(57)【要約】  評価についての専門性を必要とすることなく、簡便且つ迅速であり、非侵襲的な細胞のゲノム異常の評価方法を提供する。培地中で培養された多能性幹細胞あるいは多能性幹細胞より分化誘導を行った細胞を被検細胞として、該被検細胞がゲノム異常を有するか否かを評価する方法であって、被検細胞の培養上清における指標物質の存在量を測定するステップと、前記指標物質の存在量に基づいて前記被検細胞がゲノム異常を有するか否かを評価するステップとを含み、前記指標物質が、デオキシシチジン、キヌレニン、プトレシン、アラニン、システイン、シスタチオニン、及びトレオン酸からなる群から選ばれる少なくとも１つであり、前記少なくとも１つの指標物質の存在量に基づいて前記被検細胞がゲノム異常を有するか否かの評価が行なわれる、ゲノム異常評価方法。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培地中で培養された多能性幹細胞あるいは多能性幹細胞より分化誘導を行った細胞を被検細胞として、該被検細胞がゲノム異常を有するか否かを評価する方法であって、
被検細胞の培養上清における指標物質の存在量を測定するステップと、
前記指標物質の存在量に基づいて前記被検細胞がゲノム異常を有するか否かを評価するステップとを含み、
前記指標物質が、デオキシシチジン、キヌレニン、プトレシン、アラニン、システイン、シスタチオニン、及びトレオン酸からなる群から選ばれる少なくとも１つであり、
前記少なくとも１つの指標物質の存在量に基づいて前記被検細胞がゲノム異常を有するか否かの評価が行なわれる、ゲノム異常評価方法。
【請求項２】
正常型の染色体を有することが判っている対照細胞の培養上清における指標物質の存在量を測定するステップをさらに含み、
前記少なくとも１つの指標物質について、前記被検細胞の培養上清における前記指標物質の存在量と、前記対照細胞の培養上清における前記指標物質の存在量とを比較することにより、前記被検細胞がゲノム異常を有するか否かの評価が行なわれる、請求項１に記載のゲノム異常評価方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つの指標物質について、前記対照細胞の培養上清における前記指標物質の存在量に対する前記被検細胞の培養上清における前記指標物質の存在量との比が、予め定めた閾値以上であるか否か又は閾値以下であるか否かに基づいて、前記被検細胞がゲノム異常を有するか否かの評価が行なわれる、請求項２に記載のゲノム異常評価方法。
【請求項４】
前記指標物質が、デオキシシチジン、キヌレニン、プトレシン、シスタチオニン、又はトレオン酸の場合に、前記比が、予め定めた閾値以下であるか否かに基づいて、前記被検細胞がゲノム異常を有するか否かの評価が行なわれる、請求項３に記載のゲノム異常評価方法。
【請求項５】
前記指標物質が、アラニン、又はシステインの場合に、前記比が、予め定めた閾値以上であるか否かに基づいて、前記被検細胞がゲノム異常を有するか否かの評価が行なわれる、請求項３に記載のゲノム異常評価方法。
【請求項６】
前記指標物質のうち、プトレシン、デオキシシチジン、及びキヌレニンからなる群から選ばれる少なくとも１つを指標物質として選択する、請求項１に記載のゲノム異常評価方法。
【請求項７】
前記指標物質のうち、２種以上を指標物質として選択する、請求項１に記載のゲノム異常評価方法。
【請求項８】
１８番目の染色体に異常を有するか否かを評価する、請求項１に記載のゲノム異常評価方法。
【請求項９】
前記培養上清中の前記指標物質の存在量を、ＬＣ−ＭＳ（液体クロマトクラフ質量分析計）を用いて行う、請求項１に記載のゲノム異常評価方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法によるゲノム異常評価結果に基づいて、前記被検細胞を選別する工程を含む、細胞の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞のゲノム異常の評価方法に関し、より詳しくは、評価についての専門性を必要とすることなく、簡便且つ迅速であり、非侵襲的な細胞のゲノム異常の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの多能性幹細胞は、体を構成するあらゆる細胞に分化することが可能であり、再生医療用の細胞供給源として大きな注目を集めている。再生医療用途にこれら細胞を用いるためには、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞を大量に培養する必要がある。一方で、これらの細胞は分裂を繰り返すとゲノムに異常［染色体の数的異常、染色体の形状異常（染色体の一部が他の染色体に移る異常、染色体のある部分の向きが逆となる異常）］が生じる危険が高まることが知られている（非特許文献１、２）。ゲノムに異常が生じた細胞は癌化を引き起こす可能性も高まるため、細胞を移植する前にこれらゲノム異常が生じていないかどうかを確認する必要がある。【０００３】
染色体の解析法としては、細胞を一定数培養した後、コルセミド溶液で分裂を停止させ、低張液で処理した後、メタノール／酢酸などで固定する。その後、スライドグラス上で標本を作製し、ギムザ染色またはＧバンド／Ｑバンド処理などを行った後に顕微鏡観察する手法が一般的である。非特許文献３（日本染色体遺伝子検査 Vol.32 No.1 2014, pp60-89）参照。【０００４】
特表２０１０−５０８８１５号公報（ＷＯ２００８／０６６６５５号公報）には、受精および着床についての卵母細胞を培養する際の培地中の成分を分析して、染色体異常を診断する方法が開示されている。同号公報において、対象となる細胞は卵母細胞であり、多能性幹細胞についての開示はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２０１０−５０８８１５号公報
【特許文献２】ＷＯ２００８／０６６６５５号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Louise C. Laurent, et. al., "Dynamic Changes in the Copy Number of Pluripotency and Cell Proliferation Genes in Human ES and iPS Cells during Reprogramming and Time in Culture", Cell Stem Cell 8, 106-118, January 7, 2011
【非特許文献２】"Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage", Nature Biotechnology volume 29, 1132-1144 (2011)
【非特許文献３】日本染色体遺伝子検査学会，「染色体遺伝子検査の品質保証のための指針  第２編」（Guidelines for Quality Assurance of Chromosomal and Genetic Testing Second Edition），日本染色体遺伝子検査 Vol.32 No.1 2014, pp60-89
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記非特許文献３に開示の染色体の解析法は、前処理操作を含めてその手順が煩雑であることに加え、顕微鏡での目視観察となるため、評価には専門性を必要とする。そのため、外部委託による解析評価が一般的となっている。この場合、解析結果が得られるまでに数週間から数カ月を要する。【０００８】
また、上記解析法では、いずれも細胞に対して侵襲的な処理を行う必要があるため、染色体の解析を行った後に、該評価に供した細胞を別の目的に利用すること、例えば再生医療用の細胞源とすることができなかった。【０００９】
本発明の目的は、評価についての専門性を必要とすることなく、簡便且つ迅速であり、非侵襲的な細胞のゲノム異常の評価方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは鋭意検討した結果、培養上清中の特定の指標物質の存在量に基づいて、細胞のゲノム異常を評価できることを見出し、本発明に至った。【００１１】
本発明は、以下の発明を含む。
（１）  培地中で培養された多能性幹細胞あるいは多能性幹細胞より分化誘導を行った細胞を被検細胞として、該被検細胞がゲノム異常を有するか否かを評価する方法であって、
被検細胞の培養上清における指標物質の存在量を測定するステップと、
前記指標物質の存在量に基づいて前記被検細胞がゲノム異常を有するか否かを評価するステップとを含み、
前記指標物質が、デオキシシチジン、キヌレニン、プトレシン、アラニン、システイン、シスタチオニン、及びトレオン酸からなる群から選ばれる少なくとも１つであり、
前記少なくとも１つの指標物質の存在量に基づいて前記被検細胞がゲノム異常を有するか否かの評価が行なわれる、ゲノム異常評価方法。【００１２】
（２）  正常型の染色体を有することが判っている対照細胞の培養上清における指標物質の存在量を測定するステップをさらに含み、
前記少なくとも１つの指標物質について、前記被検細胞の培養上清における前記指標物質の存在量と、前記対照細胞の培養上清における前記指標物質の存在量とを比較することにより、前記被検細胞がゲノム異常を有するか否かの評価が行なわれる、上記（１）に記載のゲノム異常評価方法。【００１３】
（３）  前記少なくとも１つの指標物質について、前記対照細胞の培養上清における前記指標物質の存在量に対する前記被検細胞の培養上清における前記指標物質の存在量との比が、予め定めた閾値以上であるか否か又は閾値以下であるか否かに基づいて、前記被検細胞がゲノム異常を有するか否かの評価が行なわれる、上記（２）に記載のゲノム異常評価方法。【００１４】
（４）  前記指標物質が、デオキシシチジン、キヌレニン、プトレシン、シスタチオニン、又はトレオン酸の場合に、前記比が、予め定めた閾値以下であるか否かに基づいて、前記被検細胞がゲノム異常を有するか否かの評価が行なわれる、上記（３）に記載のゲノム異常評価方法。【００１５】
（５）  前記指標物質が、アラニン、又はシステインの場合に、前記比が、予め定めた閾値以上であるか否かに基づいて、前記被検細胞がゲノム異常を有するか否かの評価が行なわれる、請求項３に記載のゲノム異常評価方法。【００１６】
（６）  前記指標物質のうち、プトレシン、デオキシシチジン、及びキヌレニンからなる群から選ばれる少なくとも１つを指標物質として選択する、上記（１）〜（４）のうちのいずれかに記載のゲノム異常評価方法。【００１７】
（７）  前記指標物質のうち、２種以上を指標物質として選択する、上記（１）〜（６）のうちのいずれかに記載のゲノム異常評価方法。【００１８】
（８）  １８番目の染色体に異常を有するか否かを評価する、上記（１）〜（７）のうちのいずれかに記載のゲノム異常評価方法。【００１９】
（９）  前記培養上清中の前記指標物質の存在量を、ＬＣ−ＭＳ（液体クロマトクラフ質量分析計）を用いて行う、上記（１）〜（８）のうちのいずれかに記載のゲノム異常評価方法。【００２０】
上記（１）〜（９）のうちのいずれかに記載の方法によるゲノム異常評価結果に基づいて、前記被検細胞を選別する工程を含む、細胞の培養方法。【００２１】
本発明のゲノム異常評価方法は、培地中で培養された多能性幹細胞あるいは多能性幹細胞より分化誘導を行った細胞を被検細胞として適用される。しかしながら、多能性幹細胞に限らず、培地中で培養された一般の細胞にも適用され得る。多能性幹細胞は、ＥＳ細胞（Embryonic Stem cells、胚性幹細胞）やｉＰＳ細胞（Induced Pluripotent Stem cells、人工多能性幹細胞）等である。【００２２】
本発明において、前記培養上清中の前記指標物質の存在量に測定は、どのような方法を用いて行ってもよい。代表的な方法としてガスクロマトグラフィー分析法（ＧＣ）、液体クロマトグラフィー分析法（ＬＣ）、質量分析法（ＭＳ）、液体クロマトクラフ質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）、ガスクロマトグラフ質量分析法（ＧＣ−ＭＳ）を挙げることができる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、細胞の染色体を解析するのに培養上清を採取すればよいだけであるため、従来のような煩雑な前処理が必要なく、短時間で解析結果を得ることが可能となる。また、従来のように細胞に対して侵襲的な処理を行う必要がないため、染色体の解析後に、被検細胞を再生医療用の細胞源等として利用することが可能となる。【００２４】
すなわち、本発明によれば、従来のように、顕微鏡を用いた染色体の目視観察は不要であり、染色体の目視観察についての専門性を必要としない。また、評価手順は簡便であり、迅速にゲノム異常の評価を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、本発明の一実施例における細胞のゲノム異常の評価方法を説明する模式図である。
【図２】図２は、実施例において、対照細胞（サンプルＣ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ−ＭＳ分析により求められた指標物質トレオン酸の存在量の経時変化を示すグラフである。横軸は培養日数であり、縦軸は面積比である。面積比＝指標物質の面積値／内部標準物質の面積値。図３〜図８において、横軸、及び縦軸は同じことを表す。
【図３】図３は、実施例において、対照細胞（サンプルＣ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ−ＭＳ分析により求められた指標物質シスタチオニンの存在量の経時変化を示すグラフである。
【図４】図４は、実施例において、対照細胞（サンプルＣ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ−ＭＳ分析により求められた指標物質キヌレニンの存在量の経時変化を示すグラフである。
【図５】図５は、実施例において、対照細胞（サンプルＣ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ−ＭＳ分析により求められた指標物質システインの存在量の経時変化を示すグラフである。
【図６】図６は、実施例において、対照細胞（サンプルＣ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ−ＭＳ分析により求められた指標物質アラニンの存在量の経時変化を示すグラフである。
【図７】図７は、実施例において、対照細胞（サンプルＣ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ−ＭＳ分析により求められた指標物質プトレシンの存在量の経時変化を示すグラフである。
【図８】図８は、実施例において、対照細胞（サンプルＣ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ−ＭＳ分析により求められた指標物質デオキシシチジンの存在量の経時変化を示すグラフである。
【図９】図９は、実施例において、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ−ＭＳ分析により求められた指標物質トレオン酸の存在量の経時変化を示すグラフである。横軸は培養日数であり、縦軸は面積比である。面積比＝指標物質の面積値／内部標準物質の面積値。図１０〜図１５において、横軸、及び縦軸は同じことを表す。
【図１０】図１０は、実施例において、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ−ＭＳ分析により求められた指標物質キヌレニンの存在量の経時変化を示すグラフである。
【図１１】図１１は、実施例において、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ−ＭＳ分析により求められた指標物質システインの存在量の経時変化を示すグラフである。
【図１２】図１２は、実施例において、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ−ＭＳ分析により求められた指標物質アラニンの存在量の経時変化を示すグラフである。
【図１３】図１３は、実施例において、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ−ＭＳ分析により求められた指標物質プトレシンの存在量の経時変化を示すグラフである。
【図１４】図１４は、実施例において、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ−ＭＳ分析により求められた指標物質デオキシシチジンの存在量の経時変化を示すグラフである。
【図１５】図１５は、実施例において、対照細胞（サンプルＣ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、ｗｅｌｌの撮像により求められた細胞被覆率の経時変化を示すグラフである。横軸は培養日数であり、縦軸は細胞被覆率である。
【図１６】図１６は、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ−ＭＳ分析により求められた指標物質トレオン酸(Threonic acid)の存在量の経時変化を示すグラフである。横軸は培養日数であり、縦軸は面積比／細胞被覆率である。面積比＝指標物質の面積値／内部標準物質の面積値。図１７〜図２１において、横軸、及び縦軸は同じことを表す。
【図１７】図１７は、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ−ＭＳ分析により求められた指標物質キヌレニン(Kynurenine)の存在量の経時変化を示すグラフである。
【図１８】図１８は、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ−ＭＳ分析により求められた指標物質システイン(Cysteine)の存在量の経時変化を示すグラフである。
【図１９】図１９は、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ−ＭＳ分析により求められた指標物質アラニン(Alanine)の存在量の経時変化を示すグラフである。
【図２０】図２０は、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ−ＭＳ分析により求められた指標物質プトレシン(Putrecine)の存在量の経時変化を示すグラフである。
【図２１】図２１は、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ−ＭＳ分析により求められた指標物質デオキシシチジン(Deoxycytidine)の存在量の経時変化を示すグラフである。
【図２２】図２２は、実施例において、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養３日目の培養上清のＬＣ−ＭＳ分析により求められた指標物質トレオン酸の培養上清中のΔConc／ΔConfluencyを示すグラフである。縦軸はΔConc／ΔConfluencyである。図２３〜図２７において、縦軸は同じことを表す。
【図２３】図２３は、実施例において、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養３日目の培養上清のＬＣ−ＭＳ分析により求められた指標物質キヌレニンの培養上清中のΔConc／ΔConfluencyを示すグラフである。
【図２４】図２４は、実施例において、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養３日目の培養上清のＬＣ−ＭＳ分析により求められた指標物質システインの培養上清中のΔConc／ΔConfluencyを示すグラフである。
【図２５】図２５は、実施例において、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養３日目の培養上清のＬＣ−ＭＳ分析により求められた指標物質アラニンの培養上清中のΔConc／ΔConfluencyを示すグラフである。
【図２６】図２６は、実施例において、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養３日目の培養上清のＬＣ−ＭＳ分析により求められた指標物質プトレシンの培養上清中のΔConc／ΔConfluencyを示すグラフである。
【図２７】図２７は、実施例において、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養３日目の培養上清のＬＣ−ＭＳ分析により求められた指標物質デオキシシチジンの培養上清中のΔConc／ΔConfluencyを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明のゲノム異常評価方法は、培地中で培養された多能性幹細胞あるいは多能性幹細胞より分化誘導を行った細胞を被検細胞として、該被検細胞がゲノム異常を有するか否かを評価する方法であって、
被検細胞の培養上清における指標物質の存在量を測定するステップと、
前記指標物質の存在量に基づいて前記被検細胞がゲノム異常を有するか否かを評価するステップとを含む。
前記指標物質、すなわちバイオマーカーが、デオキシシチジン、キヌレニン、プトレシン、アラニン、システイン、シスタチオニン、及びトレオン酸からなる群から選ばれる少なくとも１つであり、
前記評価ステップにおいて、前記少なくとも１つの指標物質の存在量に基づいて前記被検細胞がゲノム異常を有するか否かの評価が行なわれる。
【００２７】
本発明において、被検細胞は、培地中で培養された多能性幹細胞あるいは多能性幹細胞より分化誘導を行った細胞である。多能性幹細胞は、ＥＳ細胞（Embryonic Stem cells、胚性幹細胞）やｉＰＳ細胞（Induced Pluripotent Stem cells、人工多能性幹細胞）等である。このような多能性幹細胞は、培地中で培養している間に分裂を繰り返して、ゲノムに異常［染色体の数的異常、染色体の形状異常（染色体の一部が他の染色体に移る異常、染色体のある部分の向きが逆となる異常）］が生じる危険が高まる。そのため、細胞にゲノム異常が生じていないかどうかを確認する必要がある。
【００２８】
本発明の好ましい形態において、ゲノム異常評価方法は、正常型の染色体を有することが判っている対照細胞の培養上清における指標物質の存在量を測定するステップをさらに含む。この形態の場合、前記評価ステップにおいて、前記少なくとも１つの指標物質について、前記被検細胞の培養上清における前記指標物質の存在量と、前記対照細胞の培養上清における前記対応する指標物質の存在量とを比較することにより、前記被検細胞がゲノム異常を有するか否かの評価が行なわれる。
【００２９】
本発明の別の形態において、ゲノム異常評価方法は、正常型の染色体を有することが判っている対照細胞の培養上清における指標物質の存在量を測定するステップの代わりに、正常型の染色体を有することが判っている対照細胞の培養上清における指標物質の存在量を予めライブラリの登録しておき、前記予め作製されたライブラリに基づいた対照細胞の培養上清における指標物質の存在量を用いてもよい。この場合、前記被検細胞の培養条件は、ライブラリ作製に用いた培養条件と同じか又は近似したものとする必要がある。
【００３０】
被検細胞の培養、及び対照細胞の培養に用いる培地としては、幹細胞の培養に一般的に使用される培地、例えばＤＭＥＭ／Ｆ１２や、該ＤＭＥＭ／Ｆ１２を主成分とする培地（例えばｍＴｅＳＲ１、ＴｅＳＲ−Ｅ８、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ−８等）を用いることができる。表１にＤＭＥＭ／Ｆ１２の構成成分を示す。
【００３１】
【表１】
2019244853.tif 000003
【００３２】
本発明において、前記指標物質は、デオキシシチジン、キヌレニン、プトレシン、アラニン、システイン、シスタチオニン、及びトレオン酸からなる群から選ばれる少なくとも１つである。
【００３３】
前記指標物質のうち、デオキシシチジン、キヌレニン、プトレシン、シスタチオニン、又はトレオン酸は、前記被検細胞がゲノム異常を有する場合に、ゲノム異常の存在しない正常型の細胞の場合に比べ、減少する傾向が見られる。一方、前記指標物質のうち、アラニン、又はシステインは、前記被検細胞がゲノム異常を有する場合に、ゲノム異常の存在しない正常型の細胞の場合に比べ、増加する傾向が見られる。
【００３４】
本発明の好ましい形態において、ゲノム異常評価方法は、前記少なくとも１つの指標物質について、前記対照細胞の培養上清における前記指標物質の存在量に対する前記被検細胞の培養上清における前記指標物質の存在量との比：
比＝（前記被検細胞の培養上清における前記指標物質の存在量）／（前記対照細胞の培養上清における前記指標物質の存在量）
が、予め定めた閾値以上であるか否か又は閾値以下であるか否かに基づいて、前記被検細胞がゲノム異常を有するか否かの評価が行なわれる。
【００３５】
前記指標物質が、デオキシシチジン、キヌレニン、プトレシン、シスタチオニン、又はトレオン酸の場合には、前記被検細胞がゲノム異常を有する場合に、ゲノム異常の存在しない正常型の細胞の場合に比べ、前記指標物質が減少する傾向が見られる。そのため、前記比が、予め定めた閾値以下であるか否かに基づいて、前記被検細胞がゲノム異常を有するか否かの評価を行うことができる。
【００３６】
前記指標物質が、アラニン、又はシステインの場合には、前記被検細胞がゲノム異常を有する場合に、ゲノム異常の存在しない正常型の細胞の場合に比べ、前記指標物質が増加する傾向が見られる。そのため、前記比が、予め定めた閾値以上であるか否かに基づいて、前記被検細胞がゲノム異常を有するか否かの評価を行うことができる。
【００３７】
これらの形態の場合において、閾値は当業者が予め定めることができる。閾値は、培養される被検細胞の株にもよって異なり得る。
【００３８】
本発明において、ゲノム異常の存在しない正常型の細胞とゲノム異常を有する細胞との間で有意な存在量の差異が認められるという観点から、前記指標物質のうち、プトレシン、デオキシシチジン、及びキヌレニンからなる群から選ばれる少なくとも１つを指標物質として選択することも推奨される。
【００３９】
また、本発明において、前記指標物質のうち、２種以上を指標物質として選択することも好ましい。２種以上の指標物質の存在量に基づいて、前記被検細胞がゲノム異常を有するか否かの評価を行うことにより、より確度の高い評価を行い得る。
【００４０】
本発明において、特に１８番目の染色体に異常を有するか否かを評価することができる。
【００４１】
また、本発明の別の形態において、正常型の染色体を有することが判っている細胞に代えて、ある特定の異常型の染色体を有することが判っている細胞を対照細胞とする場合もある。この形態の場合、本ゲノム異常評価方法は、ある特定の異常型の染色体を有することが判っている対照細胞の培養上清における指標物質の存在量を測定するステップをさらに含むとよい。あるいは、ある特定の異常型の染色体を有することが判っている対照細胞の培養上清における指標物質の存在量を予めライブラリの登録しておき、前記予め作製されたライブラリに基づいた対照細胞の培養上清における指標物質の存在量を用いてもよい。この場合、前記被検細胞の培養条件は、ライブラリ作製に用いた培養条件と同じか又は近似したものとする必要がある。
【００４２】
そして、ある特定の異常型の染色体を有することが判っている細胞を対照細胞とする形態の場合、前記評価ステップにおいて、前記少なくとも１つの指標物質について、前記被検細胞の培養上清における前記指標物質の存在量と、前記対照細胞の培養上清における前記対応する指標物質の存在量とを比較することにより、前記被検細胞がゲノム異常を有するか否かの評価が行なわれる。すなわち、前記被検細胞における前記指標物質の存在量が、前記対照細胞における前記対応する指標物質の存在量と同様の挙動が認められれば、該被検細胞は、前記対照細胞の異常型染色体と同じ特定の異常型染色体を有すると判断できる。前記被検細胞における前記指標物質の存在量が、前記対照細胞における前記対応する指標物質の存在量と異なる挙動が認められれば、該被検細胞は、前記対照細胞の異常型染色体を有していないと判断できる。この場合、該被検細胞は、正常型染色体を有しているか、あるいは、前記対照細胞の異常型染色体とは別の異常型染色体を有している可能性があると判断できる。
【００４３】
培養上清における前記指標物質の存在量を測定する方法としては、ガスクロマトグラフィー分析装置（ＧＣ）、液体クロマトグラフィー分析装置（ＬＣ）や質量分析装置による定量分析を用いることができ、特に、液体クロマトグラフ質量分析装置（ＬＣ−ＭＳ）や、ガスクロマトグラフ質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ）を用いた定量分析を好適に利用することができるが、これに限定されるものではない。例えば、培養上清に所定の前処理を施した試料を溶離液とともに液体クロマトグラフィー（ＬＣ）装置のカラムに流し、カラムにより分離されて溶出する成分を、紫外可視分光検出器や赤外分光検出器等の検出器で検出した結果から、試料中に含まれる前記指標物質の存在量を求めるようにしてもよい。また、前記各指標物質を特異的に発色又は発光させる試薬等を培養上清に添加し、該発色又は発光の強度に基づいて指標物質の存在量を求めるようにしてもよい。
【００４４】
前記指標物質の存在量については、ガスクロマトグラフィー分析法（ＧＣ）、液体クロマトグラフィー分析法（ＬＣ）、ガスクロマトグラフ質量分析法（ＧＣ−ＭＳ）、又は液体クロマトグラフ質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）における、該指標物質のピーク面積値(Area)、あるいは、該指標物質のピーク面積値(Area)から算出される培養上清における前記指標物質の濃度(Concentration)を用いることができる。あるいは、細胞の密集度(Confluency)で補正（規格化）した「Area／Confluency」、「Concentration／Confluency」；  細胞の数(Cell Number, or Cell Count)で補正した「Area／Cell Number」、「Concentration／Cell Number」を用いてもよい。細胞の密集度(Confluency)又は細胞の数(Cell Number, or Cell Count)で補正（規格化）した値を用いることにより、対照細胞と被検細胞との間で、これらの増殖率に差異がある場合においても、細胞個数当たりの指標物質のピーク面積値（Area／Confluency）又は指標物質の濃度（Concentration／Confluency）同士で比較できる。そのため、対照細胞と被検細胞それぞれの代謝がより反映された精度の高い比較が可能となり、被検細胞がゲノム異常を有するか否かをより精度高く評価することが可能となる。
【実施例】
【００４５】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に制限されるものではない。【００４６】
本発明の方法による細胞のゲノム異常の有無の評価の一実施例について説明する。図１は、本発明の一実施例における細胞のゲノム異常の評価方法を説明する模式図である。【００４７】
本実施例では、同一のヒトｉＰＳ細胞株からそれぞれ培養された４つのサンプル［正常な染色体を持つヒトｉＰＳ細胞株サンプル（Ａ，Ｂ，Ｃ）及び１８番目の染色体に異常を有するヒトｉＰＳ細胞株サンプル（Ｄ）］を使用した。すなわち、この例では、正常な染色体を持つｉＰＳ細胞株からの対照細胞サンプルＡ，Ｂ，Ｃ、及び染色体に異常を有するｉＰＳ細胞株からの被験細胞サンプルＤを用いた。以下、本実施例における細胞培養から培養上清の分析までの手順について説明する。【００４８】
［対照細胞の培養及び培養上清の回収］
ビトロネクチン−Ｎ（Vitronectin-N、Life Technologies社）がコートされた６ｗｅｌｌｐｌａｔｅ（ｗｅｌｌ直径３５ｍｍ）の５ｗｅｌｌに前記対照細胞を植え継いで培養を行った（図１では簡略化のためｗｅｌｌ１枚のみを示している）。また、コントロールサンプルとして細胞を植え継かずに培地のみ添加したものを１ｗｅｌｌ作製した。培地としてはＥｓｓｅｎｔｉａｌ−８を使用し、毎日培地の交換を行った。Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ−８の構成成分を表２に示す。細胞の植え継ぎ（継代）を行った日を１日目として４日目に達するまで培養を継続した。培養４日後に新しい６ｗｅｌｌｐｌａｔｅ（ｗｅｌｌ直径３５ｍｍ）の５ｗｅｌｌに細胞を植え継ぎ、同様に４日目に達するまで培養を継続した。継代は合計３回実施し、各日の培地交換時に培養ｗｅｌｌから回収した培養上清を分析用のサンプルＡとした。前記対照細胞を植え継いでから３回の継代培養が完了するまでを１セットとし、合計で３セット同じ条件で培養を実施し各日の培地交換時に培養ｗｅｌｌから回収した培養上清を分析用のサンプルとした（２セット目に回収した培養上清サンプルを分析用のサンプルＢ、３セット目に回収した培養上清サンプルを分析用のサンプルＣとした。）【００４９】
【表２】
2019244853.tif 000004
【００５０】
［被検細胞の培養及び培養上清の回収］
ビトロネクチン−Ｎ（Vitronectin-N、Life Technologies社）がコートされた６ｗｅｌｌｐｌａｔｅ（ｗｅｌｌ直径３５ｍｍ）の５ｗｅｌｌに前記被検細胞を植え継いで培養を行った（図１では簡略化のためｗｅｌｌ１枚のみを示している）。また、コントロールサンプルとして細胞を植え継かずに培地のみ添加したものを１ｗｅｌｌ作製した。培地としてはＥｓｓｅｎｔｉａｌ−８を使用し、毎日培地の交換を行った。細胞の植え継ぎ（継代）を行った日を１日目として４日目に達するまで培養を継続した。培養４日後に新しい６ｗｅｌｌｐｌａｔｅ（ｗｅｌｌ直径３５ｍｍ）の５ｗｅｌｌに細胞を植え継ぎ、同様に４日目に達するまで培養を継続した。継代は合計３回実施し、各日の培地交換時に培養ｗｅｌｌから回収した培養上清を質量分析用のサンプルＤとした。【００５１】
［サンプルの前処理］
前記各サンプル５０μＬに、それぞれ内部標準物質として０．５ｍＭイソプロピルリンゴ酸水溶液２０μＬを添加し、さらにメタノール２６０μＬを添加することでサンプル中に含まれるタンパク質を変性させた。ろ過フィルターによる除タンパク処理を行い、ろ液を回収した。【００５２】
［ＧＣ−ＭＳによる分析］
上述の前処理を行った各サンプルを凍結乾燥した後、メトキシアミン塩酸塩を含むピリジン溶液中でインキュベートした後、更に、各サンプルにＭＳＴＦＡ（Ｎ−メチル−Ｎ−トリメチルシリルトリフルオロアセトアミド）を添加することでサンプル中の化合物をトリメチルシリル化した。そして、これらの誘導体化処理を施したサンプルをＧＣ−ＭＳによる分析に供した。分析結果の解析には、島津製作所製の「Smart Metabolites Database」を使用した。該データベースは前記と同様の誘導体化処理を施した種々の化合物標準品をＧＣ−ＭＳで分析したデータが集約されたものである。化合物の同定は、前記データベースで設定された保持指標（保持時間を相対化した数値）とサンプル中の誘導体化化合物の保持指標との差が±５以内であるか否か、及び前記データベースで設定された定量イオン及び確認イオンの両者がサンプル中の誘導体化化合物について検出されているか否かを指標に行った。一方、化合物の定量は、前記データベースで設定された条件に従い、サンプル中の各誘導体化化合物に特徴的なイオンに関するマスクロマトグラムの面積を算出する方法により実施した。【００５３】
［ＬＣ−ＭＳによる分析］
上述の前処理を行った各サンプルに適当量の超純水（Milli-Q（登録商標）水、メルク株式会社）を加えて希釈し、ＬＣ−ＭＳによる分析に供した。ＬＣ−ＭＳ分析では、各サンプル中の化合物を逆相分離カラムを用いた勾配溶出によって時間的に分離した後、多重反応モニタリング（ＭＲＭ、Multiple Reaction Monitoring）モードによる質量分析を行った。ＭＲＭモードにおける分析条件の設定は、化合物標準品を用いて実施した。化合物の同定は、標準品の保持時間とサンプル中の化合物の保持時間との差が±０．１分以内であるか否かを基準に行った。また、化合物の定量は、サンプル中の各化合物に特徴的なイオンについてマスクロマトグラムの面積を算出する方法により実施した。【００５４】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの条件：
ＨＰＬＣ：
使用装置：超高速液体クロマトグラフNexera X2シリーズ（島津製作所）
カラム：Discovery HS F5-3* (2.1mmI.D.×150mmL、粒子径：3μｍ、Sigma-Aldrich）
ＬＣ／ＭＳ：
使用装置：超高速トリプル四重極型質量分析計LCMS-8060（島津製作所）【００５５】
ＧＣ−ＭＳによる分析、ＬＣ−ＭＳによる分析の他に、ＬＣによっても分析でき、その結果を用いて、以下と同様の手順によって、データ解析を行い、ゲノム異常についての評価を行うことができる。【００５６】
［細胞被覆率の測定］
Biostudio（Nikon製）を用いて各培養日にｗｅｌｌを撮像し、ｗｅｌｌ中の細胞が占める面積割合を細胞被覆率として算出した。【００５７】
［データ解析１：指標物質の面積比］
各培養日に回収された培養上清サンプルＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄについて、上記のＬＣ−ＭＳ分析を行うことにより求められた各指標物質化合物（マーカー）の定量値（面積値）を、前記内部標準物質の定量値（面積値）で除した値(面積比)を算出した。そして、対照細胞と被検細胞のそれぞれに関し、前記５ｗｅｌｌから回収した培養上清をそれぞれＬＣ−ＭＳで分析した結果から得られた面積比からコントロールサンプルの面積比を差し引いた値を計算し、さらに細胞被覆率で補正した補正値を、１細胞が培養２４時間の間に産生または消費した物質量の指標値として比較した。具体的には、対照細胞について求められた面積比からコントロールサンプルの面積比を差し引いた値を［ａ］、被検細胞について求められた面積比からコントロールサンプルの面積比を差し引いた値を［ｂ］、培養２４時間毎における対象細胞の細胞被覆率の増加率を［ｃ］、培養２４時間毎における被検細胞の細胞被覆率の増加率を［ｄ］としたときに、［ａ］／［ｃ］と［ｂ］／［ｄ］の信頼区間が重ならないとき、１細胞が培養２４時間の間に産生または消費した物質量には対照細胞の培養上清と被検細胞の培養上清の間で有意差があると判定した。【００５８】
まず、面積比(Area ratio)から得られた結果を以下に示す。【００５９】
図２は、対照細胞（サンプルＣ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ−ＭＳ分析により求められた指標物質トレオン酸(Threonic acid)の存在量の経時変化を示すグラフである。横軸は培養日数であり、縦軸は面積比である。面積比＝指標物質の面積値／内部標準物質の面積値。図３〜図８において、横軸、及び縦軸は同じことを表す。
図３は、対照細胞（サンプルＣ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ−ＭＳ分析により求められた指標物質シスタチオニン(Cystathionine)の存在量の経時変化を示すグラフである。
図４は、対照細胞（サンプルＣ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ−ＭＳ分析により求められた指標物質キヌレニン(Kynurenine)の存在量の経時変化を示すグラフである。
図５は、対照細胞（サンプルＣ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ−ＭＳ分析により求められた指標物質システイン(Cysteine)の存在量の経時変化を示すグラフである。
図６は、対照細胞（サンプルＣ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ−ＭＳ分析により求められた指標物質アラニン(Alanine)の存在量の経時変化を示すグラフである。
図７は、対照細胞（サンプルＣ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ−ＭＳ分析により求められた指標物質プトレシン(Putrecine)の存在量の経時変化を示すグラフである。
図８は、対照細胞（サンプルＣ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ−ＭＳ分析により求められた指標物質デオキシシチジン(Deoxycytidine)の存在量の経時変化を示すグラフである。【００６０】
ここで、対照細胞（サンプルＣ）と被検細胞（サンプルＤ）は、培養による細胞増殖率が略同じであるもの、すなわち、時間経過による細胞数が略同じものである。図１５は、対照細胞（サンプルＣ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、ｗｅｌｌの撮像により求められた細胞被覆率の経時変化を示すグラフである。横軸は培養日数であり、縦軸は細胞被覆率(Confluency)である。図１５より、対照細胞（サンプルＣ）と被検細胞（サンプルＤ）で培養による細胞増殖曲線が略一致していることがわかる。対照細胞のサンプルとしては、被検細胞のサンプルと、細胞増殖曲線が概ね一致しているものであることが好ましい。細胞増殖曲線が概ね一致していれば、細胞個数が概ね同等であるので、細胞個数当たりの指標物質のピーク面積値（Area）又は指標物質の濃度（Concentration）同士で比較できる。そのため、対照細胞と被検細胞それぞれの代謝がより反映された精度の高い比較が可能となり、被検細胞がゲノム異常を有するか否かをより精度高く評価することが可能となる。【００６１】
図２〜図４、及び図７〜図８より、指標物質としてのトレオン酸、シスタチオニン、キヌレニン、プトレシン、及びデオキシシチジンは、正常型染色体を有する対照細胞（サンプルＣ）に比べ、１８番目の染色体に異常を有する被検細胞（サンプルＤ）では、時間経過により有意な減少が見られた。【００６２】
一方、図５〜図６より、指標物質としてのシステイン、及びアラニンは、正常型染色体を有する対照細胞（サンプルＣ）に比べ、１８番目の染色体に異常を有する被検細胞（サンプルＤ）では、時間経過により有意な増加が見られた。【００６３】
図９〜図１４は、前記の図２及び図４〜図８に対して、対照細胞（サンプルＣ）と被検細胞（サンプルＤ）の他に、さらに、対照細胞（サンプルＡ）及び対照細胞（サンプルＢ）についての結果を書き加えたものである。対照細胞（サンプルＡ）及び対照細胞（サンプルＢ）は、対照細胞（サンプルＣ）及び被検細胞（サンプルＤ）とは、培養による細胞増殖率が異なっており、すなわち、時間経過による細胞数は異なっているが、対照細胞（サンプルＡ〜Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）とでは、各指標物質の存在量において有意な差が見られる。したがって、培養による細胞増殖率が異なる場合であっても、対照細胞と被検細胞における各指標物質の存在量を比較することで、被検細胞がゲノム異常を有するか否かを評価することが可能である。【００６４】
次に、面積比（Area ratio）の値を細胞被覆率（Confluency）により補正した補正値（Area ratio／Confluency）から得られた結果を以下に示す。【００６５】
図１６は、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ−ＭＳ分析により求められた指標物質トレオン酸(Threonic acid)の存在量の経時変化を示すグラフである。横軸は培養日数であり、縦軸は面積比／細胞被覆率である。面積比＝指標物質の面積値／内部標準物質の面積値。図１７〜図２１において、横軸、及び縦軸は同じことを表す。
図１７は、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ−ＭＳ分析により求められた指標物質キヌレニン(Kynurenine)の存在量の経時変化を示すグラフである。
図１８は、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ−ＭＳ分析により求められた指標物質システイン(Cysteine)の存在量の経時変化を示すグラフである。
図１９は、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ−ＭＳ分析により求められた指標物質アラニン(Alanine)の存在量の経時変化を示すグラフである。
図２０は、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ−ＭＳ分析により求められた指標物質プトレシン(Putrecine)の存在量の経時変化を示すグラフである。
図２１は、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ−ＭＳ分析により求められた指標物質デオキシシチジン(Deoxycytidine)の存在量の経時変化を示すグラフである。【００６６】
ここで、前述したように、図１５より、対照細胞（サンプルＣ）と被検細胞（サンプルＤ）は、培養による細胞増殖率が略同じであるもの、すなわち、時間経過による細胞数が略同じものである。【００６７】
図１６、図１７、図２０及び図２１より、指標物質としてのトレオン酸、キヌレニン、プトレシン、及びデオキシシチジンは、正常型染色体を有する対照細胞（サンプルＣ）に比べ、１８番目の染色体に異常を有する被検細胞（サンプルＤ）では、時間経過により有意な減少が見られた。【００６８】
一方、図１８及び図１９より、指標物質としてのシステイン、及びアラニンは、正常型染色体を有する対照細胞（サンプルＣ）に比べ、１８番目の染色体に異常を有する被検細胞（サンプルＤ）では、時間経過により有意な増加が見られた。【００６９】
ΔArea ratio／ΔConfluencyの信頼区間の算出方法は以下の通りである。
ΔArea ratio＝（３日目の対照細胞について求められた面積比）−（３日目のコントロールサンプルの面積比）
ΔConfluency＝（３日目の対照細胞について求められた細胞被覆率）−（２日目の対照細胞Ｃについて求められた細胞被覆率）
ここで、正常系の対照細胞については、対象細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）の測定値を全て用いて信頼区間を算出した。【００７０】
表３に各指標物質についての９５％信頼区間を示し、表４に各指標物質についての９０％信頼区間を示す。【００７１】
【表３】
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【００７２】
【表４】
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【００７３】
表３及び表４より、対照細胞サンプルＡ，Ｂ，Ｃについて求められた面積比からコントロールサンプルの面積比を差し引いた値を［ａ］、被検細胞について求められた面積比からコントロールサンプルの面積比を差し引いた値を［ｂ］、培養２４時間毎における対象細胞の細胞被覆率の増加率を［ｃ］、培養２４時間毎における被検細胞の細胞被覆率の増加率を［ｄ］としたときに、［ａ］／［ｃ］と［ｂ］／［ｄ］の信頼区間が重ならないとき、１細胞が培養２４時間の間に産生または消費した物質量には対照細胞の培養上清と被検細胞の培養上清の間で有意差があると判定した。このように判定することにより、より正確な判定が可能となる。【００７４】
［データ解析２：指標物質の濃度比］
各培養日に回収された培養上清サンプルについて、上記のＬＣ−ＭＳ分析を行うことにより求められた各指標物質化合物（マーカー）の面積値を、濃度が既知の各指標物質化合物のＬＣ−ＭＳ分析結果から、外部標準法により各指標物質化合物の濃度値を算出した。そして、対照細胞サンプルと被検細胞サンプルのそれぞれに関し、前記５ｗｅｌｌから回収した培養上清をそれぞれＬＣ−ＭＳで分析した結果から得られた濃度値からコントロールサンプルの濃度値を差し引いた値（ΔConc）を計算し、さらに細胞被覆率の変化量（ΔConfluency）で補正した補正値（ΔConc／ΔConfluency）を、１細胞が培養２４時間の間に産生または消費した物質量の指標値として比較した。【００７５】
ΔConc＝（３日目の培養上清サンプルについて求められた濃度値）−（３日目のコントロールサンプルの濃度値）
ΔConfluency＝（３日目の培養上清サンプルについて求められた細胞被覆率）−（２日目の培養上清サンプルについて求められた細胞被覆率）
ここで、正常系の対照細胞サンプルについては、対象細胞サンプルＡ，Ｂ，Ｃの各ΔConc／ΔConfluencyの平均値である。【００７６】
図２２は、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養３日目の培養上清のＬＣ−ＭＳ分析により求められた指標物質トレオン酸(Threonic acid)の培養上清中のΔConc／ΔConfluencyを示すグラフである。縦軸はΔConc／ΔConfluencyである。図２３〜図２７において、縦軸は同じことを表す。
図２３は、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養３日目の培養上清のＬＣ−ＭＳ分析により求められた指標物質キヌレニン(Kynurenine)の培養上清中のΔConc／ΔConfluencyを示すグラフである。
図２４は、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養３日目の培養上清のＬＣ−ＭＳ分析により求められた指標物質システイン(Cysteine)の培養上清中のΔConc／ΔConfluencyを示すグラフである。
図２５は、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養３日目の培養上清のＬＣ−ＭＳ分析により求められた指標物質アラニン(Alanine)の培養上清中のΔConc／ΔConfluencyを示すグラフである。
図２６は、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養３日目の培養上清のＬＣ−ＭＳ分析により求められた指標物質プトレシン(Putrecine)の培養上清中のΔConc／ΔConfluencyを示すグラフである。
図２７は、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養３日目の培養上清のＬＣ−ＭＳ分析により求められた指標物質デオキシシチジン(Deoxycytidine)の培養上清中のΔConc／ΔConfluencyを示すグラフである。【００７７】
このように、面積比ではなく、濃度比で比較した場合でも同様に、正常系と異常系で有意差が生じる結果が得られた。【００７８】
上記実施例では、細胞株Ａ，Ｂ，Ｃを対照細胞として、細胞株Ｄを被験細胞とした例について示した。本発明は、他の細胞株を対照細胞として、他の細胞株を被験細胞とした場合についても適用できる。このことは、上記実施例を見れば、上記指標物質（すなわち、マーカー）がゲノム異常の判定に使用できることは当業者であれば理解される。また、細胞の培地についても、実施例で用いたものに限らず、種々のものを用いてもよいことは明らかである。【００７９】
本発明の方法によるゲノム異常評価結果に基づいて、前記被検細胞を選別する工程を行うことにより、非侵襲的に正常な細胞のみを引き続いて培養することができる。
【図１】
2019244853.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2019244853.tif 000022
【図１７】
2019244853.tif 000023
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【国際調査報告】
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2019244853.tif 000035
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