(57)【要約】試料に、ポリエーテルアルキルアミン、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、及び、ＨＬＢ値が１３以下のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一種の界面活性剤を添加することを特徴とする、試料中のエクソソームの破壊方法；ポリエーテルアルキルアミン、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、及び、ＨＬＢ値が１３以下のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一種の界面活性剤を含有することを特徴とする、試料中のエクソソーム破壊用試薬。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料に、ポリエーテルアルキルアミン、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、及び、ＨＬＢ値が１３以下のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一種の界面活性剤を添加することを特徴とする、試料中のエクソソームの破壊方法。
【請求項２】
試料が、血清又は血漿である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ポリエーテルアルキルアミン、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、及び、ＨＬＢ値が１３以下のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一種の界面活性剤を含有することを特徴とする、試料中のエクソソーム破壊用試薬。
【請求項４】
試料が、血清又は血漿である、請求項３記載の試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中のエクソソームの破壊方法及び破壊用試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
エクソソームは、動物細胞から分泌される直径３０〜２００ｎｍの脂質二重膜構造を有する小胞顆粒である。エクソソーム表面には、一般的な細胞表面と同様に、種々の膜タンパク質が存在することが知られており、エクソソームの内部には、サイトカイン等各種タンパク質以外にもｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が含まれることも知られている（非特許文献１）。また、エクソソームは、種々の細胞、例えば免疫系の細胞や各種がん細胞から分泌されることが報告されており、生体内の細胞間コミュニケーションの媒介役として機能し生理現象と関連することや、がんなどの疾患との関連性が注目されている。【０００３】
エクソソームの内部に含まれる物質を分析するためには、エクソソームの脂質二重膜構造を破壊する必要がある。これまで、エクソソームの破壊方法として、細胞培養上清やヒト血清等を超遠心分離（１１０，０００Ｇ・７０分間）してエクソソームを単離し、該単離したエクソソームを抗菌ペプチドにより破壊する方法（特許文献１）、細胞培養上清を超遠心分離（１２０，０００Ｇ・１００分間）してエクソソームを単離し、該単離したエクソソームを非イオン性界面活性剤であるトリトンＸ−１００（ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル）により破壊する方法（非特許文献２）等が知られている。【０００４】
しかしながら、これらの方法は、エクソソーム破壊の前処理として、超遠心分離等によるエクソソームの単離が必要となることから、操作が煩雑で、かつ、操作に時間を要する。一方で、エクソソームの内部に含まれる物質の分析を臨床検査の現場に適用するにあたり、簡便かつ迅速なエクソソームの破壊方法が望まれている。【０００５】
また、エクソソームの分離方法として、エクソソームと、該エクソソームの表面に存在する表面抗原を認識するリガンドが結合した固相担体とを接触させ、該エクソソームと該固相担体との複合体を形成させる複合体形成工程と、該複合体を洗浄する洗浄工程を含み、該複合体形成工程及び該洗浄工程の少なくともいずれかを、芳香族基を分子中に含まない非イオン性界面活性剤の存在下にて行うことを特徴とするエクソソームの分離方法が報告されている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１６／１４３９０４号
【特許文献２】国際公開第２０１５／０６８７７２号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Int. J. Biol. Sci. 2013, 9; 10:1021-31
【非特許文献２】Sci. Rep. 6, 18346; doi: 10.1038/srep18346 (2016)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、簡便かつ迅速な試料中のエクソソームの破壊方法及び破壊用試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、試料に、ポリエーテルアルキルアミン、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル（以下、ＰＯＥ−ＰＯＰアルキルエーテルと記す）、及び、ＨＬＢ（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ−Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ  Ｂａｌａｎｃｅ）値が１３以下のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（以下、ＰＯＥアルキルフェニルエーテルと記す）からなる群より選ばれる少なくとも一種の界面活性剤を添加することにより、迅速にエクソソームを破壊できることを見出し、本発明を完成させた。【００１０】
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［４］に関する。
［１］試料に、ポリエーテルアルキルアミン、ＰＯＥ−ＰＯＰアルキルエーテル、及び、ＨＬＢ値が１３以下のＰＯＥアルキルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一種の界面活性剤を添加することを特徴とする、試料中のエクソソームの破壊方法。
［２］試料が、血清又は血漿である、［１］記載の方法。
［３］ポリエーテルアルキルアミン；ＰＯＥ−ＰＯＰアルキルエーテル；及び、ＨＬＢ値が１３以下のＰＯＥアルキルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一種の界面活性剤を含有することを特徴とする、試料中のエクソソーム破壊用試薬。
［４］試料が、血清又は血漿である、［３］記載の試薬。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、簡便かつ迅速な試料中のエクソソームの破壊方法及び破壊用試薬が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】血清をゲルろ過クロマトグラフィに供して得られたゲルろ過クロマトグラムである。横軸は、溶出分画を表す。左縦軸は、抗ＣＤ９モノクローナル抗体（第１抗体）、及び、アルカリホスファターゼ標識化抗ＣＤ９モノクローナル抗体（アルカリホスファターゼ標識化第２抗体）を用いるサンドイッチ法により得られた発光量（ＲＬＵ）を表し、各分画における発光量を●で表す。右縦軸は、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）を用いる蛋白質定量法（ＢＣＡ法）により得られた、５６０ｎｍでの吸光度を表し、各分画における５６０ｎｍでの吸光度を□で表す。
【図２】ポリエーテルアルキルアミンを含有するエクソソーム破壊用試薬、及び、対照用試薬を用いた、血清中のエクソソームの破壊試験の結果を示すゲルろ過クロマトグラムである。横軸は、溶出分画を表す。縦軸は、抗ＣＤ９モノクローナル抗体（第１抗体）、及び、アルカリホスファターゼ標識化抗ＣＤ９モノクローナル抗体（アルカリホスファターゼ標識化第２抗体）を用いるサンドイッチ法により得られた発光量（ＲＬＵ）を表す。●は、ナイミーンＬ−２０２（ポリエーテルアルキルアミン）を含有するエクソソーム破壊用試薬を用いた場合の各分画における発光量を表す。▲は、ナイミーンＤＴ−２０３（ポリエーテルアルキルアミン）を含有するエクソソーム破壊用試薬を用いた場合の各分画における発光量を表す。□は、対照用試薬を用いた場合の各分画における発光量を表す。
【図３】ＰＯＥ−ＰＯＰアルキルエーテルを含有するエクソソーム破壊用試薬、及び、対照用試薬を用いたエクソソームの破壊試験の結果を示すゲルろ過クロマトグラムである。横軸は、溶出分画を表す。縦軸は、抗ＣＤ９モノクローナル抗体（第１抗体）、及び、アルカリホスファターゼ標識化抗ＣＤ９モノクローナル抗体（アルカリホスファターゼ標識化第２抗体）を用いるサンドイッチ法により得られた発光量（ＲＬＵ）を表す。●は、ワンダサーフＩＤ−５０（ＰＯＥ−ＰＯＰアルキルエーテル）を含有するエクソソーム破壊用試薬を用いた場合の各分画における発光量を表す。□は、対照用試薬を用いた場合の各分画における発光量を表す。
【図４】ＨＬＢ値が１３以下のＰＯＥアルキルフェニルエーテルを含有するエクソソーム破壊用試薬、比較用エクソソーム破壊用試薬、及び、対照用試薬を用いたエクソソームの破壊試験の結果を示すゲルろ過クロマトグラムである。横軸は、溶出分画を表す。縦軸は、抗ＣＤ９モノクローナル抗体（第１抗体）、及び、アルカリホスファターゼ標識化抗ＣＤ９モノクローナル抗体（アルカリホスファターゼ標識化第２抗体）を用いるサンドイッチ法により得られた発光量（ＲＬＵ）を表す。●は、ノニオンＮＳ−２０４．５（ＨＬＢ値が１３以下のＰＯＥアルキルフェニルエーテル；ＨＬＢ値９．５）を含有するエクソソーム破壊用試薬を用いた場合の各分画における発光量を表す。▲は、ノニオンＨＳ−２０４．５（ＨＬＢ値が１３以下のＰＯＥアルキルフェニルエーテル；ＨＬＢ値９．８）を含有するエクソソーム破壊用試薬を用いた場合の各分画における発光量を表す。○は、トリトンＸ−１００（ＰＯＥアルキルフェニルエーテル；ＨＬＢ値１３．５）を含有するエクソソーム破壊用試薬を用いた場合の各分画における発光量を表す。△は、ノニデットＰ−４０（ＰＯＥアルキルフェニルエーテル；ＨＬＢ値１３．１）を含有するエクソソーム破壊用試薬を用いた場合の各分画における発光量を表す。□は、対照用試薬を用いた場合の各分画における発光量を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
１．エクソソームの破壊方法
本発明の試料中のエクソソームの破壊方法は、試料中のエクソソームを、ポリエーテルアルキルアミン、ＰＯＥ−ＰＯＰアルキルエーテル、及び、ＨＬＢ値が１３以下のＰＯＥアルキルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一種の界面活性剤を用いて破壊する方法である。ここで「エクソソームを破壊する」とは、エクソソーム特有の脂質二重膜構造の小胞粒子の形状を消失させて、エクソソームの内部に含まれる物質がエクソソームの外部に溶出する程度まで破壊することを意味する。本明細書において、エクソソームの破壊は、エクソソーム膜の破壊、エクソソームの溶解、エクソソーム膜の溶解と表現されることもある。
【００１４】
本発明のエクソソームの破壊方法によりエクソソームが破壊されたことを確認する方法としては、エクソソームの破壊を確認できる方法であれば特に制限はなく、例えば電子顕微鏡を用いる方法、エクソソームがその表面に有するエクソソーム特有抗原を免疫学的測定法により測定する方法等が挙げられる。電子顕微鏡を用いる方法においては、電子顕微鏡像でエクソソーム特有の脂質二重膜構造の小胞粒子の形状の消失を確認することにより、エクソソームの破壊を確認することができる。また、エクソソームがその表面に有するエクソソーム特有抗原を免疫学的測定法により測定することによりエクソソームの破壊を確認する場合、本発明のエクソソームの破壊方法を行う前に比較して、本発明のエクソソームの破壊方法を行った後で、エクソソーム特有抗原に起因する測定シグナルの減少、すなわち、エクソソームに起因する測定シグナルの減少を確認することにより、エクソソームの破壊を確認することができる。エクソソームの破壊を確認するための判断基準は、適宜、設定することができ、例えば、５０％以上の該測定シグナルの減少を判断基準に設定することができる。さらに、エクソソームがその表面に有するエクソソーム特有抗原を免疫学的測定法により測定することによりエクソソームの破壊を確認する場合、試料と、本発明の破壊用試薬とを混合することによって得られる混合物をゲルろ過クロマトグラフィに供して、得られた各分画中のエクソソームを測定することによって、エクソソームの破壊を確認することもできる。この場合、血清や血漿等の試料そのものをゲルろ過クロマトグラフィに供して、予めエクソソームが溶出される分画を確認し、その後、血清や血漿等の試料と本発明の破壊用試薬とを混合することによって得られる混合物をゲルろ過クロマトグラフィに供して、予め確認しておいた該分画中のエクソソームを免疫学的測定法により測定し、測定シグナルの減少を確認することにより、エクソソームの破壊を確認することができる。エクソソームの破壊を確認するための判断基準は、適宜、設定することができ、例えば、５０％以上の該測定シグナルの減少を判断基準に設定することができる。
【００１５】
測定シグナルは、エクソソームがその表面に有するエクソソーム特有抗原の免疫学的測定法により得られるシグナルであり、エクソソーム特有抗原を表面に有するエクソソームと、該エクソソーム特有抗原に対する抗体に標識が結合してなる標識化抗体とを含む免疫複合体中の標識に起因する。測定シグナルとしては、エクソソームの破壊を確認できるシグナルであれば特に制限はなく、例えば発色（吸光度）、蛍光、発光等が挙げられる。
測定シグナルが発色（吸光度）の場合、例えば、標識であるペルオキシダーゼと、その基質である過酸化水素および酸化発色型色原体の組み合わせとを反応させ、反応液の吸光度を分光光度計やマルチウェルプレートリーダー等で測定する方法や、標識であるβ−Ｄ−ガラクトシダーゼとその基質とを反応させ、反応液の吸光度を分光光度計やマルチウェルプレートリーダー等で測定する方法等が挙げられる。酸化発色型色原体としては、例えばロイコ型色原体、酸化カップリング発色型色原体等が挙げられる。
ロイコ型色原体は、過酸化水素およびペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、単独で色素へ変換される物質である。具体的には、テトラメチルベンジジン、Ｏ−フェニレンジアミン、１０−Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＣＣＡＰ）、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム塩（ＤＡ−６４）、１０−Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジンナトリウム塩（ＤＡ−６７）、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス［３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル］アミン（ＢＣＭＡ）等が挙げられる。
【００１６】
酸化カップリング発色型色原体は、過酸化水素およびペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、２つの化合物が酸化的カップリングして色素を生成する物質である。２つの化合物の組み合わせとしては、カプラーとアニリン類（トリンダー試薬）との組み合わせ、カプラーとフェノール類との組み合わせ等が挙げられる。
カプラーとしては、例えば４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラジン等が挙げられる。
アニリン類としては、Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ビス（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−４−フルオロ−３，５−ジメトキシアニリン（Ｆ−ＤＡＯＳ）等が挙げられる。
フェノール類としては、フェノール、４−クロロフェノール、３−メチルフェノール、３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢ）等が挙げられる。
【００１７】
β−Ｄ−ガラクトシダーゼの基質としては、例えばｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド等が挙げられる。
【００１８】
測定シグナルが蛍光の場合、例えば、標識であるペルオキシダーゼと、過酸化水素およびペルオキシダーゼの蛍光性基質の組み合わせとを反応させ、生成した蛍光の強度を蛍光光度計や蛍光マルチウェルプレートリーダー等で測定する方法、標識であるβ−Ｄ−ガラクトシダーゼと、β−Ｄ−ガラクトシダーゼの蛍光性基質とを反応させ、生成した蛍光の強度を蛍光光度計や蛍光マルチウェルプレートリーダー等で測定する方法等が挙げられる。ペルオキシダーゼの蛍光性基質としては、例えば４−ヒドロキシフェニル酢酸、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、クマリン等が挙げられる。β−Ｄ−ガラクトシダーゼの蛍光性基質としては、例えば４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド等が挙げられる。
【００１９】
測定シグナルが発光の場合、例えば、標識である発光物質に起因する発光の強度を発光光度計や発光マルチウェルプレートリーダー等で測定する方法、標識であるペルオキシダーゼと、過酸化水素およびペルオキシダーゼの発光性基質の組み合わせとを反応させ、生成した発光の強度を発光強度計や発光マルチウェルプレートリーダー等で測定する方法、標識であるβ−Ｄ−ガラクトシダーゼと、β−Ｄ−ガラクトシダーゼの発光性基質とを反応させ、生成した発光の強度を発光光度計や発光マルチウェルプレートリーダー等で測定する方法、標識であるアルカリホスファターゼと、アルカリホスファターゼの発光性基質とを反応させ、生成した発光の強度を発光強度計や発光マルチウェルプレートリーダー等で測定する方法等が挙げられる。発光物質としては、例えばアクリジニウムエステルおよびその誘導体、ルテニウム錯体化合物、ロフィン等が挙げられる。ペルオキシダーゼの発光性基質としては、例えばルミノール化合物、ルシゲニン化合物等が挙げられる。β−Ｄ−ガラクトシダーゼの発光性基質としては、例えばガラクトン−プラス（Ｇａｌａｃｔｏｎ−Ｐｌｕｓ；アプライドバイオシステムズ社製）及びその類似化合物等が挙げられる。アルカリホスファターゼの発光性基質としては、例えば３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３’−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン・二ナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ）、２−クロロ−５−｛４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３．７］デカン］−４−イル｝フェニルホスフェート・二ナトリウム塩（ＣＤＰ−ＳｔａｒＴＭ）、３−｛４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３．７］デカン］−４’−イル｝フェニルホスフェート・二ナトリウム塩（ＣＳＰＤＴＭ）、９−［（フェニルオキシ）（ホスホリルオキシ）メチリデン］−１０−メチルアクリダン・二ナトリウム、９−［（４−クロロフェニルチオ）（ホスホリルオキシ）メチリデン］−１０−メチルアクリダン・二ナトリウム（ＬｕｍｉｇｅｎＴＭ  ＡＰＳ−５）等が挙げられる。
【００２０】
エクソソームがその表面に有するエクソソーム特有抗原を免疫学的測定法により測定することによりエクソソームの破壊を確認する方法としては、例えば以下の工程を含む方法等が挙げられる。
＜エクソソームの破壊を確認する方法（１）＞
（１Ａ）試料に、ポリエーテルアルキルアミン、ＰＯＥ−ＰＯＰアルキルエーテル、及び、ＨＬＢ値が１３以下のＰＯＥアルキルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一種以上の界面活性剤を添加する工程；
（２Ａ）前記工程（１Ａ）で得られたサンプルを、エクソソームがその表面に有する第１のエクソソーム特有抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片、及び、エクソソームがその表面に有する第２のエクソソーム特有抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片と、水性媒体中で反応させ、該第１抗体若しくは該抗体断片と、エクソソームと、該第２抗体若しくは該抗体断片と、からなる免疫複合体１を生成させる工程；
（３Ａ）前記工程（２Ａ）で生成した免疫複合体を測定する工程；
（４Ａ）前記工程（１Ａ）において、試料に、ポリエーテルアルキルアミン、ＰＯＥ−ＰＯＰアルキルエーテル、及び、ＨＬＢ値が１３以下のＰＯＥアルキルフェニルエーテルのいずれの界面活性剤も添加しないことを除いては、前記工程（１Ａ）〜（３Ａ）と同じ工程により生成した免疫複合体を測定する工程；及び、
（５Ａ）前記工程（３Ａ）で得られた測定シグナルと、前記工程（４Ａ）で得られた測定シグナルとを比較し、前記工程（３Ａ）で得られた測定シグナルが、前記工程（４Ａ）で得られた測定シグナルに比較して減少した場合には、エクソソームが破壊された、と判断する工程。
【００２１】
上記工程（１Ａ）において、ポリエーテルアルキルアミン、ＰＯＥ−ＰＯＰアルキルエーテル、及び、ＨＬＢ値が１３以下のＰＯＥアルキルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一種以上の界面活性剤の試料への添加は、ポリエーテルアルキルアミン、ＰＯＥ−ＰＯＰアルキルエーテル、及び、ＨＬＢ値が１３以下のＰＯＥアルキルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一種以上の界面活性剤を含有する本発明のエクソソーム破壊用試薬の試料への添加により行うことができる。この場合、上記工程（４Ａ）は、ポリエーテルアルキルアミン、ＰＯＥ−ＰＯＰアルキルエーテル、及び、ＨＬＢ値が１３以下のＰＯＥアルキルフェニルエーテルのいずれの界面活性剤も含有しない、対照用のエクソソーム破壊用試薬を試料に添加することにより行うことができる。また、工程（５Ａ）におけるエクソソーム破壊の判断基準は、適宜、設定することができ、例えば、工程（３Ａ）で得られた測定シグナルが、工程（４Ａ）で得られた測定シグナルに比較して、５０％以上減少した場合にエクソソームが破壊された、と判断する基準を設定することができる。
上記工程（２Ａ）において、エクソソームがその表面に有する第１のエクソソーム特有抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片は不溶性担体に固定化されていなくても、固定化されていてもよいが、固定化されていることが好ましい。不溶性担体としては、エクソソームがその表面に有する第１のエクソソーム特有抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片を固定化し、本発明のエクソソームの破壊方法を可能とする不溶性担体であれば特に制限はなく、例えばマイクロタイタープレート等の合成樹脂製プレート、ガラス製または合成樹脂製の粒状物（ビーズ）、ガラス製または合成樹脂製の球状物（ボール）、ラテックス、磁性粒子、ニトロセルロース膜等の各種メンブレン、合成樹脂製の試験管等が挙げられる。合成樹脂製プレートとしては、例えばポリエチレンプレート、ポリプロピレンプレート、ポリスチレンプレート等が挙げられる。
【００２２】
エクソソームがその表面に有する第１のエクソソーム特有抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片の不溶性担体への固定化としては、本発明のエクソソームの破壊方法を可能とする固定化であれば特に制限はなく、物理吸着、化学結合による固定化等が挙げられる。物理吸着としては、例えば静電的結合、水素結合、疎水結合等が挙げられる。化学結合としては、例えば共有結合、配位結合等が挙げられる。
エクソソームがその表面に有する第１のエクソソーム特有抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片は、物理吸着及び／又は化学結合により直接、不溶性担体に固定化しても、間接的に不溶性担体に固定化してもよい。間接的な固定化方法としては、例えばビオチンとアビジン類（アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン等）との特異的結合を介して、エクソソームがその表面に有する第１のエクソソーム特有抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片を不溶性担体に固定化する方法等が挙げられる。また、エクソソームがその表面に有する第１のエクソソーム特有抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片は、リンカーを介した共有結合により不溶性担体に固定化してもよい。
また、上記工程（２Ａ）において、エクソソームがその表面に有する第２のエクソソーム特有抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片は標識に結合しても、結合していなくてもよいが、結合していることが好ましい。標識としては、例えば前述の標識等が挙げられる。エクソソームがその表面に有する第２のエクソソーム特有抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片が標識に結合している場合、上記工程（３Ａ）における、生成した免疫複合体の測定は、生成した免疫複合体中の標識を測定することにより行うことができる。
該第２抗体若しくは該抗体断片に標識が結合していない場合には、該第２抗体若しくは該抗体断片に結合する第３抗体若しくは該抗体断片に標識が結合した標識化第３抗体若しくは該抗体断片を用いて、同様に、試料中のエクソソームの破壊を確認することができる。すなわち、標識化第３抗体若しくは該抗体断片を、免疫複合体１中の第２抗体若しくは該抗体断片と反応させて、第１抗体若しくは該抗体断片と、エクソソームと、第２抗体若しくは該抗体断片と、標識化第３抗体若しくは該抗体断片と、からなる免疫複合体２を形成させ、免疫複合体２中の標識を前述の方法により測定することにより、工程（２Ａ）で生成した免疫複合体１の量を測定することができる。第３抗体としては、例えば第２抗体のＦｃ領域に結合する抗体若しくは該抗体断片等が挙げられる。標識としては、前述の標識等が挙げられる。
【００２３】
第１のエクソソーム特有抗原と第２のエクソソーム特有抗原との組み合わせとしては、本発明のエクソソームの破壊方法を可能とする組み合わせであれば特に制限はなく、例えば以下の表１に示した組み合わせ等が挙げられる。
【００２４】
【表１】
2020004436.tif 000003
【００２５】
第１のエクソソーム特有抗原に結合する第１抗体と、第２のエクソソーム特有抗原に結合する第２抗体との組み合わせとしては、本発明のエクソソームの破壊方法を可能とする組み合わせであれば特に制限はなく、例えば以下の表２に示した組み合わせ等が挙げられる。
【００２６】
【表２】
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【００２７】
本発明における、第１のエクソソーム特有抗原に結合する第１抗体の抗体断片としては、該第１のエクソソーム特有抗原に結合し、本発明のエクソソームの破壊方法を可能とする抗体断片であれば特に制限はなく、例えば、抗体をパパイン処理することにより得られるＦａｂ、抗体をペプシン処理することにより得られるＦ(ａｂ’)２、抗体をペプシン処理−還元処理することにより得られるＦａｂ’等の、Ｆｃ部分が除去された抗体断片、遺伝子工学的手法によりＦｃ部分が除去された抗体断片等が挙げられる。
本発明における、第２のエクソソーム特有抗原に結合する第２抗体の抗体断片としては、該第２のエクソソーム特有抗原に結合し、本発明のエクソソームの破壊方法を可能とする抗体断片であれば特に制限はなく、例えば、抗体をパパイン処理することにより得られるＦａｂ、抗体をペプシン処理することにより得られるＦ(ａｂ’)２、抗体をペプシン処理−還元処理することにより得られるＦａｂ’等の、Ｆｃ部分が除去された抗体断片、遺伝子工学的手法によりＦｃ部分が除去された抗体断片等が挙げられる。
【００２８】
本発明における、第１のエクソソーム特有抗原に結合する第１抗体としては、該第１のエクソソーム特有抗原に結合し、本発明のエクソソームの破壊方法を可能とする抗体であれば特に制限はなく、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれも使用可能である。
本発明における、第２のエクソソーム特有抗原に結合する第２抗体としては、該第２のエクソソーム特有抗原に結合し、本発明のエクソソームの破壊方法を可能とする抗体であれば特に制限はなく、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれも使用可能である。
【００２９】
第１のエクソソーム特有抗原に結合する第１抗体、第２のエクソソーム特有抗原に結合する第２抗体のいずれの抗体も、市販の抗体を使用することができる。市販の抗体としては、例えば、抗ＣＤ９モノクローナル抗体（クローンＡ１００−４；医学生物学研究所社製）、Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ９（日本ベクトン・ディッキンソン社製）、Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−ＨｕｍａｎＣＤ６３（日本ベクトン・ディッキンソン社製）、Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ８１（日本ベクトン・ディッキンソン社製、クローン：ＪＳ−８１）、抗ＣＤ１４７抗体［ＭＥＭ−Ｍ６／１］（Ｎｏｖｏｕｓ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社製）等が挙げられる。
【００３０】
＜エクソソームの破壊を確認する方法（２）＞
（１Ｂ）試料に、ポリエーテルアルキルアミン、ＰＯＥ−ＰＯＰアルキルエーテル、及び、ＨＬＢ値が１３以下のＰＯＥアルキルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一種の界面活性剤を添加する工程；
（２Ｂ）前記工程（１Ｂ）で得られたサンプルをゲルろ過クロマトグラフィに供し、エクソソームを含有する分画とそれ以外の分画とを分離する工程；
（３Ｂ）前記工程（２Ｂ）で得られたエクソソームを含有する分画を、エクソソームがその表面に有する第１のエクソソーム特有抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片、及び、エクソソームがその表面に有する第２のエクソソーム特有抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片と、水性媒体中で反応させ、該第１抗体若しくは該抗体断片と、エクソソームと、該第２抗体若しくは該抗体断片と、からなる免疫複合体１を生成させる工程；
（４Ｂ）前記工程（３Ｂ）で生成した免疫複合体１を測定する工程；
（５Ｂ）前記工程（１Ｂ）において、ポリエーテルアルキルアミン、ＰＯＥ−ＰＯＰアルキルエーテル、及び、ＨＬＢ値が１３以下のＰＯＥアルキルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一種の界面活性剤を添加しないことを除いては、前記工程（１Ｂ）〜（４Ｂ）と同じ工程により生成した免疫複合体を測定する工程；及び、
（６Ｂ）前記工程（４Ｂ）で得られた測定シグナルと、前記工程（５Ｂ）で得られた測定シグナルとを比較し、前記工程（４Ｂ）で得られた測定シグナルが、前記工程（５Ｂ）で得られた測定シグナルに比較して減少した場合に、エクソソームが破壊された、と判断する工程。
【００３１】
上記工程（１Ｂ）において、ポリエーテルアルキルアミン、ＰＯＥ−ＰＯＰアルキルエーテル、及び、ＨＬＢ値が１３以下のＰＯＥアルキルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一種以上の界面活性剤の試料への添加は、ポリエーテルアルキルアミン、ＰＯＥ−ＰＯＰアルキルエーテル、及び、ＨＬＢ値が１３以下のＰＯＥアルキルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一種以上の界面活性剤を含有する本発明のエクソソーム破壊用試薬の試料への添加により行うことができる。この場合、上記工程（５Ｂ）は、ポリエーテルアルキルアミン、ＰＯＥ−ＰＯＰアルキルエーテル、及び、ＨＬＢ値が１３以下のＰＯＥアルキルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一種以上の界面活性剤を含有しない、対照用のエクソソーム破壊用試薬を試料に添加することにより行うことができる。また、工程（６Ｂ）におけるエクソソーム破壊の判断基準は、適宜、設定することができ、例えば、工程（４Ｂ）で得られた測定シグナルが、工程（５Ｂ）で得られた測定シグナルに比較して、５０％以上減少した場合にエクソソームが破壊された、と判断する基準を設定することができる。
上記工程（３Ｂ）において、エクソソームがその表面に有する第１のエクソソーム特有抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片は不溶性担体に固定化されていなくても、固定化されていてもよいが、固定化されていることが好ましい。不溶性担体としては、例えば前述の不溶性担体等が挙げられる。
【００３２】
エクソソームがその表面に有する第１のエクソソーム特有抗原に結合する第１抗体若しくは該抗体断片の不溶性担体への固定化としては、例えば前述の固定化等が挙げられる。
また、上記工程（３Ｂ）において、エクソソームがその表面に有する第２のエクソソーム特有抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片は標識に結合しても、結合していなくてもよいが、結合していることが好ましい。標識としては、例えば前述の標識等が挙げられる。エクソソームがその表面に有する第２のエクソソーム特有抗原に結合する第２抗体若しくは該抗体断片が標識に結合している場合、上記工程（４Ｂ）における、生成した免疫複合体１の測定は、生成した免疫複合体１中の標識を測定することにより行うことができる。
該第２抗体若しくは該抗体断片に標識が結合していない場合には、該第２抗体若しくは該抗体断片に結合する第３抗体若しくは該抗体断片に標識が結合した標識化第３抗体若しくは該抗体断片を用いて、同様に、試料中のエクソソームの破壊を確認することができる。すなわち、標識化第３抗体若しくは該抗体断片を、免疫複合体１中の第２抗体若しくは該抗体断片と反応させて、第１抗体若しくは該抗体断片と、エクソソームと、第２抗体若しくは該抗体断片と、標識化第３抗体若しくは該抗体断片と、からなる免疫複合体２を形成させ、免疫複合体２中の標識を前述の方法により測定することにより、工程（３Ｂ）で生成した免疫複合体１の量を測定することができる。第３抗体としては、例えば第２抗体のＦｃ領域に結合する抗体若しくは該抗体断片等が挙げられる。標識としては、前述の標識等が挙げられる。
【００３３】
第１のエクソソーム特有抗原と第２のエクソソーム特有抗原との組み合わせとしては、例えば前述の組み合わせ等が挙げられる。
第１のエクソソーム特有抗原に結合する第１抗体と、第２のエクソソーム特有抗原に結合する第２抗体との組み合わせとしては、例えば前述の組み合わせ等が挙げられる。
第１のエクソソーム特有抗原に結合する第１抗体、第２のエクソソーム特有抗原に結合する第２抗体のいずれの抗体も、市販の抗体を使用することができる。市販の抗体としては、例えば前述の抗体等が挙げられる。
【００３４】
本発明におけるエクソソームとは、動物細胞から分泌される直径３０〜２００ｎｍの脂質二重膜構造を有する小胞顆粒である。
【００３５】
本発明における試料とは、超遠心分離等のエクソソームの単離操作が行われていない試料を意味し、例として、エクソソームを含有する生体試料（例えば、全血、血清、血漿、尿、唾液、乳汁、精漿、脳脊髄液等の体液試料、及び糞便）、ならびに細胞培養液等が挙げられ、生体試料が好ましく、血清及び血漿が特に好ましい。
【００３６】
本発明のエクソソームの破壊方法におけるポリエーテルアルキルアミンとしては、本発明のエクソソームの破壊方法を可能とするポリエーテルアルキルアミンであれば特に制限はないが、ＨＬＢ値が１３以下のポリエーテルアルキルアミンが好ましい。本発明におけるポリエーテルアルキルアミンとは、アルキルアミンの窒素原子に結合した水素原子の少なくとも１つが、ポリオキシエチレンで置換された構造を有するものであり、例えば、ポリオキシエチレンアルキルアミン（以下、ＰＯＥアルキルアミンと記す）、ポリオキシエチレンアルキルプロピレンジアミン（以下、ＰＯＥアルキルプロピレンジアミンと記す）等が挙げられる。
ポリエーテルアルキルアミンにおけるアルキルとしては、例えば、炭素数８〜２４のアルキルが挙げられ、炭素数１０〜２０のアルキルが好ましい。炭素数８〜２４のアルキルとしては、例えば、オクチル、イソオクチル、ノニル、デシル、イソデシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、オレイル、ノナデシル、イコシル、ヘネイコシル、ドコシル（ベヘニル）、トリコシル、テトラコシル等が挙げられる。炭素数１０〜２０のアルキルとしては、例えばデシル、イソデシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、オレイル、ノナデシル、イコシル等が挙げられる。
【００３７】
ポリエーテルアルキルアミンの市販品のうち、ＰＯＥアルキルアミンの市販品としては、例えば、ナイミーンＬ−２０１［オキシエチレンドデシルアミン;ＨＬＢ値３．８］、ナイミーンＬ−２０２［ＰＯＥドデシルアミン；ＨＬＢ値６．４］、ナイミーンＬ−２０７［ＰＯＥドデシルアミン；ＨＬＢ値１２．５］、ナイミーンＳ−２０４［ＰＯＥステアリルアミン；ＨＬＢ値８．０］、ナイミーンＳ−２２０［ＰＯＥステアリルアミン；ＨＬＢ値１５．４］、ナイミーンＴ２−２１０［ＰＯＥアルキル（牛脂）アミン；ＨＬＢ値１２．５］、ナイミーンＦ−２０２［ＰＯＥアルキル（ヤシ）アミン；ＨＬＢ値６．１］（以上、日油社製）、ブラウノンＬ−２０５［ＰＯＥドデシルアミン；ＨＬＢ値１０．４］、ブラウノンＬ−２１０［ＰＯＥドデシルアミン；ＨＬＢ値１３．６］（以上、青木油脂工業社製）等が挙げられ、ＰＯＥアルキルプロピレンジアミンの市販品としては、例えばナイミーンＤＴ−２０３［ＰＯＥアルキルプロピレンジアミン;ＨＬＢ値６．０］、ナイミーンＤＴ−２０８［ＰＯＥアルキルプロピレンジアミン;ＨＬＢ値１０．７］（以上、日油社製）、ブラウノンＤＴ−０３［ＰＯＥアルキル（牛脂）プロピレンジアミン;ＨＬＢ値５．９］、ブラウノンＤＴ−１５［ＰＯＥアルキル（牛脂）プロピレンジアミン;ＨＬＢ値１３．４］（以上、青木油脂工業社製）等が挙げられる。
ＨＬＢ値が１３以下のポリエーテルアルキルアミンの市販品として、例えば、ＰＯＥアルキルアミンとしては、ナイミーンＬ−２０１［オキシエチレンドデシルアミン;ＨＬＢ値３．８］、ナイミーンＬ−２０２［ＰＯＥドデシルアミン；ＨＬＢ値６．４］、ナイミーンＬ−２０７［ＰＯＥドデシルアミン；ＨＬＢ値１２．５］、ナイミーンＳ−２０４［ＰＯＥステアリルアミン；ＨＬＢ値８．０］、ナイミーンＴ２−２１０［ＰＯＥアルキル（牛脂）アミン；ＨＬＢ値１２．５］、ナイミーンＦ−２０２［ＰＯＥアルキル（ヤシ）アミン；ＨＬＢ値６．１］（以上、日油社製）、ブラウノンＬ−２０５［ＰＯＥドデシルアミン；ＨＬＢ値１０．４］（青木油脂工業社製）等が挙げられる。ＨＬＢ値が１３以下のＰＯＥアルキルプロピレンジアミンの市販品としては、例えば、ナイミーンＤＴ−２０３［ＰＯＥアルキルプロピレンジアミン;ＨＬＢ値６．０］、ナイミーンＤＴ−２０８［ＰＯＥアルキルプロピレンジアミン;ＨＬＢ値１０．７］（以上、日油社製）、ブラウノンＤＴ−０３［ＰＯＥアルキル（牛脂）プロピレンジアミン;ＨＬＢ値５．９］（以上、青木油脂工業社製）等が挙げられる。
【００３８】
本発明のエクソソームの破壊方法におけるＰＯＥ−ＰＯＰアルキルエーテルとは、本発明のエクソソームの破壊方法を可能とするＰＯＥ−ＰＯＰアルキルエーテルであれば特に制限はないが、ＨＬＢ値が１３以下のＰＯＥ−ＰＯＰアルキルエーテルが特に好ましい。
ＰＯＥ−ＰＯＰアルキルエーテルにおけるアルキルとしては、例えば、炭素数８〜２４のアルキルが挙げられ、炭素数１０〜２０のアルキルが好ましい。炭素数８〜２４のアルキルとしては、例えば、前述の炭素数８〜２４のアルキル等が挙げられる。炭素数１０〜２０のアルキルとしては、例えば、前述の炭素数１０〜２０のアルキル等が挙げられる。
【００３９】
ＰＯＥ−ＰＯＰアルキルエーテルの市販品としては、例えば、ノニオンＨＴ−５０５［ＰＯＥ−ＰＯＰアルキルエーテル；ＨＬＢ値５］、ノニオンＨＴ−５１０［ＰＯＥ−ＰＯＰアルキルエーテル；ＨＬＢ値１０］、ノニオンＨＴ−５１２［ＰＯＥ−ＰＯＰアルキルエーテル；ＨＬＢ値１２］、ノニオンＨＴ−５１５［ＰＯＥ−ＰＯＰアルキルエーテル；ＨＬＢ値１５］（以上、日油社製）、ワンダサーフＩＤ−５０［ＰＯＥ−ＰＯＰイソデシルエーテル；ＨＬＢ値１０．５］、ワンダサーフＩＤ−７０［ＰＯＥ−ＰＯＰイソデシルエーテル；ＨＬＢ値１２．１］、ワンダサーフＩＤ−９０［ＰＯＥ−ＰＯＰイソデシルエーテル；ＨＬＢ値１３．２］（以上、青木油脂工業社製）、ノイゲンＴＤＳ−３０［ＰＯＥ−ＰＯＰトリデシルエーテル；ＨＬＢ値８］、ノイゲンＴＤＳ−５０［ＰＯＥ−ＰＯＰトリデシルエーテル；ＨＬＢ値１０．５］、ノイゲンＴＤＳ−７０［ＰＯＥ−ＰＯＰトリデシルエーテル；ＨＬＢ値１２．１］（以上、第一工業製薬社製）等が挙げられる。
また、ＨＬＢ値が１３以下のＰＯＥ−ＰＯＰアルキルエーテルの市販品としては、例えば、ノニオンＨＴ−５０５［ＰＯＥ−ＰＯＰアルキルエーテル；ＨＬＢ値５］、ノニオンＨＴ−５１０［ＰＯＥ−ＰＯＰアルキルエーテル；ＨＬＢ値１０］、ノニオンＨＴ−５１２［ＰＯＥ−ＰＯＰアルキルエーテル；ＨＬＢ値１２］（以上、日油社製）、ワンダサーフＩＤ−５０［ＰＯＥ−ＰＯＰイソデシルエーテル；ＨＬＢ値１０．５］、ワンダサーフＩＤ−７０［ＰＯＥ−ＰＯＰイソデシルエーテル；ＨＬＢ値１２．１］（以上、青木油脂工業社製）、ノイゲンＴＤＳ−３０［ＰＯＥ−ＰＯＰトリデシルエーテル；ＨＬＢ値８］、ノイゲンＴＤＳ−５０［ＰＯＥ−ＰＯＰトリデシルエーテル；ＨＬＢ値１０．５］、ノイゲンＴＤＳ−７０［ＰＯＥ−ＰＯＰトリデシルエーテル；ＨＬＢ値１２．１］（以上、第一工業製薬社製）等が挙げられる。
【００４０】
本発明のエクソソームの破壊方法におけるＨＬＢ値が１３以下のＰＯＥアルキルフェニルエーテルとは、本発明のエクソソームの破壊方法を可能とするＨＬＢ値が１３以下のＰＯＥアルキルフェニルエーテルであれば特に制限はない。
ＨＬＢ値が１３以下のＰＯＥアルキルフェニルエーテルにおけるアルキルとしては、例えば、炭素数８〜９のアルキルが挙げられる。炭素数８〜９のアルキルとしては、例えばオクチル、ノニル等が挙げられる。
【００４１】
ＨＬＢ値が１３以下のＰＯＥアルキルフェニルエーテルの市販品としては、例えば、ノニオンＨＳ−２０４．５［ＰＯＥオクチルフェニルエーテル；ＨＬＢ値９．８］、ノニオンＨＳ−２０６［ＰＯＥオクチルフェニルエーテル；ＨＬＢ値１１．２］、ノニオンＮＳ−２０２［ＰＯＥノニルフェニルエーテル；ＨＬＢ値５．７］、ノニオンＮＳ−２０４．５［ＰＯＥノニルフェニルエーテル；ＨＬＢ値９．５］、ノニオンＮＳ−２０８．５［ＰＯＥノニルフェニルエーテル；ＨＬＢ値１２．６］（以上、日油社製）、ブラウノンＮＫ−８０５５［ＰＯＥオクチルフェニルエーテル；ＨＬＢ値１０．８］、ブラウノンＮＫ−８０８［ＰＯＥオクチルフェニルエーテル；ＨＬＢ値１２．５］、ブラウノンＮ−５０２［ＰＯＥノニルフェニルエーテル；ＨＬＢ値５．７］、ブラウノンＮ−５０６［ＰＯＥノニルフェニルエーテル；ＨＬＢ値１０．９］、ブラウノンＤＴ−９［ＰＯＥドデシルフェニルエーテル；ＨＬＢ値１２．０］（以上、青木油脂工業社製）等が挙げられる。
【００４２】
本発明のエクソソームの破壊方法におけるポリエーテルアルキルアミン、ＰＯＥ−ＰＯＰアルキルエーテル、及び、ＨＬＢ値が１３以下のＰＯＥアルキルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一種の界面活性剤を試料に添加する方法としては、本発明のエクソソームの破壊方法を可能とする添加方法であれば特に制限はなく、例えば、該界面活性剤を、試料に直接添加する方法；該界面活性剤を水性媒体に溶解して調製した該界面活性剤の水溶液を、試料に添加する方法；試料を、該界面活性剤を水性媒体に溶解して調製した該界面活性剤の水溶液に添加する方法；試料を、該界面活性剤を水性媒体に溶解して調製した該界面活性剤の水溶液を凍結乾燥して得られる組成物に添加する方法等が挙げられ、該界面活性剤を水性媒体に溶解して調製した水溶液を、試料に添加する方法が好ましい。
水性媒体としては、本発明のエクソソームの破壊方法を可能とする水性媒体であれば特に制限はなく、例えば、脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられ、緩衝液が好ましい。水性媒体のｐＨとしては、例えば４〜１０である。水性媒体として緩衝液を用いる場合には、設定するｐＨに適した緩衝液を用いることが好ましい。緩衝液の調製に使用される緩衝剤としては、緩衝能を有するものならば特に限定はなく、例えば、乳酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤、ジエタノールアミン緩衝剤、リジン緩衝剤、バルビツール緩衝剤、イミダゾール緩衝剤、リンゴ酸緩衝剤、シュウ酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、グッド緩衝剤等が挙げられる。
【００４３】
グッド緩衝剤としては、例えば２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝剤、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝剤、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）緩衝剤、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）緩衝剤、２−［Ｎ−（２−アセトアミド）アミノ］エタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）緩衝剤、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）緩衝剤、２−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］エタンスルホン酸（ＢＥＳ）緩衝剤、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝剤、２−｛Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝エタンスルホン酸（ＴＥＳ）緩衝剤、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ’−（２−スルホエチル）ピペラジン（ＨＥＰＥＳ）緩衝剤、３−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）緩衝剤、２−ヒドロキシ−３−｛［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）緩衝剤、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパン−３−スルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）緩衝剤、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ’−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）ピペラジン（ＨＥＰＰＳＯ）緩衝剤、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ’−（３−スルホプロピル）ピペラジン（ＥＰＰＳ）緩衝剤、［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン］（Ｔｒｉｓｉｎｅ）緩衝剤、［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン］（Ｂｉｃｉｎｅ）緩衝剤、３−［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）緩衝剤、２−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）緩衝剤、３−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）緩衝剤、３−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）緩衝剤等が挙げられる。
水性媒体には、塩類、金属イオン、糖類、防腐剤、蛋白質等が含有されてもよい。塩類としては、例えば塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化アンモニウム、臭化リチウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、臭化カルシウム、臭化マグネシウム、臭化アンモニウム等が挙げられる。金属イオンとしては、例えばマグネシウムイオン、マンガンイオン、亜鉛イオン等が挙げられる。糖類としては、例えばマンニトール、ソルビトール等が挙げられる。防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生物質（ストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、バイオエース、プロクリン３００、プロキセル（Ｐｒｏｘｅｌ）ＧＸＬ等が挙げられる。蛋白質としては、例えばウシ血清アルブミン等が挙げられる。
【００４４】
本発明のエクソソームの破壊方法において、試料と、ポリエーテルアルキルアミン、ＰＯＥ−ＰＯＰアルキルエーテル、及び、ＨＬＢ値が１３以下のＰＯＥアルキルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一種の界面活性剤との反応の反応温度は、本発明のエクソソームの破壊方法を可能とする温度であれば特に制限はなく、通常、０〜５０℃であり、４〜４５℃が好ましく、１５〜４０℃が特に好ましい。該反応の反応時間は、本発明のエクソソームの破壊方法を可能とする時間であれば特に制限はなく、通常、１０秒間〜２４時間であり、３０秒間〜３時間が好ましく、１分間〜２時間が特に好ましい。
【００４５】
本発明のエクソソームの破壊方法におけるポリエーテルアルキルアミン、ＰＯＥ−ＰＯＰアルキルエーテル、及び、ＨＬＢ値が１３以下のＰＯＥアルキルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一種の界面活性剤の、試料に添加された後の濃度は、本発明のエクソソームの破壊方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常０．００１〜１０％（ｗ／ｖ）であり、０．０１〜５％（ｗ／ｖ）が好ましく、０．０４〜１％（ｗ／ｖ）が特に好ましい。
【００４６】
２．エクソソームの破壊用試薬
本発明の試料中のエクソソームの破壊用試薬は、本発明の試料中のエクソソームの破壊方法に用いられる試薬であり、試料中エクソソーム破壊剤、試料中エクソソーム破壊用組成物、試料中エクソソーム溶解用試薬、試料中エクソソーム溶解剤、試料中エクソソーム溶解用組成物とも表現されうる。本発明の破壊用試薬を用いて破壊するエクソソームを含有する試料としては、例えば前述の試料等が挙げられる。
本発明のエクソソームの破壊用試薬におけるポリエーテルアルキルアミン、ＰＯＥ−ＰＯＰアルキルエーテル、及び、ＨＬＢ値が１３以下のＰＯＥアルキルフェニルエーテルとは、例えば、前述のポリエーテルアルキルアミン、ＰＯＥ−ＰＯＰアルキルエーテル、及び、ＨＬＢ値が１３以下のＰＯＥアルキルフェニルエーテルがそれぞれ挙げられる。
【００４７】
本発明のエクソソームの破壊用試薬は、液状であっても凍結乾燥状態であってもよい。液状の破壊用試薬の場合、ポリエーテルアルキルアミン、ＰＯＥ−ＰＯＰアルキルエーテル、及び、ＨＬＢ値が１３以下のＰＯＥアルキルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一種の界面活性剤は、予め、前述の水性媒体中に溶解されている。凍結乾燥状態の破壊用試薬の場合、ポリエーテルアルキルアミン、ＰＯＥ−ＰＯＰアルキルエーテル、及び、ＨＬＢ値が１３以下のＰＯＥアルキルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一種の界面活性剤は、前述の水性媒体中に溶解されて使用されても、直接試料と接触することにより使用されても良い。本発明の破壊用試薬には、前述の塩類、金属イオン、糖類、防腐剤、蛋白質等が含有されてもよい。
【００４８】
本発明のエクソソームの破壊用試薬におけるポリエーテルアルキルアミン、ＰＯＥ−ＰＯＰアルキルエーテル、及び、ＨＬＢ値が１３以下のＰＯＥアルキルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一種の界面活性剤の含量は、本発明の破壊方法を可能とする含量であれば特に制限はなく、試料と混合された後の濃度が、通常０．００１〜１０％（ｗ／ｖ）となる含量であり、０．０１〜５％（ｗ／ｖ）となる含量が好ましく、０．０４〜１％（ｗ／ｖ）となる含量が特に好ましい。
【実施例】
【００４９】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
＜材料＞
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲ  １０／３０（ＧＥヘルスケア社製）、リン酸水素二ナトリウム（リン酸緩衝液；関東化学社製）、リン酸二水素ナトリウム（リン酸緩衝液；関東化学社製）、塩化ナトリウム（和光純薬工業社製）、アジ化ナトリウム（和光純薬工業社製）、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、ＭＥＳ（同仁化学研究所社製）、牛血清アルブミン（ＢＳＡ；オリエンタル酵母工業社製）、ストレプトアビジン結合磁性粒子（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｃ１；サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２（同仁化学研究所社製）、抗ＣＤ９モノクローナル抗体（クローンＡ１００−４；医学生物学研究所社製）、ＭＥＳ（同仁化学研究所社製）、Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２（同仁化学研究所社製）、ＭＯＰＳ（同仁化学研究所社製）、塩化マグネシウム６水和物（和光純薬工業社製）、Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート；和光純薬工業社製同仁化学研究所社製）、９−［（４−クロロフェニルチオ）（ホスホリルオキシ）メチリデン］−１０−メチルアクリダン・二ナトリウム塩（ＬｕｍｉｇｅｎＴＭ  ＡＰＳ−５；オリエンタル酵母工業社製）、ナイミーンＬ−２０２［ＰＯＥラウリルアミン（ポリエーテルアルキルアミン）；日油社製］、ナイミーンＤＴ−２０３［ＰＯＥアルキルプロピレンジアミン（ポリエーテルアルキルアミン）；日油社製］、ワンダサーフＩＤ−５０［ＰＯＥ−ＰＯＰイソデシルエーテル（ＰＯＥ−ＰＯＰアルキルエーテル）；青木油脂工業社製］、ノニオンＮＳ−２０４．５［ＰＯＥノニルフェニルエーテル（ＨＬＢ値が１３以下のＰＯＥアルキルフェニルエーテル）；日油社製］、ノニオンＨＳ−２０４．５［ＰＯＥオクチルフェニルエーテル（ＨＬＢ値が１３以下のＰＯＥアルキルフェニルエーテル）；日油社製］、トリトンＸ−１００［ＰＯＥオクチルフェニルエーテル（ＨＬＢ値１３．５）；シグマアルドリッチ社製］、ノニデットＰ−４０［ＰＯＥノニルフェニルエーテル（ＨＬＢ値１３．１）；シグマアルドリッチ社製］。【００５０】
〔参考例１〕
＜血清をゲルろ過クロマトグラフィに供した際に得られる、エクソソームを含有する分画の同定＞
（１）血清の調製
協和メデックス株式会社所属の健常人より採取した全血を、２，０００ｒｐｍ、２５℃で２０分間遠心分離し、血清を調製した。
（２）ゲルろ過クロマトグラフィによる血清成分の分離操作
ゲルろ過クロマトグラフィ用カラムであるＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲ  １０／３０に、上記（１）で調製した血清（５００μＬ）をアプライし、次いで、溶出液として、アジ化ナトリウム０．２ｇ／Ｌを添加したＰＢＳ［リン酸緩衝化生理食塩水（０．１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、ｐＨ７．２）］を流速０．５ｍＬ／ｍｉｎで流し、その溶出分画として分画Ｎｏ．１〜８０（各０．５ｍＬ）を得た。
（３）上記（２）で得られた各分画の、ＢＣＡタンパク質アッセイキットによる測定
上記（２）で得られた分画Ｎｏ．１〜８０の各分画について、蛋白質量の測定用キットであるＢＣＡタンパク質アッセイキットを用いて、該キットの使用説明書に従って反応を行い、吸光度(５６０ｎｍ)を測定した。その結果を図１に示す。【００５１】
（４）抗原抗体反応を用いるサンドイッチ法に用いる測定試薬の調製
ストレプトアビジン結合磁性粒子溶液、ビオチン結合抗ＣＤ９モノクローナル抗体溶液、及び、ＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）標識抗ＣＤ９モノクローナル抗体溶液を調製した。
・ストレプトアビジン結合磁性粒子溶液
市販のストレプトアビジン結合磁性粒子（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｃ１）を用いて、以下の組成からなるストレプトアビジン結合磁性粒子溶液を調製した。
ＭＥＳ（ｐＨ６．５）                      ０．０５ｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ                                    ０．１％（ｗ／ｖ）
塩化ナトリウム                            ０．１ｍｏｌ／Ｌ
ストレプトアビジン結合磁性粒子            ０．２２５ｍｇ／ｍＬ
・ビオチン結合抗ＣＤ９モノクローナル抗体溶液
Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２（同仁化学研究所社製）を用いて、該キットの使用説明書に従い、抗ＣＤ９モノクローナル抗体（クローンＡ１００−４；医学生物学研究所社製）をビオチンで標識し、ビオチン結合抗ＣＤ９モノクローナル抗体を調製した。得られたビオチン結合抗ＣＤ９モノクローナル抗体を用いて、以下の組成からなるビオチン結合抗ＣＤ９モノクローナル抗体溶液を調製した。
ＭＥＳ（ｐＨ６．５）                      ０．０５ｍｏｌ／Ｌ
ビオチン結合抗ＣＤ９モノクローナル抗体    ７５ｎｇ／ｍＬ
ＢＳＡ                                    ０．１％（ｗ／ｖ）
塩化ナトリウム                            ０．１ｍｏｌ／Ｌ
・ＡＬＰ標識抗ＣＤ９モノクローナル抗体溶液
Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２（同仁化学研究所社製）を用いて、該キットの取扱説明書に従い、抗ＣＤ９モノクローナル抗体（クローンＡ１００−４；医学生物学研究所社製）をＡＬＰで標識し、ＡＬＰ標識抗ＣＤ９モノクローナル抗体を調製した。得られたＡＬＰ標識抗ＣＤ９モノクローナル抗体を用いて、以下の組成からなるＡＬＰ標識抗ＣＤ９モノクローナル抗体溶液を調製した。
ＭＥＳ（ｐＨ６．５）                      ０．０５ｍｏｌ／Ｌ
ＡＬＰ標識抗ＣＤ９モノクローナル抗体      ７５ｎｇ／ｍＬ
ＢＳＡ                                    ０．１％（ｗ／ｖ）
塩化ナトリウム                            ０．１ｍｏｌ／Ｌ【００５２】
（５）上記（２）で得られた各分画の、抗原抗体反応を用いるサンドイッチ法による測定
上記（２）で得られた分画Ｎｏ．１〜８０について、各分画（１０μＬ）に、上記（４）で調製したストレプトアビジン結合磁性粒子溶液（３０μＬ）、上記（４）で調製したビオチン結合抗ＣＤ９モノクローナル抗体溶液（３０μＬ）、及び、上記（４）で調製したＡＬＰ標識抗ＣＤ９モノクローナル抗体溶液（３０μＬ）を加えて撹拌し、３７℃で１０分間反応させた。次いで、磁性粒子を磁力で収集し、磁性粒子以外の反応溶液を除去するとともに、下記の洗浄液で該収集された磁性粒子を５回洗浄した。
・洗浄液
ＭＯＰＳ（ｐＨ７．３）                  ０．００５ｍｏｌ／Ｌ
塩化ナトリウム                          ０．３ｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム６水和物                ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｔｗｅｅｎ２０                          ０．０７５％（ｗ／ｖ）
その後、該収集され洗浄された磁性粒子に、９−［（４−クロロフェニルチオ）（ホスホリルオキシ）メチリデン］−１０−メチルアクリダン・二ナトリウム塩（ＬｕｍｉｇｅｎＴＭ  ＡＰＳ−５）を主成分とする発光基質液１００μＬを添加して撹拌し、生じた発光量（ＲＬＵ）を測定した。その結果を図１に示す。【００５３】
（６）エクソソームを含有する分画の同定
上記（５）の結果を示した図１から明らかなように、分画Ｎｏ．１８及びその前後の分画は、抗ＣＤ９モノクローナル抗体を用いたサンドイッチ法による測定により大きな測定シグナルが得られた。したがって、分画Ｎｏ．１８及びその前後の分画には、ＣＤ９をその表面に有するエクソソームが含まれていることが判明した。
血清中には、ＣＤ９をその表面に有するエクソソームの他、単分子のＣＤ９が存在する可能性がある。しかし、上記（５）のサンドイッチ法は、１次抗体としての抗ＣＤ９モノクローナル抗体と、標識化２次抗体としてのＡＬＰ標識抗ＣＤ９モノクローナル抗体とを用いるサンドイッチ法、すなわち、１次抗体と２次抗体の両抗体に、同一のエプトープを認識する抗体を用いるサンドイッチ法であるため、単分子のＣＤ９をサンドイッチすることはできない。したがって、図１においてサンドイッチ法によりシグナルが得られるということは、ＣＤ９をその表面に有するエクソソームのみを検出し、単分子のＣＤ９自体は検出されていないことを意味する。【００５４】
また、図１から明らかなように、分画Ｎｏ．２０〜４０は、ＢＣＡタンパク質アッセイキットを用いた測定により大きな測定シグナルが得られたことから、分画Ｎｏ．２０〜４０には、大量の蛋白質が含まれていることが判明した。また、これらの分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した結果、これらの分画には、血清中の主要な蛋白質であるアルブミン及びガンマグロブリンの分子量（それぞれ分子量約６６ｋＤａ及び１５０ｋＤａ）に相当する蛋白質が大量に含有されていることが判明した。
ここで、ゲルろ過クロマトグラフィにおいては、分子量が大きい分子ほど溶出が早い。しかしながら、図１から明らかなように、ＣＤ９（分子量約２４ｋＤａ）に起因するシグナルを示す分画Ｎｏ．１８付近の分画は、アルブミン（分子量約６６ｋＤａ）及びガンマグロブリン（分子量約１５０ｋＤａ）と比較して溶出が早い。したがって、ＣＤ９に起因するシグナルを示す分画Ｎｏ．１８付近の分画には、単分子のＣＤ９ではなく、ＣＤ９をその表面に有するエクソソームが含まれていることが判明した。【００５５】
＜エクソソーム破壊用試薬の調製＞
〔実施例１〕
ＰＢＳへ、以下の表３に示した５つの界面活性剤の各界面活性剤を１０％（ｗ／ｖ）となるように添加し、エクソソーム破壊用試薬Ａ１〜Ａ５をそれぞれ調製した。
〔比較例１〕
ＰＢＳへ、以下の表３に示した２つの界面活性剤、すなわち、トリトンＸ−１００とノニデットＰ−４０の各界面活性剤を１０％（ｗ／ｖ）となるように添加し、エクソソーム破壊用試薬Ｂ１及びＢ２をそれぞれ調製した。
〔比較例２〕
ＰＢＳを、対照用試薬Ｂ０とした。【００５６】
【表３】
2020004436.tif 000005
【００５７】
〔実施例２〕
＜ポリエーテルアルキルアミンを含有するエクソソーム破壊用試薬を用いたエクソソームの破壊＞
（１）血清の調製、及び、界面活性剤による血清の処理
参考例１における健常人とは異なる、協和メデックス株式会社所属の健常人より採取した全血を、２，０００ｒｐｍ、２５℃で２０分間遠心分離し、血清を調製した。
調製した血清（９００μＬ）に、上記の実施例１で調製したエクソソーム破壊用試薬Ａ１（１００μＬ）を添加し、１０分間静置した。同様に、調製した血清（９００μＬ）に、上記の実施例１で調製したエクソソーム破壊用試薬Ａ２（１００μＬ）を添加し、１０分間静置した。
（２）ゲルろ過クロマトグラフィによる血清成分の分離操作
ゲルろ過クロマトグラフィ用カラムであるＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲ  １０／３０（ＧＥヘルスケア社製）を使用し、上記（１）で調製及び界面活性剤処理をした血清の成分の分離操作を行った。まず、該カラムに該界面活性剤処理した血清５００μＬをアプライし、次いで、溶出液として、アジ化ナトリウム０．２ｇ／Ｌを含有するＰＢＳ［リン酸緩衝化生理食塩水（０．１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、ｐＨ７．２）］を流速０．５ｍＬ／ｍｉｎで流し、溶出分画として分画Ｎｏ．１〜８０（各０．５ｍＬ）を得た。【００５８】
（３）抗原抗体反応を用いるサンドイッチ法に用いる測定試薬の調製
上記の参考例１の（４）と同様の方法により、ストレプトアビジン結合磁性粒子溶液、ビオチン結合抗ＣＤ９モノクローナル抗体溶液、及び、ＡＬＰ標識抗ＣＤ９モノクローナル抗体溶液を調製した。
（４）上記（２）で得られた各分画の、抗原抗体反応を用いるサンドイッチ法による測定
上記（２）で得られた分画Ｎｏ．１〜８０のうち、分画Ｎｏ．１５〜２５について、各分画１０μＬに、上記（３）で調製したストレプトアビジン結合磁性粒子溶液３０μＬ、上記（３）で調製したビオチン結合抗ＣＤ９モノクローナル抗体溶液３０μＬ、及び、上記（３）で調製したＡＬＰ標識抗ＣＤ９モノクローナル抗体溶液３０μＬを加えて撹拌し、３７℃で１０分間反応させた。次いで、磁性粒子を磁力で収集し、磁性粒子以外の反応溶液を除去するとともに、上記の参考例１の（５）で使用した洗浄液で該収集された磁性粒子を５回洗浄した。その後、該収集され洗浄された磁性粒子に、９−［（４−クロロフェニルチオ）（ホスホリルオキシ）メチリデン］−１０−メチルアクリダン・二ナトリウム塩（ＬｕｍｉｇｅｎＴＭ  ＡＰＳ−５）を主成分とする発光基質液１００μＬを添加して撹拌し、生じた発光量（ＲＬＵ）を測定した。その結果を図２に示す。【００５９】
〔比較例３〕
（１）血清の調製、及び、対照用試薬Ｂ０による血清の処理
上記の実施例２の（１）で調製した血清（９００μＬ）に、上記の比較例２で調製した対照用試薬Ｂ０（１００μＬ）を添加し、１０分間静置した。
（２）ゲルろ過クロマトグラフィ〜抗原抗体反応を用いるサンドイッチ法による測定
ゲルろ過クロマトグラフィ用のサンプルとして、上記（１）で得られた血清を用いる以外は、上記の実施例２の（２）〜（４）と同様の方法により、ゲルろ過クロマトグラフィによる血清成分の分離操作、及び、該ゲルろ過クロマトグラフィにより溶出された分画Ｎｏ．１５〜２５の、抗原抗体反応を用いるサンドイッチ法による測定を行った。その結果を図２に示す。【００６０】
〔実施例３〕
上記の比較例３の（２）で得られた分画Ｎｏ．１８に対する発光量を１００としたときの、上記の実施例２の（４）において、エクソソーム破壊用試薬Ａ１で処理された血清より得られた分画Ｎｏ．１８に対する相対的発光量を算出した。同様に、上記の実施例２の（４）で得られた、エクソソーム破壊用試薬Ａ２で処理された血清より得られた分画Ｎｏ．１８に対する相対的発光量を算出した。その結果を表４に示す。【００６１】
【表４】
2020004436.tif 000006
【００６２】
図２及び表４から明らかなように、ナイミーンＬ−２０２又はナイミーンＤＴ−２０３を含有するエクソソーム破壊用試薬で１０分間血清を処理した場合、エクソソームを含有する分画（分画Ｎｏ．１８）に対する発光量は、対照用試薬Ｂ０で血清を処理した場合と比較して、顕著に減少しており、ナイミーンＬ−２０２又はナイミーンＤＴ−２０３の血清への添加により、短時間でエクソソームが破壊されることが判明した。したがって、ポリエーテルアルキルアミンの血清への添加により、血清中のエクソソームを単離することなく、簡便かつ迅速に、血清中のエクソソームを破壊できることが明らかとなった。【００６３】
〔実施例４〕
＜ＰＯＥ−ＰＯＰアルキルエーテルを含有するエクソソーム破壊用試薬を用いたエクソソームの破壊＞
（１）血清の調製、及び、界面活性剤による血清の処理
参考例１及び実施例２における健常人とは異なる、協和メデックス株式会社所属の健常人より採取した全血を、２，０００ｒｐｍ、２５℃で２０分間遠心分離し、血清を調製した。
調製した血清（９００μＬ）に、上記の実施例１で調製したエクソソーム破壊用試薬Ａ３（１００μＬ）を添加し、１０分間静置した。
（２）ゲルろ過クロマトグラフィ〜抗原抗体反応を用いるサンドイッチ法による測定
ゲルろ過クロマトグラフィ用のサンプルとして、上記（１）で得られた血清を用いる以外は、上記の実施例２の（２）〜（４）と同様の方法により、ゲルろ過クロマトグラフィによるエクソソームとそれ以外の成分との分離、及び、該ゲルろ過クロマトグラフィにより得られた分画Ｎｏ．１５〜２５中のエクソソームを、抗原抗体反応を用いるサンドイッチ法により測定した。その結果を図３に示す。【００６４】
〔比較例４〕
（１）血清の調製、及び、対照用試薬Ｂ０による血清の処理
上記の実施例４の（１）で調製した血清（９００μＬ）に、上記の比較例２で調製した対照用試薬Ｂ０（１００μＬ）を添加し、１０分間静置した。
（２）ゲルろ過クロマトグラフィ〜抗原抗体反応を用いるサンドイッチ法による測定
ゲルろ過クロマトグラフィ用のサンプルとして、上記（１）で得られた血清を用いる以外は、上記の実施例２の（２）〜（４）と同様の方法により、ゲルろ過クロマトグラフィによるエクソソームとそれ以外の成分との分離、及び、該ゲルろ過クロマトグラフィにより得られた分画Ｎｏ．１５〜２５中のエクソソームを、抗原抗体反応を用いるサンドイッチ法により測定した。その結果を図３に示す。【００６５】
〔実施例５〕
上記の比較例４の（２）で得られた分画Ｎｏ．１８に対する発光量を１００としたときの、上記の実施例４の（２）において、エクソソーム破壊用試薬Ａ３で処理された血清より得られた分画Ｎｏ．１８に対する相対的発光量を算出した。その結果を表５に示す。【００６６】
【表５】
2020004436.tif 000007
【００６７】
図３及び表５から明らかなように、ワンダサーフＩＤ−５０を含有するエクソソーム破壊用試薬で１０分間血清を処理した場合、エクソソームを含有する分画（分画Ｎｏ．１８）に対する発光量は、対照用試薬Ｂ０で血清を処理した場合と比較して、顕著に減少しており、ワンダサーフＩＤ−５０の血清への添加により、短時間でエクソソームが破壊されることが判明した。したがって、ＰＯＥ−ＰＯＰアルキルエーテルの血清への添加により、血清中のエクソソームを単離することなく、簡便かつ迅速に、血清中のエクソソームを破壊できることが明らかとなった。【００６８】
〔実施例６〕
＜ＨＬＢ値が１３以下のＰＯＥアルキルフェニルエーテルを含有するエクソソーム破壊用試薬を用いたエクソソームの破壊＞
（１）血清の調製、及び、界面活性剤による血清の処理
参考例１、実施例２及び実施例４における健常人とは異なる、協和メデックス株式会社所属の健常人より採取した全血を、２，０００ｒｐｍ、２５℃で２０分間遠心分離し、血清を調製した。
調製した血清（９００μＬ）に、上記の実施例１で調製したエクソソーム破壊用試薬Ａ４（１００μＬ）を添加し、１０分間静置した。同様に、調製した血清（９００μＬ）に、上記の実施例１で調製したエクソソーム破壊用試薬Ａ５（１００μＬ）を添加し、１０分間静置した。
（２）ゲルろ過クロマトグラフィ〜抗原抗体反応を用いるサンドイッチ法による測定
ゲルろ過クロマトグラフィ用のサンプルとして、上記（１）で得られた血清を用いる以外は、上記の実施例２の（２）〜（４）と同様の方法により、ゲルろ過クロマトグラフィによるエクソソームとそれ以外の成分との分離、及び、該ゲルろ過クロマトグラフィにより得られた分画Ｎｏ．１５〜２５中のエクソソームを、抗原抗体反応を用いるサンドイッチ法により測定した。その結果を図４に示す。【００６９】
〔比較例５〕
＜ＨＬＢ値が１３を超えたＰＯＥアルキルフェニルエーテルを含有するエクソソーム破壊用試薬を用いたエクソソームの破壊＞
（１）血清の調製、及び、界面活性剤による血清の処理
上記の実施例６の（１）で調製した血清（９００μＬ）に、上記の比較例１で調製したエクソソームの破壊用試薬Ｂ１（１００μＬ）を添加し、１０分間静置した。同様に、上記の実施例６の（１）で調製した血清（９００μＬ）に、上記の比較例１で調製したエクソソームの破壊用試薬Ｂ２（１００μＬ）を添加し、１０分間静置した。
（２）ゲルろ過クロマトグラフィ〜抗原抗体反応を用いるサンドイッチ法による測定
ゲルろ過クロマトグラフィ用のサンプルとして、上記（１）で得られた血清を用いる以外は、上記の実施例２の（２）〜（４）と同様の方法により、ゲルろ過クロマトグラフィによるエクソソームとそれ以外の成分との分離、及び、該ゲルろ過クロマトグラフィにより得られた分画Ｎｏ．１５〜２５中のエクソソームを、抗原抗体反応を用いるサンドイッチ法により測定した。その結果を図４に示す。【００７０】
〔比較例６〕
（１）血清の調製、及び、対照用試薬Ｂ０による血清の処理
上記の実施例６の（１）で調製した血清（９００μＬ）に、上記の比較例２で調製した対照用試薬Ｂ０（１００μＬ）を添加し、１０分間静置した。
（２）ゲルろ過クロマトグラフィ〜抗原抗体反応を用いるサンドイッチ法による測定
ゲルろ過クロマトグラフィ用のサンプルとして、上記（１）で得られた血清を用いる以外は、上記の実施例２の（２）〜（４）と同様の方法により、ゲルろ過クロマトグラフィによるエクソソームとそれ以外の成分との分離、及び、該ゲルろ過クロマトグラフィにより得られた分画Ｎｏ．１５〜２５中のエクソソームを、抗原抗体反応を用いるサンドイッチ法により測定した。その結果を図４に示す。【００７１】
〔実施例７〕
上記の比較例６の（２）で得られた分画Ｎｏ．１８に対する発光量を１００としたときの、上記の実施例６の（２）において、エクソソーム破壊用試薬Ａ４で処理された血清より得られた分画Ｎｏ．１８に対する相対的発光量を算出した。同様に、上記の実施例６の（２）で得られた、エクソソーム破壊用試薬Ａ５で処理された血清より得られた分画Ｎｏ．１８に対する相対的発光量を算出した。その結果を表６に示す。
また、上記の比較例６の（２）で得られた分画Ｎｏ．１８に対する発光量を１００とし、上記の比較例５の（２）で得られた、エクソソーム破壊用試薬Ｂ１で処理された血清より得られた分画Ｎｏ．１８に対する相対的発光量を算出した。同様に、上記の比較例５の（２）で得られた、エクソソーム破壊用試薬Ｂ２で処理された血清より得られた分画Ｎｏ．１８に対する相対的発光量を算出した。その結果を表６に示す。【００７２】
【表６】
2020004436.tif 000008
【００７３】
図４及び表６から明らかなように、ノニオンＮＳ−２０４．５又はノニオンＨＳ−２０４．５を含有するエクソソーム破壊用試薬で１０分間血清を処理した場合、エクソソームを含有する分画（分画Ｎｏ．１８）に対する発光量は、対照用試薬Ｂ０で血清を処理した場合と比較して、顕著に減少しており、ノニオンＮＳ−２０４．５又はノニオンＨＳ−２０４．５の血清への添加により、短時間でエクソソームが破壊されることが判明した。したがって、ＨＬＢ値が１３以下のＰＯＥアルキルフェニルエーテルの血清への添加により、血清中のエクソソームを単離することなく、簡便かつ迅速に、血清中のエクソソームを破壊できることが明らかとなった。
また、図４及び表６から明らかなように、ノニオンＮＳ−２０４．５又はノニオンＨＳ−２０４．５を含有するエクソソーム破壊用試薬で１０分間血清を処理した場合、エクソソームを含有する分画（分画Ｎｏ．１８）に対する発光量は、ＨＬＢ値が１３を超えるＰＯＥアルキルフェニルエーテルであるトリトンＸ−１００又はノニデットＰ−４０を含有するエクソソーム破壊用試薬により血清を処理した場合と比較しても、顕著に低かった。したがって、ＨＬＢ値が１３を超えるＰＯＥアルキルフェニルエーテルであるトリトンＸ−１００又はノニデットＰ−４０の血清への添加に比較して、ノニオンＮＳ−２０４．５又はノニオンＨＳ−２０４．５の血清への添加により、顕著にエクソソームが破壊されることが判明した。したがって、ＨＬＢ値が１３以下のＰＯＥアルキルフェニルエーテルの血清への添加により、血清中のエクソソームを単離することなく、簡便かつ迅速に、血清中のエクソソームを破壊できることが明らかとなった。【００７４】
〔実施例８〕
＜試料差：血清及び血漿＞
（１）血清の調製、及び、血清の処理
参考例１、実施例２、実施例４及び実施例６における健常人とは異なる、協和メデックス株式会社所属の健常人１より採取した全血を、２，０００ｒｐｍ、２５℃で２０分間遠心分離し、血清１を調製した。
調製した血清１（９００μＬ）に、上記の実施例１で調製したエクソソーム破壊用試薬Ａ４（１００μＬ）を添加して１０分間静置し、血清１Ａ４  を得た。
また、調製した血清１（９００μＬ）に、上記の比較例２で調製した対照用試薬Ｂ０（１００μＬ）を添加して１０分間静置し、血清１Ｂ０  を得た。
（２）抗原抗体反応を用いるサンドイッチ法に用いる測定試薬の調製
上記の参考例１の（４）と同様の方法により、ストレプトアビジン結合磁性粒子溶液、ビオチン結合抗ＣＤ９モノクローナル抗体溶液、及び、ＡＬＰ標識抗ＣＤ９モノクローナル抗体溶液を調製した。
（３）抗原抗体反応を用いるサンドイッチ法による測定
上記（１）で調製した血清１Ａ４  及び血清１Ｂ０  の各血清（１０μＬ）に、上記（２）で調製したストレプトアビジン結合磁性粒子溶液（３０μＬ）、上記（２）で調製したビオチン結合抗ＣＤ９モノクローナル抗体溶液（３０μＬ）、及び、上記（２）で調製したＡＬＰ標識抗ＣＤ９モノクローナル抗体溶液（３０μＬ）を加えて撹拌し、３７℃で１０分間反応させた。次いで、磁性粒子を磁力で収集し、磁性粒子以外の反応溶液を除去するとともに、上記の参考例１の（５）で使用した洗浄液で該収集された磁性粒子を５回洗浄した。その後、該収集され洗浄された磁性粒子に、９−［（４−クロロフェニルチオ）（ホスホリルオキシ）メチリデン］−１０−メチルアクリダン・二ナトリウム塩（ＬｕｍｉｇｅｎＴＭ  ＡＰＳ−５）を主成分とする発光基質液１００μＬを添加して撹拌し、血清１Ａ４  に対する発光量１Ａ４  、及び、血清１Ｂ０  に対する発光量１Ｂ０  をそれぞれ測定した。【００７５】
（４）サンドイッチ法におけるブランク発光量の測定、及び、Ｓ／Ｎ比の算出
サンプルとして生理食塩水を用いる以外は、上記（３）と同様の測定により、ブランク発光量を測定した。
次いで、該ブランク発光量と、上記（３）で得られた発光量１Ａ４  及び発光量１Ｂ０  とから、Ｓ／Ｎ比（シグナル／ノイズ比）を下記の式により算出した。
Ｓ／Ｎ比１Ａ４  ＝  発光量１Ａ４  ／ブランク発光量
Ｓ／Ｎ比１Ｂ０  ＝  発光量１Ｂ０  ／ブランク発光量
（５）Ｓ／Ｎ比残存率の算出
上記の（４）で得られたＳ／Ｎ比１Ｂ０  を１００とし、上記の（４）で得られたＳ／Ｎ比１Ａ４  の相対値を算出し、Ｓ／Ｎ比残存率１とした。その結果を表７に示す。
ここで、Ｓ／Ｎ比残存率が１００に近ければ近いほど、エクソソームが破壊されていないことを意味する。すなわち、Ｓ／Ｎ比残存率が０に近ければ近いほど、エクソソームがより破壊されていることを意味する。
（６）血漿１、並びに、血清２及び血漿２におけるＳ／Ｎ比残存率の算出
サンプルとして上記（１）の健常人１から得られたＥＤＴＡ血漿１を用いる以外は、上記（１）〜（５）と同様の方法により、Ｓ／Ｎ比残存率１’を算出した。その結果を表７に示す。
また、サンプルとして上記（１）の健常人１とは別の健常人２から得られた血清２又はＥＤＴＡ血漿２を用いる以外は、上記（１）〜（５）と同様の方法により、Ｓ／Ｎ比残存率２及びＳ／Ｎ比残存率２’をそれぞれ算出した。その結果を表７に示す。【００７６】
【表７】
2020004436.tif 000009
【００７７】
表７から明らかなように、健常人１より得られた血清と血漿のいずれの試料においても、ノニオンＮＳ−２０４．５の添加により、短時間で該試料中のエクソソームが破壊されることが判明した。また、健常人２より得られた血清と血漿のいずれの試料においても、ノニオンＮＳ−２０４．５の添加により、短時間で該試料中のエクソソームが破壊されることが判明した。したがって、健常人の相違にかかわらず、血清及び血漿のいずれの試料においても、本発明のエクソソーム破壊用試薬により、簡便かつ迅速に、該試料中のエクソソームを破壊できることが明らかとなった。【００７８】
〔実施例９〕
＜エクソソーム破壊用試薬の調製＞
ＰＢＳへ、以下の表８に示した濃度となるようノニオンＮＳ−２０４．５を添加し、エクソソーム破壊用試薬Ａ６〜Ａ８をそれぞれ調製した。【００７９】
【表８】
2020004436.tif 000010
【００８０】
〔実施例１０〕
＜エクソソーム破壊用試薬Ａ６〜Ａ８による血清中のエクソソームの破壊＞
（１）血清の調製、及び、血清の処理
参考例１、実施例２、実施例４、実施例６及び実施例８における健常人とは異なる、協和メデックス株式会社所属の健常人より採取した全血を、２，０００ｒｐｍ、２５℃で２０分間遠心分離し、血清を調製した。
調製した血清（９００μＬ）に、上記の実施例９で調製したエクソソーム破壊用試薬Ａ６〜Ａ８の各試薬（１００μＬ）を添加して１０分間静置し、血清Ａ６  、血清Ａ７  及び血清Ａ８  をそれぞれ得た。
また、調製した血清（９００μＬ）に、上記の比較例２で調製した対照用試薬Ｂ０（１００μＬ）を添加して１０分間静置し、血清Ｂ０  を得た。
（２）抗原抗体反応を用いるサンドイッチ法に用いる測定試薬の調製
上記の参考例１の（４）と同様の方法により、ストレプトアビジン結合磁性粒子溶液、ビオチン結合抗ＣＤ９モノクローナル抗体溶液、及び、ＡＬＰ標識抗ＣＤ９モノクローナル抗体溶液を調製した。
（３）抗原抗体反応を用いるサンドイッチ法による測定
上記（１）で調製した血清Ａ６  、血清Ａ７  、血清Ａ８  及び血清Ｂ０  １０μＬに、上記（２）で調製したストレプトアビジン結合磁性粒子溶液（３０μＬ）、上記（２）で調製したビオチン結合抗ＣＤ９モノクローナル抗体溶液（３０μＬ）、及び、上記（２）で調製したＡＬＰ標識抗ＣＤ９モノクローナル抗体溶液（３０μＬ）を加えて撹拌し、３７℃で１０分間反応させた。次いで、磁性粒子を磁力で収集し、磁性粒子以外の反応溶液を除去するとともに、上記の参考例１の（５）で使用した洗浄液で該収集された磁性粒子を５回洗浄した。その後、該収集され洗浄された磁性粒子に、９−［（４−クロロフェニルチオ）（ホスホリルオキシ）メチリデン］−１０−メチルアクリダン・二ナトリウム塩（ＬｕｍｉｇｅｎＴＭ  ＡＰＳ−５）を主成分とする発光基質液（１００μＬ）を添加して撹拌し、発光量Ａ６  、発光量Ａ７  、発光量Ａ８  及び発光量Ｂ０  をそれぞれ測定した。【００８１】
（４）サンドイッチ法におけるブランク発光量の測定、及び、Ｓ／Ｎ比の算出
サンプルとして生理食塩水を用いる以外は、上記（３）と同様の測定により、ブランク発光量を測定した。
次いで、該ブランク発光量と、上記（３）で得られた発光量Ａ６  、発光量Ａ７  、発光量Ａ８  及び発光量Ｂ０  の各発光量とから、Ｓ／Ｎ比を下記の式により算出した。
Ｓ／Ｎ比Ａ６  ＝  発光量Ａ６  ／ブランク発光量
Ｓ／Ｎ比Ａ７  ＝  発光量Ａ７  ／ブランク発光量
Ｓ／Ｎ比Ａ８  ＝  発光量Ａ８  ／ブランク発光量
Ｓ／Ｎ比Ｂ０  ＝  発光量Ｂ０  ／ブランク発光量
（５）Ｓ／Ｎ比残存率の算出
上記の（４）で得られたＳ／Ｎ比Ｂ０  を１００としたときの、上記の（４）で得られたＳ／Ｎ比Ａ６  、Ｓ／Ｎ比Ａ７  及びＳ／Ｎ比Ａ８  の相対値を算出し、それぞれＳ／Ｎ比残存率Ａ６  、Ｓ／Ｎ比残存率Ａ７  及びＳ／Ｎ比残存率Ａ８  とした。その結果を表９に示す。ここで、Ｓ／Ｎ比残存率が１００に近ければ近いほど、エクソソームが破壊されていないことを意味する。すなわち、Ｓ／Ｎ比残存率が０に近ければ近いほど、エクソソームがより破壊されていることを意味する。【００８２】
【表９】
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【００８３】
表９から明らかなように、血清と混合した後のノニオンＮＳ−２０４．５が０．０４〜１％の濃度の範囲において、Ｓ／Ｎ比残存率が５０％未満であり、血清中のエクソソームが破壊されていることが判明した。すなわち、広範な濃度のノニオンＮＳ−２０４．５が、血清中のエクソソームの破壊に有効であることが判明した。したがって、本発明のエクソソーム破壊用試薬を用いることにより、簡便かつ迅速に、血清中のエクソソームを破壊できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明により、簡便かつ迅速な、試料中のエクソソームの破壊方法及び破壊用試薬が提供される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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