(57)【要約】【課題】本発明は、マングローブ土壌メタゲノム由来のポリマー合成酵素遺伝子、及びこのポリマー合成酵素を用いた有用なコポリマーの製造方法を提供することにある。また、本発明の別の目的は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種ＣＦＭＲ７由来のエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子、及びこのエノイル−ＣｏＡヒドラターゼの発現によって３ＨＨｘの組成が増大する有用なコポリマーＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）の製造方法を提供することである。【解決手段】これらの課題を解決するために、配列番号１又は３に記載のアミノ酸配列、又は、１つ以上のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加された配列番号１又は３に記載のアミノ酸配列を含み、かつポリマー合成酵素活性又はヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は、１つ以上のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加された配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、かつポリマー合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号２に記載のヌクレオチド配列、若しくは、１つ以上のヌクレオチドが置換された配列番号２に記載のヌクレオチド配列、又はその相補配列を含む、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号２に記載のヌクレオチド配列において、チミンがウラシルによって置換されているヌクレオチド配列又はその相補配列を含む、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【請求項５】
プラスミド又はファージである、請求項４に記載の組換えベクター。
【請求項６】
請求項４に記載の組換えベクターによって形質転換された形質転換体。
【請求項７】
重合性材料を含む培地で、請求項６に記載の形質転換体を培養する工程と、
前記培養された培地からポリマーを回収する工程と、
を含むポリマーの製造方法。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチドをゲノムに有する組換え株。
【請求項９】
重合性材料を含む培地で、請求項８に記載の組換え株を培養する工程と、
前記培養された培地からポリマーを回収する工程と、
を含むポリマーの製造方法。
【請求項１０】
前記ポリマーがポリヒドロキシアルカノエートである、請求項７又は９に記載のポリマーの製造方法。
【請求項１１】
配列番号３に記載のアミノ酸配列、又は、１つ以上のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加された配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、かつヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１２】
配列番号４に記載のヌクレオチド配列、若しくは、１つ以上のヌクレオチドが置換された配列番号２に記載のヌクレオチド配列、又はその相補配列を含む、請求項１１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１３】
配列番号４に記載のヌクレオチド配列において、チミンがウラシルによって置換されているヌクレオチド配列、又はその相補配列を含む、請求項１１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチドを含み、及び、ポリマー合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを更に含む組換えベクター。
【請求項１５】
プラスミド又はファージである、請求項１４に記載の組換えベクター。
【請求項１６】
請求項１４に記載の組換えベクターによって形質転換された形質転換体。
【請求項１７】
重合性材料を含む培地で、請求項１４に記載の形質転換体を培養する工程と、
前記培養された培地からポリマーを回収する工程と、
を含むポリマーの製造方法。
【請求項１８】
請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチドをゲノムに有する組換え株。
【請求項１９】
重合性材料を含む培地で、請求項１８に記載の組換え株を培養する工程と、
前記培養された培地からポリマーを回収する工程と、
を含むポリマーの製造方法。
【請求項２０】
前記ポリマーがポリヒドロキシアルカノエートである、請求項１７又は１９に記載のポリマーの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マングローブ土壌メタゲノム由来のポリマー合成酵素をコードする遺伝子及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種ＣＦＭＲ７（受託番号：ＣＰ０１１５２２）由来のエノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子に関する。より詳細には、本発明は、一緒に使用すると高分子量のコポリマーの合成をもたらすポリマー合成酵素及びエノイル−ＣｏＡヒドラターゼをそれぞれコードする機能的遺伝子について詳述する。
【背景技術】
【０００２】
ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡｓ）は、栄養制限及びストレス条件下において、貯蔵化合物（予備炭素）として微生物（細菌及び古細菌）から生成されるバイオポリエステルである。合成プラスチックと比較したＰＨＡの主な利点は、石油化学由来のプラスチックと同様の物理化学的特性を有することに加えて、その生分解性、生体適合性及び持続性である。ＰＨＡの重合に関与する重要な酵素は、ＰＨＡ合成酵素（ＰｈａＣ）である。ＰｈａＣは、細胞質の親水性環境において高分子量の疎水性ＰＨＡ鎖を重合することができるので興味深い酵素である。【０００３】
ＰＨＡの多様性に関する現在の知見において、ＰＨＡプロデューサー及びＰｈａＣは、主に、培養依存的アプローチを用いた純粋な微生物の単離物に関する研究から得られたものである。属に基づく合計４種のＰｈａＣ及び１６７ＰＨＡプロデューサーは、既存の培養可能な土壌微生物から報告されており、その既存の培養可能な土壌微生物は、土壌微生物全体の１５％以下であると考えられている。残りの８５％はまだ調査されていない。従って、この調査されていない微生物群のプールから、ＰＨＡプロデューサーの多様性を理解するには大きな知見の隔たりがある。【０００４】
マングローブ土壌生物群系は、高い微生物の多様性を含み、生理食塩水及び無酸素状態などの様々な非生物的ストレスに連続的に曝される。いくつかの研究では、マングローブ環境からのＰＨＡプロデューサーの分離が報告されている。しかしながら、マングローブ土壌メタゲノム由来のＰｈａＣに関する研究は報告されていない。従って、マングローブ土壌メタゲノムにおける新たな微生物属、特に研究室で培養するのが困難な嫌気性微生物から多数の新規ＰｈａＣを発見する可能性が高い。【０００５】
ＰＨＡの特性は、二次モノマーの取り込み及び／又は組成を制御することによって、様々な用途に適合させることができる。細菌のＰＨＡは、短鎖長（ｓｃｌ）、中鎖長（ｍｃｌ）及びｓｃｌ−ｍｃｌの組み合わせのように、モノマー単位中の炭素原子の数に依存して３つの主な型に分けることができる。ｓｃｌ−ＰＨＡは３〜５個の炭素原子からなり、ｍｃｌ−ＰＨＡは６〜１４個の炭素原子を有するが、ｓｃｌ−ｍｃｌ−ＰＨＡ中の炭素原子の数はモノマー当たり３〜１４個の範囲であり得る。生成されるＰＨＡの種類は、ポリマー合成酵素の基質特異性に依存する。主としてｓｃｌモノマーからなるＰＨＡはしばしば固くて脆いが、主にｍｃｌモノマーからなるＰＨＡは本質的に弾性である。Ｓｃｌ−ｍｃｌ ＰＨＡコポリマーは、コポリマー中のｓｃｌモノマーとｍｃｌモノマーとの比に依存して、２つの状態の間の特性を有することができる。【０００６】
ｐｈａＪによってコードされるエノイル−ＣｏＡヒドラターゼは、生合成中に、（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡモノマー単位、例えば、脂肪酸β酸化からの３−ヒドロキシヘキサノエート補酵素Ａ（３ＨＨｘ−ＣｏＡ）をポリ（３−ヒドロキシブチラート−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサノエート）［Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）］コポリマーに供給する、（Ｒ）特異的ヒドラターゼ活性を示す。【０００７】
ポリマー合成酵素及びそれをコードする遺伝子に関する先行技術として、いくつかの特許技術が報告されている。特許文献１（米国特許第６，８１２，０１３号）は、ＰＨＡの調製プロセスにおいて有用なＰＨＡ合成酵素、該酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該ベクターにより形質転換された形質転換体、該形質転換体を利用したＰＨＡ合成酵素の生成プロセス及び該形質転換体を利用したＰＨＡの調製プロセスに関するものである。この発明の特徴は、培養してＰＨＡ合成酵素又はＰＨＡを生成する宿主微生物にＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子を導入した形質転換体であることである。【０００８】
また、特許文献２（米国特許第２００４−１４６９９８号）は、形質転換体及び該形質転換体を用いたポリマーの生成プロセスに関するものである。この発明は、コポリマー合成酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を利用したポリマーの発酵合成用微生物、及び微生物によるポリマーの生成方法に関して開示している。この発明は、ポリエステル合成関連酵素遺伝子、プロモーター及びターミネーターを含み、酵母に導入された形質転換体の構築に着目している。【０００９】
改良された形質転換体及び該形質転換体を用いたポリマーの生成プロセスは、特許文献３（欧州特許第１６２６０８７号）に開示されている。この発明は、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ由来ＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子を含む遺伝子発現カセットを開示している。酵母は宿主としても使用され、プロモーター及びターミネーターに変異が導入されているので、遺伝子カセットが酵母内で機能することが可能になる。【００１０】
その他特許技術として、ポリマー合成酵素をコードする遺伝子と他の遺伝子との組み合わせが開示されている。特許文献４（米国特許第２００８−２３３６２０号）は、酵母において遺伝子発現産物を産生するための形質転換体及びプロセスを開示する。形質転換体はＰＨＡ合成に関与する複数の酵素遺伝子、例えばＰＨＡ合成酵素とアセトアセチルＣｏＡ還元酵素遺伝子との組み合わせを導入することにより得られる。特許文献５（米国特許第２００３−１４６７０３号）には、ＰＨＡ合成酵素と細胞内ＰＨＡデポリメラーゼの両方を発現する組換え微生物が開示されている。この発明は、ＰＨＡの同時合成及び分解を可能とする発明である。【００１１】
特許文献６（米国特許第２０１２−０８８２８０号）には、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属由来の新規なポリマー合成酵素と、該酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該ベクターにより形質転換された形質転換体と、この形質転換体を用いたプラスチックポリマーの製造工程が開示されている。【００１２】
ほとんどの特許技術は、形質転換体及び開示された形質転換体を用いてポリマー又はＰＨＡを生成するプロセスに関するものである。しかしながら、これらの特許技術は、異なる生物種のゲノムの異なる領域に由来するＰＨＡ合成酵素遺伝子を含んでいた。これまで、メタゲノムＤＮＡからのポリマー合成酵素の単離を開示する特許技術は存在していない。従って、本発明は、ポリマー合成酵素遺伝子の改良されたＤＮＡ断片を提供して、組換えベクター及び形質転換体を生成することが望ましい。この形質転換体は、ＰＨＡ生成のための基質特異性が広いポリマー合成酵素に、様々な用途に適合させることができる特性を付与する上で有用であり得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許第６，８１２，０１３号
【特許文献２】米国特許第２００４−１４６９９８号
【特許文献３】欧州特許第１６２６０８７号
【特許文献４】米国特許第２００８−２３３６２０号
【特許文献５】米国特許第２００３−１４６７０３号
【特許文献６】米国特許第２０１２−０８８２８０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の主な目的は、マングローブ土壌メタゲノム由来のポリマー合成酵素遺伝子、及びこのポリマー合成酵素を用いた有用なコポリマーの製造方法を提供することにある。【００１５】
本発明の別の目的は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種ＣＦＭＲ７由来のエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子、及びこのエノイル−ＣｏＡヒドラターゼの発現によって３ＨＨｘの組成が増大する有用なコポリマーＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）の製造方法を提供することである。【００１６】
本発明の更に別の目的は、ポリマー合成酵素を含有する形質転換体を用いることによってより高分子量の３ＨＨｘコポリマーをより効率的に製造する方法を開発することである。【００１７】
本発明の更に別の目的は、ポリマー合成酵素を含有する形質転換体を用いることにより、４ＨＢ及び５ＨＶなどのリパーゼ分解性モノマー配列を有するコポリマーをより効率的に製造する方法を開発することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は、１つ以上のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加された配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、かつポリマー合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを開示する。【００１９】
本発明のポリヌクレオチドの一実施形態によれば、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号２に記載のヌクレオチド配列、若しくは、１つ以上のヌクレオチドが置換された配列番号２に記載のヌクレオチド配列、又はその相補配列を含む。【００２０】
本発明のポリヌクレオチドの一実施形態によれば、配列番号２に記載のヌクレオチド配列において、チミンがウラシルによって置換されているヌクレオチド配列又はその相補配列を含む。【００２１】
別の発明は、配列番号３に記載のアミノ酸配列、又は、１つ以上のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加された配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、かつヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを開示する。【００２２】
本発明のポリヌクレオチドの一実施形態によれば、配列番号４に記載のヌクレオチド配列、若しくは、１つ以上のヌクレオチドが置換された配列番号２に記載のヌクレオチド配列、又はその相補配列を含む。【００２３】
本発明のポリヌクレオチドの一実施形態によれば、配列番号４に記載のヌクレオチド配列において、チミンがウラシルによって置換されているヌクレオチド配列、又はその相補配列を含む。【００２４】
本発明の更に別の実施形態は、先の実施形態に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクターである。好ましくは、組換えベクターはプラスミド又はファージである。【００２５】
本発明の更なる実施形態では、先の実施形態に記載のベクターによる形質転換体が開示される。【００２６】
本発明の更なる実施形態では、先の実施形態に記載のポリヌクレオチドをゲノムに有する組換え株である。【００２７】
本発明の別の更なる実施形態は、重合性材料を含有する媒体において、先の実施形態の形質転換体又は組み換え株を培養すること；及び培養された培地からポリマーを回収することを含む、ポリマーの製造方法である。好ましくは、ポリマーはＰＨＡである。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明の好ましい実施形態の１つに記載されるポリマー合成酵素のポリペプチドのアミノ酸配列である。
【図２】本発明の好ましい実施形態の１つに記載されるポリマー合成酵素をコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
【図３】本発明の好ましい実施形態の１つに記載のエノイル−ＣｏＡヒドラターゼのポリペプチドのアミノ酸配列である。
【図４】本発明の好ましい実施形態の１つに記載のエノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
【図５】本発明の好ましい実施形態の１つに記載のポリマー合成酵素のＰＣＲ増幅のために使用される増幅ヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
【図６】（ａ）本発明の実施形態の１つに記載の形質転換体によって合成されたコポリマーの１つであるＰ（３−ヒドロキシブチラート−ｃｏ−４−ヒドロキシブチラート）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルである。（ｂ）本発明の実施形態の１つに記載の形質転換体によって合成されたコポリマーの１つであるＰ（３−ヒドロキシブチラート−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサノエート）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルである。
【図７】本発明の実施形態の１つに記載の形質転換体によって合成されたコポリマーの１つであるＰ（３−ヒドロキシブチラート−ｃｏ−５−ヒドロキシバレレート）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルである。
【図８】ｐｈａＪを含まない形質転換体（ＰＨＢ−４／ｐＢＢＲＭＣＳ２＿ＣＢＰ−Ｍ−ＣＰＦ４）と、炭素源として（ａ）ＰＯ又は（ｂ）ＣＰＫＯを用いて生成されたポリマーの１Ｈ  ＮＭＲ分光法による分析結果である。
【図９】ｐｈａＪを含む形質転換体（ＰＨＢ−４／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２＿ＣＢＰ−Ｍ−ＣＰＦ４＿ＪＳｓ）と、炭素源として（ａ）ＰＯ又は（ｂ）ＣＰＫＯを用いて生成されたポリマーの１Ｈ  ＮＭＲ分光法による分析結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
次に、本発明の実施形態について詳細に説明する。
なお、本明細書に記載の実施形態は、本発明の範囲を限定するものではなく、当業者であれば、本発明が目的を実行し、上述した目的及び利点、並びにそれらに固有の目的及び利点を得るためによく適合していることを容易に理解するであろう。
【００３０】
また、本発明の理解を容易にする目的で、添付の図面には好ましい実施形態が示されており、以下の説明に関連して考慮される場合、その検討から本発明、その構成及び動作、並びにその多くの利点が容易に理解され、評価される。
【００３１】
本発明は、マングローブ土壌メタゲノム由来のポリマー合成酵素をコードする遺伝子、及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種ＣＦＭＲ７由来のエノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子に関する。より詳細には、本発明は、ポリマー合成酵素及びエノイル−ＣｏＡヒドラターゼをそれぞれコードするこれら機能的遺伝子、ポリマー合成酵素遺伝子若しくはエノイル−ＣｏＡヒドラターゼのみ又はその両方の遺伝子を有する組換えベクター、これらベクターを発現する形質転換細菌株、及びこれら機能的遺伝子を介してポリマーを生成するプロセスについて詳述する。
【００３２】
本発明は、Ｂａｌｉｋ  Ｐｕｌａｕ（マレーシア、ペナン）マングローブ土壌から発見された極めて広い基質特異性を有する新規なＰｈａＣ［ＰｈａＣＢＰ−Ｍ−ＣＰＦ４（受託番号：ＡＸＢ７２５０６）］について記載する。そのＰｈａＣは、ｓｃｌ−ＰＨＡコポリマー、ポリ（３−ヒドロキシブチラート−ｃｏ−３−ヒドロキシバレレート）ランダムコポリマー［Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）］、ポリ（３−ヒドロキシブチラート−ｃｏ−３−ヒドロキシ−４−メチルバレレート）ランダムコポリマー［Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３Ｈ４ＭＶ）］、ポリ（３−ヒドロキシブチラート−ｃｏ−４−ヒドロキシブチラート）ランダムコポリマー［Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−４ＨＢ）］及びポリ（３−ヒドロキシブチラート−ｃｏ−５−ヒドロキシバレレート）ランダムコポリマー［Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−５ＨＶ）］を生成し得た。このＰＨＡ合成酵素は、その４ＨＢ及び５ＨＶのリパーゼ分解性モノマー配列を取り込む能力により、様々な生物医学的用途に使用可能なＰＨＡの生合成に適している。更に、このＰＨＡ合成酵素は、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）を生成しており、ポリプロピレン（ＰＰ）及び低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）などの汎用プラスチックと同様の性質を有する、商業的に有用なＰＨＡコポリマーとして評価されている。
【００３３】
本発明は、ＰＨＡ重合のためのｍｃｌモノマーを供給することができるＰｈａＪ［ＰｈａＪＳｓ（受託番号：ＡＬＣ３０１９７）］についても記載する。このＰｈａＪは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種ＣＦＭＲ７株から発見された。それは生合成中に脂肪酸β酸化からの３ＨＨｘ−ＣｏＡをＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）に供給する（Ｒ）特異的ヒドラターゼ活性を示す。
【００３４】
以下、本発明の好ましい実施形態に従って添付の説明及び図面を参照して本発明を説明する。しかしながら、説明を本発明の好ましい実施形態及び図面に限定することは、単に本発明の議論を容易にすることに過ぎないことを理解すべきであり、当業者は添付の特許請求の範囲から逸脱することなく様々な変更を想起し得ることが想定される。
【００３５】
本発明は、ポリマー合成酵素活性を有する配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを開示する。配列番号１が図１に示されている。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態によれば、単離されたポリヌクレオチドはポリマー合成酵素遺伝子である。また、このポリマー合成酵素遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は１個以上のアミノ酸が配列番号１のアミノ酸配列から欠失、配列番号１のアミノ酸配列で置換若しくは配列番号１のアミノ酸配列に付加された配列を含むポリペプチドをコードすることができる。配列番号１の配列中の１個以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加等の変異を受けていても、そのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、このポリペプチドがポリマー合成酵素活性を有している限り、本発明の遺伝子に含まれる。例えば、第１位のメチオニンが欠失した配列番号１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドも本発明の遺伝子に含まれる。換言すれば、本発明の遺伝子は、配列番号２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列だけでなく、縮重コドンを除いて同じポリペプチドをコードするその縮重配列も含む。欠失、置換又は付加などの上記変異は、公知の部位特異的突然変異誘発によって誘導することができる。
【００３７】
本発明の好ましい実施形態では、配列番号２に記載のヌクレオチド配列又はその相補的配列を含む単離されたポリヌクレオチドが開示される。配列番号２を図２に示す。本発明の更に別の実施形態は、ＴがＵで置換された配列番号２に記載のヌクレオチド配列又はその相補配列を含む単離されたポリヌクレオチドである。これらのポリヌクレオチドは、ポリマー合成酵素活性を有するポリペプチドをコードしている。
【００３８】
このポリマー合成酵素遺伝子は、好ましくは、マングローブ土壌メタゲノムからクローン化される。本発明の好ましい実施形態によれば、ポリマー合成酵素遺伝子は、マングローブ土壌から得られた全土壌ＤＮＡから単離される。本発明の遺伝子は、マングローブ土壌メタゲノムＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅法、又はそのヌクレオチド配列を有するＤＮＡ断片をプローブとして使用するハイブリダイゼーション法によって得ることができる。
【００３９】
本発明の好ましい実施形態によれば、鋳型として全マングローブ土壌メタゲノムＤＮＡを用いてポリマー合成酵素遺伝子のＤＮＡ断片を得る好ましい方法としてＰＣＲが使用される。最初に、メタゲノムＤＮＡを新鮮なマングローブ土壌サンプルから抽出する。メタゲノムＤＮＡの単離には、ＭｏＢｉｏ  ＰｏｗｅｒＳｏｉｌ  ＤＮＡ単離キットなどの市販キットの使用、及びショットガンメタゲノムシーケンシングを用いた全メタゲノムＤＮＡ配列の決定が含まれることは、当技術分野で公知である。土壌メタゲノム由来のポリマー合成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を得るためには、プローブを調製することが好ましい。ポリマー合成酵素遺伝子のよく保存された領域は、既知のアミノ酸配列から選択され、それらをコードするヌクレオチド配列を用いてオリゴヌクレオチドを設計することができる。この目的を達成するために、増幅ヌクレオチドのプライマー対が設計される。プライマー対の配列は図５に示されており、この図では、配列番号５が順方向プライマーとして使用され、配列番号６が逆方向プライマーとして使用されている。
【００４０】
ベクター中にポリマー合成酵素遺伝子をクローニングするために、ポリマー合成酵素遺伝子配列の後ろの終止コドン及びＡｐａＩ制限部位の前にＳｗａＩ制限部位を有するプライマーを設計することにより、制限部位ＳｗａＩをベクター中のポリマー合成酵素遺伝子の後ろに付加した。この目的を達成するために、増幅ヌクレオチドのプライマー対が設計される。プライマー対の配列は図５に示されており、この図では、配列番号７が順方向プライマーとして使用され、配列番号８が逆方向プライマーとして使用されている。
【００４１】
増幅されたＤＮＡ断片は、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｐａＩのような適切な制限酵素で消化することができる。次いで、ＤＮＡ断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｐａＩであり得る制限酵素で予め切断された適切なベクターに連結する。このベクターは、ライゲーションの前にアルカリ性ホスファターゼでの処理によって脱リン酸化される。
【００４２】
本発明の更に別の実施形態は、単離されたポリヌクレオチドを含む組換えベクターである。この組換えベクターは、単離されたポリヌクレオチドが、ポリマー合成酵素活性を有する配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は１つ若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、置換又は付加されている、ポリマー合成酵素活性を有する、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、組換えベクターである。
【００４３】
本発明の好ましい実施形態によれば、宿主微生物において自律的に複製することができるプラスミドがベクターとして使用される。ベクターとして適用できるプラスミドとしては、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２及びｐＢＢＲ１−Ｉ−ＧＧ１８（ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２誘導体クローニングベクター）が挙げられる。これらベクターは、市販のベクターの改変から得られる。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）又はバチルスブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）のような２以上の宿主細胞及び種々のシャトルベクターにおいて自律的に複製することができるベクターもまた使用することができる。このようなベクターも制限酵素で切断され、それらの断片が得られる。
【００４４】
従って、従来のＤＮＡリガーゼキットを用いてＤＮＡ断片をベクター断片と連結させる。ＤＮＡ断片をアニールし、ベクター断片と連結して組換えベクターを作製する。
【００４５】
別の本発明は、配列番号３（Ｒ）特異的ヒドラターゼ活性に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを開示する。配列番号３が図３に示されている。
【００４６】
第２の発明の好ましい実施形態によれば、単離されたポリヌクレオチドは、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子である。また、このエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は１若しくは複数のアミノ酸が配列番号３に記載のアミノ酸配列から欠失、配列番号３に記載のアミノ酸配列で置換又は配列番号３に記載のアミノ酸配列に付加された配列を含むポリペプチドをコードすることができる。配列番号３の配列中の１個以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加等の変異を受けていても、そのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ポリペプチドが（Ｒ）特異的ヒドラターゼ活性を有する限り、本発明の遺伝子に含まれる。例えば、第１位のメチオニンが欠失した配列番号３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドも本発明の遺伝子に含まれる。換言すれば、本発明の遺伝子は、配列番号４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列だけでなく、縮重コドンを除いて同じポリペプチドをコードするその縮重配列も含む。欠失、置換又は付加などの上記変異は、公知の部位特異的突然変異誘発によって誘導することができる。
【００４７】
本発明の好ましい実施形態では、配列番号４に記載のヌクレオチド配列又はその相補的配列を含む単離されたポリヌクレオチドが開示される。配列番号４を図４に示す。本発明の更に別の実施形態は、ＴがＵで置換された配列番号４に記載のヌクレオチド配列又はその相補配列を含む単離されたポリヌクレオチドである。これらのポリヌクレオチドは、（Ｒ）特異的ヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードしている。
【００４８】
このエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子は、好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種ＣＦＭＲ７からクローン化される。この本発明の遺伝子は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種ＣＦＭＲ７ゲノムＤＮＡを鋳型として用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅技術によって得ることができる。この目的を達成するために、増幅ヌクレオチドのプライマー対が設計される。プライマー対の配列は図５に示されており、この図では、配列番号９が順方向プライマーとして使用され、配列番号１０が逆方向プライマーとして使用されている。
【００４９】
増幅されたＤＮＡ断片は、ＳｗａＩなどの適切な制限酵素で消化することができる。次いで、ＤＮＡ断片を、ＳｗａＩであり得る制限酵素で予め切断された適切なベクターに連結する。このベクターは、ライゲーションの前にアルカリ性ホスファターゼでの処理によって脱リン酸化される。
【００５０】
本発明の更に別の実施形態は、単離されたポリヌクレオチドを含む組換えベクターであって、単離されたポリヌクレオチドが、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含み、かつ（Ｒ）特異的ヒドラターゼ活性を有するポリペプチド、又は１つ以上のアミノ酸が置換、欠失、置換又は付加された、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含み、かつ（Ｒ）特異的ヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドを含む組換えベクターである。
【００５１】
本発明の好ましい実施形態によれば、宿主微生物において自律的に複製することができるプラスミドがベクターとして使用される。ベクターとして適用できるプラスミドとしては、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２及びｐＢＢＲ１−Ｉ−ＧＧ１８（ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２誘導体クローニングベクター）が挙げられる。これらベクターは、市販のベクターの改変から得られる。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）又はバチルスブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）のような２以上の宿主細胞及び種々のシャトルベクターにおいて自律的に複製することができるベクターもまた使用することができる。このようなベクターも制限酵素で切断され、それらの断片が得られる。
【００５２】
従って、従来のＤＮＡリガーゼキットを用いてＤＮＡ断片をベクター断片と連結させる。ＤＮＡ断片をアニールし、ベクター断片と連結して組換えベクターを作製する。
【００５３】
本発明のさらなる実施形態において、形質転換体は、前記組換えベクターを用いて構築された発現ベクターと適合する、適切な宿主株に組換えベクターを導入することによって得られる。本発明は、組換えベクターにおいて標的遺伝子を発現することができる限り、特定の宿主株の使用に限定されない。これに適した微生物のいくつかの例は、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属（細菌）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属及びＣａｎｄｉｄａ属（酵母）、ＣＯＳ及びＣＨＯ細胞株（動物細胞）に属するものである。
【００５４】
本発明の組換えＤＮＡは、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属又はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する細菌を宿主株として使用する場合には、適切なプロモーター、本発明のＤＮＡ断片、及び宿主における自律複製を確実にするための転写終結配列からなるように構築されているのが好ましい。好ましくは、発現ベクターは、ｐＧＥＭ−Ｔ及びｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２誘導体からなるが、これらに限定されない。同様に、プロモーターは、それが宿主中で発現され得るならば、いずれのタイプであってもよい。Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ、大腸菌又はファージに由来するプロモーターの例としては、推定Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ｐＲプロモーター及びＴ７プロモーターが挙げられる。
【００５５】
確立された方法を用いて、組換えベクターを宿主微生物に導入することができる。例えば、宿主微生物が大腸菌である場合、カルシウム法及びエレクトロポレーション法を用いることができる。また、ファージＤＮＡを使用する場合には、インビトロパッケージング法を採用することができる。
【００５６】
酵母が宿主として使用される場合、Ｙｅｐ１３又はＹＣｐ５０のような発現ベクターが使用される。従って、プロモーターにはｇａｌ１プロモーター又はｇａｌ１０プロモーターを使用し得る。組換えＤＮＡを酵母に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。動物細胞が宿主として使用される場合、ｐｃＤＮＡＩ又はｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐのような発現ベクターが使用される。従って、組換えＤＮＡを動物細胞に導入する方法としては、エレクトロポレーション法又はリン酸カリウム法を用いることができる。
【００５７】
また、本発明は、重合性化合物を含む媒体中で、先の実施形態のいずれかに記載のＤＮＡを有する形質転換体を培養する工程と、形質転換体において形成され蓄積されたポリマーを回収する工程とを含むポリマーを生成するためのプロセスを開示する。
【００５８】
宿主を培養するために使用される従来の方法も、形質転換体を培養するために使用される。形質転換体の培地はまた、宿主としてのＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する微生物のために使用される。これらの培地は、窒素源、無機塩類又は他の有機栄養源が制限された微生物と同化可能な炭素源を含む培地、例えば、栄養源が培地の０．０１重量％〜０．１重量％の範囲にある培地を含む。
【００５９】
炭素源は、微生物の増殖に必要であり、同時に、グルコース、フルクトース、スクロース又はマルトースなどの炭素の出発原料でもある。また、炭素源として、炭素原子数が２以上の油脂関連物質を用いることもできる。油脂関連物質には、コーン油、大豆油、ベニバナ油、ヒマワリ油、オリーブ油、ヤシ油、パーム油、ナタネ油、魚油、鯨油、ブタ油、ウシなどの天然油脂；酢酸、プロピオン酸、ブタン酸、ペンタン酸、ヘキサン（ｈｅｘｏｉｃ）酸、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、オレイン酸、パルミチン酸、リノレン酸、リノール酸、ミリスチン酸等の脂肪酸；エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、オクタノール、ラウリルアルコール、オレイルアルコール、パルミチルアルコール等のアルコール及びそれらのエステルが挙げられる。一方、塩、ペプトン、肉エキス、酵母エキス又はコーンスティープリカー。無機物は、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸カリウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、リン酸マグネシウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム及び塩化アンモニウムを含む。
【００６０】
培養は、発現が誘導された後、３０℃〜３４℃で２４時間以上、好ましくは１〜３日間振盪しながら好気性条件下で行うのが好ましい。培養中に、アンピシリン、カナマイシン、ゲンタマイシン、アンチピリン又はテトラサイクリンなどの抗生物質を培養物に添加することができる。これにより、ポリマーを微生物に蓄積させ、ポリマーを回収することができる。
【００６１】
誘導性プロモーターを用いて発現ベクターで形質転換した微生物を培養するために、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）やインドールアクリル酸（ＩＡＡ）などのその誘導物質を培地に添加することもできる。動物細胞から形質転換体を宿主として培養するには、ＲＰＭＩ−１６４０やウシ胎仔血清を補充したＤＭＥＭ等の培地を用いることができる。本発明の好ましい実施形態によれば、培養は、通常、５％ＣＯ２の存在下、３０℃〜３７℃で１４〜２８日間実施される。培養中においては、カナマイシン又はペニシリンなどの抗生物質を培地に添加することができる。
【００６２】
本発明の好ましい実施形態によれば、ポリマー精製工程も実施することができる。好ましくは、形質転換体を遠心分離により培養物から回収し、蒸留水及びヘキサンで洗浄し、乾燥させる。その後、乾燥した形質転換体をクロロホルムに懸濁し、加熱してポリマーを抽出する。残渣はろ過によって除去することができる。好ましくは、このクロロホルム溶液にメタノールを添加してポリマーを沈殿させる。ろ過又は遠心分離によって上清を除去した後、沈殿物を乾燥させて精製ポリマーを得る。得られたポリマーは、通常の方法、例えば、ガスクロマトグラフィー、核磁気共鳴法などにより所望のものであることが確認される。
【００６３】
このポリマー合成酵素は、式（Ｉ）（式中、Ｒは水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表す）で表されるモノマー単位３−ヒドロキシアルカン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙａｌｋｏｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）からなるコポリマー（ポリマー）を合成することができる。
【化１】
2020218566.tif 000002
【００６４】
好ましくは、ポリマーはポリヒドロキシアルカノエートである。ポリマーは、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶランダムコポリマー、［Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）］ランダムコポリマー、［Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３Ｈ４ＭＶ）］ランダムコポリマー、［Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−４ＨＢ）］ランダムコポリマー及び［Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−５ＨＶ）］ランダムコポリマーを含むコポリマーであり得る。
【００６５】
ポリ（３−ヒドロキシブチラート）［Ｐ（３ＨＢ）］を生成するための従来からのプロセスは、このポリマーが高結晶性ポリマーであるために、耐衝撃性が乏しいという物理的性質の問題を引き起こす。炭素数５の３−ヒドロキシバレレート又は炭素数６の３−ヒドロキシヘキサノエートをポリマー鎖に導入することにより結晶化度が低下する。ポリマーは、熱安定性及び成形性にも優れた可撓性ポリマー材料として作用する。
【００６６】
本発明においては、ＢＰＭ−ＣＰＦ−４のポリマー合成酵素を用いることにより、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）コポリマーを高収率で生成することができる。上記の手段を用いて所望のポリマーを大量に得ることができるため、糸やフィルムなどの生分解性材料として用いることができる。また、本発明の遺伝子は、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）コポリマーを高生成する株の育種にも用いることができる。
【００６７】
本発明では、ポリマー合成酵素（この場合にはＢＰＭ−ＣＰＦ−４のポリマー合成酵素）とエノイル−ＣｏＡヒドラターゼを共発現させることにより、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）コポリマーを、より高い３ＨＨｘ組成で生成することができる。上記の手段を用いて所望のポリマーを大量に得ることができるため、糸やフィルムなどの生分解性材料として用いることができる。更に、本発明の遺伝子は、より高い３ＨＨｘ組成を有するＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）コポリマーを生成する株を育種するために使用することができる。
【００６８】
本発明においては、ＢＰＭ−ＣＰＦ−４のポリマー合成酵素を用いることにより、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−４ＨＢ）及びＰ（３ＨＢ−ｃｏ−５ＨＶ）コポリマーを高収率で生成することができる。これらのコポリマーは、４ＨＢ及び５ＨＶのリパーゼ分解性モノマー配列を取り込むその能力のために、様々な生物医学的用途に使用される。
【００６９】
出願人の開示は、添付の特許請求の範囲に含まれるようなもの、及び前述の説明のものを含む。これは、ある程度の詳細性からその好ましいものとして記載されているが、好ましい形態の本開示は、例としてのみなされたものであり、構成の詳細並びに部品の組み合わせ及び配置における多くの変更が本発明の範囲から逸脱することなく行われる可能性があることを理解すべきである。
【実施例】
【００７０】
以下、本発明の異なる態様及び実施形態を例示するために実施例を示す。これら実施例は開示された発明を限定することを意図されたものではなく、当該発明は特許請求の範囲によってのみ限定される。【００７１】
［実施例１］
マングローブ土壌メタゲノムからのポリマー合成酵素遺伝子のクローニング
最初に、メタゲノムＤＮＡをＭｏＢｉｏ  ＰｏｗｅｒＳｏｉｌ  ＤＮＡ単離キットを用いて直接マングローブ土壌から単離した。【００７２】
ショットガンメタゲノムシーケンシングは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２０００プラットフォームを用いた１２５ｂｐのペアエンドシーケンシングを用いて行った。自動配列前処理（品質チェック）及び遺伝子アノテーションのために、生の配列（フィルターなし）をメタゲノミクスＲＡＳＴサーバー（ＭＧ−ＲＡＳＴ）に提出した。メタゲノムデータは、ＩＤ：ｍｇｍ４５１２８０１．３（Ｂａｌｉｋ  Ｐｕｌａｕ＿ｍａｎｇｒｏｖｅ）の下でＭＧ−ＲＡＳＴデータベースに寄託された。ＰＨＡ合成酵素のインシリコ遺伝子マイニングのために、ＮＣＢＩ参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）データベースに対する「ＰＨＡ合成酵素」としてアノテートされたすべての配列又は読み取り（〜１２０〜２６０ｂｐ）を、ＭＧＲＡＳＴサーバーバージョン３から、５つのコンセンサスキーワード：ヒドロキシブチラート、ヒドロキシアルカノエート、ヒドロキシアルカン酸、ＰＨＡ及びＰＨＢを用いて検索した。すべてのアノテーション及び配列情報は、ＭＧ−ＲＡＳＴ  ＲＥＳＴｆｕｌ  ＡＰＩ（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ（アプリケーション・プログラミング・インターフェース））を介してＭＧ−ＲＡＳＴデータベースから検索した。マングローブ土壌メタゲノムデータからの完全長又はほぼ全長のＰＨＡ合成酵素遺伝子は、ＰＨＡ合成酵素として以前にアノテートされた配列のサブセットについてＳＰＡｄｅｓ  ３．５．０−Ｄａｒｗｉｎ（Ｓｔ．Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇゲノムアセンブラー）を用いてデノボＤＮＡ配列アセンブリを行うことによって得られた。その後の分析のために、１ｋｂを超える大きさのコンティグ集合体を選択した。ＧｅｎＢａｎｋ非重複タンパク質配列データベースに対してＢＬＡＳＴＸを実施して、類似の配列を検索し、部分的又は完全なＰＨＡ合成酵素の正しいリーディングフレームを決定した。【００７３】
次に、メタゲノムＤＮＡからポリマー合成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を得るために、プローブを調製した。参照としてＮＣＢＩデータベースを使用して設計される２つのドメイン特異的オリゴヌクレオチド（配列番号５及び配列番号６）を合成した。【００７４】
これらのオリゴヌクレオチドをプライマーとし、マングローブ土壌のメタゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより、ポリマー合成酵素遺伝子を増幅した。ＰＣＲ条件は以下の通りであった：９４℃で３分間；９４℃で３０秒間、５７℃で３０秒間及び７２℃で２分間の３０サイクル；そして７２℃で１０分間の最終工程。【００７５】
この断片からの１．７ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＡｐａＩのヌクレオチド配列をＳａｎｇｅｒ法により決定した。配列番号１のヌクレオチド配列（１６５６）を含むポリマー合成酵素遺伝子を取得した。【００７６】
［実施例２］
Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ形質転換体の調製
ＨｉｎｄＩＩＩ−ＡｐａＩポリマー合成酵素遺伝子断片を、先に同じ制限酵素で切断したクローニングベクターｐＣＲ（登録商標）４−ＴＯＰＯ（登録商標）（米国、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に最初に挿入した。次いで、断片をＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｐａＩ制限酵素で再び消化し、得られたＨｉｎｄＩＩＩ−ＡｐａＩポリマー合成酵素遺伝子断片を、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属に属する微生物において発現可能な組換えベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２に挿入し、得られた組換えプラスミドをコンジュゲーション転写法によりＣｕｐｒｉｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ  ＰＨＢ−４（ＤＳＭ５４１）（ポリマーの合成能力が欠損した株）に形質転換した。【００７７】
まず、組換えプラスミドを用いて大腸菌Ｓ１７−１を塩化カルシウム法で形質転換した。このようにして得られた組換え大腸菌及びＣ．ｎｅｃａｔｏｒ  ＰＨＢ−４をトランスコンジュゲートした。組換え大腸菌及びＣ．ｎｅｃａｔｏｒ  ＰＨＢ−４を、１．５ｍＬのＬＢ培地及び３０℃の栄養豊富な培地中で一晩培養し、それぞれの培養物（それぞれ０．１ｍＬ）を合わせ、室温で１時間シェーカー上で培養した。次いで、混合物を振とうせずに３０分間インキュベートし、その後３０分間再び振盪した。この微生物混合物を３００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含有するシモンズクエン酸寒天上に播種し、３０℃で２日間培養した。【００７８】
Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  ＰＨＢ−４は組換え大腸菌中のプラスミドをそれに移入することによりカナマイシンに対して耐性にされるので、シモンズクエン酸寒天上で増殖したコロニーはＣ．ｎｅｃａｔｏｒの形質転換体である。【００７９】
［実施例３］
Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ形質転換体によるポリマーの合成
Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ形質転換体を、１ｍｌ／Ｌの微量元素を含有する５０ｍＬのミネラル培地（０．２５ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム七水和物、３．３２ｇ／Ｌリン酸水素二ナトリウム、２．８ｇ／Ｌリン酸二水素カリウム、０．５ｇ／Ｌ塩化アンモニウム）に接種し、フラスコ内にて３０℃でインキュベートした。５０ｍｇ／ＬのカナマイシンをＣ．ｎｅｃａｔｏｒ形質転換体用の培地に加え、微生物を４８時間培養した。【００８０】
Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ形質転換体及びＰＨＢ−４の菌株をそれぞれフルクトース１０ｇ／Ｌ及び粗パーム核油（ＣＰＫＯ）６ｇ／Ｌを添加した上記ミネラル培地に接種し、各株を２５０ｍＬフラスコ中で３０℃で４８時間培養した。前駆体炭素源をコポリマー生成のために添加した。５０ｍｇ／ＬのカナマイシンをＣ．ｎｅｃａｔｏｒ形質転換体の培地に加えた。【００８１】
培養物を遠心分離によって回収し、蒸留水及びヘキサンで（ＣＰＫＯの存在下）洗浄し、凍結乾燥し、乾燥した微生物の重量を測定した。乾燥微生物１５〜２０ｍｇに２ｍＬの硫酸／メタノール混合物（１５：８５）と２ｍＬのクロロホルムを加え、単体を密封し、１００℃で１４０分間加熱して微生物中のポリマーをメチルエステルに分解させた。これに１ｍＬの蒸留水を加え、激しく渦動させた。これを放置して２層に分離し、下側の有機層を取り出し、キャピラリーカラムを通したキャピラリーガスクロマトグラフィーにより成分を分析した。ＰＨＡ含量は、ＳＰＢ−１カラム（米国、Ｓｕｐｅｌｃｏ）を備えたＳｈｉｍａｄｚｕ  ＧＣ−２０１０システムを用いたガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって測定した。カラム温度は７０℃で開始し、次いで１０℃／分の連続ステップで２８０℃に上昇させた。内部標準としてカプリル酸メチルエステル（ＣＭＥ）を用いてＰＨＡ含量及び組成を定量した。結果を表１に示す。【００８２】
表１は、フルクトースからのＣ．ｎｅｃａｔｏｒ形質転換体、異なる前駆体炭素源を添加したフルクトースの混合物及びＣＰＫＯによるＰＨＡの生合成を示す。
【表１】
2020218566.tif 000003
出発培養物からの３％接種物（Ｏ．Ｄ＝〜４．５）を２５０ｍＬ三角フラスコ中の５０ｍＬのＭＭに移し、３０℃、４８時間、２００ｒｐｍでインキュベートした。報告された値は、３回培養の平均値±ＳＤである。
ａ凍結乾燥細胞におけるＰＨＡ含量
３ＨＢ：３−ヒドロキシブチラート；３ＨＶ：３−ヒドロキシバレレート；５ＨＶ：５−ヒドロキシバレレート；４ＨＢ：４−ヒドロキシブチラート；３Ｈ４ＭＶ：３−ヒドロキシ−４−メチルバレレート；３ＨＨｘ：３−ヒドロキシヘキサノエート【００８３】
表１の結果に基づいて、形質転換体はＰ（３ＨＢ）ホモポリマーの生成にフルクトースを利用することができた。細胞乾燥重量：３．７±０．１ｇ／Ｌ及びポリマー含有量：微生物の７５±９重量％。ＣＰＫＯを唯一の炭素源として使用した場合、より低い細胞乾燥重量が得られた。形質転換体の細胞バイオマスは２．８±０．２ｇ／Ｌであり、ポリマー含量は微生物の６２±５重量％であった。興味深いことに、ＣＰＫＯの存在下で、形質転換体中に７モル％の３ＨＨｘを有するＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）コポリマーの蓄積が観察された。【００８４】
Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）コポリマーの生成を調べるために、フルクトースを補充した培養物に吉草酸ナトリウムを添加した。形質転換体によって生成された３ＨＶ組成は１３±１ｍｏｌ％であった。形質転換体の細胞バイオマスは２．５±０．１ｇ／Ｌであり、この形質転換体によって生成されたポリマー含量は微生物の５８±７重量％であった。【００８５】
Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−５ＨＶ）コポリマーの生成を調べるために、５−ヒドロキシ吉草酸ナトリウムをフルクトースを補充した培養物に添加した。形質転換体が生成する５ＨＶ組成は２３±０ｍｏｌ％であった。形質転換体の細胞バイオマスは３．８±０．９ｇ／Ｌであり、この形質転換体によって生成されるポリマー含量は微生物の６７±８重量％であった。【００８６】
Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−４ＨＢ）コポリマーの生成を調べるために、フルクトースを補充した培養物に４−ヒドロキシ酪酸ナトリウムを添加した。形質転換体が生成した４ＨＢ組成は１４±１ｍｏｌ％であった。形質転換体の細胞バイオマスは２．８±０．１ｇ／Ｌであり、この形質転換体によって生成されたポリマー含量は微生物の５８±１重量％であった。【００８７】
また、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−４ＨＢ）コポリマーの生成を調べるために、フルクトースを補充した培養物にγ−ブチロラクトンを添加した。形質転換体はホモポリマーＰ（３ＨＢ）のみを生成した。形質転換体の細胞バイオマスは３．７±０．１ｇ／Ｌであり、この形質転換体によって生成されたポリマー含量は微生物の６６±２重量％であった【００８８】
Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３Ｈ４ＭＶ）コポリマーの生成を調べるために、フルクトースを補充した培養物にイソカプロン酸を添加した。形質転換体が生成する３ＨＶ組成は１０±１ｍｏｌ％であった。形質転換体の細胞バイオマスは１．６±０．０ｇ／Ｌであり、この形質転換体によって生成されたポリマー含量は微生物の４５±５重量％であった。【００８９】
Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）コポリマーの生成を調べるために、フルクトースを補充した培養物にヘキサン酸ナトリウムを添加した。形質転換体によって生成された３ＨＨｘ組成は１８±２ｍｏｌ％であった。形質転換体の細胞バイオマスは１．９±０．１ｇ／Ｌであり、この形質転換体によって生成されたポリマー含量は微生物の４４±１重量％であった。【００９０】
およそ１グラムの凍結乾燥細胞を５０ｍＬのクロロホルムと混合し、室温で３日間撹拌した。この混合物をワットマンＮｏ．１濾紙を用いてろ過して細胞破片を除去した。次いで、得られた透明溶液を激しく撹拌している氷冷したメタノール中に滴下してＰＨＡポリマーを沈殿させた。沈殿したポリマーを真空ろ過を用いてメタノール溶液から分離し、次いで室温で一晩乾燥させた。細菌細胞からのＰＨＡの溶媒抽出は、通常、最高純度（９５〜１００％）のＰＨＡポリマーを生成することができた。【００９１】
得られたポリマーを核磁気共鳴により確認する。合計２５ｍｇのポリマー試料を１ｍＬの重水素化クロロホルム（ＣＤＣＬ３）に溶解する。ＰＨＡポリマーは、５００ＭＨｚで操作するＢｒｕｋｅｒ  ＡＶＡＮＣＥ  ５００（米国）を用いて１Ｈ  ＮＭＲ分光法によって分析した。その結果を図６及び図７に示す。【００９２】
［実施例４］
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種ＣＦＭＲ７由来のＥｎｏｙｌ−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子のクローニング
最初に、ゲノムＤＮＡを単離した。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種ＣＦＭＲ７  ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡミニキット。【００９３】
配列番号５及び配列番号６を置換するために配列番号７及び８のプライマーを用いて繰り返し実験を行って（［００７９］〜［００８３］）、ＳｗａＩ制限部位を有するＢＰ−Ｍ−ＣＰＦ４のポリマー合成酵素を有するベクターを調製した。【００９４】
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種ＣＦＭＲ７のゲノムＤＮＡからエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子を増幅するために、２つの特異的オリゴヌクレオチド（配列番号９及び配列番号１０）を合成した。【００９５】
これらのオリゴヌクレオチドをプライマーとし、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種ＣＦＭＲ７由来のゲノムＤＮＡを用いて、ＰＣＲによりエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子を増幅した。ＰＣＲ条件は以下の通りであった：９４℃で３分間；９４℃で３０秒間、５７℃で３０秒間及び７２℃で２分間の３０サイクル；そして７２℃で１０分間の最終工程。【００９６】
この断片からの８５０ｂｐのＳｗａＩ−ＳｗａＩのヌクレオチド配列をＳａｎｇｅｒ法により決定した。【００９７】
［実施例５］
Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ形質転換体の調製
ＳｗａＩ−ＳｗａＩエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子断片を、以前に構築した（［００９９］）ＢＰ−Ｍ−ＣＰＦ４のポリマー合成酵素を有する組換えベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２に挿入し、得られた組換えプラスミドをコンジュゲーション転写法によりＣｕｐｒｉｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ  ＰＨＢ−４（ＤＳＭ５４１）（ポリマーの合成能力が欠損した株）に形質転換した。［００９９］の組換えベクター構築物も、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼの効果を比較するための陰性対照として用いた。【００９８】
最初に、組換えプラスミドを使用して、大腸菌Ｓ１７−１を塩化カルシウム法により形質転換した。このようにして得られた組換え大腸菌及びＣ．ｎｅｃａｔｏｒ  ＰＨＢ−４をトランスコンジュゲートした。組換え大腸菌及びＣ．ｎｅｃａｔｏｒ  ＰＨＢ−４を、１．５ｍＬのＬＢ培地及び３０℃の栄養豊富な培地中で一晩培養し、それぞれの培養物（それぞれ０．１ｍＬ）を合わせ、室温で１時間シェーカー上で培養した。次いで、混合物を振とうせずに３０分間インキュベートし、その後３０分間再び振盪した。この微生物混合物を３００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含有するシモンズクエン酸寒天上に播種し、３０℃で２日間培養した。【００９９】
Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  ＰＨＢ−４は組換え大腸菌中のプラスミドをそれに移入することによりカナマイシンに対して耐性にされるので、シモンズクエン酸寒天上で増殖したコロニーはＣ．ｎｅｃａｔｏｒの形質転換体である。【０１００】
［実施例６］
Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ形質転換体によるポリマーの合成
Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ形質転換体の各々を、５０ｍＬのミネラル培地（４．０ｇ／Ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４、４．６ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．４５ｇ／Ｌ  Ｋ２ＳＯ４、０．５４ｇ／Ｌ  Ｕｒｅａ、０．３９ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４、０．０６２ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２及び１ｍｌ／Ｌの微量元素に接種し、フラスコ内にて３０℃でインキュベートした。微量元素溶液は、０．１Ｍ塩酸に溶解した１５ｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．４ｇ／Ｌ  ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、２．４ｇ／Ｌ  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ及び０．４８ｇ／Ｌ  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏからなるものであった。５０ｍｇ／ＬのカナマイシンをＣ．ｎｅｃａｔｏｒ形質転換体用の培地に加え、微生物を４８時間培養した。【０１０１】
Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ形質転換体の各株を６ｇ／Ｌのパームオレイン（ＰＯ）粗パーム核油（ＣＰＫＯ）を添加した上記ミネラル培地に接種し、各株を２５０ｍＬフラスコ内で３０℃で４８時間培養した。５０ｍｇ／ＬのカナマイシンをＣ．ｎｅｃａｔｏｒ形質転換体の培地に加えた。【０１０２】
培養物を遠心分離によって回収し、蒸留水及びヘキサンで（ＣＰＫＯの存在下）洗浄し、凍結乾燥し、乾燥した微生物の重量を測定した。乾燥微生物１５〜２０ｍｇに２ｍＬの硫酸／メタノール混合物（１５：８５）と２ｍＬのクロロホルムを加え、単体を密封し、１００℃で１４０分間加熱して微生物中のポリマーをメチルエステルに分解させた。これに１ｍＬの蒸留水を加え、激しく撹拌させた。これを放置して２層に分離し、下側の有機層を取り出し、キャピラリーカラムを通したキャピラリーガスクロマトグラフィーにより成分を分析した。ＰＨＡ含量は、ＳＰＢ−１カラム（米国、Ｓｕｐｅｌｃｏ）を備えたＳｈｉｍａｄｚｕ  ＧＣ−２０１０システムを用いたガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって測定した。カラム温度は７０℃で開始し、次いで１０℃／分の連続ステップで２８０℃に上昇させた。内部標準としてカプリル酸メチルエステル（ＣＭＥ）を用いてＰＨＡ含量及び組成を定量した。結果を表１に示す。【０１０３】
およそ１グラムの凍結乾燥細胞を５０ｍＬのクロロホルムと混合し、室温で３日間撹拌した。この混合物をワットマンＮｏ．１濾紙を用いてろ過して細胞破片を除去した。次いで、得られた透明溶液を激しく撹拌している氷冷したメタノール中に滴下してＰＨＡポリマーを沈殿させた。沈殿したポリマーを真空ろ過を用いてメタノール溶液から分離し、次いで室温で一晩乾燥させた。細菌細胞からのＰＨＡの溶媒抽出は、通常、最高純度（９５〜１００％）のＰＨＡポリマーを生成することができた。【０１０４】
得られたポリマーを用いて、Ｓｈｏｄｅｘ  Ｋ８０６−Ｍ及びＫ８０２カラム（日本）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １２００シリーズＧＰＣ（米国）を用いて、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により数平均分子量（Ｍｎ）及び重量平均分子量（Ｍｗ）を測定した。クロロホルムを４０℃で０．８ｍＬ／分の流速で移動相の溶媒として使用した。ＰＨＡポリマーをクロロホルムに溶解して最終濃度約１．０ｍｇ／ｍＬとし、分析前にろ過した（ＰＴＦＥ膜、０．２２μｍ）。【０１０５】
得られたポリマーを核磁気共鳴により確認する。合計２５ｍｇのポリマー試料を１ｍＬの重水素化クロロホルム（ＣＤＣＬ３）に溶解する。ＰＨＡポリマーは、５００ＭＨｚで操作するＢｒｕｋｅｒ  ＡＶＡＮＣＥ  ５００（米国）を用いて１Ｈ  ＮＭＲ分光法によって分析した。【０１０６】
表２は、ＰＯ及びＣＰＫＯ由来のｐｈａＪＳｓを用いたＣ．ｎｅｃａｔｏｒ形質転換体によるＰＨＡの生合成を示す。
【表２】
2020218566.tif 000004
出発培養物からの３％接種物（Ｏ．Ｄ＝〜４．５）を２５０ｍＬ三角フラスコ中の５０ｍＬのＭＭに移し、３０℃、４８時間、２００ｒｐｍでインキュベートした。表中にＧＣ及びＧＰＣによる分析により得られた結果を示した。この数値は、３回培養の平均値±ＳＤである。
ａ凍結乾燥細胞におけるＰＨＡ含量
３ＨＢ：３−ヒドロキシブチラート；３ＨＨｘ：３−ヒドロキシヘキサノエート【０１０７】
表２の結果よりｐｈａＪを有する形質転換体（ＰＨＢ−４／ｐＢＢＲＭＣＳ２＿ＣＢＰ−Ｍ−ＣＰＦ４＿ＪＳｓ）はｐｈａＪを含まない形質転換体（ＰＨＢ−４／ｐＢＢ１ＲＭＣＳ２＿ＣＢＰ−Ｍ−ＣＰＦ４）と比較して高い３ＨＨｘ組成を示した。【０１０８】
ＰＯにおいて、ＰＨＢ−４／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２＿ＣＢＰ−Ｍ−ＣＰＦ４の細胞バイオマスは４．９±０．５ｇ／Ｌであり、ポリマー含量は微生物の５３±６重量％であった。４モル％の３ＨＨｘを有するＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）コポリマーの蓄積が観察され、コポリマーの分子量（Ｍｗ）は９．９×１０５Ｄａであった。【０１０９】
ＣＰＫＯでは、ＰＨＢ−４／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２＿ＣＢＰ−Ｍ−ＣＰＦ４の細胞バイオマスは５．６±０．３ｇ／Ｌであり、ポリマー含量は微生物の５８±２重量％であった。３ＨＨｘを７ｍｏｌ％含むＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）コポリマーの蓄積が観察され、コポリマーの分子量（Ｍｗ）は１２．３×１０５Ｄａであった。【０１１０】
ＰＯでは、ＰＨＢ−４／ｐＢＢＲＭＣＳ２＿ＣＢＰ−Ｍ−ＣＰＦ４＿ＪＳｓの細胞バイオマスは５．０±０．１ｇ／Ｌであり、ポリマー含量は微生物の５４±４重量％であった。３ＨＨｘ  １２ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）コポリマーの蓄積が観察され、コポリマーの分子量（Ｍｗ）は８．０×１０５Ｄａであった。【０１１１】
ＣＰＫＯにおいて、ＰＨＢ−４／ｐＢＢＲＭＣＳ２＿ＣＢＰ−Ｍ−ＣＰＦ４＿ＪＳｓの細胞バイオマスは５．６±０．１ｇ／Ｌであり、ポリマー含有量は微生物の６２±４重量％であった。３ＨＨｘの１８ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）コポリマーの蓄積が観察され、コポリマーの分子量（Ｍｗ）は８．９×１０５Ｄａであった。【０１１２】
表２に示した結果のように、生成したポリマーの構造は、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）と３ＨＨｘモノマーの混合物であることが１Ｈ  ＮＭＲ分光法により確認できた。その混合物の組成は、ｐｈａＪを用いない形質転換体（ＰＨＢ−４／ｐＢＢＲＭＣＳ２＿ＣＢＰ−Ｍ−ＣＰＦ４）又はｐｈａＪを用いた形質転換体（ＰＨＢ−４／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２＿ＣＢＰ−Ｍ−ＣＰＦ４＿ＪＳｓ）による生合成において、炭素源をそれぞれ、ＣＰＯとした場合、ＣＰＫＯとした場合に、３ＨＨｘモノマーとして、５mol％、１０mol％、又は、１３mol％、２０mol％であった。結果を図８及び図９に示す。【０１１３】
図８は、ｐｈａＪを含まない形質転換体（ＰＨＢ−４／ｐＢＢＲＭＣＳ２＿ＣＢＰ−Ｍ−ＣＰＦ４）と、炭素源として（ａ）ＰＯ又は（ｂ）ＣＰＫＯを用いて生成されたポリマーの１Ｈ  ＮＭＲ分光法による分析結果である。１Ｈ  ＮＭＲ分光法により算出した３ＨＨｘモノマーの含有量は、それぞれ（ａ）５mol％、（ｂ）１０mol％であった。【０１１４】
図９は、ｐｈａＪを含む形質転換体（ＰＨＢ−４／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２＿ＣＢＰ−Ｍ−ＣＰＦ４＿ＪＳｓ）と、炭素源として（ａ）ＰＯ又は（ｂ）ＣＰＫＯを用いて生成されたポリマーの１Ｈ  ＮＭＲ分光法による分析結果である。１Ｈ  ＮＭＲ分光法により算出した３ＨＨｘモノマーの含有量は、それぞれ（ａ）１３mol％、（ｂ）２０mol％であった。
【図１】
2020218566.tif 000005
【図２】
2020218566.tif 000006
【図３】
2020218566.tif 000007
【図４】
2020218566.tif 000008
【図５】
2020218566.tif 000009
【図６】
2020218566.tif 000010
【図７】
2020218566.tif 000011
【図８】
2020218566.tif 000012
【図９】
2020218566.tif 000013
【配列表】
2020218566000001.app
【国際調査報告】
2020218566.tif 000014
2020218566.tif 000015
2020218566.tif 000016
2020218566.tif 000017
2020218566.tif 000018
2020218566.tif 000019
2020218566.tif 000020