(57)【要約】本発明の目的は、安全性に優れた天然物が含有する成分でありつつも、シワやタルミなどの皮膚の老化を抑制又は改善することが可能な有効成分を含む組成物などを提供することにある。上記目的は、５，７，３’，４’−テトラメトキシフラボン、５，７，４’−トリメトキシフラボン及び５−ＯＨ−３，７，３’，４’−テトラメトキシフラボン並びにこれらの少なくとも１種の成分の含有物からなる群から選択される少なくとも１種の有効成分を含有する、美容用組成物などにより解決される。
2020153466.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
５，７，３’，４’−テトラメトキシフラボン、５，７，４’−トリメトキシフラボン及び５−ＯＨ−３，７，３’，４’−テトラメトキシフラボン並びにこれらの少なくとも１種の成分の含有物からなる群から選択される少なくとも１種の有効成分を含有する、美容用組成物。
【請求項２】
前記組成物は、エラスターゼ活性化抑制作用、コラゲナーゼ活性化抑制作用及び炎症性サイトカイン活性化抑制作用からなる群から選ばれる少なくとも１種の作用を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物は、抗シワ用組成物、抗タルミ用組成物、抗皮膚炎症用組成物、抗老化用組成物及び皮膚異常改善用組成物からなる群から選ばれる少なくとも１種の組成物である、請求項１〜２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４】
３，５，７，３’，４’−ペンタメトキシフラボン、３，５，７−トリメトキシフラボン、３，５，７，４’−テトラメトキシフラボン、５−ＯＨ−３，７，３’，４’−テトラメトキシフラボン、５−ＯＨ−７−メトキシフラボン、５−ＯＨ−７，４’−ジメトキシフラボン、５−ＯＨ−３，７−ジメトキシフラボン及び５−ＯＨ−３，７，４’−トリメトキシフラボン並びにこれらの少なくとも１種の成分の含有物からなる群から選択される少なくとも１種の有効成分を含有する、美容用組成物。
【請求項５】
前記組成物は、チロシナーゼ活性化促進作用を有する、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物は、抗白毛症用組成物、抗白髪用組成物、抗白斑症用組成物、抗老化用組成物、日焼け促進用組成物及び皮膚黒色化用組成物からなる群から選ばれる少なくとも１種の組成物である、請求項４〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物は、化粧品用組成物である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、美容用組成物、特に天然物に由来する成分を含有する美容用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
人体最大の臓器である皮膚は生体の最外層で生体防御の最前線の役割を担っており、健康的にも審美的にも正常に保つことが求められている。肌（角質層）は紫外線、加齢、ストレス、疾病、食習慣などにより多くのストレスを受け、肌機能の減退、皮膚老化などの種々のトラブルを発生する。【０００３】
シワは、加齢や太陽光による皮膚老化（光老化）により誘導されるタンパク質分解酵素（エラスターゼやコラゲナーゼなど）の働きで形成される。皮膚老化のメカニズムは明らかではないが、紫外線は、シワ形成に関与する最大の環境因子と考えられている。紫外線により産生される活性酸素は、日焼けなどの急性炎症の原因となるのみならず、その産生が慢性的に繰り返されることにより光老化を誘発することが知られている。皮膚の健康及び美容のために、皮膚老化を抑制し、シワを改善する抗シワ剤の需要は高い。【０００４】
一方で、皮膚及び毛髪の色を決定する重要な因子はメラニンとよばれる色素性物質であり、表皮基底層や毛根に存在するメラノサイトにより産生される。メラニンの制御は、紫外線の防護だけではなく、審美的な影響を与える。先天的若しくは後天的なメラニン産生能の欠落又は低下は、白毛症や白斑症をもたらす。加齢に伴って起こる白髪も毛根におけるメラニン産生能の減退によるものと考えられている。【０００５】
また、欧米に限らず褐色の肌は健康的で美しいとする文化も広く存在しており、皮膚や髪を黒色又は黒褐色にすることには大きな需要がある。太陽光による日焼けは紫外線の暴露に晒されるため、皮膚癌の発生などの大きなリスクを伴うことから、太陽光に寄らない日焼け促進剤は有用であると考えられる。これら皮膚老化による皮膚トラブルや美容に対するニーズは世界共通であり、日本国内だけみても、化粧品の市場規模は１兆円を超える。【０００６】
これまでに、シワ形成や皮膚老化を改善するものとしては、ビタミンＥなどの抗酸化剤、コラーゲンやエラスチンなどの細胞外マトリックスの制御剤の利用などが提案されている。また、加齢に伴って起こる白髪に対しては、対症療法として染料で染めることがなされている。【０００７】
抗シワ効果を示し得るものとして、安全性の観点から天然物に由来する成分が期待されている。例えば、下記非特許文献１（該文献の全記載はここに開示として援用される。）には黒ショウガ抽出物の抗シワ効果が記載されている。また、下記特許文献１（該文献の全記載はここに開示として援用される。）には、黒ショウガ抽出物は抗酸化作用を有するという記載がある。さらに、下記非特許文献２（該文献の全記載はここに開示として援用される。）には、黒ショウガに含まれる成分のうち、５，７−ジメトキシフラボンはメラニン形成促進作用を有するという記載がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１２−１７６９７６号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Photodermatology, Photoimmunology & Photomedicine 30: 237-245, (2014)
【非特許文献２】Experimental Dermatology 20(5): 445-447(2011)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかし、特許文献１及び非特許文献１に記載の黒ショウガ抽出物は種々の成分を含むものであることから、黒ショウガ抽出物が有する抗酸化作用は小さく、それにより達成される抗シワ効果は微弱である。【００１１】
また、本発明者らが調べたところによれば、非特許文献２に記載の５，７−ジメトキシフラボンが有するメラニン形成促進作用は非常に小さい。【００１２】
そこで、本発明は、安全性に優れた天然物に由来する成分でありつつも、シワやタルミなどの皮膚の老化を抑制又は改善することが可能な有効成分を含有する組成物を提供することを、発明が解決しようとする第１の課題とする。【００１３】
また、本発明は、安全性に優れた天然物に由来する成分でありつつも、メラニン合成を促進して、毛髪や皮膚の白色化を抑制又は改善することが可能な有効成分を含有する組成物を提供することを、発明が解決しようとする第２の課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究開発を進め、多種多様の天然物及び天然物に由来する成分の生理活性作用について検討したところ、黒ショウガに含まれるポリメトキシフラボノイド１１種を単離することに成功した。そして、これらポリメトキシフラボノイドの生理活性作用について試行錯誤を繰り返して試験した結果、驚くべきことに、５，７，３’，４’−テトラメトキシフラボン、５，７，４’−トリメトキシフラボン及び５−ＯＨ−３，７，３’，４’−テトラメトキシフラボンには、シワ形成に関わるタンパク質分解酵素及び皮膚における炎症性因子の活性を抑制する作用があることを見出した。【００１５】
さらに驚くべきことに、本発明者らは、３，５，７，３’，４’−ペンタメトキシフラボン、３，５，７−トリメトキシフラボン、３，５，７，４’−テトラメトキシフラボン、５−ＯＨ−３，７，３’，４’−テトラメトキシフラボン、５−ＯＨ−７−メトキシフラボン、５−ＯＨ−７，４’−ジメトキシフラボン、５−ＯＨ−３，７−ジメトキシフラボン及び５−ＯＨ−３，７，４’−トリメトキシフラボンには、メラニン合成経路に関与する酵素の活性化を促進する作用があることを見出した。【００１６】
そして、遂に、本発明者らは、上記ポリメトキシフラボノイド及びこれらの成分の含有物を有効成分とする組成物を完成するに至った。本発明はこれらの知見や成功例を基にして完成するに至った発明である。【００１７】
したがって、本発明の一態様によれば、以下［１］〜［１０］の組成物及び方法が提供される。
［１］５，７，３’，４’−テトラメトキシフラボン、５，７，４’−トリメトキシフラボン及び５−ＯＨ−３，７，３’，４’−テトラメトキシフラボン並びにこれらの少なくとも１種の含有物からなる群から選択される少なくとも１種の有効成分を含有する、美容用組成物。
［２］前記組成物は、エラスターゼ活性化抑制作用、コラゲナーゼ活性化抑制作用及び炎症性サイトカイン活性化抑制作用からなる群から選ばれる少なくとも１種の作用を有する、［１］に記載の組成物。
［３］前記組成物は、抗シワ用組成物、抗タルミ用組成物、抗皮膚炎症用組成物、抗老化用組成物及び皮膚改善用組成物からなる群から選ばれる少なくとも１種の組成物である、［１］〜［２］のいずれか１項に記載の組成物。
［４］３，５，７，３’，４’−ペンタメトキシフラボン、３，５，７−トリメトキシフラボン、３，５，７，４’−テトラメトキシフラボン、５−ＯＨ−３，７，３’，４’−テトラメトキシフラボン、５−ＯＨ−７−メトキシフラボン、５−ＯＨ−７，４’−ジメトキシフラボン、５−ＯＨ−３，７−ジメトキシフラボン及び５−ＯＨ−３，７，４’−トリメトキシフラボン並びにこれらの少なくとも１種の含有物からなる群から選択される少なくとも１種の有効成分を含有する、美容用組成物。
［５］前記組成物は、チロシナーゼ活性化促進作用を有する、［４］に記載の組成物。
［６］前記組成物は、抗白毛症用組成物、抗白髪用組成物、抗白斑症用組成物、抗老化用組成物、日焼け促進用組成物及び皮膚黒色化用組成物からなる群から選ばれる少なくとも１種の組成物である、［４］〜［５］のいずれか１項に記載の組成物。
［７］前記組成物は、化粧品用組成物である、［１］〜［６］のいずれか１項に記載の組成物。
［８］［１］〜［７］のいずれか１項に記載の組成物を製造するための、５，７，３’，４’−テトラメトキシフラボン、５，７，４’−トリメトキシフラボン、５−ＯＨ−３，７，３’，４’−テトラメトキシフラボン、３，５，７，３’，４’−ペンタメトキシフラボン、３，５，７−トリメトキシフラボン、３，５，７，４’−テトラメトキシフラボン、５−ＯＨ−３，７，３’，４’−テトラメトキシフラボン、５−ＯＨ−７−メトキシフラボン、５−ＯＨ−７，４’−ジメトキシフラボン、５−ＯＨ−３，７−ジメトキシフラボン及び５−ＯＨ−３，７，４’−トリメトキシフラボン並びにこれらの少なくとも１種の成分の含有物からなる群から選択される少なくとも１種の有効成分の使用方法。
［９］使用個体に、［１］〜［７］のいずれか１項に記載の組成物を適用することを含む、シワ、タルミ、皮膚炎症、老化、皮膚異常、白毛症、白髪及び白斑症からなる群から選ばれる症状又は疾患を治療、予防、抑制又は改善する方法。
［１０］使用個体に、［４］〜［７］のいずれか１項に記載の組成物を適用することを含む、日焼けを促進する方法又は皮膚を黒色化する方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の一態様の組成物は、元来生薬で使用されるなどしてその安全性が実証されており、副作用を呈することについてほとんど知られていない天然物である黒ショウガに含まれる成分を有効成分として含有することから、使用個体に対して安全に使用することが可能である。また、黒ショウガは東南アジアなどで自生しており大量に入手可能であり、さらに黒ショウガに含まれる上記成分は市販されているものであることから、工業的規模で高い経済性をもって製造することが期待できる。【００１９】
本発明の一態様の組成物は、シワ形成に関わるタンパク質分解酵素の活性を抑制する作用及びシワ形成に関わる炎症性因子の産生を抑制する作用を通じて、シワ、タルミ、皮膚炎症、老化、皮膚異常などに加えて、種々の皮膚に関する疾患、症状及び異常を治療、予防、抑制又は改善することが期待できる。【００２０】
さらに、本発明の一態様の組成物は、メラニン合成経路に関与する酵素を活性化する作用を通じて、白毛症、白髪、白斑症、老化などを治療、予防、抑制又は改善することが期待でき、さらに日焼け促進や皮膚黒色化などの美容目的に使用することが期待できる。【００２１】
本発明の一態様の組成物は、外用として使用することだけではなく、副作用が少なく、経口摂取が可能な内外美容成分（インナーコスメ）を含有するものであることから、健康食品としての利用が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、後述する実施例に記載されているとおりの、黒ショウガ抽出物から単離したメトキシフラボノイドの構造式を示す。
【図２】図２は、後述する実施例に記載されているとおりの、ＩＬ−１α刺激した正常ヒト皮膚線維芽細胞のエラスターゼの酵素活性を測定した結果を示す図である。
【図３】図３は、後述する実施例に記載されているとおりの、ＩＬ−１α刺激した正常ヒト皮膚線維芽細胞のエラスターゼの遺伝子発現量を測定した結果を示す図である。
【図４】図４は、後述する実施例に記載されているとおりの、ＩＬ−１α刺激した正常ヒト皮膚線維芽細胞のエラスターゼタンパク質の発現量を測定した結果を示す図である。
【図５】図５は、後述する実施例に記載されているとおりの、ＵＶＢ照射したヒト表皮角化細胞株のＩＬ−１α遺伝子の発現量を測定した結果を示す図である。
【図６】図６は、後述する実施例に記載されているとおりの、正常ヒト皮膚線維芽細胞及びＵＶ−Ｂ照射したケラチノサイト（ＨａＣａＴ）の共培養法におけるエラスターゼの酵素活性を測定した結果を示す図である。
【図７】図７は、後述する実施例に記載されているとおりの、正常ヒト皮膚線維芽細胞及びＵＶ−Ｂ照射したケラチノサイト（ＨａＣａＴ）の共培養法におけるコラゲナーゼ（ＭＭＰ−１）の遺伝子発現量を測定した結果を示す図である。
【図８】図８は、後述する実施例に記載されているとおりの、ヒトＨＭＶ−ＩＩメラノーマ細胞のチロシナーゼの酵素活性を測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明の一態様である組成物及び方法の詳細について説明するが、本発明の技術的範囲は本項目の事項によってのみに限定されるものではなく、本発明はその目的を達成する限りにおいて種々の態様をとり得る。
【００２４】
本明細書における各用語は、別段の定めがない限り、当業者により通常用いられている意味で使用され、不当に限定的な意味を有するものとして解釈されるべきではない。また、本明細書においてなされている憶測や推論は、本発明者らのこれまでの知見や経験によってなされたものであることから、本発明の技術的範囲はこのような憶測や推論のみによって拘泥されるものではない。
【００２５】
「組成物」は、通常用いられている意味のものとして特に限定されないが、例えば、２種以上の物質が組み合わさってなる物であり、具体的には、有効成分と別の物質とが組み合わさってなるもの、有効成分の２種以上が組み合わさってなるものなどが挙げられ、より具体的には、有効成分の１種以上と固形成分又は溶媒成分の１種以上とが組み合わさってなる固形組成物及び液性組成物などが挙げられる。
【００２６】
「及び／又は」との用語は、列記した複数の関連項目のいずれか１つ、又は２つ以上の任意の組み合わせ若しくは全ての組み合わせを意味する。
【００２７】
「含有量」は、濃度と同義であり、組成物の全体量に対する成分の量の割合を意味する。ただし、成分の含有量の総量は、１００％を超えることはない。
【００２８】
数値範囲の「〜」は、本明細書において、その前後の数値を含む範囲であり、例えば、「０質量％〜１００質量％」は、０質量％以上であり、かつ、１００質量％以下である範囲を意味する。
【００２９】
物質の「活性化抑制作用」との用語は、物質が本来有する触媒作用や生理作用の程度を減弱すること、物質の遺伝子の発現量を低減すること、物質の遺伝子産物（タンパク質）の翻訳量を低減すること及び物質の遺伝子産物の産生を阻害することのうち少なくともいずれか１つの作用をいう。
【００３０】
物質の「活性化促進作用」との用語は、物質が本来有する触媒作用や生理作用の程度を増強すること、物質の遺伝子の発現量を増大すること、物質の遺伝子産物（タンパク質）の翻訳量を増大すること及び物質の遺伝子産物の産生を促進することのうち少なくともいずれか１つの作用をいう。
【００３１】
物質の「産生促進作用」との用語は、物質の遺伝子の発現量を増大すること、物質の遺伝子産物（タンパク質）の翻訳量を増大すること及び物質の遺伝子産物の産生を促進することのうち少なくともいずれか１つの作用をいう。
【００３２】
［本発明の概要］
本発明の第１態様の組成物は、５，７，３’，４’−テトラメトキシフラボン、５，７，４’−トリメトキシフラボン及び５−ＯＨ−３，７，３’，４’−テトラメトキシフラボン並びにこれらの少なくとも１種の成分の含有物からなる群から選択される少なくとも１種の有効成分を少なくとも含有する。
【００３３】
本発明の第１態様の組成物は、含有する有効成分によって、シワ形成に関わるタンパク質分解酵素の活性化抑制作用及び皮膚における炎症性因子の活性化抑制作用からなる群から選ばれる少なくとも１種の作用を有し得る。本発明の第１態様の組成物は、これらの作用を有することにより、代表的には抗シワ用組成物、抗タルミ用組成物、抗皮膚炎症用組成物、抗老化用組成物及び皮膚異常改善用組成物などの態様をとり得る。本発明の別の一態様は、使用個体に有効成分を適用して、シワ、タルミ、皮膚炎症、老化及び皮膚異常を治療、予防、抑制又は改善する方法である。
【００３４】
本発明の第２態様の組成物は、３，５，７，３’，４’−ペンタメトキシフラボン、３，５，７−トリメトキシフラボン、３，５，７，４’−テトラメトキシフラボン、５−ＯＨ−３，７，３’，４’−テトラメトキシフラボン、５−ＯＨ−７−メトキシフラボン、５−ＯＨ−７，４’−ジメトキシフラボン、５−ＯＨ−３，７−ジメトキシフラボン及び５−ＯＨ−３，７，４’−トリメトキシフラボン並びにこれらの少なくとも１種の成分の含有物からなる群から選択される少なくとも１種の有効成分を少なくとも含有する。
【００３５】
本発明の第２態様の組成物は、含有する有効成分によって、メラニン合成経路に関与する酵素の活性化促進作用を有し得る。本発明の第２態様の組成物は、これらの作用を有することにより、代表的には抗白毛症用組成物、抗白髪用組成物、抗白斑症用組成物、抗老化用組成物、日焼け促進用組成物及び皮膚黒色化用組成物などの態様をとり得る。本発明の別の一態様は、使用個体に有効成分を適用して、白毛症、白髪及び白斑症を治療、予防、抑制又は改善する方法である。本発明の別の一態様は、使用個体に有効成分を適用して、日焼けを促進する方法又は皮膚を黒色化する方法である。
【００３６】
本明細書では、本発明の第１態様の組成物及び本発明の第２態様の組成物を総称して「本発明の一態様の組成物」とよぶ場合がある。また、本発明の第１態様の組成物が含有する有効成分及び本発明の第２態様の組成物が含有する有効成分を総じて「有効成分」とよぶ場合があり、本発明の第１態様の組成物が有し得る作用及び本発明の第２態様の組成物が有し得る作用を総じて「有効作用」とよぶ場合がある。
【００３７】
［有効成分］
有効成分は、ポリメトキシフラボノイドに分類されるものであり、下記一般式（Ｉ）
【化１】
2020153466.tif 000003
（式中、Ｒｌ、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素、水酸基又はメトキシ基を表す。）
に示される化合物に包含される。
【００３８】
本発明の第１態様の組成物における有効成分は、５，７，３’，４’−テトラメトキシフラボン、５，７，４’−トリメトキシフラボン及び５−ＯＨ−３，７，３’，４’−テトラメトキシフラボンのいずれか１種若しくは２種又は３種全てであり得る。本発明の第２態様の組成物における有効成分は、３，５，７，３’，４’−ペンタメトキシフラボン、３，５，７−トリメトキシフラボン、３，５，７，４’−テトラメトキシフラボン、５−ＯＨ−３，７，３’，４’−テトラメトキシフラボン、５−ＯＨ−７−メトキシフラボン、５−ＯＨ−７，４’−ジメトキシフラボン、５−ＯＨ−３，７−ジメトキシフラボン及び５−ＯＨ−３，７，４’−トリメトキシフラボンのいずれか１種、２種、３種、４種、５種若しくは６種又は７種全てであり得る。
【００３９】
５，７，３’，４’−テトラメトキシフラボン、５，７，４’−トリメトキシフラボン及び５−ＯＨ−３，７，３’，４’−テトラメトキシフラボン、３，５，７，３’，４’−ペンタメトキシフラボン、３，５，７−トリメトキシフラボン、３，５，７，４’−テトラメトキシフラボン、５−ＯＨ−３，７，３’，４’−テトラメトキシフラボン、５−ＯＨ−７−メトキシフラボン、５−ＯＨ−７，４’−ジメトキシフラボン、５−ＯＨ−３，７−ジメトキシフラボン及び５−ＯＨ−３，７，４’−トリメトキシフラボン（以下、これらを総称して「ポリメトキシフラボノイド」とよぶ場合がある。）は、通常知られているとおりのものであれば特に限定されず、市販されているものであっても、合成されたものであっても、天然物から抽出及び／又は分離したものであってもよい。ポリメトキシフラボノイドにおけるメトキシ基及びヒドロキシ基の位置は、一般式（Ｉ）から確認することができる。
【００４０】
有効成分は、ポリメトキシフラボノイドのいずれか１種又は２種以上を含有する含有物であってもよい。該含有物は、前記ポリメトキシフラボノイドを含有するものであれば特に限定されないが、例えば、植物抽出物であり、好ましくは黒ショウガ抽出物である。
【００４１】
黒ショウガ（Ｋａｅｍｐｆｅｒｉａ ｐａｒｖｉｆｌｏｒａ）は、東南アジアなどに自生することで知られているショウガ科バンウコン属の植物である。黒ショウガは、精力増進、滋養強壮、血糖値の低下、体力回復、消化器系の改善、膣帯下、痔核、痔疾、むかつき、口内炎、関節痛、胃痛の改善などの作用があることが知られている。黒ショウガは、長期にわたりヒトに摂取されてきた実績のある天然植物であって安全性が高いことから、本発明の一態様の組成物は、非経口的又は経口的な形態で適用可能である。
【００４２】
黒ショウガの使用部位は、所望の有効作用に寄与する有効成分を含む部位であれば特に限定されず、例えば、根、茎、葉、花、枝などが挙げられるが、好ましくはポリメトキシフラボノイドを多く含む根茎である。
【００４３】
黒ショウガからポリメトキシフラボノイドを含有する黒ショウガ抽出物を製造する方法は特に限定されず、例えば、黒ショウガ抽出物と、ポリメトキシフラボノイド可溶性溶媒とを接触させることを少なくとも含む方法などが挙げられる。
【００４４】
黒ショウガ抽出物の原料となる黒ショウガは、採取したままの状態のものでもよく、採取した後に乾燥などの加工処理に供した状態のものでもよい。採取した後、加工処理までに時間を要する場合、黒ショウガの原料の変質を防ぐために低温貯蔵などの当業者が通常用いる貯蔵手段により貯蔵することが好ましい。
【００４５】
黒ショウガ抽出物の原料は、用いる黒ショウガの部位によっては水分を多く含むことから、乾燥した状態のものであることが好ましい。乾燥処理は特に限定されず、例えば、黒ショウガ抽出物の原料の乾燥後の質量（乾燥質量）が、乾燥前の質量（湿質量）に対して１／２〜１／１０程度、好ましくは１／３〜１／６程度になるように乾燥する処理などが挙げられる。乾燥処理は、例えば、熱風乾燥、高圧蒸気乾燥、電磁波乾燥、凍結乾燥などの当業者に公知の任意の方法により行われ得る。加熱による乾燥は、例えば、３０℃〜１００℃、２４時間〜７２時間にて加温により黒ショウガ抽出物の原料が変色しない温度及び時間で行われ得る。
【００４６】
黒ショウガ抽出物の原料は、抽出操作を効率的に行うという観点からは、破砕、粉砕又はすり潰した状態のものであることが好ましい。原料の破砕、粉砕又はすり潰しの方法は特に限定されないが、例えば、カッター、裁断機、クラッシャー、ブレンダー、ミキサー、ミル、グラインダー、ニーダー、乳鉢などを用いる方法などを挙げることができる。
【００４７】
黒ショウガ抽出物を抽出するための抽出溶媒としては、少なくとも有機溶媒を含む抽出溶媒であることが好ましい。抽出溶媒としては、例えば、水と有機溶媒との混合溶媒、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノールなどの低級アルコール；酢酸エチル、酢酸メチルなどの低級エステル；ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、アセトン、ヘキサン、グリセリン、プロピレングリコールなどの有機溶媒などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
有機溶媒としては、単独種を用いてもよいし、複数種を混合した混合溶媒を用いてもよい。抽出溶媒として水と有機溶媒との混合溶媒を用いる場合、混合溶媒中における有機溶媒の含有量は、好ましくは５０体積％以上、より好ましくは８０体積％以上である。混合溶媒中における有機溶媒の含有量が５０体積％未満の場合、ポリメトキシフラボノイドを効率的に抽出することが困難となる傾向にある。なお、有機溶媒としては、低級アルコールが好ましく、エタノール及びメタノールがより好ましい。
【００４９】
抽出操作としては、抽出溶媒中に黒ショウガ抽出物の原料を所定時間浸漬させる。こうした抽出操作においては、抽出効率を高めるべく、必要に応じて撹拌操作、加温などを行ってもよい。また、原料から抽出される夾雑物を削減すべく、抽出操作に先だって、別途水抽出操作又は熱水抽出操作を行ってもよい。ポリメトキシフラボノイドは、水に対して不溶の成分であるため、黒ショウガを例えば熱湯で煮沸することで、不必要な夾雑物を抽出操作に先立って除去することができる。
【００５０】
抽出操作の後に固液分離操作を行うことで、黒ショウガ抽出液と原料の残渣とを分離することができる。固液分離操作の方法は特に限定されないが、例えば、ろ過、遠心分離などの公知の分離法を利用することができる。
【００５１】
黒ショウガ抽出液は、必要に応じて濃縮してもよい。黒ショウガ抽出液に含まれる抽出溶媒を必要に応じて除去することにより、粘度を有する油状や固体状の黒ショウガ抽出物を得ることができる。濃縮の方法は特に限定されず、例えば、減圧下で常温に置く、又は加熱することにより行ってもよいし、凍結乾燥により行ってもよい。
【００５２】
黒ショウガには、有効成分に挙げられているポリメトキシフラボノイド以外のフラボノイドを含有する。例えば、カラムを用いて黒ショウガ抽出物を分画することにより、所望のポリメトキシフラボノイドを高濃度で含有した抽出物を得ることができる。カラムを用いた分離操作に用いられる充填材は特に限定されないが、例えば、オクタデシル基を結合したシリカゲルなどを挙げることができる。
【００５３】
黒ショウガ抽出物中に含まれるポリメトキシフラボノイドの確認方法及び定量方法は特に限定されず、例えば、後述する実施例に記載のような高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により行うことができる。
【００５４】
黒ショウガ抽出物におけるポリメトキシフラボノイドの含有量は特に限定されないが、例えば、黒ショウガ抽出物の質量あたり、総量として、０．１質量％以上であり、好ましくは１〜９９質量％であり、より好ましくは５〜９０質量％である。また、黒ショウガ抽出物における５，７，３’，４’−テトラメトキシフラボンの含有量は、例えば、黒ショウガ抽出物の質量あたり、０．１質量％以上、好ましくは０．５質量％以上である。黒ショウガ抽出物における５，７，４’−トリメトキシフラボンの含有量は、例えば、黒ショウガ抽出物の質量あたり、１．０質量％以上、好ましくは５．０質量％以上である。黒ショウガ抽出物における５−ＯＨ−３，７，３’，４’−テトラメトキシフラボンの含有量は、例えば、黒ショウガ抽出物の質量あたり、０．１質量％以上、好ましくは０．５質量％以上である。黒ショウガ抽出物における３，５，７，３’，４’−ペンタメトキシフラボンの含有量は、例えば、黒ショウガ抽出物の質量あたり、１．０質量％以上、好ましくは５．０質量％以上である。黒ショウガ抽出物における３，５，７−トリメトキシフラボンの含有量は、例えば、黒ショウガ抽出物の質量あたり、０．１質量％以上、好ましくは０．５質量％以上である。黒ショウガ抽出物における３，５，７，４’−テトラメトキシフラボンの含有量は、例えば、黒ショウガ抽出物の質量あたり、０．５質量％以上、好ましくは２．５質量％以上である。黒ショウガ抽出物における５−ＯＨ−３，７，３’，４’−テトラメトキシフラボンの含有量は、例えば、黒ショウガ抽出物の質量あたり、０．１質量％以上、好ましくは０．５質量％以上である。黒ショウガ抽出物における５−ＯＨ−７−メトキシフラボンの含有量は、例えば、黒ショウガ抽出物の質量あたり、０．１質量％以上、好ましくは０．５質量％以上である。黒ショウガ抽出物における５−ＯＨ−７，４’−ジメトキシフラボンの含有量は、例えば、黒ショウガ抽出物の質量あたり、０．１質量％以上、好ましくは０．５質量％以上である。黒ショウガ抽出物における５−ＯＨ−３，７−ジメトキシフラボンの含有量は、例えば、黒ショウガ抽出物の質量あたり、０．２質量％以上、好ましくは１．０質量％以上である。黒ショウガ抽出物における５−ＯＨ−３，７，４’−トリメトキシフラボンの含有量は、例えば、黒ショウガ抽出物の質量あたり、０．３質量％以上、好ましくは１．５質量％以上である。黒ショウガ抽出物におけるポリメトキシフラボノイドの含有量の上限は特に限定されず、典型的には総量として９９質量％以下である。
【００５５】
［組成物］
本発明の第１態様の組成物は、有効成分を含有することにより、シワ形成に関わるタンパク質分解酵素及び炎症性因子の活性化抑制作用のいずれか一方又は両方の作用を示す。
【００５６】
本発明の第１態様の組成物が有するシワ形成に関わるタンパク質分解酵素の活性化抑制作用としては、エラスターゼ活性化抑制作用及びコラゲナーゼ活性化抑制作用のいずれか１種の作用であることが好ましく、これら両方の作用であることがさらに好ましい。本発明の第１態様の組成物が有するシワ形成に関わる炎症性因子の活性化抑制作用としては、炎症性サイトカイン活性化抑制作用であることが好ましく、インターロイキン−１α（ＩＬ−１α）活性化抑制作用であることがさらに好ましい。
【００５７】
本発明の第１態様の組成物が有する有効作用は、後述の実施例に記載されるような、皮膚線維芽細胞又は表皮角化細胞の外部刺激によって惹起される酵素や炎症性因子に係る活性の力価、遺伝子発現量及び／又はタンパク質産生量を測定することによって確認することができる。この際、本発明の第１態様の組成物を加えない系をコントロールとして、本発明の第１態様の組成物を加えた系がコントロールよりも細胞の外部刺激によって惹起される酵素や炎症性因子に係る活性の力価、遺伝子発現量及び／又はタンパク質産生量が小さければ、本発明の第１態様の組成物は有効作用を有すると評価できる。
【００５８】
本発明の第２態様の組成物は、有効成分を含有することにより、メラニン合成経路に関与する酵素の活性化促進作用を示す。本発明の第２態様の組成物が有するメラニン合成経路に関与する酵素の活性化促進作用としては、チロシナーゼ活性化促進作用であることが好ましい。
【００５９】
本発明の第２態様の組成物が有する有効作用は、後述の実施例に記載されるような、メラノーマ細胞が産生する酵素に係る活性の力価、遺伝子発現量及び／又はタンパク質産生量を測定することによって確認することができる。この際、本発明の第２態様の組成物を加えない系をコントロールとして、本発明の第２態様の組成物を加えた系がコントロールよりも細胞の酵素に係る活性の力価、遺伝子発現量及び／又はタンパク質産生量が小さければ、本発明の第２態様の組成物は有効作用を有すると評価できる。
【００６０】
本発明の一態様の組成物は美容目的で使用される組成物であれば特に限定されないが、例えば、化粧品用組成物、飲食品用組成物、医薬品用組成物などの種々の形態をとり得る。したがって、本発明の具体的な一実施態様は、有効成分を含有する、非経口用又は経口用の化粧品用組成物、飲食品用組成物、医薬品用組成物、医薬部外品用組成物、動物飼料用組成物などである。
【００６１】
本発明の一態様の組成物に含有される有効成分の含有量は、所望の有効作用が認められる量であれば特に限定されないが、例えば、非経口用の美容用組成物としては０．００００１質量％以上、好ましくは０．０００１質量％以上であり、より好ましくは０．００１質量％以上であり；経口用の美容用組成物としては０．０００１質量％以上、好ましくは０．００１質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上である。含有量の上限は特に限定されないが、典型的には１質量％である。
【００６２】
本発明の一態様の組成物の使用個体や使用方法については特に限定されず、例えば、使用個体は動物、中でも哺乳類が挙げられ、哺乳類としてはヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマなどが挙げられ、これらの中でもヒトであることが好ましい。
【００６３】
本発明の一態様の組成物の１回の使用量、１日の使用量、使用期間、使用間隔などの用法及び用量は特に限定されず、使用態様や使用個体の状態などに応じて適宜設定され得る。使用間隔は、例えば、１日に１回、２回、３回又は数回を、一定期間、すなわち２日以上、好ましくは１週間以上、より好ましくは２週間以上、さらに好ましくは１ヶ月以上、なおさらに好ましくは６ヶ月又は１年以上にわたって継続的に適用することなどが挙げられる。本発明の一態様の組成物の適用は、毎日行うことが好ましいが、期間中継続的に適用する限り、本発明の一態様の組成物を毎日適用しなくてもよい。
【００６４】
本発明の一態様の組成物は、上記のとおりに、非経口的に適用されるものであっても、経口的に適用されるものであってもよいが、有効作用が発揮する患部に直接的に適用できることから、非経口用の美容組成物であることが好ましく、化粧品用組成物及び非経口用医薬品用組成物であることがより好ましい。
【００６５】
本発明の一態様の組成物は、本発明の課題を解決し得る限り、有効成分に加えて、その他の成分を含有してもよい。
【００６６】
非経口用の美容用組成物である場合のその他の成分としては、例えば、通常の化粧品や医薬品に含有される成分などが挙げられ、より具体的には水などの基剤、油性成分、保湿剤、清涼剤、防腐剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、増粘剤、美白剤、ビタミン類、その他各種薬効成分、粉体、香料、色材などが挙げられる。その他の成分の含有量は、本発明の課題解決を妨げない限り、当業者により適宜設定し得る。その他の成分のいくつかについて以下に列挙するが、これらはあくまでも例示であり、限定されるものではない。
【００６７】
油性成分は、例えば、油性エモリエント成分などが挙げられ、好ましくは室温（２５℃）で液体状又は半固形状である油性エモリエント成分である。油性エモリエント成分の具体例としては、ジカプリン酸ネオペンチルグリコール、トリエチルヘキサノイン、パルミチン酸イソプロピル、２−エチルヘキサン酸セチル、イソノナン酸イソノニル、イソノナン酸イソトリデシル、セバシン酸ジイソプロピル、テトラ２−エチルヘキサン酸ペンタエリスリチル、コハク酸ジエチルヘキシル、炭素数１２〜１５のアルキルベンゾエートなどのエステル油；ジメチルポリシロキサン、ジメチルシクロポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、メチルハイドロジェンポリシロキサン、高級アルコール変性シリコーン油などのシリコーン油；アセトグリセリル、トリイソオクタン酸グリセリル、トリイソステアリン酸グリセリル、トリイソパルミチン酸グリセリル、モノステアリン酸グリセリル、ジ−２−ヘプチルウンデカン酸グリセリル、トリミリスチン酸グリセリルなどのグリセライド油；液状ラノリンなどの動物油；フルオロポリエーテル、パーフルオロアルキルエーテルシリコーンなどのフッ素油；オリーブ油、ホホバ油、ラベンダー油、月見草油、アボガド油、ツバキ油、タートル油、マカデミアナッツ油、トウモロコシ油、ミンク油、ナタネ油、卵黄油、ゴマ油、パーシック油、小麦胚芽油、サザンカ油、ヒマシ油、アマニ油、サフラワー油、綿実油、エノ油、大豆油、落花生油、茶実油、カヤ油、コメヌカ油、シナギリ油、日本キリ油、胚芽油などの天然油性成分などが挙げられるが、これらに限定されない。油性エモリエント成分は、上記したものの１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用することができる。油性エモリエント成分の含有量は、０質量％〜１０質量％であることが好ましい。
【００６８】
保湿剤としては、例えば、グリセリン、ジグリセリン、トレハロース、ブチレングリコール（ＢＧ）、キシリトール、マルチトール、マルトース、ソルビトール、ブドウ糖、果糖、加水分解エラスチン、乳酸ナトリウム、シクロデキストリン、ピロリドンカルボン酸などが挙げられ、これらの１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。保湿剤の含有量は、０質量％〜１５質量％であることが好ましい。
【００６９】
防腐剤としては、例えば、安息香酸、サリチル酸、石炭酸、ソルビン酸、パラオキシ安息香酸メチル、パラクロルメタクレゾール、ヘキサクロロフェン、塩化ベンザルコニウム、塩化クロルヘキシジン、トリクロロカルバニリド、感光素、フェノキシエタノールなどが挙げられ、これらの１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。防腐剤の含有量は、０質量％〜１質量％であることが好ましい。
【００７０】
ｐＨ調整剤としては、例えば、乳酸、クエン酸、グリコール酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸、エチドロン酸、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素アンモニウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエタノールアミン、モノエタノールアミンなどが挙げられ、これらの１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。ｐＨ調整剤の含有量は、０質量％〜１質量％であることが好ましい。
【００７１】
酸化防止剤としては、例えば、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、δトコフェロールなどのビタミンＥ及びその誘導体、チオタウリン、メマツヨイグサ抽出液、βカロチン、カテキン化合物、フラボノイド化合物、ポリフェノール化合物などが挙げられ、これらの１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。酸化防止剤の含有量は、０質量％〜１質量％であることが好ましい。
【００７２】
増粘剤としては、例えば、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、アセチル化ヒアルロン酸、アセチル化ヒアルロン酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸ナトリウム、フコイダン、チューベロース多糖体、キサンタンガムなどの水溶性多糖類；カラギーナン、アルギン酸などの天然高分子；カルボキシメチルセルロースナトリウムなどの半合成高分子；カルボマー、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸ナトリウム、（メタ）アクリル酸／（メタ）アクリル酸アルキル共重合体などのアクリル酸系ポリマーなどの合成高分子などが挙げられる。カルボマーは、例えば、商品として「カーボポール９８０」、「カーボポール９１０」、「カーボポール９３４」、「カーボポール９４０」、「カーボポール９４１」、「カーボポール９８１」（それぞれＬｕｂｒｉｚｏｌ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｉｎｃ．製）などとして市販されている。（メタ）アクリル酸／（メタ）アクリル酸アルキル共重合体は、例えば、「カーボポールＳＣ−５００」、「カーボポール１３８２」、「カーボポールＥＴＤ２０２０」、「ＰＥＭＵＬＥＮ  ＴＲ−１」、「ＰＥＭＵＬＥＮ  ＴＲ−２」（それぞれＬｕｂｒｉｚｏｌ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｉｎｃ．製）などとして市販されている。カルボキシメチルセルロースナトリウムは、例えば、商品として「ＣＭＣダイセル」（ダイセル化学工業株式会社製）などとして市販されている。増粘剤は、これらの１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。増粘剤の含有量は、０質量％〜１質量％であることが好ましい。
【００７３】
化粧品用組成物としての使用態様や剤形については特に限定されず、例えば、スキンケア化粧品、メーキャップ化粧品、フレグランス化粧品、ボディケア化粧品などが挙げられ、より具体的にはクリーム、乳液、ファンデーション、化粧水、美容液、ヘアトニック、ヘアクリーム、シャンプー、ヘアリンス、トリートメント、洗顔剤、ファンデーション、育毛剤、水性軟膏、スプレー、ジェル、ローション、パック、洗顔クリーム、ハンドクリーム、メーキャップクレンジング、化粧下地、コンシーラー、ほほ紅、アイシャドウ、アイライナー、アイブロウ、口紅、脱毛・除毛クリーム、オールインワン化粧品などが挙げられる。本発明の一態様の組成物は、水中油型乳化化粧料として、ジェル、乳液、ローション、クリームなどの一定の粘性を有する剤形の形態をとることにより、皮膚や毛髪に対して良好な使用感触を有し得るものとなることから好ましい。
【００７４】
非経口用医薬品用組成物としての使用態様や剤形については特に限定されず、例えば、注射剤、貼付剤、軟膏、クリームなどが挙げられる。
【００７５】
本発明の一態様の組成物は、経口用の美容用組成物であってもよく、この場合は飲食品用組成物及び経口用医薬品用組成物であることが好ましい。
【００７６】
飲食品用組成物の具体的な一態様は、例えば、生体に対して一定の機能性を有する飲食品である機能性飲食品である。機能性飲食品は、例えば、特定保健用飲食品、機能性表示飲食品、栄養機能飲食品、保健機能飲食品、特別用途飲食品、栄養補助飲食品、健康補助飲食品、サプリメント、美容食品などのいわゆる健康飲食品に加えて、乳児用飲食品、妊産婦用飲食品、高齢者用飲食品などの特定者用飲食品を包含する。さらに機能性飲食品は、コーデックス（ＦＡＯ／ＷＨＯ合同食品規格委員会）の食品規格に基づく健康強調表示（Ｈｅａｌｔｈ  ｃｌａｉｍ）が適用される健康飲食品を包含する。
【００７７】
経口用医薬品用組成物は、適用後に有効作用を示し得る限り、あらゆる経口用医薬品の形態をとり得る。また、経口用医薬品用組成物は、本発明の目的を達成し得る限り、有効成分以外の有効作用を有する他の生理活性物質を配合してもよく、該生理活性物質を有効成分として含有する他の薬剤と併用してもよい。
【００７８】
経口用の美容用組成物の使用態様や剤形は特に限定されず、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、粉剤、カプセル剤、丸剤、トローチ剤、液剤などの形態をとり得るが、これらに限定されない。錠剤には、糖衣錠、コーティング錠、バッカル剤などが含まれる。カプセル剤には、硬カプセル剤、軟カプセル剤の双方が含まれる。顆粒剤にはコーティングされた顆粒剤も含まれる。また、液剤には、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤などが含まれる。シロップ剤にはドライシロップなどが含まれる。
【００７９】
飲食品用組成物とする場合は、例えば、パン、クッキー、ビスケット、米飯添加用麦、雑穀、うどん、そば、パスタその他の麺類、チーズ、ヨーグルトその他の乳製品、ジャム、マヨネーズ、味噌、醤油その他の大豆製品、茶、コーヒー、ココア、清涼飲料、果実飲料その他の非アルコール性飲料、薬用酒、その他のアルコール性飲料、キャンディー、チョコレートその他のスナック菓子、チューインガム、せんべい、羊羹その他の大豆を原料とする菓子などに添加して一般的な飲食品の形態とすることができる。
【００８０】
経口用の美容用組成物は、有効成分を含有するものであればよいが、その他の成分と組み合わせたものであってもよい。その他の成分としては特に限定されないが、例えば、飲食品用又は経口用医薬品用の添加物などをその他の成分として用いることができる。例えば、種々の賦形剤、結合剤、滑沢剤、安定剤、希釈剤、増量剤、乳化剤、着色料、香料、香油、増粘剤、光沢剤、緩衝剤などをその他の成分として用いることができる。その他の成分の含有量は、本発明の課題解決を妨げない限り、本発明の一態様の組成物の形態などに応じて適宜選択することができる。
【００８１】
賦形剤としては、例えば、乳糖、ブドウ糖、白糖、マンニトール、馬鈴薯デンプン、デキストリン、トウモロコシデンプン、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、結晶セルロース、カンゾウ末、ゲンチアナ末などを挙げることができる。結合剤としては、例えば、デンプン、トラガントゴム、ゼラチン、シロップ、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシルメチルセルロースなどを挙げることができる。崩壊剤としては、例えば、デンプン、寒天、ゼラチン末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、結晶セルロース、炭酸カルシウム、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシルメチルセルロースなどを挙げることができる。滑沢剤としては、例えば、タルク、ステアリン酸マグネシウムなどを挙げることができる。着色剤としては、飲食品や経口用医薬品に添加することが許容されているものなどを使用することができ、特に限定されない。
【００８２】
錠剤や顆粒剤とする場合には、所望により、白糖、ゼラチン、精製セラック、グリセリン、ソルビトール、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、フタル酸セルロースアセテート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルメタクリレート、メタアクリル酸重合体などを用いてコーティングしてもよく、複数層でコーティングすることもできる。さらに顆粒剤や粉剤をエチルセルロースやゼラチンのようなカプセルに詰めてカプセル剤とすることもできる。
【００８３】
本発明の一態様の組成物は、その製造方法について特に限定されず、例えば、化粧品、飲食品、医薬品などの使用態様に応じて、当業者に知られる方法により、有効成分と任意にその他の成分とを混合することなどにより、製造することができる。
【００８４】
本発明の一態様の組成物は、その使用方法について特に限定されず、例えば、化粧品、飲食品、医薬品などの使用態様に応じて、通常使用される方法を採用することができる。
【００８５】
本発明の一態様の組成物は、容器に詰めて密封した容器詰組成物とすることができる。容器は特に限定されないが、例えば、アルミなどの金属、紙、ＰＥＴやＰＴＰなどのプラスチック、一層又は積層（ラミネート）のフィルム袋、レトルトパウチ、真空パック、アルミ容器、プラスチック容器、ガラス容器、瓶、缶などの包装容器が挙げられる。本発明の一態様の組成物は、経時的な変質を避けるために、容器に詰めて密封した後に、加圧及び／又は加熱などにより殺菌処理したものであることが好ましい。容器詰組成物は、製造して得られた組成物を、分注、充填及び／又は個装して、それ自体で独立して、流通におかれて市販され得るものであることが好ましい。
【００８６】
［組成物の具体的態様］
本発明の第１態様の組成物は、シワ形成に関わるタンパク質分解酵素の活性化抑制作用を通じて、皮膚において発生するシワの形成を抑制、改善、緩和、治療及び／又は予防するための組成物、すなわち、抗シワ用組成物の態様をとり得る。同様に、本発明の第１態様の組成物は、シワ形成に関わるタンパク質分解酵素の活性化抑制作用を通じて、抗タルミ用組成物、抗老化用組成物、皮膚異常改善用組成物などの態様をとり得る。
【００８７】
本発明の第１態様の組成物は、皮膚における炎症性因子の活性化抑制作用を通じて、皮膚における炎症を抑制、改善、緩和、治療及び／又は予防するための組成物、すなわち、抗皮膚炎症用組成物などの態様をとり得る。
【００８８】
本発明の第２態様の組成物は、メラニン合成経路に関与する酵素の活性化促進作用を通じて、皮膚や毛髪のメラニン合成を促進することにより、白毛症や白斑症を抑制、改善、緩和、治療及び／又は予防するための組成物、すなわち、抗白毛症用組成物及び抗白斑症用組成物の態様をとり得る。同様に、本発明の第２態様の組成物は、メラニン合成経路に関与する酵素の活性化促進作用を通じて、抗白髪用組成物、抗老化用組成物、日焼け促進用組成物、皮膚黒色化用組成物などの態様をとり得る。
【００８９】
このように、本発明の一態様の組成物は、対応する有効作用を通じて、皮膚や毛髪に生じる、特に老化に伴う皮膚や毛髪の症状又は疾患の治療、予防、抑制、緩和及び／又は改善用組成物であることが好ましい。さらに、本発明の一態様の組成物は、予後の処置のために使用することができる。本発明の一態様の組成物の使用個体は、健常な個体であってもよいが、皮膚にシワ、タルミ、炎症などが表出している、又は皮膚や毛髪の白色化が表出している個体、及びこれらが表出する危険性がある個体であることが好ましい。
【００９０】
後述する実施例に記載があるとおり、本発明の第１態様の組成物における有効成分は、エラスターゼ活性化抑制作用、コラゲナーゼ活性化抑制作用及び炎症性サイトカイン活性化抑制作用を有する。したがって、本発明の別の一態様は、有効成分を含有する、エラスターゼ活性化抑制用組成物又はエラスターゼ活性化抑制剤、コラゲナーゼ活性化抑制用組成物又はコラゲナーゼ活性化抑制剤、炎症性サイトカイン活性化抑制用組成物又は炎症性サイトカイン活性化抑制剤並びに皮膚細胞におけるインターロイキン−１α活性化抑制用組成物又は皮膚細胞におけるインターロイキン−１α活性化抑制剤である。
【００９１】
後述する実施例に記載があるとおり、本発明の第２態様の組成物における有効成分は、チロシナーゼ活性化促進作用を有する。したがって、本発明の別の一態様は、有効成分を含有する、チロシナーゼ活性化促進用組成物又はチロシナーゼ活性化促進剤である。
【００９２】
［方法］
本発明の一態様の組成物の製造方法及び使用方法は、別の一態様として本発明に包含される。
【００９３】
本発明の一態様の方法は、本発明の一態様の組成物を製造するための、５，７，３’，４’−テトラメトキシフラボン、５，７，４’−トリメトキシフラボン、５−ＯＨ−３，７，３’，４’−テトラメトキシフラボン、３，５，７，３’，４’−ペンタメトキシフラボン、３，５，７−トリメトキシフラボン、３，５，７，４’−テトラメトキシフラボン、５−ＯＨ−３，７，３’，４’−テトラメトキシフラボン、５−ＯＨ−７−メトキシフラボン、５−ＯＨ−７，４’−ジメトキシフラボン、５−ＯＨ−３，７−ジメトキシフラボン及び５−ＯＨ−３，７，４’−トリメトキシフラボン並びにこれらの少なくとも１種の成分の含有物からなる群から選択される少なくとも１種の有効成分の使用方法である。
【００９４】
本発明の別の一態様の方法は、使用個体に、本発明の第１態様の組成物を適用することを含む、シワ、タルミ、皮膚炎症、老化及び皮膚異常からなる群から選ばれる症状又は疾患を治療、予防、抑制又は改善する方法である。
【００９５】
本発明の別の一態様の方法は、使用個体に、本発明の第２態様の組成物を適用することを含む、白毛症、白髪、白斑症及び老化からなる群から選ばれる症状又は疾患を治療、予防、抑制又は改善する方法である。
【００９６】
本発明の別の一態様の方法は、使用個体に、本発明の第２態様の組成物を適用することを含む、日焼けを促進する方法又は皮膚を黒色化する方法である。
【００９７】
本発明の一態様の方法は、本発明の課題を解決し得る限り、上記した工程の前段若しくは後段又は工程中に、種々の工程や操作を加入することができる。
【００９８】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではなく、本発明の課題を解決し得る限り、本発明は種々の態様をとることができる。
【実施例】
【００９９】
［例１．メトキシフラボノイドが有するエラスターゼ活性化抑制作用の評価］
（１−１）被験試料及び材料
正常ヒト皮膚繊維芽細胞（正常ヒト皮膚線維芽細胞）は、ＴＯＹＯＢＯ社（カタログ番号：ＧＣＡ１０６０５Ｆ）より購入した。ＤＭＥＭは、ＳＩＧＭＡ社（カタログ番号：Ｄ６４２９−５００ＭＬ）より購入した。その他の試薬は富士フイルム和光純薬社又はＳＩＧＭＡ社より購入した。９６ウェルマイクロプレートは、Ｎｕｎｃ社（カタログ番号：１６１０９３）より購入した。【０１００】
黒ショウガから、有機溶媒による液液分配、逆相系樹脂（三菱ケミカル社製  ダイヤイオンＨＰ２０）を用いたクロマトグラフィーと逆相系ＯＤＳカラム（富士フイルム和光純薬社製  Ｗａｋｏｐａｋ  Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ  ５Ｃ１８ＲＳ  Ｐｒｅｐ  ２８×２５０ｍｍ）を用いた分取ＨＰＬＣなどにより使用する化合物を単離し、ＮＭＲ他の構造解析により各化合物を同定した。また、黒ショウガ抽出物中に含まれるポリメトキシフラボノイドの確認方法及び定量方法は逆相系ＯＤＳカラム（富士フイルム和光純薬社製  Ｗａｋｏｐａｋ  Ｗａｋｏｓｉｌ−II  ５Ｃ１８ＲＳ  Ｐｒｅｐ  ４．６×２５０ｍｍ）を用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で行った。単離した化合物をＤＭＳＯを用いて希釈することにより被験試料を調製した。【０１０１】
（１−２）前培養
正常ヒト皮膚線維芽細胞は、ＩＬ−１α刺激によって、エラスターゼ活性が上昇する。そこで、正常ヒト皮膚線維芽細胞を培地（１０ｖｏｌ％  ＦＢＳ（胎児血清）を含むＤＭＥＭ培地）を用いて５．０×１０４細胞／ｍｌとなるように調製し、これを９６ウェルマイクロプレートに１００μｌ／ウェルにて分注した。２４時間、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。【０１０２】
（１−３）エラスターゼ酵素活性試験
前培養した培養プレートの各ウェルに、ＩＬ−１α（終濃度０．１ｎＭ）と被験試料を、単離化合物の最終濃度が１５又は３０μＭになるように添加した。被験試料を加えたプレートを７２時間培養した後、培養上清を抜き取った。次いで、ウェル内に残った細胞に０．５ｖｏｌ％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶液を加えて細胞を溶解した後、さらに基質緩衝液を添加することにより、エラスターゼの酵素活性をプレートリーダーで測定した。なお、基質としてはＳｕｃ−（Ａｌａ）３−ｐＮＡ（ＳＴＡＮＡ）を用いて、エラスターゼが作用することにより生じるｐ−ニトロアニリンの量を、４０５ｎｍの吸光度により測定した。なお、被験試料に代えてＤＭＳＯを加えて試験して得られた結果をコントロール（ＣＮ）とした。ＩＬ−１α刺激していない正常ヒト皮膚線維芽細胞を用いて被験試料及びＤＭＳＯを加えずに試験して得られた結果をブランク（ＢＬ）とした。また、ポジティブコントロールとして、被験試料の代わりに３０μＭ  レスベラトロールを用いて試験して得られた結果を得た。得られた値をＣＮに対してＤｕｎｎｅｔｔ検定を行った。有意水準は危険率５％及び１％とした。【０１０３】
（１−４）エラスターゼ遺伝子発現試験
前培養した培養プレートの各ウェルに、被験試料を、単離化合物の最終濃度が３０μＭになるように添加した。被験試料を加えたプレートを２４時間培養した後、細胞からＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製  ＴＲＩＺＯＬ  Ｒｅａｇｅｎｔ（カタログ番号：１５５９６−０１８）を用いて、全ＲＮＡの抽出とｃＤＮＡを調製し、リアルタイムＰＣＲによりエラスターゼ遺伝子の発現量を測定した。【０１０４】
（１−５）エラスターゼタンパク質発現試験
前培養した培養プレートの各ウェルに、被験試料を、単離化合物の最終濃度が１０、１５及び３０μＭになるように添加した。被験試料を加えたプレートを２４時間培養した後、ＰＢＳで洗浄後に、細胞を富士フイルム和光純薬社製  ＲＩＰＡ  Ｂｕｆｆｅｒ（カタログ番号：１８２−０２４５１）を用いて、溶解して細胞抽出液を調製し、ウェスタンブロッティング法（コントロール：β−アクチン）によりエラスターゼタンパク質（ＮＥＰ）の発現量を測定した。【０１０５】
（１−６）試験結果及び評価
図１に示すとおり、黒ショウガ抽出物から、ＭＦ１〜ＭＦ１１の１１種類のポリメトキシフラボノイドを単離した。【０１０６】
図１に示すメトキシフラボノイドのうち、５，７，３’，４’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｏｘｙｆｌａｖｏｎｅ（ＭＦ１）、５，７，４’−ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｆｌａｖｏｎｅ（ＭＦ４）及び５−ＯＨ−３，７，３’，４’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｏｘｙｆｌａｖｏｎｅ（ＭＦ７）は、ＩＬ−１α刺激で上昇するエラスターゼ酵素活性を有意に抑制した（図２）。同様に、ＭＦ１、ＭＦ４及びＭＦ７は、ＩＬ−１α刺激で上昇するエラスターゼ遺伝子発現を抑制した（図３）。さらに、ＭＦ４は、ＩＬ−１α刺激で上昇するエラスターゼタンパク質発現を抑制した（図４）。【０１０７】
以上のとおり、ＭＦ１、ＭＦ４及びＭＦ７は、シワ形成に関わるタンパク質分解酵素であるエラスターゼを酵素レベル、遺伝子レベル及びタンパク質レベルで抑制し、もってエラスターゼ活性を抑制することから、シワの予防や改善に有用であることがわかった。【０１０８】
［例２．メトキシフラボノイドが有するＩＬ−１α遺伝子発現抑制作用の評価］
（２−１）被験試料及び材料
ヒト表皮角化細胞株として、ヒトケラチノサイトＨａＣａＴ（Ｎｏｒｍａｌ  ｋｅｒａｔｉｎｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ  ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ  ａｎｅｕｐｌｏｉｄ  ｈｕｍａｎ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ．Ｂｏｕｋａｍｐ  Ｐ，Ｐｅｔｒｕｓｓｅｖｓｋａ  ＲＴ，Ｂｒｅｉｔｋｒｅｕｔｚ  Ｄ，Ｈｏｒｎｕｎｇ  Ｊ，Ｍａｒｋｈａｍ  Ａ，Ｆｕｓｅｎｉｇ  ＮＥ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９８８  Ｍａｒ；１０６（３）：７６１−７１．）を用いた。２４ウェルマイクロプレートは、ＴＰＰ社（カタログ番号：９２０２４）より購入した。【０１０９】
（２−２）前培養
ヒト表皮角化細胞株（ヒトケラチノサイトＨａＣａＴ）は、ＵＶ−Ｂ照射刺激によって、ＩＬ−１αなどの炎症性遺伝子発現が上昇する。そこで、ヒト表皮角化細胞株を培地（１０ｖｏｌ％  ＦＢＳ（胎児血清）を含むＤＭＥＭ培地）を用いて５．０×１０４細胞／ｍｌとなるように調製し、これを２４ウェルマルチプレートに５００μｌ／ウェルにて分注した。ヒト表皮角化細胞株を含む培養プレートを、２４時間、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。次いで培養上清を抜き取った後、新たな培地（０．１ｖｏｌ％ＦＢＳ（胎児血清）を含むＤＭＥＭ培地）を用いて、さらに２４時間培養した。【０１１０】
（２−３）ＩＬ−１α遺伝子発現試験
前培養した培養プレートの各ウェルに、被験試料を、単離化合物の最終濃度が１０、２０及び３０μＭになるように添加した。被験試料を加えた培養プレートに、５０ｍＪ／ｃｍ２でＵＶ−Ｂを照射し、２４時間培養した。次いで、培養後の細胞からＴｏｔａｌ  ＲＮＡを回収して、リアルタイムＰＣＲ法によりＩＬ−１α遺伝子の発現量を測定した。得られた値をＣＮに対してＤｕｎｎｅｔｔ検定を行った。有意水準は危険率５％及び１％とした。【０１１１】
（２−４）試験結果及び評価
メトキシフラボノイドのうち、５，７，４’−ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｆｌａｖｏｎｅ（ＭＦ４）はＵＶ−Ｂ刺激で上昇するＩＬ−１αの発現を有意に抑制した（図５）。【０１１２】
この結果から、ＭＦ４がケラチノサイトにおける炎症性サイトカインの産生を遺伝子レベルで抑制することにより、炎症反応を抑制することに有用であることがわかった。【０１１３】
［例３．メトキシフラボノイドが有するエラスターゼ活性化抑制作用及びコラゲナーゼ（ＭＭＰ−１）活性化抑制作用の評価］
（３−１）被験試料及び材料
１２ウェル共培養システムプレートは、Ｆａｌｃｏｎ社（カタログ番号：３５３０４３）より購入した。【０１１４】
（３−２）前培養
正常ヒト皮膚線維芽細胞は、ＵＶ−Ｂ刺激したヒト表皮角化細胞株（ヒトケラチノサイトＨａＣａＴ）との共培養によって、エラスターゼ酵素活性及びコラゲナーゼ（ＭＭＰ−１）遺伝子発現が上昇する。そこで、ヒト表皮角化細胞株を培地（１０ｖｏｌ％  ＦＢＳ（胎児血清）を含むＤＭＥＭ培地）を用いて５．０×１０４細胞／ｍｌとなるように調製し、これを１２ウェル共培養システムプレートのトランスウェルに５００μｌ／ウェルにて分注した。【０１１５】
次いで、正常ヒト皮膚線維芽細胞を培地（１０ｖｏｌ％ＦＢＳ（胎児血清）を含むＤＭＥＭ培地）を用いて５．０×１０４細胞／ｍｌとなるように調製し、これを１２ウェル共培養システムプレートのプレートウェルに１，５００μｌ／ウェルにて分注した。【０１１６】
正常ヒト皮膚線維芽細胞及びヒト表皮角化細胞株を含む培養プレートを、２４時間、３７  ℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。次いで培養上清を抜き取った後、新たな培地（０．１ｖｏｌ％ＦＢＳ（胎児血清）を含むＤＭＥＭ培地）を用いて、さらに２４時間培養した。【０１１７】
（３−３）コラゲナーゼ（ＭＭＰ−１）遺伝子発現試験
トランスウェルのヒト表皮角化細胞株（ヒトケラチノサイトＨａＣａＴ）のみにＵＶ−Ｂを５０ｍＪ／ｃｍ２で照射し、トランス・プレートの各ウェルに、被験試料を、単離化合物の最終濃度が１５及び３０μＭになるように添加した。【０１１８】
培養プレートを２４時間培養した後、培養後の細胞からＴｏｔａｌ  ＲＮＡを回収し、リアルタイムＰＣＲ法により、コラゲナーゼ（ＭＭＰ−１）遺伝子の発現量を測定した。【０１１９】
（３−４）エラスターゼ酵素活性試験
培養プレートを４８時間培養した後、上記（１−３）と同様にして、エラスターゼの酵素活性を測定した。【０１２０】
（３−５）試験結果及び評価
メトキシフラボノイドのうち、５，７，４’−ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｆｌａｖｏｎｅ（ＭＦ４）はエラスターゼ活性の上昇を抑制した（図６）。また、ＭＦ４はコラゲナーゼ（ＭＭＰ−１）遺伝子の発現上昇も抑制した（図７）。【０１２１】
これらの結果から、ＭＦ４はＵＶ−Ｂ曝露したケラチノサイトによって誘導される皮膚線維芽細胞のエラスターゼ酵素活性の上昇及びコラゲナーゼ（ＭＭＰ−１）遺伝子の発現上昇を抑制することから、シワの予防や改善に有用であることがわかった。【０１２２】
［例４．メトキシフラボノイドが有するチロシナーゼ活性化促進作用の評価］
（４−１）被験試料及び材料
ヒトＨＭＶ−ＩＩメラノーマ細胞株は、ＲＩＫＥＮ  ＢＲＣ（カタログ番号：ＲＣＢ０７７７７）より購入した。Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地は、富士フイルム和光純薬社（カタログ番号：０８７−０８３３５）より購入した。その他の試薬は富士フイルム和光純薬社又はＳＩＧＭＡ社より購入した。【０１２３】
（４−２）前培養
ヒトＨＭＶ−ＩＩメラノーマ細胞株を、培地（１０ｖｏｌ％  ＦＢＳ（胎児血清）を含むＤＭＥＭ培地）を用いて、９６ウェルマイクロプレートに１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェルで播種し、２４時間、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。【０１２４】
（４−３）チロシナーゼ酵素活性試験
前培養した培養プレートの各ウェルに、被験試料を、単離化合物の最終濃度が４０μＭになるように添加した。被験試料を加えたプレートを７２時間培養した後、培養上清を抜き取った。【０１２５】
次いで、ウェル内に残った細胞に、Ｔ．Ａ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（１％  ｓｏｄｉｕｍ  ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ＋０．５％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００＋１００ｍＭ  ＰＭＳＦ（Ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ））  ２０μＬを添加し、３０分間振とうすることにより細胞を溶解した。【０１２６】
振とうした後、各ウェルから細胞溶解液  ５μＬを取り出し、ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔを用いて、吸光度５７０ｎｍを測定してタンパク質量とした。【０１２７】
残りの細胞溶解液にＭｉｘｅｄ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ＋Ｌ−ＤＯＰＡ（３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）＋ＭＢＴＨ（３−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｂｅｎｚｏ−ｔｈｉａｚｏｌｉｎｏｎｅ  ｈｙｄｒａｚｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ））  ２００μＬを加えた。３７℃でインキュベートしながら、１０分おきに吸光度５０５ｎｍを測定した。【０１２８】
１時間当たりの吸光度の差を求め、タンパク質１ｍｇあたりの酵素活性（Δ吸光度／ｈ／ｍｇ）を求めた。【０１２９】
（４−４）試験結果及び評価
メトキシフラボノイドのうち、３，５，７，３’，４’−ｐｅｎｔａｍｅｔｈｏｘｙｆｌａｖｏｎｅ（ＭＦ２）、３，５，７−ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｆｌａｖｏｎｅ（ＭＦ５）、３，５，７，４’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｏｘｙｆｌａｖｏｎｅ（ＭＦ６）、５−ＯＨ−３，７，３’，４’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｏｘｙｆｌａｖｏｎｅ（ＭＦ７）、５−ＯＨ−７−ｍｅｔｈｏｘｙｆｌａｖｏｎｅ（ＭＦ８）、５−ＯＨ−７，４’−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｆｌａｖｏｎｅ（ＭＦ９）、５−ＯＨ−３，７−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｆｌａｖｏｎｅ（ＭＦ１０）及び５−ＯＨ−３，７，４’−ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｆｌａｖｏｎｅ（ＭＦ１１）は、ヒトＨＭＶ−ＩＩメラノーマ細胞株において、メラニン合成の律速酵素であるチロシナーゼ活性を上昇させた（図８）。【０１３０】
これらの結果から、ＭＦ２、ＭＦ５、ＭＦ６、ＭＦ７、ＭＦ８、ＭＦ９、ＭＦ１０及びＭＦ１１は、ヒト細胞において、チロシナーゼ活性を促進して、メラニン合成を促進することから、髪や皮膚の黒化に有用であることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１３１】
本発明の一態様の組成物は、黒ショウガ由来のメトキシフラボノイドを有効成分として含有することにより、炎症性因子抑制作用に基づく抗炎症効果、エラスターゼ活性化抑制作用及びコラゲナーゼ活性化抑制作用に基づく抗シワ効果並びにチロシナーゼ活性化促進作用及びメラニン産生促進作用に基づく髪や皮膚の黒化促進効果を発揮する飲用、食用及び香粧品用の組成物として、特に皮膚老化抑制用組成物、皮膚代謝改善用組成物及び美容用組成物として利用可能なものである。
【関連出願の相互参照】
【０１３２】
本出願は、２０１９年１月２５日出願の日本特願２０１９−０１０７５６号の優先権を主張し、その全記載は、ここに開示として援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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