(57)【要約】  本発明は、スルホンアミドを非天然型インターヌクレオチド結合して有するオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）を合成し、これを鋳型として用いたＤＮＡ合成酵素反応によるＯＤＮの合成法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
2019150564.tif 000021
〔式中、
Ｂ1およびＢ2は、同一または異なる核酸塩基を表し；
Ｒ1は、式ＩＩ：
【化２】
2019150564.tif 000022
（式中、
ｍは、０以上の整数を表し；
Ｂmは、前記ｍの各整数に対応して同一または異なる核酸塩基を表し；および
Ｘは、水素原子、リン酸基、ピロリン酸基、またはトリリン酸基を表す）
で表される化合物であり；および
Ｒ2は、式ＩＩＩ：
【化３】
2019150564.tif 000023
（式中、
ｎは、０以上の整数を表し、ただし、ｍおよびｎは同時に０にはならない；および
Ｂnは、前記ｎの各整数に対応して同一または異なる核酸塩基を表す）
で表される化合物である〕
で表されるスルホンアミド骨格を有する化合物を鋳型鎖として用いて、ＤＮＡ合成酵素によりオリゴデオキシヌクレオチドを合成する方法。
【請求項２】
前記式Ｉで表される化合物を合成する方法をさらに含み、ここで、式ＩＶ：
【化４】
2019150564.tif 000024
〔式中、
Ｂ1およびＲ1は、式Ｉにおいて定義される通りである〕
で表される化合物と、式Ｖ：
【化５】
2019150564.tif 000025
〔式中、
Ｂ2およびＲ2は、式Ｉにおける定義の通りであり；および
Ｙは、アゾリル基を表す〕
で表される化合物とを反応させるステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記式Ｖで表される化合物を合成する方法をさらに含み、ここで、式ＶＩ：
【化６】
2019150564.tif 000026
〔式中、
Ｙは、アゾリル基を表し；
Ｚは、保護基を有してもよい核酸塩基を表し；
Ｒ3は、リン酸の保護基を表し；
Ｒ4およびＲ5は、同一または異なって、炭素数１〜６の直線状または分岐状のアルキル基を表し、あるいは
Ｒ4およびＲ5は、直接結合して環を形成し、または酸素原子、硫黄原子およびケイ素原子からなる群から１以上の原子を介して結合して環を形成してもよい〕
で表される化合物を出発原料として、ホスホロアミダイト法による核酸固相合成法もしくは液相合成法を用いて合成するステップを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
式Ｖ：
【化７】
2019150564.tif 000027
〔式中、
Ｒ2およびＢ2は、式Ｉにおける定義の通りであり；および
Ｙは、アゾリル基を表す〕
で表される化合物を製造するための、以下の式ＶＩ：
【化８】
2019150564.tif 000028
〔式中、
Ｙは、アゾリル基を表し；
Ｚは、保護基を有してもよい核酸塩基を表し；
Ｒ3は、リン酸の保護基を表し；
Ｒ4およびＲ5は、同一または異なって、炭素数１〜６の直線状または分岐状のアルキル基を表し、あるいは
Ｒ4およびＲ5は、直接結合して環を形成し、または酸素原子、硫黄原子およびケイ素原子からなる群から１以上の原子を介して結合して環を形成してもよい〕
で表される化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スルホンアミドを非天然型インターヌクレオチド結合して有するオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）を合成し、これを鋳型として用いたＤＮＡ合成酵素反応によるＯＤＮの合成法に関する。
【背景技術】
【０００２】
化学合成したオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）をＤＮＡ合成酵素、制限酵素、リガーゼを用いて連結し、人工遺伝子を合成する方法が合成生物学や分子生物学の分野で注目されている。しかし、この目的に用いることのできる、オリゴデオキシヌクレオチドは約１５０塩基が上限であり、これ以上長いオリゴヌクレオチドは不完全なカップリングとオリゴヌクレオチド合成時の副反応のため純度が低く、ＤＮＡ合成酵素やＰＣＲ法により複製すると、望まない配列を含む人工遺伝子の混合物が生成する。そこで、より長いＯＤＮを合成するための方法としてＤＮＡリガーゼやＲＮＡリガーゼなどの酵素を用いて短いＯＤＮ断片を連結する方法が古くから知られているが、これらの酵素法は大量合成へのスケールアップが困難である（非特許文献１および２）。【０００３】
そこで、このような酵素法に替わる方法として、３’末端に反応性残基を有する３’修飾ＯＤＮと５’末端に反応性残基を有する５’修飾ＯＤＮとを酵素を用いずに連結するケミカルライゲーション法が報告されている。このようにして合成した修飾ＯＤＮは天然型のリン酸ジエステル結合とは異なる非天然型のインターヌクレオチド結合を含むが、この修飾ＯＤＮを鋳型として、ＤＮＡ合成酵素により天然型ＯＤＮを合成することができれば、鎖長の長い天然型ＯＤＮの合成法として有用である。【０００４】
そのような修飾ＯＤＮとしては、例えば、Ｂｒｏｗｎらは、３’アジドＯＤＮと５’アルキンＯＤＮとを銅触媒の存在下クリック反応で連結して、ホスホジエステル結合の代わりにトリアゾール結合を有する修飾ＯＤＮを合成し、それを鋳型としてＰＣＲ反応をすることで天然型ＯＤＮを合成することを報告している（非特許文献１および２）。【０００５】
また、３’アジドＯＤＮと５’アルキンＯＤＮの代わりに、３’アジドオリゴリボヌクレオチド（ＯＲＮ）と５’アルキンＯＲＮを用いて、同様のケミカルライゲーションを行い、逆転写酵素により天然型ＯＤＮを合成する方法も報告されている（特許文献１)。しかしながら、これらの方法で使用されるクリック反応においては、反応の進行に銅イオンが触媒として用いられているため、合成した天然型ＯＤＮを生物学的用途に用いる場合、銅イオンを完全に取り除く必要がある。そこで、銅イオンなどの触媒を用いずに連結可能であり、かつＤＮＡ合成酵素や逆転写酵素の働きを阻害しない非天然型インターヌクレオチド結合があれば、ケミカルライゲーション法を用いた長鎖ＯＤＮの合成に有用である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２０１５／１７７５２０号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】A. H. El-Sagheer, T. Brown J. Am Chem. Soc. 2009, 131, 2958-2964
【非特許文献２】A. H. El-Sagheer, A. P. Sanzone, R. Gao, A. Tavassoli, T. Brown Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2011, 108, 11338-11343
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ケミカルライゲーション法に使用され得る非天然型インターヌクレオチド結合して有するオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）を合成する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この目的を達成するために、鋭意検討を重ねた結果、本発明者らは、下記のスルホンアミド：【００１０】
【化１】
2019150564.tif 000002
を非天然型インターヌクレオチド結合として有するオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）が、ＤＮＡ合成酵素によるＯＤＮ合成における鋳型として機能することを見出し、本発明を完成するに至った。これまで、スルホンアミド結合を有する人工核酸について、過去に報告があるが（E. B. McElroy, R. Bandaru, J. Huang, T. S. Widlanski, Bioorg. Med. Chem. 1994, 4, 1071-1076； R. C. Reynolds, P. A. Crooks, J. A. Maddry, M. S. Akhtar, J. A. Montgomery, J. A. Secrist III, J. Org. Chem. 1992, 57, 1983-1985； C. Glemarecl, R. C. Reynolds, P. A. Crooks, J. A. Maddryz, M.S. Akhtar, J.A. Montgomeryz, J.A. Secrist III, J. Chattopadhyayal, Tetrahedron 1993, 49, 2287-2298）。しかしながら、このような人工核酸がＤＮＡ合成酵素の鋳型として機能するという報告はない（A. Shivalingam, A. E. S. Tyburn, A. H. El-Sagheer, T. Brown, J. Am. Chem. Soc. 2017, 139,1575-1583）。【００１１】
本発明は、好ましくは以下の態様を含む。
［１］式Ｉ：【００１２】
【化２】
2019150564.tif 000003
【００１３】
〔式中、
Ｂ1およびＢ2は、同一または異なる核酸塩基を表し；
Ｒ1は、式ＩＩ：【００１４】
【化３】
2019150564.tif 000004
【００１５】
（式中、
ｍは、０以上の整数を表し；
Ｂmは、前記ｍの各整数に対応して同一または異なる核酸塩基を表し；および
Ｘは、水素原子、リン酸基、ピロリン酸基、またはトリリン酸基を表す）
で表される化合物であり；および
Ｒ2は、式ＩＩＩ：【００１６】
【化４】
2019150564.tif 000005
【００１７】
（式中、
ｎは、０以上の整数を表し、ただし、ｍおよびｎは同時に０にはならない；および
Ｂnは、前記ｎの各整数に対応して同一または異なる核酸塩基を表す）
で表される化合物である〕
で表されるスルホンアミド骨格を有する化合物を鋳型鎖として用いて、ＤＮＡ合成酵素によりオリゴデオキシヌクレオチドを合成する方法。【００１８】
［２］前記式Ｉで表される化合物を合成する方法をさらに含み、ここで、式ＩＶ：【００１９】
【化５】
2019150564.tif 000006
【００２０】
〔式中、
Ｂ1およびＲ1は、式Ｉにおいて定義される通りである〕
で表される化合物と、式Ｖ：【００２１】
【化６】
2019150564.tif 000007
【００２２】
〔式中、
Ｂ2およびＲ2は、式Ｉにおける定義の通りであり；および
Ｙは、アゾリル基を表す〕
で表される化合物とを反応させるステップを含む、上記［１］に記載の方法。【００２３】
［３］前記式Ｖで表される化合物を合成する方法をさらに含み、ここで、式ＩＶ：【００２４】
【化７】
2019150564.tif 000008
【００２５】
〔式中、
Ｙは、アゾリル基を表し；
Ｚは、保護基を有してもよい核酸塩基を表し；
Ｒ3は、リン酸の保護基を表し；
Ｒ4およびＲ5は、同一または異なって、炭素数１〜６の直線状または分岐状のアルキル基を表し、あるいは
Ｒ4およびＲ5は、直接結合して環を形成し、または酸素原子、硫黄原子およびケイ素原子からなる群から１以上の原子を介して結合して環を形成してもよい〕
で表される化合物を出発原料として、ホスホロアミダイト法による核酸固相合成法もしくは液相合成法を用いて合成する
ステップを含む、上記［２］に記載の方法。【００２６】
［４］式Ｖ：【００２７】
【化８】
2019150564.tif 000009
【００２８】
〔式中、
Ｒ2およびＢ2は、式Ｉにおける定義の通りであり；および
Ｙは、アゾリル基を表す〕
で表される化合物を製造するための、以下の式ＶＩ：【００２９】
【化９】
2019150564.tif 000010
【００３０】
〔式中、
Ｙは、アゾリル基を表し；
Ｚは、保護基を有してもよい核酸塩基を表し；
Ｒ3は、リン酸の保護基を表し；
Ｒ4およびＲ5は、同一または異なって、炭素数１〜６の直線状または分岐状のアルキル基を表し、あるいは
Ｒ4およびＲ5は、直接結合して環を形成し、または酸素原子、硫黄原子およびケイ素原子からなる群から１以上の原子を介して結合して環を形成してもよい〕
で表される化合物。
【発明の効果】
【００３１】
本発明により、スルホンアミドを非天然型インターヌクレオチド結合して有するオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）を提供することにより、長鎖の長い天然型オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）を合成することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、テンプレート（Ｓ）の精製後の陰イオン交換ＨＰＬＣチャートを示す。
【図２】図２は、Ｋｌｅｎｏｗ断片ｅｘｏ-を用いた完全鎖長伸長反応後、２０％ＰＡＧＥで泳動し反応物を解析した結果を示す。レーン１：プライマーＤＮＡ１；レーン２：プライマーＤＮＡ１＋テンプレート（Ｐ）；レーン３：プライマーＤＮＡ１＋テンプレート（Ｓ）。
【図３】図３は、Ｋｌｅｎｏｗ断片ｅｘｏ-を用いた完全鎖長伸長反応後、２０％ＰＡＧＥで泳動し反応物を解析した結果を示す。レーン１：プライマーＤＮＡ１；レーン２：プライマーＤＮＡ１＋テンプレート（Ｐ）；レーン３：プライマーＤＮＡ１＋テンプレート（Ｓ）。
【図４】図４は、耐熱性ＤＮＡ合成酵素としてｅｘＴａｑ（Ｔａｋａｒａ）、ＫＯＤ’（Ｔｏｙｏｂｏ）、Ｄｅｅｐ  ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏ  Ｌａｂｓ）を用いた完全鎖長伸長反応後、２０％ＰＡＧＥで泳動し反応物を解析した結果を示す。レーン１：プライマーＤＮＡ１；レーン２：プライマーＤＮＡ１＋テンプレート（Ｐ）＋ｅｘＴａｑ；レーン３：プライマーＤＮＡ１＋テンプレート（Ｓ）＋ｅｘＴａｑ；レーン４：プライマーＤＮＡ１＋テンプレート（Ｐ）＋ＫＯＤ’；レーン５：プライマーＤＮＡ１＋テンプレート（Ｓ）＋ＫＯＤ’；レーン６：プライマーＤＮＡ１＋テンプレート（Ｐ）＋Ｄｅｅｐ  ｖｅｎｔ；レーン７：プライマーＤＮＡ１＋テンプレート（Ｓ）＋Ｄｅｅｐ  ｖｅｎｔ。
【図５】図５は、Ｋｌｅｎｏｗ断片ｅｘｏ-を用いた一塩基伸長反応後、２０％ＰＡＧＥで泳動し反応物を解析した結果を示す。レーン１：プライマーＤＮＡ２；レーン２：プライマーＤＮＡ２＋テンプレート（Ｓ）＋ｄＡＴＰ、１分；レーン３：プライマーＤＮＡ２＋テンプレート（Ｓ）＋ｄＧＴＰ、１分；レーン４：プライマーＤＮＡ２＋テンプレート（Ｓ）＋ｄＴＴＰ、１分；レーン５：プライマーＤＮＡ２＋テンプレート（Ｓ）＋ｄＣＴＰ、１分；レーン６：プライマーＤＮＡ２＋テンプレート（Ｓ）＋ｄＡＴＰ、２分；レーン７：プライマーＤＮＡ２＋テンプレート（Ｓ）＋ｄＧＴＰ、２分；レーン８：プライマーＤＮＡ２＋テンプレート（Ｓ）＋ｄＴＴＰ、２分；レーン９：プライマーＤＮＡ２＋テンプレート（Ｓ）＋ｄＣＴＰ、２分；レーン１０：プライマーＤＮＡ２＋テンプレート（Ｓ）＋ｄＡＴＰ、５分；レーン１１：プライマーＤＮＡ２＋テンプレート（Ｓ）＋ｄＧＴＰ、５分；レーン１２：プライマーＤＮＡ２＋テンプレート（Ｓ）＋ｄＴＴＰ、５分；レーン１３：プライマーＤＮＡ２＋テンプレート（Ｓ）＋ｄＣＴＰ、５分。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明によれば、下記式Ｉ：
【００３４】
【化１０】
2019150564.tif 000011
【００３５】
〔式中、Ｂ1およびＢ2は、同一または異なる核酸塩基を表し、また、後述するようにＲ1およびＲ2は、ヌクレオチドまたはヌクレオシドを表す〕
で表されるスルホンアミド骨格を有する化合物を鋳型鎖として用いて、ＤＮＡ合成酵素によりオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）を合成することができる。
【００３６】
本明細書中で使用するとき、用語「核酸塩基」とは、デオキシリボース部分および３’−または５’−リン酸部分以外のデオキシリボヌクレオチド中の部分、あるいはデオキシリボース部分以外のデオキシリボヌクレオシド中の部分をいう。具体的には、核酸塩基は、アデニン、グアニン、チミン、またはシトシンであり得る。
【００３７】
式Ｉ中のＲ1は、０または１つ以上のヌクレオチド単位で構成されるオリゴデオキシヌクレオチドであってもよい。典型的には、Ｒ1は、式ＩＩ：
【００３８】
【化１１】
2019150564.tif 000012
【００３９】
（式中、
ｍは、０以上の整数を表すが、ただし、後述する式ＩＩＩ中のＲ2においてｎが０である場合、ｍは０ではない；
Ｂmは、前記ｍの各整数に対応して同一または異なる核酸塩基を表し；および
Ｘは、水素原子、リン酸基、ピロリン酸基、またはトリリン酸基を表す）
で表される化合物であってもよい。
【００４０】
「ｍ」は、典型的には、０〜１，０００，０００の整数であり、限定されないが、０〜５００，０００、０〜３００，０００、０〜２００，０００、０〜１５０，０００、０〜１００，０００、０〜５０，０００、０〜３０，０００、０〜２０，０００、０〜１０，０００、０〜５，０００、０〜３，０００、０〜１，０００、０〜５００、０〜３００、０〜１００等であってもよい。
【００４１】
「Ｂm」は、核酸塩基を表すが、式Ｉ中の「核酸塩基」についての定義に従うものとする。また、「ｍの各整数に対応して同一または異なる核酸塩基を表し」については、例えば、ｍが「５」である場合、Ｂ1〜Ｂ5（５つ）は、同一の核酸塩基であってもよく、または独立して選択された核酸塩基であってもよいことを意味する。
【００４２】
式Ｉ中のＲ2は、０または１つ以上のヌクレオシド単位で構成されるオリゴデオキシ（リボ）ヌクレオチドであってもよい。典型的には、Ｒ2は、式ＩＩＩ：
【００４３】
【化１２】
2019150564.tif 000013
【００４４】
（式中、
ｎは、０以上の整数を表すが、ただし、上述する式ＩＩ中のＲ1においてｍが０である場合、ｎは０ではない；
Ｂnは、前記ｎの各整数に対応して同一または異なる核酸塩基を表す）
で表される化合物であってもよい。
【００４５】
「ｎ」は、典型的には、０〜１，０００，０００の整数であり、限定されないが、０〜５００，０００、０〜３００，０００、０〜２００，０００、０〜１５０，０００、０〜１００，０００、０〜５０，０００、０〜３０，０００、０〜２０，０００、０〜１０，０００、０〜５，０００、０〜３，０００、０〜１，０００、０〜５００、０〜３００、０〜１００等であってもよい。
【００４６】
「Ｂn」は、核酸塩基を表すが、式Ｉ中の「核酸塩基」についての定義に従うものとする。また、「ｎの各整数に対応して同一または異なる核酸塩基を表し」については、例えば、ｍが「５」である場合、Ｂ1〜Ｂ5（５つ）は、同一の核酸塩基であってもよく、または独立して選択された核酸塩基であってもよいことを意味する。
【００４７】
上記Ｒ1およびＲ2は、典型的には、オリゴデオキシヌクレオチドであるが、オリゴデオキシヌクレオチドの合成および化学修飾のための方法は、当業者に知られており、例えば、Uhlmann, E., et al., (1990), Chem. Rev., 90: 543; “Protocols for Oligonucleotides and Analogs」Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques.” S. Agrawal ed., Humana Press, Totowa, USA, 1993; Crooke, S. T., et al. (1996) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 36: 107-129; およびHunziker, J., et al., (1995), Mod. Synth. Methods, 7: 331-417において記述されている。
【００４８】
さらに、Ｒ1およびＲ2を連結させることによってＤＮＡ合成酵素によって合成されるオリゴデオキシヌクレオチド用の鋳型鎖を調製することができる。本発明によれば、このような鋳型鎖は、鎖中にスルホンアミド骨格を有することを特徴とするが、例えば、下記の式ＩＶ：
【００４９】
【化１３】
2019150564.tif 000014
【００５０】
〔式中、Ｂ1およびＲ1は、本明細書において式Ｉについて定義される通りであるが、ただし、後述する式Ｖ中のＲ2においてｎが０である場合、ｍは０ではない〕
で表される化合物と、下記の式Ｖ：
【００５１】
【化１４】
2019150564.tif 000015
【００５２】
〔式中、Ｂ2およびＲ2は、本明細書において式Ｉについて定義の通りであるが、ただし、上記式ＩＶ中のＲ1においてｍが０である場合、ｎは０ではない；Ｙは、アゾリル基を表す〕
で表される化合物において、アミン基とアゾリル基とを置換させることによって提供され得る。置換反応は、当業者であれば周知の方法により行うことができる。本明細書で使用するとき、「アゾリル基」は、環員原子として、窒素原子、硫黄原子、および酸素原子からなる群から選択される異種原子を有する飽和または不飽和複素環式基であって、異種原子のうち少なくとも１つが窒素原子であるものをいう。アゾリル基としては、限定されないが、イミダゾリル、ピラゾリル、１，２，３−トリアゾリル、１，２，４−トリアゾリル、テトラゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾトリアゾリルなどが挙げられ、環内の炭素原子に任意の置換基を有するものも含まれる。
【００５３】
本発明の方法は、式Ｉで表されるスルホンアミド骨格を有する化合物を鋳型鎖として用いて、核酸合成酵素（例えば、ＤＮＡ合成酵素）および適切なプライマーによりオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）を合成（または伸長）することができる。本明細書において使用するとき、「核酸合成酵素」とは、核酸を合成する能力を有する任意の酵素をいう。ヌクレオチドを縮合させてポリヌクレオチドにする反応を触媒する酵素の総称である。このような核酸合成酵素としては、例えば、ＤＮＡ合成酵素（例えば、ＤＮＡ依存性ＤＮＡ合成酵素、ＲＮＡ依存性ＤＮＡ合成酵素）、ＲＮＡ合成酵素などを挙げることができるが、それらに限定されない。なお、ＤＮＡ依存性ＤＮＡ合成酵素およびＲＮＡ依存性ＤＮＡ合成酵素はいずれも、検出するのはＤＮＡおよびＲＮＡを問わないことが理解される。このようなＤＮＡ合成酵素としては、限定されないが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ由来のＤＮＡポリメラーゼI、ＤＮＡポリメラーゼIクレノウフラグメント、Ｔａｑポリメラーゼ、ＫＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼなどを挙げることができる。また、本発明によれば、伸長反応において耐熱性ＤＮＡ合成酵素を使用してもよく、このような例としては、ｅｘＴａｑ、Ｑ５、ＫＯＤ、ＫＯＤ’、Ｄｅｅｐ  ｖｅｎｔ等が挙げられる。
【００５４】
本明細書において、オリゴデオキシヌクレオチドを「合成」または「伸長」させるとは、核酸について言及するとき、その核酸が少なくとも１ヌクレオチド伸びるような任意の反応をいう。上述したようなポリメラーゼを用いて伸長反応を行う場合、通常、鋳型に基づいてヌクレオチドが導入されることから、特定の配列が標識対象核酸などの伸長すべき核酸において伸長することになる。伸長反応は、（ｉ）標的核酸およびその相補鎖と核酸プライマーおよび核酸プローブとのハイブリダイゼーション（アニーリング）反応と、（ii）核酸合成酵素によるプライマー鎖の伸長反応およびプローブの分解反応からなり、これら反応（ｉ）および（ii）は、例えばトリス塩酸緩衝液等の適切な緩衝液を含む水溶液中で実施することができる。このハイブリダイゼーション反応は、典型的には、５５〜７５℃で実施することができるが、限定されない。酵素反応は、典型的には、３７℃で実施することができるが、限定されない。また、プライマー伸長産物の変性は、上記伸長反応で得られるプライマー鎖伸長産物を含む溶液を、例えば９４〜９５℃で０．５〜１分間加熱処理するなどを行うことによって実施することができる。なお、標的核酸の増幅は、例えば、その標的核酸（標識対象核酸）が所望の量になるまで、工程上記伸長反応および変性を上記と同様の条件下で複数回繰り返せばよい。上記工程をｎ回行えば、理論的には標的核酸量は当初の２ｎ−１倍にまで増幅されることとなる。
【００５５】
上述したような伸長反応は、当業者に周知であり、例えば、Sambrook, J., E Fritsch, E. and T Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. ColdSpring HarborLaboratory Press: Cold Spring Harbor(2001)などを参照されたい。なお、このような伸長反応は、市販のＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）のための装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから販売されている）を用いれば、簡便かつ効率的に実施することができる。
【００５６】
本発明によれば、上記の式Ｖを合成するための式ＶＩ：
【００５７】
【化１５】
2019150564.tif 000016
【００５８】
〔式中、
Ｙは、アゾリル基（式Ｖにおいておいて定義される通りである）を表し；
Ｚは、保護基を有していてもよい核酸塩基を表し；
Ｒ3は、リン酸の保護基を表し；
Ｒ4およびＲ5は、同一または異なって、炭素数１〜６の直線状または分岐状のアルキル基を表し、あるいは
Ｒ4およびＲ5は、直接結合して環を形成し、または酸素原子、硫黄原子およびケイ素原子からなる群から１以上の原子を介して結合して環を形成してもよい）
で表される化合物が提供される。なお、化合物ＶＩで表される化合物を用いて、式Ｖで表される化合物を合成する方法は、後述するように実施例５に具体的に記載されている。
【００５９】
上記の式ＶＩ中の「Ｒ3」に関して、Ｒ3は、リン酸の保護基であり得て、例えば、加水素分解、脱離反応、求核置換反応、または加水分解により脱離する置換基が好ましい。このような保護基の例としては、Greenes’ Protective Groups in Organic Chemistry, Fifth edition (John Wiley&Sons, 2014)などに記載されるようなリン酸の一般的な保護基であればよく、例えば、限定されないが、メチル基、トリメチルシリルエチル基、２−シアノエチル基などの置換基を有するエチル基、２−ニトロベンジル基などのベンゼン環上に置換基を有していてもよいベンジル基、ナフチル環上に置換基を有していてもよいナフチルメチル基、４−ニトロフェニルエチル基などのベンゼン環上に置換基を有していてもよいフェニルエチル基、２−クロロフェニル基などのベンゼン環上に置換基を有してもよいフェニル基が挙げられる。また、４−メチルチオブチル基やＮ−ホルミル−Ｎ―メチルアミノエチル基などのように保護基内に求核性のある基を有し、環化しながら脱保護される基も含まれる。
【００６０】
上記の式ＶＩ中の「Ｚ」に関して、Ｚは保護基を有してもよい核酸塩基を表す。ここでいう保護基とは、例えば、Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Unit2.1“Nucleobase Protection of Deoxyribo- and Ribonucleosides” Iyer, R. Pなどに記載の核酸合成に用い得る保護基であれば限定されない。このような保護としては、例えば、アデニン、シトシン、グアニンのアミノ基に対してはベンゾイル基、アセチル基、イソブチリル基などのアシル基やＮ，Ｎ−ジメチルアミノメチレン基などのアミジン型保護基が挙げられる。また、チミンのイミノ基に対してベンゾイル基などのアシル基やチミンのＯ４位にベンジル基などを導入してもよい。
【００６１】
Ｒ4およびＲ5は、同一または異なってもよい「炭素数１〜６の直線状または分岐状のアルキル基」を表すが、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシルなどが挙げられる。
【００６２】
また、Ｒ4およびＲ5は、直接結合して環を形成してもよく、例えば、ピロリジン環、ピペリジン環などが挙げられる。一方、Ｒ4およびＲ5が環を形成する場合に、酸素原子、硫黄原子またはケイ素原子のうちの１以上の原子を介して結合してもよく、例えば、モルホリン環状、チアモルホリン環などが挙げられる。
【実施例】
【００６３】
以下、本発明を実施例に基づいて、より具体的に説明する。なお本発明はこれらの実施
例に限定されるものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・
変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。【００６４】
本実施例で使用した合成試薬および有機溶媒等は、特に言及がない限り、東京化成工業、和光純薬工業、関東化学、シグマアルドリッチで購入したものを使用した。【００６５】
［原料合成例１］テンプレート（Ｓ）：３’−ｄ（ＧＴＡＣＣＣＧＣＣＧＴＡＣＣＣＧＡＡＴＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＴ）−５’（配列番号１）の合成
McElroyらの方法（McElroy, E. B.; Bandaru, R.; Huang, J.; Widlanski, T. S., Bioorg. Med. Chem. Lett. 1994, 4, 1071）により下記の化合物Ｘを合成した。なお、テンプレート名に示される「Ｓ」は、スルホンアミドを指し、配列中の下線を付した「ＴＴ」は、スルホンアミドで連結されたチミジン二量体を示す。【００６６】
【化１６】
2019150564.tif 000017
Ｘ【００６７】
次に、市販のデオキシヌクレオチドホスホロアミダイト（Ｇｌｅｎ  Ｒｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．）を用いてＤＮＡ自動合成機（ｎＳ−８ＩＩ；ジーンデザイン社）によりテンプレート（Ｓ）を合成した。合成終了後、２８％アンモニア水を用いて、５５℃で１２時間かけて脱保護と固相担体からの切り出しをトリチルオンの状態で行った。続いて、逆相ＨＰＬＣにて目的物を分取した。分取した後、逆相カートリッジカラム（Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８  Ｐｌｕｓ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ；Ｗａｔｅｒｓ）にチャージし、カートリッジ上で２％トリフルオロ酢酸水溶液にてＤＭＴｒ基を除去した後、２５％アセトニトリル／水で溶出した。溶出したオリゴヌクレオチドを再度陰イオン交換ＨＰＬＣ（Ｇｅｎ−ＰａｋＴＭ  ＦＡＸ（Ｗａｔｅｒｓ，４．６×１５０ｍｍ）、カラム温度５０℃において、溶出溶媒として２５ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に１Ｍ塩化ナトリウム、２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を加え濃度勾配をかけて流した）で精製した後、脱塩した。テンプレート（Ｓ）の精製後の陰イオン交換ＨＰＬＣチャートを図１に示す。MALDI―TOF-MS calcd. [M+H]+ 9066.552, found 9067.649。【００６８】
［原料合成例２］：３’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−５’−デオキシ−５’−（イミダゾリルスルホニルメチル）チミジン（化合物ＸＸ）の合成【００６９】
【化１７】
2019150564.tif 000018
ＸＸ【００７０】
McElroyらの方法（Huang, J.; McElroy, E. B.; Widlanski, T.S., J. Org. Chem. 1994, 59, 3520）により合成した３’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−５’−デオキシ−５’−スルホメチルチミジンのナトリウム塩（７００ｍｇ、１．５４ｍｍｏｌ）をアセトン（１５ｍＬ）に溶解した。ここに１８−クラウン−６−エーテル（２０ｍｇ、０．０７７ｍｍｏｌ）と塩化シアヌル（４２４ｍｇ、２．３１ｍｍｏｌ）を加え、６８℃で６時間反応させた。その後、イミダゾール（７．２ｇ、１３３ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間反応させた。反応系をセライトで濾過し、濾液を減圧下濃縮した。残渣に５ｇのシリカゲルを加えた後、３０ｇのシリカゲル上に静置し、８０％酢酸エチル−２０％ヘキサンにて目的物を溶出した。目的物を含むフラクションを濃縮し化合物ＸＸを７００ｍｇ（９４％）で得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 10.08 (s, 1H), 7.96 (s, 1H), 7.26 (s, 1H), 7.15 (s, 1H), 6.92 (s, 1H), 5.95 (t, J = 1.5 Hz, 1H), 4.14 (dd, J = 6.0, 5.0 Hz, 1H), 3.72-3.65 (m, 1H), 3.61-3.52 (m, 1H), 3.47-3.36 (m, 1H), 2.37-2.27 (m, 1H), 2.24-2.13 (m, 1H), 2.13-2.03 (m, 1H), 2.00-1.87 (m, 1H), 1.90 (s, 3H), 0.83 (s, 9H), 0.03 (s, 6H) ; 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 163.99, 150.48, 137.07, 136.45, 131.46, 117.79, 111.60, 86.60, 83.19, 74.47, 52.68, 39.61, 26.70, 25.71, 17.91, 12.59, -4.55, -4.80 ; ESI-TOF mass : calcd for C20H32N4O6SSi [M+Na]+ 507.1704, found 507.1693.【００７１】
［原料合成例３］：５’−デオキシ−５’−（イミダゾリルスルホニルメチル）チミジン（化合物ＸＸＸ）の合成【００７２】
【化１８】
2019150564.tif 000019
ＸＸＸ【００７３】
化合物ＸＸ（３０ｍｇ、０．０６２ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（６２０μＬ）に溶解し、１Ｍ  フッ化テトラブチルアンモニウム  テトラヒドロフラン溶液（６８μＬ、０．０６８ｍｍｏｌ）を加え、室温で２５分反応させた。反応系に酢酸（３．９μＬ  ０．０６ｍｍｏｌ）とトリメチルエトキシシラン（２８０μＬ、１．８６ｍｍｏｌ）を加え、反応を停止した。１時間後、酢酸エチル１０ｍＬを加え、飽和重曹水２ｍＬで３回、飽和食塩水２ｍＬで１回洗浄した。水層を酢酸エチル１０ｍＬで３回抽出した後、有機層を集め無水硫酸ナトリウムで乾燥した。硫酸ナトリウムを濾過に除き、濾液を減圧下濃縮した後、残渣を８ｇのシリカゲル上にチャージし、７％メタノール／塩化メチレンで溶出した。目的物を含むフラクションを濃縮し化合物ＸＸＸ（１６ｍｇ、７０％）を得た。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 11.32 (s, 1H), 8.19 (s, 1H), 7.68 (s, 1H), 7.37 (s, 1H), 7.18 (s, 1H), 6.09 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 5.44-5.32 (br, 1H), 4.12-4.05 (m, 1H), 3.95-3.77 (m, 2H), 3.66-3.60 (m, 1H), 2.26-2.18 (m, 1H), 2.06-1.93 (m, 2H), 1.90-1.80 (m, 1H), 1.79 (s, 3H) ; 13C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ 163.67, 150.40, 137.26, 136.29, 130.60, 118.52, 109.94, 83.48, 82.98, 72.50, 51.43, 38.00, 26.49, 12.09 ; ESI-TOF mass : calcd for C14H18N4O6S [M+Na]+ 393.0839, found 393.0832.【００７４】
実施例１：Ｋｌｅｎｏｗ断片ｅｘｏ-を用いた完全鎖長伸長反応
以下のプライマーおよびテンプレートを用いて、完全鎖伸長反応を行った。
プライマーＤＮＡ１：ＦＡＭ−５’−ｄ（ＣＡＴＧＧＧＣＧＧＣＡＴＧＧＧ）（配列番号２）
テンプレート（Ｐ）：３’−ｄ（ＧＴＡＣＣＣＧＣＣＧＴＡＣＣＣＧＡＡＴＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＴ）−５’（配列番号１）（「Ｐ」は、リン酸ジエステルを指す）
テンプレート（Ｓ）：３’−ｄ（ＧＴＡＣＣＣＧＣＣＧＴＡＣＣＣＧＡＡＴＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＴ）−５’（配列番号１）
（配列中の「ＴＴ」は、スルホンアミドで連結されたチミジン二量体を示す）【００７５】
プライマーＤＮＡ１、テンプレート（Ｐ）またはテンプレート（Ｓ）、ｄＮＴＰ（Ｎ＝Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃ）を市販の酵素に添付されているＫｌｅｎｏｗ断片ｅｘｏ-緩衝液１０μＬに溶解し、Ｋｌｅｎｏｗ断片ｅｘｏ-（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏ  Ｌａｂｓ）を加えて３７℃で３０分間反応を行った。加えた物質の最終濃度は以下の通りである。
プライマーＤＮＡ  ０．１μＭ
テンプレート（Ｐ）またはテンプレート（Ｓ）  ０．１μＭ
ｄＮＴＰ（Ｎ＝Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃ）  各１０μＭ
Ｋｌｅｎｏｗ断片ｅｘｏ-  ０．０２５Ｕ／μＬ【００７６】
反応終了後、反応液を７Ｍ尿素を含む２０％ＰＡＧＥで泳動し反応物を解析した。結果を図２に示す。図２に示されるように、テンプレート（Ｐ）（レーン２）およびテンプレート（Ｓ）（レーン３）を用いることにより、伸長反応が首尾よく行われたことがわかる。レーン３を見ると、リン酸ジエステルと−１ｍｅｒのバンドも検出されているが、レーン２と同様に完全伸長したバンドが検出された。【００７７】
実施例２：Ｋｌｅｎｏｗ断片ｅｘｏ+を用いた完全鎖長伸長反応
実施例１で用いたプライマーＤＮＡ１、テンプレート（Ｐ）またはテンプレート（Ｓ）、ｄＮＴＰ（Ｎ＝Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃ）を市販の酵素に添付しているＫｌｅｎｏｗ断片ｅｘｏ+緩衝液１０μＬに溶解し、Ｋｌｅｎｏｗ断片ｅｘｏ+（Ｔａｋａｒａ）を加えて３７℃で３０分間反応を行った。加えた物質の最終濃度は以下の通りである。
プライマーＤＮＡ  ０．１μＭ
テンプレート（Ｐ）またはテンプレート（Ｓ）  ０．１μＭ
ｄＮＴＰ（Ｎ＝Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃ）  各１０μＭ
Ｋｌｅｎｏｗ断片ｅｘｏ+０．０２５Ｕ／μＬ【００７８】
反応終了後、反応液を７Ｍ尿素を含む２０％ＰＡＧＥで泳動し反応物を解析した。結果を図３に示す。図３に示されるように、テンプレート（Ｐ）（レーン２）およびテンプレート（Ｓ）（レーン３）を用いることにより、伸長反応が首尾よく行われたことがわかる。校正活性を有するｅｘｏ+でも完全長が合成できたことから、スルホンアミドテンプレートの位置に導入されたヌクレオチド残基をミス取り込みと誤認されて切り出されることなく、ＤＮＡ合成が最後まで伸長していることが分かる。【００７９】
実施例３：耐熱性ＤＮＡ合成酵素を用いた完全鎖長伸長反応
実施例１で用いたプライマーＤＮＡ、テンプレート（Ｐ）またはテンプレート（Ｓ）、ｄＮＴＰ（Ｎ＝Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃ）を市販の酵素に添付している推奨緩衝液１０μＬに溶解し、耐熱性酵素を加えて５０℃で３０分間反応を行った。加えた物質の最終濃度は以下の通りである。
プレートＤＮＡ  ０．１μＭ
テンプレート（Ｐ）またはＴｅｍｐｌａｔｅ（Ｓ）  ０．１μＭ
ｄＮＴＰ（Ｎ＝Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃ）  各１０μＭ
酵素  ０．０２５Ｕ／μＬ【００８０】
ｅｘＴａｑ（レーン３）、ＫＯＤ’（レーン５）、ｖｅｎｔ（レーン７）に関して、テンプレート（Ｐ）とテンプレート（Ｓ）において同じ生成物が得られた。【００８１】
実施例４：Ｋｌｅｎｏｗ断片ｅｘｏ-を用いた一塩基伸長反応
以下のプライマーおよびテンプレートを用いて、一塩基伸長反応を行った。
プライマーＤＮＡ２：ＦＡＭ−５‘−ｄ（ＣＡＴＧＧＧＣＧＧＣＡＴＧＧＧＣＴＴ）（配列番号３）
テンプレート（Ｐ）：３’−ｄ（ＧＴＡＣＣＣＧＣＣＧＴＡＣＣＣＧＡＡＴＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＴ）−５’（配列番号１）
テンプレート（Ｓ）：３’−ｄ（ＧＴＡＣＣＣＧＣＣＧＴＡＣＣＣＧＡＡＴＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＴ）−５’（配列番号１）【００８２】
プライマーＤＮＡ２、テンプレート（Ｐ）またはテンプレート（Ｓ）、ｄＮＴＰ（Ｎ＝Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃのうちいずれか１つ）を市販の酵素に添付しているＫｌｅｎｏｗ断片ｅｘｏ−緩衝液１０μＬに溶解し、Ｋｌｅｎｏｗ断片ｅｘｏ-を加えて３７℃で１〜５分間反応を行った。加えた物質の最終濃度は以下の通りである。
プライマーＤＮＡ  ０．１μＭ
テンプレート（Ｐ）またはＴｅｍｐｌａｔｅ（Ｓ）  ０．１μＭ
ｄＮＴＰ（Ｎ＝Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃのうちいずれか１つ）  １μＭ
Ｋｌｅｎｏｗ断片ｅｘｏ-  ０．０１Ｕ／μＬ【００８３】
反応終了後、反応液を７Ｍ尿素を含む２０％ＰＡＧＥで泳動し反応物を解析した。結果を図５に示す。図５に示されるように、テンプレート（Ｓ）のＴＴ中のチミンとワトソンクリック塩基対を形成し得るｄＡＴＰを加えた場合のみ、鎖伸長が確認された。【００８４】
実施例５：５’−デオキシ−５’−（イミダゾリルスルホニルメチル）チミジン３’―（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ―ジイソプロピルホスホロアミダイト）（化合物ＸＸＸＸ）の合成【００８５】
【化１９】
2019150564.tif 000020
ＸＸＸＸ【００８６】
化合物ＸＸＸ（３０ｍｇ、０．０６２ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（６２０μＬ）に溶解し、１Ｍ  フッ化テトラブチルアンモニウム  テトラヒドロフラン溶液（６８μＬ、０．０６８ｍｍｏｌ）を加え、室温で２５分反応させた。反応系に酢酸（３．９μＬ、０．０６ｍｍｏｌ）とトリメチルエトキシシラン（２８０μＬ、１．８６ｍｍｏｌ）を加え、反応を停止した。１時間後、酢酸エチル１０ｍＬを加え、飽和重曹水２ｍＬで３回、飽和食塩水２ｍＬで１回洗浄した。水層を酢酸エチル１０ｍＬで３回抽出した後、有機層を集め無水硫酸ナトリウムで乾燥した。硫酸ナトリウムを濾過に除き、濾液を減圧下濃縮した後、残渣を８ｇのシリカゲルを上にチャージし、７％メタノール／塩化メチレンで溶出した。目的物を含むフラクションを濃縮し化合物ＸＸＸ（１６ｍｇ、７０％）を得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 9.95-9.65 (br, 1H), 8.00-7.93 (m, 1H), 7.35-7.27 (m, 1H), 7.15 (s, 1H), 6.96 (s, 1H), 6.10-6.01 (m, 1H), 4.36-4.26 (m, 1H), 3.94-3.76 (m, 3H), 3.71-3.63 (m, 1H), 3.61-3.38 (m, 4H), 2.77-2.54 (m, 2H), 2.46-2.29 (m, 2H), 2.27-2.10 (m, 1H), 2.07-1.96 (m, 1H), 1.95-1.81 (m, 3H), 1.18-1.08 (m, 12H) ; 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 163.87, 150.51, 150.46, 137.12, 137.04, 136.28, 135.95, 131.44, 131.35, 118.01, 117.90, 117.87, 117.80, 111.83, 111.81, 85.96, 85.84, 82.30, 82.26, 81.96, 81.89, 75.79, 75.64, 75.58, 75.43, 58.01, 57.92, 57.81, 57.73, 52.65, 52.60, 43.45, 43.41, 43.33, 43.29, 38.26, 38.20, 26.85, 26.82, 24.67, 24.61, 24.54, 20.57, 20.53, 20.50, 20.45, 12.51, 12.49 ; 31P NMR (203 MHz, CDCl3) : δ 149.4, -148.7 ; ESI-TOF mass : calcd for C23H35N6O7PS [M+Na]+ 593.1918, found 593.1905
【図１】
2019150564.tif 000029
【図２】
2019150564.tif 000030
【図３】
2019150564.tif 000031
【図４】
2019150564.tif 000032
【図５】
2019150564.tif 000033
【配列表】
2019150564000001.app
【国際調査報告】
2019150564.tif 000034
2019150564.tif 000035
2019150564.tif 000036
2019150564.tif 000037