(57)【要約】  本発明は、多能性幹細胞から誘導された軟骨様組織の第１重心、または前記第１重心を中心とする第１最長径×０．２の径を有する同心球の内側の領域である重心領域を通る任意の断面において、前記断面の重心である第２重心を中心とし、前記断面の最長径（第２最長径）×０．４〜０．９の径を有する同心円の内側の領域である中心領域に含まれる単位面積当たりのルブリシン発現量（中心ルブリシン量）と、非中心領域に含まれる単位面積当たりのルブリシン発現量（非中心ルブリシン量）との比が、非中心ルブリシン量／中心ルブリシン量＞１であり、ルブリシンが局在化したことを特徴とする、ルブリシン局在軟骨様組織、及びその製造方法を提供する。さらにルブリシン局在軟骨様組織を含む関節軟骨損傷治療用組成物を提供する。
2020130147.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ルブリシン局在軟骨様組織であって、
多能性幹細胞から誘導された軟骨様組織の第１重心、または前記第１重心を中心とする前記多能性幹細胞から誘導された軟骨様組織の最長径（第１最長径）×０．２の径を有する同心球の内側の領域である重心領域、を通る任意の断面において、
前記断面の重心である第２重心を中心とし、前記断面の最長径（第２最長径）×０．４〜０．９の径を有する同心円の内側の領域である中心領域に含まれる単位面積当たりのルブリシン発現量（中心ルブリシン量）と、前記中心領域の外側の非中心領域に含まれる単位面積当たりのルブリシン発現量（非中心ルブリシン量）との比が、
非中心ルブリシン量／中心ルブリシン量＞１であり、ルブリシンが局在化したことを特徴とする、ルブリシン局在軟骨様組織。
【請求項２】
前記多能性幹細胞が、ＥＳ細胞、ｎｔＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である、請求項１に記載のルブリシン局在軟骨様組織。
【請求項３】
非中心ルブリシン量／中心ルブリシン量＞１．３である、請求項１または２に記載のルブリシン局在軟骨様組織。
【請求項４】
培地中で、多能性幹細胞から誘導された軟骨様組織に力学的刺激を負荷し、ルブリシンを局在化させる工程、を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のルブリシン局在軟骨様組織の製造方法。
【請求項５】
前記力学的刺激がせん断力である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記せん断力が、攪拌手段によって負荷される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記攪拌手段が、１以上の攪拌翼を有する回転式培養装置である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記回転式培養装置の攪拌速度が、１０〜９５回転／分である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記工程の期間が、３日以上である請求項４〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記工程の期間が、１４日以上である請求項４〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記工程において用いられる前記多能性幹細胞から誘導された軟骨様組織の量が、１００ｍｇ／３０ｍＬ培地以下である、請求項４〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記培地が、ＴＧＦβ、ＢＭＰ２及びＧＤＦ５を含む、請求項４〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記培地が、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬を含む、請求項４〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記工程の前後で、前記多能性幹細胞から誘導された軟骨様組織に対し、前記ルブリシン局在軟骨様組織のＰＲＧ４の発現量が３倍以上、上昇する、請求項４〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項４〜１４のいずれか１項に記載の方法により得られるルブリシン局在軟骨様組織。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ルブリシン局在軟骨様組織及びその製造方法に関する。本発明はまた、ルブリシン局在軟骨様組織を含む関節軟骨損傷治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
軟骨組織は、軟骨細胞と、Ｉ型コラーゲンを含まず、ＩＩ型コラーゲン、ＩＸ型コラーゲン、ＸＩ型コラーゲンおよびプロテオグリカンを含む特定の細胞外マトリックスとで形成されている。関節損傷などで失われた軟骨組織は自然治癒することはないため、移植等の修復治療を行わなければ悪化してしまう。しかし、損傷部位へ移植するためには、軟骨組織の入手が必要であり、患者自身の別の部位の軟骨を用いる場合では、結局軟骨組織の欠失部位を生じてしまうため、移植治療に適応する損傷の大きさには限度がある。このため、採取した軟骨細胞を拡大培養して、移植に用いるという方法が用いられているが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養を行うと軟骨細胞が線維化してしまい、治療効果が十分ではない（非特許文献１）。この他にも、間葉系幹細胞を投与する方法が提案されているが、間葉系幹細胞は多数の種類の細胞へと分化するため、所望の軟骨細胞のみならずＩ型コラーゲンを発現する線維組織やＸ型コラーゲンを発現する肥大化組織で欠損部を修復することになってしまう（非特許文献２）。【０００３】
そのような状況の下、近年、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞といった多能性幹細胞から軟骨細胞を誘導する方法が提案されており（例えば、特許文献１）、これを用いて、失われた軟骨組織を再生する試みが提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１６／１３３２０８号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｋｎｅｅ  １６，３９８−４０４（２００９）．
【非特許文献２】Ｍｉｔｈｏｅｆｅｒ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｓｐｏｒｔｓ  Ｍｅｄ．３７，２０５３−２０６３．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、ヒトに移植した際に早期に正常な軟骨組織へ再生可能な、高い軟骨再生能を有する、ルブリシンが局在化した軟骨様組織及びそれを含む関節軟骨損傷治療用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、培地中で、多能性幹細胞から誘導された軟骨様組織に力学的刺激を負荷することで、ルブリシンが表層周辺部に局在化した軟骨様組織を安定的に製造できることを見出した。本発明はそのような知見を基にして完成させたものである。【０００８】
すなわち、本発明は以下の特徴を有する：
［１］  ルブリシン局在軟骨様組織であって、
多能性幹細胞から誘導された軟骨様組織の第１重心、または前記第１重心を中心とする前記多能性幹細胞から誘導された軟骨様組織の最長径（第１最長径）×０．２の径を有する同心球の内側の領域である重心領域、を通る任意の断面において、
前記断面の重心である第２重心を中心とし、前記断面の最長径（第２最長径）×０．４〜０．９の径を有する同心円の内側の領域である中心領域に含まれる単位面積当たりのルブリシン発現量（中心ルブリシン量）と、前記中心領域の外側の非中心領域に含まれる単位面積当たりのルブリシン発現量（非中心ルブリシン量）との比が、
非中心ルブリシン量／中心ルブリシン量＞１であり、ルブリシンが局在化したことを特徴とする、ルブリシン局在軟骨様組織。
［２］  非中心ルブリシン量／中心ルブリシン量＞１．３である、［１］に記載のルブリシン局在軟骨様組織。
［３］  非中心ルブリシン量／中心ルブリシン量＞１．５である、［１］または［２］に記載のルブリシン局在軟骨様組織。
［４］  サフラニンО染色により外膜を除く部分において一様に陽性を示す、［１］〜［３］のいずれかに記載のルブリシン局在軟骨様組織。
［５］  前記断面の全周の７割以上の範囲においてルブリシンが発現している、［１］〜［４］のいずれかに記載のルブリシン局在軟骨様組織。
［６］  略球状である、［１］〜［５］のいずれかに記載のルブリシン局在軟骨様組織。
［７］  前記多能性幹細胞が、ＥＳ細胞、ｎｔＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である、［１］〜［６］のいずれかに記載のルブリシン局在軟骨様組織。
［８］  前記非中心領域が、サフラニンＯ陽性部分を含む、［１］〜［７］のいずれかに記載のルブリシン局在軟骨様組織。
［９］  ルブリシン局在軟骨様組織であって、
多能性幹細胞から誘導された軟骨様組織の表層周辺部に含まれる単位重量当たりのルブリシン発現量（表層ルブリシン量）と、非表層周辺部に含まれる単位重量当たりのルブリシン発現量（非表層ルブリシン量）との比が、表層ルブリシン量／非表層ルブリシン量＞１．３であり、
ここで前記表層周辺部が、前記軟骨様組織の表面の任意の点（第１の点）から第１重心までの距離において、第１の点から５％〜６０％の距離にある点を第２の点と定義した場合、任意の各第１の点に対する各第２の点の集合の外側の領域であり、
前記非表層周辺部が、前記表層周辺部の内側に存在する、前記表層周辺部を除く軟骨様組織の領域である、ルブリシン局在軟骨様組織。
［１０］  表層ルブリシン量／非表層ルブリシン量＞１．５である、［９］に記載のルブリシン局在軟骨様組織。
［１１］  サフラニンО染色により外膜を除く部分において一様に陽性を示す、［９］〜［１０］のいずれかに記載のルブリシン局在軟骨様組織。
［１２］  前記表面の７割以上の範囲においてルブリシンが発現している、［９］〜［１１］のいずれかに記載のルブリシン局在軟骨様組織。
［１３］  略球状である、［９］〜［１２］のいずれかに記載のルブリシン局在軟骨様組織。
［１４］  前記多能性幹細胞が、ＥＳ細胞、ｎｔＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である、［９］〜［１３］のいずれかに記載のルブリシン局在軟骨様組織。
［１５］  前記表層周辺部が、サフラニンＯ陽性部分を含まない、［９］〜［１４］のいずれかに記載のルブリシン局在軟骨様組織。
［１６］  前記表層周辺部が、サフラニンＯ陽性部分を含む、［９］〜［１５］のいずれかに記載のルブリシン局在軟骨様組織。
［１７］  ルブリシン局在軟骨様組織であって、
多能性幹細胞から誘導された軟骨様組織の表層周辺部に含まれる単位重量当たりのルブリシン発現量（表層ルブリシン量）と、非表層周辺部に含まれる単位重量当たりのルブリシン発現量（非表層ルブリシン量）との比が、表層ルブリシン量／非表層ルブリシン量＞１．３であり、
ここで前記表層周辺部が、前記軟骨様組織の表面の任意の点（第１の点）から第１重心までの距離において、第１の点から５００μｍの距離にある点を第２の点と定義した場合、任意の各第１の点に対する各第２の点の集合の外側の領域であり、
前記非表層周辺部が、前記表層周辺部の内側に存在する、前記表層周辺部を除く軟骨様組織の領域である、ルブリシン局在軟骨様組織。
［１８］  表層ルブリシン量／非表層ルブリシン量＞１．５である、［１７］に記載のルブリシン局在軟骨様組織。
［１９］  サフラニンО染色により外膜を除く部分において一様に陽性を示す、［１７］〜［１８］のいずれかに記載のルブリシン局在軟骨様組織。
［２０］  前記表面の７割以上の範囲においてルブリシンが発現している、［１７］〜［１９］のいずれかに記載のルブリシン局在軟骨様組織。
［２１］  略球状である、［１７］〜［２０］のいずれかに記載のルブリシン局在軟骨様組織。
［２２］  最長径が１ｍｍ〜６ｍｍである、［１７］〜［２１］のいずれかに記載のルブリシン局在軟骨様組織。
［２３］  前記多能性幹細胞が、ＥＳ細胞、ｎｔＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である、［１７］〜［２２］のいずれかに記載のルブリシン局在軟骨様組織。
［２４］  前記表層周辺部が、サフラニンＯ陽性部分を含まない、［１７］〜［２３］のいずれかに記載のルブリシン局在軟骨様組織。
［２５］  前記表層周辺部が、サフラニンＯ陽性部分を含む、［１７］〜［２４］のいずれかに記載のルブリシン局在軟骨様組織。【０００９】
［２６］  培地中で、多能性幹細胞から誘導された軟骨様組織に力学的刺激を負荷し、ルブリシンを局在化させる工程、を含む、［１］〜［２５］のいずれかに記載のルブリシン局在軟骨様組織の製造方法。
［２７］  前記多能性幹細胞が、ＥＳ細胞、ｎｔＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である、［２６］に記載の方法。
［２８］  前記力学的刺激がせん断力である、［２６］または［２７］に記載の方法。
［２９］  前記せん断力が、該組織の外周全方位から負荷される、［２９］に記載の方法。
［３０］  前記せん断力が、攪拌手段によって負荷される、［２９］または［３０］に記載の方法。
［３１］  前記攪拌手段が、回転式培養装置である、［３１］に記載の方法。
［３２］  前記回転式培養装置が、１以上の攪拌翼を有する回転式培養装置である、［３１］に記載の方法。
［３３］  前記せん断力が、前記多能性幹細胞から誘導された軟骨様組織を、前記攪拌翼ならびに／または前記回転式培養装置の培養容器の底面及び内壁面に接触させることによって生じるせん断力を含む、［３２］に記載の方法。
［３４］  前記回転式培養装置の攪拌速度が、１０〜９５回転／分である、［３２］または［３３］に記載の方法。
［３５］  前記回転式培養装置の攪拌速度が、５０〜７０回転／分である、［３２］または［３３］に記載の方法。
［３６］  前記工程の期間が、３日以上である［２６］〜［３５］のいずれかに記載の方法。
［３７］  前記工程の期間が、１４日以上である［２６］〜［３５］のいずれかに記載の方法。
［３８］  前記工程の期間が、２８日以上である［２６］〜［３５］のいずれかに記載の方法。
［３９］  前記工程において用いられる前記多能性幹細胞から誘導された軟骨様組織の量が、１００ｍｇ／３０ｍＬ培地以下である、［２６］〜［３８］のいずれかに記載の方法。
［４０］  前記工程において用いられる前記多能性幹細胞から誘導された軟骨様組織の量が、６０ｍｇ／３０ｍＬ培地以下である、［２６］〜［３８］のいずれかに記載の方法。
［４１］  前記培地が、ＴＧＦβ、ＢＭＰ２及びＧＤＦ５を含む、［２６］〜［４０］のいずれかに記載の方法。
［４２］  前記培地が、血清を含む、［２６］〜［４１］のいずれかに記載の方法。
［４３］  前記培地が、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬を含む、［２６］〜［４２］のいずれかに記載の方法。
［４４］  前記ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬が、ロスバスタチンである、［４３］に記載の方法。
［４５］  前記工程の前後で、多能性幹細胞から誘導された軟骨様組織に対し、前記ルブリシン局在軟骨様組織のＰＲＧ４の発現量が３倍以上、上昇する、［２６］〜［４４］のいずれかに記載の方法。【００１０】
［４６］  ［２６］〜［４５］のいずれか１項に記載の方法により得られるルブリシン局在軟骨様組織。【００１１】
［４７］  ［１］〜［２５］および［４６］のいずれかに記載のルブリシン局在軟骨様組織を含む、関節軟骨損傷治療用組成物。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によって、ルブリシンを局在させた軟骨様組織を提供することが可能となった。本発明により提供されるルブリシンを局在させた軟骨様細胞は、軟骨の再生医療に使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、軟骨様組織を示す模式図である。（Ａ）軟骨様組織の外観の模式図。（Ｂ）（Ａ）の断面４を示す模式図。
【図２】図２は、一実施態様において用いられる回転式培養容器を示す。（Ａ）回転式培養容器の斜視図。（Ｂ）回転式培養容器の断面図。（Ｃ）回転式培養容器を底面から写した写真。矢頭は軟骨様組織を示す。
【図３−１】図３−１は、軟骨様組織の組織切片におけるルブリシン免疫染色像を示す。
【図３−２】図３−２は、軟骨様組織の組織切片にサフラニンО免疫染色像を示す。
【図４】図４は、図３のルブリシンの免疫染色像を定量化した結果を示す。（Ａ）各サンプルにおけるルブリシン免疫染色像を定量化した結果を示す。（Ｂ）（Ａ）に示された周囲領域と中心領域のＭｅａｎ  ｇｒａｙ  ｖａｌｕｅ−バックグラウンド比をグラフ化した。
【図５−１】図５−１は、軟骨様組織の組織切片におけるルブリシンの免疫染色像を示す。
【図５−２】図５−２は、軟骨様組織の組織切片におけるサフラニンО染色像を示す。
【図６−１】図６−１は、図５のルブリシンの免疫染色像を定量化した結果（０日目及び７日目）を示す。なお表層周辺部範囲は、組織長径（ｍｍ）と（１００−中心領域径／組織長径）％より算出した。
【図６−２】図６−２は、図５のルブリシンの免疫染色像を定量化した結果（１４日目及び２８日目）を示す。なお表層周辺部範囲は、組織長径（ｍｍ）と（１００−中心領域径／組織長径）％より算出した。
【図７】図７は、図５のルブリシンの免疫染色像から算出された周囲領域／中心領域のＭｅａｎ  ｇｒａｙ  ｖａｌｕｅ−ＢＧ比のグラフである。
【図８】図８は、せん断力を付与した軟骨様組織のＰＲＧ４  ｍＲＮＡの相対発現量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明を以下に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は下記の形態のみに限定されることを意図するものではない。
【００１５】
本明細書において、「第１」「第２」「第３」等の用語は、１つの要素をもう１つの要素と区別するために用いており、例えば、第１の要素を第２の要素と表現し、同様に第２の要素を第１の要素と表現してもよく、これによって本発明の範囲を逸脱するものではない。
【００１６】
特段の定義がない限り、本明細書で使用する用語（技術的用語および科学的用語）は、当業者が一般に理解している用語と同一の意味を有する。
【００１７】
一実施形態において、本発明は、
多能性幹細胞から誘導された軟骨様組織の第１重心、または前記第１重心を中心とする前記多能性幹細胞から誘導された軟骨様組織の最長径（第１最長径）×０．２の径を有する同心球の内側の領域である重心領域、を通る任意の断面において、
前記断面の重心である第２重心を中心し、前記断面の最長径（第２最長径）×０．４〜０．９の径を有する同心円の内側の領域である中心領域に含まれる単位面積当たりのルブリシン発現量（中心ルブリシン量）と、前記中心領域の外側の非中心領域に含まれる単位面積当たりのルブリシン発現量（非中心ルブリシン量）との比が、
非中心ルブリシン量／中心ルブリシン量＞１であり、ルブリシンが局在化したことを特徴とする、ルブリシン局在軟骨様組織を提供する。
【００１８】
本明細書において、「軟骨様組織」とは、多能性幹細胞から分化誘導された軟骨細胞を含み、生体に存在する軟骨組織を模倣した組織をいい、外膜および当該外膜に抱合された内容物から構成されており、外膜は、ＣＯＬ１線維を含むが、ＣＯＬ２線維を含まず、内容物は、Ｃｏｌ１１線維、Ｃｏｌ２線維、プロテオグリカンおよび軟骨細胞を含んでいる。本明細書において、「外膜」とは、軟骨様組織をサフラニンОで染色をした際に、サフラニンＯ陰性の表層部分をいう。また、本明細書において、「軟骨様組織」とは、サフラニンО染色をした際に、外膜を除く部分において一様に陽性であり、２型コラーゲンの免疫染色をした際に外膜を除く中心部に陽性を示す組織である。また、本明細書において、「軟骨様組織」とは、グリコサミノグリカンおよび２型コラーゲンが一様に分布している。このように、本明細書における「軟骨様組織」は、高い力学的強度を有するものである。また、本明細書において、「軟骨様組織」とは、乾燥重量あたりのグリコサミノグリカン含有量が１０%以上の組織であってもよく、好ましくは１５％以上、より好ましくは２０%以上の組織である。本明細書において、ＣＯＬ１線維とは、ＣＯＬ１遺伝子によってコードされるタンパク質が３重らせん構造を形成している線維である。本明細書において、ＣＯＬ２線維とは、ＣＯＬ２遺伝子によってコードされるタンパク質が３重らせん構造を形成している線維である。本明細書において、ＣＯＬ１１線維とは、ＣＯＬ１１遺伝子によってコードされるタンパク質が３重らせん構造を形成している線維である。本明細書において、プロテオグリカンとは、コアタンパク質のアミノ酸であるセリンと糖質（キシロース、ガラクトース、グルクロン酸）が結合し、コンドロイチン硫酸などの２糖単位で連続する多糖体が結合した化合物である。
【００１９】
本明細書において「軟骨細胞」とは、コラーゲンなど軟骨を構成する細胞外マトリックスを産生する細胞、または、その前駆細胞を意味する。また、軟骨細胞は、軟骨細胞マーカーを発現する細胞であってもよく、軟骨細胞マーカーとしてＩＩ型コラーゲン（ＣＯＬ２Ａ１）またはＳＯＸ９が例示される。ＣＯＬ２Ａ１は、例えば、ＮＣＢＩのアクセッション番号として、ヒトの場合、ＮＭ＿００１８４４またはＮＭ＿０３３１５０、マウスの場合、ＮＭ＿００１１１３５１５またはＮＭ＿０３１１６３に記載されたヌクレオチド配列を有する遺伝子並びに当該遺伝子にコードされるタンパク質、ならびにこれらの機能を有する天然に存在する変異体が挙げられるが、これに限定されない。ＳＯＸ９は、例えば、ＮＣＢＩのアクセッション番号として、ヒトの場合、ＮＭ＿０００３４６、マウスの場合、ＮＭ＿０１１４４８に記載されたヌクレオチド配列を有する遺伝子並びに当該遺伝子にコードされるタンパク質、ならびにこれらの機能を有する天然に存在する変異体が挙げられるが、これに限定されない。
【００２０】
本発明において提供されるルブリシン局在軟骨様組織は、軟骨細胞の他、他の細胞種が含まれる細胞集団として製造されてもよく、例えば、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の軟骨細胞が含まれる細胞集団であってもよい。
【００２１】
本発明によって提供されるルブリシン局在軟骨様組織は、中心領域（「非表層周辺部」ともいう）に比べて非中心領域（「表層周辺部」ともいう）に、ルブリシンタンパク質（単に「ルブリシン」ともいう）が局在したものが提供される。非中心領域（表層周辺部）は、サフラニンＯ陰性の外膜のみから構成されてもよいし、サフラニンＯ陰性の外膜と、外膜の内側のサフラニンＯ陽性部分とを含んでいてもよい。本発明によって提供されるルブリシン局在軟骨様組織の非中心領域には、ルブリシン陽性細胞が含まれるだけでなく、細胞外マトリックスにもルブリシンが存在する。ルブリシンは、プロテオグリカン４（ｐｒｇ４）遺伝子にコードされるタンパク質であり、別名ＰＲＧ４タンパク質、巨核球刺激因子（ＭＳＦ）及び表在層タンパク質（ＳＺＰ）とも呼ばれ、体の関節表面を被覆する遍在性の内因性糖タンパク質である（例えば、ＮＣＢＩ受託番号ＡＫ１３１４３４−Ｕ７０１３６を参照）。ルブリシンは、主に強力な細胞保護性で抗接着性の境界潤滑剤として作用する、高度表面活性（例えば、水を保持する）分子である。当該分子は、末端のタンパク質ドメインの間に位置する長い中心のムチン様ドメインを有し、それによって分子は組織表面に接着して表面を保護する役割を果たす。
【００２２】
本発明者らは、鋭意検討を行った結果、多能性幹細胞から誘導された軟骨様組織において、中心領域に比べて非中心領域に、すなわち、軟骨様組織の表層周辺部にルブリシンを局在させる方法を見出した。本発明の軟骨様組織は、従来の軟骨様組織と比較して、ヒトに移植した際に高い力学的強度を有し、表層にルブリシンが局在した正常な軟骨組織へ早期に再生する、すなわち高い軟骨再生能を有する。
【００２３】
本明細書において、「第１重心２」とは、任意の軟骨様組織１に対して働く万有引力（重力）の合力の作用点をいい、例えば、図１においては、第１重心２として示される。本明細書において、「重心領域２１」は、軟骨様組織１の第１重心２を通る最長径（第１最長径３）において、第１重心２を中心とする第１最長径 × ０．２の径、好ましくは第１最長径 × ０．１を有する同心球の内側の領域と定義される。本明細書において、断面４は、第１重心２または重心領域２１を通る軟骨様組織１の任意の断面４（好ましくは、同一平面に存在する断面４）と定義される。ここで、同一平面とは、当業者にとって周知な方法によって調製される組織切片としての断面と同義であり、厳密な意味での同一平面ではないことに留意されたい。
【００２４】
本明細書において、「第２重心４１」とは、上記で示される断面４の重心をいう。本明細書において、「中心領域４４」とは、第２重心４１を通る断面４の最長径（第２最長径４２）において、第２重心４１を中心とし、第２最長径４２ × ０．４〜０．９（「中心領域径４３」ともいう。）の径を有する同心円の内側の領域と定義される。中心領域径４３は、第２最長径４２ × ０．４〜０．９であってもよく、第２最長径４２ × ０．６〜０．９であってもよく、第２最長径４２ × ０．７〜０．９であってもよく、第２最長径４２ × ０．８〜０．９であってもよく、第２最長径４２ × ０．９であってもよく、第２最長径４２ × ０．４〜０．８であってもよく、第２最長径４２ × ０．６〜０．８であってもよく、第２最長径４２ × ０．７〜０．８であってもよく、第２最長径４２ × ０．８であってもよく、第２最長径４２ × ０．４〜０．７であってもよく、第２最長径４２ × ０．６〜０．７であってもよく、第２最長径４２ × ０．７であってもよい。
【００２５】
本明細書において、「非中心領域４５（「周辺領域」ともいう。）」は、断面４から中心領域４４が除かれた領域である。
【００２６】
本発明において提供される軟骨様組織１は、中心領域４４に含まれる単位面積当たりのルブリシン発現量（「中心ルブリシン量」ともいう。）と、非中心領域４５に含まれる単位面積当たりのルブリシン発現量（「非中心ルブリシン量」ともいう。）との比が、非中心ルブリシン量／中心ルブリシン量＞１、好ましくは非中心ルブリシン量／中心ルブリシン量＞１．１、より好ましくは非中心ルブリシン量／中心ルブリシン量＞１．２、非中心ルブリシン量／中心ルブリシン量＞１．３、非中心ルブリシン量／中心ルブリシン量＞１．４、さらに好ましくは非中心ルブリシン量／中心ルブリシン量＞１．５であり、ルブリシンが非中心領域４５に局在している。ルブリシンが非中心領域４５、すなわち、軟骨様組織１の表層周辺部に局在しているため、ヒトに移植した際に、表層にルブリシンが局在した正常な軟骨組織へ早期に再生可能な、すなわち軟骨の再生能が高い軟骨様組織１が提供される。
【００２７】
本発明において提供される軟骨様組織１は、非中心ルブリシン量／中心ルブリシン量値の上限は、特に制限されないが、非中心ルブリシン量／中心ルブリシン量＜２０、好ましくは非中心ルブリシン量／中心ルブリシン量＜１０を例示できる。
【００２８】
本発明において提供される軟骨様組織１は、移植時にいずれの面が表層に位置しても移植後に表層にルブリシンが局在した正常な軟骨へ迅速に再生可能になるという観点から、断面４の外周において、好ましくはその全周の５割以上の範囲にルブリシンが発現しており、より好ましくは７割以上、さらに好ましくは８割以上、最も好ましくは９割以上の範囲にルブリシンが発現している。
【００２９】
本発明において提供される軟骨様組織１は、任意の形状をとるが、好ましくは円柱状を除く形状、移植時に様々な形の欠損に充填することができるという観点から、最も好ましくは略球状である。本明細書において、「略球状」とは、真に球形であること以外に、球状に類する形状であることも含む。本発明における略球状体の断面は、同心円または同心多角形である場合の他、いびつな円（例えば、楕円やラグビーボール状等）やいびつな多角形（例えば、６角形以上）であることもできる。
【００３０】
本明細書において、軟骨様組織１の表層周辺部にルブリシンが局在していることを説明するために、上述のように便宜的に中心領域４４と非中心領域４５を定義する方法（「第１の特定方法」という。）によって説明したが、以下の方法（「第２の特定方法」という。）によって軟骨様組織１の表層周辺部にルブリシンが局在していることを説明することも可能である。例えば、軟骨様組織１の表面の任意の点（第１の点）から第１重心２までの距離において、第１の点から５％から６０％、１０％〜６０％、１０％〜４０％、１０％〜３０％、２０〜６０％、２０〜４０％、または２０〜３０％の距離にある点を第２の点と定義した場合、任意の各第１の点に対する各第２の点の集合の外側の領域を「表層周辺部」と定義し、前記表層周辺部の内側に存在する、前記表層周辺部を除く軟骨様組織１の領域を「非表層周辺部」と定義することができる（図示しない）。この場合、本発明において提供される軟骨様組織１は、表層周辺部に含まれる単位重量当たりのルブリシン発現量（「表層ルブリシン量」ともいう。）と、非表層周辺部に含まれる単位重量当たりのルブリシン発現量（「非表層ルブリシン量」ともいう。）との比が、表層ルブリシン量／非表層ルブリシン量＞１、好ましくは表層ルブリシン量／非表層ルブリシン量＞１．３、より好ましくは表層ルブリシン量／非表層ルブリシン量＞１．５であり、表層周辺部にルブリシンが局在している、と説明することもできる。
【００３１】
また、以下の方法（「第３の特定方法」という。）によって軟骨様組織１の表層周辺部にルブリシンが局在していることを説明することも可能である。例えば、軟骨様組織１の表面の任意の点（第１の点）から第１重心２までの距離において、第１の点から１００〜１６００μｍ、１００〜１０００μｍ、２００〜８００μｍ、３００〜７００μｍ、４００〜６００μｍ、または５００μｍの距離にある点を第２の点と定義した場合、任意の各第１の点に対する各第２の点の集合の外側の領域を「表層周辺部」と定義し、前記表層周辺部の内側に存在する、前記表層周辺部を除く軟骨様組織１の領域を「非表層周辺部」と定義することができる（図示しない）。この場合、本発明において提供される軟骨様組織１は、表層周辺部に含まれる単位重量当たりのルブリシン発現量（「表層ルブリシン量」ともいう。）と、非表層周辺部に含まれる単位重量当たりのルブリシン発現量（「非表層ルブリシン量」ともいう。）との比が、表層ルブリシン量／非表層ルブリシン量＞１、好ましくは表層ルブリシン量／非表層ルブリシン量＞１．３、より好ましくは表層ルブリシン量／非表層ルブリシン量＞１．５であり、表層周辺部にルブリシンが局在している、と説明することもできる。
【００３２】
なお、上述の第１及び第２の特定方法は本願発明を説明するための例示であり、当業者であれば、上記以外の方法で特定された軟骨様組織であっても、本願発明の範囲に含まれることを認識することができる。
【００３３】
本発明において、ルブリシンの発現量は、周知の方法によって測定することが可能である。例えば、抗ルブリシン抗体を用いて免疫組織化学染色法によって得られる像より、画像解析を行うことで測定してもよく、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法によって定量してもよく、また、ルブリシンのｍＲＮＡ、例えば、ＰＲＧ４のｍＲＮＡの発現量を定量的ＰＣＲ法によって測定してもよく、その他周知の技術を用いて評価することができる。
【００３４】
本発明は、培地中で、多能性幹細胞から誘導された軟骨様組織に力学的刺激を負荷し、ルブリシンを局在化させる工程、を含む、ルブリシン局在軟骨様組織の製造方法を提供する。
【００３５】
本発明において、ルブリシンを局在化させる前の、多能性幹細胞から誘導された軟骨様組織は、公知の方法によって分化誘導して得られる軟骨様組織を用いることができ、例えば、国際公開第２０１６／１３３２０８号公報に記載の方法によって調製することができる。なお、国際公開第２０１６／１３３２０８号公報は、参照によって本明細書中に取り込まれる。例えば、以下の工程：
【００３６】
（ｉ）多能性幹細胞をＢＭＰ２、ＴＧＦβおよびＧＤＦ５から成る群より選択される１以上の物質ならびにＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬を含む培地中で接着培養する工程、および  （ｉｉ）前記工程（ｉ）で得られた細胞をＢＭＰ２、ＴＧＦβおよびＧＤＦ５から成る群より選択される１以上の物質ならびにＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬を含む培地中で浮遊培養する工程、を含む方法により、多能性幹細胞から誘導された軟骨様組織が調製される。
【００３７】
本発明で使用可能な多能性幹細胞は、軟骨細胞に分化可能な幹細胞であればよく、特に限定されないが、例えば胚性幹（ＥＳ）細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ｎｔＥＳ）細胞、精子幹細胞（「ＧＳ細胞」）、胚性生殖細胞（「ＥＧ細胞」）、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Ｍｕｓｅ細胞）、間葉系幹細胞などが含まれる。好ましい多能性幹細胞は、ＥＳ細胞、ｎｔＥＳ細胞、およびｉＰＳ細胞である。
【００３８】
（Ａ）胚性幹細胞
ＥＳ細胞は、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚（例えば胚盤胞）の内部細胞塊から樹立された、多能性と自己複製による増殖能を有する幹細胞である。
【００３９】
ＥＳ細胞は、受精卵の８細胞期、桑実胚後の胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する胚由来の幹細胞であり、成体を構成するあらゆる細胞に分化する能力、いわゆる分化多能性と、自己複製による増殖能とを有している。ＥＳ細胞は、マウスで１９８１年に発見され（Ｍ．Ｊ．Ｅｖａｎｓ  ａｎｄ  Ｍ．Ｈ．Ｋａｕｆｍａｎ（１９８１），Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１５４−１５６）、その後、ヒト、サルなどの霊長類でもＥＳ細胞株が樹立された（Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５−１１４７；Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：７８４４−７８４８；Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６），Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，５５：２５４−２５９；Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ  ａｎｄ  Ｖ．Ｓ．Ｍａｒｓｈａｌｌ（１９９８），Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，３８：１３３−１６５）。
【００４０】
ＥＳ細胞は、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取出し、内部細胞塊を線維芽細胞のフィーダー上で培養することによって樹立することができる。また、継代培養による細胞の維持は、白血病抑制因子（ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ））、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ））などの物質を添加した培地を用いて行うことができる。ヒトおよびサルのＥＳ細胞の樹立と維持の方法については、例えばＵＳＰ５，８４３，７８０；Ｔｈｏｍｓｏｎ  ＪＡ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５），Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９２：７８４４−７８４８；Ｔｈｏｍｓｏｎ  ＪＡ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８），Ｓｃｉｅｎｃｅ．２８２：１１４５−１１４７；Ｈ．Ｓｕｅｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００６），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３４５：９２６−９３２；Ｍ．Ｕｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００６），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：９５５４−９５５９；Ｈ．Ｓｕｅｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．，２２２：２７３−２７９；Ｈ．Ｋａｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１５８０−１５８５；Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ  Ｉ，ｅｔ  ａｌ．（２００６），Ｎａｔｕｒｅ．４４４：４８１−４８５などに記載されている。
【００４１】
ＥＳ細胞作製のための培地として、例えば０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ  非必須アミノ酸、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸、２０％ＫＳＲおよび４ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦを補充したＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地を使用し、３７℃、２％ＣＯ２／９８％空気の湿潤雰囲気下でヒトＥＳ細胞を維持することができる（Ｏ．Ｆｕｍｉｔａｋａ  ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６：２１５−２２４）。また、ＥＳ細胞は、３〜４日おきに継代する必要があり、このとき、継代は、例えば１ｍＭ  ＣａＣｌ２および２０％ＫＳＲを含有するＰＢＳ中の０．２５％トリプシンおよび０．１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩＶを用いて行うことができる。
【００４２】
ＥＳ細胞の選択は、一般に、アルカリホスファターゼ、Ｏｃｔ−３／４、Ｎａｎｏｇなどの遺伝子マーカーの発現を指標にしてＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法で行うことができる。特に、ヒトＥＳ細胞の選択では、ＯＣＴ−３／４、ＮＡＮＯＧ、ＥＣＡＤなどの遺伝子マーカーの発現を指標とすることができる（Ｅ．Ｋｒｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６：４４３−４５２）。
【００４３】
ヒトＥＳ細胞株は、例えばＷＡ０１（Ｈ１）およびＷＡ０９（Ｈ９）は、ＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから、ＫｈＥＳ−１、ＫｈＥＳ−２およびＫｈＥＳ−３は、京都大学再生医科学研究所（京都、日本）から入手可能である。
【００４４】
（Ｂ）精子幹細胞
精子幹細胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、精子形成のための起源となる細胞である。この細胞は、ＥＳ細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能であり、例えばマウス胚盤胞に移植するとキメラマウスを作出できるなどの性質をもつ（Ｍ．Ｋａｎａｔｓｕ−Ｓｈｉｎｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，６９：６１２−６１６；Ｋ．Ｓｈｉｎｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００４），Ｃｅｌｌ，１１９：１００１−１０１２）。神経膠細胞系由来神経栄養因子（ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ（ＧＤＮＦ））を含む培地で自己複製可能であるし、またＥＳ細胞と同様の培養条件下で継代を繰り返すことによって、精子幹細胞を得ることができる（竹林正則ら（２００８），実験医学，２６巻，５号（増刊），４１〜４６頁，羊土社（東京、日本））。
【００４５】
（Ｃ）胚性生殖細胞
胚性生殖細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ＥＳ細胞と同様な多能性をもつ細胞であり、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ、幹細胞因子（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ）などの物質の存在下で始原生殖細胞を培養することによって樹立しうる（Ｙ．Ｍａｔｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２），Ｃｅｌｌ，７０：８４１−８４７；Ｊ．Ｌ．Ｒｅｓｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２），Ｎａｔｕｒｅ，３５９：５５０−５５１）。
【００４６】
（Ｄ）人工多能性幹細胞
人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞は、特定の初期化因子を、ＤＮＡ又はタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製することができる、ＥＳ細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞である（Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｓ．Ｙａｍａｎａｋａ（２００６）Ｃｅｌｌ，１２６：６６３−６７６；Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ｃｅｌｌ，１３１：８６１−８７２；Ｊ．Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１８：１９１７−１９２０；Ｎａｋａｇａｗａ，Ｍ．ら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：１０１−１０６（２００８）；国際公開ＷＯ２００７／０６９６６６）。初期化因子は、ＥＳ細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物もしくはｎｏｎ−ｃｏｒｄｉｎｇ  ＲＮＡまたはＥＳ細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物もしくはｎｏｎ−ｃｏｒｄｉｎｇ  ＲＮＡ、あるいは低分子化合物によって構成されてもよい。初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５−２、Ｔｃｌ１、ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ、Ｌｉｎ２８ｂ、Ｓａｌｌ１、Ｓａｌｌ４、Ｅｓｒｒｂ、Ｎｒ５ａ２、Ｔｂｘ３またはＧｌｉｓ１等が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、ＷＯ２００７／０６９６６６、ＷＯ２００８／１１８８２０、ＷＯ２００９／００７８５２、ＷＯ２００９／０３２１９４、ＷＯ２００９／０５８４１３、ＷＯ２００９／０５７８３１、ＷＯ２００９／０７５１１９、ＷＯ２００９／０７９００７、ＷＯ２００９／０９１６５９、ＷＯ２００９／１０１０８４、ＷＯ２００９／１０１４０７、ＷＯ２００９／１０２９８３、ＷＯ２００９／１１４９４９、ＷＯ２００９／１１７４３９、ＷＯ２００９／１２６２５０、ＷＯ２００９／１２６２５１、ＷＯ２００９／１２６６５５、ＷＯ２００９／１５７５９３、ＷＯ２０１０／００９０１５、ＷＯ２０１０／０３３９０６、ＷＯ２０１０／０３３９２０、ＷＯ２０１０／０４２８００、ＷＯ２０１０／０５０６２６、ＷＯ２０１０／０５６８３１、ＷＯ２０１０／０６８９５５、ＷＯ２０１０／０９８４１９、ＷＯ２０１０／１０２２６７、ＷＯ  ２０１０／１１１４０９、ＷＯ２０１０／１１１４２２、ＷＯ２０１０／１１５０５０、ＷＯ２０１０／１２４２９０、ＷＯ２０１０／１４７３９５、ＷＯ２０１０／１４７６１２、Ｈｕａｎｇｆｕ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６：７９５−７９７、Ｓｈｉ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，２：５２５−５２８、Ｅｍｉｎｌｉ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２６：２４６７−２４７４、Ｈｕａｎｇｆｕ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：１２６９−１２７５、Ｓｈｉ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，３，５６８−５７４、Ｚ���ａｏ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，３：４７５−４７９、Ｍａｒｓｏｎ  Ａ，（２００８），Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，３，１３２−１３５、Ｆｅｎｇ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ（２００９），Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１：１９７−２０３、Ｒ．Ｌ．Ｊｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２７：４５９−４６１、Ｌｙｓｓｉｏｔｉｓ  ＣＡ，ｅｔ  ａｌ．（２００９），Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１０６：８９１２−８９１７、Ｋｉｍ  ＪＢ，ｅｔ  ａｌ．（２００９），Ｎａｔｕｒｅ．４６１：６４９−６４３、Ｉｃｈｉｄａ  ＪＫ，ｅｔ  ａｌ．（２００９），Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．５：４９１−５０３、Ｈｅｎｇ  ＪＣ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０），Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．６：１６７−７４、Ｈａｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０），Ｎａｔｕｒｅ．４６３：１０９６−１００、Ｍａｌｉ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０），Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２８：７１３−７２０、Ｍａｅｋａｗａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１），Ｎａｔｕｒｅ．４７４：２２５−９．に記載の組み合わせが例示される。
【００４７】
上記初期化因子には、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤［例えば、バルプロ酸（ＶＰＡ）、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、ＭＣ１２９３、Ｍ３４４等の低分子阻害剤、ＨＤＡＣに対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ（例、ＨＤＡＣ１  ｓｉＲＮＡ  Ｓｍａｒｔｐｏｏｌ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＨｕＳＨ  ２９ｍｅｒ  ｓｈＲＮＡ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ＨＤＡＣ１（ＯｒｉＧｅｎｅ）等）等の核酸性発現阻害剤など］、ＭＥＫ阻害剤（例えば、ＰＤ１８４３５２、ＰＤ９８０５９、Ｕ０１２６、ＳＬ３２７およびＰＤ０３２５９０１）、Ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ−３阻害剤（例えば、ＢｉｏおよびＣＨＩＲ９９０２１）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、５−ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、ＢＩＸ−０１２９４等の低分子阻害剤、Ｓｕｖ３９ｈｌ、Ｓｕｖ３９ｈ２、ＳｅｔＤＢｌおよびＧ９ａに対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ等の核酸性発現阻害剤など）、Ｌ−ｃｈａｎｎｅｌ  ｃａｌｃｉｕｍ  ａｇｏｎｉｓｔ（例えばＢａｙｋ８６４４）、酪酸、ＴＧＦβ阻害剤またはＡＬＫ５阻害剤（例えば、ＬＹ３６４９４７、ＳＢ４３１５４２、６１６４５３およびＡ−８３−０１）、ｐ５３阻害剤（例えばｐ５３に対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ）、ＡＲＩＤ３Ａ阻害剤（例えば、ＡＲＩＤ３Ａに対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ）、ｍｉＲ−２９１−３ｐ、ｍｉＲ−２９４、ｍｉＲ−２９５およびｍｉｒ−３０２などのｍｉＲＮＡ、Ｗｎｔ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（例えばｓｏｌｕｂｌｅ  Ｗｎｔ３ａ）、神経ペプチドＹ、プロスタグランジン類（例えば、プロスタグランジンＥ２およびプロスタグランジンＪ２）、ｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴ、ＵＴＦ１、ＩＲＸ６、ＧＬＩＳｌ、ＰＩＴＸ２、ＤＭＲＴＢｌ等の樹立効率を高めることを目的として用いられる因子も含まれており、本明細書においては、これらの樹立効率の改善目的にて用いられた因子についても初期化因子と別段の区別をしない。
【００４８】
初期化因子は、タンパク質の形態の場合、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチド（例えば、ＨＩＶ由来のＴＡＴおよびポリアルギニン）との融合、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよい。
【００４９】
一方、ＤＮＡの形態の場合、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター（以上、Ｃｅｌｌ，１２６，ｐｐ．６６３−６７６，２００６；Ｃｅｌｌ，１３１，ｐｐ．８６１−８７２，２００７；Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１８，ｐｐ．１９１７−１９２０，２００７）、アデノウイルスベクター（Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２２，９４５−９４９，２００８）、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター（ＷＯ２０１０／００８０５４）などが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ、ＰＡＣ）などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる（Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２２：９４９−９５３，２００８）。ベクターには、核初期化物質が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができるし、さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子（例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ＦＬＡＧなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。また、上記ベクターには、体細胞への導入後、初期化因子をコードする遺伝子もしくはプロモーターとそれに結合する初期化因子をコードする遺伝子を共に切除するために、それらの前後にＬｏｘＰ配列を有してもよい。
【００５０】
また、ＲＮＡの形態の場合、例えばリポフェクション、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入しても良く、分解を抑制するため、５−メチルシチジンおよびｐｓｅｕｄｏｕｒｉｄｉｎｅ（ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を取り込ませたＲＮＡを用いても良い（Ｗａｒｒｅｎ  Ｌ，（２０１０）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．７：６１８−６３０）。
【００５１】
ｉＰＳ細胞誘導のための培地としては、例えば、１０〜１５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２又はＤＭＥ培地（これらの培地にはさらに、ＬＩＦ、ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸類、β−メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）またはマウスＥＳ細胞培養用培地（ＴＸ−ＷＥＳ培地、トロンボＸ社）、霊長類ＥＳ細胞培養用培地（霊長類ＥＳ／ｉＰＳ細胞用培地、リプロセル社）、無血清多能性幹細胞維持培地（例えば、ｍＴｅＳＲ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０３（ＡＪＩＮＯＭＯＴＯ））などの市販の培地が例示される。
【００５２】
培養法の例としては、例えば、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ又はＤＭＥＭ／Ｆ１２培地上で体細胞と初期化因子とを接触させ約４〜７日間培養し、その後、細胞をフィーダー細胞（たとえば、マイトマイシンＣ処理ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞等）上に播きなおし、体細胞と初期化因子の接触から約１０日後からｂＦＧＦ含有霊長類ＥＳ細胞培養用培地で培養し、該接触から約３０〜約４５日又はそれ以上ののちにｉＰＳ様コロニーを生じさせることができる。
【００５３】
あるいは、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて、フィーダー細胞（たとえば、マイトマイシンＣ処理ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞等）上で１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（これにはさらに、ＬＩＦ、ペニシリン／ストレプトマイシン、ピューロマイシン、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸類、β−メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）で培養し、約２５〜約３０日又はそれ以上ののちにＥＳ様コロニーを生じさせることができる。望ましくは、フィーダー細胞の代わりに、初期化される体細胞そのものを用いる（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．（２００９），ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．４：ｅ８０６７またはＷＯ２０１０／１３７７４６）、もしくは細胞外基質（例えば、Ｌａｍｉｎｉｎ−５（ＷＯ２００９／１２３３４９）およびマトリゲル（ＢＤ社））を用いる方法が例示される。
【００５４】
この他にも、血清を含有しない培地を用いて培養する方法も例示される（Ｓｕｎ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００９），Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１０６：１５７２０−１５７２５）。さらに、樹立効率を上げるため、低酸素条件（０．１％以上、１５％以下の酸素濃度）によりｉＰＳ細胞を樹立しても良い（Ｙｏｓｈｉｄａ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．（２００９），Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．５：２３７−２４１またはＷＯ２０１０／０１３８４５）。
【００５５】
上記培養の間には、培養開始２日目以降から毎日１回新鮮な培地と培地交換を行う。また、核初期化に使用する体細胞の細胞数は、限定されないが、培養ディッシュ１００ｃｍ２あたり約５×１０３〜約５×１０６細胞の範囲である。
【００５６】
ｉＰＳ細胞は、形成したコロニーの形状により選択することが可能である。一方、体細胞が初期化された場合に発現する遺伝子（例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ）と連動して発現する薬剤耐性遺伝子をマーカー遺伝子として導入した場合は、対応する薬剤を含む培地（選択培地）で培養を行うことにより樹立したｉＰＳ細胞を選択することができる。また、マーカー遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子の場合は蛍光顕微鏡で観察することによって、発光酵素遺伝子の場合は発光基質を加えることによって、また発色酵素遺伝子の場合は発色基質を加えることによって、ｉＰＳ細胞を選択することができる。
【００５７】
本明細書中で使用する「体細胞」なる用語は、卵子、卵母細胞、ＥＳ細胞などの生殖系列細胞または分化全能性細胞を除くあらゆる動物細胞（好ましくは、ヒトを含む哺乳動物細胞）をいう。体細胞には、非限定的に、胎児（仔）の体細胞、新生児（仔）の体細胞、および成熟した健全なもしくは疾患性の体細胞のいずれも包含されるし、また、初代培養細胞、継代細胞、および株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は、例えば（１）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（２）組織前駆細胞、（３）リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞（膵外分泌細胞等）、脳細胞、肺細胞、腎細胞および脂肪細胞等の分化した細胞などが例示される。
【００５８】
また、ｉＰＳ細胞を移植用細胞の材料として用いる場合、拒絶反応が起こらないという観点から、移植先の個体のＨＬＡ遺伝子型が同一もしくは実質的に同一である体細胞を用いることが望ましい。ここで、「実質的に同一」とは、移植した細胞に対して免疫抑制剤により免疫反応が抑制できる程度にＨＬＡ遺伝子型が一致していることであり、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−ＤＲの３遺伝子座あるいはＨＬＡ−Ｃを加えた４遺伝子座が一致するＨＬＡ型を有する体細胞である。
【００５９】
（Ｅ）核移植により得られたクローン胚由来のＥＳ細胞
ｎｔＥＳ細胞は、核移植技術によって作製されたクローン胚由来のＥＳ細胞であり、受精卵由来のＥＳ細胞とほぼ同じ特性を有している（Ｔ．Ｗａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：７４０−７４３；Ｓ．Ｗａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２００５），Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，７２：９３２−９３６；Ｊ．Ｂｙｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ｎａｔｕｒｅ，４５０：４９７−５０２）。すなわち、未受精卵の核を体細胞の核と置換することによって得られたクローン胚由来の胚盤胞の内部細胞塊から樹立されたＥＳ細胞がｎｔＥＳ（ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ＥＳ）細胞である。ｎｔＥＳ細胞の作製のためには、核移植技術（Ｊ．Ｂ．Ｃｉｂｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：６４２−６４６）とＥＳ細胞作製技術（上記）との組み合わせが利用される（若山清香ら（２００８），実験医学，２６巻，５号（増刊），４７〜５２頁）。核移植においては、哺乳動物の除核した未受精卵に、体細胞の核を注入し、数時間培養することで初期化することができる。
【００６０】
（Ｆ）Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｅｎｄｕｒｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ（Ｍｕｓｅ細胞）
Ｍｕｓｅ細胞は、ＷＯ２０１１／００７９００に記載された方法にて製造された多能性幹細胞であり、詳細には、線維芽細胞または骨髄間質細胞を長時間トリプシン処理、好ましくは８時間または１６時間トリプシン処理した後、浮遊培養することで得られる多能性を有した細胞であり、ＳＳＥＡ−３およびＣＤ１０５が陽性である。
【００６１】
（Ｇ）間葉系幹細胞
間葉系幹細胞」とは、未分化な細胞で、脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞、筋芽細胞、線維芽細胞、ストローマ細胞、及び／又は腱細胞等のさまざまな間葉系の細胞へ分化する能力を持ち、且つ自己複製の能力を持つ細胞をいう。Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ（ＩＳＣＴ）において、間葉系幹細胞を既定する以下の３つの最小限の基準；（１）標準的な培養条件でプラスチックに接着して培養できること、（２）免疫学的特徴として、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０が陽性、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４又はＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９ａ又はＣＤ１９、ＨＬＡ−ＤＲが陰性であること、（３）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化系で骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨芽細胞への分化能を示す、とされているが、本明細書においては、これに限定されない。その他、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１０６及びＳＴＲＯ−１も間葉系幹細胞を示す陽性マーカーとして挙げられる。本明細書において、「間葉系幹細胞」は、可能な限り最も広く解釈される。
【００６２】
間葉系幹細胞は、生体内においては、骨髄、脂肪組織、臍帯血、歯髄、滑膜、胎盤等の組織から単離される細胞であり、公知の方法を用いて単離することができる。
【００６３】
本発明に用いられる多能性幹細胞は、分化誘導工程に際して、未分化状態を失われないよう、維持しながら３次元浮遊培養することにより細胞塊の状態にすることが望ましい。本明細書において、３次元浮遊培養とは、細胞を非接着条件にて、培地中で撹拌または振とうしながら培養する方法である。
【００６４】
多能性幹細胞の未分化状態を維持するための３次元浮遊培養で用いる培地は、多能性幹細胞の未分化状態を維持できる培地であれば、特に限定されないが、このような培地として、１０〜１５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２又はＤＭＥＭ培地（これらの培地にはさらに、ＬＩＦ、ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸類、β−メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）、またはマウスＥＳ細胞培養用培地（ＴＸ−ＷＥＳ培地、トロンボＸ社）、霊長類ＥＳ細胞培養用培地（霊長類ＥＳ／ｉＰＳ細胞用培地、リプロセル社）、無血清多能性幹細胞維持培地（例えば、ｍＴｅＳＲ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０３（ＡＪＩＮＯＭＯＴＯ））などの市販の培地が例示される。
【００６５】
多能性幹細胞の未分化状態を維持するための３次元浮遊培養で用いる培地には、細胞死を抑制するため、ＲＯＣＫ阻害剤を添加してもよい。ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｒｈｏ−キナーゼ（ＲＯＣＫ）の機能を抑制できるものである限り特に限定されず、例えば、Ｙ−２７６３２（例、Ｉｓｈｉｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５７，９７６−９８３（２０００）；Ｎａｒｕｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２５，２７３−２８４（２０００）参照）、Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ１０７７（例、Ｕｅｎａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８９：９９０−９９４（１９９７）参照）、Ｈ−１１５２（例、Ｓａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．９３：２２５−２３２（２００２）参照）、Ｗｆ−５３６（例、Ｎａｋａｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５２（４）：３１９−３２４（２００３）参照）およびそれらの誘導体、ならびにＲＯＣＫに対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、およびそれらの発現ベクターが挙げられる。また、ＲＯＣＫ阻害剤としては他の公知の低分子化合物も使用できる（例えば、米国特許出願公開第２００５／０２０９２６１号、同第２００５／０１９２３０４号、同第２００４／００１４７５５号、同第２００４／０００２５０８号、同第２００４／０００２５０７号、同第２００３／０１２５３４４号、同第２００３／００８７９１９号、及び国際公開第２００３／０６２２２７号、同第２００３／０５９９１３号、同第２００３／０６２２２５号、同第２００２／０７６９７６号、同第２００４／０３９７９６号参照）。本発明では、１種または２種以上のＲＯＣＫ阻害剤が使用され得る。本工程で用いる好ましいＲＯＣＫ阻害剤としては、Ｙ−２７６３２が挙げられる。本工程で用いるＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、使用するＲＯＣＫ阻害剤に応じて当業者により適宜選択可能であるが、例えば、ＲＯＣＫ阻害剤としてＹ−２７６３２を用いる場合、０．１μＭから１００μＭ、好ましくは、１μＭから５０μＭ、さらに好ましくは、５μＭから２０μＭである。
【００６６】
多能性幹細胞の未分化状態を維持するための３次元浮遊培養で用いる培地には、細胞塊同志の接着を抑制する試薬または細胞塊の浮遊状態を保持するための試薬を添加してもよく、このような試薬として、水溶性高分子、より好ましくは、水溶性多糖類（例えば、メチルセルロース、ゲランガム）が例示される。
【００６７】
多能性幹細胞の未分化状態を維持するための３次元浮遊培養に用いられる培養器は、非接着性の培養容器であれば特に制限はなく、例えば、バイオリアクター、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリディッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトルが挙げられる。これらの容器には、適宜、撹拌装置、給気システムを付属させてもよい。培養器にガス透過性の素材を利用することや撹拌装置の撹拌翼の大きさ、形状を調整することで、培養槽上面にて軸流を発生させることで、給気システムを省略することができる。３次元浮遊培養に用いられる好適な培養器は、マグネティックスターラーを設置した、エイブル社製のバイオリアクター（図２参照）が例示される。
【００６８】
多能性幹細胞の未分化状態を維持するための３次元浮遊培養において、撹拌装置が付属された培養器を用いる場合、撹拌速度は、細胞の浮遊状態を維持できれば、特に限定されないが、例えば、１０ｒｐｍから９５ｒｐｍ、好ましくは、４０ｒｐｍから８０ｒｐｍ、さらに好ましくは、５０ｒｐｍから７０ｒｐｍ、最も好ましくは約６０ｒｐｍが例示される。
【００６９】
３次元浮遊培養は、１．０×１０４個／ｍｌから１．０×１０６個／ｍｌ、好ましくは、３．０×１０４個／ｍｌから１．０×１０５個／ｍｌの細胞密度であることが例示され、培地の容量を適宜増減することで、所望の細胞数を調整することが可能である。
【００７０】
多能性幹細胞の未分化状態を維持するための３次元浮遊培養において、培養温度は、特に限定されないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ２含有空気の雰囲気下で培養が行われる。ＣＯ２濃度は、約２〜５％、好ましくは約５％である。本工程の培養期間は、細胞塊の直径が３００μｍ以内に保つ期間であれば特に限定されないが、例えば、３日以上１０日以内、好ましくは、４日以上７日以内の培養期間が例示され、好ましくは５日である。
【００７１】
上記の工程（ｉ）において使用される培地は、動物細胞の培養に用いられる基礎培地へＢＭＰ２、ＴＧＦβおよびＧＤＦ５から成る群から選択される１以上の物質ならびにＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬を添加して調製することができる。工程（ｉ）で用いる好ましい培地は、ＢＭＰ２、ＴＧＦβ、ＧＤＦ５およびＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬が添加された基礎培地である。基礎培地としては、例えば、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、およびこれらの混合培地などが挙げられる。基礎培地には、必要に応じて、血清（例えば、ＦＢＳ）、アルブミン、トランスフェリン、ＫｎｏｃｋＯｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（ＥＳ細胞培養時のＦＢＳの血清代替物）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、脂肪酸、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール、３’−チオールグリセロール、脂質、アミノ酸、Ｌ−グルタミン、ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、ピルビン酸ナトリウム、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの物質も含有しうる。本工程の１つの実施形態において、基礎培地は、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、アスコルビン酸、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、抗生物質および１％血清を含むＤＭＥＭである。
【００７２】
上記の工程（ｉ）において、ＢＭＰ２には、ヒトおよび他の動物由来のＢＭＰ２、ならびにこれらの機能的改変体が包含され、例えば、Ｏｓｔｅｏｐｈａｒｍａ社等から市販されているものを使用することができる。本工程で用いるＢＭＰ２の濃度は、０．１ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、１ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、５ｎｇ／ｍｌから５０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌである。本発明において、ＢＭＰ２は、ＢＭＰ４に置き換えてもよい。
【００７３】
上記の工程（ｉ）において、ＴＧＦβには、ヒトおよび他の動物由来のＴＧＦβ、ならびにこれらの機能的改変体が包含され、例えば、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社等から市販されているものを使用することができる。本工程で用いるＴＧＦβの濃度は、０．１ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、１ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、５ｎｇ／ｍｌから５０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌである。
【００７４】
上記の工程（ｉ）において、湿重量で５０ｍｇの軟骨様組織に対する培地中のＴＧＦβの量は、０．１μｇより多ければよいが、好ましくは０．２μｇ以上、より好ましくは０．２５μｇ以上、さらに好ましくは０．３μｇ以上である。上限としては、特に制限されないが、１０００ｎｇ以下が例示される。なお、軟骨様組織の湿重量は、培養した軟骨様組織が組織内に含みうる水分を保持した状態の重量を指す。軟骨様組織の湿重量は、培地中の軟骨様組織をスパチュラで採取し、培養皿の縁などで余分な水分を可能な限り除去し、乾燥させることなく測定することで得ることができる。
【００７５】
上記の工程（ｉ）において、ＧＤＦ５には、ヒトおよび他の動物由来のＧＤＦ５、ならびにこれらの機能的改変体が包含され、例えば、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社等から市販されているものを使用することができる。本工程で用いるＧＤＦ５の濃度は、０．１ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、１ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、５ｎｇ／ｍｌから５０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌである。
【００７６】
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬は、例えば、メバスタチン（コンパクチン）（ＵＳＰ３９８３１４０参照）、プラバスタチン（特開昭５７−２２４０号公報（ＵＳＰ４３４６２２７）参照）、ロバスタチン（特開昭５７−１６３３７４号公報（ＵＳＰ４２３１９３８）参照）、シンバスタチン（特開昭５６−１２２３７５号公報（ＵＳＰ４４４４７８４）参照）、フルバスタチン（特表昭６０−５０００１５号公報（ＵＳＰ４７３９０７３）参照）、アトルバスタチン（特開平３−５８９６７号公報（ＵＳＰ５２７３９９５）参照）、ロスバスタチン（特開平５−１７８８４１号公報（ＵＳＰ５２６０４４０）参照）、ピタバスタチン（特開平１−２７９８６６号公報（ＵＳＰ５８５４２５９およびＵＳＰ５８５６３３６）参照）を含むが、これらに限定されない。本発明におけるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬は、好ましくは、メバスタチン、アトルバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチンおよびロバスタチンから成る群より選択される薬剤、最も好ましくはロスバスタチンである。
【００７７】
上記の工程（ｉ）において、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬としてロスバスタチンを用いる場合、濃度は、０．０１μＭから１００μＭ、好ましくは、０．１μＭから１０μＭ、より好ましくは、０．５μＭから５μＭ、１μＭである。
【００７８】
上記の工程（ｉ）において、さらに、ｂＦＧＦを基礎培地に添加してもよく、ｂＦＧＦには、ヒトおよび他の動物由来のｂＦＧＦ、ならびにこれらの機能的改変体が包含され、例えば、ＷＡＫＯ社等の市販されているものを使用することができる。本工程で用いるｂＦＧＦの濃度は、０．１ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、１ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、５ｎｇ／ｍｌから５０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌである。
【００７９】
上記の工程（ｉ）において、さらに、プテロシン誘導体を基礎培地に添加してもよく、プテロシン誘導体は、例えば、ＵＳ１４／３１５，８０９に記載のプテロシン誘導体が例示され、より好ましくは、プテロシンＢである。本工程で用いるプテロシンＢの濃度は、１０μＭから１０００μＭ、好ましくは、１００μＭから１０００μＭである。
【００８０】
本明細書において、接着条件で培養するとは、細胞を培養皿へ接着可能な状態で培養することであり、細胞接着に適した表面加工をした培養容器を用いて培養することによって行い得る。このような表面加工をした培養容器は、市販のものを用いることができ、例えば、ＩＷＡＫＩの組織培養用ディッシュが例示される。他の態様として、細胞外基質をコーティング処理された培養容器を用いて培養することによって行ってもよい。コーティング処理は、細胞外基質を含有する溶液を培養容器に入れた後、当該溶液を適宜除くことによって行い得る。
【００８１】
本明細書において、細胞外基質とは、細胞の外に存在する超分子構造体であり、天然由来であっても、人工物（組換え体）であってもよい。例えば、ポリリジン、ポリオルニチン、コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、テネイシン、エンタクチン、エラスチン、フィブリリン、ラミニンといった物質およびこれらの断片が挙げられる。これらの細胞外基質は、適宜組み合わせて用いられてもよい。
【００８２】
上記の工程（ｉ）において、培養温度は、特に限定されないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ２含有空気の雰囲気下で培養が行われる。ＣＯ２濃度は、約２〜５％、好ましくは約５％である。上記の工程（ｉ）の培養時間は、例えば、７日以上２８日以下、１０日以上２５日以下、１０日以上２０日以下、より好ましくは１４日である。
【００８３】
上記の工程（ｉｉ）では、前記工程（ｉ）で得られた細胞を培養容器より剥離させ、浮遊培養することで行い得る。上記の工程（ｉｉ）において、細胞培養物を剥離させる方法は、力学的分離方法（例えば、ピペッティング、またはスクレーパー等を用いる方法）により行うことが好ましく、プロテアーゼ活性および／またはコラゲナーゼ活性を有する分離溶液（例えば、トリプシンとコラゲナーゼの含有溶液Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＴＭ）およびＡｃｃｕｍａｘ（ＴＭ）（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）が挙げられる）を用いない方法が好ましい。
【００８４】
上記の工程（ｉｉ）において、浮遊条件で培養するとは、細胞を培養皿へ非接着の状態で培養することであり、特に限定はされないが、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリックス等によるコーティング処理）されていない培養容器（例えば、ペトリディッシュ）、または、人工的に接着を抑制する処理（例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸（ｐｏｌｙ−ＨＥＭＡ）によるコーティング処理）した培養容器を使用して行うことが好ましい。
【００８５】
上記の工程（ｉｉ）において使用される培地は、上述した工程（ｉ）と同一の培地を用いることができる。
【００８６】
上記の工程（ｉｉ）において、培養温度は、特に限定されないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ２含有空気の雰囲気下で培養が行われる。ＣＯ２濃度は、約２〜５％、好ましくは約５％である。本工程の培養時間は、例えば、２週間以上１８週間以下、６週間以上１８週間以下、より好ましくは１０週以上１５週以下である。培養期間は、所望の軟骨細胞が得られるまで培養することが望ましく、適宜軟骨細胞の製造を確認しながら培養期間を調整することができる。本発明において軟骨細胞を確認する方法として、得られた軟骨パーティクルの一部を採取し、サフラニンＯにて染色されることを確認することによって行い得る。
【００８７】
サフラニンО染色は、以下の方法によって行い得る。軟骨様組織を、４％パラホルムアルデヒドで固定し、その後、パラフィンに包埋して、組織切片を作製する。パラフィン包埋組織切片を脱パラフィン化し、鉄ヘマトキシリン溶液（Ｗｅｉｇｅｒｔ‘ｓ  ｉｒｏｎ  ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ、ミリポア社、ＨＸ７３９２９２７３）内で３分間処理し、流水で１分間洗浄する。その後、１％酢酸水溶液に３秒間浸漬し、０．０５％ファストグリーンＦＣＦ（和光純薬社、０６１−０００３１）水溶液で５分間反応させる。１％酢酸水溶液で３秒間洗浄後、０．１％サフラニンＯ（ワルデック社、１Ｂ−４６３）水溶液で５分間反応させる。その後、７０％エタノール、１００％エタノール、キシレン（３曹）に浸漬させ水分を除いた上で、封入剤およびカバーガラスで封入する。
【００８８】
また、軟骨様組織の性状確認として、２型コラーゲン染色を行うことができる。２型コラーゲン染色は、以下の方法によって行い得る。軟骨様組織を、４％パラホルムアルデヒドで固定し、その後、パラフィンに包埋して、組織切片を作製する。パラフィン包埋組織切片を脱パラフィン化し、それを１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ＰＢＳ（ｐＨ８．０）に浸漬し、８０℃で１５分間インキュベートして抗原の賦活化を行う。その後、ＰＢＳで組織切片を洗浄し、１０ｍｇ／ｍＬのＨｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅを添加し、室温で４０分間処理し、ＰＢＳで洗浄する。ＤＡＢキット（ＣＳＡ  ＩＩ  Ｂｉｏｔｉｎ−ｆｒｅｅ  Ｔｙｒａｍｉｄｅ  Ｓｉｇｎａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｄａｋｏ社）を用い、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｂｌｏｃｋ（ＤＡＢキット  ｓｔｅｐ１）で５分間処理し、ＰＢＳで洗浄後、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｌｏｃｋ（ＤＡＢキット  ｓｔｅｐ２）で５分間処理する。その後、抗２型コラーゲン抗体（サーモサイエンティフィック社、＃ＭＳ−２３５−Ｐ０、ＡＢ−２、Ｃｌｏｎｅ  ２Ｂ１．５、１：１０００希釈）を添加し、４℃で一晩反応させる。ＰＢＳで洗浄後、二次抗体（ＤＡＢキット  ｓｔｅｐ４  ｍｏｕｓｅ）を添加して１５分間処理する。ＰＢＳで洗浄後、Ａｍｐｌｉｆｃａｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（ＤＡＢキット  ｓｔｅｐ５）で１５分間処理する。ＰＢＳで洗浄後、ａｎｔｉ  ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｔ  ＨＲＰ（ＤＡＢキット  ｓｔｅｐ６）で１５分間処理する。その後、ＰＢＳで洗浄し、ＤＡＢ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ及びＤＡＢ  ｃｈｌｏｍｏ（ＤＡＢキット  ｓｔｅｐ７）を用いて発色させる。その後、７０％エタノール、８０％エタノール、９５％エタノール、１００％エタノール、キシレン（３曹）に浸漬させ水分を除いた上で、封入剤およびカバーガラスで封入する。
【００８９】
本発明は、多能性幹細胞から誘導された軟骨様組織に、培地中で力学的刺激を負荷する工程を含む。力学的刺激を負荷する工程によって、軟骨様組織、特に表層周辺部（例えば、非中心領域）に刺激が与えられ、ルブリシンの発現が促進されてルブリシンが表層周辺部（例えば、非中心領域）に局在化した軟骨様組織が得られる。力学的刺激を負荷する工程において使用される培地は、上述の工程（ｉ）と同一の培地を用いることができる。力学的刺激を負荷する工程は、せん断力を負荷する工程であることが好ましく、より好ましくは組織の外周全方位からせん断力を負荷する工程である。一実施形態において、せん断力は、攪拌手段によって負荷される。攪拌手段としては、例えば、回転式培養装置を用いることができる。回転式培養装置に用いられる培養容器としては、例えば、市販のローラーボトルやスピナーフラスコであってもよく、好ましくは１以上の攪拌翼を有する回転式培養容器であり、例えば、上記工程（ｉ）でも使用可能な、マグネティックスターラーを設置した、エイブル社（日本）製のバイオリアクター（図２参照）を用いることができる。１以上の攪拌翼を有する回転式培養装置を用いることによって、多能性幹細胞から誘導された軟骨様組織を、前記攪拌翼ならびに／または前記回転式培養装置の培養容器の底面及び内壁面に効率的に接触させることができ、それによって効果的に軟骨様組織にせん断力を負荷させることができる。
【００９０】
本発明の一実施態様において用いられる回転式培養容器５は、容器本体５２の底面から垂直に設けられた支柱５３を中心として回転する、１以上の攪拌翼５４（図２では２枚）が設けられている。攪拌翼５４の数は特に限定されないが、例えば、１枚、２枚、３枚、４枚、５枚、６枚、７枚、８枚、９枚または１０枚以上であってもよい。攪拌翼５４には、磁石５４０が設けられており、マグネティックスターラー（図示しない）によって攪拌翼５４が回転する。攪拌翼５４の底部は、容器本体５２の底面と略平行に形成され、攪拌翼５４の底部に、軟骨様組織１が巻き込まれない程度の隙間を有している。また、攪拌翼５４の外側部分は、容器本体５２の内壁に接触しないよう設計されており、軟骨様組織１が巻き込まれない程度の隙間を有している。攪拌翼５４が回転することによって、軟骨様組織１が容器本体５２の底面と内壁に効率的に接触させることができ、軟骨様組織１の表面に力学的刺激、特にせん断力を負荷することが可能となる。また、軟骨様組織１と培地の間でも力学的刺激、特に流体せん断力を負荷することが可能となる。
【００９１】
前記回転式培養装置の攪拌速度は、軟骨様組織１にせん断力を負荷することができれば、特に限定されないが、例えば、１０ｒｐｍから９５ｒｐｍ、好ましくは、４０ｒｐｍから８０ｒｐｍ、さらに好ましくは、５０ｒｐｍから７０ｒｐｍ、最も好ましくは約６０ｒｐｍが例示される。
【００９２】
一実施形態において、力学的刺激を負荷する工程の期間は、ルブリシンを、軟骨様組織の表層周辺部（例えば、非中心領域）に局在させるのに十分な期間であればよく、例えば３日以上、好ましくは１４日以上、より好ましくは２８日以上である。
【００９３】
一実施形態において、力学的刺激を負荷する工程で用いられる、ルブリシンを局在化させる前の多能性幹細胞から誘導された軟骨様組織の量は、ルブリシンを軟骨様組織の表層周辺部（例えば、非中心領域）に局在させるのに十分な量であればよく、例えば１００ｍｇ／３０ｍＬ培地以下、好ましくは６０ｍｇ／３０ｍＬ培地以下である。一実施態様において、力学的刺激を負荷する工程で用いられる、ルブリシンを局在化させる前の多能性幹細胞から誘導された軟骨様組織の大きさは、特に制限されないが、最長径の下限としては、好ましくは０．５ｍｍ以上、より好ましくは１ｍｍ以上、さらに好ましくは２ｍｍを例示できる。最長径の上限としては、好ましくは１０ｍｍ以下、より好ましくは６ｍｍ以下が例示される。最長径の範囲としては、０．５ｍｍ〜１０ｍｍ、好ましくは１ｍｍ〜６ｍｍ、より好ましくは２ｍｍ〜５ｍｍである。これらの大きさを有する多能性幹細胞から誘導された軟骨様組織であれば、培地よりも比重が重くなるため、培地中に存在する場合であっても、培養容器の底面付近に浮遊させることできる。そのため、軟骨様組織を培養容器の底面上で転がしながら培養することが可能となり、それによって力学的刺激（特にせん断力）を軟骨様組織の表面に効率的に負荷させることができる。
【００９４】
一実施形態において、力学的刺激を負荷された、ルブリシンが局在化した軟骨様組織の大きさは、特に制限されないが、最長径の下限としては、好ましくは０．５ｍｍ以上、より好ましくは１ｍｍ以上、さらに好ましくは２ｍｍを例示できる。最長径の上限としては、好ましくは１０ｍｍ以下、より好ましくは６ｍｍ以下が例示される。最長径の範囲としては、０．５ｍｍ〜１０ｍｍ、好ましくは１ｍｍ〜６ｍｍ、より好ましくは２ｍｍ〜５ｍｍが例示される。これらの大きさを有する軟骨様組織は、ヒトの軟骨、特に膝軟骨の様々な形の欠損に充填させることができる。
【００９５】
一実施形態において、力学的刺激を負荷する工程の前後で、多能性幹細胞から誘導された軟骨様組織に対し、ルブリシン局在軟骨様組織のＰＲＧ４の発現量は３倍以上上昇する。ＰＲＧ４の発現量は、ルブリシンタンパク質の発現量であってもよく、ＰＲＧ４のｍＲＮＡの発現量であってもよい。多能性幹細胞から誘導された軟骨様組織に対し、ルブリシン局在軟骨様組織のＰＲＧ４の発現量が、力学的刺激を負荷する工程の前後で３倍以上上昇すると、ルブリシンが表層周辺部（例えば、非中心領域）に局在化した軟骨様組織が得られる。
【００９６】
本発明では、上述した方法により得られたルブリシン局在軟骨様組織を含む関節軟骨損傷治療用組成物を提供する。患者への医薬品の投与方法としては、例えば、上述の方法により得られたルブリシン局在軟骨様組織をフィブリン糊で固めて、投与部位に適した大きさのルブリシン局在軟骨様組織として、患者の軟骨欠損部位に投与する方法がある。この他にも、ルブリシン局在軟骨様組織をゼラチンゲルおよび/またはコラーゲンゲルおよび/またはヒアルロン酸ゲル等と混合し、患部へ投与する方法、ルブリシン局在軟骨様組織を患部に投与し、骨膜等で固定する方法などが例示される。
【００９７】
本発明の組成物により治療される疾患として、鼻軟骨・耳介軟骨などの顔面軟骨および関節軟骨の欠損が例示され、好ましくは、関節軟骨損傷である。
【００９８】
本発明の組成物に含まれるルブリシン局在軟骨様組織は、移植片が投与後に生着できれば特に限定されなく、患部の大きさや体躯の大きさに合わせて適宜増減して調製されてもよい。
【００９９】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。
【実施例】
【０１００】
〔実施例１〕
１．方法
１−１．ヒトｉＰＳ細胞を用いた軟骨細胞の誘導
Ｎａｋａｇａｗａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．４：３５９４（２０１４）に記載の方法で樹立されたＱＨＪＩ０１ｓ０４株を京都大学ｉＰＳ細胞研究所より受領し、ヒトｉＰＳ細胞として用いた。【０１０１】
国際公開第２０１６／１３３２０８号に記載の方法に従って、ヒトｉＰＳ細胞から軟骨様組織を調製し、以降のルブリシン局在軟骨様組織の調製に用いた。【０１０２】
１−２．ルブリシン局在軟骨様組織の製造
上記１−１で得られた軟骨様組織、約５０ｍｇ（５〜１０個の軟骨様組織）を、３０ｍＬバイオリアクター（ＢＷＶ−Ｓ０３Ａ、エイブル）へ移し、上記１−１で用いた軟骨分化培地を３０ｍＬ加え、せん断力刺激を付与するために６ｃｍ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｓｔｉｒｒｅｒ（ＢＷＳ−Ｓ０３ＮＯＳ−６、エイブル）を用い、６０ｒｐｍで回転させ、３７℃、ＣＯ２５％の条件下で３０日間培養した。培養期間中、２日または３日毎に、新しい軟骨分化培地へ交換した。【０１０３】
１−３．ルブリシン局在軟骨様組織の免疫染色およびサフラニンＯ染色
上記１−２の方法によって得られた軟骨様組織（せん断力刺激付与前（０日目）、せん断力刺激付与後（３０日目）を、４％パラホルムアルデヒドで固定し、その後、パラフィンに包埋して、組織切片を作製した。パラフィン包埋組織切片を脱パラフィン化し、それを１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ＰＢＳ（ｐＨ８．０）に浸漬し、８０℃で１５分間インキュベートして抗原の賦活化を行った。その後、ＰＢＳで組織切片を洗浄し、１０ｍｇ／ｍＬのＨｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅを添加し、室温で４０分間処理し、ＰＢＳで洗浄した。ＤＡＢキット（ＣＳＡ  ＩＩ  Ｂｉｏｔｉｎ−ｆｒｅｅ  Ｔｙｒａｍｉｄｅ  Ｓｉｇｎａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｄａｋｏ社）を用い、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｂｌｏｃｋ（ＤＡＢキット  ｓｔｅｐ１）で５分間処理し、ＰＢＳで洗浄後、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｌｏｃｋ（ＤＡＢキット  ｓｔｅｐ２）で５分間処理した。その後、抗ルブリシン−マウス抗体（ミリポア社、＃ＭＡＢＴ４００、Ｃｌｏｎｅ５Ｃ１１、１：５００希釈）を添加し、４℃で一晩反応させた。ＰＢＳで洗浄後、二次抗体（ＤＡＢキット  ｓｔｅｐ４  ｍｏｕｓｅ）を添加して１５分間処理した。ＰＢＳで洗浄後、Ａｍｐｌｉｆｃａｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（ＤＡＢキット  ｓｔｅｐ５）で１５分間処理した。ＰＢＳで洗浄後、ａｎｔｉ  ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｔ  ＨＲＰ（ＤＡＢキット  ｓｔｅｐ６）で１５分間処理した。その後、ＰＢＳで洗浄し、ＤＡＢ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ及びＤＡＢ  ｃｈｌｏｍｏ（ＤＡＢキット  ｓｔｅｐ７）を用いて発色させ、カバーガラスで封入した後、画像を撮影した（図３−１）。別切片についてサフラニンＯ染色を行った（図３−２）。【０１０４】
１−４．軟骨様組織のルブリシン局在の定量的解析
Ｉｍａｇｅ  Ｊ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、ｖｅｒ．１．５１）を用いて、以下の手順により、周辺領域（非中心領域）／中心領域の免疫染色濃度の比を求めた（図４）。なお、表層周辺部範囲は具体的には、以下の式で算出した。
表層周辺部範囲(μｍ）＝組織長径（ｍｍ）×（１−中心領域径／組織長径）×１０００
（１）Ｉｍａｇｅ  ＞Ｔｙｐｅ  ＞３２ｂｉｔでＲＧＢ画像をグレイスケールに変換（ＹＵＶで重み付け）
（２）Ｅｄｉｔ  ＞  Ｉｎｖｅｒｔで白黒を反転
（３）組織に内接するように多角形ツールでＲＯＩを描き、Ａｎａｌｙｓｅ  ＞  ｍｅａｓｕｒｅ（組織全体のＡｒｅａ及びＭｅａｎ  ｇｒａｙ  ｖａｌｕｅを測定）
（４）中心領域を円形ツールで選択し、Ａｎａｌｙｓｅ  ＞  ｍｅａｓｕｒｅ（中心領域のＡｒｅａ及びＭｅａｎ  ｇｒａｙ  ｖａｌｕｅを測定）
（５）バックグラウンドを円形ツールで選択し、Ａｎａｌｙｓｅ  ＞  ｍｅａｓｕｒｅ（バックのＭｅａｎ  ｇｒａｙ  ｖａｌｕｅを測定）
（６）以下の式で周辺領域のＭｅａｎ  ｇｒａｙ  ｖａｌｕｅを算出：
（組織全体のＡｒｅａ×  Ｍｅａｎ  ｇｒａｙ  ｖａｌｕｅ）−（中心領域のＡｒｅａ×  Ｍｅａｎ  ｇｒａｙ  ｖａｌｕｅ）／（組織全体のＡｒｅａー中心領域のＡｒｅａ）
（７）以下の式で周辺領域／中心領域のＭｅａｎ  ｇｒａｙ  ｖａｌｕｅからバックグラウンドを引いた値の比を算出：
（周辺領域のＭｅａｎ  ｇｒａｙ  ｖａｌｕｅ−バックグラウンドのＭｅａｎ  ｇｒａｙ  ｖａｌｕｅ）／（中心領域のＭｅａｎ  ｇｒａｙ  ｖａｌｕｅ−バックグラウンドのＭｅａｎ  ｇｒａｙ  ｖａｌｕｅ）【０１０５】
２．結果
攪拌前の軟骨様組織（０日目、比較例）と比べて、３０日攪拌後の軟骨様組織は、周辺領域にルブリシンが局在していることが確認された（図３−１及び４）。【０１０６】
〔実施例２〕
実施例１と同様の手順により、攪拌有り又は無しの条件にて、軟骨様組織を１週間、２週間または４週間培養した。得られた軟骨様組織を、実施例１と同様の手順により、抗ルブリシン抗体を用いた免疫組織化学染色およびサフラニンО染色を行い、画像解析を行った（図５〜７）。その結果、２週間（１４日）以上培養した軟骨様組織において、周辺領域にルブリシンが局在していることが確認された（図７）。【０１０７】
〔実施例３〕
実施例１と同様の手順により、攪拌培養した軟骨様組織を経時的に回収した（０時間、２時間、６時間、２４時間及び７２時間）。得られた軟骨様組織を液体窒素で凍結し、Ｍｕｌｔｉ  Ｂｅａｄｓ  Ｓｈｏｃｋｅｒ（Ｙａｓｕｉ  Ｋｉｋａｉ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）で破砕し、Ｑｉａｚｏｌ（登録商標（Ｑｉａｇｅｎ））及びＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。トータルＲＮＡをＤＮａｓｅで処理してゲノムＤＮＡを除去し、２５０ｎｇのトータルＲＮＡをＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ（登録商標）ｑＰＣＲ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｔｏｙｏｂｏ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用いて、逆転写してｃＤＮＡを調製した。ＫＡＰＡ  ＳＵＢＲ  ＦＡＳＴ  ｑＰＣＲ  ｋｉｔ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（ＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いてＰＣＲ増幅を行った。ＰＲＧ４プライマーは、ＴａｑＭａｎ  ＩＤ：Ｈｓ０１６０６６５＿ｇ１を用い、コントロールのＧＡＰＤＨプライマーは、ＴａｑＭａｎ  ＩＤ：Ｈｓ０３９２９０９７＿ｇ１を用いた。ＲＮＡ発現レベルは、ＧＡＰＤＨのレベルでノーマライズした。結果は、攪拌前の軟骨様組織（０時間）の相対発現量として算出した。その結果、２４時間以上攪拌培養した軟骨様組織は、ＰＲＧ４の発現量が３倍以上増加している様子が確認された（図８）。
【符号の説明】
【０１０８】
１    軟骨様組織
２    第１重心
２１    重心領域
３    第１最長径
４    断面
４１    第２重心
４２    第２最長径
４３    中心領域径
４４    中心領域
４５    非中心領域
５    回転式培養容器
５１    蓋体
５１０    通気フィルタ
５２    容器本体
５３    支柱
５４    攪拌翼
５４０    磁石
６    培地
【図１】
2020130147.tif 000003
【図２】
2020130147.tif 000004
【図３−１】
2020130147.tif 000005
【図３−２】
2020130147.tif 000006
【図４】
2020130147.tif 000007
【図５−１】
2020130147.tif 000008
【図５−２】
2020130147.tif 000009
【図６−１】
2020130147.tif 000010
【図６−２】
2020130147.tif 000011
【図７】
2020130147.tif 000012
【図８】
2020130147.tif 000013
【国際調査報告】
2020130147.tif 000014
2020130147.tif 000015
2020130147.tif 000016
2020130147.tif 000017
2020130147.tif 000018
2020130147.tif 000019