(57)【要約】  本発明は、ウコンに由来する成分を有効成分とする、アルツハイマー病の治療、予防又は改善等に有用な組成物を提供する。  本発明は、水及び親水性有機溶媒からなる群から選択される少なくとも１種の抽出溶媒によるウコン抽出物、又は、ターメロノールＡ及びターメロノールＢから選択される少なくとも一種を有効成分とする、アルツハイマー病の治療用組成物、脳神経細胞死の抑制用組成物、アミロイドβペプチドで誘導されるミクログリアの活性化の抑制用組成物、或いは、アミロイドβペプチドで誘導されるＰＧＥ２、ＴＮＦ−α又はＩＬ−１β産生の抑制用組成物に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
水及び親水性有機溶媒からなる群から選択される少なくとも１種の抽出溶媒によるウコン抽出物を有効成分として含有する、アルツハイマー病の治療、予防又は改善用組成物。
【請求項２】
ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種を有効成分として含有する、アルツハイマー病の治療、予防又は改善用組成物。
【請求項３】
水及び親水性有機溶媒からなる群から選択される少なくとも１種の抽出溶媒によるウコン抽出物を有効成分として含有する、脳神経細胞死の抑制用組成物。
【請求項４】
ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種を有効成分として含有する、脳神経細胞死の抑制用組成物。
【請求項５】
水及び親水性有機溶媒からなる群から選択される少なくとも１種の抽出溶媒によるウコン抽出物を有効成分として含有する、アミロイドβペプチドで誘導されるミクログリアの活性化の抑制用組成物。
【請求項６】
ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種を有効成分として含有する、アミロイドβペプチドで誘導されるミクログリアの活性化の抑制用組成物。
【請求項７】
水及び親水性有機溶媒からなる群から選択される少なくとも１種の抽出溶媒によるウコン抽出物を有効成分として含有する、アミロイドβペプチドで誘導されるＰＧＥ２産生の抑制用組成物。
【請求項８】
ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種を有効成分として含有する、アミロイドβペプチドで誘導されるＰＧＥ２産生の抑制用組成物。
【請求項９】
水及び親水性有機溶媒からなる群から選択される少なくとも１種の抽出溶媒によるウコン抽出物を有効成分として含有する、アミロイドβペプチドで誘導されるＴＮＦ−α産生の抑制用組成物。
【請求項１０】
ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種を有効成分として含有する、アミロイドβペプチドで誘導されるＴＮＦ−α産生の抑制用組成物。
【請求項１１】
水及び親水性有機溶媒からなる群から選択される少なくとも１種の抽出溶媒によるウコン抽出物を有効成分として含有する、アミロイドβペプチドで誘導されるＩＬ−１β産生の抑制用組成物。
【請求項１２】
ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種を有効成分として含有する、アミロイドβペプチドで誘導されるＩＬ−１β産生の抑制用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病の治療、予防又は改善用組成物、脳神経細胞死の抑制用組成物、アミロイドβペプチドで誘導されるミクログリアの活性化の抑制用組成物、或いは、アミロイドβペプチドで誘導されるＰＧＥ２、ＴＮＦ−α又はＩＬ−１β産生の抑制用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病は、認知症のうち５０〜７５％を占める主要な疾患である。
アルツハイマー病患者の脳内では、アミロイドβペプチドを主成分とする老人斑、タウ蛋白を主成分とする神経原線維変化、神経細胞死等が観察される。アルツハイマー病は、認知機能の低下をはじめ多様な症状を呈するが、その発症の機序は未解明であり、治療や予防への課題は多い（非特許文献１）。【０００３】
アルツハイマー病の原因物質のうちの一つであるアミロイドβペプチドの蓄積は、神経細胞の細胞死を引き起こすだけでなく、マクロファージ細胞の一種であるミクログリアを活性化させることによってアルツハイマー病を進行させる。【０００４】
ミクログリアが活性化すると、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）を産生する。ＰＧＥ２は神経細胞に作用し、興奮毒性を発揮して神経細胞死を誘導する（非特許文献２）。アルツハイマー病患者の脳内ではＰＧＥ２が増加しており、ＰＧＥ２はアミロイドβペプチドをさらに増加させる（非特許文献３）。このため、ミクログリアによるＰＧＥ２の産生を抑制することは、アルツハイマー病の進行抑制に有効であると考えられる。【０００５】
また、ミクログリアが活性化すると、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）を産生する。ＴＮＦ−αは、神経細胞に作用して、細胞死を誘導する細胞内シグナル伝達経路を活性化したり、アミロイドβペプチドが誘導する神経細胞死を促進する。このため、ミクログリアによるＴＮＦ−α、ＩＬ−１βの産生を抑制することは、アルツハイマー病の進行抑制に有効であると考えられる。非特許文献４には、アミロイドβペプチドの存在下で活性化されたミクログリアが、ＴＮＦ−α等の液性因子を放出し、当該液性因子が神経細胞の細胞死を誘導することが開示されている。【０００６】
更に、アルツハイマー病の発生、進行に酸化ストレスが大きく関与していると考えられている。そのメカニズムとしては、神経細胞内に放出されるアミロイドβペプチドがミトコンドリアに蓄積し、酸化ストレスを引き起こして細胞死に至る経路などが考えられている（非特許文献５、６）。【０００７】
一方、ウコンには、多数の生理活性物質が含まれることが知られている。
例えば特許文献１には、ウコン由来のウコン油が、複数のビサボランセスキテルペノイドを含み、てんかん等の、アルツハイマー病を除く中枢神経系の障害における抗痙攣剤として使用できることが記載されている。【０００８】
特許文献２には、超臨界二酸化炭素による、クルクミノイドを含むウコン種抽出物を、アミロイド斑凝集又は原線維形成に罹患している被験体、特に、アルツハイマー病に罹患している被験体に投与することが記載されている。【０００９】
特許文献３には、ウコン種の根茎および葉の脂溶性抽出物が、神経脳血管障害の治療に有効であることが記載されている。特許文献３によれば、この神経脳血管障害はアルツハイマー病を含む疾患である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特表２０１４−５１８２４１号公報
【特許文献２】特表２００９−５３０３０５号公報
【特許文献３】特表２００５−５１６９３０号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】２０１０年３月  医療の俯瞰報告書〜認知症（特にアルツハイマー型認知症）について〜（https://www.jst.go.jp/crds/report/report05/CRDS-FY2009-WR-09.html）
【非特許文献２】神経化学Vol.55 (No.3), 2016, p42-51
【非特許文献３】実験医学 vol.29 No.10(増刊) ,2011 ,169(1647)-173(1651)
【非特許文献４】Clin Neurol 2014;54:1119-1121
【非特許文献５】YAKUGAKU ZASSHI 127(8) 1199-1205(2007)
【非特許文献６】Journal of Neurochemistry, 2006, 96, 1-13
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、ウコンに由来する成分を有効成分とする、アルツハイマー病の治療、予防又は改善、脳神経細胞死の抑制、アミロイドβペプチドで誘導されるミクログリアの活性化の抑制、或いは、アミロイドβペプチドで誘導されるＰＧＥ２、ＴＮＦ−α又はＩＬ−１β産生の抑制のための組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、マクロファージ細胞を、アミロイドβペプチドの凝集物の存在下で培養すると、ＰＧＥ２、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βの産生が促進されるのに対して、水溶性のウコン抽出物、並びに、該抽出物に含まれるターメロノールＡ及びターメロノールＢにより処理されたマクロファージ細胞では、アミロイドβペプチドの凝集物の存在下で培養したときのＰＧＥ２、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βの産生が抑制されること、水溶性のウコン抽出物及びターメロノールＢが、アミロイドβペプチド存在下のマクロファージ細胞の培養上清による、脳神経細胞のモデル細胞であるヒト神経芽腫細胞ＳＨＳＹ５Ｙの細胞死の誘導を抑制する作用を有すること、並びに、水溶性のウコン抽出物が、酸化ストレスが誘導するＳＨＳＹ５Ｙの細胞死を抑制する作用を有することを見出し、以下の本発明を完成するに至った。【００１４】
（１）水及び親水性有機溶媒からなる群から選択される少なくとも１種の抽出溶媒によるウコン抽出物を有効成分として含有する、アルツハイマー病の治療、予防又は改善用組成物。
（２）ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種を有効成分として含有する、アルツハイマー病の治療、予防又は改善用組成物。
（３）ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種を含有する、水及び親水性有機溶媒からなる群から選択される少なくとも１種の抽出溶媒によるウコン抽出物を有効成分として含有する、（２）に記載の組成物。
（４）水及び親水性有機溶媒からなる群から選択される少なくとも１種の抽出溶媒によるウコン抽出物を有効成分として含有する、脳神経細胞死の抑制用組成物。
（５）ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種を有効成分として含有する、脳神経細胞死の抑制用組成物。
（６）ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種を含有する、水及び親水性有機溶媒からなる群から選択される少なくとも１種の抽出溶媒によるウコン抽出物を有効成分として含有する、（５）に記載の組成物。
（７）水及び親水性有機溶媒からなる群から選択される少なくとも１種の抽出溶媒によるウコン抽出物を有効成分として含有する、アミロイドβペプチドで誘導されるミクログリアの活性化の抑制用組成物。
（８）ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種を有効成分として含有する、アミロイドβペプチドで誘導されるミクログリアの活性化の抑制用組成物。
（９）ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種を含有する、水及び親水性有機溶媒からなる群から選択される少なくとも１種の抽出溶媒によるウコン抽出物を有効成分として含有する、（８）に記載の組成物。
（１０）水及び親水性有機溶媒からなる群から選択される少なくとも１種の抽出溶媒によるウコン抽出物を有効成分として含有する、アミロイドβペプチドで誘導されるＰＧＥ２産生の抑制用組成物。
（１１）ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種を有効成分として含有する、アミロイドβペプチドで誘導されるＰＧＥ２産生の抑制用組成物。
（１２）ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種を含有する、水及び親水性有機溶媒からなる群から選択される少なくとも１種の抽出溶媒によるウコン抽出物を有効成分として含有する、（１１）に記載の組成物。
（１３）水及び親水性有機溶媒からなる群から選択される少なくとも１種の抽出溶媒によるウコン抽出物を有効成分として含有する、アミロイドβペプチドで誘導されるＴＮＦ−α産生の抑制用組成物。
（１４）ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種を有効成分として含有する、アミロイドβペプチドで誘導されるＴＮＦ−α産生の抑制用組成物。
（１５）ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種を含有する、水及び親水性有機溶媒からなる群から選択される少なくとも１種の抽出溶媒によるウコン抽出物を有効成分として含有する、（１４）に記載の組成物。
（１６）水及び親水性有機溶媒からなる群から選択される少なくとも１種の抽出溶媒によるウコン抽出物を有効成分として含有する、アミロイドβペプチドで誘導されるＩＬ−１β産生の抑制用組成物。
（１７）ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種を有効成分として含有する、アミロイドβペプチドで誘導されるＩＬ−１β産生の抑制用組成物。
（１８）ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種を含有する、水及び親水性有機溶媒からなる群から選択される少なくとも１種の抽出溶媒によるウコン抽出物を有効成分として含有する、（１７）に記載の組成物。【００１５】
（１９）アミロイドβペプチドで誘導されるミクログリアの活性化が、アミロイドβペプチドで誘導されるミクログリアによるＰＧＥ２、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βから選択される１以上の産生を含む、（７）、（８）又は（９）に記載の組成物。【００１６】
（２０）水及び親水性有機溶媒からなる群から選択される少なくとも１種の抽出溶媒によるウコン抽出物を有効成分として含有する、アミロイドβペプチドで誘導されるＰＧＥ２、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βから選択される１以上の産生の抑制用組成物。
（２１）ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種を有効成分として含有する、アミロイドβペプチドで誘導されるＰＧＥ２、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βから選択される１以上の産生の抑制用組成物。
（２２）ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種を含有する、水及び親水性有機溶媒からなる群から選択される少なくとも１種の抽出溶媒によるウコン抽出物を有効成分として含有する、（２１）に記載の組成物。【００１７】
（２３）水及び親水性有機溶媒からなる群から選択される少なくとも１種の抽出溶媒によるウコン抽出物の、アルツハイマー病の治療、予防又は改善用組成物の製造のための使用。
（２４）ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種の、アルツハイマー病の治療、予防又は改善用組成物の製造のための使用。
（２５）水及び親水性有機溶媒からなる群から選択される少なくとも１種の抽出溶媒によるウコン抽出物の、アルツハイマー病の治療、予防又は改善用医薬の製造のための使用。
（２６）ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種の、アルツハイマー病の治療、予防又は改善用医薬の製造のための使用。
（２７）水及び親水性有機溶媒からなる群から選択される少なくとも１種の抽出溶媒によるウコン抽出物を、アルツハイマー病の治療、予防又は改善を必要とする対象に投与すること、及び
前記対象においてアルツハイマー病を治療、予防又は改善すること
を含む、アルツハイマー病を治療、予防又は改善する方法。
（２８）ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種を、アルツハイマー病の治療、予防又は改善を必要とする対象に投与すること、及び
前記対象においてアルツハイマー病を治療、予防又は改善すること
を含む、アルツハイマー病を治療、予防又は改善する方法。
（２９）アルツハイマー病の治療、予防又は改善を必要とする対象において、アルツハイマー病を治療、予防又は改善するための、水及び親水性有機溶媒からなる群から選択される少なくとも１種の抽出溶媒によるウコン抽出物。
（３０）アルツハイマー病の治療、予防又は改善を必要とする対象において、アルツハイマー病を治療、予防又は改善するための、ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種。
（３１）前記ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種が、水及び親水性有機溶媒からなる群から選択される少なくとも１種の抽出溶媒によるウコン抽出物の形態である、（２４）に記載の使用、（２６）に記載の使用、（２８）に記載の方法、又は、（３０）に記載のターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種。【００１８】
（３２）水及び親水性有機溶媒からなる群から選択される少なくとも１種の抽出溶媒によるウコン抽出物の、脳神経細胞死の抑制用組成物の製造のための使用。
（３３）ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種の、脳神経細胞死の抑制用組成物の製造のための使用。
（３４）水及び親水性有機溶媒からなる群から選択される少なくとも１種の抽出溶媒によるウコン抽出物の、脳神経細胞死の抑制用医薬の製造のための使用。
（３５）ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種の、脳神経細胞死の抑制用医薬の製造のための使用。
（３６）水及び親水性有機溶媒からなる群から選択される少なくとも１種の抽出溶媒によるウコン抽出物を、脳神経細胞に、生体内又は生体外で投与すること、及び
前記脳神経細胞の細胞死を抑制すること
を含む、生体内又は生体外で脳神経細胞の細胞死を抑制する方法。
（３７）ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種を、脳神経細胞に、生体内又は生体外で投与すること、及び
前記脳神経細胞の細胞死を抑制すること
を含む、生体内又は生体外で脳神経細胞の細胞死を抑制する方法。
（３８）生体内又は生体外で脳神経細胞の細胞死を抑制するための、水及び親水性有機溶媒からなる群から選択される少なくとも１種の抽出溶媒によるウコン抽出物。
（３９）生体内又は生体外で脳神経細胞の細胞死を抑制するための、ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種。
（４０）前記ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種が、水及び親水性有機溶媒からなる群から選択される少なくとも１種の抽出溶媒によるウコン抽出物の形態である、（３３）に記載の使用、（３５）に記載の使用、（３７）に記載の方法、又は、（３９）に記載のターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種。【００１９】
（４１）水及び親水性有機溶媒からなる群から選択される少なくとも１種の抽出溶媒によるウコン抽出物の、アミロイドβペプチドで誘導されるミクログリアの活性化の抑制用組成物の製造のための使用。
（４２）ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種の、アミロイドβペプチドで誘導されるミクログリアの活性化の抑制用組成物の製造のための使用。
（４３）水及び親水性有機溶媒からなる群から選択される少なくとも１種の抽出溶媒によるウコン抽出物の、アミロイドβペプチドで誘導されるミクログリアの活性化の抑制用医薬の製造のための使用。
（４４）ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種の、アミロイドβペプチドで誘導されるミクログリアの活性化の抑制用医薬の製造のための使用。
（４５）水及び親水性有機溶媒からなる群から選択される少なくとも１種の抽出溶媒によるウコン抽出物を、ミクログリアに、生体内又は生体外で投与すること、及び
前記ミクログリアのアミロイドβペプチドで誘導される活性化を抑制すること
を含む、生体内又は生体外で、アミロイドβペプチドで誘導されるミクログリアの活性化を抑制する方法。
（４６）ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種を、ミクログリアに、生体内又は生体外で投与すること、及び
前記ミクログリアのアミロイドβペプチドで誘導される活性化を抑制すること
を含む、生体内又は生体外で、アミロイドβペプチドで誘導されるミクログリアの活性化を抑制する方法。
（４７）生体内又は生体外で、アミロイドβペプチドで誘導されるミクログリアの活性化を抑制するための、水及び親水性有機溶媒からなる群から選択される少なくとも１種の抽出溶媒によるウコン抽出物。
（４８）生体内又は生体外で、アミロイドβペプチドで誘導されるミクログリアの活性化を抑制するための、ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種。
（４９）前記ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種が、水及び親水性有機溶媒からなる群から選択される少なくとも１種の抽出溶媒によるウコン抽出物の形態である、（４２）に記載の使用、（４４）に記載の使用、（４６）に記載の方法、又は、（４８）に記載のターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種。
（５０）アミロイドβペプチドで誘導されるミクログリアの活性化が、アミロイドβペプチドで誘導されるミクログリアによるＰＧＥ２、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βから選択される１以上の産生を含む、（４１）、（４２）又は（４９）に記載の使用、（４３）、（４４）又は（４９）に記載の使用、（４５）、（４６）又は（４９）に記載の方法、或いは、（４７）、（４８）又は（４９）に記載のターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種。【００２０】
（５１）水及び親水性有機溶媒からなる群から選択される少なくとも１種の抽出溶媒によるウコン抽出物の、アミロイドβペプチドで誘導されるＰＧＥ２、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βから選択される１以上の産生の抑制用組成物の製造のための使用。
（５２）ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種の、アミロイドβペプチドで誘導されるＰＧＥ２、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βから選択される１以上の産生の抑制用組成物の製造のための使用。
（５３）水及び親水性有機溶媒からなる群から選択される少なくとも１種の抽出溶媒によるウコン抽出物の、アミロイドβペプチドで誘導されるＰＧＥ２、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βから選択される１以上の産生の抑制用医薬の製造のための使用。
（５４）ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種の、アミロイドβペプチドで誘導されるＰＧＥ２、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βから選択される１以上の産生の抑制用医薬の製造のための使用。
（５５）水及び親水性有機溶媒からなる群から選択される少なくとも１種の抽出溶媒によるウコン抽出物を、アミロイドβペプチドで誘導されるＰＧＥ２、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βから選択される１以上の産生の抑制を必要とする対象に投与すること、及び
前記対象において、アミロイドβペプチドで誘導されるＰＧＥ２、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βから選択される１以上の産生を抑制すること
を含む、アミロイドβペプチドで誘導されるＰＧＥ２、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βから選択される１以上の産生を抑制する方法。
（５６）ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種を、アミロイドβペプチドで誘導されるＰＧＥ２、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βから選択される１以上の産生の抑制を必要とする対象に投与すること、及び
前記対象において、アミロイドβペプチドで誘導されるＰＧＥ２、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βから選択される１以上の産生を抑制すること
を含む、アミロイドβペプチドで誘導されるＰＧＥ２、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βから選択される１以上の産生を抑制する方法。
（５７）アミロイドβペプチドで誘導されるＰＧＥ２、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βから選択される１以上の産生の抑制を必要とする対象において、アミロイドβペプチドで誘導されるＰＧＥ２、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βから選択される１以上の産生を抑制するための、水及び親水性有機溶媒からなる群から選択される少なくとも１種の抽出溶媒によるウコン抽出物。
（５８）アミロイドβペプチドで誘導されるＰＧＥ２、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βから選択される１以上の産生の抑制を必要とする対象において、アミロイドβペプチドで誘導されるＰＧＥ２、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βから選択される１以上の産生を抑制するための、ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種。
（５９）前記ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種が、水及び親水性有機溶媒からなる群から選択される少なくとも１種の抽出溶媒によるウコン抽出物の形態である、（５２）に記載の使用、（５４）に記載の使用、（５６）に記載の方法、又は、（５８）に記載のターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種。【００２１】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１８−１２４５０２号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【００２２】
水及び親水性有機溶媒からなる群から選択される少なくとも１種の抽出溶媒によるウコン抽出物、或いは、ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種を有効成分とする、アルツハイマー病の治療、予防又は改善、脳神経細胞死の抑制、アミロイドβペプチドで誘導されるミクログリアの活性化の抑制、或いは、アミロイドβペプチドで誘導されるＰＧＥ２、ＴＮＦ−α又はＩＬ−１β産生の抑制のための組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１には、ＴＨＰ−１細胞から分化したマクロファージ細胞が、アミロイドβペプチド凝集物の処理によって活性化し、ＰＧＥ２の産生が増加すること、並びに、５０〜２００μｇ／ｍＬのウコン抽出物、及び、１２．５〜１００μＭのターメロノールＡ、ターメロノールＢがＰＧＥ２の産生増加を抑制することが示されている。
【図２】図２には、ＴＨＰ−１細胞から分化したマクロファージ細胞が、アミロイドβペプチド凝集物の処理によって活性化し、ＴＮＦ−αの産生が増加すること、並びに、５０、１００μＭがＴＮＦ−αの産生増加を抑制することが示されている。
【図３】図３には、ＴＨＰ−１細胞から分化したマクロファージ細胞が、アミロイドβペプチド凝集物の処理によって活性化し、ＩＬ−１βの産生が増加すること、並びに、５０、１００μＭがＩＬ−１βの産生増加を抑制することが示されている。
【図４】図４の結果は、ＴＨＰ−１細胞から分化したマクロファージ細胞の、アミロイドβペプチド凝集物含有培地中での培養上清が、神経細胞死を誘導するのに対して、ウコン水抽出物又はターメロノールＢにより予め処理したマクロファージ細胞では、アミロイドβペプチド凝集物含有培地の培養上清がヒト神経芽腫細胞ＳＨＳＹ５Ｙの細胞死を誘導する作用が抑制されていることを示す。
【図５】図５の結果は、ヒト神経芽腫細胞ＳＨＳＹ５Ｙの、酸化ストレスによる細胞死が、ウコン水抽出物により抑制されることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
＜ウコン抽出物＞
本発明においてウコン抽出物とは、ショウガ科ウコン属の植物に由来する植物原料の抽出溶媒による抽出物（ウコンエキス）をいう。ウコン抽出物は、抽出溶媒による抽出により得られた溶媒抽出物に限らず、溶媒抽出物を更に、カラムクロマトグラフィ等で分画精製したものをも包含する。本発明で用いるウコン抽出物は、抽出操作（分画精製を行う場合は分画精製操作も含む）の完了した抽出液、抽出液から溶媒を部分的に除去した濃縮物、或いは、抽出液から溶媒を除去した乾燥物の形態であることができる。抽出物からの溶媒の除去は、加熱及び／又は減圧等により溶媒を揮発することにより行うことができる。これらの加熱、減圧の方法は特に限定されず、例えば従来公知の方法を使用することができる。
【００２５】
前記植物原料としては、ショウガ科ウコン属の植物であるＣｕｒｃｕｍａ  ｌｏｎｇａ（ウコン）、Ｃｕｒｃｕｍａ  ａｒｏｍａｔｉｃａ、Ｃｕｒｃｕｍａ  ｚｅｄｏａｒｉａ、Ｃｕｒｃｕｍａ  ｐｈａｅｏｃａｕｌｉｓ、Ｃｕｒｃｕｍａ  ｋｗａｎｇｓｉｅｎｓｉｓ、Ｃｕｒｃｕｍａ  ｗｅｎｙｕｊｉｎ、及び／又は、Ｃｕｒｃｕｍａ  ｘａｎｔｈｏｒｒｈｉｚａの根茎等が挙げられ、特に、Ｃｕｒｃｕｍａ  ｌｏｎｇａの根茎等が好適である。根茎は土中から採取したものを使用してよく、根茎の適当な部位を原型のまま、あるいは適当な寸法又は形状にカットしたもの、あるいは粉砕物の形態にしたものを使用することができる。これらの植物原料は適宜乾燥されたものであってよい。
【００２６】
抽出溶媒としては、水及び親水性有機溶媒からなる群から選択される少なくとも１種を用いることができる。水及び親水性有機溶媒からなる群から選択される少なくとも１種の抽出溶媒としては、水、親水性有機溶媒、水と親水性有機溶媒の混合溶媒のいずれであってもよい。親水性有機溶媒は複数種の親水性有機溶媒の混合溶媒であってもよい。「水」とは熱水も包含する。熱水としては例えば９５℃以上の熱水が使用できる。親水性有機溶媒としては少なくとも１種のアルコール（複数種のアルコールの混合溶媒であってもよい）が挙げられ、アルコールとしては、特に限定されないが、エタノールが好ましい。抽出溶媒としてアルコールと水との混合溶媒を用いる場合の混合比は特に限定されないが、例えば重量比で１０：９０〜９０：１０の範囲が好ましく、２０：８０〜５０：５０の範囲がより好ましい。
また、抽出溶媒として、超臨界二酸化炭素を用いることもできる。
【００２７】
植物原料からのウコン抽出物の抽出方法は特に限定されない。
本発明では、ウコン抽出物として、ターメロノールＡ及びターメロノールＢを含有する、前記抽出溶媒によるウコン抽出物を用いることが好ましい。
【００２８】
ターメロノールＡ及びターメロノールＢは、それぞれ、以下の平面構造を有する化合物である。
【００２９】
【化１】
2020004357.tif 000003
【００３０】
【化２】
2020004357.tif 000004
【００３１】
＜ターメロノールＡ及びターメロノールＢ＞
本発明で用いるターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種（以下「活性化合物」という場合がある）は植物に由来するものであってもよいし、人為的に合成されたものであってもよい。例えば光学活性の（＋）−ターメロノールＡは、Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９９３；５７（７）：１１３７−４０に記載の方法により合成することできる。
【００３２】
ウコン抽出物から分離される天然物において、ターメロノールＡ及びターメロノールＢは、２−メチル−２−ヘプテン−４−オンの部分構造における６位炭素の立体配置がＳ体であることが公知である。しかし、本発明においてターメロノールＡ及びターメロノールＢは上記の平面構造を有していればよく、前記立体配置がＳ体であってもよいし、Ｒ体であってもよいし、Ｓ体とＲ体との混合物であってもよい。
【００３３】
本発明で用いる活性化合物はより好ましくは植物原料に由来するものであり、より好ましくは、ショウガ科ウコン属植物に由来するものである。ショウガ科ウコン属植物及びその部位の具体例は上記の通りである。ショウガ科ウコン属の植物の根茎等の部位から活性化合物を得ることができる。
【００３４】
活性化合物は、それを含む植物原料から抽出することができる。抽出方法は既述の通りである。活性化合物は、植物抽出物、特に、水及び親水性有機溶媒からなる群から選択される少なくとも１種の抽出溶媒によるウコン抽出物の形態であってよい。
【００３５】
また、活性化合物を含む植物抽出物から、活性化合物を高純度化した画分を、本発明に使用してもよく、本発明の組成物に配合してもよい。例えば、活性化合物を含む植物抽出物を酢酸エチル／水の液液分配に供し、酢酸エチル画分に活性化合物を高純度化することができる。また、活性化合物を含む植物抽出物又はその画分を、クロマトグラフィによる精製処理に供して、高純度化した活性化合物を得ることもできる。クロマトグラフィとしては、逆相カラムクロマトグラフィ、順相薄層クロマトグラフィ等を使用することができる。
【００３６】
活性化合物を含む植物抽出物又はその画分は、常法により、乾燥、粉末化、顆粒化、溶液化等の加工を施したものであってもよい。
【００３７】
＜本発明の組成物＞
本発明の組成物の一態様は、前記ウコン抽出物、或いは、ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種を有効成分として含有する、アルツハイマー病の治療、予防又は改善用組成物に関する。本態様に係る本発明の組成物を、ヒト等の対象に投与することで、前記対象においてアルツハイマー病を治療、予防又は改善することができる。ここで、前記の各有効成分は、アルツハイマー病の治療、予防又は改善のための有効量で投与される。投与経路としては経口投与、経鼻投与、脳内投与又は髄腔内投与が好ましく、経口又は経鼻投与がより好ましく、経口投与が特に好ましい。本発明の組成物は、脳内で、アミロイドβペプチドにより活性化されたミクログリアによるＰＧＥ２、ＴＮＦ−α又はＩＬ−１βの産生、及び、これらの物質が関与する神経細胞死の誘導を抑制することで、アルツハイマー病を治療、予防又は改善することができる。
【００３８】
本発明の組成物の別の一態様は、前記ウコン抽出物、或いは、ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種を有効成分として含有する、アミロイドβペプチドで誘導されるミクログリアの活性化の抑制用組成物に関する。本態様に係る本発明の組成物を、ヒト等の対象に投与することで、前記対象においてアミロイドβペプチドで誘導されるミクログリアの活性化を抑制することができる。ここで、前記の各有効成分は、アミロイドβペプチドで誘導されるミクログリアの活性化を抑制するための有効量で投与される。投与経路としては経口投与、経鼻投与、脳内投与又は髄腔内投与が好ましく、経口又は経鼻投与がより好ましく、経口投与が特に好ましい。アルツハイマー病患者の脳内では、アミロイドβペプチドがミクログリアを活性化し、活性化されたミクログリアが、ＰＧＥ２、ＴＮＦ−α又はＩＬ−１βを産生し、脳神経細胞死を誘導すると推定されている。本発明の組成物によれば、アミロイドβペプチドがミクログリアを活性化することを抑制することができる。
【００３９】
本発明の組成物の別の一態様は、前記ウコン抽出物、或いは、ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種を有効成分として含有する、脳神経細胞死の抑制用組成物に関する。アミロイドβペプチド存在下で培養したマクロファージ細胞の培養上清が、脳神経細胞または中枢神経細胞のモデル細胞であるヒト神経芽腫細胞ＳＨＳＹ５Ｙの細胞死を誘導するのに対して、マクロファージ細胞を予め前記ウコン抽出物又はターメロノールＢにより処理した後にアミロイドβペプチド存在下で培養したマクロファージ細胞の培養上清は、ヒト神経芽腫細胞ＳＨＳＹ５Ｙの細胞死を誘導する作用が抑制されていることを本発明者らは見出した。また、前記ウコン抽出物が、酸化ストレスが誘導するＳＨＳＹ５Ｙの細胞死を抑制する作用を有することを本発明者らは見出した。これらの知見から、前記ウコン抽出物、或いは、ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種が、脳神経細胞又は中枢神経細胞の、酸化ストレスによる細胞死又はアミロイドβペプチドにより活性化されたミクログリアによる細胞死を抑制する作用を有することが裏付けられる。本態様に係る本発明の組成物を、ヒト等の対象に投与することで、前記対象において脳神経細胞又は中枢神経細胞の細胞死、特に、アミロイドβペプチドにより活性化されたミクログリアが産生するＰＧＥ２、ＴＮＦ−α又はＩＬ−１βが関与する脳神経細胞又は中枢神経細胞の細胞死、或いは、酸化ストレスが関与する脳神経細胞又は中枢神経細胞の細胞死を抑制することができる。ここで、前記の各有効成分は、脳神経細胞死又は中枢神経細胞死を抑制するための有効量で投与される。投与経路としては経口投与、経鼻投与、脳内投与又は髄腔内投与が好ましく、経口又は経鼻投与がより好ましく、経口投与が特に好ましい。
【００４０】
本発明の組成物の別の一態様は、前記ウコン抽出物、或いは、ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種を有効成分として含有する、アミロイドβペプチドで誘導されるＰＧＥ２、ＴＮＦ−α又はＩＬ−１βの産生の抑制用組成物に関する。本態様に係る本発明の組成物を、ヒト等の対象に投与することで、前記対象においてアミロイドβペプチドで誘導されるＰＧＥ２、ＴＮＦ−α又はＩＬ−１βの産生、特に、アミロイドβペプチドで活性化されたミクログリアによるＰＧＥ２、ＴＮＦ−α又はＩＬ−１βの産生を抑制することができる。ここで、前記の各有効成分は、アミロイドβペプチドで誘導されるＰＧＥ２、ＴＮＦ−α又はＩＬ−１βの産生を抑制するための有効量で投与される。投与経路としては経口投与、経鼻投与、脳内投与又は髄腔内投与が好ましく、経口又は経鼻投与がより好ましく、経口投与が特に好ましい。
【００４１】
本発明の組成物は、医薬品、飲食品、飼料、食品添加剤、飼料添加剤等の各形態の組成物であってよく、医薬品又は飲食品であることがより好ましい。飲食品は、機能性表示食品、特定保健用食品、栄養補給のためのサプリメント等の形態のものも包含する。本発明の組成物は、好ましくは、経口又は経鼻により摂取又は投与される組成物の形態であり、より好ましくは、経口により摂取又は投与される組成物の形態である。
【００４２】
有効成分として前記ウコン抽出物を含む実施形態に係る本発明の組成物での前記ウコン抽出物の含有量は、本発明の組成物の１日の摂取または投与量当たり、好ましくはヒト１人、特に成人１人に対する１日の摂取又は投与量当たり、前記ウコン抽出物をターメロノールＡとして８０μｇ以上かつターメロノールＢとして２０μｇ以上となるように含有することが、アルツハイマー病の治療、予防又は改善作用、脳神経細胞死の抑制作用、アミロイドβペプチドで誘導されるミクログリアの活性化の抑制作用、及び、アミロイドβペプチドで誘導されるＰＧＥ２、ＴＮＦ−α又はＩＬ−１β産生の抑制作用を効果的に得る点で好ましい。ここで「１日の摂取又は投与量」とは経口又は経鼻による、好ましくは経口による、摂取又は投与の場合に、典型的には、本発明の組成物の量として０．１ｇ〜５００ｇである。本発明の組成物は、継続的に摂取又は投与してもよいし、必要時に摂取又は投与して用いてもよい。
【００４３】
有効成分として前記ウコン抽出物を含む実施形態に係る本発明の組成物は、前記ウコン抽出物自体であってもよいし、前記ウコン抽出物と、少なくとも１種の他の成分とを含む組成物であってもよい。本発明の組成物が、前記ウコン抽出物と、少なくとも１種の他の成分とを含む場合、前記ウコン抽出物と、少なくとも１種の他の成分とを混合した組成物であってもよいし、前記ウコン抽出物と、少なくとも１種の他の成分とを適当な手段で製剤化した組成物であってもよいし、前記ウコン抽出物と、少なくとも１種の他の成分との製剤化した組成物を、更に他の成分と混合した組成物であってもよい。
【００４４】
有効成分としてターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種を含む実施形態に係る本発明の組成物は、１日の摂取または投与量当たり、好ましくはヒト１人、特に成人１人に対する１日の摂取又は投与量当たり、ターメロノールＡ及びターメロノールＢの合計量として１００μｇ以上となるように、ターメロノールＡ及びターメロノールＢから選択される少なくとも１種を含有する。有効成分としてターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種を含む実施形態に係る本発明の組成物はまた、１日の摂取または投与量当たり、好ましくはヒト１人、特に成人１人に対する１日の摂取又は投与量当たり、ターメロノールＡが８０μｇ以上、及び／又は、ターメロノールＢが２０μｇ以上となるように、より好ましくは、ターメロノールＡが８０μｇ以上、及び、ターメロノールＢが２０μｇ以上となるように、ターメロノールＡ及びターメロノールＢから選択される少なくとも１種を含有する。これらの実施形態によれば、アルツハイマー病の治療、予防又は改善作用、脳神経細胞死の抑制作用、アミロイドβペプチドで誘導されるミクログリアの活性化の抑制作用、及び、アミロイドβペプチドで誘導されるＰＧＥ２、ＴＮＦ−α又はＩＬ−１β産生の抑制作用を効果的に得ることができる。ここで「１日の摂取又は投与量」とは経口又は経鼻による、好ましくは経口による、摂取又は投与の場合に、典型的には、本発明の組成物の量として０．１ｇ〜５００ｇである。本発明の組成物は、継続的に摂取又は投与してもよいし、必要時に摂取又は投与して用いてもよい。
【００４５】
有効成分としてターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種を含む実施形態に係る本発明の組成物は、ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種の化合物自体であってもよいし、前記化合物と、少なくとも１種の他の成分とを含むものであってもよい。本発明の組成物が、前記化合物と、少なくとも１種の他の成分とを含む場合、前記化合物と、少なくとも１種の他の成分とを混合した組成物であってもよいし、前記化合物と、少なくとも１種の他の成分とを適当な手段で製剤化した組成物であってもよいし、前記化合物と、少なくとも１種の他の成分との製剤化した組成物を、更に他の成分と混合した組成物であってもよい。
【００４６】
本発明の組成物の形状は、特に限定されず、例えば、液体状、流動状、ゲル状、半固形状、又は固形状などの何れの形状であってもよい。
【００４７】
本発明の組成物が含み得る、少なくとも１種の他の成分としては、特に限定されないが、好ましくは、医薬品、飲食品、飼料、食品添加剤、飼料添加剤等の最終的な形態において許容される成分であって、経口摂取可能な成分が例示できる。
【００４８】
このような他の成分としては例えば、甘味料、酸味料、ビタミン類、ミネラル類、増粘剤、乳化剤、酸化防止剤、水等が挙げられる。また、必要により、色素、香料、保存料、防腐剤、防かび剤、更なる生理活性物質等を添加してもよい。
【００４９】
甘味料としては、ブドウ糖、果糖、ショ糖、乳糖、麦芽糖、パラチノース、トレハロース、キシロース等の単糖や二糖、異性化糖（ブドウ糖果糖液糖、果糖ブドウ糖液糖、砂糖混合異性化糖等）、糖アルコール（エリスリトール、キシリトール、ラクチトール、パラチニット、ソルビトール、還元水飴等）、はちみつ、高甘味度甘味料（スクラロース、アセスルファムカリウム、ソーマチン、ステビア、アスパルテーム等）等が挙げられる。
【００５０】
酸味料としては、クエン酸、リンゴ酸、グルコン酸、酒石酸、乳酸、リン酸、又はこれらの塩等があり、これらのうちの１種又は２種以上を利用することができる。
【００５１】
ビタミン類としては、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＥ、ナイアシン、イノシトール等が挙げられる。
【００５２】
ミネラル類としては、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、鉄等が挙げられる。
【００５３】
増粘剤としては、カラギーナン、ジェランガム、キサンタンガム、アラビアガム、タマリンドガム、グアーガム、ローカストビーンガム、カラヤガム、寒天、ゼラチン、ペクチン、大豆多糖類、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）等が挙げられる。
【００５４】
乳化剤としては、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、レシチン、植物性ステロール、サポニン等が挙げられる。
【００５５】
酸化防止剤としては、ビタミンＣ、トコフェロール（ビタミンＥ）、酵素処理ルチン等が挙げられる。
前記他の成分は、それぞれ当業者が飲食品、医薬品等の組成物に通常採用する範囲内の量で適宜配合することができる。
【００５６】
本発明の組成物と、少なくとも１種の他の成分とを適当な手段で製剤化した組成物の形態は、粉末、顆粒、カプセル剤、錠剤（糖衣錠等のコーティング錠又は多層錠、口中崩壊剤、チュアブル錠等を含む）等の固形組成物の形態であってもよいし、溶液剤等の液体組成物の形態であってもよい。
【００５７】
＜アルツハイマー病を治療、予防又は改善する方法＞
本発明の更なる一態様は、前記ウコン抽出物、或いは、ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種を、アルツハイマー病の治療、予防又は改善を必要とする対象に投与すること、及び
前記対象においてアルツハイマー病を治療、予防又は改善すること
を含む、アルツハイマー病を治療、予防又は改善する方法に関する。
【００５８】
本態様に係る方法で用いる前記ウコン抽出物、或いは、ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種は、本発明の組成物の上述した形態であることができる。
【００５９】
本態様に係る方法での対象としては、典型的にはヒトであるが、ヒト以外の哺乳動物であってもよい。
【００６０】
本態様に係る方法において、投与経路としては経口投与、経鼻投与、脳内投与又は髄腔内投与が好ましく、経口又は経鼻投与がより好ましく、経口投与が特に好ましい。
【００６１】
本態様に係る方法において、前記ウコン抽出物、或いは、ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種を、対象に投与する投与量は、アルツハイマー病の治療、予防又は改善のための有効量であれば良く特に限定されない。例えば、対象が成人である場合、前記ウコン抽出物、或いは、ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種を、成人１人に対し１日あたり、好ましくは、ターメロノールＡ及びターメロノールＢの合計量として１００μｇ以上となるように、より好ましくは、ターメロノールＡが８０μｇ以上、及び／又は、ターメロノールＢが２０μｇ以上となるように、特に好ましくは、ターメロノールＡが８０μｇ以上、及び、ターメロノールＢが２０μｇ以上となるように投与することが好ましい。
【００６２】
＜脳神経細胞の細胞死を抑制する方法＞
本発明の更なる一態様は、前記ウコン抽出物、或いは、ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種を、脳神経細胞に、生体内又は生体外で投与すること、及び
前記脳神経細胞の細胞死を抑制すること
を含む、生体内又は生体外で脳神経細胞の細胞死を抑制する方法に関する。
【００６３】
本態様に係る方法で用いる前記ウコン抽出物、或いは、ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種は、本発明の組成物の上述した形態であることができる。
【００６４】
本態様に係る方法で用いる脳神経細胞の起源生物は、典型的にはヒトであるが、ヒト以外の哺乳動物、例えばラット、マウス、ウシ等であってもよい。
【００６５】
脳神経細胞は、脳神経細胞又は中枢神経細胞に由来する細胞株であってもよく、例えば、ヒト神経芽腫細胞ＳＨＳＹ５Ｙであってもよい。
【００６６】
本態様に係る方法において、前記ウコン抽出物、或いは、ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種を、脳神経細胞に生体外で投与する方法としては、脳神経細胞を培養する培地中に、適当な濃度の前記ウコン抽出物、或いは、ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種を添加する方法が挙げられる。前記培地中への添加濃度は特に限定されないが、前記ウコン抽出物を投与する場合、好ましくは１０μｇ／ｍＬ以上、より好ましくは２０μｇ／ｍＬ以上、特に好ましくは５０μｇ／ｍＬ以上であることができ、好ましくは１，０００μｇ／ｍＬ以下、より好ましくは５００μｇ／ｍＬ以下であることができる。ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種を投与する場合、ターメロノールＡ及びターメロノールＢの合計の添加濃度が好ましくは１μＭ以上、より好ましくは１０μＭ以上、特に好ましくは２０μＭ以上、最も好ましくは５０μＭ以上であることができ、好ましくは１，０００μＭ以下、より好ましくは５００μＭ以下、特に好ましくは２００μＭ以下であることができる。
【００６７】
本態様に係る方法において、前記ウコン抽出物、或いは、ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種を、脳神経細胞に生体内で投与する方法として、生体内の脳神経細胞に送達できる方法であれば特に限定されないが、例えば、経口投与、経鼻投与、脳内投与又は髄腔内投与が好ましく、経口又は経鼻投与がより好ましく、経口投与が特に好ましい。生体内の脳神経細胞に投与する場合、投与量は、脳神経細胞の細胞死を抑制できる有効量であれば良く特に限定されない。例えば、成人に投与する場合、前記ウコン抽出物、或いは、ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種を、成人１人に対し１日あたり、好ましくは、ターメロノールＡ及びターメロノールＢの合計量として１００μｇ以上となるように、より好ましくは、ターメロノールＡが８０μｇ以上、及び／又は、ターメロノールＢが２０μｇ以上となるように、特に好ましくは、ターメロノールＡが８０μｇ以上、及び、ターメロノールＢが２０μｇ以上となるように投与することが好ましい。
【００６８】
本態様に係る方法では、前記ウコン抽出物、或いは、ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種を、生体内又は生体外で脳神経細胞に投与したのち、適当な時間、例えば５時間以上、好ましくは１２時間以上、より好ましくは２０時間以上、特に好ましくは２４時間以上、好ましくは７２時間以下、より好ましくは４８時間以下、特に好ましくは３６時間以下の時間、前記ウコン抽出物、或いは、ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種と脳神経細胞との接触状態を維持することにより、前記脳神経細胞の細胞死を抑制することができる。
【００６９】
＜アミロイドβペプチドで誘導されるミクログリアの活性化を抑制する方法＞
本発明の更なる一態様は、前記ウコン抽出物、或いは、ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種を、ミクログリアに、生体内又は生体外で投与すること、及び
前記ミクログリアのアミロイドβペプチドで誘導される活性化を抑制すること
を含む、生体内又は生体外で、アミロイドβペプチドで誘導されるミクログリアの活性化を抑制する方法に関する。
【００７０】
本態様に係る方法で用いるミクログリアの起源生物は、典型的にはヒトであるが、ヒト以外の哺乳動物、例えばラット、マウス、ウシ等であってもよい。
【００７１】
ミクログリアは、ミクログリアと同等の機能を有する細胞であってもよく、例えば、単球から分化したマクロファージ細胞であってもよい。
【００７２】
本態様に係る方法において、前記ウコン抽出物、或いは、ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種を、ミクログリアに生体外で投与する方法としては、ミクログリアを培養する培地中に、適当な濃度の前記ウコン抽出物、或いは、ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種を添加する方法が挙げられる。前記培地中への添加濃度は特に限定されないが、前記ウコン抽出物を投与する場合、好ましくは１０μｇ／ｍＬ以上、より好ましくは２０μｇ／ｍＬ以上、特に好ましくは５０μｇ／ｍＬ以上であることができ、好ましくは１，０００μｇ／ｍＬ以下、より好ましくは５００μｇ／ｍＬ以下であることができる。ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種を投与する場合、ターメロノールＡ及びターメロノールＢの合計の添加濃度が好ましくは１μＭ以上、より好ましくは１０μＭ以上、特に好ましくは２０μＭ以上、最も好ましくは５０μＭ以上であることができ、好ましくは１，０００μＭ以下、より好ましくは５００μＭ以下、特に好ましくは２００μＭ以下であることができる。
【００７３】
本態様に係る方法において、前記ウコン抽出物、或いは、ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種を、ミクログリアに生体内で投与する方法として、生体内のミクログリアに送達できる方法であれば特に限定されないが、例えば、経口投与、経鼻投与、脳内投与又は髄腔内投与が好ましく、経口又は経鼻投与がより好ましく、経口投与が特に好ましい。生体内のミクログリアに投与する場合、投与量は、ミクログリアのアミロイドβペプチドに誘導される活性化を抑制できる有効量であれば良く特に限定されない。例えば、成人に投与する場合、前記ウコン抽出物、或いは、ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種を、成人１人に対し１日あたり、好ましくは、ターメロノールＡ及びターメロノールＢの合計量として１００μｇ以上となるように、より好ましくは、ターメロノールＡが８０μｇ以上、及び／又は、ターメロノールＢが２０μｇ以上となるように、特に好ましくは、ターメロノールＡが８０μｇ以上、及び、ターメロノールＢが２０μｇ以上となるように投与することが好ましい。
【００７４】
本態様に係る方法では、前記ウコン抽出物、或いは、ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種を、生体内又は生体外でミクログリアに投与したのち、適当な時間、例えば５時間以上、好ましくは１２時間以上、より好ましくは２０時間以上、特に好ましくは２４時間以上、好ましくは７２時間以下、より好ましくは４８時間以下、特に好ましくは３６時間以下の時間、前記ウコン抽出物、或いは、ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種とミクログリアとの接触状態を維持することにより、前記ミクログリアのアミロイドβペプチドで誘導される活性化を抑制することができる。
【００７５】
アミロイドβペプチドは、典型的には、ミクログリアと同じ生物種に由来するアミロイドβペプチドである。
【００７６】
「ミクログリアのアミロイドβペプチドで誘導される活性化」とは、例えば、アミロイドβペプチドで誘導されるミクログリアからのＰＧＥ２、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βから選択される１以上の産生であり、本態様ではこれらの物質の産生を抑制することができる。
【００７７】
＜アミロイドβペプチドで誘導されるＰＧＥ２、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βから選択される１以上の産生を抑制する方法＞
本発明の更なる一態様は、前記ウコン抽出物、或いは、ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種を、アミロイドβペプチドで誘導されるＰＧＥ２、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βから選択される１以上の産生の抑制を必要とする対象に投与すること、及び
前記対象において、アミロイドβペプチドで誘導されるＰＧＥ２、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βから選択される１以上の産生を抑制すること
を含む、アミロイドβペプチドで誘導されるＰＧＥ２、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βから選択される１以上の産生を抑制する方法に関する。
【００７８】
本態様に係る方法で用いる前記ウコン抽出物、或いは、ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種は、本発明の組成物の上述した形態であることができる。
【００７９】
本態様に係る方法での対象としては、典型的にはヒトであるが、ヒト以外の哺乳動物であってもよい。
【００８０】
本態様に係る方法において、投与経路として経口投与、経鼻投与、脳内投与又は髄腔内投与が好ましく、経口又は経鼻投与がより好ましく、経口投与が特に好ましい。
【００８１】
本態様に係る方法において、前記ウコン抽出物、或いは、ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種を、対象に投与する投与量は、アミロイドβペプチドで誘導されるＰＧＥ２、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βから選択される１以上の産生を抑制するための有効量であれば良く特に限定されない。例えば、対象が成人である場合、前記ウコン抽出物、或いは、ターメロノールＡ及びターメロノールＢの少なくとも１種を、成人１人に対し１日あたり、好ましくは、ターメロノールＡ及びターメロノールＢの合計量として１００μｇ以上となるように、より好ましくは、ターメロノールＡが８０μｇ以上、及び／又は、ターメロノールＢが２０μｇ以上となるように、特に好ましくは、ターメロノールＡが８０μｇ以上、及び、ターメロノールＢが２０μｇ以上となるように投与することが好ましい。
【実施例】
【００８２】
＜１．実験１＞
１．１．ウコン抽出物の作製方法
ウコン抽出物は、ウコン（Ｃｕｒｃｕｍａ  ｌｏｎｇａ）の根茎部分を水にて抽出し、得られた抽出液を減圧加熱乾燥して水分を除去することにより調製した。ウコン抽出物中のターメロノールＡ及びターメロノールＢの量を、後述する手順によりＬＣ／ＭＳを用いて測定した。ウコン抽出物中のターメロノールＡの量は１８９μｇ／ｇ、ターメロノールＢの量は２４μｇ／ｇであることを確認した。【００８３】
１．２．ターメロノールＡ及びターメロノールＢの分析
ウコン抽出物を秤量し、水と酢酸エチルを加え、遠心分離して得られた上清を活性炭カラムに通した後、窒素濃縮し、アセトニトリルに溶解した。得られた液を測定試料として、ＬＣ／ＭＳ分析に供した。ＬＣ／ＭＳ分析は以下の条件で行った。【００８４】
分析装置：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＬＣＭＳ（Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｖｅｌｏｓ  Ｐｒｏ）
流速：０．５ｍＬ／分
移動相：アセトニトリル、０．１％ギ酸水溶液
送液グラジエント：
【表１】
2020004357.tif 000005
使用カラム：ＵＮＩＳＯＮ  ＵＫ−Ｃ１８（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ、３μｍ）
カラム温度：３０℃【００８５】
１．３．ターメロノールＡ及びターメロノールＢの入手
ターメロノールＡ及びターメロノールＢは、長良サイエンス株式会社の市販品を購入し、ジメチルスルホキシドに溶解して試験に用いた。【００８６】
１．４．アミロイドβが誘導するマクロファージ細胞の活性化を抑制する作用の評価
ヒト単球細胞株ＴＨＰ−１をＲＰＭＩ１６４０（１０％ＦＢＳ）培地に懸濁し、８．０×１０４セル数になるように９６穴プレートに播種して１００ｎＭの１２−Ｏ−Ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌｐｈｏｒｂｏｌ  １３−ａｃｅｔａｔｅ（ＰＭＡ，分化誘導因子）を添加し、５％ＣＯ２下で２４時間培養して細胞をマクロファージ細胞に分化させた。その後、ウコン抽出物（５０，１００，２００μｇ／ｍＬ）、ターメロノールＡ（１２．５，２５，５０，１００μＭ）、ターメロノールＢ（１２．５，２５，５０，１００μＭ）のいずれかを含むＲＰＭＩ１６４０（１０％ＦＢＳ）培地に交換し、５％ＣＯ２下で２４時間培養して各検体で細胞を処理した。その後、２５μＭのアミロイドβペプチドの凝集物（Ａβ）を含むＲＰＭＩ１６４０（２％ＦＢＳ）培地に交換し、５％ＣＯ２下で２４時間培養して細胞を活性化させた。その後、ＥＬＩＳＡ法を用いて培地に放出されたプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）を測定した。【００８７】
図１には、Ａβの処理によってＴＨＰ−１細胞から分化したマクロファージ細胞が活性化しＰＧＥ２の産生が増加すること、および５０〜２００μｇ／ｍＬのウコン抽出物、１２．５〜１００μＭのターメロノールＡ、ＢがＰＧＥ２の産生増加を抑制することが示されている。図２には、Ａβの処理によってＴＨＰ−１細胞から分化したマクロファージ細胞が活性化しＴＮＦ−αの産生が増加すること、および５０、１００μＭのターメロノールＡ、ＢがＴＮＦ−αの産生増加を抑制することが示されている。図３には、Ａβの処理によってＴＨＰ−１細胞から分化したマクロファージ細胞が活性化しＩＬ−１βの産生が増加すること、および５０、１００μＭのターメロノールＡ、ＢがＩＬ−１βの産生増加を抑制することが示されている。【００８８】
なお、マクロファージ細胞は、発現するマーカー等から、ミクログリアとほぼ同じとみなすことができ、イン・ビトロの試験でミクログリアの代替として用いられる（Frontiers in Pharmacology/Neuropharmacology, E. Solito et al, 2012-2|Volume3|Article14、International Journal of Alzheimer’s Disease, Volume 2012, Article ID 314185, 11 pages等）。アルツハイマー病患者では、Ａβにより活性化されたミクログリアが、ＰＧＥ２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β等を産生し、脳神経細胞死を誘導していると推定される。このため、Ａβにより活性化されたマクロファージ細胞によるＰＧＥ２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１βの産生を、ウコン抽出物、ターメロノールＡ及びターメロノールＢが抑制するという上記の実験結果は、ウコン抽出物、ターメロノールＡ及びターメロノールＢが、アルツハイマー病患者において、Ａβにより活性化されたミクログリアによる、ＰＧＥ２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１βの産生、及び、脳神経細胞死の誘導を抑制することを裏付ける。【００８９】
＜２．実験２＞
２．１．方法
ヒト単球細胞株ＴＨＰ−１をＲＰＭＩ１６４０（１０％ＦＢＳ）培地に懸濁し、８．０×１０４セル数になるように９６穴プレートに播種して１００ｎＭの１２−Ｏ−Ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌｐｈｏｒｂｏｌ  １３−ａｃｅｔａｔｅ（ＰＭＡ，分化誘導因子）を添加し、５％ＣＯ２下で２４時間培養して細胞をマクロファージ細胞に分化させた。その後、実験１で使用したのと同じウコン抽出物（１００μｇ／ｍＬ）、ターメロノールＢ（５０μＭ）（長良サイエンス株式会社）のいずれかを含むＲＰＭＩ１６４０（１０％ＦＢＳ）培地に交換し、５％ＣＯ２下で２４時間培養して、各濃度のウコン抽出物又はターメロノールＢにより細胞を処理した。その後、２５μＭのアミロイドβ（Ａβ）ペプチドの凝集物を含むＲＰＭＩ１６４０（２％ＦＢＳ）培地に交換し、５％ＣＯ２下で１２時間培養してマクロファージ細胞を活性化させた。その培養上清を回収し、調製培地とした。別途、ヒト神経芽腫細胞ＳＨＳＹ５ＹをＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）培地に懸濁し、３×１０４セル数になるように９６穴プレートに播種して５％ＣＯ２下で２４時間培養した。その後、ヒト神経芽腫細胞の培地を前記調製培地に交換し、５％ＣＯ２下で４８時間培養して前記調製培地で細胞を処理した。その後、ＷＳＴ−１アッセイを用いて細胞活性を測定した。【００９０】
ＷＳＴ−１アッセイは、ＷＳＴ−１（２−（４−インドフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム，モノソジウム塩；同仁化学研究所製）を、細胞を含む各ウェルに添加し、炭酸ガス培養器内にて所定時間培養して生細胞のミトコンドリアの脱水素酵素によりＷＳＴ−１から水溶性ホルマザンを生成させ、生成したホルマザン濃度を測定することを含む。生成したホルマザン濃度は、細胞活性の指標である。ホルマザン濃度は、マイクロプレートリーダーにて測定波長４５０ｎｍの吸光度により測定した（参照波長６３０ｎｍ）。【００９１】
対照試験の手順は以下の通りである。ＴＨＰ−１から分化させた前記マクロファージ細胞を、ウコン抽出物及びターメロノールＢを含まないＲＰＭＩ１６４０（１０％ＦＢＳ）培地中で５％ＣＯ２下２４時間培養し、その後、２５μＭのアミロイドβ（Ａβ）ペプチドの凝集物を含むＲＰＭＩ１６４０（２％ＦＢＳ）培地（Ａβ＋）、或いは、前記凝集物を含まないＲＰＭＩ１６４０（２％ＦＢＳ）培地（Ａβ−）に交換し、５％ＣＯ２下で１２時間培養し、その培養上清を回収した。回収した培養上清を、前記調製培地の代わりに、ヒト神経芽腫細胞の処理に使用した。【００９２】
２．２．結果
結果を図４に示す。縦軸はアッセイの結果得られた吸光度であり、細胞活性を示す。【００９３】
対照試験（Ａβ＋）では、前記マクロファージ細胞にアミロイドβペプチドを添加し、一定時間培養した後、その培養上清を回収してＳＨＳＹ５Ｙに添加すると、細胞死が誘導された。一方アミロイドβペプチドを用いない対照試験（Ａβ−）では、細胞死が誘導されなかった。このことから、アミロイドβペプチドを添加した培地中で培養したマクロファージ細胞は培養上清に液性因子を放出しており、当該液性因子が脳神経細胞の細胞死を誘導していることが推測された。【００９４】
これに対して、ウコン抽出物又はターメロノールＢにより予め処理したマクロファージ細胞では、アミロイドβペプチド存在下での培養上清が脳神経細胞の細胞死を誘導する作用が、対照試験（Ａβ＋）よりも抑制された。このことは、ウコン抽出物及びターメロノールＢが、アミロイドβペプチド存在下のマクロファージ細胞による前記液性因子の放出を抑制することを示す。【００９５】
＜３．実験３＞
３．１．方法
脳神経細胞を過酸化水素Ｈ２Ｏ２で処理すると酸化ストレスが生じ細胞死が生じることが知られている。以下の実験では、実験１で調製したウコン抽出物の、酸化ストレスによる脳神経細胞の細胞死を抑制する作用を確認した。【００９６】
ヒト神経芽腫細胞ＳＨＳＹ５ＹをＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）培地に懸濁し、３×１０４セル数になるように９６穴プレートに播種して５％ＣＯ２下で２４時間培養した。その後、実験１に記載のウコン抽出物（２５，５０，１００，２００μｇ／ｍＬ）を含むＤＭＥＭ（ＦＢＳ  Ｆｒｅｅ）培地に交換し、５％ＣＯ２下で２４時間培養し、各濃度のウコン抽出物により細胞を処理した。その後、６０μＭのＨ２Ｏ２を含むＤＭＥＭ（ＦＢＳ  Ｆｒｅｅ）培地に交換し、５％ＣＯ２下で２４時間培養して細胞を刺激した。その後、実験２と同様にＷＳＴ−１アッセイを用いて細胞活性を測定した。【００９７】
対照試験（Ｈ２Ｏ２＋）では、上記の所定濃度のウコン抽出物を含むＤＭＥＭ（ＦＢＳ  Ｆｒｅｅ）培地に代えて、ウコン抽出物を含まないＤＭＥＭ（ＦＢＳ  Ｆｒｅｅ）培地を用いた以外は上記と同様の操作を行った。対照試験（Ｈ２Ｏ２−）では、上記の所定濃度のウコン抽出物を含むＤＭＥＭ（ＦＢＳ  Ｆｒｅｅ）培地に代えて、ウコン抽出物を含まないＤＭＥＭ（ＦＢＳ  Ｆｒｅｅ）培地を用い、且つ、上記の６０μＭのＨ２Ｏ２を含むＤＭＥＭ（ＦＢＳ  Ｆｒｅｅ）培地に代えて、Ｈ２Ｏ２を含まないＤＭＥＭ（ＦＢＳ  Ｆｒｅｅ）培地を用いた以外は上記と同様の操作を行った。【００９８】
３．２．結果
結果を図５に示す。縦軸はアッセイの結果得られた吸光度であり、細胞活性を示す。エラーバーは標準偏差を示す。
対照（Ｈ２Ｏ２＋）に対してスチューデントのＴ検定を行い、有意差を確認した。＊＊：ｐ＜０．０１、＊：ｐ＜０．０５。【００９９】
この結果は、ヒト神経芽腫細胞ＳＨＳＹ５Ｙの、酸化ストレスによる細胞死が、実験１で調製したウコン抽出物により抑制されることを示す。【０１００】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１】
2020004357.tif 000006
【図２】
2020004357.tif 000007
【図３】
2020004357.tif 000008
【図４】
2020004357.tif 000009
【図５】
2020004357.tif 000010
【国際調査報告】
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