(57)【要約】  安全性が高く、実用性と有用性に優れた組換えファージを提供することを課題とする。ビリオン構成遺伝子の一部が欠失したバクテリオファージゲノムが頭部に格納されることにより、増殖能が奪われ、一度限りしか感染できない組換えバクテリオファージ及びその調製方法が提供される。また、パッケージングサイトを有し且つ目的遺伝子をコードするプラスミドが頭部に格納されることにより、増殖能が奪われ、一度限りしか感染できない組換えバクテリオファージ及びその調製方法が提供される。
2020137421.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ（１）及び（２）を含む、宿主細菌特異的ナノ粒子の調製方法：
（１）ビリオン構成遺伝子の一部が欠失したバクテリオファージゲノムを連結した組換えベクターを用意するステップ、
（２）前記組換えベクターと、欠失させたビリオン構成遺伝子をコードするプラスミドとの共存下、パッケージング反応させるステップ。
【請求項２】
前記バクテリオファージゲノムを複数の断片として用意し、該複数の断片と直鎖状ベクターを用いたシームレスクローニング法によって前記組換えベクターが調製される、請求項１に記載の調製方法。
【請求項３】
前記シームレスクローニング法が、酵母細胞内での相同組換えを利用したギャップリペアクローニング又はギブソンアッセンブリーである、請求項２に記載の調製方法。
【請求項４】
欠失させた前記ビリオン構成遺伝子が頭部遺伝子又は尾部遺伝子である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の調製方法。
【請求項５】
欠失させた前記ビリオン構成遺伝子が尾部遺伝子である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の調製方法。
【請求項６】
前記バクテリオファージゲノムが、T7ファージのゲノムである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の調製方法。
【請求項７】
ステップ（２）が、以下のステップ（２−１）及び（２−２）からなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の調製方法：
（２−１）欠失させた前記ビリオン構成遺伝子をコードするプラスミドを保持した宿主細菌に前記組換えベクターを導入するステップ、
（２−２）導入操作後の前記宿主細菌を培養するステップ。
【請求項８】
以下のステップ（３）を更に含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法：
（３）パッケージング反応によって生じたバクテリオファージを回収するステップ。
【請求項９】
ビリオン構成遺伝子の一部が欠失したバクテリオファージゲノムを格納した頭部と、尾部とを備え、宿主細菌に対する感染能を持つが再感染能を持たない組換えバクテリオファージからなる、宿主細菌特異的ナノ粒子。
【請求項１０】
欠失させた前記ビリオン構成遺伝子が頭部遺伝子又は尾部遺伝子である、請求項９に記載の宿主細菌特異的ナノ粒子。
【請求項１１】
欠失させた前記ビリオン構成遺伝子が尾部遺伝子である、請求項９に記載の宿主細菌特異的ナノ粒子。
【請求項１２】
前記バクテリオファージゲノムが、T7ファージのゲノムである、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の宿主細菌特異的ナノ粒子。
【請求項１３】
請求項９〜１２のいずれか一項に記載の宿主細菌特異的ナノ粒子を有効成分とした抗菌剤。
【請求項１４】
請求項１３に記載の抗菌剤を含む組成物。
【請求項１５】
細菌感染症に対する医薬、消毒薬、洗浄剤又は口腔用組成物である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
以下のステップ（１）及び（２）を含む、宿主細菌特異的ナノ粒子の調製方法：
（１）パッケージングサイトが欠失したバクテリオファージゲノムを連結した組換えベクターを用意するステップ、
（２）前記組換えベクターと、欠失させたパッケージングサイトを有し且つ目的遺伝子をコードするプラスミドとの共存下、パッケージング反応させるステップ。
【請求項１７】
前記バクテリオファージゲノムを複数の断片として用意し、該複数の断片と直鎖状ベクターを用いたシームレスクローニング法によって前記組換えベクターが調製される、請求項１６に記載の調製方法。
【請求項１８】
前記シームレスクローニング法が、酵母細胞内での相同組換えを利用したギャップリペアクローニングである、請求項１７に記載の調製方法。
【請求項１９】
前記バクテリオファージゲノムが、T7ファージのゲノムである、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の調製方法。
【請求項２０】
前記目的遺伝子が、マーカー遺伝子、レポーター遺伝子、酵素遺伝子、ゲノム編集用の遺伝子、抗菌ペプチドをコードする遺伝子、抗菌遺伝子、及び合成遺伝子回路を構成する遺伝子群からなる群より選択される一又は二以上の遺伝子である、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の調製方法。
【請求項２１】
ステップ（２）が、以下のステップ（２−１）及び（２−２）からなる、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の方法：
（２−１）欠失させた前記パッケージングサイトを有し且つ目的遺伝子をコードするプラスミドを保持した宿主細菌に前記組換えベクターを導入するステップ、
（２−２）導入操作後の前記宿主細菌を培養した後、溶菌させるステップ。
【請求項２２】
以下のステップ（３）を更に含む、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の方法：
（３）パッケージング反応によって生じたバクテリオファージを回収するステップ。
【請求項２３】
パッケージングサイトを有し且つ目的遺伝子をコードするプラスミドを格納した頭部と、尾部とを備え、宿主細菌に対する感染能を持つが再感染能を持たない組換えバクテリオファージからなる、宿主細菌特異的ナノ粒子。
【請求項２４】
前記バクテリオファージゲノムが、T7ファージのゲノムである、請求項２３に記載の宿主細菌特異的ナノ粒子。
【請求項２５】
前記目的遺伝子が、マーカー遺伝子、レポーター遺伝子、酵素遺伝子、ゲノム編集用の遺伝子、抗菌ペプチドをコードする遺伝子、抗菌遺伝子、及び合成遺伝子回路を構成する遺伝子群からなる群より選択される一又は二以上の遺伝子である、請求項２３又は２４に記載の宿主細菌特異的ナノ粒子。
【請求項２６】
請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の宿主細菌特異的ナノ粒子を有効成分として含む、形質導入用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌に感染するウイルスであるバクテリオファージ（以下、慣例に従い「ファージ」と略称することがある）の利用に関する。詳しくは、組換えファージからなる宿主細菌特異的ナノ粒子及びその用途に関する。本出願は、２０１８年１２月２７日に出願された日本国特許出願第２０１８−２４４７８９号に基づく優先権を主張するものであり、当該特許出願の全内容は参照により援用される。
【背景技術】
【０００２】
世界的に薬剤耐性細菌が蔓延し、一方で新たな抗菌薬の開発は滞っている。このような状況で「ファージセラピー」が注目されている（ファージセラピーに関しては例えば特許文献１、非特許文献１、２を参照）。ファージとは細菌に感染する天敵ウイルスである。(1)細菌への接着、(2)ファージゲノムの注入、(3)細菌内での増殖、(4)溶菌、(5)子孫ファージの放出、(6）細菌への再感染、という一連の生活環を持つ。ファージを用いて細菌感染症を治療するのがファージセラピーである。ファージには極めて高い宿主特異性があるため、抗菌薬のように無差別に殺菌するのではなく、ほぼ標的細菌のみを殺菌することができる。そのため、元々築かれていた細菌叢を攪乱することなく治療できるというメリットをもつ。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２０１６／０７１５０３号パンフレット
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Front Microbiol. 2012; 3: 238.
【非特許文献２】Curr Opin Investig Drugs. 2009 Aug;10(8):766-74.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ファージはウイルスであり、標的細菌（宿主）が存在する限り増殖し続けてしまう。増殖の過程で変異を獲得し、意図しない副作用、例えば、ヒトへの感染性を獲得することや、標的細菌の有害遺伝子を転移させること（水平伝播）、ヒトが持つ善玉菌への感染等が生じる可能性を排除できない。そこで本発明は、安全性が高く、実用性／有用性に優れた組換えファージ（宿主細菌特異的ナノ粒子）を提供することを課題とする。より具体的には、増殖能が奪われ、一度限りしか感染できない組換えファージの創出を課題とする。一度限りしか感染できないという特徴を示す組換えファージは、ファージセラピーに利用可能であることはもとより、標的細菌の遺伝子改変／ゲノム編集等、遺伝子工学的ツールとしても有用である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決すべく二種類の戦略を立案した。第１の戦略として、表現型としては完全な状態、遺伝子型としては不完全な状態になるようにファージを改変することにした。具体的には、ビリオン構成遺伝子（ファージ粒子を構成するタンパク質の遺伝子）の一部が欠失したファージゲノム（ビリオン構成遺伝子欠失ファージゲノム）を、欠失させた遺伝子をコードするプラスミドを保持した宿主細菌に導入することにした。導入操作後の宿主細菌内では、欠失させた遺伝子がコードするビリオン構成タンパク質以外は欠失ファージゲノムから、欠失させた遺伝子がコードするビリオン構成タンパク質はプラスミドからそれぞれ発現し、表現型としては完全である一方で遺伝子型としては不完全な（ビリオン構成遺伝子の一部が欠失している）組換えファージが形成されると期待された。欠失させる遺伝子の例として尾部遺伝子を採用し、検証実験を施行したところ、生成した組換えファージはその本来の機能（標的細菌に対する溶菌活性）を持つ一方で、再感染できなかった。一方、第２の戦略として、ファージのパッケージング、即ち、ファージゲノムの頭部への格納に必要なパッケージングサイト（PACサイト）が欠失したファージゲノム（PACサイト欠失ファージゲノム）を、PACサイトをプラスミド上に持つ宿主細菌に導入することにした。導入操作後の宿主細菌内では、ファージの形成に必要な各種タンパク質がPACサイト欠失ファージゲノムから発現し、PACサイトを有するプラスミドがパッケージングされ、プラスミドの運び屋（即ち、遺伝子導入ツール）として利用可能な組換えファージが得られると期待された。当該戦略の有効性を検証した結果、期待通りの特性を示す組換えファージの形成が認められた。このように、二種類の戦略についてその有効性が確認された。特筆すべきは、いずれの戦略についても100％の生物学的封じ込めに成功したことである。
以下の発明は以上の成果に基づく。
［１］以下のステップ（１）及び（２）を含む、宿主細菌特異的ナノ粒子の調製方法：
（１）ビリオン構成遺伝子の一部が欠失したバクテリオファージゲノムを連結した組換えベクターを用意するステップ、
（２）前記組換えベクターと、欠失させたビリオン構成遺伝子をコードするプラスミドとの共存下、パッケージング反応させるステップ。
［２］前記バクテリオファージゲノムを複数の断片として用意し、該複数の断片と直鎖状ベクターを用いたシームレスクローニング法によって前記組換えベクターが調製される、［１］に記載の調製方法。
［３］前記シームレスクローニング法が、酵母細胞内での相同組換えを利用したギャップリペアクローニング又はギブソンアッセンブリーである、［２］に記載の調製方法。
［４］欠失させた前記ビリオン構成遺伝子が頭部遺伝子又は尾部遺伝子である、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の調製方法。
［５］欠失させた前記ビリオン構成遺伝子が尾部遺伝子である、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の調製方法。
［６］前記バクテリオファージゲノムが、T7ファージのゲノムである、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の調製方法。
［７］ステップ（２）が、以下のステップ（２−１）及び（２−２）からなる、［１］〜［６］のいずれか一項に記載の調製方法：
（２−１）欠失させた前記ビリオン構成遺伝子をコードするプラスミドを保持した宿主細菌に前記組換えベクターを導入するステップ、
（２−２）導入操作後の前記宿主細菌を培養するステップ。
［８］以下のステップ（３）を更に含む、［１］〜［７］のいずれか一項に記載の方法：
（３）パッケージング反応によって生じたバクテリオファージを回収するステップ。
［９］ビリオン構成遺伝子の一部が欠失したバクテリオファージゲノムを格納した頭部と、尾部とを備え、宿主細菌に対する感染能を持つが再感染能を持たない組換えバクテリオファージからなる、宿主細菌特異的ナノ粒子。
［１０］欠失させた前記ビリオン構成遺伝子が頭部遺伝子又は尾部遺伝子である、［９］に記載の宿主細菌特異的ナノ粒子。
［１１］欠失させた前記ビリオン構成遺伝子が尾部遺伝子である、［９］に記載の宿主細菌特異的ナノ粒子。
［１２］前記バクテリオファージゲノムが、T7ファージのゲノムである、［９］〜［１１］のいずれか一項に記載の宿主細菌特異的ナノ粒子。
［１３］［９］〜［１２］のいずれか一項に記載の宿主細菌特異的ナノ粒子を有効成分とした抗菌剤。
［１４］［１３］に記載の抗菌剤を含む組成物。
［１５］細菌感染症に対する医薬、消毒薬、洗浄剤又は口腔用組成物である、［１４］に記載の組成物。
［１６］以下のステップ（１）及び（２）を含む、宿主細菌特異的ナノ粒子の調製方法：
（１）パッケージングサイトが欠失したバクテリオファージゲノムを連結した組換えベクターを用意するステップ、
（２）前記組換えベクターと、欠失させたパッケージングサイトを有し且つ目的遺伝子をコードするプラスミドとの共存下、パッケージング反応させるステップ。
［１７］前記バクテリオファージゲノムを複数の断片として用意し、該複数の断片と直鎖状ベクターを用いたシームレスクローニング法によって前記組換えベクターが調製される、［１６］に記載の調製方法。
［１８］前記シームレスクローニング法が、酵母細胞内での相同組換えを利用したギャップリペアクローニングである、［１７］に記載の調製方法。
［１９］前記バクテリオファージゲノムが、T7ファージのゲノムである、［１６］〜［１８］のいずれか一項に記載の調製方法。
［２０］前記目的遺伝子が、マーカー遺伝子、レポーター遺伝子、酵素遺伝子、ゲノム編集用の遺伝子、抗菌ペプチドをコードする遺伝子、抗菌遺伝子、及び合成遺伝子回路を構成する遺伝子群からなる群より選択される一又は二以上の遺伝子である、［１６］〜［１９］のいずれか一項に記載の調製方法。
［２１］ステップ（２）が、以下のステップ（２−１）及び（２−２）からなる、［１６］〜［２０］のいずれか一項に記載の方法：
（２−１）欠失させた前記パッケージングサイトを有し且つ目的遺伝子をコードするプラスミドを保持した宿主細菌に前記組換えベクターを導入するステップ、
（２−２）導入操作後の前記宿主細菌を培養した後、溶菌させるステップ。
［２２］以下のステップ（３）を更に含む、［１６］〜［２１］のいずれか一項に記載の方法：
（３）パッケージング反応によって生じたバクテリオファージを回収するステップ。
［２３］パッケージングサイトを有し且つ目的遺伝子をコードするプラスミドを格納した頭部と、尾部とを備え、宿主細菌に対する感染能を持つが再感染能を持たない組換えバクテリオファージからなる、宿主細菌特異的ナノ粒子。
［２４］前記バクテリオファージゲノムが、T7ファージのゲノムである、［２３］に記載の宿主細菌特異的ナノ粒子。
［２５］前記目的遺伝子が、マーカー遺伝子、レポーター遺伝子、酵素遺伝子、ゲノム編集用の遺伝子、抗菌ペプチドをコードする遺伝子、抗菌遺伝子、及び合成遺伝子回路を構成する遺伝子群からなる群より選択される一又は二以上の遺伝子である、［２３］又は［２４］に記載の宿主細菌特異的ナノ粒子。
［２６］［２３］〜［２５］のいずれか一項に記載の宿主細菌特異的ナノ粒子を有効成分として含む、形質導入用組成物。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】デザイナーファージゲノム再構成用のDNA断片を作製するためのプライマー。
【図２】デザイナーファージゲノム（ビリオン構成遺伝子欠失ファージゲノム）の設計と再構成。尾部遺伝子が増幅されないように設計したプライマーを用いてPCRでファージゲノムとベクターを増幅し、酵母内で連結する。
【図３】ビリオン構成遺伝子欠失ファージゲノムを連結するベクターの構成。
【図４】デザイナーファージゲノム（ビリオン構成遺伝子欠失ファージゲノム）の設計と再構成。頭部遺伝子が増幅されないように設計したプライマーを用いてPCRでファージゲノムとベクターを増幅し、酵母内で連結する。
【図５】Gap-repairingの機序。(1)エキソヌクレアーゼ複合体によりDNA断片の5´末端が削られ、3´末端が露出する。（2）露出した3’末端に相同配列があれば塩基対を形成する。（3）DNAポリメラーゼによりDNAが伸長する。(4)リガーゼによりDNAが連結する。
【図６】ビリオン構成遺伝子をクローニングするプラスミドの構成。
【図７】ビリオン構成遺伝子をコードするプラスミドの構築。PCRで増幅したビリオン構成遺伝子をプラスミドベクターに連結する。
【図８】PACサイト欠失ファージゲノムの設計と再構成。PACサイトが増幅されないように設計したプライマーを用いてPCRでファージゲノムとベクターを増幅し、酵母内で連結する。
【図９】ファージの構造。
【図１０】尾部遺伝子欠失ファージの作製フロー。
【図１１】尾部遺伝子欠失ファージの殺菌効果。大腸菌に対して所定数の尾部遺伝子欠失ファージを感染させ、生菌数を経時的に測定した。LB：培地のみ（尾部遺伝子欠失ファージなし）、MOI=1：大腸菌と同数の尾部遺伝子欠失ファージを感染、MOI=10：大腸菌の10倍の尾部遺伝子欠失ファージを感染、MOI=100：大腸菌の100倍の尾部遺伝子欠失ファージを感染、MOI=1000：大腸菌の1000倍の尾部遺伝子欠失ファージを感染。
【図１２】プラーク形成アッセイの結果。Killing assay後のサンプルを培養し続け、プラークが形成されるか確認した。WT：野生型T7ファージ（ポジティブコントロール）、LB：培地のみ（ネガティブコントロール）、MOI=1：大腸菌と同数の尾部遺伝子欠失ファージを感染させたサンプルを更に24時間培養した後の培養上清と大腸菌を混合したもの、MOI=10：大腸菌の10倍の尾部遺伝子欠失ファージを感染させたサンプルを更に24時間培養した後の培養上清と大腸菌を混合したもの、MOI=100：大腸菌の100倍の尾部遺伝子欠失ファージを感染させたサンプルを更に24時間培養した後の培養上清と大腸菌を混合したもの、MOI=1000：大腸菌の1000倍の尾部遺伝子欠失ファージを感染させたサンプルを更に24時間培養した後の培養上清と大腸菌を混合したもの。
【図１３】形質導入ナノ粒子の作製フロー。
【図１４】形質導入ナノ粒子の形質導入効率。抗生物質耐性遺伝子及びβ-ガラクトシダーゼをコードするlacZ遺伝子が挿入されたPACサイト保持プラスミドがパーケージングされている形質導入ナノ粒子（上段）を大腸菌に感染させ、コロニーの形成を観察した（右上のプレート）。大腸菌のみ（左下のプレート）、形質導入ナノ粒子のみ（右下のプレート）の場合と比較した。左上のプレートはプラーク形成アッセイの結果。
【図１５】プラーク形成アッセイによる、生物学的封じ込めの検証。頭部遺伝子欠失ファージ（Ａの上段）又は尾部遺伝子欠失ファージ（Ａの下段）の溶液を大腸菌に添加し、プラークが形成されるか観察した（Ｂ）。
【図１６】lysis from without現象の確認。頭部遺伝子欠失ファージを添加するとlysis from without現象が起き、プラークが形成されない（左のプレートのBSP）。大腸菌に頭部遺伝子を発現させた場合はプラークを形成した（右のプレートのBSP）。BSP: Bio-contained Synthetic Phage（宿主特異的ナノ粒子）
【図１７】殺菌作用の確認。(1) 大腸菌BW25113、(2) BW25113 ＋ ファージT7（MOI = 10）、(3) BW25113 ＋ BSPΔhead（頭部遺伝子欠失ファージ）（MOI = 10）、(4) BW25113 ＋ BSPΔtail(尾部遺伝子欠失ファージ)（MOI = 10）。
【図１８】プラーク形成アッセイによる、生物学的封じ込めの検証。左上（LB）: 宿主細菌のみのプレート、右上：MOI=1で頭部遺伝子欠失ファージを添加したプレート、左下：MOI=10で頭部遺伝子欠失ファージを添加したプレート、右下：MOI=100で頭部遺伝子欠失ファージを添加したプレート。
【図１９】in vivoでの有効性の検証。サルモネラLT2を接種したマウスの生存率を、SP6と頭部遺伝子欠失ファージのいずれも投与しない非治療群、SP6投与群（SP6）及び頭部遺伝子欠失ファージ投与群（BSP）の間で比較した。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
１．ビリオン構成遺伝子欠失組換えファージからなる宿主細菌特異的ナノ粒子
本発明の第１の局面は、ビリオン構成遺伝子の一部が欠失した組換えファージに関する。抗菌剤の有効成分として利用可能なものであることと（詳細は後述する）、ナノオーダーのサイズであることから、説明の便宜上、この局面の組換えファージのことを「本発明の抗菌性ナノ粒子」と呼称することがある。
【０００９】
ファージの構造は一般に頭部と尾部に大別される。頭部にはファージゲノムが格納されている。尾部は宿主細菌への感染に重要であり、ファージの種類によってその構成は異なるものの、尾（部）線維、ベースプレート、スパイク等によって構成される。本発明の抗菌性ナノ粒子を構成するファージゲノムはビリオン構成遺伝子の一部を欠失している。即ち、その頭部には、ビリオン構成遺伝子の一部が欠失した不完全なファージゲノムが格納されている。この構造的な特徴によって、宿主細菌に対する感染能を持つが再感染能を持たない。このように、本発明の抗菌性ナノ粒子は宿主細菌への感染に必要な表現型を示す一方、遺伝子型が不完全であり、１度限りしか感染することができない。
【００１０】
ファージは宿主細菌特異性を示す。本発明において宿主細菌は特に限定されず、形状（一般に球形、棒状、らせん状に大別される）、グラム染色性（グラム陽性又はグラム陰性）、酸素要求性（好気性、嫌気性、通性嫌気性）、病原性、存在様式等は問わない。宿主細菌を例示すると、大腸菌（Escherichia coli）、シゲラ属細菌（Shigella）（S. dysenteriae、S. frexneri、S. sonnei等）、サルモネラ属細菌（Salmonella）（S. typh、S. paratyphi-A、S. schottmuelleri、S. typhimurium、S. enteritidis等）、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌（E. aerogenes、E. cloacae等）、クレブシエラ属細菌（Klebsiella）（K. pneumoniae、K. oxytoca等）、プロテウス属細菌（Proteus）（P. mirabilis、P. vulgaris等）、エルシニア属細菌（Yersinia）（Y. pestis、Y. enterocolitica等）、ビブリオ属細菌（Vibrio）（V. cholerae、V. parahaemolyticus等）、ヘモフィルス属細菌（Haemophilus）（H. influenzae、H. parainfluenzae、H. ducreyi等）、シュードモナス属細菌（Pseudomonas）（P. aeruginosa、P. cepacia、P. putida等）、アシネトバクター属(Acinetobacter）細菌（A. calcoaceticus、A. baumannii、A. lwoffii等）、レジオネラ属細菌（Legionella）（L. pneumophila等）、ボルデテラ属細菌（Bordetella）（B. pertussis、B. parapertussis、B. bronchiseptica等）、ブルセラ属細菌（Brucella）（B. melitensis、B. abortus、B. suis等）、野兎病菌（Francisella tularensis）、バクテロイデス属細菌（Bacteroides）（B. fragilis、B. melaninogenicus等）、ナイセリア属細菌（Neisseria）（N. gonorrhoeae、N. meningitidis等）、ブドウ球菌属細菌（Staphylococcus）（S. aureus、S. epidermidis、S. saprophyticus等）、レンサ球菌属細菌（Streptococcus）（S. pyogenes、S. agalactiae、S. viridans、S. pneumoniae等）、腸球菌属細菌（Enterococcus）（E. faecalis、E. faecium、E. avium等）、バシラス属細菌（Bacillus）（B. subtilis、B. anthracis、B. cereus等）、クロストリジウム属細菌（Clostridium）（C. difficile、C. botulinum、C. perfringens、C. tetani等）、コリネバクテリウム属細菌（Corynebacterium）（C. diphtheriae等）、マイコバクテリウム属細菌（Mycobacterium）（M. tuberculosis、M. bovis、M. leprae、M. avium、M. intracellulare、M. kansasii、M. ulcerans等）、マイコプラズマ（Mycoplasma）、ボレリア属細菌（Borrelia）（B. recurrentis、B. burgdoferi等）、梅毒トレポネーマ（Treponema palidum）、カンピロバクター属細菌（Campylobacter）（C. coli、C. jejuni、C. fetus等）、ヘリコバクター属細菌（Helicobacter）（H. pylori、H. heilmannii等）、リケッチア属細菌（Rickettsia）（R. prowazekil、R. mooseri、R. tsutsugamushi等）、クラミジア属細菌（Chlamydia）（C. trachomatis、C. psittaci等）、リステリア属細菌（Listeria）（L. monocytogenes等）である。
【００１１】
以下、本発明の抗菌性ナノ粒子の調製方法を説明する。
＜抗菌性ナノ粒子の調製方法＞
本発明の調製方法は、以下のステップ（１）及び（２）を含む。
（１）ビリオン構成遺伝子の一部が欠失したバクテリオファージゲノムを連結した組換えベクターを用意するステップ
（２）前記組換えベクターと、欠失させた前記ビリオン構成遺伝子をコードするプラスミドとの共存下、パッケージング反応させるステップ
【００１２】
本発明の調製方法ではまず、ビリオン構成遺伝子の一部が欠失したバクテリオファージゲノムを連結した組換えベクターを用意する（ステップ（１））。ビリオン構成遺伝子の一部が欠失したバクテリオファージゲノム、即ち、ビリオン構成遺伝子の完全なセットを持たず、不完全なバクテリオファージゲノムのことを、本明細書では「ビリオン構成遺伝子欠失ファージゲノム」と呼称する。
【００１３】
その欠失が宿主細菌への感染に必要な構造に対して決定的な障害を与え、ファージの再感染能が喪失する限りにおいて、欠失の対象とするビリオン構成遺伝子（以下、「欠失ビリオン遺伝子」と呼ぶ）は特に限定されない。従って、頭部遺伝子（頭部の一部若しくは全部をコードする遺伝子）又は尾部遺伝子（尾部の一部若しくは全部をコードする遺伝子）を欠失させればよい。ビリオン構成遺伝子欠失ファージゲノムは遺伝子工学的手法によって調製される。従って、ビリオン構成遺伝子欠失ファージゲノムでは、人為的な操作の結果として、ビリオン構成遺伝子の一部が欠失している。尚、欠失ビリオン遺伝子の具体例として、T7ファージの頭部（NCBIのGenBankにおいて「DEFINITION: Genome of bacteriophage T7. ACCESSION: V01146 J02518 X00411. VERSION: V01146.1」として登録されているゲノム配列中のgene 10Aとgene 10Aの翻訳中にフレームシフトすることでつくられるgene 10Bによって形成される）をコードする遺伝子（gene 10AB）の配列を配列番号１に、尾部遺伝子gene 11の配列を配列番号２（NCBIのGenBankにおいて「DEFINITION: Genome of bacteriophage T7. ACCESSION: V01146 J02518 X00411. VERSION: V01146.1」として登録されているゲノム配列の24228位〜24818位）に、尾部遺伝子gene 12の配列を配列番号３（同24842位〜27226位）に、尾部線維遺伝子gene 17の配列を配列番号４（同34624位〜36285位）に、それぞれ示す。
【００１４】
ビリオン構成遺伝子欠失ファージゲノムの由来であるファージは特に限定されず、ビルレントファージとテンペレートファージのいずれであってもよい。ビルレントファージは感染後に宿主細菌内で増殖し、最終的に溶菌させて宿主細菌を死滅させる（溶菌サイクル）。テンペレートファージは溶菌サイクル又は溶原サイクルによって増殖する。溶原サイクルではファージは宿主細菌のゲノムDNAに組み込まれる。この状態のファージをプロファージと呼び、プロファージを保有する宿主細菌を溶原菌と呼ぶ。
【００１５】
ファージの例はマイオウイルス科（Myoviridae）ファージ（T4様ウイルス属, P1様ウイルス属, P2様ウイルス属, Mu様ウイルス属, SPO1様ウイルス属, phiH様ウイルス属）、サイフォウイルス科（Siphoviridae）ファージ（λ様ウイルス属, γ様ウイルス属, T1様ウイルス属, T5様ウイルス属, c2様ウイルス属, L5様ウイルス属, PsiM1様ウイルス属, phiC31様ウイルス属, N15様ウイルス属）、ポドウイルス科（Podoviridae）ファージ（T7様ウイルス属, phi29様ウイルス属, P22様ウイルス属, N4様ウイルス属）、テクティウイルス科（Tectiviridae）ファージ（Tectivirus属）、コルチコウイルス科（Corticoviridae）ファージ（Corticovirus属）、リポスリクスウイルス科（Lipothrixviridae）ファージ（Alphalipothrixvirus属, Betalipothrixvirus属, Gammalipothrixvirus属, Deltalipothrixvirus属）、プラズマウイルス科（Plasmaviridae）ファージ（Plasmavirus属）、ルディウイルス科（Rudiviridae）ファージ（Rudivirus属）、フセロウイルス科（Fuselloviridae）ファージ（Fusellovirus属）、イノウイルス科（Inoviridae）ファージ（Inovirus属, Plectrovirus属, M13様ウイルス属, fd様ウイルス属）、ミクロウイルス科（Microviridae）ファージ（Microvirus属, Spiromicrovirus属, Bdellomicrovirus属, Chlamydiamicrovirus属）、レビウイルス科（Leviviridae）ファージ（Levivirus属, Allolevivirus属）、シストウイルス科（Cystoviridae）ファージ（Cystovirus属）、アンプラウイルス科（Ampullaviridae）ファージ、ビカウダウイルス科（Bicaudaviridae）ファージ、クラバウイルス科（Clavaviridae）ファージ、グロブロウイルス科（Globuloviridae）ファージ、グッタウイルス（Guttavirus）属ファージである。本発明の抗菌性ナノ粒子は、典型的には、溶菌により宿主細菌を死滅させるという機能を備える。この機能のためにはビルレントファージ（例えば、T系ファージ、SP6ファージ、gh-1ファージなど）が好ましい。特に好ましいファージの一つであるT7ファージのゲノムDNAの情報は公共のデータベースに登録されており（例えばNCBIのGenBank、DEFINITION: Genome of bacteriophage T7. ACCESSION: V01146 J02518 X00411. VERSION: V01146.1）、本発明におけるビリオン構成遺伝子欠失ファージゲノムの設計・調製に利用することができる。T7ファージ以外のファージに対応するビリオン構成遺伝子欠失ファージゲノムの設計・調製についても同様であり、公知の配列情報を利用すればよい。
【００１６】
ビリオン構成遺伝子欠失ファージゲノムの調製にはシームレスクローニング法を利用することができる。シームレスクローニング法では、目的のDNA配列を複数の断片として用意し、当該複数の断片を、直鎖状に調製したベクターへ同時にクローニングする。ギャップリペアクローニング（Gap-repairing）（例えば Ando et al., Cell Systems:1(3), 2015を参照）、ギブソンアッセンブリー（例えば、ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社が提供するシステムやキット（Gibson Assembly Cloning Kit）等を利用することができる）、In-Fusionクローニング（例えば、タカラバイオ株式会社が提供するシステムやキット（In-Fusion（登録商標） HD Cloning Kit）等を利用することができる）等のシームレスクローニング法が開発されている。好ましい一態様では、ギャップリペアクローニングを採用し、ビリオン構成遺伝子欠失ファージゲノムを酵母細胞内で再構成する。この場合、ビリオン構成遺伝子欠失ファージゲノムを例えば2〜20個（好ましくは2個〜8個）の断片に分割し、各々を、PCR（Polymerase chain reaction）法に代表される核酸増幅反応によって増幅させておく。一方で、酵母の複製起点を有するベクターを直鎖状とし、増幅させたDNA断片とともに酵母細胞へ導入する。ベクターの直鎖化は、制限酵素処理等、常法によって行うことができる。酵母内でのクローニングの成否を確認するため、ベクターには通常、栄養要求性マーカー（例えばURA3遺伝子、LEU2遺伝子）や薬剤耐性マーカー（例えばアンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子）等の選択マーカー遺伝子が搭載される。ギャップリペアクローニングによるビリオン構成遺伝子欠失ファージゲノムの調製方法の詳細については、後述の実施例の欄で説明する。尚、改変を加えたファージゲノム（デザイナーファージゲノム）の調製（再構成）にギャップリペアクローニングが利用されている（例えば米国特許第9,617,522号を参照）。
【００１７】
ステップ（１）に続くステップ（２）では、ステップ（１）で用意した組換えベクター、即ち、再構成したビリオン構成遺伝子欠失ファージゲノムを連結した組換えベクター（以下、「欠失ファージゲノムベクター」と呼ぶ）と、欠失させたビリオン構成遺伝子（即ち、欠失ビリオン遺伝子）をコードするプラスミドとの共存下、パッケージング反応を行う。パッケージング反応には、大腸菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌等、様々な宿主細菌を用いることができる。宿主細菌は、パッケージングによって形成されるファージが溶菌し得るものである限り、本来の宿主（ビリオン構成遺伝子欠失ファージゲノムの由来であるファージの宿主）でなくてもよい。宿主細菌を用いたin vitroパッケージングの場合、通常は、欠失ビリオン遺伝子をコードするプラスミドを保持した宿主細菌を予め用意しておき、当該宿主細菌に対して欠失ファージゲノムベクターを導入する。欠失ビリオン遺伝子をコードするプラスミドには、宿主細菌の複製起点に加え、通常、その存在を確認するための選択マーカー遺伝子（例えば栄養要求性マーカー又は薬剤耐性マーカー）が搭載される。欠失ビリオン遺伝子がプロモーターを含まない場合には、当該プラスミドを構築する際にプロモーターを導入するか、或いはプロモーターを有するプラスミドベクターを用いればよい。前者の場合、例えば、PCRで欠失ビリオン遺伝子を増幅する際のプライマーにプロモーター配列を持たせ、プライマーが遺伝子のすぐ上流に配置された増幅産物が得られるようにする。欠失ビリオン遺伝子をコードするプラスミドの構築には例えば、ギブソンアッセンブリー、制限酵素とリガーゼを用いたクローニング等を利用できる。また、プラスミドの宿主細菌への導入はコンピテントセル法やエレクトロポレーション法等、常法で行えばよい。一方、宿主細菌への欠失ファージゲノムベクターの導入法も特に限定されず、例えば、エレクトロポレーションを利用することができる。
【００１８】
以上のようにして、欠失ビリオン遺伝子をコードするプラスミドを保持した宿主細菌に欠失ファージゲノムベクターが導入されると、宿主細菌内では、欠失ビリオン遺伝子がコードするビリオン構成タンパク質以外は欠失ファージゲノムベクターから、欠失ビリオン遺伝子がコードするビリオンタンパク質はプラスミドからそれぞれ発現し、表現型としては完全である一方で遺伝子型としては不完全な（ビリオン構成遺伝子の一部を欠失している）組換えファージが形成される。宿主細菌を適切な条件下で培養すると最終的に溶菌し、組換えファージが放出される。放出された組換えファージは常法で回収することができる。宿主細菌の培養には固体培地と液体培地のいずれを用いてもよいが、組換えファージの回収効率や回収操作の簡便性等の点から、液体培地を用いること、即ち液体培養を採用することが好ましい。液体培養の場合、例えば、溶菌しきるまで培養した後、培養液を必要に応じて精製、滅菌等の処理に供し、組換えファージ液を得る。好ましくは、培養液の回収操作の前に、クロロホルム処理等によって残存する宿主細菌を死滅させておく。
【００１９】
＜抗菌性ナノ粒子の用途＞
本発明の抗菌性ナノ粒子はその特徴的な構造により、宿主細菌に対する感染能を持つが再感染能を持たないという特性を示すとともに、宿主細菌特異的な殺菌能力を発揮する。従って、安全性が高く、特異性に優れた殺菌剤の有効成分として有用である。「抗菌剤」とは、細菌の増殖を抑制（静菌）する作用・効果、又は細菌を死滅（殺菌）する作用・効果を有する剤をいう。本発明の抗菌剤はそれを含む組成物として各種用途の利用に供される。以下、代表的な用途として、本発明の組成物を用いた医薬（治療薬又は予防薬）、消毒薬、洗浄剤及び口腔組成物を説明する。
【００２０】
（ｉ）医薬
本発明の医薬は細菌感染症の治療又は予防に用いられる。本発明の医薬は細菌感染症に対して治療的効果又は予防的効果（これら二つの効果をまとめて「医薬効果」と呼ぶ）を発揮し得る。ここでの医薬効果には、(1)細菌感染の阻止、（2）細菌感染症の発症の阻止、抑制又は遅延、(3)細菌感染症に特徴的な症状又は随伴症状の緩和（軽症化）、(4)細菌感染症に特徴的な症状又は随伴症状の悪化の阻止、抑制又は遅延、等が含まれる。尚、治療的効果と予防的効果は一部において重複する概念であることから、明確に区別して捉えることは困難な場合があり、またそうすることの実益は少ない。
【００２１】
医薬の製剤化は常法に従って行うことができる。好ましくは、薬学的に許容可能な媒体を組み合わせて製剤化する。「薬学的に許容可能な媒体」とは、本発明の有効成分の薬効（標的細菌特異的な殺菌）に実質的な影響を与えることなく、本発明の医薬の投与や保存等に関して利点ないし恩恵をもたらす物質をいう。「薬学的に許容可能な媒体」として、脱イオン水、超純水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、5%デキストロース水溶液等を例示できる。また、製剤化する場合には、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）を含有させることができる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、D-マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。無痛化剤としてはベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトール等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。
【００２２】
製剤化する場合の剤形も特に限定されない。剤形の例は錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、注射剤、外用剤（軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、液剤、ゲル剤、パップ剤、プラスター剤、テープ剤、エアゾール剤等）、及び座剤である。医薬はその剤形に応じて経口投与又は非経口投与（患部への局所注入、静脈内、動脈内、皮下、皮内、筋肉内、又は腹腔内注射、経皮、経鼻、経粘膜など）によって対象に適用される。また、全身的な投与と局所的な投与も対象により適応される。これらの投与経路は互いに排他的なものではなく、任意に選択される二つ以上を併用することもできる。
【００２３】
本発明の医薬には、期待される効果を得るために必要な量（即ち治療又は予防上有効量）の有効成分が含有される。本発明の医薬中の有効成分量は一般に剤形によって異なるが、所望の投与量を達成できるように有効成分量を例えば約0.001重量％〜約80重量％の範囲内で設定する。
【００２４】
本発明の医薬の投与量は、期待される効果が得られるように設定される。治療又は予防上有効な投与量の設定においては一般に症状、患者の年齢、性別、及び体重などが考慮される。当業者であればこれらの事項を考慮して適当な投与量を設定することが可能である。投与量の例を示すと、成人（体重約60kg）を対象として一日当たりの有効成分量（本発明の抗菌性ナノ粒子の量）が103 pfu/mL〜1011 pfu/mL、好ましくは 107 pfu/mL〜 1011 pfu/mLとなるよう投与量を設定することができる。投与スケジュールとしては例えば1日1回〜数回、2日に1回、或いは3日に1回などを採用できる。投与スケジュールの作成においては、患者の状態や有効成分の効果持続時間などを考慮することができる。
【００２５】
本発明の医薬による治療又は予防に並行して他の医薬、典型的には抗菌薬（例えば、ペニシリン系抗菌薬、セフェム系抗菌薬、カルバペネム系抗菌薬、ペネム系抗菌薬、テトラサイクリン系抗菌薬、βラクタマーゼ阻害剤、ホスホマイシン、バンコマイシン、アミノグリコシド系抗菌薬、マクロライド系抗菌薬）による処置を施すことにしてもよい。本発明の有効成分の作用機序は、一般に使用される既存の抗菌薬とは作用機序が異なる。従って、本発明の医薬と既存の抗菌薬を併用すれば、複合的な作用／効果の発揮を期待でき、治療効果の増大を図ることができる。
【００２６】
以上の記述から明らかな通り本願は、細菌感染症に罹患した対象又は罹患するおそれのある対象に対して、本発明の抗菌性ナノ粒子を含む医薬を、治療又は予防上有効量投与することを特徴とする、各種細菌感染症を治療又は予防する方法（いわゆるファージセラピー）も提供する。治療又は予防の対象は典型的にはヒトであるが、ヒト以外の哺乳動物（例えばサル、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、等）、鳥類（ニワトリ、ウズラ、七面鳥、ガチョウ、アヒル、ダチョウ、カモ、インコ、文鳥等）、魚介類、爬虫類（トカゲ、ヘビ、イグアナ、カメレオン、カメ、ヤモリ等）、両生類（カエル、イモリ、サンショウウオ等）、植物等に適用することにしてもよい。
【００２７】
（ｉｉ）消毒薬、洗浄剤
本発明の消毒薬又は洗浄剤は、例えば、居室（病室を含む）、調理室、トイレ、洗面所、浴室等の消毒又は洗浄、食器、カトラリー（ナイフ、フォーク、スプーン等）、調理器具（包丁、ナイフ、鍋、ミキサー、電子レンジ、オーブン等）、医療器具・装置等の消毒又は洗浄、手、指先や口腔等の消毒又は洗浄に用いられる。本発明の消毒薬又は洗浄剤は、例えば、液状（例えばスプレー剤、ローション）、ゲル状、固形状（例えば粉末）に構成され、塗布、噴霧、散布等によって適用される。天然繊維や合成繊維等からなる担体（例えばシート状）に本発明の消毒薬又は殺菌剤を担持ないし付着させ、拭き取り用途等に使用される製品や感染予防用マスク等としてもよい。
【００２８】
塩化ベンザルコニウム、塩化セチルピリジニウム、フェノキシエタノール、イソプロピルメチルフェノール、グルコン酸クロルヘキシジン等の抗菌ないし除菌成分、pH調整剤、界面活性剤、吸着剤、担体等を本発明の消毒薬又は洗浄剤に添加することにしてもよい。
【００２９】
（ｉｉｉ）口腔用組成物
本発明の口腔用組成物は口腔内の衛生状態の維持、口腔内環境の改善等に用いることができる。特に、歯周病又はその関連疾患の予防や治療への適用を期待できる。本発明の口腔用組成物によれば、標的細菌特異的な殺菌効果を期待できる。標的となる典型的な細菌は歯周病の原因となる細菌であり、例えば、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス（Aggregatibacter actinomycetemcomitans）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）、プレボテーラ・インテルメディア（Prevotella intermedia）、トレポネーマ・デンティコーラ（Treponema denticola）等が該当する。本発明の口腔用組成物を歯科用殺菌剤とすることも可能であり、例えば、インプラント術後の殺菌剤としての利用や、マウスウォッシャー（洗口液）や歯磨き粉に添加すること等が想定される。
【００３０】
本発明の口腔用組成物は例えば、練歯磨き剤、液体歯磨き剤、デンタルゲル、含嗽剤、洗口剤、飴、トローチまたはチューインガム等の形態で提供される。本発明の口腔用組成物には、本発明に特徴的な有効成分（抗菌性ナノ粒子）の他、一般に使用される口腔用基剤や添加剤等を含有させることができる。口腔用基剤の例は、歯科用リン酸水素カルシウム、酸化アルミニウム、ソルビット液である。添加剤としては、粘結剤、湿潤剤、発泡剤、界面活性剤、溶剤、溶解補助剤、保存剤、甘味料、着色料などを例示できる。
【００３１】
２．形質導入用の宿主細菌特異的ナノ粒子
本発明の第２の局面は宿主細菌への形質導入に利用可能な組換えファージに関する。説明の便宜上、この局面の組換えファージのことを「本発明の形質導入ナノ粒子」と呼称することがある。本発明の形質導入ナノ粒子では、パッケージングサイト（「PACサイト」と略称することがある）を有し且つ目的遺伝子をコードするプラスミドが頭部に格納されている。ファージゲノムの代わりに特定のプラスミドが頭部に格納されることにより、宿主細菌に対する感染能を持つが再感染能を持たず（１度限りしか感染することができない）、標的細菌特異的な形質導入用ツールとして機能する。尚、頭部に格納されるプラスミドが保持するPACサイトは、本発明の形質導入ナノ粒子の調製過程を反映するものであり、本発明に特徴的である。以下、本発明の形質導入ナノ粒子の調製方法を説明するが、第１の局面と同様の事項についてはその説明を省略し、上記の記載を援用する。
【００３２】
＜形質導入ナノ粒子の調製方法＞
本発明の調製方法は、以下のステップ（１）及び（２）を含む。
（１）パッケージングサイトが欠失したバクテリオファージゲノムを連結した組換えベクターを用意するステップ
（２）前記組換えベクターと、欠失させた前記パッケージングサイトを有し且つ目的遺伝子をコードするプラスミドとの共存下、パッケージング反応させるステップ
【００３３】
本発明の調製方法ではまず、PACサイトが欠失したバクテリオファージゲノムを連結した組換えベクターを用意する（ステップ（１））。PACサイトが欠失したバクテリオファージゲノム、即ち、PACサイトを持たず、それ自体はパッケージングされない不完全なバクテリオファージゲノムのことを、「PACサイト欠失ファージゲノム」と呼称する。PACサイトは、宿主細菌内でのファージの形成の際、ファージゲノムのパッケージングに必要な配列である。従って、PACサイト欠失ファージゲノムはパッケージングされず、ファージゲノムを持たない（ファージゲノムが欠落した）ファージが生成することになる。
【００３４】
典型的には、PACサイトのみが欠失したファージゲノムが用いられる。但し、組換え操作上の必要性等によって或いは意図的にPACサイト以外も欠失させたファージゲノムを用いることにしてもよい。この場合において、追加で欠失させた部分がファージの形成に必要な遺伝子（例えばビリオン構成遺伝子の一部）であれば、PACサイトを有することでパッケージングされるプラスミド（ステップ（２）の説明を参照）に当該遺伝子もコードさせておくか、或いは、パッケージングに利用する宿主細菌に、当該遺伝子をコードする別のプラスミドを導入しておけばよい。尚、PACサイトの一例として、T7ファージの5'末端側PACサイトの配列を配列番号５に、同3'末端側のPACサイトの配列を配列番号６にそれぞれ示す。
【００３５】
PACサイト欠失ファージゲノムは、第１の局面の場合と同様、シームレスクローニング法（好ましくはギャップリペアクローニング）によって調製することができる。
【００３６】
ステップ（１）に続くステップ（２）では、ステップ（１）で用意した組換えベクター、即ち、再構成したPACサイト欠失ファージゲノムを連結した組換えベクター（以下、「PACサイト欠失ファージゲノムベクター」と呼ぶ）と、欠失させたPACサイトを有し且つ目的遺伝子をコードするプラスミド（以下、「PACサイト保持プラスミド」と呼ぶ）との共存下、パッケージング反応を行う。第１の局面の場合と同様、パーケージング反応には、大腸菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌等、様々な宿主細菌を用いることができる。宿主細菌へのPACサイト欠失ファージゲノムベクター及びPACサイト保持プラスミドの導入操作等も第１の局面の場合と同様である。
【００３７】
典型的には、PACサイト保持プラスミドを保持した宿主細菌を予め用意しておき、当該宿主細菌に対してPACサイト欠失ファージゲノムベクターを導入し、パッケージング反応の必要な状態（即ち、PACサイト欠失ファージゲノムベクターとPACサイト保持プラスミドが共存する条件）を形成する。PACサイト保持プラスミドは、PACサイトを有することに加え、目的遺伝子をコードしている。目的遺伝子とは、本発明の形質導入ナノ粒子によって標的細菌に導入され、標的細胞内で発現することになる遺伝子である。典型的には１つの目的遺伝子が使用されるが、２つ以上の目的遺伝子がPACサイト保持プラスミドにコードされるようにしてもよい。様々な遺伝子を目的遺伝子として採用できる。目的遺伝子の例はマーカー遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子（neo）、カナマイシン耐性遺伝子（npt）、ハイグロマイシン耐性遺伝子（hph）、メタトレキセート耐性遺伝子（dhfr）等の薬剤耐性遺伝子、β-ガラクトシダーゼ遺伝子(lacZ)、β-グルクロニダーゼ（GUS）遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子（luc）等の発光タンパク質遺伝子、GFP遺伝子等の蛍光タンパク質遺伝子等）、レポーター遺伝子（ルシフェラーゼ遺伝子（luc）等の発光タンパク質遺伝子、GFP遺伝子等の蛍光タンパク質遺伝子）、（酵素遺伝子（ZFN(Zinc Finger Nuclease)、TALEN(Transcription Activator-Like Effector Nuclease)、CRISPR-Cas9等のゲノム編集用酵素の遺伝子、α-アミラーゼ、β-アミラーゼ、グルカン1,4-α-グルコシダーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ等の糖質関連酵素の遺伝子、アミノペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、ブロメライン、ペプシン、キモシン等のタンパク質関連酵素の遺伝子、リパーゼ、ホスホリパーゼ等の脂質関連酵素の遺伝子、アスパラギナーゼ、グルタミナーゼ等のアミノ酸関連酵素の遺伝子、セルラーゼ、ペクチナーゼ、ヘミセルラーゼ等の植物組織崩壊酵素の遺伝子、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、DNAポリメラーゼ、ヘリカーゼ、DNAトポイソメラーゼ、RNAポリメラーゼ、アデニル酸デアミナーゼ等の核酸関連酵素の遺伝子、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、ガラクトシダーゼ等の医薬用酵素の遺伝子、グルコースオキシダーゼ、ムタロターゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、リポプロテインリパーゼ、グリセロールキナーゼ、L-α-グリセロリン酸オキシダーゼ、ラクターゼデヒドロゲナーゼ、ウリカーゼ、D-3-ヒドロキシブチレイトデヒドロゲナーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、グルタミナーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ等の診断薬用酵素の遺伝子等）、抗菌ペプチド（ディフェンシン、カセリシジン、ダームシジン、ドロソマイシン等）をコードする遺伝子、抗菌遺伝子（リゾチーム遺伝子、エンドライシン遺伝子等）、合成遺伝子回路を構成する遺伝子群（リボレギュレーター、リコンビナーゼ遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子等）バクテリオファージの標的細菌特異的な殺傷能力をもたらす遺伝子（例えばT7ファージの溶菌酵素遺伝子）、医薬や栄養補助食品等に利用される物質（サイトカイン、ホルモン、神経伝達物質、フィブリノーゲン、血清アルブミン、ラクトフェリン等）の遺伝子、標的細胞の生存や維持等に有益な遺伝子、標的細胞が本来有する機能を高めるタンパク質をコードする遺伝子、標的細胞には作用せず、標的細胞から分泌されて周囲の細胞に作用するタンパク質をコードする遺伝子である。
【００３８】
マーカー遺伝子を目的遺伝子とした場合、当該遺伝子の発現を指標として形質導入ナノ粒子の標的細菌を検出することができる。従って、当該態様は標的細菌の検出、追跡等に有用であり、具体的な用途として、例えば、食中毒菌の食品への混入の検査を想定できる。また、本発明の形質導入ナノ粒子が標的細菌に導入されたことの確認手段としてマーカー遺伝子を用いることにしてもよく、その場合には通常、マーカー遺伝子と別の遺伝子（標的細胞への形質導入のための一又は二以上の遺伝子）が目的遺伝子として併用される。
【００３９】
目的遺伝子として酵素遺伝子を採用すれば、標的細菌内で特定の酵素を強制的に発現、機能させることができ、例えば、細菌の高機能化、新たな機能が付加された細菌の作製等に本発明の形質導入ナノ粒子を利用できる。酵素遺伝子の中でもゲノム編集用の遺伝子を目的遺伝子とした場合においては、標的細菌のゲノム改変に本発明の形質導入ナノ粒子を利用できることになる。酵素遺伝子を目的遺伝子をした場合の利用形態の例として、薬剤耐性細菌の薬剤感受性の改変（例えば、ゲノム編集によって薬剤耐性遺伝子を破壊し薬剤感受性株へ変換する）、産業用酵素生産細菌の生産性向上、食品・飲料（特に発酵食品、発酵飲料）、医薬又は工業製品（化学製品等）の製造やバイオエネルギー（例えばバイオエタノール）の生産、或いはバイオレメデーションに利用される細菌の能力（処理能力、製造／生産能力等）の向上を挙げることができる。
【００４０】
抗菌ペプチドをコードする遺伝子又はバクテリオファージの標的細菌特異的な殺傷能力をもたらす遺伝子群を目的遺伝子とすれば、標的細菌特異的な抗菌剤として本発明の形質導入ナノ粒子を利用できる。
【００４１】
以上のようにして、PACサイト保持プラスミドを保持した宿主細菌にPACサイト欠失ファージゲノムベクターが導入されると、宿主細菌内では、ファージの形成に必要な各種タンパク質がPACサイト欠失ファージゲノムベクターから発現し、PACサイト保持プラスミドがパッケージングされる。即ち、その頭部にPACサイト保持プラスミドが格納された組換えファージが形成される。形成された組換えファージはファージゲノムを欠くため、通常は溶菌が起きない。従って、宿主細菌を適切な条件下で培養し、組換えファージの形成を促した後、クロロホルム処理等によって溶菌させ、組換えファージを回収する。培養条件、回収操作等は第１の局面の場合と同様である。
【００４２】
＜形質導入ナノ粒子の用途＞
上記の通り、本発明の形質導入ナノ粒子では、ファージゲノムの代わりにPACサイト保持プラスミド（PACサイトを有し且つ目的遺伝子をコードする）が頭部に格納されている。この特徴により、宿主細菌に対して特異的な感染能を持つが再感染能を持たず（１度限りしか感染することができない）、標的細菌特異的な形質導入用ツールとして機能する。そこで本発明は、形質導入ナノ粒子を有効成分とした形質導入用組成物も提供する。上記の通り、種々の目的遺伝子を採用することができることから、本発明の形質導入用組成物は広範な用途（例えば、産業用酵素の生産、食品・飲料（特に発酵食品・発酵飲料）、医薬、工業製品（化学製品等）の製造、バイオエネルギー（例えばバイオエタノール）の生産、バイオレメデーション）に利用されうるものであり、その産業上の利用価値は極めて高い。また、上記の通り、抗菌ペプチドをコードする遺伝子又はバクテリオファージの標的細菌特異的な殺傷能力をもたらす遺伝子群を目的遺伝子とすれば、標的細菌特異的な抗菌剤として機能することになり、第１の局面の場合と同様に、医薬（治療薬又は予防薬）、消毒薬、洗浄剤、口腔組成物として利用可能となる。また、本発明の形質導入ナノ粒子は、研究（実験）用のツールとしても有用である。
【実施例】
【００４３】
組換えファージの潜在的有用性に注目し、一度限りしか感染することができない二種類の「宿主細菌特異的ナノ粒子」の開発を目指した。【００４４】
＜材料・操作＞
１．ビリオン構成遺伝子欠失ファージ（抗菌性ナノ粒子）の調製と確認
１−１．デザイナーファージゲノム（改変ファージゲノム）の設計と再構成
デザイナーファージゲノムは全てPCR断片もしくは人工合成DNA断片から再構成する。その際、各断片の5’末端と3’末端には連結する断片との相同配列を20〜40 nt付加しておく。例えば、PCRによって断片を増幅する際には、図１のようにプライマーを設計する。【００４５】
本検討では、ビリオン構成遺伝子のうち尾部遺伝子又は頭部遺伝子を欠失させた。尾部遺伝子を欠失させる場合、T7ファージの尾部遺伝子gene 11、gene 12及びgene 17を欠失したファージゲノム（尾部遺伝子欠失ファージゲノム）（配列番号７）再構成した。尾部遺伝子（gene 11、gene 12及びgene 17）が増幅されないようにプライマーを設計し（図２）、PCRでファージゲノムとベクターpTOW40836（図３）を増幅する。ベクターはファージゲノムを酵母内で保持させるのに必要となる。ファージゲノムの末端にはベクターとの相同配列を持たせる（図２）。本検討では、尾部遺伝子（gene 11、gene 12及びgene 17）を含まないように、ファージゲノムを６つに分け、６断片（5'末端側から3'末端側に向かって順に断片１、断片２、断片３、断片４、断片５、断片６と呼ぶ）をPCRで増幅させた。各断片の増幅に使用したプライマーの配列は以下の通りである。
（断片１）
フォワードプライマーの配列：CTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTCTCACAGTGTACGGACCTAAAGTTCCCCC（配列番号８）
リバースプライマーの配列：ATTACGCGATGACAGTAGACAACCTTTCCG（配列番号９）
（断片２）
フォワードプライマーの配列：TGCAGCAATACCGGAAAGGTTGTCTACTGT（配列番号１０）
リバースプライマーの配列：ATATGTCTCCTCATAGATGTGCCTATGTGG（配列番号１１）
（断片３）
フォワードプライマーの配列：ACTTGTGACTCCACATAGGCACATCTATGA（配列番号１２）
リバースプライマーの配列：AGGGAGAATATTTAAATAGTTCCTCCTTTCAGCAAAAAACCCCTC（配列番号１３）
（断片４）
フォワードプライマーの配列：GAAAGGAGGAACTATTTAAATATTCTCCCTGTGGTGGCTCG（配列番号１４）
リバースプライマーの配列：GAATAACCTGAGGGTCAATACCCTGCTTGT（配列番号１５）
（断片５）
フォワードプライマーの配列：GACATGATGGACAAGCAGGGTATTGACCCT（配列番号１６）
リバースプライマーの配列：CTTGTGATTTACCAATTGACCTCCTTAAAGTAAATCTAAGAGAC（配列番号１７）
（断片６）
フォワードプライマーの配列：CTTTAAGGAGGTCAATTGGTAAATCACAAGGAAAGACGTGTAGTC（配列番号１８）
リバースプライマーの配列：CATAATAGAAACGACACGAAATTACAAAATAGGGACACAGAGAGACACTCAAGGTAACAC（配列番号１９）【００４６】
ベクター断片の増幅に使用したプライマーの配列は以下の通りである。
フォワードプライマーの配列：ATTTTGTAATTTCGTGTCGTTTCTATTATG（配列番号２０）
リバースプライマーの配列：GGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCAAG（配列番号２１）【００４７】
頭部遺伝子を欠失したファージゲノム（頭部遺伝子欠失ファージゲノム）（配列番号２２）の再構成も同様の方法で行った（図４）。この場合には、頭部遺伝子（gene 10AB）を含まないように、ファージゲノムを５つに分け、５断片（5'末端側から3'末端側に向かって順に断片１’、断片２’、断片３’、断片４’、断片５’と呼ぶ）をPCRで増幅させた。各断片の増幅に使用したプライマーの配列は以下の通りである。
（断片１’）
フォワードプライマーの配列：CTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTCTCACAGTGTACGGACCTAAAGTTCCCCC（配列番号２３）
リバースプライマーの配列：ATTACGCGATGACAGTAGACAACCTTTCCG（配列番号２４）
（断片２’）
フォワードプライマーの配列：TGCAGCAATACCGGAAAGGTTGTCTACTGT（配列番号２５）
リバースプライマーの配列：ATATGTCTCCTCATAGATGTGCCTATGTGG（配列番号２６）
（断片３’）
フォワードプライマーの配列：ACTTGTGACTCCACATAGGCACATCTATGA（配列番号２７）
リバースプライマーの配列：GCCCCAAGGGGTTATGCTAGATTTCGAAGTCTATCAGAAGTTCGAATCGATTAC（配列番号２８）
（断片４’）
フォワードプライマーの配列：CTTCTGATAGACTTCGAAATCTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGG（配列番号２９）
リバースプライマーの配列：GAATAACCTGAGGGTCAATACCCTGCTTGT（配列番号３０）
（断片５'）
フォワードプライマーの配列：GACATGATGGACAAGCAGGGTATTGACCCT（配列番号３１）
リバースプライマーの配列：CATAATAGAAACGACACGAAATTACAAAATAGGGACACAGAGAGACACTCAAGGTAACAC（配列番号３２）【００４８】
ベクター断片の増幅には、尾部遺伝子の場合と同一のプライマーセット（配列番号２０、２１）を使用した。【００４９】
１−２．酵母コンピテントセルの作製
(1) 酵母をYPD培地5 mLで30℃、一晩培養する。
(2) YPD培地45 mLに酵母一晩培養液を全量加え、30℃で3時間培養する。
(3) 8000g、室温で15分間、遠心処理する。
(4) 培養上清を捨て、超純水25 mLに懸濁する。
(5) 8000g、室温で15分間、遠心処理する。
(6) 上清を捨て、100 mM LiAc 1mLに懸濁する。
(7) 12000g、室温で1分間、遠心処理する。
(8) 上清を捨て、100 mM LiAc 400 μLに懸濁する。これをコンピテントセルとする。【００５０】
１−３．酵母の形質転換
(1) コンピテントセル50 μLを12000g、室温で1分間、遠心処理する。
(2) 上清を捨て、以下の試薬を順に加える。
PEG3350 (50% w/v) 240 μL
1M LiAc 36 μL
ssDNA（100℃に5分、氷上に3分以上置いたもの）25 μL
DNAサンプル 50 μL（デザイナーゲノムを構成するために必要な全ての断片。尾部遺伝子欠失の場合は断片１〜６とベクターDNAをまとめたもの。頭部遺伝子欠失の場合は断片１’〜５’とベクターDNAをまとめたもの）
(3) 混合液をピペッティングで穏やかに混ぜて30℃で30分静置する。
(4) 42℃で20分静置する。
(5) 12000g、室温で1分間、遠心処理する。
(6) 上清を捨て、LB液体培地200 μLに懸濁する。
(7) 選択寒天培地に塗布する。
(8) 30℃で静置する（約3日間でコロニーが目視できる）。
使用している酵母親株は栄養要求性であり、選択培地上で生育することができない。酵母内でデザイナーゲノムが連結されベクターと繋がると、親株が必要な栄養源を供給できるようになり、選択培地上で生育が可能になる。尚、本法ではギャップリペアクローニング（Gap-repairing）を利用してデザイナーゲノムを再構成する。Gap-repairingはDNA修復機構の一部であると考えられている。Gap-repairingの機序の概要を図５に示す。【００５１】
１−４．酵母からのファージゲノム抽出
(1) 選択液体培地にファージゲノムを保持した酵母を植え、30℃で一晩培養する。
(2) 培養液2 mLを12000g、室温で2分間、遠心処理し、酵母を回収する。
(3) 培養上清を捨て、YeaStar Genomic DNA Kit（Zymo Researh）を使ってファージゲノムを抽出する。【００５２】
１−５．ビリオン構成遺伝子をコードするプラスミドの構築と大腸菌へのプラスミドの導入
ファージゲノム再構成時に除いたビリオン構成遺伝子（尾部遺伝子又は頭部遺伝子）をプラスミドベクターpBR322（図６）にクローニングした後、プラスミドベクターを大腸菌に導入し、プラスミド上にビリオン構成遺伝子を保持した大腸菌を調製する。尚、ビリオン構成遺伝子のすぐ上流にプロモーターがない場合は、PCRでプラスミドベクターにクローニングする際、プライマーにプロモーター配列を持たせる（図７）。以下、尾部遺伝子の場合と頭部遺伝子の場合の操作手順（例）を説明する。【００５３】
＜尾部遺伝子（gene 11, 12, 17）の場合＞
(1) １段階目のPCRで尾部遺伝子gene11、gene12、gene17をそれぞれ増幅し、２段階目のPCRによって各断片を連結するとともにプロモーター（TAATACGACTCACTATAGGG：配列番号３３）を付加する。各PCRに使用するプライマーの配列を以下に示す。尚、DNA断片の末端には制限酵素サイトをもたせておく。
１段階目のPCR：尾部遺伝子の増幅
（断片１）
フォワードプライマーの配列：CCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCAATGCGCTCATACGATATGAACG（配列番号３４）
リバースプライマーの配列：CGTTAGCCATTGGTATATCTCCTTCTTTTAAATACCGGAACTTCTCCG（配列番号３５）
（断片２）
フォワードプライマーの配列：CCGGTATTTAAAAGAAGGAGATATACCAATGGCTAACGTAATTAAAACCG（配列番号３６）
リバースプライマーの配列：CCCGCGGATCCTTACTCGTTCTCCACCATGATTG（配列番号３７）【００５４】
２段階目のPCR：断片の連結とプロモーターの付加
フォワードプライマーの配列：CCCGGAATTCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAG（配列番号３８）
リバースプライマーの配列：CCCGCGGATCCTTACTCGTTCTCCACCATGATTG（配列番号３９）【００５５】
(2) DNA断片（尾部遺伝子）とベクターDNAを制限酵素処理し、ライゲーションする(計5 μL)。
(3) 反応物と大腸菌ケミカルコンピテントセル45 μLを混ぜ、氷上で30分静置する。
(4) 42℃、1分間静置する。
(5) LB液体培地1 mLを加え、37℃で30分静置する。
(6) 薬剤入り寒天培地に塗布する。
プラスミドを保持する大腸菌は薬剤（耐性）マーカー（薬剤耐性遺伝子)を獲得しているため、薬剤入り寒天培地上で生育することが可能になる。【００５６】
＜頭部遺伝子（gene 10AB）の場合＞
(1) 頭部遺伝子（gene10AB）をプロモーターを含む形で増幅する。PCRに使用するプライマーの配列を以下に示す。DNA断片の末端には制限酵素サイトをもたせておく。
フォワードプライマーの配列：CCCGCGGATCCTTATTGCTCAGCGGTGGCAG（配列番号４０）
リバースプライマーの配列：CCCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAC（配列番号４１）
(2) DNA断片（頭部遺伝子）とベクターDNAを制限酵素処理し、ライゲーションする(計5 μL)。
(3) 反応物と大腸菌ケミカルコンピテントセル45 μLを混ぜ、氷上で30分静置する。
(4) 42℃、1分間静置する。
(5) LB液体培地1 mLを加え、37℃で30分静置する。
(6) 薬剤入り寒天培地に塗布する。
プラスミドを保持する大腸菌は薬剤（耐性）マーカー（薬剤耐性遺伝子)を獲得しているため、薬剤入り寒天培地上で生育することが可能になる。【００５７】
１−６．エレクトロポレーション用コンピテントセルの作製
(1) ビリオン構成遺伝子（尾部遺伝子又は頭部遺伝子）を持つ細菌を薬剤入りLB液体培地に植え、37℃で一晩培養する。
(2) 薬剤入りSOB液体培地20 mLに対して1/100倍量になるように培養液を加え、OD600 = 0.4になるまで37℃で培養する。
(3) 800g、4℃で5分間、遠心処理する。
(4) 培養上清を捨て、冷10%グリセロール10 mLに懸濁する。
(5) 800g、4℃で5分間、遠心処理する。
(6) 上清を捨て、冷10%グリセロール10 mLに懸濁する。
(7) 800g、4℃で5分間、遠心処理する。
(8) 上清を捨て、冷10%グリセロール約70 μLに懸濁する。これをエレクトロポレーション用コンピテントセルとする。【００５８】
１−７．ビリオン構成遺伝子欠失ファージの起動
(1) 抽出したビリオン構成遺伝子欠失ファージゲノム（尾部遺伝子欠失ファージゲノム又は頭部遺伝子欠失ファージゲノム）2 μLとエレクトロポレーション用コンピテントセル 20 μLを混ぜ、キュベットに入れる。
(2) エレクトロポレーション（2.5 kV、10 μF、600 Ω）。
(3) LB液体培地 500 μLをキュベットに加え、回収する。
(4) 混合液を軟寒天培地と混ぜ、LB寒天培地上に重層する。
(5) 37℃でプラーク（溶菌斑）ができるまで静置する。【００５９】
１−８．ビリオン構成遺伝子欠失ファージの確認
(1) プラークを爪楊枝もしくはチップでつついて、phage buffer 100 μLに懸濁する。
(2) ビリオン構成遺伝子（尾部遺伝子又は頭部遺伝子）を発現する細菌もしくは発現しない細菌を軟寒天培地と混ぜLB寒天培地上に重層する。そこへプラークを懸濁したphage buffer 2.5 μLを滴下して乾燥させる。
(3) 37℃でプラークができるまで静置する。
ビリオン構成遺伝子（尾部遺伝子又は頭部遺伝子）を発現する細菌ではプラークを形成し、発現しない細菌ではプラークを形成しないことを確認する。【００６０】
１−９．ビリオン構成遺伝子欠失ファージの回収
(1) 薬剤入りLB液体培地にビリオン構成遺伝子（尾部遺伝子又は頭部遺伝子）を発現する細菌を植え、37℃で一晩培養する。
(2) 薬剤入りLB液体培地 50 mLに対して1/100量の細菌培養液を添加する。
(3) 37℃でOD600 = 0.4になるまで培養する。
(4) ファージを懸濁したphage bufferを添加し、溶菌しきるまで培養する。
(5) クロロホルム1 mLを加える（残っている細菌を完全に殺す）。
(6) 12000g、4℃で5分間、遠心処理する。これにより、溶菌液とクロロホルムの層ができる。
(7) 溶菌液を0.22 μmフィルターでろ過滅菌し、ファージ液とする。【００６１】
１−１０． Killing assay（殺菌アッセイ）
(1) LB液体培地に細菌を植え、37℃で一晩培養する。
(2) LB液体培地に細菌培養液を1×106 cfu/mlになるように加えたものを5本用意し、そこにLB液体培地もしくはMOI = 1、MOI = 10、MOI = 100、MOI = 1000になるようにファージ液を加える。
(3) 37℃で培養し、2時間毎に1 mLサンプリングする。
(4) サンプルを5000g、4℃で5分間、遠心処理する。
(5) 培養上清を捨て、PBS 1 mLに懸濁する。
(6) 5000 g、4℃で5分間、遠心処理する。
(7) 上清を捨て、PBS 1 mLに懸濁する。これを原液とする。
(8) PBSで原液を10-1から10-7まで10倍段階希釈し、LB寒天培地上に2.5 μLずつ添加し、乾燥させる。
(9) 37℃で一晩静置する。
(10) 生菌数（コロニー数）を数える。【００６２】
２．形質導入ナノ粒子の調製と確認
デザイナーファージゲノムの設計と再構成、酵母コンピテントセルの作製、酵母の形質転換、酵母からのファージゲノム抽出については、ビリオン遺伝子欠失ファージの場合と同様である。ファージDNAにはパッケージング（以下、PAC）サイトと呼ばれるファージの頭部に詰め込まれるために必要な配列が存在している。その配列を除くようにプライマーを設計し、PCRで増幅する一方、ベクターpTOW40836（図３）を増幅する。本検討ではPACサイトを除いたファージゲノムを４つに分け、４断片（5'末端側から3'末端側に向かって順に断片Ｉ、断片ＩＩ、断片ＩＩＩ、断片ＩＶと呼ぶ）をPCRで増幅させた。各断片の増幅に使用したプライマーの配列は以下の通りである。
（断片Ｉ）
フォワードプライマーの配列：CTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCGTCCATCCTAAAGCCAACACCTAAAGCC（配列番号４２）
リバースプライマーの配列：ATTACGCGATGACAGTAGACAACCTTTCCG（配列番号４３）
（断片ＩＩ）
フォワードプライマーの配列：TGCAGCAATACCGGAAAGGTTGTCTACTGT（配列番号４４）
リバースプライマーの配列：ATATGTCTCCTCATAGATGTGCCTATGTGG（配列番号４５）
（断片ＩＩＩ）
フォワードプライマーの配列：ACTTGTGACTCCACATAGGCACATCTATGA（配列番号４６）
リバースプライマーの配列：GAATAACCTGAGGGTCAATACCCTGCTTGT（配列番号４７）
（断片ＩＶ）
フォワードプライマーの配列：GACATGATGGACAAGCAGGGTATTGACCCT（配列番号４８）
リバースプライマーの配列：CATAATAGAAACGACACGAAATTACAAAATTGCATAAATCACCACTCAATGAAAGACG（配列番号４９）【００６３】
ベクター断片の増幅に使用したプライマーの配列は以下の通りである。
フォワードプライマーの配列：ATTTTGTAATTTCGTGTCGTTTCTATTATG（配列番号２０）
リバースプライマーの配列：GGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCAAG（配列番号２１）【００６４】
ファージゲノムDNA断片（断片Ｉ〜ＩＶ）とベクター断片を混ぜ、超純水で50 μLにメスアップしたものを、酵母の形質転換に用いるDNAサンプルとした。酵母を形質転換し、PACサイトが欠失したファージゲノム（配列番号５０）を再構成する（図８）。【００６５】
PACサイトを持つプラスミドは、ビリオン構成遺伝子を持つプラスミドの場合と同様の方法（ビリオン構成遺伝子の代わりにPACサイトサイトをプラスミドpBR322にクローニングする）で構築する。【００６６】
ビリオン遺伝子欠失ファージの場合と同様の方法により、PACサイトを持つプラスミドを保持する細菌のエレクトロポレーション用コンピテントセルを作製し、以下の方法で形質導入ナノ粒子を起動させる。
(1) 抽出したPACサイト欠失ファージゲノム2 μLとエレクトロポレーション用コンピテントセル 20 μLを混ぜ、キュベットに入れる。
(2) エレクトロポレーション（2.5 kV、10 μF、600 Ω）。
(3) エレクトロポレーション後、PACサイト欠失ファージゲノムとコンピテントセルを入れたキュベットにLB液体培地 1mLを加え、37℃で２時間静置する。
(4) 混合液にクロロホルム 100 μLを加え、タッピングで混ぜる。
(5) 12000g、4℃で5分間、遠心処理する。これにより、混合液とクロロホルムの層ができる。
(6) 混合液を0.22 μmフィルターでろ過滅菌する。
(7) 回収した溶液を形質導入ナノ粒子液とする。
(8) 形質導入ナノ粒子液と細菌培養液を混ぜ、37℃で30分静置する。
(9) 薬剤入り寒天培地に塗布する。
プラスミドは薬剤マーカーを持つため、形質導入ナノ粒子が感染した細菌はプラスミドが注入されて、薬剤耐性を獲得する。プラスミドが注入された細菌（＝形質導入ナノ粒子が機能したもの）は薬剤入り寒天培地上で生育することができる。【００６７】
＜尾部遺伝子欠失ファージの開発＞
１．方法
ファージは、ゲノムを格納している頭部と、細菌への接着に必要な尾部から成る（図９）。尾部先端の足（尾繊維）を介して細菌表面に接着する。ファージゲノムの尾部遺伝子以外の領域及びファージゲノムの両端に対して相同配列を持ったベクターをPCRで増幅し、それらの断片を酵母内で連結し、人工ファージゲノム（配列番号７）を構築した（図１０）。尚、この実験ではギャップリペアクローニングを利用して人工ファージゲノムを構築したが、ギブソンアッセンブリーによっても人工ファージゲノムの構築に成功している。【００６８】
酵母からファージゲノムを抽出し、尾部遺伝子をコードするプラスミドを保持した大腸菌にファージゲノムを導入した（図１０）。尾部以外のファージ構成タンパク質はファージゲノムから、尾部はプラスミドから発現し、大腸菌内で「表現型としては尾部を持ち、遺伝子型として尾部を持たない」ファージが形成される。最終的に大腸菌は溶菌し、尾部遺伝子が欠失したファージが放出される（図１０）。このファージから産み出される子孫ファージは尾部を持たないため、再感染することができない。【００６９】
２．結果（尾部遺伝子欠失ファージの殺菌効果）
大腸菌を1 mLあたり1×106になるように調製し、大腸菌数に対して1、10、100、1000倍（MOI = 1、10、100、1000）の数の尾部遺伝子欠失ファージを加えて、経時的に大腸菌の生菌数を測定した（Killing assay）。大腸菌と同程度の尾部遺伝子欠失ファージを加えること（MOI = 1）で生育の阻害が見られ、MOI = 10、100、1000では大腸菌の生菌数が顕著に減少した（図１１）。また、各サンプルをそのまま培養し続け、そこから新たなファージが産生されるかどうかを確認した（プラーク形成アッセイ）。大腸菌とファージを軟寒天と混合して寒天培地に重層し、培養を続けると図１２の「WT」のように、溶菌斑（プラーク）と呼ばれる透明な斑点が形成される。これは、ファージが細菌に感染して溶菌させることで生じる。各培養液を大腸菌と混ぜても溶菌斑はみられなかった。これは、少なくとも本実験系において再感染できるファージが産生されていない可能性を強く示唆するものである。尚、頭部遺伝子欠失ファージも作製し（作製方法については上記参照）、同様の実験結果が得られた。【００７０】
＜形質導入ナノ粒子の開発＞
１．方法
ファージゲノムが頭部に格納されることをパッケージングという。ファージゲノム上にはパッケージング（PAC）サイトと呼ばれる配列があり、これが認識されることでファージゲノムは頭部に格納される。ファージゲノム上のPACサイトを欠失し、プラスミド上にPACサイトを持たせることで、ファージゲノムの代わりに任意のプラスミドをパッケージングできる形質導入ナノ粒子を開発した。上述の尾部遺伝子欠失ファージの開発方法同様、PACサイト以外の領域及びベクターをPCRで増幅し、酵母内で連結することでPACサイトが欠失したファージゲノム（配列番号５０）を構築した。次に、酵母からPACサイトが欠失したファージゲノムを抽出し、PACサイトを持つプラスミドを保持した大腸菌にこれを導入した。ファージ形成時、ファージゲノムにはPACサイトが存在しないためファージゲノムはパッケージングされず、代わりにPACサイトを持つプラスミドがパッケージングされる（図１３）。このナノ粒子が細菌に感染しても、プラスミドを導入するだけで殺菌効果はない。また、ファージゲノムを持っていないので子孫ファージも形成されない。【００７１】
２．結果（形質導入ナノ粒子の形質導入効率）
PACサイト保持プラスミドに抗生物質耐性遺伝子及びβ-ガラクトシダーゼをコードするlacZ遺伝子を挿入し、形質導入ナノ粒子にパッケージングさせた。β-ガラクトシダーゼはβ-ガラクトシドを加水分解し、ガラクトースを産生する酵素である。この酵素を持つ細菌をX-galと呼ばれる試薬を含む培地上で生育させるとコロニーが青くなる。lacZ遺伝子を持たない大腸菌と形質導入ナノ粒子10 μLを混合し、抗生物質及びX-galを含む寒天培地上に塗布した結果（図１４）、形質導入ナノ粒子を感染させた大腸菌を塗布したプレート（右上のプレート）からは青いコロニーが観察された。大腸菌のみ（左下のプレート）、もしくは形質導入ナノ粒子100 μLのみ（右下のプレート）を寒天培地上に塗布してもコロニーは形成されなかったことから、形質導入ナノ粒子を感染させた大腸菌を塗布したプレートに見られた青色大腸菌は、形質導入ナノ粒子によって抗生物質遺伝子とlacZ遺伝子を獲得したと考えられる。また野生型のファージが含まれている可能性を考え、プラーク形成アッセイを行ったが、プラークは形成されなかった（左上のプレート）。コロニー数から計算すると、形質導入効率は約4.2×105/Lであった。【００７２】
＜まとめ＞
二種類の「宿主細菌特異的ナノ粒子」を開発した。一つは殺菌能力を持つナノ粒子、もう一つは形質導入能力を持つナノ粒子として機能する。本手法は原理的にはあらゆるファージに応用できるはずである。ファージセラピーや細菌叢編集への利用、遺伝学的手法が確立していない細菌に対するツールとしての利用などが想定される。また、一回限りの感染であり、実験室レベルでは100%の生物学的封じ込めに成功している。【００７３】
＜生物学的封じ込めの検証＞
ビリオン構成遺伝子欠失ファージ（頭部遺伝子欠失ファージと尾部遺伝子欠失ファージ）の生物学的封じ込めについて検証した。【００７４】
１．プラーク形成アッセイ
大腸菌株BW25113を寒天培地に塗布した後、ファージ溶液（頭部遺伝子欠失ファージ（図１５Ａの上段）又は尾部遺伝子欠失ファージ（図１５Ａの下段）を含有する）を添加し、培養した。コントロールには野生型ファージのファージ溶液を使用した。野生型のファージの場合（図１５Ｂの左側（BW25113）のT7の列）と対照的に頭部遺伝子欠失ファージ（図１５Ｂの左側（BW25113）のT7Δ10の列）と尾部遺伝子欠失ファージ（図１５Ｂの左側（BW25113）のT7Δtailの列）ではプラークの形成が認められず、封じ込めに成功している。同じ大腸菌株に頭部遺伝子を発現させた場合（図１５Ｂの右側（BW25113/pBR-T7-g10）のT7Δ10の列）又は尾部遺伝子を発現させた場合（図１５Ｂの右側（BW25113/pBR-T7-g11-12-17）のT7Δtailの列）には、封じ込めファージ（頭部遺伝子欠失ファージと尾部遺伝子欠失ファージ）でも子孫ファージを作ることができ、プラークを形成する。【００７５】
２．lysis from without現象
lysis from withoutは大過剰量のファージを感染させたときに子孫ファージ産生の有無に関わらず宿主細菌が死滅する現象であり、個々のプラークが観察されないのが特徴である。大腸菌株BW25113を寒天培地に塗布した後、ファージ溶液（頭部遺伝子欠失ファージ）を添加し、培養した。コントロールには野生型ファージのファージ溶液を使用した。頭部遺伝子欠失ファージでは封じ込めによって子孫ファージを作ることができず、プラークを形成できない（図１６左のプレートのBSPの列）。頭部遺伝子を発現させた場合、頭部遺伝子欠失ファージでも子孫ファージを作ることができ、プラークを形成する（図１６右のプレートのBSPの列）。【００７６】
３．頭部遺伝子欠失ファージと尾部遺伝子欠失ファージの殺菌作用
大腸菌BW25113の溶液に頭部遺伝子欠失ファージ又は尾部遺伝子欠失ファージを添加した後、６時間培養し、殺菌作用を評価した。殺菌作用のある野生型ファージ（T7）（図１７の（２））と同様に、頭部遺伝子欠失ファージと尾部遺伝子欠失ファージは殺菌作用を示した（図１７の（３）、（４））。【００７７】
４．増殖性
大腸菌株BW25113を寒天培地に塗布した後、ファージ溶液（頭部遺伝子欠失ファージ）を各濃度で添加した。２４時間培養を継続した後、プラークの形成の有無を観察した。MOI=100（大過剰量のファージを添加）でもプラークは観察されなかった（図１８）。即ち、封じ込め策を施したファージ（頭部遺伝子欠失ファージ）は増殖性を獲得しておらず、一度限りの感染で終わっている（即ち、生物学的封じ込めに成功している）。【００７８】
５．in vivoでの有効性の検証
マウスBJ6にサルモネラLT2を0.8〜1.4×105cfuで接種後、SP6又は頭部遺伝子欠失ファージを2.5〜5.0×107pfuで投与し、生存率を比較・評価した。SP6と頭部遺伝子欠失ファージのいずれも投与しないものをコントロール（非治療群）とした。非治療群に比べ、頭部遺伝子欠失ファージ投与群（BSP）の生存率は有意に高く、SP6投与群（SP6）の生存率を凌駕した（図１９）。一方、頭部遺伝子欠失ファージ投与群のマウスの血液と脾臓にはファージが検出されず、100％の生物学的封じ込めに成功していた。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明が提供する組換えファージは増殖能が奪われ、一度限りしか感染できない。この特徴によって高い安全性が担保されることから、臨床応用を含め、様々な用途への利用に適する。本発明の組換えファージの内、ファージゲノム（但し、ビリオン構成遺伝子の一部を欠失している）を頭部に格納し、殺菌能力を示すものについては、特にファージセラピーへの利用が期待される。一方、ファージゲノムに代えて特定のプラスミドが頭部に格納されることになる組換えファージは、遺伝子導入ツールとして例えば薬剤耐性細菌の薬剤感受性の改変、産業用酵素生産細菌の生産性向上、食品・飲料（特に発酵食品、発酵飲料）、医薬又は工業製品（化学製品等）の製造やバイオエネルギー（例えばバイオエタノール）の生産、バイオレメデーションに利用される細菌の能力（処理能力、製造／生産能力等）の向上等、広範な用途への利用・応用を期待できる。【００８０】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【配列表フリーテキスト】
【００８１】
配列番号７：人工配列の説明：尾部遺伝子欠失ファージゲノム
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配列番号２１：人工配列の説明：リバースプライマー
配列番号２２：人工配列の説明：頭部遺伝子欠失ファージゲノム
配列番号２３：人工配列の説明：フォワードプライマー
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配列番号２５：人工配列の説明：フォワードプライマー
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配列番号３０：人工配列の説明：リバースプライマー
配列番号３１：人工配列の説明：フォワードプライマー
配列番号３２：人工配列の説明：リバースプライマー
配列番号３３：人工配列の説明：プロモーター
配列番号３４：人工配列の説明：フォワードプライマー
配列番号３５：人工配列の説明：リバースプライマー
配列番号３６：人工配列の説明：フォワードプライマー
配列番号３７：人工配列の説明：リバースプライマー
配列番号３８：人工配列の説明：フォワードプライマー
配列番号３９：人工配列の説明：リバースプライマー
配列番号４０：人工配列の説明：リバースプライマー
配列番号４１人工配列の説明：フォワードプライマー
配列番号４２：人工配列の説明：リバースプライマー
配列番号４３：人工配列の説明：フォワードプライマー
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配列番号４８：人工配列の説明：フォワードプライマー
配列番号４９：人工配列の説明：リバースプライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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