(57)【要約】  均一な大きさのスフェロイドを高効率に作製し、顕微鏡観察、特には蛍光顕微鏡観察を簡便に実施できる細胞培養容器の提供。  開口部を形成する側壁と、透光性のガラス材料からなり、前記開口部の下端を塞ぐとともに、上面が前記開口部から臨む領域に複数の凹部を有する形状である底部と、前記凹部の内面に形成された細胞接着を抑制する表層と、を有する細胞培養容器。
2019151114.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
開口部を形成する側壁と、
透光性のガラス材料からなり、前記開口部の下端を塞ぐとともに、上面が前記開口部から臨む領域に複数の凹部を有する形状である底部と、
前記凹部の内面に形成された細胞接着を抑制する表層と、
を有する細胞培養容器。
【請求項２】
前記底部上面の前記開口部から臨む領域の平面視における全面積に対して、前記凹部の占める平面視における合計面積の割合が４０％以上である、請求項１に記載の細胞培養容器。
【請求項３】
前記開口部と、前記開口部から臨む前記底部上面の領域に、前記表層が形成された複数の凹部を有する構成を、複数備えた、請求項１または２に記載の細胞培養容器。
【請求項４】
顕微Ｒａｍａｎ分光により１００倍の対物レンズを用いて測定される、前記ガラス材料を５３２ｎｍの光で励起した際の５８４ｎｍでの蛍光強度の値を、石英ガラスを５３２ｎｍの光で励起した際の５８４ｎｍでの蛍光強度の値で除した値が、１０以下である、請求項１〜３のいずれかに記載の細胞培養容器。
【請求項５】
前記表層は前記底部との間で共有結合を有する、請求項１〜４のいずれかに記載の細胞培養容器。
【請求項６】
前記表層は４０℃の水に７日間浸漬した場合に、前記表層の単位面積１ｃｍ２当たりの水に対する全有機炭素（ＴＯＣ）の溶出量が１０ｍｇ／Ｌ以下である、請求項１〜５のいずれかに記載の細胞培養容器。
【請求項７】
前記表層と前記底部の間に酸化ケイ素層を有する、請求項１〜６のいずれかに記載の細胞培養容器。
【請求項８】
前記表層が生体親和性基を有する、請求項１〜７のいずれかに記載の細胞培養容器。
【請求項９】
前記生体親和性基は、下式１で表される基、下式２で表される基および下式３で表される基からなる群から選ばれる少なくとも１種を含む、請求項８に記載の細胞培養容器。
【化１】
2019151114.tif 000016
ただし、式１中、ｎは１〜３００の整数であり、式１で表される基のうち５０〜１００モル％は、下式４で表される基中の式１で表される基である。式４におけるｎは１〜３００の整数であり、Ｒ６は水素原子または炭素数１〜５のアルキル基である。
式２中、Ｒ１〜Ｒ３はそれぞれ独立に炭素数１〜５のアルキル基であり、ａは１〜５の整数である。
式３中、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ独立に炭素数１〜５のアルキル基であり、Ｘ−は下式３−１で表される基または下式３−２で表される基であり、ｂは１〜５の整数である。
【化２】
2019151114.tif 000017
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の細胞培養容器を用いる、創薬スクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養容器に関し、特には、均一な大きさのスフェロイドを高効率に作製し、顕微鏡観察を簡便に実施できる細胞培養容器に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内の細胞周囲環境や形態を模倣してより生体内に近い機能をもつ細胞を取得する新たな培養方法が開発されている。特にスフェロイド（細胞凝集塊）培養技術は細胞の相互作用を維持できる優れた方法であり、心筋細胞、がん細胞スフェロイドを作製し、薬効や毒性を調査する創薬スクリーニング用途への応用が期待されている。近年、このようにスフェロイドを形成させる技術に加えて、スフェロイドの大きさをコントロールする技術が注目されるようになってきた。【０００３】
例えば、特許文献１には、細胞を収容し、該細胞の培養と観察が可能な凹部が複数設けられた細胞培養容器において、凹部の大きさおよび形状を規定することで、スフェロイドの大きさをコントロールしながら大量に作製する技術が記載されている。特許文献１では、凹部の大きさおよび形状を規定するために樹脂製の細胞培養容器を用いているが、創薬スクリーニング用途において、樹脂製の細胞培養容器を用いた場合、容器材質による蛍光発光が高く、高精度な観察が困難であった。高解像度での観察が可能、もしくは、細胞内蛍光を即時的にかつ高精度に観察できるスフェロイド作製の可能な低蛍光性の細胞培養容器が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１４／１９６２０４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記観点からなされたものであって、均一な大きさのスフェロイドを高効率に作製し、顕微鏡観察、特には蛍光顕微鏡観察を簡便に実施できる細胞培養容器の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、以下の構成を要旨とする。
［１］開口部を形成する側壁と、透光性のガラス材料からなり、前記開口部の下端を塞ぐとともに、上面が前記開口部から臨む領域に複数の凹部を有する形状である底部と、前記凹部の内面に形成された細胞接着を抑制する表層と、を有する細胞培養容器。
［２］前記底部上面の前記開口部から臨む領域の平面視における全面積に対して、前記凹部の占める平面視における合計面積の割合が４０％以上である［１］の細胞培養容器。
［３］前記開口部と、前記開口部から臨む前記底部上面の領域に、前記表層が形成された複数の凹部を有する構成を、複数備えた［１］または［２］の細胞培養容器。
［４］顕微Ｒａｍａｎ分光により１００倍の対物レンズを用いて測定される、前記ガラス材料を５３２ｎｍの光で励起した際の５８４ｎｍでの蛍光強度の値を、石英ガラスを５３２ｎｍの光で励起した際の５８４ｎｍでの蛍光強度の値で除した値が、１０以下である［１］〜［３］のいずれかの細胞培養容器。
［５］前記表層は前記底部との間で共有結合を有する［１］〜［４］のいずれかの細胞培養容器。
［６］前記表層は４０℃の水に７日間浸漬した場合に、前記表層の単位面積１ｃｍ２当たりの水に対する全有機炭素（ＴＯＣ）の溶出量が１０ｍｇ／Ｌ以下である［１］〜［５］のいずれかの細胞培養容器。
［７］前記表層と前記底部の間に酸化ケイ素層を有する［１］〜［６］のいずれかの細胞培養容器。
［８］前記表層が生体親和性基を有する［１］〜［７］のいずれかの細胞培養容器。
［９］前記生体親和性基は、下式１で表される基、下式２で表される基および下式３で表される基からなる群から選ばれる少なくとも１種を含む［８］の細胞培養容器。
［１０］［１］〜［９］のいずれかの細胞培養容器を用いる、創薬スクリーニング方法。  【０００７】
【化１】
2019151114.tif 000003
【０００８】
ただし、式１中、ｎは１〜３００の整数であり、式１で表される基のうち５０〜１００モル％は、下式４で表される基中の式１で表される基である。式４におけるｎは１〜３００の整数であり、Ｒ６は水素原子または炭素数１〜５のアルキル基である。
式２中、Ｒ１〜Ｒ３はそれぞれ独立に炭素数１〜５のアルキル基であり、ａは１〜５の整数である。
式３中、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ独立に炭素数１〜５のアルキル基であり、Ｘ−は下式３−１で表される基または下式３−２で表される基であり、ｂは１〜５の整数である。【０００９】
【化２】
2019151114.tif 000004
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、均一な大きさのスフェロイドを高効率に作製し、顕微鏡観察、特には蛍光顕微鏡観察を簡便に実施できる細胞培養容器が提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の実施形態の細胞培養容器の一例における平面図である。
【図２】図１に示す細胞培養容器のＸ−Ｘ線における断面模式図である。
【図３Ａ】図１に示す細胞培養容器の底部の平面図である。
【図３Ｂ】図３Ａに示す底部のＸ−Ｘ線における断面模式図である。
【図４】本発明の実施形態の細胞培養容器の他の一例を示す平面図である。
【図５】実施例の細胞培養容器で得られたスフェロイドの直径の分布を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下に、本発明の実施形態を図面を参照しながら説明する。本発明は下記説明に限定して解釈されるものではない。なお、本発明の趣旨に合致する限り、他の実施形態も本発明の範疇に属し得る。また、以下の実施形態、および変形例を任意に組み合わせた態様も好適な例である。
【００１３】
本明細書において、式で表される化合物または基は、その式の番号を付した化合物または基としても表記し、例えば、式１で表される化合物は、化合物１とも表記する。
本明細書において、数値範囲を表す「〜」では、上下限を含む。
「（メタ）アクリレート」は、アクリレートとメタクリレートの総称である。
共重合体における「単位」とは、単量体が重合することによって形成される該単量体に由来する部分を意味する。
「生体親和性基」とは、細胞が材料表面に接着して動かなくなることを抑制する性質を有する基を意味する。
【００１４】
「細胞」とは、生体を構成する最も基本的な単位であり、細胞膜の内部に細胞質と各種の細胞小器官をもつものを意味する。ＤＮＡを内包する核は、細胞内部に含まれても含まれなくてもよい。
【００１５】
動物由来の細胞には、生殖細胞（精子、卵子等）、生体を構成する体細胞、幹細胞、前駆細胞、生体から分離された癌細胞、生体から分離され不死化能を獲得して体外で安定して維持される細胞（細胞株）、生体から分離され人為的に遺伝子改変された細胞、生体から分離され人為的に核が交換された細胞等が含まれる。
【００１６】
生体を構成する体細胞には、線維芽細胞、骨髄細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、好中球、赤血球、血小板、マクロファージ、単球、骨細胞、骨髄細胞、周皮細胞、樹枝状細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、間葉細胞、上皮細胞、表皮細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、肝実質細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神経系細胞、グリア細胞、ニューロン、オリゴデンドロサイト、マイクログリア、星状膠細胞、心臓細胞、食道細胞、筋肉細胞（例えば、平滑筋細胞、骨格筋細胞）、膵臓ベータ細胞、メラニン細胞、造血前駆細胞、単核細胞等が含まれる。
【００１７】
体細胞には、皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巣、膵臓、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、膀胱、前立腺、精巣、胸腺、筋肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、血液、心臓、眼、脳、神経組織等の任意の組織から採取される細胞等が含まれる。
【００１８】
幹細胞とは、自分自身を複製する能力と他の複数系統の細胞に分化する能力を兼ね備えた細胞であり、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞、胚性生殖幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、癌幹細胞、毛包幹細胞等が含まれる。
【００１９】
前駆細胞とは、前記幹細胞から特定の体細胞または生殖細胞に分化する途中の段階にある細胞である。
【００２０】
癌細胞とは、体細胞から派生して無限の増殖能を獲得した細胞である。
細胞株とは、生体外での人為的な操作により無限の増殖能を獲得した細胞であり、ＨＣＴ１１６、Ｈｕｈ７、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞）、ＨｅＬａ（ヒト子宮頸癌細胞株）、ＨｅｐＧ２（ヒト肝癌細胞株）、ＵＴ７／ＴＰＯ（ヒト白血病細胞株）、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞株）、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、ＢＨＫ、Ｃ−３３Ａ、ＨＴ−２９、ＡＥ−１、３Ｄ９、Ｎｓ０／１、Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、Ｓ２、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ、Ｖｅｒｏ等が含まれる。
【００２１】
図１は本発明の実施形態の細胞培養容器の一例を概略的に示す平面図であり、図２は、図１に示す細胞培養容器の断面模式図である。図３Ａは底部の平面図を示し、図３Ｂは図３Ａにおける底部のＸ−Ｘ線における断面模式図を示す。本発明の細胞培養容器は、具体的には、被培養物である細胞を培養しつつ培養の過程で細胞を三次元的に凝集させて所望の大きさのスフェロイドを得る、スフェロイドの作製に用いられる。
【００２２】
図１および図２に示す細胞培養容器１０は、開口部１を形成する側壁２と、開口部１の下端を塞ぐ、透光性のガラス材料からなる底部３を有する。図３Ａ、図３Ｂに示すとおり底部３は、底部３の上面３ａが、開口部１から臨む領域Ｓに、複数の凹部４を有する形状である。細胞培養容器１０において、底部３の上面３ａは、開口部１から臨む領域Ｓにおいて、凹部４の内面を含む、全面が細胞接着を抑制する表層５で覆われた構成である。
【００２３】
底部３において、上面３ａの凹部４を除く領域および上面３ａに対向する下面３ｂの全体は平坦である。底部３において下面３ｂと上面３ａの凹部４を除く領域は互いに平行の関係にあり、底部３は全体が略平板状の形状を呈する。以下、上面３ａの領域Ｓにおいて、凹部４を除く領域を、平坦領域Ｓｆという。なお、底部３は、必要に応じて、下面３ｂと平坦領域Ｓｆとが同じ曲率を有する板状体であってもよい。ただし、細胞培養後、細胞培養容器１０をそのまま、蛍光顕微鏡観察等の顕微鏡観察に用いる場合には、底部３は全体が略平板状であるのが好ましい。
【００２４】
表層５の厚さは基本的に底部３の厚さに比べて極めて小さく、領域Ｓにおいて底部３の上面３ａ上に形成された表層５の表面形状は、底部３の上面３ａの表面形状に追従する。したがって、底部３の上面３ａの形状は、表層５の表面形状にそのまま置き換えることができる。細胞培養容器１０においては、凹部４の内面に形成された表層５の凹状の表面と、底部３の上面３ａの平坦領域Ｓｆ上に形成された表層５の表面を凹部４上に延長した面で囲まれたマクロ空間Ｍで主として細胞が培養される。マクロ空間Ｍは、底部３が有する凹部４が内側に有する空間（凹部４の内面と凹部開口面４ａで囲まれる空間）と同じ形状、大きさとして扱うことができる。したがって、図１および図２においては、マクロ空間に対して、マクロ空間自体を示す符号Ｍに凹部を示す符号４を合わせて、Ｍ（４）を付した。ここで、凹部開口面４ａとは、凹部４の上端を構成する開口面である。
【００２５】
底部３の厚さは、上面３ａの平坦領域Ｓｆと下面３ｂとの距離であり、顕微鏡観察しやすくかつ十分な強度を持つという点で、０．３ｍｍ以上１．７５ｍｍ以下が好ましい。底部３の厚さは、０．３５ｍｍ以上がより好ましく、０．４５ｍｍ以上がさらに好ましい。底部３の厚さは、１．７０ｍｍ以下がより好ましく、１．５０ｍｍ以下がさらに好ましい。顕微鏡観察のしやすさ及び細胞培養容器強度の観点から、底部３の厚さは、０．３５ｍｍ以上１．７０ｍｍ以下がより好ましく、０．４０ｍｍ以上１．５０ｍｍ以下がさらに好ましい。
【００２６】
凹部４の形状および大きさは培養する細胞の種類、目標とするスフェロイドの大きさ、培養条件等により適宜調整される。所望の大きさのスフェロイドを効率よく作製する観点から、凹部４の形状は、半球状、凹部４の最深部４ｂから凹部開口面４ａに向かって拡開する円錐状、円錐台状が好ましく、半球状が特に好ましい。なお、半球状とは、球の略半分が欠けた形状をいい、球の半分の形状に限定されない。さらに、図３Ａに示すように平面視で凹部を見た場合の凹部４の形状は円形状であるが、これに限定されず、例えば、楕円形状であってもよい。
【００２７】
図３Ａおよび図３Ｂに示す底部３における凹部４は、半球状に形成されている。凹部４の形状が半球状の場合を例に、凹部４の大きさを説明する。凹部４において、最深部４ｂとは平坦領域Ｓｆから最も深い位置をいう。また、底部３の厚さ方向において、凹部開口面４ａと平坦領域Ｓｆとは同じ位置にある。
【００２８】
凹部開口面４ａの直径Ｄｈは、播種した細胞の分散性の点から１０μｍ以上１０００μｍ以下が好ましい。凹部開口面４ａの直径Ｄｈは、１００μｍ以上がより好ましく、１５０μｍ以上がさらに好ましい。凹部開口面４ａの直径Ｄｈは、８００μｍ以下がより好ましく、７００μｍ以下がさらに好ましい。細胞分散性の観点から、直径Ｄｈは、１００μｍ以上８００μｍ以下がより好ましく、１５０μｍ以上７００μｍ以下がさらに好ましい。
【００２９】
凹部４の最深部４ｂから凹部開口面４ａまでの距離に相当する凹部４の深さＨは、透光性のガラス材料からなる底部において、凹部４を安定して成形できる加工安定性の点から凹部開口面４ａの直径Ｄｈ以下であることが好ましい。すなわち、凹部４の深さＨを凹部開口面４ａの直径Ｄｈで除した値（Ｈ／Ｄｈ）は、１以下が好ましい。Ｈ／Ｄｈは０．７以下がより好ましい。また、播種した細胞の分散性の点からＨ／Ｄｈは０．２５以上が好ましい。凹部４の深さＨは、凹部４を安定して成形できる加工安定性の点から５０μｍ以上５００μｍ以下が好ましい。凹部４の深さＨは、７５μｍ以上がより好ましく、１００μｍ以上がさらに好ましい。凹部４の深さＨは、４５０μｍ以下がより好ましく、４００μｍ以下がさらに好ましい。加工安定性の観点から、深さＨは、７５μｍ以上４５０μｍ以下がより好ましく、１００μｍ以上４００μｍ以下がより好ましい。
【００３０】
凹部４の容積は、凹部開口面４ａと凹部４の内面で囲まれた空間の容積であり、細胞培養容器１０において、細胞が培養されスフェロイドが作製される空間の容積に相当する。凹部４の容積は、播種した細胞の分散性の点から、２．０×１０３〜２．０×１０９μｍ３が好ましく、２．０×１０６〜２．０×１０９μｍ３がより好ましい。
【００３１】
スフェロイド作製の効率を考慮すれば、領域Ｓには凹部４が隙間なく配置されることが好ましい。このような観点から、隣り合う凹部４における凹部開口面４ａの中心間の距離Ｄｘを、凹部開口面４ａの直径Ｄｈで除した値（Ｄｘ／Ｄｈ）は、１．０以上、１．２以下が好ましい。Ｄｘ／Ｄｈが１．０である場合、隣り合う凹部４は、凹部開口面４ａ同士が互いに接した構成である。底部３の製造容易性から、Ｄｘ／Ｄｈは、１．０５以上がより好ましく、スフェロイド作製の効率性からは、Ｄｘ／Ｄｈは、１．１５以下がより好ましい。
【００３２】
底部３は、領域Ｓに複数の凹部４を有する。上に示した凹部開口面４ａの直径Ｄｈ、凹部４の深さＨ、Ｄｘ／Ｄｈの数値範囲は、領域Ｓ内に存在する複数の凹部４の平均値としての範囲である。領域Ｓ内に存在する複数の凹部４における、凹部開口面４ａの直径Ｄｈ、凹部４の深さＨ、Ｄｘ／Ｄｈの偏差は、平均値の上下１０％以内が好ましく、５％以内がより好ましい。なお、領域Ｓ内に設ける凹部４の数は、好ましくは、領域Ｓ内に設けることができる最大の数である。領域Ｓ内の凹部４の数は、領域Ｓの面積と凹部開口面４ａの形状および大きさによる。
【００３３】
領域Ｓの平面視の面積、すなわち、開口部１から臨む底部３の上面３ａの平面視の全面積に対する領域Ｓ内の凹部４の凹部開口面４ａの合計面積、すなわち凹部４の平面視における合計面積の割合は、４０％以上が好ましく、４５％以上がより好ましく、５０％以上が特に好ましい。ここで、領域Ｓの平面視の面積は、播種細胞の分散性の点から１〜５０ｍｍ２が好ましく、２〜２５ｍｍ２がより好ましい。その場合、領域Ｓの平面視の単位面積当たりの凹部４の個数は、２〜５０個／ｍｍ２が好ましく、５〜２０個／ｍｍ２がより好ましい。
【００３４】
領域Ｓの形状は、播種細胞の分散性およびスフェロイドの作製効率の点で、正方形を含む矩形または円形が好ましい。領域Ｓを複数有する後述の細胞培養容器の形態においては、小型化、製造容易性等の観点から領域Ｓの形状は矩形が好ましく、正方形が特に好ましい。
【００３５】
底部３の構成材料は、透光性を有するガラス材料である。ガラス材料が透光性を有するとは、該ガラス材料で作製される０．５ｍｍ厚のガラス板で測定される５００〜７００ｎｍの波長領域の分光透過率が９０％以上であることをいう。ガラス材料は、底部３を構成した場合に、底部３の波長４００ｎｍにおける分光透過率を７０％以上とできるのが好ましく、８０％以上とできるのがより好ましい。
【００３６】
ガラス材料は、組成によらず、樹脂に比べて自家蛍光が少ない。このため、細胞培養して得られたスフェロイドの蛍光顕微鏡観察においてバックグランドノイズを低くでき、高倍率での観察が可能である。ガラス材料として具体的には、ソーダライムガラス、アルミノシリケートガラス、石英ガラス、無アルカリガラス、ホウケイ酸ガラスが挙げられる。
【００３７】
ガラス材料としては、高倍率での高精度な蛍光顕微鏡観察が行えることから、自家蛍光がより少ないことが好ましい。例えば、顕微Ｒａｍａｎ分光により１００倍の対物レンズを用いて測定される、ガラス材料を５３２ｎｍの光で励起した際の５８４ｎｍでの蛍光強度の値を、石英ガラスを５３２ｎｍの光で励起した際の５８４ｎｍでの蛍光強度の値で除した値（以下、「石英ガラスに対する蛍光強度の比」ともいう。）が、１０以下であることが好ましく、９以下がより好ましい。顕微Ｒａｍａｎ分光の測定は、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製 Ａｌｍｅｇａ（商品名）を用いて行う。石英ガラスとしては、例えば、ＡＧＣ社製、ＡＱ（商品名）を用いる。
【００３８】
染色した細胞を観察する際、青色（４３５ｎｍで励起、４８５ｎｍで検出）、緑色（４８８ｎｍで励起、５２０ｎｍで検出）、赤色（５５５ｎｍで励起、５８４ｎｍで検出）の光が使用されることが多い。よって、底部３に用いるガラス材料としては、５３２ｎｍの光で励起した際の５８４ｎｍでの蛍光強度の値が低いほど、染色した細胞とのコントラスト差が大きくなり、高倍率観察が可能になり細胞の蛍光顕微鏡観察に適していると言える。
【００３９】
石英ガラスは、ガラスの中でも５３２ｎｍの光で励起した際の５８４ｎｍでの蛍光強度の値が最も低いガラスである。石英ガラスに対する蛍光強度の比が１０以下であることで、例えば、該ガラス材料を用いてガラス基板を作製し、そのガラス基板上に染色細胞（Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭにより染色されたＴＩＧ−３細胞）を播種して、２０倍の対物レンズを用いて蛍光顕微鏡観察を行った際に、染色細胞を視認できる。なお、樹脂材料では、石英ガラスに対する蛍光強度の比は、種類によらず、概ね５０〜５００の値をとる。
【００４０】
上記石英ガラスに対する蛍光強度の比が１０以下のガラス材料として、具体的には、アルミノシリケートガラス、石英ガラス、ホウケイ酸ガラス等が挙げられ、それぞれ以下の組成のガラスまたは市販品が好ましい。
【００４１】
アルミノシリケートガラスとしては、酸化物基準のモル％表示で、ＳｉＯ２を６０〜７０％、Ａｌ２Ｏ３を２〜２０％、Ｂ２Ｏ３を０〜１５％、Ｌｉ２Ｏを０〜１０％、Ｎａ２Ｏを０〜２０％、Ｋ２Ｏを０〜１０％、ＭｇＯを０〜１５％、ＣａＯを０〜１０％、ＳｒＯを０〜１０％、ＺｒＯ２を０〜１０％含有するガラスが好ましい。アルミノシリケートガラスの市販品としては、Ｄｒａｇｏｎｔｒａｉｌ（ＡＧＣ社製、登録商標、石英ガラスに対する蛍光強度の比；８．５）が挙げられる。
【００４２】
石英ガラスは、ＳｉＯ２含有量が１００％のガラスである。石英ガラスの市販品としては、ＡＱ（ＡＧＣ社製、商品名）が挙げられる。石英ガラスはいずれのガラスであっても、５３２ｎｍの光で励起した際の５８４ｎｍでの蛍光強度の値は同じ値をとる。
【００４３】
ホウケイ酸ガラスとしては、酸化物基準のモル％表示で、ＳｉＯ２を７０〜９０％、Ａｌ２Ｏ３を０〜５％、Ｂ２Ｏ３を７〜２０％、Ｌｉ２Ｏを０〜５％、Ｎａ２Ｏを０〜１０％、Ｋ２Ｏを０〜５％、ＺｒＯ２を０〜１０％含有するガラスが好ましい。ホウケイ酸ガラスの市販品としては、Ｄ２６３Ｔｅｃｏ（ＳＣＨＯＴＴ社製、商品名、石英ガラスに対する蛍光強度の比；７．４）が挙げられる。
【００４４】
底部３は、例えば、透光性のガラス材料を用いて、底部３の母材となる両主面が平坦で、板厚が底部３の厚さと同じガラス板（以下、「母材ガラス板」）を作製し、その一方の主面の所定の位置に複数の凹部を設けることで製造できる。凹部を設ける方法として、具体的には、以下の方法１および方法２が挙げられる。
【００４５】
（方法１）
母材ガラス板の両主面にＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）フィルム等の保護フィルムを貼り付ける。続いて、ＣＯ2レーザを用い凹部４の形成面に、凹部４の基になる複数の種穴を所定のピッチで穿孔する。種穴の形成後、保護フィルムを母材ガラス板から剥離し、アニールを行う。アニールの目的はＣＯ２レーザのガラスへの照射による残留応力を取り除くためであり、その条件はガラスの組成により適宜調節される。
【００４６】
次いで、種穴の形成された母材ガラス板の種穴の非形成面に保護フィルムを貼り付け、フッ化水素を含有するエッチング液のかけ流しによるシャワーエッチングを行う。エッチング後、保護フィルムを剥離することで、図３Ａ、図３Ｂに示すように、上面３ａ上に複数の凹部４が形成された底部３が得られる。なお、この場合のエッチングは、等方エッチングであるため、凹部４の深さＨは、種穴の深さとなり、凹部４の幅方向のサイズ、すなわち、凹部開口面４ａの直径Ｄｈは、エッチング時間に依存する。したがって、所望の大きさの凹部４を得るためには、種穴の形成条件、およびシャワーエッチングの時間を適宜調整する。
【００４７】
なお、上記シャワーエッチングに代えて、エッチング液に種穴の形成された母材ガラス板の全体を浸漬させる一般的なエッチングを適用してもよい。エッチング液は、フッ化水素の水溶液であり、フッ化水素以外の成分として、硫酸、塩酸、硝酸、クエン酸等のフッ化水素以外の酸を含有できる。フッ化水素以外の酸を含有することで、ガラス中のアルカリ成分とフッ化水素とが反応して析出反応が局所的におきることを抑えることができ、エッチングを面内均一に進行させることができる。
【００４８】
（方法２）
母材ガラス板の両主面にフッ化水素を含有するエッチング液でエッチングが可能な金属からなる金属保護層を形成し、金属保護層上に感光性樹脂組成物を塗布する。次いで、凹部４の形成面については、凹部４の形成領域以外の領域、すなわち、平坦領域Ｓｆに対応する部分が開口したフォトマスクを介して、紫外線等の活性エネルギー線を照射して、感光性樹脂組成物の平坦領域Ｓｆのみを硬化させる。また、凹部４を形成しない面については、全面に紫外線等の活性エネルギー線を照射して感光性樹脂組成物を硬化させる。その後、現像により凹部４の形成領域に対応する未露光領域の感光性樹脂組成物を除去する。
【００４９】
次いで、上記で得られた金属保護層と部分的に感光性樹脂組成物の硬化膜を有する母材ガラス板を、フッ化水素を含有するエッチング液に所定の時間浸漬した後、剥離液に浸漬して金属保護層および感光性樹脂組成物の硬化膜を除去する。これにより、図３Ａ、図３Ｂに示すように、上面３ａ上に複数の凹部４が形成された底部３が得られる。方法２におけるエッチング液は、方法１と同様にできる。なお、エッチング液への浸漬に際し、処理時間の短縮のために保護層を有する母材ガラス板を揺動してもよい。
【００５０】
細胞培養容器１０において、側壁２は底部３の上面３ａの周縁部に設けられる。側壁２の内壁面は、底部３の上面３ａの平坦領域Ｓｆに対して垂直となる構成でもよく、開口部１が下端から上端に向かって拡開するようにテーパー状に構成されてもよい。側壁２の外壁面は底部３の上面３ａの平坦領域Ｓｆに対して垂直となる構成が好ましい。側壁２高さ、すなわち開口部１の深さは、分注培養液の必要量の点で、１〜１０ｍｍが好ましく、２〜１０ｍｍがより好ましい。側壁２の幅は、分注培養液の必要量の点で、０．５〜２ｍｍが好ましく、０．５〜３ｍｍがより好ましい。
【００５１】
なお、側壁２は底部３の外周の外側に、底部３の端面と側壁２の内壁面の下部領域が接合する形で設けられていてもよい。その場合、開口部１の深さは、上記と同様であるのが好ましく、側壁２の高さは、開口部１の深さと底部３の厚さの合計となるのが好ましい。
【００５２】
側壁２の構成材料としては、ガラス等の無機材料、樹脂等が挙げられ、製造容易性の観点から樹脂が好ましい。樹脂としては、アクリル系樹脂、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、スチレン系樹脂、アクリル・スチレン系共重合樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂、エチレン・ビニルアルコール系共重合樹脂、熱可塑性エラストマー、塩化ビニル系樹脂、シリコーン樹脂等が挙げられ、成形容易性の点でスチレン系樹脂が好ましい。
【００５３】
側壁２と底部３の接合方法は、側壁２の構成材料に応じて適宜選択される。底部３はガラス材料からなることから側壁２がガラス材料からなる場合は、これらは一体成形されてもよく熱融着等で接合されてもよい。側壁２の構成材料が樹脂である場合、好ましくは、樹脂の種類に応じて適宜選択された接着層を介して側壁２と底部３を接合する。
【００５４】
表層５は、細胞接着を抑制する性質を有する。図２に示す細胞培養容器１０において、表層５は凹部４の内面および平坦領域Ｓｆを含む領域Ｓの全体に設けられているが、本発明の細胞培養容器において、表層は少なくとも凹部の内面に設けられればよい。細胞培養容器１０においては、表層５の表面で囲まれたマイクロ空間Ｍで、細胞培養が行われることで、細胞が表層５に接着することなく細胞同士で効率的に凝集してスフェロイドを形成し、また、マイクロ空間Ｍからのスフェロイドの取り出しが容易である。また、平坦領域Ｓｆにも表層５を有することで、細胞培養容器１０からのスフェロイドの取り出しが容易でとある。表層５は、側壁２の内壁面上に形成されてもよい。
【００５５】
表層５は生体親和性基を有することで、細胞接着を抑制する性質を持つことが好ましい。生体親和性基としては、ポリオキシアルキレン基、ホスホリルコリン基等の従来公知の有機基が使用可能である。具体的には、表層５が有する生体親和性基は、下式１で表される基、下式２で表される基および下式３で表される基からなる群から選ばれる少なくとも１種を含むことが好ましい。
【００５６】
【化３】
2019151114.tif 000005
【００５７】
ただし、式１中、ｎは１〜３００の整数であり、式１で表される基のうち５０〜１００モル％は、下式４で表される基中の式１で表される基である。式４におけるｎは１〜３００の整数であり、Ｒ６は水素原子または炭素数１〜５のアルキル基である。
式２中、Ｒ１〜Ｒ３はそれぞれ独立に炭素数１〜５のアルキル基であり、ａは１〜５の整数である。
式３中、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ独立に炭素数１〜５のアルキル基であり、Ｘ−は下式３−１で表される基または下式３−２で表される基であり、ｂは１〜５の整数である。
【００５８】
【化４】
2019151114.tif 000006
【００５９】
本明細書において、アルキル基は、直鎖、分岐鎖および環状のいずれであってもよく、これらの組み合わせであってもよい。
【００６０】
以下、基１（ただし、５０〜１００モル％は基４中の基１である）を、「基１（４）」と示す。表層５が有する生体親和性基は、基１（４）、基２および基３のうちのいずれか１種を含んでもよく、これらの２種以上を含有してもよい。生体親和性基としては、基１（４）が好ましい。表層５は、必要に応じて基１（４）、基２および基３以外の生体親和性基を有してもよいが、好ましくは、表層５が有する生体親和性基は、基１（４）、基２および基３から選ばれる少なくとも１種のみからなる。
【００６１】
表層５と底部３の間には共有結合が存在することが好ましい。表層５と底部３が共有結合を介して接合されていることで、表層５は十分な耐久性を有する。また、表層５は、４０℃の水に７日間浸漬した場合に、表層５の単位面積１ｃｍ２当たりの水に対する全有機炭素（ＴＯＣ；Ｔｏｔａｌ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃａｒｂｏｎ）の溶出量（以下、「ＴＯＣ溶出量」ともいう。）が１ｍｇ／Ｌ以下であるのが好ましい。ＴＯＣ溶出量は、言い換えれば、面積１ｃｍ２の表層を４０℃の水１Ｌに７日間浸漬した際に、水に溶出するＴＯＣの質量［ｍｇ］である。表層５から構成成分が溶出すると、細胞培養や、顕微鏡観察に影響を及ぼすことがあるため、ＴＯＣ溶出量が１ｍｇ／Ｌ以下であるのが好ましい。ＴＯＣ溶出量は、０．５ｍｇ／Ｌ以下がより好ましく、０．３ｍｇ／Ｌ以下がさらに好ましい。
【００６２】
ＴＯＣとは、有機物の全量を炭素の量で示したものである。本明細書において、表層のＴＯＣ溶出量は、具体的には、次のようにして測定できる。表層を所定量の水に４０℃で７日間浸漬した後の処理水のＴＯＣ濃度［ｍｇ／Ｌ］を測定する。浸漬に使用する水は、蒸留水またはイオン交換水とする。上記で得られたＴＯＣ濃度を浸漬した表層の面積（単位；ｃｍ２）で除すことで、ＴＯＣ溶出量［ｍｇ／Ｌ］が得られる。水中のＴＯＣ濃度測定は、一般的なＴＯＣ計、例えば、ＴＮＣ−６０００（東レエンジニアリング社製）で行える。
【００６３】
なお、ＴＯＣ溶出量の測定に用いる表層の試料としては、剥離性基材上に表層を作製し、剥離して得られる表層単体を用いてもよく、上記条件（４０℃、７日間）においてＴＯＣ溶出量が０［ｍｇ／Ｌ］の基材上に表層を形成した、表層付き基材を用いてもよい。
【００６４】
底部３との間に共有結合を有し、細胞接着を抑制する性質、具体的には生体親和性基を有する表層５としては、ガラス材料からなる底部３と共有結合を形成し得る基と、生体親和性基と、を有する化合物を含む組成物の硬化物からなる表層５が好ましい。該化合物が有するガラス材料からなる底部３と共有結合を形成し得る基としては、加水分解性シリル基が好ましく、アルコキシシリル基がより好ましい。
【００６５】
また、該化合物は、基１（４）、基２および基３から選ばれる少なくとも一種からなる生体親和性基とアルコキシシリル基とを有する化合物（以下、化合物（Ｘ）で示す。）であるのが好ましい。また、表層５を形成するために用いる上記組成物は、化合物（Ｘ）を含有し、組成物中の固形分における上記生体親和性基の含有量が２５〜８３質量％であり、アルコキシシリル基の含有量が２〜７０質量％である組成物（以下、組成物（Ｙ）で示す。）であるのが好ましい。以下、表層５を形成するための組成物として、組成物（Ｙ）を例に説明するが、得られる表層が本発明の範疇にある限り、表層５を形成するための組成物はこれに限定されない。
【００６６】
なお、組成物中の固形分とは、組成物を８０℃、３時間で真空乾燥して揮発成分を除去した残留分をいう。組成物の硬化物とは、該固形分の硬化物である。また、以下の説明において、特に断りのない限り「生体親和性基」とは、上記式１で表される基、上記式２で表される基、および上記式３で表される基からなる群から選ばれる少なくとも一種からなる生体親和性基である。
【００６７】
ここで、表層５が化合物（Ｘ）を含む組成物（Ｙ）の硬化物からなるとは、表層５が少なくとも、化合物（Ｘ）を含む加水分解縮合が可能な成分の硬化物を含むことをいう。なお、組成物（Ｙ）が硬化する際に、化合物（Ｘ）はアルコキシシリル基を有することで、加水分解反応しシラノール基（Ｓｉ−ＯＨ）を形成する。次いで、該シラノール基同士が脱水縮合反応してシロキサン結合（Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ）して硬化物となる。この際、組成物（Ｙ）が化合物（Ｘ）以外の加水分解性シリル基含有成分、好ましくはアルコキシシリル基含有成分を含有する場合も同様に該成分と化合物（Ｘ）がシロキサン結合を形成する。
【００６８】
組成物（Ｙ）を、底部３の表面で硬化させる場合、化合物（Ｘ）を含む組成物（Ｙ）中の加水分解性シリル基含有成分が加水分解反応することで生成したシラノール基は、上記Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ結合を形成するのと並行して、底部３の表面の水酸基（ガラス材料−ＯＨ）と脱水縮合反応して共有結合（ガラス材料−Ｏ−Ｓｉ）が形成される。これにより、得られる表層５は底部３の表面と強固に密着することから、高い耐久性、例えば、耐水性を有する。
【００６９】
組成物（Ｙ）において、生体親和性基の含有量が２５質量％以上であることで、得られる表層５は十分な量の生体親和性基を有し、細胞接着をより効果的に抑制できる。上記生体親和性基の含有量が８３質量％以下であることで耐水性を付与できる。組成物（Ｙ）中の固形分における生体親和性基の含有量は、３０〜８３質量％が好ましく、４０〜８３質量％がより好ましい。
【００７０】
組成物（Ｙ）において、アルコキシシリル基の含有量が２質量％以上であることで、組成物（Ｙ）が硬化する際にアルコキシシリル基が底部３の表面と十分な量の共有結合を形成し、得られる表層５は耐久性、例えば、耐水性に優れる。アルコキシシリル基の含有量が７０質量％以下であることで十分な量の生体親和性基を導入することができる。組成物（Ｙ）中の固形分におけるアルコキシシリル基の含有量は、２〜４０質量％が好ましく、２〜３０質量％がより好ましい。
【００７１】
なお、例えば、細胞培養容器１０においては、表層５と底部３の共有結合をより強固にするために、表層５と底部３の間に酸化ケイ素層を有してもよい。該酸化ケイ素層は、例えば、蒸着により得られる１〜２ｎｍ程度の厚さの酸化ケイ素層が好ましい。なお、表層５と酸化ケイ素層、酸化ケイ素層と底部３はそれぞれ共有結合で接合されるので、表層５と底部３の間に酸化ケイ素層を有する場合も、「表層５と底部３との間で共有結合を有する。」の範疇に含まれる。
【００７２】
化合物（Ｘ）が有する、アルコキシシリル基は、例えば、式５で示される基が挙げられる。
−Ｓｉ（Ｒ７）３−ｔ（ＯＲ８）ｔ      式５
ただし、式５中、Ｒ７は、炭素数１〜１８のアルキル基であり、Ｒ８は炭素数１〜１８のアルキル基であり、ｔは１〜３の整数である。Ｒ７およびＯＲ８が複数存在する場合、Ｒ７およびＲ８は同一であっても異なってもよい。製造上の観点から、Ｒ７およびＲ８は同一であることが好ましい。
【００７３】
底部３と表層５の密着性の観点から、ｔは２以上が好ましく、３がより好ましい。縮合反応時の立体障害の観点から、Ｒ７は炭素数１〜７のアルキル基が好ましく、メチル基またはエチル基がより好ましい。加水分解反応速度及び加水分解反応時の副生成物の揮発性の観点から、Ｒ８は、炭素数１〜６のアルキル基が好ましく、メチル基またはエチル基がより好ましい。
【００７４】
化合物（Ｘ）としては、例えば、上記化合物（Ｘ）としての要件を満足する、ポリオキシエチレン鎖を主鎖とし、末端または側鎖にアルコキシシリル基を有する化合物（Ｘ１）、エチレン性二重結合が重合した炭化水素鎖を主鎖とし、側鎖に生体親和性基とアルコキシシリル基を有する化合物（Ｘ２）等が挙げられる。
【００７５】
化合物（Ｘ１）は、例えば、ポリオキシエチレンポリオールまたは少なくとも１つの水酸基を有するポリオキシエチレンアルキルエーテル（ただし、アルキルの炭素数は１〜５である。）に、これらの化合物が有する水酸基および連結基を介してアルコキシシリル基を導入することで得られる。より具体的には、化合物（Ｘ１）は、例えば、ポリオキシエチレン鎖を含むポリオキシアルキレンポリオールまたはポリオキシエチレン鎖を含み少なくとも１つの水酸基を有するポリオキシアルキレンアルキルエーテル（ただし、アルキルの炭素数は１〜５である。）に、所定の割合で、水酸基に反応性の基およびアルコキシシリル基を有するシラン化合物（以下、シラン化合物（Ｓ）ともいう。）を反応させて得られる。
【００７６】
用いるポリオキシアルキレンポリオールとしては、アルカンポリオール、エーテル性酸素原子含有ポリオール、糖アルコールなどの比較的低分子量のポリオールに、少なくともエチレンオキシドを含むアルキレンモノエポキシドを開環付加重合して得られる化合物が挙げられる。ポリオキシアルキレンポリオールにおける、オキシアルキレン基としては、オキシエチレン基、オキシプロピレン基、オキシ１，２−ブチレン基、オキシ２，３−ブチレン基、オキシイソブチレン基等が挙げられる。
【００７７】
用いるポリオキシアルキレンアルキルエーテルとしては、このようなポリオキシアルキレンポリオールの水酸基の一部を炭素数１〜５の脂肪族アルコールとエーテル結合させた化合物が挙げられる。以下の説明において、特に断りのない限り「ポリオキシアルキレンアルキルエーテル」は、少なくとも１個の水酸基を有するポリオキシアルキレンアルキルエーテル（ただし、アルキルの炭素数は１〜５である。）をいう。「オキシアルキレン」が「オキシエチレン」に変わった場合も同様である。
【００７８】
上記ポリオキシアルキレンポリオールおよびポリオキシアルキレンアルキルエーテルが有するオキシアルキレン基はオキシエチレン基のみからなってもよく、オキシエチレン基と他のオキシアルキレン基の組み合わせからなってもよい。化合物（Ｘ１）としての分子設計のし易さから、オキシエチレン基のみを有するポリオキシエチレンポリオールまたはポリオキシエチレンアルキルエーテルが好ましい。以下、ポリオキシエチレンポリオールとポリオキシエチレンアルキルエーテルをまとめて、ポリオキシエチレンポリオール等ということもある。
【００７９】
すなわち化合物（Ｘ１）は、ポリオキシエチレンポリオール等とシラン化合物（Ｓ）の反応生成物が好ましい。ポリオキシエチレンポリオール等の水酸基の数としては、１〜６が挙げられ、化合物（Ｘ１）としての分子設計のし易さの観点から、１〜４が好ましく、１〜３が特に好ましい。ポリオキシエチレンポリオール等として、具体的には、ポリオキシエチレングリコール、ポリオキシエチレングリセリルエーテル、トリメチロールプロパントリオキシエチレンエーテル、ペンタエリスリトールポリオキシエチレンエーテル、ジペンタエリスリトールポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレングリコールモノアルキルエーテル（ただし、アルキルの炭素数は１〜５である。）等が挙げられる。
【００８０】
例えば、ポリオキシエチレンポリオール等が、水酸基数が２のポリオキシエチレングリコールの場合、化合物（Ｘ１）として、下記式のようにポリオキシエチレングリコールとＲ９−Ｑ１１−Ｓｉ（Ｒ７）３−ｔ（ＯＲ８）ｔで示されるシラン化合物（Ｓ１）が反応して得られる、式中、符号（Ｘ１１）で示される化合物（Ｘ１１）が挙げられる。
【００８１】
【化５】
2019151114.tif 000007
【００８２】
上記反応式において、ポリオキシエチレングリコールにおけるｎ１は１〜３００の整数であり、好ましくは２〜１００、より好ましくは４〜２０である。シラン化合物（Ｓ１）における、Ｒ７、Ｒ８、およびｔは、好ましい態様を含めて上記式５の場合と同様である。シラン化合物（Ｓ１）における、Ｒ９は、水酸基と反応性の基であり、水酸基、カルボキシル基、イソシアネート基、エポキシ基が挙げられる。Ｑ１１は、炭素数２〜２０の、炭素原子−炭素原子間に、エーテル性酸素原子を有してもよく、水素原子がハロゲン原子、例えば、塩素原子、フッ素原子や水酸基に置換されていてもよい２価炭化水素基である。水素原子が水酸基に置換される場合、置換する水酸基の個数は１〜５個が好ましい。
【００８３】
式（Ｘ１１）において、Ｑ１は、シラン化合物（Ｓ１）のＲ９−Ｑ１１がポリオキシエチレングリコールの水酸基と反応した残基であり、Ｒ９’−Ｑ１１（Ｏに結合する側がＲ９’であり、アルコキシシリル基に結合する側がＱ１１である。）で示すことができる。Ｒ９’としては、Ｒ９に対応して、単結合、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（ＣＨ３）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｃ６Ｈ５）−、−ＣＨ２ＣＨ（−ＯＨ）ＣＨ２Ｏ−が挙げられる。以下、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ…は、−ＣＯＮ…と示す。例えば、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−は、−ＣＯＮＨ−と示す。
【００８４】
Ｑ１として、好ましくは、−（ＣＨ２）ｋ−、−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｋ−、−（ＣＦ２）ｋ−（ｋは、２〜４の整数を表す）、−ＣＨ２ＯＣ３Ｈ６−、−ＣＦ２ＯＣ３Ｈ６−等が挙げられる。これらのなかでも、−ＣＯＮＨＣ３Ｈ６−、−ＣＯＮＨＣ２Ｈ４−、−ＣＨ２ＯＣ３Ｈ６−、−ＣＦ２ＯＣ３Ｈ６−、−Ｃ２Ｈ４−、−Ｃ３Ｈ６−、および−Ｃ２Ｆ４−から選択されるいずれかがより好ましい。さらに、−ＣＯＮＨＣ３Ｈ６−、−ＣＯＮＨＣ２Ｈ４−、−Ｃ２Ｈ４−、−Ｃ３Ｈ６−が好ましい。
【００８５】
なお、ポリオキシエチレングリコールを塩基性条件下で塩化アリルと反応させた後、ヒドロシリル化反応によってシラン変性することで、化合物（Ｘ１１）を得てもよい。
【００８６】
化合物（Ｘ１１）における基１は、基４中の基１である割合が、１００モル％である。すなわち、化合物（Ｘ１１）における基１は、すべてが基４に含まれる基１である。化合物（Ｘ１１）における生体親和性基の含有量は、式（Ｘ１１）中のｎ１（ＯＣＨ２ＣＨ２）−Ｏの質量％であり、アルコキシシリル基の含有量は、式（Ｘ１１）中の−Ｓｉ（Ｒ７）３−ｔ（ＯＲ８）ｔの質量％である。化合物（Ｘ１１）における生体親和性基およびアルコキシシリル基の含有量は、組成物（Ｙ）の固形分組成に応じて適宜調整される。化合物（Ｘ１１）における生体親和性基の含有量は、例えば、１０〜９０質量％が好ましく、２５〜８３質量％がより好ましく、４０〜８３質量％がさらに好ましく、６０〜８３質量％が特に好ましい。化合物（Ｘ１１）におけるアルコキシシリル基の含有量は、１〜７０質量％が好ましく、２〜７０質量％がより好ましく、２〜４５質量％がさらに好ましく、１０〜３０質量％が特に好ましい。
【００８７】
なお、化合物（Ｘ１１）における末端の水素原子が、水素原子以外のＲ６と置き換わった化合物も化合物（Ｘ１）として使用できる。すなわち、上記反応式において、水酸基数が２のポリオキシエチレングリコールの代わりにポリオキシエチレングリコールモノアルキルエーテル（アルキルはＲ６である。）を用いて得られる化合物も、化合物（Ｘ１）として使用できる。その場合のＲ６としては、メチル基、エチル基が好ましく、メチル基がより好ましい。
【００８８】
例えば、ポリオキシエチレンポリオールが、水酸基数が３のポリオキシエチレングリセリルエーテルの場合、化合物（Ｘ１）として、下記式のようにポリオキシエチレングリセリルエーテルとＲ９−Ｑ１１−Ｓｉ（Ｒ７）３−ｔ（ＯＲ８）ｔで示されるシラン化合物（Ｓ１）が反応して得られる、式中、符号（Ｘ１２）で示される化合物（Ｘ１２）が挙げられる。
【００８９】
【化６】
2019151114.tif 000008
【００９０】
上記反応式において、ポリオキシエチレングリセリルエーテルにおけるｎ１は、ポリオキシエチレングリコールにおけるｎ１と好ましい態様を含めて同様にできる。シラン化合物（Ｓ１）は上記同様とできる。化合物（Ｘ１２）における、Ｑ１は、化合物（Ｘ１１）におけるＱ１と好ましい態様を含めて同様にできる。
【００９１】
化合物（Ｘ１２）における基１は、基４中の基１である割合が、６７モル％である。化合物（Ｘ１２）における生体親和性基の含有量は、式（Ｘ１２）中のＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ１−およびＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ１−Ｈの合計質量％であり２５〜８３質量％に調整される。化合物（Ｘ１２）における生体親和性基の含有量およびアルコキシシリル基の含有量は、好ましい範囲を含めて化合物（Ｘ１１）の場合と同様にできる。
【００９２】
なお、化合物（Ｘ１２）におけるＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ１−Ｈの末端の水素原子が、水素原子以外のＲ６と置き換わった化合物も化合物（Ｘ１）として使用できる。その場合のＲ６としては、メチル基が好ましい。
【００９３】
化合物（Ｘ１）において、生体親和性基およびアルコキシシリル基以外の構造の含有量は、表層における細胞非接着性および耐久性、特に耐水性の両立の観点から、１０〜５０質量％が好ましく、２０〜３０質量％がより好ましい。化合物（Ｘ１）の重量平均分子量は、原料入手の容易性の観点から、１００〜１００００が好ましく、５００〜２０００がより好ましい。化合物（Ｘ１）の重量平均分子量（以下、「Ｍｗ」と示すこともある）は、サイズ排除クロマトグラフィーによって算出される。
【００９４】
以上、ポリオキシエチレンポリオール等として、ポリオキシエチレングリコールおよびポリオキシエチレングリセリルエーテルを例に化合物（Ｘ１）を説明した。これら以外のポリオキシエチレンポリオール等についても同様に、基１が基４中の基１である割合、生体親和性基の含有量、アルコキシシリル基の含有量等を所望の割合に適宜調整して、化合物（Ｘ１）を製造することが可能である。
【００９５】
化合物（Ｘ１）は、さらにその部分加水分解縮合物であってもよい。化合物（Ｘ１）を部分加水分解縮合物とする場合、後述のようにして底部３の表面に表層５を形成する際に支障をきたさない程度の粘度となるように、縮合度を適宜調整する。このような粘度の観点から部分加水分解縮合物のＭｗは、１，０００〜１，０００，０００が好ましく、１，０００〜１００，０００がより好ましい。以下の部分加水分解共縮合物についても、Ｍｗの好ましい範囲は同様である。なお、部分加水分解縮合物におけるアルコキシシリル基の含有量（質量％）は、原料のシラン化合物のアルコキシシリル基の含有量（質量％）と同等として扱う。部分加水分解共縮合物においては、原料のシラン化合物の混合割合からアルコキシシリル基の含有量（質量％）を算出できる。
【００９６】
化合物（Ｘ１）は、２種以上の化合物（Ｘ１）を、所望の割合で生体親和性基とアルコキシシリル基を含有するように、部分加水分解共縮合した部分加水分解共縮合物であってもよい。化合物（Ｘ１）は、また、化合物（Ｘ１）と生体親和性基を有しないアルコキシシラン化合物を、得られる部分加水分解縮合物が化合物（Ｘ）として所望の割合で生体親和性基とアルコキシシリル基を含有するように、部分加水分解共縮合した部分加水分解共縮合物であってもよい。
【００９７】
生体親和性基を有しないアルコキシシラン化合物としては、下式６のアルコキシシラン化合物が挙げられる。
Ｓｉ（Ｒ２０）４−ｐ（ＯＲ２１）ｐ      式６
【００９８】
ただし、式６中、Ｒ２０は、ポリオキシエチレン鎖を有しない一価有機基であり、Ｒ２１は炭素数１〜１８のアルキル基であり、ｐは１〜４の整数である。Ｒ２０およびＯＲ２１が複数存在する場合、Ｒ２０およびＲ２１は同一であっても異なってもよい。製造上の観点から、Ｒ２０およびＲ２１は同一であることが好ましい。
【００９９】
Ｒ２０として具体的には、炭素数１〜１８のアルキル基が挙げられ、縮合反応時の立体障害の観点からメチル基が好ましい。
【０１００】
底部３と表層５の密着性の観点から、ｐは２以上が好ましく、３または４がより好ましく、４が特に好ましい。加水分解反応速度及び加水分解反応時の副生成物の揮発性の観点から、Ｒ２１は、炭素数１〜６のアルキル基が好ましく、メチル基、エチル基がより好ましい。
【０１０１】
化合物（Ｘ２）としては、例えば、生体親和性基を有する（メタ）アクリレートとアルコキシシリル基を有する（メタ）アクリレートを必須とし、任意にこれら以外のその他（メタ）アクリレートを、含む単量体を共重合させた（メタ）アクリレート共重合体が挙げられる。この場合、原料単量体は、得られる（メタ）アクリレート共重合体が化合物（Ｘ）として所望の割合で生体親和性基とアルコキシシリル基を含有するように、上記各（メタ）アクリレートの含有量を調整する。
【０１０２】
上記（メタ）アクリレート共重合体としては、例えば、下記式（Ｘ２１）で示される共重合体（Ｘ２１）が挙げられる。
【０１０３】
【化７】
2019151114.tif 000009
【０１０４】
ただし、式（Ｘ２１）において、Ｒ１〜Ｒ６、Ｘ−およびａ、ｂは、式１〜式４におけるのと同様である。Ｒ１〜Ｒ３は、独立にメチル基が好ましく、Ｒ４およびＲ５は独立にメチル基が好ましい。Ｒ６はメチル基または水素原子が好ましい。ａ、ｂはそれぞれ独立に２が好ましい。
ｎ２は１〜３００の整数であり、好ましくは１〜１００、より好ましくは１〜２０である。Ｒ７、Ｒ８、およびｔは、好ましい態様を含めて上記式５の場合と同様である。
Ｒは各単位で独立に水素原子またはメチル基である。Ｒ１０は、水素原子、または、生体親和性基およびアルコキシシリル基を有しない一価有機基である。Ｒ１０は、水素原子または炭素原子数１〜１００のアルキル基が好ましく、炭素原子数１〜２０のアルキル基がより好ましい。
共重合体（Ｘ２１）は、ランダム共重合体であってもブロック共重合体であってもよい。
【０１０５】
Ｑ２、Ｑ４、Ｑ５は、炭素数２〜１０の、炭素原子−炭素原子間に、エーテル性酸素原子を有してもよく、水素原子がハロゲン原子、例えば、塩素原子、フッ素原子や水酸基に置換されていてもよい２価炭化水素基である。
Ｑ２は、−Ｃ２Ｈ４−、−Ｃ３Ｈ６−、−Ｃ４Ｈ８−が好ましく、−Ｃ３Ｈ６−、−Ｃ４Ｈ８−がより好ましく、さらに−Ｃ３Ｈ６−が好ましい。
Ｑ４およびＱ５は、それぞれ独立して、−Ｃ２Ｈ４−、−Ｃ３Ｈ６−、−Ｃ４Ｈ８−が好ましく、−Ｃ２Ｈ４−、−Ｃ３Ｈ６−がより好ましく、さらに−Ｃ２Ｈ４−が好ましい。
Ｑ３は、単結合または、−Ｏ−Ｑ６−であり、Ｑ６はＱ２と同様である。Ｑ３は単結合が好ましい。
【０１０６】
共重合体（Ｘ２１）において、ｅは、共重合体の全単位数を１００とした場合の、アルコキシシリル基を有する単位（以下、単位（Ａ）という）の個数を示す。ｆ、ｇ、ｈ、ｉは、同様に、基１（４）を有する単位（以下、単位（Ｂ１）という）、基２を有する単位（以下、単位（Ｂ２）という）、基３を有する単位（以下、単位（Ｂ３）という）、および−（Ｃ−Ｃ（Ｒ）（Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ１０））ｉ−で示される単位（以下、単位（Ｃ）という）の、それぞれ共重合体の全単位数を１００とした場合の個数を示す。以下、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ…は、−ＣＯＯ…と示す。
【０１０７】
式（Ｘ２１）においてｅ〜ｉの割合を調整することで、共重合体（Ｘ２１）における生体親和性基およびアルコキシシリル基（−Ｓｉ（Ｒ７）３−ｔ（ＯＲ８）ｔ）の含有量が調整できる。共重合体（Ｘ２１）におけるｅ〜ｉの割合は、組成物（Ｙ）の固形分組成に応じて適宜調整される。共重合体（Ｘ２１）における生体親和性基の含有量は、例えば、２０〜９０質量％が好ましく、２５〜８３質量％がより好ましく、３０〜８３質量％がさらに好ましく、４０〜８３質量％が特に好ましい。共重合体（Ｘ２１）におけるアルコキシシリル基の含有量は、１〜７０質量％が好ましく、２〜７０質量％がより好ましく、２〜２５質量％がさらに好ましく、２〜１５質量％が特に好ましい。
【０１０８】
共重合体（Ｘ２１）としては、単位（Ａ）および単位（Ｂ１）のみで構成される共重合体が好ましい。以下、単位（Ａ）、単位（Ｂ１）、単位（Ｂ２）、単位（Ｂ３）、単位（Ｃ）の原料となる（メタ）アクリレートをそれぞれ、（メタ）アクリレート（Ａ）、（メタ）アクリレート（Ｂ１）、（メタ）アクリレート（Ｂ２）、（メタ）アクリレート（Ｂ３）、（メタ）アクリレート（Ｃ）という。また、（メタ）アクリレート（Ｂ１）、（メタ）アクリレート（Ｂ２）および（メタ）アクリレート（Ｂ３）をまとめて（メタ）アクリレート（Ｂ）という。以下の（メタ）アクリレートの説明において、符号の意味はすべて共重合体（Ｘ２１）におけるのと同じである。
【０１０９】
（メタ）アクリレート（Ａ）は、ＣＨ２＝ＣＲ−ＣＯＯ−Ｑ２−Ｓｉ（Ｒ７）３−ｔ（ＯＲ８）ｔであり、ＣＨ２＝ＣＲ−ＣＯＯ−Ｑ２−Ｓｉ（ＯＲ８）３が好ましく、ＣＨ２＝ＣＲ−ＣＯＯ−（ＣＨ２）３−Ｓｉ（ＯＣＨ３）３、ＣＨ２＝ＣＲ−ＣＯＯ−（ＣＨ２）３−Ｓｉ（ＯＣ２Ｈ５）３が特に好ましい。
【０１１０】
（メタ）アクリレート（Ｂ１）は、ＣＨ２＝ＣＲ−ＣＯ−Ｑ３−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ２−Ｒ６であり、ＣＨ２＝ＣＲ−ＣＯＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ２−Ｒ６（ｎ２＝１〜３００、Ｒ６はＨまたはＣＨ３である。）が好ましい。ｎ２はさらに好ましくは１〜２０である。
【０１１１】
（メタ）アクリレート（Ｂ２）は、ＣＨ２＝ＣＲ−ＣＯＯ−Ｑ４−（ＰＯ４−）−（ＣＨ２）ａ−Ｎ＋Ｒ１Ｒ２Ｒ３であり、ＣＨ２＝ＣＲ−ＣＯＯ−（ＣＨ２）２−（ＰＯ４−）−（ＣＨ２）２−Ｎ＋（ＣＨ３）３が好ましい。
（メタ）アクリレート（Ｂ３）は、ＣＨ２＝ＣＲ−ＣＯＯ−Ｑ５−Ｎ＋Ｒ４Ｒ５−（ＣＨ２）ｂ−Ｘ−であり、ＣＨ２＝ＣＲ−ＣＯＯ−（ＣＨ２）２−Ｎ＋（ＣＨ３）２−ＣＨ２−ＣＯＯ−が好ましい。
【０１１２】
（メタ）アクリレート（Ｃ）は、ＣＨ２＝ＣＲ−ＣＯＯ−Ｒ１０であり、メチルメタクリレート、ブチルメタクリレート、ドデシルメタクリレート等が挙げられる。
【０１１３】
共重合体（Ｘ２１）は、例えば、原料（メタ）アクリレートを、ｅ〜ｉが上記所定の割合となるように準備し、重合開始剤の存在下、従来公知の、溶液重合、塊状重合、懸濁重合、乳化重合等の方法で共重合させることで得られる。
【０１１４】
なお、化合物（Ｘ２）において、生体親和性基およびアルコキシシリル基以外の構造の含有量は、表層における細胞非接着性および耐久性、特に耐水性の両立の観点から、１５〜５５質量％が好ましく、１５〜４０質量％がより好ましい。化合物（Ｘ２）のＭｗは、製造容易性の観点から、１，０００〜１，０００，０００が好ましく、２０，０００〜１００，０００がより好ましい。化合物（Ｘ２）のＭｗは、サイズ排除クロマトグラフィーにより算出される。
【０１１５】
化合物（Ｘ２）は、さらにその部分加水分解縮合物であってもよい。化合物（Ｘ２）を部分加水分解縮合物とする場合、後述のようにして底部３の表面に表層５を形成する際に支障をきたさない程度の粘度となるように、縮合度を適宜調整する。このような粘度の観点から部分加水分解縮合物のＭｗは、２，０００〜２，０００，０００が好ましく、３０，０００〜３００，０００がより好ましい。以下の部分加水分解縮合物についても、Ｍｗの好ましい範囲は同様である。
【０１１６】
化合物（Ｘ２）は、２種以上の化合物（Ｘ２）を、所望の割合で生体親和性基とアルコキシシリル基を含有するように、部分加水分解共縮合した部分加水分解共縮合物であってもよい。化合物（Ｘ２）は、また、化合物（Ｘ２）と生体親和性基を有しないアルコキシシラン化合物を、得られる部分加水分解縮合物が化合物（Ｘ）として所望の割合で生体親和性基とアルコキシシリル基を含有するように、部分加水分解共縮合した部分加水分解共縮合物であってもよい。
【０１１７】
組成物（Ｙ）は、化合物（Ｘ）の１種を単独で含有してもよく、２種以上を含有してもよい。化合物（Ｘ）を２種以上用いる場合には、化合物（Ｘ１）のみで２種以上を構成する、または化合物（Ｘ２）のみで２種以上を構成することが好ましい。組成物（Ｙ）が含有する固形分が化合物（Ｘ）のみで構成される場合、化合物（Ｘ）は、生体親和性基の含有量および、アルコキシシリル基の含有量が上記所定の範囲となるように選択される。組成物（Ｙ）における固形分中の化合物（Ｘ）の割合は、例えば、２５〜１００質量％が好ましく、５０〜１００質量％がより好ましく、７５〜１００質量％がさらに好ましい。
【０１１８】
組成物（Ｙ）は、化合物（Ｘ）以外のその他成分を含有してもよい。その他成分としては、表層５に固形分として含有される化合物（Ｘ）以外のその他の固形分が挙げられる。表層５の形成をドライコーティングで行う場合には、組成物（Ｙ）は固形分のみを含有する。一方、表層の形成をウェットコーティングで行う場合には、その他成分として、さらに、表層形成に際して除去される液状媒体を含有する。
【０１１９】
その他の固形分は、化合物（Ｘ）と同様に硬化する成分であってもよく、非硬化性の成分であってもよい。その他の固形分としては、化合物（Ｘ）の製造過程で用いた原料や副生成物のうち除去しきれなかった不純物、機能性の添加剤、触媒等が挙げられる。機能性の添加剤としては、紫外線吸収剤、光安定剤、酸化防止剤、レベリング剤等が挙げられる。
【０１２０】
なお、その他の固形分は、得られる表層５が上記ＴＯＣ溶出量の範囲を満足できる固形分であるのが好ましい。その他の固形分は、具体的には、化合物（Ｘ）と加水分解縮合が可能な成分が好ましく、化合物（Ｘ）以外の加水分解性シリル基含有成分、さらにはアルコキシシリル基含有成分がより好ましい。特に好ましくは、組成物（Ｙ）は、化合物（Ｘ）以外の固形分を含有しない。組成物（Ｙ）が固形分として化合物（Ｘ）のみを含有する場合、化合物（Ｘ）は、生体親和性基を２５〜８３質量％の割合で含有し、かつアルコキシシリル基を２〜７０質量％含有するのが好ましい。
【０１２１】
触媒としては、アルコキシシリル基の加水分解縮合反応に用いる従来公知の触媒が特に制限なく用いられる。触媒として、具体的には、塩酸、硝酸、酢酸、硫酸、燐酸、スルホン酸例えば、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、等の酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア等の塩基やアルミ系、チタン系の金属触媒が挙げられる。
【０１２２】
化合物（Ｘ）として、化合物（Ｘ１）を用いる場合には、その他の固形分として、生体親和性基を有しないアルコキシシラン化合物および／またはその部分加水分解縮合物を用いてもよい。生体親和性基を有しないアルコキシシラン化合物としては、上記化合物６が好ましい。生体親和性基を有しないアルコキシシラン化合物を部分加水分解縮合物とする場合には、そのＭｗは１００〜１００，０００が好ましく、１００〜１０，０００がより好ましい。
【０１２３】
組成物（Ｙ）が、固形分として化合物（Ｘ１）と、生体親和性基を有しないアルコキシシラン化合物を含有する場合、化合物（Ｘ１）と生体親和性基を有しないアルコキシシラン化合物の合計における、生体親和性基の含有量は２５〜８３質量％であり、アルコキシシリル基の含有量が２〜７０質量％であるのが好ましい。すなわち、固形分としてこれら以外の、生体親和性基および／またはアルコキシシリル基を有する化合物を含有しないことが好ましい。この場合、化合物（Ｘ１）１００質量部に対する生体親和性基を有しないアルコキシシラン化合物の割合は、５０〜２００質量部が好ましく、５０〜１００質量部がより好ましい。
【０１２４】
化合物（Ｘ）として、化合物（Ｘ１）を用いる場合には、全固形分中の化合物（Ｘ１）、生体親和性基を有しないアルコキシシラン化合物および触媒以外のその他の固形分の含有量は、合計で４０質量％以下が好ましく、２０質量％以下がより好ましく、含有しないことが最も好ましい。
【０１２５】
化合物（Ｘ）として、化合物（Ｘ２）を用いる場合にも、必要に応じて化合物（Ｘ２）以外のアルコキシシラン化合物を用いてもよい。化合物（Ｘ）として、化合物（Ｘ２）を用いる場合には、全固形分中の化合物（Ｘ２）および触媒以外のその他の固形分の含有量は、合計で４０質量％以下が好ましく、２０質量％以下がより好ましく、含有しないことが最も好ましい。
【０１２６】
表層５の形成をウェットコーティングで行う場合に組成物（Ｙ）が含有する液状媒体は、化合物（Ｘ）を含む固形分を均一に溶解または分散可能であればよく、公知の各種の液状媒体のなかから適宜選択できる。液状媒体は、表層の形成に際して、最終的には除去される必要があるため、その沸点は６０〜１６０℃の範囲にあることが好ましく、６０〜１２０℃がより好ましい。
【０１２７】
液状媒体として、具体的には、アルコール類、エーテル類、ケトン類、酢酸エステル類等が好ましい。上記沸点の条件を満足する液状媒体として、具体的には、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）、エタノール、プロピレングリコールモノメチルエーテル、２−ブタノン等が挙げられる。これらは、１種を単独で使用しても、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【０１２８】
液状媒体は、化合物（Ｘ）を含む加水分解性シリル基含有成分が加水分解反応するための水を含有することができるが、貯蔵安定性の観点からは水を含有しないことが好ましい。ただし、液状媒体が水を含有しない場合でも、化合物（Ｘ）を含む加水分解性シリル基含有成分は大気中の水分により加水分解反応が可能であるため、液状媒体における水の含有は必須ではない。
【０１２９】
液状媒体を含有する場合の組成物（Ｙ）中の固形分濃度は、０．１〜５０質量％が好ましく、１〜３０質量％がより好ましく、１〜１５質量％がさらに好ましい。固形分濃度が上記範囲内であると、組成物（Ｙ）を用いてウェットコーティングで形成される表面層の膜厚が、防藻性とその耐久性を十分に発揮できる好適な範囲内となりやすい。組成物（Ｙ）の固形分濃度は、組成物（Ｙ）を８０℃３時間の真空乾燥した後の質量と、加熱前の組成物（Ｙ）の質量とから算出できる。組成物（Ｙ）の製造時に配合される全固形分と液状媒体の量から算出してもよい。
【０１３０】
液状媒体を含有する場合の組成物（Ｙ）は、液状媒体を５０〜９９．５質量％含むことが好ましく、６５〜９９質量％含むことがより好ましく、７０〜９９質量％含むことがさらに好ましい。
【０１３１】
組成物（Ｙ）の製造方法は特に限定されない。化合物（Ｘ）を含む固形分を、さらに液状媒体を含む場合は、これら固形分と液状媒体を、上記含有量となるように混合すればよい。組成物（Ｙ）にあっては、上記に説明したとおり、化合物（Ｘ）を含み、固形分中の生体親和性基の含有量が２５〜８３質量％であり、アルコキシシリル基の含有量が２〜７０質量％であるため、組成物（Ｙ）を用いて底部３の表面に形成される該組成物の硬化物からなる表層５は、細胞の接着を抑制する能力に優れるとともに、耐久性、特に耐水性に優れる。
【０１３２】
表層５の厚さは、０．５〜２０ｎｍが好ましく、０．５〜１０ｎｍが特に好ましい。表層５の厚さが上記範囲の下限値以上であれば、細胞の接着を抑制する性能、および耐久性、特に耐水性を発現しやすい。表層５の厚さが上記範囲の上限値以下であれば、強度が優れる。表層５の厚さは、リガク社ＡＴＸ−Ｇに代表されるＸ線反射率測定装置での測定により求められる。
【０１３３】
底部３上面の所定の領域に組成物（Ｙ）を用いて表層５を形成する方法としては、ドライコーティングまたはウェットコーティングが挙げられ、ドライコーティングが好ましい。
【０１３４】
ドライコーティングとしては、真空蒸着、ＣＶＤ、スパッタリング等の手法が挙げられる。化合物（Ｘ）の分解を抑える点、および装置の簡便さの点から、真空蒸着法が好適に利用できる。真空蒸着法は、抵抗加熱法、電子ビーム加熱法、高周波誘導加熱法、反応性蒸着、分子線エピタキシー法、ホットウォール蒸着法、イオンプレーティング法、クラスターイオンビーム法等に細分することができるが、いずれの方法も適用できる。化合物（Ｘ）の分解を抑制する点、および装置の簡便さの点から、抵抗加熱法が好適に利用できる。真空蒸着装置は特に制限なく、公知の装置が利用できる。
【０１３５】
真空蒸着法を用いる場合の成膜条件は、適用する真空蒸着法の種類によって異なるが、抵抗加熱法の場合、蒸着前真空度は１×１０−２Ｐａ以下が好ましく、１×１０−３Ｐａ以下が特に好ましい。蒸着源の加熱温度は、蒸着源（ドライコーティング用の組成物（Ｙ））が十分な蒸気圧を有する温度であれば特に制限はない。具体的には３０〜４００℃が好ましく、５０〜３００℃が特に好ましい。
【０１３６】
加熱温度が上記範囲の下限値以上であれば、成膜速度が良好になる。上記範囲の上限値以下であれば、化合物（Ｘ）の分解が生じることなく、底部３の上面３ａの所定の領域に表層５を形成できる。真空蒸着時の底部３の温度は、室温（２０〜２５℃）から２００℃までの範囲であることが好ましい。底部３の温度が室温以上であれば、成膜速度が良好になる。底部３の温度が２００℃以下であれば縮合反応せずに基板に成膜することができ、成膜後速やかに基板と共有結合することが可能である。底部３の温度の上限値は１００℃がより好ましい。
【０１３７】
ドライコーティング法に際して、底部３の上面３ａの所定の領域への組成物（Ｙ）の付着は、得られる表層５の厚みを上記好ましい厚みとするために、化合物（Ｘ）の付着量として０．５〜１０ｍｇ／ｍ２となるように行うことが好ましい。化合物（Ｘ）の付着量は、０．５〜５ｍｇ／ｍ２がより好ましく、１．０〜５．０ｍｇ／ｍ２が特に好ましい。
【０１３８】
ドライコーティング法に際して、化合物（Ｘ）の反応は、上記成膜の際に底部３の温度を上記のとおり調整することにより略同時に進行する。この際、化合物（Ｘ）が有するアルコキシシリル基から加水分解反応により生成したシラノール基は、その一部が縮合反応して分子間が結合される。化合物（Ｘ）から生成したシラノール基は、底部３の上面３ａが有するガラス材料−ＯＨ基と縮合反応して底部３と表層５は共有結合で接合される。
【０１３９】
ウェットコーティングにより表層を形成する方法としては、底部３の所定の表面に、上記で説明した液状媒体を含む組成物（Ｙ）を塗布し塗膜を得ること（以下、「塗布工程」ともいう。）、および該塗膜を硬化して表層を得ること（以下、「硬化工程」ともいう。）を含む方法が挙げられる。
【０１４０】
塗布工程における、組成物（Ｙ）の底部３表面への塗布方法としては、例えばディップコート法、スピンコート法、ワイプコート法、スプレーコート法、スキージーコート法、ダイコート法、インクジェット法、フローコート法、ロールコート法、キャスト法、ラングミュア・ブロジェット法、グラビアコート法等が挙げられる。
【０１４１】
硬化工程における、塗膜の硬化方法としては、加熱が好ましい。加熱温度は、化合物（Ｘ）の種類によるが、５０〜２００℃が好ましく、８０〜１５０℃がより好ましい。なお、硬化工程においては、通常、液状媒体の除去も同時に行う。したがって、加熱温度は、液状媒体の沸点以上の温度が好ましい。
【０１４２】
ウェットコーティングによる表層５の形成においては、必要に応じて塗布工程、乾燥工程以外の工程処理を有してよい。例えば、組成物（Ｙ）が水を含有しない場合、硬化工程と同時、または、硬化工程の前、後に、加湿等の処理を行ってもよい。
【０１４３】
また、表層５の形成後、表層５中の化合物であって余剰の化合物は、必要に応じて除去してもよい。具体的な方法としては、例えば、表層５に溶剤、例えば組成物（Ｙ）の液状媒体として用いた化合物をかけ流す方法や、溶剤、例えば組成物（Ｙ）の液状媒体として用いた化合物をしみ込ませた布でふき取る方法が挙げられる。
【０１４４】
以上、本発明の細胞培養容器を、図１および図２に示す細胞培養容器１０を一例として説明した。また、表層５については、特に組成物（Ｙ）を用いて形成される表層５を例に説明した。細胞培養容器１０においては、本発明の趣旨に反しない限度において、また必要に応じて、その構成を適宜変更することができる。例えば、本発明の細胞培養容器は、図１および図２に示すような、底部３と側壁２とで形成される開口部１を１つ有し、開口部１から臨む底部３上面３ａの領域Ｓに、表層５が形成された複数の凹部４を有する構成を１ユニットとして、該ユニットを複数有する細胞培養容器であってもよい。
【０１４５】
図４は、上記ユニットを複数有する細胞培養容器の一例を概略的に示す平面図である。図４に示す細胞培養容器２０は、平面視が矩形であり、上記ユニットを縦に略等間隔に４個配置した構成を一列として、該構成を横方向に略等間隔に４列配した構成である。１ユニットにおける、開口部１、側壁２、底部３、凹部４、表層５、マイクロ空間Ｍ等の各構成要素については、細胞培養容器１０で説明したのと同様にできる。なお、細胞培養容器２０において、側壁２は隣り合うユニット同士で共用した構成としている。また、図４において、符号Ｍ（４）は、図１におけるＭ（４）と同様に、マイクロ空間Ｍと凹部４を合わせて示す符号である。
【０１４６】
細胞培養容器２０の平面視における大きさ、形状は、用途に応じて適宜調整できる。取り扱い性の観点から、形状は矩形が好ましく、縦、横がそれぞれ独立して、７５〜１５０ｍｍの範囲にあるのが好ましい。細胞培養容器２０が有するユニットの数は、細胞培養容器２０の大きさおよびユニットの大きさにより適宜調整される。細胞培養容器２０におけるユニット数は、通常、６〜１５３６個程度であり、６〜３８４個が好ましい。
【０１４７】
細胞培養容器２０において、底部３は、例えば、細胞培養容器２０の外周と同じ形状、大きさの外周を有する略板状のガラス板であって、上面３ａの各ユニットに対応する領域Ｓに所定の個数の凹部４を有する構成とすることができる。また、側壁２は、底部３の上面３ａ上に、所定の大きさの開口部１が所定の配列で複数個形成されるように格子状に一体成形された側壁２とすることができる。
【０１４８】
本発明の細胞培養容器は、例えば、ＥＯＧ滅菌（６０℃のエチレンオキサイドガスを用いた滅菌）、オートクレーブ滅菌（１２１℃の飽和水蒸気中での２０分間の滅菌）の滅菌処理を施した後に、細胞培養に供される。本発明の細胞培養容器は、スフェロイドの作製に好適に用いられる。
【０１４９】
例えば、細胞培養容器１０を用いてスフェロイドを作製する場合、培養の対象となる複数の細胞（細胞懸濁液）を細胞培養容器１０内に投入した後、細胞培養容器１０本体を揺動させることで、複数のマイクロ空間Ｍに対して、複数の細胞を均一的に分散して配置する。その後、数時間〜数日間、例えば３７℃、飽和水蒸気下、５％炭酸ガス雰囲気に保たれた培養装置内で培養やインキュベートが行われる。
【０１５０】
マイクロ空間Ｍの内面が表層５の表面で形成されているため、マイクロ空間Ｍ内の細胞は、その内面に接着することなく、細胞同士が接着して、スフェロイドを形成する。この際、細胞は、マイクロ空間Ｍの形状および大きさに対応して、三次元的に凝集する。本発明の細胞培養容器においては、これにより、大きさの均一化されたスフェロイドを高効率に得ることが可能である。
【０１５１】
さらに、底部３はガラス材料からなり、スフェロイドを作製した後、細胞培養容器１０をそのまま、顕微鏡観察、特には、蛍光顕微鏡観察に用いても、高精度な観察が可能である。
【０１５２】
心筋細胞、がん細胞スフェロイドを作製し、薬効や毒性を調査する創薬スクリーニング用途への応用を考えた際、大きさの均一性を表す指標であるスフェロイドの平均直径の±５％の割合は、２０％以上であることが好ましく、３０％以上であることが特に好ましく、５０％以上であることがさらに好ましい。
【実施例】
【０１５３】
以下、実施例を示して本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の記載によっては限定されない。「％」は、特に規定のない限り、「質量％」を示す。例１〜９は表層付き底部の作製例（ただし、例９は底部のみ）であり、例１〜７が実施例、例８、９が比較例である。例１１〜１９は、細胞培養容器の実施例である。【０１５４】
（ガラス基板上面への凹部の形成）
以下の方法で、凹部の構成が図３Ａ、図３Ｂに示すのと概略同様であるが、凹部の個数、サイズ等が以下に示すとおりである領域Ｓが、以下の所定の個数配置された以外は、図４に示す細胞培養容器２０の底部３と概略同様の構成の底部を２種類作製した。【０１５５】
＜底部の構成１；底部３Ｘ＞
底部３Ｘは、以下の凹部構成１を有する領域Ｓが、縦１０８ｍｍ、横７５ｍｍ、厚さ０．６ｍｍのガラス基板の一方の主面に３８４個配置された構成である。各領域Ｓは、領域Ｓ間の平坦領域Ｓｆに格子状の側壁が設けられるように配置されている。【０１５６】
凹部構成１は、領域Ｓが３．０ｍｍ×３．０ｍｍ、凹部４の形状が半球状であり、領域Ｓ内の凹部４の個数が１５６個、凹部４の深さＨが１００μｍ、凹部開口面４ａの直径Ｄｈが２００μｍ、隣り合う凹部４における凹部開口面４ａの中心間の距離Ｄｘが２４０μｍ、Ｄｘ／Ｄｈが１．２である。【０１５７】
＜底部の構成２；底部３Ｙ＞
底部３Ｙは、以下の凹部構成２を有する領域Ｓが、縦１０８ｍｍ、横７５ｍｍ、厚さ０．６ｍｍのガラス基板の一方の主面に９６個配置された構成である。各領域Ｓは、領域Ｓ間の平坦領域Ｓｆに格子状の側壁が設けられるように配置されている。【０１５８】
凹部構成２は、領域Ｓが１２．０ｍｍ×１２．０ｍｍ、凹部４の形状が半球状であり、領域Ｓ内の凹部４の個数が２５０個、凹部４の深さＨが２５０μｍ、凹部開口面４ａの直径Ｄｈが５００μｍ、隣り合う凹部４における凹部開口面４ａの中心間の距離Ｄｘが５００μｍ、Ｄｘ／Ｄｈが２．０である。【０１５９】
＜ガラス基板への凹部形成＞
両主面にＣｒ層を有するガラス基板（Ｄｒａｇｏｎｔｒａｉｌ（登録商標）、ＡＧＣ社製、縦１０８ｍｍ、横７５ｍｍ、厚さ０．６ｍｍ）の両主面のＣｒ層上にスピンコーターで感光性樹脂組成物（商品名：Ｇｌｉｂｅｓ  Ｎ−１００、東京応化工業株式会社製）を塗布し、ソフトベークおよびプリベークを行った。次に、一方の主面については、非露光部が凹部開口面４ａに相当するＣｒマスクを介して、他方の主面についてはマスクを介さず全面に、紫外線を照射し、ポストエクスポジャーベークを行った。次いで、現像液により未露光部分を溶解除去して、凹部形成領域を除いて感光性樹脂組成物の硬化膜（保護膜）が形成されたガラス基板を得た。【０１６０】
得られた保護膜付きのガラス基板の全体を、フッ化水素／硫酸／水＝１５／１５／７０（質量比）のエッチング液に浸漬し、エッチング液中で保護膜付きのガラス基板を揺動することにより所定の大きさの凹部４が形成されるまでエッチングを行った。次いで、エッチング後の保護膜付きのガラス基板を剥離液に浸漬し、感光性樹脂組成物の硬化膜およびＣｒ層を剥離し、上面３ａとなる一方の主面に上記所定の領域に所定の大きさ、形状の凹部４を有する底部３Ｘおよび底部３Ｙを得た。【０１６１】
（化合物（Ｘ）の合成、準備）
＜化合物（Ｘ１）＞
化合物（Ｘ１）に分類される化合物および比較例用の生体親和性基を有しない化合物を以下のとおり合成または準備した。【０１６２】
化合物（Ｘ１１−１）；以下に構造を示す化合物（Ｘ１１−１）、すなわち、２−［メトキシ（ポリオキシエチレン）９−１２プロピル］トリメトキシシランとして、市販品、ＳＩＭ６４９２．７２（商品名、Ｇｅｌｅｓｔ社製））を準備した。化合物（Ｘ１１−１）は、化合物（Ｘ１１）の末端水素原子がメチル基に置換され、ｎ１が９〜１２、Ｑ１が−Ｃ３Ｈ６−、ｔが３、Ｒ８がメチル基の化合物である。【０１６３】
【化８】
2019151114.tif 000010
【０１６４】
化合物（Ｘ１１−２）；化合物（Ｘ１１−１）においてオキシエチレン基の繰り返し数が６〜９である以外は同じ分子構造の化合物（Ｘ１１−２）、すなわち、２−［メトキシ（ポリエチレンオキシ）６−９プロピル］トリメトキシシランとして、市販品、ＳＩＭ６４９２．７（商品名、Ｇｅｌｅｓｔ社製））を準備した。【０１６５】
化合物（Ｘ１２−１）；以下に構造を示す化合物（Ｘ１２−１）は、化合物（Ｘ１２）において、ｎ１が７〜８、Ｑ１が−ＣＯＮＨＣ３Ｈ６−、ｔが３、Ｒ８がエチル基の化合物であり、次の方法で合成した。【０１６６】
【化９】
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【０１６７】
３００ｍＬナス型フラスコに、ｎ１が７〜８のポリオキシエチレングリセリルエーテル（表１中、「ポリオキシエチレンポリオールＡ」と示す。）２６３ｇ（２５９ｍｍｏｌ）、ＫＢＥ−９００７（信越シリコーン社製、製品名、トリエトキシシリルプロピルイソシアネート）６４．１ｇ（２５９ｍｍｏｌ）を加えた。続いて、得られた混合物に対して１質量％のトリエチルアミン３．２７ｇ（３２．４ｍｍｏｌ）を加え、その後８０℃で１６時間撹拌した。続いて、得られた反応混合物をロータリーエバポレーターによって加熱減圧しトリエチルアミンを除去して無色透明液体として化合物（Ｘ１２−１）を得た。収量は３２７ｇ、収率は１００％であった。【０１６８】
化合物（Ｃｆ１）；化合物（Ｃｆ１）として（３−メトキシプロピル）トリメトキシシラン（ＣＨ３−Ｏ−（ＣＨ２）３−Ｓｉ（ＯＣＨ３）３）、市販品、ＳＩＭ６４９３．０（商品名、Ｇｅｌｅｓｔ社製））を準備した。【０１６９】
化合物（Ｘ１２−１）の合成に用いたポリオキシエチレンポリオールの種類およびポリオキシエチレンポリオールに対するＫＢＥ−９００７の添加量（当量）、および、上記各化合物における、Ｍｗ、基１（４）における（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）の繰り返し数（ｎ１）、基１が基４中の基１である割合（モル％）、化合物中の生体親和性基（基１（４）の割合(質量％））、アルコキシシリル基の割合（質量％）を表１に示す。【０１７０】
【表１】
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【０１７１】
＜共重合体（Ｘ２１）＞
化合物（Ｘ２）として、共重合体（Ｘ２１−１）〜共重合体（Ｘ２１−３）を以下の表２に示す単量体組成（質量比）で製造して用いた。また、生体親和性基を有する単量体の単独重合体（Ｍ）（化合物（Ｘ）ではない）を製造して用いた。なお、用いた単量体とその略号を以下に示す。表２に示す単量体組成、例えば、製造例２におけるＨＥＭＡ／ＫＢＭ−５０３＝９５／５は、ＨＥＭＡとＫＢＭ−５０３を質量比で９５：５の割合で用いたことを示す。他の製造例においても同様である。【０１７２】
＜単量体略号＞
（１）単量体（Ａ）
ＫＢＭ−５０３；信越シリコーン社製、製品名、トリメトキシシリルプロピルメタクリレート（ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）−ＣＯＯ−（ＣＨ２）３−Ｓｉ（ＯＣＨ３）３）
ＫＢＭ−５１０３；信越シリコーン社製、製品名、トリメトキシシリルプロピルアクリレート（ＣＨ２＝ＣＨ−ＣＯＯ−（ＣＨ２）３−Ｓｉ（ＯＣＨ３）３）【０１７３】
（２）単量体（Ｂ１）
ＡＭＥ−４００；ブレンマーＡＭＥ−４００（日油社製、商品名、ＣＨ２＝ＣＨ−ＣＯＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）９−ＣＨ３）
ＨＥＭＡ；ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）−ＣＯＯ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−Ｈ
ＨＥＡ；ＣＨ２＝ＣＨ−ＣＯＯ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−Ｈ【０１７４】
［製造例１］
５００ｍＬ３つ口フラスコに、ＨＥＭＡの５７．０ｇ（４３８ｍｍｏｌ）、ＫＢＭ−５０３の３．００ｇ（１２．１ｍｍｏｌ）、１−メトキシ‐２−プロパノールの１１９ｇ、ジアセトンアルコールの２１ｇ、および２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオン酸）ジメチルの６００ｍｇ（２．６１ｍｍｏｌ）を加えた。反応液中の単量体の濃度を３０質量％、開始剤濃度を１質量％とした。続いて、得られた混合物を７５℃、窒素雰囲気下で１６時間撹拌し、室温まで空冷し無色透明液体（共重合体（Ｘ２１−１）を３０質量％含む溶液）を得た。収量は２００ｇ、収率は１００％であった。【０１７５】
［製造例２〜４］
製造例１において、単量体組成を表２に示すとおりに変更した以外は同様にして、（共重合体（Ｘ２１−２）、（Ｘ２１−３）を製造した。また、生体親和性基を有する単量体の単独重合体（Ｍ）を製造した。【０１７６】
製造例１〜４で得られた化合物（共重合体）における、Ｍｗ、基１（４）における（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）の繰り返し数（ｎ２）、化合物中の生体親和性基（基１（４）の割合（質量％））、アルコキシシリル基の割合（質量％）を表２に示す。【０１７７】
【表２】
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【０１７８】
［例１］
上記で作製した凹部構成が異なる２種類の底部３Ｘ、３Ｙを洗浄し、その凹部４が形成された表面に化合物（Ｘ１１−１）を真空蒸着（背圧３．４×１０−４Ｐａ、基板温度２５℃）することにより、膜厚２ｎｍの表層５を形成して、底部３Ｘから表層付き底部ＡＸを、底部３Ｙから表層付き底部ＡＹを得た。【０１７９】
［例２］
例１において、化合物（Ｘ１１−１）の代わりに化合物（Ｘ１１−２）を用いた以外は同様にして、底部３Ｘから表層付き底部ＢＸを、底部３Ｙから表層付き底部ＢＹを得た。【０１８０】
［例３］
共重合体（Ｘ２１−１）を含む溶液（固形分濃度：３０質量％）を１−メトキシ−２−プロパノールとジアセトンアルコールと０．１質量％硝酸水溶液を質量比５１：９：４０で混合した溶媒に、固形分濃度１０質量％になるように添加し、５０℃、１６時間撹拌して、共重合体（Ｘ２１−１）の部分加水分解縮合物を含む液状組成物を得た。得られた部分加水分解縮合物のＭｗを表２に示す。さらに、この液状組成物を、固形分濃度が１．０質量％となるように、メトキシプロパノールとジアセトンアルコールの８５：１５（質量比）の混合溶媒に溶解させ、表層形成用組成物とした。【０１８１】
上記で作製した凹部構成が異なる２種類の底部３Ｘ、３Ｙを洗浄し、表層形成用組成物を用いてディップコート法により、底部３Ｘ、３Ｙの凹部４が形成された表面に表層形成用組成物の塗膜を形成した。次いで、これを、１５０℃の熱風循環オーブンで１時間乾燥して、膜厚１．８ｎｍの表層５を形成して、底部３Ｘから表層付き底部ＣＸを、底部３Ｙから表層付き底部ＣＹを得た。【０１８２】
［例４、５、６］
例３において、共重合体（Ｘ２１−１）を、共重合体（Ｘ２１−２）、共重合体（Ｘ２１−３）、または化合物（Ｘ１２−１）に変えた以外は、同様にして、底部３Ｘから表層付き底部ＤＸ、ＥＸ、ＦＸを、底部３Ｙから表層付き底部ＤＹ、ＥＹ、ＦＹ、を得た。なお、共重合体（Ｘ２１−２）、共重合体（Ｘ２１−３）、または化合物（Ｘ１２−１）の部分加水分解縮合物のＭｗを表２または表１に示す。【０１８３】
［例７］
単独重合体（Ｍ）を固形分濃度が１．０質量％となるように、メトキシプロパノールとジアセトンアルコールの８５：１５（質量比）の混合溶媒に溶解させ、表層形成用組成物とした。得られた表層形成用組成物を用いて、例３と同様にして底部３Ｘから表層付き底部ＧＸを、底部３Ｙから表層付き底部ＧＹを得た。【０１８４】
［例８］
例３において、共重合体（Ｘ２１−１）を、化合物（Ｃｆ１）に変えた以外は、同様にして、底部３Ｘから表層付き底部ＨＸを、底部３Ｙから表層付き底部ＨＹを得た。なお、化合物（Ｃｆ１）の部分加水分解縮合物のＭｗを表１に示す。【０１８５】
［例９］
例９として、上記で作製した凹部構成が異なる２種類の底部３Ｘ、３Ｙをそのまま用いた。【０１８６】
［評価］
上記で底部３Ｘから得られた表層付き底部ＡＸ〜ＨＸ、および、底部３Ｘについて、細胞非接着性、溶出量を評価した。結果を表３に示す。【０１８７】
（細胞非接着性）
上記で底部３Ｘから得られた表層付き底部ＡＸ〜ＨＸ、底部３Ｘをそれぞれ、２３ｍｍ×２５ｍｍ（凹部構成１の領域Ｓを２０〜３０個含む）に切断し、５０ｃｃのガラスバイアル瓶に入れ、さらにＩＰＡを１０ｃｃ加えて超音波で１０分洗浄を行った。ＩＰＡを吸引した後、同様にエタノールを１０ｃｃ入れ超音波で１０分洗浄行い、乾燥させることで評価用基板を準備した。【０１８８】
得られた洗浄済みの２３ｍｍ×２５ｍｍの評価用基板を３５ｍｍφのポリスチレン製シャーレ（１０００−０３５：ＡＧＣテクノグラス社製）に設置し、１６時間クリーンベンチでＵＶ照射滅菌を行った。【０１８９】
播種時の細胞生存割合が９７％以上であることが確認されたＴＩＧ−３細胞が３ｍＬあたり１３万細胞になるように、１０％ＦＢＳが添加されたＭＥＭを培地として用いて、細胞懸濁液の調製を行った。細胞懸濁液の３ｍＬを上記評価基板が設置されたシャーレに分注することで細胞を播種し３７℃のインキュベーターで２４時間培養した。その後、観察領域を１．８ｍｍ×１．３ｍｍの範囲として、３箇所の観察領域において、顕微鏡観察（１０倍）を行い細胞の伸展の有無で接着の判定を以下の基準で行った。なお、細胞が評価用基板に対して楕円状または正円状に広がっている状態を細胞の伸展と定義する。【０１９０】
「○」；全ての箇所の観察領域に細胞が付着していない。
「△」；少なくとも１箇所の観察領域において、その一部に細胞が付着している。
「×」；全箇所について観察領域の略全体に細胞が付着している。【０１９１】
（溶出量測定）
上記で底部３Ｘから得られた表層付き底部ＡＸ〜ＨＸ、底部３Ｘをそれぞれ、１０８ｍｍ×２５ｍｍ（面積；２７ｃｍ２）に切断した検体を、１００ｍＬのガラス製バイアル瓶に蒸留水３０ｍＬとともに入れ７日間４０℃で静置してＴＯＣを溶出させた。得られた溶出液の、ＴＯＣ濃度［ｍｇ／Ｌ］をＴＯＣ計ＴＮＣ−６０００（東レエンジニアリング社製）により測定し、上記検体の面積（２７ｃｍ２）で除して表層の単位面積１ｃｍ２当たりのＴＯＣ溶出量［ｍｇ／Ｌ］を算出した。底部３ＸからのＴＯＣ溶出量は０ｍｇ／Ｌであることから、得られたＴＯＣ溶出量は、表層からのＴＯＣ溶出量を意味する。【０１９２】
【表３】
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【０１９３】
［例１１〜１４］
上記で得られた凹部構成１の領域Ｓを３８４個有する表層付き底部ＡＸ〜ＤＸを、細胞接着性の評価の際と同様の洗浄方法で洗浄した。表層付き底部ＡＸ〜ＤＸの平坦領域Ｓｆに対応するように格子状に成形された、外周サイズが１０８×７５ｍｍ、格子で仕切られた区画（領域Ｓに対応する）の数３８４個、高さ１０ｍｍの側壁２Ｘ（ＡＧＣ社製、材質；ポリスチレン）を、洗浄後の表層付き底部ＡＸ〜ＤＸの領域Ｓ間の平坦領域Ｓｆの表層上に両面テープにより貼りあわせて、平面視が図４に示す細胞培養容器２０と概略同様であるがユニット数が３８４個である例１１〜１４の３８４穴マイクロウェルプレート型培養容器（底部のサイズ；１０８×７５ｍｍ、深さ；１０ｍｍ）１１〜１４を作製した。【０１９４】
［例１５〜１９］
上記と同様に凹部構成２の領域Ｓを９６個有する表層付き底部ＡＹ、ＣＹ〜ＦＹと、表層付き底部ＡＹ、ＣＹ〜ＦＹの平坦領域Ｓｆに対応するように格子状に成形された外周サイズが１０８×７５ｍｍ、格子で仕切られた区画（領域Ｓに対応する）の数９６個、高さ１０ｍｍの側壁２Ｙ（ＡＧＣ社製、材質；ポリスチレン）を用いて、例１５〜１９の９６穴マイクロウェルプレート型培養容器（底部のサイズ；１０８×７５ｍｍ、深さ；１０ｍｍ）１５〜１９を作製した。【０１９５】
[評価]
（スフェロイド作製効率）
上記マイクロウェルプレート型培養容器１１〜２０のそれぞれに、１ｍＬあたり２００，０００細胞に調整した細胞懸濁液を５０μＬ分注することで細胞を播種し３７℃のインキュベーターで２４時間培養した。その後、マイクロウェルプレート型培養容器内の細胞をＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭ  を用いて染色し、蛍光顕微鏡によりスフェロイドの観察を行った。蛍光顕微鏡（５倍）の観察画像をＩｍａｇｅ−Ｊ（アメリカ国立衛生研究所 (NIH)製、Ｖｅｒ．１，４７）を用いて、画像解析をすることで、観察領域（２．３４ｍｍ２）において、スフェロイドの大きさの定量化を行い、スフェロイドの平均直径およびスフェロイド平均直径±５％の割合（％）の算出を行った。なお、スフェロイドの平均直径は、スフェロイドを円と仮定し、Ｉｍａｇｅ−Ｊで画像解析することによって算出した。結果を表４に示す。【０１９６】
図５に、例１１の細胞培養容器１１を用いて評価した際の、スフェロイド直径の分布状態を示す。図５おいて、例えば、スフェロイド直径が６０μｍで示される個数は、５５μｍ超６０μｍ以下の直径のスフェロイドの個数である【０１９７】
【表４】
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【０１９８】
表４からわかるように本発明の実施例である例１１〜１９の細胞培養容器を用いれば、均一な大きさのスフェロイドが効率よく生産できる。さらに、例１１〜１９の細胞培養容器においては、上記のとおり蛍光顕微鏡観察が容易である。
【産業上の利用可能性】
【０１９９】
本発明の細胞培養容器を用いれば、均一な大きさのスフェロイドを高効率に作製し、顕微鏡観察、特には蛍光顕微鏡観察を簡便に実施できる。そのため、薬効や毒性を調査する創薬スクリーニング用途での使用に好適である。
なお、２０１８年２月１日に出願された日本特許出願２０１８−０１６７３７号の明細書、特許請求の範囲、図面及び要約書の全内容をここに引用し、本発明の明細書の開示として、取り入れるものである。
【符号の説明】
【０２００】
１０、２０…細胞培養容器、１…開口部、２…側壁、３…底部、４…凹部、５…表層。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2019151114.tif 000021
【図４】
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【図５】
2019151114.tif 000023
【国際調査報告】
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