(57)【要約】  本発明は、サンプル内でブラウン運動する粒子のサイズ分布を定量的に計測することができる光計測技術を提供することを目的とする。本発明に係るサイズ分布計測装置は、計測光の光軸方向に沿って焦点位置を走査しながら反射光強度を計測し、そのなかで最も大きい反射光強度にしたがって粒子のサイズ分布を算出する（図９参照）。
2020144754.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子を含む液体のサンプルにおける前記粒子のサイズ分布を計測するサイズ分布計測装置であって、
光を出射する光源、
前記光の光軸方向に沿って前記光の焦点位置を走査する走査部、
前記サンプルから反射された前記光の強度を検出する検出部、
前記強度を用いて前記粒子のサイズを算出する演算部、
を備え、
前記走査部は、前記サンプルのなかで前記粒子が前記光軸方向に移動する過程において前記粒子の前記光軸方向におけるそれぞれ異なる位置から前記光が反射するように前記光の焦点位置を走査し、
前記演算部は、前記光軸方向に沿った前記光の焦点位置ごとの前記光の強度のうち最も大きい最大光強度を用いて、前記粒子のサイズを算出する
ことを特徴とするサイズ分布計測装置。
【請求項２】
前記走査部は、前記光軸方向に沿った前記光の焦点位置ごとに、前記光軸方向に対して直交する平面内において前記光の焦点位置を走査し、
前記演算部は、前記平面上の所定範囲内の座標領域において、前記粒子が存在するか否かを前記光の強度にしたがって判定することにより、前記平面上における前記粒子の個数を特定する
ことを特徴とする請求項１記載のサイズ分布計測装置。
【請求項３】
前記演算部は、前記座標領域上において、前記光軸方向に沿って前記光の強度を連続してサンプリングし、
前記演算部は、前記連続してサンプリングした強度が前記光軸方向に沿って第１回数以上連続して判定閾値以上である場合は前記座標領域上に前記粒子が存在すると判定し、
前記演算部は、前記粒子が存在すると判定した場合は、前記連続してサンプリングした強度が前記第１回数以上連続して前記判定閾値以上に到達してから第２回数以上連続して前記判定閾値未満になるまでの間において最も大きい前記光の強度を用いて、前記粒子のサイズを算出する
ことを特徴とする請求項２記載のサイズ分布計測装置。
【請求項４】
前記演算部はさらに、前記最大光強度を用いて前記粒子のサイズを算出するか、それとも前記粒子を撮像することにより取得した画像を用いて前記粒子のサイズを算出するかを切り替える切替ステップを実施し、
前記演算部は、前記切替ステップにおいては、前記最大光強度を用いて算出した前記粒子のサイズを前記光のスポット径で除算した値が第１切替閾値以上である場合は前記画像を用いて改めて前記粒子のサイズを算出し、
前記演算部は、前記画像を用いて算出した前記粒子のサイズが第２切替閾値以下である場合は前記最大光強度を用いて改めて前記粒子のサイズを算出する
ことを特徴とする請求項１記載のサイズ分布計測装置。
【請求項５】
前記走査部は、前記光軸方向における前記光の走査間隔をΔｄ、前記光軸方向における前記サイズ分布計測装置の分解能をΔｚ、前記粒子の拡散係数をＤ、前記光軸方向における前記光の焦点位置の毎秒走査個数をフレームレートとして定義したとき、（γ×Ｄ）／（Δｚ×Δｄ）（γは定数）以上の前記フレームレートで前記焦点位置を走査する
ことを特徴とする請求項１記載のサイズ分布計測装置。
【請求項６】
前記演算部は、前記サンプルから反射された前記光の強度と前記粒子のサイズとの間の対応関係を記述した対応関係データを用いて、前記粒子のサイズを算出し、
前記対応関係データは、前記サンプルの種類ごとに前記対応関係を記述しており、
前記演算部は、前記サンプルの種類と前記サンプルから反射された前記光の強度を用いて前記対応関係データを参照することにより、前記粒子のサイズを算出する
ことを特徴とする請求項１記載のサイズ分布計測装置。
【請求項７】
前記サイズ分布計測装置はさらに、前記光源が出射する光を分岐して測定光と参照光を生成する光分岐部を備え、
前記サイズ分布計測装置はさらに、前記測定光が前記サンプルから反射することにより生じた信号光を前記参照光と合波することにより互いに位相関係が異なる３つ以上の干渉光を生成する、干渉光学系を備え、
前記検出部は、前記干渉光を検出して電気信号として出力する
ことを特徴とする請求項１記載のサイズ分布計測装置。
【請求項８】
前記演算部は、前記粒子のサイズの個数分布を記述したデータを出力する
ことを特徴とする請求項１記載のサイズ分布計測装置。
【請求項９】
粒子を含む液体のサンプルにおける前記粒子のサイズ分布を計測するサイズ分布計測方法であって、
前記サンプルに対して光源から光を照射するステップ、
前記光の光軸方向に沿って前記光の焦点位置を走査する走査ステップ、
前記サンプルから反射された前記光の強度を検出するステップ、
前記強度を用いて前記粒子のサイズを算出する算出ステップ、
を有し、
前記走査ステップにおいては、前記光軸方向における前記光の走査間隔をΔｄ、前記光軸方向における前記サイズ分布計測方法の分解能をΔｚ、前記粒子の拡散係数をＤ、前記光軸方向における前記光の焦点位置の毎秒走査個数をフレームレートとして定義したとき、（γ×Ｄ）／（Δｚ×Δｄ）（γは定数）以上の前記フレームレートで前記焦点位置を走査する
ことを特徴とするサイズ分布計測方法。
【請求項１０】
光を照射することによりサイズを計測する粒子を含む液体のサンプルを収容するサンプル容器であって、
前記サンプルを収容する収容穴、
前記収容穴が収容している前記サンプルに含まれる気体を前記収容穴から逃がす気体放出部、
を備え、
前記収容穴の底面は光を透過する透過性基板によって封止されている
ことを特徴とするサンプル容器。
【請求項１１】
前記気体放出部は、前記収容穴の内壁から前記サンプル容器の基材に対して突出した空隙部によって構成されており、
前記収容穴の内壁は、湾曲形状を有しており、
前記空隙部は、前記収容穴の内壁に対して１つまたは２つ形成されている
ことを特徴とする請求項１０記載のサンプル容器。
【請求項１２】
前記サンプル容器はさらに、前記粒子を封止材によって封止した第２収容穴を備える
ことを特徴とする請求項１１記載のサンプル容器。
【請求項１３】
前記サンプル容器はさらに、前記収容穴と前記気体放出部を接続する気体放出流路を備え、
前記収容穴に対して前記サンプルを導入する部位は、先細り形状に形成されており、
前記収容穴の上面と前記気体放出部の放出面は、前記サンプル容器の同じ側の表面上に形成されており、
前記気体放出流路は、
前記収容穴の底部から、前記収容穴の深さ方向に対して直交する方向に沿って延伸する第１部分、
前記第１部分の終端から、前記収容穴の深さ方向に沿って前記気体放出部の放出面まで延伸する第２部分、
を備える
ことを特徴とする請求項１０記載のサンプル容器。
【請求項１４】
前記収容穴は、前記サンプル容器に対して前記サンプルを導入する流路の一部として構成されており、
前記収容穴の上面は光を透過する透過性基板によって封止されており、
前記流路は、前記収容穴の深さ方向に対して直交する方向に延伸しており、
前記収容穴の深さ方向におけるサイズは、３００μｍ以上１．５ｍｍ以下である
ことを特徴とする請求項１１記載のサンプル容器。
【請求項１５】
前記サンプル容器はさらに、前記流路に対して前記サンプルを導入する導入口を覆うことにより封止する枠部材を備える
ことを特徴とする請求項１４記載のサンプル容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体サンプルに含まれる粒子のサイズ分布を計測する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医薬品の開発対象は低分子薬からバイオ医薬品へシフトしつつある。バイオ医薬品は高分子であるがゆえに凝集しやすく、凝集すると毒性を生じる場合がある。例えばアメリカ食品医薬品局等は、凝集体の濃度管理規制を強めようとしている。そこで０．１〜１ｕｍのサブミクロン領域における凝集体について、所望密度のサイズ分布を定量的に計測する技術が必要とされている。【０００３】
下記特許文献１は、光計測を用いて粒子を検出する技術について記載している。同文献は、『共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡による光計測を用いて単一粒子を個別に検出する走査分子計数法による単一粒子検出技術に於いて、複数種類の特定の波長帯域にて発光しない単一粒子が混在する試料溶液中にて単一粒子を種類毎に検出できるようにすること。』を課題として、『本発明による試料溶液中の単一粒子を検出する技術は、互いに異なる波長帯域で発光しない複数種類の単一粒子を含む試料溶液内に於ける顕微鏡の光検出領域の位置を移動させながら光検出領域からの特定の波長帯域の光を検出して時系列の光強度データを生成し、時系列光強度データに於いて特定の波長帯域にて発光しない単一粒子が光検出領域内へ進入した際に生ずる光強度の低下をその単一粒子の各々の存在を表す信号として個別に検出する。』という技術を記載している（要約参照）。【０００４】
下記特許文献２は、『光を用いて被検物を計測する際の計測誤差を低減することができる技術を提供する。』ことを課題として、『本発明に係る光計測方法は、被検物に対して光を照射したときの反射光の強度と前記被検物のサイズとの間の対応関係を記述した対応関係データを取得し、前記対応関係データと前記反射光の強度とを用いて前記被検物のサイズを取得する。また本発明に係る光計測方法は、被検物に対して光を照射したときの反射光の強度を表す検出信号から、被検物の容器の傾きに起因する成分を減算することにより、前記容器の傾きを補正する。』という技術を記載している（要約参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１５−０８３９２２号公報
【特許文献２】特開２０１７−１０２９３２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
凝集体のサイズ分布を得るためには、粒子のサイズを計測する必要がある。光計測により粒子のサイズを計測するためには、粒子の平面位置を特定するのみならず、粒子の深さ方向に沿って光信号を得る必要があると考えられる。粒子は様々な深さ位置に存在しているからである。【０００７】
上記特許文献１においては、光検出領域の位置を粒子のブラウン運動よりも速く移動させることにより、粒子のブラウン運動に追従している（同文献の００１６）。しかし同文献においては、計測光を深さ方向（光軸に沿った方向）において走査していないので、粒子の存在を検出したとしてもそのサイズを計測することは困難であると考えられる。【０００８】
上記特許文献２においては、反射光強度を用いて対応関係データを参照することにより粒子サイズを算出している。しかし同文献においては、停止している粒子からの反射光を用いることが前提になっており、深さ方向においてブラウン運動する粒子のサイズを算出することは想定されていないと考えられる。【０００９】
本発明は、上記のような課題に鑑みてなされたものであり、サンプル内でブラウン運動する粒子のサイズ分布を定量的に計測することができる光計測技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明に係るサイズ分布計測装置は、計測光の光軸方向に沿って焦点位置を走査しながら反射光強度を計測し、そのなかで最も大きい反射光強度にしたがって粒子のサイズ分布を算出する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係るサイズ分布計測装置によれば、３次元的にブラウン運動する粒子のサイズ分布を定量的に計測することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】計測光の焦点位置と反射光強度（検出信号）との間の関係について説明する模式図である。
【図２】粒子のブラウン運動と計測光の走査速度について説明する模式図である。
【図３】シミュレーションにより得られた粒子からの反射信号波形の１例である。
【図４】Δｄ＝０．１μｍ、Δｚ＝１２．８７μｍ、ａ＝０．０５μｍ、０．１μｍ、０．２μｍとしたときのフレームレートと検出成功率の関係のシミュレーション結果である。
【図５】Δｄ＝０．１μｍ、Δｚ＝１２．８７μｍの条件において、検出成功率が０．９以上となる最小のフレームレートをａに対してプロットした結果である。
【図６】検出成功率が０．９以上となる最小のフレームレートをΔｚに対してプロットした結果である。
【図７】検出成功率が０．９以上となる最小のフレームレートをΔｄに対してプロットした結果である。
【図８】実施形態１に係るサイズ分布計測装置１００の構成図である。
【図９】サイズ分布計測装置１００がサンプル１１０内に含まれる粒子のサイズ分布を計測する手順の概要を説明する概念図である。
【図１０】図９で説明した手順の詳細を説明するフローチャートである。
【図１１】サイズ分布計測装置１００の別動作例を説明するフローチャートである。
【図１２】同じサイズの粒子を含むサンプル１１０についてサイズ分布計測装置１００がサイズ分布を算出した実験結果を示す図である。
【図１３】異なるサイズの粒子を含むサンプル１１０についてサイズ分布計測装置１００がサイズ分布を算出した実験結果を示す図である。
【図１４】異なるサイズの粒子を含むサンプル１１０について粒子濃度を様々に変えて同様にサイズ分布を算出した結果を示す図である。
【図１５】実施形態２に係るサイズ分布計測装置１００の構成図である。
【図１６】実施形態２に係るサイズ分布計測装置１００の変形例を示す図である。
【図１７】実施形態３に係るサイズ分布計測装置１００の構成図である。
【図１８】粒子径に応じて計測方法を切り替える手順を説明する図である。
【図１９】本実施形態５に係るサンプル容器１９００の構成図である。
【図２０】基準粒子収容穴１９０６を形成する手順を説明する図である。
【図２１】実施形態６に係るサンプル容器２１００の構成図である。
【図２２Ａ】実施形態７に係るサンプル容器２２００の構成を説明する図である。
【図２２Ｂ】サンプル容器２２００内にサンプル１１０を導入する手順を説明する側断面図である。
【図２３】実施形態７に係るサンプル容器２２００の使用方法を説明する側断面図である。
【図２４】反射光強度と粒子サイズとの間の対応関係を記述した対応関係データの例である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
＜粒子のサイズを計測する基本原理について＞
以下では本発明の理解を容易にするため、まず粒子のサイズを計測する基本原理について説明する。その後の本発明の実施形態に係るサイズ分布計測装置の具体的な構成例について説明する。
【００１４】
図１は、計測光の焦点位置と反射光強度（検出信号）との間の関係について説明する模式図である。計測光の焦点位置が粒子の位置と一致している場合（図１（ａ））と一致していない場合（図１（ｂ））を比較すると、照射強度が同一であっても反射光強度は異なる。両者の位置がずれるほど反射光強度は小さい。換言すると、焦点位置と粒子位置が合致するとき、反射光強度が最大となる。また、粒子サイズが大きいほど反射光強度も大きい傾向がある（図１（ｃ））。これらの対応関係を用いることにより、反射光強度を用いて粒子サイズを算出することができる。
【００１５】
ただし粒子サイズと焦点位置の対応関係によっては、異なるサイズを有する粒子からの反射光強度が同一となる場合がある（図１（ｃ）の点線部分を参照）。したがって粒子サイズを正確に算出するためには、計測光の焦点位置からの反射光強度を用いることが重要であるといえる。
【００１６】
図２は、粒子のブラウン運動と計測光の走査速度について説明する模式図である。粒子のブラウン運動速度に対して計測光の走査速度が遅いと、計測光は粒子の動きに追従することができないので、粒子を区別することが困難である（図２（ａ））。これに対して計測光の走査速度がブラウン運動に対して十分速いと、粒子毎に動きを追跡することができるので、個々の粒子を区別することができる（図２（ｂ））。具体的な設定値については後述する。
【００１７】
サイズ分布計測装置の光学系の設計パラメータについて説明する。反射光強度に基づいて粒径を計測するためには、計測光のスポットサイズは計測する粒子の上限サイズよりもわずかに大きくなるようにすることが望ましい。したがって、計測光の波長をλ、対物レンズの開口数をＮＡとすると、光スポット直径Ｒｐａｒｔｉｃｌｅは次の式１で表すことができる。
【００１８】
【数１】
2020144754.tif 000003
【００１９】
粒子にほぼ焦点が結ばれた状態で反射光を検出するためには、ｚピッチ（Δｄ）はｚ方向の分解能Δｚよりも小さくする必要がある。すなわち下記式２が満たされる必要がある。Δｚは、焦点位置をｚ方向に走査したときに、反射信号強度が最大値からある閾値（例えば最大値の半分）まで減少する距離として定義することができる。
【００２０】
【数２】
2020144754.tif 000004
【００２１】
画像の取得速度は、画像取得の毎秒回数として定義することができる。この数値を以下ではフレームレートと呼ぶ。測定対象となる液中の粒子はブラウン運動しているので、正しい粒径分布を得るためにはブラウン運動に追従できるだけのフレームレートで画像を取得する必要がある。以下では要求されるフレームレートに関して式を用いて説明する。ここでは説明の簡略化のため、ｚ方向のブラウン運動についてのみ考慮する。ブラウン運動する粒子の時間ｔの間の平均移動量Ｌは下記式３で与えられる。
【００２２】
【数３】
2020144754.tif 000005
【００２３】
式３におけるＤは粒子の拡散定数であり、ボルツマン定数ｋ、絶対温度Ｔ、流体の粘性μ、粒子直径ａを用いて下記式４で与えられる。
【００２４】
【数４】
2020144754.tif 000006
【００２５】
必要なフレームレートについて検討する上では、測定ｚ位置が一定の時間間隔ごとにΔｄだけ動いているのではなく、粒子のｚ位置がブラウン運動に基づく成分とは独立にΔｄだけ移動しており、測定ｚ位置は原点に固定されていると解釈する方が見通しが良い。以下ではそのように解釈して説明する。この解釈の元では、時刻０において原点に配置された粒子のｍ回目の測定時（時刻ｔｍ）までの平均移動量Ｌｍは下記式５で表される。Δｔはフレームレートの逆数（Δｔ＝１／ＦＲ）、ｔｍ＝ｍΔｔである。
【００２６】
【数５】
2020144754.tif 000007
【００２７】
ｚ分解能をΔｚとすると、粒子がｚ分解能の範囲内に滞在する平均時間Ｔａｖｅは近似的に書き式６を満たすと考えられる。
【００２８】
【数６】
2020144754.tif 000008
【００２９】
式６をＴａｖｅについて解くと下記式７が得られる。式の簡略化のためにα＝Δz／Δｄとおいた。
【００３０】
【数７】
2020144754.tif 000009
【００３１】
粒子にほぼ焦点が結ばれた状態で粒子からの反射光を検出するためには、粒子がｚ分解能の範囲内に滞在している間に複数回画像が取得されなければならない。そのような条件は下記式８で表すことができる。ｎは１以上の自然数であり、粒子がｚ分解能能範囲内に滞在する平均回数である。
【００３２】
【数８】
2020144754.tif 000010
【００３３】
式８は、粒子からの反射光を平均ｎ回以上連続で検出可能であるための条件とも言うことができる。式７を式８に代入して整理すると下記式９が得られる。
【００３４】
【数９】
2020144754.tif 000011
【００３５】
式９をＦＲ＝１／Δtの関係を用いて書き換えると下記式１０が得られる。
【００３６】
【数１０】
2020144754.tif 000012
【００３７】
平均滞在回数ｎは概ねΔｚ／Δｄに比例すると考えられるので、１以下の比例係数βを用いてｎを下記式１１で表す。
【００３８】
【数１１】
2020144754.tif 000013
【００３９】
式１１を用いて式１０をさらに整理すると下記式１２が得られる。γ＝２β／（１−β）２と置いた。
【００４０】
【数１２】
2020144754.tif 000014
【００４１】
式１２は理論的な考察に基づいて予測される、粒径分布を正しく計測するためにフレームレートが満たすべき条件である。右辺が拡散定数Ｄに比例しているのは、粒子の動きが速くなるほどその動きに追従するために高いフレームレートが要求されることを意味している。右辺がｚ分解能Δｚに反比例しているのは、ｚ分解能が高くなるほど反射光を検出する上で許容可能な粒子の焦点位置からのずれ量が小さくなるので、より高いフレームレートが必要となることを表している。右辺がｚピッチΔｄに反比例しているのは、ｚピッチを細かくするほどｚ方向への測定速度が低下するので、より高いフレームレートが必要となることを表している。γの値に関しては、理論的な考察のみで予測することは困難であるので、シミュレーションあるいは実験に基づいて決定することが望ましい。
【００４２】
式１２によると、ΔｚとΔｄを大きくするほど要求されるフレームレートは低くなる。一方で、Δｚを大きくし過ぎるとｚ分解能の範囲内に複数の粒子が存在する確率が高くなり、結果として高い粒子濃度のサンプルの測定が困難になる。ｚ分解能は対象とする粒子濃度範囲を考慮して決定すべきである。また、すでに述べたようにΔｄはΔｚよりも小さくしなければならないという制約がある。Δｚよりも小さい範囲であっても、Δｄを大きくし過ぎると粒子にほぼ焦点が結ばれる確率が低下し、結果として粒径の計測精度が低下する。Δｄは粒径計測精度を考慮して決定すべきである。
【００４３】
式１２の条件の妥当性を検証するため、発明者らはさらにシミュレーションによる検討を実施した。シミュレーションでは測定領域内にブラウン運動する粒子が１つ存在すると仮定し、測定領域をフレームレートＦＲ、ｚ分解能Δｚ、ｚピッチΔｄで計測した際に得られる粒子からの反射信号波形を１万回繰り返し計算し、得られた波形を所定のアルゴリズムで処理することにより、粒子の検出成功率（粒子が１個検出された回数÷１万）を評価した。シミュレーションはＴ＝３００［Ｋ］、μ＝０．００１［Ｐａ＊ｓ］、測定領域のｚ方向サイズ１ｍｍという条件の元で実施した。
【００４４】
図３は、シミュレーションにより得られた粒子からの反射信号波形の１例（Δｄ＝０．５μｍ、Δｚ＝約４．７μｍ）である。信号強度は粒子と焦点の位置が一致した際の値で規格化されている。フレームレートが０．１ｆｐｓ〜１０ｆｐｓでは、粒子が１つしか存在しないにも関わらず複数の極大ピークが見られる。これは、フレームレートが低いとｚ方向の走査速度が粒子のブラウン運動速度と同等かそれ以下となり、同一粒子からの反射光が複数のｚ位置で検出されるからである。このような波形が得られた場合に極大ピーク１つ１つが異なる粒子に対応する信号であると解釈してデータを解析すると、同一粒子を複数回カウントして粒子数を過大評価してしまう。
【００４５】
同一粒子を複数回カウントすることを避ける方法としては、例えばある一定回数（第１回数）以上連続したｚ位置で閾値以上の反射信号強度が得られた場合にのみ粒子であると判定し、その後にある一定回数（第２回数）以上連続したｚ位置で閾値以下の反射信号強度が得られた場合に当該粒子の計測を終えたと判定する解析方法が有効となりえる。ここで、第１回数と第２回数は一致していても異なっていてもかまわない。例えば閾値を０．１、第１回数と第２回数を５とすると、検出粒子数は０．１ｆｐｓのとき１個、１ｆｐｓのとき０個、１０ｆｐｓのとき１個、１００ｆｐｓのとき１個となる。この例からフレームレートが不十分であると正しい計測結果が得られないことが分かる。
【００４６】
図４は、Δｄ＝０．１μｍ、Δｚ＝１２．８７μｍ、ａ＝０．０５μｍ、０．１μｍ、０．２μｍとしたときのフレームレートと検出成功率の関係のシミュレーション結果である。フレームレートが大きくなるほど検出率が１に近づくことが分かる。また、粒径ａによって検出率がほぼ１となるフレームレートは異なる。これは、式４から分かるように粒径が小さくなるほど拡散定数Ｄが大きくなり、ブラウン運動の速度が増すからである。
【００４７】
図５は、Δｄ＝０．１μｍ、Δｚ＝１２．８７μｍの条件において、検出成功率が０．９以上となる最小のフレームレートをａに対してプロットした結果である。破線は下記式１３を用いてシミュレーション結果をフィッティングしたものである。
【００４８】
【数１３】
2020144754.tif 000015
【００４９】
フィッティングパラメータγは約４．４６となった。シミュレーション結果は式１３を用いて精度良くフィッティングされており、要求フレームレートがＤにほぼ比例（ａに反比例）していることが分かる。
【００５０】
図６および図７はそれぞれ検出成功率が０．９以上となる最小のフレームレートをΔｚおよびΔｄに対してプロットした結果である。条件はそれぞれ、ａ＝０．１μｍ、Δｚ＝１２．８７μｍおよびａ＝０．１μｍ、Δｄ＝０．１μｍである。破線は図６と同じγの値で式１３を用いて描いた線である。この結果より、要求フレームレートがΔｚとΔｄに反比例していることが分かる。図５，６，７のシミュレーション結果はすべて式１２とほぼ一致しており、以上の検討結果より式１２の妥当性が確認できた。式１２のγの値は解析アルゴリズムや実験（シミュレーション）条件などによって変化するが、検出成功率が０．９を超えるためには殆どの場合γ＞４は必要となる。
【００５１】
上述のように検出率を１に近づけるためには大きなフレームレートが好ましいが、一方でフレームレートを必要以上に大きくすると、ノイズが増大して粒径の計測精度が低下する。これは、フレームレート増大に伴い、信号の周波数帯域が増大するためである。典型的な検出器の性能を考慮すると、フレームレートは１００ｆｐｓ以下に抑えることが望ましい。これをγの値に換算すると、γの上限はおよそ１００００となる。
【００５２】
＜実施の形態１＞
図８は、本発明の実施形態１に係るサイズ分布計測装置１００の構成図である。光源１０１から出射されたレーザ光はコリメートレンズ１０２によって平行光に変換され、光学軸が水平方向に対して約２２．５度に設定されたλ／２板１０３によって偏光を４５度直線偏光に調整された後、偏光ビームスプリッタ１０４によって計測光と参照光とに偏光分離される。
【００５３】
参照光は、λ／２板１０５によって偏光状態を調整された後、参照光ミラー１０６によって反射されて再び偏光ビームスプリッタ１０４へ入射する。計測光は、対物レンズ１０８によってサンプル１１０の計測位置に対して焦点位置が合致するように集光される。ＸＹ軸駆動機構１０７は、計測光の焦点位置をＸＹ平面（サンプル１１０の深さ方向に対して垂直な平面）上で走査する。Ｚ軸駆動機構１０９は、計測光の焦点位置をＺ軸方向（計測光の光軸方向）に沿って走査する。サンプル１１０から反射した反射した反射光は、再び偏光ビームスプリッタ１０４へ入射する。
【００５４】
反射光と参照光は、偏光ビームスプリッタ１０４によって合波されて合成光となる。合成光は、ピンホール１１１を介して干渉光学系１１２に導かれる。合成光は、偏光ビームスプリッタ１１３によって透過光と反射光に分岐される。
【００５５】
反射光は、光学軸が水平方向に対して約４５度に設定されたλ／４板１１４を通過した後、集光レンズ１１５によって集光されるとともにウォラストンプリズム１１６によって２分岐されることにより、互いに位相関係が１８０度異なる第１干渉光と第２干渉光が生成される。電流差動型の光検出器１１７は第１および第２干渉光を検出し、それらの強度の差に比例した信号１２２を出力する。
【００５６】
透過光は、光学軸が水平方向に対して約２２．５度に設定されたλ／２板１１８を透過した後、集光レンズ１１９によって集光されるとともにウォラストンプリズム１２０によって２分岐されることにより、互いに位相関係が１８０度異なる第３干渉光と第４の渉光が生成される。電流差動型の光検出器１２１は第３および第４干渉光を検出し、それらの強度の差に比例した信号１２３を出力する。
【００５７】
信号処理部１２４は、信号１２２と１２３に基づき、サンプル１１０に含まれる粒子のサイズ分布を算出する。サイズ分布を算出する原理については上述の通りである。算出手順の詳細については後述する。表示部１２５は、信号処理部１２４による算出結果を表示する。
【００５８】
図９は、サイズ分布計測装置１００がサンプル１１０内に含まれる粒子のサイズ分布を計測する手順の概要を説明する概念図である。以下図９の各ステップについて説明し、次に各ステップの詳細について後述するフローチャートを用いて説明する。
【００５９】
信号処理部１２４は、計測光の焦点位置をｚ軸方向に沿って走査しながら、サンプル１１０の平面画像（ＸＹ平面における観察画像）を取得する（図９のｓｔｅｐ１）。例えばｚ軸方向に沿ってそれぞれ異なる１００か所の焦点位置において、ＸＹ画像を取得する。ｚ軸方向における焦点位置の走査間隔（ｚピッチ）に関する条件については上述の通りである。
【００６０】
信号処理部１２４は、隣接するＸＹ画像を相互に比較することにより、ＸＹ画像内に含まれる個々の粒子を特定する（図９のｓｔｅｐ２）。例えば、ＸＹ画像内の部分領域を探索ウインドウとしてセットし、そのなかに含まれる光点を隣接するＸＹ画像間で相互比較することにより、探索ウインドウ内の光点を追跡することができる。例えば図４で説明したように、隣接する３枚のＸＹ画像において反射光強度が判定閾値以上である場合、その位置に粒子が存在すると判定することができる。探索ウインドウのサイズは、概ね１個の粒子が含まれる程度にセットすることが望ましい。
【００６１】
ＸＹ画像の番号は、ｚ方向における焦点位置と対応している。図１で説明したように焦点位置と粒子位置が合致したとき反射光強度が最大となるので、画像番号と反射光強度との間の対応関係をプロットすると、図９中段に示すような信号波形を得ることができる。信号処理部１２４は、特定した粒子ごとにこの信号波形を取得する。
【００６２】
信号処理部１２４は、反射光強度と粒子サイズとの間の対応関係をあらかじめ定義した対応関係データを参照することにより、粒子サイズを特定する。具体的には、ｓｔｅｐ２で取得した最大反射光強度を用いて対応関係データを参照することにより、各粒子のサイズを取得する。信号処理部１２４は粒子サイズの分布を算出し、表示部１２５はその算出結果を表示する。例えば図９下段に示すように、粒子サイズの個数分布を出力することができる。
【００６３】
図１０は、図９で説明した手順の詳細を説明するフローチャートである。サイズ分布計測装置１００は、本フローチャートにしたがって、サンプル１１０内に含まれる粒子のサイズ分布を算出する。以下図１０の各ステップについて説明する。
【００６４】
（図１０：ステップＳ１００１）
ユーザは、サイズ分布計測装置１００に対して計測条件を入力する。信号処理部１２４はその入力を受け取る。計測条件としては例えば、計測する粒子のサイズ範囲、サンプル１１０内に含まれる粒子数の範囲、最大計測時間、などが考えられる。
【００６５】
（図１０：ステップＳ１００２〜Ｓ１００４）
信号処理部１２４は、ｚ軸方向における焦点位置を走査しながら、各焦点位置におけるＸＹ画像をそれぞれ取得する（Ｓ１００２〜Ｓ１００３）。焦点位置の初期値はｚ＝０とする。信号処理部１２４は、ＸＹ画像内において個々の粒子を追跡する際に、ゲイン補正やノイズ処理などの画像鮮明化処理などを適宜実施してもよい（Ｓ１００４）。
【００６６】
（図１０：ステップＳ１００５〜Ｓ１００７）
信号処理部１２４は、ＸＹ画像内の各粒子を特定する。信号処理部１２４は、ｚ軸方向における焦点位置と反射光強度との間の対応関係を表すプロット（図９中段のプロットに対応する）を、特定した粒子ごとに算出する（Ｓ１００５）。この処理はある程度の時間を要するので、予測される残り処理時間を表示するなどしてもよい（Ｓ１００６）。信号処理部１２４は、最大反射光強度を用いて対応関係データを参照することにより、粒子サイズを特定する（Ｓ１００７）。
【００６７】
（図１０：ステップＳ１００８〜Ｓ１００９）
計測終了条件に到達した場合はステップＳ１００９へ進み、到達していない場合はステップＳ１００１へ戻って同様の処理を繰り返す（Ｓ１００８）。ここでいう計測終了条件は、例えばステップＳ１００１において入力した粒子数の範囲や最大計測時間である。信号処理部１２４は、粒子のサイズ分布を算出し、表示部１２５を介して画面表示する（Ｓ１００９）。
【００６８】
図１１は、サイズ分布計測装置１００の別動作例を説明するフローチャートである。本フローチャートは、ステップＳ１００１の前にステップＳ１１０１を実施する点を除いて図１０と同様である。ステップＳ１１０１においてサイズ分布計測装置１００は、サンプル１１０内の粒子数を概ね把握するための簡易計測を実施する。例えば既定の計測条件を用いて少数のＸＹ画像を取得し、これを用いて粒子数を算出する。例えば明らかに異常な計測結果が得られた場合、実際の粒子数は規定の計測条件からかけ離れていると見積もることができる。これによりオペレータは、ステップＳ１００１においてセットする計測条件として適切なものを概ね予測することができる。ステップＳ１００１以降は図１０と同様である。
【００６９】
図１２は、同じサイズの粒子を含むサンプル１１０についてサイズ分布計測装置１００がサイズ分布を算出した実験結果を示す図である。図１２上段に示す実験結果は、直径０．２μｍ、０．５μｍ、１．０μｍの３種類の粒子について、粒子濃度を１．５×１０７個／ｍＬとして計測した結果を示す。いずれの粒子サイズにおいても、単一の粒子サイズのみが検出された。図１２下段は、粒子濃度を様々に変えて同様にサイズ分布を算出した結果を示す。いずれの粒子サイズにおいても、粒子濃度が概ね１０７〜１０８個／ｍＬの範囲内で、計算値と合致する実験結果が得られた。
【００７０】
図１３は、異なるサイズの粒子を含むサンプル１１０についてサイズ分布計測装置１００がサイズ分布を算出した実験結果を示す図である。図１３左図は２種類の粒子サイズを混合したサンプル１１０についての実験結果である。図１３右図は３種類の粒子サイズを混合したサンプル１１０についての実験結果である。各粒子サイズの混合比を図１３内に併記した。いずれの実験結果においても、各粒子サイズを正確に区別できていることが分かる。
【００７１】
図１４は、異なるサイズの粒子を含むサンプル１１０について粒子濃度を様々に変えて同様にサイズ分布を算出した結果を示す図である。図１４左図は２種類の粒子サイズを混合したサンプル１１０についての実験結果である。図１４右図は３種類の粒子サイズを混合したサンプル１１０についての実験結果である。各粒子濃度において、計算値と概ね合致する良好な計測結果が得られている。
【００７２】
＜実施の形態１：まとめ＞
本実施形態１に係るサイズ分布計測装置１００は、計測光の焦点位置を光軸方向に沿って走査しながら、各焦点位置におけるサンプル１１０のＸＹ画像を取得する。サイズ分布計測装置１００はさらに、ＸＹ画像上の各粒子を個別に特定し、ｚ軸方向の各焦点位置のうち反射光強度が最も大きい位置から得られる反射光強度を用いて粒子サイズを求める。これにより、ｚ軸方向に沿ってブラウン運動する粒子のサイズ分布を正確に求めることができる。
【００７３】
本実施形態１に係るサイズ分布計測装置１００は、ｚ軸方向において、粒子のブラウン運動速度よりも速く計測光を走査する。これにより、ｚ軸方向における粒子のブラウン運動に追従して、粒子個数を正確にカウントすることができる。
【００７４】
＜実施の形態２＞
図１５は、本発明の実施形態２に係るサイズ分布計測装置１００の構成図である。実施形態１においては、Ｚ軸駆動機構１０９が計測光の焦点位置をｚ方向において走査することを説明した。図１５においては対物レンズ１０８とＺ軸駆動機構１０９に代えて、焦点可変レンズ１２６を備える。焦点可変レンズ１２６は、ｚ軸方向における焦点位置を変化させることができる。したがって図１５に示す構成例においても、実施形態１と同様の動作を実施することができる。
【００７５】
図１６は、本実施形態２に係るサイズ分布計測装置１００の変形例を示す図である。図１６においてはＸＹ軸駆動機構１０７とＺ軸駆動機構１０９に代えて、ＸＹＺ軸駆動機構１２７を備える。ＸＹＺ軸駆動機構１２７は、ｘｙｚ軸方向それぞれにおける焦点位置を変化させることができる。したがって図１６に示す構成例においても、実施形態１と同様の動作を実施することができる。
【００７６】
＜実施の形態３＞
図１７は、本発明の実施形態３に係るサイズ分布計測装置１００の構成図である。本実施形態３に係るサイズ分布計測装置１００は、共焦点顕微鏡として構成されている。レーザ光源１７０１から出射された光は、ピンホール１７０２を通過した後、コリメートレンズ１７０３によって平行光に変換され、光路分離素子１７０４と走査機構１７０５に到達する。走査機構１７０５は、サンプル１１０に対する計測光の焦点位置を走査する。計測光は、投影レンズ１７０６、結像レンズ１７０７、対物レンズ１７０８を介してサンプル１１０に対して照射される。サンプル１１０から反射した反射光は、光路を反対向きに伝搬し、光路分離素子１７０４を介してピンホール１７０９に到達する。ｚ軸方向における計測光の焦点位置がサンプル１１０の計測位置に対して合焦しているとき、反射光も計測器１７１０の計測面上に焦点が合うように、光学系が設計されている。
【００７７】
本実施形態３に係るサイズ分布計測装置１００も、計測光のｘｙｚ軸方向それぞれにおける焦点位置を変化させることにより、実施形態１〜２と同様の動作を実施することができる。ピンホール１７０２と１７０９に代えてスリットを用いてもよい。またレーザ光源１７０１に代えてＬＥＤ（Ｌｉｇｈｔ  Ｅｍｉｔｔｉｎｇ  Ｄｉｏｄｅ）を用いることもできる。
【００７８】
＜実施の形態４＞
図１８は、粒子径に応じて計測方法を切り替える手順を説明する図である。計測光のスポットサイズが粒子サイズに対して比較的大きい場合、実施形態１〜３で説明した反射光強度を用いる方法により、粒子サイズ分布を計測することができる。これに対して粒子サイズがスポットサイズよりも十分大きい場合、反射光強度を用いる方法は望ましくない。計測光を走査しても反射光強度は図９中段のように大きく変化しないからである。そこで粒子サイズが十分大きい場合は、サンプル１１０の観察画像を用いて粒子サイズを計測することが考えられる。粒子サイズが十分大きければ、観察画像上で粒子を識別することができるからである。
【００７９】
計測方法を切り替える基準としては、例えば粒子サイズとスポットサイズの比（粒子サイズ／スポット径）を用いることができる。反射光強度を用いて粒子サイズを計測した結果、粒子サイズ／スポット径が閾値以下（例えば２以下）であればその計測結果を採用する。閾値以上であれば改めて観察画像を用いて粒子サイズを計測する。同様に観察画像を用いて粒子サイズを計測した結果、粒子サイズ／スポット径が閾値以上であればその計測結果を採用し、閾値以下であれば改めて反射光強度を用いて粒子サイズを計測する。両方法の境界部分においてはいずれの計測方法を用いてもよい。
【００８０】
信号処理部１２４は、例えば走査型光学顕微鏡と同様の原理により、サンプル１１０の観察画像を取得することができる。サイズ分布計測装置１００は、計測光を走査する光学系を用いているからである。
【００８１】
図１８において、反射光強度による計測から観察画像による計測へ切り替える閾値は、観察画像による計測から反射光強度による計測へ切り替える閾値と同じであるが、これらの閾値は異なっていてもよい。
【００８２】
＜実施の形態５＞
以上の実施形態においては、粒子のブラウン運動に追従して粒子サイズ分布を算出する手法を説明した。他方で計測精度の観点からは、粒子のブラウン運動をできる限り抑制することが望ましい。サンプル１１０を収容するサンプル容器の構造によっては、粒子のブラウン運動をある程度抑制することができる。また計測精度の観点からは、サンプル１１０内に気泡が混入しないようにすることが望ましい。サンプル容器の構造によっては気泡混入もある程度抑制することができる。そこで本発明の実施形態５〜７では、実施形態１〜４において用いるのに適したサンプル容器の構造例について説明する。
【００８３】
図１９は、本実施形態５に係るサンプル容器１９００の構成図である。図１９（ａ）は上面図、図１９（ｂ）はＢＢ断面図、図１９（ｃ）はＡＡ断面図、図１９（ｄ）は変形例の上面図である。サンプル容器１９００は、サンプル１１０を収容する容器である。サンプル容器１９００は、基材１９０１、気泡収容部１９０２、収容穴１９０４、水平基準マーカ１９０５、基準粒子収容穴１９０６を備える。
【００８４】
収容穴１９０４は、サンプル１１０を収容する穴であり、基材１９０１を貫通するように形成されている。収容穴１９０４の深さは例えば３００μｍ〜１．５ｍｍ程度である。気泡収容部１９０２は、収容穴１９０４の側面から突出した空隙部分であり、収容穴１９０４と連通している。収容穴１９０４に対してサンプル１１０を導入する際に気泡が生じたとしても、その気泡を気泡収容部１９０２（気体放出口）へ逃がすことができる。これにより気泡が収容穴１９０４内のサンプル１１０を測定する際に測定を阻害しないようにすることができる。
【００８５】
気泡が収容穴１９０４から気泡収容部１９０２へスムーズに移動するためには、収容穴１９０４の内壁は丸みを帯びていることが望ましい。図１９においては収容穴１９０４の側壁に１つの気泡収容部１９０２を配置しているが、気泡収容部１９０２を２つ配置してもよい。例えば穴の中心を挟んで対向する位置にそれぞれ気泡収容部１９０２を配置してもよい。気泡収容部１９０２が多過ぎると却って気泡が移動し難くなる場合もあるので、気泡収容部１９０２は収容穴１９０４ごとに１つまたは２つが望ましい。
【００８６】
収容穴１９０４の穴直径が２．５〜４ｍｍであり、上面図（図１９）における気泡収容部１９０２の形状を矩形とした場合、気泡収容部１９０２の幅を０．５ｍｍ、長さを１．５ｍｍ程度とすることにより、気泡が収容穴１９０４から気泡収容部１９０２へスムーズに移動することが確認できた。
【００８７】
図１９（ｄ）に示すように、基材１９０１上に複数の収容穴１９０４を配置する場合、各収容穴１９０４と接続されている気泡収容部１９０２の位置や個数は同じでなくともよい。図１９（ｄ）においては、１つの気泡収容部１９０２が接続されている収容穴１９０４と、２つの気泡収容部１９０２が接続されている収容穴１９０４を備えている例を示した。
【００８８】
水平基準マーカ１９０５は、サンプル容器１９００を水平に設置するときの基準として用いることができる。例えば気泡を含む水を水平基準マーカ１９０５内に収容し、気泡中心が水平基準マーカ１９０５の中心に位置するようにサンプル容器１９００を設置すればよい。
【００８９】
基準粒子収容穴１９０６は、深さ方向の概ね中央部分に、基準粒子を収容している。基準粒子の位置は、計測光のｚ軸方向における焦点位置の基準として用いることができる。基準粒子を封止する手順については後述する。
【００９０】
基材１９０１の上面は封止基板１９０８によって封止され、下面は透過性基板１９０９によって封止されている。すなわち収容穴１９０４の上面と底面もこれら基板によって封止されている。計測光は、透過性基板１９０９を介して収容穴１９０４内のサンプル１１０に対して照射される。基板からの界面反射の影響により、収容穴１９０４内の空間のうち各基板の表面に近い部分１９１０は、計測対象から除かれる。したがって実際に計測されるのは領域１９１１である。
【００９１】
図２０は、基準粒子収容穴１９０６を形成する手順を説明する図である。空の穴に対して封止材（例えば紫外線硬化樹脂）を注入する（１）。封止材が計測基準高さ（例えば穴の深さ方向の中心）まで達すると、封止材の性質に応じて紫外線照射や加熱により封止材を硬化させる（２）。封止材上に基準粒子（例えば直径１μｍのポリビーズ）を投入し（３）、均等に拡散させる（４）。封止材をさらに注入することにより（５）基準粒子を封止材で覆い（６）、同様に硬化させる（７）。封止材が硬化すると、計測基準高さに基準粒子が配置された基準粒子収容穴１９０６が完成する（８）。
【００９２】
＜実施の形態５：まとめ＞
本実施形態５に係るサンプル容器１９００は、収容穴１９０４と接続された気泡収容部１９０２を備える。これにより、サンプル１１０を収容穴１９０４へ導入する際に気泡が生じたとしても、その気泡を気泡収容部１９０２へ逃がすことができる。これにより、収容穴１９０４に対して測定を実施する際に、気泡が測定を阻害しないようにすることができるので、測定精度が向上する。
【００９３】
＜実施の形態６＞
図２１は、本発明の実施形態６に係るサンプル容器２１００の構成図である。上段は上面図、下段はＡＡ断面図である。プレート２１０１上に複数のウェル２１０２が配置されており、ウェル２１０２間の間隔（ピッチ）は例えば製品規格によって定められている。ウェル２１０２は、サンプル１１０を収容する収容穴である。ウェル２１０２は、上面から底面に向かって先細り形状に形成されている。
【００９４】
ウェル２１０２の近傍には流出口２１０３が形成されている。ウェル２１０２の底部と流出口２１０３の底部は、流路２１０４によって接続されている。ウェル２１０２の上面と流出口２１０３の上面は、プレート２１０１の上面と同じ平面上に形成されている。ウェル２１０２に対してサンプル１１０を導入した後、流路２１０４と流出口２１０３を介して、気泡を逃がすことができる。
【００９５】
プレート２１０１の底面は透過性基板２１０６によって封止され、これによりウェル２１０２の底部も封止される。計測光は、透過性基板２１０６を介してウェル２１０２内のサンプル１１０に対して照射される。ウェル２１０２がサンプル１１０を収容した後、ウェル２１０２の上面をシール２１０５（例えばシーリングテープ）によって覆う。これによりサンプル１１０がウェル２１０２内に封止される。
【００９６】
＜実施の形態６：まとめ＞
本実施形態６に係るサンプル容器２１００は、ウェル２１０２の導入口がテーパ形状に形成されているので、サンプル１１０をスムーズに導入することができる。これにより、サンプル１１０を導入するときの気泡発生を抑制することができる。またウェル２１０２内に気泡が発生したとしても、流路２１０４と流出口２１０３を介して気泡を逃がすことができる。これらの構造により、ピッチが規定されているウェル２１０２を用いる場合においても、粒子サイズ分布を精度よく算出することができる。
【００９７】
＜実施の形態７＞
図２２Ａは、本発明の実施形態７に係るサンプル容器２２００の構成を説明する図である。図２２Ａ上段は側断面図、図２２Ａ下段はＣＣ断面図である。サンプル容器２２００は、流路２２０４が形成された部材を透過性基板２２０９によって挟んだ構造を備えている。流路２２０４の深さは実施形態５の収容穴１９０４と同様に例えば３００μｍ〜１．５ｍｍ程度である。
【００９８】
図２２Ｂは、サンプル容器２２００内にサンプル１１０を導入する手順を説明する側断面図である。手順は図２２Ｂの左から右に向かって進行する。適当な部材（例えばビーカーやシャーレ）にサンプル１１０を収容し、流路２１０４の一端を液面に対して接触させる。流路２１０４の深さが適切である場合、毛細管現象によりサンプル１１０が流路２１０４に対して導入される。サンプル１１０を導入した後、サンプル容器２２００を液面から引き上げる。流路２１０４に対して気泡が導入されたとしても、流路２１０４の反対側の端部（気体放出口）からその気泡を逃がすことができる。
【００９９】
図２３は、本実施形態７に係るサンプル容器２２００の使用方法を説明する側断面図である。サンプル容器２２００は、枠部材２３０１を備える。枠部材２３０１はサンプル容器２２００の一部として構成してもよいし、サンプル容器２２００とは別の部材として構成してもよい。例えばサンプル容器２２００を保持するカセット部材を枠部材２３０１として構成することができる。
【０１００】
枠部材２３０１は、サンプル容器２２００を取り付ける部材である。サンプル容器２２００内にサンプル１１０を導入した後、サンプル容器２２００を枠部材２３０１に取り付ける。枠部材２３０１は、流路２２０４の一端を覆う壁部２３０２を有する。壁部２３０２は、サンプル容器２２００の取り扱い方に応じて、流路２２０４のいずれか一端を覆うようにしてもよいし、両端を覆うようにしてもよい。図２３（４）は両端を覆う例である。壁部２３０２により、サンプル容器１９００内に収容したサンプル１１０の乾燥を防止することができる。
【０１０１】
＜本発明の変形例について＞
本発明は、前述した実施形態に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施形態は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施形態の構成の一部を他の実施形態の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施形態の構成に他の実施形態の構成を加えることも可能である。また、各実施形態の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
【０１０２】
図２４は、反射光強度と粒子サイズとの間の対応関係を記述した対応関係データの例である。この対応関係は、サンプル溶液の光屈折率によって異なる場合もある。そこで図２４に示すように、サンプル溶液の屈折率ごとに対応関係を記述することもできる。ユーザはサイズ分布計測装置１００に対してサンプル溶液の屈折率を指定し、信号処理部１２４はその屈折率に対応する対応関係から粒子サイズを取得する。サンプル溶液の屈折率はサンプル種類に応じて異なるのが一般的であるが、同種サンプルであっても屈折率が異なる場合は、屈折率ごとに対応関係を記述してもよい。
【０１０３】
実施形態１におけるＸＹ軸駆動機構１０７としては、例えば音響光学偏向素子（ＡＯＤ）、ポリゴンミラー、共振動型ガルバノミラー（ＭＥＭＳミラー）などを用いることができる。実施形態２〜３におけるＸＹ軸駆動についても同様の構成を用いることができる。実施形態１におけるＺ軸駆動機構１０９としては、例えばサンプル１１０を載置するステージを駆動する機構を用いることができる。
【０１０４】
実施形態２における焦点可変レンズ１２６としては、例えば超音波焦点可変レンズ、液晶焦点可変ミラー、デフォーマブルミラーなどを用いることができる。実施形態３におけるＸＹＺ軸駆動機構１２７が焦点をｚ軸方向に走査する際にも同様の構成を用いることができる。
【０１０５】
信号処理部１２４は、その機能を実装した回路デバイスなどのハードウェアを用いて構成することもできるし、その機能を実装したソフトウェアを演算装置（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｕｎｉｔ：ＣＰＵなど）が実行することにより構成することもできる。
【符号の説明】
【０１０６】
１００：サイズ分布計測装置
１１０：サンプル
１１２：干渉光学系
１２４：信号処理部
１９００：サンプル容器
２１００：サンプル容器
２２００：サンプル容器
２３００：サンプル容器
２３０１：枠部材
２３０２：壁部
【図１】
2020144754.tif 000016
【図２】
2020144754.tif 000017
【図３】
2020144754.tif 000018
【図４】
2020144754.tif 000019
【図５】
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【図６】
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【図７】
2020144754.tif 000022
【図８】
2020144754.tif 000023
【図９】
2020144754.tif 000024
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2020144754.tif 000027
【図１３】
2020144754.tif 000028
【図１４】
2020144754.tif 000029
【図１５】
2020144754.tif 000030
【図１６】
2020144754.tif 000031
【図１７】
2020144754.tif 000032
【図１８】
2020144754.tif 000033
【図１９】
2020144754.tif 000034
【図２０】
2020144754.tif 000035
【図２１】
2020144754.tif 000036
【図２２Ａ】
2020144754.tif 000037
【図２２Ｂ】
2020144754.tif 000038
【図２３】
2020144754.tif 000039
【図２４】
2020144754.tif 000040
【手続補正書】
【提出日】令和1年5月21日(2019.5.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子を含む液体のサンプルにおける前記粒子のサイズ分布を計測するサイズ分布計測装置であって、
光を出射する光源、
前記光の光軸方向に沿って前記光の焦点位置を走査する走査部、
前記サンプルから反射された前記光の強度を検出する検出部、
前記強度を用いて前記粒子のサイズを算出する演算部、
を備え、
前記走査部は、前記サンプルのなかで前記粒子が前記光軸方向に移動する過程において前記粒子の前記光軸方向におけるそれぞれ異なる位置から前記光が反射するように、前記粒子の前記光軸方向における移動に追従して前記光の焦点位置を走査し、
前記演算部は、前記光軸方向に沿った前記光の焦点位置ごとの前記光の強度のうち最も大きい最大光強度を用いて、前記粒子のサイズを算出する
ことを特徴とするサイズ分布計測装置。
【請求項２】
前記走査部は、前記光軸方向に沿った前記光の焦点位置ごとに、前記光軸方向に対して直交する平面内において前記光の焦点位置を走査し、
前記演算部は、前記平面上の所定範囲内の座標領域において、前記粒子が存在するか否かを前記光の強度にしたがって判定することにより、前記平面上における前記粒子の個数を特定する
ことを特徴とする請求項１記載のサイズ分布計測装置。
【請求項３】
前記演算部は、前記座標領域上において、前記光軸方向に沿って前記光の強度を連続してサンプリングし、
前記演算部は、前記連続してサンプリングした強度が前記光軸方向に沿って第１回数以上連続して判定閾値以上である場合は前記座標領域上に前記粒子が存在すると判定し、
前記演算部は、前記粒子が存在すると判定した場合は、前記連続してサンプリングした強度が前記第１回数以上連続して前記判定閾値以上に到達してから第２回数以上連続して前記判定閾値未満になるまでの間において最も大きい前記光の強度を用いて、前記粒子のサイズを算出する
ことを特徴とする請求項２記載のサイズ分布計測装置。
【請求項４】
前記演算部はさらに、前記最大光強度を用いて前記粒子のサイズを算出するか、それとも前記粒子を撮像することにより取得した画像を用いて前記粒子のサイズを算出するかを切り替える切替ステップを実施し、
前記演算部は、前記切替ステップにおいては、前記最大光強度を用いて算出した前記粒子のサイズを前記光のスポット径で除算した値が第１切替閾値以上である場合は前記画像を用いて改めて前記粒子のサイズを算出し、
前記演算部は、前記画像を用いて算出した前記粒子のサイズが第２切替閾値以下である場合は前記最大光強度を用いて改めて前記粒子のサイズを算出する
ことを特徴とする請求項１記載のサイズ分布計測装置。
【請求項５】
前記走査部は、前記光軸方向における前記光の走査間隔をΔｄ、前記光軸方向における前記サイズ分布計測装置の分解能をΔｚ、前記粒子の拡散係数をＤ、前記光軸方向における前記光の焦点位置の毎秒走査個数をフレームレートとして定義したとき、（γ×Ｄ）／（Δｚ×Δｄ）（γは定数）以上の前記フレームレートで前記焦点位置を走査する
ことを特徴とする請求項１記載のサイズ分布計測装置。
【請求項６】
前記演算部は、前記サンプルから反射された前記光の強度と前記粒子のサイズとの間の対応関係を記述した対応関係データを用いて、前記粒子のサイズを算出し、
前記対応関係データは、前記サンプルの種類ごとに前記対応関係を記述しており、
前記演算部は、前記サンプルの種類と前記サンプルから反射された前記光の強度を用いて前記対応関係データを参照することにより、前記粒子のサイズを算出する
ことを特徴とする請求項１記載のサイズ分布計測装置。
【請求項７】
前記サイズ分布計測装置はさらに、前記光源が出射する光を分岐して測定光と参照光を生成する光分岐部を備え、
前記サイズ分布計測装置はさらに、前記測定光が前記サンプルから反射することにより生じた信号光を前記参照光と合波することにより互いに位相関係が異なる３つ以上の干渉光を生成する、干渉光学系を備え、
前記検出部は、前記干渉光を検出して電気信号として出力する
ことを特徴とする請求項１記載のサイズ分布計測装置。
【請求項８】
前記演算部は、前記粒子のサイズの個数分布を記述したデータを出力する
ことを特徴とする請求項１記載のサイズ分布計測装置。
【請求項９】
粒子を含む液体のサンプルにおける前記粒子のサイズ分布を計測するサイズ分布計測方法であって、
前記サンプルに対して光源から光を照射するステップ、
前記光の光軸方向に沿って前記光の焦点位置を走査する走査ステップ、
前記サンプルから反射された前記光の強度を検出するステップ、
前記強度を用いて前記粒子のサイズを算出する算出ステップ、
を有し、
前記走査ステップにおいては、前記光軸方向における前記光の走査間隔をΔｄ、前記光軸方向における前記サイズ分布計測方法の分解能をΔｚ、前記粒子の拡散係数をＤ、前記光軸方向における前記光の焦点位置の毎秒走査個数をフレームレートとして定義したとき、（γ×Ｄ）／（Δｚ×Δｄ）（γは定数）以上の前記フレームレートで前記焦点位置を走査する
ことを特徴とするサイズ分布計測方法。
【請求項１０】
光を照射することによりサイズを計測する粒子を含む液体のサンプルを収容するサンプル容器であって、
前記サンプルを収容する収容穴、
前記収容穴が収容している前記サンプルに含まれる気体を前記収容穴から逃がす気体放出部、
を備え、
前記収容穴の底面は光を透過する透過性基板によって封止されており、
前記収容穴の直径は、２．５〜４ｍｍであり、
前記気体放出部は、前記収容穴の内壁から前記サンプル容器の基材に対して突出した空隙部によって構成されており、
前記収容穴の内壁は、湾曲形状を有しており、
前記空隙部は、前記収容穴の内壁に対して１つまたは２つ形成されており、
前記空隙部は、少なくとも前記収容穴の底部において、前記収容穴と連結している
ことを特徴とするサンプル容器。
【請求項１１】
（削除）
【請求項１２】
前記サンプル容器はさらに、前記粒子を封止材によって封止した第２収容穴を備える
ことを特徴とする請求項１０記載のサンプル容器。
【請求項１３】
前記サンプル容器はさらに、前記収容穴と前記気体放出部を接続する気体放出流路を備え、
前記収容穴に対して前記サンプルを導入する部位は、先細り形状に形成されており、
前記収容穴の上面と前記気体放出部の放出面は、前記サンプル容器の同じ側の表面上に形成されており、
前記気体放出流路は、
前記収容穴の底部から、前記収容穴の深さ方向に対して直交する方向に沿って延伸する第１部分、
前記第１部分の終端から、前記収容穴の深さ方向に沿って前記気体放出部の放出面まで延伸する第２部分、
を備える
ことを特徴とする請求項１０記載のサンプル容器。
【請求項１４】
前記収容穴は、前記サンプル容器に対して前記サンプルを導入する流路の一部として構成されており、
前記収容穴の上面は光を透過する透過性基板によって封止されており、
前記流路は、前記収容穴の深さ方向に対して直交する方向に延伸しており、
前記収容穴の深さ方向におけるサイズは、３００μｍ以上１．５ｍｍ以下である
ことを特徴とする請求項１０記載のサンプル容器。
【請求項１５】
前記サンプル容器はさらに、前記流路に対して前記サンプルを導入する導入口を覆うことにより封止する枠部材を備える
ことを特徴とする請求項１４記載のサンプル容器。
【手続補正書】
【提出日】令和3年7月2日(2021.7.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子を含む液体のサンプルにおける前記粒子のサイズ分布を計測するサイズ分布計測装置であって、
光を出射する光源、
前記光の光軸方向に沿って前記光の焦点位置を走査する走査部、
前記サンプルから反射された前記光の強度を検出する検出部、
前記強度を用いて前記粒子のサイズを算出する演算部、
を備え、
前記走査部は、前記サンプルのなかで前記粒子が前記光軸方向に移動する過程において前記粒子の前記光軸方向におけるそれぞれ異なる位置から前記光が反射するように、前記粒子の前記光軸方向における移動に追従して前記光の焦点位置を走査し、
前記演算部は、前記光軸方向に沿った前記光の焦点位置ごとの前記光の強度のうち最も大きい最大光強度を用いて、前記粒子のサイズを算出する
ことを特徴とするサイズ分布計測装置。
【請求項２】
前記走査部は、前記光軸方向に沿った前記光の焦点位置ごとに、前記光軸方向に対して直交する平面内において前記光の焦点位置を走査し、
前記演算部は、前記平面上の所定範囲内の座標領域において、前記粒子が存在するか否かを前記光の強度にしたがって判定することにより、前記平面上における前記粒子の個数を特定する
ことを特徴とする請求項１記載のサイズ分布計測装置。
【請求項３】
前記演算部は、前記座標領域上において、前記光軸方向に沿って前記光の強度を連続してサンプリングし、
前記演算部は、前記連続してサンプリングした強度が前記光軸方向に沿って第１回数以上連続して判定閾値以上である場合は前記座標領域上に前記粒子が存在すると判定し、
前記演算部は、前記粒子が存在すると判定した場合は、前記連続してサンプリングした強度が前記第１回数以上連続して前記判定閾値以上に到達してから第２回数以上連続して前記判定閾値未満になるまでの間において最も大きい前記光の強度を用いて、前記粒子のサイズを算出する
ことを特徴とする請求項２記載のサイズ分布計測装置。
【請求項４】
前記演算部はさらに、前記最大光強度を用いて前記粒子のサイズを算出するか、それとも前記粒子を撮像することにより取得した画像を用いて前記粒子のサイズを算出するかを切り替える切替ステップを実施し、
前記演算部は、前記切替ステップにおいては、前記最大光強度を用いて算出した前記粒子のサイズを前記光のスポット径で除算した値が第１切替閾値以上である場合は前記画像を用いて改めて前記粒子のサイズを算出し、
前記演算部は、前記画像を用いて算出した前記粒子のサイズが第２切替閾値以下である場合は前記最大光強度を用いて改めて前記粒子のサイズを算出する
ことを特徴とする請求項１記載のサイズ分布計測装置。
【請求項５】
前記走査部は、前記光軸方向における前記光の走査間隔をΔｄ、前記光軸方向における前記サイズ分布計測装置の分解能をΔｚ、前記粒子の拡散係数をＤ、前記光軸方向における前記光の焦点位置の毎秒走査個数をフレームレートとして定義したとき、（γ×Ｄ）／（Δｚ×Δｄ）（γは定数）以上の前記フレームレートで前記焦点位置を走査する
ことを特徴とする請求項１記載のサイズ分布計測装置。
【請求項６】
前記演算部は、前記サンプルから反射された前記光の強度と前記粒子のサイズとの間の対応関係を記述した対応関係データを用いて、前記粒子のサイズを算出し、
前記対応関係データは、前記サンプルの種類ごとに前記対応関係を記述しており、
前記演算部は、前記サンプルの種類と前記サンプルから反射された前記光の強度を用いて前記対応関係データを参照することにより、前記粒子のサイズを算出する
ことを特徴とする請求項１記載のサイズ分布計測装置。
【請求項７】
前記サイズ分布計測装置はさらに、前記光源が出射する光を分岐して測定光と参照光を生成する光分岐部を備え、
前記サイズ分布計測装置はさらに、前記測定光が前記サンプルから反射することにより生じた信号光を前記参照光と合波することにより互いに位相関係が異なる３つ以上の干渉光を生成する、干渉光学系を備え、
前記検出部は、前記干渉光を検出して電気信号として出力する
ことを特徴とする請求項１記載のサイズ分布計測装置。
【請求項８】
前記演算部は、前記粒子のサイズの個数分布を記述したデータを出力する
ことを特徴とする請求項１記載のサイズ分布計測装置。
【請求項９】
粒子を含む液体のサンプルにおける前記粒子のサイズ分布を計測するサイズ分布計測方法であって、
前記サンプルに対して光源から光を照射するステップ、
前記光の光軸方向に沿って前記光の焦点位置を走査する走査ステップ、
前記サンプルから反射された前記光の強度を検出するステップ、
前記強度を用いて前記粒子のサイズを算出する算出ステップ、
を有し、
前記走査ステップにおいては、前記光軸方向における前記光の走査間隔をΔｄ、前記光軸方向における前記サイズ分布計測方法の分解能をΔｚ、前記粒子の拡散係数をＤ、前記光軸方向における前記光の焦点位置の毎秒走査個数をフレームレートとして定義したとき、（γ×Ｄ）／（Δｚ×Δｄ）（γは定数）以上の前記フレームレートで前記焦点位置を走査する
ことを特徴とするサイズ分布計測方法。
【請求項１０】
光を照射することによりサイズを計測する粒子を含む液体のサンプルを収容するサンプル容器であって、
前記サンプルを収容する収容穴、
前記収容穴が収容している前記サンプルに含まれる気体を前記収容穴から逃がす気体放出部、
を備え、
前記収容穴の底面は光を透過する透過性基板によって封止されており、
前記収容穴の直径は、２．５〜４ｍｍであり、
前記気体放出部は、前記収容穴の内壁から前記サンプル容器の基材に対して突出した空隙部によって構成されており、
前記収容穴の内壁は、湾曲形状を有しており、
前記空隙部は、前記収容穴の内壁に対して１つまたは２つ形成されており、
前記空隙部は、少なくとも前記収容穴の底部において、前記収容穴と連結している
ことを特徴とするサンプル容器。
【請求項１１】
前記サンプル容器はさらに、前記粒子を封止材によって封止した第２収容穴を備える
ことを特徴とする請求項１０記載のサンプル容器。
【請求項１２】
前記サンプル容器はさらに、前記収容穴と前記気体放出部を接続する気体放出流路を備え、
前記収容穴に対して前記サンプルを導入する部位は、先細り形状に形成されており、
前記収容穴の上面と前記気体放出部の放出面は、前記サンプル容器の同じ側の表面上に形成されており、
前記気体放出流路は、
前記収容穴の底部から、前記収容穴の深さ方向に対して直交する方向に沿って延伸する第１部分、
前記第１部分の終端から、前記収容穴の深さ方向に沿って前記気体放出部の放出面まで延伸する第２部分、
を備える
ことを特徴とする請求項１０記載のサンプル容器。
【請求項１３】
前記収容穴は、前記サンプル容器に対して前記サンプルを導入する流路の一部として構成されており、
前記収容穴の上面は光を透過する透過性基板によって封止されており、
前記流路は、前記収容穴の深さ方向に対して直交する方向に延伸しており、
前記収容穴の深さ方向におけるサイズは、３００μｍ以上１．５ｍｍ以下である
ことを特徴とする請求項１０記載のサンプル容器。
【請求項１４】
前記サンプル容器はさらに、前記流路に対して前記サンプルを導入する導入口を覆うことにより封止する枠部材を備える
ことを特徴とする請求項１３記載のサンプル容器。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１５−０８３９２２号公報
【特許文献２】特開２０１７−１０２０３２号公報
【国際調査報告】
2020144754.tif 000041
2020144754.tif 000042
2020144754.tif 000043
2020144754.tif 000044
2020144754.tif 000045
2020144754.tif 000046
2020144754.tif 000047
2020144754.tif 000048