(57)【要約】本発明は、第１の抗原結合分子、第２の抗原結合分子、およびこれらの組合せに関する。第２の抗原結合分子は、第１の抗原および第１の抗原結合分子を含む抗原−抗原結合分子複合体に結合し、第１の抗原結合分子の第１の抗原への結合活性を増加させる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の抗原および前記第１の抗原に結合する第１の抗原結合分子を含む抗原−抗原結合分子複合体に結合し、前記第１の抗原結合分子の前記第１の抗原への結合活性を増加させる、第２の抗原結合分子。
【請求項２】
前記第１の抗原結合分子の存在下における前記第１の抗原への結合活性が、前記第１の抗原結合分子の非存在下に比べて高い、請求項１に記載の第２の抗原結合分子。
【請求項３】
前記第１の抗原が免疫関連分子または細胞代謝物である、請求項１または請求項２に記載の第２の抗原結合分子。
【請求項４】
前記免疫関連分子が、免疫細胞の細胞膜に存在する分子である、請求項３に記載の第２の抗原結合分子。
【請求項５】
前記免疫細胞が、顆粒球、マクロファージ、樹状細胞、T細胞、およびB細胞からなる群から選択される少なくとも一つである、請求項４に記載の第２の抗原結合分子。
【請求項６】
前記免疫関連分子がＣＤ３である、請求項３〜請求項５のいずれか一項に記載の第２の抗原結合分子。
【請求項７】
前記第１の抗原結合分子が、重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せがそれぞれ配列番号：1と配列番号：122、配列番号：114と配列番号：115、配列番号：116と配列番号：117、配列番号：118と配列番号：119、および配列番号：120と配列番号：121から選択されるいずれかの組合せからなるＣＤ３結合ポリペプチド、または前記ＣＤ３結合ポリペプチドから改変された第１の改変ポリペプチドを含み、前記第１の改変ポリペプチドのＣＤ３への結合活性は前記ＣＤ３結合ポリペプチドに比べて低い、請求項６に記載の第２の抗原結合分子。
【請求項８】
前記細胞代謝物が、アデノシンまたはその誘導体である、請求項３に記載の第２の抗原結合分子。
【請求項９】
前記第１の抗原結合分子が、重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せがそれぞれ配列番号：106と配列番号：107、配列番号：108と配列番号：109、配列番号：110と配列番号：111、および配列番号：112と配列番号：113から選択されるいずれかの組合せからなるアデノシン結合ポリペプチド、または前記アデノシン結合ポリペプチドから改変された第２の改変ポリペプチドを含み、前記第２の改変ポリペプチドのアデノシへの結合活性は前記アデノシン結合ポリペプチドに比べて低いまたは高い、請求項８に記載の第２の抗原結合分子。
【請求項１０】
前記第１の抗原結合分子が多重抗原特異性を有し、さらに少なくとも第２の抗原に結合する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の第２の抗原結合分子。
【請求項１１】
前記第２の抗原が、癌抗原または免疫関連分子である、請求項１０に記載の第２の抗原結合分子。
【請求項１２】
多重抗原特異性を有し、さらに少なくとも第３の抗原に結合する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の第２の抗原結合分子。
【請求項１３】
前記第３の抗原が、癌抗原または免疫関連分子である、請求項１２に記載の第２の抗原結合分子。
【請求項１４】
前記第１の抗原結合分子が多重抗原特異性を有し、さらに少なくとも第２の抗原に結合し、前記第２の抗原結合分子が多重抗原特異性を有し、さらに少なくとも第３の抗原に結合し、前記第１の抗原と前記第２の抗原と前記第３の抗原の組合せが、以下の（１）〜（５）のいずれかの組合せである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の第２の抗原結合分子。
（１）前記第１の抗原が免疫関連分子であり、前記第２の抗原が第１の癌抗原であり、前記第３の抗原が第２の癌抗原である組合せ
（２）前記第１の抗原が標的細胞の細胞代謝物であり、前記第２の抗原が癌抗原であり、前記第３の抗原が免疫関連分子である組合せ
（３）前記第１の抗原が標的細胞の細胞代謝物であり、前記第２の抗原が免疫関連分子であり、前記第３の抗原が癌抗原である組合せ
（４）前記第１の抗原が第１の免疫関連分子であり、前記第２の抗原が癌抗原であり、前記第３の抗原が第２の免疫関連分子である組合せ
（５）前記第１の抗原が第１の免疫関連分子であり、前記第２の抗原が第２の免疫関連分子であり、前記第３の抗原が癌抗原である組合せ
【請求項１５】
請求項１に記載の第１の抗原結合分子および第２の抗原結合分子の組合せ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原結合分子および組合せに関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は高い親和性で特異的に抗原と結合するタンパク質である。低分子化合物からタンパク質まで様々な分子が抗原となることが知られている。モノクローナル抗体の作製技術が開発されて以降、抗体改変技術が発達し、特定の分子を認識する抗体の取得が容易となった。例えば、第一抗体の軽鎖部分を認識し且つ抗原結合第一抗体を特異的に認識するドミノ抗体は、ＥＬＩＳＡなどの免疫学的測定法に用いられる（特許文献１）。IL-6とgp80のタンパク質：タンパク質相互作用を安定化する接合部エピトープ抗体は、その下流シグナルを調節する（Scientific Reports (2017) 7, 1-15 Ralph, A. et al.（非特許文献９））。【０００３】
抗体は、血漿中での安定性が高く副作用が少ないことから、医薬品として注目されている。抗体は、抗原に結合する作用、アゴニスト作用やアンタゴニスト作用だけでなく、ADCC（Antibody Dependent Cytotoxicity：抗体依存性細胞傷害活性）、ADCP（Antibody Dependent Cell phagocytosis：抗体依存性細胞鈍食作用）、CDC（補体依存性細胞傷害活性）といったエフェクター細胞による細胞傷害活性（エフェクター機能とも言う）を誘導する。このような抗体の機能を利用して、癌、免疫疾患、慢性疾患、感染症等の医薬品が開発されてきている（Paul J. Carter and Greg A. Lazar、Next generation antibody drugs: pursuit of the 'high-hanging fruit'、 [online]、平成29年12月1日、Nature Reviews Drug Discovery、[平成30年1月22日検索]、インターネット〈https://www.nature.com/articles/nrd.2017.227〉（非特許文献１））。【０００４】
例えば、抗癌剤として細胞傷害活性を有するＴ細胞の活性化を促進する共刺激分子に対するアゴニスト抗体を利用した医薬品が開発されてきている（Clinical and Experimental Immunology (2009) 157, 9-19 Peggs, K. S.et al.（非特許文献２）)。近年、共抑制分子に対するアンタゴニスト活性を有する免疫チェックポイントの阻害抗体が抗癌剤として有用であることが明らかとなり、CTLA4/CD80やPD-1/PD-L1の相互作用を阻害する抗体医薬、Ipilimumab、Nivolumab、Pembrolizumab、Atezolizumabが相次いで上市された（非特許文献１）。【０００５】
天然のIgG型抗体の機能を人工的に増強もしくは付加させることまたは減弱もしくは欠失させることにより、抗体の用途にあわせてその機能が増強もしくは付加された、または減弱もしくは欠失された第２世代の抗体医薬が開発されてきている。第２世代の抗体医薬としては、例えば、エフェクター機能を増強あるいは欠失させた抗体（Current Pharmaceutical Biotechnology (2016) 17, 1298-1314 Mimoto, F. et al.（非特許文献３））、pH依存的に抗原と結合する抗体（Nature Biotechnology (2010) 28, 1203-1208 Igawa, T. et al.（非特許文献４））、１分子で２種類以上の抗原と結合する抗体（２種類の抗原と結合する抗体を一般に「二重特異性抗体」と称する）（MAbs. (2012) Mar 1, 4(2)（非特許文献５））が挙げられる。【０００６】
二重特異性抗体は、より効果の高い医薬品になることが期待されている。例えば、一方の抗原をＴ細胞の細胞膜に発現するタンパク質とし、他方の抗原を癌抗原として、細胞傷害活性をもつＴ細胞と癌細胞をクロスリンクさせることにより、抗腫瘍活性（本明細書では、この抗腫瘍活性は「TDCC活性」（T-cell Dependent Cytotoxicity：T細胞依存性細胞傷害活性）と略称され、エフェクター機能に包含される。）が高められた抗体が開発されている（Journal of Biomolecular Screening (2015) 20, 519-27 Nazarian, A. A. et al.（非特許文献１０））。二重特異性抗体としては、抗体の２つのFab領域が異なる配列を有する分子（共通軽鎖二重特異性抗体およびハイブリッドハイブリドーマ）、抗体のN末端やC末端に抗原結合部位を付加した分子（DVD-IgやscFv-IgG）、１つのFab領域が２つの抗原に結合する分子（Two-in-one IgG）、CH3領域のループ部位を新たな抗原結合部位とした分子（Fcab）が報告されている（Nature Review (2010), 10, 301-316 Chan, A. C. and Carter P. J.（非特許文献６）、Peds(2010), 23(4), 289-297 Wozniak-Knopp, G.et al.（非特許文献７））。【０００７】
一方、エフェクター機能を利用した抗体は、標的抗原の発現が低い正常細胞に対しても作用し副作用が生じやすい。そこで、抗体医薬のエフェクター機能を標的組織特異的に発揮させる試みがなされている。例えば、細胞代謝物に結合することで結合能が変化する抗体（特許文献２）、プロテアーゼによる切断を受けて抗原結合能を示す抗体（特許文献３）、抗体を介したキメラ抗原受容体 T細胞（CAR-T細胞）とがん細胞のクロスリンクを化合物（ABT-737）の添加により制御する技術 (Nature Chemical Biology (2018) 14, 112-117 Hill Z. B. et al.（非特許文献８）) が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００９／１４２２２１号
【特許文献２】国際公開第２０１３／１８０２００号
【特許文献３】国際公開第２００９／０２５８４６号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Paul J. Carter and Greg A. Lazar、Next generation antibody drugs: pursuit of the 'high-hanging fruit'、 [online]、平成29年12月1日、Nature Reviews Drug Discovery、[平成30年1月22日検索]、インターネット〈https://www.nature.com/articles/nrd.2017.227〉
【非特許文献２】Clinical and Experimental Immunology (2009) 157, 9-19 Peggs, K. S. et al.
【非特許文献３】Current Pharmaceutical Biotechnology (2016) 17, 1298-1314 Mimoto, F. et al.
【非特許文献４】Nature Biotechnology (2010) 28, 1203-1208 Igawa, T. et al.
【非特許文献５】MAbs.(2012) 4, 182-197 Kontermann, R. E.
【非特許文献６】Nature Review (2010), 10, 301-316 Chan, A. C. and Carter P. J.
【非特許文献７】Peds(2010), 23(4), 289-297 Wozniak-Knopp, G. et al.
【非特許文献８】Nature Chemical Biology (2018) 14, 112-117 Hill Z. B. et al.
【非特許文献９】Scientific Reports (2017) 7, 1-15 Ralph, A. et al.
【非特許文献１０】Journal of Biomolecular Screening (2015) 20, 519-27 Nazarian, A. A. et al.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述した抗体医薬のエフェクター機能を標的組織特異的に発揮させる試みはまだ発展途上で、さらなる試みが期待されている。そこで本発明は、抗体医薬のエフェクター機能を標的組織特異的に発揮させ、抗体医薬の副作用を低減するために有用であり、さらには他の様々なタンパク質工学にも応用可能な抗体改変技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、鋭意検討の結果、以下の［１］から［４６］の発明を見いだした。
［１］第１の抗原および前記第１の抗原に結合する第１の抗原結合分子を含む抗原−抗原結合分子複合体に結合し、前記第１の抗原結合分子の前記第１の抗原への結合活性を増加させる、第２の抗原結合分子。
［２］前記第１の抗原結合分子の存在下における前記第１の抗原への結合活性が、前記第１の抗原結合分子の非存在下に比べて高い、［１］に記載の第２の抗原結合分子。
［３］前記第１の抗原が免疫関連分子または細胞代謝物である、［１］または［２］に記載の第２の抗原結合分子。
［４］前記免疫関連分子が、免疫細胞の細胞膜に存在する分子である、［３］に記載の第２の抗原結合分子。
［５］前記免疫細胞が、顆粒球、マクロファージ、樹状細胞、T細胞、およびB細胞からなる群から選択される少なくとも一つである、［４］に記載の第２の抗原結合分子。
［６］前記免疫関連分子がＣＤ３である、［３］〜［５］のいずれかに記載の第２の抗原結合分子。
［７］前記第１の抗原結合分子が、重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せがそれぞれ配列番号：1と配列番号：122、配列番号：114と配列番号：115、配列番号：116と配列番号：117、配列番号：118と配列番号：119、および配列番号：120と配列番号：121から選択されるいずれかの組合せからなるＣＤ３結合ポリペプチド、または前記ＣＤ３結合ポリペプチドから改変された第１の改変ポリペプチドを含み、前記第１の改変ポリペプチドのＣＤ３への結合活性は前記ＣＤ３結合ポリペプチドに比べて低い、［６］に記載の第２の抗原結合分子。
［８］前記細胞代謝物が、アデノシンまたはその誘導体である、［３］に記載の第２の抗原結合分子。
［９］前記第１の抗原結合分子が、重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せがそれぞれ配列番号：106と配列番号：107、配列番号：108と配列番号：109、配列番号：110と配列番号：111、および配列番号：112と配列番号：113から選択されるいずれかの組合せからなるアデノシン結合ポリペプチド、または前記アデノシン結合ポリペプチドから改変された第２の改変ポリペプチドを含み、前記第２の改変ポリペプチドのアデノシへの結合活性は前記アデノシン結合ポリペプチドに比べて低いまたは高い、［８］に記載の第２の抗原結合分子。
［１０］前記第１の抗原結合分子が多重抗原特異性を有し、さらに少なくとも第２の抗原に結合する、［１］〜［９］のいずれかに記載の第２の抗原結合分子。
［１１］前記第２の抗原が、癌抗原または免疫関連分子である、［１０］に記載の第２の抗原結合分子。
［１２］多重抗原特異性を有し、さらに少なくとも第３の抗原に結合する、［１］〜［１１］のいずれかに記載の第２の抗原結合分子。
［１３］前記第３の抗原が、癌抗原または免疫関連分子である、［１２］に記載の第２の抗原結合分子。
［１４］前記第１の抗原結合分子が多重抗原特異性を有し、さらに少なくとも第２の抗原に結合し、前記第２の抗原結合分子が多重抗原特異性を有し、さらに少なくとも第３の抗原に結合し、前記第１の抗原と前記第２の抗原と前記第３の抗原の組合せが、以下の（１）〜（５）のいずれかの組合せである、［１］〜［１３］のいずれかに記載の第２の抗原結合分子。
（１）前記第１の抗原が免疫関連分子であり、前記第２の抗原が第１の癌抗原であり、前記第３の抗原が第２の癌抗原である組合せ
（２）前記第１の抗原が標的細胞の細胞代謝物であり、前記第２の抗原が癌抗原であり、前記第３の抗原が免疫関連分子である組合せ
（３）前記第１の抗原が標的細胞の細胞代謝物であり、前記第２の抗原が免疫関連分子であり、前記第３の抗原が癌抗原である組合せ
（４）前記第１の抗原が第１の免疫関連分子であり、前記第２の抗原が癌抗原であり、前記第３の抗原が第２の免疫関連分子である組合せ
（５）前記第１の抗原が第１の免疫関連分子であり、前記第２の抗原が第２の免疫関連分子であり、前記第３の抗原が癌抗原である組合せ
［１５］［１］に記載の第１の抗原結合分子および第２の抗原結合分子の組合せ。
［１６］第１の抗原に結合する第１の抗原結合分子であって、前記第１の抗原結合分子の前記第１の抗原への結合活性が、前記第１の抗原および前記第１の抗原結合分子を含む抗原−抗原結合分子複合体に結合する第２の抗原結合分子によって増加される、第１の抗原結合分子。
［１７］前記第１の抗原結合分子の存在下における前記第２の抗原結合分子の前記第１の抗原への結合活性が、前記第１の抗原結合分子の非存在下に比べて高い、［１６］に記載の第１の抗原結合分子。
［１８］前記第１の抗原が免疫関連分子または細胞代謝物である、［１６］または［１７］に記載の第１の抗原結合分子。
［１９］前記免疫関連分子が、免疫細胞の細胞膜に存在する分子である、［１８］に記載の第１の抗原結合分子。
［２０］前記免疫細胞が、顆粒球、マクロファージ、樹状細胞、T細胞、およびB細胞からなる群から選択される少なくとも一つである、［１９］に記載の第１の抗原結合分子。
［２１］前記免疫関連分子がＣＤ３である、［１９］〜［２０］のいずれかに記載の第１の抗原結合分子。
［２２］前記第１の抗原結合分子が、重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せがそれぞれ配列番号：1と配列番号：122、配列番号：114と配列番号：115、配列番号：116と配列番号：117、配列番号：118と配列番号：119、および配列番号：120と配列番号：121から選択されるいずれかの組合せからなるＣＤ３結合ポリペプチド、または前記ＣＤ３結合ポリペプチドから改変された第１の改変ポリペプチドを含み、前記第１の改変ポリペプチドのＣＤ３への結合活性は前記ＣＤ３結合ポリペプチドに比べて低い、［２１］に記載の第１の抗原結合分子。
［２３］前記細胞代謝物が、アデノシンまたはその誘導体である、［１８］に記載の第１の抗原結合分子。
［２４］前記第１の抗原結合分子が、重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せがそれぞれ配列番号：106と配列番号：107、配列番号：108と配列番号：109、配列番号：110と配列番号：111、および配列番号：112と配列番号：113から選択されるいずれかの組合せからなるアデノシン結合ポリペプチド、または前記アデノシン結合ポリペプチドから改変された第２の改変ポリペプチドを含み、前記第２の改変ポリペプチドのアデノシへの結合活性は前記アデノシン結合ポリペプチドに比べて低いまたは高い、［２３］に記載の第１の抗原結合分子。
［２５］多重抗原特異性を有し、さらに少なくとも第２の抗原に結合する、［１６］〜［２４］のいずれかに記載の第１の抗原結合分子。
［２６］前記第２の抗原が、癌抗原または免疫関連分子である、［２５］に記載の第１の抗原結合分子。
［２７］前記第２の抗原結合分子が多重抗原特異性を有し、さらに少なくとも第３の抗原に結合する、［１６］〜［２６］のいずれかに記載の第１の抗原結合分子。
［２８］前記第３の抗原が、癌抗原または免疫関連分子である、［２７］に記載の第１の抗原結合分子。
［２９］前記第１の抗原結合分子が多重抗原特異性を有し、さらに少なくとも第２の抗原に結合し、前記第２の抗原結合分子が多重抗原特異性を有し、さらに少なくとも第３の抗原に結合し、前記第１の抗原と前記第２の抗原と前記第３の抗原の組合せが、以下の（１）〜（５）のいずれかの組合せである、［１６］〜［２８］のいずれかに記載の第１の抗原結合分子。
（１）前記第１の抗原が免疫関連分子であり、前記第２の抗原が第１の癌抗原であり、前記第３の抗原が第２の癌抗原である組合せ
（２）前記第１の抗原が標的細胞の細胞代謝物であり、前記第２の抗原が癌抗原であり、前記第３の抗原が免疫関連分子である組合せ
（３）前記第１の抗原が標的細胞の細胞代謝物であり、前記第２の抗原が免疫関連分子であり、前記第３の抗原が癌抗原である組合せ
（４）前記第１の抗原が第１の免疫関連分子であり、前記第２の抗原が癌抗原であり、前記第３の抗原が第２の免疫関連分子である組合せ
（５）前記第１の抗原が第１の免疫関連分子であり、前記第２の抗原が第２の免疫関連分子であり、前記第３の抗原が癌抗原である組合せ
［３０］［１６］に記載の第１の抗原結合分子および第２の抗原結合分子の組合せ。
［３１］医薬組成物である、［１５］または［３０］に記載の組合せ。
［３２］前記第１の抗原結合分子および前記第２の抗原結合分子が、同時にまたは別々に投与される、［３１］に記載の組合せ。
［３３］SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも１つのアッセイを用いた第１の抗原結合分子の第１の抗原への結合活性が、化合物または抗体もしくはその断片のライブラリから任意に選択される１つの化合物または抗体もしくはその断片が存在する条件では検出されるが、前記１つの化合物または抗体もしくはその断片が存在しない条件では検出不可能である場合に、前記１つの化合物または抗体もしくはその断片を第２の抗原結合分子として同定することを含む、スクリーニング方法。
［３４］SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも１つのアッセイを用いた第１の抗原結合分子の第１の抗原への結合活性が、化合物または抗体もしくはその断片のライブラリから任意に選択される１つの化合物または抗体もしくはその断片が存在しない条件に比べて、前記１つの化合物または抗体もしくはその断片が存在する条件で高い場合に、前記１つの化合物または抗体もしくはその断片を第２の抗原結合分子として同定することを含む、スクリーニング方法。
［３５］（ａ）哺乳動物に第１の抗原と第１の抗原結合分子からなる抗原−抗原結合分子複合体を免疫し、該複合体に結合するモノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞の第１の群を得る工程、
（ｂ）前記第１の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも１つのアッセイにおいて該複合体を形成していない第１の抗原および該複合体を形成していない第１の抗原結合分子のいずれか一方または両方への結合活性が検出不可能であるモノクローナル抗体を産生する第２の群を選択する工程、
（ｃ）前記第２の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも１つのアッセイにおいて第１の抗原結合分子の第１の抗原への結合活性を増強するモノクローナル抗体を産生する第３の群を選択し、前記第３の群を第２の抗原結合分子を産生する抗体産生細胞として同定する工程を含む、スクリーニング方法。
［３６］（ａ）哺乳動物に第１の抗原と第１の抗原結合分子からなる抗原−抗原結合分子複合体を免疫し、該複合体に結合するモノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞の第１の群を得る工程、
（ｂ）前記第１の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも１つのアッセイにおいて該複合体を形成していない第１の抗原および該複合体を形成していない第１の抗原結合分子のいずれか一方または両方への結合活性が、該複合体への結合に比べ低いモノクローナル抗体を産生する第２の群を選択する工程、
（ｃ）前記第２の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも１つのアッセイにおいて第１の抗原結合分子の第１の抗原への結合活性を増強するモノクローナル抗体を産生する第３の群を選択し、前記第３の群を第２の抗原結合分子を産生する抗体産生細胞として同定する工程を含む、スクリーニング方法。
［３７］（ａ）哺乳動物に第１の抗原と第１の抗原結合領域からなる抗原−抗原結合領域複合体を免疫し、該複合体に結合するモノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞の第１の群を得る工程、
（ｂ）前記第１の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも１つのアッセイにおいて該複合体を形成していない第１の抗原および該複合体を形成していない第１の抗原結合領域のいずれか一方または両方への結合活性が検出不可能であるモノクローナル抗体を産生する第２の群を選択する工程、
（ｃ）前記第２の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも１つのアッセイにおいて第１の抗原結合領域の第１の抗原への結合活性を増強するモノクローナル抗体を産生する第３の群を選択し、前記第３の群を第２の抗原結合分子を産生する抗体産生細胞として同定する工程を含む、スクリーニング方法。
［３８］（ａ）哺乳動物に第１の抗原と第１の抗原結合領域からなる抗原−抗原結合領域複合体を免疫し、該複合体に結合するモノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞の第１の群を得る工程、
（ｂ）前記第１の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも１つのアッセイにおいて該複合体を形成していない第１の抗原および該複合体を形成していない第１の抗原結合領域のいずれか一方または両方への結合活性が、該複合体への結合に比べ低いモノクローナル抗体を産生する第２の群を選択する工程、
（ｃ）前記第２の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも１つのアッセイにおいて第１の抗原結合領域の第１の抗原への結合活性を増強するモノクローナル抗体を産生する第３の群を選択し、前記第３の群を第２の抗原結合分子を産生する抗体産生細胞として同定する工程を含む、スクリーニング方法。
［３９］（ｄ）以下の（ａ）工程から（ｃ）工程を含むスクリーニング方法により得られた抗体産生細胞を培養する工程；
（ａ）哺乳動物に第１の抗原と第１の抗原結合分子からなる抗原−抗原結合分子複合体を免疫し、該複合体に結合するモノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞の第１の群を得る工程、
（ｂ）前記第１の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも１つのアッセイにおいて該複合体を形成していない第１の抗原および該複合体を形成していない第１の抗原結合分子のいずれか一方または両方への結合活性が検出不可能であるモノクローナル抗体を産生する第２の群を選択する工程、
（ｃ）前記第２の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも１つのアッセイにおいて第１の抗原結合分子の第１の抗原への結合活性を増強するモノクローナル抗体を産生する第３の群を選択し、前記第３の群を第２の抗原結合分子を産生する抗体産生細胞として同定する工程；
（ｅ）前記抗体産生細胞培養物から培養上清または細胞破砕物を得る工程、
（ｆ）前記培養上清または細胞破砕物から第２の抗原結合分子を精製する工程を含む、第２の抗原結合分子の製造方法。
［４０］（ｄ）以下の（ａ）工程から（ｃ）工程を含むスクリーニング方法により得られた抗体産生細胞を培養する工程；
（ａ）哺乳動物に第１の抗原と第１の抗原結合分子からなる抗原−抗原結合分子複合体を免疫し、該複合体に結合するモノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞の第１の群を得る工程、
（ｂ）前記第１の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも１つのアッセイにおいて該複合体を形成していない第１の抗原および該複合体を形成していない第１の抗原結合分子のいずれか一方または両方への結合活性が、該複合体への結合に比べ低いモノクローナル抗体を産生する第２の群を選択する工程、
（ｃ）前記第２の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも１つのアッセイにおいて第１の抗原結合分子の第１の抗原への結合活性を増強するモノクローナル抗体を産生する第３の群を選択し、前記第３の群を第２の抗原結合分子を産生する抗体産生細胞として同定する工程；
（ｅ）前記抗体産生細胞培養物から培養上清または細胞破砕物を得る工程、
（ｆ）前記培養上清または細胞破砕物から第２の抗原結合分子を精製する工程を含む、第２の抗原結合分子の製造方法。
［４１］（ｄ）以下の（ａ）工程から（ｃ）工程を含むスクリーニング方法により得られた抗体産生細胞を培養する工程；
（ａ）哺乳動物に第１の抗原と第１の抗原結合領域からなる抗原−抗原結合領域複合体を免疫し、該複合体に結合するモノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞の第１の群を得る工程、
（ｂ）前記第１の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも１つのアッセイにおいて該複合体を形成していない第１の抗原および該複合体を形成していない第１の抗原結合領域のいずれか一方または両方への結合活性が検出不可能であるモノクローナル抗体を産生する第２の群を選択する工程、
（ｃ）前記第２の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも１つのアッセイにおいて第１の抗原結合領域の第１の抗原への結合活性を増強するモノクローナル抗体を産生する第３の群を選択し、前記第３の群を第２の抗原結合分子を産生する抗体産生細胞として同定する工程；
（ｅ）前記抗体産生細胞培養物から培養上清または細胞破砕物を得る工程、
（ｆ）前記培養上清または細胞破砕物から第２の抗原結合分子を精製する工程を含む、第２の抗原結合分子の製造方法。
［４２］（ｄ）以下の（ａ）工程から（ｃ）工程を含むスクリーニング方法により得られた抗体産生細胞を培養する工程；
（ａ）哺乳動物に第１の抗原と第１の抗原結合領域からなる抗原−抗原結合領域複合体を免疫し、該複合体に結合するモノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞の第１の群を得る工程、
（ｂ）前記第１の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも１つのアッセイにおいて該複合体を形成していない第１の抗原および該複合体を形成していない第１の抗原結合領域のいずれか一方または両方への結合活性が、該複合体への結合に比べ低いモノクローナル抗体を産生する第２の群を選択する工程、
（ｃ）前記第２の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも１つのアッセイにおいて第１の抗原結合領域の第１の抗原への結合活性を増強するモノクローナル抗体を産生する第３の群を選択し、前記第３の群を第２の抗原結合分子を産生する抗体産生細胞として同定する工程；
（ｅ）前記抗体産生細胞培養物から培養上清または細胞破砕物を得る工程、
（ｆ）前記培養上清または細胞破砕物から第２の抗原結合分子を精製する工程を含む、第２の抗原結合分子の製造方法。
［４３］第１の抗原に結合する第１の抗原結合分子をアミノ酸改変して、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも１つのアッセイで前記第１の抗原への結合が低下したまたは検出限界下である第１の抗原結合分子の改変体を得る第１の工程、
既存のファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリから、前記第１の抗原および前記改変体のいずれか一方または両方に結合する抗原結合分子を提示するファージを除去した、第１のファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリを得る第２の工程、および
前記第１のファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリから、前記第１の抗原および前記第１の抗原結合分子を含む抗原−抗原結合分子複合体に結合する抗原結合分子を提示するファージを濃縮した第２のファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリを得る第３の工程を含む、ファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリの製造方法。
［４４］前記第２のファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリを前記既存のファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリとし、前記第２の工程および前記第３の工程が繰り返される、［４３］の製造方法。
［４５］既存のファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリから、(i)第１の抗原に結合し得るが前記第１の抗原に結合していない第１の抗原結合分子に結合し、および(ii)前記第１の抗原結合分子に結合していない前記第１の抗原に結合する、抗原結合分子を提示するファージを除去した、第１のファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリを得る第１の工程、ならびに
前記第１のファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリから、前記第１の抗原および前記第１の抗原結合分子を含む抗原−抗原結合分子複合体に結合する抗原結合分子を提示するファージを濃縮した第２のファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリを得る第２の工程を含む、ファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリの製造方法。
［４６］前記第２のファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリを前記既存のファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリとし、前記第１の工程および前記第２の工程が繰り返される、［４５］の製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、第２の抗原結合分子が、第１の抗原および第１の抗原結合分子を含む抗原−抗原結合分子複合体に結合することにより、第１の抗原結合分子の第１の抗原への結合活性を増加させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、第１の抗原結合分子の一態様と第２の抗原結合分子の一態様が組合せて使用された場合の両分子の結合機序を模式化した図である。
【図２】図２は、第１の抗原結合分子の一態様と第２の抗原結合分子の一態様が、標的細胞とエフェクター細胞をクロスリンクする際の作用機序を模式化した図である。
【図３】図３は、実施例３で作製したクランピング抗体の候補群のＣＤ３シグナル誘導能を機能アッセイにより観察した図である。
【図４】図４は、実施例３で作製したクランピング抗体の結合活性を示した図である。
【図５】図５は、ＣＤ３と抗ＣＤ３抗体複合体がクランピング抗体によって安定化されていることを示した図である。
【図６】図６は、同一抗原を用いたTDCC活性を示した図である。
【図７】図７は、EREG/GPC3二重陽性細胞に対するTDCC活性を示した図である。
【図８】図８は、アデノシンと抗アデノシン抗体、およびクランピング抗体の結合を示した図である。
【図９】図９は、アデノシンクランピング抗体のアフィニティを示した図である。
【図１０】図１０は、抗アデノシン抗体とクランピング抗体のアデノシン濃度依存的な結合を示した図である。
【図１１】図１１は、アデノシンクランピング抗体を用いた二重特異性抗体によるアデノシン濃度依存的な細胞傷害活性を示した図である。
【図１２】図１２は、エピトープペプチド融合抗CD3抗体Fabとクランピング抗体との結晶構造を示した図である。
【図１３】図１３は、GPC3/CLDN6二重陽性細胞に対するTDCC活性を示した図である。
【図１４】図１４は、GPC3/Her2二重陽性細胞に対するTDCC活性を示した図である。
【図１５】図１５は、エフェクター細胞特異的な活性化を示した図である。
【図１６】図１６は、抗癌抗原/減弱型CD3抗体と抗CD8クランピング抗体投与によるCD8陽性T細胞特異的なTDCC活性を示した図である。
【図１７】図１７は、抗癌抗原抗体/減弱型CD3抗体と抗癌抗原抗体/クランピング抗体投与による抗腫瘍効果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
Ａ．定義
本明細書において「ポリペプチド」は、複数のアミノ酸がペプチド結合したペプチドすべてを包含する。本明細書においては、ポリペプチドを「ペプチド」または「タンパク質」と呼ぶことがある。
本明細書において「抗原結合領域」は、抗原に特異的に結合する活性を有する化合物を意味する。抗原結合領域は、ペプチド性であってもよく、非ペプチド性であってもよい。
【００１５】
本明細書において、「CH1」は、抗体のCH1の１鎖のポリペプチドを意味する。具体的には、CH1は、EUナンバリングシステムでの重鎖118〜215位のアミノ酸残基で示される領域であり、本明細書では野生型のほか、野生型においてアミノ酸残基の置換、付加、または欠失させた改変体も包含する。
本明細書において、「CH2」は、抗体のCH2の１鎖のポリペプチドを意味する。具体的には、CH2は、EUナンバリングシステムでの重鎖231〜340位のアミノ酸残基で示される領域であり、本明細書では野生型のほか、野生型においてアミノ酸残基の置換、付加、または欠失させた改変体も包含する。
本明細書において、「CH3」は、抗体のCH3の１鎖のポリペプチドを意味する。具体的には、CH3は、EUナンバリングシステムでの重鎖341位からC末端までのアミノ酸残基で示される領域であり、本明細書では野生型のほか、野生型においてアミノ酸残基の置換、付加、または欠失させた改変体も包含する。
本明細書において、「CL」は、抗体のCLの１鎖のポリペプチドを意味する。具体的には、CLは、EUナンバリングシステムでの軽鎖108位からC末端までのアミノ酸残基で示される領域であり、本明細書では野生型のほか、野生型においてアミノ酸残基の置換、付加、または欠失させた改変体を包含する。
【００１６】
本明細書における「抗体半分子」は、抗体における重鎖間の結合を解離させた場合の一分子を意味する。抗体がIgGの場合の抗体半分子としては、例えば、重鎖１鎖と軽鎖１鎖からなる複合体が挙げられる。抗体半分子には、ラクダ科等の抗体で見られる重鎖２本からなる抗体、いわゆる重鎖抗体（heavy-chain antibody）（VHH（VH originating from heavy-chain antibody）抗体とも呼ばれる。）の重鎖間の結合を解離させた、重鎖１鎖からなる分子が包含される。
一態様において、抗体半分子は、キメラ抗体やヒト化抗体に由来するものを包含する。
一態様において、抗体半分子は、IgG、IgM、IgA、IgD、IgEなどの各種アイソタイプに由来するものを包含する。抗体半分子は、好ましくはIgG由来のものである。IgGには、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4が存在する。抗体半分子は、これらのうちいずれのサブタイプ由来でもよい。抗体半分子は、天然に存在する抗体からその重鎖間の結合を解離させたものでもよく、アミノ酸残基の置換、付加、または欠失させた遺伝子組換え体でもよい。
【００１７】
本明細書における「ヒンジ領域」は、抗体におけるCH1とCH2の間に位置する領域である。具体的には、ヒンジ領域は、EUナンバリングシステムでの216〜230位のアミノ酸残基で示される領域であり、本明細書では野生型のほか、野生型においてアミノ酸残基の置換、付加、または欠失させた改変体も包含する。本明細書において「抗体半分子におけるヒンジ領域部分」とは、重鎖１鎖におけるヒンジ領域部分を意味し、１鎖のポリペプチドからなるものをいう。
【００１８】
本明細書において、「定常領域」とは、抗体におけるCH1、CH2、CH3、CLおよびヒンジ領域を含む領域である。本明細書における「抗体半分子における定常領域部分」とは、抗体半分子における定常領域部分を意味する。
【００１９】
本明細書で用語「Fc領域」は、少なくとも定常領域の一部分を含む免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために用いられる。この用語は、天然型配列のFc領域および変異体Fc領域を含む。一態様において、ヒトIgGの重鎖Fc領域はCys226から、またはPro230から、重鎖のC末端まで延びる。ただし、Fc領域のC末端のリジン (Lys447) またはグリシン‐リジン（Gly446-Lys447）は、存在していてもしていなくてもよい。本明細書では別段特定しない限り、Fc領域または定常領域中のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 1991 に記載の、EUナンバリングシステム（EUインデックスとも呼ばれる）にしたがう。
【００２０】
本明細書で「エフェクター機能」は、抗体のFc領域に起因する、抗体のアイソタイプによって異なる生物学的活性のほか、改変された抗体による免疫細胞応答を制御する活性を包含する。抗体のエフェクター機能の例には次のものが含まれる：C1q結合および補体依存性細胞傷害（complement dependent cytotoxicity:CDC）；Fc受容体結合；抗体依存性細胞介在性細胞傷害（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: ADCC）；T細胞依存性細胞傷害（T-cell Dependent Cytotoxicity: TDCC）；貪食作用；細胞表面受容体（例えば、B細胞受容体）の下方制御；および、B細胞活性化。
【００２１】
「Fc受容体」または「FcR」は、抗体のFc領域に結合する受容体のことをいう。いくつかの態様において、FcRは、天然型ヒトFcRである。いくつかの態様において、FcRは、IgG抗体に結合するもの（ガンマ受容体）であり、FcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIサブクラスの受容体を、これらの受容体の対立遺伝子変異体および選択的スプライシングによる形態を含めて、含む。FcγRII受容体は、FcγRIIA（「活性化受容体」）およびFcγRIIB（「阻害受容体」）を含み、これらは主としてその細胞質ドメインにおいて相違する類似のアミノ酸配列を有する。活性化受容体FcγRIIAは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン活性化モチーフ (immunoreceptor tyrosine-based activation motif: ITAM) を含む。阻害受容体FcγRIIBは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン阻害モチーフ（immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif: ITIM）を含む。（例えば、Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997) を参照のこと。）FcRは、例えば、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)；Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)；およびde Haas et al., J. Lab. Clin. Med 126:330-41 (1995)において総説されている。将来同定されるものを含む他のFcRも、本明細書の用語「FcR」に包含される。
【００２２】
本明細書における「共有結合」は、一般に知られているあらゆるものが包含される。共有結合は、例えば、ジスルフィド結合および炭素−炭素結合が挙げられる。
【００２３】
本明細書でいう用語「細胞傷害剤」は、細胞の機能を阻害するまたは妨げる、および／または細胞の死または破壊の原因となる物質のことをいう。細胞傷害剤は、これらに限定されるものではないが、放射性同位体（例えば、211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P、212PbおよびLuの放射性同位体）；化学療法剤または化学療法薬（例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド類（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンC、クロラムブシル、ダウノルビシン、または他のインターカレート剤）；増殖阻害剤；核酸分解酵素などの酵素およびその断片；抗生物質；例えば、低分子毒素または細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素的に活性な毒素（その断片および／または変異体を含む）などの、毒素；および、以下に開示される、種々の抗腫瘍剤または抗がん剤を含む。
【００２４】
本明細書でいう用語「結合活性」は、分子間に生じる結合の強さを表す際に使用される。分子間に生じる結合の種類には、共有結合は包含されず、水素結合、静電気力、ファンデルワールス力、および疎水結合等の分子間に生じる結合が包含される。これらの結合の総和により、分子間の結合活性は決まる。本明細書では結合活性は、特に解離定数KDで表される。KDは、分子間の結合を見る公知のアッセイのデータから求められ得る。アッセイとしては、例えば、表面プラズモン共鳴（SPR）、バイオレイヤー干渉（BLI）、酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）、蛍光標示式細胞分取器（FACS）等が挙げられる。中でもSPRが好ましい。SPRで結合活性の測定には、例えば、Biacore（登録商標）T200（GEヘルスケア社）が用いられる。
Biacore（登録商標）T200を利用したSPRで測定した場合のKDは、約1×10-12から約1×10-4の範囲で可能である。KDはこの範囲内（1×10-12から1×10-4）で大きいほど結合活性が低く、小さいほど結合活性が高い。抗原結合分子の抗原への結合活性においてKDが1×10-6以上である場合には、抗原結合分子は生理的な機能を発揮しにくいことが多い。例えば、抗原結合分子が抗体である場合、そのエフェクター機能を発揮しにくいことが多い。そこで本明細書では、SPR による測定で、KDが1×10-6以上である場合を「低結合活性」、1×10-6より低い場合を「高結合活性」と定義する。
分子間の結合アッセイの温度条件は通常25〜37℃である。SPRの場合の温度条件は、好ましくは25℃や37℃であり、より好ましくは37℃である。BLIの場合の温度条件は、好ましくは30℃である。ELISAの場合の温度条件は、好ましくは25℃である。結合アッセイに用いられるランニングバッファーは、市販のものを使ってもよく、用事調整により得てもよい。市販の例は、HBS-EP+（GE Healthcare）（0.01M HEPES、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05% (v/v) polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate、pH 7.4）である。用事調整の例は、ACESバッファー（20 mM ACES (Nacalai tesque)、150 mM NaCl、0.05% (w/v) polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate (純生化学）、pH 7.4)である。試験化合物は所望のバッファー中に溶解される。アッセイ中に分子間結合に影響を及ぼし得る主要な組成はNaClである。行われる実験の目的によってNaClの濃度は異なるものの、塩濃度の条件検討を伴わない通常の実験で使用されるバッファー中のNaClの濃度は150 mMである。すなわち、通常用いられるランニングバッファー中のNaClの濃度としては、150 mMが好ましい。pHもアッセイ中に分子間結合に影響を及ぼし得るが、pHの条件検討を伴わない通常の実験で使用されるバッファーは、pH 7.4である。すなわち、通常用いられるランニングバッファーではpH 7.4が好ましい。
【００２５】
Ｂ．第１の抗原結合分子
本発明の第１の抗原結合分子は、第１の抗原に結合する。すなわち、第１の抗原結合分子は、第１の抗原に結合する第１の抗原結合領域を含む。第１の抗原結合分子は第１の抗原に結合して抗原−抗原結合分子複合体を形成する。特定の態様において、第１の抗原結合分子は、生体内で発現していない抗原結合分子である。第１の抗原結合分子は、生体内で発現していない抗原結合分子であることが好ましい。「抗原結合分子が生体内で発現していない」とは、「抗原結合分子が投薬や免疫など人工的な処理が何もなされていない生体において、通常発現しているタンパク質またはその断片ではない」ことを意味する。
一態様において、第１の抗原結合分子または第１の抗原結合領域の第１の抗原への結合活性は、抗原−抗原結合分子複合体に結合する後述の第２の抗原結合分子（本明細書では、「clamping分子」と呼ぶこともある。）によって増加される。第１の抗原結合分子は、第１の抗原への結合活性が第２の抗原結合分子によって増加されるものであれば特に限定されず、天然の抗体のような軽鎖２分子と重鎖２分子からなる抗体の完全体であってもよく、抗体半分子、ダイアボディ(diabody；Db)、scFv、単鎖抗体、sc(Fv)2、sc(Fab')2等の抗体断片であってもよい。
別の態様において、後述する第１の抗原が受容体である場合、第１の抗原結合分子または第１の抗原結合領域は、当該受容体に対するリガンドであってもよい。例えば、第１の抗原がT細胞受容体複合体、共刺激分子、または共抑制分子である場合には、第１の抗原結合分子または第１の抗原結合領域はそれらのリガンドであってもよい。具体的には、第１の抗原がPD-1である場合、第１の抗原結合分子または第１の抗原結合領域は、PD-L1またはPD-L2であってもよい。
【００２６】
第１の抗原結合分子または第１の抗原結合領域の第１の抗原への結合活性が、抗原−抗原結合分子複合体に結合する第２の抗原結合分子によって増加されるか否かは、例えば、SPRにおける、第２の抗原結合分子の非存在下（clamping-）の第１の抗原結合分子または第１の抗原結合領域の第１の抗原に対する解離定数KD(clamping-)を、第２の抗原結合分子の存在下（clamping+）の第１の抗原結合分子または第１の抗原結合領域の第１の抗原に対する解離定数KD(clamping+)で除した値であるKD(clamping-)/ KD(clamping+)により判断される。上述の「第１の抗原結合分子または第１の抗原結合領域の第１の抗原への結合活性は、抗原−抗原結合分子複合体に結合する後述の第２の抗原結合分子によって増加される」は、KD(clamping-)/ KD(clamping+)が１より高いことを意味する。
KD(clamping-)/ KD(clamping+)が高いほど、第２の抗原結合分子の非存在下に対する、第２の抗原結合分子の存在下の第１の抗原結合分子または第１の抗原結合領域の第１の抗原への結合活性の増加率が大きいことを意味する。換言すれば、これは、第２の抗原結合分子の存在による第１の抗原結合分子または第１の抗原結合領域の第１の抗原への結合のon/offがより明確であることを意味する。
【００２７】
一局面において、第１の抗原結合分子の第１の抗原への結合活性は、SPRによる測定で高結合活性であってもよく、低結合活性であってもよく、SPRによる検出が不可能なほど低くてもよい。
第１の抗原結合分子を二重特異性抗体とし、第１の抗原を後述の免疫関連分子とした場合、副作用の低減の観点から、好ましくは、第１の抗原結合分子の第１の抗原への結合活性は、SPRによる測定で低結合活性であるか、SPRによる検出が不可能なほど低い。ここで「SPRによる検出が不可能なほど低い」とは、第１の抗原結合分子の第１の抗原に対する結合活性はSPRによる検出が不可能であるが、第１の抗原結合分子の第１の抗原への特異的な結合が僅かながらでも生じることを意味する。第１の抗原結合分子の第１の抗原に対する結合活性がSPRによる検出が不可能なほど低い場合には、上述のKD(clamping-)/ KD(clamping+)は用いられない。
【００２８】
一態様において、第１の抗原結合分子の存在下における第２の抗原結合分子の第１の抗原への結合活性は、第１の抗原結合分子の非存在下に比べて高い。これは、第２の抗原結合分子の抗原−抗原結合分子複合体への結合活性が遊離している第１の抗原に比べ高いこと、第２の抗原結合分子が遊離している第１の抗原結合分子に結合することによって該第２の抗原結合分子の遊離している第１の抗原への結合活性が上昇すること、第１の抗原と第２の抗原結合分子からなる複合体が遊離している第１の抗原結合分子に結合することによって安定化されること、またはこれらの組合せのいずれかのメカニズムによるものと推定される。
該態様において、第１の抗原結合分子の非存在下に比べた、第１の抗原結合分子の存在下における第２の抗原結合分子の第１の抗原への結合活性の指標として、例えば、SPRにおける、第１の抗原結合分子非存在下における第２の抗原結合分子の遊離している第１の抗原に対する解離定数KD (第１の抗原結合分子−)を、第１の抗原結合分子存在下の第１の抗原に対する第２の抗原結合分子の解離定数KD (第１の抗原結合分子＋)で除した、KD (第１の抗原結合分子−)/ KD (第１の抗原結合分子＋)が用いられる。上述の「第１の抗原結合分子の存在下における第２の抗原結合分子の第１の抗原への結合活性は、第１の抗原結合分子の非存在下に比べて高い」は、KD (第１の抗原結合分子−)/ KD (第１の抗原結合分子＋)が１より高いことを意味する。
【００２９】
一局面において、第２の抗原結合分子の遊離している第１の抗原に対する結合活性は、SPRによる測定で高結合活性であってもよく、低結合活性であってもよく、SPRによる検出が不可能なほど低くてもよい。
第２の抗原結合分子を二重特異性抗体とし、第１の抗原を後述の免疫関連分子とした場合、副作用の低減の観点から、好ましくは、第２の抗原結合分子の遊離している第１の抗原に対する結合活性は、SPRによる測定で低結合活性であるか、SPRによる検出が不可能なほど低い。ここで「SPRによる検出が不可能なほど低い」とは、第２の抗原結合分子の遊離している第１の抗原に対する結合活性はSPRによる検出が不可能であるが、第２の抗原結合分子の遊離している第１の抗原への特異的な結合が僅かながらでも生じることを意味する。第２の抗原結合分子の遊離している第１の抗原に対する結合活性がSPRによる検出が不可能なほど低い場合には、上述のKD (遊離)/ KD (複合体)は用いられない。
【００３０】
一態様において、第２の抗原結合分子の抗原−抗原結合分子複合体に対する結合活性として、SPRにおける、第２の抗原結合分子の抗原−抗原結合分子複合体に対するKDが用いられる。該KDは、通常約1×10-12から約1×10-4の範囲で示される。該KDがより低いほど、第２の抗原結合分子の抗原−抗原結合分子複合体に対する結合が強いことを示す。
一態様において、第１の抗原結合分子の存在下における第２の抗原結合分子の第１の抗原への結合活性を測定する際、および第２の抗原結合分子の抗原−抗原結合分子複合体に対する結合活性を測定する際において、第１の抗原結合分子と融合された第１の抗原を用いてもよい。
一態様において、第２の抗原結合分子の抗原−抗原結合分子複合体に対する結合活性と、第２の抗原結合分子の第１の抗原結合分子への結合活性とを比較する場合には、第１の抗原の存在下で測定した第２の抗原結合分子の第１の抗原結合分子への結合活性が、第１の抗原の非存在下で測定した第２の抗原結合分子の第１の抗原結合分子への結合活性と対比され得る。
【００３１】
ａ．第１の抗原
第１の抗原は、特に限定されず、如何なる抗原をも包含する。具体的な抗原の種類としては、国際公開第２０１３／１８０２００号に掲載されている抗原が挙げられる。第１の抗原は、好ましくは、免疫関連分子または細胞代謝物であるが、これらに限定されない。
一態様において、第１の抗原は細胞外に存在するタンパク質である。該細胞外に存在するタンパク質には、細胞膜タンパク質が包含される。好ましくは、該細胞外に存在するタンパク質は細胞膜タンパク質である。
別の態様において、第１の抗原はネイティブなタンパク質である。このネイティブなタンパク質は、遺伝子工学的に細胞に発現させたタンパク質ではないタンパク質である。第１の抗原は、好ましくは、ネイティブな細胞膜タンパク質である。
【００３２】
本明細書における免疫関連分子は、免疫細胞で産生される分子である限り、如何なるものをも包含する。免疫関連分子は、例えば、細胞膜に存在する分子でもよく、細胞外に放出される分子でもよい。
免疫細胞の細胞膜に存在する分子の具体的な例示は、T細胞活性化因子である、T細胞受容体複合体、共刺激分子、共抑制分子が挙げられる。これらの中でも、T細胞受容体複合体と共刺激分子が好ましい。免疫細胞の細胞膜に存在する分子は、より好ましくは、遺伝子工学的に発現させたタンパク質ではなく、ネイティブなタンパク質である。
共刺激分子としては、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ４０、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＩＣＯＳ (Inducible co-stimulator) 、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＴＩＭ１、ＳＬＡＭ、ＣＤ２２６等が挙げられる。T細胞受容体複合体としてはその構成因子であるＣＤ３が挙げられる。ＣＤ３にはサブタイプとして、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζが存在する。これらの中でも、ＣＤ３εが好ましい。
共抑制分子としては、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１６０、ＬＡＧ３、ＬＡＩＲ１、Ｂ７−１、Ｂ７−Ｈ１等が挙げられる。
細胞外に放出される分子には、例えば、種々サイトカインが包含される。
【００３３】
上述の免疫細胞としては、顆粒球、マクロファージ、樹状細胞、Ｔ細胞、およびB細胞等が挙げられる。該免疫細胞は、好ましくは、顆粒球、マクロファージ、樹状細胞、Ｔ細胞、およびB細胞からなる群から選択される少なくとも一つであり、より好ましくは、Ｔ細胞である。Ｔ細胞の種類は、CD4陽性、CD8陽性、Th1、Th2、Th12が挙げられる。これらの中でも、CD8陽性が好ましい。
【００３４】
本明細書における細胞代謝物は、細胞外に放出される細胞の代謝産物である。細胞代謝物は、特に限定されず、如何なる代謝産物をも包含する。この細胞代謝物は、好ましくは、生体に投与されたものではなく、生体内のいずれかの組織から内的に生じた化合物である。具体的な細胞代謝物の種類としては、国際公開第２０１３／１８０２００号に掲載されている癌組織特異的代謝産物および炎症組織特異的代謝産物が挙げられる。
癌組織特異的代謝産物としては、乳酸、コハク酸、クエン酸等の解糖系、またはクレブス回路の一次代謝産物、アラニン、グルタミン酸、アスパラギン酸等のアミノ酸、キヌレニン（kynurenine）等のアミノ酸の代謝産物、プロスタグランジンE2（Prostaglandin E2）等のアラキドン酸の代謝産物、アデノシン、アデノシン3リン酸（ATP）、アデノシン2リン酸（ADP）、アデノシン1リン酸（AMP）等のプリン環構造を有するヌクレオシド、尿酸、1-メチルニコチンアミド等が挙げられる。これらの中でもプリン環構造を有するヌクレオシドが好ましく、アデノシンがより好ましい。
炎症組織特異的代謝産物としては、プロスタグランジンE2（Prostaglandin E2）等のアラキドン酸の代謝産物、アデノシン、アデノシン3リン酸（ATP）、アデノシン2リン酸（ADP）、アデノシン1リン酸（AMP）等のプリン環構造を有するヌクレオシド、尿酸等が挙げられる。これらの中でもプリン環構造を有するヌクレオシドが好ましく、アデノシンがより好ましい。
【００３５】
ｂ．第２の抗原
第１の抗原結合分子は、単一の抗原に結合するものでもよく、複数の抗原に結合する、いわゆる多重抗原特異性を有するものでもよい。
第１の抗原結合分子が多重抗原特異性を有する場合には、第１の抗原結合分子は少なくとも第２の抗原に結合する。すなわち、第１の抗原結合分子は、第２の抗原に結合する第２の抗原結合領域を含む。第２の抗原結合領域としては、抗体の断片が挙げられる。該抗体の断片は、第２の抗原に結合し得る限り如何なる断片でもよい。該抗体の断片としては、Fv、Fabが挙げられる。
【００３６】
第２の抗原は、特に限定されず、如何なる抗原をも包含する。具体的な抗原の種類としては、国際公開第２０１３／１８０２００号に掲載されている抗原が挙げられる。好ましくは、第２の抗原は癌抗原または免疫関連分子である。より好ましくは、第２の抗原は癌抗原である。
癌抗原の具体的例示は、国際公開第２０１５／１５６２６８号に例示されている癌特異的抗原が挙げられる。免疫関連分子およびその例示は、上述の第１の抗原における免疫関連分子と同様である。第１の抗原が免疫関連分子である場合には、好ましくは、第２の抗原は免疫関連分子以外の抗原であり、より好ましくは癌抗原である。
【００３７】
一態様において、第２の抗原は細胞外に存在するタンパク質である。該細胞外に存在するタンパク質には、細胞膜タンパク質をも包含される。好ましくは、該細胞外に存在するタンパク質は細胞膜タンパク質である。
【００３８】
ｃ．第１の他の構成
一態様において、第１の抗原結合分子は、抗原結合領域以外の構成（第１の他の構成）を含んでいてもよく、含まなくてもよい。第１の他の構成は、例えば、抗体断片、リンカー、および細胞傷害剤である。
第１の抗原結合分子に種々の機能を付加できる観点から、好ましくは、第１の抗原結合分子は第１の他の構成を含む。第１の抗原結合分子の血漿中の安定性および製造効率等を向上させるため、第１の他の構成は、好ましくは、抗体断片である。抗体断片としては、抗体のＦｃ領域および抗体の定常領域が挙げられる。
第１の抗原結合分子が抗体のＦｃ領域を含む場合、Ｆｃ領域は天然の抗体のＦｃ領域と同じアミノ酸配列を有する天然Ｆｃ領域であってもよく、天然Ｆｃ領域から改変された改変Ｆｃ領域であってもよい。この場合、抗体のＦｃ領域は、ＩｇＧのＦｃ領域由来であることが好ましい。該ＩｇＧはヒト由来であることが好ましい。
第１の抗原結合分子が抗体の定常領域を含む場合、該定常領域は天然の抗体の定常領域と同じアミノ酸配列を有する天然定常領域であってもよく、天然定常領域から改変された改変定常領域であってもよい。この場合、抗体の該定常領域は、ＩｇＧの定常領域由来であることが好ましい。該ＩｇＧはヒト由来であることが好ましい。
【００３９】
一態様において、第１の抗原結合分子が第１の他の構成として改変Ｆｃ領域または改変定常領域を含む場合には、サイトカインストーム等の望まない免疫応答を抑える観点から、該改変Ｆｃ領域または改変定常領域は、FcγRへの結合が抑えられたまたは結合しない改変Ｆｃ領域または改変定常領域である。
FcγRへの結合が抑えられたまたは結合しない改変Ｆｃ領域または改変定常領域としては、国際公開第２０１２／０７３９８５号に掲載される改変Ｆｃ領域または改変定常領域等が挙げられる。
【００４０】
一態様において、第１の抗原結合分子が二重抗原特異性を有し、第１の抗原結合領域を含むポリペプチドと第２の抗原結合領域を含むポリペプチドのヘテロ二量体である場合には、製造効率性の観点から、好ましくは、第１の抗原結合分子は改変Ｆｃ領域または改変定常領域を含む。
【００４１】
この場合において、例えば、第１の抗原結合領域を含むポリペプチドおよび第２の抗原結合領域を含むポリペプチドは、それぞれ少なくとも第１のCH3および第２のCH3を有する。この場合の改変Ｆｃ領域または改変定常領域の具体例としては、以下の（i）から（iii）の改変が挙げられる。
【００４２】
（i）第1のCH3および第2のCH3のいずれか一方が正電荷の領域を有し、他方が負電荷の領域を有し、ヘテロ二量体が形成される際に該正電荷の領域が該負電荷の領域に相互作用する、改変
（ii）第1のCH3および第2のCH3のいずれか一方が凸部を有し、他方が凹部を有し、ヘテロ二量体が形成される際に該凸部が該凹部に嵌合して相互作用する、改変
（iii）第1のCH3および第2のCH3が改変されたIgGのCH3であり、該改変されたIgGのCH3はその一部がIgAのCH3の一部と置き換えられており、ヘテロ二量体が形成される際に該第1のCH3に置き換えられた該IgAのCH3の一部と該第2のCH3に置き換えられた該IgAのCH3の一部とが相互作用する、改変
【００４３】
上記（i）の改変としては、例えば、国際公開第２００６／１０６９０５号、国際公開第２００９／０８９００４号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１４／０８４６０７号に掲載される。
具体的には、例えば一方の重鎖定常領域のアミノ酸配列におけるEUナンバリングシステムでの356位と439位、357位と370位、及び、399位と409位の組み合わせのうち、少なくとも１つの組み合わせを同一の電荷を有するアミノ酸に改変すること、他方の重鎖定常領域のEUナンバリングシステムでの356位と439位、357位と370位、及び、399位と409位の組み合わせのうち、少なくとも１つの組み合わせを一方の重鎖定常領域とは反対の電荷を有するアミノ酸に改変することが挙げられる。より具体的には、例えば、いずれか一方の重鎖定常領域にEUナンバリングシステムでの356位のGluをLysに置換する変異を導入し、他方の重鎖定常領域にEUナンバリングシステムでの439位のLysをGluに置換する変異を導入することが挙げられる。
【００４４】
上記（ii）の改変としては、例えば、国際公開第９６／０２７０１１号やMargaret Merchant et al., Nature Biotechnology 1998, 16, 677-681に掲載される。
具体的には、CH3にT366Y,もう一方のCH3にY407Aを導入する組み合わせ、あるいは一方のCH3にT366W、もう一方のCH3にY407Aを導入する組み合わせ、あるいは一方のCH3にF405A、もう一方のCH3にT394Wを導入する組み合わせ、あるいは一方のCH3にY407T、もう一方のCH3にT366Yを導入する組み合わせ、あるいは一方のCH3にT366Y/F405A、もう一方のCH3にT394W/Y407Tを導入する組み合わせ、あるいは一方のCH3にT366W/F405W、もう一方のCH3にT394S/Y407Aを導入する組み合わせ、あるいは一方のCH3にF405W/Y407A、もう一方のCH3にT366W/T394Sを導入する組み合わせ、あるいは一方のCH3にF405W、もう一方のCH3にT394Sを導入する組み合わせ、あるいは一方のCH3にT366W、もう一方のCH3にT366S/L368A/Y407Vを導入する組み合わせ、が挙げられる。該（ii）の改変は該（i）の改変と組み合わせることも可能である。このような組み合わせとしては、例えば、国際公開第２０１２／０５８７６８号に掲載されているものが挙げられる。
【００４５】
上記（iii）の改変は、一方の重鎖のCH3の一部をその部分に対応するIgA由来の配列にし、もう一方の重鎖のCH3の相補的な部分にその部分に対応するIgA由来の配列を導入したstrand-exchange engineered domain CH3を用いることで、異なる配列を有するポリペプチドの相互作用をCH3の相補的な相互作用によって効率的に引き起こす技術である (Protein Engineering Design & Selection, 23; 195-202, 2010)。この公知技術を使っても効率的に多重抗原特異性を有する第１の抗原結合分子を製造できる。該（iii）の改変としては、例えば、国際公開第２００７／１１０２０５号に掲載される改変技術が挙げられる。
【００４６】
上記（i）から（iii）の改変以外にも、国際公開第９６／０２７０１１号に掲載されているCH3における改変が、改変Ｆｃ領域または改変定常領域として使用され得る。さらに、国際公開第２０１１／１４３５４５号に掲載されるヒンジ領域部分における改変や、国際公開第２０１４／１０４１６５号に掲載されるFAE技術が、改変定常領域として使用され得る。
【００４７】
ｄ．第１の抗原結合分子の例示
第１の抗原がＣＤ３である場合の第１の抗原結合分子または第１の抗原結合領域の例示を以下に示す。この場合、第１の抗原結合分子はＣＤ３に結合する分子である限り、新たに作製したものでも、国際公開第２０１６／０２０４４４号、国際公開第２００８／１１９５６５号および国際公開第２００７／０４２２６１号に掲載されいてるような公知のものでもよい。
本例示の具体例としては、第１の抗原結合分子または第１の抗原結合領域は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せがそれぞれ配列番号：1と配列番号：122、配列番号：114と配列番号：115、配列番号：116と配列番号：117、配列番号：118と配列番号：119、および配列番号：120と配列番号：121から選択されるいずれかの組合せからなるＣＤ３結合ポリペプチド、または前記ＣＤ３結合ポリペプチドから改変された第１の改変ポリペプチドを含む。第１の改変ポリペプチドのＣＤ３への結合活性はＣＤ３結合ポリペプチドに比べて低い。
本具体例では、好ましくは、第１の抗原結合分子または第１の抗原結合領域は、配列番号：1と配列番号：122、配列番号：114と配列番号：115、配列番号：116と配列番号：117、配列番号：118と配列番号：119、および配列番号：120と配列番号：121から選択されるいずれかの組合せからなるＣＤ３結合ポリペプチドから改変された第１の改変ポリペプチドを含む。その改変は、第１の改変ポリペプチドのＣＤ３への結合活性がＣＤ３結合ポリペプチドに比べて低い限り、如何なるものをも包含する。第１の改変ポリペプチドとその改変元のＣＤ３結合ポリペプチドの間のアミノ酸配列の相同性は、好ましくは８０％以上であり、より好ましくは９０％以上である。
【００４８】
本具体例において第１の改変ポリペプチドのＣＤ３への結合活性と、その改変前のＣＤ３結合ポリペプチドのＣＤ３への結合活性との対比の指標として、例えば、SPRにおける改変前のＣＤ３結合ポリペプチドのＣＤ３に対する解離定数KD（改変前）を第１の改変ポリペプチドのKD（改変後）で除したKD（改変前）/ KD（改変後）が用いられる。上述の「第１の改変ポリペプチドのＣＤ３への結合活性はＣＤ３結合ポリペプチドに比べて低い」は、KD（改変前）/ KD（改変後）が１より高いことを意味する。
【００４９】
第１の改変ポリペプチドのＣＤ３への結合活性は、SPRによる測定で高結合活性であってもよく、低結合活性であってもよく、SPRによる検出が不可能なほど低くてもよい。好ましくは、第１の改変ポリペプチドのＣＤ３への結合活性は、SPRによる測定で低結合活性であるか、SPRによる検出が不可能なほど低い。
第１の改変ポリペプチドのＣＤ３への結合活性がSPRによる検出が不可能なほど低い場合には、上述のKD（改変前）/ KD（改変後）は用いられず、後述する第２の抗原結合分子の存在下における、第１の改変ポリペプチドのＣＤ３に対するKDの値が用いられる。第２の抗原結合分子の存在下における、第１の改変ポリペプチドのＣＤ３に対する結合活性は、例えば、第１の抗原結合分子が抗体である場合にその抗体がエフェクター機能を発揮できる範囲であればよい。好ましくは、第２の抗原結合分子の存在下における、第１の改変ポリペプチドのＣＤ３に対する結合活性は、高結合活性である。
本具体例においては、第１の抗原結合分子は、第２の抗原結合分子の非存在下ではＣＤ３に結合しにくいが、第２の抗原結合分子の存在下でＣＤ３に結合しやすくなる。第２の抗原結合分子による第１の抗原結合分子のＣＤ３への結合のon/off機構に有用である。例えば、いずれも多重抗原特異性を有する第１の抗原結合分子および第２の抗原結合分子が組合せられて医薬として用いられた場合に、該機構によりＴ細胞による細胞傷害活性がより標的細胞特異的に誘導されるため、副作用がより低減される。
【００５０】
上述のＣＤ３に対するKDの値を求める際のSPRに用いられるＣＤ３のサブタイプは、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３εおよびＣＤ３ζのいずれか一つ、またはこれらの組合せでよい。これらの中でも、ＣＤ３のサブタイプはＣＤ３εが好ましい。いずれのＣＤ３のサブタイプも、好ましくは、ヒト由来である。
第１の抗原結合分子が結合するＣＤ３εのエピトープは、特に限定されない、好ましくは、ＣＤ３εのエピトープは少なくともＣＤ３εのＮ末端から２７番目までのアミノ酸配列を含み、より好ましくは、ＣＤ３εのエピトープは少なくともＣＤ３εのＮ末端から８番目までのアミノ酸配列を含み、最も好ましくは、ＣＤ３εのエピトープは少なくともＣＤ３εのＮ末端から５番目までのアミノ酸配列を含む。
【００５１】
第１の抗原がアデノシンである場合の第１の抗原結合分子または第１の抗原結合領域の例示を以下に示す。本例示の具体例としては、第１の抗原結合分子または第１の抗原結合領域は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せがそれぞれ配列番号：106と配列番号：107、配列番号：108と配列番号：109、配列番号：110と配列番号：111、および配列番号：112と配列番号：113から選択されるいずれかの組合せからなるアデノシン結合ポリペプチド、または前記アデノシン結合ポリペプチドから改変された第２の改変ポリペプチドを含む。本具体例において、第２の改変ポリペプチドのアデノシへの結合活性はアデノシン結合ポリペプチドに比べて低くてもよく高くてもよい。その改変は、如何なるものをも包含する。第２の改変ポリペプチドとその改変元のアデノシン結合ポリペプチドの間のアミノ酸配列の相同性は、好ましくは８０％以上であり、より好ましくは９０％以上である。本具体例において、重鎖可変領域または軽鎖可変領域がヒト以外の動物由来のものである場合には、第２の改変ポリペプチドはヒト化したものを包含する。
【００５２】
本具体例において第２の改変ポリペプチドのアデノシンへの結合活性と、その改変前のアデノシン結合ポリペプチドのアデノシンへの結合活性との対比の指標として、例えば、SPRにおける改変前のアデノシン結合ポリペプチドのアデノシンに対する解離定数KD（改変前）を第２の改変ポリペプチドのKD（改変後）で除したKD（改変前）/ KD（改変後）が用いられる。上述の「第２の改変ポリペプチドのアデノシへの結合活性はアデノシン結合ポリペプチドに比べて低い」とは、KD（改変前）/ KD（改変後）が１より高いことを意味する。逆に「第２の改変ポリペプチドのアデノシへの結合活性はアデノシン結合ポリペプチドに比べて高い」とは、KD（改変前）/ KD（改変後）が１より低いことを意味する。
【００５３】
第２の改変ポリペプチドのアデノシンへの結合活性は、SPRによる測定で高結合活性であってもよく、低結合活性であってもよく、SPRによる検出が不可能なほど低くてもよい。
第２の改変ポリペプチドのアデノシンへの結合活性がSPRによる検出が不可能なほど低い場合には、上述のKD（改変前）/ KD（改変後）は用いられず、後述する第２の抗原結合分子の存在下における、第２の改変ポリペプチドのアデノシンに対するKDの値が用いられる。第２の抗原結合分子の存在下における、第２の改変ポリペプチドのアデノシンに対する結合活性は、例えば、第１の抗原結合分子が抗体である場合にその抗体がエフェクター機能を発揮できる範囲であればよい。好ましくは、第２の抗原結合分子の存在下における、第２の改変ポリペプチドのアデノシンに対する結合活性は、高結合活性である。
【００５４】
以上の具体例では第１の抗原がＣＤ３またはアデノシンである例が示されたが、述べるまでもなく、後述する第２の抗原結合分子により、第１の抗原結合分子の第１の抗原への結合活性を増加させる本発明の抗体改変技術は、ＣＤ３およびアデノシン以外の第１の抗原にも応用可能である。
【００５５】
ｅ．第３の抗原
第１の抗原結合分子と組合せて用いられる第２の抗原結合分子は、単一の抗原に結合するものでもよく、複数の抗原に結合する、いわゆる多重抗原特異性を有するものでもよい。第３の抗原結合領域および第３の抗原は、後述する第２の抗原結合分子におけるものと同じである。
【００５６】
Ｃ．第２の抗原結合分子
本発明の第２の抗原結合分子は、抗原−抗原結合分子複合体に結合する。すなわち、第２の抗原結合分子は、該複合体に結合する複合体結合領域を含む。該複合体は、第１の抗原および該第１の抗原に結合する第１の抗原結合分子を含む。
第２の抗原結合分子は、複合体結合領域を含み、第１の抗原結合分子の第１の抗原への結合活性を増加させるものであれば特に限定されず、天然の抗体のような軽鎖２分子と重鎖２分子からなる抗体の完全体であってもよく、抗体半分子、ダイアボディ(diabody；Db)、scFv、単鎖抗体、sc(Fv)2、sc(Fab')2等の抗体断片であってもよい。
【００５７】
第２の抗原結合分子が該複合体に結合する機構は、該複合体に結合する限り特に限定されない。好ましくは、第２の抗原結合分子は、該複合体に結合する際に第１の抗原と第１の抗原結合分子の両方に結合する。すなわち、第２の抗原結合分子の該複合体中のエピトープは第１の抗原結合分子と第１の抗原の両方に含まれる。
第１の抗原結合分子が重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む抗体である場合は、第２の抗原結合分子のエピトープは第１の抗原結合分子中の重鎖可変領域または軽鎖可変領域のいずれか一方または両方および、第１の抗原に含まれる。この場合、好ましくは第２の抗原結合分子が結合するエピトープは第１の抗原結合分子中の重鎖可変領域および第１の抗原に含まれる。
第２の抗原結合分子は、該複合体が形成される前後に第１の抗原および第１の抗原結合分子に結合して、第１の抗原結合分子の第１の抗原への結合活性を増加させる。すなわち、第２の抗原結合分子は、該複合体を安定化する。
【００５８】
一態様において、第２の抗原結合分子は、第１の抗原結合分子の存在下における第１の抗原への結合活性が、第１の抗原結合分子の非存在下に比べて高い。これは、第２の抗原結合分子が第１の抗原結合分子から遊離している第１の抗原よりも該複合体への結合活性が高いこと、および第１の抗原から遊離している第１の抗原結合分子に結合することによって第１の抗原結合分子から遊離している第１の抗原への結合活性が上昇すること、のいずれかまたは両方の機構によるものと推定される。
該態様における第２の抗原結合分子の第１の抗原結合分子から遊離している第１の抗原への結合活性と、第１の抗原結合分子の存在下における第１の抗原への結合活性との対比の指標は、上述の第１の抗原結合分子における指標と同様である。
該態様においては、第２の抗原結合分子の第１の抗原への結合は第１の抗原結合分子の存在により高まる。これは、第２の抗原結合分子の第１の抗原への特異性は、第１の抗原結合分子の存在により高くなることを意味する。この特性を利用することにより、特に第１の抗原結合分子と第２の抗原結合分子が二重抗原特異性を有し、両分子が医薬として組合せて用いられた場合に、副作用がより低減される。
【００５９】
ａ．第１の抗原結合分子の例示
第１の抗原がＣＤ３である場合の第２の抗原結合分子または第２の抗原結合領域の例示を以下に示す。本例示の具体例は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せがそれぞれ配列番号：45と配列番号：46、配列番号：47と配列番号：48、配列番号：49と配列番号：50および配列番号：51と配列番号：52から選択されるいずれかの組合せからなるポリペプチドを含む第２の抗原結合分子または第２の抗原結合領域である。
【００６０】
第１の抗原がアデノシンである場合の第２の抗原結合分子または第２の抗原結合領域の例示を以下に示す。本例示の具体例は、以下の重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せからなるポリペプチドを含む第２の抗原結合分子または第２の抗原結合領域である。
重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せがそれぞれ配列番号：160と配列番号：161、配列番号：162と配列番号：163、および配列番号：164と配列番号：165から選択されるいずれかの組合せからなるポリペプチド。
【００６１】
ｂ．第３の抗原
第２の抗原結合分子は、単一の抗原に結合するものでもよく、複数の抗原に結合する、いわゆる多重抗原特異性を有するものでもよい。
第２の抗原結合分子が多重抗原特異性を有する場合には、第２の抗原結合分子は少なくとも第３の抗原に結合する。すなわち、第２の抗原結合分子は、第３の抗原に結合する第３の抗原結合領域を含む。第３の抗原結合領域としては、抗体の断片が挙げられる。該抗体の断片は、第３の抗原に結合し得る限り如何なる断片でもよい。該抗体の断片としては、Fv、Fabが挙げられる。
【００６２】
第３の抗原は、特に限定されず、如何なる抗原をも包含する。具体的な抗原の種類としては、国際公開第２０１３／１８０２００号に掲載されている抗原が挙げられる。好ましくは、第３の抗原は癌抗原または免疫関連分子である。より好ましくは、第３の抗原は癌抗原である。第３の抗原が免疫関連分子である場合には、当該免疫関連分子はCD8が例示される。
癌抗原の具体的例示は、上述の第２の抗原における癌抗原と同様である。ただし、第２の抗原と第３の抗原がいずれも癌抗原である場合には、好ましくは、第２の抗原と第３の抗原は異種の癌抗原である。より好ましくは、第２の抗原と第３の抗原は、同じ癌細胞または癌組織に発現する異種の癌抗原である。
免疫関連分子およびその例示は、上述の第１の抗原における免疫関連分子と同様である。ただし、第１の抗原と第３の抗原がいずれも免疫関連分子である場合には、好ましくは、第１の抗原と第３の抗原は異種の免疫関連分子である。ここで言う「異種」とは、単一のタンパク質の一次構造または高次構造の表面における異なる領域である場合を包含する。
一態様において、第３の抗原は細胞外に存在するタンパク質である。該細胞外に存在するタンパク質には、細胞膜タンパク質をも包含される。好ましくは、該細胞外に存在するタンパク質は細胞膜タンパク質である。
【００６３】
ｃ．第２の他の構成
一態様において、第２の抗原結合分子は、抗原結合領域以外の構成（第２の他の構成）を含んでいてもよく、含まなくてもよい。第２の他の構成は、例えば、抗体断片、リンカーおよび標識化合物である。
第２の抗原結合分子に種々の機能を付加できる観点から、好ましくは、第２の抗原結合分子は第２の他の構成を含む。第１の抗原結合分子の血漿中の安定性および製造効率等を向上させるため、第２の他の構成は、好ましくは、抗体断片である。抗体断片としては、抗体のＦｃ領域および抗体の定常領域が挙げられる。
第２の抗原結合分子が抗体のＦｃ領域を含む場合、Ｆｃ領域は天然の抗体のＦｃ領域と同じアミノ酸配列を有する天然Ｆｃ領域であってもよく、天然Ｆｃ領域から改変された改変Ｆｃ領域であってもよい。この場合、抗体のＦｃ領域は、ＩｇＧのＦｃ領域由来であることが好ましい。該ＩｇＧはヒト由来であることが好ましい。
第２の抗原結合分子が抗体の定常領域を含む場合、該定常領域は天然の抗体の定常領域と同じアミノ酸配列を有する天然定常領域であってもよく、天然定常領域から改変された改変定常領域であってもよい。この場合、抗体の該定常領域は、ＩｇＧの定常領域由来であることが好ましい。該ＩｇＧはヒト由来であることが好ましい。
【００６４】
一態様において、第２の抗原結合分子が二重抗原特異性を有し、複合体結合領域を含むポリペプチドと第３の抗原結合領域を含むポリペプチドのヘテロ二量体が形成される場合には、製造効率性の観点から、好ましくは、Ｆｃ領域または定常領域はそれぞれ改変Ｆｃ領域または改変定常領域である。この場合の改変Ｆｃ領域または改変定常領域の具体例としては、上述の第１の他の構成における（i）から（iii）の少なくとも一の改変、またはヒンジ領域部分における改変が適用され得る。この場合、ヘテロ二量体が形成されやすくなるように、第１の他の構成における改変と第２の他の構成における改変が組合せられ得る。
【００６５】
ｄ．第１の抗原
第２の抗原結合分子と組合せて用いられる第１の抗原結合分子の第１の抗原は、上述の第１の抗原結合分子におけるものと同じである。
【００６６】
ｅ．第２の抗原
第２の抗原結合分子と組合せて用いられる第１の抗原結合分子は、単一の抗原に結合するものでもよく、複数の抗原に結合する、いわゆる多重抗原特異性を有するものでもよい。第２の抗原結合領域および第２の抗原は、上述の第１の抗原結合分子におけるものと同じである。
【００６７】
Ｄ．第１の抗原と第２の抗原と第３の抗原の好適な組合せ
第１の抗原結合分子と第２の抗原結合分子の両方が多重抗原特異性を有する場合において、第１の抗原と、第２の抗原と、第３の抗原の種類は、以下の（１）〜（５）のいずれかの組合せであることが好ましい。
（１）第１の抗原が免疫関連分子であり、第２の抗原が第１の癌抗原であり、第３の抗原が第２の癌抗原である組合せ
（２）第１の抗原が標的細胞の細胞代謝物であり、第２の抗原が癌抗原であり、第３の抗原が免疫関連分子である組合せ
（３）前記第１の抗原が標的細胞の細胞代謝物であり、前記第２の抗原が免疫関連分子であり、前記第３の抗原が癌抗原である組合せ
（４）前記第１の抗原が第１の免疫関連分子であり、前記第２の抗原が癌抗原であり、前記第３の抗原が第２の免疫関連分子である組合せ
（５）前記第１の抗原が第１の免疫関連分子であり、前記第２の抗原が第２の免疫関連分子であり、前記第３の抗原が癌抗原である組合せ
【００６８】
上記（１）〜（５）のいずれにおいても、副作用の低減が期待される。
特に上記（１）においては、副作用をさらに低減する観点から、好ましくは第２の癌抗原の種類は第１の抗原と異なる。この場合において、より好ましくは第１の抗原は第２の抗原と同じ癌組織もしくは炎症組織に特異的に発現している。
上記（４）においては、副作用をさらに低減する観点から、第２の免疫関連分子の種類が好ましくは第１の免疫関連分子と異なる。この場合において、より好ましくは第２の免疫関連分子はCD8である。さらに好ましくは第１の免疫関連分子はCD3である。
【００６９】
Ｅ．製造方法
ａ．第１の抗原結合分子
第１の抗原結合分子として用いられるものは、第１の抗原に結合する第１の抗原結合領域を含む分子であれば如何なる化合物でよい。第１の抗原結合分子は、低分子化合物、高分子化合物、またはこれらの融合分子でよい。
第１の抗原結合領域としては、例えば、抗体の可変領域が挙げられる。抗原結合領域をコードするcDNAは、国際公開第２０１３／１８０２００号に掲載されるような、精製抗原による免疫またはDNA免疫、免疫された動物からの免疫細胞の採取、ハイブリドーマの形成、およびハイブリドーマから可変領域をコードするcDNAのクローニングなど、一般的な抗体作製手順により取得可能である。可変領域は、ヒト化されてもよい。クローニングされたcDNAを用いて公知のタンパク質発現系により発現した可変領域は、そのまま第１の抗原結合分子として用いられる。
【００７０】
第１の抗原結合分子がさらに第２の抗原結合領域または第１の他の構成を含む場合には、第１の抗原結合分子は、第１の抗原結合領域との融合タンパク質として発現してもよく、分子間力や共有結合により形成された複合タンパク質として発現してもよい。例えば、第１の抗原結合分子が二重特異性抗体である場合、第１の抗原結合分子は、第１の抗原結合領域と第２の抗原結合領域が該二重特異性抗体のそれぞれの可変領域であり、第１の他の構成がＦｃ領域を含む複合タンパク質として発現される。この場合、第２の抗原結合領域は、上述の第１の抗原結合領域と同様に作製される。Ｆｃ領域は、例えば、国際公開第２０１３／１８０２００号の二重特異性抗体とその作製方法に掲載されるものが用いられる。
【００７１】
本発明における、第１の抗原と第１の抗原結合分子により形成された抗原−抗原結合分子複合体を、第２の抗原結合分子によって安定化する技術は、例えば、第１の抗原結合分子の第１の抗原への結合活性がSPRによる測定で高結合活性であってもよく、低結合活性であってもよく、SPRによる検出が不可能なほど低くてもよい。
SPRによる測定で第１の抗原への結合活性が低結合活性である、またはSPRによる検出が不可能なほど低い第１の抗原結合分子は、SPRによる測定で第１の抗原への結合が高結合活性なものから、アラニンスキャン（Biochemistry Vol.32, No.27, 1993, 6828-6835）などの抗体改変技術によりその抗原結合活性を減弱することで作製され得る。SPRによるカイネティクス解析からKD値が算出できないほど結合性の低い第１の抗原結合分子は、上述の一般的な抗体作製手順により作製される。例えば、SPRによる検出が不可能なほど低い第１の抗原結合分子は、まずELISAなど異なるモードの分子間相互作用の測定で第１の抗原への結合活性が検出されたポリペプチド候補群を得て、次いで、該ポリペプチド候補群からSPRによっては検出が不可能なポリペプチドを特定するスクリーニング方法により作製される。
【００７２】
ｂ．第２の抗原結合分子
第２の抗原結合分子は、第１の抗原結合分子の第１の抗原への結合活性を増加させるものをスクリーニングすることにより同定される。第２の抗原結合分子は、例えば、化合物または抗体もしくはその断片のライブラリから、公知の結合活性を測定する方法により同定すればよい。具体的には、以下の（方法I）および（方法II）が挙げられる。
【００７３】
（方法I）
SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも１つのアッセイを用いた第１の抗原結合分子の第１の抗原への結合活性が、化合物または抗体もしくはその断片のライブラリから任意に選択される１つの化合物または抗体もしくはその断片が存在する条件では検出されるが、前記１つの化合物または抗体もしくはその断片が存在しない条件では検出不可能である場合に、前記１つの化合物または抗体もしくはその断片を第２の抗原結合分子として同定することを含む、スクリーニング方法。
【００７４】
（方法II）
SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも１つのアッセイを用いた第１の抗原結合分子の第１の抗原への結合活性が、化合物または抗体もしくはその断片のライブラリから任意に選択される１つの化合物または抗体もしくはその断片が存在しない条件に比べて、前記１つの化合物または抗体もしくはその断片が存在する条件で高い場合に、前記１つの化合物または抗体もしくはその断片を第２の抗原結合分子として同定することを含む、スクリーニング方法。
【００７５】
SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも１つのアッセイにおいて、遊離している第１の抗原に対する結合活性が検出不可能である第２の抗原結合分子、ないしSPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも１つのアッセイにおいて、第１の抗原結合分子の存在下における第１の抗原への結合活性が第１の抗原結合分子の非存在下に比べて高い第２の抗原結合分子は、以下の（方法III）から（方法VI）のスクリーニング方法により取得可能である。
【００７６】
（方法III）
（ａ）哺乳動物に第１の抗原と第１の抗原結合分子からなる抗原−抗原結合分子複合体を免疫し、該複合体に結合するモノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞の第１の群を得る工程、
（ｂ）前記第１の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも１つのアッセイにおいて該複合体を形成していない第１の抗原および該複合体を形成していない第１の抗原結合分子のいずれか一方または両方への結合活性が検出不可能であるモノクローナル抗体を産生する第２の群を選択する工程、
（ｃ）前記第２の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも１つのアッセイにおいて第１の抗原結合分子の第１の抗原への結合活性を増強するモノクローナル抗体を産生する第３の群を選択し、前記第３の群を第２の抗原結合分子を産生する抗体産生細胞として同定する工程を含む、スクリーニング方法。
【００７７】
（方法IV）
（ａ）哺乳動物に第１の抗原と第１の抗原結合分子からなる抗原−抗原結合分子複合体を免疫し、該複合体に結合するモノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞の第１の群を得る工程、
（ｂ）前記第１の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも１つのアッセイにおいて該複合体を形成していない第１の抗原および該複合体を形成していない第１の抗原結合分子のいずれか一方または両方への結合活性が、該複合体への結合に比べ低いモノクローナル抗体を産生する第２の群を選択する工程、
（ｃ）前記第２の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも１つのアッセイにおいて第１の抗原結合分子の第１の抗原への結合活性を増強するモノクローナル抗体を産生する第３の群を選択し、前記第３の群を第２の抗原結合分子を産生する抗体産生細胞として同定する工程を含む、スクリーニング方法。
【００７８】
上記方法IIIおよび方法IVでは、（ａ）工程において抗原−抗原結合分子複合体を免疫したが、該抗原結合分子を抗原結合領域以外の部分を含まないポリペプチドに変更した抗原−抗原結合領域複合体を免疫することもできる。
【００７９】
（方法V）
（ａ）哺乳動物に第１の抗原と第１の抗原結合領域からなる抗原−抗原結合領域複合体を免疫し、該複合体に結合するモノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞の第１の群を得る工程、
（ｂ）前記第１の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも１つのアッセイにおいて該複合体を形成していない第１の抗原および該複合体を形成していない第１の抗原結合領域のいずれか一方または両方への結合活性が検出不可能であるモノクローナル抗体を産生する第２の群を選択する工程、
（ｃ）前記第２の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも１つのアッセイにおいて第１の抗原結合領域の第１の抗原への結合活性を増強するモノクローナル抗体を産生する第３の群を選択し、前記第３の群を第２の抗原結合分子を産生する抗体産生細胞として同定する工程を含む、スクリーニング方法。
【００８０】
（方法VI）
（ａ）哺乳動物に第１の抗原と第１の抗原結合領域からなる抗原−抗原結合領域複合体を免疫し、該複合体に結合するモノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞の第１の群を得る工程、
（ｂ）前記第１の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも１つのアッセイにおいて該複合体を形成していない第１の抗原および該複合体を形成していない第１の抗原結合領域のいずれか一方または両方への結合活性が、該複合体への結合に比べ低いモノクローナル抗体を産生する第２の群を選択する工程、
（ｃ）前記第２の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも１つのアッセイにおいて第１の抗原結合領域の第１の抗原への結合活性を増強するモノクローナル抗体を産生する第３の群を選択し、前記第３の群を第２の抗原結合分子を産生する抗体産生細胞として同定する工程を含む、スクリーニング方法。
【００８１】
上述の方法Iから方法VIにおいて、「SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも１つのアッセイ」に替えて、結合活性を間接的に示すことができるアッセイ、たとえば細胞を用いた薬理学的なアッセイが用いられ得る。
これら（方法I）から（方法VI）の中でも、第１の抗原結合分子と第２の抗原結合分子を二重特異性抗体とし医薬として用いた場合に副作用を低減する観点から（方法III）から（方法VI）が好ましい。スクリーニングの効率性の観点から（方法V）および（方法VI）がより好ましく、副作用をさらに低減する観点から（方法III）および（方法V）がより好ましく、いずれの観点から（方法V）が最も好ましい。
【００８２】
第２の抗原結合分子の製造方法としては、例えば、上記（方法III）から（方法VI）でスクリーニングされた第２の抗原結合分子を産生する抗体産生細胞を培養し、培養上清または細胞破砕物から第２の抗原結合分子を精製する方法が挙げられる。すなわち、第２の抗原結合分子は以下の（方法III’）から（方法VI’）により製造される。
【００８３】
（方法III’）
（ｄ）以下の（ａ）工程から（ｃ）工程を含むスクリーニング方法により得られた抗体産生細胞を培養する工程；
（ａ）哺乳動物に第１の抗原と第１の抗原結合分子からなる抗原−抗原結合分子複合体を免疫し、該複合体に結合するモノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞の第１の群を得る工程、
（ｂ）前記第１の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも１つのアッセイにおいて該複合体を形成していない第１の抗原および該複合体を形成していない第１の抗原結合分子のいずれか一方または両方への結合活性が検出不可能であるモノクローナル抗体を産生する第２の群を選択する工程、
（ｃ）前記第２の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも１つのアッセイにおいて第１の抗原結合分子の第１の抗原への結合活性を増強するモノクローナル抗体を産生する第３の群を選択し、前記第３の群を第２の抗原結合分子を産生する抗体産生細胞として同定する工程；
（ｅ）前記抗体産生細胞培養物から培養上清または細胞破砕物を得る工程、
（ｆ）前記培養上清または細胞破砕物から第２の抗原結合分子を精製する工程を含む、第２の抗原結合分子の製造方法。
【００８４】
（方法IV’）
（ｄ）以下の（ａ）工程から（ｃ）工程を含むスクリーニング方法により得られた抗体産生細胞を培養する工程；
（ａ）哺乳動物に第１の抗原と第１の抗原結合分子からなる抗原−抗原結合分子複合体を免疫し、該複合体に結合するモノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞の第１の群を得る工程、
（ｂ）前記第１の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも１つのアッセイにおいて該複合体を形成していない第１の抗原および該複合体を形成していない第１の抗原結合分子のいずれか一方または両方への結合活性が、該複合体への結合に比べ低いモノクローナル抗体を産生する第２の群を選択する工程、
（ｃ）前記第２の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも１つのアッセイにおいて第１の抗原結合分子の第１の抗原への結合活性を増強するモノクローナル抗体を産生する第３の群を選択し、前記第３の群を第２の抗原結合分子を産生する抗体産生細胞として同定する工程；
（ｅ）前記抗体産生細胞培養物から培養上清または細胞破砕物を得る工程、
（ｆ）前記培養上清または細胞破砕物から第２の抗原結合分子を精製する工程を含む、第２の抗原結合分子の製造方法。
【００８５】
（方法V’）
（ｄ）以下の（ａ）工程から（ｃ）工程を含むスクリーニング方法により得られた抗体産生細胞を培養する工程；
（ａ）哺乳動物に第１の抗原と第１の抗原結合領域からなる抗原−抗原結合領域複合体を免疫し、該複合体に結合するモノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞の第１の群を得る工程、
（ｂ）前記第１の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも１つのアッセイにおいて該複合体を形成していない第１の抗原および該複合体を形成していない第１の抗原結合領域のいずれか一方または両方への結合活性が検出不可能であるモノクローナル抗体を産生する第２の群を選択する工程、
（ｃ）前記第２の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも１つのアッセイにおいて第１の抗原結合領域の第１の抗原への結合活性を増強するモノクローナル抗体を産生する第３の群を選択し、前記第３の群を第２の抗原結合分子を産生する抗体産生細胞として同定する工程；
（ｅ）前記抗体産生細胞培養物から培養上清または細胞破砕物を得る工程、
（ｆ）前記培養上清または細胞破砕物から第２の抗原結合分子を精製する工程を含む、第２の抗原結合分子の製造方法。
【００８６】
（方法VI’）
（ｄ）以下の（ａ）工程から（ｃ）工程を含むスクリーニング方法により得られた抗体産生細胞を培養する工程；
（ａ）哺乳動物に第１の抗原と第１の抗原結合領域からなる抗原−抗原結合領域複合体を免疫し、該複合体に結合するモノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞の第１の群を得る工程、
（ｂ）前記第１の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも１つのアッセイにおいて該複合体を形成していない第１の抗原および該複合体を形成していない第１の抗原結合領域のいずれか一方または両方への結合活性が、該複合体への結合に比べ低いモノクローナル抗体を産生する第２の群を選択する工程、
（ｃ）前記第２の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも１つのアッセイにおいて第１の抗原結合領域の第１の抗原への結合活性を増強するモノクローナル抗体を産生する第３の群を選択し、前記第３の群を第２の抗原結合分子を産生する抗体産生細胞として同定する工程；
（ｅ）前記抗体産生細胞培養物から培養上清または細胞破砕物を得る工程、
（ｆ）前記培養上清または細胞破砕物から第２の抗原結合分子を精製する工程を含む、第２の抗原結合分子の製造方法。
【００８７】
上述の（方法III）から（方法VI）および（方法III’）から（方法VI’）における抗体産生細胞の由来となる細胞の種類は、公知の抗体を産生する細胞の種類であれば如何なるものをも包含する。抗体産生細胞の由来となる細胞の種類は、例えば、B細胞およびハイブリドーマが挙げられる。
【００８８】
別の態様において、上述の方法Iおよび方法IIで用いられるライブラリは、以下の方法VIIまたは方法VIIIによりファージディスプレイ用の抗原結合分子ライブラリとして製造されることができる。
【００８９】
（方法VII）
第１の抗原に結合する第１の抗原結合分子をアミノ酸改変して、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも１つのアッセイで前記第１の抗原への結合が低下したまたは検出限界下である第１の抗原結合分子の改変体を得る第１の工程、
既存のファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリから、前記第１の抗原および前記改変体のいずれか一方または両方に結合する抗原結合分子を提示するファージを除去した、第１のファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリを得る第２の工程、および
前記第１のファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリから、前記第１の抗原および前記第１の抗原結合分子を含む抗原−抗原結合分子複合体に結合する抗原結合分子を提示するファージを濃縮した第２のファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリを得る第３の工程を含む、ファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリの製造方法。
【００９０】
前記方法VIIの別の態様において、前記第２のファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリを前記既存のファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリとし、前記第２の工程および前記第３の工程が繰り返される、ファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリの製造方法が提供されることができる。前記第２の工程および前記第３の工程を繰り返すことにより、上述の第２の抗原結合分子を提示するファージを高密度で含むファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリが製造されることができる。
【００９１】
（方法VIII）
既存のファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリから、(i)第１の抗原に結合し得るが前記第１の抗原に結合していない第１の抗原結合分子に結合し、および(ii)前記第１の抗原結合分子に結合していない前記第１の抗原に結合する、抗原結合分子を提示するファージを除去した、第１のファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリを得る第１の工程、ならびに
前記第１のファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリから、前記第１の抗原および前記第１の抗原結合分子を含む抗原−抗原結合分子複合体に結合する抗原結合分子を提示するファージを濃縮した第２のファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリを得る第２の工程を含む、ファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリの製造方法。
【００９２】
前記方法VIIIの別の態様において、前記第２のファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリを前記既存のファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリとし、前記第１の工程および前記第２の工程が繰り返される、ファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリの製造方法が提供されることができる。前記第１の工程および前記第２の工程を繰り返すことにより、上述の第２の抗原結合分子を提示するファージを高密度で含むファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリが製造されることができる。
【００９３】
Ｆ．組合せ
本発明の組合せは、上述の第１の抗原結合分子と、上述の第２の抗原結合分子との組合せである。第１の抗原と第２の抗原と第３の抗原の組合せが、上述の「Ｄ．第１の抗原と第２の抗原と第３の抗原の好適な組合せ」における（１）〜（５）のいずれかの組合せである場合には、該組合せはTDCC活性誘導剤またはADCC活性誘導剤であることが好ましく、TDCC活性誘導剤であることがより好ましい。
【００９４】
ａ．医薬組成物
該組合せは、医薬組成物であることが好ましい。該組合せが医薬組成物である場合において、第１の抗原結合分子と第２の抗原結合分子は、同時に投与されてもよく、別々に投与されてもよい。好ましくは、第１の抗原結合分子と第２の抗原結合分子は、別々に投与される。
【００９５】
第１の抗原結合分子と第２の抗原結合分子は同時に投与することを意図して同じ製剤にされてもよく、別々に投与されることを意図して別々に製剤化されてもよい。
第１の抗原結合分子と第２の抗原結合分子とが別々に製剤化された場合、それらを組合せてキット化してもよく、一方の製剤の添付文書に他方の製剤と組合せて用いられることを記載してもよい。前者の例としては、第１の抗原結合分子と第２の抗原結合分子を別々のアンプルに充填し、両アンプルを一の箱に梱包してキット化することが挙げられる。
【００９６】
ｂ．その他の成分
医薬組成物は、第１の抗原結合分子および第２の抗原結合分子以外にその他の成分を含有していてもよい。
その他の成分としては、例えば、薬学的に許容される担体が挙げられる。
【００９７】
医薬組成物は、当業者に公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は、指示された範囲の適当な容量が得られるように設定する。
【００９８】
注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
【００９９】
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬（例えばD-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウム）を含む等張液が挙げられる。適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート80TM、HCO-50等）を併用してもよい。
【０１００】
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル及び／またはベンジルアルコールを併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液及び酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩酸プロカイン）、安定剤（例えば、ベンジルアルコール及びフェノール）、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填する。
【０１０１】
ｃ．剤形
医薬組成物は、好ましくは非経口投与により投与される。例えば、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型の組成物とすることができる。例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。
【０１０２】
ｄ．対象疾患
医薬組成物の対象疾患は、特に限定されない。好ましくは、対象疾患は、第１の抗原が細胞代謝物である場合には該細胞代謝物が正常組織に比べ高レベルに発現する疾患であり、第１の抗原が免疫代謝物である場合には第２の抗原および第３の抗原が正常組織に比べ高レベルに発現する疾患である。すなわち、該疾患は、第１の抗原結合分子と第２の抗原結合分子が共同して標的細胞にエフェクター細胞、特にＴ細胞を誘導し、エフェクター機能、特にTDCC活性を発揮させることが望ましい疾患である。
具体的な対象疾患としては、例えば、細胞増殖性疾患、免疫亢進性疾患、感染性疾患などが挙げられる。細胞増殖性疾患としては、腫瘍が挙げられる。免疫亢進性疾患としては、自己免疫疾患が挙げられる。感染性疾患としては、細菌感染およびウイルス感染が挙げられる。
【０１０３】
ｅ．その他の用途
本発明の組合せは、医薬組成物以外の用途にも用いられる。
一の態様において、第１の抗原が細胞代謝物のような低分子化合物である場合、本発明の組合せは、低分子化合物を検出するためのより簡便なアッセイに有用である。低分子化合物の検出のために、通常SPRやHPLCが用いられるが、ELISAなどで用いられるサンドイッチ法は抗原が小さすぎるため適用することは困難であることが多い。しかし、該組合せによれば、第１の抗原結合分子と第２の抗原結合分子が低分子化合物を挟み込んで同時に結合することができることから、より簡便な低分子化合物の検出系が提供され得る。
【０１０４】
他の態様において、本発明の組合せは、in vivoイメージングに有用である。上述したとおり、従来の抗体医薬のエフェクター機能を標的組織特異的に発揮させる試みはまだ発展途上で、さらなる試みが期待されている。これと同様に、抗体を用いて標的組織特異的にin vivoイメージングをする場合にも、標的組織以外にも抗体が結合することによるノイズが生じる可能性がある。一方、該組合せを用いれば、このノイズがより低減され得る。例えば、第１の抗原が細胞代謝物であり、第２の抗原が標的細胞特異的な抗原である場合、第２の抗原結合分子に複合体結合領域と、第２の他の構成として標識化合物（例えば、放射性同位体および蛍光色素）を含ませれば、該組合せのin vivoイメージングへの適用が可能である。この場合、細胞代謝物が存在する標的組織のイメージングにおいてノイズを低減し、検出感度を向上させることができる。
【０１０５】
Ｇ．治療方法
上述の第１の抗原結合分子と第２の抗原結合分子を組合せて医薬として用いる場合、第１の抗原結合分子と第２の抗原結合分子は、同時に投与されてもよく、別々に投与されてもよい。どのように投与されるかは、第１の抗原結合分子と第２の抗原結合分子の薬物動態や作用機序に基づき決定されればよい。
投与量及び投与方法は、患者の体重、年齢、症状などにより変動するが、当業者であればそれらの条件を考慮し適当な投与量及び投与方法を設定することが可能である。
【実施例】
【０１０６】
以下の実施例において、第２の抗原結合分子の一態様として作成した抗体を、その機能に由来して「クランピング抗体」と称する。二重特異性抗体を「BiAb」とも略称する。
本実施例は本発明の一態様を示すものである。本発明における抗原は本実施例で用いられたものに必ずしも限定されない。【０１０７】
［実施例１］
抗原と結合した抗体を認識して結合する抗体のコンセプト
副作用を回避しつつ薬効を発揮するために、正常組織や血液中において全身的に作用せず、病変部位である癌や炎症部位においてのみ作用するような創薬技術が求められている。例えば、EGFR-BiTE（非特許文献: BiTE: Baeuerle PA et. al. Curr. Opin. Mol. Ther. 2009. 11, 22-30）はＣＤ３を介してＴ細胞をリクルートし活性化することによって抗腫瘍効果を発揮するため、EGFR-BiTEに対して、癌細胞近傍にいるＴ細胞に発現しているＣＤ３には結合するが、癌細胞近傍以外にいるＴ細胞に発現しているＣＤ３に結合しない性質を付与することができれば、そのような性質を付与された改変EGFR-BiTEは、癌においてのみＴ細胞を活性化することが可能であり、副作用を回避しつつ強力な抗腫瘍効果を発揮することが可能となる。【０１０８】
癌に対する抗体医薬に限らず、抗体分子が関節リウマチにおいて炎症が起こっている関節の滑液中でのみサイトカインに結合しその作用を阻害し、全身的には阻害しなければ、全身的なサイトカインの中和による感染症のリスクの増大を回避しつつ、関節リウマチ等の炎症性疾患・自己免疫疾患に対して高い治療効果を発揮することが可能であると考えられた。【０１０９】
このように癌や炎症部位においてのみ抗原二重陽性の標的細胞とエフェクター細胞をクロスリンクしたり、Ｔ細胞を活性化するような抗体は、副作用を回避しつつ薬効を発揮することが可能である。しかしながら、これまでにこのような特性を有する理想的な抗体は報告されていない。そこで、発明者らは、癌などの標的疾患部位において高濃度で存在する低分子や、癌細胞近傍にいるＴ細胞に発現しているＣＤ３を介して架橋する図1に示すような抗体、クランピング抗体と、標的疾患細胞上の抗原を認識する抗体を組み合わせることにより、図２に示すように、低分子が高濃度で存在する標的組織で細胞を架橋したり、ＣＤ３シグナルを誘導したりすることが可能になると考えられた。
そこで、癌組織において高濃度に存在すると考えられる低分子として知られるアデノシン（adenosine）に対する結合抗体、ＣＤ３シグナルを誘導可能な抗ＣＤ３抗体に対するクランピング抗体の取得が試みられた。【０１１０】
［実施例２］
減弱型ＣＤ３抗体の取得
抗ＣＤ３抗体CE115HA000はＣＤ３εを認識するラット由来抗体をヒト化した抗体である。抗原決定領域（CDR）に変異導入することにより、TDCCの誘導能の異なるバリアントが得られている。これらのうちTDCC活性が減弱したCE115HA146とTDCC活性が認められないCE115HA056を使用した。重鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号：1-3に示す。【０１１１】
［実施例３］
抗ＣＤ３抗体に対するクランピング抗体の取得
（１）抗原調製
CE115HA146重鎖N末側に、GSリンカー（GGGSGGGS、配列番号：4）を介してエピトープとなるＣＤ３εの8残基のアミノ酸（QDGNEEMG、配列番号：5）が連結するように設計した抗体（CE115HAPG13-rabCH1hG1m、配列番号：6）をコードする遺伝子作製し、哺乳動物培養細胞用発現ベクターに組み込んだ。対応する軽鎖（GLS3000-rabk、配列番号：7）をコードする遺伝子も同様に哺乳動物培養細胞用発現ベクターに組み込んだ。これら発現ベクターをFreeStyle 293F細胞（Thermo Fisher Scinetific）にトランスフェクション試薬293fectin Tranfection Reagent（Thermo Fisher Scientific）を用い、メーカー提供のマニュアルに従って導入し、5日間培養したのち培養液を回収した。回収した培養液からrProteinA Sepharose Fast Flow樹脂（GE Healthcare）によるアフィニティ精製にて抗体を精製した。精製抗体10 mgに、プロテアーゼ、FabRICATOR（Genovis）を1500 unit加え、15時間、37℃で切断した。その後、Eshmuno A樹脂（Merck Millipore）の素通り画分をゲルろ過カラムに供して、ＣＤ３εエピトープ融合F(ab’)2断片を調製した。精製したタンパク質の濃度は、分光光度計を用いて280 nmでの吸光度を測定し、得られた値からPACE法により算出された吸光係数を用いて算出した（Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423）。【０１１２】
（２）ウサギへの免疫、抗体産生細胞の選抜、抗体遺伝子の単離
ウサギの免疫は、ＣＤ３εエピトープ融合F(ab’)2溶液とTiterMax Gold（TiterMax USA）を混合して作製したエマルジョンを皮下注射することで実施した。4回の免疫後、抗体産生の認められたウサギの血液および脾臓を採取した。抗原に特異的なB細胞受容体を表面に提示しているB細胞を濃縮するために、抹消血単核球および脾細胞を調製し、ＣＤ３εエピトープ融合CE115HA146（CE115HAPG13rabCH1hG1m/GLS3000-rabk、配列番号：6、7）および、Alexa647（Invitrogen）で標識したCE115HA146（CE115HA146-rabCH1hG1m/ GLS3000-rabk、配列番号：8、7）とを反応させ、結合した抗体をDyLite488で標識した抗ヒトIgG抗体、Goat anti-Human IgG Fc Cross Absorbed DyLight488 conjugate（Thermo Fisher Scientific）で染色した。DyLite488のみで染色された細胞をセルソーター（FACS Aria III, BD）により分離し、1細胞/wellとなるように96 wellプレートに播種し、25000細胞/wellのEL4細胞存在下、BT培地で10日間培養した。なおEL4細胞は予めmytomycin C（Sigma-Aldrich）で処理をすることで細胞増殖が抑制されたものを使用した。BT培地は、RPMI 1640 with L-Gln（nacalai tesque）に、Fetal Bovine Serum, ultra-low IgG（Life technologies)、1/20容量のウサギＴ細胞培養培地を添加して作製した。ウサギＴ細胞培養培地はPhytohemagglutinin-M (Roche), phorbol 12-myristate 13-acetate (Sigma-Aldrich) 2% FBSを添加したRPMI-1640培地でウサギＴ細胞を培養することで調製した。【０１１３】
一次スクリーニングとして、B細胞培養液中に分泌された抗体とＣＤ３εエピトープ融合CE115HA146との結合性をELISAで評価した。抗ヒトF(ab’)2 抗体、Affipure F(ab’)2 Fragment Donkey Anti-Human（Jackson Immuno Research）を固相化した384 wellプレートに、ＣＤ３εエピトープ融合CE115HA146（CE115HAPG13-rabCH1hG1m/GLS3000-rabk配列番号：6、7）あるいはＣＤ３εエピトープを融合していないCE115HA146（CE115HA146-rabCH1hG1m/ GLS3000-rabk、配列番号：8、7）を結合させた。B 細胞の培養上清を添加した後、ペルオキシダーゼ標識抗ウサギFc抗体（Biolegend）を反応させ、抗原に結合したウサギ抗体をABTS Microwell Peroxidase Substrate（1-Component System）（KPL）を用い、プ レートリーダーSpectraMax 340PC384（Molecular device）で405nmの吸光を測定した。ＣＤ３εエピトープ融合CE115HA146に特異的に結合が認められたクローンについては二次スクリーニングを実施した。二次スクリーニングとしてＣＤ３εエピトープ融合コントロール抗体（hGC33VHGP01-rabCH1hG1m/hGC33VL-rabk、配列番号：9、10）との結合性を同様にELISAにて評価することで、バックボーンの抗体配列に依存せずに、ペプチド配列のみを認識する抗体を排除した。10560クローンのスクリーニングを実施し、352クローンを選択し、選抜されたB細胞からZR-96 Quick RNA Kit（Zymo research）を用いてRNAを抽出・精製した。抗体遺伝子の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするDNAに対応するそれぞれのプライマーセット（配列番号：11、12および配列番号：13、14）およびPrimeScript II High Fidelity One Step RT-PCR Kit（タカラバイオ）を用いてRT-PCRを実施し、それぞれのPCR産物を得た。得られた重鎖可変領域および軽鎖可変領域のPCR産物は、In-fusion HD Cloning Kit（タカラバイオ）を用いて、それぞれヒト重鎖定常領域をコードするプラスミドDNAおよびヒト軽鎖定常領域をコードするプラスミドDNAにクローニングされた。重鎖定常領域の塩基配列と軽鎖定常領域の塩基配列をそれぞれ配列番号15および16に示す。以上により、重鎖可変領域およびヒト重鎖定常領域が融合したポリペプチドと、軽鎖可変領域およびヒト軽鎖定常領域が融合したポリペプチドを発現するベクターが作製された。【０１１４】
（３）二重特異性抗体（BiAb）の作製
B細胞クローニングおよびELISAによるスクリーニングで選抜された抗体の遺伝子をFreeStyle 293F細胞に導入して抗体の発現を行った。６wellの細胞培養プレートに１ wellあたり５ mLの培地を添加してメーカーのマニュアルに従いトランスフェクションを実施した。4日間の培養後、細胞上清を調製し、rProteinA Sepharose Fast Flow（GE Healthcare）を用いたバッチ精製により同業者公知の方法により精製抗体を得た。抗体濃度は上記（１）でのタンパク質の濃度の算出と同様の方法で算出した。十分な発現が得られたクローンは212クローンであった。【０１１５】
BiAbはFAE技術により調整された。まず、2種類の抗体を20μgずつ混合し、Tris-Buffered saline（TBS、タカラバイオ）にて250 mMに調製した2-Mercaptoethylamine・HCl（2-MEA, Sigma-Aldrich）10μLを添加し、全量をTBSバッファーで100 μLにメスアップした。本反応溶液を37℃で90分間加温した後、Zeba 96-well Spin Plates（Thermo Fisher Scientific)を用いて2-MEAの除去およびD-PBS(-)（和光純薬)への置換を行った。第１の抗原結合分子の一例としてのBiAb1は抗ヒトグリピカン3（GPC3）抗体（GCH065-F760mnN17/L0011-k0、配列番号：17、18）とCE115HA146（CE115HA146-F760mnP17/GLS3000-k0、配列番号：19、20）を用いて、BiAb2は抗GPC3抗体（GCH065-F760mnN17/L0011-k0、配列番号：17、18）と上記（２）で得られたウサギB細胞クローニング由来の抗体を用いて作製した。【０１１６】
（４）Jurkat-luc細胞を使用したＣＤ３シグナルレポーターアッセイ（Jurkat-Lucアッセイ）
標的細胞としてSK-HEP-1細胞（ATCC HTB-52）にヒトGPC3を強制発現させたSK-pca60細胞株を使用し、エフェクター細胞としてＣＤ３シグナルによりLuciferaseを発現するNFAT-RE-luc2-Jurkat細胞（Jurkat-luc細胞、Promega）を使用した。25 μLのAssay buffer（10%FBS (HyClone)、1×MEM Non-Essential Amino Acids Solution (Gibco)、1mM Sodium Pyruvateを含むRPMI-1640 (Nacalai teesuque)）にBiAb1を0.09 μg/mL、BiAb2を0.3 μg/mLとなるように白色96 wellプレート（Corning）に添加した。また、各プレートにはプレート間のシグナル補正およびコントロールのため、抗体非添加、BiAb1のみ、BiAb2のみ添加ウェルをそれぞれ用意し、添加液量は25 μLとなるように不足分はAssay bufferにて調整した。抗体溶液添加後、標的細胞を25 μL/well (1×104 細胞/ well)、Jurkat-Luc細胞溶液を25 μL/well (1×104 細胞/ well)を播種し、37℃、5% CO2条件下で6時間培養した。96 wellプレートを常温で15分間静置した後、Bio-Glo Luciferase assay reagent (Promega)を75 μL添加し、撹拌後、10分間反応させ、プレートリーダーEnVision（Perkin Elmer）で発光測定を行った。
TDCC活性の指標としての相対発光強度の平均値(RLU)を下記の式１により補正した。【０１１７】
（式１）
2019160007.tif 000003
【０１１８】
上式１において、Aは異なる複数のプレートにおけるBiAb1のみ添加したウェルのRLU平均値を平均した値、Bは各プレートにおけるBiAb1のみ添加したウェルのRLU平均値を表す。BをAで除した項は各抗体によるＣＤ３シグナルの活性化のプレート間の補正項として用いた。Jurkat-Lucアッセイの結果を図３に示す。BiAb1によるＣＤ３シグナルの活性化において、BiAb2の添加により標準偏差の2倍以上の増強があったクローンは212クローン中6クローンであったが、配列解析の結果重複配列を除いたCLA0022、CLA0028、CLA0311、CLA0344の4クローンが第２の抗原結合分子として得られた。得られた抗体の抗原決定部位（配列番号：21-44）および可変領域のアミノ酸配列（配列番号：45-52）を示す。なお、本アッセイにおいてＣＤ３シグナルを減弱させるクローンも得られた。【０１１９】
［実施例４］
表面プラズモン共鳴（SPR）による抗ＣＤ３抗体-ＣＤ３εペプチド複合体とクランピング抗体との結合性評価
（１）アナライトおよびリガンドの調製
アナライトは、実施例３で得られた4クローン、CLA0022、CLA0028、CLA0311、CLA0334の抗体より調製したFab断片を使用した。具体的には、それぞれの抗体の配列CLA0022VH-F760mnP17/CLA0022VL-k0C（配列番号：53、54）、CLA0028VH-F760mnP17/CLA0028VL-k0C（配列番号：55、56）、CLA0311VH-F760mnP17/CLA0311VL-k0C（配列番号：57、58）、CLA0334VH-F760mnP17/CLA0334VL-k0C（配列番号：59、60））をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターをExpiFectamine293（Thermo Fisher Scientific）を用いてExpi293Fに導入し、培養5日目の培養上清を回収し、HiTrap MabSelect SuReを用いて同業者公知の方法で調製した。精製抗体からPierce Fab Preparation Kit（Thermo Fisher Scientific）を用い、メーカー添付のマニュアルに従ってFab断片を調製した。得られたFab断片の濃度は実施例３（１）でのタンパク質の濃度の算出と同様の方法で算出した。【０１２０】
リガンドはＣＤ３εエピトープ融合CE115HA146（CE115HAGP13-rabIgG/GLS3000-rabk、配列番号：61、7）、ＣＤ３εエピトープ融合CE115HA056（CE115HAGP12-rabIgG/GLS3000-rabk、配列番号：62、7）、ＣＤ３εエピトープ融合GPC3抗体（hGC33VHGP01-rabCH1hG1m/hGC33VL-rabk、配列番号：9、10）、ＣＤ３抗体CE115HA000（CE115HA000-F760mnP17/GLS3000-k0、配列番号：63、20）、CE115HA056（CE115HA056-F760mnP17/GLS3000-k0、配列番号：64、20）、CE115HA146（CE115HA146-F760mnP17/GLS3000-k0、配列番号：19、20）および陰性対照のIC17（IC17Hdk-F760mnP17/IC17L-k0、配列番号：65、66）をコードする遺伝子を組み込んだ哺乳動物用発現ベクターをExpi293Fに導入し、Fab調製用抗体と同様の方法で調製した。【０１２１】
（２）SPRによるクランピング抗体の結合性評価
センサーチップCM4にAcetate4.5（GE Healthcare）にて25 μg/mLに調製したSuRe protein A（GE Healthcare）をアミンカップリングキット（GE healthcare）を用いて１フローセルあたり約1000 RUを固定化した。【０１２２】
初めにクランピング抗体の結合特異性を評価する目的で、リガンドを37℃、流速10μL /minで60秒反応させて1000 RU捕捉し、100 nMに調製したアナライトを流速30μL /minで180秒間作用させ、結合量を測定した。リガンドを捕捉していないフローセルの値を差し引いて、リガンド1 RUあたりの結合量を算出した。図４に示すように、クランピング抗体は、ＣＤ３εエピトープ融合CE115HA146（CE115HAPG13）、ＣＤ３εエピトープ融合CE115HA056（CE115HAPG12）と結合したが、ＣＤ３抗体のみのCE115HA000、CE115HA056、CE115HA146あるいはＣＤ３εエピトープ融合GPC3抗体、陰性対照のIC17とはほとんど結合性を示さないことが明らかとなった。【０１２３】
次いでアフィニティを測定する目的で、リガンドを37℃で流速10μL /minで60秒反応させて75 RU補足して、アナライトとしてクランピング抗体由来Fab断片0、25、50、100、200、400 nMを流速30μL /minで180秒間作用させた後、300秒間解離を観察した。センサーチップはGlycine1.5と25 mM NaOHをそれぞれ流速30μL/minで15秒間流して再生させた。測定で得られたセンサーグラムから算出されたカイネティクスパラメーターである結合速度定数ka（1/Ms）、および解離速度定数kd（1/s）をもとに解離定数KD（M）を算出した。各パラメーターの算出にBiacore T200 Evaluation Software（GE Healthcare）を用いた。得られたKD値を表1に示す。【０１２４】
【表１】
2019160007.tif 000004
N. D. not determined【０１２５】
ＣＤ３εエピトープ融合ＣＤ３抗体とクランピング抗体との複合体の形成は結晶構造解析でも確認された。【０１２６】
［実施例５］
Bio-layer Interferometry （BLI）によるＣＤ３εδとの結合性評価
（１）ビオチン化ヒトＣＤ３εδヘテロダイマーの調製
ビオチン化ヒトＣＤ３εδヘテロダイマー（以下ＣＤ３εδ）は当業者公知の方法で調製した。具体的には、ヒトＣＤ３εの細胞外領域をコードする遺伝子断片の下流に抗体の定常領域をコードする遺伝子断片、TEVプロテアーゼで切断される配列（ENLYFQG、配列番号：67）をコードする遺伝子断片とビオチンリガーゼによってビオチンが付加されるAvi tag（GLNDIFEAQKIEWHE、配列番号：68）をコードする遺伝子断片をグリシンとセリンで構成されるリンカーをコードする遺伝子断片を介して連結した。ヒトＣＤ３εの細胞外領域、抗体の定常領域、TEVプロテアーゼ切断配列とAvi tagが連結されたタンパク質（Fc融合型ヒトＣＤ３ε、配列番号：69）をコードする遺伝子断片を動物細胞発現用ベクターに組み込んだ。次に、ヒトＣＤ３δの細胞外領域をコードする遺伝子断片の下流に抗体の定常領域をコードする遺伝子断片とFlag tag（DYKDDDDK、配列番号：70）をコードする遺伝子断片を連結した。ヒトＣＤ３δの細胞外領域、抗体の定常領域、Flag tagが連結されたタンパク質（Fc融合型ヒトＣＤ３δ、配列番号：71）をコードする遺伝子断片を動物細胞発現用ベクターに組み込んだ。構築された2種類のプラスミドベクターはExpiFectamine 293（Thermo Fisher Scientific）を用いてFreeStyle 293F細胞 (Invitrogen)に導入された。遺伝子導入の際に、ＣＤ３εのAvi tagをビオチン化する目的でビオチンリガーゼ（BirA、配列番号：72）を発現する遺伝子とビオチンを添加した。遺伝子導入した細胞を37℃、8% CO2で培養し、目的タンパク質を培養上清中に分泌させた。この細胞培養液を0.22μmボトルトップフィルターでろ過し、培養上清を得た。【０１２７】
培養上清をEshmuno A 樹脂（Merck Millipore）を用いて作製したカラムに添加し、目的のタンパク質をカラムに結合させた。次いで20 mM クエン酸ナトリウムpH 2.7溶液を用いて溶出した。溶出画分を中和したのち、Anti-FLAG M2 agarose樹脂（Sigma-Aldrich）を用いて作製したAnti-FLAG M2カラムに添加して吸着させ、D-PBS(-)に溶解したFLAGペプチドで目的タンパク質を溶出した。この溶出液を、Superdex 26/600 (GE healthcare)を用いたゲルろ過クロマトグラフィーによって、会合体とFLAGペプチドを除去して精製ＣＤ３εδを得た。得られた精製タンパク質の濃度は実施例３（１）でのタンパク質の濃度の算出と同様の方法で算出した。【０１２８】
（２）ワンアーム抗体の調製
抗原であるＣＤ３εδと抗体を１：１で結合させる目的で、ワンアーム型の抗体CE115HA000 one arm（CE115HA000-pE22Hh/GLS3000-k0//Kn010、配列番号：73、20、74）、CE115HA056 one arm（CE115HA056- pE22Hh/GLS3000-k0//Kn010、配列番号：75、20、74）、CE115HA146 one arm（CE115HA146-pE22Hh/GLS3000-k0//Kn010、配列番号：76、20、74）および陰性対照の抗KLH抗体IC17 one arm（IC17Hdk-pE22Hh/IC17L-k0//Kn010、配列番号：77、66、74）を調製した。それぞれの抗体重鎖をコードする遺伝子、軽鎖をコードする遺伝子とともに可変領域を持たない抗体断片をコードする遺伝子をExpiFectamine293（Thermo Fisher Scientific）を用いてExpi293Fに導入し、実施例４（１）と同様の方法で精製抗体を調製した。【０１２９】
（３）Octetによる三者複合体形成の評価
Octet RED 384（ForteBio）を使用してストレプトアビジンセンサー（ForteBio）に、ACESにて0.2μM調製したＣＤ３εδを37℃、300秒間反応させた。次いで0、111、333、1000 nMのCE115HA000 one arm、CE115HA056 one arm、CE115HA146 one armおよび陰性対照のIC17 one armを120秒間反応させた後、1μMのクランピング抗体Fab断片（実施例４（１）参照）含有HBS-EP(+)バッファー中で120秒間解離をモニターした。３秒ごとのレスポンス値を抽出し、Microsoft Excel 2013（Microsoft）を用いてグラフを作製した。図5に示すように、ランニングバッファーのみ、あるいは陰性対照のIC17 Fabを添加した場合は、ＣＤ３抗体の速やかな解離が認められたのに対し、クランピング抗体CLA0022、CLA0028、CLA0311、CLA0334より調製したFabを添加した場合には、抗ＣＤ３抗体の結合レスポンスにさらなるレスポンスの増加、あるいは解離の遅延が認められたことから、クランピング抗体の添加によりＣＤ３εδと抗ＣＤ３抗体複合体が安定化されていると考えられた。【０１３０】
［実施例６］
ヒト末梢血単球（PBMC）を用いたTDCC活性評価
（１）ヒトPBMC溶液の調製
1000 単位/mL のヘパリン溶液（ノボ・ヘパリン注5千単位，ノボ・ノルディスク）が予め200μL注入された注射器を用い、中外製薬株式会社所属の健常人ボランティアより末梢血50 mLを採取した。PBS（-）を用いて2倍に希釈された当該末梢血を4等分し、15 mLのFicoll-Paque PLUSが予め注入されて遠心操作が行なわれたLeucosepリンパ球分離管（Greiner bio-one）に加えた。当該末梢血が分注された分離管が1,000 x gの速度によって10分間室温にて遠心分離の操作をした後、単核球画分層を分取した。10%FBSを含むRPMI-1640 Medium（以下10%FBS/RPMI）10 mLによって1回当該各分層に含まれる細胞を洗浄した後、標的細胞に応じて10%FBS/RPMI、Dulbecco's Modified Eagle's Medium（以下10%FBS/D-MEM）、Eagle's Minimal Essential Medium（以下10%FBS/E-MEM）を用いて当該細胞が5×105 細胞/mLもしくは1×106 細胞/ mLとなるように懸濁し、ヒトPBMC溶液として以後の実験に供した。【０１３１】
（２）標的細胞の調製
SK-pca60（GPC3 陽性細胞）、NCI-H446（ATCC HTB-171, GPC3 陽性細胞）、ヒトEREGをSK-HEP-1細胞に強制発現させたSKE-4B2（ヒトEREG陽性細胞）、ヒトEREGとヒトGPC3をSK-HEP-1に強制発現させたhEREG/SK-pca60（ヒトEREG、GPC3陽性細胞）をCell dissociation bufferにてディッシュから剥離し、SK-pca60が10%FBS/D-MEM中にその細胞密度が6×104 細胞/mL、NCI-H446が10%FBS/RPMI中にその細胞密度が2×105 細胞/mL、SKE-4B2が10%FBS/E-MEM中にその細胞密度が1×105 細胞/mL、hEREG/SK-pca60が10%FBS/E-MEM中にその細胞密度が1×105 細胞/mLとなるように懸濁した。当該細胞懸濁液を標的細胞として以後の実験に供した。【０１３２】
（３）BiAbの調製
GCH065-F760mnN17/L0011-k0（配列番号：17、18）、EGLVH-F760mnN17/EGLVL-KT0（配列番号：78、79）、CE115HA000-F760mnP17/GLS3000-k0（配列番号：63、20）、CE115HA056-F760mnP17/GLS3000-k0（配列番号：64、20）、CLA0028VH-F760-mnP17/CLA0028VL-k0C（配列番号：55、56）、IC17Hdk-F760mnN17/IC17L-k0（配列番号：65、66）の各抗体は、それぞれの重鎖、軽鎖遺伝子を組み込んだ発現ベクターをExpiFectamine293（Thermo Fisher Scientific）を用いてExpi293F細胞（Thermo Fisher Scientific）に導入し、実施例４（１）と同様の方法で精製抗体を調製した。【０１３３】
得られた抗体を以下の組み合わせで等量（200μgまたは500μg）混合し、TBS（タカラバイオ）にて250 mMに調製した2-MEA（Sigma-Aldrich）を1/10量添加して、500μLまたは1000μLのスケールで実施した。本反応溶液を37℃で90分間加温した後、PD-Minitrap G-25あるいはPD-Miditrap G25（GE Healthcare)を用いて2-MEAの除去およびD-PBS(-)（和光純薬)への置換を行った。調製したBiAbを以下に示す。【０１３４】
【表２】
2019160007.tif 000005
【０１３５】
（４）細胞傷害アッセイ（TDCC assay）
xCELLigence（ACEA Biosciences）を用い、電極への細胞接着に伴い生じる電気抵抗値を測定することにより、TDCC活性を評価した。まず、RTCA Resistor プレート 96に標的細胞調製に用いた培地を50μL/wellで添加し、バックグラウンド値を補正した。【０１３６】
次に、実施例６（２）のように調製した標的細胞懸濁液を50 μL/well（SK-pca60：3×103 細胞/well、NCI-H446：1×104細胞/well、SKE-4B2：5×103 細胞/well、hEREG/SK-pca60：5×103 細胞/well）で播種し、xCELLigenceへ当該プレートを設置後、37℃、5% CO2条件下で一晩培養した。標的細胞がSK-pca60の場合は細胞を播種した翌日に各濃度（0、0.008、0.08、0.8、8、 80μg/mL）になるように調製したBiAb2 を25 μL/wellと各濃度（0、0.0008、0.008、0.08、0.8、8 μg/mL）に調製したBiAb1 を25 μL /wellで添加した。その後、標的細胞の10倍量の細胞数を含むヒトPBMC懸濁液を50 μL/wellで添加し、xCELLigenceへ当該プレートを設置後、37℃、5% CO2条件下で36時間培養し、その間の電気抵抗値（Cell index）を10分間隔で経時的に測定した。
一方、NCI-H446、SKE-4B2、hEREG/SK-pca60を標的細胞として使用した場合には、細胞を播種した翌日に各濃度（0、0.008、0.08、0.8、8 μg/mL）になるように調製したBiAb2 を25 μL/wellと各濃度（0、0.008、0.08、0.8、8 μg/mL）に調製したBiAb1 を25 μL /wellで添加した。その後、標的細胞の5倍量の細胞数を含むヒトPBMC懸濁液を50 μL/wellで添加し、xCELLigenceへ当該プレートを設置後、37℃、5% CO2条件下で120時間培養し、その間の電気抵抗値（Cell index）を10分間隔で経時的に測定した。
TDCC活性の指標として細胞増殖阻害率（CGI）を下記の式２により算出した。【０１３７】
（式２）
2019160007.tif 000006
【０１３８】
上式２において、使用したCell Indexは全て抗体添加後の最初の抵抗値測定ポイントを1とするDelta Cell Indexを用いて計算した。Xは抗体非添加ウェルの最終測定ポイントにおけるDelta Cell Indexの平均値、Yは抗体添加ウェルの最終測定ポイントにおけるDelta Cell Indexの平均値、Aは同一標的細胞の異なる複数のプレートにおける陽性対照BiAb (SK-pca60、NCI-H446、hEREG/SK-pca60はGCH065/CE115HA000、SKE-4B2ではEGL/CE115HA000) 0.1 μg/mLのみ添加時の最終測定ポイントのDelta Cell Index平均値を平均した値、Bは同一標的細胞の各プレートにおける陽性対照BiAb（SK-pca60、NCI-H446、hEREG/SK-pca60はGCH065/CE115、SKE-4B2ではEGL/CE115）0.1 μg/mLのみ添加時の最終測定ポイントのDelta Cell Index平均値を表す。BをAで除した項は同一標的細胞に対するTDCC活性のプレート間の補正項として用いた。【０１３９】
初めにGCH065/CE115HA056をBiAb1、GCH065/CL0028をBiAb2として使用し、抗原結合依存的なTDCC活性を評価した。標的細胞はGPC3を定常発現しているSK-pca60細胞を用い、BiAb単独でTDCC活性を発揮するGCH065/CE115HA000を陽性対照として用いた。図６左側に示すように、GCH065/CE115HA000は添加量0.001 μg/mLから顕著なTDCC活性を示し、0.01 μg/mL以上ではプラトーに達した。一方、BiAb1のGCH065/CE115HA056単独ではTDCC活性を示さないが、GPC3に結合するクランピング抗体BiAb2の添加によってTDCC活性を示すことが明らかとなった。0.01 μg/mLのBiAb2存在下で、BiAb１の濃度依存的なTDCC活性が認められた。BiAb2濃度0.1〜10 μg/mLの添加で陽性対照のGCH065/CE115HA000とほぼ同等のTDCC活性をBiAb1が示すことが明らかとなった。一方図6右側に示すように、抗原結合能を持たないクランピング抗体IC17/CLA0028をBiAb2として添加した場合には、顕著なTDCC活性が認められなかった。【０１４０】
次にGPC3とEREGを用いて、二重陽性細胞特異的なTDCC活性を評価した。陽性対照としてGCH065/CE115HA000、EGL/CE115HA000を用いた。図７に示したように、GCH065/CE115HA000およびEGL/CE115HA000はそれぞれの抗原単陽性の細胞NCI-H446（GPC3）、SKE-4B2（EREG）に対しTDCC活性を示し、二重陽性細胞hEREG/SK-pca60（EREG/GPC3）に対しては両抗体がTDCC活性を示した。BiAb1のGCH065/CE115HA056を単独で作用させた場合はいずれの細胞株に対してもTDCC活性を示さなかったが、1 μg/mLのBiAb2、EGL/CLA0028の存在下では抗原二重陽性細胞のhEREG/SK-pca60に対してのみTDCC活性を示した。これに対し、抗原結合能をもたないBiAb2、IC17/CLA0028が1 μg/mL存在する条件では、すべての細胞株に対して、GCH065/CE115HA056はTDCC活性を示さなかった。【０１４１】
以上の結果より、抗原二重陽性の細胞に特異的にTDCC活性を発揮する抗体を作出することに成功した。【０１４２】
［実施例７］
抗体ライブラリからのアデノシン結合抗体とアデノシンまたはアデノシン誘導体の複合体を認識するクランピング抗体の取得
国際公開第２０１５／１５６２６８号に記載のナイーブヒト抗体ファージディスプレイライブラリ及び合成ヒト抗体ファージディスプレイライブラリからファージディスプレイ法により、アデノシン結合抗体とアデノシンまたはアデノシン誘導体の複合体に結合するクランピング抗体を取得した。国際公開第２０１５／０８３７６４号で取得された重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を参照し、SMB0002hH-G1m3/SMB0002hL-k0a（配列番号：80、81）をアデノシン結合抗体として用いた。すなわち、磁性ビーズにキャプチャーされたアデノシン結合抗体SMB0002hH-G1m3/SMB0002hL-k0aにアデノシンまたはアデノシン誘導体の存在下で結合活性を示し、SMB0002hH-G1m3/SMB0002hL-k0aに1アミノ酸置換しアデノシン結合活性が減弱された変異体であるSMBh068-G1m3/SMB0002hL-k0a（配列番号：82、81）、SMBh508-G1m3/SMB0002hL-k0a（配列番号：83、81）、SMBh606-G1m3/SMB0002hL-k0a（配列番号：84、81）、SMB0002hH-G1m3/SMBl234-k0a（配列番号：80、85）及びSMB0002hH-G1m3/SMBl255-k0a（配列番号：80、86）には結合活性を示さないファージが回収された。本取得方法では、パンニング抗原としてEZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin （Thermo Fisher Scientific）を用いて当業者公知の方法でビオチン標識されたアデノシン結合抗体とその変異体が用いられた。【０１４３】
当業者公知の方法で構築されたナイーブヒト抗体ライブラリまたは合成ヒト抗体ライブラリのファージディスプレイファージミドベクターを保持する大腸菌に対して、国際公開第２０１５／０４６５５４号に記載のヘルパーファージM13KO7TCを感染させ、30℃で一晩培養した上清からファージが回収された。ファージ産生が行われた大腸菌の培養液に5分の1倍液量の2.5 M NaCl/10% PEGを添加することによって沈殿させたファージの集団をTBSにて希釈することによって、抗体提示ファージライブラリ液が調製された。次に、当該ファージライブラリ液に終濃度4%となるようにBSAが添加された。磁気ビーズに固定化された抗原を用いたパンニングが実施された。磁気ビーズとして、Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated (Thermo Fisher Scientific)、FG beads NeutrAvidin (多摩川精機)もしくはDynabeads MyOne Streptavidin T1（Thermo Fisher Scientific）が用いられた。【０１４４】
1回目のパンニングでは、まずアデノシン非存在下でアデノシン結合抗体に結合するファージを除くために、アデノシン結合抗体のアデノシン結合が減弱された5種類の変異体（SMBh068-G1m3/SMB0002hL-k0a、SMBh508-G1m3/SMB0002hL-k0a、SMBh606-G1m3/SMB0002hL-k0a、SMB0002hH-G1m3/SMBl234-k0a及びSMB0002hH-G1m3/SMBl255-k0a）を用いたネガティブセレクションが実施された。具体的には、BSAでブロッキングされたSera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coatedに上述の方法でビオチン標識されたSMB0002hH-G1m3/SMB0002hL-k0aの5種類の変異体を当モル量混合した溶液を添加し、合計2000 pmolの変異体をビーズに加えて室温で15分間反応させた。TBSで3回洗浄されたビーズに対して、BSAにてブロッキングが行われたファージライブラリ液0.5 mLを加え室温にて1時間結合させた。磁気スタンドを用いてビーズを分離することによって、抗原およびビーズに結合しないファージが回収された。【０１４５】
それに続き、アデノシンの存在する条件下でSMB0002hH-G1m3/SMB0002hL-k0aに対して結合する抗体のセレクションが実施された。上述の方法で回収されたファージに対して、700 pmolのビオチン標識SMB0002hH-G1m3/SMB0002hL-k0aならびに終濃度500 μMのアデノシンを加えることによって、ファージライブラリを室温で15分間抗原ならびにアデノシンと接触させた。その後、4℃で45分間接触させた。次に、当該標識抗原ならびにアデノシンとファージライブラリとの混合液にBSAでブロッキングされた磁気ビーズFG beads NeutrAvidinまたはDynabeads MyOne Streptavidin T1を加え、4℃で30分間、抗原とアデノシン及びファージの複合体を磁気ビーズと結合させた。ビーズは1 mLの氷冷されたアデノシン/TBST（500 μM アデノシン、0.1% Tween 20、TBS buffer）にて1回、氷冷されたアデノシン/TBS（500 μM アデノシン、TBS buffer）にて1回洗浄された。その後、終濃度25 mM となるようにDTT溶液が添加され、室温で10分間撹拌された後、磁気スタンドを使用して分離されたビーズからファージが回収された。さらに、終濃度1 mg/mLとなるようにトリプシン溶液が当該混合液に加えられた。当該混合液は室温で15分間攪拌された後、磁気スタンドを使用して分離されたビーズからファージが回収された。回収されたファージは、対数増殖期（OD600が0.4-0.7）となった20 mLの大腸菌株ER2738に添加された。37℃で1時間緩やかに上記大腸菌の攪拌培養を行うことによって、ファージを大腸菌に感染させた。感染させた大腸菌は225 mm x 225 mmのプレート培地へ播種された。次に、播種された大腸菌の培養液に対してM13KO7TCを感染させ、30℃で一晩培養した上清からファージを回収することによって、抗体提示ファージライブラリ液が調製された。【０１４６】
調製した抗体提示ファージライブラリ液を用いて、同様の方法で2回目以降のパンニングが実施され、5回目のパンニングまで実施された。ただし、ネガティブセレクションにおいては2回目のパンニングでは800 pmol、3回目以降は400 pmolの抗原が用いられた。また、ネガティブセレクション後に抗原として用いたSMB0002hH-G1m3/SMB0002hL-k0aについては、2回目のパンニングでは300 pmol、3回目以降は150 pmolの抗原が用いられた。SMB0002hH-G1m3/SMB0002hL-k0aとアデノシン及びファージとの複合体を磁気ビーズと結合させた後のビーズの洗浄操作においては、2回目のパンニングではアデノシン/TBSTで2回洗浄後にアデノシン/TBSで1回洗浄された。3回目以降のパンニングでは、アデノシン/TBSTで3回洗浄後にアデノシン/TBSで2回洗浄された。パニングを実施した後、回収したファージを大腸菌に感染させ、大腸菌をプレート培地へ播種することでファージが感染した大腸菌のシングルコロニーを得た。
同様のパンニング操作をアデノシン誘導体を添加して実施した。【０１４７】
［実施例８］
ファージELISAによるアデノシン結合抗体とアデノシンの複合体に対する結合活性の評価
実施例７で得られた大腸菌のシングルコロニーから常法（Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145）に倣い、ファージ含有培養上清が回収された。大腸菌のシングルコロニーから当業者公知の方法で抗体遺伝子の塩基配列を決定した。回収された培養上清はNucleoFast 96（MACHEREY-NAGEL）を用いて限外ろ過された。培養上清各200 μLが各ウェルにアプライされたNucleoFast 96を遠心分離（6000×g、4℃、40分間遠心）することによってフロースルーが除去された。200 μLのH2Oが各ウェルに加えられた当該NucleoFast 96が、再度遠心分離（6000×g、4℃、20分間遠心）によって洗浄された。最後にTBS 200 μLが加えられ、室温で5分間静置された当該NucleoFast 96の各ウェルの上清に含まれるファージが精製ファージとして回収された。TBS、もしくはアデノシン/TBSが加えられた精製ファージが以下の手順でELISAに供された。384 well Microplates Streptavidin-coated（Greiner Bio-One）が上述のビオチン標識されたSMB0002hH-G1m3/SMB0002hL-k0aまたはその変異体5種類を25 pmol/mLの濃度で含む10 μLのTBSにて1時間以上コートされた。当該プレートの各ウェルをTBSTにて洗浄することによってプレートへ結合していないビオチン標識抗原が除かれた後、当該ウェルが80 μLの2%スキムミルク-TBSにて1時間以上ブロッキングされた。2%スキムミルク/TBSを除き、その後、各ウェルに精製ファージが加えられた当該プレートを室温で1時間静置することによって、ファージが提示する抗体を各ウェルに存在するビオチン標識抗原に終濃度500 μMのアデノシンの存在下または非存在下において結合させた。アデノシン/TBSTもしくはTBSTにて洗浄された各ウェルに、アデノシン/TBSTもしくはTBSTによって希釈されたHRP結合抗M13抗体（GE Healthcare）が添加されたプレートを１時間インキュベートさせた。アデノシン/TBSTもしくはTBSTにて洗浄後、TMB single溶液（ZYMED）が添加された各ウェル中の溶液の発色反応が硫酸の添加により停止された後、450 nmの吸光度によって当該発色が測定された。また、同様のスクリーニングをアデノシン誘導体を用いて実施した。その結果、アデノシンまたはアデノシン誘導体の存在下においてSMB0002hH-G1m3/SMB0002hL-k0aに対して結合し、アデノシンまたはアデノシン誘導体の非存在下で結合しない抗体提示ファージが複数確認された。また、それらのうちアデノシンまたはアデノシン誘導体の存在下でSMB0002hH-G1m3/SMB0002hL-k0aのアデノシン結合能を減弱した変異体5種類の混合液を固定したプレートに結合しないファージが複数確認された。これらの結果から、抗体提示ファージライブラリからアデノシン結合抗体に対してアデノシンまたはアデノシン誘導体の存在下でのみ結合活性を示す抗体を取得できることが示された。ファージELISAで評価した768クローンの内、そのような結合能を示し重複配列を除いた40種類の抗体がアデノシン結合抗体とアデノシンまたはアデノシン誘導体の複合体を認識するクランピング抗体の候補として取得された。【０１４８】
［実施例９］
ビオチン標識SMB0002Fabの調製
SMB0002の軽鎖のC末端にTEVプロテアーゼ切断配列及びAviTag配列をリンカーを介して連結させたSMB0002hL-k0aTEVBAP（配列番号：87）をコードする遺伝子断片を動物発現用ベクターに導入した。SMB0002hH-G1m3及びSMB0002hL-k0aTEVBAPの動物発現用ベクターを293Fectin (Life Technologies)を用いてExpi293細胞 (Life Technologies)に導入した。このときEBNA1を発現する遺伝子およびビオチンリガーゼ（BirA）を発現する遺伝子を同時に導入し、さらにSMB0002hH-G1m3/SMB0002hL-k0aTEVBAP（配列番号：80、配列番号：87）の軽鎖のＣ末端をビオチン標識する目的でビオチンを添加した。抗体の発現ベクターが導入された細胞を37℃、8% CO2で培養し、軽鎖のＣ末端がビオチン標識されたSMB0002hH-G1m3/SMB0002hL-k0aTEVBAPを培養上清中に分泌させた。この細胞培養液を遠心分離し、上清をSARTPORE 2 300 (Sartorius) でろ過することで培養上清を得た。培養上清をD-PBS(-)で平衡化した5 mLサイズのProtein A担体カラムHiTrap MabSelect Sure pcc（GE Healthcare）に添加し、5 mL/min で4カラムボリュームの50 mM 酢酸緩衝液を添加することで抗体を溶出し、1.5 M Tris-HCl, pH 7.4 を添加して中和することで、抗体の精製画分とした。
抗体の精製画分をJumbosep 30K disc (Pall) により100 mM Tris-HCl, pH 8.0 に緩衝液を交換して濃縮した後、100 mM Tris-HCl pH 8.0にて2 mg/mLに希釈した。希釈した全長抗体に対し質量比で2000分の1倍量のLys-C（Roche）を加え、35℃に2.5時間静置した。その後、cOmplet EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail（Roche）2錠を10 mLのMQに溶かした溶液を10分の1倍量加えることで反応を停止した。【０１４９】
次にこのサンプルを D-PBS(-) で平衡化した5 mL のHiTrap Mabselect Sure pcc とタンデムに連結した5 mL のHiTrap Mabselect Sure に添加し、フロースルーを回収した。回収したサンプルに 6分の1倍液量の1 M Arginine-HCl を添加し、Jambosep 10 Kを用いて濃縮した。これをD-PBS(-) で平衡化したゲル濾過カラム Superdex 75 pg 26/60 (GE Healthcare) で分離し、精製した。
これをAmicon-Ultra 15 10K (Merck Millipore) にて濃縮後、その1.6倍液量の8M Ureaを含むD-PBS(-)を添加した。その後、Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes 20K (Thermo Fisher Scientific)を用いて、透析外液として十分液量の6M Urea、4M Urea 及び 2M Ureaを含むD-PBS(-)中で段階的に透析を行った後、D-PBS(-)で2回透析を行い、調製したFabフラグメントのリフォールディングを行った。そして、Amicon-Ultra 4 10K (Merck Millipore) にてリフォールディング後のFab溶液を濃縮し、Millex GV filter unit 0.22 um (Merck Millipore) で濾過し、軽鎖のＣ末端がビオチン標識されたSMB0002hH-G1m3/SMB0002hL-k0aTEVBAPの精製Fabフラグメントを得た。これをビオチン標識SMB0002Fabとする。【０１５０】
［実施例１０］
取得された抗体のBLI法を用いたアデノシンクランピング抗体のアデノシン結合抗体とアデノシンの複合体への結合評価
実施例８で取得されたアデノシンクランピング抗体の重鎖および軽鎖の可変領域配列は、重鎖抗体定常領域、軽鎖kappa定常領域配列、もしくは軽鎖lambda定常領域配列を有する動物発現用プラスミドへとそれぞれ挿入され、抗体の発現ベクターが作成された。得られた発現ベクターの塩基配列は当業者公知の方法で決定した。【０１５１】
抗体の発現ベクターをFreeStyle293F細胞(Thermo Fisher Scientific) またはExpi293細胞 (Thermo Fisher Scientific)に、一過性に導入し、抗体の発現を行った。得られた培養上清から、rProtein A Sepharose（登録商標）Fast Flow （GE Healthcare）またはBravo AssayMAP (Agilent)とProtein A (PA-W) Cartrige (Agilent)を用いて当業者公知の方法で、抗体を精製した。精製抗体濃度は、分光光度計を用いて280 nmでの吸光度を測定し、得られた値からPACE法により算出された吸光係数を用いて抗体濃度を算出した（Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423）。【０１５２】
調製された各精製抗体とアデノシン結合抗体のアデノシンの複合体への結合評価を、OctetHTX (ForteBio)を用いて行った。具体的には、Dip and ReadTM Streptavidin (SA) Biosensors (ForteBio)にTBSまたはアデノシン/TBSで調製された実施例９に記載の方法で調製されたビオチン標識SMB0002FabまたはEZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotinでビオチン標識されたSMB0002hH-G1m3/SMB0002hL-k0aを結合させた。続けてTBSまたはアデノシン/TBSで10 μg/mLに調製された各精製抗体を作用させて、30℃における結合を評価した。OctetHTXで測定した継時的な結合量を表すセンサーグラムを図８に示した。SC001（重鎖／軽鎖（配列番号：88、89））、SC002（重鎖／軽鎖（配列番号：90、91））、SC003（重鎖／軽鎖（配列番号：123、124））、SC014（重鎖／軽鎖（配列番号：92、93））、SC016（重鎖／軽鎖（配列番号：94、95））、SC019（重鎖／軽鎖（配列番号：96、97））、SC032（重鎖／軽鎖（配列番号：125、126））、SC034（重鎖／軽鎖（配列番号：127、128））、SC044（重鎖／軽鎖（配列番号：129、130））、SC045（重鎖／軽鎖（配列番号：131、132））、SC048（重鎖／軽鎖（配列番号：133、134））はアデノシン非存在下と比較して、アデノシンの存在下でビオチン標識SMB0002Fab及びビオチン標識SMB0002hH-G1m3/SMB0002hL-k0に高い結合シグナルを示した。一方、SC009（重鎖／軽鎖（配列番号：98、99））はアデノシン存在下と非存在下でビオチン標識SMB0002Fab及びビオチン標識SMB0002hH-G1m3/SMB0002hL-k0に同程度の結合シグナルを示した。【０１５３】
［実施例１１］
SPR法を用いたアデノシンクランピング抗体のアデノシン結合抗体とアデノシンの複合体への結合評価
実施例１０で取得されたアデノシン結合抗体とアデノシンの複合体に結合するクランピング抗体について、アデノシン存在下におけるアデノシン結合抗体へのアフィニティがBiacore T200 (GE Healthcare) を用いて解析された。アミンカップリング法でprotein G（Invitrogen）が適当量固定化されたSensor  chip CM4（GE Healthcare）上に目的の抗体がキャプチャーされた。ランニングバッファーには20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05% (w/v) Tween20または20 mM  ACES、150 mM NaCl、0.05% (w/v) Tween20、500 μMアデノシンの2種類のバッファーが用いられた。実施例９で調製されたビオチン標識SMB0002Fabがそれぞれのランニングバッファーで、終濃度250 nM、62.5 nM、15.6 nMで調製され、Biacore T200 Control Software (GE Healthcare) のsingle cycle kinetic機能を用いて流速 30 μL/minで各リガンド濃度の結合時間3分、解離時間5分の条件で各抗体とSMB0002Fabの結合が測定された。その後、10 mM Glycine-HCl（pH 2.5）と10 mM NaOHを流速30 μL/minでそれぞれ10秒間インジェクトすることによって、センサーチップが再生された。測定は全て25℃で実施された。前記の方法により測定された500 μMのアデノシン（ADO）存在下と非存在下における各抗体とSMB0002Fabのアフィニティが図９に示されている。SC001, SC002, SC003, SC014, SC016, SC019, SC032, SC044, SC045, SC048はアデノシン非存在下と比較して、アデノシン存在下でアデノシン結合抗体であるSMB0002Fabに対する結合のKD値が小さく、アデノシン存在下でアデノシン結合抗体により強く結合することが確認された。アデノシン非存在下におけるSC001とSC019のアデノシン結合抗体に対する結合活性は低かったため、KD値が求められなかった。【０１５４】
［実施例１２］
SPR法を用いたアデノシンクランピング抗体によるアデノシン結合抗体とアデノシンの結合活性増強能の評価
実施例１０で取得されたアデノシン結合抗体とアデノシンの複合体に結合するクランピング抗体について、アデノシン濃度依存的なアデノシン結合抗体への結合がBiacore T200 (GE Healthcare) を用いて評価された。アミンカップリング法でprotein G（Invitrogen）が適当量固定化されたSensor  chip  CM4（GE  Healthcare）上に目的の抗体がキャプチャーされた。ランニングバッファーには20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05% (w/v) Tween20が用いられた。実施例９で調製された 500 nM のビオチン標識SMB0002Fabが終濃度100 μM、20 μM、4 μM、800 nM、160 nM、32 nM、6.4 nM、1.28 nMのアデノシンを含むランニングバッファーで調製され、流速 30 μL/minでの結合時間3分、解離時間5分の条件でインジェクトした際の、各抗体とSMB0002Fabの結合が測定された。その後、10 mM Glycine-HCl（pH 2.5）と10 mM NaOHを流速30 μL/minでそれぞれ10秒間インジェクトすることによって、センサーチップが再生された。測定は全て25℃で実施された。前記の方法により測定された各抗体と各濃度のアデノシン存在下における500 nM SMB0002Fabとの結合を測定したセンサーグラムを図１０に示す。また前記の結果から、Biacore T200 Evaluation Softwareを用いてsteady state analysisを実施し500 nM SMB0002Fab存在下におけるアデノシンへの各抗体の結合アフィニティのKD値を算出した結果を表３に示す。【０１５５】
【表３】
2019160007.tif 000007
【０１５６】
SC001, SC002, SC003, SC014, SC016, SC019, SC032, SC044, SC045, SC048はアデノシン濃度依存的にSMB0002Fab との結合レスポンスが増大することが観察された。実施例１０, １１, １２で得られた結果から、実施例７に記載のパニング方法でアデノシンのクランピング能を有する抗体を取得できることが示された。以上の結果から、クランピング抗体の取得は実施例３で取得されたCD3クランピング抗体に限定されず、アデノシンとアデノシン結合抗体に対してもクランピング抗体を取得できることが示された。【０１５７】
［実施例１３］
アデノシンクランピング抗体を用いたアデノシン依存的な細胞傷害活性の評価
アデノシン結合抗体SMB0002hH-F760mnP17/SMB0002hL-k0a（重鎖／軽鎖（配列番号：100、81））、CD3アゴニスト抗体CE115HA000-F760mnN17/L0011-k0a（重鎖／軽鎖（配列番号：135、105））、アデノシンクランピング抗体SC003H-F760mnP17/SC003L-SCL3（重鎖／軽鎖（配列番号：136、124）、GPC3結合抗体GCH065-F760mnN17/ L0011-k0a（重鎖／軽鎖（配列番号：104、105））、ネガティブコントロール抗体 IC17HdK-F760mnN17/IC17L-k0a（重鎖／軽鎖（配列番号：137、138））またはIC17HdK-F760mnP17/IC17L-k0a（重鎖／軽鎖（配列番号：139、138））が挿入されている動物発現用ベクターをExpi293細胞に導入し、37℃、8% CO2下で培養することで培養上清中に抗体を分泌させた。その後当業者公知の方法でMonoSpin ProA 96 ウェルプレートタイプ（GL Science）を用いて抗体を精製した。実施例３（３）に記載の方法で、アデノシン結合抗体とCD3結合抗体の二重特異性抗体 (SMB0002hH-F760mnP17/SMB0002hL-k0a//CE115HA000-F760mnN17/L0011-k0a)、及びアデノシンクランピング抗体とGPC3結合抗体の二重特異性抗体（SC003H-F760mnP17/SC003L-SCL3//GCH065-F760mnN17/ L0011-k0a）、また比較対照としてアデノシンクランピング抗体とKLH結合抗体の二重特異性抗体 (SC003H-F760mnP17/SC003L-SCL3//IC17HdK-F760mnN17/IC17L-k0a)、KLH結合抗体とGPC3結合抗体の二重特異性抗体（IC17HdK-F760mnP17/IC17L-k0a//GCH065-F760mnN17/ L0011-k0a）をそれぞれ調製した。【０１５８】
調製した2種類の二重特異性抗体とアデノシンを同時に添加した際のCD3アゴニスト活性をJurkat-NFAT レポーター細胞（NFAT luc2_jurkat cell）を用いて評価した。Jurkat-NFATレポーター細胞は、CD3を発現しているヒト急性Ｔ細胞性白血病由来細胞にNFAT応答エレメントとルシフェラーゼ (luc2P) が融合しているセルラインであり、CD3の下流のシグナルが活性化するとルシフェラーゼが発現する 。標的細胞としてヒト肝がん由来細胞株のSK-HEP-1にhuman GPC3を強制発現させて樹立されたSK-pca60細胞株を使用した。White-bottomed, 96-well assay plate (Costar)の各ウェルに、1.25E+04 cells /well, 7.50E+04 cells/wellとなるように標的細胞とレポーター細胞をそれぞれ加え、当該wellに終濃度 50 nMのアデノシン結合抗体とCD3結合抗体の二重特異性抗体及び終濃度100 nM のアデノシンクランピング抗体とGPC3結合抗体の二重特異性抗体または比較対照の二重特異性抗体の混合液を添加した。さらに、終濃度1 μM、10 μM、100 μM、500 μMのアデノシンを添加した。5% CO2存在下で37℃, 6時間インキュベートしたのち、Luciferase酵素活性をBio-Glo luciferase assay system (Promega) を使用して添付のprotocolに従って発光量を測定した。使用した抗体のリストを表４に示す。【０１５９】
【表４】
2019160007.tif 000008
【０１６０】
検出には2104 EnVisionを使用する。その結果、アデノシン結合抗体とCD3結合抗体の二重特異性抗体及びアデノシンクランピング抗体とGPC3結合抗体の二重特異性抗体の混合液を添加した際、アデノシン濃度依存的にルシフェラーゼの発光シグナルの上昇が観察され、アデノシン結合抗体とCD3結合抗体の二重特異性抗体及び比較対照の二重特異性抗体の混合液を添加した場合より高いシグナルを示した (図１１)。すなわち、アデノシンのクランピングによってアデノシン結合抗体とCD3結合抗体の二重特異性抗体及びアデノシンクランピング抗体とGPC3結合抗体の二重特異性抗体が標的細胞とレポーター細胞を近接させ、CD3を活性化できることが示された。【０１６１】
［実施例１４］
クランピング抗体の存在・非存在下での抗CD3抗体とＣＤ３εδとのSPRによる結合性評価
（１）固相化抗体の調製
CE115HA000-BS03a/GLS3000-k0(配列番号：140、20) CE115HA056-BS03a/GLS3000-k0(配列番号：141、20) CE115HA146-BS03a/GLS3000-k0(配列番号：142/20) IC17Hdk-BS03a/IC17L-k0(配列番号：143、66)、CLA0028VH-BS03b/CLA0028VL-k0C (配列番号：144、56) をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターをExpiFectamine293（Thermo Fisher Scientific）を用いてExpi293Fに導入し、培養5日目の培養上清を回収し、HiTrap MabSelect SuReを用いて同業者公知の方法で調製した。抗CD3抗体とクランピング抗体CLA0028とのBiAbの調製は実施例３（３）に示したFAE技術によって実施された。抗CD3抗体あるいは陰性対照のIC17抗体と、クランピング抗体CLA0028を500μgずつ混合し、D-PBS(-)（和光純薬）にて250 mMに調製した2-Mercaptoethylamine・HCl（2-MEA, Sigma-Aldrich）50μLを添加し、全量をD-PBS(-)バッファーで500 μLにメスアップした。本反応溶液を37℃で90分間加温した後、PD-minitrap G-25（GE Healthcare）を用いて2-MEAの除去およびD-PBS(-)（和光純薬)への置換を行った。得られた抗体の濃度は実施例３（１）でのタンパク質の濃度の算出と同様の方法で算出した。【０１６２】
（２）ヒトCD3εδヘテロダイマーの調製
ヒトＣＤ３εδヘテロダイマー（以下ＣＤ３εδ）は当業者公知の方法で調製した。具体的には、ヒトＣＤ３εの細胞外領域（１-１２９番目）をコードする遺伝子にFLAG tag（DYKDDDDK、配列番号70)および終始コドンをコードする遺伝子断片を連結した。ヒトCD3δの細胞外領域（１−１０６番目）をコードする遺伝子にHis tag（HHHHHH、配列番号166）および終始コドンをコードする遺伝子断片を連結した。ヒトCD3εの細胞外領域のC末側にFLAG tagが付加した可溶型ヒトCD3ε(配列番号167)をコードする遺伝子断片と、C末にHis tagが付加した可溶型ヒトCD3δ（配列番号168）をコードする遺伝子断片を動物細胞発現用ベクターに組み込んだ。構築された2種類のプラスミドベクターは293fectin（Thermo Fisher Scientific）を用いてFreeStyle 293F細胞 (Invitrogen)に導入された。遺伝子導入した細胞を37℃、8% CO2で培養し、目的タンパク質を培養上清中に分泌させた。この細胞培養液を0.22μmボトルトップフィルターでろ過し、培養上清を得た。【０１６３】
培養上清を蒸留水で3倍に希釈し、20 mM TrisHCl(pH 7.0)で平衡化したQ Sepharose HP（GE Healthcare）に吸着させたのち、20 mM TrisHCl, 1M NaCl(pH7.0)の緩衝液を用いて50%までの塩濃度の勾配により溶出した。目的タンパク質を含む画分を20mM NaPhosphate, 500mM NaCl, 20mM Imidazol pH7.5で平衡化したHisTrap HPカラム（GE Healthcare）に吸着させ、20mM NaPhosphate, 500mM NaCl, 500 mM Imidazol pH7.5を使用して50%までのimidazoleの濃度勾配により溶出した。目的のタンパク質を含む画分をAnti-FLAG M2 agarose樹脂（Sigma-Aldrich）を用いて作製したAnti-FLAG M2カラムに添加して吸着させ、D-PBS(-)に溶解したFLAGペプチドで目的タンパク質を溶出した。この溶出液をSuperdex 26/600 (GE healthcare)を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより、会合体とFLAGペプチドを除去して精製ＣＤ３εδを得た。得られた精製タンパク質の濃度は実施例３（１）でのタンパク質の濃度の算出と同様の方法で算出した。【０１６４】
（３）SPRによるクランピング抗体の結合性評価
センサーチップCM4にAcetate4.5（GE Healthcare）にて25 μg/mLに調製したSuRe protein A（GE Healthcare）をアミンカップリングキット（GE healthcare）を用いて１フローセルあたり約1200 RUを固定化した。
ランニングバッファーはHBS-EP+（GE Healthcare）を使用し、測定温度は37℃で実施した。それぞれの抗体を流速10μL /minで60秒反応させて1000 RU捕捉し、0 nM、4.8 nM、24 nM、 120 nM、 600 nM、 3000 nM、 15000 nMに調製したアナライトＣＤ３εδを流速30μL /minで60秒間作用させて結合相をモニターし、HBS-EP+を流速30μL /minで120秒間流して解離相をモニターした。センサーチップはGlycine1.5と25 mM NaOHをそれぞれ流速30μL/minで30秒間流して再生させた。測定で得られたセンサーグラムから算出されたカイネティクスパラメーターである結合速度定数ka（1/Ms）、および解離速度定数kd（1/s）をもとに解離定数KD（M）を算出した。各パラメーターの算出にBiacore T200 Evaluation Software（GE Healthcare）を用いた。得られたKD値を表５に示す。IC17アームとのBiAbで得られたKD値をCLA0028アームとのBiAbで得られたKD値を除した値からアフィニティ増強効果を算出した。その結果、CE115HA000アームのKD値は約30倍、CE115HA056は約200倍、CE115HA146は約70倍の増強が認められた。【０１６５】
【表５】
2019160007.tif 000009
【０１６６】
［実施例１５］
クランピング抗体のX線結晶構造解析
（１）抗体の調製
クランピング抗体の調製はCLA0028VH-F760mnP17/CLA0028VL-k0C（配列番号：55、56）をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターをExpiFectamine293（Thermo Fisher Scientific）を用いてExpi293Fに導入し、培養5日目の培養上清を回収し、HiTrap MabSelect SuReを用いて同業者公知の方法で調製した。ＣＤ３εのエピトープペプチドを融合したCD3抗体は、CE115HA146重鎖（CE115HAPG13-rabCH1hG1m、配列番号：6）と対応する軽鎖（GLS3000-rabk、配列番号：7）をコードする遺伝子を発現ベクターに組み込み、FreeStyle 293F細胞（Thermo Fisher Scinetific）にトランスフェクション試薬293fectin Tranfection Reagent（Thermo Fisher Scientific）を用い、メーカー提供のマニュアルに従って導入し、5日間培養した培養液からrProteinA Sepharose Fast Flow樹脂（GE Healthcare）によるアフィニティ精製にて調製した。【０１６７】
（２）CLA0028 Fab断片の調製
CLA0028VH-F760mnP17/CLA0028VL-k0Cサンプルは、Lys-C （Roche, 11047825001）用いて、35℃ × 2時間の条件でFabとFcに断片化された。次にHiTrap SP HP 1ml （GE Healthcare） + HiTrap MabSelect SuRe 1ml （GE Healthcare）によるカラム精製とHiLoad 16/600 Superdex 200 pg （GE Healthcare）によるSEC精製を経て、Fabサンプルが調製された。【０１６８】
（３）CLA0028 Fab - CE115HAPG13 Fab複合体の調製
得られたCLA0028 FabサンプルをCE115HAGP13-rabIgG/GLS3000-rabkサンプルに、モル比でCLA0028 Fabが少し過剰となるように加え、20mM HEPES pH7.3, 100mM NaCl をbufferとして用いたSuperdex 200 Increase 10/300 GL （GE Healthcare）によるSEC精製により、CLA0028 Fab - CE115HAGP13-rabIgG/GLS3000-rabk複合体サンプルが調製された。得られたサンプルは、Lys-C （Roche, 11047825001）用いて、室温下、一晩の条件でFabとFcに断片化、その後、切断サンプルを、HiTrap MabSelect SuRe 1ml GE Healthcare）に通すことで、Fc断片が除かれた。さらに、20mM HEPES pH7.3, 100mM NaCl をbufferとして用いたSuperdex 200 Increase 10/300 GL（GE Healthcare）によるSEC精製により、CLA0028 Fab - CE115HAPG13 Fab複合体サンプルが調製され、それを限外濾過濃縮することで結晶化用複合体サンプルが調製された。【０１６９】
（４）CLA0028 Fab - CE115HAPG13 Fab複合体結晶の作成
得られた結晶化用複合体サンプルを用いて、21℃条件下、シッティングドロップ蒸気拡散法による結晶化がおこなわれ、Morpheus（登録商標）（Molecular Dimensions)F10のリザーバー条件において、X線結晶構造解析に適した結晶が得られた。【０１７０】
（５）CLA0028 Fab - CE115HAPG13 Fab複合体結晶からのX線回折データ測定および結晶構造決定
得られた結晶は、Morpheus（登録商標）（Molecular Dimensions)F10のリザーバー溶液に浸漬されたのち、液体窒素にて凍結され、Swiss Light Source X10SAにてX線回折データが測定された。測定中、結晶は常に100 Kの窒素流下に置くことで、凍結状態が維持された。得られた回折画像は、autoPROC（Acta Cryst. D67: 293-302 (2011)）を用いて処理され、分解能2.5Åまでの回折強度データが取得された。
得られたX線回折強度データから、既知のFab結晶構造を探索モデルとして、Phaser（J. Appl. Cryst. (2007) 40, 658-674）による分子置換法を実施し、初期構造が決定された。その後、coot（Acta Cryst. D66: 486-501 (2010)）、refmac5（Acta Cryst. D67: 355-367 (2011)）ならびにphenix.refine（Acta Cryst. D68: 352-367 (2012)）によるモデル構築と精密化が繰り返され、最終的な精密化座標が得られた。その結晶学的統計値は表６に示される。【０１７１】
【表６】
2019160007.tif 000010
【０１７２】
（６）CLA0028 Fab-CE115HAPG13 Fab複合体の構造
図１２に示すように、CD3eのN末7残基ペプチドを挟み込む形で、CLA0028 FabとCE115HAPG13 Fabが複合体を形成、コンセプト通りのクランピング抗体が得られたことが確認された。【０１７３】
［実施例１６］
ヒトT細胞を用いたGPC3、CLDN6陽性細胞特異的なTDCC活性の評価
（１）エフェクター細胞の調製
当業者公知の方法に従い、PBMC (Stemcell)からT-cell isolation kit (Stemcell) を用いてT細胞を単離し、CD3/CD28ビーズ (Invitrogen) により増殖させ、保存した。その後の試験では一度保存した単離T細胞を凍結融解、培養した懸濁液をエフェクター細胞として用いた。【０１７４】
（２）標的細胞の調製
NCI-H446（GPC3 陽性細胞）、AGS（CLDN6 陽性細胞）、GM5.1（GPC3、CLDN6陽性細胞）を標的細胞として以後の実験に供した。【０１７５】
（３）BiAbの調製
先に記載した方法に従い、以下の表７に示すBiAbを調製した。【０１７６】
【表７】
2019160007.tif 000011
【０１７７】
（４）細胞傷害アッセイ（TDCC assay）
xCELLigence（ACEA Biosciences）を用い、電極への細胞接着に伴い生じる電気抵抗値を測定することにより、TDCC活性を評価した。まず、RTCA Resistor プレート 96に標的細胞調製に用いた培地を添加し、バックグラウンド値を補正した。
次に、実施例６のように調製した標的細胞懸濁液を播種し、xCELLigenceへ当該プレートを設置後、37℃、5% CO2条件下で一晩培養した。細胞を播種した翌日に最終濃度（0、0.4、2、10nM）になるようBiAb1を、最終濃度（10nM）となるようBiAb2 を各ウェルに添加した。その後、標的細胞の5倍量の細胞数を含むエフェクター細胞懸濁液を添加し、xCELLigenceへ当該プレートを設置後、37℃、5% CO2条件下で培養し、その間の電気抵抗値（Cell index）を10分間隔で経時的に測定した。
TDCC活性の指標として細胞増殖阻害率（CGI）を下記の式３により算出した。【０１７８】
（式３）
2019160007.tif 000012
【０１７９】
上式３において、使用したCell Indexは全て抗体添加後の最初の抵抗値測定ポイントを1とするDelta Cell Indexを用いて計算した。Xは抗体非添加ウェルの最終測定ポイントにおけるDelta Cell Indexの平均値、Yは抗体添加ウェルの最終測定ポイントにおけるDelta Cell Indexの平均値を表す。【０１８０】
図１３は、二重抗原結合（GPC3およびCLDN6）によるTDCC活性を示した図である。
GPC3とCLDN6を用いて、二重陽性細胞特異的なTDCC活性を評価した。陽性対照としてGCH065/CE115HA000（抗GPC3  TRAB）、AE3.20/CE115HA000（抗CLDN6 TRAB）を用いた。図１３に示したように、GCH065/CE115HA000およびAE3.20/CE115HA000はそれぞれの抗原単陽性の細胞NCI-H446（GPC3）、AGS（CLDN6）に対しTDCC活性を示し、二重陽性細胞GM5.1（GPC3/CLDN6）に対しては両抗体がTDCC活性を示した。
BiAb1のGCH065/CE115HA056とBiAb2のIC17/CLA0028を作用させた場合、BiAb1のIC17/CE115HA056とBiAb2のAE3.20/CLA0028を作用させた場合、BiAb1のIC17/CE115HA056とBiAb2のGCH065/CLA0028を作用させた場合はいずれの細胞株に対してもTDCC活性を示さなかったが、 BiAb1のGCH065/CE115HA056はBiAb2のAE3.20/CLA0028の存在下では抗原二重陽性細胞のGM5.1に対してのみTDCC活性を示した。
以上の結果より、抗原二重陽性の細胞に特異的にTDCC活性を発揮する抗体を作出することに成功した。【０１８１】
［実施例１７］
ヒトT細胞を用いたGPC3、HER2陽性細胞特異的なTDCC活性の評価
（１）エフェクター細胞溶液の調製
先に記載の方法により調製した単離T細胞をエフェクター細胞として、その後の実験に用いた。【０１８２】
（２）標的細胞の調製
NCI-H446（GPC3 陽性細胞）、NCI-N87（HER2陽性細胞）、GPC3発現NCI-N87（GPC3、HER2陽性細胞）を標的細胞として以後の実験に供した。【０１８３】
（３）BiAbの調製
先に記載した方法に従い、以下の表８に示すBiAbを調製した。【０１８４】
【表８】
2019160007.tif 000013
【０１８５】
（４）細胞傷害アッセイ（TDCC assay）
実施例１６に記載したxCELLigence（ACEA Biosciences）を用いた細胞傷害アッセイを行った。細胞を播種した翌日に最終濃度（0、0.08、0.4、2nM）になるようBiAb1を、最終濃度（5nM）となるようBiAb2 を各ウェルに添加した。その後、標的細胞の5倍量の細胞数を含むエフェクター細胞懸濁液を添加し、xCELLigenceへ当該プレートを設置後、37℃、5% CO2条件下で培養し、その間の電気抵抗値（Cell index）を10分間隔で経時的に測定した。【０１８６】
図１４は、二重抗原結合（GPC3およびHER2）によるTDCC活性を示した図である。    
GPC3とHER2を用いて、二重陽性細胞特異的なTDCC活性を評価した。陽性対照としてGCH065/CE115HA000（抗GPC3  TRAB）、HER2/CE115HA000（抗Her2  TRABを用いた。図１４に示したように、GCH065/CE115HA000およびHER2/CE115HA000はそれぞれの抗原単陽性の細胞NCI-H446（GPC3）、NCI-N87（HER2）に対しTDCC活性を示し、二重陽性細胞GPC3発現NCI-N87（GPC3/HER2）に対しては両抗体がTDCC活性を示した。
BiAb1のGCH065/CE115HA056とBiAb2のIC17/CLA0028を作用させた場合、BiAb1のIC17/CE115HA056とBiAb2のHER2/CLA0028を作用させた場合はいずれの細胞株に対してもTDCC活性を示さなかったが、 BiAb1のGCH065/CE115HA056はBiAb2のHER2/CLA0028の存在下では抗原二重陽性細胞のGPC3発現NCI-N87に対してのみTDCC活性を示した。
以上の結果より、抗原二重陽性の細胞に特異的にTDCC活性を発揮する抗体を作出することに成功した。【０１８７】
［実施例１８］
クランピング抗体を用いたCD8特異的なTRAB
ＣＤ３を介してＴ細胞をリクルートし活性化することによって抗腫瘍効果を発揮するbispecific抗体（T cell-Redirecting AntiBody）（「TRAB」と略称する。）は強力な抗腫瘍作用を有する一方で、その副作用としてサイトカインリリースシンドロームを誘導することが知られている（非特許文献: Journal for ImmunoTherapy of Cancer  2018. 6, 56）。
TRABによって誘導される抗腫瘍活性は主にCD8陽性T細胞が担う一方で、TRABによって誘導されるIL6のようなサイトカインリリースシンドロームの原因となるサイトカインは主にCD4陽性T細胞から放出されることが報告されている（非特許文献  Immunology. 2017 152(3):425-438.）。CD8陽性T細胞のみをエフェクター細胞として用いるTRABを作ることができれば、サイトカインリリースの副作用は抑えつつ、TRABの強力な抗腫瘍活性を維持した理想的な薬剤となることが期待される。このように、二重陽性細胞（今回の例の場合は、CD3/CD8発現細胞）のみを利用する技術を用いることで、より優れたTRABを開発することができる。
以下の実施例ではクランピング抗体（第２の抗原結合分子）が認識する第３の抗原を癌抗原ではなく、免疫関連分子のCD8とした。第１の抗原を認識する抗体（第１の抗原結合分子）が結合したがん細胞に、このクランピング抗体が結合したCD8陽性 T細胞が近づいたときにのみ、クランピング抗体が第１の抗原を認識する抗体とCD3が形成する抗原−抗原結合分子複合体を認識し、TDCC活性を誘導することが期待される。この場合、第２の抗原は癌抗原である。【０１８８】
図１５は第１の抗原結合分子の一態様と第２の抗原結合分子の一態様が、標的細胞とエフェクター細胞をクロスリンクする際の作用機序を模式化した図である。
このコンセプトを確認するために、詳細を以下に示す実験を実施した。【０１８９】
（１）エフェクター細胞の調製
EasySep Human CD4+ T cell isolation kit (Stemcell)およびEasySep Human CD8+ T cell isolation kit (Stemcell) を用いてヒトPBMCからCD8陽性T細胞、CD4陽性T細胞を単離し、PBMCとともにエフェクター細胞としてその後のアッセイに用いた。【０１９０】
（２）標的細胞の調製
GPC3陽性細胞であるSKpca60を標的細胞として以後の実験に供した。【０１９１】
（３）抗体の調製
先に記載した方法に従い、以下の表９に示すBiAbを調製した。【０１９２】
【表９】
2019160007.tif 000014
【０１９３】
（４）細胞傷害アッセイ（TDCC assay）
実施例１６に記載したxCELLigence（ACEA Biosciences）を用いた細胞傷害アッセイを行った。
図１６は、二重抗原結合（GPC3およびCD8）によるCD8陽性T細胞特異的なTDCC活性を示した図である。【０１９４】
標的細胞として用いたSKpca60はGPC3陽性であることから、陽性対照としてGCH065/CE115HA000（抗GPC3  TRAB）を用いた。図１６に示したように、陽性対照であるGCH065/CE115HA000はPBMC（CD4陽性T細胞、CD8陽性T細胞の両方が混在する）、CD4陽性T細胞、CD8陽性T細胞のいずれをエフェクター細胞として用いた場合もTDCC活性を示した。一方で、GCH065/CE115HA056 + CD8/CLA0028はエフェクター細胞としてCD8陽性T細胞を用いた場合はTDCC活性を示したが、CD4陽性T細胞を用いた場合にはTDCC活性を示さなかった。PBMCをエフェクター細胞として用いた場合には、CD8陽性T細胞をエフェクター細胞として用いた場合の約半分のTDCCを示したが、これはPBMC中に含まれるCD8陽性T細胞の数がCD8陽性T細胞をエフェクター細胞として用いた場合よりも少ないためであると考えられた。陰性対照として用いたIC17/CE115HA056 + CD8/CLA0028、GCH065/CE115HA056 + IC17/CLA0028ではいずれの細胞をエフェクター細胞として用いた場合にもTDCC活性は確認されなかった。
以上の結果より、CD8陽性T細胞特異的にTDCC活性を発揮する抗体を作出することに成功した。【０１９５】
［実施例１９］
上述の抗体の一部について担癌モデルを用いたin vivo薬効についても評価した。
実施例６で記載されたin vitroのアッセイで細胞傷害活性が認められた表2に示したうちの代表的な抗体についてin vivoの薬効の評価が行なわれた。GPC3およびEREGを発現するヒトがん細胞株であるhEREG/SK-pca60がNOD scidマウスに移植され、腫瘍の形成が確認されたNOD scidマウスに、in vitroでヒトPBMCを培養することにより増殖させたT細胞が移入された。当該マウスに対して抗体を投与することによる治療が行なわれた（T細胞移入モデルと称される）。
すなわち、抗体のhEREG/SK-pca60 T細胞移入モデルによる薬効試験においては、下記のような試験が行われた。健常人ボランティアより採取した血液から分離されたPBMC及びDynabeads Human T-Activator CD3/CD28（Thermo Fisher Scientific社）を用いてT細胞の拡大培養が行なわれた。ヒトがん細胞株hEREG/SK-pca60 1×107細胞と、マトリゲル基底膜マトリックス（BD社）が混和され、NOD scidマウス（日本クレア、雌、7W）のそけい部皮下に移植された。移植の日をday 0とした。マウスは移植後21日目に腫瘍サイズと体重に応じて群分けが行なわれた後、抗アシアロGM1抗体が0.2 mg/匹で腹腔内に投与された。その翌日に前記拡大培養によって得られたT細胞が3×107細胞/匹で腹腔内に移植された。T細胞移植約4時間後に抗体が1 mg/kgで尾静脈内投与された。抗体投与はDay0およびDay7の2回行われた（図１７）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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