(57)【要約】うつ病のバイオマーカーであるＥＡＰ濃度を定量する新たな定量方法、定量用の酵素、定量用キット、及び定量用センサーを提供すること。エタノールアミンリン酸を含む試料にオキシドレダクターゼを添加するエタノールアミンリン酸の定量方法が提供される。前記オキシドレダクターゼを添加することによりメディエータを還元し、還元された前記メディエータと試薬とを反応させ、前記エタノールアミンリン酸の濃度を決定してもよい。または、前記オキシドレダクターゼとして、オキシダーゼを添加することにより生成した過酸化水素と試薬とを反応させ、前記エタノールアミンリン酸の濃度を決定してもよい。
2020122231.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エタノールアミンリン酸を含む試料にオキシドレダクターゼを添加するエタノールアミンリン酸の定量方法。
【請求項２】
前記オキシドレダクターゼを添加することによりメディエータを還元し、
還元された前記メディエータと試薬とを反応させ、前記エタノールアミンリン酸の濃度を決定する請求項１に記載のエタノールアミンリン酸の定量方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のエタノールアミンリン酸の定量方法において用いるオキシドレダクターゼ。
【請求項４】
前記オキシドレダクターゼは、ＥＣ番号１．４又はＥＣ番号１．５に属するオキシドレダクターゼである請求項３に記載のオキシドレダクターゼ。
【請求項５】
前記ＥＣ番号１．４又はＥＣ番号１．５に属するオキシドレダクターゼは、一級アミンデヒドロゲナーゼ、モノアミンデヒドロゲナーゼ、ジアミンデヒドロゲナーゼ、ポリアミンデヒドロゲナーゼ、エタノールアミンデヒドロゲナーゼ、チラミンデヒドロゲナーゼ、フェニルエチルアミンデヒドロゲナーゼ、ベンジルアミンデヒドロゲナーゼ、ヒスタミンデヒドロゲナーゼ、セロトニンデヒドロゲナーゼ、スペルミンデヒドロゲナーゼ、スペルミジンデヒドロゲナーゼ、β−アラニンデヒドロゲナーゼ、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）デヒドロゲナーゼ、タウリンデヒドロゲナーゼ、カダベリンデヒドロゲナーゼ、及びアグマチンデヒドロゲナーゼから選択されるオキシドレダクターゼである請求項４に記載のオキシドレダクターゼ。
【請求項６】
前記タウリンデヒドロゲナーゼは、大サブユニットを含む請求項５に記載のオキシドレダクターゼ。
【請求項７】
前記オキシドレダクターゼは、ＥＣ番号１．４．３又はＥＣ番号１．５．３に属するオキシダーゼである請求項４に記載のオキシドレダクターゼ。
【請求項８】
前記オキシドレダクターゼは、一級アミンオキシダーゼ、モノアミンオキシダーゼ、ジアミンオキシダーゼ、ポリアミンオキシダーゼ、エタノールアミンオキシダーゼ、チラミンオキシダーゼ、フェニルエチルアミンオキシダーゼ、ベンジルアミンオキシダーゼ、ヒスタミンオキシダーゼ、セロトニンオキシダーゼ、スペルミンオキシダーゼ、スペルミジンオキシダーゼ、β−アラニンオキシダーゼ、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）オキシダーゼ、タウリンオキシダーゼ、カダベリンオキシダーゼ、及びアグマチンオキシダーゼから選択されるオキシダーゼである請求項７に記載のオキシドレダクターゼ。
【請求項９】
請求項３から８の何れか１項に記載のオキシドレダクターゼを含む、エタノールアミンリン酸の定量用組成物。
【請求項１０】
前記オキシドレダクターゼを添加することにより還元されるメディエータと、
還元された前記メディエータと反応する試薬と、
を含む請求項９に記載のエタノールアミンリン酸の定量用組成物。
【請求項１１】
請求項３から８の何れか１項に記載のオキシドレダクターゼと、
前記オキシドレダクターゼを添加することにより還元されるメディエータと、
還元された前記メディエータと反応する試薬と、
を含むエタノールアミンリン酸の定量用キット。
【請求項１２】
前記オキシドレダクターゼは、オキシダーゼであり、
前記オキシダーゼを添加することにより生成した過酸化水素と試薬とを反応させ、前記エタノールアミンリン酸の濃度を決定する請求項１に記載のエタノールアミンリン酸の定量方法。
【請求項１３】
請求項１又は１２に記載のエタノールアミンリン酸の定量方法においてオキシドレダクターゼとして用いるオキシダーゼ。
【請求項１４】
前記オキシダーゼは、ＥＣ番号１．４．３又はＥＣ番号１．５．３に属するオキシダーゼである請求項１３に記載のオキシダーゼ。
【請求項１５】
前記オキシダーゼは、一級アミンオキシダーゼ、モノアミンオキシダーゼ、ジアミンオキシダーゼ、ポリアミンオキシダーゼ、エタノールアミンオキシダーゼ、チラミンオキシダーゼ、フェニルエチルアミンオキシダーゼ、ベンジルアミンオキシダーゼ、ヒスタミンオキシダーゼ、セロトニンオキシダーゼ、スペルミンオキシダーゼ、スペルミジンオキシダーゼ、β−アラニンオキシダーゼ、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）オキシダーゼ、タウリンオキシダーゼ、カダベリンオキシダーゼ、及びアグマチンオキシダーゼから選択されるオキシダーゼである請求項１４に記載のオキシダーゼ。
【請求項１６】
請求項１３から１５の何れか１項に記載のオキシダーゼを含む、エタノールアミンリン酸の定量用組成物。
【請求項１７】
前記オキシダーゼを添加することにより生成した過酸化水素と反応する試薬を含む、請求項１６に記載のエタノールアミンリン酸の定量用組成物。
【請求項１８】
請求項１３から１５の何れか１項に記載のオキシダーゼと、
前記オキシダーゼを添加することにより生成した過酸化水素と反応する試薬と、
を含むエタノールアミンリン酸の定量用キット。
【請求項１９】
請求項３から８のいずれか１項に記載のオキシドレダクターゼ、又は請求項１３から１５のいずれか１項に記載のオキシダーゼを含む電極。
【請求項２０】
請求項１９に記載の電極を作用極として備えたセンサーチップ。
【請求項２１】
請求項２０に記載のセンサーチップを備えたセンサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エタノールアミンリン酸の定量方法、定量用のオキシドレダクターゼ、定量用組成物、定量用キット、又は定量用センサーに関する。
【背景技術】
【０００２】
人の血液中には、エタノールアミンリン酸（ＥＡＰ）が含まれている。特許文献１には、ＥＡＰは、うつ病を診断するためのバイオマーカーであることが記載されている。非特許文献１には、ＥＡＰ濃度１．５μＭ以下を基準値として、うつ病を診断することが可能であることが記載されている【０００３】
また、特許文献２には、ＥＡＰホスホリアーゼとアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼとを利用したＥＡＰ濃度の測定方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開２０１１／０１９０７２号
【特許文献２】国際公開２０１３／０６９６４５号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Kawamura N, “Plasma metabolome analysis of patients with major depressive disorder.” Psychiatry Clin Neurosci. 2018 May;72(5):349-361
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献２に開示されている方法以外のＥＡＰ濃度の測定方法が、これまで報告されておらず、新たな測定方法の開発が望まれている。【０００７】
本発明は、うつ病のバイオマーカーであるＥＡＰ濃度を定量する新たな定量方法、定量用の酵素、定量用組成物、定量用キット又は定量用センサーを提供することを目的の一つとする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一実施形態によると、エタノールアミンリン酸を含む試料にオキシドレダクターゼを添加する、エタノールアミンリン酸の定量方法が提供される。【０００９】
オキシドレダクターゼを添加することによりメディエータを還元し、還元されたメディエータと試薬とを反応させ、エタノールアミンリン酸の濃度を決定してもよい。【００１０】
本発明の一実施形態によると、エタノールアミンリン酸の定量方法において用いるオキシドレダクターゼが提供される。【００１１】
オキシドレダクターゼは、ＥＣ番号１．４又はＥＣ番号１．５に属するオキシドレダクターゼでもよい。【００１２】
ＥＣ番号１．４又はＥＣ番号１．５に属するオキシドレダクターゼは、一級アミンデヒドロゲナーゼ、モノアミンデヒドロゲナーゼ、ジアミンデヒドロゲナーゼ、ポリアミンデヒドロゲナーゼ、エタノールアミンデヒドロゲナーゼ、チラミンデヒドロゲナーゼ、フェニルエチルアミンデヒドロゲナーゼ、ベンジルアミンデヒドロゲナーゼ、ヒスタミンデヒドロゲナーゼ、セロトニンデヒドロゲナーゼ、スペルミンデヒドロゲナーゼ、スペルミジンデヒドロゲナーゼ、β−アラニンデヒドロゲナーゼ、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）デヒドロゲナーゼ、タウリンデヒドロゲナーゼ、カダベリンデヒドロゲナーゼ、及びアグマチンデヒドロゲナーゼから選択されるオキシドレダクターゼでもよい。【００１３】
タウリンデヒドロゲナーゼは、大サブユニットを含んでもよい。【００１４】
ＥＣ番号１．４又はＥＣ番号１．５に属するオキシドレダクターゼは、ＥＣ番号１．４．３又はＥＣ番号１．５．３に属するオキシダーゼでもよい。【００１５】
オキシダーゼは、一級アミンオキシダーゼ、モノアミンオキシダーゼ、ジアミンオキシダーゼ、ポリアミンオキシダーゼ、エタノールアミンオキシダーゼ、チラミンオキシダーゼ、フェニルエチルアミンオキシダーゼ、ベンジルアミンオキシダーゼ、ヒスタミンオキシダーゼ、セロトニンオキシダーゼ、スペルミンオキシダーゼ、スペルミジンオキシダーゼ、β−アラニンオキシダーゼ、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）オキシダーゼ、タウリンオキシダーゼ、カダベリンオキシダーゼ、アグマチンオキシダーゼから選択されるオキシダーゼでもよい。【００１６】
本発明の一実施形態によると、前記いずれかのオキシドレダクターゼを含む、エタノールアミンリン酸の定量用組成物が提供される。【００１７】
エタノールアミンリン酸の定量用組成物は、オキシドレダクターゼを添加することにより還元されるメディエータと、還元された前記メディエータと反応する試薬と、を含んでもよい。【００１８】
本発明の一実施形態によると、前記いずれかのオキシドレダクターゼと、前記オキシドレダクターゼを添加することにより還元されるメディエータと、還元された前記メディエータと反応する試薬と、を含むエタノールアミンリン酸の定量用キットが提供される。【００１９】
上述したエタノールアミンリン酸の定量方法において、オキシドレダクターゼは、オキシダーゼであり、オキシダーゼを添加することにより生成した過酸化水素と試薬とを反応させ、エタノールアミンリン酸の濃度を決定してもよい。【００２０】
本発明の一実施形態によると、エタノールアミンリン酸の定量方法においてオキシドレダクターゼとして用いるオキシダーゼが提供される。【００２１】
オキシダーゼは、ＥＣ番号１．４．３又はＥＣ番号１．５．３に属するオキシダーゼでもよい。【００２２】
オキシダーゼは、一級アミンオキシダーゼ、モノアミンオキシダーゼ、ジアミンオキシダーゼ、ポリアミンオキシダーゼ、エタノールアミンオキシダーゼ、チラミンオキシダーゼ、フェニルエチルアミンオキシダーゼ、ベンジルアミンオキシダーゼ、ヒスタミンオキシダーゼ、セロトニンオキシダーゼ、スペルミンオキシダーゼ、スペルミジンオキシダーゼ、β−アラニンオキシダーゼ、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）オキシダーゼ、タウリンオキシダーゼ、カダベリンオキシダーゼ、及びアグマチンオキシダーゼから選択されるオキシダーゼでもよい。【００２３】
本発明の一実施形態によると、前記いずれかのオキシダーゼを含む、エタノールアミンリン酸の定量用組成物が提供される。【００２４】
エタノールアミンリン酸の定量用組成物は、オキシダーゼを添加することにより生成した過酸化水素と反応する試薬を含んでもよい。【００２５】
本発明の一実施形態によると、前記いずれかのオキシダーゼと、オキシダーゼを添加することにより生成した過酸化水素と反応する試薬と、を含むエタノールアミンリン酸の定量用キットが提供される。【００２６】
本発明の一実施形態によると、前記いずれかに記載のオキシドレダクターゼ、又は前記いずれかに記載のオキシダーゼを含む電極が提供される。【００２７】
本発明の一実施形態によると、前記電極を作用極として備えたセンサーチップが提供される。【００２８】
本発明の一実施形態によると、前記センサーチップを備えたセンサーが提供される。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によると、うつ病のバイオマーカーであるＥＡＰ濃度を定量する新たな定量方法、定量用の酵素、定量用組成物、定量用キット又は定量用センサーが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明の実施例に関するＥＡＰ濃度と酵素活性（Ｕ／ｍｌ）との相関性を示す図である。
【図２】本発明の実施例に関するＥＡＰ濃度と吸光度（Ａ４３８、ｍＡｂｓ）との関係を示す図である。
【図３】本発明の実施例に関する酵素反応のｐＨ依存性を示す図である。
【図４】本発明の実施例に関するＥＡＰ濃度と吸光度（Ａ５５５、ｍＡｂｓ）との関係を示す図である。
【図５】本発明の実施例に関するＥＡＰ濃度と吸光度（Ａ５５５、ｍＡｂｓ）との関係を示す図である。
【図６】本発明の実施例に関するＥＡＰ濃度と電流値（μＡ）との関係を示す図である。
【図７】本発明の実施例に関するＥＡＰ濃度と電流値（μＡ）との関係を示す図である。
【図８】（ａ）は本発明の一実施形態に関するセンサーチップ１０の模式図であり、（ｂ）〜（ｄ）はセンサーチップ１０を構成する部材を示す模式図である。
【図９】（ａ）は本発明の一実施形態に関するセンサー１００の模式図であり、（ｂ）は本発明の一実施形態に関するセンサー１００のブロック構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下、本発明に関するうつ病のバイオマーカーであるＥＡＰ濃度を定量する新たな定量方法、定量用の酵素、定量用組成物、定量用キット及び定量用センサーについて説明する。ただし、本発明のうつ病のバイオマーカーであるＥＡＰ濃度を定量する新たな定量方法、定量用の酵素、定量用組成物、定量用キット及び定量用センサーは、以下に示す実施形態及び実施例の記載内容に限定して解釈されるものではない。
【００３２】
一実施形態において、本発明に用いられるオキシドレダクターゼは、基質としてＥＡＰに作用する脱水素酵素である。本発明に用いられるオキシドレダクターゼは、ＥＡＰデヒドロゲナーゼを最も好適に用いることができると考えられる。しかし、本願出願時までに、ＥＡＰデヒドロゲナーゼは同定されていない。
【００３３】
そのため、本発明に用いられるオキシドレダクターゼは、ＥＡＰと類似構造を有する基質に効率的に作用する脱水素酵素を代替物として用いることができる。類似構造は、構造的、電子的、立体化学的な観点等から類似と考えられる物理化学的構造をいう。
【００３４】
例えば、ＥＡＰと構造的に類似する基質としては、ＣＨ−ＮＨ２結合又はＣＨ−ＮＨ結合を有する基質があり、当該基質の酵素としてはＥＣ番号１．４又はＥＣ番号１．５に属するオキシドレダクターゼがある。
【００３５】
例えば、ＥＣ番号１．４又はＥＣ番号１．５に属するオキシドレダクターゼとしては、一級アミンデヒドロゲナーゼ、モノアミンデヒドロゲナーゼ、ジアミンデヒドロゲナーゼ、ポリアミンデヒドロゲナーゼ、エタノールアミンデヒドロゲナーゼ、チラミンデヒドロゲナーゼ、フェニルエチルアミンデヒドロゲナーゼ、ベンジルアミンデヒドロゲナーゼ、ヒスタミンデヒドロゲナーゼ、セロトニンデヒドロゲナーゼ、スペルミンデヒドロゲナーゼ、スペルミジンデヒドロゲナーゼ、β−アラニンデヒドロゲナーゼ、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）デヒドロゲナーゼ、タウリンデヒドロゲナーゼ、カダベリンデヒドロゲナーゼ、アグマチンデヒドロゲナーゼがある。特に、ＥＡＰと構造的に類似する基質としては、タウリンがあり、当該基質の脱水素酵素としては、タウリンデヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ）を好適に用いることができる。
【００３６】
本発明に用いられるオキシドレダクターゼは、多量体でも単量体でもよい。例えば、多量体であるオキシドレダクターゼを構成するいくつかのサブユニットのうち、あるサブユニット（単量体）のみでも基質から水素をとり水素受容体にわたす脱水素反応を触媒する場合、本発明に用いられるオキシドレダクターゼは、多量体でもよいし、当該サブユニット（単量体）でもよい。
【００３７】
より具体的には、本発明に用いられるＴＤＨは、配列番号２の塩基配列を有する大サブユニット（ＬａＴＤＨ）と配列番号４の塩基配列を有する小サブユニット（ＳｍＴＤＨ）とを有し、ＬａＴＤＨとＳｍＴＤＨとを有する多量体のみならず、ＬａＴＤＨのみでも基質から水素をとり水素受容体にわたす脱水素反応を触媒する。そのため、本発明に用いられるＴＤＨは、ＬａＴＤＨとＳｍＴＤＨとを有してもよいし、ＬａＴＤＨのみでもよい。
【００３８】
また、ＥＣ番号１．４又はＥＣ番号１．５に属するオキシドレダクターゼは、ＥＣ番号１．４．３又はＥＣ番号１．５．３に属するオキシダーゼでもよい。
【００３９】
例えば、ＥＣ番号１．４．３又はＥＣ番号１．５．３に属するオキシダーゼとしては、一級アミンオキシダーゼ、モノアミンオキシダーゼ、ジアミンオキシダーゼ、ポリアミンオキシダーゼ、エタノールアミンオキシダーゼ、チラミンオキシダーゼ、フェニルエチルアミンオキシダーゼ、ベンジルアミンオキシダーゼ、ヒスタミンオキシダーゼ、セロトニンオキシダーゼ、スペルミンオキシダーゼ、スペルミジンオキシダーゼ、β−アラニンオキシダーゼ、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）オキシダーゼ、タウリンオキシダーゼ、カダベリンオキシダーゼ、アグマチンオキシダーゼがある。特に、フェニルエチルアミンオキシダーゼ（ＰＥＡＯＸ）を好適に用いることができる。
【００４０】
本発明に用いられるオキシドレダクターゼの反応条件としては、ＥＡＰに作用し、効率的に酸化反応を触媒する条件であれば、いかなる条件でもよい。もっとも、酵素には、一般に最も高い活性を示す至適温度、至適ｐＨがある。そのため、反応条件は、至適温度、至適ｐＨ付近が好適である。例えば、ＴＤＨの反応条件は、後述する温度３０℃、ｐＨ８．５を好適に用いることができるが、これに限定されるものではない。また、例えば、ＰＥＡＯＸの反応条件は、後述する温度３７℃、ｐＨ８．５を好適に用いることができるが、これに限定されるものではない。
【００４１】
本発明のオキシドレダクターゼは、自然界に存在する微生物が生産するオキシドレダクターゼでもよいし、形質転換された微生物が生産するオキシドレダクターゼでもよい。酵素の効率的な大量発現という観点からは、形質転換された微生物を用いることにより、酵素を効率的に大量発現することができる。
【００４２】
本発明のオキシドレダクターゼが由来する微生物は、特に限定されないが、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｅｔｈｙｌａｒｃｕｌａ属、Ｍａｒｔｅｌｅｌｌａ属、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属、Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ属、Ｇｅｍｍｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｐａｅｎａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｐｓｅｕｄａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｃｒｙｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｉｎｏｍｏｎａｓ属、Ｔｅｒｓｉｃｏｃｃｕｓ属、Ｋｏｃｕｒｉａ属、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｚｈｉｈｅｎｇｌｉｕｅｌｌａ属、Ｃｉｔｒｉｃｏｃｃｕｓ属、Ｇｅｏｄｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ属、Ｎｏｃａｒｄｉａ属、Ｍｏｄｅｓｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｇｌｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔｅｒ属、Ｐｓｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ属、Ｇｏｒｄｏｎｉａ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｇｅｏｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ属、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｙｃｏｌｉｃｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｕｄｏｇｌｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔｅｒ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ属、Ｎｏｎｏｍｕｒａｅａ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ属、Ｐｒａｕｓｅｒｅｌｌａ属、Ａｍｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ属、Ｌｅｉｆｓｏｎｉａ属、Ａｇｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｔｒｅｐｔａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｓ属、Ｘｙｌａｎｉｍｏｎａｓ属、Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ属、Ｗｉｌｌｉａｍｓｉａ属、Ａｓａｎｏａ属、Ｐｌａｎｔａｃｔｉｎｏｓｐｏｒａ属、Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ属、Ａｇｒｅｉａ属、Ｃｒｙｏｃｏｌａ属、Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｕｒｉｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ属、Ｓｕｂｔｅｒｃｏｌａ属、Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ属、Ｊｉａｎｇｅｌｌａ属、Ｂｌａｓｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ属、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ属、Ｃａｔｅｎｕｌｉｓｐｏｒａ属、Ｌｉｃｈｔｈｅｉｍｉａ属、Ｓｙｎｃｅｐｈａｌａｓｔｒｕｍ属の微生物を好適に用いることができる。
【００４３】
例えば、本発明のオキシドレダクターゼは、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｇｉｃａｎｓが生産するＴＤＨでもよいし、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｇｉｃａｎｓ由来のＴＤＨ遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌が生産するＴＤＨでもよいが、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｇｉｃａｎｓ由来のＴＤＨ遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌を用いることにより、オキシドレダクターゼを効率的に大量発現することができる。
【００４４】
また、例えば、本発明のオキシドレダクターゼは、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓが生産するＰＥＡＯＸでもよいし、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ由来のＰＥＡＯＸ遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌が生産するＰＥＡＯＸでもよいが、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ由来のＰＥＡＯＸ遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌を用いることにより、オキシドレダクターゼを効率的に大量発現することができる。
【００４５】
また、例えば、本発明のオキシドレダクターゼは、Ｌｉｃｈｔｈｅｉｍｉａ  ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａが生産するアミンオキシダーゼ（ＬｃＡＯＸ）でもよいし、Ｌｉｃｈｔｈｅｉｍｉａ  ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ由来の配列番号１６の塩基配列を有するＬｃＡＯＸ遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌が生産するアミンオキシダーゼでもよいが、Ｌｉｃｈｔｈｅｉｍｉａ  ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ由来のＬｃＡＯＸ遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌を用いることにより、オキシドレダクターゼを効率的に大量発現することができる。
【００４６】
また、例えば、本発明のオキシドレダクターゼは、Ｌｉｃｈｔｈｅｉｍｉａ  ｒａｍｏｓａが生産するｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＬｒＨＰ）でもよいし、Ｌｉｃｈｔｈｅｉｍｉａ  ｒａｍｏｓａ由来の配列番号２１の塩基配列を有するＬｒＨＰ遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌が生産するｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎでもよいが、Ｌｉｃｈｔｈｅｉｍｉａ  ｒａｍｏｓａ由来のＬｒＨＰ遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌を用いることにより、オキシドレダクターゼを効率的に大量発現することができる。
【００４７】
また、例えば、本発明のオキシドレダクターゼは、Ｓｙｎｃｅｐｈａｌａｓｔｒｕｍ  ｒａｃｅｍｏｓｕｍが生産するアミンオキシダーゼ（ＳｒＡＯＸ３９２５）でもよいし、Ｓｙｎｃｅｐｈａｌａｓｔｒｕｍ  ｒａｃｅｍｏｓｕｍ由来の配列番号２６の塩基配列を有するＳｒＡＯＸ３９２５遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌が生産するアミンオキシダーゼでもよいが、Ｓｙｎｃｅｐｈａｌａｓｔｒｕｍ  ｒａｃｅｍｏｓｕｍ由来のＳｒＡＯＸ３９２５遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌を用いることにより、オキシドレダクターゼを効率的に大量発現することができる。
【００４８】
また、例えば、本発明のオキシドレダクターゼは、Ｓｙｎｃｅｐｈａｌａｓｔｒｕｍ  ｒａｃｅｍｏｓｕｍが生産するアミンオキシダーゼ（ＳｒＡＯＸ３９２６）でもよいし、Ｓｙｎｃｅｐｈａｌａｓｔｒｕｍ  ｒａｃｅｍｏｓｕｍ由来の配列番号３１の塩基配列を有するＳｒＡＯＸ３９２６遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌が生産するアミンオキシダーゼでもよいが、Ｓｙｎｃｅｐｈａｌａｓｔｒｕｍ  ｒａｃｅｍｏｓｕｍ由来のＳｒＡＯＸ３９２６遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌を用いることにより、オキシドレダクターゼを効率的に大量発現することができる。
【００４９】
また、例えば、本発明のオキシドレダクターゼは、Ｓｙｎｃｅｐｈａｌａｓｔｒｕｍ  ｒａｃｅｍｏｓｕｍが生産するエタノールアミンオキシダーゼ（ＳｒＥＡＯＸ）でもよいし、Ｓｙｎｃｅｐｈａｌａｓｔｒｕｍ  ｒａｃｅｍｏｓｕｍ由来の配列番号３６の塩基配列を有するＳｒＥＡＯＸ遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌が生産するエタノールアミンオキシダーゼでもよいが、Ｓｙｎｃｅｐｈａｌａｓｔｒｕｍ  ｒａｃｅｍｏｓｕｍ由来のＳｒＥＡＯＸ遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌を用いることにより、オキシドレダクターゼを効率的に大量発現することができる。
【００５０】
一実施形態において、本発明のオキシドレダクターゼはＰａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｇｉｃａｎｓが生産するＬａＴＤＨのアミノ酸配列（配列番号１）に対して、高い配列同一性（例えば、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上）を有するオキシドレダクターゼ、および配列番号１のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が改変もしくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有するオキシドレダクターゼを挙げることができる。
【００５１】
一実施形態において、本発明のオキシドレダクターゼはＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓが生産するＰＥＡＯＸのアミノ酸配列（配列番号９）に対して、高い配列同一性（例えば、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上）を有するオキシドレダクターゼ、および配列番号９のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が改変もしくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有するオキシドレダクターゼを挙げることができる。
【００５２】
一実施形態において、本発明のオキシドレダクターゼはＬｉｃｈｔｈｅｉｍｉａ  ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａが生産するＬｃＡＯＸのアミノ酸配列（配列番号１５）に対して、高い配列同一性（例えば、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上）を有するオキシドレダクターゼ、および配列番号１５のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が改変もしくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有するオキシドレダクターゼを挙げることができる。
【００５３】
一実施形態において、本発明のオキシドレダクターゼはＬｉｃｈｔｈｅｉｍｉａ  ｒａｍｏｓａが生産するＬｒＨＰのアミノ酸配列（配列番号２０）に対して、高い配列同一性（例えば、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上）を有するオキシドレダクターゼ、および配列番号２０のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が改変もしくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有するオキシドレダクターゼを挙げることができる。
【００５４】
一実施形態において、本発明のオキシドレダクターゼはＳｙｎｃｅｐｈａｌａｓｔｒｕｍ  ｒａｃｅｍｏｓｕｍが生産するＳｒＡＯＸ３９２５のアミノ酸配列（配列番号２５）に対して、高い配列同一性（例えば、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上）を有するオキシドレダクターゼ、および配列番号２５のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が改変もしくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有するオキシドレダクターゼを挙げることができる。
【００５５】
一実施形態において、本発明のオキシドレダクターゼはＳｙｎｃｅｐｈａｌａｓｔｒｕｍ  ｒａｃｅｍｏｓｕｍが生産するＳｒＡＯＸ３９２６のアミノ酸配列（配列番号３０）に対して、高い配列同一性（例えば、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上）を有するオキシドレダクターゼ、および配列番号３０のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が改変もしくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有するオキシドレダクターゼを挙げることができる。
【００５６】
一実施形態において、本発明のオキシドレダクターゼはＳｙｎｃｅｐｈａｌａｓｔｒｕｍ  ｒａｃｅｍｏｓｕｍが生産するＳｒＥＡＯＸのアミノ酸配列（配列番号３５）に対して、高い配列同一性（例えば、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上）を有するオキシドレダクターゼ、および配列番号３５のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が改変もしくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有するオキシドレダクターゼを挙げることができる。
【００５７】
（アミノ酸配列の同一性）
アミノ酸配列の同一性は、ＧＥＮＥＴＹＸ（登録商標）（株式会社ゼネティックス）のマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラム、またはＤＮＡＳＩＳ（登録商標）Ｐｒｏ（株式会社日立ソリューションズ）のマキシマムマッチングやマルチプルアライメント、またはＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗのマルチプルアライメント等のプログラムにより計算することができる。アミノ酸配列の同一性を計算するために、２以上のオキシドレダクターゼのアミノ酸配列をアライメントしたときに、該２以上のオキシドレダクターゼにおいて同一であるアミノ酸の位置を調べることができる。こうした情報を基に、アミノ酸配列中の同一領域を決定できる。ここで２以上のアミノ酸配列について、同一性％とは、Ｂｌｏｓｕｍ６２等のアルゴリズムを利用して２以上のアミノ酸配列のアラインメントを行った際に、アラインメント可能であった領域の総アミノ酸数を分母とし、そのうち同一のアミノ酸によって占められる位置の数を分子としたときのパーセンテージをいう。故に、通常、２以上のアミノ酸配列に同一性が全く見られない領域がある場合、例えばＮ末端若しくはＣ末端に同一性が全く見られない付加配列が一方のアミノ酸配列にある場合、当該同一性のない領域はアラインメント不可能であるため、同一性％の算出には利用されない。
【００５８】
（酵素の調製方法）
以下、本発明に関するオキシドレダクターゼの調製方法について説明する。
【００５９】
（発現用プラスミドの構築）
本発明に関するオキシドレダクターゼ発現用プラスミドは、通常用いられている方法により得られる。例えば、本発明に関するオキシドレダクターゼを生産する微生物からＤＮＡを抽出し、ＤＮＡライブラリを作製する。作製したＤＮＡライブラリから、本発明に関するオキシドレダクターゼをコードするＤＮＡ断片を同定及び単離する。単離したＤＮＡ断片を鋳型とする相補的なプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により当該ＤＮＡ断片を増幅し、本発明に関するオキシドレダクターゼをコードする遺伝子をクローニングする。増幅したＤＮＡ断片をベクターに連結し、本発明に関するオキシドレダクターゼをコードするＤＮＡ断片を有するプラスミドを得る。
【００６０】
あるいは、本発明に関するオキシドレダクターゼをコードするＤＮＡ断片を化学合成し、ベクターに当該ＤＮＡ断片を連結し、本発明に関するオキシドレダクターゼをコードするＤＮＡを有するプラスミドを得る。
【００６１】
得られたプラスミドにより大腸菌等の菌株を形質転換し、本発明に関するオキシドレダクターゼをコードするＤＮＡを有する大腸菌等の菌株を得る。
【００６２】
また、例えば、得られたプラスミドにより酵母等の菌株を形質転換し、本発明に関するオキシドレダクターゼをコードするＤＮＡを有する酵母等の菌株を得てもよい。酵母への形質転換方法としては、公知の方法、例えば、酢酸リチウムを用いる方法（ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ５，  ２５５−２６９（１９９５））やエレクトロポレーション（Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５５  （２００３）４８１−４８４）等を好適に用いることができるが、これに限定されず、スフェロプラスト法やガラスビーズ法等を含む各種任意の手法を用いて形質転換を行えばよい。酵母に分類される微生物としては、例えば、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などに属する酵母が挙げられる。本発明のオキシドレダクターゼをコードするＤＮＡを有するプラスミドには、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１のような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子等が挙げられる。また、本発明のオキシドレダクターゼをコードするＤＮＡを有するプラスミドは、宿主細胞中で本発明のオキシドレダクターゼ遺伝子を発現することのできるプロモーター又はその他の制御配列（例えば、分泌シグナル配列、エンハンサー配列、ターミネーター配列又はポリアデニル化配列等）を含むことが望ましい。プロモーターとしては、具体的には、例えば、ＧＡＬ１プロモーター、ＡＤＨ１プロモーター等が挙げられる。
【００６３】
また、例えば、宿主細胞の他の例としては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属やトリコデルマ（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ）属のような糸状菌が挙げられる。糸状菌の形質転換体の作製方法は特に限定されず、例えば、常法に従って、本発明のオキシドレダクターゼをコードするＤＮＡが発現する態様で宿主糸状菌に挿入する方法が挙げられる。具体的には、本発明のオキシドレダクターゼをコードする遺伝子を発現誘導プロモーター及びターミネーターの間に挿入したＤＮＡコンストラクトを作製し、次いで本発明のオキシドレダクターゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトで宿主糸状菌を形質転換することにより、オキシドレダクターゼをコードする遺伝子を過剰発現する形質転換体が得られる。本明細書では、宿主糸状菌を形質転換するために作製された、発現誘導プロモーター−オキシドレダクターゼをコードする遺伝子−ターミネーターからなるＤＮＡ断片及び該ＤＮＡ断片を含む組換えベクターをＤＮＡコンストラクトと総称する。
【００６４】
オキシドレダクターゼをコードする遺伝子が発現する態様で宿主糸状菌に挿入する方法は特に限定されないが、例えば、相同組換えを利用することにより宿主生物の染色体上に直接的に挿入する手法、又はプラスミドベクター上に連結することにより宿主糸状菌内に導入する手法などが挙げられる。
【００６５】
相同組換えを利用する方法では、染色体上の組換え部位の上流領域及び下流領域と相同な配列の間に、ＤＮＡコンストラクトを連結し、宿主糸状菌のゲノム中に挿入することができる。宿主糸状菌自身の高発現プロモーター制御下で、宿主糸状菌内で過剰発現することにより、セルフクローニングによる形質転換体を得ることができる。高発現プロモーターは特に限定されないが、例えば、翻訳伸長因子であるＴＥＦ１遺伝子（ｔｅｆ１）のプロモーター領域、α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙ）のプロモーター領域、アルカリプロテアーゼ遺伝子（ａｌｐ）プロモーター領域などが挙げられる。
【００６６】
ベクターを利用する方法では、ＤＮＡコンストラクトを、常法により、糸状菌の形質転換に用いられるプラスミドベクターに組み込み、対応する宿主糸状菌を常法により形質転換することができる。
【００６７】
そのような、好適なベクター−宿主系としては、宿主糸状菌中で本発明のオキシドレダクターゼを生産させ得る系であれば特に限定されず、例えば、ｐＵＣ１９及び糸状菌の系、ｐＳＴＡ１４（Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２１８，  ９９−１０４，  １９８９）及び糸状菌の系などが挙げられる。
【００６８】
ＤＮＡコンストラクトは宿主糸状菌の染色体に導入して用いることが好ましいが、この他の方法として、自律複製型のベクター（Ｏｚｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５９，  １１３３  （１９９５））にＤＮＡコンストラクトを組み込むことにより、染色体に導入しない形で用いることもできる。
【００６９】
ＤＮＡコンストラクトには、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子は特に限定されず、例えば、ｐｙｒＧ、ｎｉａＤ、ａｄｅＡのような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子；ピリチアミン、ハイグロマイシンＢ、オリゴマイシンなどの薬剤に対する薬剤耐性遺伝子などが挙げられる。また、ＤＮＡコンストラクトは、宿主細胞中で本発明のオキシドレダクターゼをコードする遺伝子を過剰発現することを可能にするプロモーター、ターミネーターその他の制御配列（例えば、エンハンサー、ポリアデニル化配列など）を含むことが好ましい。プロモーターは特に限定されないが、適当な発現誘導プロモーターや構成的プロモーターが挙げられ、例えば、ｔｅｆ１プロモーター、ａｌｐプロモーター、ａｍｙプロモーターなどが挙げられる。ターミネーターもまた特に限定されないが、例えば、ａｌｐターミネーター、ａｍｙターミネーター、ｔｅｆ１ターミネーターなどが挙げられる。
【００７０】
ＤＮＡコンストラクトにおいて、本発明のオキシドレダクターゼをコードする遺伝子の発現制御配列は、挿入する本発明のオキシドレダクターゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片が、発現制御機能を有している配列を含む場合は必ずしも必要ではない。また、共形質転換法により形質転換を行う場合には、ＤＮＡコンストラクトはマーカー遺伝子を有しなくてもよい場合がある。
【００７１】
ＤＮＡコンストラクトの一実施態様は、例えば、ｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトにあるＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅに、ｔｅｆ１遺伝子プロモーター、オキシドレダクターゼをコードする遺伝子、ａｌｐ遺伝子ターミネーター及びｐｙｒＧマーカー遺伝子を連結させたＤＮＡコンストラクトである。
【００７２】
糸状菌への形質転換方法としては、当業者に知られる方法を適宜選択することができ、例えば、宿主糸状菌のプロトプラストを調製した後に、ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いるプロトプラストＰＥＧ法（例えば、Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２１８，  ９９−１０４，  １９８９、特開２００７−２２２０５５号公報などを参照）を用いることができる。形質転換糸状菌を再生させるための培地は、用いる宿主糸状菌と形質転換マーカー遺伝子とに応じて適切なものを用いる。例えば、宿主糸状菌としてアスペルギルス・ソーヤを用い、形質転換マーカー遺伝子としてｐｙｒＧ遺伝子を用いた場合は、形質転換糸状菌の再生は、例えば、０．５％寒天及び１．２Ｍソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少培地（ディフコ社製）で行うことができる。
【００７３】
（酵素の組換え発現）
本発明に関するオキシドレダクターゼをコードするＤＮＡを有する大腸菌等の菌株を、培地で培養する。微生物宿主細胞を培養する際は、１０℃〜４２℃の培養温度、好ましくは２５℃前後の培養温度で数時間〜数日間、さらに好ましくは２５℃前後の培養温度で好ましくは１日〜７日間、通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施すればよい。上記微生物宿主細胞を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー又は大豆若しくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄又は硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、さらに必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。培養して得られた培養液から、遠心分離により菌体を分離する。分離して得られた菌体を超音波粉砕、磨砕等するか、又はリゾチームやヤタラーゼ等の溶菌酵素による処理により懸濁液とし、当該懸濁液を遠心分離して得られた画分から粗酵素液を得る。
【００７４】
（酵素の精製）
酵素の精製方法は、粗酵素液から酵素を精製することができる方法であれば、いかなる方法でもよい。例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等、通常用いられる方法により、粗酵素液から酵素を精製することができる。
【００７５】
（酵素の活性測定）
酵素の活性測定の方法は、酵素が触媒する酸化還元反応による生成物を直接的又は間接的に測定する方法であれば、いかなる方法でもよい。例えば、酵素が酸化還元反応を触媒することにより還元型生成物が生成され、当該還元型生成物が電極へ電子を渡すことにより生じる電流値を計測することにより、酵素活性を測定することができる。好適には、酵素が触媒する酸化還元反応による還元型生成物と、当該還元型生成物と反応する吸光物質を含む試薬（以下、「吸光試薬」）とを反応させ吸光度測定を行うことにより、酵素活性を測定することができる。
【００７６】
（ＥＡＰの定量）
ＥＡＰを含む試料にＥＡＰに作用するオキシドレダクターゼを作用させる。試料中のＥＡＰ濃度は特に問われないが、例えば、０．１μＭ〜１０００μＭであり得る。作用時間は例えば５秒〜１２０分間、好ましくは０．５分〜６０分間、より好ましくは１分〜３０分間、さらに好ましくは１分〜１０分間とすることができる。作用温度は、用いる酵素の至適温度にもよるが、例えば、２０℃〜４５℃であり、通常の酵素反応に用いられる温度を適宜選択できる。
【００７７】
本発明に使用するＥＡＰに作用するオキシドレダクターゼの好適な使用量は、例えば、終濃度が、０．００１Ｕ／ｍｌ〜５０Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．０１Ｕ／ｍｌ〜１０Ｕ／ｍｌとなるように添加すればよい。一般に、試料溶液中に含まれる基質の濃度が低いほど、添加するオキシドレダクターゼの終濃度を高めれば良い。作用させる際のｐＨは、オキシドレダクターゼの至適ｐＨを考慮し、反応に適したｐＨとなるように緩衝剤を用いて調整することが好ましいが、作用可能なｐＨであればこれに限定されない。例えば、ｐＨ３〜ｐＨ１１、好ましくはｐＨ５〜ｐＨ９である。使用可能な緩衝剤としては、例えば、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン、硼酸塩、クエン酸塩、ジメチルグルタミン酸塩、トリシン、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、フタル酸、酒石酸等が挙げられる。
【００７８】
本発明は、ＥＡＰに作用するオキシドレダクターゼによりメディエータを還元し、還元されたメディエータと発色又は退色試薬とを反応させ、ＥＡＰを測定する方法を提供する。本発明に用いられる発色又は退色基質としては、ＤＣＩＰ（２，６−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｉｎｄｏｐｈｅｎｏｌ）の他に、例えば、テトラゾリウム化合物（Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｌｕｅ、Ｎｉｔｒｏ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｌｕｅ、Ｗａｔｅｒ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ（ＷＳＴ）−１、ＷＳＴ−３、ＷＳＴ−４、ＷＳＴ−５、ＷＳＴ−８、ＷＳＴ−９）等が挙げられる。
【００７９】
本発明のＥＡＰ測定方法に用いる試料は、ＥＡＰを含む可能性のあるあらゆる生物学的試料、例えば血液、血漿等に由来する試料とすることができる。試料は適宜、加工処理されたものでありうる。例えば、遠心濃縮装置により濃縮されたものでもよい。
【００８０】
（オキシドレダクターゼを含む組成物及びエタノールアミンリン酸の定量用キット）
本発明に係るオキシドレダクターゼを利用したＥＡＰの定量方法は、オキシドレダクターゼと生成物反応試薬とを含む組成物を提供することにより行ってもよいし、オキシドレダクターゼと市販の生成物反応試薬とを組み合わせることにより行ってもよい。例えば、オキシドレダクターゼを含むエタノールアミンリン酸の定量用組成物や、オキシドレダクターゼを添加することにより還元されるメディエータと、還元されたメディエータと反応する試薬とをさらに含むエタノールアミンリン酸の定量用組成物として提供されてもよい。また、オキシドレダクターゼと、オキシドレダクターゼを添加することにより還元されるメディエータと、還元されたメディエータと反応する試薬と、を含むエタノールアミンリン酸の定量用キットとして提供されてもよい。
【００８１】
本発明の測定方法又は定量用キットに用いるメディエータ（人工電子メディエータ、人工電子アクセプタ又は電子メディエータともいう）は、オキシドレダクターゼから電子を受け取ることができるものであれば特に限定されない。メディエータとしてはキノン類、フェナジン類、ビオロゲン類、シトクロム類、フェノキサジン類、フェノチアジン類、フェリシアン化物、例えばフェリシアン化カリウム、フェレドキシン類、フェロセン、オスミウム錯体及びその誘導体等などが挙げられ、フェナジン化合物としては例えば５−Ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ  ｍｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ（ＰＭＳ）、メトキシＰＭＳが挙げられるがこれに限定されない。
【００８２】
（センサーチップ及び電極）
図８（ａ）は本発明の一実施形態に関するセンサーチップ１０の模式図であり、図８（ｂ）〜図８（ｄ）はセンサーチップ１０を構成する部材を示す模式図である。センサーチップ１０は、基材１１上に配置した２以上の電極を備える。基材１１は絶縁材料で構成される。図８（ａ）及び図８（ｂ）においては、一例として、作用極１、対極３及び参照極５が基材１１上に配置される。各電極は配線部７にそれぞれ電気的に接続し、配線部７は各電極とは配線方向の逆側に位置する端子９に電気的に接続する。作用極１、対極３及び参照極５は互いに離間して配置される。また、作用極１、対極３及び参照極５は、配線部７及び端子９と一体で構成されることが好ましい。また、対極３及び参照極５を一体型としてもよい。
【００８３】
図８（ａ）及び図８（ｃ）に示すように、配線部７に平行な基材１１の端部には、スペーサ１３が配置され、作用極１、対極３、参照極５及びスペーサ１３を覆うカバー１５が配置される。スペーサ１３及びカバー１５は絶縁材料で構成される。スペーサ１３は作用極１、対極３及び参照極５と概略等しい厚みを有し、作用極１、対極３及び参照極５に密着することが好ましい。また、スペーサ１３とカバー１５は一体で構成されてもよい。カバー１５は、配線部７が外気に曝されて劣化したり、測定試料の滲み込みによる短絡を防止したりする保護層である。
【００８４】
一実施形態において、本発明のオキシドレダクターゼは電極に塗布、吸着、又は固定化されていてもよい。好ましくは、本発明のオキシドレダクターゼは作用極に塗布、吸着、又は固定化される。別の実施形態では、オキシドレダクターゼとともにメディエータも電極に塗布、吸着、又は固定化してもよい。オキシドレダクターゼ、又はオキシドレダクターゼとメディエータは、作用極１、対極３及び参照極５上に配置された反応層１９に含まれても良い。電極としては炭素電極、白金、金、銀、ニッケル及びパラジウムなどの金属電極などを用いることができる。炭素電極の場合、材料としてパイロリティック・グラファイトカーボン（ＰＧ）、グラッシーカーボン（ＧＣ）、カーボンペースト及びプラスチックフォームドカーボン（ＰＦＣ）などが挙げられる。測定システムは二電極系であっても三電極系であってもよく、例えば作用電極上に酵素を固定することができる。参照電極としては、標準水素電極、可逆水素電極、銀−塩化銀電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ）、パラジウム・水素電極及び飽和カロメル電極等が挙げられ、安定性や再現性の観点から、Ａｇ／ＡｇＣｌを用いることが好ましい。
【００８５】
酵素は、架橋、透析膜による被覆、高分子マトリックスへの封入、光架橋性ポリマーの使用、電気伝導性ポリマーの使用、酸化／還元ポリマーの使用等により電極に固定することができる。また酵素をメディエータと共にポリマー中に固定又は電極上に吸着固定してもよく、これらの手法を組合せてもよい。
【００８６】
本発明の組成物、キット、電極又はセンサーチップに用いるメディエータ（人工電子メディエータ、人工電子アクセプタ又は電子メディエータともいう）は、オキシドレダクターゼから電子を受け取ることができるものであれば特に限定されない。メディエータとしてはキノン類、フェナジン類、ビオロゲン類、シトクロム類、フェノキサジン類、フェノチアジン類、フェリシアン化物、例えばフェリシアン化カリウム、フェレドキシン類、フェロセン、オスミウム錯体及びその誘導体等などが挙げられ、フェナジン化合物としては例えばＰＭＳ、メトキシＰＭＳが挙げられるがこれに限定されない。
【００８７】
本発明のオキシドレダクターゼは、ポテンショスタットやガルバノスタットなどを用いることにより、種々の電気化学的な測定手法に適用することができる。電気化学的測定法としては、アンペロメトリー、ポテンショメトリー及びクーロメトリーなどの様々な手法が挙げられる。例えばアンペロメトリー法により、オキシドレダクターゼがＥＡＰと反応した際に生成した過酸化水素を過酸化水素電極により、＋６００ｍＶ〜＋１０００ｍＶ（ｖｓ．  Ａｇ／ＡｇＣｌ）を印加することで生じる電流値を測定することで、試料中のＥＡＰの濃度を算出することができる。例えば、既知のＥＡＰ濃度（０、５０、１００、１５０、２００μＭ）について電流値を測定し、ＥＡＰ濃度に対してプロットすることにより検量線を作成することができる。未知のＥＡＰの電流値を測定することにより検量線からＥＡＰ濃度を得ることができる。過酸化水素電極として、例えば炭素電極や白金電極を用いることができる。また、過酸化水素電極の変わりに、ペルオキシダーゼやカタラーゼなどのレダクターゼを固定化した電極を用いて、−４００ｍＶ〜＋１００ｍＶ（ｖｓ．  Ａｇ／ＡｇＣｌ）を印加することで生じる還元電流値を測定することで過酸化水素の量を定量し、ＥＡＰの値を測定することもできる。
【００８８】
また、反応溶液中にメディエータを混合し、例えばアンペロメトリー法により、オキシドレダクターゼがＥＡＰと反応した際に生成した電子を酸化型メディエータに受け渡し、還元型メディエータを生成させ、さらに−１０００ｍＶ〜＋５００ｍＶ（ｖｓ．  Ａｇ／ＡｇＣｌ）を印加することで生じる電流値を測定することで、試料中のＥＡＰの濃度を算出することができる。対極としては炭素電極や白金電極が好ましい。例えば、既知のＥＡＰ濃度（０、５０、１００、１５０、２００μＭ）について電流値を測定し、ＥＡＰ濃度に対してプロットすることにより検量線を作成することができる。未知のＥＡＰの電流値を測定することにより検量線からＥＡＰ濃度を得ることができる。
【００８９】
さらに、測定に必要な溶液量を低減するために、印刷電極（センサーチップ）を用いることもできる。この場合、電極は絶縁基板で構成された基材上に形成されることが好ましい。具体的には、フォトリソグラフィ技術や、スクリーン印刷、グラビア印刷及びフレキソ印刷などの印刷技術により、基材上に電極が形成されることが望ましい。また、絶縁基板の素材としては、シリコン、ガラス、セラミック、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン及びポリエステルなどが挙げられるが、各種の溶媒や薬品に対する耐性の強いものを用いるのがより好ましい。
【００９０】
［ＥＡＰ測定センサー］
一実施形態において、本発明のオキシドレダクターゼを用いるＥＡＰ測定センサーを提供する。図９（ａ）は、本発明の一実施形態に関するセンサー１００の模式図である。センサーは、本発明のオキシドレダクターゼを用いるＥＡＰ測定装置であり、オキシドレダクターゼを含むセンサーチップと、測定部を備える。測定部３０は、例えば、入力部であるスイッチ３１や、表示部であるディスプレイ３３を備えてもよい。スイッチ３１は、例えば、測定部３０の電源のＯＮ／ＯＦＦの制御に用いてもよく、センサー１００でのＥＡＰ測定の開始や中断の制御に用いてもよい。ディスプレイ３３は、例えば、ＥＡＰの測定値を表示してもよく、測定部３０を制御する入力部としてタッチパネルを備えてもよい。
【００９１】
図９（ｂ）は本発明の一実施形態に関するセンサー１００のブロック構成図である。センサー１００は、例えば、制御部１１０、表示部１２０、入力部１３０、記憶部１４０、通信部１５０及び電源１６０を測定部３０に備えてもよく、これらは配線１９０により相互に電気的に接続されてもよい。また、後述するセンサーチップ１０の端子と測定部３０の端子が電気的に接続され、センサーチップ１０で生じた電流が制御部１１０により検出される。制御部１１０は、センサー１００を制御する制御装置であり、例えば公知の中央処理装置（ＣＰＵ）と、センサー１００を制御するオペレーションプログラムで構成される。または、制御部１１０は、中央処理装置とオペレーティングシステム（ＯＳ）を備え、ＥＡＰ測定を行うためのアプリケーションプログラムまたはモジュールを備えてもよい。
【００９２】
表示部１２０は、例えば、公知のディスプレイ３３を備え、ＥＡＰの測定値や測定部３０の状態や、測定者への操作要求を表示してもよい。入力部１３０は、測定者がセンサー１００を操作するための入力装置であり、例えば、スイッチ３１やディスプレイ３３に配置されたタッチパネルであってもよい。測定部３０には、複数のスイッチ３１が配置されてもよい。
【００９３】
記憶部１４０は、主記憶装置（メモリ）で構成され、補助記憶装置（ハードディスク）を外部に配置してもよい。主記憶装置（メモリ）は、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）及び／又はランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）で構成されてもよい。オペレーションプログラム、オペレーティングシステム、アプリケーションプログラムまたはモジュールは、記憶部１４０に格納され、中央処理装置実行されて制御部１１０を構成する。また、測定値や電流値を記憶部１４０に格納することができる。
【００９４】
通信部１５０は、センサー１００又は測定部３０と、外部の装置（コンピュータ、プリンタ又はネットワーク）を接続する公知の通信装置である。通信部１５０と外部の装置とは、有線又は無線の通信により接続される。また、電源１６０は、センサー１００又は測定部３０に電源を供給する公知の電源装置である。
【００９５】
以上のように、本発明に関するＥＡＰの定量方法、定量用のオキシドレダクターゼ、定量用組成物及び定量用キットは、オキシドレダクターゼを含有することにより、うつ病のバイオマーカーであるＥＡＰ濃度を定量する新たな定量方法、定量用の酵素、定量用組成物、定量用キット、及び定量用センサーを提供することができる。
【００９６】
（オキシダーゼ活性を用いたＥＡＰの定量方法）
本発明に用いられるオキシダーゼは、基質としてＥＡＰに作用する酸化酵素である。本発明に用いられるオキシダーゼは、ＥＡＰオキシダーゼを最も好適に用いることができると考えられる。しかし、本願出願時までに、ＥＡＰオキシダーゼは同定されていない。ＥＡＰと構造的に類似する基質としては、ＣＨ−ＮＨ２結合又はＣＨ−ＮＨ結合を有する基質があり、当該基質の酵素としてはアミンオキシダーゼがある。
【００９７】
より具体的には、ＥＡＰと構造的に類似する基質としては、フェニルエチルアミン、エタノールアミン、チラミン、ベンジルアミン、ヒスタミン、セロトニン、スペルミン、スペルミジン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、タウリン、カダベリン、アグマチン等があり、当該基質の酸化酵素としては、フェニルエチルアミンオキシダーゼ（ＰＥＡＯＸ）、エタノールアミンオキシダーゼ、チラミンオキシダーゼ、ベンジルアミンオキシダーゼ、ヒスタミンオキシダーゼ、セロトニンオキシダーゼ、スペルミンオキシダーゼ、スペルミジンオキシダーゼ、β−アラニンオキシダーゼ、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）オキシダーゼ、タウリンオキシダーゼ、カダベリンオキシダーゼ、アグマチンオキシダーゼ等を好適に用いることができる。
【００９８】
本発明に用いられるオキシダーゼの反応条件としては、ＥＡＰに作用し、効率的に酸化反応を触媒する条件であれば、いかなる条件でもよい。もっとも、酵素には、一般に最も高い活性を示す至適温度、至適ｐＨがある。そのため、反応条件は、至適温度、至適ｐＨ付近が好適である。例えば、ＰＥＡＯＸの反応条件は、後述する温度３７℃、ｐＨ８．５を好適に用いることができるが、これに限定されるものではない。
【００９９】
本発明に用いられるオキシダーゼの反応過程としては、本発明のオキシダーゼがＥＡＰに作用するときに、種々の化学物質が関与してもよい。例えば、本発明のオキシダーゼがＥＡＰに作用するときに、酸素が酸化還元反応の電子受容体として関与してもよい。
【０１００】
本発明のオキシダーゼは、自然界に存在する微生物が生産するオキシダーゼでもよいし、形質転換された微生物が生産するオキシダーゼでもよい。酵素の効率的な大量発現という観点からは、形質転換された微生物を用いることにより、酵素を効率的に大量発現することができる。
【０１０１】
例えば、本発明のオキシダーゼは、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓが生産するオキシダーゼ（ＡｇＰＥＡＯＸ）でもよいし、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ由来のＰＥＡＯＸ遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌が生産するオキシダーゼでもよいが、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ由来のＰＥＡＯＸ遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌を用いることにより、オキシダーゼを効率的に大量発現することができる。
【０１０２】
また、例えば、本発明のオキシダーゼは、Ｌｉｃｈｔｈｅｉｍｉａ  ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａが生産するＬｃＡＯＸでもよいし、Ｌｉｃｈｔｈｅｉｍｉａ  ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ由来の配列番号１６の塩基配列を有するＬｃＡＯＸ遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌が生産するアミンオキシダーゼでもよいが、Ｌｉｃｈｔｈｅｉｍｉａ  ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ由来のＬｃＡＯＸ遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌を用いることにより、オキシダーゼを効率的に大量発現することができる。
【０１０３】
また、例えば、本発明のオキシダーゼは、Ｌｉｃｈｔｈｅｉｍｉａ  ｒａｍｏｓａが生産するＬｒＨＰでもよいし、Ｌｉｃｈｔｈｅｉｍｉａ  ｒａｍｏｓａ由来の配列番号２１の塩基配列を有するＬｒＨＰ遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌が生産するｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎでもよいが、Ｌｉｃｈｔｈｅｉｍｉａ  ｒａｍｏｓａ由来のＬｒＨＰ遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌を用いることにより、オキシダーゼを効率的に大量発現することができる。
【０１０４】
また、例えば、本発明のオキシダーゼは、Ｓｙｎｃｅｐｈａｌａｓｔｒｕｍ  ｒａｃｅｍｏｓｕｍが生産するＳｒＡＯＸ３９２５でもよいし、Ｓｙｎｃｅｐｈａｌａｓｔｒｕｍ  ｒａｃｅｍｏｓｕｍ由来の配列番号２６の塩基配列を有するＳｒＡＯＸ３９２５遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌が生産するアミンオキシダーゼでもよいが、Ｓｙｎｃｅｐｈａｌａｓｔｒｕｍ  ｒａｃｅｍｏｓｕｍ由来のＳｒＡＯＸ３９２５遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌を用いることにより、オキシダーゼを効率的に大量発現することができる。
【０１０５】
また、例えば、本発明のオキシダーゼは、Ｓｙｎｃｅｐｈａｌａｓｔｒｕｍ  ｒａｃｅｍｏｓｕｍが生産するＳｒＡＯＸ３９２６でもよいし、Ｓｙｎｃｅｐｈａｌａｓｔｒｕｍ  ｒａｃｅｍｏｓｕｍ由来の配列番号３１の塩基配列を有するＳｒＡＯＸ３９２６遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌が生産するアミンオキシダーゼでもよいが、Ｓｙｎｃｅｐｈａｌａｓｔｒｕｍ  ｒａｃｅｍｏｓｕｍ由来のＳｒＡＯＸ３９２６遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌を用いることにより、オキシダーゼ効率的に大量発現することができる。
【０１０６】
また、例えば、本発明のオキシダーゼは、Ｓｙｎｃｅｐｈａｌａｓｔｒｕｍ  ｒａｃｅｍｏｓｕｍが生産するＳｒＥＡＯＸでもよいし、Ｓｙｎｃｅｐｈａｌａｓｔｒｕｍ  ｒａｃｅｍｏｓｕｍ由来の配列番号３６の塩基配列を有するＳｒＥＡＯＸ遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌が生産するエタノールアミンオキシダーゼでもよいが、Ｓｙｎｃｅｐｈａｌａｓｔｒｕｍ  ｒａｃｅｍｏｓｕｍ由来のＳｒＥＡＯＸ遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌を用いることにより、オキシダーゼを効率的に大量発現することができる。
【０１０７】
一実施形態において、本発明のオキシダーゼはＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓが生産するＰＥＡＯＸのアミノ酸配列（配列番号９）に対して、高い配列同一性（例えば、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上）を有するオキシダーゼ、および配列番号９のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が改変もしくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有するオキシダーゼを挙げることができる。
【０１０８】
一実施形態において、本発明のオキシダーゼはＬｉｃｈｔｈｅｉｍｉａ  ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａが生産するＬｃＡＯＸのアミノ酸配列（配列番号１５）に対して、高い配列同一性（例えば、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上）を有するオキシダーゼ、および配列番号１５のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が改変もしくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有するオキシダーゼを挙げることができる。
【０１０９】
一実施形態において、本発明のオキシダーゼはＬｉｃｈｔｈｅｉｍｉａ  ｒａｍｏｓａが生産するＬｒＨＰのアミノ酸配列（配列番号２０）に対して、高い配列同一性（例えば、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上）を有するオキシダーゼ、および配列番号２０のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が改変もしくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有するオキシダーゼを挙げることができる。
【０１１０】
一実施形態において、本発明のオキシダーゼはＳｙｎｃｅｐｈａｌａｓｔｒｕｍ  ｒａｃｅｍｏｓｕｍが生産するＳｒＡＯＸ３９２５のアミノ酸配列（配列番号２５）に対して、高い配列同一性（例えば、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上）を有するオキシダーゼ、および配列番号２５のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が改変もしくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有するオキシダーゼを挙げることができる。
【０１１１】
一実施形態において、本発明のオキシダーゼはＳｙｎｃｅｐｈａｌａｓｔｒｕｍ  ｒａｃｅｍｏｓｕｍが生産するＳｒＡＯＸ３９２６のアミノ酸配列（配列番号３０）に対して、高い配列同一性（例えば、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上）を有するオキシダーゼ、および配列番号３０のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が改変もしくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有するオキシダーゼを挙げることができる。
【０１１２】
一実施形態において、本発明のオキシダーゼはＳｙｎｃｅｐｈａｌａｓｔｒｕｍ  ｒａｃｅｍｏｓｕｍが生産するＳｒＥＡＯＸのアミノ酸配列（配列番号３５）に対して、高い配列同一性（例えば、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上）を有するオキシダーゼ、および配列番号３５のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が改変もしくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有するオキシダーゼを挙げることができる。
【０１１３】
なお、これらのオキシダーゼのアミノ酸配列の同一性については、オキシドレダクターゼのアミノ酸配列の同一性と同様の方法により算出されるため、詳細な説明は省略する。
【０１１４】
（酵素の調製方法）
以下、本発明に関するオキシダーゼの調製方法について説明する。
【０１１５】
（発現用プラスミドの構築）
本発明に関するオキシダーゼ発現用プラスミドは、通常用いられている方法により得られる。例えば、本発明に関するオキシダーゼを生産する微生物からＤＮＡを抽出し、ＤＮＡライブラリを作製する。作製したＤＮＡライブラリから、本発明に関するオキシダーゼをコードするＤＮＡ断片を同定及び単離する。単離したＤＮＡ断片を鋳型とする相補的なプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により当該ＤＮＡ断片を増幅し、本発明に関するオキシダーゼをコードする遺伝子をクローニングする。増幅したＤＮＡ断片をベクターに連結し、本発明に関するオキシダーゼをコードするＤＮＡ断片を有するプラスミドを得る。
【０１１６】
あるいは、本発明に関するオキシダーゼをコードするＤＮＡ断片を化学合成し、ベクターに当該ＤＮＡ断片を連結し、本発明に関するオキシダーゼをコードするＤＮＡ断片を有するプラスミドを得る。
【０１１７】
得られたプラスミドにより大腸菌等の菌株を形質転換し、本発明に関するオキシダーゼをコードするＤＮＡを有する大腸菌等の菌株を得る。
【０１１８】
本発明に関するオキシダーゼの発現に利用する宿主細胞としては、酵母又は糸状菌を用いてもよい。その手法は、上述したオキシドレダクターゼの発現と同様の方法に準じれば良く、詳細な説明は省略する。
【０１１９】
本発明に関するオキシダーゼは、ＥＡＰへの反応性を高めるアミノ酸置換を有していてもよい。例えば、配列番号９のアミノ酸配列を有するＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ由来ＰＥＡＯＸの１０５位のフェニルアラニンに対応する位置及び／又は３５８位のロイシンに対応する位置にアミノ酸置換を有していてもよい。
【０１２０】
（酵素の組換え発現、精製）
オキシダーゼの発現及び精製は、上述したオキシドレダクターゼの発現及び精製と同様の方法により行ってもよく、詳細な説明は省略する。
【０１２１】
（酵素の活性測定）
酵素の活性測定の方法は、酵素が触媒する反応による生成物を直接的又は間接的に測定する方法であれば、いかなる方法でもよい。例えば、酵素が触媒する反応による生成物と当該生成物と反応する試薬（以下、「生成物反応試薬」）とを反応させ、当該反応により生成される吸光物質を測定するのであれば、吸光度測定を行うことにより、酵素活性を測定することができる。
【０１２２】
（ＥＡＰの定量）
ＥＡＰを含む試料にＥＡＰに作用するオキシダーゼを作用させる。試料中のＥＡＰ濃度は特に問われないが、例えば、０．１μＭ〜１０００μＭであり得る。作用時間は例えば５秒〜１２０分間、好ましくは０．５分〜６０分間、より好ましくは１分〜３０分間、さらに好ましくは１分〜１０分間とすることができる。作用温度は、用いる酵素の至適温度にもよるが、例えば、２０℃〜４５℃であり、通常の酵素反応に用いられる温度を適宜選択できる。
【０１２３】
本発明に使用するＥＡＰに作用するオキシダーゼの好適な使用量は、例えば、終濃度が、０．００１Ｕ／ｍｌ〜５０Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．０１Ｕ／ｍｌ〜１０Ｕ／ｍｌとなるように添加すればよい。一般に、試料溶液中に含まれる基質の濃度が低いほど、添加するオキシダーゼの終濃度を高めれば良い。作用させる際のｐＨは、オキシダーゼの至適ｐＨを考慮し、反応に適したｐＨとなるように緩衝剤を用いて調整することが好ましいが、作用可能なｐＨであればこれに限定されない。例えば、ｐＨ３〜ｐＨ１１、好ましくはｐＨ５〜ｐＨ９である。使用可能な緩衝剤は、オキシドレダクターゼによりＥＡＰを定量する場合と同様である。
【０１２４】
本発明は、ＥＡＰに作用するオキシダーゼの作用による生成物又は消費物を測定することによりＥＡＰを測定する方法を提供するが、測定が容易な生成物であり、測定対象として好ましいものとして過酸化水素が挙げられる。オキシダーゼの作用により生成した過酸化水素は、発色基質等によって検出してもよく、本発明に用いられる発色基質としては、４−アミノアンチピリンの他に、例えば、ＡＤＯＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン）、ＡＬＯＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン）、ＴＯＯＳ（N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-m-トルイジンナトリウム）、ＤＡ−６７（１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３、７−ビス（ジメチルアミノ）−フェノシアジン）、ＤＡ−６４（Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４、４’−ビス（ジメチルアミノ）−ジフェニルアミン）等が挙げられる。ＡＤＯＳ、ＡＬＯＳ、ＴＯＯＳは４−アミノアンチピリンと縮合した際に発色する。ＤＡ−６４、ＤＡ−６７は４−アミノアンチピリンを必要とせず、単独で処方するだけで発色する。いずれの場合も、発色反応はパーオキシダーゼにより触媒される。また、測定する消費物としては、溶存酸素が挙げられ、溶存酸素計等を用いて反応液中の溶存酸素量を測定することができる。例えば、上記測定試薬の発色の程度（吸光度変化量）を分光光度計または生化学自動分析装置等により測定し、標準試料の吸光度と比較して、試料中に含まれるＥＡＰを測定することができる。
【０１２５】
本発明のＥＡＰ測定方法に用いる試料は、ＥＡＰを含む可能性のあるあらゆる生物学的試料、例えば血液、血漿等に由来する試料とすることができる。試料は適宜、加工処理されたものでありうる。例えば、遠心濃縮装置により濃縮されたものでもよい。
【０１２６】
（オキシダーゼを含む組成物及びエタノールアミンリン酸の定量用キット）
本発明に係るオキシダーゼを利用したＥＡＰの定量方法は、オキシダーゼと生成物反応試薬とを含む組成物を提供することにより行ってもよいし、オキシダーゼと市販の生成物反応試薬とを組み合わせることにより行ってもよい。例えば、オキシダーゼを含むエタノールアミンリン酸の定量用組成物や、オキシダーゼを添加することにより生成した過酸化水素と反応する試薬をさらに含むエタノールアミンリン酸の定量用組成物として提供されてもよい。また、オキシダーゼと、オキシダーゼを添加することにより生成した過酸化水素と反応する試薬を含むエタノールアミンリン酸の定量用キットとして提供されてもよい。
【０１２７】
（センサーチップ及び電極）
一実施形態において、本発明のオキシダーゼは電極に塗布、吸着、又は固定化されていてもよい。好ましくは、本発明のオキシダーゼは作用極に塗布、吸着、又は固定化される。電極の構成は、オキシドレダクターゼを用いた電極について説明した構成と同様の構成を適用することができるため、詳細な説明は省略する。また、オキシダーゼは、架橋、透析膜による被覆、高分子マトリックスへの封入、光架橋性ポリマーの使用、電気伝導性ポリマーの使用、酸化／還元ポリマーの使用等により電極に固定することができる。
【０１２８】
本発明のオキシダーゼは、ポテンショスタットやガルバノスタットなどを用いることにより、種々の電気化学的な測定手法に適用することができる。電気化学的測定法としては、アンペロメトリー、ポテンショメトリー及びクーロメトリーなどの様々な手法が挙げられる。例えばアンペロメトリー法により、オキシダーゼがＥＡＰと反応した際に生成した過酸化水素を過酸化水素電極により、＋６００ｍＶ〜＋１０００ｍＶ（ｖｓ．  Ａｇ／ＡｇＣｌ）を印加することで生じる電流値を測定することで、試料中のＥＡＰの濃度を算出することができる。例えば、既知のＥＡＰ濃度（０、５０、１００、１５０、２００μＭ）について電流値を測定し、ＥＡＰ濃度に対してプロットすることにより検量線を作成することができる。未知のＥＡＰの電流値を測定することにより検量線からＥＡＰ濃度を得ることができる。過酸化水素電極として、例えば炭素電極や白金電極を用いることができる。また、過酸化水素電極の変わりに、ペルオキシダーゼやカタラーゼなどのレダクターゼを固定化した電極を用いて、−４００ｍＶ〜＋１００ｍＶ（ｖｓ．  Ａｇ／ＡｇＣｌ）を印加することで生じる還元電流値を測定することで過酸化水素の量を定量し、ＥＡＰの値を測定することもできる。
【０１２９】
さらに、測定に必要な溶液量を低減するために、印刷電極（センサーチップ）を用いることもできる。この場合、電極は絶縁基板で構成された基材上に形成されることが好ましい。オキシダーゼを用いたセンサーチップの構成は、オキシドレダクターゼを用いたセンサーチップの構成と同様の構成であってもよく、詳細な説明は省略する。
【０１３０】
［ＥＡＰ測定センサー］
一実施形態において、本発明のオキシダーゼを用いるＥＡＰ測定センサーを提供する。センサーは、本発明のオキシダーゼを用いるＥＡＰ測定装置であり、オキシダーゼを含むセンサーチップと、測定部を備える。オキシダーゼを用いるＥＡＰ測定センサーの構成は、オキシドレダクターゼを用いたＥＡＰ測定センサーの構成と同様の構成であってもよく、詳細な説明は省略する。
【０１３１】
以上のように、本発明に関するＥＡＰの定量方法、定量用のオキシダーゼ、定量用組成物及び定量用キットは、オキシダーゼを含有することにより、うつ病のバイオマーカーであるＥＡＰ濃度を定量する新たな定量方法、定量用の酵素、定量用組成物、定量用キット、及び定量用センサーを提供することができる。
【実施例】
【０１３２】
上述した本発明に関する定量方法、定量用のオキシドレダクターゼ、定量用組成物及び定量用キットの具体的な実施例及び試験結果を示して、より詳細に説明する。【０１３３】
（組換え体プラスミドｐｅＴ２２ｂ（＋）−ＬａＴＤＨ  ＤＮＡの調製）
制限酵素サイトＮｄｅＩとＢａｍＨＩを両端に含む配列番号２の塩基配列を有するＬａＴＤＨ遺伝子及び配列番号４の塩基配列を有するＳｍＴＤＨ遺伝子を全合成し、まず、ＬａＴＤＨ遺伝子をｐｅＴ２２ｂ（＋）の制限酵素サイトＮｄｅＩとＢａｍＨＩとの間に挿入し、これを用いて、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。【０１３４】
組換え体プラスミドを有する大腸菌ＪＭ１０９（ｐｅＴ２２ｂ（＋）−ＬａＴＤＨ）株を、ＬＢ−ａｍｐ培地［１％（Ｗ／Ｖ）  バクトトリプトン、０．５％（Ｗ／Ｖ）  酵母エキス、０．５％（Ｗ／Ｖ）  ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍｌ  Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ］２．５ｍｌに接種して、３７℃で２０時間振とう培養し、培養物を得た。【０１３５】
この培養物を７，０００ｒｐｍで、５分間遠心分離することにより集菌して菌体を得た。次いで、この菌体よりＱＩＡＧＥＮ（登録商標）  ｔｉｐ−１００（キアゲン社製）を用いて組換え体プラスミドｐｅＴ２２ｂ（＋）−ＬａＴＤＨを抽出して精製し、組換え体プラスミドｐｅＴ２２ｂ（＋）−ＬａＴＤＨのＤＮＡを２．５μｇ得た。【０１３６】
（組換え体プラスミドｐｅＴ２２ｂ（＋）−ＬａＴＤＨ−ＳｍＴＤＨ  ＤＮＡの調製）
配列番号４の塩基配列を有するＳｍＴＤＨ遺伝子を鋳型として、配列番号５、６の合成オリゴヌクレオチド、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）  Ｍａｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用い、以下の条件でＰＣＲ反応を行った。すなわち、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘ（２×）を２５μｌ、鋳型となるＳｍＴＤＨ遺伝子を１００ｐｇ、上記合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ１５ｐｍｏｌ加えて、滅菌水により全量を５０μｌとした。調製した反応液は、サーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用いて、９８℃で２分間インキュベートし、続いて、「９８℃、１０秒」−「５５℃、５秒」−「７２℃、３５秒」のサイクルを３０回繰り返した。同様にして、得られた組換え体プラスミドｐｅＴ２２ｂ（＋）−ＬａＴＤＨを鋳型として、配列番号７、８の合成オリゴヌクレオチドを用い、ＰＣＲ反応を行った。反応液を１．０％アガロースゲルで電気泳動し、増幅された目的のＤＮＡを切り出して精製した。【０１３７】
次に、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）を使用して、得られたＤＮＡ断片をつなぎ合わせ、ＳｍＴＤＨ遺伝子をｐｅＴ２２ｂ（＋）−ＬａＴＤＨにおけるＬａＴＤＨの３’末端側に挿入した共発現ベクターを作製した。【０１３８】
上記と同様に大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、組換え体プラスミドｐｅＴ２２ｂ（＋）−ＬａＴＤＨ−ＳｍＴＤＨのＤＮＡ２．５μｇを得た。【０１３９】
（ＬａＴＤＨ、ＳｍＴＤＨの生産）
上記の手順により得られた上記組換え体プラスミドを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。それぞれの大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を、２．５ｍｌ  ＺＹＰ−５０５２培地（０．５％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．０５％  ｇｌｕｃｏｓｅ、０．２％  ｌａｃｔｏｓｅ、５０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４）において、２５℃で２７時間培養した。【０１４０】
その後、各菌体をｐＨ８．５の０．０５Ｍ  ＣＨＥＳ−ＮａＯＨ酸緩衝液で洗浄、超音波破砕、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、配列番号１のアミノ酸配列を有するＬａＴＤＨを含む粗酵素液と、ＬａＴＤＨと配列番号３のアミノ酸配列を有するＳｍＴＤＨとを含む粗酵素液を各１．５ｍｌ調製した。【０１４１】
同様にして、ｐｅＴ２２ｂ（＋）ベクターのみで形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株も培養し、超音波破砕処理を行って、粗酵素液１．５ｍｌを調製した。【０１４２】
（各種粗酵素液の基質特異性の評価）
９６穴プレートにおいて、２，６−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｉｎｄｏｐｈｅｎｏｌ（ＤＣＩＰ）を用いた活性測定を行った。表１に示すように、リン酸カリウム緩衝液ｐＨ８．０、５−Ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ  ｍｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ（ＰＭＳ、富士フィルム和光純薬社製）、２，６−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｉｎｄｏｐｈｅｎｏｌ（ＤＣＩＰ、シグマアルドリッチ社製）及び基質からなる試薬を１４５μｌと粗酵素液５μｌを混合し、デヒドロゲナーゼ活性に起因するＤＣＩＰ由来の青色の消失（色の変化）を観察した。基質として、タウリン（富士フィルム和光純薬社製）、エタノールアミンリン酸（ＥＡＰ、富士フィルム和光純薬社製）、エタノールアミン（東京化成工業社製）、ベンジルアミン（東京化成工業社製）を用いた。【０１４３】
【表１】
2020122231.tif 000003
【０１４４】
（ＬａＴＤＨの活性測定）
表１の化合物のうち、緩衝液をリン酸カリウム緩衝液ｐＨ８．０からＣＨＥＳ−ＮａＯＨ酸緩衝液ｐＨ８．５に変更し、基質をＥＡＰとして、ＥＡＰの濃度を５ｍＭ、１０ｍＭ、３０ｍＭ、１００ｍＭに調整した試薬を、ＬａＴＤＨ−ＳｍＴＤＨまたはＬａＴＤＨの粗酵素液と混合し、６００ｎｍにおける吸光度の変化量を測定することにより、ＬａＴＤＨ−ＳｍＴＤＨまたはＬａＴＤＨの酵素活性を算出した。【０１４５】
吸光度の変化量は、ＣＨＥＳ−ＮａＯＨ酸緩衝液、ＤＣＩＰ、ＥＡＰを含む試薬１４００μｌを３０℃で５分間インキュベートした後、ＰＭＳ５０μｌと粗酵素液５０μｌを添加し、分光光度計（Ｕ−３９００、日立ハイテクサイエンス製）を用いて３０℃における１分間あたりのＡ６００変化量（ΔＡＳ）を測定することにより求めた。【０１４６】
次に、基質溶液の代わりに０．０５Ｍ  ＣＨＥＳ−ＮａＯＨ酸緩衝液５０μｌを添加して混合し、３０℃における１分間あたりのＡ６００変化量（ΔＡ０）を測定した。【０１４７】
デヒドロゲナーゼ活性は下記計算式に基づいて算出した。
デヒドロゲナーゼ活性（Ｕ／ｍｌ）
＝（ΔＡＳ−ΔＡ０）×１．５×ｄｆ／（２１．４×０．０５）
＝１．４×（ΔＡＳ−ΔＡ０）×ｄｆ
２１．４：波長６００ｎｍの光に対するＤＣＩＰ色素のミリモル吸光係数（ｍＭ−１ｃｍ−１）
ｄｆ：酵素溶液の希釈率
【０１４８】
（試験結果：各種粗酵素液の基質特異性の評価）
ＤＣＩＰ由来の青色の消失の程度を観察することにより、ＬａＴＤＨ−ＳｍＴＤＨを共発現させた粗酵素液及びＬａＴＤＨを発現させた粗酵素液は、いずれもタウリンに最も反応し、エタノールアミンリン酸にも反応したという結果を得た。一方、ＬａＴＤＨ−ＳｍＴＤＨを共発現させた粗酵素液及びＬａＴＤＨを発現させた粗酵素液は、エタノールアミン、ベンジルアミンに対しては反応しなかったという結果を得た。すなわち、ＬａＴＤＨ−ＳｍＴＤＨ及びＬａＴＤＨは、ＥＡＰを基質として認識可能であるという結果を得た。【０１４９】
（試験結果：ＬａＴＤＨによるＥＡＰ測定結果）
図１は、本発明の実施例に関するＥＡＰ濃度と酵素活性（Ｕ／ｍｌ）との相関性を示す図である。図１によると、５ｍＭ〜１００ｍＭの範囲では、ＥＡＰ濃度と酵素活性（Ｕ／ｍｌ）との相関の指標である決定係数（Ｒ２）が０．９９９５であることから、ＥＡＰ濃度（ｍＭ）と酵素活性（Ｕ／ｍｌ）との間には相関があるという結果を得た。すなわち、ＬａＴＤＨを利用することにより、５ｍＭ〜１００ｍＭの範囲では、ＥＡＰ濃度（ｍＭ）を測定することが可能であるという結果を得た。【０１５０】
（ＡｇＰＥＡＯＸの発現用プラスミドの構築）
配列番号９のアミノ酸配列を有するＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ由来フェニルエチルアミンオキシダーゼ（ＡｇＡＰＥＡＯＸ、ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｐ４６８８１）の発現用プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＡｇＰＥＡＯＸ）は、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）を使用して作製した。【０１５１】
ベクター（ｐＫＫ２２３−３）の断片は、鋳型としてｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７（ＷＯ２００７／１２５７７９公報参照）を使用し、プライマーとしてｐＫＫ２２３−３  ＨｉｎｄＩＩＩ  ３Ｆｗ（５’−ＡＡＧＣＴＴＧＧＣＴ  ＧＴＴＴＴＧＧＣＧＧ  ＡＴＧＡＧＡＧＡＡＧ−３’）及びｐＫＫ２２３−３  ＥｃｏＲＩ  ５Ｒｖ（５’−ＧＡＡＴＴＣＴＧＴＴ  ＴＣＣＴＧＴＧＴＧＡ  ＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣ−３’）を使用して、ＰＣＲにより調製した。【０１５２】
ＰＣＲ後の溶液にＤｐｎＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ製）を１．０μｌ添加して３７°Ｃで１時間処理した後、アガロースゲル電気泳動に供し、目的の断片（約４．６ｋｂｐ）を含むゲルを切り出し、ｉｌｌｕｓｔｒａ（登録商標）  ＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア製）を用いてゲルから抽出した。【０１５３】
配列番号１０の塩基配列を有するＡｇＰＥＡＯＸ遺伝子は、５’末端から３’末端の方向へ配列番号１１と配列番号１２のＤＮＡ配列が順に結合した前半部分（ａｇｐｅａｏｘ＿１−３２５）と、５’末端から３’末端の方向へ配列番号１３と配列番号１４のＤＮＡ配列が順に結合した後半部分（ａｇｐｅａｏｘ＿３２１−６３８）とに分割してＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに合成委託した。ａｇｐｅａｏｘ＿１−３２５の５’末端側の１５塩基（配列番号１１：ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＡＡＴＴＣ）とａｇｐｅａｏｘ＿３２１−６３８の３’末端側の１５塩基（配列番号１４：ＡＡＧＣＴＴＧＧＣＴＧＴＴＴＴ）とは、ｐＫＫ２２３−３ベクター由来の配列を示す。ａｇｐｅａｏｘ＿１−３２５の３’末端側の１５塩基（ＡＴＣＡＣＧＴＡＣＣＴＧＴＣＣ）とａｇｐｅａｏｘ＿３２１−６３８の５’末端側の１５塩基（ＡＴＣＡＣＧＴＡＣＣＴＧＴＣＣ）とは、ＡｇＰＥＡＯＸ遺伝子の前半と後半とで重複する配列を示す。【０１５４】
ｐＫＫ２２３−３のベクター断片、及び２つのＡｇＰＥＡＯＸ遺伝子断片を用いて表２の組成でｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ反応（５０℃、１５分）を行い、ＡｇＰＥＡＯＸの発現用プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＡｇＰＥＡＯＸ）を得た。得られたプラスミドでＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株を形質転換した。【０１５５】
【表２】
2020122231.tif 000004
【０１５６】
（ＡｇＰＥＡＯＸの組換え発現）
ＡｇＰＥＡＯＸ生産株を、試験管に仕込んだＬＢ−ａｍｐ培地（アンピシリン濃度５０μｇ／ｍｌ）２．５ｍｌに接種して３７℃、１６０ｒｐｍで一晩種培養した。種培養液１ｍｌを、坂口フラスコに仕込んだ０．１ｍＭ  ＣｕＳＯ４及び０．１ｍＭ  ＩＰＴＧを含むＬＢ−ａｍｐ培地（アンピシリン濃度５０μｇ／ｍｌ）１５０ｍｌに接種して２５℃で１６時間培養した。【０１５７】
坂口フラスコ６本分の培養液を６，５００×ｇで１０分間遠心して得たペレットを、２ｍＭ  ＣｕＳＯ４を含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０に再懸濁した。【０１５８】
菌体懸濁液を超音波破砕した後、２０，４００×ｇで１５分間遠心して得た上清を、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）  Ｕｌｔｒａ  Ｕｌｔｒａｃｅｌ−３０Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）を用いて２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０にバッファー置換し、ＡｇＰＥＡＯＸの粗酵素液とした。【０１５９】
（ＡｇＰＥＡＯＸの精製）
ＡｇＰＥＡＯＸの粗酵素液を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０で平衡化したＨｉＳｃｒｅｅｎ（登録商標）  Ｃａｐｔｏ  Ｑ（ＧＥヘルスケア製、樹脂量４．７ｍｌ）にアプライして陰イオン交換樹脂に結合させた。【０１６０】
その後、４７ｍｌ（１０ＣＶ）の１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で樹脂を洗浄し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に含まれるＮａＣｌ濃度を１５０ｍＭから５００ｍＭへと直線的に上昇させながら１６４．５ｍｌ（３５ＣＶ）送液し、樹脂に結合したＡｇＰＥＡＯＸを溶出させた。【０１６１】
溶出画分を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｕｌｔｒａｃｅｌ−３０Ｋにより濃縮し、ＨｉＬｏａｄ（登録商標）  ２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムにより精製した。樹脂の平衡化、溶出には２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いた。【０１６２】
溶出した各フラクションの純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価し、夾雑タンパク質を含んでいないフラクションを回収してＡｇＰＥＡＯＸの精製標品とした。【０１６３】
（ＡｇＰＥＡＯＸのデヒドロゲナーゼ活性測定）
表３の組成からなる試薬６０９μｌを３７℃で５分間インキュベートした後、基質溶液（１５００ｍＭ  ＥＡＰ）２１μｌを添加して混合し、分光光度計（Ｕ−３９００、日立ハイテクサイエンス製）を用いて３７℃における１分間あたりのＡ４３８変化量（ΔＡＳ）を測定した。【０１６４】
次に、基質溶液の代わりにイオン交換水２１μｌを添加して混合し、３７℃における１分間あたりのＡ４３８変化量（ΔＡ０）を測定した。１−メトキシ−５−エチルフェナジニウムエチルサルフェート（１−ＭＰＥＳ）、および２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム・一ナトリウム塩（ＷＳＴ−１）は同仁化学研究所製のものを使用した。【０１６５】
【表３】
2020122231.tif 000005
【０１６６】
デヒドロゲナーゼ活性は下記計算式に基づいて算出した。
デヒドロゲナーゼ活性（Ｕ／ｍｌ）
＝（ΔＡＳ−ΔＡ０）×６３０×ｄｆ／（３７．０×ｘ）
＝１７．０×（ΔＡＳ−ΔＡ０）×ｄｆ／ｘ
３７．０：波長４３８ｎｍの光に対するＷＳＴ−１ホルマザン色素のミリモル吸光係数（ｍＭ−１ｃｍ−１）
ｄｆ：酵素溶液の希釈率【０１６７】
（ＡｇＰＥＡＯＸによるＥＡＰの定量）
表４の組成からなる試薬６０９μｌを３７℃で５分間インキュベートした後、２１μｌのＥＡＰ溶液（３０ｍＭ〜３００ｍＭ）又はイオン交換水を添加して混合し、分光光度計（Ｕ−３９００）を用いて３７℃における１０分間の吸光度（Ａ４３８）の変化を測定した。測定開始から１０分経過後のＡ４３８を縦軸、ＥＡＰ濃度を横軸として、Ａ４３８とＥＡＰ濃度との相関性を評価した。【０１６８】
【表４】
2020122231.tif 000006
【０１６９】
（試験結果：ＡｇＰＥＡＯＸによるＥＡＰ測定結果）
図２は、ＥＡＰ濃度と１０分後の吸光度（Ａ４３８、ｍＡｂｓ）との相関性を示す図である。図２によると、１ｍＭ〜１０ｍＭの範囲では、ＥＡＰ濃度と１０分後の吸光度（Ａ４３８、ｍＡｂｓ）との相関の指標である決定係数（Ｒ２）が０．９７５であることから、ＥＡＰ濃度（ｍＭ）と吸光度（Ａ４３８（ｍＡｂｓ））との間に相関があるという結果を得た。すなわち、ＡｇＰＥＡＯＸが有するデヒドロゲナーゼ活性を利用することにより、１ｍＭ〜１０ｍＭの範囲では、ＥＡＰ濃度（ｍＭ）を測定することが可能であるという結果を得た。使用するＡｇＰＥＡＯＸ量を増やすとより低濃度のＥＡＰを定量しやすくなり、使用するＡｇＰＥＡＯＸ量を減らすとより高濃度のＥＡＰを定量しやすくなることが想定される。【０１７０】
以上説明したように、本発明に関するＥＡＰを含む試料にオキシドレダクターゼを添加するＥＡＰの定量方法、ＥＡＰを含む試料に添加されるＥＡＰの定量用のオキシドレダクターゼ、ＥＡＰを含む試料に添加されるオキシドレダクターゼを含むＥＡＰの定量用組成物、及びＥＡＰを含む試料に添加されるオキシドレダクターゼを含むＥＡＰの定量用キット、及びＥＡＰを含む試料に添加されるオキシドレダクターゼを含むＥＡＰの定量用センサーにより、うつ病のバイオマーカーであるＥＡＰ濃度を定量する新たな定量方法、定量用の酵素、定量用組成物、定量用キット、及び定量用センサーを提供することができる。【０１７１】
（ＡｇＰＥＡＯＸのオキシダーゼ活性測定）
上述した方法により発現、精製したＡｇＰＥＡＯＸについて、オキシダーゼ活性を測定した。表５の組成からなる試薬６０９μｌを３７℃で５分間インキュベートした後、基質溶液（１５００ｍＭ  ＥＡＰ）２１μｌを添加して混合し、分光光度計（Ｕ−３９００、日立ハイテクサイエンス製）を用いて３７℃における１分間あたりのＡ５５５変化量（ΔＡＳ）を測定した。【０１７２】
次に、基質溶液の代わりにイオン交換水２１μｌを添加して混合し、３７℃における１分間あたりのＡ５５５変化量（ΔＡ０）を測定した。４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）及びＥＡＰは富士フィルム和光純薬製、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＯＳ）は同仁化学研究所製、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）は東洋紡製のものを使用した。【０１７３】
【表５】
2020122231.tif 000007
【０１７４】
オキシダーゼ活性は下記計算式に基づいて算出した。
オキシダーゼ活性（Ｕ／ｍｌ）
＝（ΔＡＳ−ΔＡ０）×６３０×ｄｆ／（３９．２×０．５×ｘ）
＝３２．１×（ΔＡＳ−ΔＡ０）×ｄｆ／ｘ
３９．２：波長５５５ｎｍの光に対する４−ＡＡ−ＴＯＯＳ縮合色素のミリモル吸光係数（ｍＭ−１ｃｍ−１）
ｄｆ：酵素溶液の希釈率【０１７５】
（ＡｇＰＥＡＯＸの触媒反応のｐＨ依存性測定）
ＡｇＰＥＡＯＸの触媒反応のｐＨ依存性を測定する際には、表５の活性測定用試薬に含まれるＢｉｃｉｎｅ−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ８．５を、所定のｐＨに調整したリン酸カリウム緩衝液、ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液又はＢｉｃｉｎｅ−ＮａＯＨに置換して活性を測定した。【０１７６】
（ＡｇＰＥＡＯＸによるＥＡＰの定量）
表６の組成からなる試薬６０９μｌを３７℃で５分間インキュベートした後、２１μｌのＥＡＰ溶液（６、１２、１８、２４又は３０ｍＭ）又はイオン交換水を添加して混合し、分光光度計（Ｕ−３９００）を用いて３７℃における５分間のＡ５５５変化を測定した。測定開始から５分経過後のＡ５５５を縦軸、ＥＡＰ濃度を横軸として、Ａ５５５とＥＡＰ濃度との相関性を評価した。【０１７７】
【表６】
2020122231.tif 000008
【０１７８】
（試験結果：ＡｇＰＥＡＯＸの触媒反応のｐＨ依存性）
図３は、本発明の実施例に関する酵素反応のｐＨ依存性を示す図である。縦軸はＡｇＰＥＡＯＸの相対活性（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ（％））、横軸はｐＨをそれぞれ示している。なお、相対活性とは、Ｂｉｃｉｎｅ−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ８．５のオキシダーゼ活性を１００％としたときの相対的なオキシダーゼ活性である。図３から、ＡｇＰＥＡＯＸの触媒反応の至適ｐＨは８．５であるという結果を得た。そこで、ｐＨ８．５となるように試薬を調製し、当該試薬を用いてＥＡＰ濃度を測定した。【０１７９】
（試験結果：ＡｇＰＥＡＯＸによるＥＡＰ測定結果）
図４は、ＥＡＰ濃度と５分後の吸光度（Ａ５５５、ｍＡｂｓ）との相関性を示す図である。図４によると、２００μＭ〜１０００μＭの範囲では、ＥＡＰ濃度と５分後の吸光度（Ａ５５５、ｍＡｂｓ）との相関の指標である決定係数（Ｒ２）が０．９９３であることから、ＥＡＰ濃度（μＭ）と吸光度（Ａ５５５（ｍＡｂｓ））との間に相関があるという結果を得た。すなわち、ＡｇＰＥＡＯＸを利用することにより、２００μＭ〜１０００μＭの範囲では、ＥＡＰ濃度（μＭ）を測定することが可能であるという結果を得た。使用するＡｇＰＥＡＯＸ量を増やすとより低濃度のＥＡＰを定量しやすくなり、使用するＡｇＰＥＡＯＸ量を減らすとより高濃度のＥＡＰを定量しやすくなることが想定される。【０１８０】
以上説明したように、本発明に関するＥＡＰを含む試料にオキシダーゼを添加するＥＡＰの定量方法、ＥＡＰを含む試料に添加されるＥＡＰの定量用のオキシダーゼ、ＥＡＰを含む試料に添加されるオキシダーゼを含むＥＡＰの定量用組成物、ＥＡＰを含む試料に添加されるオキシダーゼを含むＥＡＰの定量用キット、及びＥＡＰを含む試料に添加されるオキシダーゼを含むＥＡＰの定量用センサーにより、うつ病のバイオマーカーであるＥＡＰ濃度を定量する新たな定量方法、定量用の酵素、定量用組成物、定量用キット、及び定量用センサーを提供することができる。【０１８１】
（ＬｃＡＯＸの発現用プラスミドの構築）
配列番号１５のアミノ酸配列を有するＬｉｃｈｔｈｅｉｍｉａ  ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ由来アミンオキシダーゼ（ＬｃＡＯＸ、ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ  ＣＤＨ５６１９９．１）の発現用プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＬｃＡＯＸ）は、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）を使用して作製した。【０１８２】
ベクター（ｐＫＫ２２３−３）の断片は、（ＡｇＰＥＡＯＸの発現用プラスミドの構築）に記載の方法に従って調製した。【０１８３】
配列番号１６の塩基配列を有するＬｃＡＯＸ遺伝子は、５’末端から３’末端の方向へ配列番号１１と配列番号１７のＤＮＡ配列が順に結合した前半部分（ｌｃａｏｘ＿ｆｒａｇ１）と、配列番号１８記載の中間部分（ｌｃａｏｘ＿ｆｒａｇ２）、および５’末端から３’末端の方向へ配列番号１９と配列番号１４のＤＮＡ配列が順に結合した後半部分（ｌｃａｏｘ＿ｆｒａｇ３）とに分割してＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに合成委託した。ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ反応を利用するために、ｌｃａｏｘ＿ｆｒａｇ１の３’末端側とｌｃａｏｘ＿ｆｒａｇ２の５’末端側の１５塩基（ＣＣＣＧＡＡＣＡＣＣＴＴＧＧＴ）、および、ｌｃａｏｘ＿ｆｒａｇ２の３’末端側とｌｃａｏｘ＿ｆｒａｇ３の５’末端側の１５塩基（ＣＡＧＣＡＴＣＡＴＣＡＡＣＡＴ）をそれぞれ重複させた。【０１８４】
ｐＫＫ２２３−３のベクター断片、及び３つのＬｃＡＯＸ遺伝子断片を用いて表７の組成でｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ反応（５０℃、１５分）を行い、ＬｃＡＯＸの発現用プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＬｃＡＯＸ）を得た。得られたプラスミドでＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株を形質転換した。【０１８５】
【表７】
2020122231.tif 000009
【０１８６】
（ＬｒＨＰの発現用プラスミドの構築）
配列番号２０のアミノ酸配列を有するＬｉｃｈｔｈｅｉｍｉａ  ｒａｍｏｓａ由来ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＬｒＨＰ、ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ  ＣＤＳ０２６１０．１）の発現用プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＬｒＨＰ）は、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）を使用して作製した。【０１８７】
ベクター（ｐＫＫ２２３−３）の断片は、（ＡｇＰＥＡＯＸの発現用プラスミドの構築）に記載の方法に従って調製した。【０１８８】
配列番号２１の塩基配列を有するＬｒＨＰ遺伝子は、５’末端から３’末端の方向へ配列番号１１と配列番号２２のＤＮＡ配列が順に結合した前半部分（ｌｒｈｐ＿ｆｒａｇ１）と、配列番号２３記載の中間部分（ｌｒｈｐ＿ｆｒａｇ２）、および５’末端から３’末端の方向へ配列番号２４と配列番号１４のＤＮＡ配列が順に結合した後半部分（ｌｒｈｐ＿ｆｒａｇ３）とに分割してＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに合成委託した。ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ反応を利用するために、ｌｒｈｐ＿ｆｒａｇ１の３’末端側とｌｒｈｐ＿ｆｒａｇ２の５’末端側の１５塩基（ＣＡＴＴＴＡＧＧＧＣＡＡＧＡＴ）、および、ｌｒｈｐ＿ｆｒａｇ２の３’末端側とｌｒｈｐ＿ｆｒａｇ３の５’末端側の１５塩基（ＣＡＣＣＡＴＣＡＡＣＡＴＴＴＧ）をそれぞれ重複させた。【０１８９】
ｐＫＫ２２３−３のベクター断片、及び３つのＬｒＨＰ遺伝子断片を用いて表８の組成でｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ反応（５０℃、１５分）を行い、ＬｒＨＰの発現用プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＬｒＨＰ）を得た。得られたプラスミドでＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株を形質転換した。【０１９０】
【表８】
2020122231.tif 000010
【０１９１】
（ＳｒＡＯＸ３９２５の発現用プラスミドの構築）
配列番号２５のアミノ酸配列を有するＳｙｎｃｅｐｈａｌａｓｔｒｕｍ  ｒａｃｅｍｏｓｕｍ由来アミンオキシダーゼ（ＳｒＡＯＸ３９２５、ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ  ＯＲＺ０３９２５．１）の発現用プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＳｒＡＯＸ３９２５）は、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）を使用して作製した。【０１９２】
ベクター（ｐＫＫ２２３−３）の断片は、（ＡｇＰＥＡＯＸの発現用プラスミドの構築）に記載の方法に従って調製した。【０１９３】
配列番号２６の塩基配列を有するＳｒＡＯＸ３９２５遺伝子は、５’末端から３’末端の方向へ配列番号１１と配列番号２７のＤＮＡ配列が順に結合した前半部分（ｓｒａｏｘ３９２５＿ｆｒａｇ１）と、配列番号２８記載の中間部分（ｓｒａｏｘ３９２５＿ｆｒａｇ２）、および５’末端から３’末端の方向へ配列番号２９と配列番号１４のＤＮＡ配列が順に結合した後半部分（ｓｒａｏｘ３９２５＿ｆｒａｇ３）とに分割してＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに合成委託した。ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ反応を利用するために、ｓｒａｏｘ３９２５＿ｆｒａｇ１の３’末端側とｓｒａｏｘ３９２５＿ｆｒａｇ２の５’末端側の１５塩基（ＣＡＧＴＴＴＴＴＡＣＣＡＧＡＧ）、および、ｓｒａｏｘ３９２５＿ｆｒａｇ２の３’末端側とｓｒａｏｘ３９２５＿ｆｒａｇ３の５’末端側の１５塩基（ＧＴＣＧＴＡＧＧＣＣＡＧＣＡＴ）をそれぞれ重複させた。【０１９４】
ｐＫＫ２２３−３のベクター断片、及び３つのＳｒＡＯＸ３９２５遺伝子断片を用いて表９の組成でｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ反応（５０℃、１５分）を行い、ＳｒＡＯＸ３９２５の発現用プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＳｒＡＯＸ３９２５）を得た。得られたプラスミドでＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株を形質転換した。【０１９５】
【表９】
2020122231.tif 000011
【０１９６】
（ＳｒＡＯＸ３９２６の発現用プラスミドの構築）
配列番号３０のアミノ酸配列を有するＳｙｎｃｅｐｈａｌａｓｔｒｕｍ  ｒａｃｅｍｏｓｕｍ由来アミンオキシダーゼ（ＳｒＡＯＸ３９２６、ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ  ＯＲＺ０３９２６．１）の発現用プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＳｒＡＯＸ３９２６）は、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）を使用して作製した。【０１９７】
ベクター（ｐＫＫ２２３−３）の断片は、（ＡｇＰＥＡＯＸの発現用プラスミドの構築）に記載の方法に従って調製した。【０１９８】
配列番号３１の塩基配列を有するＳｒＡＯＸ３９２６遺伝子は、５’末端から３’末端の方向へ配列番号１１と配列番号３２のＤＮＡ配列が順に結合した前半部分（ｓｒａｏｘ３９２６＿ｆｒａｇ１）と、配列番号３３記載の中間部分（ｓｒａｏｘ３９２６＿ｆｒａｇ２）、および５’末端から３’末端の方向へ配列番号３４と配列番号１４のＤＮＡ配列が順に結合した後半部分（ｓｒａｏｘ３９２６＿ｆｒａｇ３）とに分割してＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに合成委託した。ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ反応を利用するために、ｓｒａｏｘ３９２６＿ｆｒａｇ１の３’末端側とｓｒａｏｘ３９２６＿ｆｒａｇ２の５’末端側の１５塩基（ＴＴＧＣＧＣＡＡＡＧＡＴＡＴＴ）、および、ｓｒａｏｘ３９２６＿ｆｒａｇ２の３’末端側とｓｒａｏｘ３９２６＿ｆｒａｇ３の５’末端側の１５塩基（ＧＡＴＣＣＧＡＴＧＧＴＡＧＡＣ）をそれぞれ重複させた。【０１９９】
ｐＫＫ２２３−３のベクター断片、及び３つのＳｒＡＯＸ３９２６遺伝子断片を用いて表１０の組成でｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ反応（５０℃、１５分）を行い、ＳｒＡＯＸ３９２６の発現用プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＳｒＡＯＸ３９２６）を得た。得られたプラスミドでＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株を形質転換した。【０２００】
【表１０】
2020122231.tif 000012
【０２０１】
（ＳｒＥＡＯＸの発現用プラスミドの構築）
配列番号３５のアミノ酸配列を有するＳｙｎｃｅｐｈａｌａｓｔｒｕｍ  ｒａｃｅｍｏｓｕｍ由来エタノールアミンオキシダーゼ（ＳｒＥＡＯＸ、ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ  ＢＡＵ２０３７６．１）の発現用プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＳｒＥＡＯＸ）は、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）を使用して作製した。【０２０２】
ベクター（ｐＫＫ２２３−３）の断片は、（ＡｇＰＥＡＯＸの発現用プラスミドの構築）
に記載の方法に従って調製した。【０２０３】
配列番号３６の塩基配列を有するＳｒＥＡＯＸ遺伝子は、５’末端から３’末端の方向へ配列番号１１と配列番号３７のＤＮＡ配列が順に結合した前半部分（ｓｒｅａｏｘ＿ｆｒａｇ１）と、配列番号３８記載の中間部分（ｓｒｅａｏｘ＿ｆｒａｇ２）、および５’末端から３’末端の方向へ配列番号３９と配列番号１４のＤＮＡ配列が順に結合した後半部分（ｓｒｅａｏｘ＿ｆｒａｇ３）とに分割してＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに合成委託した。ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ反応を利用するために、ｓｒｅａｏｘ＿ｆｒａｇ１の３’末端側とｓｒｅａｏｘ＿ｆｒａｇ２の５’末端側の１５塩基（ＣＴＣＣＧＣＡＡＡＧＡＴＡＴＡ）、および、ｓｒｅａｏｘ＿ｆｒａｇ２の３’末端側とｓｒｅａｏｘ＿ｆｒａｇ３の５’末端側の１５塩基（ＣＣＡＡＴＧＧＴＡＧＡＴＧＧＡ）をそれぞれ重複させた。【０２０４】
ｐＫＫ２２３−３のベクター断片、及び３つのＳｒＥＡＯＸ遺伝子断片を用いて表１１の組成でｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ反応（５０℃、１５分）を行い、ＳｒＥＡＯＸの発現用プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＳｒＥＡＯＸ）を得た。得られたプラスミドでＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株を形質転換した。【０２０５】
【表１１】
2020122231.tif 000013
【０２０６】
（酵素の組換え発現）
ＬｃＡＯＸ、ＬｒＨＰ、ＳｒＡＯＸ３９２５、ＳｒＡＯＸ３９２６、ＳｒＥＡＯＸ生産株を、試験管に仕込んだＬＢ−ａｍｐ培地（アンピシリン濃度５０μｇ／ｍｌ）２．５ｍｌに接種して３７℃、１６０ｒｐｍで一晩種培養した。種培養液１．５ｍｌを、坂口フラスコに仕込んだ０．０２ｍＭ  ＣｕＳＯ４及び０．１ｍＭ  ＩＰＴＧを含むＬＢ−ａｍｐ培地（アンピシリン濃度５０μｇ／ｍｌ）１５０ｍｌに接種して２５℃で１６時間培養した。【０２０７】
１５０ｍｌの培養液を６，５００×ｇで１０分間遠心して得たペレットを、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７.5に再懸濁した。菌体懸濁液を超音波破砕した後、２０，４００×ｇで１５分間遠心して上清を回収し、粗酵素液とした。【０２０８】
（ＬｃＡＯＸ、ＬｒＨＰ、ＳｒＡＯＸ３９２５の精製）
ＬｃＡＯＸ、ＬｒＨＰもしくはＳｒＡＯＸ３９２５の粗酵素液を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５で平衡化したＨｉＳｃｒｅｅｎ（登録商標）  Ｃａｐｔｏ  Ｑ（ＧＥヘルスケア製、樹脂量４．７ｍｌ）にアプライして陰イオン交換樹脂に結合させた。【０２０９】
その後、４７ｍｌ（１０ＣＶ）の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で樹脂を洗浄し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に含まれるＮａＣｌ濃度を０ｍＭから５００ｍＭへと直線的に上昇させながら１１７．５ｍｌ（２５ＣＶ）送液し、樹脂に結合したＬｃＡＯＸ、ＬｒＨＰもしくはＳｒＡＯＸ３９２５を溶出させた。【０２１０】
溶出画分をイオン交換水で３倍希釈して塩濃度を下げた後、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５で平衡化したＨｉＳｃｒｅｅｎ（登録商標）  Ｃａｐｔｏ  Ｑ  ＩｎｐＲｅｓ（ＧＥヘルスケア製、樹脂量４．７ｍｌ）にアプライして陰イオン交換樹脂に結合させた。【０２１１】
その後、２３．５ｍｌ（５ＣＶ）の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で樹脂を洗浄し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に含まれるＮａＣｌ濃度を０ｍＭから３００ｍＭへと直線的に上昇させながら１４１ｍｌ（３０ＣＶ）送液し、樹脂に結合したＬｃＡＯＸ、ＬｒＨＰもしくはＳｒＡＯＸ３９２５を溶出させた。【０２１２】
溶出画分を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｕｌｔｒａｃｅｌ−３０Ｋにより濃縮し、ＨｉＬｏａｄ（登録商標）  ２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムにより精製した。樹脂の平衡化、溶出には１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）を用いた。【０２１３】
溶出した各フラクションの純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価し、夾雑タンパク質を含んでいないフラクションを回収してＬｃＡＯＸ、ＬｒＨＰもしくはＳｒＡＯＸ３９２５の精製標品とした。【０２１４】
（ＬｃＡＯＸ、ＬｒＨＰ、ＳｒＡＯＸ３９２５、ＳｒＡＯＸ３９２６、ＳｒＥＡＯＸのオキシダーゼ活性測定）
上述した方法により発現したＬｃＡＯＸ、ＬｒＨＰ、ＳｒＡＯＸ３９２５、ＳｒＡＯＸ３９２６、ＳｒＥＡＯＸについて、オキシダーゼ活性を測定した。表１２の組成からなる試薬５８０μｌを３７℃で５分間インキュベートした後、基質溶液（１５００ｍＭ  ＥＡＰ）２０μｌを添加して混合し、分光光度計（Ｕ−３９００、日立ハイテクサイエンス製）を用いて３７℃における１分間あたりのＡ５５５変化量（ΔＡＳ）を測定した。続いて、基質溶液の代わりにイオン交換水２０μｌを添加して混合し、３７℃における１分間あたりのＡ５５５変化量（ΔＡ０）を測定した。【０２１５】
【表１２】
2020122231.tif 000014
【０２１６】
オキシダーゼ活性は下記計算式に基づいて算出した。
オキシダーゼ活性（Ｕ／ｍｌ）
＝（ΔＡＳ−ΔＡ０）×６００．０×ｄｆ／（３９．２×０．５×ｘ）
＝３０．６×（ΔＡＳ−ΔＡ０）×ｄｆ／ｘ
３９．２：波長５５５ｎｍの光に対する４−ＡＡ−ＴＯＯＳ縮合色素のミリモル吸光係数（ｍＭ−１ｃｍ−１）
ｄｆ：酵素溶液の希釈率【０２１７】
（ＬｒＨＰによるＥＡＰの定量）
表１３の組成からなる試薬５８０．０μｌを３７℃で５分間インキュベートした後、２０．０μｌのＥＡＰ溶液（３、６、１８又は３０ｍＭ）又はイオン交換水を添加して混合し、分光光度計（Ｕ−３９００）を用いて３７℃における２０分間のＡ５５５変化を測定した。測定開始から２０分経過後のＡ５５５を縦軸、ＥＡＰ濃度を横軸として、Ａ５５５とＥＡＰ濃度との相関性を評価した。【０２１８】
【表１３】
2020122231.tif 000015
【０２１９】
（電気化学的手法によるＬｒＨＰによるＥＡＰの定量）
ＳＣＲＥＥＮ−ＰＲＩＮＴＥＤ  ＥＬＥＣＴＲＯＤＥＳ（ＤｒｏｐＳｅｎｓ社製、製品番号ＤＲＰ−Ｃ１１０）上に、１５０ｍＭ  Ｂｉｃｉｎｅ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）を２０μｌ、１．５Ｍ塩化カリウム溶液を１５μｌ、ＬｒＨＰ溶液（０．１４Ｕ／ｍｌ）を５μｌ塗布・混合させた。次に、専用コネクター（ＤＲＰ−ＣＡＣ）を用いてＡＬＳ  電気化学アナライザー  ８１４Ｄに接続した。＋６００ｍＶ（Ａｇ／ＡｇＣｌ）で、クロノアンペロメトリ測定を行った。続いて各濃度のＥＡＰ溶液を２μｌ添加し、測定開始から１００秒後の電流値を記録した。対照実験としてＬｒＨＰ溶液の代わりに超純水（イオン交換水）を５μｌ用いて同様の実験を行った。【０２２０】
（試験結果：ＬｃＡＯＸ、ＬｒＨＰ、ＳｒＡＯＸ３９２５、ＳｒＡＯＸ３９２６、ＳｒＥＡＯＸのオキシダーゼ活性測定）
ＬｃＡＯＸ、ＬｒＨＰ、ＳｒＡＯＸ３９２５、ＳｒＡＯＸ３９２６、ＳｒＥＡＯＸの粗酵素液のＥＡＰに対するオキシダーゼ活性は、それぞれ１．８、５．８、２．６、０．２および１６Ｕ／Ｌであった。ＬｃＡＯＸ、ＬｒＨＰ、ＳｒＡＯＸ３９２５については、精製した後も、それぞれ０．１１、０．３１および０．１６Ｕ／ｍｌの活性を示した。したがって、ＬｃＡＯＸ、ＬｒＨＰ、ＳｒＡＯＸ３９２５は、それぞれ単独で、ＥＡＰを酸化して過酸化水素を生成する反応を触媒することが示された。ＳｒＡＯＸ３９２６、ＳｒＥＡＯＸは、夾雑タンパク質を含まない水準まで精製した後も、ＥＡＰに対してオキシダーゼ活性を示すと考えられる。【０２２１】
（試験結果：ＬｒＨＰによるＥＡＰ測定結果）
図５は、ＥＡＰ濃度と２０分後の吸光度（Ａ５５５、ｍＡｂｓ）との相関性を示す図である。図５によると、１００μＭ〜１０００μＭの範囲では、ＥＡＰ濃度と２０分後の吸光度（Ａ５５５、ｍＡｂｓ）との相関の指標である決定係数（Ｒ２）が０．９０８であることから、ＥＡＰ濃度（μＭ）と吸光度（Ａ５５５（ｍＡｂｓ））との間に相関があるという結果を得た。すなわち、ＬｒＨＰを利用することにより、１００μＭ〜１０００μＭの範囲では、ＥＡＰ濃度（μＭ）を測定することが可能であるという結果を得た。使用するＬｒＨＰ量を増やすとより低濃度のＥＡＰを定量しやすくなり、使用するＬｒＨＰ量を減らすとより高濃度のＥＡＰを定量しやすくなることが想定される。ＬｒＨＰの代わりに、ＬｃＡＯＸ、ＳｒＡＯＸ３９２５、ＳｒＡＯＸ３９２６またはＳｒＥＡＯＸを用いた場合でも、ＥＡＰ濃度（μＭ）を測定することが可能であると考えられる。【０２２２】
（試験結果：電気化学的手法によるＬｒＨＰによるＥＡＰの定量）
図６は、０μＭ〜１４００μＭのＥＡＰ添加時について、測定開始から１００秒後の電流値をプロットした図である。図７は、０μＭ〜１７０μＭのＥＡＰ添加時について、測定開始から１００秒後の電流値をプロットした図である。両結果とも、ＥＡＰ濃度が高くなるにつれ、電流値も高くなることが分かった。対照としてＥＡＰＯＸ溶液の代わりに超純水（イオン交換水）を５μｌ用いた際に同様の実験を行ったが、ＥＡＰ添加時に応答電流の増加は見られなかった。したがって、電気化学的測定によってもＥＡＰの定量が可能である事が示された。使用するＬｒＨＰ量を増やすとより低濃度のＥＡＰを定量しやすくなり、使用するＬｒＨＰ量を減らすとより高濃度のＥＡＰを定量しやすくなることが想定される。ＬｒＨＰの代わりに、ＡｇＰＥＡＯＸ、ＬｃＡＯＸ、ＳｒＡＯＸ３９２５、ＳｒＡＯＸ３９２６またはＳｒＥＡＯＸを用いた場合でも、ＥＡＰ濃度（μＭ）を測定することが可能であると考えられる。【０２２３】
以上説明したように、本発明に関するＥＡＰを含む試料にオキシダーゼを添加するＥＡＰの定量方法、ＥＡＰを含む試料に添加されるＥＡＰの定量用のオキシダーゼ、ＥＡＰを含む試料に添加されるオキシダーゼを含むＥＡＰの定量用組成物、ＥＡＰを含む試料に添加されるオキシダーゼを含むＥＡＰの定量用キット、及びＥＡＰを含む試料に添加されるオキシダーゼを含むＥＡＰの定量用センサーにより、うつ病のバイオマーカーであるＥＡＰ濃度を定量する新たな定量方法、定量用の酵素、定量用組成物、定量用キット、及び定量用センサーを提供することができる。
【符号の説明】
【０２２４】
１  作用極、３  対極、５  参照極、７  配線部、９  端子、１０  センサーチップ、１１  基材、１３  スペーサ、１５  カバー、１９  反応層、３０  測定部、３１  スイッチ、３３  ディスプレイ、１００  センサー、１１０  制御部、１２０  表示部、１３０  入力部、１４０  記憶部、１５０  通信部、１６０  電源、１９０  配線
【図１】
2020122231.tif 000016
【図２】
2020122231.tif 000017
【図３】
2020122231.tif 000018
【図４】
2020122231.tif 000019
【図５】
2020122231.tif 000020
【図６】
2020122231.tif 000021
【図７】
2020122231.tif 000022
【図８】
2020122231.tif 000023
【図９】
2020122231.tif 000024
【配列表】
2020122231000001.app
【国際調査報告】
2020122231.tif 000025
2020122231.tif 000026
2020122231.tif 000027
2020122231.tif 000028
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