(57)【要約】  ＡＴＰ法による検体中の菌の検出を高感度とし、検出時間を短縮する細胞検出装置及び細胞検出方法を提供する。検体中の細胞を検出する細胞検出装置であって、前記検体を含む培養液を収容する培養部及び密閉可能な検体導入部及び前記培養液の接触により発光する発光試薬を有する発光試薬部を有する密閉容器と、前記培養液及び前記発光試薬の接触を制御する接触機構と、前記培養液及び前記発光試薬の接触による発光を検出する光検出器と、前記光検出器の検出信号から発光量を算出し、該発光量の経時変化に基づいて前記細胞の増殖を判定する演算部と、を備え、前記培養部及び前記発光試薬部は、分離して配置され、前記接触機構は、前記培養液及び前記発光試薬を断続的に接触させることを特徴とする。
2019230548.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中の細胞を検出する細胞検出装置であって、
前記検体を含む培養液を収容する培養部及び密閉可能な検体導入部及び前記培養液の接触により発光する発光試薬を有する発光試薬部を有する密閉容器と、
前記培養液及び前記発光試薬の接触を制御する接触機構と、
前記培養液及び前記発光試薬の接触による発光を検出する光検出器と、
前記光検出器の検出信号から発光量を算出し、該発光量の経時変化に基づいて前記細胞の増殖を判定する演算部と、を備え、
前記培養部及び前記発光試薬部は、分離して配置され、
前記接触機構は、前記培養液及び前記発光試薬を断続的に接触させる
ことを特徴とする細胞検出装置。
【請求項２】
請求項１に記載の細胞検出装置において、
前記演算部は、前記培養部及び前記発光試薬部の接触前後の発光量から、前記検体由来の発光量を算出し、該検体由来の発光量が所定の閾値以上であるかを判断することにより、前記細胞の増殖を判定することを特徴とする細胞検出装置。
【請求項３】
請求項１に記載の細胞検出装置において、
前記発光試薬部は、前記発光試薬としてルシフェラーゼを有し、
前記発光試薬部と前記培養部の一方又は両方にルシフェリンを有し、
前記光検出器は、前記細胞由来のＡＴＰと前記ルシフェリンとの反応を前記ルシフェラーゼが触媒することにより生じる発光を検出することを特徴とする細胞検出装置。
【請求項４】
請求項１に記載の細胞検出装置において、
前記演算部による判定の結果を表示する表示部をさらに備えることを特徴とする細胞検出装置。
【請求項５】
請求項１に記載の細胞検出装置において、
前記密閉容器の外部に組成を調整したガスを供給するガス供給手段をさらに備え、
前記密閉容器は、前記細胞を密閉するが気体は透過するよう構成されることを特徴とする細胞検出装置。
【請求項６】
請求項１に記載の細胞検出装置において、
前記密閉容器を温度調節する温度調節手段をさらに備えることを特徴とする細胞検出装置。
【請求項７】
請求項１に記載の細胞検出装置において、
前記培養部を攪拌する攪拌手段をさらに備えることを特徴とする細胞検出装置。
【請求項８】
請求項１に記載の細胞検出装置において、
前記密閉容器を複数備えることを特徴とする細胞検出装置。
【請求項９】
請求項１に記載の細胞検出装置において、
前記培養部は、前記培養液を滴下するための流路を備え、
前記発光試薬部は、前記培養部の下部に配置され、
前記接触機構は、前記培養液を前記発光試薬部に滴下するプランジャーを含むことを特徴とする細胞検出装置。
【請求項１０】
請求項１に記載の細胞検出装置において、
前記発光試薬部は、表面に前記発光試薬が固定された磁気ビーズであり、
前記接触機構は、前記磁気ビーズを前記培養液の内外に移動させる磁石を含むことを特徴とする細胞検出装置。
【請求項１１】
請求項１に記載の細胞検出装置において、
前記発光試薬部は、一端部に前記発光試薬が固定された光ファイバであり、
前記光ファイバは、他端部が前記光検出器に接続され、前記検体導入部から前記一端部が前記密閉容器へ挿入され、前記一端部を前記培養液へ出し入れ可能に構成されることを特徴とする細胞検出装置。
【請求項１２】
請求項１に記載の細胞検出装置において、
前記密閉容器内にガスセンサをさらに備え、
前記ガスセンサは、前記検体中の菌が産生する揮発性代謝物によって色調が異なる蛍光を発する蛍光色素を備え、前記色調によって菌種を同定するよう構成されることを特徴とする細胞検出装置。
【請求項１３】
検体中の細胞を検出する細胞検出方法であって、
密閉容器内に発光試薬を導入するステップと、
前記密閉容器において前記発光試薬と離れた位置に前記検体を含む培養液を導入するステップと、
前記密閉容器を密閉するステップと、
前記培養液及び前記発光試薬を断続的に接触させるステップと、
前記培養液及び前記発光試薬の接触による発光量を計測するステップと、
前記発光量の経時変化に基づいて前記細胞の増殖を判定するステップと、を備える
ことを特徴とする細胞検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体中の細胞を検出する細胞検出装置及び細胞検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液などの臨床検体や細胞製剤など、通常無菌である検体中に菌が存在するか否かを確認するため、従来、検体を液体培地に添加して培養して、細菌又は真菌（菌）を増殖させ、菌の有無を検出する方法が行われている。【０００３】
菌の増殖を検出する方法としては濁度計測が簡便で一般的であるが、血液のように、もともと濁っている検体の場合は検出が困難である。濁度計測以外に菌の増殖を検出する方法として、特許文献１には、菌の増殖に伴うガスの産生及び消費を多検体同時に検出する自動計測装置を用いた方法が開示されている。この自動計測装置は、培養ボトル底部に二酸化炭素、酸素などのガス濃度の変化に伴って蛍光が変化する蛍光色素を固定し、菌の増殖によるガス濃度の変化を蛍光検出する蛍光法を採用した装置である。蛍光法では、およそ生菌が１０７ＣＦＵ／ｍＬ（ＣＦＵ:Ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）以上に増殖した場合に陽性と判定されることが知られている（非特許文献１）。【０００４】
また、高感度に菌を検出する方法として、ＡＴＰ（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  Ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：アデノシン三リン酸）法による検出方法が知られている。ＡＴＰ法は、細胞のＡＴＰをルシフェリン−ルシフェラーゼ反応による生物発光により検出する方法であり、一般に１００ＣＦＵ程度の菌を検出することができ、高感度である。例えば特許文献２には、プレートに細菌培養液と発光試薬を分注し、ＡＴＰ法による発光計測を行うことで、高感度に細菌の増殖・死滅を検出することが開示されている。また、特許文献２には、嫌気性菌の検出を可能とするため、容器を密閉しガス供給機構を設けることも開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第２６９６０８１号
【特許文献２】国際公開第２０１６／１４７３１３号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Journal of Microbiology, Immunology and Infection (2015) 48, 419-424
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献１に開示される蛍光法は感度が低く、生菌が１０７ＣＦＵ／ｍＬ以上に増殖しないと検出できない。従って、初期菌数の低い検体や、増殖の遅い菌の場合、検出までに時間がかかるという課題がある。【０００８】
また、特許文献２のように、従来のＡＴＰ法は、培養液を時間ごとに分取して発光試薬と混合する操作が必要である。培養液を分取する操作により、外部から菌が混入して培養液が汚染されてしまう可能性が高まり、検査の偽陽性につながる。培養液に発光試薬を予め混合して密閉すれば、分取操作なく連続的に発光計測が可能である。しかし、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応においては、ＡＴＰとルシフェリンが不可逆的に反応して反応系から除去されるため、菌が生成したＡＴＰが常に発光反応で消費され、発光強度が低下し、感度が低下するという課題がある。【０００９】
そこで、本発明は、ＡＴＰ法による検体中の菌の検出を高感度とし、検出時間を短縮する細胞検出装置及び細胞検出方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するために、代表的な本発明の細胞検出装置は、検体中の細胞を検出する細胞検出装置であって、前記検体を含む培養液を収容する培養部及び密閉可能な検体導入部及び前記培養液の接触により発光する発光試薬を有する発光試薬部を有する密閉容器と、前記培養液及び前記発光試薬の接触を制御する接触機構と、前記培養液及び前記発光試薬の接触による発光を検出する光検出器と、前記光検出器の検出信号から発光量を算出し、該発光量の経時変化に基づいて前記細胞の増殖を判定する演算部と、を備え、前記培養部及び前記発光試薬部は、分離して配置され、前記接触機構は、前記培養液及び前記発光試薬を断続的に接触させることを特徴とする。【００１１】
また、代表的な本発明の細胞検出方法は、検体中の細胞を検出する細胞検出方法であって、密閉容器内に発光試薬を導入するステップと、前記密閉容器において前記発光試薬と離れた位置に前記検体を含む培養液を導入するステップと、前記密閉容器を密閉するステップと、前記培養液及び前記発光試薬を断続的に接触させるステップと、前記培養液及び前記発光試薬の接触による発光量を計測するステップと、前記発光量の経時変化に基づいて前記細胞の増殖を判定するステップと、を備えることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、ＡＴＰ法による検体中の菌の検出を高感度とし、検出時間を短縮することができる。
上記した以外の課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１に係る細胞検出装置１を示す構成図。
【図２】ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応による発光計測により大腸菌の増殖を計測した結果を示すグラフ。
【図３】発光計測の結果から算出した大腸菌由来の発光量を示すグラフ。
【図４】実施例２に係る細胞検出装置２を示す構成図。
【図５】実施例２に係る細胞検出装置２を示す構成図。
【図６】実施例２に係る細胞検出装置２を用いた計測方法の一例を示すフローチャート。
【図７】実施例３に係る細胞検出装置３を示す構成図。
【図８】実施例４に係る細胞検出装置４を示す構成図。
【図９】実施例４に係る細胞検出装置４を示す構成図。
【図１０】実施例５に係る細胞検出装置５を示す構成図。
【図１１】実施例６に係る細胞検出装置６を示す構成図。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、図面を用いて実施例を説明する。
【００１５】
［実施例１］
＜細胞検出装置の構成例＞
図１を参照して、本発明の一実施形態に係る細胞検出装置について説明する。図１は、実施例１に係る細胞検出装置１を示す構成図である。
【００１６】
細胞検出装置１は、図１に示すように、上容器１１（培養部）及び下容器１２（発光試薬部）を有する密閉容器１０と、プランジャー１３（接触機構）と、光検出器１５とを備える。上容器１１及び下容器１２は、下容器１２の開口部１８において嵌合され、密着する。プランジャー１３は、上容器１１の開口部１７（検体導入部）において嵌合され、密閉容器１０を密閉可能に構成される。密閉容器１０が密閉されることにより、外部からの菌の混入（コンタミネーション）を防ぐことができる。
【００１７】
上容器１１は、菌（細胞）を含む可能性のある検体及び液体培地を含む培養液２０を収容する容器である。上容器１１は、培養液２０を下容器１２へ滴下するための流路１４を備える。上容器１１の開口部１７には、セプタムが嵌合されていてもよい。この場合、検体をシリンジで採取し、シリンジの針をセプタムに貫通させることで、上容器１１内に無菌的に検体を導入することができる。この場合、セプタムの上部からプランジャー１３を嵌合することができる。
【００１８】
また、開口部１７にセプタムを設ける代わりに、プランジャー１３に、プランジャー１３を鉛直方向に貫通する孔を設け、この孔から検体を上容器１１内に導入する構成とすることもできる。この場合、プランジャー１３の孔にセプタムを設けてシリンジを用いて検体を導入することが好ましい。
【００１９】
下容器１２は、発光試薬２１を収容する容器である。発光試薬２１は、例えば、ＡＴＰの存在下において、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応により発光するルシフェラーゼ及びルシフェリンを含む試薬とすることができる。ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応は、酸素の存在下において促進される。なお、ルシフェラーゼは下容器１２に導入され、ルシフェリンは培養液２０に混合されていてもよい。また、ルシフェリン及びルシフェラーゼが下容器１２に導入され、ルシフェリンが培養液２０にも混合されていてもよい。
【００２０】
また、発光試薬２１として、例えば、キノン存在下において、生菌のキノン酸化還元酵素（ＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨ）により生成する活性酸素を定量するための化学発光試薬とすることもできる。この場合、化学発光試薬を下容器１２に導入し、キノンを培養液２０に添加することで、キノン及びキノン酸化還元酵素の反応により培養液２０中に活性酸素が生じ、この培養液２０を滴下することで、化学発光試薬が活性酸素と反応して発光する。菌の増殖に応じて活性酸素が増加するため、菌の増殖に比例した発光量を計測することができる。
【００２１】
化学発光試薬として、例えば、２−メチル−６−フェニル−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン（ＣＬＡ）、２−メチル−６−（４−メトキシフェニル）−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン（ＭＣＬＡ）、２-メチル‐６−ｐ−メトキシフェニルエチニルイミダゾピラジノン（ＭＰＥＣ）、インドシアニン型イミダゾピラノジン化合物（ＮＩＲ−ＣＬＡ）等が挙げられる。
【００２２】
下容器１２に発光試薬２１を導入して上容器１１を嵌合し、上容器１１に培養液２０を導入した後、プランジャー１３を上容器１１の開口部１７に嵌合することで、発光試薬２１と培養液２０は密閉容器１０内において密閉された状態となる。このとき、培養液２０と発光試薬２１とは、容器内で離れた場所に位置する。なお、本明細書において密閉とは、菌が通過しないということを意味しており、菌が通過しない大きさの細孔や隙間、例えば０．１μｍ以下の細孔や隙間であれば許容される。
【００２３】
密閉容器１０は、少なくとも下容器１２が、発光反応で放出される光の波長を透過させる素材で形成される。例えば、発光試薬が可視光を発する反応を起こすものである場合は、密閉容器１０は、無色透明のプラスチックやガラス等が使用できる。
【００２４】
密閉容器１０の壁の一部を、細胞を通さずガスが通過可能な素材としてもよい。ガスが通過可能な素材として、例えば、孔径０．１μｍ程度のメンブレンフィルタが挙げられる。このように、密閉容器１０内外のガスを通過可能とすることで、密閉容器１０外から密閉容器１０内のガス組成を制御し、菌の増殖に適したガス組成とすることができる。例えば嫌気性菌の発光計測を行う場合には、上容器１１の内部に酸素を含まないガスを供給して嫌気性条件とし、下容器１２の内部に酸素を含むガスを供給して好気性条件とすることもできる。
【００２５】
光検出器１５は、密閉容器１０外において下容器１２中の発光試薬２１が放出する光を検出可能な位置に配置される。光検出器１５は、所定の時間ごとに、あるいは培養中常に、発光試薬２１が放出する光を検出する。光検出器１５は、検出信号からの発光量の算出や、陽性又は陰性の判定等を行う演算部（図示せず）を備える。また、光検出器１５は、菌由来の発光量から検体が陽性か陰性かを判定するための所定の閾値等のデータを記憶する記憶部（図示せず）を備える。
【００２６】
演算部は、培養液２０の滴下後の発光量の最大値から滴下直前の発光量を差し引いた値（発光量の増加量）を菌由来の発光量として算出することもできる。また、演算部は、予め設定した所定の閾値と、菌由来の発光量とを比較して、陽性（検体中に菌が存在する）か陰性（検体中に菌が存在しない）かの判定を行う。
【００２７】
光検出器１５は、算出した発光量や、陽性か陰性かの判定結果を表示する表示部を備えていてもよい。また、光検出器１５は、演算部による判定結果を示すアラーム音を発するスピーカーを備えていてもよい。
【００２８】
下容器１２は、少なくとも発光試薬２１の周辺は、発光反応により放出される光の波長を透過させる素材で形成される。例えば、発光試薬２１が可視光を発する反応を起こすものである場合は、下容器１２として、無色透明のプラスチックやガラス等を使用できる。
【００２９】
上容器１１中の培養液２０に攪拌子１６（攪拌手段）を導入するか、密閉容器１０の外部から密閉容器１０に振動や回転を与えることにより、培養液２０を攪拌してもよい。培養液２０を攪拌することで菌が均一に分散し、培養液２０を発光試薬２１に滴下する際に、菌濃度に比例した発光量が得られる。また、培養は、密閉容器１０を温度調節する培養器（温度調節手段）中に置いて行うことが好ましい。
【００３０】
＜計測方法＞
次に、本実施例に係る細胞検出装置１を用いた計測方法の一例について説明する。まず、ユーザーは、発光試薬２１を下容器１２に導入し、上容器１１を開口部１８に嵌合する。次に、ユーザーは、予め作成した培養液２０を上容器１１に導入し、開口部１７にプランジャー１３を嵌合する。
【００３１】
次に、０時間目の発光量（菌の初期濃度）を計測するため、ユーザーは、プランジャー１３を外部から一定量押すことで、流路１４を介して培養液２０を滴下し、発光試薬２１に混合する。このとき、光検出器１５は、０時間目の発光量の計測を開始する。光検出器１５の演算部は、培養液２０の滴下後の発光量の最大値から滴下直前の発光量を差し引いた値（発光量の増加量）を菌由来の発光量として算出する。
【００３２】
所定の時間培養後、例えば１時間後に、ユーザーは、再度プランジャー１３を外部から一定量押し、０時間目と同量の培養液２０を発光試薬２１に滴下する。光検出器１５は、１時間目の発光量を計測する。その後、再度所定の時間、培養を行う。
【００３３】
以上のように、培養液２０の滴下及び発光量の計測を所定の時間毎に繰り返して、発光量の経時変化から、菌の増殖を判定する。なお、この時間間隔（培養時間）は、一定であってもよいし、適当なタイミングで変更されてもよい。
【００３４】
光検出器１５は、培養液全体の発光量あるいは菌由来の発光量が予め設定した閾値以上となった場合に、菌が増殖したと見做し、陽性であると判定する。
【００３５】
陽性と判定するための発光量の閾値は、例えば、０時間目の発光量を３倍した値などに設定することができる。また、閾値は、複数の計測における０時間目の発光量の標準偏差を求め、０時間目の発光量に標準偏差の３倍を加えた値などに設定することができる。陽性であるとの判定の確実性を向上したい場合には、例えば、０時間目の発光量を１０倍した値、０時間目の発光量と標準偏差との和を１０倍した値などに閾値を設定することが好ましい。また、例えば、複数回同じ条件（同じ初期濃度、同じ温度等）で発光計測を行い、演算部により陽性と判定された培養時間における発光量の平均値を算出し、該平均値を閾値としてもよい。また、計測される菌種ごとに推奨される閾値をそれぞれ設定していてもよい。
【００３６】
ここで、発光量の経時変化の計測回数の最大数をＳ、１回の計測で滴下する培養液２０の量をＬ（ｍＬ）とすると、培養液２０の量は、Ｓ×Ｌ（ｍＬ）以上必要である。陽性化後、菌種の同定や薬剤感受性試験を行うために培養液２０が必要な場合は、培養液２０の量は、２×Ｓ×Ｌ（ｍＬ）以上であることが好ましい。また、発光試薬２１の量は、５×Ｓ×Ｌ（ｍＬ）以上であることが好ましい。これは、滴下する培養液２０の量に比較して発光試薬２１の量を過剰とすることで、培養液２０の滴下により発光試薬２１が徐々に薄まり発光効率が変化することを防ぐことができるためである。例えば、一度に滴下される培養液２０の量が１０μＬであり、最大１０回まで計測する場合、培養液２０の量を０．２ｍＬ以上とし、発光試薬２１の量を０．５ｍＬ以上とすることで、細胞検出装置１において感度よく菌を検出することができ、また、検出後に菌種同定や薬剤感受性試験を行うことができる。
【００３７】
なお、本実施例において、上容器１１に発光試薬２１を導入し、下容器１２に培養液２０を導入して、発光試薬２１を培養液２０に滴下する構成とすることもできる。発光計測の感度を向上させるという観点からは、図１に示すように培養液２０を滴下する構成であることが好ましい。
【００３８】
（計測例１）
図２及び図３を参照して、本実施例に係る細胞検出装置１を用いた発光計測の計測例について説明する。図２は、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応による発光計測により大腸菌の増殖を計測した結果を示すグラフである。図３は、発光計測の結果から算出した大腸菌由来の発光量を示すグラフである。
【００３９】
まず、下容器１２にＡＴＰ発光試薬（プロメガ社製、ＢａｃＴｉｔｅｒＧＬｏ）０．５ｍＬを導入した。このＡＴＰ発光試薬は、ルシフェリン及びルシフェラーゼの他に、菌体を破壊して菌内のＡＴＰを抽出するための界面活性剤を含む。該ＡＴＰ発光試薬に培養液を混合すると、直ちに菌からＡＴＰが抽出され、溶液中の遊離ＡＴＰと菌由来ＡＴＰの両方がルシフェリン−ルシフェラーゼ反応を惹起して発光する。
【００４０】
次に、ＡＴＰ発光試薬を入れた下容器１２に上容器１１を嵌合し、予め作成した大腸菌培養液（０時間目の大腸菌濃度が１７ＣＦＵ／ｍＬ）を上容器１１に導入した。大腸菌培養液を入れた上容器１１にプランジャー１３を嵌合して、密閉容器１０を密閉した。
【００４１】
プランジャー１３を押して、ＡＴＰ発光試薬に、１時間ごとに、大腸菌培養液を１０μＬずつ滴下し、下容器１２の下部に設置した光検出器１５で発光量を計測した。発光量の計測は、大腸菌培養液の滴下前後のおよそ１分間行った。結果を図２に示す。
【００４２】
また、滴下後の発光量の最大値から滴下直前の発光量を差し引いた値を大腸菌由来の発光量として算出し、結果を図３の折れ線グラフａに示した。
【００４３】
（計測例２）
大腸菌培養液の０時間目の大腸菌濃度を１７０ＣＦＵ／ｍＬとしたこと以外は計測例１と同様にして、発光量の計測を行った。結果を図３の折れ線グラフｂに示した。
【００４４】
（計測例３）
大腸菌培養液の０時間目の大腸菌濃度を１８００ＣＦＵ／ｍＬとしたこと以外は計測例１と同様にして、発光量の計測を行った。結果を図３の折れ線グラフｃに示した。
【００４５】
（計測結果）
陽性と判定するための大腸菌由来の発光量の閾値を、図３中の破線のように７．５×１０３ＣＰＳ（ＣＰＳ:Ｃｏｕｎｔ  Ｐｅｒ  Ｓｅｃｏｎｄ）と設定すると、計測例１においては５時間で陽性となった。図３に示すように、計測例２においては４時間、計測例３においては２時間で陽性となった。本実施例における菌検出感度は、３×１０５ＣＦＵ／ｍＬであり、蛍光法の１０７ＣＦＵ／ｍＬよりも２桁感度が高く、蛍光法よりも短時間で菌増殖を検出することができた。
【００４６】
＜技術的効果＞
以上のように、本実施例は、培養液と発光試薬とが離れた位置に配置されるように密閉容器に収容し、培養液を発光試薬に滴下する構成を採用している。これにより、培養液を分取して発光試薬と混合する操作が不要となるため、外部からの菌の混入による偽陽性を防止することができる。また、培養液と発光試薬とが分離され、培養液と発光試薬の接触を断続的に行うことで、菌が産生したＡＴＰが発光反応で常に消費されることがなく、菌の増殖に比例して培養液中のＡＴＰ濃度が上昇するため、菌の増殖を高感度に検出することができる。さらに、菌の増殖を高感度に検出することができるため、従来の濁度法や蛍光法よりも短時間で発光計測を行うことができる。
【００４７】
［実施例２］
＜細胞検出装置の構成例＞
図４及び５を参照して、本発明の一実施形態に係る細胞検出装置について説明する。図４及び５は、実施例２に係る細胞検出装置２を示す構成図である。図４は、発光計測時における細胞検出装置２の状態を示し、図５は、培養時における細胞検出装置２の状態を示す。
【００４８】
細胞検出装置２は、図４に示すように、密閉容器２００（培養部、接触機構）及び光検出器２０６を備える。密閉容器２００は、発光試薬２０１としてルシフェラーゼが底部（発光試薬部）に固定されている。ルシフェラーゼを固定する方法としては、ルシフェラーゼ溶液をゲル化する方法、密閉容器２００の内側底面にルシフェラーゼを物理吸着又は共有結合させて固定する方法、ルシフェラーゼを密閉容器２００に導入した後、その上にルシフェラーゼが透過しない半透膜を設置する方法などが利用できる。ルシフェリンは、ルシフェラーゼと共に固定されるか、培養液に添加される。
【００４９】
密閉容器２００は、上部に開口部２０７を有し、該開口部２０７にセプタム２０３が嵌合される。菌（細胞）を含む可能性のある検体をシリンジで採取し、セプタム２０３にシリンジの針を刺すことで、密閉容器２００内に検体を導入することができる。
【００５０】
密閉容器２００は、少なくとも底部が、発光反応で放出される光の波長を透過させる素材で形成される。例えば、発光試薬が可視光を発する反応を起こすものである場合は、密閉容器２００は、無色透明のプラスチックやガラス等が使用できる。
【００５１】
光検出器２０６は、発光試薬２０１から放出される光を検出可能な位置に配置される。図４に示すように、光検出器２０６は、例えば密閉容器２００の底部の下方に配置される。光検出器２０６は、実施例１の光検出器１５と同様の構成とすることができるため、説明を省略する。
【００５２】
図５に示すように、密閉容器２００による菌の培養は、振盪培養器２０５（温度調節手段、攪拌手段）を用いて行われることが好ましい。振盪培養器２０５は、密閉容器２００を挿入可能に構成され、密閉容器２００の温度調節や、密閉容器２００を振盪して培養液２０２を攪拌するための培養器である。
【００５３】
＜計測方法＞
次に、図６を参照して、本実施例に係る細胞検出装置２を用いた計測方法の一例について説明する。図６は、実施例２に係る計測方法を示すフローチャートである。本計測方法は、細胞検出装置２を用いてマニュアルで発光計測を行う場合の計測方法である。
【００５４】
ステップＳ１において、ユーザーは、発光試薬２０１を密閉容器２００に導入し、密閉容器２００の底部に固定する。次に、ユーザーは、発光試薬２０１が固定された密閉容器２００にルシフェリンを含む液体培地を導入し、セプタム２０３を開口部２０７に嵌合して密閉する。液体培地の導入後、数時間放置することが好ましい。これにより、液体培地中に元から含まれるＡＴＰを発光反応により消費し、液体培地由来の発光を低減することができる。このとき、光検出器２０６で発光量を計測し、ユーザーは、発光量が低値で安定したことを確認する。
【００５５】
ステップＳ２において、ユーザーは、シリンジを用いて検体を採取し、シリンジの針をセプタム２０３へ刺して検体を液体培地へ添加し、培養液２０２を作成する。
【００５６】
ステップＳ３において、ユーザーは、シリンジの針をセプタムから抜く。このとき、シリンジの針を刺すことにより形成された穴はセプタムの弾性力により塞がれ、容器は密閉される。
【００５７】
ステップＳ４において、密閉容器２００内において培養液２０２及び発光試薬２０１が接触した状態であるので、光検出器２０６は、０時間目の計測として、発光計測を開始する。
【００５８】
ステップＳ５において、培養液２０２中の遊離ＡＴＰにより発光反応が起きるので、ユーザーは、この発光量が低値で安定するまで待機する。これにより、培養液２０２中の遊離ＡＴＰを低減することができ、その後の発光計測のバックグラウンドを低減することができる。
【００５９】
ステップＳ６において、ユーザーは、図５のように密閉容器２００を倒置することで、発光試薬２０１及び培養液２０２を分離する。ユーザーは、倒置した密閉容器２００を振盪培養器２０５に挿入し、所定の時間、菌を培養する。
【００６０】
ステップＳ７において、ユーザーは、所定の時間培養したら、密閉容器２００を振盪培養器２０５から取り出して図４のように正立させることにより、培養液２０２及び発光試薬２０１を接触させる。
【００６１】
ステップＳ８において、光検出器２０６は、培養液２０２及び発光試薬２０１の接触の前後の一定時間（例えば接触の前後１分間）、発光計測を行う。このとき、培養による菌の増殖に伴って培養液２０２中に増加した遊離ＡＴＰにより発光反応が起こるため、ＡＴＰ濃度に比例した発光量が得られる。また、光検出器２０６は、培養液２０２及び発光試薬２０１の接触後の発光量の最大値から接触直前の発光量を差し引いた値を菌由来の発光量として算出する。
【００６２】
ステップＳ９において、光検出器２０６の演算部は、菌由来の発光量が、所定の閾値以上であるかどうか判定する。演算部は、菌由来の発光量が所定の閾値以上であった場合は、ステップＳ１０において、陽性と判定し、発光計測を終了する。
【００６３】
演算部は、菌由来の発光量が所定の閾値未満であった場合には、ステップＳ１１において、培養時間が所定の時間以上であるか判定する。光検出器２０６は、培養時間が所定の時間以上であった場合は、ステップＳ１２において、陰性と判定し、発光計測を終了する。
【００６４】
培養時間が所定の時間未満であった場合は、ステップＳ１３において、ユーザーは、密閉容器２００を倒置して、発光試薬２０１と培養液２０２を分離して、倒置した密閉容器２００を振盪培養器２０５に挿入し、所定の時間、菌を培養する。
【００６５】
ステップＳ１３の後、ステップＳ１４において、演算部は、発光量の経時変化に基づいて、次回の発光計測時間を算出する。次回の発光計測時間になったら、ステップＳ７に戻る。
【００６６】
なお、ステップＳ１４において、次回の発光計測時間は、一回の計測ごとに変更される必要はなく、例えば毎回１時間後というように設定されていてもよい。また、次回の発光計測時間は、例えば１回目の発光計測は培養開始１時間後、２回目の発光計測は１回目の計測から２時間後、３回目の発光計測は２回目の計測から３時間後というように、一度の計測ごとに変更してもよい。
【００６７】
＜技術的効果＞
以上のように、本実施例においては、発光試薬２０１が底部に固定された密閉容器２００に培養液２０２を導入し、密閉容器２００の倒置により培養液及び発光試薬の接触及び分離を制御する構成を採用している。これにより、実施例１と同様の効果を奏することができる。
【００６８】
また、本実施例においては、菌増殖に伴って培養液２０２中に遊離するＡＴＰのみを計測するため、菌体が破壊されない。従って、発光計測後に培養液２０２から菌体を取り出して、菌種同定や分離培養、薬剤感受性試験などに利用することができる。
【００６９】
［実施例３］
＜細胞検出装置の構成例＞
図７を参照して、本発明の一実施形態に係る細胞検出装置について説明する。図７は、実施例３に係る細胞検出装置３を示す構成図である。
【００７０】
細胞検出装置３は、図７に示すように、密閉容器３００（培養部）、光検出器３０１、光ファイバ３０２（発光試薬部、接触機構）を備える。密閉容器３００は、検体、液体培地及びルシフェリンを含む培養液３０４を収容する容器である。密閉容器３００は、開口部３０６（検体導入部）を有し、開口部３０６にセプタム３０３が嵌合されることにより密閉される。
【００７１】
光ファイバ３０２は、セプタム３０３に差し込むことで密閉容器３００内に挿入される。光ファイバ３０２は、一端部にルシフェラーゼを含む発光試薬３０５が固定され、他端部は光検出器３０１に接続される。光ファイバ３０２は、発光試薬３０５が固定された一端部において放出された光を光検出器３０１に伝達する。
【００７２】
なお、発光試薬３０５として、キノン及びキノン酸化還元酵素の反応により生成する活性酸素を定量可能な化学発光試薬を用いることもできる。この場合、化学発光試薬を光ファイバ３０２の一端部に固定し、キノンを培養液３０４に添加しておく。
【００７３】
光検出器３０１は、実施例１の光検出器１５と同様の構成とすることができるため、説明を省略する。光検出器３０１は、光ファイバ３０２から伝達された光を検出する。
【００７４】
＜計測方法＞
次に、本実施例に係る細胞検出装置３を用いた計測方法について説明する。本計測方法は、細胞検出装置３を用いてマニュアルで発光計測を行う場合の計測方法である。
【００７５】
まず、ユーザーは、密閉容器３００に、検体、ルシフェリン及び液体培地を混合した培養液３０４を開口部３０６から導入し、セプタム３０３を嵌合して密閉し、所定の時間、培養する。開口部３０６にセプタムを嵌合した後、培養液３０４を採取したシリンジの針をセプタムに差し込むことによって、培養液３０４を密閉容器３００に導入することもできる。培養は、図示しない振盪培養器（温度調節手段、攪拌手段）中で行うことが好ましい。
【００７６】
次に、ユーザーは、一端部に発光試薬３０５が固定された光ファイバ３０２を開口部３０６から密閉容器３００内に導入する。所定の時間培養したら、ユーザーは、光ファイバ３０２をさらに差し込んで一端部を培養液３０４に浸し、発光試薬３０５及び培養液３０４を接触させる。光検出器３０１は、培養液３０４及び発光試薬３０５の接触の前後の一定時間（例えば接触の前後１分間）、光ファイバ３０２から伝達された光を検出して、発光計測を行う。このとき、培養による菌の増殖に伴って培養液３０４中に増加した遊離ＡＴＰにより発光反応が起こるため、ＡＴＰ濃度に比例した発光量が得られる。また、光検出器３０１の演算部は、培養液３０４及び発光試薬３０５の接触後の発光量の最大値から接触直前の発光量を差し引いた値を菌由来の発光量として算出する。
【００７７】
発光計測後、ユーザーは、光ファイバ３０２を培養液３０４から引き上げて発光試薬３０５を培養液３０４から分離し、所定の時間、培養を行う。以上のように、培養及び発光計測を所定の時間毎に繰り返すことで、培養液３０４中の遊離ＡＴＰ量の経時変化を計測することができる。なお、この時間間隔（培養時間）は、一定であってもよいし、適当なタイミングで変更されてもよい。
【００７８】
また、細胞検出装置３においても、図６に示した計測方法を適用できる。この場合、ステップＳ４は、ユーザーが光ファイバ３０２の一端部を培養液３０４に浸して発光計測を開始するステップとなる。ステップＳ６は、ユーザーが光ファイバ３０２を引き上げて、発光試薬３０５を培養液３０４から分離するステップとなる。
【００７９】
＜技術的効果＞
以上のように、本実施例は、一端部に発光試薬３０５が固定された光ファイバ３０２を培養液３０４に浸したり、引き上げたりすることによって、培養液３０４及び発光試薬３０５の接触及び分離を制御する構成を採用している。これにより、実施例１と同様の効果を奏することができる。
【００８０】
また、本実施例においては、光ファイバ３０２の一端部における局所的な発光が効率よく光検出器３０１に到達するため、少量の発光試薬３０５で高感度の計測が可能である。
【００８１】
［実施例４］
＜細胞検出装置の構成例＞
図８及び９を参照して、本発明の一実施形態に係る細胞検出装置について説明する。図８及び９は、実施例４に係る細胞検出装置４を示す構成図である。図８は、菌の培養時における細胞検出装置４の状態を示す。図９は、発光計測時における細胞検出装置４の状態を示す。
【００８２】
細胞検出装置４は、図８及び９に示すように、培養ボトル４００（培養部）、ガスセンサ４０２、磁石４０４（接触機構）、磁気ビーズ４０５（発光試薬部）、カメラ４０６、光検出器４０７を備える。培養ボトル４００は、菌（細胞）を含む可能性のある検体及び液体培地を含む培養液４０３を収容する容器である。培養ボトル４００は、開口部４０８（検体導入部）にセプタム４０１が嵌合されることにより、密閉される。
【００８３】
培養ボトル４００は、少なくとも培養液の周辺は、発光反応で放出される光の波長を透過させる素材で形成される。例えば、発光試薬が可視光を発する反応を起こすものである場合は、培養ボトル４００は、無色透明のプラスチックやガラス等が使用できる。
【００８４】
磁気ビーズ４０５は、表面に発光試薬としてルシフェラーゼが固定されている。磁気ビーズ４０５は、培養ボトル４００の内部に導入される。
【００８５】
磁石４０４は、培養ボトル４００の外部に配置され、培養ボトル４００の内部に導入される磁気ビーズ４０５を培養ボトル４００の壁面を介して保持する。図８に示すように、培養液４０３の導入時及び培養時には、発光反応が起こらないように、磁気ビーズ４０５は、培養液４０３に接触しない位置において磁石４０４により保持される。図９に示すように、発光計測時には、磁石４０４は、培養ボトル４００から離され、これにより磁気ビーズ４０５が培養液４０３内へ分散される。
【００８６】
光検出器４０７は、実施例１の光検出器１５と同様の構成とすることができるため、説明を省略する。
【００８７】
ガスセンサ４０２は、培養ボトル４００の内部において、培養液４０３と接触しない位置に配置される。ガスセンサ４０２は、菌の増殖に伴って菌から放出され、菌種に特徴的な揮発性代謝物に反応し、色調が変化する蛍光色素を備える。ガスセンサ４０２により、培養液４０３中の菌種を同定することができる。発光計測において菌の増殖が陽性となった後、そのまま培養を続けることで、培養ボトル４００中にさらに揮発性代謝物が蓄積される。
【００８８】
カメラ４０６は、培養ボトル４００の外部においてガスセンサ４０２の近傍に設置され、ガスセンサ４０２の色調を観察する。ガスセンサ４０２の色調に基づいて、菌種の同定を行うことができる。ガスセンサ４０２の色調に基づく菌種の同定は、ユーザーが行ってもよいし、カメラ４０６に演算装置を接続して、演算装置が行ってもよい。
【００８９】
＜計測方法＞
次に、本実施例に係る細胞検出装置４を用いた計測方法の一例について説明する。本計測方法は、細胞検出装置４を用いてマニュアルで発光計測を行う場合の計測方法である。
【００９０】
まず、図８に示すように、ユーザーは、培養ボトル４００の内部に磁気ビーズ４０５を導入し、磁石４０４により磁気ビーズ４０５を培養ボトル４００の内壁面に集結させておく。また、培養ボトル４００に液体培地及びルシフェリンを導入し、開口部４０８にセプタム４０１を嵌合しておく。ユーザーは、シリンジを用いて検体を採取し、セプタム４０１にシリンジの針を刺して検体を液体培地に添加し、培養液４０３とする。検体の添加後、所定の時間、培養を行う。図８のように、培養中は培養ボトル４００の外部にある磁石４０４の位置を操作して、磁気ビーズ４０５を培養液４０３から離れた場所に集結させ、発光反応が起こらないようにする。
【００９１】
所定の時間培養後、ユーザーは、磁石４０４を培養ボトル４００から離して、磁気ビーズ４０５を培養液４０３中に分散させる。光検出器４０７は、培養液４０３及び磁気ビーズ４０５の接触の前後の一定時間（例えば接触の前後１分間）、発光計測を行う。
【００９２】
発光計測後、ユーザーは、磁石４０４を用いて再度磁気ビーズ４０５を集結させ、培養液４０３から分離する。磁気ビーズ４０５を分離後、再度所定の時間、培養する。
【００９３】
以上のように、培養液４０３及び磁気ビーズ４０５の接触と、発光計測とを一定時間毎に繰り返すことで、培養液４０３中の遊離ＡＴＰ量の経時変化を計測することができる。なお、この時間間隔（培養時間）は、一定であってもよいし、適当なタイミングで変更されてもよい。
【００９４】
また、本実施例の細胞検出装置４においても、図６に示した計測方法を適用できる。この場合、ステップＳ４は、ユーザーが磁石４０４を培養ボトル４００から離して磁気ビーズ４０５を培養液４０３中に分散させ、発光計測を開始するステップとなる。ステップＳ６は、ユーザーが磁石４０４を培養ボトル４００に近づけて磁気ビーズ４０５を培養液４０３から分離するステップとなる。
【００９５】
＜技術的効果＞
以上のように、本実施例は、磁石４０４によって、発光試薬が固定された磁気ビーズ４０５と、培養液４０３との接触及び分離を制御する構成を採用している。これにより、本実施例は、実施例１と同様の効果を奏することができる。
また、本実施例においては、磁石４０４の位置を変更するだけで発光試薬及び培養液４０３の接触及び分離を制御することができ、簡便に発光計測を行うことができる。
【００９６】
［実施例５］
＜細胞検出装置の構成例＞
図１０を参照して、本発明の一実施形態に係る細胞検出装置について説明する。図１０は、実施例５に係る細胞検出装置５を示す構成図である。細胞検出装置５は、発光計測を自動で行う装置である。
【００９７】
細胞検出装置５は、図１０に示すように、密閉容器１００、接触機構１０３、光検出器１０５、演算装置１０６及び表示部１０７を備える。
密閉容器１００は、検体導入部１０４、培養部１０１、発光試薬部１０２を有する。
【００９８】
培養部１０１は、検体及び液体培地を含む培養液を収容する。発光試薬部１０２は、発光試薬を収容する。発光試薬は、例えばルシフェリン、ルシフェラーゼ及び界面活性剤を含む発光試薬や、活性酸素により発光する化学発光試薬等とすることができる。密閉容器１００内において、培養部１０１及び発光試薬部１０２は、互いに分離して配置され、これにより培養液及び発光試薬は分離されている。
【００９９】
密閉容器１００内は滅菌されていることが好ましく、培養部１０１への検体又は培養液の導入は、無菌的に行われることが好ましい。
【０１００】
検体導入部１０４は、培養部１０１への培養液の導入後に密閉容器１００を密閉可能な構造であり、外部からの菌の混入（コンタミネーション）を防ぐことができる。検体導入部１０４に、例えばセプタムを嵌合することで密閉容器１００を密閉することができる。
【０１０１】
細胞検出装置５は、検体導入部１０４から培養液又は検体を導入するためのシリンジ（図示せず）、及びシリンジの駆動を制御するためのシリンジ駆動部（図示せず）を備えていてもよい。この場合、培養液又は検体をシリンジで採取し、シリンジの針をセプタムに貫通させることで、培養液又は検体を密閉容器１００内に添加することができる。あるいは、検体導入部１０４は、スクリューキャップなどの開閉可能な蓋で密閉容器１００を密閉可能な構造としてもよい。
【０１０２】
培養部１０１には、予め、菌の発育を促進する成分や、菌の発育を阻害する物質を捕捉する成分を含む液体培地を入れておき、そこに検体を添加して培養液としてもよい。
【０１０３】
密閉容器１００は、少なくとも発光試薬部１０２の周辺は、発光反応で放出される光の波長を透過させる素材で形成される。例えば、発光試薬が可視光を発する反応を起こすものである場合は、密閉容器１００は、無色透明のプラスチックやガラス等が使用できる。
【０１０４】
接触機構１０３は、培養部１０１の培養液及び発光試薬部１０２の発光試薬の接触を制御する機構である。接触機構１０３は、培養液の汚染を防止するため、密閉容器１００の外部に設けられることが好ましい。
【０１０５】
接触機構１０３の例について説明する。実施例１の細胞検出装置１を自動化した装置を想定する。この場合、細胞検出装置１は、プランジャー１３を駆動するプランジャー制御装置をさらに備える。プランジャー制御装置がプランジャー１３を駆動させることによって、培養液が発光試薬へ滴下される。従って、プランジャー１３及びプランジャー制御装置が、接触機構１０３に相当する。
【０１０６】
また、実施例２の細胞検出装置２を自動化した装置を想定すると、細胞検出装置２は、密閉容器２００を倒置するための密閉容器駆動部をさらに備える。細胞検出装置２は、密閉容器２００の底部に発光試薬が固定されており、密閉容器駆動部が密閉容器２００を倒置させることで培養液及び発光試薬を接触させることができる。従って、密閉容器２００及び密閉容器駆動部が、接触機構１０３に相当する。
【０１０７】
さらに、実施例３の細胞検出装置３を自動化した装置を想定すると、細胞検出装置３は、光ファイバ３０２を上下させる光ファイバ駆動部をさらに備える。光ファイバ３０２は、先端に発光試薬が固定されており、光ファイバ駆動部が光ファイバ３０２を上下させることで培養液に発光試薬を接触させることができる。従って、光ファイバ３０２及び光ファイバ駆動部が、接触機構１０３に相当する。
【０１０８】
さらに、実施例４の細胞検出装置４を自動化した場合を想定すると、細胞検出装置４は、磁石４０４を駆動する磁石駆動部をさらに備える。細胞検出装置４においては、磁気ビーズ４０５に発光試薬が固定されており、磁石４０４によって磁気ビーズ４０５を培養液４０３に分散したり、培養液４０３から分離したりすることができる。従って、磁石４０４及び磁石駆動部が接触機構１０３に相当する。
【０１０９】
演算装置１０６は、図示は省略しているが、接触機構１０３及び光検出器１０５の制御を行う制御部と、光検出器１０５から検出信号を受信して、発光量の算出や、陽性又は陰性の判定等を行う演算部と、菌由来の発光量から検体が陽性か陰性かを判定するための所定の閾値等のデータを記憶する記憶部とを備える。ユーザーは、培養開始から発光計測を開始して、例えば１時間おきに発光計測を行うというように、予め発光計測する時間間隔を設定することができ、演算装置１０６は、該時間間隔を記憶部に記憶することもできる。演算装置１０６は、過去のデータ等に基づいて発光計測の時間間隔を算出するようにしてもよい。
【０１１０】
細胞検出装置５は、密閉容器１００の外部に組成を調整したガスを供給するガス供給手段を備えていてもよい。この場合、密閉容器１００の壁の一部、又は検体導入部１０４を、細胞を通さずガスが通過可能な素材とすることが好ましい。ガスが通過可能な素材として、例えば、孔径０．１μｍ程度のメンブレンフィルタが挙げられる。このように、密閉容器１００外から密閉容器１００内のガス組成を制御することで、菌の増殖に適したガス組成とすることができ、菌の増殖を加速することができる。例えば、好気性菌を検出する場合であれば、密閉容器１００外に酸素を含む好気性ガスを供給することで、菌の増殖速度を向上することができる。偏性嫌気性菌のように酸素の存在下では生育できない菌を検出する場合は、窒素やアルゴンなど、酸素を除去した嫌気性ガスを密閉容器１００外に供給することで、嫌気性菌の増殖を可能とすることができる。また、培養部１０１には嫌気性ガスを導入し、発光試薬部１０２には酸素を含むガスを供給する構成とすることもできる。
【０１１１】
培養中は、密閉容器１００内を一定温度に保ってもよく、そのために細胞検出装置５は、温度調節器（図示せず）を備えていても良い。菌種によって増殖の至適温度が異なるため、菌ごとに適した温度で培養することで、増殖を加速することができる。
【０１１２】
表示部１０７は、演算装置１０６から、算出された発光量や、陽性又は陰性の判定結果等を受信して、表示する。判定結果は、例えばアラームなどとして表示部１０７に表示してもよい。
【０１１３】
細胞検出装置５は、図示しないスピーカーを備えてもよい。スピーカーは、陽性との判定結果をアラーム音として発することができる。
細胞検出装置５は、例えば検体中の真菌や細菌の有無の判定、培養細胞の増殖のモニタリングなどに用いることができる。
【０１１４】
＜計測方法＞
次に、本実施例に係る細胞検出装置５を用いた計測方法の一例について説明する。本実施例における計測方法として、例えば図６に示した測定方法を採用することができるため、図６を参照する。
【０１１５】
ステップＳ１において、ユーザーは、発光試薬部１０２に発光試薬を導入し、培養部１０１に液体培地を導入しておき、検体導入部１０４にセプタムを嵌合して密閉容器１００を密閉しておく。
【０１１６】
ステップＳ２において、ユーザーは、シリンジを用いて検体を採取する。セプタムにシリンジの針を刺して容器に挿入する。ユーザーは、シリンジから検体を培養部１０１内の液体培地に添加して、培養液を作成する。
【０１１７】
ステップＳ３において、ユーザーは、シリンジの針をセプタムから抜く。このとき、シリンジの針により形成された穴はセプタムの弾性力により塞がれ、密閉容器１００は密閉される。
【０１１８】
ステップＳ４において、演算装置１０６は、接触機構１０３を駆動するための信号を接触機構１０３に送信し、接触機構１０３は、培養液と発光試薬を接触させる。光検出器１０５は、０時間目の計測として、接触の前後の一定時間（例えば接触の前後１分間）計測を行えるように、発光計測を開始する。このとき演算装置１０６は、光検出器１０５から検出信号を受信して、培養液由来の発光量を算出する。
【０１１９】
ステップＳ５において、演算装置１０６は、初めに発光量が一定値以下になるまで接触機構１０３を駆動せず、培養液と発光試薬を接触させ続ける。これにより、培養液中の遊離ＡＴＰを低減することができ、その後の発光計測のバックグラウンドを低減することができる。
【０１２０】
ステップＳ６において、演算装置１０６は、発光量が一定値以下になったら、接触機構１０３を駆動する。接触機構１０３は、培養液と発光試薬を分離し、培養液中の細胞を所定の時間、例えば１時間培養する。
【０１２１】
ステップＳ７において、所定の時間が経過すると、演算装置１０６は、光検出器１０５に、発光計測を行うための信号を送信し、発光計測を開始させる。また、接触機構１０３を駆動する信号を接触機構１０３に送信し、接触機構１０３は、培養液と発光試薬を接触させる。
【０１２２】
ステップＳ８において、光検出器１０５は、接触の前後の一定時間（例えば接触の前後１分間）発光を検出する。このとき、演算装置１０６は、光検出器１０５から検出信号を受信して発光量を算出し、接触後の発光量の最大値から、接触直前の発光量を差し引いた値を菌由来の発光量として算出する。
【０１２３】
ステップＳ９において、演算装置１０６は、菌由来の発光量が、所定の閾値以上であるかどうか判断する。ステップＳ１０において、演算装置１０６は、菌由来の発光量が所定の閾値以上であった場合は陽性と判定し、表示部１０７に判定結果を表示させ、発光計測を終了する。
【０１２４】
ステップＳ１１において、演算装置１０６は、菌由来の発光量が所定の閾値未満であった場合には、培養時間が所定の時間以上であるか判断する。培養時間が所定の時間以上であった場合は、ステップＳ１２において、演算装置１０６は、陰性と判定し、表示部１０７に判定結果を表示させ、発光計測を終了する。
【０１２５】
培養時間が所定の時間未満であった場合は、ステップＳ１３において、演算装置１０６は、接触機構１０３を駆動する信号を接触機構１０３に送信し、接触機構１０３は、培養液と発光試薬を分離する。ステップＳ１３の後、ステップＳ１４において、演算装置１０６は、発光量の経時変化から次回の発光計測時間を算出する。次回の発光計測時間になったら、ステップＳ７に戻る。
【０１２６】
ステップＳ１４における次回の発光計測時間は、一回の計測ごとに変更されず、例えば毎回１時間後等に設定されていてもよい。また、ステップＳ１４において、次回の発光計測時間は、例えば１回目の発光計測は培養開始１時間後、２回目の発光計測は１回目の計測から２時間後、３回目の発光計測は２回目の計測から３時間後というように、一度の計測ごとに変更してもよい。
【０１２７】
＜技術的効果＞
以上のように、本実施例は、培養部１０１及び発光試薬部１０２を分離して配置し、接触機構により培養液及び発光試薬の接触及び分離を自動的に制御する構成を採用している。これにより、本実施例は、実施例１と同様の効果を奏することができる。
【０１２８】
従来の自動化された細胞検出装置においては、培養液を吸引・吐出したり、ピペットチップを使い捨てにしたりするなど、複雑な分取操作をする機構が必要となり、装置が複雑となるという問題があった。これに対し、本実施例は、上記の構成のように、分取操作をする機構が不要であり、簡単な構成の装置とすることができる。また、培養液を分取する操作が不要であるため、外部からの菌の混入による偽陽性を防止することができる。
【０１２９】
［実施例６］
＜細胞検出装置の構成例＞
図１１を参照して、本発明の一実施形態に係る細胞検出装置について説明する。図１１は、実施例６に係る細胞検出装置６を示す構成図である。
【０１３０】
細胞検出装置６は、複数の密閉容器１０を備え、複数の検体を同時に計測することができる装置である。図１１に示す例においては、密閉容器１０は４つ配置されている。本実施例においては、密閉容器として、それぞれ、図１に示す実施例１の密閉容器１０と同様のものを使用しているため、各構成の説明を省略する。密閉容器として、図４〜５及び７〜９に示すものを採用することもできる。
【０１３１】
密閉容器１０それぞれにバーコードなどの識別番号をつけ、それぞれ同じ又は異なる時間間隔で発光計測を行うよう設定し、複数の密閉容器１０を並行して、発光量の経時変化を取得することができる。
【０１３２】
細胞検出装置６は、図１１に示すように、密閉容器１０の他に、各密閉容器１０に嵌合される複数のプランジャー１３及びプランジャー制御装置２７（接触機構）、密閉容器１０をそれぞれ覆うチャンバー２３（温度調節手段）、ガス供給管２８（ガス供給手段）、バルブ２４及びバルブ制御装置２９（ガス供給手段）、並びに演算装置３０を備える。
【０１３３】
チャンバー２３は、各密閉容器１０の温度調節を行う。各密閉容器１０は、チャンバー２３を備えることにより、それぞれの検体に適した温度で菌を培養し、増殖を最適な条件で行うことができる。
【０１３４】
プランジャー制御装置２７は、各プランジャー１３の動作を制御する。プランジャー制御装置２７は、密閉容器１０それぞれについて所定の時間ごとにプランジャー１３を一定量押し、培養液２０を滴下させる。
【０１３５】
ガス供給管２８は、各チャンバー２３内にガス２５又はガス２６を導入するための管である。ガス２５は、例えば酸素を含むガスである。ガス２６は、例えば酸素を含まないガスである。バルブ２４は、その開閉によりガス供給管２８へのガス２５又は２６の通過及び不通を変更する。バルブ制御装置２９は、各バルブ２４の開閉を制御する。図示は省略しているが、バルブ制御装置２９は、各バルブ２４へ接続される。
【０１３６】
ガス２５及びガス２６のチャンバー２３への導入をバルブ２４で制御することにより、チャンバー２３ごとにガス濃度を管理することができる。上容器１１は、その一部を菌を透過せずガスを透過する素材（例えばメンブレンフィルター）とすることができる。これにより、密閉容器１０ごとに嫌気性菌又は好気性菌を培養することができ、嫌気性菌及び好気性菌いずれも同時に検出することができる。
【０１３７】
演算装置３０は、光検出器１５、プランジャー制御装置２７及びバルブ制御装置２９を制御する。図示は省略しているが、演算装置３０は、光検出器１５から検出信号を受信して、発光量の算出や、陽性又は陰性の判定等を行う演算部と、菌由来の発光量から検体が陽性か陰性かを判定するための所定の閾値等のデータを記憶する記憶部とを備える。
【０１３８】
なお、光検出器１５を複数用意し、各密閉容器１０に設けても良い。これにより、密閉容器１０又は光検出器１５を移動させるための搬送装置が不要になり、細胞検出装置６を小さくすることができる。あるいは、図１１に示すように、光検出器１５は１つであってもよく、密閉容器１０を光検出器１５まで搬送するか光検出器１５を密閉容器１０まで移動させることで、光検出器１５を複数設置する必要がなくなり、コストを削減できる。
【０１３９】
以上のように、本実施例においては、プランジャー制御装置２７によりプランジャー１３を押して培養液２０を滴下することとした。しかし、プランジャー１３の代わりに、上容器１１にガス供給管２８を接続してガス２５又は２６を上容器１１に供給し、ガス２５又は２６の圧力によって培養液２０を滴下させることもできる。この場合、バルブ制御装置２９は、密閉容器１０それぞれについて所定の時間ごとにバルブ２４の開閉を制御する。また、上容器１１に接続されるガス供給管２８は、コンタミネーションを防止するためのフィルタを備え、ガス２５又は２６はフィルタを通して上容器１１に供給されることが好ましい。
【０１４０】
＜計測方法＞
次に、本実施例に係る細胞検出装置６を用いた計測方法の一例について説明する。
まず、ユーザーは、密閉容器１０それぞれにおいて、下容器１２に発光試薬２１を導入して上容器１１を嵌合し、上容器１１に培養液２０を導入した後、プランジャー１３を上容器１１に嵌合して密閉する。ユーザーは、密閉された密閉容器１０をそれぞれチャンバー２３へセットする。
【０１４１】
次に、演算装置３０は、プランジャー制御装置２７に信号を送信し、プランジャー制御装置２７にプランジャー１３を駆動させ、培養液２０を滴下し、発光試薬２１に混合する。このとき、演算装置３０は、０時間目の発光量（菌の初期濃度）を計測するため、光検出器１５による発光の検出を開始させる。０時間目の発光量を計測後、演算装置３０は、所定の時間待機し、培養を行う。演算装置３０は、培養液２０の滴下後の発光量の最大値から滴下直前の発光量を差し引いた値（発光量の増加量）を菌由来の発光量として算出する。
【０１４２】
所定の時間経過後、例えば１時間後に、演算装置３０は、プランジャー制御装置２７に信号を送信し、プランジャー制御装置２７は、再度プランジャー１３を一定量駆動して、０時間目と同量の培養液２０を発光試薬２１に滴下する。また、このとき演算装置３０は、光検出器１５に発光計測を開始させ、光検出器１５は、１時間目の発光量を計測し、菌由来の発光量を算出する。その後、再度所定の時間、培養を行う。
【０１４３】
以上のように、培養液の滴下及び発光量の計測を所定の時間毎に繰り返して、発光量の経時変化から、菌の増殖を判定する。なお、この時間間隔（培養時間）は、一定であってもよいし、適当なタイミングで変更されてもよい。
【０１４４】
演算装置３０は、培養液全体の発光量あるいは菌由来の発光量の増加量が予め設定した閾値以上となった場合に、菌が増殖したと見做し、陽性であると判定して、発光計測を終了する。
【０１４５】
陽性化に要する時間は、初期濃度や菌種の違いにより異なる。上述のように、外部からの菌混入を防ぐためには、密閉容器１０を密閉後に外部から検体の出し入れをしない必要があるため、発光計測の回数は、計測初期の培養液量により制限される。そこで、所定の時間ごとに発光量を計測する際、演算装置３０は、前回の計測から発光量の変化が小さく増殖が遅いと判断される場合は、発光計測の時間間隔を自動的に広くするようプログラムすることができる。これにより、増殖の遅い菌に応じた長期間の経時変化を計測することができる。
【０１４６】
また、本実施例の細胞検出装置６においても、図６に示した計測方法を適用できる。この場合、ステップＳ４は、プランジャー制御装置２７がプランジャー１３を一定量駆動して培養液２０を滴下させ、発光計測を開始するステップとなる。ステップＳ６は、下容器１２に滴下された培養液２０は分離することができないため、行わないこととなる。
【０１４７】
＜技術的効果＞
以上のように、本実施例は、実施例１と同様に、培養液と発光試薬とが離れた位置に配置されるように密閉容器に収容し、培養液を発光試薬に滴下する構成を採用している。これにより、本実施例は、実施例１と同様の効果を奏することができる。
【０１４８】
また、本実施例は、複数の密閉容器を備える構成を採用しているため、複数の検体について同時に発光計測を行うことができ、計測時間を短縮することができる。さらに、本実施例は、複数の密閉容器それぞれに異なる組成のガスを供給可能な構成を採用しているため、嫌気性菌及び好気性菌など、異なる菌種の発光計測を同時に行うことができる。
【符号の説明】
【０１４９】
１０、１００、２００…密閉容器
１１…上容器
１２…下容器
１３…プランジャー
１４…流路
１５、１０５、２０６、３０１、４０７…光検出器
１６…攪拌子
１７、１８、２０７、３０６、４０８…開口部
２０、２０２、３０４、４０３…培養液
２１、２０１、３０５…発光試薬
２３…チャンバー
２４…バルブ
２５…酸素を含むガス
２６…酸素を含まないガス
２７…プランジャー制御装置
２８…ガス供給管
２９…バルブ制御装置
３０、１０６…演算装置
１０１…培養部
１０２…発光試薬部
１０３…培養部及び発光試薬を接触させる機構
１０４…検体導入部
１０７…表示部
２０３、３０３、４０１…セプタム
２０５…振盪培養器
３０２…光ファイバ
４００…培養ボトル
４０２…ガスセンサ
４０４…磁石
４０５…磁気ビーズ
４０６…カメラ
【図１】
2019230548.tif 000003
【図２】
2019230548.tif 000004
【図３】
2019230548.tif 000005
【図４】
2019230548.tif 000006
【図５】
2019230548.tif 000007
【図６】
2019230548.tif 000008
【図７】
2019230548.tif 000009
【図８】
2019230548.tif 000010
【図９】
2019230548.tif 000011
【図１０】
2019230548.tif 000012
【図１１】
2019230548.tif 000013
【国際調査報告】
2019230548.tif 000014
2019230548.tif 000015
2019230548.tif 000016
2019230548.tif 000017