(57)【要約】本発明は、（１）ナノ粒子、（２）ナノ粒子の表面に担持された下記一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤含有基、（３）ナノ粒子の表面に担持された下記一般式（Ｌ１）で示されるリガンド含有基、及び（４）ナノ粒子の表面に担持された下記一般式（Ｂ）で示されるリン脂質疑似物質基を含む複合体、この複合体を有効成分として含有する抗ガン剤に関する。2019208820.tif 000109一般式（Ａ）中、Ｒ１０は酵素阻害剤含有部位、一般式（Ｌ１）中、Ｒ２０は細胞表面受容体に対して結合性を有するリガンド部位を含む。一般式（Ａ）、（Ｌ１）及び（Ｂ）中、−Ｓ−末端がナノ粒子担持部位である。本発明は、リガンドを結合した薬剤の細胞内への移送において、細胞内に取り込まれた薬剤が速やかに細胞膜外にリサイクルされることなしに、細胞内で放出され得る手段、この手段を利用して、細胞膜内の酵素に対する活性物質のような薬剤を送達する手段、及びこの手段を利用した抗ガン剤を提供する。
2019208820.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）ナノ粒子、（２）前記ナノ粒子の表面に担持された下記一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤含有基、（３）前記ナノ粒子の表面に担持された下記一般式（Ｌ１）で示されるリガンド含有基、及び（４）前記ナノ粒子の表面に担持された下記一般式（Ｂ）で示されるリン脂質疑似物質基を含む複合体。
【化１】
2019208820.tif 000086
（一般式（Ａ）中、ｎ１は２〜３０の整数であり、ｎ２は２〜３０の整数であり、−Ｓ−末端がナノ粒子担持部位であり、Ｒ１０は酵素阻害剤含有部位である。）
【化２】
2019208820.tif 000087
（一般式（Ｌ１）中、ｎ１は２〜３０の整数であり、ｎ２は２〜３０の整数であり、−Ｓ−末端がナノ粒子担持部位であり、Ｒ２０は細胞表面受容体に対して結合性を有するリガンド部位を含む。）
【化３】
2019208820.tif 000088
（一般式（Ｂ）中、ｎ３は２〜３０の範囲の整数であり、−Ｓ−末端がナノ粒子担持部位である。）
【請求項２】
一般式（Ａ）中のＲ１０＝Ｎ−Ｏ−は下記一般式（Ａ１）で示され、
【化４】
2019208820.tif 000089
（一般式（Ａ１）中、ＥＩＨは、酵素阻害剤部位であり、酵素阻害剤部位は、リソソーム酵素の活性中心と反応性を有する自殺基質部位、又はキナーゼと反応性を有するキナーゼ阻害部位であり、ＬＫはリンカー部位である。）
一般式（Ｌ１）中のＲ２０＝Ｎ−Ｏ−は下記一般式（Ｌ２）で示される請求項１に記載の複合体。
【化５】
2019208820.tif 000090
（一般式（Ｌ２）中、ＬＤはリガンド部位であり、ＬＫはリンカー部位である。）
【請求項３】
一般式（Ａ）中のＲ１０＝Ｎ−Ｏ−は下記一般式（Ａ２）又は（Ａ３）で示され、
【化６】
2019208820.tif 000091
（一般式（Ａ２）中、ｍ２は１〜１０の整数であり、ＥＩＨは酵素阻害剤部位であり、酵素阻害剤部位は、リソソーム酵素の活性中心と反応性を有する自殺基質部位、又はキナーゼと反応性を有するキナーゼ阻害部位である。）
【化７】
2019208820.tif 000092
（一般式（Ａ３）中、ｍ４は１〜１０の整数であり、ＥＩＨは一般式（Ａ２）と同義である。）
かつ
一般式（Ｌ１）中のＲ２０＝Ｎ−Ｏ−は下記一般式（Ｌ３）又は（Ｌ４）で示される請求項１に記載の複合体。
【化８】
2019208820.tif 000093
（一般式（Ｌ３）中、ｍ１は１〜１０の整数であり、ｍ２は１〜１０の整数であり、ＬＤはリガンド部位である。）
【化９】
2019208820.tif 000094
（一般式（Ｌ４）中、ｍ３は１〜１０の整数であり、ＬＤはリガンド部位である。）
【請求項４】
前記リガンド部位は、インテグリン、ソマトスタチンガン細胞受容体又は糖鎖受容体に対するリガンド部位である請求項１〜３のいずれかに記載の複合体。
【請求項５】
インテグリンに対するリガンド部位は、細胞接着性タンパク質、細胞外マトリックス分子、フィブロネクチン、ラミニン若しくはその断片、コラーゲン若しくはその断片、又は白血球若しくはその断片を含む、請求項４に記載の複合体。
【請求項６】
ソマトスタチンガン細胞受容体に対するリガンド部位は、１４アミノ酸型ソマトスタチン、２８アミノ酸型ソマトスタチン、オクトレオチド、ランレオチド、パシレオチド又はそれらのアナログ体を含む、請求項４に記載の複合体。
【請求項７】
一般式（Ａ）で示されるリソソーム酵素阻害剤又はキナーゼ阻害剤と一般式（Ｂ）で示されるリン脂質疑似物質のモル比率が１：１００〜１０：１の範囲であり、一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤含有基と一般式（Ｌ１）で示されるリガンド含有基のモル比率が１０：１〜１：１０の範囲である、請求項１〜６のいずれかに記載の複合体。
【請求項８】
前記ナノ粒子は、金属ナノ粒子又は半導体ナノ粒子である、請求項１〜７のいずれかに記載の複合体。
【請求項９】
前記ナノ粒子は、粒子径が０．１〜１００ｎｍの範囲である請求項１〜８のいずれかに記載の複合体。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の複合体を有効成分として含有する抗ガン剤。
【請求項１１】
前記抗ガン剤は、乳癌、前立腺癌、肝細胞癌、膵癌、大腸癌、卵巣癌、腎癌、肺癌、または脳腫瘍に対する抗ガン剤である請求項１０に記載の抗ガン剤。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれかに記載の複合体の製造方法であって、
下記一般式（Ｃ）で示される架橋前駆体Ｘ及び下記一般式（Ｄ）で示されるリン脂質疑似物質前駆体とコロイド状ナノ粒子とを混合して、ナノ粒子の表面に架橋前駆体Ｘ及びリン脂質疑似物質を担持した表面修飾ナノ粒子を得る工程（１）、及び
得られた表面修飾ナノ粒子に下記一般式（Ｅ）で示される酵素阻害剤前駆体Ｙ及び下記一般式（Ｌ５）で示されるリガンド前駆体ＰＬを混合して、前記表面修飾ナノ粒子上の架橋前駆体Ｘと連結させて下記一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤含有基及び下記一般式（Ｌ１）で示されるリガンド含有基を形成して請求項１〜９のいずれかに記載の複合体を得る工程（２）を含む前記方法。
【化１０】
2019208820.tif 000095
（一般式（Ｃ）中、ｎ１は２〜３０の整数であり、ｎ２は２〜３０の整数である。)
【化１１】
2019208820.tif 000096
(一般式（Ｄ）中、ｎ３は２〜３０の範囲の整数である。)
【化１２】
2019208820.tif 000097
（一般式（Ｅ）中、Ｒ１０は酵素阻害剤含有部位である。）
【化１３】
2019208820.tif 000098
（一般式（Ｌ５）中、Ｒ２０は細胞表面受容体に対して結合性を有するリガンド部位を含む。）
【化１４】
2019208820.tif 000099
（一般式（Ａ）中、ｎ１は２〜３０の整数であり、ｎ２は２〜３０の整数であり、−Ｓ−末端がナノ粒子担持部位であり、Ｒ１０は酵素阻害剤含有部位である。）
【化１５】
2019208820.tif 000100
（一般式（Ｌ１）中、ｎ１は２〜３０の整数であり、ｎ２は２〜３０の整数であり、−Ｓ−末端がナノ粒子担持部位であり、Ｒ２０は細胞表面受容体に対して結合性を有するリガンド部位を含む。）
【請求項１３】
一般式（Ｅ）で示される酵素阻害剤前駆体Ｙは、下記一般式（Ｅ１）で示され、
【化１６】
2019208820.tif 000101
(一般式（Ｅ１）中、ＥＩＨは、酵素阻害剤部位であり、酵素阻害剤部位は、リソソーム酵素の活性中心と反応性を有する自殺基質部位、又はキナーゼと反応性を有するキナーゼ阻害部位であり、ＬＫはリンカー部位である。）
一般式（Ｌ５）で示されるリガンド前駆体ＰＬは、下記一般式（Ｌ６）で示される、請求項１２に記載の製造方法。
【化１７】
2019208820.tif 000102
（一般式（Ｌ６）中、ＬＤはリガンド部位であり、ＬＫはリンカー部位である。）
【請求項１４】
一般式（Ｌ５）で示されるリガンド前駆体ＰＬが、下記一般式（Ｌ７）又は（Ｌ８）で示される化合物である請求項１２に記載の製造方法。
【化１８】
2019208820.tif 000103
（一般式（Ｌ７）中、ｍ１は１〜１０の整数であり、ｍ２は１〜１０の整数であり、ＬＤはリガンド部位である。）
【化１９】
2019208820.tif 000104
（一般式（Ｌ８）中、ｍ３は１〜１０の整数であり、ＬＤはリガンド部位である。）
【請求項１５】
一般式（Ｅ）で示される酵素阻害剤前駆体Ｙは、下記一般式（Ｅ２）又は（Ｅ３）で示される
【化２０】
2019208820.tif 000105
（一般式（Ｅ２）及び（Ｅ３）中、ＥＩＨは酵素阻害剤部位であり、酵素阻害剤部位は、リソソーム酵素の活性中心と反応性を有する自殺基質部位、又はキナーゼと反応性を有するキナーゼ阻害部位であり、ｍ２は１〜１０の整数であり、ｍ４は１〜１０の整数である。）請求項１３又は１４に記載の製造方法。
【請求項１６】
一般式（Ｌ６）で示されるリガンド前駆体。
【化２１】
2019208820.tif 000106
（一般式（Ｌ６）中、ＬＤはインテグリン、ソマトスタチンガン細胞受容体又は糖鎖受容体に対するリガンド部位である。
【請求項１７】
下記一般式（Ｌ７）又は（Ｌ８）で示されるリガンド前駆体。
【化２２】
2019208820.tif 000107
（一般式（Ｌ７）中、ｍ１は１〜１０の整数であり、ｍ２は１〜１０の整数であり、ＬＤはインテグリン、ソマトスタチンガン細胞受容体又は糖鎖受容体に対するリガンド部位である。）
【化２３】
2019208820.tif 000108
（一般式（Ｌ８）中、ｍ３は１〜１０の整数であり、ＬＤはリガンド部位である。）
【請求項１８】
請求項１〜９のいずれかに記載の複合体を調製する工程、および
前記複合体を酵素阻害剤移送の対象である細胞、または前記細胞を含む生体に供給して、前記細胞に酵素阻害剤を取り込ませる工程
を含む、酵素阻害剤の細胞への移送方法。
【請求項１９】
酵素阻害剤移送の対象である細胞が、ガン細胞である、請求項１８に記載の移送方法。
【請求項２０】
前記細胞を含む生体が哺乳動物（ヒトを含む、又は含まない）である、請求項１９に記載の移送方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内物質移送システムおよびその利用に関する。
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年４月２７日出願の日本特願２０１８−０８７４３６号の優先権を主張し、その全記載は、ここに特に開示として援用される。
【背景技術】
【０００２】
治療効果が期待される医薬品の多くの標的タンパク質は細胞内の核を含む特定のオルガネラあるいは細胞質に分布している。このため、医薬品を作用すべき細胞内の空間に送達できなければ期待された治療効果は得られない。【０００３】
実際、薬効を得るためには細胞内に薬効成分が取り込まれる必要があることが示されている(非特許文献１)。しかし、依然として低分子・高分子を問わず、薬剤を効率良く目的の細胞内スペースあるいは、エンドリソソーム、ミトコンドリア、核などの特定のオルガネラに運搬して低濃度で機能させることが可能なシステムの例は少ない。【０００４】
細胞表面にはインテグリンなどのレセプターが存在し、このレセプターに対するリガンドを有する薬剤がレセプターに結合し、それによりエンドサイトシスが起こることが知られている。ところが、エンドサイトシス後に、取り込まれた薬剤を有するリガンド−レセプター複合体が速やかに細胞膜にリサイクルされることも報告されている（非特許文献２〜５）。【０００５】
これに対して、薬剤を様々な種類の粒子に担持して細胞内に取り込ませる試みもなされている（非特許文献６）。種々の薬剤送達システムも考案され、特に、標的指向化を可能とする、ＥＰＲ（enhanced permeability and retention）効果等を利用した、例えば、高分子のナノ粒子、ミセル化ナノ粒子、磁性ナノ粒子などを使った種々のシステムが知られている。（例えば、特許文献１〜４参照）【０００６】
さらに、生体内に置かれた粒子が、生体内でどのような扱いを受けるかについても研究が進んでいる（非特許文献７および８）。粒子が生体内に置かれると、生体内のタンパク質が粒子表面に非特異的に結合し、薬剤を結合した粒子表面を被覆して凝集することも知られている（非特許文献７）。また、血清タンパク質が表面に結合することで、粒子サイズが増大して、エンドサイトシスが起こりにくくなる場合があることも知られている（非特許文献８）。【０００７】
特許文献１：日本特表２００９−５３４３０９号公報
特許文献２：日本特表２０１１−５２８２７５号公報
特許文献３：日本特表２０１５−５２０１９４号公報
特許文献４：日本特表２０１５−５２０１９７号公報【０００８】
非特許文献１：Shin-Ichiro Nishimura et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2012, 51, 3386-3390
非特許文献２：Sara M. Weis et al., Cancer Cell 15, 359-361(2009)
非特許文献３：Andrew R Reynolds et al., Nat. Med. 15, 392-400(2009)
非特許文献４：Rebecca E. Bridgewater et al., J. Cell Sci. 125, 3695-3701(2012)
非特許文献５：Alfredo Erazo-Oliveras et al., Pharmaceuticals 5, 1177-1209 (2012)
非特許文献６：Jinjun Shi et al., Nat.Rev.Cancer 17,20-37(2017)
非特許文献７：Marco P. Monopoli et al., Nat.Nanotechnol. 7, 779-786(2012)
非特許文献８：Carl D. Walkey et al., J.Am.Chem.Soc. 134, 2139-2147(2012)
特許文献１〜４及び非特許文献１〜８の全記載は、ここに特に開示として援用される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
薬剤にリガンドを結合し、これを細胞内に取り込ませることが行われているが、受容体が、例えばインテグリンの場合、非特許文献２〜５に記載のように、取り込まれた薬剤が速やかに細胞膜にリサイクルされ、再び細胞外に放出され、副作用の原因ともなることから、薬剤の細胞内への移送方法としての有効性が疑われている。【００１０】
そこで本発明が解決すべき課題は、リガンドを結合した薬剤の細胞内への移送において、細胞内に取り込まれた薬剤が速やかに細胞膜外にリサイクルされることなしに、細胞内で放出され得る手段を提供することであり、本発明は、このような手段を提供することを目的とする。【００１１】
さらに本発明は、薬剤を効率良く細胞内、特にエンドリソソーム、に運搬する上記手段を利用して、細胞膜内の酵素、例えば、キナーゼ等に対する活性物質（例えば、阻害剤）のような薬剤を送達する手段を提供することを目的とする。【００１２】
加えて本発明は、このような手段を利用した抗ガン剤を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、以下の通りである。
[１]
（１）ナノ粒子、（２）前記ナノ粒子の表面に担持された下記一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤含有基、（３）前記ナノ粒子の表面に担持された下記一般式（Ｌ１）で示されるリガンド含有基、及び（４）前記ナノ粒子の表面に担持された下記一般式（Ｂ）で示されるリン脂質疑似物質基を含む複合体。
【化１】
2019208820.tif 000003
（一般式（Ａ）中、ｎ１は２〜３０の整数であり、ｎ２は２〜３０の整数であり、−Ｓ−末端がナノ粒子担持部位であり、Ｒ１０は酵素阻害剤含有部位である。）
【化２】
2019208820.tif 000004
（一般式（Ｌ１）中、ｎ１は２〜３０の整数であり、ｎ２は２〜３０の整数であり、−Ｓ−末端がナノ粒子担持部位であり、Ｒ２０は細胞表面受容体に対して結合性を有するリガンド部位を含む。）
【化３】
2019208820.tif 000005
（一般式（Ｂ）中、ｎ３は２〜３０の範囲の整数であり、−Ｓ−末端がナノ粒子担持部位である。）
[２]
一般式（Ａ）中のＲ１０＝Ｎ−Ｏ−は下記一般式（Ａ１）で示され、
【化４】
2019208820.tif 000006
（一般式（Ａ１）中、ＥＩＨは、酵素阻害剤部位であり、酵素阻害剤部位は、リソソーム酵素の活性中心と反応性を有する自殺基質部位、又はキナーゼと反応性を有するキナーゼ阻害部位であり、ＬＫはリンカー部位である。）
一般式（Ｌ１）中のＲ２０＝Ｎ−Ｏ−は下記一般式（Ｌ２）で示される［１］に記載の複合体。
【化５】
2019208820.tif 000007
（一般式（Ｌ２）中、ＬＤはリガンド部位であり、ＬＫはリンカー部位である。）
[３]
一般式（Ａ）中のＲ１０＝Ｎ−Ｏ−は下記一般式（Ａ２）又は（Ａ３）で示され、
【化６】
2019208820.tif 000008
（一般式（Ａ２）中、ｍ２は１〜１０の整数であり、ＥＩＨは酵素阻害剤部位であり、酵素阻害剤部位は、リソソーム酵素の活性中心と反応性を有する自殺基質部位、又はキナーゼと反応性を有するキナーゼ阻害部位である。）
【化７】
2019208820.tif 000009
（一般式（Ａ３）中、ｍ４は１〜１０の整数であり、ＥＩＨは一般式（Ａ２）と同義である。）
かつ
一般式（Ｌ１）中のＲ２０＝Ｎ−Ｏ−は下記一般式（Ｌ３）又は（Ｌ４）で示される［１］に記載の複合体。
【化８】
2019208820.tif 000010
（一般式（Ｌ３）中、ｍ１は１〜１０の整数であり、ｍ２は１〜１０の整数であり、ＬＤはリガンド部位である。）
【化９】
2019208820.tif 000011
（一般式（Ｌ４）中、ｍ３は１〜１０の整数であり、ＬＤはリガンド部位である。）
[４]
前記リガンド部位は、インテグリン、ソマトスタチンガン細胞受容体又は糖鎖受容体に対するリガンド部位である［１］〜［３］のいずれかに記載の複合体。
[５]
インテグリンに対するリガンド部位は、細胞接着性タンパク質、細胞外マトリックス分子、フィブロネクチン、ラミニン若しくはその断片、コラーゲン若しくはその断片、又は白血球若しくはその断片を含む、［４］に記載の複合体。
[６]
ソマトスタチンガン細胞受容体に対するリガンド部位は、１４アミノ酸型ソマトスタチン、２８アミノ酸型ソマトスタチン、オクトレオチド、ランレオチド、パシレオチド又はそれらのアナログ体を含む、［４］に記載の複合体。
[７]
一般式（Ａ）で示されるリソソーム酵素阻害剤又はキナーゼ阻害剤と一般式（Ｂ）で示されるリン脂質疑似物質のモル比率が１：１００〜１０：１の範囲であり、一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤含有基と一般式（Ｌ１）で示されるリガンド含有基のモル比率が１０：１〜１：１０の範囲である、［１］〜［６］のいずれかに記載の複合体。
[８]
前記ナノ粒子は、金属ナノ粒子又は半導体ナノ粒子である、［１］〜［７］のいずれかに記載の複合体。
[９]
前記ナノ粒子は、粒子径が０．１〜１００ｎｍの範囲である［１］〜［８］のいずれかに記載の複合体。
[１０]
［１］〜［９］のいずれかに記載の複合体を有効成分として含有する抗ガン剤。
[１１]
前記抗ガン剤は、乳癌、前立腺癌、肝細胞癌、膵癌、大腸癌、卵巣癌、腎癌、肺癌、または脳腫瘍に対する抗ガン剤である［１０］に記載の抗ガン剤。
[１２]
［１］〜［９］のいずれかに記載の複合体の製造方法であって、
下記一般式（Ｃ）で示される架橋前駆体Ｘ及び下記一般式（Ｄ）で示されるリン脂質疑似物質前駆体とコロイド状ナノ粒子とを混合して、ナノ粒子の表面に架橋前駆体Ｘ及びリン脂質疑似物質を担持した表面修飾ナノ粒子を得る工程（１）、及び
得られた表面修飾ナノ粒子に下記一般式（Ｅ）で示される酵素阻害剤前駆体Ｙ及び下記一般式（Ｌ５）で示されるリガンド前駆体ＰＬを混合して、前記表面修飾ナノ粒子上の架橋前駆体Ｘと連結させて下記一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤含有基及び下記一般式（Ｌ１）で示されるリガンド含有基を形成して［１］〜［９］のいずれかに記載の複合体を得る工程（２）を含む前記方法。
【化１０】
2019208820.tif 000012
（一般式（Ｃ）中、ｎ１は２〜３０の整数であり、ｎ２は２〜３０の整数である。)
【化１１】
2019208820.tif 000013
(一般式（Ｄ）中、ｎ３は２〜３０の範囲の整数である。)
【化１２】
2019208820.tif 000014
（一般式（Ｅ）中、Ｒ１０は酵素阻害剤含有部位である。）
【化１３】
2019208820.tif 000015
（一般式（Ｌ５）中、Ｒ２０は細胞表面受容体に対して結合性を有するリガンド部位を含む。）
【化１４】
2019208820.tif 000016
（一般式（Ａ）中、ｎ１は２〜３０の整数であり、ｎ２は２〜３０の整数であり、−Ｓ−末端がナノ粒子担持部位であり、Ｒ１０は酵素阻害剤含有部位である。）
【化１５】
2019208820.tif 000017
（一般式（Ｌ１）中、ｎ１は２〜３０の整数であり、ｎ２は２〜３０の整数であり、−Ｓ−末端がナノ粒子担持部位であり、Ｒ２０は細胞表面受容体に対して結合性を有するリガンド部位を含む。）
[１３]
一般式（Ｅ）で示される酵素阻害剤前駆体Ｙは、下記一般式（Ｅ１）で示され、
【化１６】
2019208820.tif 000018
(一般式（Ｅ１）中、ＥＩＨは、酵素阻害剤部位であり、酵素阻害剤部位は、リソソーム酵素の活性中心と反応性を有する自殺基質部位、又はキナーゼと反応性を有するキナーゼ阻害部位であり、ＬＫはリンカー部位である。）
一般式（Ｌ５）で示されるリガンド前駆体ＰＬは、下記一般式（Ｌ６）で示される、［１２］に記載の製造方法。
【化１７】
2019208820.tif 000019
（一般式（Ｌ６）中、ＬＤはリガンド部位であり、ＬＫはリンカー部位である。）
[１４]
一般式（Ｌ５）で示されるリガンド前駆体ＰＬが、下記一般式（Ｌ７）又は（Ｌ８）で示される化合物である［１２］に記載の製造方法。
【化１８】
2019208820.tif 000020
（一般式（Ｌ７）中、ｍ１は１〜１０の整数であり、ｍ２は１〜１０の整数であり、ＬＤはリガンド部位である。）
【化１９】
2019208820.tif 000021
（一般式（Ｌ８）中、ｍ３は１〜１０の整数であり、ＬＤはリガンド部位である。）
[１５]
一般式（Ｅ）で示される酵素阻害剤前駆体Ｙは、下記一般式（Ｅ２）又は（Ｅ３）で示される
【化２０】
2019208820.tif 000022
【化２１】
2019208820.tif 000023
（一般式（Ｅ２）及び（Ｅ３）中、ＥＩＨは酵素阻害剤部位であり、酵素阻害剤部位は、リソソーム酵素の活性中心と反応性を有する自殺基質部位、又はキナーゼと反応性を有するキナーゼ阻害部位であり、ｍ２は１〜１０の整数であり、ｍ４は１〜１０の整数である。）［１３］又は［１４］に記載の製造方法。
[１６]
一般式（Ｌ６）で示されるリガンド前駆体。
【化２２】
2019208820.tif 000024
（一般式（Ｌ６）中、ＬＤはインテグリン、ソマトスタチンガン細胞受容体又は糖鎖受容体に対するリガンド部位であり、ＬＫはリンカー部位である。
[１７]
下記一般式（Ｌ７）又は（Ｌ８）で示されるリガンド前駆体。
【化２３】
2019208820.tif 000025
（一般式（Ｌ７）中、ｍ１は１〜１０の整数であり、ｍ２は１〜１０の整数であり、ＬＤはインテグリン、ソマトスタチンガン細胞受容体又は糖鎖受容体に対するリガンド部位である。）
【化２４】
2019208820.tif 000026
（一般式（Ｌ８）中、ｍ３は１〜１０の整数であり、ＬＤはリガンド部位である。）
[１８]
［１］〜［９］のいずれかに記載の複合体を調製する工程、および
前記複合体を酵素阻害剤移送の対象である細胞、または前記細胞を含む生体に供給して、前記細胞に酵素阻害剤を取り込ませる工程
を含む、酵素阻害剤の細胞への移送方法。
[１９]
酵素阻害剤移送の対象である細胞が、ガン細胞である、［１８］に記載の移送方法。
[２０]
前記細胞を含む生体が哺乳動物（ヒトを含む、又は含まない）である、［１９］に記載の移送方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、リガンドを結合した薬剤の細胞内への移送において、細胞内に取り込まれた薬剤が速やかに細胞膜にリサイクルされることを阻害できる手段を提供することができる。この手段を用いることで、細胞膜内の酵素に対する活性物質（例えば、阻害剤）を送達することができる。さらに、この手段を利用することで、細胞がガン細胞である場合には、ガン細胞を攻撃することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
図１は、化合物7とソラフェニブ誘導体を同時に担持した蛍光性ナノ微粒子（量子ドット）のMALDI-TOFMSを示す。
図２は、化合物7を担持した蛍光性ナノ微粒子（10 nM）の癌細胞内挙動：蛍光性ナノ微粒子の肝癌細胞（HepG2）培養開始後（0.5〜24時間）での細胞内動体（Scale bar size=50μm）を示す。
図３は、化合物7とソラフェニブ誘導体を担持した蛍光性ナノ微粒子（10 nM）の癌細胞内挙動：蛍光性ナノ微粒子の肝癌細胞（HepG2）培養開始後（0.5〜24時間）での細胞内動体（Scale bar size=50μm）を示す。
図４は、化合物7とソラフェニブ誘導体を担持した蛍光性ナノ微粒子（1〜100 nM）の抗腫瘍効果（肝癌細胞殺傷作用）を示す。
図５は、Linear型Somatostatin-14誘導体(11)のHPLC (A) および MALDI-TOF MS (B) を示す。
図６は、Somatostatin-14誘導体(12)のHPLC (A) および MALDI-TOF MS (B) を示す。
図７は、化合物12、化合物13および12と13を担持したリン脂質被覆蛍光性ナノ微粒子のMALDI-TOF MSを示す。
図８は、化合物12を担持した蛍光性ナノ微粒子のガン細胞内挙動：蛍光性ナノ微粒子を培地中に添加後、0.5〜24時間での時間変化(Scale bar size＝50μm) を示す。
図９は、化合物12および13を担持した蛍光性ナノ微粒子のガン細胞内挙動：蛍光性ナノ微粒子を培地中に添加後、0.5〜24時間での時間変化(Scale bar size＝50μm) を示す。
図１０は、化合物13および化合物12と13を担持した蛍光性ナノ微粒子（100〜1 nM QD anchored 13, 12/13）の肝癌細胞殺傷作用を示す。
図１１は、化合物12および化合物12を担持した蛍光性ナノ微粒子（100〜1 nM QD anchored 12）の肝癌細胞殺傷作用を示す。
図１２は、蛍光性ナノ微粒子（本発明の複合体（４０））のMALDI-TOF MSを示す。
図１３は、実施例６で得られた蛍光顕微鏡写真を示す。
図１４は、実施例７で得られた細胞生存率の測定結果を示す。
図１５は、参考例Ａで得られた写真及びFCS分析結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
［複合体］
本発明は、以下の（１）〜（４）を含む複合体に関する。
（１）ナノ粒子、
（２）前記ナノ粒子の表面に担持された一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤含有基、
（３）前記ナノ粒子の表面に担持された一般式（Ｌ１）で示されるリガンド含有基、及び
（４）前記ナノ粒子の表面に担持された一般式（Ｂ）で示されるリン脂質疑似物質基。
【００１７】
（１）ナノ粒子
ナノ粒子は、金属ナノ粒子又は半導体ナノ粒子であることができる。金属ナノ粒子の材質には、特に制限はないが、金、白金、銀、鉄磁性体であることができ、金属ナノ粒子は、金ナノ粒子、白金ナノ粒子、銀ナノ粒子、鉄磁性体ナノ粒子であることができる。特に、金属ナノ粒子は、金ナノ粒子、白金ナノ粒子、銀ナノ粒子が、生体に対する安全性という観点から好ましい。
【００１８】
半導体ナノ粒子の材質には、特に制限はない。半導体ナノ粒子は、量子ドットであることもできる。量子ドットとは半導体原子が数百個から数千個集まった１０数ｎｍ程度の小さな塊であり、蛍光性ナノ粒子である。粒子径により発光する蛍光の波長（色）が異なる。市販品を利用でき、本発明の複合体のナノ粒子に量子ドットを用いると、蛍光発光性の複合体とすることができ、生体内での動態をモニタリングすることも可能である。
【００１９】
ナノ粒子は、粒子径が０．１〜１００ｎｍの範囲であることができ、好ましくは、１〜５０ｎｍの範囲、より好ましくは５〜２０ｎｍの範囲、さらに好ましくは５〜１５ｎｍの範囲である。
【００２０】
（２）ナノ粒子の表面に担持された一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤含有基
本発明の複合体においては、一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤含有基が、ナノ粒子の表面に担持されている。
【化２５】
2019208820.tif 000027
一般式（Ａ）中、ｎ１は２〜３０の整数であり、ｎ２は２〜３０の整数であり、−Ｓ−末端がナノ粒子担持部位であり、Ｒ１０は酵素阻害剤含有部位である。酵素阻害剤含有部位は、例えば、リソソーム酵素の活性中心と反応性を有する自殺基質部位、又はキナーゼと反応性を有するキナーゼ阻害部位であることができるが、これらに限定される意図ではない。
【００２１】
一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤含有基は、式中のｎ１及びｎ２を選択することで、酵素阻害剤含有基とナノ粒子との間の距離を所望の範囲に保つことができ、その結果、細胞内での酵素阻害活性、例えば、リソソーム酵素不活性化作用又はキナーゼ阻害作用を調節することができる。ｎ１は２〜３０、好ましくは５〜１６、より好ましくは４〜１５の範囲の整数である。ｎ２は２〜３０、好ましくは５〜２０、より好ましくは７〜１５の範囲の整数である。
【００２２】
一般式（Ａ）中のＲ１０＝Ｎ−Ｏ−は、＞Ｃ＝Ｎ−Ｏ−で表される、炭素-窒素二重結合であるイミン結合を含む。酵素阻害剤含有基のナノ粒子への担持は、イミン結合を含むリンカーを介したものであることで、細胞内でのｐＨ変化により酵素阻害剤がリリースされ易くなる。一般式（Ａ）中のＲ１０＝Ｎ−は、例えば、下記一般式（Ａ１）で示すことができる。
【００２３】
【化２６】
2019208820.tif 000028
一般式（Ａ１）中、ＥＩＨは、酵素阻害剤部位である。酵素阻害剤部位は、リソソーム酵素の活性中心と反応性を有する自殺基質部位、又はキナーゼと反応性を有するキナーゼ阻害部位である。イミン結合における、細胞内でのｐＨ変化による酵素阻害剤ＥＩＨのリリース反応は以下で示される。
【化２７】
2019208820.tif 000029
【００２４】
ＬＫはリンカー部位であり、リンカー部位は、例えば、
【化２８】
2019208820.tif 000030
であることができる。上記リンカー部位の式中、ｍ１、ｍ２、ｍ３及びｍ４は、独立に１〜１０の整数である。
【００２５】
一般式（Ａ１）で示される酵素阻害剤含有基は、一般式（Ａ）中のｎ１及びｎ２に加えて、リンカー部位（ＬＫ１〜ＬＫ４）中のｍ１、ｍ２、ｍ３及びｍ４を選択することで、酵素阻害剤含有基とナノ粒子との間の距離を所望の範囲に保つことができる。その結果、細胞内での酵素阻害活性、例えば、リソソーム酵素不活性化作用又はキナーゼ阻害作用を調節することができる。ｍ１、ｍ２、ｍ３及びｍ４は、独立に、好ましくは１〜８、より好ましくは１〜６の範囲の整数である。
【００２６】
一般式（Ａ）中のＲ１０＝Ｎ−Ｏ−は、より具体的には、例えば、下記一般式（Ａ２）又は（Ａ３）で示すことができる。
【化２９】
2019208820.tif 000031
一般式（Ａ２）中、ｍ２は、一般式（ＬＫ２）におけるｍ２と同義であり、ＥＩＨは、一般式（Ａ１）におけるＥＩＨと同義である。
【００２７】
【化３０】
2019208820.tif 000032
一般式（Ａ３）中、ｍ４は、一般式（ＬＫ４）におけるｍ４と同義であり、ＥＩＨは、一般式（Ａ１）におけるＥＩＨと同義である。
【００２８】
酵素阻害剤含有部位の一例である、リソソーム酵素の活性中心と反応性を有する自殺基質部位は、リソソーム酵素の活性中心と反応性を有する基（反応性基）を含む。自殺基質部位は、例えば、リソソーム酵素に対する基質となり得る糖残基、および酵素不活性化のためのリソソーム酵素に対する反応性基を含むことができる。
【００２９】
糖残基は、不活性化させたいリソソーム酵素の基質特異性に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基、ガラクトース残基、グルコース残基、フコース残基、マンノース残基シアル酸残基、から成る群から選ばれる少なくとも1種の糖残基である。
【００３０】
糖残基としては、リソソーム酵素の基質特異性を考慮するとＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基、及び／又はガラクトース残基が好ましい。
【００３１】
1個の複合体粒子に複数の糖残基を使用してもよく、その場合、１個の複合体粒子に単一又は複数種の糖残基が存在しても良い。また、１個の複合体粒子には単一又は複数種の糖残基が存在し、かつ共存する異なる複合体粒子において、同一又は異なる単一又は複数種の糖残基が存在することもできる。
【００３２】
反応性基は、酵素の反応中心と反応性を有する反応性基であればよく、酵素の反応中心と反応性を有する反応性基としては、例えば、ジフルオメチルアリール基、及びトリフルオメチルアリール基から成る群から選ばれる少なくとも1種の反応性基であることができる。酵素の反応中心との反応性は、可逆的または非可逆的の何れであっても良い。
【００３３】
ジフルオメチルアリール基が、酵素の反応中心との反応性を有する反応性基であることは、Biochemistry, 2005, 44, 11669-11675を参照できる。酵素阻害剤部位ＥＩＨは、例えば、下記一般式（Ｅ）で示されるジフルオメチルアリール基である自殺基質であることができる。
【化３１】
2019208820.tif 000033
式中、Ｒは、糖残基であり、Ｆはフッ素原子である。
【００３４】
トリフルオメチルアリール基が、酵素の反応中心との反応性を有する反応性基であることは、Bioorg. Med. Chem. Lett. 2001, 11, 1769-1773を参照できる。
【００３５】
酵素阻害剤部位ＥＩＨが一般式（Ｅ）で示されるトリフルオメチルアリール基を有する自殺基質部位である一般式（Ａ２）で示される酵素阻害剤含有基は、例えば、下記式で示されるいずれかの基であることができる。式（７’）はＲがＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基であり、式（１５’）はＲがグルコース残基であり、式（２０’）はＲがＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基である。また、下記各式はリンカー（ＬＫ２）（ｍ２＝３）を含む。
【化３２】
2019208820.tif 000034
【００３６】
酵素阻害剤部位の一例である、キナーゼと反応性を有するキナーゼ阻害部位は、好ましくは細胞膜のキナーゼと反応性を有する基を含む。そのようなキナーゼ阻害部位は、例えば、下記式で示される部位であることができる。
【化３３】
2019208820.tif 000035
式中、Ｒ１は電子吸引性基である。電子吸引性基としては、ハロゲン原子(フッ素、塩素、臭素又はヨウ素)、ニトロ基、シアノ基、トシル基、アシル基等を挙げることができる。
【００３７】
このキナーゼ阻害部位は、下記ソラフェニブを含む。
【化３４】
2019208820.tif 000036
【００３８】
さらに、ソラフェニブを含む酵素阻害剤含有部位の具体例としては下記の部位を挙げることができる。下記式（１３’）は、一般式（Ａ１）におけるＬＫがＬＫ４（ｍ４＝４）であり、ピリジン環に結合する下記構造のアミド結合は、ソラフェニブの構造の一部であり、このアミド結合がリンカーＬＫ４と結合する構造を有する。
【化３５】
2019208820.tif 000037
【００３９】
【化３６】
2019208820.tif 000038
【００４０】
キナーゼは、タンパク質における特定の残基のリン酸化を触媒する酵素のファミリーである。一般的に、キナーゼは、３つのグループに分けられる。優先的にセリンおよび／またはスレオニン残基をリン酸化するもの、優先的にチロシン残基をリン酸化するもの、およびチロシンおよびセリン/スレオニン残基の両方をリン酸化するものである。キナーゼは、受容体におけるサイトカインの活性化を含む細胞外シグナルを核に伝達し、種々の生物学的な事象を引き起こすためのシグナル伝達経路における重要な要素とされる。例えば、チロシンキナーゼ活性に対する阻害剤としては、ゲフィチニブ、エルロチニブ、セツキシマブ、パニツムマブ等があげられる。ソラフェニブは、チロシンキナーゼの阻害、Ｒａｆキナーゼ（細胞増殖シグナルに深く関与するセリン/スレオニンキナーゼの一種）の阻害する薬物として知られている。
【００４１】
（３）ナノ粒子の表面に担持された一般式（Ｌ１）で示されるリガンド含有基
本発明の複合体においては、一般式（Ｌ１）で示されるリガンド含有基が、ナノ粒子の表面に担持されている。
【化３７】
2019208820.tif 000039
一般式（Ｌ１）中、ｎ１は２〜３０の整数であり、ｎ２は２〜３０の整数であり、−Ｓ−末端がナノ粒子担持部位であり、Ｒ２０は細胞表面受容体に対して結合性を有するリガンド部位を含む。
【００４２】
一般式（Ｌ１）で示されるリガンド含有基は、式中のｎ１及びｎ２を選択することで、リガンド含有基とナノ粒子との間の距離を所望の範囲に保つことができる。その結果、細胞表面受容体とリガンド含有基のリガンドとの相互作用を調節することができる。ｎ１は２〜３０、好ましくは５〜１６、より好ましくは４〜１５の範囲の整数である。ｎ２は２〜３０、好ましくは５〜２０、より好ましくは７〜１５の範囲の整数である。
【００４３】
一般式（Ｌ１）中のＲ２０＝Ｎ−Ｏ−は、＞Ｃ＝Ｎ−で表される、炭素-窒素二重結合であるイミン結合を含む。リガンド含有基のナノ粒子への担持は、イミン結合を含むリンカーを介したものであることで、後述するように、細胞内でのｐＨ変化によりリガンドがリリースされ易くなる。一般式（Ｌ１）中のＲ２０＝Ｎ−は、例えば、下記一般式（Ｌ２）で示すことができる。
【００４４】
【化３８】
2019208820.tif 000040
【００４５】
一般式（Ｌ２）中、ＬＤはリガンド部位である。ＬＫはリンカー部位であり、一般式（Ａ１）中のＬＫと同義であり、式（ＬＫ１）〜（ＬＫ４）から選ばれ、式（ＬＫ１）〜（ＬＫ４）中のｍ１、ｍ２、ｍ３及びｍ４も同義である。一般式（Ｌ２）で示されるリガンド含有基は、一般式（Ｌ１）中のｎ１及びｎ２に加えて、リンカー部位（ＬＫ１）〜（ＬＫ４）中のｍ１、ｍ２、ｍ３及びｍ４を選択することで、リガンド含有基とナノ粒子との間の距離を所望の範囲に保つことができる。その結果、細胞表面受容体とリガンド含有基のリガンドとの相互作用を調節することができる。ｍ１、ｍ２、ｍ３及びｍ４は、独立に、好ましくは１〜８、より好ましくは１〜６の範囲の整数である。
【００４６】
一般式（Ｌ１）中のＲ２０＝Ｎ−Ｏ−、より具体的には、下記一般式（Ｌ３）又は（Ｌ４）で示すことができる。
【化３９】
2019208820.tif 000041
一般式（Ｌ３）中、ｍ１は１〜１０の整数であり、ｍ２は１〜１０の整数であり、ＬＤはリガンド部位である。一般式（Ｌ３）で示されるリガンド含有基は、リンカー部位（ＬＫ１）を含むリガンド含有基である。
み、
【化４０】
2019208820.tif 000042
一般式（Ｌ４）中、ｍ３は１〜１０の整数であり、ＬＤはリガンド部位である。一般式（Ｌ４）で示されるリガンド含有基は、リンカー部位（ＬＫ３）を含むリガンド含有基である。
【００４７】
＜リガンド部位ＬＤ＞
本発明の複合体は、ナノ粒子の表面に担持されたリガンド含有基を含む。リガンドのナノ粒子への担持は、前述のように＞Ｃ＝Ｎ−Ｏ−で表されるイミン結合を含むリンカーを介したものであることが、複合体が細胞内に取り込まれた後に、細胞内のｐＨの影響でイミン結合が切断され、リガンドから切り離されたナノ粒子及びナノ粒子に担持された薬剤とは、細胞内に滞在しやすくなるので好ましい。リガンドがナノ粒子から切り離されない場合、リガンドは細胞膜のリサイクル作用によって容易に細胞外に排出されてしまうことがあり、ナノ粒子に担持された薬剤が、細胞膜のリサイクル作用によりリガンドと共に細胞外に排出されてしまうと、その生理活性により細胞の活動に影響を与える前に、細胞外に排出されてしまう場合がある。イミン結合における、細胞内でのｐＨ変化によるリガンドＬＤのナノ粒子から切り離し反応は以下で示される。
【化４１】
2019208820.tif 000043
【００４８】
リガンド部位は、細胞表面受容体に対して結合性を有する部位であればよく、細胞表面受容体は、例えば、インテグリン、ソマトスタチンガン細胞受容体及び糖鎖受容体であることができる。
【００４９】
＜インテグリン受容体及びそのリガンド＞
インテグリンは、構造的には、α鎖及びβ鎖が１：１で会合したヘテロダイマーであることが知られており、α鎖は、分子量が約１２０〜１８０ｋＤａの糖タンパク質であり、β鎖は、分子量が役９０〜１１０ｋＤａの糖タンパク質である。α鎖及びβ鎖のバリエーションは、生物の種類により異なり、ヒトの場合、α鎖は少なくとも１８種類、β鎖は少なくとも８類あることが知られている。本発明においては、インテグリンの種類（α鎖及びβ鎖の組み合わせ）によらず、例えば、ヒト・インテグリンであることがでる。ヒト・インテグリンは、α１β１、α２β１、α３β１、α４β１、α５β１、α６β１、α７β１、α８β１、α９β１、α１０β１、α１１β１、αｖβ１、αＤβ２、αＬβ２、αＭβ２、αＸβ２、αＩＩｂβ３、αｖβ３、α６β４、αｖβ５、αｖβ６、α４β７、αＥβ７、αｖβ８から成る群から選ばれる少なくとも１種のインテグリンであることができる。
【００５０】
インテグリンに対するリガンドは、例えば、細胞接着性タンパク質および／または細胞外マトリックス分子であることができる。さらに具体的には、インテグリンに対するリガンドは、フィブロネクチンであることができる。フィブロネクチンは、以下のアミノ酸配列の少なくとも１種を含む物質であることができる。
ＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）配列、
ＬＤＶ（Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ）配列、
ＮＧＲ（Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）／ｉｓｏＤＧＲ（Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）配列、
ＰＲＡＱＩ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ―Ａｌａ―Ｇｌｎ−Ｉｌｅ）／ＫＬＤＡＰＴ（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ）配列（配列番号１及び２）、
ＡＧＥＧＩＰ（Ａｌａ―Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ）配列（配列番号３）、
ＫＮＥＥＤ（Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ）配列（配列番号４）、
ＰＨＳＲＮ（Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｓｎ）配列（配列番号５）、
ＥＤＧＩＨＥＬ（Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ））配列（配列番号６）、
ＰＲＡＲＩ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ）／ＩＤＡＰＳ（Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ）配列（配列番号７及び８）、
ＲＥＤＶ（Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ）配列（配列番号９）。
【００５１】
また、インテグリンに対するリガンドは、ラミニン若しくはその断片、コラーゲン若しくはその断片、又は白血球若しくはその断片であることもできる。
【００５２】
＜ソマトスタチン受容体及びそのリガンド＞
ソマトスタチン受容体は、Ｇタンパク共役ソマトスタチン受容体として知られており、ＳＳＴ１〜ＳＳＴ５のいずれかのサブタイプに属することも知られている。本発明においては、ソマトスタチン受容体のサブタイプによらない。
【００５３】
ソマトスタチン受容体に対するリガンドは、例えば、１４アミノ酸型ソマトスタチン（ＡＧＣＫＮＦＦＷＫＴＦＴＳＣ）（配列番号１０）、２８アミノ酸型ソマトスタチン（ＳＡＮＳＮＰＡＭＡＰＲＥＲＫＡＧＣＫＮＦＦＷＫＴＦＴＳＣ）（配列番号１１）、オクトレオチド、ランレオチド、パシレオチド又はそれらのアナログ体であることができる。
【００５４】
＜糖鎖受容体及びそのリガンド＞
糖鎖受容体としては、糖鎖と結合する能力を有するタンパク質であることができ、例えば、レクチンを挙げることができる。レクチンは細胞膜およびその周囲で機能し、がんや炎症部位では活発に機能していることが知られている。レクチンの例としては、例えば、セレクチン、Siglec（シグレック）、ガレクチン、マンノース６リン酸レセプター、DC-SIGN, TLR、パターン認識レセプター、アシアロ糖タンパク質レセプターなども報告されている。但し、糖鎖と結合する能力を有するタンパク質は、これらに限定される意図ではなく、CD44などの膜レセプターも糖鎖受容体として機能するものとして挙げることができる。一般的に、糖鎖受容体と糖鎖(リガンド)の親和性は弱いため、これまでは積極的に利用することができなかった。しかし、本発明の複合体は、リン脂質疑似物質基を表面に有することから、非特異的タンパク質の吸着を阻止できたナノソーム（非吸着性ナノ微粒子）であるため、ナノ微粒子表明のリガンド部位と糖鎖受容体との相互作用を利用することができることになる（参考例Ｂ参照）。
【００５５】
糖鎖受容体に対するリガンドとして機能する本発明の複合体が有するリガンド部位は、例えば、マンノース末端を含むハイマンノース型N-グリカン、ハイブリッド型N-グリカン、シアル酸、ガラクトース、フコース、マンノース、N-アセチルーD-グルコサミン、N-アセチルーD-ガラクトサミン、グルクロン酸、リン酸化糖、硫酸化糖などを含む混合型N-グリカン、これらの単糖(例えば、シアル酸、ガラクトース、フコース、マンノース、N-アセチルーD-グルコサミン、N-アセチルーD-ガラクトサミン、グルクロン酸など)から構成されるシアリルT抗原、シアリルTn抗原、T抗原、Tn抗原などのO-グリカン、ラクトサミノグリカン鎖、プロテオグリカン糖鎖、ヒアルロン酸などを挙げることができる。糖鎖受容体に対するリガンドとして機能する本発明の複合体が有するリガンド部位は、例えば、単糖残基、オリゴ糖残基、多糖残基、N-グリカン、O-グリカン、並びにN-グリカン及びO-グリカン以外のグリカンから成る群から選ばれる少なくとも1種の糖の残基を含むリガンド部位であることができる。
【００５６】
一般式（Ｌ１）中のＲ２０＝Ｎ−Ｏ−は下記一般式（Ｌ２）で示される。
【化４２】
2019208820.tif 000044
（一般式（Ｌ２）中、ＬＤはリガンド部位であり、ＬＫはリンカー部位である。）
Ｌ２中のリガンド部位は、前述の通りであり、リンカー部位ＬＫは、前述のＬＫ１、ＬＫ２、ＬＫ３及びＬＫ４に加えて、糖鎖、アミノ酸配列（ペプチド等）、炭化水素基（例えば、アルキレン基、アリーレン基など）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基などであることもできる。リンカー部位ＬＫがアリーレン基である例として、以下の一般式(ＬＲ１)で記載された残基を挙げることができる。式中Ｒａはリガンド部位ＬＤである糖残基を示し、Ｒを有するフェニレン基がリンカー部位ＬＫである。Ｒは、例えば、水素原子、糖残基又は糖残基以外の残基、例えば、無置換又は置換アルキル（例えば、炭素数１〜６）であることができる。
【化４３】
2019208820.tif 000045
【００５７】
上記一般式（Ｌ２）で示される糖鎖受容体に対するリガンド部位を含む基は、例えば、下記式で示されるいずれかの官能基を含む部位であることができる。各式中のＲは一般式（ＬＲ１）のＲと同義である。
【化４４】
2019208820.tif 000046
【００５８】
ＬＲ１、ＬＲ１０、ＬＲ１１、ＬＲ１２で示されるリガンド部位を含む部位が有するＲは、例えば、ジフルオロメチル基、トリフルオロメチル基であることができる。Ｒとしてジフルオロメチル基、トリフルオロメチル基を有する場合、これらの部位は、糖鎖としてのリガンド部位としての機能に加えて、リソソーム酵素に対する阻害効果を奏する場合がある。この場合の糖鎖のリガンド部位の機能は、例えば、参考例Ａに示す実験結果から明らかである。
【００５９】
（４）ナノ粒子の表面に担持された一般式（Ｂ）で示されるリン脂質疑似物質基
本発明の複合体は、ナノ粒子の表面に担持された一般式（Ｂ）で示されるリン脂質疑似物質を含む。
【化４５】
2019208820.tif 000047
一般式（Ｂ）中、ｎ３は２〜３０の範囲の整数であり、−Ｓ−末端がナノ粒子担持部位である。
【００６０】
リン脂質疑似物質は、ナノ粒子の表面を修飾し、本発明の複合体が、エンドサイトシスにより細胞内に取り込ませる機能を付与する。この観点からｎ３は２〜３０、好ましくは５〜２０、より好ましくは７〜１５の範囲の整数である。
【００６１】
１個のナノ粒子に対する酵素阻害剤含有基、リガンド含有基及びリン脂質疑似物質の担持量は、ナノ粒子の表面における金属元素（反応点）の８０％以上あることが好ましい。本発明の複合体同士の凝集抑制やエドサイトシスにより細胞内に取り込ませる機能を考慮して適宜決定することができる。尚、前記担持量は、ナノ粒子の表面の全ての反応点を覆うことができる量であることがより好ましい。
【００６２】
本発明の複合体において、リガンド含有基、酵素阻害剤含有基とリン脂質疑似物質との比率は、リガンド含有基の作用による細胞内へのエンドサイトシスによる取り込み、及び取り込まれた酵素阻害剤の作用等のバランスを考慮して適宜選択することができる。一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤含有基と一般式（Ｂ）で示されるリン脂質疑似物質のモル比率は、例えば、１：１００〜１０：１の範囲であることができ、一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤含有基と一般式（Ｌ１）で示されるリガンド含有基のモル比率は、例えば、１０：１〜１：１０の範囲であることができる。
【００６３】
本発明の複合体は、一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤含有基、一般式（Ｌ１）で示されるリガンド含有基、及び一般式（Ｂ）で示されるリン脂質疑似物質に加えて、ナノ粒子の表面に下記一般式（Ａ’）で示される物質がさらに担持されたものであることができる。一般式（Ａ’）で示される物質は、後述する一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤の架橋用の前駆体Ｘに由来する。
【化４６】
2019208820.tif 000048
一般式（Ａ’）中、ｎ１は２〜３０の整数であり、ｎ２は２〜３０の整数であり、−Ｓ−末端がナノ粒子担持部位である。
【００６４】
尚、一般式（Ａ’）には、さらに、所望により糖鎖や抗体などの生理活性物質を担持させることもできる。
【００６５】
一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤含有基と一般式（Ａ’）で示される物質のモル比率は、例えば、１：１００〜１００：０の範囲であることができ、１０：１００〜１００：１０の範囲であることができる。
【００６６】
本発明の複合体は、例えば、下記一般式（１０）で模式的に示すことができる。
【化４７】
2019208820.tif 000049
【００６７】
ナノ粒子ＮＰに担持されている残基は、上から一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤含有基、一般式（Ｂ）で示されるリン脂質擬似物質基、及び一般式（Ｌ１）で示されるリガンド含有基である。実際の複合体は、一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤含有基、一般式（Ｂ）で示されるリン脂質擬似物質基、及び一般式（Ｌ１）で示されるリガンド含有基は、それぞれ１個以上、ナノ粒子ＮＰに担持されている。
【００６８】
上記一般式（１０）で模式的に示すことができる複合体は、Ｒ１０及びＲ２０を具体化した下記一般式（２０）で模式的に記載することができる。この複合体は、実施例１に示す。Ｒ１０は、ソラフェニブ含有基であり、Ｒ２０は、インテグリンリガンド含有基である。ＮＰは、量子ドットＱＤである。一般式（２０）で模式的に示される実際の複合体は、ソラフェニブ含有基及びインテグリンリガンド含有基、並びにリン脂質疑似物質基は、それぞれ少なくとも１個以上、量子ドットＱＤに担持されている。
【００６９】
【化４８】
2019208820.tif 000050
【００７０】
上記一般式（１０）で模式的に示すことができる複合体は、Ｒ１０及びＲ２０を具体化した下記一般式（３０）で模式的に記載することもできる。この複合体は、実施例３に示す。Ｒ１０は、ソラフェニブ含有基であり、Ｒ２０は、ソマトスタチン受容体リガンド含有基である。ＮＰは、量子ドットＱＤである。一般式（３０）で模式的に示される実際の複合体は、ソラフェニブ含有基及びソマトスタチン受容体リガンド含有基、並びにリン脂質疑似物質基は、それぞれ少なくとも１個以上、量子ドットＱＤに担持されている。
【化４９】
2019208820.tif 000051
【００７１】
上記一般式（１０）で模式的に示すことができる複合体は、Ｒ１０及びＲ２０を具体化した下記一般式（４０）で模式的に記載することもできる。この複合体は、実施例５に示す。Ｒ１０は、ソラフェニブ含有基であり、Ｒ２０は、糖鎖リガンド含有基である。ＮＰは、量子ドットＱＤである。一般式（４０）で模式的に示される実際の複合体は、ソラフェニブ含有基及び糖鎖リガンド含有基、並びにリン脂質疑似物質基（ＰＣで示す）を有し、各基は、それぞれ少なくとも１個以上、量子ドットＱＤに担持されている。
【化５０】
2019208820.tif 000052
【００７２】
＜複合体の製造方法＞
本発明は、上記本発明の複合体の製造方法を包含する。この方法は、下記一般式（Ｃ）で示される架橋前駆体Ｘ及び下記一般式（Ｄ）で示されるリン脂質疑似物質前駆体とコロイド状ナノ粒子とを混合して、ナノ粒子の表面に架橋前駆体Ｘ及びリン脂質疑似物質を担持した表面修飾ナノ粒子を得る工程（１）、及び
得られた表面修飾ナノ粒子に下記一般式（Ｅ）で示される酵素阻害剤前駆体Ｙ及び下記一般式（Ｌ５）で示されるリガンド前駆体ＰＬを混合して、前記表面修飾ナノ粒子上の架橋前駆体Ｘと連結させて下記一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤含有基及び下記一般式（Ｌ１）で示されるリガンド含有基を形成して、前記本発明の複合体を得る工程（２）を含む前記方法である。
【００７３】
【化５１】
2019208820.tif 000053
（一般式（Ｃ）中、ｎ１は２〜３０の整数であり、ｎ２は２〜３０の整数である。)
【００７４】
【化５２】
2019208820.tif 000054
(一般式（Ｄ）中、ｎ３は２〜３０の範囲の整数である。)
【００７５】
【化５３】
2019208820.tif 000055
（一般式（Ｅ）中、Ｒ１０は酵素阻害剤含有部位である。）
【００７６】
【化５４】
2019208820.tif 000056
（一般式（Ｌ５）中、Ｒ２０は細胞表面受容体に対して結合性を有するリガンド部位を含む。）
【００７７】
【化５５】
2019208820.tif 000057
（一般式（Ａ）中、ｎ１は２〜３０の整数であり、ｎ２は２〜３０の整数であり、−Ｓ−末端がナノ粒子担持部位であり、Ｒ１０は酵素阻害剤含有部位である。）
【００７８】
【化５６】
2019208820.tif 000058
（一般式（Ｌ１）中、ｎ１は２〜３０の整数であり、ｎ２は２〜３０の整数であり、−Ｓ−末端がナノ粒子担持部位であり、Ｒ２０は細胞表面受容体に対して結合性を有するリガンド部位を含む。）
【００７９】
工程（１）
一般式（Ｃ）で示される架橋前駆体Ｘ及び一般式（Ｄ）で示されるリン脂質疑似物質前駆体とコロイド状ナノ粒子とを混合して、ナノ粒子の表面に架橋前駆体Ｘ及びリン脂質疑似物質を担持して表面修飾ナノ粒子を得る工程である。
【００８０】
一般式（Ｃ）は、酵素阻害剤含有部位Ｒ１０又はリガンド含有部位Ｒ２０を有さず、かつ末端がＳＨ基であること以外は一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤含有基及び一般式（Ｌ１）で示されるリガンド含有基と同様である。一般式（Ｃ）中、ｎ１は２〜３０、好ましくは５〜２０、より好ましくは７〜１５の範囲の整数である。ｎ２は２〜３０、好ましくは５〜２０、より好ましくは７〜１５の範囲の整数である。一般式（Ｄ）は、末端がＳＨ基であること以外は一般式（Ｂ）で示されるリン脂質疑似物質基と同様である。一般式（Ｄ）中、ｎ３は２〜３０、好ましくは５〜２０、より好ましくは７〜１５の範囲の整数である。一般式（Ｃ）で示される架橋前駆体Ｘ及び一般式（Ｄ）で示されるリン脂質疑似物質前駆体は、いずれも市販品を入手可能であり、また、参考文献(T. Ohyanagi, et. al., J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 12507-12517)に記載の方法で調製することもできる。
【００８１】
一般式（Ｃ）で示される架橋前駆体Ｘ、一般式（Ｄ）で示されるリン脂質疑似物質前駆体及びナノ粒子の混合比率は、一般式（Ｃ）で示される架橋前駆体Ｘ及び一般式（Ｄ）で示されるリン脂質疑似物質前駆体のナノ粒子に対する所望の担持量を考慮して適宜決定することができる。
【００８２】
下記に実施例１の工程（１）を参考に示す。下記スキーム中に示す一般式（Ｃ）で示される架橋前駆体Ｘはｎ１が６であり、ｎ２が９であり、一般式（Ｄ）で示されるリン脂質疑似物質前駆体のｎ３が９である。実施例１の反応スキームである下記スキームでは、アミノオキシリンカー(AO)とホスホリルコリンリンカー(PC)のモル比AO/PCが1/8である。AO/PCは、実施例３では1/16である。モル比AO/PCは、本発明の複合体における、一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤含有基及び一般式（Ｌ１）で示されるリガンド含有基と一般式（Ｂ）で示されるリン脂質疑似物質基との比率が、前述のように、例えば、モル比率が１：１００〜１０：１の範囲であることができ、好ましくは１：１０〜１：１の範囲であることから、これに準じた比であることができる。
【００８３】
【化５７】
2019208820.tif 000059
【００８４】
ナノ粒子は、複合体において説明したものと同様である。上記スキームでは、金属ナノ粒子の原料としてコロイド状の量子ドット（ＱＤｓ（ＱＤ：Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔ））を用いた。コロイド状量子ドットは、直径の範囲が、例えば、１〜２０ｎｍの発光性の半導体ナノ粒子の表面に保護基を有する。上記スキームに示すコロイド状量子ドットは表面にトリアルキルリン酸基を有する。ナノ粒子が金属ナノ粒子の場合も、コロイド状の金属ナノ粒子を原料として用いることができる。コロイド状量子ドット及びコロイド状金属ナノ粒子は市販品を入手可能である。
【００８５】
一般式（Ｃ）で示される架橋前駆体Ｘ及び一般式（Ｄ）で示されるリン脂質疑似物質前駆体は、コロイド状ナノ粒子のナノ粒子表面に結合する官能基として、チオール（ＳＨ）基を有する。
【００８６】
コロイド状ナノ粒子と阻害剤架橋前駆体Ｘ及びリン脂質疑似物質前駆体とを、例えば、溶媒中で分散し、ナノ粒子の表面に２種類のリン脂質疑似物質を担持する。上記スキームでは溶媒としてヘキサンと水の混合溶媒を用い、室温（例えば、１５〜２５℃）で行う。使用する溶媒は、コロイド状ナノ粒子の種類、架橋前駆体Ｘ及びリン脂質疑似物質前駆体の種類に応じて適宜決定することができる。コロイド状ナノ粒子、架橋前駆体Ｘ及びリン脂質疑似物質前駆体の溶媒中の濃度や反応時間も、所望の表面修飾ナノ粒子に応じて適宜決定することができる。コロイド状ナノ粒子への担持方法の一般的な方法は、公知であり、例えば、以下の参考文献A、Bに記載の方法を参照して実施することができる。
参考文献
A. T. Ohyanagi, et. al., J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 12507-12517（非特許文献２）
B. R. S.Tan, et. al., ACS Chem. Biol. 2015, 10, 2073-2086（非特許文献３）
【００８７】
工程（２）
工程（１）で得られた表面修飾ナノ粒子に一般式（Ｅ）で示される酵素阻害剤前駆体Ｙ及び一般式（Ｌ５）で示されるリガンド前駆体ＰＬを混合して、前記表面修飾ナノ粒子上の架橋前駆体Ｘと連結させて一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤含有基及び一般式（Ｌ１）で示されるリガンド含有基を形成して、本発明の複合体を得る工程である。
【００８８】
本発明の製造方法における酵素阻害剤部位ＥＩＨ及びリンカー部位ＬＫは、本発明の複合体における酵素阻害剤部位ＥＩＨ及びリンカー部位ＬＫとそれぞれ同義であり、複合体における説明を参照することができる。
【００８９】
一般式（Ｅ）で示される酵素阻害剤前駆体Ｙは、例えば、下記一般式（Ｅ１）で示される化合物であることができる。一般式（Ｅ１）で示される化合物は、リンカー部位ＬＫにケトン基が結合した所謂ケトンリンカーを有する化合物であり、ケトンリンカーのケトン基と前述のナノ粒子表面に予め結合された一般式（Ａ’）で示される物質の末端アミノ基とが反応して、ナノ粒子表面に一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤含有基を結合させることができる。
【化５８】
2019208820.tif 000060
一般式（Ｅ１）中、ＥＩＨは、酵素阻害剤部位である。酵素阻害剤部位は、リソソーム酵素の活性中心と反応性を有する自殺基質部位、又はキナーゼと反応性を有するキナーゼ阻害部位であることができる。ＬＫはリンカー部位であり、リンカー部位は、下記一般式（ＬＫ１）〜（ＬＫ４）で示されることができる。
【００９０】
【化５９】
2019208820.tif 000061
式中、ｍ１，ｍ２、ｍ３及びｍ４は、独立に１〜１０の整数である。
【００９１】
一般式（Ｌ５）で示されるリガンド前駆体ＰＬは、例えば、下記一般式（Ｌ６）で示される化合物であることができる。一般式（Ｌ６）で示される化合物も、リンカー部位ＬＫにケトン基が結合した所謂ケトンリンカーを有する化合物であり、ケトンリンカーのケトン基と前述のナノ粒子表面に予め結合された一般式（Ａ’）で示される物質の末端アミノ基とが反応して、ナノ粒子表面に一般式（ＬＡ）で示されるリガンド含有基を結合させることができる。
【化６０】
2019208820.tif 000062
一般式（Ｌ６）中、ＬＤはリガンド部位であり、一般式（Ｌ２）中のＬＤと同義である。ＬＫはリンカー部位であり、一般式（Ｅ）中のＬＫと同義である。一般式（Ｌ６）で示されるリガンド前駆体は、新規化合物であり、本発明はこの一般式（Ｌ６）で示されるリガンド前駆体も包含する。
【００９２】
一般式（Ｌ５）及び（Ｌ６）で示されるリガンド前駆体ＰＬは、例えば、下記一般式（Ｌ７）又は（Ｌ８）で示される化合物であることができる。
【化６１】
2019208820.tif 000063
一般式（Ｌ７）中、ｍ１は１〜１０の整数であり、ｍ２は１〜１０の整数であり、ＬＤはリガンド部位である。
【化６２】
2019208820.tif 000064
一般式（Ｌ８）中、ｍ３は１〜１０の整数であり、ＬＤはリガンド部位である。
【００９３】
一般式（Ｌ８）で示されるリガンド前駆体ＰＬとしては、例えば、下記式（Ｌ８−１）、（Ｌ８−２）、（Ｌ８−３）で示される化合物を挙げることができる。但し、これらに限定される意図ではない。
【００９４】
【化６３】
2019208820.tif 000065
【００９５】
式（Ｌ８−１）、（Ｌ８−２）、（Ｌ８−３）で示される化合物及びこれに類するリガンド前駆体ＰＬは、ＷＯ２０１７／１３１２４２Ａ１の実施例１〜３のスキーム１、３、５を参照して、公知の糖化合物及び公知の原料化合物から調製することができる。
【００９６】
一般式（Ｅ）で示される酵素阻害剤前駆体Ｙは、例えば、下記一般式（Ｅ２）又は（Ｅ３）で示される化合物であることができる。
【化６４】
2019208820.tif 000066
【００９７】
一般式（Ｅ２）及び（Ｅ３）中、ＥＩＨは酵素阻害剤部位であり、酵素阻害剤部位は、リソソーム酵素の活性中心と反応性を有する自殺基質部位、又はキナーゼと反応性を有するキナーゼ阻害部位である。ｍ２は１〜１０の整数であり、ｍ４は１〜１０の整数である。
【００９８】
一般式（Ｅ）、（Ｅ１）、（Ｅ２）及び（Ｅ３）で示される酵素阻害剤前駆体ＹはＷＯ２０１７／１３１２４２に記載の方法に従って合成できる。
【００９９】
一般式（Ｌ５）、（Ｌ６）、（Ｌ７）及び（Ｌ８）で示されるリガンド前駆体ＰＬは、ケトンリンカー修飾リジン誘導体及びペプチド合成用レジンを用いて、既知のペプチドの固相合成法により合成することができる。ケトンリンカー修飾リジン誘導体は、実施例１の（１）で具体的に説明するように、公知の方法（A. Pratesi, et al., Org. Biomol. Chem., 2015, 13, 3988-4001） を参考にして合成したαアミノ基をFmoc保護、側鎖の一級アミンをBocによって保護されたリジンを出発物質として合成することができる。ペプチド合成用レジンは市販品を利用することができ、例えば、ChemMatrix（バイオタージ社）を挙げることができる。
【０１００】
下記に実施例１の工程（２）を参考に示す。酵素阻害剤前駆体Ｙとしてソラフェニブ誘導体１３を用い、リガンド前駆体ＰＬとして実施例１で合成されたケトンリンカー修飾リジン誘導体７が使用される。ソラフェニブ誘導体１３は、ＷＯ２０１７／１３１２４２の実施例５に記載の方法に従って合成できる（段落０１３４の合成スキーム参照中の化合物３２）。
【化６５】
2019208820.tif 000067
2019208820.tif 000068
【０１０１】
工程（１）で得られた表面修飾ナノ粒子に酵素阻害剤前駆体Ｙ及びリガンド前駆体ＰＬを混合して、架橋前駆体Ｘと連結させて一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤含有基及び一般式（Ｌ１）で示されるリガンド含有基を形成して、本発明の複合体を得る。上記式においては、酵素阻害剤前駆体Ｙは、一般式（Ｅ）におけるＲ１０がキナーゼ阻害部位であるソラフェニブ誘導体を含む。
【０１０２】
前述のように、酵素阻害剤含有基及びリガンド含有基のナノ粒子への担持は、イミン結合を含むリンカーを介したものであることが好ましい。イミン結合は、＞Ｃ＝Ｎ−で表される、炭素-窒素二重結合である。上記スキームから分かるように、酵素阻害剤前駆体Ｙ及びリガンド前駆体ＰＬが有する末端のケトン基は表面修飾ナノ粒子上の架橋前駆体のアミノ基と脱水縮合してイミン結合を形成する。ナノ粒子表面にアミノ基を有する表面修飾基を担持しておくことで、酵素阻害剤含有基及びリガンド含有基を、イミン結合を介してナノ粒子表面に担持することができる。
【０１０３】
下記に実施例３の工程（２）にいては、酵素阻害剤前駆体Ｙとしてソラフェニブ誘導体１３を用い、リガンド前駆体ＰＬとして実施例３で合成されたソマトスタチン誘導体１２が使用される。（表面修飾ナノ粒子は示さず。）
【化６６】
2019208820.tif 000069
【０１０４】
上記2つのスキームに示す反応は、AcOH/AcONa緩衝液中、室温（例えば、１５〜２５℃）で行うことができる。使用する緩衝液は、表面修飾ナノ粒子の種類、一般式（Ｅ）で示される酵素阻害剤前駆体Ｙ及び一般式（Ｌ５）で示されるリガンド前駆体ＰＬの種類に応じて適宜決定することができる。表面修飾ナノ粒子、一般式（Ｅ）で示される酵素阻害剤前駆体Ｙ及び一般式（Ｌ５）で示されるリガンド前駆体ＰＬの濃度や反応時間も、所望の表面修飾ナノ粒子に応じて適宜決定することができる。
【０１０５】
酵素阻害剤前駆体Ｙとしては、一般式（Ｅ）におけるＲ１０がリソソーム酵素阻害剤部位を含む化合物を用いることもでき、リソソーム酵素阻害剤部位を含む酵素阻害剤前駆体Ｙとしては、例えば、下記式（７）、（１５）、（２０）で示される化合物を挙げることができる。但し、これらに限定される意図ではない。
【０１０６】
【化６７】
2019208820.tif 000070
【０１０７】
式（７）、（１５）、（２０）で示される化合物及びこれに類する酵素阻害剤前駆体Ｙは、ＷＯ２０１７／１３１２４２を参照して、公知の糖化合物及び公知の原料化合物から調製することができる。尚、糖化合物とアリール化合物の縮合方法及び縮合したアリール化合物への側鎖の連結方法は、A. T. Ohyanagi, et. al., J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 12507-12517（非特許文献２）に記載の方法を参照して実施することができる。反応生成物は、公知の方法で分離精製することができる。
【０１０８】
酵素阻害剤前駆体Ｙ及びリガンド前駆体ＰＬと反応しなかった物質は、一般式（Ａ’）で示される物質としてナノ粒子表面に担持されたままで複合体を形成する。酵素阻害剤前駆体Ｙ及びリガンド前駆体ＰＬの種類や一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤含有基及び一般式（Ｌ１）で示されるリガンド含有基の複合体における所望の担持量、反応条件等を考慮して、工程（２）における酵素阻害剤前駆体Ｙ及びリガンド前駆体ＰＬの使用量等を適宜選択する。
【０１０９】
【化６８】
2019208820.tif 000071
【０１１０】
＜抗ガン剤＞
本発明は、前記の複合体を有効成分として含有する抗ガン剤を包含する。本発明の抗ガン剤は、前記複合体を有効成分として含有するガン（癌、悪性腫瘍）の予防又は／及び治療用の医薬組成物であり、任意で医薬的に許容される担体をさらに含むことができる。本発明の複合体はナノ粒子を構成成分とするために、ガン細胞の中には、複合体の取込み効率が、正常細胞より桁違いに高いガン細胞がある。さらに本発明の複合体は、特定のリガンド含有基を有するので、細胞表面に、このリガンド含有基に含まれるリガンド部位に対する受容体を有する細胞の受容体と結合し易く、細胞内に取り込まれやすい。本発明の複合体は、リガンド含有基に含まれるリガンド部位を選択することで、本発明の複合体が取り込まれる細胞の選択性を上げることができる。本発明の複合体は、ナノ粒子及びリガンドの効果により、癌細胞（腫瘍細胞）のような高活動状態の細胞に対する取込み効率が、正常細胞より桁違いに高く、選択性も高い。
【０１１１】
本発明の抗ガン剤が対象とする前記ガンとしては、特に制限はないが、ある種のリガンドに対する細胞表面受容体を有するものであればよく、さらにナノ粒子を有することによる本発明の複合体の取込み効率が、正常細胞より桁違いに高いガン細胞であることが好ましい。本発明の抗ガン剤が対象とする前記ガンとしては、制限はないが、例えば、乳癌、前立腺癌、肝細胞癌、膵癌、大腸癌、卵巣癌、腎癌、肺癌、及び脳腫瘍などを挙げることができる。好ましくは、乳癌、肝細胞癌、膵癌、及び脳腫瘍である。
【０１１２】
細胞内小器官のひとつであるリソソームには、数多くのリソソーム酵素が存在し、複合糖質や脂質などの細胞内基質を分解する役割を担っている。リソソーム酵素には、多数の糖鎖分解酵素が含まれる。その結果、高活動状態の細胞に、リソソーム酵素阻害剤を有する複合体が、選択的に取り込まれ、リソソーム酵素（例えば、糖鎖分解酵素）を不活性化する。リソソーム酵素の活性阻害は、細胞を死滅に導くので、本発明の複合体を有効成分とする薬剤は、抗ガン剤として有効である。
【０１１３】
細胞膜内及び膜上には様々な酵素が存在し、キナーゼはそのような酵素の典型例であり、様々な物質のリン酸化に寄与する。キナーゼ阻害剤を有する本発明の複合体が、選択的に取り込まれ、キナーゼを不活性化する。キナーゼの活性阻害は、細胞を死滅に導くので、本発明の複合体を有効成分とする薬剤は、抗ガン剤として有効である。
【０１１４】
本発明の抗ガン剤は、前記複合体を有効成分として、当業者に公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
【０１１５】
注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−６０と併用してもよい。
【０１１６】
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。また、リポソームも細胞送達のために該薬剤をカプセル化するために使用可能である。
【０１１７】
投与は、経口又は非経口であり、好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身又は局部的に投与することができる。
【０１１８】
本発明の前記複合体の用量および投与方法は、患者の年齡、体重、性別、治療すべき症状の性質もしくは重篤度等により適宜選択することができる。本抗体を含有する医薬組成物の投与量としては、例えば、一回につき体重１ｋｇあたり0.0001mgから1,000mgの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、患者あたり0.01〜100,000mg/bodyの範囲で投与量を選ぶことができるが、これらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量、投与方法は、患者の年齢、体重、性別、症状などにより変動するが、当事者であれば適宜選択することが可能である。
【０１１９】
本発明は、酵素阻害剤の細胞への移送方法を包含する。この方法は、前記本発明の複合体を調製する工程、および前記複合体を酵素阻害剤移送の対象である細胞、または前記細胞を含む生体に供給して、前記細胞に酵素阻害剤を取り込ませる工程を含む。酵素阻害剤は、本発明の複合体におけるものと同様である。
【０１２０】
薬剤移送の対象である細胞が、ガン細胞であることができる。ガン細胞は、上記抗ガン剤における説明を参照できる。
【０１２１】
酵素阻害剤移送の対象である細胞を含む生体は哺乳動物である。哺乳動物は、ヒトを含む全ての哺乳動物であるが、ヒトを含まないこともできる。
【実施例】
【０１２２】
以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明する。但し、実施例は本発明の例示であって、本発明は実施例に限定される意図ではない。【０１２３】
実施例１
酵素阻害剤部位としてソラフェニブ誘導体、リガンド部位としてｃRGD誘導体を担持した蛍光性ナノ微粒子である本発明の複合体の合成法
（１）インテグリンリガンド（化合物7）の合成法
一般式（Ｌ６）で示されるリガンド前駆体に相当するインテグリンリガンド（化合物7）の合成法を以下に説明する。【０１２４】
ケトンリンカー修飾リジン誘導体（１）の合成法
【化６９】
2019208820.tif 000072
【０１２５】
新規なケトンリンカー修飾リジン誘導体（１）は（A. Pratesi, et al., Org. Biomol. Chem., 2015, 13, 3988-4001）を参考にして作製した、αアミノ基をFmoc保護、側鎖の一級アミンをBocによって保護されたリジンを出発物質として合成した。カルボン酸をt-Buエステル化して２とし、次いで側鎖のBoc基をTFAによって選択的に脱保護して３とした。1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl carbodiimide hydrochloride) (EDC) の存在下で化合物３を5-Oxohexanoic acidと縮合した4のt-Bu基をTFAで除去することで目的とするケトンリンカー修飾リジン誘導体１を効率よく得た。【０１２６】
化合物１の構造データ：1H NMR (600 MHz, DMSO) δ ppm 7.91 (d, 2H), 7.77 (t, 1H), 7.73 (d, 2H), 7.62 (t, 1H), 7.43 (t, 2H), 7.34 (t, 2H), 4.27 (d, 2H), 4.23 (t, 1H), 3.91 (m, 1H), 2.39 (t, 2H), 2.06 (s, 3H), 2.02 (t, 2H), 1.67 (m, 2H), 1.38 (m, 4H), 1.31 (m, 2H), 1.24 (m, 2H); MALDI-TOFMS 480.116 [M+H]+【０１２７】
ケトンリンカー修飾環状RGD誘導体（化合物7）の合成法
【化７０】
2019208820.tif 000073
【０１２８】
固相合成法によってケトンリンカー修飾リジン誘導体１と各種Fmocアミノ酸誘導体から合成し樹脂からAcOH/TFE/DCM=5/1/4のカクテルによって切り出された直鎖ペプチド中間体５を既報(G. Thumshirn, et al., Chem. Eur. J., 2003, 9, 2717-2725)を参考にして環化させ化合物６とした後、TFA/H2O/TIS=95/2.5/2.5のカクテルにより処理して全ての保護基を除去し目的とする化合物７を得た。【０１２９】
化合物７の構造データ：1H NMR (600 MHz, DMSO) δ ppm 8.38 (m, 1H), 8.09 (d, 1H), 8.01 (d, 1H), 7.91(d, 1H), 7.77 (t, 1H), 7.58 (m, 1H), 7.49 (m, 1H), 7.1 (m, 4H), 6.9 (d, 2H), 6.6 (d, 2H), 5.29 (t, 1H), 4.58 (m, 1H), 4.34 (q, 1H), 4.15 (m, 1H), 4.01 (dd, 1H), 3.38 (m, 1H), 3.21 (dd, 1H), 3.06 (m, 2H), 2.93 (q, 2H), 2.77 (m, 1H), 2.65 (m, 2H), 2.36 (t, 3H), 2.04 (s, 3H), 2.01 (t, 1H), 1.63 (m, 2H), 1.27 (m, 3H), 1.2 (m, 3H), 1.04 (m, 2H), 0.82 (t, 1H) ; MALDI-TOF MS 731.968 [M+H]+【０１３０】
（２）酵素阻害剤部位としてソラフェニブ誘導体、リガンド部位としてｃRGD誘導体を担持した蛍光性ナノ微粒子である本発明の複合体の合成法
以下のスキームに一般式（Ｌ６）で示されるリガンド前駆体に相当するインテグリンリガンド化合物7と、一般式（Ｅ１）で示される酵素阻害剤前駆体に相当するソラフェニブ誘導体の両者を担持して、本発明の複合体である蛍光性ナノ微粒子（量子ドット）を作製する方法を以下に示す。
【化７１】
2019208820.tif 000074
【０１３１】
一般式（Ｌ６）で示されるリガンド前駆体に相当するインテグリンリガンド化合物7と一般式（Ｅ１）で示される酵素阻害剤前駆体に相当するケトンリンカー修飾ソラフェニブ誘導体（ＷＯ２０１７／１３１２４２に記載の化合物32に相当し、[化47]の合成スキーム参照)を参考文献（T. Ohyanagi, et al., J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 12057-12517およびR. S. Tan, et. al., ACS Chem. Biol. 2015, 10, 2073-2086）に従い、蛍光性ナノ微粒子（量子ドット）に提示した。TOPO-QDs（1μM, 50μl/octane)に対しMeOH (50μl)、i-PrOH (100μl)を加えて遠心によりナノ微粒子を沈殿させ、溶媒を取り除き再びヘキサン(50μl)を加えて分散させた。その後予め脱保護により活性化済みのアミノオキシリンカー (10 mM, 2.5μlまたは5μl/MeOH)、ホスホリルコリンリンカー (100 mM, 8 μl/MeOH)、NaBH4 (1μl, 12 wt % in 14 N NaOH)、およびmilli Q (50μl)を加えて30分間撹拌し配位子交換をして反応性ナノ微粒子前駆体AO/PC SAM-QDs (AO/PC=1/16)およびAO/PC SAM-QDs (AO/PC=1/8)とした。限外濾過(YM 50)により精製した後、化合物7とケトンリンカー修飾ソラフェニブ誘導体との複合化に供した（上記スキーム参照）。図１のMALDI-TOFMSに示すとおり、反応はスムーズに進行し全てのアミノオキシ基がケトンリンカー修飾化合物7あるいはソラフェニブ誘導体により修飾されたことが確認でき、本発明の複合体が得られたことを確認した。【０１３２】
実施例２
酵素阻害剤部位としてソラフェニブ誘導体、リガンド部位としてｃRGD誘導体を担持した蛍光性ナノ微粒子（量子ドット）である本発明の複合体の抗腫瘍効果（肝癌細胞増殖抑制効果）
(a) 細胞内イメージング：ヒト肝癌細胞（HepG2, P8, ATCCより入手）を5000 cell/200μl/wellで播種し、D-MEM High glucose, 10 % fetal bovine serum (FBS)中、37℃, 5% CO2雰囲気化で48時間インキュベートをした後に、化合物7を担持した蛍光性ナノ微粒子[10 nM の化合物7を担持したAO/PC SAM-QDs (AO/PC=1/16)]および化合物7とソラフェニブ誘導体を担持した蛍光性ナノ微粒子[10 nM の化合物7とソラフェニブ誘導体を担持したAO/PC SAM-QDs (AO/PC=1/8)]を添加してその後の24時間までの癌細胞生育過程を観察した。細胞は以下の方法で染色した後に蛍光顕微鏡にて観察した。培地を除去した後、細胞をOpti-MEMで3回洗浄後Lyso Tracker R Green DND-26 (200μl, 5 nM/Opti-MEM)を加えて37℃,5% CO2の条件下で30分インキュベートしてリソソームを染色した。その後Hoechest (2μl, 0.1 ng/μl/Opti-MEM)を加えて37℃,5% CO2雰囲気化でさらに15分間インキュベートして核を染色した後にOpti-MEMで3回洗浄してイメージングを行った（図２と図３）。
いずれのナノ微粒子も共培養初期の段階からエンドソーム・リソソームにトラップされて24時間後においてもこのコンパートメントから脱出して細胞質内へ移動している様子は観察されなかった。【０１３３】
(b) 酵素阻害剤部位としてソラフェニブ誘導体、リガンド部位としてｃRGD誘導体を担持した蛍光性ナノ微粒子である本発明の複合体の抗腫瘍効果（肝癌細胞殺傷作用）
Cell viability assayによる死細胞の定量：HepG2細胞（5×104/100μl/well）を37℃、5% CO2雰囲気化で24時間インキュベートした後にそれぞれ90μlの培地に対してQD-化合物7 (10〜1000 nM, 10μl/milli Q), QD-化合物7/sorafeniv (10〜1000 nM, 10μl/milli Q)および化合物7単独(10〜1000 nM, 10μl/MilliQ)を加えて終濃度が1〜100 nMとなるように調整した。共培養開始後48時間で培地成分により3回洗浄を行い、細胞培養液に対し10μlのCell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) を加えて37℃、5% CO2雰囲気化で1.5時間インキュベートし、450 nmでの吸光度を測定することで細胞の生存率を定量した。結果を図４に示す。【０１３４】
図４に示す結果から、酵素阻害剤部位としてソラフェニブ誘導体、リガンド部位としてｃRGD誘導体を担持した蛍光性ナノ微粒子ある本発明の複合体のエンドサイトシス（receptor-mediated endocytosis）がソラフェニブの抗腫瘍活性を大幅に増強することが明らかとなった（IC50=33.4 nM → 6.0 nM）。ソラフェニブは本来HepG2細胞に対する単独投与でのIC50は数〜数十μMとされ（ＷＯ２０１７／１３１２４２)、化合物7と共にナノ微粒子へ担持することで抗腫瘍効果は約1000倍（投与量は約1000分の1）に達したことになる。【０１３５】
参考文献
1）ＷＯ２０１７／１３１２４２
2）T. Ohyanagi, et. al., J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 12507-12517
3）R. S.Tan, et. al., ACS Chem. Biol. 2015, 10, 2073-2086【０１３６】
実施例３
酵素阻害剤部位としてソラフェニブ誘導体、リガンド部位としてSomatostatin-14誘導体を担持した蛍光性ナノ微粒子ある本発明の複合体の合成法
（１）Somatostatin-14誘導体の合成
一般式（Ｌ６）で示されるリガンド前駆体に相当するSomatostatin-14誘導体(12)の合成法を以下に説明する。
【化７２】
2019208820.tif 000075
【０１３７】
(1-1) Linear型Somatostatin-14誘導体 (11) の合成法
【化７３】
2019208820.tif 000076
【０１３８】
ペプチド固相合成は、固相担体としてTrityl ChemMatrix樹脂 (0.3 mmol/g, 30μmol)を用いた。カルボキシ末端 (C末端) のFmocアミノ酸誘導体 (Fmoc-Cys(Trt)-OH) の導入は、既報 (W. C. Chan et al., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Oxford University Press, 2000) を参考にして行った。アミノ酸伸長反応は、マイクロ波照射 (40 W、2450 MHz、50℃) の条件下、Fmocアミノ酸誘導体もしくは5-oxohexanoic acid (120μmol, 4当量)、1-[bis(dimethylamino)methyliumyl]-1H-benzotriazole-3-oxide hexafluorophosphate (HBTU, 120μmol, 4当量)、1-hydroxybenzotriazole monohydrate (HOBt, 120μmol, 4当量)、N,N-diisopropylethylamine (DIEA, 180μmol, 6当量) のDMF溶液で10分間反応させ行った。次に、無水酢酸/DIEA/DMF = 10/5/85 (v/v/v) 溶液で室温下1分間処理して未反応のアミノ基のアセチル化を実施した。続いて、マイクロ波照射 (40 W、2450 MHz、50℃) の条件下、20%ピペリジン/ DMF溶液で3分間処理してFmoc基を脱保護した。ペプチドの合成は、これら3工程 (1) 各種Fmocアミノ酸による伸長、(2) アセチル化処理、(3) 脱Fmoc化を順次繰り返して行った。合成したペプチドは、2,2,2-trifluoroacetic acid (TFA)/phenol/H2O/thioanisole/1-dodecanethiol = 82.5/5/5/5/2.5 (v/v/v/v/v) を用いて2時間室温で撹拌し、樹脂から切り出した。反応液を濾過し溶媒を留去した後、得られた残渣にt-ブチルメチルエーテルを加え目的物を沈殿させ、粗結晶を得た。その後、粗生成物を逆相高速液体クロマトグラフィー (HPLC) [A液: 0.1% TFA水溶液、B液: 0.1% TFA/アセトニトリル(ACN)、グラジエントA:B = 75:25 (0 min) → 55:45 (30 min)、 Liner gradient]で精製し、凍結乾燥粉末として化合物11 (22.9 mg, 13.1μmol, 収率44%) を得た。【０１３９】
化合物11: Analytical RP-HPLC: tR = 19.42 min. MALDI-TOF MS: C82H114N18O21S2 [M + H]+calcd (m/z) 1751.7926, found (m/z) 1751.824.
化合物11のAnalytical RP-HPLC およびMALDI-TOF MS (High Resolution, Positive Mode) は、図５で示す通りである。NMRデータ (1H NMR: 600 MHz (1D), DMSO-d6. 13C NMR: 150 MHz (HSQC), DMSO-d6)は以下の表に示す。 【０１４０】
【表１】
2019208820.tif 000077
2019208820.tif 000078
【０１４１】
(1-2) Somatostatin-14誘導体 (12) の合成法
【化７４】
2019208820.tif 000079
【０１４２】
化合物12の合成は、既報 (S. A. Mitchell et al., J. Org. Chem. 2001, 66, 2327-2342) を参考にして、化合物11を用いて行った。詳細を以下に示す。化合物11 (3.5μmol, 6.1 mg) を6 mL H2O に溶解させ、1 M アンモニア水溶液を用いてpH 8.5に調製した。また、フェリシアン化カリウム (8.8μmol, 2.9 mg, 2.5当量) を30 mL H2Oに溶解させたものを別途調製した。次に、調製したペプチド溶液をフェリシアン化カリウム水溶液中に滴下し、一晩室温にて撹拌した後、1M 酢酸水溶液でpH 4.0に調製し、反応を停止させた。その後、溶液を弱塩基型イオン交換樹脂 (DEAE Sephadex) に通し、残存するフェリシアン化カリウムを取り除いた。得られた溶液を凍結乾燥した後、逆相HPLC [A液: 0.1% TFA水溶液、B液: 0.1% TFA/ACN、グラジエントA:B = 75:25 (0 min) → 55:45 (30 min)、 Liner gradient]で精製し、凍結乾燥粉末として化合物12 (2.6 mg, 収率43%) を得た。
化合物12: Analytical RP-HPLC: tR= 17.41 min. MALDI-TOF MS: C82H112N18O21S2[M + H]+ calcd (m/z) 1749.7769, found (m/z) 1749.802.【０１４３】
化合物12のAnalytical RP-HPLC およびMALDI-TOF MS (High Resolution, Positive Mode) は、図６で示す通りである。NMRデータ (1H NMR: 600 MHz (1D), D2O. 13C NMR: 150 MHz (HSQC), D2O)は以下の表に示す。【０１４４】
【表２−１】
2019208820.tif 000080
【表２−２】
2019208820.tif 000081
【０１４５】
（２）化合物12又は化合物13、化合物12および化合物13を担持した蛍光性ナノ微粒子の作製法
一般式（Ｌ６）で示されるリガンド前駆体に相当するソマトスタチン化合物12と一般式（Ｅ１）で示される酵素阻害剤前駆体に相当するケトンリンカー修飾ソラフェニブ誘導体(13)を蛍光性ナノ微粒子に担持して、本発明の複合体を調製した。ケトンリンカー修飾ソラフェニブ誘導体(13)は、実施例1で使用したケトンリンカー修飾ソラフェニブ誘導体と同一化合物であり、ＷＯ２０１７／１３１２４２に記載の化合物32に相当する([化47]の合成スキーム参照)。
【化７５】
2019208820.tif 000082
【０１４６】
【化７６】
2019208820.tif 000083
【０１４７】
既報（T. Ohyanagi, et al., J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 12057-12517）に従い、TOPO-QDs（1 μM, 50 μL/octane)に対しMeOH (50μL)、i-PrOH (100μL)を加えて遠心によりナノ微粒子を沈殿させ、溶媒を取り除き再びヘキサン(50μL)を加えて分散させた。その後、予め酸性条件で脱保護した活性化済みのアミノオキシリンカー (1.25 mM または2.5 mM, 10μL /Milli Q)、ホスホリルコリンリンカー (100 mM, 8μlまたは10μL/MeOH)、NaBH4 (1μl, 12 wt % in 14 N NaOH)、およびmilli Q (31μL)を加えた。30分間撹拌することにより配位子交換を行い、反応性ナノ微粒子AO/PC SAM-QDs (AO/PC=1/32, 1/20, 1/16)および(AO/PC=1/16)を調製した。限外濾過(YM 50)により精製した後、化合物12、化合物13および化合物12と13(比率1:1)とのカップリングを行った(上記スキーム参照)。図７のMALDI-TOF MSに示すとおり、反応はスムーズに進行し全てのアミノオキシ基の化合物12および化合物13との置換反応が確認できた。【０１４８】
実施例４
(1) 化合物12を担持した蛍光性ナノ微粒子（参考例）および化合物12と13を担持した蛍光性ナノ微粒子（本発明の複合体）の抗腫瘍効果（肝ガン細胞増殖抑制効果）
細胞内イメージング：ヒト肝ガン細胞（HepG2, P12, ATCCより入手）をポリリジン溶液(0.001 %, 100μL/well/Milli Q)によって基盤表面をコートしたガラス基板のウェルプレートに対して5000 cell/200μl/wellで播種した。D-MEM High glucose, 10 % fetal bovine serum (FBS)中、37℃, 5% CO2雰囲気化で48時間インキュベートをした後に、化合物2を担持した蛍光性ナノ微粒子 [10 nM の化合物12担持型AO/PC SAM-QDs (AO/PC=1/20)]および化合物12と13を担持した蛍光性ナノ微粒子[10 nM の化合物12と13担持型AO/PC SAM-QDs (AO/PC=1/16)]を添加した。添加後から24時間までの細胞生育過程を蛍光イメージングにより観察した。細胞は以下の方法で染色した後に蛍光顕微鏡にて観察した。培地を除去した後、細胞をOpti-MEMで3回洗浄後Lyso Tracker(R) Green DND-26 (200μL, 5 nM/Opti-MEM)を加えて37℃, 5% CO2の条件下で30分インキュベートしてリソソームを染色した。その後Hoechest 33342 (2μL, 0.1 ng/μL/Opti-MEM)を加えて37℃, 5% CO2雰囲気化でさらに15分間インキュベートして核を染色した後にOpti-MEMで3回洗浄してイメージングを行った（図８及び９）。【０１４９】
(2) 化合物12を担持した蛍光性ナノ微粒子（参考例）および化合物12と13を担持した蛍光性ナノ微粒子（本発明の複合体）の抗腫瘍効果（肝ガン細胞殺傷作用）
Cell viability assayによる死細胞の定量：HepG2細胞（5×103 cells/100μL/well）を37℃、5% CO2雰囲気化で24時間インキュベートした後それぞれ90μLの培地に対してQD anchored 13 (1000〜10 nM, 10μL/Milli Q), QD anchored 12/13 (1000〜10 nM, 10μL/Milli Q)を加えて終濃度が 100 〜1 nMとなるように調製した溶液を添加した。培養開始後48時間で培地により3回洗浄を行い、細胞培養液100μLに対し10μlのCell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) を加えて37℃、5% CO2雰囲気化で3時間インキュベートし450 nmでの吸光度を測定することで細胞の生存率を測定した。(図１０)
図１０に示す結果から、ソラフェニブとSomatostatin-14を担持したQD anchored 12/13は、Somatostatin-14のみを担持したQD anchored 13に比べて、低濃度での細胞殺傷作用の増強効果が見られた。【０１５０】
尚、上記と同様の条件で潘種、インキュベートをしたHepG2細胞に対しそれぞれ90μLの培地に対してQD anchored 12 (1000〜10 nM, 10μL/Milli Q)および化合物12(1000〜10 nM, 10μL/Milli Q)を加えて終濃度が 100 〜1 nMとなるように調製した溶液を添加した。培養開始後96時間で培地により3回洗浄を行い、細胞培養液100μLに対し10μlのCell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) を加えて37℃、5% CO2雰囲気化で1.5時間インキュベートし450 nmでの吸光度を測定することで細胞の生存率を測定した。(図１１)
化合物12 (Somatostatin-14)は、QDに固定化するだけでは何らの細胞殺傷作用も示さなかった。【０１５１】
実施例５
(1) 化合物Ｌ８−１を担持した蛍光性ナノ微粒子（参考例）および化合物Ｌ８−１と13を担持した蛍光性ナノ微粒子（本発明の複合体（４０））の 合成
化合物12に代えて、一般式（Ｌ６）で示されるリガンド前駆体に相当する糖残基含有化合物Ｌ８−１（公知化合物）を用いたこと以外は、実施例３（２）と同様に、化合物Ｌ８−１と一般式（Ｅ１）で示される酵素阻害剤前駆体に相当するケトンリンカー修飾ソラフェニブ誘導体(13)を蛍光性ナノ微粒子に担持して、本発明の複合体（４０）を調製した。ケトンリンカー修飾ソラフェニブ誘導体(13)は、実施例1で使用したケトンリンカー修飾ソラフェニブ誘導体と同一化合物であり、ＷＯ２０１７／１３１２４２に記載の化合物32に相当する([化47]の合成スキーム参照)。【０１５２】
既報（T. Ohyanagi, et al., J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 12057-12517）に従い、TOPO-QDs（1 μM, 50 μL/octane)に対しMeOH (50μL)、i-PrOH (100μL)を加えて遠心によりナノ微粒子を沈殿させ、溶媒を取り除き再びヘキサン(50μL)を加えて分散させた。その後、予め酸性条件で脱保護した活性化済みのアミノオキシリンカー (1.25 mM または2.5 mM, 10μL /Milli Q)、ホスホリルコリンリンカー (100 mM, 8μlまたは10μL/MeOH)、NaBH4 (1μl, 12 wt % in 14 N NaOH)、およびmilli Q (31μL)を加えた。30分間撹拌することにより配位子交換を行い、反応性ナノ微粒子AO/PC SAM-QDs (AO/PC=1/16)を調製した。限外濾過(YM 50)により精製した後、化合物13または化合物Ｌ８−１と13(比率7:1)とのカップリングを行った。化合物13とのカップリングにより化合物13を担持したナノ微粒子(50)を得、化合物Ｌ８−１と13(比率7:1)とのカップリングにより化合物Ｌ８−１と化合物13を担持したナノ微粒子(40)を得得た。【０１５３】
ナノ微粒子(40)については、図１２のMALDI-TOF MSに示すとおり、m/z 907.540に未反応AO由来のシグナルが見られず、反応はスムーズに進行し全てのアミノオキシ基の化合物Ｌ８−１および化合物13との置換反応が確認できた。【０１５４】
【化７７】
2019208820.tif 000084
【０１５５】
参考例Ａ
細胞への取り込み確認実験
下記複合体（５０）を用いた。複合体（５０）は、ＷＯ２０１７／１３１２４２Ａ１の実施例１（２）に記載の方法で調製した。
【化７８】
2019208820.tif 000085
【０１５６】
ＨｅｐＧ２細胞を１０％ＦＢＳ添加培地に懸濁し、５×１０４細胞／ウェルの播種密度で８ウェルプレート（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のウェルにプレーティングした。細胞を、5％CO2の加湿インキュベーター中、３７℃で一晩接着させた。ＨｅｐＧ２細胞はクラスリン依存性エンドサイトシスにて糖鎖をリガンドとして取り込むことが知られている。異なるエンドサイトシス阻害条件で複合体（５０）と2時間共インキュベートした後の細胞取り込みの画像を、以下のように蛍光顕微鏡により観察した：（a）対照エンドサイトシス実験：10％FBS添加培地中、5％CO2の加湿インキュベーター内で37℃、2時間、10nM 複合体（５０）とインキュベートし、続いてHoechst 33342（2 μl、1 ng / μl / Opti-MEM）で核染色し、かつ60倍レンズを装備したオールインワン蛍光顕微鏡BIOREV BZ-9000シリーズジェネレーションII（キーエンス、大阪、日本）で蛍光画像を撮影した細胞。(b)ＧｌｃＮＡｃを添加したエンドサイトシス実験：5％CO2の加湿インキュベーター中、１０％ＦＢＳおよび１０ｍＭ ＧｌｃＮＡｃを添加した培地中、１０ｎＭ複合体（５０）と共に２時間インキュベートし、その後Hoechst 33342（2 μl、1 ng / μl / Opti-MEM）で核染色した、かつ蛍光画像をオールインワン蛍光顕微鏡によって撮影した細胞。(c)Ｋ＋デプリーション処理：Ｋ＋除去ＨＥＰＥＳ緩衝液（１４０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌのＤ−グルコース）中、5％CO2の加湿インキュベーター内で37℃、1時間、細胞をプレインキュベートすることによってＫ＋のデプリーション（depletion）を行った。細胞をＫ＋を含まないHEPES緩衝液で素早く洗浄した。 Ｋ＋デプリーション処理後、細胞を5％CO2の加湿インキュベーター中、３７℃で２時間、Ｋ＋を含まないＨＥＰＥＳ緩衝液中で１０ｎＭの複合体（５０）と共にインキュベートし、続いてHoechst 33342（2 μl、1 ng / μl / Opti-MEM）で核染色し、および蛍光画像をオールインワン蛍光顕微鏡によって撮影した。各蛍光画像を図１３に示す。【０１５７】
図１３に示す結果から、複合体（５０）が、糖鎖リガンドと受容体との結合を介したエンドサイトシスでＨｅｐＧ２細胞に取り込まれることが分かる。（１）図１３ａでは複合体（５０）がエンドサイトシスで取り込まれること。（２）図１３ｂでは、ＧｌｕＮＡｃ共存下では、複合体（５０）の取り込みが減少する（複合体（５０）の末端にＧｌｕＮＡｃがあり、この部分（糖鎖）と細胞の受容体との結合が競争阻害された結果と推察される。）（３）カリウムを除いた培地で細胞は、エンドサイトシスをできないことが知られている。図１３ｃでは、細胞の表面にのみ微粒子が集積しエンドサイトシスにより細胞内に取り込まれていない結果となった。これらの結果より、ＧｌｕＮＡｃを有する複合体（５０）は、ＧｌｕＮＡｃが糖鎖リガンドとして機能し、その後に、クラスリン依存性エンドサイトシスにてナノ粒子が細胞内に取り込まれることが分かる。【０１５８】
実施例６
抗腫瘍効果（肝ガン細胞増殖抑制効果）
Cell viability assayによる死細胞の定量：HepG2細胞（5×103 cells/100μL/well）を37℃、5% CO2雰囲気化で24時間インキュベートした後それぞれ90μLの培地に対してQD anchored 13 (1000〜10 nM, 10μL/Milli Q), QD anchored L8-1/13 （本発明の複合体（４０））(1000〜10 nM, 10μL/Milli Q)を加えて終濃度が 100 〜5 nMとなるように調製した溶液を添加した。培養開始後48時間で培地により3回洗浄を行い、細胞培養液100μLに対し10μlのCell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) を加えて37℃、5% CO2雰囲気化で3時間インキュベートし450 nmでの吸光度を測定することで細胞の生存率を測定した。(図１４)【０１５９】
図１４に示す結果から、ソラフェニブと糖残基としてグルコサミン（ＧｌｕＮＡｃ）を担持したQD anchored L8-1/13は、ソラフェニブのみを担持したQD anchored 13に比べて、低濃度での細胞殺傷作用の増強効果が見られた。それぞれＩＣ５０（ｎＭ）は３４．１及び７．２であった。ソラフェニブの効果が、糖鎖リガンドとの組み合わせで、ＩＣ５０で１／５となる効果が得られた。【０１６０】
参考例Ｂ
本発明のナノ微粒子はリン脂質疑似物質基を表面に有するがＰＥＧ（ポリエチレングリコール）を表面に有する粒子が知られていることから、リン脂質被覆とＰＥＧ被覆との効果を比較した。図１６に示す写真は、ＰＣリンカー（リン脂質疑似物質基）とＰＥＧリンカーとからなる混合ＳＡＭによって被覆されたナノ粒子（ＱＤ６５５）の１００％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）における挙動を表す。ＰＥＧリンカーのＳＡＭ(Self Assembled Monolayer （自己組織化膜）)によって被覆されたナノ粒子（ＰＥＧ ／ ＰＣ ＝ １００ ／ ０）のみが赤い矢印で示されているように大規模な凝集を形成した。 ＦＣＳ(Fluorescence Correlation Spectrometry （蛍光相関スペクトル）)分析は、１００％ＦＢＳ中のこれらのナノ粒子の蛍光変動を示す。 自己相関曲線は一成分拡散モデルを用いて適合させた。図１５に示す実験結果は、リン脂質被覆により血球の蛋白質による凝集が抑えられる。リガンド導入の効果は、ナノ粒子が細胞と接してはじめて生じる効果である。リン脂質被覆した微粒子は血中で安定に存在できることから、リガンド導入の効果が得られることが予測できる。即ち、本発明におけるリガンド−受容体の結合により得られる効果は、リン脂質被覆において効率的に生じることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【０１６１】
本発明は、抗ガン剤に関連する分野において有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１６２】
配列番号１〜１１は、リガンドのアミノ酸配列である。
【図１】
2019208820.tif 000110
【図２】
2019208820.tif 000111
【図３】
2019208820.tif 000112
【図４】
2019208820.tif 000113
【図５】
2019208820.tif 000114
【図６】
2019208820.tif 000115
【図７】
2019208820.tif 000116
【図８】
2019208820.tif 000117
【図９】
2019208820.tif 000118
【図１０】
2019208820.tif 000119
【図１１】
2019208820.tif 000120
【図１２】
2019208820.tif 000121
【図１３】
2019208820.tif 000122
【図１４】
2019208820.tif 000123
【図１５】
2019208820.tif 000124
【配列表】
2019208820000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年2月27日(2020.2.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）ナノ粒子、（２）前記ナノ粒子の表面に担持された下記一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤含有基、（３）前記ナノ粒子の表面に担持された下記一般式（Ｌ１）で示されるリガンド含有基、及び（４）前記ナノ粒子の表面に担持された下記一般式（Ｂ）で示されるリン脂質疑似物質基を含み、一般式（Ｌ１）中のＲ２０＝Ｎ−Ｏ−は下記一般式（Ｌ２）で示される、複合体。
【化１】
2019208820.tif 000125
（一般式（Ａ）中、ｎ１は２〜３０の整数であり、ｎ２は２〜３０の整数であり、−Ｓ−末端がナノ粒子担持部位であり、Ｒ１０は酵素阻害剤含有部位である。）
【化２】
2019208820.tif 000126
（一般式（Ｌ１）中、ｎ１は２〜３０の整数であり、ｎ２は２〜３０の整数であり、−Ｓ−末端がナノ粒子担持部位であり、Ｒ２０は細胞表面受容体に対して結合性を有するリガンド部位を含む。）
【化３】
2019208820.tif 000127
（一般式（Ｂ）中、ｎ３は２〜３０の範囲の整数であり、−Ｓ−末端がナノ粒子担持部位である。）
【化４】
2019208820.tif 000128
（一般式（Ｌ２）中、ＬＤはリガンド部位であり、ＬＫはリンカー部位である。）
【請求項２】
一般式（Ａ）中のＲ１０＝Ｎ−Ｏ−は下記一般式（Ａ１）、（Ａ２）又は（Ａ３）で示される、請求項１に記載の複合体。
【化５】
2019208820.tif 000129
（一般式（Ａ１）中、ＥＩＨは、酵素阻害剤部位であり、酵素阻害剤部位は、リソソーム酵素の活性中心と反応性を有する自殺基質部位、又はキナーゼと反応性を有するキナーゼ阻害部位であり、ＬＫはリンカー部位である。）
【化６】
2019208820.tif 000130
（一般式（Ａ２）中、ｍ２は１〜１０の整数であり、ＥＩＨは酵素阻害剤部位であり、酵素阻害剤部位は、リソソーム酵素の活性中心と反応性を有する自殺基質部位、又はキナーゼと反応性を有するキナーゼ阻害部位である。）
【化７】
2019208820.tif 000131
（一般式（Ａ３）中、ｍ４は１〜１０の整数であり、ＥＩＨは一般式（Ａ２）と同義である。）
【請求項３】
一般式（Ｌ１）中のＲ２０＝Ｎ−Ｏ−は下記一般式（Ｌ３）又は（Ｌ４）で示される請求項１又は２に記載の複合体。
【化８】
2019208820.tif 000132
（一般式（Ｌ３）中、ｍ１は１〜１０の整数であり、ｍ２は１〜１０の整数であり、ＬＤはリガンド部位である。）
【化９】
2019208820.tif 000133
（一般式（Ｌ４）中、ｍ３は１〜１０の整数であり、ＬＤはリガンド部位である。）
【請求項４】
前記リガンド部位は、インテグリンに対するリガンド部位であり、インテグリンに対するリガンド部位は、細胞接着性タンパク質、細胞外マトリックス分子、フィブロネクチン、ラミニン若しくはその断片、コラーゲン若しくはその断片、又は白血球若しくはその断片を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の複合体。
【請求項５】
前記リガンド部位は、糖鎖受容体に対するリガンド部位であり、糖鎖受容体に対するリガンド部位は、単糖残基、オリゴ糖残基、多糖残基、Ｎ−グリカン、Ｏ−グリカン、並びにＮ−グリカン及びＯ−グリカン以外のグリカンから成る群から選ばれる少なくとも１種の糖の残基を含むリガンド部位である、請求項１〜３のいずれかに記載の複合体。
【請求項６】
前記リガンド部位は、ソマトスタチンガン細胞受容体に対するリガンド部位であり、ソマトスタチンガン細胞受容体に対するリガンド部位は、１４アミノ酸型ソマトスタチン、２８アミノ酸型ソマトスタチン、オクトレオチド、ランレオチド、パシレオチド又はそれらのアナログ体を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の複合体。
【請求項７】
一般式（Ａ）で示されるリソソーム酵素阻害剤又はキナーゼ阻害剤と一般式（Ｂ）で示されるリン脂質疑似物質のモル比率が１：１００〜１０：１の範囲であり、一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤含有基と一般式（Ｌ１）で示されるリガンド含有基のモル比率が１０：１〜１：１０の範囲である、請求項１〜６のいずれかに記載の複合体。
【請求項８】
前記ナノ粒子は、金属ナノ粒子又は半導体ナノ粒子である、請求項１〜７のいずれかに記載の複合体。
【請求項９】
前記ナノ粒子は、粒子径が０．１〜１００ｎｍの範囲である請求項１〜８のいずれかに記載の複合体。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の複合体を有効成分として含有する抗ガン剤。
【請求項１１】
前記抗ガン剤は、乳癌、前立腺癌、肝細胞癌、膵癌、大腸癌、卵巣癌、腎癌、肺癌、または脳腫瘍に対する抗ガン剤である請求項１０に記載の抗ガン剤。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれかに記載の複合体の製造方法であって、
下記一般式（Ｃ）で示される架橋前駆体Ｘ及び下記一般式（Ｄ）で示されるリン脂質疑似物質前駆体とコロイド状ナノ粒子とを混合して、ナノ粒子の表面に架橋前駆体Ｘ及びリン脂質疑似物質を担持した表面修飾ナノ粒子を得る工程（１）、及び
得られた表面修飾ナノ粒子に下記一般式（Ｅ）で示される酵素阻害剤前駆体Ｙ及び下記一般式（Ｌ６）で示されるリガンド前駆体ＰＬを混合して、前記表面修飾ナノ粒子上の架橋前駆体Ｘと連結させて下記一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤含有基及び下記一般式（Ｌ１）で示され、一般式（Ｌ１）中のＲ２０＝Ｎ−Ｏ−は下記一般式（Ｌ２）で示されるリガンド含有基を形成して請求項１〜９のいずれかに記載の複合体を得る工程（２）を含む前記方法。
【化１０】
2019208820.tif 000134
（一般式（Ｃ）中、ｎ１は２〜３０の整数であり、ｎ２は２〜３０の整数である。）
【化１１】
2019208820.tif 000135
（一般式（Ｄ）中、ｎ３は２〜３０の範囲の整数である。）
【化１２】
2019208820.tif 000136
（一般式（Ｅ）中、Ｒ１０は酵素阻害剤含有部位である。）
【化１３】
2019208820.tif 000137
（一般式（Ｌ６）中、ＬＤはリガンド部位であり、ＬＫはリンカー部位である。）
【化１４】
2019208820.tif 000138
（一般式（Ａ）中、ｎ１は２〜３０の整数であり、ｎ２は２〜３０の整数であり、−Ｓ−末端がナノ粒子担持部位であり、Ｒ１０は酵素阻害剤含有部位である。）
【化１５】
2019208820.tif 000139
（一般式（Ｌ１）中、ｎ１は２〜３０の整数であり、ｎ２は２〜３０の整数であり、−Ｓ−末端がナノ粒子担持部位であり、Ｒ２０は細胞表面受容体に対して結合性を有するリガンド部位を含む。）
【化１６】
2019208820.tif 000140
（一般式（Ｌ２）中、ＬＤはリガンド部位であり、ＬＫはリンカー部位である。）
【請求項１３】
一般式（Ｅ）で示される酵素阻害剤前駆体Ｙは、下記一般式（Ｅ１）で示される、請求項１２に記載の製造方法。
【化１７】
2019208820.tif 000141
（一般式（Ｅ１）中、ＥＩＨは、酵素阻害剤部位であり、酵素阻害剤部位は、リソソーム酵素の活性中心と反応性を有する自殺基質部位、又はキナーゼと反応性を有するキナーゼ阻害部位であり、ＬＫはリンカー部位である。）
【請求項１４】
一般式（Ｌ６）で示されるリガンド前駆体ＰＬが、下記一般式（Ｌ７）又は（Ｌ８）で示される化合物である請求項１２に記載の製造方法。
【化１８】
2019208820.tif 000142
（一般式（Ｌ７）中、ｍ１は１〜１０の整数であり、ｍ２は１〜１０の整数であり、ＬＤはリガンド部位である。）
【化１９】
2019208820.tif 000143
（一般式（Ｌ８）中、ｍ３は１〜１０の整数であり、ＬＤはリガンド部位である。）
【請求項１５】
一般式（Ｅ）で示される酵素阻害剤前駆体Ｙは、下記一般式（Ｅ２）又は（Ｅ３）で示される
【化２０】
2019208820.tif 000144
（一般式（Ｅ２）及び（Ｅ３）中、ＥＩＨは酵素阻害剤部位であり、酵素阻害剤部位は、リソソーム酵素の活性中心と反応性を有する自殺基質部位、又はキナーゼと反応性を有するキナーゼ阻害部位であり、ｍ２は１〜１０の整数であり、ｍ４は１〜１０の整数である。）請求項１３又は１４に記載の製造方法。
【請求項１６】
（削除）
【請求項１７】
（削除）
【請求項１８】
請求項１〜９のいずれかに記載の複合体を調製する工程、および
前記複合体を酵素阻害剤移送の対象である細胞、または前記細胞を含む生体に供給して、前記細胞に酵素阻害剤を取り込ませる工程
を含む、酵素阻害剤の細胞への移送方法。
【請求項１９】
酵素阻害剤移送の対象である細胞が、ガン細胞である、請求項１８に記載の移送方法。
【請求項２０】
前記細胞を含む生体が哺乳動物（ヒトを含む、又は含まない）である、請求項１９に記載の移送方法。
【国際調査報告】
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