(57)【要約】  アミロイドβ（Ａβ）に関連するペプチドＡＰＰ６６９−７１１を含む、Ｎ末端がＡＰＰ６６９から始まるペプチド（総称として、これをＡＰＰ６６９−ｘと呼ぶ）を認識する抗体を提供する。さらに、その抗体を用いてＡＰＰ６６９−ｘを測定する方法を提供する。分析対象ポリペプチドを高感度で検出及び定量できるサンドイッチ免疫測定法を提供する。ＡＰＰ６６９−ｘペプチドのＮ末端を特異的に認識するＡＰＰ６６９−ｘ Ｎ末端認識モノクローナル抗体。ＡＰＰ６６９−ｘペプチドのＮ末端を特異的に認識するＡＰＰ６６９−ｘ Ｎ末端認識モノクローナル抗体を用いて、試料中のＡＰＰ６６９−ｘと前記ＡＰＰ６６９−ｘ Ｎ末端認識モノクローナル抗体とを反応させて、ＡＰＰ６６９−ｘを測定することを含む、免疫測定法。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＰＰ６６９−ｘペプチドのＮ末端を特異的に認識するＡＰＰ６６９−ｘ Ｎ末端認識モノクローナル抗体。
【請求項２】
ＡＰＰ６６９−ｘペプチドのＮ末端を特異的に認識するＡＰＰ６６９−ｘ Ｎ末端認識モノクローナル抗体を用いて、試料中のＡＰＰ６６９−ｘと前記ＡＰＰ６６９−ｘ Ｎ末端認識モノクローナル抗体とを反応させて、ＡＰＰ６６９−ｘを測定することを含む、免疫測定法。
【請求項３】
前記免疫測定法が、サンドイッチ型免疫測定法、直接ＥＬＩＳＡ、間接ＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫組織学的染色、フローサイトメトリー、免疫沈降、アフィニティークロマトグラフィー、及び免疫細胞染色からなる群から選ばれる、請求項２に記載の免疫測定法。
【請求項４】
前記サンドイッチ型免疫測定法において、前記ＡＰＰ６６９−ｘ Ｎ末端認識モノクローナル抗体（第１の抗体）、及び、ＡＰＰ６６９−ｘの前記第１の抗体が持つ抗原結合部位とは異なる一部、もしくは、ＡＰＰ６６９−ｘの断片のＣ末端を認識可能な抗Ａβ抗体（第２の抗体）を用いる、請求項３に記載の免疫測定法。
【請求項５】
前記第２の抗体が、ＡＰＰ６６９−７１１のＣ末端を認識可能なモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である、請求項３に記載の免疫測定法。
【請求項６】
前記サンドイッチ型免疫測定法が、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、生物発光免疫測定法（ＢＬＩＡ）、イムノＰＣＲ、免疫比濁法（ＴＡＩ）、及びラテックス凝集比濁法（ＬＡ）からなる群から選ばれる、請求項３に記載の免疫測定法。
【請求項７】
前記試料に、ＡＰＰ６６９−ｘに結合可能な抗原親和性物質を添加することを含む、請求項３に記載の免疫測定法。
【請求項８】
前記試料に前記抗原親和性物質を添加し、その後、前記ＡＰＰ６６９−ｘペプチドを前記第１の抗体及び前記第２の抗体と反応させるか、又は、
前記ＡＰＰ６６９−ｘペプチドを前記第１の抗体及び前記第２の抗体と反応させている時に、反応系に前記抗原親和性物質を添加するか、又は、
前記ＡＰＰ６６９−ｘペプチドを前記第１の抗体及び前記第２の抗体のいずれか一方と反応させ、その後、反応系に前記抗原親和性物質を添加し、その後、前記ＡＰＰ６６９−ｘペプチドを前記第１の抗体及び前記第２の抗体のいずれか他方と反応させる、請求項７に記載の免疫測定法。
【請求項９】
前記抗原親和性物質が、抗体、ペプチド、低分子化合物、及び核酸アプタマーからなる群から選ばれる、請求項７に記載の免疫測定法。
【請求項１０】
前記試料が、血液、脳脊髄液、尿、糞便、及び、体分泌液からなる群から選ばれる生体由来試料である、請求項２に記載の免疫測定法。
【請求項１１】
ＡＰＰ６６９−ｘペプチドのＮ末端を特異的に認識するＡＰＰ６６９−ｘ Ｎ末端認識モノクローナル抗体（第１の抗体）、及び
ＡＰＰ６６９−７１１のＣ末端を認識可能なモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体（第２の抗体）
を含む、ＡＰＰ６６９−７１１のサンドイッチ型免疫測定用キット。
【請求項１２】
さらに、ＡＰＰ６６９−ｘに結合可能な抗原親和性物質を含む、請求項１１に記載のＡＰＰ６６９−７１１のサンドイッチ型免疫測定用キット。
【請求項１３】
試料中の標的ポリペプチドを認識可能な抗原結合部位を持つ第１の抗体、及び前記標的ポリペプチドを認識可能な抗原結合部位であって前記第１の抗体が持つ抗原結合部位とは異なる抗原結合部位を持つ第２の抗体を用いたポリペプチドのサンドイッチ型免疫測定法において、試料に標的ポリペプチドに結合可能な抗原親和性物質を添加することを含む、免疫測定法。
【請求項１４】
前記標的ポリペプチドを含む試料に前記抗原親和性物質を添加し、その後、前記標的ポリペプチドを前記第１の抗体及び前記第２の抗体と反応させるか、又は、
前記標的ポリペプチドを前記第１の抗体及び前記第２の抗体と反応させている時に、反応系に前記抗原親和性物質を添加するか、又は、
前記標的ポリペプチドを前記第１の抗体及び前記第２の抗体のいずれか一方と反応させ、その後、反応系に前記抗原親和性物質を添加し、その後、前記標的ポリペプチドを前記第１の抗体及び前記第２の抗体のいずれか他方と反応させる、請求項１３に記載の免疫測定法。
【請求項１５】
前記抗原親和性物質が、抗体、ペプチド、低分子化合物、及び核酸アプタマーからなる群から選ばれる、請求項１３に記載の免疫測定法。
【請求項１６】
前記サンドイッチ型免疫測定法が、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、生物発光免疫測定法（ＢＬＩＡ）、イムノＰＣＲ、免疫比濁法（ＴＡＩ）、及びラテックス凝集比濁法（ＬＡ）からなる群から選ばれる、請求項１３に記載の免疫測定法。
【請求項１７】
前記第１の抗体が、前記標的ポリペプチドのＮ末端認識抗体であり、前記第２の抗体が、前記標的ポリペプチドのＣ末端認識抗体である、請求項１３に記載の免疫測定法。
【請求項１８】
前記抗原親和性物質が、前記標的ポリペプチドのＮ末端付近には作用せず、且つ、前記標的ポリペプチドのＣ末端付近には作用しないものである、請求項１７に記載の免疫測定法。
【請求項１９】
前記抗原親和性物質は、前記標的ポリペプチドのＮ末端から４残基部位からＣ末端から４残基部位までの中間部位に作用するものである、請求項１７に記載の免疫測定法。
【請求項２０】
前記標的ポリペプチドが、Ａβ及びＡβ関連ペプチドからなる群から選ばれる、請求項１３に記載の免疫測定法。
【請求項２１】
前記試料が、血液、脳脊髄液、尿、糞便、及び、体分泌液からなる群から選ばれる生体由来試料である、請求項１３に記載の免疫測定法。
【請求項２２】
標的ポリペプチドを認識可能な抗原結合部位を持つ第１の抗体、
前記標的ポリペプチドを認識可能な抗原結合部位であって前記第１の抗体が持つ抗原結合部位とは異なる抗原結合部位を持つ第２の抗体、及び
前記標的ポリペプチドに結合可能な抗原親和性物質
を含む、ポリペプチドのサンドイッチ型免疫測定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病分野における免疫学的測定方法に関する。より詳細には、本発明は、アミロイドβ（Ａβ）に関連するペプチドＡＰＰ６６９−７１１を含む、Ｎ末端がＡＰＰ６６９から始まるペプチド（総称として、これをＡＰＰ６６９−ｘと呼ぶ）を認識する抗体、及び、その抗体を用いてＡＰＰ６６９−ｘを測定する方法に関する。【０００２】
また、本発明は、微量成分や感染微生物抗原等の臨床検査薬、生化学研究、及び免疫学研究等の分野に属し、特異的な免疫反応を利用したサンドイッチ型免疫測定法にも関する。より詳しくは、本発明は、試料中の微量ポリペプチドを検出及び定量するのに有用なサンドイッチ型免疫測定法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
アルツハイマー病（Alzheimer's disease； ＡＤ）は認知症の主な原因で、認知症全体の５０−６０％を占める。２００１年で２４００万人以上いた世界の認知症患者数は、２０４０年には８１００万人に達すると推定される。アルツハイマー病の発症にはＡβが深く関わっていると考えられている。Ａβは、膜一回貫通タンパク質で７７０残基のアミノ酸から成るアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）がβセクレターゼとγセクレターゼによってタンパク質分解を受けることによって産生される。Ａβの線維化を伴う凝集により老人斑が出現すると、これを引き金にして神経細胞内にタウタンパク質が凝集蓄積し、神経機能不全や神経細胞死が引き起こされる。この結果として、極度の認知能力の低下が起こると考えられている。Ａβは主に４０mer（Ａβ１−４０）と４２mer（Ａβ１−４２）からなることが古くから知られており、脳脊髄液（ＣＳＦ）へ移行することもわかっている。また、血液中へも移行する可能性も示唆されている。さらに近年では、Ａβ１−４０とＡβ１−４２とは長さの異なるＡβ様のペプチドがＣＳＦ中にも存在することが知られている。【０００４】
Ａβについては、最近の研究で、本発明者らによって、Ａβ関連ペプチド（Ａβ様ペプチド）の一つであるＡＰＰ６６９−７１１とＡβ１−４２との比が血液バイオマーカーとして有望であることが報告されている（非特許文献１，特許文献１：国際公開ＷＯ２０１５／１７８３９８）。これらＡβ及びＡβ関連ペプチドは、免疫沈降法（ＩＰ）の後、質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）を行うことにより定量されている。【０００５】
さらに、本発明者らによって、特許文献２：国際公開ＷＯ２０１７／０４７５２９には、Ａβ及びＡβ関連ペプチド（Ａβ様ペプチド）についての３つの比、Ａβ１−３９／Ａβ１−４２、Ａβ１−４０／Ａβ１−４２、及びＡＰＰ６６９−７１１／Ａβ１−４２からなる群より選ばれる２以上の比を数学的手法で組み合わせた数値が血液バイオマーカーとして有望であることが開示されている。これらＡβ及びＡβ関連ペプチドは、免疫沈降法（ＩＰ）の後、質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）を行うことにより定量されている。【０００６】
このように、本発明者らによって、質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）を用いて、Ａβ関連ペプチドの一つであるＡＰＰ６６９−７１１とＡβ１−４２との比が血液バイオマーカー候補として有望であることが発見された。そして、その比ＡＰＰ６６９−７１１／Ａβ１−４２と、Ａβ１−４０／Ａβ１−４２の比とを組み合わせたcomposite biomarkerは脳内アミロイド蓄積を高精度に推定できることを日本とオーストラリアの多検体で示し、信頼性と汎用性のあるバイオマーカーであることが、本発明者らによって報告されている（非特許文献２）。【０００７】
ＡＰＰ６６９−７１１を含むＡβ関連ペプチドなどのバイオマーカーの分析技術として、質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）は有用である。一方、その他の分析技術として、サンドイッチＥＬＩＳＡは、臨床検査法として広く一般的に使用されている測定法であり、かつ安価であることから、有用な分析技術となり得る。【０００８】
現在、血漿中のＡβ１−４０やＡβ１−４２を分析可能なＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔは、各メーカー（和光純薬、ＩＢＬ等）から市販されている。【０００９】
特許文献３：特開２００５−１７０９５１号公報では、アミロイドβのＮ端部（Ａβ１−１６）を認識するモノクローナル抗体BAN-52aおよびBAN-50aや、アミロイドβのＣ端部を特異的に認識するモノクローナル抗体BA-27a、BS-85およびBC-05aが開示されており、Ａβ１−４０やＡβ１−４２に特異的なサンドイッチＥＩＡが開示されている。【００１０】
特許文献４：特開２０１４−２０８６７８号公報では、Ａβ１１−ｘを特異的に認識する抗体が開示され、Ａβ１１−４０に対するサンドイッチＥＬＩＳＡや、Ａβ１１−ｘに対するウェスタンブロットが開示されている。【００１１】
しかし、ＡＰＰ６６９−ｘを免疫学的測定方法で分析する手段は知られていない。【００１２】
免疫測定法とは、特異的な抗原抗体反応を利用して試料中の分析対象物質の濃度を測定する方法であり、微量成分を特異的に、かつ、精度よく測定できることから、臨床検査や生化学研究などで広く利用されている。【００１３】
免疫測定法には、標識物質として酵素を利用する酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射性同位元素を利用する放射免疫測定法（ＲＩＡ）、化学発光物質を利用する化学発光免疫測定法（ＣＩＡ）、蛍光発光物質を利用する蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、金属錯体を利用する電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、ルシフェラーゼなどの生物発光物質を利用する生物発光免疫測定法（ＢＬＩＡ）、抗体に標識された核酸をＰＣＲで増幅させて検出するイムノＰＣＲ、免疫複合体形成により発生する濁度を検出する免疫比濁法（ＴＡＩ）、免疫複合体形成により凝集するラテックスを検出するラテックス凝集比濁法（ＬＡ）、セルロース膜上で反応させるイムノクロマト法などがある。【００１４】
それら免疫測定法の中で、分析対象物質の異なるエピトープを認識する２つの抗体を用いて分析対象物質を挟み込む方法をサンドイッチ法と呼ぶ。例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）とはＥＩＡの一つで、９６ウェルプレート面に固相された捕捉抗体で分析対象物質を捕捉し、その分析対象物質にペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼなどの酵素で標識された検出抗体を反応させ、標識酵素の基質の発色を利用して分析対象物質の濃度を決定する方法である（例えば、特許文献５：特開平８−２２００９８号公報）。ＥＣＬＩＡにおいても、分析対象物質に対して、ビオチン化された抗体と、電気化学的変化で発光するルテニウム（Ｒｕ）錯体を標識した抗体とを反応させるサンドイッチ法を利用している（例えば、特許文献６：特表２０１４−５０９７３５号公報）。このように、免疫測定法ではサンドイッチ法が広く利用されている。【００１５】
特定のペプチド断片を特異的に定量する方法としてもサンドイッチ法は利用され、分析対象ペプチド断片をＮ末端認識抗体とＣ末端認識抗体で挟み込む方法でペプチド断片を特異的に測定している。例えば、アミロイド前駆タンパク質（Amyloid precursor protein； ＡＰＰ）からプロテアーゼによって切断されて生成されるＡβについては、異なる断片のペプチドが生体内に存在している。それらの中でＡβ１−４２は、アルツハイマー病の脳脊髄液（ＣＳＦ）バイオマーカーとして、ＥＬＩＳＡなどの免疫測定法で定量されている（非特許文献３）。【００１６】
特許文献７：特開２００４−２３９８８５号公報には、免疫測定法の測定感度を改善する方法の一つとして、試料中から抽出しにくいタンパク質に対して、免疫測定法の前に高濃度のイオン性界面活性剤で試料を抽出する方法が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２０１５／１７８３９８
【特許文献２】国際公開ＷＯ２０１７／０４７５２９
【特許文献３】特開２００５−１７０９５１号公報
【特許文献４】特開２０１４−２０８６７８号公報
【特許文献５】特開平８−２２００９８号公報
【特許文献６】特表２０１４−５０９７３５号公報
【特許文献７】特開２００４−２３９８８５号公報
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Kaneko N, Nakamura A, Washimi Y, Kato T, Sakurai T, Arahata Y, Bundo M, Takeda A, Niida S, Ito K, Toba K, Tanaka K, Yanagisawa K. : Novel plasma biomarker surrogating cerebral amyloid deposition. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2014; 90(9): 353-64.
【非特許文献２】Nakamura A, Kaneko N, Villemagne VL, Kato T, Doecke J, Dore V, Fowler C, Li QX, Martins R, Rowe C, Tomita T, Matsuzaki K, Ishii K, Ishii K, Arahata Y, Iwamoto S, Ito K, Tanaka K, Masters CL, Yanagisawa K. : High performance plasma amyloid-β biomarkers for Alzheimer's disease. Nature. 2018; 554 (7691): 249-254.
【非特許文献３】Blennow K. :Cerebrospinal Fluid Protein Biomarkers for Alzheimer's Disease. The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics 2004 Apr;1(2):213-25.
【非特許文献４】Murakami K, Masuda Y, Shirasawa T, Shimizu T, Irie K. : The turn formation at positions 22 and 23 in the 42-mer amyloid beta peptide: the emerging role in the pathogenesis of Alzheimer's disease. Geriatr Gerontol Int. 2010 Jul;10 Suppl 1:S169-79.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
ペプチド特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡを構築するためには、Ｎ末端とＣ末端を特異的に認識する抗体が必要となる。ＡＰＰ６６９−７１１のＣ末端はＡβ１−４０（すなわち、ＡＰＰ６７２−７１１）のＣ末端と同じであり、ＡＰＰ６６９−７１１のＣ末端を特異的に認識する抗体は存在する。しかし、ＡＰＰ６６９−７１１のＮ末端を特異的に認識する抗体は存在しない。【００２０】
ＡＰＰ６６９−ｘのＮ末端を認識する抗体が存在しないため、ＡＰＰ６６９−７１１を特異的に定量するサンドイッチＥＬＩＳＡやＡＰＰ６６９−ｘを免疫学的測定方法で分析する手段がない。【００２１】
そこで、本発明の目的は、アミロイドβ（Ａβ）に関連するペプチドＡＰＰ６６９−７１１を含む、Ｎ末端がＡＰＰ６６９から始まるペプチド（総称として、これをＡＰＰ６６９−ｘと呼ぶ）を認識する抗体を提供することにある。さらに、本発明の目的は、その抗体を用いてＡＰＰ６６９−ｘを測定する方法を提供することにある。【００２２】
試料中の分析対象ポリペプチドをサンドイッチ免疫測定法で特異的に定量するためには、分析対象ポリペプチドの２箇所の異なる部位（エピトープ）に対して、それぞれを認識する２つの抗体を同時に分析対象ペプチドへ結合させる、もしくは、どちらか一方の抗体を結合させた後に、もう一方の抗体を結合させる。つまり、分析対象ポリペプチドの２箇所の異なる部位（エピトープ）に２つの抗体が同時に結合し、分析対象ポリペプチドが２つの抗体によりサンドイッチされた状態とする必要がある。【００２３】
ポリペプチドの一次構造としては２つの抗体が各々結合すべき２つの異なる認識部位（エピトープ）が互いに離れていても、ポリペプチドのコンフォメーションにより空間距離的に前記２つのエピトープが近い場合がある。分析対象ポリペプチドの前記２つのエピトープが空間距離的に近い場合には、前記２つの抗体が同時に結合することが難しくなり、サンドイッチ免疫測定法の感度が低下する要因となる。例えば、ペプチド断片であるＡβを測定するサンドイッチ免疫測定法では、Ｎ認識抗体とＣ末認識抗体とでペプチド断片を挟み込むが、一次構造としては２つの抗体の認識部位（エピトープ）が互いに離れていても、空間距離的には２つのエピトープが近い（非特許文献４）。そのため、サンドイッチ免疫測定法の感度低下を引き起こす可能性がある。【００２４】
本発明の目的は、分析対象ポリペプチドを高感度で検出及び定量できるサンドイッチ免疫測定法を提供することにある。とりわけ本発明の目的は、分析対象Ａβ及びＡβ関連ペプチドを高感度で検出及び定量できるサンドイッチ免疫測定法を提供することにある。さらに、本発明の目的は、ポリペプチドのサンドイッチ型免疫測定用キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明者は、鋭意検討の結果、ＡＰＰ６６９−ｘのＮ末端を認識する抗体を作成するために、ＫＬＨ（keyhole limpet hemocyanin）結合合成ペプチドVKMCをマウスへ免疫し、細胞融合とスクリーニングにより、ＡＰＰ６６９−ｘのＮ末端を認識する抗体を産生するハイブリドーマを取得した。この抗体を用いてＡＰＰ６６９−ｘを特異的に定量するサンドイッチＥＬＩＳＡ等の免疫測定法を構築した。これにより、ＡＰＰ６６９−ｘのＥＬＩＳＡキットを構成することもできる。【００２６】
本発明は、以下の発明を含む。
（１）  ＡＰＰ６６９−ｘペプチドのＮ末端を特異的に認識するＡＰＰ６６９−ｘ Ｎ末端認識モノクローナル抗体。【００２７】
（２）  ＡＰＰ６６９−ｘペプチドのＮ末端を特異的に認識するＡＰＰ６６９−ｘ Ｎ末端認識モノクローナル抗体を用いて、試料中のＡＰＰ６６９−ｘと前記ＡＰＰ６６９−ｘ Ｎ末端認識モノクローナル抗体とを反応させて、ＡＰＰ６６９−ｘを測定することを含む、免疫測定法。【００２８】
（３）  前記免疫測定法が、サンドイッチ型免疫測定法、直接ＥＬＩＳＡ、間接ＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫組織学的染色、フローサイトメトリー、免疫沈降、アフィニティークロマトグラフィー、及び免疫細胞染色からなる群から選ばれる、上記（２）に記載の免疫測定法。【００２９】
（４）  前記サンドイッチ型免疫測定法において、前記ＡＰＰ６６９−ｘ Ｎ末端認識モノクローナル抗体（第１の抗体）、及び、ＡＰＰ６６９−ｘの前記第１の抗体が持つ抗原結合部位とは異なる一部、もしくは、ＡＰＰ６６９−ｘの断片のＣ末端を認識可能な抗Ａβ抗体（第２の抗体）を用いる、上記（３）に記載の免疫測定法。【００３０】
（５）  前記第２の抗体が、ＡＰＰ６６９−７１１のＣ末端を認識可能なモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である、上記（３）又は（４）に記載の免疫測定法。【００３１】
（６）  前記サンドイッチ型免疫測定法が、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、生物発光免疫測定法（ＢＬＩＡ）、イムノＰＣＲ、免疫比濁法（ＴＡＩ）、及びラテックス凝集比濁法（ＬＡ）からなる群から選ばれる、上記（３）〜（５）のうちのいずれかに記載の免疫測定法。【００３２】
（７）  前記試料に、ＡＰＰ６６９−ｘに結合可能な抗原親和性物質を添加することを含む、上記（３）〜（６）のうちのいずれかに記載の免疫測定法。【００３３】
（８）  前記試料に前記抗原親和性物質を添加し、その後、前記ＡＰＰ６６９−ｘペプチドを前記第１の抗体及び前記第２の抗体と反応させるか、又は、
前記ＡＰＰ６６９−ｘペプチドを前記第１の抗体及び前記第２の抗体と反応させている時に、反応系に前記抗原親和性物質を添加するか、又は、
前記ＡＰＰ６６９−ｘペプチドを前記第１の抗体及び前記第２の抗体のいずれか一方と反応させ、その後、反応系に前記抗原親和性物質を添加し、その後、前記ＡＰＰ６６９−ｘペプチドを前記第１の抗体及び前記第２の抗体のいずれか他方と反応させる、上記（７）に記載の免疫測定法。【００３４】
（９）  前記抗原親和性物質が、抗体、ペプチド、低分子化合物、及び核酸アプタマーからなる群から選ばれる、上記（７）又は（８）に記載の免疫測定法。【００３５】
（１０）  前記試料が、血液、脳脊髄液、尿、糞便、及び、体分泌液からなる群から選ばれる生体由来試料である、上記（２）〜（９）のうちのいずれかに記載の免疫測定法。【００３６】
（１１）  ＡＰＰ６６９−ｘペプチドのＮ末端を特異的に認識するＡＰＰ６６９−ｘ Ｎ末端認識モノクローナル抗体（第１の抗体）、及び
ＡＰＰ６６９−７１１のＣ末端を認識可能なモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体（第２の抗体）
を含む、ＡＰＰ６６９−７１１のサンドイッチ型免疫測定用キット。【００３７】
（１２）  さらに、ＡＰＰ６６９−ｘに結合可能な抗原親和性物質を含む、上記（１１）に記載のＡＰＰ６６９−７１１のサンドイッチ型免疫測定用キット。【００３８】
また、本発明者は、鋭意検討の結果、分析対象ポリペプチドのコンフォメーションを変化させ、サンドイッチ免疫測定法で使用される２つの抗体が各々結合すべき２つのエピトープを空間距離的に互いに遠ざける処置を施すことにより、具体的には、分析対象ポリペプチドに親和性のある物質（抗原親和性物質）を該分析対象ポリペプチドに結合させてコンフォメーションを変化させることにより、分析対象ポリペプチドを高感度で検出及び定量できるサンドイッチ免疫測定法が得られることを見出した。それにより、本発明を完成するに至った。【００３９】
本明細書において、ポリペプチドには、ペプチド、及びタンパク質が含まれる。前記タンパク質には、糖タンパク、リン酸化タンパク質などの翻訳後修飾されたタンパク質も含まれる。【００４０】
本明細書において、アミロイド・βペプチドの略称として「Ａβ」を用いる。すなわち、「Ａβ」とは、Ａβ１−４０、及びＡβ１−４２を含んでいる。アミロイド前駆タンパク質（Amyloid precursor protein；ＡＰＰ）が切断されることにより生じる前記Ａβ以外のペプチドをＡβ関連ペプチド（又は、Ａβ様ペプチド）と称することがある。アミロイド前駆タンパク質（Amyloid precursor protein；ＡＰＰ）が切断されることにより生じるＡβ及びＡβ関連ペプチド（又は、Ａβ様ペプチド）を、「ＡＰＰ派生型ペプチド」と称することがある。【００４１】
本発明は、以下の発明を含む。
（Ｂ−１）  試料中の標的ポリペプチドを認識可能な抗原結合部位を持つ第１の抗体、及び前記標的ポリペプチドを認識可能な抗原結合部位であって前記第１の抗体が持つ抗原結合部位とは異なる抗原結合部位を持つ第２の抗体を用いたポリペプチドのサンドイッチ型免疫測定法において、試料に標的ポリペプチドに結合可能な抗原親和性物質を添加することを含む、免疫測定法。【００４２】
（Ｂ−２）  前記標的ポリペプチドを含む試料に前記抗原親和性物質を添加し、その後、前記標的ポリペプチドを前記第１の抗体及び前記第２の抗体と反応させるか、又は、
前記標的ポリペプチドを前記第１の抗体及び前記第２の抗体と反応させている時に、反応系に前記抗原親和性物質を添加するか、又は、
前記標的ポリペプチドを前記第１の抗体及び前記第２の抗体のいずれか一方と反応させ、その後、反応系に前記抗原親和性物質を添加し、その後、前記標的ポリペプチドを前記第１の抗体及び前記第２の抗体のいずれか他方と反応させる、上記（Ｂ−１）に記載の免疫測定法。【００４３】
（Ｂ−３）  前記抗原親和性物質が、抗体、ペプチド、低分子化合物、及び核酸アプタマーからなる群から選ばれる、上記（Ｂ−１）又は（Ｂ−２）に記載の免疫測定法。【００４４】
（Ｂ−４）  前記サンドイッチ型免疫測定法が、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、生物発光免疫測定法（ＢＬＩＡ）、イムノＰＣＲ、免疫比濁法（ＴＡＩ）、及びラテックス凝集比濁法（ＬＡ）からなる群から選ばれる、上記（Ｂ−１）〜（Ｂ−３）のうちのいずれかに記載の免疫測定法。【００４５】
（Ｂ−５）  前記第１の抗体が、前記標的ポリペプチドのＮ末端認識抗体であり、前記第２の抗体が、前記標的ポリペプチドのＣ末端認識抗体である、上記（Ｂ−１）〜（Ｂ−４）のうちのいずれかに記載の免疫測定法。【００４６】
（Ｂ−６）  前記抗原親和性物質が、前記標的ポリペプチドのＮ末端付近には作用せず、且つ、前記標的ポリペプチドのＣ末端付近には作用しないものである、上記（Ｂ−５）に記載の免疫測定法。【００４７】
（Ｂ−７）  前記抗原親和性物質は、前記標的ポリペプチドのＮ末端から４残基部位からＣ末端から４残基部位までの中間部位に作用するものである、上記（Ｂ−５）又は（Ｂ−６）に記載の免疫測定法。【００４８】
（Ｂ−８）  前記標的ポリペプチドが、Ａβ及びＡβ関連ペプチドからなる群から選ばれる、上記（Ｂ−１）〜（Ｂ−７）のうちのいずれかに記載の免疫測定法。【００４９】
（Ｂ−９）  前記試料が、血液、脳脊髄液、尿、糞便、及び、体分泌液からなる群から選ばれる生体由来試料である、上記（Ｂ−１）〜（Ｂ−８）のうちのいずれかに記載の免疫測定法。【００５０】
（Ｂ−１０）  標的ポリペプチドを認識可能な抗原結合部位を持つ第１の抗体、
前記標的ポリペプチドを認識可能な抗原結合部位であって前記第１の抗体が持つ抗原結合部位とは異なる抗原結合部位を持つ第２の抗体、及び
前記標的ポリペプチドに結合可能な抗原親和性物質
を含む、ポリペプチドのサンドイッチ型免疫測定用キット。
【発明の効果】
【００５１】
本発明によれば、ＡＰＰ６６９−ｘのＮ末端を特異的に認識する抗体が提供される。該ＡＰＰ６６９−ｘのＮ末端を特異的に認識する抗体を用いて、ＡＰＰ６６９−ｘのサンドイッチ型免疫測定法、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫組織学的染色、フローサイトメトリー、免疫沈降、アフィニティークロマトグラフィー、免疫細胞染色などの免疫学的測定方法が提供される。【００５２】
本発明によれば、好ましい態様として、ＡＰＰ６６９−７１１のサンドイッチＥＬＩＳＡ法が提供される。また、ＡＰＰ６６９−７１１のサンドイッチＥＬＩＳＡ法を実施するための試薬キットが提供される。ＡＰＰ６６９−７１１を含むＡβ関連ペプチドなどのバイオマーカーの分析技術として、質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）は有用であるが、サンドイッチＥＬＩＳＡは、臨床検査法として広く一般的に使用されている測定法であり、かつ安価であることから、さらに有用な分析技術と言える。【００５３】
本発明のサンドイッチ型免疫測定法において、試料に標的ポリペプチドに結合可能な抗原親和性物質を添加する。このことにより、標的ポリペプチドのコンフォメーションが変化させられ、サンドイッチ免疫測定法で使用される２つの抗体が各々結合すべき２つのエピトープが空間距離的に互いに遠ざけられる。そのため、２つの部位での抗原抗体反応がうまく行われ、標的ポリペプチドを高感度で検出及び定量できる。【００５４】
特定のポリペプチドＡβ（Ａβ１−４０、及びＡβ１−４２）や、Ａβ関連ペプチド（例えば、Ａβ１−３９、ＡＰＰ６６９−７１１）は、生体内に存在しており、アルツハイマー病のバイオマーカーとして注目されていた。これらＡβやＡβ関連ペプチド、特にＡβ関連ペプチドについて、高感度で検出及び定量できるサンドイッチ免疫測定法が望まれている。本発明によれば、これらＡβやＡβ関連ペプチド、特にＡβ関連ペプチドについて、高感度で検出及び定量できるサンドイッチ免疫測定法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は、実施例１−２において、ＡＰＰ６６９−ｘ Ｎ末端特異的抗体クローン34-6Eを用いた直接ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。横軸は、ペプチド濃度（ｐｍｏｌ／ｍＬ）を表し、縦軸は、マイクロプレートリーダーで測定された主波長４５０ｎｍ／副波長６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を表す。
【図２】図２は、実施例１−２において、ＡＰＰ６６９−ｘ Ｎ末端特異的抗体クローン24-6Gを用いた直接ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。横軸は、ペプチド濃度（ｐｍｏｌ／ｍＬ）を表し、縦軸は、マイクロプレートリーダーで測定された主波長４５０ｎｍ／副波長６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を表す。
【図３】図３は、実施例１−２において、ＡＰＰ６６９−ｘ Ｎ末端特異的抗体クローン20-1Aを用いた直接ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。横軸は、ペプチド濃度（ｐｍｏｌ／ｍＬ）を表し、縦軸は、マイクロプレートリーダーで測定された主波長４５０ｎｍ／副波長６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を表す。
【図４】図４は、実施例２−１において、３種類のＡＰＰ６６９−ｘ Ｎ末端特異的抗体クローンを用いたＡＰＰ６６９−７１１ サンドイッチＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。横軸は、ＡＰＰ６６９−７１１濃度（ｐｍｏｌ／ｍＬ）を表し、縦軸は、マイクロプレートリーダーで測定された主波長４５０ｎｍ／副波長６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を表す。
【図５】図５は、実施例２−２において、ＡＰＰ６６９−ｘ Ｎ末端特異的抗体クローン34-6Eを用いた場合の、ＡＰＰ６６９−７１１ サンドイッチＥＬＩＳＡの特異性を示すグラフである。横軸は、ペプチド濃度（ｐｍｏｌ／ｍＬ）を表し、縦軸は、マイクロプレートリーダーで測定された主波長４５０ｎｍ／副波長６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を表す。
【図６】図６は、実施例２−４において、ＡＰＰ６６９−７１１ サンドイッチＥＬＩＳＡによるヒト血漿測定の結果を示すグラフである。横軸は、各血漿サンプルを表し、縦軸は、ＡＰＰ６６９−７１１濃度（ｆｍｏｌ／ｍＬ）を表す。
【図７】図７は、実施例Ｂ１において、抗Aβ抗体4G8添加によるAPP669-711 ELISAの検量線を示すグラフである。横軸はAPP669-711の濃度（fmol/mL）、縦軸は４５０ｎｍ／６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を示す。抗Aβ抗体4G8の濃度毎に検量線が示されている。
【図８】図８は、実施例Ｂ１において、抗Aβ抗体4G8添加によるAPP669-711 ELISAの反応性を示すグラフである。横軸は抗Aβ抗体4G8の濃度(ng/mL)、縦軸は４５０ｎｍ／６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を示す。APP669-711の濃度毎に点を線で繋いでいる。
【図９】図９は、実施例Ｂ１において、抗Aβ抗体4G8添加時におけるAβ1-40に対するAPP669-711 ELISAの反応性を示すグラフである。横軸はAβ1-40の濃度（fmol/mL）、縦軸は４５０ｎｍ／６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を示す。
【図１０】図１０は、実施例Ｂ２において、Ｎ末端認識抗体３クローンを用いたAPP669-711 ELISAにおける抗Aβ抗体4G8添加効果を示すグラフである。横軸は抗Aβ抗体4G8の濃度(ng/mL)、縦軸は４５０ｎｍ／６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を示す。Ｎ末端認識抗体のクローン毎に点を線で繋いでいる。
【図１１】図１１は、実施例Ｂ２において、抗Aβ抗体4G8添加時におけるAβ1-40に対するAPP669-711 ELISAの反応性を示すグラフである。Ｎ末端認識抗体として、３クローンを各々用いた。横軸はAβ1-40の濃度（fmol/mL）、縦軸は４５０ｎｍ／６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を示す。
【図１２】図１２は、実施例Ｂ３において、APP669-711 ELISAにおける抗Aβ抗体の４クローンの添加効果を示すグラフである。横軸は抗Aβ抗体の添加濃度(ng/mL)、縦軸は４５０ｎｍ／６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を示す。抗Aβ抗体のクローン毎に点を線で繋いでいる。
【図１３】図１３は、実施例Ｂ３において、抗Aβ抗体添加時におけるAβ1-40に対するAPP669-711 ELISAの反応性を示すグラフである。抗Aβ抗体は４クローンを用いた。横軸はAβ1-40の濃度（fmol/mL）、縦軸は４５０ｎｍ／６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を示す。
【図１４】図１４は、実施例Ｂ４において、Aβ1-40 ELISAにおける抗Aβ抗体4G8及び6E10の添加効果を示すグラフである。縦軸は４５０ｎｍ／６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を示す。サンプルとして、ELISA Kit内に含まれているstandardと、AnaSpec社のAβ1-40を用いた。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
［１．ＡＰＰ６６９−ｘ Ｎ末端認識モノクローナル抗体］
本発明のＡＰＰ６６９−ｘ Ｎ末端認識モノクローナル抗体は、ＡＰＰ６６９−ｘペプチドのＮ末端を特異的に認識するものである。
【００５７】
ＡＰＰ６６９−ｘのＮ末端を認識する抗体を作成するために、ＫＬＨ結合合成ペプチドVKMC（配列番号５）をマウスへ免疫し、細胞融合とスクリーニングにより、ＡＰＰ６６９−ｘのＮ末端を認識する抗体を産生するハイブリドーマを取得した。より詳細な抗体作成は、実施例で述べられる。
【００５８】
この抗体は、ＡＰＰ６６９−ｘのＮ末端を認識する抗体であるので、ＡＰＰ６６９−７１１（配列番号３）を含むＡＰＰ６６９−ｘに属する種々のペプチドのＮ末端を特異的に認識することができる。そのため、このＡＰＰ６６９−ｘ Ｎ末端認識モノクローナル抗体を用いて、試料中のＡＰＰ６６９−ｘと前記ＡＰＰ６６９−ｘ Ｎ末端認識モノクローナル抗体とを免疫反応させることができる。
【００５９】
［２．標的ＡＰＰ６６９−ｘペプチド］
アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）は、膜一回貫通タンパク質で７７０残基のアミノ酸から成る。アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）は、βセクレターゼとγセクレターゼによってタンパク質分解を受け、タンパク質分解によってアミロイド・ベータペプチド（Ａβ）が産生される。ＡＰＰ６７２−７１１とＡβ１−４０とは同じペプチドを表す（配列番号１）。ＡＰＰ６７２−７１３とＡβ１−４２とは同じペプチドを表す（配列番号２）。ＡＰＰ６６９−７１１（配列番号３）は、ＡＰＰ６６９−ｘに属するものであり、ここで、ｘは、下限については６６９よりも大きく、例えば６７７よりも大きく、また、上限については、特に限定されることはなく、７７０またはそれよりも小さい。しかしながら、本発明の趣旨、すなわち、ＡＰＰ６６９−ｘ Ｎ末端認識モノクローナル抗体が、ＡＰＰ６６９−ｘペプチドのＮ末端を特異的に認識することができ、免疫反応させることができるということからすれば、ｘの上限値は特に限定されることはない。例示すれば、ＡＰＰ６６９−ｘペプチドには、ＡＰＰ６６９−７１１（配列番号３）、ＡＰＰ６６９−７０９、ＡＰＰ６６９−７１０、ＡＰＰ６６９−７１３などが挙げられる。
【００６０】
ＡＰＰ６７２−７１１（Ａβ１−４０）（配列番号１）：
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV
ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）（配列番号２）：
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA
ＡＰＰ６６９−７１１（配列番号３）：
VKMDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV
【００６１】
［３．免疫測定法］
本発明の免疫測定法は、ＡＰＰ６６９−ｘペプチドのＮ末端を特異的に認識するＡＰＰ６６９−ｘ Ｎ末端認識モノクローナル抗体を用いて、試料中のＡＰＰ６６９−ｘと前記ＡＰＰ６６９−ｘ Ｎ末端認識モノクローナル抗体とを反応させて、ＡＰＰ６６９−ｘを測定することを含む。
【００６２】
前記免疫測定法としては、サンドイッチ型免疫測定法、直接ＥＬＩＳＡ、間接ＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫組織学的染色、フローサイトメトリー、免疫沈降、アフィニティークロマトグラフィー、及び免疫細胞染色などの種々の免疫測定法が挙げられる。通常の方法により、本発明のＡＰＰ６６９−ｘ Ｎ末端認識モノクローナル抗体を用いて、免疫測定を行うことができる。
【００６３】
前記サンドイッチ型免疫測定法においては、前記ＡＰＰ６６９−ｘ Ｎ末端認識モノクローナル抗体（第１の抗体）、及び、ＡＰＰ６６９−ｘの前記第１の抗体が持つ抗原結合部位とは異なる一部、もしくは、ＡＰＰ６６９−ｘの断片のＣ末端を認識可能な抗Ａβ抗体（第２の抗体）を用いることができる。
【００６４】
前記第２の抗体としては、ＡＰＰ６６９−ｘの断片のＣ末端を認識可能な抗Ａβ抗体をを用いるとよい。測定対象ペプチドがＡＰＰ６６９−７１１の場合には、ＡＰＰ６６９−７１１のＣ末端を認識可能なモノクローナル抗体を用いる。Ａβ１−４０のＣ末端は、ＡＰＰ６６９−７１１のＣ末端と同じであり、このようなＣ末端を認識可能な抗体は市販されている。
【００６５】
前記サンドイッチ型免疫測定法としては、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、生物発光免疫測定法（ＢＬＩＡ）、イムノＰＣＲ、免疫比濁法（ＴＡＩ）、及びラテックス凝集比濁法（ＬＡ）等が挙げられる。
【００６６】
前記サンドイッチ型免疫測定法において、通常の手法に従い、前記ＡＰＰ６６９−ｘペプチドを含む試料に、前記第１の抗体及び前記第２の抗体を逐次又は同時に添加して、免疫反応させるとよい。
【００６７】
さらに、本発明において、前記ＡＰＰ６６９−ｘペプチドを含む試料に、ＡＰＰ６６９−ｘに結合可能な抗原親和性物質を添加することを行ってもよい。
【００６８】
この場合、前記試料に前記抗原親和性物質を添加し、その後、前記ＡＰＰ６６９−ｘペプチドを前記第１の抗体及び前記第２の抗体と反応させるか、又は、
前記ＡＰＰ６６９−ｘペプチドを前記第１の抗体及び前記第２の抗体と反応させている時に、反応系に前記抗原親和性物質を添加するか、又は、
前記ＡＰＰ６６９−ｘペプチドを前記第１の抗体及び前記第２の抗体のいずれか一方と反応させ、その後、反応系に前記抗原親和性物質を添加し、その後、前記ＡＰＰ６６９−ｘペプチドを前記第１の抗体及び前記第２の抗体のいずれか他方と反応させることができる。
【００６９】
試料に標的ポリペプチドに結合可能な抗原親和性物質を添加することにより、標的ポリペプチドのコンフォメーションが変化させられ、サンドイッチ免疫測定法で使用される２つの抗体が各々結合すべき２つのエピトープが空間距離的に互いに遠ざけられる。そのため、２つの部位での抗原抗体反応がうまく行われ、標的ポリペプチドをより高感度で検出及び定量できる。
【００７０】
前記抗原親和性物質は、標的ポリペプチドに親和性を有し結合可能な物質であればよく、抗体、ペプチド、低分子化合物、及び核酸アプタマー等が挙げられる。ここでの結合とは、静電相互作用、ファンデルワールス力、水素結合、疎水性相互作用、双極子相互作用、分散力などの分子間相互作用による結合が含まれる。標的ポリペプチドのコンフォメーションが変化させられ、サンドイッチ免疫測定法で使用される２つの抗体が各々結合すべき２つのエピトープが空間距離的に互いに遠ざけられるものであればよい。
【００７１】
前記抗原親和性物質としての抗体としては、前記第１の抗体及び前記第２の抗体が持つ抗原結合部位とは異なる抗原結合部位を持つ抗体を用いるとよい。
前記抗原親和性物質としてのペプチドとしては、２〜１２アミノ酸残基からなるペプチドを用いるとよく、例えば、Ａβに結合するペプチドであれば、iAβ5（５アミノ酸）、D3（１２アミノ酸）、NH2-D-Trp-Aib-OH（２アミノ酸）等が例示される。
前記抗原親和性物質としての低分子化合物としては、標的ポリペプチドに結合可能な低分子化合物を用いるとよく、例えば、創薬で使われているような、あるタンパク質に結合する低分子化合物が挙げられる。Ａβに結合する低分子化合物であれば、Scyllo-inositol等が例示される。各種の阻害剤（例えば、Stemolecule TM 低分子化合物の各種）も挙げられる。
前記抗原親和性物質としての核酸アプタマーとしては、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー等が挙げられる。
【００７２】
前記抗原親和性物質の添加量は、試料中の標的ポリペプチドの種類や量、及び抗原親和性物質の種類にもより、特に限定されることはなく、標的ポリペプチドに結合して該標的ポリペプチドのコンフォメーションを変化させられる量とすればよい。例えば、前記抗原親和性物質の添加量は、標的ポリペプチドを含んでいる試料中の濃度として、０．１ｎｇ／ｍＬ〜１０００００ｎｇ／ｍＬ程度、好ましくは０．１ｎｇ／ｍＬ〜１００００ｎｇ／ｍＬ程度、より好ましくは０．１ｎｇ／ｍＬ〜３０００ｎｇ／ｍＬ程度とするとよい。
【００７３】
前述したように、前記サンドイッチ型免疫測定法においては、前記ＡＰＰ６６９−ｘ Ｎ末端認識モノクローナル抗体（第１の抗体）、及び、ＡＰＰ６６９−ｘの前記第１の抗体が持つ抗原結合部位とは異なる一部、もしくは、ＡＰＰ６６９−ｘの断片のＣ末端を認識可能な抗Ａβ抗体（第２の抗体）を用いることができる。
【００７４】
この場合には、前記抗原親和性物質が、標的ポリペプチドのＮ末端付近には作用せず、且つ、前記標的ポリペプチドのＣ末端付近には作用しないものが好ましい。標的ポリペプチドに対して、前記抗原親和性物質と前記第１の抗体との競合や阻害が起こることは好ましくないし、前記抗原親和性物質と前記第２の抗体との競合や阻害が起こることも好ましくない。
【００７５】
より具体的には、前記抗原親和性物質は、前記標的ポリペプチドのＮ末端から４残基部位からＣ末端から４残基部位までの中間部位に作用するものであることが好ましい。さらに、前記抗原親和性物質は、前記標的ポリペプチドのＮ末端から６残基部位からＣ末端から６残基部位までの中間部位に作用するものであることが好ましい。
【００７６】
標識物質として酵素を利用するサンドイッチＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）の場合、前記第１の抗体としての標的ポリペプチドのＮ末端認識抗体を固相化抗体（捕捉抗体）として用いて、前記第２の抗体としての標的ポリペプチドのＣ末端認識抗体を検出抗体（標識抗体）として用いるとよい。
【００７７】
本発明のサンドイッチ型免疫測定法は、標識物質として酵素を利用するサンドイッチＥＬＩＳＡの他に、放射性同位元素を利用する放射免疫測定法（ＲＩＡ）、化学発光物質を利用する化学発光免疫測定法（ＣＩＡ）、蛍光発光物質を利用する蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、金属錯体を利用する電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、ルシフェラーゼなどの生物発光物質を利用する生物発光免疫測定法（ＢＬＩＡ）、抗体に標識された核酸をＰＣＲで増幅させて検出するイムノＰＣＲ、免疫複合体形成により発生する濁度を検出する免疫比濁法（ＴＡＩ）、免疫複合体形成により凝集するラテックスを検出するラテックス凝集比濁法（ＬＡ）、セルロース膜上で反応させるイムノクロマト法などにも適用できる。
【００７８】
本発明のサンドイッチ型免疫測定法の基本的操作は、試料に抗原親和性物質を添加する場合も、公知の操作に従って行なうことができる。
【００７９】
本発明において、標的ＡＰＰ６６９−ｘペプチドは生体試料に含まれる。生体試料には、血液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、尿、体分泌液、唾液、及び痰などの体液；  及び糞便が含まれる。血液試料には、全血、血漿及び血清などが含まれる。血液試料は、個体から採取された全血を、適宜処理することによって調製することができる。採取された全血から血液試料の調製を行う場合に行われる処理としては特に限定されず、臨床学的に許容されるいかなる処理が行われてよい。例えば遠心分離などが行われうる。また、血液試料は、その調製工程の中途段階又は調製工程の後段階において、適宜冷凍など低温下での保存が行われたものであってよい。なお、本発明において生体試料は、由来元の個体に戻すことなく破棄される。血液試料を対象試料とすることは、試料採取が固体や脳脊髄液である場合に対して低侵襲であること、また、一般の健康診断や人間ドック等における種々の疾患のスクリーニングのための対象試料であることからも好ましい。
【００８０】
本発明のＡＰＰ６６９−７１１のサンドイッチ型免疫測定用キットは、上記のサンドイッチ型免疫測定を行うためのものであって、
ＡＰＰ６６９−ｘペプチドのＮ末端を特異的に認識するＡＰＰ６６９−ｘ Ｎ末端認識モノクローナル抗体（第１の抗体）、及び
ＡＰＰ６６９−７１１のＣ末端を認識可能なモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体（第２の抗体）
を含むものである。
【００８１】
キットは、さらに、ＡＰＰ６６９−ｘに結合可能な抗原親和性物質を含んでもよい。また、キットには、サンドイッチ型免疫測定法の操作に用いる各種成分、例えば、試料溶液調製用の希釈液、洗浄溶液等を含ませることができる。
【００８２】
本発明の免疫測定法は、試料中の標的ポリペプチドを認識可能な抗原結合部位を持つ第１の抗体、及び前記標的ポリペプチドを認識可能な抗原結合部位であって前記第１の抗体が持つ抗原結合部位とは異なる抗原結合部位を持つ第２の抗体を用いたポリペプチドのサンドイッチ型免疫測定法において、試料に標的ポリペプチドに結合可能な抗原親和性物質を添加することを含む。
【００８３】
本発明の免疫測定法において、前記標的ポリペプチドを含む試料に前記抗原親和性物質を添加し、その後、前記標的ポリペプチドを前記第１の抗体及び前記第２の抗体と反応させるか、又は、
前記標的ポリペプチドを前記第１の抗体及び前記第２の抗体と反応させている時に、反応系に前記抗原親和性物質を添加するか、又は、
前記標的ポリペプチドを前記第１の抗体及び前記第２の抗体のいずれか一方と反応させ、その後、反応系に前記抗原親和性物質を添加し、その後、前記標的ポリペプチドを前記第１の抗体及び前記第２の抗体のいずれか他方と反応させることができる。
【００８４】
試料に標的ポリペプチドに結合可能な抗原親和性物質を添加することにより、標的ポリペプチドのコンフォメーションが変化させられ、サンドイッチ免疫測定法で使用される２つの抗体が各々結合すべき２つのエピトープが空間距離的に互いに遠ざけられる。そのため、２つの部位での抗原抗体反応がうまく行われ、標的ポリペプチドを高感度で検出及び定量できる。
【００８５】
前記抗原親和性物質は、標的ポリペプチドに親和性を有し結合可能な物質であればよく、抗体、ペプチド、低分子化合物、及び核酸アプタマー等が挙げられる。ここでの結合とは、静電相互作用、ファンデルワールス力、水素結合、疎水性相互作用、双極子相互作用、分散力などの分子間相互作用による結合が含まれる。標的ポリペプチドのコンフォメーションが変化させられ、サンドイッチ免疫測定法で使用される２つの抗体が各々結合すべき２つのエピトープが空間距離的に互いに遠ざけられるものであればよい。
【００８６】
前記抗原親和性物質としての抗体としては、前記第１の抗体及び前記第２の抗体が持つ抗原結合部位とは異なる抗原結合部位を持つ抗体を用いるとよい。
前記抗原親和性物質としてのペプチドとしては、２〜１２アミノ酸残基からなるペプチドを用いるとよく、例えば、Ａβに結合するペプチドであれば、iAβ5（５アミノ酸）、D3（１２アミノ酸）、NH2-D-Trp-Aib-OH（２アミノ酸）等が例示される。
前記抗原親和性物質としての低分子化合物としては、標的ポリペプチドに結合可能な低分子化合物を用いるとよく、例えば、創薬で使われているような、あるタンパク質に結合する低分子化合物が挙げられる。Ａβに結合する低分子化合物であれば、Scyllo-inositol等が例示される。各種の阻害剤（例えば、Stemolecule TM 低分子化合物の各種）も挙げられる。
前記抗原親和性物質としての核酸アプタマーとしては、DNAアプタマー、RNAアプタマー等が挙げられる。
【００８７】
前記抗原親和性物質の添加量は、試料中の標的ポリペプチドの種類や量、及び抗原親和性物質の種類にもより、特に限定されることはなく、標的ポリペプチドに結合して該標的ポリペプチドのコンフォメーションを変化させられる量とすればよい。例えば、前記抗原親和性物質の添加量は、標的ポリペプチドを含んでいる試料中の濃度として、０．１ｎｇ／ｍＬ〜１０００００ｎｇ／ｍＬ程度、好ましくは０．１ｎｇ／ｍＬ〜１００００ｎｇ／ｍＬ程度、より好ましくは０．１ｎｇ／ｍＬ〜３０００ｎｇ／ｍＬ程度とするとよい。
【００８８】
本発明において、標的ポリペプチドを認識可能な抗原結合部位を持つ第１の抗体、及び前記標的ポリペプチドを認識可能な抗原結合部位であって前記第１の抗体が持つ抗原結合部位とは異なる抗原結合部位を持つ第２の抗体としては、サンドイッチ型免疫測定法で用いられている種々のものを用いることができる。
【００８９】
例えば、前記第１の抗体として、標的ポリペプチドのＮ末端認識抗体を用いて、前記第２の抗体として、標的ポリペプチドのＣ末端認識抗体を用いることができる。
【００９０】
この場合には、前記抗原親和性物質が、標的ポリペプチドのＮ末端付近には作用せず、且つ、前記標的ポリペプチドのＣ末端付近には作用しないものが好ましい。標的ポリペプチドに対して、前記抗原親和性物質と前記第１の抗体との競合や阻害が起こることは好ましくないし、前記抗原親和性物質と前記第２の抗体との競合や阻害が起こることも好ましくない。
【００９１】
より具体的には、前記抗原親和性物質は、前記標的ポリペプチドのＮ末端から４残基部位からＣ末端から４残基部位までの中間部位に作用するものであることが好ましい。さらに、前記抗原親和性物質は、前記標的ポリペプチドのＮ末端から６残基部位からＣ末端から６残基部位までの中間部位に作用するものであることが好ましい。
【００９２】
標識物質として酵素を利用するサンドイッチＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）の場合、前記第１の抗体としての標的ポリペプチドのＮ末端認識抗体を固相化抗体（捕捉抗体）として用いて、前記第２の抗体としての標的ポリペプチドのＣ末端認識抗体を検出抗体（標識抗体）として用いるとよい。
【００９３】
本発明のサンドイッチ型免疫測定法は、標識物質として酵素を利用するサンドイッチＥＬＩＳＡの他に、放射性同位元素を利用する放射免疫測定法（ＲＩＡ）、化学発光物質を利用する化学発光免疫測定法（ＣＩＡ）、蛍光発光物質を利用する蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、金属錯体を利用する電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、ルシフェラーゼなどの生物発光物質を利用する生物発光免疫測定法（ＢＬＩＡ）、抗体に標識された核酸をＰＣＲで増幅させて検出するイムノＰＣＲ、免疫複合体形成により発生する濁度を検出する免疫比濁法（ＴＡＩ）、免疫複合体形成により凝集するラテックスを検出するラテックス凝集比濁法（ＬＡ）、セルロース膜上で反応させるイムノクロマト法などにも適用できる。
【００９４】
本発明のサンドイッチ型免疫測定法の基本的操作は、試料に抗原親和性物質を添加すること以外は、公知の操作に従って行なうことができる。
【００９５】
本発明は、標的ポリペプチドがＡβ及びＡβ関連ペプチドである場合に特に好適である。Ａβ（Ａβ１−４０、及びＡβ１−４２）や、Ａβ関連ペプチド（例えば、Ａβ１−３９、ＡＰＰ６６９−７１１）は、生体内に存在しており、アルツハイマー病のバイオマーカーとして注目されている。これらＡβやＡβ関連ペプチド、特にＡβ関連ペプチドについて、高感度で検出及び定量できるサンドイッチ免疫測定法が望まれていた。本発明により、これらＡβやＡβ関連ペプチド、特にＡβ関連ペプチドについて、高感度で検出及び定量できるサンドイッチ免疫測定法が提供される。以下に、Ａβ及びＡβ関連ペプチドの例を示す。
【００９６】
ＡＰＰ６７２−７０９（Ａβ１−３８）（配列番号６）：
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGG
ＡＰＰ６７４−７１１（Ａβ３−４０）（配列番号７）：
EFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV
ＡＰＰ６７２−７１０（Ａβ１−３９）（配列番号８）：
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGV
ＡＰＰ６７２−７１１（Ａβ１−４０）（配列番号１）：
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV
ＯｘＡＰＰ６７２−７１１（ＯｘＡβ１−４０）（配列番号９）：
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV （Met ７０６が酸化されている）
ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）（配列番号２）：
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA
ＡＰＰ６６９−７１１（配列番号３）：
VKMDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV
【００９７】
アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）は、膜一回貫通タンパク質で７７０残基のアミノ酸から成る。アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）は、βセクレターゼとγセクレターゼによってタンパク質分解を受け、タンパク質分解によってアミロイド・ベータペプチド（Ａβ）が産生される。ＡＰＰ６７２−７１３とＡβ１−４２とは同じペプチドを表す（配列番号２）。また、ＡＰＰ６７２−７１１とＡβ１−４０とは同じペプチドを表す（配列番号１）。本発明において、標的ポリペプチドには、上記例示のもの以外にも、種々のＡβ関連ペプチドが限定されることなく含まれる。また、本発明は、Ａβ及びＡβ関連ペプチド以外の各種ポリペプチドにも適用される。
【００９８】
本発明において、標的ポリペプチドは生体試料に含まれる。生体試料には、血液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、尿、体分泌液、唾液、及び痰などの体液；  及び糞便が含まれる。血液試料には、全血、血漿及び血清などが含まれる。血液試料は、個体から採取された全血を、適宜処理することによって調製することができる。採取された全血から血液試料の調製を行う場合に行われる処理としては特に限定されず、臨床学的に許容されるいかなる処理が行われてよい。例えば遠心分離などが行われうる。また、血液試料は、その調製工程の中途段階又は調製工程の後段階において、適宜冷凍など低温下での保存が行われたものであってよい。なお、本発明において生体試料は、由来元の個体に戻すことなく破棄される。血液試料を対象試料とすることは、試料採取が固体や脳脊髄液である場合に対して低侵襲であること、また、一般の健康診断や人間ドック等における種々の疾患のスクリーニングのための対象試料であることからも好ましい。
【００９９】
本発明のポリペプチドのサンドイッチ型免疫測定用キットは、上記のサンドイッチ型免疫測定を行うためのものであって、
標的ポリペプチドを認識可能な抗原結合部位を持つ第１の抗体、
前記標的ポリペプチドを認識可能な抗原結合部位であって前記第１の抗体が持つ抗原結合部位とは異なる抗原結合部位を持つ第２の抗体、及び
前記標的ポリペプチドに結合可能な抗原親和性物質
を含む。
キットには、サンドイッチ型免疫測定法の操作に用いる各種成分、例えば、試料溶液調製用の希釈液、洗浄溶液等を含ませることができる。
【実施例】
【０１００】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。以下において％で示される物の量は、特に断りがない場合は、その物が固体である場合は重量基準、液体である場合は体積基準で示されている。【０１０１】
［実施例１：ＡＰＰ６６９−ｘ Ｎ末端認識抗体の作成］
［実施例１−１：モノクローナル抗体の作成］
合成ペプチドVKMC（配列番号５）のＣ末端のCysを、二価反応性試薬を用いてキャリアタンパク質（ＫＬＨ）に結合させた。【０１０２】
このＫＬＨ結合合成ペプチドをFCA（フロインドコンプリートアジュバンド）と注射筒を用いて混和して乳化させ、BALB/cマウス１匹に対して２００μｇを尾根部筋肉内に注射（免疫）した。さらに抗原をFICA（フロインドインコンプリートアジュバンド）を混和して乳化させ、二週間間隔で２回、マウス１匹に対して５０μｇを皮下に注射（追加免疫）した。その後、マウス１匹に対して１００μｇを腹腔に最終免疫した。【０１０３】
最終免疫より３日後に脾臓を採取し、リンパ球を分離した後、−８０℃で凍結保存した。また、マウスより全採血を実施し、血液から血清を分離後、−４０℃で凍結保存した。【０１０４】
得られたリンパ球とマウスミエローマを５０％ポリエチレングリコール存在下で細胞融合を実施した。融合細胞を９６ウェルマイクロプレート８枚に分注して培養した。細胞融合から８日後、９６ウェルマイクロウェルプレートの各ウェルから培養上清をサンプリングし、ＥＬＩＳＡにより一次、二次スクリーニングを順次行い、陽性ウェルの細胞を限界希釈法にてクローニングした。その後、ＥＬＩＳＡにより一次、二次スクリーニングを順次行い、陽性クローンのハイブリドーマを凍結保存した。【０１０５】
取得したハイブリドーマ（クローン20-1A, 24-6G, 34-6E）は高密度無血清培養を行った。その培養上清からProtein Aを用いて抗体を精製した。【０１０６】
［実施例１−２：直接ＥＬＩＳＡによるモノクローナル抗体の特異性の確認］
ＡＰＰ６６９−ｘ Ｎ末端認識抗体クローン20-1A, 24-6G, 34-6Eの特異性を直接ＥＬＩＳＡで評価した。直接ＥＬＩＳＡは以下のように行った。【０１０７】
合成ペプチドＡＰＰ６６９−７１１（ペプチド研）、Ａβ１−４０（ペプチド研）、又はＡＰＰ６６８−６７７（配列番号４）（東レリサーチセンター）を炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）で５０，又は５００ｐｍｏｌ／ｍＬの各濃度に希釈した。合成ペプチドの配列は表１に示す。各合成ペプチド溶液を９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに５０μＬずつ加えて、４℃、２時間インキュベーションすることで固相化した。また、ブランクウェルも用意した。プレート中の溶液を除去し、４倍希釈ブロックエース（ＤＳファーマ）を１００μＬずつ入れて、４℃、２時間インキュベートしてブロッキングを行った。プレート中の溶液を除去し、ＰＢＳＴ（0.05% Tween20 in PBS）３００μＬで洗浄した。１０倍希釈ブロックエースで０．５μｇ／ｍＬの濃度に希釈したＡＰＰ６６９−ｘ Ｎ末端認識抗体を５０μＬずつ入れて、４℃、１時間インキュベートした。プレート中のサンプル溶液を除去し、ＰＢＳＴ ３００μＬで洗浄した。１０倍希釈ブロックエースで４０００倍希釈したＨＲＰ標識−抗マウスIgG抗体（ZYMED）溶液を５０μＬずつ入れて、４℃、１時間でインキュベートした。プレート中の溶液を除去し、ＰＢＳＴ ３００μＬで洗浄した。ＥＬＩＳＡ ＰＯＤ基質ＴＭＢキット（ナカライ）を１００μＬ加えて、暗所で３０分インキュベーションで発色させた。２Ｎ 硫酸を１００μＬ加えて発色反応を止めた。マイクロプレートリーダーで主波長４５０ｎｍ／副波長６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を測定した。【０１０８】
これらの結果を図１〜３に示す。すなわち、図１は、ＡＰＰ６６９−ｘ Ｎ末端特異的抗体クローン34-6Eを用いた直接ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。図２は、ＡＰＰ６６９−ｘ Ｎ末端特異的抗体クローン24-6Gを用いた直接ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。図３は、ＡＰＰ６６９−ｘ Ｎ末端特異的抗体クローン20-1Aを用いた直接ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。図１〜３において、横軸は、ペプチド濃度（ｐｍｏｌ／ｍＬ）を表し、縦軸は、マイクロプレートリーダーで測定された主波長４５０ｎｍ／副波長６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を表す。【０１０９】
図１〜３より、ＡＰＰ６６９−ｘ Ｎ末端認識抗体の全てのクローン20-1A, 24-6G, 34-6Eで、ＡＰＰ６６９−７１１に反応することを確認した。一方、Ａβ１−４０やＡＰＰ６６８−６７７には全く反応性が確認されなかった。ＡＰＰ６６９−７１１はＮ末端側３アミノ酸がＡβ１−４０よりも長いだけで他のアミノ酸配列はＡβ１−４０と同じであるが、Ａβ１−４０には反応を示さなかったことから、クローン20-1A, 24-6G, 34-6EはＡＰＰ６６９−７１１のＮ末端側３アミノ酸を認識することを示している。また、ＡＰＰ６６８−６７７はＡＰＰ６６９−７１１よりもＮ末端側に１アミノ酸だけ長いだけだが、クローン20-1A, 24-6G, 34-6Eは反応しなくなった。このことから、クローン20-1A, 24-6G, 34-6EはＡＰＰ６６９−７１１のＮ末端を特異的に認識していることを示している。【０１１０】
以上の結果により、ＡＰＰ６６９−ｘ Ｎ末端認識抗体の３種類のクローンは、ＡＰＰ６６９−７１１のＮ末端を特異的に認識していることを確認できた。【０１１１】
【表１】
2019167830.tif 000003
【０１１２】
［実施例２：ＡＰＰ６６９−７１１のサンドイッチＥＬＩＳＡ］
［実施例２−１：ＡＰＰ６６９−ｘ Ｎ末端認識抗体の３種類のクローンを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ］
ＡＰＰ６６９−ｘ Ｎ末端認識抗体クローン20-1A、24-6G、及び、34-6Eを捕捉抗体として用いて、ＡＰＰ６６９−７１１に対するサンドイッチＥＬＩＳＡの反応性を評価した。【０１１３】
ＡＰＰ６６９−ｘ Ｎ末端認識抗体を炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）で２０μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに５０μＬずつ加えて、４℃、６時間インキュベーションすることで固相化した。プレート中の溶液を除去し、２０％ Blocking One（ナカライテスク）を１００μＬずつ入れて、４℃、２時間インキュベートしてブロッキングを行った。プレート中の溶液を除去し、ＰＢＳＴ ３００μＬで洗浄した。サンプル用バッファーＡ（5% Blocking One in PBST）で希釈した合成ペプチドＡＰＰ６６９−７１１をサンプル溶液として５０μＬずつ入れて、４℃、オーバーナトでインキュベートした。プレート中のサンプル溶液を除去し、ＰＢＳＴ ３００μＬで洗浄した。Human βAmyloid(1-40)ELISA Kit（和光純薬）に含まれるＨＲＰ標識されたＣ末端認識抗体（クローンBA27）溶液を5% Blocking One in PBST で５倍希釈した後、５０μＬずつ入れて、４℃、２時間でインキュベートした。プレート中の溶液を除去し、ＰＢＳＴ ３００μＬで洗浄した。ＥＬＩＳＡ ＰＯＤ基質ＴＭＢキットを１００μＬ加えて、暗所で３０分インキュベーションで発色させた。２Ｎ 硫酸を１００μＬ加えて発色反応を止めた。マイクロプレートリーダーで主波長４５０ｎｍ／副波長６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を測定した。【０１１４】
これらの結果を図４に示す。すなわち、図４は、３種類のＡＰＰ６６９−ｘ Ｎ末端特異的抗体クローンを用いたＡＰＰ６６９−７１１ サンドイッチＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。横軸は、ＡＰＰ６６９−７１１濃度（ｐｍｏｌ／ｍＬ）を表し、縦軸は、マイクロプレートリーダーで測定された主波長４５０ｎｍ／副波長６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を表す。【０１１５】
図４より、３種類のＡＰＰ６６９−ｘ Ｎ末端認識抗体クローンのうち34-6EがＡＰＰ６６９−７１１と最も反応性が高いことが示された。これ以降の実施例では、34-6EにフォーカスしてサンドイッチＥＬＩＳＡを評価した。【０１１６】
［実施例２−２：サンドイッチＥＬＩＳＡの特異性の確認］
ＡＰＰ６６９−ｘ Ｎ末端認識抗体クローン34-6Eを捕捉抗体として用いて、ＡＰＰ６６９−７１１に対するサンドイッチＥＬＩＳＡの特異性を評価した。サンドイッチＥＬＩＳＡは以下のように行った。【０１１７】
ＡＰＰ６６９−ｘ Ｎ末端認識抗体クローン34-6Eを炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）で２０μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに５０μＬずつ加えて、４℃、６時間インキュベーションすることで固相化した。プレート中の溶液を除去し、４倍希釈ブロックエースを１００μＬずつ入れて、４℃、２時間インキュベートしてブロッキングを行った。プレート中の溶液を除去し、ＰＢＳＴ ３００μＬで洗浄した。サンプル用バッファーＢ［10倍希釈ブロックエース、60 ng/mL 抗Aβ抗体クローン4G8（BioLegend, エピトープＡβ１８−２２）］で希釈した合成ペプチドＡＰＰ６６９−７１１、又はＡβ１−４０をサンプル溶液として５０μＬずつ入れて、４℃、オーバーナイトでインキュベートした。各サンプルは２重測定で行った。なお、サンプル用バッファーＢには反応性を高める目的で抗Aβ抗体クローン4G8（６０ｎｇ／ｍＬ）が含まれていた。プレート中のサンプル溶液を除去し、ＰＢＳＴ ３００μＬで洗浄した。Human βAmyloid(1-40)ELISA Kit（和光純薬）に含まれるＨＲＰ標識されたＣ末端認識抗体（クローンBA27）溶液を５０μＬずつ入れて、４℃、２時間でインキュベートした。プレート中の溶液を除去し、ＰＢＳＴ ３００μＬで洗浄した。ＥＬＩＳＡ ＰＯＤ基質ＴＭＢキットを１００μＬ加えて、暗所で３０分インキュベーションで発色させた。２Ｎ 硫酸を１００μＬ加えて発色反応を止めた。マイクロプレートリーダーで主波長４５０ｎｍ／副波長６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を測定した。【０１１８】
これらの結果を図５に示す。すなわち、図５は、ＡＰＰ６６９−ｘ Ｎ末端特異的抗体クローン34-6Eを用いた場合の、ＡＰＰ６６９−７１１ サンドイッチＥＬＩＳＡの特異性を示すグラフである。横軸は、ペプチド濃度（ｐｍｏｌ／ｍＬ）を表し、縦軸は、マイクロプレートリーダーで測定された主波長４５０ｎｍ／副波長６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を表す。【０１１９】
図５より、ＡＰＰ６６９−ｘ Ｎ末端特異的抗体クローン34-6EとＣ末端認識抗体（クローンBA27）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡはＡＰＰ６６９−７１１には反応を示したが、Ａβ１−４０には全く反応を示さなかった。このことにより、ＡＰＰ６６９−７１１ サンドイッチＥＬＩＳＡの特異性を確認できた。【０１２０】
また、異なる濃度の合成ペプチドＡＰＰ６６９−７１１をｎ＝４で測定して定量下限（Blank 吸光度 + 2SD）を求めたところ、２．４２ｆｍｏｌ／ｍＬであった。【０１２１】
［実施例２−３：ＡＰＰ６６９−７１１ ＥＬＩＳＡ添加回収試験］
ヒト血漿中の測定干渉物質による測定値への影響を確認するために、ＡＰＰ６６９−７１１ ＥＬＩＳＡの添加回収試験を行った。サンドイッチＥＬＩＳＡは前記実施例２−２と同様に行った。サンプルはサンプル用バッファーで４倍希釈した市販血漿（Tennessee Blood Services）を用いた。添加ＡＰＰ６６９−７１１濃度は、０，５，１０，又は２０ｆｍｏｌ／ｍＬとなるようにＡＰＰ６６９−７１１を添加した。【０１２２】
添加回収率を評価した結果、８９〜９１％と問題のない範囲を示した（表２）。【０１２３】
【表２】
2019167830.tif 000004
【０１２４】
［実施例２−４：ＡＰＰ６６９−７１１ ＥＬＩＳＡによる血漿測定］
ＡＰＰ６６９−７１１ ＥＬＩＳＡを用いて血漿中の内在性ＡＰＰ６６９−７１１を定量した。サンプルはサンプル用バッファーで４倍希釈した市販血漿５検体を用いて、２重測定で行った。【０１２５】
これらの結果を図６に示す。すなわち、図６は、ＡＰＰ６６９−７１１ サンドイッチＥＬＩＳＡによるヒト血漿測定の結果を示すグラフである。横軸は、各血漿サンプルを表し、縦軸は、ＡＰＰ６６９−７１１濃度（ｆｍｏｌ／ｍＬ）を表す。【０１２６】
図６より、５検体全てで定量下限（２．４２ｆｍｏｌ／ｍＬ）を上回る濃度を示した。以上の結果から、本サンドイッチＥＬＩＳＡは血漿中ＡＰＰ６６９−７１１を定量するのに十分な測定系であることが示された。【０１２７】
［実験例Ｂ１：APP669-711のサンドイッチELISAの操作方法］
まず、実験例Ｂ１では、APP669-711のサンドイッチELISAの基本操作方法について以下に示す。実施例Ｂ１〜Ｂ４の各操作はこの操作方法に基づいて行った。【０１２８】
（Ｎ末端認識抗体）
APP669-711のＮ末端を認識する抗体の作成をＩＴＭ社へ依頼し、３クローン（20-1A、24-6G、34-6E）を取得した。【０１２９】
（Ｎ末端認識抗体の固相化とブロッキング）
Ｎ末端認識抗体を炭酸ナトリウム緩衝液（pH9.6）で20 μg/mLの濃度に希釈し、得られた抗体希釈溶液を96 well plateの各wellに50 μLずつ加え、４℃、２時間インキュベーションすることでＮ末端認識抗体を固相化した。Plate中の抗体希釈溶液を除去し、20% Blocking One（ナカライテスク）を各wellに100 μLずつ入れて、４℃、２時間インキュベートしてブロッキングを行った。【０１３０】
（サンプル溶液の調製）
測定対象ペプチドAPP669-711を5% Blocking One in PBSTで所定の濃度にしてサンプル溶液を調製した。また、抗原親和性物質として用いる抗体を5% Blocking One in PBSTで任意の濃度に調製し、サンプル溶液に等量添加した。【０１３１】
（サンプル溶液の添加）
Plate中の20% Blocking Oneを除去し、PBST 300 μLで３回洗浄した。前記サンプル溶液をplateの各wellに50 μLずつ入れて、４℃、１時間インキュベートした。【０１３２】
（Ｃ末端認識するHRP標識抗体の添加）
Human βAmyloid(1-40)ELISA Kit（和光純薬）に含まれるＣ末端を認識するHRP標識抗体（クローンBA27）溶液を5% Blocking One in PBSTで５倍希釈した。Plate中のサンプル溶液を除去し、PBST 300 μLで３回洗浄した。５倍希釈したHRP標識抗体（BA27）溶液を50 μLずつ入れて、４℃、１時間でインキュベートした。Plate中の溶液を除去し、PBST 300 μLで５回洗浄した。【０１３３】
（酵素標識抗体添加と吸光度測定）
ELISA POD基質TMBキット（ナカライ）を100 μL ずつ加えて、暗所で１５分インキュベーションして発色させた。２Ｎ硫酸を100 μL ずつ加えて発色反応を止めた。マイクロプレートリーダーで主波長４５０ｎｍ／副波長６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を測定した。【０１３４】
［実施例Ｂ１］
［抗Aβ抗体4G8添加によるAPP669-711 サンドイッチELISA反応性評価］
アミロイドβ（Aβ）1-40は空間距離的にＣ末端とＮ末端が近い構造を取っている（非特許文献４）。Aβ1-40のＮ末端から３アミノ酸長くなっただけのAPP669-711もＣ末端とＮ末端が近いと考えられる。そこで、APP669-711に結合可能な抗体をサンプルに添加することにより、コンフォメーションが変化し、サンドイッチELISAの反応性が向上するかどうかを検証した。APP669-711に結合可能な抗体（抗原親和性物質）として、抗Aβ抗体4G8を用いた。【０１３５】
APP669-711のサンプル溶液に対して、抗原親和性物質として抗Aβ抗体4G8を添加することで、APP669-711濃度が0 fmol/mL、15.625 fmol/mL、31.25 fmol/mL、62.5 fmol/mL、125 fmol/mL、250 fmol/mL、500 fmol/mL、1000 fmol/mL、抗Aβ抗体4G8濃度が0, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1000, 3000, 10000 ng/mLとなるように調製した。それらの溶液を、APP669-711 サンドイッチELISAで測定した。クローン4G8のエピトープはAβ18-22である。固相化抗体としてはＮ末端認識抗体クローン34-6Eを用いた。その結果、4G8添加なし（0 ng/mL）と比べて、抗Aβ抗体4G8を添加することにより吸光度が増加した（図７）。添加濃度100 ng/mLまでは濃度依存的に増加し、それを超えると徐々に低下した（図８）。【０１３６】
吸光度が増加した理由として、抗Aβ抗体4G8がプレートに固相化され、それがAPP669-711を捕捉し、Ｃ末端認識HRP標識抗体とサンドイッチしたことで反応した可能性も考えられる。それを検証するため、抗Aβ抗体4G8は反応するが、Ｎ末端認識抗体34-6E では反応しないAβ1-40（0〜1000 fmol/mL）のサンプル溶液を用いて、抗Aβ抗体4G8を10000 ng/mL添加したときのAPP669-711 サンドイッチELISA反応性を評価した。抗Aβ抗体4G8のエピトープはAβ18-22であるため、仮に抗Aβ抗体4G8が固相化されたら反応性を示す。しかし、本測定結果では反応を示していなかった（図９）。つまり、抗Aβ抗体4G8が固相化され、それがAPP669-711を捕捉したことで反応性が増したわけではないことが確認された。以上の結果から、抗Aβ抗体4G8をサンプル溶液に添加することで、APP669-711への特異性を保持したまま、サンドイッチELISAの反応性を向上させることが判明した。【０１３７】
図７は、抗Aβ抗体4G8添加によるAPP669-711 ELISAの検量線を示すグラフである。横軸はAPP669-711の濃度（fmol/mL）、縦軸は４５０ｎｍ／６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を示す。抗Aβ抗体4G8の濃度毎に検量線が示されている。【０１３８】
図８は、抗Aβ抗体4G8添加によるAPP669-711 ELISAの反応性を示すグラフである。横軸は抗Aβ抗体4G8の濃度(ng/mL)、縦軸は４５０ｎｍ／６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を示す。APP669-711の濃度毎に点を線で繋いでいる。【０１３９】
図９は、抗Aβ抗体4G8添加時におけるAβ1-40に対するAPP669-711 ELISAの反応性を示すグラフである。横軸はAβ1-40の濃度（fmol/mL）、縦軸は４５０ｎｍ／６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を示す。抗Aβ抗体4G8の添加量は10000 ng/mLであった。【０１４０】
［実施例Ｂ２：Ｎ末端認識抗体のクローンを変えたときの抗Aβ抗体4G8添加効果の検証］
固相化抗体として使用するＮ末端認識抗体のクローンを変えたときに、抗Aβ抗体4G8添加の効果があるかどうかを検証するための実験を行った。【０１４１】
APP669-711のサンプル溶液に対して、抗原親和性物質として抗Aβ抗体4G8を添加することで、APP669-711濃度が500 fmol/mL、抗Aβ抗体4G8濃度が0, 10, 30, 100, 300, 1000, 3000 ng/mLとなるように調製した。それらの溶液を、APP669-711 サンドイッチELISAで測定した。固相化抗体はＮ末端認識抗体の３クローン20-1A、24-6G及び34-6Eをそれぞれ用いた。その結果、３クローン全てにおいて吸光度の増加が確認され、各クローンにおいて最も高い吸光度を示した抗Aβ抗体4G8添加濃度は共通して100 ng/mLだった（図１０）。つまり、どのクローンでも最適な抗Aβ抗体4G8添加濃度は同じであった。【０１４２】
なお、各クローンを固相化したAPP669-711 サンドイッチELISAにおいて、抗Aβ抗体4G8を3000 ng/mL添加したときのAβ1-40（0〜1000 fmol/mL）のサンプル溶液への反応性を評価したが、反応は認められなかった（図１１）。つまり、抗Aβ抗体4G8が固相化され、それがAPP669-711を捕捉することで反応性が増したわけではないことが確認された。【０１４３】
図１０は、Ｎ末端認識抗体３クローンを用いたAPP669-711 ELISAにおける抗Aβ抗体4G8添加効果を示すグラフである。横軸は抗Aβ抗体4G8の濃度(ng/mL)、縦軸は４５０ｎｍ／６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を示す。Ｎ末端認識抗体のクローン毎に点を線で繋いでいる。【０１４４】
図１１は、抗Aβ抗体4G8添加時におけるAβ1-40に対するAPP669-711 ELISAの反応性を示すグラフである。Ｎ末端認識抗体として、３クローンを各々用いた。横軸はAβ1-40の濃度（fmol/mL）、縦軸は４５０ｎｍ／６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を示す。抗Aβ抗体4G8の添加量は3000 ng/mLであった。【０１４５】
［実施例Ｂ３：添加する抗Aβ抗体を変えたときのAPP669-711 サンドイッチELISA反応性向上効果の検証］
サンプルに添加する抗Aβ抗体のクローンを変えたときに、APP669-711 サンドイッチELISAの反応性が向上する効果があるかどうかを検証するための実験を行った。【０１４６】
APP669-711のサンプル溶液に対して、抗原親和性物質として抗Aβ抗体４クローン（4G8、6E10、BAM90.1、又はNAB228）を添加することで、APP669-711濃度が500 fmol/mL、抗Aβ抗体4G8濃度が0, 10, 30, 100, 300, 1000, 3000 ng/mLとなるように調製した。それらの溶液を、APP669-711 サンドイッチELISAで測定した。クローン6E10のエピトープはAβ3-8、BAM90.1はAβ20-23であり、NAB228はAβ1-11の中の一部がエピトープとなる。固相化抗体はＮ末端認識抗体クローン34-6Eを用いた。測定の結果、添加した抗Aβ抗体４クローン全てにおいて吸光度の増加が認められた（図１２）。各クローンで最も高い吸光度を示した濃度は、4G8では100 ng/mL、6E10では300 ng/mL、BAM90.1では1000 ng/mL、NAB228では3000 ng/mLであった。つまり、クローンによって最適な濃度は異なっていた。【０１４７】
なお、APP669-711 サンドイッチELISAにおいて、各クローンの抗Aβ抗体を3000 ng/mL添加したときのAβ1-40（0〜1000 fmol/mL、具体的には、0 fmol/mL、500 fmol/mL、1000 fmol/mL）のサンプル溶液への反応性を評価したが、反応は認められなかった（図１３）。つまり、どのクローンを添加した場合においても、固相化され、APP669-711を捕捉することで反応性が増したわけではないことが確認された。【０１４８】
図１２は、APP669-711 ELISAにおける抗Aβ抗体の４クローンの添加効果を示すグラフである。横軸は抗Aβ抗体の添加濃度(ng/mL)、縦軸は４５０ｎｍ／６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を示す。抗Aβ抗体のクローン毎に点を線で繋いでいる。【０１４９】
図１３は、抗Aβ抗体添加時におけるAβ1-40に対するAPP669-711 ELISAの反応性を示すグラフである。抗Aβ抗体は４クローンを用いた。横軸はAβ1-40の濃度（fmol/mL）、縦軸は４５０ｎｍ／６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を示す。抗Aβ抗体の添加量は3000 ng/mLであった。【０１５０】
［実施例Ｂ４：Aβ1-40 サンドイッチELISAにおける抗Aβ抗体添加効果の検証］
Human βAmyloid(1-40)ELISA Kit（和光純薬）を用いて、Aβ1-40 サンドイッチELISA についても、抗Aβ抗体を添加して反応性が向上するかどうかを検証するための実験を行った。【０１５１】
サンプルはHuman βAmyloid(1-40)ELISA Kit内に含まれているstandardと、AnaSpec社から購入したAβ1-40とした。それぞれのサンプルのAβ1-40 (Standard in kit、又はAnaSpec product)に、抗Aβ抗体クローン4G8又は6E10を添加することで、Aβ1-40濃度が50 fmol/mLとなるように、4G8濃度が100 ng/mL又は6E10濃度が300 ng/mLとなるように調製した。それらの溶液をHuman βAmyloid(1-40)ELISA Kitの取り扱い説明書のプロトコールに従って操作を行い、吸光度を測定した。また、基準として、4G8も6E10も添加しないで操作を行い、吸光度を測定した(図１４において、"non-spiked"と表記されている)。その結果、クローン4G8添加では基準に対して吸光度の増加が認められたが、クローン6E10添加では基準に対して吸光度に変化を与えなかった。6E10はエピトープがAβ3-8であり、Aβ1-40のＮ末端に近いため、ELISAの固相化抗体として使用しているＮ末端認識抗体が立体構造的に6E10の結合を妨害していると考えられる。一方、クローン4G8はエピトープがAβ18-22であり、Ｎ末端認識抗体とは空間距離的に離れているため、Aβ1-40 サンドイッチELISAの反応性向上に寄与したと考えられる。【０１５２】
このため、抗原親和性物質として添加する抗Aβ抗体については、サンドイッチELISAで用いる抗体が認識するエピトープからある程度空間距離的に離れている部位をエピトープとする抗体を選択する必要があると考えられる。【０１５３】
図１４は、Aβ1-40 ELISAにおける抗Aβ抗体4G8及び6E10の添加効果を示すグラフである。縦軸は４５０ｎｍ／６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を示す。サンプルとして、ELISA Kit内に含まれているstandardと、AnaSpec社のAβ1-40を用いた。【０１５４】
以上の実施例Ｂ１〜Ｂ４の結果から、分析対象ポリペプチドであるAPP669-711やAβ1-40に対して結合する抗体を添加することにより、それぞれに対応するサンドイッチELISAの反応性が向上する効果があることが判明した。【０１５５】
以上の各実施例では、分析対象ポリペプチドがAPP669-711及びAβ1-40である例を示した。本発明は、これら以外のポリペプチドやタンパク質を分析対象とするサンドイッチELISAについても有用である。また、本発明は、ELISA法に限らず、他の標識を用いるサンドイッチ法についても同様に適用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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