(57)【要約】  （１）ロッド型の凝集体を形成するα−シヌクレイン単量体を含有する溶液、および／または、ツイスト型の凝集体を形成するα−シヌクレイン単量体を含有する溶液を調製する工程、（２）（１）で調製したα−シヌクレイン単量体含有溶液に被験者の生体試料を添加する工程、（３）（２）で得られた溶液中でα−シヌクレイン単量体を凝集させる工程、および（４）（３）で形成されたα−シヌクレイン凝集体を検出する工程、を含むパーキンソン病と多系統萎縮症とを判別する方法。
2020162388.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
パーキンソン病と多系統萎縮症とを判別する方法であって、
（１）ロッド型の凝集体を形成するα−シヌクレイン単量体を含有する溶液、および／または、ツイスト型の凝集体を形成するα−シヌクレイン単量体を含有する溶液を調製する工程、
（２）（１）で調製したα−シヌクレイン単量体含有溶液に被験者の生体試料を添加する工程、
（３）（２）で得られた溶液中でα−シヌクレイン単量体を凝集させる工程、および
（４）（３）で形成されたα−シヌクレイン凝集体を検出する工程、
を含む方法。
【請求項２】
パーキンソン病または多系統萎縮症の診断を補助する方法であって、
（１）ロッド型の凝集体を形成するα−シヌクレイン単量体を含有する溶液、および／または、ツイスト型の凝集体を形成するα−シヌクレイン単量体を含有する溶液を調製する工程、
（２）（１）で調製したα−シヌクレイン単量体含有溶液に被験者の生体試料を添加する工程、
（３）（２）で得られた溶液中でα−シヌクレイン単量体を凝集させる工程、および
（４）（３）で形成されたα−シヌクレイン凝集体を検出する工程、
を含む方法。
【請求項３】
α−シヌクレインが、配列番号１で示されるアミノ酸配列と９５％以上同一のアミノ酸配列からなるα−シヌクレインである請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ロッド型の凝集体を形成するα−シヌクレイン単量体が、３０ｋＤａで分子量分画を行う限外ろ過膜を通過する画分に存在するα−シヌクレイン単量体であり、ツイスト型の凝集体を形成するα−シヌクレイン単量体が、３０ｋＤａで分子量分画を行う限外ろ過膜を通過しない画分に存在するα−シヌクレイン単量体である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
被験者の生体試料を、ロッド型の凝集体を形成するα−シヌクレイン単量体を含有する溶液に添加し、生体試料を添加しない対照と同時に前記工程（３）を開始したときに、生体試料を添加したほうが対照より早期にα−シヌクレイン凝集体の増幅が検出された場合に、被験者はパーキンソン病であると判定する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
被験者の生体試料を、ロッド型の凝集体を形成するα−シヌクレイン単量体を含有する溶液およびツイスト型の凝集体を形成するα−シヌクレイン単量体を含有する溶液にそれぞれに添加し、同時に前記工程（３）を開始したときに、ロッド型の凝集体を形成するα−シヌクレイン単量体を含有する溶液のほうが、ツイスト型の凝集体を形成するα−シヌクレイン単量体を含有する溶液より早期にα−シヌクレイン凝集体の増幅が検出された場合に、被験者はパーキンソン病であると判定する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
さらに、被験者の生体試料をロッド型の凝集体を形成するα−シヌクレイン単量体を含有する溶液に添加して増幅されたα−シヌクレイン凝集体が、ロッド型の凝集体であることを確認したときに、被験者はパーキンソン病であると判定する、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
被験者の生体試料を、ツイスト型の凝集体を形成するα−シヌクレイン単量体を含有する溶液に添加し、生体試料を添加しない対照と同時に前記工程（３）を開始したときに、生体試料を添加したほうが対照より早期にα−シヌクレイン凝集体の増幅が検出された場合に、被験者は多系統萎縮症であると判定する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
被験者の生体試料を、ロッド型の凝集体を形成するα−シヌクレイン単量体を含有する溶液およびツイスト型の凝集体を形成するα−シヌクレイン単量体を含有する溶液に同時に添加し、同時に前記工程（３）を開始したときに、ツイスト型の凝集体を形成するα−シヌクレイン単量体を含有する溶液のほうが、ロッド型の凝集体を形成するα−シヌクレイン単量体を含有する溶液より早期にα−シヌクレイン凝集体の増幅が検出された場合に、被験者は多系統萎縮症であると判定する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
被験者の生体試料をロッド型の凝集体を形成するα−シヌクレイン単量体を含有する溶液およびツイスト型の凝集体を形成するα−シヌクレイン単量体を含有する溶液に添加して生成したα−シヌクレイン凝集体が、どちらもツイスト型のα−シヌクレイン凝集体であったときに、被験者は多系統萎縮症であると判定する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１１】
パーキンソン病と多系統萎縮症とを判別するためのキット、または、パーキンソン病もしくは多系統萎縮症の診断を補助するためのキットであって、ロッド型の凝集体を形成するα−シヌクレイン単量体、および／または、ツイスト型の凝集体を形成するα−シヌクレイン単量体を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パーキンソン病と多系統萎縮症との判別方法および判別キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
パーキンソン病（Parkinson's disease、以下「ＰＤ」と略記する場合がある）や多系統萎縮症（multiple system atrophy、以下「ＭＳＡ」と略記する場合がある）は脳内にα−シヌクレインが凝集・蓄積し神経細胞死を起こすことが知られている。その凝集したα−シヌクレインは一部髄液中に漏れ出ており、髄液中の凝集したα−シヌクレインの量を測定できればＰＤやＭＳＡの診断に有用である。この概念を実現するために、これまで主に２つの方法が開発されてきた。【０００３】
１つは、凝集したα−シヌクレインのみを検出するＥＬＩＳＡ法である（非特許文献１）。ＰＤ患者と対照患者の比較で、ＰＤ患者の方が対照患者より凝集シヌクレインが多いことが示された。もう１つは、ＲＴ−ＱＵＩＣまたはＰＭＣＡ法と称される方法である（非特許文献２）。本方法は、試料中に含まれる微量の凝集したα−シヌクレインを、大腸菌で発現し精製した組換えα−シヌクレイン単量体と混合し、振盪や超音波などの刺激を加えることで、微量なシヌクレイン凝集体を増幅できる原理に基づく方法である。チオフラビンＴ（以下「ＴｈＴ」と略記する場合がある）が凝集したα−シヌクレインに結合して蛍光を発することを利用して、系にＴｈＴを加えておくことで、凝集体の量に応じて発する蛍光を計測することで定量することができる。その際、試料中に含まれるα−シヌクレイン凝集体の量が多いほど、ＴｈＴの蛍光増加速度は速くなるため、元の試料にどの程度のα−シヌクレイン凝集体が含まれていたかを推測できる。本方法を用いて、これまでＰＤ患者やＭＳＡ患者の髄液中には、対照患者より多くのα−シヌクレイン凝集体が含まれることが示された（非特許文献３、４）。【０００４】
これらの報告では、ＰＤ患者もＭＳＡ患者も等しく凝集曲線の促進効果があり、両者の判別はできないものであった。しかしながら、患者の治療方針の決定、予後の予測、さらには未だ根本的治療薬のないこれらの疾患に対する治験を行う際に、発症早期にＰＤとＭＳＡを判別することは極めて重要である。その実現には、病態の背景を反映する判別方法および判別キットの開発は極めて大きなニーズがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Tokuda et al. Neurology. 2010 Nov 16;75(20):1766-1772
【非特許文献２】Atarashi R et al. Nat Med. 2011 Feb;17(2):175-178.
【非特許文献３】Shahnawaz M et al. JAMA Neurol. 2017 Feb 1; 74(2);163-172
【非特許文献４】Fairfoul et al. Ann Clin Transl Neurol, 2016 Aug 28; 3（10）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、パーキンソン病と多系統萎縮症との判別方法を提供することを課題とする。また、本発明は、パーキンソン病と多系統萎縮症とを判別するためのキットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、上記の課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］パーキンソン病と多系統萎縮症とを判別する方法であって、（１）ロッド型の凝集体を形成するα−シヌクレイン単量体を含有する溶液、および／または、ツイスト型の凝集体を形成するα−シヌクレイン単量体を含有する溶液を調製する工程、（２）（１）で調製したα−シヌクレイン単量体含有溶液に被験者の生体試料を添加する工程、（３）（２）で得られた溶液中でα−シヌクレイン単量体を凝集させる工程、および（４）（３）で形成されたα−シヌクレイン凝集体を検出する工程、を含む方法。
［２］パーキンソン病または多系統萎縮症の診断を補助する方法であって、（１）ロッド型の凝集体を形成するα−シヌクレイン単量体を含有する溶液、および／または、ツイスト型の凝集体を形成するα−シヌクレイン単量体を含有する溶液を調製する工程、（２）（１）で調製したα−シヌクレイン単量体含有溶液に被験者の生体試料を添加する工程、（３）（２）で得られた溶液中でα−シヌクレイン単量体を凝集させる工程、および（４）（３）で形成されたα−シヌクレイン凝集体を検出する工程、を含む方法。
［３］α−シヌクレインが、配列番号１で示されるアミノ酸配列と９５％以上同一のアミノ酸配列からなるα−シヌクレインである前記［１］または［２］に記載の方法。
［４］ロッド型の凝集体を形成するα−シヌクレイン単量体が、３０ｋＤａで分子量分画を行う限外ろ過膜を通過する画分に存在するα−シヌクレイン単量体であり、ツイスト型の凝集体を形成するα−シヌクレイン単量体が、３０ｋＤａで分子量分画を行う限外ろ過膜を通過しない画分に存在するα−シヌクレイン単量体である、前記［３］に記載の方法。
［５］被験者の生体試料を、ロッド型の凝集体を形成するα−シヌクレイン単量体を含有する溶液に添加し、生体試料を添加しない対照と同時に前記工程（３）を開始したときに、生体試料を添加したほうが対照より早期にα−シヌクレイン凝集体の増幅が検出された場合に、被験者はパーキンソン病であると判定する、前記［１］または［２］に記載の方法。
［６］被験者の生体試料を、ロッド型の凝集体を形成するα−シヌクレイン単量体を含有する溶液およびツイスト型の凝集体を形成するα−シヌクレイン単量体を含有する溶液にそれぞれに添加し、同時に前記工程（３）を開始したときに、ロッド型の凝集体を形成するα−シヌクレイン単量体を含有する溶液のほうが、ツイスト型の凝集体を形成するα−シヌクレイン単量体を含有する溶液より早期にα−シヌクレイン凝集体の増幅が検出された場合に、被験者はパーキンソン病であると判定する、前記［１］または［２］に記載の方法。
［７］さらに、被験者の生体試料をロッド型の凝集体を形成するα−シヌクレイン単量体を含有する溶液に添加して増幅されたα−シヌクレイン凝集体が、ロッド型の凝集体であることを確認したときに、被験者はパーキンソン病であると判定する、前記［５］または［６］に記載の方法。
［８］被験者の生体試料を、ツイスト型の凝集体を形成するα−シヌクレイン単量体を含有する溶液に添加し、生体試料を添加しない対照と同時に前記工程（３）を開始したときに、生体試料を添加したほうが対照より早期にα−シヌクレイン凝集体の増幅が検出された場合に、被験者は多系統萎縮症であると判定する、前記［１］または［２］に記載の方法。
［９］被験者の生体試料を、ロッド型の凝集体を形成するα−シヌクレイン単量体を含有する溶液およびツイスト型の凝集体を形成するα−シヌクレイン単量体を含有する溶液に同時に添加し、同時に前記工程（３）を開始したときに、ツイスト型の凝集体を形成するα−シヌクレイン単量体を含有する溶液のほうが、ロッド型の凝集体を形成するα−シヌクレイン単量体を含有する溶液より早期にα−シヌクレイン凝集体の増幅が検出された場合に、被験者は多系統萎縮症であると判定する、前記［１］または［２］に記載の方法。
［１０］被験者の生体試料をロッド型の凝集体を形成するα−シヌクレイン単量体を含有する溶液およびツイスト型の凝集体を形成するα−シヌクレイン単量体を含有する溶液に添加して生成したα−シヌクレイン凝集体が、どちらもツイスト型のα−シヌクレイン凝集体であったときに、被験者は多系統萎縮症であると判定する、前記［１］または［２］に記載の方法。
［１１］パーキンソン病と多系統萎縮症とを判別するためのキット、または、パーキンソン病もしくは多系統萎縮症の診断を補助するためのキットであって、ロッド型の凝集体を形成するα−シヌクレイン単量体、および／または、ツイスト型の凝集体を形成するα−シヌクレイン単量体を含むキット。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、パーキンソン病と多系統萎縮症を簡便に判別することが可能となる。本発明の方法は、極めて早期の段階で両者を判別することが可能である点で極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】大腸菌を用いて作製した組換え野生型ヒトα−シヌクレインを精製し、各種フィルターを通した後にサイズ除去クロマトグラフィーに供した結果、および、得られた２つのピークの画分（低分子量画分：ＬＭＷ−ｓｙｎ、高分子量画分：ＨＭＷ−ｓｙｎ）をネイティブＰＡＧＥに供した結果を示す図である。
【図２】ＬＭＷ−ｓｙｎ溶液およびＨＭＷ−ｓｙｎ溶液にそれぞれチオフラビンＴ（ＴｈＴ）を添加して間歇的超音波照射（１分間照射９分間休止）を２４時間行い、経時的に蛍光を測定した結果、および、２４時間後に生成した凝集体を透過型電子顕微鏡で観察した結果を示す図である。
【図３】ＬＭＷ−ｓｙｎ溶液に、シードとして組換え野生型ヒトα−シヌクレインのロッド型凝集体およびツイスト型凝集体をそれぞれ添加し、さらにＴｈＴを添加して間歇的超音波照射（１分間照射９分間休止）を２４時間行い、経時的に蛍光を測定した結果を示す図である。
【図４】図３の実験において、２４時間後に生成した凝集体を透過型電子顕微鏡で観察した結果を示す図であり、（Ａ）はシードとしてロッド型凝集体を添加した結果、（Ｂ）はシードとしてツイスト型凝集体を添加した結果を示す図である。
【図５】ＨＭＷ−ｓｙｎ溶液に、シードとして組換え野生型ヒトα−シヌクレインのロッド型凝集体およびツイスト型凝集体をそれぞれ添加し、さらにＴｈＴを添加して間歇的超音波照射（１分間照射９分間休止）を２４時間行い、経時的に蛍光を測定した結果を示す図である。
【図６】図５の実験において、２４時間後に生成した凝集体を透過型電子顕微鏡で観察した結果を示す図であり、（Ａ）はシードとしてロッド型凝集体を添加した結果、（Ｂ）はシードとしてツイスト型凝集体を添加した結果を示す図である。
【図７】ＬＭＷ−ｓｙｎ溶液に、シードとしてＰＤ患者、ＭＳＡ患者およびジストニア患者から採取した髄液をそれぞれ添加し、さらにＴｈＴを添加して間歇的超音波照射（１分間照射９分間休止）を２４時間行い、経時的に蛍光を測定した結果を示す図である。
【図８】図７の実験において、シードとしてＰＤ患者およびＭＳＡ患者から採取した髄液をそれぞれ添加した場合の２４時間後に生成した凝集体を透過型電子顕微鏡で観察した結果を示す図である。
【図９】ＨＭＷ−ｓｙｎ溶液に、シードとしてＰＤ患者、ＭＳＡ患者およびジストニア患者から採取した髄液をそれぞれ添加し、さらにＴｈＴを添加して間歇的超音波照射（１分間照射９分間休止）を２４時間行い、経時的に蛍光を測定した結果を示す図である。
【図１０】図９の実験において、シードとしてＰＤ患者およびＭＳＡ患者から採取した髄液をそれぞれ添加した場合の２４時間後に生成した凝集体を透過型電子顕微鏡で観察した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
〔判別方法、診断補助方法〕
本発明は、パーキンソン病と多系統萎縮症とを判別する方法または判別を補助する方法を提供する。また、本発明は、パーキンソン病または多系統萎縮症の診断を補助する方法を提供する。本発明は、医師によるパーキンソン病および多系統萎縮症の判別、診断を補助するために使用することができる。本発明は、パーキンソン病であるか多系統萎縮症であるかについて、発症前や発症直後など臨床的な鑑別・診断が十分にできない患者においても診断・判別を補助することができる点で有用である。
【００１１】
本発明の方法は、以下の工程（１）〜（４）を含むものであればよい。
（１）ロッド型の凝集体を形成するα−シヌクレイン単量体を含有する溶液、および／または、ツイスト型の凝集体を形成するα−シヌクレイン単量体を含有する溶液を調製する工程、
（２）（１）で調製したα−シヌクレイン単量体含有溶液に被験者の生体試料を添加する工程、
（３）（２）で得られた溶液中でα−シヌクレイン単量体を凝集させる工程、および
（４）（３）で形成されたα−シヌクレイン凝集体を検出する工程。
【００１２】
本発明で使用するα−シヌクレインは、天然のα−シヌクレインを精製したものであってもよく、遺伝子工学的に製造された組換えα−シヌクレインであってもよい。α−シヌクレインはどのような生物のα−シヌクレインであってもよく、哺乳動物のα−シヌクレインであってもよく、霊長類のα−シヌクレインであってもよく、ヒトのα−シヌクレインであってもよい。
【００１３】
本発明において、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるα−シヌクレインを好適に使用することができる。配列番号１で示されるアミノ酸配列はヒトα−シヌクレインの野生型アミノ酸配列であり、ＮＣＢＩ等の公知のデータベースにおいてアクセッション番号：NP_000336として登録されている。本発明において使用するα−シヌクレインは、配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一、９１％以上同一、９２％以上同一、９３％以上同一、９４％以上同一、９５％以上同一、９６％以上同一、９７％以上同一、９８％以上同一、９９％以上同一のアミノ酸配列からなるα−シヌクレインであってもよい。好ましくは、配列番号１で示されるアミノ酸配列と９５％以上同一のアミノ酸配列からなるα−シヌクレインである。このようなα−シヌクレインとして、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるマウスの野生型α−シヌクレイン（アミノ酸配列のアクセッション番号：NP_033247）、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるラットの野生型α−シヌクレイン（アミノ酸配列のアクセッション番号：NP_062042）、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるマーモセット（コモンマーモセット、Callithrix jacchus）の野生型α−シヌクレイン（アミノ酸配列のアクセッション番号：XP_008991227）などが挙げられる。
【００１４】
本発明において使用するα−シヌクレインは、配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して変異を有するアミノ酸配列からなるα−シヌクレインであってもよい。このようなα−シヌクレインは、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個または１４個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるα−シヌクレインであってもよい。
【００１５】
α−シヌクレインとして組換えα−シヌクレインを用いる場合、組換えα−シヌクレインは、公知の遺伝子組換え技術を適宜用いることにより製造することができる。すなわち、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（例えば、アクセッション番号：NM_000345の塩基配列のCDSを含むDNA）を公知の発現ベクターに挿入し、得られた発現ベクターを適切な宿主細胞に導入して組換えα−シヌクレインを発現させ、公知の精製方法を用いて精製することにより製造することができる。宿主細胞は特に限定されず、従来から組換えタンパク質の発現に用いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、枯草菌、酵母、植物、動物細胞などを用いることができる。
【００１６】
組換えα−シヌクレインは、精製を容易にするために、アフィニティータグを付加したものであってもよい。タグとしては、ＦＬＡＧタグ、ヒスチジンタグ、ｃ−Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＡＵ１タグ、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグ、蛍光タンパク質タグ（例えばＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ等）、イムノグロブリンＦｃタグなどが挙げられる。タグ配列が付加される位置は、α−シヌクレインポリペプチドのＮ末端であってもよく、Ｃ末端であってもよい。また、アフィニティータグを付加した組換えα−シヌクレインは、本発明にそのまま使用してもよく、アフィニティータグを切り離してから使用してもよい。
【００１７】
本発明では、単量体α−シヌクレインを使用する。α−シヌクレインが単量体であることは、例えば、ネイティブＰＡＧＥに供して、α−シヌクレインの分子量の位置に単一のバンドが現れること、または質量分析による分子量の測定、または分析的超遠心により、確認することができる。
【００１８】
ロッド型の凝集体を形成するα−シヌクレイン単量体（以下、「ロッド型単量体」と記載する場合がある）とは、α−シヌクレイン単量体溶液に、凝集を誘導する凝集体（いわゆるシード）を添加せずに、超音波照射や振盪により凝集体を形成させた際、ロッド型の凝集体が形成されるα−シヌクレイン単量体を意味する。ロッド型の凝集体とは、凝集体を透過電子顕微鏡で観察したときに、目視上捻じれがなくまっすぐな形状が観察されるものをいう。
【００１９】
ツイスト型の凝集体を形成するα−シヌクレイン単量体（以下、「ツイスト型単量体」と記載する場合がある）とは、α−シヌクレイン単量体溶液に、凝集を誘導する凝集体（いわゆるシード）を添加せずに、超音波照射や振盪により凝集体を形成させた際、ツイスト型の凝集体が形成されるα−シヌクレイン単量体を意味する。ツイスト型の凝集体とは、凝集体を透過電子顕微鏡で観察したときに目視上捻じれがある形状が観察されるものをいう。ツイスト型の凝集体はネガティブ染色で白・黒の周期的な色調変化が確認できるものであってもよい。
【００２０】
工程（１）において、α−シヌクレイン単量体溶液の調製に用いる緩衝液は、一定範囲のｐＨを維持できるものであれば特に限定されず、各種緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、トリス塩酸緩衝液、トリス緩衝生理食塩水、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液等）であってもよい。緩衝液は、ＨＥＰＰＳＯ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸））、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン−１，４−ビス−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）無水物）、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸）、ＨＥＰＰＳ（ＥＰＰＳ）（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−プロパンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−２−アミノエタンスルホン酸）およびその組合せによるものであってもよい。好ましくは、ＨＥＰＥＳが用いられる。緩衝液のｐＨは、６．５〜８．５、７．０〜８．０、７．２〜７．８、７．３〜７．７、７．４〜７．６、７．４〜７．５であってもよい。
【００２１】
緩衝液は塩を含んでいてもよい。塩としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、塩化アルミニウム、塩化リチウム、塩化ストロンチウム、塩化コバルト、塩化亜鉛、塩化鉄、塩化銅、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸アンモニウム、硝酸マグネシウム、硝酸ナトリウム、硝酸マグネシウム、硝酸アンモニウム、炭酸ナトリウム、炭酸マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、乳酸カルシウム等が挙げられる。塩濃度は、０．００１ｍＭ〜１Ｍ、０．１ｍＭ〜８００ｍＭ、１ｍＭ〜６００ｍＭ、１０ｍＭ〜５００ｍＭ、１００ｍＭ〜５００ｍＭ、２００ｍＭ〜４００ｍＭ、２５０ｍＭ〜３５０ｍＭであってもよい。
【００２２】
α−シヌクレイン単量体溶液におけるα−シヌクレイン単量体濃度は特に限定されず、０．０１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ〜０．８ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌ〜０．７ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ〜０．６ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌであってもよい。
【００２３】
工程（２）において、α−シヌクレイン単量体含有溶液に添加する生体試料は、生体から得られる試料であれば特に限定されないが、例えば、脳組織、皮膚組織、脳脊髄液（「髄液」と略記する場合がある）、血液、尿、唾液、便などを好適に使用することができる。組織を試料とする場合は、適切な緩衝液中で破砕するなどし、ホモジネートの状態にして供することが好ましい。血液を試料とする場合は、全血を用いてもよく、血漿を用いてもよく、血清を用いてもよく、細胞成分（赤血球、白血球、血小板など）を用いてもよい。生体試料は被験者から採取される。本発明の対象となる被験者はパーキンソン病または多系統萎縮症の発症が疑われる者であることが好ましい。
【００２４】
α−シヌクレイン単量体と生体試料との混合に使用される容器は特に限定されない。例えば、フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート（６、１２、２４、４８、９６穴マルチウェルプレート）、シャーレ、チューブ、トレイなどが挙げられる。
【００２５】
生体試料の添加量は、用いる生体試料に応じて適宜選択すればよい。例えば、事前に予備検討を行って最適な添加量を決定してもよい。また、生体試料を適切な緩衝液で希釈して作製した希釈系列を用いてもよい。生体試料として脳脊髄液を用いる場合、脳脊髄液の原液濃度として、０．１（v/v）％〜１０（v/v）％、０．５（v/v）％〜９（v/v）％、１（v/v）％〜８（v/v）％、２（v/v）％〜７（v/v）％、３（v/v）％〜６（v/v）％、４（v/v）％〜５（v/v）％であってもよい。
【００２６】
工程（３）は、被験者の生体試料を添加したα−シヌクレイン単量体溶液をインキュベーションすることにより行われる。工程（３）では、被験者の生体試料を添加せずにα−シヌクレイン単量体溶液のみをインキュベーションする対照を設けてもよい。インキュベーションは、通常３０℃〜４５℃で行われ、３２℃〜４２℃、３４℃〜４０℃、３６℃〜３８℃、３７℃であってもよい。
【００２７】
インキュベーション中、反応液を振盪してもよい。振盪には、例えば振盪培養器を用いることができる。振盪速度は特に限定されないが、例えば、２００ｒｐｍ〜１,２００ｒｐｍ、３００ｒｐｍ〜８００ｒｐｍ、４００ｒｐｍ〜５００ｒｐｍ、４２０ｒｐｍ〜４８０ｒｐｍであってもよい。
【００２８】
インキュベーション中反応液に超音波を照射してもよい。超音波照射には、例えば市販の超音波ホモジナイザー、超音波洗浄機などを用いることができる。
【００２９】
工程（３）では、振盪または超音波照射期間と休止期間を繰り返して、α−シヌクレインの凝集反応を行ってもよい。振盪を行う場合、３０秒振盪／３０秒休止、４５秒振盪／４５秒休止、６０秒振盪／６０秒休止、７０秒振盪／７０秒休止のサイクルであってもよい。超音波照射の場合、１０秒〜３分照射／３０秒〜１５分休止、３０秒〜２分照射／１分〜１２分休止、４５秒〜１分３０秒照射／３分〜２０分休止、１分照射／９分休止のサイクルであってもよい。
【００３０】
工程（３）に要する時間は、検出可能な凝集体が形成される時間であれば特に限定されない。２４時間以下、２０時間以下、１５時間以下、１２時間以下であってもよい。また、３時間以上、５時間以上、７時間以上、９時間以上であってもよい。
【００３１】
工程（４）で用いるα−シヌクレイン凝集体の検出方法は特に限定されず、公知のα−シヌクレイン凝集体の検出方法から適宜選択して用いることができる。具体的には、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、イムノクロマト法、ラテックス凝集法、放射免疫測定法（ＲＩＡ法）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）、ルミネッセンス免疫測定法、表面プラズモン共鳴測定法（ＳＰＲ法）、ウェスタンブロット法、電子顕微鏡法、蛍光顕微鏡法、蛍光分光法などが挙げられる。中でも、操作の容易性および迅速性の観点から、蛍光分光法が好適である。
【００３２】
蛍光分光法でα−シヌクレイン凝集体を検出する場合、生体試料とα−シヌクレインとを混合した反応混合液にアミロイド線維と結合して蛍光を発するようになる蛍光色素を添加して工程（３）を行う。形成された凝集体に蛍光色素が結合して蛍光を発するので、反応混合液に適切な波長の励起光を照射し、蛍光を分光光度計等で検出する。蛍光強度を測定すれば凝集体の量を定量することができ、生体試料に含まれる凝集体の含量を推測することができる。アミロイド線維と結合して蛍光を発するようになる蛍光色素としては、チオフラビンＴ（ＴｈＴ）、１−Ｂｒｏｍｏ−２，５−ｂｉｓ（３−ｃａｒｂｏｘｙ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｙｒｙｌ）ｂｅｎｚｅｎｅ、１−Ｆｌｕｏｒｏ−２，５−ｂｉｓ（３−ｃａｒｂｏｘｙ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｙｒｙｌ）ｂｅｎｚｅｎｅ、ＰｒｏｔｅｏＳｔａｔ（登録商標）アミロイド検出試薬などが挙げられる。
【００３３】
工程（４）におけるα−シヌクレイン凝集体の検出は、工程（３）における凝集体の形成が進行している間に行ってもよく、断続的に複数回行ってもよい。例えば、上記の振盪または超音波照射期間と休止期間を繰り返すサイクルの休止期間に、α−シヌクレイン凝集体の検出を行ってもよい。α−シヌクレイン凝集体の検出は、１サイクルごとに行ってもよく、２〜５サイクルごとに行ってもよく、不定期に行ってもよい。
【００３４】
ＰＤ患者の髄液を生体試料として本発明の方法を実施すると、以下の結果が得られることが確認されている（実施例１（５）参照）。
（Ｐ１）ロッド型単量体溶液にＰＤ患者髄液を添加し、ＰＤ患者髄液を添加していないロッド型単量体溶液（対照）と同時に凝集反応を開始すると、ＰＤ患者髄液を添加したほうが対照より早期にα−シヌクレイン凝集体の増幅が検出される。
（Ｐ２）ロッド型単量体溶液およびツイスト型単量体溶液にそれぞれＰＤ患者髄液を添加して同時に凝集反応を開始すると、ロッド型単量体溶液のほうがツイスト型単量体溶液より早期にα−シヌクレイン凝集体の増幅が検出される。
【００３５】
したがって、被験者の生体試料を本発明の方法に供した結果が、上記（Ｐ１）および／または（Ｐ２）であった場合は、被験者はＰＤであるまたはＰＤである可能性が高いと判定することができる。さらに、判定をより確実にするために、ロッド型単量体溶液に被験者の生体試料を添加して生成したα−シヌクレイン凝集体がロッド型の凝集体であることを電子顕微鏡観察で確認してもよい。加えて、ツイスト型単量体溶液被験者の生体試料を添加して生成したα−シヌクレイン凝集体がツイスト型の凝集体であることを電子顕微鏡観察で確認してもよい。
【００３６】
上記（Ｐ１）および（Ｐ２）の結果が得られ、さらに、ロッド型単量体溶液に被験者の生体試料を添加して生成したα−シヌクレイン凝集体がロッド型の凝集体あり、ツイスト型単量体溶液被験者の生体試料を添加して生成したα−シヌクレイン凝集体がツイスト型の凝集体であることの全てが確認できた場合に、被験者はＰＤであるまたはＰＤである可能性が高いと判定することが好ましい。
【００３７】
ＭＳＡ患者の髄液を生体試料として本発明の方法を実施すると、以下の結果が得られることが確認されている（実施例１（５）参照）。
（Ｍ１）ツイスト型単量体溶液にＭＳＡ患者髄液を添加し、ＭＳＡ患者髄液を添加していないロッド型単量体溶液（対照）と同時に凝集反応を開始すると、ＭＳＡ患者髄液を添加したほうが対照より早期にα−シヌクレイン凝集体の増幅が開始される。
（Ｍ２）ロッド型単量体溶液およびツイスト型単量体溶液にそれぞれＭＳＡ患者髄液を添加して同時に凝集反応を開始すると、ツイスト型単量体溶液のほうがロッド型単量体溶液より早期にα−シヌクレイン凝集体の増幅が検出される。
（Ｍ３）ロッド型単量体溶液およびツイスト型単量体溶液にそれぞれＭＳＡ患者髄液を添加して生成したα−シヌクレイン凝集体は、どちらもツイスト型の凝集体である。
【００３８】
したがって、被験者の生体試料を本発明の方法に供した結果が、上記（Ｍ１）、（Ｍ２）および（Ｍ３）のいずれか１つ以上であった場合は、被験者はＭＳＡであるまたはＭＳＡである可能性が高いと判定することができる。上記（Ｍ１）、（Ｍ２）および（Ｍ３）の２つ以上の場合に被験者はＭＳＡであるまたはＭＳＡである可能性が高いと判定することがより好ましく、（Ｍ１）、（Ｍ２）および（Ｍ３）の全部である場合に被験者はＭＳＡであるまたはＭＳＡである可能性が高いと判定することがさらに好ましい。
【００３９】
被験者の生体試料を本発明の方法に供した結果が、上記（Ｐ１）、（Ｐ２）、（Ｍ１）、（Ｍ２）および（Ｍ３）のいずれでもない場合は、被験者ＰＤおよびＭＳＡに罹患していない可能性高い、またはＰＤおよびＭＳＡ以外の疾患に罹患している可能性があると判定することができる。具体的には、ロッド型単量体溶液およびツイスト型単量体溶液にそれぞれ被験者の生体試料を添加して凝集反応を開始したときに、どちらも早期にα−シヌクレイン凝集体の増幅が検出されず、ロッド型単量体溶液ではロッド型の凝集体が生成し、ツイスト型単量体溶液ではツイスト型の凝集体が生成する場合である。
【００４０】
被験者がＰＤまたはＭＳＡの発症が疑われる者である場合に、上記（Ｐ１）、（Ｐ２）、（Ｍ１）、（Ｍ２）および（Ｍ３）のいずれでもない結果が得られた場合、当該被験者は、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、ジストニア、脊髄小脳変性症などである可能性が疑われる。それゆえ、本発明の方法は、ＰＤおよびＭＳＡの早期診断のみならず、それ以外の疾患の早期診断にも貢献することができる点で非常に有用である。
【００４１】
また、本発明の方法における工程（４）では、上記のとおり凝集体の量を定量することができ、生体試料に含まれる凝集体の含量を推測することができるので、本発明は、パーキンソン病および多系統萎縮症に対する疾患修飾療法の治療効果の判定にも好適に使用することができる。
【００４２】
〔キット〕
本発明は、上記本発明の方法を実施するためのキットを提供する。すなわち、本発明のキットは、ＰＤとＭＳＡとを判別するためのキットであってもよく、ＰＤまたはＭＳＡの診断を補助するためのキットであってもよい。本発明のキットは、ロッド型の凝集体を形成するα−シヌクレイン単量体およびツイスト型の凝集体を形成するα−シヌクレイン単量体のいずれか一方を含むものであればよく、両方を含むものであってもよい。α−シヌクレイン単量体はどのような状態のものでもよく、適当な緩衝液に溶解したα−シヌクレイン単量体溶液の状態であってもよく、α−シヌクレイン単量体溶液の凍結乾燥物の状態であってもよい。
【００４３】
上記α−シヌクレイン単量体以外のキットの構成は特に限定されず、例えば、反応用のチューブやマルチウェルプレート、プレートシール、標準曲線作成用人工フィブリル（ロッド型、ツイスト型）、取扱説明書等が含まれていてもよい。本発明のキットを使用することにより、上記本発明の方法を簡便かつ迅速に実施することができる。
【実施例】
【００４４】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００４５】
〔実施例１：野生型α−シヌクレイン単量体の構造多型を利用したパーキンソン病および多系統萎縮症の判別〕
（１）α−シヌクレインの精製
野生型ヒトα−シヌクレイン発現ベクターを導入した大腸菌BL21（DE3）（Yagi, H et al., J. Biol. Chem. 280, 38609-38616 (2005) 参照）を、定法に従い培養した。大腸菌を破砕し、Arakiらの方法（Araki, K et al., Sci Rep. 2016 Jul 29;6:30473. doi: 10.1038/srep30473.）に従ってα−シヌクレインを精製した。具体的には、リゾチームを添加して細胞膜成分を超音波破砕し、その後ストレプトマイシンを添加して核酸成分を取り除いた。さらに高温処理を行い多くの夾雑タンパク質を沈殿させた上で、硫酸アンモニア沈殿法でα−シヌクレインを精製した。さらに、イオン交換クロマトグラフィーでα−シヌクレインを精製した。野生型ヒトα−シヌクレインは、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるα−シヌクレインである。【００４６】
（２）サイズ除去クロマトグラフィーにおいて異なる通過性を示すα−シヌクレイン単量体の分離
上記（１）で精製したα−シヌクレインを、サイズ除去クロマトグラフィー（Size Exclusion Chromatography、以下「ＳＥＣ」と略記する）に供した。ＳＥＣには、ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ １００（GE Healthcare）クロマトグラフィーシステムおよびＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬ（GE Healthcare）カラムを用いた。トリス緩衝生理食塩水（150mM NaCl, 50mM Tris HCl, pH7.4）を用いて調製したα−シヌクレイン溶液を、流速１．０ｍＬ／分でカラムに供し、ＳＥＣを行った。【００４７】
結果を図１に示した。上記（１）で精製したα−シヌクレイン溶液をそのままＳＥＣに供すると、リテンションタイム２８分付近と、４０分付近に２つのピークが出現した（図１中、No Filter）。そこで、ろ過滅菌用フィルター（商品名：マイレクス−ＧＶ、ミリポア）および遠心式限外ろ過フィルターユニット（商品名：アミコンウルトラ、ミリポア）を用いて２つのピークの分離を試みた。以下、ＳＥＣにおいてリテンションタイム２８分付近にピークが出現するα−シヌクレイン単量体を「ＨＭＷ−ｓｙｎ」と称し、リテンションタイム４０分付近にピークが出現するα−シヌクレイン単量体を「ＬＭＷ−ｓｙｎ」と称する。【００４８】
図１からわかるように、２２０ｎｍのろ過滅菌用フィルター、１００ｋＤａの限外ろ過フィルターおよび５０ｋＤａの限外ろ過フィルターを通過した溶液をＳＥＣに供すると、いずれもフィルターを通していない溶液（No Filter）と同じ位置に２つのピークが出現した。一方、３０ｋＤａの限外ろ過フィルターを通過した溶液をＳＥＣに供すると、リテンションタイム４０分付近のピークのみが出現した。すなわち、リテンションタイム２８分付近にピークが出現するα−シヌクレインは３０ｋＤａの限外ろ過フィルターを通過しないことが明らかになった。さらに、リテンションタイム２８分付近のピークの画分と、４０分付近のピークの画分をそれぞれネイティブＰＡＧＥに供したところ、どちらもα−シヌクレイン単量体の分子量である約１４ｋＤａの位置に単一のバンドが出現した。【００４９】
（３）異なる構造のα−シヌクレイン凝集体形成
ＬＭＷ−ｓｙｎとＨＭＷ−ｓｙｎをそれぞれ３０ｋＤａの限外ろ過フィルターを用いて分離した。トリス緩衝生理食塩水（pH 7.4）を用いて０．５ｍｇ／ｍＬのＬＭＷ−ｓｙｎ溶液およびＨＭＷ−ｓｙｎ溶液を調製した。各溶液に終濃度１０μＭとなるようにＴｈＴを加え、超音波を１分間照射し９分間休止する間歇的超音波照射を２４時間行った。反応は３７℃で行い、照射休止ごとに蛍光光度計で蛍光を測定した。２４時間後に透過型電子顕微鏡で生成した凝集体を観察した。【００５０】
結果を図２に示した。（Ａ）がＬＭＷ−ｓｙｎ、（Ｂ）がＨＭＷ−ｓｙｎであり、上段は蛍光強度の経時的変化を示し、下段は透過型電子顕微鏡による観察結果を示す。ＬＭＷ−ｓｙｎおよびＨＭＷ−ｓｙｎとも、間歇的超音波照射により蛍光強度が増加し、凝集体の増幅が認められた。ＬＭＷ−ｓｙｎでは超音波照射開始直後から凝集体の増幅が認められたが、ＨＭＷ−ｓｙｎでは超音波照射開始から約４時間経過後に凝集体の増幅が認められた。透過型電子顕微鏡観察により、ＬＭＷ−ｓｙｎからはロッド型の凝集体が生成しており、ＨＭＷ−ｓｙｎからはツイスト型の凝集体が生成していることが確認された。以下、ＬＭＷ−ｓｙｎから生成したロッド型の凝集体を「凝集体Ａ」と称し、ＨＭＷ−ｓｙｎから生成したツイスト型の凝集体を「凝集体Ｂ」と称する。【００５１】
（４）クロスシード特異性の検証
α−シヌクレインを含むプリオン様タンパク質の凝集体には、その凝集体（シード）と反応する基質（単量体）の特異性が知られている。そこで、凝集体Ａおよび凝集体Ｂをそれぞれ含む上記反応生成物をシードとして、ＬＭＷ−ｓｙｎおよびＨＭＷ−ｓｙｎと反応させ、シードと基質の特異性を検証した。【００５２】
トリス緩衝生理食塩水（pH 7.4）を用いて０．５ｍｇ／ｍＬのＬＭＷ−ｓｙｎ溶液およびＨＭＷ−ｓｙｎ溶液を調製した。５％（v/v）となるように各シードを添加し、さらにＴｈＴを加えて、上記（３）と同様に、超音波を１分間照射し９分間休止する間歇的超音波照射を２４時間行った。反応は３７℃で行い、照射休止ごとに蛍光光度計で蛍光を測定した。２４時間後に透過型電子顕微鏡で生成した凝集体を観察した。【００５３】
ＬＭＷ−ｓｙｎの結果を図３および図４に示した。ＬＭＷ−ｓｙｎ溶液に凝集体Ａをシードとして添加すると速やかに凝集体Ａが増幅し、凝集体Ｂをシードとして添加すると速やかに凝集体Ｂが増幅した。すなわち、ＬＭＷ−ｓｙｎに対して、凝集体Ａおよび凝集体Ｂともシーディング効果が認められた。【００５４】
ＨＭＷ−ｓｙｎの結果を図５および図６に示した。ＨＭＷ−ｓｙｎ溶液に対して凝集体Ａをシードとして添加してもシーディング効果（速やかな凝集体の増幅）は認められなかった。最終産物は凝集体Ｂ（ツイスト型）であった。一方、凝集体Ｂをシードとして添加すると速やかに凝集体Ｂが増幅し、シーディング効果が認められた。【００５５】
（５）患者髄液を用いた検討
ＰＤ患者およびＭＳＡ患者からそれぞれ採取した髄液、ならびにα−シヌクレインの蓄積がない疾患であるジストニア患者から採取した髄液を、ＬＭＷ−ｓｙｎ溶液およびＨＭＷ−ｓｙｎ溶液にそれぞれ添加して、シーディング効果の有無および最終産物（凝集体）の形状を検討した。
トリス緩衝生理食塩水（pH 7.4）を用いて０．５ｍｇ／ｍＬのＬＭＷ−ｓｙｎ溶液およびＨＭＷ−ｓｙｎ溶液を調製した。５％（v/v）となるように各患者の髄液を添加し、さらにＴｈＴを加えて、上記（３）と同様に、超音波を１分間照射し９分間休止する間歇的超音波照射を２４時間行った。反応は３７℃で行い、照射休止ごとに蛍光光度計で蛍光を測定した。２４時間後に透過型電子顕微鏡で生成した凝集体を観察した。【００５６】
ＬＭＷ−ｓｙｎの結果を図７および図８に示した。ＬＭＷ−ｓｙｎ溶液にＰＤ患者の髄液を添加すると速やかに凝集体が増幅し、その最終産物はロッド型の凝集体（凝集体Ａ）であった。ＬＭＷ−ｓｙｎ溶液にＭＳＡ患者の髄液を添加した場合は速やかな凝集体の増幅は生じず、反応には時間を要した。最終産物はツイスト型の凝集体（凝集体Ｂ）であった。ジストニア患者の髄液を添加した場合は、ＭＳＡ患者の髄液を添加した場合より反応が遅かった。最終産物はロッド型の凝集体（凝集体Ａ）であった。【００５７】
ＨＭＷ−ｓｙｎの結果を図９および図１０に示した。ＨＭＷ−ｓｙｎ溶液にＭＳＡ患者の髄液を添加すると、ＰＤ患者の髄液を添加した場合より早く凝集体の増幅反応が始まった。ジストニア患者の髄液を添加した場合は、ＰＤ患者の髄液を添加した場合より反応が遅かった。いずれの髄液を添加した場合も、最終産物はツイスト型の凝集体（凝集体Ｂ）であった。【００５８】
以上の結果を表１に整理した。この結果から、パーキンソン病と多系統萎縮症の判別が可能であることが明らかになった。【００５９】
【表１】
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【００６０】
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【図１】
2020162388.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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