(57)【要約】  ゲル化された水溶性高分子、オイル及び界面活性剤を含むゲルインオイル型エマルション、及びこれを含有する経皮吸収剤。
2020004599.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲル化された水溶性高分子、オイル及び界面活性剤を含むゲルインオイル型エマルション。
【請求項２】
ゲル化された水溶性高分子中に水溶性有効成分を含む、請求項１に記載のゲルインオイル型エマルション。
【請求項３】
水溶性有効成分が増殖因子である、請求項２に記載のゲルインオイル型エマルション。
【請求項４】
ゲル化された水溶性高分子が、ゲル化された生体由来高分子である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のゲルインオイル型エマルション。
【請求項５】
生体由来高分子がコラーゲン又はゼラチンである、請求項４に記載のゲルインオイル型エマルション。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のゲルインオイル型エマルションを含有する経皮吸収剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゲルインオイル型エマルション及び経皮吸収剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
経皮吸収剤とは、薬剤等の有効成分を皮膚から吸収させ、体内に導くことを目的とするものである。ここで、有効成分を経皮吸収させるためには、皮膚の表層である疎水性の角質層を通過し、親水性の皮膚の内部に有効成分を届ける必要がある。このため、経皮吸収剤には、親水−疎水のコントロールが求められる。【０００３】
これに対して、例えば、特許文献１では、所定の油中水型マイクロエマルションが経皮吸収剤（薬物送達システム）として有用であることが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平１１−２９４６４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、経皮吸収剤は、長期間にわたり有効成分の血中濃度を安定に維持することを目的として、徐放性を有することが好ましい。しかしながら、特許文献１等の従来の油中水（Ｗ／Ｏ）型マイクロエマルションでは、経皮吸収剤からの有効成分の放出が早く、効果が持続しないという問題がある。【０００６】
そこで本発明は、徐放性に優れる経皮吸収剤、及びこれに用いられるゲルインオイル型エマルションを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記事情に鑑み、本発明者等は鋭意検討を重ねた結果、以下の［１］〜［６］に示す発明を完成させた。【０００８】
［１］  ゲル化された水溶性高分子、オイル及び界面活性剤を含むゲルインオイル型エマルション。
［２］  ゲル化された水溶性高分子中に水溶性有効成分を含む、［１］に記載のゲルインオイル型エマルション。
［３］  水溶性有効成分が増殖因子である、［２］に記載のゲルインオイル型エマルション。
［４］  ゲル化された水溶性高分子が、ゲル化された生体由来高分子である、［１］〜［３］のいずれかに記載のゲルインオイル型エマルション。
［５］  生体由来高分子がコラーゲン又はゼラチンである、［４］に記載のゲルインオイル型エマルション。
［６］  ［１］〜［５］のいずれかに記載のゲルインオイル型エマルションを含有する経皮吸収剤。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、徐放性に優れる経皮吸収剤、及びこれに用いられるゲルインオイル型エマルションを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例における皮膚透過性評価に用いた装置の模式断面図である。
【図２】実施例１及び比較例１における皮膚透過試験後の位相差観察と蛍光観察を行った結果を示す図である。
【図３】実施例６及び比較例５におけるＨ・Ｅ染色観察の写真である。
【図４】実施例６及び比較例５における吸光度の測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の一実施形態を詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１２】
本実施形態のゲルインオイル型エマルション（以下、「Ｇ／Ｏ型エマルション」ともいう。）は、ゲル化された水溶性高分子、オイル及び界面活性剤を含む。本実施形態のＧ／Ｏ型エマルションはまた、必要に応じて、ゲル化された水溶性高分子中に水溶性有効成分等を含んでいてもよい。なお、Ｇ／Ｏ型エマルションとは、ゲル化された水溶性高分子由来のゲル粒子がオイル中に分散されてなるエマルションである。
【００１３】
エマルション中のゲル粒子の平均粒径は、１μｍ以下であると好ましく、８００ｎｍ以下であるとより好ましく、６００ｎｍ以下であると更に好ましく、４００ｎｍ以下であると更に好ましく、２００ｎｍ以下であると特に好ましい。ゲル粒子の平均粒径を上記範囲とすることで、正常血管組織への浸透が抑制される一方、炎症性の血管組織への浸透性が維持されるため、有効成分のより効率的な送達が可能になり、安全性の観点からもより好ましい。ゲル粒子の平均粒径の下限値は特に限定されないが、例えば３０ｎｍ以上、又は５０ｎｍ以上とすることができる。なお、ゲル粒子の平均粒径は、動的光散乱法により測定される粒径である。
【００１４】
以下、本実施形態のＧ／Ｏ型エマルションにおける各成分について詳細に説明する。
【００１５】
（ゲル化された水溶性高分子）
水溶性高分子とは、常温のイオン交換水に、少なくとも一部が溶解する高分子であり、より具体的には例えば、１００ｍＬのイオン交換水に対して、サンプル１ｇ以上が溶解する高分子をいう。水溶性高分子の具体例としては、水溶性コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ラミニン、キチン、キトサン、アルブミン、カゼイン、フィブロイン、フィブリン、ビトロネクチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸エステル、デキストラン、プルラン、寒天、アルギン酸、スターチ、イヌリン、フコイダン、キトサン、セルロース等の生体由来高分子；ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸系ポリマー、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリオキサゾリン、ポリグリシドールおよびこれらの共重合体等の合成高分子が挙げられる。これらの中で、生体由来高分子であると好ましく、コラーゲン又はゼラチンであるとより好ましい。水溶性高分子としては、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００１６】
なお、水溶性高分子は、例えば、水溶性高分子の水溶液を低温又は高温で保持することによってゲル化することができる。ゼラチン等の生体由来の水溶性高分子は、加熱溶液ではランダムコイル状の分子構造をとっているが、冷却するとゼラチン分子の一部がらせん構造をとりネットワークが形成され、ゲル化する。水溶性コラーゲン等の水溶性高分子は、生理的環境（中性近傍のｐＨ、３７℃）において自己会合が生じ、ゲル化する。ゲル化する温度は水溶性高分子の種類によって異なるが、体温付近の温度でゲル化が解消されるような水溶性高分子、又は温度によるゲル化が不可能な水溶性高分子は、化学架橋により水溶性高分子の分子間を架橋することでゲル化することも好ましい形態の一つである。
【００１７】
化学架橋の方法としては、例えば、架橋剤を用いる方法、及び、紫外線又は電子線を照射する方法が挙げられる。
【００１８】
架橋剤を用いる方法は、好ましくはアミノ基及び／又はカルボキシル基を有する水溶性高分子、より好ましくはアミノ基及びカルボキシル基を有する水溶性高分子、更に好ましくはアミノ酸由来の構造を有する生体由来の水溶性高分子に適用することができる。
【００１９】
架橋剤は、生体に対する毒性が生じないようにできるものであれば特に限定されない。架橋剤の具体例としては、グルタルアルデヒドやホルムアルデヒド等のアルデヒド；ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミドメト−ｐ−トルエンスルホナート等のカルボジイミド；クロム、アルミニウム、鉄等の多価イオン等が挙げられる。これらの中で、グルタルアルデヒド又は１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩が好ましい。
【００２０】
化学架橋は、水溶性高分子同士で行ってもよく、水溶性高分子と反応可能な、アミノ基、カルボキシル基等を有する別の化合物（例えば、ヘパリン）を導入し、それを用いて架橋してもよい。
【００２１】
水溶性高分子の含有量は、Ｇ／Ｏ型エマルション全量を基準として、例えば０．００１〜５０質量％であると好ましく、０．１〜２０質量％であるとより好ましい。
【００２２】
なお、ゲル化された水溶性高分子は、水溶性高分子に加えて水溶液由来の水を含む。水の含有量は、水溶性高分子及び水の全量を基準として、３０〜９９質量％であると好ましく、５０〜９８質量％であるとより好ましい。
【００２３】
（オイル）
オイルとしては、例えば、大豆油、綿実油、菜種油、ゴマ油、コーン油、落花生油、サフラワー油、サンフラワー油、オリーブ油、ナタネ油、シソ油、ウイキョウ油、カカオ油、ケイヒ油、ハッカ油、ベルガモット油等の植物油；牛脂、豚油、魚油等の動物油；エチルヘキシル酸トリグリセライド、Ｃ８、Ｃ１０脂肪酸混合トリグリセライドである中鎖トリグリセライド等の脂肪酸トリグリセライド；流動パラフィン、スクアレン、スクアラン、プリスタン等の不揮発性の炭化水素類；ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル、ミリスチン酸セチル、オレイン酸エチル、リノール酸エチル、リノール酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル等の低級アルコールと高級脂肪酸とのエステル化合物等が挙げられる。その中でも低級アルコールと高級脂肪酸とのエステル化合物が好ましく、ミリスチン酸イソプロピル又はパルミチン酸イソプロピルがより好ましい。オイルとしては、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００２４】
オイルの含有量は、Ｇ／Ｏ型エマルション全量を基準として、例えば５０〜９９．９質量％であると好ましく、７５〜９９．７質量％であるとより好ましい。
【００２５】
（界面活性剤）
界面活性剤には、アニオン性、カチオン性、両性、非イオン性の界面活性剤がある。それぞれの界面活性剤は分子中に親水基と疎水基を有し、親水基と疎水基のバランス（ＨＬＢ値）によって、親水性か疎水性かに分類される。具体的には、ＨＬＢ値が１０より大きいものが親水性、ＨＬＢ値が１０以下であるものが疎水性に分類される。これらの界面活性剤は特に制限なく利用することができるが、疎水性の界面活性剤であると好ましく、疎水性の非イオン性界面活性剤であるとより好ましい。界面活性剤は、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００２６】
疎水性の非イオン性界面活性剤としては、例えば、ショ糖ステアリン酸エステル、ショ糖パルミチン酸エステル、ショ糖オレイン酸エステル、ショ糖ラウリン酸エステル、ショ糖ベヘニン酸エステル、ショ糖エルカ酸エステル等のショ糖脂肪酸エステル類；ソルビタンモノステアレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタンモノオレート、ソルビタントリオレート、ソルビタンセスキオレート、ソルビタンモノイソステアレート、ソルビタンモノラウレート、ペンタ−２−エチルヘキシル酸ジグリセロールソルビタン、及びテトラ−２−エチルヘキシル酸ジグリセロールソルビタン等のソルビタン脂肪酸エステル類；グリセロールモノステアレート、グリセロールモノオレート、モノステアリン酸グリセリンリンゴ酸等のグリセリン脂肪酸エステル類；テトライソステアリン酸ジグリセリル、ジイソステアリン酸ジグリセリル、モノイソステアリン酸ジグリセリル、モノステアリン酸ポリグリセリル、モノイソステアリン酸ポリグリセリル、ジイソステアリン酸ポリグリセリル、モノラウリン酸ポリグリセリル、モノオレイン酸ポリグリセリル、モノミリスチン酸ポリグリセリル等のポリグリセリン脂肪酸エステル類等が挙げられる。
【００２７】
界面活性剤の含有量は、Ｇ／Ｏ型エマルション中のゲル粒子全量（ゲル中の水分および水溶性有効成分を含む）を基準として、例えば０．０５〜２０質量％であると好ましく、０．０５〜１５質量％であるとより好ましく、０．１〜１５質量％であると更に好ましい。
【００２８】
（水溶性有効成分）
水溶性有効成分とは、常温のイオン交換水に、少なくとも一部が溶解するものであり、より具体的には、体内において水溶性有効成分による効果を発揮できる程度に溶解するものであればよい。このような性質を有する物質であれば、化粧品、医薬品、医薬部外品、食品等の分野に制限されることはなく、用途に応じて適宜選択することができる。また、水溶性有効成分は、合成物質でもよいし、天然物質であってもよい。これらは、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。水溶性有効成分の具体例としては、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、腫瘍増殖因子（ＴＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ケラチン細胞増殖因子（ＫＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、Ｔ細胞増殖因子、リンホカイン、サイトカイン等の増殖因子等；インスリン等の水溶性ホルモン；ネトリン等の軸索ガイダンス分子；各種の低分子治療薬、タンパク質製剤、酵素薬物、ＤＮＡ等の高分子治療薬等の水溶性薬物；保湿成分、抗炎症剤、収斂成分、ビタミン類、ペプチド、アミノ酸、抗菌成分、角質柔軟成分、細胞賦活化成分、老化防止成分、血行促進作用成分、美白成分、発毛・育毛剤等が挙げられる。
【００２９】
なお、ゲル化された水溶性高分子中に例えば増殖因子が含まれる場合には、ヘパリンを共存させることが好ましい。ゲル化された水溶性高分子中にヘパリンを共存させると、水溶性高分子中の増殖因子がヘパリン−増殖因子複合体を形成して増殖因子が固定化される。これにより、水溶性高分子中の増殖因子がより安定化され、機能をより効果的に発現することができる。さらに、水溶性高分子は、アミノ基を有する水溶性高分子であると好ましい。ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）等のカルボジイミド等の縮合剤の存在下で、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム（Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）等によりヘパリン中のカルボキシル基を活性化させ、これを水溶性高分子中のアミノ基と縮合させることにより、ヘパリンを水溶性高分子に固定化することができる。これにより、増殖因子を水溶性高分子中により安定化できる。
【００３０】
水溶性有効成分の含有量は、経皮吸収剤として有効な効果を与える濃度であることが好ましい。水溶性有効成分の含有量は、Ｇ／Ｏ型エマルション全量を基準として、例えば５０質量％以下であると好ましく、１０質量％以下であるとより好ましい。なお、水溶性有効成分の含有量の下限は特に限定されないが、例えば、１質量ｐｐｍ以上とすることができる。
【００３１】
（Ｇ／Ｏ型エマルションの製造方法）
Ｇ／Ｏ型エマルションの製造方法は特に限定されないが、例えば、以下に示す方法により調製することができる。
【００３２】
まず、オイル及び界面活性剤を含む第１液に、水溶性高分子の水溶液を含む第２液を加えて、混合液を得る。この混合液をオイル中で分散させ、更にこの液を例えば冷却することでゾル−ゲル変化等によりゲル化させて、オイル中にゲル化された水溶性高分子を含むエマルション粒子が分散されたＧ／Ｏ型エマルションが得られる。また、水溶性高分子をオイル中に分散させる際に化学架橋によってゲル化させることも、好ましい形態の一つである。分散させる方法としては、例えば、断続振とう法、プロペラ型撹拌機あるいはタービン型撹拌機やディスパー等のミキサーによる方法、コロイドミル法、ホモジナイザー法、超音波照射法等が挙げられる。また、必要に応じて、デカンテーション、遠心分離、又は濾過等を適用してエマルション粒子とオイルを分離し、エマルション粒子を別途準備したオイルに再分散させたＧ／Ｏ型エマルションとすることもできる。より好ましい分離方法は遠心分離による分離である。このような処理を行うと、原料に含まれるオイルに溶解した不純物を除去することができる。なお、第１液に含まれるオイルと再分散に用いられるオイルは、同一種であっても異なる種類のものであってもよい。
【００３３】
第２液に水溶性有効成分を加えることにより、ゲル化された水溶性高分子中に水溶性有効成分を含有させることもできる。
【００３４】
さらに上述のＧ／Ｏ型エマルションを、２次乳化に用いる界面活性剤および水に混合し、外水相成分により分散、乳化することによって、内水相に有効成分を保持したＧ／Ｏ／Ｗ型多相エマルションを調製することもできる。Ｇ／Ｏ／Ｗ型多相エマルションにすることにより、水溶性有効成分を内包したＧ／Ｏ型エマルションを水中に分散させることができ、油分によるべたつき等を低減し、使用感を向上させることができる。
【００３５】
（経皮吸収剤）
本実施形態の経皮吸収剤は、上述のＧ／Ｏ型エマルションを含有する。かかる経皮吸収剤は、Ｇ／Ｏ型エマルションを上述のＧ／Ｏ／Ｗ型多相エマルションとして含有していてもよい。かかる経皮吸収剤は、Ｇ／Ｏ型エマルションを含有するので、徐放性に優れる。経皮吸収剤の剤形は、Ｇ／Ｏ型エマルションとしての形状を維持できるものであればよく、例えば、液剤（ローション剤、スプレー剤を含む）、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、乳液剤、スティック剤等の各種の外用の製剤形態を挙げることができる。さらに本実施態様のＧ／Ｏ型エマルションの分散液を粘着剤や熱可塑性エラストマーに添加して塗工液を調製し、支持体及び／又は剥離ライナーに塗布することによって貼付剤として用いることも好ましい形態の一つである。
【００３６】
経皮吸収剤として用いる場合には必要に応じて、経皮吸収促進剤、抗酸化剤、着香剤、着色剤等を添加して用いることができる。また、貼付剤として用いる場合には、さらに、粘着付与剤、賦形剤等を添加して用いることができる。貼付剤において、Ｇ／Ｏ型エマルションと粘着付与剤の合計量に対するＧ／Ｏ型エマルションの含有量は、好ましくは１０質量％以上であり、より好ましくは２５質量％以上であり、更に好ましくは４０質量％以上である。
【００３７】
貼付剤は、例えば、下記の工程（１）〜（３）を有する方法により製造することができる。
（１）Ｇ／Ｏ型エマルションを調製する工程；
（２）Ｇ／Ｏ型エマルションを濃縮や上澄み除去等により、Ｇ／Ｏ型エマルション濃度を上昇させる工程；
（３）Ｇ／Ｏ型エマルションに貼付性付与剤、添加剤を添加して塗工液を調製し、塗工液を支持体又は剥離ライナーに塗布する工程。
【００３８】
本実施形態の経皮吸収剤の使用量は、疾患の種類や症状の程度、患部の大きさによって異なり一概に規定できない。通常１日、一回乃至は数回、適量を患部に塗布することによって用いられる。
【実施例】
【００３９】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。【００４０】
（調製例１）
［ＥＧＦＰ（高感度緑色蛍光タンパク質）の調製］
ＥＧＦＰ導入大腸菌（ＢＬ２１）を培養し、イソプロピル−β−ガラクトピラノシド（シグマアルドリッチ社製）を添加し、４時間誘導して発現させた。大腸菌を回収して、ｐＨ８．０に調整したｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ（Ｓｉｇｍａ社製）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ（和光純薬社製）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（和光純薬社製）及び１ｍＭ  Ｄｉｔｈｉｏｔｈｅｉｔｏｌ（Ｓｉｇｍａ社製）の混合物）に置換し、超音波破砕を行い、上清を以下の実験で用いた。【００４１】
（実施例１）
［ＥＧＦＰ含有Ｇ／Ｏ型エマルションの調製］
調製例１で調製したＥＧＦＰ７００μｌと１０％ゼラチン溶液３００μｌ（Ｇｅｌａｔｉｎ  ｆｒｏｍ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｓｋｉｎ，  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を混合した液をＡ液、疎水性界面活性剤ＥＲ−２９０（三菱ケミカルフーズ株式会社製（商品名）；ショ糖エルカ酸エステル）１２５ｍｇをミリスチン酸イソプロピル（ＩＰＭ  和光純薬社製）２．５ｍｌに溶解させた液をＢ液とした。Ａ液１ｍｌとＢ液２．５ｍｌを混合し、超音波ホモジナイザーを用いて１０分間処理した。得られた混合液を４℃下で３０分間冷却してエマルションを得た。得られたエマルションを５０００ｒｐｍで１分間遠心分離した後、上澄み液を吸引除去した。５００μｌのＩＰＭを加えて再分散させて、ＥＧＦＰ含有Ｇ／Ｏ型エマルションを調製した。【００４２】
［マウス皮膚を用いた皮膚透過性評価］
図１に示す装置を用いて、皮膚透過性評価を行った。図１に示す装置は、マウス皮膚９を保持するための保持部１ａ及び１ｂと、保持部１ａ側に設けられたサンプル添加口３と、保持部１ｂ側に設けられた支持部５と、保持部１ａ及び１ｂをつなぐ連結部７とを有する拡散セル１０を備える。この拡散セル１０を、６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅの１ウェル２０の底部に、支持部５が接するように設置し、リン酸緩衝生理食塩水１１をマウス皮膚９の下面に接する程度まで１ウェル２０中に加え、評価に用いた。以下、具体的な操作方法について説明する。
マウスの背中の毛を剃刀で軽く剃った後、除毛剤を用いて残りの毛をきれいに除去し、超純水で皮膚を洗浄した。マウスの皮膚を全層摘出し、ハサミで２ｃｍ角程度に切った。図１に示す拡散セルの保持部に皮膚を挟んだ。拡散セルを６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）の１ウェルに入れ、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を皮膚下面が接する程度まで加えた。サンプル添加口に上記ＥＧＦＰ含有Ｇ／Ｏ型エマルションを２００μｌ添加した。インキュベーターに入れて３７℃で１日間静置することで透過試験を行った。皮膚を回収し、プロワイプで軽く表面を拭き取った。皮膚を小さくカットし、ＯＣＴコンパウンド（サクラファインテックジャパン株式会社製）に包埋した後、−８０℃下で凍結し、ミクロトームで２０μｍの組織片を作製した。スライドガラスに組織片を吸着させ、位相差観察と蛍光観察を行った。その結果を図２に示す。【００４３】
（比較例１）
サンプル添加口に調製例１で調製したＥＧＦＰを添加した以外は実施例１と同様に透過試験を行い、試験後の皮膚の位相差観察と蛍光観察を行った。その結果を図２に示す。【００４４】
図２から明らかであるように、ＥＧＦＰを単独で用いた場合（比較例１）と比較してＥＧＦＰ含有Ｇ／Ｏ型エマルションを用いた場合（実施例１）は皮膚の深部までＥＧＦＰが浸透していることが確認された。【００４５】
（合成例１）
［Ｌ９２９細胞包埋コラーゲンゲルの作製］
ブタ皮膚製コラーゲン（日本ハム株式会社製）に超純水を加え、４℃下で一晩撹拌することにより１％コラーゲン溶液を調製した。Ｌ９２９細胞懸濁液（培養したＬ９２９細胞を回収し、培地に懸濁させたもの）（６×１０５ｃｅｌｌｓ）を１０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上澄み液を吸引除去した。２倍濃度で調製したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（サーモフィッシャー社製）に２０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ  ｂｉｏ  ｓｅｒａ社製）を添加し、２倍濃縮ＤＭＥＭ培地を調製した。Ｌ９２９細胞を、１％コラーゲン溶液と２倍濃縮ＤＭＥＭ培地を１：１で混合した溶液で懸濁した。この懸濁液を１２−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１ｍｌ／ｗｅｌｌずつ添加し、インキュベーター内で１時間静置することでゲル化させた。【００４６】
（実施例２）
［ｂＦＧＦ含有Ｇ／Ｏ型エマルションの調製］
５０ｍＭ  ＭＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（和光純薬社製）に、ヘパリン（和光純薬社製）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ、株式会社ペプチド研究所社製）及びＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ、和光純薬社製）を質量比でそれぞれ１０：１０：６となるように添加し、ヘパリン濃度が１０ｍｇ／ｍｌのヘパリン／ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液を調製した後、３０分間室温で静置した。５％ゼラチン溶液９９０μｌとヘパリン／ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液１０μｌを混合した。さらに、１０μｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）２５μｌを加えた液をＣ液とした。疎水性界面活性剤ＥＲ−２９０（三菱ケミカルフーズ株式会社製（商品名）；ショ糖エルカ酸エステル）５０ｍｇをＩＰＭ２．０ｍｌに溶解させた液をＤ液とした。Ｃ液１ｍｌとＤ液２ｍｌを混合した後、超音波ホモジナイザーを用いて３分間処理した。次に４℃下で３０分間冷却してエマルションを得た。得られたエマルションを５０００ｒｐｍで１分間遠心分離した後、上澄み液を吸引除去した。５００μｌのＩＰＭを加えて再分散させて、ｂＦＧＦ含有Ｇ／Ｏ型エマルションを調製した。【００４７】
［培養真皮モデルを用いた力価評価］
合成例１で作製したＬ９２９細胞包埋コラーゲンゲル（培養真皮モデル）の上にポリカーボネート製のリング（外径：１．４ｃｍ，内径：１．２ｃｍ，高さ：０．３ｃｍ）を置いた。リング内に上記ｂＦＧＦ含有Ｇ／Ｏ型エマルションを２００μｌ添加した。リングの外側にＤＭＥＭ培地を２００μｌ添加してインキュベーター内に入れた。毎日培地交換し、１日後、３日後、５日後のＬ９２９細胞包埋コラーゲンゲルにおけるＤＮＡ量を定量した。ＤＮＡの定量は以下のとおり行った。【００４８】
Ｌ９２９細胞包埋コラーゲンゲルに０．２５％コラゲナーゼ溶液（和光純薬社製）１ｍｌを加えた液をＥ液とした。３７℃下で１時間程度振盪することでゲルを溶解させた液をＦ液とした。それぞれのサンプルを１０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上澄み液を吸引除去した。上述のＰＢＳにＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ｓｉｇｍａ社製）を添加して０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００添加ＰＢＳを調製し、１ｍｌでサンプルを懸濁した。−８０℃下で凍結した後、室温で解凍した。この操作を３回繰り返した。９６−ｗｅｌｌ  ｂｌａｃｋ  ｐｌａｔｅにヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ（登録商標）、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）１８０μｌとサンプル２０μｌを混合して添加した。Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ＤＮＡ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｃａｔ．＃１７０−２４８０（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を使用して、励起フィルター３５５ｎｍ，吸収フィルター４６０ｎｍの条件で、蛍光輝度測定によりＤＮＡの定量を行った。蛍光測定輝度は３回測定し、その平均をＤＮＡ量とした。ＤＮＡの定量は試験開始前（０日）及び１日後、３日後、５日後、７日後に測定を行った。その結果を表１に示す。【００４９】
（比較例２）
５％ゼラチン溶液に代えて水を用いた以外は実施例２と同様にｂＦＧＦ含有Ｗ／Ｏ型エマルションを調製した。得られたｂＦＧＦ含有Ｗ／Ｏ型エマルションを用いた以外は実施例２と同様に培養真皮モデルを用いてＤＮＡ量の定量を行った。その結果を表１に示す。【００５０】
（比較例３）
ｂＦＧＦをそのまま用いた以外は実施例２と同様に培養真皮モデルを用いてＤＮＡ量の定量を行った。その結果を表１に示す。【００５１】
（比較例４）
１０μｇ／ｍｌのｂＦＧＦをＤＭＥＭで１０００倍希釈して、１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ添加培地を調製した。得られたｂＦＧＦ添加培地を２００μｌ用いた以外は実施例２と同様に培養真皮モデルを用いてＤＮＡ量の定量を行った。その結果を表１に示す。【００５２】
表１から明らかであるように、ｂＦＧＦ含有Ｗ／Ｏ型エマルションを用いた場合（比較例２）は、３日後のＤＮＡ量は多いが、５日後以降にはＤＮＡの増加量は減少している。これは培養初期にはＷ／Ｏ型エマルションから一度に大量のｂＦＧＦが放出されて培地中での濃度が高くなり増殖が促進されるが、ｂＦＧＦの安定性がきわめて悪く時間の経過とともにｂＦＧＦが枯渇し、５日後以降には細胞の増加量の減少につながったと考えられる。生体内で一度に大量の有効成分が放出されると、体内の水分や血液によって有効成分が速やかに拡散され、効果を発揮させたい場所の有効性濃度が実質的に低下し、効果が持続しないという状況が生じる。一方でｂＦＧＦ含有Ｇ／Ｏ型エマルションを用いた場合（実施例２）は、３日後のＤＮＡ量は比較例２、３及び４と比較して少ないが、７日後には比較例２、３及び４のいずれよりもＤＮＡ量が多くなった。これにより、ｂＦＧＦ含有Ｇ／Ｏ型エマルションがｂＦＧＦの徐放性に優れること、及びｂＦＧＦが安定化されていることが分かる。よって体内においても有効成分が安定化されかつ徐放され、有効成分濃度が一定化し、効果が持続することが期待される。
【表１】
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【００５３】
（実施例３）
シクロヘキサン２ｍｌに疎水性界面活性剤ＥＲ−２９０を１５０ｍｇ加え、さらに５％ゼラチンゾル１ｍｌを混合して、超音波ホモジナイザーにて１０分間処理した。処理後、４℃で３日間冷却してエマルションを得た。得られたエマルションを５０００ｒｐｍで１分間遠心分離した後、上澄み液を吸引除去した。得られた粒子が１ｍｇ／ｍｌの濃度となるようにＩＰＭを加えて再分散させて、Ｇ／Ｏ型エマルションを調製した。得られたＧ／Ｏ型エマルションについて、動的光散乱法（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ−ＺＳ、Ｍａｒｖｅｒｎ  Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｌｔｄ．社製）によりゲル粒子の平均粒径を測定した。ＩＰＭ（屈折率１．４３４）を用いてＧ／Ｏ型エマルションを分散させ、ガラスセルに導入し、温度２０℃にて５回測定し、ピーク値の平均を平均粒子径とした。その結果を表２に示す。【００５４】
（実施例４）
界面活性剤としてＬ−１９５（三菱ケミカルフーズ社製）を用いた以外は、実施例３と同様にしてＧ／Ｏ型エマルションを調製した。得られたＧ／Ｏ型エマルションについて、ゲル粒子の平均粒径を測定した結果を表２に示す。【００５５】
（実施例５）
界面活性剤としてＯ−１７０（三菱ケミカルフーズ社製）を用いた以外は、実施例３と同様にＧ／Ｏ型エマルションを調製した。得られたＧ／Ｏ型エマルションについて、ゲル粒子の平均粒径を測定した結果を表２に示す。【００５６】
【表２】
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【００５７】
表２から明らかであるように、いずれのＧ／Ｏ型エマルションにおいても、ゲル粒子の平均粒径は６００ｎｍ以下であった。【００５８】
（実施例６）
[ｂＦＧＦ含有Ｇ／Ｏ型エマルションの調製−２]
５０ｍＭ  ＭＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（和光純薬社製）にヘパリン（和光純薬社製）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ、株式会社ペプチド研究所社製）及びＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ、和光純薬社製）を質量比でそれぞれ１０：１０：６となるように添加し、ヘパリン濃度が１０ｍｇ／ｍｌのヘパリン／ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液を調製した後、３０分間室温で静置した。５％ゼラチン溶液４９５μｌとヘパリン／ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液５μｌを混合し、さらに、１０μｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ溶液（塩基性線維芽細胞増殖因子；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）２５μｌを加えた液をＣ−２液とした。疎水性界面活性剤ＥＲ−２９０（三菱ケミカルフーズ株式会社製（商品名）；ショ糖エルカ酸エステル）２５ｍｇをＩＰＭ１．０ｍｌに溶解させた液をＤ−２液とした。Ｃ−２液５００μｌとＤ−２液１ｍｌとを混合した後、超音波ホモジナイザーを用いて３分間処理した。次に４℃下で３０分間冷却してエマルションを得た。得られたエマルションを５０００ｒｐｍで２分間遠心分離した後、上澄み液を吸引除去することで、ヘパリン濃度５０μｇ／ｍｌ、ｂＦＧＦ濃度２５０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ含有Ｇ／Ｏ型エマルションを得た。【００５９】
［マウスを用いた血管新生誘導効果の評価］
イソフルランでヘアレスマウスに麻酔をかけた後、７０％エタノールで背中を滅菌し、引き続き、滅菌済み生理食塩水で滅菌部を洗浄した。次に、滅菌したヘアレスマウスの背中に［ｂＦＧＦ含有Ｇ／Ｏ型エマルションの調製−２］で調製したＧ／Ｏ型エマルション約１ｍｌを塗布し、上からＩＰＭ２５０μｌで湿らせた１．５×３．０ｃｍの滅菌済みガーゼを被せ、サージカルバンテージテープで貼り付けた。２日間、養生した後にガーゼを外し、滅菌済み生理食塩水でヘアレスマウスの背中を洗浄した。塗布、２日間養生の操作を更に３回繰り返した後、マウスの被験部の皮膚を摘出して試料とし、以下に示すＨ・Ｅ染色観察と、ヘモグロビン指標の測定を行った。【００６０】
［Ｈ・Ｅ（ヘマトキシリン・エオジン）染色観察］
皮膚摘出試料を常法に従ってＨ・Ｅ液により染色し、光学顕微鏡により倍率１０倍で観察した。その結果を図３に示す。【００６１】
［ヘモグロビン指標の測定］
被験マウスの背中皮膚を摘出し、摘出した皮膚を大量の生理食塩水で洗浄し、皮膚表面に付着した血液を洗い落とした。次に、洗浄した皮膚をハサミで細断し、１．５ｍｌのサンプルチューブに皮膚を移し、超純水１ｍｌを添加し、４℃で１日間静置した。４０μｍのフィルターでろ過し、ろ液の吸光度を測定した。皮膚組織に含まれる血管中のヘモグロビンの吸光度は、波長４１５ｎｍ付近にピークを有するため、３６０ｎｍから４７０ｎｍの吸光度のベースラインを直線で近似し、波長４１５ｎｍにおける吸光度のベースラインからの増分を、試料中のヘモグロビンの吸光度とした（図４参照）。そのようにして求めた皮膚試料中ヘモグロビンの吸光度を皮膚試料重量あたりに換算し、ヘモグロビン指標とした。その結果を表３に示す。ヘモグロビン指標が大きいほど、血管新生が誘導されたと考えられる。【００６２】
（比較例５）
Ｇ／Ｏエマルションを塗布しなかったこと以外は実施例６と同じ操作を行い、Ｈ・Ｅ染色観察と、ヘモグロビン指標の測定を行った。その結果を、図３、図４及び表３に示す。【００６３】
【表３】
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【００６４】
表３から明らかであるように、実施例６では、比較例５に対してヘモグロビン指標が高くなっており、ｂＦＧＦ含有Ｇ／Ｏエマルションを塗布することにより、血管新生が誘導されたことが示される。
【符号の説明】
【００６５】
１ａ，１ｂ…保持部、３…サンプル添加口、５…支持部、７…連結部、９…マウス皮膚、１０…拡散セル、１１…リン酸緩衝生理食塩水、２０…ウェル。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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