(57)【要約】  生物試料を培養又は封入保定した状態で局所的にマイクロビームを照射したり、細胞や組織などを観察するのに適した生物試料用マイクロチップを提供する。生物試料用マイクロチップには、表面に生物試料を培養又は封入するための少なくとも１つの凹部が形成されており、マイクロチップ全体の厚さが８００μｍ以下に形成される。また、生物試料用マイクロチップは、生物試料を培養又は封入するための凹部が形成されたマイクロチップ表面に親水性が付与される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面に生物試料を培養又は封入するための少なくとも１つの凹部が形成された生物試料用マイクロチップであって、マイクロチップ全体の厚さが８００μｍ以下に形成されることを特徴とする生物試料用マイクロチップ。
【請求項２】
マイクロチップ全体の厚さが３００μｍ以下であることを特徴とする請求項１に記載の生物試料用マイクロチップ。
【請求項３】
マイクロチップ全体の厚さが１００μｍ以下であることを特徴とする請求項１に記載の生物試料用マイクロチップ。
【請求項４】
少なくともマイクロチップ表面に親水性が付与されていることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の生物試料用マイクロチップ。
【請求項５】
マイクロチップの全体に親水性が付与されていることを特徴とする請求項４に記載の生物試料用マイクロチップ。
【請求項６】
表面に生物試料を培養又は封入するための少なくとも１つの凹部が形成された生物試料用マイクロチップであって、少なくともマイクロチップ表面に親水性が付与されていることを特徴とする生物試料用マイクロチップ。
【請求項７】
マイクロチップ表面にプラズマ処理が施されていることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の生物試料用マイクロチップ。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれかに記載の生物試料用マイクロチップの凹部に生物試料を封入し保定するために用いるカバーであって、透明であり、表面粗さが０．０３μｍ以下であることを特徴とするカバー。
【請求項９】
厚さが５０μｍ以上３００μｍ以下であることを特徴とする請求項８に記載のカバー。
【請求項１０】
水接触角が１００度以下であることを特徴とする請求項８又は９に記載のカバー。
【請求項１１】
酸素透過率が３０ｍＬ／（ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ）以上であることを特徴とする請求項８乃至１０のいずれかに記載のカバー。
【請求項１２】
二酸化炭素透過率が３０ｍＬ／（ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ）以上であることを特徴とする請求項８乃至１１のいずれかに記載のカバー。
【請求項１３】
ポリスチレン製であることを特徴とする請求項８乃至１２のいずれかに記載のカバー。
【請求項１４】
請求項１乃至７のいずれかに記載の生物試料用マイクロチップと、請求項８乃至１３のいずれかに記載のカバーと、を備えることを特徴とする生物試料封入キット。
【請求項１５】
生物試料を保定する生物試料保定方法であって、請求項１乃至７のいずれかに記載の生物試料用マイクロチップの凹部に生物試料を封入すること、を含むことを特徴とする生物試料保定方法。
【請求項１６】
生物試料にマイクロビームを照射するマイクロビーム照射方法であって、請求項１乃至７のいずれかに記載の生物試料用マイクロチップの凹部に生物試料を封入することと、  前記生物試料にマイクロビームを照射することと、を含むことを特徴とするマイクロビーム照射方法。
【請求項１７】
生物試料を培養又は飼育する方法であって、請求項１乃至７のいずれかに記載の生物試料用マイクロチップの凹部に生物試料を封入することと、前記生物試料を封入した前記生物試料用マイクロチップを前記生物試料の培養環境下又は飼育環境下に静置することと、
を含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動植物細胞や微小生物といった生物試料を培養又は封入保定した状態で局所的にマイクロビームを照射したり観察（例えば、蛍光イメージング観察）する際に使用される生物試料用マイクロチップ、および、その生物試料用マイクロチップを用いるための技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
線虫セノラブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans、以下では、「Ｃ．エレガンス」と略すことがある。）は、神経生物学、発生生物学および老化学などの研究のために確立されたモデル生物である。この線虫を用いて放射線が動物の運動性に与える影響を調べる研究が行われている。例えば、ガンマ線やイオンビームなどの量子ビームを線虫に全身照射すると、その運動性が線量に応じて低下することが知られている。しかしながら、線虫の運動性の低下が特定の組織又は領域への照射によって誘発されたものであるかどうかは不明のままである。【０００３】
そこで近年では、線虫の中枢神経がある頭部、腸や生殖器がある腹部および尾部といった特定の組織や領域のみに対してマイクロビームを標的照射することにより、運動性の低下がそれら特定の組織や領域への照射によって誘発されたものであるかどうかを調べる研究がなされている。マイクロビームとは、量子ビームをマイクロメートルサイズまで細くし、特定の領域を局所的に照射できるようにしたビームである。このような量子ビームとしては、例えば、Ｘ線、電子線、イオンビーム、レーザーなどを用いることができる。この種の従来研究では、線虫に麻酔をかけることによって線虫が動かないようにすることで、特定の組織や領域を狙ったマイクロビーム照射を可能にしている。しかし、この場合、麻酔による神経沈静作用が影響するため、特定の組織や領域へのマイクロビーム照射が線虫の運動性に対してどのように影響したかを即時に観察することができない。【０００４】
これを改善するため、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）マイクロチップを用いて麻酔なしで線虫を保定し、その保定した線虫の特定の組織や領域を狙ってマイクロビームを照射する方法が提案されている（例えば非特許文献１）。従来のＰＤＭＳマイクロチップは、線虫の神経活動イメージングなどを目的として線虫を封入保定するために開発されたものであり、チップ表面上に形成した、幅１０〜８０μｍ、深さ４０μｍ、長さ１ｍｍ程度の直線状のチャネルに線虫を封入して用いるものである。このようなＰＤＭＳマイクロチップを用いれば、麻酔なしで、線虫をチャネル内に封入し保定しておくことができるため、マイクロビームを線虫の特定の組織や領域、或いは特定の細胞一つを狙って照射することができるようになる。【０００５】
しかしながら、従来のＰＤＭＳマイクロチップは厚さｔが約２．５ｍｍであるため、例えば水中飛程１ｍｍのイオンマイクロビームは従来のＰＤＭＳマイクロチップの下面まで透過しない。そのため、ＰＤＭＳマイクロチップの下面側に設置される、ビームを電気信号に変換する、イオンマイクロビーム照射装置のイオン検出系（シンチレーター−光電子増倍管アセンブリなど）が、線虫に照射されたイオンマイクロビームを正確に検出することができないという問題がある。特に、この種の研究は、重粒子線治療で用いられる炭素イオンビームや陽子線治療で用いられるプロトンビーム（プロトンイオンビームとも言う。）による影響を調べることが重要であり、エネルギーの異なる複数種類の炭素イオンビームやプロトンビームを照射してその結果を検出できるようにすることが望まれる。ところが、一般に、炭素イオンビームやプロトンビームの水中飛程は、従来のＰＤＭＳマイクロチップを透過できる程長くはないため、従来のＰＤＭＳマイクロチップを使用することができない。【０００６】
また、従来のＰＤＭＳマイクロチップは、チャネルに封入保定した線虫に脱水症状を生じさせることも知られている。そのため、仮にチャネルに封入保定した線虫にマイクロビームを照射することができたとしても、照射後に観られる運動性の低下がマイクロビーム局部照射によるものであるのか、或いは、脱水症状によるものであるかを判別することが困難であるという問題もある。さらに脱水症状による運動性の低下は、線虫のイメージングにも影響を与えるものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Michiyo Suzuki，他５名，"Region-specific irradiation system with heavy-ion microbeam for active individuals of Caenorhabditis elegans"，Journal of Radiation Research, Vol. 58，No. 6，2017, pp. 881-886, doi: 10.1093/jrr/rrx043, OXFORD，インターネット（URL: https://academic.oup.com/jrr/article/doi/10.1093/jrr/rrx043/4098084/Regionspecific-irradiation-system-with-heavyion）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで本発明は、動植物細胞や微小生物といった生物試料を培養又は封入保定した状態で局所的にマイクロビームを照射したり観察（例えば、蛍光イメージング観察）したりするのに適したマイクロチップであって、上述した従来の問題点を解決することができる生物試料用マイクロチップを提供することを目的とし、また、その生物試料用マイクロチップと合わせて使用するのに適したカバー、および、生物試料用マイクロチップとカバーとを組み合わせた生物試料封入キットを提供することを目的とする。さらに本発明は、生物試料用マイクロチップを用いた各種の方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、本発明は、表面に生物試料を培養又は封入するための少なくとも１つの凹部が形成された生物試料用マイクロチップであって、マイクロチップ全体の厚さｔが８００μｍ以下に形成されることを特徴とするものである。【００１０】
本発明におけるマイクロチップ全体の厚さｔは、好ましくは３００μｍ以下である。また本発明におけるマイクロチップ全体の厚さｔは、さらにより好ましくは１００μｍ以下である。【００１１】
また、本発明において少なくともマイクロチップ表面には親水性が付与されていることが好ましい。本明細書において「表面」とは、「露出面」を意味する。即ち、表面に親水性が付与されているとは、最表面が親水化されていれば良い。さらに、本発明においてより好ましくは、マイクロチップの全体に親水性が付与されていることである。【００１２】
また、本発明は、表面に生物試料を培養又は封入するための少なくとも１つの凹部が形成された生物試料用マイクロチップであって、少なくともマイクロチップ表面に親水性が付与されていることを特徴とするものである。【００１３】
また、本発明においてマイクロチップ表面にはプラズマ処理を施しても良い。【００１４】
また、本発明は、上記生物試料用マイクロチップの凹部に生物試料を封入して保定するために用いるカバーを対象としている。即ち、本発明におけるカバーは、透明であり、かつ、表面粗さＲａが０．０２μｍ以下であることを特徴とするものである。【００１５】
また、カバーの厚さｔ２は、５０μｍ以上３００μｍ以下であることが好ましい。また、カバーの水接触角（２５℃、３０％ＲＨ）は、１００度以下であることが好ましい。また、カバーの酸素透過率（２０℃、５０％ＲＨ）は、３０ｍＬ／（ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ）以上であることが好ましい。また、カバーの二酸化炭素透過率（２０℃、５０％ＲＨ）は、３０ｍＬ／（ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ）以上であることが好ましい。また、カバーは、ポリスチレン製であることが好ましい。【００１６】
また、本発明は、生物試料封入キットを対象としている。即ち、本発明における生物試料封入キットは、上記生物試料用マイクロチップと、上記カバーとを備える構成である。【００１７】
また、本発明は、生物試料を封入して保定する生物試料保定方法を対象としている。即ち、本発明における生物試料保定方法は、上記生物試料用マイクロチップの凹部に生物試料を封入することを含む方法である。【００１８】
また、本発明は、生物試料にマイクロビームを照射するマイクロビーム照射方法を対象としている。即ち、本発明におけるマイクロビーム照射方法は、上記生物試料用マイクロチップの凹部に生物試料を封入することと、前記生物試料にマイクロビームを照射すること、とを含む方法である。【００１９】
また、本発明は、生物試料を培養又は飼育する方法を対象としている。即ち、本発明における方法は、上記生物試料用マイクロチップの凹部に生物試料を封入することと、前記生物試料を封入した前記生物試料用マイクロチップを前記生物試料の培養環境下又は飼育環境下に静置すること、とを含む方法である。
【発明の効果】
【００２０】
発明によれば、生物試料を良好な状態で培養又は封入保定することができ、マイクロビーム照射および細胞や組織等の観察（例えば、蛍光イメージング観察）などを良好に行うことができるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】生物試料用マイクロチップのうち、微小生物個体用のマイクロチップの一例を示す図である。
【図２】生物試料用マイクロチップのうち、動植物細胞用のマイクロチップの一例を示す図である。
【図３】生物試料用マイクロチップに用いるカバーの一例を示す図である。
【図４】マイクロチップを使用したイオンマイクロビーム局部照射実験の装置の概要を示す図である。
【図５】マイクロチップを透過して検出系に到達したイオンマイクロビームの照射痕を示す図である。
【図６】従来のＰＤＭＳマイクロチップを使用したイオンマイクロビーム局部照射実験の装置の概要を示す図である。
【図７】実験２において寒天プレート上で１時間自由に運動させた場合の線虫の頭部屈曲回数を示す図である。
【図８】実験２において純水を使用した場合の線虫の頭部屈曲回数の相対値を示す図である。
【図９】実験２において第１の緩衝液を使用した場合の線虫の頭部屈曲回数の相対値を示す図である。
【図１０】実験２において第２の緩衝液を使用した場合の線虫の頭部屈曲回数の相対値を示す図である。
【図１１】実験３において第１の緩衝液を使用した場合の線虫の頭部屈曲回数を示す図である。
【図１２】実験４において第１の緩衝液を使用した場合の線虫の頭部屈曲回数を示す図である。
【図１３】実験５においてマイクロチップのチャネルに線虫を封入保定した状態を撮影した明視野像である。
【図１４】実験５においてマイクロチップのチャネルに線虫を封入保定した状態を撮影した蛍光像である。
【図１５】実験６において市販の細胞培養用ディッシュを用いてヒト細胞を培養した結果を撮影した明視野像である。
【図１６】実験６においてマイクロチップ表面に対してプラズマ処理を行っていないマイクロチップを用いてヒト細胞を培養した結果を撮影した明視野像である。
【図１７】実験６においてマイクロチップ表面に対してプラズマ処理を行ったマイクロチップを用いてヒト細胞を培養した結果を撮影した明視野像である。
【図１８】実験６においてマイクロチップのウェル表面に細胞接着性を向上させるコート剤を塗布したマイクロチップを用いてヒト細胞を培養した結果を撮影した明視野像である。
【図１９】実験６においてマイクロチップのウェル表面にヒト細胞を培養した結果を撮影した蛍光像である。
【図２０】実験７において寒天プレート上で３時間自由に運動させた線虫又はマイクロチップに異なるカバーを用いて３時間封入保定した線虫の頭部屈曲回数を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明に関する好ましい実施形態について図面を参照しつつ詳細に説明する。尚、以下に説明する実施形態において互いに共通する部材には同一符号を付しており、それらについての重複する説明は省略する。
【００２３】
［実施例］
（マイクロチップの全体構成）
図１は、本発明における生物試料用マイクロチップ１（以下、単に「マイクロチップ１」という。）のうち、微小生物用マイクロチップの一例を示す図であり、図１（ａ）はマイクロチップ１の全体的な外観構成を示す斜視図であり、図１（ｂ）は凹部３（チャネル３ａ）の拡大断面図である。このマイクロチップ１は、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）を母材として形成される薄型チップである。例えば、線虫などの生物試料を封入保定した状態でマイクロビームを特定の組織や領域、或いは特定の細胞一つを狙って照射する際に使用される。また、マイクロチップ１は、生物試料を観察（例えば、蛍光イメージング観察）する場合にも好適に使用できるものである。このマイクロチップ１は、例えば矩形状とすることができる。例えば、Ｘ方向およびＹ方向に同一長さを有する平面視正方形状に形成される。例えば、Ｘ方向およびＹ方向のサイズは１５ｍｍである。ただし、マイクロチップ１は、必ずしも平面視正方形に限られるものではなく、長方形であっても良く、自動撮影機能を備えた一体型顕微鏡などの試料台のサイズに合わせた形状とすることもできる。
【００２４】
マイクロチップ１の表面２には、生物試料を培養又は封入するための少なくとも１つの凹部３が形成される。図１に示すマイクロチップ１では、凹部３として複数のチャネル３ａを形成したものを例示している。各チャネル３ａは、マイクロチップ１の表面２においてＸ方向に延びるように形成される。また、複数のチャネル３ａは、マイクロチップ１の表面２においてＹ方向にほぼ等間隔で形成される。このようなマイクロチップ１は、生物試料として線虫を用いる場合に好適に利用し得る形態である。即ち、チャネル３ａは線虫を封入することが可能な幅Ｗを有する溝として形成される。線虫は頭部を左右に振って移動（這行運動）する。このため、幅Ｗは線虫の体（典型的に、最も太い部分、例えば腹部）の幅（太さ）Ｂ（頭尾方向に直交する方向の大きさ）と同程度かそれ以下に設定する。線虫は円柱形の細長い体をしており、弾力があるため、体の幅Ｂよりチャネル３ａの幅Ｗが狭い場合にもチャネル３ａに封入することができ、チャネル内でのおさまりが良く、その動きを確実に抑制できる。例えば、各種線虫のうち、Ｃ．エレガンスの成虫用のマイクロチップ１の場合は、チャネル３ａの幅Ｗと線虫の体の幅Ｂの差が概ね２０μｍ以下となるように幅Ｗを設定することが好ましい。ただし、Ｃ．エレガンスの幼虫用のマイクロチップ１の場合は、チャネル３ａの幅Ｗを線虫の体の幅Ｂと同程度かそれ以下にするのが好ましい。チャネル３ａの幅Ｗを上記範囲となるように設定することで、線虫の動きを抑制し、好適に保定することができる。尚、当該チャネル３ａの中に緩衝液と共に線虫を封入した後、その開口部に後述のカバーを配置することを考慮すれば、チャネル３ａの深さＤは線虫の体の幅Ｂよりも深く設定するのが好ましい。ただし、深さＤが線虫の体の幅Ｂより深過ぎると、線虫がチャネル３ａの中で上下方向に回転したり、二つに折れ曲がることがある。したがって、例えば、線虫Ｃ．エレガンスの野生型を封入する場合には、チャネル３ａの深さＤはＣ．エレガンスの体の幅Ｂと同程度か、１０μｍ程度大きくなるように設定すれば良い。例えば、チャネル３ａの幅Ｗは１０〜９０μｍ程度であり、深さＤは２０〜１００μｍ程度である。Ｃ．エレガンスには、Ｌ１〜Ｌ４までの幼虫（孵化直後から２．５日齢程度）の発生段階があり、その体の幅Ｂは１０〜４０μｍ程度である。このため、各段階の幼虫用のマイクロチップ１の場合は、チャネル３ａの幅Ｗを５〜４０μｍとし、深さＤを１０〜５０μｍとするのが好ましい。比較的若い成虫（２．５〜４．５日齢程度）の体の幅Ｂは５０〜７０μｍ程度である。このため、比較的若い成虫用のマイクロチップ１の場合は、チャネル３ａの幅Ｗを４０〜６０μｍとし、深さＤを５０〜７０μｍとするのが好ましい。また、線虫は成虫になってからも成長し、Ｃ．エレガンスでは、その体の幅Ｂは最終的には約９０μｍとなる。このため、約４. ５日齢以降の成虫用のマイクロチップ１の場合は、チャネル３ａの幅Ｗを６０〜９０μｍとし、深さＤを７０〜１００μｍとするのが好ましい。このようにマイクロチップ１には、線虫の発生段階に応じた多様なサイズのチャネル３ａを形成することができる。また、例えば、図１に示すマイクロチップ１の直線状の��数のチャネル３ａの端に、緩衝液や餌（例えば、大腸菌）などを保持する機能を有する略矩形状のチャネルを形成し、長時間の飼育、観察を行うこともできる。
【００２５】
または、チャネル３ａの幅Ｗを線虫の体の幅Ｂよりも小さくし、チャネル３ａの深さＤを線虫の体の幅Ｂより小さくすることもできる。線虫の体の幅Ｂよりも小さい幅Ｗおよび深さＤのチャネル３ａの中では、線虫が長軸方向に体を延伸してチャネル３ａに密着して収まるため、当該線虫の動きをより強く抑制し得る。このようなチャネル３ａは、任意の細胞や組織の蛍光イメージング観察等において好適に利用できる。また、チャネル３ａの深さＤを線虫の体の幅Ｂの２／３程度とし、幅Ｗを線虫の体の幅Ｂの１．２〜１．５倍程度にすれば、線虫の体をチャネル３ａの幅方向に押し広げた状態でチャネル３ａの中に保持することができ、細胞や組織の形態観察等に好適に利用できる。ここで、チャネル３ａの幅Ｗ又は深さＤが小さいマイクロチップ１は、チャネル３ａ内に保持できる緩衝液の量が少ないため、長時間の飼育、観察時に緩衝液の液量が不足する場合がある。このため、比較的短時間の形態観察に好適に使用し得る。また、線虫をチャネル３ａの幅Ｗ又は深さＤが小さいチャネル３ａに押し込めると、線虫にストレスがかかる場合があるため、観察する応答に対するストレスの影響を考慮してチャネルサイズを選択するのが好ましい。
【００２６】
チャネル３ａの幅Ｗ又は深さＤを線虫の体の幅Ｂよりも小さくする場合、例えば、線虫Ｃ．エレガンスの野生型のＬ１〜Ｌ２の幼虫用としては、チャネル３ａの幅Ｗを５〜１５μｍとし、深さＤを１０〜１５μｍとするのが好ましい。Ｌ３〜Ｌ４の幼虫用としては、チャネル３ａの幅Ｗを１５〜３０μｍとし、深さＤを１５〜３０μｍとするのが好ましい。成虫用としては、チャネル３ａの幅Ｗおよび深さＤを線虫の体の幅Ｂより１０μｍ程度小さくするのが好ましい。
【００２７】
または、チャネル３ａの幅Ｗ又は深さＤを線虫の体の幅Ｂよりも大きくすれば、封入した線虫の体の動きを抑制せずに、顕微鏡等の観察野に留めることができ、当該線虫の動きを観察することができる。例えば、線虫Ｃ．エレガンスの野生型を封入する場合には、チャネル３ａの幅Ｗおよび深さＤを線虫の体の幅Ｂよりも１０〜２０μｍ程度大きくすれば良い。このようなチャネル３ａは、運動中の線虫の神経細胞群や筋細胞群を対象とした、比較的マクロな蛍光イメージング観察等に好適に利用できる。
【００２８】
さらにマイクロチップ１は、各種線虫の個体（卵、幼虫、成虫）のみを対象とするのではなく、凹部３に封入可能な生物試料の保定又は観察にも好適に使用することができる。かかる生物試料は、動物又は植物のいずれであっても良く、運動能の有無も制限されない。例えば、体の幅Ｂ又は直径Ｆが概ね凹部３の深さＤ以下、即ちマイクロチップ１の厚さｔの概ね２／３以下の微小生物個体、動植物や藻類の細胞、種子、花粉、卵、精子などが対象となる。具体的には、各種植物の花粉、動植物の培養細胞や血球細胞、ゾウリムシ、テトラヒメナ、ミドリムシ、オオミドリムシ、ミカヅキモなどの所謂微生物や、線虫の受精卵、ショウジョウバエの卵やゼブラフィッシュの受精卵、ワムシ（例えば、カメノコウワムシやＬ型ワムシ）、クマムシ（例えば、ドウジャルダンヤマクマムシ）などの動物個体に好適に使用することができる。ただし、マイクロチップ１の表面２に形成する凹部３の形状は、生物試料に適したものを採用することが好ましい。運動能を有する生物試料を封入する場合には、チャネル３の深さＤを当該生物試料の体の厚さ（典型的に最も薄い面の短軸方向の長さ）Ｔ又は直径Ｆと同程度かそれ以上とし、チャネル３の幅Ｗを当該生物の体の幅Ｂ又は直径Ｆと同程度かそれ以下とし、チャネル３の長さＬを当該生物の体長Ｈよりも十分長くすることが望ましい。ただし、チャネル３のサイズは上記に限らず、封入する生物試料の弾力や動きの速さなどに応じて設定すれば良い。
【００２９】
図１に示すマイクロチップ１はチャネル３ａの幅Ｗおよび深さＤが一定の場合を例に説明したが、当然これに限定されない。線虫は一般的に、腹部に比べて頭部と尾部が細い形状をしている。このため、チャネル３ａの幅Ｗ又は深さＤを線虫の部位ごとの幅に合わせた形状、例えば、チャネル３ａの一部に幅Ｗ又は深さＤが小さい狭窄部を設けても良い。かかる狭窄部に線虫の頭部又は尾部を封入することで、線虫を好適に保定することができる。このとき、非狭窄部は上記チャネル３ａの幅Ｗおよび深さＤとして説明した条件のいずれかと同等とすることが好ましい。例えば、チャネル３ａの形状は、幅の大きい部分と小さい部分を繰り返すようなくびれ形状の繰り返しパターンとすることができる。
【００３０】
また、チャネル３ａの形状は、線虫の這行運動の軌跡に合わせた正弦波形状、卵を封入可能な楕円形など、任意の形状とすれば良い。チャネル３ａの数も目的に応じて、自由に選択すれば良い。例えば、１本以上、２本以上、３本以上とすれば良く、５本以上が好ましい。より好ましくは１０本以上、さらに好ましくは１５本以上である。チャネル３ａの数の上限は限定されず、チップに形成可能な範囲で設定すれば良い。例えば、１００本以下、５０本以下とすれば良い。尚、チャネル３ａの１又は２以上が、他のチャネル３ａの形状やサイズと異なっていても良い。
【００３１】
図２は、マイクロチップ１のうち、動植物細胞用のマイクロチップの一例を示す図である。図２に示すマイクロチップ１の表面２には、生物試料を封入するための凹部３として、動植物細胞を培養するための矩形の複数のウェル３ｂが形成されたものを示している（図２（ａ）参照）。ただし、ウェル３ｂの形状は、矩形に限定されず、円形、楕円形であっても良い。細胞（激しく移動しない）は１細胞で保定しなくても、マイクロビーム照射や観察などが可能なため、凹部３のサイズは細胞よりも相当大きく設定すれば良い。例えば、図２（ｂ）に示すように、ウェル３ｂは、Ｘ方向に幅Ｌを有し、Ｙ方向に幅Ｗを有する矩形状に形成される。例えばＸ方向の幅Ｌと、Ｙ方向の幅Ｗの比を、マイクロビーム照射前後の細胞全体を撮影するカメラの画角と同じアスペクト比となるように設定すれば、１つのウェル３ｂの全領域を撮影範囲に収めることが可能であり、照射後の細胞動態の追跡等の目的での観察などに好適である。
【００３２】
培養細胞の厚さは概ね１０μｍ以下であるが、ウェル３ｂに培養液等を注入するための空間を確保するため、ウェル３ｂの深さＤは、５０〜１００μｍ程度とすることが好ましい。また、形成されたウェル３ｂの形状を保持するために、ウェル３ｂの深さＤは、マイクロチップ１の厚さｔの２／３程度を上限としておくことが好ましい。そのため、例えば、マイクロチップ１の厚さｔが３００μｍであれば、ウェル３ｂの深さＤは５０〜２００μｍとすることが好ましい。尚、ここでは図２に例示するウェル３ｂが形成されたマイクロチップ１を動植物細胞に用いる場合を例として説明したが、これに限られず、ウェル３ｂに細胞以外の生物試料（例えば、線虫）を封入して用いても良い。
【００３３】
（マイクロチップの厚さ）
上記のようなマイクロチップ１は薄型のシート状に形成される。その厚さｔを８００μｍ以下とすれば、水中飛程１０００μｍ程度のマイクロビームは、当該マイクロチップ１を透過することができ、マイクロチップ１の下面側に設けられる検出系に到達できる。このような厚さｔが８００μｍ以下のマイクロチップ１は、凹部の開口側および下面側の両面に後述のカバーを備えた場合であっても、水中飛程１０００μｍ程度のマイクロビームを透過し得るため特に好ましい。マイクロチップ１の厚さｔは８００μｍよりも薄ければ薄い程、イオンマイクロビーム照射装置のイオン検出系で検出可能なマイクロビームの種類を増加させることができる。一方、マイクロチップ１の厚さｔは厚ければ厚い程、凹部３に培養又は封入可能な生物試料の種類を増加させることができる。
【００３４】
図３は、マイクロチップ１の表面２に被せるカバーの一例を示す図である。マイクロチップ１の表面に接触する面の形状は特に限定されず、矩形、円形、楕円形などが例示される。矩形の１つ以上の角を丸めた形状であっても良い。図３に示すような矩形は容易に製造可能であり、製造ロスも生じにくいことから好ましい。カバー４は、把持部を有していても良いし、孔が形成されていても良い。把持部を有するカバー４は、マイクロチップ１の表面への配置又は剥離の操作が容易となるため好ましい。孔が形成されたカバー４は、マイクロチップ１の表面にカバー４を密着させる際に当該孔を介して気泡を容易に排出可能であることから好ましい。
【００３５】
イオンビームの水中飛程は、イオン種とエネルギーにより決定される。次の表１に、量子科学技術研究開発機構高崎量子応用研究所で使用可能な各種イオンおよびエネルギーの主なものを挙げ、その水中飛程の計算値との関係を示す。
【００３６】
【表１】
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【００３７】
マイクロチップ１に水中飛程が８００μｍよりも長いイオンビームを照射した場合には、そのイオンビームがマイクロチップ１を透過する。例えば、上記表１に例示した水中飛程９３０μｍの１９０ＭｅＶの炭素イオンであれば、イオンビームはマイクロチップ１を透過することができる。したがって、マイクロチップ１の厚さｔを８００μｍ以下にすることで、水中飛程が８００μｍよりも長いイオンビームを用いて実験を行うことができるようになり、使用可能なイオンビームの種類が従来よりも大幅に増加する。特に、重粒子線治療で使用される炭素イオンの場合、水中飛程２３７０μｍの３２０ＭｅＶの炭素イオン、水中飛程１２１０μｍの２２０ＭｅＶの炭素イオン、水中飛程９３０μｍの１９０ＭｅＶの炭素イオンというエネルギーの異なる少なくとも３種類の炭素イオンを使用できるようになるという利点がある。また、陽子線治療に使用されるプロトンの場合、水中飛程２４４０μｍの１５ＭｅＶのプロトン、水中飛程１１８０μｍの１０ＭｅＶのプロトンというエネルギーの異なる少なくとも２種類のプロトンを使用できるようになる。これにより、重粒子線治療や陽子線治療などの治療現場で使用される量子ビームについて、エネルギーの違いによる生物影響の違いを同じ実験系で調べられるようになる。ただし、マイクロチップ１の厚さｔが８００μｍ以下の場合、上記表１に例示したネオンなどのイオンビームは、マイクロチップ１を透過しない。
【００３８】
そのため、マイクロチップ１の厚さｔは、好ましくは３００μｍ以下である。厚さｔを３００μｍ以下とすることにより、表１に示した水中飛程７００μｍの３５０ＭｅＶのネオンイオンおよび水中飛程４２０μｍの２６０ＭｅＶのネオンイオンのマイクロビームもマイクロチップ１の下面側に設置される、イオンマイクロビーム照射装置のイオン検出系で正確に検出することが可能となる。これにより、少なくとも、ヘリウムイオン、プロトン、炭素イオン、ネオンイオンという異なる４種類のイオンの生物影響を同じ実験系で調べることができるようになる。
【００３９】
さらに、より好ましくは、マイクロチップ１の厚さｔは、１００μｍ以下である。厚さｔを１００μｍ以下とすることにより、表１に例示した全てのイオン種のマイクロビームが、マイクロチップ１を透過できる。即ち、マイクロチップ１の下面側に設置される、イオンマイクロビーム照射装置のイオン検出系が生物試料を透過したマイクロビームを正確に検出することが可能である。それ故、厚さｔを１００μｍ以下にすれば、表１に例示した全てのイオン種、即ち、ヘリウムイオン、プロトン、炭素イオン、ネオンイオン、アルゴンイオンという異なる少なくとも５種類のマイクロビームを用いて実験を行うことができるようになり、マイクロチップ１の汎用性がより高くなる。
【００４０】
マイクロチップ１の厚さｔを８００μｍとする場合、チャネル３ａやウェル３ｂなどの凹部３に培養又は封入可能な生物試料としては、凹部３の深さＤ以下、即ち概ね５３０μｍ以下のものが対象となる。例えば、動く生物試料としては、ゾウリムシ、テトラヒメナ、ミドリムシ、オオミドリムシ、ミジンコ、線虫Ｃ．エレガンス、ワムシ、クマムシ、ヒョウヒダニ（チリダニ）、アルテミアなどがある。これらはいずれも動きを抑制した状態で観察することが好ましいため、図１に示したマイクロチップ１を用いてチャネル３ａに封入保定すれば良い。また、動かない、又はマイクロビーム照射や観察に支障を来す程は動かない生物試料としては、花粉、ミカヅキモ、コケ、ボルボックス、培養細胞、線虫の卵（例えば、受精卵）、血球細胞、ヒトの卵子、ワムシの卵、ショウジョウバエの卵、ゼブラフィッシュの卵（例えば、受精卵）などがある。これらはいずれも動かない、又はマイクロビーム照射や観察に支障を来す程は動かないため、図２に示したマイクロチップ１を用いてウェル３ｂに培養又は封入保定すれば良い。ただし、図１に示したマイクロチップ１を用いるようにしても良い。尚、本明細書において「卵」とは、未受精卵又は受精卵のいずれも含む。
【００４１】
また、マイクロチップ１の厚さｔを３００μｍとする場合、チャネル３ａやウェル３ｂなどの凹部３に培養又は封入可能な生物試料としては、凹部３の深さＤ以下、即ち概ね２００μｍ以下のものが対象となる。例えば、動く生物試料としては、ゾウリムシ、テトラヒメナ、ミドリムシ、オオミドリムシ、線虫Ｃ．エレガンス、ワムシ、クマムシ、ヒョウヒダニ（チリダニ）などがある。これらはいずれも動きを抑制した状態で観察することが好ましいため、図１に示したマイクロチップ１を用いてチャネル３ａに封入保定すれば良い。また動かない、又はマイクロビーム照射や観察に支障を来す程は動かない生物試料としては、花粉、ミカヅキモ、コケ、培養細胞、線虫の卵（例えば、受精卵）、血球細胞、ヒトの卵子、ワムシの卵などがある。これらはいずれも動かない、又はマイクロビーム照射や観察に支障を来す程は動かないため、図２に示したマイクロチップ１を用いてウェル３ｂに培養又は封入保定すれば良い。ただし、図１に示したマイクロチップ１を用いるようにしても良い。
【００４２】
さらに、マイクロチップ１の厚さｔを１００μｍとする場合、チャネル３ａやウェル３ｂなどの凹部３に封入可能な生物試料としては、凹部３の深さＤ以下、即ち概ね６５μｍ以下のものが対象となる。例えば、動く生物試料としては、ゾウリムシ、テトラヒメナ、ミドリムシ、オオミドリムシ、線虫Ｃ．エレガンス、ワムシなどがある。これらはいずれも動きを抑制した状態で観察することが好ましいため、図１に示したマイクロチップ１を用いてチャネル３ａに封入保定すれば良い。また動かない、又はマイクロビーム照射や観察に支障を来す程は動かない生物試料としては、花粉、ミカヅキモ、コケ、培養細胞、線虫の卵（例えば、受精卵）、血球細胞などがある。これらはいずれも動かない、又はマイクロビーム照射や観察に支障を来す程は動かないため、図２に示したマイクロチップ１を用いてウェル３ｂに培養又は封入保定すれば良い。ただし、図１に示したマイクロチップ１を用いるようにしても良い。
【００４３】
ここで、マイクロチップ１の厚さｔが８００μｍ、３００μｍ、１００μｍの場合を例として説明したが、当然これに限定されない。使用するイオンビームの水中飛程と、凹部３に培養又は封入する生物試料の大きさを考慮し、適宜設定し得る。例えば、６００μｍ、５００μｍ、２００μｍなどの任意の厚さとすれば良い。厚さｔが６００μｍであれば、マイクロチップ１の表面２に形成する凹部３の深さＤを４００μｍとすることで、ミジンコなどを好適に封入保定することができ、イオンビームとしては水中飛程７００μｍの３５０ＭｅＶのネオンイオンなどを照射し得る。また、厚さｔが２００μｍであれば、凹部３の深さＤを１４０μｍとすることで、Ｌ型ワムシの幼虫や卵、ヒトの卵子などを好適に封入保定することができ、イオンビームとしては水中飛程２７０μｍの２００ＭｅＶのネオンイオンや水中飛程２５０μｍの４６０ＭｅＶのアルゴンイオンなどを照射し得る。
【００４４】
さらに、マイクロチップ１の厚さｔを８００μｍより厚くすること、例えば、１０００μｍ、１５００μｍ、２０００μｍなどの任意の厚さに設定することも当然可能である。厚さｔが１０００μｍであれば、マイクロチップ１の表面２に形成する凹部３の深さＤを６５０μｍとすることで、カイコの受精卵などを好適に封入保定することができ、イオンビームとしては水中飛程１１８０μｍの１０ＭｅＶのプロトンや水中飛程１２１０μｍの２２０ＭｅＶの炭素イオンなどを照射し得る。例えば、陽子線治療に用いられるプロトンによる影響を調べる場合、マイクロチップ１の厚さｔが１０００μｍ以下であれば、水中飛程１１８０の１０ＭｅＶのプロトンと、水中飛程２４４０μｍの１５ＭｅＶのプロトンという少なくとも２種類のプロトンを使用することができる。また、厚さｔが１５００μｍであれば、凹部３の深さＤを１０００μｍとすることで、メダカの受精卵などを好適に封入保定することができ、イオンビームとしては水中飛程１７７０μｍの５０ＭｅＶのヘリウムイオンや水中飛程２３７０μｍの３２０ＭｅＶの炭素イオンなどを照射し得る。さらに、厚さｔが２０００μｍであれば、凹部３の深さＤを１３００μｍとすることで、封入できる微小生物個体や卵、植物の種子の種類を増加させることができる。この場合、マイクロチップ１を透過可能なイオンビームとしては水中飛程１７７０μｍの５０ＭｅＶのヘリウムイオン、水中飛程２３７０μｍの３２０ＭｅＶの炭素イオン、水中飛程２６８０μｍの６３ＭｅＶのヘリウムイオンなどに限定されるが、照射に限らない蛍光イメージング観察などのための培養又は封入保定に好適に使用できる。
【００４５】
マイクロチップ１の厚さｔについて、マイクロビームの水中飛程と凹部に封入する対象物との関係に着目して説明したが、これに限定されない。マイクロチップ１の凹部３に封入した対象物の顕微鏡観察に薄いマイクロチップ１を用いることで、従来は困難であった観察を可能とすることができる。例えば、従前、対象物を生きたまま蛍光イメージング観察する場合には水浸レンズを用いた観察が行われていた。一方で、厚さｔのマイクロチップ１の凹部３に対象物を保定することで、正立蛍光顕微鏡を用い、生きたままの蛍光イメージング観察をはじめとする顕微鏡観察を実現できる。かかる観点では、マイクロチップ１の厚さは４００μｍ以下とすることが好ましく、３００μｍ以下がより好ましく、２００μｍ以下がさらに好ましい。
【００４６】
（マイクロチップの親水性）
また、マイクロチップ１は、少なくとも凹部３が形成されたマイクロチップ表面２が親水性を有している。通常、ＰＤＭＳは疎水性である。ＰＤＭＳのみを母材としてマイクロチップ１を形成した場合は、マイクロチップの表面２が疎水性を示す。マイクロチップ表面２が疎水性を示すと、例えばチャネル３ａに封入した線虫などの生物試料に脱水症状が生じる。これを防止するため、マイクロチップ１は、マイクロチップ表面２に親水性を付与している。親水性は、マイクロチップ表面２のみに付与するものであっても良いし、マイクロチップ全体に付与するものであっても良い。本明細書において親水性を有するとは、水接触角（２５℃、３０％ＲＨ）が１００度以下の状態をいう。好ましくは、水接触角が９０度以下であり、より好ましくは６０度以下であり、さらに好ましくは４０度以下である。
【００４７】
例えば、マイクロチップ表面２のみに親水性を付与する場合、マイクロチップ１の表面２に対し、例えばＭＰＣ（2-Methacryloyloxyethyl Phosphorylcholine；２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）ポリマーなどの親水性付与剤を塗布する。即ち、親水性を有する部分の厚さは、当該親水性付与剤の塗布の量（厚さ）によって調整し得る。典型的には、かかる表面親水処理がなされたマイクロチップ１は、ＰＤＭＳを母材とした基材層と、親水性付与剤を含む親水層とを備える。これにより、マイクロチップ１の表面２に親水性を付与することができる。ただし、この場合は、マイクロチップ１の表面２に塗布された親水性付与剤が空気と反応するため、時間経過に伴ってマイクロチップ表面２の親水性が失われていく。そのため、マイクロチップ１の長時間使用や反復使用には適さない。
【００４８】
また、マイクロチップ１の表面２にプラズマ処理を行うことにより、マイクロチップ表面２のみに対して親水性を付与することもできる。即ち、親水性を有する部分の厚さは、プラズマ照射の条件（照射強度、照射時間など）により調整し得る。典型的には、かかる表面親水処理がなされたマイクロチップ１は、プラズマ処理部分（親水性を有する部分）と、プラズマ未処理部分とを備える。また、プラズマ処理を施すことにより、マイクロチップ（典型的には凹部３）の最表面に極性を付与することができる。例えば、図２に示した動植物細胞用のマイクロチップ１を用いて細胞を培養する場合、培養細胞がウェル３ｂに接着することが好ましい。接着性の細胞は極性を有する足場に接着することで良好に増殖することが知られている。このため、特に接着性の細胞を対象としたマイクロビーム照射や観察にここで開示するマイクロチップ１を使用する場合には、プラズマ処理されたマイクロチップ１を好適に使用し得る。ただし、プラズマ処理による親水化では、上述したＭＰＣポリマーなどの親水性付与剤を塗布する場合と同様、時間経過に伴ってマイクロチップ表面２の親水性が失われていく可能性がある。
【００４９】
これに対し、マイクロチップ１の全体に親水性を付与する場合、例えば、マイクロチップ１の作製時に、母材となるＰＤＭＳに親水性付与剤を添加した状態で型に流し込んで固化させるようにすれば良い。これにより、マイクロチップ１の全体に対して親水性を付与することができる。この場合の親水性付与剤としては、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｂｒｉｊ３５、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００などの非イオン性界面活性剤を用いることができる。非イオン性界面活性剤は母材のＰＤＭＳに対して１０ｗｔ％程度までであれば、マイクロチップ１の成形に支障を来すことなく、ＰＤＭＳに親水性を付与することができる。ただし、非イオン性界面活性剤の添加量が１０ｗｔ％以下であっても、非イオン性界面活性剤の添加量が多くなると、ＰＤＭＳの透明性が損なわれる可能性がある。そのため、非イオン性界面活性剤の添加量は３ｗｔ％程度までとすることが好ましい。添加量が３ｗｔ％程度以下であれば、ＰＤＭＳの透明性を損なうことなく、ＰＤＭＳに有効な親水性を付与することができる。この他にも、ＰＤＭＳへ親水性を付与することが知られている従来公知の親水性付与剤を特に限定なく使用することができる。マイクロチップ１の全体に親水性を付与することにより、親水性の劣化現象を抑制することができるため、マイクロチップ１を反復使用しても親水性を保持しておくことができるという利点がある。
【００５０】
マイクロチップ１に親水性を付与することにより、生物試料を封入する凹部３にも親水性が付与される。かかる親水性付与により、凹部３内へ水を引き込みやすくなる。これにより、凹部３内への生物試料の封入をスムーズに行うことができる。また、凹部３の保水性を向上させることができる。換言すると、凹部３からの水の蒸発を抑制することができる。このため、湿潤状態を要求する生物試料を培養又は封入保定し、マイクロビーム照射又は観察を行う際、かかる生物試料の脱水や乾燥を低減することができる。例えば、チャネル３ａに線虫Ｃ．エレガンスなどの生物試料を封入保定した状態でマイクロビームを照射するとき、例えば、生物試料に脱水症状が生じること、およびそれに起因すると考えられる運動性の低下などを抑制することができるようになる。これにより、マイクロチップ１のチャネル３ａにＣ．エレガンスを封入保定した状態でマイクロビームを照射した後、線虫の運動性が低下していれば、その低下の要因がマイクロビーム照射によるものであることを容易に判別することができるようになる。また、生物試料に脱水症状を生じさせることなく、保定しておくことができるため、生物試料の観察（例えば、蛍光イメージング観察）にも適している。
【００５１】
また、図２に示した動植物細胞用のマイクロチップ１を作製する際には、上述したようにマイクロチップ１の全体に親水性を付与した後、さらにマイクロチップ表面２に対してプラズマ処理を行うようにしても良い。このプラズマ処理により、細胞のマイクロチップ表面２、とりわけ、ウェル３ｂの表面６への接着性を高めることができるため、培養細胞に適したマイクロチップ１を実現することができる。ただし、マイクロチップ１を浮遊細胞や血球細胞に用いる場合には、細胞の接着性は要求されないことがある。
【００５２】
対象として、接着性の細胞を用いる場合には、マイクロチップ１の表面２の細胞接着性を向上させる処理を施すことが好ましい。例えば、上述のプラズマ処理が挙げられる。また、プラズマ処理以外の方法を用いて細胞接着性を向上させることもできる。例えば、かかる細胞接着性を向上させる処理として、細胞接着性を向上させる表面コート剤をウェル３ｂの表面６に塗布する処理が挙げられる。この場合のウェル３ｂの表面６は、少なくともウェル３ｂの底面を含むものであれば良い。細胞接着性を向上させる表面コート剤としては、従来公知の細胞接着性高分子から適宜選択して用いれば良く、例えば、ポリリジン、ファイブロネクチン、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｉｎｃ．製のＣｅｌｌＴａｋ（登録商標）（ムラサキイガイ由来のポリフェノールタンパク質）などが挙げられる。かかる細胞接着性を向上させる処理は、１の方法を単独で実施しても良いし、２以上の方法を組み合わせても良い。また、マイクロチップ１に親水性を付与する処理、例えば、マイクロチップ１の全体に親水性を付与する処理、少なくとも表面２に親水性を付与する処理（親水性付与剤の塗布やプラズマ処理など）と、細胞接着性を向上させる処理とを、組み合わせて行っても良い。
【００５３】
（カバー）
上述のように構成されるマイクロチップ１は、使用する際に、カバーを組み合わせて用いることができる。当該カバーは、典型的にはチャネル３を被覆するように配置される。例えば、図３に示すカバー４が用いられる。カバー４は、例えば厚さ１００μｍ程度の透明シート状のカバーである。このカバー４は、例えばマイクロチップ１の表面２に密着するように被せられる。そのため、カバー４によってチャネル３ａに封入された生物試料がチャネル３ａの内部から離脱することを防ぐことができ、チャネル３ａ内に保定することができる。また、かかるカバー４をマイクロチップ１の表面２に被せることで、凹部３からの液体（典型的には水分）の蒸発を抑制することができる。生物試料の培養又は封入および凹部３からの水分蒸発抑制の観点から、マイクロチップ１とカバー４は密着するように配置するのが好ましい。ここで、「密着」とは、ＰＤＭＳの自己吸着性によりマイクロチップ表面２にカバー表面５が隙間無く接触している状態を指す。特に好ましくは、水密となるように配置する。マイクロチップ１とカバー４をＰＤＭＳの自己吸着性によって密着させて配置するため、マイクロチップ１およびカバー４の接触面、即ち、マイクロチップ表面２およびカバー表面５は平滑な平面とすることが好ましい。マイクロチップ１の表面２の平滑度は、より好ましくは、表面粗さＲａ(ＪＩＳ２００１年規格）が０．００７〜０．０１２μｍであると良い。カバー４の表面５の平滑度は、表面粗さＲａ(ＪＩＳ２００１年規格）が０．０３μｍ以下が好ましく、より好ましくは０．０２μｍ以下であり、さらに好ましくは０．０１μｍ以下である。カバーの表面５の平滑度の下限は特に限定されないが、好ましくは０．００２μｍ以上であり、より好ましくは０．００５μｍ以上である。尚、マイクロチップ１の表面２に設けるカバー４は、表面５（少なくともマイクロチップ１に接する面）が平滑であり、割れにくい透明な素材で形成されたものが好ましい。例えば、厚さ１００μｍ、Ｒａが０．００８μｍ程度であるポリスチレンフィルムは、透明で割れにくく、ＰＤＭＳへの密着性が良く、かつ容易に剥がせるため、好適である。また、ＰＤＭＳカバーフィルムを用いることもできる。
【００５４】
好ましい一実施形態では、マイクロチップ１上に配置された生物試料と液体（典型的には水又は水溶液）とをカバーで圧迫することで、生物試料をチャネル３ａ内に誘導することができる。また、このようにマイクロチップ１上にカバー４を圧迫することで、マイクロチップ１とカバー４の密着性を向上させることができる。
【００５５】
カバー４を用いてマイクロチップ１の凹部３内に保定された生物試料は、目視又は顕微鏡などの拡大鏡を用いて観察し易いことが好ましい。このため、マイクロチップ１に配するカバーは、透明であることが好ましい。即ち、マイクロチップ１の表面２に被せるカバー４は、透明であることが好ましい。或いは、マイクロチップ１の表面２以外、例えば裏面にカバーを配置する場合には、当該カバーも透明であることが好ましい。尚、上記マイクロチップ１の表面２に被せるカバー４とマイクロチップ１の裏面に配置するカバーは同一のものを用いても良いし、異なる性質のものを用いても良い。カバーの平行光線透過率（ＪＩＳＫ７１０５プラスチックの光学的特性試験方法による）は８０％以上が望ましい。好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上である。また、カバーの曇価（へーズ）（ＪＩＳＫ７１０５プラスチックの光学的特性試験方法による）は４．０％以下が望ましい。好ましくは２．５％以下、より好ましくは０％である。観察し易さ、又は実験し易さ（マイクロビームの照射し易さ）の観点から、マイクロチップ１に配するカバーの屈折率は小さいことが好ましい。例えば、カバーの屈折率は１．０以下が好ましく、例えば０．８以下がより好ましい。屈折率の下限は特に限定されないが、例えば０．３以上とすれば良い。また、観察又は励起に用いる光の波長領域で自家蛍光の無い又は少ないカバーは、蛍光観察において好適である。また、マイクロチップ１に配するカバーの光透過率（紫外可視分光光度計を用いた直線透過法による）は、用いる光の波長領域で７０％以上であることが好ましく、８０％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましい。例えば、可視光観察を行う場合には、カバーの光透過率は、波長３６０〜８６０ｎｍで８０％以上であることが望ましく、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上である。紫外光領域の光を観察に用いる場合（例えば、マルチフォトン観察を行う場合）には、波長８６０〜１５００ｎｍでの光透過率が８０％以上であることが好ましく、より好ましくは９０％以上である。
【００５６】
カバー４をマイクロチップ１から着脱する操作性の観点から、カバー４は柔軟であることが好ましい。しなやかなカバー４を用いることで、マイクロチップ１の表面２に密着したカバー４を取り外す際に当該カバーの破損を防ぐことができる。
【００５７】
上記カバーの厚さｔ２は特に限定されない。しかし、マイクロチップ１の表面２にカバー４を着脱する際の操作性の観点から、例えばカバー４は５０μｍ以上とすることが好ましく、８０μｍ以上がより好ましい。この程度の厚さのカバー４を用いることで着脱操作時にカバー４の破損を防ぐことができる。一方で、マイクロビームの透過性、又は、視認性（観察性）の観点からすると、カバー４の厚さｔ２は３００μｍ以下が好ましく、２００μｍ以下がより好ましい。例えば、１００μｍ以上１５０μｍ以下の厚さのカバー４を用いることが好ましい。マイクロチップ１の裏面に配置するカバーも、これに準じたカバーが好ましい。
【００５８】
また、カバー４は、マイクロチップ１と同様に、親水性を有することが好ましい。親水性を有するカバー４を用いることで、凹部３からの液体（典型的には水分）の蒸発をより抑制することができる。これにより、生物試料の乾燥を防止することができる。この場合、例えば水接触角（２５℃、３０％ＲＨ）が１００度以下のカバー４を用いることが好ましい。例えば９０度以下のカバー４がより好ましい。尚、カバー４の水接触角の下限は特に限定されないが、例えば、４０度以上であれば良く、６０度以上であっても良い。マイクロチップ１の凹部３からの液体（水分）の蒸発を抑制する観点からは、マイクロチップ１とカバー４の表面５との両方が親水性を有することが好ましく、例えば水接触角が１００度以下のマイクロチップ１と、表面５の水接触角が１００度以下のカバー４とを組み合わせて用いることが好ましい。表面５の水接触角が６０度以上１００度以下のカバー４は好適な組合せの一条件として例示される。
【００５９】
また、酸素を透過可能なカバー４は、凹部３に培養又は封入した生物試料に酸素を供給可能な点で好ましい。生物試料を一定時間以上凹部３内に培養又は封入して保定する場合、又は、酸素要求性の高い生物試料を用いる場合には、マイクロチップ１の凹部３内の空間において酸素が不足しがちであるため、生物試料の酸欠状態を防ぐためにもカバー４の酸素透過性が重要となる。そのため、例えば、ガスクロマトグラフ法で測定した場合の酸素透過率（２０℃、５０％ＲＨ）が３０ｍＬ／（ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ）以上であるカバー４が望ましい。１時間を超える長時間の培養又は封入を考慮する場合には、酸素透過率が１００ｍＬ／（ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ）以上であることが好ましく、より好ましくは１０００〜１５００ｍＬ／（ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ）である。
【００６０】
さらに、二酸化炭素を透過可能なカバー４は、凹部３に培養又は封入した植物などの生物試料に二酸化炭素を供給可能、或いは凹部３から二酸化炭素を排出可能な点で好ましい。生物試料を一定時間以上凹部３内に培養又は封入して保定する場合、又は、二酸化炭素要求性の高い生物試料を用いる場合には、マイクロチップ１の凹部３内の空間において二酸化炭素が不足しがち或いは二酸化炭素が過剰になりがちであるため、生物試料に対する二酸化炭素の影響をコントロールするためにもカバー４の二酸化炭素透過性が重要となる。そのため、例えば、ガスクロマトグラフ法で測定した場合の二酸化炭素透過率（２０℃、５０％ＲＨ）が３０ｍＬ／（ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ）以上であるカバー４が望ましい。１時間を超える長時間の培養又は封入を考慮する場合には、二酸化炭素透過率が３００ｍＬ／（ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ）以上であることが好ましく、より好ましくは３０００ｍＬ／（ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ）以上である。ここで、酸素透過性と二酸化炭素透過性のバランスを考慮すると、例えば酸素透過率が１０００ｍＬ／（ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ）のカバー４では、二酸化炭素透過率が３０００ｍＬ／（ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ）以上であることが望ましい。換言すると、二酸化炭素透過率が酸素透過率の３倍以上のものを選択でき、１０倍程度でも良い。
【００６１】
カバー４の材質は、特に限定されないが、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエステル、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ガラス、ポリイミドなどが挙げられる。なかでも、ポリスチレンおよびポリプロピレンは、上述の酸素透過性に優れることから、カバー４の材質としてより好ましい。尚、従来公知の種々の添加剤（可塑剤、架橋剤、安定剤など）が添加されていても良い。
【００６２】
また、ＰＤＭＳを母材として形成されるマイクロチップ１は、自己吸着性（密着性）が高いため、裏面が試料台、例えば実体顕微鏡のステージに吸着してしまい操作しづらくなることがある。これを防止するため、マイクロチップ１の裏面にも厚さ１００μｍ程度のカバーを敷いて試料台に載置するようにしても良い。マイクロチップ１の裏面に設けるカバーは、表面が平滑で透明な素材で形成されたものであれば良い。例えば、上記のポリスチレンフィルムは好適である。また、例えば、厚さが１００μｍ、表面粗さＲａ(ＪＩＳ２００１年規格）が０．００１μｍ程度であるカバーガラスやスライドガラスは、透明でＰＤＭＳへの密着性が高く、かつ容易に剥がせるため、好適である。また、イオンマイクロビームを照射する場合、マイクロビームは、マイクロチップ１に加え、マイクロチップ表面２および裏面に配置したカバーを透過する必要がある。このため、カバーを用いてイオンマイクロビーム照射を行う場合には、マイクロチップ１の表面２および裏面の各カバーの厚さとマイクロチップ１の厚さｔの総和よりも水中飛程が長いイオン種を選択して使用するのが好ましい。水中飛程が比較的短いイオン種のマイクロビーム照射を行う場合などには、カバー４として、例えば、厚さｔ２が２５μｍ程度である東レ・デュポン株式会社製のポリイミドフィルム（カプトン（登録商標））を用いても良い。また、イオンマイクロビーム照射において、生物試料を透過したイオンを視覚的に確認する場合には、マイクロチップ１の裏面に設けるカバーを、イオン飛跡検出用プラスチックフィルム、例えば、フクビ化学工業株式会社製のＣＲ-３９（Ｓｏｌｉｄ  Ｓｔａｔｅ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｔｒａｃｋ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ、ＴＮＦ−１）とすると良い。尚、ＣＲ−３９の厚さは、使用するイオン種によって、水中飛程やイオン飛跡検出のためのアルカリエッチングの条件等が異なることを考慮して１００μｍや４５０μｍなど、適したものを選択すれば良い。さらに、マイクロチップ１に培養又は封入保定した生物試料の蛍光イメージング観察を行う場合は、マイクロチップ表面２および裏面に設けるカバーは、上記の特徴に加えて、自家蛍光の無い又は少ない素材で形成されたものを選択すると良い。例えば、ポリスチレンフィルムは好適に使用できる。
【００６３】
（キット）
他の実施形態として、上記マイクロチップ１と上記カバー４と組み合わせた生物試料培養キット又は生物試料封入キットを提供し得る。かかる生物試料培養キット又は生物試料封入キットは、マイクロチップ１の凹部３とカバー４との間に構成される空隙内に生物試料を培養又は封入する。上記生物試料培養キット又は生物試料封入キットは、当該キット内に培養又は封入した生物試料を湿潤状態に保持する目的で使用し得る。この場合、表面粗さＲａが０．００７〜０．０１２μｍ程度のマイクロチップ１とＲａが０．０３μｍ以下のカバー４を組み合わせることが好ましい。マイクロチップ１の表面２に被せるカバー４としては、例えば、厚さｔ２が１００〜１３０μｍ、Ｒａが０．００８μｍ程度であるポリスチレンフィルムを使用することができる。また、マイクロチップ１の裏面に配置するカバーとしては、上記ポリスチレンフィルムの他、Ｒａが０．００２μｍ程度であるカバーガラスやスライドガラスが好適に使用できる。上記生物試料培養キット又は生物試料封入キットは、当該キット内に培養又は封入した生物試料にマイクロビームを照射する目的で使用し得る。この場合、マイクロチップ１の厚さｔとその表面２および裏面に設けるカバーの厚さの総和が使用するイオン種の水中飛程以下となるようにすることが好ましい。上記生物試料培養キット又は生物試料封入キットは、当該キット内に培養又は封入した生物試料を蛍光イメージング観察する目的で使用し得る。この場合、自家蛍光の無い又は少ない素材からなるマイクロチップ１とカバーとを組み合わせて使用することが好ましい。
【００６４】
（マイクロチップの使用方法）
上述のマイクロチップ１は、生物試料を凹部３に保定するために好適に使用し得る。例えば、生物試料が線虫である場合、図１に示したマイクロチップ１が使用される。
【００６５】
マイクロチップ１に生物試料を封入する方法は、凹部３に生物試料を誘導する操作を含む。即ち、マイクロチップ１の表面２（凹部３形成面）に生物試料を配置し、当該配置された生物試料を凹部３へ誘導する。上記生物試料として線虫を用いる場合であれば、例えば、マイクロチップ１の表面２に液体（典型的には、水又は水溶液）を所定量滴下し、当該液滴中に線虫を移入することで線虫をマイクロチップ１の表面２に配置することができる。或いは、液体中に線虫を分散させておき、当該線虫分散液をマイクロチップ１の表面２に所定量滴下することで線虫をマイクロチップ１の表面２に配置しても良い。
【００６６】
上記マイクロチップ１の表面２に形成された生物試料を凹部３に誘導する方法は特に限定されない。例えば、生物試料の運動能により凹部３に嵌るのを待つ、振動して落とし込む、白金線を用いて押し込む、上部から圧力をかけて押し込む等、生物試料の特性に応じて適宜選択すれば良い。上記生物試料として線虫を用いる場合であって、上述したようにマイクロチップ１の表面２上に滴下した液滴中に線虫を配置する場合であれば、当該液滴をマイクロチップ１の表面２に向かって押しつぶして凹部３内に液体（水又は水溶液）を行き渡らせることで、当該液滴中の線虫を凹部３に誘導することができる。
【００６７】
さらに、マイクロチップ１の凹部３に生物試料を保定するために、上記カバー４を組み合わせて用いても良い。即ち、マイクロチップ１の凹部３内に生物試料を封入する方法は、マイクロチップ１の表面２（凹部３形成面）に、凹部３を覆うようにカバー４を配置する操作をさらに含んでも良い。マイクロチップ１の表面２にカバー４を密着させる観点からは、当該マイクロチップ１とカバー４とを押圧することが好ましい。このようにカバー４を用いる場合には、上記液滴を押しつぶす操作に当該カバー４を用いることで、手技を簡略化できるため好ましい。
【００６８】
また、図２に示したマイクロチップ１を用いる場合も同様であり、生物試料をウェル３ｂ内に封入し、マイクロチップ１の表面２にカバー４を被せることにより、生物試料をウェル３ｂ内に保定することができる。
【００６９】
また、マイクロチップ１は、上記のようにして生物試料を凹部３に封入した状態で生物試料に対してマイクロビームを照射する際に好適に使用される。例えば図１のマイクロチップ１を用いて線虫Ｃ．エレガンスをチャネル３ａに保定した状態であれば、マイクロビーム照射時に線虫の動きを最小限に抑えることができるので、線虫の特定の組織や領域、或いは特定の細胞一つを狙って局所的にマイクロビームを照射することができる。
【００７０】
また、マイクロチップ１は、上記のようにして生物試料を凹部３に封入した状態で生物試料を培養又は飼育する際にも好適に使用される。例えば図２のマイクロチップ１を用いて生物試料をウェル３ｂに封入した状態であれば、生物試料を封入したマイクロチップ１を所定の培養環境下又は飼育環境下で所定時間静置することで、生物試料を培養又は飼育することができる。
【００７１】
また、マイクロチップ１は、上記のようにして生物試料を凹部３に封入した状態で生物試料を観察する際に好適に使用される。例えば、マイクロチップ１を用いて生物試料を封入保定した状態であれば、生物試料の動きを最小限に抑えることができるので、運動能を有する生物試料を観察し易い。また、マイクロチップ１の凹部３に封入保定することで、当該封入保定された生物試料を容易に区別可能である。このことから、特定の細胞、特定の細胞集団、又は特定の微小生物などの経時的な観察を行い易い。尚、観察方法は特に限定されず、可視光領域での顕微鏡観察、蛍光顕微鏡観察など目的に応じて適宜選択すれば良い。
【００７２】
尚、上記マイクロチップ１に封入した生物試料へのイオンマイクロビーム照射、上記マイクロチップ１に封入した状態での生物試料の培養又は飼育、又は上記マイクロチップ１に封入した生物試料の観察は、それら単独で行っても良いし、２つ以上を組み合わせて行っても良い。
【００７３】
［実験１］
線虫Ｃ．エレガンス（以下では、単に「線虫」と示すことがある。）の野生型を対象として、上記マイクロチップ１がマイクロビーム照射に適しているかを検証する実験を行った。図４は、マイクロチップ１を使用したイオンマイクロビーム局部照射実験の装置の概要を示す図である。実験に使用したマイクロチップ１は、図１に示したものであり、その厚さｔは３００μｍである。
【００７４】
まず、マイクロチップ１の表面２に形成された互いに平行な２つのチャネル３ａ間に、Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒなどの緩衝液を１滴（約１μＬ）滴下する。次に、実体顕微鏡で観察しながら、培養プレートから白金線を用いて線虫の成虫を１匹或いは複数匹捕捉し、洗浄した後にマイクロチップ１上に滴下した溶液の液滴の中に入れる。実験に必要な線虫の数に応じてこの操作を繰り返す。その後、マイクロチップ１上に厚さ１００μｍのカバー４を被せ、カバーで液滴を転がしながら線虫をチャネル３ａに誘導し、カバー４をマイクロチップ１の表面２に密着させる。チャネル３ａにカバー４を被せることにより、線虫がチャネル３ａの内部に自ら収まる。また、カバー４により、チャネル３ａの内部から線虫が離脱することを防ぐことができ、チャネル３ａに保定することができる。さらに、マイクロチップ１の裏面にも厚さ１００μｍのイオン飛跡検出用プラスチックフィルムをカバーとして配置した状態で試料台に載置する。
【００７５】
したがって、図２に示すように、イオンマイクロビーム照射装置の試料台に載置する、試料の厚さは、線虫を封入保定したマイクロチップ１の厚さｔ、表面２および裏面に配置した２枚のカバーの厚さを合わせた厚さとなり、合計５００μｍとなる。この状態で、チャネル３ａに封入保定された生物試料（線虫）に対し、イオンマイクロビーム照射装置のマイクロアパーチャーから水中飛程１２１０μｍの２２０ＭｅＶの炭素イオンマイクロビームを照射すると、マイクロビームがイオンマイクロビーム照射装置のイオン検出系に到達した。
【００７６】
図５は、イオンマイクロビーム照射装置のイオン検出系に到達したマイクロビームの飛跡（照射痕）を示す図である。これは、マイクロチップ１の裏面に設けたイオン飛跡検出用プラスチックフィルムＣＲ−３９を透過したマイクロビームの照射痕（エッチピット）をアルカリエッチング処理により可視化したものである。これと共に、試料台の下部に配した、ビームを電気信号に変換するイオン検出系（シンチレーター−光電子増倍管アセンブリなど）では、到達したイオンビームが計数された。このことから、マイクロチップ１をマイクロビームが透過したことは明らかである。
【００７７】
次に、比較例として、従来のＰＤＭＳマイクロチップ（非特許文献１）を使用して上記と同様の実験を行った。図６は、従来のＰＤＭＳマイクロチップを使用した実験装置の概要を示す図である。実験に使用したＰＤＭＳマイクロチップの厚さｔは約２．５ｍｍである。図６に示すように、イオンマイクロビーム照射装置の試料台に載置する、線虫を封入保定したマイクロチップとその表面および裏面に配置したカバーの厚さは、合計で約２．７ｍｍとなる。その状態で、チャネルに封入保定された線虫に対し、イオンマイクロビーム照射装置のマイクロアパーチャーから水中飛程１２１０μｍの２２０ＭｅＶの炭素イオンマイクロビームを照射すると、マイクロビームはイオンマイクロビーム照射装置のイオン検出系に到達せず、線虫に照射されたマイクロビームを測定することができなかった。
【００７８】
以上のことから、本発明におけるマイクロチップ１は、生物試料を封入保定した状態で局所的に各種イオンマイクロビームを照射するのに適していることが明らかである。また、Ｘ線、電子線、レーザーなどのマイクロビーム照射にも好適に使用できる。
【００７９】
［実験２］
次に、上述のように親水性を付与したマイクロチップ１が生物試料の脱水症状を緩和できるかを検証する実験を行った。本実験では、線虫Ｃ．エレガンスの野生型を対象とし、線虫の洗浄およびチャネル３ａへの封入に用いる溶液として、純水（Ｍｉｌｌｉ  Ｑ  ｗａｔｅｒ）と、第１の緩衝液（Ｓ  ｂａｓａｌ  ｂｕｆｆｅｒ）と、第２の緩衝液（Ｍ９  ｂｕｆｆｅｒ）との３種類の溶液を用意し、それらの溶液が線虫に及ぼす影響を調べた。尚、第１の緩衝液および第２の緩衝液の組成は、次の表２に示す通りである。
【００８０】
【表２】
2019225633.tif 000004
【００８１】
まず、基準データを得るため、線虫を培養したプレートから白金線を用いて線虫の成虫５匹以上を捕捉し、３種類の溶液のうちの１つの溶液の液滴中で洗浄する。洗浄した５匹以上の線虫を、白金線を用いて寒天プレート（以下、「ＮＧＭ」という。）上に移し、１時間自由に運動させる。その後、白金線を用いて線虫を新しいＮＧＭ上に移し、線虫の頭部屈曲回数を計数する。頭部屈曲回数は１匹当たり２０秒間計数することとし、合計５匹の線虫の頭部屈曲回数の平均値を求める。これを３種類の溶液のそれぞれについて各６回独立して行った実験の結果を図７に示す。尚、図７におけるエラーバーは標準誤差を示す。
【００８２】
図７に示すように、ＮＧＭ上で１時間自由に運動させた場合には、３種類の溶液のいずれを使用して洗浄した場合であっても、線虫の平均頭部屈曲回数は約２５回／２０秒で有意差は無い、即ち、各溶液の線虫の運動性に対する有意な影響は認められない（有意水準をＰ＜０．０５とした場合）。この平均頭部屈曲回数を次の実験の基準データとする。
【００８３】
次に、従来のＰＤＭＳマイクロチップ（以下、「チップＬ」と示すことがある。）と、上述したマイクロチップ１（図１参照）と同形状であって親水性を付与していないマイクロチップ（以下、「チップＢ１」と示すことがある。）と、マイクロチップ全体に親水性を付与したマイクロチップ１（以下、「チップＢ２」と示すことがある。）との３つのマイクロチップを用意し、それぞれのマイクロチップを用いて上記と同様の実験を行った。即ち、線虫を培養したプレートから白金線を用いて線虫の成虫５匹以上を捕捉し、３種類の溶液のうちの１つの溶液の液滴中で洗浄する。洗浄した５匹以上の線虫を、白金線を用いてマイクロチップ上の同じ溶液の液滴中に移し、カバーを用いて全ての線虫をチャネルに収め、カバーをマイクロチップに密着させる。即ち、線虫をチャネルの内部に封入保定するのである。その状態で１時間静置した後、マイクロチップ表面からカバーを取り除き、線虫を封入したチャネルに同じ溶液を滴下する。液滴中の線虫を、白金線を用いてＮＧＭ上に移し、線虫の頭部屈曲回数を計数する。上記と同様に、頭部屈曲回数は１匹当たり２０秒間計数することとし、合計５匹の線虫の頭部屈曲回数の平均値を求める。
【００８４】
図８は、溶液として純水を使用した場合の線虫の頭部屈曲回数の相対値を示す図であり、図７に示した自由に運動させた線虫の純水使用時の平均頭部屈曲回数を１として正規化して表している。図８に示すように、溶液として純水を使用した場合、従来のＰＤＭＳマイクロチップ（チップＬ）のみにおいて、線虫を１時間チャネルに封入保定した後の運動性が有意に低下した（＊Ｐ＜０．０５）。図８における＊は有意水準Ｐ＜０．０５で対照群との間に有意差があることを示している。この点は、以下の他の図においても同様である。
【００８５】
図９は、溶液として第１の緩衝液を使用した場合の線虫の頭部屈曲回数の相対値を示す図であり、図７に示した第１の緩衝液使用時の線虫の平均頭部屈曲回数を１として正規化して表している。図９における＊＊は有意水準Ｐ＜０．０１で対照群との間に有意差があることを示している。この点は、以下の他の図においても同様である。図９に示すように、溶液として塩濃度の高い第１の緩衝液を使用した場合、従来のＰＤＭＳマイクロチップ（チップＬ）と、親水性を付与していないマイクロチップ（チップＢ１）との２つのマイクロチップにおいて、線虫を１時間チャネルに封入保定した後の運動性が有意に低下した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。
【００８６】
図１０は、溶液として第２の緩衝液を使用した場合の線虫の頭部屈曲回数の相対値を示す図であり、図７に示した第２の緩衝液使用時の線虫の頭部屈曲回数を１として正規化して表している。図１０に示すように、溶液としてリン酸および塩濃度の高い第２の緩衝液を使用した場合、従来のＰＤＭＳマイクロチップ（チップＬ）のみにおいて、線虫を１時間チャネルに封入保定した後の運動性が有意に低下した（＊＊Ｐ＜０．０１）。
【００８７】
以上のことから、本発明のように、親水性を付与したマイクロチップ１（チップＢ２）は、線虫を洗浄および封入する際に使用する溶液の種類に関わらず、１時間チャネル３ａに封入保定した後においても線虫の運動性に対する影響は観られない。即ち、マイクロチップ全体に親水性を付与したマイクロチップ１を使用すれば、線虫のような微小生物の脱水症状を抑制できることが明らかである。
【００８８】
［実験３］
次に、マイクロチップ表面のみを親水化した場合と、マイクロチップ全体を親水化した場合とを比較する実験を行った。上述したマイクロチップ１と同形状であって親水性を付与していないマイクロチップ（以下、「チップＢ１」と示すことがある。）と、上述したマイクロチップ１と同形状であってプラズマ処理によって表面のみに親水性を付与したマイクロチップ（以下、「チップＢ１」と示すことがある。）と、マイクロチップ全体に親水性を付与したマイクロチップ１（以下、「チップＢ２」と示すことがある。）との３つのマイクロチップを用意し、それぞれのマイクロチップを用いて上記と同様の実験を行った。本実験では、線虫Ｃ．エレガンスの野生型を対象とし、線虫の洗浄および封入には、実験２で線虫の運動性を最も低下させた塩濃度の高い第１の緩衝液（Ｓ  ｂａｓａｌ  ｂｕｆｆｅｒ）を用いる。また、蛍光イメージング観察などでの長時間使用を想定し、線虫のチャネル３ａへの封入時間を３時間とし、３時間後にＮＧＭ上に移した線虫５匹の頭部屈曲回数を計数して平均値を求める。比較対象として、ＮＧＭ上で３時間自由に運動させた後、新たなＮＧＭ上に移した線虫５匹の頭部屈曲回数も計数して平均値を求める。これを３種類のマイクロチップとＮＧＭのそれぞれについて各３回独立して行った実験の結果を図１１に示す。
【００８９】
図１１に示すように、親水性を付与しておらず疎水性を示すマイクロチップ（チップＢ１）およびプラズマ処理により表面のみに親水性を付与したマイクロチップ（チップＢ１）に３時間封入保定した線虫では、いずれも運動性が有意に低下した（＊Ｐ＜０．０５）。これに対し、マイクロチップ全体に親水性を付与したマイクロチップ（チップＢ２）に３時間封入保定した線虫の運動性には、ＮＧＭ上で自由に運動させた線虫との間に有意な差が無く、脱水による運動性の低下が生じないことが明らかとなった。
【００９０】
したがって、生物試料の脱水症状を抑制するためには、マイクロチップ１の表面２のチャネル３ａのみに対して親水性を付与するよりも、マイクロチップ全体に対して親水性を付与する方が、特に長時間使用時において顕著な効果が得られることが判明した。
【００９１】
［実験４］
次に、マイクロチップ１の反復使用によって親水性に劣化が生じないかどうかを検証する実験を行った。本実験では、線虫Ｃ．エレガンスの野生型を対象とし、線虫の洗浄および封入には、実験３と同様の第１の緩衝液を用いることとし、マイクロチップ全体に親水性を付与したマイクロチップ１（以下、「チップＢ２」と示すことがある。）のチャネル３ａに線虫を３時間封入保定した後に線虫を取り出し、同マイクロチップ１を純水（Ｍｉｌｌｉ  Ｑ  ｗａｔｅｒ）で洗浄したうえで、７０％エタノールで滅菌処理し、その後、乾燥させる。線虫の封入保定、マイクロチップ洗浄および滅菌処理の一連の作業を、９回反復して行う。そして、１０回目の使用時には、マイクロチップ１のチャネル３ａに線虫を３時間封入保定した後、線虫をＮＧＭ上に移し、５匹の頭部屈曲回数を計数して平均値を求める。比較対象として、ＮＧＭ上で３時間自由に運動させた後、新たなＮＧＭ上に移した線虫５匹の頭部屈曲回数も計数して平均値を求める。これをチップＢ２とＮＧＭについて各３回独立して行った実験の結果を図１２に示す。
【００９２】
図１２に示すように、マイクロチップ全体に親水性を付与したマイクロチップ１を１０回使用した場合であっても、マイクロチップ１のチャネル３ａに３時間封入保定した線虫の運動性には、ＮＧＭ上で３時間自由に運動させた線虫と有意な差が無かった。したがって、マイクロチップ全体に親水性を付与したマイクロチップ１は、長時間かつ反復して使用する場合であっても親水性を保持し、線虫Ｃ．エレガンスのような微小生物の脱水症状を抑制できることが明らかである。
【００９３】
［実験５］
次に、マイクロチップ１が観察、特に蛍光イメージング観察用として適しているか否かを検証する実験を行った。図１３は、マイクロチップ１のチャネル３ａに線虫を封入保定した状態を撮影した明視野像である。チャネル３ａに封入保定した線虫は、頭から尾まで伸びる体壁筋細胞のみを蛍光プローブで標識した遺伝子組換え線虫である。蛍光がわからない図１３の明視野像では野生型の線虫と変わらない。これに対し、図１４は、同じ線虫の蛍光像である。蛍光像は、細胞の収縮強度に対応する蛍光強度の画像となる。マイクロチップ１は、麻酔薬を使うことなく線虫の動きを抑制し、生きた状態のままで観察することを可能にする。しかも、線虫の脱水症状を抑制することができ、長時間の観察にも好適である。また、上述したマイクロチップ１には、自家蛍光が全く無い。そのため、線虫の筋細胞や神経細胞等の活動を捉えることを目的とする蛍光イメージング観察にも、好適に利用できる。
【００９４】
［実験６］
次に、図２に示したマイクロチップ１が細胞培養に適しているか否かを検証する実験を行った。図１５は、市販の細胞培養用ディッシュを用いてヒト細胞を培養した結果を撮影した明視野像である。即ち、市販の細胞培養用ディッシュにヒト細胞懸濁液をスポットし（播き込み）、脱水防止のために蓋を被せて３７℃で培養し、６時間経過後にディッシュ内を撮影したものである。図１５に示すように、市販の細胞培養用ディッシュを使用すれば、細胞がディッシュに接着し、増殖し始めていることがわかる。
【００９５】
図１６は、図２に示したマイクロチップ１であってマイクロチップ全体に親水性を付与し、マイクロチップ表面２に対してプラズマ処理を行っていないマイクロチップを用いてヒト細胞を培養した結果を撮影した明視野像である。即ち、図２のマイクロチップ１を滅菌処理した後、無菌処理ディッシュ内に置き、ヒト細胞懸濁液を播き込み、脱水防止のために蓋を被せて３７℃で培養し、６時間経過後にウェル３ｂ内を撮影したものである。図１６に示すように、マイクロチップ全体に親水性を付与しただけのマイクロチップ１では、６時間経過後の細胞の接着および増殖が不十分であることがわかる。
【００９６】
次に、図１７は、図２に示したマイクロチップ１であって、マイクロチップ全体に親水性を付与し、さらにその表面２に対してプラズマ処理を行ったマイクロチップを用いてヒト細胞を培養した結果を撮影した明視野像である。即ち、プラズマ処理を行ったマイクロチップ１を滅菌処理した後、無菌処理ディッシュ内に置き、ヒト細胞懸濁液を播き込み、脱水防止のために蓋を被せて３７℃で培養し、６時間経過後にウェル３ｂ内を撮影したものである。図１７に示すように、マイクロチップ表面２にプラズマ処理を行ったマイクロチップ１では、図１５に示した市販の細胞培養用ディッシュを用いた場合と同様に細胞が接着し、増殖し始めていることが確認できる。したがって、上述したマイクロチップ１は、マイクロチップ表面２に対してプラズマ処理を行えば、培養細胞にも好適に利用することができる。
【００９７】
次に、図１８は、図２に示したマイクロチップ１であって、マイクロチップ全体に親水性を付与し、さらにマイクロチップ１のウェル３ｂの表面６に細胞接着性を向上させるコート剤（ＣｅｌｌＴａｋ（登録商標））を塗布したマイクロチップ１を用いてヒト細胞を培養した結果を撮影した明視野像である。即ち、ウェル３ｂの表面６に細胞接着性を向上させるコート剤を塗布したマイクロチップ１を滅菌処理した後、無菌処理ディッシュ内に置き、ヒト細胞懸濁液を播き込み、脱水防止のために蓋を被せて３７℃で培養し、６時間経過後にウェル３ｂ内を撮影したものである。図１８に示すように、マイクロチップ１のウェル３ｂの表面６に細胞接着性を向上させるコート剤を塗布したマイクロチップ１では、図１５に示した市販の細胞培養用ディッシュを用いた場合と同様に細胞が接着し、増殖し始めていることが確認できる。したがって、ウェル３ｂの表面６に細胞接着性を向上させるコート剤を塗布したマイクロチップ１は、培養細胞に好適に利用することができる。
【００９８】
次に、マイクロチップ１が培養細胞観察、特に蛍光イメージング観察用として適しているか否かを検証する実験を行った。マイクロチップ１として、マイクロチップ全体に親水性を付与したマイクロチップ（上記実験２における「チップＢ２」と同様の材質のマイクロチップ）を用いた。図１９は、マイクロチップ１全体に親水性を付与し、さらにウェル３ｂの表面６に細胞接着性を向上させるコート剤（ＣｅｌｌＴａｋ（登録商標））を塗布したうえで、蛍光色素で全体を生体染色したヒト細胞を播種して接着した状態で、ウェル３ｂの表面６にカバーを密着させ、正立蛍光顕微鏡を用いて撮影した蛍光像である。マイクロチップ１は、細胞を接着した状態で蛍光像を取得することができ、自家蛍光が全く無い。マイクロチップ１は厚さｔが薄いため、通常の生きた細胞の蛍光イメージング観察では水浸レンズを用いない限り実現できない正立顕微鏡を用いた撮影ができる。そのため、動植物の生きた細胞の動態を生体蛍光染色を用いて解析することを目的とする蛍光イメージング観察にも、好適に利用できる。
【００９９】
［実験７］
次に、マイクロチップ１に被せるカバー４の酸素透過性が生物試料に与える影響を検証する実験を行った。本実験では、線虫Ｃ．エレガンスの野生型の成虫を対象とし、実験２で使用したマイクロチップ全体に親水性を付与したマイクロチップ１（チップＢ２）のチャネル３ａへの封入のために被せるカバー４として、例えば波長３６０〜１５００ｎｍでの光透過率が９０％以上であり観察に好適ではあるが、酸素を透過しないカバーガラス（以下、「ガラスカバー」と示すことがある。）、酸素透過率（２０℃、５０％ＲＨ）が３０ｍＬ／（ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ）程度と極めて低いポリエステルフィルム（以下、ＰＥＴカバーと示すことがある。）、酸素透過率が１０００ｍＬ／（ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ）以上と極めて高いポリスチレンフィルム（以下、ＰＳカバーと示すことがある。）とを用い、それらの使用が線虫に及ぼす影響を調べた。ガラスカバーは厚さｔが１３０〜１７０μｍであり、ＰＥＴカバーは厚さｔが約１３０μｍであり、ＰＳカバーは厚さｔが１２５μｍである。線虫の洗浄およびチャネル３ａへの封入には、実験２において線虫の運動性を最も低下させた、即ち、脱水を生じやすい塩濃度の高い第１の緩衝液（Ｓ  ｂａｓａｌ  ｂｕｆｆｅｒ）を用いた。線虫を培養したプレートから白金線を用いて線虫の成虫を１０匹以上捕捉し、第１の緩衝液の液滴中で洗浄した。洗浄した１０匹以上の線虫を、マイクロチップ１上に滴下した緩衝液の液滴中に白金線を用いて移し、カバー４を用いて全ての線虫をチャネル３ａに収め、カバー４をマイクロチップ１の表面に密着させた。イメージング等での長時間使用を想定して線虫のチャネル３ａへの封入時間を３時間とした。即ち、３つのマイクロチップ１のチャネル３ａに線虫を封入し、それぞれのマイクロチップ１に異なるカバー４を被せて３時間静置した。その後、各マイクロチップ１の表面２からカバー４を取り除き、線虫を封入したチャネル３ａに第１の緩衝液を滴下する。液滴中の線虫をＮＧＭ上に移し、線虫１匹当たりの頭部屈曲回数を２０秒間計数することとし、合計１０匹の線虫の頭部屈曲回数の平均値を求めた。また、比較対象として、ＮＧＭ上で３時間自由運動させた後、新たなＮＧＭに移した線虫１０匹の頭部屈曲回数も計数して平均値を求めた。この実験をガラスカバー、ＰＥＴカバー、ＰＳカバーとＮＧМについて各５回独立して行った結果を図２０に示す。尚、使用した３種類のカバーの物性の測定値を次の表３に示す。
【０１００】
【表３】
2019225633.tif 000005
【０１０１】
図２０に示すように、マイクロチップ全体に親水性を付与したマイクロチップ１（チップＢ２）のチャネル３ａにガラスカバーを被せて３時間封入した線虫およびＰＥＴカバーを被せて封入した線虫の運動性はいずれも、ＮＧＭ上で３時間自由運動させた線虫に比べて有意に低下した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。一方、ＰＳカバーを被せて封入した線虫の運動性は、ＮＧＭ上で３時間自由運動させた比較例との間に有意な差が無かった。即ち、線虫をチャネル３ａに封入する際にＰＳカバーを用いれば、酸欠や脱水による運動性の低下が生じないことが明らかとなった。
【０１０２】
上記結果について考察すると、ガラスカバーで封入保定した場合には、３時間の封入保定後に全く脱水症状を起こさずに正常な運動性を示す個体と、脱水症状を起こして著しく運動性が低下した個体とが混在していた。この一因は、ガラス表面で緩衝液の液滴が十分に微細化せず、チャネル３ａに対して十分な水分が行き渡らなかったことにあると考えられる。また、酸素を全く通さないため、水分と共に密封できた場合でも、酸欠状態となって運動性が低下したと考えられる。
【０１０３】
これに対し、ＰＳカバーの場合は、マイクロチップ１の表面２上に滴下した液滴がカバー４によって直径５〜１０ｍｍの範囲に押し広げられて複数のチャネル３ａに染み渡ると共に、カバー４がマイクロチップ１の表面２に密着して線虫がチャネル３ａに密封された状態となる。そのため、ＰＳカバーで封入保定した線虫は、緩衝液で満たされたチャネル３ａの中で脱水を起こすことなく好適な状態で保持され、３時間封入保定後も正常な運動性を示した。
【０１０４】
ＰＥＴカバーで封入保定した場合、３時間封入保定後にほぼ全ての個体で運動性の低下が観られた。つまり、一部の個体の運動性が低下するのではなく、全体的に運動性が低下するという傾向が現れた。表３に示した通り、ＰＥＴカバーは、酸素透過性の極めて低いカバーである。そのため、ＰＥＴカバーで３時間封入保定した線虫は、酸欠状態となって運動性が低下したと考えられる。
【０１０５】
これに対し、ＰＳカバーは、ＰＥＴカバーに比べて酸素透過性が高い素材である。そのため、ＰＳカバーで封入保定した線虫は、酸欠状態とはならず、３時間封入保定後であっても正常な運動性を示した。
【０１０６】
以上の結果から、酸素要求性の生物試料をマイクロチップ１に培養又は封入保定する際に用いるカバー４としては、酸素透過性の高いものであることが好ましいことが明らかである。
【０１０７】
［実験結果］
以上の通り、本発明におけるマイクロチップ１およびカバー４は、動植物細胞や微小生物を培養又は封入保定した状態で、局所的にマイクロビームを照射したり観察するのに適した特徴を有しており、従来の問題点を解決することができるものである。
【符号の説明】
【０１０８】
１  マイクロチップ（生物試料用マイクロチップ）
２  マイクロチップ表面
３  凹部
３ａ  チャネル
３ｂ  ウェル
４  カバー
５  カバー表面
６  ウェル表面
【図１】
2019225633.tif 000006
【図２】
2019225633.tif 000007
【図３】
2019225633.tif 000008
【図４】
2019225633.tif 000009
【図５】
2019225633.tif 000010
【図６】
2019225633.tif 000011
【図７】
2019225633.tif 000012
【図８】
2019225633.tif 000013
【図９】
2019225633.tif 000014
【図１０】
2019225633.tif 000015
【図１１】
2019225633.tif 000016
【図１２】
2019225633.tif 000017
【図１３】
2019225633.tif 000018
【図１４】
2019225633.tif 000019
【図１５】
2019225633.tif 000020
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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