(57)【要約】  検体中のＰＳＡを修飾している糖鎖を解析し、マルチシアリル化ＬａｃｄｉＮＡｃ構造、特にＧｌｙｃａｎＩＤ：７５１２、ＧｌｙｃａｎＩＤ：７６０３、ＧｌｙｃａｎＩＤ：７６１２、及び／又はＧｌｙｃａｎＩＤ：７６１３の存在量を検出することによる前立腺がんを識別する検査方法を提供する。さらに、ＧｌｙｃａｎＩＤ：７５１２、及び／又はＧｌｙｃａｎＩＤ：７６０３の相対存在量から、ＰＳＡ  Ｇ−インデックスを算出することによって、ＰＳＡ値グレーゾーンの患者であっても前立腺がんを特異度良く検出することが可能となった。
2020013097.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
前立腺がんの検査方法であって、
検体中のＰＳＡを修飾している糖鎖を解析し、
マルチシアリル化ＬａｃｄｉＮＡｃ構造を解析することを特徴とする前立腺がんの検査方法。
【請求項２】
前立腺がんの検査方法であって、
検体中のＰＳＡを修飾している糖鎖を解析し、
ＧｌｙｃａｎＩＤ：７５１２、ＧｌｙｃａｎＩＤ：７６０３、ＧｌｙｃａｎＩＤ：７６１２、及び／又はＧｌｙｃａｎＩＤ：７６１３の相対存在量を解析することを特徴とする請求項１記載の前立腺がんの検査方法。
【請求項３】
ＧｌｙｃａｎＩＤ：７５１２、及びＧｌｙｃａｎＩＤ：７６０３の相対存在量をロジスティック解析によって解析する請求項２記載の前立腺がんの検査方法。
【請求項４】
請求項２の検査方法であって、
ＧｌｙｃａｎＩＤ：７５１２、及びＧｌｙｃａｎＩＤ：７６０３の相対存在量を下記式１に代入することによる前立腺がんの検査方法。
【数１】
2020013097.tif 000008
（なお、式中ｐはＰＳＡ  Ｇ−インデックスの値、ｘ１はＧｌｙｃａｎＩＤ：７５１２の相対存在量、ｘ２はＧｌｙｃａｎＩＤ：７６０３の相対存在量を示す。）
【請求項５】
請求項１〜４いずれか１項記載の検査方法であって、
前記検体は血液、血清、血漿、又は尿である前立腺がんの検査方法。
【請求項６】
請求項１〜５いずれか１項記載の検査方法であって、
前記検体はＰＳＡ値が４〜１０ｎｇ／ｍｌの患者から得られた検体である前立腺がんの検査方法。
【請求項７】
請求項１〜６いずれか１項記載の検査方法であって、
オキソニウムモニタリング法を用いて糖鎖解析を行う前立腺がんの検査方法。
【請求項８】
前立腺がんを識別する指標であって、
下記式１によって求められることを特徴とするＰＳＡ  Ｇ−インデックス。
【数２】
2020013097.tif 000009
（なお、式中ｐはＰＳＡ  Ｇ−インデックスの値、ｘ１はＧｌｙｃａｎＩＤ：７５１２の相対存在量、ｘ２はＧｌｙｃａｎＩＤ：７６０３の相対存在量を示す。）
【請求項９】
前立腺がんのグレードを検査する方法であって、
検体中のＰＳＡを修飾している糖鎖を解析し、
検体中のＧｌｙｃａｎＩＤ：７５１２、ＧｌｙｃａｎＩＤ：７６０３、ＧｌｙｃａｎＩＤ：３４０１、ＧｌｙｃａｎＩＤ：５６０２の少なくとも１つ以上の相対存在量を解析することを特徴とする検査方法。
【請求項１０】
前記検体が血液、血清、血漿、又は尿である請求項９記載の検査方法。
【請求項１１】
前記解析が、オキソニウムモニタリング法を用いることを特徴とする請求項９、又は１０記載の検査方法。
【請求項１２】
前立腺がんの検査方法であって、
前記解析が抗体、又はレクチンを用いることを特徴とする請求項１、２、５又は６記載の検査方法。
【請求項１３】
請求項１２記載の前立腺がんの検査方法であって、
マルチシアリル化ＬａｃｄｉＮＡｃ構造を有する糖を特異的に認識する抗体、又はレクチンを用いることを特徴とする検査方法。
【請求項１４】
マルチシアリル化ＬａｃｄｉＮＡｃ構造を有する糖を特異的に認識する抗体、又はレクチンを含む前立腺がんの検査キット。
【請求項１５】
請求項１４記載の前立腺がんの検査キットであって、
前記マルチシアリル化ＬａｃｄｉＮＡｃ構造を有する糖がＧｌｙｃａｎＩＤ：７５１２、ＧｌｙｃａｎＩＤ：７６０３、ＧｌｙｃａｎＩＤ：３４０１、ＧｌｙｃａｎＩＤ：５６０２であることを特徴とする検査キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、前立腺がん診断のための指標、及びこれを用いた検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
前立腺がんは男性に特有のがんであるが、高齢者に多発するがんであり、患者の約９０％以上が６０歳以上で占められている。高齢者の増加とともに、患者が増加しており、国立がん研究センターがん情報サービスの「がん登録・統計」の２０１７年の男性がん部位別罹患数予測によれば、新たに前立腺がんに罹患する患者数は、８６，１００人であり、胃がん、肺がんに続き罹患数では第３位となっており、今後高齢化に伴いさらに増加すると予測されている。前立腺がんは多くの場合比較的ゆっくり進行することや、手術に加えて放射線治療、内分泌（ホルモン）療法など有効な治療法をとることができることから、早期に発見すれば治療が可能である。【０００３】
前立腺がんは、血液中のＰＳＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ、前立腺がん抗原）を測定することによって診断されている。ＰＳＡ検査は、血液検査であることから低侵襲であり、感度が高いことから、前立腺がんの検査として、検診、人間ドックにも取り入れられ検査が行われている。【０００４】
しかし、ＰＳＡは前立腺上皮で産生され、前立腺がんだけではなく、前立腺肥大、前立腺炎のような他の前立腺疾患においても過剰に産生される。そのため、ＰＳＡによる患者スクリーニングは、偽陽性が非常に多いことが問題とされている。ＰＳＡは４ｎｇ／ｍｌをカットオフ値とし、血中のＰＳＡ値がそれ以上の場合には、前立腺がんの疑いがあるとされ、経直腸前立腺触診、経直腸エコー、あるいは経会陰前立腺針生検によって診断を行う必要がある。ＰＳＡ値４〜１０ｎｇ／ｍｌの「グレーゾーン」と言われる領域では７０％程度が、１０〜２０ｎｇ／ｍｌでも半数はがんではないという結果も得られている（非特許文献１）。【０００５】
経会陰前立腺針生検によって診断を確定する場合には、入院、麻酔のうえ初回の生検で１０〜１２ヶ所の組織採取を行う必要があり激しい痛みを伴う。ＰＳＡ値がグレーゾーンの領域の患者では偽陽性率が高いこともあり、検診によって二次検査を勧められても前立腺生検を行わない者も多く、早期発見の機会を見逃す場合も少なくない。実際に検診センターではＰＳＡ陽性と判定された者のうち、３０〜５０％程度しか前立腺生検を受けていないという統計もある。【０００６】
従来からＰＳＡ検査の特異度を高め、前立腺がんと前立腺肥大を区別し、前立腺がんを特異的に検査する方法が提案されている（非特許文献２〜４、特許文献１〜８）。すでに、ＦＤＡ（アメリカ食品医薬品局）は、ＰＨＩ（ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｈｅａlｔｈ  ｉｎｄｅｘ、非特許文献２）、及びＰＣＡ３（ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  ３）検査（非特許文献３、４）をＰＳＡ検査として承認している。特許文献１〜５には、ＰＳＡを特定の結合型シアル酸を認識するレクチンと接触させ、レクチンとの結合性を利用して検査する方法が記載されている。また、特許文献６〜８には、質量分析によって糖鎖構造を解析し、前立腺がんを検出する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００２−５５１０８号公報
【特許文献２】特開２０１０−９１３０８号公報
【特許文献３】特表２０１１−５２９１８４号公報
【特許文献４】特開２０１３−０７６６６６号公報
【特許文献５】国際公開第２０１０／０９０２６４号
【特許文献６】国際公開第２００９／００８３８１号
【特許文献７】国際公開第２０１０／０６４６８３号
【特許文献８】特開２０１１−１３７７５４号公報
【特許文献９】特開２０１４−０６６７０４号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Catalona WJ., et al., 1998, Jama, Vol.279,pp.1542-1547.
【非特許文献２】Loeb, S. et al., 2015, J. Urol. Vol.193,pp.1163-1169.
【非特許文献３】Wei., J.T. et al., 2014, J. Clin. Oncol.,Vol.32, pp.4066-4072.
【非特許文献４】Schmid, M. et al., 2015, Advances inexperimental medicine and biology, Vol. 867, pp.277-89
【非特許文献５】Wang, W. et al., 2014, Sci. Rep. Vol.4,p.5012
【非特許文献６】Vlaeminck-Guillem V. et al., 2010, Urology.Vol.75, pp.447-453.
【非特許文献７】Wada, Y. 2013, Methods in molecular biology(Clifton, NJ), Vol.951, pp.245-253.
【非特許文献８】Toyama, A. et al., 2012, Anal. Chem.Vol.84, pp.9655-9662.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、上記文献に開示されている検査方法はいずれも特異度、あるいは感度に問題があり、前立腺がんを特異的に識別できる方法ではなかった。ＰＨＩは、感度は８５％と高いものの、特異度は４５％と低く、前立腺がんを特異的に識別することはできない（非特許文献５）。また、ＰＣＡ３は前立腺肥大や前立腺炎といったがん以外の疾患に影響を受けないという点は優れた検査方法ではあるものの、４つの臨床試験の結果から、感度が５３〜８４％と低くＰＳＡ値がグレーゾーンを示す患者で前立腺がんを検出するのには不十分であった（非特許文献６）。【００１０】
特許文献１〜５に記載の方法は、レクチンとの結合性によってＰＳＡを修飾している糖を解析して前立腺がんを診断している。しかし、レクチンは抗体と比較した場合に親和性が低く、感度が低いという問題がある。また、レクチンは標的とするＰＳＡを修飾している糖のみを検出するわけではなく、他のタンパク質を修飾している糖にも結合するという問題がある。そのため、レクチンを用いた方法では偽陽性を完全に排除することができない。【００１１】
特許文献６〜８に記載の方法は、質量分析を用いて前立腺がんと前立腺肥大を識別する方法が開示されている。特許文献６は、フコース結合糖鎖、フコース非結合糖鎖の比によって、特許文献７はＬａｃｄｉＮＡｃを有する糖鎖の量によって、特許文献８には、ＬａｃｄｉＮＡｃを有する３本鎖以上の糖鎖の有無によって、前立腺がんを検出する方法が記載されている。しかしながら、いずれも特異度が低く偽陽性を排除するにはいたらなかった。【００１２】
ＰＳＡは糖鎖による修飾を受けており、修飾される糖の種類と前立腺疾患とが相関するということが報告されている。しかしながら、前立腺がんと前立腺肥大を精度良く区別するにはいたっていない。本発明は、ＰＳＡの増加がわずかに認められるグレーゾーンの領域であっても、精度良く前立腺がんを検出できる方法、及び前立腺がんを識別するための指標を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、以下の前立腺がんを検査する方法、及び前立腺がんを検出するためのインデックスに関する。さらに、グレード（悪性度）を判断するためのマーカーに関する。
（１）前立腺がんの検査方法であって、検体中のＰＳＡを修飾している糖鎖を解析し、マルチシアリル化ＬａｃｄｉＮＡｃ構造を解析することを特徴とする前立腺がんの検査方法。
（２）前立腺がんの検査方法であって、検体中のＰＳＡを修飾している糖鎖を解析し、ＧｌｙｃａｎＩＤ：７５１２、ＧｌｙｃａｎＩＤ：７６０３、ＧｌｙｃａｎＩＤ：７６１２、及び／又はＧｌｙｃａｎＩＤ：７６１３の相対存在量を解析することを特徴とする（１）記載の前立腺がんの検査方法。
（３）ＧｌｙｃａｎＩＤ：７５１２、及びＧｌｙｃａｎＩＤ：７６０３の相対存在量をロジスティック解析によって解析する（２）記載の前立腺がんの検査方法。
（４）（２）の検査方法であって、ＧｌｙｃａｎＩＤ：７５１２、及びＧｌｙｃａｎＩＤ：７６０３の相対存在量を下記式１に代入することによる前立腺がんの検査方法。
【数１】
2020013097.tif 000003
（なお、式中ｐはＰＳＡ  Ｇ−インデックスの値、ｘ１はＧｌｙｃａｎＩＤ：７５１２の相対存在量、ｘ２はＧｌｙｃａｎＩＤ：７６０３の相対存在量を示す。）
（５）（１）〜（４）いずれか１つ記載の検査方法であって、前記検体は血液、血清、血漿、又は尿である前立腺がんの検査方法。
（６）（１）〜（５）いずれか１つ記載の検査方法であって、前記検体はＰＳＡ値が４〜１０ｎｇ／ｍｌの患者から得られた検体である前立腺がんの検査方法。
（７）（１）〜（６）いずれか１つ記載の検査方法であって、オキソニウムモニタリング法を用いて糖鎖解析を行う前立腺がんの検査方法。
（８）前立腺がんを識別する指標であって、下記式１によって求められることを特徴とするＰＳＡ  Ｇ−インデックス。
【数２】
2020013097.tif 000004
（なお、式中ｐはＰＳＡ  Ｇ−インデックスの値、ｘ１はＧｌｙｃａｎＩＤ：７５１２の相対存在量、ｘ２はＧｌｙｃａｎＩＤ：７６０３の相対存在量を示す。）
（９）前立腺がんのグレードを検査する方法であって、検体中のＰＳＡを修飾している糖鎖を解析し、検体中のＧｌｙｃａｎＩＤ：７５１２、ＧｌｙｃａｎＩＤ：７６０３、ＧｌｙｃａｎＩＤ：３４０１、ＧｌｙｃａｎＩＤ：５６０２の少なくとも１つ以上の相対存在量を解析することを特徴とする検査方法。
（１０）前記検体が血液、血清、血漿、又は尿である（９）記載の検査方法。
（１１）前記解析が、オキソニウムモニタリング法を用いることを特徴とする（９）、又は（１０）記載の検査方法。
（１２）前立腺がんの検査方法であって、前記解析が抗体、又はレクチンを用いることを特徴とする（１）、（２）、（５）又は（６）記載の検査方法。
（１３）（１２）記載の前立腺がんの検査方法であって、マルチシアリル化ＬａｃｄｉＮＡｃ構造を有する糖を特異的に認識する抗体、又はレクチンを用いることを特徴とする検査方法。
（１４）マルチシアリル化ＬａｃｄｉＮＡｃ構造を有する糖を特異的に認識する抗体、又はレクチンを含む前立腺がんの検査キット。
（１５）（１４）記載の前立腺がんの検査キットであって、前記マルチシアリル化ＬａｃｄｉＮＡｃ構造を有する糖がＧｌｙｃａｎＩＤ：７５１２、ＧｌｙｃａｎＩＤ：７６０３、ＧｌｙｃａｎＩＤ：３４０１、ＧｌｙｃａｎＩＤ：５６０２であることを特徴とする検査キット。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】オキソニウムモニタリング法を用いたＰＳＡの糖鎖構造解析について示す図。図１Ａはオキソニウムモニタリング法の概要について、Ｂ、Ｃは、ＰＳＡ標準品を用いた解析結果を示す図。
【図２】ＰＳＡ臨床サンプルの糖鎖解析を示す図。図２Ａは、トレーニングセットにおける前立腺肥大患者群と前立腺がん患者群で検出された糖鎖の種類と量を示す図。図２Ｂ〜Ｄは、前立腺肥大患者群と前立腺がん患者群において検出されたＬａｃｄｉＮＡｃ構造を有する糖鎖の相対量を示す図。図２Ｅ、Ｆは、前立腺がん患者血清中のＰＳＡを修飾している代表的な糖鎖をＥｒｅｘｉｍ（登録商標）解析した結果を示す図。
【図３】ＰＳＡ  Ｇ−インデックスによる結果を示す図。図３Ａは、前立腺肥大患者群と前立腺がん患者群におけるＧｌｙｃａｎＩＤ：７５１２の、図３ＢはＧｌｙｃａｎＩＤ：７６０３の相対量を示す図。図３Ｃは、トレーニングセットの前立腺肥大患者群と前立腺がん患者群のＰＳＡ  Ｇ−インデックス値をプロットした図。図３Ｄは検証セットにおける前立腺肥大患者群と前立腺がん患者群のＰＳＡ  Ｇ−インデックス値をプロットした図。図３Ｅは、ＰＳＡ値、ＰＳＡ  ｆ／Ｔ値、ＰＳＡ  Ｇ−インデックス値によるＲＯＣ曲線を示す図。なお、以下に詳細に説明するが、ＧｌｙｃａｎＩＤはグリカンの種類を規定するものであり、数字は左からＨｅｘＮＡｃ、Ｈｅｘｏｓｅ、Ｆｕｃｏｓｅ、Ｎｅｕ５Ａｃの数に相当する。
【図４】前立腺がんのグレード（悪性度）を分類可能な糖鎖を示す図。図４Ａは、ＧｌｙｃａｎＩＤ：７５１２、図４Ｂは、ＧｌｙｃａｎＩＤ：７６０３、図４Ｃは、ＧｌｙｃａｎＩＤ：３４０１、図４Ｄは、ＧｌｙｃａｎＩＤ：５６０２とグリーソンスコアとの相関を示す図。
【図５】レクチン組織染色による解析結果を示す図。図５Ａは、前立腺肥大患者と前立腺がん患者のＨＥ、ＷＦＡ、ＭＡＭによる前立腺組織染色結果を示す図。図５Ｂは、前立腺肥大患者と前立腺がん患者におけるＷＦＡによる前立腺組織の染色強度を示す図。図５Ｃは、前立腺肥大患者と前立腺がん患者におけるＭＡＭによる前立腺組織の染色強度を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明者らの解析によって、前立腺がんの患者ではＬａｃｄｉＮＡｃ（ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−Ｎ−アセチルグルコサミン）構造を有する特定の糖鎖が有意に増加していることが明らかとなった。ここでは、質量分析を用いて解析を行っているが、マルチシアリル化ＬａｃｄｉＮＡｃ構造、あるいは以下にＧｌｙｃａｎＩＤで示す特定の糖鎖を認識、又は解析することができれば、どのような方法を用いてもよい。
【００１６】
質量分析による解析方法は、以下に示すように非常に感度良く検査できる方法であるが、質量分析によらずマルチシアリル化ＬａｃｄｉＮＡｃ構造を認識する抗体、レクチン、アプタマーなど特定の糖鎖を認識すればどのようなものを用いて解析してもよい。抗体を用いて検出する場合には、ＥＬＩＳＡ、ＳＰＲなど、本分野で用いられているどのような方法によって検出を行ってもよい。また、レクチンによって検出する場合には、レクチンブロット、キャピラリー電気泳動など、どのような方法を用いて検出を行ってもよい。以下の実施例で示すように、ＷＦＡ、ＭＡＭなどのレクチンはマルチシアリル化ＬａｃｄｉＮＡｃ構造を特異的に認識するものではない。しかし、いくつかのレクチンを組み合わせて用いることによって、マルチシアリル化ＬａｃｄｉＮＡｃ構造を特異的に検出することができる系を作成すればよい。
【００１７】
また、ＧｌｙｃａｎＩＤ：７５１２、及びＧｌｙｃａｎＩＤ：７６０３の相対存在量による解析だけではなく、マルチシアリル化ＬａｃｄｉＮＡｃ構造を含む糖のプロファイリングデータのプロファイル認識からも本発明を実施することが可能である。具体的には、前立腺がんが確定した患者から複数収集した糖鎖のプロファイルを教師用の学習データとしてコンピューターに機械学習させ、診断支援用システムとする。その後、検査時には被験者から得られたプロファイルをそのまま入力することによって、パターン認識から前立腺がん候補データを検出してもよい。
【００１８】
以下の実施例で示すように、ＰＳＡを修飾している糖鎖構造を解析した結果、以下に定義するＰＳＡ  Ｇ−インデックスを用いることにより、前立腺がんを精度良く検出することができることが明らかとなった。従来のＰＳＡ試験でグレーゾーンの患者に、二次スクリーニングとして、ＰＳＡ  Ｇ−インデックスを用いて検査することによって、非侵襲的に前立腺がんの患者を検出することができる。以下にデータを示しながら詳細に説明する。
【００１９】
最初にＰＳＡ標準品を用いて、ＰＳＡを修飾している糖鎖を感度良く検出、定量できるか確認を行った。ヒト精液から得られたＰＳＡを８Ｍ尿素、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、ｐＨ８．０に溶解し、１０ｍＭ  ＤＴＴ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ株式会社）で還元し、２５ｍＭ  ヨードアセトアミド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ株式会社）でアルキル化した後に、Ｔｒｙｐｓｉｎ／Ｌｙｓ−Ｃ  ｍｉｘ（プロメガ株式会社）によって消化した。糖タンパク質は、親水性精製方法（非特許文献７）によって濃縮し、真空乾燥した。
【００２０】
得られた糖タンパク質は、糖鎖を同定するために、Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅナノフロー液体クロマトグラムを連結させたトリプル四重極型質量分析計ＬＣＭＳ−８０６０（株式会社島津製作所）を用いて、オキソニウムイオンモニタリング法（Ｅｒｅｘｉｍ法、非特許文献８、特許文献９）によって解析した。
【００２１】
図１Ａに、多重反応モニタリング質量分析（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、ＭＲＭ−ＭＳ）を応用したオキソニウムイオンモニタリング法の概要を模式的に示している。ＰＳＡはトリプシンによって、ペプチドと糖ペプチドの混合物に分解され、ナノフロー液体クロマトグラムによって分離される。質量分析計においては、第１の四重極（Ｑ１）において、特定の質量を有する糖ペプチドイオンを単離する。単離された糖ペプチドイオンは第２の四重極（Ｑ２）に導入されＣＩＤ（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、衝突誘起解離）を引き起こす。第３の四重極（Ｑ３）では、フィルターによって糖由来のオキソニウムイオンを選択的に検出する。最適衝突エネルギー条件下で、ｍ／ｚ１３８．１のオキソニウムイオンは、種々の糖構成の糖ペプチドの定量的なレポーターとして機能する。
【００２２】
ヒト精液から得られたＰＳＡ標準品１００ｎｇを用いて、糖鎖構造解析を行った結果を図１Ｂに示す。図中横軸に記載している数字は、ＧｌｙｃａｎＩＤとして各グリカンの種類を規定するものであり、左からＨｅｘＮＡｃ、Ｈｅｘｏｓｅ、Ｆｕｃｏｓｅ、Ｎｅｕ５Ａｃの数に相当する。ＰＳＡの４５位のアスパラギンを修飾している糖の種類、及び量的な分布を解析した。その結果、オキソニウムイオンモニタリング法により、６７種の糖構造が存在することが明らかとなった。
【００２３】
オキソニウムイオンモニタリング法は、酵素によるグリカンの分離や、化学修飾を行う必要がなく、ＬＳ／ＭＳの作動時間が２５分という短時間で解析が終了するだけではなく、非常に鋭敏な検出方法であった。最も含有量の多い糖は、４［ＨｅｘＮＡｃ］５［Ｈｅｘ］１［Ｆｕｃ］２［Ｎｅｕ５Ａｃ］（ＧｌｙｃａｎＩＤ：４５１２、４４．５±０．９％）であり、最も含有量の少ない糖は、６［Ｈｅｘ］７［ＮＡｃＨｅｘ］０［Ｆｕｃ］０［Ｎｅｕ５Ａｃ］（ＧｌｙｃａｎＩＤ：６７００、０．０１±０．００１％）であった。従来、ＰＳＡを修飾しているグリカンとして６７種という非常に多くの種類の糖を検出したことや、０．０１％という非常に微量の糖の検出を行ったという報告はなく、非常に感度の高い方法であることが示された。
【００２４】
ＰＳＡ糖鎖解析のダイナミックレンジを図１Ｃに示す。トリプシン消化したＰＳＡを段階希釈し、検出限界の解析を行った。その結果、０．０３ｎｇのＰＳＡから得られた糖ペプチド１ｆｍｏｌまで検出することが可能であり、定量的なダイナミックレンジは５桁以上であった（Ｒ２＞０．９９）。この結果は、オキソニウムイオンモニタリング法による糖鎖解析が、４〜１０ｎｇ／ｍｌというグレーゾーンのＰＳＡであっても、十分に検査可能であることを示している。
【００２５】
次に、ＰＳＡ値が４〜１０ｎｇ／ｍｌのグレーゾーンを示す前立腺がん、又は前立腺肥大患者各１５名から得られたサンプルを用いてＰＳＡの糖鎖解析を行い、トレーニングセットとして前立腺がんを識別する指標を求めた。表１のトレーニングセットに患者特性を示す。
【００２６】
臨床サンプルを用いた解析は、前立腺がん患者、及び前立腺肥大患者の血清サンプルを用いている。なお、最終診断は前立腺生検による組織病理学的診断によっている。ＰＳＡの精製は以下のようにして行った。血清に、４倍量の洗浄液（０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を添加したＰＢＳ）を加え、抗ＰＳＡモノクローナル抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社）を固定化したＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅと混合し、４°Ｃで一晩反応させ、洗浄後、８Ｍ尿素、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、ｐＨ８．０によってＰＳＡを溶出させ、精製して用いた。溶出されたタンパク質は、１０ｍＭ  ＤＴＴで還元し、２５ｍＭヨードアセトアミドでアルキル化した後に、Ｔｒｙｐｓｉｎ／Ｌｙｓ−Ｃ  ｍｉｘによって消化した。糖タンパク質は、親水性精製方法（非特許文献７）によって濃縮し、真空乾燥した。なお、ここでは血清サンプルを用いているが、血液由来のサンプルだけではなく、尿もサンプルとして使用することができる。
【００２７】
【表１】
2020013097.tif 000005
【００２８】
上記と同様の方法により、ＰＳＡ上の５２の糖鎖構造を定量することができた（図２Ａ）。ＧｌｙｃａｎＩＤ：７５１２、７６０３、７６１２、７６１３の糖鎖構造は、前立腺肥大患者群、前立腺がん患者群間で有意に量的な差が見られた。また、ここではデータを示さないが、ＰＳＡを修飾している糖鎖は、前立腺がん患者群と健常者群間でも異なることを見出している。したがって、糖鎖構造を解析することによって、前立腺がん患者と、それ以外の者、すなわち前立腺がん以外の前立腺疾患及び健常者を区別することができる。
【００２９】
５２種類の糖鎖のうち、マルチシアリル化構造、具体的にはジ−／トリ−シアリル化ＬａｃｄｉＮＡｃ（ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）を含有している糖鎖は、前立腺肥大患者群に比べて前立腺がん患者群で有意に増加していた（図２（Ｄ）、ｐ＝０．００２３）。一方、シアリル化ＬａｃｄｉＮＡｃの総量（図２Ｂ）や単一のシアリル化ＬａｃｄｉＮＡｃが付加された糖鎖構造（図２Ｃ）は、前立腺肥大患者群、前立腺がん患者群間では有意な変化を示さなかった。また、末端ＬａｃｄｉＮＡｃ構造およびシアル酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）残基の存在は、Ｅｒｅｘｉｍ法によって確認した（図２Ｅ、Ｆ）。
【００３０】
これらの知見に基づいて、ＰＳＡ検査の特異性を補完し、偽陽性率を確実に低減できる新規診断アルゴリズムの確立を目指した。トレーニングセットで前立腺がん患者群と前立腺肥大患者群で有意に差が認められた糖鎖であるＧｌｙｃａｎＩＤ：７５１２（ｐ＝９．９１×１０−８）、ＧｌｙｃａｎＩＤ：７６０３（ｐ＝１．６６×１０−５）の２つの前立腺がんに特異的な糖鎖構造を選択し、相対量をプロットした。図３ＡにＧｌｙｃａｎＩＤ：７５１２の、図３ＢにＧｌｙｃａｎＩＤ：７６０３の前立腺肥大患者（ＢＰＨ）、前立腺がん患者における相対存在量を示す。ＧｌｙｃａｎＩＤ：７５１２、７６０３ともに、両者で有意に存在量が異なっている。
【００３１】
これらの結果をもとにロジスティック回帰に基づく診断モデル（ＰＳＡ  Ｇ−インデックス）を構築した。式１中ｐは、ＰＳＡ  Ｇ−インデックスの値を示し、ｘ１は、ＧｌｙｃａｎＩＤ：７５１２の相対存在量、ｘ２は、ＧｌｙｃａｎＩＤ：７６０３の相対存在量を示す。
【００３２】
【数３】
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【００３３】
ＰＳＡ  Ｇ−インデックスのカットオフ値を０．５に設定した場合、トレーニングセットの感度、特異度は、夫々９３．３％、１００％であった（図３Ｃ）。なお、ＰＳＡ  Ｇ−インデックスはロジスティック解析に基づくものであるから、今後解析する検体数の増加によって、式が多少異なってくる可能性があるが、ＧｌｙｃａｎＩＤ：７５１２、ＧｌｙｃａｎＩＤ：７６０３を検出し、その量によって、感度、特異度良く前立腺がんと他の前立腺疾患とを識別することができる。
【００３４】
また、ここではＰＳＡを修飾している糖をすべて解析しその相対的な量を求めているが、マルチシアリル化ＬａｃｄｉＮＡｃ構造を有する糖など、特定の糖のみの解析を行ってもよい。また、ＰＳＡのペプチドのうち、糖修飾されない領域のペプチドを基準とすることにより、特定の糖によって修飾されているＰＳＡの全ＰＳＡに対する割合を求めて解析に用いてもよい。上述した糖の相対値は、基準として用いる糖、あるいはＰＳＡ量によって異なるものとなるが、前立腺がんとそれ以外の前立腺疾患では有意にその量が異なっていることから、ロジスティック解析によって、前立腺がんとそれ以外の前立腺疾患とを感度良く区別することが可能である。
【００３５】
次に、表１の検証サンプルセットを用いてＰＳＡ  Ｇ−インデックスを評価した（図３Ｄ）。１５例の前立腺肥大患者群、１５例の前立腺がん患者群いずれの群でも、すべての臨床サンプルが正しい疾患として診断された。ＲＯＣ曲線解析では、ＰＳＡ  Ｇ−インデックスの曲線下面積（ＡＵＣ）は１．００（１００％感度、及び１００％特異度）であったが、ＰＳＡ値（Ｔｏｔａｌ  ＰＳＡ）、あるいは遊離型ＰＳＡと総ＰＳＡの比（ＰＳＡ  ｆ／Ｔ）のＡＵＣは、夫々０．５０（感度８０．０％、特異度３３．３％）、０．６０（感度７３．３％、特異度６０．０％）であった（図３Ｅ）。これらの結果は、ＰＳＡ  Ｇ−インデックスが、従来の前立腺がんの指標とされているＰＳＡ値、あるいはＰＳＡ  ｆ／Ｔ値と比較して、前立腺がん診断の特異度を大幅に改善し、偽陽性を回避できることを示している。
【００３６】
次に、血清中のＰＳＡ上の糖鎖構造が、前立腺がんのグレード（悪性度）を反映しているかどうかを解析した。表２に示すグレードの異なる７７人の患者の血清を用いて、オキソニウムイオンモニタリング法による糖鎖解析を実施した。
【００３７】
【表２】
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【００３８】
その結果、複数のシアリル化ＬａｃｄｉＮＡｃが付加された糖鎖構造であるＧｌｙｃａｎＩＤ：７５１２（図４Ａ）またはＧｌｙｃａｎＩＤ：７６０３（図４Ｂ）の頻度は、前立腺生検による悪性度の指標であるグリーソンスコア（ＧＳ）と正の相関があった（ｐ＝３．３４×１０−８、又はｐ＝２．５６×１０−９）。なお、グリーソンスコアとは、前立腺がんは同じ前立腺の中に悪性度の異なるがんが発生することから、生検により優勢病変、随伴病変を判定し、その数値の合計でＧＳ２からＧＳ１０の９段階に分類するものであり、数値が大きいほど悪性度が高いことを示している。
【００３９】
さらに、ＧｌｙｃａｎＩＤ：３４０１（図４Ｃ）、又はＧｌｙｃａｎＩＤ：５６０２（図４Ｄ）はグリーソンスコアに対して負の相関を示した（ｐ＝１．６９×１０−６、又はｐ＝９．６６×１０−７）。これらの結果は、前立腺がんの病理学的悪性度と、特定の糖鎖の量が相関し、リキッドバイオプシーによって、前立腺がんの悪性度診断を行える可能性を示している。
【００４０】
血清ＰＳＡ中のマルチシアリル化ＬａｃｄｉＮＡｃ構造の増加の原因を確認するために、正常、前立腺肥大患者、前立腺がん患者の前立腺組織を夫々９、３１、１１１含む組織マイクロアレイ（ＵＳ  Ｂｉｏｍａｘ社）を用いてレクチン組織化学染色を行った。ＬａｃｄｉＮＡｃ構造を検出するレクチンであるＷＦＡ、又はＳｉａα２-３Ｇａｌ構造を検出するレクチンであるＭＡＭを用いて組織化学染色を行った。ＷＦＡ、ＭＡＭともにビオチン化されたレクチンを用いＶｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて解析を行った。その結果、がん細胞の細胞質および原形質膜が有意に染色された（図５Ａ）。さらに、染色強度を「強い」、「中程度」、「弱い」の３段階に分類し、前立腺がん患者の組織と、正常及び前立腺肥大患者の組織染色像を比較した。前立腺がん組織では、ＷＦＡを用いて染色した場合には、９．００倍、ＭＡＭを用いた場合には２．２４倍、染色強度の「強い」像が高い頻度で観察された（図５Ｂ、５Ｃ）。
【００４１】
ＷＦＡやＭＡＭレクチンは、それぞれＬａｃｄｉＮＡｃまたはＮｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ構造を含むＧａｌＮＡｃ構造を特異的に認識する。上記結果は、前立腺がん組織では、ＬａｃｄｉＮＡｃやＮｅｕ５Ａｃ構造を含む糖タンパク質を強く発現している傾向を示している。これらの組織学的知見は、質量分析によるＰＳＡ糖鎖構造解析の結果と一致していた。したがって、組織生検を行うことなく、血液中のＰＳＡの糖鎖を解析することによって、前立腺がん、さらに前立腺がんの病期を判定することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
ＰＳＡ値から前立腺がんの疑いがあると診断された患者の二次スクリーニングとして、実施例で示した診断マーカー、ＰＳＡ  Ｇ−インデックスを用い、検査を行うことによって、特異度良く前立腺がんを識別することができる。早期の前立腺がんであっても、特異度良く識別することができ、早期治療に結びつけることが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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