(57)【要約】  本発明は、ＧＲＥＭ２遺伝子の発現レベルを指標とすることを特徴とする、毛包由来の細胞群における毛球部毛根鞘細胞（ＤＳＣＣ）の同定方法を提供する。また、本発明は、毛包由来の細胞群を含有する、毛包を再生するための組成物の評価方法であって、ＧＲＥＭ２遺伝子の発現レベルを指標として、前記毛包由来の細胞群における毛球部毛根鞘細胞（ＤＳＣＣ）の割合及び／又は活性を決定することを特徴とする、方法を提供する。
2019176881.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＲＥＭ２遺伝子の発現レベルを指標とすることを特徴とする、毛包由来の細胞群における毛球部毛根鞘細胞（ＤＳＣＣ）の同定方法。
【請求項２】
さらに、ＡＳＰＮ遺伝子、ＭＭＰ１１遺伝子、ＰＴＧＥＲ３遺伝子、ＲＢＰ４遺伝子、ＴＬＥ４遺伝子、ＧＲＥＭ１遺伝子、ＤＣＮ遺伝子、ＰＤＧＦＲＬ遺伝子、ＡＣＫＲ１遺伝子、ＨＡＰＬＮ１遺伝子、ＤＣＤ遺伝子、ＳＣＧＢ１Ｄ２遺伝子、ＡＣＴＡ２遺伝子、ＰＬＩＮ４遺伝子、ＤＯＫ６遺伝子、ＥＮＰＰ４遺伝子、ＩＬ１５遺伝子、ＣＣＤＣ８０遺伝子、ＴＮＸＢ遺伝子、ＦＢＬＮ２遺伝子、ＤＬＥＣ１遺伝子、ＬＲＲＣ１７遺伝子、ＺＮＦ７９１遺伝子、ＣＮＩＨ３遺伝子、ＰＲＲ１５Ｌ遺伝子、ＤＣＡＦ４遺伝子、ＧＹＬＴＬ１Ｂ遺伝子、ＬＯＣ１４２９３７遺伝子、ＢＰＩＦＣ遺伝子、ＡＮＯ２遺伝子、ＩＦＩ４４Ｌ遺伝子及びＰＣＳＫ７遺伝子からなる群から１つ以上選択される遺伝子の発現レベルを指標とすることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記毛包由来の細胞群が、インビトロで培養された毛包由来の細胞群である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記毛包由来の細胞群が、１回以上継代された毛包由来の細胞群である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
毛包由来の細胞群を含有する、毛包を再生するための組成物の評価方法であって、
ＧＲＥＭ２遺伝子の発現レベルを指標として、前記毛包由来の細胞群における毛球部毛根鞘細胞（ＤＳＣＣ）の割合及び／又は活性を決定することを特徴とする、方法。
【請求項６】
さらに、ＡＳＰＮ遺伝子、ＭＭＰ１１遺伝子、ＰＴＧＥＲ３遺伝子、ＲＢＰ４遺伝子、ＴＬＥ４遺伝子、ＧＲＥＭ１遺伝子、ＤＣＮ遺伝子、ＰＤＧＦＲＬ遺伝子、ＡＣＫＲ１遺伝子、ＨＡＰＬＮ１遺伝子、ＤＣＤ遺伝子、ＳＣＧＢ１Ｄ２遺伝子、ＡＣＴＡ２遺伝子、ＰＬＩＮ４遺伝子、ＤＯＫ６遺伝子、ＥＮＰＰ４遺伝子、ＩＬ１５遺伝子、ＣＣＤＣ８０遺伝子、ＴＮＸＢ遺伝子、ＦＢＬＮ２遺伝子、ＤＬＥＣ１遺伝子、ＬＲＲＣ１７遺伝子、ＺＮＦ７９１遺伝子、ＣＮＩＨ３遺伝子、ＰＲＲ１５Ｌ遺伝子、ＤＣＡＦ４遺伝子、ＧＹＬＴＬ１Ｂ遺伝子、ＬＯＣ１４２９３７遺伝子、ＢＰＩＦＣ遺伝子、ＡＮＯ２遺伝子、ＩＦＩ４４Ｌ遺伝子及びＰＣＳＫ７遺伝子からなる群から１つ以上選択される遺伝子の発現レベルを指標とすることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記毛包由来の細胞群が、インビトロで培養された毛包由来の細胞群である、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記毛包由来の細胞群が、１回以上継代された毛包由来の細胞群である、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、毛包由来の細胞群における毛球部毛根鞘細胞（ＤＳＣＣ）の同定方法に関する。また、本発明は、毛包由来の細胞群を含有する、毛包を再生するための組成物の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
毛髪は皮膚に存在する毛包によって産生される。毛包とは、毛を取り囲む組織層であり、外胚葉由来の毛母（毛母細胞）、内毛根鞘、外毛根鞘や、中胚葉由来の真皮毛根鞘、毛乳頭などから構成されている。毛乳頭を取り囲む毛母細胞が、毛乳頭から供給される栄養やタンパク質によって誘導されて分裂を繰り返し、角質化することによって毛を形成する。【０００３】
毛髪の発育に問題が生じることで薄毛・脱毛症が生じる。薄毛・脱毛症には、壮年性脱毛症、円形脱毛症、休止期脱毛症などがあり、最も頻度が多いのが壮年性脱毛症である。壮年性脱毛症は、男性において、主に男性ホルモンの影響によって引き起こされるものであり、男性型脱毛症とも呼ばれる。毛は、成長期、退行期及び休止期からなるヘアサイクルを繰り返しながら生え替わる。男性型脱毛症は、このヘアサイクルの中でも成長期が短くなり、細く短い毛髪の割合が増えることで引き起こされる症状である。【０００４】
現在、壮年性脱毛症の治療として、外用剤のミノキシジルや、経口薬のフィナステリドが主に用いられている。これらの治療法は、いずれも有効性や安全性が確認されているが、必ずしも全ての壮年性脱毛症に有効というわけではない。【０００５】
その他、壮年性脱毛症の治療として、自家植毛術が実施されている。自家植毛術とは、側頭部や後頭部から採取した毛根を含む毛髪を、自己の脱毛部に移植する術式である。しかしながら、当該術式は、自己の毛髪を別の場所へ植え替える術式であるため、毛髪の総数を増やすものではない。【０００６】
近年、様々な疾患に対する再生医療技術が開発されており、毛髪再生分野においても新たな技術が研究開発されている。例えば、毛包の中でも、毛包の再外層に位置する真皮毛根鞘、特に毛球部の底部に位置する毛球部毛根鞘（ｄｅｒｍａｌ  ｓｈｅａｔｈ  ｃｕｐ  ｃｅｌｌ：ＤＳＣ）には高い毛包誘導能力を有することが示唆されており、ＤＳＣＣを移植した実験では発毛が認められたことが報告されている（非特許文献１、２）。また、ＤＳＣＣが、発毛において重要な役割を有する毛乳頭（Ｄｅｒｍａｌ  ｐａｐｉｌｌａ：ＤＰ）細胞の前駆細胞であることも示されており、ＤＳＣＣに注目が集まっている（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｊａｈｏｄａ  ＣＡ，，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈａｉｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｂｙ  ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｄｅｒｍａｌ  ｐａｐｉｌｌａ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  １９８４；３１１：５６０−５６２．
【非特許文献２】ＭｃＥｌｗｅｅ  ＫＪ，，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｐｅｒｉｂｕｌｂａｒ  ｄｅｒｍａｌ  ｓｈｅａｔｈ  ｃｅｌｌｓ  ｃａｎ  ｉｎｄｕｃｅ  ｈａｉｒ  ｆｏｌｌｉｃｌｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｄｅｒｍａｌ  ｓｈｅａｔｈ  ａｎｄ  ｄｅｒｍａｌ  ｐａｐｉｌｌａ．Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２００３；１２１：１２６７−１２７５．
【非特許文献３】Ｒａｈｍａｎｉ  Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｉｒ  ｆｏｌｌｉｃｌｅ  ｄｅｒｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｔｈｅ  ｄｅｒｍａｌ  ｓｈｅａｔｈ，ｒｅｐｏｐｕｌａｔｅ  ｔｈｅ  ｄｅｒｍａｌ  ｐａｐｉｌｌａ，ａｎｄ  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｈａｉｒ  ｔｙｐｅ．Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ．２０１４  Ｄｅｃ．８；３１（５）：５４３−５８．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
毛髪再生の分野において毛包由来の細胞群を用いた治療法が開発されつつあるが、毛包の誘導能力が有する毛球部毛根鞘細胞は、現在のところ目視にて毛球部周辺底部の細胞を採取するしか方法がなく、特異的なマーカーは知られていなかった。また、採取された細胞に毛球部毛根鞘細胞以外の細胞がどれくらい混入しているかを評価することができなかった。また、採取した毛球部毛根鞘細胞をインビトロで培養後、その性質を維持した細胞がどのくらい残存しているかを評価することができなかった。【０００９】
したがって、本発明は、毛包由来の細胞群、特に毛球部毛根鞘細胞において特異的に発現するマーカー遺伝子を明らかにするとともに、当該遺伝子の発現レベルを指標とした、毛球部毛根鞘細胞を同定する方法を提供することを目的とする。また、毛包由来の細胞群を含有する、毛包を再生するための組成物の評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らが鋭意研究を行った結果、毛球部毛根鞘細胞において発現する遺伝子を見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。【００１１】
［１］  ＧＲＥＭ２遺伝子の発現レベルを指標とすることを特徴とする、毛包由来の細胞群における毛球部毛根鞘細胞（ＤＳＣＣ）の同定方法。
［２］  さらに、ＡＳＰＮ遺伝子、ＭＭＰ１１遺伝子、ＰＴＧＥＲ３遺伝子、ＲＢＰ４遺伝子、ＴＬＥ４遺伝子、ＧＲＥＭ１遺伝子、ＤＣＮ遺伝子、ＰＤＧＦＲＬ遺伝子、ＡＣＫＲ１遺伝子、ＨＡＰＬＮ１遺伝子、ＤＣＤ遺伝子、ＳＣＧＢ１Ｄ２遺伝子、ＡＣＴＡ２遺伝子、ＰＬＩＮ４遺伝子、ＤＯＫ６遺伝子、ＥＮＰＰ４遺伝子、ＩＬ１５遺伝子、ＣＣＤＣ８０遺伝子、ＴＮＸＢ遺伝子、ＦＢＬＮ２遺伝子、ＤＬＥＣ１遺伝子、ＬＲＲＣ１７遺伝子、ＺＮＦ７９１遺伝子、ＣＮＩＨ３遺伝子、ＰＲＲ１５Ｌ遺伝子、ＤＣＡＦ４遺伝子、ＧＹＬＴＬ１Ｂ遺伝子、ＬＯＣ１４２９３７遺伝子、ＢＰＩＦＣ遺伝子、ＡＮＯ２遺伝子、ＩＦＩ４４Ｌ遺伝子及びＰＣＳＫ７遺伝子からなる群から１つ以上選択される遺伝子の発現レベルを指標とすることを特徴とする、［１］に記載の方法。
［３］  前記毛包由来の細胞群が、インビトロで培養された毛包由来の細胞群である、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］  前記毛包由来の細胞群が、１回以上継代された毛包由来の細胞群である、［３］に記載の方法。
［５］  毛包由来の細胞群を含有する、毛包を再生するための組成物の評価方法であって、
ＧＲＥＭ２遺伝子の発現レベルを指標として、前記毛包由来の細胞群における毛球部毛根鞘細胞（ＤＳＣＣ）の割合及び／又は活性を決定することを特徴とする、方法。
［６］  さらに、ＡＳＰＮ遺伝子、ＭＭＰ１１遺伝子、ＰＴＧＥＲ３遺伝子、ＲＢＰ４遺伝子、ＴＬＥ４遺伝子、ＧＲＥＭ１遺伝子、ＤＣＮ遺伝子、ＰＤＧＦＲＬ遺伝子、ＡＣＫＲ１遺伝子、ＨＡＰＬＮ１遺伝子、ＤＣＤ遺伝子、ＳＣＧＢ１Ｄ２遺伝子、ＡＣＴＡ２遺伝子、ＰＬＩＮ４遺伝子、ＤＯＫ６遺伝子、ＥＮＰＰ４遺伝子、ＩＬ１５遺伝子、ＣＣＤＣ８０遺伝子、ＴＮＸＢ遺伝子、ＦＢＬＮ２遺伝子、ＤＬＥＣ１遺伝子、ＬＲＲＣ１７遺伝子、ＺＮＦ７９１遺伝子、ＣＮＩＨ３遺伝子、ＰＲＲ１５Ｌ遺伝子、ＤＣＡＦ４遺伝子、ＧＹＬＴＬ１Ｂ遺伝子、ＬＯＣ１４２９３７遺伝子、ＢＰＩＦＣ遺伝子、ＡＮＯ２遺伝子、ＩＦＩ４４Ｌ遺伝子及びＰＣＳＫ７遺伝子からなる群から１つ以上選択される遺伝子の発現レベルを指標とすることを特徴とする、［５］に記載の方法。
［７］  前記毛包由来の細胞群が、インビトロで培養された毛包由来の細胞群である、［５］又は［６］に記載の方法。
［８］  前記毛包由来の細胞群が、１回以上継代された毛包由来の細胞群である、［７］に記載の方法。【００１２】
［９］  ＡＳＰＮ遺伝子の発現レベルを指標とすることを特徴とする、毛包由来の細胞群における毛球部毛根鞘細胞（ＤＳＣＣ）の同定方法。
［１０］  さらに、ＧＲＥＭ２遺伝子、ＭＭＰ１１遺伝子、ＰＴＧＥＲ３遺伝子、ＲＢＰ４遺伝子、ＴＬＥ４遺伝子、ＧＲＥＭ１遺伝子、ＤＣＮ遺伝子、ＰＤＧＦＲＬ遺伝子、ＡＣＫＲ１遺伝子、ＨＡＰＬＮ１遺伝子、ＤＣＤ遺伝子、ＳＣＧＢ１Ｄ２遺伝子、ＡＣＴＡ２遺伝子、ＰＬＩＮ４遺伝子、ＤＯＫ６遺伝子、ＥＮＰＰ４遺伝子、ＩＬ１５遺伝子、ＣＣＤＣ８０遺伝子、ＴＮＸＢ遺伝子、ＦＢＬＮ２遺伝子、ＤＬＥＣ１遺伝子、ＬＲＲＣ１７遺伝子、ＺＮＦ７９１遺伝子、ＣＮＩＨ３遺伝子、ＰＲＲ１５Ｌ遺伝子、ＤＣＡＦ４遺伝子、ＧＹＬＴＬ１Ｂ遺伝子、ＬＯＣ１４２９３７遺伝子、ＢＰＩＦＣ遺伝子、ＡＮＯ２遺伝子、ＩＦＩ４４Ｌ遺伝子及びＰＣＳＫ７遺伝子からなる群から１つ以上選択される遺伝子の発現レベルを指標とすることを特徴とする、［９］に記載の方法。
［１１］  前記毛包由来の細胞群が、インビトロで培養された毛包由来の細胞群である、［９］又は［１０］に記載の方法。
［１２］  前記毛包由来の細胞群が、１回以上継代された毛包由来の細胞群である、［１１］に記載の方法。
［１３］  毛包由来の細胞群を含有する、毛包を再生するための組成物の評価方法であって、
ＡＳＰＮ遺伝子の発現レベルを指標として、前記毛包由来の細胞群における毛球部毛根鞘細胞（ＤＳＣＣ）の割合及び／又は活性を決定することを特徴とする、方法。
［１４］  さらに、ＧＲＥＭ２遺伝子、ＭＭＰ１１遺伝子、ＰＴＧＥＲ３遺伝子、ＲＢＰ４遺伝子、ＴＬＥ４遺伝子、ＧＲＥＭ１遺伝子、ＤＣＮ遺伝子、ＰＤＧＦＲＬ遺伝子、ＡＣＫＲ１遺伝子、ＨＡＰＬＮ１遺伝子、ＤＣＤ遺伝子、ＳＣＧＢ１Ｄ２遺伝子、ＡＣＴＡ２遺伝子、ＰＬＩＮ４遺伝子、ＤＯＫ６遺伝子、ＥＮＰＰ４遺伝子、ＩＬ１５遺伝子、ＣＣＤＣ８０遺伝子、ＴＮＸＢ遺伝子、ＦＢＬＮ２遺伝子、ＤＬＥＣ１遺伝子、ＬＲＲＣ１７遺伝子、ＺＮＦ７９１遺伝子、ＣＮＩＨ３遺伝子、ＰＲＲ１５Ｌ遺伝子、ＤＣＡＦ４遺伝子、ＧＹＬＴＬ１Ｂ遺伝子、ＬＯＣ１４２９３７遺伝子、ＢＰＩＦＣ遺伝子、ＡＮＯ２遺伝子、ＩＦＩ４４Ｌ遺伝子及びＰＣＳＫ７遺伝子からなる群から１つ以上選択される遺伝子の発現レベルを指標とすることを特徴とする、［１３］に記載の方法。
［１５］  前記毛包由来の細胞群が、インビトロで培養された毛包由来の細胞群である、［１３］又は［１４］に記載の方法。
［１６］  前記毛包由来の細胞群が、１回以上継代された毛包由来の細胞群である、［１５］に記載の方法。【００１３】
［１７］  ＭＭＰ１１遺伝子の発現レベルを指標とすることを特徴とする、毛包由来の細胞群における毛球部毛根鞘細胞（ＤＳＣＣ）の同定方法。
［１８］  さらに、ＧＲＥＭ２遺伝子、ＡＳＰＮ遺伝子、ＰＴＧＥＲ３遺伝子、ＲＢＰ４遺伝子、ＴＬＥ４遺伝子、ＧＲＥＭ１遺伝子、ＤＣＮ遺伝子、ＰＤＧＦＲＬ遺伝子、ＡＣＫＲ１遺伝子、ＨＡＰＬＮ１遺伝子、ＤＣＤ遺伝子、ＳＣＧＢ１Ｄ２遺伝子、ＡＣＴＡ２遺伝子、ＰＬＩＮ４遺伝子、ＤＯＫ６遺伝子、ＥＮＰＰ４遺伝子、ＩＬ１５遺伝子、ＣＣＤＣ８０遺伝子、ＴＮＸＢ遺伝子、ＦＢＬＮ２遺伝子、ＤＬＥＣ１遺伝子、ＬＲＲＣ１７遺伝子、ＺＮＦ７９１遺伝子、ＣＮＩＨ３遺伝子、ＰＲＲ１５Ｌ遺伝子、ＤＣＡＦ４遺伝子、ＧＹＬＴＬ１Ｂ遺伝子、ＬＯＣ１４２９３７遺伝子、ＢＰＩＦＣ遺伝子、ＡＮＯ２遺伝子、ＩＦＩ４４Ｌ遺伝子及びＰＣＳＫ７遺伝子からなる群から１つ以上選択される遺伝子の発現レベルを指標とすることを特徴とする、［１７］に記載の方法。
［１９］  前記毛包由来の細胞群が、インビトロで培養された毛包由来の細胞群である、［１７］又は［１８］に記載の方法。
［２０］  前記毛包由来の細胞群が、１回以上継代された毛包由来の細胞群である、［１９］に記載の方法。
［２１］  毛包由来の細胞群を含有する、毛包を再生するための組成物の評価方法であって、
ＭＭＰ１１遺伝子の発現レベルを指標として、前記毛包由来の細胞群における毛球部毛根鞘細胞（ＤＳＣＣ）の割合及び／又は活性を決定することを特徴とする、方法。
［２２］  さらに、ＧＲＥＭ２遺伝子、ＡＳＰＮ遺伝子、ＰＴＧＥＲ３遺伝子、ＲＢＰ４遺伝子、ＴＬＥ４遺伝子、ＧＲＥＭ１遺伝子、ＤＣＮ遺伝子、ＰＤＧＦＲＬ遺伝子、ＡＣＫＲ１遺伝子、ＨＡＰＬＮ１遺伝子、ＤＣＤ遺伝子、ＳＣＧＢ１Ｄ２遺伝子、ＡＣＴＡ２遺伝子、ＰＬＩＮ４遺伝子、ＤＯＫ６遺伝子、ＥＮＰＰ４遺伝子、ＩＬ１５遺伝子、ＣＣＤＣ８０遺伝子、ＴＮＸＢ遺伝子、ＦＢＬＮ２遺伝子、ＤＬＥＣ１遺伝子、ＬＲＲＣ１７遺伝子、ＺＮＦ７９１遺伝子、ＣＮＩＨ３遺伝子、ＰＲＲ１５Ｌ遺伝子、ＤＣＡＦ４遺伝子、ＧＹＬＴＬ１Ｂ遺伝子、ＬＯＣ１４２９３７遺伝子、ＢＰＩＦＣ遺伝子、ＡＮＯ２遺伝子、ＩＦＩ４４Ｌ遺伝子及びＰＣＳＫ７遺伝子からなる群から１つ以上選択される遺伝子の発現レベルを指標とすることを特徴とする、［２１］に記載の方法。
［２３］  前記毛包由来の細胞群が、インビトロで培養された毛包由来の細胞群である、［２１］又は［２２］に記載の方法。
［２４］  前記毛包由来の細胞群が、１回以上継代された毛包由来の細胞群である、［２３］に記載の方法。【００１４】
［２５］  ＰＴＧＥＲ３遺伝子の発現レベルを指標とすることを特徴とする、毛包由来の細胞群における毛球部毛根鞘細胞（ＤＳＣＣ）の同定方法。
［２６］  さらに、ＧＲＥＭ２遺伝子、ＡＳＰＮ遺伝子、ＭＭＰ１１遺伝子、ＲＢＰ４遺伝子、ＴＬＥ４遺伝子、ＧＲＥＭ１遺伝子、ＤＣＮ遺伝子、ＰＤＧＦＲＬ遺伝子、ＡＣＫＲ１遺伝子、ＨＡＰＬＮ１遺伝子、ＤＣＤ遺伝子、ＳＣＧＢ１Ｄ２遺伝子、ＡＣＴＡ２遺伝子、ＰＬＩＮ４遺伝子、ＤＯＫ６遺伝子、ＥＮＰＰ４遺伝子、ＩＬ１５遺伝子、ＣＣＤＣ８０遺伝子、ＴＮＸＢ遺伝子、ＦＢＬＮ２遺伝子、ＤＬＥＣ１遺伝子、ＬＲＲＣ１７遺伝子、ＺＮＦ７９１遺伝子、ＣＮＩＨ３遺伝子、ＰＲＲ１５Ｌ遺伝子、ＤＣＡＦ４遺伝子、ＧＹＬＴＬ１Ｂ遺伝子、ＬＯＣ１４２９３７遺伝子、ＢＰＩＦＣ遺伝子、ＡＮＯ２遺伝子、ＩＦＩ４４Ｌ遺伝子及びＰＣＳＫ７遺伝子からなる群から１つ以上選択される遺伝子の発現レベルを指標とすることを特徴とする、［２５］に記載の方法。
［２７］  前記毛包由来の細胞群が、インビトロで培養された毛包由来の細胞群である、［２５］又は［２６］に記載の方法。
［２８］  前記毛包由来の細胞群が、１回以上継代された毛包由来の細胞群である、［２７］に記載の方法。
［２９］  毛包由来の細胞群を含有する、毛包を再生するための組成物の評価方法であって、
ＰＴＧＥＲ３遺伝子の発現レベルを指標として、前記毛包由来の細胞群における毛球部毛根鞘細胞（ＤＳＣＣ）の割合及び／又は活性を決定することを特徴とする、方法。
［３０］  さらに、ＧＲＥＭ２遺伝子、ＡＳＰＮ遺伝子、ＭＭＰ１１遺伝子、ＲＢＰ４遺伝子、ＴＬＥ４遺伝子、ＧＲＥＭ１遺伝子、ＤＣＮ遺伝子、ＰＤＧＦＲＬ遺伝子、ＡＣＫＲ１遺伝子、ＨＡＰＬＮ１遺伝子、ＤＣＤ遺伝子、ＳＣＧＢ１Ｄ２遺伝子、ＡＣＴＡ２遺伝子、ＰＬＩＮ４遺伝子、ＤＯＫ６遺伝子、ＥＮＰＰ４遺伝子、ＩＬ１５遺伝子、ＣＣＤＣ８０遺伝子、ＴＮＸＢ遺伝子、ＦＢＬＮ２遺伝子、ＤＬＥＣ１遺伝子、ＬＲＲＣ１７遺伝子、ＺＮＦ７９１遺伝子、ＣＮＩＨ３遺伝子、ＰＲＲ１５Ｌ遺伝子、ＤＣＡＦ４遺伝子、ＧＹＬＴＬ１Ｂ遺伝子、ＬＯＣ１４２９３７遺伝子、ＢＰＩＦＣ遺伝子、ＡＮＯ２遺伝子、ＩＦＩ４４Ｌ遺伝子及びＰＣＳＫ７遺伝子からなる群から１つ以上選択される遺伝子の発現レベルを指標とすることを特徴とする、［２９］に記載の方法。
［３１］  前記毛包由来の細胞群が、インビトロで培養された毛包由来の細胞群である、［２９］又は［３０］に記載の方法。
［３２］  前記毛包由来の細胞群が、１回以上継代された毛包由来の細胞群である、［３１］に記載の方法。【００１５】
［３３］  ＲＢＰ４遺伝子の発現レベルを指標とすることを特徴とする、毛包由来の細胞群における毛球部毛根鞘細胞（ＤＳＣＣ）の同定方法。
［３４］  さらに、ＧＲＥＭ２遺伝子、ＡＳＰＮ遺伝子、ＭＭＰ１１遺伝子、ＰＴＧＥＲ３遺伝子、ＴＬＥ４遺伝子、ＧＲＥＭ１遺伝子、ＤＣＮ遺伝子、ＰＤＧＦＲＬ遺伝子、ＡＣＫＲ１遺伝子、ＨＡＰＬＮ１遺伝子、ＤＣＤ遺伝子、ＳＣＧＢ１Ｄ２遺伝子、ＡＣＴＡ２遺伝子、ＰＬＩＮ４遺伝子、ＤＯＫ６遺伝子、ＥＮＰＰ４遺伝子、ＩＬ１５遺伝子、ＣＣＤＣ８０遺伝子、ＴＮＸＢ遺伝子、ＦＢＬＮ２遺伝子、ＤＬＥＣ１遺伝子、ＬＲＲＣ１７遺伝子、ＺＮＦ７９１遺伝子、ＣＮＩＨ３遺伝子、ＰＲＲ１５Ｌ遺伝子、ＤＣＡＦ４遺伝子、ＧＹＬＴＬ１Ｂ遺伝子、ＬＯＣ１４２９３７遺伝子、ＢＰＩＦＣ遺伝子、ＡＮＯ２遺伝子、ＩＦＩ４４Ｌ遺伝子及びＰＣＳＫ７遺伝子からなる群から１つ以上選択される遺伝子の発現レベルを指標とすることを特徴とする、［３３］に記載の方法。
［３５］  前記毛包由来の細胞群が、インビトロで培養された毛包由来の細胞群である、［３３］又は［３４］に記載の方法。
［３６］  前記毛包由来の細胞群が、１回以上継代された毛包由来の細胞群である、［３５］に記載の方法。
［３７］  毛包由来の細胞群を含有する、毛包を再生するための組成物の評価方法であって、
ＲＢＰ４遺伝子の発現レベルを指標として、前記毛包由来の細胞群における毛球部毛根鞘細胞（ＤＳＣＣ）の割合及び／又は活性を決定することを特徴とする、方法。
［３８］  さらに、ＧＲＥＭ２遺伝子、ＡＳＰＮ遺伝子、ＭＭＰ１１遺伝子、ＰＴＧＥＲ３遺伝子、ＴＬＥ４遺伝子、ＧＲＥＭ１遺伝子、ＤＣＮ遺伝子、ＰＤＧＦＲＬ遺伝子、ＡＣＫＲ１遺伝子、ＨＡＰＬＮ１遺伝子、ＤＣＤ遺伝子、ＳＣＧＢ１Ｄ２遺伝子、ＡＣＴＡ２遺伝子、ＰＬＩＮ４遺伝子、ＤＯＫ６遺伝子、ＥＮＰＰ４遺伝子、ＩＬ１５遺伝子、ＣＣＤＣ８０遺伝子、ＴＮＸＢ遺伝子、ＦＢＬＮ２遺伝子、ＤＬＥＣ１遺伝子、ＬＲＲＣ１７遺伝子、ＺＮＦ７９１遺伝子、ＣＮＩＨ３遺伝子、ＰＲＲ１５Ｌ遺伝子、ＤＣＡＦ４遺伝子、ＧＹＬＴＬ１Ｂ遺伝子、ＬＯＣ１４２９３７遺伝子、ＢＰＩＦＣ遺伝子、ＡＮＯ２遺伝子、ＩＦＩ４４Ｌ遺伝子及びＰＣＳＫ７遺伝子からなる群から１つ以上選択される遺伝子の発現レベルを指標とすることを特徴とする、［３７］に記載の方法。
［３９］  前記毛包由来の細胞群が、インビトロで培養された毛包由来の細胞群である、［３７］又は［３８］に記載の方法。
［４０］  前記毛包由来の細胞群が、１回以上継代された毛包由来の細胞群である、［３９］に記載の方法。【００１６】
［４１］  ＴＬＥ４遺伝子の発現レベルを指標とすることを特徴とする、毛包由来の細胞群における毛球部毛根鞘細胞（ＤＳＣＣ）の同定方法。
［４２］  さらに、ＧＲＥＭ２遺伝子、ＡＳＰＮ遺伝子、ＭＭＰ１１遺伝子、ＰＴＧＥＲ３遺伝子、ＲＢＰ４遺伝子、ＧＲＥＭ１遺伝子、ＤＣＮ遺伝子、ＰＤＧＦＲＬ遺伝子、ＡＣＫＲ１遺伝子、ＨＡＰＬＮ１遺伝子、ＤＣＤ遺伝子、ＳＣＧＢ１Ｄ２遺伝子、ＡＣＴＡ２遺伝子、ＰＬＩＮ４遺伝子、ＤＯＫ６遺伝子、ＥＮＰＰ４遺伝子、ＩＬ１５遺伝子、ＣＣＤＣ８０遺伝子、ＴＮＸＢ遺伝子、ＦＢＬＮ２遺伝子、ＤＬＥＣ１遺伝子、ＬＲＲＣ１７遺伝子、ＺＮＦ７９１遺伝子、ＣＮＩＨ３遺伝子、ＰＲＲ１５Ｌ遺伝子、ＤＣＡＦ４遺伝子、ＧＹＬＴＬ１Ｂ遺伝子、ＬＯＣ１４２９３７遺伝子、ＢＰＩＦＣ遺伝子、ＡＮＯ２遺伝子、ＩＦＩ４４Ｌ遺伝子及びＰＣＳＫ７遺伝子からなる群から１つ以上選択される遺伝子の発現レベルを指標とすることを特徴とする、［４１］に記載の方法。
［４３］  前記毛包由来の細胞群が、インビトロで培養された毛包由来の細胞群である、［４１］又は［４２］に記載の方法。
［４４］  前記毛包由来の細胞群が、１回以上継代された毛包由来の細胞群である、［４３］に記載の方法。
［４５］  毛包由来の細胞群を含有する、毛包を再生するための組成物の評価方法であって、
ＴＬＥ４遺伝子の発現レベルを指標として、前記毛包由来の細胞群における毛球部毛根鞘細胞（ＤＳＣＣ）の割合及び／又は活性を決定することを特徴とする、方法。
［４６］  さらに、ＧＲＥＭ２遺伝子、ＡＳＰＮ遺伝子、ＭＭＰ１１遺伝子、ＰＴＧＥＲ３遺伝子、ＲＢＰ４遺伝子、ＧＲＥＭ１遺伝子、ＤＣＮ遺伝子、ＰＤＧＦＲＬ遺伝子、ＡＣＫＲ１遺伝子、ＨＡＰＬＮ１遺伝子、ＤＣＤ遺伝子、ＳＣＧＢ１Ｄ２遺伝子、ＡＣＴＡ２遺伝子、ＰＬＩＮ４遺伝子、ＤＯＫ６遺伝子、ＥＮＰＰ４遺伝子、ＩＬ１５遺伝子、ＣＣＤＣ８０遺伝子、ＴＮＸＢ遺伝子、ＦＢＬＮ２遺伝子、ＤＬＥＣ１遺伝子、ＬＲＲＣ１７遺伝子、ＺＮＦ７９１遺伝子、ＣＮＩＨ３遺伝子、ＰＲＲ１５Ｌ遺伝子、ＤＣＡＦ４遺伝子、ＧＹＬＴＬ１Ｂ遺伝子、ＬＯＣ１４２９３７遺伝子、ＢＰＩＦＣ遺伝子、ＡＮＯ２遺伝子、ＩＦＩ４４Ｌ遺伝子及びＰＣＳＫ７遺伝子からなる群から１つ以上選択される遺伝子の発現レベルを指標とすることを特徴とする、［４５］に記載の方法。
［４７］  前記毛包由来の細胞群が、インビトロで培養された毛包由来の細胞群である、［４５］又は［４６］に記載の方法。
［４８］  前記毛包由来の細胞群が、１回以上継代された毛包由来の細胞群である、［４７］に記載の方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、毛包由来の細胞群に含まれる毛球部毛根鞘細胞を識別可能となり、毛包由来の細胞群を含有する毛包を再生するための組成物の品質を評価することが可能となる。また、単離した毛球部毛根鞘細胞をインビトロで培養して増殖させた後においても、毛球部毛根鞘細胞が残存しているかどうか評価することが可能となり、毛包誘導能が高い毛包を再生するための組成物を選択することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】毛包（Ｆａｉｒ  ｆｏｌｌｉｃｌｅ：ＨＦ）サブユニットを示す図である。（ａ）ＨＦ全体。（ｂ）切開された上部真皮毛根鞘（Ｕｐｐｅｒ  Ｄｅｒｍａｌ  Ｓｈｅａｔｈ：ＵＤＳ）。（ｃ）切開され、反転された、分離前の、毛球部毛根鞘（Ｄｅｒｍａｌ  Ｓｈｅａｔｈ  Ｃｕｐ：ＤＳＣ）及び毛乳頭（Ｄｅｒｍａｌ  Ｐａｐｉｌｌａ：ＤＰ）。スケールバー＝２００μｍ。
【図２】主成分分析後のマイクロアレイ結果の近似性を示すグラフである。異なる視点からの三次元的視点。Ｘ軸、主成分（ＰＣ）１（３２．３４％の分散補足）；Ｙ軸、ＰＣ２（２２．８３％の分散補足）；Ｚ軸、ＰＣ３（２０．４３％の分散補足）。黒のシンボル：個人（ＩＤ）１；白のシンボル：ＩＤ２；斜線のシンボル：ＩＤ３。三角：ＤＳＣ、四角：ＤＰ、丸：ＵＤＳ。
【図３】毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）において異なって発現する遺伝子。正規化したＤＳＣ識別遺伝子の発現レベルを、３名のそれぞれにおいて、毛乳頭（ＤＰ）及び上部真皮毛根鞘（ＵＤＳ）と比較した。
【図４】定量的ＰＣＲによって解析した、毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）及び毛乳頭（ＤＰ）におけるＧＲＥＭ２の発現レベルを示すグラフである。ＧＡＰＤＨの発現量を１００％とした時の相対的な値を示す。
【図５】ヒト毛包におけるＧＲＥＭ２の発現の発現を示す図である。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの結果を示す。（ａ）ＧＲＥＭ２プローブ、（ｂ）（ａ）の拡大図、（ｃ）プローブ無し。赤：ｉｎ  ｓｉｔｕシグナル、青：Ｈｅｃｈｓｔ３３３４２による核染色。スケールバー、（ａ）：１００μｍ、（ｂ）及び（ｃ）：５０μｍ。
【図６】ヒト毛包におけるＧＲＥＭ２及びＧＲＥＭ１の発現を示す図である。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの結果を示す。（ａ）ＧＲＥＭ２プローブ、（ｂ）ＧＲＥＭ１プローブ、（ｃ）プローブ無し。上段：ｉｎ  ｓｉｔｕシグナルのみ、中段：ｉｎ  ｓｉｔｕシグナル及び核、下段：ＤＳＣ部分の拡大図。赤：ｉｎ  ｓｉｔｕシグナル、青：Ｈｅｃｈｓｔ３３３４２による核染色。スケールバー：１００μｍ。
【図７】ＤＳＣ識別遺伝子の調節制御及びその細胞内局在を示す推定図である。
【図８】毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）の培養前後におけるＤＳＣ識別遺伝子の発現量の変化を示す図である。インタクトなＤＳＣ、及び約３０日間インビトロで培養したＤＳＣからトータルＲＮＡを回収し、定量的ＰＣＲによって解析した。ＧＡＰＤＨの発現量で正規化し、インタクトなＤＳＣの遺伝子発現量を１００％とした時の、培養後のＤＳＣの相対的な遺伝子発現量を示す。
【図９】（ａ）毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）、毛乳頭（ＤＰ）、上部真皮毛根鞘（ＵＤＳ）を培養後１継代目の各細胞におけるＧＲＥＭ２の発現レベルを定量的ＰＣＲによって解析したグラフである。ＤＳＣ細胞でのＧＡＰＤＨの発現量に対するＧＲＥＭ２の発現量を１００％とした時の相対的な値の２回の実験の平均値を示す。（ｂ）毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）、毛乳頭（ＤＰ）、上部真皮毛根鞘（ＵＤＳ）を培養後１継代目の各細胞におけるコロニー形成能をＤＳＣ細胞の値を１とした時の比で示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明を実施するための形態について説明するが、本発明の技術的範囲は下記の形態のみに限定されない。
【００２０】
毛の皮膚内部最深部の膨らんだ部分を毛球部（ｈａｉｒ ｂｕｌｂ）といい、毛球部の中央部にある間葉系細胞からなる部分を毛乳頭（ｄｅｒｍａｌ ｐａｐｉｌｌａ）という。毛乳頭には毛細血管や神経が入り込んでいて、食物からの栄養や酸素を取り入れ、毛の発生や成長をつかさどっている。毛乳頭に接したところに毛母細胞（ｈａｉｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｃｅｌｌ）があり、毛はこの部位で産生される。すなわち毛母細胞は、毛乳頭に入り込んでいる毛細血管から栄養や酸素を取り込み、分裂を繰り返すことにより毛が形成される。
【００２１】
本明細書において、「毛包（Ｈａｉｒ  Ｆｏｌｌｉｃｌｅ：ＨＦ）」とは、上皮系細胞であるの毛母（毛母細胞）、内毛根鞘、外毛根鞘や、間葉系細胞であるの真皮毛根鞘、毛乳頭、及びメラノサイトなどを含む、毛を取り囲む組織層をいう。本発明において使用される組織又は細胞は、いずれの動物由来であってもよいが、脊椎動物由来が好ましく、哺乳動物由来がより好ましく、ヒト由来であることが最も好ましい。
【００２２】
本明細書において、「真皮毛根鞘（Ｄｅｒｍａｌ  Ｓｈｅａｔｈ：ＤＳ）」とは、毛包の最外層を包む一層又は数層の真皮性細胞層（ビメンチン陽性）よりなる組織であって、平滑筋型αアクチン（α−ＳＭＡ）陽性細胞を含む。真皮毛根鞘は、毛球部の最下端において毛乳頭と連続している。後述するように、本明細書において、真皮毛根鞘には、毛球部毛根鞘と上部真皮毛根層が含まれる。
【００２３】
本明細書において、「毛球部毛根鞘（ｄｅｒｍａｌ  ｓｈｅａｔｈ  ｃｕｐ：ＤＳＣ）」とは、真皮毛根鞘の一部であり、毛球部の底部に位置する組織をいう（図１参照）。「毛球部毛根鞘細胞（ｄｅｒｍａｌ  ｓｈｅａｔｈ  ｃｕｐ  ｃｅｌｌ：ＤＳＣＣ）」とは、毛球部毛根鞘を構成する細胞である。毛球部毛根鞘細胞は、毛乳頭細胞の前駆細胞であることが知られており、毛球部毛根鞘細胞を皮膚に移植することにより、移植部位において毛包が誘導されることが知られている。すなわち、毛包由来の細胞群又は毛包由来の細胞群を含有する毛包を再生するための組成物において、毛球部毛根鞘細胞の割合が高い及び／又はその活性が高い毛包由来の細胞群又は組成物を選択することができれば、より毛包誘導能が高い毛包由来の細胞群又は毛包由来の細胞群を含有する毛包を再生するための組成物を提供することが可能となる。
【００２４】
本明細書において、「上部真皮毛根鞘（Ｕｐｐｅｒ  Ｄｅｒｍａｌ  Ｓｈｅａｔｈ：ＵＤＳ）」とは、真皮毛根鞘のうち、上記の毛球部毛根鞘の部分を除いた組織をいう。
【００２５】
本明細書において、「毛包由来の細胞群」とは、上記の毛包を構成する細胞を含む細胞群をいう。また、本明細書において、「毛包由来の細胞群を含む毛包を再生するための組成物」とは、毛包由来の細胞群の他、例えば、生体適合可能な物質を含むものである。生体適合可能な物質とは、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝液、細胞培養培地、生体適合性ハイドロゲル（キトサンゲル、コラーゲンゲル、ゼラチン、ペプチドゲル、ラミニンゲル及びフィブリンゲルなど）等であってもよく、これらに限定されない。
【００２６】
本発明者らは、鋭意研究を行った結果、毛球部毛根鞘細胞（ＤＳＣＣ）において特異的に発現する遺伝子を発見した。すなわち、本発明において用いられる、毛球部毛根鞘細胞を識別するために用いられる遺伝子又は識別マーカーは、以下の表１を含む：
【表１】
2019176881.tif 000003
【００２７】
なお、本発明において用いられる表１及び表２（後述）に記載の遺伝子の具体的な配列は、ＧｅｎｅＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から取得することができる。本発明に用いられる遺伝子の具体的な配列は、表１及び表２に記載のアクセッション番号によって取得される配列に限定されるものではなく、例えば、上記表１又は表２によって特定されるヌクレオチド配列と７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上同一の配列や、それらのスプライシング変異体なども含まれる。また、その遺伝子の由来は、いずれの動物由来であってもよいが、脊椎動物由来が好ましく、哺乳動物由来がより好ましく、ヒト由来であることが最も好ましい。
【００２８】
一実施態様において、本発明は、以下の態様を含む。
ＧＲＥＭ２遺伝子の発現レベルを指標とすることを特徴とする、毛包由来の細胞群における毛球部毛根鞘細胞（ＤＳＣＣ）の同定方法。
【００２９】
また、一実施態様において、本発明は、以下の態様を含む。
ＡＳＰＮ遺伝子の発現レベルを指標とすることを特徴とする、毛包由来の細胞群における毛球部毛根鞘細胞（ＤＳＣＣ）の同定方法。
【００３０】
また、一実施態様において、本発明は、以下の態様を含む。
ＭＭＰ１１遺伝子の発現レベルを指標とすることを特徴とする、毛包由来の細胞群における毛球部毛根鞘細胞（ＤＳＣＣ）の同定方法。
【００３１】
また、一実施態様において、本発明は、以下の態様を含む。
ＰＴＧＥＲ３遺伝子の発現レベルを指標とすることを特徴とする、毛包由来の細胞群における毛球部毛根鞘細胞（ＤＳＣＣ）の同定方法。
【００３２】
また、一実施態様において、本発明は、以下の態様を含む。
ＲＢＰ４遺伝子の発現レベルを指標とすることを特徴とする、毛包由来の細胞群における毛球部毛根鞘細胞（ＤＳＣＣ）の同定方法。
【００３３】
また、一実施態様において、本発明は、以下の態様を含む。
ＴＬＥ４遺伝子の発現レベルを指標とすることを特徴とする、毛包由来の細胞群における毛球部毛根鞘細胞（ＤＳＣＣ）の同定方法。
【００３４】
毛包由来の細胞群において、上記遺伝子の発現レベルを測定することによって、毛包由来の細胞群に含まれる毛球部毛根鞘細胞（ＤＳＣＣ）を同定することができる。また、毛包由来の細胞群において、上記遺伝子の発現レベルを測定することによって、毛包由来の細胞群が有する毛包誘導効果を予測することができる。
【００３５】
一実施態様において、本発明は、以下の態様を含む。
毛包由来の細胞群を含有する、毛包を再生するための組成物の評価方法であって、
ＧＲＥＭ１遺伝子の発現レベルを指標として、前記毛包由来の細胞群における毛球部毛根鞘細胞（ＤＳＣＣ）の割合及び／又は活性を決定することを特徴とする、方法。
【００３６】
また、一実施態様において、本発明は、以下の態様を含む。
毛包由来の細胞群を含有する、毛包を再生するための組成物の評価方法であって、
ＡＳＰＮ遺伝子の発現レベルを指標として、前記毛包由来の細胞群における毛球部毛根鞘細胞（ＤＳＣＣ）の割合及び／又は活性を決定することを特徴とする、方法。
【００３７】
また、一実施態様において、本発明は、以下の態様を含む。
毛包由来の細胞群を含有する、毛包を再生するための組成物の評価方法であって、
ＭＭＰ１１遺伝子の発現レベルを指標として、前記毛包由来の細胞群における毛球部毛根鞘細胞（ＤＳＣＣ）の割合及び／又は活性を決定することを特徴とする、方法。
【００３８】
また、一実施態様において、本発明は、以下の態様を含む。
毛包由来の細胞群を含有する、毛包を再生するための組成物の評価方法であって、
ＰＴＧＥＲ３遺伝子の発現レベルを指標として、前記毛包由来の細胞群における毛球部毛根鞘細胞（ＤＳＣＣ）の割合及び／又は活性を決定することを特徴とする、方法。
【００３９】
また、一実施態様において、本発明は、以下の態様を含む。
毛包由来の細胞群を含有する、毛包を再生するための組成物の評価方法であって、
ＲＢＰ４遺伝子の発現レベルを指標として、前記毛包由来の細胞群における毛球部毛根鞘細胞（ＤＳＣＣ）の割合及び／又は活性を決定することを特徴とする、方法。
【００４０】
また、一実施態様において、本発明は、以下の態様を含む。
毛包由来の細胞群を含有する、毛包を再生するための組成物の評価方法であって、
ＴＬＥ４遺伝子の発現レベルを指標として、前記毛包由来の細胞群における毛球部毛根鞘細胞（ＤＳＣＣ）の割合及び／又は活性を決定することを特徴とする、方法。
【００４１】
毛包由来の細胞群を含有する毛包を再生するための組成物において、上記遺伝子の発現レベルを指標として、毛包由来の細胞群における毛球部毛根鞘細胞（ＤＳＣＣ）の割合及び／又は活性を決定することによって、毛包由来の細胞群に含まれる毛球部毛根鞘細胞の相対的な量又は活性を評価することができ、その結果、毛球部毛根鞘細胞による毛包誘導効果を予測することができる。
【００４２】
他の態様において、本発明は、上記のいずれかの方法は、さらに、
ＧＲＥＭ２遺伝子、ＡＳＰＮ遺伝子、ＭＭＰ１１遺伝子、ＰＴＧＥＲ３遺伝子、ＲＢＰ４遺伝子及びＴＬＥ４遺伝子からなる群から１つ以上選択される遺伝子の発現レベルを指標とするものであってもよい。毛球部毛根鞘細胞に特異的なこれらの遺伝子を組み合わせることにより、より正確に毛包由来の細胞群又は毛包由来の細胞群を含有する毛包を再生するための組成物に含まれる毛球部毛根鞘細胞を評価することが可能となる。
【００４３】
さらに、他の態様において、本発明は、上記の工程に加え、さらに、以下の表２に含まれる遺伝子（ＧＲＥＭ１遺伝子、ＤＣＮ遺伝子、ＰＤＧＦＲＬ遺伝子、ＡＣＫＲ１遺伝子、ＨＡＰＬＮ１遺伝子、ＤＣＤ遺伝子、ＳＣＧＢ１Ｄ２遺伝子、ＡＣＴＡ２遺伝子、ＰＬＩＮ４遺伝子、ＤＯＫ６遺伝子、ＥＮＰＰ４遺伝子、ＩＬ１５遺伝子、ＣＣＤＣ８０遺伝子、ＴＮＸＢ遺伝子、ＦＢＬＮ２遺伝子、ＤＬＥＣ１遺伝子、ＬＲＲＣ１７遺伝子、ＺＮＦ７９１遺伝子、ＣＮＩＨ３遺伝子、ＰＲＲ１５Ｌ遺伝子、ＤＣＡＦ４遺伝子、ＧＹＬＴＬ１Ｂ遺伝子、ＬＯＣ１４２９３７遺伝子、ＢＰＩＦＣ遺伝子、ＡＮＯ２遺伝子、ＩＦＩ４４Ｌ遺伝子及びＰＣＳＫ７遺伝子）からなる群から１つ以上選択される遺伝子の発現レベルを指標とするものであってもよい。
【表２】
2019176881.tif 000004
【００４４】
本明細書において、「遺伝子の発現レベル」とは、任意の遺伝子から転写された転写産物、又はその転写産物を鋳型として翻訳された翻訳産物を検出し、測定することによって決定することができるものをいう。転写産物とは、例えば、遺伝子のＤＮＡを鋳型として転写されるＲＮＡ鎖、すなわち、ＲＮＡポリメラーゼにより合成されるＲＮＡ鎖、及び転写後細胞内で修飾されたＲＮＡ鎖を意味する。転写産物に含まれるＲＮＡ鎖としては、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。これらのＲＮＡ鎖は、転写後、細胞内でプロセッシングされたものも含む。翻訳産物とは、例えば、遺伝子によって転写された転写産物を鋳型として翻訳されるポリペプチド鎖、すなわち、リボソームによって合成されるポリペプチド鎖、及びそのポリペプチド鎖がフォールデングすることで形成されるタンパク質を意味する。翻訳産物には、ポリペプチド鎖又はタンパク質のフラグメントも含まれる。
【００４５】
遺伝子の発現レベルは、公知の方法を用いることによって測定することができる。例えば、遺伝子の発現レベルを測定するために、遺伝子の転写産物を測定する場合、目的の遺伝子の配列を参考にすることによって適切なプローブを設計し、それらを用いて、定量的ＰＣＲ法（ｑＰＣＲ法）、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、ノーザンブロット法、ＤＮＡマイクロアレイ法などの方法を用いることによって測定することができる。
【００４６】
また、例えば、遺伝子の発現レベルを測定するために、遺伝子の翻訳産物を測定する場合、目的の遺伝子によって翻訳されるタンパク質を検出する抗体を用い、例えば、ウエスタンブロット法、フローサイトメトリー法（ＦＡＣＳ法）、ＥＬＩＳＡ法などによって測定することができる。
【００４７】
一実施態様において、遺伝子の発現レベルは、任意のハウスキーピング遺伝子の発現レベルによって正規化（標準化）することによって比較することができる。比較のために用いることができるハウスキーピング遺伝子としては、例えば、ＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、β−アクチン、β２−マイクログロブリン、ＨＰＲＴ  １（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  １）などが挙げられる。本発明に用いられる上述の遺伝子と同様の方法により、ハウスキーピング遺伝子の発現レベルを測定し、当該ハウスキーピング遺伝子の発現レベルによって正規化（標準化）することによって、異なるサンプル間で比較することができる。
【００４８】
一実施態様において、「遺伝子の発現レベルを指標とする」とは、毛包由来の細胞群において、所定のレベル以上（例えば、ネガティブコントロールのサンプルのシグナル以上）の、遺伝子を発現する細胞の割合を検出することであってもよい。これにより、毛包由来の細胞群に含まれる毛球部毛根鞘細胞の割合を評価することが可能となる。
【００４９】
一実施態様において、「遺伝子の発現レベルを指標とする」とは、毛包由来の細胞群全体において、任意の遺伝子の発現レベルを検出し、他のサンプルの同一の遺伝子の発現レベルと比較することであってもよい。これにより、毛包由来の細胞群全体として、毛球部毛根鞘細胞で発現する遺伝子が高発現又は低発現しているかどうかを評価することができる。
【００５０】
一実施態様において、「毛球部毛根鞘細胞（ＤＳＣＣ）の活性」とは、毛球部毛根鞘細胞において発現する上記の遺伝子の発現レベルである。異なるサンプル間において、上記の遺伝子の発現レベルを比較することにより、毛包由来の細胞群に含まれる毛球部毛根鞘細胞の相対的な活性を比較することができる。
【００５１】
一実施態様において、本発明は、インビトロで培養された毛包由来の細胞群を用いることができる。これにより、毛包由来の細胞群に含まれる毛球部毛根鞘細胞が、培養の前後に、その割合又はその性質が変化していないかを評価することができる。また、他の態様において、本発明は、１回以上継代された毛包由来の細胞群を用いることができる。毛包由来の細胞群をインビトロで培養し、継代する方法については公知の方法を採用すればよく、限定されない。
【実施例】
【００５２】
以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。【００５３】
＜実施例１＞
１．方法
１−１．毛包サブユニットの調製
２例の母斑細胞母斑、及び１例の脂肪腫の切除を受けた３０〜７０歳の３人の女性から、頭皮の毛包（Ｈａｉｒ  Ｆｏｌｌｉｃｌｅ：ＨＦ）を含む皮膚片を得た。サンプルは、腫瘍巣を避け、切除された皮膚の縁から採取した。ＭｃＥｌｗｅｅ  ＫＪ．，ｅｔ  ａｌ．（参考文献１）及びＮｉｉｙａｍａ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（参考文献２）を参考に、実体顕微鏡下で、単離されたインタクトのＨＦから、ＨＦの間葉系サブユニットを顕微解剖した（図１）。簡潔に述べると、ＨＦを、毛球領域に隣接した場所を鉗子で把持し、毛球を、針を用いて横断的に切断して切開した。毛球の毛球部毛根鞘（Ｄｅｒｍａｌ  Ｓｈｅａｔｈ  Ｃｕｐ：ＤＳＣ）を鉗子と針を用いて反転させ、残りの上皮由来組織を除去して毛乳頭（Ｄｅｒｍａｌ  ｐａｐｉｌｌａ：ＤＰ）を露出させた。ＤＰを横断切断してＤＳＣから分離した。上部真皮毛根鞘（Ｕｐｐｅｒ  Ｄｅｒｍａｌ  Ｓｈｅａｔｈ：ＵＤＳ）は、ＨＦの近位端を別の鉗子で保持しながら、鉗子で外毛根鞘から剥がして単離した。【００５４】
１−２．トータルＲＮＡの調製
それぞれのサブユニットをプールし、１ｍｌのＩＳＯＧＥＮ（ニッポン・ジーン社、富山、日本）に溶解し、製造業者の指示に従ってＲＮＡ抽出を行った。沈殿後、ＲＮＡの品質は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、リボソームＲＮＡ比（２８Ｓ／１８Ｓ）から評価した。６．５〜８．３のＲＮＡ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  ｎｕｍｂｅｒ（ＲＩＮ）を有するサンプルをマイクロアレイ分析に使用した。【００５５】
１−３．マイクロアレイアッセイ
マイクロアレイ解析は、製造業者の指示（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って実施した。１０ｎｇの全ＲＮＡを、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマー、ＡｆｆｉｎｉｔｙＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ及びＣｙ３色素で標識されたＣＴＰの存在下で、Ｌｏｗ  Ｉｎｐｕｔ  Ｑｕｉｃｋ  Ａｍｐ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてインビボ逆転写及びその後の転写を行い、蛍光標識ｃＲＮＡへと変換した。得られた６００ｎｇの標識ｃＲＮＡを断片化し、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  Ｇ３  Ｈｕｍａｎ  ＧＥ  ８ｘ６０Ｋマイクロアレイ（Ｇ４８５１Ａ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）へとハイブリダイズさせ、Ａｇｉｌｅｎｔデュアルレーザーマイクロアレイスキャナー（Ｇ２５６５ＡＡ）でスキャンした。シグナル強度は、Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン１１．０．１．１（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて定量した。統計分析のために、データをＧｅｎｅｓｐｒｉｎｇ  ＧＸ  １３．０ソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で処理した。マイクロアレイデータは、マイクロアレイ実験に関する最小限情報（ＭＩＡＭＥ）ガイドラインに従って記載し、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）データベース（受託番号ＧＳＥ９５２１９；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ）に寄託した。【００５６】
１−４．ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
細胞内におけるＧＲＥＭ２及びＧＲＥＭ１の局在を視覚化するために、パラフィン包埋組織切片を用いてｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った。ＶｉｅｗＲＮＡ（商標）ＩＳＨ  Ｔｉｓｓｕｅ  １−Ｐｌｅｘ  Ａｓｓａｙキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）の製造業者マニュアルに従って、高度特異的分枝状ＤＮＡシグナル増幅技術に基づき、ＧＲＥＭ２又はＧＲＥＭ１特異的タイプ６プローブを使用した。Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ基質を用いてシグナルを検出し、続いて蛍光を観察した。核の染色はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）を用いて実施した。【００５７】
１−５．定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＲＮＡ  ＸＳ（ＴＡＫＡＲＡ  ＢＩＯ  Ｉｎｃ．、滋賀、日本）を用い、添付の説明書に従って、各サンプルからトータルＲＮＡを抽出し、続いてＣｅｌｌＡｍｐ  Ｗｈｏｌｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）Ｖｅｒ．２（ＴＡＫＡＲＡ  ＢＩＯ  Ｉｎｃ．、滋賀、日本）を用いてｃＤＮＡを調製した。【００５８】
ｑＰＣＲは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  ＭａｓｔｅｒＰＬＵＳ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ及びＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ）を用い、添付の説明書に従って実施した。【００５９】
２．結果
２−１．ＨＦの各サブユニットは異なる遺伝子プロファイルを示す。
単離したインタクトなＨＦサブユニット（ＤＳＣ、ＤＰ、ＵＤＳ）の遺伝子発現プロファイルを解析した（図１）。３人の別々のドナーから得た、顕微解剖によって得られたＨＦサブユニットのトータルＲＮＡをマイクロアレイ解析し、ＨＦサブユニット特異的であり、識別可能な遺伝子を同定した。２以上の個体についてデータが信頼できない、又はバックグラウンドと等しいとタグ付けされたマイクロアレイプローブは除外した。その結果、２５３４２個のプローブを分析対象とした。インタクトなＨＦサブユニットに特異的であり、識別可能な遺伝子を同定するために、少なくとも１つのＨＦコンポーネントに対して、シグナル強度が５０以上であった１８９０５プローブをさらに選択して解析した。【００６０】
まず、主成分分析（ＰＣＡ）を実施し、トータルマイクロアレイデータセットの関係性を解析した。同一個体由来の３つのＨＦサブユニットの位置は、ＰＣ１次元に沿って密接に関連していた。一方、異なる個体由来の同一サブユニットの位置は、ＰＣ３次元に沿って弱く関連していることが明らかとなった（図２）。これらの個体内の差異を考慮し、それぞれの個体内で比較した。ＤＳＣ対ＤＰ、ＤＳＣ対ＵＤＳ、及びＵＤＳ対ＤＰで比較を行い、カットオフ値を１．５倍とした。個体内においても実質的に差異があったが、ＰＣＡによって、３名の個体間において、ＤＳＣのみならず、ＤＰ及びＵＤＳプロファイルも類似点を有することが明らかとなった。【００６１】
２−２．ＤＳＣ及びＤＰ識別遺伝子の抽出
３名すべてに共通して発現亢進又は発現抑制されていた遺伝子の数を表３に示す。
【表３】
2019176881.tif 000005
【００６２】
その結果、ＤＳＣ対ＤＰにおいて、発現亢進した遺伝子を６３個同定した。これらのうち、ＵＤＳにおいても発現亢進した遺伝子と、５個の特徴づけられていないプローブを除去し、ＤＳＣ識別遺伝子として３２個の遺伝子が得られた（表４）。
【表４】
2019176881.tif 000006
【００６３】
２−３．ＤＳＣ識別遺伝子の特徴付け
上記ＤＳＣ識別遺伝子リストには、以前、真皮毛根鞘（ＤＳ）で発現していると報告された、ａｃｔｉｎ，ａｌｐｈａ  ２，ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ（ａｌｐｈａ−ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｎ）、ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３及びｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ１１が含まれていた（参考文献３〜５）。７個の細胞外マトリックスコンポーネント：ｄｅｃｏｒｉｎ；ｆｉｂｕｌｉｎ  ２；ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ８０；ｔｅｎａｓｃｉｎ  ＸＢ；ａｓｐｏｒｉｎ；ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ｌｉｎｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １；及びｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  １１もこのリストには含まれており、このカテゴリーが、遺伝子オントロジー解析において、有意に大多数を占めていた。ＤＳＣ識別遺伝子の多くは、ＤＰと比較して、ＤＳＣのみならず、ＵＤＳにおいても高発現していた（図３）。それらのうち、６つの遺伝子：ａｓｐｏｒｉｎ，ＤＡＮ  ｆａｍｉｌｙ  ＢＭＰ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｇｒｅｍｌｉｎ  ２（ＧＲＥＭ２）；ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  １１；ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３；ｒｅｔｉｎｏｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４；及びｔｒａｎｓｄｕｃｉｎ−ｌｉｋｅ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｓｐｌｉｔ  ４（ＴＬＥ４）が、より高くＤＳＣにおいて特異的に発現しており、ＵＤＳに対して少なくとも１．５倍発現亢進されていた（表５）。
【表５】
2019176881.tif 000007
【００６４】
２−４．ＧＲＥＭ２はインタクトなＤＳＣ識別遺伝子である。
６つのＤＳＣ特異的遺伝子は、ＤＰ及びＵＤＳの両方と比較した場合に、ＤＳＣにおいて実質的に発現亢進していた。そこで、それらの遺伝子のうち、ＧＲＥＭ２に対する定量的ＰＣＲを、インタクトなＤＰ及びＤＳＣ組織において実施した。その結果、ＤＰと比較した場合、明らかに約１０倍以上、ＤＳＣ特異的に発現亢進していることが認められた（図４）。組織におけるＧＲＥＭ２遺伝子の特異的な発現をさらに確認するために、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った。その結果、毛包の毛球におけるＤＳＣ領域において、ＧＲＥＭ２が発現していることが確認でき、ＧＲＥＭ２発現が、インタクトな毛包においてＤＳＣ特異的であることが示された（図５）。また、同じＧＲＥＭファミリーであるＧＲＥＭ１においても、同様にｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行い、ＨＦにおける発現を確認した（図６）。【００６５】
２−５．ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ解析によるＤＳＣ識別遺伝子の上流調節因子の同定
発現変化を評価する上流調節因子の分析の結果、報告された文献と一致して、ＴＧＦ−ｂ１がＤＳＣ識別の９つの遺伝子の推定調節因子として同定された（図７）。５つの遺伝子がＷｎｔ経路に関連するものであり、その中の一つであるＴＬＥ４は、Ｗｎｔ経路において良く知られた核コンポーネントであるＧｒｏｕｃｈｏファミリーのメンバーである。２つのＢＭＰシグナリングアンタゴニストであるＧＲＥＭ１及びＧＲＥＭ２もまた、ＤＳＣにおいて発現亢進されていた。図７は、ＤＳＣ識別因子の推定される調節ネットワークと、細胞内局在を示し、ＴＧＦ−ｂ１が、ＤＳＣに対して特徴的な細胞外マトリックスコンポーネントを調節することを示唆している。【００６６】
＜実施例２＞
実施例１と同様の方法によって単離したＤＳＣをＡｍｎｉｏ  Ｍａｘ培地（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２にて、インビトロで約３０日間培養した。培養前のインタクトなＤＳＣ、及び培養後のＤＳＣからトータルＲＮＡを回収し、上記１−５．と同様ｑＰＣＲを実施した。ＧＡＰＤＨの発現量で正規化し、インタクトなＤＳＣの遺伝子発現量を１００％とした時の、培養後のＤＳＣの遺伝子発現量は、図８のようになった。【００６７】
＜実施例３＞
ＧＲＥＭ２は培養したＤＳＣ細胞の識別遺伝子であり、細胞のコロニー形成活性と関連する。【００６８】
実施例１と同様の方法によって単離したＤＳＣ、ＤＰ、ＵＤＳをＡｍｎｉｏ  Ｍａｘ培地（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２にて、インビトロで培養し、１継代目の各細胞からトータルＲＮＡを回収して、上記１−５．と同様にｑＰＣＲを実施した。【００６９】
ＤＳＣ細胞でのＧＡＰＤＨの発現量に対するＧＲＥＭ２の発現量を１００％とした時の相対的な値を図９（ａ）に示す。その結果、ＤＳＣ細胞においてＧＲＥＭ２の発現が亢進していることが認められた。【００７０】
培養した細胞のコロニー形成能を、１０００個の細胞を１０ｃｍシャーレに播種しＡｍｎｉｏ  Ｍａｘ培地で培養して１２日後に形成されたコロニー数を数えるという方法で評価した。その結果、ＤＳＣ細胞は、高いコロニー形成活性を有することが認められた（図９（ｂ））。【００７１】
＜参考文献＞
１．McElwee KJ, Kissling S, Wenzel E, Huth A, Hoffmann R. Cultured peribulbar dermal sheath cells can induce hair follicle development and contribute to the dermal sheath and dermal papilla. J Invest Dermatol 2003; 121: 1267-1275.
２．Niiyama S, Happle R, Hoffmann R. The feasibility of quantitative analysis of androgen metabolism by use of single dermal papillae from human hair follicles. Exp Dermatol 2001; 10: 124-127.
３．Jahoda CA, Reynolds AJ, Chaponnier C, Forester JC, Gabbiani G. Smooth muscle alpha-actin is a marker for hair follicle dermis in vivo and in vitro. J Cell Sci 1991; 99: 627-636.
４．Ishimatsu-Tsuji Y, Moro O, Kishimoto J. Expression profiling and cellular localization of genes associated with the hair cycle induced by wax depilation. J Invest Dermatol 2005; 125: 410-420.
５．Colombe L, Michelet JF, Bernard BA. Prostanoid receptors in anagen human hair follicles. Exp Dermatol 2008; 17: 63-72.
【図１】
2019176881.tif 000008
【図２】
2019176881.tif 000009
【図３】
2019176881.tif 000010
【図４】
2019176881.tif 000011
【図５】
2019176881.tif 000012
【図６】
2019176881.tif 000013
【図７】
2019176881.tif 000014
【図８】
2019176881.tif 000015
【図９】
2019176881.tif 000016
【国際調査報告】
2019176881.tif 000017
2019176881.tif 000018
2019176881.tif 000019
2019176881.tif 000020