(57)【要約】  標本（Ｘ）を載置するステージ（２）と、ステージ（２）に載置された標本（Ｘ）に励起光が照射されることにより標本（Ｘ）において発生した蛍光を集光する対物レンズ（４）と、対物レンズ（４）により集光された蛍光を透過させる位相板（５）と、位相板（５）を透過した蛍光を集光する結像レンズ（６）と、結像レンズ（６）により集光された標本（Ｘ）の蛍光像を撮影する撮像素子（７）とを備え、位相板（５）が、対物レンズ（４）の瞳位置または瞳位置と光学的に共役な位置に配置されている顕微鏡装置（１）である。
2020021663.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標本を載置するステージと、
該ステージに載置された前記標本に励起光が照射されることにより該標本において発生した蛍光を集光する対物レンズと、
該対物レンズにより集光された蛍光を透過させる位相板と、
該位相板を透過した蛍光を集光する結像レンズと、
該結像レンズにより集光された前記標本の蛍光像を撮影する撮像素子とを備え、
前記位相板が、前記対物レンズの瞳位置または該瞳位置と光学的に共役な位置に配置されている顕微鏡装置。
【請求項２】
光源から発せられた前記励起光を前記対物レンズに入射させ、前記対物レンズにより集光された蛍光を前記励起光の光路から分岐するダイクロイックミラーを備える請求項１に記載の顕微鏡装置。
【請求項３】
前記位相板が、前記ダイクロイックミラーと前記結像レンズとの間に配置されている請求項２に記載の顕微鏡装置。
【請求項４】
前記位相板が、前記ダイクロイックミラーよりも前記ステージ側に配置されている請求項２に記載の顕微鏡装置。
【請求項５】
前記励起光が紫外光であり、
前記位相板の材質が下記の条件式を満たす請求項４に記載の顕微鏡装置。
１．４３≦ｎｄ≦１．６１
６２≦νｄ≦９５
ここで、ｎｄはｄ線における屈折率、νｄはｄ線におけるアッベ数である。
【請求項６】
前記位相板の形状が以下の式で表される請求項１から請求項５のいずれかに記載の顕微鏡装置。
ｚ＝ｋ（ｘ３＋ｙ３）
ここで、ｚは光軸方向、ｘ，ｙは前記光軸に直交し、かつ相互に直交する２方向の座標、ｋは任意の有理数である。
【請求項７】
前記結像レンズと前記撮像素子との間に配置されたマイクロレンズアレイを備える請求項１から請求項６のいずれかに記載の顕微鏡装置。
【請求項８】
前記位相板の材質が合成石英である請求項５に記載の顕微鏡装置。
【請求項９】
励起光を発する光源と、
該光源からの前記励起光が入射するダイクロイックミラーと、
該ダイクロイックミラーよりも標本側に配置され、前記ダイクロイックミラーによって反射された前記励起光を前記標本に集光する対物レンズと、
前記ダイクロイックミラーよりも前記標本側、かつ前記対物レンズの瞳位置または該瞳位置と光学的に共役な位置に配置され、前記ダイクロイックミラーによって反射された前記励起光が入射する位相板と、
前記標本に前記励起光が照射されることによって発生した蛍光を集光する結像レンズと、
該結像レンズによって集光された前記標本の蛍光像を撮影する撮像素子とを備え、
前記標本に前記励起光が照射されることによって発生した前記蛍光が、前記対物レンズおよび前記位相板を通過してから前記ダイクロイックミラーに入射し、該ダイクロイックミラーを透過した前記蛍光を前記結像レンズによって集光することにより前記標本の蛍光像を前記撮像素子上に結像する顕微鏡装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
標本の３次元情報を取得可能な蛍光顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００６−８４９６０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１の蛍光顕微鏡は、対物レンズの焦点位置を光軸方向に移動させながら標本のスライス像を共焦点画像として取得することにより試料の３次元画像を取得する。このため、３次元画像の取得に長時間を要するという不都合がある。【０００５】
本発明は、標本の３次元情報を含む画像を短時間に取得することができる顕微鏡装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一態様は、標本を載置するステージと、該ステージに載置された前記標本に励起光が照射されることにより該標本において発生した蛍光を集光する対物レンズと、該対物レンズにより集光された蛍光を透過させる位相板と、該位相板を透過した蛍光を集光する結像レンズと、該結像レンズにより集光された前記標本の蛍光像を撮影する撮像素子とを備え、前記位相板が、前記対物レンズの瞳位置または該瞳位置と光学的に共役な位置に配置されている顕微鏡装置である。【０００７】
本態様によれば、標本をステージに搭載し、標本に励起光を照射することにより、励起光の照射位置において発生した蛍光が対物レンズにより集光された後、位相板を透過させられて結像レンズにより集光され撮像素子に標本の蛍光像を結像する。位相板が対物レンズの瞳位置または瞳位置と光学的に共役な位置に配置されているので、焦点深度が拡大された蛍光像が撮像素子により撮影される。これにより、標本の３次元情報を含む画像を短時間に取得することができる。【０００８】
上記態様においては、光源から発せられた前記励起光を前記対物レンズに入射させ、前記対物レンズにより集光された蛍光を前記励起光の光路から分岐するダイクロイックミラーを備えていてもよい。
この構成により、光源から発せられた励起光がダイクロイックミラーを通過した後に対物レンズに入射されて標本に照射され、標本において発生した蛍光がダイクロイックミラーを通過する際に励起光の光路から撮像素子に向かう方向に分岐される。これにより、いわゆる落射照明の顕微鏡装置を構成することができる。【０００９】
また、上記態様においては、前記位相板が、前記ダイクロイックミラーと前記結像レンズとの間に配置されていてもよい。
この構成により、励起光が位相板を通過しないので、位相板における励起光による蛍光の発生を防止することができ、蛍光が迷光となって撮影されることを未然に防止することができる。【００１０】
また、上記態様においては、前記位相板が、前記ダイクロイックミラーよりも前記ステージ側に配置されていてもよい。
この構成により、位相板を対物レンズの瞳位置または瞳位置に近い位置に配置することができ、瞳位置と光学的に共役な位置に配置する場合と比較して顕微鏡装置の小型化を図ることができる。【００１１】
また、上記態様においては、前記励起光が紫外光であり、前記位相板の材質が下記の条件式を満たしていてもよい。
１．４３≦ｎｄ≦１．６１
６２≦νｄ≦９５
ここで、ｎｄはｄ線における屈折率、νｄはｄ線におけるアッベ数である。【００１２】
この構成により、位相板を対物レンズの瞳位置または瞳位置に近い位置に配置して顕微鏡装置の小型化を図りながら、位相板を通過する励起光による蛍光の発生を抑制することができる。【００１３】
また、上記態様においては、前記位相板の形状が以下の式で表されてもよい。
ｚ＝ｋ（ｘ３＋ｙ３）
ここで、ｚは光軸方向、ｘ，ｙは前記光軸に直交し、かつ相互に直交する２方向の座標、ｋは任意の有理数である。【００１４】
また、上記態様においては、前記結像レンズと前記撮像素子との間に配置されたマイクロレンズアレイを備えていてもよい。
また、上記態様においては、前記位相板の材質が合成石英であってもよい。
また、上記態様においては、ライトフィールド技術およびコーデッドアパーチャ技術の少なくとも一方を用いて画像処理を実行する画像処理部を備えていてもよい。【００１５】
本発明の他の態様は、励起光を発する光源と、該光源からの前記励起光が入射するダイクロイックミラーと、該ダイクロイックミラーよりも標本側に配置され、前記ダイクロイックミラーによって反射された前記励起光を前記標本に集光する対物レンズと、前記ダイクロイックミラーよりも前記標本側、かつ前記対物レンズの瞳位置または該瞳位置と光学的に共役な位置に配置され、前記ダイクロイックミラーによって反射された前記励起光が入射する位相板と、前記標本に前記励起光が照射されることによって発生した蛍光を集光する結像レンズと、該結像レンズによって集光された前記標本の蛍光像を撮影する撮像素子とを備え、前記標本に前記励起光が照射されることによって発生した前記蛍光が、前記対物レンズおよび前記位相板を通過してから前記ダイクロイックミラーに入射し、該ダイクロイックミラーを透過した前記蛍光を前記結像レンズによって集光することにより前記標本の蛍光像を前記撮像素子上に結像する顕微鏡装置である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、標本の３次元情報を含む画像を短時間に取得することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の一実施形態に係る顕微鏡装置を模式的に示す全体構成図である。
【図２】図１の顕微鏡装置に備えられる対物レンズの第１実施例を示す図である。
【図３】図２の対物レンズの瞳位置に配置されるコーデッドアパーチャの形状を示す図である。
【図４】図１の顕微鏡装置に備えられる対物レンズの第２実施例を示す図である。
【図５】図１の顕微鏡装置に備えられる対物レンズの第３実施例を示す図である。
【図６】図１の顕微鏡装置の変形例を模式的に示す全体構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の一実施形態に係る顕微鏡装置１について図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡装置１は、図１に示されるように、標本Ｘを載置するステージ２と、ステージ２に載置された標本Ｘに、光源３からの励起光を照射し、標本Ｘにおいて発生した蛍光を集光する対物レンズ４と、対物レンズ４の瞳位置に配置され、集光された蛍光を透過させるコーデッドアパーチャ（位相板）５と、コーデッドアパーチャ５を透過した蛍光を集光する結像レンズ６と、集光された標本Ｘの蛍光像を撮影する撮像素子７とを備えている。
【００１９】
光源３は、紫外光を含む励起光を射出する。
図中、符号８は、励起光を偏向し、蛍光を透過する透過率特性を有するダイクロイックミラー、符号９は結像レンズ６と撮像素子７との間において撮像素子７の撮像面に配置されたマイクロレンズアレイである。
【００２０】
コーデッドアパーチャ５は、以下の条件式を満足する合成石英により構成されている。
１．４３≦ｎｄ≦１．６１      （１）
６２≦νｄ≦９５              （２）
ここで、ｎｄはｄ線における屈折率、νｄはｄ線におけるアッベ数である。
【００２１】
本実施形態に係る顕微鏡装置１の作用について、以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡装置１を用いて標本Ｘの３次元の蛍光像を取得するには、ステージ２上に標本Ｘを載置し、標本Ｘの上方に対物レンズ４を配置する。
【００２２】
光源３から励起光を発生させると、励起光は、ダイクロイックミラー８によって９０°偏向されて対物レンズ４内に入射し、対物レンズ４により集光されて標本Ｘ上に照射される。標本Ｘにおける励起光の照射位置においては標本Ｘに含まれる蛍光物質が励起されて蛍光が発生し、その一部が、対物レンズ４に入射する。
【００２３】
対物レンズ４に入射した蛍光は、対物レンズ４によって略平行光に変換されるとともに、対物レンズ４の瞳位置に配置されているコーデッドアパーチャ５を透過する。そして、対物レンズ４において略平行光に変換された蛍光はダイクロイックミラー８を透過した後、結像レンズ６によって集光され、マイクロレンズアレイ９を透過して撮像素子７により撮影される。
【００２４】
蛍光をマイクロレンズアレイ９に通過させた後に撮像素子７によって撮影することにより、蛍光像と同時に蛍光拘束の向きの情報を取得することができる。いわゆるライトフィールド技術である。本実施形態に係る顕微鏡装置１によれば、このライトフィールド技術を用いることにより、短時間に標本Ｘの３次元情報を得ることができるという利点がある。
【００２５】
さらに、本実施形態によれば、対物レンズ４の瞳位置に配置したコーデッドアパーチャ５により、蛍光像の深度が拡大されるので、ライトフィールド技術を補って、合焦位置を含む蛍光像全体の３次元情報を取得することができるという利点がある。
【００２６】
この場合において、本実施形態においては、コーデッドアパーチャ５の材質として、条件式（１）、（２）を満足する合成石英を用いているので、紫外光を含む励起光が照射されても、自家蛍光の発生を抑えることができる。したがって、標本Ｘからの蛍光に自家蛍光が迷光として含まれることを防止して、標本Ｘの鮮明な３次元の蛍光像を取得することができるという利点がある。
【００２７】
また、本実施形態によれば、合成石英を工夫することにより、対物レンズ４の瞳位置へのコーデッドアパーチャ５の配置を可能にしているので、コンパクトな顕微鏡装置１を提供することができるという利点もある。
【第１実施例】
【００２８】
次に、本実施形態に係る顕微鏡装置１に用いられる対物レンズ４の第１実施例について、図２、図３および以下のレンズデータを参照して説明する。
本実施例の対物レンズ４は、図２に示されるように、像側から順に、像側に凸面を有する凸平レンズ４１、両凸レンズと両凹レンズとの接合レンズ４２、コーデッドアパーチャ５を構成する平板ガラス、両凹レンズと両凸レンズとの接合レンズ４３、像側に平面を有する平凸レンズ４４および像側に凸面を有する凸平レンズ４５により構成されている。
【００２９】
面番号          ｒ                ｄ            ｎｄ        νｄ
１      ２５．０１５３    ２．００００  １．７３８０  ３２．２６
２    ２９２．９５４６    １２．６１４５
３      １０．３０６０    １．３７９７  １．６７７９  ５５．３４
４    −１５．２０９６    ０．５５００  １．７３８０  ３２．２６
５      ６．９９６７      １．００００
６            ∞          １．００００  １．４５８５  ６７．８０
７            ∞          １．００００
８      −８．２４２６    ０．５５００  １．７３８０  ３２．２６
９      ９．１２１０      １．３９８５  １．６７７９  ５５．３４
１０    −１１．８５６１    ７．７０７３
１１    ３４０．５２４６    ２．００００  １．７４１０  ５２．６４
１２    −１６．０２３８    ０．１０００
１３      １８．７９１９    ２．００００  １．８０４０  ４６．５８
１４    ２５８２．３５２１  １２．００００
【００３０】
対物レンズ４の焦点距離：２０ｍｍ、開口数：０．２５である。
上記レンズデータにおいて、面番号７がコーデッドアパーチャ５であり、曲率半径ｒは∞と標記しているが、実際の形状は、
ｚ＝２．２９×１０−１１（ｘ３＋ｙ３）      （３）
である。ここで、
ｚは光軸方向、
ｘ，ｙは光軸に直交する方向
であり、単位はμｍである。
【００３１】
コーデッドアパーチャ５の形状を図３に示す。図中、線で囲まれた領域は、有効径領域である。
平板ガラスの材質は合成石英または他の自家蛍光の少ないガラス材である。
対物レンズ４は物体側テレセントリックであり、コーデッドアパーチャ５は主光線が光軸と交わる瞳位置近傍に配置されている。
このレンズデータによれば、コーデッドアパーチャ５は条件式（１）、（２）を満足している。
【第２実施例】
【００３２】
次に、本実施形態に係る顕微鏡装置１に用いられる対物レンズ４の第２実施例について、図４以下のレンズデータを参照して説明する。
本実施例の対物レンズ４は、図４に示されるように、像側から順に、像側に凸面を有する凸凹レンズ５１、像側に平面を有する平凹レンズ５２、像側に凹面を有する２つのメニスカスレンズの接合レンズ５３、両凹レンズと両凸レンズとの接合レンズ５４、両凸レンズとメニスカスレンズとの接合レンズ５５、コーデッドアパーチャ５を構成する平板ガラス、像側に凸面を有する２つのメニスカスレンズと両凸レンズとの接合レンズ５６、像側に凸面を有するメニスカスレンズ５７、像側に凸面を有するメニスカスレンズ５８および平板ガラス５９により構成されている。
【００３３】
面番号          ｒ                ｄ          ｎｄ          νｄ
Ｓ１    ９．４８５６      ４．００２１  １．７３８０  ３２．２６
Ｓ２    ４４．６０４０    １．３８２６
Ｓ３  １２３．６４００    １．５５５０  １．５１６３  ６４．１４
Ｓ４    ５．２２０８      ４．２３３８
Ｓ５    −５．１８２１    １．０６２９  １．７３８０  ３２．２６
Ｓ６  −１４．４０５５    ５．０９２３  １．５９５２  ６７．７４
Ｓ７    −７．７０４５    ０．１０００
Ｓ８  −２０．３２９３    ０．７０６４  １．６７３０  ３８．１５
Ｓ９    １８．３７５９    ４．５９２２  １．４３８８  ９４．９５
Ｓ１０  −１３．５１７１    ３．５３３２
Ｓ１１    １８．３２７４    ６．２２６５  １．４３８８  ９４．９５
Ｓ１２    −８．５８９５    １．８４７０  １．６３７８  ４２．４１
Ｓ１３  −１１１．９６４７  ０．１４７４
Ｓ１４          ∞          １．００００  １．４５８５  ６７．８０
Ｓ１５          ∞          ０．１４７４
Ｓ１６    １２．８９３６    ３．６８２８  １．４３８８  ９４．９５
Ｓ１７  １１１．３６８６    ０．７４２４  １．６３７８  ４２．４１
Ｓ１８    ９．３６９５      ６．７７５３  １．４３８８  ９４．９５
Ｓ１９  −１５．２６２４    ０．１０００
Ｓ２０    ６．８３４１      ４．２４６８  １．８０４０  ４６．５８
Ｓ２１    ８．５５３５      ０．１２２９
Ｓ２２    ３．４５６１      ３．５２４７  １．８８３０  ４０．７７
Ｓ２３    １．４０００      ０．４０００  １．４５８５  ６７．８０
Ｓ２４          ∞          ０．３２００  １．４０４１  ５１．９０
Ｓ２５          ∞          ０．１７００  １．４５８５  ６７．８０
【００３４】
対物レンズ４の焦点距離：４．５ｍｍ、開口数：１．２５である。
上記レンズデータにおいて、面番号１５がコーデッドアパーチャ５であり、曲率半径ｒは∞と標記しているが、実際の形状は、式（３）および図３の通りである。
【００３５】
平板ガラスの材質は合成石英または他の自家蛍光の少ないガラス材である。
対物レンズ４は物体側テレセントリックであり、コーデッドアパーチャ５は主光線が光軸と交わる瞳位置近傍に配置されている。
このレンズデータによれば、コーデッドアパーチャ５は条件式（１）、（２）を満足している。
【第３実施例】
【００３６】
次に、本実施形態に係る顕微鏡装置１に用いられる対物レンズ４の第３実施例について、図５および以下のレンズデータを参照して説明する。
本実施例の対物レンズ４は、図５に示されるように、像側から順に、コーデッドアパーチャ５を構成する平板ガラス、像側に凹面を有するメニスカスレンズ６１、両凸レンズ６２、像側に凹面を有するメニスカスレンズ６３、像側に凸面を有するメニスカスレンズと両凸レンズと両凹レンズとの接合レンズ６４、両凸レンズ６５、像側に凸面を有するメニスカスレンズ６６および像側に凸面を有するメニスカスレンズ６７により構成されている。
【００３７】
面番号          ｒ              ｄ          ｎｄ        νｄ
Ｓ１          ∞        ２．００００  １．５１６３  ６４．１４
Ｓ２          ∞        ２．００００
Ｓ３    −８．５０００  ０．４６００  １．５１６３  ６４．１４
Ｓ４  −１７．７９６９  ０．１０００
Ｓ５    ２５．９８８６  ２．１３１０  １．７３８０  ３２．２６
Ｓ６  −２６．８７２３  １．３５３６
Ｓ７  −１３．３８１８  ４．８６２６  １．４９７０  ８１．５５
Ｓ８  −１１．６７８０  ０．１０００
Ｓ９    １８．３６３１  ０．４６００  １．６７３０  ３８．１５
Ｓ１０    ６．５８６２    ４．３６６４  １．４９７０  ８１．５５
Ｓ１１    −７．０３８１  １．９９３１  １．６７３０  ３８．１５
Ｓ１２    ５７．３９９４  ０．１１７３
Ｓ１３    １２．２６７９  ５．００００  １．４３８８  ９４．９５
Ｓ１４  −１４．８６１８  ０．１０００
Ｓ１５    １１．１００１  １．１２７１  １．６７７９  ５５．３４
Ｓ１６    ３４．２０８１  ０．１０００
Ｓ１７    ６．１５１９    ３．５１３８  １．８８３０  ４０．７７
Ｓ１８    ３．５０００    ２．５００５
【００３８】
対物レンズ４の焦点距離：９ｍｍ、開口数：０．５である。
上記レンズデータにおいて、面番号２がコーデッドアパーチャ５であり、曲率半径ｒは∞と標記しているが、実際の形状は、式（３）および図３の通りである。
【００３９】
平板ガラスの材質は合成石英または他の自家蛍光の少ないガラス材である。
対物レンズ４は物体側テレセントリックであり、コーデッドアパーチャ５は主光線が光軸と交わる瞳位置近傍に配置されている。
このレンズデータによれば、コーデッドアパーチャ５は条件式（１）、（２）を満足している。
【００４０】
なお、本実施形態においては、コーデッドアパーチャ５を対物レンズ４の瞳位置に配置することにより、顕微鏡装置１をコンパクトに構成することができ、かつ、合成石英の選択により紫外光による迷光の発生を抑えている。これに代えて、図６に示されるように、ダイクロイックミラー８と撮像素子７との間に、対物レンズ４の瞳をリレーするリレーレンズ１０を配置し、リレーレンズ１０によって構成された瞳と光学的に共役な位置にコーデッドアパーチャ５を配置してもよい。
【００４１】
これによっても、短時間に標本Ｘの３次元蛍光像を取得することができる。
この場合には、リレーレンズ１０およびコーデッドアパーチャ５を配置するためのスペースを確保する必要があるが、コーデッドアパーチャ５に励起光を通過させずに済むので、より多くの種類のガラス材から選択することができるという利点がある。
【００４２】
また、本実施形態においては、対物レンズ４を経由して標本Ｘに励起光を照射し、かつ、対物レンズ４によって蛍光を集光する、いわゆる、落射照明方式の顕微鏡装置１を例に挙げて説明したが、これに代えて、励起光は、対物レンズ４を経由せずに標本Ｘに照射してもよい。その場合には、対物レンズ４の瞳位置にコーデッドアパーチャ５を配置しつつ、コーデッドアパーチャ５を構成する平板ガラスを、より多くの種類のガラス材から選択することができる。
【００４３】
また、本実施形態においては、撮像素子７の撮像面にマイクロレンズアレイ９を配置して、ライトフィールド技術を利用する顕微鏡装置１を例示したが、マイクロレンズアレイ９はなくてもよい。コーデッドアパーチャ５による深度拡大効果によって、標本Ｘの３次元情報を取得することができる。また、本実施形態においては、顕微鏡装置１は、ライトフィールド技術およびコーデッドアパーチャ技術の少なくとも一方を用いて画像処理を実行する画像処理部を備えていてもよい。
【符号の説明】
【００４４】
１  顕微鏡装置
２  ステージ
３  光源
４  対物レンズ
５  コーデッドアパーチャ（位相板）
６  結像レンズ
７  撮像素子
８  ダイクロイックミラー
９  マイクロレンズアレイ
Ｘ  標本
【図１】
2020021663.tif 000003
【図２】
2020021663.tif 000004
【図３】
2020021663.tif 000005
【図４】
2020021663.tif 000006
【図５】
2020021663.tif 000007
【図６】
2020021663.tif 000008
【国際調査報告】
2020021663.tif 000009
2020021663.tif 000010
2020021663.tif 000011
2020021663.tif 000012