(57)【要約】ペプチド化合物を構成するアミノ酸の少なくとも１つを分子内水素結合を形成し得る側鎖を有するアミノ酸とすることで、ペプチド化合物の膜透過性を改善できることを見出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２以上のアミノ酸が連結されたペプチド化合物であって、アミノ酸の少なくとも１つがその側鎖内で水素結合を形成し得る、ペプチド化合物。
【請求項２】
側鎖内で水素結合を形成し得るアミノ酸が、側鎖内で擬似４〜７員環を形成し得る、請求項１に記載のペプチド化合物。
【請求項３】
側鎖内で水素結合を形成し得るアミノ酸が、下記式Ａで表される、請求項１または２に記載のペプチド化合物：
2020122182.tif 000410
式中、
Ｒ１は、水素、もしくはＣ１−Ｃ６アルキルであるか、または式１もしくは式２で表される基であり、この場合、Ｒ２ＡおよびＲ２Ｂは、Ｒ２Ａが水素、もしくはＣ１−Ｃ６アルキルであるか、または式１もしくは式２で表される基であり、かつＲ２Ｂは、水素またはＣ１−Ｃ６アルキルであるか、あるいは、Ｒ２ＡおよびＲ２Ｂは、それらが結合している炭素原子と一緒になって４〜６員の環を形成し、あるいは
Ｒ１は、Ｒ１が結合する窒素原子、Ｒ２Ａ、およびＲ２Aが結合する炭素原子と一緒になって４〜６員の複素環を形成し、該複素環は、式１もしくは式２で表される基、−ＯＨ、およびアルコキシ基からなる群より選択される、１つまたは複数の置換基を有していてもよく、この場合、Ｒ２Ｂは、水素またはＣ１−Ｃ６アルキルであり、
Ｒ３は、単結合、または−ＣＨＲ４−であり、
Ｒ４は、水素、もしくはＣ１−Ｃ４アルキルであるか、または式１もしくは式２で表される基であり、
式１および式２は、それぞれ下記式：
2020122182.tif 000411
で表され、式中、
＊は、結合点を示し、
Ｑ１およびＱ２は、独立して、単結合、Ｃ１−Ｃ４アルキレン、または酸素原子を１つ含むＣ２−Ｃ４ヘテロアルキレンであり、
Ａ１は、−Ｏ−、または−Ｓ−であり、
Ｌ１は、フッ素、Ｃ１−Ｃ２アルキル基、Ｃ１−Ｃ２フルオロアルキル、およびオキソ（＝Ｏ）からなる群より選択される１つまたは複数の置換基によって置換されていてもよい直鎖のＣ１−Ｃ３アルキレンであり、
Ａ２は、単結合、−Ｏ−、または−Ｓ−であり、
Ｌ２は、単結合であるか、またはフッ素、Ｃ１−Ｃ２アルキル基、Ｃ１−Ｃ２フルオロアルキル、およびオキソ（＝Ｏ）からなる群より選択される１つまたは複数の置換基によって置換されていてもよい直鎖のＣ１−Ｃ３アルキレンであり、
Ｘは、−ＯＨ、−ＮＲＺ１ＲＺ２、もしくは−ＣＯＮＲＺ１ＲＺ２であるか、または１〜３個のヘテロ原子を含有し、オキソもしくは１つまたは複数のハロゲンによって置換されていてもよい５〜６員の飽和もしくは不飽和ヘテロシクリルであり；
ＲＺ１およびＲＺ２は、独立して、水素、−ＯＨ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、およびＣ１−Ｃ４アルキルスルホニルからなる群より選択され、
Ｙは、−ＯＨ、Ｃ１−Ｃ４アルキルスルホニルアミノ、−ＮＲＺ３ＲＺ４、もしくは−ＣＯＮＲＺ３ＲＺ４であるか、または１〜３個のヘテロ原子を含有し、オキソもしくはハロゲンによって置換されていてもよい５〜６員の飽和もしくは不飽和ヘテロシクリルであり、
ＲＺ３およびＲＺ４は、独立して、水素、−ＯＨ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、およびＣ１−Ｃ４アルキルスルホニルからなる群より選択され、
Ｚは、水素またはＣ１−Ｃ４アルキルであり、
但し、Ａ２が−Ｏ−、または−Ｓ−である場合、Ｚは水素ではなく、
ここで、式Ａで表されるアミノ酸は、式１または式２で表される基のいずれかを少なくとも１つ含む。
【請求項４】
式Ａで表されるアミノ酸が以下からなる群：
2020122182.tif 000412
2020122182.tif 000413
2020122182.tif 000414
より選択される、請求項３に記載のペプチド化合物。
【請求項５】
５〜３０のアミノ酸から構成される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチド化合物。
【請求項６】
環状である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチド化合物。
【請求項７】
２〜１５のアミノ酸から構成される環状部を含む、請求項６に記載のペプチド化合物。
【請求項８】
２〜３０のＮ置換アミノ酸を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチド化合物。
【請求項９】
全アミノ酸数に対するＮ置換アミノ酸数の割合が３０％以上である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチド化合物。
【請求項１０】
４．０〜１８のＣｌｏｇＰを有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載のペプチド化合物。
【請求項１１】
１．０ｘ１０−７ｃｍ／秒以上のＰａｐｐを有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のペプチド化合物。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のペプチドおよび／または当該ペプチドをコードする核酸を含むライブラリ。
【請求項１３】
下記式Ａで表される、アミノ酸：
2020122182.tif 000415
式中、
Ｒ１は、水素、もしくはＣ１−Ｃ６アルキルであるか、または式１もしくは式２で表される基であり、この場合、Ｒ２ＡおよびＲ２Ｂは、Ｒ２Ａが水素、もしくはＣ１−Ｃ６アルキルであるか、または式１もしくは式２で表される基であり、かつＲ２Ｂは、水素またはＣ１−Ｃ６アルキルであるか、あるいは、Ｒ２ＡおよびＲ２Ｂは、それらが結合している炭素原子と一緒になって４〜６員の環を形成し、あるいは
Ｒ１は、Ｒ１が結合する窒素原子、Ｒ２Ａ、およびＲ２Aが結合する炭素原子と一緒になって４〜６員の複素環を形成し、該複素環は、式１もしくは式２で表される基、−ＯＨ、およびアルコキシ基からなる群より選択される、１つまたは複数の置換基を有していてもよく、この場合、Ｒ２Ｂは、水素またはＣ１−Ｃ６アルキルであり、
Ｒ３は、単結合、または−ＣＨＲ４−であり、
Ｒ４は、水素、もしくはＣ１−Ｃ４アルキルであるか、または式１もしくは式２で表される基であり、
式１および式２は、それぞれ下記式：
2020122182.tif 000416
で表され、式中、
＊は、結合点を示し、
Ｑ１およびＱ２は、独立して、単結合、Ｃ１−Ｃ４アルキレン、または酸素原子を１つ含むＣ２−Ｃ４ヘテロアルキレンであり、
Ａ１は、−Ｏ−、または−Ｓ−であり、
Ｌ１は、フッ素、Ｃ１−Ｃ２アルキル基、Ｃ１−Ｃ２フルオロアルキル、およびオキソ（＝Ｏ）からなる群より選択される１つまたは複数の置換基によって置換されていてもよい直鎖のＣ１−Ｃ３アルキレンであり、
Ａ２は、単結合、−Ｏ−、または−Ｓ−であり、
Ｌ２は、単結合であるか、またはフッ素、Ｃ１−Ｃ２アルキル基、Ｃ１−Ｃ２フルオロアルキル、およびオキソ（＝Ｏ）からなる群より選択される１つまたは複数の置換基によって置換されていてもよい直鎖のＣ１−Ｃ３アルキレンであり、
Ｘは、−ＯＨ、−ＮＲＺ１ＲＺ２、もしくは−ＣＯＮＲＺ１ＲＺ２であるか、または１〜３個のヘテロ原子を含有し、オキソもしくは１つまたは複数のハロゲンによって置換されていてもよい５〜６員の飽和もしくは不飽和ヘテロシクリルであり；
ＲＺ１およびＲＺ２は、独立して、水素、−ＯＨ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、およびＣ１−Ｃ４アルキルスルホニルからなる群より選択され、
Ｙは、−ＯＨ、Ｃ１−Ｃ４アルキルスルホニルアミノ、−ＮＲＺ３ＲＺ４、もしくは−ＣＯＮＲＺ３ＲＺ４であるか、または１〜３個のヘテロ原子を含有し、オキソもしくはハロゲンによって置換されていてもよい５〜６員の飽和もしくは不飽和ヘテロシクリルであり、
ＲＺ３およびＲＺ４は、独立して、水素、−ＯＨ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、およびＣ１−Ｃ４アルキルスルホニルからなる群より選択され、
Ｚは、水素またはＣ１−Ｃ４アルキルであり、
但し、Ａ２が−Ｏ−、または−Ｓ−である場合、Ｚは水素ではなく、
ここで、式Ａで表されるアミノ酸は、式１または式２で表される基のいずれかを少なくとも１つ含む。
【請求項１４】
以下からなる群：
2020122182.tif 000417
2020122182.tif 000418
2020122182.tif 000419
2020122182.tif 000420
より選択される、請求項１３に記載のアミノ酸。
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載のアミノ酸に含まれるアミノ基、および／またはカルボキシル基が保護基で保護されている、保護アミノ酸。
【請求項１６】
アミノ基の保護基が、Ｆｍｏｃ基、Ｂｏｃ基、Ｃｂｚ基、Ａｌｌｏｃ基、ノシル基、ジニトロノシル基、ｔ−Ｂｕ基、トリチル基、およびクミル基からなる群より選択される、および／または
カルボキシル基の保護基が、メチル基、アリル基、ｔ−Ｂｕ基、トリチル基、クミル基、メトキシトリチル基、およびベンジル基からなる群より選択される、請求項１５に記載の保護アミノ酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド化合物の膜透過性を向上させることのできるアミノ酸、および該アミノ酸を含むペプチド化合物、およびそれらの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク―タンパク相互作用の阻害に代表される、tough targetへのアクセスは低分子化合物と比較して、中分子化合物(分子量：500〜2000)が優れている可能性がある。また、抗体と比較して、中分子化合物は細胞内に移行できる点でも優れている可能性がある。生理活性を有する中分子化合物の中でもペプチド医薬品はすでに４０種類以上が上市されている価値の高い分子種である（非特許文献１）。【０００３】
ペプチド医薬品の代表例として、シクロスポリンＡやポリミキシンＢが挙げられる。これらの構造に着目してみるとＮ−メチルアミノ酸に代表される、いくつかの非天然アミノ酸を含むペプチドである点、あるいは、環状ペプチドである点が特徴点として挙げられる。非天然アミノ酸とは、天然でｍＲＮＡ上にコードされていないアミノ酸のことで、天然由来のシクロスポリンＡやポリミキシンＢに非天然アミノ酸が含まれていることに加え、これら非天然の構造部位や環状構造が生体内の作用部位と相互作用や体内動態に寄与して薬理活性を発現することは非常に興味深い。【０００４】
近年、中分子ペプチドが体内動態の改善に寄与しうる膜透過性の向上のための条件（ドラッグライクネスを満たすために必要な条件）として、例えば、環状部を有すること、Ｎ置換アミノ酸数、アミノ酸残基数の範囲、脂溶性などの条件が報告されている（特許文献１）。また、非天然アミノ酸であるＮ−メチルアミノ酸に着目し、翻訳合成によりＮ−メチルペプチドライブラリを作製したとの報告もある（特許文献２）。また、標的と薬物が複合体を形成するためには標的と薬物との相互作用が重要であり、その中で重要であるものが水素結合である（非特許文献３）。水素結合を形成するためにはプロトンドナーが必須であるが、膜透過性に対しては負の影響を与えうる。実際、膜透過性の改善方法のひとつとして、アミノ酸のＮ−メチル化が奏功することが知られている（特許文献１）。アミノ酸のＮ−メチル化以外でも、主鎖に含まれるアミド結合を利用してプロトンをマスクすることの膜透過性への影響が考察されている（非特許文献２）。【０００５】
一方で、アミノ酸の側鎖にプロトンとプロトンをマスクできるような官能基を有する非天然アミノ酸をデザインし、そのプロトンをマスクする機能によってペプチドの膜透過性が改善されたという報告はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１３／１００１３２号
【特許文献２】国際公開第２０１２／０３３１５４号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Future Med. Chem. 2009, 1, 1289-1310.
【非特許文献２】Angew. Chem. Int. Ed. 2018, 57, 14414-14438.
【非特許文献３】最新創薬化学上巻, p87
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
医薬に有用なペプチドの創生には、標的分子とペプチドとの相互作用の向上が必須といえる。標的分子とペプチドとの相互作用の向上には、アミノ酸の主鎖だけでなく、側鎖の構造が標的分子と相互作用することがさらに重要といえる。標的分子との相互作用を改善するためには、２０種類の天然アミノ酸からなるペプチドだけでなく、標的分子との相互作用がより強固になるようにデザインされた非天然アミノ酸をペプチドに組み込むことがより有利である。特許文献１、および特許文献２に記載の方法では、ペプチドの構成単位であるアミノ酸のアミド結合部位のＮ−メチル化、アミノ酸残基数、脂溶性の観点からの示唆が記載されている一方で、標的分子との結合に有利であると考えられる水素結合を形成するために必要な酸素原子や窒素原子などに代表されるヘテロ原子がアミノ酸の側鎖に導入された場合の構造特性に関する考察はなされていない。非特許文献１では、ペプチド医薬品や環状ペプチドの環化方法の例示は記載されているものの、膜透過性とアミノ酸の構造との相関の示唆はない。非特許文献２では、ペプチド医薬品の例示はされているが、ペプチドを構成するアミノ酸の構造変換が、医薬への有用性に結びついているという示唆はなく、あくまでも既知化合物の考察がなされているにすぎず、医薬への汎用性は限定的である。【０００９】
本発明は、ペプチド化合物のデザイン、特に膜透過性に与える影響の研究が、アミノ酸各々の構造特性に着目されずに行われてきた状況を鑑みてなされたものであり、ペプチド化合物の膜透過性を改善するアミノ酸、および該アミノ酸を含むペプチド化合物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題の解決手段として、以下を見出し、発明を完成した。すなわち、標的分子との相互作用の向上に必要なヘテロ原子をアミノ酸の側鎖に持ち、さらにそのアミノ酸側鎖上のプロトンを、同一のアミノ酸側鎖内で分子内水素結合によりマスクできるようなアミノ酸側鎖をデザインし、該アミノ酸を含むペプチド化合物を製造して膜透過性を評価したところ、驚くべきことに、該アミノ酸を含むペプチド化合物は、分子内水素結合をしないアミノ酸を含むペプチド化合物と比較して、膜透過性が優れていることを見出した。また、分子内水素結合をする側鎖を有するアミノ酸のデザインは、プロトンドナーとプロトンアクセプターが疑似環状構造、好ましくは４員環、５員環、６員環、あるいは７員環を取りうるような構造が効果を発揮することを見出した。また、該アミノ酸を含むペプチド化合物の膜透過に最適なペプチドを構成するアミノ酸残基の数、Ｎ置換アミノ酸残基の数、Ｎ置換アミノ酸残基がペプチド中に含まれる割合、ｃＬｏｇＰの範囲、芳香環の数を見出した。【００１１】
本発明は、非限定の具体的な一態様において以下を包含する。
〔１〕２以上のアミノ酸が連結されたペプチド化合物であって、アミノ酸の少なくとも１つがその側鎖内で水素結合を形成し得る、ペプチド化合物。
〔２〕側鎖内で水素結合を形成し得るアミノ酸が、側鎖内で擬似４〜７員環を形成し得る、〔１〕に記載のペプチド化合物。
〔３〕側鎖内で水素結合を形成し得るアミノ酸が、下記式Ａで表される、〔１〕または〔２〕に記載のペプチド化合物：
2020122182.tif 000002
式中、
Ｒ１は、水素、もしくはＣ１−Ｃ６アルキルであるか、または式１もしくは式２で表される基であり、この場合、Ｒ２ＡおよびＲ２Ｂは、Ｒ２Ａが水素、もしくはＣ１−Ｃ６アルキルであるか、または式１もしくは式２で表される基であり、かつＲ２Ｂは、水素またはＣ１−Ｃ６アルキルであるか、あるいは、Ｒ２ＡおよびＲ２Ｂは、それらが結合している炭素原子と一緒になって４〜６員の環を形成し、あるいは
Ｒ１は、Ｒ１が結合する窒素原子、Ｒ２Ａ、およびＲ２Aが結合する炭素原子と一緒になって４〜６員の複素環を形成し、該複素環は、式１もしくは式２で表される基、−ＯＨ、およびアルコキシ基からなる群より選択される、１つまたは複数の置換基を有していてもよく、この場合、Ｒ２Ｂは、水素またはＣ１−Ｃ６アルキルであり、
Ｒ３は、単結合、または−ＣＨＲ４−であり、
Ｒ４は、水素、もしくはＣ１−Ｃ４アルキルであるか、または式１もしくは式２で表される基であり、
式１および式２は、それぞれ下記式：
2020122182.tif 000003
で表され、式中、
＊は、結合点を示し、
Ｑ１およびＱ２は、独立して、単結合、Ｃ１−Ｃ４アルキレン、または酸素原子を１つ含むＣ２−Ｃ４ヘテロアルキレンであり、
Ａ１は、−Ｏ−、または−Ｓ−であり、
Ｌ１は、フッ素、Ｃ１−Ｃ２アルキル基、Ｃ１−Ｃ２フルオロアルキル、およびオキソ（＝Ｏ）からなる群より選択される１つまたは複数の置換基によって置換されていてもよい直鎖のＣ１−Ｃ３アルキレンであり、
Ａ２は、単結合、−Ｏ−、または−Ｓ−であり、
Ｌ２は、単結合であるか、またはフッ素、Ｃ１−Ｃ２アルキル基、Ｃ１−Ｃ２フルオロアルキル、およびオキソ（＝Ｏ）からなる群より選択される１つまたは複数の置換基によって置換されていてもよい直鎖のＣ１−Ｃ３アルキレンであり、
Ｘは、−ＯＨ、−ＮＲＺ１ＲＺ２、もしくは−ＣＯＮＲＺ１ＲＺ２であるか、または１〜３個のヘテロ原子を含有し、オキソもしくは１つまたは複数のハロゲンによって置換されていてもよい５〜６員の飽和もしくは不飽和ヘテロシクリルであり；
ＲＺ１およびＲＺ２は、独立して、水素、−ＯＨ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、およびＣ１−Ｃ４アルキルスルホニルからなる群より選択され、
Ｙは、−ＯＨ、Ｃ１−Ｃ４アルキルスルホニルアミノ、−ＮＲＺ３ＲＺ４、もしくは−ＣＯＮＲＺ３ＲＺ４であるか、または１〜３個のヘテロ原子を含有し、オキソもしくはハロゲンによって置換されていてもよい５〜６員の飽和もしくは不飽和ヘテロシクリルであり、
ＲＺ３およびＲＺ４は、独立して、水素、−ＯＨ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、およびＣ１−Ｃ４アルキルスルホニルからなる群より選択され、
Ｚは、水素またはＣ１−Ｃ４アルキルであり、
但し、Ａ２が−Ｏ−、または−Ｓ−である場合、Ｚは水素ではなく、
ここで、式Ａで表されるアミノ酸は、式１または式２で表される基のいずれかを少なくとも１つ含む。
〔４〕Ｒ１が、式１または式２で表される基であり、
Ｒ２ＡおよびＲ２Ｂが、独立して水素、もしくはＣ１−Ｃ６アルキルであるか、あるいは、Ｒ２ＡおよびＲ２Ｂは、それらが結合している炭素原子と一緒になって４〜６員の環を形成し、
Ｒ３が、単結合、または−ＣＨＲ４−であり、
Ｒ４が、水素、またはＣ１−Ｃ４アルキルである
〔３〕に記載のペプチド化合物。
〔５〕Ｒ１が、Ｒ１が結合する窒素原子、Ｒ２Ａ、およびＲ２Aが結合する炭素原子と一緒になって４〜６員の複素環を形成し、該複素環は、式１または式２で表される基を有しており、
Ｒ２Ｂが、水素またはＣ１−Ｃ６アルキルであり、
Ｒ３が、単結合、または−ＣＨＲ４−であり、
Ｒ４が、水素、またはＣ１−Ｃ４アルキルである
〔３〕に記載のペプチド化合物。
〔６〕Ｒ１が、水素、もしくはＣ１−Ｃ６アルキルであり
Ｒ２Ａが、式１もしくは式２で表される基であり、
Ｒ２Ｂは、水素またはＣ１−Ｃ６アルキルであり、
Ｒ３が、単結合、または−ＣＨＲ４−であり、
Ｒ４が、水素、またはＣ１−Ｃ４アルキルである
〔３〕に記載のペプチド化合物。
〔７〕Ｒ１が、水素、もしくはＣ１−Ｃ６アルキルであり、
Ｒ２ＡおよびＲ２Ｂが、独立して水素、もしくはＣ１−Ｃ６アルキルであるか、あるいは、Ｒ２ＡおよびＲ２Ｂは、それらが結合している炭素原子と一緒になって４〜６員の環を形成し、
Ｒ３が、−ＣＨＲ４−であり、
Ｒ４が、式１もしくは式２で表される基である、
〔３〕に記載のペプチド化合物。
〔８〕Ｑ１がＣ１−Ｃ４アルキレンであり、
Ａ１が−Ｏ−または−Ｓ−であり、
Ｌ１が、Ｃ１−Ｃ２アルキル基、Ｃ１−Ｃ２フルオロアルキル、およびオキソ（＝Ｏ）からなる群より選択される１つまたは複数の置換基によって置換されていてもよい直鎖のＣ１−Ｃ３アルキレンであり、
Ｘが−ＯＨである、
〔３〕〜〔７〕のいずれかに記載のペプチド化合物。
〔９〕Ｑ１がＣ１−Ｃ４アルキレンであり、
Ａ１が−Ｏ−または−Ｓ−であり、
Ｌ１が、Ｃ１−Ｃ２アルキル基、Ｃ１−Ｃ２フルオロアルキル、およびオキソ（＝Ｏ）からなる群より選択される１つまたは複数の置換基によって置換されていてもよい直鎖のＣ１−Ｃ３アルキレンであり、
Ｘが−ＣＯＮＲＺ１ＲＺ２であり、
ＲＺ１がＣ１−Ｃ４アルキルであり、
ＲＺ２が水素である、
〔３〕〜〔７〕のいずれかに記載のペプチド化合物。
〔１０〕Ｑ１がＣ１−Ｃ４アルキレンであり、
Ａ１が−Ｏ−または−Ｓ−であり、
Ｌ１が、Ｃ１−Ｃ２アルキル基、Ｃ１−Ｃ２フルオロアルキル、およびオキソ（＝Ｏ）からなる群より選択される１つまたは複数の置換基によって置換されていてもよい直鎖のＣ１−Ｃ３アルキレンであり、
Ｘが１〜３個のヘテロ原子を含有し、オキソもしくは１つまたは複数のハロゲンによって置換されていてもよい５〜６員の飽和もしくは不飽和ヘテロシクリルである、
〔３〕〜〔７〕のいずれかに記載のペプチド化合物。
〔１１〕Ｑ１が単結合であり、
Ａ１が−Ｏ−または−Ｓ−であり、
Ｌ１が、Ｃ１−Ｃ２アルキル基、Ｃ１−Ｃ２フルオロアルキル、およびオキソ（＝Ｏ）からなる群より選択される１つまたは複数の置換基によって置換されていてもよい直鎖のＣ１−Ｃ３アルキレンであり、
Ｘが−ＯＨである、
〔３〕〜〔７〕のいずれかに記載のペプチド化合物。
〔１２〕Ｑ１がＣＨ２−である、〔３〕〜〔１１〕のいずれかに記載のペプチド化合物。
〔１３〕Ａ１が−Ｏ−である、〔３〕〜〔１２〕のいずれかに記載のペプチド化合物。
〔１４〕Ｌ１が、−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）３−、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＦ３）−、−ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２−、−（ＣＨ２）２ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２Ｃ（ＣＨ３）２−、および−ＣＨ２ＣＯ−からなる群より選択される、〔３〕〜〔１３〕のいずれかに記載のペプチド化合物。
〔１５〕Ｑ２がＣ１−Ｃ４アルキレンであり、
Ｌ２が単結合であり、
Ｙが−ＣＯＮＲＺ３ＲＺ４であり、
Ａ２が−Ｏ−、または−Ｓ−であり、
ＺがＣ１−Ｃ４アルキルである、
〔３〕〜〔７〕のいずれかに記載のペプチド化合物。
〔１６〕Ｑ２がＣ１−Ｃ４アルキレンであり、
Ｌ２が単結合であり、
Ｙが−ＣＯＮＲＺ３ＲＺ４であり、
Ａ２が単結合であり、
Ｚが水素である、
〔３〕〜〔７〕のいずれかに記載のペプチド化合物。
〔１７〕Ｑ２がＣ１−Ｃ４アルキレンであり、
Ｌ２が単結合であり、
ＹがＣ１−Ｃ４アルキルスルホニルアミノカルボニルであり、
Ａ２が−Ｏ−、または−Ｓ−であり、
ＺがＣ１−Ｃ４アルキルである、
〔３〕〜〔７〕のいずれかに記載のペプチド化合物。
〔１８〕Ｑ２がＣ１−Ｃ４アルキレンであり、
Ｌ２が単結合であり、
Ｙが−ＯＨであり、
Ａ２が−Ｏ−、または−Ｓ−であり、
ＺがＣ１−Ｃ４アルキルである、
〔３〕〜〔７〕のいずれかに記載のペプチド化合物。
〔１９〕Ｑ２が−ＣＨ２−である、〔３〕〜〔７〕、〔１６〕〜〔１８〕のいずれかに記載のペプチド化合物。
〔２０〕Ｙが、メチルアミノカルボニル、−ＣＯＮ（ＯＨ）Ｍｅ、または−ＣＯＮＨ（ＯＨ）である、〔３〕〜〔７〕、〔１５〕、および〔１９〕のいずれかに記載のペプチド化合物。
〔２１〕Ｙが、−ＣＯＮ（ＯＨ）Ｍｅである、〔３〕〜〔７〕、〔１６〕、および〔１９〕のいずれかに記載のペプチド化合物。
〔２２〕Ａ２が−Ｏ−である、〔３〕〜〔７〕、〔１５〕、および〔１７〕〜〔２１〕のいずれかに記載のペプチド化合物。
〔２３〕Ｚがメチルである、〔３〕〜〔７〕、〔１５〕、〔１７〕〜〔２２〕のいずれかに記載のペプチド化合物。
〔２４〕式Ａで表されるアミノ酸が以下からなる群：
2020122182.tif 000004
2020122182.tif 000005
2020122182.tif 000006
2020122182.tif 000007
より選択される、〔３〕に記載のペプチド化合物。
〔２５〕５〜３０のアミノ酸から構成される、〔１〕〜〔２４〕のいずれかに記載のペプチド化合物。
〔２６〕環状である、〔１〕〜〔２５〕のいずれかに記載のペプチド化合物。
〔２７〕２〜１５のアミノ酸から構成される環状部を含む、〔２６〕に記載のペプチド化合物。
〔２８〕２〜３０のＮ置換アミノ酸を含む、〔１〕〜〔２７〕のいずれかに記載のペプチド化合物。
〔２９〕全アミノ酸数に対するＮ置換アミノ酸数の割合が３０％以上である、〔１〕〜〔２８〕のいずれかに記載のペプチド化合物。
〔３０〕４．０〜１８のＣｌｏｇＰを有する、〔１〕〜〔２９〕のいずれかに記載のペプチド化合物。
〔３１〕１．０ｘ１０−７ｃｍ／秒以上のＰａｐｐを有する、〔１〕〜〔３０〕のいずれかに記載のペプチド化合物。
〔３２〕〔１〕〜〔３１〕のいずれかに記載のペプチドおよび／または当該ペプチドをコードする核酸を含むライブラリ。
〔３３〕〔３〕〜〔２３〕のいずれかに記載の式Ａで表されるアミノ酸。
〔３４〕以下からなる群：
2020122182.tif 000008
2020122182.tif 000009
2020122182.tif 000010
より選択される、〔３３〕に記載のアミノ酸。
〔３５〕〔３３〕または〔３４〕に記載のアミノ酸に含まれるアミノ基、および／またはカルボキシル基が保護基で保護されている、保護アミノ酸。
〔３６〕アミノ基の保護基が、Ｆｍｏｃ基、Ｂｏｃ基、Ｃｂｚ基、Ａｌｌｏｃ基、ノシル基、ジニトロノシル基、ｔ−Ｂｕ基、トリチル基、およびクミル基からなる群より選択される、および／または
カルボキシル基の保護基が、メチル基、アリル基、ｔ−Ｂｕ基、トリチル基、クミル基、メトキシトリチル基、およびベンジル基からなる群より選択される、〔３５〕に記載の保護アミノ酸。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、ペプチド医薬品の探索、具体的には膜透過性に優れ標的分子に特異的に結合するアミノ酸、および該アミノ酸を含むペプチド、またはこれらアミノ酸及びペプチドを供給することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１−１】Trpの側鎖を有しない環状ペプチド化合物を母集団とした場合のClogP/total AAとPappの関係を示した図である。
【図１−２】Trpの側鎖を有する環状ペプチド化合物を母集団とした場合のClogP/total AAとPappの関係を示した図である。
【図２】環状ペプチド化合物のARCと細胞膜透過性の関係を示した図である。
【図３−１】例えば、Ser(NMe-Aca)の側鎖部分構造でのポテンシャルエネルギー曲面（Potential energy surface）の図である。
【図３−２】例えば、Ser(NMe-Aca)の側鎖部分構造でのCSDに登録されているＸ線構造解析の結果を用いた、結晶構造（Crystal structures）のコンフォメーション分布を示した図である。
【図４−１】例えば、Ser(EtOH)、bAla(3R-MeOEtOH)、bAla(2S-MeOEtOH)の側鎖部分構造でのポテンシャルエネルギー曲面の図である。
【図４−２】例えば、Ser(EtOH)、bAla(3R-MeOEtOH)、bAla(2S-MeOEtOH)の側鎖部分構造でのCSDに登録されているＸ線構造解析の結果を用いた、結晶構造のコンフォメーション分布を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下に、本明細書の好ましい非限定的な実施態様を説明する。
【００１５】
後述する本実施例に記載されるあらゆる要素(element)は、本特許出願の権利化を意図する国における、実施例に記載の内容を限定的に解釈しようとし得るいかなる特許実務、慣習、法令等の制限に縛られることなく、本「発明を実施するための形態」においても同等に記載されていると当然にみなされることを意図して記載される。
【００１６】
本明細書におけるいずれかに記載の一又は複数の要素(element)の一部又は全部を任意に組み合わせたものも、当業者の技術常識に基づいて技術的に矛盾しない限り、本明細書に含まれることが意図され、かつ、当業者には当然に理解されるものとして記載される。
【００１７】
本明細書では、以下の略号を用いる。Ａｌａ（アラニン）、Ａｒｇ（アルギニン）、Ａｓｎ（アスパラギン）、Ａｓｐ（アスパラギン酸）、Ｃｙｓ（システイン）、Ｇｌｕ（グルタミン酸）、Ｇｌｎ（グルタミン）、Ｇｌｙ（グリシン）、Ｈｉｓ（ヒスチジン）、Ｉｌｅ（イソロイシン）、Ｌｅｕ（ロイシン）、Ｌｙｓ（リシン）、Ｍｅｔ（メチオニン）、Ｐｈｅ（フェニルアラニン）、Ｐｒｏ（プロリン）、Ｓｅｒ（セリン）、Ｔｈｒ（トレオニン）、Ｔｒｐ（トリプトファン）、Ｔｙｒ（チロシン）、Ｖａｌ（バリン）。また、これらに加えて、後述の略号表および表１に記載した略号を用いる。
【００１８】
（官能基等の定義）
本明細書において「アルキル」とは、脂肪族炭化水素から任意の水素原子を１個除いて誘導される１価の基であり、骨格中にヘテロ原子（炭素及び水素原子以外の原子をいう。）または不飽和の炭素−炭素結合を含有せず、水素及び炭素原子を含有するヒドロカルビルまたは炭化水素基構造の部分集合を有する。該アルキル基は直鎖状、又は分枝鎖状のものを含む。アルキル基としては、炭素原子数１〜２０（Ｃ１−Ｃ２０、以下「Ｃｐ−Ｃｑ」とは炭素原子数がｐ〜ｑ個であることを意味する。）のアルキル基であり、好ましくはＣ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ５アルキル基、Ｃ１−Ｃ４アルキル基、Ｃ１−Ｃ３アルキル基などが挙げられる。アルキルとしては、具体的には、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、１−メチルプロピル基、１，１−ジメチルプロピル基、２，２−ジメチルプロピル、１，２−ジメチルプロピル、１，１，２−トリメチルプロピル、１，２，２−トリメチルプロピル、１，１，２，２−テトラメチルプロピル、１−メチルブチル、２−メチルブチル、３−メチルブチル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、２，３−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、１−エチルブチル、２−エチルブチル、イソペンチル、ネオペンチル等が挙げられる。
【００１９】
本明細書における「ヘテロアルキル」は、前記「アルキル」の骨格中に好ましくは１〜５個のヘテロ原子を含む基を意味し、好ましくはＣ２−Ｃ１０ヘテロアルキル、Ｃ２−Ｃ６ヘテロアルキルなどが挙げられる。ヘテロアルキルとして具体的には、−ＣＨ２ＯＣＨ３、−ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＨ３）ＯＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２などが挙げられる。
【００２０】
本明細書における「ハロゲン原子」としては、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩが挙げられ、Ｆ又はＣｌが好ましく例示される。
【００２１】
本明細書における「フルオロアルキル」は、前記「アルキル」の１つまたは複数の水素原子がフッ素原子で置換された基を意味し、好ましくはＣ１−Ｃ６フルオロアルキル、Ｃ１−Ｃ４フルオロアルキル、Ｃ１−Ｃ２フルオロアルキルなどが挙げられる。フルオロアルキルとして具体的には、トリフルオロメチル基、２，２，２−トリフルオロエチル基，ペンタフルオロエチル基、２，２，３，３−テトラフルオロプロピル基、ヘプタフルオロプロピル基、トリフルオロメトキシ基、２，２，２−トリフルオロエトキシ基、ペンタフルオロエトキシ基、２，２，３，３−テトラフルオロプロポキシ基、ヘプタフルオロプロポキシ基などが挙げられる。
【００２２】
本明細書における「アルキルスルホニル」は、前記「アルキル」が結合したスルホニル基（即ち、−ＳＯ２−アルキル）であることを意味する。アルキルスルホニルとして、好ましくは、Ｃ１−Ｃ６アルキルスルホニル、Ｃ１−Ｃ４アルキルスルホニルなどが挙げられ、具体的には、メチルスルホニル、エチルスルホニル、ｎ−プロピルスルホニル、ｉ−プロピルスルホニルなどが挙げられる。
【００２３】
本明細書における「アルキルスルホニルアミノ」は、アミノ基（−ＮＨ２）の一つの水素原子が、前記「アルキルスルホニル」で置換された基を意味する。アルキルスルホニルアミノとして、好ましくは、Ｃ１−Ｃ６アルキルスルホニルアミノ、Ｃ１−Ｃ４アルキルスルホニルアミノなどが挙げられ、具体的には、メチルスルホニルアミノ、エチルスルホニルアミノ、ｎ−プロピルスルホニルアミノ、ｉ−プロピルスルホニルアミノなどが挙げられる。
【００２４】
本明細書における「アルケニル基」は、少なくとも１個の二重結合（２個の隣接ｓｐ２炭素原子）を有する１価の基である。二重結合および置換分（存在する場合）の配置によって、二重結合の幾何学的形態は、エントゲーゲン（Ｅ）またはツザンメン（Ｚ）、シスまたはトランス配置をとることができる。アルケニル基としては、直鎖状または分枝鎖状のものが挙げられ、内部オレフィンを含む直鎖などを含む。好ましくはＣ２−Ｃ１０アルケニル基、さらに好ましくはＣ２−Ｃ６アルケニル基が挙げられる。このようなアルケニルは、具体的には、たとえば、ビニル基、アリル基、１−プロペニル基、２−プロペニル基、１−ブテニル基、２−ブテニル基（シス、トランスを含む）、３−ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基などが挙げられる。
【００２５】
本明細書において「アルキニル」は、少なくとも１個の三重結合（２個の隣接ＳＰ炭素原子）を有する、１価の基である。直鎖状または分枝鎖状のアルキニル基が挙げられ、内部アルキレンを含む。好ましくはＣ２−Ｃ１０アルキニル基、さらに好ましくはＣ２−Ｃ６アルキニル基が挙げられる。アルキニルとしては具体的には、たとえば、エチニル基、１−プロピニル基、プロパルギル基、３−ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基などが挙げられる。
【００２６】
本明細書において「シクロアルキル」とは、飽和または部分的に飽和した環状の１価の脂肪族炭化水素基を意味し、単環、ビシクロ環、スピロ環を含む。好ましくはＣ３−Ｃ１０シクロアルキルが挙げられる。シクロアルキル基は、部分的に不飽和であってもよい。シクロアルキルとしては具体的には、たとえば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチルなどが挙げられる。
【００２７】
本明細書において「アリール」とは１価の芳香族炭化水素環を意味し、好ましくはＣ６−Ｃ１０アリールが挙げられる。アリールとしては具体的には、例えば、フェニル、ナフチルが挙げられる。
【００２８】
本明細書において「ヘテロアリール」とは、環を構成する原子中（本明細書において「環内」ともいう。）に好ましくは１〜５個のヘテロ原子を含有する芳香族性の環の１価の基を意味し、部分的に飽和されていてもよい。環は単環、または２個の縮合環（例えば、ベンゼンまたは単環へテロアリールと縮合した２環式ヘテロアリール）であってもよい。環を構成する原子の数は好ましくは５〜１０である（５員−１０員ヘテロアリール）。ヘテロアリールとしては具体的には、例えば、イミダゾリル、チアゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾロニル、チアジアゾロニル、テトラゾリル、ピリジル、インドリルなどが挙げられる。
【００２９】
本明細書において、「ヘテロ原子を環内に有する」とは、環を構成する原子中にヘテロ原子を含有することを意味し、そのような環としては、ピリジンなどの芳香族複素環、ピペリジン、モルホリン、ピロリジン、またはアゼチジンなどの非芳香族複素環が例示される。また、前記ヘテロ原子が酸素原子の場合に、「環内に酸素原子を有する」などと表記される。
【００３０】
本明細書において「複素環基」とは、ヘテロ原子（例えばＮ、Ｏ、Ｓなど）を環内に少なくとも一つ有する基をいい、飽和ヘテロシクリル基、または不飽和ヘテロシクリル基ともいう。ヘテロ原子としてはＮ又はＯが好ましく、ヘテロ原子の数は１又は２個が好ましく、４〜６員環であることが好ましい。また複素環基は、アルキル基、フルオロアルキル基、オキソ、ハロゲン原子で置換されていてもよい。複素環基としては、ピリジル基、ピペリジノ基、モルホリノ基、ピロリジノ基、オキサジアゾロニル基、またはアゼチジニル基が好ましく例示される。
【００３１】
本明細書において「アリールアルキル（アラルキル）」とは、アリールとアルキルを共に含む基であり、例えば、前記アルキルの少なくとも一つの水素原子がアリールで置換された基を意味し、好ましくは、「Ｃ５−Ｃ１０アリールＣ１−Ｃ６アルキル」が挙げられる。たとえば、ベンジルなどが挙げられる。
【００３２】
本明細書において「アルキレン」とは、前記「アルキル」からさらに任意の水素原子を１個除いて誘導される二価の基を意味する。アルキレンとしては好ましくはＣ１−Ｃ２アルキレン、Ｃ１−Ｃ３アルキレン、Ｃ１−Ｃ４アルキレン、Ｃ１−Ｃ５アルキレン、Ｃ１−Ｃ６アルキレンが挙げられる。アルキレンとして具体的には、−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）３−、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２−、−Ｃ（ＣＨ３）２−、−（ＣＨ２）４−、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２−、−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２−、−ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−、−（ＣＨ２）５−、−（ＣＨ２）６−などが挙げられる。  
【００３３】
本明細書において「ヘテロアルキレン」とは、前記「ヘテロアルキル」からさらに任意の水素原子を１個除いて誘導される二価の基を意味しＣ２−Ｃ６ヘテロアルキレン、Ｃ２−Ｃ５ヘテロアルキレン、Ｃ２−Ｃ４ヘテロアルキレン、Ｃ２−Ｃ３ヘテロアルキレン、Ｃ２ヘテロアルキレンなどが挙げられる。例えば、ヘテロ原子として酸素原子を基中に含むヘテロアルキレンとして具体的には、−ＣＨ２Ｏ−、−ＯＣＨ２−、−ＣＨ２ＯＣＨ２−、−ＯＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−などが挙げられる。
【００３４】
本明細書において「アリーレン」とは、前記アリールからさらに任意の水素原子を１個除いて誘導される２価の基を意味する。アリーレンは、単環でも縮合環でもよい。環を構成する原子の数は特に限定されないが、好ましくは６〜１０である（Ｃ６−Ｃ１０アリーレン）。アリーレンとして具体的には、たとえば、フェニレンなどが挙げられる。  
【００３５】
本明細書において「ヘテロアリーレン」とは、前記ヘテロアリールからさらに任意の水素原子を１個除いて誘導される２価の基を意味する。ヘテロアリーレンは、単環でも縮合環でもよい。環を構成する原子の数は特に限定されないが、好ましくは５〜１０である（５員〜１０員ヘテロアリーレン）。ヘテロアリーレンとして具体的には、イミダゾールジイル、ピリジンジイル、オキサジアゾールジイル、チアゾールジイル、チアジアゾールジイルなどが挙げられる。  
【００３６】
本明細書において「縮環構造」とは、二つまたはそれ以上の環を有する環式化合物において、複数の環が２個またはそれ以上の原子を共有している環式構造をいう。「２以上の芳香環による縮環構造」とは、二つまたはそれ以上の芳香環を有する環式化合物において、複数の芳香環が２個またはそれ以上の原子を共有している環式構造をいう。限定を意図しないが、縮環構造としては、インドール骨格、ベンゾフラン骨格、ベンゾイミダゾール骨格、キノリン骨格、ビシクロ[4.4.0]デカンなどが例示される。
【００３７】
本明細書において、「置換されていてもよい」という修飾語句が付与されている場合、その置換基としては、例えば、アルキル基、フルオロアルキル基、アルコシキ基、フルオロアルコキシ基、アルケニル基、アルケニルオキシ基、アルキニル基、アルキニルオキシ基、シクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、ヘテロシクリル基、アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基、ハロゲン原子、ニトロ基、アミノ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、シアノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、ホルミル基などが挙げられる。
【００３８】
本明細書における「複素環」は、環を構成する原子中に好ましくは１〜５個のヘテロ原子を含有する、非芳香族の１価または２価の複素環を意味する。複素環は、環中に二重およびまたは三重結合を有していてもよく、環中の炭素原子は酸化されてカルボニルを形成してもよく、単環、縮合環、スピロ環でもよい。環を構成する原子の数は好ましくは３〜１２であり（３〜１２員複素環）、より好ましくは４〜７であり（４〜７員複素環）、さらに好ましくは５〜６である（５〜６員複素環）。複素環として具体的には、たとえば、ピペラジン、ピロリジン、ピペリジン、モルホリン、ホモモルホリン、（Ｒ）−ヘキサヒドロピロロ［１，２−ａ］ピラジン、（Ｓ）−ヘキサヒドロピロロ［１，２−ａ］ピラジン、３−オキソピペラジン、２−オキソピロリジン、アゼチジン、２−オキソイミダゾリジン、オキセタン、ジヒドロフラン、テトラヒドロフラン、ジヒドロピラン、テトラヒドロピラン、テトラヒドロピリジン、チオモルホリン、ピラゾリジン、イミダゾリン、オキサゾリジン、イソオキサゾリジン、チアゾリジン、イミダゾリジン、イソチアゾリジン、チアジアゾリジン、オキサゾリドン、ベンゾジオキサン、ベンゾオキサゾリン、ジオキソラン、ジオキサン、テトラヒドロチオピランなどが挙げられる。
【００３９】
（ペプチド化合物）
ある局面において、本発明は、２以上のアミノ酸が連結されたペプチド化合物であって、アミノ酸の少なくとも１つ（具体的には、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）がその側鎖内で水素結合を形成し得るアミノ酸である、ペプチド化合物に関する。
【００４０】
ペプチド化合物の構造
本発明における「ペプチド化合物」には、２以上のアミノ酸が連結された、直鎖状または環状のペプチド化合物が含まれる。なお、環状ペプチド化合物は、「環状部を有するペプチド化合物」と同意義である。
【００４１】
本明細書における「アミノ酸」には、天然アミノ酸、及び非天然アミノ酸が含まれる。本明細書における「天然アミノ酸」とは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｐｒｏを指す。非天然アミノ酸は特に限定されないが、β−アミノ酸、Ｄ型アミノ酸、Ｎ置換アミノ酸、α，α−二置換アミノ酸、側鎖が天然アミノ酸と異なるアミノ酸、ヒドロキシカルボン酸などが例示される。本明細書におけるアミノ酸としては、任意の立体配置が許容される。アミノ酸の側鎖の選択は特に制限を設けないが、水素原子の他にも例えばアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基、シクロアルキル基、スピロ結合した、シクロアルキル基から自由に選択される。それぞれには置換基が付与されていてもよく、それら置換基も制限されず、例えば、ハロゲン原子、Ｏ原子、Ｓ原子、Ｎ原子、Ｂ原子、Ｓｉ原子、又はＰ原子を含む任意の置換基の中から独立して１つ又は２つ以上自由に選択されてよい。すなわち、置換されていてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基、シクロアルキル基などが例示される。また、本明細書におけるアミノ酸は、後述する「分子内水素結合を形成し得る」側鎖として有していてもよい。非限定の一態様において、本明細書におけるアミノ酸は、同一分子内にカルボキシ基とアミノ基を有する化合物であってよい（この場合であっても、プロリン、ヒドロキシプロリンのようなイミノ酸もアミノ酸に含まれる）。
【００４２】
ハロゲン由来の置換基としては、フルオロ（−Ｆ）、クロロ（−Ｃｌ）、ブロモ（−Ｂｒ）、ヨウド（−Ｉ）などが挙げられる。
【００４３】
Ｏ原子由来の置換基としては、ヒドロキシル（−ＯＨ）、オキシ（−ＯＲ）、カルボニル（−Ｃ＝Ｏ−Ｒ）、カルボキシル（−ＣＯ２Ｈ）、オキシカルボニル（−Ｃ＝Ｏ−ＯＲ）、カルボニルオキシ（−Ｏ−Ｃ＝Ｏ−Ｒ）、チオカルボニル（−Ｃ＝Ｏ−ＳＲ）、カルボニルチオ基（−Ｓ−Ｃ＝Ｏ−Ｒ）、アミノカルボニル（−Ｃ＝Ｏ−ＮＨＲ）、カルボニルアミノ（−ＮＨ−Ｃ＝Ｏ−Ｒ）、オキシカルボニルアミノ（−ＮＨ−Ｃ＝Ｏ−ＯＲ）、スルホニルアミノ（−ＮＨ−ＳＯ２−Ｒ）、アミノスルホニル（−ＳＯ２−ＮＨＲ）、スルファモイルアミノ（−ＮＨ−ＳＯ２−ＮＨＲ）、チオカルボキシル（−Ｃ（＝Ｏ）−ＳＨ）、カルボキシルカルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＯ２Ｈ）が挙げられる。
【００４４】
オキシ（−ＯＲ）の例としては、アルコキシ、シクロアルコキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アラルキルオキシなどが挙げられる。
【００４５】
カルボニル（−Ｃ＝Ｏ−Ｒ）の例としては、ホルミル（−Ｃ＝Ｏ−Ｈ）、アルキルカルボニル、シクロアルキルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルキニルカルボニル、アリールカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、アラルキルカルボニルなどが挙げられる。
【００４６】
オキシカルボニル（−Ｃ＝Ｏ−ＯＲ）の例としては、アルキルオキシカルボニル、シクロアルキルオキシカルボニル、アルケニルオキシカルボニル、アルキニルオキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシカルボニル、アラルキルオキシカルボニルなどが挙げられる。
（−Ｃ＝Ｏ−ＯＲ）
【００４７】
カルボニルオキシ（−Ｏ−Ｃ＝Ｏ−Ｒ）の例としては、アルキルカルボニルオキシ、シクロアルキルカルボニルオキシ、アルケニルカルボニルオキシ、アルキニルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、ヘテロアリールカルボニルオキシ、アラルキルカルボニルオキシなどが挙げられる。
【００４８】
チオカルボニル（−Ｃ＝Ｏ−ＳＲ）の例としては、アルキルチオカルボニル、シクロアルキルチオカルボニル、アルケニルチオカルボニル、アルキニルチオカルボニル、アリールチオカルボニル、ヘテロアリールチオカルボニル、アラルキルチオカルボニルなどが挙げられる。
【００４９】
カルボニルチオ（−Ｓ−Ｃ＝Ｏ−Ｒ）の例としては、アルキルカルボニルチオ、シクロアルキルカルボニルチオ、アルケニルカルボニルチオ、アルキニルカルボニルチオ、アリールカルボニルチオ、ヘテロアリールカルボニルチオ、アラルキルカルボニルチオなどが挙げられる。
【００５０】
アミノカルボニル（−Ｃ＝Ｏ−ＮＨＲ）の例としては、アルキルアミノカルボニル、シクロアルキルアミノカルボニル、アルケニルアミノカルボニル、アルキニルアミノカルボニル、アリールアミノカルボニル、ヘテロアリールアミノカルボニル、アラルキルアミノカルボニルなどが挙げられる。これらに加えて、−Ｃ＝Ｏ−ＮＨＲ中のＮ原子と結合したＨ原子が、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された化合物が挙げられる。
【００５１】
カルボニルアミノ（−ＮＨ−Ｃ＝Ｏ−Ｒ）の例としては、アルキルカルボニルアミノ、シクロアルキルカルボニルアミノ、アルケニルカルボニルアミノ、アルキニルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、ヘテロアリールカルボニルアミノ、アラルキルカルボニルアミノなどが挙げられる。これらに加えて−ＮＨ−Ｃ＝Ｏ−Ｒ中のＮ原子と結合したＨ原子が、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された化合物が挙げられる。
【００５２】
オキシカルボニルアミノ（−ＮＨ−Ｃ＝Ｏ−ＯＲ）の例としては、アルコキシカルボニルアミノ、シクロアルコキシカルボニルアミノ、アルケニルオキシカルボニルアミノ、アルキニルオキシカルボニルアミノ、アリールオキシカルボニルアミノ、ヘテロアリールオキシカルボニルアミノ、アラルキルオキシカルボニルアミノなどが挙げられる。これらに加えて、−ＮＨ−Ｃ＝Ｏ−ＯＲ中のＮ原子と結合したＨ原子がアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された化合物が挙げられる。
【００５３】
スルホニルアミノ（−ＮＨ−ＳＯ２−Ｒ）の例としては、アルキルスルホニルアミノ、シクロアルキルスルホニルアミノ、アルケニルスルホニルアミノ、アルキニルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、ヘテロアリールスルホニルアミノ、アラルキルスルホニルアミノなどが挙げられる。これらに加えて、−ＮＨ−ＳＯ２−Ｒ中のＮ原子と結合したＨ原子がアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された化合物が挙げられる。
【００５４】
アミノスルホニル（−ＳＯ２−ＮＨＲ）の例としては、アルキルアミノスルホニル、シクロアルキルアミノスルホニル、アルケニルアミノスルホニル、アルキニルアミノスルホニル、アリールアミノスルホニル、ヘテロアリールアミノスルホニル、アラルキルアミノスルホニルなどが挙げられる。これらに加えて、−ＳＯ２−ＮＨＲ中のＮ原子と結合したＨ原子がアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された化合物が挙げられる。
【００５５】
スルファモイルアミノ（−ＮＨ−ＳＯ２−ＮＨＲ）の例としては、アルキルスルファモイルアミノ、シクロアルキルスルファモイルアミノ、アルケニルスルファモイルアミノ、アルキニルスルファモイルアミノ、アリールスルファモイルアミノ、ヘテロアリールスルファモイルアミノ、アラルキルスルファモイルアミノなどが挙げられる。さらに、−ＮＨ−ＳＯ２−ＮＨＲ中のＮ原子と結合した２つのＨ原子はアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、およびアラルキルからなる群より独立して選択される置換基で置換されていてもよく、またこれらの２つの置換基は環を形成しても良い。
【００５６】
Ｓ原子由来の置換基として、チオール（−ＳＨ）、チオ（−Ｓ−Ｒ）、スルフィニル（−Ｓ＝Ｏ−Ｒ）、スルホニル（−Ｓ（Ｏ）２−Ｒ）、スルホ（−ＳＯ３Ｈ）が挙げられる。
【００５７】
チオ（−Ｓ−Ｒ）の例としては、アルキルチオ、シクロアルキルチオ、アルケニルチオ、アルキニルチオ、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、アラルキルチオなどの中から選択される。
【００５８】
スルフィニル（−Ｓ＝Ｏ−Ｒ）の例としては、アルキルスルフィニル、シクロアルキルスルフィニル、アルケニルスルフィニル、アルキニルスルフィニル、アリールスルフィニル、ヘテロアリールスルフィニル、アラルキルスルフィニルなどが挙げられる。
【００５９】
スルホニル（−Ｓ（Ｏ）２−Ｒ）の例としては、アルキルスルホニル、シクロアルキルスルホニル、アルケニルスルホニル、アルキニルスルホニル、アリールスルホニル、ヘテロアリールスルホニル、アラルキルスルホニルなどが挙げられる。
【００６０】
Ｎ原子由来の置換基として、アジド（−Ｎ３、「アジド基」ともいう）、シアノ（−ＣＮ）、１級アミノ（−ＮＨ２）、２級アミノ（−ＮＨ−Ｒ）、３級アミノ（−ＮＲ（Ｒ'））、アミジノ（−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ２）、置換アミジノ（−Ｃ（＝ＮＲ）−ＮＲ'Ｒ"）、グアニジノ（−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ２）、置換グアニジノ（−ＮＲ−Ｃ（＝ＮＲ'''）−ＮＲ'Ｒ"）、アミノカルボニルアミノ（−ＮＲ−ＣＯ−ＮＲ'Ｒ"）が挙げられる。
【００６１】
２級アミノ（−ＮＨ−Ｒ）の例としては、アルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、アルケニルアミノ、アルキニルアミノ、アリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、アラルキルアミノなどが挙げられる。
【００６２】
３級アミノ（−ＮＲ（Ｒ'））の例としては、例えばアルキル（アラルキル）アミノなど、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルなどの中からそれぞれ独立して選択される、任意の２つの置換基を有するアミノ基が挙げられ、これらの任意の２つの置換基は環を形成しても良い。
【００６３】
置換アミジノ（−Ｃ（＝ＮＲ）−ＮＲ'Ｒ"）の例としては、Ｎ原子上の３つの置換基Ｒ、Ｒ'、およびＲ"が、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルの中からそれぞれ独立して選択された基、例えばアルキル（アラルキル）（アリール）アミジノなどが挙げられる。
【００６４】
置換グアニジノ（−ＮＲ−Ｃ（＝ＮＲ'''）−ＮＲ'Ｒ"）の例としては、Ｒ，Ｒ'、Ｒ"、およびＲ'''が、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルの中からそれぞれ独立して選択された基、あるいはこれらが環を形成した基などが挙げられる。
【００６５】
アミノカルボニルアミノ（−ＮＲ−ＣＯ−ＮＲ'Ｒ"）の例としては、Ｒ、Ｒ'、およびＲ"が、水素原子、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルの中からそれぞれ独立して選択された基、あるいはこれらは環を形成した基などが挙げられる。
【００６６】
Ｂ原子由来の置換基として、ボリル（−ＢＲ（Ｒ'））やジオキシボリル（−Ｂ（ＯＲ）（ＯＲ'））などが挙げられる。これらの２つの置換基ＲおよびＲ'は、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルなどの中からそれぞれ独立して選択されるか、あるいはこれらは環を形成してもよい。
【００６７】
一般には、アミノ酸とは、分子内にアミノ基とカルボキシル基をそれぞれ１つ以上有する分子のことを意味するが、本明細書においては。分子内にヒドロキシル基とカルボキシル基を有するヒドロキシカルボン酸も本発明のアミノ酸に含めることができる。本明細書では、ヒドロキシカルボン酸をヒドロキシアミノ酸ということもある。
【００６８】
αアミノ酸は、アミノ酸分子内のアミノ基とカルボキシル基が結合している炭素が同一のものを意味し、該炭素上の置換基をアミノ酸の側鎖という。アミノ酸分子内のアミノ基、カルボキシル基、およびこれらが結合している炭素の一連の部分をアミノ酸の主鎖という。
【００６９】
アミノ酸の主鎖アミノ基は、非置換（ＮＨ２基）でもよく、置換されていてもよい（即ち、−ＮＨＲ基：Ｒは置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、シクロアルキルを示し、またプロリンのようにＮ原子に結合した炭素鎖とα位の炭素原子とが環を形成していてもよい。）。このような主鎖アミノ基が置換されているアミノ酸を、本明細書において「Ｎ置換アミノ酸」と称する。本明細書における「Ｎ置換アミノ酸」としては、好ましくはＮ−アルキルアミノ酸、Ｎ−Ｃ１−Ｃ６アルキルアミノ酸、Ｎ−Ｃ１−Ｃ４アルキルアミノ酸、Ｎ−メチルアミノ酸、「分子内水素結合を形成し得る」側鎖を有するＮ置換アミノ酸が例示されるが、これらに限定されるものではない。
【００７０】
本明細書におけるペプチド化合物を構成する「アミノ酸」にはそれぞれに対応する全ての同位体を含む。「アミノ酸」の同位体は、少なくとも１つの原子が、原子番号（陽子数）が同じで、質量数（陽子と中性子の数の和）が異なる原子で置換されたものである。本発明のペプチド化合物を構成する「アミノ酸」に含まれる同位体の例としては、水素原子、炭素原子、窒素原子、酸素原子、リン原子、硫黄原子、フッ素原子、塩素原子などがあり、それぞれ、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３２Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆ、３６Ｃｌ等が含まれる。
【００７１】
本発明における「直鎖状のペプチド化合物」は、天然アミノ酸および／または非天然アミノ酸がアミド結合あるいはエステル結合で連結されることにより形成されたものであり、環状部を有しない化合物である限り、特に限定されない。直鎖状のペプチド化合物を構成する天然アミノ酸あるいは非天然アミノ酸の総数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０個であることができ、好ましい範囲は６〜２０個、７〜１９個、７〜１８個、７〜１７個、７〜１６個、７〜１５個、８〜１４個、９〜１３個である。
【００７２】
本発明における「環状ペプチド化合物」は、天然アミノ酸および／または非天然アミノ酸がアミド結合あるいはエステル結合で連結されることにより形成されたものであり、環状部を有する化合物である限り、特に限定されない。環状のペプチド化合物を構成する天然アミノ酸あるいは非天然アミノ酸の総数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０個であることができ、好ましい範囲は６〜２０個、７〜１９個、７〜１８個、７〜１７個、７〜１６個、７〜１５個、８〜１４個、９〜１３個である。
【００７３】
本明細書において、ペプチド化合物の「環状部」とは、２以上のアミノ酸残基が連結され、形成されている環状の部分を意味する。また本明細書において、環状ペプチド化合物の部分構造を指す際に使用される「直鎖部」とは、環状部の主鎖構造に含まれない部分であって、該部分の鎖上に少なくとも一つのアミド結合及び／又はエステル結合を有するものをいう。
【００７４】
本明細書における環状ペプチド化合物の環状部を構成するアミノ酸の数は限定されないが、例えば、２以上、３以上、４以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、３０以下、２０以下、１８以下、１６以下、１５以下、１４以下、１３以下、１２以下、１１以下、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、及び１６が挙げられる。膜透過性と代謝安定性の両立を考慮すると、前記環状部を構成するアミノ酸の数は、２〜３０、２〜１５、又は５〜１５が好ましく、５〜１４、７〜１４、又は８〜１４がより好ましく、８〜１３、９〜１３、８〜１２、８〜１１、又は９〜１２がさらに好ましく、９〜１１が特に好ましい。
【００７５】
非限定の一態様において、直鎖部のアミノ酸の数（ユニットの数）は０〜８であることが好ましく、０〜５がより好ましく、０〜３がより好ましい。なお、非限定の一態様において、本明細書における「直鎖部」には天然アミノ酸や非天然アミノ酸（化学修飾や骨格変換されたアミノ酸を含む）が含まれる場合がある。
【００７６】
非限定の一態様において、本明細書におけるペプチド化合物、または環状ペプチド化合物は環状部または直鎖部にエステル結合を有さないものが好ましい。
【００７７】
非限定の一態様において、本明細書における環状ペプチド化合物は、環状部又は直鎖部のペプチド部位の側鎖に以下（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選択される少なくとも一つを有しない環状ペプチド化合物であってよい：
（Ａ）インドール骨格；
（Ｂ）２以上の芳香環による縮環構造；
（Ｃ）無置換のヒドロキシフェニル基。
このうち、環状部の側鎖に前記（Ａ）、（Ｃ）を有しない環状ペプチド化合物が好ましく、環状部の側鎖に前記（Ｂ）、（Ｃ）を有しない環状ペプチド化合物がより好ましい。前記「２以上の芳香環による縮環構造」は、「縮環構造」であってもよい。
【００７８】
非限定の一態様において、本明細書における環状ペプチド化合物の分子量は５００〜２０００であってよい。
【００７９】
非限定の一態様において、本明細書における環状ペプチド化合物は、環状部又は直鎖部のペプチド部位の側鎖に（Ａ）メチルチオ基および（Ｂ）チオール基からなる群より選択される少なくとも一つ、又は両方を有しない、環状ペプチド化合物であることができる。
【００８０】
本発明において、２つのアミノ酸がアミド結合することによりペプチド化合物が形成される場合、第一のアミノ酸中の主鎖のカルボキシル基のＯＨ基が、第二のアミノ酸中の主鎖のアミノ基の窒素原子部分で置換することによってペプチド化合物が形成される。
【００８１】
本発明において、２つのアミノ酸がエステル結合することによりペプチド化合物が形成される場合、第一のアミノ酸中の主鎖のカルボキシル基のＯＨ基が、第二のヒドロキシアミノ酸中の主鎖の水酸基の酸素原子部分で置換することによってペプチド化合物が形成される。
【００８２】
本発明において、天然アミノ酸および／または非天然アミノ酸がアミド結合あるいはエステル結合で連結されることによりペプチド化合物が形成される場合、２つ以上のアミノ酸が、アミド結合および／またはエステル結合により、連続して結合していることにより、ペプチド化合物が形成される。
【００８３】
本明細書におけるペプチド化合物のアミド結合及び／又はエステル結合により連結される部位を本明細書において「ペプチド部位」ということがある。ただし、ペプチド化合物が環状である場合には、環化部の結合様式はアミド結合やエステル結合に限定されない。環化部の結合様式としては、例えば、アミド結合、炭素−炭素結合、ジスルフィド結合、エステル結合、チオエステル結合、チオエーテル結合、ラクタム結合、トリアゾール構造を介した結合、フルオロフォア構造を介した結合などの共有結合が挙げられ、これらのうちでは代謝安定性が高いことから、アミド結合が好ましい。すなわち、一態様において、本明細書における環状ペプチド化合物は、環化部にアミド結合を有することが好ましい。「環化部の結合様式」とは、環化反応により環化が形成された部位の結合様式のことである。
【００８４】
本発明における「ペプチド化合物」としては、上述の天然アミノ酸及び非天然アミノ酸の総数の条件に加えて、又は単独で、Ｎ置換アミノ酸を少なくとも２つ（好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０個、特に好ましくは５、６または７個、好ましい範囲は２〜３０個、３〜３０個、６〜２０個、７〜１９個、７〜１８個、７〜１７個、７〜１６個、７〜１５個、８〜１４個、９〜１３個）含み、Ｎ置換されていないアミノ酸を少なくとも１つ含む、直鎖または環状ペプチドであることができる。「Ｎ置換」としてはＮ原子に結合した水素原子のメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ヘキシル基への置換などが挙げられるがこれに限定されない。Ｎ置換アミノ酸として、好ましくは天然アミノ酸に含まれるアミノ基がＮ−メチル化、Ｎ−エチル化、Ｎ−プロピル化、Ｎ−ブチル化、Ｎ−ペンチル化されたアミノ酸が挙げられ、これらを、Ｎ−メチルアミノ酸、Ｎ−エチルアミノ酸、Ｎ−プロピルアミノ酸、Ｎ−ブチルアミノ酸、Ｎ−ペンチルアミノ酸という。Ｎ未置換アミノ酸をＮ置換アミノ酸に変換することをＮ置換化するといい、Ｎ−アルキル化、Ｎ−メチル化、またはＮ−エチル化ということがある。本発明におけるペプチド化合物に含まれるＮ置換アミノ酸数の割合としては、ペプチド化合物を構成する総アミノ酸数の３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上が例示される。
【００８５】
非限定の一態様において、本明細書における環状ペプチド化合物のペプチド部位に含まれるＮ置換アミノ酸の数は、２以上又は３以上が好ましく、４以上、５以上、又は６以上がより好ましく、７以上が更に好ましく、８以上が特に好ましく、また、２０以下、１５以下、１４以下、１３以下、１２以下、１０以下、９以下が好ましく例示される。本明細書における環状ペプチド化合物に含まれるＮ置換アミノ酸の数としては、環状部を構成するアミノ酸の数の３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上が例示される。ここでいうＮ置換アミノ酸は、好ましくはＮ−アルキルアミノ酸、より好ましくはＮ−メチルアミノ酸であってよい。すなわち、非限定の一態様においては、前記Ｎ置換アミノ酸の数は、Ｎ−アルキルアミノ酸の数、又はＮ−メチルアミノ酸の数として、例示される。環状部を構成するアミノ酸の数が８の場合、Ｎ置換アミノ酸の数は３〜７が好ましい。環状部を構成するアミノ酸の数が９の場合、Ｎ置換アミノ酸の数は３〜８が好ましい。環状部を構成するアミノ酸の数が１０の場合、Ｎ置換アミノ酸の数は３〜８が好ましい。環状部を構成するアミノ酸の数が１１の場合、Ｎ置換アミノ酸の数は４〜９が好ましい。環状部を構成するアミノ酸の数が１２の場合、Ｎ置換アミノ酸の数は４〜１０が好ましい。環状部を構成するアミノ酸の数が１３の場合、Ｎ置換アミノ酸の数は４〜１１が好ましい。環状部を構成するアミノ酸の数が１４の場合、Ｎ置換アミノ酸の数は５〜１２が好ましい。
【００８６】
本明細書において、ペプチド化合物を構成する「アミノ酸」を「アミノ酸残基」ということがある。
【００８７】
本明細書における「ペプチド化合物」には、その薬学的に許容される塩、またはこれらの溶媒和物が含まれてもよい。
【００８８】
本明細書において「側鎖」とは、アミノ酸の側鎖、又は環状ペプチド化合物の環状部の側鎖などの文脈で使用され、それぞれの主鎖構造に含まれない部分を意味する。
【００８９】
本明細書において「アミノ酸の数」とは、ペプチド化合物を構成するアミノ酸残基（アミノ酸ユニット）の数のことであり、アミノ酸を連結しているアミド結合、エステル結合、及び環化部の結合を切断した際に生じるアミノ酸ユニットの数を意味する。
【００９０】
ペプチド化合物の膜透過性
非限定の一態様において、本明細書におけるペプチド化合物、または環状ペプチド化合物は、高い膜透過性を達成するために、中性（例えばpH=7.0）で極度にイオン化される官能基を有しない環状ペプチド化合物であってよい。本明細書で用いるpKaは別段示さない限り実測値のpKaのことを指す。また、後述するADMETPredictorによって求めたpKa値を計算pKaと称する。本明細書で用いるBasic pKaは別段示さない限り実測値のBasic pKaのことを指す。また、後述するADMETPredictorによって求めたBasic pKa値をBasic計算pKaと称する。
【００９１】
pKa、及びBasic pKaは、常法により求めることができる。例えば、実験化学講座５「熱的測定および平衡」、４６０頁（日本化学会編、丸善株式会社発行）に記載の方法などにより測定することができる。より具体的には、参照例３−１に記載の方法で測定できる。また、測定しようとするアミノ酸の側鎖のpKa値、及びBasic pKa値が他の官能基の影響を受けて求められにくい時は、目的の官能基のpKa、及びBasic pKaのみが測定できるよう、適宜他の官能基を保護基などで保護して測定することができる。
【００９２】
本明細書において「酸性の側鎖」とは、pKaが１０以下の側鎖を意味し、「塩基性の側鎖」とは、Basic pKaが４以上の側鎖を意味する。本明細書において、pKaが１０を超える側鎖、Basic pKaが４未満の側鎖は、中性の側鎖と定義される。
【００９３】
非限定の一態様において、本明細書におけるペプチド化合物、または環状ペプチド化合物は、分子内水素結合をしうる側鎖を持つアミノ酸以外に分子内水素結合しない酸性の側鎖を有するアミノ酸を含むことができる。この場合、その酸性の側鎖のpKaは３．５〜１０であってよい。前記酸性の側鎖のpKaは３．５以上であることが好ましく、３．９以上がより好ましく、４．５以上がより好ましく、５．０以上がより好ましく、５．５以上がより好ましく、５．７以上がより好ましい。また前記Basic pKaは、１０以下であることが好ましい。前記pKaの範囲としては、３．５〜１０、３．９〜１０、４．５〜１０、５．０〜１０、又は５．５〜１０、５．７〜１０が好ましく例示される。これらpKaを計算値であらわすと、計算pKaは３．５以上であることが好ましく、４．５以上、５．０以上、５．４以上、８．０以上、８．３以上がより好ましい。また計算pKaは、１０以下であることが好ましい。前記計算pKaの範囲としては、３．５〜１０、４．５〜１０、５．０〜１０、５．４〜１０、８．０〜１０、又は８．３〜１０が好ましく例示される。
【００９４】
非限定の一態様において、本明細書におけるペプチド化合物、または環状ペプチド化合物は、分子内水素結合をしうる側鎖を持つアミノ酸以外に分子内水素結合しない塩基性の側鎖を有するアミノ酸を含むことができる。この場合、その塩基性の側鎖のBasic pKaは４．０〜１０であってよい。前記塩基性の側鎖のBasic pKaは１０以下であることが好ましく、９．５以下、９．０以下、８．５以下、７．５以下、または７．２以下がより好ましく、６．５以下が特に好ましい。また前記Basic pKaは、４．０以上であることが好ましい。前記Basic pKaの範囲としては、４．０〜１０、４．０〜９．５、４．０〜９．０、４．０〜８．５、４．０〜７．５、４．０〜７．２、４．０〜６．５好ましく例示される。これらBasic pKaを計算値であらわすと、Basic計算pKaは１０以下であることが好ましく、９．５以下、９．０以下、８．８以下、８．６以下、８．５以下、７．５以下、または６．５以下がより好ましい。また前記Basic計算pKaは、４．０以上であることが好ましい。前記Basic計算pKaの範囲としては、４．０〜１０、４．０〜９．５、４．０〜９．０、４．０〜８．８、４．０〜８．６、４．０〜８．５、４．０〜７．５、４．０〜６．５が好ましく例示される。
【００９５】
限定を意図しないが、後述の参照例に示されるように、ペプチド部位の側鎖に含まれる芳香環の数、又は割合は、環状ペプチド化合物の膜透過性に影響を与え得る。ペプチド部位の側鎖に含まれる芳香環の数、又は割合が一定数を超えると、高い膜透過性を有する化合物が得られる確率が低下し得る。すなわち、芳香環の数は、膜透過性に負の影響を与えうる。
【００９６】
本明細書において、発明の効果に関する文脈で使用される「負の影響」とは、発明の効果を打ち消してしまうような影響をいう。例えば、本来発揮されるはずの発明の効果を１００％とした場合に、その効果が３０％、２０％、１０％、又は５％以下になるような場合に「負の影響」があるとすることができる。
【００９７】
非限定の一態様において、高い膜透過性のためには、本明細書における環状ペプチド化合物のペプチド部位の側鎖に含まれる芳香環の数は５以下であることが好ましく、０、１、２、又は３が好ましく例示され、０〜３、１〜３が好ましい範囲として例示される。また、ペプチド部位を構成するアミノ酸の数に対する、ペプチド部位の側鎖に含まれる芳香環の数の割合としては、４０％以下が好ましく、３５％以下、３０％以下、２７％以下、２５％以下、２０％以下が好ましく例示される。
【００９８】
本明細書において「芳香環の数」（「Aromatic Ring Count」（ＡＲＣ）ともいう。）とは、環状ペプチド化合物のペプチド部位の側鎖に含まれる芳香環の数をいい、例えば、フェノール基は１個、インドール骨格のような二環式縮環は２個、アントラセンのような三環式縮環は３個と数える。
【００９９】
非限定の一態様において、高い膜透過性のためには、本明細書における環状ペプチド化合物に含んでよい芳香環の数に制限がある一方で、分子内水素結合を形成し得る側鎖を含むアミノ酸は、標的分子との結合に寄与し得る部位である環状部に存在するのが好ましい。すなわち、一態様において、本明細書におけるペプチド化合物が、環状ペプチド化合物であり、かつ該環状ペプチド化合物の環状部に、分子内水素結合を形成し得る側鎖に芳香環を含むアミノ酸が含まれる場合には、ペプチド化合物の環状部に含まれる芳香環の数として、１、２、又は３が例示され、芳香環数の範囲として１〜３又は２〜３が例示される。また、本明細書におけるペプチド化合物が、環状ペプチド化合物であり、かつ該環状ペプチド化合物の環状部に、分子内水素結合を形成し得る側鎖に芳香環を含むアミノ酸が含まれる場合には、ペプチド化合物に含まれる芳香環の総数のうち環状部に含まれる芳香環の数の割合としては、３０％以上、４０％以上、６０％以上、８０％以上、又は１００％が例示される。
【０１００】
本発明におけるペプチド化合物の膜透過性は、国際公開第２０１８／１２４１６２号に記載の膜透過性の測定方法により測定することができる。
【０１０１】
非限定の一態様において、本発明のペプチド化合物のＰａｐｐは、１．０×１０−７ｃｍ／秒以上、５．０×１０−７ｃｍ／秒以上、８．０×１０−７ｃｍ／秒以上が好ましく、９．０×１０−７ｃｍ／秒以上がより好ましく、１．０×１０−６ｃｍ／秒以上が更に好ましく、３．０×１０−６ｃｍ／秒以上が特に好ましい。
本明細書における「膜透過係数（Papp）」は、特に断りがない限り、国際公開第２０１８／１２４１６２号に記載の測定方法（改良法）を用いて測定した値を意味する。
【０１０２】
非限定の一態様において、本明細書における環状ペプチド化合物のＣｌｏｇＰは、４以上が好ましく、５以上がより好ましく、６以上が更に好ましく、８以上が特に好ましく、１８以下、１７以下、１６以下が好ましく例示され、４〜１８、５〜１７、及び６〜１６が例示される。本明細書におけるＣｌｏｇＰは、コンピューターで計算した分配係数であって、Daylight Chemical Information Systems, Inc.のDaylight Version 4.9を用いて計算できる。
【０１０３】
非限定の一態において、本明細書における環状ペプチド化合物のClogP/total aaの下限としては、１．０以上が好ましく、１．１以上がより好ましく、１．２以上が更に好ましい。またClogP/total aaの上限としては、１．８以下、１．７以下、１．６以下、１．５以下が好ましい。ClogP/total aaの範囲としては、１．０〜１．８、１．０〜１．７、１．１〜１．６、及び１．１〜１．５が例示される。本明細書において「total aa」 (「total AA」とも表記される。)とは、ペプチド化合物のペプチド部位を構成するアミノ酸の数を意味する。例えば、環状部が１０個のアミノ酸からなり、直鎖部が１個のアミノ酸からなる環状ペプチド化合物のtotal aaは１１である。本明細書においてClogP/total aaとは、ClogPをtotal aaで除することにより算出される。
【０１０４】
ペプチド化合物の代謝安定性
非限定の一態様において、本明細書におけるペプチド化合物は、良好な代謝安定性を有することが好ましい。良好な代謝安定性のためには、ペプチド化合物中に含まれるアミノ酸の数が８以上であることが好ましく、９以上がより好ましく、１１以上が更に好ましい。また、一態様において、容易に酸化される可能性のあるチオエーテル結合を有しないことが好ましい。また、一態様において、酸化されやすく代謝安定性の妨げとなり得ることから、メチルチオ基を有しないことが好ましい。
【０１０５】
（分子内水素結合を形成し得るアミノ酸）
非限定の一態様において、本発明のペプチド化合物は、その側鎖内で水素結合（即ち、分子内水素結合）を形成できるアミノ酸を少なくとも１つ、具体的には、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上含む。
【０１０６】
本明細書におけるアミノ酸の側鎖には、アミノ酸に含まれる炭素原子（例えば、α、β、又はγ−炭素原子）に結合している鎖、及び窒素原子に結合している鎖が含まれる。本明細書において、アミノ酸の側鎖の長さは、参照例１に記載の方法により求めることができる。すなわち、アミノ酸単位のＮ末をアセチル基、Ｃ末をメチルアミノ基でキャッピングし、分子モデリングソフトＭＯＥ（Chemical Computing Group社）のLowModeMDにより配座を発生させ、側鎖部位が結合している原子（天然アミノ酸の場合はα−炭素原子（Ｃα炭素））から最も遠い同側鎖の原子（水素原子は除く）までの距離を測定することで求めることができる。
【０１０７】
本明細書において「長側鎖」とは、５．４オングストローム以上の長さの側鎖をいう。分子内水素結合のためにアミノ酸の側鎖は長側鎖であることが好ましい。長側鎖の長さとしては、５．４オングストローム以上が好ましく、５．６オングストローム以上がより好ましく、５．８オングストローム以上がさらに好ましく、６．０オングストローム以上が特に好ましい。前記側鎖の長さの上限は特に限定されないが、２０オングストローム以下、１５オングストローム以下、１３オングストローム以下、１２オングストローム以下、１１オングストローム以下、１０オングストローム以下、９．０オングストローム以下、８．８オングストローム以下、８．５オングストローム以下、及び８．０オングストローム以下が例示される。前記長側鎖の長さの範囲としては、５．４〜２０オングストローム、６．０〜２０オングストローム、６．０〜１５オングストローム、６．０〜１３オングストローム、６．０〜１０オングストロームが例示される。
【０１０８】
非限定の一態様において、「長側鎖」は、（ｉ）その側鎖上にアミド結合を含まないか又は１個のアミド結合を含む側鎖が好ましく、（ｉｉ）その側鎖上にアミド結合を含まない側鎖であってもよい。すなわち、非限定の一態様において、その側鎖に２個以上のアミド結合を有さず、かつ、長さが６．０〜１１オングストロームの長側鎖を有するアミノ酸を環状部に有する環状ペプチド化合物が好ましく例示される。本明細書における長側鎖は、芳香環を有していても、有していなくてもよい。
【０１０９】
非限定の一態様において、分子内水素結合を形成し得るアミノ酸は長側鎖のアミノ酸であることが好ましい。
【０１１０】
分子内水素結合の有無は例えばX線構造解析や1HNMRによるケミカルシフトにより判別できる。一般的に、温度依存的化学シフト変化量が<2 ppb/Kの場合は明確な水素結合をしており、>4 ppb/Kの場合は水素結合していないとされている。また実施例３に例示されるような計算化学によるコンフォメーション解析も分子内水素結合を形成する可能性があるか判断するのに用いられる手法である。
【０１１１】
ある局面において、本発明のペプチド化合物は、その側鎖内で擬似Ｗ員環を形成し得るアミノ酸を少なくとも１つ、具体的には、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上含む。
【０１１２】
本明細書において「擬似Ｗ員環」とは、共有結合による環状構造は有していないが、分子内水素結合により配座が固定されることで擬似的な環状構造を形成することを意味する。「Ｗ」は、３以上の自然数から選ばれる環の大きさを表しており、擬似的な環状部分を構成する原子にはプロトンドナーである水素原子およびその水素原子と直接結合している原子、プロトンドナーと水素結合を形成できるプロトンアクセプターの３原子が必ず含まれる。疑似環状構造の環状構造の環の大きさを表すＷは、３以上であればよく、好ましくは４〜７、または５〜７、さらに好ましくは５〜６である。以下に例示するSer(nPrOH)の側鎖部分構造の場合は、プロトンドナーである水酸基の水素原子およびその水素原子が直接結合する水酸基の酸素原子、プロトンアクセプターであるエーテル基の酸素原子がそれぞれ前記３原子に該当し、擬似６員環を形成している。また、分子内水素結合は周辺の環境に合わせて環化体と、非環化体とに構造変換できることが特徴であり、生体膜中のような疎水性の環境下ではプロトンドナーをマスクするような環化体構造をとることで、分子内水素結合をする官能基を有する化合物の膜透過性向上が期待できる。一方で、標的分子の阻害剤として、ある化合物が該標的分子と結合する場合を例示すると、分子内水素結合をする官能基を有する該化合物が非環化体構造をとることで、プロトンドナーとプロトンアクセプターの双方もしくはいずれか一方が該標的分子と結合することが期待され、該化合物と標的分子との間で、より効率よく分子間水素結合を形成することが可能となる。下記にはその１例として分子内水素結合をしうる構造の一部が、標的分子のアミド部位と分子間相互結合を形成する模式図を記載している（＊はＳｅｒ（ｎＰｒＯＨ）のα炭素との、＊＊、および＊＊＊はそれぞれ標的分子のタンパクとの結合点をあらわす）。
2020122182.tif 000011
【０１１３】
非限定の一態様において、分子内水素結合し得る側鎖を有するアミノ酸は、その分子内水素結合を形成する部分構造において擬似４〜７員環を形成してもよく、擬似５〜７員環を形成することが好ましく、擬似５〜６員環を形成することが特に好ましい。
【０１１４】
非限定の一態様において、本明細書において、分子内水素結合を形成し得る構造として以下が例示される（＊は式１のＱ１または式２のＱ２との結合点をあらわす）。
2020122182.tif 000012
2020122182.tif 000013
2020122182.tif 000014
【０１１５】
非限定の一態様において、側鎖内で水素結合を形成し得るアミノ酸は、下記式Ａで表すことができる。
2020122182.tif 000015
【０１１６】
ある局面において、式（Ａ）中、Ｒ１は、水素、もしくはＣ１−Ｃ６アルキルであるか、または式１もしくは式２で表される基であり、この場合、（ａ）Ｒ２ＡおよびＲ２Ｂは、Ｒ２Ａが水素、もしくはＣ１−Ｃ６アルキルであるか、または式１もしくは式２で表される基であり、かつＲ２Ｂは、水素またはＣ１−Ｃ６アルキルであるか、あるいは、（ｂ）Ｒ２ＡおよびＲ２Ｂは、それらが結合している炭素原子と一緒になって４〜６員の環を形成する。Ｒ１がＣ１−Ｃ６アルキルである場合、Ｒ１として好ましくはメチルである。Ｒ２ＢがＣ１−Ｃ６アルキルである場合、Ｒ２Ｂはメチルが好ましい。またＲ２ＢがＣ１−Ｃ６アルキルである場合、Ｒ２Ａは式１もしくは式２で表される基であるか、またはＣ１−Ｃ６アルキルであることが好ましい。またＲ２ＡおよびＲ２Ｂが、それらが結合している炭素原子と一緒になって４〜６員の環を形成する場合、該４〜６員環として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロへキシルが好ましい。
【０１１７】
別の局面において、式（Ａ）中、Ｒ１は、Ｒ１が結合する窒素原子、Ｒ２Ａ、およびＲ２Aが結合する炭素原子と一緒になって４〜６員の複素環を形成し、この場合、Ｒ２Ｂは、水素またはＣ１−Ｃ６アルキルである。Ｒ２ＢがＣ１−Ｃ６アルキルである場合、Ｒ２Ｂはメチルが好ましい。前記４〜６員の複素環は、式１もしくは式２で表される基、−ＯＨ、およびアルコキシ基からなる群より選択される、１つまたは複数の置換基を有していてもよい。また前記４〜６員の複素環としては、ピロリジン（即ち、プロリン様の構造）が好ましい。
【０１１８】
Ｒ１、Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂの組み合わせとしては、Ｒ２Ａが式１または式２で表される基である場合、Ｒ１が水素またはＣ１−Ｃ６アルキルであり、かつＲ２Ｂが水素またはＣ１−Ｃ６アルキルであることが好ましく、該Ｃ１−Ｃ６アルキルはメチルであることが好ましい。また、Ｒ１が式１または式２で表される基である場合、Ｒ２Ａが水素またはＣ１−Ｃ６アルキルであり、かつＲ２Ｂは水素、Ｃ１−Ｃ６アルキルであるか、あるいはＲ２ＡとＲ２Ｂは一緒になって４〜６員の環を形成することが好ましく、該Ｃ１−Ｃ６アルキルはメチルが好ましい。
【０１１９】
式（Ａ）中、Ｒ３は、単結合、または−ＣＨＲ４−であり、ここでＲ４は、水素、もしくはＣ１−Ｃ４アルキルであるか、または式１もしくは式２で表される基である。Ｒ３が−ＣＨＲ４−である場合、Ｒ４として好ましくは水素、または式１もしくは式２で表される基である。
【０１２０】
式（Ａ）中、式１および／または式２で表される基は２つ以上含まれていてもよいが、式１または式２で表される基のいずれか１つのみが含まれていることが好ましい。式１または式２で表される基のいずれかが１つが含まれている態様として具体的には、たとえば、以下が挙げられる。
(i)Ｒ１が、式１または式２で表される基であり、Ｒ２Ａが水素、またはＣ１−Ｃ６アルキル、好ましくは水素であり、Ｒ２Ｂが、水素またはＣ１−Ｃ６アルキル、好ましくは水素であり、Ｒ３が、単結合、または−ＣＨＲ４−であり、Ｒ４が、水素、もしくはＣ１−Ｃ４アルキル、好ましくは水素である。
(ii)Ｒ１が水素またはＣ１−Ｃ６アルキルであり、Ｒ２Ａが式１または式２で表される基であり、Ｒ２Ｂが水素またはＣ１−Ｃ６アルキル、好ましくは水素であり、Ｒ３が、単結合、または−ＣＨＲ４−、好ましくは単結合であり、Ｒ４が、水素、もしくはＣ１−Ｃ４アルキル、好ましくは水素である。
(iii)Ｒ１が水素またはＣ１−Ｃ６アルキルであり、Ｒ２Ａが水素、またはＣ１−Ｃ６アルキル、好ましくは水素であり、Ｒ２Ｂが水素、またはＣ１−Ｃ６アルキル、好ましくは水素であり、Ｒ３が−ＣＨＲ４−であり、Ｒ４が式１または式２で表される基である。
(iv) Ｒ１、Ｒ１が結合する窒素原子、Ｒ２Ａ、およびＲ２Aが結合する炭素原子が一緒になって、４〜６員の複素環（好ましくはピロリジン環）を形成し、該複素環が式１もしくは式２で表される基を有し、Ｒ２Ｂが、水素またはＣ１−Ｃ６アルキル、好ましくは水素であり、Ｒ３が、単結合、または−ＣＨＲ４−、好ましくは単結合であり、Ｒ４が、水素、もしくはＣ１−Ｃ４アルキル、好ましくは水素である。
【０１２１】
式１および式２は、それぞれ下記式：
2020122182.tif 000016
で表され、式中の＊は結合点を示す。式Ａで表されるアミノ酸は、式１または式２で表される基のいずれかを少なくとも１つ含む。例えば、式Ａで表されるアミノ酸は、式１または式２で表される基のいずれか一方を含むことができ、この場合、式Ａ中のＲ１、Ｒ２、またはＲ４のいずれか１つが式１または式２で表される基である。
【０１２２】
式１中、Ｑ１は、単結合、Ｃ１−Ｃ４アルキレン、または酸素原子を１つ含むＣ２−Ｃ４ヘテロアルキレンである。Ｑ１がＣ１−Ｃ４アルキレンである場合、Ｑ１として好ましくは−ＣＨ２−もしくは−(ＣＨ２)２−である。
【０１２３】
式１中、Ａ１は、−Ｏ−、または−Ｓ−であり、好ましくは−Ｏ−である。
【０１２４】
式１中、Ｌ１は、フッ素、Ｃ１−Ｃ２アルキル基、Ｃ１−Ｃ２フルオロアルキル、およびオキソ（＝Ｏ）からなる群より選択される１つまたは複数の置換基によって置換されていてもよい直鎖のＣ１−Ｃ３アルキレンである。Ｌ１として具体的には、−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）３−、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＦ３）−、−ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２−、−（ＣＨ２）２ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２Ｃ（ＣＨ３）２−、−ＣＨ２ＣＯ−などが挙げられる。ある局面において、Ｌ１は、非置換の−（ＣＨ２）２−でないことが好ましい。
【０１２５】
式１中、Ｘは、−ＯＨ、−ＮＲＺ１ＲＺ２、もしくは−ＣＯＮＲＺ１ＲＺ２であるか、または１〜３個のヘテロ原子を含有し、オキソもしくは１つまたは複数のハロゲンによって置換されていてもよい５〜６員の飽和もしくは不飽和ヘテロシクリルであり、ここでＲＺ１およびＲＺ２は、独立して、水素、−ＯＨ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、およびＣ１−Ｃ４アルキルスルホニルからなる群より選択される。Ｘが−ＮＲＺ１ＲＺ２である場合、Ｘは−ＮＨ２、−ＮＨＭｅ、−ＮＨＥｔ、−ＮＨ（ｎＰｒ）、−ＮＨ（ｉＰｒ）、−ＮＨ（ｔＢｕ）が好ましい。Ｘが−ＣＯＮＲＺ１ＲＺ２である場合、Ｘは−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨＭｅ、−ＣＯＮＨＥｔ、−ＣＯＮＨ（ｎＰｒ）、−ＣＯＮＨ（ｉＰｒ）、−ＣＯＮＨ（ｔＢｕ）が好ましい。またＸがオキソもしくは１つまたは複数のハロゲンによって置換されていてもよい５〜６員の飽和もしくは不飽和ヘテロシクリルである場合、該飽和もしくは不飽和ヘテロシクリルとして４，５−ジヒドロ−１，２，４−オキサジアゾリル、４，５−ジヒドロ−１，２，４−チアジアゾリル、ピロリジルが好ましく、Ｘとして以下の基：
2020122182.tif 000017
が好ましい。
【０１２６】
このような−Ｑ１−Ａ１−Ｌ１−Ｘの好ましい組み合わせとして、具体的には、以下が挙げられる。
(i) Ｑ１がＣ１−Ｃ４アルキレン、好ましくは、−ＣＨ２−であり、Ａ１が−Ｏ−または−Ｓ−、好ましくは−Ｏ−であり、Ｌ１が、Ｃ１−Ｃ２アルキル基、Ｃ１−Ｃ２フルオロアルキル、およびオキソ（＝Ｏ）からなる群より選択される１つまたは複数の置換基によって置換されていてもよい直鎖のＣ１−Ｃ３アルキレンであり、Ｘが−ＯＨである。
(ii) Ｑ１がＣ１−Ｃ４アルキレン、好ましくは、−ＣＨ２−であり、Ａ１が−Ｏ−または−Ｓ−、好ましくは−Ｏ−であり、Ｌ１が、Ｃ１−Ｃ２アルキル基、Ｃ１−Ｃ２フルオロアルキル、およびオキソ（＝Ｏ）からなる群より選択される１つまたは複数の置換基によって置換されていてもよい直鎖のＣ１−Ｃ３アルキレン、好ましくは、−ＣＨ２−であり、Ｘが−ＮＲＺ１ＲＺ２であり、ＲＺ１がＣ１−Ｃ４アルキルであり、ＲＺ２が水素である。
(iii) Ｑ１がＣ１−Ｃ４アルキレン、好ましくは、−ＣＨ２−であり、Ａ１が−Ｏ−または−Ｓ−、好ましくは−Ｏ−であり、Ｌ１が、Ｃ１−Ｃ２アルキル基、Ｃ１−Ｃ２フルオロアルキル、およびオキソ（＝Ｏ）からなる群より選択される１つまたは複数の置換基によって置換されていてもよい直鎖のＣ１−Ｃ３アルキレン、好ましくは、−ＣＨ２−であり、Ｘが−ＣＯＮＲＺ１ＲＺ２であり、ＲＺ１がＣ１−Ｃ４アルキルであり、ＲＺ２が水素である。
(iv) Ｑ１がＣ１−Ｃ４アルキレン、好ましくは、−ＣＨ２−であり、Ａ１が−Ｏ−または−Ｓ−、好ましくは−Ｏ−であり、Ｌ１が、Ｃ１−Ｃ２アルキル基、Ｃ１−Ｃ２フルオロアルキル、およびオキソ（＝Ｏ）からなる群より選択される１つまたは複数の置換基によって置換されていてもよい直鎖のＣ１−Ｃ３アルキレン、好ましくは、−ＣＨ２−であり、Ｘが１〜３個のヘテロ原子を含有し、オキソもしくは１つまたは複数のハロゲン（好ましくはフッ素）によって置換されていてもよい５〜６員の飽和もしくは不飽和ヘテロシクリルである。
(v) Ｑ１が単結合であり、Ａ１が−Ｏ−または−Ｓ−、好ましくは−Ｏ−であり、Ｌ１が、Ｃ１−Ｃ２アルキル基、Ｃ１−Ｃ２フルオロアルキル、およびオキソ（＝Ｏ）からなる群より選択される１つまたは複数の置換基によって置換されていてもよい直鎖のＣ１−Ｃ３アルキレンであり、Ｘが−ＯＨである。
【０１２７】
式２中、Ｑ２は、単結合、Ｃ１−Ｃ４アルキレン、または酸素原子を１つ含むＣ２−Ｃ４ヘテロアルキレンである。Ｑ２がＣ１−Ｃ４アルキレンである場合、Ｑ２として好ましくは−ＣＨ２−もしくは−(ＣＨ２)２−である。
【０１２８】
式２中、Ｌ２は、単結合であるか、またはフッ素、Ｃ１−Ｃ２アルキル基、Ｃ１−Ｃ２フルオロアルキル、およびオキソ（＝Ｏ）からなる群より選択される１つまたは複数の置換基によって置換されていてもよい直鎖のＣ１−Ｃ３アルキレンである。Ｌ２として具体的には、単結合、−ＣＨ２−、−ＣＯ−、−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）３−、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＦ３）−、−ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２−、−（ＣＨ２）２ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２Ｃ（ＣＨ３）２−、−ＣＨ２ＣＯ−などが挙げられる。
【０１２９】
式２中、Ｙは、−ＯＨ、Ｃ１−Ｃ４アルキルスルホニルアミノ、−ＮＲＺ３ＲＺ４、もしくは−ＣＯＮＲＺ３ＲＺ４であるか、または１〜３個のヘテロ原子を含有し、オキソもしくはハロゲンによって置換されていてもよい５〜６員の飽和もしくは不飽和ヘテロシクリルであり、ここでＲＺ３およびＲＺ４は、独立して、水素、−ＯＨ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、およびＣ１−Ｃ４アルキルスルホニルからなる群より選択される。Ｙが−ＮＲＺ３ＲＺ４である場合、Ｙは−ＮＨ２、ＮＨＭｅ、ＮＨＥｔ、ＮＨ（ｎＰｒ）、ＮＨ（ｉＰｒ）、ＮＨ（ｔＢｕ）が好ましい。また、ＹがＣ１−Ｃ４アルキルスルホニルアミノである場合、Ｙはメチルスルホニルアミノが好ましい。さらにまた、ＹがＣ１−Ｃ４アルキルスルホニルアミノである場合、Ｌ２は−ＣＯ−であることが好ましい。
【０１３０】
式２中、Ａ２は、単結合、−Ｏ−、または−Ｓ−であり、好ましくは−Ｏ−である。
【０１３１】
式２中、Ｚは、水素、またはＣ１−Ｃ４アルキルであり、ＺがＣ１−Ｃ４アルキルである場合、該Ｃ１−Ｃ４アルキルとして好ましくはメチルである。
【０１３２】
式２中、Ａ２が−Ｏ−、または−Ｓ−である場合、Ｚは水素ではない。すなわち、−Ａ２−Ｚとして具体的には、Ａ２が単結合であり、かつＺが水素であるか、Ａ２が−Ｏ−であり、かつＺがＣ１−Ｃ４アルキルであるか、またはＡ２が−Ｓ−であり、かつＺがＣ１−Ｃ４アルキルである。
【０１３３】
このような−Ｑ２−、−Ｌ２−Ｙ、および−Ａ２−Ｚの好ましい組み合わせとして、具体的には、以下が挙げられる。
(i) Ｑ２がＣ１−Ｃ４アルキレン、好ましくは、−ＣＨ２−であり、Ｌ２がフッ素、Ｃ１−Ｃ２アルキル基、Ｃ１−Ｃ２フルオロアルキル、およびオキソ（＝Ｏ）からなる群より選択される１つまたは複数の置換基によって置換されていてもよい直鎖のＣ１−Ｃ３アルキレン、好ましくは−ＣＯ−であり、Ｙが−ＮＲＺ３ＲＺ４、好ましくはメチルアミノ、−Ｎ（ＯＨ）Ｍｅ、または−ＮＨ（ＯＨ）であり、Ａ２が−Ｏ−、または−Ｓ−、好ましくは−Ｏ−であり、ＺがＣ１−Ｃ４アルキル、好ましくはメチルである。
(ii) Ｑ２がＣ１−Ｃ４アルキレン、好ましくは、−ＣＨ２−であり、Ｌ２が単結合であり、Ｙが−ＣＯＮＲＺ３ＲＺ４、好ましくはメチルアミノカルボニルまたは−ＣＯＮ（ＯＨ）Ｍｅ、または−ＣＯＮＨ（ＯＨ）であり、Ａ２が−Ｏ−、または−Ｓ−、好ましくは−Ｏ−であり、ＺがＣ１−Ｃ４アルキル、好ましくはメチルである。
(iii) Ｑ２がＣ１−Ｃ４アルキレン、好ましくは、−ＣＨ２−であり、Ｌ２がフッ素、Ｃ１−Ｃ２アルキル基、Ｃ１−Ｃ２フルオロアルキル、およびオキソ（＝Ｏ）からなる群より選択される１つまたは複数の置換基によって置換されていてもよい直鎖のＣ１−Ｃ３アルキレン、好ましくは−ＣＯ−であり、Ｙが−ＮＲＺ３ＲＺ４、好ましくは−Ｎ（ＯＨ）Ｍｅであり、Ａ２が単結合であり、Ｚが水素である。
(iv) Ｑ２がＣ１−Ｃ４アルキレン、好ましくは、−ＣＨ２−であり、Ｌ２が単結合であり、Ｙが−ＣＯＮＲＺ３ＲＺ４、好ましくは−ＣＯＮ（ＯＨ）Ｍｅであり、Ａ２が単結合であり、Ｚが水素である。
(v) Ｑ２がＣ１−Ｃ４アルキレン、好ましくは、−ＣＨ２−であり、Ｌ２がフッ素、Ｃ１−Ｃ２アルキル基、Ｃ１−Ｃ２フルオロアルキル、およびオキソ（＝Ｏ）からなる群より選択される１つまたは複数の置換基によって置換されていてもよい直鎖のＣ１−Ｃ３アルキレン、好ましくは−ＣＯ−であり、ＹがＣ１−Ｃ４アルキルスルホニルアミノ、好ましくはメチルスルホニルアミノであり、Ａ２が−Ｏ−、または−Ｓ−、好ましくは−Ｏ−であり、ＺがＣ１−Ｃ４アルキル、好ましくはメチルである。
(vi) Ｑ２がＣ１−Ｃ４アルキレン、好ましくは、−ＣＨ２−であり、Ｌ２が単結合であり、ＹがＣ１−Ｃ４アルキルスルホニルアミノカルボニル、好ましくはメチルスルホニルアミノカルボニルであり、Ａ２が−Ｏ−、または−Ｓ−、好ましくは−Ｏ−であり、ＺがＣ１−Ｃ４アルキル、好ましくはメチルである。
(vii) Ｑ２がＣ１−Ｃ４アルキレン、好ましくは、−ＣＨ２−であり、Ｌ２が単結合であり、Ｙが−ＯＨであり、Ａ２が−Ｏ−、または−Ｓ−、好ましくは−Ｏ−であり、ＺがＣ１−Ｃ４アルキル、好ましくはメチルである。
【０１３４】
このような側鎖内で水素結合を形成し得るアミノ酸、および／または側鎖内で擬似４〜７員環を形成し得るアミノ酸としてより具体的には、以下のアミノ酸が挙げられる。
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【０１３５】
非限定の一態様において、本発明の式Ａで表されるアミノ酸が、ペプチド化合物に含まれる場合、該アミノ酸の主鎖のアミノ基およびカルボキシル基によって隣接するアミノ酸と連結することが好ましい。この場合、式（Ａ）で表されるアミノ酸は、以下のように表すこともできる（＊はペプチド化合物中で、隣接するアミノ酸との結合点をあらわす）。
2020122182.tif 000022
【０１３６】
非限定の一態様において、本発明は、前記分子内水素結合を形成し得るアミノ酸のアミノ基、および／またはカルボキシル基が保護基で保護されている保護アミノ酸に関する。保護アミノ酸のアミノ基の保護基としては、Ｆｍｏｃ基、Ｂｏｃ基、Ｃｂｚ基、Ａｌｌｏｃ基、ノシル基、ジニトロノシル基、ｔ−Ｂｕ基、トリチル基、クミル基などが挙げられる。また保護アミノ酸のカルボキシル基の保護基としては、メチル基、アリル基、ｔ−Ｂｕ基、トリチル基、クミル基、メトキシトリチル基、ベンジル基などが挙げられる。例えば、「Greene’s,“Protective Groups in Organic Synthesis″（第５版，John Wiley & Sons 2014）」に記載の方法を利用してこれらの保護基を導入することができる。
【０１３７】
特定の理論に拘束されることを意図しないが、本発明者らは以下のように考える。ペプチドに含まれるアミノ酸の側鎖上のプロトンを水素結合でマスクする手段として、ペプチドの主鎖に含まれるアミド結合を利用する場合、ペプチドのコンフォメーションがペプチドごとに異なることから、側鎖上のプロトンをマスクするような水素結合の形成は偶然に頼らざるを得ない。したがって、側鎖のプロトンを常に水素結合の形成によってマスクすることは難しい。また、隣接するアミノ酸の主鎖に含まれるアミド結合を利用して側鎖のプロトンをマスクするような水素結合を形成させる場合、採用し得る側鎖のバリエーションが限られてしまう。隣接するアミノ酸の主鎖に含まれるアミド結合と水素結合を形成することが想定されるアミノ酸の場合、プロトンドナーの位置は水素結合を形成することが可能な主鎖のアミド結合と近い位置に限定されたものになる。一方、非限定の一態様において、本明細書のアミノ酸はその「側鎖内」で水素結合を形成することが可能なため、側鎖デザインの自由度が高まり得る。例えば、プロトンをマスクし得る水素結合の形成を維持したまま側鎖を長くすることも可能であり、側鎖上のプロトンが標的との相互作用に用いられる可能性が高まり得る。
【０１３８】
（一般的製造方法）
次に本発明の側鎖内で水素結合を形成し得るアミノ酸、およびペプチド化合物の一般的な製造方法について説明する。
【０１３９】
（分子内水素結合を形成し得るアミノ酸の製造方法）
側鎖に分子内水素結合を有するアミノ酸の製造において、側鎖にエーテル結合を有するアミノ酸に関しては、以下の２つの合成法により製造できる。
【０１４０】
製法１：
アミノ基とカルボン酸基が保護されたアジリジンを有する化合物と対応する適切な保護基を有するアルコールをLewis酸存在下反応させ、開環反応を行った後、不要な保護基の脱保護を行う。下記一般式中、Ｐ１としてはＣｂｚ基、Ｆｍｏｃ基、Ａｌｌｏｃ基、ノシル基（Ｎｓ基）などを、Ｐ２としてはＭｅ基、アリル基、ベンジル基などを用いることが出来る。開環反応に用いるLewis酸としては触媒量のBF3・OEt2が好ましく例示される。溶媒はジクロロメタンが好ましく例示されるが、試薬として使用するアルコール（ＲＯＨ）を溶媒として用いることも可能である。Ｒ上に反応に関与する可能性のある官能基が含まれる場合、該官能基をLewis酸存在下において安定な保護基で保護することが好ましい。例えばＲが水酸基を含む場合はベンジル基などで該水酸基を、２級アミノ基を含む場合はＡｌｌｏｃ基などで該アミノ基を保護することが好ましい。開環反応によりアミノ酸の基本骨格を構築した後は保護基の適切な変換を行うことで所望のアミノ酸（Ｐ３がＣｂｚ基、Ｆｍｏｃ基、Ｂｏｃ基、Ａｌｌｏｃ基、ノシル基（Ｎｓ基）などで保護されたアミノ酸あるいはＰ３が水素である無保護のアミノ酸）に変換できる。
2020122182.tif 000023
【０１４１】
製法２：
側鎖に水酸基を有する、アミノ基が保護されたアミノ酸と２―ブロモ―Ｎ―メチルアセトアミドのようなαハロカルボニル化合物あるいはブロモアセトニトリルとのアルキル化反応を行った後、適切な官能基変換により下記スキームに示す製造を実施することができる。下記一般式中、Ｐ１としてはＣｂｚ基、Ｂｏｃ基、Ｔｒｔ基などの塩基性条件下で安定な保護基が好ましい。αハロカルボニル化合物としては、ＲａがＮＭｅやＮｔＢｕなどであるものが好ましく例示される。Ｘ１はハロゲンであり、ブロモ基が好ましい。アルキル化反応において用いられる塩基はＮａＨ、ＮａＯｔＢｕ、ＮａＯｔ−Ｐｅｎｔなどが例示され、側鎖に水酸基を有する、アミノ基が保護されたアミノ酸に対し、２当量以上用いることで選択的に該アミノ酸の水酸基部位をアルキル化することができる。用いる溶媒としてはＤＭＦ、ＤＭＩなどが好ましく例示される。ブロモアセトニトリルを用いたアルキル化の後、得られたニトリル基を元にヘテロ環を構築することでアミノ酸基本骨格を構築できる。下記スキームには生じたニトリル基にヒドロキシルアミンを作用させた後、ＣＤＩで環化したオキサジアゾロン環を構築したものを例示している。アミノ酸の基本骨格を構築した後は保護基の適切な変換を行うことで所望のアミノ酸（Ｐ３がＣｂｚ基、Ｆｍｏｃ基、Ｂｏｃ基、Ａｌｌｏｃ基、ノシル基（Ｎｓ基）などで保護されたアミノ酸あるいはＰ３が水素である無保護のアミノ酸）に変換できる。
2020122182.tif 000024
【０１４２】
製法３：
フェニルアラニン誘導体はJackson-Negishi coupling (Journal of Organic Chemistry, 2010, 75, 245)に記載の方法や、相関移動触媒を用いたグリシンｔｅｒｔ−ブチルエステルのベンゾフェノンイミンの不斉ベンジル化（J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 6519）などを用いて製造することができる。また、下記一般式に示すようなＮ−ヒドロキシフタルイミドエステル(NHPIエステル)と芳香族ヨウ素化合物あるいは芳香族ブロモ化合物を原料に用いた脱炭酸をともなうクロスカップリング反応を行うことでも製造することができる。下記一般式中、ｎは炭素原子の数を表しており、特に限定はされないが、ｎ＝１、もしくは２が好ましい。Ｐ１としてはクロスカップリング条件下で安定な基が用いられ、好ましくはＦｍｏｃ基が例示される。Ｒ４−Ｘ１は芳香族ハロゲン化合物であり、Ｒ４が芳香族部位を表している。Ｒ４にクロスカップリング反応条件下で変換されうる官能基が含まれる場合、クロスカップリング反応条件下において安定な保護基で保護することが好ましい。例えばＲ４に水酸基が含まれる場合、水酸基をテトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）基などで保護することが好ましい。Ｘ１はハロゲンであり、好ましくはブロモ（Ｂｒ）基、ヨード（Ｉ）基が例示される。クロスカップリング反応に用いる触媒としてはニッケルと亜鉛を触媒として用いるのが好ましく、触媒の配位子としては４，４’−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２，２’−ビピリジル（ｄｔｂｂｐｙ）を用いるのが好ましい。溶媒としてはジメチルアセトアミドを用いるのが好ましい。脱炭酸をともなうクロスカップリング反応によりアミノ酸の基本骨格を構築した後は保護基の適切な変換を行うことで所望のアミノ酸（Ｐ３がＣｂｚ基、Ｆｍｏｃ基、Ｂｏｃ基、Ａｌｌｏｃ基、ノシル基（Ｎｓ基）などで保護されたアミノ酸あるいはＰ３が水素である無保護のアミノ酸）に変換できる。
2020122182.tif 000025
下記のように側鎖部位がアミノ酸のＮ原子上にあるアミノ酸においても同様の反応にて製造することができる。
2020122182.tif 000026
【０１４３】
製法４：
アーント・アイシュタート（Arndt-Eistert）合成（人名反応に学ぶ有機合成戦略 、p18）を用いることで対応するβ―アミノ酸を製造することができる。
2020122182.tif 000027
【０１４４】
製法５：
β―アミノ酸は、対応する官能基を有するエポキシドに対しアンモニアを用いた開環反応を行い、得られる化合物のアミン部位に保護基を導入し、次いで生じる２級アルコールを脱離基に変換した後、求核置換反応による立体反転を伴ったニトリル基への変換を行い、これに続くカルボン酸への変換を行うことで製造できる。下記一般式中、Ｒに反応に関与する官能基が含まれる場合、適切な保護基で保護することが好ましく、例えばＲに水酸基が含まれる場合、該水酸基をＴｒｔ基で保護することが好ましい。開環反応後に得られるアミノ基の保護基であるＰ１としてはＣｂｚ基、Ｂｏｃ基、Ａｌｌｏｃ基などが好ましく例示される。生じた２級アルコールは脱離基Ｘ２へと変換され（Ｘ２としては好ましくはメシル基（ＯＭｓ基）などが例示される）。得られた脱離基をシアノヒドリン（ＣＮ−）による求核置換反応により立体反転を伴いながらニトリル基へと誘導し、カルボン酸へと変換することでアミノ酸の基本骨格を構築できる。ニトリル基からカルボン酸への変換は例えば酸性条件下における加水分解が例示される。アミノ酸の基本骨格を構築した後は保護基の適切な架けかえを行うことで所望のアミノ酸（Ｐ３がＣｂｚ基、Ｆｍｏｃ基、Ｂｏｃ基、Ａｌｌｏｃ基、ノシル基（Ｎｓ基）などで保護されたアミノ酸あるいはＰ３が水素である無保護のアミノ酸）に変換できる。
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【０１４５】
製法６
水酸基を有し、かつアミノ基が保護された環状アミノ酸とハロゲン化合物とを、塩基を用いたアルキル化反応に供した後、適切な官能基の変換を行うことにより下記スキームに示すとおりに環状アミノ酸を製造することができる。用いる原料の環状アミノ酸としては４〜８員環のものが好ましく、下記スキームでは５員環のものを例示した。環状部分に存在する水酸基の位置は特に限定されないが、一般式にあるようにアミノ酸のＮ原子から２原子以上離れた位置にあることが好ましい。下記一般式中、Ｐ１としてはＣｂｚ基、Ｂｏｃ基、Ａｌｌｏｃ基、ノシル基（Ｎｓ基）などを用いることが出来る。アルキル化反応に用いる塩基としては水素化ナトリウム（ＮａＨ）が好ましく例示され、溶媒はジメチルホルムアミドが好ましく例示される。アルキル化反応において、ハロゲン化合物（Ｒ−Ｘ）がＲ上に該反応に関与する可能性のある官能基を有する場合、その官能基を塩基性条件下において安定な保護基で保護することが好ましい。例えばＲが水酸基を含む場合はテトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）基、ベンジル（Ｂｎ）基、ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基などのシリルエーテルなどで該水酸基を保護することが好ましい。またＸ１はハロゲンであり、クロロ（Ｃｌ）基、ブロモ（Ｂｒ）基、ヨード（Ｉ）基が例示される。アルキル化反応によりアミノ酸の基本骨格を構築した後は保護基の適切な変換を行うことで所望のアミノ酸（Ｐ３がＣｂｚ基、Ｆｍｏｃ基、Ｂｏｃ基、Ａｌｌｏｃ基、ノシル基（Ｎｓ基）などで保護されたアミノ酸あるいはＰ３が水素である無保護のアミノ酸）に変換できる。
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【０１４６】
製法７
上記のアミノ酸は、下記スキームに沿って、酸性条件下、パラホルムアルデヒドを用いた環化反応を行い、続いて得られた環化体を酸性条件下で開環しながら生じるイミンを還元することで、Ｎ−メチル化を行うことができる。
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【０１４７】
（ペプチド化合物の製造方法）
ペプチド化合物の化学合成方法
本明細書におけるペプチド化合物、または環状ペプチド化合物の化学合成方法としては、液相合成法、Fmoc合成やBoc合成等を用いた固相合成法、及びこれらの組み合わせ等が例示される。Fmoc合成では、主鎖アミノ基がFmoc基により保護され、側鎖官能基が必要に応じてピペリジンやｔ−Ｂｕ基、ＴＨＰ基、Ｔｒｔ基などの塩基性で切断されない保護基で保護され、主鎖カルボン酸を保護しないアミノ酸を基本単位とする。基本単位としては、その他、Fmoc保護されたアミノ基とカルボキシル基を有する組み合わせであれば、特に限定されない。例えばジペプチドを基本単位としてもよい。Ｎ末端に配置させる基本単位は、Fmocアミノ酸以外であってもよい。例えば、Bocアミノ酸であってもよく、アミノ基を有しないカルボン酸類縁体であってもよい。主鎖カルボキシル基あるいは主鎖カルボキシル基が適切な保護基で保護された側鎖にカルボキシル基を有するアミノ酸の側鎖カルボキシル基を固相担体の官能基との化学反応により固相に担持させる。続いてピペリジンやDBUなどの塩基によりFmoc基を脱保護し、新たに生じたアミノ基と続いて添加される基本単位のカルボキシル基を有する保護アミノ酸とを縮合反応させることで、ペプチド結合を生成させる。縮合反応では、カルボキシル基の活性化剤として、DICとHOBtの組み合わせ、DICとHOAtの組み合わせ、HATUとDIPEAとの組み合わせなど様々な組み合わせが可能である。脱Fmoc基とそれに続くペプチド結合生成反応の繰り返しにより、望みのペプチド配列を生成させることができる。望みの配列が得られた後、固相からの切り出しと必要に応じて導入した側鎖官能基の保護基の脱保護が行われる。また、固相からの切り出しを行う前にペプチドの構造変換や環化を行うことも可能である。固相からの切り出しと、脱保護は同一の条件、例えば９０：１０のＴＦＡ／Ｈ２Ｏで行っても良いし、必要に応じて別々の条件で脱保護しても良い。固相からの切り出しは、１％ ＴＦＡなどの弱酸での切り出しが可能なものもあれば、保護基としてＰｄなどを利用して、両者の化学反応の直行性を利用することが可能である。これらの工程の間もしくは最後に、環化などの工程を実施することもできる。例えば、側鎖カルボン酸とＮ末端主鎖のアミノ基とを縮合させることや、側鎖アミノ基とＣ末端主鎖のカルボン酸を縮合させることができる。この際、Ｃ末端側のカルボン酸と環化させる側鎖カルボン酸の間、もしくはＮ末端側の主鎖アミノ基またはヒドロキシ基と環化させる側鎖アミノ基の間で反応直行性が必要であり、前述のとおり保護基の直行性を考慮して保護基の選択が行われる。このようにして得られた反応物を逆相カラムや、分子ふるいカラムなどで精製することができる。これらの詳細は、例えばメルク株式会社が平成14年5月1日に発行した固相合成ハンドブックなどに記載されている。固相合成用樹脂は市販されているものを使うことができ、ＣＴＣ樹脂、Ｗａｎｇ樹脂、またはＳＡＳＲＩＮ樹脂が例示される。
【０１４８】
本明細書に記載の化合物の製造において、定義した基が実施方法の条件下で望まない化学的変換を受けてしまう場合、例えば、官能基の保護、脱保護等の手段を用いることにより、該化合物を製造することができる。ここで保護基の選択および脱着操作は、例えば、「Greene’s,“Protective Groups in Organic Synthesis″（第５版，John Wiley & Sons 2014）」に記載の方法を挙げることができ、これらを反応条件に応じて適宜用いればよい。また、必要に応じて置換基導入等の反応工程の順序を変えることもできる。たとえば、アミノ基の保護基は、Ｆｍｏｃ、Ｂｏｃ、Ｃｂｚ、またはＡｌｌｏｃ基などが例示される。これらカーバメート基は、アミノ基をカーバメート化剤と塩基触媒存在下、反応させることで導入することができる。カーバメート化剤は、例えばＢｏｃ２Ｏ、ＢｏｃＯＰｈ、ＦｍｏｃＯＳｕ、ＦｍｏｃＣｌ、ＣｂｚＣｌ、ＡｌｌｏｃＣｌ等が挙げられる。塩基触媒としては例えば炭酸リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸セシウム、炭酸水素セシウム、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化セシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、Ｎ−メチルモルホリン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン等を挙げることができる。アミノ基の保護基であるカーバメート基は、塩基性条件下、酸性条件下、または加水素分解反応の条件下などで除去することができる。
【０１４９】
ペプチド化合物の翻訳合成方法
本明細書におけるペプチド化合物の翻訳合成方法としては、無細胞翻訳系を用いて合成する方法が例示され、同方法には再構成無細胞翻訳系による合成法が含まれる。排除したい因子を除くことができる点で、再構成無細胞翻訳系を利用するのが好ましい。
【０１５０】
一局面において、本明細書は、本明細書におけるアミノ酸を少なくとも１種、２種以上、又は３種以上含む、本明細書におけるペプチド化合物の翻訳合成方法を提供する。限定はされないが、このような翻訳合成方法は、以下(i)および(ii)を含んでよい：
(i) 本明細書におけるアミノ酸を少なくとも１種、２種以上、又は３種以上結合したtRNAを用意する工程；
(ii) 前記tRNAのアンチコドンに対応するコドンを少なくとも１つ含む核酸を無細胞翻訳系で翻訳し、前記ペプチド化合物を得る工程。
非限定の一態様において、本明細書における翻訳合成方法は、環状ペプチド化合物の翻訳合成方法であってよい。
【０１５１】
無細胞翻訳系
本明細書において「無細胞翻訳系」とは、細胞より抽出したリボソームの他、翻訳に関与する蛋白因子群、ｔＲＮＡ、アミノ酸、ＡＴＰなどのエネルギー源、その再生系を組み合わせたもので、ｍＲＮＡを蛋白質に翻訳することが出来るものであれば限定されない。また、翻訳合成反応が進行している間の系も、本明細書における「無細胞翻訳系」に含まれてよい。本明細書における無細胞翻訳系は、ペプチドを翻訳する際の鋳型となる核酸を含んでいてよく、これら以外にも、開始因子、伸長因子、解離因子、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素などを含むことができる。これらの因子は、種々の細胞の抽出液から精製することによって得ることができる。因子を精製するための細胞は、例えば原核細胞、または真核細胞を挙げることができる。原核細胞としては、大腸菌細胞、高度好熱菌細胞、または枯草菌細胞を挙げることができる。真核細胞としては、酵母細胞、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球、植物細胞、昆虫細胞、または動物細胞を材料にしたものが知られている。またｔＲＮＡやアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ARS）は天然に存在するものに加え、人工ｔＲＮＡや非天然アミノ酸を認識する人工アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を用いることもできる。人工ｔＲＮＡや人工アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を用いることにより部位特異的に非天然アミノ酸を導入したペプチドを合成することができる。なお、必要に応じて、無細胞翻訳系にT7 RNA polymeraseなどのRNAポリメラーゼを加えることで、鋳型DNAから転写させることもできる。
【０１５２】
本明細書において、「無細胞翻訳系がある物質を含む」とは、翻訳合成の開始時に該物質を含んでいなくても、翻訳合成の過程において系内で該物質が合成され含まれることになる態様も含む。例えば、翻訳合成の過程で、アミノ酸がアシル化されたｔＲＮＡが合成される場合には、無細胞翻訳系が該アミノアシルｔＲＮＡを含むと理解される。
【０１５３】
PURESYSTEM（登録商標）(BioComber, Japan)は大腸菌の翻訳に必要な蛋白因子類、エネルギー再生系酵素、リボソームそれぞれを抽出、精製し、tRNA、アミノ酸、ATP、GTPなどと混合した再構成無細胞翻訳系である。不純物の含有量が少ないだけでなく、再構成系であるため排除したい蛋白因子、アミノ酸を含まない系を容易に作製することができる。((i)Nat Biotechnol. 2001;19:751-5. Cell-free translation reconstituted with purified components. Shimizu Y, Inoue A, Tomari Y, Suzuki T, Yokogawa T, Nishikawa K, Ueda T.(ii)Methods Mol Biol. 2010;607:11-21.PURE technology.Shimizu Y, Ueda T.)。
【０１５４】
例えば、非天然アミノ酸を導入するコドンとして終止コドンを利用する方法が多く報告されているが、前述のPURESYSTEMを用いることで天然アミノ酸、ARSを除いた合成系を構築できる。これにより、除外する天然アミノ酸をコードするコドンに、非天然アミノ酸を対応付けることが出来る(J Am Chem Soc. 2005;127:11727-35.Ribosomal synthesis of unnatural peptides. Josephson K, Hartman MC, Szostak JW.)。さらにコドンの縮重を解くことにより天然アミノ酸を除外することなく非天然アミノ酸を加えることが出来る（Kwon I,et al. Breaking the degeneracy of the genetic code. J Am Chem Soc. 2003, 125, 7512-3.）。N-メチルアミノ酸を含むペプチドがPURESYSTEMなどの無細胞翻訳系の活用によりリボソームにて合成できる。
【０１５５】
より具体的には、翻訳合成は、例えば、大腸菌の翻訳に必要な蛋白因子類（メチオニルtRNAトランスフォルミラーゼ、EF-G、RF1、RF2、RF3、RRF、IF1、IF2、IF3、EF-Tu、EF-Ts、ARS（AlaRS、ArgRS、AsnRS、AspRS、CysRS、GlnRS、GluRS、GlyRS、HisRS、IleRS、LeuRS、LysRS、MetRS、PheRS、ProRS、SerRS、ThrRS、TrpRS、TyrRS、ValRSから必要なものを選ぶ））、リボソーム、アミノ酸、クレアチンキナーゼ、ミオキナーゼ、無機ピロフォスファターゼ、ヌクレオシド二リン酸キナーゼ、E. coli 由来tRNA、クレアチンリン酸、グルタミン酸カリウム、HEPES-KOH pH7.6、酢酸マグネシウム、スペルミジン、ジチオスレイトール、GTP、ATP、CTP、UTPなどを適宜取捨選択して混合したPURESYSTEM等の公知の無細胞翻訳系にmRNAを加えることによって行うことが出来る。また、T7 RNA polymeraseを加えておけば、T7プロモーターを含む鋳型DNAからの転写、翻訳を共役して行なうこともできる。また、所望のアミノアシルtRNA群やアミノアシルtRNA合成酵素（ARS）が許容する非天然アミノ酸群（例えばF-Tyr）を系に添加することによって非天然アミノ酸を含むペプチド化合物を翻訳合成することが出来る（Kawakami T, et al. Ribosomal synthesis of polypeptoids and peptoid-peptide hybrids. J Am Chem Soc. 2008, 130, 16861-3., Kawakami T, et al. Diverse backbone-cyclized peptides via codon reprogramming. Nat Chem Biol. 2009, 5, 888-90.）。さらに、天然のARSに代えて又はこれら加えて、ARSの改変体を系に含めるとともに、非天然アミノ酸群を系に含めることによっても、非天然アミノ酸を含むペプチド化合物を翻訳合成することが出来る。あるいは、リボソームやEF-Tuなどの変異体を利用することによって非天然アミノ酸の翻訳導入の効率を高めることも出来る(Dedkova LM, et al. Construction of modified ribosomes for incorporation of D-amino acids into proteins. Biochemistry. 2006, 45, 15541-51., Doi Y, et al. Elongation factor Tu mutants expand amino acid tolerance of protein biosynthesis system. J Am Chem Soc. 2007, 129, 14458-62., Park HS, et al. Expanding the genetic code of Escherichia coli with phosphoserine. Science. 2011, 333, 1151-4.)。
【０１５６】
非限定の一態様において、本明細書にける無細胞翻訳系（「本明細書における翻訳系」ともいう。）は、ペプチド化合物を製造するための翻訳系であってよく、好ましくは環状ペプチド化合物を製造するための翻訳系である。
【０１５７】
非限定の一態様において、本明細書における翻訳系は、５〜３２種類、５〜２８種類、又は５〜２０種類の非天然アミノ酸を含んでいてよく、８〜２０種類、１０〜２０種類、１３〜２０種類が好ましく例示される。一態様において、本明細書における翻訳系に含まれるアミノ酸の種類の数のうち、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上が非天然アミノ酸であってよい。
【０１５８】
非限定の一態様において、本明細書における翻訳系は、５〜２８種類、又は５〜２０種類のＮ置換アミノ酸を含んでいてよく、５〜１８種類、５〜１５種類が好ましく例示される。一態様において、本明細書における翻訳系に含まれるアミノ酸の種類の数のうち、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上がＮ置換アミノ酸であってよい。ここでのＮ置換アミノ酸は、Ｎ−アルキルアミノ酸、又はＮ−メチルアミノ酸を意味してもよいが、その場合であっても、本明細書における翻訳系に他のＮ置換アミノ酸が含まれることを否定するものではない。
【０１５９】
非限定の一態様において、本明細書における翻訳系は、該翻訳系を用いて製造されるペプチド化合物に含まれる芳香環の数の平均が一定の範囲内となるように調整されていてもよい。例えば、翻訳合成されるペプチド化合物において、環状部を構成するアミノ酸の数に占める芳香環を有するアミノ酸の数の割合の平均が４０％以下、３５％以下、３０％以下、２７％以下、２５％以下、若しくは２０％以下になるように、又は、８〜１１個のアミノ酸から構成される環状部を有するペプチド化合物の環状部の側鎖に含まれる芳香環の数の平均が０〜３になるように、本明細書における翻訳系を調整してよい。調整方法は特に限定されないが、例えば、翻訳系に含まれるアミノ酸の種類の数に占める芳香環を有するアミノ酸の種類の数を調整することが挙げられる。
【０１６０】
非限定の一態様において、本明細書における翻訳系は、芳香環を有するアミノ酸を含んでいてよく、翻訳系に含まれるアミノ酸の種類の数に占める芳香環を有するアミノ酸の種類の数の割合は４０％以下が好ましく、３５％以下、３０％以下、２７％以下、２５％以下、２０％以下が好ましく例示される。
【０１６１】
非限定の一態様において、本明細書における無細胞翻訳系は、本明細書におけるアミノ酸を少なくとも１種、２種以上、又は３種以上含む、本明細書におけるペプチド化合物を製造するための無細胞翻訳系であってよい。限定はされないが、このような無細胞翻訳系は、以下(i)および(ii)を含んでよい：
(i) 本明細書におけるアミノ酸を少なくとも１種、２種以上、又は３種以上結合したtRNA；
(ii) 前記ペプチド化合物をコードする核酸、
ここで該核酸は前記tRNAのアンチコドンに対応するコドンを少なくとも１つ含んでよい。
【０１６２】
ｔＲＮＡ
非天然アミノ酸のペプチドへの翻訳導入には、直交性を有し効率よくリボソームに取り込まれるｔＲＮＡ（(i)Biochemistry. 2003;42:9598-608.Adaptation of an orthogonal archaeal leucyl-tRNA and synthetase pair for four-base, amber, and opal suppression. Anderson JC, Schultz PG., (ii)Chem Biol. 2003;10:1077-84.Using a solid-phase ribozyme aminoacylation system to reprogram the genetic code.Murakami H, Kourouklis D, Suga H.）のアミノアシル化が必要である。tRNAをアミノアシル化する方法として以下の５つの方法を用いることができる。
【０１６３】
細胞内ではtRNAのアミノアシル化のための酵素として、アミノ酸別にアミノアシルtRNA合成酵素（ARS）が用意されている。そのため第一の方法としては、ある種のARSがN-Me Hisなど非天然アミノ酸を許容することを利用する方法や、非天然アミノ酸を許容する変異アミノアシルtRNA合成酵素を用意し、これを利用する方法が挙げられる（(i)Proc Natl Acad Sci U S A. 2002;99:9715-20. An engineered Escherichia coli tyrosyl-tRNA synthetase for site-specific incorporation of an unnatural amino acid into proteins in eukaryotic translationand its application in a wheat germ cell-free system.Kiga D, Sakamoto K, Kodama K, Kigawa T, Matsuda T, Yabuki T, Shirouzu M, Harada Y, Nakayama H, Takio K, Hasegawa Y, Endo Y, Hirao I, Yokoyama S.(ii)Science. 2003;301:964-7.An expanded eukaryotic genetic code.Chin JW, Cropp TA, Anderson JC, Mukherji M, Zhang Z, Schultz PG. Chin,JW.(iii) Proc Natl Acad Sci U S A. 2006;103:4356-61.Enzymatic aminoacylation of tRNA with unnatural amino acids.Hartman MC, Josephson K, Szostak JW.）。第二に、試験管内でtRNAをアミノアシル化しその後アミノ酸を化学修飾する方法も用いることができる（J Am Chem Soc. 2008;130:6131-6.Ribosomal synthesis of N-methyl peptides.Subtelny AO, Hartman MC, Szostak JW.）。第三に、tRNAの3'末端のCCA配列からCAを除いたものと別途調製したアミノアシル化したpdCpAとをRNAリガーゼで結合させることでアミノアシルtRNAを得ることが出来る(Biochemistry. 1984;23:1468-73.T4 RNA ligase mediated preparation of novel "chemically misacylated" tRNAPheS.Heckler TG, Chang LH, Zama Y, Naka T, Chorghade MS, Hecht SM.)。種々の非天然アミノ酸の活性エステルをtRNAに担持させるリボザイムであるフレキシザイムによるアミノアシル化もある（J Am Chem Soc. 2002;124:6834-5.Aminoacyl-tRNA synthesis by a resin-immobilized ribozyme.Murakami H, Bonzagni NJ, Suga H.)。第四に、tRNAとアミノ酸活性エステルとをカチオン性ミセル中で超音波混合する方法も用いることができる(Chem Commun (Camb). 2005;(34):4321-3.Simple and quick chemical aminoacylation of tRNA in cationic micellar solution under ultrasonic agitation. Hashimoto N, Ninomiya K, Endo T, Sisido M.)。第五として、tRNAの3'末端付近に相補的なPNAにアミノ酸活性エステルを結合したものをtRNAに加えることによってもアミノアシル化が可能である（J Am Chem Soc. 2004;126:15984-9.In situ chemical aminoacylation with amino acid thioesters linked to a peptide nucleic acid.Ninomiya K, Minohata T, NishimuraM, Sisido M.）。
【０１６４】
より具体的には、以下のような方法を用いてアミノアシルtRNAを作製することができる。所望のtRNA配列をコードし、上流にＴ７、Ｔ３もしくはＳＰ６プロモーターを配置した鋳型ＤＮＡを用意し、T7 RNA polymeraseやT3, SP6 RNA polymeraseなどプロモーターに適応したＲＮＡポリメラーゼを利用して転写によってＲＮＡを合成することが出来る。細胞からｔＲＮＡを抽出精製し、ｔＲＮＡの配列の相補配列のプローブを用いて目的の生成ｔＲＮＡを抽出することも出来る。この際目的のｔＲＮＡの発現ベクターで形質転換した細胞をソースにすることも出来る。化学合成によって目的の配列のＲＮＡを合成することも出来る。例えば、このようにして得られた３'末端のＣＣＡ配列からＣＡを除いたｔＲＮＡと別途調製したアミノアシル化したｐｄＣｐＡまたはｐＣｐＡとをＲＮＡリガーゼで結合させることでアミノアシルｔＲＮＡを得ることが出来る（ｐｄＣｐＡ法、ｐＣｐＡ法）。当該ｔＲＮＡは、ペプチド化合物の製造において有用である。あるいは、全長ｔＲＮＡを用意し、種々の非天然アミノ酸の活性エステルをｔＲＮＡに担持させるリボザイムであるフレキシザイムによるアミノアシル化も可能である。また、限定を意図しないが、天然のＡＲＳ又はその改変体を用いて、アミノアシルｔＲＮＡを作製することもできる。天然ＡＲＳ又はその改変体を用いると、翻訳系内で一旦消費されたアミノアシルｔＲＮＡが、天然ＡＲＳやその改変体によって再生成され得るため、予め作製したアミノアシルｔＲＮＡを翻訳系に大量に存在させる必要がない。このようなＡＲＳ改変体は、WO2016/148044に記載される。これらのアミノアシルtRNAの作製方法を適宜組み合わせることもできる。
【０１６５】
環状部の形成
非限定の一態様において、ペプチド化合物の環状部は、直鎖状のペプチド化合物を環化反応に供することにより形成される。
【０１６６】
本明細書において「環化反応」とは、ペプチド化合物のペプチド部位に環状部を形成させる反応をいう。一態様において、環化反応により環状部が形成されたペプチド化合物を更に化学修飾、又は反応させて得られるペプチド化合物も、本明細書におけるペプチド化合物に含まれる。また、環化反応の前に化学修飾等を行ってもよい。
【０１６７】
スキームＡに、本明細書におけるペプチド化合物のペプチド部位の環化反応の一例を示す。黒丸（●）ユニット（主鎖ユニット）、Ｄユニット（アスパラギン酸ユニット）、三角（▲）ユニット（環化Ｎ末端ユニット）はそれぞれペプチド部位を構成するアミノ酸残基を意味する。白丸は固相合成用樹脂をあらわす。スキームＡにおいては、環状部とは１つの三角ユニットと９つの黒丸ユニット及び１つのＤユニットからなる部位である。それぞれのユニットは同一のアミノ酸であっても、異なるアミノ酸であってもよい。本発明の環状ペプチドは、例えば、国際公開第２０１３／１００１３２号に記載の方法によって製造することができる。
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【０１６８】
本明細書における「ユニット」とは、本明細書における鎖状ペプチド化合物の合成後環化前のアミノ酸、環化後のアミノ酸、環化後の化学修飾が完了した時点でのアミノ酸のいずれかを意味する。環化後の化学修飾が完了した時点でのアミノ酸残基には、例えば、ペプチド化合物の製造後の化学修飾により、化学変換や骨格変換されたアミノ酸残基が含まれる。
【０１６９】
ライブラリ
非限定の一態様において、本開示におけるペプチド化合物、又はこれらをコードする核酸のライブラリは、それぞれ、本明細書に記載のペプチド化合物、又はこれらをコードする核酸から実質的になるライブラリであってよい。
本明細書におけるライブラリには、本明細書におけるペプチド化合物を含むライブラリ、及び本明細書におけるペプチド化合物をコードする核酸を含むライブラリが含まれる。本明細書におけるライブラリには、本明細書におけるペプチド化合物のライブラリ、ペプチド化合物−核酸複合体のライブラリが含まれ、中でも環状ペプチド化合物、又は環状ペプチド−核酸複合体のライブラリが好ましく、特に環状ペプチド−ｍＲＮＡ複合体のライブラリが好ましい。ライブラリとしては、ディスプレイライブラリが好ましい。ディスプレイライブラリとしては、ディスプレイを利用したライブラリが例示され、中でもｍＲＮＡディスプレイライブラリ、ＤＮＡディスプレイライブラリ、リボソームディスプレイライブラリが好ましく、ｍＲＮＡディスプレイライブラリがより好ましい。
【０１７０】
特定の理論に拘束されることを意図しないが、本発明者らは以下のように考える。これまでのペプチドライブラリでは、ペプチドを構成するアミノ酸の側鎖に含まれるプロトンドナーを分子内水素結合形成によりマスクさせることは偶然に頼ってきた。特に、構成アミノ酸をランダムに配置して多様性を持たせるようなペプチドライブラリにおいては、アミノ酸の間で狙い通りに水素結合を形成させることは困難であった。本明細書のアミノ酸を含むペプチド化合物であれば、アミノ酸の側鎖に含まれるプロトンドナー部位に水素結合がすでに形成されているアミノ酸を用いているため、ペプチド化合物の側鎖部位において分子内で水素結合を意図的に形成させることが可能になる。本明細書のアミノ酸を用いて得られるペプチド化合物のライブラリは、分子内で水素結合形成することで側鎖のプロトンドナーをマスクし得るペプチド化合物の出現頻度が高い、すなわち膜透過性の高いペプチド化合物を含む確率が高くなり得る。
【０１７１】
本明細書において、ペプチド化合物は「核酸によりコードされるペプチド化合物」であってよい。本明細書において「核酸によりコードされるペプチド化合物」とは、該核酸を鋳型として翻訳することにより直接合成されるペプチド化合物に限定されず、翻訳後修飾を受けて合成され得るペプチド化合物を含むことがある。例えば、核酸を翻訳することにより直鎖ペプチド化合物が合成され、その後の環化工程により環状ペプチド化合物が合成される場合、該環状ペプチド化合物を、前記核酸によりコードされる環状ペプチド化合物ということがある。また、一態様において、核酸を鋳型として翻訳合成されるペプチド化合物、又はその後に翻訳後修飾を受けたペプチド化合物と該核酸との複合体（ペプチド化合物−核酸複合体）も、核酸によりコードされる（環状）ペプチド化合物に含まれる。
【０１７２】
非限定の一態様において、本明細書におけるライブラリに含まれるペプチド化合物、又はライブラリに含まれる核酸によりコードされるペプチド化合物に含まれる非天然アミノ酸、Ｎ置換アミノ酸、又は芳香環を有するアミノ酸の数の平均は、ＤＮＡライブラリを合成する際に、前記アミノ酸に当てたコドンの出現頻度にて調整することができる。例えば１０のアミノ酸残基可変箇所を含むペプチドのライブラリでは、アミノ酸が２０種類から選択されると仮定した場合、該２０種類のうちＮ置換アミノ酸を１０種類とすることで、Ｎ置換アミノ酸のコドンユニットが可変箇所１箇所当り10/20(５０％)を占めるように合成することができる。このようにして、本明細書における非天然アミノ酸の数、Ｎ置換アミノ酸の数、芳香環の数、又は芳香環を有するアミノ酸の数の割合の平均を算出してもよい。
【０１７３】
本明細書におけるペプチド化合物、及び／又はこれらをコードする核酸のライブラリについて、「〜から実質的になる」とは、該ライブラリに含まれるペプチド化合物、及び／又はこれらをコードする核酸のバリエーションの理論上の総数に対する、そこに挙げられたペプチド化合物、及び／又はこれらをコードする核酸のバリエーションの理論上の数の割合が、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上であってよいが、これらに限定されるものではない。
【０１７４】
本明細書におけるライブラリにおいて、ペプチド化合物の「バリエーションの理論上の（総）数」を求める際、実際にペプチド化合物として製造され得ないものは、理論上の（総）数には算入しない。例えば、以下（１）及び（２）のような場合には、該当するアミノ酸は翻訳合成されないことから、このようなアミノ酸を含むペプチド化合物は、理論上の（総）数に算入しない：（１）ペプチド化合物の材料として翻訳液中にアミノ酸が添加されていても、同アミノ酸をコードする核酸を鋳型として含まない場合；（２）ペプチド化合物の鋳型となる核酸には塩基配列を含むが、これに対応するアミノ酸を含まない翻訳液を使用する場合。また、環状ペプチド化合物を製造する過程での副反応物や未反応物が存在する場合には、これらは前記理論上の（総）数には算入しない。
【０１７５】
例えば、計２０種類の天然アミノ酸を用いて、１種のアミノ酸に対して１組のコドンユニットを対応させたコドン表により、前記コドンユニットがランダムに配置された塩基配列から、１１残基のペプチドを翻訳合成する場合において、翻訳開始アミノ酸がメチオニンに固定されていたとすると、バリエーションの理論上の数は、２０１０となる。
【０１７６】
非限定の一態様において、本明細書におけるライブラリは、ペプチド化合物、及び／又はこれらをコードする核酸に加えて、標的分子に特異的に結合できるペプチド化合物のスクリーニングに必要な他の成分を含んでいてよい。また、本明細書におけるライブラリの効果に負の影響を与えない範囲で他の成分を含んでよい。
【０１７７】
本明細書におけるライブラリには、ペプチド化合物、又はこれらをコードする核酸が複数含まれる。本明細書において、ライブラリに含まれるペプチド化合物のバリエーション（種類）の数のことを「多様性」という。本明細書におけるライブラリに含まれるペプチド化合物、又はこれらをコードする核酸の多様性は特に限定されないが、１０３以上、１０４以上、１０５以上、１０６以上、１０７以上、１０８以上、１０９以上、１０１０以上、１０１１以上、及び１０１２以上が例示される。これら多様性は、実測値に限定されるものではなく、理論値であってよい。
【０１７８】
非限定の一態様において、本明細書におけるライブラリに含まれる、又はライブラリに含まれる核酸によりコードされるペプチド化合物の核酸連結部以外のペプチド部位の分子量の平均、又は環状ペプチド化合物の環状部の分子量の平均は５００〜２０００であってよい。
【０１７９】
ディスプレイライブラリ
ディスプレイライブラリは表現型であるペプチドとその遺伝子型であるペプチドをコードするＲＮＡもしくはＤＮＡが対応付けられているライブラリである。このライブラリを使用して、標的分子に特異的に結合できるペプチド化合物を同定することができる。例えば、所望の固定した標的にライブラリを接触させ、標的に結合しない分子を洗い流すことで、標的に結合するペプチドの濃縮が可能である(パニング法)。このような過程を経て選択されたペプチドに対応付けられている遺伝子情報を解析することで標的に結合したペプチドの配列を明らかにすることができる。例えば、アミノアシルｔＲＮＡのアナログである抗生物質ピューロマイシンがリボソームによるｍＲＮＡ翻訳伸長中の蛋白質に非特異的に連結されることを利用する方法がmRNAディスプレイ(Proc Natl Acad Sci USA. 1997;94:12297-302. RNA-peptide fusions for the in vitro selection of peptides and proteins. Roberts RW, Szostak JW.)ないしはin vitro virus(FEBS Lett. 1997;414:405-8. In vitro virus: bonding of mRNA bearing puromycin at the 3'-terminal end to the C-terminal end of its encoded protein on the ribosome in vitro. Nemoto N, Miyamoto-Sato E, Husimi Y, Yanagawa H.)として報告されている。
【０１８０】
Ｔ７プロモーターなどのプロモーターを含むＤＮＡライブラリから転写にて得たｍＲＮＡのライブラリの３'端にピューロマイシンなどのスペーサーを結合しておき、無細胞翻訳系でｍＲＮＡをタンパク質に翻訳させるとピューロマイシンがリボソームによってアミノ酸と間違ってタンパク質に取り込まれ、ｍＲＮＡとこれにコードされる蛋白質が連結され、ｍＲＮＡとその産物が対応付けられたライブラリになる。この過程では大腸菌などの形質転換を含まないため高い効率が実現され、大規模なディスプレイライブラリを構築することが出来る。パニングで濃縮、選択された分子についている遺伝子情報を含むタグであるｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲ増幅し、塩基配列を解析することで結合した蛋白の配列を明らかにすることが出来る。
【０１８１】
無細胞翻訳系を利用したディスプレイライブラリには、mRNAディスプレイの他に、ペプチドとピューロマイシンの複合体が結合しているペプチドをコードするｃＤＮＡからなるライブラリであるcDNAディスプレイ(Nucleic Acids Res. 2009;37(16):e108.cDNA display: a novel screening method for functional disulfide-rich peptides by solid-phase synthesis and stabilization ofmRNA-protein fusions.Yamaguchi J, Naimuddin M, Biyani M, Sasaki T, Machida M, Kubo T, Funatsu T, Husimi Y, Nemoto N.)、ｍＲＮＡ翻訳中にリボソームと翻訳産物が比較的安定な複合体であることを利用したリボソームディスプレイ(Proc Natl Acad Sci U S A. 1994;91:9022-6. An in vitro polysome display system for identifying ligands from very large peptide libraries. Mattheakis LC, Bhatt RR, Dower WJ.)、bacteriophage endonuclease P2AがDNAと共有結合を形成することを利用したcovalent display(Nucleic AcidsRes. 2005;33:e10.Covalent antibody display--an in vitro antibody-DNA library selection system.Reiersen H, Lobersli I, Loset GA, Hvattum E, Simonsen B, Stacy JE, McGregor D, Fitzgerald K, Welschof M, Brekke OH, Marvik OJ.)、微生物のプラスミドの複製開始蛋白RepAが複製開始点oriに結合することを利用したCIS display(Proc Natl Acad Sci U S A. 2004;101:2806-10. CIS display: In vitro selection of peptides from librariesof protein-DNA complexes. Odegrip R, Coomber D, Eldridge B, HedererR, Kuhlman PA, Ullman C, FitzGerald K, McGregor D.)が知られている。また、DNAライブラリを構成するDNAの1分子毎に転写翻訳系をwater-in-oilエマルジョンやリポソームに封入し、翻訳反応を行うin vitro compartmentalization(Nat Biotechnol. 1998;16:652-6. Man-made cell-like compartments for molecular evolution. Tawfik DS, Griffiths AD.)も知られている。適宜、公知の方法を用いて上記方法を使用することができる。
【０１８２】
核酸ライブラリ
本発明における「核酸」には、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）あるいは、人工塩基を有するヌクレオチド誘導体を含むこともできる。また、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含むこともできる。本発明の核酸は、目的とする遺伝情報が保持される限り、これらの核酸のいずれか、あるいは混成とすることもできる。すなわち、ＤＮＡ−ＲＮＡのハイブリッドヌクレオチドやＤＮＡとＲＮＡのような異なる核酸が一本鎖に連結されたキメラ核酸も本発明における核酸に含まれる。
【０１８３】
ペプチド化合物ライブラリに含まれるペプチド化合物の鋳型となる核酸のライブラリとしては、mRNAライブラリ、DNAライブラリ等が例示される。ペプチド配列上でアミノ酸残基を固定しない箇所は塩基を混ぜて合成することによって、核酸ライブラリを得ることができる。例えば、DNAライブラリとしては、A、T、G、C、RNAライブラリとしては、A、U、G、Cのそれぞれ4塩基の混合(N)の３の倍数個の繰り返し、もしくはコドンの一文字目二文字目はN、三文字目はW、M、K、Sなどの2塩基の混合として合成する、さらに導入するアミノ酸の種類を16以下に抑えるのであれば、三文字目を1種類の塩基にする方法もある。また、コドンの3文字に相当するコドンユニットを用意し、これを任意の割合で混合して合成に用いることによってアミノ酸残基の出現頻度を自由に調整できる。
【０１８４】
無細胞翻訳系を用いてこれら核酸ライブラリを翻訳することができる。無細胞翻訳系を使用する場合、目的の核酸の下流にスペーサーをコードする配列を含むことが好ましい。スペーサー配列としては、グリシンやセリンを含む配列が挙げられるがこれに限定しない。またピューロマイシン、その誘導体などリボソームによる翻訳時にペプチドに取り込まれる化合物と核酸ライブラリの間には、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ヘキサエチレングリコール（ｓｐｃ１８）のポリマー（例えば５つのポリマー）などで形成されるリンカーを含むことが好ましい。
【０１８５】
ライブラリの製造方法
非限定の一態様において、本開示におけるライブラリの製造は、上述した本開示におけるペプチド化合物の製造方法に準じて行うことができ、適宜公知の方法と組み合わせることができる。一態様において、上述した本開示における無細胞翻訳系を使用して本開示におけるペプチド化合物のライブラリを製造できる。すなわち、本開示におけるライブラリの製造方法には、本開示における無細胞翻訳系を使用してペプチド化合物を合成する工程を含んでよい。一態様において、本開示における無細胞翻訳系において記述した、例示、好ましい範囲、態様が、本開示におけるライブラリの製造方法においてもそのまま適用できる。
【０１８６】
ｍＲＮＡディスプレイライブラリは、非限定の一態様において、以下のように製造することができる。まずＴ７プロモーターなどのプロモーターの下流に所望の配列を配置したＤＮＡのライブラリを化学合成し、これを鋳型にプライマー伸長反応にて二本鎖ＤＮＡにする。これを鋳型にT7 RNApolymeraseなどのRNAポリメラーゼを用いてｍＲＮＡに転写する。このＲＮＡの３'末端にアミノアシルｔＲＮＡのアナログである抗生物質ピューロマイシンなどがつながったリンカー（スペーサー）を結合させる。これを上記のPURESYSTEMなど公知の無細胞翻訳系に加え、保温することによってｍＲＮＡが翻訳され、ｍＲＮＡとこれにコードされるペプチドがピューロマイシンなどを含むリンカーを介して連結される。このようにしてｍＲＮＡとその産物が対応付けられたｍＲＮＡとその産物の複合体からなるディスプレイライブラリを構築することが出来る。リンカーはさらに、当業者に周知のスペーサーを含むことができる。また、必要に応じて、上述の方法や公知の方法により、環化等の翻訳後修飾を行うことができる。
【０１８７】
非限定の一態様において、本開示におけるライブラリは、本明細書に記載されたアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１種、２種以上、又は３種以上のアミノ酸を含むペプチド化合物を含むペプチド化合物ライブラリであってよい。このようなライブラリの製造方法としては、以下(i)および(ii)を含む無細胞翻訳系でペプチド化合物を翻訳合成する工程を含んでよい：
(i) 本明細書に記載されたアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１種、２種以上、又は３種以上のアミノ酸が結合したtRNA；
(ii) 前記ペプチド化合物ライブラリをコードする核酸ライブラリ、
ここで該核酸ライブラリには前記tRNAのアンチコドンに対応するコドンを少なくとも１つ含む核酸が含まれてよい。
【０１８８】
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０１８９】
本発明は、以下の実施例によってさらに例示されるが、下記の実施例に限定されるものではない。【０１９０】
実施例中では以下の略号表に記載の略号を使用した。
【表１】
2020122182.tif 000032
2020122182.tif 000033
【０１９１】
ペプチド合成及び、固相合成に用いる反応溶媒はペプチド合成用（渡辺化学、和光純薬から購入）を用いた。例えばＤＣＭ、ＤＭＦ、ＮＭＰ、２％  ＤＢＵ  ｉｎ  ＤＭＦ、２０％  ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ  ｉｎ  ＤＭＦなどである。また、水を溶媒として加えない反応では、脱水溶媒、超脱水溶媒、無水溶媒（関東化学、和光純薬などから購入）を用いた。
ＬＣ／ＭＳの分析条件は、下記のとおりである。【０１９２】
【表２】
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【０１９３】
実施例１  ペプチド化合物の化学合成
ＷＯ２０１３／１００１３２に記載のＦｍｏｃ法によるペプチド合成法に従い、下記の基本ルートでペプチドの伸長を行った。すなわち、１）Ａｓｐ側鎖のカルボン酸を２−クロロトリチルレジンに担持させたものの、ＡｓｐのＮ末からのＦｍｏｃ法によるペプチド伸長反応、２）２−クロロトリチルレジンからのペプチドの切り出し過程、３）切り出し過程によって２−クロロトリチルレジンから外れて生じたＡｓｐ側鎖のカルボン酸と、ペプチド鎖Ｎ末端（三角ユニット）のアミノ基との縮合によるアミド環化、４）ペプチド鎖に含む側鎖官能基の保護基の脱保護、５）ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅＨＰＬＣによる化合物の精製、の５段階の工程である。また、側鎖に酸性官能基を有するアミノ酸を含むペプチド化合物においては、脱保護剤の残留に起因するペプチドの過剰伸長を抑えるため、ペプチド伸長反応時のレジン洗浄に０．０８  Ｍトリエチルアミン塩酸塩のジクロロメタン溶液を用いることもできる。本実施例において、特に記述がない限り、この基本ルートをもとにペプチド化合物の合成をおこなった。
2020122182.tif 000038
【０１９４】
１−１．ペプチド合成機によるペプチド合成に用いるＦｍｏｃ−アミノ酸
本明細書内に記載するペプチド合成において、ペプチド合成機による合成には、以下のＦｍｏｃ−アミノ酸を用いた。側鎖に反応性の官能基を有するアミノ酸の場合、適切な保護基で保護されているものを用いた。なおアミノ酸の略語は下記表３に記載した。
Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ＭｅＬｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ＭｅＰｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ＭｅＧｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ｇＭｅＡｂｕ−ＯＨ（Ｆｍｏｃ−ｇ−ＭｅＡｂｕ−ＯＨと記載する場合もある）、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ＭｅＶａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｂｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ―ＭｅＡｂｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ＭｅＩｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（Ｃｌｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（４−ＣＦ３）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｈｐｈ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ｂ−ＭｅＡｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−ＭｅＡｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ｛＃（ＣＨ２）２｝−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ（Ｔｈｚ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｎ）−ＯＨなどは渡辺化学もしくはＣｈｅｍｐｅｐ社もしくはＣｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ社もしくはＢａｃｈｅｍ社から購入した。またＦｍｏｃ−ｎＰｒＧｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ＭｅＰｈｅ（３−Ｃｌ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｌａ（４−Ｔｈｚ）−ＯＨなどはＷＯ２０１３／１００１３２に記載の方法にて合成した。また、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ＴＨＰ）−ＯＨ（化合物ａａ０１）、Ｆｍｏｃ−ｎＢｕＧｌｙ−ＯＨ（化合物ａａ０２）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｉＰｅｎ）−ＯＨ（化合物ａａ０４）、Ｆｍｏｃ−ＭｅＨｐｈ−ＯＨ（化合物ａａ０５）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（３−Ｆ−５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ＯＨ（化合物ａａ１２）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−３−Ｃｌ）−ＯＨ（化合物ａａ１６）、Ｆｍｏｃ−Ｎｌｅ（６−ＯＴＨＰ）−ＯＨ（化合物ａａ１７）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＥｔＯＴＨＰ）−ＯＨ（化合物ａａ２２）、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（ＥｔＯＴＨＰ）−ＯＨ（化合物ａａ２７）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＨ（化合物ａａ３４）、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＨ（化合物ａａ３９）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＨ（化合物ａａ４６）、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＨ（化合物ａａ５１）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕＯＴＨＰ）−ＯＨ（化合物ａａ５４）、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（ｔＢｕＯＴＨＰ）−ＯＨ（化合物ａａ５５）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ−２−ＢｕＯＴＨＰ）−ＯＨ（化合物ａａ６２）、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（２−Ｍｅ−２−ＢｕＯＴＨＰ）−ＯＨ（化合物ａａ６４）、Ｆｍｏｃ−Ｈｎｌ（７−Ｆ３−６−ＯＨ）−ＯＨ（化合物ａａ６８）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＨ）−ＯＨ（化合物ａａ７０）、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＨ）−ＯＨ（化合物ａａ７１）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＴＨＰ）−ＯＨ（化合物ａａ７２）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｍｅ）−ＯＨ（化合物ａａ７５）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＮｔＢｕ−Ａｃａ）−ＯＨ（化合物ａａ７８）、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（ＮｔＢｕ−Ａｃａ）−ＯＨ（化合物ａａ７９）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＮＭｅ−Ａｃａ）−ＯＨ（化合物ａａ８１）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｎＰｒＯＴＨＰ）−ＯＨ（化合物ａａ８５）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＨ（化合物ａａ８９）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＢｕＯＴＨＰ）−ＯＨ（化合物ａａ９５）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＢｕＯＴＨＰ）−ＯＨ（化合物ａａ１０１）、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（４−ＯＣｌｔ−３−ＯＭｅ）−ＯＨ（化合物ａａ１０４）、Ｔｙｒ（３−ＯＭｅ）の側鎖フェノール部位がクロロトリチル基で保護されたもの）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（３−Ｍｅ−５−Ｏｘｏ−Ｏｄｚ）−ＯＨ（化合物ａａ１０９）、Ｆｍｏｃ−ｂＡｌａ（３Ｒ−ＭｅＯＥｔＯＴＨＰ）−ＯＨ（化合物ａａ１１１）、Ｆｍｏｃ−ｂＡｌａ（２Ｓ−ＭｅＯＥｔＯＴＨＰ）−ＯＨ（化合物ａａ１１７）、Ｆｍｏｃ−Ｎｖａ（２Ｒ−４−Ｆ２−Ｐｙｒｒｏ（Ｎ−Ａｌｌｏｃ））−ＯＨ（化合物ａａ１２１）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｓ−４−Ｆ２−Ｐｙｒｒｏ（Ｎ−Ａｌｌｏｃ）−Ｍｅ）−ＯＨ（化合物ａａ１２６）、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＭｅ）−ＯＨ（化合物ａａ１２７）、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（４−ＯＭｅ−３−ＣＯＮＭｅ）−ＯＨ（化合物ａａ１２８）、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＨＭｓ）−ＯＨ（化合物ａａ１２９）、Ｆｍｏｃ−Ｈｙｐ（２−ＥｔＯＴＨＰ）−ＯＨ（化合物ａａ１３３）、Ｆｍｏｃ−（Ｐｈ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＭｅ）Ｅｔ）Ｇｌｙ−ＯＨ（化合物１３４）、Ｆｍｏｃ−Ｈｐｈ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＭｅ）−ＯＨ（化合物ａａ１３５）、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｈｐｈ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＭｅ）−ＯＨ（化合物ａａ１３６）、Ｆｍｏｃ−ＭｅＨｐｈ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＭｅ）−ＯＨ（化合物ａａ１３７）、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（４−ＣＯＮＭｅＯＴＨＰ）−ＯＨ（化合物ａａ１３９）、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＨＯＴＨＰ）−ＯＨ（化合物ａａ１４０）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｓ−（Ａｌｌｏｃ）Ｍｏｒ−３−Ｍｅ）−ＯＨ（化合物ａａ１４１）などは以下のとおり合成した。
側鎖に３級アルコールを有するアミノ酸（例えば、Ｓｅｒ（ｔＢｕＯＨ）、ＭｅＳｅｒ（ｔＢｕＯＨ）、Ｓｅｒ（２−Ｍｅ−２−ＢｕＯＨ）、ＭｅＳｅｒ（２−Ｍｅ−２−ＢｕＯＨ）など）を含む配列に関しては、側鎖の３級アルコール部位をＴＨＰで保護しないＦｍｏｃアミノ酸を用いても問題無くペプチドは伸長した（例えば、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕＯＨ）−ＯＨ（化合物ａａ５３）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ−２−ＢｕＯＨ）−ＯＨ（化合物ａａ６１）などを用いた）。
側鎖に２級アルコールであり、かつアルコールが結合している炭素にＣＦ３基が結合している構造を持つアミノ酸（例えば、Ｈｎｌ（７−Ｆ３−６−ＯＨ）、Ｓｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＨ）など）を含む配列に関しては、側鎖の２級アルコール部位をＴＨＰで保護しないＦｍｏｃアミノ酸を用いても問題無くペプチドは伸長した（例えば、Ｆｍｏｃ−Ｈｎｌ（７−Ｆ３−６−ＯＨ）−ＯＨ（化合物ａａ６８）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＨ）−ＯＨ（化合物ａａ７０）などを用いた）。【０１９５】
【表３】
2020122182.tif 000039
2020122182.tif 000040
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【０１９６】
１−２．ペプチド合成機によるペプチド合成に用いるアミノ酸合成
（２Ｓ，３Ｒ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ブタン酸（化合物ａａ０１、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ＴＨＰ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000058
（２Ｓ，３Ｒ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−ヒドロキシブタン酸一水和物（Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ−ＯＨの一水和物、東京化成より購入、５．０  ｇ、１３．９  ｍｍｏｌ）とｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（ＰＰＴＳ）（０．１７５  ｇ、０．７０  ｍｍｏｌ）の混合物にトルエン（５０  ｍＬ）を加えて、減圧下トルエンを留去することで共沸により含まれている水分を除去した。得られた残渣に超脱水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（２８  ｍＬ）と３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（８．８  ｍＬ、９７  ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下、５０度にて４時間攪拌した。ＬＣＭＳ（ＳＱＤＦＡ０５）にて原料の消失を確認後、混合物を２５度まで冷却し、酢酸エチル（３０  ｍＬ）を加えた。続いて飽和塩化ナトリウム水溶液（３０  ｍＬ）を加えて有機層を洗浄し、水層を酢酸エチル（３０  ｍＬ）で抽出した。得られた全ての有機層を混合し、これをさらに飽和塩化ナトリウム水溶液（３０  ｍＬ）にて２度洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムにて乾燥し、溶媒を減圧下留去し、粗生成物（９．３  ｇ）を得た。
得られた粗生成物のうち、４．６５  ｇをテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（３０  ｍＬ）に溶解させ、次いでｐＨ８．０に調製した１．０Ｍリン酸緩衝液（３０  ｍＬ）を加えた。この混合物を５０度で４時間攪拌した。２５度まで冷却した後、酢酸エチル（３０  ｍＬ）を加え、有機層と水層を分離した。水層に酢酸エチル（３０  ｍＬ）を加えて抽出を行った後、得られた全ての有機層を混合し、飽和塩化ナトリウム水溶液（３０  ｍＬ）で２度洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプにて減圧下、２５度で３０分乾燥させた。
得られた残渣をジエチルエーテル（５０  ｍＬ）に溶解させ、次いでヘプタン（５０  ｍＬ）を加えた。制御した減圧下（〜１００  ｈＰａ）、ジエチルエーテルのみを留去し、得られた混合物をろ過して固体を得た。このヘプタンでの洗浄操作を２度繰り返した。得られた固体をポンプにて減圧下、２５度で２時間乾燥させ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ＴＨＰ）−ＯＨのナトリウム塩（２．８０  ｇ、６．２６  ｍｍｏｌ）を得た。
得られた全量のＦｍｏｃ−Ｔｈｒ（ＴＨＰ）−ＯＨのナトリウム塩に酢酸エチル（５０  ｍＬ）とｐＨ２．１の０．０５Ｍリン酸水溶液（１４０  ｍＬ）を加えて、２５度にて５分間攪拌した後、有機層と水層を分離した。水層に酢酸エチル（５０  ｍＬ）を加えて抽出した後、得られた全ての有機層を混合し、飽和塩化ナトリウム水溶液（５０  ｍＬ）にて２度洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムにて乾燥させ、減圧下溶媒を留去した。残渣をポンプにて減圧下、２５度で２時間乾燥させた後、得られた固体をｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）（５０  ｍＬ）に溶解させ、溶媒を減圧下留去した。さらにポンプにて減圧下、２５度で１時間乾燥させることで、（２Ｓ，３Ｒ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ブタン酸（化合物ａａ０１、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ＴＨＰ）−ＯＨ、２．７０  ｇ、３０  ｍｏｌ％のｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）が残留）をＴＨＰ保護上の不斉炭素に由来するジアステレオマーとして得た。得られたＦｍｏｃ−Ｔｈｒ（ＴＨＰ）−ＯＨは−２５度の冷凍庫にて保存した。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝４２４．２（Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．８４分、０．８５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０１９７】
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−ブチルグリシン（化合物ａａ０２、Ｆｍｏｃ−ｎＢｕＧｌｙ−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000059
水素化ナトリウム（２６  ｇ、１．０８  ｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液（５００  ｍＬ）にｔｅｒｔ−ブチル（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）グリシナート（Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＯｔＢｕ）（１００  ｇ、４３２．３６  ｍｍｏｌ）を少しずつ室温で加え、３０分撹拌した後、１−ヨードブタン（２３９  ｇ、１．３０  ｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液（５０  ｍＬ）を滴下しながら加えた。反応液を１６時間室温にて撹拌したのち、水を加えた。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を減圧下除去した後、酢酸エチルを用いて３回抽出し、得られた有機溶媒を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）で精製し、ｔｅｒｔ−ブチルＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ−ブチルグリシナート（Ｂｏｃ−ｎＢｕＧｌｙ−ＯｔＢｕ）（１３０  ｇ）を定量的に得た。
上述の方法で得たｔｅｒｔ−ブチルＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ−ブチルグリシナート（Ｂｏｃ−ｎＢｕＧｌｙ−ＯｔＢｕ）（２６０  ｇ、９０４．６８  ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン溶液（１０００  ｍＬ）に濃塩酸（１０００  ｍＬ）を０度にて滴下しながら加えた。反応液を室温に昇温した後、１６時間室温にて撹拌した。反応液を濃縮することでブチルグリシン（Ｈ−ｎＢｕＧｌｙ−ＯＨ）（２００  ｇ）の塩酸塩を粗生成物として得た。
粗生成物であるブチルグリシン（Ｈ−ｎＢｕＧｌｙ−ＯＨ）（６０  ｇ）、炭酸カリウム（１８８．９  ｇ、１．３７  ｍｏｌ）、水／１，４−ジオキサン（１：１）（３０００  ｍＬ）の混合物を室温にて３０分間撹拌した後、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（１８３．２  ｇ、５４３．０９  ｍｍｏｌ）を少しずつ室温にて加えた。反応液を室温にて１６時間撹拌した後、エーテルで３回洗浄した。得られた水層がｐＨ＝３になるまで５Ｍ塩酸水溶液を加えた後、酢酸エチルで３回抽出した。有機溶媒を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去した。得られた粗生成物をエーテルで洗浄することで、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−ブチルグリシン（化合物ａａ０２、Ｆｍｏｃ−ｎＢｕＧｌｙ−ＯＨ）（１２１  ｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ＝  ３５４  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０１９８】
Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｉＰｅｎ）−ＯＨ（化合物ａａ０４）の合成は、以下のスキームに従って行った。
2020122182.tif 000060
【０１９９】
Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｏ−（３−メチルブタ−２−エン−１−イル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ０３）の合成
2020122182.tif 000061
（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−セリン（Ｂｏｃ−Ｓｅｒ−ＯＨ）（５０  ｇ、２３４．６５  ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（２５０  ｍＬ）に溶解し、氷冷下（０度）で水素化ナトリウム（２２  ｇ、９１６．６７  ｍｍｏｌ、６０％オイルディスパージョン）を加えた。氷冷下で３０分撹拌した後、１−ブロモ−３−メチルブタ−２−エン（４４  ｇ、２９５．２４  ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。添加後、反応液を２５度で１６時間撹拌した後、氷水を加えて反応をクエンチし、塩酸水溶液（５Ｍ）を加えてｐＨを２から３に調節した。その後、酢酸エチルで２回抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。ろ過後、減圧濃縮により酢酸エチルを除去し、目的物を含む粗生成物を得た。この粗生成物を順相カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル＝１００／０→８０／２０）で精製し、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｏ−（３−メチルブタ−２−エン−１−イル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ０３）（３２  ｇ、４８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ２９６  （Ｍ＋Ｎａ）＋
保持時間：１．３９分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ７）【０２００】
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−イソペンチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ０４、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｉＰｅｎ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000062
Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｏ−（３−メチルブタ−２−エン−１−イル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ０３）（１８５  ｇ、６７６．８５  ｍｍｏｌ）、アンモニアのメタノール溶液（２Ｍ、５５５  ｍＬ）、Ｐｄ／Ｃ（１８．５  ｇ）およびメタノール（１５００  ｍＬ）を混合し、水素雰囲気下（５  ａｔｍ）、室温で１６時間撹拌した。固体を濾過により除去した後、減圧濃縮により溶媒を除去することでＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｏ−イソペンチル−Ｌ−セリン（Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（ｉＰｅｎ）−ＯＨ）（１８３  ｇ）を得た。
得られたＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｏ−イソペンチル−Ｌ−セリン（Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（ｉＰｅｎ）−ＯＨ）（１７５  ｇ）を１，４−ジオキサン（５００  ｍＬ）に溶解し、濃塩酸（３００  ｍＬ）を加えた後、室温で１６時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、得られた粗生成物（１２２  ｇ）を１，４−ジオキサン／水（１０００  ｍＬ／１０００  ｍＬ）に溶解し、炭酸カリウム（２３９  ｇ、１．７３  ｍｏｌ）およびＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（２３４  ｇ、６９４．３６  ｍｍｏｌ）を加えて室温で１６時間撹拌した。その後、反応液をヘキサンで３回洗浄した。洗浄後、塩酸水溶液（６Ｍ）を加えて水層のｐＨを２から３に調節し、酢酸エチルで２回抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後に減圧濃縮して溶媒を除去した。得られた粗生成物をエーテル、ヘキサン、酢酸エチルで洗浄し、さらに逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル＝１００／０→３０／７０）で精製してＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−イソペンチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ０４、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｉＰｅｎ）−ＯＨ）（９５  ｇ、４１％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ３９８  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：２．２９分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ１８）【０２０１】
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−フェニルブタン酸（化合物ａａ０５、Ｆｍｏｃ−ＭｅＨｐｈ−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000063
窒素雰囲気下、市販の（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−フェニルブタン酸（１００  ｇ、２４４．１１  ｍｍｏｌ）のトルエン溶液（１．５Ｌ）にトシル酸（ＴｓＯＨ）（２．５７５  ｇ、１４．９５  ｍｍｏｌ）、パラホルムアルデヒト（１５．９６  ｇ、４８８．７７  ｍｍｏｌ）を室温にて加え、１１０℃で１６時間撹拌した。有機層に水を加え、水で３回洗浄した後、得られた有機層と得られた水層を酢酸エチルで抽出した有機層をあわせて無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、ろ過、減圧濃縮し、１００  ｇの（Ｓ）−５−オキソ−４−フェネチルオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチルを粗生成物として得た。
上記のように得られた（Ｓ）−５−オキソ−４−フェネチルオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）（５０  ｇ、１１８．５１  ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（７００  ｍＬ）にトリエチルシラン（Ｅｔ３ＳｉＨ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（７００  ｍＬ）を加え、２５℃で１６時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、得られた残渣に炭酸カリウム水溶液を加え、石油エーテルで洗浄した。得られた水層を濃塩酸を用いてｐＨ＝３になるように調整し、酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、ろ過、減圧濃縮し、得られた残渣にメタノール、ヘキサンを加え再び減圧濃縮し、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−フェニルブタン酸（化合物ａａ０５、Ｆｍｏｃ−ＭｅＨｐｈ−ＯＨ）（２９．５  ｇ、５８％、２工程）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝４１６（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．９５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２０２】
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（５−フルオロピリジン−３−イル）メチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１２、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（３−Ｆ−５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ＯＨ）の合成
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（５−フルオロピリジン−３−イル）メチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１２、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（３−Ｆ−５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ＯＨ）は下記のルートにて合成した。
2020122182.tif 000064
【０２０３】
（５−フルオロピリジン−３−イル）メタノール（化合物ａａ０７）の合成
2020122182.tif 000065
窒素雰囲気下、市販の５−フルオロニコチン酸（化合物ａａ０６）（１４．１  ｇ、１００  ｍｍｏｌ）にＴＨＦ（２００  ｍＬ）を加え、メカニカルスターラーを用い撹拌した。次いで、トリエチルアミン（１９．５１  ｍＬ、１４０  ｍｍｏｌ）を室温にて加え、固体が完全に溶解するまで撹拌した後、反応液を氷浴を用いて冷却した。その後、エチルクロロフォメート（１１．５  ｍＬ、１２０  ｍｍｏｌ）を滴下しながら加え、氷浴下３０分撹拌した。その後、ドライアイスバスを用い、反応液が−６０℃以下になるように冷却し、ＬｉＡｌＨ４（水素化アルミニウムリチウム）のＴＨＦ溶液（２．５Ｍ、４０  ｍＬ、１００  ｍｍｏｌ）を反応液が−２０℃を超えないように、５分以上かけて滴下した。反応液を−７８℃で３時間撹拌した後、酢酸エチル（６９  ｍＬ）を反応液が−２０℃を超えないように加えた。その後、氷浴を用いてさらに１時間撹拌し、水（１８  ｍＬ）を加え１５分室温で撹拌した。反応液をＮＨシリカゲルを用いてろ過、減圧濃縮することで（５−フルオロピリジン−３−イル）メタノール（化合物ａａ０７）（９．２８  ｇ、７３％）を黄色の油状成分として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝１２８（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．２８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２０４】
３−（ブロモメチル）−５−フルオロピリジン臭化水素酸塩（化合物ａａ０８）の合成
2020122182.tif 000066
丸底フラスコにアセトン／ドライアイスで冷却したコンデンサーを接続し、窒素雰囲気下、（５−フルオロピリジン−３−イル）メタノール（化合物ａａ０７）（８．２１  ｇ、６４．６  ｍｍｏｌ）、２５％ＨＢｒ酢酸溶液（９６  ｍＬ、３８８  ｍｍｏｌ）を加えた。なお、反応は開放系で行い、生じたＨＢｒをトラップするために１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を用いている。反応液を室温から１００℃まで徐々に撹拌しながら昇温し、さらに３時間撹拌した。その後反応液を室温まで冷却し、ジイソプロピルエーテル（４８  ｍＬ）をゆっくりと加えることを３回繰り返し、得られた固体をろ過することで３−（ブロモメチル）−５−フルオロピリジン臭化水素酸塩（化合物ａａ０８）（１２．４３  ｇ、７１％）を灰色の固体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｖａｒｉａｎ４００−ＭＲ、４００ＭＨｚ、ｄ−ＤＭＳＯ）δ４．７７（２Ｈ、ｓ）、７．８５−７．８８（１Ｈ、ｍ）、８．５５−８．５６（２Ｈ、ｍ）【０２０５】
Ｏ−（（５−フルオロピリジン−３−イル）メチル）−Ｎ−トリチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ１０、Ｔｒｔ−Ｓｅｒ（３−Ｆ−５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000067
窒素雰囲気下、ｔ−ペントキサイドナトリウム（ＮａＯｔＰｅｎ）（１３．７  ｇ、１２５ｍｍｏｌ）にＴＨＦ（４５．８ｍＬ）を加え撹拌したのち、市販のトリチルセリンのトリエチルアミン塩（Ｔｒｔ−Ｓｅｒ−ＯＨトリエチルアミン塩）（化合物ａａ０９）（１１．２４  ｇ、２５  ｍｍｏｌ）を３回に分けて加え、３０分室温にて撹拌した。反応液を氷浴を用いて１５分撹拌し、冷却した後、３−（ブロモメチル）−５−フルオロピリジン臭化水素酸塩（化合物ａａ０８）（８．１３  ｇ、３０  ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１６  ｍＬ）を滴下しながら加え、さらにＤＭＦ（１４  ｍＬ）を加えた。反応液を氷浴下４５分撹拌した後、３−（ブロモメチル）−５−フルオロピリジン臭化水素酸塩（化合物ａａ０８）（２．０３  ｇ、７．５  ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（４．０  ｍＬ）を滴下しながら加え、さらにＤＭＦ（４．０  ｍＬ）を加えた。その後、反応液を室温にてさらに１時間撹拌し、水（１２５  ｍＬ）を加えた。得られた混合液をｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）で洗浄し、有機層を水で抽出した。得られた水層をまとめて、飽和リン酸二水素ナトリウム水溶液（１５  ｍＬ）を用いてｐＨ＝７に調整した後、酢酸エチルを用いて２回抽出した。得られた有機層をまとめて、飽和食塩水を２倍に希釈した溶液を用いて３回洗浄し、その後、飽和食塩水で２回洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、ろ過、減圧濃縮し、Ｏ−（（５−フルオロピリジン−３−イル）メチル）−Ｎ−トリチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ１０、Ｔｒｔ−Ｓｅｒ（３−Ｆ−５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ＯＨ）（１１．０７  ｇ、９７％）を黄色のアモルファスとして得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝４５５（Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．８６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２０６】
Ｏ−（（５−フルオロピリジン−３−イル）メチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１１、Ｈ−Ｓｅｒ（３−Ｆ−５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ＯＨ））の合成
2020122182.tif 000068
Ｏ−（（５−フルオロピリジン−３−イル）メチル）−Ｎ−トリチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ１０、Ｔｒｔ−Ｓｅｒ（３−Ｆ−５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ＯＨ）（１０．７６  ｇ、２３．５７  ｍｍｏｌ）の１．４−ジオキサン溶液（２１．５  ｍＬ）に５〜１０％の塩酸／メタノール溶液（６４．２  ｍＬ）を室温にて加えた。１０分から２０分室温にて反応液を撹拌した後、１．４−ジオキサン（１３５  ｍＬ）を加えた。さらに追加で１．４−ジオキサン（９０  ｍＬ）を加えた後、下記に示す通り、事前に少量調製した種晶（５  ｍｇ）を加え室温で３０分さらに撹拌した。得られた固体をろ過し、ジイソプロピルエーテル（５０  ｍＬ）で４回洗浄し、減圧下乾燥することで、Ｏ−（（５−フルオロピリジン−３−イル）メチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１１、Ｈ−Ｓｅｒ（３−Ｆ−５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ＯＨ））（６．５８  ｇ、９５％）を塩酸塩として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝２１３（Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．２４分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５）【０２０７】
Ｏ−（（５−フルオロピリジン−３−イル）メチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１１、Ｈ−Ｓｅｒ（３−Ｆ−５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ＯＨ））の種晶の調整
Ｏ−（（５−フルオロピリジン−３−イル）メチル）−Ｎ−トリチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ１０、Ｔｒｔ−Ｓｅｒ（３−Ｆ−５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ＯＨ）（９８  ｍｇ、２．６９  ｍｍｏｌ）の１．４−ジオキサン溶液（８１９  μＬ）に５〜１０％の塩酸／メタノール溶液（２．４５  ｍＬ）を室温にて加え、５時間撹拌した。反応液に１．４−ジオキサン（６．０  ｍＬ）を加え、得られた固体をろ過し、ジイソプロピルエーテルで洗浄、減圧下乾燥することでＯ−（（５−フルオロピリジン−３−イル）メチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１１、Ｈ−Ｓｅｒ（３−Ｆ−５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ＯＨ））（２２２．５  ｍｇ、８６％）を塩酸塩として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝２１３（Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．２４分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５）【０２０８】
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（５−フルオロピリジン−３−イル）メチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１２、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（３−Ｆ−５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000069
Ｏ−（（５−フルオロピリジン−３−イル）メチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１１、Ｈ−Ｓｅｒ（３−Ｆ−５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ＯＨ））の塩酸塩（６．３７  ｇ、２２．１９  ｍｍｏｌ）に水（４２  ｍＬ）、１．４−ジオキサン（１１５  ｍＬ）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（１３．５３  ｍＬ、７８  ｍｍｏｌ）を室温にて加え、撹拌した。その後、反応液に炭酸Ｎ−スクシンイミジル９−フルオレニルメチル（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（７．８６  ｇ、２３．３  ｍｍｏｌ）を室温にて加え、室温で撹拌した。原料の消失をＬＣ−ＭＳで確認した後、反応液に水（５６．２  ｍＬ）を室温にて加え、２５％  ｔ−ブチルメチルエーテル（ＭＴＢＥ）／ヘキサン溶液で２回洗浄した。得られた水層を飽和リン酸二水素ナトリウム水溶液（ＮａＨ２ＰＯ４）を用いてｐＨ＝６．１になるように調整した。その後、酢酸エチルで２回抽出し、得られた有機層をまとめて、飽和食塩水を２倍に希釈した溶液、飽和食塩水で洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、ろ過、減圧濃縮し、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（５−フルオロピリジン−３−イル）メチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１２、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（３−Ｆ−５−Ｍｅ−Ｐｙｒ）−ＯＨ）（９．４７  ｇ、９８％）を黄色の固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝４３７（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８６分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５）【０２０９】
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（３−クロロフェノキシ）プロパン酸（化合物ａａ１６、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−３−Ｃｌ）−ＯＨ）の合成
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（３−クロロフェノキシ）プロパン酸（化合物ａａ１６、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−３−Ｃｌ）−ＯＨ）は下記のルートにて合成した。
2020122182.tif 000070
【０２１０】
３−（３−クロロフェノキシ）−２−（トリチルアミノ）プロパン酸（Ｓ）−メチル（Ｔｒｔ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−３−Ｃｌ）−ＯＭｅ）（化合物ａａ１４）の合成
2020122182.tif 000071
窒素雰囲気下、市販の３−ヒドロキシ−２−（トリチルアミノ）プロパン酸（Ｓ）−メチル（化合物ａａ１３、Ｔｒｔ−Ｓｅｒ−ＯＭｅ）（６．０  ｇ、１６．６  ｍｍｏｌ）とトリフェニルフォスフィン（ＰＰｈ３）（８．７１  ｇ、３３．２  ｍｍｏｌ）のトルエン溶液（３５  ｍＬ）に２．２Ｍのジエチルアゾカルボキシレート（ＤＥＡＤ）のトルエン溶液（１５．０６  ｍＬ、３３．２  ｍｍｏｌ）を室温にて加え、反応液を５０℃で３０分撹拌した。反応液を減圧濃縮した後、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液／メタノール）にて精製し、３−（３−クロロフェノキシ）−２−（トリチルアミノ）プロパン酸（Ｓ）−メチル（Ｔｒｔ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−３−Ｃｌ）−ＯＭｅ）（化合物ａａ１４）（４．４３  ｇ、５７％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｖａｒｉａｎ４００−ＭＲ、４００ＭＨｚ、ｄ−ＤＭＳＯ）δ７．４２−７．４４（６Ｈ、ｍ）、７．２８−７．３０（７Ｈ、ｍ）、７．２０−７．２１（３Ｈ、ｍ）、６．９９−７．０１（２Ｈ、ｍ）、６．８３−６．８５（１Ｈ、ｍ）、４．１９−４．２２（１Ｈ、ｍ）、４．０６−４．０８（１Ｈ、ｍ）、３．４９−３．５１（１Ｈ、ｍ）、３．１７（３Ｈ、ｓ）【０２１１】
（Ｓ）−２−アミノ−３−（３−クロロフェノキシ）プロパン酸（化合物ａａ１５、Ｈ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−３−Ｃｌ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000072
３−（３−クロロフェノキシ）−２−（トリチルアミノ）プロパン酸（Ｓ）−メチル（Ｔｒｔ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−３−Ｃｌ）−ＯＭｅ）（化合物ａａ１４）（３．９  ｇ、８．２６  ｍｍｏｌ）の１．４−ジオキサン溶液（８０  ｍＬ）に１．０Ｍ水酸化リチウム／メタノール溶液（８３  ｍＬ）を室温にて加え、反応液を５０℃で３時間撹拌した。反応液を減圧濃縮した後、得られた残渣にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（３０  ｍＬ）を加え、５０℃で１０分間撹拌した。その後、反応液を減圧濃縮し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル）にて精製し、（Ｓ）−２−アミノ−３−（３−クロロフェノキシ）プロパン酸（化合物ａａ１５、Ｈ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−３−Ｃｌ）−ＯＨ）（８５０  ｍｇ、４８％、２工程）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝２１６（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．３７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２１２】
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（３−クロロフェノキシ）プロパン酸（化合物ａａ１６、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−３−Ｃｌ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000073
（Ｓ）−２−アミノ−３−（３−クロロフェノキシ）プロパン酸（化合物ａａ１５、Ｈ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−３−Ｃｌ）−ＯＨ）（８５０  ｍｇ、３．９４  ｍｍｏｌ）と炭酸Ｎ−スクシンイミジル９−フルオレニルメチル（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（１．３３  ｇ、３．９４  ｍｍｏｌ）に１，４−ジオキサン（２０  ｍＬ）と水（２０  ｍＬ）を室温にて加えた後、炭酸セシウム（２．５６９  ｇ、７．８８  ｍｍｏｌ）を加え、室温で撹拌した。原料の消失をＬＣ−ＭＳで確認した後、水（２０  ｍＬ）を加え、ジエチルエーテル（４０  ｍＬ）で２回洗浄した。得られた水層を５Ｎ塩酸水溶液を用いてｐＨ＝２になるまで調整し、酢酸エチルで２回抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、ろ過、減圧濃縮し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル）にて精製し、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（３−クロロフェノキシ）プロパン酸（化合物ａａ１６、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｐｈ−３−Ｃｌ）−ＯＨ）（１．４２  ｇ、８２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝４３８（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．９１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２１３】
（２Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−６−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ヘキサン酸（化合物ａａ１７、Ｆｍｏｃ−Ｎｌｅ（６−ＯＴＨＰ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000074
市販で購入した（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−６−ヒドロキシヘキサン酸（Ｆｍｏｃ−Ｎｌｅ（６−ＯＨ）−ＯＨ）（３  ｇ、８．１２  ｍｍｏｌ）とｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（ＰＰＴＳ）（４０８  ｍｇ、１．６２  ｍｍｏｌ）のトルエン溶液（１０  ｍＬ）を減圧濃縮し共沸脱水をおこなった。得られた残渣をテトラヒドロフラン（１５  ｍＬ）に溶解しジヒドロピラン（５．４１  ｍＬ、５６．８  ｍｍｏｌ）を加え５０度にて１時間撹拌した。室温下、反応液に酢酸エチルを加え飽和食塩水で２回有機層を洗浄した後、得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過、減圧濃縮した。得られた残渣をテトラヒドロフラン（３０  ｍＬ）に溶解し、ｐＨを８に調節したリン酸緩衝液（３０  ｍＬ）を加え５０度にて３時間撹拌した。室温下、反応液を酢酸エチルで２度抽出を行い、得られた有機層を飽和食塩水で洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過、減圧濃縮した。得られた残渣をジエチルエーテル（５０  ｍＬ）に溶解し、そこへヘプタン（５０  ｍＬ）を加える事で粗生成物を沈殿させ、減圧濃縮を行う事でジエチルエーテルを除去し、残った上澄み溶液をデカンテーションにて取り除いた。この作業を２度繰り返す事で粗生成物を得た。得られた粗生成物をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（１５０  ｍＬ）に溶解し、０．０５Ｍリン酸水溶液（１５０  ｍＬ）を加え室温にて１時間撹拌した。有機層を回収し、酢酸エチルで水層を抽出した。得られた有機層を合わせその後、飽和食塩水で２回洗浄し、得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過、減圧濃縮し、（２Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−６−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ヘキサン酸（化合物ａａ１７、Ｆｍｏｃ−Ｎｌｅ（６−ＯＴＨＰ）−ＯＨ）（２．９２５  ｇ、７９％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ＝  ４５４  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２１４】
メチル  Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−（ベンジルオキシ）エチル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ１８、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（ＥｔＯＢｎ）−ＯＭｅ）の合成
2020122182.tif 000075
窒素雰囲気下、（Ｓ）−アジリジン−１，２−ジカルボン酸２−メチル１−ベンジル（Ｃｂｚ−Ａｚｙ−ＯＭｅ）（２５．０  ｇ、１０６  ｍｍｏｌ）および２−（ベンジルオキシ）エタン−１−オール（２３．８  ｇ、１５６  ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１００  ｍＬ）に溶解し０度に冷却したのち、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体（２．００  ｍＬ、１５．９  ｍｍｏｌ）を加えて０度で１時間攪拌した。反応液に水を加えジクロロメタンで２回抽出後、炭酸ナトリウム水溶液、飽和食塩水で有機層を洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらに減圧ポンプで減圧下乾燥させた。得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル）にて精製し、メチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−（ベンジルオキシ）エチル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ１８、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（ＥｔＯＢｎ）−ＯＭｅ）（３０．０  ｇ、７３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ３８８  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．１３分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ９）【０２１５】
Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−（ベンジルオキシ）エチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１９、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（ＥｔＯＢｎ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000076
窒素雰囲気下、水酸化リチウム１水和物（１３．９  ｇ、３３１  ｍｍｏｌ）、塩化カルシウム（１２９  ｇ、１．２４  ｍｏｌ）を水（３２１  ｍＬ）に溶解させた。そこへメチル  Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−（ベンジルオキシ）エチル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ１８、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（ＥｔＯＢｎ）−ＯＭｅ）（３０．０  ｇ、７７．４  ｍｍｏｌ）の２−プロパノール／テトラヒドロフラン溶液（１．２８  Ｌ／３２１  ｍＬ）を室温で加え３時間攪拌した。２Ｍ塩酸水溶液をｐＨ２になるまで加え、有機層を除去したのち、水層を酢酸エチルで３回抽出した。得られた有機層を混合し無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらに減圧ポンプで減圧下乾燥させ、Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−（ベンジルオキシ）エチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１９、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（ＥｔＯＢｎ）−ＯＨ）（３０．０  ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。【０２１６】
Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ２０、Ｈ−Ｓｅｒ（ＥｔＯＨ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000077
水素雰囲気下、Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−（ベンジルオキシ）エチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１９、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（ＥｔＯＢｎ）−ＯＨ）（３４．０  ｇ、９１．１  ｍｍｏｌ）とパラジウム炭素（６．８０  ｇ、２０％  ｗ／ｗ）をメタノール（５００  ｍＬ）に溶解させ、室温で１６時間撹拌した。反応液をろ過したのち、溶媒を減圧下留去し、さらに減圧ポンプで減圧下乾燥させ、Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ２０、Ｈ−Ｓｅｒ（ＥｔＯＨ）−ＯＨ）（１０．７  ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。【０２１７】
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ２１、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＥｔＯＨ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000078
窒素雰囲気下、Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ２０、Ｈ−Ｓｅｒ（ＥｔＯＨ）−ＯＨ）（５．００  ｇ、３３．５  ｍｍｏｌ）、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（１２．４  ｇ、３６．９  ｍｍｏｌ）および炭酸ナトリウム（１０．６  ｇ、１００  ｍｍｏｌ）を水／１，４−ジオキサン（１３６  ｍＬ／５６．０  ｍＬ）に溶解させ室温で３時間攪拌した。反応液をｔ−ブチルメチルエーテルで３回洗浄後、水層に２Ｍ塩酸水溶液をｐＨ２になるまで加え、酢酸エチルで３回抽出した、得られた有機層を混合し、飽和食塩水で有機層を洗浄したのち、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらに減圧ポンプで減圧下乾燥させた。得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ２１、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＥｔＯＨ）−ＯＨ）（１２．０  ｇ、９６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ３７２  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．３１分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ３３）【０２１８】
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）エチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ２２、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＥｔＯＴＨＰ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000079
窒素雰囲気下、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ２１、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＥｔＯＨ）−ＯＨ）（１．６  ｇ、４．３１  ｍｍｏｌ）と３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（２．７２８  ｍＬ、３０．３  ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（８．６１６  ｍＬ）溶液に、ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（ＰＰＴＳ）（５４．１  ｍｇ、０．２１５  ｍｍｏｌ）を加え、５０度にて２時間攪拌した。混合物を冷却した後、酢酸エチルを加えた。続いて飽和食塩水にて有機層を３回洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をテトラヒドロフラン（１０  ｍＬ）に溶解させ、次いで０．０５Ｍのリン酸緩衝液（１００  ｍＬ）（１Ｍのリン酸２水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）水溶液（９４．３  ｍＬ）と１Ｍのリン酸水素２ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）水溶液（５．７  ｍＬ）を混ぜて調製）を加えた。この混合物を室温で１０分間攪拌した後、ｔ−ブチルメチルエーテルで抽出し、飽和食塩水で有機層を洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル）で精製し、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）エチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ２２、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＥｔＯＴＨＰ）−ＯＨ）（１．７５  ｇ、９６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ＝  ４５６  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８１分（分析条件  ＳＱＤＦＡ０５）【０２１９】
（Ｓ）−４−（（２−（ベンジルオキシ）エトキシ）メチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸ベンジル（化合物ａａ２３）の合成
2020122182.tif 000080
Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−（ベンジルオキシ）エチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１９、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（ＥｔＯＢｎ）−ＯＨ）（３０．０  ｇ、８０．３  ｍｍｏｌ）、パラホルムアルデヒド（７．２０    ｇ）およびパラトルエンスルホン酸（０．８３    ｇ、４．８２  ｍｍｏｌ）をトルエン中（３００  ｍＬ）に溶解させ１１０度で１６時間攪拌した。室温に冷却後、炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、有機層を混合し無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらに減圧ポンプで減圧下乾燥させ、（Ｓ）−４−（（２−（ベンジルオキシ）エトキシ）メチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸ベンジル（化合物ａａ２３）（２７．０  ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。【０２２０】
Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−（ベンジルオキシ）エチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ２４、Ｃｂｚ−ＭｅＳｅｒ（ＥｔＯＢｎ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000081
窒素雰囲気下、（Ｓ）−４−（（２−（ベンジルオキシ）エトキシ）メチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸ベンジル（化合物ａａ２３）（２７．０  ｇ、７０．１  ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（４５０  ｍＬ）にトリエチルシラン（２４．４  ｇ、２１０  ｍｍｏｌ）とトリフルオロ酢酸（４５０  ｍＬ）を加え、室温で４８時間撹拌した。反応液を減圧下留去し、さらに減圧ポンプで減圧下乾燥させたのち、炭酸カリウム水溶液で再溶解し、ジエチルエーテルで洗浄し、濃塩酸をｐＨ２になるまで加えたのち、酢酸エチルで２回抽出した。得られた有機層を混合し無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらに減圧ポンプで減圧下乾燥させ、Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−（ベンジルオキシ）エチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ２４、Ｃｂｚ−ＭｅＳｅｒ（ＥｔＯＢｎ）−ＯＨ）（２４．０  ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。【０２２１】
Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ２５、Ｈ−ＭｅＳｅｒ（ＥｔＯＨ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000082
水素雰囲気下、Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−（ベンジルオキシ）エチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ２４、Ｃｂｚ−ＭｅＳｅｒ（ＥｔＯＢｎ）−ＯＨ）（２４．０  ｇ、６２．０  ｍｍｏｌ）とパラジウム炭素（２．４０  ｇ、１０％  ｗ／ｗ）をメタノール（４００  ｍＬ）に溶解させ、室温で１６時間撹拌した。反応液をろ過したのち、溶媒を減圧下留去し、さらに減圧ポンプで減圧下乾燥させ、Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ２５、Ｈ−ＭｅＳｅｒ（ＥｔＯＨ）−ＯＨ）（１２．０  ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。【０２２２】
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ２６、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（ＥｔＯＨ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000083
窒素雰囲気下、Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ２５、Ｈ−ＭｅＳｅｒ（ＥｔＯＨ）−ＯＨ）（１２  ｇ、７３．５４  ｍｍｏｌ）、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（２７．３  ｇ、８１．０  ｍｍｏｌ）および炭酸ナトリウム（２７．３  ｇ、２５８  ｍｍｏｌ）を水／１，４−ジオキサン（３２０  ｍＬ／１６０  ｍＬ）に溶解させ室温で３時間攪拌した。反応液をｔ−ブチルメチルエーテルで３回洗浄後、水層に２Ｍ塩酸水溶液をｐＨ２になるまで加え、酢酸エチルで３回抽出した。得られた有機層を混合し、飽和食塩水で有機層を洗浄したのち、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらに減圧ポンプで減圧下乾燥させ、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ２６、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（ＥｔＯＨ）−ＯＨ）（２０．０  ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。【０２２３】
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−メチル−Ｏ−（２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）エチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ２７、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（ＥｔＯＴＨＰ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000084
窒素雰囲気下、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ２６、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（ＥｔＯＨ）−ＯＨ）（１８．０  ｇ、４６．７  ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１００  ｍＬ）溶液に、ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（０．５９  ｇ、２．３４  ｍｍｏｌ）と３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（２７．５  ｇ、３２７  ｍｍｏｌ）を加え、５０度にて３時間攪拌した。混合物を２５度まで冷却し、酢酸エチルを加えた。続いて飽和食塩水にて有機層を洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣（３１  ｇ）のうち、２５．０  ｇをテトラヒドロフラン（２００  ｍＬ）に溶解させ、次いでｐＨ６．８に調製した１．０Ｍリン酸緩衝液（２００  ｍＬ）を加えた。この混合物を５０度で３時間攪拌した。２５度まで冷却した後、酢酸エチルを加え、有機層と水層を分離した。水層に酢酸エチルを加えて抽出を行った後、得られた全ての有機層を混合し、飽和食塩水で有機層を洗浄したのち、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらに減圧ポンプで減圧下乾燥させ、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−メチル−Ｏ−（２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）エチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ２７、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（ＥｔＯＴＨＰ）−ＯＨ）（２０．０  ｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ＝  ４８７  （Ｍ＋ＮＨ４）＋
保持時間：０．６８分（分析条件  ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ１１）【０２２４】
（４Ｓ）−４−メチル−２−フェニル−１，３−ジオキソラン（化合物ａａ２８）の合成
2020122182.tif 000085
窒素雰囲気下、（Ｓ）−プロパン−１，２−ジオール（２０．０  ｇ、２６３  ｍｍｏｌ）のトルエン（２００  ｍＬ）溶液に、ベンズアルデヒド（２９．３  ｇ、２７６  ｍｍｏｌ）およびｐ−トルエンスルホン酸（０．４５  ｇ、２．６１  ｍｍｏｌ）を加え、１３０度にて１６時間攪拌した。反応液を濃縮し、残渣を順相カラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）で精製し、（４Ｓ）−４−メチル−２−フェニル−１，３−ジオキソラン（化合物ａａ２８）（３１．５  ｇ、７３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  １６５  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８９分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ１２）【０２２５】
（２Ｓ）−２−（ベンジルオキシ）プロパン−１−オール（化合物ａａ２９）の合成
2020122182.tif 000086
窒素雰囲気下、（４Ｓ）−４−メチル−２−フェニル−１，３−ジオキソラン（化合物ａａ２８）（３２  ｇ、１９４．８８  ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１．００  Ｌ）溶液に、水素化ジイソブチルアルミニウムの１Ｍヘキサン溶液（３９０  ｍＬ、３９０  ｍｍｏｌ）を−５０度において加え、当該温度で１５分撹拌後、室温にて２時間攪拌した。飽和塩化アンモニウム水溶液を加え反応を停止したのち、ジクロロメタンで２回抽出した。混合した有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらに減圧ポンプで減圧下乾燥させ、（２Ｓ）−２−（ベンジルオキシ）プロパン−１−オール（化合物ａａ２９）（３５．５  ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。【０２２６】
メチル  Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｓ）−２−（ベンジルオキシ）プロピル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ３０、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＢｎ）−ＯＭｅ）の合成
2020122182.tif 000087
窒素雰囲気下、（Ｓ）−アジリジン−１，２−ジカルボン酸２−メチル１−ベンジル（Ｃｂｚ−Ａｚｙ−ＯＭｅ）（２５．０  ｇ、１０６  ｍｍｏｌ）および（２Ｓ）−２−（ベンジルオキシ）プロパン−１−オール（化合物ａａ２９）（２６．５  ｇ、１５９  ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１８８  ｍＬ）に溶解し０度に冷却したのち、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体（２．７５  ｍＬ）を加えて０度で１時間３０分攪拌した。反応液に水を加えジクロロメタンで抽出後、飽和炭酸ナトリウム水溶液、飽和食塩水で有機層を洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらに減圧ポンプで減圧下乾燥させ、メチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｓ）−２−（ベンジルオキシ）プロピル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ３０、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＢｎ）−ＯＭｅ）（３０．０  ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。【０２２７】
Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｓ）−２−（ベンジルオキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ３１、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＢｎ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000088
窒素雰囲気下、水酸化リチウム１水和物（１０．５  ｇ）塩化カルシウム（１０３  ｇ）を水（３００  ｍＬ）に溶解させた。そこへメチル  Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｓ）−２−（ベンジルオキシ）プロピル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ３０、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＢｎ）−ＯＭｅ）（２５  ｇ、６２．３  ｍｍｏｌ）の２−プロパノール／テトラヒドロフラン溶液（１．２０  Ｌ／３００  ｍＬ）を室温で加え５時間攪拌した。２Ｍ塩酸水溶液をｐＨ２になるまで加え、有機層を除去したのち、水層を酢酸エチルで３回抽出した。得られた有機層を混合し無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらに減圧ポンプで減圧下乾燥させ、Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｓ）−２−（ベンジルオキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ３１、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＢｎ）−ＯＨ）（２５．０  ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。【０２２８】
Ｏ−（（Ｓ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ３２、Ｈ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000089
水素雰囲気下、Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｓ）−２−（ベンジルオキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ３１、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＢｎ）−ＯＨ）（３．００  ｇ、７．７４  ｍｍｏｌ）とパラジウム炭素（０．３０  ｇ、１０％  ｗ／ｗ）をメタノール（５０．０  ｍＬ）に溶解させ、室温で１６時間撹拌した。反応液をろ過したのち、溶媒を減圧下留去し、さらに減圧ポンプで減圧下乾燥させ、Ｏ−（（Ｓ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ３２、Ｈ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）（０．７８  ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。【０２２９】
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｓ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ３３、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000090
窒素雰囲気下、Ｏ−（（Ｓ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ３２、Ｈ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）（０．７８  ｇ、４．７８  ｍｍｏｌ）、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（１．６１  ｇ、４．７８  ｍｍｏｌ）およびＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（０．９３  ｍｇ、７．１７  ｍｍｏｌ）を水／１，４−ジオキサン（８．００  ｍＬ／２２．０  ｍＬ）に溶解させ室温で３０分攪拌した。反応液をヘキサン（１８．０  ｍＬ）／ｔ−ブチルメチルエーテル（６．００  ｍＬ）で２回洗浄後、水層に２Ｍ塩酸水溶液をｐＨ２になるまで加え、酢酸エチル（２０．０  ｍＬ）で２回抽出した、得られた有機層を混合し、飽和食塩水で有機層を洗浄したのち、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらに減圧ポンプで減圧下乾燥させた。得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｓ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ３３、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）（１．６２  ｇ、８８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ３８６  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．６８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２３０】
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（２Ｓ）−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ３４、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000091
窒素雰囲気下、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｓ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ３３、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）（８３  ｍｇ、０．２２  ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１．００  ｍＬ）溶液に、ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（２．７１  ｍｇ、０．０１  ｍｍｏｌ）と３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（０．１３  ｇ、１．５１  ｍｍｏｌ）を加え、５０度にて２時間攪拌した。混合物を２５度まで冷却し、酢酸エチルを加えた。続いて飽和食塩水にて有機層を洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をテトラヒドロフラン（１．００  ｍＬ）に溶解させ、次いでｐＨ６．８に調製した１．０Ｍリン酸緩衝液（１．００  ｍＬ）を加えた。この混合物を５０度で３時間攪拌した。２５度まで冷却した後、酢酸エチル（１７５  ｍＬ）を加え、有機層と水層を分離した。水層に酢酸エチル（１７５  ｍＬ）を加えて抽出を行った後、得られた全ての有機層を混合し、飽和食塩水で有機層を洗浄したのち、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらに減圧ポンプで減圧下乾燥させ、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（２Ｓ）−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ３４、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＨ）（８８．０  ｍｇ、８７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ４６８  （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．８６分、０．８７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２３１】
（Ｓ）−４−（（（Ｓ）−２−（ベンジルオキシ）プロポキシ）メチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸ベンジル（化合物ａａ３５）の合成
2020122182.tif 000092
Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｓ）−２−（ベンジルオキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ３１、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＢｎ）−ＯＨ）（２５．０  ｇ、６４．５３  ｍｍｏｌ）、パラホルムアルデヒド（５．８０  ｇ）およびパラトルエンスルホン酸（０．６７  ｇ、３．８９  ｍｍｏｌ）をトルエン中（２５０  ｍＬ）に溶解させ１１０度で１６時間攪拌した。室温に冷却後、炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、有機層を混合し無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらに減圧ポンプで減圧下乾燥させ、（Ｓ）−４−（（（Ｓ）−２−（ベンジルオキシ）プロポキシ）メチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸ベンジル（化合物ａａ３５）（１８．６  ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。【０２３２】
Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｓ）−２−（ベンジルオキシ）プロピル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ３６、Ｃｂｚ−ＭｅＳｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＢｎ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000093
窒素雰囲気下、（Ｓ）−４−（（（Ｓ）−２−（ベンジルオキシ）プロポキシ）メチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸ベンジル（化合物ａａ３５）（１８．６  ｇ、４６．６  ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（２９６  ｍＬ）にトリエチルシシラン（１６．２  ｇ、１３９  ｍｍｏｌ）とトリフルオロ酢酸（２９６  ｍＬ）を加え、室温で４８時間撹拌した。反応液を減圧下留去し、さらに減圧ポンプで減圧下乾燥させた後、炭酸カリウム水溶液で再溶解し、ジエチルエーテルで洗浄し、濃塩酸をｐＨ２になるまで加えたのち、酢酸エチルで３回抽出した。得られた有機層を混合し無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらに減圧ポンプで減圧下乾燥させ、Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｓ）−２−（ベンジルオキシ）プロピル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ３６、Ｃｂｚ−ＭｅＳｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＢｎ）−ＯＨ）（９．４  ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。【０２３３】
Ｏ−（（Ｓ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ３７、Ｈ−ＭｅＳｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000094
水素雰囲気下、Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｓ）−２−（ベンジルオキシ）プロピル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ３６、Ｃｂｚ−ＭｅＳｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＢｎ）−ＯＨ）（９．４０  ｇ、２３．４  ｍｍｏｌ）とパラジウム炭素（１．８０  ｇ、１０％  ｗ／ｗ）をメタノール（１８５  ｍＬ）に溶解させ、室温で１６時間撹拌した。反応液をろ過したのち、溶媒を減圧下留去し、さらに減圧ポンプで減圧下乾燥させ、Ｏ−（（Ｓ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ３７、Ｈ−ＭｅＳｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）（３．４０  ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。【０２３４】
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｓ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ３８、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000095
窒素雰囲気下、Ｏ−（（Ｓ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ３７、Ｈ−ＭｅＳｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）（３．４０  ｇ、１９．２  ｍｍｏｌ）、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（７．１２  ｇ、２２．１  ｍｍｏｌ）および炭酸ナトリウム（７．１３  ｇ、６７．３  ｍｍｏｌ）を水／１，４−ジオキサン（８０．０  ｍＬ／４０．０  ｍＬ）に溶解させ室温で３時間攪拌した。反応液をｔ−ブチルメチルエーテルで３回洗浄後、水層に２Ｍ塩酸水溶液をｐＨ２になるまで加え、酢酸エチルで３回抽出した、得られた有機層を混合し、飽和食塩水で有機層を洗浄したのち、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらに減圧ポンプで減圧下乾燥させ、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｓ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ３８、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）（８．００  ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。【０２３５】
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−メチル−Ｏ−（（２Ｓ）−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ３９、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000096
窒素雰囲気下、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｓ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ３８、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）（８０．０  ｇ、２０．０  ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（４０．０  ｍＬ）溶液に、ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（０．２６  ｇ、１．０２  ｍｍｏｌ）と３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（１１．８  ｇ、１４０  ｍｍｏｌ）を加え、５０度にて２時間攪拌した。混合物を２５度まで冷却し、酢酸エチルを加えた。続いて飽和食塩水にて有機層を洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣（９．３０  ｇ）をテトラヒドロフラン（５０．０  ｍＬ）に溶解させ、次いでｐＨ６．８に調製した１．０Ｍリン酸緩衝液（５０．０  ｍＬ）を加えた。この混合物を５０度で３時間攪拌した。２５度まで冷却した後、酢酸エチルを加え、有機層と水層を分離した。水層に酢酸エチルを加えて抽出を行った後、得られた全ての有機層を混合し、飽和食塩水で有機層を洗浄したのち、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらに減圧ポンプで減圧下乾燥させ、得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．５％炭酸水素アンモニウム水溶液／アセトニトリル）にて精製し、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−メチル−Ｏ−（（２Ｓ）−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ３９、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＨ）（７．００  ｇ、７２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ５０１  （Ｍ＋ＮＨ４）＋
保持時間：０．８２分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ１０）【０２３６】
（４Ｒ）−４−メチル−２−フェニル−１，３−ジオキソラン（化合物ａａ４０）の合成
2020122182.tif 000097
窒素雰囲気下、（Ｒ）−プロパン−１，２−ジオール（２０  ｇ、２６２．８３  ｍｍｏｌ）のトルエン（２００  ｍＬ）溶液に、ベンズアルデヒド（２９．３  ｇ、２７６  ｍｍｏｌ）およびｐ−トルエンスルホン酸（０．４５  ｇ、２．６１  ｍｍｏｌ）を加え、１３０度にて１６時間攪拌した。反応液を濃縮し、残渣を順相カラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）で精製し、（４Ｒ）−４−メチル−２−フェニル−１，３−ジオキソラン（化合物ａａ４０）（３１．５  ｇ、７３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  １６３  （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：７．２１分（分析条件ＧＣ０１）【０２３７】
（２Ｒ）−２−（ベンジルオキシ）プロパン−１−オール（化合物ａａ４１）の合成
2020122182.tif 000098
窒素雰囲気下、（４Ｒ）−４−メチル−２−フェニル−１，３−ジオキソラン（化合物ａａ４０）（３２．０  ｇ、１９５  ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１．００  Ｌ）溶液に、水素化ジイソブチルアルミニウムの１Ｍヘキサン溶液（３９０  ｍＬ、３９０  ｍｍｏｌ）を−５０度において加え、当該温度で１５分撹拌後、室温にて２時間攪拌した。飽和塩化アンモニウム水溶液を加え反応を停止したのち、ジクロロメタンで２回抽出した。混合した有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらに減圧ポンプで減圧下乾燥させ、（２Ｒ）−２−（ベンジルオキシ）プロパン−１−オール（化合物ａａ４１）（３５．５  ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。【０２３８】
メチル  Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｒ）−２−（ベンジルオキシ）プロピル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ４２、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＢｎ）−ＯＭｅ）の合成
2020122182.tif 000099
窒素雰囲気下、（Ｓ）−アジリジン−１，２−ジカルボン酸２−メチル１−ベンジル（Ｃｂｚ−Ａｚｙ−ＯＭｅ）（２５  ｇ、１０６．２８  ｍｍｏｌ）および（２Ｒ）−２−（ベンジルオキシ）プロパン−１−オール（化合物ａａ４１）（２６．５  ｇ、１５９  ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１８８  ｍＬ）に溶解し０度に冷却したのち、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体（２．７５  ｍＬ）を加えて０度で１時間３０分攪拌した。反応液に水を加えジクロロメタンで抽出後、飽和炭酸ナトリウム水溶液、飽和食塩水で有機層を洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらに減圧ポンプで減圧下乾燥させ、メチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｒ）−２−（ベンジルオキシ）プロピル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ４２、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＢｎ）−ＯＭｅ）（５０．０  ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。【０２３９】
Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｒ）−２−（ベンジルオキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ４３、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＢｎ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000100
窒素雰囲気下、水酸化リチウム１水和物（１０．５  ｇ）塩化カルシウム（１０３  ｇ）を水（３００  ｍＬ）に溶解させた。そこへメチル  Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｒ）−２−（ベンジルオキシ）プロピル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ４２、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＢｎ）−ＯＭｅ）（２５．０  ｇ、６２．３  ｍｍｏｌ）の２−プロパノール／テトラヒドロフラン溶液（１．５０  Ｌ／１５０  ｍＬ）を室温で加え５時間攪拌した。２Ｍ塩酸水溶液をｐＨ２になるまで加え、有機層を除去したのち、水層を酢酸エチルで３回抽出した。得られた有機層を混合し無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらに減圧ポンプで減圧下乾燥させ、Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｒ）−２−（ベンジルオキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ４３、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＢｎ）−ＯＨ）（２５．０  ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。【０２４０】
Ｏ−（（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ４４、Ｈ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000101
水素雰囲気下、Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｒ）−２−（ベンジルオキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ４３、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＢｎ）−ＯＨ）（２．８７  ｇ、７．４１  ｍｍｏｌ）とパラジウム炭素（５７０  ｍｇ、２０％  ｗ／ｗ）をメタノール（５０  ｍＬ）に溶解させ、室温で１６時間撹拌した。反応液をろ過したのち、溶媒を減圧下留去し、得られた残渣を酢酸エチルにて６０度で再結晶することで、Ｏ−（（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ４４、Ｈ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）（９００  ｍｇ、７４％）を得た。【０２４１】
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ４５、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000102
窒素雰囲気下、上述に記載の方法で合成したＯ−（（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ４４、Ｈ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）（５．０  ｇ、３０．６４  ｍｍｏｌ）、炭酸水素ナトリウム（７．７１  ｇ、９１．８  ｍｍｏｌ）を水／１，４−ジオキサン（１２７  ｍＬ／５２．９  ｍＬ）に溶解させ、室温にてＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（１０．８５  ｇ、３２．２  ｍｍｏｌ）を加え４時間撹拌した。反応液に水を加え、ｔ−ブチルメチルエーテルで洗浄した後、水層に濃塩酸をｐＨ３になるまで加え、ｔ−ブチルメチルエーテルで２回抽出した、得られた有機層を飽和食塩水で洗浄したのち、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル）にて精製することで、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ４５、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）（８  ｇ、６８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ３８６  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：２．０８分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ４９）【０２４２】
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（２Ｒ）−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ４６、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000103
窒素雰囲気下、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ４５、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）（４．４  ｇ、１１．４  ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（５０  ｍＬ）溶液に、ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（１４３  ｍｇ、５．７  ｍｍｏｌ）と３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（６．７  ｇ、７９．８  ｍｍｏｌ）を加え、５０度にて３時間攪拌した。混合物を室温にて冷却し、ｔ−ブチルメチルエーテルを加えた後、飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、ろ過を行い、得られた溶媒を減圧下留去し、粗生成物（８  ｇ）を得た。得られた粗生成物（８００  ｍｇ）にテトラヒドロフラン（１０  ｍＬ）とｐＨ６．８に調製した１．０Ｍリン酸緩衝液（１０  ｍＬ）の混合液を加え、５０度で３時間攪拌した。反応液を室塩で冷却した後、ｔ−ブチルメチルエーテルを加え、飽和食塩水で洗浄し、ろ過を行った。得られた溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．５％炭酸水素アンモニウム水溶液／アセトニトリル）で精製し、得られたフラクションをまとめてアセトニトリルを減圧下留去した。得られた水層にｐＨ６．８に調製した１．０Ｍリン酸緩衝液を加え、ｔ−ブチルメチルエーテルで３回抽出し、減圧下溶媒を留去することでＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（２Ｒ）−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ４６、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＨ）（４００  ｍｇ、２工程６５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ４６８  （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．８５分、０．８７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２４３】
（Ｓ）−４−（（（Ｒ）−２−（ベンジルオキシ）プロポキシ）メチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸ベンジル（化合物ａａ４７）の合成
2020122182.tif 000104
Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｒ）−２−（ベンジルオキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ４３、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＢｎ）−ＯＨ）（２５．０  ｇ、６４．５  ｍｍｏｌ）、パラホルムアルデヒド（５．８０  ｇ）およびパラトルエンスルホン酸（０．６７  ｇ、３．８９  ｍｍｏｌ）をトルエン中（２５０  ｍＬ）に溶解させ１１０度で１６時間攪拌した。室温に冷却後、炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、有機層を混合し無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらに減圧ポンプで減圧下乾燥させ、（Ｓ）−４−（（（Ｒ）−２−（ベンジルオキシ）プロポキシ）メチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸ベンジル（化合物ａａ４７）（１８．６  ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。【０２４４】
Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｒ）−２−（ベンジルオキシ）プロピル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ４８、Ｃｂｚ−ＭｅＳｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＢｎ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000105
窒素雰囲気下、（Ｓ）−４−（（（Ｒ）−２−（ベンジルオキシ）プロポキシ）メチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸ベンジル（化合物ａａ４７）（１８．６  ｇ、４６．６  ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（２９６  ｍＬ）にトリエチルシラン（１６．２  ｇ、１３９  ｍｍｏｌ）とトリフルオロ酢酸（２９６  ｍＬ）を加え、室温で４８時間撹拌した。反応液を減圧下留去し、さらに減圧ポンプで減圧下乾燥させたのち、炭酸カリウム水溶液で再溶解し、ジエチルエーテルで洗浄し、濃塩酸をｐＨ２になるまで加えたのち、酢酸エチルで３回抽出した。得られた有機層を混合し無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、ささらに減圧ポンプで減圧下乾燥させ、Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｒ）−２−（ベンジルオキシ）プロピル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ４８、Ｃｂｚ−ＭｅＳｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＢｎ）−ＯＨ）（９．４０  ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。【０２４５】
Ｏ−（（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ４９、Ｈ−ＭｅＳｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000106
水素雰囲気下、Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｒ）−２−（ベンジルオキシ）プロピル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ４８、Ｃｂｚ−ＭｅＳｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＢｎ）−ＯＨ）（９．４０  ｇ、２３．４  ｍｍｏｌ）とパラジウム炭素（１．８０  ｇ、１０％  ｗ／ｗ）をメタノール（１８５  ｍＬ）に溶解させ、室温で１６時間撹拌した。反応液をろ過したのち、溶媒を減圧下留去し、さらに減圧ポンプで減圧下乾燥させ、Ｏ−（（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ４９、Ｈ−ＭｅＳｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）（３．４０  ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。【０２４６】
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ５０、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000107
窒素雰囲気下、Ｏ−（（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ４９、Ｈ−ＭｅＳｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）（３．４０  ｇ、１９．２  ｍｍｏｌ）、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（７．１２  ｇ、２２．１  ｍｍｏｌ）および炭酸ナトリウム（７．１３  ｇ、６７．３  ｍｍｏｌ）を水／１，４−ジオキサン（８０．０  ｍＬ／４０．０  ｍＬ）に溶解させ室温で３時間攪拌した。反応液をｔ−ブチルメチルエーテルで３回洗浄後、水層に２Ｍ塩酸水溶液をｐＨ２になるまで加え、酢酸エチルで３回抽出した、得られた有機層を混合し、飽和食塩水で有機層を洗浄したのち、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらに減圧ポンプで減圧下乾燥させ、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ５０、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）（８．００  ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。【０２４７】
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−メチル−Ｏ−（（２Ｒ）−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ５１、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000108
窒素雰囲気下、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ５０、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）（８．００    ｇ、２０．０  ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（４０．０  ｍＬ）溶液に、ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（０．２６  ｇ、１．０２  ｍｍｏｌ）と３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（１１．８  ｇ、１３９  ｍｍｏｌ）を加え、５０度にて２時間攪拌した。混合物を２５度まで冷却し、酢酸エチルを加えた。続いて飽和食塩水にて有機層を洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣（９．３  ｇ）をテトラヒドロフラン（１００  ｍＬ）に溶解させ、次いでｐＨ６．８に調製した１．０Ｍリン酸緩衝液（１００  ｍＬ）を加えた。この混合物を５０度で３時間攪拌した。２５度まで冷却した後、酢酸エチルを加え、有機層と水層を分離した。水層に酢酸エチルを加えて抽出を行った後、得られた全ての有機層を混合し、飽和食塩水で有機層を洗浄したのち、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらに減圧ポンプで減圧下乾燥させ、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−メチル−Ｏ−（（２Ｒ）−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ５１、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＨ）（８．５０  ｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ５０１  （Ｍ＋ＮＨ４）＋
保持時間：０．８２分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ１０）【０２４８】
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−メチル−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ５４、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕＯＴＨＰ）−ＯＨ）の合成は、以下のスキームに従って行った。
2020122182.tif 000109
【０２４９】
メチル  Ｏ−（２−（ベンジルオキシ）−２−メチルプロピル）−Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ５２、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（ｔＢｕＯＢｎ）−ＯＭｅ）の合成
2020122182.tif 000110
（Ｓ）−アジリジン−１，２−ジカルボン酸２−メチル１−ベンジル（Ｃｂｚ−Ａｚｙ−ＯＭｅ）（２．０  ｇ、８．５０  ｍｍｏｌ）および２−ベンジルオキシ−２−メチル−プロパン−１−オール（２．３０  ｇ、１２．７５  ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（７．５  ｍＬ）に溶解し、氷冷下で三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体（ＢＦ３・ＯＥｔ２）（０．１６０  ｍＬ、１．２８  ｍｍｏｌ）を５分かけて滴下した。氷冷下で３０分撹拌後、水（２．０  ｍＬ）を加えて１０分撹拌して反応を停止し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えた。ジクロロメタンで水層を抽出し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。ろ過後、有機溶媒を減圧濃縮により除去し、得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１００／０→７５／２５）で精製し、メチルＯ−（２−（ベンジルオキシ）−２−メチルプロピル）−Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ５２、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（ｔＢｕＯＢｎ）−ＯＭｅ）（２．３６  ｇ、６７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ４１６  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．９３  分（分析条件  ＳＱＤＦＡ０５）【０２５０】
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ５３、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕＯＨ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000111
メチルＯ−（２−（ベンジルオキシ）−２−メチルプロピル）−Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ５２、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（ｔＢｕＯＢｎ）−ＯＭｅ）（２．３６  ｇ、５．６８  ｍｍｏｌ）をメタノール（８．０  ｍＬ）に溶解させた。これに、水酸化リチウム一水和物（０．４７７  ｇ、１１．３６  ｍｍｏｌ）を水（８．０  ｍＬ）に溶解させた水溶液を添加し、室温で１時間撹拌した。その後、２Ｍの塩酸水溶液（８．５２  ｍＬ、１７．０４  ｍｍｏｌ）を加えた。水層を酢酸エチルで３回抽出し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。ろ過後、酢酸エチルを減圧濃縮により除去し、Ｏ−（２−（ベンジルオキシ）−２−メチルプロピル）−Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｌ−セリン（Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（ｔＢｕＯＢｎ）−ＯＨ）を得た。
上で得られた、Ｏ−（２−（ベンジルオキシ）−２−メチルプロピル）−Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｌ−セリン（Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（ｔＢｕＯＢｎ）−ＯＨ）をメタノール（４５  ｍＬ）に溶解し、Ｐｄ／Ｃ（４５６  ｍｇ）を加えて水素雰囲気化、室温で終夜撹拌した。セライトろ過によりＰｄ／Ｃを除いた後、減圧濃縮によりメタノールを除去することでＯ−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−Ｌ−セリン（Ｈ−Ｓｅｒ（ｔＢｕＯＨ）−ＯＨ）（１．０５  ｇ）を定量的に得た。
得られたＯ−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−Ｌ−セリン（Ｈ−Ｓｅｒ（ｔＢｕＯＨ）−ＯＨ）（１．５９  ｇ、８．９７  ｍＬ）および炭酸ナトリウム（２．８５  ｇ、２６．９  ｍｍｏｌ）を水（３６  ｍＬ）および１，４−ジオキサン（１５  ｍＬ）に溶解し、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（３．１８  ｇ、９．４２  ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。室温で３０分撹拌後、反応液に水（４０  ｍＬ）を加え、ｔ−ブチルメチルエーテル（６０  ｍＬ）で３回洗浄した。その後、水層に２Ｍの塩酸水溶液（２６．９  ｍＬ、５３．８  ｍｍｏｌ）を加えて水層のｐＨを１とした後、ｔ−ブチルメチルエーテル（６０  ｍＬ）で３回抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過後、ｔ−ブチルメチルエーテルを減圧濃縮して得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１ギ酸アセトニトリル溶液）で精製し、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ５３、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕＯＨ）−ＯＨ）（２．６２  ｇ、７３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ４００  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７１分（分析条件  ＳＱＤＦＡ０５）【０２５１】
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−メチル−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ５４、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕＯＴＨＰ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000112
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ５３、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕＯＨ）−ＯＨ）（１．２  ｇ、３．００  ｍｍｏｌ）および３．４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（１．９０  ｍＬ、２１．０３  ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（６．０  ｍＬ）に溶解し、ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（ＰＰＴＳ）（０．０３８  ｇ、０．１５０  ｍｍｏｌ）を加えて５０度で２時間撹拌した。その後、反応液を酢酸エチル（１５  ｍＬ）で希釈し、飽和食塩水（１５  ｍＬ）で３回洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過し、減圧濃縮により溶媒を除去した。得られた残渣をテトラヒドロフラン（２４．０  ｍＬ）に溶解し、ｐＨ６．８に調製した１．０Ｍリン酸緩衝液（２４．０  ｍＬ）を加えて５０度で３時間撹拌した。反応液を酢酸エチル（４５  ｍＬ）で希釈後、飽和食塩水（４５  ｍＬ）で３回洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。ろ過後、減圧濃縮して得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液／メタノール）で精製し、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−メチル−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ５４、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕＯＴＨＰ）−ＯＨ）（１．０５  ｇ、７２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ４８４（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．９１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２５２】
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−メチル−Ｏ−（２−メチル−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ５５、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（ｔＢｕＯＴＨＰ）−ＯＨ）の合成は、以下のスキームに従って行った。
2020122182.tif 000113
【０２５３】
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−メチル−Ｏ−（２−メチル−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ５５、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（ｔＢｕＯＴＨＰ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000114
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ５３、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕＯＨ）−ＯＨ）（１２  ｇ、３０．０４  ｍｍｏｌ）およびパラホルムアルデヒド（２．７５  ｇ、９１．６７  ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸（３１．４  ｇ、２７７．７８  ｍｍｏｌ）およびトルエン（６０  ｍＬ）に溶解させ、室温で４時間撹拌した。反応液を減圧濃縮後、得られた残渣をジクロロメタンに溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。ろ過後、ジクロロメタンを減圧濃縮により除去することで（Ｓ）−４−（（２−ヒドロキシ−２−メチルプロポキシ）メチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（１２  ｇ、９７％）を得た。
得られた（Ｓ）−４−（（２−ヒドロキシ−２−メチルプロポキシ）メチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（１  ｇ、２．４３  ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸／ジクロロメタン（１３  ｍＬ／１３  ｍＬ）に溶解し、トリエチルシラン（Ｅｔ３ＳｉＨ）（８３２  ｍｇ、７．１６  ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。室温で１６時間撹拌後、反応液を減圧濃縮して得られた残渣を炭酸カリウム水溶液に溶解し、ｔ−ブチルメチルエーテルで洗浄後、水層に塩酸水溶液（１Ｍ）を加えてｐＨを２に調節した。水層をｔ−ブチルメチルエーテルで２回抽出した後、有機層を水、飽和食塩水で各２回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。ろ過後、減圧濃縮して得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル＝１００／０→５０／５０）で精製し、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（ｔＢｕＯＨ）−ＯＨ）（７００  ｍｇ、７０％）を得た。
得られたＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（ｔＢｕＯＨ）−ＯＨ）（６  ｇ、１４．５１  ｍｍｏｌ）とｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（ＰＰＴＳ）（１８２  ｍｇ、０．７３  ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（４８  ｍＬ）に溶解し、３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（８．５  ｇ、１０１．０５  ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気化、室温で滴下して加えた。反応液を５０度で５時間撹拌後、反応液に酢酸エチルを添加し、抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後、減圧濃縮してＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−メチル−Ｏ−（２−メチル−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリンおよびテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−メチル−Ｏ−（２−メチル−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリナートを混合物として得た。
得られた混合物（５０  ｇ）をリン酸緩衝液（１Ｍ、ｐＨ＝６．８、１０００  ｍＬ）およびテトラヒドロフラン（１０００  ｍＬ）に溶解させ、５０度で４時間撹拌した。その後、反応液を酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後に減圧濃縮した。得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０〜４０％  ０．５％炭酸水素アンモニウム水溶液／アセトニトリル）で精製し、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−メチル−Ｏ−（２−メチル−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ５５、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（ｔＢｕＯＴＨＰ）−ＯＨ）（２０  ｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ４９８  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．９４分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ２０）【０２５４】
４，４−ジメチル−２−フェニル−１，３−ジオキサン（化合物ａａ５６）の合成
2020122182.tif 000115
窒素雰囲気下、３−メチルブタンー１，３−ジオール（４０．０  ｇ、３８４  ｍｍｏｌ）のクロロホルム（４００  ｍＬ）溶液に、ジメトキシメチルベンゼン（８７．６  ｇ、５７６  ｍｍｏｌ）およびｐ−トルエンスルホン酸（３．５９  ｇ、１８．９  ｍｍｏｌ）を加え、０度にて１．５時間攪拌した。反応液を濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）で精製し、４，４−ジメチル−２−フェニル−１，３−ジオキサン（化合物ａａ５６）（７０．０  ｇ、９５％）を得た。【０２５５】
３−（ベンジルオキシ）−３−メチルブタンー１−オール（化合物ａａ５７）の合成
2020122182.tif 000116
窒素雰囲気下、上述の方法で得た４，４−ジメチル−２−フェニル−１，３−ジオキサン（化合物ａａ５６）（５．００  ｇ、２６．０  ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１３０  ｍＬ）溶液に、水素化ジイソブチルアルミニウムの１Ｍヘキサン溶液（１５６  ｍＬ、１５６  ｍｍｏｌ）を−５０度において加え、当該温度で１５分撹拌後、室温にて１時間攪拌した。メタノール加え反応を停止したのち、ジクロロメタンで２回抽出した。混合した有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）で精製し、３−（ベンジルオキシ）−３−メチルブタンー１−オール（化合物ａａ５７）（２．００  ｇ、４０％）を得た。【０２５６】
メチル  Ｏ−（３−（ベンジルオキシ）−３−メチルブチル）−Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ５８、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＢｎ）−ＯＭｅ）の合成
2020122182.tif 000117
窒素雰囲気下、（Ｓ）−アジリジン−１，２−ジカルボン酸２−メチル１−ベンジル（２５  ｇ、１０６  ｍｍｏｌ）および３−（ベンジルオキシ）−３−メチルブタンー１−オール（化合物ａａ５７）（３１．０  ｇ、１５９  ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１１３  ｍＬ）に溶解し０度に冷却したのち、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体（２．２６  ｇ、１５．９  ｍｍｏｌ）を加えて０度で３時間攪拌した。反応液に水を加えジクロロメタンで抽出後、飽和炭酸ナトリウム水溶液、飽和食塩水で有機層を洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）で精製し、メチルＯ−（３−（ベンジルオキシ）−３−メチルブチル）−Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ５８、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＢｎ）−ＯＭｅ）（２８．０  ｇ、５５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ４５２  （Ｍ＋Ｎａ）＋
保持時間：１．４６分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ１３）【０２５７】
Ｏ−（３−（ベンジルオキシ）−３−メチルブチル）−Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ５９、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＢｎ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000118
窒素雰囲気下、水酸化リチウム１水和物（１１．２  ｇ）塩化カルシウム（１１０  ｇ）を水（２７８  ｍＬ）に溶解させた。そこへメチル  Ｏ−（３−（ベンジルオキシ）−３−メチルブチル）−Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ５８、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＢｎ）−ＯＭｅ）（２８．７  ｇ、６８．４  ｍｍｏｌ）の２−プロパノール／テトラヒドロフラン溶液（２７８  ｍＬ／１１１５  ｍＬ）を室温で加え５時間攪拌した。２Ｍ塩酸水溶液をｐＨ２になるまで加え、有機層を除去したのち、水層を酢酸エチルで３回抽出した。得られた有機層を混合し無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらに減圧ポンプで減圧下乾燥させ、Ｏ−（３−（ベンジルオキシ）−３−メチルブチル）−Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ５９、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＢｎ）−ＯＨ）（２８．０  ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。【０２５８】
Ｏ−（３−ヒドロキシ−３−メチルブチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ６０、Ｈ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＨ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000119
水素雰囲気下、Ｏ−（３−（ベンジルオキシ）−３−メチルブチル）−Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ５９、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＢｎ）−ＯＨ）（２８．０  ｇ、６７．４  ｍｍｏｌ）とパラジウム炭素（６．００  ｇ、２０％  ｗ／ｗ）をメタノール（５００  ｍＬ）に溶解させ、室温で１６時間撹拌した。反応液をろ過したのち、溶媒を減圧下留去し、さらに減圧ポンプで減圧下乾燥させたのちに、メタノール／ジクロロメタン（１／５）から再結晶を行い、Ｏ−（３−ヒドロキシ−３−メチルブチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ６０、Ｈ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＨ）−ＯＨ）（７．００  ｇ、５４％）を得た。【０２５９】
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（３−ヒドロキシ−３−メチルブチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ６１、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＨ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000120
窒素雰囲気下、Ｏ−（３−ヒドロキシ−３−メチルブチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ６０、Ｈ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＨ）−ＯＨ）（２．８０  ｇ、１４．６  ｍｍｏｌ）、炭酸ナトリウム（４．６６  ｇ、４４．０  ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン（２４．５  ｍＬ）／水（５８．８  ｍＬ）に溶解させた後に、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（５．１８  ｇ、１５．４  ｍｍｏｌ）を加え、室温で３時間撹拌した。反応液をｔ−ブチルメチルエーテルで３回洗浄後、水層に２Ｍ塩酸水溶液をｐＨ２になるまで加え、酢酸エチルで３回抽出した、得られた有機層を混合し、飽和食塩水で有機層を洗浄したのち、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらに減圧ポンプで減圧下乾燥させ、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（３−ヒドロキシ−３−メチルブチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ６１、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＨ）−ＯＨ）（５．８０  ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。【０２６０】
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（３−メチル−３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ブチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ６２、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＴＨＰ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000121
窒素雰囲気下、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（３−ヒドロキシ−３−メチルブチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ６１、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＨ）−ＯＨ）（６．８０  ｇ、１６．５  ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（３５．０  ｍＬ）溶液に、ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（０．２０  ｇ、０．８２  ｍｍｏｌ）と３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（１０．３  ｍＬ）を加え、５０度にて５時間攪拌した。混合物を２５度まで冷却し、酢酸エチルを加えた。続いて飽和食塩水にて有機層を洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣（１１．０  ｇ）のうち、０．７５  ｇをテトラヒドロフラン（２０．０  ｍＬ）に溶解させ、次いでｐＨ６．８に調製した１．０Ｍリン酸緩衝液（２０．０  ｍＬ）を加えた。この混合物を５０度で４時間攪拌した。２５度まで冷却した後、酢酸エチルを加え、有機層と水層を分離した。水層に酢酸エチルを加えて抽出を行った後、得られた全ての有機層を混合し、飽和食塩水で有機層を洗浄したのち、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し得られた残渣を、逆相カラムクロマトグラフィー（０．５％炭酸水素アンモニウム水溶液／アセトニトリル）にて精製し、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（３−メチル−３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ブチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ６２、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＴＨＰ）−ＯＨ）（０．６０  ｇ、８０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ４９８  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７２分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ１１）【０２６１】
（Ｓ）−４−（（３−ヒドロキシ−３−メチルブトキシ）メチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（化合物ａａ６３）の合成
2020122182.tif 000122
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（３−ヒドロキシ−３−メチルブチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ６１、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＨ）−ＯＨ）（０．２０  ｇ、０．４８  ｍｍｏｌ）、パラホルムアルデヒド（０．０６  ｇ）およびトリフルオロ酢酸（０．６４  ｇ、５．６２  ｍｍｏｌ）をトルエン中（１０．０  ｍＬ）に溶解させ室温で１６時間攪拌した。反応液を減圧下留去し、得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル）にて精製し、（Ｓ）−４−（（３−ヒドロキシ−３−メチルブトキシ）メチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（化合物ａａ６３）（０．１６  ｇ、８０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ４４８  （Ｍ＋Ｎａ）＋
保持時間：２．４７分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ１４）【０２６２】
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（３−ヒドロキシ−３−メチルブチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ６４、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＨ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000123
窒素雰囲気下、（Ｓ）−４−（（３−ヒドロキシ−３−メチルブトキシ）メチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（化合物ａａ６３）（１．００  ｇ、２．３５  ｍｍｏｌ）、塩化アルミニウム（０．６３  ｇ、４．７０  ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（５０．０  ｍＬ）に、０度においてトリエチルシラン（０．７５  ｍＬ）をゆっくり滴下し、室温で２時間撹拌した。反応液をジクロロメタンで希釈し、２Ｍ塩酸水溶液および飽和食塩水で洗浄したのち、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル）にて精製し、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（３−ヒドロキシ−３−メチルブチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ６４、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（２−Ｍｅ−ＢｕＯＨ）−ＯＨ）（０．３０  ｇ、３０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ４５０  （Ｍ＋Ｎａ）＋
保持時間：２．１２分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ１５）【０２６３】
（Ｓ）−２−（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）−６−オキソヘキサン酸メチル（化合物ａａ６５）の合成
2020122182.tif 000124
窒素雰囲気下、市販の（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−６−ヒドロキシヘキサン酸（Ｂｏｃ−Ｎｌｅ（６−ＯＨ）−ＯＨ）（１０  ｇ、４０．４  ｍｍｏｌ）のトルエン／メタノール（９０  ｍＬ／６０  ｍＬ）溶液に２Ｍの（トリメチルシリル）ジアゾメタン／ヘキサン溶液（２４．２６  ｍＬ、４８．５  ｍｍｏｌ）を滴下しながら室温にて加え、終夜撹拌した。反応液をロータリーエバポレーターを用いて減圧濃縮することで得られた残渣にトルエン／メタノール（９０  ｍＬ／６０  ｍＬ）溶液を加え、溶解させた後、２Ｍの（トリメチルシリル）ジアゾメタン／ヘキサン溶液（２４．２６  ｍＬ、４８．５  ｍｍｏｌ）を滴下しながら室温にて加え、６時間撹拌した。反応液をロータリーエバポレーターを用いて減圧濃縮することで、粗生成物として（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−６−ヒドロキシヘキサン酸メチル（Ｂｏｃ−Ｎｌｅ（６−ＯＨ）−ＯＭｅ）（１３  ｇ）を得た。
得られた粗生成物である（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−６−ヒドロキシヘキサン酸メチル（Ｂｏｃ−Ｎｌｅ（６−ＯＨ）−ＯＭｅ）（１３  ｇ）に４Ｎ塩酸／１．４−ジオキサン溶液（５０  ｍＬ、２００  ｍｍｏｌ）を室温にて加え、６時間撹拌した。反応液をロータリーエバポレーターを用いて減圧濃縮することで、粗生成物として（Ｓ）−２−アミノ−６−ヒドロキシヘキサン酸メチル（Ｈ−Ｎｌｅ（６−ＯＨ）−ＯＭｅ）の塩酸塩（９．２  ｇ）を得た
得られた粗生成物である（Ｓ）−２−アミノ−６−ヒドロキシヘキサン酸メチル（Ｈ−Ｎｌｅ（６−ＯＨ）−ＯＭｅ）の塩酸塩（９．２  ｇ）のアセトニトリル溶液（１００  ｍＬ）に１，３−ジオキソイソインドリン−２−カルボン酸エチル（９．７４  ｇ、４４．４  ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（１５．５２  ｍＬ、８９  ｍｍｏｌ）を室温にて加え、終夜撹拌した。反応液をロータリーエバポレーターを用いて減圧濃縮することで、得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール）で精製することで（Ｓ）−２−（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）−６−ヒドロキシヘキサン酸メチル（１４．６  ｇ）を得た。
上述の（Ｓ）−２−（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）−６−ヒドロキシヘキサン酸メチル（７．０８  ｇ、２４．３  ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１００  ｍＬ）にデス−マーチンペルヨージナン（ＣＡＳ＃８７４１３−０９−０、１１．３４  ｇ、２６．７  ｍｍｏｌ）を０度にて加え、室温にて３時間撹拌した。反応液をジクロロメタンで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液／水（１／１）の溶液、飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過を行った後、減圧濃縮することで得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）で精製することで、（Ｓ）−２−（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）−６−オキソヘキサン酸メチル（化合物ａａ６５）（３．６  ｇ、４工程５１％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ＝  ２９０  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７０分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５）【０２６４】
（２Ｓ）−２−（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）−７，７，７−トリフルオロ−６−ヒドロキシヘプタン酸メチル（化合物ａａ６６）の合成
2020122182.tif 000125
窒素雰囲気下、（Ｓ）−２−（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）−６−オキソヘキサン酸メチル（化合物ａａ６５）（３．６２  ｇ、１２．５１  ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（５０  ｍＬ）に０度にて（トリフルオロメチル）トリメチルシラン（１．３９０  ｍＬ、９．３９  ｍｍｏｌ）、１Ｍのテトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）／テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液（０．６２６  ｍＬ、０．６２６  ｍｍｏｌ）を加え、０度にて１０分間撹拌した。反応液に（トリフルオロメチル）トリメチルシラン（１．３９０  ｍＬ、９．３９  ｍｍｏｌ）、１Ｍのテトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）／テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液（０．６２６  ｍＬ、０．６２６  ｍｍｏｌ）を０度にて加え、３０分撹拌した。さらに反応液に（トリフルオロメチル）トリメチルシラン（１．３９０  ｍＬ、９．３９  ｍｍｏｌ）、１Ｍのテトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）／テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液（０．６２６  ｍＬ、０．６２６  ｍｍｏｌ）を０度にて加え、２時間３０分撹拌した。反応液に１Ｎ塩酸水溶液（３７．５  ｍＬ）を０度にて加え、室温で２０分間撹拌した後、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過を行い、減圧濃縮することで得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液／メタノール）で精製することで、（２Ｓ）−２−（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）−７，７，７−トリフルオロ−６−ヒドロキシヘプタン酸メチル（化合物ａａ６６）（１．８  ｇ、４０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ＝  ３５８  （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．８１分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５）【０２６５】
（２Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−７，７，７−トリフルオロ−６−ヒドロキシヘプタン酸メチル（化合物ａａ６７、Ｆｍｏｃ−Ｈｎｌ（７−Ｆ３−６−ＯＨ）−ＯＭｅ）の合成
2020122182.tif 000126
上述の方法で得た、（２Ｓ）−２−（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）−７，７，７−トリフルオロ−６−ヒドロキシヘプタン酸メチル（化合物ａａ６６）（３．１  ｇ、８．６３  ｍｍｏｌ）のメタノール溶液（３０  ｍＬ）にヒドラジンの１水和物（１．２５８  ｍＬ、２５．９  ｍｍｏｌ）、酢酸（１．４８２  ｍＬ、２５．９  ｍｍｏｌ）を室温にて加え、終夜撹拌した。メタノールを除去するために、反応液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、得られた溶液をジメチルスルホキシドで希釈した後、逆相カラムクロマトグラフィー（１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液／メタノール）で精製することで、（２Ｓ）−２−アミノ−７，７，７−トリフルオロ−６−ヒドロキシヘプタン酸メチル（Ｈ−Ｈｎｌ（７−Ｆ３−６−ＯＨ）−ＯＭｅ）（２  ｇ）を得た。
上記の（２Ｓ）−２−アミノ−７，７，７−トリフルオロ−６−ヒドロキシヘプタン酸メチル（Ｈ−Ｈｎｌ（７−Ｆ３−６−ＯＨ）−ＯＭｅ）（２  ｇ、８．７３  ｍｍｏｌ）に水（２５  ｍＬ）、炭酸ナトリウム（２．９３  ｇ、３４．９  ｍｍｏｌ）、テトラヒドロフラン（５０  ｍＬ）、炭酸Ｎ−スクシンイミジル９−フルオレニルメチル（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（３．５３  ｇ、１０．４７  ｍｍｏｌ）を室温にて加え、反応液を２時間撹拌した。テトラヒドロフランを除去するために反応液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、酢酸エチル、１Ｎ塩酸水溶液を加え、酢酸エチルで２回抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムにて乾燥後、ろ過、減圧濃縮した。得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）、順相カラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール）で精製した後、さらに、逆相カラムクロマトグラフィー（１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液／メタノール）で精製することで得られたフラクションを集め、メタノールを減圧下留去し、酢酸エチルで２回抽出し、飽和硫酸水素カリウム溶液、飽和食塩水で洗浄した。得られた有機溶媒を減圧下留去しすることで、（２Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−７，７，７−トリフルオロ−６−ヒドロキシヘプタン酸メチル（化合物ａａ６７、Ｆｍｏｃ−Ｈｎｌ（７−Ｆ３−６−ＯＨ）−ＯＭｅ）（１．４  ｇ、２工程３６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ４５２  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２６６】
（２Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−７，７，７−トリフルオロ−６−ヒドロキシヘプタン酸（化合物ａａ６８、Ｆｍｏｃ−Ｈｎｌ（７−Ｆ３−６−ＯＨ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000127
塩化カルシウム（５．１６  ｇ、４６．５  ｍｍｏｌ）の水溶液（７．００  ｍＬ）に水酸化リチウムの１水和物（０．５２１  ｇ、１２．４０  ｍｍｏｌ）を室温にて加え、５分間撹拌した。（２Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−７，７，７−トリフルオロ−６−ヒドロキシヘプタン酸メチル（化合物ａａ６７、Ｆｍｏｃ−Ｈｎｌ（７−Ｆ３−６−ＯＨ）−ＯＭｅ）（１．４  ｇ、３．１０  ｍｍｏｌ）のイソプロパノール／テトラヒドロフラン溶液（２８  ｍＬ／７  ｍＬ）を室温にて滴下しながら加え、反応液を終夜撹拌した。反応液に１Ｎ塩酸水溶液を加え、ｔ−ブチルメチルエーテルで２回抽出し、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた後、ろ過、減圧濃縮を行うことで得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（２Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−７，７，７−トリフルオロ−６−ヒドロキシヘプタン酸（化合物ａａ６８、Ｆｍｏｃ−Ｈｎｌ（７−Ｆ３−６−ＯＨ）−ＯＨ）（９５０  ｍｇ、７０％）で得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ４３８．６  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２６７】
メチルＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ６９、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＨ）−ＯＭｅ）の合成
2020122182.tif 000128
窒素雰囲気下、別途合成した（Ｓ）−アジリジン−１，２−ジカルボン酸２−メチル１−（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル）（化合物ａａ７３、Ｆｍｏｃ−Ａｚｙ−ＯＭｅ）（０．２０  ｇ、０．６２  ｍｍｏｌ）と３，３，３−トリフルオロプロパン−１，２−ジオール（０．２４  ｇ、１．９  ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（３．０  ｍＬ）に三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体（ＢＦ３・ＯＥｔ２）（７．８  μＬ、０．０６２  ｍｍｏｌ）を０度にて加え、３０分間撹拌した。また、窒素雰囲気下、（Ｓ）−アジリジン−１，２−ジカルボン酸２−メチル１−（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル）（化合物ａａ７３、Ｆｍｏｃ−Ａｚｙ−ＯＭｅ）（５．０  ｇ、１５．４６  ｍｍｏｌ）と３，３，３−トリフルオロプロパン−１，２−ジオール（６．０３  ｇ、４６．４  ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（７７．０  ｍＬ）に三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体（ＢＦ３・ＯＥｔ２）（０．１９  ｍＬ、１．５５ｍｍｏｌ）を０度にて加え、３０分間撹拌した。さらに、窒素雰囲気下、（Ｓ）−アジリジン−１，２−ジカルボン酸２−メチル１−（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル）（化合物ａａ７３、Ｆｍｏｃ−Ａｚｙ−ＯＭｅ）（３．６  ｇ、１１．１３  ｍｍｏｌ）と３，３，３−トリフルオロプロパン−１，２−ジオール（４．３４  ｇ、３３．４  ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（５５．７  ｍＬ）に三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体（ＢＦ３・ＯＥｔ２）（０．１４  ｍＬ、１．１１  ｍｍｏｌ）を０度にて加え、３０分間撹拌した。
上記３つの反応液にそれぞれ飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えた後、全ての反応液を合わせ減圧下、大部分の有機溶媒を留去し、残った溶液に酢酸エチル（３００  ｍＬ）を加え抽出した。有機層を飽和食塩水溶液で洗浄した後、有機溶媒を減圧下留去した。得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）にて精製し、メチルＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ６９、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＨ）−ＯＭｅ）（６．５７  ｇ、５３％、純度９５％）および同化合物（３．１  ｇ、２５％、純度８７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ＝  ４５４  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．１８分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ４５）【０２６８】
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ７０、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＨ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000129
塩化カルシウム（２．０６  ｇ、１８．５  ｍｍｏｌ）を水（５．２  ｍＬ）に溶解し、水酸化リチウムの１水和物（２０７  ｍｇ、４．９４  ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１０分撹拌した。その溶液にメチルＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ６９、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＨ）−ＯＭｅ）（５６０  ｍｇ、１．２４  ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（５．１５  ｍＬ）、イソプロパノール（２０．６  ｍＬ）溶液を加え、室温にて２時間撹拌した。１Ｎ塩酸水溶液を加え反応を終結させた。さらに、０．１５  ｇ、１．１１  ｇ、０．４８  ｇ、０．９６  ｇのＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＨ）−ＯＭｅをそれぞれ用いて、同様に反応を実施した。全ての反応液を集め、減圧下大部分の溶媒を留去した。得られた溶液に酢酸エチルと水を加え、抽出した。有機層を減圧下留去した後、得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ７０、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＨ）−ＯＨ）（３．１０  ｇ、９８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ＝  ４６２  （Ｍ＋Ｎａ）＋
保持時間：２．２４分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ４６）【０２６９】
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−メチル−Ｏ−（３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ７１、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＨ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000130
窒素雰囲気下、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ７０、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＨ）−ＯＨ）（１．８４  ｇ、４．１９  ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（２０．９  ｍＬ）にパラホルムアルデヒド（１５１  ｍｇ、５．０３  ｍｍｏｌ）、無水硫酸マグネシウム（１．２６  ｇ、１０．５  ｍｍｏｌ）、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体（ＢＦ３・ＯＥｔ２）（５２６  μＬ、４．１９  ｍｍｏｌ）を加え、室温にて３時間撹拌した。不溶物を除去するため反応液をろ過した後、ジクロロメタン（１０  ｍＬ）で洗浄した。
ろ過した反応液にトリエチルシラン（２．０  ｍＬ、１２．６  ｍｍｏｌ）、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体（ＢＦ３・ＯＥｔ２）（１．５８  ｍＬ、１２．６  ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分間撹拌した。反応液を飽和食塩水で希釈し、ジクロロメタンで抽出した。得られた有機層を減圧濃縮した後、得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−メチル−Ｏ−（３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ７１、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＨ）−ＯＨ）（６４０  ｍｇ、３４％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ４５２  （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：２．３３分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ４７）【０２７０】
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（３，３，３−トリフルオロ−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ７２、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＴＨＰ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000131
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ７０、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＨ）−ＯＨ）（２．５２  ｇ、５．７４  ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１９．１２  ｍＬ）に３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（３．９２  ｍＬ、４３．０  ｍｍｏｌ）、ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（０．１４４  ｇ、０．５７４  ｍｍｏｌ）を加え、４０度にて終夜撹拌した。その後、反応液に水を加え、ジクロロメタンにて抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過し、減圧濃縮により溶媒を除去した。得られた残渣をテトラヒドロフラン（２９  ｍＬ）に溶解し、１Ｍのリン酸水溶液（ｐＨ＝８，２９  ｍＬ）を加え５０度で３時間撹拌した。反応液を水で希釈し、酢酸エチルで２回抽出した。有機層を合わせ飽和食塩水にて洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過し、減圧濃縮により溶媒を除去した。得られた残渣をジクロロメタン（６０  ｍＬ）とヘプタン（６０  ｍＬ）に溶解後、ジクロロメタンを減圧濃縮することで油状粗生成物を沈殿させた。ヘプタン溶液をデカンテーションにて除去した。この操作を２度繰り返した。得られた粗生成物を酢酸エチルに溶解し、０．０５Ｍリン酸水溶液で２回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過後、減圧濃縮しＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（３，３，３−トリフルオロ−２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ７２、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＴＨＰ）−ＯＨ）（２．８９  ｇ、９６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝５２２（Ｍ−Ｈ）−
保持時間：１．００分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５−２）【０２７１】
（Ｓ）−アジリジン−１，２−ジカルボン酸２−メチル１−（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル）（化合物ａａ７３、Ｆｍｏｃ−Ａｚｙ−ＯＭｅ）の合成
2020122182.tif 000132
窒素雰囲気下、市販の（Ｓ）−１−トリチルアジリジン−２−カルボン酸メチル（Ｔｒｔ−Ａｚｙ−ＯＭｅ）（５０  ｇ、１４５．６０  ｍｍｏｌ）のクロロホルム／メタノール溶液（１４５  ｍＬ／１４５  ｍＬ）に０度にてトリフルオロ酢酸（３３  ｍＬ）を滴下しながら加え、反応液を７時間撹拌した。反応液に０度にてＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（１２７  ｍＬ）、カルボノクロリド酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（Ｆｍｏｃ−Ｃｌ）（３６  ｇ、１３９．１６  ｍｍｏｌ）の１、４−ジオキサン溶液（１４５  ｍＬ）を滴下しながら加え、反応液を０度にて１時間３０分撹拌した。反応液の溶媒を減圧下留去し、酢酸エチルで希釈した後、水、飽和塩化アンモニウム水溶液で２回、飽和食塩水で２回洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った後、減圧下溶媒留去することで得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）で精製することで、（Ｓ）−アジリジン−１，２−ジカルボン酸２−メチル１−（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル）（化合物ａａ７３、Ｆｍｏｃ−Ａｚｙ−ＯＭｅ）（４０  ｇ、２工程８５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝３２４（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２７２】
ｔｅｒｔ−ブチル  Ｎ２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ５−メチル−Ｌ−グルタミナート（化合物ａａ７４、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｍｅ）−ＯｔＢｕ）の合成
2020122182.tif 000133
氷冷下、（Ｓ）−４−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−５−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−５−オキソペンタン酸（Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ）（２０．０  ｇ、４７．０  ｍｍｏｌ）および１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）（８．８  ｇ）のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（３００  ｍＬ）溶液に、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ・ＨＣｌ）（１３．５  ｇ）を加え、１０分間撹拌した。反応液の温度を５度以下に保ちつつ、２ｍｏｌ／Ｌのメチルアミンのテトラヒドロフラン溶液（２９．５  ｍＬ）を加え、室温で１６時間攪拌した。反応液をヘキサン／酢酸エチル（１／１、１４００  ｍＬ）と塩化アンモニウム水溶液（５００  ｍＬ）で希釈し、有機層を分離した。有機層を炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒留去し、ｔｅｒｔ−ブチルＮ２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ５−メチル−Ｌ−グルタミナート（化合物ａａ７４、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｍｅ）−ＯｔＢｕ）（３６．２  ｇ）を粗生成物として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ４３９  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．０５分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ２３）【０２７３】
Ｎ２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ５−メチル−Ｌ−グルタミン（化合物ａａ７５、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｍｅ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000134
ｔｅｒｔ−ブチル  Ｎ２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ５−メチル−Ｌ−グルタミナート（化合物ａａ７４、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｍｅ）−ＯｔＢｕ）（４３．６  ｇ）のジクロロメタン（ＤＣＭ）（３００  ｍＬ）溶液に、氷冷下、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（３００  ｍＬ）を滴下し、室温で１６時間攪拌した。減圧下溶媒留去し、得られた残渣にジエチルエーテルと炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、有機相を分離した。得られた水層を５ｍｏｌ／Ｌの塩酸水溶液でｐＨを１から２の間に調整し、沈殿した固体をろ取し、Ｎ２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ５−メチル−Ｌ−グルタミン（化合物ａａ７５、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｍｅ）−ＯＨ）（２６．７  ｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ３８３  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．７５分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ５）【０２７４】
２−ブロモーＮ−ｔｅｒｔ−ブチルアセトアミド（化合物ａａ７６）の合成
2020122182.tif 000135
窒素雰囲気下、２−ブロモ酢酸（５０．０  ｇ、３６０  ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（８０．０  ｍＬ）溶液に、２−メチルプロパン−２−アミン（２６．７  ｇ、３６５  ｍｍｏｌ）、Ｎ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（１３９  ｇ、１．０８  ｍｏｌ）およびプロピルホスホン酸無水物（Ｔ３Ｐ）（２２９  ｇ、７２０  ｍｍｏｌ）を加え、室温にて２時間攪拌した。反応液に水を加え酢酸エチルで２回抽出し、得られた有機層を混合し、飽和食塩水で有機層を洗浄したのち、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、得られた残渣をヘキサンで洗浄し、２−ブロモ−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルアセトアミド（化合物ａａ７６、３６．５  ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。【０２７５】
Ｏ−（２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−トリチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ７７、Ｔｒｔ−Ｓｅｒ（ＮｔＢｕ−Ａｃａ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000136
窒素雰囲気下、トリチル−Ｌ−セリン（Ｔｒｔ−Ｓｅｒ−ＯＨ）のトリエチルアミン塩（１．５０  ｇ、４．３２  ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（２．００  ｍＬ）溶液に、水素化ナトリウム（０．５２  ｇ、１３．０  ｍｍｏｌ、６０％オイルディスパージョン）を加え、室温で２時間撹拌した。そこへ２−ブロモ−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルアセトアミド（化合物ａａ７６）（０．９６  ｇ）のＤＭＦ（１．００  ｍＬ）溶液を加え、室温で１時間撹拌した。反応液に水を加え酢酸エチルで２回抽出し、得られた有機層を混合し、飽和食塩水で有機層を洗浄したのち、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらに減圧ポンプで減圧下乾燥させ、Ｏ−（２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−トリチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ７７、Ｔｒｔ−Ｓｅｒ（ＮｔＢｕ−Ａｃａ）−ＯＨ）（１．６０  ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。【０２７６】
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−２−オキソエチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ７８、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＮｔＢｕ−Ａｃａ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000137
窒素雰囲気下、Ｏ−（２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−トリチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ７７、Ｔｒｔ−Ｓｅｒ（ＮｔＢｕ−Ａｃａ）−ＯＨ）（１５．３  ｇ、３３．２  ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１５０  ｍＬ）／水（１５０  ｍＬ）溶液に、４度にてトリフルオロ酢酸（１１．２  ｇ、９９．１  ｍｍｏｌ）を加え同温度において２時間攪拌した。水層を分離し、Ｎ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）をｐＨ７になるまで加えた。そこへ１，４−ジオキサン（１５０  ｍＬ）を加えたのち、Ｎ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（１４．９  ｇ、１１５  ｍｍｏｌ）およびＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（２２．３  ｇ、２３１  ｍｍｏｌ）を加え、２５度で１６時間撹拌した。反応液に水を加え、ヘキサンで２回洗浄したのち、水層に濃塩酸をｐＨ２になるまで加え、酢酸エチルで２回抽出した。得られた有機層を混合し、飽和食塩水で有機層を洗浄したのち、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し得られた残渣を、逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製しＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−２−オキソエチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ７８、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＮｔＢｕ−Ａｃａ）−ＯＨ）（１４．２  ｇ、９８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ４４１  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．０８分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ９）【０２７７】
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ７９、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（ＮｔＢｕ−Ａｃａ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000138
窒素雰囲気下、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−２−オキソエチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ７８、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＮｔＢｕ−Ａｃａ）−ＯＨ）（１．０  ｇ、２．２７０  ｍｍｏｌ）、パラホルムアルデヒド（２０３  ｍｇ、６．８１  ｍｍｏｌ）、（（１Ｓ，４Ｒ）−７，７−ジメチル−２−オキソビシクロ［２．２．１］ヘプタン−１−イル）メタンスルホン酸（２６  ｍｇ、０．１１４  ｍｍｏｌ）のトルエン溶液（１．２  ｍＬ）を８０度にて１時間撹拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで３回抽出し、飽和食塩水で洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、ろ過、減圧濃縮することで、（Ｓ）−４−（（２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−２−オキソエトキシ）メチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（１．０３５  ｇ）を粗生成物として得た。
窒素雰囲気下、上述の粗生成物である（Ｓ）−４−（（２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−２−オキソエトキシ）メチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（１．０３５  ｇ）のジクロロメタン（ＤＣＭ）溶液（２．８６  ｍＬ）にトリエチルシラン（Ｅｔ３ＳｉＨ）（１．０９６  ｍＬ、６．８６  ｍｍｏｌ）と水（４０  μＬ）を加え室温にて２分間撹拌した後、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体（ＢＦ３・ＯＥｔ２）（０．５８０  ｍＬ、４．５７  ｍｍｏｌ）を加え、２４時間室温にて撹拌した。反応液に飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、室温で４０分撹拌した後、ジクロロメタン（ＤＣＭ）で２回抽出した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮することで得られた残渣にアセトニトリルを加え、ヘキサンで洗浄した。アセトニトリルを減圧下留去することで、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−セリン（化合物ａａ７９、Ｆｍｏｃ−ＭｅＳｅｒ（ＮｔＢｕ−Ａｃａ）−ＯＨ）（０．９４４９  ｇ、２工程９２％）を得た
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ＝  ４５５  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２７８】
２−ブロモ−Ｎ−メチルアセトアミド（化合物ａａ８０）の合成
2020122182.tif 000139
窒素雰囲気下、炭酸カリウム（１１．６１  ｇ、８４  ｍｍｏｌ）にジクロロメタン（１００  ｍＬ）を加えた後、室温にてメチルアミン塩酸塩（２．８４  ｇ、４２．０  ｍｍｏｌ）を加えた。反応液に０度にて臭化  ２−ブロモアセチル（３．４７  ｍＬ、４０  ｍｍｏｌ）を滴下しながら加え、室温にて１時間撹拌した。反応液に水（２０  ｍＬ）を加え、ジクロロメタンで抽出した後、減圧下濃縮し、オイルポンプで乾燥させ２−ブロモ−Ｎ−メチルアセトアミド（化合物ａａ８０）（５．２  ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。【０２７９】
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ８１、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＮＭｅ−Ａｃａ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000140
窒素雰囲気下、トリチル−Ｌ−セリン（Ｔｒｔ−Ｓｅｒ−ＯＨ）のトリエチルアミン塩（１．８０  ｇ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（２．００  ｍＬ）溶液に、１．９Ｍナトリウムビス（トリメチルシリル）アミド（ＮａＨＭＤＳ）のＴＨＦ溶液（４．８６  ｍＬ、９．２３  ｍｍｏｌ）を０度にて加え、１５分間撹拌した。反応液に２−ブロモ−Ｎ−メチルアセトアミド（化合物ａａ８０）（１．２２  ｇ）のＴＨＦ（２．００  ｍＬ）溶液を０度にて加え、室温で１５分間撹拌した。反応液を酢酸エチル（３００  ｍＬ）、水（６０  ｍＬ）、１Ｎ塩酸水溶液（４．８  ｍＬ）の混合液に加え、得られた有機層を減圧下留去し粗生成物を得た。また、窒素雰囲気下、トリチル−Ｌ−セリン（Ｔｒｔ−Ｓｅｒ−ＯＨ）のトリエチルアミン塩（１．８０  ｇ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（２．００  ｍＬ）溶液に、１．９Ｍナトリウムビス（トリメチルシリル）アミド（ＮａＨＭＤＳ）のＴＨＦ溶液（４．６５  ｍＬ、８．８３  ｍｍｏｌ）を０度にて加え、１５分間撹拌した。反応液に２−ブロモ−Ｎ−メチルアセトアミド（化合物ａａ８０）（１．２２  ｇ）のＴＨＦ（２．００  ｍＬ）溶液を０度にて加え、室温で１５分間撹拌した。反応液を酢酸エチル（３００  ｍＬ）、水（６０  ｍＬ）、１Ｎ塩酸水溶液（４．８  ｍＬ）の混合液に加え、得られた有機層を減圧下留去し粗生成物を得た。上記２つの粗生成物を合わせて、逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、Ｏ−（２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−トリチル−Ｌ−セリン（Ｔｒｔ−Ｓｅｒ（ＮＭｅ−Ａｃａ）−ＯＨ）（２．５  ｇ）を得た。
得られたＯ−（２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−トリチル−Ｌ−セリン（Ｔｒｔ−Ｓｅｒ（ＮＭｅ−Ａｃａ）−ＯＨ）（２．４  ｇ、５．７３  ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（ＤＣＭ）溶液（２．８７  ｍＬ）にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（１．３２５  ｍＬ、１７．２０  ｍｍｏｌ）を０度にて加え、３０分間撹拌した。反応液に水（２．８７  ｍＬ）を加え、得られた水層を逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル）で精製することで、Ｏ−（２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル）−Ｌ−セリン（Ｈ−Ｓｅｒ（ＮｔＢｕ−Ａｃａ）−ＯＨ）（９００  ｍｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。
得られた粗生成物であるＯ−（２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル）−Ｌ−セリン（Ｈ−Ｓｅｒ（ＮｔＢｕ−Ａｃａ）−ＯＨ）（９００  ｍｇ）に水（４．２  ｍＬ）、Ｎ−エチル−Ｎ−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（２．２３１  ｍＬ、１２．７７  ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン溶液（１４．０  ｍＬ）を室温にて加えた後、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（１．７２３  ｇ、５．１１  ｍｍｏｌ）を室温にて加え、３０分間撹拌した。反応液を酢酸エチル（１５０  ｍＬ）、水（３０  ｍＬ）、１Ｎ塩酸水溶液（３．０  ｍＬ）の混合液に加え、得られた有機層を減圧下留去した。得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル）にて精製し、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ８１、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＮＭｅ−Ａｃａ）−ＯＨ）（１．８  ｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ３９９  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．６３分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２８０】
メチル  Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（３−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ８２、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（ｎＰｒＯＨ）−ＯＭｅ）の合成
2020122182.tif 000141
窒素雰囲気下、市販の（Ｓ）−アジリジン−１，２−ジカルボン酸２−メチル１−ベンジル（Ｃｂｚ−Ａｚｙ−ＯＭｅ）（５００  ｍｇ、２．１２５  ｍｍｏｌ）およびプロパン−１，３−ジオール（８１０  ｍｇ、１０．６４５  ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１０  ｍＬ）に溶解し０度に冷却したのち、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体（ＢＦ３・Ｅｔ２Ｏ）（４６  ｍｇ、０．３２４  ｍｍｏｌ）を加えて０度で４時間攪拌した。反応液にジクロロメタンを加え、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル）にて精製し、メチル  Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（３−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ８２、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（ｎＰｒＯＨ）−ＯＭｅ）（３９０  ｍｇ、５９％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ３３４  （Ｍ＋Ｎａ）＋
保持時間：１．０９分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ１３）【０２８１】
Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（３−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ８３、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（ｎＰｒＯＨ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000142
窒素雰囲気下、水酸化リチウム（３．１４  ｇ、１３１．０４９  ｍｍｏｌ）、塩化カルシウム（５４．５４  ｇ、４９１．４３４  ｍｍｏｌ）に水（１３４  ｍＬ）、２−プロパノール（５３８  ｍＬ）を室温にて加え、撹拌した後、メチル  Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（３−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ８２、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（ｎＰｒＯＨ）−ＯＭｅ）（１０．２  ｇ、３２．７６２  ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（１３４  ｍＬ）を室温にて加え、５時間攪拌した。反応液に６Ｎ塩酸水溶液をｐＨ３になるまで加え、有機溶媒を減圧下除去した後、水層を酢酸エチルで抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらに減圧ポンプで減圧下乾燥させ、Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（３−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ８３、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（ｎＰｒＯＨ）−ＯＨ）（１０．６  ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。【０２８２】
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（３−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ８４、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｎＰｒＯＨ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000143
水素雰囲気下（〜３  ａｔｍ）、上述のように得た粗生成物であるＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（３−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ８３、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（ｎＰｒＯＨ）−ＯＨ）（１３  ｇ）、１０％  パラジウム炭素（４．６５  ｇ）、メタノール（１３０  ｍＬ）の混合物を室温で１６時間撹拌した。反応液をろ過した後、溶媒を減圧下留去し、得られた残渣を酢酸エチルで再結晶することで、Ｏ−（３−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（Ｈ−Ｓｅｒ（ｎＰｒＯＨ）−ＯＨ）（５．５  ｇ、２工程７８％）を得た。
窒素雰囲気下、Ｏ−（３−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（Ｈ−Ｓｅｒ（ｎＰｒＯＨ）−ＯＨ）（５．５  ｇ、３３．７０７  ｍｍｏｌ）、炭酸水素ナトリウム（８．６  ｇ、１０２  ｍｍｏｌ）の水／１，４−ジオキサン（５０  ｍＬ／１３０  ｍＬ）溶液にＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（１１．９４  ｇ、３５．３９６  ｍｍｏｌ）を室温にて加え、４時間撹拌した。反応液に水を加え、ｔ−ブチルメチルエーテルで２回洗浄した後、水層のｐＨが３になるまで６Ｎ塩酸水溶液を加え、ｔ−ブチルメチルエーテルで抽出した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過後、溶媒を減圧下留去し、さらに減圧ポンプで減圧下乾燥させた。得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル）にて精製し、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（３−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ８４、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｎＰｒＯＨ）−ＯＨ）（８  ｇ、６７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ３８６  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．６１分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ５０）【０２８３】
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ８５、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｎＰｒＯＴＨＰ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000144
窒素雰囲気下、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（３−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ８４、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｎＰｒＯＨ）−ＯＨ）（１  ｇ、２．５９５  ｍｍｏｌ）と３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（１．５  ｇ、１７．８３  ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（５  ｍＬ）溶液に、ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（ＰＰＴＳ）（３２．６  ｍｇ、０．１３０  ｍｍｏｌ）を加え、５０度にて４時間攪拌した。反応液を冷却し、ｔ−ブチルメチルエーテルを加え、飽和食塩水で洗浄した後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った。溶媒を減圧下留去することで、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ８５、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｎＰｒＯＴＨＰ）−ＯＨ）とテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル  Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリナート（Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｎＰｒＯＴＨＰ）−ＯＴＨＰ）（１．５  ｇ）を混合物として得た。
上述のようにして得たＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ８５、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｎＰｒＯＴＨＰ）−ＯＨ）とテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル  Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリナート（Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｎＰｒＯＴＨＰ）−ＯＴＨＰ）の混合物（１．５  ｇ）にテトラヒドロフラン（８  ｍＬ）、１Ｍリン酸緩衝液（８  ｍＬ、ｐＨ  ８．０）を加え、５０度で３時間攪拌した。反応液を冷却し、ｔ−ブチルメチルエーテルを加え、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った後、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をジエチルエーテル／ヘプタンで再結晶することで、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ８５、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｎＰｒＯＴＨＰ）−ＯＨ）をナトリウム塩（１  ｇ）として得た。
上述のようにして得たＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ８５、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｎＰｒＯＴＨＰ）−ＯＨ）のナトリウム塩（５  ｇ）にｔ−ブチルメチルエーテル（１００  ｍＬ）、０．０５Ｍリン酸水溶液（２５０  ｍＬ）を加え、室温で５分間撹拌した。反応液をｔ−ブチルメチルエーテルで２回抽出した後、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った。溶媒を減圧下留去することで、粗生成物としてＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ８５、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｎＰｒＯＴＨＰ）−ＯＨ）（４．９  ｇ）を得た。これをさらなる精製をすることなくペプチド合成に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ＝  ４６８  （Ｍ―Ｈ）―
保持時間：０．８４分（分析条件  ＳＱＤＦＡ０５）【０２８４】
メチル  Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルプロピル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ８６、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ２−ＰｒＯＨ）−ＯＭｅ）の合成
2020122182.tif 000145
窒素雰囲気下、市販の（Ｓ）−アジリジン−１，２−ジカルボン酸２−メチル１−ベンジル（Ｃｂｚ−Ａｚｙ−ＯＭｅ）（３０  ｇ、１２７．５３  ｍｍｏｌ）および２，２−ジメチルプロパン−１，３−ジオール（２６．５６  ｇ、２５５．０６  ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（４００  ｍＬ）に溶解し、０度に冷却した後、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体（ＢＦ３・Ｅｔ２Ｏ）（２．７２  ｇ、１９．１２９  ｍｍｏｌ）を滴下しながら加え１時間攪拌した。反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄した後、得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行い、減圧下溶媒を留去した。得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル）にて精製し、メチル  Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルプロピル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ８６、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ２−ＰｒＯＨ）−ＯＭｅ）（２６．７  ｇ、６２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ３２６  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．１２分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ１３）【０２８５】
Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ８７、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000146
窒素雰囲気下、水酸化リチウムの１水和物（１３．１６  ｇ、３１３．５０５  ｍｍｏｌ）、塩化カルシウム（１３０．４８  ｇ、１１７５．６４６  ｍｍｏｌ）に水（２６０  ｍＬ）、２−プロパノール（１０５０  ｍＬ）を室温にて加え、撹拌した後、メチル  Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルプロピル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ８６、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ２−ＰｒＯＨ）−ＯＭｅ）（２６．６  ｇ、７８．３７６  ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（２６０  ｍＬ）を室温にて加え、２時間攪拌した。反応液に６Ｎ塩酸水溶液をｐＨ３になるまで加え、有機溶媒を減圧下除去した後、水層を酢酸エチルで抽出した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過を行い、得られた溶媒を減圧下留去することで、Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ８７、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）（２５．０  ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。【０２８６】
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ８８、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000147
水素雰囲気下（〜３  ａｔｍ）、上述のように得た粗生成物であるＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｏ−（３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ８７、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）（２５．０  ｇ）、１０％  パラジウム炭素（５  ｇ、２０％  ｗ／ｗ）、メタノール（２５０  ｍＬ）の混合物を室温で１６時間撹拌した。反応液をろ過した後、溶媒を減圧下留去し、得られた固体を酢酸エチルで３回洗浄することで、Ｏ−（３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルプロピル）−Ｌ−セリン（Ｈ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）（１３．１  ｇ、２工程８７％）を得た。
窒素雰囲気下、Ｏ−（３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルプロピル）−Ｌ−セリン（Ｈ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）（１３  ｇ、６７．９８２  ｍｍｏｌ）、炭酸水素ナトリウム（１７．１３  ｇ、２０３．９４６  ｍｍｏｌ）の水／１，４−ジオキサン（２６０  ｍＬ／１０４  ｍＬ）溶液にＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（２４．０８  ｇ、７１．３８１  ｍｍｏｌ）を室温にて加え、２時間撹拌した。反応液に水を加え、ｔ−ブチルメチルエーテルで２回洗浄した後、水層に６Ｎ塩酸水溶液をｐＨ３になるまで加え、ｔ−ブチルメチルエーテルで抽出した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過後、溶媒を減圧下留去し、さらに減圧ポンプで減圧下乾燥させた。得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル）にて精製し、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ８８、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）（２６．５  ｇ、９４％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ４１４  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．４４分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ５１）【０２８７】
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２，２−ジメチル−３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ８９、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000148
窒素雰囲気下、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルプロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ８８、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ２−ＰｒＯＨ）−ＯＨ）（２０  ｇ、４８．３７１  ｍｍｏｌ）と３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（２８．４８  ｇ、３３８．５９８  ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１６１  ｍＬ）溶液に、ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（ＰＰＴＳ）（６０７．７９  ｍｇ、２．４１９  ｍｍｏｌ）を加え、５０度にて３時間攪拌した。反応液を冷却し、ｔ−ブチルメチルエーテルを加え、飽和食塩水で洗浄した後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った。溶媒を減圧下留去することで、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２，２−ジメチル−３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ８９、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＨ）とテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル  Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２，２−ジメチル−３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリナート（Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＴＨＰ）を混合物として得た。
上述のようにして得たＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２，２−ジメチル−３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ８９、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＨ）とテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル  Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２，２−ジメチル−３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリナート（Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＴＨＰ）の混合物にテトラヒドロフラン（１６１  ｍＬ）、１Ｍリン酸緩衝液（１６１  ｍＬ、ｐＨ  ８．０）を加え、５０度で３時間攪拌した。反応液を冷却し、ｔ−ブチルメチルエーテルを加え、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った後、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をジエチルエーテル／ヘプタンで再結晶することで、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２，２−ジメチル−３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ８９、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＨ）をナトリウム塩（１７．１  ｇ）として得た。
上述のようにして得たＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２，２−ジメチル−３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ８９、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＨ）のナトリウム塩（８  ｇ）にｔ−ブチルメチルエーテル（１２０  ｍＬ）、０．０５Ｍリン酸水溶液（３５０  ｍＬ）を加え、室温で５分間撹拌した。反応液をｔ−ブチルメチルエーテルで抽出し、飽和食塩水で２回洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った。溶媒を減圧下留去することで、粗生成物としてＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２，２−ジメチル−３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ８９、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（２−Ｍｅ２−ＰｒＯＴＨＰ）−ＯＨ）（７  ｇ）を得た。これをさらなる精製をすることなくペプチド合成に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ＝  ４９６  （Ｍ―Ｈ）―
保持時間：０．９７分（分析条件  ＳＱＤＦＡ０５）【０２８８】
（４Ｓ）−４−メチル−２−フェニル−１，３−ジオキサン（化合物ａａ９０）の合成
2020122182.tif 000149
窒素雰囲気下、（Ｓ）−ブタン−１，３−ジオール（２５  ｇ、２７７．４０７  ｍｍｏｌ、ＣＡＳ＃２４６２１−６１−２）と（ジメトキシメチル）ベンゼン（６３．３７  ｇ、４１６．６８８  ｍｍｏｌ）のクロロホルム（ＣＨＣｌ３）溶液（２１０  ｍＬ）に０度にてｐ−トルエンスルホン酸（ＴｓＯＨ）（２．６４  ｇ、１３．８８０  ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１６時間撹拌した。反応液にジクロロメタンを加え、炭酸ナトリウム水溶液、水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行い、減圧下溶媒留去した。得られた残渣をエタノール（ＥｔＯＨ）（１３５  ｍＬ）に溶解し、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）（５．２５  ｇ、１３８．７７８  ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分間撹拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２１０  ｍＬ）を加え、室温で２時間撹拌した後、酢酸エチルを加えて抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、ろ過を行い、減圧下溶媒留去した。得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）で精製し、（４Ｓ）−４−メチル−２−フェニル−１，３−ジオキサン（化合物ａａ９０）（４２．７  ｇ、８６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  １７９  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．２６分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ１３）【０２８９】
（Ｓ）−３−（ベンジルオキシ）ブタン−１−オール（化合物ａａ９１）の合成
2020122182.tif 000150
窒素雰囲気下、上述のようにして得た（４Ｓ）−４−メチル−２−フェニル−１，３−ジオキサン（化合物ａａ９０）（３５  ｇ、１９６．６２９  ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（９６０  ｍＬ）にー５０度にて１Ｍ  水素化ジイソブチルアルミニウム（ＤＩＢＡＬ）のヘキサン溶液（３９０  ｍＬ、３９０  ｍｍｏｌ）を滴下しながら加えた。反応液を−５０度で３０分間撹拌した後、室温でさらに２時間撹拌した。反応液にメタノール（ＭｅＯＨ）をー３０度で加え、反応を停止させた後、水を加えた。反応液がｐＨ＝２になるまで６Ｎ塩酸水溶液を加えた後、ジクロロメタンで抽出し、得られた有機層を飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った。減圧下溶媒を留去し、得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）で精製し、（Ｓ）−３−（ベンジルオキシ）ブタン−１−オール（化合物ａａ９１）（２１．６  ｇ、６１％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  １８１  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．１６分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ１３）【０２９０】
メチル  Ｏ−（（Ｓ）−３−（ベンジルオキシ）ブチル）−Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ９２、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＢｕＯＢｎ）−ＯＭｅ）の合成
2020122182.tif 000151
窒素雰囲気下、（Ｓ）−アジリジン−１，２−ジカルボン酸２−メチル１−ベンジル（Ｃｂｚ−Ａｚｙ−ＯＭｅ）（１８．８  ｇ、８０．０  ｍｍｏｌ）および上述のようにして得た（Ｓ）−３−（ベンジルオキシ）ブタン−１−オール（化合物ａａ９１）（２１．６  ｇ、１２０  ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１９０  ｍＬ）に溶解し、０度にて三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体（ＢＦ３・Ｅｔ２Ｏ）（１．５１  ｍＬ、１１．９７６  ｍｍｏｌ）を加えて室温で２時間攪拌した。反応液にジクロロメタンを加え、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った後、溶媒を減圧下留去し、得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル）にて精製し、メチル  Ｏ−（（Ｓ）−３−（ベンジルオキシ）ブチル）−Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ９２、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＢｕＯＢｎ）−ＯＭｅ）（１５  ｇ、３０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ４１６  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．３９分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ１３）【０２９１】
Ｏ−（（Ｓ）−３−（ベンジルオキシ）ブチル）−Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ９３、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＢｕＯＢｎ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000152
窒素雰囲気下、水酸化リチウムの１水和物（６．１  ｇ、１４５．２３８  ｍｍｏｌ）、塩化カルシウム（６０．２  ｇ、５４２．３４２  ｍｍｏｌ）に水（１５５  ｍＬ）、２−プロパノール（６１５  ｍＬ）を室温にて加え、撹拌した後、上述のようにして得たメチル  Ｏ−（（Ｓ）−３−（ベンジルオキシ）ブチル）−Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ９２、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＢｕＯＢｎ）−ＯＭｅ）（１５  ｇ、３６．１４４  ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（１５５  ｍＬ）を室温にて加えた。反応液を室温にて５時間攪拌した後、反応液のｐＨが３になるまで、６Ｎ塩酸水溶液を加えた。有機溶媒を減圧下除去した後、水層を酢酸エチルで抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った後、溶媒を減圧下留去し、さらに減圧ポンプで減圧下乾燥させ、Ｏ−（（Ｓ）−３−（ベンジルオキシ）ブチル）−Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ９３、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＢｕＯＢｎ）−ＯＨ）（１６．５  ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。【０２９２】
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｓ）−３−ヒドロキシブチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ９４、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＢｕＯＨ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000153
水素雰囲気下（〜  ３  ａｔｍ）、上述のように得た粗生成物であるＯ−（（Ｓ）−３−（ベンジルオキシ）ブチル）−Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ９３、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＢｕＯＢｎ）−ＯＨ）（１６．５  ｇ）、１０％  パラジウム炭素（８．２５  ｇ、５０％  ｗ／ｗ）、メタノール（２８０  ｍＬ）の混合物を室温で１６時間撹拌した。反応液をろ過した後、溶媒を減圧下留去し、得られた固体を酢酸エチルで３回洗浄することで、Ｏ−（（Ｓ）−３−ヒドロキシブチル）−Ｌ−セリン（Ｈ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＢｕＯＨ）−ＯＨ）（５．８５  ｇ）を得た。
窒素雰囲気下、上述のようにして得たＯ−（（Ｓ）−３−ヒドロキシブチル）−Ｌ−セリン（Ｈ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＢｕＯＨ）−ＯＨ）（５．８５  ｇ、３３．０３  ｍｍｏｌ）、炭酸水素ナトリウム（８．３０  ｇ、９８．８１  ｍｍｏｌ）の水／１，４−ジオキサン（１３５  ｍＬ／５５  ｍＬ）溶液にＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（１１．７  ｇ、３４．６８１５  ｍｍｏｌ）を室温にて加え、２時間撹拌した。反応液に水を加え、ｔ−ブチルメチルエーテルで２回洗浄した後、水層のｐＨが３になるまで６Ｎ塩酸水溶液を加え、ｔ−ブチルメチルエーテルで抽出した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過後、溶媒を減圧下留去し、さらに減圧ポンプで減圧下乾燥させた。得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル）にて精製し、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｓ）−３−ヒドロキシブチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ９４、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＢｕＯＨ）−ＯＨ）（８．１  ｇ、６１％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ４００  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．２１分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ１３）【０２９３】
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（３Ｓ）−３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ブチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ９５、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＢｕＯＴＨＰ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000154
窒素雰囲気下、上述のようにして得たＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｓ）−３−ヒドロキシブチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ９４、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＢｕＯＨ）−ＯＨ）（８．１０  ｇ、２０．２９２  ｍｍｏｌ）と３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（１１．９４  ｇ、１４１．９４  ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（９０  ｍＬ）溶液に、ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（ＰＰＴＳ）（２５５  ｍｇ、１．０１４  ｍｍｏｌ）を加え、５０度にて３時間攪拌した。反応液を冷却し、ｔ−ブチルメチルエーテルを加え、飽和食塩水で洗浄した後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った。溶媒を減圧下留去することで、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（３Ｓ）−３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ブチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ９５、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＢｕＯＴＨＰ）−ＯＨ）とテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル  Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（３Ｓ）−３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ブチル）−Ｌ−セリナート（Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＢｕＯＴＨＰ）−ＯＴＨＰ）を混合物として得た。
上述のようにして得たＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（３Ｓ）−３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ブチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ９５、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＢｕＯＴＨＰ）−ＯＨ）とテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル  Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（３Ｓ）−３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ブチル）−Ｌ−セリナート（Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＢｕＯＴＨＰ）−ＯＴＨＰ）の混合物にテトラヒドロフラン（９０  ｍＬ）、１Ｍリン酸緩衝液（９０  ｍＬ、ｐＨ  ８．０）を加え、５０度で３時間攪拌した。反応液を冷却し、ｔ−ブチルメチルエーテルを加え、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った後、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をジエチルエーテル／ヘプタンで再結晶することで、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（３Ｓ）−３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ブチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ９５、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＢｕＯＴＨＰ）−ＯＨ）をナトリウム塩（７．４  ｇ）として得た。
上述のようにして得たＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（３Ｓ）−３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ブチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ９５、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＢｕＯＴＨＰ）−ＯＨ）のナトリウム塩（７．４  ｇ）にｔ−ブチルメチルエーテル（１３０  ｍＬ）、０．０５Ｍリン酸水溶液（３６０  ｍＬ）を加え、室温で５分間撹拌した。反応液をｔ−ブチルメチルエーテルで抽出し、飽和食塩水で２回洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った。溶媒を減圧下留去することで、粗生成物としてＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（３Ｓ）−３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ブチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ９５、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＢｕＯＴＨＰ）−ＯＨ）（６．９  ｇ）を得た。これをさらなる精製をすることなくペプチド合成に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ＝  ４８２  （Ｍ―Ｈ）―
保持時間：０．８７分、０．８８分（分析条件  ＳＱＤＦＡ０５）【０２９４】
（４Ｒ）−４−メチル−２−フェニル−１，３−ジオキサン（化合物ａａ９６）の合成
2020122182.tif 000155
窒素雰囲気下、（Ｒ）−ブタン−１，３−ジオール（２０  ｇ、２２１．９２１  ｍｍｏｌ、ＣＡＳ＃６２９０−０３−５）と（ジメトキシメチル）ベンゼン（５０．６６  ｇ、３３２．８６７  ｍｍｏｌ）のクロロホルム（ＣＨＣｌ３）溶液（２００  ｍＬ）に０度にてｐ−トルエンスルホン酸（ＴｓＯＨ）（１．９１  ｇ、１１．０９６  ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１６時間撹拌した。反応液にジクロロメタンを加え、炭酸ナトリウム水溶液、水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行い、減圧下溶媒留去した。得られた残渣をエタノール（ＥｔＯＨ）（１３  ｍＬ）に溶解し、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）（４．２０  ｇ、１１０．９６１  ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分間撹拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１３  ｍＬ）を加え、室温で２時間撹拌した後、酢酸エチルを加えて抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、ろ過を行い、減圧下溶媒留去した。得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）で精製し、（４Ｒ）−４−メチル−２−フェニル−１，３−ジオキサン（化合物ａａ９６）（２５  ｇ、６３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  １７９  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．２９分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ１３）【０２９５】
（Ｒ）−３−（ベンジルオキシ）ブタン−１−オール（化合物ａａ９７）の合成
2020122182.tif 000156
窒素雰囲気下、上述のようにして得た（４Ｒ）−４−メチル−２−フェニル−１，３−ジオキサン（化合物ａａ９６）（２０  ｇ、１１２．３６  ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（５６１  ｍＬ）にー５０度にて１Ｍ  水素化ジイソブチルアルミニウム（ＤＩＢＡＬ）のヘキサン溶液（２２５  ｍＬ、２２５  ｍｍｏｌ）を滴下しながら加えた。反応液を−５０度で３０分間撹拌した後、室温でさらに２時間撹拌した。反応液にメタノール（ＭｅＯＨ）をー３０度で加え、反応を停止させた後、水を加えた。反応液がｐＨ＝２になるまで６Ｎ塩酸水溶液を加えた後、ジクロロメタンで抽出し、得られた有機層を飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った。減圧下溶媒を留去し、得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）で精製し、（Ｒ）−３−（ベンジルオキシ）ブタン−１−オール（化合物ａａ９７）（１６．６  ｇ、８２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  １８１  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．１１分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ１３）【０２９６】
メチル  Ｏ−（（Ｒ）−３−（ベンジルオキシ）ブチル）−Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ９８、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＢｕＯＢｎ）−ＯＭｅ）の合成
2020122182.tif 000157
窒素雰囲気下、（Ｓ）−アジリジン−１，２−ジカルボン酸２−メチル１−ベンジル（Ｃｂｚ−Ａｚｙ−ＯＭｅ）（１４．４  ｇ、６１．４８１  ｍｍｏｌ）および上述のようにして得た（Ｒ）−３−（ベンジルオキシ）ブタン−１−オール（化合物ａａ９７）（１６．６  ｇ、９２．２  ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１４５  ｍＬ）に溶解し、０度にて三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体（ＢＦ３・Ｅｔ２Ｏ）（１．３１  ｇ、９．２２２  ｍｍｏｌ）を滴下しながら加えて、室温で２時間攪拌した。反応液にジクロロメタンを加え、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った後、溶媒を減圧下留去し、得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル）にて精製し、メチル  Ｏ−（（Ｒ）−３−（ベンジルオキシ）ブチル）−Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ９８、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＢｕＯＢｎ）−ＯＭｅ）（１３．４  ｇ、５２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ４１６  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．４２分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ１３）【０２９７】
Ｏ−（（Ｒ）−３−（ベンジルオキシ）ブチル）−Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ９９、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＢｕＯＢｎ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000158
窒素雰囲気下、水酸化リチウムの１水和物（５．４１  ｇ、１２８．９２  ｍｍｏｌ）、塩化カルシウム（５３．６９  ｇ、４８３．７７１  ｍｍｏｌ）に水（１３４  ｍＬ）、２−プロパノール（５３８  ｍＬ）を室温にて加え、撹拌した後、上述のようにして得たメチル  Ｏ−（（Ｒ）−３−（ベンジルオキシ）ブチル）−Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｌ−セリナート（化合物ａａ９８、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＢｕＯＢｎ）−ＯＭｅ）（１３．４  ｇ、３２．２５１  ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（１３４  ｍＬ）を室温にて加えた。反応液を室温にて５時間攪拌した後、反応液のｐＨが３になるまで６Ｎ塩酸水溶液を加えた。有機溶媒を減圧下除去した後、水層を酢酸エチルで抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った後、溶媒を減圧下留去し、さらに減圧ポンプで減圧下乾燥させ、Ｏ−（（Ｒ）−３−（ベンジルオキシ）ブチル）−Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ９９、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＢｕＯＢｎ）−ＯＨ）（１３．６  ｇ）を粗生成物として得た。これを精製することなく次工程に用いた。【０２９８】
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｒ）−３−ヒドロキシブチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１００、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＢｕＯＨ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000159
水素雰囲気下（〜  ３  ａｔｍ）、上述のように得た粗生成物であるＯ−（（Ｒ）−３−（ベンジルオキシ）ブチル）−Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ９９、Ｃｂｚ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＢｕＯＢｎ）−ＯＨ）（１３．６  ｇ）、１０％  パラジウム炭素（５．４４  ｇ）、メタノール（２７０  ｍＬ）の混合物を室温で１６時間撹拌した。反応液をろ過した後、溶媒を減圧下留去し、得られた固体を酢酸エチルで３回洗浄することで、Ｏ−（（Ｒ）−３−ヒドロキシブチル）−Ｌ−セリン（Ｈ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＢｕＯＨ）−ＯＨ）（５．３  ｇ、２工程９３％）を得た。
窒素雰囲気下、上述のようにして得たＯ−（（Ｒ）−３−ヒドロキシブチル）−Ｌ−セリン（Ｈ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＢｕＯＨ）−ＯＨ）（５．３  ｇ、２９．９１  ｍｍｏｌ）、炭酸水素ナトリウム（７．５４  ｇ、８９．７３  ｍｍｏｌ）の水／１，４−ジオキサン（１３４  ｍＬ／５７  ｍＬ）溶液にＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（１０．５８  ｇ、３１．４０５  ｍｍｏｌ）を室温にて加え、２時間撹拌した。反応液に水を加え、ｔ−ブチルメチルエーテルで２回洗浄した後、水層のｐＨが３になるまで６Ｎ塩酸水溶液を加え、ｔ−ブチルメチルエーテルで抽出した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過後、溶媒を減圧下留去し、さらに減圧ポンプで減圧下乾燥させた。得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル）にて精製し、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｒ）−３−ヒドロキシブチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１００、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＢｕＯＨ）−ＯＨ）（７．４  ｇ、６２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ４００  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．２０分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ１３）【０２９９】
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（３Ｒ）−３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ブチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１０１、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＢｕＯＴＨＰ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000160
窒素雰囲気下、上述のようにして得たＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（Ｒ）−３−ヒドロキシブチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１００、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＢｕＯＨ）−ＯＨ）（８．９０  ｇ、２２．２８１  ｍｍｏｌ）と３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（１３．１２  ｇ、１５５．９７１  ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（７４  ｍＬ）溶液に、ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（ＰＰＴＳ）（２８０  ｍｇ、１．１１４  ｍｍｏｌ）を加え、５０度にて３時間攪拌した。反応液を冷却し、ｔ−ブチルメチルエーテルを加え、飽和食塩水で洗浄した後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った。溶媒を減圧下留去することで、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（３Ｒ）−３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ブチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１０１、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＢｕＯＴＨＰ）−ＯＨ）とテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル  Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（３Ｒ）−３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ブチル）−Ｌ−セリナート（Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＢｕＯＴＨＰ）−ＯＴＨＰ）を混合物として得た。
上述のようにして得たＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（３Ｒ）−３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ブチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１０１、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＢｕＯＴＨＰ）−ＯＨ）とテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル  Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（３Ｒ）−３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ブチル）−Ｌ−セリナート（Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＢｕＯＴＨＰ）−ＯＴＨＰ）の混合物にテトラヒドロフラン（７４  ｍＬ）、１Ｍリン酸緩衝液（７４  ｍＬ、ｐＨ  ８．０）を加え、５０度で３時間攪拌した。反応液を冷却し、ｔ−ブチルメチルエーテルを加え、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った後、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をジエチルエーテル／ヘプタンで再結晶することで、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（３Ｒ）−３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ブチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１０１、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＢｕＯＴＨＰ）−ＯＨ）をナトリウム塩（１０．２  ｇ）として得た。
上述のようにして得たＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（３Ｒ）−３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ブチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１０１、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＢｕＯＴＨＰ）−ＯＨ）のナトリウム塩（１０  ｇ）にｔ−ブチルメチルエーテル（１６０  ｍＬ）、０．０５Ｍリン酸水溶液（４４０  ｍＬ）を加え、室温で５分間撹拌した。反応液をｔ−ブチルメチルエーテルで抽出し、飽和食塩水で２回洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った。溶媒を減圧下留去することで、粗生成物としてＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（３Ｒ）−３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ブチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１０１、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＢｕＯＴＨＰ）−ＯＨ）（８．８  ｇ）を得た。これをさらなる精製をすることなくペプチド合成に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ＝  ４８２  （Ｍ―Ｈ）―
保持時間：０．８６分、０．８８分（分析条件  ＳＱＤＦＡ０５）【０３００】
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロパン酸（化合物ａａ１０２、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（３−ＯＭｅ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000161
市販の（Ｓ）−２−アミノ−３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロパン酸（Ｈ−Ｔｙｒ（３−ＯＭｅ）−ＯＨ）（２．５  ｇ、１１．４８  ｍｍｏｌ）に水（４９．９  ｍＬ）、炭酸ナトリウム（３．６５  ｇ、３４．４  ｍｍｏｌ）、１，４−ジオキサン（１４．９  ｍＬ）を室温にて加えた。反応液にＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（３．１０  ｇ、９．１８  ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン溶液（５０  ｍＬ）を０度にて滴下しながら加え、０度で２０分間撹拌した後、反応液にさらにＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（３８８  ｍｇ、１．１５  ｍｍｏｌ）を加え２０分間撹拌した。反応液に０度にて、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（３８８  ｍｇ、１．１５  ｍｍｏｌ）を再び加え、４０分間撹拌した。反応液に水、ｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）を加え、得られた水層を１Ｎ  塩酸水溶液用いて酸性にした後、酢酸エチルで３回抽出した。得られた有機層をまとめて飽和食塩水で洗浄、無水硫酸マグネシウムで乾燥、ろ過を行った後、減圧下溶媒を留去した。得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロパン酸（化合物ａａ１０２、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（３−ＯＭｅ）−ＯＨ）（３．５３  ｇ、９３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ４３４  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７３分（分析条件ＳＱＤ２ＦＡ０５）【０３０１】
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロパン酸メチル（化合物ａａ１０３、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（３−ＯＭｅ）−ＯＭｅ）の合成
2020122182.tif 000162
窒素雰囲気下、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロパン酸（化合物ａａ１０２、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（３−ＯＭｅ）−ＯＨ）（２．２９  ｇ、５．２３  ｍｍｏｌ）に室温にてメタノール（２０．７５  ｍＬ）とアセトニトリル（５．４０  ｍＬ）を加え、０度で１０分間撹拌した後、２．０Ｍトリメチルシリルジアゾメタン（ＴＭＳジアゾメタン）のヘキサン溶液（２．６２  ｍＬ、５．２３  ｍｍｏｌ）を０度にて滴下しながら加えた。反応液に再び２．０Ｍトリメチルシリルジアゾメタン（ＴＭＳジアゾメタン）のヘキサン溶液（２．６２  ｍＬ、５．２３  ｍｍｏｌ）を０度にて滴下しながら加えた後、２．０Ｍトリメチルシリルジアゾメタン（ＴＭＳジアゾメタン）のヘキサン溶液（３．９３  ｍＬ、７．８５  ｍｍｏｌ）を０度にて滴下しながらさらに加えた。酢酸（２．０  ｍＬ）を加えることで反応を停止させた後、５０％飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と酢酸エチルを加え、酢酸エチルで洗浄した。有機層を５０％飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で抽出し、得られた水層をまとめて酢酸エチルで３回洗浄した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた後、ろ過を行い、減圧下溶媒留去した。粗生成物として得られた（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロパン酸メチル（化合物ａａ１０３、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（３−ＯＭｅ）−ＯＭｅ）（２．３９  ｇ）はさらなる精製を行わずに次の工程に用いた。【０３０２】
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（４−（（２−クロロフェニル）ジフェニルメトキシ）−３−メトキシフェニル）プロパン酸（化合物ａａ１０４、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（４−ＯＣｌｔ−３−ＯＭｅ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000163
窒素雰囲気下、粗生成物である（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロパン酸メチル（化合物ａａ１０３、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（３−ＯＭｅ）−ＯＭｅ）（２．３９  ｇ）にアセトニトリル（１０．５８  ｍＬ）、塩化  ２−クロロトリチル（１．６５６  ｇ、５．２９  ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．９０６  ｍＬ、５．２９  ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。反応液に水、ｔ−ブチルメチルエーテルを加え、有機層を減圧下濃縮することで得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液／メタノール）にて精製し、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（４−（（２−クロロフェニル）ジフェニルメトキシ）−３−メトキシフェニル）プロパン酸メチル（Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（４−ＯＣｌｔ−３−ＯＭｅ）−ＯＭｅ）（２．６  ｇ、６８％）を得た。
塩化カルシウム（５．９８  ｇ、５３．８  ｍｍｏｌ）に水（１４．９６  ｍＬ）、水酸化リチウムの１水和物（０．６０３  ｇ、１４．３６  ｍｍｏｌ）を加え、室温で５分間撹拌した。反応液にイソプロパノール（５９．８  ｍＬ）と（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（４−（（２−クロロフェニル）ジフェニルメトキシ）−３−メトキシフェニル）プロパン酸メチル（Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（４−ＯＣｌｔ−３−ＯＭｅ）−ＯＭｅ）（２．６  ｇ、３．５９  ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液（１４．９６  ｍＬ）を加え、４時間撹拌した後、０．０５Ｍリン酸水溶液とｔ−ブチルメチルエーテルを加えた。水層をｔ−ブチルメチルエーテルで３回抽出し、得られた有機層を飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過を行った後、減圧下溶媒留去した。粗生成物として得られた（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（４−（（２−クロロフェニル）ジフェニルメトキシ）−３−メトキシフェニル）プロパン酸（化合物ａａ１０４、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（４−ＯＣｌｔ−３−ＯＭｅ）−ＯＨ）（２．８  ｇ）はさらなる精製を行わずにペプチド合成に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ７０８  （Ｍ―Ｈ）―
保持時間：０．７４分（分析条件ＳＱＤ２ＡＡ５０）【０３０３】
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）メチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１０９、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（３−Ｍｅ−５−Ｏｘｏ−Ｏｄｚ）−ＯＨ）の合成
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）メチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１０９、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（３−Ｍｅ−５−Ｏｘｏ−Ｏｄｚ）−ＯＨ）は下記のスキームに従って合成した。
2020122182.tif 000164
窒素雰囲気下、市販の（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−セリン（Ｂｏｃ−Ｓｅｒ−ＯＨ）（５０  ｇ、２４３．６５  ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液（１０００  ｍＬ）に０度にて水素化ナトリウム（３４  ｇ、１４２０  ｍｍｏｌ、６０％オイルディスパージョン）を加え、１時間撹拌した。反応液に２−ブロモアセトニトリル（３７．２  ｍＬ、５３６．０３  ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液（５０  ｍＬ）を滴下しながら０度にて加え、さらに１時間撹拌した。反応液に水を加えた後、酢酸エチルで３回抽出し、得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った。ろ液を減圧下濃縮し、得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製することで、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｏ−（シアノメチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１０５、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（ＣＨ２ＣＮ）−ＯＨ）（２９  ｇ、４９％）を得た。
上記のようにして得たＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｏ−（シアノメチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１０５、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（ＣＨ２ＣＮ）−ＯＨ）（３８．５  ｇ、１５７．６３  ｍｍｏｌ）のエタノール（ＥｔＯＨ）溶液（４００  ｍＬ）に室温にてヒドロキシルアミン塩酸塩（２２．４  ｇ、３１５．２６  ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（５８．８  ｍＬ、４２５．６０  ｍｍｏｌ）を加え、８５度で２時間撹拌した。減圧下溶媒を留去し、粗生成物であるＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｏ−（２−（ヒドロキシアミノ）−２−イミノエチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１０６）（１０７  ｇ）を得た。
窒素雰囲気下、得られた粗生成物であるＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｏ−（２−（ヒドロキシアミノ）−２−イミノエチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１０６）（１２  ｇ）の１、４−ジオキサン溶液（１２０  ｍＬ）に室温にてカルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）（３．９６  ｇ、２４．４２  ｍｍｏｌ）、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン（ＤＢＵ）（４．９２  ｇ、３２．３２  ｍｍｏｌ）を加え、１１０度で２時間撹拌した。濃塩酸を用い、反応液をｐＨ＝２に調節した後、ジクロロメタン（ＤＣＭ）で２回抽出した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行ったを行った後、ろ液を減圧下濃縮することで、粗生成物としてＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｏ−（（５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）メチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１０７、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（３−Ｍｅ−５−Ｏｘｏ−Ｏｄｚ）−ＯＨ）（１．２  ｇ）を得た。
窒素雰囲気下、得られた粗生成物であるＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｏ−（（５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）メチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１０７、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（３−Ｍｅ−５−Ｏｘｏ−Ｏｄｚ）−ＯＨ）（２５８  ｍｇ）の１、４−ジオキサン溶液（１０  ｍＬ）に室温にて４Ｎ塩酸／１，４−ジオキサン溶液（１５  ｍＬ）を加え、１６時間撹拌した。減圧下溶媒を留去し、粗生成物であるＯ−（（５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）メチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１０８、Ｈ−Ｓｅｒ（３−Ｍｅ−５−Ｏｘｏ−Ｏｄｚ）−ＯＨ）（１６０  ｍｇ）を得た。
窒素雰囲気下、上記のように得た粗生成物であるＯ−（（５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）メチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１０８、Ｈ−Ｓｅｒ（３−Ｍｅ−５−Ｏｘｏ−Ｏｄｚ）−ＯＨ）（２２．４  ｇ）と炭酸カリウム（１８．８  ｇ、１３５．０４  ｍｍｏｌ）の１．４−ジオキサン／水（１６５  ｍＬ／１１０  ｍＬ）溶液にＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（２３  ｇ、６８．２  ｍｍｏｌ）を室温にて加え、３時間撹拌した。反応液をｔ−ブチルメチルエーテル／ヘキサン（１／３）で洗浄し、得られた水層を濃塩酸を用いてｐＨ＝２になるまで調節した後、ジクロロメタン（ＤＣＭ）で２回抽出した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った。ろ液を減圧下濃縮し、得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル）にて精製することで、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）メチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１０９、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（３−Ｍｅ−５−Ｏｘｏ−Ｏｄｚ）−ＯＨ）（５．６９  ｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ＝  ４２６  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７２分（分析条件ＳＱＤ２ＦＡ０５）【０３０４】
（（２Ｓ）−４−ジアゾ−３−オキソ−１−（２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）エトキシ）ブタン−２−イル）カルバミン酸  （９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（化合物ａａ１１０）の合成
2020122182.tif 000165
窒素雰囲気下、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）エチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ２２、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＥｔＯＴＨＰ）−ＯＨ）（１．４  ｇ、３．０７  ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（５．０  ｍＬ）に氷と食塩で調製したアイスバスを用いて冷却しながら４−メチルモルホリン（０．３５５  ｍＬ、３．２３  ｍｍｏｌ）、クロロギ酸エチル（０．３１０  ｍＬ、３．２３  ｍｍｏｌ）を加え、１時間１０分間撹拌した。続いて、氷と食塩で調製したアイスバスを用いて冷却しながら反応液に別途調整したジアゾメタンのジエチルエーテル溶液を滴下しながら加え、３０分間撹拌した。反応液に酢酸（０．８８  ｍＬ、１５．３７  ｍｍｏｌ）を加え、１０分間撹拌した後、酢酸エチル、水を加え、酢酸エチルで抽出し、得られた有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過を行った。ろ液を減圧下溶媒留去することで得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）で精製し、（（２Ｓ）−４−ジアゾ−３−オキソ−１−（２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）エトキシ）ブタン−２−イル）カルバミン酸  （９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（化合物ａａ１１０）（１．１３  ｇ、７７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝５０２（Ｍ＋Ｎａ）＋
保持時間：０．８７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０３０５】
ジアゾメタンのジエチルエーテル溶液の調整
約５０％の水が含まれる１−メチル−３−ニトロ−１−ニトロソグアニジン（５．０  ｇ、東京化成あるいは富士フィルム和光純薬より購入）にジエチルエーテル（１７．０  ｍＬ）を加え０度にて５０％水酸化カリウム水溶液（９．５  ｍＬ）を滴下しながら加えた。反応液を１時間撹拌した後、黄色のジエチルエーテル層を先端をなめしたパスツールを用い分離し、得られた溶液をそのまま上記の反応に使用した。【０３０６】
（３Ｒ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）エトキシ）ブタン酸（化合物ａａ１１１、Ｆｍｏｃ−ｂＡｌａ（３Ｒ−ＭｅＯＥｔＯＴＨＰ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000166
窒素雰囲気下、上述のようにして得た（（２Ｓ）−４−ジアゾ−３−オキソ−１−（２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）エトキシ）ブタン−２−イル）カルバミン酸  （９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（化合物ａａ１１０）（１．７  ｇ、３．５５  ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン／水（１８  ｍＬ／１．８  ｍＬ）溶液に、０度にて４−メチルモルホリン（０．９７４  ｍＬ、８．８６  ｍｍｏｌ）、トリフルオロ酢酸銀（ＡｇＯＣＦ３）（０．０７８  ｍＬ、０．３５５  ｍｍｏｌ）を加えた後、室温で２時間３０分間撹拌した。反応液にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を加え、逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル）で精製することで、（３Ｒ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）エトキシ）ブタン酸（化合物ａａ１１１、Ｆｍｏｃ−ｂＡｌａ（３Ｒ−ＭｅＯＥｔＯＴＨＰ）−ＯＨ）（１．４  ｇ、８４％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝４６８（Ｍ―Ｈ）―
保持時間：０．７８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０３０７】
（２Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−２−（（２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）エトキシ）メチル）プロパン酸（化合物ａａ１１７）は以下のスキームにより合成した。
2020122182.tif 000167
【０３０８】
（２Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−２−（（２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）エトキシ）メチル）プロパン酸（化合物ａａ１１７、Ｆｍｏｃ−ｂＡｌａ（２Ｓ−ＭｅＯＥｔＯＴＨＰ）―ＯＨ）の合成
窒素雰囲気下、論文記載の方法（Ｂｅｉｌｓｔｅｉｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２０１７，  １３，  ２４２８−２４４１．）で合成した２−（トリチルオキシ）エタン−１−オール（ＣＡＳ．  Ｎｏ．  １８３２５−４５−６）（８．８  ｇ、２８．９  ｍｍｏｌ）と市販の４−メチルベンゼンスルホン酸  （Ｒ）−オキシラン−２−イルメチル（６．０  ｇ、２６．３  ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液（１００  ｍＬ）に０度にて水素化ナトリウム（１．１６  ｇ、２８．９  ｍｍｏｌ、６０％オイルディスパージョン）を加え、室温にて１２時間撹拌した。反応液に水を加えた後、酢酸エチルで２回抽出し、得られた有機層を減圧下濃縮し、得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝５／１）にて精製することで、（Ｒ）−２−（（２−（トリチルオキシ）エトキシ）メチル）オキシラン（化合物ａａ１１２）（７．３２  ｇ、７７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ＝  ３８３  （Ｍ＋Ｎａ）＋
保持時間：１．４０分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ４５）【０３０９】
上記のようにして得た（Ｒ）−２−（（２−（トリチルオキシ）エトキシ）メチル）オキシラン（化合物ａａ１１２）（３８．５  ｇ、１５７．６３  ｍｍｏｌ）に７Ｍのアンモニアのメタノール溶液（１９６  ｍＬ）を室温にて加え、室温で１５時間撹拌した。反応液を減圧下で溶媒を留去し、得られた残渣に水を加え、酢酸エチルで抽出した。得られた有機層を減圧下濃縮し、得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル）にて精製した。さらに得られたフラクションを集め、その溶液に飽和炭酸水素ナトリウム溶液（２１．４  ｍＬ）と二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（Ｂｏｃ２Ｏ）（５．５５  ｇ）を加え、室温にて１０分間撹拌した。反応液を減圧下で溶媒を留去し、得られた残渣に水を加え、酢酸エチルで抽出した。得られた有機層を減圧下濃縮し、得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝４／１）にて精製することで、（Ｒ）−（２−ヒドロキシ−３−（２−（トリチルオキシ）エトキシ）プロピル）カルバミン酸  ｔｅｒｔ−ブチル（化合物ａａ１１３）（４．２５  ｇ、７０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ＝  ５００  （Ｍ＋Ｎａ）＋
保持時間：１．４０分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ４５）【０３１０】
窒素雰囲気下、得られた（Ｒ）−（２−ヒドロキシ−３−（２−（トリチルオキシ）エトキシ）プロピル）カルバミン酸  ｔｅｒｔ−ブチル（化合物ａａ１１３）（４．５３  ｇ、９．４８  ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（４７．４  ｍＬ）に室温にてトリエチルアミン（３．９７  ｍＬ、２８．５  ｍｍｏｌ）とメタンスルホン酸  無水物（２．４８  ｇ、１４．２  ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮し、得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル）にて精製することで、メタンスルホン酸  （Ｒ）−１２，１２−ジメチル−１０−オキソ−１，１，１−トリフェニル−２，５，１１−トリオキサ−９−アザトリデカン−７−イル（化合物ａａ１１４）（４．６２  ｇ、８８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ＝  ５７８  （Ｍ＋Ｎａ）＋
保持時間：１．４７分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ４５）【０３１１】
窒素雰囲気下、得られたメタンスルホン酸  （Ｒ）−１２，１２−ジメチル−１０−オキソ−１，１，１−トリフェニル−２，５，１１−トリオキサ−９−アザトリデカン−７−イル（化合物ａａ１１４）（４．４１  ｇ、７．９３  ｍｍｏｌ）のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液（３９．６  ｍＬ）に室温にてシアン化ナトリウム（１．９５  ｇ、３９．７  ｍｍｏｌ）を加え、８０度で１０時間撹拌した。反応液にアセトニトリルと水を加え、逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル）にて精製することで、（Ｒ）−（２−シアノ−３−（２−（トリチルオキシ）エトキシ）プロピル）カルバミン酸  ｔｅｒｔ−ブチル（化合物ａａ１１５）（２．１６ｇ、５３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ＝  ５０９  （Ｍ＋Ｎａ）＋
保持時間：１．４９分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ４５）【０３１２】
窒素雰囲気下、得られた（Ｒ）−（２−シアノ−３−（２−（トリチルオキシ）エトキシ）プロピル）カルバミン酸  ｔｅｒｔ−ブチル（化合物ａａ１１５）（３．６３  ｇ、７．４６  ｍｍｏｌ）のクロロベンゼン溶液（９．３  ｍＬ）に０度にてトリフルオロメタンスルホン酸（３．５  ｍＬ、３９．５  ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。続いて室温にて反応液に水（３．６  ｍＬ、２０１  ｍｍｏｌ）を加え、１１０度で３時間撹拌した。反応液に水（２０  ｍＬ）とヘキサン（７  ｍＬ）とトルエン（２０  ｍＬ）を加え、水層を除去した。得られた有機層に水（１２  ｍＬ）を加え、洗浄した。得られた水層を集め、アセトニトリル（３７．３  ｍＬ）と炭酸水素ナトリウム（６．２７  ｇ、７４．６  ｍｍｏｌ）を加え、（１−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（３．７７  ｇ、１１．２  ｍｍｏｌ）を室温にて加え、３０分間撹拌した。さらにＦｍｏｃ−ＯＳｕ（１．２６  ｇ、３．７３  ｍｍｏｌ）を室温にて加え、終夜撹拌した。反応液をろ過した後、ｔ−ブチルメチルエーテルで抽出した。得られた水層に６Ｎ濃塩酸をｐＨ＝１になるまで加えた後、逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル）にて精製することで、（Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−２−（（２−ヒドロキシエトキシ）メチル）プロパン酸（化合物ａａ１１６）（１．３１  ｇ、４６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ＝  ３８６  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．７８分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ４７）【０３１３】
窒素雰囲気下、上記で得た（Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−２−（（２−ヒドロキシエトキシ）メチル）プロパン酸（化合物ａａ１１６）（１．０３  ｇ、２．６７  ｍｍｏｌ）と３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（０．７３  ｍＬ、８．０２  ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１３．４  ｍＬ）溶液にパラトルエンスルホン酸ピリジニウム（ＰＰＴＳ）（６７  ｍｇ、０．２７  ｍｍｏｌ）を室温にて加え、４０度にて１０時間撹拌した。反応液に水を加え、ジクロロメタンで抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った。得られた粗生成物のテトラヒドロフラン溶液（１３．４  ｍＬ）に、別途調製したリン酸緩衝液（ｐＨ＝８、１３．４  ｍＬ）を加え、５０度で２０時間撹拌した。反応液に水（５０  ｍＬ）を加え、ｔ−ブチルメチルエーテル／ヘキサン（４０  ｍＬ／１０  ｍＬ）で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った。得られた有機層を減圧下濃縮し、得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル）にて精製することで、（２Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−２−（（２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）エトキシ）メチル）プロパン酸（化合物ａａ１１７）（１．０４  ｇ、８３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ＝  ４９２  （Ｍ＋Ｎａ）＋
保持時間：０．９５分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５−２）【０３１４】
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−５−（（Ｒ）−１−（（アリルオキシ）カルボニル）−４，４−ジフルオロピロリジン−２−イル）ペンタン酸（化合物ａａ１２２、Ｆｍｏｃ−Ｎｖａ（２−Ｒ−４−Ｆ２−Ｐｙｒｒｏ（Ｎ−Ａｌｌｏｃ））―ＯＨ）は以下のスキームにより合成した。
2020122182.tif 000168
【０３１５】
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−５−（（Ｒ）−１−（（アリルオキシ）カルボニル）−４，４−ジフルオロピロリジン−２−イル）ペンタン酸（化合物ａａ１２２、Ｆｍｏｃ−Ｎｖａ（２−Ｒ−４−Ｆ２−Ｐｙｒｒｏ（Ｎ−Ａｌｌｏｃ））―ＯＨ）の合成
窒素雰囲気下、市販の（Ｓ）−４，４−ジフルオロピロリジン−２−カルボン酸メチル塩酸塩（ＣＡＳ．  Ｎｏ．  １５６０４６−０５−８）（６．９  ｇ、３４．２  ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（６８．５  ｍＬ）に室温にてトリエチルアミン（１１．９  ｍＬ、８６  ｍｍｏｌ）を加えた。反応液に二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（Ｂｏｃ２Ｏ）（１１．２  ｇ、５１．３  ｍｍｏｌ）を室温にて加え、１時間撹拌した。反応液に水を加えた後、酢酸エチルで抽出した。得られた有機層を減圧下濃縮し、得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル）にて精製することで、（Ｓ）−４，４−ジフルオロピロリジン−１，２−ジカルボン酸  ２−メチル  １−（ｔｅｒｔ−ブチル）（化合物ａａ１１８）（６．８５  ｇ、７５％）を得た。【０３１６】
上記のようにして得た（Ｓ）−４，４−ジフルオロピロリジン−１，２−ジカルボン酸  ２−メチル  １−（ｔｅｒｔ−ブチル）（化合物ａａ１１８）（６．４３  ｇ、２４．２  ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液（１２１  ｍＬ）に０度にてリチウムホウ水素化物／テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液（６．６７  ｍＬ、２６．７  ｍｍｏｌ）を加え、室温で１．５時間撹拌した。さらに０度にてリチウムホウ水素化物／テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液（１．５  ｍＬ、６．０  ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。０度にて反応液に１０％塩化ナトリウム水溶液を加えた後、酢酸エチルで抽出した。得られた有機層を減圧下濃縮し、得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル）にて精製することで、（Ｓ）−４，４−ジフルオロ−２−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−１−カルボン酸  ｔｅｒｔ−ブチル（化合物ａａ１１９）（５．７０  ｇ、９９％）を得た。【０３１７】
窒素雰囲気下、得られた（Ｓ）−４，４−ジフルオロ−２−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−１−カルボン酸  ｔｅｒｔ−ブチル（３３５  ｍｇ、１．４１  ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（７．０  ｍＬ）に市販の１，１，１−トリアセトキシ−１，１−ジヒドロ−１，２−ベンゾヨードキソール−３（１Ｈ）−オン（Ｄｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎ  ｒｅａｇｅｎｔ）（７１９  ｍｇ、１．６９  ｍｍｏｌ）を０度にて加え、室温で３０分間撹拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えた後、酢酸エチルで抽出し、得られた有機層を水で洗浄した。得られた有機層を減圧下濃縮し、得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル）にて精製し、アルデヒド中間体を得た。【０３１８】
窒素雰囲気下、臭化メチルトリフェニルホスホニウム（５６２  ｍｇ、１．５７  ｍｍｏｌ）のジエチルエーテル溶液（３．１  ｍＬ）に室温にてカリウム  ２−メチルプロパン−２−オラート（ｔＢｕＯＫ）（１７７  ｍｇ、１．５７  ｍｍｏｌ）を加え、室温にて２時間撹拌した。反応液に、別途調製したアルデヒド中間体（１８５  ｍｇ、０．７８６  ｍｍｏｌ）のジエチルエーテル溶液（０．７９  ｍＬ）を加え、室温にて１時間撹拌した。反応液に１０％塩化アンモニウム水溶液を加えた後、酢酸エチルで抽出し、得られた有機層を水で洗浄した。得られた有機層を減圧下濃縮し、得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル）にて精製し、（Ｓ）−４，４−ジフルオロ−２−ビニルピロリジン−１−カルボン酸  ｔｅｒｔ−ブチル（化合物ａａ１２０）（１３５  ｍｇ、７４％）を得た。【０３１９】
窒素雰囲気下、得られた（Ｓ）−４，４−ジフルオロ−２−ビニルピロリジン−１−カルボン酸  ｔｅｒｔ−ブチル（化合物ａａ１２０）（３．５０  ｇ、１５．０  ｍｍｏｌ）と（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）ペンタ−４−エン酸（ＣＡＳ＃：１４６５４９−２１−５、Ｆｍｏｃ−Ａｌｇｌｙ−ＯＨ）（９．５２  ｇ、２８．２  ｍｍｏｌ）を２−メチルテトラヒドロフラン（２−ＭｅＴＨＦ）（６０ｍＬ）に溶解した。その溶液に第２世代Ｈｏｖｅｙｄａ−Ｇｒｕｂｂｓ触媒（０．９４ｇ、１．５０ｍｍｏｌ）を加え、６０度にて終夜撹拌した。室温に冷却した後、セライトろ過し、ろ液を減圧下濃縮した。得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、粗生成物（７．５８  ｇ）を得た。【０３２０】
得られた粗生成物（７．５８  ｇ）をメタノール（１８６  ｍＬ）に溶解し、１０％パラジウム炭素（１．６  ｇ）を加え水素雰囲気下、室温で２日間撹拌した。反応液をセライトろ過し、ろ液を減圧下濃縮した。得られた残渣をメタノール（３４．９  ｍＬ）に溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（３４．９  ｍＬ）、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（７．０７  ｇ、２０．９５  ｍｍｏｌ）を加え室温で２時間撹拌した。不溶物を濾別し、ろ液を１Ｍ塩酸水溶液にて酸性化した後、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムにて乾燥し、ろ過し、減圧濃縮した。得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−５−（（Ｒ）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−４，４−ジフルオロピロリジン−２−イル）ペンタン酸（化合物ａａ１２１）（２．５４  ｇ、３３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ＝  ５６７  （Ｍ＋Ｎａ）＋
保持時間：１．３２分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ４５）【０３２１】
得られた（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−５−（（Ｒ）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−４，４−ジフルオロピロリジン−２−イル）ペンタン酸（化合物ａａ１２１）（２．１７  ｇ、３．９８  ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（ＤＣＭ）（５３．１  ｍＬ）に溶解し、トリフルオロ酢酸（９．１５  ｍＬ、１１９．８  ｍｍｏｌ）を加え室温で１時間３０分間撹拌した。反応液を減圧下濃縮し、残渣にトルエンを加え再度減圧下濃縮し、粗生成物（２．６６  ｇ）を得た。【０３２２】
得られた粗生成物（２．６６  ｇ）を１，４−ジオキサン／水（１２．６７  ｍＬ／１２．６７ｍＬ）溶液に溶解し、炭酸水素ナトリウム（１．９２  ｇ、２２．８０  ｍｍｏｌ）とＮ−（アリルオキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ａｌｌｏｃ−ＯＳｕ）（０．６１  ｍＬ、３．９１  ｍｍｏｌ）を室温にて加え、３０分間撹拌した。反応液にギ酸とジメチルスルホキシドを加え逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−５−（（Ｒ）−１−（（アリルオキシ）カルボニル）−４，４−ジフルオロピロリジン−２−イル）ペンタン酸（化合物ａａ１２２、Ｆｍｏｃ−Ｎｖａ（２−Ｒ−４−Ｆ２−Ｐｙｒｒｏ（Ｎ−Ａｌｌｏｃ））―ＯＨ）（１．９７  ｇ、９４％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ＝  ５２９  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：２．７５分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ４７）【０３２３】
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（（Ｓ）−１−（（アリルオキシ）カルボニル）−４，４−ジフルオロピロリジン−２−イル）メチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１２６、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｓ−４−Ｆ２−Ｐｙｒｒｏ（Ｎ−Ａｌｌｏｃ）−Ｍｅ）−ＯＨ）は以下のスキームにより合成した。
2020122182.tif 000169
【０３２４】
窒素雰囲気下、市販の（Ｓ）−４，４−ジフルオロピロリジン−２−カルボン酸メチル塩酸塩（ＣＡＳ．  Ｎｏ．  １５６０４６−０５−８）（５．０８  ｇ、２５．２  ｍｍｏｌ）の水溶液（１１．４３  ｍＬ）に室温にて炭酸水素ナトリウム（５．２９  ｇ、６３．０  ｍｍｏｌ）を加えた。反応液に室温でクロロギ酸アリル（４．０  ｍＬ、３７．８  ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン溶液（２２．９  ｍＬ）を滴下しながら加え、さらに１．５時間撹拌した。反応液に水を加えた後、酢酸エチルで２回抽出し、得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った。ろ液を減圧下濃縮し、得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル）にて精製することで、（Ｓ）−４，４−ジフルオロピロリジン−１，２−ジカルボン酸  ２−メチル  １−アリル（化合物ａａ１２３）（６．２１  ｇ、９９％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ＝  ２５０  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．９１分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ４５）【０３２５】
上記のようにして得た（Ｓ）−４，４−ジフルオロピロリジン−１，２−ジカルボン酸  ２−メチル  １−アリル（化合物ａａ１２３）（６．８１  ｇ、２７．３  ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液（８２．０  ｍＬ）に０度にてリチウムホウ水素化物／テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液（１０．２４  ｍＬ、４１．０  ｍｍｏｌ）を滴下しながら加え、室温で２時間撹拌した。反応液に０度にて水と２Ｎ塩酸水溶液（２０．５  ｍＬ、４１．０  ｍｍｏｌ）を加えた後、酢酸エチルで抽出し、得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った。ろ液を減圧下濃縮し、得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル）にて精製することで、（Ｓ）−４，４−ジフルオロ−２−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−１−カルボン酸アリル（化合物ａａ１２４）（５．１３  ｇ、８５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ＝  ２２２  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７６分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ４５）【０３２６】
窒素雰囲気下、得られた（Ｓ）−４，４−ジフルオロ−２−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−１−カルボン酸アリル（化合物ａａ１２４）（５．１  ｇ、２３．０６  ｍｍｏｌ）と（Ｓ）−アジリジン−１，２−ジカルボン酸  ２−メチル  １−（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル）（化合物ａａ７３、Ｆｍｏｃ−Ａｚｙ−ＯＭｅ）（４．９７  ｇ、１５．３７  ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（３６  ｍＬ）に０度にて三フッ化ホウ素−エチルエーテルコンプレックス（０．８７６  ｍＬ、６．９２  ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液を滴下しながら加え、さらに１．５時間撹拌した。反応液に水を加えた後、ジクロロメタンで抽出し、得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った。ろ液を減圧下濃縮し、得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル）にて精製することで、（Ｓ）−２−（（（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−メトキシ−３−オキソプロポキシ）メチル）−４，４−ジフルオロピロリジン−１−カルボン酸アリル（化合物１２５、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｓ−４−Ｆ２−Ｐｙｒｒｏ（Ｎ−Ａｌｌｏｃ）−Ｍｅ）−ＯＭｅ）（５．６８  ｇ、６８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ＝  ５４５（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：３．０２分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ４７）【０３２７】
窒素雰囲気下、塩化カルシウム（１８．７  ｇ、１６８  ｍｍｏｌ）の水溶液（４６．８  ｍＬ）に室温にて水酸化リチウム一水和物（１．８９  ｇ、４４．９  ｍｍｏｌ）を加え、室温で５分間撹拌した。イソプロピルアルコール（１８７  ｍＬ）と（Ｓ）−２−（（（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−メトキシ−３−オキソプロポキシ）メチル）−４，４−ジフルオロピロリジン−１−カルボン酸アリル（化合物１２５、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｓ−４−Ｆ２−Ｐｙｒｒｏ（Ｎ−Ａｌｌｏｃ）−Ｍｅ）−ＯＭｅ）（６．１２  ｇ、１１．２３  ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（４６．８  ｍＬ）を室温にて加え、６．５時間撹拌した。２Ｎ塩酸（３３．７  ｍＬ、６７．４  ｍｍｏｌ）を加えた後、減圧下溶媒を留去し、得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル）にて精製することで、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（（Ｓ）−１−（（アリルオキシ）カルボニル）−４，４−ジフルオロピロリジン−２−イル）メチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１２６、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｓ−４−Ｆ２−Ｐｙｒｒｏ（Ｎ−Ａｌｌｏｃ）−Ｍｅ）−ＯＨ）（３．７６  ｇ、６３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ＝  ５３１  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：２．６９分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ４７）【０３２８】
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（３−メトキシ−４−（メチルカルバモイル）フェニル）プロパン酸（化合物ａａ１２７、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＭｅ）−ＯＨ）および（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（４−メトキシ−３−（メチルカルバモイル）フェニル）プロパン酸（化合物ａａ１２８、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（４−ＯＭｅ−３−ＣＯＮＭｅ）−ＯＨ）および（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（３−メトキシ−４−（（メチルスルホニル）カルバモイル）フェニル）プロパン酸（化合物ａａ１２９、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＨＭｓ）−ＯＨ）は以下のスキームに従って合成した。
2020122182.tif 000170
【０３２９】
（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｌ−アスパラギン酸  ４−（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）  １−（ｔｅｒｔ−ブチル）（化合物ａａ１３０）の合成
2020122182.tif 000171
窒素雰囲気下、市販の（Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−４−オキソブタン酸（Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ−ＯｔＢｕ）（３００  ｇ、７２９．１２  ｍｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシフタルイミド（１３０．８  ｇ、８０１．８  ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（３０００  ｍＬ）に室温にてＮ，Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（１８１．８  ｇ、１．１０  ｍｍｏｌ）を滴下しながら加え、３時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮することで得られた残渣にトルエンを加え、ろ過を行った後、得られた固体をトルエンで洗浄した。ろ液を減圧下濃縮することで得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）にて精製することで、（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｌ−アスパラギン酸  ４−（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）  １−（ｔｅｒｔ−ブチル）（化合物ａａ１３０）（２７２  ｇ、６７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ＝  ５７４  （Ｍ＋ＮＨ４）＋
保持時間：１．００分（分析条件ＳＱＤ２ＦＡ０５）【０３３０】
４−ヨード−２−メトキシ−Ｎ−メチルベンズアミド（化合物ａａ１３１）の合成
2020122182.tif 000172
窒素雰囲気下、市販の４−ヨード−２−メトキシ安息香酸（５  ｇ、１７．９８３  ｍｍｏｌ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ・ＨＣｌ）（４．１５  ｇ、２１．１４８  ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（４．１５  ｇ、２１．１４８  ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液（５０  ｍＬ）に室温にて２Ｍのメチルアミンのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液（２２．５  ｍＬ、４５．０  ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（１２．５３  ｍＬ、９４．９４２  ｍｍｏｌ）を加え、１６時間撹拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで３回抽出した後、得られた有機層を水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った。得られたろ液を減圧下濃縮し、残渣を順相カラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）にて精製することで、４−ヨード−２−メトキシ−Ｎ−メチルベンズアミド（化合物ａａ１３１）（３．３  ｇ、６３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ＝  ２９２  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７８分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ５０）【０３３１】
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（３−メトキシ−４−（メチルカルバモイル）フェニル）プロパン酸（化合物ａａ１２７、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｒ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＭｅ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000173
窒素雰囲気下、臭化ニッケル（ＩＩ）の３水和物（ＮｉＢｒ２・３Ｈ２Ｏ）（２．１５  ｇ、７．５９  ｍｍｏｌ）と４，４'−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２，２'−ビピリジル（ｄｔｂｂｐｙ）（２．１５  ｇ、７．５９  ｍｍｏｌ）のジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）溶液（１２０  ｍＬ）を５０℃で３時間撹拌した後、室温に冷却することでニッケル触媒溶液を得た。窒素雰囲気下、亜鉛粉末（８．６１  ｇ、１３４．５  ｍｍｏｌ）、（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｌ−アスパラギン酸  ４−（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）  １−（ｔｅｒｔ−ブチル）（化合物ａａ１３０）（１４．６  ｇ、２６．３  ｍｍｏｌ）、４−ヨード−２−メトキシ−Ｎ−メチルベンズアミド（化合物ａａ１３１）（１１．５  ｇ、３９．５  ｍｍｏｌ）のジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）溶液（１２０  ｍＬ）を室温で３０分間撹拌した後、上述のニッケル触媒溶液を滴下しながら室温にて加え、１６時間撹拌した。反応液に１０％ＥＤＴＡ・２Ｎａ（エチレンジアミン四酢酸の２ナトリウム塩）水溶液を加え、酢酸エチルで３回抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、減圧下溶媒を留去することで得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製することで、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（３−メトキシ−４−（メチルカルバモイル）フェニル）プロパン酸  ｔｅｒｔ−ブチル（Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＭｅ）−ＯｔＢｕ）（９．２  ｇ、８４％）を得た。
窒素雰囲気下、上述のように得た（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（３−メトキシ−４−（メチルカルバモイル）フェニル）プロパン酸  ｔｅｒｔ−ブチル（Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＭｅ）−ＯｔＢｕ）（１１  ｇ、２０．８  ｍｍｏｌ）とクロロトリメチルシラン（ＴＭＳＣｌ）（７．９６  ｍＬ、６２．３  ｍｍｏｌ）の２，２，２−トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）溶液（１０４  ｍＬ）を室温にて１時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮し、得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル）にて精製することで、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（３−メトキシ−４−（メチルカルバモイル）フェニル）プロパン酸（化合物ａａ１２７、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｒ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＭｅ）−ＯＨ）（５．０  ｇ、５１％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ＝  ４７５  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．６８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０３３２】
５−ヨード−２−メトキシ−Ｎ−メチルベンズアミド（化合物ａａ１３２）の合成
2020122182.tif 000174
窒素雰囲気下、市販の５−ヨード−２−メトキシ安息香酸（５  ｇ、１７．９８３  ｍｍｏｌ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ・ＨＣｌ）（４．１５  ｇ、２１．１４８  ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（４．１５  ｇ、２１．１４８  ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液（５０  ｍＬ）に室温にて２Ｍのメチルアミンのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液（２２．５  ｍＬ、４５．０  ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（１２．５  ｍＬ、９４．９４２  ｍｍｏｌ）を加え、１６時間撹拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで２回抽出した後、得られた有機層を水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った。得られたろ液を減圧下濃縮し、残渣を順相カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製することで、５−ヨード−２−メトキシ−Ｎ−メチルベンズアミド（化合物ａａ１３２）（３．３  ｇ、６３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ＝  ２９２  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７９分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ５０）【０３３３】
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（４−メトキシ−３−（メチルカルバモイル）フェニル）プロパン酸（化合物ａａ１２８、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（４−ＯＭｅ−３−ＣＯＮＭｅ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000175
窒素雰囲気下、臭化ニッケル（ＩＩ）の３水和物（ＮｉＢｒ２・３Ｈ２Ｏ）（２．８６  ｇ、１０．５０  ｍｍｏｌ）と４，４'−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２，２'−ビピリジル（ｄｔｂｂｐｙ）（２．８６  ｇ、１０．６６  ｍｍｏｌ）のジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）溶液（１６１  ｍＬ）を５０℃で３時間撹拌した後、室温に冷却することでニッケル触媒溶液を得た。窒素雰囲気下、亜鉛粉末（１１．４  ｇ、１７４  ｍｍｏｌ）、（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｌ−アスパラギン酸  ４−（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）  １−（ｔｅｒｔ−ブチル）（化合物ａａ１３０）（１９．７４  ｇ、３５．４７  ｍｍｏｌ）、５−ヨード−２−メトキシ−Ｎ−メチルベンズアミド（化合物ａａ１３２）（１５．５  ｇ、５３．２  ｍｍｏｌ）のジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）溶液（１６１  ｍＬ）を室温で３０分間撹拌した後、上述のニッケル触媒溶液を滴下しながら室温にて加え、１６時間撹拌した。反応液に１０％ＥＤＴＡ・２Ｎａ（エチレンジアミン四酢酸の２ナトリウム塩）水溶液を加え、セライトろ過を行った後、得られたろ液の有機層を分離し、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。混合物をろ過した後、ろ液を減圧下溶媒留去することで得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製することで、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（４−メトキシ−３−（メチルカルバモイル）フェニル）プロパン酸  ｔｅｒｔ−ブチル（Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（４−ＯＭｅ−３−ＣＯＮＭｅ）−ＯｔＢｕ）（１０．２  ｇ、３６％）を得た。
窒素雰囲気下、上述のように得た（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（４−メトキシ−３−（メチルカルバモイル）フェニル）プロパン酸  ｔｅｒｔ−ブチル（Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（４−ＯＭｅ−３−ＣＯＮＭｅ）−ＯｔＢｕ）（１０．２  ｇ、１９．２２  ｍｍｏｌ）とクロロトリメチルシラン（ＴＭＳＣｌ）（７．２６  ｍＬ、５６．８  ｍｍｏｌ）の２，２，２−トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）溶液（９６  ｍＬ）を室温にて１時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮し、得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル）にて精製することで、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（４−メトキシ−３−（メチルカルバモイル）フェニル）プロパン酸（化合物ａａ１２８、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（４−ＯＭｅ−３−ＣＯＮＭｅ）−ＯＨ）（６．１２  ｇ、３６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ＝  ４７５  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０３３４】
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（３−メトキシ−４−（（メチルスルホニル）カルバモイル）フェニル）プロパン酸（化合物ａａ１２９、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＨＭｓ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000176
窒素雰囲気下、市販の４−ブロモ−２−メトキシ安息香酸（４５  ｇ、１９４．７６７  ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液（２２０  ｍＬ）にカルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）（４７．３７  ｇ、２９２．１５１  ｍｍｏｌ）を室温にて加え、２時間撹拌した。反応液にメタンスルホンアミド（５５．５８  ｇ、５８４．３１５  ｍｍｏｌ）、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン（ＤＢＵ）（８８．９５  ｇ、５８４．３０２  ｍｍｏｌ）を加え、１６時間撹拌した後、酢酸エチルを加えた。混合物に２Ｎの塩酸水溶液をｐＨ  ５になるまで加えた後、得られた有機層を水、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った。得られたろ液を減圧下濃縮し、残渣を順相カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製することで、４−ブロモ−２−メトキシ−Ｎ−（メチルスルホニル）ベンズアミド（５７．５  ｇ、９５％）を得た。
窒素雰囲気下、臭化ニッケル（ＩＩ）の３水和物（ＮｉＢｒ２・３Ｈ２Ｏ）（２．９３  ｇ、１０．７８  ｍｍｏｌ）と４，４'−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２，２'−ビピリジル（ｄｔｂｂｐｙ）（２．８９  ｇ、１０．７８  ｍｍｏｌ）のジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）溶液（１００  ｍＬ）を５０℃で３時間撹拌した後、室温に冷却することでニッケル触媒溶液を得た。窒素雰囲気下、亜鉛粉末（１１．７５  ｇ、１７９．６７２  ｍｍｏｌ）、（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｌ−アスパラギン酸  ４−（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）  １−（ｔｅｒｔ−ブチル）（化合物ａａ１３０）（２０．０  ｇ、３５．９３４  ｍｍｏｌ）、４−ブロモ−２−メトキシ−Ｎ−（メチルスルホニル）ベンズアミド（３３．２２  ｇ、１０７．８０３  ｍｍｏｌ）のジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）溶液（１００  ｍＬ）を室温撹拌した後、上述のニッケル触媒溶液を滴下しながら室温にて加え、１６時間撹拌した。反応液に１０％ＥＤＴＡ・２Ｎａ（エチレンジアミン四酢酸の２ナトリウム塩）水溶液を加え、酢酸エチルで３回抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、ろ過、減圧濃縮を行うことで得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製することで、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（３−メトキシ−４−（（メチルスルホニル）カルバモイル）フェニル）プロパン酸  ｔｅｒｔ−ブチル（Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＨＭｓ）−ＯｔＢｕ）（５．０５ｇ、１９％）を得た。
窒素雰囲気下、上述のように得た（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（３−メトキシ−４−（（メチルスルホニル）カルバモイル）フェニル）プロパン酸  ｔｅｒｔ−ブチル（Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＨＭｓ）−ＯｔＢｕ）（１０．１  ｇ、１６．９８４  ｍｍｏｌ）とクロロトリメチルシラン（ＴＭＳＣｌ）（５．５４  ｇ、５０．９５２  ｍｍｏｌ）の２，２，２−トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）溶液（１００  ｍＬ）を室温にて１時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮し、得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル）にて精製することで、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（３−メトキシ−４−（（メチルスルホニル）カルバモイル）フェニル）プロパン酸（化合物ａａ１２９、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＨＭｓ）−ＯＨ）（５．０６  ｇ、５５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ＝  ５３９  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７２分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０３３５】
（２Ｓ，４Ｒ）−１−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−４−（２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）エトキシ）ピロリジン−２−カルボン酸（化合物ａａ１３３、Ｆｍｏｃ−Ｈｙｐ（２−ＥｔＯＴＨＰ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000177
窒素雰囲気下、−１０℃にて市販の（２Ｓ，４Ｒ）−１−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−４−ヒドロキシピロリジン−２−カルボン酸（Ｃｂｚ−Ｈｙｐ−ＯＨ）（１２．０  ｇ、４５．２  ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド溶液（１２０  ｍＬ）に水素化ナトリウム（ＮａＨ）  （１８．１  ｇ、４５１．９  ｍｍｏｌ、６０ｗｔ％）を少しづつ加え、−１０℃で１時間撹拌した。反応液に２−（２−ブロモエトキシ）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン（２８．３  ｇ、１３５．７  ｍｍｏｌ）を−１０℃にて滴下しながら加え、反応液を３０℃にて３時間撹拌した。反応を炭酸水素ナトリウム水溶液（１２０  ｍＬ）で停止し、酢酸エチル（１２０  ｍＬ）を加え洗浄した。得られた水層に１Ｎ塩酸水溶液をｐＨ＝６になるまで加えた後、酢酸エチル（１２０  ｍＬ）で２回抽出した。得られた有機層を飽和食塩水、５％チオ硫酸ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った。得られたろ液を減圧下濃縮することで（２Ｓ，４Ｒ）−１−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−４−（２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）エトキシ）ピロリジン−２−カルボン酸（Ｃｂｚ−Ｈｙｐ（２−ＥｔＯＴＨＰ）−ＯＨ）（１０．４  ｇ）を粗生成物として得た。
水素雰囲気下、得られた粗生成物である（２Ｓ，４Ｒ）−１−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−４−（２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）エトキシ）ピロリジン−２−カルボン酸（Ｃｂｚ−Ｈｙｐ（２−ＥｔＯＴＨＰ）−ＯＨ）（１０．１  ｇ）とパラジウム炭素（Ｐｄ／Ｃ）（３．０  ｇ）のメタノール溶液（１００  ｍＬ）を室温にて２時間撹拌した。反応液をろ過した後、得られた固体をメタノール（１００  ｍＬ）で洗浄した。ろ液を減圧下濃縮することで得られた残渣をエーテルで洗浄することで（２Ｓ，４Ｒ）−４−（２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）エトキシ）ピロリジン−２−カルボン酸（Ｈ−Ｈｙｐ（２−ＥｔＯＴＨＰ）−ＯＨ）（６．１  ｇ）を粗生成物として得た。
得られた粗生成物である（２Ｓ，４Ｒ）−４−（２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）エトキシ）ピロリジン−２−カルボン酸（Ｈ−Ｈｙｐ（２−ＥｔＯＴＨＰ）−ＯＨ）（６．１  ｇ）と炭酸水素ナトリウム（５．９  ｇ、７０．５  ｍｍｏｌ）の１、４−ジオキサン／水＝１／１溶液（１３０  ｍＬ）にＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（７．９  ｇ、２３．５  ｍｍｏｌ）を加え、室温にて２時間撹拌した。反応液にｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）／ヘキサン＝１／３溶液（１００  ｍＬ）を加え、洗浄する操作を３回行った後、得られた水層に１Ｎ塩酸水溶液をｐＨ＝６になるまで加え、ｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）（１００  ｍＬ）で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った。得られたろ液を減圧下濃縮し、残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル）にて精製することで、（２Ｓ，４Ｒ）−１−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−４−（２−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）エトキシ）ピロリジン−２−カルボン酸（化合物ａａ１３３、Ｆｍｏｃ−Ｈｙｐ（２−ＥｔＯＴＨＰ）−ＯＨ）（１．８８  ｇ、３工程３０％）で得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ＝  ４８２  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０３３６】
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−（３−メトキシ−４−（メチルカルバモイル）フェネチル）グリシン（化合物ａａ１３４、Ｆｍｏｃ−（Ｐｈ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＭｅ）Ｅｔ）Ｇｌｙ−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000178
【０３３７】
Ｓｔｅｐ  １
文献記載の方法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （１９９１），  ３４（４），  １２９７−１３０１）により調整した３−（（２−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−２−オキソエチル）アミノ）プロパン酸メチル（３１．０  ｇ、１４２．６８３  ｍｍｏｌ）とＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（４８．１３  ｇ、１４２．６８３  ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン溶液（２００  ｍＬ）に炭酸ナトリウム（３０．２５  ｇ、２８５．３６６  ｍｍｏｌ）の水溶液（２００  ｍＬ）を室温にて加え１６時間撹拌した。反応液にアセトニトリルを加え、ろ過をした後、ろ液を減圧下濃縮した。得られた残渣に酢酸エチルを加え、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った。
得られたろ液を減圧下濃縮することで粗生成物として３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（２−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−２−オキソエチル）アミノ）プロパン酸メチル（６２  ｇ、３６％）を得た。【０３３８】
Ｓｔｅｐ  ２
塩化カルシウム（８４．５４  ｇ、７６１．７６１  ｍｍｏｌ）と水酸化リチウムの１水和物（８．５２  ｇ、２０３．１３６  ｍｍｏｌ）に水（２５０  ｍＬ）とイソプロパノール（１０００  ｍＬ）を加えた後、上述の粗生成物である３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（２−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−２−オキソエチル）アミノ）プロパン酸メチル（６２  ｇ、５０．７８４  ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（２５０  ｍＬ）を０℃にて加え、１６時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮した後、得られた残渣に水を加え、ｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）で洗浄した。得られた水層に１Ｎ塩酸水溶液を溶液のｐＨが酸性になるまで加えた後、酢酸エチルで抽出した。得られた有機層を水、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った。得られたろ液を減圧下濃縮することで粗生成物として３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（２−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−２−オキソエチル）アミノ）プロパン酸（１４  ｇ、５８％）を得た。【０３３９】
Ｓｔｅｐ  ３
窒素雰囲気下、上述の粗生成物である３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（２−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−２−オキソエチル）アミノ）プロパン酸（１４  ｇ、３２．９０４  ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド（５．９０  ｇ、３６．１９４  ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（７．４７  ｇ、３６．１９４  ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（１４０  ｍＬ）を室温にて１６時間撹拌した。反応液をろ過した後、減圧下濃縮することで得られた残渣に酢酸エチルを加え、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った。得られたろ液を減圧下濃縮することで粗生成物として３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（２−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−２−オキソエチル）アミノ）プロパン酸  １，３−ジオキソイソインドリン−２−イル（１４  ｇ、７５％）を得た。【０３４０】
Ｓｔｅｐ  ４
窒素雰囲気下、臭化ニッケル（ＩＩ）の３水和物（ＮｉＢｒ２・３Ｈ２Ｏ）（５．７３  ｇ、２１．０３１ｍｍｏｌ）と４，４'−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２，２'−ビピリジル（ｄｔｂｂｐｙ）（５．６４  ｇ、２１．０３１  ｍｍｏｌ）のジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）溶液（２００  ｍＬ）を５０℃で３時間撹拌した後、室温に冷却することでニッケル触媒溶液を得た。窒素雰囲気下、亜鉛粉末（２２．９３  ｇ、３５０．５０９  ｍｍｏｌ）、上述の様にして得た粗生成物である３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（２−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−２−オキソエチル）アミノ）プロパン酸  １，３−ジオキソイソインドリン−２−イル（４０．０  ｇ、７０．１０２  ｍｍｏｌ）、実施例に記載の通り合成した４−ヨード−２−メトキシ−Ｎ−メチルベンズアミド（化合物ａａ１３１）（４０．８１  ｇ、１４０．２０４  ｍｍｏｌ）のジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）溶液（２００  ｍＬ）を室温で１０分間撹拌した後、上述のニッケル触媒溶液を滴下しながら室温にて加え、１６時間撹拌した。反応液に１０％ＥＤＴＡ・２Ｎａ（エチレンジアミン四酢酸の２ナトリウム塩）水溶液を加え、ろ過した後、酢酸エチルで３回抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った後、得られたろ液を減圧下濃縮し、残渣を順相カラムクロマトグラフィーにて精製することで、ｔｅｒｔ−ブチル  Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−（３−メトキシ−４−（メチルカルバモイル）フェネチル）グリシナート（１４  ｇ、３７％）を得た。【０３４１】
Ｓｔｅｐ  ５
上述のｔｅｒｔ−ブチル  Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−（３−メトキシ−４−（メチルカルバモイル）フェネチル）グリシナート（１４．０  ｇ、２５．７０５  ｍｍｏｌ）の４Ｎ塩酸／１，４−ジオキサン溶液（６５  ｍＬ）を室温にて４８時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮した後、得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル）にて精製することで、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−（３−メトキシ−４−（メチルカルバモイル）フェネチル）グリシン（化合物ａａ１３４、Ｆｍｏｃ−（Ｐｈ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＭｅ）Ｅｔ）Ｇｌｙ−ＯＨ）（６  ｇ、４７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ＝  ４８９  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０３４２】
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（３−メトキシ−４−（メチルカルバモイル）フェニル）ブタン酸（化合物ａａ１３５、Ｆｍｏｃ−Ｈｐｈ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＭｅ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000179
【０３４３】
Ｓｔｅｐ  １
窒素雰囲気下、市販の（Ｓ）−４−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−５−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−５−オキソペンタン酸（Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ）（１７５  ｇ、４１１．２９９  ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド（６７．１  ｇ、４１１．２９９  ｍｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ・ＨＣｌ）（７８．８５  ｇ、４１１．２９９  ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン（ＤＭＡＰ）（２．５１  ｇ、２０．５６５  ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド溶液（２０００  ｍＬ）を室温にて１６時間撹拌した。反応液に１  Ｍ塩酸水溶液を加えた後、ｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）で抽出した。得られた有機層を水、５０％飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った後、得られたろ液を減圧下濃縮し、残渣を順相カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製することで、（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｌ−グルタミン酸  ５−（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）  １−（ｔｅｒｔ−ブチル）（１０５  ｇ、４５％）を得た。【０３４４】
Ｓｔｅｐ  ２
窒素雰囲気下、臭化ニッケル（ＩＩ）の３水和物（ＮｉＢｒ２・３Ｈ２Ｏ）（１４１  ｍｇ、０．５２６  ｍｍｏｌ）と４，４'−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２，２'−ビピリジル（ｄｔｂｂｐｙ）（１４０  ｍｇ、０．５２６  ｍｍｏｌ）のジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）溶液（５  ｍＬ）を５０℃で３時間撹拌した後、室温に冷却することでニッケル触媒溶液を得た。窒素雰囲気下、亜鉛粉末（６１７  ｍｇ、８．７５  ｍｍｏｌ）、上述の様にして得た（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｌ−グルタミン酸  ５−（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）  １−（ｔｅｒｔ−ブチル）（１．０  ｇ、１．７５  ｍｍｏｌ）、実施例に記載の通り合成した４−ヨード−２−メトキシ−Ｎ−メチルベンズアミド（化合物ａａ１３１）（１．１９  ｇ、３．５０  ｍｍｏｌ）のジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）溶液（５  ｍＬ）を室温で１時間撹拌した後、上述のニッケル触媒溶液を滴下しながら室温にて加え、１６時間撹拌した。反応液に１０％ＥＤＴＡ・２Ｎａ（エチレンジアミン四酢酸の２ナトリウム塩）水溶液を加え、ろ過した後、酢酸エチルで３回抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った後、得られたろ液を減圧下濃縮し、残渣を順相カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製することで、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（３−メトキシ−４−（メチルカルバモイル）フェニル）ブタン酸  ｔｅｒｔ−ブチル（５５０  ｍｇ、５７％）を得た。【０３４５】
Ｓｔｅｐ  ３
上述の様にして得た（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（３−メトキシ−４−（メチルカルバモイル）フェニル）ブタン酸  ｔｅｒｔ−ブチル（３．００  ｇ、５．５０８  ｍｍｏｌ）のトリフルオロエタノール（ＴＦＥ）溶液（３０  ｍＬ）に室温にてクロロトリメチルシラン（ＴＭＳ−Ｃｌ）（１．８０  ｇ、１６．５６８  ｍｍｏｌ）を加え、３時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮した後、得られた残渣を酢酸エチルで精製することで、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（３−メトキシ−４−（メチルカルバモイル）フェニル）ブタン酸（化合物ａａ１３５、Ｆｍｏｃ−Ｈｐｈ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＭｅ）−ＯＨ）（１．９  ｇ、７０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ＝  ４８９  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０３４６】
（Ｒ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（３−メトキシ−４−（メチルカルバモイル）フェニル）ブタン酸（化合物ａａ１３６、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｈｐｈ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＭｅ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000180
市販の（Ｒ）−４−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−５−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−５−オキソペンタン酸（Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ）を用い化合物ａａ１３５の合成と同様な手法により（Ｒ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（３−メトキシ−４−（メチルカルバモイル）フェニル）ブタン酸（化合物ａａ１３６、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｈｐｈ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＭｅ）−ＯＨ）（５  ｇ、３工程２０％）で合成した。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ＝  ４８７  （Ｍ―Ｈ）―
保持時間：０．８３分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０３４７】
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−（３−メトキシ−４−（メチルカルバモイル）フェニル）ブタン酸（化合物ａａ１３７、Ｆｍｏｃ−ＭｅＨｐｈ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＭｅ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000181
別途合成した（Ｓ）−４−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−５−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−５−オキソペンタン酸  （化合物ａａ１３８、Ｆｍｏｃ−ＭｅＧｌｕ−ＯｔＢｕ）を用い化合物ａａ１３５の合成と同様な手法により（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−（３−メトキシ−４−（メチルカルバモイル）フェニル）ブタン酸（化合物ａａ１３７、Ｆｍｏｃ−ＭｅＨｐｈ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＭｅ）−ＯＨ）（２．８  ｇ、３工程２０％）で合成した。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ＝  ５０３  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７３分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０３４８】
（Ｓ）−４−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−５−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−５−オキソペンタン酸  （化合物ａａ１３８、Ｆｍｏｃ−ＭｅＧｌｕ−ＯｔＢｕ）の合成
2020122182.tif 000182
窒素雰囲気下、市販の（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−５−（アリルオキシ）−５−オキソペンタン酸（Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＡｌｌ）−ＯＨ）（１００  ｇ、２４４．２３７  ｍｍｏｌ）、パラホルムアルデヒド（２２  ｇ、７３３．３３３  ｍｍｏｌ）、ｐ−トルエンスルホン酸（ＴｓＯＨ）（０．４２  ｇ、２．４３８  ｍｍｏｌ）のトルエン溶液（１０００  ｍＬ）を１１０℃にて１．５時間撹拌した。反応液を室温にて冷却した後、減圧下濃縮することで得られた残渣に酢酸エチルを加え、炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った後、減圧下濃縮することで粗生成物として、（Ｓ）−４−（３−（アリルオキシ）−３−オキソプロピル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸  （９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（１１０  ｇ）を得た。
窒素雰囲気下、上述の粗生成物として得られた（Ｓ）−４−（３−（アリルオキシ）−３−オキソプロピル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸  （９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（１１０  ｇ）、トリエチルシラン（Ｅｔ３ＳｉＨ）（６０．６  ｇ、５２２．５６５  ｍｍｏｌ）、水（４．７  ｍＬ、２６４．２８２  ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１１００  ｍＬ）に０℃にて三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体（ＢＦ３・ＯＥｔ２）（７４．２  ｇ、５２２．５６５  ｍｍｏｌ）を加え、１６時間撹拌した。反応液に塩化アンモニウム水溶液を加え、酢酸エチルで２回抽出した後、得られた有機層を減圧下濃縮した。残渣に炭酸水素ナトリウム水溶液を加え溶解させた後、ヘキサン／酢酸エチル（５／１）で３回洗浄した。水層に６Ｎ塩酸水溶液をｐＨ＝２になるまで加え、酢酸エチルで２回抽出した。有機層を水、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った後、ろ液を減圧下濃縮した。得られた残渣を１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）のアセトニトリル／水（１／５）溶液を用いて再結晶することで、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−５−（アリルオキシ）−５−オキソペンタン酸（Ｆｍｏｃ−ＭｅＧｌｕ（ＯＡｌｌ）−ＯＨ）（９５  ｇ、２工程８６％）を得た。
窒素雰囲気下、上述の様に得た（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−５−（アリルオキシ）−５−オキソペンタン酸（Ｆｍｏｃ−ＭｅＧｌｕ（ＯＡｌｌ）−ＯＨ）（１００  ｇ、２３６．４０６  ｍｍｏｌ）と三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体（ＢＦ３・ＯＥｔ２）（０．１６  ｇ、２．３６４  ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（２６０  ｍＬ）に０℃にて２，２，２−トリクロロアセトイミド酸  ｔｅｒｔ−ブチル（５１  ｇ、４７２．８１３  ｍｍｏｌ）のシクロヘキサン溶液を加えた後、１時間撹拌した。反応液にピリジンを加え、ろ過を行った後、ろ液を炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った。ろ液を減圧下濃縮することで得られた残渣をアセトニトリル／水（１／５）溶液を用いて再結晶することで、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−メチル−Ｌ−グルタミン酸  １−（ｔｅｒｔ−ブチル）  ５−アリル（１０２  ｇ）を定量的に得た。
窒素雰囲気下、上述の様にして得たＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−メチル−Ｌ−グルタミン酸  １−（ｔｅｒｔ−ブチル）  ５−アリル（２９０  ｇ、６０５．４２７  ｍｍｏｌ）とテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（Ｐｄ（ＰＰｈ３）４）（７．０  ｇ、６．０５４  ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１４５０  ｍＬ）にフェニルシラン（ＰｈＳｉＨ３）（４５．７７  ｇ、４２３．７９９  ｍｍｏｌ）を滴下しながら室温にて加え、撹拌した。原料の消失をＬＣ−ＭＳにて確認した後、反応液をろ過し、得られたろ液を減圧下濃縮した。残渣に炭酸ナトリウム水溶液を加え溶解させた後、ヘキサン／ｔ−ブチルメチルエーテル（１／３）溶液で３回洗浄した。水層にリン酸をｐＨ＝２になるまで加えた後、ｔ−ブチルメチルエーテルで２回抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った後、得られたろ液を減圧下濃縮することで、（Ｓ）−４−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−５−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−５−オキソペンタン酸  （化合物ａａ１３８、Ｆｍｏｃ−ＭｅＧｌｕ−ＯｔＢｕ）（２４７  ｇ、９３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ＝  ４６２  （Ｍ＋Ｎａ）＋
保持時間：１．３８０分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ５２）【０３４９】
（２Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（４−（メチル（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）カルバモイル）フェニル）プロパン酸（化合物ａａ１３９、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（４−ＣＯＮＭｅＯＴＨＰ）−ＯＨ）、（２Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（３−メトキシ−４−（（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）カルバモイル）フェニル）プロパン酸（化合物ａａ１４０、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＨＯＴＨＰ）−ＯＨ）は以下のスキームに従って合成した。
2020122182.tif 000183
【０３５０】
（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｌ−アスパラギン酸  １−メチル  ４−（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）の合成
2020122182.tif 000184
窒素雰囲気下、市販の（Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−メトキシ−４−オキソブタン酸（Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ−ＯＭｅ）（１５．０  ｇ、４０．６  ｍｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシフタルイミド（７．３  ｇ、４４．７  ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（８．４  ｇ、４０．６  ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（２２５  ｍＬ）を室温にて、２５℃で２時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮することで得られた残渣に酢酸エチルを加え、ろ過を行った後、得られた固体を酢酸エチルで洗浄した。ろ液を減圧下濃縮することで得られた残渣に酢酸エチル（１．５  Ｌ）を加え、５０℃で１６時間撹拌した。室温に冷却した後、ろ過を行い、固体を酢酸エチルで洗浄した後、ろ液を減圧下濃縮することで、粗生成物である（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｌ−アスパラギン酸  １−メチル  ４−（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）（１０．４  ｇ）を得た。【０３５１】
（Ｓ）−４−（２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−メトキシ−３−オキソプロピル）安息香酸  ｔｅｒｔ−ブチル（Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（４−ＣＯｔＢｕ）−ＯＭｅ）の合成
2020122182.tif 000185
窒素雰囲気下、臭化ニッケル（ＩＩ）の３水和物（ＮｉＢｒ２・３Ｈ２Ｏ）（１．６４９  ｇ、６．０６４  ｍｍｏｌ）と４，４'−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２，２'−ビピリジル（ｄｔｂｂｐｙ）（１．６２７  ｇ、６．０６４  ｍｍｏｌ）のジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）溶液（５０  ｍＬ）を５０℃で３時間撹拌した後、室温に冷却することでニッケル触媒溶液を得た。窒素雰囲気下、亜鉛粉末（６．６１  ｇ、１０１．０７１  ｍｍｏｌ）、（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｌ−アスパラギン酸  １−メチル  ４−（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）（１０．４  ｇ、２０．２１４  ｍｍｏｌ）のジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）溶液（５０  ｍＬ）に４−ブロモ安息香酸  ｔｅｒｔ−ブチル（１０．４  ｇ、４０．４４７  ｍｍｏｌ）を滴下しながら０℃にて加え、室温にて１６時間撹拌した。反応液に１０％ＥＤＴＡ・２Ｎａ（エチレンジアミン四酢酸の２ナトリウム塩）水溶液を０℃にて加え、ろ過を行い、固体を酢酸エチルで洗浄した後、ろ液を酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った後、ろ液を減圧下濃縮することで得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製することで、（Ｓ）−４−（２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−メトキシ−３−オキソプロピル）安息香酸  ｔｅｒｔ−ブチル（Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（４−ＣＯｔＢｕ）−ＯＭｅ）（１１．９  ｇ、７６％）を得た。【０３５２】
（Ｓ）−４−（２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−メトキシ−３−オキソプロピル）安息香酸（Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（４−ＣＯＯＨ）−ＯＭｅ）の合成
2020122182.tif 000186
窒素雰囲気下、上述の（Ｓ）−４−（２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−メトキシ−３−オキソプロピル）安息香酸  ｔｅｒｔ−ブチル（１１．９  ｇ、２３．７  ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（２３８  ｍＬ）にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（７１．４  ｍＬ）を加え、室温にて３時間撹拌した。反応液に水（２５０  ｍＬ）を加えた後、ジクロロメタン（２５０  ｍＬ）で抽出した。有機層を水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った後、ろ液を減圧下濃縮することで、粗生成物として（Ｓ）−４−（２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−メトキシ−３−オキソプロピル）安息香酸（Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（４−ＣＯＯＨ）−ＯＭｅ）（１０．１  ｇ）を得た。【０３５３】
（２Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（４−（メチル（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）カルバモイル）フェニル）プロパン酸メチル（Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（４−ＣＯＮＭｅＯＴＨＰ）−ＯＭｅ）の合成
2020122182.tif 000187
窒素雰囲気下、上述の粗生成物である（Ｓ）−４−（２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−メトキシ−３−オキソプロピル）安息香酸（１０．１  ｇ、２２．６  ｍｍｏｌ）と文献記載の方法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２０１４，  ７９（２０），  ９６９９−９７０３）で別途合成したＮ−メチル−Ｏ−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ヒドロキシルアミン（１４．９  ｇ、１１３．５  ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１００  ｍＬ）にＯ−（７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロリン酸塩（ＨＡＴＵ）（１２．９  ｇ、３４．０  ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（４．４  ｇ、３４．０  ｍｍｏｌ）を室温にて加え、１６時間撹拌した。反応液に水（１００  ｍＬ）を加え、酢酸エチル（２００  ｍＬ）で抽出した後、水（１００  ｍＬ）、飽和食塩水（１００  ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った後、ろ液を減圧下濃縮することで得られる残渣を順相カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製することで、（２Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（４−（メチル（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）カルバモイル）フェニル）プロパン酸メチル（Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（４−ＣＯＮＭｅＯＴＨＰ）−ＯＭｅ）（７．２  ｇ、５５％）を得た。【０３５４】
（２Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（４−（メチル（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）カルバモイル）フェニル）プロパン酸（化合物ａａ１３９、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（４−ＣＯＮＭｅＯＴＨＰ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000188
塩化カルシウム（２１．４６  ｇ、１９３．３３  ｍｍｏｌ）と水酸化リチウムの１水和物（２．１６  ｇ、５１．４７  ｍｍｏｌ）に水（７２  ｍＬ）を加え、室温にて１５分撹拌した後、上述の（２Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（４−（メチル（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）カルバモイル）フェニル）プロパン酸メチル（Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（４−ＣＯＮＭｅＯＴＨＰ）−ＯＭｅ）（７．２０  ｇ、１２．８９  ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン／ｔ−ブタノール（７２  ｍＬ／２８８  ｍＬ）溶液を室温にて加え、１６時間撹拌した。反応液をろ過し、固体をテトラヒドロフラン（２００  ｍＬ）で洗浄した後、ろ液を減圧下濃縮し、水（５０  ｍＬ）を加え、酢酸エチル（２００  ｍＬ）で２回抽出した。有機層を０．０５Ｎリン酸水溶液（３５０  ｍＬ）で洗浄した後、得られた水層を再び酢酸エチル（２００  ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせて、減圧下濃縮し、得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル）で精製することで、（２Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（４−（メチル（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）カルバモイル）フェニル）プロパン酸（化合物ａａ１３９、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（４−ＣＯＮＭｅＯＴＨＰ）−ＯＨ）（５．１  ｇ、７１％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ＝  ５４５  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０３５５】
４−ヨード−２−メトキシ安息香酸  ｔｅｒｔ−ブチルの合成
2020122182.tif 000189
窒素雰囲気下、市販の４−ヨード−２−メトキシ安息香酸（１５．０  ｇ、５３．９４８  ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（６０．０  ｍＬ）に２，２，２−トリクロロアセトイミド酸  ｔｅｒｔ−ブチル（２３．５８  ｇ、１０７．８９６  ｍｍｏｌ）のシクロヘキサン溶液（１２０  ｍＬ）を室温にて滴下しながら加えた後、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体（ＢＦ３・ＯＥｔ２）（７６．５７  ｍｇ、０．５３９  ｍｍｏｌ）を滴下しながら加え、室温で２時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮し、得られた残渣にヘキサンを加え、１時間撹拌し、ろ過を行った後、ろ液を減圧下濃縮することで、粗生成物として４−ヨード−２−メトキシ安息香酸  ｔｅｒｔ−ブチル（２１  ｇ）を得た。【０３５６】
（Ｓ）−４−（２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−メトキシ−３−オキソプロピル）−２−メトキシ安息香酸  ｔｅｒｔ−ブチル（Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯｔＢｕ）−ＯＭｅ）の合成
2020122182.tif 000190
窒素雰囲気下、臭化ニッケル（ＩＩ）の３水和物（ＮｉＢｒ２・３Ｈ２Ｏ）（４．２８  ｇ、１５．７１１  ｍｍｏｌ）と４，４'−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２，２'−ビピリジル（ｄｔｂｂｐｙ）（４．２２  ｇ、１５．７１１  ｍｍｏｌ）のジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）溶液（１５０  ｍＬ）を５０℃で３時間撹拌した後、室温に冷却することでニッケル触媒溶液を得た。窒素雰囲気下、亜鉛粉末（１７．１３  ｇ、２６１．８５６  ｍｍｏｌ）、上述の様に合成した（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｌ−アスパラギン酸  １−メチル  ４−（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）（２６．９４  ｇ、５２．３７１  ｍｍｏｌ）、上述の様に合成した粗生成物である４−ヨード−２−メトキシ安息香酸  ｔｅｒｔ−ブチル（３５．０  ｇ、１０４．７４２  ｍｍｏｌ）のジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）溶液（１５０  ｍＬ）を室温で１０分間撹拌した後、上述のニッケル触媒溶液を滴下しながら室温にて加え、１６時間撹拌した。反応液に１０％ＥＤＴＡ・２Ｎａ（エチレンジアミン四酢酸の２ナトリウム塩）水溶液を加え、ろ過を行った後、得られたろ液を酢酸エチルで２回抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、ろ過、減圧濃縮を行うことで得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製することで、（Ｓ）−４−（２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−メトキシ−３−オキソプロピル）−２−メトキシ安息香酸  ｔｅｒｔ−ブチル（Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯｔＢｕ）−ＯＭｅ）（８．４  ｇ、１３％）を得た。【０３５７】
（Ｓ）−４−（２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−メトキシ−３−オキソプロピル）−２−メトキシ安息香酸（Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＯＨ）−ＯＭｅ）の合成
2020122182.tif 000191
窒素雰囲気下、上述のように得た（Ｓ）−４−（２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−メトキシ−３−オキソプロピル）−２−メトキシ安息香酸  ｔｅｒｔ−ブチル（Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯｔＢｕ）−ＯＭｅ）（２６．８  ｇ、５０．４  ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン溶液（３０．０  ｍＬ）に室温にて４Ｎ  塩酸／１，４−ジオキサン溶液（２６８  ｍＬ）を加え、１時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮することで得られた残渣をヘキサン／酢酸エチル（５／１）で洗浄することで、粗生成物として（Ｓ）−４−（２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−メトキシ−３−オキソプロピル）−２−メトキシ安息香酸（Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＯＨ）−ＯＭｅ）（２２  ｇ）を得た。【０３５８】
（２Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（３−メトキシ−４−（（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）カルバモイル）フェニル）プロパン酸メチル（Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＨＯＴＨＰ）−ＯＭｅ）の合成
2020122182.tif 000192
窒素雰囲気下、上述の粗生成物である（Ｓ）−４−（２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−メトキシ−３−オキソプロピル）−２−メトキシ安息香酸（Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＯＨ）−ＯＭｅ）（２２．０  ｇ、４６．２６７  ｍｍｏｌ）と市販のＯ−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ヒドロキシルアミン（２７．１  ｇ、２３１．３３７  ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（４００  ｍＬ）にＯ−（７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロリン酸塩（ＨＡＴＵ）（２１．１１  ｇ、５５．５２１  ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（７．１８  ｇ、５５．５２１  ｍｍｏｌ）を室温にて加え、１６時間撹拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで２回抽出した後、飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った後、ろ液を減圧下濃縮することで粗生成物として（２Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（３−メトキシ−４−（（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）カルバモイル）フェニル）プロパン酸メチル（Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＨＯＴＨＰ）−ＯＭｅ）  （３５．０  ｇ）を得た。【０３５９】
（２Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（３−メトキシ−４−（（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）カルバモイル）フェニル）プロパン酸（化合物ａａ１４０、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＨＯＴＨＰ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000193
塩化カルシウム（１０１．４０  ｇ、９１３．６３１  ｍｍｏｌ）と水酸化リチウムの１水和物（５．８３  ｇ、２４３．６３５  ｍｍｏｌ）に水（３６０  ｍＬ）、イソプロパノール（１４４０  ｍＬ）を０℃にて加え、上述の粗生成物である（２Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（３−メトキシ−４−（（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）カルバモイル）フェニル）プロパン酸メチル（Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＨＯＴＨＰ）−ＯＭｅ）（３５．０  ｇ、６０．９０９  ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（３６０  ｍＬ）を滴下しながら加えた後、室温にて１６時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮し、有機溶媒を除去した後、得られた水層に２Ｍ塩酸水溶液をｐＨ＝７になるまで加え、酢酸エチルで２回抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った後、得られたろ液を減圧下濃縮し、残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル）で精製することで、（２Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（３−メトキシ−４−（（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）カルバモイル）フェニル）プロパン酸（化合物ａａ１４０、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＨＯＴＨＰ）−ＯＨ）  （７．３  ｇ、４０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ＝  ５６１  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０３６０】
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（（Ｓ）−４−（（アリルオキシ）カルボニル）モルホリン−３−イル）メチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１４１、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｓ−（Ａｌｌｏｃ）Ｍｏｒ−３−Ｍｅ）−ＯＨ）は下記のスキームにより合成した。
2020122182.tif 000194
【０３６１】
Ｓｔｅｐ  １
窒素雰囲気下、市販の（Ｓ）−モルホリン−３−カルボン酸（ＣＡＳ．  Ｎｏ．  ７４１２８８−３１−３）（１４．０  ｇ、１０７  ｍｍｏｌ）の水溶液（１００  ｍＬ）に室温にて炭酸水素ナトリウム（２０．２６  ｇ、２４１．１７２  ｍｍｏｌ）を加えた。反応液に室温でクロロギ酸アリル（Ａｌｌｏｃ−Ｃｌ）（１７．４４  ｇ、１２０．５３  ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン溶液（１００  ｍＬ）を滴下しながら加え、２時間撹拌した。反応液に水を加えた後、酢酸エチルで抽出し、得られた有機層を飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った。ろ液を減圧下濃縮し、得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製することで、（Ｓ）−モルホリン−３，４−ジカルボン酸  ３−メチル  ４−アリル（１９  ｇ、８６％）を得た。【０３６２】
Ｓｔｅｐ  ２
上記の様にして得た（Ｓ）−モルホリン−３，４−ジカルボン酸  ３−メチル  ４−アリル（１９．５  ｇ、８５．０６７  ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液（２８３  ｍＬ）に０度にてリチウムホウ水素化物（５．５６  ｇ、２５５．２３３）／テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液を滴下しながら加え、室温で２時間撹拌した。反応液に０度にて水と２Ｎ塩酸水溶液を加えた後、酢酸エチルで抽出し、得られた有機層を飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った。ろ液を減圧下濃縮し、得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製することで、（Ｒ）−３−（ヒドロキシメチル）モルホリン−４−カルボン酸アリル（１０．１  ｇ、５９％）を得た。【０３６３】
Ｓｔｅｐ  ３
窒素雰囲気下、上述の（Ｒ）−３−（ヒドロキシメチル）モルホリン−４−カルボン酸アリル（７．０  ｇ、３４．８  ｍｍｏｌ）と特許記載の方法（ＷＯ２０１５／１７９８２３）で合成した（Ｓ）−アジリジン−１，２−ジカルボン酸  ２−メチル  １−（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル）（７．５０  ｇ、２３．２  ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（４７  ｍＬ）に０度にて三フッ化ホウ素−エチルエーテルコンプレックス（１．４８  ｇ、１０．４５  ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液を滴下しながら加え、２時間撹拌した。反応液に水を加えた後、ジクロロメタンで抽出し、得られた有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った。ろ液を減圧下濃縮し、得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル）にて精製することで、（Ｓ）−３−（（（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−メトキシ−３−オキソプロポキシ）メチル）モルホリン−４−カルボン酸アリル（４．５  ｇ、３７％）を得た。【０３６４】
Ｓｔｅｐ  ４
窒素雰囲気下、塩化カルシウム（１５．８７  ｇ、１４２．９７４  ｍｍｏｌ）の水溶液（５０  ｍＬ）に室温にて水酸化リチウム一水和物（０．９１  ｇ、３７．９９９  ｍｍｏｌ）を加え、室温で１０分間撹拌した。反応液に上述の様にして得た（Ｓ）−３−（（（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−メトキシ−３−オキソプロポキシ）メチル）モルホリン−４−カルボン酸アリル（５．０  ｇ、９．５３２  ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（５０  ｍＬ）、イソプロパノール（２００  ｍＬ）を０℃にて加え、室温にて９時間撹拌した後、１Ｍ塩酸水溶液を加え、減圧下溶媒を留去した。得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル）にて精製することで、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（（（Ｓ）−４−（（アリルオキシ）カルボニル）モルホリン−３−イル）メチル）−Ｌ−セリン（化合物ａａ１４１、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｓ−（Ａｌｌｏｃ）Ｍｏｒ−３−Ｍｅ）−ＯＨ）（２．４  ｇ、４９％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ＝  ５１１  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０３６５】
１−３．ペプチド合成機によるペプチド合成に用いるレジン合成
ペプチド合成機によるペプチド合成に用いるレジンは、以下のとおり合成した。２−クロロトリチルクロライドレジン（１００−２００ｍｅｓｈ、１％ＤＶＢ）は渡辺化学工業及びＣｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ社から購入した。【０３６６】
（Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−オキソ−４−（ピペリジン−１−イル）ブタン酸−２−クロロトリチルレジン（化合物ｐｄ０１、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）−ｒｅｓｉｎ）−ｐｉｐ）の合成
2020122182.tif 000195
（Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−オキソ−４−（ピペリジン−１−イル）ブタン酸−２−クロロトリチルレジン（化合物ｐｄ０１、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）−ｒｅｓｉｎ）−ｐｉｐ）は、ＷＯ２０１３／１００１３２に記載の方法にて合成した。
なお、本明細書では、ポリマーやレジンと化合物が結合した場合、ポリマーやレジン部位を○にて表記する場合がある。また、レジン部位の反応点を明確にさせる目的で、○に接続させて反応部位の化学構造を表記させる場合がある。上の構造では、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）−ｒｅｓｉｎ）−ｐｉｐ（化合物ｐｄ０１）において、レジン上の２−クロロトリチル基がＡｓｐの側鎖カルボン酸とエステル結合を介して結合している様子を示している。【０３６７】
（Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−オキソ−４−（ピペリジン−１−イル）ブタン酸−２−クロロトリチルレジン（化合物ｐｄ０７、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｓｐ（Ｏ−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）−Ｒｅｓｉｎ）−ｐｉｐ）の合成
2020122182.tif 000196
（Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−オキソ−４−（ピペリジン−１−イル）ブタン酸−２−クロロトリチルレジン（化合物ｐｄ０７、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｓｐ（Ｏ−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）−Ｒｅｓｉｎ）−ｐｉｐ）は下記のルートにて合成した。
2020122182.tif 000197
【０３６８】
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−（アリルオキシ）−４−オキソブタン酸（化合物ｐｄ０４、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｓｐ（ＯＡｌ）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000198
窒素雰囲気下、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（アリルオキシ）−４−オキソブタン酸（化合物ｐｄ０２、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯＡｌ）−ＯＨ）（１０．０  ｇ、２５．３  ｍｍｏｌ）のトルエン溶液（１００  ｍＬ）に室温にてパラホルムアルデヒド（１．５２  ｇ）、トシル酸（ＴｓＯＨ）（２６０  ｍｇ、１．５１  ｍｍｏｌ）を加え、１１０℃にて１６時間撹拌した。その後、室温まで反応液を冷却し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液による洗浄を２回行った。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、ろ過、減圧濃縮し、粗生成物として（Ｓ）−４−（２−（アリルオキシ）−２−オキソエチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（化合物ｐｄ０３）（８．０  ｇ）を得た。
窒素雰囲気下、前工程にて得られた（Ｓ）−４−（２−（アリルオキシ）−２−オキソエチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（化合物ｐｄ０３）（５．０  ｇ、１２．３  ｍｍｏｌ）とトリエチルシラン（Ｅｔ３ＳｉＨ）（４．３  ｇ、３７．０  ｍｍｏｌ）のジクロロメタン／トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）＝１／１（８０  ｍＬ／８０  ｍＬ）の溶液を室温にて２日間撹拌した後、反応液を減圧濃縮した。得られた残渣に炭酸カリウム（Ｋ２ＣＯ３）水溶液を加え、石油エーテルで３回洗浄した後、塩酸を用いてｐＨ３まで調整し、酢酸エチルを用いて３回抽出した。有機層をまとめて、無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、ろ過、減圧濃縮し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル）にて精製し、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−（アリルオキシ）−４−オキソブタン酸（化合物ｐｄ０４、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｓｐ（ＯＡｌ）−ＯＨ）（３．０  ｇ、４６％、２工程）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝４１０（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０３６９】
（Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−オキソ−４−（ピペリジン−１−イル）ブタン酸アリル（化合物ｐｄ０５、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｓｐ（ＯＡｌ）−ｐｉｐ）の合成
2020122182.tif 000199
窒素雰囲気下、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣＩ・ＨＣｌ）（１６．５  ｇ、８６  ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１４３  ｍＬ）に１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（１０．６  ｇ、７９  ｍｍｏ）を０℃にて加え、続いて（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−（アリルオキシ）−４−オキソブタン酸（化合物ｐｄ０４、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｓｐ（ＯＡｌ）−ＯＨ）（２９．３  ｇ、７１．６  ｍｍｏｌ）のＤＭＦ／ＤＣＭ＝１／１の混合溶液（１１７  ｍＬ）を０℃にて滴下しながら加え、３０分撹拌した。その後、ピペリジン（８．４９  ｍＬ、８６  ｍｍｏｌ）を０℃で滴下しながら加え、３０分撹拌した。反応の進行をＬＣ−ＭＳにて確認した後、反応液に酢酸エチルを加え、室温まで昇温した。得られた有機層を２Ｍの塩酸水溶液で２回、５％炭酸水素ナトリウム水溶液で２回、飽和食塩水で２回洗浄した後、硫酸マグネシウムにて乾燥した。得られた混合物をろ過、減圧濃縮し、（Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−オキソ−４−（ピペリジン−１−イル）ブタン酸アリル（化合物ｐｄ０５、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｓｐ（ＯＡｌ）−ｐｉｐ）（３３．７  ｇ、９９％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝４７７（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．３２分（分析条件ＳＭＤｍｅｔｈｏｄ６）【０３７０】
（Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−オキソ−４−（ピペリジン−１−イル）ブタン酸（化合物ｐｄ０６、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｓｐ−ｐｉｐ）の合成
2020122182.tif 000200
窒素雰囲気下、（Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−オキソ−４−（ピペリジン−１−イル）ブタン酸アリル（化合物ｐｄ０５、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｓｐ（ＯＡｌ）−ｐｉｐ）（３１．４  ｇ、６５．９  ｍｍｏｌ）、４−メチルベンゼンスルフィン酸ナトリウム（１１．２  ｇ、６２．６  ｍｍｏｌ）、テトラキストリフェニルフォスフィンパラジウム（Ｐｄ（ＰＰｈ３）４）（７６１  ｍｇ、０．６５９  ｍｍｏｌ）にジクロロメタン（１３２  ｍＬ）を加え、室温で１．５時間撹拌した。その後、反応液に５％炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）で２回洗浄した。得られた水層のｐＨを６Ｍ塩酸水溶液を用い酸性にした後、酢酸エチルで抽出した。得られた有機層を５０％食塩水で２回洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、得られた混合物をろ過、減圧下濃縮した。得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル）にて精製し、さらに順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＯ２Ｈシリカゲル、ヘキサン／酢酸エチル）で精製することで（Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−オキソ−４−（ピペリジン−１−イル）ブタン酸（化合物ｐｄ０６、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｓｐ−ｐｉｐ）（１７．１  ｇ、６０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝４３７（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．１０分（分析条件ＳＭＤｍｅｔｈｏｄ６）【０３７１】
（Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−オキソ−４−（ピペリジン−１−イル）ブタン酸−２−クロロトリチルレジン（化合物ｐｄ０７、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｓｐ（Ｏ−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）−ｒｅｓｉｎ）−ｐｉｐ）の合成
2020122182.tif 000201
フィルター付きの反応容器に２−クロロトリチルクロライドレジン（１．６０  ｍｍｏｌ／ｇ、１００−２００ｍｅｓｈ、１％ＤＶＢ、渡辺化学から購入、２５  ｇ、４０．０  ｍｍｏｌ）と脱水ジクロロメタン（４００  ｍＬ）を入れ、室温にて１０分間振とうした。窒素圧をかけてジクロロメタンを除いた後、（Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−オキソ−４−（ピペリジン−１−イル）ブタン酸（化合物ｐｄ０６、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｓｐ−ｐｉｐ）（８．３７  ｇ、２０．０  ｍｍｏｌ）と脱水ジクロロメタン（４００  ｍＬ）に脱水メタノール（６．４８  ｍＬ）及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（１６．７  ｍＬ）を加えた混合液を反応容器に添加し、３０分間振とうした。窒素圧をかけて反応液を除いた後、脱水ジクロロメタン（４００  ｍＬ）に脱水メタノール（５０．０  ｍＬ）とジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（１６．７  ｍＬ）を加えた混合液を反応容器に添加し、１時間３０分振とうした。窒素圧をかけて反応液を除いた後、ジクロロメタンを入れ、５分間振とうした。窒素圧をかけて反応液を除いた。このジクロロメタンでのレジンの洗浄を２回繰り返し、得られたレジンを減圧下で一晩乾燥させ、（Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−オキソ−４−（ピペリジン−１−イル）ブタン酸−２−クロロトリチルレジン（化合物ｐｄ０７、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｓｐ（Ｏ−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）−ｒｅｓｉｎ）−ｐｉｐ）（２９．９  ｇ）を得た。
得られた（Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−オキソ−４−（ピペリジン−１−イル）ブタン酸−２−クロロトリチルレジン（化合物ｐｄ０７、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｓｐ（Ｏ−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）−ｒｅｓｉｎ）−ｐｉｐ）（１０．７  ｍｇ）を反応容器に入れ、ＤＭＦ（２００  μＬ）、ピペリジン（２００  μＬ）を加えて室温にて１時間振とうした。その後、反応混合液にＤＭＦ（１．６  ｍＬ）を加え、４００  μＬを取りだし、その吸光度（３０１．２  ｎｍ）を測定し（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、ＵＶ−１６００ＰＣ（セル長１．０  ｃｍ）を用いて測定）、（Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−オキソ−４−（ピペリジン−１−イル）ブタン酸−２−クロロトリチルレジン（化合物ｐｄ０７、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｓｐ（Ｏ−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）−ｒｅｓｉｎ）−ｐｉｐ）のローディング量を０．４１６  ｍｍｏｌ／ｇと算出した。
なお、同様に合成したローディング量が異なる別ロットについてもペプチド合成に使用した。【０３７２】
（Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（メチル（（Ｓ）−１−オキソ−１−（（（Ｓ）−１−オキソ−１−（ピペリジン−１−イル）プロパン−２−イル）アミノ）−３−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−４−オキソブタン酸−２−クロロトリチルレジン（化合物ｐｄ０８、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）−ｒｅｓｉｎ）−ＭｅＰｈｅ−Ａｌａ−ｐｉｐ）の合成
2020122182.tif 000202
（Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（メチル（（Ｓ）−１−オキソ−１−（（（Ｓ）−１−オキソ−１−（ピペリジン−１−イル）プロパン−２−イル）アミノ）−３−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−４−オキソブタン酸−２−クロロトリチルレジン（化合物ｐｄ０８、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）−ｒｅｓｉｎ）−ＭｅＰｈｅ−Ａｌａ−ｐｉｐ）は、文献記載の方法にて合成した（文献：国際公開番号：ＷＯ２０１３／１００１３２Ａ１）。【０３７３】
（Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（メチル（（Ｓ）−１−オキソ−１−（（（Ｓ）−１−オキソ−３−フェニル−１−（ピペリジン−１−イル）プロパン−２−イル）アミノ）−３−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−４−オキソブタン酸−２−クロロトリチルレジン（化合物ｐｄ０９、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）−ｒｅｓｉｎ）−ＭｅＰｈｅ−Ｐｈｅ−ｐｉｐ）の合成
2020122182.tif 000203
（Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（メチル（（Ｓ）−１−オキソ−１−（（（Ｓ）−１−オキソ−３−フェニル−１−（ピペリジン−１−イル）プロパン−２−イル）アミノ）−３−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−４−オキソブタン酸−２−クロロトリチルレジン（化合物ｐｄ０９、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）−ｒｅｓｉｎ）−ＭｅＰｈｅ−Ｐｈｅ−ｐｉｐ）は、文献記載の方法を用い、化合物ｐｄ０８と同様の手法にて合成した（文献：国際公開番号：ＷＯ２０１３／１００１３２Ａ１）。【０３７４】
（Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（メチル（（Ｓ）−１−オキソ−１−（（（Ｓ）−１−オキソ−１−（（（Ｓ）−１−オキソ−１−（ピペリジン−１−イル）プロパン−２−イル）アミノ）−３−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−３−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−４−オキソブタン酸−２−クロロトリチルレジン（化合物ｐｄ１０、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）−ｒｅｓｉｎ）−ＭｅＰｈｅ−ＭｅＰｈｅ−Ａｌａ−ｐｉｐ）の合成
2020122182.tif 000204
（Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（メチル（（Ｓ）−１−オキソ−１−（（（Ｓ）−１−オキソ−１−（（（Ｓ）−１−オキソ−１−（ピペリジン−１−イル）プロパン−２−イル）アミノ）−３−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−３−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−４−オキソブタン酸−２−クロロトリチルレジン（化合物ｐｄ１０、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）−ｒｅｓｉｎ）−ＭｅＰｈｅ−ＭｅＰｈｅ−Ａｌａ−ｐｉｐ）は、ＷＯ２０１３／１００１３２に記載の方法にて合成した。【０３７５】
１−４．ペプチドの化学合成
特別な記載がない限り、Ａ０１−Ａ１０、Ｂ０１−Ｂ１０、Ｃ０１−Ｃ１７、Ｄ０１−Ｄ１７、Ｅ０１−Ｅ０８、Ｆ０１−Ｆ０８、Ｇ０１−Ｇ１１、Ｈ０１−Ｈ１１、Ｉ０１−Ｉ０６、Ｊ０１−Ｊ０６、ＡＰ０１−ＡＰ１４３、ｐｄ３０−ｐｄ３６、ｐｄ５０−ｐｄ７０、ｐｄ１００−ｐｄ１２９、ｐｄ１６２、ｐｄ１６３、ｐｄ１６７、ｐｄ１７７−ｐｄ２４７、ｐｄ３８６−ｐｄ３９５、ｐｄ４５２−ｐｄ４５４、ｐｄ４８２−ｐｄ４８７のペプチド化合物の合成は実施例１の冒頭に記載した基本ルートで、以下の方法にて行った。【０３７６】
１）自動合成機によるペプチド固相合成
ＷＯ２０１３／１００１３２に記載の方法にてペプチド合成機（Ｍｕｌｔｉｐｅｐ  ＲＳ；Ｉｎｔａｖｉｓ社製）を用いて、Ｆｍｏｃ法によりペプチド合成を行った。なお、操作の詳細な手順については合成機に付属のマニュアルに従った。
合成機にＮ末端がＦｍｏｃで保護されたアスパラギン酸の側鎖カルボン酸部位が結合した２−クロロトリチルレジン（例えば（Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−オキソ−４−（ピペリジン−１−イル）ブタン酸−２−クロロトリチルレジン（化合物ｐｄ０１、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）−ｒｅｓｉｎ）−ｐｉｐ））（１カラムあたり１００  ｍｇ）と、各種Ｆｍｏｃ−アミノ酸（０．６  ｍｏｌ／Ｌ）と１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）もしくはｏｘｙｍａ（０．３７５  ｍｏｌ／Ｌ）のＮ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）溶液と、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液（１０％  ｖ／ｖ）をセットした。Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ＴＨＰ）−ＯＨ（化合物ａａ０１）はＮＭＰ溶液においてｏｘｙｍａと共存させ、さらにモレキュラシーブス４Ａ１／８（和光純薬工業）もしくはモレキュラシーブス４Ａ１／１６（和光純薬工業）を添加してセットした。Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ＴＨＰ）−ＯＨ（化合物ａａ０１）と同様にアミノ酸側鎖の保護基にＴＨＰ基を有するアミノ酸（例えば、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＥｔＯＴＨＰ）―ＯＨ（化合物ａａ２２）など）もまたＮＭＰ溶液においてｏｘｙｍａと共存させ、さらにモレキュラシーブス４Ａ１／８（和光純薬工業）もしくはモレキュラシーブス４Ａ１／１６（和光純薬工業）を添加してセットした。使用するアミノ酸が塩酸塩などの塩を用いる場合、ＤＩＰＥＡ／ＤＭＦ＝３／１の溶液をセットし、ペプチド伸長の際に使用するアミノ酸に対して、０．９６等量分のＤＩＰＥＡを上記のＤＭＦ溶液として別途添加した。また、側鎖に酸性官能基を有するアミノ酸を含むペプチド化合物においては、脱保護剤の残留に起因するペプチドの過剰伸長を抑えるため、ペプチド伸長反応時のレジン洗浄に０．０８  Ｍトリエチルアミン塩酸塩のジクロロメタン溶液を用いた。【０３７７】
２）伸長したペプチドのレジンからの切り出し
ＷＯ２０１３／１００１３２に記載の方法にて、上記の方法によって得られた固相上に担持された鎖状ペプチドに対し、ＤＣＭを加えレジンを再膨潤させた後、レジンに２，２，２−トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）／ＤＣＭ（１／１，ｖ／ｖ，２  ｍＬ）を加えて室温にて２時間振とうした。続いてチューブ内の溶液を合成用カラムでろ過することによりレジンを除き、残ったレジンをさらに２，２，２−トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）／ＤＣＭ（１／１，ｖ／ｖ，１  ｍＬ）にて２回洗浄した。得られた全ての切り出し溶液を混合した溶液、あるいはその溶液をさらにジクロロエタン（ＤＣＥ）（４  ｍＬ）で希釈したものを減圧下濃縮した。なお２，２，２−トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）／ＤＣＭ（１／１，ｖ／ｖ，２  ｍＬ）による切り出し時には用いたレジン上のモル数（ローディング量（ｍｍｏｌ／ｇ）に使用したレジン量（通常は０．１０ｇ）をかけたもの）に対して１．８等量となる容量のＤＩＰＥＡを添加することも出来る。【０３７８】
３）切り出したペプチドの環化法
切り出し後に減圧下濃縮した残渣をＤＭＦ／ＤＣＭ（１／１，ｖ／ｖ，８ｍＬ）に溶解した。０．５ＭのＯ−（７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）／ＤＭＦ溶液（用いたレジン上のモル数（ローディング量（ｍｍｏｌ／ｇ）に使用したレジン量（通常は０．１０  ｇ）をかけたもの）に対して１．５等量となる容量）と、ＤＩＰＥＡ（用いたレジン上のモル数に対して１．８等量）を加え、室温にて２時間以上撹拌した。その後、減圧下溶媒を留去した。目的の環状ペプチドの生成はＬＣＭＳ測定によって確認した。【０３７９】
４）５）環状ペプチドが有する側鎖官能基の保護基の脱保護
調製した０．０５Ｍの硫酸水素テトラメチルアンモニウム／１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロイソプロピルアルコール（ＨＦＩＰ）溶液（２％トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ））を４  ｍＬ加え、残渣を溶解させた後、室温にて４時間以上撹拌した。一定時間静置した後、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（７０μＬ）を加え、減圧下溶媒を留去した。
なお、側鎖にＡｌｌｏｃ基を有するアミノ酸を含むペプチド（例えばＮｖａ（２−Ｒ−４−Ｆ２−Ｐｙｒｒｏ）、Ｓｅｒ（Ｓ−４−Ｆ２−Ｐｙｒｒｏ−Ｍｅ）などを配列中に含むペプチド）は、塩化亜鉛（用いたレジン上のモル数に対して１．０等量）、テトラキス（トリフェニルフォスフィン）パラジウム（０）（Ｐｄ（ＰＰｈ３）４）（用いたレジン上のモル数に対して１．０等量）、ポリ（メチルヒドロシロキサン）（ＰＭＨＳ、ＣＡＳ＃６３１４８−５７−２）（用いたレジン上のモル数に対して０．９  Ｍ）、テトラヒドロフラン（用いたレジン上のモル数に対して０．１  Ｍ）を用いて室温で３時間３０分以上撹拌することでＡｌｌｏｃ基の脱保護を行った後、反応液に調製した０．０５Ｍの硫酸水素テトラメチルアンモニウム／１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロイソプロピルアルコール（ＨＦＩＰ）溶液（２％トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ））を４  ｍＬ加え、室温にて４時間以上撹拌した。一定時間静置した後、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（７０μＬ）を加え、減圧下溶媒を留去した。Ａｌｌｏｃ基の脱保護においては、上記のＰＭＨＳを用いる代わりにテトラメチルジシロキサン（ＴＭＤＳ、ＣＡＳ＃３２７７−２６−７）（用いたレジン上のモル数に対して４．０等量）を用いることができる。
いずれの場合においても、減圧下、溶媒を留去した後、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、もしくは２０％メタノール水溶液を加え、不溶物をフィルターろ過にて取り除いた後、ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ−ＨＰＬＣで精製した。
０．０５Ｍの硫酸水素テトラメチルアンモニウム／ＨＦＩＰ溶液（２％ＴＩＰＳ）は、ＨＦＩＰ（１１．６６ｍＬ）、ＴＩＰＳ（０．２４ｍＬ）、ＤＣＥ（０．１０ｍＬ）を混合した溶液から４ｍＬを抜き取り、これに３４．３ｍｇの硫酸水素テトラブチルアンモニウムを溶解させて調製した。この溶液（０．０５Ｍの硫酸水素テトラメチルアンモニウム／ＨＦＩＰ溶液（２％ＴＩＰＳ））はＨＦＩＰの代わりに別のフルオロアルコール、例えば２，２，２−トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）なども用いることができる。【０３８０】
実施例２  側鎖にドナー（ｄｏｎｏｒ）を有し、該ドナー部分に分子内水素結合を有するアミノ酸の膜透過性評価
２−１  側鎖にドナーを有するアミノ酸でドナー部分に分子内水素結合を有するものと有しないものの膜透過性の比較
側鎖にドナーを有するアミノ酸でドナー部分に分子内水素結合を有するものが有しないものよりも良好な膜透過性をもつことを確認するため、それぞれのアミノ酸を含有する２つの環状ペプチドを合成し、国際公開第２０１８／１２４１６２号に記載の改良法により膜透過性を比較した。上記のような２つの環状ペプチドの組み合わせを複数個合成、評価することで一般性を確認した。その結果、（１）Ｓｅｒ（ＥｔＯＨ）とＮｌｅ（６−ＯＨ）、（２）Ｓｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＨ）とＨｎｌ（７−Ｆ３−６−ＯＨ）、（３）Ｔｙｒ（３−ＯＭｅ）とＴｙｒ、（４）Ｓｅｒ（Ｓ−４−Ｆ２−Ｐｙｒｒｏ−Ｍｅ）とＮｖａ（２−Ｒ−４−Ｆ２−Ｐｙｒｒｏ）、（５）Ｓｅｒ（ＮＭｅ−Ａｃａ）とＧｌｎ（Ｍｅ）の組み合わせにおいて側鎖にドナーを有するアミノ酸でドナー部分に分子内水素結合を有するものを含有するペプチドの方が有しないものを含むペプチドよりも良好な膜透過性をもつことが確認できた。【０３８１】
比較する２つの環状ペプチドの配列設計はドナーを有する側鎖部分構造以外の膜透過性に関係する要因の影響が最小限になるように行った。【０３８２】
例えば、比較するアミノ酸同士が２つの環状ペプチドの同じ位置になるようにそれぞれ挿入し、環状部および直鎖部を構成するアミノ酸の数を同じにした（結果としてtotal AAが同じになる）。２つの環状ペプチド全体の側鎖部分のドナーの数が同じになるように揃えた（評価したいアミノ酸以外に側鎖にドナーを持つアミノ酸の例としてはＴｈｒなどが挙げられる）。さらに比較したいアミノ酸以外に側鎖にドナーを持つアミノ酸が存在する場合、その位置が同じになるように設計した。また、２つの環状ペプチド主鎖上のアミド基部分のＮ−アルキル基の数を揃えた。さらに２つの環状ペプチド主鎖上のアミド基のＮ−アルキル基（例えばＮＭｅ基）とＮＨ基の出現パターン（Ｎ−アルキルパターン）、Ｇｌｙ誘導体（例えばＭｅＧｌｙ、ｎＢｕＧｌｙなどのアルキル−Ｇｌｙも含む）の位置やＰｒｏのような環状アミノ酸の位置を同じにすることで、比較する２つの環状ペプチドのコンフォメーションが同じになるように設計した。参照例４に記載の通り、比較する２つのペプチドのClogP/total AAの値が±０．０３の間となるように調節し、Ｔｒｐを含まないようにした。参照例６に記載の通り、芳香環の数（Aromatic Ring Count: ARC）を揃えた。【０３８３】
また、本明細書におけるＣｌｏｇＰは、コンピューターで計算した分配係数であって、Daylight Chemical Information Systems, Inc.のDaylight Version 4.9を用いて計算した。【０３８４】
（１）Ｓｅｒ（ＥｔＯＨ）とＮｌｅ（６−ＯＨ）の比較（表４）
上記の概念をもとに設計したＳｅｒ（ＥｔＯＨ）もしくはＮｌｅ（６−ＯＨ）を含む環状ペプチドを合成し、国際公開第２０１８／１２４１６２号に記載の改良法により膜透過性を比較した。Ｓｅｒ（ＥｔＯＨ）を含む配列の化合物番号がＡＸＸ（ＸＸは数字を意味する）、Ｎｌｅ（６−ＯＨ）を含む配列の化合物番号がＢＸＸ（ＸＸは数字を意味する）である。化合物番号Ａ０１とＢ０１がそれぞれ対応する化合物であり、以下同様にＡＸＸ、ＢＸＸとＸＸの部分が同じ配列同士がそれぞれ対応している組み合わせである。１０個の組み合わせを比較したところ、全ての組み合わせでＳｅｒ（ＥｔＯＨ）を含有する環状ペプチドの方がＮｌｅ（６−ＯＨ）を含有する環状ペプチドよりも膜透過性に優れていた。
以下、特に記載のない限り同様の方法で解析した。
なお、Ａ０１を例にとり、表４、表６、表８、表１０、表１２および表１４のカラムについて説明する。Ａ０１は１１残基からなる環状ペプチドであり、１１残基のアミノ酸で環を形成している。環化部分を１番目のアミノ酸と定義し、Ａ０１の場合ではＡｓｐが該当する。Ａｓｐの隣で環状部を構成するアミノ酸を２番目のアミノ酸と定義し（Ａ０１の場合ＭｅＬｅｕが該当）、以下３番目、４番目とＮ末端まで繰り返す（Ａ０１の場合３番目ＭｅＰｈｅ、４番目Ｓｅｒ（ｉＰｅｎ）となり、環状部が１１残基からなるためＮ末端は１１番目のＤ−Ｖａｌ）。またＣ−ｔｅｒｍのカラムはＣ末端のアミノ酸のカルボン酸部位と縮合する官能基を意味しており、ｐｉｐはピペリジンを意味している。そして、Ｎ末端のアミノ基と環化部のアミノ酸の側鎖カルボン酸をアミド結合により環化させたペプチドであるということを表４、表６、表８、表１０、表１２および表１４で表している。例えば、Ａ０１はＮ末端であるＤ−Ｖａｌのアミノ基と環化部のＡｓｐの側鎖カルボン酸がアミド結合により環化している。本文中に記載の環状ペプチドに関しては特に記述が無い限り、全て同様の手法で表現している。【０３８５】
（２）Ｓｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＨ）とＨｎｌ（７−Ｆ３−６−ＯＨ）の比較（表６）
Ｓｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＨ）を含む配列の化合物番号がＣＸＸ、Ｈｎｌ（７−Ｆ３−６−ＯＨ）を含む配列の化合物番号がＤＸＸである。１７個の組み合わせを比較したところ、１５個の組み合わせでＳｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＨ）を含有する環状ペプチドの方がＨｎｌ（７−Ｆ３−６−ＯＨ）を含有する環状ペプチドよりも膜透過性に優れていた。【０３８６】
（３）Ｔｙｒ（３−ＯＭｅ）とＴｙｒの比較（表８）
Ｔｙｒ（３−ＯＭｅ）を含む配列の化合物番号がＥＸＸ、Ｔｙｒを含む配列の化合物番号がＦＸＸである。８個の組み合わせを比較したところ、全ての組み合わせでＴｙｒ（３−ＯＭｅ）を含有する環状ペプチドの方がＴｙｒを含有する環状ペプチドよりも膜透過性に優れていた。【０３８７】
（４）Ｓｅｒ（Ｓ−４−Ｆ２−Ｐｙｒｒｏ−Ｍｅ）とＮｖａ（２−Ｒ−４−Ｆ２−Ｐｙｒｒｏ）の比較（表１０）
Ｓｅｒ（Ｓ−４−Ｆ２−Ｐｙｒｒｏ−Ｍｅ）を含む配列の化合物番号がＧＸＸ、Ｎｖａ（２−Ｒ−４−Ｆ２−Ｐｙｒｒｏ）を含む配列の化合物番号がＨＸＸである。１１個の組み合わせを比較したところ、１０個の組み合わせでＳｅｒ（Ｓ−４−Ｆ２−Ｐｙｒｒｏ−Ｍｅ）を含有する環状ペプチドの方がＮｖａ（２−Ｒ−４−Ｆ２−Ｐｙｒｒｏ）を含有する環状ペプチドよりも膜透過性に優れていた。【０３８８】
（５）Ｓｅｒ（ＮＭｅ−Ａｃａ）とＧｌｎ（Ｍｅ）の比較（表１２）
Ｓｅｒ（ＮＭｅ−Ａｃａ）を含む配列の化合物番号がＩＸＸ、Ｇｌｎ（Ｍｅ）を含む配列の化合物番号がＪＸＸである。６個の組み合わせを比較したところ、全ての組み合わせでＳｅｒ（ＮｔＢｕ−Ａｃａ）を含有する環状ペプチドの方がＧｌｎ（Ｍｅ）を含有する環状ペプチドよりも膜透過性に優れていた。【０３８９】
【表４】
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【０３９０】
環状ペプチドＡ０１〜Ｂ１０の構造を以下に示す。（なお環状ペプチドの構造式において、構造を明瞭にする目的でヘテロ原子に結合している水素原子を省略している場合もある）【０３９１】
【表５】
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【０３９２】
【表６】
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【０３９３】
環状ペプチドＣ０１〜Ｄ１７の構造を以下に示す。（なお環状ペプチドの構造式において、構造を明瞭にする目的でヘテロ原子に結合している水素原子を省略している場合もある）【０３９４】
【表７】
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【０３９５】
【表８】
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【０３９６】
環状ペプチドＥ０１〜Ｆ０８の構造を以下に示す。（なお環状ペプチドの構造式において、構造を明瞭にする目的でヘテロ原子に結合している水素原子を省略している場合もある）【０３９７】
【表９】
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【０３９８】
【表１０】
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【０３９９】
環状ペプチドＧ０１〜Ｈ１０の構造を以下に示す。（なお環状ペプチドの構造式において、構造を明瞭にする目的でヘテロ原子に結合している水素原子を省略している場合もある）【０４００】
【表１１】
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【０４０１】
【表１２】
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【０４０２】
環状ペプチドＩ０１〜Ｊ０６の構造を以下に示す。（なお環状ペプチドの構造式において、構造を明瞭にする目的でヘテロ原子に結合している水素原子を省略している場合もある）【０４０３】
【表１３】
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2020122182.tif 000236
【０４０４】
実施例３に記載の低エネルギーコンフォメーション（Low energy conformation）の計算方法により、Ｓｅｒ（ＥｔＯＨ）、Ｓｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＨ）、Ｔｙｒ（３−ＯＭｅ）、Ｓｅｒ（Ｓ−４−Ｆ２−Ｐｙｒｒｏ−Ｍｅ）、Ｓｅｒ（ＮＭｅ−Ａｃａ）の側鎖部分構造を計算するといずれも最安定なコンフォメーションが分子内水素結合を有しているコンフォメーションであった。その結果、膜透過性の改善が側鎖に存在するドナーを分子内水素結合でマスクするものによることであることが計算の結果からも確認された。【０４０５】
２−２  側鎖にドナー（ｄｏｎｏｒ）を有するアミノ酸でドナー部分に分子内水素結合を有するものを含有するペプチドの膜透過性の結果
Ｓｅｒ（ｔＢｕＯＨ）、Ｓｅｒ（ＮｔＢｕ−Ａｃａ）、ｂＡｌａ（３Ｒ−ＭｅＯＥｔＯＨ）、Ｐｈｅ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＭｅ）、Ｐｈｅ（４−ＯＭｅ−３−ＣＯＮＭe）、Ｓｅｒ（３−Ｍｅ−５−Ｏｘｏ−Ｏｄｚ）、Ｓｅｒ（２−Ｍｅ−２−ＢｕＯＨ）、Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＨ）、Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＨ）、Ｓｅｒ（ｎＰｒＯＨ）、Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＢｕＯＨ）、Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＢｕＯＨ）、Ｓｅｒ（２−Ｍｅ２−ＰｒＯＨ）、ｂＡｌａ（２Ｓ−ＭｅＯＥｔＯＨ）、Ｐｈｅ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＨＭｓ）、Ｈｐｈ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＭｅ）、Ｄ−Ｈｐｈ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＭｅ）、（Ｐｈ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＭｅ）Ｅｔ）Ｇｌｙ、ＭｅＨｐｈ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＭｅ）、Ｈｙｐ（２−ＥｔＯＨ）、Ｓｅｒ（Ｓ−Ｍｏｒ−３−Ｍｅ）、Ｐｈｅ（４−ＣＯＮＭｅＯＨ）、Ｐｈｅ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＨＯＨ）の膜透過性を評価した。結果は下記の通りであった。共に擬似６員環を形成するＳｅｒ（ｎＰｒＯＨ）とＳｅｒ（２−Ｍｅ２−ＰｒＯＨ）の膜透過性を比較するとジェミナルにメチル基が存在するＳｅｒ（２−Ｍｅ２−ＰｒＯＨ）の膜透過性の方がジェミナルにメチル基を有さないＳｅｒ（ｎＰｒＯＨ）よりも良好な傾向がみられた。この理由としてソープ・インゴールド効果による配座自由度の減少やドナー部分付近にジメチル基のような立体的に大きな脂溶性の置換基が存在することで極性表面積（Polar Surface Area：ＰＳＡ）が減少しているなどといったことが考えられる。【０４０６】
環状ペプチドＡＰ０１〜ＡＰ１４３、ＡＰ２００〜ＡＰ２６６の膜透過性を評価した結果を以下に示す。【０４０７】
【表１４】
2020122182.tif 000237
2020122182.tif 000238
2020122182.tif 000239
2020122182.tif 000240
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2020122182.tif 000242
2020122182.tif 000243
【０４０８】
実施例３に記載のLow energy conformationの計算方法により、Ｓｅｒ（ｔＢｕＯＨ）、Ｓｅｒ（ＮｔＢｕ−Ａｃａ）、ｂＡｌａ（３Ｒ−ＭｅＯＥｔＯＨ）、Ｐｈｅ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＭｅ）、Ｐｈｅ（４−ＯＭｅ−３−ＣＯＮＭe）、Ｓｅｒ（２−Ｍｅ−２−ＢｕＯＨ）、Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＨ）、Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＨ）、Ｓｅｒ（ｎＰｒＯＨ）、Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＢｕＯＨ）、Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＢｕＯＨ）、Ｓｅｒ（２−Ｍｅ２−ＰｒＯＨ）、ｂＡｌａ（２Ｓ−ＭｅＯＥｔＯＨ）、Ｐｈｅ（３−ＯＭe−４−ＣＯＮＨＭｓ）、Ｈｐｈ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＭｅ）、Ｄ−Ｈｐｈ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＭｅ）、（Ｐｈ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＭｅ）Ｅｔ）Ｇｌｙ、ＭｅＨｐｈ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＭｅ）、Ｈｙｐ（２−ＥｔＯＨ）、Ｓｅｒ（Ｓ−Ｍｏｒ−３−Ｍｅ）、Ｐｈｅ（４−ＣＯＮＭｅＯＨ）、Ｐｈｅ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＨＯＨ）の側鎖部分構造を計算するといずれも最安定なコンフォメーションが分子内水素結合を有しているコンフォメーションであった。またＳｅｒ（３−Ｍｅ−５−Ｏｘｏ−Ｏｄｚ）、の側鎖部分構造を計算すると、分子内水素結合を有するコンフォメーションは最安定コンフォメーションから０．８９ｋＪ／ｍｏｌ離れたものであった。そのため、これらのアミノ酸も膜透過する際に分子内水素結合を形成し、分子内水素結合を有しないアミノ酸よりも良好な膜透過性を有していると考えられる。【０４０９】
膜透過性を評価した環状ペプチドＡＰ０１〜ＡＰ１４３、ＡＰ２００〜ＡＰ２６６の構造を以下に示す。（なお環状ペプチドの構造式において、構造を明瞭にする目的でヘテロ原子に結合している水素原子を省略している場合もある）【０４１０】
【表１５】
2020122182.tif 000244
2020122182.tif 000245
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【０４１１】
上記実施例において膜透過性を評価した環状ペプチドの分析情報を以下に示す。【０４１２】
【表１６】
2020122182.tif 000297
2020122182.tif 000298
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【０４１３】
実施例３  側鎖部分構造のコンフォメーション解析
実施例３−１  側鎖部分構造のLow energy conformationの計算方法
側鎖部分構造のLow energy conformationは側鎖β位（主鎖に直結する炭素）からアミノ酸の側鎖部分を抜き出した部分構造を用いて計算した。下スキームにＳｅｒ（ＥｔＯＨ）、ｂＡｌａ（３Ｒ−ＭｅＯＥｔＯＨ）、ｂＡｌａ（２Ｓ−ＭｅＯＥｔＯＨ）、Ｐｈｅ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＭｅ）の例を示す。
2020122182.tif 000311
【０４１４】
また、Ｈｙｐ（２−ＥｔＯＨ）のような環状部（Ｈｙｐ（２−ＥｔＯＨ）の場合はピロリジン環）をもつアミノ酸に関しては環状部に直結する原子からアミノ酸の側鎖部分を抜き出した部分構造を用いて計算した。下スキームにＨｙｐ（２−ＥｔＯＨ）の例を示す。
2020122182.tif 000312
【０４１５】
例えばＳｅｒ（ＥｔＯＨ）、ｂＡｌａ（３Ｒ−ＭｅＯＥｔＯＨ）、ｂＡｌａ（２Ｓ−ＭｅＯＥｔＯＨ）、Ｈｙｐ（２−ＥｔＯＨ）は側鎖部分構造としては同一のものを有していると考えることができる。【０４１６】
また、（Ｐｈ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＭｅ）Ｅｔ）Ｇｌｙのようなアミノ酸のアミノ基に置換基を有するタイプのアミノ酸はＮ原子に直結する原子からアミノ酸の側鎖部分を抜き出した部分構造を用いて計算した。
2020122182.tif 000313
【０４１７】
Low energy conformationは以下の手順で計算した。
（１）初期構造発生
回転可能な単結合に関して初期二面角を０、９０、１８０、２７０度と与えた。アミド結合ならびにＣとＯＨの間の結合に関して初期二面角を０、１８０度と与えた。Ｓｅｒ（ＥｔＯＨ）の側鎖の部分構造を計算する場合、２個の単結合に４個づつ初期二面角、ＣとＯＨの間の結合に２個の初期二面角を考慮するので、合計３２個の初期コンフォメーションを発生した。
（２）構造最適化
Gaussian09を用いて（１）で発生させたすべてのコンフォメーションの構造最適化を行った。B3LYP/6-31G(d) レベルにPolarizable Continuum Model (PCM)を加えて疑似水中での構造最適化を行った。
（３）Low energy conformationの選択【０４１８】
（２）で得たminimized conformationのエネルギーの低い順からユニークなLow energy conformationを選んだ。コンフォメーションのユニークさは、構造発生の際に考慮した二面角でのコンフォメーション間の距離（違い）で判断する。二面角空間でのコンフォメーション間の距離（定義式は下記参照）が他のすべてのLow energy conformationと６０°以上あるコンフォメーションをユニークと定義する。
【数１】
2020122182.tif 000314
【０４１９】
実施例３−２  ポテンシャルエネルギー曲面（Potential energy surface）の計算方法
１）下記部分構造(例えばSer(NMe-Aca)の側鎖部分構造)でのポテンシャルエネルギー曲面（図３−１）の場合
2020122182.tif 000315
（１）Low energy conformationsは上述の手順で計算した。
（２）各コンフォメーション（grid point）のエネルギー計算【０４２０】
初期値としてφ１は１８０°φ２、φ３は０°、１５°・・・３４５°まで１５°間隔で初期コンフォメーション（grid point）として２４ｘ２４＝５７６個生成した。【０４２１】
φ２とφ３を初期値に固定し、Gaussian09を用いて発生させたすべてのコンフォメーションの構造最適化を行った。B3LYP/6-31G(d) レベルにPolarizable Continuum Model (PCM)を加えて疑似水中での構造最適化を行った。その結果、φ２とφ３を１５°間隔で計算した５７６個のコンフォメーションのエネルギー（Ｅ（φ２、φ３））を求めた。下記の式から求めたΔＥ（φ２、φ３）をプロットしたものが図３−１である。
ΔＥ（φ２、φ３）＝Ｅ（φ２、φ３）―Ｅｌｏｗｅｓｔ
Ｅｌｏｗｅｓｔ  ：  lowest energy conformationのエネルギー【０４２２】
２）下記部分構造（例えば、Ｓｅｒ（ＥｔＯＨ）、ｂＡｌａ（３Ｒ−ＭｅＯＥｔＯＨ）、ｂＡｌａ（２Ｓ−ＭｅＯＥｔＯＨ）、Ｈｙｐ（２−ＥｔＯＨ）の側鎖部分構造）でのポテンシャルエネルギー曲面（図４−１）の場合
2020122182.tif 000316
（１）Low energy conformationsは上述の手順で計算した。
（２）各コンフォメーション（grid point）のエネルギー計算【０４２３】
初期値としてφ１は０°、９０°、１８０°、２７０°φ２は０°、１５°・・・３４５°まで１５°間隔、φ３は０°１８０°で初期コンフォメーション（ｇｒｉｄ  ｐｏｉｎｔ）として４ｘ２４ｘ２＝１９２個を生成した。ただし、φ２＝１８０°の時はさらにφ１＝０°、９０°、１８０°、２７０°φ３＝０°、９０°、１８０°、２７０°として４ｘ４＝１６個のコンフォメーションを発生させた。
φ２を初期値に固定して、Gaussian09を用いて発生させたすべてのコンフォメーションの構造最適化を行った。B3LYP/6-31G(d) レベルにPolarizable Continuum Model (PCM)を加えて疑似水中での構造最適化を行った。その結果、各φ２に対して４ｘ２＝８個のＥ（φ２）が得られる。このＥ（φ２）の中で最もエネルギーの低いものをＥｌｏｗｅｓｔ（φ２）とした。φ２を１５°間隔で計算した２４個のコンフォメーションのエネルギー（ΔＥ（φ２））は下記の式で求めた。ΔＥ（φ２）をプロットしたものが図４−１である。
ΔＥ（φ２）＝Ｅｌｏｗｅｓｔ（φ２）―Ｅｌｏｗｅｓｔ
Ｅｌｏｗｅｓｔ  ：  lowest energy conformationのエネルギー【０４２４】
実施例３−３  ＣＳＤ（The Cambridge Structural Database）に登録されているＸ線構造解析の結果を用いた、結晶構造（Crystal structures）のコンフォメーション分布（図３−２、図４−２）の調査
ＣＳＤ（The Cambridge Structural Database）5.39+2 updatesを用いてqueryを以下のものとして検索した。
2020122182.tif 000317
【０４２５】
検索条件として3D coordinates determined、R factor≦０．０５、Not disordered、No errors、Not polymeric、No ions、No powder structures、Only Organicsとしてそれぞれ検索を行った。その結果をプロットしたものが図３−２、図４−２である。解析の結果、図３−２、図４−２は計算結果である図３−１および図４−１と大きな矛盾がなかった。つまり、いずれの部分構造も分子内水素結合を取りやすい構造であることが確認された。さらに図３−２のφ２＝１８０°付近に存在する２つの結晶構造（CSD code： MAPPAVおよびMUVJOE）を解析してみると、分子内水素結合を形成するドナー部分であるアミドＮＨ基が自分以外の他の分子と分子間水素結合を形成し、相互作用するのに用いられていることが確認できた。これは図３−１で解析した構造が膜透過する場合は膜透過に有利である分子内水素結合を形成するコンフォメーション、標的との相互作用の際には結合に有利である分子間水素結合を形成するコンフォメーションといったように、周りの環境に応じたコンフォメーションをとり得ることが確認できた。【０４２６】
実施例３−４  側鎖部分構造のLow energy conformation計算結果
下記に記載のいずれアミノ酸においても、側鎖部分構造は分子内水素結合を有するコンフォメーションを取りやすい構造であることが計算的に示された。
Ｓｅｒ（ＥｔＯＨ）、ｂＡｌａ（３Ｒ−ＭｅＯＥｔＯＨ）、ｂＡｌａ（２Ｓ−ＭｅＯＥｔＯＨ）、Ｈｙｐ（２−ＥｔＯＨ）：これら３つのアミノ酸は側鎖部分構造は同一になる。計算結果は分子内水素結合を有するコンフォメーションが最安定コンフォメーションであった。
Ｈｐｈ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＭｅ）−ＯＨ、Ｄ−Ｈｐｈ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＭｅ）−ＯＨ、ＭｅＨｐｈ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＭｅ）−ＯＨ、（Ｐｈ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＭｅ）Ｅｔ）Ｇｌｙ：これら４つのアミノ酸は側鎖部分構造は同一になる。計算結果は分子内水素結合を有するコンフォメーションが最安定コンフォメーションであった。
表１７の計算結果のカラムは最安定コンフォメーションのみを記載した。【０４２７】
【表１７】
2020122182.tif 000318
2020122182.tif 000319
【０４２８】
Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＰｒＯＨ）、Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＰｒＯＨ）、Ｓｅｒ（ｔＢｕＯＨ）、Ｓｅｒ（ｎＰｒＯＨ）、Ｓｅｒ（Ｓ−２−ＢｕＯＨ）、Ｓｅｒ（Ｒ−２−ＢｕＯＨ）、Ｓｅｒ（２−Ｍｅ２−ＰｒＯＨ）、Ｓｅｒ（２−Ｍｅ―２−ＢｕＯＨ）、Ｓｅｒ（ＮＭｅ−Ａｃａ）、Ｓｅｒ（ＮｔＢｕ−Ａｃａ）、Ｐｈｅ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＭｅ）、Ｐｈｅ（４−ＯＭｅ−３−ＣＯＮＭｅ）、Ｔｙｒ（３−ＯＭｅ）、Ｐｈｅ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＨＭｓ）、Ｐｈｅ（４−ＣＯＮＭｅＯＨ）、Ｐｈｅ（３−ＯＭｅ−４−ＣＯＮＨＯＨ）：いずれの計算結果も分子内水素結合を有するコンフォメーションが最安定コンフォメーションであった。表１８の計算結果のカラムは最安定コンフォメーションのみを記載した。【０４２９】
Ｓｅｒ（１−ＣＦ３−ＥｔＯＨ）：本アミノ酸はＣＦ３基が結合している炭素部分がラセミ体であるため、Ｒ体であるＳｅｒ（Ｒ−１−ＣＦ３−ＥｔＯＨ）、Ｓ体であるＳｅｒ（Ｓ−１−ＣＦ３−ＥｔＯＨ）それぞれについて安定コンフォメーションを計算した。いずれの計算結果も分子内水素結合を有するコンフォメーションが最安定コンフォメーションであった。表１８の計算結果のカラムは最安定コンフォメーションのみを記載した。【０４３０】
Ｓｅｒ（３−Ｍｅ−５−Ｏｘｏ−Ｏｄｚ）：計算結果は分子内水素結合を有するコンフォメーションは最安定コンフォメーションから０．８９ｋＪ／ｍｏｌ離れたものであった。表の計算結果のカラムは最安定コンフォメーションから０．８９ｋＪ／ｍｏｌ離れたものを記載した。【０４３１】
Ｓｅｒ（Ｓ−４−Ｆ２−Ｐｙｒｒｏ−Ｍｅ）、Ｓｅｒ（Ｓ−Ｍｏｒ−３−Ｍｅ）：これらのアミノ酸は側鎖部位に２級アミノ基を有しているため、チャージをもつ可能性がある。チャージを持たない場合（neutral）、チャージをもつ場合（charged）の２つの場合についてそれぞれ計算を行ったが、いずれの計算結果も分子内水素結合を有するコンフォメーションが最安定コンフォメーションであった。表１８の計算結果のカラムは最安定コンフォメーションのみを記載した。【０４３２】
【表１８】
2020122182.tif 000320
2020122182.tif 000321
2020122182.tif 000322
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2020122182.tif 000324
【０４３３】
（参照例１）アミノ酸側鎖の長さの求め方
本明細書におけるアミノ酸の側鎖には、アミノ酸に含まれる炭素原子（例えば、α、β、又はγ−炭素原子）に結合している鎖、及び窒素原子に結合している鎖が含まれる。本明細書において、アミノ酸の側鎖の長さは、以下の方法により求めることができる。すなわち、アミノ酸単位のＮ末をアセチル基、Ｃ末をメチルアミノ基でキャッピングし、分子モデリングソフトＭＯＥ（Chemical Computing Group社）のLowModeMDにより配座を発生させ、側鎖部位が結合している原子（天然アミノ酸の場合はα−炭素原子（Ｃα炭素））から最も遠い同側鎖の原子（水素原子は除く）までの距離を測定することで求めることができる。例としてＰｈｅまたはｎＢｕＧｌｙの側鎖の長さの求め方を以下に示す。
2020122182.tif 000325
【０４３４】
また、アミノ酸側鎖が主鎖構造の一部と環を形成している場合は、側鎖部分が結合している原子が複数個存在することになる。その場合の側鎖の長さは上記と同様の計算をそれぞれの側鎖部分が結合している原子と最も遠い側鎖の原子（水素原子は除く）に対して行い、求めた距離のうち最も長いものとする。例としてＨｙｐ（Ｅｔ）を示すと、窒素原子からもとめた側鎖の距離は６．０４Å、Ｃα炭素から求めた側鎖の距離は６．０９Åであることから、Ｈｙｐ（Ｅｔ）の側鎖の距離は６．０９Åとする。
2020122182.tif 000326
【０４３５】
上述の方法により算出したアミノ酸の側鎖の長さを下記に示す。【０４３６】
【表１９】
2020122182.tif 000327
【０４３７】
（参照例２）ｐＫａの求め方
本明細書においてアミノ酸の側鎖、又は環状ペプチド化合物の環状部の側鎖の計算pKa及びBasic 計算pKaは、ADMETPredictor（Simulations Plus Inc.社、ver.8.0）を用いて求めることができる。計算pKa及びBasic 計算pKaは側鎖β位（主鎖に直結する炭素）から側鎖部分を抜き出した部分構造を用いて計算される。例としてＬｙｓの場合を以下に示す。側鎖β位（主鎖に直結する炭素）を含む部分構造を用いてBasic 計算pKaを計算すると１０．５であった。同様に計算すると、酸としては、Ａｓｐの側鎖力ルボキシ基の計算pKaが４．３であり、Ｔｙｒの側差フェノール性水酸基の計算pKaが９．９であり、３−フルオロチロシン（Ｔｙｒ（３−Ｆ））の側差フェノール性水酸基の計算pKaが８．７であり、テトラゾールの計算pKaが３．７であった。一方、塩基としては、Ａｒｇの側鎖グアニジノ基のBasic 計算pKaが１２．７であり、Ｈｉｓのイミダゾリル基のBasic 計算pKaが７．６であり、ピリジンのBasic 計算pKaが５．４であった。
2020122182.tif 000328
【０４３８】
本明細書に記載の方法でbasic pKaを計算した塩基性側鎖を有するアミノ酸の一部を下記の表に示す。【０４３９】
【表２０】
2020122182.tif 000329
【０４４０】
本明細書に記載の方法でpKaを計算した酸性側鎖を有するアミノ酸の一部を下記の表に示す。【０４４１】
【表２１】
2020122182.tif 000330
【０４４２】
（参照例３−１）アミノ酸側鎖のpKaの実測
本明細書においてアミノ酸側鎖のpKaの実測は以下の手順に従って行った。
（使用装置）
Sirius T3（Sirius Analytical Instruments Ltd., Forest Row, East Sussex, RH18 5DW, UK）【０４４３】
【表２２】
2020122182.tif 000331
【０４４４】
（実施手順）
被験物質約１ｍｇの粉体または１０ｍＭのＤＭＳＯ溶液約１００ｕＬに０．１５ＭのＫＣｌを添加し、塩基性化合物の場合はｐＨ２となるまで０．５ＭのＨＣｌを添加後、０．５ＭのＫＯＨにてｐＨ１２まで滴定を行った。
酸性化合物の場合は、ｐＨ１２となるまで０．５ＭのＫＯＨ添加後、０．５ＭのＨＣｌにてｐＨ２まで滴定を行った。
滴定操作はSirius社製Ｔ３にて自動で行い、得られた滴定曲線からsirius T3 Refinementソフトを用いてｐＫａを求めた。
また参照化合物としてイミプラミン・ＨＣｌ、プロプラノロール・ＨＣｌ、ワルファリンを用いて同様にｐＫａを求め、Sirius社で得られた試験結果範囲内であることを確認した。
アミノ酸側鎖のｐＫａは評価したいアミノ酸を下記に示す３残基からなるペプチドの２残基目（下記表のＸの位置）に導入した配列を合成することで求めた。【０４４５】
【表２３】
2020122182.tif 000332
【０４４６】
以下にその結果を示す。
【表２４】
2020122182.tif 000333
【０４４７】
（参照例３−２）ｐＫａ実測に用いた３残基ペプチドの合成
実施例１に記載のペプチド化合物の化学合成と同様の手法を用いペプチドの伸長、レジン上からの切り出しを行った後、Ｃ末端のカルボン酸とピペリジンを縮合することでｐｄ３０−ｐｄ３７を合成した。また、ペプチド合成に用いたFmoc-MeGly-Trt(2-Cl)-resin（化合物ｐｄ１１）は下記の通り合成した。ZMeGly（Cbz-MeGly-OH、CAS#39608-31-6）は東京化成工業より購入した。【０４４８】
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−メチルグリシン−２−クロロトリチルレジン（化合物ｐｄ１１、Fmoc-MeGly-Trt(2-Cl)-resin）の合成
2020122182.tif 000334
フィルター付きの反応容器に２−クロロトリチルクロライドレジン（１．５８ｍｍｏｌ／ｇ、１００−２００ｍｅｓｈ、１％ＤＶＢ、渡辺化学から購入、１０ｇ、１５．８ｍｍｏｌ）と脱水ジクロロメタンを入れ、室温にて１時間振とうした。窒素圧をかけてジクロロメタンを除いた後、市販のＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−メチルグリシン（Fmoc-MeGly-OH）（３．５４ｇ、１１．３９ｍｍｏｌ）とジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（５．２９ｍＬ、３０．４ｍｍｏｌ）の脱水ジクロロメタン（１３０ｍＬ）溶液を反応容器に添加し、３０分間振とうした。窒素圧をかけて反応液を除いた後、脱水ジクロロメタン（１３０ｍＬ）に脱水メタノール（５．７６ｍＬ）とジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（５．２９ｍＬ、３０．４ｍｍｏｌ）を加えた混合液を反応容器に添加し、１時間振とうした。窒素圧をかけて反応液を除いた後、ジクロロメタンを入れ、５分間振とうした。窒素圧をかけて反応液を除いた後、ジクロロメタンを入れ、５分間振とうした。窒素圧をかけて反応液を除いた。得られたレジンを減圧下で一晩乾燥させ、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−メチルグリシン−２−クロロトリチルレジン（化合物ｐｄ１１、Fmoc-MeGly-Trt(2-Cl)-resin）（１３．２ｇ）を得た。
得られたレジンのローディング量は文献記載（Letters in Peptie Science, 2002, 9, 203）の方法を用い算出した。Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−メチルグリシン−２−クロロトリチルレジン（化合物ｐｄ１１、Fmoc-MeGly-Trt(2-Cl)-resin）（１４．４ｍｇ）を反応容器に入れ、ＤＭＦ（２ｍＬ）を加え１時間振とうした。反応液にＤＢＵ（０．０４ｍＬ）を加え、３０分振とうした後、ＤＭＦ（１０ｍＬ）を加え、１ｍＬを取りだし、さらに溶液量が１２．５ｍＬになるまでＤＭＦで希釈した。得られた溶液の吸光度（２９４ｎｍ）を測定し（Shimadzu、UV-1600PC（セル長１．０ｃｍ）を用いて測定）、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ−メチルグリシン−２−クロロトリチルレジン（化合物ｐｄ１１、Fmoc-MeGly-Trt(2-Cl)-resin）のローディング量を０．７８９ｍｍｏｌ／ｇと算出した。【０４４９】
（参照例３−３）ｐＫａを実測したペプチド化合物の分析情報
【表２５】
2020122182.tif 000335
【０４５０】
（参照例３−４）ｐＫａを実測したペプチド化合物の構造情報
【表２６】
2020122182.tif 000336
2020122182.tif 000337
【０４５１】
実測値のbasic pKaが９．１、計算値のbasic pKaが８．９のアミノ酸であるSer(Et-2-NMe2)を含む配列は、１．２１≦ClogP/total aa≦１．３６の範囲で、実測値のｐＫａが３．８、計算値のｐＫａが５．３のアミノ酸であるＧｌｎ（Ｍｓ）を含む配列は１．２０≦ClogP/total aa≦１．３３の範囲で膜透過性の評価を行った（ｐｄ５０〜ｐｄ７０）。一方、MeAbu(pip-4-F2)、MeAbu(Mor)、Ser(Et-2-Mor)、MeAbu(pip-3-F2)、Abu(5-Oxo-Odz)を含む配列で膜透過性、Papp≧１．０ｘ１０−６ｃｍ／秒を達成したものの例を以下に示す（ｐｄ３８６−ｐｄ３９５、ｐｄ４５２−ｐｄ４５４、ｐｄ４８２−ｐｄ４８７）。【０４５２】
（参照例３−５）Ser(Et-2-NMe2)またはGln(Ms)を含む環状ペプチド化合物の膜透過性
【表２７】
2020122182.tif 000338
【０４５３】
環状ペプチドｐｄ５０〜ｐｄ７０の構造を以下に示す。（なお環状ペプチドの構造式において、構造を明瞭にする目的でヘテロ原子に結合している水素原子を省略している場合もある）【０４５４】
【表２８】
2020122182.tif 000339
2020122182.tif 000340
2020122182.tif 000341
2020122182.tif 000342
2020122182.tif 000343
2020122182.tif 000344
【０４５５】
（参照例３−６）MeAbu(pip-4-F2)、MeAbu(Mor)、Ser(Et-2-Mor)、MeAbu(pip-3-F2)、Abu(5-Oxo-Odz)を含む環状ペプチド化合物でPapp≧１．０ｘ１０−６ｃｍ／秒を達成したものの例
【表２９】
2020122182.tif 000345
【０４５６】
環状ペプチドｐｄ３８６〜ｐｄ３９５、ｐｄ４５２〜ｐｄ４５４、ｐｄ４８２〜４８７の構造を以下に示す。（なお環状ペプチドの構造式において、構造を明瞭にする目的でヘテロ原子に結合している水素原子を省略している場合もある）【０４５７】
【表３０】
2020122182.tif 000346
2020122182.tif 000347
2020122182.tif 000348
2020122182.tif 000349
2020122182.tif 000350
【０４５８】
（参照例３−７）Ｆｍｏｃアミノ酸の合成
ｐＫａ実測に用いた３残基ペプチドおよび膜透過性を評価した環状ペプチドを合成するために使用したFmoc-Ser(Et-2-NMe2)-OH（化合物ｔｍ０１）、Fmoc―MeAbu(pip-4-F2)-OH（化合物ｔｍ０４）、Fmoc―MeAbu(pip-3-F2)-OH（化合物ｔｍ１０）、Fmoc-MeAbu(Mor)-OH（化合物ｔｍ１９）、Fmoc-Ser(Et-2-Mor)-OH（化合物ｔｍ２０）、Fmoc-Abu(5-Oxo-Odz)-OH（化合物ｔｍ２１）、Fmoc-Gln(Ms)-OH（化合物ｔｍ２２）は以下のように合成した。【０４５９】
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−（ジメチルアミノ）エチル）−Ｌ−セリン（化合物ｔｍ０１、Fmoc-Ser(Et-2-NMe2)-OH）の合成
2020122182.tif 000351
窒素雰囲気下、市販のトリチル−Ｌ−セリン（Trt-Ser-OH）のトリエチルアミン塩（５ｇ、１１．１５ｍｍｏｌ）にジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（４０ｍＬ）を加えた後、ナトリウムｔｅｒｔ−ペントキシド（７．３６ｇ、６６．９ｍｍｏｌ）を室温にて加え、３０分撹拌した。反応液に室温にて、２−クロロ−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタン−１−アミン塩酸塩（４．０１ｇ、２７．９ｍｍｏｌ）を加え、終夜撹拌した。反応液にギ酸（６．４１ｍＬ、１６７ｍｍｏｌ）を加え、逆相カラムクロマトグラフィー（１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液／メタノール）で精製し、Ｏ−（２−（ジメチルアミノ）エチル）−Ｎ−トリチル−Ｌ−セリン（Trt-Ser(Et-2-NMe2)-OH）（４．１ｇ）を得た。
得られた、Ｏ−（２−（ジメチルアミノ）エチル）−Ｎ−トリチル−Ｌ−セリン（Trt-Ser(Et-2-NMe2)-OH）（４．１ｇ、９．８０ｍｍｏｌ）にジクロロメタン（１０ｍＬ）を加えた後、４Ｎ塩酸／１，４−ジオキサン溶液（４０ｍＬ、１６０ｍｍｏｌ）、水（４ｍＬ）を加え、室温で３時間撹拌した。反応液に水（８０ｍＬ）を加え、ヘキサンで２回洗浄し、得られた水層に０度にて炭酸ナトリウム（２６．０ｇ、２４５ｍｍｏｌ）、１、４−ジオキサン（１２０ｍＬ）、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（３．９７ｇ、１１．７６ｍｍｏｌ）を加え、室温にて２時間撹拌した。反応液にギ酸（１１．２８ｍＬ、２９４ｍｍｏｌ）を加えた後、減圧下１，４−ジオキサンを留去し、得られた水層を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）で精製することでＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−（ジメチルアミノ）エチル）−Ｌ−セリン（化合物ｔｍ０１、Fmoc-Ser(Et-2-NMe2)-OH）のギ酸塩（３．０７ｇ、３工程６９％）を得た。得られたＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−（ジメチルアミノ）エチル）−Ｌ−セリン（化合物ｔｍ０１、Fmoc-Ser(Et-2-NMe2)-OH）のギ酸塩（３．０ｇ、７．５３ｍｍｏｌ）にジクロロメタン（４ｍＬ）、４Ｎ塩酸／１、４−ジオキサン溶液（９．４１１ｍＬ、３７．６ｍｍｏｌ）を加え、室温にて２０分撹拌した。反応液を減圧濃縮することで、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−（ジメチルアミノ）エチル）−Ｌ−セリン（化合物ｔｍ０１、Fmoc-Ser(Et-2-NMe2)-OH）の塩酸塩（２．７ｇ、８２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ３９９  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０４６０】
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）−４−オキソブタン酸ｔｅｒｔ−ブチル（化合物ｔｍ０２、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ｐｉｐ−４−Ｆ２）−ＯｔＢｕ）の合成
2020122182.tif 000352
窒素雰囲気下、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ・ＨＣｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（１２ｍＬ）に０度で１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（７２３ｍｇ、５．３５ｍｍｏｌ）と市販で購入した（Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−４−オキソブタン酸（Fmoc-Asp-OtBu）（２ｇ、４．８６ｍｍｏｌ）を加え１時間撹拌した。反応液に４，４−ジフルオロピペリジン塩酸塩（８４３ｍｇ、５．３５ｍｍｏｌ）とＮ−エチル−Ｎ−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（９３１μＬ、５．３５ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（２ｍＬ）を加え０度で３時間撹拌した。反応液に水を加え酢酸エチルで２回抽出した。有機層を合わせたものを０．５Ｍ塩酸水溶液、水、５０％炭酸水素ナトリウム水溶液、５０％食塩水で洗浄後、得られた有機層を減圧濃縮する事で（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）−４−オキソブタン酸ｔｅｒｔ−ブチル（化合物ｔｍ０２、Fmoc-Asp(pip-4-F2)-OtBu）（２．６３５ｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ＝  ５１５  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．９７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０４６１】
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）ブタン酸（化合物ｔｍ０３、Fmoc-Abu(pip-4-F2)-OH）の合成
2020122182.tif 000353
窒素雰囲気下、三ルテニウムドデカカルボニル（６２ｍｇ、０．０９７ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（５ｍＬ）に１，１，３，３−テトラメチルジシロキサン（２．７６ｍＬ，１５．５５ｍｍｏｌ）を加え室温にて１０分間撹拌した。反応液にテトラヒドロフラン（７ｍＬ）に溶解した（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）−４−オキソブタン酸ｔｅｒｔ−ブチル（化合物ｔｍ０２、Fmoc-Asp(pip-4-F2)-OtBu）（１．０ｇ、１．９４３ｍｍｏｌ）を加え、５０度にて３時間撹拌した後、反応液を減圧濃縮した。得られた残渣を２，２，２−トリフルオロエタノール（１０ｍＬ）に溶解し、トリメチルクロロシラン（７４５μＬ、５．８３ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。反応液を減圧濃縮した後、得られた残渣を１，４−ジオキサン（５ｍＬ）と２Ｎ塩酸水溶液（１０ｍＬ）に溶解し、室温で１時間撹拌した。反応液をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルで２回抽出し、有機層を減圧濃縮した。得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）ブタン酸（化合物ｔｍ０３、Fmoc-Abu(pip-4-F2)-OH)）（５４０ｍｇ、６３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ＝  ４４５  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０４６２】
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）ブタン酸（化合物ｔｍ０４、Fmoc-MeAbu(pip-4-F2)-OH）の合成
2020122182.tif 000354
窒素雰囲気下、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）ブタン酸（化合物ｔｍ０３、Fmoc-Abu(pip-4-F2)-OH)）（１３ｇ、９．２５ｍｍｏｌ）、パラホルムアルデヒド（２．６ｇ、２８．８６ｍｍｏｌ）とトリフルオロ酢酸（３０．５９ｇ、２６３．７１ｍｍｏｌ）のトルエン溶液（６０ｍＬ）を室温で１６時間撹拌した。反応液を減圧濃縮した後、ジクロロメタンに溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水、飽和食塩水で洗浄した後、得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過、減圧濃縮した。得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製し、中間体である（Ｓ）−４−（２−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）エチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（１０．９ｇ、８２％）を得た。得られた中間体（６ｇ、１３．１４ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸（６５ｍＬ）とジクロロエタン（６５ｍＬ）に溶解し室温にてトリエチルシラン（１３．５ｇ、１１６．１ｍｍｏｌ）を加え、７０度にて４時間撹拌した。反応液を室温に戻した後、減圧濃縮し得られた残渣をジクロロメタンに溶解した。有機層を水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過、減圧濃縮した。得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．５％塩酸水溶液／０．５％塩酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−（４，４−ジフルオロピペリジン−１−イル）ブタン酸（化合物ｔｍ０４、Fmoc-MeAbu(pip-4-F2)-OH)(4.0 g、66%)を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ＝  ４５９  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：２．７１分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ２８）【０４６３】
１−ベンジル−３，３−ジフルオロピペリジン（化合物ｔｍ０５）の合成
2020122182.tif 000355
窒素雰囲気下、１−ベンジルピペリジン−３−オン（６０ｇ、３１７．０３ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液に０度にてジメチルアミノ三フッ化硫黄（ＤＡＳＴ）（１５０ｇ、４．０４ｍｏｌ）を加え２時間撹拌した。その後、反応液に３００ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルにて３回抽出を行い、有機層を合わせた物を飽和食塩水で洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過を行い、得られた有機層を減圧濃縮することで粗生成物である１−ベンジル−３，３−ジフルオロピペリジン（化合物ｔｍ０５）（３１ｇ、４６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ＝  ２１２  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．９４分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ３１）【０４６４】
（Ｓ）−２−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−（３，３−ジフルオロピペリジン−１−イル）ブタン酸ベンジル（化合物ｔｍ０７、Ｃｂｚ−ＭｅＡｂｕ（ｐｉｐ−３−Ｆ２）−ＯＢｎ）の合成
2020122182.tif 000356
得られた粗生成物１−ベンジル−３，３−ジフルオロピペリジン（化合物ｔｍ０５）を２００ｍＬのメタノールに溶解し、１０％パラジウム／炭素（１ｇ）を加え、水素雰囲気下室温にて４８時間撹拌した。反応液をろ過し、得られたろ液を減圧濃縮する事で３，３−ジフルオロピペリジン（化合物ｔｍ０６）（１９ｇ）を粗生成物として得た。
別途合成した、（Ｓ）−２−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−（エチルチオ）−４−オキソブタン酸ベンジル（化合物ｔｍ０８、Cbz-MeAsp(SEt)-OBn）（２０ｇ、４８．１３ｍｍｏｌ）、３，３−ジフルオロピペリジン（化合物ｔｍ０６）（８．２６ｇ、６８．１９ｍｍｏｌ）、トリエチルシラン（４０ｍＬ）、１０％パラジウム／炭素（２．６ｇ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（２０ｍＬ）に０度にてナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３）（２０．４ｇ、２０４ｍｍｏｌ）を加え、室温にて３０分間撹拌した。反応液をろ過、減圧濃縮することで得た粗生成物を順相シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）にて精製し、（Ｓ）−２−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−（３，３−ジフルオロピペリジン−１−イル）ブタン酸ベンジル（化合物ｔｍ０７、Cbz-MeAbu(pip-3-F2)-OBn）（１１ｇ、５０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ＝  ４６１  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．４２分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ３２）【０４６５】
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−（３，３−ジフルオロピペリジン−１−イル）ブタン酸（化合物ｔｍ１０、Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｂｕ（ｐｉｐ−３−Ｆ２）−ＯＨ）の合成
2020122182.tif 000357
（Ｓ）−２−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−（３，３−ジフルオロピペリジン−１−イル）ブタン酸ベンジル（化合物ｔｍ０７、Cbz-MeAbu(pip-3-F2)-OBn）（２０ｇ、４３．４３ｍｍｏｌ）を３３％臭化水素酢酸溶液に溶解し、室温にて２時間撹拌した後、５０度にてさらに１時間撹拌した。反応溶液を減圧濃縮することで得た残渣をジエチルエーテルにて沈殿させ、（２Ｓ）−４−（３，３−ジフルオロピペリジン−１−イル）−２−（メチルアミノ）ブタン酸の臭化物（化合物ｔｍ０９）（２９ｇ）を粗生成物として得た。
上述の粗生成物である（２Ｓ）−４−（３，３−ジフルオロピペリジン−１−イル）−２−（メチルアミノ）ブタン酸の臭化物（化合物ｔｍ０９）（７．０８ｇ、２９．９７ｍｍｏｌ）とＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（１６ｇ、４７．４８ｍｍｏｌ）を炭酸カリウムの水／１，４−ジオキサン溶液＝１／１（３００ｍＬ）に溶解し室温にて４時間撹拌した。その後反応液をジエチルエーテルにて３回洗浄し、塩酸で水層のｐＨを３に調節し、酢酸エチルにて２度抽出した。得られた有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧濃縮し、得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（１０ｍｍｏｌ炭酸水素アンモニウム水溶液／アセトニトリル）にて精製し、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−（３，３−ジフルオロピペリジン−１−イル）ブタン酸（化合物ｔｍ１０、Fmoc-MeAbu(pip-3-F2)-OH)）（７．２ｇ、７１％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ＝  ４５９  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．６１分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ５）【０４６６】
（Ｓ）−２−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−（エチルチオ）−４−オキソブタン酸（化合物ｔｍ１３、Cbz-MeAsp(SEt)-OH）の合成
2020122182.tif 000358
窒素雰囲気下、（（ベンジルオキシ）カルボニル）−Ｌ−アスパラギン酸（Cbz-Asp-OH）（２００ｇ、７４８．４１ｍｍｏｌ）とパラホルムアルデヒド（６７．５ｇ、７４９．３５ｍｍｏｌ）とｐ−トルエンスルホン酸（７．７４ｇ、４４．９５ｍｍｏｌ）のトルエン溶液（２０００ｍＬ）を１１０度に昇温し、３日間撹拌した。反応液を室温にした後、水を加え酢酸エチルにて３回抽出した。合わせた有機層を飽和食塩水で洗浄し、得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、ろ過、減圧濃縮することで、（Ｓ）−２−（３−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−オキソオキサゾリジン−４−イル）酢酸（化合物ｔｍ１１）を粗生成物として得た（２００ｇ）。
上述と同様の方法で合成した（Ｓ）−２−（３−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−オキソオキサゾリジン−４−イル）酢酸（化合物ｔｍ１１）（２６５ｇ、９４８．９９ｍｍｏｌ）の粗生成物とエタンチオール（８８．３ｇ、１．４２ｍｏｌ）と４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（１１．５９ｇ、９５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液に０度にてＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（２１４ｇ、１．０４ｍｏｌ）を加え、室温にて５時間撹拌した。反応溶液をろ過し、得られたろ液を飽和食塩水で洗浄し、得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、ろ過、減圧濃縮した。得られた粗生成物を順相シリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製し、（Ｓ）−４−（２−（エチルチオ）−２−オキソエチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸ベンジル（化合物ｔｍ１２）（１６７ｇ）の混合物を得た。
得られた（Ｓ）−４−（２−（エチルチオ）−２−オキソエチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸ベンジル（化合物ｔｍ１２）（１３９ｇ、１．２０ｍｏｌ）のジクロロメタン（ＤＣＭ）とトリフルオロ酢酸溶液（１５００ｍＬ／１５００ｍＬ）にトリエチルシラン（１３９ｇ、１．２ｍｏｌ）を加え、室温にて３日間撹拌した。反応液を減圧濃縮し得られた残渣に炭酸カリウム水溶液を加え、ジエチルエーテルで３度洗浄した。得られた水層を２Ｎ塩酸水溶液でｐＨを３に調節したものに対して酢酸エチルで２度抽出した。合わせた有機層を飽和食塩水で洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、ろ過、減圧濃縮し、（Ｓ）−２−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−（エチルチオ）−４−オキソブタン酸（化合物ｔｍ１３、Cbz-MeAsp(SEt)-OH）（７５ｇ）の粗生成物を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ＝  ３２６  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．００分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ１６）【０４６７】
（Ｓ）−２−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−（エチルチオ）−４−オキソブタン酸ベンジル（化合物ｔｍ０８、Ｃｂｚ−ＭｅＡｓｐ（ＳＥｔ）−ＯＢｎ）の合成
2020122182.tif 000359
室温下、（Ｓ）−２−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−（エチルチオ）−４−オキソブタン酸（化合物ｔｍ１３、Cbz-MeAsp(SEt)-OH）（３ｇ、９．２２ｍｍｏｌ）の粗生成物と炭酸カリウム（１．９ｇ、１３．６５ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（４６ｍＬ）にベンジルブロミド（１．７３ｇ、１０．１１ｍｍｏｌ）を加え１６時間撹拌した後ろ過をした。得られたろ液を減圧濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製し、（Ｓ）−２−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−（エチルチオ）−４−オキソブタン酸ベンジル（化合物ｔｍ０８、Cbz-MeAsp(SEt)-OBn）（１．５ｇ）を得た。
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．３６−７．３１（ｍ，１０Ｈ），５．１９−４．８９（ｍ，５Ｈ），３．３４−２．８５（ｍ，７Ｈ），１．３０−１．２１（ｍ，３Ｈ）【０４６８】
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−モルホリノブタン酸（化合物ｔｍ１７、Fmoc-Abu(Mor)-OH）の合成は、以下のスキームに従って行った。
2020122182.tif 000360
【０４６９】
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（エチルチオ）−４−オキソブタン酸ｔｅｒｔ−ブチル（化合物ｔｍ１４、Fmoc-Asp(SEt)-OtBu）の合成
2020122182.tif 000361
（Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−４−オキソブタン酸（Fmoc-Asp-OtBu）（５ｇ、１２．１５ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（１４８ｍｇ、１．２２ｍｍｏｌ）およびエタンチオール（ＥｔＳＨ）（１．１３ｇ、１８．１９ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（ＤＣＭ）（５０ｍＬ）に溶解し、氷冷下でＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（２．７５６ｇ、１．３３７ｍｍｏｌ）を加えた。室温で５時間撹拌した後、固体をろ過により除去した。ろ液をジクロロメタン（ＤＣＭ）で希釈した後、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過、減圧濃縮した。得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（０〜４０％酢酸エチル／石油エーテル）で精製し、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（エチルチオ）−４−オキソブタン酸ｔｅｒｔ−ブチル（化合物ｔｍ１４、Fmoc-Asp(SEt)-OtBu）（３．９ｇ、７０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ４７８  （Ｍ＋Ｎａ）＋
保持時間：３．１３分（分析条件  ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ１４）【０４７０】
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−オキソブタン酸ｔｅｒｔ−ブチル（化合物ｔｍ１５）の合成
2020122182.tif 000362
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（エチルチオ）−４−オキソブタン酸ｔｅｒｔ−ブチル（化合物ｔｍ１４、Fmoc-Asp(SEt)-OtBu）（１ｇ、２．２０ｍｍｏｌ）をアセトン（４．４ｍＬ）に溶解し、Ｐｄ／Ｃ（ｗｅｔ、１０％、４４ｍｇ）を加えた。氷冷下、トリエチルシラン（１．２７６ｇ、１０．９７ｍｍｏｌ）を加えて１時間撹拌した。その後、ろ過によりＰｄ／Ｃを除去し、ろ液を減圧濃縮して得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（０〜６０％酢酸エチル／石油エーテル）で精製し、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−オキソブタン酸ｔｅｒｔ−ブチル（化合物ｔｍ１５）（６８０ｍｇ、７８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ４１８  （Ｍ＋Ｎａ）＋
保持時間：２．０７分（分析条件  ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ４０）【０４７１】
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−モルホリノブタン酸ｔｅｒｔ−ブチル（化合物ｔｍ１６、Ｆｍｏｃ−Ａｂｕ（Ｍｏｒ）−ＯｔＢｕ）の合成
2020122182.tif 000363
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−オキソブタン酸ｔｅｒｔ−ブチル（化合物ｔｍ１５）（１．６ｇ、４．０５ｍｍｏｌ）およびモルホリン（３８７ｍｇ、４．４４ｍｍｏｌ）をジクロロエタン（ＤＣＥ）（８ｍＬ）に溶解し、室温で１時間撹拌した。その後、氷冷下でナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３）（１．７１７ｇ、８．１０ｍｍｏｌ）のジクロロエタン（ＤＣＥ）（８ｍＬ）溶液を加え、４時間撹拌した。その後、反応液をジクロロメタンで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後、減圧濃縮した。得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）で精製し、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−モルホリノブタン酸ｔｅｒｔ−ブチル（化合物ｔｍ１６、Fmoc-Abu(Mor)-OtBu）（１．７ｇ、９８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ４６７  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：２．０２分（分析条件  ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ４１）【０４７２】
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−モルホリノブタン酸（化合物ｔｍ１７、Fmoc-Abu(Mor)-OH）の合成
2020122182.tif 000364
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−モルホリノブタン酸ｔｅｒｔ−ブチル（化合物ｔｍ１６、Fmoc-Abu(Mor)-OtBu）（９ｇ、１９．２９ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／ジクロロエタン（ＤＣＥ）（２５ｍＬ／２５ｍＬ）に溶解させ、４０度で２時間撹拌した。室温まで冷却後、反応液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過、減圧濃縮することで（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−モルホリノブタン酸（化合物ｔｍ１７、Fmoc-Abu(Mor)-OH）（７ｇ、９０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ４１１  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．２０分（分析条件  ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ４２）【０４７３】
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−モルホリノブタン酸（化合物ｔｍ１９、Fmoc-MeAbu(Mor)-OH）の合成は、以下のスキームに従って行った。
2020122182.tif 000365
【０４７４】
（Ｓ）−４−（２−モルホリノエチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（化合物ｔｍ１８）の合成
2020122182.tif 000366
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−モルホリノブタン酸（化合物ｔｍ１７、Fmoc-Abu(Mor)-OH）（６００ｍｇ、１．４６ｍｍｏｌ）およびパラホルムアルデヒド（１３１．４ｍｇ、１．４６ｍｍｏｌ）をトルエン（３ｍＬ）およびトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（１．５２７ｇ、１３．１６ｍｍｏｌ）に懸濁させ、室温で１６時間撹拌した。その後、反応液を減圧濃縮し、得られた残渣をジクロロメタンで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水、飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過し、ろ液を減圧濃縮して得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）で精製し、（Ｓ）−４−（２−モルホリノエチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（化合物ｔｍ１８）（４８６ｍｇ、７９％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ４２３  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．１４分（分析条件  ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ４０）【０４７５】
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−モルホリノブタン酸（化合物ｔｍ１９、Fmoc-MeAbu(Mor)-OH）の合成
2020122182.tif 000367
（Ｓ）−４−（２−モルホリノエチル）−５−オキソオキサゾリジン−３−カルボン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（化合物ｔｍ１８）（４８６ｍｇ、１．１５ｍｍｏｌ）およびトリエチルシラン（１．５ｍＬ、１０．３５ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸／ジクロロエタン（１／１、１２ｍＬ）に溶解し、７０度で４時間撹拌した。室温まで冷却した後、反応液を減圧濃縮して得られた残渣をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後、ろ液を減圧濃縮した。得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（５〜７０％  ０．５％塩酸水溶液／０．５％塩酸アセトニトリル溶液）で精製し、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−４−モルホリノブタン酸（化合物ｔｍ１９、Fmoc-MeAbu(Mor)-OH）（４００ｍｇ、８２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ４２５  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．４０分（分析条件  ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ３４）【０４７６】
Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−モルホリノエチル）−Ｌ−セリン（化合物ｔｍ２０、Fmoc-Ser(Et-2-Mor)-OH）の合成
2020122182.tif 000368
窒素雰囲気下、市販の（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−セリン（Ｂｏｃ−Ｓｅｒ−ＯＨ）（２０ｇ、９７．４６ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液（１００ｍＬ）に水素化ナトリウム（７．７１８ｇ、３２１．６２ｍｍｏｌ、６０％オイルディスパージョン）を室温にて加え、１時間撹拌した。反応液を０度に冷却し、４−（２−クロロエチル）モルホリン（１６．０４０ｇ、１０７．２１ｍｍｏｌ）を滴下しながら加え、室温にて１６時間撹拌した。反応液に０度にて５０％ギ酸水溶液を加え、ろ過を行った後、得られたろ液を逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル）で精製し、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｏ−（２−モルホリノエチル）−Ｌ−セリン（Boc-Ser(Et-2-Mor)-OH）（５．６ｇ、１８％）を得た。
Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｏ−（２−モルホリノエチル）−Ｌ−セリン（Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｅｔ−２−Ｍｏｒ）−ＯＨ）（５．６ｇ、１７．５９ｍｍｏｌ）に４Ｎ塩酸／１，４−ジオキサン溶液（２８．０ｍＬ、９２１．５３ｍｍｏｌ）を室温にて加え、１時間撹拌した。減圧下溶媒を留去し、得られた残渣をジクロロメタンで洗浄した後、水（１０ｍＬ）を加え溶液とした。得られた溶液に炭酸カリウムを加えｐＨ７に調節し、水（１００ｍＬ）と１．４−ジオキサン（１５０ｍＬ）を加えた後、室温にて炭酸カリウム（４．４６５ｇ、３２．０７ｍｍｏｌ）、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（５．６８ｇ、１６．８４ｍｍｏｌ）を加え、１６時間撹拌した。反応液をジエチルエーテルで洗浄し、濃塩酸を用いて水層のｐＨを１に調節し、ジクロロメタンで３回抽出した。得られた有機層を水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った。ろ液を減圧下濃縮し、得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％塩酸水溶液／０．１％塩酸アセトニトリル溶液）で精製することでＮ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（２−モルホリノエチル）−Ｌ−セリン（化合物ｔｍ２０、Fmoc-Ser(Et-2-Mor)-OH）の塩酸塩（３．２ｇ、２工程４８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ４４１  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０４７７】
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）ブタン酸（化合物ｔｍ２１、Fmoc-Abu(5-Oxo-Odz)-OH）の合成
2020122182.tif 000369
窒素雰囲気下、市販の（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−グルタミン（Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−ＯＨ）（５０ｇ、２０３．０３ｍｍｏｌ）のピリジン溶液（３５０ｍＬ）にＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（４６．１ｇ、２２３．４３ｍｍｏｌ）を室温にて加え、２時間撹拌した。反応液をろ過し、ろ液を濃縮することで得られた残渣にジクロロメタン、濃塩酸をｐＨ＝３になるように調整しながら加え、ジクロロメタンで２回抽出した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った後、減圧下溶媒留去した。得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製することで、（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−シアノブタン酸（４５．５ｇ、９８％）を得た。
上述のように得られた（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−シアノブタン酸（５０ｇ、２１９．０６ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（５００ｍＬ）に室温にてヒドロキシルアミンの塩酸塩（３２ｇ、４６０．５０ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（８３ｍＬ）を加え、８０度で２時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮することで、（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−５−（ヒドロキシアミノ）−５−イミノペンタン酸（１０７ｇ）を粗生成物として得た。
窒素雰囲気下、上述の粗生成物である（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−５−（ヒドロキシアミノ）−５−イミノペンタン酸（４４ｇ、１６８．４０ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン溶液（５００ｍＬ）に室温にて１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）（３９ｇ、２４０．５２ｍｍｏｌ）と１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン（ＤＢＵ）（５５ｇ、３６１．２７ｍｍｏｌ）を加え、１１０度で４時間撹拌した。反応液を室温にて冷却した後、濃塩酸を加えｐＨ＝２になるように調整し、ジクロロメタンで２回抽出した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った後、減圧下溶媒留去することで、（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−（５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）ブタン酸（Boc-Abu(5-Oxo-Odz)-OH）（１１ｇ）を粗生成物として得た。
窒素雰囲気下、上述のように得られた（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−（５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）ブタン酸（Boc-Abu(5-Oxo-Odz)-OH）（１３．５ｇ、４６．９９ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン溶液（１０ｍＬ）に室温にて４Ｎ塩酸／１，４−ジオキサン溶液（１４０ｍＬ）を加え、１６時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮することで、（Ｓ）−２−アミノ−４−（５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）ブタン酸（H-Abu(5-Oxo-Odz)-OH）（８．８ｇ）を粗生成物として得た。
窒素雰囲気下、得られた粗生成物である（Ｓ）−２−アミノ−４−（５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）ブタン酸（H-Abu(5-Oxo-Odz)-OH）（８．８ｇ、４７．０２ｍｍｏｌ）と炭酸カリウム（１３ｇ、９４．０６ｍｍｏｌ）の水／１，４−ジオキサン溶液（１００ｍＬ／１００ｍＬ）に室温にて、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（１４．３ｇ、４２．４ｍｍｏｌ）を加え、３時間撹拌した。反応液をｔ−ブチルメチルエーテル／ヘキサン（１／３）で洗浄し、濃塩酸を用いて水層のｐＨを２に調節し、ジクロロメタンで２回抽出した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った。ろ液を減圧下濃縮し、得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル）で精製することで、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）ブタン酸（化合物ｔｍ２１、Fmoc-Abu(5-Oxo-Odz)-OH）（２．６７ｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ４１０  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．６６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０４７８】
Ｎ２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ５−（メチルスルホニル）−Ｌ−グルタミン（化合物ｔｍ２２、Fmoc-Gln(Ms)-OH）の合成
2020122182.tif 000370
窒素雰囲気下、市販の（Ｓ）−４−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−５−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−５−オキソペンタン酸（Fmoc-Glu-OtBu）（２０ｇ、４７ｍｍｏｌ）、メタンスルホンアミド（２０ｇ、２１０ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（１．３ｇ、１０．６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（３６０ｍＬ）に１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ・ＨＣｌ）（９．６４ｇ、５０．３ｍｍｏｌ）を室温にて加え、１６時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮し、酢酸エチルを加え、０．１％塩酸水溶液で３回、水で１回洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過を行った。得られた溶液を減圧下濃縮し、残渣を順相カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）で精製することで、ｔｅｒｔ−ブチルＮ２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ５−（メチルスルホニル）−Ｌ−グルタミナート（Fmoc-Gln(Ms)-OtBu）（９．３ｇ、３９％）を得た。
窒素雰囲気下、上述のようにして得られた、ｔｅｒｔ−ブチルＮ２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ５−（メチルスルホニル）−Ｌ−グルタミナート（Fmoc-Gln(Ms)-OtBu）（５．５ｇ、１０．９ｍｍｏｌ）の２，２，２−トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）溶液（１００ｍＬ）に０度にてクロロトリメチルシラン（ＴＭＳＣｌ）（３．５７ｇ、３２．８６１ｍｍｏｌ））を加え、１時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮し、得られた残渣にｔ−ブチルメチルエーテルを加え再び濃縮した。この操作をさらに２回繰り返し、アセトニトリル／ジクロロメタンで再結晶を行うことで、Ｎ２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ５−（メチルスルホニル）−Ｌ−グルタミン（化合物ｔｍ２２、Fmoc-Gln(Ms)-OH）（３．８１７８ｇ、７７％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ４４７  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．６５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０４７９】
（参照例４）ClogPが膜透過性に与える影響
Trpの側鎖を有する環状ペプチド化合物、及び同側鎖を有しない環状ペプチド化合物を合成し、改良法により膜透過性試験を行った。なお、MeTrpはTrpの側鎖を含むことから、構成アミノ酸にMeTrpを含む環状ペプチド化合物も、Trpの側鎖を有する環状ペプチド化合物に含まれる。その結果、Trpの側鎖を持たない環状ペプチド化合物はClogPを上昇させることによりＰａｐｐ≧１．０×１０−６ｃｍ／秒を達成することが可能であった（図１−１）。一方、Trpの側鎖を１つ以上有しているとClogPを上昇させてもＰａｐｐ≧１．０×１０−６ｃｍ／秒まで膜透過性を上げるのは難しかった（図１−２）。例えばTrp側鎖の位置、Ｎアルキルのパターンを変えたもので、１．０６≦ClogP/total aa≦１．４３の範囲にある環状ペプチド化合物の配列を表３１に示すが、これらはＰａｐｐ≧１．０×１０−６ｃｍ／秒の膜透過性を達成することは難しかった。
以上のことから、Trpの側鎖を持たない環状ペプチド化合物の膜透過性を評価したところ、ＣｌｏｇＰを上昇させることにより膜透過性が向上することが確認できたため（図１−１）、比較する２つのペプチドのClogP/total AAの値が±０．０３の間となるように調節した。【０４８０】
【表３１】
2020122182.tif 000371
【０４８１】
環状ペプチドｐｄ１００〜ｐｄ１１１の構造を以下に示す。（なお環状ペプチドの構造式において、構造を明瞭にする目的でヘテロ原子に結合している水素原子を省略している場合もある）【０４８２】
【表３２】
2020122182.tif 000372
2020122182.tif 000373
2020122182.tif 000374
【０４８３】
（参照例５）Tyr(3-F)又はTyrの側鎖を有する環状ペプチド化合物の膜透過性試験
Tyr(3-F)又はTyrの側鎖を有する環状ペプチド化合物を合成し、改良法により膜透過性試験を行った。その結果、Tyr(3-F)又はTyrの側鎖を有する環状ペプチド化合物もTrpの側鎖を有する環状ペプチド化合物と同様の傾向であった。１．０６≦ClogP/total aa≦１．２９の範囲にある環状ペプチド化合物の配列を表３３に示すが、Ｔｒｐの場合と同様、これらがＰａｐｐ≧１．０×１０−６ｃｍ／秒を達成することは困難であった。【０４８４】
【表３３】
2020122182.tif 000375
【０４８５】
環状ペプチドｐｄ１１２〜ｐｄ１２９の構造を以下に示す。（なお環状ペプチドの構造式において、構造を明瞭にする目的でヘテロ原子に結合している水素原子を省略している場合もある）【０４８６】
【表３４】
2020122182.tif 000376
2020122182.tif 000377
2020122182.tif 000378
2020122182.tif 000379
2020122182.tif 000380
【０４８７】
（参照例６）環状ペプチド中の芳香環の数（ＡＲＣ）が膜透過性に与える影響
ＡＲＣが増加するにともなって環状ペプチド化合物のＰａｐｐが低下、すなわち膜透過性が低下する傾向が確認できた（図２）。そのため、比較する２つのペプチドの芳香環の数（Aromatic Ring Count: ARC）を揃えた。
なお、本解析では、環状部の側鎖に縮環構造を有するもの、並びに置換及び無置換のヒドロキシフェニル基を有する環状ペプチド化合物を解析対象から除外した。ＡＲＣ＝３の場合、ClogP/total AAが０．８８以上の配列で、１．０×１０−６以上のＰａｐｐが認められた。一方、ＡＲＣ＝４の場合は前記ＡＲＣ＝３の化合物群と同程度のClogP/total AA（０．８８以上）の化合物であっても、Ｐａｐｐが１．０×１０−６以上となるものはほとんど存在しなかった。このことから、同程度の脂溶性の配列群であるにも関わらず、ＡＲＣ＝３とＡＲＣ＝４を比較すると、ＡＲＣ＝３の方が良好な膜透過性を示すことが示された（表３５、表３６、表３７）。
また、ｐｄ１９８を例にとり、表３５、表３６及び表３７のカラムについて説明する。ｐｄ１９８は１２残基からなる環状ペプチドであり、１０残基のアミノ酸で環を形成している。環化部分を１番目のアミノ酸と定義し、ｐｄ１９８の場合ではＡｓｐが該当する。Ａｓｐの隣で環状部を構成するアミノ酸を２番目のアミノ酸と定義し（ｐｄ１９８の場合Ｐｈｅが該当）、以下３番目、４番目とＮ末端まで繰り返す（ｐｄ１９８の場合３番目ＭｅＶａｌ、４番目ＭｅＬｅｕとなり、環状部が１０残基からなるためＮ末端は１０番目のｇ−ＭｅＡｂｕ）。また環化部のアミノ酸のＣ末端から近い順に、Ｈ−１、Ｈ−２、Ｈ−３と示している。ｐｄ１９８の場合Ｈ−１はＭｅＰｈｅ、Ｈ−２はＡｌａであるので、ＡｓｐのＣ末端にＭｅＰｈｅが結合しており、ついでＡｌａが結合していることを意味している。またＣ−ｔｅｒｍのカラムはＣ末端のアミノ酸のカルボン酸部位と縮合する官能基を意味しており、ｐｉｐはピペリジンを表し、ｐｙｒｒｏはピロリジンを意味している（ｐｄ１９８の場合、Ｃ末端のアミノ酸はＨ−２のＡｌａであり、そのカルボン酸部位がｐｉｐ（ピペリジン）と縮合した構造になる）。そして、Ｎ末端のアミノ基と環化部のアミノ酸の側鎖カルボン酸をアミド結合により環化させたペプチドであるということを表３５、表３６及び表３７で表している。例えば、ｐｄ１９８はＮ末端であるｇ−ＭｅＡｂｕのアミノ基と環化部のＡｓｐの側鎖カルボン酸がアミド結合により環化している。本文中に記載の環状ペプチドに関しては特に記述が無い限り、全て同様の手法で表現している。  【０４８８】
【表３５】
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【０４８９】
【表３６】
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【０４９０】
【表３７】
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【０４９１】
上記に記載の環状ペプチドの構造を以下に示す。（なお環状ペプチドの構造式において、構造を明瞭にする目的でヘテロ原子に結合している水素原子を省略している場合もある）【０４９２】
【表３８】
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【０４９３】
参照例において膜透過性を評価した環状ペプチドの分析情報を以下に示す。【０４９４】
【表３９】
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【産業上の利用可能性】
【０４９５】
本発明は、ペプチドの膜透過性を改善するアミノ酸、および該アミノ酸を含むペプチド化合物を提供することができる。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【国際調査報告】
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