(57)【要約】【課題】副作用が少なく、優れた抗腫瘍効果を有する天然植物由来の医薬組成物及びその吸引投与剤の提供を目的とする。【解決手段】ヒノキ科アスナロ属の針葉樹であるヒバ（Thujopsis dolabrata）由来の精油又は当該精油の揮発性成分を含有する点に特徴がある。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒノキ科アスナロ属の針葉樹であるヒバ（Thujopsis dolabrata）由来の精油又は当該精油の揮発性成分を含有する抗腫瘍医薬組成物。
【請求項２】
ヒノキ科アスナロ属の針葉樹であるヒバ（Thujopsis dolabrata）由来の精油の揮発性成分からなる、癌の治療又は予防のために使用する吸引投与剤。
【請求項３】
前記吸引投与する方法は室内の生活空間に前記ヒバ由来の精油又はその揮発性成分を噴霧するものである請求項２記載の吸引投与剤。
【請求項４】
前記吸引投与する方法は前記ヒバ由来の精油が含まれたヒバ精油揮発性成分の発生材をマスクに保持させることを特徴とする請求項２記載の吸引投与剤。
【請求項５】
前記ヒバ由来の精油の揮発性成分にはツヨプセンが含まれていることを特徴とする請求項２記載の吸引投与剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胃癌，大腸癌，乳癌等の多くの癌に対して、抗腫瘍効果を有する天然植物由来の抗腫瘍医薬組成物及び癌の治療、予防に用いられる吸引投与剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒノキ科アスナロ属に属するヒバ：檜葉は、和名がアスナロであり、学名はＴｈｕｊｏｐｓｉｓ  ｄｏｌａｂｒａｔａである。
ヒバは、日本固有の針葉樹であり、青森県内に存在する青森ヒバと、石川県の能登半島に広く分布する能登ヒバが広く知られている。【０００３】
ヒバから抽出されるヒバ精油には、ヒノキチオールが含まれており、ヒノキチオールは低毒性で、クラミジア，ＭＲＳＡ，カンジタ等に対する抗菌作用を有し、防腐作用を有していることが報告されている（非特許文献１〜３）。
この特性を活かして、人工的に合成された合成ヒノキチオールが歯磨き剤，化粧品，整髪剤，食用防腐剤等に利用されている。
ヒバ精油には、ヒノキチオール以外の成分、例えばβ−Ｄｏｌａｂｒｉｎ，γ−Ｔｈｕｊａｐｌｉｃｉｎ，４−Ａｃｅｔｙｌｔｒｏｐｌｏｎｅ等が含まれ、ストレス抑制効果（非特許文献４）やＩｇＡを介する免疫増強作用（非特許文献５）等が報告されている。【０００４】
ヒバ精油に含まれるヒノキチオールの抗腫瘍効果としては、非特許文献６に前立腺癌細胞に対しての抗腫瘍効果を示し、非特許文献７に肺癌細胞に対しての細胞死を誘導する効果が開示されている。
本発明者は、ヒバ精油にはヒノキチオール以外の揮発性成分も含まれていることに着目し、その相乗効果を胃癌細胞について比較した（非特許文献８）。
本発明者は、さらに詳細に研究した結果、本発明に至った。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Yamano H. Yamazaki T. Sato K. Shiga S. Hagiwara T. Ouchi K. Kishimoto T. In vitro inhibitory effects of hinokitiol on proliferation of Chlamydia trachomatis. Antimicrobial agents and chemotherapy. 2005; 49(6): 2519-2521. doi:10.1128/AAC.49.6.2519-2521.
【非特許文献２】Shih YH. Chang KW. Hsia SM et al. In vitro antimicrobial and anti cancer potential against oral pathogens and oral cancer cell lines. Microbiological Res. 2013; 168:254-262.
【非特許文献３】Komaki N. Watanabe T. Ogasawara A et al. Antifungal mechanism of Hinokitiol against Candida Albicans. 2008; Biol. Pharm. Bull. 31(4): 735-737.
【非特許文献４】Matsusaka T. Yamaguchi T. Zaike Y et al. Reduction of the chronic stress response by inhalation of hiba (Thujopsis dolabrata) essential oil in rats. Bioscience, Biotec. Biochem.. 2014; 78(7): 1135-1139.
【非特許文献５】Otsu R. The effect of transient inhalation of systhetic Hinokitiol (HT) on the mood of humans and salivary secretion of chromogranin A (CgA) and Immunoglobulin A (IgA). Autonomic Neurons System. 2005; 42: 337-343.
【非特許文献６】Liu S, Yamauchi H (2006) Hinokitiol, a metal chelator derived from natural plants, suppresses cell growth and disrupts androgen receptor signaling in prostate carcinoma cell lines. Biochem Biophys Res Commun 351(1): 26-32. doi: 10.1016/j.bbrc.2006.09.166
【非特許文献７】Li LH, Wu P, Lee JY, Li PR, Hsieh WY, Ho CC, Chen WJ, Wang CC, Hinokitiol Induces DNA Damage and Autophagy followed by Cell Cycle Arrest and Senescence in Gefitinib-Resistant Lung Adenocarcinoma Cells. PLOS one. 2014; DOI: 10.1371/joural.pone.0104203.
【非特許文献８】Nagata T, Fujino Y, Toume K, Xiao Long L, Yamaguchi T, Okumura T, Komatsu K and Shimada Y. Anti-cancer effect in volatile components of Hiba essential oil (Thujopsis dolablata). Clin Exp Pharmacol. 2016. Doi: 10.4172/2161-1459.1000214.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、副作用が少なく、優れた抗腫瘍効果を有する天然植物由来の医薬組成物及びその吸引投与剤の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明に係る抗腫瘍医薬組成物は、ヒノキ科アスナロ属の針葉樹であるヒバ（Thujopsis dolabrata）由来の精油又は当該精油の揮発性成分を含有する点に特徴がある。【０００８】
ここでヒバは、日本国内に分布しているいずれのヒバであってよく、能登ヒバであってもよい。
精油を抽出する方法は、ヒバの木材をチップ状にして抽出槽に投入し、この抽出槽に水蒸気を通過させる水蒸気蒸留法を用いることができる。
また、ヒバの木材を熱水で処理する熱水抽出方法でもよい。
得られた抽出液は、水と精油に蒸留分離することでヒバ精油が得られる。
ヒバ精油は、各種保存剤，添加剤等と混合し、医薬組成物（医薬品）とすることができる。【０００９】
本発明に係る癌の治療又は予防のために使用する吸引投与剤は、ヒノキ科アスナロ属の針葉樹であるヒバ（Thujopsis dolabrata）由来の精油の揮発性成分を有することを特徴とする。
ここで、吸引投与する方法は室内の生活空間に前記ヒバ由来の精油又はその揮発性成分を噴霧する方法や、前記ヒバ由来の精油が含まれたヒバ精油揮発性成分の発生材をマスクに保持させる方法が例として挙げられる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係る医薬組成物は、経口投与，注射による投与でもよいが、揮発性成分が多く含まれることから、ヒバ精油を噴霧等にて吸引投与することも効果的である。【００１１】
ヒバ精油及びその揮発性成分は、ヒノキチオール単独よりも抗腫瘍効果が高く、詳細は後述するが胃癌のみならず、大腸癌，食道癌及び乳癌等の増殖が抑制されることが確認できた。
ヒバ精油には、ヒノキチオール以外の成分として、ツヨプセンを含有していることも確認できた。
また、この効果は、それぞれの抗癌剤と併用することで、抗癌剤の使用を減らすことができることも確認できた。
これにより、従来の抗癌剤の服用による副作用を低減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ヒバ精油による各癌細胞の増殖能の変化をＭＴＴアッセイを用いて評価した結果を示す。（ａ）は胃癌、（ｂ）は乳癌、（ｃ）は食道癌、（ｄ）は大腸癌の試験結果を示す。
【図２】癌細胞の顕微鏡写真を示す。
【図３】ヒバ精油とヒノキチオールとの抗腫瘍作用の比較結果を示す。
【図４】ヒバ精油と抗癌剤（５−ＦＵ）の併用結果を示す。
【図５】ヌードマウスの胃癌細胞腹膜播種転移モデルにおける転移抑制作用の比較結果を示す。
【図６】ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図７】ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
能登ヒバ由来の水蒸気蒸留法によるヒバ精油を用いて各試験評価を実施したので、以下説明する。
【００１４】
＜試験１＞
ヒバ精油に２〜１０ｇ／ｍｌのＤＭＳＯ（ジメチルスルヒキシド）を加えて試験溶液とし、−２０℃にて保存した。
胃癌細胞株（ＭＫＮ４５：American Type Culture Collection），乳癌細胞株（MCF7 : American Type Culture Collection），食道癌細胞株（KYSE520 :established in Kyoto University），大腸癌細胞株（DLD1 :American Type Culture Collection）をそれぞれ５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地で培養した。
それぞれの癌細胞を１００Ｌ当たり１×１０４個の密度にて、９６ウェルプレートに播種し、これに２μｇ／ｍｌの濃度のヒバ精油を添加し、３７℃で１〜７２時間インキュベートした。
なお、コントロールには、ＤＭＳＯ溶液を添加した。
次に、ＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド］を各ウェルに添加し、３７℃で４時間インキュベートした後に、視覚化溶液を各ウェルに加え、さらに３７℃にて一晩インキュベートした。
次に、波長４５０ｎｍにて各ウェルの吸光度を多機能プレートリーダー（Ｆｉｌｔｅｒ  Ｍａｘ  ５Ｆ：Molecular Devices Wokingham - Berkshire UK）を用いて測定した。
それに基づいて得られた細胞生存率の時間経過を図１のグラフに示す。
このグラフからヒバ精油は、時間依存的に各癌細胞の増殖を抑制していることが明らかになった。
【００１５】
７２時間後の癌細胞の様子を、ヒバ精油を投与したものとコントロールとを顕微鏡観察した結果を図２の写真に示す。
ヒバ精油を投与したものは、コントロールと比較して細胞数が減少し、核の凝集等アポトーシス様の変化が確認できた。
【００１６】
＜試験２＞
試験１と同様にＭＴＴアッセイを用いて、能登ヒバ精油と比較して液体ヒノキチオールとをウェルに、０．０００６，０．００２，０．００６，０．０２，０．０６，０．２，０．６，２μｇ／ｍｌを加え、３７℃，６０時間のインキュベートした生存能の評価結果を図３のグラフに示す。
このことから、ヒノキチオール単独よりも能登ヒバ精油の方が抗腫瘍効果に優れていることが明らかになった。
【００１７】
＜試験３＞
試験１と同様のＭＴＴアッセイを用いて、能登ヒバ精油０．２μｇ／ｍｌ投与したもの、抗癌剤５−ＦＵ：５−フルオロウラシルを１０ｎＭ投与したもの、上記抗癌剤を１／３にして、それに能登ヒバ精油０．２μｇ／ｍｌ添加した物を３７℃，６０時間インキュベートした結果を図４に示す。
抗癌剤を１／３に減量しても優れた抗腫瘍効果を示すことが明らかになった。
【００１８】
＜試験４＞
４週齢のヌードマウスの腹腔内に、胃癌細胞（ＭＫＮ４５）を動物あたり２×１０６個の量を注入し、１０匹の腹膜播種転移モデルを作成した。
これをヒバ精油群とコントロール群の２つの群に分け、ヒバ精油群には飼育ケージ内にヒバ精油を入れた皿をマウスから分離した状態でセットした。
２４時間毎に新しいヒバ精油に交換し、吸引投与しながら４週間飼育した。
コントロール群は、無臭の別室にて４週間飼育した。
４週間後にそれぞれのマウスを犠死させ、腹膜播種転移個数を比較した結果を図５に示す。
このことからヒバ精油群は、コントロール群に比較して、有意に腹膜播種転移個数が減少していた。
【００１９】
ヒバ精油には、ヒノキチオール以外の揮発性成分が含まれ、ヒノキチオール単独よりも抗腫瘍効果が高いことが試験２にて明らかになった。
そこで本発明者らは、ヒバ精油に含まれるヒノキチオール以外の成分にどのような成分が含まれているかを調査し、その中でもツヨプセン（Ｔｈｕｊｏｐｓｅｎｅ）に着目し、次のような実験を行った。
ヒト胃癌培養細胞株ＭＫＮ４５から試薬Ｍ−ＰＥＲ（Ｔｈｅｒｍｏ製）を用いて、細胞溶解液を作成した。
Ｌｙｓａｔｅの濃度は、３．７１６ｍｇ／ｍｌであった。
上記Ｌｙｓａｔｅを用いて、ＤＡＲＴＳ反応試験を行った。
ＤＡＲＴＳ（drug affinity responsive target stability）法は、タンパクが化合物と結合すると構造が変化するため、タンパク分解酵素による分解能に変化が生じることを利用して、化合物が直接結合するタンパクを同定する方法である。
上記、Ｌｙｓａｔｅ（５μｇ分）１．４μｌにＤＭＳＯで希釈したツヨプセンを１０ｍＭの濃度になるように加え、室温にて３０分放置した。
なお、コントロールとしてツヨプセンを加えないものを用いた。
次に、タンパク質分解酵素としてＴｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎを加えて、３７℃，３０ｍｉｎ反応させた。
その後に所定の前処理を行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果を図６に示す。
ツヨプセン１０ｍＭ添加したものの方が、コントロールよりも弱くなった図６にて矢印で示したバンドの部分を切り取り、ｎａｎｏＬＣ−ＭＳ解析をしたところ、この部分はＰＫＭ２（pyruvate kinase isoenzyme M2）に相当していた。
確認のため、このバンド部分のタンパクを分離し、ＰＫＭ２の抗体でwestern blottingを行った結果を図７のグラフに示す。
このことから、ヒバ精油中のツヨプセンは、抗腫瘍作用を有していることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００２０】
ヒバ由来の精油又はその揮発成分には抗腫瘍効果が認められたので、癌の治療薬及び予防薬としての利用が期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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