(57)【要約】本発明は、アンチオリゴヌクレオチドを含有する組成物及びデュシェンヌ型筋ジストロフィーを治療するためのその使用に関する。本発明は、特に、処置の投与量で投与した場合にデュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療に有効な上記組成物およびその使用に関する。
2020004675.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトジストロフィン遺伝子の第５３番目のエクソンの５’末端から第３６〜５６番目のヌクレオチドからなる配列に相補的な塩基配列からなるアンチセンスオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩又はその水和物を含有する、ヒト患者のデュシェンヌ型筋ジストロフィーを治療するための医薬組成物であって、
前記治療は、アンチセンスオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩又はその水和物が４０ｍｇ／ｋｇ〜８０ｍｇ／ｋｇで前記ヒト患者に週１回静脈内投与することを含む、前記医薬組成物。
【請求項２】
前記アンチセンスオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩又はその水和物が、４０ｍｇ／ｋｇで前記ヒト患者に週１回静脈内投与される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記アンチセンスオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩又はその水和物が、８０ｍｇ／ｋｇで前記ヒト患者に週１回静脈内投与される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ヒト患者が、ジストロフィン遺伝子にエクソン４３−５２、４５−５２、４７−５２、４８−５２、４９−５２、５０−５２または５２からなる群より選択されるいずれかのエクソンが欠損した変異を有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ヒト患者における治療前のジストロフィンタンパク質の発現が、ウェスタンブロッティングまたは質量分析による測定で健常人の１％以下である、請求項１に記載の医薬組成物
【請求項６】
前記ヒト患者において、治療前にジストロフィンタンパク質の発現がみられない、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記アンチセンスオリゴマーの塩基部分の配列が、配列番号３に示す配列からなる、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記アンチセンスオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩又はその水和物が、Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ又はその同等品である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記アンチセンスオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩又はその水和物を２．５〜５００ｍｇ／ｍｌまたは１０〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度で含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記アンチセンスオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩又はその水和物を２５ｍｇ／ｍｌの濃度で含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記アンチセンスオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩又はその水和物を、５０ｍｇ／ｍｌの濃度で含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
等張化剤、ｐＨ調整剤及び溶媒からなる群より選択される少なくとも１つの成分をさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記等張化剤が塩化ナトリウム、塩化カリウム、グルコース、フルクトース、マルトース、スクロース、ラクトース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、トレハロース及びグリセリンからなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記ｐＨ調整剤が塩酸、水酸化ナトリウム、クエン酸、乳酸、リン酸塩（リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム）及びモノエタノールアミンからなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１２または１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記溶媒が水である、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
２．５〜５００ｍｇ／ｍｌまたは１０〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度のアンチセンスオリゴマー、８〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度の塩化ナトリウムを含み、かつｐＨが７．２〜７．４の水溶液である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記治療により、以下の（１）〜（６）からなる群より選択される少なくとも１つの効果が生じる、請求項１に記載の医薬組成物：
（１）患者の骨格筋におけるジストロフィンタンパク質発現量の平均値が、ベースラインと比較して、２４週間の投与後に９倍以上に増加すること；
（２）立ち上がり時間（ＴＴＳＴＡＮＤ）から得られる速度の変化が、ベースラインと比較して、２４週間の投与後２５週時に−０．０５５回／秒以上であること；
（３）１０メートル走行／歩行時間（ＴＴＲＷ）から得られる速度の変化が、ベースラインと比較して、２４週間の投与後２５週時に−０．０２５メートル／秒以上であること；
（４）４段階段昇り時間（ＴＴＣＬＩＭＢ）から得られる速度の変化が、ベースラインと比較して、２４週間の投与後２５週時に−０．０６０回／秒以上であること；
（５）ノース・スター歩行能力評価（ＮＳＡＡ）のスコアの変化が、ベースラインと比較して、２４週間の投与後２５週時に−２．２スコア以上であること；及び
（６）６分間歩行試験（６ＭＷＴ）の変化が、ベースラインと比較して、２４週間の投与後２５週時に−７．５メートル以上であること。
【請求項１８】
７〜９歳のデュシェンヌ型筋ジストロフィーのヒト患者に前記治療を８４週間行った場合に、以下の（１）〜（６）からなる群より選択される少なくとも一つの効果が生じる、請求項１に記載の医薬組成物：
（１）治療開始から第８５週までに、立ち上がり能力を喪失する患者が２０％未満であること；
（２）治療開始から第８５週までに、４段階段昇りが出来なくなる患者が１０％未満であること；
（３）治療開始から第８５週までに、自立歩行能力を喪失する患者が１０％未満であること；
（４）治療開始から第８５週までに、１０メートル走行／歩行の速度に加齢による減少がみられないこと；
（５）治療開始から第８５週までに、４段階段昇りの速度に加齢による減少がみられないこと；及び
（６）治療開始から第８５週までに、立ち上がりの速度に加齢による減少がみられないこと。
【請求項１９】
１０〜１２歳のデュシェンヌ型筋ジストロフィーのヒト患者に前記治療を８４週間行った場合に、以下の（１）〜（６）からなる群より選択される少なくとも一つの効果が生じる、請求項１に記載の医薬組成物：
（１）治療開始から第８５週までに、立ち上がり能力を喪失する患者が６０％未満であること；
（２）治療開始から第８５週までに、４段階段昇りが出来なくなる患者が５０％未満であること；
（３）治療開始から第８５週までに、自立歩行能力を喪失する患者が５０％未満であること；
及び
（４）治療開始から第８５週までに、１０メートル走行／歩行の速度に加齢による減少がみられないこと。
（５）治療開始から第８５週までに、４段階段昇りの速度が増加する時期がみられること；及び
（６）治療開始から第８５週までに、立ち上がりの速度が増加する時期がみられること。
【請求項２０】
ヒトジストロフィン遺伝子の第５３番目のエクソンの５’末端から第３６〜５６番目のヌクレオチドからなる配列に相補的な塩基配列からなるアンチセンスオリゴマー又はその医薬的に許容可能な塩若しくは水和物を含有する医薬組成物を、
前記アンチセンスオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩又はその水和物を４０ｍｇ／ｋｇ〜８０ｍｇ／ｋｇでヒト患者に週１回静脈内投与することを含む、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療方法。
【請求項２１】
ヒト患者のデュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療方法に用いるためのヒトジストロフィン遺伝子の第５３番目のエクソンの５’末端から第３６〜５６番目のヌクレオチドからなる配列に相補的な塩基配列からなるアンチセンスオリゴマー又はその医薬的に許容可能な塩若しくは水和物であって、
前記アンチセンスオリゴマー又はその医薬的に許容可能な塩若しくは水和物が４０ｍｇ／ｋｇ〜８０ｍｇ／ｋｇで前記ヒト患者に週１回静脈内投与される、
前記アンチセンスオリゴマー又はその医薬的に許容可能な塩若しくは水和物。
【請求項２２】
ヒト患者のデュシェンヌ型筋ジストロフィーを治療するための医薬組成物の製造のためのヒトジストロフィン遺伝子の第５３番目のエクソンの５’末端から第３６〜５６番目のヌクレオチドからなる配列に相補的な塩基配列からなるアンチセンスオリゴマー又はその医薬的に許容可能な塩若しくは水和物の使用であって、
前記アンチセンスオリゴマー又はその医薬的に許容可能な塩若しくは水和物が４０ｍｇ／ｋｇ〜８０ｍｇ／ｋｇで前記ヒト患者に週１回静脈内投与される、
前記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトジストロフィン遺伝子の第５３番目のエクソンのスキッピングを可能にするアンチセンスオリゴマーの用法用量及び該オリゴマーを含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は出生男子約３，５００人に１人が発症する最も頻度の高い遺伝性進行性筋萎縮症である。乳幼児期には正常のヒトとほとんど変わらない運動機能を示すが、４〜５歳頃から筋力低下がみられる。その後筋力低下は進行し１２歳頃までに歩行不能になり、２０歳代で心不全または呼吸器不全により死に至る重篤な疾患である。現在、ＤＭＤに対する有効な治療法はなく、新たな治療薬の開発が強く求められている。【０００３】
ＤＭＤはジストロフィン遺伝子の変異が原因であることが知られている。ジストロフィン遺伝子はＸ染色体に存在し、２２０万塩基対のＤＮＡから成る巨大な遺伝子である。ＤＮＡからｍＲＮＡ前駆体に転写され、さらにスプライシングによりイントロンが除かれ７９のエクソンが結合したｍＲＮＡが合成される。このｍＲＮＡから３，６８５のアミノ酸に翻訳され、ジストロフィンタンパク質が生成される。ジストロフィンタンパク質は筋細胞の膜安定性の維持に関与しており、筋細胞を壊れにくくするために必要である。ＤＭＤ患者のジストロフィン遺伝子は変異を有するため、筋細胞において機能を有するジストロフィンタンパク質が殆ど発現されない。そのため、ＤＭＤ患者体内では、筋細胞の構造を維持できなくなり、多量のカルシウムイオンが筋細胞内に流れ込む。その結果、炎症に似た反応が生じ、線維化が進むために筋細胞が再生されにくくなる。【０００４】
ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）もジストロフィン遺伝子の変異が原因であるが、その症状は筋萎縮による筋力低下を呈するものの一般にＤＭＤと比較して軽く、筋力低下の進行も遅く、多くの場合、成人期に発症する。ＤＭＤとＢＭＤとの臨床症状の違いは、変異によりジストロフィンのｍＲＮＡがジストロフィンタンパク質へと翻訳される際のアミノ酸読み取り枠が破壊されるか、あるいは維持されるかによるものと考えられている（非特許文献１）。つまり、ＤＭＤでは、アミノ酸読み取り枠がずれる変異を有することにより、機能を持つジストロフィンタンパク質がほとんど発現しないが、ＢＭＤでは変異によりエクソンの一部は欠失しているが、アミノ酸読み取り枠は維持されているために不完全ながらも機能を有するジストロフィンタンパク質が産生される。【０００５】
ＤＭＤの治療法として、エクソンスキッピング法が期待されている。この方法は、スプライシングを改変することでジストロフィンのｍＲＮＡのアミノ酸読み取り枠を修復し、部分的に機能を回復したジストロフィンタンパク質の発現を誘導する方法である（非特許文献２）。エクソンスキッピングの対象となるアミノ酸配列部分は失われることになる。そのためこの治療で発現されるジストロフィンタンパク質は正常のものより短くなるが、アミノ酸読み取り枠が維持されるために筋細胞を安定化する機能が部分的に保持される。したがって、エクソンスキッピングにより、ＤＭＤは、より軽症のＢＭＤと同じような症状を呈するようになると期待されている。エクソンスキッピング法は、マウスやイヌによる動物実験を経て、ヒトＤＭＤ患者に対する臨床試験が行われている。【０００６】
エクソンスキッピングは、５’若しくは３’スプライス部位のいずれか若しくは両方、又はエクソンの内部を標的とするアンチセンス核酸の結合により誘導することができる。エクソンは両方のスプライス部位がスプライソソーム複合体によって認識された場合のみｍＲＮＡに包含される。したがって、スプライス部位をアンチセンス核酸でターゲッティングすることにより、エクソンスキッピングを誘導することができる。また、エクソンがスプライシングの機構に認識されるためにはエクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）へのＳＲタンパク質の結合が必要であると考えられており、ＥＳＥをターゲッティングすることでもエクソンのスキッピングを誘導することができる。【０００７】
ジストロフィン遺伝子の変異はＤＭＤ患者によって異なるため、遺伝子変異の場所や種類に応じたアンチセンス核酸が必要になる。これまでに、西オーストラリア大学のＳｔｅｖｅ  Ｗｉｌｔｏｎらによって７９個全てのエクソンに対してエクソンスキッピングを誘導するアンチセンス核酸が作製されており（非特許文献３）、オランダのＡｎｎｅｍｉｅｋｅ  Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓらによって３９種類のエクソンに対してエクソンスキッピングを誘導するアンチセンス核酸が作られている（非特許文献４）。【０００８】
全ＤＭＤ患者の１０％程度は、第５３番目のエクソン（以下、「エクソン５３」という）をスキッピングすることで治療可能と考えられている。近年では、ジストロフィン遺伝子のエクソン５３をエクソンスキッピングのターゲットとした研究について、複数の研究機関から報告がなされている（特許文献１〜４；非特許文献５及び６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開公報ＷＯ  ２００６／００００５７
【特許文献２】国際公開公報ＷＯ  ２００４／０４８５７０
【特許文献３】米国特許公開公報  ＵＳ  ２０１０／０１６８２１２
【特許文献４】国際公開公報  ＷＯ  ２０１０／０４８５８６
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｍｏｎａｃｏ  Ａ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １９８８；２：ｐ．９０−９５
【非特許文献２】Ｍａｔｓｕｏ  Ｍ．，Ｂｒａｉｎ  Ｄｅｖ  １９９６；１８：ｐ．１６７−１７２
【非特許文献３】Ｗｉｌｔｏｎ  Ｓ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２００７：１５：ｐ．１２８８−９６
【非特許文献４】Ａｎｎｅｍｉｅｋｅ  Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  １２：Ｓ７１−Ｓ７７
【非特許文献５】Ｌｉｎｄａ  Ｊ．Ｐｏｐｐｌｅｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，ｖｏｌ．２０，ｎｏ．２，ｐ．１０２−１０
【非特許文献６】Ｂｌａｄｅｎ  Ｃ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ（２０１５）３６：３９５−４０２
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、非限定的に以下のとおりである。
＜１＞
ヒトジストロフィン遺伝子の第５３番目のエクソンの５’末端から第３６〜５６番目のヌクレオチドからなる配列に相補的な塩基配列からなるアンチセンスオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩又はその水和物を含有する、ヒト患者のデュシェンヌ型筋ジストロフィーを治療するための医薬組成物であって、
前記治療は、アンチセンスオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩又はその水和物が４０ｍｇ／ｋｇ〜８０ｍｇ／ｋｇで前記ヒト患者に週１回静脈内投与することを含む、前記医薬組成物。
＜２＞
前記アンチセンスオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩又はその水和物が、４０ｍｇ／ｋｇで前記ヒト患者に週１回静脈内投与される、前記＜１＞に記載の医薬組成物。
＜３＞
前記アンチセンスオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩又はその水和物が、８０ｍｇ／ｋｇで前記ヒト患者に週１回静脈内投与される、前記＜１＞に記載の医薬組成物。
＜４＞
前記ヒト患者が、ジストロフィン遺伝子にエクソン４３−５２、４５−５２、４７−５２、４８−５２、４９−５２、５０−５２または５２からなる群より選択されるいずれかのエクソンが欠損した変異を有する、前記＜１＞に記載の医薬組成物。
＜５＞
前記ヒト患者における治療前のジストロフィンタンパク質の発現が、ウェスタンブロッティングまたは質量分析による測定で健常人の１％以下である、前記＜１＞に記載の医薬組成物
＜６＞
前記ヒト患者において、治療前にジストロフィンタンパク質の発現がみられない、前記＜５＞に記載の医薬組成物。
＜７＞
前記アンチセンスオリゴマーの塩基部分の配列が、配列番号３に示す配列からなる、前記＜１＞に記載の医薬組成物。
＜８＞
前記アンチセンスオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩又はその水和物が、Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ又はその同等品である、前記＜１＞に記載の医薬組成物。
＜９＞
前記アンチセンスオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩又はその水和物を２．５〜５００ｍｇ／ｍｌまたは１０〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度で含む、前記＜１＞に記載の医薬組成物。
＜１０＞
前記アンチセンスオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩又はその水和物を２５ｍｇ／ｍｌの濃度で含む、前記＜１＞に記載の医薬組成物。
＜１１＞
前記アンチセンスオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩又はその水和物を５０ｍｇ／ｍｌの濃度で含む、前記＜１＞に記載の医薬組成物。
＜１２＞
等張化剤、ｐＨ調整剤及び溶媒からなる群より選択される少なくとも１つの成分をさらに含む、前記＜１＞に記載の医薬組成物。
＜１３＞
前記等張化剤が塩化ナトリウム、塩化カリウム、グルコース、フルクトース、マルトース、スクロース、ラクトース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、トレハロース及びグリセリンからなる群より選択される少なくとも１つである、前記＜１２＞に記載の医薬組成物。
＜１４＞
前記ｐＨ調整剤が塩酸、水酸化ナトリウム、クエン酸、乳酸、リン酸塩（リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム）及びモノエタノールアミンからなる群より選択される少なくとも１つである、前記＜１２＞または＜１３＞に記載の医薬組成物。
＜１５＞
前記溶媒が水である、前記＜１２＞〜＜１４＞のいずれかに記載の医薬組成物。
＜１６＞
２．５〜５００ｍｇ／ｍｌまたは１０〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度のアンチセンスオリゴマー、８〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度の塩化ナトリウムを含み、かつｐＨが７．２〜７．４の水溶液である、前記＜１＞に記載の医薬組成物。
＜１７＞
前記治療により、以下の（１）〜（６）からなる群より選択される少なくとも１つの効果が生じる、前記＜１＞に記載の医薬組成物：
（１）患者の骨格筋におけるジストロフィンタンパク質発現量の平均値が、ベースラインと比較して、２４週間の投与後に９倍以上に増加すること；
（２）立ち上がり時間（ＴＴＳＴＡＮＤ）から得られる速度の変化が、ベースラインと比較して、２４週間の投与後２５週時に−０．０５５回／秒以上であること；
（３）１０メートル走行／歩行時間（ＴＴＲＷ）から得られる速度の変化が、ベースラインと比較して、２４週間の投与後２５週時に−０．０２５メートル／秒以上であること；
（４）４段階段昇り時間（ＴＴＣＬＩＭＢ）から得られる速度の変化が、ベースラインと比較して、２４週間の投与後２５週時に−０．０６０回／秒以上であること；
（５）ノース・スター歩行能力評価（ＮＳＡＡ）のスコアの変化が、ベースラインと比較して、２４週間の投与後２５週時に−２．２スコア以上であること；及び
（６）６分間歩行試験（６ＭＷＴ）の変化が、ベースラインと比較して、２４週間の投与後２５週時に−７．５メートル以上であること。
＜１８＞
７〜９歳のデュシェンヌ型筋ジストロフィーのヒト患者に前記治療を８４週間行った場合に、以下の（１）〜（６）からなる群より選択される少なくとも一つの効果が生じる、前記＜１＞に記載の医薬組成物：
（１）治療開始から第８５週までに、立ち上がり能力を喪失する患者が２０％未満であること；
（２）治療開始から第８５週までに、４段階段昇りが出来なくなる患者が１０％未満であること；
（３）治療開始から第８５週までに、自立歩行能力を喪失する患者が１０％未満であること；
（４）治療開始から第８５週までに、１０メートル走行／歩行の速度に加齢による減少がみられないこと；
（５）治療開始から第８５週までに、４段階段昇りの速度に加齢による減少がみられないこと；
及び
（６）治療開始から第８５週までに、立ち上がりの速度に加齢による減少がみられないこと。
＜１９＞
１０〜１２歳のデュシェンヌ型筋ジストロフィーのヒト患者に前記治療を８４週間行った場合に、以下の（１）〜（６）からなる群より選択される少なくとも一つの効果が生じる、前記＜１＞に記載の医薬組成物：
（１）治療開始から第８５週までに、立ち上がり能力を喪失する患者が６０％未満であること；
（２）治療開始から第８５週までに、４段階段昇りが出来なくなる患者が５０％未満であること；
（３）治療開始から第８５週までに、自立歩行能力を喪失する患者が５０％未満であること；
及び
（４）治療開始から第８５週までに、１０メートル走行／歩行の速度に加齢による減少がみられないこと。
（５）治療開始から第８５週までに、４段階段昇りの速度が増加する時期がみられること；
及び
（６）治療開始から第８５週までに、立ち上がりの速度が増加する時期がみられること。
＜２０＞
ヒトジストロフィン遺伝子の第５３番目のエクソンの５’末端から第３６〜５６番目のヌクレオチドからなる配列に相補的な塩基配列からなるアンチセンスオリゴマー又はその医薬的に許容可能な塩若しくは水和物を含有する医薬組成物を、
前記アンチセンスオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩又はその水和物を４０ｍｇ／ｋｇ〜８０ｍｇ／ｋｇでヒト患者に週１回静脈内投与することを含む、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療方法。
＜２０−１＞
前記治療方法により、請求項１７に記載の少なくとも１つの効果、請求項１８に記載の少なくとも１つの効果または請求項１９に記載の少なくとも１つの効果が生じる、前記＜２０＞に記載の治療方法。
＜２１＞
ヒト患者のデュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療方法に用いるためのヒトジストロフィン遺伝子の第５３番目のエクソンの５’末端から第３６〜５６番目のヌクレオチドからなる配列に相補的な塩基配列からなるアンチセンスオリゴマー又はその医薬的に許容可能な塩若しくは水和物であって、
前記アンチセンスオリゴマー又はその医薬的に許容可能な塩若しくは水和物が４０ｍｇ／ｋｇ〜８０ｍｇ／ｋｇで前記ヒト患者に週１回静脈内投与される、
前記アンチセンスオリゴマー又はその医薬的に許容可能な塩若しくは水和物。
＜２１−１＞
前記投与により、請求項１７に記載の少なくとも１つの効果、請求項１８に記載の少なくとも１つの効果または請求項１９に記載の少なくとも１つの効果が生じる、前記＜２１＞に記載のアンチセンスオリゴマー又はその医薬的に許容可能な塩若しくは水和物。
＜２２＞
ヒト患者のデュシェンヌ型筋ジストロフィーを治療するための医薬組成物の製造のためのヒトジストロフィン遺伝子の第５３番目のエクソンの５’末端から第３６〜５６番目のヌクレオチドからなる配列に相補的な塩基配列からなるアンチセンスオリゴマー又はその医薬的に許容可能な塩若しくは水和物の使用であって、
前記アンチセンスオリゴマー又はその医薬的に許容可能な塩若しくは水和物が４０ｍｇ／ｋｇ〜８０ｍｇ／ｋｇで前記ヒト患者に週１回静脈内投与される、
前記使用。
【００１２】
また、別の態様として、本発明は、非限定的に以下のとおりである。
［１］：約４０ｍｇ／ｋｇ／週の用量で被験者にＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１を静脈内投与する工程を含む、エクソン５３スキッピングによる治療に適したデュシェンヌ型筋ジストロフィーを有する被験者を治療するための方法。
［２］：約８０ｍｇ／ｋｇ／週の用量で被験者にＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１を静脈内投与する工程を含む、エクソン５３スキッピングによる治療に適したデュシェンヌ型筋ジストロフィーを有する被験者を治療するための方法。
［３］：４０ｍｇ／ｋｇ／週以上８０ｍｇ／ｋｇ／週以下の用量で被験者にＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１を静脈内投与する工程を含む、エクソン５３スキッピングによる治療に適したデュシェンヌ型筋ジストロフィーを有する被験者を治療するための方法。
［４］：投与されるものが、
２．５ｍｇ／ｍＬ以上５００ｍｇ／ｍＬ以下の濃度のＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１；および
等張化剤として、８．５５ｍｇ／ｍＬ以上９．４５ｍｇ／ｍＬ以下の濃度の塩化ナトリウム
を含む水溶液であり、
当該水溶液が約７．３のｐＨを有する、［１］に記載の方法。
［５］：投与されるものが、
２．５ｍｇ／ｍＬ以上５００ｍｇ／ｍＬ以下の濃度のＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１；および
等張化剤として、８．５５ｍｇ／ｍＬ以上９．４５ｍｇ／ｍＬ以下の濃度の塩化ナトリウム
を含む水溶液であり、
当該水溶液が約７．３のｐＨを有する、［２］に記載の方法。
［６］：投与されるものが、
２．５ｍｇ／ｍＬ以上５００ｍｇ／ｍＬ以下の濃度のＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１；および
等張化剤として、８．５５ｍｇ／ｍＬ以上９．４５ｍｇ／ｍＬ以下の濃度の塩化ナトリウム
を含む水溶液であり、
当該水溶液が約７．３のｐＨを有する、［３］に記載の方法。
［７］：約４０ｍｇ／ｋｇ／週の用量で被験者にＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１を静脈内投与する工程を含む、エクソン５３スキッピングによる治療に適したデュシェンヌ型筋ジストロフィーを有する被験者において、ジストロフィンタンパク質産生を誘導するための方法。
［８］：約８０ｍｇ／ｋｇ／週の用量で被験者にＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１を静脈内投与する工程を含む、エクソン５３スキッピングによる治療に適したデュシェンヌ型筋ジストロフィーを有する被験者において、ジストロフィンタンパク質産生を誘導するための方法。
［９］：４０ｍｇ／ｋｇ／週以上８０ｍｇ／ｋｇ／週以下の用量で被験者にＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１を静脈内投与する工程を含む、エクソン５３スキッピングによる治療に適したデュシェンヌ型筋ジストロフィーを有する被験者において、ジストロフィンタンパク質産生を誘導するための方法。
［１０］：投与されるものが、
２．５ｍｇ／ｍＬ以上５００ｍｇ／ｍＬ以下の濃度のＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１；および
等張化剤として、８．５５ｍｇ／ｍＬ以上９．４５ｍｇ／ｍＬ以下の濃度の塩化ナトリウム
を含む水溶液であり、
当該水溶液が約７．３のｐＨを有する、［７］に記載の方法。
［１１］：投与されるものが、
２．５ｍｇ／ｍＬ以上５００ｍｇ／ｍＬ以下の濃度のＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１；および
等張化剤として、８．５５ｍｇ／ｍＬ以上９．４５ｍｇ／ｍＬ以下の濃度の塩化ナトリウム
を含む水溶液であり、
当該水溶液が約７．３のｐＨを有する、［８］に記載の方法。
［１２］：投与されるものが、
２．５ｍｇ／ｍＬ以上５００ｍｇ／ｍＬ以下の濃度のＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１；および
等張化剤として、８．５５ｍｇ／ｍＬ以上９．４５ｍｇ／ｍＬ以下の濃度の塩化ナトリウム
を含む水溶液であり、
当該水溶液が約７．３のｐＨを有する、［９］に記載の方法。
上記［１］〜［１２］において、ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１（本明細書において、「Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ」ともいう）は、その同等品であってもよい。また、上記［１］〜［１２］において、被験者はヒト患者であってもよい。
【００１３】
本発明により、Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎの安定な組成を有する、デュシェンヌ型筋ジストロフィー治療用の医薬組成物が提供される。また、Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎを含む医薬組成物に関し、効果的なデュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療効果を奏しかつヒト患者に安全な範囲のＶｉｌｔｏｌａｒｓｅｎの用法・用量が提供される。当該医薬組成物により、低い副作用でデュシェンヌ型筋ジストロフィーの症状を効果的に軽減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】米国第２相用量設定試験ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１−２０１のデザインを示す。
【図２】ウェスタンブロット法を用いた骨格筋におけるｄｅ  ｎｏｖｏジストロフィンタンパク質発現量の測定の結果を示す。
【図３】米国／カナダ第２相用量設定試験ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１−２０１のデザインを示す。
【図４】２４週間にわたる時間機能検査におけるベースラインからの変化の比較を示す。５つのグラフにおいて、「Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ」は、ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１の国際一般名（ＩＮＮ）である。
【図５】Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎのブリットン−ロビンソン緩衝液（ｐＨ  ３〜１１）中の安定性評価の結果を示す。
【図６】Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎのリン酸カリウム−ホウ砂緩衝液（ｐＨ  ６〜９）中における安定性評価の結果を示す。
【図７】１２１℃におけるｐＨ調整剤の検討の結果を示す。
【図８】各運動機能試験結果のベースラインからの変化を表すグラフである。
【図９】８５週時（初回投与から８４週経過）までのＶｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ投与群（４０  ｍｇ／ｋｇ投与群と８０  ｍｇ／ｋｇ投与群）各被験患者における、６分間歩行試験の結果を表すグラフである。
【図１０】８５週時（初回投与から８４週経過）までのＶｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ投与群（４０  ｍｇ／ｋｇ投与群と８０  ｍｇ／ｋｇ投与群）の各被験患者における、ノース・スター歩行能力テストのスコアを表すグラフである。
【図１１】８５週時（初回投与から８４週経過）までのＶｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ投与群（４０  ｍｇ／ｋｇ投与群と８０  ｍｇ／ｋｇ投与群）の各被験患者における、立ち上がり時間試験の速度の結果を表すグラフである。
【図１２】８５週時（初回投与から８４週経過）までのＶｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ投与群（４０  ｍｇ／ｋｇ投与群と８０  ｍｇ／ｋｇ投与群）の各被験患者における、４段階段昇り時間試験の速度の結果を表すグラフである。
【図１３】８５週時（初回投与から８４週経過）までのＶｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ投与群（４０  ｍｇ／ｋｇ投与群と８０  ｍｇ／ｋｇ投与群）の各被験患者における、１０ｍ歩行／走行時間試験の速度の結果を表すグラフである。
【図１４】４９週時（初回投与から４８週経過）のＶｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ投与群（４０  ｍｇ／ｋｇ投与群と８０  ｍｇ／ｋｇ投与群）の各被験患者における、ＷＢによるジストロフィン定量値のベースラインからのジストロフィン発現量の変化と立ち上がり時間試験のベースラインからの速度変化の相関を表すグラフである。
【図１５】４９週時（初回投与から４８週経過）のＶｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ投与群（４０  ｍｇ／ｋｇ投与群と８０  ｍｇ／ｋｇ投与群）の各被験患者における、ＷＢによるジストロフィン定量値のベースラインからのジストロフィン発現量の変化と４段階段昇り時間試験のベースラインからの速度変化の相関を表すグラフである。
【図１６】４９週時（初回投与から４８週経過）のＶｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ投与群（４０  ｍｇ／ｋｇ投与群と８０  ｍｇ／ｋｇ投与群）の各被験患者における、ＷＢによるジストロフィン定量値のベースラインからのジストロフィン発現量の変化と１０ｍ歩行／走行時間試験のベースラインからの速度変化の相関を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、２０１８年６月２６日に出願された本願優先権主張の基礎となる米国仮特許出願（ＵＳ６２／６９０，２７０）及び２０１８年１０月１日に出願された本願優先権主張の基礎となる米国仮特許出願（ＵＳ６２／７３９，３８６）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
【００１６】
Ｉ．第一の形態
本発明は、第一の形態として、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを治療するための医薬組成物を提供する。すなわち、本発明の医薬組成物は、ヒトジストロフィン遺伝子の第５３番目のエクソンの５’末端から第３６〜５６番目のヌクレオチドからなる配列に相補的な塩基配列からなるアンチセンスオリゴマー（以下、「本発明のオリゴマー」ともいう）もしくはその医薬的に許容可能な塩又はその水和物を含有する、ヒト患者のデュシェンヌ型筋ジストロフィーを治療するための医薬組成物であって、
前記治療はアンチセンスオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩又はその水和物が４０ｍｇ／ｋｇ〜８０ｍｇ／ｋｇで前記ヒト患者に週１回静脈内投与することを含む、前記医薬組成物を提供する。
【００１７】
［ヒトジストロフィン遺伝子の第５３番目のエクソン］
本発明において、「遺伝子」には、ゲノム遺伝子以外に、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体及びｍＲＮＡも含まれる。好ましくは、遺伝子は、ｍＲＮＡ前駆体、即ち、ｐｒｅ−ｍＲＮＡである。
ヒトゲノムにおいて、ヒトジストロフィン遺伝子は遺伝子座Ｘｐ２１．２に存在する。ヒトジストロフィン遺伝子は、３．０Ｍｂｐのサイズを有しており、既知のヒト遺伝子としては最大の遺伝子である。但し、ヒトジストロフィン遺伝子のコード領域はわずか１４ｋｂに過ぎず、該コード領域は７９個のエクソンとしてジストロフィン遺伝子内に分散している（Ｒｏｂｅｒｔｓ，ＲＧ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１６：５３６−５３８（１９９３））。ヒトジストロフィン遺伝子の転写物であるｐｒｅ−ｍＲＮＡは、スプライシングを受けて１４ｋｂの成熟ｍＲＮＡを生成する。ヒトの野生型ジストロフィン遺伝子の成熟ｍＲＮＡの塩基配列は公知である（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００４００６）。
ヒトの野生型ジストロフィン遺伝子のエクソン５３の塩基配列を配列番号１に示す。
【００１８】
本発明の医薬組成物は、ヒトジストロフィン遺伝子の第５３番目のエクソンの５’末端から第３６〜５６番目のヌクレオチドからなる配列に相補的な塩基配列からなるアンチセンスオリゴマー（本発明のオリゴマー）もしくはその医薬的に許容可能な塩又はその水和物を含有する。
ここで、本発明のオリゴマーは、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５３のスキッピングにより、ＤＭＤ型ジストロフィン遺伝子でコードされるタンパク質を、ＢＭＤ型ジストロフィンタンパク質に改変することを目的として作製されたものである。したがって、本発明のオリゴマーのエクソンスキッピングの対象となるジストロフィン遺伝子のエクソン５３には、野生型だけではなく、変異型も含まれる。
【００１９】
変異型のヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５３は、具体的には、配列番号１の塩基配列に対して、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、又は９９．９％以上の同一性を有するポリヌクレオチドをあげることができる。本明細書中、「ポリヌクレオチド」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。
【００２０】
なお、塩基配列の同一性は、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７２２６４−２２６８，１９９０；Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：５８７３，１９９３）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ，ｅｔ  ａｌ：Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３，１９９０）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
【００２１】
本明細書中、「相補的な塩基配列」とは、対象となる塩基配列とワトソン・クリック対を形成する塩基配列に限定されるものではなく、揺らぎ塩基対（Ｗｏｂｂｌｅ  ｂａｓｅｐａｉｒ）を形成する塩基配列も含む。ここで、ワトソン・クリック対とは、アデニン−チミン、アデニン−ウラシル及びグアニン−シトシン間に水素結合が形成される塩基対を意味し、揺らぎ塩基対とは、グアニン−ウラシル、イノシン−ウラシル、イノシン−アデニン及びイノシン−シトシン間に水素結合が形成される塩基対を意味する。また、「相補的な塩基配列」とは、対象となる塩基配列と１００％の相補性を有していなくてもよく、例えば、対象となる塩基配列に対して、１個、２個、３個、４個又は５個の非相補的塩基が含まれていてもよく、また、対象となる塩基配列に対して、１塩基、２塩基、３塩基、４塩基又は５塩基短い塩基配列であってもよい。
【００２２】
エクソン５３の５’末端から第３６〜５６番目のヌクレオチドからなる配列（配列番号２）及び同配列に相補的な塩基配列（配列番号３）の例を以下の表１に示す。
【００２３】
【表１】
2020004675.tif 000003
【００２４】
ここでチミン「Ｔ」とウラシル「Ｕ」は相互に交換可能であり、「Ｔ」であっても「Ｕ」であっても本発明のオリゴマーのエクソンスキッピング活性に本質的に影響は生じないので、本願では配列番号に示される塩基配列の「Ｔ」が「Ｕ」であっても同一の配列番号で示すこととする。したがって、本願に開示される配列は、必然的に「Ｔ」の配列及び「Ｕ」の配列の両者を含む。
【００２５】
したがって、本発明のオリゴマーは、その塩基部分の配列が配列番号３に示す配列からなるものであってもよい。また、本発明のオリゴマーは、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５３のスキッピングを可能にする限り、ターゲット配列に対して１００％相補的な塩基配列を有していなくてもよい。例えば、本発明のオリゴマーには、ターゲット配列である配列番号２に対して、１個、２個、３個、４個又は５個の非相補的塩基が含まれていてもよく、また、対象となる塩基配列に対して、１塩基、２塩基、３塩基、４塩基又は５塩基短い塩基配列であってもよい。
【００２６】
ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５３のスキッピングが生じたか否かは、ジストロフィン発現細胞（例えば、ヒト横紋筋肉腫細胞）に本発明のオリゴマーを導入し、前記ジストロフィン発現細胞のｔｏｔａｌ  ＲＮＡから、ヒトジストロフィン遺伝子のｍＲＮＡのエクソン５３の周辺領域をＲＴ−ＰＣＲ増幅し、該ＰＣＲ増幅産物に対してｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ又はシークエンス解析を行うことにより確認することができる。あるいは、本発明のオリゴマーを投与された患者由来のサンプルにおいて、ＲＴ−ＰＣＲ、ウェスタンブロット、質量分析などの手法により、エクソン５３の量を測定することによっても、スキッピングが生じたか否かを確認することができる。
スキッピング効率は、ヒトジストロフィン遺伝子のｍＲＮＡを被検細胞から回収し、該ｍＲＮＡのうち、エクソン５３がスキップしたバンドのポリヌクレオチド量「Ａ」と、エクソン５３がスキップしなかったバンドのポリヌクレオチド量「Ｂ」を測定し、これら「Ａ」及び「Ｂ」の測定値に基づき、以下の式に従って計算することができる。
スキッピング効率（％）＝Ａ／（Ａ＋Ｂ）×１００
【００２７】
本発明のオリゴマーとしては、オリゴヌクレオチド、モルホリノオリゴマー、又はペプチド核酸（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ：ＰＮＡ）オリゴマーが挙げられる。本発明のオリゴマーは、モルホリノオリゴマーが好ましい。
【００２８】
前記オリゴヌクレオチド（以下、「本発明のオリゴヌクレオチド」という）は、ヌクレオチドを構成単位とする本発明のオリゴマーであり、かかるヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド又は修飾ヌクレオチドのいずれであってもよい。
修飾ヌクレオチドとは、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを構成する核酸塩基、糖部分、及びリン酸結合部分の全部又は一部が修飾されているものをいう。
【００２９】
核酸塩基としては、例えば、アデニン、グアニン、ヒポキサンチン、シトシン、チミン、ウラシル又はそれらの修飾塩基を挙げることができる。かかる修飾塩基としては、例えば、シュードウラシル、３−メチルウラシル，ジヒドロウラシル、５−アルキルシトシン（例えば、５−メチルシトシン）、５−アルキルウラシル（例えば、５−エチルウラシル）、５−ハロウラシル（５−ブロモウラシル）、６−アザピリミジン、６−アルキルピリミジン（６−メチルウラシル）、２−チオウラシル、４−チオウラシル、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５’−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、１−メチルアデニン、１−メチルヒポキサンチン、２，２−ジメチルグアニン、３−メチルシトシン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メチルカルボニルメチルウラシル、５−メチルオキシウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸、２−チオシトシン、プリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノプリン、イソグアニン、インドール、イミダゾール、キサンチン等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３０】
糖部分の修飾としては、例えば、リボースの２’位の修飾及び糖のその他の部分の修飾を挙げることができる。リボースの２’位の修飾としては、例えば、リボースの２’位の−ＯＨ基をＯＲ、Ｒ、Ｒ’  ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、Ｎ３、ＣＮ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉに置換する修飾を挙げることができる。ここで、Ｒはアルキル又はアリールを表す。Ｒ’はアルキレンを表す。
糖のその他の部分の修飾としては、例えば、リボース又はデオキシリボースの４’位のＯをＳに置換したもの、糖の２’位と４’位を架橋したもの、例えば、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）又はＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３１】
リン酸結合部分の修飾としては、例えば、ホスホジェステル結合をホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、ボラノフォスフェート結合（Ｅｎｙａ  ｅｔ  ａｌ：Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００８，１８，９１５４−９１６０）に置換する修飾を挙げることができる（例えば、特許再公表公報第２００６／１２９５９４号及び第２００６／０３８６０８号を参照）。
【００３２】
アルキルとしては、直鎖状または分枝鎖状の炭素数１〜６のアルキルが好ましい。具体的には、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシルが挙げられる。当該アルキルは置換されていてもよく、かかる置換基としては、例えば、ハロゲン、アルコキシ、シアノ、ニトロを挙げることができ、これらが１〜３個置換されていてもよい。
【００３３】
シクロアルキルとしては、炭素数５〜１２のシクロアルキルが好ましい。具体的には、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロデシル、シクロドデシルが挙げられる。
【００３４】
ハロゲンとしては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素を挙げることができる。
【００３５】
アルコキシとしては、直鎖状または分枝鎖状の炭素数１〜６のアルコキシ、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｎ−ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ｎ−ヘキシルオキシ、イソヘキシルオキシ等を挙げることができる。とりわけ、炭素数１〜３のアルコキシが好ましい。
【００３６】
アリールとしては、炭素数６〜１０のアリールが好ましい。具体的には、例えば、フェニル、α−ナフチル、β−ナフチルを挙げることができる。とりわけフェニルが好ましい。当該アリールは置換されていてもよく、かかる置換基としては、例えば、アルキル、ハロゲン、アルコキシ、シアノ、ニトロを挙げることができ、これらが１〜３個置換されていてもよい。
【００３７】
アルキレンとしては、直鎖状または分枝鎖状の炭素数１〜６のアルキレンが好ましい。具体的には、例えば、メチレン、エチレン、トリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、２−（エチル）トリメチレン、１−（メチル）テトラメチレンを挙げることができる。
【００３８】
アシルとしては、直鎖状若しくは分枝鎖状のアルカノイル、又はアロイルを挙げることができる。アルカノイルとしては、例えば、ホルミル、アセチル、２−メチルアセチル、２，２−ジメチルアセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、ペンタノイル、２，２−ジメチルプロピオニル、ヘキサノイル等が挙げられる。アロイルとしては、例えば、ベンゾイル、トルオイル、ナフトイルを挙げることができる。かかるアロイルは置換可能な位置において置換されていてもよく、アルキルで置換されていてもよい。
【００３９】
本発明のオリゴマーがオリゴヌクレオチドである態様において、同オリゴヌクレオチドは、好ましくは、リボースの２’位の−ＯＨ基がメトキシで置換され、リン酸結合部分がホスホロチオエート結合である、下記一般式で表される基を構成単位とするものであってもよい。
【化１】
2020004675.tif 000004
（式中、Ｂａｓｅは、核酸塩基を表す。）
【００４０】
このようなオリゴヌクレオチドは、各種自動合成装置（例えば、ＡＫＴＡ  ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔｐｌｕｓ  １０／１００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を用いて容易に合成することが可能であり、あるいは、第三者機関（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ社又はＴａｋａｒａ社）等に委託して作製することもできる。
【００４１】
本発明のオリゴマーがモルホリノオリゴマーである場合、同モルホリノオリゴマーは下記一般式で表される基を構成単位とするものであってもよい。
【化２】
2020004675.tif 000005
（式中、Ｂａｓｅは、前記と同義であり；
Ｗは、以下のいずれかの式で表わされる基を表す。
【化３】
2020004675.tif 000006
（式中、Ｘは、−ＣＨ２Ｒ１、−Ｏ−ＣＨ２Ｒ１、−Ｓ−ＣＨ２Ｒ１、−ＮＲ２Ｒ３又はＦを表し；
Ｒ１は、Ｈ、アルキルを表し；
Ｒ２及びＲ３は、同一又は異なって、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、又は、アリールを表し；
Ｙ１は、０、Ｓ、ＣＨ２又はＮＲ１を表し；
Ｙ２は、０、Ｓ又はＮＲ１を表し；
Ｚは、０又はＳを表す。））
【００４２】
モルホリノオリゴマーは、好ましくは、以下の式で表わされる基を構成単位とするオリゴマー（ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（以下、「ＰＭＯ」という））である。
【化４】
2020004675.tif 000007
（式中、Ｂａｓｅ、Ｒ２、Ｒ３は、前記と同義である。）
【００４３】
モルホリノオリゴマーは、例えば、国際公開公報第１９９１／００９０３３号、又は国際公開公報第２００９／０６４４７１号に従って製造することができる。特に、ＰＭＯは、国際公開公報第２００９／０６４４７１号に記載の方法に従って製造するか、又は以下に示す方法に従って製造することができる。
【００４４】
ＰＭＯの１つの態様として、例えば、次の一般式（Ｉ）で表される化合物（以下、ＰＭＯ（Ｉ）という）を挙げることができる。
【化５】
2020004675.tif 000008
［式中、各Ｂａｓｅ、Ｒ２、Ｒ３は、前記と同義であり；
ｎは、１〜９９の範囲内にある任意の整数であり、好ましくは、１８〜２８の範囲内にある任意の整数である。］
【００４５】
ＰＭＯ（Ｉ）は、公知の方法に従い製造することができ、使用される化合物及び試薬は、ＰＭＯの製造に一般的に使用されているものであれば特に限定されない。また、製造は、液相法又は固相法（マニュアル又は市販の固相自動合成機を用いる）で実施することができる。固相法でＰＭＯを製造する場合、操作手順の簡便化及び合成の正確性の点から自動合成機を用いる方法が望ましい。
【００４６】
ペプチド核酸は、下記一般式で表される基を構成単位とする本発明のオリゴマーである。
【化６】
2020004675.tif 000009
［式中、Ｂａｓｅは、前記と同義である。］
【００４７】
ペプチド核酸は、例えば、以下の文献に従って製造することができる。
１）Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｍ．Ｅｇｈｏｌｍ，Ｒ．Ｈ．Ｂｅｒｇ，Ｏ．Ｂｕｃｈａｒｄｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４，１４９７（１９９１）
２）Ｍ．Ｅｇｈｏｌｍ，Ｏ．Ｂｕｃｈａｒｄｔ，Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｒ．Ｈ．Ｂｅｒｇ，Ｊａｃｓ．，１１４，１８９５（１９９２）
３）Ｋ．Ｌ．Ｄｕｅｈｏｌｍ，Ｍ．Ｅｇｈｏｌｍ，Ｃ．Ｂｅｈｒｅｎｓ，Ｌ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｈ．Ｆ．Ｈａｎｓｅｎ，Ｔ．Ｖｕｌｐｉｕｓ，Ｋ．Ｈ．Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｒ．Ｈ．Ｂｅｒｇ，Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｏ．Ｂｕｃｈａｒｄｔ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５９，５７６７（１９９４）
４）Ｌ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｒ．Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ，Ｂ．Ｇｉｌｄｅａ，Ｋ．Ｈ．Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｈ．Ｆ．Ｈａｎｓｅｎ，Ｔ．Ｋｏｃｈ，Ｍ．Ｅｇｈｏｌｍ，Ｏ．Ｂｕｃｈａｒｄｔ，Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｊ．Ｃｏｕｌｌ，Ｒ．Ｈ．Ｂｅｒｇ，Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．，１，１７５（１９９５）
５）Ｔ．Ｋｏｃｈ，Ｈ．Ｆ．Ｈａｎｓｅｎ，Ｐ．Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｔ．Ｌａｒｓｅｎ，Ｈ．Ｇ．Ｂａｔｚ，Ｋ．Ｏｔｔｅｓｏｎ，Ｈ．Ｏｒｕｍ，Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．，４９，８０（１９９７）
【００４８】
また、本発明のオリゴマーは、５’末端が、下記化学式（１）〜（３）のいずれかの基であってもよい。好ましくは（３）−ＯＨである。
【化７】
2020004675.tif 000010
以下、上記（１）、（２）及び（３）で示される基を、それぞれ「基（１）」、「基（２）」及び「基（３）」と呼ぶ。
【００４９】
本発明のオリゴマーの医薬的に許容可能な塩の例としては、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩などの金属塩；アンモニウム塩；ｔ−オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ−ベンジル−フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機アミン塩；弗化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、沃化水素酸塩のようなハロゲン化水素酸塩；硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩などの無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスルホン酸塩；ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩のようなアリールスルホン酸塩；酢酸塩、リンゴ酸塩、フマール酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩などの有機酸塩；グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩などが挙げられる。これらの塩は、公知の方法で製造することができる。あるいは、本発明のオリゴマーは、その水和物の形態にあってもよい。
【００５０】
別の態様では、本発明のオリゴマーは、Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ又はその同等品であってもよい。
Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎとは、ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１の国際一般名（ＩＮＮ）である。本明細書において、ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１は、ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１、ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１（Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ）またはＶｉｌｔｏｌａｒｓｅｎとも称される。
【００５１】
ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１（Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ）は、エクソン５３スキッピングによる治療に適したデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）患者の治療のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド原薬である。ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１（Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ）は米国特許第９，０７９，９３４Ｂ２号において「ＰＭＯ  Ｎｏ．８」として開示されている化合物であり、塩基部分の配列が配列番号３５（５’−ＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣ  ＴＧＡＡＧＧＴＧＴＴＣ−３’、本明細書における配列番号３）によって表され、−ＯＨの５’末端を有する。本明細書には、米国特許第９，０７９，９３４Ｂ２号はその内容の全体が参照により組み込まれる。米国特許第９，０７９，９３４Ｂ２号はまた、ＰＭＯ  Ｎｏ．８、すなわち、ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１（Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ）を合成する方法を開示する。
【００５２】
ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１（Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ）は、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドよりも高い安全性を提供すると予想されるモルホリノ骨格を有する。例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであるｄｒｉｓａｐｅｒｓｅｎ（ＢｉｏＭａｒｉｎによる）の開発は安全上の懸念のために中断されているが、モルホリノオリゴヌクレオチドであるｅｔｅｐｌｉｒｓｅｎ（ＳａｒｅｐｔａによるＥｘｏｎｄｙｓ５１（登録商標））はＦＤＡによって承認されている。ｄｒｉｓａｐｅｒｓｅｎおよびｅｔｅｐｌｉｒｓｅｎの両者は、エクソン５１スキッピングによる治療に適したＤＭＤ患者のためのものである。Ｅｔｅｐｌｉｒｓｅｎは米国特許第９，５０６，０５８Ｂ２号に開示され、その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００５３】
米国特許第９，０７９，９３４Ｂ２号に開示されているように、ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１（Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ）はエクソン４３−５２、４５−５２、４７−５２、４８−５２、４９−５２、５０−５２または５２を含む、特異的なエクソンが欠損しているＤＭＤ患者において機能性ジストロフィンタンパク質を生成するために、特異的にエクソン５３スキッピング活性を示すように設計された。特定のエクソンをスキップすることによって理論的に治療可能なＤＭＤを引き起こす突然変異の例は、Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓら、２００２の表３に示されている。Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓらの文献の内容は、その全体が参照により組み込まれる（Ａｎｎｅｍｉｅｋｅ  Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ，Ｍａｔｔｉｅ  Ｂｒｅｍｍｅｒ−Ｂｏｕｔ，Ａｎｎｅｋｅ  Ａ．Ｍ．Ｊａｎｓｏｎ，Ｊｏｈａｎ  Ｔ．ｄｅｎ  Ｄｕｎｎｅｎ，Ｇｅｒｔ−Ｊａｎ  Ｂ．ｖａｎ  Ｏｍｍｅｎ，ａｎｄ  Ｊｕｄｉｔｈ  Ｃ．Ｔ．ｖａｎ  Ｄｅｕｔｅｋｏｍ，″Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｅｘｏｎ  ｓｋｉｐｐｉｎｇ  ａｓ  ａｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｇｅｎｅ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ，″Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，Ｖｏｌ．１２，ｐｐ．Ｓ７１−Ｓ７７（２００２））。
【００５４】
Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎの「同等品」とは、Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎの後発医薬品又はその有効成分となる化合物である。このような同等品は、Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎの臨床試験で確認された安全性及び有効性に基づいて、同等品自体については臨床試験を経ることなく薬事法上の製造販売承認を受けており、Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎと類似するエクソン５３スキッピング活性を有することが期待される。ある態様では、Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎの「同等品」は、Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎと同一の塩基配列を有し、その核酸塩基、糖部分、及びリン酸結合部分の全部又は一部がＶｉｌｔｏｌａｒｓｅｎと同一に修飾されている、または異なって修飾されているものを含む。これらの修飾の態様は、上記した態様と同様である。また、Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎの「同等品」は、フリー体、医薬的に許容可能な塩または水和物の形態であってもよい。
【００５５】
２．医薬品組成物
本発明の医薬組成物は、水溶液の形態にあってもよい。本発明の医薬組成物は、本発明のオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩又はその水和物を、２．５〜５００ｍｇ／ｍｌ、５〜４５０ｍｇ／ｍｌ、１０〜４００ｍｇ／ｍｌ、１５〜３５０ｍｇ／ｍｌ、２０〜３００ｍｇ／ｍｌ、２０〜２５０ｍｇ／ｍｌ、２０〜２００ｍｇ／ｍｌ、２０〜１５０ｍｇ／ｍｌ、２０〜１００ｍｇ／ｍｌ、２０〜５０ｍｇ／ｍｌ、２０〜４０ｍｇ／ｍｌ、２０〜３０ｍｇ／ｍｌ、２３〜２７ｍｇ／ｍｌ、２４〜２６ｍｇ／ｍｌ又は２５ｍｇ／ｍｌの濃度で含んでいてもよい。または、本発明の医薬組成物は、本発明のオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩又はその水和物を、１０〜１００ｍｇ／ｍｌ、１５〜９５ｍｇ／ｍｌ、２０〜８０ｍｇ／ｍｌ、２５〜７５ｍｇ／ｍｌ、３０〜７０ｍｇ／ｍｌ、３５〜６５ｍｇ／ｍｌ、４０〜６０ｍｇ／ｍｌ、４５〜５５ｍｇ／ｍｌ、４７〜５３ｍｇ／ｍｌ、４８〜５２ｍｇ／ｍｌ、４９〜５１ｍｇ／ｍｌ、又は５０ｍｇ／ｍｌの濃度で含んでいてもよい。
【００５６】
本発明の医薬組成物において、水溶液中のＶｉｌｔｏｌａｒｓｅｎの濃度は変更されてもよい。Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎの水溶液を調製するために、例えば、２５０ｍｇのＶｉｌｔｏｌａｒｓｅｎを、０．５ｍＬ〜１００ｍＬの水に混合（２．５ｍｇ／ｍＬ〜５００ｍｇ／ｍＬのＶｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ濃度に相当する）、より好ましくは１ｍＬ〜５０ｍＬの水に混合（５ｍｇ／ｍＬ〜２５０ｍｇ／ｍＬのＶｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ濃度に相当する）、最も好ましくは５ｍＬ〜１０ｍＬの水に混合（２５ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬのＮＶｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ濃度に相当する）してもよい。
【００５７】
本発明の医薬組成物の投与形態は、静脈内投与である。本発明の医薬組成物の取り得る剤形としては、例えば注射液（点滴液を含む）である。
【００５８】
本発明の医薬組成物は、等張化剤、ｐＨ調整剤及び溶媒から選択される少なくとも１つの成分をさらに含んでいてもよい。
【００５９】
本発明の医薬組成物に含まれる等張化剤は塩化ナトリウム、塩化カリウム、グルコース、フルクトース、マルトース、スクロース、ラクトース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、トレハロース、グリセリンから選択される少なくとも１つであってもよい。
【００６０】
Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎを２５０ｍｇ含む注射に適した１０ｍＬの水溶液は、等張化剤として、７２．０ｍｇ以上１０８．０ｍｇ以下の塩化ナトリウム（塩化ナトリウム濃度７．２ｍｇ／ｍＬ〜１０．８ｍｇ／ｍＬに相当）、より好ましくは８１．０ｍｇ以上９９．０ｍｇ以下の塩化ナトリウム（塩化ナトリウム濃度８．１ｍｇ／ｍＬ〜９．９ｍｇ／ｍＬに相当）、最も好ましくは８５．５ｍｇ以上９４．５ｍｇ以下の塩化ナトリウム（塩化ナトリウム濃度８．５５ｍｇ／ｍＬ〜９．４５ｍｇ／ｍＬに相当）を含んでいてもよい。
【００６１】
等張化剤としては、リン酸バッファーを用いてもよい。このようなリン酸バッファーとしては、クエン酸バッファー、乳酸バッファー、酢酸バッファーなどが挙げられる。また、等張化剤として、糖類（グルコース以外）を用いてもよい。このような糖の例としては、ソルビトールおよびマンニトールが挙げられる。Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎを含有する組成物を調製する際に、複数の等張化剤を同様に使用してもよい。
【００６２】
本発明の医薬組成物に含まれるｐＨ調整剤は、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエタノールアミン、クエン酸、乳酸、リン酸塩（リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム）、モノエタノールアミンから選択される少なくとも１つであってもよい。
【００６３】
本発明のオリゴマー、例えばＶｉｌｔｏｌａｒｓｅｎについてリン酸緩衝剤を用いる場合、リン酸緩衝剤の濃度は１００ｍＭ未満であることが好ましい。したがって、本発明の医薬組成物はリン酸緩衝剤の濃度が９０ｍＭ以下、８０ｍＭ以下、７０ｍＭ以下、６０ｍＭ以下、５０ｍＭ以下、４０ｍＭ以下、３０ｍＭ以下、２０ｍＭ以下、１０ｍＭ以下又は５ｍＭ以下に調整されているか、あるいはリン酸緩衝液を含まないものであってもよい。
【００６４】
本発明の医薬組成物に含まれる溶媒は水であってもよい。
【００６５】
Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎを含む注射に適した水溶液のｐＨは、６．０以上８．５以下、より好ましくは６．５以上８．０以下、最も好ましくは７．０以上７．５以下であってもよい。
本発明のオリゴマーは、広範囲のｐＨにおいて安定性を示すが、本発明の医薬組成物は、ｐＨが７．０〜７．５、７．０〜７．４、７．１〜７．５、７．１〜７．４、７．２〜７．５、７．２〜７．４、７．３〜７．５、７．３〜７．４又は７．３に調整されていることが好ましい。
【００６６】
また、本発明の医薬組成物は、２．５〜５００ｍｇ／ｍｌまたは１０〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度の本発明のオリゴマー、８〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度の塩化ナトリウムを含み、かつｐＨが７．２〜７．４の水溶液であってもよい。
あるいは、本発明の医薬組成物は、２５ｍｇ／ｍｌの濃度の本発明のオリゴマーを含み、かつｐＨが７．３に調整され、緩衝剤を含まない水溶液であってもよい。この医薬組成物において、ｐＨの調整は塩酸及び／又は水酸化ナトリウムを用いて行われる。
【００６７】
本発明の医薬組成物の例として、米国／カナダ第２相臨床プログラムにおいて使用した２５０ｍｇのＶｉｌｔｏｌａｒｓｅｎを含有する注射用の組成物を以下の表２に示す。表２に示す医薬組成物を、以下では「ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１（Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ）注射液２５０ｍｇ」と称する。
【００６８】
【表２】
2020004675.tif 000011
【００６９】
なお、「ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１（Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ）注射液２５０ｍｇ」の組成において、注射用水及び等張化剤の塩化ナトリウムの値を約半量にし、総量を５ｍＬとしてもよい。このような組成に係るＶｉｌｔｏｌａｒｓｅｎを５０ｍｇ／ｍＬの濃度で含む医薬組成物も、本発明に含まれる。
【００７０】
Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎを含有する水溶液の体積は、ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１および使用される等張化剤の濃度、ならびにＶｉｌｔｏｌａｒｓｅｎと使用される等張化剤との間の重量比が上記の説明と同等に維持される限り、増減されてもよい。
【００７１】
Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎを含む組成物はまた、筋肉組織へのＶｉｌｔｏｌａｒｓｅｎの送達を促進するための担体を含んでいてもよい。このような担体としては、医薬的に許容可能なものであれば特に限定されず、例えば、カチオン性担体（例えば、カチオン性リポソームおよびカチオン性ポリマー）およびウイルスエンベロープを用いた担体が挙げられる。カチオン性リポソームとしては、例えば、２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロールおよびリン脂質を必須成分とするリポソーム、オリゴフェクタミン（登録商標）（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、リポフェクチン（登録商標）（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、リポフェクタミン（登録商標）（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、リポフェクタミン（登録商標）２０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、ＧｅｎｅＳｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ（登録商標）（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ（登録商標）（。カチオン性ポリマーの例は、ＪｅｔＳＩ（登録商標）（ＧｅｎｅＸ  Ｉｎｄｉａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）およびＪｅｔ−ＰＥＩ（登録商標）（ポリエチレンイミン、ＧｅｎｅＸ  Ｉｎｄｉａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）などが挙げられる。ウイルスエンベロープを用いたキャリアとしては、例えば、ＧｅｎｏｍｅＯｎｅ（登録商標）（ＨＶＪ−Ｅリポソーム、石原産業株式会社製）が挙げられる。
【００７２】
さらに、本発明の医薬組成物は、乳化補助剤（例えば、炭素数６〜２２の脂肪酸やその医薬的に許容可能な塩、アルブミン、デキストラン）や安定化剤（例えば、コレステロール、ホスファチジン酸）を含んでもよい。
【００７３】
Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎと担体とを含む本発明の医薬組成物において、Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎと担体（すなわち、担体／Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ）の重量比は、使用する担体の種類に応じて変更してもよく、適切には０．１〜１００の範囲、好ましくは１〜５０の範囲、より好ましくは１０〜２０の範囲である。
【００７４】
Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎを含有する水溶液は、静脈内点滴または点滴によって患者に投与することができる。
【００７５】
３．効能・効果及び用法・用量
本発明の医薬組成物を治療に用いる場合、本発明のオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩又はその水和物が４０ｍｇ／ｋｇ〜８０ｍｇ／ｋｇでヒト患者に週１回静脈内投与される（以下、「本発明の用法・用量」という）。あるいは、本発明の用法・用量は、本発明のオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩又はその水和物が４０ｍｇ／ｋｇでヒト患者に週１回静脈内投与されるものであってもよい。または、本発明の用法・用量は、本発明のオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩又はその水和物が８０ｍｇ／ｋｇでヒト患者に週１回静脈内投与されるものであってもよい。ここで、用量の単位「ｍｇ／ｋｇ」において分子の「ｍｇ」は、本発明のオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩又はその水和物の量をミリグラムで表すものであり、分母の「ｋｇ」はヒト患者の体重１キログラムを表す。
【００７６】
ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１（Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ）注射液２５０ｍｇは、エクソン５３スキッピングによる治療に適したＤＭＤ患者の治療を目的とした週１回の点滴静注のために開発された。米国／カナダの第２相臨床プログラムは、２用量のＶｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ：４０ｍｇ／ｋｇ／週および８０ｍｇ／ｋｇ／週を評価するように設計された。ここで、ｋｇは患者の体重の単位である。例えば、体重４０ｋｇの患者について４０ｍｇ／ｋｇ／週であれば、１週間に１回、前記患者に１，６００ｍｇ（＝４０ｍｇ×４０）のＶｉｌｔｏｌａｒｓｅｎを投与することを意味する。
【００７７】
４．疾患
ＤＭＤはジストロフィン遺伝子における機能喪失突然変異によって引き起こされる筋疾患であり、患者の筋肉におけるジストロフィンタンパク質の喪失をもたらす（Ｈｏｆｆｍａｎら、１９８７）。ジストロフィン遺伝子はＸ染色体上にあり、高い自然突然変異率を示し、研究された全ての世界の集団において、ＤＭＤの発生率は生存出産された男性５，０００人に１人である。最近の評価では、グローバル患者データベースで評価された７，１４９人のＤＭＤ患者の１０．１％がエクソン５３スキッピングによる治療に適していることが示された（Ｂｌａｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。臨床症状は典型的には若年就学時期（４〜６歳まで）に呈され、罹患した男児は近位筋力低下（例えば、階段を登ることの困難性、または走ることの困難性）に起因して、同年齢の児童と身体的に対応することに困難性を示す。床からの立ち上がりの困難性は、典型的なＧｏｗｅｒの動きを用いて立位を達成する患者のほとんどに見られる（すなわち、立位を達成するために脚、膝、および大腿に手支持を使用する）（Ｈｏｆｆｍａｎ  ＥＰ，Ｂｒｏｗｎ  ＲＨ，ａｎｄ  Ｋｕｎｋｅｌ  ＬＭ．（１９８７）．Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ：ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｌｏｃｕｓ．Ｃｅｌｌ  ５１，９１９−９２８．およびＢｌａｄｅｎ  ＣＬ，Ｓａｌｇａｄｏ  Ｄ，Ｍｏｎｇｅｓ  Ｓ，Ｆｏｎｃｕｂｅｒｔａ  ＭＥ，Ｋｅｋｏｕ  Ｋ，Ｋｏｓｍａ  Ｋ，Ｄａｗｋｉｎｓ  Ｈ，Ｌａｍｏｎｔ  Ｌ，Ｒｏｙ  ＡＪ，Ｃｈａｍｏｖａ  Ｔ，Ｇｕｅｒｇｕｅｌｔｃｈｅｖａ  Ｖ，Ｃｈａｎ  Ｓ，Ｋｏｒｎｇｕｔ  Ｌ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ  Ｃ，
2020004675.tif 000012
Ｋａｒｃａｇｉ  Ｖ，Ｇａｒａｍｉ  Ｍ，Ｖｉｓｗａｎａｔｈａｎ  Ｖ，Ｂａｙａｔ  Ｆ，Ｂｕｃｃｅｌｌａ  Ｆ，Ｋｉｍｕｒａ  Ｅ，Ｋｏｅｋｓ  Ｚ，ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇｅｎ  ＪＣ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ  Ｍ，Ｒｏｘｂｕｒｇｈ  Ｒ，Ｌｕｓａｋｏｗｓｋａ  Ａ，Ｋｏｓｔｅｒａ−Ｐｒｕｓｚｃｚｙｋ  Ａ，Ｚｉｍｏｗｓｋｉ  Ｊ，Ｓａｎｔｏｓ  Ｒ，Ｎｅａｇｕ  Ｅ，Ａｒｔｅｍｉｅｖａ  Ｓ，Ｒａｓｉｃ  ＶＭ，Ｖｏｊｉｎｏｖｉｃ  Ｄ，Ｐｏｓａｄａ  Ｍ，Ｂｌｏｅｔｚｅｒ  Ｃ，Ｊｅａｎｎｅｔ  ＰＹ，Ｊｏｎｃｏｕｒｔ  Ｆ，Ｄｉａｚ−Ｍａｎｅｒａ  Ｊ，Ｇａｌｌａｒｄｏ  Ｅ，Ｋａｒａｄｕｍａｎ  ＡＡ，
2020004675.tif 000013
Ｂｅｌｌｇａｒｄ  ＭＩ，Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒ  Ｊ，Ｆｌａｎｉｇａｎ  ＫＭ，Ｓｔｒａｕｂ  Ｖ，Ｂｕｓｈｂｙ  Ｋ，Ｖｅｒｓｃｈｕｕｒｅｎ  Ｊ，Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ  Ａ，Ｂｅｒｏｕｄ  Ｃ，Ｌｏｃｈｍｕｌｌｅｒ  Ｈ．（２０１５）．Ｔｈｅ  ＴＲＥＡＴ−ＮＭＤ  ＤＭＤ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ：ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  ７，０００  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ．３６（４）：３９５−４０２）。
【００７８】
ＤＭＤ患者の筋肉組織は慢性炎症を示し、筋肉の変性および再生の発作を伴い、筋肉消耗、障害、および早期死に至る。患者は典型的には生後２０年までに歩行を失い、３０年までに日常生活の多くの面での支援を必要とするようになる。この疾患は通常、青年期または成人期早期の死亡につながるが、人工呼吸器補助装置の使用は時には寿命を４０年まで延ばすが５０年まで延ばすことは稀である。
【００７９】
被験者におけるＤＭＤ遺伝子変異は多重連結依存性プローブ増幅（ＭＬＰＡ）の使用によって検出することができる（Ｍｕｒｕｇａｎら、２０１０）。Ｍｕｒｕｇａｎらによるこの論文の内容の全体が参考として援用される（Ｓａｋｔｈｉｖｅｌ  Ｍｕｒｕｇａｎ  Ｓ．Ｍ．，Ａｒｔｈｉ  Ｃｈａｎｄｒａｍｏｈａｎ  ａｎｄ  Ｂｒｅｍａｄｅｓａｍ  Ｒａｍａｎ  Ｌａｋｓｈｍｉ，“Ｕｓｅ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｂｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＭＬＰＡ）ｆｏｒ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ（ＤＭＤ）ｇｅｎｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ，”Ｉｎｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１３２，ｐｐ．３０３−３１１（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２０１０）．）。
【００８０】
本発明の医薬組成物による治療の対象となるヒト患者（以下、「本発明の対象となる患者」という）は、医師によってＤＭＤを罹患していると診断された患者であれば特に限定されないが、ある態様では、ジストロフィン遺伝子にエクソン４３−５２、４５−５２、４７−５２、４８−５２、４９−５２、５０−５２または５２からなる群より選択されるいずれかのエクソンが欠損した変異を有する患者であってもよい。
【００８１】
また、本発明の対象となる患者は、本発明の医薬組成物又は本発明のオリゴマーを用いる治療前にジストロフィンタンパク質の発現がウェスタンブロッティングまたは質量分析による測定で健常人（１００％）の１％以下であることを特徴としていてもよい。ここで、「健常人」とはジストロフィンタンパク質に関する疾患を有しないヒトである。健常人におけるジストロフィンタンパク質の発現量は、一般に知られた値を用いても良いし、個別の健常人から得られた値を用いてもよい。また、本発明の対象となる患者は、本発明の医薬組成物又は本発明のオリゴマーを用いた治療前にはジストロフィンタンパク質の発現がみられないことを特徴としていてもよい。「ジストロフィンタンパク質の発現がみられない」とは、ジストロフィンタンパク質の発現量が、ウェスタンブロッティングまたは質量分析による測定で、陰性対照と同程度の発現量であること、または検出限界以下の値であることを意味する。  また、ウェスタンブロットおよび質量分析は、当分野で通常用いられる方法であれば特に限定されない。ウェスタンブロットおよび質量分析の一例として、本実施例における実験手法を参照することができる。
【００８２】
５．治療理論
ＤＭＤは重篤な遺伝性筋障害であるが、最も一般的にはジストロフィン遺伝子からの１つ以上のエクソンが欠失し、アウト・オブ・フレーム（Ｏｕｔ  ｏｆ  Ｆｒａｍｅ）アミノ酸翻訳が生じることによって引き起こされる。これにより筋肉機能に重要な患者の機能性ジストロフィンタンパク質が発現されなくなる。より重症度の低い形態の障害であるベッカー筋ジストロフィー（ＢＭＤ）は、ジストロフィン遺伝子中に１つ以上のエクソンが存在しないが、残りのエクソンがインフレームでアミノ酸翻訳される場合に最も一般的に生じる。ＢＭＤ患者は一般に、疾患の進行が遅く、障害の程度が低い。ＤＭＤ患者の医学的処置は一般に、四肢の筋肉における症状の発症を遅らせるためのグルココルチコイド処置や呼吸のサポートを含む。２０１８年２月のＦＤＡの最終ガイダンス「Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  Ｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ：Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  Ｄｒｕｇｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ．」（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／Ｄｒｕｇｓ／ＧｕｉｄａｎｃｅＣｏｍｐｌｉａｎｃｅＲｅｇｕｌａｔｏｒｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ／Ｇｕｉｄａｎｃｅｓ／ＵＣＭ４５０２２９．ｐｄｆ．にて入手可能）に示されているように、ＤＭＤ患者には、重大なアンメットメディカルニーズが存在する。
【００８３】
ＤＭＤ患者を治療するための１つの治療的アプローチは、機能的ジストロフィンタンパク質を産生してＤＭＤ患者をＢＭＤ表現型に移行させることを目的として「エクソンスキッピング」戦略を使用することである。エクソンスキッピングは欠失したエクソンの隣のエクソンのスキッピングを誘導し、これによってアミノ酸リーディングフレームを回復させることができる（Ｃｉｒａｋら、２０１１；Ｖｏｉｔら、２０１４；Ｙｏｋｏｔａら、２０１２）。エクソン５３のスキッピングにより、正常よりもわずかに短いが部分的に機能活性を保持するジストロフィンタンパク質が発現されることになる。ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１（Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ）注射液２５０ｍｇはＤＭＤ表現型を、患者の疾患進行が遅くなり、患者の生活の質が改善する、ＢＭＤのより軽度の疾患にシフトさせることが期待される（Ｃｉｒａｋ  Ｓ，Ａｒｅｃｈａｖａｌａ−Ｇｏｍｅｚａ  Ｖ，Ｇｕｇｌｉｅｒｉ  Ｍ，Ｆｅｎｇ  Ｌ，Ｔｏｒｅｌｌｉ  Ｓ，Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｋ，Ａｂｂｓ  Ｓ，Ｇａｒｒａｌｄａ  ＭＥ，Ｂｏｕｒｋｅ  Ｊ，Ｗｅｌｌｓ  ＤＪ，Ｄｉｃｋｓｏｎ  Ｇ，Ｗｏｏｄ  ＭＪ，Ｗｉｌｔｏｎ  ＳＤ，Ｓｔｒａｕｂ  Ｖ，Ｋｏｌｅ  Ｒ，Ｓｈｒｅｗｓｂｕｒｙ  ＳＢ，Ｓｅｗｒｙ  Ｃ，Ｍｏｒｇａｎ  ＪＥ，Ｂｕｓｈｂｙ  Ｋ，Ｍｕｎｔｏｎｉ  Ｆ．（２０１１）．Ｅｘｏｎ  ｓｋｉｐｐｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ａｆｔｅｒ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｄａｔｅ  ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ  ｏｌｉｇｏｍｅｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：ａｎ  ｏｐｅｎ−ｌａｂｅｌ，ｐｈａｓｅ  ２，ｄｏｓｅ−ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｙ．Ｌａｎｃｅｔ  ３７８：５９５−６０５．、Ｖｏｉｔ  Ｔ，Ｔｏｐａｌｏｇｌｕ  Ｈ，Ｓｔｒａｕｂ  Ｖ，Ｍｕｎｔｏｎｉ  Ｆ，Ｄｅｃｏｎｉｎｃｋ  Ｎ，Ｃａｍｐｉｏｎ  Ｇ，Ｄｅ  Ｋｉｍｐｅ  ＳＪ，Ｅａｇｌｅ  Ｍ，Ｇｕｇｌｉｅｒｉ  Ｍ，Ｈｏｏｄ  Ｓ，Ｌｉｅｆａａｒｄ  Ｌ，Ｌｏｕｒｂａｋｏｓ  Ａ，Ｍｏｒｇａｎ  Ａ，Ｎａｋｉｅｌｎｙ  Ｊ，Ｑｕａｒｃｏｏ  Ｎ，Ｒｉｃｏｔｔｉ  Ｖ，Ｒｏｌｆｅ  Ｋ，Ｓｅｒｖａｉｓ  Ｌ，Ｗａｒｄｅｌｌ  Ｃ，Ｗｉｌｓｏｎ  Ｒ，Ｗｒｉｇｈｔ  Ｐ，Ｋｒａｕｓ  ＪＥ．（２０１４）．Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｄｒｉｓａｐｅｒｓｅｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ（ＤＥＭＡＮＤ  ＩＩ）：ａｎ  ｅｘｐｌｏｒａｔｏｒｙ，ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ，ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｈａｓｅ  ２  ｓｔｕｄｙ．Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ．１３（１０）：９８７−９６．、およびＹｏｋｏｔａ  Ｔ，Ｎａｋａｍｕｒａ  Ａ，Ｎａｇａｔａ  Ｔ，Ｓａｉｔｏ  Ｔ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｍ，Ａｏｋｉ  Ｙ，Ｅｃｈｉｇｏｙａ  Ｙ，Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ  Ｔ，Ｈｏｆｆｍａｎ  ＥＰ，Ｔａｋｅｄａ  Ｓ．（２０１２）．Ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｖｉｖｏ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｅｘｏｎ  Ｓｋｉｐｐｉｎｇ  ｉｎ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ  Ｄｏｇｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｈｅｒ  ２２（５）：３０６−１５．）。
【００８４】
したがって、本発明の医薬組成物を、前述の本発明の用法・用量にしたがってヒト患者に投与することにより、ＤＭＤを治療することが可能である。
ここで、「治療」とは、患者におけるＤＭＤの症状を軽減することを意味する。
【００８５】
本発明の医薬組成物を本発明の用法用量に沿って用いた治療は、以下の（１）〜（６）からなる群より選択される少なくとも１つの効果を生じさせ得る（括弧内は平均±標準偏差を表す）：
（１）患者の骨格筋におけるジストロフィンタンパク質発現量の平均値が、ベースラインと比較して、２４週間の投与後に９倍以上に増加すること；
（２）立ち上がり時間（ＴＴＳＴＡＮＤ）から得られる速度の変化が、ベースラインと比較して、２４週間の投与後２５週時に−０．０５５回／秒以上または０．０２４±０．０７５秒以上であること；
（３）１０メートル走行／歩行時間（ＴＴＲＷ）から得られる速度の変化が、ベースラインと比較して、２４週間の投与後２５週時に−０．０２５メートル／秒以上または０．２２７±０．２５１メートル／秒以上であること；
（４）４段階段昇り時間（ＴＴＣＬＩＭＢ）から得られる速度の変化が、ベースラインと比較して、２４週間の投与後２５週時に−０．０６０回／秒以上または０．０３２±０．０８８回／秒以上であること；
（５）ノース・スター歩行能力評価（ＮＳＡＡ）のスコアの変化が、ベースラインと比較して、２４週間の投与後２５週時に−２．２スコア以上または０．８±２．９スコア以上であること；及び
（６）６分間歩行試験（６ＭＷＴ）の変化が、ベースラインと比較して、２４週間の投与後２５週時に−７．５メートル以上または２８．９±３６．３メートル以上であること。
【００８６】
上記（１）〜（６）において、「ベースライン」とは、未処置患者群における平均値を意味する。また（２）〜（６）における「変化」は、平均値の変化を意味する。
【００８７】
ある実施態様では、本発明の医薬組成物を、前述の本発明の用法・用量にしたがって、７〜９歳のデュシェンヌ型筋ジストロフィーのヒト患者に８４週間投与する場合において、以下の（７）〜（１２）からなる群より選択される少なくとも一つの効果が生じ得る：
（７）治療開始から第８５週までに、立ち上がり能力を喪失する患者が２０％未満であること；
（８）治療開始から第８５週までに、４段階段昇りが出来なくなる患者が１０％未満であること；
（９）治療開始から第８５週までに、自立歩行能力を喪失する患者が１０％未満であること；
（１０）治療開始から第８５週までに、１０メートル走行／歩行の速度に加齢による減少がみられないこと；
（１１）治療開始から第８５週までに、４段階段昇りの速度に加齢による減少がみられないこと；及び
（１２）治療開始から第８５週までに、立ち上がりの速度に加齢による減少がみられないこと。
上記（７）〜（１２）に係る効果は、治療を開始した週を第１週と定め、第１週〜第８５週まで、第１週〜第８０週まで、第１週〜第７５週まで、第１週〜第７０週まで、第１週〜第６５週まで、第１週〜第６０週までのいずれかの時点で生じてもよい。
【００８８】
ある実施態様では、本発明の医薬組成物を、前述の本発明の用法・用量にしたがって、１０〜１２歳のデュシェンヌ型筋ジストロフィーのヒト患者に投与することにより、以下の（１３）〜（１８）からなる群より選択される少なくとも一つの効果が生じる：
（１３）治療開始から第８５週までに、立ち上がり能力を喪失する患者が６０％未満であること；
（１４）治療開始から第８５週までに、４段階段昇りが出来なくなる患者が５０％未満であること；
（１５）治療開始から第８５週までに、自立歩行能力を喪失する患者が５０％未満であること；
及び
（１６）治療開始から第８５週までに、１０メートル走行／歩行の速度に加齢による減少がみられないこと。
（１７）治療開始から第８５週までに、４段階段昇りの速度が増加する時期がみられること；及び
（１８）治療開始から第８５週までに、立ち上がりの速度が増加する時期がみられること。
上記（１３）〜（１８）に係る効果は、治療を開始した週を第１週と定め、第１週〜第８５週まで、第１週〜第８０週まで、第１週〜第７５週まで、第１週〜第７０週まで、第１週〜第６５週まで、第１週〜第６０週までのいずれかの時点で生じてもよい。
【００８９】
すなわち、本発明の医薬組成物は、上記（１）〜（１８）に係る効果の少なくとも１つを生じ得る。
【００９０】
ＩＩ．第二の形態
本発明は、その第二の形態の形態において、
ヒトジストロフィン遺伝子の第５３番目のエクソンの５’末端から第３６〜５６番目のヌクレオチドからなる配列に相補的な塩基配列からなるアンチセンスオリゴマー又はその医薬的に許容可能な塩若しくは水和物を含有する医薬組成物を、
前記アンチセンスオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩又はその水和物を４０ｍｇ／ｋｇ〜８０ｍｇ／ｋｇで前記ヒト患者に週１回静脈内投与することを含む、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療方法（以下、「本発明の治療方法」という）を提供する。
本発明の治療方法に係る各構成の意味は、すでに項目「Ｉ．第一の形態」で本発明の医薬組成物に係る構成について説明したものと同一である。
また、本発明の治療方法は、項目「Ｉ．第一の形態」の副項目「５．治療理論」で説明した（１）〜（１８）に係る効果の少なくとも１つを生じ得る。
【００９１】
ＩＩＩ．第三の形態
さらに、本発明は、その第三の形態の形態において、
ヒト患者のデュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療方法に用いるためのヒトジストロフィン遺伝子の第５３番目のエクソンの５’末端から第３６〜５６番目のヌクレオチドからなる配列に相補的な塩基配列からなるアンチセンスオリゴマー又はその医薬的に許容可能な塩若しくは水和物であって、
前記アンチセンスオリゴマー又はその医薬的に許容可能な塩若しくは水和物が４０ｍｇ／ｋｇ〜８０ｍｇ／ｋｇで前記ヒト患者に週１回静脈内投与される、
前記アンチセンスオリゴマー又はその医薬的に許容可能な塩若しくは水和物（以下、「本発明の用途特定形態」という）を提供する。
本発明の用途特定形態に係る各構成の意味は、すでに項目「Ｉ．第一の形態」で本発明の医薬組成物に係る構成について説明したものと同一である。
また、本発明の用途特定形態は、項目「Ｉ．第一の形態」の副項目「５．治療理論」で説明した（１）〜（１８）に係る効果の少なくとも１つを生じ得る。
【００９２】
ＩＶ．第四の形態
さらに、本発明は、その第四の形態の形態において、
ヒト患者のデュシェンヌ型筋ジストロフィーを治療するための医薬組成物の製造のためのヒトジストロフィン遺伝子の第５３番目のエクソンの５’末端から第３６〜５６番目のヌクレオチドからなる配列に相補的な塩基配列からなるアンチセンスオリゴマー又はその医薬的に許容可能な塩若しくは水和物の使用であって、
前記アンチセンスオリゴマー又はその医薬的に許容可能な塩若しくは水和物が４０ｍｇ／ｋｇ〜８０ｍｇ／ｋｇで前記ヒト患者に週１回静脈内投与される、
前記使用（以下、「本発明のスイスタイプ使用」という）を提供する。
本発明のスイスタイプ使用に係る各構成の意味は、すでに項目「Ｉ．第一の形態」で本発明の医薬組成物に係る構成について説明したものと同一である。
また、本発明のスイスタイプ使用は、項目「Ｉ．第一の形態」の副項目「５．治療理論」で説明した（１）〜（１８）に係る効果の少なくとも１つを生じ得る。
【００９３】
以下に、実施例を掲げて、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は実施例に示される範囲に限定されるものではない。
【実施例】
【００９４】
［製造例］
（１）アミノメチルポリスチレン樹脂に担持された４−｛［（２Ｓ，６Ｒ）−６−（４−ベンズアミド−２−オキソピリミジン−１−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル］メトキシ｝−４−オキソブタン酸の製造
工程１：４−｛［（２Ｓ，６Ｒ）−６−（４−ベンズアミド−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル］メトキシ｝−４−オキソブタン酸の製造
アルゴン雰囲気下、Ｎ−｛１−［（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ヒドロキシメチル）−４−トリチルモルホリン−２−イル］−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル｝ベンズアミド２２．０ｇと４−ジメチルアミノピリジン（４−ＤＭＡＰ）７．０４ｇをジクロロメタン２６９ｍＬに懸濁し、無水コハク酸５．７６ｇを加え、室温で３時間撹拌した。反応液にメタノール４０ｍＬを加え、減圧濃縮した。残渣に酢酸エチルと０．５Ｍのリン酸二水素カリウム水溶液を用いて抽出操作を行った。得られた有機層を０．５Ｍのリン酸二水素カリウム水溶液、水、飽和食塩水の順で洗浄した。得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮し、２５．９ｇの目的物を得た。【００９５】
工程２：アミノメチルポリスチレン樹脂に担持された４−｛［（２Ｓ，６Ｒ）−６−（４−ベンズアミド−２−オキソピリミジン−１−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル］メトキシ｝−４−オキソブタン酸の製造
４−｛［（２Ｓ，６Ｒ）−６−（４−ベンズアミド−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル］メトキシ｝−４−オキソブタン酸２３．５ｇをピリジン（脱水）３３６ｍＬに溶解し、４−ＤＭＡＰ４．２８ｇ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩４０．３ｇを加えた。次いで、アミノメチルポリスチレン樹脂  １％ＤＶＢ架橋（東京化成工業社製、Ａ１５４３）２５．０ｇ、トリエチルアミン２４ｍＬを加え、室温で４日間振とうした。反応後、樹脂をろ取した。得られた樹脂をピリジン、メタノール、ジクロロメタンの順で洗浄し、減圧乾燥した。得られた樹脂にテトラヒドロフラン（脱水）１５０ｍＬ、無水酢酸１５ｍＬ、２，６−ルチジン１５ｍＬを加え、室温で２時間振とうした。樹脂をろ取し、ピリジン、メタノール、ジクロロメタンの順で洗浄し、減圧乾燥し、３３．７ｇの目的物を得た。
当該目的物のローディング量は、公知の方法を用いて、樹脂１ｇ当たりのトリチルのモル量を４０９ｎｍにおけるＵＶ吸光度を測定することにより決定した。樹脂のローディング量は、３９７．４μｍｏｌ／ｇであった。【００９６】
ＵＶ測定条件
機器：Ｕ−２９１０（日立製作所）
溶媒：メタンスルホン酸
波長：２６５ｎｍ
ε値：４５０００【００９７】
（２）ＰＭＯ  Ｎｏ．８の製造
ＰＭＯ  Ｎｏ．８は、エクソン５３中の「第３６〜５６番目」を標的配列としり、５’末端の基は「基（３）」であり、塩基部分の配列は配列番号３で表される。
アミノメチルポリスチレン樹脂に担持された４−｛［（２Ｓ，６Ｒ）−６−（４−ベンズアミド−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル］メトキシ｝−４−オキソブタン酸（参考例１）２ｇ（８００μｍｏｌ）を反応槽に移し入れ、ジクロロメタン３０ｍＬを添加し、３０分間静置した。さらに、ジクロロメタン３０ｍＬで２回洗浄した後、下記合成サイクルを開始した。標記化合物の塩基配列になるよう、各サイクルにおいて所望のモルホリノモノマー化合物を添加した。【００９８】
【表３】
2020004675.tif 000014
なお、デブロック溶液としては、トリフルオロ酢酸（２当量）とトリエチルアミン（１当量）の混合物を３％（ｗ／ｖ）になるように、１％（ｖ／ｖ）のエタノールと１０％（ｖ／ｖ）の２，２，２−トリフルオロエタノールを含有するジクロロメタン溶液で溶解したものを用いた。中和溶液としては、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを５％（ｖ／ｖ）になるように、２５％（ｖ／ｖ）の２−プロパノールを含有するジクロロメタン溶液で溶解したものを用いた。カップリング溶液Ａとしては、モルホリノモノマー化合物を０．１５Ｍになるように、１０％（ｖ／ｖ）のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを含有する１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノンで溶解したものを用いた。カップリング溶液Ｂとしては、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを１０％（ｖ／ｖ）になるように、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノンで溶解したものを用いた。キャッピング溶液としては、ジクロロメタンに対して２０％（ｖ／ｖ）の無水酢酸と３０％（ｖ／ｖ）の２，６−ルチジンを溶解したものを使用した。【００９９】
上記で合成したＰＭＯが担持されたアミノメチルポリスチレン樹脂を反応容器から回収し、２時間以上室温で減圧乾燥した。乾燥したアミノメチルポリスチレン樹脂に担持されたＰＭＯを反応容器に入れ、２８％アンモニア水−エタノール（１／４）２００ｍＬを加え、５５℃で１５時間撹拌した。アミノメチルポリスチレン樹脂をろ別し、水−エタノール（１／４）５０ｍＬで洗浄した。得られたろ液を減圧濃縮した。得られた残渣を２０ｍＭの酢酸−トリエチルアミン緩衝液（ＴＥＡＡ緩衝液）とアセトニトリルの混合溶媒（４／１）１００ｍＬに溶解し、メンブレンフィルターでろ過した。得られたろ液を逆相ＨＰＬＣにて精製した。使用した条件は、以下のとおりである。【０１００】
【表４】
2020004675.tif 000015
各フラクションを分析して、アセトニトリル−水（１／１）１００ｍＬで目的物を回収し、エタノール２００ｍＬを添加し、減圧濃縮した。さらに、減圧乾燥し、白色固体を得た。得られた固体に１０ｍＭのリン酸水溶液３００ｍＬを加え、懸濁させた。２Ｍのリン酸水溶液１０ｍＬを加え、１５分間攪拌した。さらに、２Ｍの水酸化ナトリウム水溶液１５ｍＬを加えて中和した。さらに、２Ｍの水酸化ナトリウム水溶液１５ｍＬを加えてアルカリ性とし、メンブレンフィルター（０．４５μｍ）でろ過した。１０ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液１００ｍＬで洗いこみ、水溶液として目的物を得た。
得られた目的物を含有する水溶液を陰イオン交換樹脂カラムで精製した。使用した条件は下記のとおりである。【０１０１】
【表５】
2020004675.tif 000016
各フラクションを分析（ＨＰＬＣ）し、目的物を水溶液として得た。得られた水溶液に０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）２２５ｍＬを添加し中和した。メンブレンフィルター（０．４５μｍ）でろ過した。次いで、下記条件で限外ろ過を行い脱塩した。【０１０２】
【表６】
2020004675.tif 000017
ろ液を濃縮し、約２５０ｍＬの水溶液を得た。得られた水溶液をメンブレンフィルター（０．４５μｍ）でろ過した。得られた水溶液を凍結乾燥して、白色綿状固体として１．５ｇの目的化合物を得た。
ＥＳＩ―ＴＯＦ―ＭＳ  計算値：６９２４．８２
測定値：６９２３．５４【０１０３】
［実施例１］米国第２相試験
第ＩＩ相用量設定試験「ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１−２０１試験」が２０１６年１２月に「ＩＮＤ１２７４７４」のもとに開始された。本試験はＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ認識番号「ＮＣＴ０２７４０９７２」として「Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  Ｄｏｓｅ  Ｆｉｎｄｉｎｇ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１  ｉｎ  Ｂｏｙｓ  Ｗｉｔｈ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  Ｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ（ＤＭＤ）」の表題のもとに行われた。本試験の治験実施計画書は、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ｓｔｕｄｙ／ＮＣＴ０２７４０９７２から入手可能であり、その内容の全体が参考として援用される。本試験は、エクソン５３スキッピングによる治療に適したデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）患者において、点滴静注として送達される高用量（８０ｍｇ／ｋｇ）および低用量（４０ｍｇ／ｋｇ）のＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１（Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ）の安全性を評価することを主な目的とした。また、忍容性、筋肉機能および筋力、薬物動態、および薬力学がさらなる目的として含まれた。【０１０４】
より具体的には、第ＩＩ相多施設２期間無作為化プラセボ対照用量設定試験であり、ＤＭＤの４歳以上１０歳未満の外来男児にＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１（Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ）を週１回２４週間点滴投与した。２つの用量レベルコホートを含めた。期間１は、二重盲検様式で試験した。患者は無作為にＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１（Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ）またはプラセボを、参加の最初の４週間（期間１）週１回点滴静注され、次いでＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１（Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ）を、５〜２４週間（２０週間の実薬治療−期間２）点滴静注された。４０ｍｇ／ｋｇ用量コホートの期間１からの安全性データの分析は、８０ｍｇ／ｋｇ用量コホートに患者を登録する前に完了した。２４週間の試験を完了した患者は、非盲検延長試験を受けることができた。【０１０５】
臨床的有効性は、定期的に予定された試験来院時に評価した。すべての患者は、ベースライン時に二頭筋生検を受け、２４週目に２回目の筋生検を受けた。【０１０６】
安全性は、有害事象（ＡＥ）、血液および尿の実験室試験、心電図（ＥＣＧ）、バイタルサイン、および試験全体にわたる身体検査を収集することによって評価した。ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１（Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ）の薬物動態を評価するために、４回の試験来院時に連続血液サンプルを採取した。【０１０７】
＜治験の種類：介入（臨床試験）＞
・実際の登録：１６人の参加者。
・割付：無作為化。
・介入モデル：並列割り当て。
・マスキング：Ｑｕａｄｒｕｐｌｅ（参加者、ケア提供者、治験責任医師、アウトカム評価者）。
・主要目的：治療。
・実際の試験開始日：２０１６年１２月。
・初回完了日：２０１８年３月。【０１０８】
＜患者群と介入＞
・実験：ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１（Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ）  ４０ｍｇ／ｋｇ
エクソン５３スキッピングによる治療に適した遺伝子欠失を有するＤＭＤが確認された６人の患者に、ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１（Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ）  ４０ｍｇ／ｋｇ用量を週１回２４週間点滴静注した。
・実験：ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１（Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ）  ８０ｍｇ／ｋｇ
エクソン５３スキッピングによる治療に適した遺伝子欠失を有するＤＭＤが確認された６人の患者に、ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１（Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ）  ８０ｍｇ／ｋｇ用量を週１回２４週間点滴静注した。
・プラセボ比較剤：プラセボ
各用量群の２人または３人の患者に、４週間、週に１回、点滴静注としてプラセボを投与し、その後、２０週間のオープンラベル処置を行った。【０１０９】
＜選択基準＞
・４歳以上、１０歳未満の男性。
・エクソン５３のスキッピング治療によるジストロフィンｍＲＮＡリーディングフレームの回復に適したジストロフィン遺伝子におけるＤＭＤ突然変異（単数または複数）を有することが確認されていること
・補助装置なしで独立して歩くことができること
・立ち上がるまでの時間、走る／歩くまでの時間、および評価を上昇させるまでの時間
・グルココルチコイドの少なくとも３ヵ月間の安定投与【０１１０】
＜除外基準＞
・治験薬の初回投与前４週間以内の急性疾患。
・症候性心筋症の証拠。（調査時の無症候性心臓異常は除外せず）
・薬物療法に対する重度のアレルギーまたは過敏症
・治験責任医師の意見において、治験への参加を妨げる重篤な行動上または認知上の問題
・治験責任医師の意見による、安全性に影響を及ぼす可能性があるか、治療および追跡調査が正しく完了する見込みが低いか、または治験結果の評価を損うような、以前または進行中の病状、病歴、身体所見または臨床検査値異常
・現在または治験薬投与開始前３ヵ月以内に他の治験薬の服用。
・ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１（Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ）の最初の予想される投与前３ヶ月以内に手術を受けたか、または試験期間に外科手術を予定していた患者
・以前に本試験に参加した患者又はＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１（Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ）が投与されて以前に他の試験に参加していた患者【０１１１】
再度要約すると、エクソン５３スキッピングによる治療に適し、かつ３ヶ月以上のグルココルチコイド投与において安定な１６人の男性患者に４０ｍｇ／ｋｇ／週および８０ｍｇ／ｋｇ／週用量を試験する、２４週間の２コホート試験であった。各コホートのプラセボ群患者は、有害事象（安全性アウトカム）の対照として最初の４週間の無作為化期間を受けた。次いで、プラセボ処置患者および活性処置患者の両方を、２０週間の処置期間にわたって試験を継続させた。ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１−２０１試験では、ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１（Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ）注射液を４０ｍｇ／ｋｇ／週の低用量および８０ｍｇ／ｋｇ／週の高用量の２つの用量コホートで２０〜２４週間投与し、ジストロフィンタンパク質のｄｅ  ｎｏｖｏ発現に及ぼす影響を評価した（図１を参照）。試験ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１−２０１の目標は、ウェスタンブロット（ＷＢ）法（プライマリーサロゲートエンドポイント）を用いて測定した骨格筋におけるジストロフィンタンパク質のｄｅ  ｎｏｖｏ発現に基づいて、安全かつ有効な用量を同定することであった。セカンダリーサロゲートエンドポイントには、ｄｅ  ｎｏｖｏジストロフィンタンパク質発現の免疫蛍光（ＩＦ）染色および質量分析検出、ならびにｄｅ  ｎｏｖｏジストロフィンｍＲＮＡレベルのＲＴ−ＰＣＲ検出が含まれた。第２相試験のセカンダリーエンドポイントとして、いくつかの機能的なエンドポイントも含められた。試験ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１−２０１のエンドポイントは以下のとおりである：【０１１２】
＜プライマリーエンドポイント＞
・ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１（Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ）注射液の低用量（４０ｍｇ／ｋｇ／週）および高用量（８０ｍｇ／ｋｇ／週）静脈内（ＩＶ）投与の安全性および忍容性
・治療の２０〜２４週間後に筋肉におけるジストロフィンタンパク質の誘導をウェスタンブロットによって測定し、これをＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１（Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ）注射液の低および高ＩＶ用量の効果とした。【０１１３】
図１において、下半分に示した「高用量：８０ｍｇ／ｋｇ／週」の時系列は下半分に示した「低用量：４０ｍｇ／ｋｇ／週」の時系列から後の時間に相殺されており、低用量投与で安全性が確認された後にのみ高用量投与が開始されたことを示している。【０１１４】
測定内容：
１．ｍＲＮＡ分析のためのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ‐ＰＣＲ）によって測定した筋肉におけるジストロフィンｍＲＮＡの誘導（タイムフレーム２０〜２４週の処置）
ＲＴ−ＰＣＲはジストロフィンＲＮＡの変化したスプライシングを測定する。この方法において、ｍＲＮＡは凍結筋生検から単離され、ｃＤＮＡに逆転写される。ＰＣＲプライマーはジストロフィンｍＲＮＡ上のエクソン５３部位に隣接して設計される。スプライシングされたジストロフィンｍＲＮＡの特定のバージョンに対応するＲＴ−ＰＣＲバンドを、ゲル電気泳動によって可視化し、異なるｍＲＮＡアイソフォームの量を比較する。薬剤がＲＮＡ標的にうまく結合する場合、エクソン５３は得られるｍＲＮＡ転写物から除外される。
２．タンパク質分析のためのウェスタンブロットによって測定される筋肉で誘導されたジストロフィンタンパク質。（タイムフレーム：２０〜２４週間の処置）【０１１５】
主要な生化学的結果の測定は、イムノブロット（ウェスタンブロット）によるジストロフィン産生量の薬物誘発性増加の測定であり。ジストロフィンイムノブロットは可溶化された筋肉生検凍結切片を使用し、タンパク質は、ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、ニトロセルロースへのエレクトロブロッティング、次いで、ジストロフィンタンパク質を検出するための抗体とのニトロセルロースのインキュベーションを経て、分子量によって分画される。次いで、患者の生検からのジストロフィンについてのイムノブロットシグナルを、同じゲル（混合ＤＭＤおよび正常対照）上のジストロフィンの標準曲線のシグナルと比較する。これにより、筋肉中のジストロフィン含量の半定量的評価が提供される。【０１１６】
米国第２相試験：有効性
アウトカム測定１
アウトカム測定１（すなわち、ｄｅ  ｎｏｖｏジストロフィンｍＲＮＡレベルのＲＴ−ＰＣＲ検出）について得られた結果は、以下のとおりである。【０１１７】
【表７】
2020004675.tif 000018
【０１１８】
アウトカム測定２
アウトカム測定２（すなわち、ウェスタンブロット法を用いた骨格筋におけるｄｅ  ｎｏｖｏジストロフィンタンパク質発現量の測定）について得られた結果は、ベースラインの平均値と治療中の平均値との間で比較して、ベースラインから１９．０倍の増加（４０ｍｇ／ｋｇ／週で２４週間）および９．８倍の増加（８０ｍｇ／ｋｇ／週で２４週間）、ならびに各患者の増加率の平均値として計算して、２７．２倍の増加（４０および８０ｍｇ／ｋｇ／週で２４週間）を示した。得られたデータを以下の表８および図２に要約する。【０１１９】
【表８】
2020004675.tif 000019
【０１２０】
ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１（Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ）によるジストロフィン回復の程度（４０または８０ｍｇ／ｋｇ／週、２４週）は、２０１６年にサレプタ・セラピューティクス社によって発売されたエクソン５１スキッピングによる治療に適したＥｘｏｎｄｙｓ５１（登録商標）（ｅｔｅｐｌｉｒｓｅｎ）（３０ｍｇ／ｋｇ／週、４８および１８０週）について以前に報告された回復の程度と比べて少なく見積もっても約３〜７倍または８．８〜９．７倍高かった。具体的には、比較のために、Ｅｘｏｎｄｙｓ５１（登録商標）（ｅｔｅｐｌｉｒｓｅｎ）の対応するウェスタンブロットデータを以下に示す。ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１（Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ）を２４週間投与された１６人の患者のうち３人では、ジストロフィンレベルはベースラインから１０％を超えて増加していた。ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１（Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ）を２４週間投与した患者１６例中１２例では、ジストロフィン値の３％以上の上昇が認められた。ホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎ）らは、「ベッカー型ジストロフィーおよび異常なジストロフィン表現型のデュシェンヌ（正常レベルのジストロフィンの３％未満）を有する患者の中で、臨床表現型の重症度とジストロフィン評価の結果との間に明確な補正があった」と報告している（Ｅｒｉｃ  Ｐ．Ｈｏｆｆｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｉｎ  Ｍｕｓｃｌｅ−Ｂｉｏｐｓｙ  Ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ’ｓ  ｏｆ  Ｂｅｃｋｅｒ’ｓ  Ｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．”Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３１８：１３６３−１３６８（１９８８））。【０１２１】
・ｅｔｅｐｌｉｒｓｅｎ  ウェスタンブロッティング：２．８倍増加（０．１６％から０．４４％への変化（３０ｍｇ／ｋｇ／週、４８週間））。（「評価可能な結果が得られた１２例において、ジストロフィン濃度は治療前では健康被験者のジストロフィン濃度の０．１６％±０．１２％（平均±標準偏差）であり、ＥＸＯＮＤＹＳ５１投与４８週間後では０．４４％±０．４３％（ｐ＜０．０５）であった」）
（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／ＡｄｖｉｓｏｒｙＣｏｍｍｉｔｔｅｅｓ／ＣｏｍｍｉｔｔｅｅｓＭｅｅｔｉｎｇＭａｔｅｒｉａｌｓ／ＰｅｄｉａｔｒｉｃＡｄｖｉｓｏｒｙＣｏｍｍｉｔｔｅｅ／ＵＣＭ５５７９１７．ｐｄｆより入手可能）
・ｅｔｅｐｌｉｒｓｅｎ  ウェスタンブロッティング：３．１倍（０．３％から０．９３％への変化）（３０ｍｇ／ｋｇ／週、１８０週間）。（「短指伸筋（ＥＤＢ）の生検からのウェスタンブロットではジストロフィンレベルは平均して正常値の約０．３％でしたが、その範囲は検出不能から正常値の約１％以上までであった。」「本出願人が使用した最も正確な定量的方法であるウェスタンブロット法では、ｅｔｅｐｌｉｒｓｅｎ処置から約３．５年後の平均ジストロフィンレベルは、健康被験者の０．９３％±０．８４％であった（平均±標準偏差））
（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／ａｄｖｉｓｏｒｙｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓ／ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓｍｅｅｔｉｎｇｍａｔｅｒｉａｌｓ／ｄｒｕｇｓ／ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌａｎｄｃｅｎｔｒａｌｎｅｒｖｏｕｓｓｙｓｔｅｍｄｒｕｇｓａｄｖｉｓｏｒｙｃｏｍｍｉｔｔｅｅ／ｕｃｍ４９７０６３．ｐｄｆ．より入手可能）
・ｅｔｅｐｌｉｒｓｅｎ  ウェスタンブロット：１８０週で０．９３％、範囲は０％〜２．４７％（３０ｍｇ／ｋｇ／週、１８０週）であった（Ｋｅｎｊｉ  Ｒｏｗｅｌ  Ｑ  Ｌｉｍ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｔｅｐｌｉｒｓｅｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．”Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．Ｄｅｖｅｌ．Ｔｈｅｒ．，１１：５３３−５４５（２０１７）
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｍｃ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ＰＭＣ５３３８８４８／）。
・さらに、「ｅｔｅｐｌｉｒｓｅｎについて１８０週目に実施された試験では、３０ｍｇ／ｋｇと５０ｍｇ／ｋｇの週投与量によるジストロフィン産生量に対する用量反応に差は見られなかった。このことはこのアプローチが他のエクソンについては有効ではない可能性を示唆する」（Ｋｅｎｊｉ  Ｒｏｗｅｌ  Ｑ  Ｌｉｍ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｔｅｐｌｉｒｓｅｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．”Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．Ｄｅｖｅｌ．Ｔｈｅｒ．，１１：５３３−５４５（２０１７）  ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｍｃ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ＰＭＣ５３３８８４８／）【０１２２】
エクソン５３スキッピングによる治療に適したＤＭＤ患者用のモルホリノオリゴヌクレオチドであるＳＲＰ−４０５３（ｇｏｌｏｄｉｒｓｅｎ；Ｓａｒｅｐｔａによる）との比較においても、観察されるジストロフィンレベルの増加量において、Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎではより優れた効果が得られることが示された。具体的には、比較目的のために、Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎの２４週間の投与ではなく、４８週間の投与後に得られたＳＲＰ−４０５３（ｇｏｌｏｄｉｒｓｅｎ）の対応するウェスタンブロットデータを以下に示す。【０１２３】
・ｇｏｌｏｄｉｒｓｅｎ  ウェスタンブロット：０．０９５％から１．０１９％への変化（４８週間３０ｍｇ／ｋｇ）。（「ジストロフィンタンパク質の平均増加量は、ウェスタンブロット測定（本試験の生物学的プライマリーエンドポイント）において、正常値の０．０９５％（ｐ＜０．００１）の平均ベースラインと比較して、正常値の１．０１９％に増加した。これは、ベースラインから１０．７倍の増加を表す。」）
（ｈｔｔｐ：／／ｉｎｖｅｓｔｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ．ｓａｒｅｐｔａ．ｃｏｍ／ｎｅｗｓ−ｒｅｌｅａｓｅｓ／ｎｅｗｓ−ｒｅｌｅａｓｅ−ｄｅｔａｉｌｓ／ｓａｒｅｐｔａ−ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ−ａｎｎｏｕｎｃｅｓ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｒｅｓｕｌｔｓ−ｉｔｓ−ｓｔｕｄｙ．より入手可能）
・ｇｏｌｏｄｉｒｓｅｎ  ウェスタンブロット：最小０．０９％、最大４．３０％（３０ｍｇ／ｋｇ／週で４８週間。２５例中２例で３％以上のジストロフィン値の上昇が認められた（２２ｎｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ（３−７  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２０１７，Ｓｔ．Ｍａｌｏ，Ｆｒａｎｃｅ），
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｏｏｇｌｅ．ｃｏ．ｊｐ／ｕｒｌ？ｓａ＝ｔ＆ｓｏｕｒｃｅ＝ｗｅｂ＆ｃｄ＝２＆ｖｅｄ＝２ａｈＵＫＥｗｉｄ７ＺＴＱ９ＯｒｂＡｈＵＥＴＬｗＫＨＸ３ｘＤｋ８ＱＦｊＡＢｅｇＱＩＡＲＡＢ＆ｕｒｌ＝ｈｔｔｐ％３Ａ％２Ｆ％２Ｆｉｎｖｅｓｔｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ．ｓａｒｅｐｔａ．ｃｏｍ％２Ｆｓｔａｔｉｃ−ｆｉｌｅｓ％２Ｆ６４ｄ８ｄ８９７−２ｅ４ａ−４１１９−８０ｂ４−１１５ｃｂａｅ１７９９３＆ｕｓｇ＝ＡＯｖＶａｗ１Ａｍｈ１Ｍｑ１ＶａｕｖＬｋＰｖＹＷｆＶｄＲ）。【０１２４】
米国第２相試験：安全性
ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１（Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ）を高用量および低用量（４０ｍｇ／ｋｇ／週および８０ｍｇ／ｋｇ／週）を投与したＤＭＤ患者１６例の安全性データについては、試験の実施、データの質、または参加者の安全性に大きな懸念はなかった。３６週間の時点で治療を中止した参加者はいなかった。具体的には、重篤な有害事象はなく、中止に至った有害事象もなく、薬剤関連有害事象もなかった。すべての有害事象は軽度または中等度であった。【０１２５】
［実施例２］米国／カナダの第２相試験
第ＩＩ相用量設定試験「ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１−２０１試験」が２０１６年１２月に「ＩＮＤ１２７４７４」のもとに開始された。本試験はＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ認識番号「ＮＣＴ０２７４０９７２」として「Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  Ｄｏｓｅ  Ｆｉｎｄｉｎｇ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１  ｉｎ  Ｂｏｙｓ  Ｗｉｔｈ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  Ｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ（ＤＭＤ）」の表題のもとに行われた。本試験の治験実施計画書は、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ｓｔｕｄｙ／ＮＣＴ０２７４０９７２で入手可能であり、その内容の全体が参考として援用される。本試験は、エクソン５３スキッピングによる治療に適したデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）患者において、点滴静注として送達される高用量（８０ｍｇ／ｋｇ）および低用量（４０ｍｇ／ｋｇ）のＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１（Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ）の安全性を評価することを主な目的とした。また、忍容性、筋肉機能および筋力、薬物動態、および薬力学が更なる目的として含まれた。
より具体的には、第ＩＩ相多施設２期間無作為化プラセボ対照用量設定試験であり、ＤＭＤの４歳以上１０歳未満の外来男児にＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１（Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ）を週１回２４週間点滴投与した。２つの用量レベルコホートを含めた。期間１は、二重盲検様式で試験した。患者は無作為にＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１（Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ）またはプラセボを、参加の最初の４週間（期間１）週１回点滴静注され、次いでＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１（Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ）を、５〜２４週間（２０週間の実薬治療−期間２）点滴静注された。４０ｍｇ／ｋｇ用量コホートの期間１からの安全性データの分析は、８０ｍｇ／ｋｇ用量コホートに患者を登録する前に完了した。２４週間の試験を完了した患者は、非盲検延長試験を受けることができた。【０１２６】
臨床的有効性は、定期的に予定された試験来院時に評価した。すべての患者は、ベースライン時に二頭筋生検を受け、２４週目に２回目の筋生検を受けた。【０１２７】
安全性は、有害事象（ＡＥ）、血液および尿の実験室試験、心電図（ＥＣＧ）、バイタルサイン、および試験全体にわたる身体検査を収集することによって評価した。ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１（Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ）の薬物動態を評価するために、４回の試験来院時に連続血液サンプルを採取した。【０１２８】
＜治験の種類：介入（臨床試験）＞
・実際の登録：１６人の参加者。
・割付：無作為化。
・介入モデル：並列割り当て。
・マスキング：Ｑｕａｄｒｕｐｌｅ（参加者、ケア提供者、治験責任医師、アウトカム評価者）。
・主な目的：治療。
・実際の試験開始日：２０１６年１２月。
・初回完了日：２０１８年３月。【０１２９】
＜患者群と介入＞
・実験：ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１（Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ）  ４０ｍｇ／ｋｇ
エクソン５３スキッピングによる治療に適した遺伝子欠失を有するＤＭＤが確認された６人の患者に、ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１（Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ）  ４０ｍｇ／ｋｇ用量を週１回２４週間点滴静注した。
・実験：ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１（Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ）  ８０ｍｇ／ｋｇ
エクソン５３スキッピングによる治療に適した遺伝子欠失を有するＤＭＤが確認された５人の患者に、ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１（Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ）  ８０ｍｇ／ｋｇ用量を週１回２４週間点滴静注した。
・プラセボ比較剤：プラセボ
４０ｍｇ／ｋｇ用量群の２人の患者および８０ｍｇ／ｋｇ用量群の３人の患者に、４週間、週に１回、点滴静注としてプラセボを投与し、その後、２０週間のオープンラベル処置を行った。【０１３０】
＜選択基準＞
・同意時に４歳以上であり、初回点滴静注時に１０歳未満の男性。
・エクソン５３のスキッピング治療によるジストロフィンｍＲＮＡリーディングフレームの回復に適したジストロフィン遺伝子におけるＤＭＤ突然変異（単数または複数）を有することが確認されていること。
・補助装置なしで独立して歩くことができること
・運動機能評価者が立ち上がり時間（ＴＳＴＡＮＤ）、１０メートル走行／歩行時間（ＴＴＲＷ）、および４段階段昇り時間（ＴＴＣＬＩＭＢ）の評価を実施可能と判断した患者
・グルココルチコイドの少なくとも３ヵ月間の安定投与【０１３１】
＜除外基準＞
・治験薬の初回投与前４週間以内の急性疾患。
・症候性心筋症の証拠（調査時の無症候性心臓異常は除外せず）
・薬物療法に対する重度のアレルギーまたは過敏症
・治験責任医師の意見において、治験への参加を妨げる重篤な行動上または認知上の問題
・治験責任医師の意見による、安全性に影響を及ぼす可能性があるか、治療および追跡調査が正しく完了する見込みが低いか、または治験結果の評価を損うような、以前または進行中の病状、病歴、身体所見または臨床検査値異
・現在または治験薬投与開始前３ヵ月以内に他の治験薬の服用
・ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１（Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ）の最初の予想される投与前３ヶ月以内に手術を受けたか、または試験期間に外科手術を予定していた患者
・以前に本試験に参加した患者又はＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１（Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ）が投与された他の試験に参加していた患者【０１３２】
再度要約すると、エクソン５３スキッピング治療に適し、かつ３ヶ月以上のグルココルチコイド投与において安定な１６人の男性患者に４０ｍｇ／ｋｇ／週および８０ｍｇ／ｋｇ／週用量を試験する、２４週間の２コホート試験であった。各コホートのプラセボ群患者は、有害事象（安全性アウトカム）の対照として最初の４週間の無作為化期間を受けた。次いで、プラセボ処置患者および活性処置患者の両方を、２０週間の処置期間にわたって試験を継続させた。ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１−２０１試験では、ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１（Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ）注射液２５０ｍｇを４０ｍｇ／ｋｇ／週の低用量および８０ｍｇ／ｋｇ／週の高用量の２つの用量コホートで２０〜２４週間投与し、ジストロフィンタンパク質のｄｅ  ｎｏｖｏ発現に及ぼす影響を評価した（図３を参照）。試験ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１−２０１の目標は、ウェスタンブロット（ＷＢ）法（プライリーサロゲートエンドポイント）を用いて測定した骨格筋におけるジストロフィンタンパク質のｄｅ  ｎｏｖｏ発現に基づいて、安全かつ有効な用量を同定することであった。セカンダリーサロゲートエンドポイントには、ｄｅ  ｎｏｖｏジストロフィンタンパク質発現の免疫蛍光（ＩＦ）染色および質量分析検出、ならびにｄｅ  ｎｏｖｏジストロフィンｍＲＮＡレベルのＲＴ−ＰＣＲ検出が含まれた。第２相試験のセカンダリーエンドポイントとして、いくつかの運動機能的なエンドポイントも含められた。試験ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１−２０１のエンドポイントは以下のとおりである：【０１３３】
＜プライマリーエンドポイント＞
・ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１（Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ）注射液２５０ｍｇの低用量（４０ｍｇ／ｋｇ／週）および高用量（８０ｍｇ／ｋｇ／週）静脈内（ＩＶ）投与の安全性および忍容性
・治療の２０〜２４週間後に筋肉におけるジストロフィンタンパク質の誘導をウェスタンブロットによって測定し、これをＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１（Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ）注射液２５０ｍｇの低および高ＩＶ用量の効果とした。
・ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１（Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ）の血中薬物濃度【０１３４】
＜セカンダリーエンドポイント＞
・ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１（Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ）注射液２５０ｍｇの低用量および高用量静注が、２０〜２４週間の治療後に筋肉中のジストロフィンｍＲＮＡおよびタンパク質の誘導に及ぼす効果を、ＲＴ−ＰＣＲ法によるｍＲＮＡ分析、並びに免疫蛍光染色及び質量分析法によるタンパク質分析で測定することにより評価する。
・ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１（Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ）注射液２５０ｍｇの低用量および高用量の静脈内投与が、２０〜２４週間の治療後に筋力、可動性、および機能的運動能力に及ぼす影響を調べるために、立ち上がり時間（ＴＳＴＡＮＤ）、１０メートル走行／歩行時間（ＴＴＲＷ）、４段階段昇り時間（ＴＴＣＬＩＭＢ）、ノース・スター歩行能力評価（ＮＳＡＡ）、６分間歩行試験（６ＭＷＴ）、および定量的筋肉試験（ＱＭＴ）を対応する自然歴対照群との比較において測定した。【０１３５】
図３において、下半分に示した「高用量：８０ｍｇ／ｋｇ／週」の時系列は上半分に示した「低用量：４０ｍｇ／ｋｇ／週」の時系列から後の時間に相殺されており、低用量投与で安全性が確認された後にのみ高用量投与が開始されたことを示している。【０１３６】
米国／カナダ第２相試験セカンダリーエンドポイント：外部の無治療自然歴群（国際神経筋研究グループ（ＣＩＮＲＧ）のデュシェンヌ型の自然歴の研究（ＤＮＨＳ））との比較における時間機能検査
米国／カナダ第２相試験ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１−２０１に登録された患者を、ベースライン、１３週目、および２５週目に筋肉機能について臨床的に評価した。本試験の目的において４週間のプラセボ期間について補正は行っていない。これらの評価にはいくつかのタイプの時間機能検査が含まれた：仰臥位からの立ち上がり時間（ＴＴＳＴＡＮＤ）；１０メートル走行／歩行時間（ＴＴＲＷ）；４段階段昇り時間（ＴＴＣＬＩＭＢ）；６分間歩行試験（６ＭＷＴ）；およびノース・スター歩行能力評価（ＮＳＡＡ）。経時変化を、ＣＩＮＲＧ  ＤＮＨＳで試験した対応する患者における疾患軌跡と比較した。【０１３７】
ＣＩＮＲＧ  ＤＮＨＳとは４４０人のＤＭＤ患者のそれぞれを数年にわたって追跡した試験である（トータルの試験期間は約１０年間）。ＣＩＮＲＧは国際神経筋研究グループ（Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｒｏｕｐ）を指し、「神経筋病患者とその家族の生活に良い影響を与えたいという共通の目標を共有する学術・研究センターの医学・科学研究者のコンソーシアム」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｉｎｒｇｒｅｓｅａｒｃｈ．ｏｒｇ／）である。ＤＮＨＳはデュシェンヌ型の自然歴の研究（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｎａｔｕｒａｌ  Ｈｉｓｔｏｒｙ  Ｓｔｕｄｙ）を表し、ＣＩＮＲＧ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｉｎｒｇｒｅｓｅａｒｃｈ．ｏｒｇ／Ｄｕｃｈｅｎｎｅ−Ｎａｔｕｒａｌ−ｈｉｓｔｏｒｙ／  から）によって確立された「Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ（ＤＭＤ）における今日までの最大のプロスペクティブ多施設自然歴研究」である（ＭｃＤｏｎａｌｄ  ＣＭ，Ｈｅｎｒｉｃｓｏｎ  ＥＫ，Ａｂｒｅｓｃｈ  ＲＴ，Ｈａｎ  ＪＪ，Ｅｓｃｏｌａｒ  ＤＭ，Ｆｌｏｒｅｎｃｅ  ＪＭ，Ｄｕｏｎｇ  Ｔ，Ａｒｒｉｅｔａ  Ａ，Ｃｌｅｍｅｎｓ  ＰＲ，Ｈｏｆｆｍａｎ  ＥＰ，ａｎｄ  Ｃｎａａｎ  Ａ，“ＣＩＮＲＧ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ．Ｔｈｅ  ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｇｒｏｕｐ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｎａｔｕｒａｌ  ｈｉｓｔｏｒｙ  ｓｔｕｄｙ−ａｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｒａ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｕｓｅｄ，”Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ．，４８（１），３２−５４（２０１３）．、Ｈｅｎｒｉｃｓｏｎ  ＥＫ，Ａｂｒｅｓｃｈ  ＲＴ，Ｃｎａａｎ  Ａ，Ｈｕ  Ｆ，Ｄｕｏｎｇ  Ｔ，Ａｒｒｉｅｔａ  Ａ，Ｈａｎ  Ｊ，Ｅｓｃｏｌａｒ  ＤＭ，Ｆｌｏｒｅｎｃｅ  ＪＭ，Ｃｌｅｍｅｎｓ  ＰＲ，Ｈｏｆｆｍａｎ  ＥＰ，ａｎｄ  ＭｃＤｏｎａｌｄ  ＣＭ，“ＣＩＮＲＧ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ．Ｔｈｅ  ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｇｒｏｕｐ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｎａｔｕｒａｌ  ｈｉｓｔｏｒｙ  ｓｔｕｄｙ：ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｐｒｅｓｅｒｖｅｓ  ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ｍｅａｎｉｎｇｆｕｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｍｉｌｅｓｔｏｎｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｒａｔｅ  ｏｆ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｓ  ｍｅａｓｕｒｅｄ  ｂｙ  ｍａｎｕａｌ  ｍｕｓｃｌｅ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｃｏｍｍｏｎｌｙ  ｕｓｅｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｍｅａｓｕｒｅｓ，”Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ．，４８（１），５５−６７（２０１３）．およびＭｃＤｏｎａｌｄ  ＣＭ，Ｈｅｎｒｉｃｓｏｎ  ＥＫ，Ａｂｒｅｓｃｈ  ＲＴ，Ｄｕｏｎｇ  Ｔ，Ｊｏｙｃｅ  ＮＣ，Ｈｕ  Ｆ，Ｃｌｅｍｅｎｓ  ＰＲ，Ｈｏｆｆｍａｎ  ＥＰ，Ｃｎａａｎ  Ａ，ａｎｄ  Ｇｏｒｄｉｓｈ−Ｄｒｅｓｓｍａｎ  Ｈ，“ＣＩＮＲＧ  Ｉ���ｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ．Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ  ｏｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｌｉｆｅ，ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ：ａ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｃｏｈｏｒｔ  ｓｔｕｄｙ，”Ｌａｎｃｅｔ，３９１（１０１１９），４５１−４６１（２０１８））。【０１３８】
ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１−２０１試験は、ＣＩＮＲＧネットワークに参加している臨床施設によって実施した。標準操作手順（臨床マニュアル）および臨床評価者訓練プロトコルは、ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１−２０１臨床試験およびＣＩＮＲＧ  ＤＮＨＳに非常に類似していた。ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１−２０１対ＣＩＮＲＧ  ＤＮＨＳに登録された患者の対応（マッチング）は、以下の基準を用いて行った。
・ベースライン時の年齢が４歳から１０．５歳未満の男児。
・１２ヵ月以上の時間機能テストデータを有する患者。
・地域：北米（米国、カナダ）。
・ステロイドが少なくとも３ヵ月間投与されており、１２／２４ヵ月の観察期間を通じてステロイドを持続投与されること
・別の臨床試験への不参加【０１３９】
ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１−２０１臨床試験に登録された患者にマッチした患者についてのＣＩＮＲＧ  ＤＮＨＳデータベースの問い合わせは、エクソン５３スキッピングによる治療に適したジストロフィン突然変異は特定しなかったが、エクソン３−７欠失を有する患者およびエクソン４４スキッピングによる治療に適したジストロフィン欠失を有する患者は除外し、その結果以下の表９に示される６９人の被験者が得られた。エクソン３−７欠失を有する患者およびエクソン４４スキッピングによる治療に適したジストロフィン欠失を有する患者を除外した理由は、これらの患者が比較的軽度の症状を示すことが報告されていたからである。【０１４０】
【表９】
2020004675.tif 000020
【０１４１】
表９の一番上の行において、「エクソン５３スキップ」とは、エクソン５３スキッピングによる治療に適したＤＭＤ患者を意味し、「非エクソン５３スキップ」は他の全ての患者を意味する（ただし、上記の除外事項に留意）。表９の下列において、「大きな欠失／重複なし」は、点突然変異（エクソンスキッピングによる治療に適さない）のような他のカテゴリーを包含する。【０１４２】
６ＭＷＴのデータを有するＣＩＮＲＧ  ＤＮＨＳ患者の数は、他の評価項目の患者の数よりも少なかった。その理由は、６ＭＷＴがＣＩＮＲＧ  ＤＮＨＳプロトコルの後期に追加されたため、他の時間機能検査と比較してデータ量が限られてしまったからである。【０１４３】
ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１−２０１に登録された１６人の患者とＣＩＮＲＧ  ＤＮＨＳに登録された６９人の患者の２４週間にわたる疾患の軌跡を比較したところ、２４週間の時間枠において自然歴比較群の患者が時間機能検査において機能低下を呈することが分かった。対照的に、ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１−２０１に登録された患者は、２４週間の同じ期間において時間機能検査において平均値として改善を示した。これらの改善のうちの３つは、統計的有意性に達した：ＴＴＲＷ（１３週目および２５週目）；ＴＳＴＡＮＤ（２５週目）；および６ＭＷＴ（２５週目）。４０ｍｇ／ｋｇ／週および８０ｍｇ／ｋｇ／週のＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１（Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ）の用量の間に統計的有意差は観察されなかった。【０１４４】
図４（合計５つのグラフと１つの表）は、ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１−２０１に登録された患者（青色実線で「Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ」として示される）とＣＩＮＲＧ  ＤＮＨＳにおいてマッチした患者（赤色破線で「ＤＮＨＳ」として示される）における２４週間にわたる時間機能検査におけるベースラインからの変化の比較を示す。【０１４５】
図４の５つのグラフにおいて、「Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ」は、ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１の国際一般名（ＩＮＮ）である。また、全てのグラフにおいて、ベースラインからの変化を、反復測定（ＭＭＲＭ）分析のための制限最尤（ＲＥＭＬ）ベースの混合モデルを用いて、Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ投与群とＣＩＮＲＧ  ＤＮＨＳ患者群との間で比較した。【０１４６】
（１）時間機能検査（Ｔｉｍｅｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔ）
時間機能検査はＴＴＳＴＡＮＤ，ＴＴＲＷ，ＴＴＣＬＩＭＢ，６ＭＷＴであった。ＴＳＴＡＮＤおよびＴＴＲＷは、別個の評価項目として事前に特定され、時間および６点満点評価のスケールに基づいて評価された。ＴＳＴＡＮＤおよびＴＴＲＷはＮＳＡＡの構成項目でもある。したがって、それらを１回測定してそのデータを独立型エンドポイントとして用い、さらに組み合わせてＮＳＡＡ試験の一部として使用した。ＴＳＴＡＮＤおよびＴＴＲＷは、組み合わされたＮＳＡＡスケールとの関係について以下でさらに説明される。ＴＴＣＬＩＭＢを用いて、患者が４段階段を昇るのに要した時間（秒）を評価した。上記「米国／カナダ第２相試験」に記載された臨床プロトコルでは、ＴＴＣＬＩＭＢ試験がＮＳＡＡの一部として実施したと誤って記載されていることに留意すべきである。【０１４７】
６ＭＷＴは多くの疾患において広く使用され、受け入れられている試験であり、そのなかでも本試験で使用したものはＤＭＤに適合されたバージョンである。この試験は、１）機能的運動状態、および２）運動に対する統合された全体的な反応、を臨床的に評価する、簡単で、標準化された、低技術で、費用効果の高い評価手段であると考えられている。本試験を実施するにあたり、２点（コーン）を２５メートル離して設置し、患者に、コーン間を迅速かつ安全に６分間にわたって歩行するように依頼した。患者が６分間で歩いた総距離（メートル）を記録した。臨床評価者は患者が最初の５０メートルに要した歩数と６分間で歩行した総距離（メートル）を測定した（Ｃｒａｉｇ  Ｍ．ＭｃＤｏｎａｌｄ，ＭＤ，Ｅｒｉｋ  Ｋ．Ｈｅｎｒｉｃｓｏｎ，ＭＰＨ，Ｊａｙ  Ｊ．Ｈａｎ，ＭＤ，Ｒ．Ｔｅｄ  Ａｂｒｅｓｃｈ  ＭＳ，Ａｌｉｎａ  Ｎｉｃｏｒｉｃｉ，ＢＳ，Ｇａｒｙ  Ｌ．Ｅｌｆｒｉｎｇ，ＭＳ，Ｌｅｏｎｅ  Ａｔｋｉｎｓｏｎ  ＭＤ，ＰｈＤ，Ａｌｌｅｎ  Ｒｅｈａ  ＢＳ，Ｓａｍｉｔ  Ｈｉｒａｗａｔ  ＭＤ，ａｎｄ  Ｌａｎｇｄｏｎ  Ｌ．Ｍｉｌｌｅｒ  ＭＤ，“Ｔｈｅ  ６−ｍｉｎｕｔｅ  Ｗａｌｋ  Ｔｅｓｔ  ａｓ  ａ  Ｎｅｗ  Ｏｕｔｃｏｍｅ  Ｍｅａｓｕｒｅ  ｉｎ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  Ｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ，”Ｍｕｓｃｌｅ  ＆  Ｎｅｒｖｅ，Ｖｏｌ．４１，ｐｐ．５００−５１０，Ａｐｒｉｌ  ２０１０，Ｗｉｌｅｙ  Ｐｅｒｉｏｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．およびＣｒａｉｇ  Ｍ．ＭｃＤｏｎａｌｄ，ＭＤ，Ｅｒｉｋ  Ｋ．Ｈｅｎｒｉｃｓｏｎ，ＭＰＨ，Ｒ．Ｔｅｄ  Ａｂｒｅｓｃｈ，ＭＳ，Ｊｕｌａｉｎｅ  Ｆｌｏｒｅｎｃｅ，ＰｈＤ，Ｍｉｃｈｅｌｌｅ  Ｅａｇｌｅ，ＰｈＤ，Ｅｄｕａｒｄ  Ｇａｐｐｍａｉｅｒ，ＰｈＤ，Ａｌｌａｎ  Ｍ．Ｇｌａｎｚｍａｎ，ＤＰＴ，Ｒｏｂｅｒｔ  Ｓｐｉｅｇｅｌ，ＭＤ，Ｊａｙ  Ｂａｒｔｈ，ＭＤ，Ｇａｒｙ  Ｅｌｆｒｉｎｇ，ＭＳ，Ａｌｌｅｎ  Ｒｅｈａ，ＭＳ，ａｎｄ  Ｓｔｕａｒｔ  Ｗ．Ｐｅｌｔｚ，ＰｈＤ，“Ｔｈｅ  ６−ｍｉｎｕｔｅ  Ｗａｌｋ  Ｔｅｓｔ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｎｄｐｏｉｎｔｓ  ｉｎ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  Ｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ：Ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ，Ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ  Ｖａｌｉｄｉｔｙ，ａｎｄ  Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  Ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  Ｓｔｕｄｙ，”Ｍｕｓｃｌｅ  ＆  Ｎｅｒｖｅ，Ｖｏｌ．４８，ｐｐ．３５７−３６８，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２０１３，Ｗｉｌｅｙ  Ｐｅｒｉｏｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）。【０１４８】
定量的筋肉検査（ＱＭＴ）評価は、静的収縮時に生み出される筋力を測定するように設計され、神経筋疾患における筋力低下を測定するために十分に確立された方法である。この方法ではＣＩＮＲＧ定量筋肉システム（ＣＱＭＳ）を使用した。ＣＱＭＳは、ＤＭＤを患う子供の適合性を増加させる視聴覚フィードバックプロセスを含む。患者は背中を支持する機構を備えた検査テーブル上に置かれ、これにより手動で背中を安定化させる必要性を排除した。単回実施投与（ｓｉｎｇｌｅ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）の後、各患者はスコア付けによるＱＭＴ評価を完了した（２つの検査を行い、２つの値のうち高い方をデータ分析に使用した）。ＱＭＴは、歪みゲージを備えた直接コンピュータインターフェースを用い、力をポンドとして記録することによって行った。試験位置および試験順序を標準化した。以下に列挙した筋肉群の両側試験を行った（Ｍａｙｈｅｗ  ＪＥ，Ｆｌｏｒｅｎｃｅ  ＪＭ，Ｍａｙｈｅｗ  ＴＰ，Ｈｅｎｒｉｃｓｏｎ  ＥＫ，Ｌｅｓｈｎｅｒ  ＲＴ，Ｍｃｃａｒｔｅｒ  ＲＪ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｒｅｌｉａｂｌｅ  ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｍｅａｓｕｒｅｓ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ  ｏｆ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ，”Ｍｕｓｃｌｅ  ＆  Ｎｅｒｖｅ，２００７；３５（１）：３６−４２．Ｅｐｕｂ  ２００６／０９／１４．）：
・ハンドグリップ。
・肘屈筋（二頭筋）。
・肘伸筋（三頭筋）。
・膝屈筋（ハムストリング）。
・膝伸筋（四頭筋）。【０１４９】
ＱＭＴについては肘伸筋を除いて、２４週間の処置期間にわたって、すべてのパラメーターにおいて強度の平均値にわずかな減少が観察された。しかし肘伸筋には強度のわずかな増加（改善）が見られた。いずれの項目においても２５週目でのベースラインからの変化に統計的有意差はなかった。【０１５０】
強度・機能試験は、ＴＴＳＴＡＮＤ、ＴＴＲＷ、ＴＴＣＬＩＭＢ、ＮＳＡＡ、６ＭＷＴ、ＱＭＴの順に実施した。【０１５１】
（２）ノース・スター歩行能力評価（ＮＳＡＡ）
ＮＳＡＡは、本来は少なくとも１０メートルの歩行が可能なＤＭＤを患う男児のために設計され、臨床医の採点による１７項目からなる機能評価系である（Ｅ．Ｓ．Ｍａｚｚｏｎｅ，Ｓ．Ｍｅｓｓｉｎａ，Ｇ．Ｖａｓｃｏ，Ｍ．Ｍａｉｎ，Ｍ．Ｅａｇｌｅ，Ａ．Ｄ’Ａｍｉｃｏ，Ｌ．Ｄｏｇｌｉｏ，Ｌ．Ｐｏｌｉｔａｎｏ，Ｆ．Ｃａｖａｌｌａｒｏ，Ｓ．Ｆｒｏｓｉｎｉ，Ｌ．Ｂｅｌｌｏ，Ｆ．Ｍａｇｒｉ，Ａ．Ｃｏｒｌａｔｔｉ，Ｅ．Ｚｕｃｃｈｉｎｉ，Ｂ．Ｂｒａｎｃａｌｉｏｎ，Ｆ．Ｒｏｓｓｉ，Ｍ．Ｆｅｒｒｅｔｔｉ，Ｍ．Ｇ．Ｍｏｔｔａ，Ｍ．Ｒ．Ｃｅｃｉｏ，Ａ．Ｂｅｒａｒｄｉｎｅｌｌｉ，Ｐ．Ａｌｆｉｅｒｉ，Ｔ．Ｍｏｎｇｉｎｉ，Ａ．Ｐｉｎｉ，Ｇ．Ａｓｔｒｅａ，Ｒ．Ｂａｔｔｉｎｉ，Ｇ．Ｃｏｍｉ，Ｅ．Ｐｅｇｏｒａｒｏ，Ｌ．Ｍｏｒａｎｄｉ，Ｍ．Ｐａｎｅ，Ｃ．Ａｎｇｅｌｉｎｉ，Ｃ．Ｂｒｕｎｏ，Ｍ．Ｖｉｌｌａｎｏｖａ，Ｇ．Ｖｉｔａ，Ｍ．Ａ．Ｄｏｎａｔｉ，Ｅ．Ｂｅｒｔｉｎｉ，ａｎｄ  Ｅ．Ｍｅｒｃｕｒｉ，“Ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｏｒｔｈ  Ｓｔａｒ  Ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｉｎ  ａ  ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｒｉｃ  ｓｅｔｔｉｎｇ，”Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，Ｖｏｌ．１９，Ｉｓｓｕｅ  ７，ｐｐ．４５８−４６１，Ｊｕｌ  ２００９，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｂ．Ｖ．）。この評価ツールは立ち上がり、フロアからの起き上がり、決められたステップ、ホッピング、およびランニングを含む機能的活動を評価する。評価は、２＝試験内容を正常に実行する能力；１＝修正された方法または補助があれば試験内容を実行することができる；および０＝試験を実行することができない、という３点評価尺度に基づく。したがって、総スコアは、これらの評価において、０（完全に歩行不能）から３４（障害なし）までの範囲となり得る。個々の試験項目のスコアと合計スコアを記録した。ＴＳＴＡＮＤおよびＴＴＲＷはＮＳＡＡの一部として実行した。
・ＴＴＳＴＡＮＤはＤＭＤ患者の標準的な臨床検査として行われるルーチン試験である。この試験では、患者が床に平らに横たわることから立つことまでに要した時間を用いて評価する。試験を実行するのに必要な秒数と、および患者がどのように立位に達したかを６点満点で評価した点数を記録した。
・ＴＴＲＷを用いて、患者が１０メートル歩行／走行するのに要した時間（秒単位）を評価した（走行／歩行の質についての６点満点評価スケールを含む）。【０１５２】
米国／カナダの第２相試験：安全性
高用量および低用量のＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１（Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ）（４０ｍｇ／ｋｇ／週または８０ｍｇ／ｋｇ／週）を投与したＤＭＤ患者１６例の安全性データについては、試験の実施、データの質、または参加者の安全性に大きな懸念はなかった。４８週間の時点で治療を中止した参加者はいなかった。具体的には、ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１（Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ）の投与中止又は減量を要したＴＥＡＥ（治療時に発現した有害事象）は認められなかった。すべての有害事象（有害事象）は軽度または中等度であった。【０１５３】
［実施例３］  Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎの安定性へのｐＨの影響
（ア）ｐＨ安定性評価（１）
溶液の液性とＶｉｌｔｏｌａｒｓｅｎの安定性との関係を調べるため、ブリットン−ロビンソン（Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）緩衝液（ｐＨ３，４，５，６，７，８，９，１０または１１）を用いて、各種ｐＨ溶液中でのＶｉｌｔｏｌａｒｓｅｎの安定性を評価した。【０１５４】
［試験条件］
薬液濃度：Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ  ２ｍｇ／ｍＬ
溶解液  ：ブリットン−ロビンソン緩衝液（ｐＨ３，４，５，６，７，８，９，１０または１１）
保存条件：（１）１２１℃（オートクレーブ処理）で１０，３０または６０分；あるいは
（２）８０℃恒温器中で４または７日
エンドポイント：外観（目視確認）、ｐＨ（ｐＨ計）、純度試験（ＨＰＬＣ法）、回収率（残存率）（ＨＰＬＣ法）
ＨＰＬＣ条件：
流量：毎分１．０ｍＬ
検出器：市外吸光光度計（測定波長：２６４ｎｍ）
カラム：内径４．６ｍｍ、長さ１５ｃｍのステンレス管に３．５μｍの液体クロマトグラフィー用オクタデシルシリル化シリカゲルを充填した（Ｗａｔｅｒｓ，Ｘ−ｂｒｉｄｇｅ  Ｃ１８）。
カラム温度：６０℃
移動相：
・リン酸水素二ナトリウム１．４２ｇを水約７５０ｍＬに溶かし、水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ１２．０に調製した後、水を加えて１０００ｍＬとした（Ｐ液）。
・Ｐ液７００ｍＬにアセトニトリル３００ｍＬを加え、臭化テトラブチルアンモニウム１６．１２ｇを溶かした（移動相Ａ）。
・Ｐ液３００ｍＬにアセトニトリル３００ｍＬを加え、臭化テトラブチルアンモニウム９．６７ｇを溶かした（移動相Ｂ）。
・移動相の送液：移動相Ａ／Ｂ（１００ｖｏｌ％／０ｖｏｌ％）から（０ｖｏｌ％／１００ｖｏｌ％）へ３０分かけて変更した。
本実施例および以下の実施例において、純度試験の値として、不純物を含む検出された全ピークの面積の合計を１００とした場合のＶｉｌｔｏｌａｒｓｅｎの主ピークの面積の百分率（主ピーク面百（％））を表す。【０１５５】
［試験結果］
試験結果を表１０及び図５に示す。「ＳＴ」とは、同じ薬液濃度で精製水に希釈したＶｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ水溶液であり、試験時にその都度調製した（保存は行っていない）。その結果、Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎは、酸性領域の溶液中では不安定であったが、中性〜弱アルカリ性の溶液中では比較的安定であった。【０１５６】
【表１０】
2020004675.tif 000021
2020004675.tif 000022
【０１５７】
（イ）ｐＨ−安定性評価（２）
Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎの安定なｐＨ領域を更に詳細に調べるため、リン酸カリウム−ホウ砂緩衝液（ｐＨ６．０，６．５，７．０，７．５，８．０，８．５，９．０または９．２）を用いて、ｐＨ６〜９の各種ｐＨ溶液中でのＶｉｌｔｏｌａｒｓｅｎの安定性を評価した。【０１５８】
［試験条件］
薬液濃度：Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ  ２ｍｇ／ｍＬ
溶解液  ：リン酸カリウム−ホウ砂緩衝液（ｐＨ６．０，６．５，７．０，７．５，８．０，８．５，９．０または９．２）
保存条件：（１）１２１℃（オートクレーブ処理）で１０，３０または６０分；あるいは
（２）８０℃恒温器中で１，４，７または１４日
エンドポイント：外観（目視確認）、ｐＨ（ｐＨ計）、純度試験（ＨＰＬＣ法）、回収率（残存率）（ＨＰＬＣ法）
ＨＰＬＣ条件：
カラム温度を５０℃とした以外は（ア）に同じ。【０１５９】
［試験結果］
試験結果を表１１及び図６に示す。その結果、ＶｉｌｔｏｌａｒｓｅｎはｐＨ７〜７．５の溶液中で最も安定であった。【０１６０】
【表１１】
2020004675.tif 000023
【０１６１】
［実施例４］  製剤の安定性に対するｐＨ調整剤の影響
本実施例は、Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ注射液を安定なｐＨ域（ｐＨ７〜７．５）へ調整するためのｐＨ調整剤を選択することを目的とする。各種ｐＨ調整剤（１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４−Ｎａ２ＨＰＯ４または１００ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４−Ｎａ２ＨＰＯ４）を添加して安定ｐＨに調整した１０ｍｇ／ｍＬ  Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ溶液の安定性を評価した。【０１６２】
［試験条件］
薬液濃度：Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ  １０ｍｇ／ｍＬ
薬液処方：下記表１２のとおり
保存条件：１２１℃（オートクレーブ処理）で３０〜６０分まで
エンドポイント：外観（目視確認）、ｐＨ（ｐＨ計）、純度試験（ＨＰＬＣ法）、回収率（残存率）（ＨＰＬＣ法）【０１６３】
【表１２】
2020004675.tif 000024
【０１６４】
［試験結果］
試験結果を表１３並びに図７に示す。その結果、Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎは、緩衝剤なしの場合であってもリン酸緩衝剤ありの場合と同等以上に安定であった。特に、高濃度のリン酸緩衝液（本実施例では１００ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４−Ｎａ２ＨＰＯ４）中よりも安定であった。【０１６５】
【表１３】
2020004675.tif 000025
2020004675.tif 000026
【０１６６】
［実施例５］  緩衝剤と多量体の生成との関係
Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎは、保存条件によっては多量体が形成し、単量体の純度が低下することがある。本実施例において、等張化剤として塩化ナトリウムを０．９添加した５０ｍｇ／ｍＬのＶｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ薬液に、さらに各種緩衝剤を添加したときの多量体の生成を測定した。【０１６７】
［試験条件］
薬液濃度：Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ  ５０ｍｇ／ｍＬ
保存条件：６０℃恒温器中で５日まで
エンドポイント：多量体（ＨＰＬＣ法、ＳＥＣカラム）
分析条件：
検出器：紫外吸光光度計（測定波長：２６０ｎｍ）
カラム：内径７．８ｍｍ、長さ３０ｃｍのステンレス管に７μｍの液体クロマトグラフィー用スチレン系ビニルポリマーゲルを充填し、そのカラム２本を直列に接続した（ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ３０００  ＰＷＸＬ、７μｍ、７．８ｍｍ×３０ｃｍ、東ソー）。
カラム温度：２５°Ｃ
移動相：リン酸二水素ナトリウム二水和物１５．６ｇを水７５０ｍＬに溶かし、水酸化ナトリウム試液を加えてｐＨを７．３に調整した後、水を加えて１０００ｍＬとした。この液８００ｍＬにアセトニトリル２００ｍＬを加えた。
流量：Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎの単量体の保持時間が約２１分になるように調整した。
面積測定範囲：Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎの単量体のピークまでの範囲【０１６８】
［試験結果］
試験結果を表１４に示す。その結果、５０ｍＭリン酸緩衝液（リン酸二水素ナトリウム・二水和物−リン酸水素二ナトリウム：ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ−Ｎａ２ＨＰＯ４）やクエン酸緩衝液（クエン酸三ナトリウム・二水和物）を添加することにより、多量体の生成が増加した。【０１６９】
【表１４】
2020004675.tif 000027
【０１７０】
［実施例６］  溶解性の検討（１００ｍｇ／ｍＬ）
注射液の高濃度化の検討を実施した。【０１７１】
［試験条件］
薬液          ：下記の２種類【０１７２】
【表１５】
2020004675.tif 000028
ろ過フィルター：ＰＶＤＦ製（Ｍｉｌｌｅｘ  ＧＶ，０．２２μｍ，３３ｍｍ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）
エンドポイント    ：外観（目視確認）、ｐＨ（ｐＨ計）、純度試験（ＨＰＬＣ法）、ろ過後の回収率（ＨＰＬＣ法）【０１７３】
［試験結果］
試験結果を表１６に示す。１００ｍｇ／ｍＬのＶｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ注射液を調製したところ、溶解性や滅菌フィルターによるろ過に問題はなく、無色澄明の溶液となった。冷所保存後は粘性が出たものの外観に変化はなかった。以上のことから、１００ｍｇ／ｍＬの注射液は調製可能であることがわかった。【０１７４】
【表１６】
2020004675.tif 000029
2020004675.tif 000030
【０１７５】
［実施例７］  溶解性の検討（５０ｍｇ／ｍＬ）
５０ｍｇ／ｍＬの薬液の溶解性を評価した。薬液を調製し、溶解性や滅菌フィルターによるろ過を行った。【０１７６】
［試験条件］
薬液          ：【０１７７】
【表１７】
2020004675.tif 000031
ろ過フィルター：ＰＶＤＦ製（ミリディスクカートリッジフィルター，０．２２μｍ，ＭＣＧＬ４０Ｓ０３／１個＋ＭＣＧＬ４０Ｓ０３／２個，メルク）
エンドポイント    ：外観（目視確認）、ｐＨ（ｐＨ計）、純度試験（ＨＰＬＣ法）、定量（ＨＰＬＣ法）【０１７８】
［試験結果］
試験結果を表１８に示す。その結果、５０ｍｇ／ｍＬは無色澄明の溶液となり、ろ過前後での含量に変化はなかった。以上のことから、５０ｍｇ／ｍＬの注射液は調製可能であり、スケールアップも問題なかった【０１７９】
【表１８】
2020004675.tif 000032
【０１８０】
以下の実施例８〜１０では、実施例２の臨床試験に参加した患者から得られたサンプル、または実施例２の臨床試験に参加した患者について試験を行った。
［実施例８］
ジストロフィンタンパク質の質量分析による定量
（実験方法）
概要：生物学的分析法
サンプルはＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によってタンパク質の分離を行い、ゲル内にてトリプシンによる酵素消化を行って、ペプチド断片とした。ペプチド断片をゲル片から抽出し、乾燥させた。ペプチドを再溶解し、逆相カラムによるＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳでのジストロフィンタンパク質の同定と定量を行った。検量線の範囲は、正常コントロールのジストロフィンタンパク質量を１００％とした場合の１％〜２５％であり、濃度は標準化タンパク質にフィラミンＣを用いて、ピーク面積比から算出した。回帰式には最小２乗法を用い、ｙ＝ｍｘ＋ｂ（ｙ：ピーク面積比、ｘ：％ジストロフィン）の式を得た。【０１８１】
ゲル内消化
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析で測定するサンプルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ：ドジデル硫酸ナトリウム、ＰＡＧＥ：ポリアクリルアミド電気泳動）し、分子量によるタンパク質の分離を行い、ゲル内消化にて得た。各ゲルは標準曲線を構成する検量体（０．０％，１．０％，３．０％，１０．０％，２５．０％ジストロフィン）、安定同位体標識アミノ酸を加えて培養したヒト筋管細胞から抽出したタンパク質（ＳＩＬＡＣ）１２．５μｇ、ｂｌａｎｋ、臨床試験４サンプルの合計１１サンプルで構成した。ゲルには１２レーンあり、残り１レーンは分子量マーカーに用いた。検量体は５種類の非ＤＭＤ筋生検、２種類のＤＭＤ筋生検からのタンパク質抽出液を混合して作製した。ＤＭＤ筋生検はＢｉｎｇｈａｍｔｏｎ大から入手し、倫理審査を終えている。本実施例に先立ち、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔにより、各筋生検のジストロフィン量を予め測定しておいた。凍結切片作製装置により筋生検から厚さ１０μｍの連続切片７０枚を得た。筋切片は予めドライアイス上で冷やしてあったマイクロチューブに移した。Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のプロテアーゼとホスファターゼ阻害剤を加えたＲＩＰＡバッファーを用いて、筋切片よりタンパク質を抽出した。抽出液のタンパク質濃度は、ＢＣＡｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて定量した。電気泳動に供するサンプルは、各サンプルが５０μｇのタンパク質を含むようにし、ＳＩＬＡＣを１２．５μｇ添加して調整した。検量体と臨床サンプルには％ジストロフィンを求める際の内部標準として、ＳＩＬＡＣ抽出液を加えている。ＮｕＰＡＧＥ３−８％  Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅゲルを用いて１５０Ｖ  ７５分間の電気泳動を行った。ゲル泳動は同一のサンプルに対して２枚のゲル（ゲルＡとゲルＢ）を用い、ｄｕｐｌｉｃａｔｅで実施した。電気泳動を終えたゲルはメタノール：水：酢酸（５０：４５：５）にて３０分間の固定をし、水に交換し再水和を２回行った。クマシーブルー染色を１時間行った。ゲルの脱色は４℃下で一晩行った。分子量マーカーで４６０ｋＤａから２６８ｋＤａの範囲のジストロフィンタンパク質が存在するゲルを切出し、水：アセトニトリル（５０：５０）で２度洗浄した。トリプシン（Ｇｏｌｄ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｇｒａｄｅ，Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いてゲル内消化し、ペプチド断片を得て、減圧遠心にて乾燥した。ジストロフィンのペプチド断片は、−８０℃で保管しておき、Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ  Ｎａｎｏ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳでの分析に用いた。【０１８２】
試験サンプル
臨床試験に参加した患者は１６名で、各患者から投与前後の筋生検を得た。３２検体からｄｕｐｌｉｃａｔｅのため６４サンプルの分析を行った。また、４検体のｄｕｐｌｉｃａｔｅとなる８サンプルは再分析を実施したので、合計７２サンプルを分析した。【０１８３】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析
高速液体クロマトグラフィーシステムＤｉｏｎｅｘ  Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ３０００  ＲＳＬＣｎａｎｏ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と質量分析装置Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ  Ｐｌｕｓ（ＨＢＭＳ：Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を組合せた液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）により、得られたペプチド断片を分析した。
乾燥ペプチド断片は２％アセトニトリル（ＡＣＮ）＋０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて再溶解した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳへの試料導入にはインジェクションループ５μＬ  Ｄｉｎｏｅｘ  ｎａｎｏＶｉｐｅｒ  ｓａｍｐｌｅ  ｌｏｏｐ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した。【０１８４】
以下の条件で液体クロマトグラムを行った。
分析カラム：逆相カラムＡｃｃｌａｉｍ  Ｐｅｐｍａｐ  ＲＳＬＣ  Ｃ１８  １５ｃｍ×７５μｍ、粒子径３μｍ、ＥＡＳＹ  ＳＰＲＡＹ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）
分析カラム温度：５０℃
移動相Ａ：１％ギ酸（ＨＣＯＯＨ）、移動相Ｂ：０．１％ギ酸ＡＣＮ
流速：０．５００μＬ／ｍｉｎ（ＮＣ）
試料注入モード：Ｐａｒｔｉａｌ  ｌｏｏｐ（ｌｏｏｐ  ｓｉｚｅ  ５μＬ）
試料注入量：１．００‐４．００μＬ
オートサンプラー温度：１０℃
実行時間：４０．００分【０１８５】
【表１９】
2020004675.tif 000033
【０１８６】
質量分析装置は以下の条件で使用した。
イオン源：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＥＡＳＹ−Ｓｐｒａｙ
イオンモード：陽イオン
スキャン：並列反応モニタリング
クロムピーク幅（半値全幅）：１０秒
最小総サイクル時間：４０分
分解能：１７，５００
自動利得制御（Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  Ｇａｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）ターゲット：１ｅ５
最大試料注入時間：５０ミリ秒
四重極型質量検出器分離幅：１．０ｍ／ｚ単位
スペクトラムデータ：プロファイル
Ｍａｓｓ許容範囲：１０ｐｐｍ
Ｔｙｐｉｃａｌ  Ｔｕｎａｂｌｅ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ（Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  Ｔｕｎｅ  Ｆｉｌｅ）
Ｓｐｒａｙ  Ｖｏｌｔａｇｅ：１．８ｋＶ
Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：２７５℃
Ｓ−Ｌｅｎｓ  ＲＦ−Ｌｅｖｅｌ：７０【０１８７】
【表２０】
2020004675.tif 000034
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【０１８８】
【表２１】
2020004675.tif 000036
【０１８９】
【表２２】
2020004675.tif 000037
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【０１９０】
クロマトグラフからＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＬＣ  Ｑｕａｎ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．０によってデータ収集を行った。Ｍａｓｓの許容範囲は２０ｐｐｍ、積分アルゴリズムはＩＣＩＳとした。検量体１％もしくは他の検量体のジストロフィンのピーク面積が１００００付近以下である場合は、次のことに留意した。検量体０％と比較して、ジストロフィンとフィラミンＣともに得られたペプチドと標識ペプチドのピーク面積比が信頼できる数値であり、％ジストロフィンに乱れを及ばさないことを確認した。
ジストロフィンとフィラミンＣのピーク面積はプロダクトイオンに一致するピーク面積を合計することで計算した。ジストロフィンのピーク面積は、ジストロフィンの１種類のペプチド断片（ＤＹＳＴ２アミノ酸配列：ＩＦＬＴＥＱＰＬＥＧＬＥＫ（配列番号４））から得た。フィラミンＣのピーク面積は、フィラミンＣの２種類のペプチド断片（ＦＩＬＣ１アミノ酸配列：ＶＡＶＧＱＥＱＡＦＳＶＮＴＲ（配列番号６）、ＦＩＬＣ２アミノ酸配列：ＳＰＦＶＶＮＶＡＰＰＬＤＬＳＫ（配列番号８））の平均値とした。【０１９１】
【表２３】
2020004675.tif 000039
2020004675.tif 000040
【０１９２】
検量体と各臨床サンプルにおけるジストロフィンタンパク質レベル（ジストロフィンとフィラミンＣのピーク面積比）は以下の式から計算した。０％の検量体からもジストロフィンが検出されたため、各検量体のジストロフィンタンパク質レベルの数値から検量体０％のジストロフィンタンパク質レベルの数値を引いて補正した。Ｅｘｃｅｌのテンプレートを用いて、ゲル毎に検量体から％ジストロフィンとジストロフィンタンパク質レベルの数値の回帰直線を求め、臨床サンプルのジストロフィンタンパク質レベルの数値から臨床サンプルの％ジストロフィンを得た。
【数１】
2020004675.tif 000041
【０１９３】
【表２４】
2020004675.tif 000042
【０１９４】
（結果）
分析した各サンプルの％ジストロフィンは事前に規定した合否基準により、採択を決定した。測定した７２サンプルのうち、６０サンプルが基準を満たした。測定結果を表２５及び２６に示す。各検体はｄｕｐｌｉｃａｔｅのサンプルを用いて試験を行っているが、４０ｍｇ／ｋｇ投与群の２患者（表２５の患者Ｅ及びＦ）から得られた投与前後４検体については、一方のサンプル（ゲルＢ）が基準を満たさなかったので、得られた測定値は１サンプル（ゲルＡ）からの１つのみとなった。すなわち、４０ｍｇ／ｋｇ投与群では投与前の８検体１６サンプルのうち１４サンプルを測定できた。１サンプルが１％を示し、１１サンプルは定量限界以下であった。また、２５週時の８検体１６サンプルのうち１４サンプルを測定できた。１検体が２回の測定ともに定量限界以下となった他は、１％以上のジストロフィンが検出された。
８０ｍｇ／ｋｇ投与群では投与前の８検体１６サンプル全てが定量限界未満となった。また、２５週時の８検体１６サンプルでは、全てのサンプルにおいて定量限界以上のジストロフィンが検出され、平均で４．２％であった。
以上からＶｉｌｔｏｌａｒｓｅｎの４０ｍｇ／ｋｇおよび８０ｍｇ／ｋｇの投与によってジストロフィンタンパク質の発現が回復することが確認された。【０１９５】
【表２５】
2020004675.tif 000043
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【０１９６】
【表２６】
2020004675.tif 000045
【０１９７】
［実施例９］
運動機能試験（１３、２５週時（初回投与から１２、２４週経過時））
（実験方法）
本剤群の運動機能評価を、自然歴群を対照として比較した。自然歴群は米国の筋ジストロフィーの臨床試験ネットワークであるｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｇｒｏｕｐ（ＣＩＮＲＧ）が実施したＤｕｃｈｅｎｎｅ  ｎａｔｕｒａｌ  ｈｉｓｔｏｒｙ  ｓｔｕｄｙ（ＣＩＮＲＧ  ＤＮＨＳ）と呼ばれる研究から、ベースライン時のデータに基づき選択した。
ＣＩＮＲＧ  ＤＮＨＳは男性４４０名のＤＭＤ患者を対象とした縦断的自然歴研究であり、２００６年から２０１６年のデータを収集し、ベースライン時、１年目に４回、２年目に２回、その後年１回、最長１０年間来院することとしていた。各来院時には時間機能検査、筋力検査、アンケートによる機能検査、肺機能検査、生活の質の評価が実施された。２０１試験はＣＩＮＲＧに所属する施設によって実施され、標準操作手順書（ＳＯＰ）及び臨床評価者訓練手順書は両試験間で一致させた。【０１９８】
本試験の対照として、ＣＩＮＲＧ  ＤＮＨＳから２０１試験の年齢、ステロイド使用状況及び地域等の主要な登録基準を含む以下の基準を満たす患者を選択した。
・最低１２ヵ月の時間機能検査データがある［ベースライン時の立ち上がり時間（ＴＴＳＴＡＮＤ）、４段階段昇り時間（ＴＴＣＬＩＭＢ）及び１０ｍ歩行／走行時間（ＴＴＲＷ）のデータが必要］。
・ベースライン時に４歳から１０歳未満
・北アメリカ（米国又はカナダ）
・コルチコステロイドを最低３ヵ月間投与し、１２−２４ヵ月の観察期間を通して継続して使用している。
・他のエクソンスキップ薬の臨床試験に同時に登録していない。
・下記の遺伝的適格性基準を満たす。
（選択基準）：
遺伝子検査結果がある患者
重複変異をもつ患者
ナンセンス変異又はフレームシフトを引き起こす微小変異をもつ患者
（除外基準）：
プロモーターからエクソン８の間に変異がある患者（病状の進行が遅いとの報告（１）Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ．２０１８；３９：１１９３−１２０２及び（２）Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ．２００８；２９（５）：７２８−３７があることから除外した）
エクソン４４スキッピングによる治療に適した患者（病状の進行が遅いとの報告（１）があることから除外した）
インフレーム変異をもつ患者【０１９９】
その結果、男児ＤＭＤ患者６５例が上記基準を満たし、そのうち、９例はエクソン５３スキッピングによる治療に適したＤＭＤ患者（エクソン５３スキップ群）、５６例はエクソン５３スキッピングによる治療に適さないＤＭＤ患者（非エクソン５３スキップ群）であった。【０２００】
【表２７】
2020004675.tif 000046
【０２０１】
（結果）
Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎの治療を受けた被験者（Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ投与群）１６例とＣＩＮＲＧ  ＤＮＨＳの自然歴群（ＤＮＨＳ群）６５例における、１３週時と２５週時における投与前もしくはベースラインからの時間機能検査［６分間歩行試験（６ＭＷＴ）、立ち上がり時間（ＴＴＳＴＡＮＤ）の速度、４段階段昇り時間（ＴＴＣＬＩＭＢ）の速度、１０メートル走行／歩行時間（ＴＴＲＷ）の速度］とノース・スター歩行能力評価（ＮＳＡＡ）の変化を比較した。
本実施例で使用している解析方法では、「投与前値」またはベースラインを結果に影響を与える背景因子である共変量とし、１３週時と２５週時のデータを特定の被験者で繰り返し測定された値（ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｍｅａｓｕｒｅｓ）として用いＭＭＲＭ解析を行った。その結果、６分間歩行距離及び１０メートル走行／歩行時間の速度で本実施例のＶｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ投与群の方が有意に改善していた。また、その他の全ての運動機能試験においても本剤群の方が自然歴の経過より改善していた。【０２０２】
図８は１３週投与時（初回投与から１２週経過時）および２５週投与時（初回投与から２４週経過時）のＶｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ投与群とＣＩＮＲＧ自然歴対照群（ＤＮＨＳ）における各運動機能試験結果のベースラインからの変化を表すグラフである。変化量はベースラインから、１３週時、２５週時までの変化量の最小２乗平均、エラーバーは標準誤差、Ｐ値はＭＭＲＭを用いて算出した。【０２０３】
Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ投与群とＤＮＨＳの各時点におけるサンプル数は以下であった。
【表２８】
2020004675.tif 000047
【０２０４】
【表２９】
2020004675.tif 000048
2020004675.tif 000049
【０２０５】
［実施例１０］
運動機能試験（８５週時（初回投与から８４週経過時）まで）
（実験方法）
時間機能検査［６分間歩行試験（６ＭＷＴ）、立ち上がり時間（ＴＴＳＴＡＮＤ）、４段階段昇り時間（ＴＴＣＬＩＭＢ）、１０メートル走行／歩行時間（ＴＴＲＷ）］とノース・スター歩行能力評価（ＮＳＡＡ）は、初回投与１週間前と、初回投与時（１週時）から１２週が経過する時点毎（１３，２５，３７，４９，６１，７３，８５週時）に測定した。２０１試験はＣＩＮＲＧに所属する施設によって実施され、運動機能試験はＣＩＮＲＧのＤＮＨＳで用いられた標準操作手順書（ＳＯＰ）及び臨床評価者訓練手順書に一致させて行われた。被験者が子供であることもあり、試験実施への興味が持続しない等の理由で、試験によっては実施できない項目があった。【０２０６】
（結果）
結果を図９〜図１６に示す。ノース・スター歩行能力評価では、Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ投与群の５歳以上の多くの患者においてスコアが維持もしくは向上した。イタリアとイギリスの自然歴データを元に、臨床試験のような患者エントリー基準を設けて１，２年後のＮＳＡＡスコアの変化を研究した文献によると、エクソン５３スキッピング対象治療患者の１年間の平均変化量は−４．１ポイントであった（Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  Ｐｓｙｃｈｉｃａｒｙ  ８７，１４９−５５，２０１６）。文献のエントリー基準に一致するＶｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ投与群の患者の４８週経過時の変化量は＋１．３ポイントであった。ＤＨＮＳの結果を報告した文献（Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ  ４８，５５−６７，２０１３）において７歳から９歳のＤＭＤ患者のうち２０％が立ち上がり能力を喪失するが、Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ投与群では該当する患者はいなかった。７歳から９歳のＤＭＤ患者のうち１０％は４段階段昇りが出来なくなるが、Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ投与群では該当する患者はいなかった。速度は、加齢とともに減少していくが、Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ投与群では全体としては速度の上昇が見られた。７歳から９歳のＤＭＤ患者のうち１０％は自立歩行能力を喪失するが、ＮＳＰでは該当する患者はいなかった。また１０メートル走行／歩行時間の速度は、加齢とともに減少していくが、Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ投与群では全体としては速度の上昇が見られた。ＷＢによるジストロフィン定量値のベースラインからのジストロフィン発現量の変化と立ち上がり時間試験、４段階段昇り試験、１０ｍ歩行／走行試験のベースラインからの４８週間での速度変化について、相関の有無と直線回帰式をＥｘｃｅｌにて計算した。立ち上がり時間試験と１０メートル走行／歩行試験に関しては、ジストロフィン発現量と速度変化において有意な相関関係があり（Ｐ＜０．０５）、ジストロフィンの増加に伴い運動機能の速度変化が上昇することが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０２０７】
本発明により、ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１（Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ）の安定な組成を有する、デュシェンヌ型筋ジストロフィー治療用の医薬組成物が提供される。また、ＮＳ−０６５／ＮＣＮＰ−０１（Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎ）を含む医薬組成物に関し、効果的なＤＭＤ治療を奏しかつヒト患者に安全な範囲の用法・用量が提供される。当該医薬組成物により、低い副作用でデュシェンヌ型筋ジストロフィーの症状を効果的に軽減することができる。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2020004675.tif 000059
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2020004675.tif 000068
【手続補正書】
【提出日】令和2年12月9日(2020.12.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
2020004675.tif 000069
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８】
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【国際調査報告】
2020004675.tif 000071
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