(57)【要約】  創傷被覆材等に適用した場合、生体組織への優れた接着力を有する粉体を提供することを課題とする。また、創傷被覆材、及び癒着防止材を提供することも課題とする。  架橋されたゼラチン誘導体を含有する粒子を含有する粉体であって、上記ゼラチン誘導体は、式（１）：ＧｔｌｎＮＨ−Ｌ−ＣＨＲ１Ｒ２（式中、Ｇｌｔｎはゼラチンの残基を表し、Ｌは単結合又は２価の連結基を表し、Ｒ１は炭素数１〜２０個の炭化水素基を表し、Ｒ２は水素原子又は炭素数１〜２０個の炭化水素基を表す）で表される構造を有し、前記粒子の真球度の平均値が、１．４５以下であり、前記粒子の真球度の標準偏差が、０.２５以下である、粉体。【特許請求の範囲】
【請求項１】
架橋されたゼラチン誘導体を含有する粒子を含む粉体であって、
前記ゼラチン誘導体は、下記式（１）：
ＧｔｌｎＮＨ−Ｌ−ＣＨＲ１Ｒ２  ・・・（１）
［式（１）中、Ｇｌｔｎはゼラチンの残基を表し、Ｌは単結合、又は２価の連結基を表し、Ｒ１は炭素数１〜２０個の炭化水素基を表し、Ｒ２は水素原子又は炭素数１〜２０個の炭化水素基を表す］
で表される構造を有し、
前記粒子の真球度の平均値が、１．４５以下であり、前記粒子の真球度の標準偏差が、０.２５以下である、粉体。
【請求項２】
上記ゼラチン誘導体は、下記式（２）：
ＧｌｔｎＮＨ−ＣＨＲ１Ｒ２  ・・・（２）
［式中、Ｇｌｔｎはゼラチンの残基を表し、Ｒ１は炭素数１〜１７のアルキル基であり、Ｒ２は水素原子又は炭素数１〜１７のアルキル基である］
で表される構造を有する、請求項１に記載の粉体。
【請求項３】
水を滴下して５秒後の水接触角が７０°未満であるか、或いは
生理食塩水に５分間浸漬後にＡＳＴＭ Ｆ−２２５８−０５に従って測定したブタ胃内壁組織との接着強度が、浸漬前に比べ、１／２以下に低下する、請求項１又は２に記載の粉体。
【請求項４】
前記ゼラチンがアルカリ処理済みゼラチンである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の粉体。
【請求項５】
前記ゼラチンが低エンドトキシン化処理済みゼラチンである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の粉体。
【請求項６】
前記ゼラチンが、冷水魚由来である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の粉体。
【請求項７】
以下のゲル層断面積測定試験から得られるゲル層の面積が０．０１０ｍｍ２以上である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の粉体：
ゲル層断面積測定試験：食道粘膜下組織の表面の２．５ｃｍ×２．５ｃｍあたりに、測定対象とする粉体を１００ｍｇ噴霧し、３７℃で４８時間保持して、前記組織の表面上にゲルを形成し、前記ゲルを中性緩衝ホルマリンにより固定して固定済みゲルを得て、前記染色済みゲルを位相差顕微鏡で観察した位相差顕微鏡像からゲル層の断面積を平方ミリメートル単位で算出し、この試験を３回実施し、それらの算術平均値をゲル層の面積とする。
【請求項８】
抗凝固剤を添加したブタ血液と混和して２分３０分後に測定した貯蔵弾性率（Ｇ’）が、２００以上である、請求項２〜７のいずれか１項に記載の粉体。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の粉体を含有する創傷被覆材。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の粉体を含有する癒着防止材。
【請求項１１】
請求項８に記載の粉体を含有する局所止血材。
【請求項１２】
下記式（１）：
ＧｔｌｎＮＨ−Ｌ−ＣＨＲ１Ｒ２  ・・・（１）
［式（１）中、Ｇｌｔｎはゼラチンの残基を表し、Ｌは単結合又は２価の連結基を表し、Ｒ１は炭素数１〜２０個の炭化水素基を表し、Ｒ２は水素原子又は炭素数１〜２０個の炭化水素基を表す］
で表される構造を有するゼラチン誘導体を良溶媒に溶解させ、前記ゼラチン誘導体と前記良溶媒とを含有するゼラチン溶液を得る工程と、
前記ゼラチン溶液に貧溶媒を加え、前記ゼラチン誘導体を含有する中間体粒子を前記ゼラチン溶液中に析出させる工程と、
前記析出後の前記ゼラチン溶液を凍結乾燥させ、前記中間体粒子を含む中間粉体を得る工程と、
前記中間体粒子の前記ゼラチン誘導体を架橋させて、架橋された前記ゼラチン誘導体を含有する粒子を含む粉体を得る工程とを含む、粉体の製造方法。
【請求項１３】
前記ゼラチン誘導体は、下記式（２）：
ＧｌｔｎＮＨ−ＣＨＲ１Ｒ２  ・・・（２）
［式中、Ｇｌｔｎはゼラチンの残基を表し、Ｒ１は炭素数１〜１７のアルキル基であり、Ｒ２は水素原子又は炭素数１〜１７のアルキル基である］
で表される構造を有する、請求項１２に記載の製造方法。
【請求項１４】
前記中間粉体を加熱し、前記ゼラチン誘導体を架橋させる、請求項１２又は１３に記載の製造方法。
【請求項１５】
前記中間粉体を、１００〜２００℃で２．５〜５時間加熱し、前記中間体粒子中の前記ゼラチン誘導体を架橋させる、請求項１４に記載の製造方法。
【請求項１６】
更に、前記架橋されたゼラチン誘導体を含有する粒子を含む粉体に、紫外線を照射し、前記粒子の表面を親水性化する、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１７】
前記粉体に、紫外線を３時間〜６時間照射する、請求項１６に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、創傷被覆材、癒着防止材、止血材等に適する粉体、及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゼラチンは生体適合性及び生分解性に優れることから種々の医療用途に使用されている。そのような材料として、特許文献１には、「エンドトキシン含有量を、タンパク質１．０％当たり１ＥＵ／ｍＬ未満に低下させた、分子量３万〜３０万のゼラチンを外来の架橋剤を用いることなく架橋したゼラチンであって、生理食塩水への溶解時間が２４０時間以下である架橋率を有する架橋ゼラチン。」が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１０−８３７８８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、創傷被覆材等に適用した場合、生体組織への優れた接着性を有する粉体を提供することを課題とする。本発明はまた、創傷被覆材等に適用した場合、生体組織への接着後の他の組織への癒着が低減された粉体を提供することを課題とする。また、本発明は、このような粉体の製造方法を提供することを課題とする。更には、本発明は、創傷被覆材、癒着防止材、及び止血材を提供することも課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を達成すべく鋭意検討した結果、以下の構成により上記課題を達成することができることを見出した。【０００６】
［１］架橋されたゼラチン誘導体を含有する粒子を含む粉体であって、前記ゼラチン誘導体は、下記式（１）：
ＧｔｌｎＮＨ−Ｌ−ＣＨＲ１Ｒ２  ・・・（１）
［式（１）中、Ｇｌｔｎはゼラチンの残基を表し、Ｌは単結合、又は２価の連結基を表し、Ｒ１は炭素数１〜２０個の炭化水素基を表し、Ｒ２は水素原子又は炭素数１〜２０個の炭化水素基を表す］
で表される構造を有し、前記粒子の真球度の平均値が、１．４５以下であり、前記粒子の真球度の標準偏差が、０.２５以下である、粉体。
［２］前記ゼラチン誘導体は、下記式（２）：
ＧｌｔｎＮＨ−ＣＨＲ１Ｒ２・・・（２）
［式中、Ｇｌｔｎはゼラチンの残基を表し、Ｒ１は炭素数１〜１７のアルキル基であり、Ｒ２は水素原子又は炭素数１〜１７のアルキル基である］、
で表される構造を有する、［１］に記載の粉体。
［３］水を滴下して５秒後の水接触角が７０°未満であるか、或いは
生理食塩水に５分間浸漬する前後でＡＳＴＭ Ｆ−２２５８−０５に従って測定したブタ胃内壁組織との接着強度が１／２以下に低下する、［１］又は［２］に記載の粉体。
［４］前記ゼラチンがアルカリ処理済みゼラチンである、［１］〜［３］のいずれかに記載の粉体。
［５］前記ゼラチンが低エンドトキシン化処理済みゼラチンである、［１］〜［４］のいずれかに記載の粉体。
［６］前記ゼラチンが、冷水魚由来である、［１］〜［５］のいずれかに記載の粉体。
［７］以下のゲル層断面積測定試験から得られるゲル層の断面積が０．０１ｍｍ以上である、［１］〜［６］のいずれかに記載の粉体：
ゲル層断面積測定試験：食道粘膜下組織の表面の２．５ｃｍ×２．５ｃｍあたりに、測定対象とする粉体を１００ｍｇ噴霧し、３７℃で４８時間保持して、前記組織の表面上にゲルを形成し、前記ゲルを中性緩衝ホルマリンにより固定して固定済みゲルを得て、前記固定済みゲルを位相差顕微鏡で観察した位相差顕微鏡像から、前記ゲルの断面積をミリメートル単位で算出する試験を３回実施し、それらの算術平均値をゲル層の断面積とする。
［８］抗凝固剤を添加したブタ血液と混和して２分３０分後に測定した貯蔵年弾性率（Ｇ’）が、２００以上である、［２］〜［７］のいずれかに記載の粉体。
［９］［１］〜［８］のいずれかに記載の粉体を含む創傷被覆材。
［１０］［１］〜［８］のいずれかに記載の粉体を含む癒着防止材。
［１１］［８］に記載の粉体を含有する局所止血材。
［１２］下記式（１）：
ＧｔｌｎＮＨ−Ｌ−ＣＨＲ１Ｒ２  ・・・（１）
［式（１）中、Ｇｌｔｎはゼラチンの残基を表し、Ｌは単結合又は２価の連結基を表し、Ｒ１は炭素数１〜２０個の炭化水素基を表し、Ｒ２は水素原子又は炭素数１〜２０個の炭化水素基を表す］
で表される構造を有するゼラチン誘導体を良溶媒に溶解させ、前記ゼラチン誘導体と前記良溶媒とを含有するゼラチン溶液を得る工程と、
前記ゼラチン溶液に貧溶媒を加え、前記ゼラチン誘導体を含有する中間体粒子を前記ゼラチン溶液中に析出させる工程と、
前記析出後の前記ゼラチン溶液を凍結乾燥させ、前記中間体粒子を含む中間粉体を得る工程と、
前記中間体粒子の前記ゼラチン誘導体を架橋させて、架橋されたゼラチン誘導体を含有する粒子を含む粉体を得る工程と
を含む粉体の製造方法。
［１３］前記ゼラチン誘導体は、下記式（２）：
ＧｌｔｎＮＨ−ＣＨＲ１Ｒ２・・・（２）
［式中、Ｇｌｔｎはゼラチンの残基を表し、Ｒ１は炭素数１〜１７のアルキル基であり、Ｒ２は水素原子又は炭素数１〜１７のアルキル基である］
で表される構造を有する、［１３］に記載の方法。
［１４］前記中間粉体を加熱し、前記ゼラチン誘導体を架橋させる、［１２］又は［１３］に記載の製造方法。
［１５］前記中間粉体を、１００〜２００℃で２．５〜５時間加熱し、前記ゼラチン誘導体を架橋させる、［１４］に記載の製造方法。
［１６］更に、前記架橋されたゼラチン誘導体を含有する粒子を含む粉体に、紫外線を照射し、前記粒子の表面を親水性化する、［１２］〜［１５］のいずれかに記載の製造方法。
［１７］前記粉体に、紫外線を３時間〜６時間照射する、［１６］に記載の製造方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の一の実施形態によれば、創傷被覆材等に適用した場合に、生体組織への優れた接着力を有する粉体を提供できる。また、本発明の他の実施形態によれば、創傷被覆材等に適用した場合に、生体組織への接着後に露出面の他の組織への癒着が低減される粉体を提供できる。また、本発明の更に他の実施形態によれば、このような特性を有する創傷被覆材、及び癒着防止材も提供できる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】７６．８Ｃ６  ＡｐＧｌｔｎ（Ｍｗ：３．１万）から方法Ａ−１により調製した粉体の走査型電子顕微鏡像である。
【図２】７６．８Ｃ６  ＡｐＧｌｔｎ（Ｍｗ：３．１万）から方法Ｂにより調製した粉体の走査型電子顕微鏡像である。
【図３】Ｏｒｇ  ＡｐＧｌｔｎ（Ｍｗ：３．１万）から方法Ａ−１により調製した粉体の走査型電子顕微鏡像である。
【図４】７５Ｃ８ブタゼラチンから方法Ｃにより調製した粉体の走査型電子顕微鏡像である。
【図５】ゲル層の断面積の測定に使用した位相差顕微鏡像の例である。
【図６】３６．４Ｃ１０  ＡｐＧｌｔｎ及びＯｒｇ  ＡｐＧｌｔｎから方法Ａ−４により調製した粉体を、ＵＶ照射による表面処理を異なる時間（３０分、１時間、２時間、及び４時間）行い又はせずに得た粉体と水滴との接触角を測定した結果を示す。左は、ＵＶ照射時間と接触角との関係を示すグラフであり、右は、各試験で観察された水滴の状態を示す図である。
【図７】３６．４Ｃ１０  ＡｐＧｌｔｎ及びＯｒｇ  ＡｐＧｌｔｎから方法Ａ−４により調製した粉体を、ＵＶ照射による表面処理を異なる時間（３０分、１時間、２時間、及び４時間）行い又はせずに得た粉体について、ブタ胃内壁組織に対する接着強度を測定した結果を示す。
【図８】３６．４Ｃ１０  ＡｐＧｌｔｎ及びＯｒｇ  ＡｐＧｌｔｎから方法Ａ−４により粉体を調製し、更にＵＶ照射による表面処理を行うプロセスの過程において得られる、加熱により架橋させる前若しくは後、又は更にＵＶ照射による表面処理を行った後の粉体の走査型電子顕微鏡像である。
【図９】３６．４Ｃ１０  ＡｐＧｌｔｎ及びＯｒｇ  ＡｐＧｌｔｎから方法Ａ−４により調製した粉体を、更にＵＶ照射による表面処理をして又はせずに得た粉体を、生理食塩水中に加えて、異なる時間（攪拌直後、３０分、１時間、２時間）放置した後の走査型電子顕微鏡像である。
【図１０】微小孔デンプン球（商品名：バード  アリスタＡＨ、株式会社メディコン）を、生理食塩水中に加えて、異なる時間（攪拌直後、３０分、１時間、２時間、４時間後、２４時間後）放置した後の走査型電子顕微鏡像である。
【図１１】３６．４Ｃ１０  ＡｐＧｌｔｎ及びＯｒｇ  ＡｐＧｌｔｎから方法Ａ−４により調製した粉体を、更にＵＶ照射による表面処理をして又はせずに得た粉体を、生理食塩水中に加えて５分間放置した後で、ブタ胃内壁組織に対する接着強度を測定した結果を示す。対照として粉体を用いない場合の接着強度も示す。
【図１２】３６．４Ｃ１０  ＡｐＧｌｔｎ及びＯｒｇ  ＡｐＧｌｔｎから方法Ａ−４により調製した粉体を、更にＵＶ照射による表面処理をして又はせずに得た粉体を、一定時間（２４時間、４８時間）放置後に、粉体と水滴との接触角を測定した結果を示す。左は、各条件での接触角を示すグラフであり、右は、各試験で観察された水滴の状態を示す図である。
【図１３】４４．２Ｃ１０  ＡｐＧｌｔｎから方法Ａ−２（架橋時間１時間）、方法Ａ−３（架橋時間２時間）、又は方法Ａ−４（架橋時間３時間）により調製した粉体を、更にＵＶ照射による表面処理をして又はせずに得た粉体について、ブタ胃内壁組織に対する接着強度を測定した結果を示す
【図１４】４４．２Ｃ１０  ＡｐＧｌｔｎから方法Ａ−２、方法Ａ−３、又は方法Ａ−４により調製した粉体を、更にＵＶ照射による表面処理をして又はせずに得た粉体について、粉体と水滴との接触角を測定した結果を示す。左は、各条件での接触角を示すグラフであり、右は、各試験で観察された水滴の状態を示す図である。
【図１５】４４．２Ｃ１０  ＡｐＧｌｔｎから方法Ａ−２、方法Ａ−３、又は方法Ａ−４により調製した粉体を、更にＵＶ照射による表面処理をして又はせずに得た粉体について、抗凝固材添加ブタ血液と混和した際の貯蔵弾性率（Ｇ’）を測定した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明について詳細に説明する。
以下の説明は、本発明の代表的な実施形態に基づいてなされるが、本発明はそのような実施形態に制限されるものではない。
なお、本明細書において、「〜」を用いて表される数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
【００１０】
〔粉体〕
本発明の一の実施形態に係る粉体は、架橋されたゼラチン誘導体を含有する粒子を含む粉体であって、前記ゼラチン誘導体は、下記式（１）：
ＧｔｌｎＮＨ−Ｌ−ＣＨＲ１Ｒ２  ・・・（１）
［式（１）中、Ｇｌｔｎはゼラチンの残基を表し、Ｌは単結合、又は２価の連結基を表し、Ｒ１は炭素数１〜２０個の炭化水素基を表し、Ｒ２は水素原子又は炭素数１〜２０個の炭化水素基を表す］
で表される構造を有し、前記粒子の真球度の平均値が、１．４５以下であり、前記粒子の真球度の標準偏差が、０．２５以下である、粉体である。
【００１１】
理論に拘泥するものではないが、このような粉体が生体組織への優れた接着力を発揮する作用機序としては、本発明者らは以下のとおり推測している。なお、以下の機序は推測であり、以下の機序以外の機序により本発明の効果が得られる場合であっても本発明の範囲に含まれる。なお、本明細書において「粉体」とは、複数個の粒子の集合体（凝集体を含む）を意味する。
【００１２】
この実施形態に係る粉体は、上記式（１）に示す通り、疎水基（後で詳細に説明する）が導入された架橋ゼラチン誘導体を含有する粒子を含む。そのため、乾燥状態の粉体を噴霧すると、導入された疎水基が粉体の対象組織への浸透性を向上させ、結果として生体組織への優れた接着性が得られるものと推測される。このような特性は、後述する実施例で、疎水基が導入された架橋ゼラチン誘導体の粒子を含む例１の粉体が、疎水基が導入されなかった架橋ゼラチン誘導体の粒子を含む例３の粉体と比較して、生体組織への接着力が２．４倍に向上していることからも説明される。
【００１３】
また、この実施形態に係る粉体は、真球度が高く、形状のばらつきの少ない粒子を含有する。このため、生体組織に本粉体を適用した際、組織表面に対して本粉体が六方細密充填され、結果として生体組織への優れた接着力が得られるものと推測される。
この特性は、後述する実施例で、真球度が高く、真球度の標準偏差が小さい例１の粉体が、これより真球度が低く、真球度の標準偏差が大きい例２の粉体と比較して、生体への接着力が１．３倍以上に向上していることからも説明される。
【００１４】
この実施形態に係る粉体は、上記２つの特徴の相乗効果によって優れた接着力が得られたものと推測され、本発明は、このような粉体を初めて提供する。
【００１５】
本発明の他の実施形態に係る粉体は、架橋されたゼラチン誘導体を含有する粒子を含む粉体であって、前記ゼラチン誘導体は、下記式（１）：
ＧｔｌｎＮＨ−Ｌ−ＣＨＲ１Ｒ２  ・・・（１）
［式（１）中、Ｇｌｔｎはゼラチンの残基を表し、Ｌは単結合又は２価の連結基を表し、Ｒ１は炭素数１〜２０個の炭化水素基を表し、Ｒ２は水素原子又は炭素数１〜２０個の炭化水素基を表す］
で表される構造を有し、
水を滴下した５秒後の水滴の接触角が７０°未満であるか、或いは
生理食塩水に５分間浸漬する前後で米国試験材料協会の規格（ＡＳＴＭ Ｆ−２２５８−０５）に従って測定したブタ胃内壁組織との接着強度が１／２以下に低下する、粉体である。
この実施形態に係る粉体も、疎水基が導入された架橋ゼラチン誘導体を含有する粒子を含むことで、生体組織への優れた接着性が得られるものと推測される。この実施形態に係る粉体はまた、上記の通り、水を滴下した５秒後の水滴の接触角が７０°未満であるか、或いは生理食塩水に５分間浸漬する前後でブタ胃内壁組織との接着強度が１／２以下に低下するという特性を有する。これらの特性は、後述する実施例で記載する通り、紫外線照射により粒子表面が親水性化されることでもたらされるものと理解され、この実施形態に係る粉体では、組織への接着力が依然大きいものの、組織に適用後は露出面の接着力が迅速に低下し、他の組織への癒着が防止されるという利点を有する。また、必ずしもその作用機序は明らかではないが、後述する実施例で実証するように、この実施形態の好ましい態様では、血液凝固能に優れ、この特性を利用した応用が期待される。
以下、これら本発明の代表的な実施形態に係る粉体（以下では、纏めて本粉体ということがある）の成分等について詳述する。
【００１６】
＜ゼラチン誘導体＞
本粉体は架橋されたゼラチン誘導体を含有する粒子を含む。このゼラチン誘導体は、下記式（１）で表される構造を有する。
【００１７】
ＧｔｌｎＮＨ−Ｌ−ＣＨＲ１Ｒ２  ・・・（１）
式（１）中、Ｇｌｔｎはゼラチンの残基を表し、Ｌは単結合又は２価の連結基を表し、Ｒ１は炭素数１〜２０個の炭化水素基を表し、Ｒ２は水素原子又は炭素数１〜２０個の炭化水素基を表す。
【００１８】
Ｌの２価の連結基としては特に制限されないが、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ）−（Ｒは水素原子又は１価の有機基（好ましくは炭素数１〜２０個の炭化水素基）を表す）、アルキレン基（好ましくは炭素数２〜１０のアルキレン基）、アルケニレン基（好ましくは炭素数２〜１０のアルケニレン基）、及びこれらの組み合わせ等が挙げられ、なかでも−Ｃ（Ｏ）−が好ましい。従って、Ｌは、単結合又は−Ｃ（Ｏ）−が好ましい。
【００１９】
＊−ＮＨ−ＣＨＲ１Ｒ２（＊は結合位置を表す）は、原料となるゼラチンが有するε−アミノ基に結合していることが好ましく、ゼラチン中のリジン（Ｌｙｓ）のε−アミノ基に結合していることがより好ましい。アミノ基、好ましくはリジンのアミノ基に連結基を介して、又は介さずに（言い換えれば直接）、＊−ＣＨ２Ｒ１Ｒ２を結合させる方法としては、例えば、いわゆる還元（的）アミノ化反応（アルデヒド、又はケトンを用いる方法）、及びショッテン・バウマン（Ｓｃｈｏｔｔｅｎ−Ｂａｕｍａｎｎ）反応（酸クロライドを用いる方法）等を利用する方法が挙げられる。
【００２０】
なお、式（１）の−ＮＨ−構造は、例えばＦＴ−ＩＲ（フーリエ変換赤外吸収）スペクトルにおいて３３００ｃｍ−１付近のバンドにより検出することができる。
【００２１】
炭素数１〜２０個の炭化水素基としては特に制限されず、例えば、炭素数１〜２０個の鎖状炭化水素基、炭素数３〜２０個の脂環式炭化水素基、炭素数６〜１４個の芳香族炭化水素基、及びこれらを組み合わせた基が挙げられる。
【００２２】
Ｒ２が１〜２０個の炭化水素基である場合、Ｒ２は、Ｒ１と同一でも異なってもよい。また、Ｒ１、及びＲ２のアルキル基は直鎖状であっても、分岐鎖状であってもよい。
【００２３】
炭素数１〜２０個の鎖状炭化水素基としては、特に制限されないが、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ヘキシル基、オクチル基（又はカプリル基）、ノニル基（又はペラルゴルニル基）、デシル基、ドデジシル基（又はラウリル基）、及びテトラデシル基（又はミリスチル基）等が挙げられる。なかでもより優れた接着性を有する粉体が得られ易い点で、Ｒ１が炭素数１〜１３のアルキル基であることが好ましく、炭素数７〜１２のアルキル基であることがより好ましく、炭素数８〜１１のアルキル基であることが更に好ましく、炭素数９〜１１のアルキル基であることが特に好ましい。Ｒ２としては特に制限されないが、水素原子であることが好ましい。
【００２４】
炭素数３〜２０個の脂環式炭化水素基としては、例えば、シクロプロピル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、アダマンチル基、及び、ノルボルニル基等が挙げられる。
【００２５】
炭素数６〜１４個の芳香族炭化水素基としては、特に制限されないが、フェニル基、トリル基、及びナフチル基等が挙げられる。
【００２６】
上記を組み合わせた基としては、特に制限されないが、例えば、ベンジル基、フェネチル基、ナフチルメチル基、及び、ナフチルエチル基等の炭素数６〜１２個のアラルキル基等が挙げられる。
【００２７】
式（１）で表されるゼラチン誘導体としては、以下の式（２）及び式（３）からなる群より選択される少なくとも１種のゼラチン誘導体が好ましく、式（２）で表されるゼラチン誘導体がより好ましい。
【００２８】
ＧｌｔｎＮＨ−ＣＨＲ１Ｒ２  ・・・（２）
【００２９】
【化１】
2020137903.tif 000002
【００３０】
式（２）及び式（３）中、各記号の意味はすでに説明した式（１）と同様であり、好適形態も同様である。
【００３１】
本願明細書において、「誘導化率」は、原料ゼラチン中のアミノ基の含有量に対する、ゼラチン誘導体中におけるアルキル基が結合されたイミノ基（＊−ＮＨ−ＣＨＲ１Ｒ２）の含有量の含有モル比と定義される。
上記ゼラチン誘導体の誘導化率は特に制限されないが、一般に、２０〜８０モル％が好ましく、３０〜７０モル％がより好ましい。言い換えれば、得られたゼラチン誘導体におけるイミノ基／アミノ基（モル比）は、２０／８０〜８０／２０が好ましく、３０／７０〜７０／３０がより好ましい。
なお、本明細書において、誘導化率は、原料ゼラチンのアミノ基数と、ゼラチン誘導体のアミノ基数を、２，４，６-トリニトロベンゼンスルホン酸法（ＴＮＢＳ法）によって定量し、得られた値から、以下の式により算出される。
誘導化率（モル％）＝［原料ゼラチンのアミノ基数−ゼラチン誘導体のアミノ基数］／［原料ゼラチンのアミノ基数］×１００
【００３２】
ゼラチン誘導体の原料となるゼラチン（以下「原料ゼラチン」ともいう。）は、天然由来であってもよいし、合成されたもの（発酵、及び遺伝子組換え等を含む）であってもよいし、又は天然由来の若しくは合成されたゼラチンに何らかの処理をしたものでもよい。
より具体的には、例えば、ほ乳類、鳥類、及び魚類等の皮、骨、及び腱等から取得された天然由来のゼラチン、及び天然由来のゼラチンを酸又はアルカリで処理した（必要に応じて加熱抽出された）処理済みゼラチン等が挙げられる。
なかでも、より優れた本発明の効果を有する粉体が得られる点で、アルカリ処理済みゼラチンが好ましい。
【００３３】
また、上記粉体を生体内に投与して用いる場合、例えば、創傷被覆材等として用いる場合、エンドトキシンの含有量が低減された低エンドトキシン化処理済みゼラチンを用いることが好ましい。このような低エンドトキシン化処理済みゼラチンとしては特に制限されず、公知のものが使用できるが、例えば、特開２００７−２３１２２５号公報に記載のものが挙げられ、この内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【００３４】
ほ乳類由来のゼラチンとしては、ブタ、及びウシ由来のゼラチンが挙げられる。魚類由来のゼラチンとしては、特に制限されないが、なかでも、サケ、マス、タラ、タイ、ティラピア、及びマグロ等の冷水魚（冷水性魚類）由来のゼラチン（以下「冷水魚由来ゼラチン」ともいう。）が好ましい。
【００３５】
冷水魚由来ゼラチンは、２個以上のアミノ酸が直鎖状に連結された高分子であり、構成アミノ酸１０００個当たり、１９０個以下のイミノ酸、より具体的には、８０個以下のヒドロキシプロリン（Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ）と、１１０個以下のプロリンを有している。冷水魚由来ゼラチンの常温流動性は、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ）の数が８０個以下であること又はプロリンの数が１１０個以下であることに起因すると考えられる。いずれかの条件を満たせば、変性温度がほぼ室温以下となり、常温流動性が生じると考えられる。
【００３６】
タイゼラチンのヒドロキシプロリン数は７３、プロリン数は１０８で変性温度（Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ｔｅｎｐｅｒａｔｕｒｅ）は３０２．５Ｋである。ティラピアゼラチンのヒドロキシプロリン数は８２、プロリン数は１１０で変性温度（Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｔｅｎｐｅｒａｔｕｒｅ）は３０９Ｋである。これらに対して、ブタゼラチンのヒドロキシプロリン数は９５、プロリン数は１２１で変性温度（Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｔｅｎｐｅｒａｔｕｒｅ）は３１６Ｋである。
【００３７】
なお、冷水魚由来ゼラチンは、動物由来のゼラチンのアミノ酸配列と類似しており、酵素により容易に分解され、また生体親和性も高い。
【００３８】
原料ゼラチンの分子量としては特に制限されないが、重量平均分子量（Ｍｗ）として、５，０００〜１００，０００が好ましく、１０，０００〜５０，０００がより好ましく、２０，０００〜４０，０００が更に好ましい。なお、本明細書において重量平均分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により求めた重量平均分子量を意味する。
【００３９】
本発明の実施形態において、粉体は、架橋された上記ゼラチン誘導体を含有する粒子を含む。
本願明細書において「架橋された」とは、可逆的な物理架橋構造は含まず、不可逆的な架橋反応により得られる架橋構造を意味する。したがって、「架橋されたゼラチン誘導体」は、ゼラチン誘導体に熱、光、エネルギー線などでエネルギーを付与して、及び／又は架橋剤により生じる、架橋反応により得られる不可逆的な架橋構造を有するゼラチン誘導体である。典型的には、ゼラチンの側鎖の官能基（−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ等）間の反応を通じて生じる。後述する実施例で示す通り、架橋されたゼラチン誘導体を含有する粒子は、接着強度が増強するため、より創傷被覆材等に適する。
【００４０】
本発明の好ましい実施形態において、架橋されたゼラチン誘導体を含有する粒子は、表面が親水性化されている。より具体的には、水を滴下して５秒後の水滴の接触角が７０°未満であり、好ましくは５０°以下である。
本願明細書において、「水滴の接触角」若しくは「水接触角」とは、水を粒子表面に滴下した際の水滴と粒子表面の角度を接線法によって算出される角度を意味する。具体的には、各粉体２０ｍｇを、１．５ｃｍ×１ｃｍの両面テープ上に平坦になるように敷き詰め、イオン交換水１μｌを滴下し、滴下後１秒の時点から０．５秒毎に水滴の側面から水滴の形状を写真撮影し、水滴の形状が一定になった時点に撮影された水滴の形状から接線法により接触角を求めた。
【００４１】
この実施形態に係る粒子は、水分の存在する環境で膨潤し易い性質があり、生理食塩水に５分間浸漬する前後でＡＳＴＭ Ｆ−２２５８−０５に従って測定した（試験手順の詳細は後述する実施例に記載の通り）ブタ胃内壁組織との接着強度が１／２以下、好ましくは１／３以下に低下する。このような特性は、後述する実施例に記載するとおり、典型的には、ＵＶ照射によりもたらされる。また、このような特性は、生体組織へ接着後、露出面は水分の存在により迅速に接着強度が低下し、他の組織への癒着を防ぐことができる。
【００４２】
本発明の好ましい実施形態では、粉体が、優れた血液凝固能を有する。より具体的には、粉体が１０質量％となるように、抗凝固剤（例えば、クエン酸Ｎａ）を添加したブタ血液と粉体をボルテックスを用いて混合し、２分後に測定した混合物の貯蔵弾性率（Ｇ’）が、３０Ｐａ以上であり、好ましくは２００Ｐａ以上であり、より好ましくは３００Ｐａ以上であり、更に好ましくは４００Ｐａ以上である。このような高い貯蔵弾性率（Ｇ’）を有する粉体は、例えば、止血材等への利用が考えられる。
ここで、本願明細書における「貯蔵弾性率（Ｇ’）」は、３７度にあらかじめ温めておいたステージにおいて上記混合溶液をレオメーター（商品名：ＭＣＲ３０、ANTON PAAR GMBH社製）を用いて５分間、１ヘルツ、１％ひずみの条件下において測定した値をいう。
【００４３】
＜粒子＞
本発明の実施形態において、粒子は、架橋されたゼラチン誘導体を含有していればよく、本発明の効果を奏する範囲内においてその他の成分を含有していてもよい。粒子の架橋されたゼラチン誘導体の含有量としては、特に制限されないが、より優れた本発明の効果を有する粉体が得られ易い点で、粒子の全質量に対して、架橋されたゼラチン誘導体を９０質量％以上含有していることが好ましく、９９質量％以上含有していることがより好ましい。
粒子が含有してもよいその他の成分としては特に制限されないが、例えば、非架橋のゼラチン誘導体、溶媒、緩衝化剤、着色料、保存料、賦形剤、及び薬剤（抗血栓薬、抗菌剤、及び、成長因子等）等が挙げられる。
【００４４】
粒子の真球度は、１．４５以下であるが、より優れた生体組織への接着力が得られる点で、１．２９以下が好ましく、１．２０以下がより好ましく、１．１５以下が更に好ましい。なお、本明細書において、真球度とは以下の試験方法により求められる値を意味する。
【００４５】
・試験方法
測定対象とする粉体を、カーボンテープを貼った走査型電子顕微鏡ステージに振りかけ、その後、エアースプレーの噴霧によりカーボンテープに接着していない粉体を除いて作成した試料を走査型電子顕微鏡で観察し、１視野から無作為に抽出した２０個の粒子について「ＩｍａｇｅＪ（ｖ１．５１）」を用いて横軸、及び縦軸の長さを計測する。次に、各粒子について「横軸／縦軸」を計算し、これを算術平均し、得られた値について小数第３位を四捨五入して小数第２位まで求め、これを真球度とする。なお、上記計測、及び計算においては、（縦軸）≦（横軸）と定義する。すなわち、計測された１つの粒子に係る粒子径のうち、最も大きい粒子径を横軸と定義する。また、縦軸は、横軸から９０度回転した位置の径とする。
【００４６】
また、粉体中における上記粒子の真球度の標準偏差（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｄｅｖｉａｔｉｏｎ、ＳＤ）は、０．２５以下であるが、生体組織へのより優れた接着力が得られる点で、０．２０以下が好ましく、０．１５以下がより好ましい。
なお、粉体中における粒子の真球度の標準偏差は、上記２０個の粒子の真球度から計算され、得られた計算値の小数第３位を四捨五入して、小数第２位まで求め標準偏差とする。
粒子の平均粒径は、通常０．５〜５０μｍであり、好ましくは１〜３０μｍであり、より好ましくは１〜１０μｍである。本願明細書における「平均粒径」は、電子顕微鏡によってランダムに１００個の粒子の粒径（長径）を測定して平均することによって求められた値である。
【００４７】
＜ゲル層の断面積＞
本粉体は、所定のゲル層断面積測定試験によって測定されるゲル層の断面積が０．０１０ｍｍ２以上であることが好ましい。ゲル層の断面積が０．０１０ｍｍ２以上であると、粉体を生体組織に適用した際、より優れた接着力が得られる。
ゲル層の断面積としては特に制限されないが、０．０２０ｍｍ２以上がより好ましく、０．０３０以上が更に好ましく、０．０５０以上がより更に好ましく、０．１００以上が特に好ましく、０．１２０以上が最も好ましい。
ゲル層の面積の上限値としては特に制限されないが、一般に、０．５００ｍｍ２以下が好ましい。
【００４８】
本願明細書における「ゲル層断面積測定試験」は、以下の通り実施することができる：食道粘膜下組織の表面の２．５ｃｍ×２．５ｃｍあたりに、測定対象とする粉体を１００ｍｇ噴霧し、３７℃で４８時間保持して、組織表面上にゲルを形成し、形成されたゲルを中性緩衝ホルマリンにより固定して固定済みゲルを得、得られた固定済みゲルを位相差顕微鏡で観察し、位相差顕微鏡像から通常ゲルの幅と厚みを計測し、ゲルの断面積を平方ミリメートル単位で算出する。この試験を３回実施し、それらの算術平均値をゲル層の面積とする。ゲル層の把握には、ヘマトキシリン-エオジン染色して染色済みゲルを得ることが便利である。得られた染色済みゲルを位相差顕微鏡で観察し、位相差顕微鏡像からゲルの断面積を算出してもよい。
【００４９】
なお、図５に示す位相差顕微鏡像は、染色済みゲルの断面像であり、ゲル層の面積は、面積既知の断面像における染色済みゲルの占める割合から算出される。具体的には位相差顕微鏡像を「ＩｍａｇｅＪ（ｖ１．５１）」により二値化して算出されている。
【００５０】
〔粉体の製造方法〕
上記粉体の作成方法としては特に制限されないが、以下の各工程を含む方法により作成されることが好ましい。
・工程１：ゼラチン誘導体を良溶媒に溶解させ、ゼラチン誘導体と良溶媒とを含有するゼラチン溶液を得る工程
・工程２：ゼラチン溶液に貧溶媒を加え、ゼラチン誘導体を含有する中間体粒子をゼラチン溶液中に析出させる工程
・工程３：析出後のゼラチン溶液を凍結乾燥させ、中間体粒子を含む中間粉体を得る工程
・工程４：中間体粒子のゼラチン誘導体を架橋させて、架橋されたゼラチン誘導体を含有する粒子を含む粉体を得る工程
・工程５：任意選択で、更に、架橋されたゼラチン誘導体を含有する粒子を含む粉体に、紫外線を照射し、粒子の表面を親水性化する工程
以下では、上記各工程について詳述する。
【００５１】
・工程１（溶解工程）
工程１は、すでに説明したゼラチン誘導体を良溶媒に溶解させ、ゼラチン溶液を得る工程である。本明細書において、良溶媒とは、ゼラチン誘導体を溶解させやすい溶媒を意味し、特に制限されないが、水、グリセリン、酢酸、及びこれらの混合物等が挙げられ、なかでも水を含有することが好ましい。また、上記良溶媒は加温されてもよい。加温の際の温度としては特に制限されないが、５０〜７０℃が好ましい。
【００５２】
ゼラチン誘導体を良溶媒に溶解させる方法としては、特に制限されず、公知の方法が使用できる。例えば、ゼラチン誘導体に低温（例えば室温）の良溶媒を加えてゼラチン誘導体を膨潤させ、得られた膨潤体を加熱して、ゼラチン溶液を得る方法（膨潤溶解法）、及び予め加熱した上記良溶媒にゼラチン誘導体を投入し、ゼラチン溶液を得る方法（直接溶解法）を使用できる。
【００５３】
ゼラチン溶液中のゼラチン誘導体の含有量としては特に制限されないが、ゼラチン溶液の全体積に対して、ゼラチン誘導体の含有量（終濃度）が０．０１〜３０質量／体積％が好ましく、１〜２５質量／体積％がより好ましく、５〜２０質量／体積％が更に好ましく、５〜１５質量／体積％が特に好ましい。
ゼラチン溶液中におけるゼラチンの含有量が上記範囲内であると得られる粉体中における粒子の真球度の標準偏差がより小さくなり易い。
【００５４】
・工程２（析出工程）
工程２はゼラチン溶液に貧溶媒を加え、ゼラチン誘導体を含有する中間体粒子をゼラチン溶液中に析出させる工程である。
本明細書において、貧溶媒とは、工程１で使用した良溶媒と比較した場合に、ゼラチン誘導体をより溶解させ難い溶媒を意味する。すなわち、本明細書において、良溶媒、及び貧溶媒とは、ゼラチン誘導体の溶解度の絶対量により定義されるのではなく、それぞれ貧溶媒及び良溶媒との関係で相対的に定義される。
【００５５】
貧溶媒としては、特に制限されないが、例えば、有機溶媒が挙げられ、中でも、水溶性の有機溶媒が好ましく、アルコール類、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、及びｔ−ブチルアルコール等がより好ましい。
【００５６】
ゼラチン溶液に貧溶媒を加えると、ゼラチン溶液中に中間体粒子が析出する。この中間体粒子は、上記ゼラチン誘導体を含有する粒子状物である。本工程において析出する中間体粒子の粒子径としては特に制限されないが、０．１〜１００μｍが好ましく、１〜５０μｍがより好ましく、１〜１０μｍが更に好ましい。
【００５７】
粒子径が上記範囲内であると、ゼラチン溶液中で析出した中間体粒子がより沈降しにくく、後述する工程３において上記中間体粒子を含むゼラチン溶液ごと凍結させ、更に凍結乾燥させた場合に中間体粒子同士が凝集するのがより抑制されやすい。その結果、工程４において得られる粒子の真球度等が所望の範囲内になり易い。
【００５８】
貧溶媒を加える際の温度としては特に制限されないが、一般に１０〜３０℃が好ましく、１５〜２５℃がより好ましい。工程１において、溶媒を加熱してゼラチン誘導体を溶解させた場合には、工程１及び工程２の間に、ゼラチン溶液を冷却する工程を更に有することが好ましい。
【００５９】
貧溶媒を滴下する際、ゼラチン溶液を撹拌することが好ましい。撹拌の方法としては特に制限されず、公知の方法が使用できる。ゼラチン溶液を撹拌しながら貧溶媒を加えることにより、析出する粒子がより凝集しにくく、かつ、より沈降しにくい。その結果として、所望の特性を有する粒子を含有する粉体がより簡便に得られやすい。
【００６０】
・工程３（乾燥工程）
工程３は、上記コアセルベーションにより析出後の未架橋ゼラチン粒子の分散溶液を凍結乾燥させ、未架橋ゼラチン誘導体を含有する粒子を含む中間粉体を得る工程である。
ゼラチン溶液の凍結の方法としては特に制限されないが、凍結させる際に未架橋ゼラチン誘導体を含有する粒子の凝集をより発生し難くする観点から、より急速に凍結させることが好ましい。この際、凍結させる際の雰囲気温度としては特に制限されないが、−２０℃以下が好ましく、−３０℃以下がより好ましい。
また、凍結乾燥の方法としては特に制限されず、公知の方法が使用できる。
【００６１】
中間粉体は、中間体粒子を含む粉体である。中間粉体は中間体粒子以外の成分を含んでもよい。このような成分としては、例えば、上記良溶媒、及び貧溶媒等が挙げられる。
【００６２】
・工程４（架橋工程）
工程４は、中間体粒子のゼラチン誘導体を架橋させて、架橋されたゼラチン誘導体を含有する粉体を得る工程である。本工程を経て、粒子のゼラチン誘導体が不可逆的に分子間、及び／又は分子内で架橋する。その結果、架橋されたゼラチン誘導体を含有する粒子を含む粉体が得られる。
【００６３】
架橋の方法としては特に制限されないが、例えば、ゼラチン誘導体に、熱エネルギーを付与し、又は活性光線若しくは放射線（例えば、電子線等）等を照射する方法が挙げられる。
なかでも、より容易にゼラチン誘導体の架橋物が得られ、架橋剤に由来する不純物の発生が無く安全な点で、熱エネルギーを付与する（言い換えれば加熱する）方法が好ましい（熱架橋）。この方法では、例えば、ゼラチン誘導体中のアミノ基とその他の反応性基（例えば、カルボキシ基、及びメルカプト基等）が反応し、架橋構造が形成される。
【００６４】
熱架橋の方法としては特に制限されず公知の方法が使用できる。熱架橋の方法としては、例えば、粉体前駆体が収容された容器を、容器ごと加熱雰囲気（例えば、オーブン内）に配置し、所定の時間維持する方法が挙げられる。
【００６５】
熱架橋の際の加熱温度としては特に制限されないが、一般に、８０〜２００℃が好ましく、１００〜２００℃がより好ましい。
熱架橋の際の加熱時間としては特に制限されないが、一般に、０．１〜２０時間が好ましく、０．５〜１０時間がより好ましく、１〜６時間が更に好ましく、２〜５時間がより更に好ましく、２．５〜４時間が特に好ましい。
加熱時間が上記数値範囲内であると、得られる粉体は、より優れた接着性が得られやすい。
【００６６】
また、ゼラチン誘導体の架橋物は、ゼラチン誘導体と、架橋剤とを反応させて得られたものであってもよい。架橋剤としては特に制限されないが、ゲニピン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−スルホキシスクシンイミドで活性化された多塩基酸、アルデヒド化合物、酸無水物、ジチオカーボネート、及びジイソチオシアネート等が挙げられる。
架橋剤としては、例えば、国際公開第２０１８／０７９５３８号の００２１〜００２４段落に記載された化合物も使用でき、上記内容は本明細書に組み込まれる。
【００６７】
・工程５（粒子表面の親水性化工程）
工程５は、架橋されたゼラチン誘導体を含有する粒子に、更に、紫外線を照射し、粒子の表面を親水性化する工程である。この紫外線照射による表面処理により、粒子と水滴との接触角が小さく成り、水分の存在下でより膨潤し易くなる。他方、乾燥状態で組織と接触させれば、紫外線照射後の粒子は、依然優れた接着性を有する。
紫外線照射の条件については、特に制限は無いが、通常、１時間〜１０時間の間で照射し、より好ましくは２時間〜８時間の間で照射し、更に好ましくは３時間〜６時間の間で照射する。紫外線強度は０．０５〜５０ｍＷ／ｃｍ２が好ましく、０．５〜１０ｍＷ／ｃｍ２がより好ましい。また、紫外線積算光量は、１〜１００Ｊ／ｃｍ２が好ましく、５〜１００Ｊ／ｃｍ２がより好ましい。
紫外線照射装置については特に制限はなく、市販の紫外線照射装置を用いてもよい。
なお、照射中は、粒子にむらなく紫外線が照射されるように、一定時間で（例えば、３０分毎に）粒子を混ぜることが好ましい。また、紫外線照射後は、粒子表面が親水性になっているので、保存する際は、除湿剤の存在下など、乾燥した雰囲気で保存することが好ましい。
【００６８】
＜粉体の用途＞
本発明の実施形態に係る粉体は、創傷被覆材として使用可能である。創傷被覆材としては特に制限されないが、呼吸器外科（特に肺がん手術後の創部）、消化器外科、心臓血管外科、口腔外科、及び、消化器内科等の外科手術における切開口、及び、皮膚創傷等に適用することができる。
ＥＳＤ（Ｅｎｄｏｓｃｏｐｉｃ  Ｓｕｂｍｕｃｏｓａｌ  Ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）の場合、止血鉗子、ステント、バルーン、及び、内視鏡等によって、ドライの状態で適用することができる。適用量は適用部位、創傷に依存して適宜調整することができる。
また、本発明の実施形態に係る粉体は、創傷被覆効果を発揮した後は創傷治癒に伴い速やかに分解吸収されるという特長を有する。
【００６９】
また、本粉体は、癒着防止材としても使用可能である。（術後）癒着とは、外科手術などで損傷した生体組織が修復する過程において起きる現象である。本粉体を含有する癒着防止材は患部に噴霧することで、適用部位の組織表面に接着してゲル状被膜を形成し、これが物理的隔壁となり、癒着防止効果を奏する。更に、癒着防止効果を発揮した後は、このゲル状被膜は速やかに分解吸収されるという特長を有する。
【００７０】
また、本発明の実施形態に係る粉体は、創傷被覆、及び癒着防止の２つの機能を有する部材の形成用としても使用できる。例えば、術後の損傷部に適用すれば、創傷被覆効果と癒着防止効果とを有する膜が形成される。
従来、創傷被覆材と癒着防止材とを別々に適用していたのと比較して、より簡便に両者を達成できる。
【００７１】
また、本発明の実施形態に係る粉体は、血液凝固能に優れ、止血材として使用可能である。創傷被覆、及び癒着防止という機能に加え、血液凝固能を有する部材の形成用としても使用できる。
【実施例】
【００７２】
以下に実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。したがって、本発明の範囲は以下に示す実施例により限定的に解釈されるべきものではない。【００７３】
［ゼラチン誘導体の調製（１）］
ゼラチン誘導体「７６．８Ｃ６ ＡｐＧｔｌｎ」を以下の手順により調製した。
スケソウダラ由来のアルカリ処理ゼラチン（Ｍｗ＝３１０００、「ビーマトリックスフィッシュゼラチンＴＡ（商品名）」、新田ゼラチン（株）製、後述の方法で測定されるアミノ基量：３２４μｍｏｌ／ｇ、以下「Ｏｒｇ  ＡｐＧｌｔｎ」ともいう。）１０ｇを、５０℃のオイルバスに浸したナス型フラスコ中の超純水−エタノール混合溶媒５０ｍＬに加え、２時間程度撹拌しながら溶解して２０質量％水溶液を調製した。
次に、得られた水溶液に、ヘキサナールの１．５倍当量のピコリンボラン（純正化学（株）製）を加えた後、ヘキサナール（東京化成工業（株）製）を、ゼラチンのアミノ基に対する２倍当量（ゼラチンのアミノ基１モルに対するヘキサナールのモル比）添加した。【００７４】
次に、ナス型フラスコに還流冷却器を取り付け、攪拌しながら５０℃で１７時間反応させた。
次に、反応溶液を１Ｌのエタノールに滴下し再沈殿させた。１時間攪拌後、冷凍庫にて１時間静置した後、ガラスフィルターでろ過した。ろ過残渣を、再びビーカー中の１Ｌのエタノールに入れ再沈殿させ、１時間攪拌後、冷凍庫にて１時間静置した。再びガラスフィルターでろ過した後、ろ過残渣を減圧乾燥器で一晩以上乾燥させ、ヘキシル基が導入されたゼラチン誘導体を９１％の収率で得た。【００７５】
得られたゼラチン誘導体における、ヘキシル基の導入率を以下の手法によって求めた。
まず、原料ゼラチン、及びゼラチン誘導体をそれぞれ０．１質量／体積％で水・ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）混合溶媒（体積比１：１、以下同様）に溶解し、４８ウェルプレートに１００μＬ分注した。
そこへ水・ＤＭＳＯ混合溶媒に溶解した０．１体積／体積％のトリエチルアミン（ＴＥＡ、ナカライテスク社製）を１００μＬ加え、プレートシェーカーで４００ｒｐｍ、１分間撹拌した。更に、水・ＤＭＳＯ混合溶媒に溶解した０．１質量／体積％トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ、和光純薬（株）製）を１００μＬ加え、プレートシェーカーで４００ｒｐｍ、１分間撹拌した。アルミホイルで遮光し、３７℃のインキュベーター内で２時間静置した後、インキュベーターから取り出し６ＮＨＣｌを５０μＬ加えて反応を停止し、プレートシェーカーで４００ｒｐｍ、１分間撹拌した。
次に、遮光して１０分間静置後、３４０ｎｍの吸光度（Ａｂｓ）を吸光度計（ＴＥＣＡＮ社製、Ｓｐａｒｋ １０Ｍ−ＮＭＳＴ）で測定した。測定された吸光度から、ゼラチンを含まない点でのみ異なるブランク試料の吸光度を引き、以下の計算式によって、ゼラチン誘導体のヘキシル基導入率が７６．８モル％であることを求めた。
導入率（モル％）＝［Ａｂｓ（原料ゼラチン）−Ａｂｓ（ゼラチン誘導体）］／［Ａｂｓ（原料ゼラチン）］×１００【００７６】
上記の方法により得られたゼラチン誘導体を「７６．８Ｃ６」とした。以下では、上記と同様にヘキサナールを用いて、又はヘキサナールに代えて、オクタナール、ヘプタナール、デカナール、及びドデカナールを用いて、種々の導入率となるよう仕込み比率を調整し、各ゼラチン誘導体を得た。なお、以下の実施例では、各ゼラチン誘導体について、「（疎水基の導入率）（誘導体化に使用したアルデヒドの炭素数）」により命名して表記している。例えば、「１０．６Ｃ６」である場合は、ヘキサナールを用いて、ヘキシル基の導入率が１０．６モル％であったことを示している。【００７７】
［粉体の調製（１）］
上記の方法により得られた各ゼラチン誘導体０．５ｇを目盛付きバイアル瓶（５０ｍＬ）に量り取り、ＭｉｌｌｉＱ（登録商標）水７．５ｍＬを添加した。
次に、５０℃水浴にて溶解後、ＭｉｌｌｉＱ水にて１０ｍＬにメスアップした。
この時、ゼラチン溶液中にけるゼラチン誘導体の含有量（終濃度）は、５質量／体積％とし、ゼラチン種、実験条件によって適宜変更した。【００７８】
次に、室温でスターラーバーを攪拌させながら、ゼラチン溶液が白濁するまでエタノール（ＥｔＯＨ）を滴下し、中間体粒子を含有するゼラチン溶液を得た。
次に、ゼラチン溶液を冷凍庫（−３０℃）で２時間以上静置した。次に、冷凍庫から取り出したバイアル瓶の口をキムワイプ（登録商標）で覆い、凍結乾燥して中間体粒子を含有する中間粉体を得た。得られた中間粉体を１５０℃にて６時間加熱して架橋させ、各粉体を得た。以下、本段落に記載の粉体の調製方法を、単に「方法Ａ−１」という。【００７９】
［粉体の調製（２）］
上記の方法により得られた各ゼラチン誘導体をゼラチン濃度が５質量／体積％となるよう、５０℃の水浴で加熱した水に溶解し、ゼラチン溶液を得た。次に、このゼラチン溶液をテトラフルオロエチレン製容器に流し込み、４０℃のヒーター上に載置し溶媒を乾燥させた。次に、得られた乾燥済みゼラチン溶液を粉砕機（Ｗｏｎｄｅｒ  Ｃｒｕｓｈｅｒ）で粉砕した。なお、粉砕の条件は、１サイクル（Ｓｐｅｅｄ５にて２０秒、Ｓｐｅｅｄ１０にて１分）を３回実施した。
この粉砕済み中間体粉体を上記と同様に加熱架橋し、粉体を得た。以下、本段落に記載の粉体の調製方法を、単に「方法Ｂ」という。【００８０】
［粉体の調製（３）］
上記の方法により得られた各ゼラチン誘導体をゼラチン濃度が６質量％となるよう、５０℃の超純水に溶解し、ゼラチン溶液を得た。次に、上記水溶液に同体積のエタノールを加え、ゼラチン濃度が３質量％となるよう希釈して希釈液を得た。次に、上記希釈液の温度を５０℃に維持し、スプレードライヤー装置（身にスプレードライヤー、Ｂ−２９０、ビュッヒ社製）に設置し、１８０℃で窒素ガスの流速４４０Ｌ／ｈ、希釈液の流速４１０ｍＬ／ｈとなるように調整し、中間体粒子を含有する中間粉体を得た。得られた中間粉体を上記と同様に加熱架橋し、粉体を得た。以下、本段落に記載の粉体の調製方法を、単に「方法Ｃ」という。【００８１】
ゼラチン誘導体「７６．８Ｃ６  ＡｐＧｌｔｎ」を用いて、「方法Ａ−１」により調製した粉体を例１とした。また、ゼラチン誘導体「７６．８Ｃ６  ＡｐＧｌｔｎ」を用いて「方法Ｂ」により調製した粉体を例２とした。
また、「Ｏｒｇ  ＡｐＧｌｔｎ」を用いて、「方法Ａ−１」により調製した粉体を例３とした。なお、いずれも架橋時間は６時間とした。【００８２】
原料ゼラチンとしてブタ皮膚由来のアルカリ処理ゼラチン（Ｍｗ＝１００，０００、ｂｅＭａｔｒｉｘ（商品名）、新田ゼラチン（株）製）を用いたこと以外は「ゼラチン誘導体の調製」にて説明した方法により調製したゼラチン誘導体「７５Ｃ８  ブタゼラチン」を用いて、「方法Ｃ」により調製した粉体を例４とした。【００８３】
得られた各粉体を、以下の方法により、走査型電子顕微鏡を用いて観察し、得られた画像から真球度、及び標準偏差を算出した。走査型電子顕微鏡像を図１〜４に、真球度、及び標準偏差の計算結果を表１に示した。なお、図１〜４はそれぞれ例１〜４に対応する。【００８４】
［走査型電子顕微鏡による観察（１）］
各例の粉体を、カーボンテープを貼った走査型電子顕微鏡ステージに振りかけ、その後、エアースプレーの噴霧によりカーボンテープに接着していない粉体を除いて作成した試料を走査型電子顕微鏡で観察した。【００８５】
［真球度、及び標準偏差の算出方法（１）］
・真球度
１視野から無作為に抽出した２０個の粒子について「ＩｍａｇｅＪ（ｖ１．５１）」を用いて横軸、及び縦軸（但し、縦軸≦横軸であり、横軸は最も大きな粒子径とし、縦軸は、横軸から９０度回転した位置の径とした）の長さを計測した。
次に、各粒子について「横軸／縦軸」を計算し、これを算術平均し、得られた値について小数第３位を四捨五入して小数第２位まで求め、これを真球度とした。【００８６】
・真球度の標準偏差
粉体中における粒子の真球度の標準偏差は、上記２０個の粒子の真球度から計算し、得られた計算値の小数第３位を四捨五入して、小数第２位まで求めた。【００８７】
【表１】
2020137903.tif 000003
【００８８】
表１に記載した結果から、方法Ａ−１により粉体を調製することにより、所望の真球度、及び標準偏差を有する粉体が得られることがわかった。【００８９】
［ブタ胃内壁組織との接着強度の測定試験（１）］
粉体とブタ胃内壁組織との接着強度を以下の方法により測定した。試験方法は、米国試験材料協会の規格（ＡＳＴＭ Ｆ−２２５８−０５）に従って行った。ブタ胃を開き、粘膜層を取り除いた。この際、生理食塩水を粘膜下組織へ注入し、隆起した部分を取り除くことで粘膜下組織をある程度残した状態で粘膜層のみを切除した。得られた組織を２．５ｃｍ四方の組織片へと裁断し、試験装置の上下の治具それぞれに瞬間接着剤を用いて固定した。ホットプレートを用いることで測定中のブタ胃内壁組織の温度を３７℃に保った。【００９０】
次に、上記組織表面の余分な水分を取り除くため、工業用紙ウエス（商品名「キムワイプ」）を押し付けて水分を取り除いた。次に、上記組織を５０Ｎで３分圧縮し、しみ出した水分を再度取り除いた。【００９１】
次に、組織上に１００ｍｇの粉体をのせた。上部の治具によって８０ｋＰａで３分間圧着した後、上部へと引っ張り上げることで接着力（ｋＰａ）を測定した。
次に、例３−１の粉体の接着力を１．０とし、例１と例２の粉体の接着力の比を求めた。結果を表２に示した。
【表２】
2020137903.tif 000004
【００９２】
表２中、例１〜例３−１は、表１中の例１〜例３−１とそれぞれ同一の粉体を示している。上記によれば、例１の粉体は、例２及び例３−１の粉体と比較して、組織へのより優れた接着力を有することがわかった。【００９３】
なお、上記と同様の試験をブタゼラチン（Ｍｗ：約４万、Ｌｏｔ  Ｎｏ．１８０４２５、新田ゼラチン社製、以下「Ｏｒｇ  ブタゼラチン」という。）を使って実施した。すなわち、上記ブタゼラチンを原料として、以下の例Ａ〜Ｃの粉体をそれぞれ調製した。
・例Ａ：Ｏｒｇ  ブタゼラチン、方法Ａ−１
・例Ｂ：７８．７Ｃ６  ブタゼラチン、方法Ａ−１
・例Ｃ：７８．７Ｃ６  ブタゼラチン、方法Ｂ【００９４】
上記について、接着強度比を算出したところ、例Ａを１．０としたとき、例Ｃは０．７で例Ｂは１．１であることがわかった。上記から、原料ゼラチンの由来によらず、同様の結果が得られることがわかった。【００９５】
［ゼラチン誘導体の調製（２）］
オクタナール（東京化成工業（株）製）を、ゼラチンのアミノ基に対して２倍当量に相当する量をゼラチン溶液に混合した以外は、上記［ゼラチン誘導体の調製（１）］と同様にして、ゼラチン誘導体を調製した。また、上記［ゼラチン誘導体の調製（１）］と同様にして、デシル基の導入率を測定し、オクチル基の導入率が５７．７であることを確認した。以下では、得られたゼラチン誘導体を、ゼラチン誘導体「５７．７Ｃ８ ＡｐＧｔｌｎ」と称する。【００９６】
［粉体の調製（４）］
上記［ゼラチン誘導体の調製（２）］で得られたゼラチン誘導体を用いて、「方法Ａ−１」と同様にして粉体を調製した。この方法で得られた粉体を例５とした。【００９７】
［ゼラチン誘導体の調製（３）］
デカナール（東京化成工業（株）製）を、ゼラチンのアミノ基に対して２倍当量に相当する量をゼラチン溶液に混合した以外は、上記［ゼラチン誘導体の調製（１）］と同様にして、ゼラチン誘導体を調製した。また、上記［ゼラチン誘導体の調製（１）］と同様にして、デシル基の導入率を測定し、デシル基の導入率が４６．１であることを確認した。以下では、得られたゼラチン誘導体を、ゼラチン誘導体「４６．１Ｃ１０ ＡｐＧｔｌｎ」と称する。【００９８】
［粉体の調製（５）］
上記［ゼラチン誘導体の調製（３）］で得られたゼラチン誘導体を用いて、「方法Ａ−１」と同様にして、或いは加熱架橋を１時間又は３時間行った以外は、「方法Ａ−１」と同様にして粉体を調製した。熱架橋時間を変更したこれらの方法を「方法Ａ−２」及び「方法Ａ−４」といい、得られた粉体をそれぞれ例６−１、例６−２及び例６−３とした。【００９９】
［ゼラチン誘導体の調製（４）］
ドデカナール（東京化成工業（株）製）を、ゼラチンのアミノ基に対して２倍当量に相当する量をゼラチン溶液に混合した以外は、上記［ゼラチン誘導体の調製（１）］と同様にして、ゼラチン誘導体を調製した。また、上記［ゼラチン誘導体の調製（１）］と同様にして、ドデシル基の導入率を測定し、ドデシル基の導入率が４８．６であることを確認した。以下では、得られたゼラチン誘導体を、ゼラチン誘導体「４８．６Ｃ１２ ＡｐＧｔｌｎ」と称する。【０１００】
［粉体の調製（６）］
上記［ゼラチン誘導体の調製（４）］で得られたゼラチン誘導体を用いて、「方法Ａ−１」と同様にして粉体を調製した。この方法で得られた粉体を例７とした。【０１０１】
［ブタ胃内壁組織との接着強度の測定試験（２）］
例３−１、例１、及び例５〜７の各粉体とブタ胃内壁組織との接着強度を米国試験材料協会の規格（ＡＳＴＭ Ｆ−２２５８−０５）に従って測定した。試験方法の詳細は、［ブタ胃内壁組織との接着強度の測定試験（１）］に記載した通りである。【０１０２】
［ゲル層断面積測定試験］
粉体のゲル層の断面積を以下の方法で測定した。食道粘膜下組織の表面の２．５ｃｍ×２．５ｃｍあたりに、測定対象とする粉体を１００ｍｇ噴霧し、３７℃で４８時間保持して、組織表面にゲルを形成した。ゲルを中性緩衝ホルマリンにより固定して固定済みゲルを得た。固定済みゲルを位相差顕微鏡で観察し、位相差顕微鏡像から固定済みゲルの幅と厚みを計測し、断面積を平方ミリメートル単位で算出した。試験は３回実施し、それらの算術平均値をゲル層の断面積とした。
結果を表３に示した。【０１０３】
好ましい実施形態では、ゲル層の断面積は、ヘマトキシリン-エオジン染色等の色素を用いてゲルを視認容易な状態にして測定する。一例として、ゲル層の断面積は、以下の方法で測定してもよい。食道粘膜下組織の表面の２．５ｃｍ×２．５ｃｍあたりに、測定対象とする粉体を１００ｍｇ噴霧し、３７℃で４８時間保持して、組織表面にゲルを形成した。ゲルを中性緩衝ホルマリンにより固定して固定済みゲルを得て、固定済みゲルをヘマトキシリン-エオジン染色して染色済みゲルを得た。染色済みゲルを位相差顕微鏡（断面像）で観察し、位相差顕微鏡像を「ＩｍａｇｅＪ（ｖ１．５１）」により二値化して平方ミリメートル単位でゲル層の断面積を算出した。この試験を３回実施し、それらの算術平均値をゲル層の断面積とした。
なお、位相差顕微鏡像の例を図５に示した。図５におけるスケールバーは、上段が１ｍｍ、それぞれの一部拡大図である下段が１００μｍを示している。【０１０４】
図５において１ｈ、３ｈ、６ｈとあるのは、表３における例６−２（１ｈ）、例６−３（３ｈ）、例６−１（６ｈ）に対応している。上段は断面像、下段は一部拡大図を示している。図５の結果から、例６−３は、例６−２及び例６−１と比較してより、緻密なゲルが形成され、ゲル層の断面積がより大きいことがわかった。【０１０５】
ゲル層の断面積がより大きいことは、粉体により形成されるゲル層が湿潤環境下（水中）においてもより残存しやすいことを意味し、粉体が創傷に適用された際にも、創傷を常にゲル層（膜）が覆っていることになり、より持続的な接着力が得られるものと推測される。これにより、創傷が治癒するための細胞の増殖・遊走の足場を提供するというより優れた効果も有する。
図５の結果からは、架橋条件を制御することにより、ゲル層の面積を制御可能であることがわかった。【０１０６】
【表３】
2020137903.tif 000005
【０１０７】
なお、例３−１、例１、例５、例６−１〜例６−３及び例７の粉末は、中間粉体を１５０℃、１〜６時間の条件で架橋して得られたものであり、得られた粉体における真球度は、いずれも１．４５以下であり、標準偏差は０．２５以下であった。【０１０８】
表３に示した結果から、例１、例５、例６−１〜例６−３及び例７の粉体は、例３−１の粉体と比較して、いずれも優れた接着強度を有していた。
なかでも、Ｒ２が水素原子であって、Ｒ１のアルキル基の炭素数が７以上である例５の粉体は、例１の粉体と比較してより優れた接着力を有していた。
また、Ｒ２が水素原子であって、Ｒ１のアルキル基の炭素数が９以上である例６−１の粉体は、例５の粉体と比較してより優れた接着力を有していた。
また、Ｒ２が水素原子であって、Ｒ１のアルキル基の炭素数が１１以下である、例６−１の粉体は、例７の粉体と比較してより優れた接着力を有していた。【０１０９】
また、ゲル層の面積が、０．０１０以上である例５、例６−１〜例６−３、及び例７の粉体は、ゲル層の面積が、０．０１０未満である例１の粉体と比較してより優れた接着力を有していた。
また、例６−１〜例６−３の比較から、架橋時間によってゲル層の面積が制御でき、ゲル層の面積が０．０３０ｍｍ２以上であることが好ましく、０．１１０ｍｍ２以上であることがより好ましく、０．１２０ｍｍ２以上であることが特に好ましいことがわかった。【０１１０】
［ゼラチン誘導体の調製（５）］
デカナール（東京化成工業（株）製）を、ゼラチンのアミノ基に対して２倍当量に相当する量をゼラチン溶液に混合した以外は、上記［ゼラチン誘導体の調製（１）］と同様にして、ゼラチン誘導体を調製した。また、上記［ゼラチン誘導体の調製（１）］と同様にして、デシル基の導入率を測定し、デシル基の導入率が３６．４であることを確認した。以下では、得られたゼラチン誘導体を、ゼラチン誘導体「３６．４Ｃ１０ ＡｐＧｔｌｎ」と称する。【０１１１】
［粉体の調製（７）］
上記［ゼラチン誘導体の調製（５）］で得られたゼラチン誘導体を用いて、「方法Ａ−４」（加熱架橋を３時間）と同様にして粉体を調製した。この方法で得られた粉体を例８とした。
また、「Ｏｒｇ  ＡｐＧｌｔｎ」を用いて、「方法Ａ−４」により調製した粉体を例３−２とした。【０１１２】
［ＵＶ照射による表面処理（１）］
［粉体の調製（７）］で得られた例８及び３−２の粉体をガラスシャレーに入れて、ＵＶ照射ボックス（物質・材料研究機構にて作成）に静置し、３０分毎に粒子を混ぜながら、１時間、２時間および４時間の異なる時間、１８５ｎｍおよび２５４ｎｍの紫外線（線源：ＵＶランプMIYATA ELEVAM Inc.製)を、常温で照射し、粒子の表面処理を行った。得られた粉体を、それぞれ、例８（Ｕ１）、例８（Ｕ２）、例８（Ｕ４）、例３−２（Ｕ１）、例３−２（Ｕ２）、及び例３−２（Ｕ４）とした。また、対象として、ＵＶ照射をしない粉体を、それぞれ例８（Ｕ０）及び例３−２（Ｕ０）とした。【０１１３】
［水との接触角の測定（１）］
例８（Ｕ１）、例８（Ｕ２）、例８（Ｕ４）、例３−２（Ｕ１）、例３−２（Ｕ２）、及び例３−２（Ｕ４）の各粉体について、水接触角を水滴法で測定して表面処理による効果を評価した。
各粉体２０ｍｇを、１．５ｃｍ×１ｃｍの両面テープ上に平坦になるように載せ、イオン交換水１μｌを滴下し、滴下後１秒の時点から０．５秒毎に水滴の側面から水滴の形状を１０枚の写真を撮影し、水滴の形状が一定になった滴下後５秒の時点で撮影された水滴の形状から接触角を測定し、平均値（ｎ＝１０）を求めた。
図６は、滴下後５秒時点の水滴の像及び接触角を示すグラフである。図６に示す通り、ＵＶ照射による表面処理により、架橋されたゼラチン及び架橋されたゼラチン誘導体の粉体は、いずれも接触角が小さくなった。また、架橋されたゼラチン誘導体の粒子では、ＵＶ照射時間が長くなるにつれ、接触角が小さく成り、４時間ＵＶ照射された粉体では、疎水基が導入されていない架橋ゼラチンと同レベルの接触角となった。【０１１４】
［ブタ胃内壁組織との接着強度の測定試験（３）］
例８（Ｕ１）、例８（Ｕ２）、例８（Ｕ４）、例３−２（Ｕ１）、例３−２（Ｕ２）、及び例３−２（Ｕ４）の各粉体とブタ胃内壁組織との接着強度を米国試験材料協会の規格（ＡＳＴＭ Ｆ−２２５８−０５）に従って測定した。試験方法の詳細は、［ブタ胃内壁組織との接着強度の測定試験（１）］に記載した通りである。図７に試験結果を示す。
例８（Ｕ１）、例８（Ｕ２）及び例８（Ｕ４）の粒子並びに例３−２（Ｕ１）、例３−２（Ｕ２）、及び例３−２（Ｕ４）の粉体の何れも、ＵＶ照射による表面処理によって接着強度は影響を受けなかった。例８（Ｕ１）、例８（Ｕ２）及び例８（Ｕ４）の架橋されたゼラチン誘導体の粉体は、例の架橋されたゼラチンの粒子に対して約４倍の接着強度を示した。【０１１５】
［走査型電子顕微鏡による観察（２）］
例８（Ｕ０）、及び例８（Ｕ４）の粒子、並びに例３−２（Ｕ０）、及び例３−２（Ｕ４）の粉体を走査型電子顕微鏡で観察した。また、比較対象として、「方法Ａ−４」のプロセスにおける熱架橋前の３６．４Ｃ１０  ＡｐＧｔｌｎ及びＯｒｇ  ＡｐＧｌｔｎの中間粉体も走査型電子顕微鏡で観察した。顕微鏡で観察するための試料の調製は、＜走査型電子顕微鏡による観察（１）＞に記載の通りである。
図８に各粉体の顕微鏡像を示す。各像から理解される通り、熱架橋及びＵＶ照射による、粒子の形状及び大きさに対する影響は認められなかった。【０１１６】
［生理食塩水中での粒子の融合］
例８（Ｕ０）、及び例８（Ｕ４）の粒子、並びに例３−２（Ｕ０）、及び例３−２（Ｕ４）の各粉体１０ｍｇを２ｍｌチューブに入れ、３０℃の生理食塩水を２００μｌ添加した。ボルテックスで攪拌後３７℃の高温槽に各チューブを静置し、攪拌直後、攪拌後３０分、１時間および２時間の時間でチューブから生理食塩水中の粉体を取り出し、走査型電子顕微鏡で観察した。図９に、各粉体の各時間での顕微鏡像を示す。各像から理解される通り、３６．４Ｃ１０  ＡｐＧｔｌｎ粒子はＵＶ照射の有無にかかわらず、水環境で粒子が融合して膜を形成した。
参考として、微小孔デンプン球からなる局所止血材（商品名：バード  アリスタＡＨ、株式会社メディコン）について、同様の試験を行い、攪拌直後、攪拌後３０分、１時間、２時間、４時間及び２４時間にチューブから生理食塩水中の粉体を取り出し、走査型電子顕微鏡で観察した。図１０に、粉体の各時間での顕微鏡像を示す。各像から理解される通り、アリスタＡＨは、水環境でも球状を維持して粒子同士が融合せず、膜を形成しなかった。【０１１７】
［ブタ胃内壁組織との接着強度の測定（４）］
上記の通り生理食塩水で膨潤処理した各粉体とブタ胃内壁組織との接着強度を、米国試験材料協会の規格（ＡＳＴＭ Ｆ−２２５８−０５）に従って測定した。
試験方法は、組織上に１００ｍｇの粉体をのせた後、生理食塩水５０ｍｌ中に５分間浸漬し、その後、接着剤で試験装置の上下の治具に固定し、上部の治具によって５０Ｎで３分間圧着した後、上部へと引っ張り上げることで接着力を測定した。その他の点は、［ブタ胃内壁組織との接着強度の測定試験（１）］に記載の通りである。試験結果を図１１に示した。
図１１に示す通り、架橋されたゼラチン誘導体の粉体を更に紫外線照射による表面処理をした例８（Ｕ４）の粉体、および架橋されたゼラチン（疎水基の導入なし）の粉体を更に紫外線照射による表面処理をした例３−２（Ｕ４）の粉体のいずれも、生理食塩水に浸漬後の接着強度が低下した。特に、例８（Ｕ４）の粉体は、生理食塩水に浸漬しない場合に比べ、接着強度が１／４まで低下し、例３−２（Ｕ４）の粉体と同レベルになった。このような特性は、生体組織へ粉体を接着した後に粉体の露出面が他の組織へ癒着するのを低減することが期待される。【０１１８】
［水との接触角の測定（２）］
例８（Ｕ０）、及び例８（Ｕ４）の粒子、並びに例３−２（Ｕ０）、及び例３−２（Ｕ４）の各粉体について、水との接触角の経時的変化を測定した。
各粉体をデシケーター内で保存し、ＵＶ照射直後、２４時間後、及び４８時間後の各時点で水との接触角を測定した。試験方法は、前記［水との接触角の測定（１）］に記載の通りである。
図１２に、滴下後５秒後の水滴の像及び接触角を示す。図１２に示す通り、例８の粉体、及び例３−２の粉体とも、ＵＶ照射による表面処理により、接触角が小さくなり、特に例８の粉体では大幅接触角が小さくなった。一方、ＵＶ照射後の放置時間は、接触角に影響を及ぼさなかった。【０１１９】
［ゼラチン誘導体の調製（６）］
デカナール（東京化成工業（株）製）を、ゼラチンのアミノ基に対して２倍当量に相当する量をゼラチン溶液に混合した以外は、上記［ゼラチン誘導体の調製（１）］と同様にして、ゼラチン誘導体を調製し、９０％の収率でゼラチン誘導体を得た。また、上記［ゼラチン誘導体の調製（１）］と同様にして、デシル基の導入率を測定し、デシル基の導入率が４４．２モル％であることを確認した。以下では、得られたゼラチン誘導体を、ゼラチン誘導体「４４．２Ｃ１０ ＡｐＧｔｌｎ」と称する。【０１２０】
［粉体の調製（８）］
上記［ゼラチン誘導体の調製（６）］で得られたゼラチン誘導体を用いて、加熱架橋を１時間、２時間、又は３時間行った以外は、「方法Ａ−１」と同様にして粉体を調製した。この方法を「方法Ａ−２」「方法Ａ−３」及び「方法Ａ−４」といい、この方法で得られた粉体を例９、例１０及び例１１とした。【０１２１】
［ＵＶ照射による表面処理（２）］
［粉体の調製（８）］で得られた例９、例１０及び例１１の各粉体をガラスシャレーに入れて、ＵＶ照射ボックス（物質・材料研究機構にて作成）に静置し、３０分毎に粒子を混ぜながら、４時間、１８５ｎｍおよび２５４ｎｍの紫外線（線源：ＵＶランプ、MIYATA ELEVAM Inc.製)を、常温で照射し、粒子の表面処理を行った。ＵＶ照射した各粉体を例９（ＵＶ４）、例１０（ＵＶ４）及び例１１（ＵＶ４）と称し、ＵＶ照射しなかった各粉体を例９（ＵＶ０）、例１０（ＵＶ０）及び例１１（ＵＶ０）と称する。【０１２２】
［ブタ胃内壁組織との接着強度の測定試験（５）］
例９（ＵＶ４）、例１０（ＵＶ４）及び例１１（ＵＶ４）並びに例９（ＵＶ０）、例１０（ＵＶ０）及び例１１（ＵＶ０）の各粉体とブタ胃内壁組織との接着強度を米国試験材料協会の規格（ＡＳＴＭ Ｆ−２２５８−０５）に従って測定した。試験方法の詳細は、［ブタ胃内壁組織との接着強度の測定試験（１）］に記載した通りである。図１３に試験結果を示す。
ＵＶ照射した架橋ゼラチン誘導体の粉体も、ＵＶ照射しなかった架橋ゼラチンの粉体も、熱架橋時間が長くなるにつれ、接着強度が大きくなる傾向が認められた。この傾向は、ＵＶ照射による表面処理をしていない、架橋ゼラチン誘導体の粉体でより大きかった。【０１２３】
［水との接触角の測定（３）］
例９（ＵＶ４）、例１０（ＵＶ４）及び例１１（ＵＶ４）、並びに例９（ＵＶ０）、例１０（ＵＶ０）及び例１１（ＵＶ０）の各粉体について、水との接触角を水滴法で測定した。試験方法は、［水との接触角の測定（１）］に記載の通りである。図１４は、各粉体について、滴下後５秒後の水滴の像及び水接触角を示す。図１４に示す通り、ＵＶ照射による表面処理を行った例９（ＵＶ４）、例１０（ＵＶ４）及び例１１（ＵＶ４）の粉体は、同処理を行わなかった例９（ＵＶ０）、例１０（ＵＶ０）及び例１１（ＵＶ０）の粉体に比べ、水接触角が小さく成り、粒子表面の濡れ性が増加していた。【０１２４】
［血液凝固能の評価］
例９（ＵＶ４）、例１０（ＵＶ４）及び例１１（ＵＶ４）並びに例９（ＵＶ０）、例１０（ＵＶ０）及び例１１（ＵＶ０）の各粉体について、血液凝固能を評価した。
クエン酸Ｎａを添加したブタ血液５００μｌを、３７度にあらかじめ温めておいたレオメーター（商品名：ＭＣＲ３０、ANTON PAAR GMBH社製）のステージに滴下し、血液に各粉体５０ｍｇ（粒子濃度１０ｗ／ｖ％）添加し、スパチュラで混和した。２分３０分後にレオメーターの測定を５分間、１ヘルツ、１％ひずみの条件下で開始して貯蔵弾性率（Ｇ’）を求めた。
試験結果を図１５に示す。ＵＶ照射による表面処理がされた又はされていない架橋ゼラチン誘導体の何れでも、熱架橋時間が長くなるにつれ、貯蔵弾性率（Ｇ’）が大きくなった。特に、ＵＶ照射による表面処理がされた架橋ゼラチン誘導体では、熱架橋時間が３時間の場合に貯蔵弾性率（Ｇ’）が著しく増大した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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