(57)【要約】本発明は、筋肉量減少抑制作用、筋力低下抑制作用、筋肉量増加作用又は筋力増加作用を有し、かつ、安全性が高い物質を有効成分として含む、筋肉量減少抑制用、筋力低下抑制用、筋肉量増加用又は筋力増加用の組成物、及び、筋肉量減少を抑制、筋力低下を抑制、筋肉量を増加又は筋力を増加させる方法を提供することを目的とする。本発明の筋肉量減少抑制用、筋力低下抑制用、筋肉量増加用又は筋力増加用の組成物は、ソヤサポゲノール類及び／又はソヤサポニン類の１種以上を有効成分として含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ソヤサポゲノール類及び／又はソヤサポニン類の１種以上を有効成分として含む、筋肉量減少抑制用、筋力低下抑制用、筋肉量増加用又は筋力増加用の組成物。
【請求項２】
前記ソヤサポゲノール類の１種以上を有効成分として含む請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ソヤサポゲノール類の１種以上が、ソヤサポゲノールＡ及び／又はソヤサポゲノールＢである請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ソヤサポニン類の１種以上を有効成分として含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
ソヤサポニン類の１種以上が、Ａ群ソヤサポニン類及び／又はＢ群ソヤサポニン類の１種以上である請求項１又は４に記載の組成物。
【請求項６】
「筋肉減少抑制」、「筋肉維持」、「筋肉増加」、「筋肉改善」、「筋力低下抑制」、「筋力維持」、「筋力増加」、「筋力改善」、「筋肉をつくる力をサポート」、「歩行機能の改善」、「歩行機能の維持」、「運動機能改善」、「運動機能維持」、「加齢によって衰える筋肉の維持」及び「加齢によって衰える筋力の維持」の１又は２以上の表示を付した、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
ソヤサポゲノール類及び／又はソヤサポニン類の１種以上を投与することを含む、筋肉量減少抑制、筋力低下抑制、筋肉量増加又は筋力増加の方法。
【請求項８】
筋肉量減少抑制、筋力低下抑制、筋肉量増加又は筋力増加のための、ソヤサポゲノール類及び／又はソヤサポニン類の１種以上の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、筋肉量減少抑制用、筋力低下抑制用、筋肉量増加用又は筋力増加用の組成物に関する。本発明はまた、筋肉量減少抑制、筋力低下抑制、筋肉量増加又は筋力増加の方法に関する。また、本発明は、筋肉量減少抑制、筋力低下抑制、筋肉量増加又は筋力増加のための、ソヤサポゲノール類及び／又はソヤサポニン類の１種以上の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本のような人口構成における高齢者比率が高い国では、健康寿命の延長や日常生活の質（ＱＯＬ）の向上が課題となっている。健康寿命の短縮の要因の一つとして、加齢に伴う筋肉量（筋量）の減少や筋力の低下が挙げられる。筋肉量や筋力の低下は、転倒リスク上昇、骨折等の怪我、長期臥床等を招く。怪我、病気等によって高齢者の活動量が減少すると、筋肉量や筋力が更に低下するという悪循環を招き、ロコモティブシンドローム等の原因となる。【０００３】
また、交通手段の発達等による運動不足や、手術後、病気の療養等において長期間安静が必要とされる場合等にも、筋肉量及び筋力が低下する。治癒後により早く日常生活に復帰するためには、筋肉量減少や筋力低下を抑制することが望まれる。【０００４】
筋肉量又は筋力の低下抑制又は増加の手段の一つとして、リハビリテーション等の運動療法が行われている。一方、栄養学的観点から筋肉増強作用を有する成分の研究が行われている。例えば特許文献１には、マスリン酸及びオレアノール酸を摂取すると、摂取しない場合と比較して、トレーニング機器を使用しないレジスタンストレーニング後に骨格筋量が増加し、握力が強くなったことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１７−１０９９４２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
運動療法は、時間的及び物理的な理由などから継続的な実施が難しく、高齢者等にとっては、身体的にも負担が大きい場合がある。このため安全性が高く、経口摂取等により筋肉量の減少抑制、筋力低下抑制、筋肉量増加又は筋力増加に有効な物質の開発が求められている。特許文献１に記載のマスリン酸及びオレアノール酸は、オリーブ等の植物に含まれる成分であり安全性が高いと考えられるが、より優れた筋肉量減少抑制作用、筋力低下抑制作用等を有する物質の開発が望まれている。【０００７】
本発明は、筋肉量減少抑制作用、筋力低下抑制作用、筋肉量増加作用又は筋力増加作用を有し、かつ、安全性が高い物質を有効成分として含む、筋肉量減少抑制用、筋力低下抑制用、筋肉量増加用又は筋力増加用の組成物を提供することを目的とする。また、本発明は、筋肉量減少を抑制、筋力低下を抑制、筋肉量を増加又は筋力を増加させる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意研究した結果、ソヤサポゲノール類及びその配糖体であるソヤサポニン類が、優れた筋肉量減少抑制作用、筋力低下抑制作用、筋肉量増加作用又は筋力増加作用を有することを見出し、この知見に基づき、本発明を完成するに至った。【０００９】
すなわち、これに限定されるものではないが、本発明は以下の筋肉量減少抑制用、筋力低下抑制用、筋肉量増加用又は筋力増加用の組成物、方法及び使用に関する。
〔１〕ソヤサポゲノール類及び／又はソヤサポニン類の１種以上を有効成分として含む、筋肉量減少抑制用、筋力低下抑制用、筋肉量増加用又は筋力増加用の組成物。
〔２〕上記ソヤサポゲノール類の１種以上を有効成分として含む上記〔１〕に記載の組成物。
〔３〕ソヤサポゲノール類の１種以上が、ソヤサポゲノールＡ及び／又はソヤサポゲノールＢである上記〔１〕又は〔２〕に記載の組成物。
〔４〕上記ソヤサポニン類の１種以上を有効成分として含む、上記〔１〕に記載の組成物。
〔５〕ソヤサポニン類の１種以上が、Ａ群ソヤサポニン類及び／又はＢ群ソヤサポニン類の１種以上である上記〔１〕又は〔４〕に記載の組成物。
〔６〕「筋肉減少抑制」、「筋肉維持」、「筋肉増加」、「筋肉改善」、「筋力低下抑制」、「筋力維持」、「筋力増加」、「筋力改善」、「筋肉をつくる力をサポート」、「歩行機能の改善」、「歩行機能の維持」、「運動機能改善」、「運動機能維持」、「加齢によって衰える筋肉の維持」及び「加齢によって衰える筋力の維持」の１又は２以上の表示を付した、上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の組成物。【００１０】
〔７〕ソヤサポゲノール類及び／又はソヤサポニン類の１種以上を投与することを含む、筋肉量減少抑制、筋力低下抑制、筋肉量増加又は筋力増加の方法。
〔８〕筋肉量減少抑制、筋力低下抑制、筋肉量増加又は筋力増加のための、ソヤサポゲノール類及び／又はソヤサポニン類の１種以上の使用。
〔９〕ソヤサポゲノール類の１種以上を投与する上記〔７〕に記載の方法。
〔１０〕ソヤサポゲノール類の１種以上が、ソヤサポゲノールＡ及び／又はソヤサポゲノールＢである上記〔７〕又は〔９〕に記載の方法。
〔１１〕ソヤサポニン類の１種以上を投与する上記〔７〕に記載の方法。
〔１２〕ソヤサポニン類の１種以上が、Ａ群ソヤサポニン類及び／又はＢ群ソヤサポニン類の１種以上である上記〔７〕又は〔１１〕に記載の方法。
〔１３〕ソヤサポゲノール類の１種以上の使用である上記〔８〕に記載の使用。
〔１４〕ソヤサポゲノール類の１種以上が、ソヤサポゲノールＡ及び／又はソヤサポゲノールＢである上記〔８〕又は〔１３〕に記載の使用。
〔１５〕ソヤサポニン類の１種以上の使用である上記〔８〕に記載の使用。
〔１６〕ソヤサポニン類の１種以上が、Ａ群ソヤサポニン類及び／又はＢ群ソヤサポニン類の１種以上である上記〔８〕又は〔１５〕に記載の使用。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、筋肉量減少抑制作用、筋力低下抑制作用、筋肉量増加作用又は筋力増加作用を有し、かつ、安全性が高い物質を有効成分として含む、筋肉量減少抑制用、筋力低下抑制用、筋肉量増加用又は筋力増加用の組成物が提供される。また本発明によれば、筋肉量減少を抑制、筋力低下を抑制、筋肉量を増加又は筋力を増加させる方法が提供される。本発明によれば、例えば、加齢等の要因による筋肉量の減少又は筋力低下を抑制して、又は、筋肉量又は筋力を増加させて、筋肉量又は筋力を維持することが可能となる。このため本発明は、高齢者等のＱＯＬの改善に資する新たな手段を提供することができる。本発明で筋肉量減少抑制、筋力低下抑制、筋肉量増加又は筋力増加のために使用されるソヤサポゲノール類及びソヤサポニン類は、食用植物であるダイズ等にも含まれる成分であり、安全性が高く継続的に摂取できる点でも有利である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウスについて加齢による筋力の変化を調べた結果を示すグラフである。
【図２】図２は、コントロール群、ソヤサポニン群及びソヤサポゲノール群の各群の握力変化率（試験終了時の握力／試験開始時の握力）を示すグラフである。
【図３】図３は、コントロール群、ソヤサポニン群及びソヤサポゲノール群の各群の体重当たりの両後肢筋重量の割合（両後肢筋重量／体重）を示すグラフである。
【図４】図４は、ソヤサポゲノール粗画分を投与したマウスの腓腹筋におけるタンパク質合成量を示すグラフである。
【図５】図５は、ソヤサポゲノール粗画分を投与したマウスの腓腹筋におけるリン酸化型ｐ７０Ｓ６Ｋ（Ｔ３８９）の量を示すグラフである。
【図６】図６は、ソヤサポゲノールＡ、ソヤサポゲノールＢ、マスリン酸又はオレアノール酸を投与したマウスの腓腹筋におけるタンパク質合成量を示すグラフである。
【図７】図７は、正常ヒト骨格筋筋芽細胞を用いて、ソヤサポゲノール粗画分による筋管細胞分化促進効果を調べた結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の筋肉量減少抑制用、筋力低下抑制用、筋肉量増加用又は筋力増加用の組成物は、ソヤサポゲノール類及び／又はソヤサポニン類の１種以上を有効成分として含む。
本発明の組成物は、筋肉量減少抑制用組成物、筋力低下抑制用組成物、筋肉量増加用組成物又は筋力増加用組成物と表すこともできる。筋肉量又は筋力の増加は、筋肉増強ということもできる。本発明の筋肉量減少抑制用、筋力低下抑制用、筋肉量増加用又は筋力増加用の組成物を、以下では単に本発明の組成物ともいう。
【００１４】
ソヤサポゲノール類（ソヤサポゲノール化合物ともいうことができる）及びソヤサポニン類（ソヤサポニン化合物ということもできる）は、ダイズ（学名：Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）等のマメ科植物等に含まれる化合物である。本発明の組成物には、ソヤサポゲノール類及び／又はソヤサポニン類の１種以上として、化合物１種のみを用いてもよく、２種以上の化合物を用いてもよい。
【００１５】
本発明におけるソヤサポゲノール類の化合物として、ソヤサポゲノールＡ、ソヤサポゲノールＢ等が挙げられる。本発明におけるソヤサポゲノール類は、これらの化合物の１種以上を含む。一態様において、本発明の組成物はソヤサポゲノール類の１種以上を有効成分として含むものであることが好ましい。筋肉量減少抑制作用、筋力低下抑制作用、筋肉量増加作用又は筋力増加作用の観点から、ソヤサポゲノール類の１種以上として、ソヤサポゲノールＡ及び／又はソヤサポゲノールＢが好ましい。
【００１６】
ソヤサポニン類は、上記のソヤサポゲノール類をアグリコンとする配糖体である。ソヤサポニン類の化合物として、Ａ群ソヤサポニン類、Ｂ群ソヤサポニン類等が挙げられる。Ａ群ソヤサポニン類は、ソヤサポゲノールＡをアグリコンとする配糖体である。Ｂ群ソヤサポニン類は、ソヤサポゲノールＢをアグリコンとする配糖体である。ソヤサポゲノール類は、化合物１種以上を含む。本発明の組成物はソヤサポニン類の１種以上を有効成分として含むものであってよい。筋肉量減少抑制作用、筋力低下抑制作用、筋肉量増加作用又は筋力増加作用の観点から、ソヤサポニン類の１種以上として、Ａ群ソヤサポニン類及び／又はＢ群ソヤサポニン類の１種以上が好ましい。
【００１７】
Ａ群ソヤサポニン類の例として、ソヤサポニンＡａ（ソヤサポニンＡ４）、ソヤサポニンＡｂ（ソヤサポニンＡ１）、ソヤサポニンＡｃ、ソヤサポニンＡｄ、ソヤサポニンＡｅ（ソヤサポニンＡ５）、ソヤサポニンＡｆ（ソヤサポニンＡ２）、ソヤサポニンＡｇ（ソヤサポニンＡ６）、ソヤサポニンＡｈ（ソヤサポニンＡ３）が挙げられる。中でも、ソヤサポニンＡａ、ソヤサポニンＡｂが好ましい。
【００１８】
Ｂ群ソヤサポニン類の例として、ソヤサポニンＢａ（ソヤサポニンＶ）、ソヤサポニンＢｂ（ソヤサポニンＩ）、ソヤサポニンＢｃ（ソヤサポニンＩＩ）、ソヤサポニンＢｂ’（ソヤサポニンＩＩＩ）、ソヤサポニンＢｃ’（ソヤサポニンＩＶ）が挙げられる。中でも、ソヤサポニンＢａ、ソヤサポニンＢｂが好ましい。
【００１９】
一態様において、ソヤサポゲノール類及び／又はソヤサポニン類として、ソヤサポゲノール類が好ましく、ソヤサポゲノールＡ及び／又はソヤサポゲノールＢがより好ましい。
【００２０】
ソヤサポゲノール類及び／又はソヤサポニン類を得るための由来、製法については特に制限はない。ソヤサポゲノール類及び／又はソヤサポニン類を多く含む植物又はその部位として、ダイズ（特にダイズ種子（大豆））、小豆、葛根などが知られている。これらの植物から、公知の方法でソヤサポゲノール類及び／又はソヤサポニン類を抽出及び精製して調製することができる。ソヤサポゲノール類は、ソヤサポニン類を公知の方法で加水分解することによって得ることもできる。ソヤサポゲノール類及びソヤサポニン類は、市販品を使用することもできる。
【００２１】
本発明においては、本発明の効果を奏することになる限り、ソヤサポゲノール類及び／又はソヤサポニン類の１種以上を豊富に含む植物由来原料を本発明の組成物に含有させてもよい。ソヤサポゲノール類及び／又はソヤサポニン類の１種以上を豊富に含む植物由来原料としては、例えば、ダイズ種子を生のまま又は凍結乾燥などによって乾燥させたもの、ダイズ種子を熱水又は有機溶剤により抽出した液（抽出液）を濃縮又は凍結乾燥したもの、又は、抽出液の乾燥物をカラム等で精製し、ソヤサポゲノール類及び／又はソヤサポニン類を高純度化したもの等を使用することができる。このようなソヤサポゲノール類及び／又はソヤサポニン類の１種以上を含む植物由来原料は、市販のものを使用してもよく、ダイズ等の植物から公知の方法で調製してもよい。
【００２２】
実施例に示されるように、ソヤサポゲノール類又はソヤサポニン類を老齢マウスに摂取させると、当該マウスの握力が増加した。また、ソヤサポゲノール類又はソヤサポニン類の摂取により、老齢マウスの体重あたりの筋肉重量の割合が増加した。また、絶食によってタンパク質合成量が減少するところ、ソヤサポゲノール類を摂取させたマウスでは、絶食群と比較して有意に筋タンパク質合成量が増加した。ソヤサポゲノール類を摂取させたマウスでは、ｐ７０Ｓ６キナーゼ（ｐ７０Ｓ６Ｋ）のリン酸化も促進された。ｐ７０Ｓ６Ｋは、筋タンパク質合成を制御する主要因子であり、リン酸化されると筋タンパク質合成が促進される。従ってｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化の促進は、筋タンパク質の合成を促進し、筋肉量の減少抑制又は増加をもたらす。筋タンパク質の合成促進による筋肉量の減少抑制又は増加により、筋力の低下抑制又は増加効果が得られる。
また、ソヤサポゲノール類の１種以上を摂取させたマウスでは、オレアノール酸及びマスリン酸を摂取させたマウスよりも筋タンパク質合成量が多かった。このことは、ソヤサポゲノール類がオレアノール酸及びマスリン酸よりも優れた筋肉量減少抑制作用、筋力低下抑制作用、筋肉量増加作用又は筋力増加作用を示すことを意味する。さらに、実施例に示されるように、ソヤサポゲノール類を含む画分は、筋芽細胞から筋管細胞へ分化を促進した。筋肉は、筋芽細胞が筋管細胞へ分化し、さらに筋管細胞が融合した筋線維から形成されている。筋芽細胞から筋管細胞への分化が促進されることは、筋肉量の減少抑制又は増加をもたらし、筋力の低下抑制又は増加をもたらす。なおソヤサポニン類についても、摂取されたソヤサポニン類は、体内で、消化酵素又は代謝酵素の働きによりソヤサポゲノール類となり、体内でソヤサポゲノール類と同様の効果を発揮すると考えられる。
従ってソヤサポゲノール類及び／又はソヤサポニン類は、筋肉量減少抑制作用、筋力低下抑制作用、筋肉量増加作用又は筋力増加作用を有し、筋肉量減少を抑制するため、筋力低下を抑制するため、筋肉量を増加させるため又は筋力を増加させるために使用され得る。またソヤサポゲノール類及び／又はソヤサポニン類は、ｐ７０Ｓ６キナーゼのリン酸化促進のため、筋芽細胞から筋管細胞への分化促進のためにも使用され得る。
【００２３】
本発明の組成物は、ソヤサポゲノール類及び／又はソヤサポニン類の１種以上を有効成分として含むことにより、優れた筋肉量減少抑制効果、筋力低下抑制効果、筋肉量増加効果又は筋力増加効果を奏する。また、このような効果により、例えば、筋肉量減少の予防、筋肉量の維持、筋力低下の予防、筋力維持、筋肉量が減少した状態又は筋力が低下した状態の改善等が可能となる。従って本発明の組成物は、筋肉量の減少予防のため、筋力低下予防のため、筋肉量が減少した状態の改善のため、筋力が低下した状態の改善のため、筋肉量維持のため、筋力維持のため等に使用され得る。一態様において、本発明の組成物は、筋肉量の減少抑制又は筋力低下抑制のために好適に使用され、例えば、加齢による筋委縮等による筋肉量減少の抑制、筋力低下抑制等のために好適に使用され得る。筋肉としては、骨格筋が好ましく、脚等の筋肉が挙げられる。筋肉量の増加は、体重あたりの筋肉重量の増加であり得る。
ヒト等の動物の筋肉量は、例えば、マイクロＰＥＴ／ＣＴ（陽電子（ポジトロン）放射断層撮影／コンピュータ断層撮影、ＩＮＶＥＯＮ、シーメンス、米国）により測定することができる。
【００２４】
本発明の組成物は、筋肉量減少抑制、筋力低下抑制、筋肉量増加又は筋力増加により予防又は改善が期待できる状態又は疾患の処置のために用いることができる。このような状態又は疾患として、例えば、ロコモティブシンドローム、カヘキシア（がんや慢性疾患などの消耗性疾患が原因となり、食欲不振と代謝調節機構の障害による重度の骨格筋の萎縮と臓器の機能不全の病態を示す状態）等の筋肉量が減少した又は筋力が低下した状態又は疾患が挙げられる。
本明細書で状態又は疾患の予防は、状態又は疾患の発症を防止すること、状態又は疾患の発症を遅延させること、状態又は疾患の発症率を低下させること、状態又は疾患の発症のリスクを軽減することを包含する。状態又は疾患の改善は、対象を状態又は疾患から回復させること、状態又は疾患の症状を軽減すること、状態又は疾患の進行を遅延させること又は防止することを包含する。
【００２５】
本発明の組成物は、治療用途（医療用途）又は非治療用途（非医療用途）のいずれにも適用することができる。
本発明の組成物は、例えば、飲食品、医薬品、医薬部外品、飼料等の形態で提供することができるが、これらに限定されるものではない。本発明の組成物は、それ自体が飲食品、医薬品、医薬部外品、飼料等であってもよく、これらに使用される添加剤等の製剤、素材であってもよい。本発明の組成物は、一例として、剤の形態で提供することができるが、本形態に限定されるものではない。当該剤をそのまま組成物として、又は、当該剤を含む組成物として提供することもできる。本発明の組成物は、筋肉量減少抑制、筋力低下抑制、筋肉量増加又は筋力増加のための剤ということもできる。
一態様において、本発明の組成物は、好ましくは経口用組成物である。本発明によれば、優れた筋肉量減少抑制、筋力低下抑制、筋肉量増加又は筋力増加作用を有する経口用組成物を提供することができる。経口用組成物として、飲食品、医薬品、医薬部外品が挙げられ、好ましくは飲食品である。
【００２６】
本発明の組成物は、本発明の効果を損なわない限り、上述したソヤサポゲノール類及び／又はソヤサポニン類以外に、任意の添加剤、任意の成分を含有することができる。これらの添加剤及び成分は、組成物の形態等に応じて選択することができ、一般的に飲食品、医薬品、医薬部外品、飼料等に使用可能なものが使用できる。
【００２７】
本発明の組成物を飲食品とする場合、ソヤサポゲノール類及び／又はソヤサポニン類の１種以上に、飲食品に使用可能な成分（例えば、飲食品素材、必要に応じて使用される添加剤等）を配合して、種々の飲食品とすることができる。飲食品は特に限定されず、例えば、一般的な飲食品、健康食品、食品添加剤、これらの原料等が挙げられる。飲食品の形態も特に限定されず、固形状、半流動状、流動状などを挙げることができる。飲食品は、錠剤、被覆錠剤、細粒剤、顆粒剤、散剤、丸薬、カプセル剤、ドライシロップ剤、チュアブル剤等の経口用固形製剤；内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤の各種製剤形態とすることもできる。
【００２８】
本発明の組成物を医薬品又は医薬部外品とする場合、ソヤサポゲノール類及び／又はソヤサポニン類の１種以上に、薬理学的に許容される賦形剤等を配合して、各種剤形の医薬品とすることができる。本発明の効果をより充分に得る観点から、医薬品又は医薬部外品の投与形態は、経口投与が好ましい。剤形は、投与形態に適した剤形とすればよい。経口用医薬品の剤形として、例えば、錠剤、被覆錠剤、細粒剤、顆粒剤、散剤、丸薬、カプセル剤、ドライシロップ剤、チュアブル剤等の経口用固形製剤；内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤が挙げられる。医薬品は、非ヒト動物用医薬であってもよい。
【００２９】
本発明の組成物を飼料とする場合、ソヤサポゲノール類及び／又はソヤサポニン類の１種以上に、飼料に使用可能な成分を配合して飼料とすることができる。飼料としては、例えば、ウシ、ブタ、ニワトリ、ヒツジ、ウマ等に用いる家畜用飼料；ウサギ、モルモット、ラット、マウス等に用いる小動物用飼料；イヌ、ネコ、小鳥等に用いるペットフードなどが挙げられる。
【００３０】
本発明の組成物を、飲食品、医薬品、医薬部外品、飼料等とする場合、その製造方法は特に限定されず、有効成分として使用されるソヤサポゲノール類及び／又はソヤサポニン類の１種以上を用いて、一般的な方法により製造することができる。
本発明の組成物の製造においては、ソヤサポゲノール類及び／又はソヤサポニン類として、精製された化合物を使用してもよく、上述したソヤサポゲノール類及び／又はソヤサポニン類の１種以上を豊富に含む植物由来原料を使用してもよい。ソヤサポゲノール類及び／又はソヤサポニン類は、当該化合物を含む植物由来原料の形態で組成物に含有させてもよい。
【００３１】
本発明の組成物には、包装、容器又は説明書等に用途、有効成分の種類、上述した効果、使用方法（例えば、摂取方法、投与方法）等の１又は２以上を表示してもよい。本発明の組成物には、筋肉量減少抑制作用、筋力低下抑制作用、筋肉量増加作用若しくは筋力増加作用、又は、これらの作用に基づく作用を有する旨の表示が付されていてもよい。本発明の組成物には、例えば、「筋肉減少抑制」、「筋肉維持」、「筋肉増加」、「筋肉改善」、「筋力低下抑制」、「筋力維持」、「筋力増加」、「筋力改善」、「筋肉をつくる力をサポート」、「歩行機能の改善」、「歩行機能の維持」、「運動機能改善」、「運動機能維持」、「加齢によって衰える筋肉の維持」及び「加齢によって衰える筋力の維持」等の１又は２以上の表示が付されていてもよい。
【００３２】
本発明の組成物中のソヤサポゲノール類及び／又はソヤサポニン類の含有量は、該組成物の形態等に応じて適宜設定することができる。例えば、ソヤサポゲノール類及びソヤサポニン類の総含有量は、組成物中に０．０１〜９０重量％であってよい。一態様において、本発明の組成物を、飲食品、医薬品、医薬部外品等の経口用組成物とする場合、ソヤサポゲノール類及びソヤサポニン類の総含有量は、組成物中に０．０１重量％以上が好ましく、０．２重量％以上がより好ましく、また、２０重量％以下が好ましく、１０重量％以下がより好ましい。一態様において、ソヤサポゲノール類及びソヤサポニン類の総含有量は、本発明の組成物中に０．０１〜２０重量％が好ましく、０．２〜１０重量％がより好ましい。上記総含有量は、ソヤサポゲノール類及び／又はソヤサポニン類の化合物が２種以上含まれる場合、それらの合計量である。ソヤサポゲノール類及び／又はソヤサポニン類の含有量は、公知の方法に従って測定することができ、例えば、ＨＰＬＣ法等を用いることができる。
【００３３】
本発明の組成物は、その形態に応じた適当な方法で摂取又は投与することができる。本発明の組成物は、好ましくは、経口投与又は経口摂取される。
本発明の組成物の摂取量（投与量ということもできる）は特に限定されず、筋肉量減少抑制効果、筋力低下抑制効果、筋肉量増加効果又は筋力増加効果が得られるような量（有効量）であればよく、投与形態、投与方法等に応じて適宜設定すればよい。例えば、ヒト（成人）を対象に経口で投与する又は摂取させる場合、ソヤサポゲノール類及びソヤサポニン類の総摂取量は、１日あたり、５ｍｇ以上が好ましく、１０ｍｇ以上がより好ましく、２０ｍｇ以上がさらに好ましく、また、５００ｍｇ以下が好ましく、２００ｍｇ以下がより好ましく、１００ｍｇ以下がさらに好ましい。一態様として、ヒト（成人）を対象に経口で投与する又は摂取させる場合、本発明の組成物の摂取量は、ソヤサポゲノール類及びソヤサポニン類の総摂取量として、１日あたり、５〜５００ｍｇが好ましく、１０〜２００ｍｇがより好ましく、２０〜１００ｍｇがさらに好ましい。上記量を、例えば１日１回で又は２〜３回に分けて経口投与又は摂取させることが好ましい。ヒト（成人）を対象に筋肉量減少抑制効果、筋力低下抑制効果、筋肉量増加効果又は筋力増加効果を得ることを目的として本発明の組成物を摂取させる場合は、ソヤサポゲノール類及びソヤサポニン類の総摂取量が上記範囲となるように、本発明の組成物を対象に経口で摂取させる又は投与することが好ましい。
【００３４】
一態様において、本発明の組成物は、その投与形態、投与方法等を考慮して、本発明の所望の効果が得られるような量、すなわち有効量の上記ソヤサポゲノール類及び／又はソヤサポニン類の１種以上を含有することが好ましい。一態様として例えば、本発明の組成物が飲食品、経口用医薬品等の経口用組成物である場合、該組成物の成人１人１日当たりの摂取量中に、ソヤサポゲノール類及びソヤサポニン類の総含有量が、５〜５００ｍｇが好ましく、１０〜２００ｍｇがより好ましく、２０〜１００ｍｇがさらに好ましい。
【００３５】
ソヤサポゲノール類及び／又はソヤサポニン類は、継続的に摂取（投与）されることによって、筋肉量減少抑制、筋力低下抑制、筋肉量増加又は筋力増加効果が高まることが期待される。好ましい態様において、本発明の組成物は、継続して摂取されるものである。本発明の一実施態様において、本発明の組成物は、好ましくは１週間以上、より好ましくは４週間以上、さらに好ましくは８週間以上継続して摂取されることが好ましい。
【００３６】
本発明の組成物を投与又は摂取させる対象（以下、単に投与対象ともいう）は、哺乳動物（ヒト及び非ヒト哺乳動物）が好ましく、ヒトがより好ましい。また、本発明における投与対象として、筋肉量減少抑制、筋力低下抑制、筋肉量増加又は筋力増加を必要とする又は希望する対象が好ましい。例えば、筋肉量が減少した対象、筋力が低下した対象、上述した筋肉量が減少した又は筋力が低下した状態又は疾患の予防又は改善を希望する対象等が好適な対象として挙げられる。一態様において、本発明の組成物の投与対象は、高齢者が好ましい。ソヤサポゲノール類及び／又はソヤサポニン類は、例えば、高齢者における筋肉量減少（加齢による筋肉量減少）の抑制、筋力低下（加齢による筋力低下）の抑制のために好適に使用される。一態様において、本発明の組成物は、筋肉量減少抑制、筋力低下抑制、筋肉量増加又は筋力増加により改善が期待できる状態又は疾患の予防を目的として、健常な状態にある対象に対して用いることができる。
【００３７】
本発明は、以下の筋肉量減少抑制、筋力低下抑制、筋肉量増加又は筋力増加方法も包含する。
ソヤサポゲノール類及び／又はソヤサポニン類の１種以上を投与することを含む、筋肉量減少抑制、筋力低下抑制、筋肉量増加又は筋力増加の方法。
上記方法は、治療的な方法であってもよく、非治療的な方法であってもよい。「非治療的」とは、医療行為、すなわち手術、治療又は診断を含まない概念である。
ソヤサポゲノール類及び／又はソヤサポニン類の投与量は、筋肉量減少抑制効果、筋力低下抑制効果、筋肉量増加効果又は筋力増加効果が得られる量、すなわち有効量であればよく、特に限定されず、例えば上述した量を投与することが好ましい。ソヤサポゲノール類及び／又はソヤサポニン類は、そのまま投与してもよいし、ソヤサポゲノール類及び／又はソヤサポニン類の１種以上を含有する組成物として投与してもよい。例えば、上述した本発明の組成物を投与することができる。ソヤサポゲノール類及び／又はソヤサポニン類、投与対象、投与方法、投与量及びそれらの好ましい態様等は、上述した本発明の組成物におけるものと同じである。本発明によれば、副作用を生じず安全に、優れた筋肉量減少抑制、筋力低下抑制、筋肉量増加又は筋力増加効果を得ることができる。
【００３８】
本発明は、筋肉量減少抑制、筋力低下抑制、筋肉量増加又は筋力増加のための、ソヤサポゲノール類及び／又はソヤサポニン類の１種以上の使用、も包含する。
上記の使用は、通常、ヒト又は非ヒト動物における使用であり、好ましくはヒト又は非ヒト哺乳動物、さらに好ましくはヒトにおける使用である。使用は、治療的使用であってもよく、非治療的使用であってもよい。ソヤサポゲノール類及び／又はソヤサポニン類等の好ましい態様等は、上述した本発明の組成物と同じである。
【００３９】
本発明の方法及び使用において、ソヤサポゲノール類及び／又はソヤサポニン類の１種以上として、１種の化合物を用いてもよく、２種以上の化合物を用いてもよい。上記の方法及び使用においては、ソヤサポゲノール類及び／又はソヤサポニン類の１種以上を継続して投与することが好ましい。一態様において、ソヤサポゲノール類及び／又はソヤサポニン類の１種以上を、好ましくは１週間以上、より好ましくは４週間以上、さらに好ましくは８週間以上継続して投与することが好ましい。
【００４０】
本発明は一態様において、筋肉量減少抑制用、筋力低下抑制用、筋肉量増加用又は筋力増加用の組成物を製造するための、ソヤサポゲノール類及び／又はソヤサポニン類の１種以上の使用も包含する。ソヤサポゲノール類及び／又はソヤサポニン類や筋肉量減少抑制用、筋力低下抑制用、筋肉量増加用又は筋力増加用の組成物及びその好ましい態様等は、上記の本発明の組成物及びその好ましい態様と同じである。
【実施例】
【００４１】
以下、本発明を実施例によりさらに詳しく説明するが、これにより本発明の範囲を限定するものではない。【００４２】
なお、実施例及び比較例を含めた動物実験は全て、動物愛護管理法他関連法令を遵守し、社内動物実験委員会の審査を経て機関の長が承認した計画に基づき実施した。【００４３】
＜調製例１＞
ソヤサポニンの入手方法及びソヤサポゲノール粗画分の調製法
以下の試験では、ソヤサポニンとして、市販の大豆由来サポニン（株式会社Ｊ−オイルミルズ製のサポニンＢ−５０（Ｂ群大豆サポニン含量が６０重量％、Ａ群大豆サポニン含量が１３重量％））を用いて評価した。サポニンＢ−５０中のＢ群大豆サポニンには、ソヤサポニンＢａ、ソヤサポニンＢｂ等が含まれ、Ａ群大豆サポニンにはソヤサポニンＡａ、ソヤサポニンＡｂ等が含まれる。
大豆由来サポゲノールを含む画分は、次の方法で調製した。サポニンＢ−５０を２０倍量、２規定の塩酸水溶液にて１００℃で２時間反応させ、サポニンの糖鎖を切断した。反応終了後、反応液を室温まで冷却し、水酸化ナトリウム水溶液にて中和した。その反応液を吸引濾過し、残渣について大量の蒸留水で洗浄、吸引濾過を繰り返し、水酸化ナトリウムの残存がないことを確認し、乾燥し、ソヤサポゲノール粗画分（純度５０％：ソヤサポゲノールＡ及びＢの合計）を得た。【００４４】
＜試験例１＞
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウスの加齢による筋力の低下
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウス（日本チャールスリバー株式会社）の筋力の加齢変化を確認するために、指標となる四肢握力合計値の推移を検証した。７ヶ月齢（２３匹）、２０ヶ月齢（２２匹）、２２ヶ月齢（７匹）及び２４ヶ月齢（７匹）時点の四肢握力合計値を、握力測定機器（ＭＫ−３８０Ｓ、室町機械株式会社）を用いて測定し、握力とした。有意差検定にはＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を用いた。７ヶ月齢（７Ｍ）、２０ヶ月齢（２０Ｍ）、２２ヶ月齢（２２Ｍ）及び２４ヶ月齢（２４Ｍ）の各群の握力測定結果を図１に示す（＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１、７ヶ月齢との比較）。結果は、各群の平均値±標準誤差で示した。統計解析の結果、２０ヶ月齢、２２ヶ月齢、２４ヶ月齢のマウスの握力は、７ヶ月齢のマウスの握力と比較して、有意に低下していることがわかる。この結果により、上記系統のマウスでは、加齢に伴う筋力の低下を観察することができることが確認された。【００４５】
＜実施例１＞
ソヤサポニン及びソヤサポゲノール粗画分の筋重量の減少抑制又は増加作用及び筋力の低下抑制又は増加作用
ソヤサポニン及びソヤサポゲノール粗画分が、加齢に伴う筋力低下に対し、筋力の低下抑制又は増加効果を示すか否かをマウスの四肢の握力を測定することで評価した。同時にマウス後肢の筋重量への減少抑制又は増加効果があるか否かに関しても検討した。ソヤサポゲノール粗画分は、調製例１で調製したものを用いた。【００４６】
（試験方法）
７０週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウス（日本チャールスリバー株式会社）を８週間予備飼育した。予備飼育後のマウス（老齢マウス）を、コントロール（ｃｏｎｔｒｏｌ）群、ソヤサポニン群及びソヤサポゲノール群の３群に分けた。各群５〜８匹で評価した。
コントロール群にはＣＥ−２飼料（日本クレア株式会社）を８週間（試験期間）自由摂食させた。ソヤサポニン群にはサポニンＢ−５０（株式会社Ｊ−オイルミルズ製）が０．５重量％になるように配合したＣＥ−２飼料を、またソヤサポゲノール群にはソヤサポゲノール粗画分を０．５重量％配合したＣＥ−２飼料を８週間自由摂食させた。
試験期間終了後、マウスの体重、後肢の筋重量及び握力を測定した。握力はマウス四肢の握力合計値を、握力測定機器（ＭＫ−３８０Ｓ、室町機械株式会社）を用いて測定した。後肢の筋重量は試験終了時に、腓腹筋、ヒラメ筋、足底筋、前脛骨筋、長趾伸筋及び大腿四頭筋を採取し、重量を測定した。筋重量の評価指標として、体重当たりの両後肢筋重量（腓腹筋、ヒラメ筋、足底筋、前脛骨筋、長趾伸筋及び大腿四頭筋の合計重量）の割合を求めた。有意差検定にはＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を用いた。有意水準Ｐ＜０．０５を有意差ありとした。【００４７】
（結果）
１−１  握力測定結果
各群について、試験終了時の握力を試験開始時の握力で除した握力変化率（試験終了時の握力／試験開始時の握力）を求めた。コントロール群、ソヤサポニン群及びソヤサポゲノール群の各群の握力変化率を図２に示す（＊＊：Ｐ＜０．０１、コントロール群との比較）。図２に示す結果は、各群の平均値±標準誤差で示した。統計解析の結果、コントロール群と比較して、ソヤサポニン群で有意に握力の増加が確認され、ソヤサポゲノール群でも握力の増加が確認された。【００４８】
１−２  筋重量測定結果
各群について、試験終了時の両後肢筋重量を体重で除した、体重当たりの両後肢筋重量の割合（両後肢筋重量／体重）を求めた。コントロール群、ソヤサポニン群及びソヤサポゲノール群の各群の体重当たりの両後肢筋重量の割合を図３に示す。図３に示す結果は、各群の平均値±標準誤差で示した。統計解析の結果、コントロール群と比較して、ソヤサポニン群及びソヤサポゲノール群で、体重当たりの両後肢筋重量の割合の増加が確認された。【００４９】
以上より、ソヤサポニン類及びソヤサポゲノール類に、加齢に伴う筋力低下を抑制又は筋力を増加させて筋力を維持する効果があることが確認された。また、ソヤサポニン類及びソヤサポゲノール類に体重当たりの後肢筋重量の割合を増加させる効果が確認された。【００５０】
＜実施例２＞
筋タンパク質合成量及び筋合成シグナルの評価（ソヤサポゲノール粗画分）
（試験方法）
（試薬）
ポンソーＳ溶液はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入した。カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ−Ｎａ）、Ｅｘｔｒａ  ＰＡＧＥ  Ｏｎｅ  Ｐｒｅｃａｓｔ  Ｇｅｌ、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｏｎｅはナカライテスク株式会社から購入した。Ｔｉｓｓｕｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ  ｋｉｔ、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔは、サーモフィッシャーサイエンティフィック社から購入した。ピューロマイシンはＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社から、Ａｎｔｉ−ｐｕｒｏｍｙｃｉｎは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社から購入した。Ａｎｔｉ−β−ａｃｔｉｎ、Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ，  ＨＲＰ−ｌｉｎｋｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ，  ＨＲＰ−ｌｉｎｋｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ７０  Ｓ６  Ｋｉｎａｓｅ（Ｔｈｒ３８９）  Ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔは、Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ社から購入した。ＰＶＤＦメンブレンは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から、ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓは、Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ社から購入した。ソヤサポゲノール粗画分は、調製例１で調製したものを用いた。【００５１】
（動物）
雄性７週齢Ｃ５７ＢＬ６Ｊマウスを日本クレア株式会社から購入し、１週間の馴化期間の後、実験に供した。動物は、空調設備のある飼育室（温度２３．５±１．０℃、湿度５５±１０％、換気回数１２〜１５回／時間、照明７：００−１９：００／日）で飼育した。馴化期間中は、市販飼料（ＣＥ−２、日本クレア株式会社）及び水道水を自由に摂取させた。【００５２】
馴化期間終了後、３０匹のマウスを、以下の３群に分けた。
飽食群（Ｃｏｎｔ．）ｎ＝６
絶食群（Ｆａｓｔ．）ｎ＝１２
絶食＋ソヤサポゲノール粗画分群（Ｆａｓｔ．＋ＳＳ）ｎ＝１２
飽食群を除いた２群に対して、２４時間の絶食を行った。絶食終了後に、絶食直後、絶食から７時間後、絶食から２２時間後の３回に分けて、飽食群及び絶食群には０．５％ＣＭＣ−Ｎａ水溶液を、絶食＋ソヤサポゲノール粗画分群には、０．５％ＣＭＣ−Ｎａ水溶液に懸濁した２６ｍｇ／ｋｇ（１回あたり、体重１ｋｇあたり２６ｍｇ）のソヤサポゲノール粗画分をそれぞれ経口投与した（ソヤサポゲノール粗画分の投与量は、１日あたり、体重１ｋｇあたり７８ｍｇ）。絶食から２３時間後に全群に対して、１．２５ｍＭのピューロマイシン水溶液を２００μＬ／ｈｅａｄで腹腔内投与した。ピューロマイシン投与時に腹腔内から溶液が漏れた個体、麻酔下での開腹時に腹腔内出血が確認された個体は、ピューロマイシンの組織中への取り込みに影響があると考え、この段階で解析対象から除外した。絶食から２４時間後の試験終了後、腓腹筋を採取し、−８０℃で凍結保存した。【００５３】
採取した腓腹筋について、下記方法でタンパク質合成量を測定した。また、腓腹筋中のｐ７０Ｓ６キナーゼ（ｐ７０Ｓ６Ｋ）について、３８９番目のスレオニン（Ｔ３８９）がリン酸化されたｐ７０Ｓ６Ｋ（リン酸化型ｐ７０Ｓ６Ｋ（Ｔ３８９））の量を測定した。【００５４】
（腓腹筋中のタンパク質合成量の測定）
腓腹筋中のタンパク質合成量の測定はｓｕｒｆａｃｅ  ｓｅｎｓｉｎｇ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（ＳＵｎＳＥＴ）法を用いて実施した（Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ２００９  Ａｐｒ；６（４）：２７５−７）。マウスの腓腹筋を氷冷したＰｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ、ＥＤＴＡを含むＴｉｓｓｕｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔでホモジナイズした後、１０，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃で遠心し、上清を回収した。上清について、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔを用いてタンパク質濃度定量を実施し、ウエスタンブロット用にＳＤＳ化を行った。得られた試料をタンパク質濃度１０μｇ／１０μＬに調製後、Ｅｘｔｒａ  ＰＡＧＥ  Ｏｎｅ  Ｐｒｅｃａｓｔ  Ｇｅｌに１０μＬをアプライし、電気泳動装置（Ａｔｔｏ株式会社）を用いて電気泳動を行った。泳動完了後、ブロッティング装置を用いてＰＶＤＦメンブレンに転写を行った。ポンソーＳ溶液による染色で転写されたタンパク質量に差がないことを確認した後、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｏｎｅ存在下でＡｎｔｉ−ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（１：３０００）、Ａｎｔｉ−β−ａｃｔｉｎ（１：２０００）を添加し、４℃で１８時間インキュベーションを行った。室温でＡｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ，ＨＲＰ−ｌｉｎｋｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（１：１００００）を添加し、２時間インキュベーション後に、ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓを添加し、ＦＵＳＩＯＮＳＯＬＯを用いてバンドの検出及び解析を実施した。尚、結果は絶食群（Ｆａｓｔ．）を１００とした相対値で表した。【００５５】
（腓腹筋中のリン酸化型ｐ７０Ｓ６Ｋ（Ｔ３８９）量の測定）
腓腹筋中のリン酸化型ｐ７０Ｓ６Ｋ（Ｔ３８９）量の測定は、ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔを用いて添付のプロトコルに従い実施した。リン酸化型ｐ７０Ｓ６Ｋ（Ｔ３８９）量として、試料中のタンパク質濃度あたりのリン酸化型ｐ７０Ｓ６Ｋ（Ｔ３８９）量を求めた。尚、結果は絶食群（Ｆａｓｔ．）を１００とした相対値で表した。【００５６】
（統計解析）
得られた数値は平均値±標準誤差で示した。ソヤサポゲノール粗画分の有効性を確認する際の統計学的検定は、ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡで分散分析の後、Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ  ｔｅｓｔを用いて絶食群との多重比較検定を実施した。有意水準Ｐ＜０．０５を有意差ありとした。なお、これらの解析は全てエクセル統計（ＢｅｌｌＣｕｒｖｅ社製）を用いて実施した。【００５７】
（結果）
図４は、ソヤサポゲノール粗画分を投与したマウスの腓腹筋におけるタンパク質合成量を示すグラフである（＊：Ｐ＜０．０５、絶食群との比較）。図５は、ソヤサポゲノール粗画分を投与したマウスの腓腹筋におけるリン酸化型ｐ７０Ｓ６Ｋ（Ｔ３８９）の量を示すグラフである（＊：Ｐ＜０．０５、絶食群との比較）。図４及び図５に示すグラフのデータは、平均±標準誤差で示される（ｎ＝６又は１２）。
図４の飽食群（Ｃｏｎｔ．）と絶食群（Ｆａｓｔ．）との比較から、絶食によりタンパク質合成量が減少することが分かる。絶食群と比較して、絶食＋ソヤサポゲノール粗画分群（Ｆａｓｔ．＋ＳＳ）で、１．３８倍の有意な筋タンパク質合成量の増加が確認された（図４）。
また、リン酸化型ｐ７０Ｓ６Ｋ（Ｔ３８９）量も絶食群（Ｆａｓｔ．）と比較して、絶食＋ソヤサポゲノール粗画分群（Ｆａｓｔ．＋ＳＳ）で有意な増加が確認された（図５）。ｐ７０Ｓ６Ｋがリン酸化されることは、筋重量の増加に重要である。リン酸化型ｐ７０Ｓ６Ｋ（Ｔ３８９）量の増加により、筋タンパク質合成量が増加したと考えられた。【００５８】
＜実施例３＞
筋タンパク質合成量の評価（４種のトリテルペノイド化合物）
ソヤサポゲノールＡ、ソヤサポゲノールＢ、マスリン酸又はオレアノール酸の４種のトリテルペノイドをマウスに摂取させて、タンパク質合成に与える効果を調べた。ソヤサポゲノールＡ、ソヤサポゲノールＢ、マスリン酸、オレアノール酸は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入した。【００５９】
（試験方法）
実施例２と同じ動物（雄性７週齢Ｃ５７ＢＬ６Ｊマウス）を、実施例２と同じ方法で飼育して馴化させた。馴化期間終了後、５４匹のマウスを、以下の６群（各群９匹）に分けた。
飽食群（Ｃｏｎｔ．）、絶食群（Ｆａｓｔ．）、絶食＋ソヤサポゲノールＡ群（Ｆａｓｔ．＋ＳＳＡ）、絶食＋ソヤサポゲノールＢ群（Ｆａｓｔ．＋ＳＳＢ）、絶食＋マスリン酸群（Ｆａｓｔ．＋ＭＡ）、絶食＋オレアノール酸群（Ｆａｓｔ．＋ＯＡ）
飽食群を除いた５群に対して、２４時間の絶食を行った。絶食終了後に、絶食直後、絶食から７時間後、絶食から２２時間後の３回に分けて、飽食群及び絶食群には０．５％ＣＭＣ−Ｎａ水溶液を、絶食＋トリテルペノイド群には、０．５％ＣＭＣ−Ｎａ水溶液に懸濁した２６ｍｇ／ｋｇ（１回あたり、体重１ｋｇあたり２６ｍｇ）のトリテルペノイド（ソヤサポゲノールＡ、ソヤサポゲノールＢ、マスリン酸又はオレアノール酸）を経口投与した。絶食から２３時間後に全群に対して、１．２５ｍＭのピューロマイシン水溶液を２００μＬ／ｈｅａｄで腹腔内投与した。ピューロマイシン投与時に腹腔内から溶液が漏れた個体、麻酔下での開腹時に腹腔内出血が確認された個体は、ピューロマイシンの組織中への取り込みに影響があると考え、この段階で解析対象から除外した。絶食から２４時間後の試験終了後、腓腹筋を採取し、−８０℃で凍結保存した。採取した腓腹筋について、実施例２と同じ方法でタンパク質合成量を測定した。【００６０】
（統計解析）
得られた数値は平均値±標準誤差で示した。４種のトリテルペノイドの効果を比較する際には、ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡで分散分析の後、Ｔｕｋｅｙ’ｓ  ｔｅｓｔを用いて多重比較検定を実施した。有意水準Ｐ＜０．０５を有意差ありとした。なお、これらの解析は全てエクセル統計（ＢｅｌｌＣｕｒｖｅ社製）を用いて実施した。【００６１】
（結果）
図６は、ソヤサポゲノールＡ、ソヤサポゲノールＢ、マスリン酸又はオレアノール酸を投与したマウスの腓腹筋におけるタンパク質合成量を示すグラフである（＊：Ｐ＜０．０５、各群との比較）。図６に示すグラフのデータは、平均±標準誤差で示される（ｎ＝９）。
絶食群（Ｆａｓｔ．）と比較して、絶食＋ソヤサポゲノールＡ群（Ｆａｓｔ．＋ＳＳＡ）及び絶食＋ソヤサポゲノールＢ群（Ｆａｓｔ．＋ＳＳＢ）に有意な筋タンパク質合成量の増加が確認された。４種のトリテルペノイド間の比較に関しては、絶食＋ソヤサポゲノールＡ群に、絶食＋オレアノール酸群（Ｆａｓｔ．＋ＯＡ）と比較して有意な筋タンパク質合成量の増加が確認された。絶食＋ソヤサポゲノールＡ群は、絶食＋マスリン酸群（Ｆａｓｔ．＋ＭＡ）と比較して筋タンパク質合成量の増加傾向が確認された。絶食＋ソヤサポゲノールＢ群は絶食＋マスリン酸群及び絶食＋オレアノール酸群と比較して、有意な筋タンパク質合成量の増加が確認された（図６）。【００６２】
＜実施例４＞
正常ヒト骨格筋筋芽細胞（ＨＳＭＭ）（ＬＯＮＺＡ社）を用いて、被験物質による筋管細胞分化促進効果を調べた。
被験物質には、調製例１で製造したソヤサポゲノール粗画分を用いた。被験物質（４μｇ／ｍＬ）の存在下で、ｎ＝３で２日間、ＨＳＭＭの筋管分化誘導を行った。得られた細胞についてＭＨＣ染色による筋管染色及びＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色による核染色を行い、筋管分化率を定量化した。【００６３】
（被験サンプルの調製）
ソヤサポゲノール粗画分はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した。これを０．１％ＤＭＳＯ含有分化培地で順次５倍希釈し、試験に用いた。コントロール（Ｖｅｈｉｃｌｅコントロール）として、０．１％ＤＭＳＯ含有分化培地を用いた。分化培地には、２％  ＨＯＲＳＥ  ＳＥＲＵＭ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）添加ＤＭＥＭ：Ｆ−１２培地（Ｌｏｎｚａ社）を使用した。陽性対照として、０．５μＭ  ＬＤＮ−１９３１８９（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）添加０．１％ＤＭＳＯ含有分化培地を用いた。【００６４】
（Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｄｕｃｅｄ（ＧＦＲ）Ｍａｔｒｉｇｅｌ  Ｍａｔｒｉｘコート）
筋管分化誘導時は９６ウェルプレートをＧＦＲ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ  Ｍａｔｒｉｘ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）でコートして用いた。ＧＦＲ  ＦＲ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ  Ｍａｔｒｉｘを４℃で一晩解凍した後、ＤＭＥＭ：Ｆ−１２培地（４℃）で１００倍希釈し、氷上で９６ウェルプレートの各ウェルに０．１ｍＬずつ分注し、室温で１時間インキュベートした。溶液を吸引してＤＭＥＭ：Ｆ−１２培地（０．１ｍＬ）でリンスし、細胞播種に用いた。【００６５】
（細胞前培養）
ＨＳＭＭは、増殖培地（２０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、４％ｕｌｔｒｏｓｅｒＧ（ＰＡＬＬ社）、１％Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ  Ｍｉｘｅｄ  Ｓｔｏｃｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ナカライテスク株式会社）添加ＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社））を用いて前培養した。７０％コンフルエントになった時点でＴｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（０．０５％）、ｐｈｅｎｏｌ  ｒｅｄ（いずれもサーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて細胞を剥離し、増殖培地を用いて５，０００ｃｅｌｌｓ／０．１ｍＬ／ｗｅｌｌとなるようＧＦＲ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ  Ｍａｔｒｉｘコート９６ウェルプレートに播種し、ＣＯ２インキュベーターで培養した。【００６６】
（被験物質の処理（筋管分化誘導））
ＧＦＲ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ  Ｍａｔｒｉｘコート９６ウェルプレートにＨＳＭＭを播種翌日、ソヤサポゲノール粗画分添加分化培地（０．１ｍＬ）に交換し、２日間ＣＯ２インキュベーターで培養した。コントロールは、ソヤサポゲノール粗画分添加分化培地の代わりにＶｅｈｉｃｌｅコントロール（０．１％ＤＭＳＯ含有分化培地）を使用して培養した。【００６７】
（免疫染色）
培養後に、培地を除去した後、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）（４℃）を０．１ｍＬ加え、４℃で１５分間インキュベートして細胞を固定した。次に、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ（ＤＰＢＳ）（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）０．１ｍＬを用いてウェルを３回洗浄した後、ブロッキング／膜透過溶液（３％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）／０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００／ＤＰＢＳ）を０．１ｍＬ加え、室温で３０分間インキュベートした。次に、一次抗体溶液（一次抗体を１／１５０量、３％ＢＳＡ／ＤＰＢＳに添加して調製）０．０５ｍＬに交換し、４℃でオーバーナイトインキュベートした。３％ＢＳＡ／ＤＰＢＳ溶液０．１ｍＬで３回洗浄した後、二次抗体溶液（二次抗体を１／５００量、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を１／１０００量、３％ＢＳＡ／ＤＰＢＳに添加して調製）０．０５ｍＬに交換し、室温で２時間インキュベートした。ＤＰＢＳ０．１ｍＬで３回洗浄した後、ＤＰＢＳ０．１ｍＬを加え、Ｏｐｅｒｅｔｔａ  ＣＬＳ（登録商標）（パーキンエルマー社）で画像撮影及び定量解析を行った。上記一次抗体にはＡｎｔｉ−Ｍｙｏｓｉｎ−Ｈｅａｖｙ  Ｃｈａｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ（抗ＭＨＣ抗体）（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を、二次抗体にはＧｏａｓｔ  ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ｂ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ，  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）をそれぞれ使用した。【００６８】
（イメージング解析）
Ｏｐｅｒｅｔｔａ  ＣＬＳ（登録商標）を用いて、各ウェル中央９視野を、１０倍対物レンズを用いて撮影した。画像を取得後、核及びＭＨＣ陽性の核を検出し、カウントした後、ｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ（％ｏｆ  ＭＨＣ陽性核＝１００×ＭＨＣ陽性核数／総核数）を算出し、筋管分化率を定量化した。【００６９】
（統計解析）
Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔにより比較試験群間（コントロールｖｓソヤサポゲノール粗画分添加群）の有意差検定を行った。両側検定を行い、Ｐ＜０．０５を有意差有とした。【００７０】
（結果）
図７は、正常ヒト骨格筋筋芽細胞を用いて、ソヤサポゲノール粗画分による筋管細胞分化促進効果を調べた結果を示すグラフである（＊：Ｐ＜０．０５、コントロールとの比較）。図７のソヤサポゲノールは、ソヤサポゲノール粗画分添加群である。ソヤサポゲノール粗画分添加群では、コントロールと比較してｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ（％ｏｆ  ＭＨＣ陽性核）が大きく、筋管分化率が高かった。ソヤサポゲノール粗画分により、正常ヒト骨格筋筋芽細胞から筋管細胞への分化が促進された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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