(57)【要約】  本発明は、エキノマイシンと同等又はそれ以上の抗がん活性を有するエキノマイシン誘導体ならびにその化学的な手法に基づく製造方法を提供することを目的とする。  式（Ｉ）で表されるエキノマイシン誘導体ならびにその化学的な手法に基づく製造方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（Ｉ）：
【化１】
2019151439.tif 000037
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して選択することができ同一又は異なって、一又は複数の置換基で置換されていてもよい、芳香族炭化水素基、飽和もしくは不飽和の複素環式基、アントラキノン基、又はベンゾフェノン基を示す）で表される化合物又はその塩。
【請求項２】
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して選択することができ同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、及び炭素数１〜６のアルキル基からなる群から選択される一又は複数の置換基で置換されていてもよい、キノリル基、イソキノリル基、キナゾリニル基、キノキサリル基、シンノリル基、インドリル基、ベンゾフラニル基、ベンゾチアゾリル基、ベンゾオキサゾリル基、ベンゾチオフェン基、ピラジル基、アントラキノン基、ベンゾフェノン基より選択される基である、請求項１に記載の化合物又はその塩。
【請求項３】
以下の式（ＩＩ）：
【化２】
2019151439.tif 000038
又は
以下の式（ＩＩＩ）：
【化３】
2019151439.tif 000039
で表される、請求項１又は２に記載の化合物又はその塩。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物又はその塩を含む、がんを治療するための医薬組成物。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物の製造方法であって、
下記式（６）：
【化４】
2019151439.tif 000040
（式中、ＰＧ１はアミノ基の保護基を示す）で表される化合物と下記式（７）：
【化５】
2019151439.tif 000041
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して選択することができ同一又は異なって、一又は複数の置換基で置換されていてもよい、芳香族炭化水素基、飽和もしくは不飽和の複素環式基、アントラキノン基、又はベンゾフェノン基を示す）で表される化合物より、式（Ｉ）で表される化合物を製造する工程
を含む、方法。
【請求項６】
前記式（６）で表わされる化合物が、下記式（３）：
【化６】
2019151439.tif 000042
（式中、ＰＧ１はアミノ基の保護基を示し、
ＰＧ３はカルボキシル基の保護基を示し、
ＰＧ４及びＰＧ５は、同一であっても異なっていてもよく、ＰＧ１とは異なるアミノ基の保護基を示す）で表される化合物を、下記式（４）：
【化７】
2019151439.tif 000043
（式中、ＰＧ６はＰＧ１とは異なるアミノ基の保護基を示す）
で表される化合物と反応させ、下記式（５）：
【化８】
2019151439.tif 000044
（式中、ＰＧ１、ＰＧ６、ＰＧ３は前記定義のとおりである）
で表される化合物を製造し、得られた式（５）で表される化合物より製造される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記式（３）で表わされる化合物が、下記式（１）：
【化９】
2019151439.tif 000045
（式中、ＰＧ１はアミノ基の保護基を示し、
ＰＧ２はＰＧ１とは異なる、アミノ基の保護基を示し、
ＰＧ３はカルボキシル基の保護基を示す）
で表される化合物と、下記式（２）：
【化１０】
2019151439.tif 000046
（式中、ＰＧ４及びＰＧ５は、同一であっても異なっていてもよく、ＰＧ１とは異なるアミノ基の保護基を示す）
で表される化合物より製造される、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エキノマイシン誘導体及びその製造方法、ならびにエキノマイシン誘導体を有効成分として含有するがんを治療するための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは昭和５６年より今日まで、日本人の死因の第一位となっており、常に新たな治療法が求められている。がんの治療法としては、外科療法、放射線療法、化学療法（抗がん剤）等が挙げられ、なかでも抗がん剤は、他の治療法とも併用され広く用いられている。抗がん剤としては、アルキル化剤、代謝拮抗剤、アルカロイド系抗がん剤、抗生物質抗がん剤、白金製剤等が用いられているが、その治療効果は未だ十分とはいえず、また副作用の発生頻度が高いという問題もあり、より優れた抗がん剤の開発が望まれている。【０００３】
エキノマイシン（Ｅｃｈｉｎｏｍｙｃｉｎ）は、１９５７年に放線菌であるストレプトマイセス・エキナタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｅｃｈｉｎａｔｕｓ）から単離された環状ペプチド系天然物である。エキノマイシンは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおいて強力な抗がん活性を有することが確認されている。米国においては、エキノマイシンを有効成分とする抗がん剤の第２相臨床試験が実施されたが（非特許文献１）、毒性が認められたためその後の臨床開発は中止された。【０００４】
しかしながら、近年、エキノマイシンがＨＩＦ−１ａ阻害活性を有することが明らかとなり（非特許文献２）、また、エキノマイシンを低用量で投与した場合にはがん幹細胞選択的に細胞増殖抑制活性を示し、すい臓がんや急性骨髄性白血病等の治療に有効であることが報告されている（非特許文献３、非特許文献４）。このため、エキノマイシンは再び注目されており、投与量をコントロールする事で臨床試験を再開する事も検討されている。【０００５】
一方、エキノマイシンの製造は、微生物の生合成に基づく手法に依存しており、化学的な製造法は開発されていない。また、微生物より得られたエキノマイシンを、化学修飾する方法が知られているが、これまでに合成されたエキノマイシン誘導体は、エキノマイシンと比べて抗がん活性が低下したものばかりであった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９４，３４，２６６−２６９．
【非特許文献２】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００５，１９，９９０４７−９０５５．
【非特許文献３】Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１６  Ｊａｎ  １９；７（３）：３２１７−３２．
【非特許文献４】Ｂｌｏｏｄ．２０１４  Ａｕｇ  １４；１２４（７）：１１２７-１１３５．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、エキノマイシンと同等又はそれ以上の抗がん活性を有するエキノマイシン誘導体ならびにその化学的な手法に基づく製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、エキノマイシンの化学構造において、チオアセタール部位は抗がん活性の発現に必要とされず、また当該部位を除いたエキノマイシン誘導体は化学的な手法に基づいて容易に製造できることを見出した。また、このようにして得られたエキノマイシン誘導体は、エキノマイシンと同等又はそれ以上の抗がん活性を有することを見出した。
本発明はこれらの知見に基づくものであり、以下の発明を包含する。【０００９】
［１］  以下の式（Ｉ）：
【化１】
2019151439.tif 000002
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して選択することができ同一又は異なって、一又は複数の置換基で置換されていてもよい、芳香族炭化水素基、飽和もしくは不飽和の複素環式基、アントラキノン基、又はベンゾフェノン基を示す）で表される化合物又はその塩。
［２］  Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して選択することができ同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、及び炭素数１〜６のアルキル基からなる群から選択される一又は複数の置換基で置換されていてもよい、キノリル基、イソキノリル基、キナゾリニル基、キノキサリル基、シンノリル基、インドリル基、ベンゾフラニル基、ベンゾチアゾリル基、ベンゾオキサゾリル基、ベンゾチオフェン基、ピラジル基、アントラキノン基、ベンゾフェノン基より選択される基である、［１］の化合物又はその塩。
［３］  以下の式（ＩＩ）：
【化２】
2019151439.tif 000003
又は
以下の式（ＩＩＩ）：
【化３】
2019151439.tif 000004
で表される、［１］又は［２］の化合物又はその塩。
［４］  ［１］〜［３］のいずれか一項に記載の化合物又はその塩を含む、がんを治療するための医薬組成物。【００１０】
［５］  ［１］〜［３］のいずれかの化合物の製造方法であって、
下記式（６）：
【化４】
2019151439.tif 000005
（式中、ＰＧ１はアミノ基の保護基を示す）で表される化合物と下記式（７）：
【化５】
2019151439.tif 000006
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して選択することができ同一又は異なって、一又は複数の置換基で置換されていてもよい、芳香族炭化水素基、飽和もしくは不飽和の複素環式基、アントラキノン基、又はベンゾフェノン基を示す）で表される化合物より、式（Ｉ）で表される化合物を製造する工程を含む、方法。
［６］  前記式（６）で表わされる化合物が、下記式（３）：
【化６】
2019151439.tif 000007
（式中、ＰＧ１はアミノ基の保護基を示し、
ＰＧ３はカルボキシル基の保護基を示し、
ＰＧ４及びＰＧ５は、同一であっても異なっていてもよく、ＰＧ１とは異なるアミノ基の保護基を示す）で表される化合物を、下記式（４）：
【化７】
2019151439.tif 000008
（式中、ＰＧ６はＰＧ１とは異なるアミノ基の保護基を示す）で表される化合物と反応させ、下記式（５）：
【化８】
2019151439.tif 000009
（式中、ＰＧ１、ＰＧ６、ＰＧ３は前記定義のとおりである）
で表される化合物を製造し、得られた式（５）で表される化合物より製造される、［５］の方法。
［７］  前記式（３）で表わされる化合物が、下記式（１）：
【化９】
2019151439.tif 000010
（式中、ＰＧ１はアミノ基の保護基を示し、
ＰＧ２はＰＧ１とは異なる、アミノ基の保護基を示し、
ＰＧ３はカルボキシル基の保護基を示す）
で表される化合物と、下記式（２）：
【化１０】
2019151439.tif 000011
（式中、ＰＧ４及びＰＧ５は、同一であっても異なっていてもよく、ＰＧ１とは異なるアミノ基の保護基を示す）
で表される化合物より製造される、［６］の方法。【００１１】
［８］  ［１］〜［３］のいずれかの化合物又はその塩をがん患者に投与することを含む、がんを治療するための方法。
［９］  がんを治療する方法において使用するための、［１］〜［３］のいずれかの化合物又はその塩。
［１０］  がんを治療するための医薬の製造における、［１］〜［３］のいずれかの化合物又はその塩の使用。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１８−０１５６０６号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、エキノマイシンと同等又はそれ以上の抗がん活性を有するエキノマイシン誘導体ならびにその化学的な手法に基づく製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１−１】図１−１は、本発明の化合物が有する抗がん活性を、膵臓がん細胞（ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞）株を用いたＳＲＢアッセイにより評価した結果を示すグラフ図である。＊：ｐ＜０．０５（ｖｓ対照、スチューデントのt検定）
【図１−２】図１−２は、本発明の化合物が有する抗がん活性を、膵臓がん細胞（ＳｕｉＴ−２細胞）株を用いたＳＲＢアッセイにより評価した結果を示すグラフ図である。＊：ｐ＜０．０５（ｖｓ対照、スチューデントのt検定）
【図１−３】図１−３は、本発明の化合物が有する抗がん活性を、大腸がん細胞（ＳＷ６２０細胞）株を用いたＳＲＢアッセイにより評価した結果を示すグラフ図である。＊：ｐ＜０．０５（ｖｓ対照、スチューデントのt検定）
【図２−１】図２−１は、本発明の化合物が有する抗がん活性を、膵臓がん細胞（ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞）株を移植した動物モデルを用いたｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにより評価した結果を示すグラフ図である。（Ａ）移植したがん細胞の表面積（ｍｍ２）の経時的変化を示すグラフ図である。（Ｂ）移植から２８日目のがん細胞の質量（ｍｇ）を示すグラフ図である。＊：ｐ＜０．０５（ｖｓ対照、スチューデントのt検定）
【図２−２】図２−２は、本発明の化合物が有する抗がん活性を、大腸がん細胞（ＳＷ６２０細胞）株を移植した動物モデルを用いたｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにより評価した結果を示すグラフ図である。（Ａ）移植したがん細胞の表面積（ｍｍ２）の経時的変化を示すグラフ図である。（Ｂ）移植から１０日目のがん細胞の質量（ｍｇ）を示すグラフ図である。＊：ｐ＜０．０５（ｖｓ対照、スチューデントのt検定）
【図３】図３は、本発明の化合物による大腸がん細胞（ＳＷ６２０細胞）株に対する細胞死誘導能を、ＴＵＮＥＬ法により評価した結果を示すグラフ図である。＊：ｐ＜０．０５（ｖｓ対照、スチューデントのt検定）
【図４】図４は、本発明の化合物による大腸がん細胞（ＳＷ６２０細胞）株に対する細胞死誘導能を、活性化型カスパーゼ−３の定量（ウエスタン・ブロッティング法）により評価した結果を示す。
【図５】図５は、本発明の化合物が毎日投与された、膵臓がん細胞株を移植した動物モデルの投与２８日目における体重を示すグラフ図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
１．化合物
本発明の化合物は、以下の式（Ｉ）：
【００１５】
【化１１】
2019151439.tif 000012
で表される。
【００１６】
式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して選択することができ同一又は異なって、一又は複数の置換基で置換されていてもよい、芳香族炭化水素基、飽和もしくは不飽和の複素環式基、アントラキノン基、又はベンゾフェノン基を示す。
【００１７】
「置換基」とは、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アミノ基、シアノ基、ニトロ基、オキソ基、オキシド基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ハロアルキル基、アルコキシ基、シクロアルキル基、−ＯＲ３基、−ＳＲ３基、−ＮＲ３Ｒ４基、−Ｃ（Ｏ）Ｒ３基、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ４基、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ４基、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ３基、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｒ４基、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＯＲ４基、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５基、−ＮＲ３Ｃ（Ｓ）ＮＲ４Ｒ５基、−ＮＲ３Ｓ（Ｏ）２Ｒ４基、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ３Ｒ４基、−Ｓ（Ｏ）Ｒ３基、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ３基等（ここで、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して選択することができ同一又は異なって、水素原子、アルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基等を示す）を意味する。
【００１８】
「ハロゲン原子」とは、塩素原子、フッ素原子、臭素原子、ヨウ素原子等を意味する。
【００１９】
「アルキル基」とは、直鎖状もしくは分枝状のアルキル基を意味し、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等を挙げることができる。
【００２０】
「アルケニル基」とは、炭素−炭素間の二重結合を少なくとも一つ含む直鎖状もしくは分枝状のアルケニル基を意味し、例えば、ビニル基、アリル基、メチルビニル基、プロペニル基、ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基等を挙げることができる。
【００２１】
「アルキニル基」とは、炭素−炭素間の三重結合を少なくとも一つ含む直鎖状もしくは分枝状のアルキニル基を意味し、例えば、エチニル基、２−プロピニル基等を挙げることができる。
【００２２】
「ハロアルキル基」とは、アルキル基における水素原子の一もしくは複数個又は全てがハロゲン原子で置換されたものを意味する。例えば、モノフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、トリフルオロメチル基、１−フルオロエチル基、２−フルオロエチル基、１，１−ジフルオロエチル基、１，２−ジフルオロエチル基、２，２−ジフルオロエチル基等を挙げることができる。
【００２３】
「アルコキシ基」とは、アルキル基が結合したオキシ基を意味し、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基等を挙げることができる。
【００２４】
「シクロアルキル基」とは、単環式又は多環式のアルキル基を意味する。例えば、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、デカリル基、アダマンチル基等を挙げることができる。
【００２５】
「芳香族炭化水素基」とは、単環式もしくは多環式の芳香族炭化水素基を意味し、一部の環のみが芳香族性を示す基であってもよい。このような芳香族炭化水素基としては、例えば、フェニル基、ナフチル基、テトラヒドロナフチル基等を挙げることができる。
【００２６】
「飽和複素環式基」とは、窒素、酸素及び硫黄からからなる群から選択される少なくとも一つのヘテロ原子を含む単環式もしくは多環式の飽和複素環式基を意味する。このような飽和複素環式基としては、例えば、ピロリジニル基、ピペリジニル基、ピペラジニル基、ヘキサメチレンイミノ基、モルホリノ基、チオモルホリノ基、ホモピペラジニル基、オキセタニル基、テトラヒドロフラニル基、テトラヒドロピラニル基等を挙げることができる。
【００２７】
「不飽和複素環式基」とは、窒素、酸素及び硫黄からからなる群から選択される少なくとも一つのヘテロ原子を含む単環式もしくは多環式の、完全不飽和もしくは部分不飽和の複素環式基を意味する。このような不飽和複素環式基としては、例えば、キノリル基、イソキノリル基、キナゾリニル基、キノキサリル基、シンノリル基、イミダゾリル基、チエニル基、フリル基、ピロリル基、オキサゾリル基、イソキサゾリル基、チアゾリル基、イソチアゾリル基、チアジアゾリル基、ピラゾリル基、トリアゾリル基、テトラゾリル基、ピリジル基、ピラジル基、ピリミジニル基、ピリダジニル基、インドリル基、イソインドリル基、インダゾリル基、トリアゾロピリジル基、ベンゾイミダゾリル基、ベンゾオキサゾリル基、ベンゾチアゾリル基、ベンゾチエニル基、ベンゾフラニル基、ベンゾチオフェン基、プリニル基、メチレンジオキシフェニル基、エチレンジオキシフェニル基、ジヒドロベンゾフラニル基等が挙げられる。
【００２８】
好ましくは、本発明の式（Ｉ）で表される化合物において、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して選択することができ同一又は異なって、一又は複数の置換基で置換されていてもよい、不飽和複素環式基、アントラキノン基、又はベンゾフェノン基である。例えば、本発明の式（Ｉ）で表される化合物において、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して選択することができ同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、及び炭素数１〜６のアルキル基からなる群より選択される一又は複数の置換基で置換されていてもよい、キノリル基、イソキノリル基、キナゾリニル基、キノキサリル基、シンノリル基、インドリル基、ベンゾフラニル基、ベンゾチアゾリル基、ベンゾオキサゾリル基、ベンゾチオフェン基、ピラジル基、アントラキノン基、ベンゾフェノン基等が挙げられる。
【００２９】
具体的には、本発明の式（Ｉ）で表される化合物において、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、及び炭素数１〜６のアルキル基からなる群より選択される一又は複数の置換基で置換されていてもよい、２−、３−、４−、５−、６−、もしくは７−インドリル基、２−ベンゾフラニル基、２−、もしくは３−ベンゾチオフェン基、５−、もしくは６−ベンゾオキサゾリル基、６−ベンゾチアゾリル基、６−ピラジル基、２−アントラキノン基、４−ベンゾフェノン基である。
【００３０】
あるいは、本発明の式（Ｉ）で表される化合物において、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、２−キノリル基ならびにその３位、４位、５位、６位、７位、又は８位にハロゲン原子、ヒドロキシル基、及び炭素数１〜６のアルキル基から選択される置換基を一つ有する２−キノリル基、ならびに、２-キノキサリル基、ならびにその３位、４位、５位、６位、７位、及び８位から選択される２か所に、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、及び炭素数１〜６のアルキル基からなる群から選択される置換基をそれぞれ一つ有する。好ましくは、Ｒ１及びＲ２は３位に前記置換基を一つ有する２−キノリル基であるか、３位及び４位に前記置換基をそれぞれ一つ有する２−キノキサリル基である。
【００３１】
特に好ましくは、本発明の化合物は以下の式（ＩＩ）：
【化１２】
2019151439.tif 000013
又は
【００３２】
以下の式（ＩＩＩ）：
【化１３】
2019151439.tif 000014
で表される。
【００３３】
本発明の化合物が、光学異性体、立体異性体、位置異性体、回転異性体、互変異性体等の異性体を有する場合には、いずれかの異性体も混合物も本発明の化合物に包含される。例えば、本発明の化合物に光学異性体が存在する場合には、ラセミ体から分割された光学異性体も本発明の化合物に包含される。
【００３４】
本発明の化合物の塩とは、薬学的に許容される塩であればよく、有機化学の分野で一般的に用いられるもの包含し、塩基付加塩や酸付加塩等を挙げることができる。塩基付加塩としては、例えば、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩、マグネシウム塩等）、アンモニウム塩、有機アミン塩（トリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、エタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、プロカイン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩等）が挙げられる。また、酸付加塩としては、例えば、無機酸塩（塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、過塩素酸塩等）、有機酸塩（酢酸塩、ギ酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、トリフルオロ酢酸塩等）、スルホン酸塩（メタンスルホン酸塩、イセチオン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩等）が挙げられる。
【００３５】
本発明化合物又はその塩は、結晶の形態であってもよい。結晶形は、単一であっても多形混合物であってもよく、従来公知の結晶化法を用いて製造することができる。また、本発明の化合物又はその塩は、溶媒和物（例えば、水和物等）の形態であってもよいし、無溶媒和物の形態であってもよい。また、本発明化合物又はその塩は、同位元素（例えば、重水素、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、１２５Ｉ等）等で標識されていてもよい。
【００３６】
２．製造方法
本発明の式（Ｉ）で表される化合物は、例えば、下記の製造法又は実施例に示す方法等により製造することができる。ただし、本発明の式（Ｉ）で表される化合物の製造法はこれら反応例に限定されるものではない。
【００３７】
下記化合物の製造法において、「アミノ基の保護基」とは、Ｂｏｃ基、ベンジルオキシカルボニル基、４−メトキシベンジル基、２，４，６−トリメトキシベンジル基、２，４−ジメトキシベンジル基、４−メトキシベンジル基等が挙げられるがこれらに限定はされない。
【００３８】
下記化合物の製造法において、「カルボキシル基の保護基」とは、アリル基、アルキル基、シクロアルキル基、ｔ−ブチル基、ベンジル基、メトキシベンジル基、ニトロベンジル基、トリクロロエチル基、フェナシル基挙げられるがこれらに限定はされない。
【００３９】
下記化合物の製造法において、「保護基の除去（脱保護）」は、公知の手法により行うことができ、トリフルオロ酢酸、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、塩酸、硫酸、酢酸、蟻酸、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、イソプロパノール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、トルエン、ベンゼン、塩化メチレン、クロロホルム、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミドＮ−メチルピロリジノン、ジメチルスルホキシド等を溶媒として用いることができ、選択される除去対象の保護基（及び除去対象でない保護基）の種類に応じて適宜選択することができる。反応には、必要に応じて、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオール、Ｐｄ触媒、液体アンモニアを添加することができる。反応は溶媒中にて−７８℃〜２００℃、好ましくは２５℃〜１００℃、より好ましくは、３０℃〜５０℃にて、１０分〜２４時間、より好ましくは３０分〜１２時間、反応させることにより行うことができる。
【００４０】
下記化合物の製造法において、「縮合反応」は、公知の手法により行うことができ、縮合剤を添加した溶媒中にて、−７８℃〜２００℃、好ましくは２５℃〜１００℃、より好ましくは、３０℃〜５０℃にて、１０分〜３日間、好ましくは１時間〜２４時間、より好ましくは３〜１５時間、反応させることにより行うことができる。
【００４１】
縮合剤としては、例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドと１−ヒドロキシベンゾトリアゾールの組み合わせ、ジフェニルリン酸アジド、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリスジメチルアミノホスホニウム塩、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロライド、２−クロロ−１，３−ジメチルイミダゾリニウムクロライド、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾ−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルヘキサウロニウム  ヘキサフルオロホスフェート、３Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジン−３−オール等を用いることができる。
【００４２】
縮合反応の溶媒としては、例えば、ジメチルホルムアミド、イソプロパノール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、トルエン、ベンゼン、塩化メチレン、クロロホルム、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリジノン、ジメチルスルホキシド及びその混合溶媒等を用いることができる。
【００４３】
縮合反応において溶媒にはさらに塩基を添加することができる。塩基としては、無機塩基（例えば、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸セシウム、水酸化ナトリウム、水素化ナトリウム等）や有機塩基（例えば、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、ルチジン、コリジン、４−ジメチルアミノピリジン、カリウム−ｔｅｒｔ−ブチラート、ナトリウム−ｔｅｒｔ−ブチラート、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、リチウムヘキサメチルジシラジド、ナトリウムヘキサメチルジシラジド、カリウムヘキサメチルジシラジド、ブチルリチウム等）を用いることができる。
【００４４】
下記化合物の製造法において、各工程において得られる化合物は、化合物の分離手段を用いて単離精製することができる。「化合物の分離手段」としては、化合物の単離精製に通常用いられている手段を利用することが可能であり、例えば溶媒抽出、再結晶、分取用逆相高速液体クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、分取薄層クロマトグラフィー等を挙げることができる。
【００４５】
本発明の式（Ｉ）で表される化合物は、下記の工程１〜工程３を含む方法により製造することができる。
【００４６】
（工程１）
本工程は、下記式（１）：
【化１４】
2019151439.tif 000015
で表される化合物と、下記式（２）：
【００４７】
【化１５】
2019151439.tif 000016
で表される化合物より、下記式（３）：
【００４８】
【化１６】
2019151439.tif 000017
で表される化合物を製造する工程である。
【００４９】
上記式中、ＰＧ１は慣用されるアミノ基の保護基を示し、好ましくは、ベンジルオキシカルボニル基である。
【００５０】
上記式中、ＰＧ２は、ＰＧ１とは異なる慣用されるアミノ基の保護基を示し、好ましくはＢｏｃ基である。
【００５１】
上記式中、ＰＧ３は、慣用されるカルボキシル基の保護基を示し、好ましくは、ＰＧ３はアリル基である。
【００５２】
上記式中、ＰＧ４及びＰＧ５は、ＰＧ１とは異なる慣用されるアミノ基の保護基を示し、ＰＧ４及びＰＧ５は同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは同一であり、Ｂｏｃ基である。
【００５３】
本工程において、式（１）で表される化合物はＰＧ２で表される基の脱保護反応に付す。次いで、得られた脱保護された化合物と式（２）で表される化合物との縮合反応により、式（３）で表される化合物を得ることができる。
【００５４】
原料となる式（１）で表される化合物は、下記式（１ａ）：
【化１７】
2019151439.tif 000018
で表される化合物と下記式（１ｂ）：
【００５５】
【化１８】
2019151439.tif 000019
で表される化合物より、公知の手法（Ｎａｇａｓａｗａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１６，１４，２０９０．）に基づいて製造することができる。
【００５６】
また、原料となる式（２）で表される化合物は、下記式（２ａ）：
【化１９】
2019151439.tif 000020
で表される化合物より製造することができ、式（２ａ）で表される化合物のカルボキシル基を保護した後、３価のリン化合物で処理して硫黄原子を一つ取り出し、その後カルボキシル基の保護基を脱保護することにより得ることができる。３価のリン化合物としては、例えばトリス(ジメチルアミノ)ホスフィンを利用することができる。
【００５７】
式（１ａ）、（１ｂ）及び式（２ａ）において、ＰＧ１、ＰＧ２、ＰＧ３、ＰＧ４及びＰＧ５は、上記定義のとおりである。
【００５８】
（工程２）
本工程は、上記式（３）で表される化合物を、下記式（４）：
【化２０】
2019151439.tif 000021
で表される化合物と反応させ、下記式（５）：
【００５９】
【化２１】
2019151439.tif 000022
で表される化合物を製造し、次いで式（５）で表される化合物より、下記式（６）：
【００６０】
【化２２】
2019151439.tif 000023
で表される化合物を製造する工程である。
【００６１】
上記式中、ＰＧ６は、ＰＧ１とは異なる慣用されるアミノ基の保護基を示し、好ましくはＢｏｃ基である。好ましくは式（４）で表される化合物として、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−アラニンを利用することができる。
【００６２】
ＰＧ１、ＰＧ３、ＰＧ４及びＰＧ５は、上記定義のとおりである。
【００６３】
式（３）で表される化合物はＰＧ４及びＰＧ５で表される基の脱保護反応に付す。得られた脱保護された化合物と式（４）で表される化合物との縮合反応により、式（５）で表される化合物を得ることができる。
【００６４】
次いで、式（５）で表される化合物は、ＰＧ３及びＰＧ６で表される基の脱保護反応に付す。得られた脱保護された化合物を縮合反応に付し、式（６）で表される化合物を得ることができる。
【００６５】
（工程３）
本工程は、式（６）で表される化合物と下記式（７）：
【化２３】
2019151439.tif 000024
で表される化合物より、目的とする式（Ｉ）で表される化合物を製造する工程である。
【００６６】
上記式中、Ｒ１及びＲ２は、上記Ｒ１及びＲ２と同義である。Ｒ１とＲ２とが同一である場合には、これらは同一の化合物である。
【００６７】
本工程において、式（６）で表される化合物を、ＰＧ１で表される基の脱保護反応に付す。得られた脱保護された化合物と式（７）で表される化合物との縮合反応により、式（Ｉ）で表される目的の化合物を得ることができる。
【００６８】
３．用途
本発明の化合物又はその塩は、がんを治療するための医薬組成物（以下、「本発明の医薬組成物」と記載する）における有効成分として利用することができる。
【００６９】
本発明において「がん」とは、固形がん及び血液がん（例えば、白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫等）が含まれるが、好ましくは固形がんである。固形がんには血液がんを除く全ての固形がん（すなわち、上皮細胞がん及び非上皮細胞がん）が含まれる。このような固形がんとしては、脳腫瘍・神経膠腫、下垂体腺腫、聴神経鞘腫、ぶどう膜悪性黒色腫、髄膜腫、咽頭がん、喉頭がん、舌がん、甲状腺がん、乳がん、肺がん、胸腺腫、胸腺がん、中皮腫、食道がん、胃がん、大腸がん、肝細胞がん、胆管がん、膵臓がん、腎細胞がん、膀胱がん、前立腺がん、腎盂・尿管がん、陰茎がん、精巣（睾丸）腫瘍、子宮がん、卵巣がん、外陰がん、皮膚がん、悪性黒色腫（皮膚）、基底細胞がん、皮膚がん前駆症、表皮内がん、有棘細胞がん、菌状息肉症、悪性骨腫瘍（骨肉腫）、軟部肉腫、軟骨肉腫、悪性線維性組織球種、ならびに、これらの転移癌等が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００７０】
また、本発明において「治療」とは、がんが完全に消失した状態を意味するだけでなく、一時的あるいは永続的に、がんが縮小又は消失している状態やがんが進行（増悪）せず安定している状態も意味するものである。例えば、本発明におけるがんの「治療」には、本発明の化合物又はその塩の投与又は摂取前と比べて、患者におけるがんサイズの低下、がんマーカーレベルの低下、がんに伴う症状の改善、全生存期間、無増悪生存期間、生存期間中央値等の尺度の延長等の一以上が含まれる。
【００７１】
本発明の医薬組成物には、本発明の化合物又はその塩に加えて、医薬の製造において通常用いられている、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を含めることができ、企図される用法・用量に適した剤型として製造することができる。
【００７２】
賦形剤としては、例えば、糖（単糖、二糖類、シクロデキストリン及びアルギン酸等の多糖類）、金属塩、カオリン、ケイ酸、ポリエチレングリコール及びこれらの混合物等が挙げられる。
【００７３】
結合剤としては、例えば、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、エチルセルロース、及びこれらの混合物等が挙げられる。
【００７４】
崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖及びこれらの混合物等が挙げられる。
【００７５】
滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコール及びこれらの混合物等が挙げられる。
【００７６】
必要に応じて、さらに医薬の製造において通常用いられている希釈剤、安定化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、溶解補助剤、懸濁化剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤、コーティング剤、保存剤、防腐剤、抗酸化剤等も適宜含めることができる。
【００７７】
例えば、経口投与に適した剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、粉剤、シロップ剤、懸濁剤等が挙げられる。固形の剤形を有するものは、必要に応じてコーティングを施すことができる（例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶錠等）。
【００７８】
また、非経口投与に適した剤形として、注射剤や点滴剤等が挙げられる。これらの剤形は、凍結乾燥化し保存し得る状態で提供され、用時、水や生埋的食塩水等を含む緩衝液等で溶解して適当な濃度に調製した後に使用されるものであってもよい。あるいは、坐剤、軟膏剤、吸入剤、貼付剤等の剤形としてもよい。
【００７９】
本発明の医薬組成物には、本発明の化合物又はその塩をプロドラッグの形態で含めてもよい。「プロドラッグ」とは、生体内における生理条件下で酵素や胃酸等による反応により本発明の化合物又はその塩に変換する化合物、即ち酵素的に酸化、還元、加水分解等を起こして本発明の化合物又はその塩に変化する化合物、胃酸等により加水分解等を起こして本発明の化合物又はその塩に変化する化合物を意味する。また、本発明の化合物又はその塩のプロドラッグとは、広川書店１９９０年刊「医薬品の開発」第７巻分子設計１６３頁から１９８頁に記載されているような生理的条件で本発明の化合物又はその塩へと変化するものであってもよい。
【００８０】
本発明の医薬組成物の投与量は、患者におけるがんの種類や重篤度、ならびに患者の症状、体重、年齢、性別等の要因によって変化し得、一概には決定できないが、例えば成人（体重５０ｋｇ）１日あたり、本発明の化合物又はその塩の量にして約０．０５〜５０００ｍｇ、好ましくは０．１〜１０００ｍｇから選択される量を、１日１回又は２〜３回程度に分けて投与することができる。
【００８１】
以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００８２】
実施例１：化合物の合成
（核磁気共鳴）
核磁気共鳴（以下、１Ｈ−ＮＭＲ）スペクトルは、ＪＥＯＬ  ＪＭＭ−ＥＣＳ−４００、ＪＥＯＬ  ＪＮＭ−ＥＣＸ−４００Ｐ、ＪＥＯＬ  ＪＮＭ−ＥＣＡ−５００（日本電子株式会社）を用いて測定した。【００８３】
１Ｈ−ＮＭＲの化学シフトは、テトラメチルシランを内部標準としたときのδ値をｐｐｍで、スピン結合定数Ｊ値をＨｚでそれぞれ表示した。【００８４】
シグナルの多重度は、ｓ：一重線、ｄ：二重線、ｔ：三重線、ｑ：四重線、ｍ：多重線、ｂｒ：ブロードの略号を用いて示した。【００８５】
（室温）
室温は、２０℃〜２５℃程度の範囲を指し、特に記載のない限り非水性反応はアルゴン雰囲気下で行った。【００８６】
（質量分析）
質量分析はＳＱ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ２（日本ウォーターズ株式会社）を用いて、ＥＳＩ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｓｐｒａｙ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）法により行った。【００８７】
（反応溶媒）
反応溶媒として用いた塩化メチレンは五酸化二リンより、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドは水素化カルシウムより、ベンゼンは金属ナトリウムより蒸留したものを用いた。水は脱イオン水をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｉａ−Ｑ（登録商標）Ａｄｖａｎｔａｇｅ  Ａ１０（登録商標）超純水製造装置で精製したものを用いた。その他の試薬及び溶媒については特に記載のない限り市販のものを用いた。【００８８】
（クロマトグラフィー）
Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｔｈｉｎ  ｌａｙｅｒ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＴＬＣ）は、Ｍｅｒｃｋ  ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０  Ｆ２５４を用いた。シリカゲルカラムクロマトグラフィーには充填剤としてＷａｋｏｇｅｌ  ６０Ｎ（６３〜２１２μｍ）、フラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィーには充填剤としてＫａｎｔｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０Ｎ（ｓｐｈｅｒｉｃａｌ，ｎｅｕｔｒａｌ，４０〜５０μｍ）、ハイフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィーには充填剤としてＣＨＲＯＭＡＴＯＲＥＸ  ＰＳＱ６０Ｂをそれぞれ用いた。重金属除去用ＳＨシリカゲルは、Ｆｕｊｉ  Ｓｉｌｙｓｉａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＬＴＤ．Ｓｃａｖｅｎｇｅｒ  ＳＨ  Ｓｉｌｉｃａを用いた。【００８９】
本発明の化合物の合成は以下のとおり行った。
（化合物１の合成）
Ｄ−Ｓｅｒ（１０．０ｇ，９５．２ｍｍｏｌ）を出発物質とし、公知の手法（Ｋｏｈｎ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１１，５４，４８１５．Ｋｕｎｚ，Ｈ．；Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ−Ｂｏｃｈｎｉｔｓｃｈｅｋ，Ｓ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８９，５４，７５１．）と同様の条件によって、下記化合物１（１９．５ｇ，６９．８ｍｍｏｌ，７３％，２工程）を無色油状物質として得た。【００９０】
【化２４】
2019151439.tif 000025
【００９１】
（化合物２の合成）
Ｂｏｃ−Ｌ−Ｖａｌ−ＯＨ（１５．０ｇ，６９．０ｍｍｏｌ）を出発物質とし、公知の手法（Ｎａｇａｓａｗａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．上掲）と同様の条件によって、下記化合物２（１５．１ｇ，６５．３ｍｍｏｌ，９５％）を淡黄色油状物質として得た。【００９２】
【化２５】
2019151439.tif 000026
【００９３】
（化合物３の合成）
化合物１（５．７８ｇ，２０．７ｍｍｏｌ）及び化合物２（４．７９ｇ，２０．７ｍｍｏｌ）より公知の手法（Ｎａｇａｓａｗａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．上掲）と同様の条件によって、下記化合物３（６．４８ｇ，１３．２ｍｍｏｌ，６４％）を無色油状物質として得た。【００９４】
【化２６】
2019151439.tif 000027
【００９５】
（化合物４の合成）
（Ｒ）−チアゾリジンカルボン酸（５０．０ｇ，３７５ｍｍｏｌ）を出発物質とし、公知の手法（ＵＳ２０１４０１８７５４６）と同様の条件によって、下記化合物４（２４．６ｇ，５２．５ｍｍｏｌ，２８％，３工程）を白色泡状物質として得た。【００９６】
【化２７】
2019151439.tif 000028
【００９７】
（化合物５の合成）
化合物４（２５．４ｇ，５４．２ｍｍｏｌ）及び炭酸カリウム（１６．４ｇ，１１９ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（１８０ｍＬ）懸濁液に、ヨウ化メチル（７．４１ｍＬ，１１９ｍｍｏｌ）を氷冷下にて加え、１．５時間撹拌した。さらに、ヨウ化メチル（０．７４ｍＬ，１１．９ｍｍｏｌ）を加え、１．５時間撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、水、飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液、及び飽和食塩水で順次洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下溶媒を留去し、得られた残渣をベンゼン（４２ｍＬ）に溶解し、トリスジメチルアミノホスフィン（１１．８ｍＬ，６５．０ｍｍｏｌ）を加え、室温で２４時間撹拌した。反応液を減圧下溶媒を留去し、得られた残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（φ６．５×２５ｃｍ、ヘキサン／酢酸エチル：１１／３→１１／７）にて精製することで、下記化合物５（２２．７ｇ，４８．８ｍｍｏｌ，９０％，２工程）を淡黄色油状物質として得た。【００９８】
【化２８】
2019151439.tif 000029
【００９９】
（化合物６の合成）
化合物５（２３．９ｇ，５１．４ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１５０ｍＬ）、メタノール（５０ｍＬ）、及び水（５０ｍＬ）の混合溶媒に、水酸化リチウム水和物（４．７４ｇ，１１３ｍｍｏｌ）の水（１００ｍＬ）溶液を氷冷下にて加え、１時間撹拌した。水酸化リチウム水和物（４７４ｍｇ，１１．３ｍｍｏｌ）の水（１０ｍＬ）溶液を氷冷下にて加え、３０分撹拌した。反応液を減圧下溶媒を留去することでおよそ１５０ｍＬに濃縮して得られた残渣に、１Ｍ塩酸水溶液を加え、クロロホルムで抽出した。抽出液を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下溶媒を留去することで、下記化合物６（２２．４ｇ，５１．３ｍｍｏｌ，定量的収率）を白色泡状物質として得た。【０１００】
【化２９】
2019151439.tif 000030
【０１０１】
（化合物７の合成）
化合物３（２５．４ｇ，６９．０ｍｍｏｌ）に４Ｍ塩化水素／ジオキサン溶液（１００ｍＬ，４００ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。減圧下溶媒を留去して得られた残渣に、ジオキサンを加えて減圧下溶媒を留去することで白色固体を得た。この白色固体、化合物６（１６．０ｇ，３４．５ｍｍｏｌ）、及びＨＯＡｔ（１２．２ｇ，８９．７ｍｍｏｌ）の塩化メチレン（１３０ｍＬ）懸濁液にジイソプロピルエチルアミン（１７．０ｍＬ，１００ｍｍｏｌ）、及びＥＤＣＩ（１７．２ｇ，８９．７ｍｍｏｌ）を氷冷下にて加え、室温で１９時間撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、１Ｍ塩酸水溶液、飽和重曹水、及び飽和食塩水で順次洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下溶媒を留去し、得られた残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（φ６．５×１５ｃｍ、ヘキサン／酢酸エチル：５／３→５／６）にて精製することで、下記化合物７（３０．６ｇ，２５．８ｍｍｏｌ，７４％，２工程）を白色泡状物質として得た。【０１０２】
【化３０】
2019151439.tif 000031
【０１０３】
（化合物８の合成）
化合物７（２１．１ｇ，１７．８ｍｍｏｌ）の塩化メチレン（２０ｍＬ）溶液に４Ｍ塩化水素／ジオキサン溶液（５０ｍＬ）を加え、室温で１時間撹拌した。減圧下溶媒を留去して得られた残渣に、ジオキサンを加えて減圧下溶媒を留去することで白色固体を得た。この白色固体、Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ（１０．１ｇ，５３．４ｍｍｏｌ）、ＨＯＡｔ（９．６９ｇ，７１．２ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（２３ｍＬ）、及び塩化メチレン（１１７ｍＬ）の懸濁液に、炭酸水素ナトリウム（７．７８ｇ，９２．６ｍｍｏｌ）を室温で、及びＥＤＣＩ（１３．６ｇ，７１．２ｍｍｏｌ）を氷冷下にて加え、室温で１４時間撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、１Ｍ塩酸水溶液、飽和重曹水、及び飽和食塩水で順次洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下溶媒を留去し、得られた残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（φ４×１５ｃｍ、ヘキサン／酢酸エチル：３／１→１／１）にて精製することで、下記化合物８（１６．５ｇ，１２．５ｍｍｏｌ，７０％，２工程）を白色泡状物質として得た。【０１０４】
【化３１】
2019151439.tif 000032
【０１０５】
（化合物９の合成）
化合物８（２２．３ｇ，１６．８ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１１０ｍＬ）溶液にモルホリン（５．１２ｍＬ，５８．８ｍｍｏｌ）、及びテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（３８．９ｍｇ，３３．６μｍｏｌ）を氷冷下にて加え、４時間撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、１Ｍ塩酸水溶液、及び飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下溶媒を留去し、得られた残渣を上部に重金属除去用ＳＨシリカゲルを含むシリカゲルカラムクロマトグラフィー（φ４×２ｃｍ、クロロホルム／メタノール／酢酸：１００／０／０→９８／０／２→９５／３／２）にて粗精製することで淡黄色泡状化合物を得た。この残渣に４Ｍ塩化水素／ジオキサン溶液（１００ｍＬ）を加え、室温で１時間撹拌した。減圧下溶媒を留去して得られた残渣にジオキサンを加えて溶媒置換を行った後、ジエチルエーテルで洗浄することで、下記化合物９（１７．９ｇ，１６．０ｍｍｏｌ，９５％，２工程）を得た。【０１０６】
【化３２】
2019151439.tif 000033
【０１０７】
（化合物１０の合成）
化合物９（２．６９ｇ，２．４０ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（１．２Ｌ）溶液に、ジフェニルホスホリルアジド（５．１６ｍＬ，２４．０ｍｍｏｌ）、及びＮ−メチルモルホリン（３．６９ｍＬ，３３．６ｍｍｏｌ）を氷冷下にて加え、室温で７２時間撹拌した。反応液を、減圧下溶媒を留去することでおよそ（１０ｍＬ）に濃縮した。この残渣を酢酸エチル／混合溶媒で希釈し、水、１Ｍ塩酸水溶液、飽和重曹水、及び飽和食塩水で順次洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（φ３×１５ｃｍ、クロロホルム／メタノール：１００／０→９９．５／０．５→９９／１→９８．５／１．５→９８／２）にて精製することで、下記化合物１０（６７６ｍｇ，０．６６９ｍｍｏｌ，２８％）を白色固体として得た。【０１０８】
【化３３】
2019151439.tif 000034
【０１０９】
（化合物１１の合成）
化合物１０（７０．０ｍｇ，６９．２μｍｏｌ）、及びメチルフェニルスルフィド（３２４μＬ，２．７７ｍｍｏｌ）にトリフルオロ酢酸（６．９ｍＬ）を加え、４０℃で１５時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮して得られた残渣をジエチルエーテルで洗浄することで淡黄色の固体を得た。この固体を、キノキサリン−２−カルボン酸（４８．２ｍｇ，０．２７７ｍｍｏｌ）、ＨＯＡｔ（４７．１ｍｇ，０．３４６ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（７０．６μＬ，０．４１５ｍｍｏｌ）、及びＥＤＣＩ（６６．３ｍｇ，０．３４６ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（１ｍＬ）の懸濁液に氷冷下にて加え、室温で５時間撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、水、１Ｍ塩酸水溶液、飽和重曹水、及び飽和食塩水で順次洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下溶媒を留去し、得られた残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（φ１×１５ｃｍ，クロロホルム／メタノール：１００／０→９９／１→９８／２→９７／３）にて精製することで、下記化合物１１（３０．０ｍｇ，２８．４μｍｏｌ，４１％，２工程）を無色固体として得た。【０１１０】
【化３４】
2019151439.tif 000035
【０１１１】
（化合物１２の合成）
化合物１０（３０．０ｍｇ，２９．７μｍｏｌ）、及びメチルフェニルスルフィド（１３９μＬ，１．１９ｍｍｏｌ）にトリフルオロ酢酸（３．０ｍＬ）を加え、４０℃で１５時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮して得られた残渣をジエチルエーテルで洗浄することで淡黄色の固体を得た。この固体を、３−ヒドロキシキノリン−２−カルボン酸（１６．９ｍｇ，８９．１μｍｏｌ）、ＨＯＡｔ（１２．１ｍｇ，８９．１μｍｏｌ）、炭酸水素ナトリウム（２０．０ｍｇ，２３８μｍｏｌ）、及びＥＤＣＩ（１７．１ｍｇ，８９．１μｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（０．３ｍＬ）懸濁液に氷冷下にて加え、室温で５時間撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、水、１Ｍ塩酸水溶液、飽和重曹水、及び飽和食塩水で順次洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下溶媒を留去し、得られた残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（φ１×１５ｃｍ，クロロホルム／メタノール：１００／０→９９／１→９８／２→９７／３）にて精製することで、下記化合物１２（９．６ｍｇ，８．８μｍｏｌ，３０％，２工程）を無色固体として得た。【０１１２】
【化３５】
2019151439.tif 000036
【０１１３】
実施例２：抗がん活性の測定
（１）実験方法
（細胞株及びその培養）
細胞は、大腸がん細胞株であるＳＷ６２０細胞株（ＡＴＣＣ）、膵臓がん細胞株であるＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞株（ＡＴＣＣ）及びＳｕｉｔ２細胞株（ヒューマンサイエンス資源バンク）を用いた。【０１１４】
ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞株及びＳｕｉｔ２細胞株の培養は、１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０Ｕ／ｍＬのペニシリン及び５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ培地を用いて行った。ＳＷ６２０細胞株の培養は、１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０Ｕ／ｍＬのペニシリン及び５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０を用いて行った。【０１１５】
（ＳＲＢアッセイ）
９６穴プレートに１．０×１０４個／ウェルとなるように分注した被験細胞を２４時間培養した後、上記化合物１１又は化合物１２を終濃度１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、又は１０００ｎｇ／ｍＬとなるように培養液に添加してインキュベーションを開始し、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間後にプレートを回収した（各ｎ＝５）。【０１１６】
回収したプレートの各ウェルに１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を１００μＬ添加して４℃で１時間静置し、純水で４回洗浄した。室温でプレートを乾燥させ、０．０５７％のスルホローダミンＢ水溶液１００μＬを各ウェルに加えて細胞を染色し、０．１％酢酸で４回洗浄してから乾燥させた。染色された細胞を１０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液に溶解したときの５１０ｎｍにおけるＯＤを測定することで、各インキュベーション時間における細胞密度を測定した。対照群には化合物を添加せず、エキノマイシン投与群には、エキノマイシンの終濃度が１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、又は１０００ｎｇ／ｍＬとなるように添加して、同様に操作した。【０１１７】
（細胞死誘導能）
１．ＴＵＮＥＬ法
４ウェルガラスチャンバースライドに５．０×１０４個／ウェルとなるように分注したＳＷ６２０細胞株を２４時間培養した後、上記化合物１２を終濃度１０ｎｇ／ｍＬとなるように培養液に添加してインキュベーションを開始し、４８時間後にスライドを回収した。
ＴＵＮＥＬ（ＴｄＴ−ｍｅｄｉａｔｅｄｄＵＴＰｎｉｃｋｅｎｄｌａｂｅｌｉｎｇ）法を利用する市販の細胞死検出キット（Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ａｎｄ  ＴＭＲ  ｒｅｄ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ））を製造元のプロトコルに従って使用し、ＴＵＮＥＬ染色された細胞（すなわち、細胞死を起こした細胞）を検出・カウントした。対照群には化合物を添加せず、エキノマイシン投与群には、エキノマイシンの終濃度が１０ｎｇ／ｍＬとなるように添加して、同様に操作した。
対照群、エキノマイシン投与群、及び化合物１２投与群はそれぞれｎ＝４にて実施した。【０１１８】
２．活性化型カスパーゼ−３の検出（ウエスタン・ブロッティング法）
６穴プレートに２．０×１０５個／ウェルとなるように分注したＳＷ６２０細胞株を２４時間培養した後、上記化合物１２を終濃度１０ｎｇ／ｍＬとなるように培養液に添加してインキュベーションを開始し、４８時間後にプレートを回収した。
市販のタンパク回収キット（ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ））を製造元のプロトコルに従って使用してタンパク質を回収し、ｃｌｅａｖｅｄ  ｃａｓｐａｓｅ−３に対する特異抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を用いたウエスタン・ブロッティング法により活性化型カスパーゼ−３を定量した。内在性コントロールにはアクチンを用いた。対照群には化合物を添加せず、エキノマイシン投与群には、エキノマイシンの終濃度が１０ｎｇ／ｍＬとなるように添加して、同様に操作した。
対照群、エキノマイシン投与群、及び化合物１２投与群はそれぞれｎ＝４にて実施した。【０１１９】
（腫瘍細胞移植動物モデルアッセイ１−移植した腫瘍サイズの評価）
ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに抗アシアロＧＭ１（ウサギ）（和光純薬工業株式会社）を腹腔内投与し、室温にて２時間飼育した。２×１０６個の被験細胞を、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの背部皮下に注射して移植した。ＳＷ６２０細胞株を移植したマウスには移植の翌日から、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞株を移植したマウスには移植の一週間後から、化合物１１又は化合物１２を一匹あたり５０ｎｇ又は５００ｎｇ、あるいは４０ｎｇ又は４００ｎｇの用量で毎日腹腔内に投与し、各移植部位における腫瘍塊の成長を観察した。対照群には化合物を投与せず、エキノマイシン投与群には、エキノマイシンを一匹あたり４０ｎｇ又は４００ｎｇの用量で毎日腹腔内に投与した。
対照群、エキノマイシン投与群、化合物１１投与群、及び化合物１２投与群は、それぞれｎ＝５にて実施した。【０１２０】
（腫瘍細胞移植動物モデルアッセイ２−体重変化の評価）
ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに抗アシアロＧＭ１（ウサギ）（和光純薬工業株式会社）を腹腔内投与し、室温にて２時間飼育した。２×１０６個のＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞株を、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの背部皮下に注射して移植した。移植の翌日から、化合物１１又は化合物１２を一匹あたり５００ｎｇの用量で毎日腹腔内に投与し、毎日体重を計測した（各ｎ＝５）。対照群には化合物を投与せず、エキノマイシン投与群には、エキノマイシンを一匹あたり４００ｎｇの用量で毎日腹腔内に投与し、屠殺日に体重を計測した（各ｎ＝５）。【０１２１】
（２）結果
（ＳＲＢアッセイ）
ＳＲＢアッセイの結果を、図１−１〜図１−３に示す。
化合物１２については、１００ｎｇ／ｍＬ以上の添加により、いずれの細胞株においても、対照における吸光度との間に有意な差が認められ、当該化合物ががん細胞の増殖を抑制する活性を有することが確認された（図１−１〜図１−３）。また、低濃度（１０ｎｇ／ｍＬ）における当該活性は、エキノマイシンよりも高いものであることが、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞株及びＳＷ６２０細胞株において確認された。【０１２２】
（腫瘍細胞移植動物モデルアッセイ１−移植した腫瘍サイズの評価）
腫瘍細胞移植動物モデルアッセイ１−移植した腫瘍サイズの評価の結果を、図２−１〜図２−２に示す。
化合物１１については、５００ｎｇの投与により、移植した腫瘍サイズの縮小が認められた（図２−１）。この活性は、４００ｎｇのエキノマイシンを投与した場合に匹敵することが確認された。【０１２３】
一方、化合物１２については、いずれの細胞株及びいずれの添加量においても、移植した腫瘍サイズの縮小が認められた（図２−１、図２−２）。特に、４０ｎｇの化合物１２を投与した場合の効果は、４００ｎｇのエキノマイシンを投与した場合に匹敵することが確認された。【０１２４】
（細胞死誘導能）
ＴＵＮＥＬ法による、細胞死を起こした細胞数の測定結果を図３に示す。
化合物１２の投与により誘導された細胞死を起こした細胞の数は、対照群やエキノマイシン投与群のそれと比べて有意に高いことが確認された（＊：ｐ＜０．０５（ｖｓ対照、スチューデントのt検定））。
また、ウエスタン・ブロッティング法による活性化型カスパーゼ−３の定量結果を図４に示す。
化合物１２投与群における活性化型カスパーゼ−３の量は＊１１０７±２７３であり、対照群（１００±４５）及びエキノマイシン投与群（＊３６２±１７６）の値と比べて高いことが確認された（＊：ｐ＜０．０５（ｖｓ対照、スチューデントのt検定））。化合物１２投与群及びエキノマイシン投与群における各数値は、対照群の数値に対する相対値にて示す。
これらの結果は、化合物１２がエキノマイシンと比べて、腫瘍に対する高い細胞死誘導活性、すなわち抗がん活性を有することを示す。【０１２５】
（腫瘍細胞移植動物モデルアッセイ２−体重変化の評価）
各群における投与２８日目の体重を図５に示す。化合物１１及び化合物１２のいずれの投与群についても、対照群及びエキノマイシン投与群と同様に、大きな体重減少は認められなかった。この結果は、本発明の化合物の毒性が低いことを示す。【０１２６】
以上の結果より、本発明の化合物は化学合成の手法により製造することが可能であり、かつエキノマイシンに匹敵する、またエキノマイシンよりも高い抗がん活性を有することが明らかとなった。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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