(57)【要約】  胚様体を単一細胞に解離させてＢａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ）及びＥｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）を含有する無血清培地中で浮遊培養し、神経幹細胞塊を得る工程と、前記神経幹細胞塊を単一細胞に解離させて無血清培地中で接着培養し、アストロサイトを含む細胞集団を得る工程と、を備える、アストロサイトの製造方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
胚様体を単一細胞に解離させてＢａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ）及びＥｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）を含有する無血清培地中で浮遊培養し、神経幹細胞塊を得ることと、
前記神経幹細胞塊を単一細胞に解離させて無血清培地中で接着培養し、アストロサイトを含む細胞集団を得ることと、
を備える、アストロサイトの製造方法。
【請求項２】
前記胚様体が、多能性幹細胞を無血清培地中で培養することにより得られたものである、請求項１に記載のアストロサイトの製造方法。
【請求項３】
前記多能性幹細胞が、健常人由来の人工多能性幹細胞又は神経疾患患者由来の人工多能性幹細胞である、請求項２に記載のアストロサイトの製造方法。
【請求項４】
前記神経幹細胞塊を得ることが、
前記胚様体を単一細胞に解離させてｂＦＧＦ及びＥＧＦを含有する無血清培地中で浮遊培養し、１次神経幹細胞塊を得ることと、
前記１次神経幹細胞塊を単一細胞に解離させてｂＦＧＦ及びＥＧＦを含有する無血清培地中で浮遊培養し、高次神経幹細胞塊を得ることと、
を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のアストロサイトの製造方法。
【請求項５】
前記アストロサイトを含む細胞集団を得ることにおいて、前記無血清培地にＢｒａｉｎ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ（ＢＤＮＦ）及び／又はＧｌｉａｌ−Ｃｅｌｌ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｆａｃｔｏｒ（ＧＤＮＦ）を更に含有させる、請求項１〜４のいずれか一項に記載のアストロサイトの製造方法。
【請求項６】
前記細胞集団中のアストロサイトの割合が９０％以上である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のアストロサイトの製造方法。
【請求項７】
前記アストロサイトが静的状態である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のアストロサイトの製造方法。
【請求項８】
容器内に無血清状態で収容された細胞集団であって、アストロサイトの割合が９０％以上である、細胞集団。
【請求項９】
静的状態である、請求項８に記載の細胞集団。
【請求項１０】
細胞密度が１×１０５個／ｍＬ以上である、請求項８又は９に記載の細胞集団。
【請求項１１】
Ｇｌｉａｌ  Ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  Ａｃｉｄｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＡＰ）陽性細胞を９５％以上含み、Ｓ１００  Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ（Ｓ１００Ｂ）陽性細胞を９５％以上含む、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の細胞集団。
【請求項１２】
培地に血清を添加するとＧＦＡＰ、ＮＦＩＡ、ＡＬＤＨ１Ｌ１又はＥＡＡＴ２の発現量が上昇する、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の細胞集団。
【請求項１３】
請求項８〜１２のいずれか一項に記載の細胞集団及び神経細胞の共培養物。
【請求項１４】
被験物質の存在下で、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の細胞集団及び神経細胞を共培養することと、
前記神経細胞の、突起伸長、形態、シナプス小胞、遺伝子発現、タンパク質発現又は電気生理学的パラメータを評価し、評価結果を得ることと、
を備え、前記評価結果が、被験物質の非存在下における評価結果と比較して有意に変化したことが、前記被験物質が神経疾患の治療薬の候補であることを示す、神経疾患の治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１５】
トランスフェリン、プトレシン、インスリン、プロゲステロン、亜セレン酸ナトリウム及びＢ２７サプリメントを含有する、神経幹細胞からアストロサイトへの分化誘導用無血清培地。
【請求項１６】
ＢＤＮＦ及び／又はＧＤＮＦを更に含有する、請求項１５に記載の神経幹細胞からアストロサイトへの分化誘導用無血清培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アストロサイトの製造方法に関する。より詳細には、本発明は、アストロサイトの製造方法、アストロサイト、アストロサイト及び神経細胞の共培養物、神経疾患の治療薬のスクリーニング方法、及び神経幹細胞からアストロサイトへの分化誘導用無血清培地に関する。本願は、２０１８年９月１４日に日本に出願された特願２０１８−１７２４０７号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
神経疾患において、アストロサイトの病態への関与が数多く報告されている。アストロサイトの神経疾患への関与を解析するためには、アストロサイトを大量に調製し解析する必要がある。このため、多能性幹細胞等からアストロサイトを分化誘導する技術を確立することが求められている。例えば、特許文献１には、アストロサイトの分化誘導方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表２０１６−５０４０１４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、従来のアストロサイトの分化誘導方法では、純度が１００％に近いアストロサイトの細胞集団を短期間で得ることは困難であった。また、本来のアストロサイトは静的状態であり、血清存在下では不可逆的な炎症性／反応性を獲得してしまうと考えられている。しかしながら、従来のアストロサイトの分化誘導方法は、分化誘導の過程で血清を使用するものであり、静的状態の成熟したアストロサイトを得ることができなかった。【０００５】
そこで、本発明は、静的状態の成熟したアストロサイトの細胞集団を製造する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は以下の態様を含む。
［１］胚様体を単一細胞に解離させてＢａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ）及びＥｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）を含有する無血清培地中で浮遊培養し、神経幹細胞塊を得ることと、前記神経幹細胞塊を単一細胞に解離させて無血清培地中で接着培養し、アストロサイトを含む細胞集団を得ることと、を備える、アストロサイトの製造方法。
［２］前記胚様体が、多能性幹細胞を無血清培地中で培養することにより得られたものである、［１］に記載のアストロサイトの製造方法。
［３］前記多能性幹細胞が、健常人由来の人工多能性幹細胞又は神経疾患患者由来の人工多能性幹細胞である、［２］に記載のアストロサイトの製造方法。
［４］前記神経幹細胞塊を得ることが、前記胚様体を単一細胞に解離させてｂＦＧＦ及びＥＧＦを含有する無血清培地中で浮遊培養し、１次神経幹細胞塊を得ることと、前記１次神経幹細胞塊を単一細胞に解離させてｂＦＧＦ及びＥＧＦを含有する無血清培地中で浮遊培養し、高次神経幹細胞塊を得ることと、を含む、［１］〜［３］のいずれかに記載のアストロサイトの製造方法。
［５］前記アストロサイトを含む細胞集団を得ることにおいて、前記無血清培地にＢｒａｉｎ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ（ＢＤＮＦ）及び／又はＧｌｉａｌ−Ｃｅｌｌ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｆａｃｔｏｒ（ＧＤＮＦ）を更に含有させる、［１］〜［４］のいずれかに記載のアストロサイトの製造方法。
［６］前記細胞集団中のアストロサイトの割合が９０％以上である、［１］〜［５］のいずれかに記載のアストロサイトの製造方法。
［７］前記アストロサイトが静的状態である、［１］〜［６］のいずれかに記載のアストロサイトの製造方法。
［８］容器内に無血清状態で収容された細胞集団であって、アストロサイトの割合が９０％以上である、細胞集団。
［９］静的状態である、［８］に記載の細胞集団。
［１０］細胞密度が１×１０５／ｍＬ以上である、［８］又は［９］に記載の細胞集団。
［１１］Ｇｌｉａｌ  Ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  Ａｃｉｄｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＡＰ）陽性細胞を９５％以上含み、Ｓ１００  Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ（Ｓ１００Ｂ）陽性細胞を９５％以上含む、［８］〜［１０］のいずれかに記載の細胞集団。
［１２］培地に血清を添加するとＧＦＡＰ、ＮＦＩＡ、ＡＬＤＨ１Ｌ１又はＥＡＡＴ２の発現量が上昇する、［８］〜［１１］のいずれかに記載の細胞集団。
［１３］［８］〜［１２］のいずれかに記載の細胞集団及び神経細胞の共培養物。
［１４］被験物質の存在下で、［８］〜［１２］のいずれかに記載の細胞集団及び神経細胞を共培養することと、前記神経細胞の、突起伸長、形態、シナプス小胞、遺伝子発現、タンパク質発現又は電気生理学的パラメータを評価し、評価結果を得ることと、を備え、前記評価結果が、被験物質の非存在下における評価結果と比較して有意に変化したことが、前記被験物質が神経疾患の治療薬の候補であることを示す、神経疾患の治療薬のスクリーニング方法。
［１５］トランスフェリン、プトレシン、インスリン、プロゲステロン、亜セレン酸ナトリウム及びＢ２７サプリメントを含有する、神経幹細胞からアストロサイトへの分化誘導用無血清培地。
［１６］ＢＤＮＦ及び／又はＧＤＮＦを更に含有する、［１５］に記載の神経幹細胞からアストロサイトへの分化誘導用無血清培地。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、静的状態の成熟したアストロサイトの細胞集団を製造する技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実験例１で用いた分化誘導プロトコールを示す模式図である。
【図２】（ａ）〜（ｆ）は、実験例２におけるアストロサイト関連遺伝子の発現量の測定結果を示すグラフである。（ａ）はＧｌｉａｌ  Ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  Ａｃｉｄｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＡＰ）の測定結果を示し、（ｂ）はＳ１００  Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ（Ｓ１００Ｂ）の測定結果を示し、（ｃ）はＮｕｃｌｅａｒ  Ｆａｃｔｏｒ  ＩＡ（ＮＦＩＡ）の測定結果を示し、（ｄ）はＡｌｄｅｈｙｄｅ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  １  Ｆａｍｉｌｙ  Ｍｅｍｂｅｒ  Ｌ１（ＡＬＤＨ１Ｌ１）の測定結果を示し、（ｅ）はＧＬｕｔａｍａｔｅ  ＡＳｐａｒｔａｔｅ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ（ＧＬＡＳＴ、ＳＬＣ１Ａ３とも呼ばれる）の測定結果を示し、（ｆ）はＥｘｃｉｔａｔｏｒｙ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ２（ＥＡＡＴ２、ＳＬＣ１Ａ２とも呼ばれる）の測定結果を示す。
【図３】（ａ）〜（ｄ）は実験例２における蛍光免疫染色の結果を示す写真である。（ａ）はＧＦＡＰの発現を検出した写真であり、（ｂ）はＳ１００Ｂの発現を検出した写真であり、（ｃ）はＮＦＩＡの発現を検出した写真であり、（ｄ）はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で細胞核を染色した結果を示す写真である。
【図４】実験例３において、細胞の培地中のグルタミン酸濃度の経時変化を測定した結果を示すグラフである。
【図５】実験例３において、アストロサイトへのカルシウムイオンの流入を検出した蛍光顕微鏡写真である。
【図６】（ａ）〜（ｆ）は、実験例４におけるアストロサイト関連遺伝子の発現量の測定結果を示すグラフである。（ａ）はＧＦＡＰの測定結果を示し、（ｂ）はＳ１００Ｂの測定結果を示し、（ｃ）はＮＦＩＡの測定結果を示し、（ｄ）はＡＬＤＨ１Ｌ１の測定結果を示し、（ｅ）はＧＬＡＳＴの測定結果を示し、（ｆ）はＥＡＡＴ２の測定結果を示す。
【図７】（ａ）〜（ｃ）は実験例５における蛍光免疫染色の結果を示す写真である。（ａ）はＭｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ２（ＭＡＰ２）の発現を検出した写真であり、（ｂ）はＳｙｎａｐｓｉｎ−１の発現を検出した写真であり、（ｃ）はＧＦＡＰの発現を検出した写真である。また、（ｃ）の右上の枠内にＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で細胞核を染色した写真を示す。
【図８】（ａ）〜（ｄ）は、実験例６の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図９】実験例６において、図８（ａ）〜（ｄ）の結果に基づいて計測した神経スパイン密度を示すグラフである。
【図１０】実験例７において、各アストロサイトについて測定した蛍光強度（相対値）のヒストグラムである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
［アストロサイトの製造方法］
１実施形態において、本発明は、胚様体を単一細胞に解離させてｂＦＧＦ及びＥＧＦを含有する無血清培地中で浮遊培養し、神経幹細胞塊を得る工程と、前記神経幹細胞塊を単一細胞に解離させて無血清培地中で接着培養し、アストロサイトを含む細胞集団を得る工程と、を備える、アストロサイトの製造方法を提供する。
【００１０】
実施例において後述するように、本実施形態の製造方法により、高い割合でアストロサイトを含む細胞集団を製造する技術を提供することができる。また、従来、アストロサイトを分化誘導するには半年程度を要していた。これに対し、本実施形態の方法によれば、約３ヵ月でアストロサイトを製造することができる。また、本実施形態の製造方法は全工程を無血清状態で行うため、静的状態のアストロサイトを製造することができる。
【００１１】
静的状態のアストロサイトは、不活性な状態のアストロサイトであるということができる。実施例において後述するように、アストロサイトが静的状態であるか否かは、例えば次の方法により判定することができる。まず、判定対象のアストロサイトの培地に血清を加え、血清添加前及び血清添加後における、ＧＦＡＰ、ＮＦＩＡ、ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＥＡＡＴ２等のアストロサイト関連遺伝子の発現量をそれぞれ測定する。その結果、血清添加前のアストロサイトにおける上記遺伝子の発現量と比較して、血清添加後のアストロサイトにおける上記遺伝子の発現量が上昇した場合、判定対象のアストロサイトは静的状態であると判定することができる。
【００１２】
本実施形態の製造方法において、前記胚様体は、多能性幹細胞を無血清培地中で培養することにより得られたものであることが好ましい。これにより、静的状態のアストロサイトを製造しやすくなる。
【００１３】
本実施形態の製造方法において、単一細胞に解離させるとは、細胞塊を形成している細胞を１個ずつばらばらに解離させることを意味する。単一細胞への解離は、通常、細胞の解離に用いられる、トリプシン、ＴｒｉｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ、アキュターゼ等の酵素処理を行い、ピペッティングすること等により行うことができる。
【００１４】
また、上記の胚様体は、フィーダー細胞を使用しない培養系で培養した多能性幹細胞から得られたものであってもよい。フィーダー細胞を使用しないことにより、不純物の混入が更に低減されたアストロサイト細胞集団を製造することができる。
【００１５】
上記の多能性幹細胞は、例えばＥＳ細胞であってもよく、例えば人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であってもよい。また、上記の多能性幹細胞はヒト由来の細胞であってもよく、マウス、ラット、ブタ、ヤギ、ヒツジ、サル等の非ヒト動物由来の細胞であってもよい。  
【００１６】
また、上記の多能性幹細胞は、健常人由来の人工多能性幹細胞であってもよく、神経疾患患者由来の人工多能性幹細胞であってもよい。神経疾患患者由来の人工多能性幹細胞からアストロサイトを製造した場合、得られたアストロサイトを神経疾患のモデルとして用いることができる。このようなアストロサイトは、神経疾患のメカニズムの解明等に有用である。
【００１７】
本実施形態の製造方法において、胚様体を単一細胞に解離させて浮遊培養し、神経幹細胞塊を得る前記工程は、前記胚様体を単一細胞に解離させてｂＦＧＦ及びＥＧＦを含有する無血清培地中で浮遊培養し、１次神経幹細胞塊を得る工程と、前記１次神経幹細胞塊を単一細胞に解離させてｂＦＧＦ及びＥＧＦを含有する無血清培地中で浮遊培養し、高次神経幹細胞塊を得る工程とを含むことが好ましい。
【００１８】
本明細書において、１次神経幹細胞塊を単一細胞に解離させて無血清培地中で浮遊培養した結果得られる神経幹細胞塊を２次神経幹細胞塊という。また、２次神経幹細胞塊を単一細胞に解離させて無血清培地中で浮遊培養した結果得られる神経幹細胞塊を３次神経幹細胞塊という。
【００１９】
本実施形態の製造方法では、単一細胞への解離と神経幹細胞塊の形成を２回以上繰り返すことが好ましく、３回以上繰り返すことがより好ましい。実施例において後述するように、高次神経幹細胞塊を経てアストロサイトを製造することにより、静的状態を示すアストロサイトを高濃度に含有するアストロサイト細胞集団を製造することができる。
【００２０】
なお、細胞の浮遊培養は、細胞接着用の表面コートがなされていない培養容器を用いて細胞を培養することにより行うことができる。
【００２１】
本実施形態の製造方法において、神経幹細胞塊を単一細胞に解離させて接着培養し、アストロサイトを得る工程には、無血清培地を用いてもよいし、ＢＤＮＦを添加した無血清培地を用いてもよいし、ＧＤＮＦを添加した無血清培地を用いてもよいし、ＢＤＮＦ及びＧＤＮＦを添加した無血清培地を用いてもよい。
【００２２】
ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦは必須ではないが、ＢＤＮＦ及び／又はＧＤＮＦを無血清培地に添加することにより、得られるアストロサイトの形態を、放射状グリアのように未熟な形態から、星型形態、アメーバ形態等の、より成熟したアストロサイトの形態にすることができる。
【００２３】
また、無血清培地としては、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、実施例において後述するＭＨＭ／Ｂ２７培地等を用いることができる。
【００２４】
なお、細胞の接着培養は、細胞接着用の表面コートがなされた培養容器を用いて細胞を培養することにより行うことができる。細胞接着用の表面コートとしては、ラミニンコート、ポリオルニチンコート、ポリ−Ｌ−リジンコート、マトリゲルコート等を用いてもよい。
【００２５】
本実施形態の製造方法により得られる細胞集団中のアストロサイトの割合は９０％以上であり、例えば９５％以上であり、例えば１００％である。本明細書において、アストロサイトの割合が１００％であるとは、培養容器中に存在する細胞の全てがアストロサイトであることを意味する。従来、このような純度のアストロサイトを製造することは困難であった。これに対し、上述した製造方法により、このようなアストロサイトを製造することができる。
【００２６】
本明細書において、細胞集団中のアストロサイトの割合が高いとは、培養容器中に存在する細胞のうち、アストロサイトが占める割合が高いことを意味し、アストロサイトの分化効率が高いといいかえることもできる。
【００２７】
本実施形態の製造方法において、神経幹細胞塊を単一細胞に解離させて、無血清培地中、又は、ＢＤＮＦ及び／又はＧＤＮＦを含有する無血清培地中で接着培養すると、アストロサイト及び神経細胞が出現する。この段階において、細胞集団中のアストロサイトの割合は約７０％程度である。このアストロサイトを培養容器から剥離させて継代を行うと、神経細胞が消失し、よりアストロサイトの割合が高い細胞集団を得ることができる。継代を３回行った場合、得られる細胞集団中のアストロサイトの割合はほぼ１００％になる。この継代により、神経前駆細胞の分化を促しつつ、出現する神経細胞を除去し、更には未熟なアストロサイトを成熟したものへと導くことができる。
【００２８】
［細胞集団］
１実施形態において、本発明は、容器内に無血清状態で収容された細胞集団であって、アストロサイトの割合が９０％以上、好ましくは９５％以上、更に好ましくは１００％である、細胞集団を提供する。
【００２９】
従来、このような割合でアストロサイトを含む細胞集団を製造することは困難であった。これに対し、上述した製造方法により、このような細胞集団を製造することができる。本実施形態の細胞集団中のアストロサイトは成熟状態であり、長期の調製時間を経ることなく直ちに研究等に用いることができ便利である。従来、アストロサイトを製造するためには、半年程度の時間を要する場合があった。
【００３０】
本実施形態の細胞集団中のアストロサイトは静的状態であることが好ましい。上述した製造方法により製造し、無血清状態を維持した状態で容器に収容することにより、静的状態を維持した状態でアストロサイトを提供することが可能である。
【００３１】
静的状態のアストロサイトは、生体内に存在する正常なアストロサイトにより近い状態であると考えられている。このため、静的状態のアストロサイトを用いた解析を行うことにより、より生体内の状態を反映した実験結果を得ることができる。
【００３２】
本実施形態の細胞集団は、１×１０５個／ｍＬ以上、例えば５×１０５個／ｍＬ以上、例えば１×１０６個／ｍＬ以上の細胞密度で容器に収容されていてもよい。従来、このような大量のアストロサイトを製造することは困難であった。これに対し、上述した製造方法により、このようなアストロサイトを製造することができる。
【００３３】
本実施形態のアストロサイトは凍結状態であり、通常細胞の凍結保存に用いられるクライオチューブ等に収容されていてもよい。この場合、凍結保存液としては市販のものを用いることができる。無血清の凍結保存液としては、例えば、ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標）２（日本全薬工業株式会社）やバンバンカー（登録商標）（株式会社リンフォテック）等が挙げられる。
【００３４】
また、実施例において後述するように、本実施形態の細胞集団は、ＧＬｕｔａｍａｔｅ  ＡＳｐａｒｔａｔｅ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ（ＧＬＡＳＴ）の発現量とＧＦＡＰの発現量について下記式（１）で算出される値αが、ヒト脳組織におけるＧＬＡＳＴの発現量とＧＦＡＰの発現量について下記式（１）で算出される値αよりも大きいことを特徴とする。
α＝ＧＬＡＳＴの発現量／ＧＦＡＰの発現量  …（１）
【００３５】
ここで、ヒト脳組織として、市販のヒト脳組織由来の全ＲＮＡを用いて上記の値αを算出してもよい。本実施形態のアストロサイトにおける値αは、ヒト脳組織における値αの、例えば１．２倍であり、例えば１．４倍であり、例えば１．６倍であり、例えば１．８倍であり、例えば２倍である。
【００３６】
また、実施例において後述するように、本実施形態の細胞集団は、Ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ２（ＥＡＡＴ２）の発現量とＧＦＡＰの発現量について下記式（２）で算出される値βが、ヒト脳組織におけるＥＡＡＴ２の発現量とＧＦＡＰの発現量について下記式（２）で算出される値βよりも大きいことを特徴とする。
β＝ＥＡＡＴ２の発現量／ＧＦＡＰの発現量  …（２）
【００３７】
ここでも、ヒト脳組織として、市販のヒト脳組織由来の全ＲＮＡを用いて上記の値βを算出することができる。本実施形態のアストロサイトにおける値βは、ヒト脳組織における値βの、例えば１．２倍であり、例えば１．４倍であり、例えば１．６倍であり、例えば１．８倍であり、例えば２倍である。
【００３８】
また、実施例において後述するように、本実施形態の細胞集団は、ＧＦＡＰ陽性細胞を９５％以上、好ましくは９８％以上、更に好ましくは１００％含む。また、本実施形態の細胞集団は、Ｓ１００Ｂ陽性細胞を９５％以上、好ましくは９８％以上、更に好ましくは１００％含む。また、実施例において後述するように、本実施形態の細胞集団は、ＮＦＩＡ陽性細胞を９５％以上、好ましくは９８％以上、更に好ましくは１００％含む。
【００３９】
また、実施例において後述するように、本実施形態の細胞集団は、培地に血清を添加するとＧＦＡＰ、ＮＦＩＡ、ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＥＡＡＴ２等の発現量が上昇することを特徴とする。
【００４０】
本実施形態の細胞集団は、上述した製造方法により製造されたものであるため、細胞集団中のアストロサイトは静的状態である。そこで、培地に血清を添加すると、ＧＦＡＰ、ＮＦＩＡ、ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＥＡＡＴ２等の発現量が、無血清状態における発現量と比較して上昇する。例えば、ＧＦＡＰの発現量の上昇の程度は、例えば１．２倍であり、例えば１．４倍であり、例えば１．６倍である。
【００４１】
［共培養物］
１実施形態において、本発明は、上述した細胞集団及び神経細胞の共培養物を提供する。
【００４２】
ここで、神経細胞としては、多能性幹細胞から分化誘導した神経細胞や初代培養の神経細胞等が挙げられる。この場合、神経細胞の分化誘導に用いる多能性幹細胞は、アストロサイトの分化誘導に用いる多能性幹細胞と同様であってよい。すなわち、上記の多能性幹細胞は、例えばＥＳ細胞であってもよく、例えば人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であってもよい。また、上記の多能性幹細胞はヒト由来の細胞であってもよく、マウス、ラット、ブタ、ヤギ、ヒツジ、サル等の非ヒト動物由来の細胞であってもよい。
【００４３】
上述した細胞集団及び神経細胞の共培養物は、アストロサイト及び神経細胞が共培養された共培養系といいかえることができる。共培養物とは、すなわち、培養容器内で共培養されたアストロサイト及び神経細胞であり、これに培地、培養容器を含めてもよい。
【００４４】
本実施形態の共培養物を用いることにより、神経疾患の治療薬のスクリーニング、神経疾患のメカニズムの解明等を行うことができる。
【００４５】
［神経疾患の治療薬のスクリーニング方法］
１実施形態において、本発明は、被験物質の存在下で、上述した細胞集団及び神経細胞を共培養する工程と、前記神経細胞の、突起伸長、形態、シナプス小胞、遺伝子発現、タンパク質発現又は電気生理学的パラメータを評価し、評価結果を得る工程と、を備え、前記評価結果が、被験物質の非存在下における評価結果と比較して有意に変化したことが、前記被験物質が神経疾患の治療薬の候補であることを示す、神経疾患の治療薬のスクリーニング方法を提供する。本実施形態のスクリーニング方法により、神経疾患の治療薬をスクリーニングすることができる。
【００４６】
本実施形態のスクリーニング方法において、被験物質としては特に制限されず、例えば、天然化合物ライブラリ、合成化合物ライブラリ、既存薬ライブラリ、代謝物ライブラリ等が挙げられる。
【００４７】
神経細胞の突起伸長の評価としては、例えば、共培養したアストロサイト及び神経細胞をパラホルムアルデヒド固定後、免疫染色によりＭＡＰ２やβ３−ｔｕｂｕｌｉｎを染色し、顕微鏡観察により神経突起の長さを測定することが挙げられる。
【００４８】
神経細胞の形態の評価としては、例えば、共培養したアストロサイト及び神経細胞をパラホルムアルデヒド固定後、免疫染色によりＭＡＰ２やβ３−ｔｕｂｕｌｉｎを染色し、顕微鏡観察により評価するか、神経突起の長さや形態を評価することが挙げられる。
【００４９】
神経細胞のシナプス小胞の評価としては、例えば、共培養したアストロサイト及び神経細胞をパラホルムアルデヒド固定後、免疫染色によりＳｙｎａｐｓｙｎ−１を染色して、陽性ドットを定量することが挙げられる。
【００５０】
神経細胞の遺伝子発現の評価としては、例えば、共培養したアストロサイト及び神経細胞をセルソーター等を用いてそれぞれの細胞種に分離し、リアルタイム定量ＰＣＲ解析や、ＲＮＡ−Ｓｅｑ解析等により解析することが挙げられる。
【００５１】
神経細胞のタンパク質発現の評価としては、例えば、共培養したアストロサイト及び神経細胞を免疫染色やウェスタンブロット解析に供し、対象とするタンパク質の発現を解析することが挙げられる。
【００５２】
神経細胞の電気生理学的パラメータの評価としては、例えば、パッチクランプ法やカルシウムイメージング法、微小電極アレイを用いて電位依存性神経活動を定量すること等が挙げられる。
【００５３】
被験物質の存在下における、神経細胞の、突起伸長、形態、シナプス小胞、遺伝子発現、タンパク発現又は電気生理学的パラメータの評価結果が、被験物質の非存在下における評価結果と比較して有意に変化した場合、上記の被験物質は神経疾患の治療薬の候補であると判断することができる。
【００５４】
［神経幹細胞からアストロサイトへの分化誘導用無血清培地］
１実施形態において、本発明は、トランスフェリン、プトレシン、インスリン、プロゲステロン、亜セレン酸ナトリウム及びＢ２７サプリメントを含有する、神経幹細胞からアストロサイトへの分化誘導用無血清培地を提供する。
【００５５】
神経幹細胞は、神経幹細胞塊を単一細胞に解離させたものであることが好ましい。また、本実施形態の培地は、神経幹細胞の接着培養に用いるものであることが好ましい。
【００５６】
神経幹細胞をアストロサイトに分化誘導するための従来の培地は血清を含んでいた。これに対し、本実施形態の培地は無血清である。このため、静的状態のアストロサイトを分化誘導することができる。
【００５７】
また、神経幹細胞をアストロサイトに分化誘導するための従来の培地は、Ｐｌａｔｅｌｅｔ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＰＤＧＦ）やＣｉｌｉａｒｙ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ（ＣＮＴＦ）を含有しており、高コストであった。これに対し、本実施形態の培地はこれらの因子を必要としないため、安価である。
【００５８】
本実施形態の培地は、ＢＤＮＦ又はＧＤＮＦのいずれか一方を更に含有していてもよく、ＢＤＮＦ及びＧＤＮＦの双方を更に含有していてもよい。ＢＤＮＦ及びＧＤＮＦは必須ではないが、ＢＤＮＦ及び／又はＧＤＮＦを無血清培地に添加することにより、得られるアストロサイトの形態を、星型形態、アメーバ形態等の、より成熟したアストロサイトの形態にすることができる。
【実施例】
【００５９】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００６０】
［実験例１］
（ヒトｉＰＳ細胞からアストロサイトへの分化誘導）
ヒトｉＰＳ細胞を分化誘導し、アストロサイトを製造した。ヒトｉＰＳ細胞としては、ヒトｉＰＳ細胞株である２０１Ｂ７細胞を使用した。【００６１】
図１は、本実験例で用いた分化誘導プロトコールを示す模式図である。図１中、「Ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙ」は胚様体を意味し、「Ｎｅｕｒａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ（ＮＳ）」は神経幹細胞塊を意味し、「Ｐｒｉｍａｒｙ  ＮＳ」は１次神経幹細胞塊を意味し、「Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ＮＳ」は２次神経幹細胞塊を意味し、「Ｎｅｕｒｏｎ」は神経細胞を意味し、「Ａｓｔｒｏｃｙｔｅ」はアストロサイトを意味する。また、「ＤＭＥＭ」はダルベッコ改変イーグル培地を意味し、「Ｆ１２」はハムＦ１２  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅを意味し、「ＭＨＭ」はｍｅｄｉａ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｍｉｘ  ｍｅｄｉｕｍを意味し、「ＫＳＲ」はＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔを意味し、「３ｉ」は３μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１、３μＭ  ＳＢ４３１５４２、３μＭ  Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎｅを意味し、「ＲＡ」はレチノイン酸を意味し、「ＰＭ」はＰｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅを意味し、「ｂＦＧＦ」はＦＧＦ−２とも呼ばれるＢａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒを意味し、「ＥＧＦ」はＥｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒを意味し、「ＢＤＮＦ」はＢｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒを意味し、「ＧＤＮＦ」はｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒを意味する。【００６２】
図１に示す分化誘導プロトコールでは、一貫して血清を使用しない。以下、より詳細な分化誘導の手順を説明する。【００６３】
《ヒト胚様体（ｈＥＢ）形成（０〜１５日目）》
まず、フィーダー入りの１０ｃｍディッシュ上にセミコンフルエントのヒトｉＰＳ細胞を準備した。続いて、解離液Ｔでフィーダー細胞をはがした。解離液Ｔの組成を下記表１に示す。続いて、５ｍＬのＰＢＳ（−）で２度洗浄した。【００６４】
【表１】
2020054647.tif 000002
【００６５】
続いて、１０ｃｍディッシュあたり２ｍＬのｈＥＳ培地を入れた。ｈＥＳ培地の組成を下記表２に示す。【００６６】
【表２】
2020054647.tif 000003
【００６７】
続いて、スクレイパーを用いて、ヒトｉＰＳ細胞コロニーをディッシュからはがした。続いて、１５ｍＬチューブに細胞を回収し、室温で５分間静置した。続いて、上清を除去し、５ｍＬのｂＦＧＦ不含ｈＥＳ培地を添加した。続いて、室温、１，０００ｒｐｍで５分間遠心した。【００６８】
続いて、１０ｃｍ微生物用ディッシュに１０μＭ  Ｙ−２７６３２を入れた。続いて、遠心後の上清を吸引し、１０ｍＬのｂＦＧＦ不含ｈＥＳ培地を優しく加え、Ｙ−２７６３２入り１０ｃｍ微生物用ディッシュに全量移した。続いて、３７℃、３％ＣＯ２の条件下で一晩細胞をインキュベートした。【００６９】
続いて、翌日、ｈＥＢ培地に培地交換した（１日目）。ｈＥＢ培地の組成を下記表３に示す。【００７０】
【表３】
2020054647.tif 000004
【００７１】
続いて、ｈＥＢを１５ｍＬチューブに回収し、５分間静置した。続いて、培地を吸引し、３μＭ  Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎｅ（型式「Ｐ５４９９」Ｓｉｇｍａ社）、３μＭ  ＳＢ４３１５４２（型式「Ｓ４３１７」、Ｓｉｇｍａ社）及び３μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１を含むｈＥＢ培地１０ｍＬで細胞を優しく懸濁し、微生物用ディッシュに戻した。【００７２】
続いて、１μＭレチノイン酸（型式「Ｒ２６２５」、Ｓｉｇｍａ社）を含むｈＥＢ培地に培地交換した（４日目）。続いて、１μＭレチノイン酸及び１μＭ  Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅを含むｈＥＢ培地に培地交換した（７日目）。その後、３日毎に１μＭレチノイン酸及び１μＭ  Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅを含むｈＥＢ培地に培地交換した（１０日目と１３日目）。【００７３】
《ＥＢ分離（１６日目）》
続いて、ヒト胚様体を１５ｍＬチューブに回収し、５分間静置した。続いて、上清を除去し、細胞解離酵素であるＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（サーモフィッシャーサイエンテェフィック社）１ｍＬで細胞を懸濁した。続いて、３７℃の温浴で１０分間細胞をインキュベートした。続いて、温浴から出して、細胞の分離具合を見ながら素早くトリプシンインヒビター１ｍＬを加え、ピペッティングを行った。【００７４】
続いて、１０００μＬピペットで１０〜２０回ピペッティングし、ヒト胚様体を単一細胞まで解離させた。続いて、解離せずに残ったヒト胚様体の塊を除くために、セルストレイナー（７０μｍ、ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ社）を通した。続いて、セルストレイナー上にＭＨＭ培地  １ｍＬを注いで洗浄した。続いて、１，０００ｒｐｍで５分間遠心を行った。続いて、上清を除去し、ＭＨＭ培地  １ｍＬを加え、細胞数を計測した。ＭＨＭ培地の組成を下記表４に示す。【００７５】
【表４】
2020054647.tif 000005
【００７６】
２０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ（型式「１００−１８Ｂ」、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、１０ｎｇ／ｍＬ  ＥＧＦ（型式「ＡＦ−１００−１５」、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、１μＭ  Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅを含むｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ培地３０ｍＬをＴ７５フラスコに用意しておき、１×１０５〜４×１０５個／ｍＬで細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに入れた。ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ培地の組成を下記表５に示す。【００７７】
【表５】
2020054647.tif 000006
【００７８】
《１次神経幹細胞塊の維持（１７〜３１日目）》
２０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍＬ  ＥＧＦをＴ７５フラスコに添加した（２０日目）。続いて、１次神経幹細胞塊を５０ｍＬチューブに回収し、１，０００ｒｐｍで１０分間遠心した。２０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍＬ  ＥＧＦ、１μＭ  Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅを含む新しいｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ培地３０ｍｌをＴ７５フラスコに用意しておき、細胞を全量フラスコに移し、培地交換した（２４日目）。続いて、２０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍＬ  ＥＧＦをＴ７５フラスコに添加した（２８日目）。【００７９】
《１次神経幹細胞塊の継代（３２日目）》
１次神経幹細胞塊を５０ｍＬチューブに回収し、１，０００ｒｐｍで５分間遠心した。続いて、上清を除去し、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ  １ｍＬで１次神経幹細胞塊を懸濁した。続いて、３７℃の温浴で１０〜１５分間インキュベートした。続いて、細胞の分離具合を見ながら、素早くトリプシンインヒビター１ｍＬを添加し混合した。【００８０】
続いて、１０００μＬピペットで２０〜３０回ピペッティングし、１次神経幹細胞塊を単一細胞まで解離させた。続いて、解離せずに残った１次神経幹細胞塊を除くために、セルストレイナー（７０μｍ、ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ社）を通した。続いて、セルストレイナー上にＭＨＭ／Ｂ２７  １ｍＬを注いで洗浄した。続いて、１，０００ｒｐｍで５分間遠心を行った。続いて、上清を除去し、ＭＨＭ／Ｂ２７  １ｍＬを加え、細胞数を計測した。【００８１】
続いて、２０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍＬ  ＥＧＦを含むｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ培地３０ｍＬをＴ７５フラスコに用意しておき、１×１０５〜４×１０５個／ｍＬで細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに入れた。【００８２】
《２次神経幹細胞塊の維持（３３〜４８日目）》
２０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍＬ  ＥＧＦをＴ７５フラスコに添加した（３６日目）。続いて、２次神経幹細胞塊を５０ｍＬチューブに回収し、１，０００ｒｐｍで１０分間遠心した。２０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍＬ  ＥＧＦを含む新しいｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ培地３０ｍｌをＴ７５フラスコに用意しておき、細胞を全量フラスコに移し、培地交換した（４０日目）。続いて、２０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍＬ  ＥＧＦをＴ７５フラスコに添加した（４４日目）。【００８３】
《アストロサイトへの終末分化（４８〜７６日目）》
２次神経幹細胞塊を５０ｍＬチューブに回収し、１，０００ｒｐｍで５分間遠心した。続いて、上清を除去し、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ  １ｍＬで２次神経幹細胞塊を懸濁した。続いて、３７℃の温浴で１０〜１５分間インキュベートした。続いて、細胞の分離具合を見ながら、素早くトリプシンインヒビター１ｍＬを添加し混合した。【００８４】
続いて、１０００μＬピペットで２０〜３０回ピペッティングし、２次神経幹細胞塊を単一細胞まで解離させた。続いて、解離せずに残った２次神経幹細胞塊を除くために、セルストレイナー（７０μｍ、ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ社）を通した。続いて、セルストレイナー上にＭＨＭ／Ｂ２７  １ｍＬを注いで洗浄した。続いて、１，０００ｒｐｍで５分間遠心を行った。続いて、上清を除去し、ＭＨＭ／Ｂ２７  １ｍＬを加え、細胞数を計測した。【００８５】
続いて、細胞をｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ培地に懸濁し、ＰＢＳ（−）で２００倍希釈したマトリゲルで１時間コーティングした６ウェルプレートに、４×１０５個／ウェルで播種した。ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ培地の組成を下記表６に示す。【００８６】
【表６】
2020054647.tif 000007
【００８７】
続いて、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに入れた。続いて、７日間毎にｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ培地２ｍＬを用いて培地交換を行った（この細胞をＡ０とした）。【００８８】
《アストロサイトの純化（７７〜９８日目）》
続いて、Ａ０からＡ１に継代した。まず、培地を除去し、細胞剥離液（商品名「アキュターゼ」、フナコシ株式会社）７００μＬ／ウェルを添加し、３７℃で３０〜６０分間インキュベートした。【００８９】
続いて、１０００μＬピペットを用いて、６ウェルプレートの各ウェルの細胞をピペッティングによりはがし、１５ｍＬチューブに回収した。続いて、ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ培地１ｍＬを用いて、６ウェルプレートの全ウェルを順々に洗浄し、同じ１５ｍＬチューブに回収した（計７ｍＬ）。【００９０】
続いて、１，０００ｒｐｍで５分間遠心を行った。続いて、上清を除去し、ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ培地６ｍＬを加え、強めに２０〜３０回ピペッティングを行った。【００９１】
続いて、マトリゲルで１時間コーティングを行った６ウェルプレートへ、ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ培地を１ｍＬ／ウェルずつ添加した。続いて、ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ培地６ｍＬの細胞懸濁液を１ｍＬずつ６ウェルプレートの各ウェルへ播種した。続いて、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに入れた。続いて、Ａ０からＡ１への継代と同様にして、９１日目にＡ１からＡ２への継代を行い、更に９８日目にＡ２からＡ３への継代を行った。【００９２】
以上の方法により、ヒトｉＰＳ細胞からアストロサイトを分化誘導することができた。アストロサイトは血清存在下では不可逆的な炎症性／反応性を獲得してしまうと考えられている。これに対し、上記の方法は無血清で行うため、上記の方法により静的状態の成熟したアストロサイトを得ることができる。また、上記の方法により分化誘導したアストロサイトは、成熟アストロサイトの段階で、無血清状態で凍結保存し、また、解凍することができた。また、フィーダー細胞を使用しない培養系のｉＰＳ細胞からも同様にしてアストロサイトを誘導することができた。【００９３】
［実験例２］
（ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導したアストロサイトの遺伝子発現の検討）
実験例１と同様にして分化誘導したアストロサイトの各分化段階における、アストロサイト関連遺伝子の発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により検討した。アストロサイト関連遺伝子としては、Ｇｌｉａｌ  Ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  Ａｃｉｄｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＡＰ）、Ｓ１００  Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ（Ｓ１００Ｂ）、Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆａｃｔｏｒ  ＩＡ（ＮＦＩＡ）、Ａｌｄｅｈｙｄｅ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  １  Ｆａｍｉｌｙ  Ｍｅｍｂｅｒ  Ｌ１（ＡＬＤＨ１Ｌ１）、ＧＬｕｔａｍａｔｅ  ＡＳｐａｒｔａｔｅ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ（ＧＬＡＳＴ、ＳＬＣ１Ａ３とも呼ばれる）、Ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ２（ＥＡＡＴ２、ＳＬＣ１Ａ２とも呼ばれる）を検討した。【００９４】
図２（ａ）〜（ｆ）は、各遺伝子の発現量の測定結果を示すグラフである。図２（ａ）はＧＦＡＰの測定結果を示すグラフであり、図２（ｂ）はＳ１００Ｂの測定結果を示すグラフであり、図２（ｃ）はＮＦＩＡの測定結果を示すグラフであり、図２（ｄ）はＡＬＤＨ１Ｌ１の測定結果を示すグラフであり、図２（ｅ）はＧＬＡＳＴの測定結果を示すグラフであり、図２（ｆ）はＥＡＡＴ２の測定結果を示すグラフである。図２（ａ）〜（ｆ）中、縦軸は発現量の相対値を示し、「ｉＰＳＣ」はアストロサイトへの分化誘導前のｉＰＳ細胞を意味し、「ＥＢ」はアストロサイトへの分化誘導過程の胚様体を意味し、「ＮＳ−ｐ１」は１次神経幹細胞塊を意味し、「ＮＳ−ｐ２」は２次神経幹細胞塊を意味し、「Ｎｅｕｒｏｎ＋Ａｓｔｒｏｃｙｔｅ」は実験例１の分化誘導開始後３０日目の細胞を意味する。この段階のアストロサイトは約７０％程度の割合の神経細胞を含んでいた。また、「ＮＧ２−Ｎｅｕｒｏｎ」はｉＰＳ細胞にＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ−２遺伝子を導入して作製した純粋な神経細胞を意味し、「ｈｕｍａｎ  Ｂｒａｉｎ」はヒト脳組織を意味する。「ｈｕｍａｎ  Ｂｒａｉｎ」としては、ヒト脳組織由来の全ＲＮＡ（型式「６３９３２０」、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を使用した。【００９５】
その結果、アストロサイト関連遺伝子の発現量は、ｉＰＳ細胞からアストロサイトへの分化誘導が進行するにつれて上昇する傾向が認められた。【００９６】
また、実験例１と同様にしてｉＰＳ細胞から分化誘導したアストロサイトは、ＧＬＡＳＴの発現量とＧＦＡＰの発現量について下記式（１）で算出される値αが、ヒト脳組織におけるＧＬＡＳＴの発現量とＧＦＡＰの発現量について下記式（１）で算出される値αよりも大きいという特徴を有していた。
α＝ＧＬＡＳＴの発現量／ＧＦＡＰの発現量  …（１）【００９７】
すなわち、実験例１と同様にしてｉＰＳ細胞から分化誘導したアストロサイトは、ＧＦＡＰの発現量がヒト脳組織におけるＧＦＡＰの発現量と同程度であり、かつ、ＧＬＡＳＴの発現量がヒト脳組織におけるＧＬＡＳＴの発現量の約２倍程度であった。【００９８】
また、実験例１と同様にしてｉＰＳ細胞から分化誘導したアストロサイトは、ＥＡＡＴ２の発現量とＧＦＡＰの発現量について下記式（２）で算出される値βが、ヒト脳組織におけるＥＡＡＴ２の発現量とＧＦＡＰの発現量について下記式（２）で算出される値αよりも大きいという特徴を有していた。
β＝ＥＡＡＴ２の発現量／ＧＦＡＰの発現量  …（２）【００９９】
すなわち、実験例１と同様にしてｉＰＳ細胞から分化誘導したアストロサイトは、ＧＦＡＰの発現量がヒト脳組織におけるＧＦＡＰの発現量と同程度であり、かつ、ＥＡＡＴ２の発現量がヒト脳組織におけるＥＡＡＴ２の発現量の約２倍程度であった。【０１００】
続いて、実験例１と同様にして分化誘導開始後５１日目のアストロサイトにおける、ＧＦＡＰ、Ｓ１００Ｂ、ＮＦＩＡの発現量を蛍光免疫染色により検討した。【０１０１】
図３（ａ）〜（ｄ）は蛍光免疫染色の結果を示す写真である。図３（ａ）はＧＦＡＰの発現を検出した写真であり、図３（ｂ）はＳ１００Ｂの発現を検出した写真であり、図３（ｃ）はＮＦＩＡの発現を検出した写真であり、図３（ｄ）はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で細胞核を染色した結果を示す写真である。【０１０２】
その結果、実験例１と同様にして分化誘導した細胞はアストロサイトの形状をしていることが確認された。また、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２陽性細胞の全てが、ＧＦＡＰ、Ｓ１００Ｂ、ＮＦＩＡをそれぞれ発現していることが明らかとなった。この結果は、分化誘導により得られた細胞のほぼ１００％がアストロサイトであることを意味する。【０１０３】
［実験例３］
（ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導したアストロサイトの機能解析１）
実験例１と同様にして分化誘導したアストロサイトの機能を解析した。具体的には、実験例１と同様にして分化誘導開始後５１日目のアストロサイトにおける、グルタミン酸取り込み及びグルタミンレセプター刺激への応答性を検討した。【０１０４】
《グルタミン酸取り込み》
アストロサイトはグルタミン酸を取り込むことが知られている。そこで、実験例１と同様にして分化誘導したアストロサイトと、分化誘導に用いたヒトｉＰＳ細胞株である２０１Ｂ７のそれぞれについて、グルタミン酸添加後の培地中のグルタミン酸濃度を継時的に測定した。【０１０５】
図４は、各細胞における培地中のグルタミン酸濃度を測定した結果を示すグラフである。その結果、実験例１と同様にして分化誘導したアストロサイトは、培地中のグルタミン酸を取り込むことが確認された。この結果は、実験例１と同様にして分化誘導したアストロサイトが機能的なアストロサイトであることを示す。【０１０６】
《グルタミン酸受容体刺激への応答性》
実験例１と同様にして分化誘導したアストロサイトにカルシウム蛍光指示薬であるＦｌｕｏ−４を終濃度５μｇ／ｍＬで培地に添加し、３７℃で３０分〜１時間インキュベートした。続いて、蛍光顕微鏡を用いて１０秒毎にタイムラプス撮影を行った。【０１０７】
図５は、実験例１と同様にして分化誘導したアストロサイトへのカルシウムイオンの流入を検出した蛍光顕微鏡写真を示す。スケールバーは１００μｍである。その結果、カルシウムイオンの流入を示すシグナルが継時的に近接するアストロサイトへ伝播する様子が観察された。この結果は、実験例１と同様にして分化誘導したアストロサイトが機能的なアストロサイトであることを更に支持するものである。【０１０８】
［実験例４］
（ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導したアストロサイトの培地ヘの血清添加の影響）
実験例１と同様にして分化誘導したアストロサイトは、無血清状態であり、静的状態である。このアストロサイトの培地に血清を添加し、アストロサイト関連遺伝子の発現量の変化を定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により検討した。アストロサイト関連遺伝子としては、実験例２と同様の遺伝子、すなわち、ＧＦＡＰ、Ｓ１００Ｂ、ＮＦＩＡ、ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＳＬＣ１Ａ３、ＳＬＣ１Ａ２を検討した。【０１０９】
図６（ａ）〜（ｆ）は、各遺伝子の発現量の測定結果を示すグラフである。図６（ａ）はＧＦＡＰの測定結果を示すグラフであり、図６（ｂ）はＳ１００Ｂの測定結果を示すグラフであり、図６（ｃ）はＮＦＩＡの測定結果を示すグラフであり、図６（ｄ）はＡＬＤＨ１Ｌ１の測定結果を示すグラフであり、図６（ｅ）はＧＬＡＳＴの測定結果を示すグラフであり、図６（ｆ）はＥＡＡＴ２の測定結果を示すグラフである。図６（ａ）〜（ｆ）中、縦軸は発現量の相対値を示し、「ｓｔａｎｄａｒｄ」は無血清状態のアストロサイトを意味し、「１０％ＦＢＳ」は培地に１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したアストロサイトを意味する。【０１１０】
その結果、実験例１と同様にして分化誘導したアストロサイトは、培地に血清を添加するとＧＦＡＰ、ＮＦＩＡ、ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＥＡＡＴ２の発現量が上昇することが明らかとなった。この結果は、培地への血清の添加により、実験例１と同様にして分化誘導したアストロサイトの活性化が誘導されていることを示す。【０１１１】
［実験例５］
（ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導したアストロサイトと神経細胞の共培養１）
実験例１と同様にして分化誘導したアストロサイトと神経細胞との共培養を行った。神経細胞としては、ｉＰＳ細胞から分化誘導した神経細胞を使用した。【０１１２】
まず、ｉＰＳ細胞から神経細胞を分化誘導した。続いて、神経細胞の培地に、実験例１と同様にして分化誘導したアストロサイトを播種し、３０日間共培養した。【０１１３】
続いて、細胞をパラホルムアルデヒド固定し、神経細胞のマーカーであるＭｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ２（ＭＡＰ２）及びＳｙｎａｐｓｉｎ−１、並びにアストロサイトのマーカーであるＧＦＡＰを蛍光免疫染色した。【０１１４】
図７（ａ）〜（ｃ）は蛍光免疫染色の結果を示す写真である。図７（ａ）はＭＡＰ２の発現を検出した写真であり、図７（ｂ）はＳｙｎａｐｓｉｎ−１の発現を検出した写真であり、図７（ｃ）はＧＦＡＰの発現を検出した写真である。スケールバーは１００μｍである。【０１１５】
その結果、神経細胞及びアストロサイトがそれぞれ検出された。また、アストロサイトは神経細胞の培養系に後から添加したにもかかわらず、神経細胞の下に潜り込んだ状態となった。この状態は生体内におけるアストロサイトと神経細胞との配置に類似していた。  【０１１６】
本共培養系を用いることにより、神経細胞の突起伸長、形態、シナプス小胞、遺伝子発現、タンパク発現、シナプス応答の電気生理学的変化等を解析することができる。また、これらの変化を被験物質の存在下で解析することにより、神経疾患の治療薬のスクリーニングを行うこともできる。また、疾患患者由来のｉＰＳ細胞から分化誘導した神経細胞や、疾患患者由来のｉＰＳ細胞から分化誘導したアストロサイトを用いた共培養系を解析することにより、疾患のメカニズムを解析することができる。【０１１７】
［実験例６］
（ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導したアストロサイトと神経細胞の共培養２）
アポリポタンパクＥは、ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、ＨＤＬ等のリポタンパク質を構成している主要なアポリポタンパク質の１つである。アポリポタンパクＥをコードするＡＰＯＥ遺伝子にはε２、ε３、ε４の３つの対立遺伝子があり、アポリポタンパクＥには、各対立遺伝子に対応するＥ２、Ｅ３、Ｅ４の３つのアイソフォームが存在する。ε３／ε３アリルにコードされるアポリポタンパクＥ３は正常型（野生型）であり、ε４／ε４アリルにコードされるアポリポタンパクＥ４はアルツハイマー病（ＡＤ）の危険因子と考えられている。また、ε２／ε２アリルにコードされるアポリポタンパクＥ２は受容体との結合力が低く高脂血症の原因になると考えられている。【０１１８】
本実験例では、まず、ＡＰＯＥ遺伝子座が、それぞれ、ε２／ε２アリル、ε３／ε３アリル及びε４／ε４アリルであるｉＰＳ細胞を用いた以外は実験例１と同様にして、各アイソフォームのアポリポタンパク質を発現するアストロサイトをそれぞれ分化誘導した。【０１１９】
続いて、得られた各アストロサイトを神経細胞とそれぞれ共培養した。神経細胞としては、ｉＰＳ細胞から分化誘導した神経細胞を使用した。また、アストロサイトと共培養しなかった神経細胞を対照に用いた。【０１２０】
まず神経細胞に対してリポソーム法を用いて緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）とアクチンとの融合タンパク質（ＧＦＰ−Ａｃｔｉｎ）の発現プラスミドを導入した。続いて、発現プラスミドの導入から２週間以内にアストロサイトとの共培養を開始した。続いて、共培養開始から７日以内に各共培養系の細胞をパラホルムアルデヒド固定して、神経スパインを検出した。【０１２１】
図８（ａ）〜（ｄ）は、ＧＦＰの蛍光を検出した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。それぞれ２視野ずつの観察結果を示す。図８（ａ）はアストロサイトと共培養しなかった神経細胞の結果であり、図８（ｂ）はε２／ε２アリルを有するアストロサイトと共培養した神経細胞の結果であり、図８（ｃ）はε３／ε３アリルを有するアストロサイトと共培養した神経細胞の結果であり、図８（ｄ）はε４／ε４アリルを有するアストロサイトと共培養した神経細胞の結果である。【０１２２】
また、図９は、図８（ａ）〜（ｄ）の結果に基づいて計測した神経スパイン密度を示すグラフである。図９中、「＊」はテューキーのポストホック検定に基づく一元配置分散分析の結果、ｐ＜０．０５で有意差が存在することを示し、「＊＊」はｐ＜０．０１で有意差が存在することを示す。【０１２３】
その結果、ε４／ε４アリルを有するアストロサイトと共培養した神経細胞では、神経スパイン密度が有意に減少したことが明らかとなった。【０１２４】
［実験例７］
（ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導したアストロサイトの機能解析２）
アストロサイトの活動性を評価するシステムを構築した。まず、実験例１と同様にして、ヒトｉＰＳ細胞を分化誘導し、アストロサイトを製造した。ヒトｉＰＳ細胞としては、健常人由来のｉＰＳ細胞株である２０１Ｂ７、ＷＤ３９、１２１０Ｃ１、及び、アルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞株であるＡＤを使用した。【０１２５】
続いて、実験例１と同様にして、Ａ３以降まで継代した各アストロサイトを、５×１０４〜１×１０５個／プレートの細胞密度で９６ウェルプレートに播種した。続いて、各アストロサイトを固定し、抗ＧＦＡＰ抗体を用いて、アストロサイトの活動性マーカーであるＧＦＡＰを蛍光免疫染色した。続いて、画像撮影解析装置（製品名「Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎａｌｙｚｅｒ」、ＧＥヘルスケア社）を用いて、各アストロサイトの蛍光強度を１細胞レベルで測定した。【０１２６】
図１０は、各アストロサイトについて測定した蛍光強度（相対値）のヒストグラムである。その結果、健常人由来のｉＰＳ細胞から分化誘導したアストロサイトではＧＦＡＰ発現量が低い細胞の割合が多かったのに対し、アルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞から分化誘導したアストロサイトではＧＦＡＰ発現量がより高い細胞の割合が増加し、ヒストグラムのピークが右側に移動する傾向が認められた。【０１２７】
この結果は、アルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞から分化誘導したアストロサイトは活動性が上昇していることを示す。また、アルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞から分化誘導したアストロサイトはアルツハイマー病の病態を反映しており、アルツハイマー病のモデルとして用いることができることを示す。
【産業上の利用可能性】
【０１２８】
本発明によれば、静的状態の成熟したアストロサイトの細胞集団を製造する技術を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年5月7日(2020.5.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
胚様体を単一細胞に解離させてＢａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ）及びＥｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）を含有する無血清培地中で浮遊培養し、神経幹細胞塊を得ることと、
前記神経幹細胞塊を単一細胞に解離させて無血清培地中で接着培養し、アストロサイトを含む細胞集団を得ることと、
を備える、アストロサイトの製造方法。
【請求項２】
前記胚様体が、多能性幹細胞を無血清培地中で培養することにより得られたものである、請求項１、１７又は１８に記載のアストロサイトの製造方法。
【請求項３】
前記多能性幹細胞が、健常人由来の人工多能性幹細胞又は神経疾患患者由来の人工多能性幹細胞である、請求項２に記載のアストロサイトの製造方法。
【請求項４】
前記神経幹細胞塊を得ることが、
前記胚様体を単一細胞に解離させてｂＦＧＦ及びＥＧＦを含有する無血清培地中で浮遊培養し、１次神経幹細胞塊を得ることと、
前記１次神経幹細胞塊を単一細胞に解離させてｂＦＧＦ及びＥＧＦを含有する無血清培地中で浮遊培養することを２回以上繰り返し、高次神経幹細胞塊を得ることと、
を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のアストロサイトの製造方法。
【請求項５】
前記アストロサイトを含む細胞集団を得ることにおいて、前記無血清培地にＢｒａｉｎ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ（ＢＤＮＦ）及び／又はＧｌｉａｌ−Ｃｅｌｌ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｆａｃｔｏｒ（ＧＤＮＦ）を更に含有させる、請求項１〜４のいずれか一項に記載のアストロサイトの製造方法。
【請求項６】
前記細胞集団中のアストロサイトの割合が９０％以上である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のアストロサイトの製造方法。
【請求項７】
前記アストロサイトが静的状態である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のアストロサイトの製造方法。
【請求項８】
容器内に無血清状態で収容された細胞集団であって、アストロサイトの割合が９０％以上であり、ＧＬｕｔａｍａｔｅ  ＡＳｐａｒｔａｔｅ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ（ＧＬＡＳＴ）の発現量とＧｌｉａｌ  Ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  Ａｃｉｄｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＡＰ）の発現量について下記式（１）で算出される値αが、ヒト脳組織におけるＧＬＡＳＴの発現量とＧＦＡＰの発現量について下記式（１）で算出される値αよりも大きい、細胞集団。
α＝ＧＬＡＳＴの発現量／ＧＦＡＰの発現量  …（１）
【請求項９】
静的状態である、請求項８に記載の細胞集団。
【請求項１０】
細胞密度が１×１０５個／ｍＬ以上である、請求項８又は９に記載の細胞集団。
【請求項１１】
Ｇｌｉａｌ  Ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  Ａｃｉｄｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＡＰ）陽性細胞を９５％以上含み、Ｓ１００  Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ＰｒｏｔｅｉｎＢ（Ｓ１００Ｂ）陽性細胞を９５％以上含む、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の細胞集団。
【請求項１２】
培地に血清を添加するとＧＦＡＰ、ＮＦＩＡ、ＡＬＤＨ１Ｌ１又はＥＡＡＴ２の発現量が上昇する、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の細胞集団。
【請求項１３】
請求項８〜１２のいずれか一項に記載の細胞集団及び神経細胞の共培養物。
【請求項１４】
被験物質の存在下で、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の細胞集団及び神経細胞を共培養することと、
前記神経細胞の、突起伸長、形態、シナプス小胞、遺伝子発現、タンパク質発現又は電気生理学的パラメータを評価し、評価結果を得ることと、
を備え、前記評価結果が、被験物質の非存在下における評価結果と比較して有意に変化したことが、前記被験物質が神経疾患の治療薬の候補であることを示す、神経疾患の治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１５】
トランスフェリン、プトレシン、インスリン、プロゲステロン、亜セレン酸ナトリウム、Ｂ２７サプリメント、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ及びＰｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅを含有し、
胚様体を単一細胞に解離させてｂＦＧＦ及びＥＧＦを含有する無血清培地中で浮遊培養して得た神経幹細胞塊を接着培養し、アストロサイトを含む細胞集団を得るために用いられる、単一細胞に解離させた胚様体から神経幹細胞塊への分化誘導用無血清培地。
【請求項１６】
トランスフェリン、プトレシン、インスリン、プロゲステロン、亜セレン酸ナトリウム、Ｂ２７サプリメントを含有し、ＢＤＮＦ及び／又はＧＤＮＦを更に含有する、
胚様体を単一細胞に解離させてｂＦＧＦ及びＥＧＦを含有する無血清培地中で浮遊培養して得た神経幹細胞塊を接着培養し、アストロサイトを含む細胞集団を得るために用いられる、神経幹細胞からアストロサイトへの分化誘導用無血清培地。
【請求項１７】
前記神経幹細胞塊を得ることにおける培地が、２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ及び１０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを含有する、請求項１に記載のアストロサイトの製造方法。
【請求項１８】
前記神経幹細胞塊を得ることにおける培地が、Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅを更に含有する、請求項１又は１７に記載のアストロサイトの製造方法。
【国際調査報告】
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2020054647.tif 000019
2020054647.tif 000020
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