(57)【要約】  本発明は、抗原結合タンパク質と蛍光タンパク質または蛍光標識されるタグタンパク質との融合タンパク質を提供する。  本発明によれば、抗原結合タンパク質と蛍光タンパク質または蛍光標識されるタグとの融合タンパク質であって、抗原結合タンパク質は、末端にヘリックス構造またはβシート構造を有する抗原結合タンパク質であり、蛍光タンパク質または蛍光標識されるタグは、末端にヘリックス構造またはβシート構造を有する蛍光タンパク質または蛍光標識されるタグであり、当該末端のヘリックスと末端のヘリックスとが連結されている、または当該末端のβシート構造と末端のβシート構造とが連結されている、融合タンパク質などが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原結合タンパク質と蛍光タンパク質または蛍光標識されるタグとの融合タンパク質であって、
抗原結合タンパク質は、末端にヘリックス構造またはβシート構造を有する抗原結合タンパク質であり、
蛍光タンパク質または蛍光標識されるタグは、末端にヘリックス構造またはβシート構造を有する蛍光タンパク質または蛍光標識されるタグであり、
当該末端のヘリックスと末端のヘリックスとが連結されている、または
当該末端のβシート構造と末端のβシート構造とが連結されている、
融合タンパク質。
【請求項２】
抗原結合タンパク質が、Ｎ末端にヘリックス構造を有し、
蛍光タンパク質または蛍光標識されるタグが、Ｃ末端にヘリックス構造を有し、
抗原結合タンパク質の末端のヘリックスと蛍光タンパク質または蛍光標識されるタグの末端のヘリックスとが連結されている、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
抗原結合タンパク質が、アフィマーである、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
蛍光タンパク質が、ＧＦＰ及びＧＦＰ様のβバレル構造を有する蛍光タンパク質と点変異体の円順列変異体から選択されるＣ末端にヘリックス構造を有する蛍光タンパク質である、請求項２または３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
抗原結合タンパク質が、Ｃ末端にβシート構造を有し、
蛍光タンパク質が、Ｎ末端にβシート構造を有し、
当該Ｃ末端のβシート構造とＮ末端のβシート構造とが連結されている、
請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
抗原結合タンパク質が、ナノボディまたはｓｃＦｖである、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
蛍光タンパク質が、ＧＦＰ及びＧＦＰ様のβバレル構造を有する蛍光タンパク質および点変異体、並びにこれらの円順列変異体および欠失変異体からなる群から選択される、Ｎ末端にβシート構造を有する蛍光タンパク質である、請求項５または６に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
蛍光標識されるタグが、Ｃ末端にヘリックス構造を有する配列番号９または２９に記載されるアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するハロアルカンデハロゲナーゼの脱ハロゲン化ドメインである、請求項２または３に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
蛍光タンパク質が、Ｃ末端にヘリックス構造を有するフィトクロム系もしくはシアノバクテリオクロム系の近赤外蛍光タンパク質である、請求項２または３に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む、組成物。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項１２】
請求項１１の核酸を含み、前記核酸は、制御配列に作動可能に連結したものである、細胞内で融合タンパク質を発現させることに用いるための遺伝子発現ベクター、または当該ベクターで形質転換された細胞、もしくはｍＲＮＡを導入された細胞。
【請求項１３】
抗原の観察方法であって、
請求項１〜９のいずれか一項に記載の融合タンパク質と結合した抗原を観察することを含む、方法。
【請求項１４】
抗原が、水溶液内または細胞内もしくは細胞表面の抗原である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載の方法であって、
請求項１〜９のいずれか一項に記載の融合タンパク質である第一の融合タンパク質と結合した第一の抗原と、
請求項１〜９のいずれか一項に記載の融合タンパク質である第二の融合タンパク質｛但し、第一の融合タンパク質と第二の融合タンパク質の蛍光波長は異なる｝と結合した第二の抗原と
のそれぞれを観察することを含む、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、
第一の融合タンパク質および第二の融合タンパク質の蛍光相関分光、蛍光相互相関分光を実施することを含む、方法。
【請求項１７】
蛍光相関分光、および蛍光相互相関分光が、偏光蛍光相関分光である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
融合タンパク質のアミノ酸配列を設計する方法であって、
抗原結合タンパク質のアミノ酸配列である第一のアミノ酸配列と蛍光タンパク質のアミノ酸配列である第二のアミノ酸配列を用意することと、ここで、第一のアミノ酸配列のＮ末端および第二のアミノ酸配列のＣ末端、または、第一のアミノ酸配列のＣ末端および第二のアミノ酸配列のＮ末端が、共にヘリックス構造であるか、共にβシート構造であるか、Ｎ末端またはＣ末端の一部を切除することで共にヘリックス構造となるものであるか、Ｎ末端またはＣ末端の一部を切除することで共にβシート構造となるものであり、
第一のアミノ酸配列のＮ末端および第二のアミノ酸配列のＣ末端、または、第一のアミノ酸配列のＣ末端および第二のアミノ酸配列のＮ末端を連結し、これによって、連結箇所がヘリックス構造またはβシート構造の一部となるアミノ酸配列を得ることとを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原結合タンパク質と蛍光タンパク質または蛍光標識されるタグタンパク質との融合タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の可視化のために蛍光タンパク質または蛍光標識されるタグタンパク質を標的タンパク質に連結させる技術が開発されている。これらの技術は、標的タンパク質の局在を蛍光顕微鏡下で観察することに用いられる。【０００３】
蛍光は、偏光を有することが知られている。例えば、緑色蛍光タンパク質であるＧＦＰが偏光を有することが開示されている（非特許文献１）。また、ＧＦＰをセプチンというタンパク質に連結させてセプチンの偏光を観察した事例が開示されている（非特許文献２）。非特許文献２では、出芽酵母の細胞分裂面におけるセプチン繊維の配向が時間と共に変化することが、その偏光を観察することで初めて明らかになった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ，  ９９：  ４２７２−４２７７，  ２００２
【非特許文献２】Ｖｒａｂｉｏｉｕ  ａｎｄ  Ｍｉｔｃｈｉｓｏｎ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２８，  ４６６−４６９，  ２００６
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、抗原結合タンパク質と蛍光タンパク質または蛍光標識されるタグタンパク質との融合タンパク質を提供する。
【０００６】
本発明者らは、抗原結合タンパク質と蛍光タンパク質または蛍光標識されるタグタンパク質との融合タンパク質において、２つのタンパク質のヘリックス同士を連結させた融合タンパク質、およびβシート同士を連結させた融合タンパク質を多数得た。本発明者らは、得られた融合タンパク質が抗原への結合性を保持し、かつ蛍光の観察に適していることを見出した。本発明者らはまた、得られた融合タンパク質は、蛍光偏光の観察に適していることを見出した。
【０００７】
すなわち、本発明によれば、以下の産業上利用可能な発明が提供される。
（１）抗原結合タンパク質と蛍光タンパク質または蛍光標識されるタグとの融合タンパク質であって、
抗原結合タンパク質は、末端にヘリックス構造またはβシート構造を有する抗原結合タンパク質であり、
蛍光タンパク質または蛍光標識されるタグは、末端にヘリックス構造またはβシート構造を有する蛍光タンパク質または蛍光標識されるタグであり、
当該末端のヘリックスと末端のヘリックスとが連結されている、または
当該末端のβシート構造と末端のβシート構造とが連結されている、
融合タンパク質。
（２）抗原結合タンパク質が、Ｎ末端にヘリックス構造を有し、
蛍光タンパク質または蛍光標識されるタグが、Ｃ末端にヘリックス構造を有し、
抗原結合タンパク質の末端のヘリックスと蛍光タンパク質または蛍光標識されるタグの末端のヘリックスとが連結されている、上記（１）に記載の融合タンパク質。
（３）抗原結合タンパク質が、アフィマーである、上記（２）に記載の融合タンパク質。
（４）蛍光タンパク質が、ＧＦＰ及びＧＦＰ様のβバレル構造を有する蛍光タンパク質と点変異体の円順列変異体から選択されるＣ末端にヘリックス構造を有する蛍光タンパク質である、上記（２）または（３）に記載の融合タンパク質。
（５）抗原結合タンパク質が、Ｃ末端にβシート構造を有し、
蛍光タンパク質が、Ｎ末端にβシート構造を有し、
当該Ｃ末端のβシート構造とＮ末端のβシート構造とが連結されている、
上記（１）に記載の融合タンパク質。
（６）抗原結合タンパク質が、ナノボディまたはｓｃＦｖである、上記（５）に記載の融合タンパク質。
（７）蛍光タンパク質が、ＧＦＰ及びＧＦＰ様のβバレル構造を有する蛍光タンパク質および点変異体、並びにこれらの円順列変異体および欠失変異体からなる群から選択される、Ｎ末端にβシート構造を有する蛍光タンパク質である、上記（５）または（６）に記載の融合タンパク質。
（８）蛍光標識されるタグが、Ｃ末端にヘリックス構造を有する配列番号９または２９に記載されるアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するハロアルカンデハロゲナーゼの脱ハロゲン化ドメインである、上記（２）または（３）のいずれかに記載の融合タンパク質。
（９）蛍光タンパク質が、Ｃ末端にヘリックス構造を有するフィトクロム系もしくはシアノバクテリオクロム系の近赤外蛍光タンパク質である、上記（２）または（３）に記載の融合タンパク質。
（１０）上記（１）〜（９）のいずれかに記載の融合タンパク質を含む、組成物。
（１１）上記（１）〜（９）のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする核酸。
（１２）上記（１１）に記載の核酸を含み、前記核酸は、制御配列に作動可能に連結したものである、細胞内で融合タンパク質を発現させることに用いるための遺伝子発現ベクター、または当該ベクターで形質転換された細胞、もしくはｍＲＮＡを導入された細胞。
（１３）抗原の観察方法であって、
上記（１）〜（９）のいずれかに記載の融合タンパク質と結合した抗原を観察することを含む、方法。
（１４）抗原が、水溶液内または細胞内、もしくは細胞表面の抗原である、上記（１３）に記載の方法。
（１５）上記（１３）または（１４）に記載の方法であって、
上記（１）〜（９）のいずれかに記載の融合タンパク質である第一の融合タンパク質と結合した第一の抗原と、
上記（１）〜（９）のいずれかに記載の融合タンパク質である第二の融合タンパク質｛但し、第一の融合タンパク質と第二の融合タンパク質の蛍光波長は異なる｝と結合した第二の抗原と
のそれぞれを観察することを含む、方法。
（１６）上記（１５）に記載の方法であって、
第一の融合タンパク質および第二の融合タンパク質の蛍光相関分光、及び蛍光相互相関分光を実施することを含む、方法。
（１７）蛍光相関分光、及び蛍光相互相関分光が、偏光蛍光相関分光である、上記（１６）に記載の方法。
（１８）融合タンパク質のアミノ酸配列を設計する方法であって、
抗原結合タンパク質のアミノ酸配列である第一のアミノ酸配列と蛍光タンパク質のアミノ酸配列である第二のアミノ酸配列を用意することと、ここで、第一のアミノ酸配列のＮ末端および第二のアミノ酸配列のＣ末端、または、第一のアミノ酸配列のＣ末端および第二のアミノ酸配列のＮ末端が、共にヘリックス構造であるか、共にβシート構造であるか、Ｎ末端またはＣ末端の一部を切除することで共にヘリックス構造となるものであるか、Ｎ末端またはＣ末端の一部を切除することで共にβシート構造となるものであり、
第一のアミノ酸配列のＮ末端および第二のアミノ酸配列のＣ末端、または、第一のアミノ酸配列のＣ末端および第二のアミノ酸配列のＮ末端を連結し、これによって、連結箇所がヘリックス構造またはβシート構造の一部となるアミノ酸配列を得ることとを含む、方法。
（１８Ａ）得られたアミノ酸配列をコードする核酸を得ることを含む、上記（１８）に記載の方法。
（１８Ｂ）プロモーターに作動可能に上記（１８Ａ）において得られた核酸を連結することを含む、当該核酸を発現させるための遺伝子発現ベクターを製造する方法。
（１８Ｃ）上記（１８）に記載の方法によって得られるアミノ酸配列。
（１８Ｄ）上記（１８Ａ）に記載の方法によって得られる核酸。
（１８Ｅ）上記（１８Ｂ）に記載の方法によって得られる遺伝子発現ベクター。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明の融合タンパク質における２つのタンパク質の連結方法（ヘリックス同士の連結方法）を図解するものである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、それぞれのタンパク質の結晶構造から推定して得たｃｐ−ｓｆＧＦＰとアフィマーとの融合タンパク質の立体構造モデルを示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ｃｐ−ｓｆＧＦＰとアフィマーとの融合タンパク質の結晶構造解析結果を示す。
【図２】図２は、蛍光タンパク質がｃｐ−ｓｆＧＦＰであり、アフィマーがアクチンに結合するアフィマーである本発明の融合タンパク質を発現した細胞を蛍光偏光顕微鏡下で観察した結果を示す。
【図３】図３は、蛍光タンパク質がｃｐｍＶｅｎｕｓであり、アフィマーがアクチンに結合するアフィマーである本発明の融合タンパク質を発現した細胞を蛍光偏光顕微鏡下で観察した結果を示す。
【図４】図４は、蛍光タンパク質がｃｐｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２であり、アフィマーがアクチンに結合するアフィマーである本発明の融合タンパク質を発現した細胞を蛍光偏光顕微鏡下で観察した結果を示す。
【図５】図５は、蛍光標識されるタグがハロタグであり、アフィマーがアクチンに結合するアフィマーである本発明の融合タンパク質の連結方法を図解するものである。
【図６Ａ】図６Ａは、ハロタグとアクチンに対するアフィマーとの融合タンパク質の立体構造モデルと、この融合タンパク質を発現する細胞を蛍光偏光顕微鏡下で観察した結果を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ハロタグとアクチンに対するアフィマーとの融合タンパク質の立体構造モデルと、この融合タンパク質を発現する細胞を蛍光偏光顕微鏡下で観察した結果を示す。図６Ａとは、連結箇所のヘリックスの巻き数が異なる。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ハロタグとアクチンに対するアフィマーとの融合タンパク質の立体構造モデルと、この融合タンパク質を発現する細胞を蛍光偏光顕微鏡下で観察した結果を示す。図６Ａおよび図６Ｂとは、連結箇所のヘリックスの巻き数が異なる。
【図７Ａ】図７Ａは、ｃｐ−ｓｆＧＦＰとナノボディとの融合タンパク質の連結方法を図解するものである。
【図７Ｂ】図７Ｂは、図７Ａの連結方法で連結したｃｐ−ｓｆＧＦＰとビメンチンに結合するナノボディとの融合タンパク質を発現する細胞を蛍光偏光顕微鏡下で観察した結果を示す。
【図７Ｃ】図７Ｃは、図７Ａと同様の連結方法で連結した、ビメンチンに結合するナノボディとｃｐ１７６−１７２ｍＶｅｎｕｓとの融合タンパク質を発現する細胞を蛍光偏光顕微鏡下で観察した結果を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、ｍＡｐｐｌｅとナノボディとの融合タンパク質の連結方法を図解するものである。
【図８Ｂ】図８Ｂは、図８Ａの連結方法で連結したｍＡｐｐｌｅとビメンチンに結合するナノボディとの融合タンパク質を発現する細胞を蛍光偏光顕微鏡下で観察した結果を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、ｃｐ−ｓｆＧＦＰとｓｃＦｖとの融合タンパク質の連結方法を図解するものである。
【図９Ｂ】図９Ｂは、図９Ａの連結方法で連結したｃｐ−ｓｆＧＦＰと非筋ミオシンＩＩＡに結合するｓｃＦｖとの融合タンパク質を発現する細胞を蛍光偏光顕微鏡下で観察した結果を示す。
【図９Ｃ】図９Ｃは、図７Ｃと同じ連結方法で連結した、ミオシンに結合するｓｃＦｖとｃｐ１７６−１７２ｍＶｅｎｕｓとの融合タンパク質を発現する細胞を蛍光偏光顕微鏡下で観察した結果を示す。
【図１０】図１０は、表１に記載のユトロフィンのアクチン結合部位とｍＥＧＦＰとの融合タンパク質（配列番号３５）の立体構造モデルと、当該融合タンパク質を発現する細胞を蛍光偏光顕微鏡下で観察した結果を示す。
【図１１】図１１は、アクチンに結合するアフィマーとｍＳｃａｒｌｅｔとの融合タンパク質の３次元構造モデルと、当該融合タンパク質を用いて細胞を蛍光偏光顕微鏡下で観察した結果を示す。
【図１２】図１２は、アクチンに結合するアフィマーとｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎとの融合タンパク質の３次元構造モデルと、当該融合タンパク質を用いて細胞を蛍光偏光顕微鏡下で観察した結果を示す。
【図１３】図１３は、ＡＬＦＡタグに結合するナノボディとｃｐ１７６−１７２ｍＶｅｎｕｓとの融合タンパク質の３次元構造モデルと、当該融合タンパク質と、アフィマーとＡＬＦＡタグとの融合タンパク質（すなわち、アクチンに結合するアフィマーのＮ末端のアルファヘリックスを削り、アルファへリックスを連続させる形でＡＬＦＡタグ配列をつないだ融合タンパク質）を共発現させた細胞を蛍光偏光顕微鏡下で観察した結果を示す。
【図１４】図１４は、ＡＬＦＡタグを連結させたアクチンに結合するアフィマーの３次元構造モデルを示す。図中、ＡＬＦＡタグは、暗いグレーで示され、アフィマーは、明るいグレーで示されている。
【発明の詳細の説明】
【０００９】
本明細書では、「抗原結合タンパク質」とは、ある特定の物質に結合するタンパク質を意味する。抗原結合タンパク質は、改変されたタンパク質もしくは非天然のタンパク質またはその抗原結合性断片であり得る。抗原結合タンパク質としては、アミノ酸配列を改変することによって抗原に対する結合親和性を付与でき、かつ、Ｎ末端もしくはＣ末端のβシート構造またはヘリックス構造を有するタンパク質（例えば、スキャフォルドタンパク質）である限り特に限定されないが例えば、抗体、抗体の抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ）、ラクダやラマの重鎖抗体の単鎖可変ドメイン（ＶＨＨドメイン）（例えば、ナノボディ（商標））、細菌のアルブミン結合ドメインを基本骨格とするスキャフォルドタンパク質（例えば、ＡＢＤ（商標））、ヒトフィブロネクチンの１０番目のドメインを基本骨格とするスキャフォルドタンパク質（例えば、アドネクチン（Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）、ＦｉｎｇＲ（商標）またはモノボディ（商標）））、ブドウ球菌タンパク質ＡのＺドメインを基本骨格とするスキャフォルドタンパク質（例えば、アフィボディー（Ａｆｆｉｂｏｄｙ（商標）））、ヒトγ−Ｂ−クリスタリンを基本骨格とするスキャフォルドタンパク質（例えば、アフィリン（Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）））、古細菌のＤＮＡ結合タンパク質Ｓａｃ７ｄを基本骨格とするスキャフォルドタンパク質（例えば、アフィチン（Ａｆｆｉｔｉｎ（商標）））、三重逆平行ヘリックスを基本骨格とするスキャフォルドタンパク質（例えば、アルファボディ（Ａｌｐｈａｂｏｄｙ（商標）））、ヒトまたは昆虫のリポカリンを基本骨格とするスキャフォルドタンパク質（例えば、アンチカリン（Ａｎｔｉｃａｌｉｎ（商標）））、アルマジロタンパク質を基本骨格とするスキャフォルドタンパク質（例えば、アルマジロリピートタンパク質）、ヒトＣ型レクチンドメインＣＴＬＤ３を基本骨格とするスキャフォルドタンパク質（例えば、アトリマー（Ａｔｒｉｍｅｒ（商標）））、重合化ＬＤＬＲ−Ａモジュールを基本骨格とするスキャフォルドタンパク質（例えば、アビマー（Ａｖｉｍｅｒ（商標）））、ヒトテネイシンＣのＦｎ３ドメインを基本骨格とするスキャフォルドタンパク質（例えば、センチリン（Ｃｅｎｔｙｒｉｎ（商標）））、ヒトＦｙｎチロシンキナーゼのＳＨ３ドメインを基本骨格とするスキャフォルドタンパク質（例えば、フィノマー（Ｆｙｎｏｍｅｒ（商標）））、ヒトＢＰＴＩ／ＬＡＣＩ−Ｄ１／ＩＴＩ−Ｄ２／ＡＰＰＩを基本骨格とするスキャフォルドタンパク質（例えば、クニッツドメイン（ｋｎｉｔｚ  ｄｏｍａｉｎ（商標）））、バイロバキュラム・エロフィルムのアスパルチルｔＲＮＡ合成酵素のＯＢ形状を基本骨格とするスキャフォルドタンパク質（例えば、オーボディー（Ｏｂｏｄｙ（商標）））、ヒトフィブロネクチンＩＩＩの１４番目の細胞外ドメインを基本骨格とするスキャフォルドタンパク質（例えば、プロネクチン（Ｐｒｏｎｅｃｔｉｎ（商標）））、無顎類の可変リンパ球受容体のロイシンリッチリピートモジュールを基本骨格とするスキャフォルドタンパク質（例えば、レペボディ（Ｒｅｐｅｂｏｄｙ（商標）））、ヒトアンキリンリピートタンパク質を基本骨格とするスキャフォルドタンパク質（例えば、ＤＡＲＰｉｎ（商標））及びステフィンＡまたはシスタチンを基本骨格とするスキャフォルドタンパク質（例えば、アフィマー（商標））が挙げられ（Ｓｋｒｌｅｃ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  ３３，  Ｎｏ．  ７：  ４０８−４１８，  ２０１５）、これらのタンパク質のＮ末端もしくはＣ末端のβシート構造またはヘリックス構造が本発明の融合タンパク質における連結に用いられ得る。上記のスキャフォルドタンパク質において、抗原への結合親和性に関与するアミノ酸の存在部位は、周知であり、当該部位のアミノ酸に関して、リボソームディスプレイやファージディスプレイによって抗原への結合に適したものを選択することによって、所望の抗原結合特性を有するスキャフォルドタンパク質を得ることができる。その他、抗原結合タンパク質としては、Ｎ末端またはＣ末端にヘリックスまたはβシートを有する抗原結合タンパク質は、本発明において蛍光タンパク質との融合タンパク質において用いることができる。スキャフォルドタンパク質とは、パラトープを保持する（特にその立体形状を保持する）機能を有する、親タンパク質（改変前のタンパク質）と３次構造において類似した骨格を有するタンパク質をいう。基本骨格とは、スキャフォルドタンパク質において、意図された改変部位（例えば、パラトープ）以外の部分を意味する。パラトープとは、抗原結合タンパク質において、抗原と結合する部分を意味する。
【００１０】
本明細書では、「蛍光タンパク質」とは、短波長の電磁波を照射することによって、そのエネルギーを吸収して電子が励起し、これが基底状態に戻る際に、より長波長の電磁波を放出するタンパク質をいう。蛍光タンパク質には、可視光を放出する蛍光タンパク質、および近赤外光を放出する近赤外蛍光タンパク質が挙げられる。蛍光偏光観察に適する蛍光タンパク質は、蛍光偏光観察に好ましく用いられ得る。蛍光偏光観察に適する蛍光タンパク質および蛍光偏光観察に適さない蛍光タンパク質は、単なる蛍光観察に用いられ得る。
【００１１】
本明細書では、「アフィマー」（Ａｆｆｉｍｅｒ）とは、生物学的に不活性であり、物理的に安定なステフィンＡまたはシスタチンの改変体を基本骨格として有するタンパク質であり、当該基本骨格が有する４本のβシート構造から同一側に提示される２つのループに抗原結合部位を有するタンパク質である。前記ループ部分のアミノ酸配列に多様性を持たせることができる。そして、前記ループ部分のアミノ酸配列に多様性を持たせることによって、様々な抗原に対する結合性を有するアフィマーを取得することがファージディスプレイによって可能となっている。アフィマーの基本骨格としては、例えば、ＷＯ２００９／１３６１８２において開示された配列番号１に対応するアミノ酸配列を有するステフィンＡの改変体を用いることができ、ステフィンＡの４番目のグリシンがアルギニンで置換されていてもよいステフィンＡの改変体は当該基本骨格が有する４本のβシート構造から同一側に提示される２つのループ（例えば、ステフィンＡの４６〜５４番目のアミノ酸部位および６７〜８４番目のアミノ酸部位）に異種アミノ酸配列を有するタンパク質である。アフィマーは、Ｎ末端にαヘリックス構造を有する。アフィマーはまた、植物由来のシスタチンを基本骨格として有するタンパク質であり得、当該基本骨格が有する４本のβシート構造から同一側に提示される２つのループに抗原結合部位を有するタンパク質である場合もある。シスタチンを基本骨格とするアフィマーとしては、例えば、ＷＯ２０１４／１２５２９０において開示された配列番号１〜６のいずれか１つの配列が挙げられる。アフィマーの分子量は、約１２〜１４ｋＤａであり得る。
【００１２】
本発明では、「ナノボディ」とは、抗体が重鎖と軽鎖とからなるのに対して、ある種の動物において発見された重鎖のみからなる抗体の可変領域ドメインに基づく抗原結合タンパク質である。この重鎖のみからなる抗体は、ヒトコブラクダ、フタコブラクダ、ラマ、およびアルパカに共通して見られる抗体であり、上記重鎖の可変領域ドメインのみで抗原に結合することができる。近年では、軟骨魚類（サメ等）においても類似した重鎖のみからなる抗体が発見されている。ナノボディは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を有し、この３つのＣＤＲで抗原と結合する。ナノボディは、上記の重鎖のみからなる抗体を産生する動物を抗原で免疫し、免疫された動物からＢ細胞を単離し、可変領域を含むｃＤＮＡライブラリを得て、Ｍ１３ファージを用いたファージディスプレイライブラリに組み込み、抗原でスクリーニングすることによって得ることができる。ナノボディは、Ｎ末端およびＣ末端に、本発明で蛍光物質を接続できるβシート構造を有する。本発明では、ナノボディのＮ末端および／またはＣ末端のβシート構造、例えば、Ｃ末端のβシート構造を蛍光タンパク質や蛍光標識されるタグのβシート構造と連結させることができる。
【００１３】
本明細書では、「ｓｃＦｖ」は、抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）とをフレキシブルなペプチドリンカーで連結した単鎖の抗原結合タンパク質である。重鎖可変領域と軽鎖可変領域とで抗原認識をすることによって元となる抗体の抗原特異性を保持しながら、重鎖可変領域と軽鎖可変領域との会合を促進するためにフレキシブルなリンカーによって両者を接続したものである。フレキシブルなリンカーは、ｓｃＦｖと抗原との会合状態等に応じて自由に構造を変化させることができるものが用いられ、例えば、約１５アミノ酸のグリシンリッチな配列（例えば、親水性を確保するためにセリンが挿入されることがある）が好ましく用いられ得る。フレキシブルなリンカーとしては、例えば、−（ＧＧＧＧＳ）３−のアミノ酸配列を有するリンカーが用いられ得る。ｓｃＦｖは、フレームワーク配列を有するｓｃＦｖ（例えば、ヒトなどの哺乳動物のフレームワーク配列）の抗原結合部位をランダム化したファージライブラリーから所望の抗原結合性を有することを指標として選択して得ることができる。ｓｃＦｖは、Ｎ末端およびＣ末端に本発明で蛍光物質を接続できるβシート構造を有する。本発明では、ｓｃＦｖのＮ末端および／またはＣ末端のβシート構造、例えば、Ｃ末端のβシート構造を蛍光タンパク質や蛍光標識されるタグのβシート構造と連結させることができる。
【００１４】
本明細書では、「ＤＡＲＰｉｎ」とは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｒｔｎｅｒｓ  ＡＧ社が開発した抗原結合タンパク質である。ＤＡＲＰｉｎは、アンキリン反復単位（通常、２〜３０個程度）を有する人工タンパク質であって、各反復単位は骨格残基および標的相互作用残基を含む（例えば、ＷＯ２００２／０２０５６５参照）。アンキリン反復単位は、２つの逆平行αヘリックスとそれに続くβヘアピン｛ここでβペアピンは次の反復単位に結合するループを有する｝からなる共通の折りたたみ構造を有する。アンキリン反復単位が積み重なることで、ＤＡＲＰｉｎは、湾曲した構造を形成する。標的相互作用残基は、アンキリン反復単位のβヘアピンおよび第一のαヘリックスの露出した部分に存在し得る。ＤＡＲＰｉｎは、抗原に対する結合性に基づいて選択することにより得ることができる。ＤＡＲＰｉｎは、例えば、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、プラスミドディスプレイなどの方法を用いて得ることができる。ＤＡＲＰｉｎは、末端にαヘリックスおよび他端にβシートを有し、本願発明で、蛍光物質を接続する部位を提供する。
【００１５】
本明細書では、「モノボディ」とは、ＦｉｎｇＲまたはアドネクチン（Ａｄｎｅｃｔｉｎ）とも呼ばれ、ヒトフィブロネクチンの１０番目のドメイン（フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン）を基本骨格とするスキャフォルドタンパク質である。このドメインは、抗体の可変ドメインと同様の構造を有し、すなわち、βサンドイッチを形成する７本のβシート構造と３つの相補性決定領域に対応する３つのループを両側に有する。抗原への結合特異性は、２本目と３本目のβシートの間のループＢＣ、４本目と５本目のβシートの間のループＤＥ、および６本目と７本目のβシートの間のループＦＧのアミノ酸配列によって改変し得る。あるいは、３本目と４本目のβシートの間のループＣＤおよび６本目と７本目のβシートの間のループＦＧに加えて３本目、４本目、６本目および７本目のβシートへのアミノ酸配列によって改変し得る。モノボディは、Ｎ末端およびＣ末端にβシートを有し、蛍光物質を接続する部位を提供し得る。
【００１６】
本明細書では、「あるアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する」とは、当該アミノ酸配列に加えて、そのアミノ酸配列に対応する同じ機能を保持したアミノ酸配列を有するものを包含する意味で用いられる。例えば、種間で配列が異なる場合、特定の種のアミノ酸配列だけでなく、近縁の種における同じ機能を保持したアミノ酸配列は、前記特定の種のアミノ酸配列を類似性の高いアミノ酸配列を有する。「あるアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する」とは、このようなそのアミノ酸配列に対応する同じ機能を保持したアミノ酸配列を有することを意味し得るものである。例えば、タンパク質では、当該あるアミノ酸配列を有するタンパク質とオーソログの関係を有する他の種のタンパク質を意味し得る。
【００１７】
本発明では、蛍光タンパク質が有するＣ末端のヘリックス構造（例えば、αヘリックス、３／１０ヘリックス）とアフィマーが有するＮ末端のヘリックス構造を連結することができる。連結された２つのヘリックスは、一つの大きなヘリックス構造を形成し得るが、本発明の融合タンパク質は、このようにして連結された蛍光タンパク質とアフィマーとの融合タンパク質を提供し得る。連結は、ヘリックス構造同士を直接的に結合することによって行ってもよいし、またはリンカーを介して行ってもよい。リンカーとしては、例えば、ヘリックス構造を有するリンカー（ヘリックスリンカー）を用いることができる。ヘリックス構造同士を連結させる場合には、ヘリックス構造の長さ、および／またはヘリックスリンカーの長さを調整することによって、蛍光タンパク質と抗原結合性タンパク質との結合角を調整することが可能となる。ヘリックスリンカーとしては、特に限定されないが例えば、配列番号３、１０、１２、１４、および２３のいずれかに記載のアミノ酸配列を有しうる。
【００１８】
本発明では、蛍光タンパク質が有するＮ末端のβシート構造とナノボディまたはｓｃＦｖがＣ末端に有するβシート構造を連結することができる。連結された２つのβシートは、１つの大きなβシート構造を形成し得るが、本発明の融合タンパク質は、このようにして連結された蛍光タンパク質とナノボディまたはｓｃＦｖとの融合タンパク質を提供する。連結は、β−シート同士を直接的に結合することによって行ってもよいし、またはリンカーを介して行ってもよい。リンカーとしては、例えば、βシート構造を有するリンカーを用いるか、または１もしくは２〜数個のバリン（Ｖ）などの構造的にフレキシブルではないアミノ酸をリンカーとして用いることができる。
【００１９】
Ｃ末端にヘリックス構造を有する蛍光タンパク質としては、ＧＦＰの円順列変異体（ｃｐＧＦＰ）が用いられ得る。ＧＦＰの改変体蛍光タンパク質が各種知られている。円順列変異体蛍光タンパク質とは、タンパク質のＮ末端とＣ末端をリンカーを介してまたは介さずに連結し、他の適当な部分で２分することによって、Ｎ末端とＣ末端の配列の位置を変更させた変異体である。円順列変異体は、Ｎ末端およびＣ末端が立体構造上で近傍に位置していることが重要な条件となり得るが、多くの蛍光タンパク質がこの条件を満たし、円順列変異体による蛍光タンパク質の改変は、標準的な蛍光タンパク質の改変技術となっている。本発明では、円順列変異体により、Ｃ末端にヘリックス構造を有する蛍光タンパク質がアフィマーとの融合タンパク質の作製に用いられ得る。本発明ではまた、円順列変異体により、Ｎ末端にβシート構造を有する蛍光タンパク質が、ナノボディまたはｓｃＦｖとの融合タンパク質の作製に用いられ得る。
【００２０】
ＧＦＰの改変体蛍光タンパク質｛より具体的には、例えば、ＧＦＰ及びＧＦＰ様のβバレル構造を有する蛍光タンパク質（すなわち、ＧＦＰ様タンパク質）とその点変異体、もしくはこれらの円順列変異体が挙げられる｝としては例えば、ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ  ＧＦＰ  （ｓｆＧＦＰ）、ＥＧＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ｍＶｅｎｕｓ、ＹＦＰ、ｍＡｐｐｌｅ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＢＦＰ、ＴａｇＢＦＰ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、およびＣｅｒｕｌｅａｎ、ｍＨｏｎｅｙｄｅｗ、ｍＢａｎａｎａ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＰｌｕｍ、ｍＳｃａｒｌｅｔ、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ、ｍＮｅｐｔｕｎｅおよびＮｉｒＦＰなどのＧＦＰ様蛍光タンパク質、並びにこれらの改変体蛍光タンパク質の円順列変異体（例えば、Ｃ末端にヘリックス構造を有する円順列変異体である蛍光タンパク質；タンパク質名の接頭辞として表記“ｃｐ−”を付与することにより、当該タンパク質が円順列変異体であることが明示される）を用いることができる。ＧＦＰの改変体蛍光タンパク質としては、βバレルを構成するβシートの順番を交換した置換体や、βシートの数を減らしたβバレル構造をもつ蛍光タンパク質が多数知られており、これらは本発明の融合タンパク質に用い得る。Ｃ末端にヘリックス構造を有する蛍光タンパク質としては、ｍＴｕｒｑｕｉｏｓｅの円順列変異体（ｃｐｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ）を用いることができる。ｍＴｕｒｑｕｉｏｓｅは、Ｎ末端にヘリックス構造を有するため、円順列変異体であるＣ末端にヘリックス構造を有するｃｐｍＴｕｒｑｕｉｏｓｅを用い得る。ｍＴｕｒｑｕｉｏｓｅとしては、例えば、ｍＴｕｒｑｕｉｏｓｅ−ＤＲ、ｍＴｕｒｑｕｉｏｓｅ−ＧＬ、ｍＴｕｒｑｕｉｏｓｅ−ＧＶ、ｍＴｕｒｑｕｉｏｓｅ−ＲＡ、ｍＴｕｒｑｕｉｏｓｅ２、ｍＴｕｒｑｕｉｏｓｅ２−Ｇ、ｍＴｕｒｑｕｉｏｓｅ−１４６Ｇ、およびｍＴｕｒｑｕｉｏｓｅ−１４６Ｓ、並びにこれらの改変体蛍光タンパク質が知られ、これらからなる群から選択される１以上をＣ末端にヘリックス構造を有する円順列変異体に変換して用いることができる。これらのタンパク質の結晶構造は、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  （ＰＤＢ）において公開されており、これらのタンパク質のＮ末端もしくはＣ末端に存在するβシート構造またはヘリックス構造を、本発明の融合タンパク質の連結のために用いることができる。
本発明で用いられるＣ末端にヘリックス構造を有するｃｐ−ｓｆＧＦＰとしては、Ｃ末端にヘリックス構造を有する限り特に限定されないが、例えば、配列番号１のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するｃｐ−ｓｆＧＦＰを用いることができる。
【００２１】
Ｃ末端にヘリックス構造を有する蛍光タンパク質としては、フィトクロム系の近赤外蛍光タンパク質が挙げられる。フィトクロム系の近赤外蛍光タンパク質としては、ｉＲＦＰおよびｍｉＲＦＰが挙げられる。ｉＲＦＰは、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓのバクテリオフィトクロムＲｐＢｐｈＰ２のＰＡＳドメインおよびＧＡＦドメイン（ＰＡＳ−ＧＡＦ）を含み、ビリベルジンＩＸａを取り込むことで近赤外の蛍光を発し、二量体化に必要なＣ末端のαへリックスを欠き、かつ、Ｓ１３Ｌ、Ａ９２Ｔ、Ｖ１０４Ｉ、Ｖ１１４Ｉ、Ｅ１６１Ｋ、Ｙ１９３Ｋ、Ｆ１９８Ｙ、Ｄ２０２Ｔ、Ｉ２０３Ｖ、Ｙ２５８Ｆ、Ａ２８３Ｖ、Ｋ２８８Ｔ、およびＮ２９０Ｙの変異を有する（Ｆｉｌｏｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２９（８）：  ７５７−７６１，  ２０１１参照）。ｍｉＲＦＰは、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓのバクテリオフィトクロムＲｐＢｐｈＰ１のＰＡＳドメインおよびＧＡＦドメイン（ＰＡＳ−ＧＡＦ）を含み、ビリベルジンＩＸａを取り込むことで近赤外の蛍光を発し、二量体化に必要なＣ末端のαへリックスを欠き、かつ、各種変異を有する（Ｓｈｃｈｅｒｂａｋｏｖａ  ＤＭ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ，  ７，  Ａｒｔｉｃｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ：  １２４０５，  ２０１６参照）。ｍｉＲＦＰとしては、特に限定されないが例えば、ｍｉＲＦＰ６７０  （ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ａｔ  ６４２／６７０  ｎｍ）、ｍｉＲＦＰ７０９  （ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ａｔ  ６８３／７０９  ｎｍ）、およびｍｉＲＦＰ７０３  （ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ａｔ  ６７３／７０３  ｎｍ）、並びにこれらのｍｉＲＦＰから誘導されたｍｉＲＦＰが挙げられる。ｍｉＲＦＰ６７０は、例えば配列番号２２に記載のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有し得る。これらのフィトクロム系の近赤外蛍光タンパク質は、ＧＡＦドメインのＣ末端にヘリックス構造を有し、アフィマーとの融合タンパク質の作製に用いられ得る。また、Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ由来のシアノバクテリオクロムＮｐＲ３７８４のＧＡＦドメインに由来する、ｍｉＲＦＰ、例えばｍｉＲＦＰ６７０ｎａｎｏも本発明の融合タンパク質の作製に用いられ得る。ｍｉＲＦＰ６７０ｎａｎｏとしては、ＮｐＲ３７８４のＧＡＦドメインに、Ｖ７Ｍ，  Ｆ２５Ｃ，  Ｍ２６Ｖ，  Ｙ２７Ｆ，  Ｐ３１Ｅ，  Ｓ４１Ａ，  Ａ４８Ｓ，  Ｎ５１Ｋ，  Ｑ５５Ｒ，  Ｔ５７Ｒ，  Ｉ７２Ｙ，  Ｇ８２Ｎ，  Ｈ８７Ｙ，  Ｎ９９Ｉ，  Ｎ１１７Ｈ，  Ｃ１１９Ｌ，  Ｌ１３６Ｑ，  Ｑ１３９Ｖの１８個の変異を導入したものを用いることができる。ｍｉＲＦＰ６７０ｎａｎｏは、Ｎ末端にヘリックス構造を有し、本発明において蛍光タンパク質との連結に用いることができる。
【００２２】
Ｃ末端にヘリックス構造を有する蛍光標識されるタグタンパク質としては、ロドコッカス属細菌のハロアルカンデハロゲナーゼの脱ハロゲン化ドメインに由来する改変タンパク質が挙げられる。ハロアルカンデハロゲナーゼの脱ハロゲン化ドメインでは、活性中心のＡｓｐ１０６付近にリガンドが挿入されるポケットを有する。このポケットにリガンドが有する基−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２）６−Ｃｌが挿入される。リガンドを蛍光物質とし、これに基−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２）６−Ｃｌを導入することにより、上記タグを付与したタンパク質に蛍光物質が結合することができるようになる。このような目的に用い得るハロアルカンデハロゲナーゼの脱ハロゲン化ドメインとしては、脱ハロゲン化酵素活性を喪失したハロアルカンデハロゲナーゼの脱ハロゲン化ドメインが挙げられ、例えば、活性中心のヒスチジンがフェニルアラニンに変換された活性変異体（Ｈ２７２Ｆ）を用いることができ、例えば、配列番号９または２９に記載のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する脱ハロゲン化ドメインが挙げられる。このハロアルカンデハロゲナーゼの脱ハロゲン化ドメインは、Ｃ末端にαヘリックスを有している。リガンドと当該脱ハロゲン化ドメインとの結合は、偏光観察に適する。本発明では、ハロアルカンデハロゲナーゼの脱ハロゲン化ドメインおよびその活性変異体の蛍光偏光観察における使用が提供され得る。リガンドに用いられ得る蛍光物質としては、クマリン、オレゴングリーン、ｄｉＡｃＦＡＭ、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）、ＳＴＥＬＬＡ  Ｆｌｕｏｒ  ６５０、ＳＴＥＬＬＡ  Ｆｌｕｏｒ７００、ＳＴＥＬＬＡ  Ｆｌｕｏｒ  ７２０、インドシアニングリーン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０が挙げられ、それぞれがＨａｌｏｔａｇリガンドとして市販されている。
【００２３】
ヘリックス構造の長さは、ヘリックス構造が形成される限り特に限定されない。ヘリックス構造同士の連結においては、連結部位のヘリックスのアミノ酸の長さを変えることによって、アフィマーとの結合角を変化させることができ、これによって蛍光タンパク質の偏光面をアフィマーに対して変化させることが可能である。αヘリックスの場合には、約３．５アミノ酸で１周するため、αヘリックスを１アミノ酸長くすることによって、結合角は約１００度変更される。３／１０ヘリックスにおいては、約３アミノ酸で１周するため、ヘリックスを１アミノ酸長くすることによって結合角は約１２０度変更される。ヘリックスの長さは、アミノ酸の付加、欠失、および挿入から選択される１以上によって調節することができる。また、ヘリックスは、その目的に応じて適宜その長さを調節することができる。調節の方法は、特に限定されないが例えば、融合タンパク質のいずれかのヘリックスの長さを変更することによって行ってもよいし、融合タンパク質の連結部位にヘリックス構造を有するペプチドを挿入することによって行ってもよい。いずれの場合にも、連結部位の前後の領域を含むヘリックス構造が新たに形成されて、これにより融合タンパク質が、より硬く連結することとなる。
【００２４】
βシート構造の長さは、βシート構造が形成される限り特に限定されない。βシート構造同士の連結においては、連結後に連結部前後のβシート構造を含む構造的にフレキシブルでない構造が新たに形成されて、これにより融合タンパク質が、より硬く連結することとなる。
【００２５】
本発明の融合タンパク質は、例えば、以下であり得る：
（Ａ）Ｃ末端にヘリックス構造を有する蛍光タンパク質とＮ末端にヘリックス構造を有するアフィマーとの融合タンパク質｛但し、２つのタンパク質はヘリックス構造同士が連結される｝；
（Ｂ）Ｃ末端にヘリックス構造を有するハロアルカンデハロゲナーゼの脱ハロゲン化ドメインとＮ末端にヘリックス構造を有するアフィマーとの融合タンパク質｛但し、２つのタンパク質はヘリックス構造同士が連結される｝；
（Ｃ）Ｃ末端にβシート構造を有するナノボディとＮ末端にβシート構造を有する蛍光タンパク質との融合タンパク質｛但し、２つのタンパク質はβシート構造同士が連結される｝；および
（Ｄ）Ｃ末端にβシート構造を有するｓｃＦｖとＮ末端にβシート構造を有する蛍光タンパク質との融合タンパク質｛但し、２つのタンパク質はβシート構造同士が連結される｝。
【００２６】
本発明によれば、本発明の融合タンパク質をコードする核酸（例えば、ＤＮＡである）が提供される。本発明の融合タンパク質をコードする核酸は、少なくとも１つの制御配列（例えば、プロモーター）と作動可能に連結されていることができる。本発明によれば、少なくとも１つの制御配列（例えば、プロモーター）と作動可能に連結された本発明の融合タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクター（例えば、哺乳動物の細胞に当該融合タンパク質を発現させるベクター）が提供される。制御配列としては、特に限定されないが例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのプロモーターが挙げられ、例えば、ＣＭＶ即時早期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、早期および後期ＳＶ４０、レトロウイルスのＬＴＲ、メタロチオネインＩなどのプロモーターが挙げられる。大腸菌で発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰＲ、ラムダＰＬ、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、などのプロモーターが挙げられる。植物で発現させるためのプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ転写開始領域、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＴ−ＤＮＡ由来の１’または２’プロモーター、およびオーキシンなどのプロモーターが挙げられる。出芽酵母で発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ＡＤＨ１、ＴＤＨ３、ＰＧＫ１、ＧＡＬ１が挙げられる。分裂酵母で発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ａｄｈ、ｔｅｆ、ｎｍｔ１、およびＣＭＶ等のプロモーターが挙げられる。発現ベクターとしては、プラズミド、ファージ、ファージミド、コスミド、フォスミド、人工染色体、レトロウイルス、レンチウイルス、麻疹ウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびセンダイウイルスなどが挙げられる。本発明によれば、これらの発現カセットをゲノム中に含む、細胞（例えば、動物細胞、植物細胞、細菌、古細菌、および菌類の細胞）が提供される。その他、制御配列に作動可能に連結した本発明の融合タンパク質をコードする直鎖状または環状ＤＮＡを細胞に導入する方法（導入後に安定発現株を取得してもよい）、ゲノム編集技術（例えば、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム等）を用いて、制御配列に作動可能に連結した本発明の融合タンパク質をコードする直鎖状または環状ＤＮＡを細胞のゲノムに導入する方法などを用いてもよい。
細胞に対して遺伝子発現ベクターを用いずに核酸を導入する方法や核酸にコードされるタンパク質を発現させる方法も知られている。制御配列（例えば、プロモーター）を作動可能に連結した本発明の融合タンパク質をコードする核酸（例えば、直鎖状核酸、例えば、直鎖状ＤＮＡ）を細胞に導入して本発明の融合タンパク質を細胞内に発現させることができる。本発明の融合タンパク質をコードするｍＲＮＡを細胞に導入して本発明の融合タンパク質を細胞内に発現させることもできる。
【００２７】
本発明によれば、本発明の融合タンパク質をコードする核酸は、ＤＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であり得る。
【００２８】
本発明によれば、本発明の融合タンパク質をコードする核酸を含む組成物が提供される。本発明によれば、本発明の融合タンパク質をコードする核酸を含む遺伝子発現ベクターを含む組成物が提供される。これらの組成物には、核酸および／または遺伝子発現ベクターと賦形剤とを含み得る。賦形剤としては、核酸および／または遺伝子発現ベクターを安定化させるための賦形剤が挙げられる。賦形剤としては、塩、キレート剤、およびｐＨ調整剤が挙げられる。
【００２９】
本発明の融合タンパク質は、タンパク質であるので、細胞に導入するか、または細胞に融合タンパク質をコードする核酸を導入して強制発現させることができる。従って、本発明の融合タンパク質は、細胞内での抗原の観察に用いることができる。本発明によれば、本発明の融合タンパク質を含む、組成物（例えば、本発明の融合タンパク質の細胞導入用の組成物）が提供されうる。本発明によれば、本発明の融合タンパク質をコードする核酸を含む、組成物（例えば、本発明の融合タンパク質の細胞内発現用の組成物）が提供されうる。
【００３０】
本発明によれば、抗原の観察方法（以下、「本発明の融合タンパク質の観察方法」とも読み替えることができる）が提供される。抗原の観察方法は、本発明の融合タンパク質と結合した抗原を観察することを含み得る。ここで「抗原」とは、特に限定されないが、抗体の免疫原となり得る物質、アフィマーの免疫原となり得る物質、ナノボディの免疫原となり得る物質、またはｓｃＦｖの免疫原となり得る物質を意味し得るものであり、このような抗原であれば、例えば、溶液中または細胞中において、または細胞表面で、本発明の融合タンパク質との結合を形成し得る。抗原は、他のタンパク質と複合体を形成していてもよく、他のタンパク質と複合体を形成していなくてもよい。観察は通常、溶液中または細胞中、または細胞表面の本発明の融合タンパク質に結合した抗原に対して行われ得る。観察は、顕微鏡（例えば、蛍光顕微鏡および蛍光偏光顕微鏡）下で行われ得る。本発明の融合タンパク質は、蛍光タンパク質と抗原結合タンパク質とが一定の回転角で結合し、蛍光が有する偏光が抗原結合タンパク質に対して一定する。従って、本発明の融合タンパク質は、好ましくは、蛍光偏光顕微鏡下で観察されうる。
【００３１】
本発明によれば、抗原としては、動物、植物、細菌、菌類、および古細菌の抗原が挙げられる。抗原としては、細胞内の抗原、細胞外の抗原、および細胞膜上の抗原が挙げられる。抗原は、遊離型でもよいし、何らかの他の構成成分と複合体を形成していてもよい。抗原は、モノマー形態の抗原でもよいし、ポリマー形態の抗原でもよい。本発明では、細胞は、受精卵、多能性幹細胞、幹細胞、前駆細胞、体細胞、および生殖細胞（例えば、卵細胞）のいずれであってもよい。本発明では、抗原は、生物における細胞以外の構成体、例えば、鞭毛（例えば、精子や微生物の鞭毛）の構成要素であってもよい。本発明によれば、抗原は、アクチン、微小管、セプチン、および中間径フィラメント等の細胞内骨格であり得る。本発明によれば、抗原は、細胞内のアクチン（例えば、α−アクチン、β−アクチン、およびγ−アクチン）、微小管のチューブリン（例えば、α−チューブリン、βチューブリン、およびγ−チューブリン）、セプチン、および中間径フィラメント（例えば、ケラチン、ＧＦＡＰ（グリア細胞線維性酸性蛋白質）、ビメンチン、ニューロフィラメント−Ｍ、ニューロフィラメント−Ｌ、ニューロフィラメント−Ｈ、α−インターネキシン、ラミンＢ１、ラミンＢ２、ラミンＡ）等の細胞内骨格であり得る。本発明によれば、抗原としては、特に限定されないが例えば、ミオシン（例えば、ミオシンＩ、ミオシンＩＩ、ミオシンＩＩＩ、ミオシンＩＶ、ミオシンＶ、ミオシンＶＩ、ミオシンＶＩＩＩ、およびミオシンＩＸ等のミオシン、並びにこれらの重鎖または軽鎖）、ダイニン（例えば、軸糸ダイニンおよび細胞質ダイニン）、キネシン（特に限定されないが例えば、ＫＩＦ１Ａ、ＫＩＦ１Ｂα、ＫＩＦ１Ｂβ、ＫＩＦ１Ｃ、ＫＩＦ２Ａ、ＫＩＦ３、ＫＩＦ４、ＫＩＦ５、ＫＩＦ１３Ｂ、ＫＩＦ１７、ＫＩＦ２６Ａ、ＫＩＦＣ１、ＫＩＦＣ２、およびＫＩＦＣ３、並びにキネシンスーパーファミリーに属する他のキネシン）が挙げられる。本発明によれば、抗原は、特に限定されないが例えば、膜タンパク質（例えば、受容体タンパク質、Ｇタンパク質、イオン輸送体（イオンチャンネル、イオンポンプ）、およびトランスポータータンパク質が挙げられる。本発明によれば、抗原は、特に限定されないが例えば、ＢＡＲドメインタンパク質（Ａｍｐｈｉｐｈｙｓｉｎ、ＥｎｄｏｐｈｉｌｉｎＡ１、ＦＣＨＯ２、Ｐａｃｓｉｎ２、ＩＲＳｐ５３）やＥＳＣＲＴ−ＩＩＩタンパク質（ＣＨＭＰ２Ａ、ＣＨＭＰ２Ｂ、ＣＨＭＰ４Ａ、ＣＨＭＰ４Ｂ、ＣＨＭＰ４Ｃ）が挙げられる。その他、特に抗原は、上記に限られず、様々な生体分子（例えば、タンパク質、脂質、核酸、ホルモン、および糖など）であり得る。本発明によれば、抗原は、特に限定されないが例えば、脂質膜や脂質膜ドメインであり得る｛例えば、脂溶性の蛍光色素や脂質結合モチーフを用い得る｝。本発明によれば、細胞内骨格以外の細胞の構成要素も観察対象であり得る。例えば、本発明において偏光蛍光相関分光または偏光蛍光相互相関分光を実施する場合には、細胞内骨格以外の細胞の構成要素の回転拡散を評価することができる。
【００３２】
本発明によれば、抗原の観察方法は、蛍光相関分光（ＦＣＳ）を含み得る。蛍光相関分光は、蛍光物質の分子運動を顕微鏡（例えば、共焦点顕微鏡または２光子顕微鏡など）下で観察することを含み得る。蛍光相関分光は、本発明の融合タンパク質に光（例えば、レーザー光）を照射して蛍光強度のゆらぎを測定することを含み得る。蛍光相関分光は、強度スペクトル（時間スペクトル）を逆フーリエ変換して時間的自己相関を得ることを含み得る。蛍光相関分光は、得られた結果から、本発明の融合タンパク質の拡散運動（並進拡散運動）、および測定領域内の分子数を評価することができる。本発明の方法は、本発明の融合タンパク質の拡散係数を求めることを含み得る。本発明によれば、複数種の蛍光分子由来の蛍光強度変化の同時測定は、本発明の複数種の融合タンパク質間の結合の検出に用いられ得る。本発明によれば、抗原の観察方法は、ある態様では、蛍光偏光を観察することを含み得る。蛍光偏光は、蛍光偏光顕微鏡下にて観察され得る。偏光は、偏光板を通してその強度を解析する等することにより、融合タンパク質の回転拡散運動を評価することができる。本発明の方法は、本発明の融合タンパク質の流体回転半径を求めることを含み得る。本発明によれば、流体回転半径は、本発明の融合タンパク質の構造揺らぎ・周囲の微視的環境の揺らぎの評価、本発明の融合タンパク質と他のタンパク質の結合の評価、または本発明の複数種の融合タンパク質間の結合の評価に用いられ得る。
【００３３】
本発明によれば、抗原の観察方法は、ある態様では、本発明の融合タンパク質である第一の融合タンパク質と結合した抗原と、本発明の融合タンパク質である第二の融合タンパク質｛但し、第一の融合タンパク質と第二の融合タンパク質の蛍光波長は異なる｝と結合した第二の抗原とのそれぞれを観察することを含み得る。本発明によれば、抗原の観察方法は、本発明の融合タンパク質である第一の融合タンパク質と結合した抗原と、本発明の融合タンパク質である第二の融合タンパク質｛但し、第一の融合タンパク質と第二の融合タンパク質の蛍光波長は異なる｝と結合した第二の抗原と蛍光相関分光（ＦＣＳ）を含み得る。本発明によれば、抗原の観察方法は、２つ以上の抗原の蛍光強度の揺らぎの同時性を解析すること（蛍光相互相関分光（ＦＣＣＳ））を含み得る。２つ以上の抗原の蛍光強度を測定するためには、２つ以上の本発明の融合タンパク質（すなわち、第一の融合タンパク質、第二の融合タンパク質を用いることができ、例えば、第三の融合タンパク質を用いてもよく、第四の融合タンパク質をさらに用いてもよく、更にまた必要に応じてそれ以上の本発明の融合タンパク質を用いてもよい（但し、それぞれの蛍光波長は異なることが好ましい）。本発明によれば、抗原の観察方法は、ある態様では、蛍光偏光を観察することを含み得る。蛍光偏光は、蛍光偏光顕微鏡下にて観察され得る。蛍光相関分光（ＦＣＳ）、および蛍光相互相関分光（ＦＣＣＳ）を偏光蛍光顕微鏡下で行うメリットは、蛍光の回転拡散運動を検出することができることである。従って、本発明では、抗原の観察方法は、ある態様では、蛍光偏光を観察して分子の回転拡散運動を検出することをさらに含んでいてもよい。回転拡散運動は、粒子径の変化に対して感受性であるため、偏光蛍光相関分光によれば、２つ以上の抗原の結合状態をより精密に評価することができると期待される。本発明では、抗原の観察方法は、ある態様では、細胞内の２つ以上の抗原の結合状態を評価すること、または溶液中の２つ以上の抗原の結合状態を評価することを含み得る。
【００３４】
蛍光の偏光観察は、蛍光偏光顕微鏡を用いて当業者が適宜行うことができる。偏光は、例えば、第一の偏光面と第二の偏光面を含む２つまたはそれ以上の偏光面に関して観察することができる。偏光は、第一の偏光面と第二の偏光面と第三の偏光面と第四の偏光面を含む４つまたはそれ以上の偏光面に関して観察することができる。観察する偏光面を増やすにつれて、蛍光分子の回転の検出感度が高まると期待できる。
【００３５】
本発明では、本発明の融合タンパク質の観察は、超解像度顕微鏡法により行うことができる。超解像度顕微鏡法としては、例えば、誘導放出抑制顕微鏡法（ＳＴＥＤ）、光活性化局在性顕微鏡法（ＰＡＬＭ）、確率的光学再構築顕微鏡法、走査型近接場光顕微鏡法（ＳＮＯＭ）、構造化照明顕微鏡法、共焦点レーザー顕微鏡法、および２光子励起顕微鏡法によるものが挙げられる。超解像度顕微鏡法では、光の回折限界以下の分解能（例えば、２００  ｎｍ以下の分解能）で観察対象物を観察することができる。更に全反射照明下等、適切な観察条件下では、蛍光分子を１分子レベルで輝点として検出することができる。超解像度顕微鏡法においても、蛍光相関分光（ＦＣＳ）および蛍光相互相関分光（ＦＣＣＳ）、並びに蛍光に代えて発光物質を用いる前記方法と同様に、抗原の観察が可能である。従来の超解像度顕微鏡法では抗原の位置を計測するのみであったが、本発明では複数の抗原の位置に加えて偏光の方向を同時に観察することで、各抗原の構造上の相関関係を評価することが可能である。これは、超解像度顕微鏡法において従来存在しなかった点像変換アルゴリズムの実験的基盤となることが期待できる。
【００３６】
本発明によれば、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、および４３からなる群から選択される１つの配列番号に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、およびこれをコードする核酸が提供される。本発明によれば、上記核酸を含む、細胞内発現用のベクターが提供される。
【００３７】
本発明によれば、融合タンパク質のアミノ酸配列を設計する方法であって、
抗原結合タンパク質のアミノ酸配列である第一のアミノ酸配列と蛍光タンパク質のアミノ酸配列である第二のアミノ酸配列を用意することと、ここで、第一のアミノ酸配列のＮ末端および第二のアミノ酸配列のＣ末端、または、第一のアミノ酸配列のＣ末端および第二のアミノ酸配列のＮ末端が、共にヘリックス構造であるか、Ｎ末端またはＣ末端の一部を切除することで共にヘリックス構造となるものであり、
第一のアミノ酸配列のＮ末端および第二のアミノ酸配列のＣ末端、または、第一のアミノ酸配列のＣ末端および第二のアミノ酸配列のＮ末端を連結し、これによって、連結箇所がヘリックス構造の一部となるアミノ酸配列を得ることとを含む、方法が提供される。設計されたアミノ酸配列を有する融合タンパク質は、蛍光偏光観察に適したものであり得る。好ましくは、Ｎ末端またはＣ末端の一部を切除することは、抗原結合タンパク質の結合特性および蛍光タンパク質の蛍光特性を消失させない。
【００３８】
本発明によれば、融合タンパク質のアミノ酸配列を設計する方法であって、
抗原結合タンパク質のアミノ酸配列である第一のアミノ酸配列と蛍光タンパク質のアミノ酸配列である第二のアミノ酸配列を用意することと、ここで、第一のアミノ酸配列のＮ末端および第二のアミノ酸配列のＣ末端、または、第一のアミノ酸配列のＣ末端および第二のアミノ酸配列のＮ末端が、共にβシートであるか、Ｎ末端またはＣ末端の一部を切除することで共にβシートとなるものであり、
第一のアミノ酸配列のＮ末端および第二のアミノ酸配列のＣ末端、または、第一のアミノ酸配列のＣ末端および第二のアミノ酸配列のＮ末端を連結し、これによって、連結箇所がβシート構造の一部となるアミノ酸配列を得ることとを含む、方法が提供される。設計されたアミノ酸配列を有する融合タンパク質は、蛍光偏光観察に適したものであり得る。好ましくは、Ｎ末端またはＣ末端の一部を切除することは、抗原結合タンパク質の結合特性および蛍光タンパク質の蛍光特性を消失させない。
【００３９】
本発明によれば、融合タンパク質を設計する方法であって、
タンパク質のアミノ酸配列を用意することと、ここで、当該アミノ酸配列の少なくともＮ末端またはＣ末端がヘリックス構造を有し、
当該ヘリックスとＡＬＦＡタグ（ＡＬＦＡタグは、例えば、配列番号４０に記載のアミノ酸配列または対応するＡＬＦＡタグのアミノ酸配列を有し得る）のヘリックスのアミノ酸配列とを連結し、これによって、連結箇所がヘリックス構造の一部となるアミノ酸配列を得ることとを含む、方法が提供される。設計されたアミノ酸配列を有する融合タンパク質は、ＡＬＦＡタグに結合する抗原結合タンパク質と硬く連結した蛍光タンパク質によって検出され得、蛍光偏光観察に用い得る。好ましくは、Ｎ末端またはＣ末端の一部を切除することは、タンパク質の機能性領域を欠失させない。ある態様では、上記タンパク質は、抗原結合タンパク質であり得る。ある態様では、上記タンパク質は、観察対象であるタンパク質であり得る。ＡＬＦＡタグに結合する抗原結合タンパク質としては、ＡＬＦＡタグに結合するナノボディ、ｓｃＦｖ、アフィマーおよび上記で例示した抗原結合タンパク質が挙げられ、蛍光タンパク質も上記で例示した蛍光タンパク質が挙げられ、これらがヘリックス構造同士、またはβシート同士で連結された融合タンパク質（例えば、上記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかの融合タンパク質であって、ＡＬＦＡタグに結合する融合タンパク質）を、ＡＬＦＡタグを検出するために用いることができる。また、検出されるタンパク質は、Ｎ末端またはＣ末端にヘリックス構造を有することが好ましく、ＡＬＦＡタグのヘリックス構造と連結されて、連結部がヘリックス構造の一部となった、融合タンパク質とすることができる。
【００４０】
本発明によれば、設計されたアミノ酸配列に基づいて、当該融合タンパク質をコードする核酸配列を得ることを含む、方法が提供される。本発明によれば、設計されたアミノ酸配列をコードする核酸配列を有する核酸を製造する方法が提供され得る。本発明によれば、設計されたアミノ酸配列をコードする核酸配列を有する核酸（例えば、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）が提供され得る。本願発明によればまた、得られた核酸配列を有する核酸を含む遺伝子発現ベクターが提供される。遺伝子発現ベクターにおいては、核酸は、プロモーターに作動可能に連結させることができる。得られた遺伝子発現ベクターは、細胞に発現可能に導入されることによって、細胞内で設計されたアミノ酸配列を有する融合タンパク質を合成することに用いることができる。得られた融合タンパク質が、蛍光偏光観察に適したものである場合には、当該融合タンパク質およびこれをコードする核酸は、蛍光偏光観察に有用であり得る。
【００４１】
本発明によれば、上記によって設計されたアミノ酸配列に基づいて、融合タンパク質を製造する方法が提供される。
【実施例】
【００４２】
実施例１：円順列変異体ｃｐ−ｓｆＧＦＰとアフィマーとの融合タンパク質の設計と観察
本実施例では、円順列変異体ｃｐ−ｓｆＧＦＰとアフィマーとの融合タンパク質を設計した。【００４３】
アフィマーは、ステフィン由来またはシスタチン由来のタンパク質であり、αヘリックスとそれに接する４本の折り返しβシート構造とからなるタンパク質である。４本の折り返しβシートは、αヘリックスによって安定化されており、固い３次構造を有する。４本のβシートによって３箇所のループが形成されるが、そのうち同じ側の２箇所のループには、アミノ酸を導入することができることが知られている。導入するアミノ酸によってアフィマーが、抗体のような抗原に対する選択的な結合親和性を獲得できることも知られている。また、ファージディスプレイなどの技法によって、所望の抗原に対して結合親和性を示すアフィマーを設計することができることも明らかになっている。【００４４】
本実施例では、Ｃ末端にヘリックス（３／１０ヘリックスと考えられる）を有するｃｐ−ｓｆＧＦＰと、Ｎ末端にαヘリックスを有するアフィマーとを、当該Ｃ末端のヘリックスとＮ末端のヘリックスとをヘリックスリンカーを介して連結させて、融合タンパク質を得た（図１Ａ参照）。【００４５】
得られる融合タンパク質の予想される立体構造モデルは、図１Ｂに示される通りであった。【００４６】
ｃｐ−ｓｆＧＦＰとしては、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するｃｐ−ｓｆＧＦＰを用いた。また、アフィマーとしては、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するアフィマーを用いた。このアフィマーは、アクチン線維（Ｆ−アクチン）に選択的に結合することができる。遺伝子工学的手法により、配列番号１に記載のアミノ酸配列と配列番号２に記載のアミノ酸配列とを、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するヘリックスリンカーを介して、インフレームで連結し、これによって配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する融合タンパク質を設計した。配列番号４は、Ｃ末端にＨＡタグのアミノ酸配列を含む。【００４７】
設計した融合タンパク質を大腸菌に産生させて精製し、得られた融合タンパク質を結晶化し、Ｘ線結晶構造解析に供した。得られたＸ線回折像から、当該融合タンパク質は、図１Ｃに示される結晶構造を有することが明らかとなった。図１Ｃに示されるように、ｃｐ−ｓｆＧＦＰとアフィマーとは、当該Ｃ末端のヘリックスとＮ末端のヘリックスとが連結して１本のヘリックスを新たに形成させたことが明らかとなった。【００４８】
設計した融合タンパク質をコードするＤＮＡを適切なプロモーター下に配置した発現ベクターをリポフェクション法（リポフェクタミン３０００試薬）によって導入することにより、ＨｅＬａ細胞に上記融合タンパク質を発現させた。蛍光偏光顕微鏡下で融合タンパク質を発現した細胞を観察した。融合タンパク質がアクチン繊維に結合したときに、結合した融合タンパク質の蛍光の偏光面が揃っていれば、蛍光の偏光（異方性）が観察されると予想される。偏光ビームスプリッタを用いて縦の観察偏光面と横の観察偏光面の像を同時に取得し、比較した。結果は図２に示される通りであった。図２に示されるように、観察偏光面が横であるときに蛍光強度が弱く観察されるアクチン線維束（矢尻参照）が、観察偏光面が縦であるときに蛍光強度が強く観察される一方で、観察偏光面が横であるときに蛍光強度が強く観察されるアクチン線維束（矢印参照）が、観察偏光面が縦であるときに弱く観察された。このことは、アクチン繊維に結合した融合タンパク質の偏光面が揃っていることを意味する。同様の実験を、ＨｅＬａ細胞に代えてＬＬＣ−ＰＫ１細胞、Ｐｔｋ２細胞、酵母細胞やヒトデの卵母細胞、または受精卵を用いて実施し、上記融合タンパク質の偏光を細胞内において観察することができることを確認した。【００４９】
アフィマーは、アクチン線維に対して揃った向きで結合すると考えられる。アクチン線維は、アクチンモノマーの繰り返しにより構成されたポリマーであるからである。融合タンパク質の偏光面が揃っているということは、融合タンパク質におけるｃｐ−ｓｆＧＦＰがアフィマーに対して硬く固定されていることを示すものである。従って、本発明の融合タンパク質において、Ｃ末端のヘリックスとＮ末端のヘリックスとを連結させる方法は、ｃｐ−ｓｆＧＦＰをアフィマーに対して固定して、ｃｐ−ｓｆＧＦＰの偏光面をアフィマーに対して固定化する方法論を提供するものである。アフィマーのＮ末端のαヘリックスと連結するように、ｓｆＧＦＰのＮ末端のヘリックスをＣ末端に移動させる円順列変異体の作製がこの固定化のための方法論に役立ち得ることが示された。【００５０】
これによって、所望の抗原に対して結合して、偏光を発する蛍光標識法が構築できる。この蛍光偏光標識法の戦略の有効性を以下実施例によりさらに確認した。【００５１】
実施例２：円順列変異体ｃｐｍＶｅｎｕｓとアフィマーとの融合タンパク質の設計と観察
実施例１に開示した戦略を用いて、ｃｐｍＶｅｎｕｓとアフィマーとを連結させた。具体的には、ｃｐｍＶｅｎｕｓのＣ末端に存在する３／１０ヘリックスと、アフィマーのＮ末端に存在するαヘリックスとをインフレームで連結させて融合タンパク質を設計した。【００５２】
ｃｐｍＶｅｎｕｓとしては、配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質を用いた。アフィマーとしては、実施例１と同じアミノ酸配列を有するアフィマーを用いた。遺伝子工学的手法により、配列番号５に記載のアミノ酸配列と配列番号２に記載のアミノ酸配列とを、アラニン（Ａ）を介してインフレームで連結し、これによって配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するｃｐｍＶｅｎｕｓとアフィマーとの融合タンパク質を設計した。配列番号６は、Ｃ末端にＨＡタグのアミノ酸配列を含む。【００５３】
設計した融合タンパク質をコードするＤＮＡを適切なプロモーター下に配置した発現ベクターをリポフェクション法（アバランシェ−エブリデートランスフェクション試薬）によって導入することにより、ＨｅＬａ細胞に上記融合タンパク質を発現させた。蛍光偏光顕微鏡下で融合タンパク質を発現した細胞を観察した。結果は、図３に示される通りであった。図３に示されるように、観察偏光面が横であるときに蛍光強度が弱く観察されるアクチン線維束が、観察偏光面が縦であるときに蛍光強度が強く観察される一方で、観察偏光面が横であるときに蛍光強度が強く観察されるアクチン線維束が、観察偏光面が縦であるときに弱く観察される様子が認められた。このことから、ｃｐｍＶｅｎｕｓのＣ末端に存在する３／１０ヘリックスと、アフィマーのＮ末端に存在するαヘリックスとをインフレームで直接的に連結させて得た融合タンパク質もまた、偏光を示すものであった。【００５４】
実施例３：円順列変異体ｃｐｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２とアフィマーとの融合タンパク質の設計と観察
実施例１に開示した戦略を用いて、ｃｐｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２とアフィマーとを連結させた。具体的には、ｃｐｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２のＣ末端に存在する３／１０ヘリックスと、アフィマーのＮ末端に存在するαヘリックスとをインフレームで連結させて融合タンパク質を設計した。【００５５】
ｃｐｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２としては、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質を用いた。アフィマーとしては、実施例１と同じアミノ酸配列を有するアフィマーを用いた。遺伝子工学的手法により、配列番号７に記載のアミノ酸配列と配列番号２に記載のアミノ酸配列とをアラニン（Ａ）を介してインフレームで連結し、これによって配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するｃｐｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２とアフィマーとの融合タンパク質を設計した。配列番号８は、Ｃ末端にＨＡタグのアミノ酸配列を含む。【００５６】
設計した融合タンパク質をコードするＤＮＡを適切なプロモーター下に配置した発現ベクターをリポフェクション法（アバランシェ−エブリデートランスフェクション試薬）によって導入することにより、ＨｅＬａ細胞に上記融合タンパク質を発現させた。蛍光偏光顕微鏡下で融合タンパク質を発現した細胞を観察した。結果は、図４に示される通りであった。図４に示されるように、観察偏光面が横であるときに蛍光強度が弱く観察されるアクチン線維束が、観察偏光面が縦であるときに蛍光強度が強く観察される一方で、観察偏光面が横であるときに蛍光強度が強く観察されるアクチン線維束が、観察偏光面が縦であるときに弱く観察される様子が認められた。このことから、ｃｐｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２のＣ末端に存在する３／１０ヘリックスと、アフィマーのＮ末端に存在するαヘリックスとをインフレームで連結させて得た融合タンパク質もまた、偏光を示すものであった。【００５７】
上記実施例１〜３から、蛍光タンパク質のＣ末端のヘリックスと、アフィマーのＮ末端のヘリックスとを連結する戦略は、蛍光の偏光面をアフィマーに対して固定することができ、標的タンパク質（すなわち、アフィマーの抗原）を蛍光偏光観察する新しい手法を提供するものとなる。【００５８】
実施例４：蛍光標識されるタグとアフィマーとの融合タンパク質の設計と観察
上記実施例に開示した戦略を用いて、蛍光標識されるタグとアフィマーとを連結させた。蛍光標識されるタグとしてはハロタグを用いた。ハロタグは、細胞膜透過性の様々な蛍光リガンドと結合することができるタンパク質標識技術である。ハロタグとアフィマーとを連結させることによって、所望の抗原に対してハロタグを導入することができるが、上記実施例に開示した戦略を用いることで蛍光偏光観察への適用を試みた。【００５９】
（１）融合タンパク質（１つ目）
ハロタグとしては、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質を用いた。アフィマーとしては、実施例１と同じアミノ酸配列を有するアフィマーを用いた。遺伝子工学的手法により、配列番号９に記載のアミノ酸配列と配列番号２に記載のアミノ酸配列とを配列番号１０のアミノ酸配列を有するヘリックスリンカーを介してインフレームで連結し、これによって配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有するハロタグとアフィマーとの融合タンパク質を設計した。ハロタグは、図５に示されるようにＣ末端にαヘリックス構造を有する。本実施例では、このＣ末端のαヘリックスとアフィマーのＮ末端のαヘリックスとを上記ヘリックスリンカーを介して連結させた（図５参照）。【００６０】
設計した融合タンパク質をコードするＤＮＡを適切なプロモーター下に配置した発現ベクターをリポフェクション法（リポフェクタミン３０００試薬）によって導入することにより、ＨｅＬａ細胞に上記融合タンパク質を発現させた。ハロタグリガンドとしては、オレゴングリーンリガンドを用いて、蛍光偏光顕微鏡下で融合タンパク質を発現した細胞を観察した。結果は、図６Ａに示される通りであった。図６Ａに示されるように、観察偏光面が横であるときに蛍光強度が弱く観察されるアクチン線維束が、観察偏光面が縦であるときに蛍光強度が強く観察される一方で、観察偏光面が横であるときに蛍光強度が強く観察されるアクチン線維束が、観察偏光面が縦であるときに弱く観察される様子が認められた。このことから、ハロタグのＣ末端に存在するαヘリックスと、アフィマーのＮ末端に存在するαヘリックスとをインフレームで直接的に連結させて得た融合タンパク質もまた、偏光を示すものであった。偏光を示すということから、蛍光色素とハロタグ、アフィマーとの相互の結合がタイトに固定されており、その結合には柔軟性がほとんどないものと考えられる。【００６１】
このことから、本実施例の戦略によってハロタグのＣ末端に存在するαヘリックスと、アフィマーのＮ末端に存在するαヘリックスとを連結させると、アフィマーに対してハロタグが硬く結合することによって、ハロタグに結合する蛍光標識を介して蛍光偏光観察が可能となることが明らかとなった。【００６２】
（２）融合タンパク質（２つ目；巻き数変更）
αヘリックスは、３．５アミノ酸で１巻きするタンパク質の二次構造である。αヘリックス同士をアミノ酸をずらして連結させること（巻き数変更）によって、偏光面が回転するのかを確認した。【００６３】
ハロタグとしては、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質を用いた。アフィマーとしては、実施例１と同じアミノ酸配列を有するアフィマーを用いた。遺伝子工学的手法により、配列番号９に記載のアミノ酸配列と配列番号２に記載のアミノ酸配列とを配列番号１２のアミノ酸配列を有するヘリックスリンカーを介してインフレームで連結し、これによって配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有するハロタグとアフィマーとの融合タンパク質を設計した。図６Ａに示された融合タンパク質とはヘリックスリンカーの長さが１アミノ酸相違する（すなわち回転角が約１００度異なる）。図６Ａと図６Ｂとを比較すると理解できるように、ハロタグに対するアフィマーの結合角が図６Ａと図６Ｂの融合タンパク質では異なる。【００６４】
設計した融合タンパク質をコードするＤＮＡを適切なプロモーター下に配置した発現ベクターをリポフェクション法（リポフェクタミン３０００試薬）によって導入することにより、ＨｅＬａ細胞に上記融合タンパク質を発現させた。ハロタグリガンドとしては、オレゴングリーンリガンドを用いて、蛍光偏光顕微鏡下で融合タンパク質を発現した細胞を観察した。結果は、図６Ｂに示される通りであった。図６Ｂに示されるように、観察偏光面が横であるときに蛍光強度が弱く観察されるアクチン線維束が、観察偏光面が縦であるときに蛍光強度が強く観察される一方で、観察偏光面が横であるときに蛍光強度が強く観察されるアクチン線維束が、観察偏光面が縦であるときに弱く観察される様子が認められた。このことから、ハロタグのＣ末端に存在するαヘリックスと、アフィマーのＮ末端に存在するαヘリックスとをインフレームで直接的に連結させて得た融合タンパク質もまた、偏光を示すものであった。【００６５】
このことから、ハロタグのＣ末端に存在するαヘリックスと、アフィマーのＮ末端に存在するαヘリックスとは、巻き数を変更して連結させても蛍光偏光標識戦略として成立することが明らかとなった。図６Ａおよび図６Ｂに開示されたモデルによれば、巻き数を変更することによって、偏光の回転角を自由に変えることが原理的に可能であることが明らかである。【００６６】
（３）融合タンパク質（３つ目；更なる巻き数変更）
αヘリックス同士をアミノ酸を更にずらして連結させた（更なる巻き数変更）。【００６７】
ハロタグとしては、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質を用いた。アフィマーとしては、実施例１と同じアミノ酸配列を有するアフィマーを用いた。遺伝子工学的手法により、配列番号９に記載のアミノ酸配列と配列番号２に記載のアミノ酸配列とを配列番号１４のアミノ酸配列を有するヘリックスリンカーを介してインフレームで連結し、これによって配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有するハロタグとアフィマーとの融合タンパク質を設計した。図６Ａに示された融合タンパク質とはヘリックスリンカーの長さが２アミノ酸相違する（すなわち回転角が約２００度異なる）。図６Ａと図６Ｂと図６Ｃとを比較すると理解できるように、ハロタグに対するアフィマーの結合角が図６Ａと図６Ｂと図６Ｃの融合タンパク質では異なる。【００６８】
設計した融合タンパク質をコードするＤＮＡを適切なプロモーター下に配置した発現ベクターをリポフェクション法（リポフェクタミン３０００試薬）によって導入することにより、ＨｅＬａ細胞に上記融合タンパク質を発現させた。ハロタグリガンドとしては、オレゴングリーンリガンドを用いて、蛍光偏光顕微鏡下で融合タンパク質を発現した細胞を観察した。結果は、図６Ｃに示される通りであった。図６Ｃに示されるように、観察偏光面が横であるときに蛍光強度が弱く観察されるアクチン線維束が、観察偏光面が縦であるときに蛍光強度が強く観察される一方で、観察偏光面が横であるときに蛍光強度が強く観察されるアクチン線維束が、観察偏光面が縦であるときに弱く観察される様子が認められた。このことから、ハロタグのＣ末端に存在するαヘリックスと、アフィマーのＮ末端に存在するαヘリックスとをインフレームで直接的に連結させて得た融合タンパク質もまた、偏光を示すものであった。なお、ハロタグリガンドとして、オレゴングリーンリガンドに代えて、ＴＭＲリガンド、ＨＭＳｉＲリガンドを用いても強い偏光が観察され、ハロタグリガンドに用いられる蛍光物質によらずに偏光の観察が可能であった。【００６９】
このことから、ハロタグのＣ末端に存在するαヘリックスと、アフィマーのＮ末端に存在するαヘリックスとは、巻き数を変更して連結させても蛍光偏光標識戦略として成立することがさらに確認された。【００７０】
実施例５：円順列変異体ｃｐ−ｓｆＧＦＰとナノボディとの融合タンパク質の設計と観察
本実施例では、蛍光タンパク質とナノボディの融合タンパク質を設計した。【００７１】
ナノボディは、ヒト、ウサギ、及びマウスなどに見られる一般的な抗体（重鎖と軽鎖を有する抗体）とは異なり、重鎖のみからなる抗体（例えば、サメやギンザメなどの軟骨魚類やラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、アルパカなどの抗体）は、重鎖可変領域のみで抗原に結合することができるものと、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とに由来するものがある。これらの可変領域を含むペプチドは、分子量が通常のＩｇＧ抗体の１０分の１ほど（おおよそ１２〜１５ｋＤａ）であり、ナノボディと呼ばれる。ファージディスプレイなどの技法によって、所望の抗原に対して結合親和性を示すナノボディを設計することができることも明らかになっている。【００７２】
ｓｆＧＦＰ（ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ  ＧＦＰ）は、オワンクラゲから得られるＧＦＰの改変体である。細胞内で迅速に構造形成（ｆｏｌｄｉｎｇ）することが特徴とされる。本実施例では、このｓｆＧＦＰとナノボディとをβシート同士で連結することを試みた。ナノボディはＣ末端にβシートを有するので、Ｎ末端にβシートを有する円順列変異体ｃｐ−ｓｆＧＦＰ（詳細には、ｃｐ１０／８（１０／９）ｓｆＧＦＰ）を構築した。【００７３】
Ｎ末端にβシートを有する円順列変異体ｃｐ−ｓｆＧＦＰは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質を用いた。ナノボディとしては、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有する、ビメンチンに結合するナノボディを用いた。遺伝子工学的手法により、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するｃｐ−ｓｆＧＦＰのＮ末端のβシートと、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有する、ビメンチンに結合するナノボディのＣ末端のβシートとを連結させて、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有する融合タンパク質を設計した。配列番号１７に記載のアミノ酸配列は、Ｎ末端にＨｉｓタグとＴ７タグを有する。図７Ａに予想される融合タンパク質の構造モデルを示す。このモデルでは、ナノボディが抗原に結合する部位は、蛍光タンパク質とは反対方向に存在し、抗原への接近可能性が担保されている。【００７４】
設計した融合タンパク質をコードするＤＮＡを適切なプロモーター下に配置した発現ベクターをリポフェクション法（アバランシェ−エブリデートランスフェクション試薬）によって導入することにより、ＨｅＬａ細胞に上記融合タンパク質を発現させた。蛍光偏光顕微鏡下で融合タンパク質を発現した細胞を観察した。結果は、図７Ｂに示される通りであった。図７Ｂに示されるように、観察偏光面が横であるときに蛍光強度が弱く観察されるビメンチン繊維が、観察偏光面が縦であるときに蛍光強度が強く観察される一方で、観察偏光面が横であるときに蛍光強度が強く観察されるビメンチン繊維が、観察偏光面が縦であるときに弱く観察される様子が認められた。このように、作製した融合タンパク質は、ビメンチン繊維を染色することができた上に、その蛍光は偏光を示した。【００７５】
このことから、ｃｐ−ｓｆＧＦＰのＮ末端のβシートとナノボディのＣ末端のβシートとを連結させて融合タンパク質を得る戦略は、蛍光偏光標識に有用であり得ることが示唆された。【００７６】
実施例６：ナノボディとｃｐ１７６−１７２ｍＶｅｎｕｓとの融合タンパク質の設計と観察
また、ビメンチンに結合するナノボディ（配列番号１６）とｃｐ１７６−１７２ｍＶｅｎｕｓ（配列番号３０）とをＶＶを介して連結した融合タンパク質（配列番号３１、配列番号３１に記載のアミノ酸配列は、Ｎ末端にＨｉｓタグとＴ７タグを有する。）を設計し（図７Ｃの上のパネル参照）、実施例５と同様にＨｅＬａ細胞に発現させた。蛍光偏光顕微鏡下で融合タンパク質を発現した細胞を観察したところ、図７Ｃに示されるように、細胞内のビメンチンを観察することができ、かつ、その蛍光は偏光を示した。その偏光の方向は、先のｃｐ−ｓｆＧＦＰの場合と異なっていた。実施例５のｃｐ−ｓｆＧＦＰと本実施例で用いたｃｐ１７６−１７２ｍＶｅｎｕｓとは、基本的に同じタイプの蛍光タンパク質であるが、ｃｐの位置において相違する。従って、本実施例では、様々な場所で蛍光タンパク質の円順列変異体を作成することで、偏光の角度を変えることができることが示された。【００７７】
実施例７：ｍＡｐｐｌｅとナノボディとの融合タンパク質の設計と観察
そこで次に、別の蛍光タンパク質であるｍＡｐｐｌｅとナノボディとの融合タンパク質を設計した。【００７８】
ｍＡｐｐｌｅは、配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質を用いた。ナノボディとしては、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有する、ビメンチンに結合するナノボディを用いた。遺伝子工学的手法により、配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有するｍＡｐｐｌｅのＮ末端のβシートと、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有する、ビメンチンに結合するナノボディのＣ末端のβシートとを、フレキシブルではないリンカー（「硬いリンカー」）を介して連結させて、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有する融合タンパク質を設計した。配列番号１９に記載のアミノ酸配列は、Ｎ末端にＨｉｓタグとＴ７タグを有する。図８Ａに予想される融合タンパク質の構造モデルを示す。このモデルでは、ナノボディが抗原に結合する部位は、蛍光タンパク質とは反対方向に存在し、抗原への接近可能性が担保されている。【００７９】
設計した融合タンパク質をコードするＤＮＡを適切なプロモーター下に配置した発現ベクターをリポフェクション法（アバランシェ−エブリデートランスフェクション試薬）によって導入することにより、ＨｅＬａ細胞に上記融合タンパク質を発現させた。蛍光偏光顕微鏡下で融合タンパク質を発現した細胞を観察した。結果は、図８Ｂに示される通りであった。図８Ｂに示されるように、観察偏光面が横であるときに蛍光強度が弱く観察されるビメンチン繊維が、観察偏光面が縦であるときに蛍光強度が強く観察される一方で、観察偏光面が横であるときに蛍光強度が強く観察されるビメンチン繊維が、観察偏光面が縦であるときに弱く観察される様子が認められた。このように、作製した融合タンパク質は、ビメンチン繊維を染色することができた上に、その蛍光は偏光を示した。【００８０】
このように、ナノボディのＣ末端のβシート構造を利用し、蛍光タンパク質のＮ末端に存在するβシート構造と連結させることにより、偏光性を喪失することなく、ナノボディの蛍光タンパク質標識が可能であることが明らかである。【００８１】
実施例８：ｃｐ−ｓｆＧＦＰとｓｃＦｖとの融合タンパク質の設計と観察
本実施例では、Ｎ末端にβシート構造を有するｃｐ−ｓｆＧＦＰを設計し、ｓｃＦｖのＣ末端に存在するβシート構造と連結させて、融合タンパク質を得た。【００８２】
ｓｃＦｖは、抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域とをフレキシブルなリンカーで連結した構造を有するタンパク質である。抗体から遺伝子工学的手法により作製する場合には、当該抗体の結合特性を維持させることができる。現在では、ｓｃＦｖをファージディスプレイで作製する手法が周知であり、これにより所望の抗原に対して所望の結合特性を有するｓｃＦｖを入手することができる。【００８３】
ｃｐ−ｓｆＧＦＰとしては、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するｓｆＧＦＰの円順列変異体を用いた。ｓｃＦｖとしては、配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有する、非筋ミオシンＩＩＡに結合するｓｃＦｖを用いた。遺伝子工学的手法によって、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するｓｆＧＦＰのＮ末端のβシート構造と、配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖのＣ末端のβシート構造とを直接的に連結させて、配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有する融合タンパク質を設計した。配列番号２１に記載のアミノ酸配列は、Ｎ末端にＨｉｓタグとＴ７タグを有する。この融合タンパク質の予想される立体構造は図９Ａにされる。ｓｃＦｖの融合タンパク質の抗原認識部位は、融合させたｃｐ−ｓｆＧＦＰとは反対側に露出しており、抗原認識部位に対する抗原の接近可能性は担保された。【００８４】
設計した融合タンパク質をコードするＤＮＡを適切なプロモーター下に配置した発現ベクターをリポフェクション法（アバランシェ−エブリデートランスフェクション試薬）によって導入することにより、ＨｅＬａ細胞に上記融合タンパク質を発現させた。蛍光偏光顕微鏡下で融合タンパク質を発現した細胞を観察した。結果は、図９Ｂに示される通りであった。図９Ｂに示されるように、観察偏光面が横であるときに蛍光強度が弱く観察される部分が、観察偏光面が縦であるときに蛍光強度が強く観察される一方で、観察偏光面が横であるときに蛍光強度が強く観察される部分が、観察偏光面が縦であるときに弱く観察される様子が認められた。このように、作製した融合タンパク質は、ミオシンを染色することができた上に、その蛍光は偏光を示した。【００８５】
さらに、ｓｃＦｖ（配列番号２０）とｃｐ１７６−１７２ｍＶｅｎｕｓ（配列番号３０）とをＶＶを介して連結した融合タンパク質（配列番号３２）を設計し（図９Ｃの上のパネル参照）、同様にＨｅＬａ細胞に発現させた。蛍光偏光顕微鏡下で融合タンパク質を発現した細胞を観察したところ、図９Ｃに示されるように、細胞内のミオシンを観察することができ、かつ、その蛍光は偏光を示した。その偏光の方向は、先のｃｐ−ｓｆＧＦＰの場合と異なっていた。本実施例のｃｐ−ｓｆＧＦＰとｃｐ１７６−１７２ｍＶｅｎｕｓとは、基本的に同じタイプの蛍光タンパク質であるが、ｃｐの位置において相違する。従って、本実施例では、様々な場所で蛍光タンパク質の円順列変異体を作成することで、偏光の角度を変えることができることが示された。【００８６】
このように、ｓｃＦｖのＣ末端のβシート構造を利用し、蛍光タンパク質のＮ末端に存在するβシート構造と連結させることにより、偏光性を喪失することなく、ｓｃＦｖの蛍光タンパク質標識が可能であることが明らかである。【００８７】
実施例９：アフィマーとｍＳｃａｒｌｅｔの融合タンパク質の設計と観察
ｍＳｃａｒｌｅｔのＮ末端を削り、アフィマーのＣ末端のβシートと連結させて、アフィマーとｍＳｃａｒｌｅｔとの融合タンパク質を得た。ｍＳｃａｒｌｅｔとしては、Ｎ末端のアミノ酸を削り込んで作成した配列番号３６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質を用いた。アフィマーとしては、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するアクチンに結合するアフィマーを用いた。遺伝子工学的手法によって、これらを連結させ、配列番号３７に記載されたアミノ酸配列を有する融合タンパク質を設計した。【００８８】
得られた融合タンパク質は、図１１に記載の３次元構造モデルにより示されている。設計した融合タンパク質をコードするＤＮＡを適切なプロモーター下に配置した発現ベクターをリポフェクション法（リポフェクタミン３０００試薬）によって導入することにより、ＨｅＬａ細胞に上記融合タンパク質を発現させた。蛍光偏光顕微鏡下で融合タンパク質を発現した細胞を観察した。【００８９】
結果は、図１１に示される通りであった。図１１に示されるように、縦の偏光および横の偏光による観察像が異なる結果となり、このことから、得られた融合タンパク質は、偏光顕微鏡観察下において抗原（アクチン）に結合して偏光を示す蛍光タンパク質であることが明らかとなった。【００９０】
実施例１０：アフィマーとｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎの融合タンパク質の設計と観察
ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎのＮ末端のβシートを露出させ、アフィマーのＣ末端のβシートと連結させて、アフィマーとｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎとの融合タンパク質を得た。ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎとしては、Ｎ末端のアミノ酸を削り込んで作成した配列番号３８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質を用いた。アフィマーとしては、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するアクチンに結合するアフィマーを用いた。遺伝子工学的手法によって、これらを連結させ、配列番号３９に記載されたアミノ酸配列を有する融合タンパク質を設計した。【００９１】
得られた融合タンパク質は、図１２に記載の３次元構造モデルにより示されている。図１２では、アフィマーのＣ末端のβシートと、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎのＮ末端のβシートが一連のβシートを形成しているようすが認められる。設計した融合タンパク質をコードするＤＮＡを適切なプロモーター下に配置した発現ベクターをリポフェクション法（リポフェクタミン３０００試薬）によって導入することにより、ＨｅＬａ細胞に上記融合タンパク質を発現させた。蛍光偏光顕微鏡下で融合タンパク質を発現した細胞を観察した。【００９２】
結果は、図１２に示される通りであった。図１２に示されるように、縦の偏光および横の偏光による観察像が異なる結果となり、このことから、得られた融合タンパク質は、偏光顕微鏡観察下において抗原（アクチン）に結合して偏光を示す蛍光タンパク質であることが明らかとなった。【００９３】
実施例１１：タンパク質にＡＬＦＡタグを導入して偏光蛍光観察をする手法
本実施例では、観察対象のタンパク質に対する結合タンパク質を取得することなく、当該タンパク質の蛍光偏光観察を可能とする手法の構築を試みた。具体的には、観察対象のタンパク質をＡＬＦＡタグ（アルファタグ）で標識し、ＡＬＦＡタグに結合するナノボディでこれを検出する系を構築した。【００９４】
具体的には、上記検出系の検証のためのモデル系として、Ｆ−アクチンに結合するアフィマー（配列番号２）にＡＬＦＡタグ（配列番号４０）を導入して、配列番号４１に記載のアミノ酸配列を有する融合タンパク質を得た。この融合タンパク質の３次元構造モデルは、図１３に示される通りであった。この融合タンパク質をＨｅＬａＭ細胞に発現させた。これに対して、抗ＡＬＦＡタグナノボディ（配列番号４２）とｃｐ１７６−１７２ｍＶｅｎｕｓの融合タンパク質（配列番号４３）と接触させ、蛍光偏光観察を行った。抗ＡＬＦＡタグナノボディとｃｐ１７６−１７２ｍＶｅｎｕｓの融合タンパク質は、ナノボディとｃｐ１７６−１７２ｍＶｅｎｕｓとが硬く連結した融合タンパク質であり、蛍光偏光観察に適したものである（参考：実施例５）。【００９５】
結果は、図１３に示される通りであった。図１３に示されるように、縦の偏光および横の偏光による観察像が異なる結果となり、このことから、得られた融合タンパク質は、偏光顕微鏡観察下において抗原（アクチン）に結合して偏光を示す蛍光タンパク質であることが明らかとなった。本実施例の実施形態においてはまず、Ｆ−アクチンをアフィマーが硬く認識している。次に、アフィマーとＡＬＦＡタグが硬く連結しており、かつ、ＡＬＦＡタグをナノボディが硬く認識している。これにより、いずれのタンパク間相互作用も、タンパク質間の連結も硬いものとなっていて、Ｆ−アクチンをｃｐ１７６−１７２ｍＶｅｎｕｓの蛍光偏光を用いて観察できたということが結論できた。【００９６】
実施例１２：他の実施例
その他、以下表１の融合タンパク質を設計して同様に蛍光偏光標識が可能かを確認した。下記のいずれにおいても、抗原を蛍光標識することができた上に、その蛍光は明らかに偏光を示し、蛍光偏光標識として利用可能であることが確認された。また、抗原結合タンパク質としてアフィマー、ナノボディ、およびｓｃＦｖを用いることができた。なお、表１において、ユトロフィンは、アクチンに結合するタンパク質として知られたタンパク質である。
【表１】
2020175502.tif 000002
【００９７】
以上の通り、本実施例で設計した融合タンパク質は、いずれも抗原の蛍光観察に適する上に、いずれも蛍光の偏光観察に適していた。偏光観察においては、蛍光標識と抗原とが硬く（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）に連結していることが有利であると考えられる。【００９８】
本実施例の結果によれば、蛍光偏光標識をする際に、蛍光タンパク質もしくは蛍光標識されるタグタンパク質の末端のヘリックス構造と抗原結合タンパク質の末端のヘリックス構造とを連結させること、および蛍光タンパク質の末端のβシート構造と抗原結合タンパク質の末端のβシート構造とを連結させることが有効であり得る。また、末端にヘリックスまたはβシート構造を有しない蛍光タンパク質に関しては、例えば、末端にヘリックスまたはβシート構造を有するように蛍光タンパク質の円順列変異体を作製することは、有用なタンパク質改変技術であり得る。
さらには、ヘリックス同士は、直接連結してもよく、ヘリックス構造を有しうるリンカーを介して連結してもよいことが明らかとなった。ヘリックス構造を有しうるリンカーを介して連結する場合には、その長さを１アミノ酸変更することによって、融合タンパク質における２つのタンパク質部分の結合角を約１００度回転させることができ、融合タンパク質の作製技術の戦略の幅を広げるものとなり得る。また、βシート構造同士を連結する場合にも、直接連結してもよく、末端を削除して連結してもよく、または、バリン（Ｖ）などの硬いアミノ酸残基を介して連結してもよいことが明らかとなった。偏光観察においては、蛍光標識と抗原とが硬く（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）に連結していることが有利であるが、偏光観察に対しては、本実施例で示した様々な連結方法がいずれも有効であることが明らかとなった。【００９９】
配列表
配列番号１：ｃｐ−ｓｆＧＦＰのアミノ酸配列の一例
配列番号２：アクチンに結合するアフィマーのアミノ酸配列の一例
配列番号３：ヘリックスリンカーのアミノ酸配列の一例
配列番号４：ｃｐ−ｓｆＧＦＰとアフィマーとの融合タンパク質のアミノ酸配列の一例
配列番号５：ｃｐｍＶｅｎｕｓのアミノ酸配列の一例
配列番号６：ｃｐｍＶｅｎｕｓとアフィマーとの融合タンパク質のアミノ酸配列の一例
配列番号７：ｃｐｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２のアミノ酸配列の一例
配列番号８：ｃｐｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２とアフィマーとの融合タンパク質のアミノ酸配列の一例
配列番号９：ハロタグのアミノ酸配列の一例
配列番号１０：ヘリックスリンカー２のアミノ酸配列の一例
配列番号１１：ハロタグとアフィマーとの融合タンパク質のアミノ酸配列の一例
配列番号１２：ヘリックスリンカー３のアミノ酸配列の一例
配列番号１３：ハロタグとアフィマーとの融合タンパク質のアミノ酸配列の一例
配列番号１４：ヘリックスリンカー４のアミノ酸配列の一例
配列番号１５：ハロタグとアフィマーとの融合タンパク質のアミノ酸配列の一例
配列番号１６：ビメンチンに結合するナノボディのアミノ酸配列の一例
配列番号１７：ナノボディとｃｐ−ｓｆＧＦＰとの融合タンパク質のアミノ酸配列の一例
配列番号１８：ｍＡｐｐｌｅのアミノ酸配列
配列番号１９：ナノボディとｍＡｐｐｌｅとの融合タンパク質のアミノ酸配列の一例
配列番号２０：非筋ミオシンＩＩＡに結合するｓｃＦｖのアミノ酸配列の一例
配列番号２１：ｓｃＦｖとｃｐ−ｓｆＧＦＰとの融合タンパク質のアミノ酸配列の一例
配列番号２２：ｍｉＲＦＰ６７０のアミノ酸配列
配列番号２３：ヘリックスリンカー５のアミノ酸配列の一例
配列番号２４：ｍｉＲＦＰ６７０とアフィマーとの融合タンパク質のアミノ酸配列の一例
配列番号２５：ナノボディとｃｐｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２との融合タンパク質のアミノ酸配列の一例
配列番号２６：ナノボディとｃｐｍＶｅｎｕｓとの融合タンパク質のアミノ酸配列の一例
配列番号２７：ｓｃＦｖとｃｐｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２との融合タンパク質のアミノ酸配列の一例
配列番号２８：Ｈａｌｏａｌｋａｎｅ  ｄｅｈａｌｏｇｅｎａｓｅのアミノ酸配列
配列番号２９：Ｈａｌｏａｌｋａｎｅ  ｄｅｈａｌｏｇｅｎａｓｅのＨ２７２Ｆ変異体のアミノ酸配列
配列番号３０：ｃｐ１７６−１７２ｍＶｅｎｕｓのアミノ酸配列の一例
配列番号３１：ナノボディとｃｐ１７６−１７２ｍＶｅｎｕｓとの融合タンパク質のアミノ酸配列の一例
配列番号３２：ｓｃＦＶとｃｐ１７６−１７２ｍＶｅｎｕｓとの融合タンパク質のアミノ酸配列の一例
配列番号３３：ユトロフィンのアクチン結合部位のアミノ酸配列の一例
配列番号３４：ｍＥＧＦＰのアミノ酸配列の一例
配列番号３５：ユトロフィンのアクチン結合部位とｍＥＧＦＰとの融合タンパク質のアミノ酸配列の一例
配列番号３６：Ｎ末端を切除したｍＳｃａｒｌｅｔの断片のアミノ酸配列の一例
配列番号３７：アクチンに結合するアフィマーとｍＳｃａｒｌｅｔとの融合タンパク質のアミノ酸配列の一例
配列番号３８：Ｎ末端を切除したｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎの断片のアミノ酸配列の一例
配列番号３９：アクチンに結合するアフィマーとｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎとの融合タンパク質のアミノ酸配列の一例
配列番号４０：ＡＬＦＡタグのアミノ酸配列の一例
配列番号４１：ＡＬＦＡタグが導入されたアフィマーのアミノ酸配列の一例
配列番号４２：抗ＡＬＦＡタグナノボディのアミノ酸配列の一例
配列番号４３：抗ＡＬＦＡタグナノボディとｃｐ１７６−１７２ｍＶｅｎｕｓとの融合タンパク質のアミノ酸配列の一例
【図１Ａ】
2020175502.tif 000003
【図１Ｂ】
2020175502.tif 000004
【図１Ｃ】
2020175502.tif 000005
【図２】
2020175502.tif 000006
【図３】
2020175502.tif 000007
【図４】
2020175502.tif 000008
【図５】
2020175502.tif 000009
【図６Ａ】
2020175502.tif 000010
【図６Ｂ】
2020175502.tif 000011
【図６Ｃ】
2020175502.tif 000012
【図７Ａ】
2020175502.tif 000013
【図７Ｂ】
2020175502.tif 000014
【図７Ｃ】
2020175502.tif 000015
【図８Ａ】
2020175502.tif 000016
【図８Ｂ】
2020175502.tif 000017
【図９Ａ】
2020175502.tif 000018
【図９Ｂ】
2020175502.tif 000019
【図９Ｃ】
2020175502.tif 000020
【図１０】
2020175502.tif 000021
【図１１】
2020175502.tif 000022
【図１２】
2020175502.tif 000023
【図１３】
2020175502.tif 000024
【図１４】
2020175502.tif 000025
【配列表】
2020175502000001.app
【国際調査報告】
2020175502.tif 000026
2020175502.tif 000027
2020175502.tif 000028
2020175502.tif 000029