(57)【要約】  本発明は、心不全患者の心機能回復可能性の評価方法の提供を目的とする。本発明はまた、心不全患者から非薬物治療が必要な患者を特定する方法と、心不全患者から薬物治療により良好な効果があると予測される患者を特定する方法の提供を目的とする。本発明によれば、心筋細胞のＤＮＡ損傷の程度を測定する工程を含んでなる、心不全患者の心機能回復可能性の評価方法が提供される。本発明によればまた、心筋細胞のＤＮＡ損傷の程度を測定する工程を含んでなる、心不全患者から非薬物治療が必要な患者を特定する方法と心不全患者から薬物治療により良好な効果があると予測される患者を特定する方法が提供される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
心筋細胞のＤＮＡ損傷の程度を測定する工程を含んでなる、心不全患者の心機能回復可能性の評価方法。
【請求項２】
心筋細胞のＤＮＡ損傷の程度が心不全患者の心機能回復可能性と相関する、請求項１に記載の評価方法。
【請求項３】
ＤＮＡ損傷の程度をＤＮＡ損傷マーカーに基づいて測定する、請求項１または２に記載の評価方法。
【請求項４】
ＤＮＡ損傷の程度が、心筋細胞におけるＤＮＡ損傷マーカー陽性核数の総核数に対する割合で示される、請求項３に記載の評価方法。
【請求項５】
ＤＮＡ損傷マーカーを免疫学的分析により検出する、請求項３または４に記載の評価方法。
【請求項６】
心筋細胞におけるＤＮＡ損傷マーカーの存在が、心機能回復可能性が低いことを示す、請求項３〜５のいずれか一項に記載の評価方法。
【請求項７】
心不全患者の心筋生検検体を用いてＤＮＡ損傷の程度を測定する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の評価方法。
【請求項８】
心不全患者が心筋症患者である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の評価方法。
【請求項９】
心筋症患者が拡張型心筋症患者である、請求項８に記載の評価方法。
【請求項１０】
心不全患者の治療方針決定に用いるための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の評価方法。
【請求項１１】
心不全患者から非薬物治療が必要な患者を特定する方法であって、心不全患者における心筋細胞のＤＮＡ損傷の程度を測定する工程を含んでなる、方法。
【請求項１２】
非薬物治療が外科的治療または再生医療である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
外科的治療が心臓移植、補助人工心臓の植込み手術またはデバイス治療である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
心不全患者から薬物治療により良好な効果があると予測される患者を特定する方法であって、心不全患者における心筋細胞のＤＮＡ損傷の程度を測定する工程を含んでなる方法。
【請求項１５】
心不全患者の治療方法であって、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法を実施して心不全患者から非薬物治療が必要な患者を特定する工程と、該患者に対して非薬物治療を実施する工程とを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の参照】
【０００１】
本願は、先行する米国特願６２／７８１，９２７（出願日：２０１８年１２月１９日）の優先権の利益を享受するものであり、その開示内容全体は引用することにより本明細書の一部とされる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、心筋細胞のＤＮＡ損傷の程度を指標とする心不全患者の心機能回復可能性の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
心不全は世界中で推定３千８百万人の患者が罹患しており、過去数十年にわたって心血管療法が進歩しているにもかかわらず、罹患率および死亡率の主な原因である。心不全の病因として、拡張型心筋症（ＤＣＭ）は一般的なものである。ＤＣＭは、左室拡大と収縮機能障害によって診断されるが、圧負荷や冠動脈疾患といった心筋機能障害は伴っていない。β遮断薬やレニン・アンジオテンシン・アルドステロン系阻害剤、心臓再同期療法などの一般的な治療は、ＤＣＭ患者の一部において左室容積の減少および収縮機能の改善を特徴とする左室リバースリモデリング（ＬＶＲＲ）を導くが、多くのＤＣＭの臨床試験では左室駆出率（ＬＶＥＦ）の増加と左室拡張末期容積および左室収縮末期容積の減少とともに死亡率が減少することが報告されている（非特許文献１〜３）。【０００４】
ＬＶＲＲはＤＣＭ患者の約４０％でのみ生じるため、治療方針を決定するにあたっては、ＬＶＲＲの可能性を有する患者を早い段階で特定することが重要となる（非特許文献１および２）。これまでにも、ＤＣＭ患者のＬＶＲＲ予測因子を同定する試みが数多くなされており、例えば、血行動態パラメーター（血圧など）や心エコー検査によるパラメーター（左室拡張末期径など）、心臓磁気共鳴のガドリニウム後期増強によって評価される間質性線維症がＬＶＲＲの有用な予測因子として報告されている（非特許文献４〜６）。しかしながら、血圧測定や心エコー検査などの一般的な検査はＬＶＲＲの強力な予測因子ではなく、心臓磁気共鳴による後期ガドリニウム増強評価は偽陽性の問題を抱えており腎機能障害の患者では実施することができない。したがって、ＤＣＭ患者の心機能回復を予測する精度の高い方法を未だ欠いている状況にある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Merlo M et al, J Am Coll Cardiol 2011;57:1468-76.
【非特許文献２】Matsumura Y et al, Am J Cardiol 2013;111:106-10.
【非特許文献３】Merlo M et al, J Am Heart Assoc 2015;4:e001504.
【非特許文献４】McNamara DM et al, J Am Coll Cardiol 2011;58:1112-8.
【非特許文献５】Kubanek M et al, J Am Coll Cardiol 2013;61:54-63.
【非特許文献６】Broch K et al, Am J Cardiol 2015;116:952-9.
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、心不全患者の心機能回復可能性の評価方法の提供を目的とする。本発明はまた、心不全患者から非薬物治療が必要な患者を特定する方法と、心不全患者から薬物治療により良好な効果があると予測される患者を特定する方法と、心不全患者の治療方法の提供を目的とする。
【０００７】
本発明者らは、心筋細胞のＤＮＡ損傷に着目して鋭意研究を進めていたところ、心不全患者のうち心機能回復に至らなかった患者の生検検体では心筋細胞のＤＮＡ損傷の程度が心機能を回復した患者に対して有意に高いことを見出した。本発明者らはまた、心筋細胞のＤＮＡ損傷の程度を指標として心不全患者の心機能回復可能性を評価できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づくものである。
【０００８】
本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］心筋細胞のＤＮＡ損傷の程度を測定する工程を含んでなる、心不全患者の心機能回復可能性の評価方法。
［２］心筋細胞のＤＮＡ損傷の程度が心不全患者の心機能回復可能性と相関する、上記［１］に記載の評価方法。
［３］ＤＮＡ損傷の程度をＤＮＡ損傷マーカーに基づいて測定する、上記［１］または［２］に記載の評価方法。
［４］ＤＮＡ損傷の程度が、心筋細胞におけるＤＮＡ損傷マーカー陽性核数の総核数に対する割合で示される、上記［３］に記載の評価方法。
［５］ＤＮＡ損傷マーカーを免疫学的分析により検出する、上記［３］または［４］に記載の評価方法。
［６］心筋細胞におけるＤＮＡ損傷マーカーの存在が、心機能回復可能性が低いことを示す、上記［３］〜［５］のいずれかに記載の評価方法。
［７］心不全患者の心筋生検検体を用いてＤＮＡ損傷の程度を測定する、上記［１］〜［６］のいずれかに記載の評価方法。
［８］心不全患者が心筋症患者である、上記［１］〜［７］のいずれかに記載の評価方法。
［９］心筋症患者が拡張型心筋症患者である、上記［８］に記載の評価方法。
［１０］心不全患者の治療方針決定に用いるための、上記［１］〜［９］のいずれかに記載の評価方法。
［１１］心不全患者から非薬物治療が必要な患者を特定する方法であって、心不全患者における心筋細胞のＤＮＡ損傷の程度を測定する工程を含んでなる、前記方法。
［１２］非薬物治療が外科的治療または再生医療である、請求項１１に記載の方法。
［１３］外科的治療が心臓移植、補助人工心臓の植込み手術またはデバイス治療である、請求項１２に記載の方法。
［１４］心不全患者から薬物治療により良好な効果があると予測される患者を特定する方法であって、心不全患者における心筋細胞のＤＮＡ損傷の程度を測定する工程を含んでなる方法。
［１５］心不全患者の治療方法であって、上記［１１］〜［１３］のいずれかに記載の方法を実施して心不全患者から非薬物治療が必要な患者を特定する工程と、該患者に対して非薬物治療を実施する工程とを含む、前記方法。
【０００９】
本発明によれば、心不全患者の心筋細胞のＤＮＡ損傷の程度を測定することで、心不全患者の心機能回復可能性を評価することができる。これによって、心機能回復可能性が低いと評価された心不全患者に対して心臓移植や補助人工心臓の植込みなどの治療方針を早期に決定することができる点で有利である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ＬＶＲＲ陽性患者またはＬＶＲＲ陰性患者のＰＡＲまたはγ−Ｈ２Ａ．Ｘで染色された核の蛍光強度の分布の例をそれぞれ示す。
【図２】図２は、ＬＶＲＲ陰性患者とＬＶＲＲ陽性患者の生検検体におけるＰＡＲ染色の画像の例を示す。図２Ａ−ＤはＰＡＲによる染色の生画像を示し、図２ＥおよびＦはハイブリッド細胞数プログラムによる自動判定後の同じ画像を示す。小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）は細胞膜を、４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）は核をそれぞれ標識している。スケールバー＝５０μｍ。
【図３】図３は、ＬＶＲＲ陰性患者とＬＶＲＲ陽性患者の生検検体におけるγ−Ｈ２Ａ．Ｘ染色の画像の例を示す。図３Ａ−Ｄはγ−Ｈ２Ａ．Ｘによる染色の生画像を示し、図３ＥおよびＦはハイブリッド細胞数プログラムによる自動判定後の同じ画像を示す。小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）は細胞膜を、４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）は核をそれぞれ標識している。スケールバー＝５０μｍ。
【図４】図４は、ＰＡＲとγ−Ｈ２Ａ．Ｘの免疫染色の画像およびＰＡＲ染色細胞の型を示す。図４ＡはＰＡＲとγ−Ｈ２Ａ．Ｘの二重染色の画像であり、矢印はＰＡＲとγ−Ｈ２Ａ．Ｘの共染色を示す。図４ＢはＰＡＲとビメンチン（線維芽細胞マーカー）の二重染色の画像であり、矢印はＰＡＲ陽性の線維芽細胞を示す。図４ＣはＰＡＲとＣＤ３１（内皮細胞マーカー）の二重染色の画像を示す。スケールバー＝１０μｍ。図４ＤはＰＡＲ陽性の心筋細胞と非心筋細胞の平均割合の比較を示す。＊＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。
【図５】図５は、ＬＶＲＲ陰性群とＬＶＲＲ陽性群のＰＡＲ陽性核およびγ−Ｈ２Ａ．Ｘ陽性核の割合を比較したものを示す。図５ＡはＬＶＲＲ陰性群とＬＶＲＲ陽性群の各検体のカウントされた核の数の比較を示す。図５ＢおよびＣは、ＬＶＲＲ陰性群とＬＶＲＲ陽性群におけるＰＡＲ陽性核またはγ−Ｈ２Ａ．Ｘ陽性核の割合を比較したものをそれぞれ示す。標準偏差を伴い、＊＊＊＊はｐ＜０．００１、ｎ．ｓ．は有意差なしをそれぞれ示す。
【図６】図６は、家族性と非家族性のＤＣＭ患者におけるＬＶＲＲ陰性群とＬＶＲＲ陽性群のＰＡＲ陽性核の割合を比較したものをそれぞれ示す。
【図７】図７は、ＤＣＭ患者におけるＬＶＲＲの長期予後の影響について、ＬＶＲＲ陽性患者群とＬＶＲＲ陰性患者群とを比較した、複合エンドポイント（死、補助人工心臓の植込みおよび心臓移植）に該当するイベントの発生に関するカプラン・マイヤー曲線をそれぞれ示す。
【図８】図８は、ＬＶＲＲ予測に対する％ＰＡＲ核（左）と％γ−Ｈ２Ａ．Ｘ核（右）の有用性を評価したＲＯＣ曲線をそれぞれ示す。
【発明の具体的説明】
【００１１】
本発明の評価方法の評価対象は心不全患者であり、好ましくは心筋症患者、より好ましくは拡張型心筋症患者である。ここで「心不全」は、なんらかの心臓機能障害、すなわち、心臓に器質的および／あるいは機能的異常が生じて心ポンプ機能の代償機転が破綻した結果、呼吸困難・倦怠感や浮腫が出現し、それに伴い運動耐容能が低下する臨床症候群を意味する（急性・慢性心不全診療ガイドライン（２０１７年改訂版））。また、「心筋症」は心機能障害を伴う心筋疾患のうち、肥大型心筋症、拡張型心筋症、不整脈原性右室心筋症、拘束型心筋症に加えこれらの４つの基本病態には分類できない分類不能心筋症を意味し、「拡張型心筋症」は左室のびまん性収縮障害と左室拡大を特徴とする疾患群を意味する（心筋症診療ガイドライン（２０１８年改訂版））。
【００１２】
本発明における「心機能回復」とは、左室機能回復を意味し、左室リバースリモデリング（ＬＶＲＲ、Left Ventricular Reverse Remodeling）を含む意味で用いられるものとする。ここで、ＬＶＲＲは、診療ガイドラインに則った適切な治療の開始の１２か月後に左室駆出率が１０％以上増加しかつ３５％を超え、左室拡張末期径の１０％以上の減少を伴うものとして定義される。
【００１３】
本発明では、心不全患者のうち心機能が回復しない患者の心筋生検検体中の心筋細胞のＤＮＡ損傷の程度が、心機能が回復する患者に対して有意に高いことが確認された（例１および２）。このことは心筋細胞のＤＮＡ損傷の程度と心不全患者の心機能回復可能性との間の相関性（負の相関）を示している。すなわち本発明の評価方法では、参照値を超える（または参照値以上の）心筋細胞のＤＮＡ損傷の程度は心機能回復可能性が低いことを示し、参照値を下回る（または参照値以下の）心筋細胞のＤＮＡ損傷の程度は心機能回復可能性が高いことを示すと規定することができる。参照値は後述のようにあらかじめ定めておくことができる。
【００１４】
本発明において「ＤＮＡ損傷」は、核ＤＮＡに生じた一本鎖切断および／または二本鎖切断を意味する。ＤＮＡ損傷の程度の測定は、ＤＮＡ損傷の程度を定量できる方法であれば特に限定されない。ＤＮＡ損傷の程度は、例えば、ＤＮＡ損傷マーカーを検出することにより測定することができる。ＤＮＡ損傷マーカーは公知であり、例えば、ポリ（ＡＤＰ−リボース）（ＰＡＲ）、γ−Ｈ２Ａ．Ｘ、８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシン（８−ＯＨｄＧ）を検出対象とすることができ、１種のみを検出しても、２種以上を組み合わせて検出してもよい。
【００１５】
ＤＮＡ損傷マーカーに基づいてＤＮＡ損傷の程度を測定する場合には、心筋細胞（特に心筋細胞の核）におけるＤＮＡ損傷マーカーの存在を指標にすることができる。すなわち、本発明の一態様において、心筋細胞（特に心筋細胞の核）におけるＤＮＡ損傷マーカーの存在は心不全患者の心機能回復可能性が低いことを示し、心筋細胞（特に心筋細胞の核）におけるＤＮＡ損傷マーカーの不存在は心不全患者の心機能回復可能性が高いことを示す。心筋細胞（特に心筋細胞の核）におけるＤＮＡ損傷マーカーの存在は定量化することができ、ＤＮＡ損傷の程度も定量的に評価することが可能となる。例えば、後記実施例のように所定範囲内におけるＤＮＡ損傷マーカー陽性の心筋細胞（特に心筋細胞の核）の数に基づいて、あるいは、所定範囲内における全心筋細胞（特に全心筋細胞の核）の数に対するＤＮＡ損傷マーカー陽性の心筋細胞（特に心筋脂肪の核）の数の割合に基づいて、心筋細胞におけるＤＮＡ損傷マーカーの存在を定量化することができ、ひいては心筋細胞のＤＮＡ損傷の程度を定量化することができる。
【００１６】
本発明の評価方法では、評価対象の心不全患者において測定したＤＮＡ損傷マーカー陽性の心筋細胞（特に心筋細胞の核）の数の全心筋細胞（特に全心筋細胞の核）の数に対する割合があらかじめ定めた参照値より大きい場合に（あるいは前記参照値以上である場合に）、心機能回復可能性が低いと評価または判断することができる。本発明の評価方法ではまた、評価対象の心不全患者において測定したＤＮＡ損傷マーカー陽性の心筋細胞（特に心筋細胞の核）の数の全心筋細胞（特に全心筋細胞の核）の数に対する割合があらかじめ定めた参照値より小さい場合に（あるいは前記参照値以下である場合に）、心機能回復可能性が高いと評価または判断することができる。すなわち本発明の評価方法は、評価対象の心筋細胞について測定したＤＮＡ損傷の程度をあらかじめ定めた参照値と比較する工程をさらに含んでもよい。ここで、前記参照値は、ＤＮＡ損傷マーカーがＰＡＲである場合、例えば、５．４７％とすることができ、ＤＮＡ損傷マーカーがγ−Ｈ２Ａ．Ｘである場合、例えば、６．３％とすることができる。
【００１７】
本発明の評価方法において参照値は、心筋細胞のＤＮＡ損傷の程度をあらかじめ測定した心不全患者を心機能が回復した群（心機能回復群）と心機能が回復しなかった群（心機能非回復群）に層別化し、心機能回復群のＤＮＡ損傷の程度の平均値と、心機能非回復群のＤＮＡ損傷の程度の平均値をもとにして決定することができる。すなわち、本発明の評価方法では、前記参照値をあらかじめ準備する工程を含んでいてもよい。本発明の評価方法において参照値は、例えば、心機能非回復群のＤＮＡ損傷の程度の平均値とすることができる。
【００１８】
ＤＮＡ損傷マーカーに基づいてＤＮＡ損傷の程度を測定する方法としては、免疫学的分析によるＤＮＡ損傷マーカーの検出が挙げられる。このような手法としては、ＥＬＩＳＡ（例えば、直接法、間接法、サンドイッチ法、競合法）、ウエスタンブロット、免疫組織化学染色等のイムノアッセイなどが挙げられるが、例えば、後述の実施例で用いたＤＮＡ損傷マーカーを使用した免疫組織化学染色によりＤＮＡ損傷の程度を測定することができる。
【００１９】
本発明の評価方法においてＤＮＡ損傷の程度の測定は、心不全患者の生検検体（特に心筋生検検体）に対して実施することができる。心不全患者の生検検体は、心臓のカテーテル検査時に生検鉗子を用いて右心室または左心室等から採取することができる。心不全患者の治療においては重篤度に応じて心臓のカテーテル検査が実施されることが通常であるところ、本発明の評価方法はこのカテーテル検査により採取可能な生検検体を用いることができるため、心不全患者に対して追加となる侵襲が不要である点で有利である。
【００２０】
本発明の評価方法においては、前記ＤＮＡ損傷の程度の測定に加えて、他の臨床変数の測定を組み合わせて実施することもできる。組み合わせる臨床変数としては、年齢、ボディマス指数（ＢＭＩ）、収縮期血圧、心不全罹病期間、ＮＹＨＡ分類（心不全重症度）、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、左室径等のエコー指標などが挙げられる。
【００２１】
本発明の評価は、統計学的解析によりカットオフ値を設定して実施することもできる。具体的には、受診者動作特性曲線（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｏｒａｔｉｎｇ  Ｃｈａｒａｓｔｅｒｉｓｔｉｃ  ｃｕｒｖｅ、ＲＯＣ）分析等の統計学的解析により得られたカットオフ値を元に前記参照値を決定することができる。例えば、後述の例３に示されるような、ＲＯＣ曲線分析を使用してカットオフ値を設定してもよい。ＲＯＣ曲線分析では、所望の感度および特異度となるカットオフ値を選択することができ、Ｙｏｕｄｅｎインデックス（感度−（１−特異度））が最大となるポイントをカットオフ値とすることができる。
【００２２】
本発明の評価方法によれば、心不全患者において心機能回復（特にＬＶＲＲ）の可能性を予測することが可能になり、ひいては心不全患者の予後を予測することが可能となる。心不全患者のうち心機能回復（特にＬＶＲＲ）の可能性が低い患者は薬物治療に対する治療応答性が低いため、本発明の評価方法により心機能回復（特にＬＶＲＲ）の可能性が低いと評価された患者については非薬物治療を実施することができる。本発明において非薬物治療は、外科的治療および再生医療を含む意味で用いられる。外科的治療の非制限的な例としては、心臓移植、補助人工心臓の植込み、デバイス治療（植込み型除細動器（ＩＣＤ、Implantable Cardioverter Defibrillator）、心臓再同期療法（ＣＲＴ、Cardiac Resynchronization Therapy）を用いた治療）が挙げられる。再生医療の非制限的な例としては、再生医療等の安全性の確保等に関する法律２条において定義される細胞加工物を用いた治療が挙げられる。一方で、本発明の評価方法により心機能回復（特にＬＶＲＲ）の可能性が高いと評価された患者は薬物治療に対する治療応答性が高いことが期待されるため、薬物治療により良好な効果があると予測される患者と評価することができ、このような患者に対しては薬物治療を選択し、実施することができる。本発明において薬物治療は、アンジオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥ阻害剤）、β遮断剤、アンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬、抗ミネラルコルチコイド、利尿薬、ＳＧＬＴ２阻害剤等の心不全治療薬の投与による治療を意味する。このように本発明の評価方法は、医師による心不全患者の治療応答性の予測、心不全患者の予後診断、さらには心不全患者の治療方針の決定に補助的に用いることができ、個々の患者に対して適切な治療を施す医療（個別化医療、精密医療）を可能とする点で有利である。
【００２３】
本発明の別の側面によれば、心不全患者から非薬物治療が必要な患者を特定する方法であって、心不全患者における心筋細胞のＤＮＡ損傷の程度を測定する工程を含んでなる方法が提供される。本発明の非薬物治療が必要な患者を特定する方法は、本発明の評価方法に従って実施することができる。すなわち、本発明の評価方法に従って心不全患者における心筋細胞のＤＮＡ損傷の程度を測定し、心機能回復可能性が低いと評価または判断された患者を非薬物治療が必要な患者と特定することができる。本発明の心不全患者から非薬物治療が必要な患者を特定する方法は、医師による心不全患者の治療方針の決定に補助的に用いることができる。
【００２４】
本発明の別の側面によればまた、心不全患者から薬物治療により良好な効果があると予測される患者を特定する方法であって、心不全患者における心筋細胞のＤＮＡ損傷の程度を測定する工程を含んでなる方法が提供される。本発明の薬物治療により良好な効果があると予測される患者を特定する方法は、本発明の評価方法に従って実施することができる。すなわち、本発明の評価方法に従って心不全患者における心筋細胞のＤＮＡ損傷の程度を測定し、心機能回復可能性が高いと評価または判断された患者を薬物治療により良好な効果があると予測される患者と特定することができる。本発明の心不全患者から薬物治療により良好な効果があると予測される患者を特定する方法は、医師による心不全患者の治療方針の決定に補助的に用いることができる。
【００２５】
本発明のさらに別の側面によれば、本発明の非薬物治療が必要な患者を特定する方法を実施して非薬物治療が必要な患者を特定し、該患者に対して非薬物治療を実施する、心不全患者の治療方法が提供される。本発明の治療方法のうち本発明の非薬物治療が必要な患者を特定する方法は、前述の通り本発明の評価方法に従って実施することができる。
【実施例】
【００２６】
以下の例に基づき本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。【００２７】
例１：拡張型心筋症患者の心筋細胞におけるＤＮＡ損傷
例１では、拡張型心筋症患者の生検検体を用いて、心筋細胞のＤＮＡ損傷の程度について評価した。【００２８】
（１）方法
ア  生検検体
２００９年から２０１６年に東京大学医学部附属病院で拡張型心筋症（ＤＣＭ）と診断されて入院した８２例の心不全患者のうち、すでに治療介入がなされた２４例を除いた５８例の患者の心筋生検検体を使用した。ＤＣＭ診断は、現在のガイドラインに従って、冠動脈造影、心エコー検査、および心筋生検を含む様々なモダリティに基づいて行った。【００２９】
ＤＣＭ患者は、心筋生検を受けＤＣＭと診断された直後から、ＡＣＥ阻害剤またはアンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬の投与、抗ミネラルコルチコイド、およびβ遮断薬の用量設定の引き上げなどを含む心不全の最適な治療が開始された。エンドポイントは、死亡、補助人工心臓の植込み、および心臓移植の複合結果として定義される複合エンドポイントであり、上記の治療開始後１２ヶ月以前にエンドポイントに該当するイベントのあった患者をＬＶＲＲ陰性群に分類した。ＬＶＲＲ陽性群（本明細書中「ＬＶＲＲ（＋）」ということがある。）とＬＶＲＲ陰性群（本明細書中「ＬＶＲＲ（−）」ということがある。）の生検時の臨床背景は表１に示す通りであった。【００３０】
【表１】
2020130111.tif 000003
【００３１】
イ  免疫組織化学
ＤＣＭ患者のホルマリン固定パラフィン包埋生検検体を用いて、ＤＮＡ損傷の指標となるＰＡＲ（ポリ（ＡＤＰ−リボース））およびγ−Ｈ２Ａ．Ｘを測定した。パラフィンブロックから４μｍの切片を切り取り、スライド上に置いた。脱パラフィンおよび再水和後、ＭＩ−３３マイクロ波プロセッサー（東屋医科器械）を使用して、Ｄａｋｏ  Ｓ１６９９抗原賦活化液（Agilent）でスライドを２０分間煮沸することにより、抗原をアンマクスした。スライドを室温で６０分間、５％の正常ヤギ血清でブロックし、続いて抗ＰＡＲポリマー抗体（ａｂ１４４５９、１：１００、Abcam）と一晩インキュベートした。リン酸緩衝生理食塩水で洗浄後、サンプルを抗マウスＩｇＧ−Ａｌｅｘａ６４７（１：３００、Thermo Fisher Scientific）で室温で１時間染色した。細胞膜と核を小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）−Ａｌｅｘａ４８８（１：２００、Thermo Fisher Scientific）と４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（１：１，０００、同仁化学研究所）で対比染色した。ここで使用した他の抗体と色素には、γ−Ｈ２Ａ．Ｘ（ａｂ８１２９９、１：２００、Abcam）、γ−Ｈ２Ａ．Ｘ（ＭＡ１−２０２２、１：２００、Thermo Fisher Scientific）、ＷＧＡ−Ａｌｅｘａ３５０（１：２００、Thermo Fisher Scientific）、ビメンチン（ａｂ９２５４７、１：２００、Abcam）、ＰＥＣＡＭ１（ＨＰＡ００４６９０、１：１００、Sigma-Aldrich）、および抗マウスＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８および５９４（１：３００、Thermo Fisher Scientific）が含まれる。患者ごとに、残りの生検検体から２つのセクションを１つはＰＡＲ染色用、もう１つはγ−Ｈ２Ａ．Ｘ染色用として使用した。画像は、２０倍対物レンズを備えた倒立蛍光顕微鏡（BZ-X700、Keyence Corporation）で取得し、１つの視野内の生検検体のほとんどの領域をカバーした。生の画像データをＢＺ−Ｘアナライザーソフトウェア（Keyence Corporation）を使用して分析し、各核でＤＡＰＩと結合したＰＡＲシグナルの蛍光強度を定量化した。その後、蛍光強度のヒストグラムに基づいてＰＡＲ陽性核を検出するための閾値を設定し、前記ソフトウェアによって認識された各ＰＡＲ陽性領域が各セクションで高いＰＡＲ信号強度を示すことを確認した。図１は、ＬＶＲＲ陽性患者またはＬＶＲＲ陰性患者のＰＡＲまたはγ−Ｈ２Ａ．Ｘで染色された各核の蛍光強度の分布の例を示す。前記ソフトウェアによって、ＰＡＲ陽性核の割合（％ＰＡＲ核）を自動的に計算した（［ＰＡＲ染色核］／［ＤＡＰＩで染色されたすべての核］）。すべての生画像データは、同じアルゴリズムを使用して分析した。γ−Ｈ２Ａ．Ｘの免疫染色でも同じ分析を行った。ＰＡＲ陽性細胞のタイプを分析するために、ＰＡＲ染色細胞のすべての画像データを評価し、染色された各細胞が心筋細胞であるか非心筋細胞であるかを形態の違いに基づいて決定した。非心筋細胞は、典型的な大きな成熟心筋細胞と比較して非常に小さく、その核は細胞膜の近くにあり、ＷＧＡ染色で検出される。【００３２】
ウ  統計学的解析
連続変数は平均値±ＳＤ、カテゴリー変数はカウントおよび割合として表した。歪んだ分布を持つ変数について、中央値（四分位範囲［ＩＱＲ］）が報告され、ウィルコクソンのランクサムテストを使用して比較した。２つの群間の統計的有意性は、対応のない両側スチューデントｔ検定によって決定した。【００３３】
すべての分析は、ＳＡＳソフトウェアバージョン９．４（SAS Institute、Inc）を使用して行い、すべてのテストでｐ＜０．０５のｐ値が有意であるとみなした。【００３４】
（２）結果
図２Ａ〜Ｄは、それぞれＬＶＲＲ陰性患者とＬＶＲＲ陽性患者の心筋生検検体を使用したＰＡＲの免疫蛍光染色の生画像であり、ＰＡＲとＤＡＰＩ（核ＤＮＡ）の染色された場所が一致していることが確認された。図２ＥおよびＦは、ハイブリッド細胞計数プログラムによる自動評価後の同じ画像であり、白色で表されるのがＰＡＲ陽性核である。【００３５】
図３Ａ〜Ｄは、それぞれＬＶＲＲ陰性患者とＬＶＲＲ陽性患者の心筋生検検体を使用したγ−Ｈ２Ａ．Ｘの生画像であり、γ−Ｈ２Ａ．ＸとＤＡＰＩ（核ＤＮＡ）の染色された場所が一致していることが確認された。図３ＥおよびＦは、ハイブリッド細胞計数プログラムによる自動評価後の同じ画像であり、白色で表されるのがＰＡＲ陽性核である。【００３６】
図４Ａは、ＰＡＲとγ−Ｈ２Ａ．Ｘの二重染色の生画像であり、核で共染色されたことを確認した。図４ＢおよびＣは、ＰＡＲとビメンチン（線維芽細胞マーカー）およびＰＡＲとＣＤ３１（血管内皮細胞マーカー）の二重染色のそれぞれの生画像を示す。ビメンチン陽性細胞はＰＡＲと共染色されたのに対し、ＣＤ陽性細胞はＰＡＲとは共染色されなかったことから、陽性の非心筋細胞はすべて心臓線維芽細胞に属していることが確認された。図４Ｄに示す通り、５８人の患者（１０６８細胞）のすべての生検検体のＰＡＲ陽性細胞における心筋細胞と非心筋細胞の平均割合は、それぞれ９４．５％と５．５％であった。【００３７】
また、図５に示す通り、ＬＶＲＲ陰性群とＬＶＲＲ陽性群のＰＡＲ染色検体で分析された核の平均数は、それぞれ８８７±４１個および９０３±６９個であった（ｐ＝０．８３２）（図５Ａ）。ＰＡＲ染色した核の割合は、ＬＶＲＲ陽性群（３．７％［ＩＱＲ：０．６％から３．９％］）がＬＶＲＲ陰性群（１６．３％［ＩＱＲ：６．３％から１９．３％］）に対して有意に低かった（ｐ＜０．００１）（図５Ｂ）。γ−Ｈ２Ａ．Ｘ染色した核の割合もまた、ＬＶＲＲ陽性群（３．５％［ＩＱＲ：１．２％から６．４％］）がＬＶＲＲ陰性群（１１．７％［ＩＱＲ：６．０％から１４．６％］）に対して有意に低かった（ｐ＜０．００１）（図５Ｃ）。【００３８】
さらに、図６に示す通り、家族性と非家族性のいずれのＤＣＭ患者においてもＬＶＲＲ陰性患者は高い％ＰＡＲ核を示した。【００３９】
これらの結果から、ＬＶＲＲ陰性患者のＤＮＡ損傷の程度は、ＬＶＲＲ陽性患者に対して有意に高いことが確認された。【００４０】
例２：拡張型心筋症患者の治療経過とＬＶＲＲ
例２では、拡張型心筋症患者の経過とＬＶＲＲについて統計学的解析を行った。【００４１】
（１）方法
ベースライン時の患者のすべてのパラメーターの単変量スクリーニングを最初に実行し、スチューデントｔ検定は連続変数に使用した。カテゴリー変数にはフィッシャーの正確検定を使用し、ｍｉｄ−ｐ値を計算した。カプラン−マイヤー法とログランク検定を使用して、エンドポイントに対するＬＶＲＲの影響を評価した。ロバストな標準誤差を使用した逆確率加重Ｃｏｘ比例ハザード回帰モデルにより、複合エンドポイントの％ＰＡＲ核および％γ−Ｈ２Ａ．Ｘ核の影響を推定した。各被験者の体重は、一般化された傾向スコアを使用して計算したが、ベースライン交絡因子を調整するモデルの以下の変数が含まれる：年齢、ＢＭＩ、家族歴、心不全の期間、ニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）機能クラス、収縮期血圧、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、左室拡張末期径、重度の僧帽弁逆流（グレードＩＩＩまたはＩＶ）。％ＰＡＲ核とＬＶＲＲの関係、および％γ−Ｈ２Ａ．Ｘ核とＬＶＲＲの関係も、ロジスティック回帰モデリングの傾向スコア法を使用して調べた。上記以外の統計学的解析は例１（１）ウに記載の方法に従って行った。【００４２】
（２）結果
調査期間の中央値は１３８６（ＩＱＲ：６６７〜２０３２）日であった。ＬＶＲＲの判定期間中、５８人中２５人（４３．１％）の患者が、レニン・アンジオテンシン・アルドステロン系の阻害剤、β遮断薬、心臓再同期療法を含む集学的治療後にＬＶＲＲを達成した。アンジオテンシン変換酵素阻害剤またはアンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬、抗ミネラルコルチコイドおよびβ遮断薬による神経ホルモン薬の治療は、目標用量でほとんどの患者（それぞれ９５％、７８％、１００％）に合わせて調整された。最適な薬物療法の開始後１２ヶ月において、次の薬物については投与割合に関してＬＶＲＲの患者とＬＶＲＲの患者との間に有意差は認められなかった：アンジオテンシン変換酵素阻害薬（ＬＶＲＲあり患者６８．０％、ＬＶＲＲなし患者７２．７％、ｐ＝０．７７５）、アンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬（ＬＶＲＲあり患者２８．０％、ＬＶＲＲなし患者２１．２％、ｐ＝０．７５８）、抗ミネラルコルチコイド（ＬＶＲＲあり患者７２．０％、ＬＶＲＲなし患者８１．８％、ｐ＝０．５２７）、β遮断薬（カルベジロール相当で１日あたりの用量はＬＶＲＲあり患者２２．７ｍｇ、ＬＶＲＲなし患者１９．５ｍｇで、いずれの患者も１００％投与、ｐ＝０．２８１）。【００４３】
ＬＶＲＲの有無によって分類された被験者の生存曲線を図７に示す。ＬＶＲＲあり患者は、ＬＶＲＲなし患者と比較して予後が有意に良好であった（ログランク検定、ｐ＜０．００１）。フォローアップ期間中に、１７人の患者で複合エンドポイントに到達した：心臓移植８名（１３．８％）、ＬＶＡＤ（左心補助人工心臓、left ventricular assist device）植込み１６名（２７．６％）、死亡１名（１．７％）。【００４４】
傾向スコア分析における調整の交絡因子として、年齢、ＢＭＩ、家族歴、心不全の期間、ＮＹＨＡ機能分類、収縮期血圧、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド、左室拡張末期径、および重度の僧帽弁逆流（グレードＩＩＩまたはＩＶ）を使用した。表２に示す通り、複合エンドポイントの傾向スコア分析により、他の主要な臨床因子の調整後、％ＰＡＲ核（１０％増加ごとに、ハザード比：１．３６；９５％信頼区間［ＣＩ］：１．０２から１．８１；ｐ＝０．０３５）は、有意かつ独立した予後因子であることが明らかになった。単変量Ｃｏｘ分析の結果不良を予測する他の主要な予後因子は、年齢、高いＮＹＨＡ機能クラス、低血圧、および低ＢＭＩであった。今回のコホート試験では、少数の患者のみが心臓磁気共鳴（２７．６％）および心肺運動検査（５１．７％）を受けていたため、傾向スコア分析のモデルに後期ガドリニウム増強の程度およびピーク酸素消費量を含めることができなかった。【００４５】
また、表３に示す通り、傾向スコア分析によりＬＶＲＲの有意かつ独立した予測因子として、％ＰＡＲ核（１％増加ごとに、オッズ比：０．８７；９５％ＣＩ：０．７９から０．９５；ｐ＝０．００３）が同定された。γ−Ｈ２Ａ．Ｘ染色のデータを使用した同様の分析により、％γ−Ｈ２Ａ．Ｘ核もまた、独立してＬＶＲＲを予測できることが明らかとなった。表３の結果から、心筋細胞のＤＮＡ損傷の程度を指標として、心不全患者のＬＶＲＲの可能性を評価することができることが確認された。【００４６】
【表２】
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【００４７】
【表３】
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【００４８】
例３：拡張型心筋症患者のＬＶＲＲ予測
例３では、拡張型心筋症患者のＬＶＲＲの予測について、心筋ＤＮＡ損傷の程度の指標となる％ＰＡＲ核と％γ−Ｈ２Ａ．Ｘ核を用いて受信者動作特性（ＲＯＣ）分析を行った。【００４９】
（１）方法
ＲＯＣ分析では、カットポイント分析により、Ｙｏｕｄｅｎインデックス（感度−（１−特異度））が最大となるポイントをカットオフ値として決定した。ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ：Ａｒｅａ  Ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  Ｃｕｒｖｅ）は、ロジスティック回帰を使用して計算した。【００５０】
（２）結果
結果は、図８に示す通りであった。％ＰＡＲ核については、カットオフ値を５．７４％とした場合、感度７７．８％（９５％ＣＩ：５７．７％から９１．４％）、特異度８７．１％（９５％ＣＩ：７０．２％から９６．４％）、ＡＵＣ０．８７９でＬＶＲＲを予測できるという結果であった。％γＨ２Ａ．Ｘ核については、カットオフ値を６．３％とした場合、感度６９．６％（９５％ＣＩ：４７．１％から８６．８％）、特異度７５．９％（９５％ＣＩ：５６．５％から８９．７％）、ＡＵＣ０．８８０でＬＶＲＲを予測できるという結果であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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