(57)【要約】  本発明は、埋め込み型バイオセンサのプローブにおいて、レドックスメディエータとして、フェナジン基をポリアミノ酸、ポリイミンまたはポリアリルアミンなどの、カルボキシル基またはアミノ基を有する高分子量ポリマーに共有結合させ、ポリエチレングリコール鎖によりフェナジン基と高分子量ポリマー主鎖との間の距離を延長したフェナジン誘導体を用いて、検知層を形成する。
2019187586.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料に含まれる検体を検出または定量するセンサであって、少なくとも、一般式（１）：
【化１】
2019187586.tif 000033
［式中、X-は陰イオン種を示し、Rは末端にアミノ基またはカルボキシル基を有する有機基を示す。］
で表されるフェナジン誘導体および検体応答性酵素を含む、センサ。
【請求項２】
一般式（１）で表されるフェナジン誘導体が、一般式（２）：
【化２】
2019187586.tif 000034
［式中、X-は陰イオン種を示し、R1は存在しないか、または-O-、-C(=O)-NH-もしくは-NH-C(=O)-であり；R2は-COOHもしくは-NH2またはそれらの塩であり；p、qおよびsは、それぞれ、独立して、１〜１５の整数であって；rは０〜３０の整数である。］
で表されるフェナジン誘導体である、請求項１に記載のセンサ。
【請求項３】
一般式（１）で表されるフェナジン誘導体が、
【化３】
2019187586.tif 000035
で表されるアミノ基を有するフェナジン誘導体よりなる群から選択され、または、
【化４】
2019187586.tif 000036
で表されるカルボキシル基を有するフェナジン誘導体よりなる群から選択される、請求項１に記載のセンサ。
【請求項４】
前記検体がグルコースであり、前記検体応答性酵素がグルコース酸化酵素またはグルコース脱水素酵素である、請求項１に記載のセンサ。
【請求項５】
一般式（１）：
【化５】
2019187586.tif 000037
［式中、X-は陰イオン種を示し、Rは末端にアミノ基またはカルボキシル基もしくはカルボキシル基とN-スクシンイミドとのエステルを有する有機基を示す。］
で表されるフェナジン誘導体が、分子内にカルボキシル基またはアミノ基を含む高分子量ポリマーに共有結合した高分子量レドックスポリマーであって、前記フェナジン誘導体のアミノ基またはカルボキシル基と、前記高分子量ポリマーのカルボキシル基またはアミノ基とのアミド結合により、フェナジン誘導体が高分子量ポリマーに共有結合している、高分子量レドックスポリマー。
【請求項６】
一般式（１）で表されるフェナジン誘導体が、一般式（２）：
【化６】
2019187586.tif 000038
［式中、X-は陰イオン種を示し、R1は存在しないか、または-O-、-C(=O)-NH-もしくは-NH-C(=O)-であり；R2は-COOHもしくは-NH2もしくはそれらの塩または下式：
【化７】
2019187586.tif 000039
で表されるカルボキシル基とN-スクシンイミドとのエステルであり；p、qおよびsは、それぞれ、独立して、１〜１５の整数であって；rは０〜３０の整数である。］
で表されるフェナジン誘導体である、請求項５に記載の高分子量レドックスポリマー。
【請求項７】
一般式（１）で表されるフェナジン誘導体が、
【化８】
2019187586.tif 000040
で表されるアミノ基を有するフェナジン誘導体よりなる群から選択され、または、
【化９】
2019187586.tif 000041
で表されるカルボキシル基を有するフェナジン誘導体よりなる群から選択される、請求項５に記載の高分子量レドックスポリマー。
【請求項８】
前記カルボキシル基を有するフェナジン誘導体のカルボキシル基がＮ−ヒドロキシスクシンイミドでエステル化されている、請求項７に記載の高分子量レドックスポリマー。
【請求項９】
さらに、検体応答性酵素が共有結合する、請求項５〜８いずれかに記載の高分子量レドックスポリマー。
【請求項１０】
前記検体応答性酵素がグルコース酸化酵素またはグルコース脱水素酵素である、請求項９に記載の高分子量レドックスポリマー。
【請求項１１】
試料に含まれる検体を検出または定量するセンサであって、少なくとも、請求項５〜１０いずれかに記載の高分子量レドックスポリマーおよび検体応答性酵素を含む、センサ。
【請求項１２】
前記検体がグルコースであり、前記検体応答性酵素がグルコース酸化酵素またはグルコース脱水素酵素である、請求項１１に記載のセンサ。
【請求項１３】
前記検体応答性酵素が、高分子量レドックスポリマーに共有結合している、請求項１２に記載のセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、フェナジン誘導体またはフェナジン誘導体を含有する高分子量レドックスポリマーを用いたセンサに関する。特に、荷電レドックス酵素を用いたバイオセンサ用の高分子量レドックスポリマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオセンサとは、生体の有する分子認識能を利用あるいは模倣して物質を計測するシステムであり、例えば、酵素−基質、抗原−抗体、ホルモン−レセプターなどの組合せのうち一方を検体（測定対象物質）とし、他方を受容体として検体とその受容体との間の分子認識反応によって発生する化学的な変化をトランスデューサーで電気信号に変換し、得られた電気信号の強さに応じて検体の量を測定する測定装置である。【０００３】
バイオセンサに用いる生体分子として、上記以外にも遺伝子、糖鎖、脂質、ペプチド、細胞、組織なども含まれる。なかでも、酵素を用いたバイオセンサは盛んに開発が行われており、その代表例が、自己血糖測定に用いられるグルコース酸化酵素（Glucose oxidase; GOx）やグルコース脱水素酵素 (Glucose dehydrogenase; GDH)などを用いた電気化学式グルコースセンサである。【０００４】
自己血糖測定に用いられる電気化学式グルコースセンサは、概略、その表面に電極が形成された絶縁基板の上に、スペーサーを介してカバーが配置されている構成である。前記電極上には検体応答性酵素、レドックスメディエータ（電子伝達体）等を含む試薬が配置されており、この部分が分析部となる。この分析部には、血液を導入するための流路の一端が連通しており、前記流路の他端は外部に向かって開口しており、ここが血液供給口となる。このようなセンサを用いた血糖値の測定は、例えば、次のようにして行われる。すなわち、まず、前記センサを専用の測定装置（メータ）にセットする。そして、指先等をランセットで傷つけて出血させ、これに前記センサの血液供給口を接触させる。血液は、毛細管現象によりセンサの流路に吸い込まれ、これを通って分析部に導入され、ここで、前記試薬と接触する。そして、検体応答性酵素E（例えば、GOx、GDH）は、血液中のグルコースと特異的に反応することでグルコースを酸化する。レドックスメディエータMは、酸化によって発生した電子を受容する。電子を受容して還元されたレドックスメディエータMは、電極で電気化学的に酸化される。還元体レドックスメディエータMの酸化によって得られる電流値や電荷量などの大きさから、血液中のグルコース濃度、すなわち血糖値が簡便に検出される。【０００５】
このような電気化学式血糖センサは、糖尿病治療における血糖値管理に重要な役割を果たし、糖尿病患者は血糖値に基づく適切なインスリン投与や食事制限を行うことができる。しかしながら、一日に何度も血糖値を測定しなければならず、その都度血液採取をすることは患者に苦痛を強いることとなるので、生活の質（Quality of Life; QOL）を維持することが困難であった。【０００６】
すでに埋め込み型電気化学式グルコースセンサが開発されている。このような埋め込み型電気化学式グルコースセンサ1の本体10を生体2に貼り付けてプローブ11を生体内に挿入して継続的に血糖値の測定を行う（図１および２）。これにより、その都度血液採取することなく、長時間にわたり血糖値を測定することができる。【０００７】
埋め込み型バイオセンサは、そのプローブを長時間体内に挿入するので、構成要素である検体応答性酵素やレドックスメディエータが流出する機会が増大する。検体応答性酵素やレドックスメディエータがセンサ外部に流出すれば、検知感度が劣化するのみならず、生体に対して害を与えることとなる。また、検体応答性酵素やレドックスメディエータが外部に流出すれば、センサの耐久性も低下する。したがって、検体応答性酵素やレドックスメディエータの流出を防止する対策が非常に重要である。【０００８】
特許文献１は、酵素電気化学センサ用イオン型親水性高分子量レドックスポリマーを開示する。このイオン型親水性高分子量レドックスポリマーは、例えば、イオン部分を有する親水性ポリマーに複数のレドックスメディエータがペンダント状に共有結合されている。また、親水性ポリマーとしては、重合性アクリレートまたはビニル基を有する親水性モノマーから形成される。特許文献１のレドックスポリマーは、上記した親水性ポリマー主鎖にフェロセンなどのレドックスメディエータをペンダント状に共有結合することによって得られる。また、荷電レドックス酵素はイオン結合により固定化されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開2006-131893号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
埋め込み型バイオセンサのプローブにおいて、検知層を構成するレドックスメディエータの流出を防止する。特に、グルコース検知感度を維持しつつ、保存安定性（耐久性）を向上させることが必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本開示において、フェナジン誘導体などのレドックスメディエータを高分子量ポリマーに共有結合して、レドックスメディエータの流出を防止する高分子量レドックスポリマーを提供する。本開示に用いるレドックスメディエータは、アミノ基またはカルボキシル基を有する誘導体であり、本開示に用いる高分子量ポリマーはカルボキシル基またはアミノ基を有する。したがって、本開示の高分子量レドックスポリマーは、レドックスメディエータのアミノ基またはカルボキシル基と、高分子量ポリマーのカルボキシル基またはアミノ基との間のアミド結合により構成される。【００１２】
レドックスメディエータとしては、フェリシアン化物やフェロセンなどの種々の化合物を用いることができるが、本開示のフェナジン誘導体は、酸化還元電位が０Ｖよりも負（vs. Ag/AgCl 飽和KCl）であるため、生体試料中のアスコルビン酸（ビタミンＣ）、尿酸などの夾雑物の影響を受けにくいため、高精度な検体（アナライト）の検出が期待できる。【００１３】
本開示において、アミノ基またはカルボキシル基を有するレドックスメディエータとして、一般式（１）で表されるフェナジン誘導体を用いることができる。【００１４】
【化１】
2019187586.tif 000003
［式中、X-は陰イオン種を示し、Rは末端にアミノ基またはカルボキシル基を有する有機基を示す。］【００１５】
本開示の一般式（１）で表されるフェナジン誘導体は、例えば、一般式（２）：【００１６】
【化２】
2019187586.tif 000004
［式中、X-は陰イオン種を示し、R1は存在しないか、または-O-、-C(=O)-NH-もしくは-NH-C(=O)-であり；R2は-COOHもしくは-NH2またはそれらの塩であり；p、qおよびsは、それぞれ、独立して、１〜１５の整数であって；rは０〜３０の整数である。］
で表されるフェナジン誘導体を含む。【００１７】
上記式中、陰イオン種であるX-は、ハロゲンイオン、ハロゲンを含む化合物のイオン、水酸化物イオン、カルボン酸イオン、硝酸イオン、亜硝酸イオン、酢酸イオン、炭酸水素イオン、リン酸二水素イオン、硫酸水素イオン、アルキルスルホン酸イオン、硫化水素イオン、シュウ酸水素イオン、シアン酸イオン、およびチオシアン酸イオンからなる群から選択されるいずれか１つまたはそれらの混合物である。【００１８】
上記Rの末端またはR2は下式：
【化３】
2019187586.tif 000005
で表されるカルボキシル基とN-スクシンイミドとのエステルであってよい。【００１９】
本開示のフェナジン誘導体の具体例には、例えば、下式で表される化合物が含まれる。【００２０】
【化４】
2019187586.tif 000006
【００２１】
【化５】
2019187586.tif 000007
【００２２】
ポリエチレングリコール鎖や炭化水素鎖などのリンカーによりフェナジン部分と高分子量ポリマー主鎖との間の距離を延長すると、レドックスメディエータの生体環境における熱安定性が向上するので好ましい。【００２３】
上記カルボキシル基を有するフェナジン誘導体のカルボキシル基は、反応性向上のためにN-ヒドロキシスクシンイミドにより活性化されていてもよい。一例として、下式：【００２４】
【化６】
2019187586.tif 000008
で表されるN-ヒドロキシスクシンイミドと、フェナジン誘導体とのエステルが含まれる。上記カルボキシル基を有するフェナジン誘導体はいずれもN-ヒドロキシスクシンイミドとエステル形成する。【００２５】
本開示において、カルボキシル基またはアミノ基を有する高分子量ポリマーとして、例えば、下記のポリアミノ酸、ポリイミンおよび重合性アクリレートまたはビニル基から形成されるポリマーを用いることができる。【００２６】
【化７】
2019187586.tif 000009
【００２７】
【化８】
2019187586.tif 000010
【００２８】
【化９】
2019187586.tif 000011
【００２９】
【化１０】
2019187586.tif 000012
【００３０】
本開示の高分子量レドックスポリマーは、アミノ基を有するフェナジン誘導体とカルボキシル基を有する高分子量ポリマーとのアミド結合、または、カルボキシル基を有するフェナジン誘導体とアミノ基を有する高分子量ポリマーとのアミド結合により形成される。【００３１】
本開示の高分子量レドックスポリマーには、上記と同様のアミド結合により、直接または、ポリエチレングリコール鎖もしくは炭化水素鎖などのリンカーを介して、さらに、荷電レドックス酵素を共有結合することができる。【００３２】
５．タンパク質
また、本開示において、カルボキシル基またはアミノ基を有する高分子量ポリマーとして、例えば、牛血清アルブミン (BSA)、グルコースデヒドロゲナーゼ (GDH)、グルコースオキシダーゼ (GOx)などのタンパク質を用いることができる。すなわち、本開示の高分子レドックスポリマーには、フェナジン誘導体が荷電レドックス酵素に結合した複合体も含まれる。【００３３】
本開示の高分子量レドックスポリマーを適用する埋め込み型バイオセンサのプローブの内部構造の一例を図３〜６に示すが、例示的なものであり、本開示の高分子量レドックスポリマーの適用対象を限定するものではない。【００３４】
埋め込み型バイオセンサ1は本体10とプローブ11を含み、プローブ11は、概略、生体内に挿入するセンシング部分およびバイオセンサ本体10の内部回路と電気的接続するための端子部分からなる鍵形状である。センシング部分は体内に挿入できるように細く形成され、端子部分はバイオセンサ本体10に挿入して電気的接続を形成するように一定の大きさを有する。したがって、まず、鍵形状の絶縁性基板111を準備する。
図３に表側から見た上面図を示し、図３のA-A’切断線での断面図を図４に示す。
絶縁性基板111の両面に、炭素または金、銀、白金もしくはパラジウムなどの金属よりなる群から選択される導電性金属材料をスパッタ法、蒸着法、イオンプレーティングなどにより堆積することによって導電性薄膜112を形成する。
絶縁性基板111の表側に形成した導電性薄膜112にレーザー描写することによって絶縁性基板111の表面に達する深さの溝113を形成して、作用電極リード112aと参照電極リード112bに分離して電気的絶縁する。
絶縁性基板111の両面に、所定の位置に開口を有する絶縁性レジスト膜116a,116bを形成する。
絶縁性基板111の表側に形成したレジスト膜116aの参照電極用の開口にAg/AgClをスクリーン印刷法やインクジェット法により堆積させて、参照電極115を形成する。
作用電極114の上に、カーボン粒子などの導電性粒子の懸濁液、レドックスメディエータが共有結合した高分子量レドックスポリマーの水溶液や検体応答性酵素などの水溶液を塗布乾燥して、導電性粒子、検体応答性酵素およびレドックスメディエータを含む検知層118を形成する。検体応答性酵素もこの高分子量レドックスポリマーに共有結合されていてもよい。
本開示において、「検体応答性酵素」とは、検体の酸化または還元を特異的に触媒することのできる生化学物質を意味する。バイオセンサの検出目的に使用できれば、いかなる生化学物質でもよい。例えば、グルコースを検体とする場合、適した検体応答性酵素は、グルコース酸化酵素（Glucose oxidase; GOx）やグルコース脱水素酵素 (Glucose dehydrogenase; GDH)などである。「レドックスメディエータ」とは、電子伝達を仲介する酸化還元物質を意味し、バイオセンサにおいて、検体（アナライト）の酸化還元反応によって生じる電子の伝達を担う。例えば、フェナジン誘導体などが含まれるが、これに限定されず、バイオセンサの検出目的に使用できれば、いかなる酸化還元物質でもよい。
センシング部分を、保護膜用ポリマーを含む溶液に浸漬して、センシング部分の両面、側面および先端に保護膜119を形成することができる。
【発明の効果】
【００３５】
本開示の高分子量レドックスポリマーは、レドックスメディエータが高分子量ポリマーに共有結合しているので、埋め込み型バイオセンサのプローブに用いても、レドックスメディエータが外部に流出することがなく、外部への流出を防止することができる。検知感度の劣化のみならず、生体に対する害も防止することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】埋め込み型バイオセンサが生体（人体）に取り付けられた状態を示す概略図。
【図２】生体（人体）に取り付けられた状態の埋め込み型バイオセンサを示す断面図。
【図３】本開示のひとつの具体例の埋め込み型バイオセンサのプローブ表側の上面図。
【図４】図３におけるA-A’切断線での断面図。
【図５】図４におけるB-B’切断線での断面図。
【図６】図４におけるC-C’切断線での断面図。
【図７】本開示のフェナジン誘導体が共有結合した高分子量ポリマーを用いたセンサのボルタモグラム。
【図８】本開示のフェナジン誘導体が共有結合した高分子量ポリマーを用いたセンサのボルタモグラム。
【図９】本開示のフェナジン誘導体が共有結合したタンパク質を用いたセンサのボルタモグラム。
【図１０】比較として低分子のフェナジン誘導体を用いたセンサのボルタモグラム。
【図１１】本開示のフェナジン誘導体が共有結合した高分子量ポリマーの吸光スペクトル。
【図１２】本開示のフェナジン誘導体が共有結合した高分子量ポリマーを用いたプローブのグルコース応答特性を示すグラフ。
【図１３】本開示のフェナジン誘導体が共有結合した高分子量ポリマーを用いたプローブの耐久性を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
Ａ．低分子量フェナジン誘導体の合成
上記のアミノ基またはカルボキシル基を有するフェナジン誘導体は、概略、以下の合成スキームにより合成することができる。
【００３８】
［合成例１：アミノ基を有するフェナジン誘導体の合成］
1-メトキシフェナジンにＮ-アルキル化剤を作用して、例えば、5-[6-(N-フタルイミド)ヘキシル]-1-メトキシフェナジニウム硝酸塩を合成し、次いで、フタルイミドを切り離すことによって、5-(6-アミノヘキシル)-1-メトキシフェナジニウム硝酸塩を合成する。対応するN-アルキル化剤を選択して、所望のN-アルキルアミノフェナジニウム塩を合成することができる。
【００３９】
【化１１】
2019187586.tif 000013
【００４０】
［合成例２：アミノ基を有するフェナジン誘導体の合成］
同様に、1-メトキシフェナジンにN-アルキル化剤を作用して、例えば、5-{12-[(12-アンモニオドデシル)オキシ]ドデシル}-1-メトキシフェナジン-5-イウム二硝酸塩を合成する。
【００４１】
【化１２】
2019187586.tif 000014
【００４２】
［合成例３：カルボキシル基を有するフェナジン誘導体の合成］
1-メトキシフェナジンにN-アルキル化剤を作用して、例えば、5-(4-カルボキシブチル)-1-メトキシフェナジニウム硝酸塩を合成する。さらに、末端カルボキシル基にN-ヒドロキシスクシンイミドを付加してカルボキシル基の反応性が向上した、5-{[(2,5-ジオキソピリジン-1-イル)オキシ]-5-オキソペンチル}-1-メトキシフェナジニウム硝酸塩を合成する。対応するN-アルキル化剤を選択して、所望のN-アルキルカルボキシフェナジニウム塩を合成することができる。
【００４３】
【化１３】
2019187586.tif 000015
【００４４】
［合成例４：カルボキシル基を有するフェナジン誘導体の合成］
同様に、1-メトキシフェナジンにN-アルキル化剤を作用して、さらに、末端カルボキシル基にN-ヒドロキシスクシンイミドを付加してカルボキシル基の反応性が向上した、5-{11-[(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)オキシ]-11-オキソウンデシル}-1-メトキシフェナジン-5-イウム硝酸塩を合成する。
【００４５】
【化１４】
2019187586.tif 000016
【００４６】
［合成例５：カルボキシル基を有するフェナジン誘導体の合成］
同様に、1-メトキシフェナジンにN-アルキル化剤を作用して、さらに、末端カルボキシル基にN-ヒドロキシスクシンイミドを付加してカルボキシル基の反応性が向上した、5-{11-[11-(2,5-ジオキソピロリジン-1-イルオキシ)-11-オキソウンデシルアミノ]-11-オキソウンデシル}-1-メトキシフェナジン-5-イウム硝酸塩を合成する。
【００４７】
【化１５】
2019187586.tif 000017
【００４８】
Ｂ．フェナジン誘導体が共有結合した高分子量レドックスポリマーの合成
合成例１〜５で合成したフェナジン誘導体、または前記合成例に準じて合成した各種フェナジン誘導体のいずれかをカルボキシル基またはアミノ基を有する高分子量ポリマーに共有結合して、高分子量レドックスポリマーを合成することができる。
【００４９】
［実施例１］
合成例２で得られた5-{12-[(12-アンモニオドデシル)オキシ]ドデシル}-1-メトキシフェナジン-5-イウム二硝酸塩（Ph-C24-NH3+）：
【００５０】
【化１６】
2019187586.tif 000018
を6.47 mg計り取り、エタノール500 μLに溶解した。別途、一般式：
【００５１】
【化１７】
2019187586.tif 000019
で表されるポリ(L-グルタミン酸ナトリウム)（株式会社ペプチド研究所 Code 3063; M.W.>12000, 透析によるカットオフ）を11.86 mg計り取り、100 mM 2-モルホリノエタンスルホン酸 (MES)緩衝液（pH 6.0）1.5 mLに溶解した。別途、水溶性カルボジイミド (WSC）（同仁化学）を8.8 mg計り取り、100 mM MES緩衝液（pH6.0）500 μLに溶解した。上記3つの溶液を混合し、４時間、室温にて撹拌しながら反応させた。
反応溶液は、溶出バッファーとしてリン酸緩衝生理食塩水 (PBS, pH7.4)を用いるPD-10カラム（GEヘルスケア）によるゲルろ過クロマトグラフィーに付した。ゲルろ過後の溶液を遠心式限外ろ過フィルター（アミコンウルトラ-4 10k；メルクミリポア）を用いて限外ろ過を行った。上記の手順により、ポリ(L-グルタミン酸ナトリウム)にフェナジンが共有結合した高分子量ポリマー（PGA-C24-Ph）を得た。
得られたPGA-C24-Phの溶液は、マイクロプレート (greiner bio-one UV-STAR MICROPALLETE 96 WELL F-BODEN)およびプレートリーダー (TECAN infinite M200 PRO)により測定しながら、PBSで386nmの吸光度を約11に調整した。また、吸光度はPBSの測定吸光度をブランク値として減じた値を用いた。
【００５２】
［実施例２］
合成例４で得られた、5-{11-[(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)オキシ]-11-オキソウンデシル}-1-メトキシフェナジン-5-イウム硝酸塩（Ph-C11-Su）：
【００５３】
【化１８】
2019187586.tif 000020
を0.70mg計り取り、100 mM 2-モルホリノエタンスルホン酸 (MES)緩衝液（pH 6.0）500 μLに溶解した。別途、一般式：
【００５４】
【化１９】
2019187586.tif 000021
で表されるポリ（L-リジン）塩酸塩（株式会社ペプチド研究所 Code 3075; M.W.>12000, 透析によるカットオフ）を3.34mg 計り取り、 100ｍM MES緩衝液（pH6.0） 500 μLに溶解させた。上記２つの溶液を混合し、４時間、室温にて撹拌しながら反応させた。
反応溶液は、溶出バッファーとしてPBSを用いるPD-10カラム（GEヘルスケア）によるゲルろ過クロマトグラフィーに付した。ゲルろ過後の溶液を遠心式限外ろ過フィルター（アミコンウルトラ-4 30k；メルクミリポア）を用いて限外ろ過を行った。上記の手順により、ポリ（L-リジン）塩酸塩にフェナジンが共有結合した高分子量ポリマー（PLL-C11-Ph）を得た。
得られたPLL-C11-Phの溶液は、マイクロプレート (greiner bio-one UV-STAR MICROPALLETE 96 WELL F-BODEN)およびプレートリーダー (TECAN infinite M200 PRO) により測定しながら、PBSで386nmの吸光度を約11に調整した。また、吸光度はPBSの測定吸光度をブランク値として減じた値を用いた。
【００５５】
［実施例３］
合成例３で得られた、5-{[(2,5-ジオキソピリジン-1-イル)オキシ]-5-オキソペンチル}-1-メトキシフェナジニウム硝酸塩（Ph-C5-Su）：
【００５６】
【化２０】
2019187586.tif 000022
を0.6 mg計り取り、100 mM 2-モルホリノエタンスルホン酸 (MES)緩衝液（pH 6.0）120 μLに溶解した。別途、ポリ（L-リジン）塩酸塩（株式会社ペプチド研究所 Code 3075; M.W.>12000, 透析によるカットオフ）を5 mg計り取り、100 mM MES緩衝液（pH 6.0）1 mLに溶解した。上記２つの溶液を混合し、４時間、室温にて撹拌しながら反応させた。
反応溶液は、溶出バッファーとしてPBSを用いるPD-10カラム（GEヘルスケア）によるゲルろ過クロマトグラフィーに付した。ゲルろ過後の溶液を遠心式限外ろ過フィルター（アミコンウルトラ-4 30k；メルクミリポア）を用いて限外ろ過を行った。
上記の手順により、ポリ（L-リジン）塩酸塩にフェナジンが共有結合した高分子量ポリマー（PLL-C5-Ph_1）を得た。
得られたPLL-C5-Ph_1の溶液は、マイクロプレート (greiner bio-one UV-STAR MICROPALLETE 96 WELL F-BODEN)およびプレートリーダー (TECAN infinite M200 PRO)により測定しながら、PBSで386nmの吸光度を約11に調整した。また、吸光度はPBSの測定吸光度をブランク値として減じた値を用いた。
【００５７】
［実施例４］
合成例３で得られたPh-C5-Suを2 mg計り取り、100 mM 2-モルホリノエタンスルホン酸 (MES)緩衝液（pH 6.0）500 μLに溶解した。別途、一般式：
【００５８】
【化２１】
2019187586.tif 000023
で表されるポリアリルアミン塩酸塩（SIGMA-ALDRICH 製品番号283215；GPC測定による重量平均分子量（ＰＥＧ換算）Mw ~17,500）を3.31 mg計り取り、100 mM MES緩衝液（pH 6.0） 500 μLに溶解した。上記２つの溶液を混合し、４時間、室温にて撹拌しながら反応させた。
反応溶液は、溶出バッファーとしてリン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.5） 10mMを用いるPD-10カラム（GEヘルスケア）によるゲルろ過クロマトグラフィーに付した。ゲルろ過後の溶液を遠心式限外ろ過フィルター（アミコンウルトラ-4 10k；メルクミリポア）を用いて限外ろ過を行った。
上記の手順により、ポリアリルアミン塩酸塩にフェナジンが共有結合した高分子量ポリマー（PAA-C5-Ph）を得た。
得られたPAA-C5-Phの溶液は、マイクロプレート (greiner bio-one UV-STAR MICROPALLETE 96 WELL F-BODEN)およびプレートリーダー (TECAN infinite M200 PRO)により測定しながら、リン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.5）で386nmの吸光度を約11に調整した。また、吸光度はリン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.5） 10mMの測定吸光度をブランク値として減じた値を用いた。
【００５９】
［実施例５］
合成例３で得られたPh-C5-Suを2.38 mg計り取り、100 mM 2-モルホリノエタンスルホン酸 (MES)緩衝液（pH 6.0）1 mLに溶解した。別途、一般式：
【００６０】
【化２２】
2019187586.tif 000024
で表されるポリ（エチレンイミン）溶液（SIGMA-ALDRICH 製品番号181978; GPC測定による数平均分子量 Mn ~60,000、LS測定による重量平均分子量 Mw ~750,000、H2O中50重量%）を5mg測り取り、100 mM MES緩衝液（pH 6.0） 1.5mLに溶解した。上記２つの溶液を混合し、４時間、室温にて撹拌しながら反応させた。
反応溶液は、溶出バッファーとしてPBSを用いるPD-10カラム（GEヘルスケア）によるゲルろ過クロマトグラフィーに付した。ゲルろ過後の溶液を遠心式限外ろ過フィルター（アミコンウルトラ-4 30k；メルクミリポア）を用いて限外ろ過を行った。
上記の手順により、ポリエチレンイミンにフェナジンが共有結合した高分子量ポリマー（PEI-C5-Ph）を得た。
得られたPEI-C5-Phの溶液は、マイクロプレート (greiner bio-one UV-STAR MICROPALLETE 96 WELL F-BODEN)およびプレートリーダー (TECAN infinite M200 PRO) により測定しながら、PBSで386nmの吸光度を約11に調整した。また、吸光度はPBSの測定吸光度をブランク値として減じた値を用いた。
【００６１】
［実施例６］
合成例３で得られたPh-C5-Suを0.91 mg計り取り、100 mM 2-モルホリノエタンスルホン酸 (MES)緩衝液（pH 6.0）1 mLに溶解した。別途、一般式：
【００６２】
【化２３】
2019187586.tif 000025
で表されるアリルアミン塩酸塩・ジアリルアミン塩酸塩共重合体水溶液（ニットーボーメディカル PAA-D11-HCL；重量平均分子量Mw=100,000, 濃度40%、pH (5%ゾル)=2-3, 粘度 600 mPa・s）を8.75 mg測り取り、100 mM MES緩衝液（pH 6.0） 1.5 mLに溶解した。上記２つの溶液を混合し、４時間、室温にて撹拌しながら反応させた。
反応溶液は、溶出バッファーとしてPBSを用いるPD-10カラム（GEヘルスケア）によるゲルろ過クロマトグラフィーに付した。ゲルろ過後の溶液を遠心式限外ろ過フィルター（アミコンウルトラ-4 30k；メルクミリポア）を用いて限外ろ過を行った。
上記の手順により、アリルアミン塩酸塩・ジアリルアミン塩酸塩共重合体にフェナジンが共有結合した高分子量ポリマー（PAA-DAA-C5-Ph）を得た。
得られたPAA-DAA-C5-Phの溶液は、マイクロプレート (greiner bio-one UV-STAR MICROPALLETE 96 WELL F-BODEN)およびプレートリーダー (TECAN infinite M200 PRO)により測定しながら、PBSで386nmの吸光度を約11に調整した。また、吸光度はPBSの測定吸光度をブランク値として減じた値を用いた。
【００６３】
［実施例７］
合成例３で得られたPh-C5-Suを2.04mg計り取り、100 mM 2-モルホリノエタンスルホン酸 (MES)緩衝液（pH 6.0）1 mLに溶解した。別途、一般式：
【００６４】
【化２４】
2019187586.tif 000026
で表されるアリルアミンジアリルジメチルアンモニウムクロリド共重合体水溶液（ニットーボーメディカル PAA-1123；重量平均分子量Mw=18,000, 濃度15%、pH (5%ゾル)=11, 粘度 14 mPa・s）を6.88mg測り取り、100 mM MES緩衝液（pH 6.0） 1.5mLに溶解した。上記２つの溶液を混合し、４時間、室温にて撹拌しながら反応させた。
反応溶液は、溶出バッファーとしてPBSを用いるPD-10カラム（GEヘルスケア）によるゲルろ過クロマトグラフィーに付した。ゲルろ過後の溶液を遠心式限外ろ過フィルター（アミコンウルトラ-4 10k；メルクミリポア）を用いて限外ろ過を行った。
上記の手順により、アリルアミンジアリルジメチルアンモニウムクロリド共重合にフェナジンが共有結合した高分子量ポリマー（PAA-DADMA-C5-Ph）を得た。
得られたPAA-DADMA-C5-Phの溶液は、マイクロプレート (greiner bio-one UV-STAR MICROPALLETE 96 WELL F-BODEN)およびプレートリーダー (TECAN infinite M200 PRO) により測定しながら、PBSで386nmの吸光度を約11に調整した。また、吸光度はPBSの測定吸光度をブランク値として減じた値を用いた。
【００６５】
［実施例８］
合成例３で得られたPh-C5-Suを0.43 mg計り取り、100 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸 (HEPES)緩衝液（pH 7.0）300 μLに溶解した。別途、ウシ血清アルブミン (BSA)（ナカライテスク商品コード01860-65；一般グレードpH7.0）を 0.6 mg 計り取り、100ｍM HEPES緩衝液（pH7.0） 200 μLに溶解させた。上記２つの溶液を混合し、４時間、室温にて撹拌しながら反応させた。
反応溶液は、溶出バッファーとしてPBSを用いるPD MiniTrap G-25（GEヘルスケア）によるゲルろ過クロマトグラフィーに付した。ゲルろ過後の溶液を遠心式限外ろ過フィルター（アミコンウルトラ-4 30k；メルクミリポア）を用いて限外ろ過を行った。
上記の手順により、BSAにフェナジンが共有結合したタンパク質（BSA-C5-Ph）を得た。
得られたBSA-C5-Phの溶液は、マイクロプレート (greiner bio-one UV-STAR MICROPALLETE 96 WELL F-BODEN)およびプレートリーダー (TECAN infinite M200 PRO) により測定しながら、PBSで386nmの吸光度を約11に調整した。また、吸光度はPBSの測定吸光度をブランク値として減じた値を用いた。
【００６６】
［実施例９］
合成例３で得られたPh-C5-Suを0.86 mg計り取り、100 mM HEPES緩衝液（pH 7.0）300 μLに溶解した。別途、グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-依存性）(BBI International GDH GLD1)を 1.37 mg 計り取り、 100ｍM HEPES緩衝液（pH7.0） 200 μLに溶解させた。上記２つの溶液を混合し、４時間、室温にて撹拌しながら反応させた。
反応溶液は、溶出バッファーとしてPBSを用いるPD MiniTrap G-25（GEヘルスケア）によるゲルろ過クロマトグラフィーに付した。ゲルろ過後の溶液を遠心式限外ろ過フィルター（アミコンウルトラ-4 30k；メルクミリポア）を用いて限外ろ過を行った。
上記の手順により、グルコースデヒドロゲナーゼにフェナジンが共有結合したタンパク質（GDH-C5-Ph）を得た。
得られたGDH-C5-Phの溶液は、マイクロプレート (greiner bio-one UV-STAR MICROPALLETE 96 WELL F-BODEN)およびプレートリーダー (TECAN infinite M200 PRO) により測定しながら、PBSで386nmの吸光度を約11に調整した。また、吸光度はPBSの測定吸光度をブランク値として減じた値を用いた。
【００６７】
［実施例１０］
合成例５で得られた5-{11-[11-(2,5-ジオキソピロリジン-1-イルオキシ)-11-オキソウンデシルアミノ]-11-オキソウンデシル}-1-メトキシフェナジン-5-イウム硝酸塩（Ph-C22-Su）を2.78mg計り取り、エタノール500 μLに溶解した。別途、グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-依存性）(BBI International GDH GLD1)を15mg 計り取り、 100ｍM HEPES緩衝液（pH7.0） 2mLに溶解させた。上記２つの溶液を混合し、４時間、室温にて撹拌しながら反応させた。
反応溶液は、溶出バッファーとしてPBSを用いるPD-10（GEヘルスケア）によるゲルろ過クロマトグラフィーに付した。ゲルろ過後の溶液を遠心式限外ろ過フィルター（アミコンウルトラ-4 30k；メルクミリポア）を用いて限外ろ過を行った。
上記の手順により、グルコースデヒドロゲナーゼにフェナジンが共有結合したタンパク質（GDH-C22-Ph）を得た。
得られたGDH-C22-Phの溶液は、マイクロプレート (greiner bio-one UV-STAR MICROPALLETE 96 WELL F-BODEN)およびプレートリーダー (TECAN infinite M200 PRO) により測定しながら、PBSで386nmの吸光度を約11に調整した。また、吸光度はPBSの測定吸光度をブランク値として減じた値を用いた。
【００６８】
［比較例１］
下式： 
【００６９】
【化２５】
2019187586.tif 000027
で表される合成例１で得られた、5-(6-アミノヘキシル)-1-メトキシフェナジニウム硝酸塩（Ph-C6-NH2）を0.63 mg計り取り、PBS 500 μLに溶解して、Ph-C6-NH2溶液を得た。
得られた溶液につき、マイクロプレート (greiner bio-one UV-STAR MICROPALLETE 96 WELL F-BODEN)およびプレートリーダー (TECAN infinite M200 PRO)により測定したところ、386nmの吸光度が約11であった。また、吸光度はPBSの測定吸光度をブランク値として減じた値を用いた。
【００７０】
［実施例１１］
合成例３で得られたPh-C5-Suを2mg計り取り、100 mM MES緩衝液（pH6.0）500 μLに溶解した。別途、ポリ（L-リジン）塩酸塩（株式会社ペプチド研究所 Code 3075; M.W.>12000, 透析によるカットオフ）を11.33mg計り取り、100 mM MES緩衝液（pH6.0）500 μLに溶解した。上記の２つの溶液を混合し、４時間、室温にて攪拌させながら反応させた。
反応溶液は、溶出バッファーとしてPBSを用いるPD-10カラム（GEヘルスケア）によるゲルろ過クロマトグラフィーに付した。ゲルろ過後の溶液を遠心式限外ろ過フィルター（アミコンウルトラ-4 30k；メルクミリポア）を用いて限外ろ過を行った。
上記の手順により、ポリ（L-リジン）塩酸塩にフェナジンが共有結合した高分子量ポリマー（PLL-C5-Ph_2）を得た。
得られたPLL-C5-Ph_2の溶液は、マイクロプレート (greiner bio-one UV-STAR MICROPALLETE 96 WELL F-BODEN)およびプレートリーダー (TECAN infinite M200 PRO)により測定しながら、PBSで386nmの吸光度を0.52〜0.57の範囲に調整した。また、吸光度はPBSの測定吸光度をブランク値として減じた値を用いた。
【００７１】
［実施例１２］
合成例１で得られたPh-C6-NH2を2mg計り取り、100 mM MES緩衝液（pH6.0）300 μLに溶解した。別途、Acid-PEG5-NHSエステル (BROADPHARM)を1.8mg計り取り、100 mM MES緩衝液（pH6.0）300 μLに溶解した。上記の２つの溶液を混合し、約20時間、室温にて攪拌させながら反応させて、下式：
【００７２】
【化２６】
2019187586.tif 000028
で表されるPEG鎖結合フェナジニウム硝酸塩を含む溶液Ａを得た。別途、ポリ（L-リジン）塩酸塩（株式会社ペプチド研究所 Code 3075; M.W.>12000, 透析によるカットオフ）を11.02 mg計り取り、100 mM MES緩衝液（pH6.0）300 μLに溶解した。別途、水溶性カルボジイミド (WSC）（同仁化学）を4 mg計り取り、100 mM MES緩衝液（pH6.0）100 μLに溶解した。溶液Ａに上記のポリ（L-リジン）塩酸塩、WSC溶液を順次混合し、４時間、室温で攪拌させながら反応させた。
反応溶液は、溶出バッファーとしてPBSを用いるPD-10カラム（GEヘルスケア）によるゲルろ過クロマトグラフィーに付した。ゲルろ過後の溶液を遠心式限外ろ過フィルター（アミコンウルトラ-4 30k；メルクミリポア）を用いて限外ろ過を行った。
上記の手順により、エチレングリコール５単位のポリエチレングリコール (PEG)鎖を付加したポリ（L-リジン）塩酸塩にフェナジンが共有結合した高分子量ポリマー（PLL-PEG5-Ph）を得た。
得られたPLL-PEG5-Phの溶液は、マイクロプレート (greiner bio-one UV-STAR MICROPALLETE 96 WELL F-BODEN)およびプレートリーダー (TECAN infinite M200 PRO)により測定しながら、PBSで386nmの吸光度を0.52〜0.57の範囲に調整した。また、吸光度はPBSの測定吸光度をブランク値として減じた値を用いた。
【００７３】
［実施例１３］
合成例１で得られたPh-C6-NH2を2mg計り取り、100 mM MES緩衝液（pH6.0）300 μLに溶解した。別途、Acid-PEG13-NHSエステル (BROADPHARM)を3.26mg計り取り、100 mM MES緩衝液（pH6.0）300 μLに溶解した。上記の２つの溶液を混合し、約20時間、室温にて攪拌させながら反応させて、下式：
【００７４】
【化２７】
2019187586.tif 000029
で表されるPEG鎖結合フェナジニウム硝酸塩を含む溶液Ｂを得た。別途、ポリ（L-リジン）塩酸塩（株式会社ペプチド研究所 Code 3075; M.W.>12000, 透析によるカットオフ）を11.02 mg計り取り、100 mM MES緩衝液（pH6.0）300 μLに溶解した。別途、水溶性カルボジイミド (WSC）（同仁化学）を4 mg計り取り、100 mM MES緩衝液（pH6.0）100 μLに溶解した。溶液Ｂに上記のポリ（L-リジン）塩酸塩、WSC溶液を順次混合し、４時間、室温で攪拌させながら反応させた。
反応溶液は、溶出バッファーとしてPBSを用いるPD-10カラム（GEヘルスケア）によるゲルろ過クロマトグラフィーに付した。ゲルろ過後の溶液を遠心式限外ろ過フィルター（アミコンウルトラ-4 30k；メルクミリポア）を用いて限外ろ過を行った。
上記の手順により、エチレングリコール１３単位のポリエチレングリコール (PEG)鎖を付加したポリ（L-リジン）塩酸塩にフェナジンが共有結合した高分子量ポリマー（PLL-PEG13-Ph）を得た。
得られたPLL-PEG13-Phの溶液は、マイクロプレート (greiner bio-one UV-STAR MICROPALLETE 96 WELL F-BODEN)およびプレートリーダー (TECAN infinite M200 PRO)により測定しながら、PBSで386nmの吸光度を0.52〜0.57の範囲に調整した。また、吸光度はPBSの測定吸光度をブランク値として減じた値を用いた。
【００７５】
［実施例１４］
合成例１で得られたPh-C6-NH2を2mg計り取り、100 mM MES緩衝液（pH6.0）300 μLに溶解した。別途、Acid-PEG25-NHSエステル (BROADPHARM)を5.44mg計り取り、100 mM MES緩衝液（pH6.0）300 μLに溶解した。上記の２つの溶液を混合し、約20時間、室温にて攪拌させながら反応させて、下式：
【００７６】
【化２８】
2019187586.tif 000030
で表されるPEG鎖結合フェナジニウム硝酸塩を含む溶液Ｃを得た。別途、ポリ（L-リジン）塩酸塩（株式会社ペプチド研究所 Code 3075; M.W.>12000, 透析によるカットオフ）を11.02 mg計り取り、100 mM MES緩衝液（pH6.0）300 μLに溶解した。別途、水溶性カルボジイミド (WSC）（同仁化学）を4 mg計り取り、100 mM MES緩衝液（pH6.0）100 μLに溶解した。溶液Ｃに上記のポリ（L-リジン）塩酸塩、WSC溶液を順次混合し、４時間、室温で攪拌させながら反応させた。
反応溶液は、溶出バッファーとしてPBSを用いるPD-10カラム（GEヘルスケア）によるゲルろ過クロマトグラフィーに付した。ゲルろ過後の溶液を遠心式限外ろ過フィルター（アミコンウルトラ-4 30k；メルクミリポア）を用いて限外ろ過を行った。
上記の手順により、エチレングリコール２５単位のポリエチレングリコール (PEG)鎖を付加したポリ（L-リジン）塩酸塩にフェナジンが共有結合した高分子量ポリマー（PLL-PEG25-Ph）を得た。
得られたPLL-PEG25-Phの溶液は、マイクロプレート (greiner bio-one UV-STAR MICROPALLETE 96 WELL F-BODEN)および、プレートリーダー (TECAN infinite M200 PRO)により測定しながら、PBSで386nmの吸光度を0.52〜0.57の範囲に調整した。また、吸光度はPBSの測定吸光度をブランク値として減じた値を用いた。
【００７７】
Ｃ．評価試験
（１）メディエータ流出性
作用電極および対極に金電極、参照電極にAg/AgCl（飽和塩化カリウム）（ビー・エー・エス株式会社）の三電極式でポテンショスタット（ビー・エー・エス株式会社）を用いて、掃引速度10 mV/秒にてサイクリックボルタンメトリーを行った。
作用電極上に実施例１〜７で得られた各種フェナジン誘導体結合高分子レドックスポリマーの溶液を、それぞれ、10 μL塗布し、乾燥させた。
作用電極上にケッチェンブラック懸濁液を0.6 μL塗布し、約10分乾燥させた。その後実施例８〜１０で得られた各種フェナジン誘導体結合タンパク質の溶液を0.6 μL塗布し、約1時間乾燥させた。
作用電極上に比較例１で得られたPh-C6-NH2溶液を10 μL塗布し、乾燥させた。
これらの電極をPBSに浸漬し、初期電位において１０秒間静止した後に電位の掃引を開始した。得られたサイクリックボルタモグラムを図７〜９に示す。
【００７８】
比較例１の低分子量フェナジン誘導体Ph-C6-NH2を用いた電極では、３サイクル目に酸化ピークがほぼ消失してしまい、一方、実施例１〜７で得られた各種フェナジン誘導体結合高分子レドックスポリマーを用いた電極では、３サイクル後でも酸化ピークが維持され、実施例８〜１０で得られた各種フェナジン誘導体結合タンパク質を用いた電極では、５サイクル後でも酸化ピークが維持されていた。
このことは、低分子量のフェナジン誘導体は電極から流出するが、高分子量のポリマーまたはタンパク質に結合することによって、電極からの流出が抑制されたことを示している。
【００７９】
（２）メディエータ保存安定性
実施例１１〜１４で得られた高分子量レドックスポリマーにつき、合成初期および３７℃で１日間および３日間保管後に吸収スペクトルを測定した。測定は、各高分子量レドックスポリマー溶液100 μLをマイクロプレート (greiner bio-one UV-STAR MICROPALLETE 96 WELL F-BODEN)に分注し、プレートリーダー (TECAN infinite M200 PRO)により測定した。また、吸光度はPBSの測定吸光度をブランク値として減じた値を用いた。得られた吸収スペクトルを図１１に示す。
【００８０】
２８０ｎｍおよび３８５ｎｍ付近の吸収ピークの変動から、PLL-C5-Ph_2と比較して、PEG鎖が長くなるにしたがって、吸収ピークの変化が少なくなっていることがわかる。
このことは、フェナジン部分とポリマー主鎖との間の距離を延長することによって、レドックスメディエータの生体内環境における熱安定性が向上することを示している。
【００８１】
（３）プローブ特性の測定
金電極上に以下の組成および手順で作製したセンサのグルコース応答性および耐久性を評価した。
【００８２】
＜溶液調製＞
（ａ）酵素／メディエータ溶液
グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-依存性）(BBI International GDH GLD1)、グルタルアルデヒド 20%溶液（和光純薬工業株式会社製）および実施例１４と同様に合成したPLL-PEG25-Phの各試薬を以下の終濃度となるように混合し、約２時間反応させた。
【００８３】
【表１】
2019187586.tif 000031
【００８４】
（ｂ）炭素微粒子懸濁液
ケッチェンブラックEC600JD（ライオン・スペシャリティ・ケミカルズ株式会社）をMiliQ水に2mg/mLになるように懸濁させ、超音波ホモジナイザーで10分以上処理した。また、懸濁液調製後、数時間経過した場合は使用前に再度超音波ホモジナイザーで約10分処理した。
【００８５】
（ｃ）保護膜用ポリマー溶液
ポリ(4-ビニルピリジン)（Mw=160,000）(SIGMA-ALDRICH) ［P4VP］を１０％（重量/体積）になるようにエタノールに溶解して、P4VPエタノール溶液を調製した。
【００８６】
＜センサ作製＞
ケッチェンブラック懸濁液を金作用電極上に0.5 μL塗布し、約5分乾燥させた。さらに塗布、乾燥を２回繰り返し、計３回ケッチェンブラック懸濁液の塗布を行った。２時間反応後の酵素／メディエータ溶液を0.5 μL塗布し、約30分乾燥させた。さらに、P4VPエタノール溶液に浸漬し、10分乾燥後に再度浸漬し、30分以上乾燥して、保護膜を形成し、センサを作製した。
【００８７】
＜電気化学測定＞
作用極に上記のセンサ、対極に金電極、参照電極にAg/AgCl（飽和塩化カリウム）（ビー・エー・エス株式会社）の三電極式でポテンショスタット（ビー・エー・エス株式会社）を用いて、作製したセンサPBSに浸漬し、アンペロメトリックi-tカーブを用いた測定を行った。測定開始1000秒後から500秒ごとに、50、150、300、500 mg/dLになるようにグルコースを添加して、継続的に電流応答値を測定した。測定後はセンサを37℃のPBS中に保存し、１日保存後、３日保存後においても同様に測定した。測定結果を、それぞれ、図１２および１３に示し、表２にまとめた。
【００８８】
【表２】
2019187586.tif 000032
【００８９】
グルコース濃度0〜500 mg/dLにおいて、高い直線性を示し、グルコース応答性は良好であった。
３７℃にて３日保存後においても、グルコース濃度0〜500 mg/dLにおいて高い直線性を示し、初期の応答に比べて、電流値の減少が見られず、耐久性は良好であった。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本開示の高分子量レドックスポリマーを用いれば、レドックスメディエータが高分子量ポリマー主鎖に共有結合しているので、バイオセンサのプローブにおいて、応答性および耐久性を維持または向上しつつ、検知層を構成するレドックスメディエータの流出を防止することができる。したがって、本開示の高分子量レドックスポリマーは、特に、埋め込み型バイオセンサに有用である。
【符号の説明】
【００９１】
1    埋め込み型電気化学式グルコースセンサ
10   本体
11   プローブ
111  絶縁性基板
112  導電性薄膜
112a 作用電極リード
112b 参照電極リード
112c 対極リード
113  溝
114  作用電極
115  参照電極
116  絶縁性レジスト
117  対極
118  検知層
119  保護膜
2    生体
【図１】
2019187586.tif 000042
【図２】
2019187586.tif 000043
【図３】
2019187586.tif 000044
【図４】
2019187586.tif 000045
【図５】
2019187586.tif 000046
【図６】
2019187586.tif 000047
【図７】
2019187586.tif 000048
【図８】
2019187586.tif 000049
【図９】
2019187586.tif 000050
【図１０】
2019187586.tif 000051
【図１１】
2019187586.tif 000052
【図１２】
2019187586.tif 000053
【図１３】
2019187586.tif 000054
【手続補正書】
【提出日】令和2年10月5日(2020.10.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料に含まれる検体を検出または定量するセンサであって、少なくとも、一般式（１）：
【化１】
2019187586.tif 000055
［式中、X-は陰イオン種を示し、Rは末端にアミノ基またはカルボキシル基を有する有機基を示す。］
で表されるフェナジン誘導体および検体応答性酵素を含む、センサ。
【請求項２】
一般式（１）で表されるフェナジン誘導体が、一般式（２）：
【化２】
2019187586.tif 000056
［式中、X-は陰イオン種を示し、R1は存在しないか、または-O-、-C(=O)-NH-もしくは-NH-C(=O)-であり；R2は-COOHもしくは-NH2またはそれらの塩であり；p、qおよびsは、それぞれ、独立して、１〜１５の整数であって；rは０〜３０の整数である。］
で表されるフェナジン誘導体である、請求項１に記載のセンサ。
【請求項３】
一般式（１）で表されるフェナジン誘導体が、
【化３】
2019187586.tif 000057
で表されるアミノ基を有するフェナジン誘導体よりなる群から選択され、または、
【化４】
2019187586.tif 000058
で表されるカルボキシル基を有するフェナジン誘導体よりなる群から選択される、請求項１に記載のセンサ。
【請求項４】
前記検体がグルコースであり、前記検体応答性酵素がグルコース酸化酵素またはグルコース脱水素酵素である、請求項１に記載のセンサ。
【国際調査報告】
2019187586.tif 000059
2019187586.tif 000060
2019187586.tif 000061
2019187586.tif 000062