(57)【要約】【課題】  本発明は、簡便、高精度かつ非侵襲に、スフェロイド等の３次元細胞組織の内部におけるグルコースを連続的に計測可能な新規な検出用材料及び検出手法を提供することを課題とする。【解決手段】３次元細胞組織内のグルコースを測定するための蛍光マイクロ粒子であって、平均粒径がマイクロメートルのオーダーであるコア粒子と、グルコースとの結合により蛍光応答を示す蛍光色素ユニットと、細胞接着性分子を有する細胞接着ユニットとを含み；前記蛍光色素ユニット及び前記細胞接着ユニットが、前記コア粒子の表面上に共有結合によって固定化された構造を有する、該蛍光マイクロ粒子。【選択図】なし
2019142913.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
３次元細胞組織内のグルコースを測定するための蛍光マイクロ粒子であって、
平均粒径がマイクロメートルのオーダーであるコア粒子と、
グルコースとの結合により蛍光応答を示す蛍光色素ユニットと、
細胞接着性分子を有する細胞接着ユニットとを含み；
前記蛍光色素ユニット及び前記細胞接着ユニットが、前記コア粒子の表面上に共有結合によって固定化された構造を有する、
該蛍光マイクロ粒子。
【請求項２】
前記コア粒子が、それぞれ表面上に修飾用官能基を有する含ケイ素材料、高分子ポリマー、及び金属微粒子よりなる群から選択される、請求項１に記載の蛍光マイクロ粒子。
【請求項３】
前記コア粒子が、表面上に修飾用官能基を有する多孔質材料である、請求項１に記載の蛍光マイクロ粒子。
【請求項４】
前記修飾用官能基が、カルボキシル基、チオール基、イソシアノ基、チオイソシアノ基、エポキシ基、活性カルボン酸エステル、マレイミド基、アセチル基、及びアジド基よりなる群から選択される１以上の官能基である、請求項２又は３に記載の蛍光マイクロ粒子。
【請求項５】
前記コア粒子が、１００ｎｍ〜２０μｍの平均粒径を有する、請求項１〜４のいずれか１に記載の蛍光マイクロ粒子。
【請求項６】
前記細胞接着ユニットが、４以上のアミノ酸残基よりなるポリペプチド又はオリゴペプチドを含む、請求項１〜５のいずれか１に記載の蛍光マイクロ粒子。
【請求項７】
前記細胞接着ユニットが、コラーゲン、ゼラチン、プロテオグリカン、ヒアルロン酸、フィブロネクチン、ラミニン、テネイシン、エンタクチン、エラスチン、及びそれらに由来する化合物よりなる群から選択される１種以上を含む、請求項１〜５のいずれか１に記載の蛍光マイクロ粒子。
【請求項８】
前記蛍光色素ユニットが蛍光団及び消光団を有しており；
グルコース非存在下では前記消光団により前記蛍光団が消光されているが、前記消光団がグルコースと結合することによって蛍光団が発光することにより蛍光応答を示す、請求項１〜７のいずれか１に記載の蛍光マイクロ粒子。
【請求項９】
前記蛍光団がアントラセンを有し、前記消光団がアリールボロン酸を有する、請求項８に記載の蛍光マイクロ粒子。
【請求項１０】
前記蛍光色素ユニットが末端に１又は複数のアミノ基を有し、当該アミノ基を介した共有結合によって前記コア粒子の表面に固定化されている、請求項１〜９のいずれか１に記載の蛍光マイクロ粒子。
【請求項１１】
前記蛍光色素ユニットが以下の式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される、
【化１】
2019142913.tif 000009
【化２】
2019142913.tif 000010
（式（ＩＩ）において、「ＰＥＧ」は、ポリエチレングリコール鎖を表す。）
請求項１〜１０のいずれか１に記載の蛍光マイクロ粒子。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１に記載の蛍光マイクロ粒子を含む、グルコースモニタリングセンサー。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか１に記載の蛍光マイクロ粒子を用いて３次元細胞組織中のグルコースの存在を蛍光応答として検出する工程を含む、グルコース検出方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載のグルコース検出方法により、３次元細胞組織中のグルコースの存在を連続的にモニタリングすることを特徴とする、グルコースの連続的モニタリング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３次元細胞組織内に存在するグルコースを連続的に測定可能な蛍光マイクロ粒子、及び当該蛍光マイクロ粒子を用いた連続的グルコースモニタリングに関する。
【背景技術】
【０００２】
臓器などの生体組織は、細胞により形成される３次元構造を有する。生体組織の生物学的機能は、細胞間の相互作用および周囲の環境を通して組織の内部に現れることが知られている。近年、臓器や組織の置換を目指した再生医療研究や動物実験に代わるヒト細胞のチップを用いた医薬品評価のための“Ｏｒｇａｎ ｏｎ ａ ｃｈｉｐ”研究など、様々な分野で３次元組織構築の技術が注目を集めている。かかる３次元組織培養においては、スフェロイドのような細胞凝集体が用いられ、当該スフェロイド等の内部におけるグルコース濃度のモニタリングは、培養系の環境を制御するだけでなく、細胞代謝のメカニズム等を明らかにするためにも有用である（例えば、非特許文献１）。【０００３】
しかしながら、従来、スフェロイド等の３次元細胞組織内部の局所的な環境を観察した例は少なく、そのほとんどが尖鋭化した酵素電極を細胞凝集体に挿し、得られる電流値により細胞凝集体内部のグルコース濃度を測定したものである。このような酵素電極を用いた方法は電極の尖鋭化に限界があり、ｐＨや電極表面へタンパク質の吸着など周囲の環境の影響を受けやすく精度点で問題があった。また、電極の挿入による侵襲のみならず、測定時にグルコースを消費し、グルコラクトンや過酸化水素を放出するため細胞凝集体へのダメージが懸念されていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】C. C. Dibble and B. D. Manning, Nature Cell Biology 15, 555--564 (2013)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明は、簡便、高精度かつ非侵襲に、スフェロイド等の３次元細胞組織の内部におけるグルコースを連続的に計測可能な新規な検出用材料及び検出手法を提供することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った結果、平均粒径がマイクロメートルのオーダーである微粒子の表面上に、グルコースとの結合により蛍光応答を示す蛍光色素分子、及び標的となる３次元細胞組織と接着することができる細胞接着性分子を共有結合により修飾することで、グルコース濃度の増減に対応し蛍光強度を変化させるグルコース応答性蛍光マイクロ粒子を作製することができ、当該蛍光マイクロ粒子を用いることで、簡便、高精度かつ非侵襲で、スフェロイド等の３次元細胞組織の内部におけるグルコースを連続的にモニタリングできることを見出し、かかる知見に基づき、本発明を完成するに至ったものである。【０００７】
すなわち、本発明は、一態様において、
＜１＞３次元細胞組織内のグルコースを測定するための蛍光マイクロ粒子であって、平均粒径がマイクロメートルのオーダーであるコア粒子と、グルコースとの結合により蛍光応答を示す蛍光色素ユニットと、細胞接着性分子を有する細胞接着ユニットとを含み；前記蛍光色素ユニット及び前記細胞接着ユニットが、前記コア粒子の表面上に共有結合によって固定化された構造を有する、
該蛍光マイクロ粒子；
＜２＞前記コア粒子が、それぞれ表面上に修飾用官能基を有する含ケイ素材料、高分子ポリマー、及び金属微粒子よりなる群から選択される、上記＜１＞に記載の蛍光マイクロ粒子；
＜３＞前記コア粒子が、表面上に修飾用官能基を有する多孔質材料である、上記＜１＞に記載の蛍光マイクロ粒子；
＜４＞前記修飾用官能基が、カルボキシル基、チオール基、イソシアノ基、チオイソシアノ基、エポキシ基、活性カルボン酸エステル、マレイミド基、アセチル基、及びアジド基よりなる群から選択される１以上の官能基である、請求項２又は３に記載の蛍光マイクロ粒子；
＜５＞前記コア粒子が、１００ｎｍ〜１００μｍの平均粒径を有する、上記＜１＞〜＜４＞のいずれか１に記載の蛍光マイクロ粒子。
＜６＞前記細胞接着ユニットが、４以上のアミノ酸残基よりなるポリペプチド又はオリゴペプチドを含む、上記＜１＞〜＜５＞のいずれか１に記載の蛍光マイクロ粒子；
＜７＞前記細胞接着ユニットが、コラーゲン、ゼラチン、プロテオグリカン、ヒアルロン酸、フィブロネクチン、ラミニン、テネイシン、エンタクチン、エラスチン、及びそれらに由来する化合物よりなる群から選択される１種以上を含む、上記＜１＞〜＜５＞のいずれか１に記載の蛍光マイクロ粒子；
＜８＞前記蛍光色素ユニットが蛍光団及び消光団を有しており；グルコース非存在下では前記消光団により前記蛍光団が消光されているが、前記消光団がグルコースと結合することによって蛍光団が発光することにより蛍光応答を示す、上記＜１＞〜＜７＞のいずれか１に記載の蛍光マイクロ粒子；
＜９＞前記蛍光団がアントラセンを有し、前記消光団がアリールボロン酸を有する、上記＜８＞に記載の蛍光マイクロ粒子；
＜１０＞前記蛍光色素ユニットが末端に１又は複数のアミノ基を有し、当該アミノ基を介した共有結合によって前記コア粒子の表面に固定化されている、上記＜１＞〜＜９＞のいずれか１に記載の蛍光マイクロ粒子；及び
＜１１＞前記蛍光色素ユニットが以下の式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される、
【化１】
2019142913.tif 000003
【化２】
2019142913.tif 000004
（式（ＩＩ）において、「ＰＥＧ」は、ポリエチレングリコール鎖を表す。）
上記＜１＞〜＜１０＞のいずれか１に記載の蛍光マイクロ粒子を提供するものである。【０００８】
別の態様において、本発明は、
＜１２＞上記＜１＞〜＜１１＞のいずれか１に記載の蛍光マイクロ粒子を含む、グルコースモニタリングセンサー；
＜１３＞上記＜１＞〜＜１１＞のいずれか１に記載の蛍光マイクロ粒子を用いて３次元細胞組織中のグルコースの存在を蛍光応答として検出する工程を含む、グルコース検出方法；及び
＜１４＞上記＜１３＞に記載のグルコース検出方法により、３次元細胞組織中のグルコースの存在を連続的にモニタリングすることを特徴とする、グルコースの連続的モニタリング方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、測定対象であるスフェロイド等の３次元細胞組織内に適した大きさにマイクロ粒子のサイズを調整することができ、周囲の環境の変化に影響を受けずに測定できるため、高精度でグルコースの存在及ぶ濃度を測定することができる。また、測定時にグルコースを消費せずに非接触で測定するため、３次元細胞組織内における侵襲を小さく抑えられ、よりありのままに近い状態で、３次元細胞組織内におけるグルコース濃度をマッピングすることが可能になる。【００１０】
臓器や組織の置換を目指した再生医療研究や動物実験に代わるヒト細胞のチップを用いた医薬品評価等を目的として３次元組織構築の研究が隆盛を極める昨今、３次元組織の評価系の構築という観点から本発明の意義は大きいものである。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本発明の蛍光マイクロ粒子の電子顕微鏡イメージ及び蛍光イメージ画像である。（ａ）ＧＦ−ｐａｒｔｉｃｌｅ、（ｂ）ＧＦ−ＲＧＤ−ｐａｒｔｉｃｌｅ、（ｃ）ＧＦ−Ｃｏｌ−ｐａｒｔｉｃｌｅである。
【図２】図２は、本発明の蛍光マイクロ粒子のＳＥＭ画像である。（ａ）ＧＦ−ｐａｒｔｉｃｌｅ、（ｂ）ＧＦ−ＲＧＤ−ｐａｒｔｉｃｌｅ、（ｃ）ＧＦ−Ｃｏｌ−ｐａｒｔｉｃｌｅである。
【図３】図３は、本発明の蛍光マイクロ粒子に０〜１，０００ｍｇ／ｄＬのグルコースを添加した場合の（ａ）蛍光スペクトル変化を示すグラフ、及び（ｂ）４７０ｎｍにおける蛍光強度変化をプロットしたグラフである。
【図４】図４は、ＨｅｐＧ２（肝臓肝細胞）スフェロイドに本発明の蛍光マイクロ粒子を導入した場合の蛍光イメージ画像である。（ａ）ＧＦ−ｐａｒｔｉｃｌｅ、（ｂ）ＧＦ−ＲＧＤ−ｐａｒｔｉｃｌｅ、（ｃ）ＧＦ−Ｃｏｌ−ｐａｒｔｉｃｌｅである。
【図５】図５は、本発明の蛍光マイクロ粒子を用いてスフェロイド内部におけるグルコース濃度のモニタリングを行い得られた画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の実施形態について説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
【００１３】
本発明の蛍光マイクロ粒子は、３次元細胞組織内のグルコースを測定するための蛍光マイクロ粒子であって、
１）平均粒径がマイクロメートルのオーダーであるコア粒子と、
２）グルコースとの結合により蛍光応答を示す蛍光色素ユニットと、
３）細胞接着性分子を有する細胞接着ユニット
により構成されることを特徴する。さらに、前記蛍光色素ユニット及び前記細胞接着ユニットが、前記コア粒子の表面上に共有結合によって固定化された構造を有することを特徴とするものである。一般に、「マイクロ粒子」とは、サブミクロンからサブミリメータの粒径を有する粒子のことである。
【００１４】
かかる構成を有することにより、本発明の蛍光マイクロ粒子は、測定対象となるスフェロイド等の３次元細胞組織の内部に侵入できるサイズを有し、細胞接着ユニットにより当該３次元細胞組織に安定に接着することができる。そして、コア粒子の表面にグルコース濃度の増減に対応して蛍光強度を変化させる蛍光色素ユニットを備えるため、その蛍光応答を観測することで３次元細胞組織を侵襲することなく、３次元細胞組織内部のグルコースの存在及び濃度を高精度かつ連続的に測定及びモニタリングすることができるというものである。ここで、「３次元細胞組織」とは、複数の細胞同士が集合・凝集化した３次元形状（典型的には球状）の細胞集合体であって、細胞凝集体或いはスフェロイドとも呼ばれる。
【００１５】
以下、本発明の蛍光マイクロ粒子の構成要素についてそれぞれ説明する。
【００１６】
１．コア粒子
コア粒子は、マイクロメートルのオーダーの平均粒径を有するマイクロ粒子（マイクロ微粒子）であり、本発明の蛍光マイクロ粒子の基材となるものである。用いるコア粒子のサイズを適宜変更することで、蛍光マイクロ粒子を所望の大きさに調節することが可能である。コア粒子の平均粒径は、１００ｎｍ〜１００μｍ、好ましくは１〜２０μｍであり、より好ましくは、２〜１０μｍである。
【００１７】
コア粒子の材料は、細胞組織等の生体に対して用いることができる材料であれば特にその種類についての制限はなく、ある程度均一な粒径を有する粒子形状を有する材料、或いはかかる粒子形状に加工可能な材料であることができる。典型的には、コア材料としては、含ケイ素材料、高分子ポリマー、及び金属微粒子を用いることができる。例えば、含ケイ素材料としては、シリカゲルやゼオライトなどを挙げることができる。また、高分子ポリマーの例としては、ポリスチレンやナイロンなどを挙げることができ、金属微粒子の例としては、金（Ａｕ）微粒子を挙げることができる。その他にも、高分子ポリマーとして、ポリ乳酸、ポリエチレン、ポリフェノール、ポリウレタン、ポリアクリル、ベンゾアミンメラミン、ポリカーボネート、ポリオレフィン、ポリエステルなどを用いることもできる。
【００１８】
また、別の観点から、コア粒子は、多孔質材料であることが好ましい。本発明の蛍光マイクロ粒子では、コア粒子の表面上に蛍光色素ユニットが固定化されるが、多孔質材料を用いることで、粒子内部にも蛍光分子を固定化することができ、これにより、蛍光分子とグルコースとの結合において周囲環境の影響を受け難くすることができるという利点を奏する。かかる多孔質材料としては、メソポーラスシリカやゼオライトなどの無機ポーラス材料、ポリスチレンビーズなどの多孔質ポリマー材料を挙げることができる。その他にも、ポリ乳酸、ポリエチレン、ポリフェノール、ポリウレタン、ポリアクリル、ベンゾアミンメラミン、ポリカーボネート、ポリオレフィン、ポリエステルなどの多孔質ポリマー材料を用いることができる。コア粒子が多孔質材料である場合、例えば、かさ密度は３．０〜４．５ｇ／ｃｍ３であることができる。
【００１９】
上述のように、これらコア粒子は、その表面上に蛍光色素ユニットと細胞接着ユニットを修飾して固定化するための修飾用官能基を有する。コア粒子表面上の修飾用官能基と、蛍光色素ユニット等の末端に存在する官能基が反応することで共有結合を形成させ、これら機能性ユニットを化学的にコア粒子の表面に固定することができる。かかる修飾用官能基の例としては、カルボキシル基、チオール基、イソシアノ基、チオイソシアノ基、エポキシ基、活性カルボン酸エステル、マレイミド基、アセチル基、及びアジド基よりなる群から選択される１以上の官能基を挙げることができる。例えば、修飾用官能基がカルボキシル基であり、蛍光色素ユニットや細胞接着ユニットがアミノ基を有する場合、これらユニットはアミド結合を形成することでコア粒子の表面上に固定化される。コア粒子の表面上への修飾用官能基の付与には、当該技術分野において公知の手法を用いることができる。
【００２０】
かかる表面上に修飾用官能基を有するコア粒子の例示としては、表面にカルボキシル基を修飾したシリカゲル、側鎖にカルボキシル基を有するポリマー粒子、表面にチオール基を有する金微粒子などを挙げることができる。ただし、これらに限定されるものではない。
【００２１】
なお、測定対象であるグルコースがヒドロキシル基（ＯＨ基）を有するものであるため、コア粒子は表面上にＯＨ基を有しないことが好ましい。例えば、シリカゲルの場合には、シランカップリングによって表面処理を行うことができる。
【００２２】
２．細胞接着ユニット
細胞接着ユニットは、本発明の蛍光マイクロ粒子に細胞接着性を付与するものである。これにより、蛍光マイクロ粒子が３次元細胞組織に近接した場合に、当該細胞に接着しその内部（或いは表面）に安定に存在することができ、グルコースの存在による蛍光応答変化をより高精度に検出することができる。
【００２３】
好ましくは、細胞接着ユニットは、細胞接着因子として、４以上のアミノ酸残基よりなるポリペプチド又はオリゴペプチドを含むことができる。例えば、細胞接着ユニットは、コラーゲン、ゼラチン、プロテオグリカン、ヒアルロン酸、フィブロネクチン、ラミニン、テネイシン、エンタクチン、エラスチン、及びそれらに由来する化合物よりなる群から選択される１種以上を含むことができる。これらの混合物を用いることもできる。
【００２４】
「コラーゲン」とは、真皮、靭帯、腱、骨、軟骨などを構成するたんぱく質のひとつであり、細胞外マトリックスを構成する要素である。コラーゲンタンパク質のペプチド鎖は、“−（グリシン）−（アミノ酸Ｘ）−（アミノ酸Ｙ）−”と、グリシンが３残基ごとに繰り返す一次構造を有する。多くの型のコラーゲンでは、このペプチド鎖が３本集まり、らせん構造を形成し、トロポコラーゲンと呼ばれる。例えば、Ｉ型コラーゲンの１本のペプチド鎖は１０１４アミノ酸残基繰返す配列を持っており、分子量は１０万程度である。ヒトのコラーゲンには、３０種類以上あることが知られており、例えば、真皮、靱帯、腱、骨などではＩ型コラーゲンが、関節軟骨ではＩＩ型コラーゲンが主成分である。また、すべての上皮組織の裏打ち構造である基底膜にはＩＶ型コラーゲンが主に含まれている。体内で最も豊富に存在しているのはＩ型コラーゲンである。好ましくは、水可溶性コラーゲンを用いることができる。また、「ゼラチン」とは、コラーゲンのうち水で長時間加熱することで、水に抽出されたものを意味する。ゼラチンは、ペプチド化されていてもよい。
【００２５】
より好ましくは、細胞接着ユニットは、哺乳動物または魚由来のコラーゲン、アテロコラーゲン、ゼラチン、それらの誘導体及びこれらの混合物を用いることができる。「アテロコラーゲン」とは、コラーゲン分子の両端に存在するテロペプチドを酵素処理で取り外したコラーゲンであり、水に可溶となったコラーゲンである。アテロコラーゲンは、ペプチド化されていてもよい。
【００２６】
細胞接着ユニットは、それらに本来的に含まれる官能基或いは修飾により導入された官能基によって、上記コア粒子の表面上に修飾用官能基との反応により共有結合を形成し、当該コア粒子の表面上に固定化されることができる。細胞接着ユニットの官能基としては、アミノ基等が例示される。
【００２７】
３．蛍光色素ユニット
本発明の蛍光マイクロ粒子は、グルコースとの結合により蛍光応答を示す蛍光色素ユニットを少なくともその表面に含む。これにより、３次元細胞組織内のグルコースの存在を蛍光応答として検出することができる。
【００２８】
当該蛍光色素ユニットは、好ましくは、蛍光色素ユニットが蛍光団及び消光団を有している。「蛍光団」は、特定の波長で励起されることにより蛍光を発する分子を含む部位である。「消光団」は、当該蛍光団との相互作用により蛍光団からの発光を低減し得る電子受容体を含む部位であり、かつ、グルコースとの結合によりかかる消光作用が解消されて、蛍光団の発光を再び生じさせるものである。これにより、グルコース非存在下では前記消光団により前記蛍光団が消光されているが、前記消光団がグルコースと結合することによって蛍光団が発光することにより、グルコースの存在をＯＮ−ＯＦＦの蛍光応答として検出すること可能となる。
【００２９】
好ましくは、前記蛍光団がアントラセンを有し、前記消光団がアリールボロン酸を有するものである。ただし、グルコースとの結合によって蛍光応答を示すものであれば、場合によっては、これらに限定されず、当該技術分野における公知の蛍光団と消光団の組み合わせを用いることもできる。
【００３０】
また、当該蛍光色素ユニットは、前記コア粒子の表面に共有結合によって固定化されている。したがって、好ましくは、蛍光色素ユニットが、上記コア粒子の表面上の修飾用官能基と化学反応により共有結合を形成し得る官能基を有する。典型的には、蛍光色素ユニットは、その末端に１又は複数のアミノ基を有し、当該アミノ基と上記修飾用官能基との共有結合によって蛍光マイクロ粒子表面に固定化されている。
【００３１】
本発明の蛍光マイクロ粒子において用いられる蛍光色素ユニットの好ましい例としては、以下の式（Ｉ）で表される化合物が挙げられる。
【化３】
2019142913.tif 000005
【００３２】
式（Ｉ）で表される化合物において、中央部のアトラセンが蛍光団であり、その両側の２つのアリールボロン酸が消光団である。以下の平衡式に示すように、グルコース非存在下ではアリールボロン酸部位によりアトラセンの蛍光は消光されているが、アリールボロン酸部位とグルコースが結合すると、分子内の窒素原子とホウ素原子の静電相互作用によりアントラセン部位への電子移動が抑えられ、消光作用が解消してアトラセンの蛍光発光が生じる。かかる認識機構によって、グルコースの存在をＯＮ−ＯＦＦの蛍光応答として検出することができる。
【化４】
2019142913.tif 000006
【００３３】
また、式（Ｉ）の化合物は、末端に２つのアミノ基を有しており、当該アミノ基が、上記コア粒子の表面上の修飾用官能基と反応することによって、当該蛍光色素ユニットを蛍光マイクロ粒子表面に共有結合により固定化することができる。なお、ここでは、式（Ｉ）の化合物の末端の官能基がアミノ基である例を示したが、これに限定されず、コア粒子の表面上の修飾用官能基と共有結合し得る官能基であれば用いることができることは当業者には理解可能であろう。
【００３４】
本発明の蛍光マイクロ粒子において用いられる蛍光色素ユニットの別の好ましい例としては、以下の式（ＩＩ）で表される化合物が挙げられる。
【化５】
2019142913.tif 000007
【００３５】
式（Ｉ）において、「ＰＥＧ」は、ポリエチレングリコール鎖を表す。当該ポリエチレングリコール鎖は、好ましくは、繰り返し単位が２〜６０である。ただし、当該ポリエチレングリコール鎖の長さは、適宜変更して用いることができる。
【００３６】
式（ＩＩ）で表される化合物も、上記式（Ｉ）の化合物と同様に、中央部のアトラセンが蛍光団であり、その両側の２つのアリールボロン酸が消光団である。したがって、グルコースの存在をＯＮ−ＯＦＦの蛍光応答として検出する機構は、上述のとおりである。
【００３７】
一方、式（ＩＩ）で表される化合物は、上記式（Ｉ）の化合物と異なり、末端に２つのマレイミド基を有している。当該マレイミド基が、上記コア粒子の表面上の修飾用官能基と反応することによって、当該蛍光色素ユニットを蛍光マイクロ粒子表面に共有結合により固定化することができる。
【００３８】
４．蛍光マイクロ粒子の調製
本発明の蛍光マイクロ粒子は、当該技術分野において公知のゲル作製方法により調製することができる。例えば、表面上にカルボキシル基等の修飾用官能基を有するマイクロ粒子材料は市販されているため、後述の実施例で示すように、かかるマイクロ粒子材料をコア粒子として用い、公知のアミド縮合剤を用いて、細胞接着ユニットと蛍光色素ユニットとを順にコア粒子の表面上に修飾・固定化することにより、本発明の蛍光マイクロ粒子を得ることができる。蛍光色素ユニットと細胞接着ユニットの表面修飾率は適宜調整することができる。アミド縮合剤の例としては、ＤＭＴ−ＭＭを挙げることができる。
【００３９】
５．蛍光マイクロ粒子を用いたグルコース検出及びモニタリング
さらに、本発明は、上述の蛍光マイクロ粒子を用いて、スフェロイド等の３次元細胞組織内のグルコースを検出・モニタリングする方法、及び当該蛍光マイクロ粒子を含むセンサーにも関する。具体的には、本発明の蛍光マイクロ粒子を測定対象である３次元細胞組織と接触させ、特定の波長の光を照射することによって、３次元細胞組織内のグルコースの存在を蛍光応答として検出することができる。
【００４０】
本発明の蛍光マイクロ粒子は、例えば、３次元細胞培養における培養液中に含有させスフェロイドを形成することで、３次元細胞組織内に導入することができる。さらに、ＬＥＤ等の光源；光電子増倍管等の検出器；無線データ転送システム等を備える小型センサーデバイスを作製し、培養系に適用することで、連続的なグルコースモニタリングセンサーとして用いることができる。なお、蛍光シグナルの検出は、蛍光測定装置や顕微鏡など当該技術分野において公知の装置やシステム等を用いることができる。
【実施例】
【００４１】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【実施例１】
【００４２】
１．蛍光マイクロ粒子の調製
以下の試料を用いて本発明の蛍光マイクロ粒子を調製した。
１）コア粒子：ポリスチレン（平均粒径１５μｍ）
細胞接着ユニット：アテロコラーゲン、ＲＧＤペプチド
アミド縮合剤：ＤＭＴ−ＭＭ（社製）
グルコース応答性蛍光色素：アリールボロン酸化アントラセン誘導体Ａ（製品名「G55」：株式会社ＮＡＲＤ社製）
２）コア粒子：ナイロン多孔質ビーズ（平均粒径15μｍ；かさ密度３．０〜４．５ｇ／ｃｍ３）
細胞接着ユニット：アテロコラーゲン、ＲＧＤペプチド
アミド縮合剤：ＤＭＴ−ＭＭ（社製）
グルコース応答性蛍光色素：アリールボロン酸化アントラセン誘導体Ａ（製品名「G55」：株式会社ＮＡＲＤ社製）
【化６】
2019142913.tif 000008
【００４３】
アミド縮合剤を用いて、以下の３種類の蛍光色素固定化マイクロ粒子を調製した。グルコース応答性蛍光色素のみ表面に固定化したマイクロ粒子（ＧＦ−ｐａｒｔｉｃｌｅ）、蛍光色素とＲＧＤペプチドを表面に固定化したマイクロ粒子（ＧＦ−ＲＧＤ−ｐａｒｔｉｃｌｅ）、蛍光色素とアテロコラーゲンを表面に固定化したマイクロ粒子（ＧＦ−Ｃｏｌ−ｐａｒｔｉｃｌｅ）。ＲＧＤペプチドおよびアテロコラーゲンは、いずれも細胞接着性を有する分子である。【００４４】
具体的には、マイクロ粒子とコラーゲン溶液を混ぜ、そこに縮合剤であるＤＭＴ−ＭＭを添加し、その後蛍光色素を添加する手順で各蛍光マイクロ粒子を調製した。
【実施例２】
【００４５】
２．蛍光マイクロ粒子による３次元細胞組織内のグルコース応答性の評価
実施例１で得た３種の蛍光マイクロ粒子を用いてグルコースの蛍光応答を評価した。【００４６】
グルコース応答性色素（ＧＦ色素）は、それぞれ特異的グルコース認識部位として作用する、及び蛍光発生部位として作用するアントラセンを含む。従って、上述のように、グルコース分子が存在しない場合には蛍光は消光されているが、グルコース分子がジボロン酸部分に結合すると、蛍光発光を示す。【００４７】
まず、スフェロイドに導入する以前の状態における蛍光マイクロ粒子の電子顕微鏡イメージ及び蛍光イメージを図１に、それらのＳＥＭ画像を図２に示す。いずれの図も、（ａ）ＧＦ−ｐａｒｔｉｃｌｅ、（ｂ）ＧＦ−ＲＧＤ−ｐａｒｔｉｃｌｅ、（ｃ）ＧＦ−Ｃｏｌ−ｐａｒｔｉｃｌｅである。これらの画像から、微粒子に蛋白質が修飾できており、均質な粒子がたもたれていることが分かる。【００４８】
これら蛍光マイクロ粒子に０〜１，０００ｍｇ／ｄＬのグルコースを添加した場合の蛍光スペクトル変化を図３（ａ）に示す（励起波長：４０５ｎｍ）。４７０ｎｍにおける蛍光強度変化をプロットしたものが図３（ｂ）である。この結果、グルコース応答性色素は、グルコース濃度の増加に応じて、蛍光強度が増大することを確認した。【００４９】
次に、これら蛍光マイクロ粒子を、超低付着性多層プレートを用いてＨｅｐＧ２（肝臓肝細胞）のスフェロイド中に導入し、ルコース応答性試験を行った。グルコース濃度をモニターするために、タイムラプスビデオを用いて蛍光マイクロ粒子の蛍光強度を観察した。【００５０】
図４に、それぞれスフェロイドに導入後の蛍光イメージ画像を示す。細胞接着性分子を含まない「ＧＦ−ｐａｒｔｉｃｌｅ」では、スフェロイドとの結合は見られなかった。一方、ＲＧＤペプチドを有する「ＧＦ−ＲＧＤ−ｐａｒｔｉｃｌｅ」では、スフェロイドへの接着は見られたものの、蛍光強度の増大は見られなかった。これらに対し、アテロコラーゲンを有する「ＧＦ−Ｃｏｌ−ｐａｒｔｉｃｌｅ」では、スフェロイドに接着するとともに、グルコースとの結合による蛍光強度の増大が観測された。このことは、グルコースモニタリングのためには、細胞接着性分子としてＲＧＤペプチドでは安定性に欠き、より長い４以上のアミノ酸残基を有するペプチド鎖が有効であることを示唆するものである。【００５１】
さらに、「ＧＦ−Ｃｏｌ−ｐａｒｔｉｃｌｅ」を用いて、スフェロイド内部におけるグルコース濃度のモニタリングを行った結果を図５に示す（０〜２時間経過後）。その結果、蛍光強度は時間とともに減少し、グルコース消費を経時的に観測することができた。これは、「ＧＦ−Ｃｏｌ−ｐａｒｔｉｃｌｅ」を用いてスフェロイド内部のグルコース濃度を好適に測定できることを実証するものである。【００５２】
なお、図５に示す結果では、回転楕円体の中心に近い領域ほど蛍光の減少率が高かった。これは、スフェロイド（Ｄ＝１ｍｍ）が大きすぎて、十分な量のグルコースをスフェロイドの中心に移動させることができなかったことものと考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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