(57)【要約】  Ｄ−グルコースを構成糖とする新規な環状糖質と、当該環状糖質を生成する新規酵素、それらの製造方法並びに用途を提供することを課題とし、４分子のＤ−グルコースがα−１，６グルコシド結合を介して環状に連結した構造を有するシクロイソマルトテトラオース、シクロイソマルトテトラオース生成酵素、当該酵素をコードするＤＮＡ、及びこれらの製造方法並びに用途を提供することによって上記課題を解決する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
４分子のＤ−グルコースがα−１，６グルコシド結合を介して環状に連結した構造を有するシクロイソマルトテトラオース。
【請求項２】
請求項１記載のシクロイソマルトテトラオースの結晶。
【請求項３】
５含水結晶の形態にある請求項２記載のシクロイソマルトテトラオースの結晶。
【請求項４】
粉末Ｘ線回折図において回折角（２θ）９．０°、９．８°、１１．８°、１３．１°及び１９．１°に特徴的な回折ピークを有する請求項３記載の５含水結晶の形態にあるシクロイソマルトテトラオースの結晶。
【請求項５】
請求項１記載のシクロイソマルトテトラオース及び／又は請求項２記載のシクロイソマルトテトラオースの結晶とともに他の糖質を含んでなるシクロイソマルトテトラオース含有糖質。
【請求項６】
形態が、シラップ、粉末、結晶含有粉末又は固状物のいずれかである請求項５記載のシクロイソマルトテトラオース含有糖質。
【請求項７】
シクロイソマルトテトラオースに１分子又は２分子のＤ−グルコースが結合した構造を有するシクロイソマルトテトラオースのグルコシル誘導体。
【請求項８】
グルコース重合度４以上のα−１，６グルカン、デキストラン、又はデキストランの部分分解物に作用し、請求項１記載のシクロイソマルトテトラオースを生成する作用を有するシクロイソマルトテトラオース生成酵素。
【請求項９】
下記の理化学的性質を有する請求項８記載のシクロイソマルトテトラオース生成酵素：
（１）   分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において、８６，０００±１０,０００ダルトン；
（２）至適温度
ｐＨ６．０、３０分間反応の条件下で、３５乃至４０℃；
（３）至適ｐＨ
４０℃、３０分間反応の条件下で、ｐＨ５．５乃至６．０；
（４）温度安定性
ｐＨ６．０、３０分間保持の条件下で、４０℃まで安定；
（５）ｐＨ安定性
４℃、１６時間保持の条件下で、ｐＨ５．０乃至１０．０で安定。
【請求項１０】
配列表における配列番号５又は６で示されるアミノ酸配列をＮ末端アミノ酸配列として有する請求項８又は９記載のシクロイソマルトテトラオース生成酵素。
【請求項１１】
配列表における配列番号７又は８で示されるアミノ酸配列か、又は配列表における配列番号７又は８で示されるアミノ酸配列において、その酵素活性を保持する範囲で１個又は２個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列を有する請求項８乃至１０のいずれかに記載のシクロイソマルトテトラオース生成酵素。
【請求項１２】
配列表における配列番号７又は８で示されるアミノ酸配列に対し、７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する請求項１１記載のシクロイソマルトテトラオース生成酵素。
【請求項１３】
微生物由来の酵素である請求項８乃至１２のいずれかに記載のシクロイソマルトテトラオース生成酵素。
【請求項１４】
微生物が、アグレイア（Ａｇｒｅｉａ）属に属する微生物であるか、又はミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物である請求項１３記載のシクロイソマルトテトラオース生成酵素。
【請求項１５】
アグレイア（Ａｇｒｅｉａ）属に属する微生物が、アグレイア・スピーシーズ（Ａｇｒｅｉａ  ｓｐ．）  Ｄ１１１０（独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１５）又はその変異株であり、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物が、ミクロバクテリウム・トリコセシノリティカム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｏｌｙｔｉｃｕｍ）  Ｄ２００６（独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１６）又はその変異株である請求項１４記載のシクロイソマルトテトラオース生成酵素。
【請求項１６】
アグレイア・スピーシーズ  Ｄ１１１０（独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１５）若しくはその変異株、又はミクロバクテリウム・トリコセシノリティカム  Ｄ２００６（独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１６）若しくはその変異株である請求項８乃至１５のいずれかに記載のシクロイソマルトテトラオース生成酵素産生能を有する微生物。
【請求項１７】
請求項１１記載のシクロイソマルトテトラオース生成酵素をコードするＤＮＡ。
【請求項１８】
配列表における配列番号９又は１０で示される塩基配列か、又は配列表における配列番号９又は１０で示される塩基配列において、コードする酵素の活性を保持する範囲で１個又は２個以上の塩基が欠失、置換若しくは付加した塩基配列、又はそれらに相補的な塩基配列を有する請求項１７記載のＤＮＡ。
【請求項１９】
遺伝子コードの縮重に基づき、コードするアミノ酸配列を変えることなく、配列表における配列番号９又は１０で示される塩基配列における塩基の１個又は２個以上を他の塩基で置換した請求項１８記載のＤＮＡ。
【請求項２０】
アグレイア（Ａｇｒｅｉａ）属に属する微生物又はミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物に由来する請求項１７乃至１９のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項２１】
請求項１７乃至２０のいずれかに記載のＤＮＡと、自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡ。
【請求項２２】
請求項２１記載の組換えＤＮＡを適宜の宿主に導入してなる形質転換体。
【請求項２３】
請求項８乃至１５のいずれかに記載のシクロイソマルトテトラオース生成酵素の産生能を有する微生物を栄養培地で培養する工程と、得られる培養物から請求項８乃至１５のいずれかに記載のシクロイソマルトテトラオース生成酵素を採取する工程とを含んでなるシクロイソマルトテトラオース生成酵素の製造方法。
【請求項２４】
請求項２２記載の形質転換体を培養する工程と、培養物から組換え型シクロイソマルトテトラオース生成酵素を採取する工程とを含んでなる組換え型シクロイソマルトテトラオース生成酵素の製造方法。
【請求項２５】
グルコース重合度４以上のα−１，６グルカン、デキストラン、又はデキストランの部分分解物を含有する溶液に、請求項８乃至１５のいずれかに記載のシクロイソマルトテトラオース生成酵素を作用させる工程を含んでなる請求項１又は２記載のシクロイソマルトテトラオース又はその結晶、又は、請求項５又は６記載のシクロイソマルトテトラオース含有糖質の製造方法。
【請求項２６】
澱粉又は澱粉部分分解物に作用し、グルコース重合度４以上のα−１，６グルカン、デキストラン又はα−１，６グルカンを部分構造として有する糖質を生成する酵素と、請求項８乃至１５のいずれかに記載のシクロイソマルトテトラオース生成酵素とを組合せて澱粉又は澱粉部分分解物を含有する溶液に作用させる工程を含んでなる、澱粉又は澱粉部分分解物からの請求項１又は２記載のシクロイソマルトテトラオース又はその結晶、又は、請求項５又は６記載のシクロイソマルトテトラオース含有糖質の製造方法。
【請求項２７】
請求項１又は２記載のシクロイソマルトテトラオース又はその結晶、請求項５又は６記載のシクロイソマルトテトラオース含有糖質、又は、請求項７記載のシクロイソマルトテトラオースのグルコシル誘導体とともに他の成分を含んでなる組成物。
【請求項２８】
飲食物、嗜好物、飼料、餌料、化粧品、医薬品又は工業用品である請求項２７記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｄ−グルコースを構成糖とする新規な環状糖質と、当該環状糖質を生成する新規酵素、それらの製造方法並びに用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖質の分野では、澱粉又は澱粉部分分解物などのＤ−グルコースを構成糖とするα−１，４グルカンを原料として酵素反応により製造される種々の環状糖質が知られている。非特許文献１には、澱粉にマセランス  アミラーゼ（ｍａｃｅｒａｎｓ  ａｍｙｌａｓｅ）を作用させることにより得られる、６乃至８分子のＤ−グルコースがα−１，４グルコシド結合を介して環状構造を形成した糖質であるα−、β−又はγ−シクロデキストリンが開示されている。現在では、澱粉からこれらシクロデキストリンが工業的規模で生産され、非還元性で、無味であり、包接能を有するなどのそれぞれの特性を生かした用途に利用されている。また、特許文献１には、澱粉又はその部分分解物にα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素を作用させることにより得られる、４分子のグルコースがα−１，３グルコシド結合及びα−１，６グルコシド結合で交互に結合した環状構造、すなわち、シクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖が開示されている。さらに、特許文献２には、澱粉又はその部分分解物に環状マルトシルマルトース生成酵素を作用させることにより得られる、４分子のグルコースがα−１，４グルコシド結合及びα−１，６グルコシド結合で交互に結合した環状構造、すなわち、シクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖（別名、環状マルトシルマルトース）が開示されている。また、さらに、特許文献３には、マルトペンタオース分子の還元末端グルコースの１位と非還元末端グルコースの６位水酸基がα−１，６グルコシド結合して環状構造を形成した環状五糖（イソシクロマルトペンタオース）、及び、マルトへキサオース分子の還元末端グルコースの１位と非還元末端グルコースの６位水酸基がα−１，６グルコシド結合して環状構造を形成した環状六糖(イソシクロマルトへキサオース）が開示されている。これら環状糖質は、環状構造を有することから包接能を有し、揮発性有機物を安定化する作用を示すとともに、非還元性の糖質であるため、アミノカルボニル反応を起こさず、褐変、劣化を懸念することなく利用、加工できることから、それぞれの特性を生かして種々の分野に利用され又は利用が期待されている。【０００３】
一方、Ｄ−グルコースを構成糖とする別のα−グルカンとして、Ｄ−グルコースがα−１，６グルコシド結合を介して鎖状に連なったα−１，６グルカンを基本構造とするデキストランが知られており、デキストランを原料とした酵素反応により得られる環状糖質としてシクロイソマルトオリゴ糖（「環状イソマルトオリゴ糖」、「シクロデキストラン」とも呼ばれている）が報告されている。特許文献４、非特許文献２には、デキストランにバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属微生物由来の酵素を作用させて得られる、７乃至９分子のＤ−グルコースがα−１，６グルコシド結合を介して環状構造を形成した糖質であるシクロイソマルトヘプタオース（ＣＩ−７）、シクロイソマルトオクタオース（ＣＩ−８）又はシクロイソマルトノナオース（ＣＩ−９）が開示されている。また、特許文献５、非特許文献３には、グルコース重合度がさらに１０乃至１６と大きいＣＩ−１０〜ＣＩ−１６が、特許文献６には、グルコース重合度がまたさらに１３乃至３３と大きいＣＩ−１３〜ＣＩ−３３が開示されている。しかしながら、グルコース重合度が７未満であるシクロイソマルトオリゴ糖は全く知られていない。【０００４】
上記した糖質以外にもＤ−グルコースを構成糖とする環状糖質が提供されれば、更に多様な用途への利用が期待される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００１／９０３３８Ａ１号パンフレット
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００５／２１５６４Ａ１号パンフレット
【特許文献３】国際公開ＷＯ２００６／３５７２５Ａ１号パンフレット
【特許文献４】特開平６−１９７７８３号公報
【特許文献５】特開２００４−１６６６２４号公報
【特許文献６】特開２００５−１９２５１０号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）、米国、１９４９年、第７１巻、３５３乃至３５８頁
【非特許文献２】バイオサイエンス・バイオテクノロジー・バイオケミストリー（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）第５７巻、１２２５−１２２７頁（１９９３年）
【非特許文献３】バイオサイエンス・バイオテクノロジー・バイオケミストリー（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）第７２巻、３２７７−３２８０頁（２００８年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、Ｄ−グルコースを構成糖とする新規な環状糖質と、当該環状糖質を生成する新規酵素、それらの製造方法並びに用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、上記課題を解決するために、Ｄ−グルコースがα−１，６グルコシド結合を介して直鎖状に連結したグルコースポリマーであるα−１，６グルカンを基本構造とするデキストラン又はその部分分解物から新規な環状糖質を生成する全く新しい酵素に期待を込めて、このような酵素を産生する微生物を広く検索してきた。【０００９】
その結果、新たに土壌から分離したアグレイア属に属する微生物Ｄ１１１０株やミクロバクテリウム属に属する微生物Ｄ２００６株が新規な酵素を産生し、この新規酵素の作用により、α−１，６グルカン、又はα−１，６グルカンを基本構造とするデキストラン又はその部分分解物から、４分子のＤ−グルコースがα−１，６グルコシド結合（以下、本明細書では、単に「α−１，６結合」という場合がある。）を介して環状に連結した構造を有する新規糖質、シクロイソマルトテトラオースが著量生成することを見出した。【００１０】
また、本発明者等は、当該シクロイソマルトテトラオースを生成する新規酵素の産生能を有する微生物を培養し、培養物からシクロイソマルトテトラオース生成酵素を精製し、その諸性質を明らかにするとともに、その製造方法を確立し、また、当該酵素をコードするＤＮＡとこれを含んでなる組換えＤＮＡ及び形質転換体を確立し、さらに、本酵素を用いたシクロイソマルトテトラオース又はシクロイソマルトテトラオース含有糖質の製造方法並びに用途を確立して、本発明を完成した。【００１１】
すなわち、本発明は、４分子のＤ−グルコースがα−１，６グルコシド結合を介して環状に連結した構造を有する新規糖質であるシクロイソマルトテトラオース、当該糖質を生成する新規なシクロイソマルトテトラオース生成酵素、当該酵素をコードするＤＮＡとこれを含んでなる組換えＤＮＡ及び形質転換体、それらの製造方法、さらには、シクロイソマルトテトラオース又はシクロイソマルトテトラオース含有糖質を含んでなる、飲食物、嗜好物、飼料、餌料、化粧品、医薬品、工業用品などの組成物を提供することによって上記課題を解決するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、従来未知であった新規環状糖質であるシクロイソマルトテトラオース、又は、シクロイソマルトテトラオース含有糖質が供給できることとなり、飲食物、化粧品、医薬品をはじめとする様々な分野における利用が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、デキストラン基質に微生物Ｄ１１１０株由来粗酵素液を作用させて得た酵素反応物のＴＬＣクロマトグラムである。
【図２】図２は、未知糖質Ｉ精製標品のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図３】図３は、未知糖質Ｉ精製標品の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図４】図４は、未知糖質Ｉ精製標品の１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹスペクトルである。
【図５】図５は、未知糖質Ｉ精製標品の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。
【図６】図６は、未知糖質Ｉ精製標品のＨＳＱＣスペクトルである。
【図７】図７は、未知糖質Ｉ精製標品のＨＭＢＣスペクトルである。
【図８】図８は、本発明のシクロイソマルトテトラオースの構造を示す図である。
【図９】図９は、シクロイソマルトテトラオース結晶の顕微鏡写真（倍率４００倍）である。
【図１０】図１０は、シクロイソマルトテトラオース５含水結晶の粉末Ｘ線回折図である。
【図１１】図１１は、アグレイア・スピーシーズ  Ｄ１１１０由来シクロイソマルトテトラオース生成酵素の至適温度を示す図である。
【図１２】図１２は、アグレイア・スピーシーズ  Ｄ１１１０由来シクロイソマルトテトラオース生成酵素の至適ｐＨを示す図である。
【図１３】図１３は、アグレイア・スピーシーズ  Ｄ１１１０由来シクロイソマルトテトラオース生成酵素の温度安定性を示す図である。
【図１４】図１４は、アグレイア・スピーシーズ  Ｄ１１１０由来シクロイソマルトテトラオース生成酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【図１５】図１５は、ミクロバクテリウム・トリコセシノリティカム  Ｄ２００６由来シクロイソマルトテトラオース生成酵素の至適温度を示す図である。
【図１６】図１６は、ミクロバクテリウム・トリコセシノリティカム  Ｄ２００６由来シクロイソマルトテトラオース生成酵素の至適ｐＨを示す図である。
【図１７】図１７は、ミクロバクテリウム・トリコセシノリティカム  Ｄ２００６由来シクロイソマルトテトラオース生成酵素の温度安定性を示す図である。
【図１８】図１８は、ミクロバクテリウム・トリコセシノリティカム  Ｄ２００６由来シクロイソマルトテトラオース生成酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【図１９】図１９は、アグレイア・スピーシーズ  Ｄ１１１０及びミクロバクテリウム・トリコセシノリティカム  Ｄ２００６のシクロイソマルトテトラオース生成酵素遺伝子、ＯＲＦ９０３８及びＯＲＦ５３２８がそれぞれコードするアミノ酸配列の相同性を示す図である。
【図２０】図２０は、組換えＤＮＡ、ｐＲＳＥＴ  Ａ−ＯＲＦ９０３８を示す図である。図中、黒い太線で示した部分は、アグレイア・スピーシーズ  Ｄ１１１０由来のシクロイソマルトテトラオース生成酵素をコードするＤＮＡである。
【図２１】図２１は、組換えＤＮＡ、ｐＲＳＥＴ  Ａ−ＯＲＦ９０３８を保有する組換え大腸菌Ｅ９０３８を培養して調製した細胞抽出物上清を基質デキストランに作用させて得た反応液のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２２】図２２は、シクロイソマルトテトラオースを受容体、α−シクロデキストリンを糖供与体としたシクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼの糖転移反応により得た反応物をグルコアミラーゼ処理、アルカリ処理して得たシクロイソマルトテトラオースのグルコシル誘導体含有糖質のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２３】図２３は、シクロイソマルトテトラオースの２種のグルコシル誘導体の構造を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、新規な環状糖質であるシクロイソマルトテトラオースに係るものである。本発明に係るシクロイソマルトテトラオースとは、４分子のＤ−グルコースがα−１，６グルコシド結合を介して環状に連結した構造、すなわち、シクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状グルコ四糖を意味する（図８を参照）。
【００１５】
本発明のシクロイソマルトテトラオースは、本発明者らが、土壌より得た微生物の培養液を粗酵素剤として基質デキストランに作用させ、得られた反応液中にその生成を初めて見出した従来未知の新規糖質であり、上記構造を有しているかぎり、その給源、製造方法を問わず本発明に包含される。
【００１６】
また、本発明のシクロイソマルトテトラオースは、別の実施態様として、結晶の形態にあるものを含む。本発明のシクロイソマルトテトラオースの結晶は、通常、５含水結晶の形態にある。
【００１７】
本発明のシクロイソマルトテトラオースの５含水結晶は、その粉末Ｘ線回折図において回折角（２θ）９．０°、９．８°、１１．８°、１３．１°及び１９．１°に特徴的な回折ピークを有している。
【００１８】
本発明は、その別の実施態様として、シクロイソマルトテトラオース及び／又はシクロイソマルトテトラオースの結晶とともに他の糖質を含んでなるシクロイソマルトテトラオース含有糖質を含む。シクロイソマルトテトラオース含有糖質の形態はシラップ、粉末、結晶含有粉末又は固状物のいずれであってもよい。
【００１９】
本発明は、その別の実施態様として、シクロイソマルトテトラオースに１分子又は２分子のＤ−グルコースが結合した構造を有するシクロイソマルトテトラオースのグルコシル誘導体を含む。このグルコシル誘導体におけるＤ−グルコースのシクロイソマルトテトラオースへの結合様式は特に限定されず、α−１，２、α−１，３、又はα−１，４結合のいずれであってもよい。１分子のＤ−グルコースがシクロイソマルトテトラオースを構成する４つのグルコース残基の内１残基にα−１，３結合を介して結合したグルコシル誘導体は、後述する酵素によるシクロイソマルトテトラオース生成反応の反応液中に微量に存在する。また、後述する実施例に例示するとおり、シクロイソマルトテトラオースを受容体とし、適宜の糖供与体の存在下で適宜の糖転移酵素を作用させる糖転移反応、さらには糖転移生成物の酵素分解を行うことよりシクロイソマルトテトラオースのグルコシル誘導体を生成させ取得することもできる。糖転移酵素としては、例えば、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、α−アミラーゼ、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）などを用いることができる。糖転移生成物の酵素分解には、例えば、グルコアミラーゼ、β−アミラーゼなどを用いることができる。さらに、糖供与体と糖転移酵素を選択することにより、Ｄ−グルコース以外の糖をシクロイソマルトテトラオースに転移させたシクロイソマルトテトラオースのグリコシル誘導体、例えば、フラクトシル誘導体、ガラクトシル誘導体などを生成させ取得することも有利に実施できる。
【００２０】
本発明に係るシクロイソマルトテトラオース生成酵素とは、グルコース重合度４以上のα−１，６グルカン、デキストラン、又はその部分分解物に作用し、シクロイソマルトテトラオースを生成する反応を触媒する酵素全般を意味する。上記の反応を触媒する酵素はその給源、形態、粗酵素又は精製酵素の区別なく、また、グルコース重合度４以上のα−１，６グルカン、デキストラン、又はその部分分解物に作用し、シクロイソマルトテトラオースを生成する反応のメカニズムに関わりなく、本発明のシクロイソマルトテトラオース生成酵素に包含される。本発明のシクロイソマルトテトラオース生成酵素は、その一例において、デキストランに作用させた場合、イソマルトテトラオース単位でα−１，６結合を切断し、このイソマルトテトラオースの還元末端グルコースの１位を同一分子の非還元末端グルコースの６位水酸基にα−１，６転移する分子内転移反応で環化することによりシクロイソマルトテトラオースを生成しているものと推察される。なお、本発明のシクロイソマルトテトラオース生成酵素は、その好適な一例において、一旦生成したシクロイソマルトテトラオースにさらに作用して加水分解することにより環状構造を開環し、イソマルトテトラオースを生成する活性をも有している。
【００２１】
本発明のシクロイソマルトテトラオース生成酵素の酵素活性は、次のようにして測定することができる。基質としてのデキストラン又はデキストランの部分分解物を濃度１．１１ｗ／ｖ％となるよう２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させ基質溶液とし、その基質溶液０．９ｍＬに２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で調製した酵素液０．１ｍＬを加えて４０℃で反応を開始し、反応０．５分と反応３０．５分の時点で反応液を０．４ｍＬサンプリングしそれぞれ１００℃の湯浴で１０分間加熱することにより酵素を失活させ反応を停止させた後、それぞれの液中のシクロイソマルトテトラオース量を、後述する実験１に記載のＨＰＬＣで定量する。３０．５分の時点でのシクロイソマルトテトラオース量から０．５分の時点のそれを減算することにより反応３０分間で生成したシクロイソマルトテトラオース量を算出する。シクロイソマルトテトラオース生成酵素の活性１単位（Ｕ）は、上記の条件下で１分間に１μモルのシクロイソマルトテトラオースを生成する酵素量と定義する。
【００２２】
本発明のシクロイソマルトテトラオース生成酵素の具体例としては、例えば、下記の理化学的性質を有するシクロイソマルトテトラオース生成酵素が挙げられる。
（１）分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において、８６，０００±１０，０００ダルトン；
（２）至適温度
ｐＨ６．０、３０分間反応の条件下で、３５乃至４０℃；
（３）至適ｐＨ
４０℃、３０分間反応の条件下で、ｐＨ５．５乃至６．０；
（４）温度安定性
ｐＨ６．０、各温度３０分間保持の条件下で、４０℃まで安定；
（５）ｐＨ安定性
４℃、１６時間保持の条件下で、ｐＨ５．０乃至１０．０で安定；
【００２３】
本発明のシクロイソマルトテトラオース生成酵素の別の具体例としては、例えば、下記の理化学的性質を有するシクロイソマルトテトラオース生成酵素が挙げられる。
（１）分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において、８６，０００±１０，０００ダルトン；
（２）至適温度
ｐＨ６．０、３０分間反応の条件下で、４０℃；
（３）至適ｐＨ
４０℃、３０分間反応の条件下で、ｐＨ５．５付近；
（４）温度安定性
ｐＨ６．０、各温度３０分間保持の条件下で、３５℃まで安定；
（５）ｐＨ安定性
４℃、１８時間保持の条件下で、ｐＨ５．０乃至７．０で安定；
【００２４】
また、上記理化学的性質を有する本発明のシクロイソマルトテトラオース生成酵素は、そのＮ末端配列として、配列表における配列番号５又は６で表されるアミノ酸配列を有している場合がある。
【００２５】
しかしながら、上記理化学的性質又はＮ末端アミノ酸配列を有するシクロイソマルトテトラオース生成酵素はあくまで一例であって、上記と異なる理化学的性質又はＮ末端アミノ酸配列を有する酵素も、シクロイソマルトテトラオースを生成するかぎり本発明に係るシクロイソマルトテトラオース生成酵素に包含されることは言うまでもない。
【００２６】
本発明のシクロイソマルトテトラオース生成酵素は、通常、所定のアミノ酸配列を有しており、その一例としては、例えば、配列表における配列番号７又は８で示されるアミノ酸配列又はそれに相同的なアミノ酸配列が挙げられる。配列表における配列番号７又は８で示されるアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列を有する変異体酵素としては、デキストラン又はその部分分解物に作用しシクロイソマルトテトラオースを生成するという酵素活性を保持する範囲で、配列番号７又は８で示されるアミノ酸配列において１個又は２個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列を有するものが挙げられ、配列番号７又は８で示されるアミノ酸配列に対し、通常、７０％以上、望ましくは、８０％以上、さらに望ましくは、９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するものが好適である。
【００２７】
本発明のシクロイソマルトテトラオース生成酵素はその給源によって制限されないものの、好ましい給源として、微生物が挙げられ、とりわけ本発明者らが土壌より単離した微生物Ｄ１１１０株若しくはその変異株、又は、同じく土壌より単離した微生物Ｄ２００６株若しくはその変異株が好適に用いられる。ここでいう変異株としては、例えば、人為的に変異を導入することにより、親株よりも培養性状が改善された変異株、シクロイソマルトテトラオース生成酵素の産生能が親株よりも向上した酵素高生産変異株、より活性の高いシクロマルトテトラオース生成酵素を産生する変異株などが挙げられる。
【００２８】
前述したとおり、シクロイソマルトテトラオース生成酵素の産生能を有する微生物Ｄ１１１０株及びＤ２００６株は、本発明者らが土壌から新たに単離した微生物であるが、後述する実験４に記載のとおり、１６Ｓ  ｒＲＮＡ（１６Ｓ  ｒＤＮＡ）の塩基配列に基づいて、公知菌のそれとの相同性を検討し、菌種の同定を行ったところ、微生物Ｄ１１１０株は、アグレイア・スピーシーズ（Ａｇｒｅｉａ  ｓｐ．）と同定され、また、微生物Ｄ２００６株はミクロバクテリウム・トリコセシノリティカム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｏｌｙｔｉｃｕｍ）と同定された。これらの結果に基づき、本発明者等は、微生物Ｄ１１１０株及びＤ２００６株をそれぞれ新規微生物アグレイア・スピーシーズ  Ｄ１１１０、及び、ミクロバクテリウム・トリコセシノリティカム  Ｄ２００６と命名し、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−６所在の独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託し、平成３０年１２月２８日付でそれぞれ受託番号  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１５、及び、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１６として受託された。
【００２９】
本発明のシクロイソマルトテトラオース生成酵素産生能を有する微生物には、上記菌はもとより、その変異株、更には、本明細書において用いた、基質デキストランに培養液を粗酵素液として作用させ、シクロイソマルトテトラオースの生成を調べるスクリーニング方法により、自然界から単離、選抜される他の属、種に属するシクロイソマルトテトラオース生成酵素産生能を有する微生物、及び、それらの変異株なども包含される。
【００３０】
本発明は、前述した本発明に係るシクロイソマルトテトラオース生成酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列全般、及び当該塩基配列に相補的な塩基配列全般を有するＤＮＡに係るものでもある。本発明のＤＮＡは、シクロイソマルトテトラオース生成酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するものである限り、それが天然由来のものであっても、人為的に合成されたものであってもよい。天然の給源としては、例えば、アグレイア・スピーシーズ  Ｄ１１１０を含むアグレイア属の微生物、ミクロバクテリウム・トリコセシノリティカム  Ｄ２００６を含むミクロバクテリウム属の微生物などが挙げられ、これらの菌体から本発明のＤＮＡを含むゲノムＤＮＡを得ることができる。すなわち、斯かる微生物を栄養培地に接種し、好気的条件下で約５乃至１０日間培養後、培養物から菌体を採取し、リゾチームやβ−グルカナーゼなどの細胞壁溶解酵素や超音波で処理することにより当該ＤＮＡを含むゲノムＤＮＡを菌体外に溶出させる。このとき、プロテアーゼなどの蛋白質分解酵素を併用したり、ＳＤＳなどの界面活性剤を共存させたり凍結融解してもよい。斯くして得られる処理物に、例えば、フェノール抽出、アルコール沈殿、遠心分離、リボヌクレアーゼ処理などの常法を適用すれば目的のゲノムＤＮＡが得られる。本発明のＤＮＡを人為的に合成するには、例えば、配列表における配列番号９又は１０で示される塩基配列に併記されたアミノ酸配列に基づいて化学合成すればよい。また、当該ＤＮＡを含むゲノムＤＮＡを鋳型として、適当なプライマーとなる化学合成ＤＮＡを用いてＰＣＲ合成することも有利に実施できる。
【００３１】
本発明に係るＤＮＡの一例としては、配列表における配列番号９又は１０で示される塩基配列、又はそれらに相同的な塩基配列、さらには、それらの塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。配列表における配列番号９又は１０で示される塩基配列に相同的な塩基配列を有するＤＮＡとしては、コードするシクロイソマルトテトラオース生成酵素の活性を保持する範囲で、配列番号９又は１０で示される塩基配列において１個以上の塩基が欠失、置換若しくは付加した塩基配列を有するものが挙げられ、配列番号９又は１０で示される塩基配列に対し、通常、７０％以上、望ましくは、８０％以上、さらに望ましくは、９０％以上、またさらに望ましくは９５％以上の相同性（配列同一性）を有する塩基配列を有するものが好適である。また、これらシクロイソマルトテトラオース生成酵素をコードするＤＮＡにおいて、遺伝子コードの縮重に基づき、それぞれがコードするシクロイソマルトテトラオース生成酵素のアミノ酸配列を変えることなく塩基の１個又は２個以上を他の塩基に置換したもの、それらに相補的なものも本発明のＤＮＡに包含される。
【００３２】
本発明のＤＮＡを、自律複製可能な適宜ベクターに挿入して組換えＤＮＡとすることも有利に実施できる。組換えＤＮＡは、通常、ＤＮＡと自律複製可能なベクターとからなり、ＤＮＡが入手できれば、常法の組換えＤＮＡ技術により比較的容易に調製することができる。斯かるベクターの例としては、プラスミド、ファージ又はコスミド等を用いることができ、導入される細胞又は導入方法に応じて適宜選択できる。ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、宿主細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。宿主細胞の種類に応じて、確実に上記遺伝子を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと上記遺伝子を各種プラスミド等に組み込んだものを発現ベクターとして用いればよい。かかる発現ベクターとしては、例えば、ファージベクター、プラスミドベクター、ウィルスベクター、レトロウィルスベクター、染色体ベクター、エピソームベクター及びウィルス由来ベクター（例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体エレメント及びウィルス（例えば、バキュロウィルス、パポバウィルス、ワクシニアウィルス、アデノウィルス、トリポックスウィルス、仮性狂犬病ウィルス、ヘルペスウィルス、レンチウィルス及びレトロウィルス））並びにそれらの組合せに由来するベクター（例えば、コスミド及びファージミド）を利用可能である。
【００３３】
細菌における使用に好ましいベクターとしては、例えば、ｐＲＳＥＴ  Ａ、ｐＱＥ−７０、ｐＱＥ−６０、ｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ６ａ、ｐＮＨ１８Ａ及びｐＮＨ４６Ａ；並びにｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０及びｐＲＩＴ５などが挙げられる。また、真核生物における使用に好ましいベクターとしては、ｐＷＬＮＥ０、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１及びｐＳＧ；並びにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ及びｐＳＶＬなどが挙げられる。
【００３４】
本発明のＤＮＡを斯かるベクターに挿入するには、斯界において通常一般の方法が採用される。具体的には、まず、目的とするＤＮＡを含む遺伝子ＤＮＡと自律複製可能なベクターとを制限酵素及び／又は超音波により切断し、次に、生成したＤＮＡ断片とベクター断片とを連結する。斯くして得られる組換えＤＮＡは、適宜宿主に導入して形質転換体とし、これを培養することにより無限に複製することができる。
【００３５】
このようにして得られる組換えＤＮＡは、大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母をはじめとする適宜の宿主微生物に導入することができる。形質転換体を取得するには、コロニーハイブリダイゼーション法を適用するか、栄養培地で培養し、シクロイソマルトテトラオース生成酵素を産生するものを選択すればよい。
【００３６】
本発明のシクロイソマルトテトラオース生成酵素産生能を有する形質転換体も含めた微生物の培養に用いる培地は、微生物が生育でき、シクロイソマルトテトラオース生成酵素を産生しうる栄養培地であればよく、合成培地および天然培地のいずれでもよい。炭素源としては、微生物が生育に利用できる物であればよく、例えば、デキストランやその部分分解物、植物由来の澱粉やフィトグリコーゲン、動物や微生物由来のグリコーゲンやプルラン、また、これらの部分分解物やグルコース、フラクトース、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、糖蜜などの糖質、また、クエン酸、コハク酸などの有機酸も使用することができる。培地におけるこれらの炭素源の濃度は炭素源の種類により適宜選択できる。窒素源としては、例えば、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物および、例えば、尿素、コーン・スティープ・リカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなどの有機窒素含有物を適宜用いることができる。また、無機成分としては、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト塩などの塩類を適宜用いることができる。更に、必要に応じて、アミノ酸、ビタミンなども適宜用いることができる。
【００３７】
培養は、通常、温度１５乃至３７℃でｐＨ５．５乃至１０の範囲、好ましくは温度２０乃至３４℃でｐＨ５．５乃至８．５の範囲から選ばれる条件で好気的に行われる。培養時間は当該微生物が増殖し得る時間であればよく、好ましくは１０時間乃至１５０時間である。また、培養条件における培養液の溶存酸素濃度には特に制限はないが、通常は、０．５乃至２０ｐｐｍが好ましい。そのために、通気量を調節したり、攪拌したりするなどの手段を適宜採用する。また、培養方式は、回分培養または連続培養のいずれでもよい。
【００３８】
このようにして微生物を培養した後、本発明の酵素を含む培養物を回収する。シクロイソマルトテトラオース生成酵素活性は、主に培養物の除菌液に認められ、除菌液を粗酵素液として採取することも、培養物全体を粗酵素液として用いることもできる。培養物から菌体を除去するには公知の固液分離法が採用される。例えば、培養物そのものを遠心分離する方法、あるいは、プレコートフィルターなどを用いて濾過分離する方法、平膜、中空糸膜などの膜濾過により分離する方法などが適宜採用される。除菌液をそのまま粗酵素液として用いることができるものの、一般的には、濃縮して用いられる。濃縮法としては、硫安塩析法、アセトン及びアルコール沈殿法、平膜、中空膜などを用いた膜濃縮法などを採用することができる。
【００３９】
更に、シクロイソマルトテトラオース生成酵素活性を有する除菌液及びその濃縮液を用いて、シクロイソマルトテトラオース生成酵素を公知の方法により固定化することもできる。例えば、イオン交換体への結合法、樹脂及び膜などとの共有結合法・吸着法、高分子物質を用いた包括法などを適宜採用できる。
【００４０】
上記のように本発明のシクロイソマルトテトラオース生成酵素は、粗酵素液をそのまま又は濃縮して用いることができるものの、必要に応じて、公知の方法によって、さらに分離・精製して利用することもできる。例えば、培養液の処理物を硫安塩析して濃縮した粗酵素標品を透析後、『ＤＥＡＥ−トヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）  ６５０Ｓ』ゲル（東ソ−株式会社製）を用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、続いて、『フェニル−トヨパール（Ｐｈｅｎｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）  ６５０Ｍ』ゲル（東ソ−株式会社製）を用いた疎水クロマトグラフィーを用いて精製することにより、本発明のシクロイソマルトテトラオース生成酵素を電気泳動的に単一なレベルにまで精製された精製酵素として得ることができる。
【００４１】
シクロイソマルトテトラオース生成酵素が組換え型酵素である場合には、宿主の種類によっては菌体内に酵素が蓄積することがある。このような場合には、菌体又は培養物をそのまま使用することも可能であるものの、通常は使用に先立ち、必要に応じて、浸透圧ショックや界面活性剤により菌体から抽出した後、又は、超音波や細胞壁溶解酵素により菌体を破砕した後、濾過、遠心分離などにより組換え型酵素を菌体又は菌体破砕物から分離して用いることも有利に実施できる。
【００４２】
上記の方法で得られる天然型又は組換え型シクロイソマルトテトラオース生成酵素を用いれば、本発明のシクロイソマルトテトラオース、及び、シクロイソマルトテトラオース含有糖質を製造することができる。
【００４３】
シクロイソマルトテトラオース、及び、シクロイソマルトテトラオース含有糖質を製造するに際し、シクロイソマルトテトラオース生成酵素を作用させる基質原料としては、デキストランや、デキストランを酸やデキストラナーゼなどの酵素によって部分的に加水分解して得られるデキストランの部分分解物などのα−１，６グルカンを用いることができる。また、後述する実験１４に記載のとおり、本発明のシクロイソマルトテトラオース生成酵素はイソマルトテトラオースに作用し、シクロイソマルトテトラオースを生成することから、少なくともグルコース重合度４以上のα−１，６グルカンが基質として使用できることが分かった。さらに、国際公開番号ＷＯ２００８／１３６３３１号パンフレットに開示された分岐α−グルカンは、その分子の部分構造としてＤ−グルコースがα−１，６結合で連結したα−１，６グルカン構造を有していることから、シクロイソマルトテトラオース生成酵素を作用させる基質原料として用いることができる。
【００４４】
本発明のシクロイソマルトテトラオース生成酵素を基質原料に作用させるに際し、その基質濃度は特に限定されないものの、例えば、基質濃度が１０質量％以上の比較的高濃度の水溶液を用いた場合には、本発明のシクロイソマルトテトラオース生成酵素による生成反応は進行し難くなるため、基質濃度５質量％以下が好適であり、この条件下で、シクロイソマルトテトラオースを有利に生成できる。反応温度は反応が進行する温度、即ち５５℃付近までで行えばよい。好ましくは３０乃至４５℃付近の温度を用いる。反応ｐＨは、通常、４．０乃至８．０の範囲、好ましくはｐＨ４．５乃至７．５の範囲に調整するのがよい。酵素の使用量と反応時間とは密接に関係しており、目的とする酵素反応の進行により酵素の使用量と反応時間を適宜調整すればよい。
【００４５】
上述のとおり、本発明のシクロイソマルトテトラオース生成酵素は、グルコース重合度４以上のα−１，６グルカン、デキストラン、又はα−１，６グルカンを部分構造として有する糖質からシクロイソマルトテトラオースを生成する。したがって、澱粉又は澱粉部分分解物に作用し、グルコース重合度４以上のα−１，６グルカン、デキストラン、又はα−１，６グルカンを部分構造として有する糖質を生成する酵素と本発明のシクロイソマルトテトラオース生成酵素とを組合わせて用いれば、澱粉又は澱粉部分分解物を基質原料としてシクロイソマルトテトラオースを製造することができる。澱粉又は澱粉部分分解物に作用し、グルコース重合度４以上のα−１，６グルカン又はデキストランを生成する酵素としては、例えば、デキストリンデキストラナーゼを用いることができ、また、α−１，６グルカンを部分構造として有する糖質を生成する酵素としては、例えば、国際公開番号ＷＯ２００８／１３６３３１号パンフレットに開示されたα−グルコシル転移酵素を用いることができる。
【００４６】
上記した酵素の組合せにより澱粉又は澱粉部分分解物からシクロイソマルトテトラオースを製造するに際しては、まず、澱粉又は澱粉部分分解物に作用し、グルコース重合度４以上のα−１，６グルカン、デキストラン、又はα−１，６グルカンを部分構造として有する糖質を生成する酵素を澱粉又は澱粉部分分解物に作用させてグルコース重合度４以上のα−１，６グルカン、デキストラン、又はα−１，６グルカンを部分構造として有する糖質を一旦生成させた後、この生成物に本発明のシクロイソマルトテトラオース生成酵素を作用させてシクロイソマルトテトラオースを生成させる逐次反応を行ってもよく、また、澱粉又は澱粉部分分解物に、澱粉又は澱粉部分分解物に作用し、グルコース重合度４以上のα−１，６グルカン、デキストラン、又はα−１，６グルカンを部分構造として有する糖質を生成する酵素と本発明のシクロイソマルトテトラオース生成酵素を同時に作用させる同時反応を行うこともできる。
【００４７】
上記の反応によって得られた反応液は、そのままシクロイソマルトテトラオース含有糖液として用いることができる。また、必要に応じて、シクロイソマルトテトラオース含有糖液に、デキストラナーゼ、α−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼなどを作用させて、夾雑するイソマルトオリゴ糖を加水分解したシクロイソマルトテトラオース含有糖液として用いることもできる。また、水素添加して反応液中に残存する還元性糖質を糖アルコールに変換して還元力を消滅させるなどの更なる加工処理を施すことも随意である。一般的には、シクロイソマルトテトラオース含有糖液はさらに精製して用いられる。精製方法としては、糖の精製に用いられる通常の方法を適宜採用すればよく、例えば、活性炭による脱色、Ｈ型、ＯＨ型イオン交換樹脂による脱塩、イオン交換カラムクロマトグラフィー、活性炭カラムクロマトグラフィー、シリカゲルカラムクロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィーによる分画、アルコールおよびアセトンなど有機溶媒による分別、適度な分離性能を有する膜による分離、更には、シクロイソマルトテトラオースを利用せず夾雑糖質を資化、分解する微生物、例えば酵母などによる発酵処理や、アルカリ処理などにより残存している還元性糖質を分解除去するなどの１種または２種以上の精製方法が適宜採用できる。
【００４８】
とりわけ、大量生産方法としては、イオン交換カラムクロマトグラフィーの採用が好適であり、例えば、特開昭５８−２３７９９号公報、特開昭５８−７２５９８号公報などに開示されている強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより夾雑糖類を除去し、目的物の含量を向上させたシクロイソマルトテトラオース又はシクロイソマルトテトラオース含有糖質を有利に製造することができる。この際、固定床方式、移動床方式、擬似移動床方式のいずれの方式を採用することも随意である。
【００４９】
このようにして得られたシクロイソマルトテトラオースを含む水溶液、又はその含量を向上させた糖質水溶液は、通常、シクロイソマルトテトラオースを、固形物当たり、１０質量％以上、望ましくは４０質量％以上含有する糖質水溶液で、通常、これを濃縮し、シラップ状製品とする。このシラップ状製品は、更に、乾燥して非晶質固状物製品又は非晶質粉末製品にすることも随意である。
【００５０】
さらに、前記シクロイソマルトテトラオースを含有する糖質水溶液を常法により精製することにより、シクロイソマルトテトラオース高含有糖質や高純度のシクロイソマルトテトラオース標品とすることができ、また、シクロイソマルトテトラオース高含有糖質や高純度のシクロイソマルトテトラオース標品を原料として結晶化を行うことによりシクロイソマルトテトラオースの結晶、及び、結晶含有粉末を調製することができる。
【００５１】
なお、本発明のシクロイソマルトテトラオースは小腸粘膜α−グルコシダーゼによって僅かに分解されるのみであることから、経口摂取してもほとんど消化吸収されない難消化性の糖質であって、無毒、無害な糖質と考えられる。
【００５２】
本発明のシクロイソマルトテトラオース又はシクロイソマルトテトラオース含有糖質は、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、粉末化基材などとして、他の成分と組合せ、飲食物、嗜好物、飼料、餌料、化粧品、医薬品、工業用品などの各種組成物に有利に利用できる。
【００５３】
本発明のシクロイソマルトテトラオース又はシクロイソマルトテトラオース含有糖質は、そのまま甘味付のための調味料として使用できる。必要ならば、例えば、粉飴、ブドウ糖、異性化糖、砂糖、麦芽糖、トレハロース、蜂蜜、メープルシュガー、ソルビトール、マルチトール、ジヒドロカルコン、ステビオシド、α−グリコシルステビオシド、ラカンカ甘味物、グリチルリチン、ソーマチン、スクラロース、Ｌ−アスパラチルフェニルアラニンメチルエステル、サッカリン、グリシン、アラニンなどのような他の甘味料と、また、デキストリン、澱粉、乳糖などのような増量剤と混合して使用することもできる。
【００５４】
また、本発明のシクロイソマルトテトラオース又はシクロイソマルトテトラオース含有糖質の粉末状製品は、そのままで、または必要に応じて、増量剤、賦形剤、結合剤などと混合して、顆粒、球状、短棒状、板状、立方体、錠剤など各種形状に成形して使用することも随意である。
【００５５】
また、本発明のシクロイソマルトテトラオース又はシクロイソマルトテトラオース含有糖質の甘味は、酸味、塩から味、渋味、旨味、苦味などの他の呈味を有する各種の物質とよく調和し、加えて、本発明のシクロイソマルトテトラオースは、後述する実験に示すとおり、耐酸性、耐熱性も大きいので、一般の飲食物の甘味付、呈味改良に、また品質改良などに有利に利用できる。
【００５６】
例えば、醤油、粉末醤油、味噌、粉末味噌、もろみ、ひしお、フリカケ、マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三杯酢、粉末すし酢、中華の素、天つゆ、麺つゆ、ソース、ケチャップ、焼き肉のタレ、カレールウ、シチューの素、スープの素、ダシの素、複合調味料、みりん、新みりん、テーブルシュガー、コーヒーシュガーなどの各種調味料への甘味料、更には、呈味改良剤、品質改良剤などとして使用することも有利に実施できる。また、例えば、せんべい、あられ、おこし、求肥、餅類、まんじゅう、ういろう、あん類、羊羹、水羊羹、錦玉、ゼリー、カステラ、飴玉などの各種和菓子、パン、ビスケット、クラッカー、クッキー、パイ、プリン、バタークリーム、カスタードクリーム、シュークリーム、ワッフル、スポンジケーキ、ドーナツ、チョコレート、チューインガム、キャラメル、ヌガー、キャンディーなどの各種洋菓子、アイスクリーム、シャーベットなどの氷菓、果実のシロップ漬、氷蜜などのシロップ類、フラワーペースト、ピーナッツペースト、フルーツペーストなどのペースト類、ジャム、マーマレード、シロップ漬、糖果などの果実、野菜の加工食品類、福神漬け、べったら漬、千枚漬、らっきょう漬などの漬物類、たくあん漬の素、白菜漬の素などの漬物の素、ハム、ソーセージなどの畜肉製品類、魚肉ハム、魚肉ソーセージ、カマボコ、チクワ、天ぷらなどの魚肉製品、ウニ、イカの塩辛、酢コンブ、さきするめ、ふぐのみりん干し、タラ、タイ、エビなどの田麩などの各種珍味類、海苔、山菜、するめ、小魚、貝などで製造される佃煮類、煮豆、ポテトサラダ、コンブ巻などの惣菜食品、乳製品、魚肉、畜肉、果実、野菜の瓶詰、缶詰類、合成酒、増醸酒、清酒、果実酒、発泡酒、ビールなどの酒類、珈琲、ココア、ジュース、炭酸飲料、乳酸飲料、乳酸菌飲料などの清涼飲料水、プリンミックス、ホットケーキミックス、即席ジュース、即席コーヒー、即席しるこ、即席スープなどの即席食品、更には、離乳食、治療食、ドリンク剤、ペプチド食品、冷凍食品などの各種飲食物への甘味付に、呈味改良に、品質改良などに有利に実施できる。
【００５７】
また、家畜、家禽、蜜蜂、蚕、魚などの飼育動物のための飼料、餌料などに嗜好性を向上させる目的で使用することもできる。その他、タバコ、練歯磨、口紅、リップクリーム、内服液、錠剤、トローチ、肝油ドロップ、口中清涼剤、口中香剤、うがい剤などの、固形状、ペースト状、液状など任意の形態にある嗜好物、化粧品、医薬品、医薬部外品などの各種組成物への甘味剤として、または呈味改良剤、矯味剤として、さらに品質改良剤、安定剤などとして有利に利用できる。
【００５８】
品質改良剤、安定剤としては、有効成分、活性など失い易い各種生理活性物質またはこれを含む健康食品、機能性食品、医薬品などに有利に適用できる。例えば、インターフェロン−α、−β、−γ、ツモア・ネクロシス・ファクター−α、−β、マクロファージ遊走阻止因子、コロニー刺激因子、トランスファーファクター、インターロイキンＩＩなどのリンホカイン含有液、インシュリン、成長ホルモン、プロラクチン、エリトロポエチン、卵細胞刺激ホルモンなどのホルモン含有液、ＢＣＧワクチン、日本脳炎ワクチン、はしかワクチン、ポリオ生ワクチン、痘苗、破傷風トキソイド、ハブ抗毒素、ヒト免疫グロブリンなどの生物製剤含有液、ペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、硫酸カナマイシンなどの抗生物質含有液、チアミン、リボフラビン、Ｌ−アスコルビン酸、肝油、カロチノイド、エルゴステロール、トコフェロールなどのビタミン含有液、ＥＰＡ、ＤＨＡ、アラキドン酸、などの高度不飽和脂肪酸又はそのエステル誘導体、リパーゼ、エステラーゼ、ウロキナーゼ、プロテアーゼ、β−アミラーゼ、イソアミラーゼ、グルカナーゼ、ラクターゼなどの酵素含有液、薬用人参エキス、スッポンエキス、クロレラエキス、アロエエキス、プロポリスエキスなどのエキス類、ウィルス、乳酸菌、酵母などの生菌ペースト、ローヤルゼリーなどの各種生理活性物質を含む健康食品、機能性食品、医薬品などに対しても、本発明のシクロイソマルトテトラオース又はシクロイソマルトテトラオース含有糖質を品質改良剤又は安定剤として用いることにより、その有効成分、活性を失うことなく、安定で高品質の液状、ペースト状または固状の健康食品、機能性食品や医薬品などを容易に製造できることとなる。
【００５９】
以上述べたような各種組成物に、シクロイソマルトテトラオース又はシクロイソマルトテトラオース含有糖質を含有させる方法としては、その製品が完成するまでの工程に含有せしめればよく、例えば、混和、混捏、溶解、融解、浸漬、浸透、散布、塗布、被覆、噴霧、注入、晶析、固化など公知の方法が適宜選ばれる。その量は、通常０．１質量％以上、望ましくは１質量％以上含有せしめるのが好適である。
【００６０】
以下、実験により本発明を詳細に説明する。
【００６１】
＜実験１：デキストランからの生成物＞
＜実験１−１：粗酵素液の調製＞
市販のデキストラン（商品名『デキストラン  Ｔ７０』、ファーマコスモス社製）１５ｇ／Ｌ、酵母エキス（商品名『粉末酵母エキスＳＨ』、日本製薬株式会社製造）１．０ｇ／Ｌ、ポリペプトン（商品名『ハイポリペプトン』、日本製薬株式会社製造）５．０ｇ／Ｌ、リン酸二カリウム１．０ｇ／Ｌ、リン酸一ナトリウム・２水和物０．６ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水和物０．５ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄・７水和物０．０１ｇ／Ｌ、硫酸マンガン・５水和物０．０１ｇ／Ｌ、炭酸カルシウム３．０ｇ／Ｌ、及び水からなる液体培地（ｐＨ６．８）を、５００ｍＬ容三角フラスコ２０本に１００ｍＬずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却した。次いで、土壌より単離した微生物Ｄ１１１０株を接種し、２７℃、２４０ｒｐｍで４日間回転振トウ培養した。培養後、培養液を遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０分間）して菌体を除き、培養上清を得た。得られた培養上清約０．９Ｌに硫酸アンモニウムを８０％飽和になるよう添加、溶解して塩析し、塩析物を２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、４℃で２４時間透析し、次いで、４℃、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して得た上清を粗酵素液として回収した。
【００６２】
＜実験１−２：粗酵素液のデキストランへの作用＞
デキストラン（商品名『デキストラン  Ｔ７０』、ファーマコスモス社製）を１％（ｗ／ｖ）、防腐剤としてのヒノキチオールを０．００６％（ｗ／ｖ）含有する５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）１Ｌに実験１−１で得た粗酵素液を添加し、４０℃で２０時間反応させた。反応液を１００℃で１０分間熱処理することにより酵素を失活させ、エバポレーターを用いて濃縮し、脱イオン水１００ｍＬに溶解した。これにエタノール２００ｍＬを添加することにより反応液中に残存する高分子（デキストラン、蛋白質など）を沈殿させ、４℃で１２，０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離し、上清を回収した。得られた上清は分画分子量１０，０００の膜ろ過を行い残存する高分子をさらに除去し、酵素反応物とした。
【００６３】
得られた酵素反応物中の糖質を調べるため、イソマルトオリゴ糖マーカー（株式会社林原調製品）、イソマルトトリオース標準品（株式会社林原調製品）、イソマルトテトラオース標準品（株式会社林原調製品）とともに、展開溶媒として２−プロパノール：１−ブタノール：水混液（容量比１２：３：４）を、また、薄層プレートとしてメルク社製『キーゼルゲル  ６０』（アルミプレート、１０×２０ｃｍ）を用い、２回展開する薄層クロマトグラフィー（以下、「ＴＬＣ」と略す）に供し、糖質を分離した。得られたＴＬＣプレート上に分離された糖質を硫酸−メタノール法にて発色させ検出した。結果を図１に示した。図１に見られるとおり、同時に展開したイソマルトオリゴ糖マーカー（レーン１）、イソマルトトリオース標準品（レーン２）、及びイソマルトテトラオース標準品（レーン３）との対比において、酵素反応物を分離したレーン４では、グルコース重合度３のイソマルトトリオース（図１中の符号「ＩＧ３」）よりも移動度が小さく、グルコース重合度４のイソマルトテトラオース（図１中の符号「ＩＧ４」）よりも移動度が大きい未知糖質のスポット（図１中の符号「Ｉ」）が検出された。この未知糖質を「未知糖質Ｉ」と名付けた。
【００６４】
＜実験１−３：未知糖質Ｉの調製＞
酵素反応物を少量用いた予備試験において、未知糖質Ｉがα−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼにより分解されず、アルカリ処理で分解されないことが確認されたので、引き続き、未知糖質Ｉに夾雑するデキストラン分解物をＤ−グルコースまで加水分解する実験を行った。すなわち、実験１−２で得た未知糖質Ｉを含有する酵素反応物を塩酸でｐＨ５．０に調整した後、α−グルコシダーゼ（商品名『トランスグルコシダーゼＬ「アマノ」』、天野エンザイム株式会社製造）を固形物１グラム当り１００単位及びグルコアミラーゼ（ナガセケムテックス株式会社販売）を固形物１グラム当り１，０００単位添加して５０℃、４日間反応させた。反応後、約１００℃で１０分間、熱処理して反応を停止させた。得られた反応液中の糖質を分析用の高速液体クロマトグラフィー（以下、分析ＨＰＬＣと略称する。）で分析したところ、溶出時間５８．７分のＤ−グルコース、溶出時間４９．４分の未知糖質Ｉが検出された。反応液の糖組成は、Ｄ−グルコースが３０．０質量％、未知糖質Ｉが６５．５質量％、その他イソマルトオリゴ糖を含むデキストラン部分分解物が４．５質量％であった。なお、分析ＨＰＬＣは、カラムに『ＭＣＩｇｅｌ  ＣＫ０４ＳＳ』（三菱ケミカル株式会社製造）の２本を直列につなぎ、溶離液に水を用いて、カラム温度８０℃、流速０．４ｍＬ／分の条件で行い、検出は示差屈折計ＲＩＤ−１０Ａ（株式会社島津製作所製造）を用いて行った。
【００６５】
続いて、α−グルコシダーゼ及びグルコアミラーゼ処理によって得られた上記反応液に水酸化ナトリウムを添加してｐＨを１２に調整し、９８℃で１時間保持することにより還元糖（Ｄ−グルコースと少量のデキストラン部分分解物）を分解した。不溶物を濾過して除去した後、三菱ケミカル株式会社製カチオン交換樹脂『ダイヤイオンＳＫ−１Ｂ』を添加して中和することによりｐＨ８付近とした後、活性炭処理により脱色した。得られた糖液をさらに『ダイヤイオンＳＫ−１Ｂ』と三菱ケミカル株式会社製アニオン交換樹脂『ダイヤイオンＷＡ３０』及びオルガノ製アニオン交換樹脂『ＩＲＡ４１１』を用いて脱塩し、精密濾過した後、エバポレーターで濃縮し、真空乾燥して固形物として約６０ｍｇの未知糖質Ｉの精製標品を得た。得られた未知糖質Ｉ標品の糖組成を分析ＨＰＬＣで調べたところ、図２のＨＰＬＣクロマトグラムに示すように、未知糖質Ｉの純度は９９．１質量％であり、極めて高純度の標品であることが判明した。
【００６６】
＜実験２：未知糖質Ｉの構造解析＞
実験１で得た未知糖質Ｉの精製標品について、ＬＣ／ＭＳ分析、各種ＮＭＲ分析を行い、未知糖質Ｉの構造解析を行った。
【００６７】
＜実験２−１：ＬＣ／ＭＳ分析＞
実験１で得た未知糖質Ｉの精製標品について、ＬＣ／ＭＳ分析装置（商品名「Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ」）（株式会社島津製作所製）を用いて、液体クロマトグラフィーに関しては、前記実験１−３で行ったＨＰＬＣと同じ条件で分析したところ、未知糖質Ｉのピークが保持時間４９．５分に溶出するとともに、質量数（ｍ／ｚ）６７１のナトリウム付加分子イオンが顕著に検出され、未知糖質Ｉの分子量は６４８であることが判明した。この分子量は、未知糖質Ｉが、４分子のＤ−グルコースが環状に連結した構造を有する環状グルコ四糖であることを示唆するものであった。
【００６８】
＜実験２−２：１Ｈ−ＮＭＲ及び１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹ解析＞
未知糖質Ｉの化学構造を決定する目的で、実験１で得た未知糖質Ｉの精製標品を重水（Ｄ２Ｏ）に溶解し、ＮＭＲ装置（『Ａｖａｎｃｅ  ＩＩ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ』、Ｂｒｕｋｅｒ社製）を用いた核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析に供し、１Ｈ−ＮＭＲ及び１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹ解析を行った。未知糖質Ｉの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図３に、１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹスペクトルを図４にそれぞれ示した。
【００６９】
図３に見られるとおり、未知糖質Ｉの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルには７つの主要なピークが認められた（なお、ＮＭＲ分析の溶媒として重水を用いているため、本スペクトルではＯＨ基のプロトンは検出されない）。ピークの積分比から、未知糖質Ｉの分子内には環境の異なる７つのプロトンが存在することが分かった。５．１３ｐｐｍに認められたダブレットのピークをＤ−グルコースのアノメリックカーボンに結合する１位のプロトンと帰属した。図４に示した１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹスペクトルに基づき、１位プロトンから順次相関が認められたピークを帰属した。認められた７つのプロトンピークを帰属した結果を表１に示した。
【００７０】
【表１】
2020122050.tif 000003
【００７１】
表１に示す各プロトンピークのカップリング定数及びケミカルシフトの値から、未知糖質Ｉはグルコピラノシル構造を有することが判明し、アノメリックカーボンに結合する１位のプロトンのピークが５．１３ｐｐｍに認められたことから未知糖質ＩにおけるＤ−グルコースの結合様式はα−アノマーであることが分かった。
【００７２】
＜実験２−３：１３Ｃ−ＮＭＲ、ＨＳＱＣ、及び、ＨＭＢＣ解析＞
実験２−２で用いたＮＭＲ装置を用い、引き続き１３Ｃ−ＮＭＲ、ＨＳＱＣ（Ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、異種核一量子相関分光法）、及び、ＨＭＢＣ（Ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｂｏｎｄ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、異種核多量子相関分光法）解析を行った。未知糖質Ｉの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル、ＨＳＱＣスペクトル、及び、ＨＭＢＣスペクトルをそれぞれ図５、図６、及び、図７に示した。
【００７３】
図５に見られるとおり、未知糖質Ｉの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルにはカーボンのピークが６種だけ認められた。実験２−１のＬＣ／ＭＳ分析において分子量から未知糖質Ｉは４分子のＤ−グルコースが環状に連結した構造を有する環状グルコ四糖であることが示唆されており、カーボンのピークが６種しか認められなかったことから、未知糖質Ｉは単一の結合様式で結合した環状グルコ四糖であることが示唆された。１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおける９５．５２２ｐｐｍに認められるカーボンをアノメリックカーボンと帰属した。
【００７４】
表１に示した１Ｈ−ＮＭＲスペクトルのピークの帰属結果に基づき、図６に示すＨＳＱＣスペクトルにおいて各プロトンと相関を示したカーボンを帰属した結果を表２に示した。
【００７５】
【表２】
2020122050.tif 000004
【００７６】
さらに、図７に示したＨＭＢＣスペクトルにおいて、１位のプロトンと相関を示すカーボンを観察したところ、１位プロトンと２，３，５，６位のカーボンに相関が認められ、４位カーボンには相関が認められなかった。２，３，５位のカーボンに加えて６位のカーボンとの間にも相関を示したことから、未知糖質Ｉにおいて、１位のカーボンと６位のカーボンとの間にグルコシド結合が存在すること、すなわち、未知糖質ＩにおいてＤ−グルコースは１，６グルコシド結合を介して結合していることが判明した。
【００７７】
以上の結果から、未知糖質Ｉは、図８に示すとおり、４分子のＤ−グルコースがα−１，６グルコシド結合を介して環状に連結した構造を有する環状グルコ四糖、すなわち、シクロイソマルトテトラオースであることが判明した。このような構造を有する糖質は従来全く知られておらず、シクロイソマルトテトラオースは新規な環状糖質である。
【００７８】
＜実験３：シクロイソマルトテトラオースの結晶＞
実験１の方法をスケールアップして再調製したシクロイソマルトテトラオース精製標品（２５．９ｇ、純度９６．１質量％）を用い、当該糖質の結晶の取得を試みた。
【００７９】
＜実験３−１：結晶の調製＞
上記シクロイソマルトテトラオース精製標品を脱イオン水に懸濁した後、加熱溶解し、糖濃度（Ｂｒｉｘ値）５３．２％に調整したシクロイソマルトテトラオース水溶液を静置して室温まで冷却したところ、結晶が析出した。結晶の顕微鏡写真を図９に示した。析出した結晶を濾過にて回収し、２５℃で減圧乾燥することによりシクロイソマルトテトラオースの結晶標品８．６ｇを得た。本結晶のシクロイソマルトテトラオース純度を前記した分析ＨＰＬＣで測定したところ、９９．５質量％と高純度であった。
【００８０】
＜実験３−２：結晶シクロイソマルトテトラオースの分析＞
実験３−１で得たシクロイソマルトテトラオースの結晶標品について、常法により、水分含量を測定するとともに熱分析、粉末Ｘ線回折を行った。
【００８１】
＜水分含量＞
実験３−１で得たシクロイソマルトテトラオースの結晶標品について、水分含量をカールフィッシャー水分測定装置（商品名「ＡＶＱ−２２００Ａ」、平沼産業株式会社製）にて測定したところ１３．９質量％の値が得られた。結晶シクロイソマルトテトラオースが５含水結晶又は６含水結晶であると仮定した場合の水分含量の理論値は１２．２質量％又は１４．３質量％であることから、本結晶シクロイソマルトテトラオースは５含水結晶又は６含水結晶のいずれかと考えられた。
【００８２】
＜熱分析（ＤＳＣ、ＴＧ／ＤＴＡ）＞
実験３−１で得たシクロイソマルトテトラオース結晶標品約５ｍｇをアルミニウム容器に精秤し、窒素雰囲気下において、５℃／分の昇温速度で３０℃から３００℃まで昇温し、示差熱量重量同時測定装置（商品名「ＴＧ／ＤＴＡ  ６２００」、株式会社日立ハイテクサイエンス製）により熱分析を行ったところ１１６．５℃までに１２．１２質量％の重量減少が認められた。この重量減少は結晶水の脱離によるものと考えられ、水分含量についての前記の知見と合わせ、本結晶シクロイソマルトテトラオースは５含水結晶と考えられた。
【００８３】
＜粉末Ｘ線回折図＞
シクロイソマルトテトラオース５含水結晶の粉末Ｘ線回折分析は、シリコン製無反射板に試料をのせ、粉末Ｘ線回折装置「Ｘ‘  Ｐｅｒｔ  Ｐｒｏ  ＭＰＤ」（ＣｕＫα線使用）（スペクトリス株式会社製）を用いて行った。シクロイソマルトテトラオース５含水結晶の粉末Ｘ線回折図を図１０に示した。回折角（２θ）９．０°、９．８°、１１．８°、１３．１°及び１９．１°（図１０における符号「↓」）に特徴的な回折ピークが認められた。
【００８４】
＜実験４：シクロイソマルトテトラオース生成酵素生産菌の同定＞
土壌スクリーニングにおいて、シクロイソマルトテトラオース生成酵素生産菌として、新規微生物Ｄ１１１０株と、菌のコロニー形態がＤ１１１０株とは異なる新規微生物Ｄ２００６株の２株を単離した。各微生物の顕微鏡観察を行ったところ、微生物Ｄ１１１０株とＤ２００６株はいずれも桿菌であることが分かった。本実験では、１６Ｓ  ｒＲＮＡ（１６Ｓ  ｒＤＮＡ）の塩基配列を決定し、この塩基配列に基づき微生物Ｄ１１１０株及びＤ２００６株の菌種同定を行った。
【００８５】
＜実験４−１：微生物Ｄ１１１０株及びＤ２００６株からの１６Ｓ  ｒＤＮＡの調製＞
市販のデキストラン（商品名『デキストラン  Ｔ７０』、ファーマコスモス社製）１．５ｇ／Ｌ、リン酸二カリウム１．０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水和物１．０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１．０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２．０ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄・７水和物０．０１ｇ／Ｌ、硫酸マンガン・７水和物０．０１ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛・７水和物０．００１ｇ／Ｌ、ジェランガム２０．０ｇ／Ｌ及び水からなる培地（ｐＨ６．８）を、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌した後、シャーレに分注し冷却してジェランガム平板培地を調製した。次いで、土壌より単離した微生物Ｄ１１１０株及びＤ２００６株をそれぞれこの平板培地に接種し、それぞれ２７℃で３日間静置培養し、単コロニー化した。
【００８６】
上記で単コロニー化した微生物Ｄ１１１０株及びＤ２００６株をそれぞれ釣菌し、市販のＤＮＡ簡易抽出試薬（商品名『ＭｉｇｈｔｙＰｒｅｐ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  ＤＮＡ』、タカラバイオ株式会社販売）５０μＬに懸濁し、９５℃で１０分間処理した後、１５，０００ｒｐｍ、２分間遠心分離することによりゲノムＤＮＡを含む上清を回収した。回収した微生物Ｄ１１１０株のゲノムＤＮＡ及び微生物Ｄ２００６株のゲノムＤＮＡそれぞれに対して、配列表における配列番号１で示される塩基配列を有するセンスプライマー「８Ｆ」、及び、配列表における配列番号２で示される塩基配列を有するアンチセンスプライマー「１５１２Ｒ」を用いたＰＣＲを行い、ＰＣＲ増幅産物についてアガロース電気泳動を行ったところ、それぞれから約１．５ｋｂｐのＰＣＲ増幅産物が認められたため、エタノール沈殿によりそれぞれを回収し１６Ｓ  ｒＤＮＡとした。
【００８７】
＜実験４−２：１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列の決定＞
実験４−１で得た微生物Ｄ１１１０株及びＤ２００６株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列をそれぞれ常法により決定したところ、それぞれ配列表における配列番号３で示される塩基配列（１，４４７ｂｐ）及び配列表における配列番号４で示される塩基配列（１，４８５ｂｐ）を有していることが判明した。
【００８８】
＜実験４−３：相同性検索による微生物Ｄ１１１０株及びＤ２００６株の同定＞
実験４−２で決定した１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列に基づき、データベースＲＤＰ（Ｔｈｅ  Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ）及びＥｚＴａｘｏｎに対して、遺伝子解析ソフトウェア（ＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ．１３）を用いて相同性検索を行った。
【００８９】
実験４−２で得た微生物Ｄ１１１０株の１６Ｓ  ｒＤＮＡについて行った相同性検索の結果として、検索された相同性の高い上位２０エントリーの内、エントリー上位５位までの微生物の属・種・株とそれらの１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列との相同性を表３に示した。また、微生物Ｄ２００６株の１６Ｓ  ｒＤＮＡについて同様に行ったものの結果を表４に示した。
【００９０】
【表３】
2020122050.tif 000005
【００９１】
【表４】
2020122050.tif 000006
【００９２】
表３に見られるとおり、Ｄ１１１０株の１６Ｓ  rＤＮＡの塩基配列はアグレイア・プラテンシス（Ａｇｒｅｉａ  ｐｒａｔｅｎｓｉｓ）  ＶＫＭ  Ａｃ−２５１０（Ｔ）株との間で最も高い相同性９８．３４％を示した。一般的に、１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列での細菌の分類は９９％以上の相同性があれば同種である可能性が高いと言われている。検索した中に９９％以上の相同性を示すものはなく、菌種の同定にまでは至らなかったものの、Ｄ１１１０株はアグレイア属に属することが示された。この結果に基づき、Ｄ１１１０株をアグレイア・スピーシーズ（Ａｇｒｅｉａ  ｓｐ．）と同定し、アグレイア・スピーシーズ  Ｄ１１１０と命名した。
【００９３】
また、表４に見られるとおり、Ｄ２００６株の１６Ｓ  rＤＮＡの塩基配列はミクロバクテリウム・トリコセシノリティカム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｏｌｙｔｉｃｕｍ）  ＤＳＭ８６０８株との間で最も高い相同性９９．１７％を示した。この結果に基づき、Ｄ２００６株の属・種をミクロバクテリウム・トリコセシノリティカムと同定し、ミクロバクテリウム・トリコセシノリティカム  Ｄ２００６と命名した。
【００９４】
アグレイア・スピーシーズ  Ｄ１１１０及びミクロバクテリウム・トリコセシノリティカム  Ｄ２００６はいずれも、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−６所在の独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託し、平成３０年１２月２８日付でそれぞれ受託番号  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１５、及び、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１６として受託された。
【００９５】
＜実験５：アグレイア・スピーシーズ  Ｄ１１１０（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１５）由来シクロイソマルトテトラオース生成酵素の調製＞
実験１−１で用いたと同じ液体培地を試験管に３ｍＬずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、アグレイア・スピーシーズ  Ｄ１１１０（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１５）を接種し、２７℃、２４０ｒｐｍで９６時間振トウ培養したものを種培養とした。
【００９６】
種培養と同じ組成の液体培地を１００ｍＬ入れた容量５００ｍＬの三角フラスコ２０本をオートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して温度２７℃とした後、種培養液１ｍＬずつ接種し、温度２７℃で６６時間回転振トウ培養した。培養後、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１５分間）して菌体を除き、培養上清約１．８Ｌを得た。培養上清についてシクロイソマルトテトラオース生成酵素活性を測定したところ、培養上清中には該酵素活性を０．１１２Ｕ／ｍＬ含むことが分かった。
【００９７】
＜実験６：アグレイア・スピーシーズ  Ｄ１１１０（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１５）由来シクロイソマルトテトラオース生成酵素の精製＞
実験５で得た培養上清約１．８Ｌ（総活性２０２Ｕ）に、８０％飽和となるように硫安を添加し、４℃、２４時間放置することにより塩析した。生成した塩析沈殿物を遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、３０分間）にて回収し、これを２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解後、同緩衝液に対して透析し、透析酵素液として１５３ｍＬを得た。透析酵素液中のシクロイソマルトテトラオース生成酵素活性は３３．２Ｕであった。この酵素液を東ソー株式会社製『ＤＥＡＥ−トヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）  ６５０Ｓ』ゲルを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー（ゲル容量２４．１ｍＬ）に供した。シクロイソマルトテトラオース生成酵素活性は、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した『ＤＥＡＥ−トヨパール  ６５０Ｓ』ゲルに吸着し、食塩濃度０Ｍから０．５Ｍまでのリニアグラジエントで溶出させたところ、食塩濃度約０．２５Ｍ付近に溶出した。この活性画分を回収し、終濃度１Ｍとなるように硫安を添加した後、遠心分離して不溶物を除き、東ソー株式会社製『フェニル−トヨパール（Ｐｈｅｎｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）  ６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水クロマトグラフィー（ゲル容量１１ｍＬ）に供した。シクロイソマルトテトラオース生成酵素活性は、１Ｍ硫安を含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した『フェニル−トヨパール  ６５０Ｍ』ゲルに吸着し、硫安濃度１Ｍから０Ｍまでのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近に溶出した。この精製の各ステップにおけるシクロイソマルトテトラオース生成酵素の全活性、全蛋白、比活性及び収率を表５に示す。
【００９８】
【表５】
2020122050.tif 000007
【００９９】
『フェニル−トヨパール  ６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水クロマトグラフィーで精製したシクロイソマルトテトラオース生成酵素標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（８乃至１６ｗ／ｖ％濃度勾配）に供し、純度を検定したところ単一な蛋白バンドを示し、純度の高い標品であることが判明した。
【０１００】
＜実験７：アグレイア・スピーシーズ  Ｄ１１１０（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１５）由来シクロイソマルトテトラオース生成酵素の性質＞
【０１０１】
＜実験７−１：分子量＞
実験６の方法で得たシクロイソマルトテトラオース生成酵素精製標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（６乃至１６ｗ／ｖ％濃度勾配）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（商品名『プレシジョンＰｌｕｓプロテイン未着色スタンダード』、日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社販売）と比較して分子量を測定したところ、シクロイソマルトテトラオース生成酵素の分子量は、８６，０００±１０，０００ダルトンであることが判明した。
【０１０２】
＜実験７−２：酵素反応の至適温度及び至適ｐＨ＞
実験６の方法で得たシクロイソマルトテトラオース生成酵素精製標品を用いて、酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。これらの結果を図１１（至適温度）、図１２（至適ｐＨ）に示した。シクロイソマルトテトラオース生成酵素の至適温度は、ｐＨ６．０、３０分間反応の条件下で、３５乃至４０℃であり、至適ｐＨは、４０℃、３０分間反応の条件下でｐＨ５．５乃至６．０であることが判明した。
【０１０３】
＜実験７−３：酵素の温度安定性及びｐＨ安定性＞
実験６の方法で得た精製シクロイソマルトテトラオース生成酵素標品を用いて、本酵素の温度安定性及びｐＨ安定性を調べた。温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）各温度に３０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨの１００ｍＭ緩衝液中で４℃、１６時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。これらの結果を図１３（温度安定性）、図１４（ｐＨ安定性）に示した。図１３から明らかなように、シクロイソマルトテトラオース生成酵素の温度安定性は４０℃まで安定であることが判明した。また、図１４から明らかなように、シクロイソマルトテトラオース生成酵素のｐＨ安定性はｐＨ５．０乃至１０．０の範囲で安定であることが判明した。
【０１０４】
＜実験７−４：Ｎ末端アミノ酸配列＞
実験６の方法で得たシクロイソマルトテトラオース生成酵素精製標品を用いて、Ｄ１１１０由来酵素のＮ末端アミノ酸配列を、プロテインシーケンサー  ＰＰＳＱ−３１Ａ型（株式会社島津製作所製）を用いて分析したところ、配列表における配列番号５で示されるアミノ酸配列、すなわち、アラニン−スレオニン−バリン−グリシン−アスパラギン酸−アラニン−トリプトファン−スレオニン−アスパラギン酸−リジン−アラニン−アルギニン−チロシン−アスパラギン酸−プロリン  を有していることが判明した。
【０１０５】
＜実験８：ミクロバクテリウム・トリコセシノリティカム  Ｄ２００６（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１６）由来シクロイソマルトテトラオース生成酵素の調製＞
実験１−１で用いたと同じ液体培地を試験管に３ｍＬずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、ミクロバクテリウム・トリコセシノリティカム  Ｄ２００６（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１６）を接種し、２７℃、２４０ｒｐｍで９６時間振トウ培養したものを種培養とした。
【０１０６】
種培養と同じ組成の液体培地を１００ｍＬ入れた容量５００ｍＬの三角フラスコ１５本をオートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して温度２７℃とした後、種培養液１ｍＬずつ接種し、温度２７℃で６６時間回転振トウ培養した。培養後、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１５分間）して菌体を除き、培養上清約１．４Ｌを得た。培養上清についてシクロイソマルトテトラオース生成酵素活性を測定したところ、培養上清中には該酵素活性を０．０６９Ｕ／ｍＬ含むことが分かった。
【０１０７】
＜実験９：ミクロバクテリウム・トリコセシノリティカム  Ｄ２００６（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１６）由来シクロイソマルトテトラオース生成酵素の精製＞
実験８で得た培養上清約１．４Ｌ（総活性９６．６Ｕ）に、８０％飽和となるように硫安を添加し、４℃、１６時間放置することにより塩析した。生成した塩析沈殿物を遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、３０分間）にて回収し、これを１ｍＭの塩化カルシウムを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解後、同緩衝液に対して透析し、透析酵素液として１１０ｍＬを得た。透析酵素液中のシクロイソマルトテトラオース生成酵素活性は１４０．７Ｕであった。この酵素液を東ソー株式会社製『ＤＥＡＥ−トヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）  ６５０Ｓ』ゲルを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー（ゲル容量２０ｍＬ）に供した。シクロイソマルトテトラオース生成酵素活性は、１ｍＭの塩化カルシウムを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した『ＤＥＡＥ−トヨパール  ６５０Ｓ』ゲルに吸着し、食塩濃度０Ｍから０．５Ｍまでのリニアグラジエントで溶出させたところ、食塩濃度約０．２Ｍ付近に溶出した。この活性画分を回収し、１ｍＭの塩化カルシウムを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に対して透析した後、ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製『モノＱ（Ｍｏｎｏ  Ｑ）  ５／５０ＧＬ』ゲルを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー（ゲル容量１．０ｍＬ）に供した。シクロイソマルトテトラオース生成酵素活性は、１ｍＭの塩化カルシウムを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した『モノＱ  ５／５０ＧＬ』ゲルに吸着し、食塩濃度０Ｍから０．５Ｍまでのリニアグラジエントで溶出させたところ、食塩濃度約０．３Ｍ付近に溶出した。この精製の各ステップにおけるシクロイソマルトテトラオース生成酵素の全活性、全蛋白、比活性及び収率を表６に示す。
【０１０８】
【表６】
2020122050.tif 000008
【０１０９】
『モノＱ  ５／５０ＧＬ』ゲルを用いた疎水クロマトグラフィーで精製したシクロイソマルトテトラオース生成酵素標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（８乃至１６ｗ／ｖ％濃度勾配）に供し、純度を検定したところ単一な蛋白バンドを示し、純度の高い標品であることが判明した。
【０１１０】
＜実験１０：ミクロバクテリウム・トリコセシノリティカム  Ｄ２００６（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１６）由来シクロイソマルトテトラオース生成酵素の性質＞
【０１１１】
＜実験１０−１：分子量＞
実験９の方法で得たシクロイソマルトテトラオース生成酵素精製標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（６乃至１６ｗ／ｖ％濃度勾配）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（商品名『プレシジョンＰｌｕｓプロテイン未着色スタンダード』、日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社販売）と比較して分子量を測定したところ、シクロイソマルトテトラオース生成酵素の分子量は、８６，０００±１０，０００ダルトンであることが判明した。
【０１１２】
＜実験１０−２：酵素反応の至適温度及び至適ｐＨ＞
実験９の方法で得たシクロイソマルトテトラオース生成酵素精製標品を用いて、酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。これらの結果を図１５（至適温度）、図１６（至適ｐＨ）に示した。シクロイソマルトテトラオース生成酵素の至適温度は、ｐＨ６．０、３０分間反応の条件下で、４０℃であり、至適ｐＨは、４０℃、３０分間反応の条件下でｐＨ５．５付近であることが判明した。
【０１１３】
＜実験１０−３：酵素の温度安定性及びｐＨ安定性＞
実験９の方法で得た精製シクロイソマルトテトラオース生成酵素標品を用いて、本酵素の温度安定性及びｐＨ安定性を調べた。温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）各温度に３０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨの１００ｍＭ緩衝液中で４℃、１８時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。これらの結果を図１７（温度安定性）、図１８（ｐＨ安定性）に示した。図１７から明らかなように、シクロイソマルトテトラオース生成酵素の温度安定性は３５℃まで安定であることが判明した。また、図１８から明らかなように、シクロイソマルトテトラオース生成酵素のｐＨ安定性はｐＨ５．０乃至７．０の範囲で安定であることが判明した。
【０１１４】
＜実験１０−４：Ｎ末端アミノ酸配列＞
実験９の方法で得たシクロイソマルトテトラオース生成酵素精製標品を用いて、Ｄ２００６由来酵素のＮ末端アミノ酸配列を、プロテインシーケンサー  ＰＰＳＱ−３１Ａ型（株式会社島津製作所製）を用いて分析したところ、配列表における配列番号６で示されるアミノ酸配列、すなわち、アラニン−アスパラギン酸−ロイシン−グリシン−アスパラギン酸−アラニン−トリプトファン−スレオニン−アスパラギン酸  を有していることが判明した。
【０１１５】
＜実験１１：シクロイソマルトテトラオース生成酵素をコードするＤＮＡのクローニング及びこれを含む組換えＤＮＡと形質転換体の調製＞
シクロイソマルトテトラオース生成酵素をコードするＤＮＡを、アグレイア・スピーシーズ  Ｄ１１１０（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１５）及びミクロバクテリウム・トリコセシノリティカム  Ｄ２００６（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１６）からそれぞれクローニングし、自律複製可能な組換えＤＮＡの作製、酵素をコードするＤＮＡの塩基配列の決定、及び形質転換体の調製を行った。
【０１１６】
＜実験１１−１：ゲノムＤＮＡの調製＞
平板寒天培地にて継代培養したアグレイア・スピーシーズ  Ｄ１１１０（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１５）又はミクロバクテリウム・トリコセシノリティカム  Ｄ２００６（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１６）をそれぞれ一白金耳かきとり、実験１で用いた液体培地３ｍＬを入れた試験管に植菌し、２７℃、２４０ｒｐｍで５日間それぞれ振トウ培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して回収したそれぞれの菌体より、市販の全ＤＮＡ精製キット（商品名『ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ』、ＱＩＡＧＥＮ社販売）を用いて、常法によりゲノムＤＮＡを調製した。
【０１１７】
＜実験１１−２：次世代シーケンサーを用いた全ゲノム塩基配列の決定＞
実験１１−１で得たそれぞれの微生物由来のゲノムＤＮＡを、それぞれ市販のキット(商品名『Ｎｅｘｔｅｒａ  ＸＴ  ＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ』、イルミナ社販売)を用いて酵素的に断片化し、断片化したＤＮＡの末端の平滑化処理とＤＮＡ末端へのアダプター配列の付加を行うことによりＤＮＡ断片をライブラリー化し、さらにＰＣＲで増幅した後、市販のＤＮＡ精製キット（商品名『ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ』、ベックマン・コールター社販売）を用いて精製した。次いで、ライブラリー化したＤＮＡ断片の塩基配列を次世代シーケンサー（装置名『ＭｉＳｅｑ』、イルミナ社製）を用いて決定し、決定した各ＤＮＡ断片の塩基配列（コンティグ配列）をコンピュータ上で統合することにより、全ゲノムＤＮＡの塩基配列をそれぞれ得た。
【０１１８】
次いで、遺伝子領域予測ソフトウェア（『Ｇｌｉｍｍｅｒ』）を用いて全ゲノムＤＮＡの塩基配列を解析し、蛋白質をコードしていると推定されるオープンリーディングフレーム（Ｏｐｅｎ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ、ＯＲＦ：推定遺伝子領域）を予測したところ、アグレイア・スピーシーズ  Ｄ１１１０（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１５）の全ゲノムＤＮＡには、ＯＲＦが９，１３９個あることが判明し、同様にミクロバクテリウム・トリコセシノリティカム  Ｄ２００６（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１６）の全ゲノムＤＮＡには、ＯＲＦが１１，０６８個あることが判明した。
【０１１９】
＜実験１１−３：シクロイソマルトテトラオース生成酵素をコードするＯＲＦの同定＞
実験１１−２の全ゲノム解析において認められたアグレイア・スピーシーズ  Ｄ１１１０（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１５）由来ゲノムＤＮＡの９，１３９個のＯＲＦを対象とし、実験３−２で決定したアグレイア・スピーシーズ  Ｄ１１１０（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１５）由来シクロイソマルトテトラオース生成酵素のＮ末端アミノ酸配列（配列表における配列番号５で示されるアミノ酸配列）と一致するアミノ酸配列をコードするＯＲＦを検索したところ、同Ｎ末端アミノ酸配列と完全に一致するアミノ酸配列がＯＲＦ９０３８にコードされていることが判明した。この結果から、ＯＲＦ９０３８の塩基配列、すなわち配列表における配列番号９で示される塩基配列がシクロイソマルトテトラオース生成酵素の構造遺伝子ＤＮＡであり、アグレイア・スピーシーズ  Ｄ１１１０（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１５）由来シクロイソマルトテトラオース生成酵素は、配列表における配列番号９で示される塩基配列に併記されたアミノ酸配列から、分泌シグナル配列と推定されるＮ末端部分の３１アミノ酸残基が除去されたアミノ酸配列、すなわち、配列表における配列番号７で示されるアミノ酸配列からなることが判明した。
【０１２０】
また、実験１１−２の全ゲノム解析において認められたミクロバクテリウム・トリコセシノリティカム  Ｄ２００６（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１６）由来ゲノムＤＮＡの１１，０６８個のＯＲＦを対象とし、実験１０−４で決定したシクロイソマルトテトラオース生成酵素のＮ末端アミノ酸配列（配列表における配列番号６で示されるアミノ酸配列）と一致するアミノ酸配列をコードするＯＲＦを検索したところ、同Ｎ末端アミノ酸配列と完全に一致するアミノ酸配列がＯＲＦ５３２８にコードされていることが判明した。この結果から、ＯＲＦ５３２８の塩基配列、すなわち配列表における配列番号１０で示される塩基配列がミクロバクテリウム・トリコセシノリティカム  Ｄ２００６（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１６）由来シクロイソマルトテトラオース生成酵素の構造遺伝子ＤＮＡであり、ミクロバクテリウム・トリコセシノリティカム  Ｄ２００６（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１６）由来シクロイソマルトテトラオース生成酵素は、配列表における配列番号１０で示される塩基配列に併記されたアミノ酸配列から、分泌シグナル配列と推定されるＮ末端部分の３２アミノ酸残基が除去されたアミノ酸配列、すなわち、配列表における配列番号８で示されるアミノ酸配列を有することが判明した。
【０１２１】
因みに、配列表における配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるアグレイア・スピーシーズ  Ｄ１１１０（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１５）由来シクロイソマルトテトラオース生成酵素の分子量は８６，３５０と、また、配列表における配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるミクロバクテリウム・トリコセシノリティカム  Ｄ２００６（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１６）由来同酵素の分子量は８６，６５８とそれぞれ算出され、前記実験３−１及び実験１０−１においてＳＤＳ−ＰＡＧＥによりそれぞれ求めた分子量８６，０００±１０，０００とよく一致した。配列表における配列番号９で示されるアグレイア・スピーシーズ  Ｄ１１１０（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１５）由来酵素遺伝子がコードするアミノ酸配列と、配列表における配列番号１０で示されるミクロバクテリウム・トリコセシノリティカム  Ｄ２００６（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１６）由来酵素遺伝子がコードするアミノ酸配列との相同性（配列同一性）を市販の遺伝情報処理ソフトウェア（『ＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ．１３』、株式会社ゼネティックス販売）を用いて調べたところ、７１％であった（図１９を参照）。
【０１２２】
＜実験１２：発現用組換えＤＮＡ、ｐＲＳＥＴ  Ａ−ＯＲＦ９０３８の作製とその形質転換体Ｅ９０３８による組換え型シクロイソマルトテトラオース生成酵素の産生＞
アグレイア・スピーシーズ  Ｄ１１１０（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１５）のゲノムＤＮＡからＯＲＦ９０３８のシクロイソマルトテトラオース生成酵素遺伝子を常法によりＰＣＲにて増幅し、発現用ベクター『ｐＲＳＥＴ  Ａ』（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）に挿入し、組換え型シクロイソマルトテトラオース生成酵素の大腸菌における発現を検討した。
【０１２３】
＜実験１２−１：発現用組換えＤＮＡ、ｐＲＳＥＴ  Ａ−ＯＲＦ９０３８の作製及び形質転換体Ｅ９０３８の調製＞
アグレイア・スピーシーズ  Ｄ１１１０（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１５）のシクロイソマルトテトラオース生成酵素遺伝子を発現用ベクター『ｐＲＳＥＴ  Ａ』に組込むに際し、配列表における配列番号１１で示される塩基配列を有するセンスプライマーと、配列表における配列番号１２で示される塩基配列を有するアンチセンスプライマーとの組合せで、アグレイア・スピーシーズ  Ｄ１１１０（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１５）の全ゲノムＤＮＡに対してＰＣＲを行い、増幅ＤＮＡ断片を得た。このＰＣＲ増幅ＤＮＡは、ベクターｐＲＳＥＴ  ＡにＩｎ−ｆｕｓｉｏｎ法にて組込むために、５´末端及び３´末端にｐＲＳＥＴ  Ａと相同な１５塩基の配列を有し、且つ、開始コドンＡＴＧの直後にシクロイソマルトテトラオース生成酵素の成熟酵素のアミノ酸配列、すなわち配列表における配列番号７で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを配置し、その直後に終止コドンＴＡＡ・ＴＡＧが位置するように設計されている。なお、Ｔ７プロモーター、リボソ−ム結合部位（ＲＢＳ）及び開始コドンＡＴＧはｐＲＳＥＴ  Ａ上のものを利用することとした。
【０１２４】
上記で増幅したＤＮＡをベクターｐＲＳＥＴ  ＡにＩｎ−ｆｕｓｉｏｎ法で組込んで得られた組換えＤＮＡを『ｐＳＥＴ  Ａ−ＯＲＦ９０３８』と命名した。ｐＲＳＥＴ  Ａ−ＯＲＦ９０３８を図２０に示す。ｐＳＥＴ  Ａ−ＯＲＦ９０３８を用いて大腸菌ＨＳＴ−０８（タカラバイオ株式会社販売）を形質転換し、得られた形質転換体からｐＲＳＥＴ  Ａ−ＯＲＦ９０３８を単離、調製し、発現用宿主大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（メルク株式会社販売）を形質転換して形質転換体『Ｅ９０３８』を調製した。
【０１２５】
＜実験１２−２：形質転換体Ｅ９０３８による組換え型シクロイソマルトテトラオース生成酵素の産生＞
Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）４７ｇ／Ｌ、グリセロール４ｇ／Ｌ、及び水からなる液体ＴＢ培地（ｐＨ６．８）を、ガラス試験管に５ｍＬずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却した後、アンピシリンを終濃度１００μｇ／ｍＬとなるように無菌的に添加して液体培地を調製した。この液体培地に実験１２−１で得た形質転換体Ｅ９０３８を接種し、３７℃で８時間振盪培養した時点でイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を終濃度１００μＭになるように添加してシクロイソマルトテトラオース生成酵素遺伝子の発現を誘導し、さらに１６時間培養した。得られた培養物から遠心分離により菌体を回収した。得られた菌体を常法に従い、リゾチーム処理、凍結解凍処理の後、超音波破砕し細胞抽出物を調製した。超音波破砕は、菌体を２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した後、その菌体懸濁液を氷水中で冷却しながら超音波ホモジナイザー（モデルＵＨ−６００、株式会社エスエムテー製）で細胞破砕することによって行った。得られた細胞破砕抽出物を遠心分離し、細胞抽出物上清を得た。
【０１２６】
このようにして調製した細胞抽出物上清を組換えシクロイソマルトテトラオース生成酵素の粗酵素液とし、当該粗酵素液０．３ｍＬをデキストラン（商品名『デキストラン  Ｔ７０』ファーマコスモス社製）を２．０％（ｗ／ｖ）含有する２００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）０．３ｍＬと混合し、４０℃で一晩保持することにより反応させた後、１００℃で１０分間加熱し反応を停止させた。得られた反応液を実験１で用いた分析ＨＰＬＣに供した。反応液のＨＰＬＣクロマトグラムを図２１に示した。なお、対照として、発現ベクターｐＲＳＥＴ  Ａを保持する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を上述の形質転換体の場合と同一条件で培養し、培養物から細胞抽出物上清を調製し、同様にシクロイソマルトテトラオース生成能を調べた。
【０１２７】
図２１に見られるとおり、反応液のＨＰＬＣクロマトグラムには、保持時間１７分付近に基質としたデキストランのピーク（図２１における符号「Ｄｅｘ」）の溶出が認められ、保持時間４９．４分付近にシクロイソマルトテトラオースのピーク（図２１における符号「ＣＩ−４」）が認められた。この結果から、宿主大腸菌の細胞内でシクロイソマルトテトラオース生成酵素遺伝子が発現し、シクロイソマルトテトラオース生成酵素が産生していることが定性的に確認された。一方、具体的なクロマトグラムは省略するが、宿主である対照の大腸菌の菌体抽出上清ではシクロイソマルトテトラオースの生成は認められず、当該酵素活性は全く検出できなかった。
【０１２８】
なお、詳細は省略するものの、ミクロバクテリウム・トリコセシノリティカム  Ｄ２００６（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１６）由来酵素についても、上記アグレイア・スピーシーズ  Ｄ１１１０（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１５）由来酵素の場合と同様に、組換えＤＮＡ、形質転換体を調製し、宿主大腸菌の細胞内で組換え酵素を発現させたところ、シクロイソマルトテトラオース生成酵素の産生が確認された。
【０１２９】
＜実験１３：シクロイソマルトテトラオース生成酵素のイソマルトペンタオースへの作用＞
シクロイソマルトテトラオース生成酵素の基質特異性を調べる一環として、イソマルトペンタオースへの作用を調べた。イソマルトペンタオース（株式会社林原調製品、純度９８．１質量％）を１％（ｗ／ｖ）、防腐剤としてのヒノキチオールを０．００６％（ｗ／ｖ）含有する５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）０．５ｍＬに実験６の方法で得たアグレイア・スピーシーズ  Ｄ１１１０（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１５）由来のシクロイソマルトテトラオース生成酵素の精製標品をイソマルトペンタオース１ｇ当たり２．０単位添加し、４０℃で２４時間反応させ、反応液を１００℃で１０分間熱処理することにより酵素を失活させた。反応液中の生成物を調べるため、展開溶媒としてアセトニトリル：水：酢酸エチル：１−プロパノール混液（容量比８５：７０：２０：５０）を、また、薄層プレートとしてメルク社製『キーゼルゲル  ６０』（アルミプレート、１０×２０ｃｍ）を用い、２回展開するＴＬＣを行い、糖質を分離した。硫酸−メタノール法にて発色させることにより分離した糖質を検出し、イソマルトペンタオースからの酵素反応生成物を確認した。
【０１３０】
その結果、シクロイソマルトテトラオース生成酵素は、イソマルトペンタオースに作用し、シクロイソマルトテトラオースを生成するとともにイソマルトテトラオースを生成し、また、僅かにイソマルトトリオース、イソマルース、グルコース及び高分子グルカンを生成することが判明した。この結果から、本酵素は少なくともグルコース重合度が５以上のα−１，６グルカンに作用すると考えられた。
【０１３１】
＜実験１４：シクロイソマルトテトラオース生成酵素の基質特異性＞
各種糖質を用いて、シクロイソマルトテトラオース生成酵素の基質特異性を調べた。Ｄ−グルコース、マルトース、イソマルトース、パノース、イソマルトトリオース、イソマルトテトラオース、イソマルトペンタオース、イソマルトヘキサオース、イソマルトヘプタオース、デキストラン  Ｔ１０（平均分子量１０，０００、ファーマコスモス社製）、デキストラン  Ｔ７０（平均分子量７０，０００、ファーマコスモス社製）又はデキストラン  Ｔ２０００（平均分子量２，０００，０００、ファーマコスモス社製）を含む水溶液を調製した。これらの基質溶液に、最終濃度５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）と最終濃度１ｍＭ塩化カルシウムを加えた後、実験６の方法で得たアグレイア・スピーシーズ  Ｄ１１１０（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１５）由来シクロイソマルトテトラオース生成酵素精製標品を基質固形物１グラム当たりそれぞれ２０単位ずつ加え、基質濃度を１％（ｗ／ｖ）になるように調整し、４０℃、ｐＨ６．０で２４時間作用させた。酵素反応前後の反応液中の糖質を調べるため、展開溶媒として２−プロパノール、１−ブタノール、水混液（容量比１２：３：４）を、また、薄層プレートとしてメルク社製『キーゼルゲル  ６０Ｆ２５４』（アルミプレート、１０×２０ｃｍ）を用い、２回展開するシリカゲル薄層クロマトグラフィー（以下、ＴＬＣと略す）を行い、糖質を分離した。硫酸−メタノール法にて発色させ、分離した糖質を検出し、それぞれの糖質からのシクロイソマルトテトラオースの生成の程度とその他の生成物を調べた。結果を表７に示す。
【０１３２】
【表７】
2020122050.tif 000009
【０１３３】
表７に見られるとおり、シクロイソマルトテトラオース生成酵素は、試験した糖質のうち、Ｄ−グルコース、マルトース、イソマルトース、パノース、イソマルトトリオースなどの単糖、二糖、三糖へは作用しなかった。一方、同酵素は、イソマルトテトラオース、イソマルトペンタオース、イソマルトヘキサオース、イソマルトヘプタオース、及び、デキストランに作用し、シクロイソマルトテトラオースを生成したことから、グルコース重合度が４以上のα−１，６グルカンに作用し、シクロイソマルトテトラオースを生成することが判明した。また、同酵素は、生成したシクロイソマルトテトラオースを加水分解することによりイソマルトテトラオースを生成した。さらに、同酵素は、グルコース重合度が４以上のα−１，６グルカンに作用し、グルコース重合度２以上の一連のイソマルトオリゴ糖を生成する不均化反応を触媒することも判明した。加えて、同酵素は、受容体としてのイソマルトースの共存下でシクロイソマルトテトラオースに作用させたところ、イソマルトヘキサオースを生成したことから、シクロイソマルトテトラオースを開環するとともにイソマルトテトラオースをイソマルトースに結合させるカップリング反応をも触媒することも判明した。なお、ミクロバクテリウム・トリコセシノリティカム  Ｄ２００６（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１６）由来シクロイソマルトテトラオース生成酵素についても同様に基質特異性を調べたところ、アグレイア・スピーシーズ  Ｄ１１１０（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１５）由来酵素と同様にグルコース重合度が４以上のα−１，６グルカンに作用し、シクロイソマルトテトラオースを生成した。さらに、同酵素は、シクロイソマルトテトラオースの加水分解反応、α−１，６グルカンの不均化反応、カップリング反応を触媒する点でもＤ１１１０由来酵素と同様であり、全体として、その基質特異性はＤ１１１０由来酵素と同等であった。
【０１３４】
＜実験１５：シクロイソマルトテトラオースの小腸粘膜酵素による消化試験＞
実験３−１で得た純度９９．５質量％のシクロイソマルトテトラオース結晶標品を５０ｍＭマレイン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に濃度１質量％になるよう溶解し、基質溶液とした。この基質溶液にラット小腸アセトンパウダー（シグマ・アルドリッチ社販売）より調製した小腸粘膜酵素（α−グルコシダーゼ）をマルトース分解活性として、シクロイソマルトテトラオース１ｇ当たり５０単位添加し、３７℃で２４時間保持した後、１００℃で１０分間加熱し酵素を失活させた。反応前及び反応後の溶液中のシクロイソマルトテトラオースをＨＰＬＣ法にてそれぞれ定量し、酵素反応後のシクロイソマルトテトラオースの残存率（％）、すなわち、（反応後の質量／反応前の質量）×１００を測定したところ、酵素反応２４時間後で残存率９１．６％であった。シクロイソマルトテトラオースは小腸粘膜酵素でわずかしか分解されない難消化性の糖質であった。
【０１３５】
＜実験１６：シクロイソマルトテトラオースの熱安定性＞
実験３−１で得た純度９９．５質量％のシクロイソマルトテトラオース結晶標品を脱イオン水に溶解し、濃度７ｗ／ｖ％のシクロイソマルトテトラオース水溶液を調製した。その水溶液８ｍｌをスクリューキャップ付きガラス製遠心管に採り、密封した後、１２０℃で３０乃至９０分間加熱した。加熱前と、各加熱時間後の水溶液について着色度の測定と、ＨＰＬＣ法によるシクロイソマルトテトラオースの純度測定を行った。着色度は１ｃｍセルでの４８０ｎｍにおける吸光度とした。結果を表８に示した。
【０１３６】
【表８】
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【０１３７】
表８の結果から明らかなように、シクロイソマルトテトラオース水溶液は１２０℃の高温加熱においても着色せず、分解による純度低下も認められず、シクロイソマルトテトラオースは熱に対して安定な糖質であることが判明した。
【０１３８】
＜実験１７：シクロイソマルトテトラオースのｐＨ安定性＞
実験３−１で得たシクロイソマルトテトラオース結晶標品を各種緩衝液に溶解し、シクロイソマルトテトラオース濃度４ｗ／ｖ％、ｐＨを３乃至９に調整した７種類のシクロイソマルトテトラオース水溶液を調製した。それぞれの水溶液８ｍｌをスクリューキャップ付きガラス製遠心管に採り、密封した後、１００℃で２４時間加熱した。放冷後、実験１６と同様にそれら水溶液の着色度の測定と、ＨＰＬＣ法によるシクロイソマルトテトラオースの純度測定を行った。結果を表９に示した。
【０１３９】
【表９】
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【０１４０】
表９から明らかなように、シクロイソマルトテトラオースは１００℃、２４時間の加熱において、ｐＨ４乃至９の範囲で実質的に分解されず、弱酸性から弱アルカリ性の広い範囲で安定であることが分かった。しかしながら、ｐＨ３では僅かに分解され、純度の低下が認められた。
【０１４１】
以下、実施例によりさらに詳細に本発明を説明する。しかしながら、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【０１４２】
市販のデキストラン（商品名『デキストラン  Ｔ７０』、ファーマコスモス社製）１５ｇ／Ｌ、酵母エキス（商品名『粉末酵母エキスＳＨ』、日本製薬株式会社販売）１．０ｇ／Ｌ、ポリペプトン（商品名『ハイポリペプトン』、日本製薬株式会社販売）５．０ｇ／Ｌ、リン酸二カリウム１．０ｇ／Ｌ、リン酸一ナトリウム・２水和物０．６ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水和物０．５ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄・７水和物０．０１ｇ／Ｌ、硫酸マンガン・５水和物０．０１ｇ／Ｌ、炭酸カルシウム３．０ｇ／Ｌ、及び水からなる液体培地（ｐＨ６．８）を、５００ｍｌ容三角フラスコ５０本に１００ｍＬずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却した。次いで、アグレイア・スピーシーズ  Ｄ１１１０（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１５）を接種し、２７℃、２４０ｒｐｍで４日間回転振トウ培養した。培養後、培養液を遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０分間）して菌体を除き、培養上清を得た。更に、その培養上清約４．８ＬをＵＦ膜濃縮し、０．７０Ｕ／ｍＬの本発明のシクロイソマルトテトラオース生成酵素を含む濃縮酵素液１，１００ｍＬを粗酵素液として回収した。
【実施例２】
【０１４３】
酵母エキス（商品名『粉末酵母エキスＳＨ』、日本製薬株式会社販売）を他の酵母エキス（商品名『酵母エキスミースト顆粒Ｓ』、アサヒフードアンドヘルスケア株式会社販売）に、また、ポリペプトン（商品名『ハイポリペプトン』、日本製薬株式会社販売）を（商品名『ハイニュートＳ』、不二製油株式会社販売）に変えた以外は実施例１と同じ組成の液体培地（ｐＨ６．８）を調製し、５００ｍｌ容三角フラスコ５０本に１００ｍＬずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却した。次いで、ミクロバクテリウム・トリコセシノリティカム  Ｄ２００６（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１６）を接種し、２７℃、２４０ｒｐｍで４日間回転振トウ培養した。培養後、培養液を遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０分間）して菌体を除き、培養上清を得た。更に、その培養上清約４．７ＬをＵＦ膜濃縮し、０．４１Ｕ／ｍＬの本発明のシクロイソマルトテトラオース生成酵素を含む濃縮酵素液９２０ｍＬを粗酵素液として回収した。
【実施例３】
【０１４４】
デキストラン（商品名『デキストラン  Ｔ７０』、ファーマコスモス社製）を２％（ｗ／ｖ）、防腐剤としてのヒノキチオールを０．００６％（ｗ／ｖ）含有する５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）１０Ｌに実施例１の方法で得たアグレイア・スピーシーズ  Ｄ１１１０（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１５）由来のシクロイソマルトテトラオース生成酵素を含む粗酵素液をデキストラン１ｇ当たり５単位添加し、４０℃で２４時間反応させたところ、反応物は、固形物当たりシクロイソマルトテトラオースを１１．２質量％、イソマルトテトラオースを１．８質量％含有していた。反応液を９５℃で３０分間熱処理することにより酵素を失活させ冷却した後、分画分子量１０，０００のＵＦ膜にて膜ろ過を行い高分子をさらに除去し、固形物当たりシクロイソマルトテトラオースを６２質量％、イソマルトテトラオースを１２．８質量％含有する糖液を得た。得られた濾液を、常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して、濃度６０質量％のシラップを得た。得られたシラップを糖液として、強酸性カチオン交換樹脂（アンバーライトＣＲ−１３１０、Ｎａ型、オルガノ株式会社製造）を用いたカラム分画を行なった。樹脂を内径５．４ｃｍのジャケット付きステンレス製カラム４本に充填し、直列につなぎ樹脂層全長２０ｍとした。カラム内温度６０℃に維持しつつ、糖液を樹脂に対して５ｖ／ｖ％加え、これに６０℃の温水をＳＶ０．１３で流して分画し、溶出液の糖組成をＨＰＬＣ法でモニターし、シクロイソマルトテトラオースを含む画分を採取し、濃縮してシクロイソマルトテトラオース溶液（シクロイソマルトテトラオース純度９８．６質量％）を得た。次いで、実験３−１記載の方法に準じてシクロイソマルトテトラオースを結晶化し、純度９９．８質量％のシクロイソマルトテトラオース５含水結晶を得た。本品は、還元力を有さず、品質改良剤、安定剤、賦形剤、粉末化基材などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例４】
【０１４５】
デキストラン（商品名『デキストラン  Ｔ７０』、ファーマコスモス社製）を２．５％（ｗ／ｖ）、防腐剤としてのヒノキチオールを０．００６％（ｗ／ｖ）含有する５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）２０Ｌに実施例２の方法で得たミクロバクテリウム・トリコセシノリティカム  Ｄ２００６（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１６）由来のシクロイソマルトテトラオース生成酵素を含む粗酵素液をデキストラン１ｇ当たり５単位添加し、３５℃で４８時間反応させたところ、反応物は、固形物当たりシクロイソマルトテトラオースを９．７質量％、イソマルトテトラオースを２．０質量％含有していた。反応液を９５℃で３０分間熱処理することにより酵素を失活させ、冷却した後分画分子量１０，０００のＵＦ膜ろ過を行い高分子をさらに除去し、固形物当たりシクロイソマルトテトラオースを６２質量％、イソマルトテトラオースを１２．８質量％含有する糖液を得た。得られた糖液を更に濃縮、粉末化して、シクロイソマルトテトラオース含有粉末を得た。本品は、固形物当たり、シクロイソマルトテトラオースを６４質量％、イソマルトテトラオースを１３質量％、グルコース重合度７以上のその他の糖質を２５質量％含有していた。本品は、品質改良剤、安定剤、賦形剤、粉末化基材などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例５】
【０１４６】
市販のコーンスターチを、１ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に濃度３０質量％になるよう懸濁した後、加熱溶解し、これを５０℃まで冷却した原料溶液に、国際公開番号ＷＯ２００８／１３６３３１号パンフレットに開示されたα−グルコシル転移酵素、イソアミラーゼ（澱粉枝切り酵素）、及び、α−アミラーゼ（商品名『クライスターゼ  Ｅ５ＣＣ』、天野エンザイム株式会社販売）をそれぞれ基質固形物当たり１０単位、１，０００単位、及び１０単位添加し、温度５０℃で７２時間反応させ、次いで、１００℃で１５分間加熱することにより酵素を失活させ、α−１，６グルカンを部分構造として有する分岐α−グルカン混合物を含有する反応液を調製した。【０１４７】
上記で得た分岐α−グルカン混合物含有反応液の一部を、１ｍＭ塩化カルシウムを含む１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で濃度１．０質量％になるよう希釈し、実験８の方法で得たミクロバクテリウム・トリコセシノリティカム  Ｄ２００６（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１６）由来シクロイソマルトテトラオース生成酵素を基質固形物１ｇ当たり２．２単位添加して４０℃で４８時間反応させたところ、反応物は、固形物当たりシクロイソマルトテトラオースを８．１質量％、イソマルトテトラオースを５．７質量％、イソマルトトリオースを４．２質量％、イソマルトースを５．０質量％含有していた。このことから、澱粉からα−１，６グルカンを部分構造として有する糖質を生成する酵素とシクロイソマルトテトラオース生成酵素を組合わせて用いることにより、澱粉基質からシクロイソマルトテトラオースを製造できることが分かった。
【実施例６】
【０１４８】
＜シクロイソマルトテトラオースのグルコシル誘導体＞
無水物換算で０．５ｇの実施例３の方法で得たシクロイソマルトテトラオース五含水結晶と、２．５ｇの市販のα−シクロデキストリン（商品名『ＣＡＶＡＭＡＸ  Ｗ６  ｆｏｏｄ』、シクロケム社販売）をそれぞれ糖転移反応の受容体及び糖供与体として用い、１ｍＭの塩化カルシウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）５０ｍＬに溶解し、得られた溶液を基質溶液とした。この基質溶液に糖転移酵素としてジオバチラス・ステアロサーモフィラス由来ＣＧＴａｓｅを糖供与体１ｇ当たり２単位添加し、５０℃で２４時間反応させた後、１００℃で１０分間加熱することにより酵素反応を停止させた。次いで、得られた反応液に市販のグルコアミラーゼ（商品名『グルコチーム＃２０００』、ナガセケムテックス株式会社販売）を糖供与体１ｇ当たり１０単位添加し、さらに５０℃で２４時間反応させた後、１００℃で１０分間加熱することにより酵素反応を停止させた。得られたグルコアミラーゼ処理液に水酸化ナトリウムを添加しｐＨ１３．０に調整した後、１０５℃で１時間オートクレーブするアルカリ処理を行いグルコアミラーゼ処理液中の還元糖を分解した。さらにアルカリ処理液を常法により脱塩、濃縮、ろ過し、シクロイソマルトテトラオースのグルコシル誘導体含有糖液を得た。【０１４９】
上記で得たシクロイソマルトテトラオースのグルコシル誘導体含有糖液を下記条件によるＨＰＬＣ分析に供し、得られたクロマトグラムを図２２に示した。
（ＨＰＬＣ条件）
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−ＡＱ３０３（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）
（株式会社ワイエムシィ製）
溶離液：水／メタノール（９５：５、ｖ／ｖ）
カラム温度：４０℃                  流速：０．７ｍＬ／分
検出：示差屈折計【０１５０】
図２２に見られるように、保持時間６．４７分にシクロイソマルトテトラオースのピークが、保持時間９．１２分及び１１．３６分にシクロイソマルトテトラオースのグルコシル誘導体と考えられる２つの糖質ピークが認められ、また、保持時間１９．１分に糖供与体としたα−シクロデキストリンのピークが、保持時間４７，７分にα−シクロデキストリンから生成したと考えられるβ−シクロデキストリンのピークが認められた。保持時間９．１２分及び１１．３６分に溶出した糖質をそれぞれグルコシル誘導体Ａ及びＢとした。グルコシル誘導体含有糖液におけるグルコシル誘導体Ａの含量は３１．６質量％、グルコシル誘導体Ｂの含量は１５．８質量％であった。【０１５１】
グルコシル誘導体含有糖液をＯＤＳカラム（商品名『Ｄ−ＯＤＳ−５』、（株式会社ワイエムシィ製）を用いた分取ＨＰＬＣに供し、グルコシル誘導体Ａ及びＢをそれぞれ分取することにより、純度９９．２質量％のグルコシル誘導体Ａを２２９ｍｇ、純度９８．０質量％のグルコシル誘導体Ｂを１１７ｍｇ得た。グルコシル誘導体Ａ及びＢを実験２で用いたＬＣ／ＭＳ分析及びＮＭＲ分析に供したところ、グルコシル誘導体Ａは分子量８１０を有し、１分子のＤ−グルコースがシクロイソマルトテトラオースを構成する４つのグルコース残基の内１残基にα−１，４結合を介して結合した構造を有する５糖であり、シクロイソマルトテトラオースのモノグルコシル誘導体であることが判明した。また、グルコシル誘導体Ｂは分子量９７２を有し、２分子のＤ−グルコースがシクロイソマルトテトラオースを構成する４つのグルコース残基の内対角線に位置する２つのグルコース残基にそれぞれα−１，４結合を介して結合した構造を有する６糖であり、シクロイソマルトテトラオースのジグルコシル誘導体であることが判明した。シクロイソマルトテトラオースのグルコシル誘導体Ａ及びＢの構造を図２３に示した。
【実施例７】
【０１５２】
＜ハードキャンディー＞
濃度５５％蔗糖溶液１００質量部に実施例３の方法で得たシクロイソマルトテトラオース５含水結晶３０質量部を加熱混合し、次いで減圧下で水分２％未満になるまで加熱濃縮し、これにクエン酸０．６質量部および適量のレモン香料と着色料とを混和し、常法に従って成型し、製品を得た。本品は歯切れ、呈味、風味とも良好で、シクロイソマルトテトラオースを含有することから蔗糖の晶出も起こさず、吸湿性少なく、ダレも起こさない安定で高品質のハードキャンディーである。
【実施例８】
【０１５３】
＜チョコクッキー＞
小麦粉（薄力粉）１４０質量部、バター９０質量部、チョコレート１１５質量部、グラニュー糖３６０質量部、全卵２００質量部、アーモンド２００質量部、実施例４の方法で調製したシクロイソマルトテトラオース含有粉末３０質量部を使用して、常法によりチョコクッキーを製造した。本品を、室温で２週間保存後、試食したところ、吸湿や乾燥もなく、又、シクロイソマルトテトラオースが油脂の酸化や分解を抑制し、製造直後の風味がよく保持されていた。
【実施例９】
【０１５４】
＜乳酸菌飲料＞
脱脂粉乳１７５質量部、実施例４の方法で得たシクロイソマルトテトラオース含有粉末３０質量部及びラクトスクロース高含有粉末（株式会社林原販売、登録商標『乳果オリゴ』）７０質量部を水１、５００質量部に溶解し、６５℃で３０分間殺菌し、４０℃に冷却後、これに、常法に従って、乳酸菌のスターターを３０質量部植菌し、３７℃で８時間培養して乳酸菌飲料を得た。本品は、風味良好で、オリゴ糖、シクロイソマルトテトラオースを含有し、乳酸菌を安定に保つだけでなく、ビフィズス菌増殖促進作用、整腸作用を有する乳酸菌飲料として好適である。
【実施例１０】
【０１５５】
＜ボディーソープ＞
ラウリン酸カリウム１５質量部、ミリスチン酸カリウム５．０質量部、実施例４の方法で得たシクロイソマルトテトラオース含有粉末４．０質量部、プロピレングリコール２．０質量部、ポリエチレン粉末０．５質量部、ヒドロキシプロピルキトサン溶液０．５質量部、グリシン０．２５質量部、グルタミン０．２５質量部、感光色素２０１号０．１質量部、適量のフェノール、ｐＨ調整剤、ラベンダー水を適量加えた後、精製水を加えて総量を１００質量部とし、常法により乳化してホディーソープを調製した。本品は、泡立ちの良い、使用感に優れたホディーソープである。また、本品は、体臭の発生の予防、かゆみの予防や、或いは、皮膚の老化の治療用、予防用などに有利に利用できる。また、本品は、シクロイソマルトテトラオースを含有することから保湿性に優れている上、皮膚に対する刺激性が低いので、過敏症を懸念することなく利用することができる。
【実施例１１】
【０１５６】
＜化粧用クリーム＞
モノステアリン酸ポリオキシエチレングリコール２質量部、自己乳化型モノステアリン酸グリセリン５質量部、実施例３の方法で得たシクロイソマルトテトラオース５含水結晶２質量部、α−グルコシルルチン（株式会社林原販売、商品名「αＧルチン」）１質量部、流動パラフィン１質量部、トリオクタン酸グリセリン１０質量部および防腐剤の適量を常法に従って加熱溶解し、これにＬ−乳酸２質量部、１、３−ブチレングリコール５質量部および精製水６６質量部を加え、ホモゲナイザーにかけ乳化し、更に香料の適量を加えて攪拌混合し、化粧用クリームを製造した。本品は、シクロイソマルトテトラオースがα−グルコシルルチンの抗酸化能を安定化し、高品質の日焼け止め、美肌剤、色白剤などとして有利に利用できる。
【実施例１２】
【０１５７】
＜練歯磨＞
第二リン酸カルシウム４５質量部、ラウリル硫酸ナトリウム１．５質量部、グリセリン２５質量部、ポリオキシエチレンソルビタンラウレート０．５質量部、実施例３の方法で得たシクロイソマルトテトラオース５含水結晶１０質量部、サッカリン０．０２質量部を水１８質量部と混合して練歯磨を得た。本品は、界面活性剤の洗浄力を落とすことなく、嫌味を改良し、使用後感も良好である。
【産業上の利用可能性】
【０１５８】
本発明によれば、４分子のＤ−グルコースがα−１，６グルコシド結合を介して環状に連結した構造を有する新規糖質であるシクロイソマルトテトラオース又はシクロイソマルトテトラオース含有糖質を、シクロイソマルトテトラオース生成酵素を用いて製造し、提供することが可能となる。全く新規なシクロイソマルトテトラオースの提供を可能とする本発明は、飲食物、化粧品、医薬品など種々の利用分野に貢献することとなり、その産業的意義はきわめて大きい。
【符号の説明】
【０１５９】
図１において、
レーン１：イソマルトオリゴ糖マーカー
レーン２：イソマルトトリオース標準品
レーン３：イソマルトテトラオース標準品
レーン４：デキストラン基質に微生物Ｄ１１１０株由来粗酵素を作用させて得た酵素反応物
Ｇ：グルコース
ＩＧ２：イソマルトース
ＩＧ３：イソマルトトリオース
ＩＧ４：イソマルトテトラオース
Ｉ：未知糖質
図４、図６、及び図７において、
破線は、シグナル帰属の便宜上、出願人が加えた補助線である。
１Ｈ：Ｄ−グルコースの１位カーボンに結合したプロトン
２Ｈ：Ｄ−グルコースの２位カーボンに結合したプロトン
３Ｈ：Ｄ−グルコースの３位カーボンに結合したプロトン
４Ｈ：Ｄ−グルコースの４位カーボンに結合したプロトン
５Ｈ：Ｄ−グルコースの５位カーボンに結合したプロトン
６Ｈａ及び６Ｈｂ：Ｄ−グルコースの６位カーボンに結合したプロトン
図６及び図７において、
１Ｃ：Ｄ−グルコースの１位カーボン
２Ｃ：Ｄ−グルコースの２位カーボン
３Ｃ：Ｄ−グルコースの３位カーボン
４Ｃ：Ｄ−グルコースの４位カーボン
５Ｃ：Ｄ−グルコースの５位カーボン
６Ｃ：Ｄ−グルコースの６位カーボン
図１０において、
↓：シクロイソマルトテトラオース５含水結晶の粉末Ｘ線回折図における特徴的な回折ピーク
図１９において、
ＯＲＦ９０３８：アグレイア・スピーシーズ  Ｄ１１１０由来シクロイソマルトテトラオース生成酵素遺伝子がコードするアミノ酸配列
ＯＲＦ５３２８：ミクロバクテリウム・トリコセシノリティカム  Ｄ２００６由来シクロイソマルトテトラオース生成酵素遺伝子がコードするアミノ酸配列
図２０において、
ｆ１  ｏｒｉ：ｆ１ファージ複製起点
Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ：アンピシリン耐性遺伝子
ｐＵＣ  ｏｒｉ：ｐＵＣ複製起点
ＰＴ７：Ｔ７プロモーター
ＲＢＳ：リボソーム結合部位
ＡＴＧ：開始コドン
黒矢印：シクロイソマルトテトラオース生成酵素遺伝子
図２１において、
Ｄｅｘ：デキストラン
ＣＩ−４：シクロイソマルトテトラオース
図２２において、
ＣＩ−４：シクロイソマルトテトラオース
Ａ：シクロイソマルトテトラオース誘導体Ａ
Ｂ：シクロイソマルトテトラオース誘導体Ｂ
α−ＣＤ：α−シクロデキストリン
β−ＣＤ：β−シクロデキストリン
図２３において
（Ａ）誘導体Ａ：シクロイソマルトテトラオースのグルコシル誘導体；
（Ｂ）誘導体Ｂ：シクロイソマルトテトラオースのジグルコシル誘導体；
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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