(57)【要約】  本発明の目的は、交差効率を高めることで効率よく部位特異的ホモ接合体を獲得するとともに、ホモ接合体を、ゲノム修飾の無い態様で得ることも容易な技術を提供することにある。  以下の工程を含む、ホモ接合型細胞の作製方法：（Ａ）標的部位にヘテロ接合変異を有する細胞に対し、相同染色体の片アレル特異的なＤＮＡ二重鎖切断の導入を行いブルーム症候群タンパク質阻害剤の存在下で交差を生じさせることで、前記標的部位のホモ接合型細胞を得る工程、及び（Ｂ）前記ホモ接合型細胞を選別する工程。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、ホモ接合型細胞の作製方法：
（Ａ）標的部位にヘテロ接合変異を有する細胞に対し、相同染色体の片アレル特異的なＤＮＡ二重鎖切断の導入を行いブルーム症候群タンパク質阻害剤の存在下で交差を生じさせることで、前記標的部位のホモ接合型細胞を得る工程、及び
（Ｂ）前記ホモ接合型細胞を選別する工程。
【請求項２】
前記ブルーム症候群タンパク質阻害剤が、１−（４−フルオロ−３−（トリフルオロメチル）フェニル）−３−（５−（ピリジン−４−イル）１，３，４−チアジアゾール−２−イル）ウレア及び／又は１−（４−（１Ｈ−ピラゾリル）−３−シアノフェニル）−３−（５−（ピリジン−４−イル）１，３，４−チアジアゾール−２−イル）ウレアである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ブルーム症候群タンパク質阻害剤を３．０〜５０．０μＭの濃度で用いる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ブルーム症候群タンパク質阻害剤を、前記（Ａ）工程の前に、前記ヘテロ接合変異を有する細胞と共存させておく、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記（Ａ）工程において、前記ＤＮＡ二重鎖切断を、クリスパー（ＣＲＩＳＰＲ）／クリスパー関連ヌクレアーゼ法、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）法、又は転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）法から選択されるＤＮＡ二重鎖切断法によって行う、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記（Ａ）工程において、前記染色体の片アレル特異的なＤＮＡ二重鎖切断の導入を、前記ＤＮＡ二重鎖切断における認識配列のうち片アレルに多型が存在する認識配列を選択して設計されたベクターを、前記ヘテロ接合変異を有する細胞に導入することによって行う、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記（Ａ）工程において、前記相同染色体のアレルの一方又は他方に、一の薬剤に対する薬剤耐性遺伝子と他の薬剤に対する薬剤耐性遺伝子とを互いに逆方向に配置した配列を有する選択カセットの導入と前記配列の反転とを行い、
前記（Ｂ）工程において、前記一の薬剤及び前記他の薬剤の両方に耐性である細胞を、前記標的部位のホモ接合型細胞として選別する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記（Ａ）工程において、前記選択カセットをトランスポゾンベクターに組み込んで導入し、
前記（Ｂ）工程の後に、再切り出し用トランスポゼースによって前記選択カセットを除去する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記（Ａ）工程において、前記選択カセットの両方又は片方にインシュレーター配列を導入する、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記標的部位が主要組織適合抗原の遺伝子座である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的部位にヘテロ接合変異を有する細胞が二倍体細胞である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記二倍体細胞がヒト由来細胞である、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホモ接合型細胞の作製方法に関する。より具体的には、本発明は、効率良くホモ接合型細胞を作成する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
我々のゲノムは一対の染色体で構成されており、そのうち片方は母親由来、もう片方は父親由来である。ゲノム配列情報は母親と父親由来で同一ではなく（このような状態をヘテロ接合体という）、一塩基多型(SNP)だけでもゲノム上に１００万カ所程度存在すると報告されている。SNP以外にも、欠失、リピート配列などの多型がさらに存在する。これまで、多型の一部が疾患に関連しているという報告が多数なされている。さらに近年では、全ゲノムシークエンス技術、及びその解析手法の劇的な進歩に伴って、多型と疾患又は形質との相関が示唆されるデータが多く報告されている。【０００３】
これらのデータは、統計的に、多型と実際の表現型（疾患又は形質）との相関を統計学的に示すものであるが、その相関を技術的に証明するものではない。それらの多型がヒト疾患に直接関与しているかどうかを技術的に証明するためには、その多型のホモ接合体について表現型を解析する必要がある。染色体をヘテロ接合体からホモ接合体に変化させる技術は、従来より、実験動物などの交配実験として行なわれてきた。ヒトの場合は、倫理上交配実験が不可能であるため、人工多能性幹細胞（iPS細胞）などの体細胞において父方と母方の染色体の相同組換えを起こし、染色体の一部をホモ接合体に変化させた細胞株を獲得するしか方法はない。【０００４】
CRISPR/Cas9法（特許文献１）は、ＤＮＡ切断酵素であるCas9ヌクレアーゼと、ヒトU6ポリメラーゼIIIプロモータで発現されたガイドＲＮＡベクターとを共発現させ、特定の標的ＤＮＡ配列を切断する技術である。つまり、CRISPR/Cas9法は、部位特異的にＤＮＡ二重鎖切断（ＤＳＢ）を導入することができる。Cas9ヌクレアーゼによってＤＳＢが導入されると、相同組み換え修復の経路を経て修復されうる。したがって、CRISPR/Cas9法は、相同組換え速度を部位特異的に向上させることができるツールとしての可能性を有している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第８６９７３５９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
相同組換え（交差）のシステムは減数分裂には組み込まれており、交差頻度は、各染色体あたり１〜２回と比較的高い。一方で、体細胞における交差頻度は非常に低く、これまで体系的に部位特異的に交差を起こした相同組換え体の細胞株を獲得することは困難であった。本発明者らは、テトラサイクリン遺伝子発現調節システム（Ｔｅｔ−ｏｆｆ）を用い、染色体安定に関連するブルーム症候群タンパク質（ＢＬＭタンパク質）の遺伝子発現抑制とＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９による部位特異的ＤＮＡ二重鎖切断（ＤＳＢ）導入とを組み合わせることで、染色体の狙った領域において、効率よく部位特異的ホモ接合体を獲得できることを見出した。【０００７】
しかしながら、このようにして得られたホモ接合体の細胞は、ＢＬＭ遺伝子発現制御を外来遺伝子導入することで作製されているため、ゲノムが修飾（つまり遺伝情報の変更）を受けている。遺伝子的に導入した部分を組換え後に抜く技術としては、トランスポゾンベクターを用いることが知られている。しかしながら、仮にもＢＬＭ遺伝子発現制御を導入したＴｅｔ−ｏｆｆをトランスポゾンベクターに遺伝的に組み込むことは、トランスポゾン認識配列の遺伝子発現への悪影響を考えると技術常識的には不可能である。つまり、ＢＬＭタンパク質の遺伝子発現抑制によって効率よく部位特異的ホモ接合体が得られるとしても、ゲノム修飾の除去ができないために治療へ適用することができないという新たな課題に直面した。【０００８】
そこで本発明は、交差効率を高めることで効率よく相同組換えを起こした部位特異的ホモ接合体を獲得するとともに、ホモ接合体を、ゲノム修飾の無い態様で得ることも容易な技術を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は鋭意検討の結果、ＢＬＭタンパク質の阻害剤の存在下で相同染色体の片アレル特異的なＤＮＡ二重鎖切断を導入することによって、交差効率を高めて効率よく相同組換えを起こした部位特異的ホモ接合体を獲得するとともに、獲得したホモ接合体を、ゲノム修飾の抜き取りが容易な態様で得られることを見出した。本発明は、この知見に基づいてさらに検討を重ねることにより完成したものである。【００１０】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．  以下の工程を含む、ホモ接合型細胞の作製方法：
（Ａ）標的部位にヘテロ接合変異を有する細胞に対し、相同染色体の片アレル特異的なＤＮＡ二重鎖切断の導入を行いブルーム症候群タンパク質阻害剤の存在下で交差を生じさせることで、前記標的部位のホモ接合型細胞を得る工程、及び
（Ｂ）前記ホモ接合型細胞を選別する工程。
項２．  前記ブルーム症候群タンパク質阻害剤が、１−（４−フルオロ−３−（トリフルオロメチル）フェニル）−３−（５−（ピリジン−４−イル）１，３，４−チアジアゾール−２−イル）ウレア及び／又は１−（４−（１Ｈ−ピラゾリル）−３−シアノフェニル）−３−（５−（ピリジン−４−イル）１，３，４−チアジアゾール−２−イル）ウレアである、項１に記載の方法。
項３．  前記ブルーム症候群タンパク質阻害剤を３．０〜５０．０μＭの濃度で用いる、項１又は２に記載の方法。
項４．  前記ブルーム症候群タンパク質阻害剤を、前記（Ａ）工程の前に、前記ヘテロ接合変異を有する細胞と共存させておく、項１〜３のいずれかに記載の方法。
項５．  前記（Ａ）工程において、前記ＤＮＡ二重鎖切断を、クリスパー（ＣＲＩＳＰＲ）／クリスパー関連ヌクレアーゼ法、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）法、又は転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）法から選択されるＤＮＡ二重鎖切断法によって行う、項１〜４のいずれかに記載の方法。
項６．  前記（Ａ）工程において、前記染色体の片アレル特異的なＤＮＡ二重鎖切断の導入を、前記ＤＮＡ二重鎖切断における標的配列のうち片アレルに多型が存在する標的配列を選択して設計されたベクターを、前記ヘテロ接合変異を有する細胞に導入することによって行う、項１〜５のいずれかに記載の方法。
項７．  前記（Ａ）工程において、前記相同染色体のアレルの一方又は他方に、一の薬剤に対する薬剤耐性遺伝子と他の薬剤に対する薬剤耐性遺伝子とを互いに逆方向に配置した配列を有する選択カセットの導入と前記配列の反転とを行い、
前記（Ｂ）工程において、前記一の薬剤及び前記他の薬剤の両方に耐性である細胞を、前記標的部位のホモ接合型細胞として選別する、項１〜６のいずれかに記載の方法。
項８．前記（Ａ）工程において、前記選択カセットをトランスポゾンベクターに組み込んで導入し、
前記（Ｂ）工程の後に、再切り出し用トランスポゼースによって前記選択カセットを除去する、項７に記載の方法。
項９．  前記（Ａ）工程において、前記選択カセットの両方又は片方にインシュレーター配列を導入する、項７または８に記載の方法。
項１０．  前記標的部位が主要組織適合抗原の遺伝子座である、項１〜９のいずれかに記載の方法。
項１１．  前記標的部位にヘテロ接合変異を有する細胞が二倍体細胞である、項１〜１０のいずれかに記載の方法。
項１２．  前記二倍体細胞がヒト由来細胞である、項１１に記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、交差効率を高めて効率よく相同組換えを起こした部位特異的ホモ接合体を獲得するとともに、獲得したホモ接合体を、ゲノム修飾の抜き取りが容易な態様で得ることができるため、獲得したホモ接合体は、例えば移植による治療等への応用価値も高い。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明のホモ接合型細胞の作製方法の（Ａ）工程の一例を模式的に示す。
【図２】本発明のホモ接合型細胞の作製方法の（Ａ）工程の他の一例を模式的に示す。
【図３】ＤＮＡ二重鎖切断（ＤＳＢ）及びブルームタンパク質（ＢＬＭタンパク質）阻害剤による相同組換え（交差）を模式的に説明する。
【図４】ダブル薬剤選択カセットの構築法を模式的に示す。
【図５】ダブル薬剤選択カセットを用いた場合の選別工程を模式的に示す。
【図６】参考例の実験デザインであり、TALENによるBLM遺伝子座の両アレルに対するTetカセットのターゲティングを示す。
【図７】参考例の実験デザインであり、AAVS1遺伝子座への二重選択カセットのターゲティングを示す。
【図８】参考例及び実施例の実験デザインであり、４Ｎ期における有糸分裂交差の模式図を示す。
【図９】Tet offを用いた参考例において、１９番染色体におけるホモ接合型細胞のスクリーニングのために行った競合ＰＣＲの結果を示す。
【図１０】ＭＬ２１６を用いた実施例において、１９番染色体におけるホモ接合型細胞のスクリーニングのために行った競合ＰＣＲの結果を示す。
【図１１】ＭＬ２１６を用いた実施例において、６番染色体におけるホモ接合型細胞のスクリーニングのために行った競合ＰＣＲの結果を示す。
【図１２】Tet offを用いた参考例（図中３のサンプル）の交差効率を、当該参考例において種々の条件（Ｄｏｘの有無及びＣＲＩＳＰＲの有無）を変更した場合（図中１，２のサンプル）の交差効率（それぞれ７回実施）とともに示す。
【図１３】ＭＬ２１６を用いた実施例（図中３のサンプル）の交差効率を、当該実施例において種々の条件（ＭＬ２１６の有無及びＣＲＩＳＰＲの有無）を変更した場合（図中１，２のサンプル）の交差効率（それぞれ４回実施）とともに示す。
【図１４】１９番染色体における交差部位の分布を示す（参考例）
【図１５】１９番染色体セントロメアからの9Mb（３５Ｍ領域）における交差部位の分布を示す（参考例）。
【図１６】１９番染色体セントロメアからの14Mb（４０Ｍ領域）における交差部位の分布を示す（参考例）。
【図１７】１９番染色体セントロメアからの19Mb-I, 19Mb-II（４５Ｍ−１、４５Ｍ−２）における交差部位の分布を示す（参考例）。
【図１８】ML216によるBLMタンパク質の抑制下における１９番染色体セントロメアからの9Mb（３５Ｍ領域）における交差部位の分布を示す（実施例）。
【図１９】６番染色体の短腕の交差前の模式図を示す。
【図２０】６番染色体の短腕の交差後の模式図を示す。
【図２１】ｈｉＰＳＣにおけるＨＬＡ−Ａハプロタイプのフローサイトメトリープロファイルを示す（実施例）。
【図２２Ａ】親線維芽細胞（parental fibroblast cells）についての６番染色体及び１９番染色体におけるＳＮＰアレイ分析結果を示す。
【図２２Ｂ】ヒト人工多能性幹細胞（hiPSCs）についての６番染色体及び１９番染色体におけるＳＮＰアレイ分析結果を示す。
【図２２Ｃ】参考例の項目（４）で得られたhiPSC-BLMtet/tetAAVS1cNP/+についての６番染色体及び１９番染色体におけるＳＮＰアレイ分析結果を示す。
【図２２Ｄ】参考例で得られたホモ接合型細胞hiPSC-BLMtet/tetAAVS1cNP/+Dox(+)9M-CRISPR(+)についての６番染色体及び１９番染色体におけるＳＮＰアレイ分析結果を示す。
【図２２Ｅ】実施例で得られたホモ接合型細胞hiPSC-AAVS1cNP/+ML216(+)9M-CRISPR(+)についての６番染色体及び１９番染色体におけるＳＮＰアレイ分析結果を示す。
【図２２Ｆ】実施例で得られたホモ接合型細胞hiPSC-telHLAcNP/+ML216(+)HLA I-III-CRISPR(+)についての６番染色体及び１９番染色体におけるＳＮＰアレイ分析結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
［ホモ接合型細胞の作製方法］
本発明のホモ接合型細胞の作製方法は、（Ａ）標的部位にヘテロ接合変異を有する細胞に対し、相同染色体の片アレル特異的なＤＮＡ二重鎖切断を導入しブルーム症候群タンパク質阻害剤の存在下で交差を生じさせることで、前記標的部位のホモ接合型細胞を得る工程と、（Ｂ）前記ホモ接合型細胞を選別する工程とを含む。
【００１４】
［（Ａ）工程］
図１及び図２に、（Ａ）工程の例を模式的に示す。（Ａ）工程では、生体外で、標的部位にヘテロ接合変異（図１及び図２中、Ｘで示される。）を有する細胞（図１及び図２中、（i）で示される。）に対し、相同染色体の片アレル特異的なＤＮＡ二重鎖切断（ＤＳＢ）を導入しブルーム症候群（ＢＬＭ）タンパク質阻害剤の存在下で交差を生じさせることで、ヘテロ性喪失（ＬＯＨ；Loss Of Heterozygosity）により標的部位のホモ接合型細胞（図１及び図２中、（ii）及び（iii）で示される。）を得る。
【００１５】
［標的部位］
本発明において標的部位とは、ヘテロ接合変異を含む部位であり、染色体上の交差によりホモ接合を生じさせるべき部位である。ヘテロ接合変異としては、例えば疾患を引き起こす可能性のある変異、免疫反応性の個人差を生じさせる変異等が挙げられる。当該変異としては特に限定されず、塩基多型（ＳＮＰ）、挿入欠失（インデル）、コピー数多型（ＣＮＶ）等が挙げられる。標的部位中に、変異は１個のみ含んでいてもよいし、複数含んでいてもよい。標的部位の長さとしては特に限定されず、染色体上の狭い領域から短腕全体又は長腕全体といった広い領域を含む、例えば１〜２００Ｍｂｐが挙げられる。
【００１６】
標的部位の具体的な一例としては、連鎖解析等で疾患を引き起こす変異の存在が疑われる部位が挙げられる。好ましくは、遺伝子間領域（intergenic region）が挙げられる。本発明によってこのような標的部位を狙って交差を起こすことで２種類のホモ接合型細胞が得られる。一方は、当該変異のホモ接合体（図１中（ii）で示される細胞）であり、この細胞は、当該変異と疾患との関連を技術的に解析するために応用することができる。この細胞は、特に、多因子疾患における遺伝子間領域での原因因子探索を行う場合に有用である。もう一方は、変異がなくなり正常の表現型となったホモ接合体（図１中（iii）で示される細胞）であり、この細胞は、再生医療に応用することができる。また、疾患を引き起こす変異がわかっている場合においては、標的部位を狙った交差により、相同組換え体として、図２中（ii）及び（iii）に示されるような、人工的復帰変異モザイクを生じさせ、これによって図２（iii）に示される復帰細胞（Revertant細胞）を得ることができる。なお、図１（iii）に示される細胞も復帰細胞に該当するが、特に図２（iii）に示される復帰細胞は、治療、疾患発生機構の解析、異なる細胞系列における遺伝子変異回復時おける生体への影響の解析等に応用することができる。
【００１７】
さらに、標的部位の具体的な他の一例としては、ＭＨＣ（主要組織適合性複合体）を規定する主要組織適合抗原の遺伝子座が挙げられ、好ましくはＨＬＡ（ヒト白血球抗原）が挙げられる。本発明によってこのような標的部位を狙って交差を起こし、当該変異のホモ接合体（図１中（ii）で示される細胞）に変換することで、再生医療材料、がん発症を予防するがんワクチン、がんを発症した患者に対してがん切除後の再発抑制のためのがん免疫薬として好適な細胞を作製することができる。また、本発明によって、交差を生じさせる部位として様々な部位をターゲットとすることができるため、様々なハプロタイプのＭＨＣホモ接合型の細胞を作製することができる。本発明によってもたらされるＭＨＣホモ接合型細胞の多様性により、ＭＨＣホモ接合型細胞からなる細胞バンクを構築することができる。このような細胞バンクにストックされたホモ接合型細胞は、その多様性により、再生医療材料として用いられる場合に、再生医療材料の免疫適合率が高められている点で好ましい。或いは、細胞バンクにストックされたホモ接合型細胞は、その多様性により、がんワクチンあるいはがん免疫薬として用いられる場合に、患者本人から自前のｉＰＳ細胞（がんワクチン又はがん免疫薬）作製を要することなく、細胞バンクから当該患者に免疫適合する細胞が速やかに選択されて治療に適用されることが可能となる点で好ましい。ＨＬＡを規定している遺伝子領域は第６番染色体短腕にあり、クラスＩ（ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ等）、クラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲ、−ＤＱ、−ＤＰ等）、クラスＩＩＩ等の遺伝子領域が挙げられる。これら遺伝子領域のうち、１つの領域に標的部位を設定してもよいし、連続する２つの領域に跨るように標的部位を設定してもよいし、又はすべての領域（つまりクラスＩからクラスＩＩの全領域）に跨るように標的部位を設定してもよい。
【００１８】
［細胞］
標的部位にヘテロ接合変異を含む細胞の種類としては特に限定されない。本発明は交差効率を高めることができるため、ヘテロ接合型細胞が、本来（ＢＬＭを抑制しない条件下で）交差が起こりにくい二倍体細胞である場合に特に有用である。二倍体細胞としては、多能性幹細胞、体性幹細胞、芽細胞、体細胞等が挙げられる。多能性幹細胞としては、ＥＳ細胞、ＥＧ細胞、ｍＧＳ細胞、ｉＰＳ細胞等が挙げられ；体性幹細胞としては、間葉系幹細胞、造血幹細胞（骨髄細胞、末梢血幹細胞、臍帯血幹細胞等）、血管幹細胞（血管前駆細胞、血管内皮前駆細胞等）、神経幹細胞等が挙げられ；芽細胞としては、線維芽細胞、筋芽細胞、骨芽細胞等が挙げられ；体細胞としては、角膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、肝細胞、甲状腺細胞、血液細胞（単核球、樹状細胞等）等が挙げられる。また、体性幹細胞は、人工的復帰変異モザイクを生じさせる場合に特に有用であり、多能性幹細胞は、ＨＬＡをホモ化し移植の汎用性を高める場合に特に有用である。
【００１９】
ヘテロ接合型細胞の由来としても特に限定されず、例えば、哺乳類（例えば、マウス、ラット、ブタ、及びウシ、並びにヒト、コモンマーモセット等の霊長類）、アフリカツメガエル、ゼブラフィッシュ、ショウジョウバエ、線虫、植物等に由来する細胞が挙げられる。ヘテロ接合型細胞の種類が体細胞である場合、その由来としては、好ましくは哺乳類が挙げられ、より好ましくはヒトが挙げられる。
【００２０】
［ブルーム症候群タンパク質阻害剤］
ブルーム症候群は、ブルーム遺伝子に劣性変異のある疾患として知られており、顔面の毛細血管拡張、日光過敏、小人症、免疫不全、高頻度の発がん等の症状が報告されている。ブルーム症候群タンパク質（ＢＬＭタンパク質）は、ブルーム症候群に関連するタンパク質であり、本発明におけるブルーム症候群タンパク質阻害剤としては、ＢＬＭタンパク質のヘリカーゼ活性を阻害する物質が用いられる。具体的には、５−（ピリジン−４−イル）−１，３，４−チアジアゾール−２−アミン誘導体が挙げられる。５−（ピリジン−４−イル）−１，３，４−チアジアゾール−２−アミン誘導体としては、１−フェニル−３−（５−（ピリジン−４−イル）１，３，４−チアジアゾール−２−イル）ウレア誘導体が挙げられ、より具体的には、１−（４−フルオロ−３−（トリフルオロメチル）フェニル）−３−（５−（ピリジン−４−イル）１，３，４−チアジアゾール−２−イル）ウレア（ＭＬ２１６；下記式化合物（１））及び１−（４−（１Ｈ−ピラゾリル）−３−シアノフェニル）−３−（５−（ピリジン−４−イル）１，３，４−チアジアゾール−２−イル）ウレア（下記式化合物（２））が挙げられる。これらのＢＬＭタンパク質阻害剤は、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。
【００２１】
【化１】
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【００２２】
本発明において、ＢＬＭタンパク質阻害剤は、ＤＮＡ二重鎖切断（ＤＳＢ）後の交差により相同組換えを効率的に生じさせることを可能にする。図３に、ＤＳＢ及びＢＬＭタンパク質阻害剤による交差を模式的に説明する。図３のStep Iに示すように、ＤＮＡにＤＳＢが起こると、切断されたＤＮＡは５’→３’の方向に切り取られ、一本鎖部分が生じる。この一本鎖ＤＮＡ部分は、図３のStep IIに示すように、自身と相補的な部分をみつけダブルホリデイジャンクションを形成する。ＢＬＭタンパク質阻害剤が存在しない場合（ＢＬＭ（＋））は、ＢＬＭタンパク質のヘリケース活性によりＤＮＡが解けるため、交差反応があまり起こらない（Non-crossover）。一方、ＢＬＭタンパク質阻害剤が存在する場合（ＢＬＭ（−））は、ＤＮＡがうまく解けないため、ＤＮＡ同士が結合することにより交差反応が起こる（Crossover）と考えられる。
【００２３】
（Ａ）工程において、ＢＬＭタンパク質阻害剤は、交差を効率的に生じさせる観点から、例えば３．０μｍ以上の濃度で用いることができる。交差をより効率的に生じさせる観点から、あるいは、ヘテロ接合型細胞が特にヒトｉＰＳ細胞である場合、ＢＬＭタンパク質阻害剤は、好ましくは１０．０μｍ以上、より好ましくは１１．０μｍ以上、さらに好ましくは１２．０μｎ以上の濃度で用いることができる。また、ＢＬＭタンパク質阻害剤は、交差を効率的に生じさせる観点から、例えば５０．０μＭ以下、好ましくは２５．０μＭ以下の濃度で用いることができる。交差をより効率的に生じさせる観点から、あるいは、ヘテロ接合型細胞が特にヒトｉＰＳ細胞である場合、ＢＬＭタンパク質阻害剤は、より好ましくは１４．０μＭ、さらに好ましくは１３．５μＭ、一層好ましくは１３．０μＭの濃度で用いることができる。具体的なＢＬＭタンパク質阻害剤の濃度範囲としては、３．０〜５０．０μＭ、３．０〜２５．０μＭ、３．０〜１４．０μＭ、３．０〜１３．５μＭ、３．０〜１３．０μＭ、１０．０〜５０．０μＭ、１０．０〜２５．０μＭ、１０．０〜１４．０μＭ、１０．０〜１３．５μＭ、１０．０〜１３．０μＭ、１１．０〜５０．０μＭ、１１．０〜２５．０μＭ、１１．０〜１４．０μＭ、１１．０〜１３．５μＭ、１１．０〜１３．０μＭ、１２．０〜５０．０μＭ、１２．０〜２５．０μＭ、１２．０〜１４．０μＭ、１２．０〜１３．５μＭ、１２．０〜１３．０μＭが挙げられる。より具体的には、１０6個のヘテロ接合型細胞を仕込んだ培養液１０ｍＬ中に対し、ＢＬＭタンパク質阻害剤の終濃度が上記の濃度となるように含ませることができる。
【００２４】
形質転換をより効率的に生じさせる観点から、ＢＬＭタンパク質阻害剤は、（Ａ）工程の前、つまり相同染色体の片アレル特異的なＤＮＡ二重鎖切断を導入するための核酸構築物をヘテロ接合型細胞に導入する前に、培養液中でヘテロ接合型細胞にＢＬＭタンパク質を共存させておくことが好ましい。具体的には、ＢＬＭタンパク質阻害剤存在下でヘテロ接合型細胞を培養することができる。交差をより効率的に生じさせる観点から、核酸構築物導入前にＢＬＭタンパク質阻害剤を共存させておく時間としては、６〜２４時間、好ましくは１０〜２４時間、より好ましくは１０〜１５時間が挙げられる。
【００２５】
［片アレル特異的にＤＮＡ二重鎖切断導入する核酸構築物］
ヘテロ接合型細胞に導入する核酸構築物は、相同染色体の片アレル特異的なＤＮＡ二重鎖切断導入を作動させるターゲティングベクターに組み込まれて構築される。
【００２６】
本発明において、ＤＮＡ二重鎖切断の方法としては特に限定されず、例えば、クリスパー（ＣＲＩＳＰＲ）−クリスパー関連ヌクレアーゼ法、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）法、又は転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）法等が挙げられ、好ましくはクリスパー（ＣＲＩＳＰＲ）／クリスパー関連ヌクレアーゼ法が挙げられる。クリスパー関連ヌクレアーゼとしては特に限定されず、例えば、Ｃａｓ３、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１等が挙げられる。当業者であれば、これらのＤＮＡ二重鎖切断システムを発現させるカセットを、ＤＮＡ二重鎖切断を生じさせるべき部位に応じて容易に設計することができる。
【００２７】
ＤＮＡ二重鎖切断導入を相同染色体の片アレル特異的なもの（相同染色体の片方のアレルのみをＤＮＡ二重鎖切断するもの）として構築するために、ＤＮＡ二重鎖切断システムを発現させるカセットは、当該二重鎖切断システムが切断標的とする認識配列のうち、片アレルに一塩基多型等の多型が存在する認識配列を選択して設計する。例えば、ＺＦＮ法を用いる場合はＺＦドメイン認識配列、ＴＡＬＥＮ法を用いる場合はＴＡＬＥドメイン配列、ＣＲＩＳＰＲ法を用いる場合はプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列が挙げられる。ＰＡＭ配列としては、使用するクリスパー関連ヌクレアーゼの由来に応じて決定することができる。
【００２８】
より具体的には、ＺＦＮ法及びＴＡＬＥＮ法を用いる場合は、近接する一対のドメイン認識配列のうち、一方のドメイン配列に多型が存在する認識配列を選択することができる。ＣＲＩＳＰＲ法を用いる場合は、一塩基多型が存在するＰＡＭ配列を選択することができる。特に、ＰＡＭ配列がＮＧＧである場合において３塩基目のＧに一塩基多型が存在するものを認識配列として選択すると、片アレル切断の特異性により優れる点で好ましい。なお、片アレルに多型が存在する認識配列を選択する具体的な方法としては、公知のジェノタイピングによる多型検出法を用いればよい。
【００２９】
交差を起こした細胞を選別可能とするため、ターゲットベクターには、適宜設計された選択カセットが導入されていてよい。選択カセットに含まれる遺伝子としては、宿主細胞を選択する指標として機能する遺伝子であればよく、例えば、薬剤耐性遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、レポーター遺伝子、フランキングプローブ遺伝子等が挙げられる。
【００３０】
薬剤耐性遺伝子としては、例えば、ピューロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００３１】
本発明においては、一の薬剤に対する薬剤耐性遺伝子と他の薬剤に対する薬剤耐性遺伝子とが互いに逆方向に配置した配列を有する選択カセット（ダブル薬剤選択カセット）を用いることが好ましい。図４に、ダブル薬剤選択カセットの構築法の一例を模式的に示す。図４（ｉ）に示すように、ネオマイシン耐性遺伝子（neo；発現方向に配置された一の薬剤に対する薬剤耐性遺伝子）とピューロマイシン耐性遺伝子（puro：発現方向と逆方向に配置された他の薬剤に対する薬剤耐性遺伝子）とが互いに逆方向に配置した配列を有するダブル薬剤選択カセット（neo/puroカセット）を相同染色体のアレルの一方又は他方（targeted allele）に導入しておくことで、図４（ｉｉ）に示すように交差によるホモ接合体となった場合に、両アレルにダブル薬剤選択カセットが入る。さらに、図４（ｉｉｉ）に示すように、当該配列（一の薬剤に対する薬剤耐性遺伝子と他の薬剤に対する薬剤耐性遺伝子とを互いに逆方向に配置した配列）を反転させることで、交差により生じたホモ接合体のみが、一の薬剤と他の薬剤との両方に耐性となる。より具体的には、当該配列が、互いに逆向きに配置した２つのｌｏｘＰ配列の間に配置するように構築したターゲティングベクターをヘテロ接合型細胞に導入し（図４（ｉ））、ＤＮＡ二重鎖切断による交差を誘発し（図４（ｉｉ））、Ｃｒｅリコンビナーゼを作用させることでｌｏｘＰ配列間の当該配列を反転させる（図４（ｉｉｉ））ことができる。
【００３２】
蛍光タンパク質遺伝子としては、例えば、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、ＤｓＲｅｄ、ＨｃＲｅｄ、ＡｓＲｅｄ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ＡｍＣｙａｎ、ＡｃＧＦＰ、Ｋａｅｄｅなどの蛍光タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。レポーター遺伝子としては、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼなどが挙げられる。フランキングプローブ遺伝子としては、相同組み換えをサザンブロット法により確認する場合に、検出用プローブとして利用できる任意の配列を当業者が適宜決定することができる。
【００３３】
本発明においては、選択カセットは、トランスポゾンベクターに組み込んで導入することが好ましい。より具体的には、２つのトランスポゾン認識配列の間に選択カセット及びプロモータ（図４参照）を挟むように選択カセットを組み込んだトランスポゾンベクター、及び切り出し用トランスポゼース発現ベクターを、ヘテロ接合型細胞に共導入し、細胞内で発現させたトランスポゼースによって選択カセットをゲノムに組み込むことができる。このように組み込まれた選択カセットは、後述の（Ｂ）工程を終えた後に、再切り出し用トランスポゼースによってゲノムから除去することができる。このようなトランスポゾン発現システムを用いることは、ホモ接合体細胞を、ゲノム修飾が無い態様で得ることができる点で好ましい。
【００３４】
標的部位をＨＬＡ領域に設定する場合、選択カセットは、標的部位よりもテロメア側の領域に挿入されることが好ましい。このような領域を含め、選択カセットが、メチル化などによる不活性化が起こりうる部位に挿入される場合は、不活性化を抑制する観点で、選択カセットの両方又は片方、好ましくは両方にインシュレーター配列を導入しておくことが好ましい。インシュレーター配列は、その活動範囲内に置かれた遺伝子の転写を遮断するものの、遺伝子発現を動揺させない制御要素として機能することで、遺伝子発現の独立性を保つ配列であることが知られている。インシュレーター配列としては特に限定されないが、例えば、ヒト７番染色体の39519983〜39520225位の配列、及びGenomic discovery of potent chromatin insulators for human gene therapy.Liu M, Maurano MT, Wang H, Qi H, Song CZ, Navas PA, Emery DW, Stamatoyannopoulos JA, Stamatoyannopoulos G.Nat Biotechnol. 2015 Feb;33(2):198-203.に記載のインシュレーター配列等が挙げられるが、最も好ましくはヒト７番染色体の39519983〜39520225位の配列が挙げられる。
【００３５】
上述の外来ＤＮＡは、遺伝子発現に関連する配列と適宜組み合わされた発現ユニットとしてターゲティングベクター中に組み込むことができる。外来ＤＮＡの発現に関連する配列としては、プロモータ配列、転写終結シグナル配列等の遺伝子発現に必要な配列、及び調節エレメント等の遺伝子発現を調節する配列等が挙げられる。プロモータ配列としては、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＥＦ１α、ＣＡＧ、Ｕ６、ｐＧＫ等が挙げられる。転写終結シグナル配列としては、ＢＧＨポリＡシグナル配列、ＳＶ４０ポリＡシグナル配列等が挙げられる。調節エレメントとしては、エンハンサー、ＩＲＥＳ（internal ribosome entry site）配列、lｏｘＰ配列およびＦＲＴ配列等が挙げられる。
【００３６】
なお、ターゲティングベクターの種類としては特に限定されず、例えば、プラスミドベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、ウイルスベクター（アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター）、人工染色体ベクター（大腸菌人工染色体(bacterial artificial chromosome：ＢＡＣ)、P1フアージ由来人工染色体(P1 bacteriophage artificial chromosome：ＰＡＣ)、酵母人工染色体(Yeast artificial chromosome：ＹＡＣ)、ヒト人工染色体(human artificial chromosome：ＨＡＣ)等）等が挙げられる。
【００３７】
ターゲティングベクターをヘテロ接合型細胞に導入する方法としては特に限定されず、従来公知の方法を用いることができる。例えば、ウイルスベクター系手法として、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス等のウイルスベクター等を感染させる方法が挙げられ、非ウイルスベクター系手法として、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法などの物理化学的方法が挙げられる。
【００３８】
ターゲティングベクターをヘテロ接合型細胞に導入した後は、ＢＬＭタンパク質阻害剤存在下でインキュベーションを行う。インキュベーションの間に、ＢＬＭタンパク質阻害剤存在下での核酸構築物の発現による相同染色体の片アレル特異的なＤＮＡ二重鎖切断（前述図３ Step I）とそれに引き続く交差（前述図３ Step II）とが起こることで、相同組換え体としてＬＯＨにより標的部のホモ接合型細胞を得ることができる（前述図１及び図２）。ＢＬＭタンパク質阻害剤存在下でのインキュベーション時間としては、交差による相同組換えをより効率的に生じさせる観点から、２０時間以上、たとえば２０〜６０時間が挙げられる。交差による相同組換えを一層効率的に生じさせる観点から、好ましくは４０〜６０時間が挙げられ、より好ましくは４５〜６０時間が挙げられる。
【００３９】
［（Ｂ）工程］
（Ｂ）工程では、ホモ接合型細胞を選別する。交差によって相同組換え体として生じる２種類のホモ接合型細胞のいずれを選別してもよい。選別には、（Ａ）工程で用いた選択カセットの内容に応じた選択マーカーを含む培養液（選択培養液）中で細胞を培養すればよい。薬剤耐性遺伝子を含む選択カセットを用いた場合は対応する薬剤を含む培養液中で樹立した細胞（ポジティブクローン）を選別することができ、蛍光タンパク質遺伝子を含む選択カセットを用いた場合は蛍光顕微鏡で観察することによって選別することができ、レポーター遺伝子を含む選択カセットを用いた場合は対応する基質を加えることによって選別することができ、フランキングプローブ遺伝子を含む選択カセットを用いた場合はサザンブロット法により選別することができる。
【００４０】
（Ａ）工程における選択カセットとして、一の薬剤に対する薬剤耐性遺伝子と他の薬剤に対する薬剤耐性遺伝子とを互いに逆方向に配置した配列を有する選択カセット（ダブル薬剤選択カセット）を用いた場合は、当該一の薬剤及び他の薬剤との両方に耐性である細胞を、目的とするホモ接合型細胞として選別することができる。
【００４１】
例えば、図４の例では、Ｃｒｅリコンビナーゼによりダブル薬剤選択カセットが反転することではじめてピューロマイシン耐性となる。したがって、最初に、ダブル薬剤選択カセットで発現方向と逆向きに配置させられた薬剤耐性遺伝子（図４の例ではピューロマイシン耐性遺伝子）に対応する前記他の薬剤（図４の例ではピューロマイシン）を用いて選択を行うことができる。ダブル薬剤カセットはＣｒｅリコンビナーゼにより一定の時間反転を繰り返していると考えられるため、当該一定時間で、ダブル薬剤選択カセットで発現方向に配置させられた薬剤耐性遺伝子（図４の例ではネオマイシン耐性遺伝子）に対応する前記一の薬剤（図４の例ではネオマイシン）も用いて選択を行うことができる。例えば、当該一定の時間で、最初に他の薬剤を用い、その後に他の薬剤と一の薬剤との両方を用いて選択を行うことができる。他の薬剤と一の薬剤との両方を用いての選択は２回またはそれ以上行うことができ、この場合、選択の回数を重ねるごとに一の薬剤の濃度を上げることができる。
【００４２】
図５に、ダブル薬剤選択カセットを用いた場合の選別工程をさらに具体的に説明する。例えば、ヘテロ接合型細胞においてヘテロ接合変異が相同染色体の一方（図中、母方として示される。）のアレルに存在していた場合において、ダブル薬剤選択カセット（図中、両矢印で示される。）が当該一方（母方）のアレルに導入されると、得られる２種類のホモ接合型細胞のうち、図中（i）に示されるように当該変異のホモ接合型であるものが、一の薬剤及び他の薬剤の両方に耐性な細胞として選別される。この細胞は、表現型検出用細胞に応用することができる。一方、ダブル薬剤選択カセットが他方（父方）のアレルに導入されると、得られる２種類のホモ接合型細胞のうち、図中（ii）に示されるように当該変異がなくなった細胞が、一の薬剤及び他の薬剤の両方に耐性な細胞として選別される。この細胞は治療用細胞に応用することができる。
【００４３】
［その他の工程］
（Ｂ）工程で選別されたホモ接合型細胞は、その応用目的に応じた工程に供されることができる。例えば、選別されたホモ接合型細胞が治療に応用される場合等のゲノムに修飾が無い状態が要求される場合は、（Ａ）工程でゲノムに組み込まれた選択カセットを除去する。具体的には、選別されたホモ接合型細胞に再切り出し用トランスポゼース発現ベクターを導入することによって、細胞内でトランスポゼースが発現し、組み込まれた選択カセットを痕跡を残すことなく除去することができる。
【００４４】
［ホモ接合型細胞］
本発明によって得られるホモ接合型細胞は、ホモ化した標的部位に応じて様々な用途に応用することができる。ホモ接合型細胞を、疾患を引き起こす変異のホモ接合体（図１中（ii）で示される細胞）として得た場合は、当該変異と疾患との関連を技術的に解析するために応用することができる。この細胞は、特に、多因子疾患における遺伝子間領域での原因因子探索を行う場合に有用である。また、ホモ接合型細胞を、変異がなくなり正常の表現型のもの（図１中（iii）で示される細胞）として得た場合は、再生医療に応用することができる。さらに、ホモ接合型細胞を、復帰細胞（Revertant細胞）（図２（iii）に示される細胞）として得た場合は、治療、疾患発生機構の解析、異なる細胞系列での遺伝子変異回復時における生体への影響の解析等に応用することができる。
【００４５】
特に、ホモ接合型細胞を、ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）などのＭＨＣ（主要組織適合性複合体）をホモ化したものとして得た場合は、当該ホモ接合型細胞を、再生医療材料、がん発症を予防するがんワクチン、がんを発症した患者に対してがん切除後の再発抑制のためのがん免疫薬として好適に用いることができる。また、本発明によって、交差を生じさせる部位として様々な部位をターゲットとすることができるため、様々なハプロタイプのＭＨＣホモ接合型の細胞を作製することができる。本発明によってもたらされるＭＨＣホモ接合型細胞の多様性により、ＭＨＣホモ接合型細胞からなる細胞バンクを構築することができる。このような細胞バンクにストックされたホモ接合型細胞は、その多様性により、再生医療材料として用いられる場合に、再生医療材料の免疫適合率が高められている点で好ましい。或いは、細胞バンクにストックされたホモ接合型細胞は、がんワクチンあるいはがん免疫薬として用いられる場合に、患者本人から自前のｉＰＳ細胞（がんワクチン又はがん免疫薬）作製を要することなく、細胞バンクから当該患者に免疫適合する細胞が速やかに選択されて治療に適用されることが可能となる点で好ましい。
【実施例】
【００４６】
以下に実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００４７】
概要
まず、参考例として、ブルーム症候群タンパク質阻害剤ＭＬ２１６を用いず、テトラサイクリン遺伝子発現調節システム（Ｔｅｔ−ｏｆｆ）を用い、ＢＬＭタンパク質の遺伝子発現抑制と片アレル特異的にＤＮＡ二重鎖切断（ＤＳＢ）を導入するように設計したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の導入とを組み合わせることで、ホモ接合型細胞を作製した。さらに、実施例として、Ｔｅｔ−ｏｆｆを用いず、ブルーム症候群タンパク質阻害剤ＭＬ２１６存在下で、片アレル特異的にＤＳＢを導入するように設計したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を細胞に導入することで、ホモ接合型細胞を作製した。【００４８】
［参考例］Tet-offシステムを用いたＢＬＭ遺伝子制御ユニットの構築及び内在性ＢＬＭ遺伝子への挿入並びに片アレル特異的にＤＮＡ二重鎖切断によるホモ接合型細胞の作製
ＭＬ２１６を用いず、ブルーム遺伝子の発現を一過性にシャットダウンにするTet-offシステムと片アレル特異的にＤＮＡ二重鎖切断（ＤＳＢ）を導入するように設計したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の導入とを組み合わせ、neomycinとpuromycinとのダブル薬剤選択を行うことで、１９番染色体ＡＡＶＳ１領域（セントロメアからの9Mb（３５Ｍ領域）、セントロメアからの14Mb（４０Ｍ領域）、セントロメアからの19Mb-I, 19Mb-II（４５Ｍ−１領域、４５Ｍ−２領域）を標的部位とする部位特異的ホモ接合体の細胞株を獲得した。なお、セントロメアからの19Mb-I, 19Mb-II（４５Ｍ−１領域、４５Ｍ−２領域）は、４５Ｍ領域における異なる領域である。この実験では、テトラサイクリン誘導体（ドキシサイクリン：Ｄｏｘ）を添加した時だけブルーム遺伝子の発現が低下するように設計した。また、ダブル薬剤選択カセットとして図４に示すものを用いた。ダブル薬剤選択カセット内には薬剤選択可能な２種類の遺伝子(neomycin及びpuromycin)が逆向きに配置されており、当該２種類の遺伝子の外側には逆向きｌｏｘＰが存在する。このダブル薬剤選択カセットは、部位特異的ホモ接合体に変化することで２コピーとなり、Ｃｒｅリコンビナーゼの作用により２種類の薬剤に対して耐性となる。実験デザインを図６〜図８に示す。図６は、TALENによるBLM遺伝子座の両アレルに対するTetカセットのターゲティングを示す。ターゲティング後のpuromycin選択カセットはフリッパーゼリコンビナーゼによって除去された。図７は、AAVS1遺伝子座への二重選択カセットのターゲティングを示す。図８は、４Ｎ期における有糸分裂交差の模式図を示す。なお、片アレル特異的ＤＳＢ導入用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム構築、細胞培養、ＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成、ＤＮＡ抽出、ホモ接合型細胞のスクリーニング、交差部位の決定、フローサイトメトリーの手法の詳細については、後述の実施例に記載の手法と同様である。【００４９】
（１．BLM-ターゲティングベクター）
ヒトBLM-ターゲティングベクターを調製するために、ヒトサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーターをｈＥＦ１αプロモーターに変更し、マウスBlmターゲティングベクター（Yusa K, Horie K, Kondoh G, Kouno M, Maeda Y, Kinoshita T, Takeda J. Genome-wide phenotype analysis in ES cells by regulated disruption of Bloom's syndrome gene. Nature. 2004 Jun 24;429(6994):896-9.）において、ｔＴＡ翻訳のためのコザック配列をAGGATTからGCCACCへ改変した。さらに、マウスBlm-ターゲティングベクターから人工イントロン配列を除去した。ターゲティングベクターの左右のアームは、下記表に示すプライマーをそれぞれ用いてＰＣＲによって調製した。【００５０】
【表１】
2019216338.tif 000003
【００５１】
（２．選択カセットを有する第１９染色体ＡＡＶＳ１領域用ターゲティングベクター）
選択カセット（cNPカセット）は、マウスESC（Horie, K., Kokubu, C., Yoshida, J., Akagi, K., Isotani, A., Oshitani, A., Yusa, K., Ikeda, R., Huang, Y., Bradley, A., et al. (2011). A homozygous mutant embryonic stem cell bank applicable for phenotype-driven genetic screening. Nature methods 8, 1071-1077.）で使用されたcNPカセットに、３つの改変（PgkプロモーターをhEF1αプロモーターに変更、Thymidine kinase  遺伝子を除去、及びlox2272をloxPに置き換え）を加えたものとして作製した。【００５２】
具体的には、以下のようにして、選択用プラスミドを作製した。
まず、発現のために必要なbGH (bovine growth hormone) polyA配列を、以下の鋳型及びプライマーを用い、以下の条件で増幅した。
鋳型：
PGK-L21-NPT-L21-pA (A homozygous mutant embryonic stem cell bank applicable for phenotype-driven genetic screening. Nature Methods 8, 1071-1077 (2011))
プライマー：
*KpnI-bGHpA-puro-up-up：TAGTGGGCGCGCCGGTACCTTATCGAGTCC
*Gly -puro- low：GGCTTGTACTCGGTCATGGT GGATCCAATAACTTCGTATAATGT
ＰＣＲ条件：
９４℃２分、（９８℃１０秒、６８℃１分）×３５サイクル、及び６８℃７分【００５３】
puromycin遺伝子を、以下の鋳型及びプライマーを用い、以下の条件で増幅した。
鋳型：
pPGKpuro-F2F
プライマー：
*Gly -puro- up：GACCGAGTACAAGCC CACGGTGCGCCTCGC
*puro-up：TAA CTCGAGTCATTA GGCACCGGGCTTGCGGGTCATGCAC
ＰＣＲ条件：
９４℃２分、（９８℃１０秒、６８℃１分）ｘ３５サイクル、及び６８℃７分【００５４】
neomycin遺伝子を、以下の鋳型及びプライマーを用い、以下の条件で増幅した。
鋳型：
pMulti-hEF1a-LP1-NPT-LP1-SLRarm
プライマー：
neo-low：TAATGACTCGAGTTAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAG
XhoI-tTA-up：TCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGT
PCR条件：
９４℃２分、（９８℃１０秒、６８℃１．５分）ｘ３５サイクル、及び６８℃７分【００５５】
上述のようにして得られた３つのフラグメントを、hEF1αプロモーターを有し且つPmeI/AscI/SfiI及びFseI/NotIのターゲティングアーム・クローニングサイトが挿入されている基本ベクターにIn Fusion法で導入した。【００５６】
下記表に示すプライマーを用いたＰＣＲによって、ターゲティングベクターの左右のアームを調製した。【００５７】
【表２】
2019216338.tif 000004
【００５８】
（３．ＢＬＭ領域のターゲティング）
8μgのDNA（TALEN左2μg、TALEN右2μg、及びBLMターゲティングベクター4μg）を用い、100μlのチップ内の１００万個のヒト人工多能性幹細胞（ヒトｉＰＳ細胞(hiPSCs)；後述実施例の細胞培養の欄参照）に対し、１３００Ｖ、３０ミリ秒、１パルスの条件でエレクトロポレーション（Neon transfection platform; Invitrogen）によってトランスフェクトした。TALEN配列は下記のとおりである。トランスフェクションを行った細胞を、Synthemax(R)II-SC被覆組織培養皿上の１０ｍＭのＹ−２７６３２を含有しピューロマイシンを含有しないｈＥＳＣ培地中にプレーティングした。トランスフェクションの２日後、ピューロマイシン０．５μｇ／ｍｌで選択を開始した。標的クローンを下記表に示すプライマーhBLM-3およびプライマーtTA2を用いたPCRによって最初に選択し、次に両アレル標的クローン（hiPSC-BLMtet/tet）をプライマーhBLM-1、プライマーhBLM-2およびプライマーtTA-1を用いたPCRによって選択した。【００５９】
【表３】
2019216338.tif 000005
【００６０】
【表４】
2019216338.tif 000006
【００６１】
【表５】
2019216338.tif 000007
【００６２】
（４．１９番染色体AAVS1領域への選択カセットのターゲティング及び片アレル標的クローンの選択）
基本ベクターに、１９番染色体ＡＡＶＳ１領域のアームを挿入することで、１９番染色体ＡＡＶＳ１のターゲティング用ベクターとして構築した。また、8μgのDNA（AAVS1-ZFN左2μg、AAVS1-ZFN右2μg、及びAAVS1用ターゲティングベクター4μg）を用い、100μlのチップ内の１００万個のBLMtet/tet hiPSCに対し、１１００Ｖ、３０ミリ秒、１パルスの条件でエレクトロポレーション（Neon transfection platform; Invitrogen）によってトランスフェクトした。AAVS1-ZFNの配列としては、Hockemeyer D, Soldner F, Beard C, Gao Q, Mitalipova M, Dekelver RC, Jaenisch R, et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases. Nature biotechnology. 2009;27(9):851-857.で報告されたものを用いた。【００６３】
トランスフェクションを行った細胞を、Synthemax(R)II-SC被覆組織培養皿上の１０ｍＭのＹ−２７６３２を含有しＧ４１８を含有しないｈＥＳＣ培地中にプレーティングした。トランスフェクションの２日後、１００μｇ／ｍｌのＧ４１８で選択を開始した。標的クローンをプライマーAAVS1-LF2及びPuro-L2を用いたＰＣＲによって最初に選択し、次に片アレル標的クローン（hiPSC-BLMtet/tetAAVS1cNP/+）をプライマーAAVS1-C-F、AAVS1-C-R、及びPuro-L2を用いたＰＣＲによって選択した。【００６４】
【表６】
2019216338.tif 000008
【００６５】
【表７】
2019216338.tif 000009
【００６６】
（５．１９番染色体での片アレル特異的ＤＳＢの導入及びホモ接合型細胞の選択）
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（種々のｇＲＮＡ配列を含むｐＸ３３０）６．５〜８．０μｇを、ｉＣｒｅリコンビナーゼプラスミド３μｇとともに、Neon(R) Transfection Systemを用いて、１３００Ｖ、２０ミリ秒、１パルスの条件で、エレクトロポレーションにより、１００万個のBLMtet/tetAAVS1cNP/+ hiPSC細胞にトランスフェクトした。ｇＲＮＡ配列は、後述表１２に示したものを用いた。【００６７】
トランスフェクションを行った細胞を、Synthemax(R)II-SC被覆組織培養皿上の１０ｍＭのＹ−２７６３２を含有しピューロマイシン及びＧ４１８を含有しないｈＥＳＣ培地中にプレーティングした。トランスフェクションの２日後、ピューロマイシン０．５μｇ／ｍｌで選択を開始した。トランスフェクションの４日後には、選択条件を１．０μｇ／ｍｌのピューロマイシンおよび１００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ネオマイシン選択用）に変更した。６日後には、選択条件を１．０μｇ／ｍｌのピューロマイシンおよび２００μｇ／ｍｌのＧ４１８に変更した。これによって、ホモ接合型細胞hiPSC-BLMtet/tetAAVS1cNP/+Dox(+)9M-CRISPR(+)を得た。【００６８】
［実施例］ＢＬＭタンパク質阻害剤を用いた片アレル特異的にＤＮＡ二重鎖切断によるホモ接合型細胞の作製
Ｔｅｔ−ｏｆｆを用いず、ＢＬＭタンパク質阻害剤ＭＬ２１６（１０．０μＭ、１２．５μＭ、及び１４．０μＭ）存在下で１２時間培養した１００万個の細胞に、片アレル特異的にＤＳＢを導入するように設計したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を導入し、neomycinとpuromycinとのダブル薬剤選択を行うことで、１９番染色体ＡＡＶＳ１領域（セントロメアからの9Mb（３５Ｍ領域）、セントロメアからの14Mb（４０Ｍ領域）、セントロメアからの19Mb-I, 19Mb-II（４５Ｍ−１領域、４５Ｍ−２領域）をそれぞれ標的部位とする部位特異的ホモ接合体の細胞株を獲得した。なお、セントロメアからの19Mb-I, 19Mb-II（４５Ｍ−１領域、４５Ｍ−２領域）は、４５Ｍ領域における異なる領域である。さらに、実施例では、６番染色体ＨＬＡ領域をそれぞれ標的部位とする部位特異的ホモ接合体の細胞株も獲得した。ダブル薬剤選択カセット内には薬剤選択可能な２種類の遺伝子(neomycin及びpuromycin)が逆向きに配置されており、当該２種類の遺伝子の外側には逆向きｌｏｘＰが存在する。このダブル薬剤選択カセットは、部位特異的ホモ接合体に変化することで２コピーとなり、Ｃｒｅリコンビナーゼの作用により２種類の薬剤に対して耐性となる。【００６９】
（１．部位特異的ホモ接合体を検出する選択カセットの作製）
参考例と同様、以下のようにして、選択用プラスミドを作製した。
まず、発現のために必要なbGH (bovine growth hormone) polyA配列を、以下の鋳型及びプライマーを用い、以下の条件で増幅した。
鋳型：
PGK-L21-NPT-L21-pA (A homozygous mutant embryonic stem cell bank applicable for phenotype-driven genetic screening. Nature Methods 8, 1071-1077 (2011))
プライマー：
*KpnI-bGHpA-puro-up-up：TAGTGGGCGCGCCGGTACCTTATCGAGTCC
*Gly -puro- low：GGCTTGTACTCGGTCATGGT GGATCCAATAACTTCGTATAATGT
ＰＣＲ条件：
９４℃２分、（９８℃１０秒、６８℃１分）×３５サイクル、及び６８℃７分【００７０】
puromycin遺伝子を、以下の鋳型及びプライマーを用い、以下の条件で増幅した。
鋳型：
pPGKpuro-F2F
プライマー：
*Gly -puro- up：GACCGAGTACAAGCC CACGGTGCGCCTCGC
*puro-up：TAA CTCGAGTCATTA GGCACCGGGCTTGCGGGTCATGCAC
ＰＣＲ条件：
９４℃２分、（９８℃１０秒、６８℃１分）ｘ３５サイクル、及び６８℃７分【００７１】
neomycin遺伝子を、以下の鋳型及びプライマーを用い、以下の条件で増幅した。
鋳型：
pMulti-hEF1a-LP1-NPT-LP1-SLRarm
プライマー：
neo-low：TAATGACTCGAGTTAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAG
XhoI-tTA-up：TCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGT
PCR条件：
９４℃２分、（９８℃１０秒、６８℃１．５分）ｘ３５サイクル、及び６８℃７分【００７２】
上述のようにして得られた３つのフラグメントを、hEF1αプロモーターを有し且つPmeI/AscI/SfiI及びFseI/NotIのターゲティングアーム・クローニングサイトが挿入されている基本ベクターにIn Fusion法で導入した。【００７３】
（２．選択カセットのターゲティング）
（２−１．１９番染色体ＡＡＶＳ１領域への選択カセットのターゲティング）
基本ベクターに、１９番染色体ＡＡＶＳ１領域のアームを挿入することで、１９番染色体ＡＡＶＳ１のターゲティング用ベクターとして構築した。また、8μgのDNA（AAVS1-ZFN 左 2μg、AAVS1-ZFN 右 2μg、及びAAVS1用ターゲティングベクター 4μg）を用い、Neon(R) Transfection Systemを用いて、１１００Ｖ、３０ミリ秒、１パルスの条件で、１００万個のヒトｉＰＳ細胞にトランスフェクションを行った。AAVS1-ZFNの配列としては、Hockemeyer D, Soldner F, Beard C, Gao Q, Mitalipova M, Dekelver RC, Jaenisch R, et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases. Nature biotechnology. 2009;27(9):851-857.で報告されたものを用いた。【００７４】
また、ターゲティングベクターのアームより外側（１９番染色体 + 55114902-55114931）のプライマーAAVS1-LF2と選択カセット内部（選択カセット内部のpuromycin上）のプライマーPuro-L2とを用いたＰＣＲ（９４℃２分、（９８℃１０秒、６８℃３０秒）ｘ３５サイクル、及び６８℃７分）を行うことで、選択カセットの挿入を確認した。【００７５】
【表８】
2019216338.tif 000010
【００７６】
交差による相同組換え後に選択カセットを除去できるようにするため、トランスポゾンの認識配列を有するベクターに上述の選択カセットを導入したベクターを構築した。【００７７】
（２−２．６番染色体ＨＬＡ領域への選択カセットのターゲティング）
トランスポゾンの認識配列を有したベクター（PiggyBacトランスポゾンベクター）に選択カセットと、挿入された外来ＤＮＡ（選択カセット）をメチル化などの不活性化から守るためのインシュレーター配列とを、選択カセットの両方に組み込んだ。選択カセット及びインシュレーター配列を組み込んだベクターのターゲティングアーム・クローニングサイトに、６番染色体ＨＬＡ領域のテロメア側の配列ＰＣＲによって増幅し組み込んだものをターゲティングベクターとした。【００７８】
・PiggyBacトランスポゾンベクターへのインシュレーター配列の導入
インシュレーター配列（tgcttgtccttccttcctgtaacacagccattaaaccaggagcatcgcccttccccggccctcaggtaagaggaccaaataccgtagccgtttccaatttcagtcctttagcgccacctggtgctaactactctatcacgcttttatccaataactacctttgtaaatttcctttcaaaagttctggccgggcgcggtggctcacgcttgtaatcccagcactttgtgaggggtcaggagttc; ７番染色体 +39519983-39520225）を、５’側をプライマーPB5'-HindIII-ins及びプライマーins-HindIII-PB5'で、３’側をプライマーbghpA-ins及びプライマーins-SpeI-PB3'でＰＣＲによって増幅し、PiggyBacトランスポゾンベクターに組み込んだ(#28 pPB-hEF1-puro-bghpA-h5F-insurator-2)。【００７９】
【表９】
2019216338.tif 000011
【００８０】
・ターゲティングアームの挿入
AscIサイトには、下記のプライマーchr6-Asc1-up及びプライマーchr6-Asc1-lowで増幅したアームを挿入した。また、PacIサイトには下記のプライマーchr6-Pac1-up及びプライマーchr6-Pac1-lowで増幅したアームを挿入した。ＰＣＲ条件は、９４℃２分（９８℃１０秒、６８℃１分）ｘ３５サイクル、及び６８℃７分であった。【００８１】
【表１０】
2019216338.tif 000012
【００８２】
上記アームがゲノム上で接合する部分(agaaaatagccgccacttaaagg)を認識するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９：８μｇを、ターゲティングベクター３μｇとともに、Neon(R) Transfection Systemを用いて、１２００Ｖ、３０ミリ秒、１パルスの条件で、１００万個のヒトｉＰＳ細胞にトランスフェクトした。【００８３】
選択カセットが片方のアリルのみに挿入され欠失などが起きていないことを確認するため、下記の３つのプライマー（chr6-TG-low、chr6-TG-up、及びhEF1a-TG）で同時にＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９４℃２分、（９８℃１０秒、６８℃１．５分）ｘ３５サイクル、及び６８℃７分であった。【００８４】
【表１１】
2019216338.tif 000013
【００８５】
ＰＣＲ産物を電気泳動した結果、1320bpのバンド（選択カセットが挿入されたもの）と570bpのバンド（選択カセットの挿入がなく野生型のままのもの）との両方が検出されたクローンを、片方のアリルのみにカセットが挿入されたものとして獲得した。【００８６】
（３．片アレル特異的ＤＮＡ二重鎖切断導入用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの構築）
１９番染色体ＡＡＶＳ１領域（セントロメアからの9Mb（３５Ｍ領域）、セントロメアからの14Mb（４０Ｍ領域）、セントロメアからの19Mb-I, 19Mb-II（４５Ｍ−１領域、４５Ｍ−２領域）、及び６番染色体ＨＬＡ領域（２９Ｍ領域）を標的部位としたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによるＤＮＡ二重鎖切断（ＤＳＢ）を行うために、標的部位の３’側に位置するＰＡＭ（ＮＧＧ）にＳＮＰがあるｇＲＮＡを用意し、片アレルだけ選択的にＤＳＢを導入するようにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを構築した。ＳＮＰ情報（ＳＮＰタイプは、ＰＡＭ配列ＮＧＧの「Ｇ」におけるＳＮＰタイプを示す。いずれのＧにおけるＳＮＰタイプかについては、表１２のSNP_IDにより明らかにされている。）標的部位の染色体上の位置、及びｇＲＮＡ標的配列を下記表に示す。【００８７】
【表１２】
2019216338.tif 000014
【００８８】
例えば３５Ｍ領域の片アリル切断用のｇＲＮＡ標的配列をｐＸ３３０に挿入するため、以下の配列を有するオリゴＤＮＡを、ＴＥ中それぞれ１００μＭとなるように調製した各溶液１０μｌに３０μｌのイオン交換水を加え、１００℃で加熱後、常温になるまで放置しアニールさせた。その後、アニーリングさせたオリゴＤＮＡをｐＸ３３０ベクターの制限酵素ＢｂｓＩ部位にクローニングすることで、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を構築した。
・１９番染色体３５Ｍ領域用オリゴＤＮＡ：
CACCGCCTGGTGTGGGGGCCCTGCG
AACCGCAGGGCCCCCACACCAGGC【００８９】
以下の領域を標的部位とする場合も、以下のオリゴＤＮＡを用いたことを除いて同様の手順を行った。
・１９番染色体４０Ｍ領域用オリゴＤＮＡ：
CACCGGTCAGGGATGGGATTAGGGA
AAACTCCCTAATCCCATCCCTGACC
・１９番染色体４５Ｍ−１領域用オリゴＤＮＡ：
CACCGCCCAGAAGCCTCCGCGGCGC
AAACGCGCCGCGGAGGCTTCTGGGC
・１９番染色体４５Ｍ−２領域用オリゴＤＮＡ：
CACCGATTGTTATATTGGTGAGGGG
AAACCCCCTCACCAATATAACAATC
・６番染色体ＨＬＡ領域用オリゴＤＮＡ：
CACCGATTGCTTTGATGCTGGGTCA
AAACTGACCCAGCATCAAAGCAATC【００９０】
（４．細胞培養）
ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）系統（Igawa K, Kokubu C, Yusa K, Horie K, Yoshimura Y, Yamauchi K, Suemori H, Yokozeki H, Toyoda M, Kiyokawa N, Okita H, Miyagawa Y, Akutsu H, Umezawa A, Katayama I, Takeda J. Removal of reprogramming transgenes improves the tissue reconstitution potential of keratinocytes generated from human induced pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 2014 Sep; 3(9): 992-1001.）を、Synthemax(R) II-SC（Corning）被覆組織培養皿上のｈＥＳＣ培地で培養し、Accutase(R)を用いて継代し、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ−２７６３２（１０μＭ、ＬＣラボラトリーズ）を用いてプレーティングした。【００９１】
（５．ブルーム症候群タンパク質阻害剤（ＭＬ２１６）の使用量・使用方法）
１０．０μＭ、１２．５μＭ、又は１４．０μＭのＭＬ２１６を、交差を誘発するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９と選択カセットを作動させるＣｒｅリコンビナーゼとを細胞に導入（トランスフェクション）する１２時間前から導入後の４８時間の間、細胞に作用させた。具体的には、上述の細胞培養において、ＤＭＳＯに溶解させたＭＬ２１６を、ｈＥＳＣ培地中上記濃度となるように含ませた。【００９２】
（６．片アレル特異的ＤＳＢの導入及びホモ接合型細胞の選択）
（６−１．１９番染色体での片アレル特異的ＤＳＢの導入及びホモ接合型細胞の選択）
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（表１２に基づくｇＲＮＡ配列を含むｐＸ３３０）８μｇを、ｉＣｒｅリコンビナーゼプラスミド３μｇとともに、Neon(R) Transfection Systemを用いて、１３００Ｖ、２０ミリ秒、１パルスの条件で、エレクトロポレーションにより、１００万個のヒト人工多能性幹細胞（ヒトｉＰＳ細胞(hiPSCs)）にトランスフェクトした。【００９３】
トランスフェクションを行った細胞を、Synthemax(R)II-SC被覆組織培養皿上の１０ｍＭのＹ−２７６３２を含有しピューロマイシン及びＧ４１８を含有しないｈＥＳＣ培地中にプレーティングした。トランスフェクションの２日後、ピューロマイシン０．５μｇ／ｍｌで選択を開始した。トランスフェクションの４日後には、選択条件を１．０μｇ／ｍｌのピューロマイシンおよび１００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ネオマイシン選択用）に変更した。６日後には、選択条件を１．０μｇ／ｍｌのピューロマイシンおよび２００μｇ／ｍｌのＧ４１８に変更した。これによって、ホモ接合型細胞hiPSC-AAVS1cNP/+ML216(+)9M-CRISPR(+)を得た。【００９４】
（６−２．６番染色体での片アレル特異的ＤＳＢの導入及びホモ接合型細胞の選択）
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（表１２に基づくｇＲＮＡ配列を含むｐＸ３３０）８μｇを、ｉＣｒｅリコンビナーゼプラスミド３μｇとともに、Neon(R) Transfection Systemを用いて、１３００Ｖ、２０ミリ秒、１パルスの条件で、エレクトロポレーションにより、１００万個のヒト人工多能性幹細胞（ヒトｉＰＳ細胞(hiPSCs)）にトランスフェクトした。【００９５】
トランスフェクションを行った細胞について、トランスフェクションの２日後に、０．２μｇ／ｍｌのピューロマイシンで選択を開始した。トランスフェクションの４日後には、選択条件を０．２５μｇ／ｍｌのピューロマイシンおよび２５μｇ／ｍｌのＧ４１８に変更した。６日後には、選択条件を０．３３μｇ／ｍｌのピューロマイシンおよび５０μｇ／ｍｌのＧ４１８に変更した。これによって、ホモ接合型細胞hiPSC-telHLAcNP/+ML216(+)HLA I-III-CRISPR(+)を得た。【００９６】
［参考例及び実施例による結果１］
（１．ホモ接合型細胞の処理）
以下のように、参考例及び実施例で得られたホモ接合型細胞（参考例で得られたhiPSC-BLMtet/tetAAVS1cNP/+Dox(+)9M-CRISPR(+)、並びに、実施例で得られたhiPSC-AAVS1cNP/+ML216(+)9M-CRISPR(+)及びhiPSC-telHLAcNP/+ML216(+)HLA I-III-CRISPR(+)）について、ＲＮＡ抽出及びｃＤＮＡ合成、ＤＮＡ抽出、ホモ接合型細胞のスクリーニング（ジェノタイピング）、交差部位の決定、ＨＬＡ遺伝子型反対（実施例の場合）、並びにフローサイトメトリーを行った。【００９７】
（１−１．ＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成）
総ＲＮＡサンプルは、RNeasy Plus Micfro Kit（QIAGEN）を用いて細胞から調製した。 SuperScriptIII（Invitrogen）を用い、５０℃で６０分間、ランダムヘキサマープライマーを用いて８００ｎｇの全ＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡを合成した。【００９８】
（１−２．ＤＮＡ抽出）
細胞を溶解緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭＥＤＴＡ、Ｘ１ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、及び２００μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ）中、５５℃で一晩インキュベートした。ＤＮＡ抽出キットDNeasy(R)（Qiagen）を用いてｈｉＰＳＣからＤＮＡを抽出した。【００９９】
（１−３．ホモ接合型細胞のスクリーニング（ジェノタイピング））
（１−３−１．１９番染色体におけるホモ接合型細胞のスクリーニング）
選択後のｈｉＰＳＣコロニーから抽出したＤＮＡについて、以下のプライマー（AAVS1-C-F、AAVS1-C-R、及びPuro-L2）を用いて競合的ＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９４℃２分（９８℃１０秒、６８℃１．５分）ｘ３５サイクル、及び７２℃７分であった。【０１００】
【表１３】
2019216338.tif 000015
【０１０１】
（１−３−２．６番染色体におけるホモ接合型細胞のスクリーニング）
選択後のｈｉＰＳＣコロニーから抽出したＤＮＡについて、以下のプライマー（chr6-TG-check-up-outside、chr6-TG-check-low-outside、及びPuro-L2）を用いて競合的ＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９４℃２分（９８℃１０秒、６８℃２分１０秒）ｘ３５サイクル、及び７２℃７分であった。【０１０２】
【表１４】
2019216338.tif 000016
【０１０３】
（１−４．１９番染色体及び６番染色体の交差部位の決定）
まず、染色体交差を起す前の細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、２本の染色体で配列が異なっている（ヘテロ状態）ＳＮＰを同定した。また、交差反応が起きた後に、競合的ＰＣＲによって同定された陽性クローンからゲノムＤＮＡを抽出し、当該ＳＮＰ部位を解析し、配列が一種類（ホモ状態）へ変化しているかどうかを解析した。解析の結果、ヘテロ状態のＳＮＰ部位とホモ状態のＳＮＰ部位との中間位置を交差部位（ＣＯ）として決定した。【０１０４】
（１−５．ＨＬＡ遺伝子型判定）
まず、グループ特異的プライマー（LABType SSO HLA A Locus、LABType SSO HLA B Locus、LABType SSO HLA C Locus、及びLABType SSO HLA DRB1）を用いて標的ＤＮＡをＰＣＲ増幅した。Ｒ−フィコエリトリン結合ストレプトアビジンを用いた検出のため、ＰＣＲ産物をビオチン化した。ＰＣＲ産物を変性させ、蛍光ビーズ（One Lamda）と結合したｃＤＮＡプローブに再ハイブリダイズさせた。LABScan 100（Luminex(R) 100）フロー分析器によって、各ビーズ上のフィコエリトリンの蛍光強度を同定した。陽性および陰性ビーズIDのパターンをLABType SSOワークシートまたはHLA Fusion 4.1 HotFix 2の情報と照合することにより、試料中のHLA対立遺伝子または対立遺伝子群を決定した。【０１０５】
（１−６．フローサイトメトリー）
ｈｉＰＳＣ懸濁液を、１％（ｗｔ／ｖｏｌ）のウシ血清アルブミン及び０．０５％（ｖ／ｖ）アジ化ナトリウムを含有するリン酸緩衝食塩水で洗浄し、次いで氷上で３０分間、適切な抗体と共にインキュベートした。試料は、BD FACSCanto II（BD Biosciences）を用いて分析した。データは、FlowJoソフトウェア（Tomy Digital Biology）を用いて分析した。フローサイトメトリーに使用した抗体は、ＦＩＴＣ結合抗ＨＬＡ−Ａ２抗体（BioLegend、343303）、抗ＨＬＡ−Ａ３２／２５モノクローナルＩｇＭ抗体（One Lamda、0136HA）、およびAlexa Fluor 647結合ヤギ抗マウスＩｇＭ（Abcam ab150123）であった。【０１０６】
（２．結果）
（２−１．ホモ接合型細胞のスクリーニング結果（ジェノタイピング結果））
Tet offを用いた参考例において、１９番染色体におけるホモ接合型細胞のスクリーニングのために行った競合ＰＣＲの結果を図９に示す。野生型対立遺伝子は275bpで検出され、ネオマイシン選択性対立遺伝子は407bpで検出され、ピューロマイシン選択性対立遺伝子は1435bpで検出された。野生型バンドが検出されず、ネオマイシン選択性及びピューロマイシン選択性の両方について陽性を示す407bpと1435bpとの両バンドのみが検出されたクローン（posi）を、目的のホモ接合型細胞として獲得した。なお、407bpと1435bpと共に275bpも併せて検出されたクローンは、本来２本の染色体を４本にしたり、同じ染色体上で選択カセットを複数に増幅させたりすることで生き残ったバックグラウンドクローンである。ＭＬ２１６を用いた実施例において、１９番染色体におけるホモ接合型細胞のスクリーニングのために行った競合ＰＣＲの結果を図１０に示す。図１０の結果も図９と同様であり、野生型バンドが検出されず、ネオマイシン選択性及びピューロマイシン選択性の両方について陽性を示す両バンドのみが検出されたクローンを、目的のホモ接合型細胞として獲得した。【０１０７】
ＭＬ２１６を用いた実施例において、６番染色体におけるホモ接合型細胞のスクリーニングのために行った競合ＰＣＲの結果を図１１示す。野生型対立遺伝子は924bpで検出され、ネオマイシン選択性対立遺伝子は1355bpで検出され、ピューロマイシン選択性対立遺伝子は2264bpで検出された。野生型バンドが検出されず、ネオマイシン選択性及びピューロマイシン選択性の両方について陽性を示す1355bpと2264bpとの両バンドのみが検出されたクローン（posi）を、目的のホモ接合型細胞として獲得した。【０１０８】
また、図１２に、Tet offを用いた参考例（図中３のサンプル）の交差効率を、当該参考例において種々の条件（Ｄｏｘの有無及びＣＲＩＳＰＲの有無）を変更した場合（図中１，２のサンプル）の交差効率（それぞれ７回実施）とともに示す。また、図１３に、ＭＬ２１６を用いた実施例（図中３のサンプル）の交差効率を、当該実施例において種々の条件（ＭＬ２１６の有無及びＣＲＩＳＰＲの有無）を変更した場合（図中１，２のサンプル）の交差効率（それぞれ４回実施）とともに示す。【０１０９】
参考例及び実施例のいずれにおいても同様に、１９番染色体及び６番染色体それぞれにおける交差によって目的のホモ接合型細胞を得ることができた。参考例と実施例とを比較すると、実施例のほうが、頻度高くホモ接合型細胞を得ることができた。さらに実施例においては、ＭＬ２１６を１０．０μＭ、１２．５μＭ、及び１４．０μＭいずれの濃度で用いた場合にも目的のホモ接合型細胞を得ることができたが、これらの中でも、１２．５μＭの濃度で用いた場合に最も頻度高く（図１３）ホモ接合型細胞を得ることができたことが確認できた。【０１１０】
（２−２．交差部位の解析結果）
（２−２−１．１９番染色体における交差部位の解析結果）
図１４は、１９番染色体における交差部位の分布を示す（参考例）。図１４において、×で示されるポイントは、それぞれ、１９番染色体セントロメアからの9Mb（３５Ｍ領域）においてＤＳＢを生じたクローンを示し；▲で示されるポイントは、それぞれ、セントロメアからの14Mb（４０Ｍ領域）においてＤＳＢを生じたクローンを示し；○で示されるポイントは、それぞれセントロメアからの19Mb-I, 19Mb-II（４５Ｍ−１、４５Ｍ−２領域）においてＤＳＢを生じたクローンを示す。図１５は、１９番染色体セントロメアからの9Mb（３５Ｍ領域）における交差部位の分布を示す（参考例）。図１６は、１９番染色体セントロメアからの14Mb（４０Ｍ領域）における交差部位の分布を示す（参考例）。図１７は、１９番染色体セントロメアからの19Mb-I, 19Mb-II（４５Ｍ−１、４５Ｍ−２）における交差部位の分布を示す（参考例）。図１８は、ML216によるBLMタンパク質の抑制下における１９番染色体セントロメアからの9Mb（３５Ｍ領域）における交差部位の分布を示す（実施例）。【０１１１】
図１４〜図１８に示すように、参考例と実施例とで、いずれもＤＳＢを導入した近傍で交差が起きており、且つ、図１５及び図１８に示すように、参考例と実施例とで、交差を起こした部位は良好な一致を示した。【０１１２】
（２−２−２．６番染色体における交差部位の解析結果）
図１９に、６番染色体の短腕の交差前の模式図を示す。二重選択カセットの標的化後、片アレル特異的ＤＳＢがＨＬＡクラスIとIIIとの間に導入された。親細胞のＨＬＡ遺伝子型は右パネルに示されている。図２０に、６番染色体の短腕の交差後の模式図を示す。交差後のＨＬＡ遺伝子型が右パネルに示されている。６番染色体においても、ＤＳＢを導入した近傍で交差が起きたことが確認された。【０１１３】
（２−３．フローサイトメトリー結果）
図２１に、ｈｉＰＳＣにおけるＨＬＡ−Ａハプロタイプのフローサイトメトリープロファイルを示す（実施例）。図２１に示すように、交差を生じさせる前のParental human iPS cellsのハプロタイプはＨＬＡ−Ａ領域においてA2とA32のヘテロであったことに対し、ブルーム症候群タンパク質阻害剤（ＭＬ２１６）を用いて交差を起こさせ、この領域にＬＯＨが生じたHLA-homozygouse human iPS cellsのハプロタイプは、HLA-A2のみのホモとなっていることがフローサイトメトリーにより示された。【０１１４】
（２−４．まとめ）
ジェノタイピングおよびフローサイトメトリーの結果から、染色体交差に関連するLOHがホモ接合型細胞の予想される位置に生じることを実証した。【０１１５】
［参考例及び実施例による結果２］
（１．細胞の処理）
ＳＮＰコピー数を分析するために、ゲノムＤＮＡを、親線維芽細胞（parental fibroblast cells；hiPSCsの由来元となる細胞）、hiPSCs、参考例の項目（４）で得られたhiPSC-BLMtet/tetAAVS1cNP/+、並びに、参考例及び実施例で得られたホモ接合型細胞（参考例で得られたhiPSC-BLMtet/tetAAVS1cNP/+Dox(+)9M-CRISPR(+)、並びに、実施例で得られたhiPSC-AAVS1cNP/+ML216(+)9M-CRISPR(+)及びhiPSC-telHLAcNP/+ML216(+)HLA I-III-CRISPR(+)）から単離し、Infinium Omni5-4 v1.2 BeadChip（Illumina）にハイブリダイズさせた。GenomeStudio（Illumina）を用い、一塩基多型（ＳＮＰ）アレイ分析を行った。【０１１６】
（２．結果）
親線維芽細胞（parental fibroblast cells）、hiPSCs、hiPSC-BLMtet/tetAAVS1cNP/+、hiPSC-BLMtet/tetAAVS1cNP/+Dox(+)9M-CRISPR(+)、hiPSC-AAVS1cNP/+ML216(+)9M-CRISPR(+)、及びhiPSC-telHLAcNP/+ML216(+)HLA I-III-CRISPR(+)）についての６番染色体及び１９番染色体におけるＳＮＰアレイ分析結果を、それぞれ、図２２Ａ〜図２２Ｆに示す。図２２Ａ〜図２２Ｅから明らかなように、ＤＳＢが第１９染色体の９Ｍｂの位置に導入された場合、親線維芽細胞（parental fibroblast cells）、hiPSCs、及びhiPSC-BLMtet/tetAAVS1cNP/+（図２２Ａ〜図２２Ｃ）と対比したhiPSC-BLMtet/tetAAVS1cNP/+Dox(+)9M-CRISPR(+)（図２２Ｄ）及びhiPSC-AAVS1cNP/+ML216(+)9M-CRISPR(+)（図２２Ｅ）の結果から、ホモ接合ＳＮＰパターンが第１９染色体上のＤＳＢに対してテロメア的に観察された。また、図２２Ａ〜図２２Ｃ及び図２２Ｆから明らかなように、ＤＳＢが第６染色体のＨＬＡの位置に導入された場合、親線維芽細胞（parental fibroblast cells）、hiPSCs、及びhiPSC-BLMtet/tetAAVS1cNP/+（図２２Ａ〜図２２Ｃ）と対比したhiPSC-telHLAcNP/+ML216(+)HLA I-III-CRISPR(+)（図２２Ｆ）の結果から、ホモ接合ＳＮＰパターンが第６染色体上のＤＳＢに対してテロメア的に観察された。【０１１７】
上述のＳＮＰアレイ分析結果から、染色体交差は狙った位置でのみ起こったことが明らかになった。なお、図示していないが、６番染色体及び１９番染色体以外の全ての染色体についてのＳＮＰアレイ分析結果から、他の染色体において交差は起こっていないことを確認した。特に、hiPSC-telHLAcNP/+ML216(+)HLA I-III-CRISPR(+)（図２２Ｆ）の結果から、親線維芽細胞から作製されたＨＬＡホモ接合ｈｉＰＳＣが、ドナーと宿主との間の免疫学的差異に起因するｈｉＰＳＣベースの移植における現在の欠点を軽減するのに役立つことが期待できる。つまり、本発明によって、hiPSCの遺伝子解析が促進されるだけでなく、hiPSCに基づく再生医療も著しく促進されることが期待できる。
【配列表フリーテキスト】
【０１１８】
配列番号１は、１９番染色体34512783-34512803に対するｇＲＮＡ標的配列である。
配列番号２は、１９番染色体40498170-40498189に対するｇＲＮＡ標的配列である。
配列番号３は、１９番染色体44500571-44500590に対するｇＲＮＡ標的配列である。
配列番号４は、１９番染色体44536861-44536880に対するｇＲＮＡ標的配列である。
配列番号５は、６番染色体2810497-2810516に対するｇＲＮＡ標的配列である。
【図１】
2019216338.tif 000017
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２２Ｅ】
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【図２２Ｆ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年11月14日(2019.11.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、ホモ接合型細胞の作製方法：
（Ａ）標的部位にヘテロ接合変異を有する細胞に対し、相同染色体の片アレル特異的なＤＮＡ二重鎖切断の導入を行いブルーム症候群タンパク質阻害剤の存在下で交差を生じさせることで、前記標的部位のホモ接合型細胞を得る工程、及び
（Ｂ）前記ホモ接合型細胞を選別する工程。
【請求項２】
前記ブルーム症候群タンパク質阻害剤が、１−（４−フルオロ−３−（トリフルオロメチル）フェニル）−３−（５−（ピリジン−４−イル）１，３，４−チアジアゾール−２−イル）ウレア及び／又は１−（４−（１Ｈ−ピラゾリル）−３−シアノフェニル）−３−（５−（ピリジン−４−イル）１，３，４−チアジアゾール−２−イル）ウレアである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ブルーム症候群タンパク質阻害剤を３．０〜５０．０μＭの濃度で用いる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ブルーム症候群タンパク質阻害剤を、前記（Ａ）工程の前に、前記ヘテロ接合変異を有する細胞と共存させておく、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記（Ａ）工程において、前記ＤＮＡ二重鎖切断を、クリスパー（ＣＲＩＳＰＲ）／クリスパー関連ヌクレアーゼ法、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）法、又は転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）法から選択されるＤＮＡ二重鎖切断法によって行う、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記（Ａ）工程において、前記染色体の片アレル特異的なＤＮＡ二重鎖切断の導入を、前記ＤＮＡ二重鎖切断における認識配列のうち片アレルに多型が存在する認識配列を選択して設計されたベクターを、前記ヘテロ接合変異を有する細胞に導入することによって行う、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記（Ａ）工程において、前記相同染色体のアレルの一方又は他方に、一の薬剤に対する薬剤耐性遺伝子と他の薬剤に対する薬剤耐性遺伝子とを互いに逆方向に配置した配列を有する選択カセットの導入と前記配列の反転とを行い、
前記（Ｂ）工程において、前記一の薬剤及び前記他の薬剤の両方に耐性である細胞を、前記標的部位のホモ接合型細胞として選別する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記（Ａ）工程において、前記選択カセットをトランスポゾンベクターに組み込んで導入し、
前記（Ｂ）工程の後に、再切り出し用トランスポゼースによって前記選択カセットを除去する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記（Ａ）工程において、前記選択カセットの両方又は片方にインシュレーター配列を導入する、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記標的部位が主要組織適合抗原の遺伝子座である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的部位にヘテロ接合変異を有する細胞が二倍体細胞である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記二倍体細胞がヒト由来細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ブルーム症候群タンパク質阻害剤を１２．０〜１３．０μＭの濃度で用いる、請求項１２に記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】令和2年4月13日(2020.4.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、ホモ接合型細胞の作製方法：
（Ａ）標的部位にヘテロ接合変異を有する細胞に対し、ブルーム症候群タンパク質阻害剤の存在下で相同染色体の片アレル特異的なＤＮＡ二重鎖切断の導入を行うことで染色体上の前記標的部位を狙って交差を生じさせることにより、前記標的部位のホモ接合型細胞を得る工程、及び
（Ｂ）前記ホモ接合型細胞を選別する工程。
【請求項２】
前記ブルーム症候群タンパク質阻害剤が、１−（４−フルオロ−３−（トリフルオロメチル）フェニル）−３−（５−（ピリジン−４−イル）１，３，４−チアジアゾール−２−イル）ウレア及び／又は１−（４−（１Ｈ−ピラゾリル）−３−シアノフェニル）−３−（５−（ピリジン−４−イル）１，３，４−チアジアゾール−２−イル）ウレアである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ブルーム症候群タンパク質阻害剤を３．０〜５０．０μＭの濃度で用いる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ブルーム症候群タンパク質阻害剤を、前記（Ａ）工程の前に、前記ヘテロ接合変異を有する細胞と共存させておく、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記（Ａ）工程において、前記ＤＮＡ二重鎖切断を、クリスパー（ＣＲＩＳＰＲ）／クリスパー関連ヌクレアーゼ法、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）法、又は転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）法から選択されるＤＮＡ二重鎖切断法によって行う、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記（Ａ）工程において、前記染色体の片アレル特異的なＤＮＡ二重鎖切断の導入を、前記ＤＮＡ二重鎖切断における認識配列のうち片アレルに多型が存在する認識配列を選択して設計されたベクターを、前記ヘテロ接合変異を有する細胞に導入することによって行う、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記（Ａ）工程において、前記相同染色体のアレルの一方又は他方に、一の薬剤に対する薬剤耐性遺伝子と他の薬剤に対する薬剤耐性遺伝子とを互いに逆方向に配置した配列を有する選択カセットの導入と前記配列の反転とを行い、
前記（Ｂ）工程において、前記一の薬剤及び前記他の薬剤の両方に耐性である細胞を、前記標的部位のホモ接合型細胞として選別する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記（Ａ）工程において、前記選択カセットをトランスポゾンベクターに組み込んで導入し、
前記（Ｂ）工程の後に、再切り出し用トランスポゼースによって前記選択カセットを除去する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記（Ａ）工程において、前記選択カセットの両方又は片方にインシュレーター配列を導入する、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記標的部位が主要組織適合抗原の遺伝子座である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的部位にヘテロ接合変異を有する細胞が二倍体細胞である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記二倍体細胞がヒト由来細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ブルーム症候群タンパク質阻害剤を１２．０〜１３．０μＭの濃度で用いる、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【国際調査報告】
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