(57)【要約】  本発明は、細菌性眼内炎の治療に有効な新規バクテリオファージと、当該新規バクテリオファージを含む細菌性眼内炎治療剤を提供することを目的とする。本発明に係る細菌性眼内炎治療剤は、Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｓｐｏｕｎａｖｉｒｉｎａｅ  ｐｈｉＥＦ７Ｈ（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８８６）、Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｓｐｏｕｎａｖｉｒｉｎａｅ  ｐｈｉＥＦ１９Ｇ（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８８７）、Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｓｐｏｕｎａｖｉｒｉｎａｅ  ｐｈｉＥＦ１４Ｈ１（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８８８）、およびその変異体から必須的になる群から選択される１以上のバクテリオファージを含むことを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｓｐｏｕｎａｖｉｒｉｎａｅ  ｐｈｉＥＦ７Ｈ（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８８６）。
【請求項２】
Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｓｐｏｕｎａｖｉｒｉｎａｅ  ｐｈｉＥＦ１９Ｇ（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８８７）。
【請求項３】
Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｓｐｏｕｎａｖｉｒｉｎａｅ  ｐｈｉＥＦ１４Ｈ１（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８８８）。
【請求項４】
Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｓｐｏｕｎａｖｉｒｉｎａｅ  ｐｈｉＥＦ７Ｈ（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８８６）、Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｓｐｏｕｎａｖｉｒｉｎａｅ  ｐｈｉＥＦ１９Ｇ（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８８７）、Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｓｐｏｕｎａｖｉｒｉｎａｅ  ｐｈｉＥＦ１４Ｈ１（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８８８）、およびその変異体から必須的になる群から選択される１以上のバクテリオファージを含むことを特徴とする細菌性眼内炎治療剤。
【請求項５】
上記変異体が以下のいずれかの塩基配列を有する請求項４に記載の細菌性眼内炎治療剤：
（１）  配列番号１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、配列番号２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、または配列番号３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）の塩基配列において、１以上、１５００以下の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列であり、当該塩基配列を有する上記変異体が細菌性眼内炎の原因細菌に対する溶菌性を示す；
（２）  配列番号１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、配列番号２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、または配列番号３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）の塩基配列に対して９９．９％以上の同一性を有する塩基配列であり、当該塩基配列を有する上記変異体が細菌性眼内炎の原因細菌に対する溶菌性を示す。
【請求項６】
更に、Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｓｐｏｕｎａｖｉｒｉｎａｅ  ｐｈｉＥＦ２４Ｃ、Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｓｐｏｕｎａｖｉｒｉｎａｅ  ｐｈｉＥＦ２４Ｃ−Ｐ２、およびその変異体から必須的になる群より選択される１以上のバクテリオファージを含む請求項４または５に記載の細菌性眼内炎治療剤。
【請求項７】
液剤である請求項４〜６のいずれかに記載の細菌性眼内炎治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌性眼内炎の治療に有効な新規バクテリオファージと、当該新規バクテリオファージを含む細菌性眼内炎治療剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
眼内炎は目の中に炎症が起きるぶどう膜炎の一種であり、眼内炎の中でも感染性眼内炎は細菌、真菌、ウイルス、寄生虫などを原因とする。特に眼手術後の細菌性眼内炎は、医原性であるため社会的にも問題である上に、病状の進行が速いことが多く数日で失明に至ることもある。眼組織は眼光学系として働くため、細菌感染により角膜混濁や網膜瘢痕化が残ると、除菌できたとしても視機能は回復しない。従って、細菌性眼内炎の治療では迅速に除菌し、眼組織破壊をいかに最小に留めるかが治療上最も重要である。【０００３】
細菌感染症の治療としては、ペニシリンが発見されて以来、抗生物質を用いた薬物療法が中心である。例えば特許文献１には、合成抗生物質の一種であるフルオロキノロンを用いた眼内炎の治療方法が開示されている。しかしながら抗生物質の濫用により１９８０年代から薬剤耐性菌が出現し、抗生物質の新規開発と耐性菌の出現のいたちごっことなった。現在では多くの薬剤に高度の耐性を示す多剤耐性菌が出現して治療が困難な症例が見られている一方で、抗生物質の新規開発は年々減少しており、従来の抗生物質とは異なる機序を持つ治療薬の開発が急務である。【０００４】
抗生物質を用いない細菌感染症の治療法としては、バクテリオファージを用いるファージ療法が知られている。バクテリオファージは抗生物質に比べて特異性が高く、特定の細菌株以外に溶菌性を示さないことも多いので、理論上、患者に対して無害なだけでなく、腸内細菌叢に含まれる善玉細菌など、病原性を持たず、日和見感染症を防ぐ他の細菌に対しても無害であるバクテリオファージを選択して用いることも可能であるため、副作用を起こし難いと考えられる。また、バクテリオファージは宿主細菌に感染して増殖するため、投与量や投与回数も少なくてよい。【０００５】
ファージ療法は、東欧やロシアを中心に臨床応用されたが、近年、西欧諸国でも薬剤耐性菌に対する治療手段として注目され、我が国の薬剤耐性国家行動計画にもその可能性が明記されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２０１０−５３６８６０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述したように、細菌性眼内炎に対して迅速な除菌ができなければ眼組織破壊や瘢痕化が進行し、視機能の回復は期待できない。それに対してファージは菌に感染後増殖するため、病巣で増加する唯一の治療薬であるといえ、また宿主特異性が高いため毒性も低いと考えられる。また、ファージは抗菌薬よりも速く殺菌するため、眼組織破壊を有効に抑制できる可能性を有する。更にファージと抗菌薬とでは作用機序が異なるため、薬剤耐性菌に対しても効果が期待できる。
そこで本発明は、細菌性眼内炎の治療に有効な新規バクテリオファージと、当該新規バクテリオファージを含む細菌性眼内炎治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、細菌性眼内炎の四大起炎菌の一つである眼内炎由来腸球菌の複数株に対して溶菌性を示す新規バクテリオファージを見出して、本発明を完成した。
以下、本発明を示す。【０００９】
［１］  Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｓｐｏｕｎａｖｉｒｉｎａｅ  ｐｈｉＥＦ７Ｈ（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８８６）。
［２］  Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｓｐｏｕｎａｖｉｒｉｎａｅ  ｐｈｉＥＦ１９Ｇ（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８８７）。
［３］  Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｓｐｏｕｎａｖｉｒｉｎａｅ  ｐｈｉＥＦ１４Ｈ１（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８８８）。
［４］  Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｓｐｏｕｎａｖｉｒｉｎａｅ  ｐｈｉＥＦ７Ｈ（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８８６）、Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｓｐｏｕｎａｖｉｒｉｎａｅ  ｐｈｉＥＦ１９Ｇ（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８８７）、Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｓｐｏｕｎａｖｉｒｉｎａｅ  ｐｈｉＥＦ１４Ｈ１（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８８８）、およびその変異体から必須的になる群から選択される１以上のバクテリオファージを含むことを特徴とする細菌性眼内炎治療剤。
［５］  上記変異体が以下のいずれかの塩基配列を有する上記［４］に記載の細菌性眼内炎治療剤：
（１）  配列番号１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、配列番号２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、または配列番号３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）の塩基配列において、１以上、１５００以下の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列であり、当該塩基配列を有する上記変異体が細菌性眼内炎の原因細菌に対する溶菌性を示す；
（２）  配列番号１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、配列番号２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、または配列番号３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）の塩基配列に対して９９．９％以上の同一性を有する塩基配列であり、当該塩基配列を有する上記変異体が細菌性眼内炎の原因細菌に対する溶菌性を示す。
［６］  更に、Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｓｐｏｕｎａｖｉｒｉｎａｅ  ｐｈｉＥＦ２４Ｃ、Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｓｐｏｕｎａｖｉｒｉｎａｅ  ｐｈｉＥＦ２４Ｃ−Ｐ２、およびその変異体から必須的になる群より選択される１以上のバクテリオファージを含む上記［４］または［５］に記載の細菌性眼内炎治療剤。
［７］  液剤である上記［４］〜［６］のいずれかに記載の細菌性眼内炎治療剤。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、バクテリオファージは一般的に特異性が極めて高く単一の菌株にのみ溶菌性を示すことも多いのに対して、様々な細菌が原因となる細菌性眼内炎のファージ療法が可能になる。この様に本発明は、抗生物質によらない眼内炎の治療手段として、非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本発明に係るバクテリオファージｐｈｉＥＦ７Ｈを投与された眼内炎モデルマウスの各臨床スコアを示すグラフである。
【図２】図２は、本発明に係るバクテリオファージｐｈｉＥＦ１９Ｇを投与された眼内炎モデルマウスの各臨床スコアを示すグラフである。
【図３】図３は、本発明に係るバクテリオファージｐｈｉＥＦ１４Ｈ１を投与された眼内炎モデルマウスの各臨床スコアを示すグラフである。
【図４】図４は、本発明に係るバクテリオファージｐｈｉＥＦ７Ｈを投与された眼内炎モデルマウスの眼球における腸球菌の生菌数を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明に係るバクテリオファージｐｈｉＥＦ１９Ｇを投与された眼内炎モデルマウスの眼球における腸球菌の生菌数を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明に係るバクテリオファージｐｈｉＥＦ１４Ｈ１を投与された眼内炎モデルマウスの眼球における腸球菌の生菌数を示すグラフである。
【図７】図７は、本発明に係るバクテリオファージｐｈｉＥＦ７Ｈを投与された眼内炎モデルマウスの眼球におけるミエロペルオキシダーゼ活性を示すグラフである。
【図８】図８は、本発明に係るバクテリオファージｐｈｉＥＦ１９Ｇを投与された眼内炎モデルマウスの眼球におけるミエロペルオキシダーゼ活性を示すグラフである。
【図９】図９は、本発明に係るバクテリオファージｐｈｉＥＦ１４Ｈ１を投与された眼内炎モデルマウスの眼球におけるミエロペルオキシダーゼ活性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明に係るバクテリオファージＭｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｓｐｏｕｎａｖｉｒｉｎａｅ  ｐｈｉＥＦ７Ｈ（以下、「ｐｈｉＥＦ７Ｈ株」と略記する）は、下記の通り寄託機関に国際寄託されている。ｐｈｉＥＦ７Ｈ株のゲノムの塩基配列を配列番号１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）として示す。
（ｉ）  寄託機関の名称およびあて名
名称：  独立行政法人製品評価技術基盤機構  バイオテクノロジーセンター  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）
あて名：  日本国  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室
（ｉｉ）  原寄託日：  ２０１９年２月１４日
（ｉｉｉ）  受託番号：  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８８６
【００１３】
本発明に係るバクテリオファージＭｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｓｐｏｕｎａｖｉｒｉｎａｅ  ｐｈｉＥＦ１９Ｇ（以下、「ｐｈｉＥＦ１９Ｇ株」と略記する）は、下記の通り寄託機関に国際寄託されている。ｐｈｉＥＦ１９Ｇ株のゲノムの塩基配列を配列番号２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）として示す。
（ｉ）  寄託機関の名称およびあて名
名称：  独立行政法人製品評価技術基盤機構  バイオテクノロジーセンター  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）
あて名：  日本国  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室
（ｉｉ）  原寄託日：  ２０１９年２月１４日
（ｉｉｉ）  受託番号：  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８８７
【００１４】
本発明に係るバクテリオファージＭｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｓｐｏｕｎａｖｉｒｉｎａｅ  ｐｈｉＥＦ１４Ｈ１（以下、「ｐｈｉＥＦ１４Ｈ１株」と略記する）は、下記の通り寄託機関に国際寄託されている。ｐｈｉＥＦ１４Ｈ１株のゲノムの塩基配列を配列番号３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）として示す。
（ｉ）  寄託機関の名称およびあて名
名称：  独立行政法人製品評価技術基盤機構  バイオテクノロジーセンター  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）
あて名：  日本国  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室
（ｉｉ）  原寄託日：  ２０１９年２月１４日
（ｉｉｉ）  受託番号：  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８８８
【００１５】
なお、Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｓｐｏｕｎａｖｉｒｉｎａｅ  ｐｈｉＥＦ７Ｈ、Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｓｐｏｕｎａｖｉｒｉｎａｅ  ｐｈｉＥＦ１９Ｇ、およびＭｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｓｐｏｕｎａｖｉｒｉｎａｅ  ｐｈｉＥＦ１４Ｈ１は、それぞれ、Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ属Ｓｐｏｕｎａｖｉｒｉｎａｅ科に属するｐｈｉＥＦ７Ｈ、ｐｈｉＥＦ１９ＧおよびｐｈｉＥＦ１４Ｈ１を意味する。他のファージ株の表記も同様である。
【００１６】
Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｓｐｏｕｎａｖｉｒｉｎａｅ  ｐｈｉＥＦ２４Ｃ（以下、「ｐｈｉＥＦ２４Ｃ株」と略記する）は公知のバクテリオファージであり、例えば、Ｕｃｈｉｙａｍａ  Ｊ．ら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．，２００８，２７８（２），ｐｐ．２００−２０６に記載されている。
【００１７】
Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｓｐｏｕｎａｖｉｒｉｎａｅ  ｐｈｉＥＦ２４Ｃ−Ｐ２（以下、「ｐｈｉＥＦ２４Ｃ−Ｐ２株」と略記する）は公知のバクテリオファージであり、例えば、そのａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒはＡＢ６０９７１８である。
【００１８】
本発明に係る細菌性眼内炎治療剤は、ｐｈｉＥＦ７Ｈ株、ｐｈｉＥＦ１９Ｇ株、ｐｈｉＥＦ１４Ｈ１株、およびその変異体から必須的になる群から選択される１以上のバクテリオファージを含む。以下、便宜上、これらバクテリオファージを「バクテリオファージ１」と記載する場合がある。
【００１９】
上記変異体のゲノムは、１以上の変異を受けたｐｈｉＥＦ７Ｈ株、ｐｈｉＥＦ１９Ｇ株、またはｐｈｉＥＦ１４Ｈ１株のゲノムに相当するものであり、且つ細菌性眼内炎の原因菌に対する溶菌性を有するものをいう。細菌性眼内炎の原因菌は特に制限されないが、例えば、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ等の腸球菌などが挙げられる。
【００２０】
上記変異体は、例えば、以下のいずれかの塩基配列のゲノムを有する。
（１）  配列番号１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、配列番号２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、または配列番号３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）の塩基配列において、１以上、１５００以下の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列であり、当該塩基配列を有する上記変異体が細菌性眼内炎の原因細菌に対する溶菌性を示す；
（２）  配列番号１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、配列番号２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、または配列番号３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）の塩基配列に対して９９．９％以上の同一性を有する塩基配列であり、当該塩基配列を有する上記変異体が細菌性眼内炎の原因細菌に対する溶菌性を示す。
【００２１】
上記塩基配列（１）において、変異数としては、１２００以下が好ましく、１０００以下がより好ましく、８００以下、５００以下、２００以下または１００以下がより更に好ましい。
上記塩基配列（２）における同一性としては、９９．９２％以上が好ましく、９９．９５％以上がより好ましく、９９．９８％以上または９９．９９％以上がより更に好ましい。
塩基配列の同一性は、例えばアミノ酸配列多重アラインメント用プログラムであるＣｌｕｓｔａｌ（http://www.clustal.org/omega/）を使う方法など、当業者であれば常法を使って決定することができる。また、上記塩基配列（１），（２）における変異の位置も、同じく常法を使って決定することができる。
【００２２】
上記変異体が細菌性眼内炎の原因細菌に対する溶菌性を示すか否かは、常法により測定することができる。例えば、細菌性眼内炎患者の患部から細菌を単離して培養し、培養培地に変異体を添加して更に培養した後に細菌を観察し、細菌の形状の変化や溶菌斑の有無により溶菌性を判断すればよい。また、本発明に係るｐｈｉＥＦ７Ｈ株、ｐｈｉＥＦ１９Ｇ株およびｐｈｉＥＦ１４Ｈ１株や、ｐｈｉＥＦ２４Ｃ株とｐｈｉＥＦ２４Ｃ−Ｐ２株の細菌性眼内炎原因細菌に対する溶菌性も、同様に予備試験してもよい。
【００２３】
本発明に係る細菌性眼内炎治療剤は、ｐｈｉＥＦ７Ｈ株、ｐｈｉＥＦ１９Ｇ株、ｐｈｉＥＦ１４Ｈ１株、およびその変異体から必須的になる群から選択される１以上のバクテリオファージ１に加えて、ｐｈｉＥＦ２４Ｃ株、ｐｈｉＥＦ２４Ｃ−Ｐ２株およびその変異株から必須的になる群より選択される１以上のバクテリオファージ２を含んでいてもよい。当該バクテリオファージ２は、バクテリオファージ１が溶菌性を示さない細菌性眼内炎原因細菌に対して、補足的に溶菌性を示す可能性がある。
【００２４】
細菌性眼内炎治療剤は、経口投与してもよいが、細菌性眼内炎は早急に治療する必要があるため、血液中に点滴投与したり、更には眼内に注射投与することが好ましい。
【００２５】
細菌性眼内炎治療剤は、上記バクテリオファージの懸濁液から調製される。バクテリオファージの懸濁液は常法により調製することができる。例えば、対象となるバクテリオファージが溶菌性を示す細菌を液体培地中で培養した後、当該培地に対象バクテリオファージを添加してバクテリオファージを細菌に感染させる。次いで、培養を継続すると細菌は溶菌され、その結果、バクテリオファージが培養液中に増加する。培養液中におけるバクテリオファージの濃度が適度、例えば１０2個／ｍＬ以上、１０12個／ｍＬ以下になったら、遠心分離や濾過などによりバクテリオファージ以外の固形成分を除去し、バクテリオファージの懸濁液とする。
【００２６】
上記液体培地や懸濁液には、バクテリオファージを安定して保存するための安定化剤を添加することが好ましい。かかる安定化剤としては、ｐＨを６以上、８以下、好ましくは６．５以上、７．５以下に維持するためのｐＨ調整剤や緩衝剤；グリシン、アルギニン、リジン等のアミノ酸；塩化ナトリウムや塩化カルシウム等の塩類を挙げることができる。
【００２７】
液状の細菌性眼内炎治療剤中のバクテリオファージ濃度は、最終的に１０3ｐｆｕ／ｍＬ以上、１０14ｐｆｕ／ｍＬ以下にすることが好ましい。また、液状の細菌性眼内炎治療剤は、血液などの体液と等張または略等張とすることが好ましい。なお、経口投与のための固体状細菌性眼内炎治療剤も、上記バクテリオファージ懸濁液に賦形剤などを添加し、造粒するなどして調製することができる。
【００２８】
本発明に係る細菌性眼内炎治療剤の投与量は特に制限されず、患者の年齢、性別、体重、症状、重篤度などに応じて適宜調整すればよいが、例えば、ヒトまたは動物に対して１回あたり、上記バクテリオファージ１の力価で１０2ｐｆｕ以上、１０8ｐｆｕ以下程度とすることができる。また、１日あたりの投与回数は、０．５回以上、６回以下程度とすることができる。
【００２９】
本願は、２０１８年３月１２日に出願された日本国特許出願第２０１８−４４４０７号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１８年３月１２日に出願された日本国特許出願第２０１１−４４４０７号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
【実施例】
【００３０】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。【００３１】
実施例１：  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験
細菌性眼内炎の原因腸球菌であるＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓの各菌株を一晩予備培養した。別途、トリプチックソイブロス（Ｔｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ，Ｂａｃｔｏ）に０．５％寒天を加えて加熱溶解し、５５℃で保温した軟寒天を調製した。１．５％の寒天を含む寒天培地の上に予備培養液０．２ｍＬを加え、更に軟寒天を加えて混合した後、上部の軟寒天が固化するまで室温で放置して二重寒天培地を作製した。
１０μＬの植菌ループを使用し、１ループの各バクテリオファージ液を上記二重寒天培地上に画線し、３７℃で一晩培養した後、溶菌斑（プラーク）の形成の有無や細菌の形状を観察した。結果を表１，２に示す。なお、表１，２中、「〇」はプラークの形成が明確に認められたことを示し、「▲」は、プラークは形成されなかったが薄い溶菌のみが認められたことを示し、「×」は溶菌が認められなかったことを示す。【００３２】
【表１】
2019176729.tif 000002
【００３３】
【表２】
2019176729.tif 000003
【００３４】
表１，２に示す結果の通り、バクテリオファージｐｈｉＥＦ７Ｈ、ｐｈｉＥＦ１９ＧおよびｐｈｉＥＦ１４Ｈ１は、試験した眼内炎由来の腸球菌５株すべてに対して溶菌性を示し、眼内炎の原因細菌の一つである腸球菌Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓに対して広い抗菌スペクトルを示すことが実証された。なお、上記腸球菌のうち、１１．Ｍ−ＩＯＬは眼内炎患者の眼内レンズから分離したものであり、１２．Ｍ−ＡＣは同一患者の前房から分離したものである。【００３５】
実施例２：  新規バクテリオファージの同定
上記実施例１で眼内炎の原因細菌に対して特に効果が認められたバクテリオファージｐｈｉＥＦ７Ｈ、ｐｈｉＥＦ１９ＧおよびｐｈｉＥＦ１４Ｈ１の属種を検討した。具体的には、各バクテリオファージの全ゲノムを精製し、塩基配列を決定した。ｐｈｉＥＦ７Ｈのゲノムの塩基配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１として示し、ｐｈｉＥＦ１９Ｇのゲノムの塩基配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２として示し、ｐｈｉＥＦ１４Ｈ１のゲノムの塩基配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３として示す。
次に、得られたゲノム塩基配列をＢＬＡＳＴｎにより解析したところ、これらゲノム塩基配列は、Ｑｕｅｒｙ  ｃｏｖｅｒ：８９％、Ｅ−ｖａｌｕｅ：０．０、Ｉｄｅｎｔｉｔｙ：９８％で、ｐｈｉＥＦ２４Ｃ−Ｐ２の全ゲノム塩基配列と高い相同性を示したが、同一の公知のゲノム塩基配列は見付からなかった。ｐｈｉＥＦ２４Ｃ−Ｐ２は、Ｕｃｈｉｙａｍａ，Ｊ．ら，２００８，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７４，ｐｐ．４１４９−４１６３に開示されている公知のバクテリオファージであり、Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｓｐｏｕｎａｖｉｒｉｎａｅに属するものであることから、ｐｈｉＥＦ７Ｈ、ｐｈｉＥＦ１９ＧおよびｐｈｉＥＦ１４Ｈ１は、Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｓｐｏｕｎａｖｉｒｉｎａｅに属する新規のバクテリオファージであることが明らかにされた。【００３６】
実施例３：  ｉｎ  ｖｉｖｏ実験
眼内炎患者から分離した腸球菌である９３３−１株、１５０５０６３株、１１．Ｍ−ＩＯＬ、１５．Ｋ−ＥＯ株、およびバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ２）を、それぞれマウス４匹の右眼の硝子体に１×１０3ｃｅｌｌｓ投与し、眼内炎を誘導した。感染から６時間後に、ファージｐｈｉＥＦ７Ｈ、ｐｈｉＥＦ１９Ｇ、またはｐｈｉＥＦ１４Ｈ１、或いは対照として生理食塩水を硝子体に投与した。感染から２４時間後に臨床スコアを評価した後、眼球を摘出して、腸球菌の生菌数と、炎症細胞浸潤の指標としてミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性を評価した。臨床スコアの平均値を図１〜３に、腸球菌生菌数の平均値を図４〜６に、ＭＰＯ活性値の平均値を図７〜９に示す。なお、眼内炎の臨床スコアは、以下の基準で評価した。また、図１〜９中、「＊」は独立２群スチューデントテストｔ検定においてｐ＜０．０５で有意差があることを示し、「＊＊」はｐ＜０．０１で有意差があることを示す。
スコア０：  前房・硝子体が透明で、網膜の透見性良好
スコア１：  軽度の前房フレア、軽度の硝子体混濁、網膜がやや透見性低下
スコア２：  中等度の前房フレア、中等度の硝子体混濁、網膜が中等度透見性低下
スコア３：  高度の前房フレア、高度の硝子体混濁、網膜が高度に透見性低下
スコア４：  スコア３の所見に加え前房出血がある
生理食塩水投与群では、腸球菌の感染から２４時間後には眼内炎が生じ、前房内のフィブリン析出あるいは出血により眼底は透見できなくなり、眼内の生菌数は約１×１０8に増加し、ＭＰＯ活性は上昇した。
それに対して腸球菌感染後に本発明に係るバクテリオファージを投与すると、図１〜９に示す結果の通り、腸球菌１２Ｍ−ＡＣを原因とする眼内炎に対してファージｐｈｉＥＦ７Ｈを投与した場合に、臨床スコアが上がり、ＭＰＯ活性も上がる傾向が認められたが、その他のケースでは臨床スコア、生菌数、ＭＰＯ活性のいずれも低下する傾向が見られ、有意に低下する場合も多かった。
これらの結果より、ファージｐｈｉＥＦ７Ｈ、ｐｈｉＥＦ１９Ｇ、ｐｈｉＥＦ１４Ｈ１のいずれも眼内炎に効果があるといえ、これら２以上を組み合わせることによって眼内炎をより効果的に治療できると考えられた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年12月2日(2019.12.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｓｐｏｕｎａｖｉｒｉｎａｅ  ｐｈｉＥＦ７Ｈ（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８８６）。
【請求項２】
Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｓｐｏｕｎａｖｉｒｉｎａｅ  ｐｈｉＥＦ１９Ｇ（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８８７）。
【請求項３】
Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｓｐｏｕｎａｖｉｒｉｎａｅ  ｐｈｉＥＦ１４Ｈ１（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８８８）。
【請求項４】
Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｓｐｏｕｎａｖｉｒｉｎａｅ  ｐｈｉＥＦ７Ｈ（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８８６）、Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｓｐｏｕｎａｖｉｒｉｎａｅ  ｐｈｉＥＦ１９Ｇ（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８８７）、Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｓｐｏｕｎａｖｉｒｉｎａｅ  ｐｈｉＥＦ１４Ｈ１（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８８８）、およびその変異体から必須的になる群から選択される１以上のバクテリオファージを含み、
上記変異体が以下のいずれかの塩基配列を有することを特徴とする細菌性眼内炎治療剤：
（１）配列番号１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、配列番号２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、または配列番号３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）の塩基配列において、１以上、１５００以下の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列であり、当該塩基配列を有する上記変異体が細菌性眼内炎の原因細菌に対する溶菌性を示す；
（２）配列番号１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、配列番号２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、または配列番号３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）の塩基配列に対して９９．９％以上の同一性を有する塩基配列であり、当該塩基配列を有する上記変異体が細菌性眼内炎の原因細菌に対する溶菌性を示す。
【請求項５】
上記欠失、置換および／または付加された塩基の変位数が８００以下であり、上記同一性が９９．９５％以上である請求項４に記載の細菌性眼内炎治療剤。
【請求項６】
更に、Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｓｐｏｕｎａｖｉｒｉｎａｅ  ｐｈｉＥＦ２４Ｃ、Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  Ｓｐｏｕｎａｖｉｒｉｎａｅ  ｐｈｉＥＦ２４Ｃ−Ｐ２、およびその変異体から必須的になる群より選択される１以上のバクテリオファージを含む請求項４または５に記載の細菌性眼内炎治療剤。
【請求項７】
液剤である請求項４〜６のいずれかに記載の細菌性眼内炎治療剤。
【国際調査報告】
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