(57)【要約】  動物の使用を含まない、被験物質の光毒性または光アレルギーの測定方法、並びに上記測定方法において使用するための試薬を提供すること。光毒性または光アレルギーの測定方法は、Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）システインまたはα−Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）リジンである有機化合物と、被験物質とを、紫外線の照射下において反応させること；上記有機化合物と、被験物質とを、紫外線の非照射下において反応させること；反応後の上記有機化合物の減少率を光学的測定により検出すること；および紫外線の照射下における反応後の有機化合物の減少率と、紫外線の非照射下における反応後の有機化合物の減少率との差から光毒性または光アレルギーを検出すること；を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）システインまたはα−Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）リジンである有機化合物と、被験物質とを、紫外線の照射下において反応させること；
Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）システインまたはα−Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）リジンである有機化合物と、被験物質とを、紫外線の非照射下において反応させること；
反応後の有機化合物の減少率を光学的測定によりそれぞれ検出すること；および
紫外線の照射下における反応後の有機化合物の減少率と、紫外線の非照射下における反応後の有機化合物の減少率との差から光毒性または光アレルギーを検出すること；
を含む、光毒性または光アレルギーの測定方法。
【請求項２】
有機化合物が、Ｎ−（２−フェニルアセチル）システインまたはＮ−［２−（ナフタレン−１−イル）アセチル］システインである、請求項１に記載の光毒性または光アレルギーの測定方法。
【請求項３】
有機化合物が、α−Ｎ−（２−フェニルアセチル）リジンまたはα−Ｎ−［２−（ナフタレン−１−イル）アセチル］リジンである、請求項１に記載の光毒性または光アレルギーの測定方法。
【請求項４】
紫外線の照射下における反応において用いられる紫外線が、波長４００ｎｍ以下の紫外線である、請求項１から３のいずれか一項に記載の光毒性または光アレルギーの測定方法。
【請求項５】
反応後の有機化合物の減少率を、蛍光検出器を用いた光学的測定により検出する、請求項１から４のいずれか一項に記載の光毒性または光アレルギーの測定方法。
【請求項６】
蛍光検出器を用いた光学的測定において、励起波長が２００〜３５０ｎｍであり、蛍光波長が２００〜４００ｎｍである、請求項５に記載の光毒性または光アレルギーの測定方法。
【請求項７】
反応後の有機化合物の減少率を、紫外線検出器を用いた光学的測定により検出する、請求項１から４のいずれか一項に記載の光毒性または光アレルギーの測定方法。
【請求項８】
紫外線検出器を用いた光学的測定において、検出波長が２００〜４００ｎｍである、請求項７に記載の光毒性または光アレルギーの測定方法。
【請求項９】
有機化合物と被験物質との反応における反応液中の有機化合物の濃度が０．０５μｍｏｌ／Ｌ以上４００μｍｏｌ／Ｌ以下である、請求項１から８のいずれか一項に記載の光毒性または光アレルギーの測定方法。
【請求項１０】
有機化合物と被験物質とを反応させる際に、有機化合物と、２以上の被験物質を含有する混合物とを反応させる、請求項１から９のいずれか一項に記載の光毒性または光アレルギーの測定方法。
【請求項１１】
有機化合物と被験物質とを反応させることにより得られる反応物を、クロマトグラフィー処理することを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の光毒性または光アレルギーの測定方法。
【請求項１２】
紫外線の照射下における反応後の有機化合物の減少率と、紫外線の非照射下における反応後の有機化合物の減少率との差から光毒性または光アレルギーを検出することにおいて、
（１）
Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）システインの紫外線照射下における反応後の減少率から、Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）システインの紫外線非照射下における反応後の減少率を引いた差が１５％以上；
（２）
α−Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）リジンの紫外線照射下における反応後の減少率から、α−Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）リジンの紫外線非照射下における反応後の減少率を引いた差が１５％以上；または、
（３）上記（１）に記載の減少率の差と上記（２）に記載の減少率の差の平均が１０％以上；
のいずれか一つ以上を満たす場合は陽性と判断する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の光毒性または光アレルギーの測定方法。
【請求項１３】
Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）システインまたはα−Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）リジンを含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の光毒性または光アレルギーの測定方法において使用するための試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験物質の光毒性または光アレルギーの測定方法、並びに被験物質の光毒性または光アレルギーの測定方法において使用するための試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
光毒性および光アレルギー性は、物質が光照射下で活性化されることで引き起こされる皮膚の発赤、腫脹および色素沈着などの症状のことである。特に光アレルギー性は、物質に暴露された箇所の局所的な症状に留まらず、アナフィラキシーという重篤で生命に危険を及ぼす全身性のアレルギー反応を伴う場合がある。また、光毒性および光アレルギー性は、一旦発症すると長期にわたって暴露を回避する管理が必要となることなどから、重要な毒性の一つと考えられている。そのため、暴露された状態で日光などの光にさらされる可能性のある製品（例えば、医薬、農薬、および化粧品等）に含まれる化学物質は、アレルギー反応を引き起こさない物質であることが重要である。
【０００３】
医薬品における日米ＥＵ医薬品規制調和国際会議（ＩＣＨ）では、新規医薬有効成分、新規添加剤、経皮投与用臨床製剤、および光線力学療法用製剤における光毒性および光アレルギーの評価の必要性が定義されている。しかし、動物を用いたｉｎ  ｖｉｖｏ試験については確立された試験法がない。また、動物を用いない試験法としては、光毒性評価法であるＲＯＳ  ａｓｓａｙ、および３Ｔ３  ＮＲＵ  ＰＴの２試験が知られているのみである。そのため、光毒性および光アレルギーの評価については、実施すべき試験は特に定められておらず、試験法の選択は薬剤開発者に委ねられている。
【０００４】
上記の通り、光毒性のｉｎ  ｃｈｅｍｉｃｏ試験としてはＩＣＨガイドラインに掲載されているＲＯＳアッセイが知られている。この試験法は光毒性の原因の一つである光照射によって発生する活性酸素を検出する試験法であり、具体的にはｐ−Ｎｉｔｒｏｓｏｄｉｍｅｔｈｙｌａｎｉｌｉｎｅ（ＲＮＯ）およびＩｍｉｄａｚｏｌｅを添加した反応液とＮｉｔｒｏｂｌｕｅ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＮＢＴ）を添加した反応液における光照射による吸光度の変化から、活性酸素の一種であるｓｉｎｇｌｅｔ  ｏｘｙｇｅｎとｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅの産生を検出する（非特許文献１及び２）。
【０００５】
光アレルギー性のｉｎ  ｃｈｅｍｉｃｏ試験としては、皮膚感作性試験であるＤＰＲＡ（Ｄｉｒｅｃｔ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  Ａｓｓａｙ）を応用したｐｈｏｔｏ−ｍＤＰＲＡが報告されている（非特許文献３）。この報告では、ＤＰＲＡにおける被験物質と求核試薬との反応において光を照射することにより、光アレルギー物質を添加した反応液では非照射の場合に対して被験物質と求核試薬との反応性が高くなることが示されている。しかし、検討しているデータ数が少ないため、ヒトに対する予測精度や光アレルギーと判定する基準については定められていない。
【０００６】
一方、皮膚感作性試験のための培養細胞を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験としては、ＡＲＥ−Ｎｒｆ２  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ＫｅｒａｔｉｎｏＳｅｎｓＴＭ  ｔｅｓｔ  ｍｅｔｈｏｄ（ＫｅｒａｔｉｎｏＳｅｎｓは登録商標）、ＬｕＳｅｎｓ（ＡＲＥ−ＮｒＦ２  ｌｕｓｉｆｅｒａｓｅ  ＬｕＳｅｎｓ  ｔｅｓｔ  ｍｅｔｈｏｄ）、ｈ−ＣＬＡＴ（ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔ）、Ｕ−ＳＥＮＳ（Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｕ９３７  Ｓｋｉｎ  Ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔ）およびＩＬ−８  Ｌｕｃ  ａｓｓａｙなどが知られている。さらに、皮膚感作性試験のためのｉｎ  ｃｈｅｍｉｃｏ試験としては、特許文献１および２には、アリール環を導入したシステイン誘導体およびアリール環を導入したリジン誘導体を求核試薬とする皮膚感作性測定試薬および皮膚感作性測定方法が記載されている。特許文献１および２に記載の方法においては、皮膚感作の初期段階で起こる感作性物質と生体内のタンパク質との結合に着目し、タンパク質の代わりにシステイン誘導体およびリジン誘導体を用いて、被験物質との反応性をもとに皮膚感作性を予測する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Onoue S, Tsuda Y. (2006). Analytical studies on the prediction of photosensitive/phototoxic potential of pharmaceutical substances. Pharmaceutical Research 23(1):156-164
【非特許文献２】Onoue S, Igarashi N, Yamada S, Tsuda Y. (2008). High-throughput reactive oxygen species (ROS) assay: an enabling technology for screening the phototoxic potential of pharmaceutical substances. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 46(1):187-193.
【非特許文献３】de Avila RI, Teixeira GC, Veloso DFMC, Moreira LC, Lima EM, Valadares MC. (2017). In vitro assessment of skin sensitization, photosensitization and phototoxicity potential of commercial glyphosate-containing formulations. Toxicology In Vitro, 45(3):386-392.
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１１−５９１０２号公報
【特許文献２】特開２０１４−３７９９５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ＲＯＳアッセイでは光毒性の試験法のため、光アレルギー性を評価することができない。また、ｐｈｏｔｏ−ｍＤＰＲＡでは光毒性の評価についての報告はないため、光毒性を評価できるかが不明であり、光アレルギーにおいては明確な判定基準が設けられていない。
【００１０】
上記の通り、光毒性試験および光アレルギー性試験は医薬、農薬および化粧品等の製品開発において必要な安全性試験であるが、確立された試験法が少ない。特に、光アレルギー性においては動物試験および動物を用いない試験のどちらにおいても確立された試験法がない。
【００１１】
本発明の課題は、動物を使用することなく被験物質の光毒性または光アレルギーを評価することができる、被験物質の光毒性または光アレルギーの測定方法、並びに上記測定方法において使用するための試薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討し、Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）システインまたはα−Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）リジンと、被験物質とを、紫外線の照射下において反応させ、および紫外線の非照射下において反応させ、上記反応後の有機化合物の減少率を光学的測定により検出した。そして、本発明者らは、紫外線の照射下における反応後の有機化合物の減少率と、紫外線の非照射下における反応後の有機化合物の減少率との差から、被験物質の光毒性または光アレルギーを測定できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【００１３】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
＜１＞  Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）システインまたはα−Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）リジンである有機化合物と、被験物質とを、紫外線の照射下において反応させること；Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）システインまたはα−Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）リジンである有機化合物と、被験物質とを、紫外線の非照射下において反応させること；反応後の有機化合物の減少率を光学的測定によりそれぞれ検出すること；および紫外線の照射下における反応後の有機化合物の減少率と、紫外線の非照射下における反応後の有機化合物の減少率との差から光毒性または光アレルギーを検出すること；を含む、光毒性または光アレルギーの測定方法。
＜２＞  有機化合物が、Ｎ−（２−フェニルアセチル）システインまたはＮ−［２−（ナフタレン−１−イル）アセチル］システインである、＜１＞に記載の光毒性または光アレルギーの測定方法。
＜３＞  有機化合物が、α−Ｎ−（２−フェニルアセチル）リジンまたはα−Ｎ−［２−（ナフタレン−１−イル）アセチル］リジンである、＜１＞に記載の光毒性または光アレルギーの測定方法。
＜４＞  紫外線の照射下における反応において用いられる紫外線が、波長４００ｎｍ以下の紫外線である、＜１＞から＜３＞のいずれか一に記載の光毒性または光アレルギーの測定方法。
＜５＞  反応後の有機化合物の減少率を、蛍光検出器を用いた光学的測定により検出する、＜１＞から＜４＞のいずれか一に記載の光毒性または光アレルギーの測定方法。
＜６＞  蛍光検出器を用いた光学的測定において、励起波長が２００〜３５０ｎｍであり、蛍光波長が２００〜４００ｎｍである、＜５＞に記載の光毒性または光アレルギーの測定方法。
＜７＞  反応後の有機化合物の減少率を、紫外線検出器を用いた光学的測定により検出する、＜１＞から＜４＞のいずれか一に記載の光毒性または光アレルギーの測定方法。
＜８＞  紫外線検出器を用いた光学的測定において、検出波長が２００〜４００ｎｍである、＜７＞に記載の光毒性または光アレルギーの測定方法。
＜９＞  有機化合物と被験物質との反応における反応液中の有機化合物の濃度が０．０５μｍｏｌ／Ｌ以上４００μｍｏｌ／Ｌ以下である、＜１＞から＜８＞のいずれか一に記載の光毒性または光アレルギーの測定方法。
＜１０＞  有機化合物と被験物質とを反応させる際に、有機化合物と、２以上の被験物質を含有する混合物とを反応させる、＜１＞から＜９＞のいずれか一に記載の光毒性または光アレルギーの測定方法。
＜１１＞  有機化合物と被験物質とを反応させることにより得られる反応物を、クロマトグラフィー処理することを含む、＜１＞から＜１０＞のいずれか一に記載の光毒性または光アレルギーの測定方法。
＜１２＞  紫外線の照射下における反応後の有機化合物の減少率と、紫外線の非照射下における反応後の有機化合物の減少率との差から光毒性または光アレルギーを検出することにおいて、
（１）
Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）システインの紫外線照射下における反応後の減少率から、Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）システインの紫外線非照射下における反応後の減少率を引いた差が１５％以上；
（２）
α−Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）リジンの紫外線照射下における反応後の減少率から、α−Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）リジンの紫外線非照射下における反応後の減少率を引いた差が１５％以上；または、
（３）上記（１）に記載の減少率の差と上記（２）に記載の減少率の差の平均が１０％以上；
のいずれか一つ以上を満たす場合は陽性と判断する、＜１＞から＜１１＞のいずれか一に記載の光毒性または光アレルギーの測定方法。
＜１３＞  Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）システインまたはα−Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）リジンを含む、＜１＞から＜１２＞のいずれか一に記載の光毒性または光アレルギーの測定方法において使用するための試薬。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、動物を使用することなく、被験物質の光毒性または光アレルギーを測定することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書において、「〜」とはその前後に記載される数値を下限値および上限値として含む意味で使用される。
本発明は、Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）システインまたはα−Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）リジンである有機化合物と、被験物質とを、紫外線の照射下において反応させること；Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）システインまたはα−Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）リジンである有機化合物と、被験物質とを、紫外線の非照射下において反応させること；反応後の有機化合物の減少率を光学的測定によりそれぞれ検出すること；および紫外線の照射下における反応後の有機化合物の減少率と、紫外線の非照射下における反応後の有機化合物の減少率との差から光毒性または光アレルギーを検出すること；を含む、光毒性または光アレルギーの測定方法に関する。
【００１６】
本発明はさらに、Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）システインまたはα−Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）リジンを測定主薬として含む、本発明による光毒性または光アレルギーの測定方法において使用するための試薬に関する。
【００１７】
本発明においては、Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）システインまたはα−Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）リジンを試薬として使用することにより、動物を使用することなく光毒性または光アレルギーを測定できるという利点がある。また、本発明において有機化合物は、蛍光検出が可能であり、これを利用することにより、被験物質と完全に区別して定量することができる。
【００１８】
本発明において、光毒性または光アレルギーの測定とは、光毒性または光アレルギーの測定の検定を含む意味であり、また、一定の基準の光毒性または光アレルギーの有無の判断、および光毒性または光アレルギーの定量的測定を含む意味である。
【００１９】
基底状態の化学物質は、光照射により、活性酸素種（Reactive Oxygen Species）を生成するとともに、励起（活性化）された化学物質を生成する。この活性酸素種または励起（活性化）された化学物質が、細胞毒性を引き起こすことを光毒性という。また、上記のようにして生成した励起（活性化）された化学物質は、タンパク質と結合して複合体を形成する場合がある。この複合体を生体の免疫系が認識および記憶することによりアレルギー症状が生じることを、光アレルギーという。
【００２０】
本発明においては、Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）システインまたはα−Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）リジンを使用し、この２種類のいずれかの試薬と被験物質とを、紫外線の照射下において反応させ、および紫外線の非照射下において反応させ、それぞれの反応後の有機化合物の減少率を光学的測定により検出する。次いで、紫外線の照射下における反応後の有機化合物の減少率と、紫外線の非照射下における反応後の有機化合物の減少率との差から、光毒性または光アレルギーの予測を行う試験法である。
本発明において、有機化合物と被験物質とを反応させる際の条件、および、各光学的測定方法における条件は、紫外線の照射下における反応および紫外線の非照射下における反応において、それぞれ同一の条件を用いることが好ましく、完全に同一の条件を用いることが特に好ましい。
また、本発明において、紫外線の照射下における反応とは、有機化合物と被験物質との混合および反応を紫外線の照射下において行うことのみならず、有機化合物と被験物質とを十分に混合させた後、一定時間紫外線の照射下に置くことも含む。
【００２１】
本発明においては、Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）システインまたはα−Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）リジンを使用する。
Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）システインまたはα−Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）リジンとしては、２００〜４００ｎｍに蛍光を発し、吸収極大波長におけるモル吸光係数が１０Ｌ／ｍｏｌ・ｃｍ以上５０００００Ｌ／ｍｏｌ・ｃｍ以下の有機化合物であることが好ましい。
【００２２】
Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）システインは、そのままの状態、または溶液状態で、好ましくは、波長１９０〜２５００ｎｍの領域で吸収を示す化合物であり、さらに好ましくは、波長２００〜７００ｎｍの領域に吸収を示す化合物である。さらに、上記波長領域に吸収極大を有する化合物が好ましい。また、Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）システインは、好ましくは、その吸収極大のモル吸光係数（Ｌ／ｍｏｌ・ｃｍ）が１０以上の吸収を有する化合物であり、さらに好ましくは、モル吸光係数が１００以上の吸収を有する化合物である。特に好ましくは、波長２００〜７００ｎｍの領域に吸収極大を有し、そのモル吸光係数が１００以上の吸収を有する化合物である。
【００２３】
Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）システインにおいて、アリール基は炭素数６〜１６程度であればよい。またアルキルカルボニル基における炭素数は２〜１１程度であればよい。カルボニル基に結合するアルキル基は直鎖状、分岐鎖状、環状のいずれでもよく、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、ヘキシル基、へプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、２−エチルヘキシル基、シクロプロピル基などを挙げることができる。上記の有機化合物としての具体例としては、Ｎ−（２−フェニルアセチル）システイン、およびＮ−[２−(ナフタレン−１−イル)アセチル]システインが挙げられる。
【００２４】
Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）システインは公知の方法により製造することが可能であり、例えば、Ｎ−（２−フェニルアセチル）システインは、特開２０１１−５９１０２号公報の段落００１５〜００１７に記載の方法により合成することができる。
【００２５】
Ｎ−[２−(ナフタレン−１−イル)アセチル]システインは、以下の方法により合成できる。
１−ナフチル酢酸５０ｇをトルエン２７０ｍＬに溶解し、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を滴下しながら、２０℃で塩化チオニル９５．８ｇを滴下する。６０℃で２時間反応後冷却し、トルエン２００ｍＬ添加した後、減圧乾燥して１−ナフチルアセチルクロリドを得る（５６ｇ）。
水酸化ナトリウム１４ｇ、水３５０ｍＬの水溶液にＬ−シスチン２０ｇを添加し、溶解する。溶液を氷水浴にて冷却し、１−ナフチルアセチルクロリド８．７６ｇを滴下する。反応混合物を２０℃で２時間撹拌し、冷却後濃塩酸１６．７ｍＬ添加する。酢酸エチルを約７００ｍＬ添加して結晶を濾取し、減圧乾燥して、Ｎ，Ｎ’−ビス（１−ナフチルアセチル）シスチンを得る（３９．２ｇ）。
Ｎ，Ｎ’−ビス（１−ナフチルアセチル）シスチン２０ｇ、亜鉛粉末２０ｇ、メタノール５００ｍＬの混合物に窒素置換下、トリフリオロ酢酸１２０ｍＬを２時間かけて滴下する。反応混合物を２時間撹拌した後、酢酸エチル５００ｍＬで抽出し、有機相を硫酸マグネシウムで乾燥後、濾過、濃縮する。得られた残渣を酢酸エチルから再結晶し、乾燥してＮ−[２−(ナフタレン−１−イル)アセチル]システインを得る（５．２ｇ）。
【００２６】
Ｎ−[２−(ナフタレン−１−イル)アセチル]システインは、２００〜４００ｎｍに蛍光を発し、２８１ｎｍに吸収極大を示し、モル吸光係数は、約７０００（Ｌ／ｍｏｌ・ｃｍ）であり、最大蛍光波長は、３３５ｎｍである。
【００２７】
α−Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）リジンは、アミノ基を有するため、Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）システインとの反応が低い物質とも反応性を有し、汎用の簡易な分析装置を用いて測定することが可能であり、疎水性の化学物質を溶解させるために用いられる有機溶媒比率の高い反応液においても十分な溶解度および安定性を有する。
【００２８】
α−Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）リジンはそのままの状態、または溶液状態で、好ましくは、波長１９０〜２５００ｎｍの領域で吸収を示す化合物であり、さらに好ましくは、波長２００〜７００ｎｍの領域に吸収を示す化合物である。さらに、上記波長領域に吸収極大を有する化合物が好ましい。α−Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）リジンは、好ましくは、吸収極大波長におけるモル吸光係数（Ｌ／ｍｏｌ・ｃｍ）が１０以上５０００００以下である化合物であり、より好ましくは、吸収極大波長におけるモル吸光係数（Ｌ／ｍｏｌ・ｃｍ）が１０〜２０００である化合物であり、さらに好ましくは、吸収極大波長におけるモル吸光係数が１００〜２０００である化合物である。特に好ましくは、波長２００〜７００ｎｍの領域に吸収極大を有し、吸収極大波長におけるモル吸光係数が１００〜２０００である化合物である。
【００２９】
なおモル吸光係数（ε）は下記式で与えられる。
ε＝Ｄ／（ｃ・ｄ）
ここで、Ｄは溶液の吸光度を表し、ｃは溶質のモル濃度（ｍｏｌ／Ｌ）、ｄは溶液層の厚さ（光路長）（ｃｍ）を表す。モル吸光係数は、市販の分光光度計を用いて吸収スペクトルまたは吸光度を測定することにより求めることができる。
【００３０】
α−Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）リジンにおいて、アリール基は炭素数６〜１６程度であればよい。アリール基として、ベンゼン環、ナフタレン環などが挙げられる。またアルキルカルボニル基における炭素数は２〜１１程度であればよい。カルボニル基に結合するアルキル基は直鎖状、分岐鎖状、環状のいずれでもよく、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、ヘキシル基、へプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、２−エチルヘキシル基、シクロプロピル基などを挙げることができる。α−Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）リジンの具体例としては、α−Ｎ−（２−フェニルアセチル）リジン（以下、ＰＡＬとも言う）、およびα−Ｎ−［２−（ナフタレン−１−イル）アセチル］リジン（以下、ＮＡＬとも言う）が挙げられる。
【００３１】
α−Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）リジンは公知の方法に準じて製造することが可能であり、例えば、ＰＡＬおよびＮＡＬは、特開２０１４−３７９９５号公報の段落００２５〜００３１に記載の方法により合成することができる。
α−Ｎ−（２−フェニルアセチル）リジンは、２００〜４００ｎｍに蛍光を発し、吸収極大波長（２５５ｎｍ付近）におけるモル吸光係数は約２００Ｌ／ｍｏｌ・ｃｍである。
α−Ｎ−［２−（ナフタレン−１−イル）アセチル］リジンは、２００〜４００ｎｍに蛍光を発し、吸収極大波長（２８０ｎｍ付近）におけるモル吸光係数は約４００Ｌ／ｍｏｌ・ｃｍであり、最大蛍光波長は、３３２ｎｍである。
【００３２】
本発明の光毒性または光アレルギー測定試薬は、上記のＮ−（アリールアルキルカルボニル）システインまたはα−Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）リジンのみからなるものであってもよく、測定主薬である上記の有機化合物のほかに１または２以上の添加剤を含んでいるものであってもよい。測定主薬とは、試薬の主成分を意味する。測定主薬の濃度は、測定試薬において有効に機能すればよく、特に限定されないが、例えば下記に示す範囲であることが好ましい。添加剤の例としては、ｐＨ調整剤、安定化剤、キレート剤、還元剤等が挙げられる。また、本発明の光毒性または光アレルギー測定試薬は、上記の測定主薬および必要に応じて上記の添加剤を、水、水性緩衝液、有機溶媒、またはこれらいずれかの混合溶媒等に溶解させたものであってもよい。本発明の光毒性または光アレルギー測定試薬は、溶液、液体状、固体状（粉末、顆粒、凍結乾燥物、錠剤等）のいずれの形態で提供されてもよい。
【００３３】
本発明の光毒性または光アレルギー測定試薬は、例えば、酢酸アンモニウムなどの有機酸塩類またはリン酸塩などの無機塩類を含む水性緩衝液もしくは水またはこれらと有機溶媒との混合溶媒に溶解した形態で、例えば約０．０１μｍｏｌ／Ｌ〜約１ｍｏｌ／Ｌ程度、通常約０．１ｍｍｏｌ／Ｌ〜約５００ｍｍｏｌ／Ｌ程度の上記有機化合物の濃度として使用すればよい。
【００３４】
本発明においては、有機化合物と被験物質とを反応させる際に、有機化合物と、単一の被験物質を反応させてもよいし、２以上の被験物質を含有する混合物とを反応させてもよい。２以上の被験物質を含有する混合物とは、主成分に相当する成分として２以上の被験物質を含む混合物を意味し、１種類の被験物質に対して多種類の不純物が含まれている混合物を意味するものではない。
【００３５】
単一の被験物質または混合物の具体例としては、例えば、香料、精油、高分子化合物、医薬品、農薬、食品、化学製品、および天然物由来成分からなる植物抽出液のうちの少なくとも１種を挙げることができるが、特にこれらに限定されるものではない。
【００３６】
被験物質は、モル濃度を調節できる場合には、例えば、水、水と相溶性のある有機溶媒（例えば、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン、Ｎ,Ｎ−ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ））、又はこれらの混合溶媒（水と有機溶媒との混合溶媒、または２種以上の有機溶媒の混合溶媒）に、例えば約０．０１μｍｏｌ／Ｌ〜約１ｍｏｌ／Ｌ程度の濃度、通常約０．１ｍｍｏｌ／Ｌ〜約５００ｍｍｏｌ／Ｌ程度、または約１ｍｍｏｌ／Ｌ〜約５００ｍｍｏｌ／Ｌ程度の濃度となるように溶解すればよい。
【００３７】
次いで、本発明の光毒性または光アレルギー測定試薬の測定主薬である上記有機化合物と被験物質溶液とを、上記有機化合物と被験物質とのモル濃度比が例えば１：１００〜２０：１、または１：１００〜１０：１となるように混合し反応させればよい。
【００３８】
被験物質は、モル濃度を調節できない場合には、例えば、水、水と相溶性のある有機溶媒（例えば、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン、Ｎ,Ｎジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ））、又はこれらの混合溶媒（水と有機溶媒との混合溶媒、または２種以上の有機溶媒の混合溶媒）に、例えば約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ程度の濃度、通常約０．１ｍｇ／Ｌ〜約１ｍｇ／ｍＬ程度の濃度となるように溶解すればよい。
【００３９】
次いで、本発明の光毒性または光アレルギー測定試薬の測定主薬である上記有機化合物の約０．１〜約１００μｇ／ｍＬ、通常１〜１０μｇ／ｍＬの溶液を上記被験物質溶液に等量加えれば良い。ただし、濃度と添加量を上記のようにすれば良く、例えば、測定試薬の濃度を２倍にして、添加量を１／２にするなど適切に調整してもよい。
【００４０】
有機化合物と被験物質との反応における反応液中の有機化合物の濃度は、好ましくは０．０５μｍｏｌ／Ｌ以上４００μｍｏｌ／Ｌ以下であり、より好ましくは０．１μｍｏｌ／Ｌ以上１００μｍｏｌ／Ｌ以下であり、さらに好ましくは１．０μｍｏｌ／Ｌ以上１０μｍｏｌ／Ｌ以下である。
【００４１】
反応は、上記有機化合物と被験物質とを含む溶液を、例えば約４℃〜約６０℃、好ましくは約１０℃〜約５０℃、より好ましくは約１５℃〜約４０℃の温度範囲にて、必要により保温しながら、通常は約１分〜約２日間、好ましくは１時間〜２日間、より好ましくは８時間〜３６時間攪拌または静置することによって行うことができる。
【００４２】
本発明においては、Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）システインまたはα−Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）リジンである有機化合物と、被験物質とを、紫外線の照射下において反応させること、並びにＮ−（アリールアルキルカルボニル）システインまたはα−Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）リジンである有機化合物と、被験物質とを、紫外線の非照射下において反応させることを、それぞれ行う。
【００４３】
紫外線としては、波長４００ｎｍ以下の紫外線を使用することが好ましい。本発明において、紫外線の波長は２００ｎｍ〜４００ｎｍである。
紫外線の照射は、反応時間の全範囲に渡って行ってもよいし、反応時間の一部だけ行ってもよい。例えば、反応開始時に紫外線照射を行い、その後は紫外線照射なしで反応させてもよい。
紫外線の照射は、好ましくは１００〜１００，０００μＷ／ｃｍ２、より好ましくは５００〜１０，０００μＷ／ｃｍ２、さらに好ましくは1，０００〜５，０００μＷ／ｃｍ２の範囲で、例えば１０分〜５時間、好ましくは３０分から３時間行うことができる。
本発明の実施例では紫外線照射装置は、ＳＸＬ−２５００Ｖ２（セリック社製）を用いた。紫外線照射装置としては、市販の装置を使用することができ、ナガノサイエンス社製、Ｄｒ．Ｈoｎｌｅ （oは ウムラウト）  ＡＧ,  ＵＶ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製、Ａｔｌａｓ  Ｍａｔｅｒｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＬＣＣ社製などが挙げられる。
【００４４】
本発明においては、紫外線の照射下における反応後の有機化合物の減少率と、紫外線の非照射下における反応後の有機化合物の減少率との差から、被験物質の光毒性または光アレルギーを測定することができる。上記のそれぞれの反応後の有機化合物の減少率を調べるためには、光毒性または光アレルギー測定試薬溶液と被験物質溶液との混合液中における上記有機化合物の残存量を分析すればよい。
【００４５】
なお、残存量を分析する場合、光毒性または光アレルギー測定試薬が反応液中で何らかの変化を起こす可能性がある場合は、必要に応じて被験物質のみを含まない反応液（コントロール群）を別途用意して分析を行い、この反応液中の残存量の値を元にして補正しても良い。
【００４６】
例えば、光毒性または光アレルギー測定試薬がチオール基を有している場合には、容易に酸化されてジスルフィド体（２量体）になることがある。そのため、有機化合物の残存量を定量する際には、必要に応じてジスルフィド体も含めて分析を行い、これらの総計により上記有機化合物の残存量としてもよい。
【００４７】
被験物質と求核試薬（例えば、光毒性または光アレルギー測定試薬）との反応性（共有結合能）は、未反応の求核試薬を定量することにより推定することが可能であるが、被験物質と求核試薬との反応の生成物（反応生成物）を検出して定量することが、最も直接的で正しい評価である。混合物の場合、その構成成分が明らかであって、成分と求核試薬との反応生成物が入手可能である場合には、これを用いて、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）−蛍光法により定量することが可能である。
【００４８】
有機化合物または反応の生成物の分析方法としては、特に限定されないが、有機化合物と被験物質とを反応させる工程で得られる反応物を、クロマトグラフィー処理することを含むことが好ましい。例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）などにより、上記反応により生成した化合物、上記有機化合物および被験物質を分離して分析する方法が挙げられる。上記ＨＰＬＣ、ＧＣまたはＴＬＣに用いることのできるクロマトグラフ手法としては、逆相、順相、イオン交換などを挙げることができる。このようなクロマトグラフ手法に使用可能な市販のカラムやＴＬＣとしては、例えば、ＬＣカラムとしてはＣＡＰＣＥＬＬ  ＣＯＲＥ  Ｃ１８（大阪ソーダ社製）、ＣＡＰＣＥＬＬ−ＰＡＫ（大阪ソーダ社製）、Ｌ−ｃｏｌｕｍｎ  ＯＤＳ（化学品評価研究機構製）、Ｓｈｏｄｅｘ  Ａｓａｈｉｐａｋ（昭和電工社製）、ＣＯＲＴＥＣＳ（ウォーターズ社製）、Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ（アジレント・テクノロジー社製）などを挙げることができ、ＴＬＣプレートではシリカゲル６０Ｆ２５４（メルク社製）、Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  Ｐｌａｔｅ（ナカライテスク社製）などを挙げることができる。
【００４９】
本発明の一例においては、被験物質と光毒性または光アレルギー測定試薬との反応後の有機化合物の減少率を、蛍光検出器を用いた光学的測定により検出してもよい。
基底状態の分子は、励起光を吸収して励起状態へ遷移する。吸収した励起エネルギーの一部は、振動エネルギーなどにより失活し、振動準位の低い位置に無輻射遷移した後、基底状態に戻る際に発する光が蛍光である。蛍光検出器を用いた光学的測定は、吸光光度法に比べて一般に１０３倍以上高感度な分析手法と言われる。さらに蛍光物質を測定対象とするため、選択性に優れ、かつ極微量の分析手段として用いられる。蛍光強度は蛍光物質の濃度に比例するため、検量線を作成することで定量分析が可能である。蛍光検出器としては、市販の検出器を使用することができ、島津製作所社製、ウォーターズ社製、日立製作所社製、アジレント・テクノロジー社製、大阪ソーダ社製などが挙げられる。
【００５０】
蛍光検出器を用いた光学的測定においては、励起波長が好ましくは２００〜３５０ｎｍであり、より好ましくは２３０〜３２０ｎｍであり、さらに好ましくは２５０〜３００ｎｍであり、さらに一層好ましくは２７０〜３００ｎｍであり、特に好ましくは２８０〜２９０ｎｍである。蛍光波長は、好ましくは２００〜４００ｎｍであり、より好ましくは３００〜３７０ｎｍであり、さらに好ましくは３００〜３６０ｎｍであり、特に好ましくは３２０〜３５０ｎｍである。
【００５１】
本発明の別の例においては、被験物質と光毒性または光アレルギー測定試薬との反応後の有機化合物の減少率を、紫外線検出器を用いた光学的測定により検出してもよい。
紫外線検出器としては、市販の検出器を使用することができ、島津製作所社製、ウォーターズ社製、日立製作所社製、アジレント・テクノロジー社製などが挙げられる。
【００５２】
紫外線検出器を用いた光学的測定においては、検出波長は、好ましくは２００〜４００ｎｍであり、より好ましくは２２０〜３５０ｎｍであり、さらに好ましくは２５０〜３００ｎｍである。
【００５３】
紫外線の照射下における反応後の有機化合物の減少率と、紫外線の非照射下における反応後の有機化合物の減少率との差から光毒性または光アレルギーを検出する場合の判定基準としては、例えば、以下の基準のいずれか一つ以上を満たす場合は陽性と判断し、以下の基準の全てを満たさない場合は陰性と判断することができる。
（１）
Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）システインの紫外線照射下における反応後の減少率から、Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）システインの紫外線非照射下における反応後の減少率を引いた差が１５％以上；
（２）
α−Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）リジンの紫外線照射下における反応後の減少率から、α−Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）リジンの紫外線非照射下における反応後の減少率を引いた差が１５％以上；または、
（３）上記（１）に記載の減少率の差と上記（２）に記載の減少率の差の平均が１０％以上。
【００５４】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００５５】
実施例における略号は以下の意味を有する。
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸
ＮＡＣ：Ｎ−[２−(ナフタレン−１−イル)アセチル]システイン
ＮＡＬ：α−Ｎ−［２−（ナフタレン−１−イル）アセチル］リジン
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
【００５６】
＜試験法＞
（１）各種溶液調製
（１−１）０．１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ水溶液
１）  １５ｍＬ容量のコニカルチューブにＥＤＴＡ・２Ｎａ・２Ｈ２Ｏ（同仁化学製）を３７．２ｍｇ秤量し、２５ｍＬメスピペットを使って１０ｍＬの蒸留水（光製薬製、日本薬局方注射用水）を加え、溶解させる（１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ水溶液）。
２）  １００ｍＬ容量の容器に蒸留水（光製薬製、日本薬局方注射用水）を５０ｍＬメスピペットを使って４９．５ｍＬ加え、そこに上記１）の１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ水溶液を０．５ｍｌ添加して混合し１００倍希釈する（０．１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ水溶液）。
【００５７】
（１−２）１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）
１）  １００ｍＬ容量の容器に無水リン酸二水素ナトリウム（富士フイルム和光純薬社製、特級）を０．６ｇ秤量し、５０ｍＬメスピペットを使って５０ｍＬの蒸留水（（光製薬製、日本薬局方注射用水））を加え、溶解させる。
２）  ５００ｍＬ容量の容器に５０ｍＬ（または１００ｍＬ）メスピペットを使って３００ｍＬの蒸留水（光製薬製、日本薬局方注射用水）を加える。
３）  無水リン酸水素二ナトリウム（富士フイルム和光純薬社製、特級）を４．２６ｇ秤量し、２）の蒸留水（光製薬製、日本薬局方注射用水）に添加して溶解させる。
４）  ３）の無水リン酸水素二ナトリウム溶液に１）の無水リン酸二水素ナトリウム溶液を２５ｍＬメスピペットを使って１６ｍＬ加える。
５）  ２５ｍＬメスピペットを使って４）の溶液から１７ｍＬを除き、残りの４）に０．１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ水溶液を１ｍＬ添加して３００ｍＬにする。この溶液中のＥＤＴＡの濃度は０．３３μｍｏｌ／Ｌであり、反応液中での濃度は０．２５μｍｏｌ／Ｌとなる。
６）  上記溶液の一部を別の容器に分取し、ｐＨメーターでｐＨ測定して、ｐＨ７．９〜８．１の範囲内であることを確認する。
【００５８】
（１−３）１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ１０．２）
１）  ５０ｍＬメスピペットを使って５００ｍＬ容量の容器に２８６ｍＬの蒸留水（光製薬製、日本薬局方注射用水）を加える。
２）  無水リン酸水素二ナトリウムを４．２６ｇ秤量し、１）の蒸留水（光製薬製、日本薬局方注射用水）に添加して溶解させる。
３）  ０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ水溶液（富士フイルム和光純薬製、特級）を２５ｍＬメスピペットを使って１４ｍＬ加える。
４）  上記溶液の一部を別の容器に分取し、ｐＨメーター（ポータブルｐＨ計（ＨＭ−２０Ｐ）、東亜電波工業）でｐＨ測定して、ｐＨ１０．１〜１０．３の範囲内であることを確認する。
【００５９】
（１−４）反応停止液（２．５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ水溶液または０．５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ水溶液）
蒸留水（富士フイルム和光純薬社製）１００ｍＬにＴＦＡ（富士フイルム和光純薬製、特級）を２．５ｍＬ添加する（２．５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ水溶液）。
蒸留水（富士フイルム和光純薬社製）１００ｍＬにＴＦＡ（富士フイルム和光純薬製、特級）を０．５ｍＬ添加する（０．５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ水溶液）。
【００６０】
（１−５）ＨＰＬＣ移動相Ａ：０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ水溶液
蒸留水（富士フイルム和光純薬社製）１ＬにＴＦＡを１．０ｍＬ添加する。
【００６１】
（１−６）ＨＰＬＣ移動相Ｂ：０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡアセトニトリル溶液
ＨＰＬＣグレードのアセトニトリル（富士フイルム和光純薬社製、ＨＰＬＣ用）１ＬにＴＦＡ１．０ｍＬを添加する。
【００６２】
（２）求核試薬ストック液調製
（２−１）ＮＡＣストック溶液調製
１試験では同一のストック溶液を使用し、１試験毎に使い切れる量に小分けして保存する。具体的な調製例を以下に示す。
１）  ５０ｍＬ容量の容器に１１．６ｍｇ（±０．１ｍｇ）のＮＡＣを秤量し、これに２５ｍＬメスピペットを使って２０ｍＬの１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を添加し、試験管ミキサーで軽く攪拌して溶解させる（２ｍｍｏｌ／Ｌ）。
２）  ５００ｍＬ容量の容器に同緩衝液を５０ｍＬメスピペットを使って１４９．５ｍＬ加え、そこに上記の２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮＡＣ溶液を０．５ｍＬ添加し、転倒混和をして３００倍希釈する（６．６６７μｍｏｌ／Ｌ）。
【００６３】
（２−２）ＮＡＬストック溶液調製（分子量＝３１４．３８）
１試験では同一のストック溶液を使用し、１試験毎に使い切れる量に小分けして保存する。具体的な調製例を以下に示す。
１）  ５０ｍＬ容量の容器に１２．６ｍｇ（±０．１  ｍｇ）のＮＡＬを秤量し、そこに２５ｍＬメスピペットを使って２０ｍＬの１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ１０．２）を添加し、試験管ミキサーで軽く攪拌して溶解させる（２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮＡＬ溶液）。
２）  ５００ｍＬ容量の容器に同緩衝液を５０ｍＬメスピペットを使って１４９．５ｍＬ加え、そこに上記の２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮＡＬ溶液を０．５ｍＬ添加し、転倒混和をして３００倍希釈する（６．６６７μｍｏｌ／Ｌ）。
【００６４】
（３）被験物質溶液調製
（３−１）被験物質が単体の場合
被験物質を水、アセトニトリル、アセトン、５質量％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）／アセトニトリル溶液のいずれかの溶媒を用いて１ｍｍｏｌ／Ｌに調製したものを被験物質溶液として用いる。また、溶媒は１ｍｍｏｌ／Ｌにて被験物質が溶解するものを使用し、複数の溶媒に溶解する場合は水、アセトニトリル、アセトン、５質量％ＤＭＳＯ／アセトニトリルの優先順位に従って選択する。
【００６５】
（３−２）被験物質が多成分系からなる混合物の場合
（３−２−１）被験物質が液体の場合
被験物質原液を「無希釈溶液」として、これを用いる。なお、この「無希釈溶液」を適切な溶媒で１／１０、１／１００、１／１０００など、適切に希釈した溶液を用いても良い。
（３−２−２）被験物質が固体の場合
最も良く溶解する溶媒に最大可溶濃度まで溶解させる。その後は、最大可溶濃度まで溶解させた溶液を「無希釈溶液」として試験する。なお、この「無希釈溶液」を適切な溶媒で１／１０、１／１００、１／１０００など、適切に希釈した溶液を用いても良い。
【００６６】
（４）反応
（４−１）添加
被験物質溶液は９６ウェルプレート（Ｕ９６ ＰＰ−０．５ ＭＬ ＮＡＴＵＲＡＬ、Ｔｈｅｒｍｏ（ＮＵＮＣ）社）上で主に１２連ピペットを用いて調製し、以下の用量に従って試薬を添加する。
求核試薬（ＮＡＣおよびＮＡＬ）：１５０μＬ
被験物質溶液：５０μＬ
【００６７】
（４−２）反応
プレートシール（レジスタントエンボスシール、島津ジーエルシー社）でしっかり密封し、プレートシェーカー（Ｔｉｔｒａｍａｘ １００、Ｈｅｉｄｏｌｐｈ社）で攪拌する。遠心機でスピンダウンしたのち、紫外線照射装置としてＳＸＬ−２５００Ｖ２（セリック社製）を用い、１時間、２０００μＷ／ｃｍ２の光照射を行う。その後２５℃、２３時間、遮光状態でインキュベートする。光非照射の対照として反応液調製後２５℃、２４時間、遮光状態でインキュベートしたものも用意する。
【００６８】
（４−３）反応停止
インキュベートした後、プレートシールを剥がし、各サンプルに反応停止液（２．５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ）を５０μＬずつ添加して反応を停止させる。蛍光検出器を用いて測定する場合は、あらかじめ別のプレートに反応停止液（０．５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ）を１８０μＬずつ分注しておき、そこに各サンプルを２０μＬ添加して１０倍希釈する。
【００６９】
（５）ＨＰＬＣ測定
求核試薬のＨＰＬＣ測定条件を以下に示す。
【００７０】
【表１】
2020129509.tif 000002
【００７１】
（６）データ解析
（６−１）減少率の算出
反応後の未反応のＮＡＣ又はＮＡＬ及び標準（反応前）のＮＡＣ又はＮＡＬのピーク面積の平均値（各々、ｎ＝３）から、次式に従ってＮＡＣ又はＮＡＬの減少率を計算する。
ＮＡＣ減少率（％  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）＝［１−（反応後の未反応のＮＡＣのピーク面積の平均値／標準（被験物質未添加）のＮＡＣピーク面積の平均値）］×１００ＮＡＬ減少率（％  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）＝［１−（反応後の未反応のＮＡＬのピーク面積の平均値／標準（被験物質未添加）のＮＡＬピーク面積の平均値）］×１００
【００７２】
反応後の未反応のＮＡＣのピーク面積の平均値とは、反応後の未反応のＮＡＣを３回測定した際の面積平均値であり、標準（被験物質未添加）のＮＡＣピーク面積の平均値とは、被験物質溶液の代わりに被験物質の溶解に使用した溶媒を添加した反応液のＮＡＣを３回測定した際の面積平均値である。
反応後の未反応のＮＡＬのピーク面積の平均値とは、反応後の未反応のＮＡＬを３回測定した際の面積平均値であり、標準（被験物質未添加）のＮＡＬピーク面積の平均値とは、被験物質溶液の代わりに被験物質の溶解に使用した溶媒を添加した反応液のＮＡＣを３回測定した際の面積平均値である。
【００７３】
（７）光アレルギー性予測の判定基準
ＮＡＣ／ＮＡＬの減少率から、下記に従って「光毒性および光アレルギー性」並びに「非光毒性および非光アレルギー性」を判定する。
【００７４】
（１）
Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）システインの紫外線照射下における反応後の減少率から、Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）システインの紫外線非照射下における反応後の減少率を引いた差が１５％以上；
（２）
α−Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）リジンの紫外線照射下における反応後の減少率から、α−Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）リジンの紫外線非照射下における反応後の減少率を引いた差が１５％以上；または、
（３）上記（１）に記載の減少率の差と上記（２）に記載の減少率の差の平均が１０％以上。
【００７５】
上記（１）〜（３）のいずれか一以上を満たす場合には、被験物質は、光毒性および光アレルギー性物質と判定する。
上記（１）〜（３）のいずれも満たさない場合には、被験物質は、非光毒性および非光アレルギー性物質と判定する。
【００７６】
＜実施例１＞一般化学物質を用いた光毒性および光アレルギー性予測
光毒性または光アレルギー性の情報のある市販の化学物質を用いて、本発明の評価法により光毒性および光アレルギー性の予測を行った。
【００７７】
被験物質：
下記の表に示す５９化合物において、表に記載の溶媒を用いてそれぞれ1 ｍｍｏｌ／Ｌの濃度に調製したものを試験に用いた。５９化合物の和文名は以下に示す。
Chlorpromazine HCl（クロルプロマジンHCl）
6-Methylcoumarin（6-メチルクマリン）
8-Methoxypsoralen（8-メトキシソラレン、キサントトキシン）
Benzophenone（ベンゾフェノン）
Bithionol（ビチオノール）
Enoxacin（エノキサシン）
Indomethacin（インドメタシン）
Piroxicam（ピロキシカム）
Pyridoxine HCl（ピリドキシンHCl）
Tribromsalan（トリブロムサラン）
p-Phenylenediamine（p-フェニレンジアミン）
Tetrachlorosalicylanilide（テトラクロロサリチルアニリド）
Diclofenac Na（ジクロフェナクNa）
Promethazine HCl（プロメタジンHCl）
Quinine HCl (2H2O)（キニーネHCl（2H2O））
Ketoprofen（ケトプロフェン）
Musk ambrette（ムスクアンブレット）
Musk xylene（ムスクキシレン）
Octyl dimethyl PABA（パラジメチルアミノ安息香酸  ２−エチルヘキシル）
Triclocarban（トリクロカルバン）
Dichlorophen（ジクロロフェン）
Fenticlor （フェンチクロール）
Glibenclamide（グリベンクラミド）
Hydrochlorothiazide（ヒドロクロロチアジド）
Isoniazid（イソニアジド）
Omadine (Na salt)（オマジン（Na塩））
Sulfanilamide（スルファニルアミド）
Sulfasalazine（スルファサラジン）
4-Methyl-7-ethoxycoumarin（4-メチル-7-エトキシクマリン）
7-Methoxycoumarin（7-メトキシクマリン）
5-Methoxypsoralen（5-メトキシソラレン、ベルガプテン）
Methyl-N-methylanthranilate（メチル-N-メチルアントラニレート）
Musk ketone（ムスクケトン）
Acridine（アクリジン）
Anthracene（アントラセン）
Tetracycline（テトラサイクリン）
Methyl β-naphthylketone（メチルβ-ナフチルケトン）
Fenofibrate（フェノフィブラート）
4'-Methylbenzylidene camphor（4'-メチルベンジリデンカンファー）
Aspirin（アスピリン）
Benzocaine（ベンゾカイン）
Erythromycin（エリスロマイシン）
Methylsalicylate（サリチル酸メチル）
Penicillin G（ペニシリンG）
Phenytoin（フェニトイン）
1,3-Butylene glycol（1,3-ブチレングリコール）
2-Propanol（2-プロパノール）
Ascorbic acid（アスコルビン酸）
Cetyl alcohol（セチルアルコール）
Ethanol（エタノール）
Glycerine（グリセリン）
Isopropyl myristate（ミリスチン酸イソプロピル）
Lauric acid（ラウリン酸）
Propylene glycol（プロピレングリコール）
Sodium laurate（ラウリン酸ナトリウム）
Sodium lauryl sulfate（ラウリル硫酸ナトリウム）
Sulisobenzone（スリソベンゾン）
DMSO（ジメチルスルホキシド）
Lactic acid（乳酸）
【００７８】
【表２−１】
2020129509.tif 000003
【表２−２】
2020129509.tif 000004
【００７９】
In vivo光毒性は、下記参考文献１〜３を参照。
In vivo光アレルギー性は、下記参考文献１及び２を参照。
参考文献：
1. Onoue S, Ohtake H, Suzuki G, Seto Y, Nishida H, Hirota M,Ashikaga T, Kouzuki H. 2016. Comparative study on prediction performance of photosafety testing tools on photoallergens. Toxicology In Vitro. 33:147-52
2. Onoue S, Suzuki G, Kato M, Hirota M, Nishida H, Kitagaki M, Kouzuki H, Yamada S. 2013. Non-animal photosafety assessment approaches for cosmetics based on the photochemical and photobiochemical properties. Toxicology In Vitro. 27(8):2316-24
3. Seto Y, Kato M, Yamada S, Onoue S. 2013. Development of micellar reactive oxygen species assay for photosafety evaluation of poorly water-soluble chemicals. Toxicology In Vitro. 27(6):1838-46
【００８０】
上記の１ｍｍｏｌ／Ｌ被験物質溶液と求核試薬であるＮＡＣおよびＮＡＬとを、それぞれ光非照射条件において２５℃で２４時間反応させた。光照射条件においては室温下にて１時間、２０００μＷ／ｃｍ２の光照射を行い、その後２５℃で２３時間反応させた。
【００８１】
反応はすべて９６ウェルプレート上で行い、各サンプルｎ＝３で調製した。また、比較対照として各被験物質を溶解している溶媒のみを添加した反応液も調製した。反応液中のＮＡＣおよびＮＡＬの濃度は５μｍｏｌ／Ｌ、被験物質の濃度は０．５ｍｍｏｌ／Ｌとなるよう調製した。２４時間後、ＨＰＬＣを用いてフォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）検出器による吸光での検出、および蛍光検出器による蛍光での検出の２種類の検出方法で測定した。ＨＰＬＣ測定の前にＰＤＡ検出においては反応液に、終濃度０．５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）となるようＴＦＡ水溶液を添加、蛍光検出においては０．５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液で各サンプルを１０倍希釈し、それらを測定に用いた。その後、測定結果をもとに、それぞれにおけるクロマトグラフとＮＡＣおよびＮＡＬの減少率を比較した。
【００８２】
測定条件：
上記の「（５）ＨＰＬＣ測定」に記載のＨＰＬＣ測定条件に従い、２８１ｎｍでのＵＶ検出または励起波長２８４ｎｍ、蛍光波長３３３ｎｍでの蛍光検出により、求核試薬（ＮＡＣおよびＮＡＬ）の減少率を求めた。
【００８３】
結果：
各化合物における光照射および光非照射の反応におけるＮＡＣおよびＮＡＬの減少率と平均スコア、光照射と光非照射におけるこれらの値の差を以下の表に示す。
【００８４】
１．ＵＶ検出における結果
【表３−１】
2020129509.tif 000005
【表３−２】
2020129509.tif 000006
【表３−３】
2020129509.tif 000007
【表３−４】
2020129509.tif 000008
【表３−５】
2020129509.tif 000009
【表３−６】
2020129509.tif 000010
【００８５】
２．蛍光検出における結果
【表４−１】
2020129509.tif 000011
【表４−２】
2020129509.tif 000012
【表４−３】
2020129509.tif 000013
【表４−４】
2020129509.tif 000014
【表４−５】
2020129509.tif 000015
【表４−６】
2020129509.tif 000016
【００８６】
今回使用した５９化合物のうち５８化合物においては、ＵＶ検出および蛍光検出のどちらにおいても光毒性または光アレルギー性の判定は同じ結果となった。１化合物（Ｓｕｌｆａｓａｌａｚｉｎｅ）についてはＵＶ検出において、ＨＰＬＣ測定における被験物質とＮＡＣの共溶出がみられ、且つＮＡＬのみでは陰性となったため、光毒性および光アレルギー性の有無を判別することはできなかった。
【００８７】
５９化合物のうち、光毒性または光アレルギー性のある物質は３８化合物であったが、本発明ではそのうちの３３化合物を光毒性および光アレルギー性と検出することができた。非光毒性および非光アレルギー性の２１化合物においては、そのうちの２０化合物において本発明でも非光毒性および非光アレルギー性となった。また、ＵＶ検出では２１化合物においてＨＰＬＣ測定における被験物質由来のピークとＮＡＣまたはＮＡＬのピークとの共溶出が見られたが、蛍光検出では全ての物質において共溶出はなかった。
【００８８】
考察：
上記の結果から本発明の試験法の５９化合物における予測精度（ｉｎ  ｖｉｖｏ試験との一致率）は約９０％となり、動物実験代替法の予測精度としては非常に高いことが分かった。また、ＵＶ検出および蛍光検出のどちらにおいてもＵＶ検出で判定不可であった１化合物を除き、判定結果は同じであったが、ＵＶ検出ではＨＰＬＣ測定において、被験物質由来のピークとＮＡＣまたはＮＡＬのピークとの共溶出が見られたのに対し、蛍光検出では全ての物質において共溶出はなかったことから、蛍光検出を用いることでより定量性のある結果が得られることが分かった。このことは、本発明が物質の光毒性および光アレルギー性を評価できる試験法であることを支持していると考えられる。
【００８９】
＜実施例２＞多成分混合液中に含まれる光毒性および光アレルギー性物質の検出
光毒性または光アレルギー性の情報のある市販の化学物質を複数混合した多成分混合液を調製し、これを用いて本発明の評価法により光毒性および光アレルギー性の予測を行った。
【００９０】
被験物質：
実施例１で使用した５９化合物のうち、下記の表に示す非光毒性および非光アレルギー性である５化合物と、光毒性または光アレルギー性である３化合物のうち１化合物を混合した、６化合物の混合液を３種類調製したものを試験に用いた。また、比較対照として非光毒性および非光アレルギー性である５化合物を混合した混合液も調製し、試験に用いた。なお、各混合液中に含まれる化合物の濃度は全て１ｍｍｏｌ／Ｌとなるよう調製した。
【００９１】
【表５】
2020129509.tif 000017
【００９２】
in vivo光毒性及びin vivo光アレルギーについては以下を参照。
1. Onoue S, Ohtake H, Suzuki G, Seto Y, Nishida H, Hirota M,Ashikaga T, Kouzuki H. 2016. Comparative study on prediction performance of photosafety testing tools on photoallergens. Toxicology In Vitro. 33:147-52
2. Onoue S, Suzuki G, Kato M, Hirota M, Nishida H, Kitagaki M, Kouzuki H, Yamada S. 2013. Non-animal photosafety assessment approaches for cosmetics based on the photochemical and photobiochemical properties. Toxicology In Vitro. 27(8):2316-24
【００９３】
実験条件：
上記の合液を求核試薬であるＮＡＣおよびＮＡＬとそれぞれ光非照射条件においては２５℃で２４時間反応させた。光照射条件においては室温下にて１時間、２０００μＷ／ｃｍ２の光照射を行い、その後２５℃で２３時間反応させた。
反応はすべて９６ウェルプレート上で行い、各サンプルｎ＝３で調製した。また、ＮＡＣ、ＮＡＬの減少率の算出に使用する溶媒のみを添加した反応液も調製した。反応液中のＮＡＣおよびＮＡＬの濃度は５μｍｏｌ／Ｌ、被験物質の濃度は０．５ｍｍｏｌ／Ｌとなるよう調製した。２４時間後、ＨＰＬＣを用いてフォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）検出器による吸光での検出、および蛍光検出器による蛍光での検出の２種類の検出方法で測定した。ＨＰＬＣ測定の前にＰＤＡ検出においては反応液に、終濃度０．５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）となるようＴＦＡ水溶液を添加、蛍光検出においては０．５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液で各サンプルを１０倍希釈し、それらを測定に用いた。その後、測定結果をもとに、それぞれにおけるクロマトグラフとＮＡＣ、ＮＡＬの減少率を比較した。
【００９４】
測定条件：
上記の「（５）ＨＰＬＣ測定」に記載のＨＰＬＣ測定条件に従い、２８１ｎｍでのＵＶ検出または励起波長２８４ｎｍ、蛍光波長３３３ｎｍでの蛍光検出により、求核試薬（ＮＡＣおよびＮＡＬ）の減少率を求めた。
【００９５】
結果：
各混合液における光照射および光非照射の反応におけるＮＡＣおよびＮＡＬの減少率と平均スコア、光照射と光非照射におけるこれらの値の差を以下の表に示す。
【００９６】
１．ＵＶ検出における結果
【表６】
2020129509.tif 000018
【００９７】
２．蛍光検出における結果
【表７】
2020129509.tif 000019
【００９８】
今回使用した５化合物の非光毒性および非光アレルギー性化合物と３種類の光毒性および光アレルギー性化合物との混合液においては、ＵＶ検出および蛍光検出のどちらにおいても光毒性または光アレルギー性の判定は同じ結果となった。また、光毒性および光アレルギー性化合物単体における判定結果と同様に、３種の混合液全てにおいて光毒性および光アレルギー性と検出することができた。５化合物の非光毒性および非光アレルギー性化合物のみを混合した混合液についても、各化合物単体の時と同様に非光毒性および非光アレルギー性となった。ＨＰＬＣ測定において、ＵＶ検出では１つの混合液で、光毒性および光アレルギー性化合物単体の時と同様に、被験物質由来のピークとＮＡＣまたはＮＡＬのピークとの共溶出が見られたが、蛍光検出では全ての物質において共溶出はなかった。
【００９９】
考察：
上記の結果から本発明の試験法は多成分系の混合液に含まれる光毒性および光アレルギー性化合物も検出できる可能性が高いことが示唆された。また、判定結果は同じであったが、ＵＶ検出ではＨＰＬＣ測定において、被験物質由来のピークとＮＡＣまたはＮＡＬのピークとの共溶出が見られたのに対し、蛍光検出では全ての物質において共溶出はなかったことから、蛍光検出を用いることでより定量性のある結果が得られることが分かった。このことは、物質が単体か多成分からなる混合物かによらず、本発明が光毒性および光アレルギー性を評価できる試験法であることを支持していると考えられる。
【０１００】
＜実施例３＞模擬化粧品中に含まれる光アレルギー性化合物の検出
公知のデータベースに記載の処方例をもとに調製した模擬化粧品に、光アレルギー性の情報のある市販の化学物質を混合した多成分混合液を調製し、これを用いて本発明の評価法により光アレルギー性の予測を行った。
【０１０１】
被験物質：
化粧品配合成分のデータベースであるＣｏｓｍｅｔｉｃ−Ｉｎｆｏ.ｊｐに記載の処方例を参考に、模擬化粧品として下記の表８に示す成分を混合した模擬化粧水、模擬乳液および模擬クレンジングオイルを調製した。これらの模擬化粧品に実施例１で使用した５９化合物のうち、下記の表９に示す光アレルギー性である３化合物の内１化合物を混合した多成分混合液を９種類調製したものを試験に用いた。また、比較対照として模擬化粧水、模擬乳液または模擬クレンジングオイルのみの溶液を試験に用いた。なお、各混合液中に含まれる化合物の濃度は、各模擬化粧品については成分の合計が０．５ｍｇ／ｍＬとなるよう調製し、光アレルギー性である３化合物についてはそれぞれ０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬまたは０．５ｍｇ／ｍＬとなるよう調製した。
【０１０２】
【表８】
2020129509.tif 000020
【０１０３】
【表９】
2020129509.tif 000021
1. Onoue S et al. (2016). Comparative study on prediction performance of photosafety testing tools on photoallergens. Toxicol In Vitro. 33:147-52
2. Onoue S et al. (2013). Non-animal photosafety assessment approaches for cosmetics based on the photochemical and photobiochemical properties. Toxicol In Vitro. 27(8):2316-24
【０１０４】
実験条件：
上記混合液と求核試薬であるＮＡＣおよびＮＡＬとを、それぞれ光非照射条件において２５℃で２４時間反応させた。光照射条件においては室温下にて１時間、２０００μＷ／ｃｍ２の光照射を行い、その後２５℃で２３時間反応させた。
反応はすべて９６ウェルプレート上で行い、各サンプルｎ＝３で調製した。また、ＮＡＣ、ＮＡＬの減少率（％）の算出に使用する溶媒のみを添加した反応液も調製した。反応液中のＮＡＣおよびＮＡＬの濃度は５μｍｏｌ／Ｌ、被験物質の濃度は０．０１２５ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬまたは０．１２５ｍｇ／ｍＬとなるよう調製した。２４時間後、ＨＰＬＣを用いてフォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）検出器による吸光での検出、および蛍光検出器による蛍光での検出の２種類の検出方法で測定した。ＨＰＬＣ測定の前にＰＤＡ検出においては反応液に、終濃度０．５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）となるようＴＦＡ水溶液を添加、蛍光検出においては０．５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液で各サンプルを１０倍希釈し、それらを測定に用いた。その後、測定結果をもとに、それぞれにおけるクロマトグラフとＮＡＣ、ＮＡＬの減少率を比較した。
【０１０５】
測定条件：
上記の「（５）ＨＰＬＣ測定」に記載のＨＰＬＣ測定条件に従い、２８１ｎｍでのＵＶ検出または励起波長２８４ｎｍ、蛍光波長３３３ｎｍでの蛍光検出により、求核試薬（ＮＡＣおよびＮＡＬ）の減少率（％）を求めた。
【０１０６】
結果：
各混合液における光照射および光被照射の反応におけるＮＡＣおよびＮＡＬの減少率と平均スコア、光照射と光被照射におけるこれらの値の差を以下の表に示す。
【０１０７】
１．ＵＶ検出における結果
【表１０−１】
2020129509.tif 000022
【表１０−２】
2020129509.tif 000023
【表１０−３】
2020129509.tif 000024
【表１０−４】
2020129509.tif 000025
【０１０８】
２．蛍光検出における結果
【表１１−１】
2020129509.tif 000026
【表１１−２】
2020129509.tif 000027
【表１１−３】
2020129509.tif 000028
【表１１−４】
2020129509.tif 000029
【０１０９】
今回使用した模擬化粧品と３種類の光アレルギー性化合物との混合液においては、ＵＶ検出および蛍光検出のどちらにおいても、光アレルギー性化合物の濃度が０．０５ｍｇ／ｍｌにおけるＴｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｓａｌｉｃｙｌａｎｉｌｉｄｅを添加した場合を除き、光アレルギー性の判定は同じ結果となった。また、光アレルギー性化合物の濃度が０．２ｍｇ／ｍｌ以上においては、光毒性および光アレルギー性化合物単体における判定結果と同様に、３種の混合液全てにおいて光毒性・光アレルギー性と検出することができた。
これに対し、化合物濃度が０．０５ｍｇ／ｍｌにおいては、模擬化粧品および模擬クレンジングオイルにＨｙｄｒｏｃｈｌｏｒｏｔｈｉａｚｉｄまたは, Ｓｕｌｆａｎｉｌａｍｉｄｅを添加した場合と、模擬乳液にＨｙｄｒｏｃｈｌｏｒｏｔｈｉａｚｉｄｅを添加した場合において、ＵＶ検出と蛍光検出の両方で非光アレルギー性と判定された。また、同化合物濃度におけるＴｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｓａｌｉｃｙｌａｎｉｌｉｄｅを添加した場合において、ＨＰＬＣ測定におけるＵＶ検出で被験物質とＮＡＣの共溶出がみられ、且つＮＡＬのみでは陰性となったため、光アレルギー性の有無を判別することはできなかった。
ＨＰＬＣ測定において、ＵＶ検出ではＴｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｓａｌｉｃｙｌａｎｉｌｉｄｅを添加した場合において、光アレルギー性化合物単体の時と同様に、被験物質由来のピークとＮＡＣまたはＮＡＬのピークとの共溶出が見られたが、蛍光検出では全ての物質において共溶出はなかった。
【０１１０】
考察：
上記の結果から本発明の試験法は多成分系の混合液に光アレルギー性化合物が０．２ｍｇ／ｍｌ以上含まれている場合、検出できる可能性が高いことが示唆された。光アレルギー性化合物濃度が０．０５ｍｇ／ｍｌの場合においては、化合物単体でも判定基準付近の減少率であることから、多成分からなる混合物かによらず、本発明の試験法における検出限界付近である可能性が考えられる。
また、ＵＶ検出ではＨＰＬＣ測定において、被験物質由来のピークとＮＡＣまたはＮＡＬのピークとの共溶出が見られ、１化合物において光アレルギー性の有無を判別することはできなかったのに対し、蛍光検出では全ての物質において共溶出はなかったことから、蛍光検出を用いることでより定量性のある結果が得られることが分かった。
以上のことは、物質が単体か多成分からなる混合物かによらず、本発明が光アレルギー性を評価できる試験法であることを支持していると考えられる。
【手続補正書】
【提出日】令和3年6月17日(2021.6.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
（６）データ解析
（６−１）減少率の算出
反応後の未反応のＮＡＣ又はＮＡＬ及び標準（被験物質未添加）のＮＡＣ又はＮＡＬのピーク面積の平均値（各々、ｎ＝３）から、次式に従ってＮＡＣ又はＮＡＬの減少率を計算する。
ＮＡＣ減少率（％  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）＝［１−（反応後の未反応のＮＡＣのピーク面積の平均値／標準（被験物質未添加）のＮＡＣピーク面積の平均値）］×１００
ＮＡＬ減少率（％  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）＝［１−（反応後の未反応のＮＡＬのピーク面積の平均値／標準（被験物質未添加）のＮＡＬピーク面積の平均値）］×１００
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
２．蛍光検出における結果
【表４−１】
2020129509.tif 000030
【表４−２】
2020129509.tif 000031
【表４−３】
2020129509.tif 000032
【表４−４】
2020129509.tif 000033
【表４−５】
2020129509.tif 000034
【表４−６】
2020129509.tif 000035
【国際調査報告】
2020129509.tif 000036
2020129509.tif 000037
2020129509.tif 000038
2020129509.tif 000039
2020129509.tif 000040
2020129509.tif 000041