８μＭ〜２．４μＭ、ＬＢプライマーは、０．４μＭ〜１．２μＭであることが好ましい。この濃度範囲であることによって反応の特異性及び効率をより向上させることができる。
【００９６】
増幅工程（Ｓ１−４）においては、伸長産物１０を含む溶液と、増幅溶液との混合物を等温増幅反応条件下で維持する。例えば、等温増幅条件は、温度５０〜７５℃の等温を３０〜９０分間などとすればよいが、温度は、６０〜７０℃であることが好ましい。それにより伸長産物１０が増幅され、標的ｍｉＲＮＡ１のｃＤＮＡ（第１ａの配列５）及びその相補配列を含む増幅産物が得られる。
【００９７】
検出工程（Ｓ１−５）は、増幅工程（Ｓ１−４）中に経時的に増幅産物の増加に応じて変化する信号を検出し、信号の立ち上がり時間を測定し、その結果標的ｍｉＲＮＡの定量を行うことが好ましい。経時的とは、連続的であってもよいし、所望の時間間隔で複数の時点で検出することであってもよい。
【００９８】
信号として、例えば反応液の濁度、又は反応液からの光学的信号若しくは電気化学的信号等を用いることが好ましい。光学的信号を用いる場合、例えば、増幅産物の増加に応じて変化する光学的信号を生ずる標識物質の存在下で増幅反応を行うことが好ましい。この場合、標識物質は、例えば蛍光試薬又はインターカレータ等の指示薬である。電気化学的信号を用いる場合、例えば、増幅産物の増加に応じて変化する電気化学的信号を生ずる標識物質の存在下で増幅反応を行うことが好ましい。この場合、標識物質は、例えばレドックスプローブ等である。
【００９９】
検出は、例えば、検出用デバイスを用いて行うことが好ましい。検出用デバイスは、例えばチップを含む。チップは、標的ｍｉＲＮＡを増幅し、増幅産物を検出する増幅検出部であり、例えば、基板と、基板の１つの面上に備えられた１つ以上の検出領域とを備える。例えば、前記１つの面上で逆転写工程（Ｓ１−１）〜増幅工程（Ｓ１−４）を行うことができ、増幅産物が存在すると、検出領域で信号を検出することができる。また、検出デバイスは増幅検出部で得られた検出の結果から標的ｍｉＲＮＡの定量値を算出する算出部を更に備え得る。
【０１００】
検出領域は、光学的信号を用いる場合、例えば光学センサである。検出領域は、電気化学的信号を用いる場合、例えば電極である。電極は、例えば金であれば感度が良好であるため好ましい。
【０１０１】
検出領域の付近には標的ｍｉＲＮＡを逆転写するための逆転写用プライマー、標的ｍｉＲＮＡを伸長するための伸長用プライマー及び／又は標的ｍｉＲＮＡを増幅するための増幅用プライマーセットが遊離可能に固定されていてもよい。
【０１０２】
また、検出工程（Ｓ１−５）には、核酸プローブを用いてもよい。核酸プローブは増幅産物とハイブリダイズする配列を有し、核酸プローブと増幅産物とのハイブリダイゼーションを検出することにより、増幅産物を検出することができる。例えば、上記検出用デバイスの検出領域付近に核酸プローブが固定されていてもよい。
【０１０３】
次に、検出工程（Ｓ１−５）で得られた信号の立ち上がり時間から試料中の標的ｍｉＲＮＡを定量する。例えば、立ち上がり時間が早いほど標的ｍｉＲＮＡの存在量が多いと決定することができる。例えば、立ち上がり時間と標的ｍｉＲＮＡの存在量との関係を表す検量線を用いて、試料中の標的ｍｉＲＮＡの定量を行うことが好ましい。
【０１０４】
以上に説明した第３実施形態の定量工程によれば、標的ｍｉＲＮＡをより特異的かつ効率的に逆転写し、伸長し、増幅し、検出することができる。したがって、第１実施形態の定量工程（Ｓ１）及び第２実施形態の定量工程（Ｓ１１）を第３実施形態の定量工程で行うことにより、より精度よくがん、特に、標的がんの少なくとも１つの罹患の有無を判定することが可能である。
【０１０５】
更なる実施形態において、ＲＮＡの抽出効率は細胞の種類によって異なる場合がある。そのため、定量工程で得られた定量値は判定工程に用いる前にＲＮＡ抽出効率に基づいて補正することが好ましい。補正は例えば次のように行うことができる。予め試料に既知の量の標準ｍｉＲＮＡを添加する。例えば試料からＲＮＡを抽出するための試薬に標準ｍｉＲＮＡを添加（ｓｐｉｋｅ−ｉｎ）する。その後、標的ｍｉＲＮＡとともに標準ｍｉＲＮＡを抽出し、標的ｍｉＲＮＡの定量とともに標準ｍｉＲＮＡの定量も行う。その後、標準ｍｉＲＮＡの定量値から抽出効率を評価し、標的ｍｉＲＮＡの定量値を補正することができる。
【０１０６】
標準ｍｉＲＮＡの定量は専用のプライマーセットを用いて例えば図４に示す方法で標的ｍｉＲＮＡの定量と同じように行うことが好ましい。
【０１０７】
標準ｍｉＲＮＡは、対象に存在しないｍｉＲＮＡを用いることが好ましい。標準ｍｉＲＮＡとして例えば線虫に存在するｃｅｌ−ｍｉＲ−３９−３ｐを用いることができる。ｃｅｌ−ｍｉＲ−３９−３ｐは次の配列：
ＵＣＡＣＣＧＧＧＵＧＵＡＡＡＵＣＡＧＣＵＵＧ（配列番号４９）
を有するｍｉＲＮＡである。
【０１０８】
ｃｅｌ−ｍｉＲ−３９−３ｐは下記表２に記載のプライマーセットＫを用いて定量することができる。
【０１０９】
【表２】
2021125105.tif 000005
各プライマーの配列は上記表に示すものに限定されるものではなく、上記配列のうち１又は２の塩基の欠失、置換、付加又は挿入があるものも使用することができる。
【０１１０】
例えば標的ｍｉＲＮＡの定量値を標準ｍｉＲＮＡの定量値で除することによって補正値が得られる。補正値を次の判定工程に使用することによって、より正確な判定を行うことが可能である。
【０１１１】
第３実施形態の方法においてもがん、又は標的がんの罹患の有無を判定するためのキットが提供される。このキットは、例えば、上記の何れかのＲＴプライマー３、ＥＬプライマー７、増幅用プライマーセット、及び／又は核酸プローブを含むことが好ましい。例えば、キットは、上記表１に示すプライマーセットＡ〜Ｄ及びＪから選択される少なくとも１つを含むことが好ましい。
【０１１２】
また、第３実施形態の方法においても、第２実施形態において説明した他のマーカーを併用することができる。その場合、他のマーカーも第３実施形態の方法で定量することが好ましい。また、その場合、キットは、他のマーカーのためのＲＴプライマー、ＥＬプライマー、増幅用プライマーセットを更に含んでもよい。
【０１１３】
例えば、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ−３ｐを併用する場合、キットは、以下の表３に記載のプライマーセットＥ〜Ｇの何れかを更に含むことが好ましい。ＬＢプライマーについては、何れのプライマーセットにおいても配列番号２５又は２６のどちらかを用いることができる。
【０１１４】
【表３】
2021125105.tif 000006
各プライマーの配列は上記表に示すものに限定されるものではなく、上記配列のうち１又は２の塩基の欠失、置換、付加又は挿入があるものも使用することができる。
【０１１５】
ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２−５ｐを併用する場合、以下の表４に記載のプライマーセットＨ又はＩを用いることが好ましい。ＬＢプライマーについては、何れのプライマーセットにおいても配列番号３９又は４０のどちらかを用いることができる。
【０１１６】
【表４】
2021125105.tif 000007
各プライマーの配列は上記表に示すものに限定されるものではなく、上記配列のうち１又は２の塩基の欠失、置換、付加又は挿入があるものも使用することができる。
【０１１７】
表３及び４に示すプライマーセットを用いれば、より特異的にｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ−３ｐ及びｈｓａ−ｍｉＲ−１２２−５ｐを定量することができる。それにより、前立腺がん及び膵臓がんの検出精度がより向上する。キットに含ませる他のマーカーのためのプライマーセットは上記のものに限定されるものではなく、他の何れのプライマーセットもキットに含ませることが可能である。
【０１１８】
或いは、第３実施形態の定量工程及びキットは、標的ｍｉＲＮＡをより特異的に検出及び定量することが可能であるため、標的ｍｉＲＮＡをマーカーとして用いる他の疾患の検出に用いた場合もその検出をより精度よく行うことができる。例えば、他の疾患とは、神経障害、認知症、肝炎、心疾患、リウマチなどの自己免疫疾患等である。
【０１１９】
また、第３実施形態に係るキットは、補正用のｍｉＲＮＡを定量するためのプライマーセット又は核酸プローブを含んでもよい。例えばキットは表２に示すプライマーセットＫを更に含んでもよい。
【０１２０】
［例］
以下に、実施形態の分析方法又はキットを用いて行った実験について記載する。
【０１２１】
例１．ｑＲＴ−ＰＣＲ法を用いた健常者及びがん患者におけるｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐの定量
健常者２９検体、乳がん患者１５検体、大腸がん患者６検体、胃がん患者５検体、肺がん患者３検体、卵巣がん患者５検体、膵臓がん患者８検体、胆管がん患者５検体、食道がん患者５検体、肝臓がん患者５検体、脳腫瘍患者５検体、膀胱がん患者４検体、前立腺がん患者５検体、肉腫患者５検体、子宮体がん患者４検体、子宮肉腫患者５検体から得られた合計１１４検体の血清を用意した。
【０１２２】
（ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐの定量）
全ての血清からＲＮＡを抽出した。抽出は、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ｍｉＲＮＡ  Ｐｌａｓｍａ（商品名、タカラバイオ製）を用いて行った。ｃｅｌ−ｍｉＲ−３９−３ｐの合成ＲＮＡをｓｐｉｋｅ−ｉｎし抽出を行った。
【０１２３】
次に、抽出サンプル中に存在する短鎖ＲＮＡを逆転写しｃＤＮＡを合成及び増幅した。合成は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｍｉＲＮＡ  Ａｓｓａｙ（商品名、サーモフィッシャー・サイエンティフィック製）の取扱説明書にしたがって、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｍｉＲＮＡ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（商品名、サーモフィッシャー・サイエンティフィック製）を用いて行った。
【０１２４】
続いて、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（商品名、サーモフィッシャー・サイエンティフィック製）及びＴａｑＭａｎ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｍｉＲＮＡ  Ａｓｓａｙ  ＩＤ：４７７８９７＿ｍｉｒを用いてＴａｑＭａｎ  ＰＣＲを行い、Ｃｔ値を測定した。サンプルとともに、異なる濃度の配列番号１の合成ＲＮＡ（１０３、１０４、１０５、１０６コピー／μＬ）を用いて同様に反応させて検量線とした。
【０１２５】
（ｃｅｌ−ｍｉＲ−３９−３ｐの定量）
上記血清サンプルの、ｃｅｌ−ｍｉＲ−３９−３ｐ（配列番号４９）を、定量した。ｃｅｌ−ｍｉＲ−３９−３ｐの長鎖化及び増幅はｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐと同様の方法で行った。また、ｃｅｌ−ｍｉＲ−３９−３ｐを１０３，１０４，１０５，１０６コピー／μＬで反応させて検量線を作成した。検量線と比較することによりｃｅｌ−ｍｉＲ−３９−３ｐの定量値を得た。
【０１２６】
（補正値の算出）
次にｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐの定量値をｃｅｌ−ｍｉＲ−３９−３ｐの定量値で除して補正値を得た。
【０１２７】
図５は健常者及び各がん患者におけるｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐの定量値の補正値の箱ひげ図を示す。補正値は、健常者では０〜約０．４の範囲に分布し、がん患者では約０．５５〜約１を超える範囲に分布していた。この結果から、がん患者では血清中のｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐの存在量が多いことが示された。
【０１２８】
図６は、補正値を健常者群とがん患者群とで区分した結果を示す箱ひげ図である。がん患者群は健常者以外の全てのがん患者の結果を併せたものであり、健常者より高い値に分布した。健常者群及びがん患者群を切り分けるＡＵＣ（Ａｒｅａ  Ｕｎｄｅｒ  Ｃｕｒｖｅ）は、０．９８であった。
【０１２９】
したがって、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐは、健常者とがん患者とを識別して検出するためのマーカーとして高性能であることが示された。
【０１３０】
例２．ＬＡＭＰ法を用いた健常者及びがん患者におけるｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐの定量
（ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐの定量）
例１と同様の検体から得られた血清を用意した。例１と同じ方法で検体からＲＮＡの抽出を行った。抽出サンプル２μＬを、反応体積２０μＬ、１６℃１０分、４２℃５分、８５℃５分の条件で逆転写した。逆転写反応液の組成は、６７ｕｎｉｔ  ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（＊）、１×ＲＴ  Ｂｕｆｆｅｒ（＊）、０．１ｍＭのｄＮＴＰｓ（＊）、４ＵのＲＮａｓｅＯＵＴ（商品名、サーモフィッシャー・サイエンティフィック製）、１０ｎＭのＲＴプライマーとした。「＊」を付したものは全てＨｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（商品名、サーモフィッシャー・サイエンティフィック製）に含まれているものを用いた。
【０１３１】
逆転写後の反応液に、伸長溶液５μＬを添加して、９５℃２分後、９５℃２０秒−５９℃３０秒−７２℃１０秒のサイクルを２０回かけて伸長を行った。伸長溶液は、２５μＬ中に、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（ｅｘｏ−）ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（０．５Ｕ、ニューイングランドバイオ）を含み、終濃度が、０．２×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＤｅｅｐＶｅｎｔ（ｅｘｏ−）ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ付属）、０．２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１２ｍＭのｄＮＴＰｓ、１０ｎＭのＥＬプライマーとなるよう調整した。
【０１３２】
次に、伸長した産物１μＬを、反応体積２５μＬ、６５℃６０分の条件でＬＡＭＰ増幅を行い、同時に蛍光強度の立ち上り時間を測定した。ＬＡＭＰ増幅溶液は、８ＵのＴｉｎ（ｅｘｏ−）ＬＦ  ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｏｐｔｉｇｅｎｅ）、０．５μＬのＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）（Ｂｉｏｔｉｕｍ）を含み、終濃度がそれぞれ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭのＫＣｌ、８ｍＭのＭｇＳＯ４、１０ｍＭの（ＮＨ４）ＳＯ４、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０、０．８Ｍのベタイン、各１．４ｍＭのｄＮＴＰｓ、１．６μＭのＦＩＰプライマー、１．６μＭのＢＩＰプライマー、及び０．８μＭのＬＢプライマーとなるよう調整した。リアルタイムＰＣＲ装置にて、経時的に蛍光強度を測定し、閾値を超える時間を測定した。
【０１３３】
上記ＲＴプライマー、ＥＬプライマー、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー及びＬＢプライマーは、表１のプライマーセットＡ又はプライマーセットＪを用いた。
【０１３４】
サンプルとともに、既知の濃度の配列番号１の合成ＲＮＡを上記のプライマーを用いて逆転写、伸長及びＬＡＭＰ増幅し、同様に蛍光強度の立ち上り時間を測定した。合成ＲＮＡの濃度は、プライマーセットＡについては０、１０３、１０４、１０５及び１０６コピー／μＬ、プライマーセットＪについては０、５×１０２、５×１０３、５×１０４、５×１０５コピー／μＬとした。この結果を用いて配列番号１のＲＮＡのコピー数と立ち上がり時間の検量線を作成し、この検量線を用いて、各検体における立ち上がり時間からＲＮＡのコピー数を算出した。
【０１３５】
（ｃｅｌ−ｍｉＲ−３９−３ｐの定量）
上記血清サンプルの、ｃｅｌ−ｍｉＲ−３９−３ｐ（配列番号４９）を定量した。ｃｅｌ−ｍｉＲ−３９−３ｐ抽出、長鎖化及び増幅はｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐと同様の方法で行った。ｃｅｌ−ｍｉＲ−３９−３ｐの逆転写は、２０ｎＭ  ＲＴ  プライマー、長鎖化は４０ｎＭ  ＥＬ  プライマーを用いた。増幅は、１．６μＭのＦＩＰプライマー、１．６μＭのＢＩＰプライマー、及び０．８μＭのＬＢプライマーを用いた。
【０１３６】
上記ＲＴプライマー、ＥＬプライマー、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー及びＬＢプライマーは、表２のプライマーセットＫを用いた。
【０１３７】
また、ｃｅｌ−ｍｉＲ−３９−３ｐを１０３，１０４，１０５，１０６コピー／μＬで反応させて検量線を作成した。検量線と比較することによりｃｅｌ−ｍｉＲ−３９−３ｐの定量値を得た。
【０１３８】
（補正値の算出）
次にｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐの定量値をｃｅｌ−ｍｉＲ−３９−３ｐの定量値で除して補正値を得た。
【０１３９】
図７は、プライマーセットＡを用いた場合の健常者及び各がん患者におけるｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐの補正値の箱ひげ図を示す。ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐは、健常者では約０．１５〜約０．５５の範囲に分布しているのに対し、がん患者では約０．３５〜約０．９５の高い値の範囲に分布した。また、子宮肉腫を除く標的がんの患者では約０．５〜約０．９５のより高い値の範囲に分布した。この結果から、がん患者、特に標的がんの患者では血清中のｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐの存在量が多いことが示された。
【０１４０】
図８は、図７の補正値を健常者群とがん患者群とで区分した結果を示す箱ひげ図である。がん患者群は上記健常者以外の全てのがん患者の結果を併せたものであり、健常者より高い値に分布した。健常者群及びがん患者群を切り分けるＡＵＣは、０．９３であった。
【０１４１】
図９は、図１０の補正値を標的がんの患者群と、子宮肉腫の患者群とで区分した結果を示す箱ひげ図である。他がん患者群は健常者群より高い値に分布し、標的がん患者群は、子宮肉腫の患者群よりも更に高い値に分布した。他がん患者群と４種のがん患者群とを切り分けるＡＵＣは０．９５であった。
【０１４２】
図１０は、プライマーセットＪを用いた場合の健常者及び各がん患者におけるｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐの補正値を示す。ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐは、健常者では約０．２５〜約０．５０の範囲に分布しているのに対し、がん患者では約０．４２〜約０．８０の高い値の範囲に分布した。また、標的がんの患者では子宮肉腫よりも高い値の範囲に分布した。この結果から、がん患者、特に標的がんの患者では血清中のｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐの存在量が多いことが示された。
【０１４３】
図１１は、図１０の補正値を健常者群とがん患者群とで区分した結果を示す箱ひげ図である。がん患者群は上記健常者以外の全てのがん患者の結果を併せたものであり、健常者より高い値に分布した。健常者群及びがん患者群を切り分けるＡＵＣは、０．９０であった。
【０１４４】
図１２は、図１０の補正値を標的がんの患者群と、子宮肉腫の患者群とで区分した結果を示す箱ひげ図である。他がん患者群は健常者群より高い値に分布し、標的がん患者群は、子宮肉腫の患者群よりも更に高い値に分布した。子宮肉腫群と４種のがん患者群とを切り分けるＡＵＣは０．９２であった。
【０１４５】
したがって、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐは、健常者とがん患者とを識別して検出するためのマーカー、又は標的がんを健常者又は子宮肉腫患者とを識別して検出するためのマーカーとして高性能であることが示された。
【０１４６】
また、プライマーセットの安定性を評価した。複数種類のプライマーセットを用いて既知のコピー数のｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐを定量して検量線を作成した。増幅はリアルタイムＰＣＲ装置にて、経時的に蛍光強度を測定し、閾値を超える時間を測定した。測定は２連で行い、閾値を超えた時間の平均値とＣＶを算出した。定量を複数回繰り返し、検量線の式の再現性を評価した。結果の優れていたプライマーセットＡにおける結果を表５に、より結果の優れていたプライマーセットＪにおける結果を表６に示す。プライマーセットＡについて６回（ｒｕｎ１〜６）、プライマーセットＪについては５回（ｒｕｎ１〜５）検量線を作成した。
【０１４７】
【表５】
2021125105.tif 000008
【０１４８】
【表６】
2021125105.tif 000009
表５に示す通り、プライマーセットＡにおける検量線の傾きは２．１５〜２．７２の範囲でありばらつきが少なかった。したがって、プライマーセットＡはより安定してｍｉＲＮＡを定量できる優れたプライマーセットであることが明らかとなった。
【０１４９】
表６に示す通り、プライマーセットＪにおける検量線の傾きは２．７５〜２．９０であり、プライマーセットＡと比べて更にばらつきが少なかった。またｒｕｎ１〜５の何れにおいてもｍｉＲＮＡの濃度が０コピーであるとき蛍光の立ち上がりが観察されず、非特異的増幅が起きにくいことが明らかとなった。また、プライマーセットＪではプライマーセットＡと同じ濃度で比較したときもばらつきが少ない。例えば、プライマーセットＡでは１０６コピーの時の立ち上がり時間はｒｕｎごとにばらつきがあるが、プライマーセットＪについては５×１０５の立ち上がり時間はｒｕｎごとにばらつきが少ない。
【０１５０】
以上のことから、プライマーセットＪはより安定してｍｉＲＮＡを定量できるより優れたプライマーセットであることが明らかとなった。
【０１５１】
例３．電気化学的検出
例２で使用したＦＩＰプライマー及びＢＩＰプライマー（各４８μＭ）、ＬＢプライマー（２４μＭ）を含むプライマー溶液を調製した。シリコーン製流路パッキン（流路幅×高さ：１ｍｍ×１ｍｍ）にプライマー溶液１００ｎＬを、微量分注機を用いてスポットした。電極をパターニングしたＤＮＡチップ基板（ガラス（０．８ｍｍ）／チタン（５００ｎｍ）／金（２０００ｎｍ））と該流路パッキンとをカセットに組み込み、チップを作製した。
【０１５２】
次に、表７に示す組成のＬＡＭＰ増幅反応液を調整した。
【０１５３】
【表７】
2021125105.tif 000010
上記ＬＡＭＰ増幅反応液に、例２で用いた伸長後の鋳型を１μＬ添加し、表８に示す条件で電気化学測定を行った。
【０１５４】
【表８】
2021125105.tif 000011
ＬＡＭＰ増幅反応が開始されると、ルテニウムヘキサアミン（ＲｕＨｅｘ）の還元電流値が増加し始めた。電流が増加する時間は、伸長産物の存在量が多いほど早く、本チップを用いて定量検出が可能であることが明らかとなった。
【０１５５】
本発明の幾つかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら新規な実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これらの実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれるとともに、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれる。
【図１】
2021125105.tif 000012
【図２】
2021125105.tif 000013
【図３】
2021125105.tif 000014
【図４】
2021125105.tif 000015
【図５】
2021125105.tif 000016
【図６】
2021125105.tif 000017
【図７】
2021125105.tif 000018
【図８】
2021125105.tif 000019
【図９】
2021125105.tif 000020
【図１０】
2021125105.tif 000021
【図１１】
2021125105.tif 000022
【図１２】
2021125105.tif 000023
【配列表】
2021125105000001.app
【国際調査報告】
2021125105.tif 000024
2021125105.tif 000025
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