(57)【要約】  本発明の課題は、目的タンパク質を高い生産性で製造することができる動物細胞、上記動物細胞の製造方法、および上記動物細胞を使用した目的タンパク質の製造方法を提供することである。本発明によれば、目的タンパク質をコードする遺伝子と、ＳＮＡＴ２をコードする外来遺伝子であってプロモーターに連結された外来遺伝子とを有し、上記ＳＮＡＴ２が過剰発現している、動物細胞；上記動物細胞の製造方法；および上記動物細胞を使用した目的タンパク質の製造方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的タンパク質をコードする遺伝子と、ＳＮＡＴ２をコードする外来遺伝子であってプロモーターに連結された外来遺伝子とを有し、前記ＳＮＡＴ２が過剰発現している、動物細胞。
【請求項２】
過剰発現が恒常的である、請求項１に記載の動物細胞。
【請求項３】
ＳＮＡＴ２をコードする外来遺伝子が、配列番号１に記載の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有する、請求項１または２に記載の動物細胞。
【請求項４】
ＳＮＡＴ２をコードする外来遺伝子が、配列番号１に記載の塩基配列を含む、請求項１から３の何れか一項に記載の動物細胞。
【請求項５】
動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１から４の何れか一項に記載の動物細胞。
【請求項６】
動物細胞に対して、目的タンパク質をコードする遺伝子と、ＳＮＡＴ２をコードする外来遺伝子であってプロモーターに連結された外来遺伝子とを導入する工程を含む、請求項１から５の何れか一項に記載の動物細胞の製造方法。
【請求項７】
ＳＮＡＴ２をコードする外来遺伝子であってプロモーターに連結された外来遺伝子を導入する工程が、エレクトロポレーションにより行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１から５の何れか一項に記載の動物細胞を培養することを含む、目的タンパク質の製造方法。
【請求項９】
培養が、フェドバッチ培養である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
細胞培養の播種細胞密度が０．２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
培養期間中の生細胞率が全期間において６０％以上である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
培養が、灌流培養である、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
細胞培養の播種細胞密度が０．２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
培養期間中の生細胞率が全期間において９０％以上である、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的タンパク質を発現する動物細胞に関する。本発明は、上記動物細胞の製造方法、および上記動物細胞を使用した目的タンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体などのバイオ医薬品の製造においては、抗体の生産性を向上するため、培養液に栄養を追添加することで細胞の状態を良化させるフェドバッチ培養がよく用いられている。また、抗体などのバイオ医薬品の製造においては、抗体の生産性を向上するため、培養液を連続的に濾過および排出し、一方で栄養成分を含むフレッシュな培地を連続的に培養槽に供給する、灌流培養法がよく用いられている。【０００３】
特許文献１には、タンパク質を高い生産量で製造することができる方法として、アラニンアミノトランスフェラーゼを強発現し、かつ所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを導入した細胞を培養し、所望のポリペプチドを産生させることを含む、ポリペプチドの製造方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００９／０２０１４４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
フェドバッチ培養においては、栄養を追添加しない場合に比べ、より高密度の細胞密度で長期間の細胞培養が可能になるが、細胞から分泌される老廃物の蓄積の影響で培養後半の細胞生存率が低下するため、培養期間延長によって産物が増やせないという問題がある。
また、灌流培養法において細胞を高密度で培養するためには、栄養の供給および老廃物を系外に排出する目的で、１日当たり、培養体積の１〜３倍量の培地の回収および供給が必要であるため、培養コストが高くなることが問題である。【０００６】
本発明は、目的タンパク質を高い生産性で製造することができる動物細胞を提供することを解決すべき課題とする。本発明はさらに、上記動物細胞の製造方法、および上記動物細胞を使用した目的タンパク質の製造方法を提供することを解決すべき課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ＳＮＡＴ２（Sodium-dependent neutral amino acid transporter-2 ）遺伝子（遺伝子名はSLC38A2）をＣＨＯ細胞に強制発現させることによりタンパク質の生産量に影響し、その結果として、抗体生産性（Ｑｐ）の向上及び抗体生産量の向上を達成することができた。本発明は、上記の知見に基づいて完成したものである。【０００８】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
＜１＞  目的タンパク質をコードする遺伝子と、ＳＮＡＴ２をコードする外来遺伝子であってプロモーターに連結された外来遺伝子とを有し、上記ＳＮＡＴ２が過剰発現している、動物細胞。
＜２＞  過剰発現が恒常的である、＜１＞に記載の動物細胞。
＜３＞  ＳＮＡＴ２をコードする外来遺伝子が、配列番号１に記載の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有する、＜１＞または＜２＞に記載の動物細胞。
＜４＞  ＳＮＡＴ２をコードする外来遺伝子が、配列番号１に記載の塩基配列を含む、＜１＞から＜３＞の何れか一に記載の動物細胞。
＜５＞  動物細胞がＣＨＯ細胞である、＜１＞から＜４＞の何れか一に記載の動物細胞。
＜６＞  動物細胞に対して、目的タンパク質をコードする遺伝子と、ＳＮＡＴ２をコードする外来遺伝子であってプロモーターに連結された外来遺伝子とを導入する工程を含む、＜１＞から＜５＞の何れか一に記載の動物細胞の製造方法。
＜７＞  ＳＮＡＴ２をコードする外来遺伝子であってプロモーターに連結された外来遺伝子を導入する工程が、エレクトロポレーションにより行われる、＜６＞に記載の方法。
＜８＞  ＜１＞から＜５＞の何れか一に記載の動物細胞を培養することを含む、目的タンパク質の製造方法。
＜９＞  培養が、フェドバッチ培養である、＜８＞に記載の方法。
＜１０＞  細胞培養の播種細胞密度が０．２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下である、＜９＞に記載の方法。
＜１１＞  培養期間中の生細胞率が全期間において６０％以上である、＜１０＞に記載の方法。
＜１２＞  培養が、灌流培養である、＜８＞に記載の方法。
＜１３＞  細胞培養の播種細胞密度が０．２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下である、＜１２＞に記載の方法。
＜１４＞  培養期間中の生細胞率が全期間において９０％以上である、＜１３＞に記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の動物細胞によれば、目的タンパク質を高い生産性で製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、遺伝子導入後の細胞の培養上清における抗体濃度を測定した結果を示す。
【図２】図２は、遺伝子導入後の細胞の培養上清における細胞あたりの抗体生産性（Ｑｐ）を測定した結果を示す。
【図３】図３は、遺伝子導入後の細胞サイズを測定した結果を示す。
【図４】図４は、培養期間の積算生細胞数を測定した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を実施するための形態を、詳細に説明する。
本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を意味する。
【００１２】
［動物細胞］
本発明の動物細胞は、目的タンパク質をコードする遺伝子と、ＳＮＡＴ２をコードする外来遺伝子であってプロモーターに連結された外来遺伝子とを有し、上記ＳＮＡＴ２が過剰発現している、動物細胞である。
【００１３】
マウス肝臓においてＳＮＡＴ２遺伝子発現がｍＴＯＲＣ１／Ｓ６Ｋパスウェイを活性化することから（Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ６，  Ａｒｔｉｃｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ：７９４０（２０１５））、ＳＮＡＴ２遺伝子の発現とｍＴＯＲ遺伝子の発現の関連性が示唆される。ラット細胞においてはｍＴＯＲの活性化により細胞増殖が抑えられ細胞サイズが大きくなることが報告されている（Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ２００２  Ｊｕｎ  １５；  １６（１２）：１４７２-１４８７）。また、細胞サイズが大きいほどタンパク質産物の生産量が多くなる（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３４：５９−７０，２０００）ことが示されている。しかしながら、ＳＮＡＴ２遺伝子発現と組み換えタンパク質の生産量との関係は不明である。
【００１４】
特許文献１においては、アラニンアミノトランスフェラーゼの導入の効果により生存率の低下が緩やかになったが、６０％以下の期間が長いため、抗体品質への影響が懸念される。また、タウリントランスポーターの導入により、細胞あたりの抗体生産性（Ｑｐ）が低下しているために、細胞密度が上昇しても生産量に結びつかないという問題がある。これに対し、本発明においては、タンパク質生合成に関わるＳＮＡＴ２遺伝子の発現を増強することにより、細胞あたりの抗体生産性（Ｑｐ）を向上させている。
【００１５】
＜目的タンパク質＞
本発明において、目的タンパク質の種類は特に限定されず、例えば、組み換えポリペプチド鎖、組み換え分泌ポリペプチド鎖、抗原結合タンパク質、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、マウス抗体、バイスペシフィック抗体、Ｆｃ融合タンパク質、断片化免疫イムノグロブリン、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）である。目的タンパク質は、好ましくはヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはマウス抗体である。断片化免疫イムノグロブリンとしては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなどが挙げられる。抗体のクラスも特に限定されるものではなく、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４などのＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭなどいずれのクラスでもよいが、医薬として用いる場合はＩｇＧおよびＩｇＭが好ましい。
【００１６】
ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列から誘導される１つまたは複数の可変および定常領域を有する全ての抗体を含む。一実施形態では、可変および定常ドメインの全てが、ヒト免疫グロブリン配列から誘導される（完全ヒト抗体）。
ヒト化抗体は、ヒト対象に投与されたときに、非ヒト種抗体と比較して、ヒト化抗体が免疫反応を誘発する可能性が低くなるように、および／または重篤な免疫反応の誘発がより少なくなるように、１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、および／または付加により非ヒト種から誘導された抗体の配列と異なる配列を有する。一実施形態では、非ヒト種抗体の重鎖および／または軽鎖のフレームワークおよび定常ドメイン内のある特定のアミノ酸は、ヒト化抗体を産生するように変異している。別の実施形態では、ヒト抗体からの定常ドメインは、非ヒト種の可変ドメインに融合される。
【００１７】
キメラ抗体とは、互いに由来の異なる可変領域と定常領域を連結した抗体である。例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖の可変領域と、ヒト抗体の重鎖および軽鎖の定常領域からなる抗体は、マウス・ヒト異種キメラ抗体である。マウス抗体の可変領域をコードするＤＮＡをヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡと連結させ、これを発現ベクターに組み込むことによって、キメラ抗体を発現する組換えベクターが作製できる。上記ベクターにより形質転換された組換え細胞を培養し、組み込まれたＤＮＡを発現させることによって、培養中に生産されるキメラ抗体を取得できる。
【００１８】
バイスペシフィック抗体とは、２つの異なる抗原特異性を認識する、化学的方法または細胞融合によって作製された抗体である。バイスペシフィック抗体を作製する方法としては、２つのイムノグロブリン分子をＮ−サクシンイミジル  ３−（２−ピリジルジチオール）  プロピオネートまたはＳ−アセチルメルカプトサクシニックアシッドアンハイドライドなどの架橋剤を用いて結合して作製する方法、イムノグロブリン分子のＦａｂフラグメントどうしを結合して作製する方法などが報告されている。
【００１９】
Ｆｃ融合タンパク質とは、Ｆｃ領域を有するタンパク質を示し、抗体を含む。
Ｆａｂは、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインを有する一価断片である。
Ｆ（ａｂ’）２は、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により結合された２つのＦａｂ断片を有する二価断片である。
Ｆｖ断片は、抗体のシングルアームのＶＬおよびＶＨドメインを有する。
一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、ＶＬおよびＶＨ領域がリンカー（例えば、アミノ酸残基の合成配列）を介して接合して、連続したタンパク質鎖を形成する抗体であり、ここでリンカーは、タンパク質鎖をそれ自身に折り重ね、一価抗原結合部位を形成させるのに十分な長さである。
【００２０】
目的タンパク質をコードする遺伝子は、当業者に公知の方法により入手することができる。目的タンパク質が抗体である場合には、抗体のＬ鎖をコードするＤＮＡおよびＨ鎖をコードするＤＮＡを使用することができる。
【００２１】
抗体のＬ鎖をコードするＤＮＡおよびＨ鎖をコードするＤＮＡは、以下のようにして調製することができる。抗体を発現する遺伝子を持つハイブリドーマ、細胞、ファージ、リボソームなどからｍＲＮＡを抽出する。このｍＲＮＡより逆転写酵素を用いる逆転写反応によりｃＤＮＡを作製する。Ｌ鎖遺伝子またはＨ鎖遺伝子と相補塩基配列を持つプライマーとｃＤＮＡを用いるＰＣＲによりＬ鎖遺伝子またはＨ鎖遺伝子を増幅し、クローニング用プラスミドと結合することにより各遺伝子を取得する。
【００２２】
抗体のＬ鎖の断片をコードするＤＮＡおよびＨ鎖の断片をコードするＤＮＡは、以下のようにして調製することができる。抗体を発現する遺伝子を持つハイブリドーマ、細胞、ファージ、リボソームなどからｍＲＮＡを抽出する。このｍＲＮＡより逆転写酵素を用いる逆転写反応によりｃＤＮＡを作製する。Ｌ鎖遺伝子断片またはＨ鎖遺伝子断片と相補塩基配列を持つプライマーとｃＤＮＡを用いるＰＣＲによりＬ鎖遺伝子断片またはＨ鎖遺伝子断片を増幅し、クローニング用プラスミドと結合することにより各遺伝子断片を取得する。
【００２３】
＜ＳＮＡＴ２およびＳＮＡＴ２遺伝子＞
本発明において、ＳＮＡＴ２の由来は特に限定されず、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスターなどの哺乳動物由来のＳＮＡＴ２をコードする外来遺伝子を使用することができる。本発明において、外来遺伝子とは、動物細胞に外から導入された遺伝子のことを言う。また、内在遺伝子を増幅させて遺伝子導入した場合でも外来遺伝子とみなす。
【００２４】
ヒトＳＮＡＴ２の塩基配列とアミノ酸配列を配列表の配列番号１および２に示す。
【００２５】
ヒトＳＮＡＴ２遺伝子の塩基配列（配列番号１）
ATGAAGAAGGCCGAAATGGGACGATTCAGTATTTCCCCGGATGAAGACAGCAGCAGCTACAGTTCCAACA
GCGACTTCAACTACTCCTACCCCACCAAGCAAGCTGCTCTGAAAAGCCATTATGCAGATGTAGATCCTGA
AAACCAGAACTTTTTACTTGAATCGAATTTGGGGAAGAAGAAGTATGAAACAGAATTTCATCCAGGTACT
ACTTCCTTTGGAATGTCAGTATTTAATCTGAGCAATGCGATTGTGGGCAGTGGAATCCTTGGGCTTTCTT
ATGCCATGGCTAATACTGGAATTGCTCTTTTTATAATTCTCTTGACATTTGTGTCAATATTTTCCCTGTA
TTCTGTTCATCTCCTTTTGAAGACTGCCAATGAAGGAGGGTCTTTATTATATGAACAATTGGGATATAAG
GCATTTGGATTAGTTGGAAAGCTTGCAGCATCTGGATCAATTACAATGCAGAACATTGGAGCTATGTCAA
GCTACCTCTTCATAGTGAAATATGAGTTGCCTTTGGTGATCCAGGCATTAACGAACATTGAAGATAAAAC
TGGATTGTGGTATCTGAACGGGAACTATTTGGTTCTGTTGGTGTCATTGGTGGTCATTCTTCCTTTGTCG
CTGTTTAGAAATTTAGGATATTTGGGATATACCAGTGGCCTTTCCTTGTTGTGTATGGTGTTCTTTCTGA
TTGTGGTCATTTGCAAGAAATTTCAGGTTCCGTGTCCTGTGGAAGCTGCTTTGATAATTAACGAAACAAT
AAACACCACCTTAACACAGCCAACAGCTCTTGTACCTGCTTTGTCACATAACGTGACTGAAAATGACTCT
TGCAGACCTCACTATTTTATTTTCAACTCACAGACTGTCTATGCTGTGCCAATTCTGATCTTTTCATTTG
TCTGTCATCCTGCTGTTCTTCCCATCTATGAAGAACTGAAAGACCGCAGCCGTAGAAGAATGATGAATGT
GTCCAAGATTTCATTTTTTGCTATGTTTCTCATGTATCTGCTTGCCGCCCTCTTTGGATACCTAACATTT
TACGAACATGTTGAGTCAGAATTGCTTCATACCTACTCTTCTATCTTGGGAACTGATATTCTTCTTCTCA
TTGTCCGTCTGGCTGTGTTAATGGCTGTGACCCTGACAGTACCAGTAGTTATTTTCCCAATCCGGAGTTC
TGTAACTCACTTGTTGTGTGCATCAAAAGATTTCAGTTGGTGGCGTCATAGTCTCATTACAGTGTCTATC
TTGGCATTTACCAATTTACTTGTCATCTTTGTCCCAACTATTAGGGATATCTTTGGTTTTATTGGTGCAT
CTGCAGCTTCTATGTTGATTTTTATTCTTCCTTCTGCCTTCTATATCAAGTTGGTGAAGAAAGAACCTAT
GAAATCTGTACAAAAGATTGGGGCTTTGTTCTTCCTGTTAAGTGGTGTACTGGTGATGACCGGAAGCATG
GCCTTGATTGTTTTGGATTGGGTACACAATGCACCTGGAGGTGGCCAT
【００２６】
ヒトＳＮＡＴ２遺伝子のアミノ酸配列（配列番号２）
MKKAEMGRFSISPDEDSSSYSSNSDFNYSYPTKQAALKSHYADVDPENQNFLLESNLGKKKYETEFHPGT
TSFGMSVFNLSNAIVGSGILGLSYAMANTGIALFIILLTFVSIFSLYSVHLLLKTANEGGSLLYEQLGYK
AFGLVGKLAASGSITMQNIGAMSSYLFIVKYELPLVIQALTNIEDKTGLWYLNGNYLVLLVSLVVILPLS
LFRNLGYLGYTSGLSLLCMVFFLIVVICKKFQVPCPVEAALIINETINTTLTQPTALVPALSHNVTENDS
CRPHYFIFNSQTVYAVPILIFSFVCHPAVLPIYEELKDRSRRRMMNVSKISFFAMFLMYLLAALFGYLTF
YEHVESELLHTYSSILGTDILLLIVRLAVLMAVTLTVPVVIFPIRSSVTHLLCASKDFSWWRHSLITVSI
LAFTNLLVIFVPTIRDIFGFIGASAASMLIFILPSAFYIKLVKKEPMKSVQKIGALFFLLSGVLVMTGSM
ALIVLDWVHNAPGGGH
【００２７】
ＳＮＡＴ２をコードする外来遺伝子としては、
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ＳＮＡＴ２機能を有するタンパク質をコードする遺伝子；または
（３）配列番号２に記載のアミノ酸配列と８５％以上（さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ＳＮＡＴ２機能を有するタンパク質をコードする遺伝子；
を使用することができる。
【００２８】
ＳＮＡＴ２機能とは、ｍＴＯＲＣ１／Ｓ６Ｋパスウェイを活性化する機能を意味する。ラット細胞においてはｍＴＯＲの活性化により細胞増殖が抑えられ細胞サイズが大きくなることが知られている。
【００２９】
ＳＮＡＴ２をコードする外来遺伝子としてはさらに、
（４）配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子；
（５）配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、ＳＮＡＴ２機能を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（６）配列番号１に記載の塩基配列の相補配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、ＳＮＡＴ２機能を有するタンパク質をコードする遺伝子；または
（７）配列番号１に記載の塩基配列と９０％以上（さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上）の配列同一性を有する塩基配列を有し、ＳＮＡＴ２機能を有するタンパク質をコードする遺伝子： 
を使用することもできる。
【００３０】
「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」における「１若しくは数個」とは、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個を意味する。
【００３１】
本発明における配列同一性は、以下の式で計算される値を指す。
％配列同一性＝［（同一残基数）／（長い方のアラインメント長）］×１００
２つのアミノ酸配列における配列同一性は当業者に公知の任意の方法で決定することができ、ＢＬＡＳＴ（（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ））プログラム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）等を使用して決定することができる。分母の「長い方のアラインメント長」とは、二つのアラインメントを比較した場合に、分母には長い方のアラインメント長を用いることを意味する。
【００３２】
「１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列」における「１若しくは数個」とは、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個を意味する。
【００３３】
「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」における「ストリンジェントな条件下」とは、中程度または高程度のストリンジェント条件下でハイブリダイズすることを意味し、これらは当業者であれば認識することができる。中程度のストリンジェントな条件としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｖｏｌ．１、７．４２−７．４５  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１に記載されている条件を挙げることができる。中程度のストリンジェントな条件は、例えば、ニトロセルロースフィルターにおいて５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４０〜５０℃での約５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ〜６×ＳＳＣ（または約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、および約６０℃、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの洗浄条件を挙げることができる。高程度のストリンジェントな条件もまた当業者により容易に決定することができ、例えば、上記した中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度および／または低い塩濃度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を含む。例えば、上記のようなハイブリダイゼーション条件、および６８℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄を挙げることができる。ここで、１×ＳＳＣの組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．４である。ＳＤＳはドデシル硫酸ナトリウムであり、ＥＤＴＡはエチレンジアミン四酢酸である。
【００３４】
ヒト以外のＳＮＡＴ２のアミノ酸配列と塩基配列の情報を以下に示す。以下の番号はＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＧｅｎｅ  Ｎｏ．を示す。
ＩＤ：  ２９６４２   ラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）
ＩＤ：  ６７７６０   マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）
ＩＤ：  ５６６５３７ ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）
ＩＤ：  ３３８０４４ ウシ（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ）
ＩＤ：  ４１７８０７ ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）
ＩＤ：  ７０２２５３ アカゲサル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）
ＩＤ：  １０１０８３３４８  ネコ（Ｆｅｌｉｓ  ｃａｔｕｓ）
ＩＤ：  １００５２５６４４  ブタ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）
ＩＤ：  １０１１４９５６４  ゴリラ（Ｇｏｒｉｌｌａ  ｇｏｒｉｌｌａ）
【００３５】
ヒト以外のＳＮＡＴ２についても、ヒトＳＮＡＴ２の場合と同様に、
（２Ａ）所定のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ＳＮＡＴ２機能を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（３Ａ）所定のアミノ酸配列と８５％以上（さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ＳＮＡＴ２機能を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（５Ａ）所定の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、ＳＮＡＴ２機能を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（６Ａ）所定の塩基配列の相補配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、ＳＮＡＴ２機能を有するタンパク質をコードする遺伝子；または
（７Ａ）所定の塩基配列と９０％以上（さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上）の配列同一性を有する塩基配列を有し、ＳＮＡＴ２機能を有するタンパク質をコードする遺伝子： 
を使用してもよい。
【００３６】
ＳＮＡＴ２をコードする外来遺伝子はプロモーターに連結されている。
プロモーターとしては宿主の動物細胞において機能してＳＮＡＴ２を発現させることができるものであれば特に限定されない。プロモーターとしては、ＣＭＶプロモーター（サイトメガロウィルスプロモーター）、ＥＦ１αプロモーター（ヒトポリペプチド鎖伸長因子遺伝子のプロモーター）、ＳＶ４０プロモーター（シアミンウイルス４０プロモーター）、β−ａｃｔｉｎプロモーター、ＭＭＬＶ−ＬＴＲプロモーター（モロニーマウス白血病ウイルスの長い末端反復のプロモーター）、またはマウスβグロビンプロモーターが好ましく、ＣＭＶプロモーターがより好ましい。
【００３７】
本発明の動物細胞においては、ＳＮＡＴ２が過剰発現している。過剰発現とは、ある遺伝子の発現が、宿主における通常の発現量を超えていることを意味する。ＳＮＡＴ２をコードする外来遺伝子を宿主に導入し、上記外来遺伝子を宿主において発現させることにより、ＳＮＡＴ２を過剰発現している動物細胞を得ることができる。
【００３８】
本発明の動物細胞におけるＳＮＡＴ２の発現量は、ＳＮＡＴ２をコードする外来遺伝子を有さない動物細胞に対して、３倍以上であることが好ましく、３．５倍以上であることがより好ましく、４倍以上であることがより一層好ましく、４．５倍以上であることがさらに好ましく、５倍以上であることがさらに一層好ましく、５．５倍以上であることが特に好ましい。上限はなくてもよいが、３００００倍以下でもよく、１００００倍以下でもよい。
【００３９】
ＳＮＡＴ２の発現量は、ＲＴ−ＰＣＲ法（逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応）などによって調べることができる。ＳＮＡＴ２の発現量は、ｍＲＮＡの逆転写とリアルタイムＰＣＲにより実施することが好ましい。ＳＮＡＴ２の発現量は、ノーマライゼーションによって算出される相対的発現量であることが好ましい。ノーマライゼーションは、たとえば、β―アクチンやＨＰＲＴ１などのハウスキーピング遺伝子の発現量を内在性コントロールとした比較定量によって行える。
【００４０】
＜動物細胞＞
本発明における細胞は、動物細胞であれば特に限定されない。動物細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＢＨＫ細胞、２９３細胞、ミエローマ細胞（ＮＳ０細胞など）、ＰｅｒＣ６細胞、ＳＰ２／０細胞、ハイブリドーマ細胞、ＣＯＳ細胞、３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＰＣ１２細胞、ＷＩ３８細胞などを挙げることができる。上記の中でも、特にＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、２９３細胞、ミエローマ細胞（ＮＳ０細胞など）、ＰｅｒＣ６細胞、ＳＰ２／０細胞、ハイブリドーマ細胞が好ましく、さらにＣＨＯ細胞が好ましい。ＣＨＯ細胞は、組換えタンパク質、例えば、サイトカイン、凝固因子、および抗体の産生に広く使用されている。ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）を欠損したＣＨＯ細胞を使用することが好ましく、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞としては、例えば、ＣＨＯ−ＤＧ４４を使用することができる。
【００４１】
［動物細胞の製造方法］
本発明によれば、動物細胞に対して、目的タンパク質をコードする遺伝子と、ＳＮＡＴ２をコードする外来遺伝子であってプロモーターに連結された外来遺伝子とを導入する工程を含む、本発明の動物細胞の製造方法が提供される。
【００４２】
目的タンパク質をコードする遺伝子、およびＳＮＡＴ２をコードする外来遺伝子はそれぞれベクターに組み込まれた形で、宿主である動物細胞に導入されることが好ましい。
【００４３】
遺伝子を宿主に導入するために使用できるベクターとしては、例えば、哺乳動物由来の発現ベクターを使用することができ、例えば、ｐＣＭＶ６−Ｅｎｔｒｙ（ＯｒｉＧｅｎｅ社製）、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９０，１８（１７），ｐ５３２２）、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８（フナコシ社製）、ＩＮＰＥＰ４（Ｂｉｏｇｅｎ−ＩＤＥＣ社製）などが挙げられるが、特に限定されない。
【００４４】
また、ポリＡを持つｍＲＮＡは細胞内で安定することが知られている。目的タンパク質をコードする遺伝子、およびＳＮＡＴ２をコードする外来遺伝子は、ポリＡを遺伝子に付加させるために必要なポリＡシグナル、例えばマウスβグロビンポリＡシグナル、ウシ成長ホルモンポリＡシグナル、ＳＶ４０ポリＡシグナルなどを持っていてもよい。
【００４５】
動物細胞への、目的タンパク質をコードする遺伝子、およびＳＮＡＴ２をコードする外来遺伝子の導入方法は特に限定されず、当業者に公知の方法により行うことができる。例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、カチオニックリポソームＤＯＴＡＰ（ロシュ・ライフサイエンス社製）を用いた方法、またはウイルスベクターを用いた方法で行うことが可能である。上記の中でも好ましくは、エレクトロポレーションである。
【００４６】
動物細胞に遺伝子を導入する場合、使用する発現ベクターの種類および遺伝子導入法に応じて、遺伝子は、遺伝子導入に供された細胞のうちの一部の細胞のみに導入される。遺伝子を導入した細胞を同定および選択するために、例えば抗生物質に対する耐性について選択可能なマーカーをコードする遺伝子を、目的の遺伝子とともに宿主細胞内に導入してもよい。好ましい選択可能マーカーには、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキサートなどの、薬物に耐性を与えるものが含まれる。
【００４７】
本発明の細胞においては、目的タンパク質をコードする遺伝子は、一過性発現系で発現していてもよいし、恒常的発現系で発現していてもよいが、恒常的発現系で発現しているものが好ましい。
【００４８】
本発明の細胞においては、ＳＮＡＴ２をコードする外来遺伝子は、一過性発現系で発現していてもよいし、恒常的発現系で発現していてもよいが、恒常的発現系で発現しているものが好ましい。
【００４９】
一過性発現系とは、環状プラスミドをリン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法などにより細胞内に取り込ませ発現させる方法である。目的タンパク質をコードする遺伝子、およびＳＮＡＴ２をコードする外来遺伝子は染色体外に存在することが多い。
【００５０】
恒常的発現系とは、環状プラスミドまたは制限酵素処理などにより作成した直鎖上プラスミドをリン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法などにより細胞内に取り込ませ、一部が細胞のゲノム中に挿入されることで目的タンパク質を発現させる方法である。目的タンパク質をコードする遺伝子、およびＳＮＡＴ２をコードする外来遺伝子の発現を長期間維持することが可能である。またプラスミドへの薬剤耐性遺伝子の導入を行えば薬剤選抜が可能となり、目的タンパク質をコードする遺伝子、およびＳＮＡＴ２をコードする外来遺伝子が染色体上に維持された細胞を効率的に選択することができる。
【００５１】
［目的タンパク質の製造方法］
本発明によれば、本発明の動物細胞を培養することを含む、目的タンパク質の製造方法が提供される。
【００５２】
本発明の動物細胞を培養することにより、目的タンパク質を製造することができる。培養は、公知の方法に従い行うことができる。
本発明の動物細胞の培養に用いる培地としては、通常の動物細胞の培養で使用されている培地を用いることができる。例えば、ＯｐｔｉＣＨＯ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、１２６８１０１１）培地、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＲＰＭＩ−１６４１培地、Ｆ−１２Ｋ培地、ハムＦ１２培地、イスコブ変法ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、マッコイ５Ａ培地、ライボビッツＬ−１５培地、およびＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）３００シリーズ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＣＨＯ−ＳＦ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、ＣＤ−ＣＨＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、  ＩＳ  ＣＨＯ−Ｖ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、ＰＦ−ＡＣＦ−ＣＨＯ  （Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）などを使用することができる。
【００５３】
培地には牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清を添加してもよく、より好ましくは無血清培地で培養してもよく、最も好ましくは完全合成培地がよい。
培地には、アミノ酸、塩、糖類、ビタミン、ホルモン、増殖因子、緩衝液、抗生物質、脂質、微量元素、植物タンパク質の加水分解物などの追加成分を補充してもよい。
【００５４】
培地のｐＨは培養する細胞により異なるが、一般的にはｐＨ６．０〜８．０であり、好ましくはｐＨ６．８〜７．６であり、より好ましくはｐＨ７．０〜７．４である。
培養温度は、一般的には３０℃〜４０℃であり、好ましくは３２℃〜３７℃であり、より好ましくは３６℃〜３７℃であり、培養中に培養温度を変更してもよい。
【００５５】
培養は、ＣＯ２濃度が０〜４０％、好ましくは２〜１０％の雰囲気下で行うことが好ましい。
培養時間は特に限定されないが、一般的には１２時間〜９０日間であり、好ましくは２４時間〜６０日間であり、より好ましくは２４時間〜３０日間である。
培養においては、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加えることができる。
【００５６】
本発明の動物細胞の培養は、培養装置（バイオリアクターとも言う）、またはそれ以外の好適な容器内で行うことができる。培養装置としては、発酵槽型タンク培養装置、エアーリフト型培養装置、カルチャーフラスコ型培養装置、スピンナーフラスコ型培養装置、マイクロキャリアー型培養装置、流動層型培養装置、ホロファイバー型培養装置、ローラーボトル型培養装置、充填槽型培養装置等を用いてすることができる。
【００５７】
培養スケールは、一般的には１Ｌ〜２００００Ｌであり、好ましくは１Ｌ〜１００００Ｌであり、より好ましくは２００Ｌ〜２０００Ｌであり、さらに好ましくは５００Ｌ〜２０００Ｌである。
【００５８】
培養は、バッチ培養（ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｕｒｅ）、フェドバッチ培養  （ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｕｒｅ；流加培養とも言う）、灌流培養（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ）などのいずれの方法を用いてもよいが、フェドバッチ培養または灌流培養が好ましい。
【００５９】
バッチ培養とは、細胞を固定体積の培養培地中で短期間増殖させ、その後、完全に回収する不連続な方法である。バッチ法を用いて増殖させた培養物は、最大細胞密度に達するまで細胞密度の増加を経験し、その後、培地成分が消費され、代謝副産物（乳酸塩およびアンモニア等）のレベルが蓄積するにつれて生存細胞密度が減退する。回収は、典型的には、最大細胞密度（典型的には、５〜１０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）が達成された時点で行う。バッチプロセスは、最も単純な培養方法であるが、しかしながら生存細胞密度は、栄養分利用能によって制限され、細胞が一度最大密度になると、培養は減退し、目的タンパク質の産生が低減する。廃棄産物の蓄積および栄養枯渇が培養減退に迅速につながるため（典型的には、約３〜７日）、目的タンパク質の産生期間を延長することはできない。
【００６０】
フェドバッチ培養は、ボーラスまたは連続的に培地を供給して、消費された培地成分を補給することによって、バッチプロセスを改善する培養方法である。即ち、フェドバッチ培養においては、培養形態は懸濁培養であり、培養プロセスの開始後の一以上の時点において培養に追加成分を提供する。追加成分としては、培養プロセス中に枯渇している細胞のための栄養補助成分が挙げられ、その他の補助成分（例えば、細胞周期阻害化合物）を含めてもよい。
【００６１】
フェドバッチ培養では、培養期間を通して追加の栄養分を添加するため、バッチ培養と比較して、より高い細胞密度、および目的タンパク質の高い産生量を達成できる可能性がある。フェドバッチ培養では、バッチ培養とは異なり、所望の細胞密度を達成するための細胞増殖の期間（増殖期）を、中止したまたは遅い細胞増殖の期間（産生期）から区別するように供給スケジュールおよび培地成分を操作することにより二相培養を作製および持続することができる。これにより、フェドバッチ培養は、バッチ培養と比較して、目的タンパク質のより高い産生量を達成できる可能性がある。
【００６２】
フェドバッチ培養において、細胞培養の播種細胞密度は、一般的には０．２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下であり、好ましくは０．２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下であり、より好ましくは０．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上２．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下であり、さらに好ましくは０．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上１．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下である。
フェドバッチ培養において、培養期間中の生細胞率は全期間において、好ましくは６０％以上１００％以下であり、より好ましくは７０％以上１００％以下であり、さらに好ましくは７５％以上１００％以下である。
【００６３】
灌流培養は、新鮮な培地を添加し、同時に使用済み培地を除去する培養法であり、バッチ培養およびフェドバッチ培養をさらに改善できる可能性がある。灌流培養は、例えば、ＡＴＦ（Alternating Tangential Flow Filtration）ポンプまたはＴＦＦ（Tangential Flow Filtration）ポンプを用いて行うことができる。灌流培養によれば、１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬを超える高い細胞密度を達成することが可能である。典型的な灌流培養は、１日間または２日間続くバッチ培養スタートアップで始まり、その後、培養物に新鮮な供給培地を連続的、段階的、および／または断続的に添加し、使用済み培地を同時に除去する。灌流培養においては、沈降、遠心分離または濾過などの方法を用いて、細胞密度を維持しながら使用済み培地を除去することができる。灌流培養は、例えば、ＡＴＦポンプまたはＴＦＦポンプを用いて行うことができる。
【００６４】
灌流培養の利点は、目的タンパク質が生産される培養が、バッチ培養法またはフェドバッチ培養よりも長期間維持されることである。しかし、長期の灌流培養、特に高細胞密度での灌流培養を維持するためには、培地の調製、使用、保存および廃棄が必要である。灌流培養では、多くの栄養分が必要であり、バッチ培養およびフェドバッチ培養と比較して、目的タンパク質の生産コストが高くなる傾向にある。また、膜孔径の選択により、抗体を系外へ回収しながら培養を継続することが可能であるため、抗体の培養液中での滞留時間を短くし、化学的変化を減らすことで抗体の品質を高く保つことが可能である。  
【００６５】
フェドバッチ培養および灌流培養を組み合わせた培養を行うことも可能である。一例としては、ボーラス供給を伴うフェドバッチ培養を、増殖期の細胞の培養を維持するために使用し、次いで、灌流培養を目的タンパク質の産生のために使用することができる。
【００６６】
灌流は、連続的、段階的、断続的またはこれらの組み合わせの何れの形態でもよい。動物細胞は、培養物中に保持され、除去される使用済みの培地は、細胞を実質的に含まないか、または培養物よりもはるかに少ない細胞を有していてもよい。細胞培養によって発現される目的タンパク質は膜孔径の選択により、培養物中に保持または回収することができる。培養中の細胞密度が過剰にならないよう、培養液の一部を細胞ごと抜き取り、新鮮な培地を同量加えることにより細胞密度を減らす（セルブリーディング）ことを行っても良い。
【００６７】
灌流培養において、細胞培養の播種細胞密度は、一般的には０．２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下であり、好ましくは０．２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下であり、より好ましくは０．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下である。
灌流培養において、培養期間中の生細胞率は全期間において、好ましくは８０％以上であり、より好ましくは８５％以上であり、さらに好ましくは９０％以上である。
【００６８】
灌流培養において、最高到達細胞密度は、好ましくは２×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下であり、より好ましくは１．５×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下であり、さらに好ましくは１．０×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下である。
【００６９】
灌流培養における灌流比としては、好ましくは０．３ｖｖｄ以上５．０ｖｖｄ以下であり、より好ましくは０．３ｖｖｄ以上１．５ｖｖｄ以下である。但し、ｖｖｄは以下を表す。
ｖｖｄ＝（ｖｏｌｕｍｅ  ｏｆ  ｆｒｅｓｈ  ｍｅｄｉｕｍ／ｗｏｒｋｉｎｇ  ｖｏｌｕｍｅ  ｏｆ  ｒｅａｃｔｏｒ／ｄａｙ，  １日当たりの供給培養液量／培養液量）
【００７０】
細胞培養の播種細胞密度、および培養における最高到達細胞密度は、細胞数を常法により測定し、細胞数を培養液量で割ることにより求めることができる。
培養期間中の生細胞率（生存率）は、生細胞数を（生細胞数＋死細胞数）で除算することで求められる。たとえば、細胞数の測定はＶｉ−ＣＥＬＬ  ＸＲ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を用いて測定することができる。
【００７１】
上記した培養により製造される目的タンパク質は精製することができる。目的タンパク質の分離および精製は通常のタンパク質で使用されている分離および精製方法を使用すればよい。例えば、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択および組み合わせることにより、目的タンパク質を分離および精製することができるが、これらに限定されるものではない。上記で得られた目的タンパク質の濃度測定は、吸光度測定または酵素結合免疫吸着検定法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）等により行うことができる。
【００７２】
アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。アフィニティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる。これらのクロマトグラフィーはＨＰＬＣ（ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；高速液体クロマトグラフィー）またはＦＰＬＣ（ｆａｓｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
【００７３】
なお、目的タンパク質は、精製前または精製後に適当なポリペプチド修飾酵素を作用させることにより、目的タンパク質を修飾したり、部分的にペプチドを除去することもできる。ポリペプチド修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼなどが用いられる。
【００７４】
［目的タンパク質の利用］
本発明の方法により製造された目的タンパク質が、医薬品として有用な生物学的活性を有する場合には、目的タンパク質を、薬学的に許容される担体または添加剤と混合して製剤化することにより、医薬品を製造することができる。
【００７５】
薬学的に許容される担体および添加剤の例として、水、薬学的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、薬学的に許容される界面活性剤等が挙げられる。
【００７６】
例えば、注射用製剤として使用する場合、精製された目的タンパク質を溶剤、例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等に溶解し、これに吸着防止剤、例えばＴｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ２０、ゼラチン、ヒト血清アルブミン等を加えたものを使用することができる。あるいは、目的タンパク質は、使用前に溶解再構成する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよく、凍結乾燥のための賦形剤としては、例えば、マンニトール、ブドウ糖等の糖アルコールや糖類を使用することができる。
【００７７】
目的タンパク質の投与方法は、経口投与または非経口投与のいずれでもよいが、好ましくは非経口投与である。例えば、注射（例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などによる全身または局所投与）、経鼻投与、経肺投与、または経皮投与などが挙げられる。
【００７８】
目的タンパク質の投与量は、目的タンパク質の種類、治療や予防の対象とする疾患の種類、患者の年齢、疾患の重篤度などにより適宜選択される。一般的には、一回につき体重１ｋｇあたり０．００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲であるが、特に限定されない。
【００７９】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００８０】
＜実施例１＞動物細胞の作製
ヒトＳＮＡＴ２遺伝子をコードするベクター（ＯｒｉＧｅｎｅ社、Ｃａｔ＃  ＲＣ２０１８９２）を購入し、ＳＮＡＴ２遺伝子の発現カセット（プロモーター、オープンリーディングフレーム、ターミネーター）をプライマー１（配列番号３）及びプライマー２（配列番号４）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。【００８１】
抗体１（デノスマブ、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａ／ｄｒｕｇｓ／ＤＢ０６６４３）、抗体２（ブロソズマブ、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａ／ｄｒｕｇｓ／ＤＢ１２５６０）または抗体３（抗ＭＵＣ１抗体、特表２０１６−５１７６９１号公報）の各抗体のＬ鎖及びＨ鎖を共発現するベクターに、増幅したＳＮＡＴ２発現カセットを挿入した。Ｌ鎖及びＨ鎖共発現ベクターの構築および細胞への導入は、特表２０１６−５１７６９１号公報の実施例２に準じて行った。【００８２】
抗体及びＳＮＡＴ２遺伝子を導入する前のホストＣＨＯ−ＤＧ４４細胞はすべて３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下のインキュベーターで培養した。ホスト細胞５×１０６ｃｅｌｌｓにエレクトロポレーション法（Ｌｏｎｚａ社、４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ）を用いて上記ベクターを導入し、１００倍希釈したＨＴ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ｘ１００）（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、１１０６７−０３０）を含む２０ｍＬのＯｐｔｉＣＨＯ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、１２６８１０１１）培地に懸濁の後、Ｔ７５フラスコに播種した。１日後、ＨＴサプリメントを含まず１７５ｎｍｏｌ／Ｌのメトトレキサート（ＭＴＸ）（和光純薬工業社）を含むＯｐｔｉＣＨＯ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、１２６８１０１１）培地に入れ替えた。遺伝子導入後３週間からＴ７５フラスコの顕微鏡観察を開始し、細胞の増殖が見られたフラスコから順次、培養体積を２０ｍＬへ拡大し、１２５ｍＬ容振とうフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）へ播種し、１４０ｒｐｍで振とう培養した。【００８３】
上記の方法で、ヒトＳＮＡＴ２遺伝子及び抗体１又は抗体２又は抗体３を強制発現する抗体１−ＳＮＡＴ２細胞、抗体２−ＳＮＡＴ２細胞、抗体３−ＳＮＡＴ２細胞を樹立した。また、抗体Ｌ鎖及びＨ鎖を発現するベクターを用いて、同様の方法で遺伝子導入を実施し、対照群の抗体１細胞、抗体２細胞、抗体３細胞を構築した。【００８４】
プライマ−１: CCGCGGTCATAGCTGTTTCCTGAAC（配列番号３）
プライマ−２： CAGCTATGACCGCGGTTAATGGCCACCTCCAGGTGCATTGTGT（配列番号４）【００８５】
＜実施例２＞培養実験
抗体１−ＳＮＡＴ２細胞、抗体２−ＳＮＡＴ２細胞、抗体３−ＳＮＡＴ２細胞および抗体１細胞、抗体２細胞、抗体３細胞をそれぞれ８水準ずつ用いて流加培養実験を実施した。
細胞を５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度でＯｐｔｉＣＨＯ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、１２６８１０１１）培地１５ｍＬに懸濁し、ＡＭＢＲ１５培養装置（ザルトリウス・ステディム社）による自動培養を行った。培養開始２日目から１３日目まで、毎日フィード培地（Ｃｅｌｌｂｏｏｓｔ７ａ，７ｂ，ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を初期培養体積比で２％ずつ加えた。経時的に細胞密度、培養液成分および抗体濃度を測定するため、３−４日おきにサンプリングを実施した。培養開始１４日目に培養液を回収し、０．２２μｍのデプスフィルター（メルクミリポア社）を用いて細胞および細胞デブリを除いた。上清中の抗体濃度および細胞あたりの抗体生産性（Ｑｐ）を液体クロマトグラフィーによって測定したところ、抗体濃度は抗体１で１２１％、抗体２で２５％、抗体３で５６％増加した（図１および表１）。また、Ｑｐは抗体１で１２７％、抗体２で３４％、抗体３で７４％増加した（図２および表２）。ＳＮＡＴ２の発現によってタンパク質生合成が活性化したため、抗体生産性が向上したと考えられる。一方で、Ｖｉ−ＣＥＬＬ（ベックマン・コールター社）にて細胞径を測定した結果、驚くべきことに、各細胞のサイズは、抗体１−ＳＮＡＴ２細胞（平均１５．８μｍ）、抗体２−ＳＮＡＴ２細胞（平均１６．３μｍ）、抗体３−ＳＮＡＴ２細胞（平均１６．５μｍ）となっていることがわかり、対照群の抗体１細胞（平均１６．３μｍ）、抗体２細胞（平均１５．８μｍ）、抗体３細胞（平均１６．２μｍ）と比較し、必ずしも細胞径が大きくならずほぼ同程度を示した（図３および表３）。また、細胞の増殖性を示す培養期間の積算生細胞数（ＩＶＣＤ）は、対照群と比較して同程度か若干多かった（図４および表４）。図１〜図４において、左は抗体のみ、右は抗体−ＳＮＡＴ２を示す。このことは、ＳＮＡＴ２を発現してもＣＨＯ細胞の分化が亢進せず、抗体産生細胞の樹立や抗体の生産に必要な細胞増殖能を維持していることを証明した。
なお、積分生存細胞密度（ＩＶＣＤ）は、以下の方法で測定した。０、３、７、１０および１４日目に生細胞密度（ＶＣＤ）をＶｉ−ＣＥＬＬ  ＸＲ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社）で測定し、それぞれの値をＶ０、Ｖ３、Ｖ７、Ｖ１０およびＶ１４とする。積分生存細胞密度（ＩＶＣＤ）は、以下の式で求められる。
積分生存細胞密度（ＩＶＣＤ）＝｛（Ｖ０＋Ｖ３）×（３−０）／２｝＋｛（Ｖ３＋Ｖ７）×（７−３）／２｝＋｛（Ｖ１０＋Ｖ７）×（１０−７）／２｝＋｛（Ｖ１４＋Ｖ１０）×（１４−１０）／２｝【００８６】
【表１】
2020122049.tif 000002
【００８７】
【表２】
2020122049.tif 000003
【００８８】
【表３】
2020122049.tif 000004
【００８９】
【表４】
2020122049.tif 000005
【００９０】
細胞あたりの抗体生産性Ｑｐ［ｐｇ／ｃｅｌｌ／ｄａｙ］は、以下の式で求めた。【００９１】
【数１】
2020122049.tif 000006
【００９２】
Ｐｔｉ［ｇ／Ｌ］  ＝  培養日ｔｉにおける精製物の濃度
Ｘｔｉ［ｃｅｌｌ／ｄａｙ］＝  培養日ｔｉにおける生細胞密度【００９３】
積分の近似値は、時間ｔ１からｔ２までの増殖曲線下面積を台形の面積として求めることで算定した。
【数２】
2020122049.tif 000007
【図１】
2020122049.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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