(57)【要約】  歯周病の治療において、抗菌処置と併用して用いることのできる歯周病治療剤であって、短期間に優れた治療効果を奏し、かつ、歯周病により損傷した歯周組織の再生を促進できる歯周病治療剤の提供を課題とする。  本発明は、間葉系細胞の培養上清を含む歯周病治療剤であって、歯周病病原菌に対する抗菌処置と併用される歯周病治療剤に関する。【選択図】なし
2019216438.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉系細胞の培養上清を含む歯周病治療剤であって、歯周病病原菌に対する抗菌処置と併用される歯周病治療剤。
【請求項２】
請求項１に記載の歯周病治療剤であって
前記抗菌処置が抗菌剤の投与、消毒液の投与、レーザー照射、スケーリング、ルートプレーニング、歯周ポケット内洗浄からなる群より選択される少なくとも一つの処置である、歯周病治療剤。
【請求項３】
請求項１または２に記載の歯周病治療剤であって、
前記抗菌処置が、ミノサイクリンまたはその薬学的に許容される塩を含む歯周病治療剤の投与である、歯周病治療剤。
【請求項４】
請求項３に記載の歯周病治療剤であって、
ミノサイクリンまたはその薬学的に許容される塩の投与と同時に用いられる、歯周病治療剤。
【請求項５】
請求項３または４に記載の歯周病治療剤であって、
前記歯周病治療剤とともに併用して投与されるミノサイクリンまたはその薬学的に許容される塩の量が１回あたり１０ｍｇ未満である、歯周病治療剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の歯周病治療剤であって、
前記間葉系細胞の培養上清が間葉系幹細胞を含む間葉系細胞群を培養した培養上清である、歯周病治療剤。
【請求項７】
請求項６に記載の歯周病治療剤であって、
前記間葉系細胞が歯髄細胞であり、かつ、間葉系幹細胞が歯髄幹細胞である、歯周病治療剤。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の歯周病治療剤であって、
ＧＴＲ法、β−ＴＣＰ、骨移植材、コラーゲンスポンジ、および、b-FGFからなる群より選択される少なくとも一つの歯周病治療と併用して用いられる、歯周病治療剤。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の歯周病治療剤であって、
歯周病により炎症または損傷した歯周組織への塗付用である、歯周病治療剤。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の歯周病治療剤であって、
前記間葉系細胞の培養上清が、無血清培地を用いた間葉系細胞の培養により得られた培養上清である、歯周病治療剤。
【請求項１１】
請求項１０に記載の歯周病治療剤であって、
前記間葉系細胞の培養上清が、血清を含む培地を用いた間葉系細胞の培養とそれに続く無血清培地を用いた間葉系細胞の培養により得られた培養上清である、歯周病治療剤。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の歯周病治療剤であって
歯周病により損傷した歯槽骨の再生用である、歯周病治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間葉系細胞の培養上清を含む歯周病治療剤に関する。特に歯周病治療のための抗菌処置と併用して用いられる間葉系細胞の培養上清を含む歯周病治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
歯周病は国民の約８０％以上が罹患する疾患であり、口腔内細菌の感染、歯周病病原菌の増加、細菌の組織内侵入及び感染に対する宿主免疫応答等が主たる原因と考えられている。歯周病病原菌の感染により、歯を支持している歯周組織（歯肉、セメント質、歯根膜、および歯槽骨）が破壊される炎症性疾患である。この疾患では、歯周ポケットの形成、歯の動揺、歯槽骨の吸収、及びポケットからの排膿が認められ、そのほとんどが無痛性に進行する。歯周病の進行により歯周組織の炎症や破壊に留まらず、歯槽骨と呼ばれる歯を支える骨が吸収（または破壊）され、最終的に歯が脱落する。このように歯周病は最終的には歯の喪失に至りＱｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｌｉｆｅを損なう極めて重要な疾患である。【０００３】
歯周病の治療法は感染源の排除が治療上重要であることから、ブラッシングとスケーリングといった極めて原始的な方法やレーザー照射による殺菌などの歯周外科等がいまだに主流である。また、テトラサイクリン系の抗生物質の投与も歯周治療として有効とされてきた。
歯周炎には、特定の歯周溝内グラム陰性桿菌が関与していることが知られている。例えば、成人性歯周炎は Bacteroides gingivalis、若年性歯周炎にはActinobacillus  actinomycetemcomitans、急性壊死潰瘍性歯周炎には Bacteriodes intermediusが関与している。テトラサイクリン系の抗生物質はこれらの歯周病病原菌に対する抗菌作用を有する。ミノサイクリンはテトラサイクリン系抗生物質の一種であり、上記の歯周病原性菌に対して強い抗菌作用を示し、歯周炎に対して優れた臨床効果を発揮する。例えば、ミノサイクリンを含む軟膏を歯周ポケットに直接投与する方法が提案されており、歯周炎治療薬として「ペリオクリン歯科用軟膏」（サンスター株式会社販売）や「ペリオフィール歯科用軟膏」（昭和薬品化工株式会社販売）が臨床で用いられている。【０００４】
しかしながら、抗菌剤の投与や歯周外科による抗菌処置は、歯周病原菌による歯周病の進行を抑制することが可能であるが、重度の歯周病患者のように一度損傷した歯周組織、特に歯槽骨を再生することはできなかった。
また、抗生物質の使用は作用が強力で効果が優れる反面、抗生物質の長期使用は耐性菌の出現や副作用等の問題があり、薬物療法の限界も示唆されている。したがって歯周病の治療に対して抗生物質を使用する際には、使用量が制限される中、短期間で歯周病治療が完了するような治療方針の実現が望まれていた。【０００５】
損傷した歯周組織を再生する一つの手法として、歯周組織誘導法（guided tissue regeneration：GTR）が知られている。ＧＴＲ法は、創傷面を覆うのが早い上皮組織が歯周組織の損傷部内部へ浸潤するのを回避するために、吸収性又は非吸収性のバイオフィルムやチタンフィルムを、歯周組織の損傷部に配置する手法である。これにより、歯根膜由来の組織・細胞が創傷面においてセメント質新生を伴い新しい結合組織性付着を形成させる。ＧＴＲ法は、メンブレンを生体内に置く必要があることから手術時間の長期化や外科的侵襲が少なからず生じ、術後の合併症や歯肉退縮が課題となる。また、ＧＴＲ法により再生したセメント質の構造は本来のセメント質の構造と異なることや歯根膜のコラーゲンの走行が異なっていることなどが報告されている（非特許文献１）。
また別の手法として、エムドゲイン法が知られている。この手法は、エナメルマトリックスデリバティブを主成分として含むエムドゲイン（登録商標）を歯周外科の治療後に歯周組織の損傷部位に塗布することで、歯根膜にある未分化の間葉組織に作用してセメント芽細胞に分化させ、無細胞性セメント質をつくりだす。これにより、破壊されたセメント質などの再生を図るものである。例えば非特許文献２には、垂直性骨欠損を有する患者群に対してエムドゲインで処置した場合、手術日から８カ月後において、歯周ポケットの深さ（PD）が平均7.6±1.3mmから平均3.5±1.3mmへ減少したことを報告している。【０００６】
また近年、生体由来の細胞を用いて損傷した組織を再生させる手法が検討されている。
特許文献１は、歯周病を治療するための製品の調製における歯原性幹細胞の使用を開示している。
しかしながら、細胞を用いた細胞治療は、ウイルスなどの感染因子に関する問題、原材料として用いられる細胞自体の特性析や適格性に関する問題、造腫瘍性のリスク排除、有効性・安全性・品質を担保しつつ医療現場へ速やかに安定供給を行わなければならない点で多くの高いハードルが存在する。
一方、特許文献２は、細胞自体を含まない細胞の培養上清を用いて組織の損傷を再生する手法を開示する。具体的には、歯髄幹細胞を培養し、細胞から放出された成長因子を利用して組織を再生させる技術を開示する。特許文献２は、歯髄幹細胞を無血清培養することによって得られた幹細胞培養上清を含む損傷部治療用組成物に関する発明を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２０１７−５０７１２３号公報
【特許文献２】特開２０１６−６５１０６号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】佐藤秀一、”再生治療を応用した歯周病治療の現状”、Nihon Univ. Dent J. 89, 93-99, 2015
【非特許文献２】末田武、星野二郎、山村准男、”多施設におけるエムドゲインの使用成績調査報告”  日歯周誌、46(2):152-160, 2004
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
歯周病の治療において、抗菌処置と併用して用いることのできる歯周病治療剤であって、短期間に優れた治療効果を奏し、かつ、歯周病により損傷した歯周組織の再生を促進できる歯周病治療剤の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上述のように、重度の歯周病患者は歯槽骨の吸収を含む歯周組織の損傷を有しており、歯周病治療における抗生物質などの抗菌処置では歯周組織の再生を望むことができなかった。
そこで本発明者らは歯周病の治療において、抗菌処置とともに歯周病により損傷した歯周組織の再生を促進できる方法について検討した。ここで特許文献１のように細胞自体を直接損傷部位に投与する方法は、上述ようにウイルスなどの感染因子の問題、原材料として用いる細胞自体の特性や適格性の評価・選別に関する問題、細胞の造腫瘍性のリスク排除の問題、細胞の調製過程における一定の品質の担保などに未だ高いハードルが存在する。そこで本発明者らは、細胞自体を用いずに、細胞の培養上清のみを歯周病治療に応用できないか検討した。
細胞の培養上清を治療に用いることを開示する特許文献２は、実施例としてヒト骨髄幹細胞（Lonza Co., ltd, USA）を培養することで培養上清から成長因子を回収し、当該成長因子を損傷した歯周組織に注入することで歯周組織が再生したことを記載している。【００１１】
ここで特許文献２の実施例においては、人為的にイヌの臼歯遠位部に２壁性の歯周欠損を作製・模したサンプル、女性の犬歯内側に歯周欠損を有するサンプルを用いており、歯周病病原菌に由来する歯周病罹患状態にある歯周組織部位において、ヒト骨髄幹細胞由来の成長因子が実際に有効であるのかについては開示がない。
また歯周病を患っている患者に対して、従来の抗菌処置と併用して細胞の培養上清を投与することについては検討されていない。
これに対し本発明者らは、間葉系細胞のうち歯髄細胞を用いて培養上清を調製し、重度の歯周病に罹患する患者に対して抗菌処置と併用して当該培養上清を投与したところ、短時間で臨床検査による歯周病のスコアが大きく改善し、かつ、従来の抗菌処置では得ることのできなかった歯槽骨を含む歯周組織の再生を促すことができることを見出した。【００１２】
本発明は上記知見により完成されたものであり、下記態様を含む：
本発明は一態様において、
〔１〕間葉系細胞の培養上清を含む歯周病治療剤であって、歯周病病原菌に対する抗菌処置と併用される歯周病治療剤に関する。
また本発明の歯周病治療剤は、一実施の形態において、
〔２〕上記〔１〕に記載の歯周病治療剤であって
前記抗菌処置が抗菌剤の投与、消毒液の投与、レーザー照射、スケーリング、ルートプレーニング、歯周ポケット内洗浄からなる群より選択される少なくとも一つの処置であることを特徴とする。
また本発明の歯周病治療剤は、一実施の形態において、
〔３〕上記〔１〕または〔２〕に記載の歯周病治療剤であって、
前記抗菌処置が、ミノサイクリンまたはその薬学的に許容される塩を含む歯周病治療剤の投与であることを特徴とする。
また本発明の歯周病治療剤は、一実施の形態において、
〔４〕上記〔３〕に記載の歯周病治療剤であって、
ミノサイクリンまたはその薬学的に許容される塩の投与と同時に用いられることを特徴とする。
また本発明の歯周病治療剤は、一実施の形態において、
〔５〕上記〔３〕または〔４〕に記載の歯周病治療剤であって、
歯周病治療剤とともに併用して投与されるミノサイクリンまたはその薬学的に許容される塩の量が１回あたり１０ｍｇ未満であることを特徴とする。
また本発明の歯周病治療剤は、一実施の形態において、
〔６〕上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の歯周病治療剤であって、
前記間葉系細胞の培養上清が間葉系幹細胞を含む間葉系細胞群を培養した培養上清であることを特徴とする。
また本発明の歯周病治療剤は、一実施の形態において、
〔７〕上記〔６〕に記載の歯周病治療剤であって、
前記間葉系細胞が歯髄細胞であり、かつ、間葉系幹細胞が歯髄幹細胞であることを特徴とする。
また本発明の歯周病治療剤は、一実施の形態において、
〔８〕上記〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の歯周病治療剤であって、
ＧＴＲ法、β−ＴＣＰ、骨移植材、コラーゲンスポンジ、または、b-FGFからなる群より選択される少なくとも一つの歯周病治療と併用して用いられることを特徴とする。
また本発明の歯周病治療剤は、一実施の形態において、
〔９〕上記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の歯周病治療剤であって、
歯周病により炎症または損傷した歯周組織への塗付用であることを特徴とする。
また本発明の歯周病治療剤は、一実施の形態において、
〔１０〕上記〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の歯周病治療剤であって、
前記間葉系細胞の培養上清が、無血清培地を用いた間葉系細胞の培養により得られた培養上清であることを特徴とする。
また本発明の歯周病治療剤は、一実施の形態において、
〔１１〕上記〔１０〕に記載の歯周病治療剤であって、
前記間葉系細胞の培養上清が、血清を含む培地を用いた間葉系細胞の培養とそれに続く無血清培地を用いた間葉系細胞の培養により得られた培養上清であることを特徴とする。
また本発明の歯周病治療剤は、一実施の形態において、
〔１２〕上記〔１〕〜〔１１〕のいずれか一項に記載の歯周病治療剤であって
歯周病により損傷した歯槽骨の再生用である、歯周病治療剤。
また本発明は、別の態様において、
〔１３〕歯周病を患う対象を治療する方法であって
歯周病原菌に対する抗菌処置と併用して、間葉系細胞または間葉系幹細胞の培養上清を含む歯周病治療剤を投与する工程を含む、治療方法に関する。
また本発明は、別の態様において、
〔１４〕歯周病を患う対象の治療において用いられる、間葉系細胞または間葉系幹細胞の培養上清を含む歯周病治療剤であって、歯周病原菌に対する抗菌処置と併用される歯周病治療剤に関する。
また本発明は、別の態様において、
〔１５〕歯周病原菌に対する抗菌処置と併用される歯周病治療剤の製造における、間葉系細胞または間葉系幹細胞の培養上清の使用に関する。
また本発明は、別の態様において、
〔１６〕歯周病病原菌に対する抗菌処置と併用される歯周病治療用の間葉系細胞の培養上清に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の歯周病治療剤によれば、抗菌処置と併用することで歯周病治療として従来用いられてきたスケーリングおよび抗生物質の投与による歯周病治療と比較して、より短時間でより高い歯周病の治療効果を奏することができる。
特に本発明の歯周病治療剤によれば、スケーリングや抗生物質の投与などの歯周病治療のみでは得ることのできなかった歯槽骨の再生を促すことができる。本発明の歯周病治療剤によれば、重度の歯周病に罹患した患者に対しても短期間で歯槽骨の再生を含む歯周組織再生を促すことができる。
さらに本発明の歯周病治療剤によれば、間葉系細胞自体を生体へ投与するものではないため、細胞治療で懸念される安全性や品質担保の問題を避けることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例５における歯周病治療前の患者の口腔内を示す画像である。
【図２】実施例５における歯周病治療前の患者の口腔内を示す画像である。
【図３】実施例５におけるフラップ手術中の患者の口腔内を示す画像である。
【図４】実施例５におけるフラップ手術中の患者の口腔内を示す画像である。
【図５】実施例５におけるフラップ手術後の培養上清含有治療剤を投与中の患者の口腔内を示す画像である。
【図６】実施例５における培養上清含有治療剤を投与後、切開した歯肉を縫合した状態の患者の口腔内を示す画像である。
【図７】実施例５における培養上清含有治療剤を投与した日（１回目、３回目、または、４回目）の患者の口腔内をＸ線で撮影した画像を示す。
【図８】実施例６の歯周病治療における治療前後の各患者における歯周ポケットの深さの変化を示すグラフである。
【図９】実施例６の歯周病治療初診時および最終評価時の患者（S.N氏）口腔内写真、ならびに、歯の動揺度数および自他覚症状の評価を示す。
【図１０】実施例６の歯周病治療初診時および最終評価時の患者（Y.M氏）口腔内写真、ならびに、歯の動揺度数および自他覚症状の評価を示す。
【図１１】実施例６の歯周病治療初診時および最終評価時の患者（N.M氏）口腔内写真、ならびに、歯の動揺度数および自他覚症状の評価を示す。
【図１２】実施例６の歯周病治療初診時および最終評価時の患者（M.Y氏）口腔内写真、ならびに、歯の動揺度数および自他覚症状の評価を示す。
【図１３】実施例６の歯周病治療初診時および最終評価時の患者（Y.T氏）口腔内写真、ならびに、歯の動揺度数および自他覚症状の評価を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書において「間葉系細胞」とは、骨芽細胞、脂肪細胞、筋細胞、軟骨細胞等、間葉系に属する細胞への分化能を有するとされる細胞である。より具体的には、歯髄細胞、骨髄細胞、臍帯細胞および脂肪細胞等が挙げられる。また、「間葉系幹細胞」とは骨芽細胞、軟骨芽細胞及び脂肪芽細胞等の間葉系の細胞全て又はいくつかへの分化が可能な幹細胞又はその前駆細胞の集団を意味する。より具体的には、歯髄幹細胞、骨髄由来幹細胞、脂肪組織由来幹細胞等が挙げられる。
【００１６】
間葉系細胞または間葉系幹細胞が由来する個体は、本歯周病治療剤を適用する個体との関係においては、拒絶反応を抑制又は回避するため、同一生物種（ヒトであればヒト由来）由来であることが好ましく、より好ましくは同一生物種であり、かつ、自家組織または自家細胞を用いる実施形態である。
本発明において間葉系細胞というとき間葉系細胞の細胞集団も含む。このとき間葉系細胞の細胞集団には間葉系幹細胞が含まれていてもよい。すなわち、間葉系細胞というとき、間葉系細胞の細胞集団、または、間葉系細胞と間葉系幹細胞とを含む細胞集団と読み替えることもできる。間葉系細胞の細胞集団、または、間葉系細胞と間葉系幹細胞を含む細胞集団を用いる場合には、当該細胞集団より間葉系幹細胞を選別する工程を含まず、この点において調製が簡便である。
また、本発明の一実施の形態においては、間葉系細胞は間葉系幹細胞と置き換えることもできる。すなわち、本発明は一実施の形態として、例えば、歯髄幹細胞の培養上清を含む歯周病治療剤であって、歯周病病原菌に対する抗菌処置と併用される歯周病治療剤を提供する。
【００１７】
本発明の好ましい一実施の形態において、間葉系細胞は歯髄細胞であり、間葉系幹細胞は歯髄幹細胞である。ここで、「歯髄細胞」とは、歯髄組織より回収・単離された歯髄細胞またはその細胞集団をいい、歯髄組織より酵素処理等により回収して得られた歯髄細胞を使用することができる。歯髄組織より回収した歯髄細胞を凍結保存しておき、解凍により得られた歯髄細胞であってもよい。または、歯髄組織自体を凍結保存しておき、解凍後に酵素処理等を行い回収した歯髄細胞であってもよい。好ましくは、歯髄組織より酵素処理等により回収して直ぐの歯髄細胞を用いる実施形態である。
「歯髄幹細胞」は、歯髄組織より回収された歯髄細胞集団中に含まれる。歯髄細胞から歯髄幹細胞を選別する手法は公知である（Yamaza et al., "Immunomodulatory properties of stem cells from human exfoliated deciduous teeth". Stem Cell Res Ther. (2010)1:5）。
【００１８】
本明細書において「歯髄組織」は、乳歯及び永久歯のいずれからも採取することができ、従来医療廃棄物として処理されてきた乳歯や親知らず（智歯）などの抜去歯の歯髄から得ることが可能である。すなわち歯髄組織は、歯科医療施設において歯科処置的に抜歯された歯からも取り出すことができるし、自然抜歯または自然脱落された歯から取り出されてもよい。なお、歯より歯髄組織を取り出す方法は公知であり、当業者は適宜実施することができる。なお、歯科処置的に抜歯された歯など、その場ですぐに凍結処理を行うことができない場合には、輸送のため、例えば、alpha-minimum essential medium (alpha-MEM) などの培地に歯を浸し、低温（例えば、4℃）で保存・輸送することができる。
【００１９】
本発明の培養上清を調製するために用いる細胞（間葉系細胞、間葉系幹細胞、歯髄組織、歯髄細胞、または、歯髄幹細胞）の由来はヒトに限られず、その他の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、サル、ヒツジ、ウシ、ウマ）であってもよい。
また本発明の培養上清を調製するために用いる細胞は、永久歯由来でよく、乳歯由来でもよいが、好ましくは細胞増殖能の観点から脱落した乳歯に由来したものである。また、得られた培養上清が歯周病治療における抗菌処置とともに併用されることで、向上した歯周病治療効果および歯周組織の再生効果を奏する限りにおいて、iPS細胞やES細胞などの多能性幹細胞より誘導された間葉系細胞（例えば、歯髄細胞）または間葉系幹細胞（例えば、歯髄幹細胞）を用いても良い。
【００２０】
歯髄組織から歯髄細胞を採取する方法も公知であり、例えば、下記実施例１に記載の方法に準じて実施することができる。例えば、メスなどを用いて歯髄組織を細断した後、細断した歯髄組織をディスパーゼやコラゲナーゼ、またはそれらの混合酵素液などを用いて酵素処理する。酵素処理は、用いる酵素にもよるが、例えば、4%ディスパーゼと3％コラゲナーゼとを1:1で混合した混合酵素液（を用いる場合、37℃で60分間、酵素処理することができる。酵素処理の後、血清を含む培養液にて十分に混和した後、セルストレーナーなどを用いて夾雑物を取り除く。その後、遠心処理（例えば、2,000 rpm、4℃）を行い、上清を捨て、培養液中を添加することで歯髄組織より歯髄細胞を採取することができる。また酵素液としては、アクターゼ（Innovative cell technologies社製；登録商標）を好適に用いることもできる。上記のように、歯髄組織から歯髄細胞を採取する方法は公知であり当業者であれば、適宜、使用する試薬や試験条件を設定して行うことができる。
【００２１】
本発明に用いることのできる培養上清は、間葉系細胞を培養して得られる培養液であって実質的に細胞を含まない培養液である。本発明の歯周病治療剤は細胞を含まない培養上清であるため、培養期間中、制御された一定の培養条件下にある間葉系細胞から歯周病治療に有効な成分を培養中に蓄積することができ好ましい。
また培養液からの細胞成分を分離する手法として、当業者に公知の固液分離方法を適用してもよい。さらに、培養液に対して各種処理（例えば、遠心処理、濃縮、溶媒の置換、透析、凍結、乾燥、凍結乾燥、希釈、脱塩、保存等）を適宜施した培養上清を用いることにしてもよい。
【００２２】
間葉系細胞の培養は通常行われている公知の培養条件を用いることができ、当業者であれば適宜、用いる間葉系細胞ごとに条件を設定して培養することができる。
間葉系細胞の培養には、基本培地、或いは基本培地に血清等を添加したもの等を使用可能である。本明細書において「基本培地」とは、低分子量の既知成分のみの培地をいい、基本培地の非限定的な例として、BME（Basal medium Eagle's）、MEM（Minimum essential medium）、DMEM（Dulbecco's modified Eagle's medium）、イスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）などのイーグル培地、RPMI1630、RPMI1640などRPMI（Roswell Park Memorial Institue）培地、フィッシャー培地（Fischer's medium）、F10培地、F12培地などのハム培地（Ham's medium）、MCDB104、107、131、151、153、170、202などのMCDB培地、RITC80-7培地が知られており、適宜選択することができる。二種以上の基本培地を併用することにしてもよい。混合培地の一例として、IMDMとHamF12を等量混合した培地(例えば商品名:IMDM/HamF12(GIBCO社)として市販される)を挙げることができる。
【００２３】
また培地に添加可能な成分の例として、血清（ウシ胎仔血清（FBS）、ヒト血清、羊血清等）、血清代替物（Knockout serum replacement(KSR)など）、ウシ血清アルブミン（BSA）、抗生物質、各種ビタミン、各種ミネラルを挙げることができる。
血清や血清代替物は、培地全体に対して25%(v/v)以下、20%(v/v)未満、15％(v/v)未満、13%(v/v)未満、10％(v/v)未満、7％(v/v)未満、5％(v/v)未満等であることが好ましい。
間葉系細胞の培養に用いる基本培地として好ましくは、血清（FBS、ヒト血清など）を含有するαMEMを挙げることができる。
【００２４】
なお培養上清を含む歯周病治療剤をヒトに適用する場合、動物由来成分の混入を避けるために回収対象の培養液には動物由来の成分（血清など）を含まないことが好ましい。例えば血清を含まない培地を用いることでその安全性を高めることができる。すなわち、本発明の歯周病治療剤の製造における一実施の形態は、例えば、血清を含まない培地（無血清培地）で間葉系細胞を培養することによって、血清を含まない培養上清を調製する工程を含む。また、Penicillin-Streptomycinなどの抗生物質が培養上清に含まれないことも好ましい。一実施の形態において、培養上清を回収する対象となる最後の培養において、抗生物質を含まない培地を用いることができる。
無血清培地としては、回収した培養上清から調製した歯周病治療剤が歯周病治療における抗菌処置と併用して用いられた際に、向上した歯周病治療効果および歯周組織の再生効果を奏する限りにおいて限定されない。無血清培地としては例えば、血清を含まない上記基本培地やリンゲル液などを用いることができる。
【００２５】
また例えば、歯髄幹細胞などの間葉系幹細胞の培養上清を調製する場合、幹細胞用無血清培地を用いてもよい。幹細胞用無血清培地とは、幹細胞の増殖性および幹細胞特性を維持できる培地であり、市販のものを用いることができる。特に間葉系幹細胞用の無血清培地であることが好ましい。このような幹細胞用無血清培地としては、以下に限定されないが、例えば、EXPREP MSC Medium（株式会社バイオミメティックスシンパシーズ）、STK2（登録商標）間葉系幹細胞用無血清培地（DSファーマバイオメディカル株式会社）、Mesenchymal Stem Cell Growth Medium DXF（Promo Cell）、Stemgro（登録商標） hMSC Medium （Corning）、MesenCult-SF、MesenCult-XF、MesenCult-ACF（STEMCELL Technologies）、TheraPEAK MSCGM-CD Mesenchymal Stem Cell Medium, Chemically Defined（Lonza）、PRIME-XV（登録商標） MSC Expansion XSFM、PRIME-XV（登録商標） MSC Expansion SFM（Irvine Scientific）、MSC NutriStem（登録商標）XF（Biological industries）、StemXVivo Xeno-Free Human MSC Expansion Media、StemXVivo Serum-Free Human MSC Expansion Media（R&D Systems）、StemMACS MSC Expansion Media kit XF, Human（Miltenyi Biotec）、MesenPRO MSC SFM、MesenPRO MSC SFM XenoFree（Gibco）、FibroGRO Xeno-Free Human Fibroblast Expansion Medium（Merck）、PL SOLUTION、PL SOLUTION GMP grade（PL BioScience）などを挙げることができる。
【００２６】
間葉系細胞から培養上清を調製するための培養は、１回又は複数回の継代培養を行うことが好ましい。好ましい一実施の形態においては、最後又は最後から数回の継代培養を無血清培地で培養する。これにより血清を含まない培養上清を得ることができる。一方、回収した培養上清から、透析やカラムによる溶媒置換などを利用して血清を除去することにより、血清を含まない培養上清を得てもよい。
間葉系細胞の培養は通常の温度、pH条件下で行うことができ、培養条件を整えるためのインキュベータの使用が好ましい。また培地はその組成成分が充分に供給できるように保つことが好ましく、例えば３、４日に１回程度の頻度で新しい培地に交換することができる。
【００２７】
本発明の歯周病治療剤に含まれる培養上清を調製するための間葉系細胞の培養工程は、血清を含む培地で間葉系細胞を培養する工程を含むことができる。血清の濃度は上記の範囲内で培地中に含まれていればよく、好ましくは培地全体に対して10〜25%(v/v)、より好ましくは約20%(v/v)で含まれる形態である。血清を含む培地での培養は、少なくとも24時間以上、好ましくは36時間以上、より好ましくは48時間以上行うことが好ましい。
培養上清から動物由来成分を排除するために、無血清培地で一定時間、間葉系細胞を培養することが好ましい。本発明の歯周病治療剤に含まれる培養上清の製造における一実施の形態においては、血清を含む培地で間葉系細胞を培養する工程に続き、さらに無血清培地で間葉系細胞を培養する工程を含む。無血清培地での培養は、少なくとも24時間以上、好ましくは36時間以上、より好ましくは48時間以上行うことが好ましい。
【００２８】
以下、歯髄細胞を例として培養方法及び培養上清の回収方法について例示するが、歯周病治療における抗菌処置と併用した際に向上した歯周病治療効果および歯周組織の再生効果を奏する限りにおいて以下の手法や態様に限定されない。また、以下の各種手法や態様は他の細胞を原料とした際にも適用することができる。
例えば、歯髄細胞を上記基本培地が入った培養用ディッシュに播種し、５％ＣＯ２、３７℃に調整したインキュベータにて培養する。必要に応じて継代培養を行う。例えば、肉眼で観察してセミコンフルエント（培養容器の表面の約７０％を細胞が占める状態）又はコンフルエントに達したときに細胞を培養容器から剥離して回収し、再度、培養液を満たした培養容器に播種する。継代培養を繰り返し行ってもよい。例えば継代培養を１〜８回行い、必要な細胞数（例えば約1×10６個／ｍｌ）まで増殖させる。尚、培養容器からの細胞の剥離は、トリプシン処理など常法で実施することができる。以上の培養の後、細胞を回収して凍結保存することにしてもよい。
【００２９】
次いで、歯髄細胞の培養上清を回収する。回収の時期は限定されず、継代のタイミングとなるセミコンフルエントな状態でも良いし、細胞の対数増殖期、または、培地の交換に合わせて回収することもできる。例えば、スポイトやピペットなどで培養液を吸引して回収することができる。回収した培養上清はそのまま、または、一以上の処理を経た後に本発明の歯周病治療剤の有効成分として使用される。ここでの処理として、遠心処理、濃縮、溶媒の置換、透析、凍結、乾燥、凍結乾燥、希釈、脱塩、保存（例えば、４℃、−８０℃）を例示することができる。
【００３０】
回収した培養上清に対しては、適宜濃縮処理を施すこともできる。すなわち、培養上清というとき、回収した培養上清の濃縮物を含む。一方で、培養上清に対して緩衝液など適当な媒体による希釈処理を施すこともできる。濃縮方法としては公知の手法から当業者であれば適宜選択して用いることができる。例えば、スピンカラム濃縮法、エタノール沈殿濃縮法により、培養上清の濃縮物を得ることができる。本培養上清は、凍結乾燥処理が施されていてもよい。すなわち、本培養上清は、凍結乾燥物であってもよい。
【００３１】
「歯周病」はその進行度合いにより主に歯肉炎と歯周炎とに分けることができ、その他、咬合性外傷などが知られている。歯肉炎は、歯周病の初期段階であり、歯の根本や歯と歯の間に生じた歯垢（プラーク）や歯石により歯肉が腫れて出血しやすくなった状態を指す。また歯周炎は、その症状から大きく軽度〜中等度〜重度に分類することができる。軽度の歯周炎は、腫れた歯肉に歯周病病原菌や菌の出す毒素が入り込み、歯槽骨を溶かし始めた状態を指す。中等度の歯周炎は歯周病によって、歯の根の長さの半分まで歯槽骨が溶けた状態を指す。また、重度の歯周炎は歯の根の長さの半分以上歯槽骨が溶けた状態を指す。歯を支持する歯槽骨が少なくなると、歯はグラグラと動揺し、やがて脱落する。また本明細書において「歯周病」にはインプラント周囲炎も含む。インプラント周囲炎とは、インプラント埋入後にインプラント周囲に生じる歯槽骨の吸収をいう。本発明の歯周病治療剤は、インプラント周囲炎により生じた骨吸収および炎症の改善（増骨および消炎）も対象である。
本発明の歯周病治療剤が対象とする歯周病は上述のものを含み、特に歯周病病原菌により引き起こされる歯肉炎および歯周炎を対象とすることができる。本発明は特に、歯槽骨が吸収しており歯槽骨を含めて歯周組織の再生が必要な状態にある歯周病を対象とすることが望ましい。本発明の歯周病治療剤は、一実施の形態において、歯槽骨が吸収された歯周病治療するための治療剤である。
【００３２】
歯周病の状態や進行度合は、例えば、歯周ポケットの深度（PPD）、歯の動揺、歯周組織からの排膿、出血などにより評価することができる。歯周ポケットの深度は、ポケットプローブを使用し、１歯６点計測（６点法）により評価することができる。歯の動揺は、Millerの判定基準に基づいて評価することができる。Millerの判定基準では、0度(生理的動揺 0.2 mm 以内)、1度(軽度；唇舌的に0.2 〜1 mm)、2度(中等度；唇舌、近遠心的に1 ~ 2 mm)、3度(高度；唇舌、近遠心的に2 mm以上、または垂直方向の舞踏状動揺)に分類する。歯周組織からの排膿または出血は、排膿または出血の有無により評価することができる。排膿または出血が観察されなる場合に（−）とし、排膿または出血が観察される場合に（＋）とする（多量の排膿または出血が観察される場合には（＋＋）とする）。出血の具体的な確認は、ポケットプローブを歯肉溝やポケット内へ軽く（約15~20gの力で）挿入し、引き抜いてから約20~30秒後の出血の状態を確認する。
本明細書において歯周病の治療効果というとき、下記（i）〜（iv）のいずれかの効果と歯槽骨の再生効果とをいう：
（i）歯周ポケットの深度（PPD）の改善
（ii）歯の動揺の改善
（iii）歯周組織からの排膿の改善
（iv）歯周組織からの出血の改善
上記症状の改善は、上述の手法による評価により確認することができる。また本明細書において歯槽骨を含む歯周組織の再生とは、歯周病により吸収された歯槽骨を本発明の歯周病治療剤投与前後の状態で比較した際に、歯周病罹患前の状態に近づくように回復している状態をいう。治療対象の歯周組織の状態にも依るが、本発明の歯周病治療剤は好ましい一実施の形態において上記（i）〜（iv）の効果と歯槽骨の再生効果との全ての効果を奏する。
【００３３】
本発明の「歯周病治療剤」は間葉系細胞の培養上清を含み、歯周病治療における抗菌処置とともに併用されるものである。好ましい一実施の形態において、歯周病治療剤は、歯髄細胞の培養上清を含むものである。
また本発明の歯周病治療剤は、生体吸収性材料、ゲル化剤、製剤上許容される他の成分を含んでも良い。生体吸収性材料としては、有機系生体吸収性材料としてヒアルロン酸、コラーゲン、フィブリノーゲン等を挙げることができる。また、ゲル化材料としては、生体親和性が高いものを用いることが好ましく、ヒアルロン酸、コラーゲン又はフィブリン糊等を用いることができる。ヒアルロン酸、コラーゲンとしては種々のものを選択して用いることができるが可溶性（酸可溶性コラーゲン、アルカリ可溶性コラーゲン、酵素可溶性コラーゲン等）であることが好ましい。製剤上許容される他の成分としては、例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水などを挙げることができる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、D-マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。無痛化剤としてはベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトール等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。抗生物質、ｐＨ調整剤、成長因子（例えば、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、神経成長因子（NGF）、脳由来神経栄養因子（BDNF））等を含有させることにしてもよい。
【００３４】
本発明の間葉系細胞の培養上清を含む歯周病治療剤の用法用量は、歯周病治療の抗菌処置とともに併用された際に、向上した歯周病治療効果および歯周組織の再生効果が得られる限りにおいて特に限定されない。当業者であれば、被験対象の年齢、体重、病態等を勘案して設定することができる。以下に限定されないが、投与スケジュールとしては、例えば３〜５日に一回、１〜２週に一回、１〜２月に一回などを採用できる。投与スケジュールの作成においては、対象（レシピエント）の性別、年齢、体重、病態などを考慮することができる。
【００３５】
投与量は歯周病を患っている歯および歯周組織の状態、投与ルート、患者の年齢、または体重などによって異なる。治療効果を奏する限り以下に制限されないが、例えば、セミコンフルエントな状態の細胞密度で培養し回収した培養上清をそのまま歯周病治療に用いる場合、有効成分量として成人に投与する場合、例えば、１歯あたり0.1〜10ml／回の範囲で投与することができ、好ましくは0.1〜1ml／回の範囲で投与することができる。これを１回あるいは数回投与すればよい。
【００３６】
本発明の歯周病治療剤の投与経路は経口投与であり、歯周病を患う歯および／または歯周組織に対して直接投与することが好ましい。投与の方法は、患部への注入、塗布又は噴霧などが挙げられる。なお、本発明の歯周病治療剤の形態は特に限定されないが、患部への投与に適した液体、粉末、ペレット、クリーム状、顆粒状等などの製剤形態が好ましい。本発明の歯周病治療剤は、フラップ手術等の併用により患部へ直接投与されることが好ましいが、フラップ手術等を併用せずに歯周組織および歯周ポケットへ投与することもできる。治療計画における最初の投与時は、フラップ手術と併用させることが好ましい。
【００３７】
本発明の歯周病治療剤が適用される対象個体としては、ヒトを含む哺乳動物（ペット、家畜、実験動物等）が挙げられる。例えば、ヒトのほか、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、サル、モルモット、ラット及びマウス等が挙げられる。
【００３８】
本明細書において「抗菌処置」とは間葉系細胞の培養上清を含む歯周病治療剤とともに歯周病治療に用いることのできる抗菌処置であり、歯周病の原因となる歯周病病原菌またはそれに由来する歯垢、歯石、バイオフィルムなどを除去するために行われる処置をいう。以下に制限されないが、例えば、抗菌剤の投与、クロルヘキシジンなどの消毒液の投与、炭酸ガスレーザー、ペリオウェイブ、エルビウム・ヤグ(Er:YAG)レーザーなどのレーザー照射、ブラッシングやスケーリング、ルートプレーニング、歯周ポケット内洗浄などを含む。抗菌処置はルートプレーニングと抗菌剤の投与との組み合わせのように、複数の抗菌処置を組み合わせて行うこともできる。本発明の好ましい一実施の形態において、抗菌処置は抗菌剤の投与である。またより好ましい一実施の形態において、抗菌処置はスケーリングおよび／またはルートプレーニングと抗菌剤の投与とを含む。
【００３９】
本発明に用いることのできる「抗菌剤」とは、歯周病病原菌に対して抗菌作用を有する抗生物質や抗菌剤であれば限定されず、例えば、テトラサイクリン系やマクロライド系抗生物質を挙げられ、例えば塩酸ミノサイクリン、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、エリスロマイシン、クラリスロマイシン、ロキシスロマイシン、アジスロマイシン等が挙げられる。抗菌剤としては、塩化セチルピリジニウム等の４級アンモニウム塩、クロルヘキシジン等のビスグアニド類、スパルフロキサシン、レボフロキサシン等のフルオロキノロン系抗菌剤、トリクロサン等が挙げられる。テトラサイクリン系抗生物質としては、より具体的には、ミノサイクリンまたはその薬学的に許容される塩、水和物、若しくは、溶媒和物を含む歯周病治療用組成物（特開2001-335477号公報、特開平11-286448号公報、特公平1-12728号公報、特公平2-34325号公報などを参照)を挙げることができる。好ましい一実施の形態において、抗菌剤はミノサイクリンまたはその薬学的に許容される塩を含むものである。ミノサイクリンまたはその薬学的に許容される塩を含む抗菌剤としては、市販の「ペリオクリン歯科用軟膏」（サンスター株式会社販売）または「ペリオフィール歯科用軟膏」（昭和薬品化工株式会社販売）を用いてもよい。
【００４０】
ミノサイクリンの生理学的に許容される塩の種類は特に限定されないが、例えば、塩酸塩、硫酸塩、酢酸塩などの鉱酸塩、メタンスルホン酸塩などの有機酸塩を用いることができる。ミノサイクリンまたは生理学的に許容されるその塩は水和物又は溶媒和物であってもよい。溶媒和物を形成する溶媒は生理学的に許容されるものであれば特に限定されないが、例えばエタノールなどの溶媒和物を用いることができる。ミノサイクリンの塩としては塩酸塩を用いることが好ましい。本発明の医薬組成物に含まれるミノサイクリン又は生理学的に許容されるその塩の含有量は、一般的には、組成物重量に対して０．０１〜１５重量％程度（遊離体換算量）であり、好ましくは０．１〜５重量％程度である。また組成物中にはその他の成分として、油性基剤、緩衝剤；ｐＨ調節剤；界面活性剤；可塑剤；結合剤；分散剤；防腐剤；及び／又は着色剤などを適宜配合してもよい。
【００４１】
本発明の抗菌剤は、好ましくは口腔内または歯周組織に対する局所投与に適するように、例えば、粘稠な液状またはペースト状の組成物として提供されることが望ましい。しかしながら、液状やペースト状に限定されず、歯周病治療における抗菌剤としての効果を奏する限りにおいて経口投与に適した剤型などにしても良い。
本発明の抗生物質を含む歯周病治療剤は、そのまま患部（例えば、歯周疾患領域など）に直接的に塗布することによって患者に投与することができ、好ましくは歯周ポケット、より詳細には歯周組織の損傷部位に局所投与される。なお、塗布量は患部の大きさ、疾患の程度などに応じて適宜選択することができる。例えば、ミノサイクリンまたは薬学的に許容されるその塩を０．０１〜１５重量％程度（遊離体換算量）で含む歯周病治療剤を１歯当たり約１〜１００ｍｇずつ、好ましくは１〜１０ｍｇ投与することができる。本発明の歯周病治療剤と併用する際には、ミノサイクリンまたは薬学的に許容される塩の使用量を抑えても歯周病治療効果を得ることができる。一実施の形態においては、１回の治療に用いるミノサイクリンまたは薬学的に許容される塩の量を１０ｍｇ未満／回（１回あたり１ｍｇ以上１０ｍｇ未満、より好ましくは１ｍｇ以上５ｍｇ以下、さらに好ましくは１ｍｇ以上２ｍｇ以下）とすることができる。これによりミノサイクリンまたは薬学的に許容される塩の投与量を抑えることができる。また、投与回数や投与期間も適宜選択することができるが、投与量を抑えることのできる好ましい一実施の形態においては、投与回数は二週間に一回、三週間に一回、または、一月に一回の投与とすることができる。
【００４２】
本明細書において培養上清を含む歯周病治療剤と歯周病病原菌に対する抗菌処置とを「併用する」とは、歯周病治療剤の投与のタイミングと抗菌処置のタイミングを同時に行う、または、時系列的に一定の間隔をあけて前後して行うことを含む。
同時に投与と処置が行われる場合、治療経過により一定の間隔を開けて、複数回（例えば、2回、3回、4回、5回又はそれ以上）繰り返すことができる。該間隔は、例えば、30分、1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、12時間、1日、2日、3日、4日、5日、6日、1週、2週又は3週とすることができる。
逐次に歯周病治療剤の投与と抗菌処置が行われる場合、一定の間隔を開けて投与または処置が行われる。該間隔は、例えば、30分、1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、12時間、1日、2日、3日、4日、5日、6日、1週、2週又は3週とすることができる。歯周病治療剤の投与と抗菌処置とを、交互に行ってもよい。抗菌処置を最初に1回又は複数回（例えば、2回、3回、4回、5回又はそれ以上）行い、その後、歯周病治療剤の投与を1回又は複数回（例えば、2回、3回、4回、5回又はそれ以上）投与してもよい。また、歯周病治療剤の投与と抗菌処置との同時併用と逐次併用とを、対象の症状等に合わせて、交互に又はランダムに組み合せてもよい。
本発明において好ましい実施の形態は、歯周病治療剤の投与と抗菌処置とが同時に行われる形態である。
本発明の歯周病治療剤は、抗菌処置と併用することで歯周病治療として従来用いられてきたスケーリングおよび抗菌剤の投与による歯周病治療と比較して、より少量の抗菌剤で短時間に高い歯周病の治療効果を奏することができる。これにより、例えば従来抗生物質の投与で問題となっていた副作用や耐性菌の発生を抑制することが可能となる。
歯周病治療剤の投与と抗菌処置とを同時に行う場合、以下の形態に制限されないが、例えば、一実施の形態においては、培養上清と抗菌剤を予め混合した歯周病治療剤を調製して、直接患部に塗布する形態を挙げることができる。このような歯周病治療剤は、培養上清および抗菌材が上記の投与量の範囲内で含むように調製すればよい。
一方、歯周病治療剤の投与と抗菌処置との時系列が前後して実施される場合としては、以下の形態に限定されないが、培養上清を含む歯周病治療剤を患部に直接投与して、抗菌剤を別途経口投与する形態を挙げることができる。
【００４３】
本発明の歯周病治療剤は、一実施の形態において、ＧＴＲ法、骨移植材、コラーゲンスポンジ、または、b-FGFなどの歯周組織の再生を目的とする治療方法と併用して用いることができる。
本明細書において「骨移植材」とは、歯周病により損傷した歯周組織の再生のために併用して用いることのできる自家骨または人工骨をいい、ハイドロキシアパタイト（HA）、リン酸三カルシウム（TCP）、β−リン酸カルシウム（β-TCP）活性化ガラスなどを構成成分とする人工骨を指す。また、組み換え型ヒトb-FGF（塩基性線維芽細胞成長因子）も併用して投与されてもよく、市販のリグロス歯科用液セット（科研製薬株式会社；歯周組織再生剤および組み換え型ヒトb-FGF（塩基性線維芽細胞成長因子）を含む）などを併用することができる。
これら歯周組織の再生を目的とする治療方法は、本発明の歯周病治療剤の治療有効量を患部に投与した際に併せて治療に用いることができる。以下に制限されないが、例えば、患部に本発明の歯周病治療剤の塗布および抗菌処置をした後、ＧＴＲ法に用いるメンブレン、骨移植材、コラーゲンスポンジを患部に適用することができる。
【００４４】
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記実施形態にも下記実施例にも限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。また、本明細書において開示される文献の内容は、参照として本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００４５】
（実施例１：歯髄組織から歯髄細胞の採取）
１．試薬
・α-MEM培地（20%FBSおよび1% Penicillin-Streptomycinを含む）【００４６】
２．抜去乳歯から歯髄組織および歯髄細胞の回収
以下の作業はすべてセルプロセシングセンター（CPC）内の安全キャビネット内で行った。
提携先の歯科クリニックの患者（4〜13歳）より採取した抜去乳歯からピンセットなどを用いて歯髄組織を取り出した。歯髄組織はスカルペルなどを用いて細切し、Accutase（登録商標）などの組織分散用の酵素液を37℃にて30分間処置して細胞分散を行った。分散した細胞を20%FBS含有α-MEM培地にて懸濁し、細胞数のカウントを行った。細胞数のカウントの結果から適切なサイズの細胞培養用フラスコを用いて培養（37℃、5%CO2）した。【００４７】
（実施例２．継代培養および凍結保存）
１．試薬（実施例２以下、同様の試薬を用いた）
・α-MEM培地（20%FBSおよび1% Penicillin-Streptomycinを含む）
・TrypLE Select（gibco/12604-013）
・セルバンカー２（日本全薬工業）【００４８】
２．拡大培養
上記実施例１でフラスコに回収した初代培養細胞をフラスコ内でセミコンフルエント(細胞密度：70〜80%)状態になるまで培養した。検鏡によってセミコンフルエント状態であることを確認し、培地を全量取り除いた。血清を含む培地成分を完全に除去するためにD-PBS(-)(gibco/14190-144)を適量用いてフラスコ底面の洗浄を行い、この操作を2回繰り返した。洗浄後、TrypLE Select (gibco/12563-011)を適量加え、フラスコの底面全体へ行き渡らせ、37℃にてインキュベートを行った。一部の細胞がフラスコ底面より剥離したタイミングで、フラスコの中でゆっくりと液を循環させ、細胞をフラスコ底面より剥離させた。フラスコを傾けα-MEM培地をフラスコ全体に流すように加え、細胞を剥がし細胞懸濁液とした。細胞懸濁液を15mL tubeへ回収した。新たにα-MEM培地をフラスコ全体に流すように加え、細胞を剥がした。細胞懸濁液を15ml tubeへ回収した。フラスコから細胞が剥がれていることを検鏡によって確認した。回収した細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去し、α-MEM培地を加えて懸濁し、細胞数のカウントを行った。細胞密度2,000〜5,000cells/cm2で適切なサイズの細胞培養用フラスコを用いて、37℃、5%CO2のインキュベータ内で培養を行った。α-MEM培地を用いて拡大培養を行い、凍結保存した。【００４９】
３．凍結保存
拡大培養中の細胞がセミコンフルエント(細胞密度：70-80%)状態であることを確認後、培養上清を新しい50mLチューブに回収した。上清回収後のフラスコ内の細胞は凍結処理を行い、50mLチューブに回収した培養上清は、各種検査に用いた。HBV定量、HCV定量、HIV定量、パルボIgG、パルボIgM、CMV-IgG、CMV-IgM、FTA-ABS、STD-マイコプラズマ同定、エンドトキシンを含む検査により歯周病治療への使用に適した細胞であることを確認した。【００５０】
拡大培養中セミコンフルエント状態になり、培養上清を回収した後のフラスコ内から血清を含む培地成分を完全に除去するためにD-PBS(-)を用いてフラスコ底面の洗浄を行い、この操作を各フラスコ2回繰り返した。TrypLE Selectを各フラスコへ加え、フラスコの底面全体へ行き渡らせ、37℃にてインキュベートを行った。一部の細胞がフラスコ底面より剥離したタイミングで、フラスコの中でゆっくりと液を循環させ、細胞をフラスコ底面より剥離させた。α-MEM培地をフラスコ全体に流すように加え、細胞を剥がし細胞懸濁液とした。細胞懸濁液を15mL チューブへ回収した。新たに各フラスコにα-MEM培地を3mLずつフラスコ全体を流すように加え、フラスコ内の残りの細胞を剥がして細胞懸濁液とし、15mlチューブへ回収した。回収した細胞懸濁液は遠心分離を行い、その後上清を除去し、D-PBS(-)を加えて懸濁し、細胞数のカウントを行った。再度、遠心分離を行い、上清を除去した。細胞数に応じた量(最終濃度：0.9〜1.3×106cells/ml)の凍結保存液であるセルバンカー2を加え、優しくピペッティングを行った。細胞を含む凍結保存液をクライオチューブへ1mLずつ移した。クライオチューブをバイセルに入れ-80℃フリーザーで凍結させ、3日以内に液体窒素タンクへ移し保管した。【００５１】
（実施例３：培養上清回収のための歯髄細胞の調製）
２．細胞を起こす
凍結保存していた歯髄幹細胞を含む凍結細胞液を恒温槽中で7割ほど急速解凍した。7割ほど解凍した凍結細胞液を37℃に加温した培地（αMEM培地）へ加えた。解凍後、遠心分離を行い、その後上清を除去した。新たに培地を加えて、細胞数をカウントした。細胞密度2,000〜5,000cells/cm2で適切なサイズの細胞培養用フラスコを用いて、37℃、5%CO2のインキュベータ内でαMEM培地を用いて培養を行った。播種後、2〜3日おきに全量の培地交換を行った。【００５２】
３．細胞の継代
フラスコ内で細胞がセミコンフルエント(細胞密度：70-80%)状態になるまで培養した。検鏡によってセミコンフルエント状態であることを確認し、培地を全量取り除いた。血清を含む培地成分を完全に除去するためにD-PBS(-)(gibco/14190-144)を適量用いてフラスコ底面の洗浄を行い、この操作を2回繰り返した。洗浄後、TrypLE Select (gibco/12563-011)を適量加え、フラスコの底面全体へ行き渡らせ、37℃にてインキュベートを行った。一部の細胞がフラスコ底面より剥離したタイミングで、フラスコの中でゆっくりと液を循環させ、細胞をフラスコ底面より剥離させた。フラスコを傾けα-MEM培地をフラスコ全体に流すように加え、細胞を剥がし細胞懸濁液とした。細胞懸濁液を15mL tubeへ回収した。新たにα-MEM培地をフラスコ全体に流すように加え、細胞を剥がした。細胞懸濁液を15ml tubeへ回収した。フラスコから細胞が剥がれていることを検鏡によって確認した。回収した細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去し、α-MEM培地を加えて懸濁し、細胞数のカウントを行った。細胞密度2,000〜5,000cells/cm2で適切なサイズの細胞培養用フラスコを用いて、37℃、5%CO2のインキュベータ内でα-MEM培地を用いて培養を行った。【００５３】
（実施例４：培養上清の回収）
上記実施例３の継代培養後の歯髄細胞を、血清を含まないαMEM培地を含むフラスコ内で培養した。培養は37℃、5%CO2で72時間培養した。その後、培養に用いた培地を捨てずに、新しい15mLチューブへ回収した。回収後の培地を遠心にかけた。遠心処理後、上澄みのみ（沈査を含まない）を新しい15mLチューブへ回収し、歯髄細胞由来の培養上清とした。【００５４】
（実施例５：培養上清およびミノサイクリンの併用による歯周病治療１）
歯周病を患う男性患者（４９歳）に対して、歯髄幹細胞の培養上清およびミノサイクリンを併用した治療を施した。
当該男性患者からの主訴は、左上２番の歯について動揺と出血に伴う痛みであった。治療前の口腔内写真図を図１および図２に示す。当該男性患者に対する臨床所見は、歯肉の発赤膨張と咬合痛とを認めた。左上２番の歯周ポケットにおけるプロ―ピングデプス（ＰＰＤ）は１０ｍｍ、動揺は３度（２mm以上）、排膿（＋＋）、出血ＢＯＰ（＋＋）であった。Ｘ線検査をしたところ左上２番遠心の垂直的な骨吸収像が認められた。
２０１７年６月より歯周病初期治療を開始した。具体的には、Tooth Brushing Instruction（TBI）後、スケーリングルートプレーニングを行い消炎および口腔清掃状態（oral hygiene status）の改善を行った。
２０１７年８月４日に、左上２番の歯および歯肉に対してフラップ手術（歯肉を切開し、不良肉芽組織の除去および歯根面のスケーリングルートプレーニング）を行った（フラップ手術中の口腔内写真を図３および図４に示す）。その際、上記実施例４で調製した歯髄幹細胞の培養上清およびミノサイクリンを含む治療剤（培養上清含有治療剤）を歯根面および歯槽骨の骨欠損部位に塗布した。具体的には、培養上清０．２５ｍｌとペリオフィール（登録商標）歯科用軟膏２％（昭和薬品化工株式会社；０．５ｇ中ミノサイクリン塩酸塩１０ｍｇ（力価）含有）０．１ｇとを注入用シリンジ（ディスポ・ニプロシリンジとニプロブラント針）に添加し、滅菌した金属のかき混ぜ棒を使用して機械的にゲル状になるまで混合して培養上清含有治療剤を調製した。その後、歯根面に対してEDTAにて表面処理を行い、上記注入用シリンジにて歯根面および歯槽骨の骨欠損部位に培養上清含有治療剤を全量塗布した（図５）。塗布後は、切開した歯肉を閉じて縫合した（図６）。
その後、下記治療歴に記載するように、３回にわたり培養上清含有治療剤の塗布を行った。２回目以降の培養上清含有治療剤の塗付は、フラップ手術を併用せずに歯周組織および歯周ポケット内へ塗付した。【００５５】
【表１】
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【００５６】
４回目の培養上清含有治療剤を用いた治療を行った際（１回目の培養上清含有治療剤を用いた治療から８５日経過後）の臨床所見は、歯周ポケットＰＰＤは４ｍｍ、動揺は１度（０．２mm以下）、排膿（−）、出血ＢＯＰ（−）であった。また、Ｘ線検査の結果、歯周病により吸収された歯槽骨の再生を観察することができた（図７）。【００５７】
（実施例６：培養上清およびミノサイクリンの併用による歯周病治療２）
歯周病を患う５名の患者（２０〜８５歳）に対して、歯髄幹細胞の培養上清およびミノサイクリンを併用した治療を施した。歯髄幹細胞の培養上清は上記実施例４で調製したものを用い、ミノサイクリンは実施例５と同じものを使用した。５名の患者の年齢、試験開始前における歯周ポケット、動揺度数、自他覚症状の有無の評価を下記表に示す。
【表２】
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【表３】
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【表４】
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各患者の「自覚症状」、「他覚症状」、「歯周ポケットの深さ」、「増骨」について下記表のスケジュールに従い評価した。また、前記４つの項目に加えて、「歯の動揺度数」について試験開始前と最終評価時に測定・評価した。
【表５】
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（最終評価は、各患者の治療終了時点または治療から一定期間経過後に行った。具体的には、S.N氏は2017年12月4日、Y.M氏は2017年12月11日、N.M氏は2018年2月16日、M.Y氏は2018年3月16日、Y.T氏は2018年4月4日に最終評価を行った）【００５８】
各患者に対する培養上清およびミノサイクリンの投与量、投与回数、投与期間を下記表に示す。表中、FOP実施はフラップ手術を実施したことを示す。
【表６】
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【００５９】
５各の患者における治療前後の歯周ポケットの変化の結果を図８に示す。また各患者の初診時と最終評価時における口腔内の写真図と動揺度数、他自覚症状の評価を図９〜１３に示す。
図８に示すように、治療後の各患者において歯周ポケットの深さは平均約２５％も減少した。また図９〜１３に示すように、歯の動揺度数は全患者において改善し、動揺度数の平均は２．６から１．０へと減少した。さらに、各患者はいずれも初診時に咬合痛、鈍痛、排膿、出血が認められていたが、最終評価時にはすべての患者において咬合痛、鈍痛、排膿、出血が消失した。【００６０】
従来のスケーリング・ルートプレーニングによる歯周病治療は、細菌およびその代謝産物を減少させる処置である。またキュレット型スケーラーを用いて行う歯肉縁下のスケーリング・ルートプレーニングは歯肉縁下、すなわち歯周ポケットに面した歯面に対して行うものであり、歯周ポケットが深くなるにつれて操作は複雑となり、適切な技術および時間と労力を必要とする。
また、ポケット掻爬については、スケーリング・ルートプレーニングで改善がない場合に、歯周ポケットに面する根面の細菌性プラークと歯石を除去した後、さらに汚染している根表面のセメント質を除去するとともに歯周ポケット内壁の接合上皮を含む歯周ポケット上皮層と炎症性結合組織とをキュレット型スケーラーを用いて掻爬する。歯周ポケット掻爬を行うことで、歯周組織の炎症を改善し、歯周ポケットを浅くすることが期待される。
このように、従来のスケーリング、ルートプレーニング、更にポケット掻爬による歯周病治療については、歯周組織の炎症の改善および歯周ポケットを浅くすることが主な目的となる。同様にペリオフィールのような抗生物質の投与についても歯周ポケット内の歯周病原菌の総細菌数を減少させることが目的のため、今回の実施例５に示される様に一般的には歯槽骨の再生は期待できない。
また、上記実施例５で治療に用いたミノサイクリン塩酸塩は４回の投与で合計約８ｍｇであった。従来のミノサイクリン塩酸塩を含む歯科用軟膏の用量（週１回、１０ｍｇ（力価）のミノサイクリン塩酸塩を使用）と比較して、少ない量の投与で高い歯周病治療効果を奏していた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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