(57)【要約】  心機能障害の治療法を確立する。ジストロフィン遺伝子のイントロン55の領域の一部に相補的なヌクレオチド配列からなる塩基数１５〜３０のオリゴヌクレオチドであって、5’-TGTCTTCCT-3’又は5’-CAGCTTGAACCGGGC-3’（配列番号６４）の配列（但し、配列中のTはUであってもよい）を含む前記オリゴヌクレオチド、その薬理上許容される塩又は溶媒和物。前記オリゴヌクレオチド、その医薬的に許容できる塩又は溶媒和物を含む、心機能障害の予防及び／又は治療薬。前記オリゴヌクレオチド、その医薬的に許容できる塩又は溶媒和物を含む、Dp116発現抑制剤。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジストロフィン遺伝子のイントロン55の領域の一部に相補的なヌクレオチド配列からなる塩基数１５〜３０のオリゴヌクレオチドであって、5’-TGTCTTCCT-3’又は5’-CAGCTTGAACCGGGC-3’（配列番号６４）の配列（但し、配列中のTはUであってもよい）を含む前記オリゴヌクレオチド、その薬理上許容される塩又は溶媒和物。
【請求項２】
オリゴヌクレオチドが、5’-TGTCTTCCT-3’の配列（但し、配列中のTはUであってもよい）を含む、請求項１記載のオリゴヌクレオチド、その薬理上許容される塩又は溶媒和物。
【請求項３】
配列番号１５〜５９のいずれか１つの配列（但し、配列中のTはUであってもよく、UはTであってもよい）を含む、請求項１又は２に記載のオリゴヌクレオチド、その薬理上許容される塩又は溶媒和物。
【請求項４】
配列番号２０、２５〜３３及び３５〜３７のいずれか１つの配列を含む、請求項１又は２に記載のオリゴヌクレオチド、その薬理上許容される塩又は溶媒和物。
【請求項５】
ジストロフィンDp116の発現を抑制できる、請求項１〜４のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、その薬理上許容される塩又は溶媒和物。
【請求項６】
オリゴヌクレオチドを構成する糖及び／又はリン酸ジエステル結合の少なくとも１個が修飾されている、請求項１〜５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、その薬理上許容される塩又は溶媒和物。
【請求項７】
オリゴヌクレオチドを構成する糖がD-リボフラノースであり、糖の修飾がD-リボフラノースの2'位の水酸基の修飾である、請求項１〜６のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、その薬理上許容される塩又は溶媒和物。
【請求項８】
オリゴヌクレオチドを構成する糖がD-リボフラノースであり、糖の修飾がD-リボフラノースの2’-O-アルキル化及び／又は2'-,4'-架橋化である、請求項１〜７のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、その薬理上許容される塩又は溶媒和物。
【請求項９】
オリゴヌクレオチドを構成する糖がD-リボフラノースであり、糖の修飾がD-リボフラノースの2’-O-アルキル化及び／又は2'-O,4'-C-アルキレン化である、請求項１〜８のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、その薬理上許容される塩又は溶媒和物。
【請求項１０】
オリゴヌクレオチドを構成する糖がD-リボフラノースであり、糖の修飾がD-リボフラノースの2’-O-メチル化及び／又は2'-O,4'-C-エチレン化である、請求項１〜８のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、その薬理上許容される塩又は溶媒和物。
【請求項１１】
オリゴヌクレオチドを構成するリン酸ジエステル結合の修飾がホスホロチオエートである、請求項１〜１０
のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、その薬理上許容される塩又は溶媒和物。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、その薬理上許容される塩又は溶媒和物を含む、心機能障害の予防及び／又は治療薬。
【請求項１３】
ジストロフィンDp116を発現している患者を対象とする、請求項１２記載の予防及び／又は治療薬。
【請求項１４】
ジストロフィンDp116を発現している患者がDuchenne型筋ジストロフィー患者である、請求項１３記載の予防及び／又は治療薬。
【請求項１５】
請求項１〜１１のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、その薬理上許容される塩又は溶媒和物を含む、Dp116発現抑制剤。
【請求項１６】
請求項１〜１１のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、その薬理上許容される塩又は溶媒和物を医薬的に有効な量で被験者に投与することを含む、心機能障害の予防及び／又は治療方法。
【請求項１７】
Dp116を発現する細胞、組織又は器官を請求項１〜１１のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、その薬理上許容される塩又は溶媒和物で処理することを含む、Dp116の発現を抑制する方法。
【請求項１８】
心機能障害の予防及び／又は治療方法に使用するための、請求項１〜１１のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、その薬理上許容される塩又は溶媒和物。
【請求項１９】
Dp116の発現を抑制するための、請求項１〜１１のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、その薬理上許容される塩又は溶媒和物の使用。
【請求項２０】
請求項１〜１１のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、その薬理上許容される塩又は溶媒和物を含む、経口又は非経口で投与するための配合物。
【請求項２１】
医薬として使用するための、請求項１〜１１のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、その薬理上許容される塩又は溶媒和物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心筋障害治療薬に関し、より詳細には、Dp116 mRNAの発現を抑制できるオリゴヌクレオチド及びそれを含む医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
Duchenne型筋ジストロフィー（DMD）は、DMD遺伝子の異常によりジストロフィンが欠損し発症する。DMDでは心機能障害が殆どの症例で合併し、多くの症例が心不全により死亡する（非特許文献１及び２）。このDMDの心機能障害の治療としては、一般的な心保護剤等が使われ、DMDに特異的な心機能障害の治療はない（非特許文献３）。【０００３】
ジストロフィンはDp427というアイソフォームであり、DMDでは、遺伝子の異常の部位により患者毎に欠損するジストロフィンのアイソフォームが異なる。ジストロフィンのアイソフォームとしては、Dp427、Dp260、Dp140、Dp116及びDp71が知られている。【０００４】
松尾らは、DMDの心機能障害の発症因子が心臓に発現するジストロフィンDp116（以後、Dp116とも呼ぶ）にあることを見い出し報告した（非特許文献４）。Dp116の発現と心機能障害との関連を解析したところ、Dp116を発現するDMD患者は発現しない患者よりも心機能障害が早くしかも強く出現することが判明した。このことは、Dp116の発現を抑制することが、心機能障害治療の分子標的であることを示唆した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Kamdar F, Garry DJ. Dystrophin-deficient cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol. 2016;67:2533-2546.
【非特許文献２】Nigro G, Comi LI, Politano L, Bain RJ. The incidence and evolutive of cardiomyopathy in Duchenne muscular dystrophy. Int J Cardiol. 1990;26:271-277.
【非特許文献３】Markham LW, Spicer RL, Khoury PR, Wong BL, Mathews KD, Cripe LH. Steroid therapy and cardiac function in Duchenne muscular dystrophy. Pediatr Cardiol. 2005;26:768-771.
【非特許文献４】Yamamoto T, Awano H, Zhan Z, Enomoto-Sakuma M, Kitaaki S, Matsumoto M, Nagai M, Sato I, Imanishi T, Hayashi N, Matsuo M, Iijima K, Saegusa J, Cardiac dysfunction in Duchenne muscular dystrophy is less frequent in patients with mutations in the dystrophin Dp116 coding region than in other regions. 2018; Cirs Genom Precis Med. 2018;11:e001782.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、心機能障害の治療法を確立することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、Dp116mRNAの発現を抑制する修飾核酸の探索を行った。Dp116のエクソンS１のスプライシング促進配列に対する修飾核酸を各種合成し、それらをU251細胞に導入し、Dp116 mRNAの量をRT-PCR法により解析した。その結果、Dp116の発現を抑制する核酸医薬を見い出した。【０００８】
本核酸医薬は、DMDの心機能障害の治療に応用できるものである。また、成人での心機能障害の治療へも応用があると考えられる。【０００９】
本発明の要旨は以下の通りである。
（１）ジストロフィン遺伝子のイントロン55の領域の一部に相補的なヌクレオチド配列からなる塩基数１５〜３０のオリゴヌクレオチドであって、5’-TGTCTTCCT-3’又は5’-CAGCTTGAACCGGGC-3’（配列番号６４）の配列（但し、配列中のTはUであってもよい）を含む前記オリゴヌクレオチド、その薬理上許容される塩又は溶媒和物。
（２）オリゴヌクレオチドが、5’-TGTCTTCCT-3’の配列（但し、配列中のTはUであってもよい）を含む、（１）記載のオリゴヌクレオチド、その薬理上許容される塩又は溶媒和物。
（３）配列番号１５〜５９のいずれか１つの配列（但し、配列中のTはUであってもよく、UはTであってもよい）を含む、（１）又は（２）に記載のオリゴヌクレオチド、その薬理上許容される塩又は溶媒和物。
（４）配列番号２０、２５〜３３及び３５〜３７のいずれか１つの配列を含む、（１）又は（２）に記載のオリゴヌクレオチド、その薬理上許容される塩又は溶媒和物。
（５）ジストロフィンDp116の発現を抑制できる、（１）〜（４）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、その薬理上許容される塩又は溶媒和物。
（６）オリゴヌクレオチドを構成する糖及び／又はリン酸ジエステル結合の少なくとも１個が修飾されている、（１）〜（５）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、その薬理上許容される塩又は溶媒和物。
（７）オリゴヌクレオチドを構成する糖がD-リボフラノースであり、糖の修飾がD-リボフラノースの2'位の水酸基の修飾である、（１）〜（６）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、その薬理上許容される塩又は溶媒和物。
（８）オリゴヌクレオチドを構成する糖がD-リボフラノースであり、糖の修飾がD-リボフラノースの2’-O-アルキル化及び／又は2'-,4'-架橋化である、（１）〜（７）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、その薬理上許容される塩又は溶媒和物。
（９）オリゴヌクレオチドを構成する糖がD-リボフラノースであり、糖の修飾がD-リボフラノースの2’-O-アルキル化及び／又は2'-O,4'-C-アルキレン化である、（１）〜（８）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、その薬理上許容される塩又は溶媒和物。
（１０）オリゴヌクレオチドを構成する糖がD-リボフラノースであり、糖の修飾がD-リボフラノースの2’-O-メチル化及び／又は2'-O,4'-C-エチレン化である、（１）〜（８）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、その薬理上許容される塩又は溶媒和物。
（１１）オリゴヌクレオチドを構成するリン酸ジエステル結合の修飾がホスホロチオエートである、（１）〜（１０）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、その薬理上許容される塩又は溶媒和物。
（１２）（１）〜（１１）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、その薬理上許容される塩又は溶媒和物を含む、心機能障害の予防及び／又は治療薬。
（１３）ジストロフィンDp116を発現している患者を対象とする、（１２）記載の予防及び／又は治療薬。
（１４）ジストロフィンDp116を発現している患者がDuchenne型筋ジストロフィー患者である、（１３）記載の予防及び／又は治療薬。
（１５）（１）〜（１１）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、その薬理上許容される塩又は溶媒和物を含む、Dp116発現抑制剤。
（１６）（１）〜（１１）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、その薬理上許容される塩又は溶媒和物を医薬的に有効な量で被験者に投与することを含む、心機能障害の予防及び／又は治療方法。
（１７）Dp116を発現する細胞、組織又は器官を（１）〜（１１）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、その薬理上許容される塩又は溶媒和物で処理することを含む、Dp116の発現を抑制する方法。
（１８）心機能障害の予防及び／又は治療方法に使用するための、（１）〜（１１）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、その薬理上許容される塩又は溶媒和物。
（１９）Dp116の発現を抑制するための、（１）〜（１１）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、その薬理上許容される塩又は溶媒和物の使用。
（２０）（１）〜（１１）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、その薬理上許容される塩又は溶媒和物を含む、経口又は非経口で投与するための配合物。
（２１）医薬として使用するための、（１）〜（１１）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、その薬理上許容される塩又は溶媒和物。【００１０】
本発明は、DMD患者が発現するDp116を標的として、極めて特異性の高い治療法となることが大きく期待される。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、Dp116の発現を抑制し、心機能障害を治療することが可能となる。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2018‐112863の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】合成したアンチセンスオリゴヌクレオチドをU251細胞に導入し、２４時間後に細胞から抽出したmRNAをRT-PCRを行いて増幅し、Bioanalyzerを用いて解析した図。Dp116とGAPDHのRT-PCR産物の泳動バンドを示す。
【図２】図１で増幅した産物を半定量的解析した結果。Dp116とGAPDHのRT-PCR産物量の比を求め、AO無添加(MQ)を１として、各AO添加時の値を比で表したもの。
【図３】本発明のオリゴヌクレオチドの作用機序を示す。本発明のオリゴヌクレオチドは、Dp116のエクソン１(S1)とエクソン５６が連結するスプライシング反応をブロックし、Dp116の発現を特異的に阻害できる。
【図４】実施例化合物によるMiraCell cardiomyocytesでのDp116タンパク質発現抑制を示す図。縦軸は、Dp116のバンド強度をβ-actin強度のバンドで除した値を示す。
【図５】実施例化合物によるU251細胞でのDp116 mRNA発現抑制を示す図。縦軸は、Dp116のPCR反応物のバンド強度をGAPDHのPCR反応物のバンド強度で除した値を示す。
【図６】実施例化合物によるU251細胞でのDp116 mRNA発現抑制を示す図。縦軸は、Dp116のPCR反応物のバンド強度をGAPDHのPCR反応物のバンド強度で除した値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。
【００１４】
本発明は、ジストロフィン遺伝子のイントロン５５の領域の一部に相補的なヌクレオチド配列からなる塩基数１５〜３０のオリゴヌクレオチドであって、5’-TGTCTTCCT-3’又は5’-CAGCTTGAACCGGGC-3’（配列番号６４）の配列（但し、配列中のTはUであってもよい）を含む前記オリゴヌクレオチド、その薬理上許容される塩又は溶媒和物を提供する。
【００１５】
本発明のオリゴヌクレオチド、その薬理上許容される塩及び溶媒和物は、5’-TGTCTTCCT-3’の配列（但し、配列中のTはUであってもよい）を含むことが好ましい。
【００１６】
本発明のオリゴヌクレオチド、その薬理上許容される塩及び溶媒和物として、配列番号１５〜５９のいずれか１つの配列（但し、配列中のTはUであってもよく、UはTであってもよい）を含むものを例示することができる。
【００１７】
本発明のオリゴヌクレオチドの塩基数は、１５〜３０が適当であり、１５〜２１が好ましく、１５〜１８がより好ましい。
【００１８】
本発明のオリゴヌクレオチド、その薬理上許容される塩及び溶媒和物は、ジストロフィンDp116の発現を抑制できるものであるとよい。Dp116の発現を抑制することにより、心機能障害の予防及び／又は治療効果が期待できる。
【００１９】
DMD遺伝子はDuchenne型筋ジストロフィー（DMD）の責任遺伝子で、その異常によりジストロフィン（Dp427）が欠損する。DMD遺伝子はヒト最大の遺伝子で４２００Kbあり、７９ヶのエクソンからなる１４kbのmRNAをコードしている。遺伝子内には５カ所のプロモーターがあり、それぞれからDp427、Dp260、Dp140、Dp116とDp71の組織特異的なジストロフィンアイソフォームが産生される。
【００２０】
ジストロフィンDp116は、イントロン55内にあるプロモーターから産生される2番目に小さなアイソフォームで、シュワン細胞に発現する。プロモーターはSプロモーターそしてエクソン１はS１と名付けられている。そのmRNAは、Dp116特異的エクソン１とDMD遺伝子のエクソン５６から７９のエクソンを他のアイソフォームと共有する。
【００２１】
本発明のオリゴヌクレオチドは、ジストロフィン遺伝子のイントロン55の領域の一部に相補的なヌクレオチド配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドである。本発明のオリゴヌクレオチドは、Dp116のエクソン１(S1) とエクソン５６が連結するスプライシング反応をブロックし、Dp116の発現を特異的に阻害できる（図３）。本発明のオリゴヌクレオチドは、イントロン55の機能に影響がないか、あったとしても少ないと考えられ、例えば、Dp427のpre-mRNAを分解しないと考えられる。
【００２２】
本発明のオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）を構成するヌクレオチドは、天然型DNA、天然型RNA、DNA/RNAのキメラ、これらの修飾体のいずれであってもよいが、少なくとも１つが修飾ヌクレオチドであることが好ましい。
【００２３】
本発明における修飾ヌクレオチドとしては、糖が修飾されたもの（例えば、D-リボフラノースの2’位の水酸基が修飾されたもの（D-リボフラノースが2'-O-アルキル化されたもの、D-リボフラノースが2'-,4'-架橋化されたもの（D-リボフラノースが2'-O, 4'-C-アルキレン化されたものなど）など）、リン酸ジエステル結合が修飾されたもの（例えば、チオエート化、塩基が修飾されたもの、それらを組み合わせたものなどを例示することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを構成する少なくとも１個のD-リボフラノースが2'-O-アルキル化されたものや2'-O,4'-C-アルキレン化されたものは、RNAに対する結合力が高いこと、ヌクレアーゼに対する耐性が高いことから、天然型のヌクレオチド（すなわち、オリゴDNA、オリゴRNA）より高い治療効果が期待できる。また、オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも１個のリン酸ジエステル結合がチオエート化されたものも、ヌクレアーゼに対する耐性が高いことから、天然型のヌクレオチド（すなわち、オリゴDNA、オリゴRNA）より高い治療効果が期待できる。上記のような修飾された糖と修飾されたリン酸の両者を含むオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼに対する耐性がより高いことから、さらに高い治療効果が期待できる。
【００２４】
本発明のオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）について、糖の修飾の例としては、D-リボフラノースの2'-O-アルキル化（例えば、2'-O-メチル化、2'-O-アミノエチル化、2'-O-プロピル化、2'-O-アリル化、2'-O-メトキシエチル化、2'-O-ブチル化、2'-O-ペンチル化、2'-O-プロパルギル化など）；D-リボフラノースの2'-O,4'-C-アルキレン化（例えば、2'-O,4'-C-エチレン化、2'-O,4'-C-メチレン化、2'-O,4'-C-プロピレン化、2'-O,4'-C-テトラメチレン化、2'-O,4'-C-ペンタメチレン化など）、S-cEt（2',4'-constrained ethyl）、AmNA（Amide-bridged nucleic acid）などの2'-,4'-架橋化；D-リボフラノースの2'-デオキシ-2'-C,4’-C-メチレンオキシメチレン化、3'-デオキシ-3'-アミノ-2'-デオキシ-D-リボフラノース、3'-デオキシ-3'-アミノ-2'-デオキシ-2'-フルオロ-D-リボフラノースなどの2'デオキシ化とその他の修飾の組み合わせなどを挙げることができる。
【００２５】
本発明のオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）について、リン酸ジエステル結合の修飾の例としては、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、メチルチオホスホネート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホロアミデート結合などを挙げることができる。
【００２６】
本発明のオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）について、塩基の修飾の例としては、シトシンの5-メチル化、5-フルオロ化、5-ブロモ化、5-ヨード化、N4-メチル化、チミンの5-デメチル化（ウラシル）、5-フルオロ化、5-ブロモ化、5-ヨード化、アデニンのN6-メチル化、8-ブロモ化、グアニンのN2-メチル化、8-ブロモ化などを挙げることができる。
【００２７】
本発明のオリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチド残基としては、下記に構造を示すAt、Gt、5meCt、Ct、Tt、Ut、Ap、Gp、5meCp、Cp、Tp、Up、As、Gs、5meCs、Cs、Ts、Us、Am1t、Gm1t、Cm1t、5meCm1t、Um1t、Am1p、Gm1p、Cm1p、5meCm1p、Um1p、Am1s、Gm1s、Cm1s、5meCm1s、Um1s、A2t、G2t、C2t、T2t、Ae2p、Ge2p、Ce2p、Te2p、Ae2s、Ge2s、Ce2s、Te2s、A1t、G1t、C1t、T1t、Ae1p、Ge1p、Ce1p、Te1p、Ae1s、Ge1s、Ce1s、Te1s、Am2t、Gm2t、5meCm2t、Tm2t、Am2p、Gm2p、5meCm2p、Tm2p、Am2s、Gm2s、5meCm2s、Tm2sを挙げることができる。
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本発明のオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、市販の合成機（例えば、パーキンエルマー社のホスホロアミダイド法によるモデル３９２）などを用いて、文献（Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984))に記載の方法に準じて合成することができる。その際に用いられるホスホロアミダイト試薬は、天然型のヌクレオシド及び2'-O-メチルヌクレオシド（すなわち、2'-O-メチルグアノシン、2'-O-メチルアデノシン、2'-O-メチルシチジン、2'-O-メチルウリジン）については、市販の試薬を用いることができる。アルキル基の炭素数が２〜６個の2'-O-アルキルグアノシン、アデノシン、シチジンおよびウリジンについては、以下の通りである。
【００２８】
2'-O-アミノエチルグアノシン、アデノシン、シチジン、ウリジンは、文献（Blommers et al. Biochemistry (1998), 37, 17714-17725.）に従って合成できる。
【００２９】
2'-O-プロピルグアノシン、アデノシン、シチジン、ウリジンは、文献（Lesnik,E.A. et al. Biochemistry (1993), 32, 7832-7838.）に従って合成できる。
【００３０】
2'-O-アリルグアノシン、アデノシン、シチジン、ウリジンは、市販の試薬を用いることができる。
【００３１】
2'-O-メトキシエチルグアノシン、アデノシン、シチジン、ウリジンは、特許（US6261840）または、文献（Martin, P. Helv. Chim. Acta. (1995) 78, 486-504.に従って合成できる。
【００３２】
2'-O-ブチルグアノシン、アデノシン、シチジン、ウリジンは、文献（Lesnik,E.A. et al. Biochemistry (1993), 32, 7832-7838.）に従って合成できる。
【００３３】
2'-O-ペンチルグアノシン、アデノシン、シチジン、ウリジンは、文献（Lesnik,E.A. et al. Biochemistry (1993), 32, 7832-7838.）に従って合成できる。
【００３４】
2'-O-プロパルギルグアノシン、アデノシン、シチジン、ウリジンは、市販の試薬を用いることができる。
【００３５】
2'-O, 4'-C-メチレングアノシン、アデノシン、シチジン、5-メチルシチジンおよびチミジンについては、WO99/14226に記載の方法に従って、アルキレン基の炭素数が２〜５個の2'-O, 4'-C-アルキレングアノシン、アデノシン、シチジン、5-メチルシチジンおよびチミジンについては、WO00/47599に記載の方法に従って製造することができる。
【００３６】
D-リボフラノースの2'-デオキシ-2'-C,4'-C-メチレンオキシメチレン化されたヌクレオシドは、文献（Wang,G. et al. Tetrahedron (1999), 55, 7707-7724に従って合成できる。
【００３７】
S-cEt（constrained ethyl）は、文献（Seth,P.P. et al. J.Org.Chem (2010), 75, 1569-1581.）に従って合成できる。
【００３８】
AmNAは、文献（Yahara,A. et al. ChemBioChem (2012), 13, 2513-2516.）または、WO2014/109384に従って合成できる。
【００３９】
本発明において、核酸塩基配列は、アデニンを(A)又は(a)、グアニンを(G)又は(g)、シトシンを(C)又は(c)、チミンを(T)又は(t)、及び、ウラシルを(U)又は(u)とそれぞれ記載することができる。シトシンの代わりに、5-メチルシトシンを使うことができる。核酸塩基のうち、ウラシル(U)又は(u)とチミン(T)又は(t)は、互換性がある。ウラシル(U)又は(u)とチミン(T)又は(t)のどちらも、相補鎖のアデニン(A)又は(a)との塩基対形成に使うことができる。
【００４０】
ホスホロアミダイト試薬をカップリング後、硫黄、テトラエチルチウラムジスルフィド（TETD、アプライドバイオシステム社）、Beaucage試薬（Glen Research社）、または、キサンタンヒドリドなどの試薬を反応させることにより、ホスホロチオエート結合を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成することができる（Tetrahedron Letters, 32, 3005 (1991), J. Am. Chem. Soc. 112, 1253 (1990), PCT/WO98/54198）。
【００４１】
合成機で用いるコントロールド  ポア  グラス（CPG）としては、2'-O-メチルヌクレオシドの結合したものは、市販のものを利用することができる。また、2'-O,4'-C-メチレングアノシン、アデノシン、5-メチルシチジンおよびチミジンについては、WO99/14226に記載の方法に従って、アルキレン基の炭素数が２〜５個の2'-O, 4'-C-アルキレングアノシン、アデノシン、5-メチルシチジンおよびチミジンについては、WO00/47599に記載の方法に従って製造したヌクレオシドを文献（Oligonucleotide Synthesis, Edited by M.J.Gait, Oxford University Press, 1984）に従って、CPGに結合することができる。修飾されたCPG（特開平７−８７９８２の実施例１２ｂに記載）を用いることにより、3'末端に2-ヒドロキシエチルリン酸基が結合したオリゴヌクレオチドを合成できる。また、3'-amino-Modifier C3 CPG, 3'-amino-Modifier C7 CPG, Glyceryl CPG, (Glen Research), 3'-specer C3 SynBase CPG 1000, 3'-specer C9 SynBase CPG 1000（link technologies）を使えば、3'末端にヒドロキシアルキルリン酸基、または、アミノアルキルリン酸基が結合したオリゴヌクレオチドを合成できる。
【００４２】
本発明のオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、医薬として、具体的には、心機能障害、特に、心筋障害、例えば、心筋症、好ましくは、拡張型心筋症の予防及び／又は治療に用いることができる。
【００４３】
本発明のオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、薬理上許容される塩の形態で用いてもよい。「薬理上許容される塩」とは、オリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）の塩をいい、そのような塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩などの金属塩；アンモニウム塩のような無機塩、ｔ−オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ−ベンジル−フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機塩などのアミン塩；弗化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、沃化水素酸塩のようなハロゲン化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、燐酸塩などの無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩のようなアリールスルホン酸塩、酢酸塩、りんご酸塩、フマール酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、蓚酸塩、マレイン酸塩などの有機酸塩；グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩などを挙げることができる。これらの塩は、公知の方法で製造することができる。
【００４４】
また、オリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）及びその薬理上許容される塩は、溶媒和物（例えば、水和物）としても存在することがあり、そのような溶媒和物であってもよい。
【００４５】
よって、本発明は、上記のオリゴヌクレオチド、その薬理上許容される塩又は溶媒和物を含む、心機能障害の予防及び／又は治療薬を提供する。
【００４６】
本発明の予防及び／又は治療薬は、ジストロフィンDp116を発現している患者を対象とするとよい。ジストロフィンDp116を発現している患者はDuchenne型筋ジストロフィー患者であるとよいが、そのような患者に限定されるわけではない。
【００４７】
本発明のオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）、その薬理上許容される塩又は溶媒和物を心機能障害の予防及び／又は治療に使用する場合には、それ自体あるいは適宜の薬理上許容される賦形剤、希釈剤などと混合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤若しくはシロップ剤などにより経口的に、あるいは、注射剤、坐剤、貼付剤若しくは外用剤などにより非経口的に投与することができる。
【００４８】
これらの製剤は、賦形剤（例えば、乳糖、白糖、葡萄糖、マンニトール、ソルビトールのような糖誘導体；トウモロコシデンプン、バイレショデンプン、α澱粉、デキストリンのような澱粉誘導体；結晶セルロースのようなセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルランのような有機系賦形剤；軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、珪酸カルシウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウムのような珪酸塩誘導体；燐酸水素カルシウムにような燐酸塩；炭酸カルシウムのような炭酸塩；硫酸カルシウムのような硫酸塩などの無機系賦形剤など）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸；ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウムのようなステアリン酸金属塩；タルク；コロイドシリカ；ビーズワックス、ゲイ蝋のようなワックス類；硼酸；アジピン酸；硫酸ナトリウムのような硫酸塩；グリコール；フマル酸；安息香酸ナトリウム；ＤＬロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウムのようなラウリル硫酸塩：無水珪酸、珪酸水和物のような珪酸類；上記澱粉誘導体など）、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール、前記賦形剤と同様の化合物など）、崩壊剤（例えば、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、内部架橋カルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース誘導体；カルボキシメチルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドンのような化学修飾されたデンプン・セルロース類など）、乳化剤（例えば、ベントナイト、ビーガムのようなコロイド性粘土；水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウムのような金属水酸化物；ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸カルシウムのような陰イオン界面活性剤；塩化ベンザルコニウムのような陽イオン界面活性剤；ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルのような非イオン界面活性剤など）、安定剤（メチルパラベン、プロピルパラベンのようなパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコールのようなアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾールのようなフェノール類；チメロサール；デヒドロ酢酸；ソルビン酸など）、矯味矯臭剤（例えば、通常使用される甘味料、酸味料、香料など）、希釈剤などの添加剤を用いて周知の方法で製造される。
【００４９】
本発明の予防及び／又は治療薬は、０．１〜２５０μmoles／mLのオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）、その薬理上許容される塩又は溶媒和物を含有するとよく、好ましくは、１〜５０μmoles／mLのオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）、その薬理上許容される塩又は溶媒和物、0.02〜10％w/vの炭水化物又は多価アルコール及び0.01〜0.4％w/vの薬理上許容される界面活性剤を含有させておいてもよい。
【００５０】
上記炭水化物としては、単糖類又は二糖類が特に好ましい。これら炭水化物及び多価アルコールの例としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、ラクトース、マルトース、マンニトール及びソルビトールが挙げられる。これらは、単独で用いても、併用してもよい。
【００５１】
また、本発明における界面活性剤の好ましい例としては、ポリオキシエチレンソルビタンモノ〜トリ−エステル、アルキルフェニルポリオキシエチレン、ナトリウムタウロコラート、ナトリウムコラート、及び多価アルコールエステルが挙げられる。このうち特に好ましいのは、ポリオキシエチレンソルビタンモノ〜トリ−エステルであり、ここにおいてエステルとして特に好ましいのは、オレエート、ラウレート、ステアレート及びパルミテートである。これらは単独で用いても、併用してもよい。
【００５２】
また、本発明の治療薬は、更に好ましくは、0.03〜0.09Ｍの薬理上許容される中性塩、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム及び／又は塩化カルシウムを含有させておいてもよい。
【００５３】
また、本発明の治療薬は、更に好ましくは、0.002〜0.05Ｍの薬理上許容される緩衝剤を含有することができる。好ましい緩衝剤の例としては、クエン酸ナトリウム、ナトリウムグリシネート、リン酸ナトリウム、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンが挙げられる。これらの緩衝剤は、単独で用いても、併用してもよい。
【００５４】
さらに、上記の治療薬は、溶液状態で供給してもよい。しかし、ある期間保存する必要がある場合等のために、オリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）を安定化して治療効果の低下を防止する目的で通常は凍結乾燥しておくことが好ましく、その場合は用時に溶解液（注射用蒸留水など）で再構成（reconstruction）して、即ち投与される液体状態にして用いればよい。従って、本発明の治療薬は、各成分が所定の濃度範囲になるよう溶解液で再構成して使用するための、凍結乾燥された状態のものも包含する。凍結乾燥物の溶解性を促進する目的で、アルブミン、グリシン等のアミノ酸を更に含有させておいてもよい。
【００５５】
本発明のオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）、その薬理上許容される塩又は溶媒和物をヒトに投与する場合には、例えば、成人１日あたり約０．０１〜１００mg/kg（体重）、好ましくは０．１〜２０mg/kg（体重）の投与量で、１回または数回に分けて皮下注射、点滴静脈注射、または、静脈注射するとよいが、その投与量や投与回数は、疾患の種類、症状、年齢、投与方法などにより適宜変更しうる。
【００５６】
ヒト、例えば、ジストロフィンDp116を発現している患者への本発明のオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）、その薬理上許容される塩又は溶媒和物の投与は、例えば、以下のようにして行うことができる。すなわち、オリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）、その薬理上許容される塩又は溶媒和物を当業者に周知の方法で製造し、これを常法により滅菌処理し、例えば１２５mg/mLの注射用溶液を調製する。この溶液を、患者静脈内にオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）の投与量が体重１kg当たり例えば１０mgとなるように、例えば輸液の形で点滴投与する。投与は、例えば１週間の間隔で行い、その後も、心エコーなどにより治療効果の確認をしながら、適宜この治療を繰り返す。
【００５７】
また、本発明のオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）、その薬理上許容される塩及び溶媒和物は、Dp116の発現を抑制するために用いることができる。よって、本発明は、上記のオリゴヌクレオチド、その薬理上許容される塩又は溶媒和物を含む、Dp116発現抑制剤を提供する。Dp116発現抑制剤としては、Dp116を発現する細胞において、Dp116  mRNA量をコントロールと比較して約30%以下、好ましくは20％以下、更に好ましくは10%以下に減少させることができるオリゴヌクレオチド、その薬理上許容される塩又は溶媒和物を用いることができるが、Dp116の発現抑制能を有している限り、上記の範囲に限定されない。本発明のDp116発現抑制剤は、医薬として、あるいは実験用試薬として用いることができる。
実験用試薬として用いる場合には、Dp116を発現する細胞、組織又は器官を本発明のオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）、その薬理上許容される塩及び溶媒和物で処理することにより、Dp116の発現を抑制することができる。本発明のオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）、その薬理上許容される塩及び溶媒和物は、Dp116の発現を抑制するのに有効な量で用いればよい。Dp116を発現する細胞としては、グリオブラストーマ（glioblastoma）由来の細胞、心筋細胞（cardiomyocyte）、シュワン細胞などの天然由来の細胞を例示することができる。また、天然由来の細胞の他、Dp116遺伝子を導入した組み換え細胞を例示することもできる。Dp116を発現する組織及び器官としては、グリオブラストーマ（glioblastoma）、心臓、末梢神経系などを例示することができる。Dp116の発現は、サンプル中のDp116 mRNAをRT-PCRで解析したり、サンプル中のDp116タンパク質をウェスタンブロット法で検出したり、Dp116に特異的なペプチド断片を質量分析法で検出したりすることにより解析することができる。
【実施例】
【００５８】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
（参考例１〜１４）
HO-Am1s-Te2s-Am1s-Gm1s-Te2s-Am1s-Gm1s-Ae2s-Am1s-Gm1s-Ae2s-Am1s-Um1s-Ce2s-Um1s-Gm1s-Ae2s-Cm1ｔ-H (Dp116-01)（配列番号１）
核酸自動合成機（BioAutomation製MerMade 192X）を用い、ホスホロアミダイト法（Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984)を用いて合成を行った。試薬としては、アクチベーター溶液-3 (0.25 mol/L 5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール・アセトニトリル溶液、和光純薬工業製、product No. 013-20011)、CAP A for AKTA (1-メチルイミダゾール・アセトニトリル溶液、Sigma-Aldrich製、product No. L040050)、Cap B1 for AKTA (無水酢酸・アセトニトリル溶液、Sigma-Aldrich製、product No. L050050)、Cap B2 for AKTA (ピリジン・アセトニトリル溶液、Sigma-Aldrich製、product No. L050150)、DCA Deblock (ジクロロ酢酸・トルエン溶液、Sigma-Aldrich製、product No. L023050)を用いた。ホスホロチオエート結合を形成するためのチオ化試薬として、0.2 Mになるようにフェニルアセチルジスルフィド（CARBOSYNTH製、product No. FP07495）を、アセトニトリル (脱水、関東化学製、product No. 01837-05)、ピリジン (脱水、関東化学製、product No. 11339-05)1:1(v/v)溶液を用いて溶解して用いた。アミダイト試薬としては、2'-O-Meヌクレオシドのホスホロアミダイト(アデノシン体product No. ANP-5751, シチジン体product No. ANP-5752,グアノシン体product No. ANP-5753, ウリジン体product No. ANP-5754)はChemGenes製のものを用いた。非天然型のホスホロアミダイトは特開２０００−２９７０９７の実施例14(5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O,4'-C-エチレン-6-N-ベンゾイルアデノシン-3'-O-(2-シアノエチル N,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト)、実施例27 (5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O,4'-C-エチレン-2-N-イソブチリルグアノシン-3'-O-(2-シアノエチル N,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト)、実施例22（5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O,4'-C-エチレン-4-N-ベンゾイル-5-メチルシチジン-3'-O-(2-シアノエチル N,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト）、実施例9（5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O,4'-C-エチレン-5-メチルウリジン-3'-O-(2-シアノエチル N,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト）、の化合物を用いた。固相担体として、Glen Unysupport FC 96ウェルフォーマット0.2 μmol（GlenResearch製）を用い、表記の参考例１の化合物を合成した。但し、アミダイト体の縮合に要する時間は、約9分とした。【００５９】
目的配列を有する保護されたオリゴヌクレオチド類縁体を600 μLの濃アンモニア水で処理することによってオリゴマーを支持体から切り出すとともに、リン原子上の保護基シアノエチル基と核酸塩基上の保護基をはずした。オリゴマーの混合溶液を、Clarity QSP DNA Loading Buffer（Phenomenex製）300 μLを混合し、Clarity SPE 96 well plate（Phenomenex製）上にチャージした。Clarity QSP DNA Loading Buffer:水 = 1:1溶液1 mL、水3 mL、3%ジクロロ酢酸(DCA)水溶液3 mL、水6 mLの順に添加した後、20 mM Tris水溶液:アセトニトリル = 9:1溶液にて抽出される成分を集めた。溶媒留去後、目的化合物を得た。本化合物は、逆相HPLC（カラム（Phenomenex, Clarity 2.6 μm Oligo-MS 100A (2.1×50 mm)）、A溶液：100 mMヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)、8 mMトリエチルアミン水溶液、B溶液：メタノール、B%：10% → 25%（4min, linear gradient）；60℃；0.5 mL/min；260nm）で分析すると、2.887分に溶出された。化合物は負イオンESI質量分析により同定した。【００６０】
本化合物の塩基配列は、Homo sapiens dystrophin (DMD)（NCBI-GenBank accession No. NG_012232.1）のヌクレオチド番号1836403〜1836420に相補的な配列である。【００６１】
参考例2乃至14の化合物も参考例1の化合物と同様に合成した。参考例1の化合物のデータ、及び、参考例2乃至14の化合物について表１に記載する。
表１
---------------------------------------------------------------------
参考例 配列名称    配列 (5’-3’)    開始     終了   分子量  配列番号
---------------------------------------------------------------------
1      Dp116-01 aTagTagAagAauCugAc  1836403  1836420  6422.78    １
2      Dp116-02 gTagAagAauCugAccTu  1836400  1836417  6375.72    ２
3      Dp116-03 gAagAauCugAccTuuAc  1836397  1836414  6321.64    ３
4      Dp116-04 gAauCugAccTuuAcaTg  1836394  1836411  6312.64    ４
5      Dp116-05 uCugAccTuuAcaTggTa  1836391  1836408  6303.32    ５
6      Dp116-06 gAccTuuAcaTggTauGu  1836388  1836405  6329.65    ６
7      Dp116-07 cTuuAcaTggTauGucTu  1836385  1836402  6281.62    ７
8     Dp116-07.1 uTuaCauGguAugTcuTc 1836384  1836401  6281.64    ８
9     Dp116-07.2 uTacAugGuaTguCuuCc 1836383  1836400  6280.65    ９
10     Dp116-16 cTucCugTguAacAuuTu  1836370  1836387  6241.62  １０
11     Dp116-17 cCugTguAacAuuTucAg  1836367  1836384  6289.67  １１
12     Dp116-18 gTguAacAuuTucAgcTu  1836364  1836381  6290.65  １２
13     Dp116-19 uAacAuuTucAgcTugAa  1836361  1836378  6283.67  １３
14     Dp116-20 cAuuTucAgcTugAacCg  1836358  1836375  6288.67  １４
---------------------------------------------------------------------
表中の「配列」において大文字はD-リボフラノースの2'-O,4'-C-エチレン化、小文字はD-リボフラノースの2'-O-メチル化を示す。ヌクレオシド間の結合は、すべてホスホロチオエート結合である。すなわち、大文字は、Ae2s, Ge2s, Ce2s, Te2sのいずれかであり、3’末端以外の小文字は、Am1s, Gm1s, Cm1s, Um1sであり、3’末端の小文字は、Am1t, Gm1t, Cm1t, Um1tのいずれかである。表中の「開始」および「終了」は、Homo sapiens dystrophin (DMD), RefSeqGene (LRG_199) on chromosome X（NCBI-GenBank accession No. NG_012232.1）のヌクレオチド番号を示し、表中の「配列」は、「開始」から「終了」までのヌクレオチド配列に相補的な配列を示す。表中の「分子量」は、負イオンESI質量分析による実測値を示す。【００６２】
（実施例１〜１０）
実施例1乃至10の化合物も参考例1と同様に合成した。実施例1乃至10について表２に記載する。
表２
---------------------------------------------------------------------
実施例 配列名称    配列 (5’-3’)    開始     終了   分子量  配列番号
---------------------------------------------------------------------
1      Dp116-08 uAcaTggTauGucTucCu  1836382  1836399  6280.65  １５
2      Dp116-09 aCauGguAugTcuTccTg  1836381  1836398  6319.66  １６
3      Dp116-10 cAugGuaTguCuuCcuGu  1836380  1836397  6282.62  １７
4      Dp116-11 aTggTauGucTucCugTg  1836379  1836396  6350.66  １８
5      Dp116-12 uGguAugTcuTccTguGu  1836378  1836395  6299.60  １９
6      Dp116-13 gGuaTguCuuCcuGugTa  1836377  1836394  6336.63  ２０
7      Dp116-14 gTauGucTucCugTguAa  1836376  1836393  6320.64  ２１
8      Dp116-15 uGucTucCugTguAacAu  1836373  1836390  6266.66  ２２
9      Dp116-21 uTucAgcTugAacCggGc  1836355  1836372  6343.69  ２３
10     Dp116-22 cAgcTugAacCggGcaCu  1836352  1836369  6365.75  ２４
---------------------------------------------------------------------
表中の「配列」において大文字はD-リボフラノースの2'-O,4'-C-エチレン化、小文字はD-リボフラノースの2'-O-メチル化を示す。ヌクレオシド間の結合は、すべてホスホロチオエート結合である。すなわち、大文字は、Ae2s, Ge2s, Ce2s, Te2sのいずれかであり、3’末端以外の小文字は、Am1s, Gm1s, Cm1s, Um1sであり、3’末端の小文字は、Am1t, Gm1t, Cm1t, Um1tのいずれかである。表中の「開始」および「終了」は、Homo sapiens dystrophin (DMD), RefSeqGene (LRG_199) on chromosome X（NCBI-GenBank accession No. NG_012232.1）のヌクレオチド番号を示し、表中の「配列」は、「開始」から「終了」までのヌクレオチド配列に相補的な配列を示す。表中の「分子量」は、負イオンESI質量分析による実測値を示す。【００６３】
（実施例１１〜１８）
実施例11乃至18の化合物も参考例1と同様に合成した。実施例11乃至18について表３に記載する。
表３
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実施例 配列名称  配列 (5’-3’)     開始     終了   分子量  配列番号
---------------------------------------------------------------------
11     Dp116-13a ggTaTgucuTccTgTgTa  1836377  1836394  6364.70   ２５
12     Dp116-13b ggTaTgucTuccTgTgTa  1836377  1836394  6364.70   ２６
13     Dp116-13c ggTaTguCuucCugTgTa  1836377  1836394  6364.68   ２７
14     Dp116-13d ggTaTguCuuCcugTgTa  1836377  1836394  6364.70   ２８
15     Dp116-13e ggTaTgTcuTccTgTgTa  1836377  1836394  6390.71   ２９
16     Dp116-13f ggTaTgTcTuccTgTgTa  1836377  1836394  6390.69   ３０
17     Dp116-13g ggTaTgTcTTccTgTgTa  1836377  1836394  6416.72   ３１
18     Dp116-13h ggTaTgTcTuCcTgTgTa  1836377  1836394  6416.72   ３２
---------------------------------------------------------------------
表中の「配列」において大文字はD-リボフラノースの2'-O,4'-C-エチレン化、小文字はD-リボフラノースの2'-O-メチル化を示す。ヌクレオシド間の結合は、すべてホスホロチオエート結合である。すなわち、大文字は、Ae2s, Ge2s, Ce2s, Te2sのいずれかであり、小文字は、Am1s, Gm1s, Cm1s, Um1s, Am1t, Gm1t, Cm1t, Um1tのいずれかである。表中の「開始」および「終了」は、Homo sapiens dystrophin (DMD), RefSeqGene (LRG_199) on chromosome X（NCBI-GenBank accession No. NG_012232.1）のヌクレオチド番号を示し、表中の「配列」は、「開始」から「終了」までのヌクレオチド配列に相補的な配列を示す。表中の「分子量」は、負イオンESI質量分析による実測値を示す。【００６４】
（実施例１９〜４５）
実施例19乃至45の化合物も参考例1と同様に合成した。実施例19乃至45について表４に記載する。
表４
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実施例 配列名称 配列 (5’-3’)     開始     終了    分子量  配列番号
---------------------------------------------------------------------
19  Dp116-13a.1  ggTaTgucuTccTgTgT  1836378  1836394  6005.6455  ３３
20  Dp116-13a.2  gTaTgucTuccTgTgTa  1836377  1836393  5989.6571  ３４
21  Dp116-13a.3  ggTaTguCuucCugTg   1836379  1836394  5643.6161  ３５
22  Dp116-13a.4  gTaTguCuuCcugTgT   1836378  1836395  5630.6015  ３６
23  Dp116-13a.5  TaTgTcuTccTgTgTa   1836377  1836392  5614.6060  ３７
24  Dp116-13a.6  ggTaTgTcTuccTgT    1836374  1836394  5268.5651  ３８
25  Dp116-13a.7  gTaTgTcTTccTgTg    1836375  1836393  5268.5675  ３９
26  Dp116-13a.8  TaTgTcTuCcTgTgT    1836376  1836392  5255.5722  ４０
27  Dp116-13a.9  aTgucuTccTgTgTa    1836377  1836391  5252.5687  ４１
28  Dp116-13e.1  ggTaTgucuTccTgTgT  1836378  1836394  6031.6439  ４２
29  Dp116-13e.2  gTaTgucTuccTgTgTa  1836377  1836393  6015.6527  ４３
30  Dp116-13e.3  ggTaTguCuucCugTg   1836379  1836394  5669.6344  ４４
31  Dp116-13e.4  gTaTguCuuCcugTgT   1836378  1836395  5656.6177  ４５
32  Dp116-13e.5  TaTgTcuTccTgTgTa   1836377  1836392  5640.6201  ４６
33  Dp116-13e.6  ggTaTgTcTuccTgT    1836374  1836394  5294.5832  ４７
34  Dp116-13e.7  gTaTgTcTTccTgTg    1836375  1836393  5294.5835  ４８
35  Dp116-13e.8  TaTgTcTuCcTgTgT    1836376  1836392  5281.5756  ４９
36  Dp116-13e.9  aTgucuTccTgTgTa    1836377  1836391  5278.5856  ５０
37  Dp116-13g.1  ggTaTgucuTccTgTgT  1836378  1836394  6057.6588  ５１
38  Dp116-13g.2  gTaTgucTuccTgTgTa  1836377  1836393  6041.6637  ５２
39  Dp116-13g.3  ggTaTguCuucCugTg   1836379  1836394  5695.6337  ５３
40  Dp116-13g.4  gTaTguCuuCcugTgT   1836378  1836395  5682.6421  ５４
41  Dp116-13g.5  TaTgTcuTccTgTgTa   1836377  1836392  5666.6295  ５５
42  Dp116-13g.6  ggTaTgTcTuccTgT    1836374  1836394  5320.5994  ５６
43  Dp116-13g.7  gTaTgTcTTccTgTg    1836375  1836393  5320.5993  ５７
44  Dp116-13g.8  TaTgTcTuCcTgTgT    1836376  1836392  5307.5983  ５８
45  Dp116-13g.9  aTgucuTccTgTgTa    1836377  1836391  5304.6046  ５９
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表中の「配列」において大文字はD-リボフラノースの2'-O,4'-C-エチレン化、小文字はD-リボフラノースの2'-O-メチル化を示す。ヌクレオシド間の結合は、すべてホスホロチオエート結合である。すなわち、大文字は、Ae2s, Ge2s, Ce2s, Te2sのいずれかであり、小文字は、Am1s, Gm1s, Cm1s, Um1s, Am1t, Gm1t, Cm1t, Um1tのいずれかである。表中の「開始」および「終了」は、Homo sapiens dystrophin (DMD), RefSeqGene (LRG_199) on chromosome X（NCBI-GenBank accession No. NG_012232.1）のヌクレオチド番号を示し、表中の「配列」は、「開始」から「終了」までのヌクレオチド配列に相補的な配列を示す。表中の「分子量」は、負イオンESI質量分析による実測値を示す。【００６５】
（試験例１）実施例及び参考例化合物によるU251細胞でのDp116発現抑制
glioblastoma由来のU251細胞はATCCより購入した。細胞を37℃５% CO2 in air中にて培養した。
U251細胞へのオリゴヌクレオチドのトランスフェクション
以下のようにして、実施例及び参考例で製造した化合物（アンチセンスオリゴヌクレオチド）をU251細胞にトランスフェクションした。
１．Opti-MEM （GIBCO-BRL）100μlに、実施例で製造した化合物（ミリQで10μg
/20μlとしたもの）200 pmolを溶解した。
２．１の溶液へ6μlのplus reagent（GIBCO-BRL）を加え、15分間室温で放置した。
３．別のチューブでOpti-MEM 100μlに8μl Lipofectamine（GIBCO-BRL）を溶解した。
４．２の処理後、処理液に３を加えさらに15分間室温に放置した。
５．分化誘導後４日目の筋芽細胞をPBSにて１回洗浄した後、Opti-MEM 800μlを加えた。
６．４の処理後、処理液を５に加えた。
７．６の細胞を37℃５% CO2 in air中にて３時間培養した後、DMEM (6%HSを含む) 500μlを各ウエルに加えた。
８．さらに培養を継続した。【００６６】
RNA抽出
以下のようにしてＲＮＡの抽出を行った。
１．アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクションした細胞を１日間培養した後、PBSにて１回
洗浄し、ISOGEN (ニッポンジーン) 500μlを細胞に添加した。
２．５分間室温に放置した後、ウエル内のISOGENをチューブに回収した。
３．ISOGEN (ニッポンジーン)のプロトコールに従ってRNAを抽出した。
４．最終的にDEPW 20 μlにRNAを溶解した。【００６７】
逆転写反応
以下のようにして逆転写反応を行った。
１．RNA 2μgにDEPW（ジエチルピロカーボネートで処理した滅菌水）を加え、6μlとした。
２．１の溶液へrandom hexamer （Invitrogen  3μg/μlを20倍希釈したもの）2μlを加えた。
３．65℃で10分間加熱した。
４．氷上で２分間冷却した。
５．上記の反応液に、MMLV-reverse transcriptase（Invitrogen 200U/μl）1μl、Human placenta ribonuclease inhibitor（Takara 40U/μl）1μl、DTT（MMLV-reverse transcriptaseに添付）1μl、バッファー（MMLV-reverse transcriptaseに添付）4μl、dNTPs（Takara Ex Taqに添付）5μlを加えた。
６．37℃に１時間保温し、その後95℃で５分間加熱した。
７．反応後は-80℃で保存した。【００６８】
PCR反応
以下のようにしてＰＣＲ反応を行った。
１．下記の成分を混和後、94℃で4分間加熱した。
逆転写反応産物3μl
フォワードプライマー(10pmol/μl) 1μl
リバースプライマー(10pmol/μl) 1μl
dNTP（TAKARA Ex Taqに添付） 2μl
バッファー （TAKARA Ex Taqに添付） 2μl
Ex Taq (TAKARA) 0.1 μl
滅菌水 11μl
２．94℃4分の処理後に、94℃1分・60℃1分・72℃３分の処理を35サイクル行った。
３．72℃で7分間加熱した。
なお、Dp116の発現抑制を検出するためのＰＣＲ反応に用いたフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列は以下の通りである。
フォワードプライマーDp116ex1F-2: 5'- GGGTTTTCTCAGGATTGCTATGC -3'（配列番号６０）
リバースプライマー4F: 5'- CCCACTCAGTATTGACCTCCTC -3' （配列番号６１）
また、内部標準としてGAPDH遺伝子を用いた。ＰＣＲ反応に用いたフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列は以下の通りである。
フォワードプライマーGAPDH-F: 5’- CCCTTCATTGACCTCAAC -3’（配列番号６２）
リバースプライマー GAPDH-R: 5’- TTCACACCCATGACGAAC -3’（配列番号６３）
４．PCR反応物の解析は、Agilent Bioanalyzerを用いて行った。泳動分離後、それぞれの、バンドの量を定量した。
５．ＰＣＲ反応の反応産物のシークエンス
増幅産物を２％アガロースゲル電気泳動によって解析した。
泳動したゲルから増幅産物のバンドを切り出し、PCR産物をpT7 Blue-T vector（Novagen）にサブクローニングし、Thermo Sequenqse TM II dye terminator cycle sequencing kit (Amersham Pharmacia Biotec)を用い、ABI PRISM 310 Genetic analyzer（アプライドバイオシステムズ）によってシークエンス反応を行って、塩基配列を確認した。反応手順は添付マニュアルに従った。【００６９】
[結果]
実施例及び参考例のDp116-01乃至-022のアンチセンスオリゴヌクレオチドをU251細胞に導入し、２４時間後にmRNAをRT-PCR解析した。アンチセンスオリゴヌクレオチドの代わりにMQ（ミリQ水）のみを導入した細胞からは、増幅産物を得た。同様に、各種のアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入した細胞から抽出したRNAを材料にDp116をRT-PCR増幅した。増幅産物のバンドの濃さが異なって得られた。（図１、図中のレーンの番号01乃至22は、それぞれDp116-01乃至Dp116-022を表す。レーンの表示のMQは、MQを用いた場合を示す）そこで、この増幅産物の半定量的解析を行った。その結果、Dp116-08乃至Dp116-015、Dp116-021、及び、Dp116-022は、Dp116  mRNA量をコントロールと比較して約20%程度またはそれ以下にDp116  mRNA量を低下させた。特にDp116-13が最も強くDp116量を低下させた。MQを用いた細胞の約10％までDp116  mRNA量を低下させること判明した。（図２）
以上よりDp116-13を最も有力なDp116発現阻害アンチセンスオリゴヌクレオチドと決定した。【００７０】
（試験例２）  実施例化合物によるMiraCell cardiomyocytesでのDp116タンパク質発現抑制
0.1μg/mLのfibronectin溶液(F1141-1MG, SIGMA)または0.1% gelatin溶液(190-15805, 富士フィルム和光純薬)を96ウェルプレートに1ウェルあたり100μL添加して、37℃で2時間インキュベーションすることでプレートをコーティングした。ウェルの溶液を除くとともに、添付文書に示された通りの操作によって解凍してThawing Medium(Y50015, タカラバイオ)に懸濁したMiraCell cardiomyocytes (Y50015, タカラバイオ)を1x105cells/wellで100μLの容量でプレートに播種し、37℃, 5%CO2インキュベーターにて2日間培養後、Culture Medium (Y50013, タカラバイオ)に培地交換した。さらに1日培養後、OptiMEM (31985062, GIBCO)に懸濁した1μMの実施例化合物（Dp116-13、Dp116-13a、及び、Dp116-13e）とOptiMEMに懸濁した5% Lipofectamine 2000 (52887, Invitrogen)を1:1で混合して20分間インキュベーションした溶液を１ウェルあたり10μL添加することでトランスフェクトした。なお、実施例化合物を含まないLipofectamine 2000のみの溶液を添加したものを陰性対照とし、Dp116発現プラスミドを添加したものを陽性対照とした。3日間培養後(Day6)、細胞をPBS (10010023, GIBCO)にて2回洗浄し、125 mM Tris-HCl (pH6.8), 4% SDS, 4M ureaにプロテアーゼインヒビター (P8340, SIGMA)を添加したlysis bufferを1ウェルあたり50μL添加することで細胞を溶解してlysateとした。
Laemmli sample buffer (1610737, Bio-Rad)に100 mM DTTを添加したサンプルバッファーとlysateを1:1のvolumeで混合し、95℃で5分間加熱処理した。このサンプルを1wellあたり10μLずつ4-20% Criterion TGXプレキャストゲル (5671095, Bio-Rad)にアプライし、150Vで60分間電気泳動した。泳動後、iBlot2 dry blotting system(Thermo Scientific) を用いてゲル上の蛋白質をPVDF膜へ転写した。StartingBlock (TBS) Blocking Buffer (37579, Thermo Scientific)を用いてBlocking後、Can Get Signal Immunoreaction Enhancer solution 1 (NKB-101, TOYOBO)で1000倍希釈した抗dystrophin抗体(ab15277, abcam)と4℃で一晩反応させた。PVDF膜をTBS-T (9997S, CST) にて洗浄後、Can Get Signal solution 2で20000倍希釈したAnti-rabbit IgG, HRP-linked whole Ab Donkey (NA-934-1mL, GE Healthcare)を室温で1時間反応させた。PVDF膜をTBS-Tで洗浄後、Luminata Forte Western HRP基質 (WBLUF0500, Merck-Millipore)を1分間反応させて、化学発光するバンドをImageQuant LAS4000 (GE Healthcare) にて検出した。ローディングコントロールのβ-actinは、Dp116検出後のPVDF膜をRestore PLUS Western Blot Stripping Buffer (46430, Thermo Scientific) に室温で15分間浸してストリッピングを行った後、Can Get Signal Immunoreaction Enhancer solution 1 で1000倍希釈した抗β-actin抗体 (4970S, CST)およびCan Get Signal solution 2で20000倍希釈したAnti-rabbit IgG, HRP-linked whole Ab Donkeyを室温で各1時間反応させ、Luminata Forte Western HRP基質を用いて化学発光するバンドをImageQuant LAS4000にて検出した。
Dp116およびβ-actinのバンドは、ImageQuant TLソフトウェアーを用いて、各バンドの平均バンド発光強度からバックグラウンドの発光強度を引いた値を算出した。ロード量の補正のため、Dp116のバンド強度をβ-actinのバンドで除した値をグラフ化した（図４）。
Dp116タンパク質のバンド強度は、陽性対照のDp116プラスミドをトランスフェクトした細胞では上昇していた。一方、実施例化合物（Dp116-13、Dp116-13a、及び、Dp116-13e）をトランスフェクトした細胞ではバンド強度がコントロールと比較して低下しており、Dp116タンパク質の発現量が減少した。特にDp116-13はコントロールと比較して約30%程度にDp116タンパク質の発現量を減少させた。【００７１】
（試験例３）  実施例化合物によるU251細胞でのDp116発現抑制
実施例化合物であるDp116-13、Dp116-13a乃至Dp116-13hを試験例１と同様の方法で評価した。その結果、Dp116-13、Dp116-13a乃至Dp116-13hはコントロールと比較してDp116  mRNA量を約20%以下に低下させた（図５）。特にDp116-13a, -13b, -13c, -13g及び-13hはコントロールと比較して約10%程度またはそれ以下にDp116  mRNA量を低下させた。【００７２】
（試験例４）  実施例化合物によるU251細胞でのDp116発現抑制
実施例化合物であるDp116-13a.1乃至Dp116-13a.8を試験例１と同様の方法で評価した。その結果、Dp116-13a.1乃至Dp116-13a.8はDp116  mRNA量をコントロールと比較して低下させた（図６）。特に、Dp116-13a.1、Dp116-13a.3乃至Dp116-13a.5はコントロールと比較して約20%程度またはそれ以下にDp116  mRNA量をDp116  mRNA量を低下させた。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明は、心機能障害の予防及び／又は治療に利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【００７４】
＜配列番号１〜５９＞アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列を示す。アンチセンスオリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチドは、天然型DNA、天然型RNA、DNA/RNAのキメラ、これらの修飾体のいずれであってもよいが、少なくとも１つが修飾ヌクレオチドであってもよい。
＜配列番号６０〜６３＞プライマーの配列を示す。
＜配列番号６４＞アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列を示す。アンチセンスオリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチドは、天然型DNA、天然型RNA、DNA/RNAのキメラ、これらの修飾体のいずれであってもよいが、少なくとも１つが修飾ヌクレオチドであってもよい。
【図１】
2019240164.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
2019240164000001.app
【国際調査報告】
2019240164.tif 000014
2019240164.tif 000015
2019240164.tif 000016