(57)【要約】  ハイドロゲル上で接着性細胞を培養し、生細胞内で発色する染色剤を用いて生細胞を染色し、顕微鏡観察により生細胞数を測定する第１測定工程と、第１測定工程後にハイドロゲルを洗浄し、顕微鏡観察により生細胞数を測定する第２測定工程と、第１測定工程における測定結果と第２測定工程における測定結果とに基づき、ハイドロゲルに対する細胞接着性を評価する接着性評価工程と、を含むハイドロゲルの評価方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイドロゲル上で接着性細胞を培養し、生細胞内で発色する染色剤を用いて生細胞を染色し、顕微鏡観察により生細胞数を測定する第１測定工程と、
前記第１測定工程後に前記ハイドロゲルを洗浄し、顕微鏡観察により生細胞数を測定する第２測定工程と、
前記第１測定工程における測定結果と前記第２測定工程における測定結果とに基づき、前記ハイドロゲルに対する細胞接着性を評価する接着性評価工程と、
を含むハイドロゲルの評価方法。
【請求項２】
前記第１測定工程及び前記第２測定工程では、プレート状のハイドロゲル基材に設けられた凹部内で前記接着性細胞を培養する、請求項１に記載のハイドロゲルの評価方法。
【請求項３】
前記第１測定工程における測定結果に基づき、前記ハイドロゲルの細胞毒性を評価する毒性評価工程をさらに含む、請求項１又は２に記載のハイドロゲルの評価方法。
【請求項４】
前記染色剤がＭＴＴである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のハイドロゲルの評価方法。
【請求項５】
ハイドロゲル上で細胞を培養し、生細胞内で発色する染色剤を用いて生細胞を染色し、顕微鏡観察により生細胞数を測定する測定工程と、
前記測定工程における測定結果に基づき、前記ハイドロゲルの細胞毒性を評価する毒性評価工程と、
を含むハイドロゲルの評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイドロゲルの評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、三次元網目構造を有する高分子であるハイドロゲルが、医療用材料として注目されている。ハイドロゲルは、上記三次元網目構造によって多量の水を保持している。【０００３】
ハイドロゲルとしては、プルラン、デキストラン、コラーゲン、アルギン酸塩、ポリビニルアルコール等に由来する種々のハイドロゲルが知られており、それらの機械的強度、保水性、細胞接着性、生体適合性等の特性に応じた用途がある。例えば、細胞接着性の高いハイドロゲルは、細胞の足場として再生医療等の分野で利用することができる。反対に、細胞接着性の低いハイドロゲルは、治療薬を含有する創傷被覆剤等として利用することができる。【０００４】
例えば、特許文献１には、組織修復、組織再生等に適している細胞の足場として用いることができる架橋したプルラン及びデキストランの混合物を含むハイドロゲルが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１４−１４０３８１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述した通り、近年、特性の異なる様々なハイドロゲルが開発されているため、それらの細胞接着性、生体適合性等の特性を簡便に評価し、用途に応じて最適なハイドロゲルを選択することが望まれる。【０００７】
本発明は、上記に鑑みてなされたものであり、ハイドロゲルの細胞接着性及び細胞毒性を簡便に測定することができるハイドロゲルの評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するための具体的な手段には、以下の実施態様が含まれる。
＜１＞ハイドロゲル上で接着性細胞を培養し、生細胞内で発色する染色剤を用いて生細胞を染色し、顕微鏡観察により生細胞数を測定する第１測定工程と、該第１測定工程後に前記ハイドロゲルを洗浄し、顕微鏡観察により生細胞数を測定する第２測定工程と、前記第１測定工程における測定結果と前記第２測定工程における測定結果とに基づき、前記ハイドロゲルに対する細胞接着性を評価する接着性評価工程と、を含むハイドロゲルの評価方法。【０００９】
＜２＞前記第１測定工程及び前記第２測定工程では、プレート状のハイドロゲル基材に設けられた凹部内で前記接着性細胞を培養する＜１＞に記載のハイドロゲルの評価方法。【００１０】
＜３＞前記第１測定工程における測定結果に基づき、前記ハイドロゲルの細胞毒性を評価する毒性評価工程をさらに含む＜１＞又は＜２＞に記載のハイドロゲルの評価方法。【００１１】
＜４＞前記染色剤がＭＴＴである＜１＞〜＜３＞のいずれか１項に記載のハイドロゲルの評価方法。【００１２】
＜５＞ハイドロゲル上で細胞を培養し、生細胞内で発色する染色剤を用いて生細胞を染色し、顕微鏡観察により生細胞数を測定する測定工程と、前記測定工程における測定結果に基づき、前記ハイドロゲルの細胞毒性を評価する毒性評価工程と、を含むハイドロゲルの評価方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ハイドロゲルの細胞接着性及び細胞毒性を簡便に測定することができるハイドロゲルの評価方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】実施例の細胞接着性試験における洗浄前のハイドロゲルの顕微鏡画像を示す図である。
【図１Ｂ】実施例の細胞接着性試験における洗浄後のハイドロゲルの顕微鏡画像を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の実施形態について説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１６】
［第１実施形態］
本発明の第１実施形態に係るハイドロゲルの評価方法は、ハイドロゲル上で接着性細胞を培養し、生細胞内で発色する染色剤を用いて生細胞を染色し、顕微鏡観察により生細胞数を測定する第１測定工程と、該第１測定工程後に上記ハイドロゲルを洗浄し、顕微鏡観察により生細胞数を測定する第２測定工程と、上記第１測定工程における測定結果と上記第２測定工程における測定結果とに基づき、上記ハイドロゲルに対する細胞接着性を評価する接着性評価工程と、を含む。
【００１７】
評価対象となるハイドロゲルは、水を保持している三次元網目構造を有する高分子であれば特に制限されない。例えば、寒天、カラギーナン、デキストラン、プルラン、キトサン、セルロース、ゼラチン、セリシン、フィブロイン、コラーゲン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリアクリルアミド（ＰＡＡ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）等に由来するハイドロゲルが挙げられる。また、上記高分子の誘導体に由来するハイドロゲルであってもよい。
【００１８】
ハイドロゲルの形態は特に制限されないが、マイクロプレート、シャーレ等に充填したハイドロゲルであっても、鋳型を用いて作成した凹部を有するプレート状のハイドロゲル基材であってもよい。
【００１９】
凹部を有するプレート状のハイドロゲル基材の作製方法としては、例えば、中心に凸部を有する鋳型に溶液を流し込み、凍結融解法等によりゲル化した後、ハイドロゲルを取り外し反転させることにより、中心に凹部を有するプレート状のハイドロゲル基材を作製する方法等が挙げられる。凍結融解の条件は、ＰＶＡ誘導体を例に挙げると、−２０℃で１８時間凍結し、３５℃で６時間融解する工程を１サイクルとし、これを数回行う条件としてもよい。
【００２０】
ハイドロゲルに対する細胞接着性の評価に用いる細胞は、接着性細胞であれば特に制限されない。
【００２１】
接着性細胞を培養しているハイドロゲル上に、染色剤を滴下して、適切な時間インキュベートする。
【００２２】
染色剤は、生細胞内で発色する染色剤であれば特に制限されず、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）、カルセインアセトキシメチルエステル（カルセインＡＭ）、７−イソブトキシカルボニルオキシ−３Ｈ−フェノキサジン−３−オン（ＣｙｔｏＲｅｄ）、二酢酸フルオレセイン（ＦＤＡ）、５−（６−）−カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）、２'，７'−ビス−(２−カルボキシエチル)−５−（６−）−カルボキシフルオレセイン，アセトキシメチルエステル（ＢＣＥＣＦ−ＡＭ）等が挙げられる。
【００２３】
上記染色剤は、生細胞内に取り込まれると酵素によって加水分解、還元等されることにより発色する。例えば、ＭＴＴを例に挙げると、黄色の溶液であるＭＴＴが、脱水素酵素によって還元されて難溶性沈殿物である青色のホルマザン色素に変換される。上記脱水素酵素は、ミトコンドリアの電子伝達系に関連する酵素であるため、死細胞ではホルマザン色素は生成されない。
【００２４】
ハイドロゲルは多孔質構造を有し、染色剤を吸着するため、ハイドロゲル上の細胞に染色剤を滴下すると、ハイドロゲルも細胞と同様に染色される。生細胞内で発色する染色剤を用いた場合、染色剤が上記の作用機序により生細胞内で異なる色素に変換されるため、生細胞はハイドロゲルと異なる色に染色される。一方、生細胞内で発色が起こらない染色剤を用いてハイドロゲル上の細胞を染色する場合、ハイドロゲルと細胞とが同色に染色されるため、細胞を識別することが困難となる。
【００２５】
染色された生細胞数は、顕微鏡観察により測定される。測定方法については特に制限されないが、例えば、目視により生細胞数を計数してもよく、画像解析により生細胞に起因する発色部の面積を測定して生細胞数とみなしてもよい。この結果得られたハイドロゲル上の生細胞数を、第１測定工程における測定結果とする。
【００２６】
顕微鏡の種類は、特に制限されないが、光透過性が低い半透明又は不透明なハイドロゲルに対しては、透過型顕微鏡ではなく落射型顕微鏡を用いる。
【００２７】
顕微鏡を用いて観察することにより、生細胞を簡便に測定することが可能となる。
【００２８】
第１測定工程後、ハイドロゲルを洗浄する。これにより、ハイドロゲル上に接着しなかった細胞は除去される。
【００２９】
第１測定工程における測定方法と同様の方法により、洗浄されたハイドロゲル上の生細胞数を測定する。この結果得られたハイドロゲルに接着した生細胞数を、第２測定工程における測定結果とする。
【００３０】
ハイドロゲルの細胞接着性は、第１測定工程における測定結果と第２測定工程における測定結果とに基づき評価される。具体的には、例えば、第１測定工程における測定結果に対する第２測定工程における測定結果の比を細胞接着率として算出し評価してもよい。
【００３１】
また、本実施形態に係るハイドロゲルの評価方法は、第１測定工程における測定結果に基づき、ハイドロゲルの細胞毒性を評価する工程を含んでもよい。例えば、予めハイドロゲルに播種される細胞に含まれる生細胞数を確認し、第１測定工程にて得られた生細胞数との差から、培養中にハイドロゲルの影響を受けて死滅した細胞数を算出することができる。上記の細胞毒性を評価する工程を含む場合、一連の工程において、ハイドロゲルの細胞接着性と細胞毒性とを評価することができる。
【００３２】
［第２実施形態］
本発明の第２実施形態に係るハイドロゲルの評価方法は、ハイドロゲル上で細胞を培養し、生細胞内で発色する染色剤を用いて生細胞を染色し、顕微鏡観察により生細胞数を測定する測定工程と、該測定工程における測定結果に基づき、上記ハイドロゲルの細胞毒性を評価する毒性評価工程とを含む。
【００３３】
本実施形態に係る評価対象となるハイドロゲル、染色剤、及び顕微鏡観察による生細胞数の測定方法については、第１実施形態と同様であるため、その説明を省略する。
【００３４】
ハイドロゲルに対する細胞毒性の評価に用いる細胞は、特に制限されず、接着性細胞であっても、浮遊性細胞であってもよい。
【００３５】
細胞培養及び染色工程では、予め生細胞数を測定した細胞懸濁液をハイドロゲル上に播種し、インキュベートし、染色剤を滴下した後、適切な時間インキュベートする。
【００３６】
染色された生細胞数を顕微鏡観察により測定し、この測定結果と最初に播種した生細胞数とに基づき、ハイドロゲルの細胞毒性を評価する。具体的には、例えば、最初に播種した生細胞数に対する上記顕微鏡観察による測定結果の比を細胞毒性率として算出し評価してもよい。
【００３７】
第１実施形態及び第２実施形態に係るハイドロゲルの評価方法によれば、ハイドロゲルの細胞接着性及び細胞毒性を簡便に測定することができる。これにより、用途に応じて有効なハイドロゲルを選別することができる。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。【００３９】
［実施例１］
実施例１では、以下の方法により、ハイドロゲルの細胞接着性試験及び細胞毒性試験を行った。【００４０】
＜ハイドロゲル基材の調製＞
評価対象となるハイドロゲル基材は、以下のように作製した。
まず、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）の誘導体であるＥＸＣＥＶＡＬ（登録商標、クラレ社製）に超純水を加え、ＥＸＣＥＶＡＬの濃度が１０ｗ／ｖ％の溶液を調製した。次いで、１８０℃で１時間、乾熱滅菌した金属片（直径２０ｍｍ、厚さ１０ｍｍ）をステンレス製シャーレ（直径４０ｍｍ、厚さ１５ｍｍ）の中心に設置した。そして、上記１０ｗ／ｖ％ＥＸＣＥＶＡＬ溶液を、上記ステンレス製シャーレ上に充填し、凍結融解法によりゲル化した。その後、ゲル化した１０ｗ／ｖ％ＥＸＣＥＶＡＬのハイドロゲルを上記ステンレス製シャーレから取り外し反転させて、凹部を有するプレート状のハイドロゲル基材を作製した。なお、凍結融解は、−２０℃で１８時間凍結し、３５℃で６時間融解する工程を１サイクル行った。【００４１】
＜細胞接着性試験＞
まず、調製した１０ｗ／ｖ％ＥＸＣＥＶＡＬのハイドロゲル基材の凹部に、ＨａＣａＴ細胞を１００００細胞／ｃｍ２となるよう播種して２４時間インキュベートした後、ＭＴＴ試薬を滴下して２時間インキュベートした。次いで、落射型顕微鏡を用いて、上記ハイドロゲル基材の凹部を観察して、ＭＴＴ試薬により発色した生細胞数を測定した。そして、上記ハイドロゲル基材を振とう機を用いてリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で１５分間振とう洗浄した。その後、再び落射型顕微鏡にて上記ハイドロゲル基材の凹部を観察して、生細胞数を測定した。【００４２】
図１ＡはＰＢＳで洗浄前の上記ハイドロゲル基材の顕微鏡画像、図１ＢはＰＢＳで洗浄後の上記ハイドロゲル基材の顕微鏡画像である。図１Ａから、上記ハイドロゲル上での細胞の生存が確認された。そして、図１Ｂから、上記ハイドロゲル上の細胞数は明らかに減少し、ほとんどの細胞が洗い流されたことが確認された。このことから、１０ｗ／ｖ％ＥＸＣＥＶＡＬハイドロゲル上に生存していたほとんどの細胞は接着していなかったと考えられる。【００４３】
＜細胞毒性試験＞
細胞接着性試験と同様に、調製した１０ｗ／ｖ％ＥＸＣＥＶＡＬのハイドロゲル基材の凹部に、ＨａＣａＴ細胞を１００００細胞／ｃｍ２となるよう播種して２４時間インキュベートした後、ＭＴＴ試薬を滴下して２時間インキュベートした。次いで、落射型顕微鏡を用いて、上記ハイドロゲル基材の凹部を観察して、ＭＴＴ試薬により発色した生細胞数を測定した。細胞の生存が確認されたことから、細胞毒性はないと判断された。【００４４】
［比較例１］
比較例１では、以下の方法により、ハイドロゲル上の細胞数の測定を行った。【００４５】
＜ハイドロゲルの調製＞
評価対象となるハイドロゲルを以下のように調製した。
まず、ＥＸＣＥＶＡＬに超純水を加え、ＥＸＣＥＶＡＬの濃度が２．５ｗ／ｖ％、５．０ｗ／ｖ％、７．５ｗ／ｖ％、及び１０．０ｗ／ｖ％の溶液を調製し、これら全ての濃度の溶液が異なるウェルに充填された２４ウェルプレートを４枚準備した。また、ＰＶＡであるＰＯＶＡＬ（クラレ社製）に超純水を加え、２．５ｗ／ｖ％、５．０ｗ／ｖ％、７．５ｗ／ｖ％、及び１０．０ｗ／ｖ％の溶液を調製し、これら全ての濃度の溶液が異なるウェルに充填された２４ウェルプレートを４枚準備した。
次いで、上記８枚の２４ウェルプレートに充填された溶液を、以下の４条件で凍結融解法によりゲル化した。凍結融解条件は、−２０℃で１８時間凍結し、３５℃で６時間融解する工程を１サイクル、２サイクル、３サイクル、及び４サイクルとした。そして、凍結融解したウェル内のハイドロゲルをＰＢＳで洗浄後、ＤＭＥＭ培地を加え２４時間静置した。【００４６】
＜ハイドロゲル上の細胞数の測定＞
各条件で調製したハイドロゲルが充填されたウェル内に、ＨａＣａＴ細胞を５０００細胞／ｃｍ２で播種して２４時間インキュベートした後、ＤＭＥＭ培地を取り除き、４％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液を用いて１０分間、細胞の固定処理を行った。そして、０．５％クリスタルバイオレットを用いて１５分間、細胞を染色した。その後、超純水でクリスタルバイオレットを洗い流し、落射型顕微鏡を用いて、ハイドロゲル上の細胞数を測定した。【００４７】
全条件で調製したハイドロゲルにおいて、クリスタルバイオレットにより細胞が青紫色に染色されたが、ハイドロゲルも染色剤が吸着することにより青紫色に染色された。このため、ハイドロゲル上の細胞を識別できず、細胞数を測定することができなかった。そこで、２４ウェルプレートからハイドロゲルを取り出し還流洗浄した。ハイドロゲル内のクリスタルバイオレットは除去することができたが、細胞も脱色されたため、細胞数を測定できなかった。
【図１Ａ】
2019225600.tif 000002
【図１Ｂ】
2019225600.tif 000003
【国際調査報告】
2019225600.tif 000004
2019225600.tif 000005
2019225600.tif 000006
2019225600.tif 000007