(57)【要約】  微細な足場材を用いた接着性細胞の浮遊培養によって得られた懸濁液から、該懸濁液中に含まれた固体の分離対象物を分離するための分離デバイスおよび分離方法である。当該分離デバイスは第１室と第２室とを持った分離室を有し、第１室と第２室は分離用網状構造によって仕切られている。分離用網状構造は、分離対象物の通過を抑制するように、予め定められた大きさの網の目を持っており、懸濁液中の液体が前記網の目を通過するときの該液体の進行方向が鉛直上向きの方向成分を有するように、分離室中に分離用網状構造が配置されている。
2020054755.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微細な足場材を用いた接着性細胞の浮遊培養によって得られた懸濁液から、該懸濁液中に含まれた固体の分離対象物を分離するための分離デバイスであって、
当該分離デバイスは分離室を有し、該分離室は、第１室と第２室とを少なくとも有し、第１室と第２室は分離用網状構造によって仕切られており、当該分離デバイス内に入った前記懸濁液中の液体が、第１室から前記分離用網状構造を通過して第２室へと移動し、その後、当該分離デバイスから出て行くように、内部流路が構成されており、
前記分離用網状構造は、前記分離対象物の通過を抑制するように、予め定められた大きさの網の目を持っており、
前記懸濁液中の液体が前記網の目を通過するときの該液体の進行方向が鉛直上向きの方向成分を有するように、前記分離室中に前記分離用網状構造が配置されている、
前記分離デバイス。
【請求項２】
前記懸濁液には、前記分離用網状構造を前記液体と共に通過させるべき固体の通過対象物が含まれており、
前記分離用網状構造は、前記分離対象物の通過を抑制し、かつ、前記通過対象物の通過を許容するように、予め定められた大きさの網の目を持っている、
請求項１に記載の分離デバイス。
【請求項３】
前記懸濁液中の液体が液体培地であり、前記分離対象物が、足場材と接着性細胞を分離する試薬によって液体培地中で細胞から剥離した足場材であり、通過対象物が、足場材から剥離した接着性細胞である、請求項２に記載の分離デバイス。
【請求項４】
前記足場材が、非水溶性多糖類からなるナノファイバーであり、
前記接着性細胞が、イヌ腎臓尿細管上皮細胞（ＭＤＣＫ細胞）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、及び間葉系幹細胞（ＭＳＣ）からなる群から選択される細胞である、
請求項３に記載の分離デバイス。
【請求項５】
前記懸濁液中の液体が液体培地であり、分離対象物が、液体培地中で浮遊培養された接着性細胞が付着した足場材であり、通過対象物が、浮遊培養において細胞から液体培地中に放出された液性因子である、請求項２に記載の分離デバイス。
【請求項６】
前記懸濁液中の液体が、浮遊培養された接着性細胞の細胞溶解物を含有する液体であり、分離対象物が、該細胞の溶解によって前記液体中に残された足場材であり、通過対象物が、該接着性細胞の溶解によって前記液体中に放出された該接着性細胞由来の物質である、請求項２に記載の分離デバイス。
【請求項７】
前記分離用網状構造がシート状であるか、または、袋の形状を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の分離デバイス。
【請求項８】
第１室が、
前記懸濁液を、外部から第１室に流入させるための第１の流入ポートと、
洗浄液または試薬を、外部から第１室に流入させるための第２の流入ポートと、
分離対象物を、第１室から外部に流出させるための流出ポートと
を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の分離デバイス。
【請求項９】
第２室は、第１室の上に位置し、
第１室は、前記懸濁液を外部から流入させるための流入ポートを少なくとも有し、該流入ポートは第１室の側壁に設けられている、
請求項１〜８のいずれか１項に記載の分離デバイス。
【請求項１０】
前記流入ポートの中心軸線は、第１室の室内の全高さの４０％以上の高さに位置する、請求項９に記載の分離デバイス。
【請求項１１】
第２室の上に、上方へと積層された１以上の部屋を分離室としてさらに有し、
前記１以上の部屋のうちの第２室に隣接する部屋と、第２室とは、さらなる分離用網状構造によって仕切られ、
前記１以上の部屋が２以上の部屋である場合には、上下に隣接する部屋同士は、さらなる他の分離用網状構造によって仕切られ、
より上方に位置する分離用網状構造の網の目ほど、前記分離対象物の通過をより抑制するように、該網の目の開口面積がより小さくなっている、
請求項９または１０に記載の分離デバイス。
【請求項１２】
前記懸濁液には、前記液体と共に前記分離用網状構造を通過させるべき固体の通過対象物が含まれており、
前記通過対象物の通過を許容するように、最も上に位置する分離用網状構造の網の目の大きさが予め定められている、
請求項１１に記載の分離デバイス。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の分離デバイスを用い、
微細な足場材を用いた接着性細胞の浮遊培養によって得られた懸濁液から、該懸濁液中に含まれた固体の分離対象物を分離する方法。
【請求項１４】
前記懸濁液には、前記分離デバイスの分離用網状構造を前記液体と共に通過させるべき固体の通過対象物が含まれており、
前記分離用網状構造は、前記分離対象物の通過を抑制し、かつ、前記通過対象物の通過を許容するように、予め定められた大きさの網の目を持っており、
該分離用網状構造を通過する前記通過対象物を回収する工程を有する、
請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記懸濁液中の液体が、前記分離デバイスの分離用網状構造を通過するときの流速が、０．０１ｍｍ／秒〜２５ｍｍ／秒である、請求項１３または１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微細な足場材を用いて行われる接着性細胞の浮遊培養によって得られた懸濁液中の分離対象物を液体から分離するための分離デバイス、およびその用途に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、水への分散性を高めた多糖類（キチン等の非水溶性多糖類）からなるナノファイバーを液体培地中に分散させて微細な足場材とし、動植物細胞および／または組織を浮遊状態にて培養する技術が報告されている（特許文献１）。【０００３】
前記のナノファイバーを足場材として用い、間葉系幹細胞や前駆脂肪細胞等の接着性細胞を該ナノファイバーに接着した状態で培養することにより、該細胞を静置した状態で浮遊培養することができる。該ナノファイバーは、液体培地に不溶性であり、該液体培地中で浮遊し、細胞を接着させる活性を有している。よって、該ナノファイバーを用いた浮遊培養では、該ナノファイバーに接着した間葉系幹細胞や前駆脂肪細胞は、長期間の生存性を示し、その形質を維持しながら、該ナノファイバー上で良好に増殖する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１５／１１１６８６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
前記のナノファイバーは、生分解性であり、該ナノファイバーを構成する多糖類（例えばキチン）を分解する酵素（多糖類分解酵素）によって分解することが可能である。本発明者らは、この点に着目し、液体培地中において培養細胞が接着しているナノファイバーに前記多糖類分解酵素を適用すれば、タンパク質分解酵素を使用することなしに、即ち、培養細胞へのダメージを抑制しながら、培養細胞を単離できることを見出した。【０００６】
しかしながら、前記ナノファイバー上に接着した状態で成長した培養細胞を、多糖類分解酵素を用いて単離する場合、前記ナノファイバーを該多糖類分解酵素によって十分に分解し、残された培養細胞を沈降させて回収するといったプロセスが必要となる。そのような回収プロセスでは、大量の細胞を培養するのに伴い、多糖類分解酵素も大量に必要となるというさらなる問題や、未分解の多糖類が残存し、回収した培養細胞に混ざるというさらなる問題が生じることがわかった。また、液体培地中において培養細胞が自重で沈降するのを利用するプロセスでは、回収に長時間を要するので好ましくなく、遠心分離を利用するプロセスでは、培養細胞がダメージを受けるので好ましくないこともわかった。【０００７】
一方、細胞培養では、培養した細胞によって生産される液性因子（培養細胞が液体培地中に分泌する物質、培養細胞を溶解することで得られる物質など）を回収すべき対象物とする場合がある。例えば、液体培地中に浮遊する微細な足場材に付着した細胞が液体培地中に分泌する物質を回収する場合、（足場材とそれに付着した培養細胞）と（液体培地）とを分離し、液体培地を回収する必要がある。また、培養細胞中に含まれる物質を回収する場合、培養細胞を試薬によって液体培地中に溶解し、（足場材）と（培養細胞が溶解した液体培地）とを分離し、該（培養細胞が溶解した液体培地）を回収する必要がある。【０００８】
前記のように液体が通過対象物である場合、遠心分離を利用しない簡単な回収方法として、多孔性のフィルターを用い、液体だけを通過させて回収する方法が考えられる。しかしながら、多孔性のフィルターを用いる方法では、該フィルターが（足場材とそれに付着した培養細胞）または（足場材）によって早々に目詰まりするので、頻繁にフィルターの交換が必要となり、効率よく液体培地だけを回収することは困難であることがわかった。【０００９】
本発明の目的は、前記の問題を解消し、微細な足場材を用いた接着性細胞の浮遊培養において、分離対象物をより効率よく分離し、通過対象物を得ることを可能にする分離デバイス、および、それを用いた分離対象物の分離方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の主たる構成は、次のとおりである。
〔１〕微細な足場材を用いた接着性細胞の浮遊培養によって得られた懸濁液から、該懸濁液中に含まれた固体の分離対象物を分離するための分離デバイスであって、
当該分離デバイスは分離室を有し、該分離室は、第１室と第２室とを少なくとも有し、第１室と第２室は分離用網状構造によって仕切られており、当該分離デバイス内に入った前記懸濁液中の液体が、第１室から前記分離用網状構造を通過して第２室へと移動し、その後、当該分離デバイスから出て行くように、内部流路が構成されており、
前記分離用網状構造は、前記分離対象物の通過を抑制するように、予め定められた大きさの網の目を持っており、
前記懸濁液中の液体が前記網の目を通過するときの該液体の進行方向が鉛直上向きの方向成分を有するように、前記分離室中に前記分離用網状構造が配置されている、
前記分離デバイス。
〔２〕前記懸濁液には、前記分離用網状構造を前記液体と共に通過させるべき固体の通過対象物が含まれており、
前記分離用網状構造は、前記分離対象物の通過を抑制し、かつ、前記通過対象物の通過を許容するように、予め定められた大きさの網の目を持っている、
前記〔１〕に記載の分離デバイス。
〔３〕前記懸濁液中の液体が液体培地であり、前記分離対象物が、足場材と接着性細胞を分離する試薬によって液体培地中で細胞から剥離した足場材であり、通過対象物が、足場材から剥離した接着性細胞である、前記〔２〕に記載の分離デバイス。
〔４〕前記足場材が、非水溶性多糖類からなるナノファイバーであり、
前記接着性細胞が、イヌ腎臓尿細管上皮細胞（ＭＤＣＫ細胞）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、及び間葉系幹細胞（ＭＳＣ）からなる群から選択される細胞である、
前記〔３〕に記載の分離デバイス。
〔５〕前記懸濁液中の液体が液体培地であり、分離対象物が、液体培地中で浮遊培養された接着性細胞が付着した足場材であり、通過対象物が、浮遊培養において細胞から液体培地中に放出された液性因子である、前記〔２〕に記載の分離デバイス。
〔６〕前記懸濁液中の液体が、浮遊培養された接着性細胞の細胞溶解物を含有する液体であり、分離対象物が、該細胞の溶解によって前記液体中に残された足場材であり、通過対象物が、該接着性細胞の溶解によって前記液体中に放出された該接着性細胞由来の物質である、前記〔２〕に記載の分離デバイス。
〔７〕前記分離用網状構造がシート状であるか、または、袋の形状を有する、前記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の分離デバイス。
〔８〕第１室が、
前記懸濁液を、外部から第１室に流入させるための第１の流入ポートと、
洗浄液または試薬を、外部から第１室に流入させるための第２の流入ポートと、
分離対象物を、第１室から外部に流出させるための流出ポートと
を有する、前記〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の分離デバイス。
〔９〕第２室は、第１室の上に位置し、
第１室は、前記懸濁液を外部から流入させるための流入ポートを少なくとも有し、該流入ポートは第１室の側壁に設けられている、
前記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の分離デバイス。
〔１０〕前記流入ポートの中心軸線は、第１室の室内の全高さの４０％以上の高さに位置する、前記〔９〕に記載の分離デバイス。
〔１１〕第２室の上に、上方へと積層された１以上の部屋を分離室としてさらに有し、
前記１以上の部屋のうちの第２室に隣接する部屋と、第２室とは、さらなる分離用網状構造によって仕切られ、
前記１以上の部屋が２以上の部屋である場合には、上下に隣接する部屋同士は、さらなる他の分離用網状構造によって仕切られ、
より上方に位置する分離用網状構造の網の目ほど、前記分離対象物の通過をより抑制するように、該網の目の開口面積がより小さくなっている、
前記〔９〕または〔１０〕に記載の分離デバイス。
〔１２〕前記懸濁液には、前記液体と共に前記分離用網状構造を通過させるべき固体の通過対象物が含まれており、
前記通過対象物の通過を許容するように、最も上に位置する分離用網状構造の網の目の大きさが予め定められている、
前記〔１１〕に記載の分離デバイス。
〔１３〕前記〔１〕〜〔１２〕のいずれかに記載の分離デバイスを用い、
微細な足場材を用いた接着性細胞の浮遊培養によって得られた懸濁液から、該懸濁液中に含まれた固体の分離対象物を分離する方法。
〔１４〕前記懸濁液には、前記分離デバイスの分離用網状構造を前記液体と共に通過させるべき固体の通過対象物が含まれており、
前記分離用網状構造は、前記分離対象物の通過を抑制し、かつ、前記通過対象物の通過を許容するように、予め定められた大きさの網の目を持っており、
該分離用網状構造を通過する前記通過対象物を回収する工程を有する、
前記〔１３〕に記載の方法。
〔１５〕前記懸濁液中の液体が、前記分離デバイスの分離用網状構造を通過するときの流速が、０．０１ｍｍ／秒〜２５ｍｍ／秒である、前記〔１３〕または〔１４〕に記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の分離デバイス（以下、当該分離デバイスともいう）では、懸濁液中の液体が分離用網状構造の網の目を通過するときの該液体の進行方向が、鉛直上向きの方向成分を有するように、該分離用網状構造が配置されている。これにより、分離用網状構造の入口側の面は、オーバーハング面または下方を向いた面になっているので、網の目を通過できず該分離用網状構造にトラップされた分離対象物は、重力により、該分離用網状構造から剥がれ落ちて沈降する。例えば、浮遊培養に用いられる微細な足場材や、該足場材に細胞が付着したものは、液体培地中を緩やかに沈降する傾向があるので、これらが分離用網状構造にトラップされると、重力により分離用網状構造から剥がれ液中を降下する傾向を示す。よって、分離用網状構造の目詰まりが抑制され、効率の良い分離対象物の分離または除去が可能になり、効率のよい通過対象物の取得も可能になる。【００１２】
足場材が非水溶性多糖類からなるナノファイバーであり、培養細胞が間葉系幹細胞である場合に、当該分離デバイスの有用性が顕著になる。該ナノファイバーは、緩やかに沈降し、かつ、非水溶性多糖類を分解する酵素を用いることで、完全に消化させなくとも、培養細胞から容易に剥離する。これにより、培養細胞が受けるダメージをより小さくすることができる。このようにして得られた懸濁液（ナノファイバーと培養細胞とが互いに離れた状態で液体中に含まれてなる懸濁液）に対して、本発明の分離デバイスを適用すれば、目詰まりを抑制しながら、該懸濁液から効率良くナノファイバーを分離することができ、ダメージの少ない培養細胞を効率良く回収することが可能になる。【００１３】
前記のような培養細胞の回収のみならず、浮遊培養において細胞から液体培地中に放出された液性因子を回収する場合や、該細胞の溶解によって前記液体中に放出された該細胞由来の物質を回収する場合にも、本発明の分離デバイスは、懸濁液中の固体の分離対象物を、目詰まりを抑制しながら効率良く分離することができるので、その有用性が顕著になる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明による分離デバイスの好ましい態様の一例を概略的に示す断面図である。図では、分離用網状構造の断面を太い点線で表している。該点線における点同士の間隔と、実際の網の目の大きさは関係がない。分離対象物は、足場材としてのナノファイバーを示唆する波型のシンボルによって示しており、通過対象物は、足場材から剥離した培養細胞を示唆する白い円形のシンボルを用いて示している（図２、図９、図１０も同様である）。
【図２】図２は、当該分離デバイスの好ましい態様の他の例を概略的に示す断面図である。
【図３】図３は、当該分離デバイスの好ましい態様の他の例を概略的に示す端面図である。同図では、図を簡略化するために、分離室の壁部を太い実践で描いている。分離対象物や通過対象物の図示は省略している。
【図４】図４は、当該分離デバイスの好ましい態様の他の例を概略的に示す断面図である。
【図５】図５は、分離用網状構造として用いられるメッシュの構成を示す図である。図５（ａ）は、メッシュのシート面の所定の領域を示す部分拡大図であり、図５（ｂ）は、図５（ａ）のＸ１−Ｘ１断面図である。図５（ｂ）では、線材の断面にハッチングを施している。
【図６】図６は、分離用網状構造として用いられる多孔フィルムの構成を示す図である。図６（ａ）は、多孔フィルムのシート面の所定の領域を示す部分拡大図であり、図６（ｂ）は、図６（ａ）のＸ２−Ｘ２断面図である。図６（ｂ）では、フィルム部分の断面にハッチングを施している。
【図７】図７は、当該分離デバイスの好ましい態様の他の例を示す図である。図７（ａ)は、当該分離デバイスの内部を見せるために、側壁部を除いた図であり、図７（ｂ)は、図７（ａ)のＸ３−Ｘ３断面図である。
【図８】図８は、当該分離デバイスの好ましい態様の他の例を示す図である。図８（ａ)は、当該分離デバイスの内部を見せるために、側壁部を除いた図である。図８（ｂ)は、図８（ａ)の分離デバイスの構成の一例を模式的に示す斜視図である。図８（ｃ)は、図８（ａ)の分離デバイスの構成の他の例を模式的に示す斜視図である。
【図９】図９は、当該分離デバイスの好ましい態様の他の例を示す断面図である。
【図１０】図１０は、当該分離デバイスの好ましい態様の他の例を示す断面図である。
【図１１】図１１は、当該分離デバイスを用いて構成された細胞培養システムの一例を示すブロック図および配管図である。図では、管路と液体の流れの方向を矢印で表している。
【図１２】図１２は、当該分離デバイスを用い、懸濁液から細胞を回収するプロセスを例示するフローチャートである。
【図１３】図１３は、当該分離デバイスを用い、懸濁液から液体培地を回収するプロセスを例示するフローチャートである。
【図１４】図１４は、当該分離デバイスを用い、細胞が溶解した液体培地を回収するプロセスを例示するフローチャートである。
【図１５】図１５は、本発明の実施例１で製作した当該分離デバイスを示す写真図である。
【図１６】図１６は、本発明の実施例２の結果を示す顕微鏡写真図である。
【図１７】図１７は、本発明の実施例３の結果を示す顕微鏡写真図である。
【図１８】図１８は、本発明の実施例５におけるＳｔｅｐ１からＳｔｅｐ４の各工程で得られた懸濁液の顕微鏡写真図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
先ず、本発明の分離デバイスを詳細に説明する。
本発明の分離デバイスは、微細な足場材を用いた接着性細胞の浮遊培養によって得られた懸濁液から、該懸濁液中に含まれた固体の分離対象物を分離するためのものである。分離対象物は、捨てるべきものであってもよく、利用すべきものであってもよい。図１に示す例では、説明のために、浮遊培養における足場材となる微細なナノファイバーを分離対象物とし、そこから剥離した細胞（浮遊培養された細胞）を通過対象物として示している。図１に示すように、当該分離デバイス１は、分離室１０を有し、該分離室１０は、第１室１０ａと第２室１０ｂとを少なくとも有する。第１室１０ａと第２室１０ｂは、分離用網状構造２０によって仕切られている。図１の例では、分離室を側方から見たときの形状は、滞留が生じるような隅部（デッドスペース）の少ない円形であるが、楕円形や、適宜に丸みをつけた四角形などであってもよい。第１室１０ａには、懸濁液Ｑ１が流入するための流入ポート３１が設けられ、第２室１０ｂには、分離用網状構造２０を通過した液体Ｑ２が流出するための流出ポート３２が設けられている。当該分離デバイスの全体の内部流路は、液体が内部に入り、第１室１０ａから、分離用網状構造２０の網の目を通過して第２室１０ｂへと移動し、その後、外部へ出て行くように構成されている。分離用網状構造２０は、分離対象物Ｅ１の通過を抑制するように、予め定められた大きさの網の目を持っている。通過対象物Ｅ２については後述する。ここで重要な特徴は、懸濁液中の液体が分離用網状構造２０の網の目を通過するときの該液体の進行方向Ｆが、鉛直上向きの方向成分Ｆｖを有するように、分離室１０中に分離用網状構造２０が配置されていることである。図１の例では、液体の進行方向Ｆは、水平方向成分Ｆｈをも有している。図１の例では、分離用網状構造２０は、平坦なシート状のメッシュである。該分離用網状構造は、第２室１０ｂ側の面が傾斜面となるように、斜めに傾いて配置されており、よって、該分離用網状構造の第１室１０ａ側の面は、オーバーハング面となっている。分離用網状構造の第１室１０ａ側の面は、全面的にオーバーハング面となっていなくともよく、該分離用網状構造が湾曲や屈曲することで、局所的にオーバーハング面でない面が含まれていてもよい。また、流入ポート３１は、必ずしも分離室の最下部に設けられる必要はなく、流出ポート３２は、必ずしも分離室の最上部に設けられる必要はない。図１の構成において、流入ポート３１が第１室１０ａの上部に設けられ、流出ポート３２が第２室１０ｂの下部に設けられる場合、流入ポート３１が流出ポート３２よりも高い位置に設けられる場合であっても、懸濁液中の液体が分離用網状構造２０の網の目を通過するときの該液体の進行方向Ｆは、鉛直上向きの方向成分Ｆｖを有する。
以上の構成により、分離用網状構造２０の第１室１０ａ側の面にトラップされた分離対象物Ｅ１は、該分離用網状構造から剥がれ落ちて沈降する。よって、該分離用網状構造の網の目が分離対象物Ｅ１によって目詰まりすることが抑制され、懸濁液中の液体や通過対象物Ｅ２は、効率よく分離用網状構造を通過し、当該分離デバイス外に取り出して回収することができる。
【００１６】
本発明でいう「微細な足場材を用いた接着性細胞の浮遊培養によって得られた懸濁液」には、次のものが含まれる。
（Ａ）接着性細胞が足場材に付着した状態で溶解又は分散している液体（例えば、浮遊培養の状態そのままの液体、そこから、液体培地だけが所定量だけ除去されたものなど）。
（Ｂ）足場材と接着性細胞の接着能を低減する試薬によって、接着性細胞が足場材から剥離し、該細胞と足場材が独立して分散している液体。
（Ｃ）接着性細胞が細胞溶解試薬によって溶解され、それにより、接着性細胞から剥離した足場材と溶解された接着性細胞に由来する物質が溶解又は分散している液体。
（Ｄ）足場材が足場材を分解する試薬によって分解され、それにより、足場材から剥離した細胞と分解された足場材が分散している液体。
【００１７】
当該分離デバイスは、固体を効率良く分離し、液体だけを通過させるように用いることができるが、前記懸濁液には、分離用網状構造を液体と共に通過すべき固体の通過対象物が含まれていてもよい。図１の例では、上記（Ｂ）のように、試薬によって、細胞Ｅ２が足場材Ｅ１から剥離しており、該細胞Ｅ２が固体の通過対象物となっている。このような場合、分離用網状構造２０の網の目の大きさは、単に分離対象物Ｅ１の通過を抑制するだけではなく、通過対象物Ｅ１の通過を許容するように、予め定められる。
【００１８】
懸濁液と分離対象物と通過対象物としては、次のものが例示される。
（ａ）懸濁液中の液体が液体培地であり、分離対象物が、細胞が付着した足場材である。この場合、固体の通過対象物は無く、例えば、単なる分離対象物の濃縮や、浮遊培養において細胞から液体培地中に放出された液性因子の回収のために利用可能である。
（ｂ）懸濁液中の液体が液体培地であり、分離対象物が、足場材と接着性細胞を分離する試薬によって液体培地中で細胞から剥離した足場材であり、固体の通過対象物が、足場材から剥離した細胞である。
（ｃ）懸濁液中の液体が、細胞を溶解する試薬によって溶解した該細胞を含有する液体であり、分離対象物が、該細胞の溶解によって前記液体中に残された足場材である。固体の通過対象物は無いが、該細胞の溶解によって前記液体中に放出された該細胞由来の物質が回収対象物である。
浮遊培養される接着性細胞、液体培地、浮遊培養のための足場材、該足場材と接着性細胞を分離する試薬、接着性細胞から液体培地中に放出される液性因子、細胞を溶解する試薬、細胞の溶解によって液体中に放出される該細胞中の物質を、次に例示する。
【００１９】
（浮遊培養）
接着性細胞を、液体培地中の適当な足場材（以下に詳述する）に付着させた状態で培養することにより、接着性細胞を浮遊培養（３次元培養）することができる。本発明において、細胞の浮遊とは、培養容器に対して細胞が接着しない状態（非接着）であることをいい、細胞が沈降しているか否かは問わない。
【００２０】
接着性細胞を浮遊培養する際の温度は、動物細胞であれば通常２５乃至３９℃、好ましくは３３乃至３９℃（例、３７℃）である。ＣＯ２濃度は、通常、培養の雰囲気中、４乃至１０体積％であり、４乃至６体積％が好ましい。培養期間は、培養の目的に合わせて適宜設定すればよい。
【００２１】
接着性細胞の浮遊培養は、細胞の培養に一般的に用いられるシャーレ、フラスコ、プラスチックバック、テフロン（登録商標）バック、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトル等の培養容器を用いて実施することができる。足場材に付着した接着性細胞が、培養容器へ接着しないよう、これらの培養容器は細胞低接着性であることが望ましい。細胞低接着性の培養容器としては、培養容器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリクス等によるコーティング処理）されていないもの、あるいは培養容器の表面が、細胞との接着性を低減させる目的で人工的に処理されているものを使用できる。
【００２２】
培地交換が必要となった際には、遠心分離やろ過処理を行うことにより細胞を分離した後、新鮮な培地を該細胞に添加すればよい。或いは、遠心やろ過処理を行うことにより細胞を適宜濃縮した後、新鮮な培地をこの濃縮液に添加すればよい。例えば、遠心分離する際の重力加速度（Ｇ）は１００乃至４００Ｇであり、ろ過処理をする際に用いるフィルターの細孔の大きさは１０μｍ乃至１００μｍであるが、これらに制限されることは無い。
【００２３】
接着性細胞の培養は、機械的な制御下のもと閉鎖環境下で細胞播種、培地交換、細胞画像取得、培養細胞回収を自動で実行し、ｐＨ、温度、酸素濃度などを制御しながら、高密度での培養が可能なバイオリアクターや自動培養装置によって行うこともできる。
【００２４】
（浮遊培養される接着性細胞）
「接着性細胞」とは、生存や増殖に容器壁等の足場を必要とする細胞である。前記浮遊培養される接着性細胞は、特に限定されるものではないが、例えば、幹細胞、前駆細胞、体性非幹細胞、初代培養細胞、細胞株、癌細胞等を挙げることができる。幹細胞とは、自分自身を複製する能力と他の複数系統の細胞に分化する能力を兼ね備えた細胞である。接着性の幹細胞の例としては、以下に限定されるものではないが、例えば、間葉系幹細胞、神経幹細胞、造血幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、癌幹細胞、毛包幹細胞等の体性幹細胞等を挙げることができる。間葉系幹細胞とは、骨細胞、軟骨細胞及び脂肪細胞の全て又はいくつかへの分化能を有する幹細胞である。間葉系幹細胞は骨髄、末梢血、臍帯血、脂肪組織等の組織中に低頻度で存在し、これらの組織から公知の方法で単離することが出来る。前駆細胞とは、前記幹細胞から特定の体細胞や生殖細胞に分化する途中の段階にある細胞である。接着性の前駆細胞の例としては、以下に限定されるものではないが、例えば、前駆脂肪細胞、前駆心筋細胞、前駆内皮細胞、神経前駆細胞、肝前駆細胞、膵臓前駆細胞、腎臓前駆細胞等を挙げることができる。接着性の体性非幹細胞の例としては、以下に限定されるものではないが、例えば、線維芽細胞、骨細胞、骨周皮細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、間葉細胞、上皮細胞、表皮細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、肝実質細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神経系細胞、グリア細胞、ニューロン、オリゴデンドロサイト、マイクログリア、星状膠細胞、心臓細胞、食道細胞、筋肉細胞（たとえば、平滑筋細胞または骨格筋細胞）、膵臓ベータ細胞、メラニン細胞等が含まれる。初代培養細胞とは、生体から分離した細胞や組織を播種し、第１回目の継代を行うまでの培養の状態にある細胞をいう。初代培養細胞は、例えば皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巣、膵臓、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、膀胱、前立腺、精巣、胸腺、筋肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、血液、心臓、眼、脳または神経組織などの任意の組織から採取された細胞であり得る。細胞株とは、生体外での人為的な操作により無限の増殖能を獲得した細胞をいう。本発明において使用する接着性細胞は、好ましくは、イヌ腎臓尿細管上皮細胞（ＭＤＣＫ細胞）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が挙げられ、より好ましくは、間葉系幹細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
また、接着性細胞の由来も特に限定されず、動物および植物のいずれに由来する細胞であってよい。動物としては、限定されるものではないが、例えば魚類、両生類、爬虫類、鳥類、汎甲殻類、六脚類、哺乳類等が挙げられ、好適には哺乳類である。哺乳類の例としては、限定されるものではないが、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、リス、ハムスター、ハタネズミ、カモノハシ、イルカ、クジラ、イヌ、ネコ、ヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ゾウ、コモンマーモセット、リスザル、アカゲザル、チンパンジー、ヒト等が挙げられる。植物としては、採取した細胞が液体培養可能なものであれば、特に限定はない。例えば、生薬類（例えば、サポニン、アルカロイド類、ベルベリン、スコポリン、植物ステロール等）を生産する植物（例えば、薬用人参、ニチニチソウ、ヒヨス、オウレン、ベラドンナ等）や、化粧品・食品原料となる色素や多糖体（例えば、アントシアニン、ベニバナ色素、アカネ色素、サフラン色素、フラボン類等）を生産する植物（例えば、ブルーベリー、紅花、セイヨウアカネ、サフラン等）、或いは医薬品原体を生産する植物などがあげられるが、それらに限定されない。本発明においては、好適には、哺乳類の接着性細胞が用いられる。
【００２６】
（液体培地）
前記浮遊培養に利用可能な液体培地は、使用する接着性細胞の種類等により適宜選択することが可能であり、例えば、哺乳類の接着性細胞の培養を目的とする場合、哺乳類細胞の培養に一般的に使用される培地を、本発明の培地組成物に含まれる培地として使用することができる。哺乳類細胞用の培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地（Ｈａｍ’ｓ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ１２）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、マッコイ５Ａ培地（ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ  ｍｅｄｉｕｍ）、イーグルＭＥＭ培地（Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ；ＥＭＥＭ）、αＭＥＭ培地（ａｌｐｈａ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ；αＭＥＭ）、ＭＥＭ培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ；ＩＭＤＭ）、ＭＣＤＢ１３１培地、ウィリアム培地Ｅ、ＩＰＬ４１培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（インビトロジェン社製）、Ｘ−ＶＩＶＯ  １０（ケンブレックス社製）、Ｘ−ＶＩＶＯ  １５（ケンブレックス社製）、ＨＰＧＭ（ケンブレックス社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎ  Ｈ３０００（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎＳＦＥＭ（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ（シグマアルドリッチ社製）、ＱＢＳＦ−６０（クオリティバイオロジカル社製）、ＳｔｅｍＰｒｏｈＥＳＣＳＦＭ（インビトロジェン社製）、ｍＴｅＳＲ１或いは２培地（ステムセルテクノロジー社製）、Ｓｆ−９００ＩＩ（インビトロジェン社製）、Ｏｐｔｉ−Ｐｒｏ（インビトロジェン社製）、などが挙げられる。
【００２７】
（浮遊培養のための足場材）
前記浮遊培養のための足場材は、接着性細胞を浮遊培養させ得るものであれば特に限定されないが、非水溶性多糖類から構成されるナノファイバーやマイクロキャリアビーズ等が好適に使用される。マイクロキャリアビーズの担体表面に細胞を生着させ、そのビーズを含む培地を撹拌して浮遊状態にて培養する方法は、一般的に「マイクロキャリア培養」や「懸濁培養」等とも称されるが、本明細書においては、当該培養方法も「浮遊培養」に含まれるものとする。
【００２８】
本明細書において、「ナノファイバー」とは、平均繊維径（Ｄ）が、０．００１乃至１．００μｍの繊維をいう。本発明において使用するナノファイバーの平均繊維径は、好ましくは、０．００５乃至０．５０μｍ、より好ましくは０．０１乃至０．０５μｍ、更に好ましくは０．０１乃至０．０２μｍである。浮遊培養に使用され得るナノファイバーのアスペクト比（Ｌ／Ｄ）は、平均繊維長／平均繊維径より得られ、特に限定されないが、通常２〜５００であり、好ましくは５〜３００であり、より好ましくは１０〜２５０である。また、これらが二次集合体として会合したファイバーも含まれる。
【００２９】
ナノファイバーを用いて接着性細胞を浮遊培養する場合、培地に対して別途調製した接着性細胞を添加し、均一に混合すればよい。その際の混合方法は特に制限はなく、例えばピペッティング等の手動での混合、スターラー、ヴォルテックスミキサー、マイクロプレートミキサー、振とう機等の機器を用いた混合が挙げられる。混合後は、得られた細胞懸濁液を静置状態にて培養してもよいし、必要に応じて回転、振とう或いは撹拌しながら培養してもよい。その回転数と頻度は、当業者の目的に合わせて適宜設定すればよい。例えば、接着性細胞を継代培養から回収し、適切な細胞解離液を用いて単一細胞、又はこれに近い状態にまで分散し、分散された接着性細胞を、培地中に懸濁し、これを浮遊培養（好ましくは、浮遊静置培養）に付す。
【００３０】
好ましい態様において、ナノファイバーは、液体培地と混合した際、一次繊維径を保ちながら当該ナノファイバーが当該液体中で分散し、当該液体の粘度を実質的に高めること無く、ナノファイバーに付着した細胞を実質的に保持し、沈降して培養容器に付着することを防ぐ効果を有する。液体の粘度を実質的に高めないとは、液体の粘度が８ｍＰａ・ｓを上回らないことを意味する。この際の当該液体の粘度（すなわち、下記の本発明の培地組成物の粘度）は、８ｍＰａ・ｓ以下であり、好ましくは４ｍＰａ・ｓ以下であり、より好ましくは２ｍＰａ・ｓ以下である。ナノファイバーを含む液体の粘度は、例えば、２５℃条件下で音叉振動式粘度測定（ＳＶ−１Ａ、Ａ＆Ｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｌｔｄ．）を用いて評価することができる。
【００３１】
ナノファイバーを構成する非水溶性多糖類としては、セルロース、ヘミセルロース等のセルロース類；キチン、キトサン等のキチン質等が挙げられるが、これらに限定されない。非水溶性多糖類は、好ましくは、セルロース、キチン又はキトサンであり、より好ましくはキチンである。
【００３２】
セルロースとは、ブドウ糖の６員環であるＤ−グルコピラノースがβ−１、４グルコシド結合した天然高分子化合物である。原料としては、例えば、木材、竹、麻、ジュート、ケナフ、コットン、農作物・食物残渣など植物由来のセルロース、又はバクテリアセルロース、シオグサ（クラドフォラ）、灰色植物（グラウコキスチス）、バロニア、ホヤセルロースなど、微生物産生若しくは動物産生のセルロースを使用することができる。植物由来のセルロースはミクロフィブリルと呼ばれる非常に細い繊維がさらに束になりフィブリル、ラメラ、繊維細胞と段階的に高次構造を形成している。また、バクテリアセルロースは菌細胞から分泌されたセルロースのミクロフィブリルが、そのままの太さで微細な網目構造を形成している。
【００３３】
本発明において、コットンやバクテリアセルロースなど高純度のセルロース原料は原料のまま用いる事ができるが、これ以外の植物由来のセルロースなどは、単離・精製したものを用いる事が好ましい。本発明において好適に用いられるセルロースは、コットンセルロース、バクテリアセルロース、クラフトパルプセルロース、微結晶セルロース等である。
【００３４】
キチン質とは、キチン及びキトサンからなる群より選ばれる１以上の糖質をいう。キチン及びキトサンを構成する主要な糖単位は、それぞれ、Ｎ−アセチルグルコサミン及びグルコサミンであり、一般的に、Ｎ−アセチルグルコサミンの含有量が多く酸性水溶液に対し難溶性であるものがキチン、グルコサミンの含有量が多く酸性水溶液に対し可溶性であるものがキトサンとされる。本明細書においては、便宜上、構成糖に占めるＮ−アセチルグルコサミンの割合が５０％以上のものをキチン、５０％未満のものをキトサンと呼ぶ。高い浮遊作用を達成する観点から、キチンを構成する糖単位に占めるＮ−アセチルグルコサミンの割合が高いほど好ましい。キチンを構成する糖単位に占めるＮ−アセチルグルコサミンの割合は、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９８％以上、最も好ましくは１００％である。
【００３５】
キチンの原料としては、例えば、エビ、カニ、昆虫、貝、キノコなど、多くの生物資源を用いることができる。本発明に用いるキチンは、カニ殻やエビ殻由来のキチンなどのα型の結晶構造を有するキチンであってもよく、イカの甲由来のキチンなどのβ型の結晶構造を有するキチンであってもよい。カニやエビの外殻は産業廃棄物として扱われることが多く、入手容易でしかも有効利用の観点から原料として好ましいが、不純物として含まれるタンパク質や灰分等の除去のために脱タンパク工程および脱灰工程が必要となる。そこで、本発明においては、既に脱マトリクス処理が施された精製キチンを用いることが好ましい。精製キチンは、市販されている。
【００３６】
上述の非水溶性多糖類を含有する原料を粉砕することにより、該非水溶性多糖類から構成されるナノファイバーを得ることができる。粉砕方法は限定されないが、本発明の目的に合う後述する繊維径・繊維長にまで微細化するには、高圧ホモジナイザー、グラインダー（石臼）、あるいはビーズミルなどの媒体撹拌ミルといった、強いせん断力が得られる方法が好ましい。
【００３７】
これらの中でも高圧ホモジナイザーを用いて微細化することが好ましく、例えば特開２００５−２７０８９１号公報や特許第５２３２９７６号に開示されるような湿式粉砕法を用いて微細化（粉砕化）することが望ましい。具体的には、原料を分散させた分散液を、一対のノズルから高圧でそれぞれ噴射して衝突させることにより、原料を粉砕するものであって、例えばスターバーストシステム（（株）スギノマシン製の高圧粉砕装置）やナノヴェイタ（吉田機械興業（株）の高圧粉砕装置）を用いることにより実施できる。
【００３８】
前述の高圧ホモジナイザーを用いて原料を微細化（粉砕化）する際、微細化や均質化の程度は、高圧ホモジナイザーの超高圧チャンバーへ圧送する圧力と、超高圧チャンバーに通過させる回数（処理回数）、及び水分散液中の原料の濃度に依存することとなる。圧送圧力（処理圧力）は、特に限定されないが、通常５０〜２５０ＭＰａであり、好ましくは１５０〜２４５ＭＰａである。
【００３９】
また、微細化処理時の水分散液中の原料の濃度は、特に限定されないが、通常０．１質量％〜３０質量％、好ましくは１質量％〜１０質量％である。微細化（粉砕化）の処理回数は、特に限定されず、前記水分散液中の原料の濃度にもよるが、原料の濃度が０．１〜１質量％の場合には処理回数は１０〜１００回程度で充分に微細化されるが、１〜１０質量％では１０〜１０００回程度必要となる場合がある。
【００４０】
前記微細化処理時の水分散液の粘度は特に制限されないが、例えば、非水溶性多糖類がαキチンの場合、該水分散液の粘度の範囲は、１〜１００  ｍＰａ・Ｓ、好ましくは１〜８５  ｍＰａ・Ｓ（２５℃条件下での音叉振動式粘度測定（ＳＶ−１Ａ、Ａ＆Ｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｌｔｄ．）による）である。また、微細化処理時の水分散液中の非水溶性多糖類の粒子径も特に制限されないが、例えば、非水溶性多糖類がαキチンの場合、該水分散液中のαキチンの平均粒子径の範囲は、０．５〜２００μｍ、好ましくは３０〜１５０μｍ（レーザー回折／散乱式粒子径分布測定装置ＬＡ−９６０（堀場製作所）による）である。
【００４１】
尚、浮遊培養に用い得るナノファイバーの調製方法については、ＷＯ２０１５／１１１６８６等に記載されている。
【００４２】
浮遊培養に使用することができるマイクロキャリアビーズとしては、その表面に接着性細胞が生着し、且つ維持および増殖し得るものであれば特に限定されず、公知のマイクロビーズを使用することができる。ビーズの形状は、球状、長球状、楕円体状等が挙げられるが、特に限定されるものではない。かかるマイクロキャリアビーズの例としては、ガラスビーズ、ポリスチレンビーズ、セラミックスビーズ等が挙げられるが、これらに限定されない。マイクロキャリアビーズは市販されており、培養する接着性細胞の種類等に合わせて最適なものを適宜選択すればよい。
【００４３】
マイクロキャリアビーズを用いて接着性細胞を浮遊培養する場合、マイクロキャリアビーズを含有する培地に対して別途調製した接着性細胞を添加し、均一に混合すればよい。その際の混合方法は特に制限はなく、例えばピペッティング等の手動での混合、スターラー、ヴォルテックスミキサー、マイクロプレートミキサー、振とう機等の機器を用いた混合が挙げられる。混合後は、得られた細胞懸濁液を回転、振とう或いは撹拌しながら培養し、細胞が生着したマイクロキャリアビーズを浮遊させた状態を維持させる。その回転数や頻度は、当業者の目的に合わせて適宜設定すればよい。
【００４４】
（足場材と接着性細胞を分離する試薬）
足場材と接着性細胞を分離する試薬としては、足場材と接着性細胞を分離できるものであれば特に限定されない。足場材と接着性細胞を分離する試薬の例としては、「足場材を分解する試薬」や「細胞の接着能を低減させる試薬」等が挙げられるがこれらに限定されない。足場材を分解する試薬としては、足場材を分解し、足場材と接着性細胞を剥離できるものであれば特に限定されない。例えば、足場材としてセルロースナノファイバーを用いる場合、その分解酵素としては、セルラーゼ（エンドグルカナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４）（“ＥＧ”）、エキソグルカナーゼまたはセロビオヒドロラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．９１）（“ＣＢＨ”）、β−グルコシダーゼ（［β］−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼ；ＥＣ  ３．２．１．２１）（“ＢＧ”））を使用することができる。セルロース原料中にヘミセルロースが多く含まれる場合、セルラーゼ以外にヘミセルロースを分解するための酵素として、キシラナーゼやマンナナーゼを添加することが好ましい。また、非水溶性多糖類としてキチン又はキトサンを用いる場合、その分解酵素として、キチナーゼ、キトビアーゼ、キトサナーゼ、β−１，３−グルカナーゼ等を使用することができる。複数の足場材を分解する試薬を組み合わせて使用してもよい。例えば、非水溶性多糖類としてキチン又はキトサンを用いる場合、その分解試薬として、キチナーゼ、キトビアーゼ、キトサナーゼ、及びβ−１，３−グルカナーゼからなる群から選択される２、３又は４の酵素の混合物を用いてもよい。Ｙａｔａｌａｓｅ（タカラバイオ）は、キチナーゼ、キトビアーゼ、キトサナーゼ、及びβ−１，３−グルカナーゼを含む混合物であり、キチン又はキトサンを分解する試薬として好適に用いることができる。
【００４５】
例えば、足場材が、非水溶性多糖類からなるナノファイバーである場合、該ナノファイバーに付着した接着性細胞の懸濁液に対して、該非水溶性多糖類の分解酵素を添加し、混合物を、接着性細胞の剥離に十分な時間、インキュベートする。当該剥離には、培養した細胞にダメージを与え得るキレート剤（ＥＤＴＡ）やタンパク質分解酵素（トリプシン、コラゲナーゼ）を必ずしも使用する必要はない。非水溶性多糖類の分解酵素によるインキュベーション温度は、通常、２０℃〜３７℃である。インキュベーション時間は、酵素の種類等にもよるが、通常、５〜６０分である。ナノファイバーが分解し、接着性細胞がナノファイバーから剥離したら、本発明の分離デバイスに供することにより、剥離した接着性細胞を効率よく回収することができる。
【００４６】
また、細胞の接着能を低減させる試薬は、細胞の接着能を低減させるものであれば特に限定されない。かかる試薬としては、トリプシン、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、およびプロナーゼ等のタンパク質分解酵素やＥＤＴＡ等を、細胞の接着能を低減させる試薬として使用することができる。例えば、足場材が、マイクロキャリアビーズである場合、該マイクロキャリアビーズに付着した接着性細胞の懸濁液に対して、該試薬を添加し、混合物を、接着性細胞の接着を低減させるのに十分な時間、インキュベートする。該試薬の存在下での懸濁液のインキュベーション温度は、通常、２０℃〜３７℃である。インキュベーション時間は、酵素の種類等にもよるが、通常、５〜６０分である。接着性細胞の接着能の低減により、接着性細胞が足場材から剥離したら、本発明の分離デバイスに供することにより、剥離した接着性細胞を効率よく回収することができる。
【００４７】
（接着性細胞から液体培地中に放出される液性因子）
所望の液性因子を産生する接着性細胞を、非水溶性多糖類からなるナノファイバーに付着させた状態で浮遊培養に付し、培養物（例、培養上清）から、目的とする液性因子を本発明の分離デバイスを用いて分離することにより、当該液性因子を得ることが出来る。液性因子としては、抗体、酵素（ウロキナーゼ等）、ホルモン（インシュリン等）、サイトカイン（インターフェロン、インターロイキン、腫瘍壊死因子、コロニー刺激因子、成長因子等）、ワクチンの抗原、その他の生理活性物質（タンパク質、ペプチド等）を挙げることができるが、これらに限定されない。液性因子を産生する接着性細胞には、皮膚細胞、軟骨細胞、肝細胞、膵臓細胞、腎細胞、間葉系幹細胞、脂肪細胞等の非形質転換細胞や、当該液性因子をコードする遺伝子や有用物質の生合成に関与する遺伝子を導入した形質転換細胞が含まれる。所望の液性因子を産生する接着性細胞は、好適には、当該液性因子を細胞外へ分泌する細胞である。液性因子を産生する接着性細胞としては、具体的には、当該液性因子をコードする遺伝子や当該液性因子の生合成に関与する遺伝子を導入した、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ−Ｋ１、ＢＨＫ−２１、ＭＤＣＫ、Ｖｅｒｏ、ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ−７等を挙げることができるが、これらに限定されない。組み換えタンパク質等の液性因子の生産に使用される細胞は当業者に周知である。
【００４８】
（細胞溶解用試薬）
細胞溶解試薬としては、細胞の膜を破壊もしくは溶解して、細胞内に含まれている所望の物質を細胞外へ溶出させる作用を有するものであれば、特に限定されるものではなく、当該技術分野において公知の化合物や組成物の中から適宜選択して用いることができる。細胞溶解試薬としては、具体的には、有機溶媒、カオトロピック塩、界面活性剤等が挙げられるがこれらに限定されない。なお、細胞溶解試薬としては、１種類の試薬を用いてもよく、２種類以上の試薬を用いてもよい。
【００４９】
（接着性細胞の溶解によって液体中に放出される該細胞中の物質）
細胞の溶解により液体中に放出される物質には、細胞中に含まれるあらゆる物質が含まれ、特に限定されないが、一例としては、培養された接着性細胞の細胞外には分泌されないタンパク質、ウイルス、核酸分子等が挙げられる。
【００５０】
（分離用網状構造の配置姿勢）
図１の例では、分離用網状構造は、網状の部分がシート状（即ち、薄い平板状）のメッシュであって、該分離用網状構造の第１室１０ａ側の面（下面）は、オーバーハング面となっており、水平面に対して仰角θだけ傾いている。このような構成であれば、分離室の形状によっても異なるが、分離用網状構造が分離室を斜めに横切るので、該分離用網状構造の面積（網の目が存在する面の面積）がより広くなる場合が多く、流量が多くても線流速を下げることが可能であるので好ましい。また、第１室に入った液体の流れが、分離用網状構造に対して角度を成して当たると、分離用網状構造に付着した分離対象物が、該液体の流れにより剥がれやすくなるといった作用を期待することもできる。
一方、図２の例では、分離用網状構造は、図１の例と同様に、網状の部分がシート状のメッシュであるが、該分離用網状構造の第１室１０ａ側の面（下面）は、水平面（仰角θは０度）となっており、真下の方向を向いている（換言すると、懸濁液中の液体が分離用網状構造２０の網の目を通過するときの該液体の進行方向Ｆは、鉛直上向きの方向成分Ｆｖだけを有する）。このような態様は、網の目にトラップされた分離対象物に作用する重力の全てが、分離用網状構造の下面に垂直に引き剥がす力として該分離対象物に作用するので、最も効果的に目詰まりを解消することができ、好ましい。
【００５１】
分離用網状構造の下面と水平面との間の角度（図１の仰角θ）は、０度以上、９０度未満であればよいが、図１の態様のように、分離用網状構造を斜めに配置しかつ液体を下方から第１室に流入させる場合には、分離用網状構造に付着した分離対象物が、該液体の流れにより剥がれやすくなるといった作用を期待し、分離対象物による目詰まりを抑制する観点からは、４５度≦θ＜９０度が、仰角θの好ましい範囲である。上記したように、分離用網状構造の下面を水平面にする態様（仰角θ＝０度）と、分離用網状構造の下面を斜めのオーバーハング面とする態様とは、それぞれに利点があるので、用途や分離室の内部形状に応じて、好ましい態様を選択してもよい。
【００５２】
図３は、図２の態様のバリエーションであって、分離用網状構造２０の下面が水平面（仰角θは０度）となっており、かつ、該分離用網状構造の面積（網の目が存在する面の面積）がより広くなるように、分離室が広がっている。図３（ａ）の態様では、流入ポート３１は第１室の中央に設けられ、流出ポート３２も第２室の中央に設けられ、液体が真下から第１室に入り、分離用網状構造を真上に通過し、第２室から真上へ出るようになっている。一方、図３（ｂ）の態様では、流入ポート３１は第１室の側面に設けられ、流出ポート３２は、流入ポート３１の位置とは反対側における、第２室の側面に設けられ、液体が側方から第１室に入り、分離用網状構造を真上に通過し、第２室から側方へ出るようになっている。図３の例では、分離室の形状は、角部に丸みを設けた円柱状（回転中心軸は紙面の縦方向）であるが、流れが分離用網状構造の全面により広がるように、該分離室の形状を適宜決定することが好ましい。
【００５３】
（分離用網状構造の形状）
分離用網状構造の形状（網状の部分の形状）は、図１、図２に示すような平坦なシート状のみならず、図４に例示するような袋の形状であってもよい。
図４（ａ）に例示する態様では、袋の開口が下方を向くように分離用網状構造２０が配置されており、該袋の内部が第１室１０ａの一部または全部であり、該袋の外部が第２室１０ｂである。図４（ａ）の例では、該袋の内部が第１室１０ａの全部であるが、該袋の位置が分離室内で上方へと移動すると、該袋の内部が第１室１０ａの一部となる。該袋の壁部は、互いに向かい合った内面が、互いに平行ではなく、前記開口から袋内を奥へと進むにつれて、該内面同士の間の距離が狭くなっていく。これによって、該袋の内面は、全て斜めのオーバーハング面または真下を向いた面となっている。
図４（ｂ）に例示する態様では、袋の開口が上方を向くように分離用網状構造２０が配置されており、該袋の外部が第１室１０ａであり、該袋の内部が第２室１０ｂの一部または全部である。図４（ｂ）の例では、該袋の内部が第２室１０ｂの全部であるが、該袋の位置が分離室内で下方へと移動すると、該袋の内部が第２室１０ｂの一部となる。該袋の壁部は、互いに向かい合った内面が、互いに平行ではなく、前記開口から袋内を奥へと進むにつれて、該内面同士の間の距離が狭くなっていく。これによって、該袋の外面は、全て斜めのオーバーハング面または真下を向いた面となっている。
【００５４】
（分離用網状構造の網の構造）
分離用網状構造は、分離対象物が通過しないように（即ち、トラップされるように）予め定められた大きさの網の目を持っている。これにより、当該分離デバイス内に液体と共に入った固体のうち、分離を意図する大きさを持った分離対象物が、分離用網状構造の網の目を通過できず、第１室に滞留する。よって、第１室に滞留した分離対象物を分離することができる。懸濁液から分離された分離対象物は、廃棄されるべきものであってもよいし、回収し利用すべきものであってもよい。
【００５５】
分離用網状構造は、線材を編んだメッシュであっても、フィルム面に多数の貫通孔が設けられた多孔フィルムであってもよい。メッシュは、種々の線径の線材および種々の開口率を有する素材が安価で市販されており、また、丸線（断面形状が円形の線材）からなるメッシュであれば、細胞など柔らかい分離対象物が切断されて網目を通過するといった現象を抑制して、受け止める可能性が高くなるので好ましい。以下、メッシュについて説明するが、同様の構成を多孔フィルムによって達成してもよい。
【００５６】
（分離用網状構造の貫通孔の開口形状の円相当直径）
分離用網状構造の貫通孔（網の目）の開口形状の円相当直径は、分離対象物および通過対象物によって異なる。例えば、分離対象物が、ポリスチレンビーズなど、浮遊培養の足場材として用いられる粒状物や球状物（例えば、CellBIND（登録商標）表面マイクロキャリア（粒径１２５〜２１２μｍ、Corning社製）であり、通過対象物が該足場材から剥離した細胞であれば、貫通孔の開口形状の円相当直径は、該ビーズが通過し得ない寸法として、２０μｍ〜２００μｍ程度が好ましく、２０μｍ〜１００μｍがより好ましく、２０μｍ〜５０μｍがさらに好ましい。通過対象物が無く、液体だけであれば、貫通孔の開口形状の円相当直径は、より小さくてもよい。
分離対象物が、前記ビーズに付着した状態のイヌ腎臓尿細管上皮細胞（ＭＤＣＫ細胞）やチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）などの細胞であって、通過対象物が無く、液体だけが通過する場合であれば、貫通孔の開口形状の円相当直径は、１μｍ〜２０μｍ程度）が例示される。
分離対象物が、ＭＤＣＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＭＳＣなどの浮遊培養の足場材として用いられる非水溶性多糖類からなるナノファイバーであって、通過対象物が該足場材から剥離した細胞であれば、貫通孔の開口形状の円相当直径は、１０μｍ〜２００μｍ程度が好ましく、２０μｍ〜１００μｍがより好ましく、２０μｍ〜５０μｍがさらに好ましい。通過対象物が無く、液体だけであれば、貫通孔の開口形状の円相当直径は、より小さくてもよい。
また、分離対象物が、前記ナノファイバーに付着した状態のＭＤＣＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＭＳＣなどの細胞であって、通過対象物が無く、液体だけが通過する場合であれば、貫通孔の開口形状の円相当直径は、１μｍ〜２００μｍ程度が好ましく、より好ましくは５μｍ〜１００μｍであり、さらに好ましくは１０μｍ〜５０μｍである。
以上の寸法は、それぞれの分離対象物、通過対象物における一例である。各分離対象物のサイズや、通過対象物のサイズ、通過対象物の有無に応じて、該分離対象物の通過が抑制されるように、適宜決定してよい。
以下、接着性細胞がＭＳＣであって、足場材がナノファイバーである場合に対する、各部の好ましい寸法等を例示するが、それら以外の他の細胞や足場材についても、それぞれに適宜応じた寸法へと変更してよい。
【００５７】
前記の円相当直径の規定だけでは、スリットのような細長い開口形状や迷路のように入り組んだ開口形状も含まれてしまい、分離対象物以外の通過させるべき固体も全てトラップされる。
そこで、本発明では、足場材だけを分離する場合には、前記の円相当直径の限定に加えて、該開口形状が、直径１０μｍ〜２００μｍの円（以下、収容円と呼ぶ）を収容し得る形状であることをも限定条件に加える。ここで、開口形状が収容円を収容し得るとは、収容円が開口形状に内接する場合や、収容円が開口形状と一致する場合をも含む。収容円の直径は、直径２０μｍ〜１００μｍがより好ましく、直径２０μｍ〜５０μｍがさらに好ましい。開口形状が円形である場合は、収容円の直径＝円相当直径であり、それ以外の場合は、収容円の直径＜円相当直径である。
また、足場材に細胞が付着したものを分離する場合には、前記の円相当直径の限定に加えて、該開口形状が、直径１μｍ〜２００μｍの収容円を収容し得る形状であることをも限定条件に加える。収容円の直径は、直径５μｍ〜１００μｍがより好ましく、直径１０μｍ〜５０μｍがさらに好ましい。
【００５８】
（網目の開口形状）
分離用網状構造の網の目の開口形状は、特に限定はされず、三角形、四角形、六角形、その他の多角形や異形などであってもよいが、一般的な安価で高品質なメッシュの開口形状として、正方形が挙げられる。メッシュのシート面を正視した場合には、図５（ａ）に示すように、縦糸と横糸が直線的に交差しているように見え、かつ、網の目も、平面的な正方形に見える。個々の網の目を微視的に観察すると、縦糸と横糸は互いをよけるように３次元的に編まれているので、１つの正方形の網の目２００を取り囲む４辺を構成する４本の線材（２本の縦糸（２０１、２０２）と、２本の横糸（２１１、２１２））は、図５（ｂ）に示すように、それぞれにメッシュの厚さ方向に大きく波打っている。該正方形の開口の４辺のうち、互いに対向する平行な２辺の間の距離Ｗ１は、前記収容円の直径であってよい。
【００５９】
線材の径は、分離対象物によって変更してもよいが、概ね同様であり、１０μｍ〜１００μｍ程度が好ましく、３０μｍ〜８０μｍがより好ましい。
線材の材料は、ナイロン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエステル、ＰＴＦＥ、ＥＶＡ、ＰＰＳ、ＰＥＥＫ、アラミド、ステンレス鋼などが挙げられる。
分離対象物が培養された接着性細胞（細胞塊）である場合、線材をより太くすることで細胞が線材によって分断されることを抑制してもよいし、また、分離用網状構造を通過する液体の流速を遅くすることで、細胞が線材によって分断されることを抑制してもよい。分離用網状構造が配置される分離室の容積をより大きくし、流れの断面積を他の管路の断面積よりも大きくし、分離用網状構造の網の目の開口面積の総和を他の管路の断面積よりも大きくすることで、分離用網状構造を通過する液体培地の流速は遅くなり、細胞が分離用網状構造で分割されることが抑制される。これにより、細胞は、分離用網状構造でトラップされ、第１室１０ａに滞留する。分離用網状構造の網の目の開口面積の総和は、他の配管用チューブの断面積の０．０１倍〜１０００倍程度が好ましく、０．１倍〜５００倍程度がより好ましい。例えば、配管用チューブの断面積が、１ｍｍ２〜５０ｍｍ２程度である場合、分離用網状構造の網の目の開口面積の総和は、０．０１ｍｍ２〜５００００ｍｍ２程度が好ましい。
【００６０】
（多孔フィルム）
分離用網状構造は、多孔フィルムであってもよい。多孔フィルムは、図６（ａ）、（ｂ）に示すように、フィルム厚さの方向に貫通する多数の貫通孔２００と、該貫通孔同士の間の隔壁であるビーム部２２０とを有して構成される。貫通孔２００は、前記のメッシュと同様に、分離対象物の通過を抑制する大きさの開口形状を持っている。ビーム部２２０は、隣合った貫通孔同士の間に位置する材料部分（フィルムから貫通孔を除いた残部）である。該ビーム部は、網状をなすように一体的につながっている。多孔フィルムの貫通孔２００の開口形状、開口面積、ビーム部の幅は、上記したメッシュの開口形状、開口面積、線材の太さと同様であってよい。多孔フィルムの製造方法としては、樹脂成形、パンチング、フィルムに対するエッチング、電鋳などが例示される。
【００６１】
（分離用網状構造の面積、分離室の容積）
分離用網状構造の面積（第１室に面し、網の目が存在する領域の面積）は、当該分離デバイスの用途（小規模な実験用や、大規模な産業用）に応じて決定すればよく、特に限定はされないが、例えば、小規模な実験用であれば１００〜５０００ｍｍ２程度が好ましい範囲として例示され、大規模な産業用であれば５０００〜５００００ｍｍ２程度が好ましい範囲として例示される。
分離室の容積も、当該分離デバイスの用途に応じて決定すればよく、特に限定はされないが、例えば、小規模な実験用であれば１０００〜５００００ｍｍ３程度が好ましい範囲として例示され、大規模な産業用であれば５００００〜５０００００ｍｍ３程度が好ましい範囲として例示される。
【００６２】
（分離室の形状、ポート、分離用網状構造の位置）
分離室の形状は、特に限定はされず、円柱状、角柱状（直方体）、板状（円板、四角い板状）、塊状（球状、楕円球状、立方体に近い形状）、異形などが挙げられる。このような分離室における流入ポート、分離用網状構造、流出ポートの位置も、特に限定はされず、当該分離デバイス内に入った懸濁液中の液体が、より低い抵抗でスムーズに、第１室から分離用網状構造を好ましく通過して第２室へと移動し、その後、当該分離デバイスから出て行くように、内部流路が構成されていることが好ましい。また、当該分離デバイス内に入った懸濁液中の液体が、分離用網状構造に対してより大きく広がって、該離用網状構造を通過する用に、分離室の形状とポートの位置が決定されることが好ましい。
【００６３】
（分離室の壁部の材料）
分離室の壁部を構成する材料は、特に限定はされないが、ポリスチレンやポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、アクリル、シリコン、ポリビニリデンフロライドなどの有機高分子材料や、ステンレスなどの金属材料が挙げられる。安価に成形可能であり、かつ、オートクレーブやガンマ線に対する耐性の観点からは、ポリプロピレンやポリカーボネート、アクリルが好ましい材料として例示される。
【００６４】
（分離用網状構造を分離室内に配置するための構成）
分離用網状構造を分離室内に配置するための構成としては、特に限定はされないが、例えば、第１室と第２室とを別個の部品として用意し、これらによって分離用網状構造を挟み込んで固定する構成や、１つの分離室内に、接着しろを持った分離用網状構造を挿入に、該分離室の内壁に分離用網状構造を接着しろを利用して接着して固定し、該分離室を第１室と第２室とに分ける構成などが挙げられる。接着は、接着剤を用いた接着、部品自体同士の溶着などであってよい。
【００６５】
（第１室が、複数の入出ポートを有する態様）
当該分離デバイスには、目的に応じて、第１室、第２室にそれぞれ複数のポートが設けられてもよい。
図７に示す態様例では、第１室に３つのポート（第１の流入ポート３１１、第２の流入ポート３１２、および、流出ポート３１３）が設けられており、第２室には、流出ポート３２だけが設けられている。図７に示す態様例では、分離室の外形が円板状（円柱状）であり、各ポートは、分離室の外周側面に角度９０度の間隔をおいた位置にある。
図８に示す態様例も同様に、第１室に３つのポート（第１の流入ポート３１４、第２の流入ポート３１５、および、流出ポート３１６）が設けられており、第２室には、流出ポート３２だけが設けられている。図８に示す態様例では、分離室の形状が直方体状（薄い板状）であり、各ポートは、分離室の外周側面の４面のうち、互いに対向する２面にそれぞれ２つ設けられている。図８（ａ）に示す態様のより具体的な例としては、図８（ｂ）に示す態様、および、図８（ｃ）に示す態様が例示される。
図８（ｂ）に示す態様では、分離室は８つの頂点（Ｃ11、Ｃ12、Ｃ13、Ｃ14、Ｃ31、Ｃ32、Ｃ33、Ｃ34）を持った直方体状（薄い四角形の板を水平に寝かせたような形状）である。該分離室は、水平に配置された方形のシート状の分離用網状構造２０によって、下側の第１室１０ａと、上側の第２室１０ｂとに仕切られている。該分離用網状構造２０の４つの頂点は、Ｃ21、Ｃ22、Ｃ23、Ｃ24である。第１室における第１の流入ポート３１４および第２の流入ポート３１５は、側面（Ｃ22、Ｃ23、Ｃ33、Ｃ32）内に位置し、第１室における流出ポート３１６は、側面（Ｃ21、Ｃ24、Ｃ34、Ｃ31）内に位置する。また、第２室の流出ポート３２は、側面（Ｃ11、Ｃ14、Ｃ24、Ｃ21）内に位置する。
図８（ｃ）に示す態様では、分離室は８つの頂点（Ｃ41、Ｃ42、Ｃ43、Ｃ44、Ｃ51、Ｃ52、Ｃ53、Ｃ54）を持った直方体状（薄い四角形の板を垂直に立てたような形状）である。該分離室は、斜めに配置された方形のシート状の分離用網状構造２０によって、下側の第１室１０ａと、その斜め上側の第２室１０ｂとに仕切られている。方形のシート状の分離用網状構造２０の４つの頂点は、Ｃ41、Ｃ52、Ｃ53、Ｃ44である。第１室における第１の流入ポート３１４および第２の流入ポート３１５は、側面（Ｃ41、Ｃ51、Ｃ52）内に位置し、第１室における流出ポート３１６は、側面（Ｃ44、Ｃ54、Ｃ53）内に位置する。また、第２室の流出ポート３２は、側面（Ｃ44、Ｃ53、Ｃ43）内に位置する。
図７、図８のいずれの態様でも、第１の流入ポートは、懸濁液を外部から第１室に流入させるためのポートである。また、第２の流入ポートは、洗浄液や試薬などを、外部から第１室に流入させるためのポートである。前記試薬としては、細胞剥離液（例えば、足場材を分解し得る試薬）や、細胞を溶解するための細胞溶解試薬などが挙げられる。また、第１室に設けられる流出ポートは、分離用網状構造によって第１室内に残された分離対象物を外部に流出させるためのポートである。
これらのポートを設けることによって、分離室の第１室に外部の試薬容器を接続し、第１室において該試薬の適用による足場材の剥離や細胞の溶解が可能になる。また、第１室に他の外部容器を接続すれば、第１室内に残留した分離対象物を該外部容器に移動させることもできるようになり、閉鎖系の培養システムに適した流路構築が可能となる。
【００６６】
（第１室の流入ポートの位置）
図９に示す態様例では、第２室１０ｂは、第１室１０ａの上に位置し、シート状の分離用網状構造２０が水平に配置されている。よって、分離用網状構造２０の網の目を通過するときの液体の進行方向Ｆは、鉛直上向きの方向である。
図９に示す態様例では、第１室は、懸濁液Ｑ１を外部から流入させるための流入ポート３１を少なくとも有し、該流入ポート３１は、第１室の側壁に設けられている。これにより、分離室の底面は平坦になり、安定してベース面上に配置することができる。
また、好ましい態様として、流入ポートの中心軸線の高さｈ１は、第１室の室内の全高さＨ１の４０％以上の高さ、好ましくは６０％以上の高さに位置する。これによって、第１室内には、流入ポート３１の中心軸線の高さｈ１よりも下に、スペースが存在する。このスペースの存在と、側面に設けられた流入ポートから流入する懸濁液Ｑ１の流れとによって、第１室１０ａ内では、分離対象物と通過対象物とが好ましく循環し、分離対象物が分離用網状構造から剥がれ落ちながら、前記スペースに溜まることができる。該スペースに溜まった分離対象物は、新たに流入する通過対象物の障害にはならない。また、流入ポート３１は第１室の底面に設けられていないので、新たに流入する懸濁液が、該スペースの底に溜まった分離対象物を上方へと吹き上げることもない。よって、通過対象物が分離用網状構造を好ましく通過する。流入ポートの中心軸線の高さｈ１の上限は、流入ポートの開口の上端が分離用網状構造の下面に接触する位置である。即ち、開口の口径をｄとすると、流入ポートの中心軸線の高さｈ１の上限は、分離用網状構造の下面からｄ／２だけ下がった位置である。
【００６７】
第２室に設けられる流出ポート３２の位置は特に限定されないが、図９に示す態様例のように、第２室の側面に設けられてもよい。図９に示す態様例では、第１室に設けられた流入ポート３１と、第２室に設けられた流出ポート３２は、分離室の側面のうち、互いに反対側の面に設けられているが、互いに同じ側の面に設けられてもよい。流入ポート３１と流出ポート３２の位置は、配管作業やチューブが占める配管スペースを考慮して適宜決定することが好ましい。
【００６８】
（分離室が２以上の分離用網状構造によって３以上に分けられた態様）
図９の態様では、分離室は１つの分離用網状構造によって２つに分けられたものであったが、第２室の上には、上方へと積層された１以上の部屋が分離室としてさらに設けられていてもよい。前記１以上の部屋のうちの第２室に隣接する部屋と、第２室とは、さらなる分離用網状構造によって仕切られる。また、前記１以上の部屋が２以上の部屋である場合には、上下に隣接する部屋同士が、さらなる他の分離用網状構造によって仕切られる。
図１０に示す態様例では、図９に示した第２室の上に、上方へと積層された部屋１０ｃが分離室としてさらに設けられている。第２室１０ｂは、第１室１０ａの上に位置し、それらの間にシート状の分離用網状構造２１が水平に配置されており、第３室１０ｃが、第２室１０ｂの上に位置し、それらの間にシート状の分離用網状構造２２が水平に配置されている。換言すると、分離室が、２つの分離用網状構造２１、２２によって、３つの部屋１０ａ、１０ｂ、１０ｃに分けられている。流出ポートは、最も上に位置する部屋（第３室１０ｃ）に設けられる。このような構成では、より上方に位置する分離用網状構造の網の目ほど、前記分離対象物の通過をより抑制するように、該網の目の開口面積が、より小さくなっている。これにより、分離用網状構造が単一の場合よりも、流量を上げたときの分離能（即ち、流量を上げても、分離対象物を通過させてしまうことなく止める性能）が向上するため好ましい。
【００６９】
（上下に複数重ねた態様２）
図１０に示す態様において、懸濁液Ｑ１中に固体として分離対象物Ｅ１だけが分散している場合には、最も上に位置する分離用網状構造２２の網の目の大きさの下限は、特に限定はされず、通過させるべき液体がより小さい抵抗で効率よく通過できるような大きさであることが好ましい。
一方、図１０に示す態様において、懸濁液Ｑ１中に固体として分離対象物Ｅ１のみならず、固体の通過対象物Ｅ２が含まれている場合、最も上に位置する分離用網状構造２２の網の目の大きさは、分離対象物Ｅ１の通過を抑制しながらも、通過対象物Ｅ２が通過できる大きさであるように定められる。このように、分離用網状構造を多段に設ける態様により、最初の分離用網状構造２１の網の目を大きくし、該分離用網状構造２１を通過する時に粗いふるい分けを行って大きい分離対象物だけを先に除去することができるため、比較的流量を上げても分離能が低下しないので好ましい。
【００７０】
（本発明の分離デバイスを用いた細胞培養システム）
図１１は、当該分離デバイスを用いて構成された細胞培養システムの一例を示すブロック図および配管図である。図では、管路と液体の流れの方向を矢印で表している。図１１に例示する構成では、足場材とそれに付着した細胞が、当該分離デバイスによって懸濁液から分離され、液性因子を含んだ液体培地だけが通過し回収されるか、または、細胞から剥離された足場材が、当該分離デバイスによって懸濁液から分離され、細胞を含んだ液体培地が通過して回収される。図の例では、送液ポンプＳ１、Ｓ２はチューブポンプであり、容器１１０、１２０、１６０、１７０は柔軟なバッグであり、容器同士を接続する配管は軟質チューブであり、細胞や液体培地が外気に露出することのない閉鎖系での細胞培養と細胞の分離、回収を可能にしている。
【００７１】
液体培地容器１１０には足場材が分散した液体培地が収容されている。液体培地容器１１０は、細胞培養容器１２０に配管Ｐ１を介して接続されており、配管Ｐ１の経路上には送液ポンプＳ１が設けられており、足場材（例えば、キチンを主成分とするナノファイバー）が分散した液体培地が、細胞培養容器１２０に送られる。一方、細胞培養容器１２０には、細胞注入ポート１３０から、該容器内に播種のための接着性細胞（例えば、ＭＤＣＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＭＳＣ）が所定量だけ注入され、細胞培養容器１２０内で浮遊培養が行われる。当該細胞培養システム全体は、インキュベーター内に配置され、適当な温度（例えば、３３℃〜３９℃）に保たれる。
【００７２】
図１１に例示した細胞培養システムは次のように作動する。
先ず、液性因子（例えば、ＩＮＦ−β、エクソソーム）を含んだ液体培地だけを回収する場合には、細胞が付着した足場材を含んだ懸濁液は、細胞培養容器１２０から配管Ｐ２を通じて、当該分離デバイス１の第１室１０ａに送り込まれる。そこで、細胞が付着した足場材が第１室１０ａに残り、液体培地だけが分離用網状構造２０を通過して第２室１０ｂに入り、当該分離デバイスから出て行く。該液体培地は、配管Ｐ３、切替えバルブ１５０、配管Ｐ４を通って、液体（上清）回収容器１６０に収容される。この手順は、細胞培養容器１２０内の細胞（足場材に付着している）の濃縮にも利用され得る。例えば、その場合、送液ポンプＳ２を送り方向が逆になるよう操作し、第１室１０ａに残留していた濃縮物を細胞培養容器１２０へと戻し、液体培地容器１１０から液体培地を再度送り込むことで、細胞培養容器１２０内で培養を続けることができる。
次に、浮遊培養された接着性細胞から足場材を分離し、細胞を含んだ液体培地を回収する場合には、該接着性細胞から足場材を剥離するために、試薬注入ポート１４０から細胞培養容器１２０内に試薬（例えば、Ｙａｔａｌａｓｅ）が送り込まれる。この際には、送液ポンプＳ２は送り方向が逆になるよう操作される。足場材と細胞とが剥離した懸濁液は、細胞培養容器１２０から配管Ｐ２を通じて、当該分離デバイス１の第１室１０ａに送り込まれる。そこで、足場材が分離されて第１室１０ａに残り（第１室内には液体培地も残っている）、細胞と液体培地が分離用網状構造２０を通過して第２室１０ｂに入り、当該分離デバイスから出て行く。細胞と液体培地は、配管Ｐ３、切替えバルブ１５０、配管Ｐ５を通って、細胞回収容器１７０に収容される。
これらの回収操作は、細胞培養システムをインキュベーター外に取り出して行っても良いし、インキュベーター内で行っても良い。
【００７３】
図１１に示したシステムはあくまでも一例であって、培養された細胞が液体培地と共に、外気に直接的に接触することなしに、当該分離デバイスの分離用網状構造を通過して（または、当該分離デバイスの第１室に入った後、分離用網状構造を通過せずに）、容器同士の間を移動するように（または、もとの容器に戻るように）、必要な数の容器を配管で接続してもよい。
【００７４】
上記した細胞培養システムに用いられる容器は、特に限定はされないが、細胞培養等に用いられている柔軟なバッグ、硬質のプラスチックやガラス製のボトルやフラスコなどが好ましいものとして例示される。培養スケールに応じて適切な撹拌装置（例：シェーカー、パドル撹拌器など）を使用してもよい。
【００７５】
各容器の容量は、システムの用途（小規模な実験用や、大規模な産業用）に応じて決定すればよく、特に限定はされないが、例えば、小規模な実験用であれば１０ｍＬ（ミリリットル）〜１０００ｍＬ程度が好ましい範囲として例示され、大規模な産業用であれば１Ｌ〜１０００Ｌ程度が好ましい範囲として例示される。
【００７６】
送液ポンプは、特に限定はされないが、シリンジ、チューブポンプなどが好ましいものとして挙げられる。
【００７７】
容器としてガス透過バッグやベントキャップ付フラスコを用いる場合には、インキュベーターは、内部の温度とガス濃度（とりわけＣＯ２濃度）を制御可能な装置を用いることが好ましい。また、容器がガス不透過性の密閉容器の場合は、培地交換等によって液体培地中のＣＯ２濃度を制御することで、温度制御だけを行うインキュベーターを用いることが出来る。
【００７８】
（分離方法）
上記した本発明の分離デバイスを用いて、微細な足場材を用いた接着性細胞の浮遊培養によって得られた懸濁液から、該懸濁液中に含まれた固体の分離対象物を好ましく分離する方法を提供することができる。上記したように、懸濁液に含まれる固体と、分離すべき対象物と、通過させるべき対象物との組み合わせは、多岐に渡る。例えば、懸濁液中の液体が液体培地であり、分離対象物が、接着性細胞が付着した足場材である場合、固体の通過対象物は無く、当該方法は、液体の単なる除去（濃縮）や、浮遊培養において接着性細胞から液体培地中に放出された液性因子の回収に利用可能である。分離対象物は回収対象物であってもよい。懸濁液中の液体が液体培地であり、分離対象物が、足場材と接着性細胞を分離する試薬によって液体培地中で接着性細胞から剥離した足場材である場合には、通過対象物（回収対象物）は足場材から剥離した接着性細胞である。懸濁液中の液体が、接着性細胞を溶解する細胞溶解試薬によって溶解した該細胞を含有する液体であり、分離対象物が、該細胞の溶解によって前記液体中に残された足場材である場合には、通過対象物（回収対象物）は、該細胞の溶解によって前記液体中に放出された該細胞由来の物質である。
【００７９】
（流速、流量）
懸濁液中の液体が、当該分離デバイスの分離用網状構造を通過するときの流速は、特に限定はされないが、分離性を向上させかつ目詰まりを抑制する点からは、０．０１ｍｍ／秒〜２５ｍｍ／秒が好ましく、０．１ｍｍ／秒〜１５ｍｍ／秒がより好ましく、１ｍｍ／秒〜１０ｍｍ／秒がさらに好ましい。
分離用網状構造の面積（網として有効に作用する部分の面積）１ｃｍ２当たりを通過する液体の流量は、分離性を向上させかつ目詰まりを抑制する点からは、１〜１０ｍＬ／ｍｉｎが好ましく、２〜５ｍＬ／ｍｉｎがより好ましく、３ｍＬ／ｍｉｎがさらに好ましい。後述の実施例３は、３０ｍＬ／ｍｉｎで実施したものであり、分離用網状構造の面積は約１２ｃｍ２であるから、分離用網状構造の面積１ｃｍ２当たりの流量は２．５ｍＬ／ｍｉｎである。
【００８０】
（分離および回収例１：浮遊培養された移植用ＭＳＣの回収）
図１２は、本発明の分離デバイスを用い、浮遊培養された移植用ＭＳＣを回収する場合のプロセスの一例を示すフローチャートである。
該フローチャートに示すように、先ず、足場材（例、キチンナノファイバー）を用いて細胞を浮遊培養する。
次に、懸濁液（液体培地中に、細胞が付着した足場材が分散している）を当該分離デバイスに送り込むことで、所定量の液体培地を通過させ、細胞が付着した足場材を濃縮することができる。このとき、当該分離デバイスを通過した液体培地（培養上清）を回収してよい。
次に、足場材を分解する酵素（例、Ｙａｔａｌａｓｅ）を含有した溶液を注入し、所定時間インキュベートすることで足場材表面を分解し、細胞を足場材から剥離させる。酵素溶液注入前にＰＢＳ（−）（リン酸緩衝液）等で洗浄してもよい。
次に、培地又はＰＢＳ（−）を送液し、足場材をトラップし、細胞のみを通過させることで、該細胞を回収する。この際、分離用網状構造のメッシュ面に対して重力方向と逆方向に送液することで、効果的な細胞回収が可能となる。
次に、回収液を遠心分離し、上清を除去することで細胞のみを回収する。
【００８１】
（分離および回収例２：浮遊培養後の液体培地を回収する場合）
図１３は、本発明の分離デバイスを用い、浮遊培養後の液体培地を回収する場合のプロセスの一例を示すフローチャートである。該フローチャートに示すように、足場材を用いて接着性細胞を浮遊培養した後、本発明の分離デバイスに懸濁液（液体培地中に、接着性細胞が付着した足場材が分散している）を送り込むことで、細胞が付着した足場材を除去し、液体培地（培養上清）の回収が可能となる。接着性細胞が付着した足場材は、培養容器に戻し、再度浮遊培養に供してもよい。
【００８２】
（分離および回収例３：培養された細胞由来の物質を回収する場合）
図１４は、本発明の分離デバイスを用い、浮遊培養後、培養された細胞由来の物質を回収する場合のプロセスの一例を示すフローチャートである。
該フローチャートに示すように、先ず、足場材を用いて細胞を浮遊培養する。
次に、懸濁液（液体培地中に、細胞が付着した足場材が分散している）を当該分離デバイスに送り込み液体培地を通過させ、接着性細胞が付着した足場材を濃縮する。このとき、当該分離デバイスを通過した液体培地（培養上清）を必要に応じて回収してもよい。
次に、細胞溶解試薬によって細胞を溶解する。この結果、懸濁液中には、細胞から剥離した足場材および細胞溶解物が含まれる。
次に、本発明の分離デバイスによって足場材を除去し、細胞溶解物を含んだ液体を通過させ、該液体を回収する。
【実施例】
【００８３】
［調製例１］
（キチンナノファイバーを含んだ培地組成物の調製）
上記特許文献１（国際公開第２０１５／１１１６８６号）の記載に準じて調製した２質量％キチンナノファイバー（バイオマスナノファイバー  ＢｉＮＦｉ−Ｓ（ビンフィス）、株式会社スギノマシン）を、１％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に混合し懸濁させた。その後、これらの水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。得られた１％（ｗ／ｖ）キチンナノファイバー分散液を、終濃度０．０１または０．０２％（ｗ／ｖ）となるように、間葉系幹細胞増殖培地２（＃Ｃ−２８００９、タカラバイオ社製）（以下、培地と表記することもある）に添加し、懸濁することで、キチンナノファイバーが分散した状態で含まれた培地組成物（以下、ＣＮＦ培地組成物と表記）を調製した。【００８４】
［実施例１］
（分離デバイスの作製）
図１５の写真図に外観を示すように、５０ｍＬコニカルチューブ（Ｆａｌｃｏｎ(R)、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）を４５ｍＬ目盛の位置において上側部分と下側部分に切断し、下側部分を上下逆さにし、下端の円錐状部分を上側部分に下から差し込んで、該上側部分の内部を第１室１０ａとした。
前記の第１室１０ａの上に、流入ポート３１を持ったコネクターリング３１Ｒを接続し、その上に、３つのセルストレーナー（ｐｌｕｒｉＳｔｒａｉｎｅｒ（登録商標）、ｐｌｕｒｉＳｅｌｅｃｔ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）２１Ａ、２２Ａ、２３Ａを順に積み重ね接続し、さらにその上に、上下が開口した円錐台状の筒（Ｆｕｎｎｅｌ、ｐｌｕｒｉＳｅｌｅｃｔ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）１０ｄを接続し、本発明の分離デバイスを得た。前記３つのセルストレーナーのそれぞれの分離用網状構造（メッシュ）の方形の開口の円相当直径は、下から順に１００μｍ、６０μｍ、２０μｍである。
この分離デバイスでは、セルストレーナー２１Ａのメッシュとセルストレーナー２２Ａのメッシュとの間の空間が第２室１０ｂであり、セルストレーナー２２Ａのメッシュとセルストレーナー２３Ａのメッシュとの間の空間が第３室１０ｃであり、その上の円錐台状の筒１０ｄの内部が第４室である。本実施例の分離デバイスは、構造上の概念では、図１０に示す分離デバイスと同様である。【００８５】
［実施例２］
（分離デバイスを用いた細胞と足場材の分離）
実施例１で作製した分離デバイスを用いて、細胞と足場材の分離を検討した。
培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞（Ｃ−１２９７４、タカラバイオ社製）を、１００万細胞／１０ｍＬとなるように調製例１で作製した０．０２％（ｗ／ｖ）キチンナノファイバー配合培地組成物と懸濁した後、１０ｍＬシリンジ（テルモ社製）に充填した。これを分離デバイスのコネクターリング横部のポートに接続し、注入した。
次に、間葉系幹細胞増殖培地２を４０ｍＬ充填した５０ｍＬシリンジ（テルモ社製）をポートに接続し、０．５ｍＬ／ｓｅｃの流速で培地を注入することにより、メッシュに対して重力方向に逆らって下からフローした。
Ｆｕｎｎｅｌ部に流入した培地を回収し、回収液を遠心分離（３００×ｇ、３分間）後、上清を除去した。残った沈降物に培地１０ｍＬを加えて再懸濁し、懸濁液の細胞中に含まれるＡＴＰ量をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（プロメガ社）を用いてプレートリーダー（テカン社製）により定量した。【００８６】
分離操作前の培養後細胞懸濁液を測定して得られたＲＬＵ値を基準（細胞回収率１００％）として、分離操作をした際に得られるＲＬＵ値を比較して細胞回収率を算出した。
その結果、細胞回収率は８９％であった。また、回収後の懸濁液および分離デバイス下部の残渣を倒立顕微鏡で観察したところ、回収後の懸濁液にはほとんどキチンナノファイバーが観察されないことを確認した。図１６（ａ）、（ｂ）にそれぞれの顕微鏡写真を示す。図１６（ａ）は、当該分離デバイスを通過した液体中に含まれる固体を示す顕微鏡写真図であり、図１６（ｂ）は、当該分離デバイスの第１室に残った液体中に含まれる固体（残渣）を示す顕微鏡写真図である。【００８７】
［比較例１］
（セルストレーナーでの細胞と足場材の分離）
５０ｍＬコニカルチューブにコネクターリングを接続し、２０μｍ、６０μｍ、１００μｍのセルストレーナーと、Ｆｕｎｎｅｌを順に載せて固定した。
培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞（Ｃ−１２９７４、タカラバイオ社製）を、１００万細胞／１０ｍＬとなるように調製例１で作製した０．０２％（ｗ／ｖ）キチンナノファイバー配合培地組成物と懸濁した後、電動ピペッター（ビオラモディスポピペット）で吸引し、Ｆｕｎｎｅｌを伝わらせてセルストレーナー上にゆっくり吐出した。
次に、無充填の１０ｍＬシリンジをコネクターリング横部のポートに接続し、シリンジのピストンをゆっくり引っ張ることでコニカルチューブ内を減圧し、セルストレーナーに通液した。
次に、４０ｍＬの間葉系幹細胞増殖培地２を、Ｆｕｎｎｅｌを伝わらせてセルストレーナー上にゆっくり注ぎ、無充填の５０ｍＬシリンジをコネクターリング横部のポートに接続し、シリンジのピストンをゆっくり引っ張ることでコニカルチューブ内を減圧し、セルストレーナーに通液した。
コニカルチューブ内の培地を遠心分離（３００×ｇ、３分間）後、上清を除去した。
残った沈降物に培地１０ｍＬを加えて再懸濁し、懸濁液の細胞中に含まれるＡＴＰ量をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（プロメガ社）を用いてプレートリーダー（テカン社製）により定量した。【００８８】
分離操作前の培養後細胞懸濁液を測定して得られたＲＬＵ値を基準（細胞回収率１００％）として、分離操作をした際に得られるＲＬＵ値を比較して細胞回収率を算出した。その結果、細胞回収率は５２％であった。
これは、上部から順にフィルターしたことにより、キチンナノファイバーがメッシュを覆う形で塞いでしまい、細胞の通過を阻害したものと考えられる。また、再懸濁した液を目視観察したところ、細胞とは異なる浮遊物がみられたことから、キチンナノファイバーの混入が確認され、分離が不十分であることもわかった。このことから、実施例１で作製した分離デバイス形状を利用して実施例２で行った分離回収方法の有効性が示された。【００８９】
［実施例３］
（バッグ型セルストレーナーを用いた細胞と足場材の分離）
市販品の一部材である骨髄液ろ過フィルター（カネカ社製）を用いて、細胞と足場材の分離を検討した。
培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞（Ｃ−１２９７４、タカラバイオ社製）を、１００万細胞／１０ｍＬとなるように調製例１で作製した０．０２％（ｗ／ｖ）キチンナノファイバー配合培地組成物と懸濁した後、１０ｍＬシリンジに充填した。これを骨髄液ろ過フィルターの一端に接続し、下部から上部方向に送液した。
次に、培地を２５ｍＬ充填した５０ｍＬシリンジに着け替え、下部から上部方向に送液し、上部の流路から出てきた培地を５０ｍＬコニカルチューブに回収した。
回収液を遠心分離（３００×ｇ、３分間）後、上清を除去した。
残った沈降物に培地１０ｍＬを加えて再懸濁し、細胞数をセルカウンター（ＴＣ−２０、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）で計測した結果、回収前の細胞数と比較して８６％の回収率となった。
また、懸濁液の細胞中に含まれるＡＴＰ量をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（プロメガ社）を用いてプレートリーダー（テカン社製）により定量した。分離操作前の培養後細胞懸濁液を測定して得られたＲＬＵ値を基準（細胞回収率１００％）として、分離操作をした際に得られるＲＬＵ値を比較して細胞回収率を算出した。
その結果、細胞回収率は８３％であった。また、回収後の懸濁液および分離デバイス下部の残渣を倒立顕微鏡で観察したところ、懸濁液にはほとんどキチンナノファイバーが観察されないことを確認した。図１７（ａ）、（ｂ）にそれぞれの顕微鏡写真を示す。図１７（ａ）は、当該分離デバイスを通過した液体中に含まれる固体を示す顕微鏡写真図であり、図１７（ｂ）は、当該分離デバイスの第１室に残った液体中に含まれる固体（残渣）を示す顕微鏡写真図である。【００９０】
上記実施例２、４及び比較例１の結果を表１にまとめる。
比較例１では、回収液への足場材の残存が多く観察されたのに対し、実施例２、４では、ほとんどないことを確認した。また、実施例２、４は下部からフローすることにより、細胞が外気に触れにくくなり、回収過程で細胞が乾燥することを防ぎ、効率的な回収を達成することが出来た。【００９１】
【表１】
2020054755.tif 000003
【００９２】
※１…○：回収液への足場材混入が極少量、×：回収液への足場材混入が多い
※２…○：空気に暴露低、×：空気に常に暴露【００９３】
［実施例４］
培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞（Ｃ−１２９７４、タカラバイオ社製）を、４００００細胞／ｍＬとなるように、上記調製例１で作製した０．０１％（ｗ／ｖ）キチンナノファイバー配合培地組成物及び未添加培地に播種した後、６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７１）のウェルに１ウェル当たり２ｍＬになるように分注した。
各プレートはＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で培養し、５日間継続した。５日目に細胞回収の操作を行った。培養後、該細胞／キチンナノファイバー懸濁液を１５ｍＬ遠沈管に回収し、遠心分離（２２０×ｇ、３分間）を行った。
上清を除去後、Ｄ−ＰＢＳ（＃０４５−２９７９５、富士フイルム和光純薬社製）を３ｍＬ添加し、洗浄後、遠心分離（２２０×ｇ、３分間）を行った。
続いて、足場材を分解する試薬としてＹａｔａｌａｓｅ（＃Ｔ０１７、タカラバイオ社製）を１％（ｗ／ｖ）となるようにＤ−ＰＢＳに溶解させた。ＤＭＥＭ（低グルコース）（＃０４１−２９７７５、富士フイルム和光純薬社製）に１％（ｗ／ｖ）Ｙａｔａｌａｓｅ溶液（終濃度０．４％）及びＴｒｙｐｌｅ  ｓｅｌｅｃｔ  （１×）（＃１２５６３０２９、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）（終濃度０．１×）を加えた剥離溶液（サンプル１）、１％（ｗ／ｖ）Ｙａｔａｌａｓｅ溶液（終濃度０．４％）を加えた剥離溶液（サンプル２）を２ｍＬ／１５ｍＬ遠沈管で添加した。
また、コントロールのサンプルとして、ＤＭＥＭ（低グルコース）のみを２ｍＬ添加した（サンプル３）。懸濁後に６ウェル平底超低接着表面マイクロプレートに再度播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて１時間静置した。
続いて、剥離した細胞、キチンナノファイバー及び培地を１５ｍＬ遠沈管に回収し、遠心分離（２２０×ｇ、３分間）を行った。
上清を除去後にＤ−ＰＢＳを３ｍＬ添加し、洗浄後に遠心分離（２２０×ｇ、３分間）を行った。上清を除去後に培地を２ｍＬ添加し、６ウェル接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３５１６）に播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて３時間静置した。３時間後に上清及びキチンナノファイバーを回収し、遠心分離（２２０×ｇ、３分間）を行った。
上清を除去後にＡＴＰ試薬５００μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＧｌｏＴＭ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ，  Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加した。
また、６ウェル接着表面マイクロプレートに接着した細胞はＤ−ＰＢＳを２ｍＬ添加して洗浄を行い、除去した後にＡＴＰ試薬５００μＬを添加した。
Ｅｎｓｐｉｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ社製）を用いて、発光値（ＲＬＵ）の測定を行い、１００×（マイクロプレート上のＲＬＵ）/（マイクロプレート中のＲＬＵ＋キチンナノファイバー中のＲＬＵ）を算出することにより、剥離溶液による回収率を算出した。その結果、サンプル１及びサンプル２ではそれぞれ７８％及び６９％の細胞を回収することができた。一方、剥離溶液を処置しなかったコントロール群では回収率は５％であった。
以上の結果から、足場材を分解する試薬を使用することにより、浮遊培養された接着細胞を足場材から簡便に剥離させることができ、さらに、該剥離させた細胞を効率よく回収できることが示された。【００９４】
［実施例５］
（分散培養から細胞と足場材の分離および細胞回収までを一連した検討）
<<Ｓｔｅｐ１：培養工程>>
培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞（Ｃ−１２９７４、タカラバイオ社製）を、１００００細胞／ｍＬとなるように、上記調製例１で作製した０．０１％（ｗ／ｖ）ＣＮＦ培地組成物に播種した後、６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７１）のウェルに１ウェル当たり１０ｍＬになるように４ウェル分注した。各プレートはＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で培養し、５日間継続した。
<<Ｓｔｅｐ２：基材と細胞の粗分離工程>>
培養後の懸濁液（４０ｍＬ）を５０ｍＬコニカルチューブに回収し、遠心分離（３００×ｇ、３分間）を行い、上清（３５ｍＬ）を除去した。つぎに、密度勾配調整液（Ｐｅｒｃｏｌｌ ＰＬＵＳ、ＧＥヘルスケア社製）（４５ｍＬ）に１０×ＰＢＳ（−）（５ｍＬ）を加えることで得られた等張Ｐｅｒｃｏｌｌ液（１０ｍＬ）を加え、ピペッティングにより混合後、遠心分離（４００×ｇ、１０分間）を行うことで、細胞が付着していない基材は沈殿し、基材に付着した細胞画分のみが上層に留まった。この上層（１０ｍＬ）を５０ｍＬコニカルチューブに回収し、ＰＢＳ（−）（４０ｍＬ）を加え希釈後、遠心分離（４００×ｇ、３分間）を行い、上清（４０ｍＬ）を除去することで洗浄した。
<<Ｓｔｅｐ３：基材から細胞の剥離工程>>
つぎに、細胞剥離用酵素（Ａｃｃｕｍａｘ、ナカライテスク社製）（１０ｍＬ）を加え、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置することで基材から細胞を剥離した。
<<Ｓｔｅｐ４：基材と細胞の分離・細胞回収>>
つぎに、得られた懸濁液に培地（１０ｍＬ）を加えたものを５０ｍＬシリンジ（ニプロ社製）に充填し、市販品の一部材である骨髄液ろ過フィルター（カネカ社製）の一端に接続後、下部から上部方向に送液し、続けて、培地を２５ｍＬ充填した５０ｍＬシリンジに着け替え、下部から上部方向に送液し、上部の流路から出てきた培地全量（約４０ｍＬ）を５０ｍＬコニカルチューブに回収した。これを遠心分離（３００×ｇ、３分間）を行い、上清（３５ｍＬ）を除去することで濃縮し細胞を回収した。Ｓｔｅｐ１から４の各工程で得られた懸濁液の顕微鏡写真を図１８に示す。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明によって、微細な足場材を用いた接着性細胞の浮遊培養において、分離対象物をより効率よく分離し、通過対象物を得ることを可能にする分離デバイスが提供される。当該分離デバイスを用いることによって、分離対象物を好ましく分離する方法を提供することができ、通過対象物を好ましく通過させ、回収対象物を好ましく回収することが可能になる。【００９６】
本出願は、日本で出願された特願2018-170092（出願日：2018年9月11日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【符号の説明】
【００９７】
１      分離デバイス
１０    分離室
１０ａ  第１室
１０ｂ  第２室
２０    分離用網状構造
Ｆ      分離用網状構造の網の目を通過するときの液体の進行方向
Ｆｖ    進行方向Ｆの鉛直上向きの方向成分
【図１】
2020054755.tif 000004
【図２】
2020054755.tif 000005
【図３】
2020054755.tif 000006
【図４】
2020054755.tif 000007
【図５】
2020054755.tif 000008
【図６】
2020054755.tif 000009
【図７】
2020054755.tif 000010
【図８】
2020054755.tif 000011
【図９】
2020054755.tif 000012
【図１０】
2020054755.tif 000013
【図１１】
2020054755.tif 000014
【図１２】
2020054755.tif 000015
【図１３】
2020054755.tif 000016
【図１４】
2020054755.tif 000017
【図１５】
2020054755.tif 000018
【図１６】
2020054755.tif 000019
【図１７】
2020054755.tif 000020
【図１８】
2020054755.tif 000021
【国際調査報告】
2020054755.tif 000022
2020054755.tif 000023
2020054755.tif 000024
2020054755.tif 000025