(57)【要約】【課題】真菌感染症の一つであるカンジダ症の起因菌のカンジダ種を迅速に同定できる方法の開発。【解決手段】  １つのユニバーサルプライマーセットと３つの不完全なマッチプローブを使用して、リアルタイムＰＣＲを行い、３つのＴｍ値を生成し、それらをデータベースに登録されたデータと比較することにより、８種のカンジダ種を同定することができる。  従って、本発明の方法は、カンジダ症のカンジダ種の迅速な同定方法として有用である。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
カンジタ菌の同定方法であって、下記（１）〜（４）の工程を有することを特徴とするカンジタ菌の同定方法。
（１）血液などの検体からカンジタ菌のＤＮＡを抽出する工程。
（２）抽出したカンジダ菌ＤＮＡを鋳型とし、カンジダ菌のユニバーサルプライマー１セットおよび不完全なマッチプローブ３種を用いてＰＣＲを行う工程。
（３）不完全なマッチプローブの融解温度（Ｔｍ）値を取得する工程。
（４）Ｔｍ値をデータベースと照合する工程。
【請求項２】
前記工程（２）のユニバーサルプライマーがカンジタ菌の１８ＳリボソームＲＮＡの保存領域に設計されたものであり、３種の不完全なマッチプローブがユニバーサルプライマーで増幅されたＰＣＲアプリコンに対して設計されたものである請求項１に記載のカンジタ菌の同定方法。
【請求項３】
前記工程（２）の不完全のマッチプローブが、２０〜３５塩基、かつ、ミスマッチ数が１５以下である請求項２に記載のカンジタ菌の同定方法。
【請求項４】
カンジタ菌の１８ＳリボソームＲＮＡの保存領域に対して設計されたユニバーサルプライマーで増幅されたＰＣＲアプリコンをターゲットとするに対して設計された２０〜３５塩基、かつ、ミスマッチ数が１５以下の不完全のマッチプローブ。
【請求項５】
塩基配列が、配列番号２〜配列番号４のいずれかである不完全のマッチプローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、不完全なマッチプローブ（imperfect-match probes：ＩＭプローブ）を用いたカンジダ菌の迅速同定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カンジダ種は、浸潤性真菌感染症の最も一般的な生物であり、局所粘膜感染から多系統臓器不全による広範な播種を引き起こす。
最近、大手術、特に腹部手術、透析および免疫抑制剤などの医学の進歩のために、侵襲性カンジダ症が増加しており、米国では院内血流感染の第4位の原因である。
カンジダ血症は関連死亡率が２５％以上であり、初期の適切な抗真菌療法は粗死亡率を有意に低下させる。
しかし、血液培養は確定するまでに2〜5日かかるため、治療の実施が大幅に遅れる。
また、カンジダ種については感受性に応じた治療を目標とするために迅速かつ正確な情報を必要とする。【０００３】
真菌感染において、いくつかの研究では、融解Ｔｍ値（二本鎖ＤＮＡの50%が解離して一本鎖ＤＮＡになる温度（Melting temperature）の値)を用いてカンジダ種の迅速な同定が報告されている（非特許文献１、２）。
これらの報告では、1つのプライマーセットの分析を使用し、カンジダ血症の臨床検体での評価も行われている。
また、全ての細菌に共通な塩基配列領域をターゲットとして設計した細菌ユニバーサルプライマーを用い、得られた7つのＰＣＲ増幅産物のＴｍ値を測定し、その7つのＴｍ値の組合せ（＝菌種による塩基配列の相違を反映する）を菌の指紋（finger print）として、データベースとの照合により同定する方法（Ｔｍマッピング法）が報告されている。（特許文献１、２）
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】WO2007/097323号公開パンフレット
【特許文献２】WO2010/082640号公開パンフレット
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Decat E et.al. Res Microbiol. 2013;164:110-117.
【非特許文献２】Nemcova E et.al. PLoS One. 2015;10:e0116940.
【非特許文献３】Neely LA et.al. Sci Transi Med. 2013;24:182ra54.
【非特許文献４】Mylonakis E et.al. Clin Infect Dis. 2015;60:892-899.
【非特許文献５】Chakravorty S et. al. J Clini Microbiol. 2010;48:258-267.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
Ｔｍマッピング法は、７種のプライマーセットの融解温度（Ｔｍ）を用いることによって100種以上の細菌種を同定することができ、3時間以内に結果が得られる。
しかし、カンジダ種はヒトのような真核生物種であるため、真菌特異的プライマーを細菌よりも設計することは難しい。
さらに、複雑さ、高価格などのために、各カンジダ種に特異的なプライマーを調製することは面倒である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ＤＮＡプローブの一種である分子ビーコン技術（Sloppy Molecular Beacon；SMB）を利用した融解温度シグネチャー技術（Sloppy Molecular Beacon Melting Temperature Signature）を用いた細菌単離物の迅速な同定が報告されている（非特許文献５）。
この報告では、6つのＴｍ値を細菌分離株のシグネチャーとして使用し、６次元空間における２点間の距離としてＴｍ値を用いて細菌分離株を同定しようと試みがなされている。
ＳＭＢ融解温度シグネチャー技術におけるＴｍの変動は、不規則な分子ビーコンハイブリダイゼーションにおけるプローブ −標的ミスマッチの数および位置に依存する。【０００８】
発明者らは、ＤＮＡプローブの一種である分子ビーコン技術に着目し、ＰＣＲ伸長中に加水分解しない消光プローブの適応を試みた。
該消光プローブは日本のＤＮＡデータバンクで報告されたカンジダ種で十分に評価され、同じカンジダ種の複数の変異株の間で変異がない（＝塩基配列が全く同じ）場所に対応して作成した。
また、消光プローブは二次構造を形成することで自己消光する傾向があるため、デルタＧ値で二次構造を取らない最適プローブを選択した。
さらに研究を進め、３つの消光プローブによるＴｍ値の組み合わせにより、カンジダ種を同定できることを見出し、本発明を完成するに至った。
以下、本発明を詳細に説明する。【０００９】
本発明の不完全なマッチプローブを用いたカンジダ菌の迅速同定法とは、以下の工程で行うカンジダ菌の迅速同定方法である（図１）。
（１）血液などの検体からカンジダ菌のＤＮＡを抽出する工程。
（２）抽出したカンジダ菌ＤＮＡを鋳型とし、カンジダ菌のユニバーサルプライマーセットおよび３種の不完全なマッチプローブを用いてＰＣＲを行う工程。
（３）不完全なマッチプローブの融解温度（melting temperature：Ｔｍ）値を取得する工程。
（４）Ｔｍ値をデータベースと照合する工程。
によりカンジダ菌を同定する方法。【００１０】
・工程（１）：血液などの検体からカンジダ菌のＤＮＡを抽出する工程。
臨床試料（２ｍＬの全血試料など）からＰＣＲ用鋳型としてカンジダ菌ＤＮＡを直接抽出する。
抽出方法は、特に限定されず、臨床試料の採取、ＤＮＡ抽出などは公知の方法を用いればよい。
ここで、細菌核酸等の抽出効率を高めるビーズ法を併用することが好ましい。【００１１】
・工程（２）：抽出したカンジダ菌ＤＮＡを鋳型とし、カンジダ菌のユニバーサルプライマーセットおよび３種の不完全なマッチプローブを用いてＰＣＲを行う工程。
この工程で用いられるカンジダ菌のユニバーサルプライマーセットは、1セットであればよく、例えば、カンジダ菌の１８ＳリボゾームＲＮＡ（１８Ｓ  ｒＲＮＡ）の保存領域にハイブリダイズする20〜25塩基のオリゴヌクレオチドがセットとなったプライマーが挙げられる。
不完全なマッチプローブは、カンジダ菌の１８ＳリボゾームＲＮＡ（１８Ｓ  ｒＲＮＡ）の保存領域を増幅したＰＣＲアプリコンに対する３つの消光機能を有する２０〜３５塩基のオリゴヌクレオドである。
３つのプローブにおいて、一つのプローブのミスマッチ数は、１〜１２であるが、本発明では、３つのプローブの全てにミスマッチがある必要はなく、例えば、一つのプローブに３つのミスマッチがあれば、他の二つのプローブにミスマッチなくてもよい場合も含むものである【００１２】
本工程のＰＣＲに用いられる熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲ阻害物質によるＰＣＲ効率の低下防止のため、例えば、超好熱菌Thermococcus kodakarensis ＫＯＤ１株由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ）が好ましい。
ＰＣＲは、例えば、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ、順方向プライマー、逆方向プライマーおよび各プローブを含む混合物用い、９８℃で１０秒間変性、５７℃で３０秒間アニーリング、７２℃で２０秒間伸長、８２℃で２秒間の蛍光捕捉といったサイクルを５０サイクル前後行えばよい。【００１３】
・工程（３）：不完全なマッチプローブの融解温度（melting temperature：Ｔｍ）値を取得（分析）する工程。
例えば、ＰＣＲ後のＴｍ値分析は、４０℃〜９５℃で１℃/ステップで増加させて行う。 続いて使用したＴｍ値分析機器付属の解析プログラム（例えばＲｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  Ｑソフトウェアプログラム、など）を用いてデータプロファイルを分析し、Ｔｍ値を取得すればよい。【００１４】
・工程（４）：Ｔｍ値をデータベースと照合する工程。
各Ｔｍ値をデータベースと比較することにより、カンジダ種を同定する。
具体的には、Ｔｍ値の３回測定の平均値を表す８種のカンジダ種の予備データベース（図８）を作成し、目的のカンジダ種は、データベース中の既知のカンジダ種と最も近いマッチを見つけることによって同定する。
ここで、識別プログラムは、各Ｔｍ値を３次元空間内の単一点として表現するために作成される。
その点と既知のカンジダ種のそれぞれについて決定された点との間の距離を計算して、一連の距離指標、または差値（Ｄ値）を生成する（図３）。【００１５】
本発明のカンジダ菌の迅速同定法の工程（２）に用いるカンジダ菌ユニバーサルプライマーは、カンジダ菌の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を普遍的に増幅するように設計すればよい。例えば、マルチアラインメントソフトウェアプログラム（Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘ）を用いて設計し、化学合成すればよい。
この工程で用いられるカンジダユニバーサルプライマーセットは、１セットであればよく、例えば、カンジダ菌の１８ＳリボゾームＲＮＡ（１８Ｓ  ｒＲＮＡ）の保存領域に対応する２０〜２５塩基のオリゴヌクレオチドがセットとなったプライマーが挙げられる。
具体的なプライマーは以下とおりである。
・順方向：5'-CTTTCGATGGTAGGATAGTGG-3 '：配列番号１
［21bp、C.albicans 18S rRNA（アクセッション番号AF114470）遺伝子由来のヌクレオチド210-230］
・逆方向：5'-GCTTTCGCAGTAGTTAGTCTTC-3'：配列番号２
［22bp、C.albicans 18S rRNA（アクセッション番号AF114470）遺伝子由来のヌクレオチド802-823］【００１６】
不完全なマッチプローブ法に用いる消光プローブ（imperfect-match quenching probes：ＩＭＱプローブ）の「消光プローブ」とは、励起された蛍光色素から放出される蛍光を「クエンティング：消光」する機能を持つ２０〜３５塩基のオリゴヌクレオドを意味する。
３種のプローブにおいて、１つのプローブのミスマッチ数は、１〜１２であるが、本発明では、３種のプローブの全てにミスマッチがある必要はなく、例えば、一つのプローブ３つのミスマッチがあれば、他の２つのプローブにミスマッチなくてもよい場合も含むものである。
ＩＭＱプローブは、例えば、カンジダ菌１８Ｓ  ｒＲＮＡ（アクセッション番号AF114470）複数の部位を選び、マルチアラインメントソフトウェアプログラム（Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘ）を用いて設計し、化学合成すればよい。【００１７】
具体的なＩＭＱプローブは、以下のとおりである。
＜プローブ１＞
・5'-CTTTCCTTCTGGGTAGCCATTT--3'：配列番号３
［22bp、C.albicans 18S rRNA（アクセッション番号AF114470）遺伝子のヌクレオチド585-607部位に結合（プローブは不完全一致の塩基配列）］
＜プローブ２＞
・5'-TGGAATAATAGAATAGGACGTTATGGTTC-3'：配列番号４
［29bp、C.albicans 18S rRNA（アクセッション番号AF114470）遺伝子のヌクレオチド679-708部位に結合（プローブは不完全一致の塩基配列）］
＜プローブ３＞
・5'-GCATCAGTAATCAGTTGTCAGAGGAGAAATTC-3'：配列番号５
［32bp、C.albicans 18S rRNA（アクセッション番号AF114470）遺伝子のヌクレオチド758-790部位に結合（プローブは不完全一致の塩基配列）］
【発明の効果】
【００１８】
本発明のカンジダ菌の同定方法の検出・同定感度は、1.2 CFU C.albicans/PCR Tubeである（図９）。
データベースに登録されたカンジダ８菌種の菌株を健常者血液に混入したカンジダ血症疑似血液検体を作成し、本発明方法にてカンジダ菌種の検出・同定を行った（図１０）。
その結果、カンジダ８菌種全てで正確に同定することが出来た。
実際のカンジダ血症患者の血液検体１５検体（３菌種）を用い、本発明方法にてカンジダ菌種の迅速同定を行った（図１１）。
その結果、１５検体全てにおいて、採血後３．５時間程度でカンジダ菌種を正確に検出・同定することが出来た。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明のカンジタ菌の同定方法の概要図である。
【図２】本発明のカンジタ菌の同定方法におけるカンジダ菌属のユニバーサル・プライマーおよびプローブの設計に係る概要図である。
【図３】Ｄ値を説明する図である。３つのＴｍ値を３次元の１点の位置として、データベース中の既知のカンジダ菌との２点間の距離を“Difference Value”として表す。この値がゼロに近い程、検出菌がデータベース中のカンジダ菌種と一致することを意味する。
【図４】８種のカンジダ菌種における３つのプローブのＴｍ値の相違を示す図である。
【図５】８つのカンジダ菌種でそれぞれ異なるＴｍ値の組み合わせが出来ることを示す図である。
【図６】具体的なプローブおよびプローブ配列を説明する表（表１）である。
【図７】８種のカンジダ菌種における，３つのプローブそれぞれの塩基配列ミスマッチの位置と数を説明する表（表２）である。
【図８】データベース中の８種のカンジダ菌種の各プローブでのＴｍ値の表（表３）である。
【図９】本発明のカンジタ菌の同定方法の検出・同定感度の確認実験を示す表（表７）である。
【図１０】カンジダ血症疑似血液検体を用い、カンジダ８菌種の同定を行った結果を示す表（表８）である。
【図１１】カンジダ血症患者の血液検体１５検体を用い、本発明方法にてカンジダ菌種の迅速同定を行った結果を示す表（表９）である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
次に、本発明の不完全なマッチプローブを用いたカンジダ菌の同定法を実施例で説明する。
なお、本発明に係るプローブをＩＭＱプローブ（imperfect-match quenching probes）と表現した。全体の流れ（ワークフロー）を図１に示す。
カンジダ株は、富山大学病院で患者の血液、喀痰および尿培養分離株からカンジダ株を得、それから配列決定して種レベルで同定した。
血液検体は、富山大学病院と流杉病院において、カンジダ血症患者から採取した全血であり、以下の実施例のすべての手技は、富山大学倫理委員会および流杉病院倫理委員会の承認並びにすべての患者から文書による同意を得て行われ、また実施例の方法は、承認されたガイドラインに従って実施された。
【実施例１】
【００２１】
＜培養物からのカンジダＤＮＡの抽出＞
カンジダコロニーを滅菌接種ループで採取し、分子レベル等級の蒸留水（分子生物学のために脱イオンおよび滅菌した蒸留水、NACALAI TESQUE INC Kyoto Japan；以下、蒸留水）１ｍＬに懸濁した。
その後、試料を20,000×gで10分間遠心分離し、ペレットを失わないように上清900μLを注意深く除去した。製品付属説明書の指示に従って、ＤＮＡ抽出キット（QIAamp UCP Pathogen Mini Kit、Qiagen、Germany）およびガラスビーズを用いて、得られたペレットからＤＮＡを単離した。最後に、100μLの溶出緩衝液でカンジダＤＮＡを溶出させた。【００２２】
＜全血からのカンジダＤＮＡの抽出＞
合計２ｍＬの静脈血をEDTA-2Kチューブ（NIPRO Osaka Japan）に採血した。
次いで、血液サンプルを100×gで5分間遠心分離して血液細胞を遠心分離し、得られた上清画分（１ｍＬ）を使用した。
上清を再び20,000×gで10分間遠心分離し、上清画分900μLを慎重に除去してペレットを妨げないようにした。
次に、蒸留水１ｍＬをペレットに加え、穏やかに上下逆さまにした後、20,000×gで5分間遠心分離した。
最後に、ペレットを再懸濁しないよう、上清画分１ｍＬを注意深く取り除いた。
製品付属説明書の指示に従って、ＤＮＡ抽出キットおよびガラスビーズを用いてペレットからＤＮＡを単離した。
最後に、100μLの溶出緩衝液でカンジダＤＮＡを溶出させた。【００２３】
＜ＰＣＲアッセイ＞
以下、標的ＤＮＡの増幅、リアルタイム検出、および不完全なマッチプローブのＴｍ値分析のためにRotor-Gene Q（Qiagen）を使用した。
すべてのＰＣＲアッセイは、１チューブに１ＰＣＲ、１プローブのアッセイとして行った。
RNaseおよびDNaseフリー（Eppendorf、Germany）のＰＣＲ用０．２ｍＬＰＣＲチューブ（Qiagen）である１．５ｍＬＰＣＲ専用エッペンドルフチューブを使用した。
公知の18SリボソームRNA遺伝子（18S rDNA）を標的とする真菌ユニバーサルプライマーを使用した（PLoS One. 2015;10:e0129032）。
多種の塩基配列アラインメントを作成するソフト（Clustal X）を用いてクエンチングプローブ（Qプローブ）を設計し、NIPPON STEEL SUMIKIN Eco-Tech Corporation（茨城、日本）において合成した。【００２４】
＜カンジダ菌属ユニバーサルプライマー＞
・順方向：5'-CTTTCGATGGTAGGATAGTGG-3 '
［21bp、C.albicans 18S rRNA（アクセッション番号AF114470）遺伝子由来のヌクレオチド210-230］ 
・逆方向：5'-GCTTTCGCAGTAGTTAGTCTTC-3'
［22bp、C.albicans 18S rRNA（アクセッション番号AF114470）遺伝子由来のヌクレオチド802-823］【００２５】
＜プローブ１＞
5'-CTTTCCTTCTGGGTAGCCATTT--3'
［22bp、C.albicans 18S rRNA（アクセッション番号AF114470）遺伝子のヌクレオチド585-607部位に結合（プローブは不完全一致の塩基配列）］
＜プローブ２＞
5'-TGGAATAATAGAATAGGACGTTATGGTTC-3'
［29bp、C.albicans 18S rRNA（アクセッション番号AF114470）遺伝子のヌクレオチド679-708部位に結合（プローブは不完全一致の塩基配列）］
＜プローブ３＞
5'-GCATCAGTAATCAGTTGTCAGAGGAGAAATTC-3'
［32bp、C.albicans 18S rRNA（アクセッション番号AF114470）遺伝子のヌクレオチド758-790部位に結合（プローブは不完全一致の塩基配列）］【００２６】
＜ＰＣＲ手順＞
ＰＣＲ用酵素は、KOD FX Neo（東洋紡）を使用した。
ＰＣＲ反応混合物（50μL）は、KOD FX Neo、0.4mMのdNTP、および0.02Uの1×ＰＣＲ緩衝液（KOD FX Neo：東洋紡、に付属）、0.2μMの順方向プライマー、0.6μMの逆方向プライマーおよび0.02μMの各プローブを含む。
各試料を95℃で5分間インキュベートし、次いで98℃で10秒間熱変性させ、57℃で30秒間アニーリングし、72℃で20秒間伸長し、82℃で2秒間の蛍光捕捉に供した。
以上のＰＣＲ条件で50サイクル実施した。【００２７】
＜融点（Ｔｍ）値分析＞
Ｔｍ値分析のために、得られたＰＣＲアンプリコンに各プローブが入ったＰＣＲチューブを95℃で10秒間加熱し、次いで40℃で90秒間冷却した。
ＰＣＲ後のＴｍ値分析を40℃〜95℃で1℃/ステップで増加させて行った。
続いてデータプロフィールをRotor-Gene Qソフトウェアプログラムを用いて分析し、Ｔｍ値を同定した。【００２８】
＜分析感度試験＞
カンジダ・アルビカンス（C. albicans）の1つのコロニーを、サブロー（Sabouraud）デキストロース寒天培地で48時間培養した後に表面からこすり落とし、リン酸緩衝溶液（PBS）に懸濁し、再び培地に撒いた。
カンジダ・アルビカンスの１つの菌株のみを確実に純培養するために、48時間後に第2の培地から再び1つのコロニーを掻き取り、PBSに懸濁し、10倍希釈した。
各希釈液をいくつかのアリコートに分けた。
コロニーの数（等価CFU / ml）を評価するために、サブローデキストロース寒天培地3枚に撒いた。
検出限界（LOD）は、PBS中のカンジダ・アルビカンスの既知の数を基にしてＤＮＡを連続的に希釈し、各希釈サンプルのＰＣＲ検出の有無を測定することによって決定した。【００２９】
＜真菌ゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列に基づく分析＞
公知のD1-D2領域および内部転写スペーサー（ITS）領域を標的とする真菌プライマーを精製し（QIAquick PCR Puri cation Kit; QIAGEN）、次いでシークエンスにて配列決定した（3500 Genetic Analyzer; Applied Biosystems）。
菌種の同定は、ＤＮＡデータバンク（http://www.ddbj.nig.ac.jp/index-j.html）のＢＬＡＳＴヌクレオチドデータベースツールを用いて、菌種同定のためのオンライン・ヌクレオチド相同性検索を行った。【００３０】
＜カンジダ種の培養に基づく生化学的同定＞
同じ穿刺部位から採取した同じ検体のＴｍ分析のために、全血液サンプル（１つの好気性血液培養ボトルおよび１つの嫌気性血液培養ボトル）を血液サンプルと同時に収集した。
そして、富山大学病院臨床検査センター（ISO15189認証）の標準的な方法に従って全血試料を分析した。
血液培養手順は、BacT/ALERT 3Dシステム（bioMerieux、Inc.、Mercy-l'Etoile、France）を用いて行った。
真菌の同定は、CHROMager Candida（Becton Dickinson and Company、USA）およびマトリックス支援レーザー脱離イオン化 - 飛行時間型（MALDI-TOF）質量分析（Bruker、USA）によって行った。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明のカンジタ菌の同定方法は、1つのＰＣＲプライマーセットと3つの不完全なマッチプローブを使用して、3つのＴｍ値を生成させ、それらをデータベースに登録されたデータと比較することにより、カンジダ症のカンジダ種（8種）を迅速に同定することができる。
同定に要する時間は、採血から3時間半以内である。
本発明の新たな遺伝子検査法は、迅速に加え、簡便・安価に実施可能であるため、体外診断薬としてキット化でき、医療上有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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