(57)【要約】  本発明は、線維症の発症に重要な分子及び線維化を抑制できる物質を提供することを目的とする。ＲＮＡ結合モチーフタンパク質７（ＲＢＭ７）からなる、線維症のバイオマーカーは、線維症を診断するためのバイオマーカーとして有用である。被験対象に由来する生体試料中のＲＢＭ７の検出を好ましくは抗ＲＢＭ７抗体を用いて行う工程を含む線維症の検出方法は、線維症の診断に有用である。また、ＲＢＭ７を発現抑制する物質、好ましくはＲＢＭ７に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及びアンチセンス核酸よりなる群から選択される少なくとも１種の核酸医薬を含む抗線維化剤は、線維症の治療に有用である。
2019202767.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡ結合モチーフタンパク質７（ＲＢＭ７）を発現抑制する物質を有効成分とする抗線維化剤。
【請求項２】
前記物質が、ＲＢＭ７に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及びアンチセンス核酸よりなる群から選択される少なくとも１種の核酸医薬である、請求項１に記載の抗線維化剤。
【請求項３】
線維症の治療、予防又は進行防止の用途に使用される、請求項１又は２に記載の抗線維化剤。
【請求項４】
前記線維症が、ＲＢＭ７を発現している線維症である、請求項３に記載の抗線維化剤。
【請求項５】
ＲＢＭ７からなる、線維症のバイオマーカー。
【請求項６】
前記線維症が、肺線維症、肝線維症、腎線維症、強皮症、心線維症、骨髄線維症からなる群より選択される、請求項５に記載のバイオマーカー。
【請求項７】
被験対象に由来する生体試料中のＲＢＭ７の検出を行う工程を含む、線維症の検出方法。
【請求項８】
前記生体試料が血液試料である、請求項７に記載の検出方法。
【請求項９】
前記検出を、抗ＲＢＭ７抗体を用いて行う、請求項７又は８に記載の検出方法。
【請求項１０】
抗ＲＢＭ７抗体を含む線維症の診断薬。
【請求項１１】
以下の（Ａ）〜（Ｃ）の工程を含む、抗線維化剤の有効成分のスクリーニング方法：
（Ａ）ＲＢＭ７を発現する細胞に被検物質を接触させる工程、
（Ｂ）前記細胞におけるＲＢＭ７の発現量を測定する工程、及び
（Ｃ）ＲＢＭ７の発現抑制能が認められた被験物質を抗線維化剤の有効成分の候補として選択する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗線維化剤及び線維症のバイオマーカーに関する。より具体的には、本発明は、抗線維化剤、線維症のバイオマーカー、線維症の検出方法、線維症の診断薬、及び抗線維化剤の有効成分のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
線維症は、結合組織の過度の形成によって引き起こされる生命を脅かす疾患であり、重要な器官に影響を及ぼす（非特許文献１〜３）。そして、線維症を含め、炎症または組織損傷後の異常な治癒によって引き起こされる様々な難病において、先天性免疫細胞が重要役割を果たすことが知られている（非特許文献４〜７）。これまで、いくつかの造血細胞型が線維症に関与していることが報告されている（非特許文献８〜１１）。この中でも、線維症の発症に関わる免疫系細胞として、ＳａｔＭ（Segregated nucleus containing Atypical Monocyte）及びその制御因子Ｃ／ＥＢＰβが報告されている（非特許文献１１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】J. Clin. Invest. 115, 209-218 (2005)
【非特許文献２】Exp. Biol. Med. (Maywood) 233, 109-122 (2008)
【非特許文献３】J. Hepatol. 56, 965-972 (2012)
【非特許文献４】Immunity 34, 85-95 (2011)
【非特許文献５】Cell 157, 832-844 (2014)
【非特許文献６】Nature 495, 524-528 (2013)
【非特許文献７】Nat. Immunol. 11, 936-944 (2010)
【非特許文献８】Annu. Rev. Pathol. 8, 241-276 (2013)
【非特許文献９】Nat. Rev. Immunol. 14, 181-194 (2014)
【非特許文献１０】Nature 496, 445-455 (2013)
【非特許文献１１】Nature volume 541, 96-101 (2017)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
線維症の発症原理の全貌は明らかになっておらず、未だ有効な薬が開発されていない。また、ＳａｔＭが線維症の開始に重要であることはわかっているものの、それが線維化時に線維化領域に遊走するメカニズムは解明されていない。【０００５】
本発明者らは、線維化段階で肺組織によって分泌されるいくつかの分子がＳａｔＭの患部への遊走に関与することに着目し、線維化期に肺抽出物を使用することによって細胞遊走アッセイを行った。その結果、本発明者らは、ＳａｔＭが、ブレオマイシン（ＢＬＭ）の気管内投与後の野生型（ＷＴ）の肺からの、炎症期ではなく線維化期の抽出物で有意にリクルートされたことを見出した。このことは、線維化期の非造血細胞が誘引物質を産生し、これによって、ＳａｔＭを患部へと遊走して肺の線維症を進行させることを意味する。そこで本発明は、非造血細胞に焦点を当て、線維症の発症に重要な分子及び線維化を抑制できる物質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは鋭意検討を行い、ＢＬＭの気管内投与後の線維化期にあるＷＴマウスの肺におけるｍＲＮＡおよびタンパク質発現を調べたところ、示差的に発現されたｍＲＮＡおよびタンパク質の中で、ＲＮＡ結合モチーフタンパク質７（ＲＢＭ７）がＢＬＭ処理後に顕著に増加したことを見出した。さらに注目すべきことに、肺線維症の患者の肺切片において、非線維化コントロールと比較して進行性線維症の領域においてＲＢＭ７の発現が顕著に上昇したことを見出した。ＲＢＭ７は、様々なタイプのＲＮＡの分解を調節する核エキソソームターゲティング複合体の成分として知られているが、ＲＮＡプロセシング機能以外の生理学的又は病理学的役割についてはほとんど知られておらず、ＲＢＭ７と線維症との関連に至っては全く知られていない。さらに、本発明者らは、in vivoでＲＢＭ７の発現を抑制することによって、線維化を抑制できることも見出した。本発明は、この知見に基づいてさらに検討を重ねることにより完成したものである。【０００７】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．  ＲＮＡ結合モチーフタンパク質７（ＲＢＭ７）を発現抑制する物質を有効成分とする抗線維化剤。
項２．  前記物質が、ＲＢＭ７に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及びアンチセンス核酸よりなる群から選択される少なくとも１種の核酸医薬である、項１に記載の抗線維化剤。
項３．  線維症の治療、予防又は進行防止の用途に使用される、項１又は２に記載の抗線維化剤。
項４．  前記線維症が、ＲＢＭ７を発現している線維症である、項３に記載の抗線維化剤。
項５．  ＲＢＭ７からなる、線維症のバイオマーカー。
項６．  前記線維症が、肺線維症、肝線維症、腎線維症、強皮症、心線維症、骨髄線維症からなる群より選択される、項５に記載のバイオマーカー。
項７．  被験対象に由来する生体試料中のＲＢＭ７の検出を行う工程を含む、線維症の検出方法。
項８．  前記生体試料が血液試料である、項７に記載の検出方法。
項９．  前記検出を、抗ＲＢＭ７抗体を用いて行う、項７又は８に記載の検出方法。
項１０．  抗ＲＢＭ７抗体を含む線維症の診断薬。
項１１．  以下の（Ａ）〜（Ｃ）の工程を含む、抗線維化剤の有効成分のスクリーニング方法：
（Ａ）ＲＢＭ７を発現する細胞に被検物質を接触させる工程、
（Ｂ）前記細胞におけるＲＢＭ７の発現量を測定する工程、及び
（Ｃ）ＲＢＭ７の発現抑制能が認められた被験物質を抗線維化剤の有効成分の候補として選択する工程。
項１２．  被験対象に由来する生体試料中のＲＢＭ７の検出を行う工程、及び前記工程で得られた検出結果に基づいて線維症を診断する工程を含む、線維症の診断方法。
項１３．  線維症患者に、治療有効量のＲＢＭ７の発現を抑制する物質を投与する工程を含む、線維症の治療、予防又は進行防止方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、線維症の発症に重要なＲＢＭ７がバイオマーカーとして提供される。ＲＢＭ７は正常細胞ではほとんど発現が認められないため、本発明の線維症の検出方法により、特異性の高い線維症の診断が可能となる。【０００９】
また、本発明のスクリーニング方法によれば、ＲＢＭ７をターゲットとして、その発現を抑制する物質をスクリーニングすることにより、優れた抗線維化剤の開発を加速させることができる。【００１０】
さらに、本発明の抗線維化剤によれば、ＲＢＭ７をターゲットとして、その発現を抑制することによって、効果的に線維化を抑制することが可能になる。実際、線維症に対してＲＢＭ７に対するsiRNAによるin vivo線維化抑制効果が確認されている。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１ａ】PBS又はBLMで処置した肺のSatMの遊走能評価であり、Diff Quick染色（n=3）を行った。スケールバーは100μmを示す。
【図１ｂ】PBS又はBLMで処置した肺のSatMの遊走能評価であり、遊走したSatMを発光を指標に測定した(n=2)。
【図１ｃ】肺組織に存在している造血細胞（CD45+）と非造血細胞（CD45-）の遊走能評価であり、PBSまたはBLM投与後の10日目の肺を造血系と非造血系に分けて、それらの細胞が示すSatM遊走能を発光を指標に測定した（n=4）。
【図１ｄ】PBSまたはBLM投与の10日後（n=3）の、WTマウス肺組織の非造血細胞のウェスタンブロット（WB）分析を示す。
【図１ｅ】コントロール及びヒト線維化肺（n=9）のRBM7発現を示す。スケールバーは100μmを示す。
【図１ｆ】BLM処置WTまたはRbm7-/-マウス（n=5）の生存率を示す。
【図１ｇ】BLM投与10日後のマウス肺のMRIによる線維化領域の評価を示す。
【図１ｈ】Azan-（上）、H＆E-（中）およびαSMA染色（下）肺切片を示す。スケールバーは100μmを示す。
【図１ｉ】BLM投与14日後のマウス肺のヒドロキシプロリン含量を示す。
【図１ｊ】BLM投与の14日後のマウス肺（n=3）におけるtgfb1およびcol1a1 mRNAのqPCR分析を示す。
【図１ｋ】BLM投与10日後のBAL（気管支肺胞洗浄液）液（WT、n=4；Rbm7-/-、n=3）のFACS分析によるSatMの遊走を示す。
【図１ｌ】コリン欠乏症-L-アミノ酸-高脂肪食（CDA-HFD、n=3）によって誘導される肝線維症のモデルにおいて、通常の食餌（N.C.）またはCDA-HFDによる12週間後の肝臓と、H＆E-（上）およびAzan染色された肝臓（下）の画像とを示す。
【図１ｍ】コリン欠乏症-L-アミノ酸-高脂肪食（CDA-HFD、n=3）によって誘導される肝線維症のモデルにおけるヒドロキシプロリン含有量を示す。
【図１ｎ】コリン欠乏症-L-アミノ酸-高脂肪食（CDA-HFD、n=3）によって誘導される肝線維症のモデルにおいて、WTマウスからの肝臓のWB分析によるRbM7の発現量を示す。
【図１ｏ】コリン欠乏症-L-アミノ酸-高脂肪食（CDA-HFD、n=3）によって誘導される肝線維症のモデルにおけるtgfb1およびcol1a1のmRNA発現を示す。
【図１ｐ】片側性尿管閉塞によって誘発された腎線維症のモデル（UUO、n=3）において、UUOの7日後のH＆E-（上）、Azan-（中）およびPicrosirius Red（下）染色された腎臓を示す。
【図１ｑ】片側性尿管閉塞によって誘発された腎線維症のモデル（UUO、n=3）におけるヒドロキシプロリン含有量を示す。
【図１ｒ】片側性尿管閉塞によって誘発された腎線維症のモデル（UUO、n=3）において、WTマウスからの腎臓のWB分析によるRbM7の発現量を示す。
【図１ｓ】片側性尿管閉塞によって誘発された腎線維症のモデル（UUO、n=3）におけるtgfb1およびcol1a1のmRNA発現を示す。
【図２ａ】BLMまたはPBSで処置した10日目の野生型マウスにおける肺CD45陽性および陰性細胞のRBM7発現のWB分析を示す。
【図２ｂ】BLMまたはPBS処置した野生型マウスにおけるRBM7の免疫組織染色を示す。
【図２ｃ】BLM処置骨髄（BM）キメラマウス（n=5）の生存率を示す。§および†の間のｐ値はp <0.01であった。
【図２ｄ】BMキメラから得たH＆E（上）およびAzan（下）染色を示す。スケールバーは100μmを示す。
【図２ｅ】BLM投与注入の14日後の肺（n=3）におけるtgfb1およびcol1a1のmRNAレベルを示す。
【図２ｆ】BLM投与の14日後の肺（n=3）におけるヒドロキシプロリン含量を示す。
【図２ｇ】BLM投与後所定日（d0、d1、d3、n=3；d6、n=4；d10、n=3；d14、n=4）経過後のWTマウスからの肺のWB分析を示す。
【図２ｈ】線維性ヒト肺（n=9）におけるRBM7発現の免疫組織染色を示す。
【図２ｉ】BLM投与後所定日経過後のWTマウスからの肺（n=3 /グループ）のWB分析を示す。
【図２ｊ】5日目から8日目まで所定処置を受けたBLM処置マウス（mock、n=23; Q-VD-OPh、n=15）の生存率を示す。§及び#の間のｐ値はP <0.01であった。
【図２ｋ】BLM投与10日後の肺の、H＆E（上）、Azan（中）およびTUNEL（下）染色を示す。スケールバーは100μmを示す。
【図２ｌ】BLM接種12日後のBAL（n=3）におけるSatM細胞数を示す。
【図２ｍ】BLM 摂取後のWTマウス及びRbm7-/-マウスの肺組織（左）、CDA-HFDを12週間与えたマウスの肝臓組織（中）、並びに、UUO後7日目の腎臓組織（右）のTUNEL染色を示す。
【図２ｎ】TUNEL陽性細胞の定量化（1群あたりn=3）を示す。
【図２ｏ】BLM処置及びそれに引き続く5および10日目（線維化段階）における肺特異的siRNAのi.v.注射後のマウスの生存率（siコントロール、n=22;線維化段階におけるsi-Rbm7、n=18）。＃及び†の間のＰ値は、P <0.01であった。
【図２ｐ】線維化段階（5および10日目）における所定のsiRNA処置を行ったBLM処置12日後の肺のH＆E（上）およびAzan（下）染色を示す。スケールバーは100μmを示す。
【図２ｑ】BLM処置投与10日後の肺のH＆E（上）およびTUNEL（下）染色を示す。スケールバーは100μmを示す。
【図２ｒ】BLM投与後10日目の骨髄（BM）キメラマウスのWB分析。
【図２ｓ】50μMエトポシドで24時間処理した後のWTおよびRbm7-/-HEK293細胞のWB分析を示す。
【図２ｔ】対照またはRBM7発現ベクターでトランスフェクトし、50μMエトポシドで24時間処理したWTまたはRbm7-/-HEK293細胞のWB分析を示す。
【図３ａ】WTおよびRbm7-/-HEK293細胞のアポトーシス関連分子の散布図を示す。
【図３ｂ】WTおよびRbm7-/-HEK293細胞のアポトーシス関連分子のタンパク質コード遺伝子の散布図を示す。
【図３ｃ】WTおよびRbm7-/-HEK293細胞のlncRNAおよびアンチセンスRNA発現のヒートマップを示す。
【図３ｄ】WTおよびRbm7-/-HEK293細胞のRNA-seqおよびRIP-seqによって検出されたncRNAのベン図を示す。
【図３ｅ】WTおよびRbm7-/-HEK293細胞の未処理のものからのRbm7の潜在的標的のヒートマップを示す。
【図３ｆ】WTおよびRbm7-/-HEK293細胞のエトポシド処理したもの（50μM、6時間）からのRbm7の潜在的標的のヒートマップを示す。
【図３ｇ】NEAT1およびMALAT1 lncRNAのRNA-およびRIP-seqデータを示す。
【図３ｈ】WT、Rbm7-/-または指定のncRNAをノックダウンしたRbm7-/-HEK293細胞の50μMエトポシド処理を24時間行ったもののWB分析を示す。
【図３ｉ】生細胞（緑色で視認された）および死細胞（赤色で視認された）の画像、およびHEK293細胞中、24時間50μMエトポシド処理によるそれらの定量を示す。
【図３ｊ】0日（BLM投与の6時間前）、5日および10日目に所定のsiRNA処置を行ったBLM処置マウス（WT si-コントロール、n=17；Rbm7-/-si-コントロール、n=10；Rbm7-/-si-NEAT1、n=10）の生存率を示す。§および＃の間と†および＃の間のＰ値はP <0.01であった。
【図３ｋ】所定のsiRNA処置（0、5および10日目）を行ったBLM投与後14日経過時の肺の、H＆E（上）およびAzan（下）染色を示す。スケールバーは100μMを示す。
【図３ｌ】所定のsiRNA処置（0、5および10日目）を行ったBLM処置後14日経過時の肺(WT si-control, n=5；Rbm7-/- si-control, n=5；Rbm7-/- si-NEAT1, n=4)におけるtgfb1及びcol1a1 mRNA量を示す。
【図３ｍ】所定のsiRNA処置（0、5および10日目）行ったBLM処置後14日経過時の肺（n=4）のヒドロキシプロリン含量を示す。
【図４ａ】WTまたはRbm7-/-HEK293細胞におけるNEAT1およびNEAT1.2 lncRNAのqPCR分析を示す。
【図４ｂ】空の完全長Rbm7またはRNA結合ドメイン欠失突然変異体をコードするベクターでトランスフェクトされたRbm7-/-HEK293細胞におけるNEAT1およびNEAT1.2のRNA発現レベルのqPCR分析を示す。
【図４ｃ】WTまたはRbm7-/-HEK293細胞におけるNEAT1含有（赤色で視認される）のパラスペックルの画像を示す。
【図４ｄ】WTまたはRbm7-/-HEK293細胞におけるNEAT1含有のパラスペックルの定量を示す。
【図４ｅ】WTおよびRbm7-/-マウス肺におけるNEAT1のin situハイブリダイゼーション染色（赤色で視認される）の画像を示す。
【図４ｆ】肺上皮細胞におけるNEAT1発現レベルのqPCR分析（n=3）を示す。
【図４ｇ】WTおよびRbm7-/-マウス初代肺上皮細胞のNEAT1 RNA-FISH（赤色で視認される）およびDAPI（青色で視認される）の画像を示す。
【図４ｈ】マウス初代肺上皮細胞におけるNEAT1含有パラスペックルの定量を示す。
【図４ｉ】50μMエトポシド処理で6時間処理したWT、Rbm7-/-またはNEAT1ノックダウンRbm7-/-HEK293細胞のγ-H2AX（緑色で視認される）およびDAPI（青色で視認される）び」色を示す。
【図４ｊ】6時間50μMエトポシド処理後のWT、Rbm7-/-またはNEAT1ノックダウンRbm7-/-HEK293細胞のWB分析を示す。
【図４ｋ】HEK293細胞における所定の抗体を用いた免疫沈降後のNEAT1エンリッチメントのホルムアルデヒド架橋RIP-qPCR分析を示す。
【図４ｌ】BRCA1（緑色で視認される）、NEAT1 RNA（赤色で視認される）およびDAPI（青色で視認される）について染色されたWTまたはRbm7-/-HEK293細胞を示す。
【図４ｍ】50μMエトポシドで24時間処理した、WT、Rbm7-/-またはBrca1ノックダウンRbm7-/-HEK293細胞のWB分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
１．バイオマーカー
本発明の線維症のバイオマーカーは、ＲＮＡ結合モチーフタンパク質７（ＲＢＭ７）からなることを特徴とする。以下、本発明のバイオマーカーについて詳述する。
【００１３】
本発明において線維症は、結合組織の過度の形成によって引き起こされる疾患であり、いかなる臓器の線維症であってもよい。本発明においては、線維症のバイオマーカーＲＢＭ７が、線維化期において過剰な細胞死を生じさせることを見出しており、細胞死がいずれの臓器にも共通して機能していることから、バイオマーカーＲＢＭ７は、いかなる臓器の線維症に対しても適用することができる。具体的には、線維症として、肺線維症、肝線維症、腎線維症、強皮症、心線維症、骨髄線維症等が挙げられる。
【００１４】
ＲＢＭ７は、ＲＮＡの分解を調節する核エキソソームターゲティング複合体の成分として公知であり、そのアミノ酸配列及びそれをコードするｍＲＮＡの塩基配列は、公的データベースに登録されている。具体的には、ヒトＲＢＭ７アミノ酸配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔにおける受入番号Ｑ９Ｙ５８０として登録されており、ヒトＲＢＭ７をコードするｍＲＮＡの塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおけるアクセッション番号ＡＦ１５６０９８として登録されている。
【００１５】
ヒトＲＢＭ７について、タンパク質の具体的なアミノ酸配列を配列番号１に示し、ｍＲＮＡの具体的な塩基配列を配列番号２に示す。ＲＢＭ７は、配列番号１における１位〜９１位のＲＮＡ結合ドメインが、線維化に関し重要な役割を果たす。
【００１６】
本発明の線維症のバイオマーカーであるＲＢＭ７は、配列番号１に示されるヒトＲＢＭ７の他、その変異体であってもよい。すなわち、本発明の線維症のバイオマーカーであるＲＢＭ７としては、配列番号１に示されるヒトＲＢＭ７、ヒトＲＢＭ７の変異体、ヒト以外の生物種のＲＢＭ７、ヒト以外の生物種のＲＢＭ７の変異体が挙げられる。
【００１７】
より具体的には、本発明の線維症のバイオマーカーであるＲＢＭ７としては、以下の（１）〜（３）のタンパク質が挙げられ、好ましくは（１）のタンパク質が挙げられる。
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（２）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＲＢＭ７としての活性を有するタンパク質
（３）配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が８０％以上であり、かつ、ＲＢＭ７としての活性を有するタンパク質
【００１８】
なお、上記（２）のタンパク質において、「１個もしくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加された」とは、特に限定されるものではないが、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により、置換、欠失、挿入、および／または付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは９個以下、より好ましくは８個以下、より好ましくは７個以下、より好ましくは６個以下、より好ましくは５個以下、より好ましくは４個以下、より好ましくは３個以下、より好ましくは１個又は２個、最も好ましくは１個）のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加されることを意図する。
【００１９】
また、上記（３）のタンパク質において、配列番号１に示すアミノ酸配列に対する配列同一性は、８０％以上であればよいが、好ましくは８５％以上、９０％以上、９５％以上、更に好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上が挙げられる。ここで、配列番号１に示すアミノ酸配列に対する配列同一性とは、配列番号１に示すアミノ酸配列と比較して算出される配列同一性である。また、「配列同一性」とは、ＢＬＡＳＴ  ＰＡＣＫＡＧＥ［ｓｇｉ３２  ｂｉｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０．１２；ａｖａｉｌａｂｌｅ  ｆｒｏｍ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）］のｂｌ２ｓｅｑ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｔａｔｉａｎａ  Ａ．Ｔａｔｓｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．１７４，ｐ２４７−２５０，１９９９）により得られるアミノ酸配列の同一性の値を示す。パラメーターは、Ｇａｐ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  Ｃｏｓｔ  ｖａｌｕｅ：１１、Ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｃｏｓｔ  ｖａｌｕｅ：１に設定すればよい。
【００２０】
また、上記（２）又は（３）のタンパク質において、ＲＢＭ７としての活性の測定には、周知の方法に従い、任意のタンパク質のＲＮＡプロセシング活性を測定すればよい。測定の結果、当該タンパク質がＲＮＡプロセシング活性を有していれば、当該タンパク質を、ＲＢＭ７としての活性を有するタンパク質と判定することができる。
【００２１】
２．線維症の検出方法
本発明は、線維症の検出方法を提供する。本発明の検出方法は、被験対象に由来する生体試料中の、ＲＢＭ７の検出を行う工程を含むことを特徴とする。
【００２２】
２−１．検出対象
本発明の検出方法の検出対象試料は生体試料であり、検出対象物質は前記バイオマーカー（即ち、ＲＢＭ７）である。
【００２３】
２−２．被験対象
本発明の検出方法で分析される線維症は、分析対象である生体試料の由来元となる被験対象が罹患する線維症に相当する。被験対象としては、任意の動物であってよく、具体的には、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類及びウサギ等の実験動物；ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の家畜；イヌ、ネコ等のペット；ヒト、サル、オランウータン、チンパンジー等の霊長類が挙げられる。本発明における被験対象は、好ましくは霊長類、更に好ましくはヒトである。
【００２４】
さらに、生体試料としては、被験対象から採取されたものであればよく、血液試料、組織試料及び細胞試料が挙げられる。非侵襲性の観点からは、生体試料として好ましくは血液試料が挙げられる。血液試料としては、例えば全血、血清、血漿等が挙げられる。調製簡便性及び診断精度の観点から、好ましくは血清が挙げられる。各種血液試料の採取及び調製は公知の手法に従って行うことができる。例えば、血清であれば、採取された血液（全血）から血球と、フィブリノーゲン（Ｉ因子）、プロトロンビン（ＩＩ因子）、Ｖ因子、ＶＩＩＩ因子等の血液凝固因子を除去して調製することができ、血液を静置した後に得られる上清、あるいは血液を遠心分離に供して得られる上清として得ることができる。血液試料は、必要に応じて、適切な濃度に希釈して使用される。
【００２５】
また、診断精度の観点からは、生体試料として好ましくは組織試料及び細胞試料が挙げられる。組織試料及び細胞試料としては、例えば、生検、外科病理診断、または細胞診により得られる試料が挙げられる。具体的には、組織試料及び細胞試料としては、新鮮組織及び細胞、凍結組織及び細胞、並びに病理組織学的に処理された（例えば、ホルマリン固定又はパラフィン包埋処理された）組織及び細胞等であってよい。これらの試料は、切片として使用されてもよいし、組織又は細胞から調製したタンパク質可溶画分として使用されてもよい。
【００２６】
２−３．抗ＲＢＭ７抗体
本発明の検出方法において、ＲＢＭ７の検出は、抗ＲＢＭ７抗体を使用し、生体試料中の前記バイオマーカー（ＲＢＭ７）と特異的結合させることにより行われる。
【００２７】
本発明の検出方法において生体試料中の前記バイオマーカーを検出するために使用される抗ＲＢＭ７抗体は、被験対象から採取された生体試料中に存在する前記バイオマーカー（ＲＢＭ７）を抗原として特異的に認識し得る限り特に限定されないが、被験対象と同じ種に属する動物に由来する抗ＲＢＭ７抗体が好ましい。例えば、被験対象がヒトである場合には、バイオマーカーの検出に使用する抗ＲＢＭ７抗体はヒト由来であることが好ましい。
【００２８】
また、血液試料中の前記バイオマーカーを検出するために使用される抗ＲＢＭ７抗体は、検出可能である限り特に限定されず、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ｓＩｇＡ、ＩｇＭ等のいずれのアイソタイプであってもよい。本発明において好ましい抗体のアイソタイプとしては、ＩｇＧが例示される。また、抗ＲＢＭ７抗体は、ＲＢＭ７を特異的に認識し結合するための相補性決定領域（ＣＤＲ）を少なくとも有するものであればよく、具体的には、（ａｂ'）2、Ｆａｂ'、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ）等の抗体の結合性断片であってもよい。抗ＲＢＭ７抗体は、常法に従って遺伝子工学的に作製することができる。
【００２９】
２−４．バイオマーカーの検出
本発明の検出方法は、被験対象から採取された生体試料中の前記バイオマーカーの存在の有無を検出することにより行うことができる。また、本発明の検出方法においては、前記バイオマーカーの検出を、生体試料中の前記バイオマーカーの量を測定することにより行ってもよい。前記バイオマーカーの量を測定し、当該測定値を、正常対照群及び／又は線維症に罹患した被験対象における前記バイオマーカーの値と比較することで、より精度の高い分析を行うことができる。従って、本発明の検出方法は、好ましくは、生体試料中の前記バイオマーカーを定量する方法によって行われる。
【００３０】
抗ＲＢＭ７抗体を使用して生体試料中に存在する前記バイオマーカーを検出する方法としては、具体的には、抗ＲＢＭ７抗体と生体試料とを接触させて、抗ＲＢＭ７抗体と前記バイオマーカーＲＢＭ７との特異的結合を直接的又は間接的に検出する方法が挙げられる。このような検出方法としては、具体的には、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロット法、免疫沈降法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法、蛍光イムノアッセイ法、免疫組織学的染色法等のイムノアッセイが例示される。これらのイムノアッセイにより前記バイオマーカーを検出する場合には、前記バイオマーカーＲＢＭ７に特異的に結合する抗体またはその二次抗体に酵素標識、発色標識、放射標識又は発光標識などの標識を結合し、この標識を検出又は測定することにより行うことができる。
【００３１】
前記イムノアッセイを実施する際の条件については、生体試料中の前記バイオマーカーＲＢＭ７と抗ＲＢＭ７抗体との特異的結合を検出し得る限り特に限定されず、従来公知の条件に基づいて設定される。
【００３２】
例えば、ＥＬＩＳＡ法により本発明のバイオマーカーＲＢＭ７を検出する場合、抗ＲＢＭ７抗体が固定されたマルチウェルプレートの各ウェルに被験対象から採取した生体試料を添加し、ウェル中の抗ＲＢＭ７抗体と血液試料中のバイオマーカーＲＢＭ７とを反応させる。そして、被験対象由来のＲＢＭ７に特異的に結合する標識化抗体を各ウェルに添加して反応させた後、酵素基質を添加して得られる反応生成物を検出及び／又は定量することによって、生体試料中の前記バイオマーカーの検出及び／又は定量を行うことができる。ここで、標識化抗体としては、生体試料を採取する被験対象の動物に基づいて適宜選択され得るが、被験対象がヒトである場合には、ヒトＲＢＭ７と特異的に結合する非ヒト標識化抗体（例えば、ウサギ由来抗ヒトＲＢＭ７抗体）等が挙げられる。
【００３３】
また、標識化抗体の標識に使用される酵素についても、通常使用されるものから適宜選択して用いることができ、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、エステラーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、β−Ｄ−グルクロニダーゼ等が挙げられる。また、酵素基質としては、酵素の種類に応じて公知の基質から適宜選択され得るが、例えば、酵素がペルオキシダーゼの場合であれば、３，３'，５，５'−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を基質として使用することができる。
【００３４】
酵素と基質との反応により生じた反応生成物の検出及び／又は定量は、反応生成物の吸光度を測定することによって行うことができ、例えば３，３'，５，５'−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を酵素基質として用いた場合には、４５０ｎｍにおける吸光度を測定することによって実施され得る。
【００３５】
ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）であれば、抗ＲＢＭ７抗体を放射性同位元素で標識し、生体試料中のバイオマーカーＲＢＭ７と反応させ免疫複合体を形成させ、放射性同位元素から放出される放射能に基づいて検出することができる。
【００３６】
蛍光イムノアッセイであれば、抗ＲＢＭ７抗体をプレート等に固相化し、そこに生体試料を加えて反応させた後、被験対象の生体試料中に存在するＲＢＭ７に特異的に結合する標識化抗体を更に反応させて、蛍光発色を検出することにより行うことができる。被験対象由来のＲＢＭ７に特異的に結合する標識化抗体としては、前記ＥＬＩＳＡ法において記載される通りであり、蛍光色素により標識化されたものを用いる。蛍光色素としては、ＦＩＴＣ、ＰＥ、ＡＰＣ、Ｃｙ−３、Ｃｙ−５等が例示される。
【００３７】
免疫沈降法であれば、抗ＲＢＭ７抗体と生体試料とを反応させて免疫複合体を形成させ、プロテインＡ、プロテインＧ等の活性吸着剤を用いて、不溶化物として沈降させることによって検出することができる。更に、免疫沈降法とウェスタンブロット法を組合せて検出することもできる。より具体的には、ＦＬＡＧ等のタグが連結された抗ＲＢＭ７抗体と生体試料とを反応させ、試料中にバイオマーカーＲＢＭ７が存在すれば免疫複合体が形成されるため、前述の活性吸着剤によって沈降させる。そして、得られた沈降物をウェスタンブロット法に供する。即ち、沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離展開し、ニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ膜等に転写した後、タグに対する抗体と転写膜上で抗原抗体反応を行うことにより生体試料中に前記バイオマーカーＲＢＭ７が存在していた場合にはバンドとして検出することができる。
【００３８】
免疫組織学的染色法により本発明のバイオマーカーＲＢＭ７を検出する場合は、組織試料又は細胞試料から、組織又は細胞組織の病理切片を作製し、必要に応じ脱パラフィン処理及び／又は賦活化処理を行った後、抗ＲＢＭ７抗体を用いて病理切片の表面に存在するバイオマーカーＲＢＭ７と特異的結合させる。そして、抗ＲＢＭ７抗体の二次抗体を標識化抗体に用いた可視化（染色）により、特異的結合したバイオマーカーＲＢＭ７の所在を判断することができる。可視化（染色）は、酵素抗体法、蛍光抗体法、オートラジオグラフィー法などによるシグナルの変化等を介して行われる。バイオマーカーＲＢＭ７の発現量の定量化は、染色状態を反映させたスコア値を割り出して数値化することによって行うことができる。ここで、標識化抗体としては、生体試料を採取する被験対象の動物に基づいて適宜選択され得るが、被験対象がヒトである場合には、抗ＲＢＭ７抗体に対するヒト標識化抗体が挙げられる。
【００３９】
２−５．線維症の罹患可能性の判定
本発明の検出方法によって、被験対象から採取された生体試料中に前記バイオマーカーが検出された場合、被験対象が線維症に罹患していると判断することができる。
【００４０】
線維症に罹患した被験対象では、生体試料中の本発明のバイオマーカーの量が正常対照群に比較して顕著に上昇している。従って、本発明のバイオマーカーを定量的に検出する場合には、正常対照群の血液試料中のバイオマーカーの量と被験対象由来の生体試料中のバイオマーカー量を比較することによって、線維症の診断を行うことができる。
【００４１】
本発明において、生体試料中に含まれるバイオマーカー量が正常対照群に比較して多いとは、具体的には被験対象のバイオマーカー量が正常対照群の９５パーセンタイル値をカットオフ値と設定し、当該カットオフ値以上である場合が挙げられる。当該カットオフ値以上であれば被験対象が線維症に罹患している可能性が高いと判断することができる。また、カットオフ値未満であれば、被験対象が線維症に罹患している可能性が低いと判断してもよい。また、生体試料中の本発明のバイオマーカーの量が多いほど、線維症の症状が重篤であると予測され得る。
【００４２】
また、本発明のバイオマーカーを検出することによって、被験対象の予後を予測することもできる。例えば、治療後に本発明の検出方法を行うことで、治療効果をモニターすることができる。この場合、本発明のバイオマーカーが検出されなくなった時点、又は検出量がカットオフ値未満となった時点で、治療を終了することができる。また、経過観察中に本発明の検出方法を行うことで、治療の開始又は再開のタイミングをモニターすることもできる。この場合、本発明のバイオマーカーが検出された時点、又は検出量がカットオフ値以上となった時点で、治療を開始又は再開することができる。
【００４３】
３．線維症の診断薬
本発明は、抗ＲＢＭ７抗体を含む、線維症の診断薬を提供する。本発明の診断薬は、上述の筋疾患の検出方法を行うために用いることができる。
【００４４】
本発明の診断薬に用いられる抗ＲＢＭ７抗体については、前述の通りである。
【００４５】
本発明の診断薬において、抗ＲＢＭ７抗体は、不溶化担体上に固定化された状態で提供されてよい。不溶化担体の素材としては、バイオマーカーの検出を妨げない限り特に限定されず、例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリルニトリル、ポリビニルクロライド、フッ素樹脂、架橋デキストラン、紙、シリコン、ガラス、金属、アガロース等を例示することができる。また、これらの材料を２種以上組合せて用いてもよい。不溶化担体の形状としては、例えばマイクロプレート、トレイ状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、試験管等のいずれの形状であってもよい。
【００４６】
不溶化担体上への抗ＲＢＭ７抗体の固定化は、従来公知の方法に従って行うことができる。
【００４７】
不溶化担体上に固定化される抗ＲＢＭ７抗体の量は、生体試料中のＲＢＭ７と特異的に結合するために十分な量であれば特に限定されないが、例えば、不溶化担体に固定化する際に使用される溶液中の抗ＲＢＭ７抗体の濃度として、１〜１０μｇ／ｍＬとなる量が挙げられる。
【００４８】
また、本発明の診断薬は、抗ＲＢＭ７抗体の他に、緩衝液、安定化剤、防腐剤等を含んでいてもよく、また、従来公知の方法に従って製剤化されていてもよい。さらに、本発明の診断薬は、ＲＢＭ７の検出を実施するために必要とされ得る標識化抗体、標識物質の検出剤、溶解剤、洗浄剤、反応停止液、コントロール試料、検査プロトコル等を含んでいてもよい。検査プロトコルには、上述の線維症の検出方法を実施するための操作及び手順等の情報が含まれる。
【００４９】
４．抗線維化剤の有効成分のスクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、抗線維化剤の有効成分をスクリーニングする方法であって、以下の（Ａ）〜（Ｃ）の工程を含む。
（Ａ）ＲＢＭ７を発現する細胞に被検物質を接触させる工程、
（Ｂ）前記細胞におけるＲＢＭ７の発現量を測定する工程、及び
（Ｃ）被検物質の非存在下において測定した場合と比較して、ＲＢＭ７の発現量を低下させる場合に、前記被験物質を、抗線維化剤の有効成分の候補物質として選択する工程。
【００５０】
４−１．被験物質
本発明のスクリーニング方法において、被験物質は、抗線維化剤の有効成分の候補物質となり得るものであればよく、その種類については、特に制限されず、例えば、生体由来物質等の天然物質であってもよく、また化学的に合成された合成物質であってもよい。具体的には、被験物質として、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アプタマー等の核酸分子等が挙げられる。
【００５１】
４−２．（Ａ）工程
本発明のスクリーニング方法では、先ず、（Ａ）工程において、ＲＢＭ７を発現する細胞に被検物質を接触させる。
【００５２】
ＲＢＭ７を発現する細胞については、ＲＢＭ７を発現することを限度として、特に制限されないが、例えば、線維化細胞等のＲＢＭ７を内在的に発現している細胞、正常細胞にＲＢＭ７遺伝子をトランスフェクトすることにより、ＲＢＭ７発現能を獲得させた細胞等を使用することができる。正常細胞へのＲＢＭ７遺伝子のトランスフェクションは、公知の遺伝子工学的手法を用いて行うことができる。
【００５３】
ＲＢＭ７を発現する細胞に被験物質を接触させるには、当該細胞が生育可能な培地中に、当該細胞と被験物質を添加して、当該細胞が生育可能な温度で培養すればよい。また、被験物質として、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ等の核酸分子を使用する場合であれば、これらの核酸分子が前記細胞内に導入され易いように、核酸導入補助剤も共存させてもよい。核酸導入剤としては、核酸導入補助剤としては、リポフェクタミン、オリゴフェクタミン、ＲＮＡｉフェクト、リポソーム、ポリアミン、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム、デンドリマー等が挙げられる。
【００５４】
４−３．（Ｂ）工程
次に、（Ｂ）工程において、前記細胞におけるＲＢＭ７の発現量を測定する。前記細胞におけるＲＢＭ７発現量の測定は、細胞内のＲＢＭ７のｍＲＮＡ量及び／又はＲＢＭ７量（タンパク質量）を公知の手法に従って測定することによって行うことができる。
【００５５】
４−４．（Ｃ）工程
さらに、（Ｃ）工程において、ＲＢＭ７の発現抑制能が認められた被験物質を抗線維化剤の有効成分の候補として選択する。
【００５６】
具体的には、被験物質を添加せずに前記（Ａ）工程及び前記（Ｂ）工程を行った場合のＲＢＭ７の発現量に比べて、ＲＢＭ７の発現量が少ない被験物質が、ＲＢＭ７の発現抑制能があると判定される。
【００５７】
ＲＢＭ７の発現抑制能が認められた被験物質については、線維化を抑制する作用があり、抗線維化剤の有効成分の候補として選択される。このようにして選択された被験物質は、実際に、線維化抑制作用を試験し、抗線維化剤としての臨床応用の是非を評価することができる。
【００５８】
５．抗線維化剤
本発明の抗線維化剤は、ＲＢＭ７の発現を抑制する物質を有効成分とすることを特徴とする。
５−１．有効成分
ＲＢＭ７は線維化期における過剰な細胞死に関与しており、線維化を亢進させる作用がある。本発明の抗線維化剤は、ＲＢＭ７の発現を抑制することによって、線維化期における細胞死を抑制し、線維化を効果的に抑制させることが可能になる。ＲＢＭ７のアミノ酸配列及びそれをコードするｍＲＮＡの塩基配列は、「１．バイオマーカー」で述べた通りである。
【００５９】
本発明において、「ＲＢＭ７の発現を抑制する物質」としては、薬学的に許容され、且つＲＢＭ７をコードするＤＮＡ（ＲＢＭ７遺伝子）からＲＢＭ７の発現を抑制できることを限度として特に制限されない。ＲＢＭ７の発現を抑制する物質は、ＲＢＭ７遺伝子の転写、転写後調節、翻訳、翻訳後修飾等のいずれの段階でＲＢＭ７の発現に対する抑制作用を発揮するものであってもよい。ＲＢＭ７の発現を抑制する物質として、具体的には、デコイ核酸等のＲＢＭ７遺伝子の転写を抑制する核酸分子；ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ等のＲＢＭ７のｍＲＮＡに対してＲＮＡ干渉作用を有するＲＮＡ分子又はその前駆体；ｍｉＲＮＡ、アンチセンス核酸（アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）、リボザイム等のＲＢＭ７のｍＲＮＡの翻訳を抑制する核酸分子等の核酸医薬が挙げられる。これらの核酸医薬は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。また、これらの核酸医薬の塩基配列は、ＲＢＭ７遺伝子の塩基配列の情報に基づいて、当業者が公知の手法により適宜設計することができる。これらの核酸医薬の中でも、臨床応用への容易性等の観点から、好ましくは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンス核酸が挙げられ、更に好ましくはｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡが挙げられ、特に好ましくはｓｉＲＮＡが挙げられる。
【００６０】
また、前記核酸分子がＲＮＡ分子である場合は、生体内で生成し得るようにデザインされたものであってもよい。具体的には、当該ＲＮＡ分子をコードしているＤＮＡを哺乳動物細胞用の発現ベクターに挿入したものであってもよい。このような発現ベクターとしては、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルス等のウイルスベクターや、動物細胞発現プラスミド等が挙げられる。
【００６１】
５−２．対象疾患
ＲＢＭ７は、線維化期における過剰な細胞死により線維化を亢進させているため、本発明の抗線維化剤では、ＲＢＭ７の発現を抑制することにより、線維化の抑制が可能となる。従って、本発明の抗線維化剤は、線維症の治療、予防又は進行防止の用途に使用できる。ＲＢＭ７が亢進する細胞死は、いずれの臓器でも共通して機能している。したがって、本発明の抗線維化剤の適用対象となる線維症としては、いずれの臓器における線維症であってもよい。具体的には、肺線維症、肝線維症、腎線維症、強皮症、心線維症、骨髄線維症等が挙げられる。
【００６２】
また、本発明の抗線維化剤は、ヒトのみならず、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ヤギ、ラット、マウス、ウサギ等の哺乳動物に対して使用できるが、ヒト用の医薬品として好適に使用される。
【００６３】
５−３．投与態様
本発明の抗線維化剤の投与形態については、抗線維化効果が得られることを限度として、経口投与又は非経口投与のいずれであってもよく、使用する有効成分の種類に応じて適宜設定すればよい。本発明の抗線維化剤の投与形態として、具体的には、経口投与；注射投与（静脈注射、皮下注射、筋肉注射、腹腔注射、患部への局所注射等）、座薬投与等の非経口投与が挙げられる。
【００６４】
本発明の抗線維化剤の投与量については、使用する有効成分の種類、投与形態、適用対象となる臓器、患者の症状の程度等に応じて適宜設定すればよい。例えば、有効成分として核酸分子を使用する場合であれば、核酸分子の１回量として、たとえば０．０１μｇ〜３０００ｍｇ／ｋｇ体重程度を１〜３日ごとに１回程度の頻度で投与することが挙げられるが、抗線維化剤及び投与対象ごとに、薬理作用、血中濃度、及び副作用等に応じて適宜調節することができる。
【００６５】
５−４．製剤形態
本発明の抗線維化剤は、有効成分の種類や投与形態に応じた製剤形態に調製される。本発明の抗線維化剤の製剤形態としては、例えば、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤、坐剤等の固形製剤；液剤、懸濁剤、乳剤、注射剤等の液状製剤等が挙げられる。
【００６６】
また、本発明の抗線維化剤は、その製剤形態に応じて、薬学的に許容される担体や添加剤を加えて製剤化される。例えば、固形製剤の場合であれば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を用いて製剤化することができる。また、液状製剤の場合であれば、生理食塩水、緩衝液等を用いて製剤化することができる。
【００６７】
また、本発明の抗線維化剤において、有効成分として核酸分子を使用する場合であれば、当該核酸分子が細胞内に移行され易いように、核酸導入補助剤と共に製剤化されていることが望ましい。核酸導入補助剤としては、上述の「４．抗線維化剤の有効成分のスクリーニング方法」で述べた通りである。
【００６８】
６．線維症の診断方法
本発明は、線維症の診断方法を提供する。当該診断方法は、被験対象から採取された生体試料におけるＲＢＭ７を検出する工程、ならびに前記工程で得られた結果に基づいて線維症を診断する工程、を含むことを特徴とする。
【００６９】
本発明の診断方法において、抗体の検出方法、及び被験対象が線維症に罹患していると判定する基準等については、上述の「２．線維症の検出方法」で述べた通りである。
【００７０】
７．線維症の治療、予防又は進行防止方法
本発明は、線維症の治療、予防又は進行防止方法（以下、治療方法等と記載する。）を提供する。当該治療方法等は、線維症患者に、治療有効量のＲＢＭ７の発現を抑制する物質を投与する工程を含むことを特徴とする。
【００７１】
本発明の治療方法等において、投与されるＲＢＭ７の発現を抑制する物質、及び治療有効量、投与方法等については、上述の「５．抗線維化剤」で述べた通りである。
【実施例】
【００７２】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。【００７３】
［動物］
マウス（６週齢より若い雄）を、特定病原体が存在しない施設の温度調節された室内の換気ケージに個々に収容し、餌及び水を自由に与えた。すべての実験は、地方倫理審査委員会の承認を受け、大阪大学微生物病研究所の動物愛護利用委員会のガイドラインに従って実施された。【００７４】
［試薬］
フローサイトメトリのための抗体は、以下の商品を購入して用いた：抗Ly6C（AL-21; BioLegend）、抗-F4 / 80（BM8; BioLegend、San Diego、CA、米国）、抗CD45（30-F11; BioLegend）、抗CD66a（Ceacam1）（Mab-CC1; BioLegend）、及び抗Msr1（LS-c43466; LSBio）。
ウェスタンブロッティング、免疫沈降及び免疫組織化学染色のための抗体は、以下のものを用いた：抗BCLXL（No.2762;Cell Signaling Technology、米国マサチューセッツ州ダンバーズ）、抗BCL2（No.2876; Cell Signalingテクノロジー）、抗PARP（no.9532; Cell Signaling Technology）、抗ヒト切断PARP、抗マウス切断PARP（No.9544; Cell Signaling Technology）、抗γH2AX（No.9718; Cell Signaling Technology）、抗ATM（No.2618及び32420; Abcam、抗BRCA1（16780及び16781; Abcam）、抗BRCA2（sc-8326; Santa Cruz Biotechnology、Dallas、TX、USA）、抗ATRA（No.2905; Abcam）抗マウスRBM7（調製品）、抗ヒストンH3（No.9715; Cell Signaling Technology）、抗ヒトRBM7（No HPA013993; Atlas Antibodies、Bromma、Sweden））、抗Oas1a（sc-365357、Santa Cruz Biotechnology）、抗Oas1a（Santa Cruz Biotechnology）、抗Oas1a抗PPO1R14B（No.18476-1-AP; Proteintech、Rosemont、IL、USA）、抗PCOLCE（no.ab39204; Abcam）、抗-PCOLCE-β-アクチン（no. sc-1615; Santa Cruz Biotechnology）、マウスモノクローナル抗α平滑筋アクチン（no. A254 7; Sigma、St.Louis、MO、USA）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）-コンジュゲート抗マウスIgG（no. NA931V; GE Healthcare）、HRPコンジュゲート抗ウサギIgG（NA934V番号; GE Healthcare、Little Chalfont、UK）、Alexa Fluor 488結合ヤギ抗ウサギIgG（A21202、Life Technologies、Carlsbad、CA、USA） Alexa Fluor 568結合ヤギ抗マウスIgG（No11031; Life Technologies）及び正常マウスIgG（no. sc-2025; Santa Cruz）。【００７５】
［動物］
Rbm7-/-マウスは、非特許文献７の記載に従い、遺伝子ターゲッティング技術を用いて生成され、PCRによって遺伝子型決定された。10回以上C57BL / 6Jマウスへ戻し交配した後、Rbm7+/-マウスを交配させることによってRbm7+/+（WT）及びRbm7-/-同腹仔を得た。Cebpb-/-キメラマウスは、非特許文献１１の記載に基づいて調製した。【００７６】
［ヒト臨床サンプル］
肺組織は、慢性線維化特発性間質性肺炎（特発性肺線維症６例および線維化非特異性間質性肺炎３例）の９例および癌などの他の病態に罹患している非線維性正常肺領域９例から採取した。経験豊富な病理学者により、この研究で分析されたすべてのサンプルが癌腫を含まないことが確認された。すべての患者および対照被験者は、大阪大学倫理委員会の承認を受けた同意書に署名した。ヒトの研究は、大阪大学の倫理委員会によって承認された。【００７７】
［線維症モデル］
肺線維症の実験のため、性別が一致した8〜10週齢のマウスの群を麻酔し、PBSまたはブレオマイシン（BLM、3μg/ g体重; Nippon Kayaku、Tokyo、Japan）を気管内に注入し、所定の時点で肺を採取した。肝線維症の実験のため、性別一致の8〜12週齢のマウスのグループに、通常の飼料またはコリン欠乏L-アミノ酸の高脂肪食（CDA-HFD; Research Diets、ニューブランズウィック、ニュージャージー州、米国）、肝臓を12週間後に採取した。腎線維症の実験のため、6〜8週齢の雄マウスの左尿管結紮により片側尿管閉塞（UUO）を誘導した。反対側の腎臓は対照とした。手術後7日目に腎臓を採取した。また、パンカスパーゼ阻害剤Q-VD-OPh（No. 1135695-98-5, Santa Cruz Biotechnology）を5日目に体重1kgあたり20mgとなる濃度で、ブレオマイシン接種後6日目から8日目に体重1kgあたり10mgとなる濃度で、腹腔内注射した。【００７８】
［in vivo肺特異的siRNA］
肺特異的siRNA媒介標的RNAノックダウンは、背側静脈からInvivofectamine（登録商標）Lung-siRNA複合体の注射により得た。注射は、siRNAが0.5mg / kg体重となる濃度で行った。 Invivofectamine（登録商標）Lungは、Thermo Fisher Scientific（Waltham、MA、USA）によって提供された。Ambion（登録商標）In Vivo Pre-designed siRNAは、Thermo Fisher Scientific（Rbm7; S84280、NEAT1; n256283）から購入した。Invivofectamine（登録商標）Lung-siRNA複合体は、プロトコルに従って調製した。具体的には、siRNA溶液を複合体形成緩衝液と混合し、Invivofectamine（登録商標）Lung Reagentを添加した。Invivofectamine（登録商標）Lung-siRNA混合物を、プロトコルに従って、Float-A-Lyzer（登録商標）透析装置（8〜10kDa）により透析した。透析後、最終容量を調整し、PBSで希釈して所定の濃度とした。【００７９】
［初代細胞単離および蛍光活性化細胞選別］
初代細胞を単離するために、肺をマウスから切除し、約1mm3の断片に切断した。肺の初代細胞は、F12K培地（no. 21127022; Thermo Fisher Scientific）中ペニシリン（100U / ml）-ストレプトマイシン（100μg/ ml）（no. 09367-34;ナカライテスク（Nacalai Tesque））の存在下で、37℃で1時間インキュベートすることにより、肺組織からコラゲナーゼＩ（1mg / ml; Sigma） Kyoto、Japan）により分離された。次いで、細胞を1100rpmで10分間遠心分離し、0.2mg / mlのデオキシリボヌクレアーゼI（no. 11284932001; Roche）を含有するF12Kにより5分間25℃で処理した。次いで、単一細胞懸濁液を1100rpmで10分間遠心分離し、赤血球溶解緩衝液（Sigma-Aldrich）で3分間処理した。細胞を抗マウスCD45-APC（BioLegend）で染色し、次いでCD45およびCD45-細胞をFACS Aria（BD Biosciences、San Jose、CA、USA）を用いて選別した。初代肺上皮細胞の単離のため、細胞を10％FBSを含むF-12K培地に再懸濁し、10cm培養皿に37℃で2時間置いた。インキュベーション後、非接着細胞を回収した。【００８０】
［ヒドロキシプロリンアッセイ］
組織試料を塩基加水分解に付した。ヒドロキシプロリンは、ヒドロキシプロリン比色アッセイキット（BioVision、San Francisco、CA、USA）をプロトコルに従って使用して測定し、レベルは組織g当たりのμg量として表した。【００８１】
［SatM遊走アッセイ］
非特許文献１１に記載の方法に従って、SatMを骨髄から収穫した。細胞の遊走能評価は、5μm孔サイズのインサートを有する遊走チャンバー（番号3421; Corning、NY、USA）を用い、プロトコルに従って行った。具体的には、ホモジナイズした肺または細胞抽出物と共に5％（v / v）ウシ胎仔血清（番号10270-106; Thermo Fisher Scientific）を含むRPMI 1640を収容した24ウェルプレートにインサートを入れた。 PBSまたはBLM接種マウス肺をULTRA-TURRAX（登録商標）T25（IKA、Werke Staufen、Germany）によりホモジナイズし、不溶性画分を遠心分離により除去した。同数の細胞をBioMasherIII（Nipp
i、Tokyo、Japan）でホモジナイズし、不溶性画分を遠心分離により除去した。ホモジナイズしたサンプルの上清を収集し、Amicon（登録商標）Ultra-15 10K（no. UFC901024; Millipore）による限外濾過によってプロトコルに従い濃縮した。次いで、血清欠乏細胞（n=1×10 5）をインサート上に載せ、37℃で16時間インキュベートした。移動した細胞を、Diff Quick（No. 16920、Sysmex、Hyogo、Japan）で染色し、CellTiter-Glo（登録商標）Luminescent Cell Viability Assay（No.G7570、Promega、Madison、USA）によってプロトコルに従い定量した。【００８２】
［ウェスタンブロッティング］
タンパク質をSDS-PAGEにより分離し、ポリビニリデンジフルオリド（PVDF）膜に転写した。膜を適切な一次抗体およびHRP結合二次抗体とともにインキュベートし、ブロットを増強化学発光（ECL）を用いて可視化した。ローディングコントロールとしてβ-アクチンをプロービングした。以下の一次抗体を用いた：ウサギポリクローナル抗γH2AX（1：1000; Cell Signaling Technology）、ウサギポリクローナル抗PARP（1：1000; Cell Signaling Technology）、ウサギポリクローナル抗開裂PARP（1：1000; Cell Signaling 技術）、ウサギポリクローナル抗BCL2（1：1000; Cell Signaling Technology）、ウサギポリクローナル抗BCLXL（1：1000; Cell Signaling Technology）、ウサギポリクローナル抗開裂カスパーゼ3（1：1000; Cell Signaling Technology） ウサギ抗マウスRBM7（1：1000;独自で調製）およびウサギポリクローナル抗ヒトRBM7（1：200; Atlas抗体）を用いた。【００８３】
［RT-qPCR］
High Pure RNA isolation kit（no. 1828665; Roche）またはTRIzol（no. 5596018; Thermo Fisher Scientific）を使用して、プロトコルに従い全RNAを単離した。RNAをNanoDrop 1000で定量し、ReverTra Ace qPCR RT Master Mix（Toyobo、Osaka、Japan）を用いて逆転写した。定量的逆転写PCR（RT-qPCR）は、SYBR Green 2x Master Mixを用いて、ReverTra Ace qPCR RT Master Mixのプロトコルに従い、又は、tnfa、il6、il1b、cxcl1、tgfb、col1a1および18Sに関してはTaqMan Gene Expression Assay（Thermo Fisher Scientific）を用いて行った。相対的mRNA発現値は、18Sを標的遺伝子とした標準曲線法を用いて計算した。【００８４】
qRT-PCRにおけるプライマー配列は以下のとおりである。
human NEAT1(fw: atgccacaacgcagattgat, rv: cgagaaacgcacaagaagg)
human NEAT1.2 (fw: ctagaggctcgcattgtgtg, rv: gcccacacgaaaccttacat)
human MALAT1 (fw: cttccctaggggatttcagg, rv: gcccacaggaacaagtccta)
mouse NEAT1 (fw: ttgggacagtggacgtgtgg, rv: tcaagtgccagcagacagca)
mouse MALAT1 (fw: tcggccttgtagattaaaacgaa, rv: aacggccgtcaacttaacct)
18S (fw: cgaacgtctgccctatcaactt, rv: acccgtggtcaccatggta),
NIFK-AS1 (fw: cttcccaggctcagagatgg, rv: cctgatgcggcaaatctgtgg)
HEXA-AS1 (fw: ggcttgagaagtgatcaagg, rv: tatcatgcccagtgaaagcc)
ZNF197-AS1 (fw: gatttgcatttcaattgagg, rv: attctgttctcatctgcagg)
ENO1-AS1 (fw: acctacctggattcttgtgaaccattc, rv: cttgaactttgagaaattcc)
FAM41C (fw: gaacattgctgtaaactgctctgaga, rv: caaggtcctcttgctgttcc)
HCG25 (fw: gagcctaagttcaaacgagg, rv: ttcccaagaccacttcccat)
TMEM9B-AS1 (fw: ggtcttctactggacaaagg, rv: tattccagaacagcacttcc)
proSTK11IP (fw: gggagtctaaggaaaaggag, rv: cagtgaaaggagagcgtatc)
proPOGZ (fw: agttccaagaaaccacacac, rv: ggtcgtttgagtggactaac)
STK11IP (fw: ggtcagacacaaccacaagg, rv: cgtgaccatggtagttggag)
POGZ (fw: aagcctggagagatgcctta, rv: aatgcattgccatttttgaa)【００８５】
［TUNELアッセイ］
パラフィン包埋組織切片のTUNEL染色を、ApopTag(登録商標) Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kitを用いて、プロトコルに従い行った。切片をジアミノベンジジンで染色し、ヘマトキシリンで対比染色した。TUNEL陽性アポトーシス細胞は茶色の核を示した。5つのビューを各セクション（20倍の倍率）でランダムに選択し、アポトーシス細胞の数を計算した。【００８６】
［細胞死アッセイ］
細胞を、50μMのエトポシド(no. E0675; Tokyokasei, Tokyo, Japan)を含むまたは含まないガラスチャンバスライド上で24時間培養し、live/death detection kit (PK-CA707-30002; PromoKine, Heidelberg, Germany)を用いてプロトコルに従い細胞死を検出した。【００８７】
［フローサイトメトリおよびELISAによる気管支肺胞液（BALF）の分離および分析］
マウスをCO2麻酔で安楽死させ、気管にカニューレを挿入し、肺を1mlずつ氷冷PBSで3回洗浄した（合計3ml）。遠心分離後、細胞を赤血球溶解緩衝液（Sigma-Aldrich）で3分間処理した。氷冷FACS緩衝液[PBS中0.5％ウシ血清アルブミン（BSA）および2mM EDTA、pH7.2]で洗浄した後、細胞を抗体とともに30分間インキュベートし、FACS緩衝液で2回洗浄した。フローサイトメーター（FACSCalibur、BD Biosciences）を用いてデータを取得し、FlowJoソフトウェア（Tree Star）によって分析した。市販のELISA（R＆D Biosystems、Minneapolis、MN、USA）を使用して、プロトコルに従い検出されたサンプル中の全TNF-αおよびIL-6を測定した。【００８８】
［組織学的分析］
肺、肝臓および腎組織をPBS中の4％パラホルムアルデヒド（PFA）中で24時間固定し、パラフィンに包埋した。ステンレススチールのナイフを有するパラフィンミクロトームを用いて切片（４μｍ厚）を切り出し、ガラススライド上に載せ、キシレンで脱パラフィンし、段階的にエタノールで脱水し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。コラーゲン沈着を評価するために、切片をAzanで染色した。腎臓におけるコラーゲン線維形成を評価するために、切片を、0.2％リンモリブデン酸水和物、0.4％Direct Red 80および1.3％の2,4,6-トリニトロフェノール（Polysciences、Inc.、Warrington、PA、USA）を用いてPicrosirius Red法により染色した。免疫蛍光研究のために、肺組織を氷上で4％PFA中で1時間固定し、次いで30％ショ糖を含むPBS中4℃で一晩インキュベートした。組織をOCT化合物（Sakura Finetek、Torrance、CA、USA）に包埋し、10μm切片に凍結切片化し、Superfrostスライド（Thermo Fisher Scientific）上に載せた。切片をPBSで洗浄し、3％BSAでブロッキングし、マウスモノクローナルα平滑筋アクチン（1：200）と共にインキュベートした。二次抗体はFITC結合（1：1000; Life Technologies）のものを用いた。オイルレッドO染色のために、肝臓組織を4％パラホルムアルデヒドで固定し、OCTで凍結し、切片化した。空気乾燥の15分後、切片をオイルレッドO（no. O1391; Sigma）で染色し、ヘマトキシリンで対比染色した。【００８９】
［組織切片の免疫組織化学］
ホルマリン固定パラフィン包埋4μm厚（肺および肝臓）および3μm厚（腎臓）切片を、標準的な手順を用いて染色した。具体的には、切片を段階的にアルコールで脱パラフィンし、PBSで洗浄した。熱活性化抗原回収は、クエン酸塩緩衝液（no. S170084-2; DAKO）（肺および肝臓）およびオートクレーブ（腎臓）を用いてPascal Pressurized Heating Chamber（Dako、Glostrup、Denmark）内で行った。内在性ペルオキシダーゼは、ペルオキシダーゼブロッカー（DAKO）（肺および肝臓）およびH2O2（腎臓）を用いてブロッキングした。3％BSA（肺および肝臓）および5％正常ヤギ血清（腎臓）中でのインキュベーションにより、スライドを非特異的タンパク質結合についてブロッキングした。組織は、1：300希釈（肺および肝臓）および1：1000希釈（腎臓）の両方でウサギ抗ヒトRBM7またはウサギ抗マウスRBM7を用いて免疫染色した。【００９０】
［培養細胞の免疫細胞化学およびin situハイブリダイゼーション］
細胞をカバースリップ上で培養し、4％PFAで固定し、PBS中の0.5％Triton X-100で透明化し、1％BSAでブロッキングした。次いで、細胞を一次抗体および二次抗体と共にそれぞれ1時間および30分間インキュベートした。抗体は以下の希釈度で使用した：ウサギポリクローナル抗γ-H2AX、1：500；ウサギポリクローナル抗ヒトRBM7、1：200；Alexa Fluor 488結合ヤギ抗ウサギIgG、1：1000；およびAlexa Fluor 568結合ヤギ抗マウスIgG（1：1000）。ヒトNEAT1（VA1-12621-01; Thermo Fisher Scientific）またはマウスNEAT1（VB1-12456; Thermo Fisher Scientific）をターゲットとして設計されたQG ViewRNA TYPE 1プローブセットを用い、QuantiGene ViewRNA ISH細胞アッセイ（Thermo Fisher Scientific）を使用して、プロトコルに従いin situハイブリダイゼーション（ISH）を行った。同時免疫蛍光のために、以下の一次抗体および希釈を、FIH実験の後に使用した：ウサギポリクローナル抗ヒトRBM7（1：200; Atlas Antibodies）、マウスモノクローナル抗BRCA1（ab16781,1：200; Abcam）、ウサギポリクローナル抗BRCA2（sc-8326, 1:50; Santa Cruz）、マウスポリクローナル抗ATM（1:250; Abcam）、ウサギモノクローナル抗ATR（1：100; Abcam）またはウサギポリクローナル抗p53（1：250; Abcam） 2000;細胞シグナリング技術）。また、Alexa 488結合二次抗体（1：1000; Life Technologies）を使用した。ゲノムDNAをHoechst 33342色素で染色した。LSM780共焦点レーザー走査顕微鏡（Carl Zeiss、Oberkochen、Germany）を用いて試料を検査した。 NEAT1含有パラスペックルは、NEAT1含有核集合体によって同定された。NEAT1含有パラスペックルの定量は、63×倍率で5枚の画像を取得し、核の総数に対するNEAT1含有パラスペックルで核数を計測することによって行った。【００９１】
［骨髄キメラマウスの作製］
骨髄（BM）細胞をWTおよびRbm7-/-マウスから調製し、致死的にγ線を照射したCD45.1+ドナーマウスに静脈注射した。キメラマウスに、ネオマイシンおよびポリミキシンB（Sigma）を飲料水中で4週間投与した。マウスを分析前に少なくとも8週間再構成した。 キメラマウス由来の脾細胞の90％以上がCD45.2+であった。【００９２】
［CRISPR / Cas9媒介によるRbm7の標的化欠失］
CRISPR / Cas9を用いたゲノム編集を行うため、標的配列をプラスミドpX330にクローニングした。精製されたプラスミド（Rbm7および空のベクターコントロール）を、Lipofectamine 2000を用いてHEK293細胞にトランスフェクトした。単一のクローンを選択し、配列決定した。RBM7タンパク質の消失はウェスタンブロッティングによって確認した。【００９３】
［HEK293およびHEK293T細胞培養］
細胞を、50μMの2-メルカプトエタノール（no. 21417-52; Nacalai Tesque）、10％（v / v）のウシ胎仔血清（no. 10270-106; Gibco）、100U / mlのペニシリンGおよび100μg/ mlのストレプトマイシン（ともにNacalai Tesque製）を含むDMEM（no. 08459-64; Nacalai Tesque）培地で、加湿した5％CO2雰囲気中、37℃で培養した。【００９４】
［プラスミドおよびプライマー］
RNA結合ドメイン（1-267および92-267）を欠く全長ヒトRbm7およびRbm7をコードするcDNAを、pFlag-CMV2（Sigma）またはpcDNA 3.1（+）（Invitrogen）ベクターに挿入した。ヒト全長BRCA1は、addgene（No. 71117）から購入した。【００９５】
［HEK293およびHEK293T細胞のトランスフェクション］
トランスフェクションの前日に細胞を播種した。翌日、細胞が70〜80％コンフルエントになったとき、培地をペニシリンおよびストレプトマイシンを含まない培地に交換した。 Opti-MEM（Life Technologies）中のDNAをLipofectamine 2000（Invitrogen）と混合し、室温で20分間以上インキュベートした。次いで、混合物を細胞に滴下した。6時間後に培地を完全培地に交換し、細胞をトランスフェクションの24時間後に実験に使用した。【００９６】
［Flagタグ付きRBM7発現HEK293細胞のRNA免疫沈降（RIP）］
FLAG標識RBM7発現HEK293細胞を、細胞溶解緩衝液[25mM Tris（pH7.6）、150mM NaCl、1mM EDTA、0.5％NP-40、1mM DTT、150U / ml RNaseOUT RNase阻害剤（Thermo Fisher Scientific）およびEDTAを含まないプロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche）]に溶解させた。ライセートを遠心分離によって清澄化した。ライセートを、抗FLAG M2アガロース親和性ゲル（No.A2220; Sigma）で2時間インキュベートした。免疫沈降物を最終的に細胞溶解緩衝液を用いて3回洗浄し、Trizol（番号15596018; Invitrogen）で溶離した。単離されたRNAをDNase1（番号79254; QIAGEN）で処理した。【００９７】
［RNA配列決定］
RIP試料から溶離させたRNA (n=2 biological replicates)と、50μMのエトポシド（Tokyokasei）（4μg/サンプル）存在下又は不在下で処理されたWT及びRbm7-/-HEK293細胞からの全RNAとは、Ribo-Zero Gold rRNA removal kit（Illumina、San Diego、CA、USA）を用いてリボソームRNAを枯渇させた。ライブラリーは、TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit（Illumina）で調製し、Illumina HiSeq 2500プラットフォームで100-bp paired raw passing filter reads、50〜60万回の読み取りで配列決定した。【００９８】
［磁気共鳴画像］
MRIからの画像を取得し、非特許文献１１に記載のように1H QDを備えたAvance III BioSpec 117/11システム（Bruker、Ettlingen、Germany）を使用して処理した。MRI中にマウスをセボフルランで麻酔した。T1強調およびT2強調イメージングおよび水抑制イメージングのために高速スピンエコープロトコル（RARE）を使用した。取得した画像をDICOM形式に変換し、ImageJソフトウェア（National Institutes of Health、Bethesda、MD、USA）を使用して3D再構成のために処理した。Imarisソフトウェア（Bitplane AG, Zurich, Switzerland）を用いて最終画像を処理し、線維化領域を灰色で囲むことにより示した。イメージングのためのパラメータは以下の通りである：T1加重：TR / TE=800 / 12ms、10回平均; T2加重：TR / TE=3500 / 32ms、8回平均;及び水抑制：水信号からの抑制パルスオフセット-300HzによるT1加重と同様。画像取得マトリックスは256×128であり、視野4×3cmであり、それぞれ1.2mm厚のものが18枚得られた。脂肪抑制はすべての画像法に適用された。【００９９】
［シーケンスリードのマッピングとカウント］
シーケンスリードはcutadaptでフィルタリングされ、TopHat v2.1.1の一部としてのBowtie2 v2.2.9を使用してヒトゲノムhg38（ftp://ussd-ftp.illumina.com/Homo#sapiens/UCSC/hg38/ Homo#sapiens#UCSC#hg38.tar.gz）にアライメントされた。GENCODE GTFアノテーションファイルでCufflinksを使用してFPKMデータを得た。【０１００】
［FPKMデータプロットと経路解析］
FPKMデータはExcelにインポートされ、ヒートマップをプロットするために処理されました。 Excelファイルは、IPA（Qiagen）による標準的な経路分析にも用いられた。経路マップ（Cell Signaling Technology）に基づいて選択されたアポトーシス関連遺伝子のFPKMデータは散布図にプロットした。【０１０１】
［様々なタイプの長い非コードRNAおよびBRCA1に対するshRNAの調製］
各標的コード配列に対する2つ以上の有効なshRNAクローンを調製した。標的配列は以下の通りである：
ヒトNEAT1コード配列（5'-gaggaagttctccaatgtt-3'、5'-gtcttagaaaagccttgta-3'）
ヒトMALAT1コード配列（5'-ggggattcttctctaatct-3'、5'-agaaagtcaggggtctata-3'）
ヒトBRCA1コード配列（5'-aagtctattaaagaaagaaaa-3'、5'-aatgatgaatattactaatag-3'）【０１０２】
shRNA配列をレンチウイルス発現プラスミドpFU6pGKpuroにクローニングし、HEK293T細胞にトランスフェクトして、組換えレンチウイルスを作製した。WTまたはRbm7-/-HEK293細胞に、ポリブレン（Millipore）の存在下でレンチウイルス上清を形質導入し、1μMピューロマイシン（InvivoGen、San Diego、CA、USA）で選択した。RT-qPCRおよびウェスタンブロット分析を実施して、各標的配列の有意な枯渇を確認した。【０１０３】
［ホルムアルデヒド架橋RIP］
HEK293細胞をPBS中の0.1％ホルムアルデヒドで固定してタンパク質-RNA複合体を架橋させ、グリシンを0.25Mの濃度で添加することによりホルムアルデヒドをクエンチした。次いで、細胞をPBSで洗浄し、氷上で、1mLのRIPA緩衝液[50 mM Tris？Cl、pH 7.5、1% Nonidet P- 40 (NP-40)、0.5% sodium deoxycholate、1 mM EDTA、150 mM NaCl]、1mM DTT、プロテアーゼ阻害剤およびRNaseOUTで15分間インキュベートした。次いで、ライセートをBioruptor（Diagenode）を用いて超音波処理した。不溶性成分を、4℃で10,000rpmで10分間微量遠心分離することによって除去した。特異的抗体で被覆されたDynabeads［BRCA1（2μg; Abcam）、BRCA2（2μg; Santa Cruz）、ATM（2μg; Abcam）、ATR（2μg; Abcam）、p53（5μl; Cell Signaling Technology）、PARP （5μl; Cell Signaling Technology）またはIgG（2μg; Santa Cruz）]をライセートに加え、4℃で3時間インキュベートした。ビーズをRIPA緩衝液で4回洗浄した。最後に、脱架橋を行い、試料をTrizol（no. 15596018; Invitrogen）で溶出した。単離したRNAをDNase1（QIAGEN）で処理し、ReverTra Ace qPCR RTマスターミックス（FSQ-201; TOYOBO）を用いてcDNA合成を行った。【０１０４】
［UV架橋RNA免疫沈降（CLIP）-qPCR］
UV架橋のために、FLAG標識RBM7およびBRCA1発現HEK293細胞をPBSで2回洗浄し、2000J/m2で照射してタンパク質-RNA複合体を架橋させた。次いで、細胞をPBSで洗浄し、500μlのRIPA緩衝液[50mM Tris-HCl、pH7.5,1％Nonidet P-40（NP-40）、0.5％デオキシコール酸ナトリウム、1mM EDTA、150mM NaCl]、1mM DTT、プロテアーゼ阻害剤およびRNaseOUTを氷上で15分間インキュベートした。次いで、ライセートをBioruptor（Diagenode）を用いて超音波処理した。不溶性成分を、4℃で10,000rpmで10分間微量遠心分離することによって除去した。ライセートを抗FLAG M2アガロース親和性ゲル（no. A2220; Sigma）と共に4℃で2時間インキュベートした。ビーズを高塩緩衝液（20mM Tris-HCl pH7.6、500mM NaCl、1％NP40、1mM EDTA）で2回、低塩緩衝液（20mM Tris-HCl pH7.6,500mM NaCl、1％NP40、1mM EDTA）で洗浄した。ビーズを、0.5％SDSおよび2μlプロテイナーゼK（NEB）を含むTE200μlに懸濁し、55℃で1時間インキュベートした。 RNAをTrizol（Invitrogen）で抽出した。【０１０５】
［RNAアンチセンス精製（RAP）］
プローブ設計と生成：標的RNAを捕捉するために使用されるプローブを作製するため、標的RNAの全長にわたる90mer DNAオリゴヌクレオチド（Fasmac、Kanagawa、Japan）を設計し、合成した。各DNAオリゴヌクレオチドプローブの配列は、標的RNA配列相補鎖に対してアンチセンスであった。各DNAオリゴヌクレオチドプローブも5 'ビオチンで修飾し、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズ上のDNA / RNAハイブリッドの捕捉を可能にした。UV架橋のために、2000万個のHEK293細胞をPBSで2回洗浄し、8000J/m2で照射してタンパク質-RNA複合体を架橋させた。次いで、細胞をPBSで洗浄し、866μlの全細胞溶解緩衝液[10mMトリスpH7.5,500mM LiCl、0.5％ドデシルマルトシド（DDM; Sigma）、0.2％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS; Thermo Fisher Scientific） 0.1％デオキシコール酸ナトリウム（Sigma）プロテアーゼ阻害剤]に溶解し、920UのMurine RNase Inhibitor（NEB）を添加し、試料を氷上で10分間インキュベートして溶解を進行させた。このインキュベーション中、細胞試料を1mlシリンジに取り付けられた26ゲージの針で3〜5回通し、ペレットを破壊しゲノムDNAをせん断した。次に、各試料をBioruptorを用いて超音波処理した。超音波処理の間、サンプルを冷却して、ライセートの過熱を防止した。【０１０６】
次いで、サンプルを2.5mM MgCl2、0.5mM CaCl2および20UのTURBO DNase（Thermo Fisher Scientific）を用いて37℃で10分間処理することでDNAを消化した。サンプルを氷に戻し、10mM EDTAおよび5mM EGTAの添加によって反応を直ちに停止させた。 2.5mMトリス-2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）の添加によりジスルフィド結合を還元し、次いでサンプルを、ライセート体積の２倍量のLiCl/尿素緩衝液（10mM Tris pH7.5、5mM EDTA、 500mM LiCl、0.5％ DDM、0.2％の SDS、0.1％ デオキシコール酸塩、4M 尿素、2.5mM TCEP）と混合した。ライセートを氷上で10分間インキュベートし、次いで16,000gで10分間遠心分離して清澄化した。次いで、ライセートを架橋複合体のRNAアンチセンス精製に使用した。2000万個の細胞からのライセートを各捕捉に使用した。ライセートサンプルを、洗浄されたストレプトアビジンC1磁気ビーズとともに、Eppendorf Thermomixer C (30 s mixing, 30 s off)で間欠的に1100rpmで振盪しながら37℃で30分間インキュベートすることで、予備的に清澄化した。次いで、ストレプトアビジンビーズはDynamag磁石（Life Technologies）を用いてライセートサンプルから磁気的に分離した。溶解物を予備的に清澄化するために使用したビーズを捨て、ライセートサンプルを新しいチューブに2回移して痕跡量の磁性ビーズをすべて除去した。【０１０７】
目的のRNA標的に特異的なビオチン化90mer DNAオリゴヌクレオチドプローブ（サンプル当たり水中2μg）を85℃で3分間熱変性させ、次いで氷上でスナップ冷却した。プローブと予備的に清澄化したライセートとを混合し、Eppendorf thermomixerを用いて間欠的に振とう(30 s shaking, 30 s off)しながら40℃で2時間インキュベートし、標的RNAを捕捉するようにプローブをハイブリダイズさせた。ビオチン化DNAプローブと標的RNAとの複合体を、上記のように断続的に振とうさせながら、Eppendorf Thermomixer Cで40℃で30分間、洗浄したストレプトアビジン被覆磁気ビーズ60μlと共に各サンプルをインキュベートすることによってストレプトアビジンビーズに結合させた。捕捉された複合体を有するビーズを、40℃で5分間LiCl /尿素ハイブリダイゼーション緩衝液で6回洗浄して、非特異的な関連タンパク質を除去した。ビーズをウエスタンブロットサンプルバッファーに再懸濁し、5分間煮沸した後、それらをDynamag磁石を用いて磁気的にサンプルから分離した。次いで、サンプルをSDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析に供した。【０１０８】
［マイクロアレイ解析］
RNA isolation kit（Roche）を用いて、PBSまたはBLM接種の10日後にマウス肺CD45-細胞から全RNAを単離した。10ngの全RNAから、GeneChip WT PLUS Reagent Kit（no. 902280; Thermo Fisher Scientific）を用いて、プロトコルに従い断片化し標識したssDNAを合成した。生成物をマウス発現マイクロアレイチップ（Mouse Transcriptome Array 1.0; Thermo Fisher Scientific）上でハイブリダイズさせた後、プロトコルに従いマイクロアレイチップを染色し、洗浄し、スキャンした。バックグラウンド調整した強固なマルチチップ平均発現値は、Expression Console Software（Thermo Fisher Scientific）およびTranscriptome Analysis Software（Thermo Fisher Scientific）を用いて計算した。【０１０９】
［プロモーターアッセイ］
NEAT1のプロモーター領域（コード領域の2kb上流を含む）の各断片をPCRにより増幅し、pGL3-Basicベクター（Promega）にクローニングした。Lipofectamine 2000 reagent (Qiagen)を用い、DNAを含む20ngのリポータープラスミドと、RBM7が挿入された又は挿入されていない20ngのpcDNA3.1 vectorと、6ngのリファレンスプラスミド(pRL-CMV) (Promega)との46ngとともに96-well plate (4 × 104 cells per well)で培養されたHEK293 cellsをトランスフェクトした。nutlin 3a（Sigma）を含むまたは含まない48時間のインキュベーションの後、Dual-Glo Luciferase assay system（Promega）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。【０１１０】
［統計分析］
全ての定量データは、少なくとも3回の独立した実験の平均±標準偏差（SD）として示される。グループ間の差異をスチューデントt検定を用いて分析し、生存検定をログランク検定を用いて分析した。 P <0.05の値は統計的に有意であるとした。【０１１１】
［結果］
図１ａ〜図１ｓは、Rbm7欠損が線維症に対する耐性をもたらすことを示す結果である。スチューデントt検定により、*はP<0.05、**はP<0.01を示す。生存曲線は対数ランク検定により解析した。すべてのエラーバーはSDを表す。３（図１ａ〜図１ｃ）、５（図１ｆ、図１ｈ〜図１ｊ）および３以上（図１ｄ、図１ｅ、図１ｇ、図１ｋ〜図１ｓ）の別途独立に実施した実験においても同様の結果が得られた。【０１１２】
図１ａ〜図１ｃは、PBS又はBLMで処置した肺のSatMの遊走能評価（図１ａ、図１ｂ）、及び肺組織に存在している造血細胞（CD45+）と非造血細胞（CD45-）の遊走能評価（図１ｃ）である。図１ａ〜図１ｃに示すように、線維化期における肺抽出物を使用した細胞遊走アッセイを行った結果、SatMが、ブレオマイシン（BLM）の気管内投与後の野生型（WT）の肺からの、炎症期ではなく線維化期の抽出物で有意にリクルートされた。このことは、線維化期の非造血細胞が誘引物質を産生し、これによって、SatMを患部へ遊走させて肺の線維症を発症させることを意味する。【０１１３】
このように、線維化段階における非造血細胞は、造血細胞と同様、線維症の発生に関与する。線維症の発症に重要な分子を同定するために、BLMの気管内投与後の線維化期のWTマウスの肺におけるmRNAおよびタンパク質発現を調べた。図１ｄで示されるように、示差的に発現されたmRNAおよびタンパク質の中で、RNA結合モチーフタンパク質7（RBM7）がBLM処理後に顕著に増加した。特筆すべきは、肺線維症の患者の肺切片において、非線維化コントロール（図１ｅ）と比較して進行性線維症の領域でRBM7の発現が顕著に上昇したことである。したがって、ヒトにおける線維症発症の病態生理におけるRbm7の関連が明らかとなった。【０１１４】
このタンパク質の病態生理学的役割を調べるために、メンデル比で生まれ、正常に成長したRbm7-/-マウスを作製した。免疫細胞の集団は、Rbm7-/-マウスにおいても正常であったが、興味深いことに、Rbm7-/-マウスは、図１ｆの生存率に示されるように、BLM誘発線維症に対して有意に耐性であった。さらに、in vivoでの磁気共鳴イメージング（MRI）分析により、図１ｇに示されるように、Rbm7-/-マウスにおける線維症が劇的に減少した。線維化段階のRbm7-/-マウスはまた、図１ｈに示されるように肺でのコラーゲンおよびα−平滑筋アクチン沈着の減少と、図１ｉに示されるようにヒドロキシプロリン（線維性マーカー）の蓄積の欠如とを示した。さらに、図１ｊに示されるように、コラーゲン1α（col1a1）およびTGFβ1（tgfb1）などの前線維性マーカーのBLM誘導性発現は、Rbm7-/-マウスの肺で有意に抑制された。図１ｋに示すように、SatMはRbm7-/-マウスの肺にはリクルートされなかった。これらの知見を総合すると、Rbm7-/-マウスが肺線維症に耐性であることを示している。【０１１５】
さらに、Rbm7が他の組織における線維症発症に必要であるかを調べた。図１ｌ〜図１ｏに、コリン欠乏症-L-アミノ酸-高脂肪食（CDA-HFD、n=3）によって誘導される肝線維症のモデルを示す。図１ｌ〜図１ｏに示すように、コリン欠乏L-アミノ酸規定高脂肪食（CDA-HFD）によってWTおよびRbm7-/-マウスにおいて脂肪肝が同じ程度に起こったにもかかわらず、CDA-HFDによって誘導された肝線維症がRbm7-/-マウスでは著しく抑制され、線維性肝臓でRBM7発現が高度に上昇したことが確認された。【０１１６】
また、図１ｐ〜図１ｓに、片側性尿管閉塞によって誘発された腎線維症のモデル（UUO、n=3）を示す。図１ｐ〜図１ｓに示すように片側性尿管閉塞（UUO）によって誘導されたマウス腎臓線維症モデルにおいても同様の所見（腎線維症がRbm7-/-マウスで著しく抑制）が観察された。図示していないが、HClによって誘導された別の肺線維症モデルにおいても同様の所見が観察されたことを確認した。これらの知見は、Rbm7が様々なマウス組織における線維症の発症に重要であることを示唆している。【０１１７】
BLM誘導性線維症にどの細胞型が重要であるかを調べるために、造血細胞（CD45+）および非造血細胞（CD45-）におけるRBM7発現を調べた。図２ａ〜図２ｔは、Rbm7によって制御されたアポトーシスが線維症の発症に重要な役割を果たすことを示す。スチューデントt検定により、*はP<0.05、**はP<0.01を示す。生存曲線は対数ランク検定により解析した。§および†の間と、＃及び†の間とにおけるＰ値は、両方ともP <0.01であった。すべてのエラーバーはSDを示す。５以上（図２ｅ〜図２ｉ、図２ｓ、図２ｔ）および３以上（図２ａ〜図２ｄ、図２ｊ〜図２ｒ）の別途独立に実施した実験においても同様の結果が得られた。【０１１８】
図２ａ及び図２ｂに示されるように、タンパク質が非造血細胞で優先的に発現したことを見出した。なお、図示していないが、Rbm7-/-マウス由来の種々のマクロファージは、刺激に対して正常な応答を示したことを確認した。非造血細胞のRBM7発現が線維症の発症に寄与していることを確認するために、WTまたはRbm7-/-マウスに致死的に照射し、WTまたはRbm7-/-マウスから骨髄（BM）を再構成することによってキメラマウスを作製した。図２ｃ〜図２ｆに示されるように、BLMモデルでは、造血細胞がRbm7発現を欠損したキメラマウス（Rbm7-/-→WT）において肺線維症が正常に起こったが、Rbm7欠損非造血細胞（WT→Rbm7-/-）のマウスは、肺モデルにおいて線維症に耐性であった。図示していないが、肝臓モデルおよび腎臓モデルでも同様の結果が得られたことを確認した。したがって、非造血細胞で発現されるRBM7は、線維症発症に必須であることが示された。【０１１９】
次に、Rbm7喪失が線維化を防止する根底にある機構を調べた。図２ｇに示されるように、RBM7の発現は線維化期の初めから上昇し始め、図２ｂ及び２ｈに示されるようにこの分子は線維症の発症においてマウスおよびヒトの両方の肺上皮細胞で高度に発現された。図２ｉに示されるように、RBM7発現のタイミングと一致して、BLMは重篤かつ連続的なアポトーシスを誘導した。これらの知見から、肺線維症の発症におけるRbm7とアポトーシスとの関係を調査した。ここで、細胞死は、薬物投与、感染または物理的外傷のいずれによって誘発されたものかにかかわらず、死細胞からの内因性リガンドの放出によって線維化を進行しうることが知られている。線維化段階におけるアポトーシスの役割を調べるために、広く使用されている抗アポトーシス試薬Q-VD-OPhを、BLM投与後の線維化段階の開始時に、マウスに投与した。【０１２０】
図２ｊ〜図２ｌに示されるように、線維化抑制は炎症期におけるQ-VD-OPh投与では抑制されず、線維化期におけるQ-VD-OPh投与のみで抑制され、線維症に対する耐性をもたらし、SatMの遊走を有意に抑制した。事実、図２ｍ及び図２ｎに示されるように、線維化段階では、WTマウスの肺で多数の死滅細胞が検出されたが、BLMで処理されたRbm7-/-マウスでは検出されなかった。また、図２ｍ及び図２ｎに示すように、肝臓および腎線維症マウスモデル由来のRbm7-/-細胞もまた、細胞死に耐性であった。さらに、線維化期におけるRbm7の抑制が線維症に対する耐性をもたらすことを確認するために、WTマウスの肺に、Rbm7に対するsiRNAをin vivo投与した。図２ｏ及び図２ｐに示すように、WTマウスにおけるRbm7の抑制は、線維症に対する耐性をもたらした。対照的に、図２ｑ及び図２ｒに示すように、SatM欠損cebpb-/-キメラマウスは、線維症の開始時の肺に匹敵するアポトーシスを示した。【０１２１】
さらに、図３ａ〜図ｍに、RBM7によるノンコーディングRNAの調節を示す。スチューデントt検定により、*はP<0.05、**はP<0.01を示す。５以上（図３ａ、図３ｂ、図３ｇ、図３ｉ）および３以上（図３ｃ〜図３ｆ、図３ｈ、図３ｊ〜ｎ）の別途独立に実施した実験においても同様の結果が得られた。【０１２２】
WTおよびRbm7-/-HEK293細胞間において、アポトーシス関連経路に差異が無く、且つ、図３ａに示すように、遺伝子発現にも差異がないことも確認した。興味深いことに、図３ｂ及び図３ｃに示すように、長いncRNA（lncRNA）及びアンチセンスRNA（タンパク質コード遺伝子ではない）の発現が、WTおよびRbm7-/-細胞間で顕著に異なっていた。そこで、RBM7によって調節されるlncRNAおよびアンチセンスRNAの潜在的標的を同定するために、RNA免疫沈降配列決定（RIP-seq）分析を行った。NIPK-AS1、MALAT1およびNEAT1を含むいくつかのlncRNAおよびアンチセンスRNAが沈殿し（RIP-seqデータから決定）、増加（RNA-seqおよびqPCR分析により決定）したことを確認した。さらに、図３ｄに示されるように、9つの分子が2つの分析の間でオーバーラップしていることを確認した。【０１２３】
RBM7のこれらの潜在的な標的の中で、エトポシド処理の有無によるRNA-seqデータにおけるそれらの発現レベルをさらに調査し、図３ｅ、図３ｆ、及び図３ｇに示されるように、NEAT1のようなncRNAがいずれの状況においても高度に発現されることを見出した。これらのncRNAのいずれかがRBM7の喪失により誘導される細胞死に対する抵抗性と関連するかどうかを調べるために、WTまたはRbm7-/-細胞におけるNEAT1およびMALAT1のshRNA媒介性ノックダウン（KD）の効果を調べた。図３ｈ及び図３ｉに示されるように、MALAT1ではなくNEAT1の抑制が、エトポシドがRbm7-/-HEK293細胞において細胞死を誘発する能力を救済した。さらに、Rbm7-/-マウスのNEAT1の抑制が線維症に対する抵抗性を導いたことを確認するために、このncRNAに対するsiRNAをRbm7-/-マウス肺にin vivo投与した。興味深いことに、図３ｊ〜図３ｍに示されるように、Rbm7-/-マウスにおけるNEAT1の抑制は、線維症の発症をもたらした。これらの知見から、RBM7が、選択された標的ncRNAの発現を制御することによって細胞死誘導において重要な役割を果たすことが示された。【０１２４】
図４ａ〜図４ｍに、BRCA1がRBM7調節されたNEAT1含有パラスペックルに局在することを示す。スチューデントt検定により、*はP<0.05、**はP<0.01を示す。生存曲線を対数ランク検定により解析した。５以上（図４ａ〜図４ｄ、図４ｉ、図４ｊ）、及び３以上（図４ｅ〜図４ｈ、図４ｋ〜図４ｍ）の別途独立に実施した実験においても同様の結果が得られた。【０１２５】
NEAT1およびNEAT1.2 RNAの発現はいずれも、図４ａ及び図４ｂに示されるように、Rbm7-/-HEK293細胞で上昇したが、これは全長RBM7の再発現によって逆転された。なお、重要なRNA結合部位を欠くRBM7の再発現によっては当該逆転は起こらなかった。また、TERTではなくNEAT1、MALAT1、U1 snRNAが、RIPおよびCLIP-qPCR分析により、RBM7と強固に結合していることも確認した。RBM7はNEAT1と部分的に共局在した。さらに、Rbm7はNEAT1の転写に関与しなかった。これは、RBM7がNEAT1 ncRNAの崩壊に関与していることを示している。ここで、最近の報告では、NEAT1がパラスペックル核体の必須構成要素であることが示唆されている。そこで、パラスペックルに関するRBM7およびNEAT1の局在を調べた。図４ｃ〜図４ｈに示されるように、RBM7欠損細胞でNEAT1 RNA崩壊が抑制されていることと一致して、マウス肺およびヒト細胞系の両方において、Rbm7欠損下でのNEAT1含有パラスペックルの数およびパラスペックル陽性細胞の頻度の増加を確認した。NEAT1の発現の増加がRBM7欠損下での細胞死抑制と関連しているかどうかを調べるために、shRNAを用いてRbm7-/-細胞におけるNEAT1をレンチウィルスを用いたシステムにより阻害した。図４ｉ及び図４ｊに示されるように、Rbm7-/-細胞におけるNEAT1の抑制は、細胞死に関連するDNA損傷応答の活性化を引き起こした。【０１２６】
Rbm7欠損、細胞死抑制、およびNEAT1蓄積の間を関連させている要因を解明するために、本発明者らは、NEAT1と細胞死に関与する様々なタンパク質との関連性を調べた。図４ｋに示されるように、RNA-免疫沈降-qPCR分析により、NEAT1とBRCA1（DNA修復タンパク質にとっての重要因子であることが知られている）とが関連し、他のDNA修復または細胞死関連因子とは関連していないことが分かった。図４ｌに示されるように、BRCA1はNEAT1と特異的に共局在し、BRCA1およびNEAT1含有のパラスペックルはWT HEK293細胞よりもRbm7-/-においてより豊富であった。また、図示されないが、NEAT1が、MALAT1およびTERTのような他のncRNAとは異なり、BRCA1と強固に結合していることもCLIP-qPCR分析によって確認した。そして、NEAT1プローブを用いたRNAアンチセンス精製（RAP）で、BRCA1はRBM7およびFUS（既知のパラスペックルマーカー）と同様にNEAT1と強固に結合していることも確認した。さらに、DNA損傷がNEAT1パラスペックルからのBRCA1の分散を誘発することも確認した。最後に、図４ｍに示されるように、レンチウィルス的にshRNAを介したBRCA1のノックダウンが、Rbm7-/-細胞がエトポシドに応答して細胞死誘導を受ける能力を再確立した。これらの知見から、RBM7がNEAT1レベルおよび核内のBRCA1の局在を制御することによって細胞死を調節することが示された。【０１２７】
最近の研究では、別のmRNAであるMORRBIDが細胞死に関与しており、炎症性単球、好中球および好酸球などの造血細胞の生存にとって重要であることが示されている。 MORRBIDは、そのプロモーター領域でのPRC複合体の富化を促進することにより、アポトーシス促進タンパク質Bimの転写を調節する。対照的に、RBM7は、主に非造血細胞で発現し、細胞死関連分子の発現を直接制御しない。したがって、細胞死のncRNA媒介性調節は、多くの細胞型に共通であり得る。【０１２８】
KL-6、SP-DおよびMCP-125を含むいくつかの肺疾患診断マーカーが広く使用されている。しかし、これらは間接的なマーカーであり、進行性線維症の検出に利用できるマーカーはほとんどない。本発明においては、RBM7が進行性線維症を伴う肺領域で高度に発現することが見出され、マウスにおけるRbm7の発現パターンと、Rbm7の喪失によって線維症に対する耐性が付与されることとにより、当該タンパク質RBM7が肺線維症の発生に強く関連付けられていることが見出された。また、RBM7がヒトにおいて同様に機能すると推認される。したがって、RBM7は、線維症の有用な診断マーカーとなりうる。【０１２９】
細胞死はRbm7-/-細胞で著しく抑制され、これによって、RBM7が細胞死調節に関与する新規な因子であることが示された。DNA損傷は、MDM2複合体からのp53の放出を誘導することが知られている。そしてp53は、NoxaおよびPumaなどのBH3のみのタンパク質の発現を誘導することが知られている。これらの2つの分子は、細胞死の阻害後の抗アポトーシス遺伝子Bcl-2と関連しており、さらに、p53は、前アポトーシス促進遺伝子Baxの発現に関与していることが知られている。したがって、p53の活性化は、細胞死の誘導にとって重要である。最近、p53がNEAT1含有パラスペックルの形成を誘発することが報告されている。本発明により、RBM7がNEAT1レベルおよびBRCA1とNEAT1パラスペックルとの関連を制御することを示した。したがって、RBM7は、蓄積されたNEAT1パラスペックルの解離を誘導し、それによって不可逆的に損傷した細胞の修復を防止することによって細胞死を制御する、管理システムとなると考えられる。線維化段階において、RBM7発現は非常に上昇し、極めて多数の死細胞が検出された。結果として、死に至る非造血細胞から分泌される化学誘引物質といったいくつかの因子は、罹患した病変部位への前線維性単球SatMのリクルートを誘導した。したがって、RBM7は、非コードRNAの崩壊および細胞死の調節を介したSatM誘導による線維症の発生を認めると考えられる。さらに、Rbm7は、マウスとヒトとの間の線維症発症の状況において同様の機能を共有しうるため、RBM7の阻害剤が開発されていることを考慮すると、RBM7の阻害剤は線維症の有効な治療薬となる。
【図１ａ】
2019202767.tif 000003
【図１ｂ】
2019202767.tif 000004
【図１ｃ】
2019202767.tif 000005
【図１ｄ】
2019202767.tif 000006
【図１ｅ】
2019202767.tif 000007
【図１ｆ】
2019202767.tif 000008
【図１ｇ】
2019202767.tif 000009
【図１ｈ】
2019202767.tif 000010
【図１ｉ】
2019202767.tif 000011
【図１ｊ】
2019202767.tif 000012
【図１ｋ】
2019202767.tif 000013
【図１ｌ】
2019202767.tif 000014
【図１ｍ】
2019202767.tif 000015
【図１ｎ】
2019202767.tif 000016
【図１ｏ】
2019202767.tif 000017
【図１ｐ】
2019202767.tif 000018
【図１ｑ】
2019202767.tif 000019
【図１ｒ】
2019202767.tif 000020
【図１ｓ】
2019202767.tif 000021
【図２ａ】
2019202767.tif 000022
【図２ｂ】
2019202767.tif 000023
【図２ｃ】
2019202767.tif 000024
【図２ｄ】
2019202767.tif 000025
【図２ｅ】
2019202767.tif 000026
【図２ｆ】
2019202767.tif 000027
【図２ｇ】
2019202767.tif 000028
【図２ｈ】
2019202767.tif 000029
【図２ｉ】
2019202767.tif 000030
【図２ｊ】
2019202767.tif 000031
【図２ｋ】
2019202767.tif 000032
【図２ｌ】
2019202767.tif 000033
【図２ｍ】
2019202767.tif 000034
【図２ｎ】
2019202767.tif 000035
【図２ｏ】
2019202767.tif 000036
【図２ｐ】
2019202767.tif 000037
【図２ｑ】
2019202767.tif 000038
【図２ｒ】
2019202767.tif 000039
【図２ｓ】
2019202767.tif 000040
【図２ｔ】
2019202767.tif 000041
【図３ａ】
2019202767.tif 000042
【図３ｂ】
2019202767.tif 000043
【図３ｃ】
2019202767.tif 000044
【図３ｄ】
2019202767.tif 000045
【図３ｅ】
2019202767.tif 000046
【図３ｆ】
2019202767.tif 000047
【図３ｇ】
2019202767.tif 000048
【図３ｈ】
2019202767.tif 000049
【図３ｉ】
2019202767.tif 000050
【図３ｊ】
2019202767.tif 000051
【図３ｋ】
2019202767.tif 000052
【図３ｌ】
2019202767.tif 000053
【図３ｍ】
2019202767.tif 000054
【図４ａ】
2019202767.tif 000055
【図４ｂ】
2019202767.tif 000056
【図４ｃ】
2019202767.tif 000057
【図４ｄ】
2019202767.tif 000058
【図４ｅ】
2019202767.tif 000059
【図４ｆ】
2019202767.tif 000060
【図４ｇ】
2019202767.tif 000061
【図４ｈ】
2019202767.tif 000062
【図４ｉ】
2019202767.tif 000063
【図４ｊ】
2019202767.tif 000064
【図４ｋ】
2019202767.tif 000065
【図４ｌ】
2019202767.tif 000066
【図４ｍ】
2019202767.tif 000067
【配列表】
2019202767000001.app
【国際調査報告】
2019202767.tif 000068
2019202767.tif 000069
2019202767.tif 000070
2019202767.tif 000071
2019202767.tif 000072
2019202767.tif 000073
2019202767.tif 000074
2019202767.tif 000075