(57)【要約】  腫瘍細胞の被検物質に対する感受性を判定できる新たな判定方法を提供する。  本発明の被検物質への感受性の判定方法は、被検物質と接触させた腫瘍細胞について、コヒーレント反ストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）顕微鏡を用いて取得された第二高調波（ＳＨＧ）を取得する取得工程と、前記ＳＨＧに基づき、前記腫瘍細胞の前記被検物質に対する感受性を判定する判定工程とを含む。
2020162595.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検物質と接触させた腫瘍細胞について、コヒーレント反ストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）顕微鏡を用いて取得された第二高調波（ＳＨＧ）を取得する取得工程と、
前記ＳＨＧに基づき、前記腫瘍細胞の前記被検物質に対する感受性を判定する判定工程とを含む、被検物質への感受性の判定方法。
【請求項２】
前記判定工程において、前記ＳＨＧの信号光の形状および位置の少なくとも一方に基づき、前記腫瘍細胞の前記被検物質に対する感受性を判定する、請求項１記載の判定方法。
【請求項３】
前記判定工程において、前記ＳＨＧの信号光の分散値に基づき、前記腫瘍細胞の前記被検物質に対する感受性を判定する、請求項１または２記載の判定方法。
【請求項４】
前記判定工程において、前記ＳＨＧの信号光の分散値を基準値と比較し、前記ＳＨＧの信号光の分散値が、前記基準値より大きい場合、前記腫瘍細胞は、前記被検物質に対する感受性であると判定する、請求項３記載の判定方法。
【請求項５】
前記基準値は、前記被検物質と未接触の腫瘍細胞におけるＳＨＧの信号光の分散値である、請求項４記載の判定方法。
【請求項６】
前記判定工程において、前記ＳＨＧに基づき、前記腫瘍細胞の前記被検物質に対する感受性の判定結果を出力する機械学習により生成された学習済みモデルを用いて、前記腫瘍細胞の前記被検物質に対する感受性を判定する、請求項１から５のいずれか一項に記載の判定方法。
【請求項７】
前記判定工程において、前記腫瘍細胞のＺ軸方向におけるＳＨＧの信号光の局在に基づき、前記腫瘍細胞の前記被検物質に対する感受性を判定する、請求項１から６のいずれか一項に記載の判定方法。
【請求項８】
前記判定工程において、前記腫瘍細胞のＺ軸方向における中央部にＳＨＧの信号光が局在する場合、前記腫瘍細胞は、前記被検物質に対する感受性であると判定する、請求項１から７のいずれか一項に記載の判定方法。
【請求項９】
前記被検物質が、低分子化合物、ペプチド、タンパク質および核酸からなる群から選択された少なくとも１つである、請求項１から８のいずれか一項に記載の判定方法。
【請求項１０】
前記腫瘍細胞が、肺がん細胞である、請求項１から９のいずれか一項に記載の判定方法。
【請求項１１】
被検物質と接触させた腫瘍細胞について、コヒーレント反ストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）顕微鏡を用いて取得された第二高調波（ＳＨＧ）を取得する取得手段と、
前記ＳＨＧに基づき、前記腫瘍細胞の前記被検物質に対する感受性を判定する判定手段とを含む、被検物質への感受性の判定装置。
【請求項１２】
前記判定手段では、前記ＳＨＧの信号光の形状および位置の少なくとも一方に基づき、前記腫瘍細胞の前記被検物質に対する感受性が判定される、請求項１１記載の判定装置。
【請求項１３】
前記判定手段では、前記ＳＨＧの信号光の分散値に基づき、前記腫瘍細胞の前記被検物質に対する感受性が判定される、請求項１１または１２記載の判定装置。
【請求項１４】
前記判定手段では、前記ＳＨＧの信号光の分散値を基準値と比較し、前記ＳＨＧの信号光の分散値が、前記基準値より大きい場合、前記腫瘍細胞は、前記被検物質に対する感受性であると判定される、請求項１３記載の判定装置。
【請求項１５】
前記基準値は、前記被検物質と未接触の腫瘍細胞におけるＳＨＧの信号光の分散値である、請求項１４記載の判定装置。
【請求項１６】
前記判定手段では、前記ＳＨＧに基づき、前記腫瘍細胞の前記被検物質に対する感受性の判定結果を出力する機械学習により生成された学習済みモデルを用いて、前記腫瘍細胞の前記被検物質に対する感受性が判定される、請求項１１から１５のいずれか一項に記載の判定装置。
【請求項１７】
前記判定手段では、前記腫瘍細胞のＺ軸方向におけるＳＨＧの信号光の局在に基づき、前記腫瘍細胞の前記被検物質に対する感受性が判定される、請求項１１から１６のいずれか一項に記載の判定装置。
【請求項１８】
前記判定手段では、前記腫瘍細胞のＺ軸方向における中央部にＳＨＧの信号光が局在する場合、前記腫瘍細胞は、前記被検物質に対する感受性であると判定される、請求項１１から１７のいずれか一項に記載の判定装置。
【請求項１９】
前記被検物質が、低分子化合物、ペプチド、タンパク質および核酸からなる群から選択された少なくとも１つである、請求項１１から１８のいずれか一項に記載の判定装置。
【請求項２０】
前記腫瘍細胞が、肺がん細胞である、請求項１１から１９のいずれか一項に記載の判定装置。
【請求項２１】
被検物質と接触させた腫瘍細胞について、前記被検物質に対する感受性を判定する判定工程と、
前記腫瘍細胞が感受性であると判定された被検物質について、抗癌剤の候補物質として選択する工程とを含み、
前記判定工程は、請求項１から１０のいずれか一項に記載の判定方法により実施される、抗癌剤のスクリーニング方法。
【請求項２２】
前記被検物質が、低分子化合物、ペプチド、タンパク質および核酸からなる群から選択された少なくとも１つである、請求項２１記載のスクリーニング方法。
【請求項２３】
被検物質から抗癌剤の候補物質を選抜する選抜工程を含み、
前記選抜工程は、請求項２１または２２記載のスクリーニング方法で実施される、抗癌剤の候補物質の製造方法。
【請求項２４】
被検物質と接触させた腫瘍細胞について、コヒーレント反ストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）顕微鏡を用いて取得された第二高調波（ＳＨＧ）を取得する取得工程と、
前記ＳＨＧと、前記腫瘍細胞の被検物質に対する感受性との組を教師データとして、前記ＳＨＧから腫瘍細胞の被検物質に対する感受性の判定結果を出力する学習済モデルを生成する学習工程とを含む、腫瘍細胞の感受性の判定に用いる学習済モデルの製造方法。
【請求項２５】
前記ＳＨＧから、前記ＳＨＧの信号光の形状および位置の少なくとも一方を検出する信号光検出工程を含み、
前記学習工程において、前記ＳＨＧの信号光の形状および位置の少なくとも一方と、前記腫瘍細胞の被検物質に対する感受性との組を教師データとする、請求項２４記載の製造方法。
【請求項２６】
前記ＳＨＧから、前記ＳＨＧの信号光の分散値を算出する算出工程を含み、
前記学習工程において、前記ＳＨＧの信号光の分散値と、前記腫瘍細胞の被検物質に対する感受性との組を教師データとする、請求項２４または２５記載の製造方法。
【請求項２７】
前記ＳＨＧから、前記腫瘍細胞のＺ軸方向におけるＳＨＧの信号光の局在を検出する局在検出工程を含み、
前記学習工程において、前記腫瘍細胞のＺ軸方向におけるＳＨＧの信号光の局在と、前記腫瘍細胞の被検物質に対する感受性との組を教師データとする、請求項２４から２６のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項２８】
被検物質と接触させた腫瘍細胞について、コヒーレント反ストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）顕微鏡を用いて取得された第二高調波（ＳＨＧ）を取得する取得手段と、
前記ＳＨＧと、前記腫瘍細胞の被検物質に対する感受性との組を教師データとして、前記ＳＨＧから腫瘍細胞の被検物質に対する感受性の判定結果を出力する学習済モデルを生成する学習手段とを含む、腫瘍細胞の感受性の判定に用いる学習済モデルの製造装置。
【請求項２９】
前記ＳＨＧから、前記ＳＨＧの信号光の形状および位置の少なくとも一方を検出する信号光検出手段を含み、
前記学習手段において、前記ＳＨＧの信号光の形状および位置の少なくとも一方と、前記腫瘍細胞の被検物質に対する感受性との組を教師データとする、請求項２８記載の製造装置。
【請求項３０】
前記ＳＨＧから、前記ＳＨＧの信号光の分散値を算出する算出手段を含み、
前記学習手段において、前記ＳＨＧの信号光の分散値と、前記腫瘍細胞の被検物質に対する感受性との組を教師データとする、請求項２８または２９記載の製造装置。
【請求項３１】
前記ＳＨＧから、前記腫瘍細胞のＺ軸方向におけるＳＨＧの信号光の局在を検出する局在検出手段を含み、
前記学習手段において、前記腫瘍細胞のＺ軸方向におけるＳＨＧの信号光の局在と、前記腫瘍細胞の被検物質に対する感受性との組を教師データとする、請求項２８から３０のいずれか一項に記載の製造装置。
【請求項３２】
被検物質と接触させた腫瘍細胞について、コヒーレント反ストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）顕微鏡における第二高調波（ＳＨＧ）を取得する取得処理と、
前記ＳＨＧと、前記腫瘍細胞の被検物質に対する感受性との組を教師データとして、前記ＳＨＧから腫瘍の被検物質に対する感受性の判定結果を出力する学習済モデルを生成する学習処理とを、コンピュータ上で実行可能であるプログラム。
【請求項３３】
被検物質と接触させた腫瘍細胞のコヒーレント反ストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）顕微鏡を用いて取得された第二高調波（ＳＨＧ）を取得する取得処理と、
前記ＳＨＧと、前記腫瘍細胞の被検物質に対する感受性との組を教師データとして、前記ＳＨＧから腫瘍細胞の被検物質に対する感受性の判定結果を出力する学習済モデルを生成する学習処理とを、コンピュータ上で実行可能であるプログラム。
【請求項３４】
被検腫瘍細胞について、コヒーレント反ストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）顕微鏡を用いて第二高調波（ＳＨＧ）を取得する取得工程と、
前記ＳＨＧに基づき、前記被検腫瘍細胞から、前記被検物質の感受性試験に用いる候補腫瘍細胞を選択する選択工程とを含む、被検物質の感受性判定用細胞の選抜方法。
【請求項３５】
前記選択工程において、前記ＳＨＧが検出された被検腫瘍細胞を前記候補腫瘍細胞として選択する、請求項３４記載の選抜方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検物質への感受性の判定方法、被検物質への感受性の判定装置、抗癌剤のスクリーニング方法、抗癌剤の候補物質の製造方法、学習済モデルの製造方法、学習済モデルの製造装置、および選抜方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗癌剤のスクリーニングとしては、対象の腫瘍細胞と抗癌剤の候補化合物とを共存させ、前記腫瘍細胞の細胞死（生存率）を指標とする方法等が用いられている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】John G. Moffat et.al., "Phenotypic screening in cancer drug discovery - past, present and future", 2014, Nature Reviews Drug Discovery, volume 13, pages 588-602
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、腫瘍細胞の被検物質に対する感受性を判定可能な新たな判定方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記目的を達成するために、本発明の被検物質への感受性の判定方法（以下、「判定方法」ともいう）は、被検物質と接触させた腫瘍細胞について、コヒーレント反ストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）顕微鏡を用いて取得された第二高調波（ＳＨＧ）を取得する取得工程と、
前記ＳＨＧに基づき、前記腫瘍細胞の前記被検物質に対する感受性を判定する判定工程とを含む。【０００６】
本発明の被検物質への感受性の判定装置（以下、「判定装置」ともいう）は、被検物質と接触させた腫瘍細胞について、コヒーレント反ストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）顕微鏡を用いて取得された第二高調波（ＳＨＧ）を取得する取得手段と、
前記ＳＨＧに基づき、前記腫瘍細胞の前記被検物質に対する感受性を判定する判定手段とを含む。【０００７】
本発明の抗癌剤のスクリーニング方法（以下、「スクリーニング方法」ともいう）は、被検物質と接触させた腫瘍細胞について、前記被検物質に対する感受性を判定する判定工程と、
前記腫瘍細胞が感受性であると判定された被検物質について、抗癌剤の候補物質として選択する工程とを含み、
前記判定工程は、前記本発明の判定方法により実施される。【０００８】
本発明の抗癌剤の候補物質の製造方法（以下、「製造方法」ともいう）は、被検物質から抗癌剤の候補物質を選抜する選抜工程を含み、
前記選抜工程は、前記本発明のスクリーニング方法で実施される。【０００９】
本発明の腫瘍細胞の感受性の判定に用いる学習済モデルの製造方法（以下、「学習方法」ともいう）は、被検物質と接触させた腫瘍細胞について、コヒーレント反ストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）顕微鏡を用いて取得された第二高調波（ＳＨＧ）を取得する取得工程と、
前記ＳＨＧと、前記腫瘍細胞の被検物質に対する感受性との組を教師データとして、前記ＳＨＧから腫瘍細胞の被検物質に対する感受性の判定結果を出力する学習済モデルを生成する学習工程とを含む。【００１０】
本発明の腫瘍細胞の感受性の判定に用いる学習済モデルの製造装置（以下、「学習装置」ともいう）は、被検物質と接触させた腫瘍細胞について、コヒーレント反ストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）顕微鏡を用いて取得された第二高調波（ＳＨＧ）を取得する取得手段と、
前記ＳＨＧと、前記腫瘍細胞の被検物質に対する感受性との組を教師データとして、前記ＳＨＧから腫瘍細胞の被検物質に対する感受性の判定結果を出力する学習済モデルを生成する学習手段とを含む。【００１１】
本発明の被検物質の感受性判定用細胞の選抜方法（以下、「選抜方法」ともいう）は、被検腫瘍細胞について、コヒーレント反ストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）顕微鏡を用いて第二高調波（ＳＨＧ）を取得する取得工程と、
前記ＳＨＧに基づき、前記被検腫瘍細胞から、前記被検物質の感受性試験に用いる候補腫瘍細胞を選択する選択工程とを含む。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、腫瘍細胞の被検物質に対する感受性を判定できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、実施形態１の判定装置の構成の一例を示すブロック図である。
【図２】図２は、実施形態１の判定装置のハードウェア構成の一例を示すブロック図である。
【図３】図３は、実施形態１の判定方法の一例を示すフローチャートである。
【図４】図４は、実施形態１において、腫瘍細胞における第二高調波のシグナルの分布を示す模式図である。
【図５】図５は、実施形態２の学習装置の構成の一例を示すブロック図である。
【図６】図６は、実施形態２の学習方法の一例を示すフローチャートである。
【図７】図７は、実施例１で用いたＣＡＲＳ顕微鏡の光学系の構成の概略図である。
【図８】図８は、実施例１におけるＳＨＧ像を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明において、「細胞」は、例えば、単離された細胞、細胞から構成される細胞塊、組織、または臓器を意味する。前記細胞は、例えば、培養細胞でもよいし、生体から単離された細胞でもよい。また、前記細胞塊、組織または臓器は、例えば、前記細胞から作製した細胞塊、細胞シート、組織または臓器でもよいし、生体から単離した細胞塊、組織または臓器でもよい。
【００１５】
以下、本発明について、図面を参照して詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の説明に限定されない。なお、以下の図１〜図８において、同一部分には、同一符号を付し、その説明を省略する場合がある。また、図面においては、説明の便宜上、各部の構造は適宜簡略化して示す場合があり、各部の寸法比等は、実際とは異なり、模式的に示す場合がある。また、各実施形態は、特に言及しない限り、互いにその説明を援用できる。
【００１６】
＜判定方法および判定装置＞
本発明の被検物質への感受性の判定方法は、前述のように、被検物質と接触させた腫瘍細胞について、コヒーレント反ストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）顕微鏡を用いて取得された第二高調波（ＳＨＧ）を取得する取得工程と、前記ＳＨＧに基づき、前記腫瘍細胞の前記被検物質に対する感受性を判定する判定工程とを含む。また、本発明の被検物質への感受性の判定装置は、被検物質と接触させた腫瘍細胞について、コヒーレント反ストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）顕微鏡を用いて取得された第二高調波（ＳＨＧ）を取得する取得手段と、前記ＳＨＧに基づき、前記腫瘍細胞の前記被検物質に対する感受性を判定する判定手段とを含む。本発明の判定方法および判定装置は、被検物質と接触させた腫瘍細胞から得られたＳＨＧに基づき、前記腫瘍細胞の前記被検物質に対する感受性を判定することが特徴であり、その他の構成および条件は、制限されない。
【００１７】
本発明者らは鋭意研究の結果、ＣＡＲＳ顕微鏡を用いて取得された信号光、具体的には、第二高調波が、腫瘍細胞の被検物質に対する感受性と相関することを見出し、本発明を確立するに至った。このため、本発明によれば、被検細胞についてＣＡＲ顕微鏡を用いて取得された信号光に基づき、腫瘍細胞の被検物質に対する感受性を判定できる。
【００１８】
（実施形態１）
図１に、本実施形態における判定装置のブロック図を示す。図１に示すように、本実施形態の判定装置１０は、取得手段１１１および判定手段１１２を含む。図１に示すように、取得手段１１１および判定手段１１２は、ハードウェアであるデータ処理手段（データ処理装置）１１に組み込まれてもよく、ソフトウェアまたは前記ソフトウェアが組み込まれたハードウェアでもよい。データ処理手段１１は、ＣＰＵ等を備えてもよい。また、データ処理手段１１は、例えば、後述のＲＯＭ、ＲＡＭ等を備えてもよい。
【００１９】
つぎに、図２に、判定装置１０のハードウェア構成のブロック図を例示する。判定装置１０は、例えば、ＣＰＵ（中央処理装置）２０１、メモリ２０２、バス２０３、記憶装置２０４、入力装置２０６、ディスプレイ２０７、通信デバイス２０８等を有する。判定装置１０の各部は、それぞれのインタフェース（Ｉ／Ｆ）により、バス２０３を介して接続されている。判定装置１０のハードウェア構成は、例えば、後述の学習装置におけるハードウェア構成としても採用できる。
【００２０】
ＣＰＵ２０１は、例えば、コントローラ（システムコントローラ、Ｉ／Ｏコントローラ等）等により、他の構成と連携動作し、判定装置１０の全体の制御を担う。判定装置１０において、ＣＰＵ２０１により、例えば、本発明のプログラム２０５やその他のプログラムが実行され、また、各種情報の読み込みや書き込みが行われる。具体的には、例えば、ＣＰＵ２０１が、取得手段１１１および判定手段１１２として機能する。判定装置１０は、演算装置として、ＣＰＵを備えるが、ＧＰＵ（Graphics Processing Unit）、ＡＰＵ（Accelerated Processing Unit）等の他の演算装置を備えてもよいし、ＣＰＵとこれらとの組合せを備えてもよい。なお、ＣＰＵ２０１は、例えば、後述する実施形態２における記憶手段以外の各手段として機能する。
【００２１】
メモリ２０２は、例えば、メインメモリを含む。前記メインメモリは、主記憶装置ともいう。ＣＰＵ２０１が処理を行う際には、例えば、後述する記憶装置２０４（補助記憶装置）に記憶されている本発明のプログラム２０５等の種々の動作プログラムを、メモリ２０２が読み込む。そして、ＣＰＵ２０１は、メモリ２０２からデータを読み出し、解読し、前記プログラムを実行する。前記メインメモリは、例えば、ＲＡＭ（ランダムアクセスメモリ）である。メモリ２０２は、例えば、さらに、ＲＯＭ（読み出し専用メモリ）を含む。
【００２２】
バス２０３は、例えば、外部機器とも接続できる。前記外部機器は、例えば、外部記憶装置（外部データベース等）、プリンター等があげられる。判定装置１０は、例えば、バス２０３に接続された通信デバイス２０８により、通信回線網に接続でき、通信回線網を介して、前記外部機器と接続することもできる。また、判定装置１０は、通信デバイス２０８および通信回線網を介して、端末等にも接続できる。
【００２３】
記憶装置２０４は、例えば、前記メインメモリ（主記憶装置）に対して、いわゆる補助記憶装置ともいう。前述のように、記憶装置２０４には、本発明のプログラム２０５を含む動作プログラムが格納されている。記憶装置２０４は、例えば、記憶媒体と、前記記憶媒体に読み書きするドライブとを含む。前記記憶媒体は、特に制限されず、例えば、内蔵型でも外付け型でもよく、ＨＤ（ハードディスク）、ＦＤ（フロッピー（登録商標）ディスク）、ＣＤ−ＲＯＭ、ＣＤ−Ｒ、ＣＤ−ＲＷ、ＭＯ、ＤＶＤ、フラッシュメモリー、メモリーカード等があげられ、前記ドライブは、特に制限されない。記憶装置２０４は、例えば、前記記憶媒体と前記ドライブとが一体化されたハードディスクドライブ（ＨＤＤ）であってもよい。
【００２４】
判定装置１０は、例えば、さらに、入力装置２０６、ディスプレイ２０７を有する。入力装置２０６は、例えば、タッチパネル、トラックパッド、マウス等のポインティングデバイス；キーボード；カメラ、スキャナ等の撮像手段；ＩＣカードリーダ、磁気カードリーダ等のカードリーダ；マイク等の音声入力手段；等があげられる。ディスプレイ２０７は、例えば、ＬＥＤディスプレイ、液晶ディスプレイ等の表示装置があげられる。本実施形態１において、入力装置２０６とディスプレイ２０７とは、別個に構成されているが、入力装置２０６とディスプレイ２０７とは、タッチパネルディスプレイのように、一体として構成されてもよい。
【００２５】
つぎに、本実施形態の判定装置１０の処理の一例について、腫瘍細胞についてＣＡＲＳ顕微鏡を用いて信号光を取得した場合を例に取り、図３のフローチャートに基づき、説明する。
【００２６】
判定装置１０の処理に先立ち、まず、被検物質と接触させた腫瘍細胞について、ＣＡＲＳ顕微鏡を用いて、信号光を取得する。前記被検物質と前記腫瘍細胞との接触は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでもよいし、ｉｎ ｖｉｖｏでもよい。前記接触をｉｎ ｖｉｔｒｏで実施する場合、前記接触は、例えば、前記被検物質と前記腫瘍細胞との共存下で培養することにより実施できる。前記培養における条件は、特に制限されず、前記腫瘍細胞の種類に応じて適宜設定できる。具体例として、培養時間は、例えば、１〜９６時間、１２〜４８時間である。培養温度は、例えば、２５〜４０℃、３５〜３８℃である。前記培養は、例えば、湿潤環境下で実施される。前記接触をｉｎ ｖｉｖｏで実施する場合、前記接触は、例えば、前記被検物質を、前記腫瘍細胞を有する被検体に投与することにより、実施できる。前記被検体は、例えば、ヒトまたは非ヒト動物があげられる。前記非ヒト動物は、例えば、サル、ゴリラ、チンパンジー、マーモセット等の霊長類、マウス、ラット、イヌ、ウサギ、ヒツジ、ウマ、モルモット等があげられる。前記被検物質の投与量、投与経路、投与条件等は、特に制限されず、前記被検物質の溶媒への溶解性、体内への吸収性等に応じて適宜決定できる。そして、前記接触後、腫瘍細胞を回収し、ＣＡＲＳ顕微鏡による観察に供する。
【００２７】
前記腫瘍細胞は、例えば、生体から単離された腫瘍細胞、すなわち、初代細胞またはその継代細胞でもよいし、馴化させた培養細胞でもよいし、ウイルス、変異原等により腫瘍化させた細胞でもよいが、単離された腫瘍細胞またはその継代細胞が好ましい。また、前記腫瘍細胞は、１細胞から構成されもよいし、複数細胞から構成されてもよい。後者の場合、前記腫瘍細胞は、例えば、腫瘍細胞を含む組織、器官または臓器であってもよい。前記腫瘍細胞の由来は、特に制限されない。具体例として、前記腫瘍細胞は、例えば、肺がん、乳がん、大腸がん、肝臓がん、膵臓がん、胆道がん、食道がん、胃がん、卵巣がん、子宮頸がん、脳腫瘍、血液腫瘍、中皮腫、皮膚がん等に由来する腫瘍細胞があげられる。前記腫瘍細胞は、例えば、前記被検物質に対して感受性の腫瘍細胞でもよいし、前記被検物質に対して耐性の腫瘍細胞でもよいし、前記被検物質に対する感受性が不明の腫瘍細胞でもよい。
【００２８】
前記被検物質は、例えば、低分子化合物、ペプチド、タンパク質、核酸等があげられる。前記被検物質は、１種類を単独で用いてもよいし、複数種類を併用してもよい。前記被検物質は、抗腫瘍作用または腫瘍の転移を抑制することが知られている物質（いわゆる、抗癌剤または転移抑制剤）でもよいし、抗腫瘍作用または腫瘍の転移を抑制しないことが知られている物質でもよいし、抗腫瘍作用または腫瘍の転移を抑制するかが不明の物質でもよい。前記被検物質が抗腫瘍作用または腫瘍の転移を抑制することが知られている物質である場合、本発明の判定装置は、例えば、癌の抗癌剤または転移抑制剤に対する感受性の判定装置または試験装置ということができる。また、本発明の判定方法は、例えば、癌の抗癌剤または転移抑制剤に対する感受性の判定方法または試験方法ということもできる。
【００２９】
そして、このように被検物質と接触させた腫瘍細胞についてＣＡＲＳ顕微鏡で観察し、信号光を取得する。前記ＣＡＲＳ顕微鏡による信号光の取得は、前記腫瘍細胞全体または一部に対して実施する。後者の場合、前記ＣＡＲＳ顕微鏡による信号光の取得は、例えば、前記腫瘍細胞の中心部において、腫瘍細胞の配置面に対して垂直方向を含む断面の信号光を取得することが好ましい。前記観察に供する腫瘍細胞は、１つでもよいし、複数でもよい。後者の場合、前記ＣＡＲＳ顕微鏡による信号光の取得は、その一部または全部の細胞に対して実施する。前記ＣＡＲＳ顕微鏡は、コヒーレント反ストークスラマン散乱を利用した顕微鏡であり、その構成は特に制限されず、例えば、後述の実施例の構成を参照できる。前記ＣＡＲＳ顕微鏡では、ＣＡＲＳ分光用の光照射手段を含み、前記光照射手段により、超広帯域光および励起光の混合光が腫瘍細胞に照射される。そして、前記ＣＡＲＳ顕微鏡では、前記腫瘍細胞から出射された出射光から、回折格子等によりＣＡＲＳ光（信号光）が分光される。そして、前記ＣＡＲＳ光のシグナル強度、空間位置等の情報が、取得される。本発明において、前記信号光としては、第二高調波（ＳＨＧ）のみを取得してもよいし、第三高調波（ＴＨＧ）、二光子励起蛍光等の他の信号光も取得してもよい。前記超広帯域光の波長は、例えば、４００〜２４００ｎｍである。また、前記励起光の波長は、例えば、７５０〜１１００ｎｍ、７５０〜１０６４ｎｍである。
【００３０】
つぎに、判定装置１０による処理を開始する。まず、判定装置１０の取得手段１１１が、前記ＣＡＲＳ顕微鏡で取得された、信号光、より具体的には、信号光の情報を取得する（Ｓ１、取得工程）。前記取得工程において取得する信号光は、後述の判定工程で使用される信号光を含み、具体例として、第二高調波（ＳＨＧ）の信号光を含むことが好ましい。前記ＳＨＧの信号光の波数は、入射レーザの波長をλとするとλ/2となる。
【００３１】
つぎに、判定手段１１２が、前記信号光、具体的には、ＳＨＧの信号光に基づき、前記腫瘍細胞の感受性を判定する（Ｓ２、判定工程）。Ｓ２工程では、前記腫瘍細胞が、前記被検物質に感受性であると判定してもよいし、前記被検物質に抵抗性であると判定してもよい。また、Ｓ２工程では、前記腫瘍細胞が、前記被検物質に感受性を有するか不明と判定してもよい。前記信号光において、各波数（Raman shift/cm-1）は、その信号の由来となる腫瘍細胞内の物質が異なる。また、腫瘍細胞の状態が異なる場合、状態の異なる細胞ではその機能および代謝も異なるため、前記腫瘍細胞が含有する物質の種類、物質の含有率および物質の局在等も異なると推定される。そこで、本発明では、前記腫瘍細胞の状態の違いが、例えば、前記信号光の違いとして生じることを利用し、前記信号光に基づき、前記腫瘍細胞の感受性を判定する。以下、前記腫瘍細胞が、肺がん細胞である場合を例にあげて説明するが、本発明はこれに限定されず、他の腫瘍細胞の推定にも利用できる。
【００３２】
まず、Ｓ２工程において、ＳＨＧの信号から再構築されるＳＨＧ像におけるＳＨＧのシグナルの位置（局在）に基づき、判定する方法について説明する。図４（Ａ）に示すように、前記被検物質と未接触の肺がん細胞Ｃでは、ＳＨＧの信号から再構築されるＳＨＧ像において、ＳＨＧのシグナルＳが、肺がん細胞ＣのＺ軸方向の両極、すなわち、上端側と下端側とに局在する。そして、前記被検物質と接触後の肺がん細胞Ｃであり、かつ肺がん細胞Ｃが被検物質に対して感受性を示す場合、図４（Ｂ）に示すように、ＳＨＧ像において、ＳＨＧのシグナルＳは、肺がん細胞ＣのＺ軸方向の赤道周辺、すなわち、中央部に局在する。他方、前記被検物質と接触後の肺がん細胞Ｃであり、かつ肺がん細胞Ｃが被検物質に対して抵抗性を示す場合、図４（Ａ）に示すように、前記被検物質と未接触の肺がん細胞Ｃと同様に、ＳＨＧ像において、ＳＨＧのシグナルＳが、肺がん細胞ＣのＺ軸方向の両極、すなわち、上端側と下端側とに局在する。したがって、Ｓ２工程では、ＳＨＧ信号光の位置、すなわち、ＳＨＧの信号から再構築されるＳＨＧ像におけるＳＨＧのシグナルの位置に基づき、肺がん細胞Ｃが感受性か否かを判定できる。前記局在は、例えば、全ＳＨＧシグナルのうち、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上のＳＨＧシグナルが所定の位置に存在することを意味する。前記上端側は、前記腫瘍細胞のＺ軸方向において、上端と、上端からＺ軸方向の長さ３０％、２５％、２０％、１５％、１０％の位置との間の領域を意味する。前記下端側は、前記腫瘍細胞のＺ軸方向において、下端と、下端から腫瘍細胞のＺ軸方向の長さ３０％、２５％、２０％、１５％、１０％の位置との間の領域を意味する。前記中央部は、例えば、前記上端側および下端側以外の領域を意味し、具体例として、前記腫瘍細胞のＺ軸方向において、例えば、下端から腫瘍細胞のＺ軸方向の長さ５０％の位置を基準として、腫瘍細胞のＺ軸方向の長さ±５％、±１０％、＋１５％、±２０％、±２５％、±３０％の範囲の領域を意味する。
【００３３】
つぎに、Ｓ２工程において、ＳＨＧの信号から再構築されるＳＨＧ像におけるＳＨＧのシグナルの形状に基づき、判定する方法について説明する。図４（Ａ）に示すように、前記被検物質と未接触の肺がん細胞Ｃでは、ＳＨＧ像において、ＳＨＧのシグナルＳは、滑らかな円弧を形成する。そして、前記被検物質と接触後の肺がん細胞Ｃであり、かつ肺がん細胞Ｃが被検物質に対して感受性を示す場合、図４（Ｂ）に示すように、ＳＨＧ像において、ＳＨＧのシグナルＳは、境界がぼやけた粒を形成する。他方、前記被検物質と接触後の肺がん細胞Ｃであり、かつ肺がん細胞Ｃが被検物質に対して抵抗性を示す場合、図４（Ａ）に示すように、前記被検物質と未接触の肺がん細胞Ｃと同様に、ＳＨＧ像において、ＳＨＧのシグナルは、滑らかな円弧を形成する。したがって、Ｓ２では、ＳＨＧ信号光の形状、すなわち、ＳＨＧの信号から再構築されるＳＨＧ像におけるＳＨＧのシグナルの形状に基づき、前記肺がん細胞が感受性か否かを判定できる。
【００３４】
また、前述のように、前記肺がん細胞の被検物質に対する感受性の有無により、前記ＳＨＧのシグナルの形状の差異があり、特にその形状の外延の明瞭さが異なる。このため、Ｓ２工程では、ＳＨＧの信号光の分散値、すなわち、ＳＨＧの信号光のシグナル強度の分散値に基づき、前記肺がん細胞の被検物質に対する感受性を判定できる。具体的には、前記被検物質に感受性の肺がん細胞では、例えば、ＳＨＧのシグナルの境界がぼやけており、シグナル強度の分布が相対的に広くなるのに対して、前記被検物質に耐性の肺がん細胞では、ＳＨＧのシグナルの境界が明瞭であり、シグナル強度の分布が相対的に狭くなる。このため、Ｓ２工程では、前記腫瘍細胞のＳＨＧの信号光の分散値、すなわち、ＳＨＧの信号光のシグナル強度の分散値を、基準値と比較して、ＳＨＧの信号の分散値が前記基準値より有意に大きい場合、前記腫瘍細胞は、前記被検物質に感受性であると判定できる。他方、Ｓ２工程では、前記腫瘍細胞のＳＨＧの信号光の分散値を、前記基準値と比較して、ＳＨＧの信号の分散値が前記基準値と同等（有意差がない）または有意に小さい場合、前記腫瘍細胞は、前記被検物質に耐性であると判定できる。前記基準値は、例えば、前記被検物質と未接触の肺がん細胞におけるＳＨＧの信号光の分散値としてもよいし、前記被検物質に感受性の肺がん細胞におけるＳＨＧの信号光の分散値と、前記被検物質に耐性の肺がん細胞におけるＳＨＧの信号光の分散値とに基づき、両者の間の数値としてもよい。
【００３５】
Ｓ２工程では、例えば、機械学習により生成された学習済モデルを用いて実施してもよい。前記学習済モデルは、例えば、後述の前記ＳＨＧと、前記腫瘍細胞の被検物質に対する感受性との組を教師データとして、前記ＳＨＧから腫瘍の被検物質に対する感受性の判定結果を出力する学習済モデルがあげられる。
【００３６】
このようにして、Ｓ２工程では、前記腫瘍細胞が、前記被検物質に対する感受性の有無を判定できる。なお、実施形態１において、Ｓ２工程では、１つの判定方法を用いる例をあげて説明したが、複数の判定方法を組み合わせてもよい。この場合、Ｓ２工程では、いずれか１つの判定方法により感受性と判定された場合に、前記腫瘍細胞は前記被検物質に対する感受性を有すると判定してもよいし、複数の判定方法により感受性と判定された場合に、前記腫瘍細胞は前記被検物質に対する感受性を有すると判定してもよい。
【００３７】
実施形態１において、信号光として、ＳＨＧを用いる場合を例にあげて説明したが、他の信号光を用いてもよい。
【００３８】
実施形態１において、被検物質に対する感受性を判定する被検細胞として、腫瘍細胞を例にあげて説明したが、本発明はこれに限定されず、腫瘍細胞以外の細胞、例えば、正常組織由来の細胞等を用いてもよい。
【００３９】
実施形態１では、ハードウェア資源を用いて判定する場合を例にあげて説明したが、本発明はこれに限定されず、ハードウェア資源を用いなくてもよい。
【００４０】
＜スクリーニング方法＞
本発明の抗癌剤のスクリーニング方法は、前述のように、被検物質と接触させた腫瘍細胞について、前記被検物質に対する感受性を判定する判定工程と、前記腫瘍細胞が感受性であると判定された被検物質について、抗癌剤の候補物質として選択する工程とを含み、前記判定工程は、前記本発明の判定方法により実施される。本発明のスクリーニング方法は、前記判定工程が本発明の判定方法により実施されることが特徴であり、その他の工程および条件は特に制限されない。本発明のスクリーニング方法によれば、抗癌剤をスクリーニングできる。本発明のスクリーニング方法は、前記本発明の判定方法および判定装置の説明を援用できる。
【００４１】
前記抗癌剤は、例えば、腫瘍の発生の停止もしくは抑制、腫瘍の増殖の停止もしくは抑制、腫瘍の進行の停止もしくは抑制、腫瘍の転移の停止もしくは抑制、または腫瘍の縮小を誘導する薬剤を意味し、いずれの意味で用いてもよい。
【００４２】
＜抗癌剤の候補物質の製造方法＞
本発明の抗癌剤の候補物質の製造方法は、前述のように、被検物質から抗癌剤の候補物質を選抜する選抜工程を含み、前記選抜工程は、前記本発明のスクリーニング方法で実施される。本発明の製造方法は、前記選抜工程が前記本発明のスクリーニング方法で実施されることが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の製造方法によれば、抗癌剤の候補物質を製造できる。本発明のスクリーニング方法は、前記本発明の判定方法、判定装置、およびスクリーニング方法の説明を援用できる。
【００４３】
＜学習済モデルの製造方法および製造装置＞
本発明の腫瘍細胞の感受性の判定に用いる学習済モデルの製造方法は、前述のように、被検物質と接触させた腫瘍細胞について、コヒーレント反ストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）顕微鏡を用いて取得された第二高調波（ＳＨＧ）を取得する取得工程と、前記ＳＨＧと、前記腫瘍細胞の被検物質に対する感受性との組を教師データとして、前記ＳＨＧから腫瘍細胞の被検物質に対する感受性の判定結果を出力する学習済モデルを生成する学習工程とを含む。また、本発明の腫瘍細胞の感受性の判定に用いる学習済モデルの製造装置は、被検物質と接触させた腫瘍細胞について、コヒーレント反ストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）顕微鏡を用いて取得された第二高調波（ＳＨＧ）を取得する取得手段と、前記ＳＨＧと、前記腫瘍細胞の被検物質に対する感受性との組を教師データとして、前記ＳＨＧから腫瘍細胞の被検物質に対する感受性の判定結果を出力する学習済モデルを生成する学習手段とを含む。本発明の学習方法および学習装置は、ＣＡＲＳ顕微鏡により取得されたＳＨＧと、前記腫瘍細胞の被検物質に対する感受性との組を教師データとして、前記ＳＨＧから腫瘍細胞の被検物質に対する感受性の判定結果を出力する学習済モデルを生成することが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の学習方法および学習装置によれば、前記本発明の判定方法および判定装置に使用可能な学習済モデルを製造できる。本発明の学習方法および学習装置は、前記本発明の判定方法、判定装置、およびスクリーニング方法の説明を援用できる。
【００４４】
（実施形態２）
図５に、本実施形態における学習装置のブロック図を示す。図５に示すように、本実施形態の学習装置２０は、取得手段１１１および学習手段１１３を備える。図５に示すように、取得手段１１１および学習手段１１３は、ハードウェアであるデータ処理手段（データ処理装置）１１に組み込まれてもよく、ソフトウェアまたは前記ソフトウェアが組み込まれたハードウェアでもよい。データ処理手段１１は、ＣＰＵ等を備えてもよい。また、データ処理手段１１は、例えば、前述のＲＯＭ、ＲＡＭ等を備えてもよい。取得手段１１１は、実施形態１の判定装置１０における取得手段１１１と同様であり、その説明を援用できる。
【００４５】
つぎに、図５の学習装置における処理の一例を、図６のフローチャートに基づいて説明する。
【００４６】
まず、実施形態１の判定方法のＳ１と同様に、取得手段１１１により、被検物質と接触させた腫瘍細胞について、ＣＡＲＳ顕微鏡を用いて取得された信号光を取得する。前記腫瘍細胞の数は、特に制限されず、任意の数とできる。前記腫瘍細胞が複数の場合、各腫瘍細胞の由来は、同じでもよいし、異なってもよい。後者の場合、一部の腫瘍細胞は、由来が同じであることが好ましい。具体例として、肺がん細胞、乳がん細胞および大腸がん細胞かを判定可能な学習済モデルを生成する場合、前記腫瘍細胞としては、肺がん細胞、乳がん細胞および大腸がん細胞を用いることが好ましい。また、各腫瘍細胞は、複数用いることが好ましい。
【００４７】
つぎに、学習手段１１３は、前記信号光（例えば、ＳＨＧ）と、前記腫瘍細胞の被検物質に対する感受性との組を教師データとして、前記信号光から腫瘍細胞の被検物質に対する感受性の判定結果を出力する学習済モデルを生成する（Ｓ３、学習工程）。具体的には、各被検細胞について、Ｓ１工程で得られた信号光と、前記腫瘍細胞の感受性の有無とを関連付ける。関連付ける信号光は、Ｓ１工程で得られた信号光のスペクトル全体でもよいし、特定の信号光でもよいし、特定の信号光から得られる算出値でもよい。前記特定の信号光と関連づける場合、特定の信号光は、例えば、ＳＨＧの信号光があげられる。前記特定の信号光を関連付ける場合、本実施形態の学習方法は、例えば、Ｓ１工程後、検出手段により、得られた信号において、特定の信号光を検出する。前記検出手段は、例えば、特定の信号光のシグナル強度を検出してもよいし、特定の信号光を再構築して得られた信号像における信号光の形状および／または位置（局在）を検出してもよい。前記位置は、例えば、前記腫瘍細胞のＺ軸方向におけるＳＨＧの信号光の局在である。また、前記特定の信号光から得られる算出値と関連付ける場合、本実施形態の学習方法は、例えば、算出手段により、特定の信号光の分散値、すなわち、特定の信号光のシグナル強度の分散値を算出してもよい。
【００４８】
学習済モデルの生成に用いる機械学習の方法は、特に制限されず、例えば、分類に用いる学習技法を用いることができる。具体例として、前記機械学習の方法としては、サポートベクターマシン、エクストリーム・ラーニング・マシン、表現学習（Feature learning）等があげられる。本実施形態において、前記機械学習は、教師あり学習を用いているが、半教師あり学習を用いてもよい。前記教師データの数は、複数であり、その上限は特に制限されない。
【００４９】
このようにして、Ｓ３工程では、学習済モデルを生成できる。
【００５０】
＜選抜方法＞
本発明の被検物質の感受性判定用細胞の選抜方法は、前述のように、被検腫瘍細胞について、コヒーレント反ストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）顕微鏡を用いて第二高調波（ＳＨＧ）を取得する取得工程と、前記ＳＨＧに基づき、前記被検腫瘍細胞から、前記被検物質の感受性試験に用いる候補腫瘍細胞を選択する選択工程とを含む。本発明の選抜方法は、ＣＡＲＳ顕微鏡を用いて得られたＳＨＧに基づき、前記候補腫瘍細胞を選択することが特徴であり、その他の構成および条件は、制限されない。本発明の選抜方法によれば、前記本発明の判定方法に適した腫瘍細胞を選抜できる。本発明の選抜方法は、前記本発明の判定方法、判定装置、スクリーニング方法、学習方法および学習装置の説明を援用できる。
【００５１】
前記取得工程は、前記本発明の判定方法における取得工程の説明を援用できる。前記被検腫瘍細胞は、例えば、前記腫瘍細胞の説明を援用できる。
【００５２】
前記選択工程は、前記ＳＨＧに基づき、前記被検腫瘍細胞から、前記被検物質の感受性試験に用いる候補腫瘍細胞を選択する。前記選択工程は、例えば、前記ＳＨＧの有無、ＳＨＧの信号光のシグナル強度、ＳＨＧの信号光から再構築されるＳＨＧ像におけるＳＨＧシグナルの形状および／またはＳＨＧ像におけるＳＨＧシグナルの位置（局在）に基づき、実施できる。具体例として、前記選択工程は、例えば、前記被検腫瘍細胞において、ＳＨＧが取得される場合、ＳＨＧの信号光のシグナル強度が所定の値以上の場合、ＳＨＧ像におけるＳＨＧシグナルの形状が、境界が明瞭な円弧状の場合、および／またはＳＨＧ像におけるＳＨＧシグナルの位置が、前記候補腫瘍細胞のＺ軸方向において、上端側および／または下端側に局在している場合、前記被検腫瘍細胞を、前記候補腫瘍細胞として選択する。
【００５３】
＜プログラム＞
本発明のプログラムは、前記本発明の判定方法、スクリーニング方法、製造方法、学習方法、または選抜方法を、コンピュータ上で実行可能なプログラムである。または、本実施形態のプログラムは、例えば、コンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録されてもよい。前記記録媒体は、例えば、非一時的なコンピュータ可読記録媒体（non-transitory computer-readable storage medium）である。前記記録媒体は、特に制限されず、例えば、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、読み出し専用メモリ（ＲＯＭ）、ハードディスク（ＨＤ）、光ディスク、フロッピー（登録商標）ディスク（ＦＤ）等があげられる。
【実施例】
【００５４】
次に、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコルに基づいて使用した。【００５５】
［実施例１］
ＣＡＲＳ顕微鏡により取得した信号光に基づき、腫瘍細胞の被検物質に対する感受性を判定できることを確認した。【００５６】
（１）ＣＡＲＳ顕微鏡
実施例１で用いるＣＡＲＳ顕微鏡は、マルチプレックスＣＡＲＳ顕微分光装置を用いた。実施例１で用いたＣＡＲＳ顕微鏡の光学系の構成の概略図を図７に示す。【００５７】
光源は、発振波長１０６４ｎｍ、パルス幅８００ｐｓ、繰り返し周波数33 kHzのｃｗ  ＱスイッチマイクロチップNd:YAGレーザー（Ａ）を用いた。パルス幅がサブナノ秒であり、１ｃｍ−１以下程度の線幅を持つ。この出力を二つに分け、一方はω１光として基本波である中心波長１０６４ｎｍのパルスレーザーを、他方はPCFに導入し、ω２光としてスーパーコンティニュウム光を発生させた。ω１光は、光源本体から出射されるレーザ光をf=400.0 mm（AC254-400-C f=400.0 mm, φ1" Achromatic Doublet, ARC: 1050-1700 nm; Thorlabs）の平凸レンズ（Ｂ）でコリメートし、ω２光はPCFから出射された広帯域な波長成分を有するスーパーコンティニュウム光を非軸放物面鏡（Protected Silver Reflective Collimator, 450 nm-20 um, φ4 mm, FC/APC; Thorlabs）（Ｃ）に導入することでコリメートし伝搬させた。【００５８】
また、ω１光は伝搬の途中でVariable Neutral Density Filter(VND Filter)（Ｄ）と１０６４ｎｍ半波長板(S333-1064-2; 駿河精機社製)（Ｅ）を挟んだ。VND Filterは、試料に入射するω１光の光量調整を、１０６４ｎｍ半波長板は後述するSHGアクティブな分子の偏光依存性を確認するために用いた。【００５９】
さらに、ω１光は中心波長１０６４ｎｍ以外にもその短波長側に微弱な成分を含んでおり、検出するCARS光の以外のω１光に含まれる余分なスペクトル成分を効率的にカットするために１０６４ｎｍ  narrow Band Pass Filter(1064.1-1 OD7 Ultra Narrow Bandpass; Alluxa)（Ｆ）を用いた。前記バンドパスフィルターは、中心波長１０６４．１ｎｍ、半値幅１ｎｍのスペクトル成分のみを透過させる超狭帯域バンドパスフィルターを用いた。【００６０】
ω２光はPCFによって可視域から近赤外域まで緩やかに伸びるブロードなバンドを持っている。ω１光の中心波長１０６４ｎｍに対してCARS光の測定に必要なω２光の波長域は１０６４〜１６５０ｎｍ程度までである。そこで、ω２光のコリメート直後に可視光の成分をカットする二つのフィルター1050 nm long Pass Filter（Ｇ）、赤外透過フィルター(IR80N; ケンコー光学社製)（Ｈ）によってω２光の近赤外域に広がるスペクトル成分のみを十分に透過させた。そして、ω１光とω２光の合波後、二つの光を顕微鏡へと伝搬させた。【００６１】
顕微鏡としては、倒立顕微鏡（eclipse Ti-U、株式会社Nikon社製）をカスタムメイドした正倒立顕微鏡を使用した。顕微鏡の倒立側から対物レンズ（Water immersion, Plan, ×60, 1.27NA; Nikon社製）（Ｊ）に入射し、試料に集光されたω１光とω２光によりCARSやSHGといった非線形光学現象が発生する。対物レンズで絞られているため、これらの非線形光学現象は位相整合条件から前方方向に効率よく発生する。焦点で発生した信号光は顕微鏡正立側の対物レンズ（Dry, S Plan Fluor, ×40, 0.60NA; Nikon社製）（Ｋ）によって集光、コリメートされた。【００６２】
倒立側対物レンズにより試料面で集光された位置でパワーメーターを用いて測定した平均パワーはそれぞれω１光が最大55 mW、ω２光が最大20 mWであった。実際の測定ではこのうちパワーの高いω１光に前述のVND Filterを用いることでサンプル信号強度の調節を行った。【００６３】
顕微鏡にはハロゲンランプが備え付けられており、試料の光学像をＣＣＤカメラで撮影可能である。顕微鏡内ではω１光とω２光がハロゲンランプの光と同軸に存在するため、倒立側対物レンズ直前のダイクロイックビームスプリッター（FF825-SDi01-25×36×2.0シングルエッジショートパスDichroicビームスプリッター; オプトライン社製）（Ｌ）と、正立側対物レンズの直後のダイクロイックミラー（TFMS-30C05-3/20超広帯域誘多膜平面ミラー; シグマ光機社製）（Ｍ）とを使用した。【００６４】
顕微鏡に設置したステージは二軸の微小位置決め装置によって制御されるステップモータ式MicroStage（Micro-Stage(2 axis); Mad City Labs）（Ｎ）を利用した。さらに前記MicroStageの上に動作範囲75 μm×75 μm×50 μmのピエゾステージ（Nano-LPQ; Mad City Labs社製）（Ｏ）を設置し、ミリ単位での面内幅広いストロークに加え、さらに細かいストロークの面内ステージ制御と光軸Ｚ方向、すなわち試料に対しての奥行方向のスキャンを可能とした。MicroStageは非常に高精度の駆動装置により最小ステップサイズ95 nm、最大速度2 mm/secの制御が可能である。【００６５】
つぎに、検出器側の光学系は、以下の通りとした。顕微鏡の正立側対物レンズで集光された信号光は、直後のダイクロイックミラーによって反射され、その後ダイクロイックビームスプリッター（FF685-Di02-25×36 685 nm シングルエッジDichroicビームスプリッター; Semrock社製）（Ｐ）によって、近赤外域のCARS光を透過させ、可視域の光は反射させた。【００６６】
可視域の光について、６３３ｎｍ short Pass Filter（Ｑ）により可視域外の励起光由来のバックグラウンドを遮断し、その後f=65 mmの平凸レンズ（Ｒ）により分光器（Z-300 Series; LUCIR社製）（Ｓ）に集光させた。前記分光器を接続したPC上でソフトウェア（Ementool; Zolix社製）によって制御を行った。本実施例では、Grating Groove 300本/mm、Grating Blaze 500 nm、分光器の中心波長410 nmに設定した。SHGの検出には電子冷却CCDカメラ（iVac300; Andor社製）（Ｔ）を用いた。【００６７】
近赤外域の光はダイクロイックビームスプリッターを透過し、１０６４ｎｍ  notch Filter（1064 Narrow ノッチフィルター; Iridian社製）（Ｕ）と１０５０ｎｍ  short Pass Filter（3RD1050SP; Omega）（Ｖ）によってω１光とω２光を遮断し、CARS光のみを分光器へと導光した。【００６８】
１０６４ｎｍ  notch Filterと１０５０ｎｍ  short Pass Filterとを透過後、CARS光はf=25 mmの平凸レンズで分光器（Acton Series LS785; Princeton Instruments社製）（Ｘ）によって波長ごとに分光され、電子冷却CCDカメラ（PIXIS 100BR; Princeton Instruments社製）（Ｙ）で検出した。PIXIS 100BR、iVac 316、およびiVac300は、それぞれPC上のソフトウェア（LightField; Princeton Instruments社製、Andor SOLIS; Andor社製）によって制御されている。【００６９】
（２）腫瘍細胞
腫瘍細胞としては、肺腺がん細胞（ＰＣ−９）を使用した。前記ＰＣ−９は、ゲフィチニブに対して感受性を示すことが知られている肺がん細胞株である。前記腫瘍細胞は、２４ウェルディッシュ内にプレパラートを配置し、プレパラート上で培養した。そして、被検物質として、ゲフィチニブを添加し、４８時間培養した。【００７０】
（３）測定
培養後の各腫瘍細胞を含むプレパラートをスライドグラスにマウントし、前記実施例１（１）のＣＡＲＳ顕微鏡で、信号光を取得した。そして、得られたＳＨＧの信号光を再構築し、ＳＨＧ像を作製した。また、コントロールは、ゲフィチニブを添加しなかった以外は同様にして実施した。これらの結果を図８に示す。【００７１】
図８は、ＳＨＧ像を示す写真である。図８において、（Ａ）は、ゲフィチニブ未添加のコントロールの結果を示し、（Ｂ）は、ゲフィチニブを添加したサンプルの結果を示す。図８（Ａ）に示すように、ゲフィチニブ未添加の状態では、矢印で示すように、ＰＣ−９は、ＳＨＧ像において上端側および下端側にＳＨＧシグナルが局在していた。これに対して、図８（Ｂ）に示すように、ゲフィチニブ添加の状態では、ＳＨＧ像において赤道周辺、すなわち、中央部に局在していた。これらのことから、ＣＡＲＳ顕微鏡により取得した信号光を用いて、腫瘍細胞の感受性を判定できることがわかった。【００７２】
以上、実施形態および実施例を参照して本発明を説明したが、本発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。【００７３】
この出願は、２０１９年２月８日に出願された日本出願特願２０１９−０２１９３２を基礎とする優先権を主張し、その開示のすべてをここに取り込む。【００７４】
＜付記＞
上記の実施形態および実施例の一部または全部は、以下の付記のように記載されうるが、以下には限られない。
（付記１）
被検物質と接触させた腫瘍細胞について、コヒーレント反ストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）顕微鏡を用いて取得された第二高調波（ＳＨＧ）を取得する取得工程と、
前記ＳＨＧに基づき、前記腫瘍細胞の前記被検物質に対する感受性を判定する判定工程とを含む、被検物質への感受性の判定方法。
（付記２）
前記判定工程において、前記ＳＨＧの信号光の形状および位置の少なくとも一方に基づき、前記腫瘍細胞の前記被検物質に対する感受性を判定する、付記１記載の判定方法。
（付記３）
前記判定工程において、前記ＳＨＧの信号光の分散値に基づき、前記腫瘍細胞の前記被検物質に対する感受性を判定する、付記１または２記載の判定方法。
（付記４）
前記判定工程において、前記ＳＨＧの信号光の分散値を基準値と比較し、前記ＳＨＧの信号光の分散値が、前記基準値より大きい場合、前記腫瘍細胞は、前記被検物質に対する感受性であると判定する、付記３記載の判定方法。
（付記５）
前記基準値は、前記被検物質と未接触の腫瘍細胞におけるＳＨＧの信号光の分散値である、付記４記載の判定方法。
（付記６）
前記判定工程において、前記ＳＨＧに基づき、前記腫瘍細胞の前記被検物質に対する感受性の判定結果を出力する機械学習により生成された学習済みモデルを用いて、前記腫瘍細胞の前記被検物質に対する感受性を判定する、付記１から５のいずれかに記載の判定方法。
（付記７）
前記判定工程において、前記腫瘍細胞のＺ軸方向におけるＳＨＧの信号光の局在に基づき、前記腫瘍細胞の前記被検物質に対する感受性を判定する、付記１から６のいずれかに記載の判定方法。
（付記８）
前記判定工程において、前記腫瘍細胞のＺ軸方向における中央部にＳＨＧの信号光が局在する場合、前記腫瘍細胞は、前記被検物質に対する感受性であると判定する、付記１から７のいずれかに記載の判定方法。
（付記９）
前記被検物質が、低分子化合物、ペプチド、タンパク質および核酸からなる群から選択された少なくとも１つである、付記１から８のいずれかに記載の判定方法。
（付記１０）
前記腫瘍細胞が、肺がん細胞である、付記１から９のいずれかに記載の判定方法。
（付記１１）
被検物質と接触させた腫瘍細胞について、コヒーレント反ストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）顕微鏡を用いて取得された第二高調波（ＳＨＧ）を取得する取得手段と、
前記ＳＨＧに基づき、前記腫瘍細胞の前記被検物質に対する感受性を判定する判定手段とを含む、被検物質への感受性の判定装置。
（付記１２）
前記判定手段では、前記ＳＨＧの信号光の形状および位置の少なくとも一方に基づき、前記腫瘍細胞の前記被検物質に対する感受性が判定される、付記１１記載の判定装置。
（付記１３）
前記判定手段では、前記ＳＨＧの信号光の分散値に基づき、前記腫瘍細胞の前記被検物質に対する感受性が判定される、付記１１または１２記載の判定装置。
（付記１４）
前記判定手段では、前記ＳＨＧの信号光の分散値を基準値と比較し、前記ＳＨＧの信号光の分散値が、前記基準値より大きい場合、前記腫瘍細胞は、前記被検物質に対する感受性であると判定される、付記１３記載の判定装置。
（付記１５）
前記基準値は、前記被検物質と未接触の腫瘍細胞におけるＳＨＧの信号光の分散値である、付記１４記載の判定装置。
（付記１６）
前記判定手段では、前記ＳＨＧに基づき、前記腫瘍細胞の前記被検物質に対する感受性の判定結果を出力する機械学習により生成された学習済みモデルを用いて、前記腫瘍細胞の前記被検物質に対する感受性が判定される、付記１１から１５のいずれかに記載の判定装置。
（付記１７）
前記判定手段では、前記腫瘍細胞のＺ軸方向におけるＳＨＧの信号光の局在に基づき、前記腫瘍細胞の前記被検物質に対する感受性が判定される、付記１１から１６のいずれかに記載の判定装置。
（付記１８）
前記判定手段では、前記腫瘍細胞のＺ軸方向における中央部にＳＨＧの信号光が局在する場合、前記腫瘍細胞は、前記被検物質に対する感受性であると判定される、付記１１から１７のいずれかに記載の判定装置。
（付記１９）
前記被検物質が、低分子化合物、ペプチド、タンパク質および核酸からなる群から選択された少なくとも１つである、付記１１から１８のいずれかに記載の判定装置。
（付記２０）
前記腫瘍細胞が、肺がん細胞である、付記１１から１９のいずれかに記載の判定装置。
（付記２１）
被検物質と接触させた腫瘍細胞について、前記被検物質に対する感受性を判定する判定工程と、
前記腫瘍細胞が感受性であると判定された被検物質について、抗癌剤の候補物質として選択する工程とを含み、
前記判定工程は、付記１から１０のいずれかに記載の判定方法により実施される、抗癌剤のスクリーニング方法。
（付記２２）
前記被検物質が、低分子化合物、ペプチド、タンパク質および核酸からなる群から選択された少なくとも１つである、付記２１記載のスクリーニング方法。
（付記２３）
被検物質から抗癌剤の候補物質を選抜する選抜工程を含み、
前記選抜工程は、付記２１または２２記載のスクリーニング方法で実施される、抗癌剤の候補物質の製造方法。
（付記２４）
被検物質と接触させた腫瘍細胞について、コヒーレント反ストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）顕微鏡を用いて取得された第二高調波（ＳＨＧ）を取得する取得工程と、
前記ＳＨＧと、前記腫瘍細胞の被検物質に対する感受性との組を教師データとして、前記ＳＨＧから腫瘍細胞の被検物質に対する感受性の判定結果を出力する学習済モデルを生成する学習工程とを含む、腫瘍細胞の感受性の判定に用いる学習済モデルの製造方法。
（付記２５）
前記ＳＨＧから、前記ＳＨＧの信号光の形状および位置の少なくとも一方を検出する信号光検出工程を含み、
前記学習工程において、前記ＳＨＧの信号光の形状および位置の少なくとも一方と、前記腫瘍細胞の被検物質に対する感受性との組を教師データとする、付記２４記載の製造方法。
（付記２６）
前記ＳＨＧから、前記ＳＨＧの信号光の分散値を算出する算出工程を含み、
前記学習工程において、前記ＳＨＧの信号光の分散値と、前記腫瘍細胞の被検物質に対する感受性との組を教師データとする、付記２４または２５記載の製造方法。
（付記２７）
前記ＳＨＧから、前記腫瘍細胞のＺ軸方向におけるＳＨＧの信号光の局在を検出する局在検出工程を含み、
前記学習工程において、前記腫瘍細胞のＺ軸方向におけるＳＨＧの信号光の局在と、前記腫瘍細胞の被検物質に対する感受性との組を教師データとする、付記２４から２６のいずれかに記載の製造方法。
（付記２８）
被検物質と接触させた腫瘍細胞について、コヒーレント反ストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）顕微鏡を用いて取得された第二高調波（ＳＨＧ）を取得する取得手段と、
前記ＳＨＧと、前記腫瘍細胞の被検物質に対する感受性との組を教師データとして、前記ＳＨＧから腫瘍細胞の被検物質に対する感受性の判定結果を出力する学習済モデルを生成する学習手段とを含む、腫瘍細胞の感受性の判定に用いる学習済モデルの製造装置。
（付記２９）
前記ＳＨＧから、前記ＳＨＧの信号光の形状および位置の少なくとも一方を検出する信号光検出手段を含み、
前記学習手段において、前記ＳＨＧの信号光の形状および位置の少なくとも一方と、前記腫瘍細胞の被検物質に対する感受性との組を教師データとする、付記２８記載の製造装置。
（付記３０）
前記ＳＨＧから、前記ＳＨＧの信号光の分散値を算出する算出手段を含み、
前記学習手段において、前記ＳＨＧの信号光の分散値と、前記腫瘍細胞の被検物質に対する感受性との組を教師データとする、付記２８または２９記載の製造装置。
（付記３１）
前記ＳＨＧから、前記腫瘍細胞のＺ軸方向におけるＳＨＧの信号光の局在を検出する局在検出手段を含み、
前記学習手段において、前記腫瘍細胞のＺ軸方向におけるＳＨＧの信号光の局在と、前記腫瘍細胞の被検物質に対する感受性との組を教師データとする、付記２８から３０のいずれかに記載の製造装置。
（付記３２）
被検物質と接触させた腫瘍細胞について、コヒーレント反ストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）顕微鏡における第二高調波（ＳＨＧ）を取得する取得処理と、
前記ＳＨＧと、前記腫瘍細胞の被検物質に対する感受性との組を教師データとして、前記ＳＨＧから腫瘍の被検物質に対する感受性の判定結果を出力する学習済モデルを生成する学習処理とを、コンピュータ上で実行可能であるプログラム。
（付記３３）
被検物質と接触させた腫瘍細胞のコヒーレント反ストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）顕微鏡を用いて取得された第二高調波（ＳＨＧ）を取得する取得処理と、
前記ＳＨＧと、前記腫瘍細胞の被検物質に対する感受性との組を教師データとして、前記ＳＨＧから腫瘍細胞の被検物質に対する感受性の判定結果を出力する学習済モデルを生成する学習処理とを、コンピュータ上で実行可能であるプログラム。
（付記３４）
被検腫瘍細胞について、コヒーレント反ストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）顕微鏡を用いて第二高調波（ＳＨＧ）を取得する取得工程と、
前記ＳＨＧに基づき、前記被検腫瘍細胞から、前記被検物質の感受性試験に用いる候補腫瘍細胞を選択する選択工程とを含む、被検物質の感受性判定用細胞の選抜方法。
（付記３５）
前記選択工程において、前記ＳＨＧが検出された被検腫瘍細胞を前記候補腫瘍細胞として選択する、付記３４記載の選抜方法。
（付記３６）
付記３２または３３に記載のプログラムを記録している、コンピュータ読み取り可能な記録媒体。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
以上のように、本発明によれば、腫瘍細胞の被検物質に対する感受性を判定できる。このため、本発明は、化合物のスクリーニングを行なう等において、極めて有用である。
【符号の説明】
【００７６】
１０            判定装置
１１            データ処理手段
１１１          取得手段
１１２          判定手段
１１３          学習手段
２０            学習装置
【図１】
2020162595.tif 000003
【図２】
2020162595.tif 000004
【図３】
2020162595.tif 000005
【図４】
2020162595.tif 000006
【図５】
2020162595.tif 000007
【図６】
2020162595.tif 000008
【図７】
2020162595.tif 000009
【図８】
2020162595.tif 000010
【国際調査報告】
2020162595.tif 000011
2020162595.tif 000012
2020162595.tif 000013
2020162595.tif 000014
2020162595.tif 000015
2020162595.tif 000016