(57)【要約】  生体触媒を用いた３−ヒドロキシイソ酪酸エステルの製造方法として、アルコールアシルトランスフェラーゼの存在下、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡにアルコールまたはフェノール類を作用させて、３−ヒドロキシイソ酪酸エステルを生成する工程を含む、３−ヒドロキシイソ酪酸エステルの製造方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルコールアシルトランスフェラーゼの存在下、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡにアルコールまたはフェノール類を作用させて、３−ヒドロキシイソ酪酸エステルを生成する工程を含む、３−ヒドロキシイソ酪酸エステルの製造方法。
【請求項２】
前記アルコールアシルトランスフェラーゼが植物由来である、請求項１記載の３−ヒドロキシイソ酪酸エステルの製造方法。
【請求項３】
前記植物が、アオイ目、バラ目またはナス目に属するものである、請求項２記載の３−ヒドロキシイソ酪酸エステルの製造方法。
【請求項４】
前記植物が、アオイ科、バラ科、またはナス科に属するものである、請求項２記載の３−ヒドロキシイソ酪酸エステルの製造方法。
【請求項５】
前記植物が、ドリアン属、リンゴ属、またはナス属に属するものである、請求項２記載の３−ヒドロキシイソ酪酸エステルの製造方法。
【請求項６】
前記植物が、ドリアン、リンゴ、またはトマトである、請求項２記載の３−ヒドロキシイソ酪酸エステルの製造方法。
【請求項７】
前記アルコールアシルトランスフェラーゼが、以下の（１）〜（４）のいずれかのアミノ酸配列を含んでなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の３−ヒドロキシイソ酪酸エステルの製造方法、
（１）配列番号１、配列番号５、または配列番号７のアミノ酸配列。
（２）配列番号１、配列番号５、または配列番号７のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換および／または付加されたアミノ酸配列。
（３）配列番号１、配列番号５、または配列番号７のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列。
（４）配列番号２、配列番号６、または配列番号８の塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列。
【請求項８】
前記アルコールアシルトランスフェラーゼを発現する遺伝子組み換え微生物を用いる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の３−ヒドロキシイソ酪酸エステルの製造方法。
【請求項９】
３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡが、前記微生物の生体内でメタクリリル−ＣｏＡから合成されるものである、請求項８記載の３−ヒドロキシイソ酪酸エステルの製造方法。
【請求項１０】
アルコールアシルトランスフェラーゼの存在下、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡにアルコールまたはフェノール類を作用させて、３−ヒドロキシイソ酪酸エステルを生成する工程と、
３−ヒドロキシイソ酪酸エステルの脱水反応によりメタクリル酸エステルを生成する工程と、を含むメタクリル酸エステルの製造方法。
【請求項１１】
以下の（１）〜（４）のいずれかのタンパク質。
（１）配列番号１のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質。
（２）配列番号１のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換および／または付加されたアミノ酸配列を含んでなり、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡのエステル化を触媒するアルコールアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
（３）配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号１のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡのエステル化を触媒するアルコールアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
（４）配列番号２の塩基配列、または配列番号２の塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を含んでなり、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡのエステル化を触媒するアルコールアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３−ヒドロキシイソ酪酸エステルおよびメタクリル酸エステルの製造方法に関する。より詳しくは、アルコールアシルトランスフェラーゼの触媒反応を利用して３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡから３−ヒドロキシイソ酪酸エステルを生成する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
メタクリル酸エステルは、主にアクリル樹脂の原料として使われており、塗料、接着剤および樹脂改質剤などの分野のコモノマーとしても多くの需要がある。メタクリル酸エステルは、例えば３−ヒドロキシイソ酪酸エステルを化学的手法により脱水することで生成できる。【０００３】
アルコールアシルトランスフェラーゼは、フルーティーフレーバー合成酵素として知られている。特許文献１，２には、アルコールアシルトランスフェラーゼの存在下、メタクリリル−ＣｏＡにアルコールまたはフェノール類を作用させて、メタクリル酸エステルを生成する反応が開示されている。これらの反応は、鎖式炭化水素で構成されたＣｏＡ化合物を出発物質としている。
ＣｏＡ化合物の鎖式炭化水素に水酸基が導入された場合、ＣｏＡ化合物の物理化学的性質が変化すると予想されるが、アルコールアシルトランスフェラーゼが水酸化された鎖式炭化水素で構成されたＣｏＡ化合物についてもそのエステル化を触媒し得るかどうかは明らかでなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開２０１４／０３８２１４号
【特許文献２】国際公開２０１５／１３３１４６号
【特許文献３】特開平７−１７９０９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、生体触媒を用いた３−ヒドロキシイソ酪酸エステルの製造方法を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題解決のため、本発明は、以下の［１］〜［１９］を提供する。
［１］  アルコールアシルトランスフェラーゼの存在下、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡにアルコールまたはフェノール類を作用させて、３−ヒドロキシイソ酪酸エステルを生成する工程を含む、３−ヒドロキシイソ酪酸エステルの製造方法。
［２］  前記アルコールアシルトランスフェラーゼが植物由来である、［１］の３−ヒドロキシイソ酪酸エステルの製造方法。
［３］  前記植物が、アオイ目、バラ目またはナス目に属するものである、［２］の３−ヒドロキシイソ酪酸エステルの製造方法。
［４］  前記植物が、アオイ科、バラ科、またはナス科に属するものである、［２］の３−ヒドロキシイソ酪酸エステルの製造方法。
［５］  前記植物が、ドリアン属、リンゴ属、またはナス属に属するものである、［２］の３−ヒドロキシイソ酪酸エステルの製造方法。
［６］  前記植物が、ドリアン、リンゴ、またはトマトである、［２］の３−ヒドロキシイソ酪酸エステルの製造方法。
［７］  前記アルコールアシルトランスフェラーゼが、以下の（１）〜（４）のいずれかのアミノ酸配列を含んでなる、［１］〜［６］のいずれかの３−ヒドロキシイソ酪酸エステルの製造方法、
（１）配列番号１、配列番号５、または配列番号７のアミノ酸配列。
（２）配列番号１、配列番号５、または配列番号７のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換および／または付加されたアミノ酸配列。
（３）配列番号１、配列番号５、または配列番号７のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列。
（４）配列番号２、配列番号６、または配列番号８の塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列。
［８］  前記アルコールアシルトランスフェラーゼを発現する遺伝子組み換え微生物を用いる、［１］〜［７］のいずれかの３−ヒドロキシイソ酪酸エステルの製造方法。
［９］  ３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡが、前記微生物の生体内でメタクリリル−ＣｏＡから合成されるものである、［８］の３−ヒドロキシイソ酪酸エステルの製造方法。【０００７】
［１０］  アルコールアシルトランスフェラーゼの存在下、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡにアルコールまたはフェノール類を作用させて、３−ヒドロキシイソ酪酸エステルを生成する工程と、
３−ヒドロキシイソ酪酸エステルの脱水反応によりメタクリル酸エステルを生成する工程と、を含むメタクリル酸エステルの製造方法。
［１１］  前記アルコールアシルトランスフェラーゼが植物由来である、［１０］のメタクリル酸エステルの製造方法。
［１２］  前記植物が、アオイ目、バラ目またはナス目に属するものである、［１１］のメタクリル酸エステルの製造方法。
［１３］  前記植物が、アオイ科、バラ科、またはナス科に属するものである、［１１］のメタクリル酸エステルの製造方法。
［１４］  前記植物が、ドリアン属、リンゴ属、またはナス属に属するものである、［１１］のメタクリル酸エステルの製造方法。
［１５］  前記植物が、ドリアン、リンゴ、またはトマトである、［１１］のメタクリル酸エステルの製造方法。
［１６］  前記アルコールアシルトランスフェラーゼが、以下の（１）〜（４）のいずれかのアミノ酸配列を含んでなる、［１０］〜［１５］のいずれかのメタクリル酸エステルの製造方法、
（１）配列番号１、配列番号５、または配列番号７のアミノ酸配列。
（２）配列番号１、配列番号５、または配列番号７のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換および／または付加されたアミノ酸配列。
（３）配列番号１、配列番号５、または配列番号７のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列。
（４）配列番号２、配列番号６、または配列番号８の塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列。
［１７］  前記アルコールアシルトランスフェラーゼを発現する遺伝子組み換え微生物を用いる、［１０］〜［１６］のいずれかのメタクリル酸エステルの製造方法。
［１８］  ３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡが、前記微生物の生体内でメタクリリル−ＣｏＡから合成されるものである、［１７］のメタクリル酸エステルの製造方法。【０００８】
［１９］  以下の（１）〜（４）のいずれかのタンパク質。
（１）配列番号１のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質。
（２）配列番号１のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換および／または付加されたアミノ酸配列を含んでなり、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡのエステル化を触媒するアルコールアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
（３）配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号１のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡのエステル化を触媒するアルコールアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
（４）配列番号２の塩基配列、または配列番号２の塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を含んでなり、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡのエステル化を触媒するアルコールアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、生体触媒を用いた３−ヒドロキシイソ酪酸エステルの製造方法が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００１１】
［３−ヒドロキシイソ酪酸エステルおよびメタクリル酸エステルの製造方法］
本発明に係る３−ヒドロキシイソ酪酸エステルの製造方法は、以下の「工程Ａ」を含む。また、本発明に係るメタクリル酸エステルの製造方法は、工程Ａに加えて以下の「工程Ｂ」を含む。
工程Ａ：アルコールアシルトランスフェラーゼの存在下、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡにアルコールまたはフェノール類を作用させて、３−ヒドロキシイソ酪酸エステルを生成する工程。
工程Ｂ：３−ヒドロキシイソ酪酸エステルの脱水反応によりメタクリル酸エステルを生成する工程。
工程Ａおよび工程Ｂを以下に示す。
【００１２】
【化１】
2019168154.tif 000002
【００１３】
本発明において、「メタクリル酸エステル」とは、式１で示される化合物である。式１において、Ｒは直鎖あるいは分岐の炭素数１〜２０の炭化水素基を表す。炭化水素基は、飽和または不飽和の非環式であってもよく、飽和または不飽和の環式であってもよい。好ましくは直鎖あるいは分岐鎖の炭素数１〜１０の無置換のアルキル基、アラルキル基またはアリール基である。特に好ましくはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基、２−ヘキシル基、ジメチルブチル基、エチルブチル基、ヘプチル基、オクチル基、２−エチルヘキシル基の炭素数１〜８のアルキル基、ベンジル基またはフェニル基である。
【００１４】
ＣＨ2＝Ｃ（ＣＨ3）ＣＯＯ−Ｒ    （式１）
【００１５】
［アルコール・フェノール類］
工程Ａで用いられる「アルコール」または「フェノール類」は、以下の式２で示される化合物である。アルコールまたはフェノール類の構造は、メタクリル酸エステルに対応することから、その構造は、前記式１のＲと同じ定義であり、直鎖あるいは分岐の炭素数１〜２０の炭化水素基を表す。炭化水素基は、飽和または不飽和の非環式であってもよく、飽和または不飽和の環式であってもよい。好ましくは直鎖あるいは分岐の炭素数１〜１０の無置換のアルコール、アラルキルアルコールまたはフェノール類であり、より好ましくはメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、ｎ−ペンチルアルコール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ−ペンチルアルコール、ｎ−ヘキシルアルコール、イソヘキシルアルコール、２−ヘキシルアルコール、ジメチルブチルアルコール、エチルブチルアルコール、ヘプチルアルコール、オクチルアルコール、２−エチルヘキシルアルコールの炭素数１〜８のアルキルアルコール、ベンジルアルコールまたはフェノールである。特に好ましくは、メタノール、エタノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｎ−ヘキシルアルコールである。
【００１６】
Ｒ−ＯＨ    （式２）
【００１７】
［アルコールアシルトランスフェラーゼ］
アルコールアシルトランスフェラーゼ（以下「ＡＡＴ」とも称する）は、アシル−ＣｏＡのアシル基をアルコールまたはフェノール類に転移させてエステルを生成する反応を触媒する活性を有する。ＡＡＴは、種々の果物におけるエステルの生成に関与していると言われている。ＡＡＴはショウガ目（バナナ）、バラ目（イチゴ、リンゴ、ナシ、モモ）、ウリ目（メロン）、ツツジ目（キウイ）、シソ目（オリーブ）、ナス目（トマト）、ムクロジ目（レモン、マンゴー）等の植物に存在することが知られている。
【００１８】
工程Ａで用いられるＡＡＴは、特に３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡのアシル基をアルコールまたはフェノール類に転移させて３−ヒドロキシイソ酪酸エステルを生成する反応を触媒する活性（以下、単に「触媒活性」あるいは「ＡＡＴ活性」とも称する）を有する。
【００１９】
工程Ａで用いられるＡＡＴは、上記触媒活性を有する限り、その由来は限定されない。ＡＡＴは、植物由来であることが好ましい。例えば、ショウガ目（Ｚｉｎｇｉｂｅｒａｌｅｓ）、バラ目（Ｒｏｓａｌｅｓ）、ツツジ目（Ｅｒｉｃａｌｅｓ）、ウリ目（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｌｅｓ）、アブラナ目（Ｂｒａｓｓｉｃａｌｅｓ）、クスノキ目（Ｌａｕｒａｌｅｓ）、イネ目（Ｐｏａｌｅｓ）、ヤシ目（Ａｒｅｃａｌｅｓ）、クサスギカズラ目（Ａｓｐａｒａｇａｌｅｓ）、ユキノシタ目（Ｓａｘｉｆｒａｇａｌｅｓ）、ナデシコ目（Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｌｅｓ）、ブドウ目（Ｖｉｔａｌｅｓ）、キントラノオ目（Ｍａｌｐｉｇｈｉａｌｅｓ）、カタバミ目（Ｏｘａｌｉｄａｌｅｓ）、マメ目（Ｆａｂａｌｅｓ）、ムクロジ目（Ｓａｐｉｎｄａｌｅｓ）、アオイ目（Ｍａｌｖａｌｅｓ）、フトモモ目（Ｍｙｒｔａｌｅｓ）、キンポウゲ目（Ｒａｎｕｎｃｕｌａｌｅｓ）、ナス目（Ｓｏｌａｎａｌｅｓ）、シソ目（Ｌａｍｉａｌｅｓ）、リンドウ目（Ｇｅｎｔｉａｎａｌｅｓ）、モクレン目（Ｍａｇｎｏｌｉａｌｅｓ)およびキク目（Ａｓｔｅｒａｌｅｓ）の各目に属する植物由来のＡＡＴを好適に用いることができる。これらのうち、アオイ目、バラ目及びナス目に属する植物由来のＡＡＴがより好ましい。
なお、本発明において、植物の分類はＡＰＧ植物分類体系第３版（Ｂｏｔａｎｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌｉｎｎｅａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  ２００９，  １６１，  １０５１２１）に従うものとする。
【００２０】
ＡＡＴは以下の方法により、前記植物から容易に取得することが可能である。すなわち、まず、植物組織の適当な部位を必要に応じて裁断する。裁断した部位に３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡとアルコールまたはフェノール類を含む溶液を添加して振とうし、一定時間反応させる。反応液中の３−ヒドロキシイソ酪酸エステルの有無をＧＣ（ガスクロマトグラフィー）により確認することにより触媒活性を確認する。具体的には、例えば、葉、花、蕾、果肉あるいは果皮を裁断し、０．０１〜１０ｍＭの３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡおよび２〜５０倍モル量のｎ−ブタノールを含む溶液を添加し、３０℃で１〜１０時間振とうする。反応終了後、ＧＣにより３−ヒドロキシイソ酪酸ブチルの有無を確認することにより、本発明に利用可能なＡＡＴを取得できる。
【００２１】
ショウガ目に属するものとしてはバショウ科（Ｍｕｓａｃｅａｅ）およびショウガ科（Ｚｉｎｇｉｂｅｒａｃｅａｅ）；
バラ目に属するものとしてはバラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）およびクワ科（Ｍｏｒａｃｅａｅ）；
ツツジ目に属するものとしてはツツジ科（Ｅｒｉｃａｃｅａｅ）、マタタビ科（Ａｃｔｉｎｉｄｉａｃｅａｅ）、カキノキ科（Ｅｂｅｎａｃｅａｅ）およびツバキ科（Ｔｈｅａｃｅａｅ）；
ウリ目に属するものとしてはウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）；
アブラナ目に属するものとしてはパパイア科（Ｃａｒｉｃａｃｅａｅ）およびアブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）；
クスノキ目に属するものとしてはクスノキ科（Ｌａｕｒａｃｅａｅ）；
イネ目に属するものとしてはパイナップル科（Ｂｒｏｍｅｌｉａｃｅａｅ）およびイネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）；
ヤシ目に属するものとしてはヤシ科（Ａｒｅｃａｃｅａｅ）；
クサスギカズラ目に属するものとしてはラン科（Ｏｒｃｈｉｄａｃｅａｅ）およびアヤメ科（Ｉｒｉｄａｃｅａｅ）；
ユキノシタ目に属するものとしてはスグリ科（Ｇｒｏｓｓｕｌａｒｉａｃｅａｅ）；
ナデシコ目に属するものとしてはナデシコ科（Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ）；
ブドウ目に属するものとしてはブドウ科（Ｖｉｔａｃｅａｅ）；
キントラノオ目に属するものとしてはキントラノオ科（Ｍａｌｐｉｇｈｉａｃｅａｅ）、トケイソウ科（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａｃｅａｅ）、トウダイグサ科（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ）およびヤナギ科（Ｓａｌｉｃａｃｅａｅ）；
カタバミ目に属するものとしてはカタバミ科（Ｏｘａｌｉｄａｃｅａｅ）；
マメ目に属するものとしてはマメ科（Ｆａｂａｃｅａｅ）；
ムクロジ目に属するものとしてはウルシ科（Ａｎａｃａｒｄｉａｃｅａｅ）、ビーベルステイニア科（Ｂｉｅｂｅｒｓｔｅｉｎｉａｃｅａｅ）、カンラン科（Ｂｕｒｓｅｒａｃｅａｅ）、キルキア科（Ｋｉｒｋｉａｃｅａｅ）、センダン科（Ｍｅｌｉａｃｅａｅ）、ソウダノキ科（Ｎｉｔｒａｒｉａｃｅａｅ）、ミカン科（Ｒｕｔａｃｅａｅ）、ムクロジ科（Ｓａｐｉｎｄａｃｅａｅ）およびニガキ科（Ｓｉｍａｒｏｕｂａｃｅａｅ）；
アオイ目に属するものとしてはベニノキ科（Ｂｉｘａｃｅａｅ）、ハンニチバナ科（Ｃｉｓｔａｃｅａｅ）、キティヌス科（Ｃｙｔｉｎａｃｅａｅ）、フタバガキ科（Ｄｉｐｔｅｒｏｃａｒｐａｃｅａｅ）、アオイ科（Ｍａｌｖａｃｅａｅ）、ナンヨウザクラ科（Ｍｕｎｔｉｎｇｉａｃｅａｅ）、ネウラダ科（Ｎｅｕｒａｄａｃｅａｅ）、サルコラエナ科（Ｓａｒｃｏｌａｅｎａｃｅａｅ）、スファエロセパルム科（Ｓｐｈａｅｒｏｓｅｐａｌａｃｅａｅ）およびジンチョウゲ科（Ｔｈｙｍｅｌａｅａｃｅａｅ）；
フトモモ目に属するものとしてはミソハギ科（Ｌｙｔｈｒａｃｅａｅ）、アカバナ科（Ｏｎａｇｒａｃｅａｅ）およびフトモモ科（Ｍｙｒｔａｃｅａｅ）；
キンポウゲ目に属するものとしてはキンポウゲ科（Ｒａｎｕｎｃｕｌａｃｅａｅ）およびケシ科（Ｐａｐａｖｅｒａｃｅａｅ）；
ナス目に属するものとしてはナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）；
シソ目に属するものとしてはキツネノマゴ科（Ａｃａｎｔｈａｃｅａｅ）、ノウゼンカズラ科（Ｂｉｇｎｏｎｉａｃｅａｅ）、ビブリス科（Ｂｙｂｌｉｄａｃｅａｅ）、キンチャクソウ科（Ｃａｌｃｅｏｌａｒｉａｃｅａｅ）、カールマニア科（Ｃａｒｌｅｍａｎｎｉａｃｅａｅ）、イワタバコ科（Ｇｅｓｎｅｒｉａｃｅａｅ）、シソ科（Ｌａｍｉａｃｅａｅ）、アゼナ科（Ｌｉｎｄｅｒｎｉａｃｅａｅ）、タヌキモ科（Ｌｅｎｔｉｂｕｌａｒｉａｃｅａｅ）、ツノゴマ科（Ｍａｒｔｙｎｉａｃｅａｅ）、モクセイ科（Ｏｌｅａｃｅａｅ）、ハマウツボ科（Ｏｒｏｂａｎｃｈａｃｅａｅ）、キリ科（Ｐａｕｌｏｗｎｉａｃｅａｅ）、ゴマ科（Ｐｅｄａｌｉａｃｅａｅ）、ハエドクソウ科（Ｐｈｒｙｍａｃｅａｅ）、オオバコ科（Ｐｌａｎｔａｇｉｎａｃｅａｅ）、プロコスペルマ科（Ｐｌｏｃｏｓｐｅｒｍａｔａｃｅａｅ、シュレーゲリア科（Ｓｃｈｌｅｇｅｌｉａｃｅａｅ）、ゴマノハグサ科（Ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉａｃｅａｅ）、スティルベ科（Ｓｔｉｌｂａｃｅａｅ）、テトラコンドラ科（Ｔｅｔｒａｃｈｏｎｄｒａｃｅａｅ）、トマンデルシア科（Ｔｈｏｍａｎｄｅｒｓｉａｃｅａｅ）およびクマツヅラ科（Ｖｅｒｂｅｎａｃｅａｅ）；
リンドウ目に属するものとしてはキョウチクトウ科（Ａｐｏｃｙｎａｃｅａｅ）；
モクレン目に属するものとしてはバンレイシ科（Ａｎｎｏｎａｃｅａｅ）、デゲネリア科（Ｄｅｇｅｎｅｒｉａｃｅａｅ）、エウポマティア科（Ｅｕｐｏｍａｔｉａｃｅａｅ）、ヒマンタンドラ科（Ｈｉｍａｎｔａｎｄｒａｃｅａｅ）、モクレン科（Ｍａｇｎｏｌｉａｃｅａｅ）およびニクズク科（Ｍｙｒｉｓｔｉｃａｃｅａ）；
キク目に属するものとしてはアルセウオスミア科（Ａｌｓｅｕｏｓｍｉａｃｅａｅ）、アルゴフィルム科（Ａｒｇｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ）、キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）、カリケラ科（Ｃａｌｙｃｅｒａｃｅａｅ）、キキョウ科（Ｃａｍｐａｎｕｌａｃｅａｅ））、クサトベラ科（Ｇｏｏｄｅｎｉａｃｅａｅ）、ミツガシワ科（Ｍｅｎｙａｎｔｈａｃｅａｅ）、ユガミウチワ科（Ｐｅｎｔａｐｈｒａｇｍａｔａｃｅａｅ）、フェリネ科（Ｐｈｅｌｌｉｎａｃｅａｅ）、ロウッセア科（Ｒｏｕｓｓｅａｃｅａｅ）およびスティリディウム科（Ｓｔｙｌｉｄｉａｃｅａｅ）の植物が好ましい。上記植物の近縁種も利用することができる。
これらのうち、アオイ科、バラ科、又はナス科に属する植物がより好ましい。
【００２２】
バショウ科に属するものとしてはバショウ（Ｍｕｓａ）属；
ショウガ科（Ｚｉｎｇｉｂｅｒａｃｅａｅ）に属するものとしてはショウガ属（Ｚｉｎｇｉｂｅｒ）；
バラ科に属するものとしてはオランダイチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａ）属、リンゴ（Ｍａｌｕｓ）属、サクラ（Ｐｒｕｎｕｓ）属、ナシ（Ｐｙｒｕｓ）属、ビワ（Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ）属、ボケ（Ｃｈａｅｎｏｍｅｌｅｓ）属、キイチゴ（Ｒｕｂｕｓ）属およびバラ（Ｒｏｓａ）属；
クワ科（Ｍｏｒａｃｅａｅ）に属するものとしてはイチジク（Ｆｉｃｕｓ）属；
ツツジ科に属するものとしてはスノキ（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ）属；
マタタビ科に属するものとしてはマタタビ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ）属；
カキノキ科に属するものとしてはカキノキ（Ｄｉｏｓｐｙｒｏｓ）属；
ツバキ科に属するものとしてはツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ）属；
ウリ科に属するものとしてはキュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ）属およびスイカ（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ）属；
パパイア科に属するものとしてはパパイア（Ｃａｒｉｃａ）属およびヴァスコンセレア（Ｖａｓｃｏｎｃｅｌｌｅａ）属；
アブラナ科に属するものとしてはシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）属；
クスノキ科に属するものとしてはワニナシ（Ｐｅｒｓｅａ）属；
パイナップル科に属するものとしてはアナナス属（Ａｎａｎａｓ）；
イネ科に属するものとしてはイネ（Ｏｒｙｚａ）属、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）属、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ）属、トウモロコシ（Ｚｅａ）属、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ）属およびヤマカモジグサ（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ）属；
ヤシ科に属するものとしてはココヤシ（Ｃｏｃｏｓ）属；
ラン科に属するものとしてはバンダ（Ｖａｎｄａ）属；
アヤメ科に属するものとしてはアヤメ（Ｉｒｉｓ）属；
スグリ科に属するものとしてはスグリ（Ｒｉｂｅｓ）属；
ナデシコ科に属するものとしてはカスミソウ属（Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ）；
ブドウ科に属するものとしてはブドウ属（Ｖｉｔｉｓ）、ノブドウ属（Ａｍｐｅｌｏｐｓｉｓ）、ヤブガラシ属（Ｃａｙｒａｔｉａ）、セイシカズラ属（Ｃｉｓｓｕｓ）、キフォステンマ属（Ｃｙｐｈｏｓｔｅｍｍａ）、ウドノキ属（Ｌｅｅａ）、ツタ属（Ｐａｒｔｈｅｎｏｃｉｓｓｕｓ）およびミツバカズラ属（Ｔｅｔｒａｓｔｉｇｍａ）；
キントラノオ科に属するものとしてはヒイラギトラノオ（Ｍａｌｐｉｇｈｉａ）属；
トケイソウ科に属するものとしてはトケイソウ（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ）属；
トウダイグサ科に属するものとしてはトウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ）属；
ヤナギ科に属するものとしてはヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ）属；
カタバミ科に属するものとしてはゴレンシ（Ａｖｅｒｒｈｏａ）属；
マメ科に属するものとしてはウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）属、ハウチワマメ（Ｌｕｐｉｎｕｓ）属、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ）属およびチョウマメ（Ｃｌｉｔｏｒｉａ）属；
ウルシ科に属するものとしてはマンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ）属；
ミカン科に属するものとしてはミカン属（Ｃｉｔｒｕｓ）、アエグレ属（Ａｅｇｌｅ）、サンショウ属（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ）、ゲッキツ属（Ｍｕｒｒａｙａ）、ヘンルーダ属（Ｒｕｔａ）、コクサギ属（Ｏｒｉｘａ）、ミヤマシキミ属（Ｓｋｉｍｍｉａ）、ゴシュユ属（Ｅｕｏｄｉａ）、キハダ属（Ｐｈｅｌｌｏｄｅｎｄｒｏｎ）、ボロニア属（Ｂｏｒｏｎｉａ）、アクロニキア属（Ａｃｒｏｎｙｃｈｉａ）、ワンピ属（Ｃｌａｕｓｅｎａ）、コレア属（Ｃｏｒｒｅａ）、ハナシンボウギ属（Ｇｌｙｃｏｓｍｉｓ）およびアワダン属（Ｍｅｌｉｃｏｐｅ）；
ムクロジ科に属するものとしてはレイシ（Ｌｉｔｃｈｉ）属；
アオイ科に属するものとしてはドリアン属（Ｄｕｒｉｏ）、カカオ属（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ）、イチビ属（Ａｂｕｔｉｌｏｎ）、トロロアオイ属（Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ）、ワタ属（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）、ヤノネボンテンカ属（Ｐａｖｏｎｉａ）、フヨウ属（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ）、キンゴジカ属（Ｓｉｄａ）およびアオイ属（Ｍａｌｖａ）；
ミソハギ科に属するものとしてはザクロ（Ｐｕｎｉｃａ）属、アカバナ科に属するものとしてはサンジソウ（Ｃｌａｒｋｉａ）属；
フトモモ科に属するものとしてはバンジロウ（Ｐｓｉｄｉｕｍ）属；
キンポウゲ科に属するものとしてはルイヨウショウマ（Ａｃｔａｅａ）属、ケシ科に属するものとしてはケシ（Ｐａｐａｖｅｒ）属；
ナス科に属するものとしてはナス（Ｓｏｌａｎｕｍ）属、トウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）属、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）属およびツクバネアサガオ（Ｐｅｔｕｎｉａ）属；
モクセイ科に属するものとしてはモクセイ属（Ｏｓｍａｎｔｈｕｓ）およびオリーブ属（Ｏｌｅａ）、ソケイ属（Ｊａｓｍｉｎｕｍ）、レンギョウ属（Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ）、ハシドイ属（Ｓｙｒｉｎｇａ）、ヒトツバタゴ属（Ｃｈｉｏｎａｎｔｈｕｓ）トネリコ属（Ｆｒａｘｉｎｕｓ）およびイボタノキ属（Ｌｉｇｕｓｔｒｕｍ）；
シソ科に属するものとしてはアキギリ（Ｓａｌｖｉａ）属；
クマツヅラ科に属するものとしてはグランデュラリア（Ｇｌａｎｄｕｌａｒｉａ）属；
キョウチクトウ科に属するものとしてはラウオルフィア（Ｒａｕｖｏｌｆｉａ）属およびニチニチソウ（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ）属；
モクレン科に属するものとしてはモクレン属（Ｍａｇｎｏｌｉａ）；
キク科に属するものとしてはカミツレ属（Ｃｈａｍａｅｍｅｌｕｍ）、ノコギリソウ属（Ａｃｈｉｌｌｅａ）、ムラサキバレンギク属（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ）、シカギク属（Ｍａｔｒｉｃａｒｉａ）、ヨモギギク属（Ｔａｎａｃｅｔｕｍ）、タンポポ属（Ｔａｒａｘａｃｕｍ）、ヨモギ属（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ）、フキ属（Ｐｅｔａｓｉｔｅｓ）、ムギワラギク属（Ｈｅｌｉｃｈｒｙｓｕｍ）、ワタスギギク属（Ｓａｎｔｏｌｉｎａ）、チョウセンアザミ属（Ｃｙｎａｒａ）、オオアザミ属（Ｓｉｌｙｂｕｍ）、キンセンカ属（Ｃａｌｅｎｄｕｌａ）、キクニガナ属（Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ）、ベニバナ属（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ）およびキク属（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ）の植物が好ましい。
これらのうち、ドリアン属、リンゴ属、またはナス属に属する植物がより好ましい。
【００２３】
バショウ属に属するものとしてはバナナ（Ｍｕｓａｘｐａｒａｄｉｓｉａｃａ）、バショウ（Ｍｕｓａｂａｓｊｏｏ）、ヒメバショウ（Ｍｕｓａｃｏｃｃｉｎｅａ）およびマレーヤマバショウ（Ｍｕｓａａｃｕｍｉｎａｔａ）；
ショウガ属に属するものとしてはショウガ（Ｚｉｎｇｉｂｅｒｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）；
オランダイチゴ属に属するものとしてはイチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａｘａｎａｎａｓｓａ）、バージニアイチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａｖｉｒｇｉｎｉａｎａ）、チリイチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａｃｈｉｌｏｅｎｓｉｓ）およびエゾノヘビイチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａｖｅｓｃａ）；
リンゴ属に属するものとしてはリンゴ（Ｍａｌｕｓｐｕｍｉｌａ、Ｍａｌｕｓｄｏｍｅｓｔｉｃａ、Ｍａｌｕｓｂａｃｃａｔａ）、ハナカイドウ（Ｍａｌｕｓｈａｌｌｉａｎａ）、カイドウズミ（Ｍａｌｕｓｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ）およびイヌリンゴ（Ｍａｌｕｓｐｒｕｎｉｆｏｌｉａ）；
サクラ属に属するものとしてはウメ（Ｐｒｕｎｕｓｍｕｍｅ）、セイヨウミザクラ（Ｐｒｕｎｕｓａｖｉｕｍ）、モモ（Ｐｒｕｎｕｓｐｅｒｓｉｃａ）、アンズ（Ｐｒｕｎｕｓａｒｍｅｎｉａｃａ）、アーモンド（Ｐｒｕｎｕｓｄｕｌｃｉｓ）、スモモ（Ｐｒｕｎｕｓｓａｌｉｃｉｎａ）およびセイヨウスモモ（Ｐｒｕｎｕｓｄｏｍｅｓｔｉｃａ）；
ナシ属に属するものとしてはセイヨウナシ（Ｐｙｒｕｓｃｏｍｍｕｎｉｓ）、ナシ（Ｐｙｒｕｓｐｙｒｉｆｏｌｉａ）、マメナシ（Ｐｙｒｕｓｃａｌｌｅｒｙａｎａ）およびヤセイセイヨウナシ（Ｐｙｒｕｓｐｙｒａｓｔｅｒ）；
ビワ属に属するものとしてはビワ（Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａｊａｐｏｎｉｃａ）；
ボケ属に属するものとしてはカリン（Ｃｈａｅｎｏｍｅｌｅｓｓｉｎｅｎｓｉｓ）；
キイチゴ属に属するものとしてはラズベリー（Ｒｕｂｕｓｉｄａｅｕｓ）およびブラックラズベリー（Ｒｕｂｕｓｆｒｕｔｉｃｏｓｕｓ）；
バラ属に属するものとしてはハマナス（Ｒｏｓａｒｕｇｏｓａ）；
イチジク属に属するものとしてはイチジク（Ｆｉｃｕｓｃａｒｉｃａ）；
スノキ属に属するものとしてはブリーベリー（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍｃｏｒｙｍｂｏｓｕｍ、Ｖａｃｃｉｎｉｕｍａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍ）、ビルベリー（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍｍｙｒｔｉｌｌｕｓ）、コケモモ（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍｖｉｔｉｓ-ｉｄａｅａ）およびツルコケモモ（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍｏｘｙｃｏｃｃｏｓ）；
マタタビ属に属するものとしてはキウイ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａｃｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ａｃｔｉｎｉｄｉａｄｅｌｉｃｉｏｓａ）、サルナシ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａａｒｇｕｔａ）、シマサルナシ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａｒｕｆａ）およびマタタビ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａｐｏｌｙｇａｍａ）；
カキノキ属に属するものとしてはカキ（Ｄｉｏｓｐｙｒｏｓｋａｋｉ）；
ツバキ属に属するものとしてはチャノキ（Ｃａｍｅｌｌｉａｓｉｎｅｎｓｉｓ）；
キュウリ属に属するものとしてはキュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓｓａｔｉｖｕｓ）、メロン（Ｃｕｃｕｍｉｓｍｅｌｏ）、ニシインドコキュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓａｎｇｕｒｉａ）およびツノニガウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓｍｅｔｕｌｉｆｅｒ）；
スイカ属に属するものとしてはスイカ（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓｌａｎａｔｕｓ）；
パパイア属に属するものとしてはパパイア（Ｃａｒｉｃａｐａｐａｙａ）；
ヴァスコンセレア属に属するものとしてはマウンテンパパイア（Ｖａｓｃｏｎｃｅｌｌｅａｃｕｎｄｉｎａｍａｒｃｅｎｓｉｓ）；
シロイヌナズナ属に属するものとしてはシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）およびミヤマハタザオ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｌｙｒａｔａ）；
ワニナシ属に属するものとしてはアボカド（Ｐｅｒｓｅａａｍｅｒｉｃａｎａ）；
アナナス属に属するものとしてはパイナップル（Ａｎａｎａｓｃｏｍｏｓｕｓ）；
イネ属に属するものとしてはイネ（Ｏｒｙｚａｓａｔｉｖａ）；
コムギ属に属するものとしてはコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍ）；
オオムギ属に属するものとしてはオオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍｖｕｌｇａｒｅ）；
トウモロコシ属に属するものとしてはトウモロコシ（Ｚｅａｍａｙｓ）；
モロコシ属に属するものとしてはモロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍｂｉｃｏｌｏｒ）；
ヤマカモジグサ属に属するものとしてはセイヨウヤマカモジ（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ）；
ココヤシ属に属するものとしてはココナッツ（Ｃｏｃｏｓｎｕｃｉｆｅｒａ）；
バンダ属に属するものとしてはバンダ（Ｖａｎｄａｈｙｂｒｉｄｃｕｌｔｉｖａｒ）；
アヤメ属に属するものとしてはオランダアヤメ（Ｉｒｉｓｘｈｏｌｌａｎｄｉｃａ）；
スグリ属に属するものとしてはクロスグリ（カシス）（Ｒｉｂｅｓｎｉｇｒｕｍ）；
カスミソウ属に属するものとしてはカスミソウ（Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａｐａｎｉｃｕｌａｔａ、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａｅｌｅｇａｎｓ）；
ブドウ属に属するものとしてはブドウ（Ｖｉｔｉｓｖｉｎｉｆｅｒａ、Ｖｉｔｉｓｌａｂｒｕｓｃａ）、サマーグレープ（Ｖｉｔｉｓａｅｓｔｉｖａｌｉｓ）、ヤマブドウ（Ｖｉｔｉｓｃｏｉｇｎｅｔｉａｅ）およびエビヅル（Ｖｉｔｉｓｆｉｃｉｆｏｌｉａ）；
ヒイラギトラノオ属に属するものとしてはアセロラ（Ｍａｌｐｉｇｈｉａｇｌａｂｒａ）；
トケイソウ属に属するものとしてはパッションフルーツ（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａｅｄｕｌｉｓ）；
トウゴマ属に属するものとしてはトウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓｃｏｍｍｕｎｉｓ）；
ヤマナラシ属に属するものとしてはコットンウッド（Ｐｏｐｕｌｕｓｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）；
ゴレンシ属に属するものとしてはスターフルーツ（Ａｖｅｒｒｈｏａｃａｒａｍｂｏｌａ）；
ウマゴヤシ属に属するものとしてはタルウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）；
ハウチワマメ属に属するものとしてはルピナス（シロバナハウチワマメ）（Ｌｕｐｉｎｕｓａｌｂｕｓ）；
ダイズ属に属するものとしてはダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ）；
チョウマメ属に属するものとしてはチョウマメ（Ｃｌｉｔｏｒｉａｔｅｒｎａｔｅａ）；
マンゴー属に属するものとしてはマンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａｉｎｄｉｃａ）；
ドリアン属に属するものとしてはドリアン（Ｄｕｒｉｏｚｉｂｅｔｈｉｎｕｓ、Ｄｕｒｉｏｔｅｓｔｕｄｉｎａｒｉｕｓ、Ｄｕｒｉｏｋｕｔｅｊｅｎｓｉｓ、Ｄｕｒｉｏｏｘｌｅｙａｎｕｓ、Ｄｕｒｉｏｇｒａｖｅｏｌｅｎｓ、Ｄｕｒｉｏｄｕｌｃｉｓ）；
ミカン属に属するものとしてはレモン（Ｃｉｔｒｕｓｌｉｍｏｎ）、スダチ（Ｃｉｔｒｕｓｓｕｄａｃｈｉ）、カボス（Ｃｉｔｒｕｓｓｐｈａｅｒｏｃａｒｐａ）、グレープフルーツ（Ｃｉｔｒｕｓｘｐａｒａｄｉｓｉ）、ユズ（Ｃｉｔｒｕｓｊｕｎｏｓ）ライム（Ｃｉｔｒｕｓａｕｒａｎｔｉｆｏｌｉａ）、ウンシュウミカン（Ｃｉｔｒｕｓｕｎｓｈｉｕ）およびオレンジ（Ｃｉｔｒｕｓｓｉｎｅｎｓｉｓ）；
アエグレ属に属するものとしてはアエグレ・マルメロス（Ａｅｇｌｅｍａｒｍｅｌｏｓ）；
レイシ属に属するものとしてはライチ（Ｌｉｔｃｈｉｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）；
カカオ属に属するものとしてはカカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａｃａｃａｏ）；
ザクロ属に属するものとしてはザクロ（Ｐｕｎｉｃａｇｒａｎａｔｕｍ）；
サンジソウ属に属するものとしてはフェアリーファンズ（ｆａｉｒｙｆａｎｓ）（Ｃｌａｒｋｉａｂｒｅｗｅｒｉ）およびレッドリボンズ（Ｒｅｄｒｉｂｂｏｎｓ）（Ｃｌａｒｋｉａｃｏｎｃｉｎｎａ）；
バンジロウ属に属するものとしてはグァバ（Ｐｓｉｄｉｕｍｇｕａｊａｖａ）；
ルイヨウショウマ属に属するものとしてはアメリカショウマ（Ａｃｔａｅａｒａｃｅｍｏｓａ）；
ケシ属に属するものとしてはケシ（Ｐａｐａｖｅｒｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）、オニゲシ（Ｐａｐａｖｅｒｏｒｉｅｎｔａｌｅ）およびハカマオニゲシ（Ｐａｐａｖｅｒｂｒａｃｔｅａｔｕｍ）；
ナス属に属するものとしてはトマト（Ｓｏｌａｎｕｍｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）；
トウガラシ属に属するものとしてはピーマン（Ｃａｐｓｉｃｕｍａｎｎｕｕｍ）およびハバネロ（Ｃａｐｓｉｃｕｍｃｈｉｎｅｎｓｅ）；
タバコ属に属するものとしてはタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａａｔｔｅｎｕａｔａ）；
ツクバネアサガオ属に属するものとしてはペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａｘｈｙｂｒｉｄａ）；
モクセイ属に属するものとしてはモクセイ（ギンモクセイ、キンモクセイ、ウスギモクセイ、シロモクセイ）（Ｏｓｍａｎｔｈｕｓｆｒａｇｒａｎｓ）、ヒイラギ（Ｏｓｍａｎｔｈｕｓｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌｕｓ）、リュウキュウモクセイ（Ｏｓｍａｎｔｈｕｓｍａｒｇｉｎａｔｕｓ）、ヒイラギモクセイ（Ｏｓｍａｎｔｈｕｓ×ｆｏｒｔｕｎｅｉ）およびシマモクセイ（Ｏｓｍａｎｔｈｕｓｉｎｓｕｌａｒｉｓ）；
オリーブ属に属するものとしてはオリーブ（Ｏｌｅａｅｕｒｏｐａｅａ）；
アキギリ属に属するものとしてはサルビア（Ｓａｌｖｉａｓｐｌｅｎｄｅｎｓ）；
グランデュラリア属に属するものとしてはビジョザクラ（Ｇｌａｎｄｕｌａｒｉａｘｈｙｂｒｉｄａ）；
ラウオルフィア属に属するものとしてはインドジャボク（Ｒａｕｖｏｌｆｉａｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ）；
ニチニチソウ属に属するものとしてはニチニチソウ（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓｒｏｓｅｕｓ）；
モクレン属に属するものとしてはカラタネオガタマ（Ｍａｇｎｏｌｉａｆｉｇｏ）、オガタマノキ（Ｍａｇｎｏｌｉａｃｏｍｐｒｅｓｓａ）、キンコウボク（Ｍａｇｎｏｌｉａｃｈａｍｐａｃａ）、モクレン（Ｍａｇｎｏｌｉａｌｉｌｉｉｆｌｏｒａ）、コブシ（Ｍａｇｎｏｌｉａｋｏｂｕｓ）、ホオノキ（ＭａｇｎｏｌｉａｏｂｏｖａｔａおよびＭａｇｎｏｌｉａｌａｅｖｉｆｏｌｉａ）；
カミツレ属に属するものとしてはローマンカモミール（ＣｈａｍａｅｍｅｌｕｍｎｏｂｉｌｅおよびＣｈａｍａｅｍｅｌｕｍｆｕｓｃａｔｕｍ）が好ましい。
これらのうち、ドリアン、リンゴ、またはトマトがより好ましい。
【００２４】
ドリアンＡＡＴは、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなる。配列番号１のアミノ酸配列に対応する塩基配列を配列番号２に示す。また、リンゴＡＡＴは、配列番号３のアミノ酸配列もしくは配列番号７のアミノ酸配列を含んでなるものとできる。配列番号３のアミノ酸配列を含んでなるリンゴＡＡＴは野生型であり、配列番号７のアミノ酸配列を含んでなるＡＡＴは野生型ＡＡＴの４８位、１６７位、２７０位、２７４位及び４４７位のシステインが全てアラニンに置換され、１５０位のシステインがアルギニンに置換され、かつＡ６４Ｖ、Ｋ１１７Ｑ、Ｖ２４８Ａ及びＱ３６３Ｋの４重変異を有する変異型ＡＡＴである（特願２０１７−５３８０７０号参照）。配列番号３のアミノ酸配列及び配列番号７のアミノ酸配列に対応する塩基配列をそれぞれ配列番号４及び配列番号８に示す。
トマトＡＡＴは、配列番号５のアミノ酸配列を含んでなるものとできる。配列番号５のアミノ酸配列を含んでなるトマトＡＡＴは、トマト（野生種）野生型ＡＡＴの２番目のアミノ酸がアラニンからリジンに置換されたトマト（野生種）Ａ２Ｋ型ＡＡＴである。配列番号５のアミノ酸配列に対応する塩基配列を配列番号６に示す。
ＡＡＴは、配列番号１，３，５、または７のアミノ酸配列を含んでなるものであることが好ましく、配列番号１，５，または７のアミノ酸配列を含んでなるものであることがより好ましい。
【００２５】
ＡＡＴには、例えば、配列番号１，３，５，または７のアミノ酸配列において、好ましくは配列番号１，５，または７のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を用いることもできる。ここで、同タンパク質は、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡのエステル化を触媒するアルコールアシルトランスフェラーゼ活性を維持しているものである。
ここで、「数個」とは、１〜４０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、特に好ましくは５個以下をいう。アミノ酸配列に欠失等を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）、ＴａＫａＲａ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ、Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ等：タカラバイオ社）等を用いることができる。あるいは、欠失等を含む配列を有する遺伝子全体を人工合成してもよい。
【００２６】
また、ＡＡＴには、例えば配列番号１，３，５，または７のアミノ酸配列に対して、好ましくは配列番号１，５，または７のアミノ酸配列に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９９．５％以上、特に好ましくは９９．９％以上の同一性の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質を用いることもできる。ここで、同タンパク質は、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡのエステル化を触媒するアルコールアシルトランスフェラーゼ活性を維持しているものである。
ここで、「配列同一性」とは、比較すべき２つのアミノ酸配列の残基ができるだけ多く一致するように両配列を整列させ、一致した残基数を、全残基数で除したものを百分率で表したものである。上記整列の際には、必要に応じ、比較する２つの配列の一方または双方に適宜ギャップを挿入する。このような配列の整列化は、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ等の周知のプログラムを用いて行なうことができる。ギャップが挿入される場合、上記全残基数は、１つのギャップを１つの残基として数えた残基数となる。このようにして数えた全残基数が比較する２つの配列間で異なる場合には、長い方の配列の全残基数で一致した残基数を除して同一性（％）を算出する。
【００２７】
さらに、ＡＡＴには、例えば配列番号２，４、６，または８の塩基配列の相補鎖に、好ましくは配列番号２，６，または８の塩基配列の相補鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質を用いることもできる。ここで、同タンパク質は、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡのエステル化を触媒するアルコールアシルトランスフェラーゼ活性を維持しているものである。
ストリンジェントな条件としては、例えば、ＤＮＡを固定したナイロン膜を、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは塩化ナトリウム８．７６ｇ、クエン酸ナトリウム４．４１ｇを１リットルの水に溶かしたもの）、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコールを含む溶液中で６５℃にて２０時間プローブとともに保温してハイブリダイゼーションを行う条件を挙げることができるが、これに限定されるわけではない。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件を加味し、ハイブリダイゼーションの条件を設定することができる。ハイブリダイゼーション後の洗浄条件として、例えば、「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」、「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」、よりストリンジェントな条件としては、例えば、「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」、「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃」等の条件を挙げることができる。
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）））、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７））等を参照することができる。
【００２８】
ＡＡＴを反応に供するに際しては、前記触媒活性を示す限りその使用形態は特に限定されず、ＡＡＴが含まれる生体組織またはその処理物をそのまま用いることも可能である。このような生体組織として植物体全体、植物器官（例えば果実、葉、花弁、茎、種子等）、植物組織（例えば果実表皮、果肉等）を用いることが出来る。生体組織の処理物としては、生体組織から抽出したＡＡＴの粗酵素液または精製酵素等が挙げられる。
【００２９】
ＡＡＴを精製する方法としては特に制限されないが、好ましくは以下の方法により精製され得る。上記植物のＡＡＴ活性を有する組織を破砕後、トリス−ＨＣｌ緩衝液、リン酸緩衝液等の緩衝液に懸濁する。この粗酵素液について、酵素の精製に常用される（１）沈澱による分画、（２）各種クロマトグラフィー、（３）透析、限外濾過等による低分子物質の除去方法などを単独でまたは適宜組み合わせて適用する。
【００３０】
ＡＡＴの精製方法として好ましい態様は次のとおりである。生体組織を液体窒素等により凍結してすりつぶした後、５倍量のＤＴＴ（ジチオスレイトール）およびグリセロール等を含むトリス−ＨＣｌ緩衝液で抽出する。続いて、粗酵素抽出液をイオン交換クロマトグラフィーに供し、その非吸着部分を回収することで酵素抽出液を取得する。いくつかの粗酵素抽出液の調製方法について検討した結果、この方法によれば、植物に含有するポリフェノールの影響を排除し、安定に且つ効率的に取得できることが判明した。得られた酵素抽出液をイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過カラム等を用いることで酵素タンパク質を効率よく精製することができる。
【００３１】
［ＡＡＴ発現遺伝子組み換え微生物］
ＡＡＴを反応に供するに際しては、ＡＡＴ遺伝子を単離し、一般的な宿主ベクター系に導入し、該ベクター系で形質転換した微生物を利用することも可能である。宿主としては、細菌では大腸菌、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属などが挙げられ、酵母ではＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、糸状菌ではＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属などが挙げられる。これらの中で、特に大腸菌を用いることが簡便であり、効率もよく好ましい。
【００３２】
公知のＡＡＴ遺伝子の単離は、データベースに公開された遺伝子情報を利用して、ＰＣＲ等の汎用の分子生物学的手法を用いて行うことができる。また、ＡＡＴ遺伝子の塩基配列を通常の方法で全合成することも可能である。一方、遺伝子情報が未知のＡＡＴ、精製したタンパク質のアミノ酸配列に基づいて分子生物学的手法により推定される遺伝子の配列情報を利用することで、公知のＡＡＴ遺伝子と同様に単離できる。公知または新規のＡＡＴが、本発明の触媒活性を有するかどうかについては、前述の方法で確認することができる。
【００３３】
組換え微生物を培養して得られる培養液をそのまま用いるか、または、該培養液から遠心分離等の集菌操作によって得られる菌体またはその処理物等を用いることができる。菌体処理物としては、アセトンおよびトルエン等で処理した菌体、凍結乾燥菌体、菌体破砕物、菌体を破砕した無細胞抽出物、並びにこれらから酵素を抽出した粗酵素または精製酵素等が挙げられる。
【００３４】
３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡは、微生物の生体内でメタクリリル−ＣｏＡから合成されるものであってよい。
アルコールアシルトランスフェラーゼは、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡのみならずメタクリリル−ＣｏＡに対しても反応性を有し、メタクリリル−ＣｏＡからメタクリル酸エステルを生成させる。アルコールアシルトランスフェラーゼが、メタクリリル−ＣｏＡに対して高い反応性を有すると、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡから３−ヒドロキシイソ酪酸エステルへの反応に機能するアルコールアシルトランスフェラーゼの量が減少する。この結果、目的とする３−ヒドロキシイソ酪酸エステルの生成効率が低下することとなる。
したがって、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡから３−ヒドロキシイソ酪酸エステルを効率よく生成させるため、アルコールアシルトランスフェラーゼには、メタクリリル−ＣｏＡに対する活性と３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡに対する活性の比（対３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ活性／対メタクリリル−ＣｏＡ活性）がより高いものを用いることが好ましい。このようなアルコールアシルトランスフェラーゼとして、ドリアンのアルコールアシルトランスフェラーゼが好適に採用できる（実施例４参照）。
【００３５】
３−ヒドロキシイソ酪酸エステルおよびその原料となる３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡは、メタクリル酸エステルおよびその原料となり得るメタクリル酸およびメタクリリル−ＣｏＡとは異なり反応性の高いアルファ位の二重結合をもたないため毒性が低い。また、３−ヒドロキシイソ酪酸エステルは、メタクリル酸に比して高い水溶性を有する。毒性が低く水溶性が高い３−ヒドロキシイソ酪酸エステルを原料とした本発明に係るメタクリル酸エステルの製造方法は、特に微生物を利用した反応系において有利な効果を発揮する。
【００３６】
工程Ａでは、溶媒に３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡおよびアルコールまたはフェノール類を添加して溶解または懸濁させる。そして、この溶液または懸濁液に、ＡＡＴを接触させ、温度等の条件を制御しながら３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡとアルコールまたはフェノール類とを反応させる。前記反応により、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡの３−ヒドロキシイソブチリル基をアルコールまたはフェノール類に転移させて３−ヒドロキシイソ酪酸エステルを生成させる。
【００３７】
溶媒には、通常、緩衝液等の水性溶媒が用いられる。
菌体を用いる場合、反応を円滑に進行させるために、浸透圧調整剤等によりモル浸透圧濃度および／またはイオン強度を制御してもよい。浸透圧調整剤としては、菌体内細胞液の浸透圧に対して等張または高張になるように調節する目的で加えられる水溶性物質であればよく、例えば、塩または糖類であり、好ましくは塩である。塩は、好ましくは金属塩、より好ましくはアルカリ金属塩、より好ましくはハロゲン化アルカリ金属であり、例えば、塩化ナトリウムや塩化カリウムが挙げられる。糖類は、好ましくは単糖類またはオリゴ糖類、より好ましくは単糖類または二糖類であり、例えば、グルコース、スクロース、マンニトール等が挙げられる。浸透圧調整剤は１ｍＭ以上の濃度で添加することが好ましく、使用する菌体内細胞液と比して等張または高張になるように調節することが特に好ましい。
【００３８】
また、生成した３−ヒドロキシイソ酪酸エステルを分離する目的で、あらかじめ、有機溶媒を添加し、２相系で反応させることも可能である。有機溶媒としては、例えば直鎖状、分岐状または環状の、飽和または不飽和脂肪族炭化水素、飽和または不飽和芳香族炭化水素等を単独でまたは２種以上を混合して用いることができる。具体的には、例えば、炭化水素系溶媒（例えばペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、キシレンなど）、ハロゲン化炭化水素系溶媒（例えば塩化メチレン、クロロホルムなど）、エーテル系溶媒（例えばジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、ジメトキシエタンなど）、エステル系溶媒（例えばギ酸メチル、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピオン酸メチル）などが挙げられる。これらの有機溶媒を添加しておくことで、３−ヒドロキシイソ酪酸エステルが有機相に移行し、効率的に反応が進行する場合がある。
【００３９】
３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡおよびアルコールまたはフェノール類並びにＡＡＴのモル比および濃度は、特に制限されず、適宜調整され得る。例えば、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡおよびアルコールまたはフェノール類並びにＡＡＴが、１００ｐＭ〜１０ｍＭ：１０μＭ〜１Ｍ：１ｐＭ〜１０ｍＭであることが好ましい。反応温度または反応時間等の各種条件も、特定限定されず、適宜決定され得る。反応温度および反応時間は、通常５〜８０℃で２０分〜１週間とされ、好ましくは、１０〜７０℃で２０分〜１２０時間であり、同温度帯で２０分〜６０時間がより好ましく、２０分〜４０時間がさらに好ましい。反応液のｐＨも、特に限定されないが、例えばｐＨ４〜１０の範囲、好ましくはｐＨ５．０〜９．０である。
【００４０】
［３−ヒドロキシイソ酪酸エステルの脱水反応］
工程Ｂでは、従来公知の化学的手法によって３−ヒドロキシイソ酪酸エステルを脱水し、メタクリル酸エステルを生成させる。
化学的手法として、例えば、特許文献３に記載の方法を採用できる。具体的には、シリカ、シリカ−アルミナ、ゼオライトおよび固体リン酸等の固体触媒を用いた、常圧、温度２００〜５００℃での気相反応によって脱水できる。また、硫酸およびリン酸等を用いた液相反応により脱水することもできる。
【００４１】
生成したメタクリル酸エステルは、高速液体クロマトグラフィーおよびＬＣ−ＭＳなどの通常の方法を用いて検出し、定量できる。また、培養容器または反応容器の気相部（ヘッドスペース部）に揮発したメタクリル酸エステルは、ガスクロマトグラフィーなどの通常の方法を用いて検出し、定量できる。
【００４２】
反応液からのメタクリル酸エステルの単離は、ろ過、遠心分離、真空濃縮、イオン交換または吸着クロマトグラフィー、溶媒抽出、蒸留および結晶化などの周知の操作を必要に応じて適宜組み合わせて行うことができる。得られたメタクリル酸エステルは、アクリル樹脂の原料や、塗料、接着剤および樹脂改質剤などのコモノマーとして利用できる。
【実施例】
【００４３】
［実施例１：ドリアンAATの活性測定］
１．ドリアンAATの精製
ドリアン（Durio zibethinus）の果実を液体窒素中で粉末状にすりつぶし、緩衝液（200mM Tris-HCl(pH8.0), 5mM 2-メルカプトエタノール）に懸濁し、ガーゼを用いて濾過した。濾液を遠心分離して上清を分離した。上清にヘキサンを加え混和した後、遠心分離により油層と水層を分離し、水層を粗酵素液として得た。後述する方法により、粗酵素液のAAT活性を測定した。【００４４】
粗酵素液に硫安を添加し、添加濃度30%〜60%の画分を緩衝液A（20mM Tris-HCl(pH8.0),5mM 2-メルカプトエタノール）に対して透析した（透析画分１）。
透析画分１をQ-セファロースカラムに供し、緩衝液Aで十分洗浄した後、塩化ナトリウムの濃度を上昇させて溶出を行った。溶出液を回収し緩衝液B（20mM Tris-HCl(pH8.0), 5mM 2-メルカプトエタノール, 30%飽和硫安）に対して透析した（透析画分２）。
次に、透析画分２をResource PHEカラムに供し、緩衝液Bで十分洗浄した後、硫安濃度を減少させて溶出を行った。溶出液を回収し緩衝液Aに対して透析した（透析画分３）。
さらに、透析画分３をMonoQ 10/100カラムに供し、緩衝液Aで十分洗浄した後、塩化ナトリウムの濃度を上昇させて溶出を行った。溶出液を回収し緩衝液C（50mM Tris-HCl(pH8.0), 5mM 2-メルカプトエタノール, 150 mM 塩化ナトリウム）に対して透析した（透析画分４）。
最後に、透析画分４を緩衝液Cで平衡化したSuperdex 200カラムに供した。溶出液を回収し、精製酵素液とした。精製酵素をSDS-PAGEに供したところ、53kDaの単一バンドが確認された。【００４５】
２．AAT活性の測定方法
以下に記載する方法により、粗酵素液、透析画分１〜４および精製酵素液のAAT活性を測定した。
反応液（１００ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー(ｐＨ７．０)、４０ｍＭ  ｎ−ブタノール、０．５０ｍＭ メタクリリル−ＣｏＡ）を１００μｌ調製した。粗酵素液、透析画分１〜４または精製酵素液を添加して密閉し、３０℃で３０分間反応させた。反応後、内部標準として１０ｍＭ ２−ヘキサノンを１０μｌ加え、１００μｌオクタンを用いて溶媒抽出した。遠心分離による分液８μｌをガスクロマトグラフィー（ＧＣ）にインジェクションし、酵素反応により生成したメタクリル酸ブチル量を測定した。メタクリル酸エステル量は、内部標準法による検量線を作成して算出した。【００４６】
ＧＣ分析条件
カラム：ＤＢ−ＷＡＸ（内径０．２５ｍｍ×６０ｍ、０．５μｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
カラム温度：１００℃・５ｍｉｎ、その後４０℃／ｍｉｎで昇温し、２００℃・２ｍｉｎ
キャリアガス：ヘリウム
検出：ＦＩＤ
Ｉｎｊｅｃｔ温度：２３０℃
Ｄｅｔｅｃｔ温度：２５０℃【００４７】
各精製段階における酵素組成物の収量と活性を「表１」に示す。硫安画分と４回のカラム分離により、活性において2334倍に精製された、195mU/mgのＡＡＴが得られた。【００４８】
【表１】
2019168154.tif 000003
【００４９】
［実施例２：ドリアンAAT遺伝子の同定］
ドリアンの種皮、子房室および種子から市販のキット（PureLink Plant RNA Reagent、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いてトータルRNAを抽出した。トータルRNAから市販のキット（SMART RACE cDNA Amplification Kit、タカラバイオ社もしくはGeneRacer Kit、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いてcDNAを合成した。【００５０】
植物由来のAATに保存されている塩基配列に基づいてプライマーペアを設計し、cDNAからDNA断片の増幅を行った。得られた増幅断片（700bp）の塩基配列を決定した。【００５１】
上記増幅断片の塩基配列に基づいてプライマーを設計し、cDNAを用いた5'RACEおよび3'RACEを行った。得られた増幅断片（約1.1kbpおよび約1.0kbp）の塩基配列を決定し、配列番号２のドリアンAAT遺伝子配列を得た。【００５２】
［実施例３：ドリアンAAT遺伝子発現組み換え大腸菌の作成および組み換えドリアンAATの精製］
１．AAT発現ベクター（pET21-NHisMBPTEV-optDzibAAT）の作成
His-tag配列、MBP（Maltose Binding Protein）配列およびTEVプロテアーゼ切断配列を含むDNA断片をベクターpET21a（ノバジェン社）に組み込んで、ベクターpET21-NHisMBPTEVを得た。【００５３】
配列番号２のドリアンAAT遺伝子配列のコドンを大腸菌に対して最適化して、配列番号９のコドン最適化AAT遺伝子配列（付加配列としてTEVプロテアーゼ切断配列及び制限酵素認識配列を含む）を委託合成し、ベクターpET21-NHisMBPTEVに組み込んで、発現ベクターpET21-NHisMBPTEV-optDzibAATを得た。
発現ベクターpET21-NHisMBPTEV-optDzibAATを大腸菌NiCo21(DE3)（ニューイングランドバイオラボ社）に導入し、組換え体NiCo21(DE3)/pET21-NHisMBPTEV-optDzibAATを得た。【００５４】
２．組み換えドリアンAATの精製
大腸菌組換え体NiCo21(DE3)/pET21-NHisMBPTEV-optDzibAATを、アンピシリンを含む2×YT液体培地200mLに植菌し、37℃にて16時間前培養を行った。培養液を100mL取り、20Lの同培地に添加し、37℃にて培養した。濁度（OD）が1.2になるまで振盪培養した後、IPTG（終濃度0.5mM）を添加し、培養温度を20℃に下げ、さらに16時間振盪培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を回収し、緩衝液D（20 mM Tris-HCl(pH8.0), 300mM NaCl, 10mMイミダゾール, 0.2mM Tris(2-carboxyethyl)phosphine Hydrochloride）に懸濁
した。菌体懸濁液を氷冷しながら超音波破砕機を用いて30分間破砕した後、遠心分離を行って細胞抽出液として上清を得た。
細胞抽出液をNi-NTAカラムに供し、緩衝液Dで十分洗浄した後、イミダゾール濃度を上昇させて溶出を行った。280nmの吸光がある画分を回収し、SDS-PAGEに供し、MBPとAATが融合した目的タンパク質と一致する分子量のバンドを回収し、緩衝液Dに対して4℃で16時間透析した（透析画分１）。
次に、透析画分１に500UのTEVプロテアーゼ（ProTEV Plus、プロメガ社）を添加し、4℃で48時間放置しHisタグ-MBPを切断した。透析画分１をNi-NTAカラムに供し切断されたHisタグ-MBPを吸着させ、AATを含む通過画分に25%飽和硫安になるように80%飽和硫安溶液を加え、アミロースカラム（ニューイングランドバイオラボ社）に供して通過画分を得た。通過画分をTOYOPEARL Butyl-600カラム（東ソー社）に供し、25%飽和硫安を含む緩衝液E（20mM Tris-HCl(pH7.5), 1 mM EDTA, 1mM DTT）で十分洗浄した後、硫安濃度を減少させて溶出を行った。280nmの吸光がある画分を回収し、SDS-PAGEに供し、AATと一致する分子量のバンドを回収し、緩衝液Eに対して4℃で16時間透析した（透析画分２）。
最後に、透析画分３をSP Sepharoseカラム（GEヘルスケア社）に供し、緩衝液Eで十分洗浄した後、塩化ナトリウムの濃度を上昇させて溶出を行った。得られた溶出液を回収して精製酵素液とした。【００５５】
実施例１記載の方法により、細胞抽出液、透析画分１、２および精製酵素液のAAT活性を測定した。各精製段階における酵素組成物の収量と活性を「表２」に示す。３回のカラム分離により、活性において1195倍に精製された、16.4U/mgのAATが得られた。【００５６】
【表２】
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【００５７】
［実施例４：AATによる3-ヒドロキシイソ酪酸ブチルの生成］
反応液（１００ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー(ｐＨ７．０)、４０ｍＭ  ｎ−ブタノール、０．５ｍＭ ３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ）を１００μｌ調製した。実施例３で得られた精製酵素液を添加して密閉し、３０℃で３０分間反応させた。反応後、内部標準として１０ｍＭ ２−ヘキサノンを１０μｌ加え、１００μｌオクタンを用いて溶媒抽出した。遠心分離による分液８μｌをガスクロマトグラフィー（ＧＣ）にインジェクションし、酵素反応により生成した３−ヒドロキシイソ酪酸ブチルを測定した。３−ヒドロキシイソ酪酸エステル量は、内部標準法による検量線を作成して算出した。
ＧＣ分析条件
カラム：ＤＢ−ＷＡＸ（内径０．２５ｍｍ×６０ｍ、０．５μｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
カラム温度：１００℃・５ｍｉｎ、その後４０℃／ｍｉｎで昇温し、２４０℃・２ｍｉｎ
キャリアガス：ヘリウム
検出：ＦＩＤ
Ｉｎｊｅｃｔ温度：３００℃
Ｄｅｔｅｃｔ温度：３００℃【００５８】
精製酵素として1 μg/mlドリアンAATを加え、反応後の溶液をGC分析した。ドリアンAATを加えた反応溶液から0.13 mM  ３−ヒドロキシイソ酪酸ブチルが検出された。比活性度は6.1 (U/mg)であった。
ドリアンAATの３-ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡに対する活性とメタクリリル−ＣｏＡに対する活性との比（対３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ活性／対メタクリリル−ＣｏＡ活性）は３７％（6.1/16.4）であった。この値は、後述するリンゴAAT及びトマトAATの値と比べて顕著に高く、ドリアンAATがイソブチリル−ＣｏＡに対して高い反応性を有していることが明らかとなった。【００５９】
［実施例５：各植物AATによる3-ヒドロキシイソ酪酸ブチルの生成］
１．リンゴAAT遺伝子発現組み換え大腸菌及びトマトAAT遺伝子発現組み換え大腸菌
野生型リンゴＡＡＴ（配列番号３）の４８位、１６７位、２７０位、２７４位及び４４７位のシステインが全てアラニンに置換され、１５０位のシステインがアルギニンに置換され、かつＡ６４Ｖ、Ｋ１１７Ｑ、Ｖ２４８Ａ及びＱ３６３Ｋの４重変異を有する変異型ＡＡＴ（配列番号７）遺伝子を含むプラスミドｐＡＡＴ１５４を文献（特願２０１７−５３８０７０号）記載の方法により作成した。
また、トマト（野生種）野生型ＡＡＴの２番目のアミノ酸がアラニンからリジンに置換されたトマト（野生種）Ａ２Ｋ型ＡＡＴ（配列番号５）遺伝子を含むプラスミドｐＡＡＴ０３２を委託合成した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社、以下同じ）。【００６０】
リンゴＡＡＴ発現ベクターｐＡＡＴ１５４及びトマトＡＡＴ発現ベクターｐＡＡＴ０３２を大腸菌ＪＭ１０９株に導入し、組換え体を得た。【００６１】
２．AATを含む細胞抽出液の調製
アンピシリンを含むＬＢ（１％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、１％ＮａＣｌ）培地に大腸菌形質転換体を植菌し、３７℃にて７時間前培養を行った。
培養液を２００μｌ取り、１００ｍｌの同培地（１ｍＭＩＰＴＧ含有）に加え、３７℃にて１５時間振盪培養した。
培養液から菌体を回収し、５０ｍＭリン酸−ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、同緩衝液に懸濁した。【００６２】
得られた菌体懸濁液をＯＤ６３０が２０となるように調整した。
超音波処理により細胞を破砕し、遠心分離により菌体及び膜画分を除いた。その後、Nalgene Rapid-flow Bottle Top Filter（孔径０．２μｍ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて濾過し、細胞抽出液を調製した。【００６３】
３．AATを含む細胞抽出液の濃縮
得られた細胞抽出液を１４，４００ｇの遠心力にて３０分遠心分離し上清を分離した。上清を分画分子量１，０００，０００の限外濾過膜Vivaspin（Sartorius社製）に供し、通過画分を得、それを分画分子量３０，０００の限外濾過膜Amicon Ultra（メルク社製）に供し１／１０から１／２０の液量になるまで濃縮した。【００６４】
４．濃縮処理したAATを含む細胞抽出液のＡＡＴ活性測定
３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ  ０．５ｍＭとｎ−ブタノール  ４０ｍＭを含む反応液１８０μｌに２０μｌの細胞抽出液を添加し、３−ヒドロキシイソ酪酸ブチルの生成反応を開始した。反応は、２ｍｌ容量のバイアル中で行った。バイアルを３０℃でインキュベートして、１５〜３５時間反応を進行させた。反応終了後、バイアル中の反応液に０．８ｍｌの酢酸エチルを添加し混和し、静置後の酢酸エチル層を分取し、ＧＣ分析に供した。【００６５】
ＧＣ分析条件
装置：GC-2010(島津製作所）
カラム：DB-1  30m×0.25mmID 0.25μm
カラム流量：He 1.0mL/min
昇温条件：50℃、その後10℃/minで150℃まで昇温し、さらに20℃/minで300℃まで昇温
検出：FID
Ｉｎｊｅｃｔ温度：220℃  
Ｄｅｔｅｃｔ温度：300℃
スプリット比：1/20
GC注入量：1.0μL【００６６】
また、メタクリリル−ＣｏＡ  ０．５ｍＭとｎ−ブタノール  ４０ｍＭを含む反応液９００μｌに１００μｌの細胞抽出液を添加し、メタクリル酸ブチルの生成反応を開始した。反応は、１０ｍｌ容量のサンプル瓶（ＧＣ用）中で行った。サンプル瓶を３０℃でインキュベートして、１〜５時間反応を進行させた。反応終了後、サンプル瓶中の反応液に１ｍｌのアセトニトリルを添加し混和した。その後、シリンジフィルターＤＩＳＭＩＣ（穴径０．４５μｍ、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）を用いて濾過後、ＨＰＬＣ分析に供した。【００６７】
ＨＰＬＣ分析条件：
装置：Ｗａｔｅｒｓ ２６９５
カラム：Ｓｈｉｓｅｉｄｏ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ１２０  ５μｍ
移動相：６５％ＭｅＯＨ、０．２％リン酸
流量：０．２５ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：３５℃
検出：ＵＶ２１０ｎｍ
注入量：１０μＬ【００６８】
リンゴＡＡＴ又はトマトＡＡＴ又はドリアンＡＡＴを含む細胞抽出液を加えた反応液から３−ヒドロキシイソ酪酸ブチルが検出された。
３−ヒドロキシイソ酪酸ブチル及びメタクリル酸ブチルの生成量から、リンゴＡＡＴ及びトマトＡＡＴの３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ（３ＨＩＢＡ−ＣｏＡ）及びメタクリリル−ＣｏＡ（ＭＡＡ−ＣｏＡ）に対する活性を評価した（表３参照）。【００６９】
【表３】
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【配列表フリーテキスト】
【００７０】
配列番号１：ドリアンAATのアミノ酸配列
配列番号２：ドリアンAAT遺伝子の塩基配列
配列番号３：リンゴAATのアミノ酸配列
配列番号４：コドン最適化リンゴAAT遺伝子配列
配列番号５：トマトA2K型AATのアミノ酸配列
配列番号６：コドン最適化トマトA2K型AAT遺伝子配列
配列番号７：変異型リンゴAATのアミノ酸配列
配列番号８：コドン最適化変異型リンゴAAT遺伝子配列
配列番号９：コドン最適化ドリアンAAT遺伝子配列（付加配列としてTEVプロテアーゼ切断配列及び制限酵素認識配列を含む）
【配列表】
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【国際調査報告】
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2019168154.tif 000007
2019168154.tif 000008
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