(57)【要約】  本発明は、試料中の2種以上の標的核酸の絶対量を同時に決定することができる簡便な手段の提供を目的とする。  本発明者らは、試料中の2種以上の標的核酸の絶対量を決定する方法であって、（a）試料と既知量のコントロール核酸とを混合する工程、（b）試料中の全ての標的核酸および標的核酸と一括して増幅される特定の核酸群並びにコントロール核酸を共増幅する工程、（c）増幅された全ての標的核酸および前記特定の核酸群の合計の量の指標並びに増幅されたコントロール核酸の量の指標から、試料中の全ての標的核酸および前記特定の核酸群の合計の量を決定する工程、並びに、（d）増幅された全ての標的核酸および前記特定の核酸群の合計の量の指標と増幅された標的核酸の量の指標とから算出される、全ての標的核酸および前記特定の核酸群の合計中の各標的核酸の占有率から、試料中の各標的核酸の絶対量を算出する工程、を含む、前記方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の2種以上の標的核酸の絶対量を決定する方法であって、
(a) 試料と既知量のコントロール核酸とを混合する工程、
(b) 試料中の全ての標的核酸および標的核酸と一括して増幅される特定の核酸群並びにコントロール核酸を共増幅する工程、
(c) 増幅された全ての標的核酸および前記特定の核酸群の合計の量の指標並びに増幅されたコントロール核酸の量の指標から、試料中の全ての標的核酸および前記特定の核酸群の合計の量を決定する工程、並びに、
(d) 増幅された全ての標的核酸および前記特定の核酸群の合計の量の指標と増幅された各標的核酸の量の指標とから算出される、全ての標的核酸および前記特定の核酸群の合計中の各標的核酸の占有率から、試料中の各標的核酸の絶対量を算出する工程、
を含む、前記方法。
【請求項２】
コントロール核酸が、増幅に必要な塩基配列と一部または全部の塩基がランダムに組み合わされた塩基配列とで構成された人工配列であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試料中の全ての標的核酸および前記特定の核酸群の合計並びにコントロール核酸の共増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法、Loop-Mediated Isothermal Amplification（LAMP）法、In vitro転写からなる群から選択される手法によって行われる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
試料中の全ての標的核酸および前記特定の核酸群の合計並びにコントロール核酸の共増幅が、PCR法によって行われる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
試料が、飲食品、生体試料、環境試料および工業プロセスからの試料からなる群から選択される少なくとも一種であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
試料が、活性汚泥、土壌、河川水、海水、温泉水、飲料水、加工食品、発酵槽培養物、並びに、真核生物から採取された組織、細胞および体液からなる群から選択される少なくとも一種であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
生体試料が、哺乳動物から採取された、唾液、プラーク、歯肉溝浸出液(GCF)、糞便および皮膚由来試料からなる群から選択される少なくとも一種であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
標的核酸が細菌のリボソームRNA（rRNA）遺伝子であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
標的核酸が、Abiotrophia属、Achromobacter属、Acinetobacter属、Actinomyces属、Aerococcus属、Aggregatibacter属、Alloprevotella属、Alloscardovia属、Anaerococcus属、Anaeroglobus属、Arcanobacterium属、Atopobium属、Bacillus属、Bacteroides属、Bifidobacterium属、Bordetella属、Brevundimonas属、Brucella属、Burkholderia属、Campylobacter属、Candidatus Absconditabacteria(SR1)、Candidatus Saccharibacteria (TM7) 、Capnocytophaga属、Cardiobacterium属、Catonella属、Chlamydia属、Chlamydophila属、Chryseobacterium属、Citrobacter属、Clostridium属、Collinsella属、Corynebacterium属、Coxiella属、Cronobacter属、Cryptobacterium属、Curvibacter属、Dialister属、Eggerthella属、Eikenella属、Elizabethkingia、Enterobacter属、Enterococcus属、Escherichia属、Eubacterium属、Filifactor属、Finegoldia属、Fusobacterium属、Gardnerella属、Gemella属、Granulicatella属、Haemophilus属、Helicobacter属、Kingella属、Klebsiella属、Kocuria属、Lachnoanaerobaculum属、Lactobacillus属、Lactococcus属、Lautropia属、Legionella属、Leptotrichia属、Listeria属、Megasphaera属、Methanobrevibacter属、Microbacterium属、Micrococcus属、Mitsuokella属、Mobiluncus属、Mogibacterium属、Moraxella属、Morganella属、Mycobacterium属、Mycoplasma属、Neisseria属、Nocardia属、Olsenella属、Oribacterium属、Paracoccus属、Parascardovia属、Parvimonas属、Peptoniphilus属、Peptostreptococcus属、Porphyromonas属、Prevotella属、Propionibacterium(Cutibacterium)属、Proteus属、Providencia属、Pseudomonas属、Pseudopropionibacterium属、Pseudoramibacter属、Pyramidobacter属、Ralstonia属、Rothia属、Scardovia属、Schlegelella属、Sebaldella属、Selenomonas属、Serratia属、Simonsiella属、Slackia属、Sneathia属、Solobacterium属、Staphylococcus属、Stenotrophomonas属、Stomatobaculum属、Streptococcus属、Tannerella属、Treponema属、Ureaplasma属、Veillonella属およびFretibacterium属の細菌からなる群から選択される少なくとも２種の細菌のrRNA遺伝子であることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
標的核酸が、Abiotrophia defectiva、Achromobacter xylosoxidans、Acinetobacter baumannii、Acinetobacter calcoaceticus、Acinetobacter johnsonii、Acinetobacter junii、Acinetobacter lwoffii、Actinomyces dentalis、Actinomyces georgiae、Actinomyces gerencseriae、Actinomyces graevenitzii、Actinomyces israelii、Actinomyces johnsonii、Actinomyces meyeri、Actinomyces naeslundii、Actinomyces odontolyticus、Actinomyces oris、Actinomyces turicensis、Actinomyces viscosus、Aggregatibacter actinomycetemcomitans、Aggregatibacter aphrophilus、Alloprevotella rava、Alloprevotella tannerae、Alloscardovia omnicolens、Anaeroglobus geminatus、Atopobium parvulum、Bacillus cereus、Bacteroides fragilis、Bifidobacterium adolescentis、Bifidobacterium bifidum、Bifidobacterium breve、Bifidobacterium dentium、Bifidobacterium longum、Bordetella pertussis、Brucella abortus、Burkholderia cepacia、Campylobacter concisus、Campylobacter gracilis、Campylobacter rectus、Campylobacter showae、Capnocytophaga gingivalis、Capnocytophaga ochracea、Capnocytophaga sputigena、Cardiobacterium hominis、Catonella morbi、Chlamydia psittaci、Chlamydia trachomatis 、Chlamydia pneumoniae、Chryseobacterium indologenes、Citrobacter freundii、Clostridium perfringens、Collinsella aerofaciens、Corynebacterium diphtheriae、Corynebacterium durum、Corynebacterium matruchotii、Corynebacterium pseudodiphtheriticum、Corynebacterium pseudotuberculosis、Corynebacterium renale、Corynebacterium striatum、Corynebacterium xerosis、Coxiella burnetii 、Cryptobacterium curtum、Curvibacter delicatus、Dialister invisus、Dialister micraerophilus、Dialister pneumosintes、Eggerthella lenta、Eikenella corrodens、Elizabethkingia meningoseptica、Enterobacter aerogenes、Enterobacter cloacae、Enterococcus avium、Enterococcus faecalis、Enterococcus faecium、Escherichia coli、Eubacterium brachy、Eubacterium infirmum、Eubacterium limosum、Eubacterium minutum、Eubacterium nodatum 、Eubacterium saphenum、Eubacterium sulci、Filifactor alocis、Fretibacterium fastidiosum 、Fusobacterium necrophorum、Fusobacterium nucleatum、Fusobacterium nucleatum subsp. animalis、Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum、Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum、Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii、Fusobacterium periodonticum、Fusobacterium simiae、Gemella haemolysans、Gemella morbillorum、Gemella sanguinis、Granulicatella adiacens、Granulicatella balaenopterae、Granulicatella elegans、Haemophilus ducreyi、Haemophilus haemolyticus、Haemophilus influenzae、Haemophilus parainfluenzae、Helicobacter pylori、Kingella denitrificans、Kingella kingae、Kingella oralis、Klebsiella oxytoca、Klebsiella pneumoniae、Lachnoanaerobaculum orale、Lachnoanaerobaculum saburreum、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus brevis、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus casei、Lactobacillus crispatus、Lactobacillus delbrueckii、Lactobacillus fermentum、Lactobacillus gasseri、Lactobacillus paracasei、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus reuteri、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus salivarius、Lautropia mirabilis、Legionella pneumophila、Leptotrichia buccalis 、Leptotrichia sp. OT 215、Leptotrichia sp. OT 417、Leptotrichia sp. OT 462、Listeria monocytogenes、Megasphaera micronuciformis、Micrococcus luteus、Mogibacterium diversum、Mogibacterium neglectum、Mogibacterium pumilum、Mogibacterium timidum、Mogibacterium vescum、Moraxella catarrhalis、Moraxella lacunata、Morganella morganii、Mycobacterium abscessus、Mycobacterium avium、Mycobacterium chelonae、Mycobacterium fortuitum、Mycobacterium gordonae、Mycobacterium haemophilum、Mycobacterium intracellulare、Mycobacterium kansasii、Mycobacterium marinum、Mycobacterium szulgai、Mycobacterium tuberculosis、Mycobacterium xenopi、Mycoplasma genitalium、Mycoplasma hominis、Mycoplasma orale、Mycoplasma pneumoniae、Mycoplasma salivarium、Neisseria elongata、Neisseria flava、Neisseria flavescens、Neisseria gonorrhoeae、Neisseria meningitidis、Neisseria mucosa、Neisseria sicca、Neisseria subflava、Nocardia asteroides、Nocardia brasilliensis、Nocardia farcinica、Nocardia nova、Olsenella uli、Oribacterium asaccharolyticum、Oribacterium parvum、Parascardovia denticolens、Parvimonas micra、Peptostreptococcus stomatis、Porphyromonas catoniae、Porphyromonas endodontalis、Porphyromonas gingivalis、Porphyromonas pasteri、Prevotella dentalis、Prevotella denticola、Prevotella histicola、Prevotella intermedia、Prevotella loescheii、Prevotella melaninogenica、Prevotella nigrescens、Prevotella oralis、Prevotella oris、Prevotella pallens、Prevotella salivae、Prevotella shahii、Prevotella veroralis、Propionibacterium acnes（Cutibacterium acnes）、Propionibacterium granulosum(Cutibacterium granulosum)、Propionibacterium propionicus(Pseudopropionibacterium propionicum)、Proteus mirabilis、Proteus vulgaris、Providencia stuartii、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas putida、Pseudoramibacter alactolyticus、Ralstonia pickettii、Rothia aeria、Rothia dentocariosa、Rothia mucilaginosa、Scardovia inopinata、Schlegelella aquatica、Sebaldella termitidis、Selenomonas flueggei、Selenomonas noxia、Selenomonas sp. OT 478、Selenomonas sputigena、Serratia marcescens、Simonsiella muelleri、Slackia exigua、Solobacterium moorei、SR1 sp. OT 345、Staphylococcus aureus、Staphylococcus epidermidis、Staphylococcus saccharolyticus、Stenotrophomonas maltophilia、Streptococcus agalactiae、Streptococcus anginosus、Streptococcus australis、Streptococcus constellatus、Streptococcus cristatus、Streptococcus dentisani、Streptococcus gordonii、Streptococcus infantis、Streptococcus intermedius、Streptococcus milleri、Streptococcus mitis、Streptococcus mutans、Streptococcus oralis、Streptococcus parasanguinis、Streptococcus pneumoniae、Streptococcus pyogenes、Streptococcus salivarius、Streptococcus sanguinis、Streptococcus sobrinus、Streptococcus tigurinus、Streptococcus vestibularis、Tannerella forsythia、Treponema denticola、Treponema lecithinolyticum、Treponema medium、Treponema pallidum、Treponema socranskii、Treponema vincentii、Ureaplasma urealyticum、Veillonella atypica、Veillonella dispar、Veillonella parvulaおよびVeillonella rogosaeからなる群から選択される少なくとも２種の細菌のrRNA遺伝子であることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
工程(c)が以下である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
(c1) 標的核酸の一部または全部および前記特定の核酸群並びにコントロール核酸を用いて、増幅前の量と増幅後の量の指標との関係について、検量線を作成する工程、および
(c2) 試料から増幅された全ての標的核酸および前記特定の核酸群の合計の量の指標並びに増幅されたコントロール核酸の量の指標を、(c1)の工程で作成した検量線に当てはめ、試料中の全ての標的核酸および前記特定の核酸群の合計の量を算出する工程
【請求項１２】
工程(c1)で用いられる核酸が、標的核酸の一部および前記特定の核酸群である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
検量線が、増幅後のコントロール核酸の量の指標に対する標的核酸の一部または全部および前記特定の核酸群の合計の量の指標の比と、増幅前のコントロール核酸の量に対する標的核酸の一部または全部および前記特定の核酸群の合計の量の比との関係を表すものであることを特徴とする、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
工程（c）および（d）における、増幅された各標的核酸の量の指標、増幅された全ての標的核酸および前記特定の核酸群の合計の量の指標並びに増幅されたコントロール核酸の量の指標が、それぞれDNAチップに搭載した以下のプローブ(x)〜(z)とのハイブリダイゼーションで得られるシグナル強度である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
(x) 2種以上の標的核酸のそれぞれの増幅産物とハイブリダイズするプローブ
(y) 試料中の全ての標的核酸および前記特定の核酸群の両方の増幅産物に共通してハイブリダイズするプローブ
(z) コントロール核酸の増幅産物とハイブリダイズするプローブ
【請求項１５】
工程(d)が以下である、請求項１４に記載の方法。
(d1) 2種以上の標的核酸のそれぞれ（各標的核酸）について、DNAチップとのハイブリダイゼーションを行い、各標的核酸にハイブリダイズするプローブ(x)とプローブ(y)とのシグナル強度の関係式を算出する工程、
(d2) 試料から増幅された産物をDNAチップにハイブリダイズさせて得られるプローブ(x)のシグナル強度を、工程(d1)で算出された関係式から、各標的核酸にハイブリダイズするプローブ(y)のシグナル強度に相当する値に換算する工程、
(d3) 試料から増幅された産物をDNAチップにハイブリダイズさせて得られるプローブ(y)のシグナル強度に対する、工程(d2)で算出されたプローブ(y)のシグナル強度に相当する値の割合を算出する工程、並びに
(d4) 工程(c)で算出された、試料中の全ての標的核酸および前記特定の核酸群の合計の量に工程(d3)で算出された占有率を乗じて、試料中の各標的核酸の絶対量を算出する工程
【請求項１６】
工程（b）が、増幅後の核酸を、DNAチップに搭載されたプローブとハイブリダイゼーションする片鎖に富化する工程を含む、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
片鎖に富化する工程が非対称PCRまたはλエキソヌクレアーゼ処理によるものである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
プローブ(x)が、以下のいずれかの配列である、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。
（ア）配列番号３〜１９１に示される塩基配列からなる群から選ばれる配列、
（イ）（ア）の相補配列、または
（ウ）（ア）もしくは（イ）の配列と実質的に同一の配列
【請求項１９】
DNAチップが繊維型DNAチップである、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
試料中の全ての標的核酸および前記特定の核酸群並びにコントロール核酸をPCR法で共増幅するための1対あるいは2対のプライマーセット、コントロール核酸、並びに以下のプローブ(x)〜(z)を搭載したDNAチップを含むキット。
(x) 2種以上の標的核酸のそれぞれの増幅産物とハイブリダイズするプローブ
(y) 試料中の全ての標的核酸および前記特定の核酸群の両方の増幅産物に共通してハイブリダイズするプローブ
(z) コントロール核酸の増幅産物とハイブリダイズするプローブ
【請求項２１】
プローブ(x)が以下のいずれかの配列である、請求項２０に記載のキット。
（ア）配列番号３〜１９１に示される塩基配列からなる群から選ばれる配列、
（イ）（ア）の相補配列、または
（ウ）（ア）もしくは（イ）の配列と実質的に同一の配列
【請求項２２】
以下のプローブ(x)〜(z)：
(x) 2種以上の標的核酸のそれぞれの増幅産物とハイブリダイズするプローブ
(y) 試料中の全ての標的核酸および前記特定の核酸群の両方の増幅産物に共通してハイブリダイズするプローブ
(z) コントロール核酸の増幅産物とハイブリダイズするプローブ
を搭載し、プローブ(x)が以下のいずれかの配列である、DNAチップ。
（カ）配列番号４３〜１９１に示される塩基配列からなる群から選ばれる配列、
（キ）（カ）の相補配列、または
（ク）（カ）もしくは（キ）の配列と実質的に同一の配列
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の定量方法およびそれを利用した解析キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
試料中の多種類の核酸を同時に定量することが必要な分野は多くあり、その一つとして菌叢解析が挙げられる。
近年ヒトの健康と、口腔内細菌叢や腸内細菌叢との関係が明らかになっており、検査用途に簡便に菌叢を解析する手法が求められている。
細菌叢を評価するツールとして、伝統的に顕微鏡法や培養法が用いられてきたが、判定や定量が可能な菌種が限られるという問題がある。これらに代わるものとして、核酸の配列の特異性に基づく分子生物学的な手法が近年用いられている。分子生物学的な手法として、定量PCR（qPCR）、競合的PCR、DNAチップ、次世代シークエンサー（NGS）が知られている。
汎用されるqPCR法は高感度に定量可能であるが、作業が煩雑であり、競合的PCRと同様に検査可能な項目数が限定される。また、DNAチップはハイスループットであるが、これを用いた定量は相対定量である。NGSは作業が複雑で高価であるため、日常的な診断を目的として使用するには、まだ課題を抱えている。【０００３】
現在のところ、DNAチップを用いた菌叢解析では絶対定量を行うことはできない。DNAチップやNGSで菌叢解析を行う場合、PCR等の手法によって標的核酸を含む核酸群を増幅する必要がある。ここで得られる測定結果は、増幅により、複数の標的間の相対的な関係を示す結果になる。
核酸の絶対量を簡便に決定する手法として、競合的PCRがある。競合的PCRは、増幅前に、濃度既知でかつ標的と共増幅されるコントロール核酸を添加することで、増幅後の量の指標から増幅前の絶対量を決定する方法である。しかし、この競合的PCRは定量対象となる核酸は一種のみであり、複数種の核酸を同時に定量することは困難である。
また、菌叢解析において、濃度既知のコントロール核酸を増幅前に添加し、その存在量を検討する手法はすでに知られている(特許文献１、非特許文献１)。例えば、非特許文献１では、コントロール核酸を加え、PCR増幅後にDNAチップにより、サンプル間の相対的な量比を比較している。DNAチップではプローブごとにハイブリダイゼーションの効率が異なり、異なるプローブ間のシグナルが比較できないため、この方法では絶対量の決定はできていない。
一方、特許文献１には、NGSでの絶対定量を目的に、増幅前に複数のコントロール核酸を添加し、これら複数のコントロール核酸のみで検量線を作成、各標的核酸の量を決定する方法が開示されている。この方法はコントロール核酸と標的核酸の増幅効率が同一であることが前提であり、特許文献１では増幅効率が同一になるように人工的にデザインした配列を提案している。この方法は高価なNGSを使用し、さらに複数のコントロール核酸を使用する煩雑な方法である。加えて、試料中の標的核酸および複数のコントロール核酸間で、これらの増幅効率を同一にするという極めて困難な課題を抱えている。
以上のように、複数種の標的核酸の絶対量を同時に定量することが可能で且つ簡便な方法は知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開2015-204813号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Treimo, J. et al. J Appl Microbiol, 100, 985-998, 2006
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで本発明は、試料中の2種以上の標的核酸の絶対量を同時に決定することができる簡便な手段を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、コントロール核酸を用いて、試料中の全ての標的核酸および標的核酸と一括して増幅される特定の核酸群の合計の絶対定量およびその内訳を算出する工程によって、試料中の2種以上の標的核酸のそれぞれについて絶対定量が可能であること見出し、本発明を完成するに至った。【０００８】
すなわち本発明は、以下のとおりである。
［１］試料中の2種以上の標的核酸の絶対量を決定する方法であって、
(a) 試料と既知量のコントロール核酸とを混合する工程、
(b) 試料中の全ての標的核酸および標的核酸と一括して増幅される特定の核酸群並びにコントロール核酸を共増幅する工程、
(c) 増幅された全ての標的核酸および前記特定の核酸群の合計の量の指標並びに増幅されたコントロール核酸の量の指標から、試料中の全ての標的核酸および前記特定の核酸群の合計の量を決定する工程、並びに、
(d) 増幅された全ての標的核酸および前記特定の核酸群の合計の量の指標と増幅された各標的核酸の量の指標とから算出される、全ての標的核酸および前記特定の核酸群の合計中の各標的核酸の占有率から、試料中の各標的核酸の絶対量を算出する工程、
を含む、前記方法。【０００９】
［２］コントロール核酸が、増幅に必要な塩基配列と一部または全部の塩基がランダムに組み合わされた塩基配列とで構成された人工配列であることを特徴とする、上記［１］に記載の方法。
［３］試料中の全ての標的核酸および前記特定の核酸群の合計並びにコントロール核酸の共増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法、Loop-Mediated Isothermal Amplification（LAMP）法、In vitro転写からなる群から選択される手法によって行われる、上記［１］又は［２］に記載の方法。
［４］試料中の全ての標的核酸および前記特定の核酸群の合計並びにコントロール核酸の共増幅が、PCR法によって行われる、上記［３］に記載の方法。
［５］試料が、飲食品、生体試料、環境試料および工業プロセスからの試料からなる群から選択される少なくとも一種であることを特徴とする、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。【００１０】
［６］試料が、活性汚泥、土壌、河川水、海水、温泉水、飲料水、加工食品、発酵槽培養物、並びに、真核生物から採取された組織、細胞および体液からなる群から選択される少なくとも一種であることを特徴とする、上記［５］に記載の方法。
［７］生体試料が、哺乳動物から採取された、唾液、プラーク、歯肉溝浸出液(GCF)、糞便および皮膚由来試料からなる群から選択される少なくとも一種であることを特徴とする、上記［５］に記載の方法。
［８］標的核酸が細菌のリボソームRNA（rRNA）遺伝子であることを特徴とする、上記［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。【００１１】
［９］標的核酸が、Abiotrophia属、Achromobacter属、Acinetobacter属、Actinomyces属、Aerococcus属、Aggregatibacter属、Alloprevotella属、Alloscardovia属、Anaerococcus属、Anaeroglobus属、Arcanobacterium属、Atopobium属、Bacillus属、Bacteroides属、Bifidobacterium属、Bordetella属、Brevundimonas属、Brucella属、Burkholderia属、Campylobacter属、Candidatus Absconditabacteria(SR1)、Candidatus Saccharibacteria (TM7) 、Capnocytophaga属、Cardiobacterium属、Catonella属、Chlamydia属、Chlamydophila属、Chryseobacterium属、Citrobacter属、Clostridium属、Collinsella属、Corynebacterium属、Coxiella属、Cronobacter属、Cryptobacterium属、Curvibacter属、Dialister属、Eggerthella属、Eikenella属、Elizabethkingia、Enterobacter属、Enterococcus属、Escherichia属、Eubacterium属、Filifactor属、Finegoldia属、Fusobacterium属、Gardnerella属、Gemella属、Granulicatella属、Haemophilus属、Helicobacter属、Kingella属、Klebsiella属、Kocuria属、Lachnoanaerobaculum属、Lactobacillus属、Lactococcus属、Lautropia属、Legionella属、Leptotrichia属、Listeria属、Megasphaera属、Methanobrevibacter属、Microbacterium属、Micrococcus属、Mitsuokella属、Mobiluncus属、Mogibacterium属、Moraxella属、Morganella属、Mycobacterium属、Mycoplasma属、Neisseria属、Nocardia属、Olsenella属、Oribacterium属、Paracoccus属、Parascardovia属、Parvimonas属、Peptoniphilus属、Peptostreptococcus属、Porphyromonas属、Prevotella属、Propionibacterium(Cutibacterium)属、Proteus属、Providencia属、Pseudomonas属、Pseudopropionibacterium属、Pseudoramibacter属、Pyramidobacter属、Ralstonia属、Rothia属、Scardovia属、Schlegelella属、Sebaldella属、Selenomonas属、Serratia属、Simonsiella属、Slackia属、Sneathia属、Solobacterium属、Staphylococcus属、Stenotrophomonas属、Stomatobaculum属、Streptococcus属、Tannerella属、Treponema属、Ureaplasma属、Veillonella属およびFretibacterium属の細菌からなる群から選択される少なくとも２種の細菌のrRNA遺伝子であることを特徴とする、上記［８］に記載の方法。【００１２】
［１０］標的核酸が、Abiotrophia defectiva、Achromobacter xylosoxidans、Acinetobacter baumannii、Acinetobacter calcoaceticus、Acinetobacter johnsonii、Acinetobacter junii、Acinetobacter lwoffii、Actinomyces dentalis、Actinomyces georgiae、Actinomyces gerencseriae、Actinomyces graevenitzii、Actinomyces israelii、Actinomyces johnsonii、Actinomyces meyeri、Actinomyces naeslundii、Actinomyces odontolyticus、Actinomyces oris、Actinomyces turicensis、Actinomyces viscosus、Aggregatibacter actinomycetemcomitans、Aggregatibacter aphrophilus、Alloprevotella rava、Alloprevotella tannerae、Alloscardovia omnicolens、Anaeroglobus geminatus、Atopobium parvulum、Bacillus cereus、Bacteroides fragilis、Bifidobacterium adolescentis、Bifidobacterium bifidum、Bifidobacterium breve、Bifidobacterium dentium、Bifidobacterium longum、Bordetella pertussis、Brucella abortus、Burkholderia cepacia、Campylobacter concisus、Campylobacter gracilis、Campylobacter rectus、Campylobacter showae、Capnocytophaga gingivalis、Capnocytophaga ochracea、Capnocytophaga sputigena、Cardiobacterium hominis、Catonella morbi、Chlamydia psittaci、Chlamydia trachomatis 、Chlamydia pneumoniae、Chryseobacterium indologenes、Citrobacter freundii、Clostridium perfringens、Collinsella aerofaciens、Corynebacterium diphtheriae、Corynebacterium durum、Corynebacterium matruchotii、Corynebacterium pseudodiphtheriticum、Corynebacterium pseudotuberculosis、Corynebacterium renale、Corynebacterium striatum、Corynebacterium xerosis、Coxiella burnetii 、Cryptobacterium curtum、Curvibacter delicatus、Dialister invisus、Dialister micraerophilus、Dialister pneumosintes、Eggerthella lenta、Eikenella corrodens、Elizabethkingia meningoseptica、Enterobacter aerogenes、Enterobacter cloacae、Enterococcus avium、Enterococcus faecalis、Enterococcus faecium、Escherichia coli、Eubacterium brachy、Eubacterium infirmum、Eubacterium limosum、Eubacterium minutum、Eubacterium nodatum 、Eubacterium saphenum、Eubacterium sulci、Filifactor alocis、Fretibacterium fastidiosum 、Fusobacterium necrophorum、Fusobacterium nucleatum、Fusobacterium nucleatum subsp. animalis、Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum、Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum、Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii、Fusobacterium periodonticum、Fusobacterium simiae、Gemella haemolysans、Gemella morbillorum、Gemella sanguinis、Granulicatella adiacens、Granulicatella balaenopterae、Granulicatella elegans、Haemophilus ducreyi、Haemophilus haemolyticus、Haemophilus influenzae、Haemophilus parainfluenzae、Helicobacter pylori、Kingella denitrificans、Kingella kingae、Kingella oralis、Klebsiella oxytoca、Klebsiella pneumoniae、Lachnoanaerobaculum orale、Lachnoanaerobaculum saburreum、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus brevis、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus casei、Lactobacillus crispatus、Lactobacillus delbrueckii、Lactobacillus fermentum、Lactobacillus gasseri、Lactobacillus paracasei、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus reuteri、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus salivarius、Lautropia mirabilis、Legionella pneumophila、Leptotrichia buccalis 、Leptotrichia sp. OT 215、Leptotrichia sp. OT 417、Leptotrichia sp. OT 462、Listeria monocytogenes、Megasphaera micronuciformis、Micrococcus luteus、Mogibacterium diversum、Mogibacterium neglectum、Mogibacterium pumilum、Mogibacterium timidum、Mogibacterium vescum、Moraxella catarrhalis、Moraxella lacunata、Morganella morganii、Mycobacterium abscessus、Mycobacterium avium、Mycobacterium chelonae、Mycobacterium fortuitum、Mycobacterium gordonae、Mycobacterium haemophilum、Mycobacterium intracellulare、Mycobacterium kansasii、Mycobacterium marinum、Mycobacterium szulgai、Mycobacterium tuberculosis、Mycobacterium xenopi、Mycoplasma genitalium、Mycoplasma hominis、Mycoplasma orale、Mycoplasma pneumoniae、Mycoplasma salivarium、Neisseria elongata、Neisseria flava、Neisseria flavescens、Neisseria gonorrhoeae、Neisseria meningitidis、Neisseria mucosa、Neisseria sicca、Neisseria subflava、Nocardia asteroides、Nocardia brasilliensis、Nocardia farcinica、Nocardia nova、Olsenella uli、Oribacterium asaccharolyticum、Oribacterium parvum、Parascardovia denticolens、Parvimonas micra、Peptostreptococcus stomatis、Porphyromonas catoniae、Porphyromonas endodontalis、Porphyromonas gingivalis、Porphyromonas pasteri、Prevotella dentalis、Prevotella denticola、Prevotella histicola、Prevotella intermedia、Prevotella loescheii、Prevotella melaninogenica、Prevotella nigrescens、Prevotella oralis、Prevotella oris、Prevotella pallens、Prevotella salivae、Prevotella shahii、Prevotella veroralis、Propionibacterium acnes（Cutibacterium acnes）、Propionibacterium granulosum(Cutibacterium granulosum)、Propionibacterium propionicus(Pseudopropionibacterium propionicum)、Proteus mirabilis、Proteus vulgaris、Providencia stuartii、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas putida、Pseudoramibacter alactolyticus、Ralstonia pickettii、Rothia aeria、Rothia dentocariosa、Rothia mucilaginosa、Scardovia inopinata、Schlegelella aquatica、Sebaldella termitidis、Selenomonas flueggei、Selenomonas noxia、Selenomonas sp. OT 478、Selenomonas sputigena、Serratia marcescens、Simonsiella muelleri、Slackia exigua、Solobacterium moorei、SR1 sp. OT 345、Staphylococcus aureus、Staphylococcus epidermidis、Staphylococcus saccharolyticus、Stenotrophomonas maltophilia、Streptococcus agalactiae、Streptococcus anginosus、Streptococcus australis、Streptococcus constellatus、Streptococcus cristatus、Streptococcus dentisani、Streptococcus gordonii、Streptococcus infantis、Streptococcus intermedius、Streptococcus milleri、Streptococcus mitis、Streptococcus mutans、Streptococcus oralis、Streptococcus parasanguinis、Streptococcus pneumoniae、Streptococcus pyogenes、Streptococcus salivarius、Streptococcus sanguinis、Streptococcus sobrinus、Streptococcus tigurinus、Streptococcus vestibularis、Tannerella forsythia、Treponema denticola、Treponema lecithinolyticum、Treponema medium、Treponema pallidum、Treponema socranskii、Treponema vincentii、Ureaplasma urealyticum、Veillonella atypica、Veillonella dispar、Veillonella parvulaおよびVeillonella rogosaeからなる群から選択される少なくとも２種の細菌のrRNA遺伝子であることを特徴とする、上記［８］に記載の方法。【００１３】
［１１］工程(c)が以下である、上記［１］〜［１０］のいずれかに記載の方法。
(c1) 標的核酸の一部または全部および前記特定の核酸群並びにコントロール核酸を用いて、増幅前の量と増幅後の量の指標との関係について、検量線を作成する工程、および
(c2) 試料から増幅された全ての標的核酸および前記特定の核酸群の合計の量の指標並びに増幅されたコントロール核酸の量の指標を、(c1)の工程で作成した検量線に当てはめ、試料中の全ての標的核酸および前記特定の核酸群の合計の量を算出する工程
［１２］工程(c1)で用いられる核酸が、標的核酸の一部および前記特定の核酸群である、上記［１１］に記載の方法。
［１３］検量線が、増幅後のコントロール核酸の量の指標に対する標的核酸の一部または全部および前記特定の核酸群の合計の量の指標の比と、増幅前のコントロール核酸の量に対する標的核酸の一部または全部および前記特定の核酸群の合計の量の比との関係を表すものであることを特徴とする、上記［１１］又は［１２］に記載の方法。【００１４】
［１４］工程（c）および（d）における、増幅された各標的核酸の量の指標、増幅された全ての標的核酸および前記特定の核酸群の合計の量の指標並びに増幅されたコントロール核酸の量の指標が、それぞれDNAチップに搭載した以下のプローブ(x)〜(z)とのハイブリダイゼーションで得られるシグナル強度である、上記［１］〜［１３］のいずれかに記載の方法。
(x) 2種以上の標的核酸のそれぞれの増幅産物とハイブリダイズするプローブ
(y) 試料中の全ての標的核酸および前記特定の核酸群の両方の増幅産物に共通してハイブリダイズするプローブ
(z) コントロール核酸の増幅産物とハイブリダイズするプローブ【００１５】
［１５］工程(d)が以下である、上記［１４］に記載の方法。
(d1) 試料中の全ての標的核酸のそれぞれ（各標的核酸）について、DNAチップとのハイブリダイゼーションを行い、各標的核酸にハイブリダイズするプローブ(x)とプローブ(y)とのシグナル強度の関係式を算出する工程、
(d2) 試料から増幅された産物をDNAチップにハイブリダイズさせて得られるプローブ(x)のシグナル強度を、工程(d1)で算出された関係式から、各標的核酸にハイブリダイズするプローブ(y)のシグナル強度に相当する値に換算する工程、
(d3) 試料から増幅された産物をDNAチップにハイブリダイズさせて得られるプローブ(y)のシグナル強度に対する、工程(d2)で算出されたプローブ(y)のシグナル強度に相当する値の割合を算出する工程、並びに
(d4) 工程(c)で算出された、試料中の全ての標的核酸および前記特定の核酸群の合計の量に工程(d3)で算出された占有率を乗じて、試料中の各標的核酸の絶対量を算出する工程【００１６】
［１６］工程（b）が、増幅後の核酸を、DNAチップに搭載されたプローブとハイブリダイゼーションする片鎖に富化する工程を含む、上記［１４］又は［１５］に記載の方法。
［１７］片鎖に富化する工程が非対称PCRまたはλエキソヌクレアーゼ処理によるものである、上記［１６］に記載の方法。
［１８］プローブ(x)が、以下のいずれかの配列である、上記［１４］〜［１７］のいずれかに記載の方法。
（ア）配列番号３〜１９１に示される塩基配列からなる群から選ばれる配列、
（イ）（ア）の相補配列、または
（ウ）（ア）もしくは（イ）の配列と実質的に同一の配列
［１９］DNAチップが繊維型DNAチップである、上記［１４］〜［１８］のいずれかに記載の方法。【００１７】
［２０］試料中の全ての標的核酸および前記特定の核酸群並びにコントロール核酸をPCR法で共増幅するための1対あるいは2対のプライマーセット、コントロール核酸、並びに以下のプローブ(x)〜(z)を搭載したDNAチップを含むキット。
(x) 2種以上の標的核酸のそれぞれの増幅産物とハイブリダイズするプローブ
(y) 試料中の全ての標的核酸および前記特定の核酸群の両方の増幅産物に共通してハイブリダイズするプローブ
(z) コントロール核酸の増幅産物とハイブリダイズするプローブ
［２１］プローブ(x)が以下のいずれかの配列である、上記［２０］に記載のキット。
（ア）配列番号３〜１９１に示される塩基配列からなる群から選ばれる配列、
（イ）（ア）の相補配列、または
（ウ）（ア）もしくは（イ）の配列と実質的に同一の配列
［２２］以下のプローブ(x)〜(z)：
(x) 2種以上の標的核酸のそれぞれの増幅産物とハイブリダイズするプローブ
(y) 試料中の全ての標的核酸および前記特定の核酸群の両方の増幅産物に共通してハイブリダイズするプローブ
(z) コントロール核酸の増幅産物とハイブリダイズするプローブ
を搭載し、プローブ(x)が以下のいずれかの配列である、DNAチップ。
（カ）配列番号４３〜１９１に示される塩基配列からなる群から選ばれる配列、
（キ）（カ）の相補配列、または
（ク）（カ）もしくは（キ）の配列と実質的に同一の配列
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、簡便な方法で試料中の2種以上の標的核酸の絶対量を同時に決定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】検量用核酸とコントロール核酸との、増幅前の量比と増幅後の量の指標の比との関係を示す図である。
【図２】プローブ間のシグナル強度の関係を示す図である。
【図３】検量用核酸とコントロール核酸との、増幅前の量比と増幅後の量の指標の比との関係を示す図である。
【図４Ａ】本発明の実施形態の１例をもって原理を示す模式図であり、工程(a)を示す図である。
【図４Ｂ】本発明の実施形態の１例をもって原理を示す模式図であり、工程(b)を示す図である。
【図４Ｃ】本発明の実施形態の１例をもって原理を示す模式図であり、工程(c)を示す図である。
【図４Ｄ】本発明の実施形態の１例をもって原理を示す模式図であり、工程(d)を示す図である。
【図５】検量用核酸とコントロール核酸との、増幅前の量比と増幅後の量の指標の比との関係を示す図である。
【図６】プローブ間のシグナル強度の関係を示す図である。
【図７】検量用核酸とコントロール核酸との、増幅前の量比と増幅後の量の指標の比との関係を示す図である。
【図８】プローブ間のシグナル強度の関係を示す図である。
【図９】検量用核酸とコントロール核酸との、増幅前の量比と増幅後の量の指標の比との関係を示す図である。
【図１０】プローブ間のシグナル強度の関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。また、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる2018年5月25日に出願された日本国特許出願（特願2018-100475号）及び2019年2月18日に出願された日本国特許出願（特願2019-026519号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
【００２１】
１．標的核酸の絶対量の決定
（１）標的核酸
本発明において、標的核酸とは、定量対象となる核酸である。例えば、測定対象である細菌のゲノムDNA、測定対象ではない細菌のゲノムDNA、及びその他のDNAを含む試料において、標的核酸は測定対象である細菌由来の核酸である。本発明においては、仮に、測定対象ではない細菌由来の核酸の一部が標的核酸と一括して増幅された場合であっても、当該増幅された核酸の一部は標的核酸ではない。当該「標的核酸と一括して増幅される特定の核酸群」については後述する。
細菌叢を評価する場合、標的核酸としては、測定対象となる複数の細菌のゲノムDNA間で保存されているコンセンサス配列を含む核酸を用いることができる。また、標的核酸としては、測定対象となる細菌のそれぞれに特異的な塩基配列を含む核酸を用いることができる。
標的核酸が複数の細菌のコンセンサス配列を含むことにより、一種類のプローブで複数種類の細菌の標的核酸（全ての標的核酸）を捕捉することができる。また、標的核酸が測定対象となる細菌のそれぞれに特異的な塩基配列を含むことにより、目的の細菌の標的核酸（各標的核酸）を特異的に検出することができる。
標的核酸は、1分子の核酸である場合もあるし、1分子の核酸中に部分配列として複数存在する場合もある。例えば細菌の16SrRNA遺伝子（例えば16SrRNAをコードするDNA）は1分子のゲノムDNA中に複数コピー存在することがあるが、これを標的核酸とする場合は各コピーそれぞれを1分子の標的核酸とみなすことができる。核酸はDNA及びRNAのいずれでもよい。
さらに、本発明において、標的核酸には量の指標を得る際に1種類とみなすことのできる核酸の集合体を含む。具体的には、同一の塩基配列部分を含む核酸の集合を1種類とみなすことができる。例えばDNAチップを用いる場合、部分的に共通の配列を有する核酸の集合について、その共通配列にハイブリダイズするプローブのシグナル強度として量の指標を得ることで、一つの標的核酸とみなすことができる。これは例えば具体的には、試料中のStreptococcus属の細菌の16SrRNA遺伝子を標的核酸とし、その共通配列に対応するプローブから量の指標を得る場合などが例示できる。
【００２２】
標的核酸としては、例えばゲノムDNA、ゲノムDNA中の目的の遺伝子、mRNAなどが挙げられる。より具体的には、細菌のゲノムDNAであることが好ましく、より好ましくは細菌のゲノムDNA中のrRNA遺伝子であり、特に好ましくは細菌のゲノムDNA中の16SrRNA遺伝子である。
口腔細菌叢の評価を行う場合は、例えば、Abiotrophia属、Achromobacter属、Acinetobacter属、Actinomyces属、Aerococcus属、Aggregatibacter属、Alloprevotella属、Alloscardovia属、Anaerococcus属、Anaeroglobus属、Arcanobacterium属、Atopobium属、Bacillus属、Bacteroides属、Bifidobacterium属、Bordetella属、Brevundimonas属、Brucella属、Burkholderia属、Campylobacter属、Candidatus Absconditabacteria(SR1)、Candidatus Saccharibacteria (TM7) 、Capnocytophaga属、Cardiobacterium属、Catonella属、Chlamydia属、Chlamydophila属、Chryseobacterium属、Citrobacter属、Clostridium属、Collinsella属、Corynebacterium属、Coxiella属、Cronobacter属、Cryptobacterium属、Curvibacter属、Dialister属、Eggerthella属、Eikenella属、Elizabethkingia、Enterobacter属、Enterococcus属、Escherichia属、Eubacterium属、Filifactor属、Finegoldia属、Fusobacterium属、Gardnerella属、Gemella属、Granulicatella属、Haemophilus属、Helicobacter属、Kingella属、Klebsiella属、Kocuria属、Lachnoanaerobaculum属、Lactobacillus属、Lactococcus属、Lautropia属、Legionella属、Leptotrichia属、Listeria属、Megasphaera属、Methanobrevibacter属、Microbacterium属、Micrococcus属、Mitsuokella属、Mobiluncus属、Mogibacterium属、Moraxella属、Morganella属、Mycobacterium属、Mycoplasma属、Neisseria属、Nocardia属、Olsenella属、Oribacterium属、Paracoccus属、Parascardovia属、Parvimonas属、Peptoniphilus属、Peptostreptococcus属、Porphyromonas属、Prevotella属、Propionibacterium(Cutibacterium)属、Proteus属、Providencia属、Pseudomonas属、Pseudopropionibacterium属、Pseudoramibacter属、Pyramidobacter属、Ralstonia属、Rothia属、Scardovia属、Schlegelella属、Sebaldella属、Selenomonas属、Serratia属、Simonsiella属、Slackia属、Sneathia属、Solobacterium属、Staphylococcus属、Stenotrophomonas属、Stomatobaculum属、Streptococcus属、Tannerella属、Treponema属、Ureaplasma属、Veillonella属およびFretibacterium属の細菌のrRNA遺伝子などを標的核酸とすることができ、より好ましくは Actinomyces属、Aggregatibacter属、Alloprevotella属、Campylobacter属、Candidatus Absconditabacteria(SR1)、Capnocytophaga属、Corynebacterium属、Eikenella属、Eubacterium属、Filifactor属、Fusobacterium属、Gemella属、Granulicatella属、Haemophilus属、Helicobacter属、Lactobacillus属、Leptotrichia属、Megasphaera属、Neisseria属、Parvimonas属、Peptostreptococcus属、Porphyromonas属、Prevotella属、Rothia属、Selenomonas属、Solobacterium属、Streptococcus属、Tannerella属、Treponema属、Veillonella属の細菌のrRNA遺伝子などを標的核酸とすることができるが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
さらに、標的核酸としては、ヒトの健康に関連していると考えられる、Abiotrophia defectiva、Achromobacter xylosoxidans、Acinetobacter baumannii、Acinetobacter calcoaceticus、Acinetobacter johnsonii、Acinetobacter junii、Acinetobacter lwoffii、Actinomyces dentalis、Actinomyces georgiae、Actinomyces gerencseriae、Actinomyces graevenitzii、Actinomyces israelii、Actinomyces johnsonii、Actinomyces meyeri、Actinomyces naeslundii、Actinomyces odontolyticus、Actinomyces oris、Actinomyces turicensis、Actinomyces viscosus、Aggregatibacter actinomycetemcomitans、Aggregatibacter aphrophilus、Alloprevotella rava、Alloprevotella tannerae、Alloscardovia omnicolens、Anaeroglobus geminatus、Atopobium parvulum、Bacillus cereus、Bacteroides fragilis、Bifidobacterium adolescentis、Bifidobacterium bifidum、Bifidobacterium breve、Bifidobacterium dentium、Bifidobacterium longum、Bordetella pertussis、Brucella abortus、Burkholderia cepacia、Campylobacter concisus、Campylobacter gracilis、Campylobacter rectus、Campylobacter showae、Capnocytophaga gingivalis、Capnocytophaga ochracea、Capnocytophaga sputigena、Cardiobacterium hominis、Catonella morbi、Chlamydia psittaci、Chlamydia trachomatis 、Chlamydia pneumoniae、Chryseobacterium indologenes、Citrobacter freundii、Clostridium perfringens、Collinsella aerofaciens、Corynebacterium diphtheriae、Corynebacterium durum、Corynebacterium matruchotii、Corynebacterium pseudodiphtheriticum、Corynebacterium pseudotuberculosis、Corynebacterium renale、Corynebacterium striatum、Corynebacterium xerosis、Coxiella burnetii 、Cryptobacterium curtum、Curvibacter delicatus、Dialister invisus、Dialister micraerophilus、Dialister pneumosintes、Eggerthella lenta、Eikenella corrodens、Elizabethkingia meningoseptica、Enterobacter aerogenes、Enterobacter cloacae、Enterococcus avium、Enterococcus faecalis、Enterococcus faecium、Escherichia coli、Eubacterium brachy、Eubacterium infirmum、Eubacterium limosum、Eubacterium minutum、Eubacterium nodatum 、Eubacterium saphenum、Eubacterium sulci、Filifactor alocis、Fretibacterium fastidiosum 、Fusobacterium necrophorum、Fusobacterium nucleatum、Fusobacterium nucleatum subsp. animalis、Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum、Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum、Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii、Fusobacterium periodonticum、Fusobacterium simiae、Gemella haemolysans、Gemella morbillorum、Gemella sanguinis、Granulicatella adiacens、Granulicatella balaenopterae、Granulicatella elegans、Haemophilus ducreyi、Haemophilus haemolyticus、Haemophilus influenzae、Haemophilus parainfluenzae、Helicobacter pylori、Kingella denitrificans、Kingella kingae、Kingella oralis、Klebsiella oxytoca、Klebsiella pneumoniae、Lachnoanaerobaculum orale、Lachnoanaerobaculum saburreum、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus brevis、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus casei、Lactobacillus crispatus、Lactobacillus delbrueckii、Lactobacillus fermentum、Lactobacillus gasseri、Lactobacillus paracasei、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus reuteri、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus salivarius、Lautropia mirabilis、Legionella pneumophila、Leptotrichia buccalis 、Leptotrichia sp. OT 215、Leptotrichia sp. OT 417、Leptotrichia sp. OT 462、Listeria monocytogenes、Megasphaera micronuciformis、Micrococcus luteus、Mogibacterium diversum、Mogibacterium neglectum、Mogibacterium pumilum、Mogibacterium timidum、Mogibacterium vescum、Moraxella catarrhalis、Moraxella lacunata、Morganella morganii、Mycobacterium abscessus、Mycobacterium avium、Mycobacterium chelonae、Mycobacterium fortuitum、Mycobacterium gordonae、Mycobacterium haemophilum、Mycobacterium intracellulare、Mycobacterium kansasii、Mycobacterium marinum、Mycobacterium szulgai、Mycobacterium tuberculosis、Mycobacterium xenopi、Mycoplasma genitalium、Mycoplasma hominis、Mycoplasma orale、Mycoplasma pneumoniae、Mycoplasma salivarium、Neisseria elongata、Neisseria flava、Neisseria flavescens、Neisseria gonorrhoeae、Neisseria meningitidis、Neisseria mucosa、Neisseria sicca、Neisseria subflava、Nocardia asteroides、Nocardia brasilliensis、Nocardia farcinica、Nocardia nova、Olsenella uli、Oribacterium asaccharolyticum、Oribacterium parvum、Parascardovia denticolens、Parvimonas micra、Peptostreptococcus stomatis、Porphyromonas catoniae、Porphyromonas endodontalis、Porphyromonas gingivalis、Porphyromonas pasteri、Prevotella dentalis、Prevotella denticola、Prevotella histicola、Prevotella intermedia、Prevotella loescheii、Prevotella melaninogenica、Prevotella nigrescens、Prevotella oralis、Prevotella oris、Prevotella pallens、Prevotella salivae、Prevotella shahii、Prevotella veroralis、Propionibacterium acnes（Cutibacterium acnes）、Propionibacterium granulosum(Cutibacterium granulosum)、Propionibacterium propionicus(Pseudopropionibacterium propionicum)、Proteus mirabilis、Proteus vulgaris、Providencia stuartii、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas putida、Pseudoramibacter alactolyticus、Ralstonia pickettii、Rothia aeria、Rothia dentocariosa、Rothia mucilaginosa、Scardovia inopinata、Schlegelella aquatica、Sebaldella termitidis、Selenomonas flueggei、Selenomonas noxia、Selenomonas sp. OT 478、Selenomonas sputigena、Serratia marcescens、Simonsiella muelleri、Slackia exigua、Solobacterium moorei、SR1 sp. OT 345、Staphylococcus aureus、Staphylococcus epidermidis、Staphylococcus saccharolyticus、Stenotrophomonas maltophilia、Streptococcus agalactiae、Streptococcus anginosus、Streptococcus australis、Streptococcus constellatus、Streptococcus cristatus、Streptococcus dentisani、Streptococcus gordonii、Streptococcus infantis、Streptococcus intermedius、Streptococcus milleri、Streptococcus mitis、Streptococcus mutans、Streptococcus oralis、Streptococcus parasanguinis、Streptococcus pneumoniae、Streptococcus pyogenes、Streptococcus salivarius、Streptococcus sanguinis、Streptococcus sobrinus、Streptococcus tigurinus、Streptococcus vestibularis、Tannerella forsythia、Treponema denticola、Treponema lecithinolyticum、Treponema medium、Treponema pallidum、Treponema socranskii、Treponema vincentii、Ureaplasma urealyticum、Veillonella atypica、Veillonella dispar、Veillonella parvulaおよびVeillonella rogosaeなどの細菌のrRNA遺伝子を標的核酸とすることが好ましく、より好ましくは、Actinomyces graevenitzii、Actinomyces israelii、Actinomyces naeslundii、Actinomyces odontolyticus、Actinomyces viscosus、Aggregatibacter actinomycetemcomitans、Aggregatibacter actinomycetemcomitans、Alloprevotella rava、Alloprevotella sp. OT 308、Campylobacter concisus、Campylobacter gracilis、Campylobacter rectus、Campylobacter showae、Capnocytophaga gingivalis、Capnocytophaga ochracea、Capnocytophaga sputigena、Corynebacterium matruchotii、Eikenella corrodens、Enterobacter cloacae、Enterococcus faecalis、Eubacterium nodatum 、Eubacterium saphenum、Eubacterium sulci、Filifactor alocis、Fusobacterium nucleatum、Fusobacterium nucleatum subsp. animalis、Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum、Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii、Fusobacterium periodonticum、Gemella sanguinis、Granulicatella adiacens、Haemophilus parainfluenzae、Helicobacter pylori、Klebsiella pneumoniae、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus casei、Lactobacillus salivarius、Leptotrichia sp. OT 215、Leptotrichia sp. OT 417、Leptotrichia sp. OT 462、Megasphaera micronuciformis、Neisseria flavescens、Parvimonas micra、Peptostreptococcus stomatis、Porphyromonas catoniae、Porphyromonas endodontalis、Porphyromonas gingivalis、Porphyromonas pasteri、Prevotella denticola、Prevotella histicola、Prevotella intermedia、Prevotella loescheii、Prevotella melaninogenica、Prevotella nigrescens、Prevotella pallens、Prevotella shahii、Prevotella sp. OT 306、Prevotella sp. OT 313、Prevotella veroralis、Rothia dentocariosa、Rothia mucilaginosa、Selenomonas noxia、Selenomonas sp. OT 478、Selenomonas sputigena、Solobacterium moorei、SR1 sp. OT 345、Staphylococcus aureus、Staphylococcus epidermidis、Streptococcus constellatus、Streptococcus dentisani、Streptococcus gordonii、Streptococcus intermedius、Streptococcus mitis、Streptococcus mutans、Streptococcus parasanguinis、Streptococcus pneumoniae、Streptococcus salivarius、Streptococcus sobrinus、Tannerella forsythia、Treponema denticola、Treponema medium、Treponema socranskii、Veillonella atypica、Veillonella parvulaおよびVeillonella rogosaeのrRNA遺伝子などを標的核酸とすることができるが、これらに限定されるものではない。
【００２４】
（２）絶対量
本発明において標的核酸の絶対量とは、標的核酸の物質量、コピー数または重量を意味する。NGS の結果（リード数）およびDNAチップのシグナル強度は、相対的な定量値であるため、それぞれの存在比あるいは試料間で値の大小を比較することはできるが、絶対量は示さない。
【００２５】
２．工程(a)について
（１）試料
本発明の方法は、（a）試料と既知量のコントロール核酸とを混合する工程を含む(図４Ａ)。
本発明において試料は、核酸が含有されるものであれば特に制限されない。試料には、例えば飲食品、生体試料、環境試料、および工業プロセスからの試料などを用いることができる。
飲食品としては、例えば、天然由来の食品及び飲料水、加工食品、加工飲料などが挙げられるが、これらに限定されない。
生体試料としては、限定されるものではなく、例えば、真核生物（例えば、哺乳動物、鳥類、植物など）から得られた（例えば採取された）組織、細胞、体液、プラーク（歯垢）、糞便などが挙げられる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、サル、ヒトが挙げられるが、これらに限定されない。組織としては、各種臓器から得られるものであれば限定されるものではなく、例えば、皮膚組織、口内組織、粘膜組織、腸管組織、癌組織などが挙げられる。細胞としては、これらの組織由来の細胞であれば限定されるものではなく、例えば、口内組織由来の細胞、粘膜組織由来の細胞、皮膚由来の細胞などが挙げられる。体液としては、限定されるものではなく、例えば、唾液、歯肉溝滲出液(GCF)、血液、尿、母乳、羊水などが挙げられる。
環境試料としては、例えば、土壌、河川水、海水、温泉水などが挙げられる。
工業プロセスからの試料としては、例えば、活性汚泥などが挙げられる。
その他の試料としては、人工的に微生物を増殖させた培養物が挙げられ、例えば、発酵槽培養物が挙げられる。
【００２６】
一態様において、本発明における試料は、活性汚泥、土壌、河川水、海水、温泉水、飲料水、加工食品、発酵槽培養物、並びに、真核生物から採取された組織、細胞および体液からなる群から選択される少なくとも一種である。
また別の態様において、本発明における試料は、哺乳動物から採取された、唾液、プラーク、歯肉溝浸出液(GCF)、糞便および皮膚由来試料からなる群から選択される少なくとも一種である。
【００２７】
本発明において、「試料」としては、上記例示された試料のほか、上記例示された試料から抽出された核酸、および抽出された核酸を含有する組成物を用いることができる。
本発明において試料から核酸を抽出する方法は限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、市販の核酸抽出キットを利用する方法、プロテイナーゼKで処理した後にフェノール・クロロホルム抽出する方法等が挙げられる。細菌DNAを抽出する場合には、溶菌処理も含む。溶菌処理としては、例えば酵素処理、加熱処理、ビーズ破砕などが挙げられる。また、試料の懸濁液をそのまま増幅反応に用いることもできる。
【００２８】
本発明における試料には、2種以上の標的核酸が含まれていてもよい。試料に含まれる標的核酸の種類数については特に上限はなく、評価の目的に応じて適宜選択することができる。
【００２９】
（２）コントロール核酸
本発明においてコントロール核酸とは、増幅反応液に反応前に既知量添加することで、標的核酸等の定量の対照とする核酸である。
コントロール核酸の添加によって、全ての標的核酸および標的核酸と一括して増幅される特定の核酸群（以下、「標的核酸と一括して増幅される特定の核酸群」を「特定の核酸群」ともいう）の増幅後の量の指標から増幅前の量を決定することが可能になる。例えばPCR法による増幅を用いる場合、競合的PCR法の原理により、増幅前の量に依存した量の指標が得られる。
コントロール核酸は、標的核酸の量の指標や標的核酸および特定の核酸群の合計の量の指標を得るのに影響を与えない配列であることが望ましく、例えば量の指標を得る手法がDNAチップである場合、標的核酸並びに標的核酸および特定の核酸群に対するプローブに非特異的にハイブリダイズしない配列、より具体的には標的核酸並びに標的核酸および特定の核酸群に対するプローブの相補配列と同一性や類似性が低い特異的な配列であることが望ましい。
コントロール核酸は増幅に必要な部位を含む必要がある。例えばPCR法による増幅を用いる場合、前記「増幅に必要な部位」はプライマー結合部位である。このときプライマー結合部位の塩基配列は、標的核酸のプライマー結合部位の塩基配列と同一でもよいし、異なってもよい。
【００３０】
コントロール核酸について、増幅効率を標的核酸および特定の核酸群と同一にすることは困難であるが、一方で、極端に増幅効率が異なれば定量に影響があると考えられるので、両者の増幅効率はなるべく近づけることが望ましい。コントロール核酸と標的核酸および特定の核酸群の増幅効率をなるべく近づけるために、コントロール核酸の塩基長は、標的核酸および特定の核酸群にて増幅される部位の塩基長と大きな差のないようにすることが望ましい。例えば、標的核酸および特定の核酸群由来の増幅産物が500bp程度となるのであれば、コントロール核酸の増幅産物は300bpから1000bp程度とすることが望ましい。
コントロール核酸の塩基配列について、設計方法としては、ランダムに塩基配列を生成する方法、標的核酸および特定の核酸群の塩基配列と部分的に相同性を有する配列を用いる方法などが挙げられる。本発明においては、ランダムに塩基配列を生成する方法が特に好ましい。これは、ヒト由来試料中の菌叢のような、標的核酸の塩基配列の多様性が高く且つ互いに類似性も高い試料中では、ランダムに設計する方が、例えばDNAチップの場合は非特異的ハイブリダイゼーションが定量に与える影響を抑制できる可能性が高いためである。
コントロール核酸の設計は、例えば、Microsoft社のソフトウェアー「EXCEL」のRNDBETWEEN関数を使用し、1から4までの整数をランダムにX個（Xは任意の数）発生させ、それをつなげて1から4までの数値のみから構成されるX桁の数値とし、1をA、2をT、3をC、4をGと置き換えることにより、ATGCのX塩基によるランダム配列を多数得ることができる。これらの配列につき、GとCの和がAとTの和と同数になる配列のみを抜粋し、抜粋された配列を、NCBIのGenBank等のデータベースにおいてBlast検索し、類似配列の少ないものを選抜し、例えばPCR法で増幅する場合は配列の両末端に増幅に必要な部位を付加することで、設計可能である。このとき付加する増幅に必要な部位は、例えば上記と同様にランダムに設計された配列でも良いし、標的核酸のプライマー結合部位の配列と同一でも良い。また、設計された配列を適宜連結させて長くしたり、部分的に除去して短くしたりすることも可能である。
【００３１】
本発明で用いられるコントロール核酸の種類数は限定されるものではないが、簡便性の観点からその数はできるだけ少ない方が好ましく、例えば１種類である。
【００３２】
（３）混合
工程(a)において、試料とコントロール核酸とを「混合する」には、試料にコントロール核酸を添加すること、または、コントロール核酸を含む組成物に試料を添加することが含まれる。
【００３３】
３．工程(ｂ)について
（１）標的核酸と一括して増幅される特定の核酸群
本発明の方法は、試料中の全ての標的核酸および標的核酸と一括して増幅される特定の核酸群並びにコントロール核酸を共増幅する工程（工程(b)）を含む（図４Ｂ）。
本発明において、「全ての標的核酸」とは、試料または増幅産物に含まれる複数種類の標的核酸の全て（全部）を意味する。
本発明において、試料には、測定対象の細菌のゲノムDNA、測定対象ではない細菌のゲノムDNA、および／またはその他の核酸が含まれうる（図４Ａ）。そして、この試料に含まれる測定対象ではない細菌のゲノムDNAが、全ての標的核酸（例えば16SrRNA遺伝子）の塩基配列の一部と共通する塩基配列（コンセンサス配列）を含む場合、この試料または抽出した核酸において全ての標的核酸（例えば16SrRNA遺伝子）を増幅すると、測定対象ではない細菌のゲノムDNAにおける16SrRNA遺伝子も一括して増幅される（図４Ｂ）。このように、全ての標的核酸と一括して（共に）増幅される標的核酸以外の核酸群を、本発明では、「標的核酸と一括して増幅される特定の核酸群」又は「特定の核酸群」という。
また、例えば、測定対象であるmRNA及び測定対象ではないmRNAを含む試料において、測定対象であるmRNAを標的核酸とする場合、増幅方法としてポリA配列を利用した逆転写後のIn vitro転写を選択することができる。この場合、測定対象ではないmRNAも一括して得られるが、このmRNAも「標的核酸と一括して増幅される特定の核酸群」又は「特定の核酸群」に該当する。
すなわち、本発明において、「標的核酸と一括して増幅される特定の核酸群」(「特定の核酸群」ともいう)とは、標的核酸以外で、試料中の全ての標的核酸の増幅と共に一括して増幅される核酸の群を指す。
【００３４】
試料中の全ての標的核酸と特定の核酸群とは、前述のように、共に一括して増幅される核酸である。従って、本発明においては、「全ての標的核酸および特定の核酸群」は、共通する配列を含むひとまとまりの核酸の群として把握することができる。また、本発明では、全ての標的核酸と特定の核酸群とをまとめた量を、「全ての標的核酸および特定の核酸群の合計」と称することがある。
【００３５】
（２）共増幅
本発明において、「共増幅」とは、同一の核酸増幅反応系で一緒に増幅することを意味する。
本発明において、核酸の増幅手法は限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、標的がDNAである場合は、PCR法やLAMP（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法などが挙げられ、標的がRNAである場合は、逆転写後のIn vitro転写やPCR法が挙げられる。PCR法を利用することが特に好ましい。DNAチップを用いる場合は、例えばプライマーを蛍光標識しておくことでシグナル強度として量の指標が得られる。
例えばPCR法で細菌の16SrRNA遺伝子を増幅する場合、反応液中の試料からの抽出DNA量を1pg〜10ng、コントロール核酸の濃度を0.0001〜1pM、プライマーそれぞれの濃度を0.01〜10μM、総液量1〜100μL、という条件で行うことができる。より好ましくは、反応液中の試料由来からの抽出DNA量を50pg〜200pg、コントロール核酸の濃度を0.01〜0.05pM、プライマーそれぞれの濃度を0.1〜2μM、総液量20μL、という条件で行うことができる。この場合、例えばサイクル数は10〜50回で行うことができる。より好ましくはサイクル数を15〜40回で行うことができる。ここで用いるDNAポリメラーゼは、特に制限はなく、市販の耐熱性のDNAポリメラーゼを利用することができる。また、温度、時間、緩衝液の組成等にも特に制限はなく、使用するDNAポリメラーゼおよび目的の核酸の増幅領域の大きさ等を考慮して、適宜設定することができる。本発明の定量法において、市販のDNAポリメラーゼを用いる場合、DNAポリメラーゼの反応時間は、取扱説明書等に記載の推奨時間以上の充分な反応時間を設定することが好ましい。具体的には、各ステップの増幅反応時間は、使用するDNAポリメラーゼの反応時間として取扱説明書等で推奨される時間の1.2倍以上3倍以下が好ましい。さらに必要に応じて、最終伸長ステップでは、いわゆるファイナルエクステンションを5〜15分間設定することができる。このようにして標的核酸等の完全長を均一に増幅させる。
【００３６】
菌数の測定を目的として、rRNA遺伝子を定量した場合は、rRNA遺伝子は１ゲノム中に複数コピー存在しているので、菌数を得るためには定量値を１ゲノム内のコピー数で割れば（除算すれば）よい。1ゲノム内のrRNA遺伝子のコピー数は、菌種によって異なり、その値は公知の情報（例えばGenbank）を用いることができる。
本発明においてDNAチップを用いる場合、共増幅する工程は、増幅後の核酸を、DNAチップに搭載されたプローブとハイブリダイゼーションする片鎖（１本鎖）に富化（enrichment）する工程を含むことができる。本発明の定量法においては、２本鎖DNAよりも１本鎖DNAをハイブリダイゼーションしたほうが、感度の向上のみならず、その精度も向上することが、本発明者らの検討で初めて見出された。
片鎖に富化する工程としては、例えば、本発明の方法における共増幅の反応条件として片鎖に富化する増幅反応条件を用いるものであっても、共増幅の反応後に片鎖に富化する処理をさらに含むものであってもよい。
片鎖に富化する増幅反応条件とは、例えば、いわゆる非対称PCRとなる条件が挙げられる。非対称PCRとなる条件としては、具体的には、PCRに用いる一組のプライマー間で、濃度を変える、融点に差をつける、塩基長に差をつける等の条件を単独あるいは組み合わせて採用することができる。さらに、PCR反応組成物のうち、核酸の融点に影響する化合物（例えば、塩、dNTP、オリゴ、変性剤）の濃度を調整し、片鎖への富化においてより効果的な条件とすることができる。また、非対称PCRにおいては、PCR反応の途中で片方のプライマーを追添加したり、アニール条件(温度または反応液中の化合物濃度）を変えたりすることも可能である。
共増幅の反応後に片鎖に富化する処理としては、例えば、共増幅後の２本鎖DNAを１本鎖DNAに物理的に分離する方法（例えば、変性高速液体クロマトグラフィー等）と化学的な方法（例えば、λエキソヌクレアーゼ処理）が挙げられる。本発明においては、特に限定はされないが、その操作性の面から、λエキソヌクレアーゼ（酵素番号（Enzyme Commission numbers）：EC 3.1.11.3）処理による方法が好ましい。
この処理工程を実施する場合は、工程(b)の共増幅において使用するプライマーセットのうちの一方のプライマーとして、５’末端がリン酸化されたものを用いることが必要となる。λエキソヌクレアーゼ反応時においては、増幅断片、バッファー及び酵素等を含む反応液組成や、反応温度、反応時間及び酵素不活性化条件等の反応条件は、特に限定はされず、例えば、市販のλエキソヌクレアーゼの推奨条件に従い、適宜設定することができる。また、工程(b)の共増幅反応後の産物に対して精製工程なしでそのままλエキソヌクレアーゼ処理を行うこともできる。
【００３７】
４．工程(c)について
本発明は、増幅された全ての標的核酸および特定の核酸群の合計の量の指標並びに増幅されたコントロール核酸の量の指標から、試料中の全ての標的核酸および特定の核酸群の合計の量を決定する工程（工程(c)）を含む（図４Ｃ）。ここで、「増幅された全ての標的核酸および特定の核酸群」、並びに「増幅されたコントロール核酸」とは、それぞれ、上記共増幅された増幅産物のうち、全ての標的核酸および特定の核酸群由来の増幅産物、並びにコントロール核酸由来の増幅産物を指す。
この工程は、好ましくは、予め、標的核酸の一部または全部および特定の核酸群並びにコントロール核酸を用いて、標的核酸の一部または全部および特定の核酸群の合計並びにコントロール核酸の増幅前の量と増幅後の量の指標との関係について、検量線を作成する工程（工程(c1)）を含む。これは、全ての標的核酸および特定の核酸群の合計の量とコントロール核酸の量との関係が、両者の増幅効率が異なる場合、増幅前後で変化するためである。
特許文献１では、細菌の16SrRNA遺伝子およびコントロール核酸に相当する核酸について、増幅後の量の指標の比を、増幅前の量の比またはそれに比例する値として扱った解析を行っている。しかしながら、このように扱うことが可能なのは両者の増幅効率が同一の場合である。また、コントロール核酸は人工的にデザインした配列を用いるが、この増幅効率を全ての標的核酸の増幅効率と同一にするのは困難であり、前記増幅後の量の指標の比が増幅前の量の比に相当するという仮定が成り立たない可能性が高い。
本発明においては、予め検量線を得ておき、それに基づき全ての標的核酸および特定の核酸群の合計の量を決定することでより正確な定量が可能である。
ここで量の指標とは、例えばDNAチップであれば対応するプローブのシグナル強度であり、例えばNGSであれば対応する配列のリード数である。
【００３８】
本発明において、検量線作成に使用する核酸は、標的核酸の一部または全部および特定の核酸群を用いることができる。以下、検量線の作成で用いる「標的核酸の一部または全部および特定の核酸群」を「検量用核酸」と称す。
本発明において、検量用核酸としては、例えば標的核酸が2種以上の特定の細菌の16SrRNA遺伝子で、かつ特定の核酸群が細菌の16SrRNA遺伝子である場合には、ある単一の細菌のゲノムDNAに部分配列として含まれる16SrRNA遺伝子、または複数の細菌のゲノムDNAの混合物に部分配列として含まれる16SrRNA遺伝子を用いることができる。これらの細菌の16SrRNA遺伝子の全長、または増幅部位を含む部分配列について、公知の配列情報を取得し、その配列の合成核酸を検量線核酸として用いることもできる。ここで細菌は、標的核酸となる16SrRNA遺伝子を持つ細菌から選ばれてもよいし、それ以外の細菌から選ばれてもよい。あるいはその両方から選ばれてもよい。すなわち、本発明では、検量線の作成においては、標的核酸となりうる核酸の全部を用いる必要はなく、標的核酸の一部の種類および／または特定の核酸群を用いることができる。従って、試料中の標的核酸が多種類の場合、これら全てを用いて検量線を作成する作業が省略でき、簡便な方法となる。
【００３９】
検量線の作成では、検量用核酸の濃度条件が、試料中に含まれると想定される全ての標的核酸および特定の核酸群の合計の量を含む範囲で行われることが望ましい。例えば、唾液中の16SrRNA遺伝子の測定において、唾液から抽出されたDNAが増幅反応液に100pg含まれるように試料の測定を行う場合、仮に100pgすべてが細菌のゲノムDNAであるとした場合の16SrRNA遺伝子の物質量を推定することができる。例えば、唾液中の細菌について、ゲノムの分子量の平均を2.2×106、1ゲノム内の16SrRNAのコピー数の平均を4.5とすると、100pgの細菌ゲノムDNA中の16SrRNA遺伝子の物質量は0.31amol程度と推定される。ここで、上記推定に使用した唾液中の細菌のゲノムの分子量の平均および1ゲノム内の16SrRNAのコピー数の平均は、Oral Dis. 21, 748-54(2015)で報告されている健常人の唾液中の菌の組成のデータの平均と、各菌の情報から、本発明者らが推算した値である。
また、Microbiome 6, 42(2018)( https://doi.org/10.1186/s40168-018-0426-3)によれば、唾液から抽出したDNAの86%〜97%程度はヒトのゲノムDNAであり、つまり細菌由来DNAは3%〜14%程度と推定される。従って、これを含むように検量線作成での反応液中の検量用核酸の濃度条件を決定することができる。検量線作成は少なくとも2条件以上の濃度条件で行う必要があるが、このとき最大の濃度条件は、例えば増幅反応液量が20μLのとき、0.050pM〜500pMから選ばれる濃度条件にすることができる。より好ましくは、0.050pM〜50pMから選ばれる濃度条件にすることができる。また最小の濃度条件は、例えば増幅反応液量が20μLのとき、0.10aM〜0.10fMから選ばれる濃度条件にすることができる。より好ましくは0.010fM〜0.10fMから選ばれる濃度条件にすることができる。
【００４０】
検量線は、［（増幅後のコントロール核酸の量の指標）に対する（標的核酸の一部または全部および特定の核酸群の合計の量の指標）の比］と、［（増幅前のコントロール核酸の量）に対する（標的核酸の一部または全部および特定の核酸群の合計の量）の比］との関係を表すものであることが特に好ましい。これらの関係について、回帰分析し、検量線として使用することができる。最も単純な方法は直線回帰であるが、その他の非線形モデルを用いる非線形回帰も使用できる。仮にコントロール核酸と標的核酸の一部または全部および特定の核酸群の合計との増幅効率が同一であれば、この関係式は一次式で表される。しかし、実際には増幅効率が異なる場合が多い。この場合は曲線的な関係になるが、例えば両対数をとったときに1次式で近似することができる。
つまり、増幅された全ての標的核酸および特定の核酸群の合計の量の指標をIT、コントロール核酸の量の指標をIC、増幅前の全ての標的核酸および特定の核酸群の合計の量をCT、増幅前のコントロール核酸の量をCCとすると、これらの値の関係は下式で近似できる。
log10( IT ÷ IC ) = a × log10( CT ÷ CC ) ＋ b  …(式1)
この係数aとbは、検量線作成用の実験データから、例えばMicrosoft社のソフトウェアー「EXCEL」のLINEST関数で求めることができる。
【００４１】
あるいは、シグモイド様の非線形回帰の検量線を作成することもできる。例えば増幅反応としてPCR法を用いる場合、増幅のサチュレーションには、全ての標的核酸および特定の核酸群の合計とコントロール核酸との間で部分的には別々に起こるメカニズムと、系の核酸全体に起こるメカニズムの両方が寄与する。これらの組み合わせによって、［（増幅前のコントロール核酸の量）に対する（標的核酸の一部または全部および特定の核酸群の合計の量）の比］の変化に対する［（増幅後のコントロール核酸の量の指標）に対する（標的核酸の一部または全部および特定の核酸群の合計の量の指標）の比］は単調ではない変化をする。この場合、非線形の検量線を用いることで、広い濃度範囲で精度の良い定量が可能となる。
一般的なシグモイド様曲線をとる関数であれば、特に制限はないが、例えば、増幅された全ての標的核酸および特定の核酸群の合計の量の指標をIT、コントロール核酸の量の指標をIC、増幅前の全ての標的核酸および特定の核酸群の合計の量をCT、増幅前のコントロール核酸の量をCCとすると、これらの値の関係は下式で近似できる。
log10( IT ÷ IC ) = b × ( log10( CT÷ CC ) - c ) ÷ ( a - |log10( CT ÷ CC ) - c| ) …(式2)
この係数aとb、cは、検量線作成用の実験データから、例えばMicrosoft社のソフトウェアー「EXCEL」の「ソルバー」という機能を用いて回帰することで求めることができる。
【００４２】
本明細書で用いられる記号の説明を下記に示す。
IT：増幅された全ての標的核酸および特定の核酸群の合計の量の指標（Intensity, Total bacteria）
IC：増幅されたコントロール核酸の量の指標（Intensity, Control）
CT：増幅前の全ての標的核酸および特定の核酸群の合計の量（Concentration, Total bacteria）
CC：増幅前のコントロール核酸の量（Concentration, Control）
CTM：増幅前の全ての標的核酸および特定の核酸群の合計の量の測定値（Concentration, Total bacteria, Measurement）
ITM：増幅された全ての標的核酸および特定の核酸群の合計の量の指標の測定値（Intensity, Total bacteria, Measurement）
ICM：増幅されたコントロール核酸の量の指標の測定値（Intensity, Control, Measurement）
IUS：各標的核酸Sに由来するプローブ(x)のシグナル強度（Intensity, Unique, Species）(S=A, B, …)
ITS：各標的核酸Sに由来するプローブ(y)のシグナル強度（Intensity, Total bacteria, Species）(S=A, B, …)
ES：各標的核酸Sにおける係数（Efficiency, Species）(S=A, B, …)
ITSM：各標的核酸Sに由来するプローブ(y)のシグナル強度に相当する値の測定値（Intensity, Total bacteria, Species, Measurement）(S=A, B, …)
IUSM：各標的核酸Sに対応するプローブ(x)のシグナル強度の測定値（Intensity, Unique, Species, Measurement）(S=A, B, …)
RS：各標的核酸Sの占有率（Rate, Species）(S=A, B, …)
【００４３】
本発明において、工程(c)は、好ましくは、試料から増幅された全ての標的核酸および標的核酸と一括して増幅される特定の核酸群の合計の量の指標並びにコントロール核酸の量の指標を、前工程で作成した検量線に当てはめ、試料中の全ての標的核酸および前記特定の核酸群の合計の量を算出する工程（工程(c2)）を含む。
この工程においては、例えば、試料から増幅された、全ての標的核酸および特定の核酸群の合計の量の指標をITM、コントロール核酸の量の指標をICMとし、上記で作成した検量線(式1)にあてはめると、増幅前（すなわち試料中）の全ての標的核酸および特定の核酸群の合計の量CTMは、下式を用いて算出することができる。
CTM = CC × 10 ^((log10(ITM÷ICM )-b)÷a)  …(式3)
【００４４】
シグモイド様の検量線についてもその近似式にあてはめ、同様に算出することができる。例えば、増幅された全ての標的核酸および特定の核酸群の合計の量の指標をITM、コントロール核酸の量の指標をICMとし、上記で作成した検量線(式2)にあてはめると、増幅前（すなわち試料中）の全ての標的核酸および特定の核酸群の合計の量CTMは、下式を用いて算出することができる。
CTM= CC × 10 ^ ( a × log10( ITM ÷ ICM ) ÷ ( b + | log10( ITM ÷ ICM )|) + c ) …(式4)
【００４５】
５．工程(d)について
本発明は、増幅された全ての標的核酸および特定の核酸群の合計の量の指標と増幅された各標的核酸の量の指標とから、全ての標的核酸および特定の核酸群の合計中の各標的核酸の占有率を算出し、この占有率から試料中の各標的核酸の絶対量を算出する工程（工程(d)）を含む（図４Ｄ）。
本発明において、「各標的核酸」とは、試料中または増幅産物中に含まれる複数種類の標的核酸のそれぞれを意味する。
この工程では、工程(c)で得た全ての標的核酸および特定の核酸群の合計の絶対量に、該占有率を乗ずることで、試料中の各標的核酸の絶対量を決定することができる。
【００４６】
本発明は、全ての標的核酸および特定の核酸群の合計の量を求める工程と、各標的核酸の占有率を求める工程が分かれていることを特徴としている。本発明において、全ての標的核酸および特定の核酸群の合計中の各標的核酸の占有率は、例えば量の指標がNGSのリード数の場合、全ての標的核酸および特定の核酸群の増幅産物のリード数に対する各標的核酸の増幅産物のリード数の割合である。
【００４７】
本発明でDNAチップを用いる場合、量の指標は以下のプローブ(x)〜(z)のシグナル強度である。
(x) 2種以上の標的核酸のそれぞれの増幅産物とハイブリダイズするプローブ
(y)試料中の全ての標的核酸および特定の核酸群の両方の増幅産物に共通してハイブリダイズするプローブ
(z)コントロール核酸の増幅産物とハイブリダイズするプローブ
ここで、プローブ(x)は、標的核酸のそれぞれの増幅産物と特異的にハイブリダイズするものであることが好ましい。
DNAチップについての詳細な説明は後述する。
【００４８】
工程(d)において、占有率の算出は、以下に示す工程(d1)〜(d3)で行われることが好ましい。
(d1) 予め、2種以上の標的核酸のそれぞれ（各標的核酸）について、DNAチップとのハイブリダイゼーションを行い、各標的核酸にハイブリダイズするプローブ(x)とプローブ(y)とのシグナル強度の関係式を算出する工程、
(d2) 試料から増幅された産物をDNAチップにハイブリダイズさせて得られるプローブ(x)のシグナル強度を、上記(d1)で算出された関係式から、各標的核酸にハイブリダイズするプローブ(y)のシグナル強度に相当する値に換算する工程、並びに
(d3) 試料から増幅された産物をDNAチップにハイブリダイズさせて得られるプローブ(y)のシグナル強度に対する、上記(d2)で算出されたプローブ(y)のシグナル強度に相当する値の割合を算出する工程。
ここで、工程(d1)に使用する標的核酸は、例えば人工的に合成したものでもよいし、生体由来のもの、例えば細菌のゲノムDNAであれば単離された菌から抽出したものでもよい。
【００４９】
DNAチップにおいては、ハイブリダイズさせる核酸の量が同一でも、プローブの種類が異なればハイブリダイゼーションの効率あるいは諸条件の違いによってシグナル強度に違いが生じる。すなわち、プローブ(x)とプローブ(y)のシグナル強度から、全ての標的核酸および特定の核酸群の合計中の各標的核酸の占有率を求めるためには、プローブ(x)のシグナル強度をプローブ(y)のシグナル強度に相当する値に換算する必要がある(工程(d2))。そのためには、上記(d1)の工程で、プローブ(x)とプローブ(y)のシグナル強度の関係式を予め得る必要がある。この関係式は実験から適切に決定することができ、例えば比例関係で近似できる。
つまり、単一の標的核酸S（Sは各標的核酸の種類のインデックス）にハイブリダイズするプローブ(x)のシグナル強度をIUS、プローブ(y)のシグナル強度をITSとすると、IUSとITSの関係は例えば下式で近似できる。
ITS = ES × IUS  …(式5)
この係数ESは、工程(d1)で得られたそれぞれのプローブのシグナルから、例えばMicrosoft社のソフトウェアー「EXCEL」のLINEST関数を使用して、求めることができる。
このとき試料から増幅された産物をDNAチップにハイブリダイズさせて得られた、各標的核酸Sに対応するプローブ(x)のシグナル強度をIUSM、プローブ(y)のシグナル強度をITMとすると、工程(d2)で求める各標的核酸に由来するプローブ(y)のシグナル強度に相当する値ITSMは下式で表される。
ITSM =  ES× IUSM  …(式6)
さらにこのとき、各標的核酸Sの占有率RSは、下式を用いて算出することができる（工程(d3)）。
RS  = ITSM ÷ ITM  …(式7)
【００５０】
本発明において、工程(d)はさらに、工程(c)で算出された試料中の全ての標的核酸および特定の核酸群の合計の量に、工程(d3)で算出された占有率を乗じて、試料中の各標的核酸の絶対量を算出する工程（工程(d4)）を含む。
この工程においては、工程(d3)で算出された占有率を、工程(c)で算出された核酸群の量に乗ずることで、試料中の各標的核酸の絶対量を算出することができる。
【００５１】
６．DNAチップ
本発明において、DNAチップは、プローブが独立にかつ位置を特定できるように固定化されているものであればいずれのデバイスにも限定されないが、菌叢解析では広いダイナミックレンジが求められるので、単に平面基板上にプローブを固定化しているものよりも、プローブ固定化量の多いアレイが適している。このようなDNAチップとしては、特に、ゲルを介して三次元的にプローブを固定化する繊維型ＤＮＡチップが挙げられる。
【００５２】
DNAチップについて、その支持体の形態は特には限定されず、平板、棒状、ビーズ等のいずれの形態も使用できる。支持体として、平板を使用する場合は、その平板上に、所定の間隔をもって、所定のプローブを種類毎に固定することができる（スポッティング法等；Science 270,467-470(1995)等参照）。また、平板上の特定の位置で、所定のプローブを種類毎に逐次合成していくこともできる（フォトリソグラフィー法等；Science 251, 767-773(1991)等参照）。
他の好ましい支持体の形態としては、中空繊維を使用するものが挙げられる。支持体として中空繊維を使用する場合は、オリゴヌクレオチドプローブを種類毎に各中空繊維に固定し、すべての中空繊維を集束させ固定した後、繊維の長手方向で切断を繰り返すことにより得られるデバイスが好ましく例示できる。このデバイスは、貫通孔基板にオリゴヌクレオチドプローブを固定化したタイプのものと説明することができる（特許第３５１０８８２号公報の図１等を参照、）。
支持体へのプローブの固定化方法は特には限定されず、どのような結合様式でもよい。また、支持体に直接固定化することに限定はされず、例えば、予め支持体をポリリジン等のポリマーでコーティング処理し、処理後の支持体にプローブを固定することもできる。さらに、支持体として中空繊維等の管状体を使用する場合は、管状体にゲル状物を保持させ、そのゲル状物にプローブを固定化することもできる。
【００５３】
７．プローブ
プローブは核酸をハイブリダイゼーションにより捕捉するものであり、当該捕捉対象核酸に特異的な配列とハイブリダイズするDNAを用いることができる。
一般的に多種類のプローブを一括搭載しているDNAチップを使用する場合、多種類のプローブを同一条件下でハイブリダイゼーション反応に供するため、プローブ間のハイブリダイゼーション効率をできるだけ揃えることが望ましい。このような目的のため、プローブは設計時にGC含量や配列長を調整し、Tm値を可能な範囲で一定に揃える必要がある。DNAチップに搭載されるプローブの種類や数は特に限定されない。
本発明において、プローブの配列は、捕捉対象に特異的な塩基配列の相補配列から構成される配列であることが好ましい。
【００５４】
本発明において2種以上の標的核酸それぞれの増幅産物にハイブリダイズするプローブ（前記プローブ（x））は、例えば、Achromobacter xylosoxidans、Acinetobacter baumannii、Acinetobacter calcoaceticus、Acinetobacter lwoffii、Actinomyces graevenitzii、Actinomyces israelii、Actinomyces meyeri、Actinomyces naeslundii、Actinomyces odontolyticus、Actinomyces turicensis、Actinomyces viscosus、Aggregatibacter actinomycetemcomitans、Alloprevotella rava、Alloprevotella sp.OT 308、Atopobium parvulum、Bacteroides fragilis、Burkholderia cepacia、Campylobacter concisus、Campylobacter gracilis、Campylobacter rectus、Campylobacter showae、Capnocytophaga gingivalis、Capnocytophaga ochracea、Capnocytophaga sputigena、Chlamydophila (Chlamydia) pneumoniae、Chryseobacterium indologenes、Citrobacter freundii、Corynebacterium matruchotii、Corynebacterium striatum、Eikenella corrodens、Enterobacter aerogenes、Enterobacter cloacae、Enterobacter cloacae subsp. cloacae、Enterobacter cloacae subsp. dissolvens、Enterococcus faecium、Escherichia coli、Eubacterium nodatum 、Eubacterium saphenum、Eubacterium sulci、Filifactor alocis、Fusobacterium necrophorum subsp. funduliforme、Fusobacterium necrophorum subsp. necrophorum、Fusobacterium nucleatum、Fusobacterium nucleatum subsp. animalis、Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum、Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii、Fusobacterium periodonticum、Gemella sanguinis、Granulicatella adiacens、Haemophilus influenzae、Haemophilus parainfluenzae、Helicobacter pylori、Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus casei、Lactobacillus salivarius、Legionella pneumophila、Legionella pneumophila subsp. pneumophila str. Philadelphia、Leptotrichia sp. OT 215、Leptotrichia sp. OT 417、Leptotrichia sp. OT 462、Megasphaera micronuciformis、Moraxella catarrhalis、Morganella morganii、Mycobacterium avium、Mycobacterium intracellulare、Mycobacterium kansasii、Mycoplasma pneumoniae、Neisseria flavescens、Nocardia brasilliensis、Parvimonas micra、Peptostreptococcus stomatis、Porphyromonas catoniae、Porphyromonas endodontalis、Porphyromonas gingivalis、Porphyromonas pasteri、Prevotella dentalis、Prevotella denticola、Prevotella histicola、Prevotella intermedia、Prevotella loescheii、Prevotella melaninogenica、Prevotella nigrescens、Prevotella oris、Prevotella pallens、Prevotella shahii、Prevotella veroralis、Propionibacterium acnes（Cutibacterium acnes）、Proteus mirabilis、Proteus vulgaris、Pseudomonas aeruginosa、Rothia dentocariosa、Rothia mucilaginosa、Selenomonas noxia、Selenomonas sp. OT 478、Selenomonas sputigena、Serratia marcescens、Serratia marcescens subsp. marcescens、Solobacterium moorei、SR1 sp. OT 345、Staphylococcus aureus、Staphylococcus epidermidis、Stenotrophomonas maltophilia、Streptococcus agalactiae、Streptococcus anginosus、Streptococcus constellatus、Streptococcus dentisani、Streptococcus gordonii、Streptococcus intermedius、Streptococcus mitis、Streptococcus mutans、Streptococcus parasanguinis、Streptococcus pneumoniae、Streptococcus pyogenes、Streptococcus salivarius、Streptococcus sobrinus、Tannerella forsythia、Treponema denticola、Treponema medium、Treponema socranskii、Veillonella atypica、Veillonella parvula、Veillonella rogosae、総Streptococcus属の16SrRNA遺伝子を捕捉する場合、配列番号３〜１９１に示される塩基配列からなる群から選ばれる配列であることが好ましい。この場合、配列番号３〜１９１に示される塩基配列からなる群から選ばれる配列の相補配列でもよく、配列番号３〜１９１に示される塩基配列からなる群から選ばれる配列またはこれの相補配列と実質的に同一の配列であってもよい。
【００５５】
ここで、実質的に同一の配列とは、配列番号３〜１９１に示される塩基配列からなる群から選ばれる配列または相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列である。
プローブの長さとしては、例えば、13塩基以上、好ましくは15塩基以上、より好ましくは17塩基以上の配列である。ここで、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味する。すなわち、ストリンジェントな条件とは、高い相同性（相同性または同一性が９５％以上、好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上）を有する一対のポリヌクレオチドがハイブリダイズする条件をいう。
【００５６】
本発明において、ストリンジェントな条件は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0．5％SDS、50％ホルムアミド、50℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するDNAが効率的に捕捉できることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度等の複数の要素が考えられ、当業者であればこれらの要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することができる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual(4th edition)」（Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012)）等を参照することができる。
【００５７】
また、ストリンジェントな条件は、当該分野において周知慣用な手法、例えば、ノーザンブロッティング法、ドットブロット法、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法またはサザンブロットハイブリダイゼーション法などにおいて採用される条件を設定することができる。
本発明において、全ての標的核酸および特定の核酸群の両方の増幅産物に共通してハイブリダイズするプローブ（前記プローブ（y））は、好ましくは全ての標的核酸および特定の核酸群に含まれる配列の増幅産物が共通して含む配列の相補配列である。例えば、プローブが細菌の16SrRNA遺伝子を捕捉する場合、細菌の16SrRNA遺伝子のコンセンサス配列の一部の相補鎖であることができる。この場合のプローブとしては、例えば配列番号２に示される塩基配列を含むプローブが挙げられる。
本発明においてコントロール核酸の増幅産物とハイブリダイズするプローブ(前記プローブ(z)) とは、好ましくはコントロール核酸の増幅産物の一部の相補配列である。例えばコントロール核酸の配列として配列番号１９６に示される塩基配列を使用する場合には、プローブとしては配列番号１に示される塩基配列を含むプローブが挙げられる。
【００５８】
８．キット
本発明は、上記定量手法を実現するための、全ての標的核酸および特定の核酸群並びにコントロール核酸をPCR法で共増幅するための1対あるいは2対のプライマーセット、コントロール核酸、並びに上記プローブ(x)〜(z)を搭載したDNAチップを含むキットを提供する。
例えばAchromobacter xylosoxidans、Acinetobacter baumannii、Acinetobacter calcoaceticus、Acinetobacter lwoffii、Actinomyces graevenitzii、Actinomyces israelii、Actinomyces meyeri、Actinomyces naeslundii、Actinomyces odontolyticus、Actinomyces turicensis、Actinomyces viscosus、Aggregatibacter actinomycetemcomitans、Alloprevotella rava、Alloprevotella sp.OT 308、Atopobium parvulum、Bacteroides fragilis、Burkholderia cepacia、Campylobacter concisus、Campylobacter gracilis、Campylobacter rectus、Campylobacter showae、Capnocytophaga gingivalis、Capnocytophaga ochracea、Capnocytophaga sputigena、Chlamydophila (Chlamydia) pneumoniae、Chryseobacterium indologenes、Citrobacter freundii、Corynebacterium matruchotii、Corynebacterium striatum、Eikenella corrodens、Enterobacter aerogenes、Enterobacter cloacae、Enterobacter cloacae subsp. cloacae、Enterobacter cloacae subsp. dissolvens、Enterococcus faecium、Escherichia coli、Eubacterium nodatum 、Eubacterium saphenum、Eubacterium sulci、Filifactor alocis、Fusobacterium necrophorum subsp. funduliforme、Fusobacterium necrophorum subsp. necrophorum、Fusobacterium nucleatum、Fusobacterium nucleatum subsp. animalis、Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum、Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii、Fusobacterium periodonticum、Gemella sanguinis、Granulicatella adiacens、Haemophilus influenzae、Haemophilus parainfluenzae、Helicobacter pylori、Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus casei、Lactobacillus salivarius、Legionella pneumophila、Legionella pneumophila subsp. pneumophila str. Philadelphia、Leptotrichia sp. OT 215、Leptotrichia sp. OT 417、Leptotrichia sp. OT 462、Megasphaera micronuciformis、Moraxella catarrhalis、Morganella morganii、Mycobacterium avium、Mycobacterium intracellulare、Mycobacterium kansasii、Mycoplasma pneumoniae、Neisseria flavescens、Nocardia brasilliensis、Parvimonas micra、Peptostreptococcus stomatis、Porphyromonas catoniae、Porphyromonas endodontalis、Porphyromonas gingivalis、Porphyromonas pasteri、Prevotella dentalis、Prevotella denticola、Prevotella histicola、Prevotella intermedia、Prevotella loescheii、Prevotella melaninogenica、Prevotella nigrescens、Prevotella oris、Prevotella pallens、Prevotella shahii、Prevotella veroralis、Propionibacterium acnes（Cutibacterium acnes）、Proteus mirabilis、Proteus vulgaris、Pseudomonas aeruginosa、Rothia dentocariosa、Rothia mucilaginosa、Selenomonas noxia、Selenomonas sp. OT 478、Selenomonas sputigena、Serratia marcescens、Serratia marcescens subsp. marcescens、Solobacterium moorei、SR1 sp. OT 345、Staphylococcus aureus、Staphylococcus epidermidis、Stenotrophomonas maltophilia、Streptococcus agalactiae、Streptococcus anginosus、Streptococcus constellatus、Streptococcus dentisani、Streptococcus gordonii、Streptococcus intermedius、Streptococcus mitis、Streptococcus mutans、Streptococcus parasanguinis、Streptococcus pneumoniae、Streptococcus pyogenes、Streptococcus salivarius、Streptococcus sobrinus、Tannerella forsythia、Treponema denticola、Treponema medium、Treponema socranskii、Veillonella atypica、Veillonella parvula、Veillonella rogosae、総Streptococcus属の16SrRNA遺伝子を標的核酸とする場合、プローブ(x)は配列番号３〜１９１に示される塩基配列からなる群から選ばれる配列である。この場合、プローブは、配列番号３〜１９１に示される塩基配列からなる群から選ばれる配列の相補配列でもよく、配列番号３〜１９１に示される塩基配列からなる群から選ばれる配列またはこれの相補配列と実質的に同一の配列であってもよい。「実質的に同一の配列」の意義については、上記の通りである。
また本発明は、上記プローブ(x)〜(z)を搭載し、プローブ(x)が配列番号４３〜１９１に示される塩基配列からなる群から選ばれる配列、配列番号４３〜１９１に示される塩基配列からなる群から選ばれる配列の相補配列、または配列番号４３〜１９１に示される塩基配列からなる群から選ばれる配列もしくはこれの相補配列と実質的に同一の配列であるDNAチップを提供する。
【００５９】
本発明に用いられるプローブを下記の表１に示す。
表１
【表１−１】
2019225732.tif 000002
【表１−２】
2019225732.tif 000003
【表１−３】
2019225732.tif 000004
【００６０】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００６１】
本実施例では、試料中に含まれる多種類の細菌について、各細菌に由来する標的核酸（各標的核酸）の絶対量を決定した。具体的には、以下の通り、検量線の作成、プローブ間のシグナル強度の関係式の算出、および試料における標的核酸の絶対量の決定を行った。【００６２】
１．検量線の作成
標的核酸の一部および特定の核酸群の合計（検量用核酸）並びにコントロール核酸の、増幅前の量と増幅後の量に係る指標との関係について、検量線を作成した。具体的には、[（増幅後のコントロール核酸の量に係る指標）に対する（標的核酸の一部および特定の核酸群の合計の量に係る指標）の比]と［（増幅前のコントロール核酸の量）に対する（標的核酸の一部および特定の核酸群の合計の量）の比］との関係について、検量線を作成した。増幅前のコントロール核酸の量は既知であるため、この検量線に基づき、増幅前の全ての標的核酸および特定の核酸群の合計の量を決定することができる。
検量線の作成には、検量用核酸として、11種の細菌のゲノムDNAの混合液を用いた。使用した混合液の組成は表２に示す通りである。使用した各ゲノムDNAは、ATCC（登録商標）(American Type Culture Collection)から表２に記載のATCC番号のものを購入した。
標的核酸としては16SrRNA遺伝子を用いた。
【表２】
2019225732.tif 000005
上記の混合液（104pM）を、PCR反応液中の16SrRNA遺伝子の濃度の合計が、0.24pMと、その0.25n倍（n=1, 2, … ,9）になるようにPCR反応液に加えた。PCR反応液のその他の組成については、表３に示す通りである。総液量は20μLに調整した。各条件2反応ずつ行った。
【表３】
2019225732.tif 000006
【００６３】
ここで、各プライマーとコントロール核酸の配列は、それぞれ表４、５に示す通りであり、F（フォワード）プライマーは5´端がCy5修飾されたものである。表４の配列中のR、Yは混合塩基を示しており、RはAとG、YはCとTを示す。各プライマーは、各細菌の16SrRNA遺伝子のコンセンサス配列に結合するように設計されている。コントロール核酸は、増幅に必要な塩基配列と塩基がランダムに組み合わされた塩基配列とから構成された人工配列を含む核酸である（表５）。
【表４】
2019225732.tif 000007
【表５】
2019225732.tif 000008
【００６４】
また、用いたPCR用酵素はPremix Ex Taq（登録商標） Hot Start Version（TaKaRa）であり、酵素とバッファーを含めて2xの濃度で提供されているものを1xの濃度になるように調整して反応を行った。
PCR反応は、サーマルサイクラーで表６に示す条件で行った。
【表６】
2019225732.tif 000009
【００６５】
PCR終了後、それぞれの反応液(20μL全量)にハイブリダイゼーション反応液(1M Tris-HCl  48μL、1M NaCl 48μL、0.5% Tween20 20μL、Nuclease free water 64μL)を添加した。この液とDNAチップを用いて、自動ハイブリ洗浄装置(三菱ケミカル)にて、50℃で16時間ハイブリダイゼーションを行った。その後洗浄を行った。
本実施例で使用したDNAチップは、三菱ケミカル製のDNAチップであるジェノパール（登録商標）である。このDNAチップに搭載された、各細菌に特異的な配列にハイブリダイズするプローブ（プローブ(x)）は、配列番号３〜１８に示される塩基配列であり（表７）、全ての標的核酸および特定の核酸群の両方の増幅産物に共通してハイブリダイズするプローブ（プローブ(y)）およびコントロール核酸の増幅産物とハイブリダイズするプローブ（プローブ(z)）はそれぞれ配列番号２および１のものを用いた。ただし、Aggregatibacter actinomycetemcomitansおよびPrevotella intermedia由来の核酸の検出については、配列番号３と４に示される塩基配列のヌクレオチドの混合物および配列番号９と１０に示される塩基配列のヌクレオチドの混合物をそれぞれプローブとして用いた。これらの配列の5末端ビニル化オリゴDNAを、ジェノパールのプラットフォームを用いてアレイ化した (特許第6299660号)。
検出にはジェノパールリーダー(三菱ケミカル)を用いた。検出された蛍光シグナルを基に換算された数値データを解析に使用した。16SrRNA遺伝子の濃度の合計が0.24pMの0.25n倍(n=8, 9)の条件のものについては、濃度を変化させてもシグナル強度比が変化しないことから、定量下限以下と判断し、検量線の作成には用いなかった。【００６６】
11種の細菌のゲノムDNAの混合液およびコントロール核酸の増幅産物には、当該11種の細菌由来の全ての16SrRNA遺伝子（総16SrRNA遺伝子）とコントロール核酸の増幅産物とが含まれる。
総16SrRNA遺伝子にハイブリダイズするプローブ（配列番号２）のシグナル強度（増幅後の16SrRNA遺伝子の量を示す指標）をIT、コントロール核酸にハイブリダイズするプローブ（配列番号１）のシグナル強度をIC、増幅前の16SrRNA遺伝子の量をCT、増幅前のコントロール核酸の量をCCとし、これらを［式1：（log10( IT ÷ IC ) = a × log10( CT÷ CC ) ＋ b）］で近似した(図１)。Microsoft社のソフトウェアー「EXCEL」のLINEST関数を用いて近似直線の傾き、切片を求め、(式1)のパラメータについてa=0.389,  b=0.581と決定した。
この検量線により、増幅前の全ての標的核酸および特定の核酸群の合計の量を決定することが可能となった。この「増幅前の全ての標的核酸および特定の核酸群の合計の量」は、最終的に各細菌由来の標的核酸（各標的核酸）の絶対量を求める際に必要となる。【００６７】
２．プローブ間のシグナル強度の関係式の算出
後の試験において、「全ての標的核酸および特定の核酸群の合計」における各細菌由来の標的核酸（各標的核酸）の占有率に基づいて各標的核酸の絶対量を決定するためには、各標的核酸にハイブリダイズする各プローブ(x)のシグナル強度と「全ての標的核酸および特定の核酸群」にハイブリダイズするプローブ(y)のシグナル強度とを同じ式にあてはめて計算する必要がある。一方、プローブ(x)とプローブ(y)とは、シグナル強度の絶対値に違いが生じる可能性があるため、両者を同じ式にあてはめて計算するためには、両者のシグナル強度の関係式を得た上で、プローブ(x)のシグナル強度を、プローブ(y)のシグナル強度に相当する値に換算する必要がある。
そこで、本実施例では、14種の細菌（表７）のそれぞれに特異的な配列にハイブリダイズするプローブ（プローブ(x)）（配列番号３〜１８）のシグナル強度と、当該14種の細菌に由来する全ての16SrRNA遺伝子（総16SrRNA遺伝子）にハイブリダイズするプローブ（プローブ(y)）（配列番号２）のシグナル強度との関係式を、細菌の種類ごとに算出した。
使用した各ゲノムDNAは、ATCC（登録商標）(American Type Culture Collection)あるいはDSMZ(Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen Und Zellkulturen)から表７に記載の番号のものを購入した。
【表７】
2019225732.tif 000010
【００６８】
各ゲノムDNAそれぞれについて、以下の実験を行った。
まず、PCR反応液を、液中に含まれるゲノムDNAの重量が1pg、0.5pg、0.1gになるように調製した。その他の組成および液量は、上記「１．検量線の作成」と同様である。
上記「１．検量線の作成」と同様に、PCR反応、ハイブリダイゼーションおよび検出を行い、検出された蛍光シグナルを基に換算された数値データを解析に使用した。具体的には、上記14種の細菌に由来する全ての16SrRNA遺伝子のDNAをPCR反応により増幅し、DNAチップに搭載したプローブにハイブリダイズさせた。各細菌のそれぞれに特異的な塩基配列にハイブリダイズする各プローブ（プローブ(x)）のシグナル強度をIUS、総16SrRNA遺伝子にハイブリダイズするプローブ（プローブ(y)）のシグナル強度をITSとし、これらを［式5: ITS = ES× IUS］を用いて細菌の種類ごとに近似した。14種全ての細菌について、この関係式、すなわち各プローブ(x)のシグナル強度とプローブ(y)のシグナル強度との関係式を求めた。
代表してAggregatibacter actinomycetemcomitansとCampylobacter rectusのゲノムDNAにおける結果を図２に示す。Microsoft社のソフトウェアー「EXCEL」のLINEST関数で切片を0にするオプションを用いて近似直線の傾きを求めた結果、(式5)のパラメータESについては、表８に示す通りに決定された。
【表８】
2019225732.tif 000011
【００６９】
３．試料における標的核酸の絶対量の決定
成人健常者（被験者）1名の協力により唾液評価試験を実施した。
唾液は、起床後のものを採取し、ビーズ破砕、プロテイナーゼK(QIAGEN)による処理およびQIAamp 96 DNA Blood Kit(QIAGEN)によるDNA抽出を行った。唾液から抽出したDNAには、測定対象となる上記14種の細菌のゲノムDNA、測定対象となる細菌以外の細菌のゲノムDNAおよびその他のDNAが含まれる（図４Ａ）。【００７０】
抽出したDNAの濃度をNanoDrop（商標）（Thermo Fisher Scientific）で測定し、測定濃度に基づき、PCR反応液を、液中に含まれる抽出DNAの重量が100pgになるように調製した。その他の組成および液量は、上記「１．検量線の作成」と同様である。
上記「１．検量線の作成」と同様に、PCR反応、ハイブリダイゼーション、検出を行い、検出された蛍光シグナルを基に換算された数値データを解析に使用した。
唾液試料から抽出したDNAおよびコントロール核酸の増幅産物には、(i) 測定対象となる上記14種の細菌由来の16SrRNA遺伝子（標的核酸）、(ii) 測定対象となる細菌以外の細菌由来の16SrRNA遺伝子であって、全ての標的核酸の増幅により標的核酸と一括して増幅される特定の核酸群（特定の核酸群）、並びに(iii) 増幅されたコントロール核酸が含まれる（図４Ｂ）。
上記(i)と(ii)との合計は、上記「全ての標的核酸および特定の核酸群の合計」又は「総16SrRNA遺伝子」に該当する。【００７１】
総16SrRNA遺伝子のプローブのシグナル強度ITMと、「１．検量線の作成」で求めたパラメータから、式3［CTM = CC ×10^((log10(ITM÷ICM )-0.581)÷0.389)］に従って、PCR反応液中に加えた総16SrRNA遺伝子の物質量（mol）CTMを算出し（図４Ｃ）、これにアボガドロ数を乗じてコピー数を算出した。抽出工程およびPCR反応液調製工程での希釈率に基づき、唾液1mL中の総16SrRNA遺伝子のコピー数を算出した。
続いて、各菌に特異的にハイブリダイズする各プローブ（x）のシグナル強度IUSと、「２．プローブ間のシグナル強度の関係式の算出」で求めたパラメータおよび上記唾液1mL当たりの総16SrRNA遺伝子のコピー数とから、式6（ITSM =ES × IUSM）および 式7（RS = ITSM ÷ ITM）にしたがって各菌の16SrRNA遺伝子のコピー数を算出した（図４Ｄ）。
算出された、唾液1mL当たりの各16SrRNA遺伝子のコピー数は表９に示した通りである。
【表９】
2019225732.tif 000012
【実施例２】
【００７２】
本実施例では、実施例１とは異なる条件で、検量線の作成を行った。【００７３】
検量用核酸として使用した混合液の組成は、実施例１と同一である。
上記の混合液を、PCR反応液中の16SrRNA遺伝子の濃度の合計が、24pMと、その(1/16)n倍(n=1, 2, … ,5)になるようにPCR反応液に加えた。PCR反応液のその他の組成については、表１０に示す通りである。総液量は20μLに調整した。各条件1反応ずつ行った。
【表１０】
2019225732.tif 000013
【００７４】
ここで、各プライマーとコントロール核酸の配列は、それぞれ表１１、１２に示す通りであり、Fプライマーは5´端がCy5修飾されたものである。表１１の配列中のIはイノシンを示す。
【表１１】
2019225732.tif 000014
【表１２】
2019225732.tif 000015
【００７５】
PCR反応は、サーマルサイクラーで表１３に示す条件で行った。
【表１３】
2019225732.tif 000016
【００７６】
実施例１の「１．検量線の作成」と同様にハイブリダイゼーション、検出を行い、検出された蛍光シグナルを基に換算された数値データを解析に使用した。
総16SrRNA遺伝子にハイブリダイズするプローブ（配列番号２）のシグナル強度をIT、コントロール核酸にハイブリダイズするプローブ（配列番号１）のシグナル強度をIC、増幅前の16SrRNA遺伝子の量をCT、増幅前のコントロール核酸の量をCCとし、これらを［式1：（log10( IT ÷ IC ) = a × log10( CT ÷ CC ) ＋ b）］で近似した(図３)。Microsoft社のソフトウェアー「EXCEL」のLINEST関数を用いて近似直線の傾き、切片を求め、(式1)のパラメータについてa=0.730,  b=1.85と決定した。【００７７】
本実施例１、２により、本発明の方法が、試料に含まれる多種類の標的核酸の絶対量を、同時にかつ簡便に決定することができることが示された。また、本発明の方法では、コントロール核酸としては一種類の核酸を用いればよく、複数種類のコントロール核酸を用いる必要はないことが示された。
【実施例３】
【００７８】
本実施例では、実施例１とは異なる条件で、試料中に含まれる細菌について、各細菌に由来する標的核酸（各標的核酸）の絶対量を決定した。組成が既知の標準サンプルを試料として使用し、測定値と理論値の比較を行った。【００７９】
１.検量線の作成
検量線の作成には、検量用核酸として、市販されている20 Strain Even Mix Genomic Material (ATCC（登録商標） MSA-1002 TM)および20 Strain Staggerd Mix Genomic Material (ATCC（登録商標） MSA-1003 TM)、さらに、表１４に示す組成の7種の細菌のゲノムDNAの混合液を加えた合計3種の溶液を標準サンプルとした。
【表１４】
2019225732.tif 000017
【００８０】
上記標準サンプルを表１５に示す条件（鋳型濃度、反復数(N数)）でPCR反応を行い、得られたPCR産物を用いてDNAチップによる測定を行った。PCR反応液の検量用核酸以外の組成については、表１６に示す通りである。
【表１５】
2019225732.tif 000018
【表１６】
2019225732.tif 000019
【００８１】
ここで、使用するプライマーは実施例２と同様であり、コントロール核酸の塩基配列は表１７に示す通りである。
【表１７】
2019225732.tif 000020
【００８２】
PCR反応は、サーマルサイクラーで実施例１の「１.検量線の作成」と同様の条件で行った。本実施例で使用したDNAチップは、実施例１と同様の構成であるが、各細菌に特異的な配列にハイブリダイズするプローブ（プローブ(x)）にActinomyces odontolyticus用プローブ（配列番号１９）およびStreptococcus mutans用プローブ（配列番号３８）を追加搭載したものを新たに調製した。【００８３】
実施例１の「１．検量線の作成」と同様にハイブリダイゼーションおよび検出を行い、検出された蛍光シグナルを基に換算された数値データを解析に使用した。
総16SrRNA遺伝子にハイブリダイズするプローブ（配列番号２）のシグナル強度をIT、コントロール核酸にハイブリダイズするプローブ（配列番号１）のシグナル強度をIC、増幅前の16SrRNA遺伝子の量をCT、増幅前のコントロール核酸の量をCCとし、これらを[式2：log10( IT÷ IC ) = b × ( log10( CT ÷ CC ) - c ) ÷ ( a - |log10( CT÷ CC ) - c| )
]で近似した(図５)。Microsoft社のソフトウェアー「EXCEL」の「ソルバー」という機能を用いて近似式を作成し、(式2)のパラメータについてa=8.07, b=3.43, c=0.119と決定した。また、得られるシグナル強度は、使用した検量用核酸の種類によらず、ほぼ同一曲線上にプロットされることが確認できた。【００８４】
２.プローブ間のシグナル強度の関係式の算出
ここでは、3種の細菌（表１８）のそれぞれに特異的な塩基配列にハイブリダイズするプローブ（プローブ(x)）（配列番号８、１９、３８）のシグナル強度と、当該3種の細菌に由来する全ての16SrRNA遺伝子（総16SrRNA遺伝子）にハイブリダイズするプローブ（プローブ(y)）（配列番号２）のシグナル強度との関係式を、細菌の種類ごとに算出した。
使用したDNAは、表１８で説明する塩基配列の合成核酸である。
【表１８】
2019225732.tif 000021
【００８５】
当該3種の細菌の各DNAそれぞれについて、以下の実験を行った。
まず、PCR反応液を、液中に含まれるDNAの物質量が0.5amol、0.05amol、0.005amolになるように調製した。その他の組成および液量は、本実施例の上記「１．検量線の作成」と同様である。【００８６】
本実施例の上記「１．検量線の作成」と同様に、PCR反応、ハイブリダイゼーションおよび検出を行い、検出された蛍光シグナルを基に換算された数値データを解析に使用した。
具体的には、上記3種のDNAをPCR反応により増幅し、DNAチップに搭載したプローブにハイブリダイズさせた。各細菌のそれぞれに特異的な塩基配列にハイブリダイズする各プローブ（プローブ(x)）のシグナル強度をIUS、総16SrRNA遺伝子にハイブリダイズするプローブ（プローブ(y)）のシグナル強度をITSとし、これらを［式5: ITS = ES× IUS］を用いて細菌の種類ごとに近似した。3種全ての細菌について、この関係式、すなわち各プローブ(x)のシグナル強度とプローブ(y)のシグナル強度との関係式を求めた。
3種のDNAにおける結果を図６に示す。Microsoft社のソフトウェアー「EXCEL」のLINEST関数で切片を0にするオプションを用いて近似直線の傾きを求めた結果、(式5)のパラメータESについては、表１９に示す通りに決定された。
【表１９】
2019225732.tif 000022
【００８７】
３．試料における標的核酸の絶対量の決定
既知濃度のサンプルとして20 Strain Even Mix Genomic Material (ATCC（登録商標） MSA-1002TM)を用いて、定量性の検証を実施した。このサンプルに含まれる上記表１８の3菌のゲノムDNAのコピー数は、それぞれ全体の5%であることが分かっている。すなわち、このゲノムDNAの組成情報と、各菌のゲノムDNAの1ゲノム内の16SrRNAのコピー数、ゲノムサイズ等の情報から、このサンプルの重量あたりの各菌のゲノムDNAのコピー数の理論値を計算することが可能である。【００８８】
PCR反応液を、液中に含まれるサンプルDNAの重量が211pgになるように調製した。その他の組成および液量は、上記「１．検量線の作成」と同様である。
上記「１．検量線の作成」と同様に、PCR反応、ハイブリダイゼーション、検出を行い、検出された蛍光シグナルを基に換算された数値データを解析に使用した。
総16SrRNA遺伝子のプローブのシグナル強度ITMと、「１．検量線の作成」で求めたパラメータから、式4［CTM = CC × 10 ^ ( 8.43×log10(ITM÷ICM )  ÷  (3.43 + | log10(ITM÷ICM )|) + 0.119 )］に従って、PCR反応液に加えた総16SrRNA遺伝子の物質量（mol）CTMを算出し（図４Ｃ）、これにアボガドロ数を乗じてコピー数を算出した。
続いて、各菌に特異的にハイブリダイズする各プローブ（x）のシグナル強度IUSと、「２．プローブ間のシグナル強度の関係式の算出」で求めたパラメータおよび上記で算出された総16SrRNA遺伝子のコピー数とから、式6（ITSM = ES × IUSM）および 式7（RS = ITSM ÷ ITM）にしたがって各菌の16SrRNA遺伝子のコピー数を算出した（図４Ｄ）。
さらに、算出した３菌の16SrRNA遺伝子のコピー数とそれぞれの菌の1ゲノム内の16SrRNAのコピー数（それぞれGenbankのIDがAP009380.1、NZ_DS264586.1、AE014133.2の配列のアノテーション情報を参照）から、各菌のゲノムDNAのコピー数を算出した。総ゲノムDNAのコピー数については、サンプルとして用いた20 Strain Even Mix Genomic Material (ATCC（登録商標） MSA-1002TM)の菌組成の加重平均値である5.25を用いて算出した。【００８９】
PCR反応液に加えた各ゲノムDNAのコピー数の測定値と理論値を表２０に示した。Actinomyces odontolyticusを除き、測定値は理論値の差は２倍程度の誤差範囲内で一致した。
【表２０】
2019225732.tif 000023
上記結果から、本発明の方法は、高い精度で試料中の2種以上の標的核酸の絶対量を決定することができることが示された。
【実施例４】
【００９０】
本実施例では、PCR増幅後にλエキソヌクレアーゼ処理を加え、絶対量を決定し、理論値との比較を行った。【００９１】
１.検量線の作成
検量線の作成には、検量用核酸として、市販されている20 Strain Even Mix Genomic Material (ATCC（登録商標） MSA-1002TM)を用いた。上記の溶液を、PCR反応液中の16SrRNA遺伝子の濃度の合計が、1.60pMと、その0.25n倍（n=1, 2, … ,8）になるようにPCR反応液に加えた。PCR反応液のその他の組成については、実施例３と同様である。総液量は20μLに調整した。各条件1反応ずつ行った。【００９２】
ここで、使用するFプライマーとコントロール核酸は実施例３と同様である。ただし、Rプライマーは実施例３と同じ配列を有し、5´端がリン酸化されたものを用いた。
実施例３と同様にPCR反応を行った後、λエキソヌクレアーゼ処理の反応液を、PCR反応液全量を用いて表２１に示す組成で、総液量50μLに調整した。λエキソヌクレアーゼ処理の反応はサーマルサイクラーで表２２に示す条件で行った。用いたλエキソヌクレアーゼとバッファーはNEW ENGLAND BioLabs社製のものである。
【表２１】
2019225732.tif 000024
【表２２】
2019225732.tif 000025
【００９３】
λエキソヌクレアーゼによる反応終了後、それぞれの反応液(50μL全量)にハイブリダイゼーション反応液(1M Tris-HCl  48μL、1M NaCl 48μL、0.5% Tween20 20μL、Nuclease free water 34μL)を添加した。この液とDNAチップを用いて、自動ハイブリ洗浄装置(三菱ケミカル)にて、50℃で16時間ハイブリダイゼーションを行った。その後洗浄を行った。DNAチップは実施例３と同じものを使用した。
実施例３の「１．検量線の作成」と同様に検出を行い、検出された蛍光シグナルを基に換算された数値データを解析に使用した。(式2)での近似も実施例３の「１．検量線の作成」と同様に行い(図７)、パラメータについてa=7.29, b=2.94, c=0.0746と決定した。【００９４】
２.プローブ間のシグナル強度の関係式の算出
ここでは、実施例３で定量した3種の細菌（表１８）のそれぞれに特異的な配列にハイブリダイズするプローブ（プローブ(x)）（配列番号８、１９、３８）のシグナル強度と、当該3種の細菌に由来する全ての16SrRNA遺伝子（総16SrRNA遺伝子）にハイブリダイズするプローブ（プローブ(y)）（配列番号２）のシグナル強度との関係式を、細菌種ごとに算出した。すなわち、PCR反応後のλエキソヌクレアーゼ処理およびハイブリダイゼーション反応液の添加を上記「１.検量線の作成」と同様に、その他は実施例３の「2.プローブ間のシグナル強度の関係式の算出」と同様に行い、3種全ての細菌について、各プローブ(x)のシグナル強度とプローブ(y)のシグナル強度との関係式を求めた。
3種の細菌のDNAにおける結果を図８に示す。(式5)のパラメータESは、表２３に示す通りに決定した。
【表２３】
2019225732.tif 000026
【００９５】
３．試料における標的核酸の絶対量の決定
標準サンプルとして市販されている20 Strain Even Mix Genomic Material (ATCC（登録商標） MSA-1002TM)の定量実験を実施した。
PCR反応後のλエキソヌクレアーゼ処理およびハイブリダイゼーション反応液の添加を上記「1.検量線の作成」と同様に、その他は実施例３の「３．試料における標的核酸の絶対量の決定」と同様に行い、3種全ての細菌について、各菌のゲノムDNAのコピー数を算出した。
PCR反応液中の各ゲノムDNAのコピー数の算出された測定値と理論値は表２４に示した通りである。
【表２４】
2019225732.tif 000027
【００９６】
上記結果においては、コピー数の測定値と理論値との差が小さい（測定値/理論値が１に近い）ほど絶対量測定の精度が高いことを示す。
上記結果から、本発明の方法は、増幅後の核酸を片鎖（１本鎖）に富化する工程を含むことにより、実施例３の結果（表２０）と比較してさらに高い精度で試料中の2種以上の標的核酸の絶対量を決定することができることが示された。特に、実施例４におけるActinomyces odontolyticusの標的核酸の絶対量の決定においては、実施例３の結果（表２０）と比較して、絶対量の測定の精度が顕著に向上することが認められた。
【実施例５】
【００９７】
本実施例では、PCR反応条件を一部変更し、実施例３と同様に理論値との比較を行った。
１.検量線の作成
検量線の作成に用いた検量用核酸、PCR反応液の組成、使用したプライマーとコントロール核酸は、実施例４と同様である。
PCR反応をサーマルサイクラーで表２５に示す条件で行った後、実施例1の「１．検量線の作成」と同様にハイブリダイゼーションおよび検出を行い、検出された蛍光シグナルを基に換算された数値データを解析に使用した。DNAチップは実施例３と同じものを使用した。
【表２５】
2019225732.tif 000028
【００９８】
(式2)での近似を実施例３の「１．検量線の作成」と同様に行い(図９)、パラメータについてa=4.74, b=0.834, c=-0.593と決定した。【００９９】
２.プローブ間のシグナル強度の関係式の算出
ここでは、実施例３で定量した3種の細菌（表１８）のうち2菌、Actinomyces odontolyticusとStreptococcus mutansについてそれぞれに特異的な配列にハイブリダイズするプローブ（プローブ(x)）（配列番号１９、３８）のシグナル強度と、当該2種の細菌に由来する全ての16SrRNA遺伝子（総16SrRNA遺伝子）にハイブリダイズするプローブ（プローブ(y)）（配列番号２）のシグナル強度との関係式を、細菌種ごとに算出した。すなわち、PCR反応を上記「１.検量線の作成」と同様に、その他は実施例３の「２.プローブ間のシグナル強度の関係式の算出」と同様に行い、2種の細菌について、各プローブ(x)のシグナル強度とプローブ(y)のシグナル強度との関係式を求めた。
2種のDNAにおける結果を図１０に示す。(式5)のパラメータESは、表２６に示す通りに決定した。
【表２６】
2019225732.tif 000029
【０１００】
３．試料における標的核酸の絶対量の決定
標準サンプルとして市販されている20 Strain Even Mix Genomic Material (ATCC（登録商標） MSA-1002TM)の定量実験を実施した。
PCR反応を上記「１.検量線の作成」と同様に、その他は実施例３の「３．試料における標的核酸の絶対量の決定」と同様に行い、2種の細菌について、各菌のゲノムDNAのコピー数を算出した。
PCR反応液中の各ゲノムDNAのコピー数の算出された測定値と理論値は表２７に示した通りである。
【表２７】
2019225732.tif 000030
【０１０１】
上記結果から、本発明の方法は、実施例３の結果（表２０）と比較して、さらに高い精度で試料中の2種以上の標的核酸の絶対量を決定することができることが示された。特に、実施例５におけるActinomyces odontolyticusの標的核酸の絶対量の決定においては、実施例３の結果（表２０）と比較して、絶対量測定の精度が顕著に向上することが認められた。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本発明によれば、簡便な方法で多種類の標的核酸のそれぞれ（各標的核酸）について絶対定量が可能である。
【配列表フリーテキスト】
【０１０３】
配列番号１〜１９９：合成DNA
【図１】
2019225732.tif 000031
【図２】
2019225732.tif 000032
【図３】
2019225732.tif 000033
【図４Ａ】
2019225732.tif 000034
【図４Ｂ】
2019225732.tif 000035
【図４Ｃ】
2019225732.tif 000036
【図４Ｄ】
2019225732.tif 000037
【図５】
2019225732.tif 000038
【図６】
2019225732.tif 000039
【図７】
2019225732.tif 000040
【図８】
2019225732.tif 000041
【図９】
2019225732.tif 000042
【図１０】
2019225732.tif 000043
【配列表】
2019225732000001.app
【国際調査報告】
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2019225732.tif 000045
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