(57)【要約】  本発明は、人為的な遺伝子導入を行うことなく、体細胞から心筋細胞を製造する方法、当該製造方法から得られる心筋細胞、又は当該製造方法のために使用することができる化学物質の組み合わせを含む組成物を提供することを主な課題とする。  本発明として、例えば、体細胞から直接分化誘導することにより心筋細胞を製造する方法であって、ＭＥＫ阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導剤の存在下で体細胞を培養する工程を含むことを特徴とする心筋細胞の製造方法や、当該製造方法により得られる心筋細胞、そして体細胞から直接分化誘導することにより心筋細胞を製造するための組成物であって、ＭＥＫ阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導剤を含むことを特徴とする、体細胞から心筋細胞を製造するための組成物を挙げることができる。  本発明により得られた心筋細胞は、再生医療などにおいて有用である。
2019151097.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
体細胞から直接分化誘導することにより心筋細胞を製造する方法であって、ＭＥＫ阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程を含むことを特徴とする、心筋細胞の製造方法。
【請求項２】
前記工程が、さらにｃＡＭＰ誘導剤の存在下で体細胞を培養する工程である、請求項１に記載の心筋細胞の製造方法。
【請求項３】
前記工程が、さらにＴＧＦ−β阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、及びＧＲアゴニストからなる群から選択される少なくとも１種の存在下で体細胞を培養する工程である、請求項１又は２に記載の心筋細胞の製造方法。
【請求項４】
前記工程が、さらにＥＲＫ阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程である、請求項３に記載の心筋細胞の製造方法。
【請求項５】
前記工程が、次の（１）〜（６）のいずれかの組み合わせ存在下で体細胞を培養する工程である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の心筋細胞の製造方法。
（１）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、及びＴＧＦ−β阻害剤、
（２）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、及びＰＤＥ４阻害剤、
（３）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、及びＧＲアゴニスト、
（４）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、ＰＤＥ４阻害剤、及びＧＲアゴニスト、
（５）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、ＴＧＦ−β阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、及びＧＲアゴニスト、
（６）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、ＴＧＦ−β阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、ＧＲアゴニスト、及びＥＲＫ阻害剤。
【請求項６】
前記工程が、さらにＲＡＲアゴニスト、ＲＸＲアゴニスト、及びＰＤＫ１活性化剤からなる群から選択される少なくとも１種の存在下で体細胞を培養する工程である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の心筋細胞の製造方法。
【請求項７】
ＭＥＫ阻害剤がＰＤ０３２５９０１である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の心筋細胞の製造方法。
【請求項８】
ｃＡＭＰ誘導剤がフォルスコリンである、請求項２〜７のいずれか一項に記載の心筋細胞の製造方法。
【請求項９】
ＴＧＦ−β阻害剤がレプソックス、ＰＤＥ４阻害剤がロリプラム、又はＧＲアゴニストがデキサメタゾンである、請求項３〜８のいずれか一項に記載の心筋細胞の製造方法。
【請求項１０】
ＥＲＫ阻害剤がＧＤＣ−０９９４である、請求項４〜９のいずれか一項に記載の心筋細胞の製造方法。
【請求項１１】
体細胞から直接分化誘導することにより心筋細胞を製造する方法であって、ｃＡＭＰ誘導剤、ＴＧＦ−β阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、ＧＲアゴニスト、及びＥＲＫ阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程を含むことを特徴とする、心筋細胞の製造方法。
【請求項１２】
ｃＡＭＰ誘導剤がフォルスコリン、ＴＧＦ−β阻害剤がレプソックス、ＰＤＥ４阻害剤がロリプラム、ＧＲアゴニストがデキサメタゾン、又はＥＲＫ阻害剤がＧＤＣ−０９９４である、請求項１１に記載の心筋細胞の製造方法。
【請求項１３】
前記体細胞が線維芽細胞である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の心筋細胞の製造方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の心筋細胞の製造方法から製造される、心筋細胞。
【請求項１５】
体細胞から直接分化誘導することにより心筋細胞を製造するための組成物であって、ＭＥＫ阻害剤を含むことを特徴とする、体細胞から心筋細胞を製造するための組成物。
【請求項１６】
さらにｃＡＭＰ誘導剤を含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
さらにＴＧＦ−β阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、ＧＲアゴニスト、及びＥＲＫ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種を含む、請求項１５又は１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記工程が、さらにＥＲＫ阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程である、請求項１７に記載の心筋細胞の製造方法。
【請求項１９】
次の（１）〜（６）のいずれかの組み合わせを含む、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
（１）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、及びＴＧＦ−β阻害剤、
（２）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、及びＰＤＥ４阻害剤、
（３）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、及びＧＲアゴニスト、
（４）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、ＰＤＥ４阻害剤、及びＧＲアゴニスト、
（５）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、ＴＧＦ−β阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、及びＧＲアゴニスト、
（６）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、ＴＧＦ−β阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、ＧＲアゴニスト、及びＥＲＫ阻害剤。
【請求項２０】
さらにＲＡＲアゴニスト、ＲＸＲアゴニスト、及びＰＤＫ１活性化剤からなる群から選択される少なくとも１種を含む、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
ＭＥＫ阻害剤がＰＤ０３２５９０１である、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
ｃＡＭＰ誘導剤がフォルスコリンである、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
ＴＧＦ−β阻害剤がレプソックス、ＰＤＥ４阻害剤がロリプラム、ＧＲアゴニストがデキサメタゾンである、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
ＥＲＫ阻害剤がＧＤＣ−０９９４である、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
体細胞から直接分化誘導することにより心筋細胞を製造するための組成物であって、ｃＡＭＰ誘導剤、ＴＧＦ−β阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、ＧＲアゴニスト、及びＥＲＫ阻害剤を含むことを特徴とする、体細胞から心筋細胞を製造するための組成物。
【請求項２６】
ｃＡＭＰ誘導剤がフォルスコリン、ＴＧＦ−β阻害剤がレプソックス、ＰＤＥ４阻害剤がロリプラム、ＧＲアゴニストがデキサメタゾン、又はＥＲＫ阻害剤がＧＤＣ−０９９４である、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記体細胞が線維芽細胞である、請求項１５〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
この出願は、２０１８年１月３０日に出願された日本国出願番号第２０１８−１３３０１号を基礎とする優先権を主張し、その開示内容は全て本明細書の一部に組み込まれる。【０００２】
本発明は、再生医療、ないし体細胞からのダイレクトリプログラミング（Ｄｉｒｅｃｔ  Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）の技術分野に属する。本発明は、その技術分野において、低分子化合物により体細胞から心筋細胞を直接製造する方法、及びかかる製造方法によって製造される低分子化合物誘導性心筋細胞（ｃｉＣＭｓ：ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｄ−Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ）に関するものである。本発明はさらに、当該心筋細胞、及び当該心筋細胞を製造する方法のために使用することができる組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
近年の細胞関連研究の発展、特に多能性細胞に関する研究の発展により、治療用細胞を個体への移植に利用可能な品質及び量において入手することが可能になりつつある。幾つかの疾患については、治療に有効な細胞を患者に移植する試みが開始されている。【０００４】
間葉系の細胞は、筋肉、骨、軟骨、骨髄、脂肪及び結合組織等の生体の各種器官を形成しており、再生医療の材料として有望である。間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：ＭＳＣ）は、骨髄、脂肪組織、血液、胎盤及び臍帯等の組織に存在する未分化細胞である。間葉系に属す細胞への分化能を有しているため、間葉系幹細胞は、それらの細胞を製造する際の出発材料として注目されている。また、間葉系幹細胞自体を骨、軟骨、心筋等の再構築に利用する再生医療も検討されている。【０００５】
一方、線維芽細胞のような体細胞を直接他の細胞に転換する方法も報告されている。例えば、線維芽細胞を化学物質と共に培養することにより神経細胞を得ることが知られている（非特許文献１）。
心筋細胞についても、マウス胎児線維芽細胞からＧＳＫ３阻害剤（ＣＨＩＲ９９０２１）などを含む一定の化学物質と共に培養することにより直接誘導されることが知られている（非特許文献２）。同様にして、ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）又は胎児肺線維芽細胞（ＨＬＦ）から直接誘導されることが知られている（非特許文献３）。【０００６】
また、特許文献１には、ＷＮＴアゴニスト、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ１）、Ｒａｓ  ＧＴＰａｓｅ活性タンパク質阻害剤（Ｒａｓ−ＧＡＰ）、Ｏｃｔ−４活性化剤、Ｒｈｏ関連コイルドコイル形成タンパク質セリン／スレオニンキナーゼ阻害剤、鉄キレーター、ＫＤＭ５Ｂ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、及びＰＤＧＦチロシンキナーゼ阻害剤の中から少なくとも５つを含む組成物により、ヒト線維芽細胞から心筋細胞を直接誘導する発明が記載されている。特許文献２には、ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤の存在下で、かつｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ５阻害剤（ＴＧＦ−β阻害剤）及びＥＲＫ阻害剤の存在下で体細胞を培養することにより、ヒト線維芽細胞から心筋細胞を直接誘導する発明が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１６／０１８６１４１号公報
【特許文献２】国際公開第２０１８／０６２２６９号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，２０１５年，５６巻，３号，１６６−１７０頁
【非特許文献２】Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１５年，２５巻，１０１３−１０２４頁
【非特許文献３】Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１６年，３５２巻，１２１６−１２２０頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
非特許文献１に記載されている方法のように、遺伝子導入を行うことなく体細胞から所望の細胞への転換を直接行う方法は、治療用細胞を取得する手段として有効な選択肢となる場合がある。心筋細胞についても、上記の通り、実際に、一定の化学物質と共に培養することにより直接誘導されているが、非特許文献２に記載の発明では、マウス線維芽細胞からの直接誘導であって、ヒト線維芽細胞からの直接誘導ではない。また、非特許文献３に記載の発明では、ヒト線維芽細胞から心筋細胞が直接誘導されているが、これにはＥＳ細胞から分化させた心筋細胞の上清が必須である。特許文献１や２に記載の発明については、ヒト線維芽細胞から心筋細胞が直接誘導されている。【００１０】
本発明は、人為的な遺伝子導入を行うことなく、また特許文献１や２に記載の発明とは異なる低分子化合物の組み合わせにより体細胞から心筋細胞を直接誘導する方法、即ち、一定の低分子化合物の組成物により体細胞から心筋細胞を直接製造することができる新たな製造方法を提供することを主な課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、鋭意検討した結果、一定の低分子阻害剤等の存在下で体細胞を培養することによって、体細胞を心筋細胞に直接転換できることを見出し、本発明を完成するに到った。【００１２】
本発明として、例えば、下記のものを挙げることができる。
［１］体細胞から直接分化誘導することにより心筋細胞を製造する方法であって、ＭＥＫ阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程を含むことを特徴とする、心筋細胞の製造方法。
［２］前記工程が、さらにｃＡＭＰ誘導剤の存在下で体細胞を培養する工程である、上記［１］に記載の心筋細胞の製造方法。
［３］前記工程が、さらにＴＧＦ−β阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、及びＧＲアゴニストからなる群から選択される少なくとも１種の存在下で体細胞を培養する工程である、上記［１］又は［２］に記載の心筋細胞の製造方法。
［４］前記工程が、さらにＥＲＫ阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程である、上記［３］に記載の心筋細胞の製造方法。
［５］前記工程が、次の（１）〜（６）のいずれかの組み合わせ存在下で体細胞を培養する工程である、上記［１］〜［３］のいずれか一項に記載の心筋細胞の製造方法。
（１）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、及びＴＧＦ−β阻害剤、
（２）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、及びＰＤＥ４阻害剤、
（３）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、及びＧＲアゴニスト、
（４）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、ＰＤＥ４阻害剤、及びＧＲアゴニスト、
（５）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、ＴＧＦ−β阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、及びＧＲアゴニスト、
（６）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、ＴＧＦ−β阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、ＧＲアゴニスト、及びＥＲＫ阻害剤。
［６］前記工程が、さらにＲＡＲアゴニスト、ＲＸＲアゴニスト、及びＰＤＫ１活性化剤からなる群から選択される少なくとも１種の存在下で体細胞を培養する工程である、上記［１］〜［５］のいずれか一項に記載の心筋細胞の製造方法。
［７］ＭＥＫ阻害剤がＰＤ０３２５９０１である、上記［１］〜［６］のいずれか一項に記載の心筋細胞の製造方法。
［８］ｃＡＭＰ誘導剤がフォルスコリンである、上記［２］〜［７］のいずれか一項に記載の心筋細胞の製造方法。
［９］ＴＧＦ−β阻害剤がレプソックス、ＰＤＥ４阻害剤がロリプラム、又はＧＲアゴニストがデキサメタゾンである、上記［３］〜［８］のいずれか一項に記載の心筋細胞の製造方法。
［１０］ＥＲＫ阻害剤がＧＤＣ−０９９４である、上記［４］〜［９］のいずれか一項に記載の心筋細胞の製造方法。
［１１］体細胞から直接分化誘導することにより心筋細胞を製造する方法であって、ｃＡＭＰ誘導剤、ＴＧＦ−β阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、ＧＲアゴニスト、及びＥＲＫ阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程を含むことを特徴とする、心筋細胞の製造方法。
［１２］ｃＡＭＰ誘導剤がフォルスコリン、ＴＧＦ−β阻害剤がレプソックス、ＰＤＥ４阻害剤がロリプラム、ＧＲアゴニストがデキサメタゾン、又はＥＲＫ阻害剤がＧＤＣ−０９９４である、上記［１１］に記載の心筋細胞の製造方法。
［１３］前記体細胞が線維芽細胞である、上記［１］〜［１２］のいずれか一項に記載の心筋細胞の製造方法。
［１４］上記［１］〜［１３］のいずれか一項に記載の心筋細胞の製造方法から製造される、心筋細胞。【００１３】
［１５］体細胞から直接分化誘導することにより心筋細胞を製造するための組成物であって、ＭＥＫ阻害剤を含むことを特徴とする、体細胞から心筋細胞を製造するための組成物。
［１６］さらにｃＡＭＰ誘導剤を含む、上記［１５］に記載の組成物。
［１７］さらにＴＧＦ−β阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、及びＧＲアゴニストからなる群から選択される少なくとも１種を含む、上記［１５］又は［１６］に記載の組成物。
［１８］さらにＥＲＫ阻害剤を含む、上記［１７］に記載の組成物。
［１９］次の（１）〜（６）のいずれかの組み合わせを含む、上記［１５］〜［１８］のいずれか一項に記載の組成物。
（１）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、及びＴＧＦ−β阻害剤、
（２）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、及びＰＤＥ４阻害剤、
（３）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、及びＧＲアゴニスト、
（４）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、ＰＤＥ４阻害剤、及びＧＲアゴニスト、
（５）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、ＴＧＦ−β阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、及びＧＲアゴニスト、
（６）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、ＴＧＦ−β阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、ＧＲアゴニスト、及びＥＲＫ阻害剤。
［２０］さらにＲＡＲアゴニスト、ＲＸＲアゴニスト、及びＰＤＫ１活性化剤からなる群から選択される少なくとも１種を含む、上記［１５］〜［１９］のいずれか一項に記載の組成物。
［２１］ＭＥＫ阻害剤がＰＤ０３２５９０１である、上記［１５］〜［２０］のいずれか一項に記載の組成物。
［２２］ｃＡＭＰ誘導剤がフォルスコリンである、上記［１６］〜［２１］のいずれか一項に記載の組成物。
［２３］ＴＧＦ−β阻害剤がレプソックス、ＰＤＥ４阻害剤がロリプラム、又はＧＲアゴニストがデキサメタゾンである、上記［１７］〜［２２］のいずれか一項に記載の組成物。
［２４］ＥＲＫ阻害剤がＧＤＣ−０９９４である、上記［１８］〜［２３］のいずれか一項に記載の組成物。
［２５］体細胞から直接分化誘導することにより心筋細胞を製造するための組成物であって、ｃＡＭＰ誘導剤、ＴＧＦ−β阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、ＧＲアゴニスト、及びＥＲＫ阻害剤を含むことを特徴とする、体細胞から心筋細胞を製造するための組成物。
［２６］ｃＡＭＰ誘導剤がフォルスコリン、ＴＧＦ−β阻害剤がレプソックス、ＰＤＥ４阻害剤がロリプラム、ＧＲアゴニストがデキサメタゾン、又はＥＲＫ阻害剤がＧＤＣ−０９９４である、上記［２５］に記載の組成物。
［２７］前記体細胞が線維芽細胞である、上記［１５］〜［２６］のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、遺伝子導入を行うことなく、体細胞から自発的に拍動する心筋細胞を製造することができる。本発明により得られた心筋細胞は、再生医療などにおいて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】細胞の培養写真である。各写真において、左側は培養７日目の結果を、右側は培養開始後１０日目の結果を、それぞれ示す。
【図２】細胞の培養写真である。各写真において、左側は培養７日目の結果を、右側は培養１０日目の結果を、それぞれ示す。
【図３】細胞の培養写真である。各写真において、左側は培養７日目の結果を、右側は培養１０日目の結果を、それぞれ示す。
【図４】細胞の培養写真である。各写真において、左側は培養７日目の結果を、右側は培養１３日目の結果を、それぞれ示す。
【図５】細胞の培養写真である。各写真において、左側は培養７日目の結果を、右側は培養１３日目の結果を、それぞれ示す。
【図６】細胞の培養写真である。上２つは実施例７についての別々の箇所における培養１３日目の結果を、下２つは実施例Ａについての別々の箇所における培養１７日目の結果を、それぞれ示す。
【図７】ｍＲＮＡの相対的発現量を表す。左図は、各組み合わせ阻害剤等による心筋前駆細胞特異的遺伝子Ｔｂｘ１の発現量を、右図は、各組み合わせ阻害剤等による心筋細胞特異的遺伝子Ｔｎｎｔ２の発現量を、それぞれ表す。各図において、縦軸は内部標準遺伝子量（Ｔｂｐ）に対する当該ｍＲＮＡ量の相対値を示す。
【図８】ｍＲＮＡの相対的発現量を表す。左図は、各組み合わせ阻害剤等による心筋前駆細胞特異的遺伝子の発現量を、右図は、各組み合わせ阻害剤等による心筋特異的遺伝子の発現量を、それぞれ表す。各図において、縦軸は内部標準遺伝子量（Ｔｂｐ）に対する当該ｍＲＮＡ量の相対値を示す。
【図９】左は、Ａｌｐｈａ  Ａｃｔｉｎｉｎ／ＤＡＰＩで細胞を染色した免疫染色写真である。右は、左写真に明視野の画像を重ね合わせた免疫染色写真である。
【図１０】細胞の培養写真である。上段３つの写真は培養１３日目の結果を、下段３つの写真は培養１９日目の結果を、それぞれ示す。
【図１１】細胞の培養写真である。上段４つの写真は培養７日目の結果を、下段４つの写真は培養１２日目の結果を、それぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１７】
１  心筋細胞の製造方法
本発明に係る、心筋細胞の製造方法（以下、「本発明製法」という。）は、体細胞から直接分化誘導することにより心筋細胞を製造する方法であって、ＭＥＫ阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程を含むことを特徴とする。
【００１８】
好ましくは、上記工程が、さらにｃＡＭＰ誘導剤の存在下で体細胞を培養する工程である本発明製法を挙げることができる。より好ましくは、上記工程が、さらにＴＧＦ−β阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、及びＧＲアゴニストからなる群から選択される少なくとも１種の存在下で体細胞を培養する工程である本発明製法を挙げることができる。また、更に好ましくは、上記工程が、さらにＥＲＫ阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程である本発明製法を挙げることができる。特に好ましくは、上記工程が、次の（１）〜（６）のいずれかの組み合わせ存在下で体細胞を培養する工程である本発明製法である。
（１）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、及びＴＧＦ−β阻害剤、
（２）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、及びＰＤＥ４阻害剤、
（３）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、及びＧＲアゴニスト、
（４）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、ＰＤＥ４阻害剤、及びＧＲアゴニスト、
（５）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、ＴＧＦ−β阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、及びＧＲアゴニスト、
（６）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、ＴＧＦ−β阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、ＧＲアゴニスト、及びＥＲＫ阻害剤。
また、本発明として、体細胞から直接分化誘導することにより心筋細胞を製造する方法であって、ｃＡＭＰ誘導剤、ＴＧＦ−β阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、ＧＲアゴニスト、及びＥＲＫ阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程を含むことを特徴とする、心筋細胞の製造方法も挙げることができる。以下、かかる製造方法も含めて本発明製法という。
【００１９】
本発明製法は、上記工程において、さらにＲＡＲアゴニスト、ＲＸＲアゴニスト、及びＰＤＫ１活性化剤からなる群から選択される少なくとも１種の存在下で体細胞を培養することができる。
本発明製法においては、少なくとも上記いずれかの組み合わせの存在下で体細胞を培養すればよく、必要に応じて、任意にさらに他の阻害剤や誘導剤等を存在させて体細胞を培養し心筋細胞を製造することができる。
上記阻害剤や誘導剤等は、それぞれにおいて、１種を用いても２種以上を併用してもよい。
具体的な上記阻害剤等においては、２種類以上の阻害作用等を有するものもあり得るが、その場合、一つで複数の阻害剤等が存在しているとみなすことができる。
【００２０】
１．１  体細胞について
生物の細胞は、体細胞と生殖細胞とに分類できる。本発明製法には、その出発材料として任意の体細胞を使用することができる。体細胞には特に限定はなく、生体から採取された初代細胞、又は株化された細胞の何れでもよい。本発明製法では、分化の種々の段階にある体細胞、例えば、最終分化した体細胞（例、線維芽細胞、臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、肝細胞（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ）、胆管細胞（Ｂｉｌｉａｒｙ  ｃｅｌｌｓ）、膵α細胞（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  α  ｃｅｌｌｓ）、膵腺房細胞（Acinar cells）、膵管腺細胞（Ductal cells）、小腸腺窩細胞（Intestinal crypt cells）など）、最終分化への途上にある体細胞（例、間葉系幹細胞、神経幹細胞、内胚葉前駆細胞など）、又は初期化され多能性を獲得した体細胞を使用することができる。本発明製法に使用できる体細胞としては、任意の体細胞、例えば、造血系の細胞（各種のリンパ球、マクロファージ、樹状細胞、骨髄細胞等）、臓器由来の細胞（肝細胞、脾細胞、膵細胞、腎細胞、肺細胞等）、筋組織系の細胞（骨格筋細胞、平滑筋細胞、筋芽細胞、心筋細胞等）、線維芽細胞、神経細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、内皮細胞、間質細胞、脂肪細胞（褐色脂肪細胞、白色脂肪細胞等）等が挙げられる。また、これらの細胞の前駆細胞、癌細胞にも本発明製法を適用できる。好ましくは、線維芽細胞を使用することができる。
【００２１】
上記の体細胞の供給源としては、ヒト、ヒト以外の哺乳動物、及び哺乳動物以外の動物（鳥類、爬虫類、両生類、魚類等）が例示されるが、これらに限定されるものではない。体細胞の供給源としては、ヒト、及びヒト以外の哺乳動物が好ましく、ヒトが特に好ましい。ヒトへの投与を目的として本発明製法により心筋細胞を製造する場合、好ましくは、レシピエントと組織適合性抗原のタイプが一致又は類似したドナーより採取された体細胞を使用することができる。レシピエント自身より採取された体細胞を心筋細胞の製造に供してもよい。
【００２２】
１．２  本発明に係る阻害剤等について
１．２．１  ＭＥＫ阻害剤
ＭＥＫ（ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ）は、ＥＧＦ（上皮増殖因子）などの増殖因子によって活性化されるＭＡＰＫシグナル伝達経路に属するリン酸化酵素であり、哺乳類では２つの遺伝子によってコードされるＭＥＫ１とＭＥＫ２が存在する。ＭＥＫは、上流のＲＡＦによってリン酸化され、これによって活性化されたＭＥＫはＥＲＫをリン酸化することでさらに下流へシグナルを伝達させる。ＭＥＫ阻害剤によってＥＲＫのリン酸化が阻害されることで、ＭＥＫを介したＭＡＰＫシグナル伝達経路が阻害される。
【００２３】
「ＭＥＫ阻害剤の存在下」とは、ＭＥＫ、好ましくはＭＥＫ１ないしＭＥＫ２を阻害することができる培養条件下であることをいい、その手段は特に限定はなく、ＭＥＫの活性を阻害する物質、例えば、抗ＭＥＫ抗体やＭＥＫ阻害剤のようなＭＥＫシグナル阻害手段を利用することができる。また、ＭＥＫの活性化に関わるタンパク質、例えば、ＭＡＰＫシグナル伝達経路のＭＥＫより上流に位置するＥＧＦＲ等の細胞膜受容体、低分子ＧＴＰ結合タンパク質ＲＡＳ、リン酸化酵素ＲＡＦ等を阻害する手段もＭＥＫ阻害に利用することができる。
【００２４】
本発明では特に限定されないが、ＭＥＫ阻害剤としては、例えば、以下の化合物を使用することができる。好ましくは、ＰＤ０３２５９０１、Ｔｒａｍｅｔｉｎｉｂを使用することができる。
【００２５】
ＰＤ０３２５９０１（ＣＡＳ  Ｎｏ．：３９１２１０−１０−９）
【００２６】
【化１】
2019151097.tif 000003
【００２７】
Ｔｒａｍｅｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：８７１７００−１７−３）
【化２】
2019151097.tif 000004
【００２８】
Ｕ０１２６−ＥｔＯＨ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１１７３０９７−７６−１）
ＴＡＫ−７３３（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１０３５５５５−６３−５）
ＢＩ−８４７３２５（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１２０７２９３−３６−４）
Ｈｏｎｏｋｉｏｌ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：３５３５４−７４−６）
Ｍｙｒｉｃｅｔｉｎ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：５２９−４４−２）
ＡＳ７０３０２６（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１２３６６９９−９２−５）
ＡＺＤ８３３０（ＣＡＳ  Ｎｏ．：８６９３５７−６８−６）
ＣＩ−１０４０（ＣＡＳ  Ｎｏ．：２１２６３１−７９−３）
Ｃｏｂｉｍｅｔｉｒｌｉｂ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：９３４６６０−９３−２）
ＧＤＣ−０６２３（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１１６８０９１−６８−６）
ＭＥＫ１６２（ＣＡＳ  Ｎｏ．：６０６１４３−８９−９）
ＰＤ３１８０８８（ＣＡＳ  Ｎｏ．：３９１２１０−００−７）
ＰＤ９８０５９（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１６７８６９−２１−８）
Ｒｅｆａｍｅｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：９２３０３２−３７−５）
Ｓｅｌｕｍｅｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：６０６１４３−５２−６）
ＳＬ３２７（ＣＡＳ  Ｎｏ．：３０５３５０−８７−２）
【００２９】
ＭＥＫ阻害剤の濃度は適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、０．１μｍｏｌ／Ｌ〜１０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．５μｍｏｌ／Ｌ〜５μｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することができる。
【００３０】
１．２．２  ｃＡＭＰ誘導剤
ｃＡＭＰ（環状アデノシン１リン酸）は、セカンドメッセンジャーとして種々の細胞内シグナル伝達に関わっている物質である。ｃＡＭＰは、細胞内ではアデニル酸シクラーゼ（ａｄｅｎｙｌａｔｅ  ｃｙｃｌａｓｅ）によりアデノシン３リン酸（ＡＴＰ）が環状化されることで生成する。
【００３１】
「ｃＡＭＰ誘導剤の存在下」とは、ｃＡＭＰを誘導することができる培養条件下であることをいい、その手段は特に限定はなく、例えば、細胞内ｃＡＭＰ濃度を増加させることができる任意の手段を利用することができる。ｃＡＭＰの生成に関わる酵素であるアデニル酸シクラーゼに直接作用して誘導することができる物質、アデニル酸シクラーゼの発現を促進しうる物質の他、ｃＡＭＰを分解する酵素であるホスホジエステラーゼを阻害する物質等を、細胞内ｃＡＭＰ濃度を増加させる手段として使用することができる。細胞内でｃＡＭＰと同じ作用を持つｃＡＭＰの構造類似体であるジブチリルｃＡＭＰ（ｄｉｂｕｔｙｒｙｌ  ｃＡＭＰ）や８-ｂｒｏｍｏ-ｃＡＭＰ等の膜透過性ｃＡＭＰアナログを使用することもできる。
【００３２】
本発明では特に限定されないが、ｃＡＭＰ誘導剤（アデニル酸シクラーゼ活性化剤）としては、例えば、フォルスコリン（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ：ＣＡＳ  Ｎｏ．：６６５７５−２９−９）、及びフォルスコリン誘導体（例えば特開２００２−３４８２４３号公報）や以下の化合物などが挙げられる。好ましくは、フォルスコリンを使用することができる。
【００３３】
フォルスコリン（ＣＡＳ  Ｎｏ．：６６４２８−８９−５）
【００３４】
【化３】
2019151097.tif 000005
【００３５】
イソプロテレノール（ＣＡＳ  Ｎｏ．：７６８３−５９−２）
ＮＫＨ４７７（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１３８６０５−００−２）
ＰＡＣＡＰ１−２７（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１２７３１７−０３−７）
ＰＡＣＡＰ１−３８（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１３７０６１−４８−４）
【００３６】
ｃＡＭＰ誘導剤の濃度は適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、０．２μｍｏｌ／Ｌ〜５０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１μｍｏｌ／Ｌ〜３０μｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することができる。
【００３７】
１．２．３  ＴＧＦ−β阻害剤
ＴＧＦ−β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β、形質転換増殖因子β）には、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３の３種類が存在し、ほぼ全ての細胞から生産されている。ＴＧＦ−βは、上皮細胞をはじめ、多くの細胞の増殖を抑制するなど細胞増殖、形質転換、分化、発生、アポトーシスの制御等の多種多様な細胞機能に関与している。
【００３８】
「ＴＧＦ−β阻害剤の存在下」とは、ＴＧＦ−βを阻害することができる培養条件下であることをいい、その手段は特に限定はなく、ＴＧＦ−βを阻害することができる任意の手段を利用することができる。本発明には、ＴＧＦ−βに直接作用してその機能を阻害する物質（例えば、抗ＴＧＦ−β抗体やその他の薬剤）、ＴＧＦ−β自体の産生を抑制する薬剤等を利用することができる。また、ＴＧＦ−βが関わるシグナル伝達をその上流で阻害することによってもＴＧＦ−βを阻害することができる。
【００３９】
本発明では特に限定されないが、ＴＧＦ−β阻害剤としては、例えば、以下の化合物を使用することができる。好ましくは、レプソックスを使用することができる。
【００４０】
Ａ８３−０１（ＣＡＳ  Ｎｏ．：９０９９１０−４３−６）
【００４１】
【化４】
2019151097.tif 000006
【００４２】
レプソックス（ＣＡＳ  Ｎｏ．：４４６８５９−３３−２）
【００４３】
【化５】
2019151097.tif 000007
【００４４】
ＳＢ４３１５４２（ＣＡＳ  Ｎｏ．：３０１８３６−４１−９）
【００４５】
【化６】
2019151097.tif 000008
【００４６】
ＬＹ３６４９４７（ＣＡＳ  Ｎｏ．：３９６１２９−５３−６）
ＳＢ５２５３３４（ＣＡＳ  Ｎｏ．：３５６５５９−２０−１）
ＳＤ２０８（ＣＡＳ  Ｎｏ．：６２７５３６−０９−８）
Ｇａｌｕｎｉｓｅｒｔｉｂ（ＬＹ２１５７２９９）（ＣＡＳ  Ｎｏ．：７００８７４−７２−２）
ＬＹ２１０９７６１（ＣＡＳ  Ｎｏ．：７００８７４−７１−１）
ＳＢ５０５１２４（ＣＡＳ  Ｎｏ．：６９４４３３−５９−５）
ＧＷ７８８３８８（ＣＡＳ  Ｎｏ．：４５２３４２−６７−５）
ＥＷ−７１９７（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１３５２６０８−８２−２）
【００４７】
ＴＧＦ−β阻害剤の濃度は適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、０．１μｍｏｌ／Ｌ〜３０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．５μｍｏｌ／Ｌ〜１０μｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することができる。
【００４８】
１．２．４  ＰＤＥ４阻害剤
ＰＤＥ４（Ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ−４）は、ホスホジエステラーゼスーパーファミリーの一つである。ホスホジエステラーゼは、リン酸ジエステル結合を加水分解する酵素であり、特にＰＤＥ４は、シグナル伝達経路のセカンドメッセンジャーであるｃＡＭＰの環状リン酸ジエステル結合を加水分解し、その細胞内濃度の調節に重要な役割を担っている。ＰＤＥ４は、免疫細胞や脳・神経細胞などに存在する。
【００４９】
「ＰＤＥ４阻害剤の存在下」とは、ＰＤＥ４を阻害することができる培養条件下であることをいい、その手段は特に限定はなく、ＰＤＥ４を阻害することができる任意の手段を利用することができる。本発明には、ＰＤＥ４に直接作用してその機能を阻害する物質（例えば、抗ＰＤＥ４抗体やその他の薬剤）、ＰＤＥ４自体の産生を抑制する薬剤等を利用することができる。また、ＰＤＥ４が関わるシグナル伝達をその上流で阻害することによってもＰＤＥ４を阻害することができる。
【００５０】
本発明では特に限定されないが、ＰＤＥ４阻害剤としては、例えば、以下の化合物を使用することができる。好ましくは、ロリプラムやその光学異性体（例えば、Ｒ（−）体、Ｓ（＋）体）を使用することができる。
【００５１】
ロリプラム（ＣＡＳ  Ｎｏ．：６１４１３−５４−５）
【００５２】
【化７】
2019151097.tif 000009
【００５３】
Ｒｏｆｌｕｍｉｌａｓｔ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１６２４０１−３２−３）
Ｃｉｌｏｍｉｌａｓｔ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１５３２５９−６５−５）
ＧＳＫ２５６０６６（ＣＡＳ  Ｎｏ．：８０１３１２−２８−７）
Ａｐｒｅｍｉｌａｓｔ（ＣＣ−１０００４）（ＣＡＳ  Ｎｏ．：６０８１４１−４１−９）
【００５４】
ＰＤＥ４阻害剤の濃度は適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、０．１μｍｏｌ／Ｌ〜２０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．５μｍｏｌ／Ｌ〜１０μｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することができる。
【００５５】
１．２．５  ＧＲアゴニスト
ＧＲ（Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、グルココルチコイド受容体）は、核内受容体スーパーファミリーに属し、ステロイドホルモンであるグルココルチコイドと結合してその転写活性を調節する転写因子として働く。ＧＲは広くヒトの全身に発現しており、その機能的な重要性から、デキサメタゾンなどの合成アゴニストが多数開発されている。
【００５６】
「ＧＲアゴニストの存在下」とは、ＧＲを作動することができる培養条件下であることをいい、その手段は特に限定はなく、ＧＲを作動することができる任意の手段を利用することができる。本発明には、ＧＲに直接作用してその機能を作動する物質、ＧＲ自体の発現を促進する薬剤等を利用することができる。また、ＧＲと相互作用する転写因子あるいは転写共役因子、またこれらの発現や翻訳後修飾などを調節することによってもＧＲの機能を制御することができる。
【００５７】
本発明では特に限定されないが、ＧＲアゴニストとしては、例えば、以下の化合物を使用することができる。好ましくは、デキサメタゾンを使用することができる。
【００５８】
デキサメタゾン、ベタメタゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン、ベクロメタゾン、ブデソニド、ヒドロコルチゾン、酢酸コルチゾン、ＧＳＫ９０２７、フルチカゾン、モメタゾン等のステロイド化合物。
選択的グルココルチコイド受容体修飾物質あるいは選択的グルココルチコイド受容体アゴニストに分類される非ステロイド化合物。
【００５９】
ＧＲアゴニストの濃度は適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、０．０１μｍｏｌ／Ｌ〜１０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０５μｍｏｌ／Ｌ〜２μｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することができる。
【００６０】
１．２．６  ＲＡＲアゴニスト、ＲＸＲアゴニスト
ＲＡＲ（Ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、レチノイン酸受容体）は、核内受容体スーパーファミリーに属し、レチノイン酸をリガンドとしその転写活性が活性化される。ＲＡＲは、生体内で様々な機能を有しており、特に細胞の分化に密接に関わっていることから、人工の合成アゴニストが多数開発されている。
ＲＸＲ（ｒｅｔｉｎｏｉｄ  Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、レチノイドＸ受容体）は、核内受容体スーパーファミリーに属し、ＲＡＲと同様にレチノイン酸などをリガンドとしその転写活性が調節される。ＲＸＲは、ＲＡＲをはじめとする様々な核内受容体とヘテロダイマーを形成し、特定の塩基配列への結合や転写共役因子のリクルートなどを介して、パートナーとなる核内受容体の転写活性を複雑に調節している。
【００６１】
「ＲＡＲアゴニストないしＲＸＲアゴニストの存在下」とは、ＲＡＲないしＲＸＲを作動することができる培養条件下であることをいい、その手段は特に限定はなく、ＲＡＲないしＲＸＲを作動することができる任意の手段を利用することができる。本発明には、ＲＡＲないしＲＸＲに直接作用してその機能を作動する物質、ＲＡＲないしＲＸＲ自体の発現を促進する薬剤等を利用することができる。また、ＲＡＲないしＲＸＲと相互作用する転写因子あるいは転写共役因子、またこれらの発現および翻訳後修飾などを調節することによってもＲＡＲないしＲＸＲの機能を制御することができる。
【００６２】
本発明では特に限定されないが、ＲＡＲアゴニストないしＲＸＲアゴニストとしては、例えば、以下の化合物を使用することができる。好ましくは、ＴＴＮＰＢ、レチノイン酸、ＣＨ５５、ＡＭ５８０を使用することができる。
【００６３】
ＴＴＮＰＢ（アロチノイド酸、ＣＡＳ  Ｎｏ．：７１４４１−２８−６）
【００６４】
【化８】
2019151097.tif 000010
【００６５】
レチノイン酸（ＣＡＳ  Ｎｏ．：３０２−７９−４）
Ｔｒｅｔｉｎｏｉｎ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：３０２−７９−４）
Ａｄａｐａｌｅｎｅ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１０６６８５−４０−９）
Ｂｅｘａｒｏｔｅｎｅ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１５３５５９−４９−０）
Ｔａｚａｒｏｔｅｎｅ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１１８２９２−４０−３）
Ｔａｍｉｂａｒｏｔｅｎｅ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：９４４９７−５１−５）
ＣＨ５５（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１１０３６８−３３−７）
ＡＭ５８０（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１０２１２１−６０−８）
【００６６】
ＲＡＲアゴニストないしＲＸＲアゴニストの濃度は適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、０．０５μｍｏｌ／Ｌ〜１０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．５μｍｏｌ／Ｌ〜５μｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することができる。
【００６７】
１．２．７  ＰＤＫ１活性化剤
ＰＤＫ１（ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ−１、ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ１）は、ＡＫＴをリン酸化し活性化するリン酸化酵素であり、イノシトールリン脂質を介したシグナル伝達経路の中心として機能している。このＰＤＫ１／ＡＫＴシグナル経路は、細胞の生存、増殖、糖および脂質代謝などに極めて重要な役割を果たしている。ＰＤＫ１活性化剤であるＰＳ４８は、ＰＤＫ１に直接結合しＡＫＴをリン酸化させ、このシグナル経路を活性化する。
【００６８】
「ＰＤＫ１活性化剤の存在下」とは、ＰＤＫ１を活性化することができる培養条件下であることをいい、その手段は特に限定はなく、例えば、細胞内ＰＤＫ１濃度を増加させることができる任意の手段を利用することができる。また、ＰＤＫ１はチロシンキナーゼ受容体、サイトカイン受容体、Ｇタンパク質共役型受容体をはじめとする様々な受容体を介して、ホスホイノシチド３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）が活性化されることにより生産されるホスファチジルイノシトール３リン酸によって活性化されるため、これらの受容体を活性化させる物質、あるいは、ホスファチジルイノシトール３リン酸の生産を誘導する他の刺激もＰＤＫ１を活性化させる手段となりうる。
【００６９】
本発明では特に限定されないが、ＰＤＫ１活性化剤としては、例えば、以下の化合物を使用することができる。好ましくは、ＰＳ４８を使用することができる。
【００７０】
ＰＳ４８（（２Ｚ）−５−（４−Ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−３−ｐｈｅｎｙｌ−２−ｐｅｎｔｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ、ＣＡＳ  Ｎｏ．：１１８０６７６−３２−７）
ＯＳＵ−０３０１２（ＡＲ−１２）（ＣＡＳ  Ｎｏ．：７４２１１２−３３−０）
ＢＸ７９５（ＣＡＳ  Ｎｏ．：７０２６７５−７４−９）
ＢＸ９１２（ＣＡＳ  Ｎｏ．：７０２６７４−５６−４）
ＰＨＴ−４２７（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１１９１９５１−５７−１）
【００７１】
ＰＤＫ１活性化剤の濃度は適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、０．５μｍｏｌ／Ｌ〜３０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１μｍｏｌ／Ｌ〜１０μｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することができる。
【００７２】
１．２．８  ＥＲＫ阻害剤について
ＥＲＫ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｋｉｎａｓｅ、細胞外シグナル調節キナーゼ）は、ＥＧＦ（上皮増殖因子）、血清刺激又は酸化ストレスなどによって活性化されるＭＡＰＫのサブファミリーで、ＥＲＫはその関わるシグナル伝達経路の違いからＥＲＫ１／２、ＥＲＫ５、ＥＲＫ７、ＥＲＫ８に分けられる。上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）などのチロシンキナーゼ受容体にリガンドが結合することでシグナルが流れた結果、ＥＲＫの活性化ループに存在するＴＥＹモチーフがリン酸化されて活性化する。
【００７３】
「ＥＲＫ阻害剤の存在下」とは、ＥＲＫを阻害することができる培養条件下であることをいい、その手段は特に限定はなく、ＥＲＫの活性を阻害する物質、例えば、抗ＥＲＫ抗体やＥＲＫ阻害剤のようなＥＲＫシグナル阻害手段を利用することができる。また、ＥＲＫの活性化に関わる酵素、例えば、ＥＲＫキナーゼやＥＲＫキナーゼキナーゼ等を阻害する手段もＥＲＫ阻害に利用することができる。
【００７４】
本発明では特に限定されないが、ＥＲＫ阻害剤としては、以下の化合物を使用することができる。好ましくは、ＧＤＣ−０９９４（Ｒａｖｏｘｅｒｔｉｎｉｂ）を使用することができる。
【００７５】
ＧＤＣ−０９９４（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１４５３８４８−２６−４）
【００７６】
【化９】
2019151097.tif 000011
【００７７】
ＳＣＨ７７２９８４（ＣＡＳ  Ｎｏ．：９４２１８３−８０−４）
ＭＫ−８３５３（ＳＣＨ９００３５３）（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１１８４１７３−７３−６）
Ｍａｇｎｏｌｉｎ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：３１００８−１８−１）
ＬＹ３２１４９９６（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１９５１４８３−２９−６）
ＦＲ  １８０２０４（ＣＡＳ  Ｎｏ．：８６５３６２-７４-９）
ＡＺＤ０３６４（ＣＡＳ  Ｎｏ．：２０９７４１６-７６-５）
【００７８】
ＥＲＫ阻害剤の濃度は適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、０．１μｍｏｌ／Ｌ〜１０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．２μｍｏｌ／Ｌ〜５μｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することができる。
【００７９】
１．３  体細胞の培養
本発明製法における体細胞の培養は、使用する体細胞の種類に応じた培地、温度、その他の条件を選択し、上記の各種の阻害剤（及び、場合により誘導剤ないし活性化剤）の存在下において実施すればよい。培地は、公知の培地又は市販の培地から選択することができる。例えば、一般的な培地であるＭＥＭ（最少必須培地）、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、又はこれらを改変した培地に、適切な成分（血清、タンパク質、アミノ酸、糖類、ビタミン類、脂肪酸類、抗生物質等）を添加して使用することができる。
【００８０】
培養条件としては、一般的な細胞培養の条件を選択すればよい。３７℃、５％ＣＯ２の条件などが例示される。培養中は適切な間隔（好ましくは１日から７日に１回、より好ましくは３日から４日に１回）で培地を交換することが好ましい。線維芽細胞を材料として本発明製法を実施する場合、３７℃、５％ＣＯ２の条件では５ないし８日間から３週間で心筋細胞が出現する。使用する体細胞として培養が容易なものを選択することにより、あらかじめ細胞数を増加させた体細胞を心筋細胞に転換することも可能である。従って、スケールアップした心筋細胞の製造も容易である。
【００８１】
体細胞の培養には、プレート、ディッシュ、細胞培養用フラスコ、細胞培養用バッグ等の細胞培養容器を使用することができる。なお、細胞培養用バッグとしては、ガス透過性を有するものが好適である。大量の細胞を必要とする場合には、大型培養槽を使用してもよい。培養は開放系又は閉鎖系のどちらでも実施することができるが、得られた心筋細胞のヒトへの投与等を目的とする場合には、閉鎖系で培養を行うことが好ましい。
本発明製法においては、上記した各種の阻害剤等を含む培地において体細胞を培養することにより、一段階の培養によって体細胞から心筋細胞を製造することができる。
【００８２】
本発明製法においては、体細胞から心筋細胞を製造する。５−アザシチジン、アンジオテンシンＩＩ、ＢＭＰ−２（Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ２）、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）等は、心筋細胞への分化の誘導に有効な物質として知られている。心筋細胞への分化の誘導に有効な物質としては、例えば、分化誘導剤として市販されているものを使用することもできる。本発明においては、上記した物質の存在下において体細胞を培養することができる。
【００８３】
１．４  心筋細胞
上記した本発明製法により、心筋細胞を含有する細胞集団を得ることができる。本発明製法により製造される心筋細胞も本発明の範囲内である。本発明製法で製造される心筋細胞は、最終分化した細胞の他、心筋細胞に分化することが運命づけられた前駆細胞でもよい。
本発明製法により製造される心筋細胞は、低分子化合物により体細胞から直接誘導される、いわゆる低分子化合物誘導性心筋細胞（ｃｉＣＭｓ）であって、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞から分化誘導される心筋細胞とは区別される。また、使用する低分子化合物の相違によって、特許文献１等に記載の低分子化合物誘導性心筋細胞とも区別される。
【００８４】
本発明製法で製造される心筋細胞は、例えば、細胞の形態的変化、心筋細胞の特徴的性質や特異的マーカーを利用して、検出、確認及び分離を行うことができる。
心筋細胞は、自律的に拍動するという他の細胞にない特徴を有しており、顕微鏡下での観察により他の細胞と区別することができる。また、心筋細胞の特異的マーカーとしては、心筋トロポニンＣ（ｃＴｎＴ）、αミオシン重鎖、αアクチン等が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００８５】
特異的マーカーの検出には、検疫的方法（抗体による検出）を利用できるが、タンパク質分子に関してはそのｍＲＮＡ量の定量により検出を実施してもよい。心筋細胞の特異的マーカーを認識する抗体は、本発明製法により得られた心筋細胞を単離及び精製する上でも有用である。
【００８６】
本発明製法で製造される心筋細胞は、例えば、組織修復等のために使用することができる。本発明製法で製造される心筋細胞を使用して、組織修復等のための医薬用組成物を製造することができる。心不全又は心筋梗塞等の心疾患の治療手段として、心筋細胞の製造方法、及び心筋細胞の移植方法の開発が行なわれている。例えば、心筋細胞と内皮細胞等を積層化することにより形成された心筋シートは、優れた治療効果と生着性を示すことから、重度の心不全の治療への利用が期待されている。
【００８７】
本発明製法で製造される心筋細胞を医薬用組成物とする場合には、常法により、心筋細胞を医薬的に許容される担体と混合するなどして、個体への投与に適した形態の製剤とすればよい。担体としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等）を加えて等張とした注射用蒸留水を挙げることができる。さらに、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤、酸化防止剤等を配合してもよい。
本発明製法で製造される心筋細胞は、さらに、心筋細胞の機能発揮や生着性向上に有効な他の細胞や成分と組み合わせた組成物とすることもできる。
【００８８】
さらに、本発明製法で製造される心筋細胞は、心筋細胞に作用する医薬候補化合物のスクリーニングや医薬候補化合物の安全性評価のために使用することもできる。心筋細胞は、医薬候補化合物の心毒性を評価するための重要なツールである。本発明製法によれば、一度の操作で多くの心筋細胞を取得することができることから、細胞のロット差の影響を受けずに、再現性のある研究結果を得ることが可能になる。
【００８９】
２  組成物
本発明に係る組成物（以下、「本発明組成物」という。）は、体細胞から直接分化誘導することにより心筋細胞を製造するための組成物であって、ＭＥＫ阻害剤を含むことを特徴とする。
【００９０】
好ましくは、さらにｃＡＭＰ誘導剤を含む本発明組成物を挙げることができる。より好ましくは、さらにＴＧＦ−β阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、及びＧＲアゴニストからなる群から選択される少なくとも１種を含む本発明組成物を挙げることができる。また、更に好ましくは、さらにＥＲＫ阻害剤を含む本発明組成物を挙げることができる。
特に好ましくは、次の（１）〜（６）のいずれかの組み合わせを含む本発明組成物である。
（１）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、及びＴＧＦ−β阻害剤、
（２）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、及びＰＤＥ４阻害剤、
（３）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、及びＧＲアゴニスト、
（４）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、ＰＤＥ４阻害剤、及びＧＲアゴニスト、
（５）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、ＴＧＦ−β阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、及びＧＲアゴニスト、
（６）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、ＴＧＦ−β阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、ＧＲアゴニスト、及びＥＲＫ阻害剤。
また、本発明として、体細胞から直接分化誘導することにより心筋細胞を製造するための組成物であって、ｃＡＭＰ誘導剤、ＴＧＦ−β阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、ＧＲアゴニスト、及びＥＲＫ阻害剤を含むことを特徴とする、体細胞から心筋細胞を製造するための組成物も挙げることができる。以下、かかる組成物も含めて本発明組成物という。
【００９１】
本発明組成物は、さらにＲＡＲアゴニスト、ＲＸＲアゴニスト、及びＰＤＫ１活性化剤からなる群から選択される少なくとも１種を含むことができる。
本発明組成物においては、少なくとも上記いずれかの組み合わせを含んでいればよく、必要に応じて、任意にさらに他の阻害剤や誘導剤等を含むことができる。
上記阻害剤や誘導剤等は、それぞれにおいて、１種を用いても２種以上を併用してもよい。
具体的な上記阻害剤等においては、２種類以上の阻害作用等を有するものもあり得るが、その場合、一つで複数の阻害剤等を含んでいるとみなすことができる。
上記した阻害剤や誘導剤等の具体例や好ましい例などは、前記と同義である。
【００９２】
本発明組成物は、体細胞から心筋細胞を製造するための組成物として使用することができる。本発明組成物は、また、体細胞から心筋細胞を製造するための培地として使用することもできる。
【００９３】
体細胞から心筋細胞の製造に使用される培地としては、細胞の培養に必要な成分を混合して製造した基礎培地に、有効成分として、ＭＥＫ阻害剤及びｃＡＭＰ誘導剤等を含有させた培地を例示することができる。上記の有効成分は、心筋細胞の製造に有効な濃度で含まれていればよく、濃度は当業者が適宜決定することができる。基礎培地は、公知の培地又は市販の培地から選択することができる。例えば、一般的な培地であるＭＥＭ（最少必須培地）、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、又はこれらを改変した培地を、基礎培地として使用することができる。
【００９４】
培地にはさらに、本明細書中で上記した公知の培地成分、例えば、血清、タンパク質（アルブミン、トランスフェリン、成長因子等）、アミノ酸、糖類、ビタミン類、脂肪酸類、抗生物質等を添加してもよい。
【００９５】
培地にはさらに、本明細書中で上記した、心筋細胞への分化の誘導に有効な物質を添加してもよい。
【００９６】
さらに本発明においては、ＭＥＫ阻害剤及びｃＡＭＰ誘導剤等を生体に投与することによって、生体内において体細胞から心筋細胞を製造することもできる。即ち、本発明によれば、ＭＥＫ阻害剤及びｃＡＭＰ誘導剤等を生体に投与することを含む、生体内において体細胞から心筋細胞を製造する方法が提供される。生体に投与する阻害剤等の好ましい組み合わせは、本明細書中に記載した通りである。また、生体としては、ヒト、ヒト以外の哺乳動物、及び哺乳動物以外の動物（鳥類、爬虫類、両生類、魚類等）が例示されるが、ヒトが特に好ましい。ＭＥＫ阻害剤及びｃＡＭＰ誘導剤等を生体内の特定部位に投与することによって、上記特定部位において、体細胞から心筋細胞を製造することができる。
【実施例】
【００９７】
以下、実施例や試験例により本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例等に記載の範囲に限定されるものではない。【００９８】
実施例  心筋細胞の製造
＜ヒト線維芽細胞から心筋細胞への直接誘導＞
（１）ヒト線維芽細胞
材料としたヒト線維芽細胞はＤＳファーマバイオメディカル株式会社から購入した。３８才のヒト皮膚に由来する線維芽細胞である。【００９９】
（２）ヒト線維芽細胞から心筋細胞への直接誘導
ヒト線維芽細胞を、ゼラチン（Ｃａｔ＃：１９０−１５８０５，和光純薬工業社製）でコーティングされた３５ｍｍディッシュに８×１０４個ずつ播種し、１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ  ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）で、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２日間培養した（８０−９０％以上がコンフルエント）。なおＤＭＥＭは、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）を示す。【０１００】
上記のヒト線維芽細胞のディッシュの培地を、２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２％Ｂ２７-ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ社製）、１％Ｎ２（Ｇｉｂｃｏ社製）、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ：Ｎｏｎ-ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ；Ｇｉｂｃｏ社製）、βメルカプトエタノール（ナカライテスク社製；終濃度０．１ｍｍｏｌ／Ｌ）、２−ｐｈｏｓｐｈｏ  ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ（Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ社製；終濃度５０μｇ／ｍＬ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び下記の低分子化合物を添加したＤＭＥＭ（Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅ）ｗｉｔｈ  Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  Ｐｈｅｎｏｌ  Ｒｅｄ，Ｓｏｄｉｕｍ  Ｐｙｒｕｖａｔｅ（Ｇｉｂｃｏ社製）に培地を交換した。その後、３日毎に同組成の培地へ培地交換を行いながら、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。【０１０１】
＜低分子化合物＞
２μＭ  ＰＤ０３２５９０１（Ｃａｔ＃：１６２−２５２９３，Ｗａｋｏ）
１５μＭ  フォルスコリン（Ｃａｔ＃：０６３−０２１９３，Ｗａｋｏ）
５μＭ  レプソックス（Ｃａｔ＃：１８９４−２５，ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）
３μＭ  ロリプラム（Ｃａｔ＃：１８０−０１４１１，Ｗａｋｏ）
１μＭ  デキサメタゾン（Ｃａｔ＃：０４７−１８８６３，Ｗａｋｏ）
１μＭ  レチノイン酸（Ｃａｔ＃：１８６−０１１１４，Ｗａｋｏ）
２μＭ  ＴＴＮＰＢ（Ｃａｔ＃：１６１４４，Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）
１０μＭ  ＰＳ４８（Ｃａｔ＃：１６４−２５０１１，Ｗａｋｏ）【０１０２】
（３）結果
上記（２）に従って培養した結果を表１・表２、及び図１〜６に示す。表中、「＋」は培地中に当該化合物が存在することを示し、「−」は培地中に当該化合物が存在しないことを示す。【０１０３】
【表１】
2019151097.tif 000012
【０１０４】
【表２】
2019151097.tif 000013
【０１０５】
（４）心筋細胞の評価
本実験において、低分子化合物を添加して培養後５日目程度から心筋様の細胞が出現した。これは、顕微鏡下において自発的かつ周期的に収縮する細胞塊を観察することによって評価した。細胞の写真（図１〜６）は、当該低分子化合物を添加して培養７日後と１０日後（図１〜３）、７日後と１３日後（図４、５）、又は１３日後と１７日後（図６）に、それぞれ撮影したものである。【０１０６】
また、表２の低分子化合物の組み合わせの一部について、当該低分子化合物を添加して培養１７日後の細胞からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲによって心筋前駆細胞特異的遺伝子Ｔｂｘ１および心筋細胞特異的遺伝子Ｔｎｎｔ２の発現量を定量した。その結果を図７に示す。図中のＴｂｐとは内部標準となる遺伝子を示し、このｍＲＮＡ量による相対値によりＴｂｘ１およびＴｎｎｔ２のｍＲＮＡ量が評価している。図中の各記号の組み合わせ化合物は下記の通りである。【０１０７】
Ｃ：コントロール（当該低分子化合物なし）
Ｍ：実施例Ａ
Ｆ：比較例２
ＭＦ：実施例７
ＭＦ＋Ｒｅｐ：実施例８
ＭＦ＋Ｒｏｌｉ：実施例９
ＭＦ＋Ｄｅｘ：実施例１０
ＭＦ＋Ｒｅｐ＋Ｒｏｌｉ＋Ｄｅｘ：実施例１２【０１０８】
表１や図１〜３の写真から明らかな通り、特にＰＤ０３２５９０１（ＭＥＫ阻害剤）を化合物の組み合わせから除いた場合、自発的に収縮する細胞塊がほとんど現れないようになった。また表２や図４〜６の写真から明らかな通り、頻度は少ないながらＰＤ０３２５９０１（ＭＥＫ阻害剤）とフォルスコリン（ｃＡＭＰ誘導剤）あるいはＰＤ０３２５９０１（ＭＥＫ阻害剤）のみの添加によって、心筋様の細胞塊が出現した。また図６の写真が示すように、一箇所だけでなく、複数箇所において自発的に動く細胞塊を生じたことが確認された。【０１０９】
図７から、当該低分子化合物を加えていない時の細胞の発現量と比較して、それぞれの化合物の組み合わせによって、これら心筋細胞に特異的な遺伝子が活性化していることがわかった。特に、３種類の化合物（ＰＤ０３２５９０１（ＭＥＫ阻害剤）、フォルスコリン（ｃＡＭＰ誘導剤）、レプソックス（ＴＧＦ−β））および５種類の化合物（ＰＤ０３２５９０１（ＭＥＫ阻害剤）、フォルスコリン（ｃＡＭＰ誘導剤）、レプソックス（ＴＧＦ−β）、ロリプラム（ＰＤＥ４阻害剤）、デキサメタゾン（ＧＲアゴニスト））の組み合わせでは、これら両遺伝子の発現が大きく上昇していた。【０１１０】
本実験結果から、ＭＥＫ阻害剤は、心筋細胞の誘導に重要な化合物であり、少なくともＭＥＫ阻害剤（例、ＰＤ０３２５９０１）、又はそれとｃＡＭＰ誘導剤（例、フォルスコリン）との存在下で培養することにより、誘導効率の良好な心筋細胞が得られることが分かった。また、ＭＥＫ阻害剤及びｃＡＭＰ誘導剤、並びにＴＧＦ−β阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、及びＧＲアゴニストの存在下で培養すると、当該特定的遺伝子の発現は顕著であった。【０１１１】
試験例１
（１）心筋細胞に係る遺伝子発現
ＰＤ０３２５９０１（ＭＥＫ阻害剤）、フォルスコリン（ｃＡＭＰ誘導剤）、レプソックス（ＴＧＦ−β）、及びロリプラム（ＰＤＥ４阻害剤）の４種類（４Ｃ）、又はこれらにデキサメタゾン（ＧＲアゴニスト）を加えた５種類の化合物の組み合わせについて、前記実施例と同様に添加して細胞培養を行い、培養１８日後の細胞からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲによって心筋前駆細胞特異的遺伝子Ｈａｎｄ２及びＴｂｘ１、並びに心筋細胞特異的遺伝子Ｔｎｎｔ２、Ｎｐｐａ、及びＮｋｘ２．５の発現量を定量した。その結果を図８に示す。図中のＴｂｐとは内部標準となる遺伝子を示し、このｍＲＮＡ量による相対値により各遺伝子のｍＲＮＡ量が評価している。図中、「Ｎｏ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ」は当該化合物を一つも添加しなかった場合の結果であることを、「４Ｃ＋Ｄｅｘ」は上記５種類の化合物を全て添加した場合の結果であることを示す。【０１１２】
図８から明らかな通り、４Ｃ又はこれにデキサメタゾン（ＧＲアゴニスト）を加えた化合物群を添加培養することにより、ヒト皮膚線維芽細胞から心筋細胞へ直接誘導が進んでいることが示された。【０１１３】
（２）免疫染色
上記（１）において、４Ｃにデキサメタゾン（ＧＲアゴニスト）を加えた化合物群を添加培養した細胞について、培養後１８日目に細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、免疫染色を行った。染色には抗Ｓａｒｃｏｍｅｒｉｃ  Ａｌｐｈａ  Ａｃｔｉｎｉｎ抗体（ａｂ９４６５、Ａｂｃａｍ社製；２００倍希釈で使用）を使用した。その結果を図９に示す。図中、赤がＡｌｐｈａ  Ａｃｔｉｎｉｎの染色結果、青がＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）による核染色を示す。なお、図９はグレー表示であるため、赤色と青色等は表示されないが、実際のオリジナル写真では、赤色と青色等が表示されている。【０１１４】
図９に示すように、当該化合物群を添加して培養後、心筋様細胞のある一定数でＡｌｐｈａ  Ａｃｔｉｎｉｎの染色が見られ、相対的にＤＡＰＩで染色された細胞核ではなく、細胞質で染色が観察された。心筋細胞のマーカーであるＡｌｐｈａ  Ａｃｔｉｎｉｎの発現が一部の細胞で見られたことから、免疫染色の結果からも、当該化合物群を添加培養することにより、ヒト皮膚線維芽細胞から心筋様細胞へ直接誘導が進んでいることが示された。【０１１５】
試験例２
下記低分子化合物の組み合わせについて、前記実施例と同様に添加して細胞培養を行った。当該化合物群を添加して培養後１３日目と１９日目の細胞の状態を図１０に示す。
図１０中、「５Ｃ」は、下記６種類の低分子化合物の中、Ｔｒａｍｅｔｉｎｉｂ以外の５種類の化合物の組み合わせを表し、左側２写真は、その化合物群の添加培養結果を示す。「５Ｃ−Ｍ」は、５Ｃの化合物群からＰＤ０３２５９０１（ＭＥＫ阻害剤）を除いた化合物群を表し、中２写真は、その化合物群の添加培養結果を示す。「５Ｃ−Ｍ＋Ｔｒａｍｅｔｉｎｉｂ」は、５Ｃの化合物群からＰＤ０３２５９０１（ＭＥＫ阻害剤）を除き、別のＭＥＫ阻害剤であるＴｒａｍｅｔｉｎｉｂを加えた化合物群を表し、右側２写真は、その化合物群の添加培養結果を示す。【０１１６】
＜低分子化合物＞
２μＭ  ＰＤ０３２５９０１（Ｃａｔ＃：１６２−２５２９３，Ｗａｋｏ）
１５μＭ  フォルスコリン（Ｃａｔ＃：０６３−０２１９３，Ｗａｋｏ）
５μＭ  レプソックス（Ｃａｔ＃：１８９４−２５，ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）
３μＭ  ロリプラム（Ｃａｔ＃：１８０−０１４１１，Ｗａｋｏ）
１μＭ  デキサメタゾン（Ｃａｔ＃：０４７−１８８６３，Ｗａｋｏ）
３μＭ  Ｔｒａｍｅｔｉｎｉｂ（Ｃａｔ＃：ＨＹ-１０９９９，ＭｅｄＣｈｅｍ  Ｅｘｐｒｅｓｓ）【０１１７】
図１０から明らかな通り、ヒト皮膚線維芽細胞から心筋細胞への直接誘導にはＭＥＫ阻害剤が重要であることが示された。【０１１８】
試験例３
下記低分子化合物の組み合わせについて、前記実施例と同様に添加して培養を行った。当該低分子化合物を添加して培養後７日目と１２日目の細胞の状態を図１１に示す。
図１１中、「５Ｃ」は、下記６種類の低分子化合物の中、ＧＤＣ−０９９４以外の５種類の化合物の組み合わせを表し、左端２写真は、その化合物群の添加培養結果を示す。「５Ｃ−Ｍ」は、５Ｃの化合物群からＰＤ０３２５９０１（ＭＥＫ阻害剤）を除いた化合物群を表し、左側から２つ目の２写真は、その化合物群の添加培養結果を示す。「５Ｃ−Ｍ＋ＧＤＣ−０９９４」は、５Ｃの化合物群からＰＤ０３２５９０１（ＭＥＫ阻害剤）を除き、代わりにＧＤＣ−０９９４（ＥＲＫ阻害剤）を加えた化合物群を表し、右側から２つ目の２写真は、その化合物群の添加培養結果を示す。「５Ｃ＋ＧＤＣ−０９９４」は、５Ｃの化合物群にＧＤＣ−０９９４（ＥＲＫ阻害剤）を加えた化合物群を表し、右端２写真は、その化合物群の添加培養結果を示す。【０１１９】
＜低分子化合物＞
２μＭ  ＰＤ０３２５９０１（Ｃａｔ＃：１６２−２５２９３，Ｗａｋｏ）
１５μＭ  フォルスコリン（Ｃａｔ＃：０６３−０２１９３，Ｗａｋｏ）
５μＭ  レプソックス（Ｃａｔ＃：１８９４−２５，ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）
３μＭ  ロリプラム（Ｃａｔ＃：１８０−０１４１１，Ｗａｋｏ）
１μＭ  デキサメタゾン（Ｃａｔ＃：０４７−１８８６３，Ｗａｋｏ）
３μＭ  ＧＤＣ−０９９４（Ｃａｔ＃：２１１０７，Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）【０１２０】
図１１に示されるように、ＭＥＫ阻害剤が不存在でもＥＲＫ阻害剤が存在すれば、ヒト皮膚線維芽細胞から心筋細胞への直接誘導が可能であった。また、ＭＥＫ阻害剤とＥＲＫ阻害剤の両方が存在すれば、ヒト皮膚線維芽細胞から心筋細胞への直接誘導が促進されることが分かった。
【図１】
2019151097.tif 000014
【図２】
2019151097.tif 000015
【図３】
2019151097.tif 000016
【図４】
2019151097.tif 000017
【図５】
2019151097.tif 000018
【図６】
2019151097.tif 000019
【図７】
2019151097.tif 000020
【図８】
2019151097.tif 000021
【図９】
2019151097.tif 000022
【図１０】
2019151097.tif 000023
【図１１】
2019151097.tif 000024
【国際調査報告】
2019151097.tif 000025
2019151097.tif 000026
2019151097.tif 000027
2019151097.tif 000028
2019151097.tif 000029