(57)【要約】  本発明は、新規な炎症性疾患またはアレルギー性疾患の治療、予防または改善剤の提供を目的とする。本発明によれば、（±）５，６−ジヒドロキシ−８Ｚ、１１Ｚ、１４Ｚ、１７Ｚ−エイコサテトラエン酸（５，６−ＤｉＨＥＴＥ）を有効成分として含んでなる、炎症性疾患またはアレルギー性疾患の治療、予防または改善剤が提供される。前記炎症性疾患は、血管内皮細胞のカルシウム濃度の上昇に起因する疾患とすることができ、前記炎症性疾患は、消化器、循環器、呼吸器、泌尿器、生殖器、脳、皮膚、眼および脂肪からなる群から選択される組織または器官において生じる炎症性疾患とすることができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（±）５，６−ジヒドロキシ−８Ｚ、１１Ｚ、１４Ｚ、１７Ｚ−エイコサテトラエン酸（５，６−ＤｉＨＥＴＥ）を有効成分として含んでなる、炎症性疾患の治療、予防または改善剤。
【請求項２】
炎症性疾患が、血管内皮細胞のカルシウム濃度の上昇に起因する炎症性疾患である、請求項１に記載の治療、予防または改善剤。
【請求項３】
炎症性疾患が、消化器、循環器、呼吸器、泌尿器、生殖器、脳、皮膚、眼および脂肪からなる群から選択される組織または器官において生じる炎症性疾患である、請求項１または２に記載の治療、予防または改善剤。
【請求項４】
炎症性疾患が、腸管において生じる炎症性疾患である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の治療、予防または改善剤。
【請求項５】
腸管において生じる炎症性疾患が、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、感染性胃腸炎からなる群から選択される疾患である、請求項４に記載の治療、予防または改善剤。
【請求項６】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）が、潰瘍性大腸炎、クローン病、腸結核、虚血性大腸炎および放射線性腸炎および薬剤性腸炎からなる群より選択される疾患である、請求項５に記載の治療、予防または改善剤。
【請求項７】
炎症性疾患が、肺において生じる炎症性疾患である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の治療、予防または改善剤。
【請求項８】
肺において生じる炎症性疾患が、肺炎、肺水腫および肺線維症からなる群から選択される疾患である、請求項７に記載の治療、予防または改善剤。
【請求項９】
（±）５，６−ジヒドロキシ−８Ｚ、１１Ｚ、１４Ｚ、１７Ｚ−エイコサテトラエン酸（５，６−ＤｉＨＥＴＥ）を有効成分として含んでなる、アレルギー性疾患の治療、予防または改善剤。
【請求項１０】
アレルギー性疾患が、血管内皮細胞のカルシウム濃度の上昇に起因するアレルギー性疾患である、請求項９に記載の治療、予防または改善剤。
【請求項１１】
アレルギー性疾患が、蕁麻疹、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎、アレルギー性胃腸炎、食物アレルギー、喘息、気管支喘息、アナフィラキシーおよびアナフィラキシーショックからなる群より選択される疾患である、請求項１０に記載の治療、予防または改善剤。
【請求項１２】
経口、経皮、静脈内投与からなる群より選択される投与形態である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の治療、予防または改善剤。
【請求項１３】
（±）５，６−ジヒドロキシ−８Ｚ、１１Ｚ、１４Ｚ、１７Ｚ−エイコサテトラエン酸（５，６−ＤｉＨＥＴＥ）を有効成分として含んでなる、炎症性疾患の治療、予防または改善用食品。
【請求項１４】
（±）５，６−ジヒドロキシ−８Ｚ、１１Ｚ、１４Ｚ、１７Ｚ−エイコサテトラエン酸（５，６−ＤｉＨＥＴＥ）を有効成分として含んでなる、アレルギー性疾患の治療、予防または改善用食品。
【請求項１５】
５，６−ジヒドロキシ−８Ｚ、１１Ｚ、１４Ｚ、１７Ｚ−エイコサテトラエン酸（５，６−ＤｉＨＥＴＥ）が食物由来である、請求項１〜１２に記載の治療、予防または改善剤ならびに請求項１３または１４に記載の治療、予防または改善用食品。
【請求項１６】
有効量の（±）５，６−ジヒドロキシ−８Ｚ、１１Ｚ、１４Ｚ、１７Ｚ−エイコサテトラエン酸（５，６−ＤｉＨＥＴＥ）またはそれを含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含んでなる、炎症性疾患の治療、予防または改善方法。
【請求項１７】
有効量の（±）５，６−ジヒドロキシ−８Ｚ、１１Ｚ、１４Ｚ、１７Ｚ−エイコサテトラエン酸（５，６−ＤｉＨＥＴＥ）またはそれを含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含んでなる、アレルギー性疾患の治療、予防または改善方法。
【請求項１８】
炎症性疾患の治療、予防または改善剤の製造のための、あるいは、炎症性疾患の治療、予防または改善剤としての、（±）５，６−ジヒドロキシ−８Ｚ、１１Ｚ、１４Ｚ、１７Ｚ−エイコサテトラエン酸（５，６−ＤｉＨＥＴＥ）の使用。
【請求項１９】
アレルギー性疾患の治療、予防または改善剤の製造のための、あるいは、アレルギー性疾患の治療、予防または改善剤としての、（±）５，６−ジヒドロキシ−８Ｚ、１１Ｚ、１４Ｚ、１７Ｚ−エイコサテトラエン酸（５，６−ＤｉＨＥＴＥ）の使用。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の参照】
【０００１】
本願は、先行する日本国出願である特願２０１８−２３５１３９（出願日：２０１８年１２月１７日）の優先権の利益を享受するものであり、その開示内容全体は引用することにより本明細書の一部とされる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、炎症性疾患およびアレルギー性疾患の治療、予防または改善剤に関する。
【背景技術】
【０００３】
炎症は、細菌・ウィルスへの感染や外傷等により誘導される、局所性の生体防衛反応である。通常の炎症（急性炎症）では、刺激を受けた微小循環系が一過性に収縮した後、拡大し、通常は閉じている毛細血管床が開き、血流量が増加する。さらに、細静脈領域の内皮細胞間隙が開くことにより、この間隙を通じて血漿成分が組織間質へ滲出する血管透過亢進現象が起こる。この血管透過亢進は通常２相性に起こり、第１相はプロスタグランジン、ヒスタミンまたはセロトニンによって起こる弱い反応であり即時型透過と呼ばれ、第２相の遅延型透過が炎症における血管透過の主体をなす。引き続いて、多核白血球、単球およびリンパ球等が細静脈領域から組織間質へ進出する。これらの血漿および細胞成分によって生成される活性因子系の作用が組織細胞の増殖を促し、修復へと導く（非特許文献１）。【０００４】
急性炎症反応が関与する疾患は生体の様々な組織および器官で生じうるため、多くの治療剤が開発されている。炎症性疾患のうち炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、先進国に多くみられる疾患であり、日本でも患者数は増加し続けている。日本における２０１４年度の患者数は潰瘍性大腸炎が１７万人（前年度比１０．１％増加）であり、クローン病が４万人（同６．８％増加）である。炎症性腸疾患は原因が特定されていない難治性疾患であり、依然として新しい治療戦略が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Medzhitov R., Nature, 454: 428-435(2008)
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、新規な炎症性疾患の治療、予防または改善剤を提供することを目的とする。本発明はまた、新規なアレルギー性疾患の治療、予防または改善剤を提供することを目的とする。
【０００７】
本発明者らは今般、（±）５，６−ジヒドロキシ−８Ｚ、１１Ｚ、１４Ｚ、１７Ｚ−エイコサテトラエン酸（本明細書において「５，６−ＤｉＨＥＴＥ」ということがある）を投与したマウスでは、ヒスタミン誘発性の血管拡張および血管透過亢進が阻害されることを見出した。本発明者らはまた、５，６−ＤｉＨＥＴＥの投与は、アセチルコリン誘発性の血管弛緩を阻害すること、また、ヒスタミン誘発性の内皮バリア機能障害を阻害することを見出した。本発明者らはまた、５，６−ＤｉＨＥＴＥの投与は、ヒト臍帯静脈内皮細胞においてヒスタミン誘導性の細胞内カルシウムイオン濃度の増加および続く一酸化窒素（ＮＯ）の産生を阻害することを見出した。本発明者らはまた、デキストラン硫酸ナトリウムの投与により大腸炎が誘発された大腸炎マウスにおいて、誘発された大腸炎の治癒期において大腸組織中の５，６−ＤｉＨＥＴＥの濃度が増加すること、また、５，６−ＤｉＨＥＴＥを大腸炎マウスへ投与することにより、炎症を起こした大腸組織における浮腫形成が阻害され大腸炎の治癒が促進されることを見出した。本発明者らはまた、塩酸の投与により肺水腫が誘発された肺水腫マウスにおいて、５，６−ＤｉＨＥＴＥを投与することにより、肺組織における浮腫形成が阻害されることを見出した。本発明者らはまた、ヒスタミンの投与によりアナフィラキシーが誘発されたアナフィラキシーマウスにおいて、５，６−ＤｉＨＥＴＥを投与することにより、アナフィラキシーの進行が抑制されることを見出した。本発明者らはまた、５，６−ＤｉＨＥＴＥは青魚の腸管および肝臓に豊富に存在することを見出した。本発明はこれらの知見に基づくものである。
【０００８】
本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］（±）５，６−ジヒドロキシ−８Ｚ、１１Ｚ、１４Ｚ、１７Ｚ−エイコサテトラエン酸（５，６−ＤｉＨＥＴＥ）を有効成分として含んでなる、炎症性疾患の治療、予防または改善剤および炎症性疾患の治療、予防または改善用組成物。
［２］炎症性疾患が、血管内皮細胞のカルシウム濃度の上昇に起因する疾患である、上記［１］に記載の用剤および組成物。
［３］炎症性疾患が、消化器、循環器、呼吸器、泌尿器、生殖器、脳、皮膚、眼および脂肪からなる群から選択される組織または器官において生じる炎症性疾患である、上記［１］または［２］に記載の用剤および組成物。
［４］炎症性疾患が、腸管において生じる炎症性疾患である、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の用剤および組成物。
［５］腸管において生じる炎症性疾患が、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、感染性胃腸炎からなる群から選択される疾患である、上記［４］に記載の用剤および組成物。
［６］炎症性腸疾患（ＩＢＤ）が、潰瘍性大腸炎、クローン病、腸結核、虚血性大腸炎および放射線性腸炎および薬剤性腸炎からなる群より選択される疾患である、上記［５］に記載の用剤および組成物。
［７］炎症性疾患が、肺において生じる炎症性疾患である、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の用剤および組成物。
［８］肺において生じる炎症性疾患が、肺炎、肺水腫および肺線維症からなる群から選択される疾患である、上記［７］に記載の用剤および組成物。
［９］（±）５，６−ジヒドロキシ−８Ｚ、１１Ｚ、１４Ｚ、１７Ｚ−エイコサテトラエン酸（５，６−ＤｉＨＥＴＥ）を有効成分として含んでなる、アレルギー性疾患の治療、予防または改善剤およびアレルギー性疾患の治療、予防または改善用組成物。
［１０］アレルギー性疾患が、血管内皮細胞のカルシウム濃度の上昇に起因するアレルギー性疾患である、上記［９］に記載の用剤および組成物。
［１１］アレルギー性疾患が、蕁麻疹、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎、アレルギー性胃腸炎、食物アレルギー、喘息、気管支喘息、アナフィラキシーおよびアナフィラキシーショックからなる群より選択される疾患である、上記［１０］に記載の用剤および組成物。
［１２］経口、経皮、静脈内投与からなる群より選択される投与形態である、上記［１］〜［１１］のいずれかに記載の用剤および組成物。
［１３］（±）５，６−ジヒドロキシ−８Ｚ、１１Ｚ、１４Ｚ、１７Ｚ−エイコサテトラエン酸（５，６−ＤｉＨＥＴＥ）を有効成分として含んでなる、炎症性疾患の治療、予防または改善用食品。
［１４］（±）５，６−ジヒドロキシ−８Ｚ、１１Ｚ、１４Ｚ、１７Ｚ−エイコサテトラエン酸（５，６−ＤｉＨＥＴＥ）を有効成分として含んでなる、アレルギー性疾患の治療、予防または改善用食品。
［１５］５，６−ジヒドロキシ−８Ｚ、１１Ｚ、１４Ｚ、１７Ｚ−エイコサテトラエン酸（５，６−ＤｉＨＥＴＥ）が食物由来である、上記［１］〜［１２］のいずれかに記載の治療、予防または改善剤ならびに上記［１３］または［１４］に記載の治療、予防または改善用食品。
［１６］有効量の（±）５，６−ジヒドロキシ−８Ｚ、１１Ｚ、１４Ｚ、１７Ｚ−エイコサテトラエン酸（５，６−ＤｉＨＥＴＥ）またはそれを含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含んでなる、炎症性疾患の治療、予防または改善方法。
［１７］有効量の（±）５，６−ジヒドロキシ−８Ｚ、１１Ｚ、１４Ｚ、１７Ｚ−エイコサテトラエン酸（５，６−ＤｉＨＥＴＥ）またはそれを含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含んでなる、アレルギー性疾患の治療、予防または改善方法。
［１８］炎症性疾患の治療、予防または改善剤の製造のための、あるいは、炎症性疾患の治療、予防または改善剤としての、（±）５，６−ジヒドロキシ−８Ｚ、１１Ｚ、１４Ｚ、１７Ｚ−エイコサテトラエン酸（５，６−ＤｉＨＥＴＥ）の使用。
［１９］アレルギー性疾患の治療、予防または改善剤の製造のための、あるいは、アレルギー性疾患の治療、予防または改善剤としての、（±）５，６−ジヒドロキシ−８Ｚ、１１Ｚ、１４Ｚ、１７Ｚ−エイコサテトラエン酸（５，６−ＤｉＨＥＴＥ）の使用。
［２０］（±）５，６−ジヒドロキシ−８Ｚ、１１Ｚ、１４Ｚ、１７Ｚ−エイコサテトラエン酸（５，６−ＤｉＨＥＴＥ）を有効成分として含んでなる、血管内皮細胞のカルシウム濃度の上昇抑制剤および血管内皮細胞のカルシウム濃度の上昇抑制用組成物。
［２１］（±）５，６−ジヒドロキシ−８Ｚ、１１Ｚ、１４Ｚ、１７Ｚ−エイコサテトラエン酸（５，６−ＤｉＨＥＴＥ）を有効成分として含んでなる、炎症性疾患の発症リスクの低減剤および炎症性疾患の発症リスクの低減用組成物。
［２２］（±）５，６−ジヒドロキシ−８Ｚ、１１Ｚ、１４Ｚ、１７Ｚ−エイコサテトラエン酸（５，６−ＤｉＨＥＴＥ）を有効成分として含んでなる、アレルギー性疾患の発症リスクの低減剤およびアレルギー性疾患の発症リスクの低減用組成物。
【０００９】
上記［１］、［９］、［２０］、［２１］および［２２］の用剤を本明細書において「本発明の用剤」と、上記［１］、［９］、［２０］、［２１］および［２２］の組成物を本明細書において「本発明の組成物」と、それぞれいうことがある。
【００１０】
本発明の用剤および組成物の有効成分である５，６−ＤｉＨＥＴＥは、ヒトの食経験があるオメガ３脂肪酸の代謝物であり、内因性の物質であることから、本発明によれば副作用の少ない炎症性疾患の治療、予防または改善剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ヒスタミン誘発血管透過亢進に対する５，６−ＤｉＨＥＴＥの効果を示す図である。（Ａ）マウスの耳においてヒスタミンにより誘発された血管透過亢進に対する脂質代謝物の効果を示す写真である。（Ｂ）定量化した溢出色素量を示すグラフである（ｎ＝４〜２２）。＊＊はＰ＜０．０１（ビヒクルと比較）を表し、＃はＰ＜０．０５（ヒスタミンと比較）を表す。
【図２】図２は、ヒスタミン誘発動脈弛緩および血管透過亢進に対する５，６−ＤｉＨＥＴＥの効果を示す図である。（Ａ）マウスの耳における血管透過亢進に対する５，６−ＤｉＨＥＴＥの効果を示す写真である。（Ｂ）定量化したＦＩＴＣ−デキストランの溢出を示すグラフである（ｎ＝６〜７）。（Ｃ）マウスの耳における動脈弛緩に対する５，６−ＤｉＨＥＴＥの効果を示す写真である。（Ｄ）定量化した動脈径を示すグラフである（ｎ＝６〜７）。（Ｅ）定量化した静脈径を示すグラフである（ｎ＝６〜７）。
【図３】図３は、アセチルコリン誘発大動脈弛緩に対する５，６−ＤｉＨＥＴＥの効果を示す図である。（Ａ）大動脈に対するノルエピネフリン（ＮＥ）または５，６−ＤｉＨＥＴＥの累積投与の効果を示すグラフである（ｎ＝４）。（Ｂ）ノルエピネフリンによって予め収縮させた大動脈に対するアセチルコリン（Ａｃｈ）または５，６−ＤｉＨＥＴＥの累積投与の効果を示すグラフである（ｎ＝４）。（Ｃ）ノルエピネフリンによって予め収縮させた大動脈のアセチルコリン誘発弛緩に対する５，６−ＤｉＨＥＴＥ前処置の効果を示すグラフである（ｎ＝９）。
【図４】図４は、ヒスタミン誘発内皮バリア機能障害に対する５，６−ＤｉＨＥＴＥの効果を示す図である。（Ａ）ＨＵＶＥＣの経内皮電気抵抗（ＴＥＲ）に対するトロンビン（Ｔｈｒ、１Ｕ／ｍＬ）、フォルスコリン（１μＭ）または５，６−ＤｉＨＥＴＥ（０．１μＭおよび０．３μＭ）の影響を示すグラフである。なお、０．１μＭ  ５，６−ＤｉＨＥＴＥについての結果は、０．３μＭ  ５，６−ＤｉＨＥＴＥとほぼ同じ値であったことから、グラフにおいて重なり合っている。（Ｂ）定量化した正規化細胞指数の最大値を示すグラフである（ｎ＝４〜７）。＊＊＊はＰ＜０．００１（ビヒクルと比較）を表す。（Ｃ）ＨＵＶＥＣにおけるＴＥＲについて、ヒスタミン誘発変化に対するジフェンヒドラミン（１０μＭ）前処置（＋１０μＭ  ジフェンヒドラミン）または５，６−ＤｉＨＥＴＥ（０．１μＭおよび０．３μＭ）前処置（＋０．１μＭ  ５，６−ＤｉＨＥＴＥ、＋０．３μＭ  ５，６−ＤｉＨＥＴＥ）の効果を示すグラフである。（Ｄ）定量化した正規化細胞指数の最大値を示すグラフである（ｎ＝８）。＊＊＊はＰ＜０．００１（ビヒクルと比較）を表し、＃はＰ＜０．０５、＃＃＃はＰ＜０．００１（ヒスタミンと比較）を表す。
【図５】図５は、ＨＵＶＥＣにおけるヒスタミン誘発ｅＮＯＳ（Endothelial Nitric Oxide Synthase）リン酸化およびＮＯ産生に対する５，６−ＤｉＨＥＴＥの効果を示す図である。ヒスタミン（１０μＭ）誘発ｅＮＯＳリン酸化およびＮＯ産生に対する５，６−ＤｉＨＥＴＥ前処置（０．１μＭ）の効果。（Ａ）総ｅＮＯＳおよびリン酸化ｅＮＯＳ（ｐ−ｅＮＯＳ）のウェスタンブロット分析の代表的結果を示す画像である。（Ｂ）定量化したｅＮＯＳリン酸化を示すグラフである（ｎ＝８）。＊はＰ＜０．０５（ヒスタミンと比較）。（Ｃ）ジフェンヒドラミン（１０μＭ）前処置または５，６−ＤｉＨＥＴＥ（０．１μＭ）前処置のヒスタミン誘発ＮＯ産生（ｎ＝６〜１０）に対する効果を示すグラフである。＊＊はＰ＜０．０１（非刺激と比較）、＃はＰ＜０．０５（ヒスタミンと比較）を表す。
【図６】図６は、ヒスタミン誘発性の内皮細胞におけるカルシウムイオン濃度の増加に対する５，６−ＤｉＨＥＴＥの効果を示す図である。（Ａ）ＨＵＶＥＣにおけるヒスタミン誘発によるカルシウムイオン濃度レベルの経時変化とジフェンヒドラミン前処置（＋１０μＭ  ジフェンヒドラミン）または５，６−ＤｉＨＥＴＥ前処置（＋０．０３μＭ  ５，６−ＤｉＨＥＴＥ、＋０．１μＭ  ５，６−ＤｉＨＥＴＥ、＋０．３μＭ  ５，６−ＤｉＨＥＴＥ）による効果を示すグラフである。（Ｂ）刺激１分後の曲線下面積（ＡＵＣ）による定量を示すグラフである（ｎ＝４〜５）。＊はＰ＜０．０５、＊＊＊はＰ＜０．００１（ヒスタミンと比較）を表す。
【図７】図７は、健常群または大腸炎モデルマウス（大腸炎群）における大腸炎誘発後の経過を示すグラフである。（Ａ）大腸炎群（大腸炎モデルマウス）（ｎ＝４）および健常群（ｎ＝４）について、相対的な体重の推移を示すグラフである。体重は、０日目の体重の割合に対する値として表した。＊はＰ＜０．０５（健常群と比較）を表す。（Ｂ）大腸炎群（大腸炎モデルマウス）（ｎ＝４）および健常群（ｎ＝４）について、糞便スコアの推移を示すグラフである。＊はＰ＜０．０５（健常群と比較）を表す。（Ｃ）大腸炎群（大腸炎モデルマウス）について、０日目、４日目、７日目、９日目および１８日目における大腸の長さ（ｎ＝４）を示すグラフである。＊はＰ＜０．０５（０日目と比較）を表す。測定値は平均±標準誤差で表記した。
【図８】図８は、大腸における各脂質メディエーターの絶対濃度（ｎ＝４）を示すグラフである。測定値は平均±標準誤差で表記した。
【図９】図９は、ＤＳＳ誘発大腸炎に対する５，６−ＤｉＨＥＴＥの効果を示す図である。（Ａ）健常群（ｎ＝６）、大腸炎群（ｎ＝６）および５，６−ＤｉＨＥＴＥ投与群（ｎ＝６）について、相対的な体重の推移を示すグラフである。体重は、０日目の体重の割合に対する値として表される。＃はＰ＜０．０５（大腸炎群と比較）を表す。（Ｂ）健常群（ｎ＝６）、大腸炎群（ｎ＝６）および５，６−ＤｉＨＥＴＥ投与群（ｎ＝６）について、糞便スコアの推移を示すグラフである。＊はＰ＜０．０５（健常群と比較）を表す。（Ｃ）健常群、大腸炎群および５，６−ＤｉＨＥＴＥ投与群について、代表的なマウス大腸を示す写真である。（Ｄ）健常群、大腸炎群および５，６−ＤｉＨＥＴＥ投与群について、大腸の長さ（ｎ＝６）を示すグラフである。＃はＰ＜０．０５（大腸炎群と比較）を表す。測定値は平均±標準誤差で表記した。
【図１０】図１０は、大腸炎における形態変化および浮腫に対する５，６−ＤｉＨＥＴＥの効果を示す図である。（Ａ）健常群、大腸炎群および５，６−ＤｉＨＥＴＥ投与群について、大腸の形態学的な外観を示す写真である。スケールバーは１００μｍを示す。（Ｂ）健常群、大腸炎群および５，６−ＤｉＨＥＴＥ投与群について、大腸炎の組織学的評点（ｎ＝６）を示すグラフである。（Ｃ）健常群、大腸炎群および５，６−ＤｉＨＥＴＥ投与群について、湿・乾燥重量比（ｎ＝４〜５）を示すグラフである。＊はＰ＜０．０５（健常群と比較）を表し、＃はＰ＜０．０５（大腸炎群と比較）を表す。測定値は平均±標準誤差で表記した。
【図１１】図１１は、肺炎における形態変化および肺水腫に対する５，６−ＤｉＨＥＴＥの効果を示す図である。（Ａ）肺炎群（ＨＣｌ）および５，６−ＤｉＨＥＴＥ投与群について、肺の形態学的な外観を示す写真である。（Ｂ）肺炎群および５，６−ＤｉＨＥＴＥ投与群について、肺の組織切片を示す写真である。（Ｃ）肺炎群および５，６−ＤｉＨＥＴＥ投与群について、湿・乾燥重量比（ｎ＝４〜５）を示すグラフである。測定値は平均±標準誤差で表記した。（Ｄ）肺炎群および５，６−ＤｉＨＥＴＥ投与群について、動脈血酸素飽和度（ｎ＝４〜５）を示すグラフである。測定値は平均±標準誤差で表記した。
【図１２】図１２は、アレルギー反応に対する５，６−ＤｉＨＥＴＥの効果を示す図である。（Ａ）アナフィラキシー群（ヒスタミン）、５，６−ＤｉＨＥＴＥ投与群およびＬ−ＮＡＭＥ投与群について、血圧を示すグラフである。＊はＰ＜０．０５（アナフィラキシー群と比較）を表す。測定値は平均±標準誤差で表記した。（Ｂ）アナフィラキシー群（ヒスタミン）、５，６−ＤｉＨＥＴＥ投与群およびＬ−ＮＡＭＥ投与群について、体温を示すグラフである。＊はＰ＜０．０５（アナフィラキシー群と比較）を表す。測定値は平均±標準誤差で表記した。
【発明の具体的説明】
【００１２】
本発明の用剤および組成物の有効成分である（±）５，６−ジヒドロキシ−８Ｚ、１１Ｚ、１４Ｚ、１７Ｚ−エイコサテトラエン酸（５，６−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ，１７Ｚ−ｅｉｃｏｓａｔｅｔｒａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ、ＣＡＳ  Ｎｏ．：８４５６７３−９７−４）は、エイコサペンタエン酸（ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ、ＥＰＡ）およびドコサヘキサエン酸（Ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ、ＤＨＡ）等のω３脂肪酸から生成されるω３脂肪酸代謝物である。
【００１３】
５，６−ＤｉＨＥＴＥの化学構造式（相対配置（相対立体化学）による）は以下に示される通りである。
【化１】
2020130003.tif 000003
【００１４】
５，６−ＤｉＨＥＴＥは、エイコサペンタエン酸をシトクロムＰ４５０触媒で代謝し、α−５二重結合のエポキシ化を行った後に調製することができる。あるいは、市販されている５，６−ＤｉＨＥＴＥを本発明に用いてもよい。
【００１５】
後記実施例によれば、５，６−ＤｉＨＥＴＥは、青魚に豊富に存在することが確認された。従って、本発明の用剤および組成物に使用する５，６−ＤｉＨＥＴＥは植物や魚類等の天然素材や食品素材から調製することができ、例えば、本発明では青魚の調製物を５，６−ＤｉＨＥＴＥとして用いることができる。本発明において、５，６−ＤｉＨＥＴＥの調製に用いる青魚としては、ニシン目ニシン科（例えば、マイワシ、ウルメイワシ）、ニシン目カタクチイワシ科（例えば、カタクチイワシ）、ダツ目サンマ科（例えば、サンマ）、スズキ目アジ科（例えば、マアジ）、スズキ目サバ科（例えば、マサバ、ゴマサバ）の魚類が挙げられる。５，６−ＤｉＨＥＴＥの調製に用いる青魚の部位としては、腸管、肝臓、筋肉、骨、心臓が挙げられ、好ましくは、腸管および肝臓である。５，６−ＤｉＨＥＴＥの青魚からの調製は、例えば、アルコール抽出により行うことができる。従って、本発明の用剤および組成物では、青魚のアルコール抽出物を５，６−ＤｉＨＥＴＥとして用いることができる。また、α−リノレン酸、ＥＰＡ、ＤＨＡ等のω３脂肪酸は摂取後、生体内で代謝されて５，６−ＤｉＨＥＴＥが生成しうる。このため本発明の用剤および組成物では、ω３脂肪酸あるいはそれを含有する天然素材や食品素材（例えば、亜麻仁油、えごま油、クルミ）を５，６−ＤｉＨＥＴＥとして用いることができる。
【００１６】
本発明の用剤および組成物は、５，６−ＤｉＨＥＴＥを単独で使用することができ、あるいは、他の成分と混合して使用することもできる。本発明の用剤および組成物における５，６−ＤｉＨＥＴＥの含有量（固形分換算）は、その目的、用途、形態、剤型、症状、年齢等に応じて任意に定めることができ、本発明はこれに限定されないが、例えば、全体量に対して、０．００１〜９９質量％または０．０１〜９５質量％とすることができる。本発明においては、本発明の用剤を５，６−ＤｉＨＥＴＥからなるものとし、本発明の組成物を５，６−ＤｉＨＥＴＥと他の成分とを含んでなるものとすることができる。
【００１７】
５，６−ＤｉＨＥＴＥ濃度の測定は、例えば、質量分析法や、ＥＬＩＳＡ法およびイムノクロマト法等のイムノアッセイにより測定することができる。質量分析法の例としては、液体クロマトグラフィー−マススペクトロメトリー法（ＬＣ−ＭＳ）、液体クロマトグラフィー−タンデムマススペクトロメトリー法（ＬＣ−ＭＳＭＳ）、高速液体クロマトグラフィー−マススペクトロメトリー法（ＨＰＬＣ−ＭＳ）および高速液体クロマトグラフィー−タンデムマススペクトロメトリー法（ＨＰＬＣ−ＭＳＭＳ）が挙げられる。イムノアッセイは、検出可能に標識した抗脂質代謝物抗体、または検出可能に標識した、抗脂質代謝物抗体に対する抗体（二次抗体）を用いる分析法である。抗体の標識法により、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）等に分類され、これらのいずれも本発明に用いることができる。構造が類似した脂肪酸代謝物の濃度を正確に測定する観点から、質量分析法（特に、ＬＣ−ＭＳＭＳおよびＨＰＬＣ−ＭＳＭＳ）による測定が好ましい。
【００１８】
本発明の用剤および組成物は、炎症性疾患の治療、予防および／または改善に用いるためのものである。ここで、「炎症性疾患」とは、生体の組織および器官において生じる炎症（特に急性炎症）を伴う疾患であれば特に限定されることなく、消化器（例えば、肝臓、消化管、大腸および小腸等の腸管）、循環器、呼吸器（例えば、肺、口腔および鼻腔）、泌尿器（例えば、腎臓および膀胱）、生殖器、脳、皮膚、眼等の組織および器官、全身において生じる炎症を伴う疾患が挙げられ、好ましくは腸管、皮膚、鼻腔、口腔、肺、全身において生じる炎症を伴う疾患である。腸管において生じる炎症性疾患としては、例えば、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、感染性胃腸炎が挙げられる。炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、大腸および小腸の粘膜に慢性の炎症を引き起こす疾患の総称であり、例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病、腸結核、虚血性大腸炎および放射線性腸炎および薬剤性腸炎が挙げられる。また、皮膚において生じる炎症性疾患としては、例えば、感染症やアレルギー性皮膚炎が挙げられる。また、肺において生じる炎症性疾患としては、例えば、肺炎、肺水腫、肺線維症が挙げられる。なお、炎症性疾患には炎症の一態様であるアレルギー疾患も含まれる。
【００１９】
炎症のメカニズムとして、血管内皮細胞における細胞内カルシウム濃度上昇により内皮細胞における一酸化窒素産生が誘導され、誘導された一酸化窒素により血管平滑筋の弛緩により血管拡張が引き起こされ血流の増大が生じるとともに、内皮細胞バリア機能が破壊されることが知られている。内皮細胞バリア機能の破壊と血流の増大という主として２つの要因により血管透過亢進が生じる。これによって炎症細胞が血液から組織に浸潤して炎症反応を増強する。過度および／または持続した血管透過亢進は種々の炎症性疾患を引き起こすことが知られている（Goel, S. et al., Physiological reviews, 91: 1071-1121(2011)およびMehta, D. & A. B. Malik, Physiological reviews 86: 279-367(2006)）。
【００２０】
後記実施例によれば、５，６−ＤｉＨＥＴＥは、ヒト内皮細胞においてヒスタミン誘発の血管細胞内カルシウム濃度の上昇を阻害することにより、内皮細胞バリア機能の破壊を抑制するとともに、血管平滑筋の弛緩による血管拡張を抑制し、ひいてはヒスタミン誘発の血管透過亢進を抑制することが確認された。従って、本発明の用剤および組成物は、炎症性疾患のうち血管内皮細胞における細胞内カルシウム濃度の上昇に起因する炎症性疾患を治療等することができる。また本発明の別の面によれば、５，６−ＤｉＨＥＴＥを有効成分として含んでなる、血管内皮細胞のカルシウム濃度の上昇抑制剤および血管内皮細胞のカルシウム濃度の上昇抑制用組成物が提供される。
【００２１】
後記実施例によればまた、５，６−ＤｉＨＥＴＥはアレルギー性疾患の症状の一つであるアナフィラキシー症状を抑制したが、これはヒト内皮細胞においてヒスタミン誘発の血管細胞内カルシウム濃度の上昇を阻害することにより、内皮細胞バリア機能の破壊を抑制するとともに、血管平滑筋の弛緩による血管拡張を抑制し、アナフィラキシー反応の症状である血圧低下や体温低下を抑制したと考えられる。従って、本発明の用剤および組成物はアレルギー性疾患の治療、予防および／または改善に用いるためのものであり、特に、アレルギー性疾患のうち血管内皮細胞における細胞内カルシウム濃度の上昇に起因するアレルギー性疾患（例えば、蕁麻疹、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎、アレルギー性胃腸炎、食物アレルギー、喘息、気管支喘息、アナフィラキシー、アナフィラキシーショック）を治療等することができる。
【００２２】
本発明の用剤および組成物は、医薬品（例えば、医薬組成物）、医薬部外品（薬用化粧品を含む）、食品（例えば、食品組成物）、飼料（畜産飼料やペットフードを含む）、化粧品（例えば、化粧組成物）等の形態で提供することができ、下記の記載に従って実施することができる。
【００２３】
本発明の用剤および組成物を医薬品として提供する場合、投与経路は特に限定されることなく、経口投与または非経口投与（例えば、経皮投与および静脈内投与）のいずれであってもよい。経口投与剤としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、錠剤（糖衣錠を含む）、丸剤、トローチ錠剤、チュアブル錠剤、飴状剤、シロップ剤、液剤、乳剤、懸濁剤およびゼリー状剤等が挙げられる。非経口投与剤としては、例えば、注射剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、皮膚外用剤、点眼剤および点鼻剤等が挙げられる。これらの製剤は、当分野で通常行われている手法（例えば、第１５改正日本薬局方  製剤総則等に記載の公知の方法）により、薬学上許容される担体を用いて製剤化することができる。薬学上許容される担体としては、賦形剤、結合剤、希釈剤、添加剤、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤等が挙げられる。
【００２４】
本発明の用剤および組成物を食品として提供する場合には、５，６−ＤｉＨＥＴＥを食品に含有させて提供することができる。このようにして提供された食品は５，６−ＤｉＨＥＴＥを有効量含有した食品である。本明細書において、５，６−ＤｉＨＥＴＥを「有効量含有した」とは、個々の食品において通常使用される量を用いた場合に後述するような範囲で５，６−ＤｉＨＥＴＥが対象に摂取されるような含有量をいう。「食品」とは、健康食品、機能性食品、栄養補助食品、保健機能食品（例えば、特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品）、特別用途食品（例えば、幼児用食品、妊産婦用食品、病者用食品）およびサプリメントを含む意味で用いられる。
【００２５】
「食品」の形態は特に限定されるものではなく、例えば、液体、半液体あるいはゲル状の形態であっても、固形体や粉末状の形態であってもよい。また、「サプリメント」としては、５，６−ＤｉＨＥＴＥに賦形剤や結合剤を加え練り合わせた後に打錠することにより製造された錠剤や、５，６−ＤｉＨＥＴＥを賦形剤や結合剤とともに封入してなるカプセル剤が挙げられる。
【００２６】
本発明で提供される食品は、有効量の５，６−ＤｉＨＥＴＥを含有する限り、特に限定されるものではないが、例えば、飲料類、野菜加工品、果実加工品、香辛料、麺類、パン類、穀物加工品、菓子類、豆類製品、肉製品、乳製品、加工卵製品、水産加工品、調味料、食用油脂、調理品、半調理食品が挙げられる。５，６−ＤｉＨＥＴＥは前記のような炎症性疾患やアレルギー性疾患の改善効果を有することから、炎症やアレルギー反応を惹起または増強する可能性がある食品に配合することで、炎症やアレルギー反応とそれに関連する疾患の発症リスクを低減できる点で有利である。
【００２７】
本発明の用剤および組成物を化粧品として提供する場合には、５，６−ＤｉＨＥＴＥを化粧品に許容される基材、担体、添加剤、保湿成分等を用いて常法に従って製剤化して製造することができる。本発明の化粧品はまた、５，６−ＤｉＨＥＴＥを既存の化粧品に配合して調製してもよく、例えば、化粧品の形態に応じて従来公知の化粧品に許容される基材、担体、添加剤、保湿成分等と共に５，６−ＤｉＨＥＴＥを配合し、常法に従って製造することができる。
【００２８】
本発明における５，６−ＤｉＨＥＴＥの投与量は、投与対象の性別、年齢および体重、症状、摂取時間、剤形、投与経路並びに組み合わせる薬剤等に依存して決定できる。本発明において５，６−ＤｉＨＥＴＥを炎症性疾患またはアレルギー性疾患の治療、予防または改善を目的として投与する場合のヒト１日あたりの投与量は、例えば、１〜１０００ｍｇの範囲とすることができるが、これに限定されるものではない。本発明の用剤および組成物は、それを必要とするヒトのみならず、ヒト以外の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、サル）に対しても投与することができる。なお、上記の５，６−ＤｉＨＥＴＥの投与量は、５，６−ＤｉＨＥＴＥを非治療目的および治療目的のいずれで使用する場合にも適用があり、非治療目的の場合には投与は摂取または適用に読み替えることができる。
【００２９】
本発明の用剤および組成物は、ヒトが食経験を有するω３脂肪酸の代謝物である５，６−ＤｉＨＥＴＥを有効成分とすることから、継続使用しても副作用の懸念がなく、安全性が高い。このため本発明の用剤および組成物を既存の抗炎症剤あるいは抗アレルギー剤と組み合わせて用いると、既存薬剤の用量を低減することができ、ひいては既存薬剤の副作用を軽減あるいは解消することができる。他の薬剤との併用に当たっては、他の薬剤と本発明の用剤および組成物を別個に調製しても、他の薬剤と本発明の用剤および組成物を同一の組成物に配合してもよい。
【００３０】
後記実施例に示される通り、５，６−ＤｉＨＥＴＥは生体内で炎症反応を惹起する血管内皮細胞におけるカルシウム濃度上昇を抑制する作用を有することから、本発明の用剤および組成物は、炎症性疾患の発症リスクがある対象に投与することができ、それにより、炎症性疾患の発症リスクを低減することができる。ここで、「炎症性疾患の発症リスクがある対象」は、炎症性疾患の自覚症状がないが、将来において炎症性疾患発症の恐れがある対象を意味する。また、「炎症性疾患の発症リスクの低減」は、炎症性疾患の発症確率が低減されることを意味する。すなわち、本発明の別の面によれば、５，６−ＤｉＨＥＴＥを有効成分として含んでなる、炎症性疾患の発症リスクの低減剤および炎症性疾患の発症リスクの低減用組成物が提供される。
【００３１】
後記実施例に示される通り、５，６−ＤｉＨＥＴＥはアレルギー反応の一種であるアナフィラキシー反応を抑制する作用を有することから、本発明の用剤および組成物は、アレルギー性疾患の発症リスクがある対象に投与することができ、それにより、アレルギー性疾患の発症リスクを低減することができる。ここで、「アレルギー性疾患の発症リスクがある対象」は、アレルギー性疾患の自覚症状がないが、将来においてアレルギー性疾患の恐れがある対象を意味する。また、「アレルギー性疾患の発症リスクの低減」は、アレルギー性疾患の発症確率が低減されることを意味する。すなわち、本発明の別の面によれば、５，６−ＤｉＨＥＴＥを有効成分として含んでなる、アレルギー性疾患の発症リスクの低減剤およびアレルギー性疾患の発症リスクの低減用組成物が提供される。
【００３２】
本発明の別の面によれば、有効量の本発明の５，６−ＤｉＨＥＴＥあるいはそれを含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含んでなる、炎症性疾患の治療、予防および／または改善方法が提供される。本発明の別の面によればまた、有効量の本発明の５，６−ＤｉＨＥＴＥあるいはそれを含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含んでなる、血管内皮細胞のカルシウム濃度の上昇抑制方法が提供される。本発明の別の面によればまた、有効量の本発明の５，６−ＤｉＨＥＴＥあるいはそれを含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含んでなる、炎症性疾患の発症リスクの低減方法が提供される。本発明の方法は、本発明の用剤および組成物に関する記載に従って実施することができる。
【００３３】
本発明の別の面によれば、有効量の本発明の５，６−ＤｉＨＥＴＥあるいはそれを含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含んでなる、アレルギー性疾患の治療、予防および／または改善方法が提供される。本発明の別の面によればまた、有効量の本発明の５，６−ＤｉＨＥＴＥあるいはそれを含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含んでなる、アレルギー性疾患の発症リスクの低減方法が提供される。本発明の方法は、本発明の用剤および組成物に関する記載に従って実施することができる。
【００３４】
本発明の別の面によれば、炎症性疾患の治療、予防および／または改善剤の製造のための、あるいは、炎症性疾患の治療、予防および／または改善剤としての、５，６−ＤｉＨＥＴＥの使用が提供される。本発明の別の面によればまた、血管内皮細胞のカルシウム濃度の上昇抑制剤の製造のための、あるいは、血管内皮細胞のカルシウム濃度の上昇抑制剤としての、５，６−ＤｉＨＥＴＥの使用が提供される。本発明の別の面によればまた、炎症性疾患の発症リスクの低減剤の製造のための、あるいは、炎症性疾患の発症リスクの低減剤としての、５，６−ＤｉＨＥＴＥの使用が提供される。本発明の使用は、本発明の用剤および組成物に関する記載に従って実施することができる。
【００３５】
本発明の別の面によれば、アレルギー性疾患の治療、予防および／または改善剤の製造のための、あるいは、アレルギー性疾患の治療、予防および／または改善剤としての、５，６−ＤｉＨＥＴＥの使用が提供される。本発明の別の面によればまた、アレルギー性疾患の発症リスクの低減剤の製造のための、あるいは、アレルギー性疾患の発症リスクの低減剤としての、５，６−ＤｉＨＥＴＥの使用が提供される。本発明の使用は、本発明の用剤および組成物に関する記載に従って実施することができる。
【００３６】
本発明の別の面によれば、炎症性疾患の治療、予防および／または改善薬としての、あるいは、炎症性疾患の治療、予防および／または改善に用いるための５，６−ＤｉＨＥＴＥが提供される。本発明の別の面によればまた、血管内皮細胞のカルシウム濃度の上昇抑制に用いるための５，６−ＤｉＨＥＴＥが提供される。本発明の別の面によればまた、炎症性疾患の発症リスクの低減に用いるための５，６−ＤｉＨＥＴＥが提供される。上記の５，６−ＤｉＨＥＴＥは、本発明の用剤および組成物に関する記載に従って実施することができる。
【００３７】
本発明の別の面によれば、アレルギー性疾患の治療、予防および／または改善薬としての、あるいは、アレルギー性疾患の治療、予防および／または改善に用いるための５，６−ＤｉＨＥＴＥが提供される。本発明の別の面によればまた、アレルギー性疾患の発症リスクの低減に用いるための５，６−ＤｉＨＥＴＥが提供される。上記の５，６−ＤｉＨＥＴＥは、本発明の用剤および組成物に関する記載に従って実施することができる。
【００３８】
本発明の方法および本発明の使用はヒトを含む哺乳動物における使用であってもよく、治療的使用と非治療的使用のいずれもが意図される。本明細書において、「非治療的」とはヒトを手術、治療または診断する行為（すなわち、ヒトに対する医療行為）を含まないことを意味し、具体的には、医師または医師の指示を受けた者がヒトに対して手術、治療または診断を行う方法を含まないことを意味する。
【実施例】
【００３９】
以下の例に基づき本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。【００４０】
例１：ヒスタミン誘発血管透過亢進に対する５，６−ＤｉＨＥＴＥの阻害効果
（１）修飾マイルス（Ｍｉｌｅｓ）アッセイ
Ｃ５７ＢＬ／６系統のマウス（雄、８〜１２週齢）に、前処置として、ジフェンヒドラミン（２．５μｇ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）、ＬａＣｌ３（２５０μｇ）、７−ＨＤｏＨＥ（０．１μｇ、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）、１３−ＨＯＴｒＥ（０．１μｇ、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）または５，６−ＤｉＨＥＴＥ（０．１μｇ、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）を皮内注射した。皮内注射から１５分後に、ビヒクル（８０％アセトン）またはヒスタミン（４００μｇ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）を耳の腹側表面に経皮投与した。血管透過性を評価するために、ヒスタミン投与から５分後にエバンスブルー（５０ｍｇ／ｋｇ、シグマ社製）を静脈内に注射した。次いで、エバンスブルーの注射から３０分後にマウスを頸椎脱臼により安楽死させた。耳を切開し、５５℃で乾燥させ、重量を測定した。耳に存在する血管外に溢出したエバンスブルーをホルムアミド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）中で抽出し、分光光度法（パーキンエルマージャパン社製）により６１０ｎｍの波長で定量した。【００４１】
（２）統計処理
例１〜６において、測定値は平均±標準誤差（ＳＥＭ）で表した。データの統計的評価は、一方向ＡＮＯＶＡを用いて行い、続いてボンフェローニ検定を行い、３つ以上の群を比較した。ｐ＜０．０５の場合に統計的に有意差ありと判定した。【００４２】
（３）結果
結果は図１に示される通りであった。【００４３】
図１の結果から、４００μｇのヒスタミンの投与により青色色素の血管外溢出が誘発され（０．１４±０．０２μｇ／ｍｇ）、これはビヒクル処置により溢出される量（０．０６±０．０２μｇ／ｍｇ）の２倍であった。ヒスタミンはヒスタミンＨ１受容体を刺激して、内皮細胞の細胞内カルシウムイオン濃度（［Ｃａ２＋］ｉ）を増加させる。このシグナリングの活性化は内皮ＮＯ産生を促進し、血管拡張および血管透過亢進を引き起こす。ヒスタミンＨ１受容体のブロッカーであるジフェンヒドラミン（２．５μｇ／耳、１５分）またはカルシウムイオンチャネル遮断薬であるＬａＣｌ３（２５０μｇ／耳、１５分）による前処置は、色素溢出を有意に阻害した。また、７−ＨＤｏＨＥ（０．１μｇ／耳、１５分）または１３−ＨＯＴｒＥ（０．１μｇ／耳、１５分）による前処置は、マウスの耳におけるヒスタミン誘発性色素溢出に影響しなかった。対照的に、５，６−ＤｉＨＥＴＥ（０．１μｇ／耳、１５分）による前処置は、色素溢出を有意に阻害（０．０６±０．０２μｇ／ｍｇ）した。以上の結果から、５，６−ＤｉＨＥＴＥは血管透過亢進をイン・ビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で阻害することが示された。【００４４】
例２：ヒスタミン誘発動脈弛緩に対する５，６−ＤｉＨＥＴＥの阻害効果
（１）イン・ビボ顕微鏡法
マウス耳の血管を視覚化するために、７０ｋＤａのフルオレセインイソチオシアネート−デキストラン（１０ｍｇ／ｋｇ、シグマアルドリッチ社製）を静脈内に注射した。次いで、フルオレセインイソチオシアネート−デキストラン投与直後に前処置として５，６−ＤｉＨＥＴＥ（０．１μｇ）を滴下投与（経皮投与）し、これを「５，６−ＤｉＨＥＴＥ投与群」とした。対照群として５，６−ＤｉＨＥＴＥを投与しない群を「ヒスタミン投与群」とした。次いで、滴下投与から１５分後に、ヒスタミン（４００μｇ）を両群の耳の腹側表面に滴下投与（経皮投与）した。次いで、マウスを顕微鏡共焦点顕微鏡（ＥＣＬＩＰＳＥ  Ｔｉ  ｗｉｔｈ  Ｃ１共焦点システム、ニコン社製）のステージ上に置き、体温を３７℃に維持した。ＥＺ−Ｃ１フリービューア（ニコン社製）を用いてヒスタミン投与後０分から３０分までの耳におけるデキストラン溢出および血管直径を毎分モニターし、Omori, K. et al., British Journal of Pharmacology, 171:4879-4889(2014)の記載に従ってデキストラン溢出量、動脈直径および静脈直径を定量した。なお、平滑筋収縮は下流の血流を減少させて血管溢出を制限するが、平滑筋弛緩（血管経の増大）は血流を増加させ、それによって血管溢出をもたらすことが知られている。【００４５】
（２）結果
結果は図２に示される通りであった。【００４６】
図２Ａおよび図２Ｂの結果から、ヒスタミン投与群では主に脈管構造および末梢血管の分岐領域からＦＩＴＣ−デキストランの血管外溢出が誘発され、ＦＩＴＣ−デキストランの平均蛍光強度はヒスタミン投与後０分と比較して投与後３０分では有意に高かった。５，６−ＤｉＨＥＴＥ投与群では、ＦＩＴＣ−デキストラン溢出の面積が小さくなり、ヒスタミン投与群のサンプルの平均蛍光強度と比較して有意に減少した。図２Ｃおよび図２Ｄの結果から、ヒスタミン投与群では動脈直径がヒスタミン非刺激時と比較して１７８±１３％に増加したことから、ヒスタミンが血管拡張を誘発したことが確認された。５，６−ＤｉＨＥＴＥ投与群では動脈直径がヒスタミン非刺激時と比較して１３２±１５％でありヒスタミンが誘発する血管拡張が有意に阻害された。一方、ヒスタミン投与群では静脈径が増加する傾向があったが、５，６−ＤｉＨＥＴＥ投与群では、ヒスタミンに誘発される静脈直径の増加は阻害されなかった。【００４７】
例３：アセチルコリン誘発大動脈弛緩に対する５，６−ＤｉＨＥＴＥの阻害効果
（１）大動脈の血管収縮の測定
何も処置していないマウスから胸部大動脈を摘出し、脂肪および結合組織を除去した後、大動脈をリング状に切断して大動脈リング標本を作製した。リング標本を正常栄養液（１３６．９ｍＭ  ＮａＣｌ、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、５．５ｍＭグルコース、２３．８ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および０．０１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する生理食塩水）を満たした液槽に浸漬し、２本のステンレスフックをリング標本の管腔に通した。ステンレスフックの一端を固定し、もう一端を、歪み増幅器（3134 strain AMPL、横河計測社製）に接続された、力−変位変換器（T7-30-240、オリエンテック社製）に接続した。次いで、下記（ア）、（イ）または（ウ）を行った。【００４８】
（ア）リング標本の入った液槽中に、０．００１μＭ、０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭとなるようにノルエピネフリン（シグマ社製）を各収縮の安定後（約３０分おき）に累積的に添加し、これを「ノルエピネフリン投与群」（ｎ＝４）とした（図３Ａ）。また、リング標本の入った液槽中に、０．００１μＭ、０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭとなるように５，６−ＤｉＨＥＴＥを各収縮の安定後（約３０分おき）に累積的に添加し、これを「５，６−ＤｉＨＥＴＥ投与群」（ｎ＝４）とした（図３Ａ）。【００４９】
（イ）リング標本の入った液槽中に、０．３μＭとなるようにノルエピネフリンを添加し、ノルエピネフリン投与により前収縮を誘導した（図３Ｂ）。次いで、ノルエピネフリン投与による収縮が安定した後に、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭとなるようにアセチルコリン（シグマ社製）を各弛緩反応の安定後（約１５分おき）に累積的に添加し、これを「アセチルコリン投与群」とした（図３Ｂ）。また、ノルエピネフリン投与による収縮が安定した後に、０．００１μＭ、０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭとなるように５，６−ＤｉＨＥＴＥを約１５分おきに累積的に添加し、これを「５，６−ＤｉＨＥＴＥ投与群」とした（図３Ｂ）。【００５０】
（ウ）５，６−ＤｉＨＥＴＥのアセチルコリン投与に対する効果を検証するため、リング標本の入った液槽中に、１μＭとなるようにノルエピネフリンを添加した。ノルエピネフリン投与による収縮が安定した後に、１μＭとなるように５，６−ＤｉＨＥＴＥまたはビヒクル（溶媒のみ）を添加し、次いで、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭとなるようにアセチルコリンを各弛緩反応の安定後（約１５分おき）に累積的に添加し、これらをそれぞれ「５，６−ＤｉＨＥＴＥ投与群」および「ビヒクル投与群」とした（図３Ｃ）。【００５１】
上記（ア）〜（ウ）において、３ｍＮの静止張力下で上記の力−変位変換器を用いて大動脈リング標本に発生する張力（収縮力）を等尺性に、経時的に測定し記録した。【００５２】
（２）結果
結果は図３に示される通りであった。【００５３】
図３Ａの結果から、ノルエピネフリン投与群では、大動脈を濃度依存的に収縮させたが、対照的に、５，６−ＤｉＨＥＴＥ投与群では収縮を引き起こさなかった。図３Ｂの結果から、アセチルコリンはノルエピネフリンによって前収縮したマウス大動脈を用量依存的に拡張したのに対して、５，６−ＤｉＨＥＴＥはノルエピネフリンによる前収縮に影響しなかった。図３Ｃの結果から、５，６−ＤｉＨＥＴＥ投与群では、ビヒクル投与群と比較して、アセチルコリン誘発大動脈弛緩が有意に減弱された。以上の結果から、５，６−ＤｉＨＥＴＥは動脈において平滑筋収縮に影響を与えずにアセチルコリン誘発による平滑筋弛緩を抑制することが示された。【００５４】
例４：ヒスタミン誘発内皮バリア機能障害に対する５，６−ＤｉＨＥＴＥの阻害効果
（１）ヒト臍帯静脈内皮細胞の培養
例４〜６において、ヒト臍帯静脈内皮細胞（以下、「ＨＵＶＥＣ」ということがある、Ｌｏｎｚａ社製）はＥＧＭ−２（Ｌｏｎｚａ社製）で培養した。これらの細胞（継代４〜９）は、２％ＦＢＳを含むＥＢＭ−２（Ｌｏｎｚａ社製）における４時間の飢餓の後に実験に用いた。【００５５】
（２）内皮バリア機能の評価
上記（１）で調製したＨＵＶＥＣの経内皮電気抵抗（以下、「ＴＥＲ」ということがある）を経時的に測定することにより、イン・ビトロにおける内皮バリア機能を評価した。具体的には、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅリアルタイムセルアナライザーＤＰシステム（ロシュ社製）を用いて経内皮電気抵抗を測定した。該システムは、組織培養Ｅプレート（ロシュ社製）の底にある櫛形マイクロ電極を経て、ＴＥＲの変化をモニターする。ＨＵＶＥＣ（８０００個）をＥプレート上にプレーティングし、コンフルエントになるまでインキュベートした。次いで、下記（ア）または（イ）を行った。【００５６】
（ア）ＨＵＶＥＣを培養しているプレートに、ビヒクル、トロンビン  １Ｕ／ｍＬ、フォルスコリン  １μＭ、５，６−ＤｉＨＥＴＥ  ０．１μＭまたは５，６−ＤｉＨＥＴＥ  ０．３μＭとなるように各試薬を添加した（図４Ａ、Ｂ）。【００５７】
（イ）ＨＵＶＥＣを培養しているプレートに、ビヒクルまたはヒスタミン  １０μＭとなるように添加した。あるいは、ヒスタミンを投与（添加）する３０分前に、ＨＵＶＥＣを培養しているプレートに、ジフェンヒドラミン  １０μＭ、５，６−ＤｉＨＥＴＥ  ０．１μＭまたは５，６−ＤｉＨＥＴＥ  ０．３μＭとなるように各試薬を添加し、添加から３０分後にヒスタミン  １０μＭを各プレートに添加した（図４Ｃ、Ｄ）。【００５８】
上記（ア）および（イ）においてＴＥＲは６０秒ごとに測定した。正規化のために、各時点での細胞指標値を初期値に対する比として示した。刺激後の最大正規化細胞指数を定量化し、最大応答として表した。なお、内皮バリア機能の破壊はＴＥＲを低下させるが、内皮バリア機能の増強はＴＥＲを増加させることが知られている。【００５９】
（３）結果
結果は図４に示される通りであった。【００６０】
図４Ａおよび４Ｂの結果から、トロンビン（１Ｕ／ｍＬ）による処置はＴＥＲを有意に減少させたが、アデニル酸シクラーゼ活性化剤フォルスコリン（１μＭ）による処置はＴＥＲを増加させた。５，６−ＤｉＨＥＴＥ単独（０．１μＭおよび０．３μＭ）による処置はＴＥＲを変化させなかった。図４Ｃおよび４Ｄの結果から、ヒスタミン（１０μＭ）での処置はＴＥＲを顕著に減少（最小０．８２±０．０５倍）させたが、これはヒスタミンＨ１受容体拮抗薬であるジフェンヒドラミン（１０μＭ）による前処置によって無効にされた。また、５，６−ＤｉＨＥＴＥ（０．３μＭ、１５分）による前処置は、ヒスタミン誘発バリア破壊を有意に阻害（最小０．９１５±０．０１２倍）した。これらの結果から、５，６−ＤｉＨＥＴＥがヒスタミン刺激下での内皮バリア機能障害を阻害することが示された。【００６１】
例５：ヒスタミン誘発ｅＮＯＳリン酸化およびＮＯ産生に対する５，６−ＤｉＨＥＴＥの阻害効果【００６２】
（１）ｅＮＯＳリン酸化の評価
ＨＵＶＥＣを培養しているプレートに、１００ｎＭとなるように５，６−ＤｉＨＥＴＥを添加し、該添加から１５分後に、１０μＭとなるようにヒスタミンを添加した。次いで、リン酸化ｅＮＯＳおよびｅＮＯＳのタンパク質量を測定するため、ヒスタミン投与から５分後に改変溶解緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１％ＮＰ−４０代替物、０．１％ＳＤＳ、０．１％デオキシコール酸、５０ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１０ｍＭ  β−グリセロリン酸）でＨＵＶＥＣを溶解した。Ｐｅｆａｂｌｏｃ  ＳＣ（１．０ｍｇ／ｍＬ）および完全プロテアーゼインヒビターカクテル錠剤（１錠／５０ｍＬ）を溶解バッファーに新たに加えた。２０μｇのタンパク質を電気泳動し、ＰＶＤＦ膜上にブロットした。膜を、マウス抗ヒトリン酸化ｅＮＯＳ（ｐＳ１１７７、ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）抗体またはマウス抗ヒトｅＮＯＳ抗体（ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて４℃で一晩プローブした。二次抗体として、ヤギ抗マウスＩｇＧ  ＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷ（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を室温で３０分間適用した（図５Ａ）。Ｏｄｙｓｓｅｙシステム（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いてバンドを検出し定量した（図５Ｂ）。具体的には、リン酸化ｅＮＯＳおよびｅＮＯＳのバンドをＯｄｙｓｓｅｙシステムでスキャン（８００ｎｍ）して検出し、その強度（バンド輝度）を定量した。リン酸化ｅＮＯＳのバンド輝度をｅＮＯＳのバンド輝度で除した相対値により、ｅＮＯＳのリン酸化レベル（ｅＮＯＳに対するリン酸化ｅＮＯＳの比率）を定量し評価した。なお、セリン／スレオニンキナーゼＡｋｔがｅＮＯＳをリン酸化／活性化してＮＯ産生を誘導することが知られている（van Nieuw Amerongen, G. P. et al., Circulation research, 87: 335-340(2000)およびDimmeler, S. et al., Nature, 399: 601-605(1999)）。【００６３】
（２）ＮＯ生成の評価
ＨＵＶＥＣをＨＥＰＥＳで３回洗浄し、１ｍＭ  Ｌ−アルギニンおよび１０μＭテトラヒドロビオプテリンを添加したＨＥＰＥＳ中でインキュベートした。３０分間平衡化した後、培地を交換し、細胞をさらに３０分間インキュベートした。次いで、細胞を５，６−ＤｉＨＥＴＥ（０．１μＭ）またはジフェンヒドラミン（１０μＭ）で１５分間刺激し、次いでヒスタミン（１０μＭ）で５分間刺激した。また、ジフェンヒドラミン、５，６−ＤｉＨＥＴＥおよびヒスタミンのいずれでも刺激しない群を「非刺激」とした。刺激前および刺激後の馴化培地（各１００μＬ）を集め、３００ｇで３分間遠心分離した。上清を回収し、ＥＮＯ−２０  ＮＯｘ分析計（エイコム社製）を用いてＮＯの安定な代謝産物である亜硝酸塩および硝酸塩を測定した。刺激後の亜硝酸塩および硝酸塩レベルの増加の程度を、細胞タンパク質含有量で正規化した。【００６４】
（３）結果
結果は図５に示される通りであった。【００６５】
図５Ａおよび５Ｂの結果から、ヒスタミン（１０μＭ、５分）による処置は、ＨＵＶＥＣにおけるＮＯ合成に必須であるセリン１１７７のｅＮＯＳリン酸化をもたらすことが確認された。５，６−ＤｉＨＥＴＥ（０．１μＭ、１５分）による前処置は、ヒスタミン誘発のｅＮＯＳのリン酸化を有意に減少させた。図５Ｂの結果から、５，６−ＤｉＨＥＴＥ処理は、ヒスタミン単独投与と比較して、リン酸化ｅＮＯＳの比率が有意に減少することが確認された。図５Ｃの結果から、ヒスタミン（１０μＭ）はＮＯ産生を刺激（０．３１±０．０６ｐｍｏｌ／μｇタンパク質）したが、ヒスタミンＨ１受容体拮抗薬であるジフェンヒドラミン（１０μＭ、１５分）前処置によって無効にされた。ｅＮＯＳリン酸化の結果と一致して、５，６−ＤｉＨＥＴＥ（０．１μＭ、１５分）による前処置は、ヒスタミン誘発ＮＯ産生を有意に阻害（０．１１±０．０６ｐｍｏｌ／μｇタンパク質）した。これらの結果から、５，６−ＤｉＨＥＴＥが内皮細胞におけるｅＮＯＳリン酸化およびＮＯ産生を阻害することが示された。【００６６】
例６：内皮細胞におけるヒスタミン誘発カルシウムイオン濃度上昇に対する５，６−ＤｉＨＥＴＥの阻害効果
（１）カルシウムイオン（Ｃａ２＋）濃度の測定
ＨＵＶＥＣをカルシウム蛍光指示薬（０．１１％クレモフォール  ＥＬを含有する３μｇ  ｆｕｒａ−２／ＡＭ）とともに３０分間インキュベートし、ＨＥＰＥＳ緩衝液で３回洗浄した。次いで、ＨＵＶＥＣにジフェンヒドラミン  １０μＭ、５，６−ＤｉＨＥＴＥ  ０．０３μＭ、５，６−ＤｉＨＥＴＥ  ０．１μＭまたは５，６−ＤｉＨＥＴＥ  ０．３μＭとなるように各試薬を添加した（前処置）。次いで、各試薬の添加から５分後に、１０μＭとなるようにヒスタミンを添加した。また、前処置をせずに１０μＭとなるようにヒスタミンを添加した群も調製した。３７℃に維持された顕微鏡のステージ上に取り付けられた特殊な気密チャンバにカバースリップを入れた。ＨＵＶＥＣを３４０ｎｍおよび３８０ｎｍで励起し、放出された蛍光シグナルを５１０ｎｍにおいて３秒間隔で６０秒間測定した。蛍光比（Ｒ：Ｆ３４０／Ｆ３８０）は、蛍光イメージングシステム（ＡＱＵＡＣＯＳＭＯＳ、浜松ホトニクス社製）を用いて決定した。実験後、１μＭのイオノマイシンを添加して、０または１．５ｍＭのカルシウムイオンの存在下で蛍光変化を測定した。カルシウムイオン濃度はΔ蛍光比として示された。Δ蛍光比を評価するために各刺激の１分後にＡＵＣを算出した。なお、内皮細胞におけるカルシウムイオン濃度の増加は、ｅＮＯＳリン酸化によってＮＯ産生を促進して平滑筋細胞を拡張させることが知られている（Garcia-Cardena, G. et al., Nature, 392: 821-824(1998)、Luo, Z. et al., The Journal of clinical investigation, 106: 493-499(2000)）。【００６７】
（２）結果
結果は図６に示される通りであった。【００６８】
図６Ａおよび６Ｂの結果から、ヒスタミン処置（１０μＭ）はＨＵＶＥＣにおけるカルシウムイオン濃度（［Ｃａ２＋］ｉ）を急速に増加（ＡＵＣ：１２．２±２．１）させたが、ヒスタミンＨ１受容体拮抗薬であるジフェンヒドラミン（１０μＭ）による前処置によって抑制（ＡＵＣ：１．５±０．４）されたことが確認された。また、０．０３μＭの５，６−ＤｉＨＥＴＥによる前処置は、ヒスタミン誘発性のカルシウムイオン濃度の増加を阻害しなかった（ＡＵＣ：７．８±２．３）が、０．１μＭおよび０．３μＭの５，６−ＤｉＨＥＴＥは、用量依存的にカルシウムイオン濃度の増加を顕著に阻害する（ＡＵＣ：５．９±１．５および１．８±１．１）ことが確認された。以上の結果から、５，６−ＤｉＨＥＴＥが、内皮細胞においてカルシウムイオン濃度の増加を阻害することが示された。【００６９】
例７：大腸炎モデルマウスの作製
（１）大腸炎モデルマウスの作製
Ｃ５７ＢＬ／６系統のマウス（雄、８〜１２週齢）に２％デキストラン硫酸ナトリウム（ＭＰ  Ｂｉｏ社製、以下「ＤＳＳ」ということがある）を含む水を４日間与えることにより、大腸炎モデルマウスを作製した（以下、例７〜１０において「大腸炎群」ということがある）。ＤＳＳを４日間摂取させたマウスには、５日目から通常の水を与えた。なお、ＤＳＳ摂取開始日を試験１日目とし、ＤＳＳ摂取開始日の前日を試験０日目とした。また、Ｃ５７ＢＬ／６系統のマウス（雄、８〜１２週齢）に通常の水を与えた群を「健常群」とした（例８〜１０においても同様）。【００７０】
（２）大腸炎の重篤度の評価
大腸炎の重篤度を評価するため、上記（１）で作製した大腸炎モデルマウスおよび健常群について、糞便状態の評価および体重測定を毎日実施した。糞便状態は以下の５段階の糞便スコアで評価した。すなわち、０：正常、１：柔らかく形がある、２：非常に柔らかい、３：下痢、４：血便とした。また、大腸炎の重篤度の指標として、大腸の長さを測定した。【００７１】
（３）統計処理
例７〜１０において、測定値は平均±標準誤差（ＳＥＭ）で表した。データの統計的評価は、対応のないスチューデントｔ検定または一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いた後、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を行った。ｐ＜０．０５の場合に統計的に有意差ありと判定した。【００７２】
（４）結果
上記（１）で作製したモデルマウスについて行った上記（２）の評価結果は図７に示される通りであった。【００７３】
図７の結果から、健常群では試験期間において体重が増加したのに対して、大腸炎群では、試験４日目から体重が減少し、試験７日目以降から増加した。また、健常群の糞便は正常であったのに対して、大腸炎群では、試験４日目から柔らかい糞便（糞便スコア１）となり、糞便状態は試験７日目に最も悪化し（糞便スコア１．８±０．３）、試験７日目から徐々に回復した。さらに、大腸炎群では、大腸の長さが試験０日目（６．９±０．３ｃｍ）と比較して、試験７日目および９日目において顕著に短く（それぞれ５．６±０．２ｃｍ）なり、試験１８日目には、大腸の長さの短縮は回復した。これらの結果から、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を摂取させることにより大腸炎が誘発され大腸炎モデルマウスが作製できることが確認された。また、大腸炎モデルマウスは、試験９日目以降が治癒期であると判断された。【００７４】
例８：大腸炎モデルマウスにおける脂質メディエーター濃度の変動
（１）脂質メディエーター濃度の測定
液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳＭＳ）を用いて炎症した大腸組織中の脂質メディエーターの絶対濃度を測定した。測定はLe Faouder P. et al., Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences, 932: 123-133(2013)を参考にした。具体的には、腸組織ホモジネートを２００μＬのエタノール中で３０秒間ボルテックスを用いて混合し、４℃の暗所で１時間インキュベートした。１０，０００×ｇ、１５分で遠心分離した後、８５０μＬの蒸留水、１０μＬのギ酸および５０μＬの内部標準混合物（１００ｎｇ／ｍＬのＬＴＢ４−ｄ４および１２−ＨＥＴＥ−ｄ８）と混合した上清１００μＬを固相抽出カートリッジ（ＯＡＳＩＳ  ＨＬＢ、Ｗａｔｅｒｓ社製）で洗浄し、次いで１ｍＬの蒸留水および１ｍＬのヘキサンで洗浄した。試料を１ｍＬのエタノールで溶出し、真空下で乾燥し、５０μＬのエタノール中で再構成した。１０μＬの試料を、陽イオンモードおよび陰イオンモードでのエレクトロスプレーイオン化を伴うＨＰＬＣシステムおよびトリプル四重極質量分析計（ＬＣＭＳ−８０３０、島津製作所社製）のＬＣ−ＭＳ／ＭＳに注入した。液体クロマトグラフィー分離は、０．０５％（ｖ／ｖ）ギ酸（溶媒Ａ）および０．０５％（ｖ／ｖ）ギ酸を含むアセトニトリル（溶媒Ｂ）からなる移動相を用いてＩｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３カラム（ＧＬサイエンス社製）を用いて行った。次の勾配を４００μＬ／分の流速で使用した：９５：５（Ａ：Ｂ）で初期（２分）、７５：２５で５分、６５：３５で１０分、２５：７５で２０分および５：９５で２５分。分析のために、５，６−ＤｉＨＥＴＥのモニターされた遷移はｍ／ｚ  ３３５．３→１４５．１であり、溶出時間は、１８分であった。【００７５】
（２）結果
評価結果は図８に示される通りであった。【００７６】
図８の結果から、５，６−ＤｉＨＥＴＥの絶対濃度は、試験０日目（６０．１±２１．０ｐｇ／ｍｇ組織）から試験７日目（１２．２±４．２ｐｇ／ｍｇ組織）まで減少し、次いで治癒期である試験９日目（５２．４±９．６ｐｇ／ｍｇ組織）から試験１８日目（８１．４±２１．０ｐｇ／ｍｇ組織）において増加した。一方、炎症反応を媒介するＰＧＥ２およびＰＧＤ２の絶対濃度は、試験７日目に最大であり、次いで治癒期において減少した。これらの結果から、５，６−ＤｉＨＥＴＥは、ＤＳＳ誘発大腸炎が悪化する試験７日目までの期間において減少し、治癒期において増加することが示された。【００７７】
例９：５，６−ＤｉＨＥＴＥの大腸炎からの回復促進効果
（１）５，６−ＤｉＨＥＴＥの投与
治癒期における５，６−ＤｉＨＥＴＥの役割を調べるために、例７（１）で作製した大腸炎モデルマウスに対して、試験９日目、１１日目および１３日目に５０μｇ／ｋｇ／日の５，６−ＤｉＨＥＴＥ（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）またはＨＣ−０６７０４７（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）（１ｍｇ／ｋｇ／日）を腹腔内注射した（以下、例９および例１０においてそれぞれ「５，６−ＤｉＨＥＴＥ投与群」、「ＨＣ−０６７０４７投与群」ということがある）。なお、ＨＣ−０６７０４７は、内皮細胞においてカルシウムイオン濃度の増加を阻害することが知られている。【００７８】
（２）大腸炎の重篤度の評価
大腸炎の重篤度は、例７（２）に記載の指標および基準に従って行った。【００７９】
（３）結果
結果は図９に示される通りであった。【００８０】
図９の結果から、試験１４日目の相対的な体重は、大腸炎群では初期重量の１０２．４±１．４％であったのに対して、５，６−ＤｉＨＥＴＥ投与群では初期重量の１１５．２±２．５％に増加した。また、５，６−ＤｉＨＥＴＥ投与群では糞便スコアが改善され、試験１４日目には正常レベルへ低下した。さらに、試験１４日目における大腸の長さは、大腸炎群では５．８±０．１ｃｍであったのに対して、５，６−ＤｉＨＥＴＥ投与群では６．４±０．１ｃｍであり、５，６−ＤｉＨＥＴＥの投与により大腸の短縮が抑制された。ＨＣ−０６７０４７投与群では、大腸炎群と比較して、大腸炎からの回復が促進されたことが確認された。なお、各群の飲水量には差がみられなかった（データ示さず）。以上の結果から、大腸炎モデルマウスにおいて５，６−ＤｉＨＥＴＥを腹腔内投与することにより大腸炎の回復が促進されることが示された。【００８１】
例１０：５，６−ＤｉＨＥＴＥのＤＳＳ誘発白血球浸潤および大腸浮腫に対する阻害効果
（１）ＤＳＳ誘発大腸炎の組織学的評価
健常群、大腸炎群、５，６−ＤｉＨＥＴＥ投与群およびＨＣ−０６７０４７投与群の試験１４日目の遠位大腸切片を４％パラホルムアルデヒド中で２４時間固定し、パラフィンに包埋し、厚さ２μｍの切片に切断した。これらの切片のヘマトキシリン染色およびエオシン染色は、常法に従って行った。次いで、大腸炎の重篤度を評価するためKruschewski M. et al., Digestive Diseases and Sciences, 46:2336-2343(2001)の記載に従って組織学的スコアを判定した。【００８２】
（２）大腸浮腫の判定
大腸浮腫の指標として湿・乾重量比を用いた（Rachmilewitz D. et al., Gastroenterology, 97: 326-337(1989)）。具体的には、遠位結腸を採取して湿重量を測定した。次いで、６０℃で２４時間乾燥させた後に乾重量を測定した。【００８３】
（３）結果
結果は図１０に示される通りであった。【００８４】
図１０の結果から、試験１４日目において、健常群では大腸内でほとんど炎症を示さなかった（組織学的スコア：１．０±０．５）。大腸炎群ではびまん性白血球浸潤、組織浮腫および陰嚢喪失（組織学的スコア：６．８±０．８）を示したが、５，６−ＤｉＨＥＴＥ投与群（組織学的スコア：３．３±０．５）およびＨＣ−０６７０４７投与群（組織学的スコア：２．８±０．４）では大腸内の炎症が改善された。大腸浮腫は、大腸組織中の含水量を測定することによって定量的に評価した。大腸組織の含水量は、健常群では４．４±０．１であったのに対して、大腸炎群では６．４±０．３を示し顕著に高くなることが示された。一方、５，６−ＤｉＨＥＴＥ投与群およびＨＣ−０６７０４７投与群では、大腸浮腫が阻害された（それぞれ５．２±０．２湿・乾重量比、５．０±０．１湿・乾重量比）。以上の結果から、大腸炎モデルマウスにおいて５，６−ＤｉＨＥＴＥを腹腔内投与することにより大腸炎の回復が促進されることが示された。【００８５】
例１１：５，６−ＤｉＨＥＴＥの肺炎に対する阻害効果
（１）急性肺障害モデルマウスの作製
Ｃ５７ＢＬ／６系統のマウス（雄、８〜１２週齢）に０．１規定の塩酸５０μＬを経鼻投与することにより、急性肺障害モデルマウスを作製した（以下、「肺炎群」ということがある）。一方、該塩酸経鼻投与の５分前と３時間後にそれぞれ５０μｇ／ｋｇの５，６−ＤｉＨＥＴＥ（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）を腹腔内注射に投与した（以下、「５，６−ＤｉＨＥＴＥ投与群」ということがある）。【００８６】
（２）肺炎の組織学的評価
肺炎群および５，６−ＤｉＨＥＴＥ投与群の肺を塩酸の経鼻投与から６時間後に採取して、４％パラホルムアルデヒド中で２４時間固定し、パラフィンに包埋し、厚さ２μｍの切片に切断した。これらの切片のヘマトキシリン染色およびエオシン染色は、常法に従って行った。【００８７】
（３）肺炎の判定
肺水腫の指標として湿・乾重量比を用いた（Rachmilewitz D. et al., Gastroenterology, 97: 326-337(1989)）。具体的には、塩酸の経鼻投与から６時間後に肺を採取して湿重量を測定した。次いで、６０℃で２４時間乾燥させた後に乾重量を測定した。また、肺炎の指標として肺の換気能を動脈血酸素飽和度を用いた。【００８８】
（４）統計処理
測定値は平均±標準誤差（ＳＥＭ）で表した。データの統計的評価は、Student T検定を用いて行った。ｐ＜０．０５の場合に統計的に有意差ありと判定した。【００８９】
（５）結果
結果は図１１に示される通りであった。【００９０】
図１１の結果から、肺の外観において、肺炎群では炎症の惹起により組織が赤みを帯びていたが、５，６−ＤｉＨＥＴＥ投与群ではそれらが改善された。また、肺のＨＥ染色像において、肺炎群では上皮障害や好中球の組織浸潤を示したが、５，６−ＤｉＨＥＴＥ投与群では上皮障害および好中球の組織浸潤が抑制された。肺炎の症状である肺水腫は、肺組織中の水分含有量を測定することによって評価した。肺組織の水分含有量は、肺炎群では組織浮腫を示す水分含有量の増加が確認されたのに対して、５，６−ＤｉＨＥＴＥ投与群では一例を除いて有意に水分含有量を低下させることが確認された。また、肺炎群では肺の換気能低下を示す動脈血酸素飽和度の低下が観察されたのに対して、５，６−ＤｉＨＥＴＥ投与群では動脈血酸素飽和度の低下が抑制された。これらの結果から、肺炎モデルマウスにおいて５，６−ＤｉＨＥＴＥを腹腔内投与することにより肺炎の回復が促進されることが示された。【００９１】
例１２：５，６−ＤｉＨＥＴＥのアナフィラキシーに対する阻害効果
（１）アナフィラキシーモデルマウスの作製
Ｃ５７ＢＬ／６系統のマウス（雄、８〜１２週齢）に生理食塩水に溶解したヒスタミン（５０ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与して、アナフィラキシーモデルマウスを作製した（以下、「アナフィラキシー群」ということがある）。一方、該ヒスタミン投与の１５分前に５０μｇ／ｋｇの５，６−ＤｉＨＥＴＥ（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）または２００ｍｇ／ｋｇのＬ−ＮＡＭＥ（Sigma社）を静脈内投与した（以下、「５，６−ＤｉＨＥＴＥ投与群」、「Ｌ−ＮＡＭＥ投与群」ということがある）。なお、Ｌ−ＮＡＭＥは、ＮＯ合成阻害剤である。【００９２】
（２）アナフィラキシーの判定
アナフィラキシー症状の指標として、体温低下と血圧低下を観察した。体温は、体温計（ＲＥＣＴＡＬ  ＰＲＯＢＥ、Ｐｈｙｓｉｔｅｍｐ社）を用いて５〜３０分おきに１５０分間直腸で測定した。血圧は、非観血式血圧測定器（ＢＰ−９８Ａ、ｓｏｆｔｒｏｎ社）を用いてＴａｉｌ−ｃｕｆｆ法により５〜３０分おきに１５０分間測定した。【００９３】
（３）統計処理
測定値は平均±標準誤差（ＳＥＭ）で表した。データの統計的評価は、Student T検定を用いて行った。ｐ＜０．０５の場合に統計的に有意差ありと判定した。【００９４】
（４）結果
結果は図１２に示される通りであった。【００９５】
図１２の結果から、マウスにヒスタミンを静脈内投与すると、血圧低下や体温低下などのアナフィラキシー反応が観察された。血圧は、ヒスタミン処置の２０分後に、最も低下した（７７．４±１０．３ｍｍＨｇ）が、ＮＯ合成阻害剤であるＬ−ＮＡＭＥの前処置により、ヒスタミンによる血圧低下は有意に抑制された（１０６．６±８．８ｍｍＨｇ）。また、５，６−ＤｉＨＥＴＥの前処置により、ヒスタミンによる血圧低下は抑制される傾向が確認された（９３．３±４．９ｍｍＨｇ）。また、体温は、ヒスタミン処置の３０分後に最も低下した（−２．２±０．３℃）が、Ｌ−ＮＡＭＥの前処置により、ヒスタミンによる体温低下は有意に抑制された（−０．８±０．２℃）。５，６−ＤｉＨＥＴＥの前処置により、ヒスタミンによる体温低下は有意にほぼ完全に抑制された（−０．２±０．１℃）。これらの結果から、５，６−ＤｉＨＥＴＥはアナフィラキシーの進行を抑制することが示された。【００９６】
例１３：青魚からの５，６−ＤｉＨＥＴＥの調製
（１）青魚からの５，６−ＤｉＨＥＴＥの調製
イワシ、サバ、アジの生魚から筋肉、骨、心臓、肝臓、腸管を摘出した。摘出した各臓器を液体窒素を用いて凍結し、ＳｈａｋｅＭａｓｔｅｒＡｕｔｏ（ＢＭＳ−Ａ２０ＴＰ社）を用いて組織を破砕した。次いで、メタノールを添加して遠心し、上清を採取した。上清を０．１％ギ酸を加えた蒸留水で３０％溶液に希釈し、内部標準物質となる、（±）１４（１５）−ＤｉＨＥＴ−ｄ１１（１μｇ／ｍｌ）、エイコサペンタエン酸−ｄ５（１０μｇ／ｍｌ）、ドコサヘキサエン酸−ｄ５（１０μｇ／ｍｌ）およびアラキドン酸メチルエステル−ｄ８（１００μｇ／ｍｌ）を添加した。次いで、各溶液を、Ｏａｓｉｓ  ＨＬＢ  １  ｃｃ  Ｖａｃ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ社、米国）を用いて固相抽出し、得られた標本の各脂質の濃度を、質量分析装置ＬＣＭＳ−８０３０（島津製作所社製）を用いて測定した。液体クロマトグラフィー分離は、０．１％（ｖ／ｖ）酢酸（溶媒Ａ）およびアセトニトリル（溶媒Ｂ）からなる移動相を使用したＫｉｎｅｔｅｘ  Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社）を使用して実施した。液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析は、負イオンモードで行った。溶出液を乾燥し、蒸留水中のアセトニトリルで再構成した。【００９７】
（２）統計処理
実験の結果は、平均±標準誤差（ＳＥＭ）（一元配置分散分析）で表した。【００９８】
（３）結果
アジ、サバ、イワシの筋肉、骨、心臓、肝臓、腸管の５，６−ＤｉＨＥＴＥ濃度は以下の通りであった。アジでは、５，６−ＤｉＨＥＴＥは、肝臓に１１８．９８±１７．１３ｎｇ／ｇ、腸管に１５６．１４±２６．６４ｎｇ／ｇ、筋肉に３．３９±２．０７ｎｇ／ｇ、骨に２７．７２±５．１７ｎｇ／ｇおよび心臓に４３．９５±２２．５３ｎｇ／ｇの濃度で含まれていた。また、サバでは、５，６−ＤｉＨＥＴＥは、肝臓に２７４．１８±５４．５３ｎｇ／ｇ、腸管に３３４．４９±２０５．７９ｎｇ／ｇ、筋肉に２２．６３±１６．１３ｎｇ／ｇ、骨に３２．００±５．４１ｎｇ／ｇおよび心臓に３４．３６±７．０１ｎｇ／ｇの濃度で含まれていた。また、イワシでは、５，６−ＤｉＨＥＴＥは、肝臓に４７６．１１±１７５．５６ｎｇ／ｇ、腸管に９７０．２２±２２１．２４ｎｇ／ｇ、筋肉に８３．１７±３２．７６ｎｇ／ｇ、骨に１０８．８９±４９．５８ｎｇ／ｇおよび心臓に１２２．０６±１７．０５ｎｇ／ｇの濃度で含まれていた。これらの結果から、５，６−ＤｉＨＥＴＥ濃度は、青魚の筋肉、骨および心臓では相対的に低いこと、肝臓と腸管で相対的に高いこと、特にイワシの腸管で高いことが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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