(57)【要約】  本発明は、少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質における抗原結合活性を担う構造領域内の二次構造の折り返し部分に存在し、かつタンパク質の表面に露出している部位に、生理活性ペプチドを融合する、人工タンパク質を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質における抗原結合活性を担う構造領域内の二次構造の折り返し部分に存在し、かつタンパク質の表面に露出している部位に、生理活性ペプチドを融合する、人工タンパク質。
【請求項２】
抗体由来の抗原結合活性を保持し、かつ生理活性ペプチドに由来する機能が付与された、請求項１に記載の人工タンパク質。
【請求項３】
生理活性ペプチドが、環状ペプチド又は直鎖ペプチドである、請求項１又は２に記載の人工タンパク質。
【請求項４】
少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質が、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ＩｇＧ、Ｄｉａｂｏｄｙ又はｔａＦｖである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の人工タンパク質。
【請求項５】
抗原結合活性を担う構造領域における二次構造の折り返し部分に存在し、かつタンパク質の表面に露出している部位が、抗体Ｆａｂ断片におけるループ領域又はエルボウ領域に存在する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の人工タンパク質。
【請求項６】
多重特異性を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の人工タンパク質。
【請求項７】
少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質に、生理活性ペプチドを提示する方法であって、当該タンパク質における抗原結合活性を担う構造領域における二次構造の折り返し部分に存在し、かつタンパク質の表面に露出している部位に、当該生理活性ペプチドを融合することで、タンパク質に生理活性ペプチドを提示する方法。
【請求項８】
抗体由来の抗原結合活性を保持し、かつ生理活性ペプチドに由来する機能を付与させる、請求項７に記載のタンパク質に生理活性ペプチドを提示する方法。
【請求項９】
生理活性ペプチドが、環状ペプチド又は直鎖ペプチドである、請求項７又は８に記載のタンパク質に生理活性ペプチドを提示する方法。
【請求項１０】
少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質が、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ＩｇＧ、Ｄｉａｂｏｄｙ又はｔａＦｖである、請求項７〜９のいずれか１項に記載のタンパク質に生理活性ペプチドを提示する方法。
【請求項１１】
抗原結合活性を担う構造領域における二次構造の折り返し部分に存在し、かつタンパク質の表面に露出している部位が、抗体Ｆａｂ断片におけるループ領域又はエルボウ領域に存在する、請求項７〜１０のいずれか１項に記載のタンパク質に生理活性ペプチドを提示する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体の抗原結合領域を含み、生理活性ペプチドを融合する人工タンパク質等に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体の機能は、本質的に、標的分子として、ただ一つの抗原分子に特異的に結合することである。タンパク質工学的手法により得られる改変型抗体として、二つ以上の異なる抗原分子を認識する抗体（多重特異性抗体：ＭｓＡｂ）が知られている。
ＭｓＡｂは、一つの抗体が二つ以上の標的分子に同時に結合するので、がん細胞とリンパ球のような異種細胞同士を架橋して抗がん作用を発揮する医薬として利用できる。また、抗体固有の第一の結合特異性を有する抗体に、第二の結合特異性を付与することで、ＭｓＡｂを望みの組織や細胞に集積させることも可能である。したがって、単一の標的に対する結合能・阻害能を有するのみである通常のモノクローナル抗体を用いた医薬に対して、ＭｓＡｂはより複雑な作用機序を介しての病態制御が可能であり、次世代の抗体医薬の主役として重要視されている。【０００３】
ＭｓＡｂの形態として、二つの抗原認識Ｆａｂ領域を異なる抗体由来のもので組み合わせる形の二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）が主流であるが、このＩｇＧ型のＢｓＡｂでは異なる抗体由来の重鎖をヘテロ二量体化させるため、特殊な工学的改変が必要である（非特許文献１）。ヘテロ二量化における問題点を回避するために、Ｆａｂ領域以外の場所であるＦｃに第二の結合特異性を埋め込むことでＩｇＧ型のＢｓＡｂを創生したのがＦｃａｂと呼ばれる技術である（非特許文献２）。Ｆｃａｂにおいては、Ｆａｂ領域は元の抗体のままであるため、抗体が本来有する第一の結合特異性に関しては性質が保たれ、そこにＦｃに組み込んだ第２の結合特異性が純粋に追加されることになる。
しかしながら、ＩｇＧ型のＢｓＡｂでは、いずれも高度な工学的改変を要し、ＩｇＧ型の高分子（分子量１５万）であることからも、開発や生産において困難が多い。さらに、このようなＩｇＧ型のＢｓＡｂでは付与できる新たな結合特異性は一般に一つである。よって、第三、第四の結合特異性付与を実現した例はない。【０００４】
これらＩｇＧ型のＢｓＡｂに対し、二つの抗体のＦｖ領域を一本鎖型のｓｃＦｖの状態で直列につないだｔａｎｄｅｍ  ｓｃＦｖ（ｔａＦｖ）という、より小型で遺伝子組み換え生産が容易な形態のＢｓＡｂが開発され、これによりリンパ球をがん細胞に集積させて攻撃させるがん免疫療法薬（Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｅｎｇａｇｅｒ；  ＢｉＴＥ）として使われている（例えば、特許文献１を参照。）。ただし、ｔａＦｖは天然の抗体とはかけ離れた構造をした人工物であり、そのために生体内での安定性も低い（非特許文献３）。さらに、原理的には３つ以上のｓｃＦｖを連結することは可能であるものの、さらなる安定性の低下が予想されるため、現状では特異性の付加は２つが限度である。
一方、元々の抗体分子の一部であるＦａｂはＶＨ、ＶＬ、ＣＨ１、ＣＬという４つのドメインから構成され、ＩｇＧをパパインなどのプロテアーゼで処理することにより得られる安定な抗原結合蛋白質として古くから使われている。Ｆａｂの抗原結合部位（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲと呼ばれる）は、ＶＨとＶＬの先端部にそれぞれが提示する３つのループ領域、合計６つのループによって構成されるので、この先端部以外の領域は工学的改変の余地がある。すなわち、ＣＤＲ以外の領域のアミノ酸配列を改変して新たな生理活性部位を創出できれば、既存の抗体に、第２の標的結合性のような新規の機能を賦与することが可能になる。しかしながら、それらループ領域のアミノ酸をランダム化して新たな生理活性を付与しようとしても、通常、構造的安定性において大きな犠牲を払うため、前述のＦｃａｂやｔａＦｖよりもさらに創出が困難である。このため、これまでにＦａｂ領域に新たな活性を賦与した例は、軽鎖のＣ末端に生理活性ペプチドや小タンパク質を融合したものが知られているに過ぎない（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２０１８−５２５３４７号公報
【特許文献２】特表２０１１−５０９０８４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ, １９９８；１６：６７７−６８１
【非特許文献２】Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  Ｄｅｓ．  Ｓｅｌ．, ２０１０；２３（４）：２８９−２９７
【非特許文献３】Ｃｌｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．, ２０１６；５５：１２７１-１２８８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明が解決しようとする課題は、抗体の抗原結合領域を含み、生理活性ペプチドを融合する新規人工タンパク質を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、以下のとおりである。
（１）
少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質における抗原結合活性を担う構造領域内の二次構造の折り返し部分に存在し、かつタンパク質の表面に露出している部位に、生理活性ペプチドを融合する、人工タンパク質。
（２）
抗体由来の抗原結合活性を保持し、かつ生理活性ペプチドに由来する機能が付与された、（１）に記載の人工タンパク質。
（３）
生理活性ペプチドが、環状ペプチド又は直鎖ペプチドである、（１）又は（２）に記載の人工タンパク質。
（４）
少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質が、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ＩｇＧ、Ｄｉａｂｏｄｙ又はｔａＦｖである、（１）〜（３）のいずれかに記載の人工タンパク質。
（５）
抗原結合活性を担う構造領域における二次構造の折り返し部分に存在し、かつタンパク質の表面に露出している部位が、抗体Ｆａｂ断片（Ｆａｂ）におけるループ領域又はエルボウ領域に存在する、（１）〜（４）のいずれかに記載の人工タンパク質。
抗体Ｆａｂ断片におけるループ領域としては、ＡＢループ（ＣＨ１）、ＣＤループ（ＣＨ１）、ＥＦループ（ＣＨ１）、ＡＢループ（ＶＨ）、Ｃ”Ｄループ（ＶＨ）、ＥＦループ（ＶＨ）、ＤＥループ（ＣＨ１）、ＦＧループ（ＣＨ１）又はＣＣ’ループ（ＶＨ）、ＡＢループ（ＣＬ）、ＣＤループ（ＣＬ）、ＥＦループ（ＣＬ）、ＡＢループ（ＶＬ）、Ｃ”Ｄループ（ＶＬ）、ＥＦループ（ＶＬ）、ＤＥループ（ＣＬ）、ＦＧループ（ＣＬ）又はＣＣ’ループ（ＶＬ）であることが好ましく、エルボウ領域としては、ＧＡループ（ＶＨ−ＣＨ１）又はＧＡループ（ＶＬ−ＣＬ）であることが好ましい。
抗体Ｆａｂ断片におけるループ領域としては、Ｃｈｏｔｈｉａの番号に準じて、Ｈ鎖については、１１２−１１９位、１２５−１３４位、１５５−１６２位、１８６−１９４位、１３−１７位、６１−６６位、８２ｂ−８７位、１７２−１７４位、２０１−２０３位又は４０−４４位に存在するループ領域であることが好ましく、Ｌ鎖については、１０５−１１３位、１１９−１２８位、１５１−１５８位、１８２−１９０位、１３−１８位、５７−６１位、７６−８３位、１６５−１７４位、１９８−２０３位又は３９−４４位に存在するループ領域であることが好ましい。
（５−１）
抗体におけるループ領域中の挿入部位が、図７及び図８に例示される軽鎖（Ｌ鎖）におけるＢ１、Ｂ２、Ｂ２―２、Ｂ３、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ２―２、Ｍ３、Ｍ３―２、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ５−２又はＭ６サイトであるか、図１４及び図１５に例示される重鎖（Ｈ鎖）におけるＢ１、Ｂ２、Ｂ２―２、Ｂ３、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ２−２、Ｍ３、Ｍ３―２、Ｍ４、Ｍ５又はＭ６サイトである、（５）に記載の人工タンパク質。
（５−２）
抗体におけるエルボウ領域中の挿入部位が、図７に例示されるＬ鎖におけるエルボウサイトであるか、図１４に例示されるＨ鎖におけるエルボウサイトである、（５）に記載の人工タンパク質。
（６）
多重特異性を有する、（１）〜（５−２）のいずれかに記載の人工タンパク質。
（７）
少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質に、生理活性ペプチドを提示する方法であって、当該タンパク質における抗原結合活性を担う構造領域における二次構造の折り返し部分に存在し、かつタンパク質の表面に露出している部位に、当該生理活性ペプチドを融合することで、タンパク質に生理活性ペプチドを提示する方法。
（８）
抗体由来の抗原結合活性を保持し、かつ生理活性ペプチドに由来する機能を付与させる、（７）に記載のタンパク質に生理活性ペプチドを提示する方法。
（９）
生理活性ペプチドが、環状ペプチド又は直鎖ペプチドである、（７）又は（８）に記載のタンパク質に生理活性ペプチドを提示する方法。
（１０）
少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質が、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ＩｇＧ、Ｄｉａｂｏｄｙ又はｔａＦｖである、（７）〜（９）のいずれかに記載のタンパク質に生理活性ペプチドを提示する方法。
（１１）
抗原結合活性を担う構造領域における二次構造の折り返し部分に存在し、かつタンパク質の表面に露出している部位が、抗体Ｆａｂ断片（Ｆａｂ）におけるループ領域又はエルボウ領域に存在する、（７）〜（１０）のいずれかに記載のタンパク質に生理活性ペプチドを提示する方法。
抗体Ｆａｂ断片におけるループ領域としては、ＡＢループ（ＣＨ１）、ＣＤループ（ＣＨ１）、ＥＦループ（ＣＨ１）、ＡＢループ（ＶＨ）、Ｃ”Ｄループ（ＶＨ）、ＥＦループ（ＶＨ）、ＤＥループ（ＣＨ１）、ＦＧループ（ＣＨ１）又はＣＣ’ループ（ＶＨ）、ＡＢループ（ＣＬ）、ＣＤループ（ＣＬ）、ＥＦループ（ＣＬ）、ＡＢループ（ＶＬ）、Ｃ”Ｄループ（ＶＬ）、ＥＦループ（ＶＬ）、ＤＥループ（ＣＬ）、ＦＧループ（ＣＬ）又はＣＣ’ループ（ＶＬ）であることが好ましく、エルボウ領域としては、ＧＡループ（ＶＨ−ＣＨ１）又はＧＡループ（ＶＬ−ＣＬ）であることが好ましい。
抗体Ｆａｂ断片におけるループ領域としては、Ｃｈｏｔｈｉａの番号に準じて、Ｈ鎖については、１１２−１１９位、１２５−１３４位、１５５−１６２位、１８６−１９４位、１３−１７位、６１−６６位、８２ｂ−８７位、１７２−１７４位、２０１−２０３位又は４０−４４位に存在するループ領域であることが好ましく、Ｌ鎖については、１０５−１１３位、１１９−１２８位、１５１−１５８位、１８２−１９０位、１３−１８位、５７−６１位、７６−８３位、１６５−１７４位、１９８−２０３位又は３９−４４位に存在するループ領域であることが好ましい。
（１１−１）
抗体におけるループ領域中の挿入部位が、図７及び図８に例示されるＬ鎖におけるＢ１、Ｂ２、Ｂ２―２、Ｂ３、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ２―２、Ｍ３、Ｍ３―２、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ５−２又はＭ６サイトであるか、図１４及び図１５に例示されるＨ鎖におけるＢ１、Ｂ２、Ｂ２―２、Ｂ３、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ２−２、Ｍ３、Ｍ３―２、Ｍ４、Ｍ５又はＭ６サイトである、（１１）に記載のタンパク質に生理活性ペプチドを提示する方法。
（１１−２）
抗体におけるエルボウ領域中の挿入部位が、図７に例示されるＬ鎖におけるエルボウサイトであるか、図１４に例示されるＨ鎖におけるエルボウサイトである、（１１）に記載のタンパク質に生理活性ペプチドを提示する方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、抗体の抗原結合領域を含み、生理活性ペプチドを融合する新規人工タンパク質を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ヒトＩｇＧ抗体である１ＨＺＨの立体構造を示す。抗体のＨ鎖及びＬ鎖のＦａｂ領域におけるＶＨドメインとＣＨ１ドメイン、ＶＬドメインとＣＬドメインを結ぶ領域をエルボウ領域として示す。
【図２】少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質の例示として、抗体、Ｆａｂ及びｓｃＦｖの構造を模式的に示す。抗体における重鎖と軽鎖の構造に対応させて、Ｆａｂ及びｓｃＦｖにおける重鎖及び軽鎖に由来する構造を示す。中でも、ｓｃＦｖは、重鎖に由来するＶＨドメイン及び軽鎖に由来するＶＬドメインから構成される可変領域（Ｆｖ）をフレキシブルなペプチドリンカー（ｌｉｎｋｅｒとして示す。）で結合した単鎖可変領域フラグメントである。また、抗体、Ｆａｂ及びｓｃＦｖにおける抗原との結合様式を模式的に示す。
【図３】少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質の例示として、ＢｓＡｂの構造を模式的に示す。ＢｓＡｂは、既存の抗体や抗体フラグメントを利用した構造を有しており、異なる多くのデザインが可能な構造を有している。
【図４】少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質の例示として、非対称型のＢｓＡｂの構造を模式的に示す。
【図５】少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質の例示として、対称型のＢｓＡｂの構造を模式的に示す。
【図６】Ｌ鎖における生理活性ペプチドの挿入部位を例示する。アミノ酸残基における番号は、Ｃｈｏｔｈｉａのアミノ酸残基番号に基づいたナンバリングによる。挿入された生理活性ペプチドは、ｍＰ６−９のアミノ酸配列に相当する。
【図７】ヒトＩｇＧ抗体である１ＨＺＨのＦａｂ領域の立体構造を示す。手前側に配置される構造がＬ鎖を示し、奥側に配置される構造がＨ鎖を示す。Ｌ鎖における生理活性ペプチドの挿入部位として、エルボウ（Ｅ）サイト、Ｂ１サイト、Ｂ２サイト、Ｂ２―２サイト及びＢ３サイトを示す。
【図８】ヒトＩｇＧ抗体である１ＨＺＨのＦａｂ領域の立体構造を示す。図７で示したＦａｂ領域の立体構造を１８０°回転させた図である。手前側に配置される構造がＨ鎖を示し、奥側に配置される構造がＬ鎖を示す。Ｌ鎖における生理活性ペプチドの挿入部位として、Ｍ１サイト、Ｍ２サイト、Ｍ２―２サイト、Ｍ３サイト、Ｍ３―２サイト、Ｍ４サイト、Ｍ５サイト、Ｍ５−２サイト及びＭ６サイトを示す。
【図９】ｍＰ６−９ペプチドをＬ鎖の各サイトに挿入したニューロピリン１に対するヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体（Ｎ１抗体、クローン名ＹＷ６４．３）のＦａｂ（ｍＰ６−９ペプチド融合型Ｎ１＿Ｆａｂ）のＮｉ−ＮＴＡ  Ｐｕｌｌｄｏｗｎ試験による発現結果を示す。
【図１０】ｍＰ６−９ペプチド融合型Ｎ１＿ＦａｂのプレキシンＢ１（ｈＰｌｅｘＢ１）へのＮｉ−ＮＴＡ  Ｐｕｌｌｄｏｗｎ試験による結合結果を示す。
【図１１】ｍＰ６−９ペプチド融合型Ｎ１＿Ｆａｂのニューロピリン１（Ｎｒｐ１ｅｃ）へのＮｉ−ＮＴＡ  Ｐｕｌｌｄｏｗｎ試験による結合結果を示す。
【図１２】ｍＰ６−９ペプチド融合型Ｎ１＿ＦａｂのｈＰｌｅｘＢ１及びＮｒｐ１ｅｃへのＡｎｔｉ−ＦＬＡＧ  ｔａｇ  Ｐｕｌｌｄｏｗｎ試験による結合結果を示す。
【図１３】Ｈ鎖における生理活性ペプチドの挿入部位を例示する。アミノ酸残基における番号は、Ｃｈｏｔｈｉａのアミノ酸残基番号に基づいたナンバリングによる。挿入された生理活性ペプチドは、ｍＰ６−９のアミノ酸配列に相当する。
【図１４】図８と同様のヒトＩｇＧ抗体である１ＨＺＨのＦａｂ領域の立体構造を示す。手前側に配置される構造がＨ鎖を示し、奥側に配置される構造がＬ鎖を示す。Ｈ鎖における生理活性ペプチドの挿入部位として、エルボウ（Ｅ）サイト、Ｂ１サイト、Ｂ２サイト、Ｂ２−２サイト及びＢ３サイトを示す。
【図１５】図７と同様のヒトＩｇＧ抗体である１ＨＺＨのＦａｂ領域の立体構造を示す。手前側に配置される構造がＬ鎖を示し、奥側に配置される構造がＨ鎖を示す。Ｈ鎖における生理活性ペプチドの挿入部位として、Ｍ１サイト、Ｍ２サイト、Ｍ２−２サイト、Ｍ３サイト、Ｍ３−２サイト、Ｍ４サイト、Ｍ５サイト及びＭ６サイトを示す。
【図１６】ｍＰ６−９ペプチドをＨ鎖の各サイトに挿入したニューロピリン１に対するヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体（Ｎ１抗体、クローン名ＹＷ６４．３）のＦａｂ（ｍＰ６−９ペプチド融合型Ｎ１＿Ｆａｂ）のＮｉ−ＮＴＡ  Ｐｕｌｌｄｏｗｎ試験による発現結果を示す。
【図１７】ｍＰ６−９ペプチド融合型Ｎ１＿ＦａｂのプレキシンＢ１（ｈＰｌｅｘＢ１）へのＮｉ−ＮＴＡ  Ｐｕｌｌｄｏｗｎ試験による結合結果を示す。
【図１８】ｍＰ６−９ペプチド融合型Ｎ１＿Ｆａｂのニューロピリン１（Ｎｒｐ１ｅｃ）へのＮｉ−ＮＴＡ  Ｐｕｌｌｄｏｗｎ試験による結合結果を示す。
【図１９】ｍＰ６−９ペプチド融合型Ｎ１＿ＦａｂのｈＰｌｅｘＢ１及びＮｒｐ１ｅｃへのＡｎｔｉ−ＦＬＡＧ  ｔａｇ  Ｐｕｌｌｄｏｗｎ試験による結合結果を示す。
【図２０】２種の標的分子を同時に結合することを示すサンドイッチ測定系の原理（Ａ）と、測定結果（Ｂ）を示す。図２０Ａにおいて、生理活性ペプチドは、重鎖へ挿入された場合を示す。
【図２１】ｍＰ６−９ペプチドをＬ鎖の各サイトに挿入したニューロピリン１に対するヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体（Ｎ１抗体、クローン名ＹＷ６４．３）（ｍＰ６−９ペプチド融合型Ｎ１抗体）のｒＰｒｏｔｅｉｎＡ  Ｐｕｌｌｄｏｗｎ試験による発現結果を示す。
【図２２】ｍＰ６−９ペプチド融合型Ｎ１抗体のプレキシンＢ１（ｈＰｌｅｘＢ１）へのｒＰｒｏｔｅｉｎＡ  Ｐｕｌｌｄｏｗｎ試験による結合結果を示す。
【図２３】ｍＰ６−９ペプチド融合型Ｎ１抗体のニューロピリン１（Ｎｒｐ１ｅｃ）へのｒＰｒｏｔｅｉｎＡ  Ｐｕｌｌｄｏｗｎ試験による結合結果を示す。
【図２４】Ｌ鎖における生理活性ペプチドの挿入部位を例示する。アミノ酸残基における番号は、Ｃｈｏｔｈｉａのアミノ酸残基番号に基づいたナンバリングによる。挿入された生理活性ペプチドは、ａＭＤ４のアミノ酸配列に相当する。
【図２５】ａＭＤ４ペプチドをＬ鎖の各サイトに挿入したニューロピリン１に対するヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体（Ｎ１抗体、クローン名ＹＷ６４．３）のＦａｂ（ａＭＤ４ペプチド融合型Ｎ１＿Ｆａｂ）のＮｉ−ＮＴＡ  Ｐｕｌｌｄｏｗｎ試験による発現結果を示す。
【図２６】ａＭＤ４ペプチド融合型Ｎ１＿ＦａｂのＭｅｔ受容体（Ｍｅｔ）へのＮｉ−ＮＴＡ  Ｐｕｌｌｄｏｗｎ試験による結合結果を示す。
【図２７】ａＭＤ４ペプチド融合型Ｎ１＿Ｆａｂのニューロピリン１（Ｎｒｐ１ｅｃ）へのＮｉ−ＮＴＡ  Ｐｕｌｌｄｏｗｎ試験による結合結果を示す。
【図２８】Ｈ鎖における生理活性ペプチドの挿入部位を例示する。アミノ酸残基における番号は、Ｃｈｏｔｈｉａのアミノ酸残基番号に基づいたナンバリングによる。挿入された生理活性ペプチドは、ａＭＤ４のアミノ酸配列に相当する。
【図２９】ａＭＤ４ペプチドをＨ鎖の各サイトに挿入したニューロピリン１に対するヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体（Ｎ１抗体、クローン名ＹＷ６４．３）のＦａｂ（ａＭＤ４ペプチド融合型Ｎ１＿Ｆａｂ）のＮｉ−ＮＴＡ  Ｐｕｌｌｄｏｗｎ試験による発現結果を示す。
【図３０】ａＭＤ４ペプチド融合型Ｎ１＿ＦａｂのＭｅｔ受容体（Ｍｅｔ）へのＮｉ−ＮＴＡ  Ｐｕｌｌｄｏｗｎ試験による結合結果を示す。
【図３１】ａＭＤ４ペプチド融合型Ｎ１＿Ｆａｂのニューロピリン１（Ｎｒｐ１ｅｃ）へのＮｉ−ＮＴＡ  Ｐｕｌｌｄｏｗｎ試験による結合結果を示す。
【図３２】２種の標的分子を同時に結合することを示すサンドイッチ測定系の原理（Ａ）と、測定結果（Ｂ）を示す。図３２Ａにおいて、生理活性ペプチドは、重鎖へ挿入した場合を示す。
【図３３】ａＭＤ４ペプチド又はａＭＤ５ペプチドをＬ鎖又はＨ鎖の各サイトに挿入した抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）のＦａｂ（ａＭＤ４ペプチド融合型ＯＫＴ３＿Ｆａｂ又はａＭＤ５ペプチド融合型ＯＫＴ３＿Ｆａｂ）のＮｉ−ＮＴＡ  Ｐｕｌｌｄｏｗｎ試験による発現結果を示す。
【図３４】ａＭＤ４又はａＭＤ５ペプチド融合型ＯＫＴ３＿ＦａｂのＭｅｔ受容体（Ｍｅｔ）へのＰＡ  ｔａｇ  Ｐｕｌｌｄｏｗｎ試験による結合結果を示す。
【図３５】ａＭＤ４ペプチド融合型ＯＫＴ３＿Ｆａｂの、ＣＤ３又はＭｅｔ発現細胞への結合をＦＡＣＳで評価した結果を示す。
【図３６】ａＭＤ４ペプチド又はａＭＤ５ペプチドをＬ鎖又はＨ鎖の各サイトに挿入した抗ＣＤ３抗体（ＵＣＨＴ１）のＦａｂ（ａＭＤ４ペプチド融合型ＵＣＨＴ１＿Ｆａｂ又はａＭＤ５ペプチド融合型ＵＣＨＴ１＿Ｆａｂ）のＮｉ−ＮＴＡ  Ｐｕｌｌｄｏｗｎ試験による発現結果を示す。
【図３７】ａＭＤ４又はａＭＤ５ペプチド融合型ＵＣＨＴ１＿ＦａｂのＭｅｔ受容体（Ｍｅｔ）へのＰＡ  ｔａｇ  Ｐｕｌｌｄｏｗｎ試験による結合結果を示す。
【図３８】ａＭＤ４又はａＭＤ５ペプチド融合型ＵＣＨＴ１＿Ｆａｂの、ＣＤ３又はＭｅｔ発現細胞への結合をＦＡＣＳで評価した結果を示す。
【図３９】ａＭＤ４ペプチド又はａＭＤ５ペプチドをＬ鎖又はＨ鎖の各サイトに挿入した抗ＣＤ１６抗体（３Ｇ８）のＦａｂ（ａＭＤ４ペプチド融合型３Ｇ８＿Ｆａｂ又はａＭＤ５ペプチド融合型３Ｇ８＿Ｆａｂ）のＮｉ−ＮＴＡ  Ｐｕｌｌｄｏｗｎ試験による発現結果を示す。
【図４０】ａＭＤ４又はａＭＤ５ペプチド融合型３Ｇ８＿ＦａｂのＣＤ１６受容体（ＣＤ１６）へのＰＡ  ｔａｇ  Ｐｕｌｌｄｏｗｎ試験による結合結果を示す。
【図４１】ａＭＤ４又はａＭＤ５ペプチド融合型３Ｇ８＿ＦａｂのＭｅｔ受容体（Ｍｅｔ）へのＰＡ  ｔａｇ  Ｐｕｌｌｄｏｗｎ試験による結合結果を示す。
【図４２】ｍＰ６−９ペプチド及びａＭＤ４ペプチドをＬ鎖又はＨ鎖の各サイトに挿入したニューロピリン１に対するヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体（Ｎ１、クローン名ＹＷ６４．３）のＦａｂ（三重特異性Ｆａｂ）のＮｉ−ＮＴＡ  Ｐｕｌｌｄｏｗｎ試験による発現結果を示す。
【図４３】三重特異性Ｆａｂのニューロピリン１（Ｎｒｐ１ｅｃ）へのＮＺ−１  Ｐｕｌｌｄｏｗｎ試験による結合結果を示す。
【図４４】三重特異性ＦａｂのプレキシンＢ１（ｈＰｌｅｘＢ１）への結合結果を示す。
【図４５】三重特異性ＦａｂのＭｅｔ受容体（Ｍｅｔ）への結合結果を示す。
【図４６】三重特異性Ｆａｂが二種の標的分子を同時に結合することを示すサンドイッチ測定系の原理（Ａ）と、測定結果（Ｂ）を示す。
【図４７】ニューロピリン１に対するヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体（Ｎ１抗体、クローン名ＹＷ６４．３）のＨ鎖のアミノ酸配列を示す。
【図４８】実施例に記載の抗体Ｈ鎖Ｆａｂ領域発現ベクターから生産されるＮ１抗体Ｈ鎖Ｆａｂ領域のアミノ酸配列を示す。
【図４９】実施例に記載の抗体Ｌκ鎖発現ベクターから生産されるＮ１抗体Ｌκ鎖のアミノ酸配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明を、発明を実施するための形態により具体的に説明するが、本発明は、以下の発明を実施するための形態に限定されるものではなく、種々変形して実施することができる。
【００１２】
〔人工タンパク質〕
本発明の人工タンパク質は、少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質における抗原結合活性を担う構造領域内の二次構造の折り返し部分に存在し、かつタンパク質の表面に露出している部位に、生理活性ペプチドが融合されている。
本発明の人工タンパク質は、抗体の抗原結合領域を有する。また、本発明の人工タンパク質は、人工タンパク質が抗原結合領域を有していることにより、当該抗原結合領域に基づいて、人工タンパク質の構造として、抗原結合活性を担う構造を保持していることになる。
本発明の人工タンパク質の抗原結合活性を担う構造領域内には、二次構造の折り返し部分が存在しており、当該折り返し部分には、タンパク質における立体構造として、タンパク質の表面に露出している部位が存在する。
本発明においては、当該タンパク質の表面に露出している部位に、生理活性ペプチドが融合されている。
二次構造の折り返し部分のすべてがタンパク質の表面に露出していてもよく、二次構造の折り返し部分の一部がタンパク質の表面に露出していてもよい。
【００１３】
抗体においては、一般に、Ｈ鎖及びＬ鎖の６つのＣＤＲからなる先端部を２つ有する。本発明においては、タンパク質が少なくとも有する抗体の抗原結合領域として、Ｈ鎖及びＬ鎖の６つのＣＤＲからなる先端部が挙げられ、抗体の場合、２つの先端部を有するが、本発明の人工タンパク質においては、当該先端部を１つ有していればよい。
かかる先端部を有するタンパク質としては、抗体が挙げられ、抗体としては、特に限定されるものではないが、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥの５種類に分類される。
本発明において、少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質が抗体である場合には、抗体としては、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥのいずれであってもよいが、ＩｇＧが好適である。ＩｇＧのサブクラスとして、多数のサブクラスが知られており、それらの中から選択されてもよい。
また、抗体としては、その由来は特に限定されず、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ウマ抗体、イヌ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体であってよい。
【００１４】
少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質として、上述したような抗体の断片であってもよく、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｄｉａｂｏｄｙ又はｔａＦｖが例示される。
なお、少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質として、図２〜５に記載される構造であってもよい。
Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｄｉａｂｏｄｙ又はｔａＦｖについては、当業界において既に知られている構造として理解される抗体断片といえる。
【００１５】
本発明の人工タンパク質においては、生理活性ペプチドが、抗原結合活性を担う構造領域内に融合されているが、生理活性ペプチドが融合される前における抗原結合活性を、人工タンパク質が保持していることが好ましい。
本明細書において、抗原結合活性を人工タンパク質が保持しているとは、生理活性ペプチドが、人工タンパク質に融合された後においても、当該人工タンパク質がインタクトなタンパク質であった場合の抗原結合活性を保持していることを意味する。その場合に、抗原結合活性の程度は、生理活性ペプチドを融合させた前後で、異なる結合活性を示してもよい。
本発明において、抗原結合活性は、抗体の抗原結合領域を有するタンパク質を抗体と見立てた場合における抗体の抗原結合活性であることが好ましい。
【００１６】
本発明の人工タンパク質は、生理活性ペプチドが融合されているので、生理活性ペプチドに由来する機能が付与されていることが好ましい。
本発明の人工タンパク質は、抗原結合活性を保持し、かつ融合された生理活性ペプチドに由来する機能が付与されていることが好ましい。抗原結合活性を保持し、かつ融合された生理活性ペプチドに由来する機能が付与されている場合には、本発明の人工タンパク質が、多重特異性を有する人工タンパク質であるといえる。
本発明の好適な態様として、Ｆｖ領域の周辺部に、第二の結合特異性を融合される生理活性ペプチドを介して賦与するという、ａｕｔｈｅｎｔｉｃな抗体そのもののエンジニアリング技術を提供することができる。
ここで、Ｆｖ領域とは、Ｈ鎖のＶＨドメインとＬ鎖のＶＬドメインから構成される独立した構造領域を意味する。
【００１７】
本発明においては、抗体の抗原結合領域を含む人工タンパク質であり、生理活性ペプチドが、抗原結合活性を担う構造領域内の二次構造の折り返し部分に存在し、かつタンパク質の表面に露出している部位に融合されていることで、抗体の抗原結合領域による機能に加えて、新たな機能が賦与された人工タンパク質であってよい。具体的には、人工タンパク質が、少なくとも抗体の抗原結合領域を有するため、抗体が本来有する抗原結合性を示し、さらに、抗原結合領域近傍において生理活性ペプチドが融合されていることにより、本発明では、生理活性ペプチドに由来する新たな機能を獲得している抗体類似タンパク質であることが好ましい態様といえる。
したがって、本発明の人工タンパク質は、抗体が本来有する抗原結合性を示し、さらに、融合されている生理活性ペプチドに由来する新たな機能を示す場合には、少なくとも二重特異性を有する人工タンパク質である。
好ましくは、本発明の人工タンパク質は、抗体由来の抗原結合活性を保持し、かつ融合された生理活性ペプチドに由来する機能が付与された、多重特異性を有するが、本発明の人工タンパク質は、抗体が本来有する抗原結合性についてＤＵＡＬであり得、及び／又は、複数の生理活性ペプチドを融合されことにより、異なる生理活性ペプチドでは異なる２以上の生理活性が示されるので、本発明の人工タンパク質は、多重特異性を有し得る。
【００１８】
一般に、タンパク質工学において、抗体を含め何らかのタンパク質に対して、何らかの結合活性を付与しようとする場合、当該タンパク質を土台として、当該タンパク質において近接する複数のループをランダム化してライブラリーを作り、そこから所望の標的分子への結合物を取得するという手法が採用される。この点、Ｆｃａｂにおいても同様に、２カ所もしくは３カ所のループをランダム化するという手法が採用されている。
本発明においては、好適には、生理活性ペプチドを、抗原結合活性を担う構造領域内の二次構造の折り返し部分に存在し、かつタンパク質の表面に露出している部位に融合することで、従来技術における手法を採用することなく、タンパク質に生理活性ペプチドを融合することができるという利点を有する。
本発明の人工タンパク質においては、好適には、抗原結合活性を担う構造領域内の二次構造の折り返し部分に存在し、かつタンパク質の表面に露出している部位に融合されている構造は、生理活性ペプチドに由来するアミノ酸構造のみであり得る。
【００１９】
〔生理活性ペプチド〕
人工タンパク質に融合される生理活性ペプチドは、特に限定されるものではないが、環状ペプチド又は直鎖ペプチドであることが好適である。
生理活性ペプチドとは、何らかの生理学的な活性を有しているペプチドであることを意味し、生理学的な活性に関しては、特に限定されない。
生理活性ペプチドの生理学的な活性は、好ましくは、所望の分子への結合活性であり、より好ましくは、所望の標的分子への結合活性であり、結合活性は、分子へ結合することにより分子の活性を活性化するものであってもよく、分子の活性を阻害するものであってもよく、分子の活性を調節するものであってもよい。
生理活性ペプチドは、阻害剤であっても、活性化剤であってもよく、アンタゴニスト、アゴニストに分類されるペプチドであってもよい。生理活性ペプチドとは、生理活性ペプチド単独で、ある特定の標的分子に結合する活性を示すペプチドと言うこともできる。
標的分子としては、特に限定されないが、医薬における標的となる分子であることが好ましく、その例示として、受容体や酵素等が挙げられる。
生理活性の強さとしては、Ｋｄ値あるいはＥＣ５０値で表示したときにｐＭオーダーの活性でも、ｎＭオーダーの活性でも、μＭオーダーの活性でも、ｍＭオーダーの活性でもよいが、ｎＭ以下のオーダーで活性を有することが好ましい。
生理活性は、生理活性ペプチドの有する活性が、人工タンパク質に融合されることにより、増強されていても、減弱されていてもよい。
生理活性ペプチドは本発明の人工タンパク質に融合されている状態として、生理活性を有することが知られたアミノ酸配列の全長が、人工タンパク質に融合されていてもよく、その部分配列が融合されていてもよい。
生理活性ペプチドの部分配列が融合される場合には、生理活性ペプチドの有する生理活性を保持するように部分配列が好ましくは選択される。
生理活性ペプチドが部分配列として融合される場合には、人工タンパク質の表面に提示されることにより、生理活性を保持するように融合されていてもよい。すなわち、部分配列を有するペプチドである場合には、全長の生理活性ペプチドに比して生理活性を減弱させていても、人工タンパク質に融合されることにより生理活性ペプチドが本来有する生理活性を保持するような場合も本発明における好ましい態様である。
【００２０】
生理活性ペプチドが環状ペプチドである場合には、環状ペプチドの環構造における特定の結合を切断して得られる鎖状のペプチドとして人工タンパク質に融合されていることが好ましい。
環状ペプチドにおける特定の結合の切断部位は、切断部位をタンパク質に融合させた後において、生理活性を保持するような部位であることが好ましい。
環状ペプチドの全長を鎖状のペプチドで表現した場合のアミノ酸配列の全長が人工タンパク質に融合されていてもよく、当該アミノ酸配列の部分配列が人工タンパク質に融合されていてもよい。
すなわち、所望の分子に結合活性を有する生理活性ペプチドを所望の分子に対する結合活性を保持したまま生理活性ペプチドが融合されていることが好ましい。
【００２１】
生理活性ペプチドが、人工タンパク質に挿入される場合には、人工タンパク質由来のアミノ酸部分と、生理活性ペプチド由来のアミノ酸部分とが直接結合していてもよく、何らかのリンカーを介して結合していてもよい。
リンカーは、生理活性ペプチドと元の少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質とを連結することができれば特に限定されないが、生理学的に不活性なアミノ酸配列を有することが好ましい。
リンカーとしては、グリシンやセリンといったアミノ酸が１つの又は２以上連結した配列を有することが好ましい。
生理活性ペプチドは、特に限定されないが、例えば、５〜２０のアミノ酸を有するペプチドである。
【００２２】
生理活性ペプチドが融合される場合には、生理活性ペプチドの有するアミノ酸をそのまま有していてもよく、生理活性を保持する範囲で、１又は複数のアミノ酸が置換、欠失又は挿入されていてもよい。
１又は複数とは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０であってもよく、１〜１０の範囲内であってもよく、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、１又は２、１であってもよい。
生理活性ペプチドが、その変異体として融合される場合には、元の生理活性ペプチドの有するアミノ酸配列と、生理活性が消失しない限り、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列として融合されていてもよい。
【００２３】
生理活性ペプチドが環状ペプチドである場合には、天然に存在する環状ペプチドであってもよいが、一般的なｍＲＮＡディスプレイ法により製造されるペプチドであってよく、ＴＲＡＰ法やＲａＰＩＤ法で製造されるペプチドであってもよく、また、ファージディスプレイ法により製造されるペプチドであってもよい。また、これらの変法におり製造されるペプチドであってもよい。
環状ペプチドは、分子内環状構造を形成するための化学架橋構造として、例えば、チオエーテル結合又はジスルフィド結合を含む。
通常、ＲａＰＩＤ法やＴＲＡＰ法のようなｍＲＮＡディスプレイ法やファージディスプレイ法により選択される環状ペプチドは、チオエーテル結合又はジスルフィド結合といった分子内環状構造を形成するための化学架橋構造以外の構造が、生理活性を有する活性点であることが多い。
そうすると、環状ペプチドのチオエーテル結合又はジスルフィド結合を、切断して見かけ上直鎖状のペプチドを想定し、当該直鎖状のペプチドが、人工タンパク質に融合されていることが好ましい。この場合、通常、ＲａＰＩＤ法やＴＲＡＰ法のようなｍＲＮＡディスプレイ法やファ−ジディスプレイ法により得られる環状ペプチドの高い特異性と親和性を、所望の人工タンパク質の所望の構造内に賦与することができる。また。特に限定されるものではないが、チオエーテル結合又はジスルフィド結合を分子内環状構造として有する環状ペプチドを融合することにより、ＲａＰＩＤ法やＴＲＡＰ法のようなｍＲＮＡディスプレイ法やファ−ジディスプレイ法により得られる環状ペプチドを汎用性をもって融合させることができる。
【００２４】
環状ペプチドとしては、特に限定されるものではないが、天然型の環状ぺプチドを用いてもよく、非天然型の環状ペプチドを用いてもよい。
天然型の環状ペプチドを人工タンパク質上に融合する場合には、アミノ酸残基同士を結合するいずれの結合も、分子内環状構造を形成するための化学架橋構造といえるため、いずれの結合を採用することもできるが、環状ペプチドにおける活性部位と考えられる領域以外のアミノ酸残基同士の結合を、人工タンパク質と融合させるための化学架橋構造とすることが好ましい。
【００２５】
環状ペプチドは、４以上のアミノ酸残基により形成される環状構造を分子内に少なくとも有するペプチドである。４以上のアミノ酸残基により形成される環状ペプチドにおける環状構造は、直鎖状ペプチドにおいて、２アミノ酸以上離れた２つのアミノ酸残基が直接に、又はリンカー等を介して結合することによって分子内に形成される閉環構造である。
２つのアミノ酸残基が２アミノ酸以上離れていることは、２つのアミノ酸残基の間に少なくとも２つのアミノ酸残基が存在していることと同義であり、２つのアミノ酸残基は、その間に２つ以上のアミノ酸を介して結合することとなる。
【００２６】
本発明においては、抗原結合活性を担う構造領域内の二次構造の折り返し部分に存在し、かつタンパク質の表面に露出している部位に、生理活性ペプチドが融合されているが、融合されている生理活性ペプチドを構成するアミノ酸数は、特に限定されない。
本発明の人工タンパク質においては、抗原結合活性を保持していることが好ましいため、抗原結合活性を担う構造領域に対して、抗原結合活性が失われてしまうまでに生理活性ペプチドが融合されることは望まれない。
生理活性ペプチドのアミノ酸数としては、下限は特に限定されないものの、４以上であってよく、上限は特に限定されないものの、３０以下であってよく、２５以下であってよく、２０以下であってよい。
また、本発明の人工タンパク質においては、生理活性ペプチドを融合する前後において、アミノ酸数が増加していてもよく、減少していてもよい。
【００２７】
〔少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質〕
本発明の人工タンパク質においては、少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質に対して、生理活性ペプチドが挿入されている融合タンパク質であるともいえるが、少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質は、代表的には、図２〜図５に示されるタンパク質を例示することができ、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ＩｇＧ、Ｄｉａｂｏｄｙ又はｔａＦｖが好ましく、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ又はＩｇＧがより好ましい。
したがって、抗体の抗原結合領域に基づく抗原結合活性は、生理活性ぺプチドが融合される前の、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ＩｇＧ、Ｄｉａｂｏｄｙ又はｔａＦｖといった構造における抗体又はその誘導体における抗原結合活性であることが好ましい。
また、図３〜５には、抗体の抗原結合領域が異なる二重（多重）特異性抗体が例示されているが、これらの二重（多重）特異性抗体も、本発明における少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質として例示できる。すなわち、少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質としては、抗体様分子であってもよい。
図３〜５には、抗体の抗原結合領域が異なるタンパク質として記載されているが、本発明の少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質においては、図３〜５に示されるタンパク質において、抗体の抗原結合部位が同一であるタンパク質であってもよい。
【００２８】
〔抗原結合活性を担う構造領域内の二次構造の折り返し部分に存在し、かつタンパク質の表面に露出している部位〕
本発明の人工タンパク質においては、生理活性ペプチドは、少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質に融合されており、具体的には、当該タンパク質において、抗原結合活性を担う構造領域における二次構造の折り返し部分に存在し、かつタンパク質の表面に露出している部位に融合されている。
抗原結合活性を担う構造領域における二次構造の折り返し部分に相当するアミノ酸配列において、生理活性ペプチドを融合する部位としては、隣接するアミノ酸の間であってもよい。また、抗原結合活性を担う構造領域における二次構造の折り返し部分に相当するアミノ酸配列において、生理活性ペプチドを融合する部位としては、当該アミノ酸配列において離れたアミノ酸の間であってもよい。離れたアミノ酸の間に生理活性ぺプチドが融合される場合、生理活性ペプチドと結合するために選択される抗原結合活性を担う構造領域における二次構造の折り返し部分に相当するアミノ酸配内のアミノ酸間に存在する１又は複数のアミノ酸については、人工タンパク質においては欠失していてよい。
抗原結合活性を担う構造領域における二次構造の折り返し部分に存在し、かつタンパク質の表面に露出している部位は、好ましくは、抗体Ｆａｂ断片（Ｆａｂ）におけるループ領域又はエルボウ領域に存在する部位である。
抗体Ｆａｂ断片におけるループ領域又はエルボウ領域内から生理活性ぺプチドが融合される部位は任意に選択してもよい。
【００２９】
抗原結合活性を担う構造領域における二次構造の折り返し部分に存在し、かつタンパク質の表面に露出している部位は、Ｆｖ領域内にあってもよく、Ｆｖ領域外にあってもよいが、Ｆｖ領域外にある場合には、Ｆｖと独立には安定に存在し得ない構造領域、例えば、抗体Ｆａｂ断片（Ｆａｂ）でＦｖ領域に隣接して存在するＨ鎖のＣＨ１ドメインやＬ鎖のＣＬドメインにあることが好ましい。この場合、単にＦｖやＦａｂに連結した独立ドメイン（例えば、抗体のＦｃ領域や人工的に融合したＦｎ３モジュール）内を、生理活性ペプチドを融合する部位としないことが好ましい。
【００３０】
本発明において、抗原結合活性を担う構造領域内の二次構造の折り返し部分に存在し、かつタンパク質の表面に露出している部位としては、抗体やその誘導体において、ループ領域と呼ばれる部分であることが好ましい。
抗体やその誘導体におけるループ領域としては、Ｈ鎖においては、ＧＡループ（ＶＨ−ＣＨ１）、ＡＢループ（ＣＨ１）、ＣＤループ（ＣＨ１）、ＥＦループ（ＣＨ１）、ＡＢループ（ＶＨ）、Ｃ”Ｄループ（ＶＨ）、ＥＦループ（ＶＨ）、ＤＥループ（ＣＨ１）、ＦＧループ（ＣＨ１）及びＣＣ’ループ（ＶＨ）が挙げられ、Ｌ鎖においては、ＧＡループ（ＶＬ−ＣＬ）、ＡＢループ（ＣＬ）、ＣＤループ（ＣＬ）、ＥＦループ（ＣＬ）、ＡＢループ（ＶＬ）  、Ｃ”Ｄループ（ＶＬ）、ＥＦループ（ＶＬ）、ＤＥループ（ＣＬ）、ＦＧループ（ＣＬ）及びＣＣ’ループ（ＶＬ）が挙げられる。
なお、好適なループ領域は、少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質に応じて適宜選択し得る。少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質が、抗体やＦａｂである場合には、上述のループ領域から選択してよい。すなわち、少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質が有する構造に存在するループ領域を選択すればよい。
【００３１】
本発明においては、図４８及び図４９で示すように、アミノ酸残基番号をＣｈｏｔｈｉａのナンバリングを使用して記載すると、Ｈ鎖については、
ＧＡループ（ＶＨ−ＣＨ１）  １１２−１１９位
ＡＢループ（ＣＨ１）        １２５−１３４位
ＣＤループ（ＣＨ１）        １５５−１６２位
ＥＦループ（ＣＨ１）        １８６−１９４位
ＡＢループ（ＶＨ）          １３−１７位
Ｃ”Ｄループ（ＶＨ）        ６１−６６位
ＥＦループｖｅｒ１（ＶＨ）  ８２ｂ−８７位
ＤＥループ（ＣＨ１）        １７２−１７４位
ＦＧループ（ＣＨ１）        ２０１−２０３位
ＣＣ’ループ（ＶＨ）        ４０−４４位
であることが好ましく、Ｌ鎖については、
ＧＡループ（ＶＬ−ＣＬ）    １０５−１１３位
ＡＢループ（ＣＬ）          １１９−１２８位
ＣＤループ（ＣＬ）          １５１−１５８位
ＥＦループ（ＣＬ）          １８２−１９０位
ＡＢループ（ＶＬ）          １３−１８位
Ｃ”Ｄループ（ＶＬ）        ５７−６１位
ＥＦループ（ＶＬ）          ７６−８３位
ＤＥループ（ＣＬ）          １６５−１７４位
ＦＧループ（ＣＬ）          １９８−２０３位
ＣＣ’ループ（ＶＬ）        ３９−４４位
であることが好ましい。
本発明においては、抗原結合活性を担う構造領域内の二次構造の折り返し部分が、上記Ｃｈｏｔｈｉａの番号で特定可能なループ構造であることが好ましく、抗原結合活性を担う構造領域内の二次構造の折り返し部分に存在し、かつタンパク質の表面に露出している部位は、当該ループ構造全体であってもよく、当該ループ構造の一部分であってもよい。
すなわち、抗原結合活性を担う構造領域内の二次構造の折り返し部分に存在し、かつタンパク質の表面に露出している部位は、好適には、Ｃｈｏｔｈｉａの番号で特定可能なループ構造内の部位であってよい。
【００３２】
ＧＡループ（ＶＨ−ＣＨ１）を例示して説明すると、ＧＡループ（ＶＨ−ＣＨ１）は、Ｃｈｏｔｈｉａの番号として１１２−１１９位のアミノ酸として規定されるが、抗原結合活性を担う構造領域内の二次構造の折り返し部分に存在し、かつタンパク質の表面に露出している部位は、Ｃｈｏｔｈｉａのナンバリングを使用して、特に限定されるものではないが、１１２−１１３位、１１３−１１４位、１１４−１１５位、１１５−１１６位、１１６−１１７位、１１７−１１８位、１１８−１１９位、１１２−１１４位、１１３−１１５位、１１４−１１６位、１１５−１１７位、１１６−１１８位、１１７−１１９位、１１２−１１５位、１１３−１１６位、１１４−１１７位、１１５−１１８位、１１６−１１９位、１１２−１１６位、１１３−１１７位、１１４−１１８位、１１５−１１９位、１１２−１１７位、１１３−１１８位、１１４−１１９位、１１２−１１８位、１１３−１１９位というように、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８位の任意の位置から、１１９位、１１８位、１１７位、１１６位、１１５位、１１４位、１１３位の任意の位置までの部位として選択されてもよい。
選択される任意の位置として、Ｃｈｏｔｈｉａのナンバリングに基づくアミノ酸番号の小さい方の位置で生理活性ペプチドのN末端側が結合していてよく、、Ｃｈｏｔｈｉａのナンバリングに基づくアミノ酸番号の大きい方の位置で生理活性ペプチドのC末端側が結合していてもよい。
また、ＧＡループ（ＶＨ−ＣＨ１）は、Ｃｈｏｔｈｉａの番号として１１２−１１９位のアミノ酸として規定されるが、タンパク質の表面に露出している部位であれば、１１２位よりもＮ末端側の位置から選択されてもよく、同様に、１１９位よりもＣ末端側の位置から選択されてもよい。
【００３３】
本発明においては、それぞれの人工タンパク質において、Ｃｈｏｔｈｉａのナンバリングにより規定されるアミノ酸番号に対応するループ構造が選択されていてもよい。
【００３４】
ループ領域中の生理活性ペプチドの挿入部位が、図７及び図８に例示されるＬ鎖におけるＢ１、Ｂ２、Ｂ２―２、Ｂ３、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ２―２、Ｍ３、Ｍ３―２、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ５−２又はＭ６サイト内であるか、図１４及び図１５に例示されるＨ鎖におけるＢ１、Ｂ２、Ｂ２―２、Ｂ３、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ２−２、Ｍ３、Ｍ３―２、Ｍ４、Ｍ５又はＭ６サイト内であることが好ましい。
図６に従うと以下のとおりである（Ｎ１＿ｍＰ６−９＿Ｍ６Ｌ）。
．．．ＹＱＱＫＰ４０−（ＧＷＲＰＹＩＥＲＷＴＧＲＬＩＶＧＧ）−Ｇ４１ＫＡＰＫ．．．  図１３に従うと以下のとおりである（Ｎ１＿ｍＰ６−９＿Ｍ６Ｈ）。
．．．ＶＲＱＡＰ４１−（ＧＷＲＰＹＩＥＲＷＴＧＲＬＩＶＧＧ）−Ｇ４２ＫＧＬＥ．．．  エルボウ領域中の生理活性ペプチドの挿入部位が、図７に例示されるＬ鎖におけるエルボウサイト内であるか、図１４に例示されるＨ鎖におけるエルボウサイト内であることが好ましい。
図７、図８、図１４及び図１５においては、抗体（１ＨＺＨ）の構造を参考にして各挿入部位を例示しているが、他の抗体の場合には、抗体（１ＨＺＨ）におけるサイトに相当する他の抗体におけるサイトを挿入部位とすることができる。
生理活性ペプチドの挿入部位の例示として、図６及び図１３が挙げられる。
【００３５】
本発明においては、Ｃｈｏｔｈｉａの番号で記載すると、Ｈ鎖については、
ＧＡループ（ＶＨ−ＣＨ１）中におけるＥサイトとして、１１３−１１４位
ＡＢループ（ＣＨ１）中におけるＢ１サイトとして、１３２−１３３位
ＣＤループ（ＣＨ１）中におけるＢ２サイトとして、１５６−１５７位、Ｂ２−２サイトとして、１６０−１６１位
ＥＦループ（ＣＨ１）中におけるＢ３サイトとして、１９０−１９１位
ＡＢループ（ＶＨ）中におけるＭ１サイトとして、１４−１５位
Ｃ”Ｄループ（ＶＨ）中におけるＭ２サイトとして、６１−６２位、Ｍ２−２サイトとして、６５−６６位
ＥＦループ（ＶＨ）中におけるＭ３サイトとして、８２ａ−８２ｂ、Ｍ３−２サイトとして、８３−８４位
ＤＥループ（ＣＨ１）中におけるＭ４サイトとして、１７２−１７３位
ＦＧループ（ＣＨ１）中におけるＭ５サイトとして、２０３−２０４位
ＣＣ’ループ（ＶＨ）中におけるＭ６サイトとして、４１−４２位
であることが好ましく、Ｌ鎖については、
ＧＡループ（ＶＬ−ＣＬ）中におけるＥサイトとして、１０８−１０９位
ＡＢループ（ＣＬ）中におけるＢ１サイトとして、１２７−１２８位
ＣＤループ（ＣＬ）中におけるＢ２サイトとして、１５１−１５２位、Ｂ２−２サイトとして、１５６−１５７位
ＥＦループ（ＣＬ）中におけるＢ３サイトとして、１８８−１８９位
ＡＢループ（ＶＬ）中におけるＭ１サイトとして、１５−１６位
Ｃ”Ｄループ（ＶＬ）中におけるＭ２サイトとして、５６−５７位、Ｍ２−２位サイトとして、６０−６１位
ＥＦループ（ＶＬ）中におけるＭ３サイトとして、７６−７７位、Ｍ３−２サイトとして、８０−８１位
ＤＥループ（ＣＬ）中におけるＭ４サイトとして、１６９−１７０位
ＦＧループ（ＣＬ）中におけるＭ５サイトとして、２０２−２０３位、Ｍ５０２サイトとして、１９９−２００位
ＣＣ’ループ（ＶＬ）中におけるＭ６サイトとして、４０−４１位
であることが好ましい。
なお、図６や図１３では、Ｈ鎖又はＬ鎖であることを示すため、下付き文字によりＨ又はＬを付して記載している。
本発明においては、少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質が抗体やＦａｂ等である場合には、いわゆるボトムサイトとなる、Ｈ鎖であれば、Ｂ１サイト、Ｂ２サイト、Ｂ３サイトであることが好ましく、Ｌ鎖であれば、Ｂ１サイト、Ｂ２サイト、Ｂ２−２サイト、Ｂ３サイトであることが好ましい。
本発明においては、抗原結合領域近傍にも生理活性ペプチドを融合できるため、いわゆるボトムサイト以外の挿入部位も好適に利用可能である。
Ｈ鎖であれば、Ｂ１サイト、Ｂ２サイト、Ｂ３サイトが属するループ領域が好ましく、Ｌ鎖であれば、Ｂ１サイト、Ｂ２サイト、Ｂ２−２サイト、Ｂ３サイトが属するループ領域が好ましい。
【００３６】
〔少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質における抗原結合活性を担う構造領域内の二次構造の折り返し部分に存在し、かつタンパク質の表面に露出している部位に、生理活性ペプチドが融合されている、人工タンパク質の製造〕
本発明は、少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質における抗原結合活性を担う構造領域内の二次構造の折り返し部分に存在し、かつタンパク質の表面に露出している部位に、生理活性ペプチドが融合されている、人工タンパク質の製造方法は特に限定されず、本発明の人工タンパク質は、実施例に記載の方法を援用して製造することが可能である。また、その際に、従来公知の遺伝子工学に係る手法又はその変法を採用することが可能である。
本発明における、少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質における抗原結合活性を担う構造領域内の二次構造の折り返し部分に存在し、かつタンパク質の表面に露出している部位に、生理活性ペプチドが融合されている、人工タンパク質の製造方法は、
生理活性ペプチドのアミノ酸配列から、タンパク質上に融合する全部又は部分アミノ酸配列を選択し、該アミノ酸配列に相当する塩基配列を選択し、
少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質における抗原結合活性を担う構造領域内の二次構造の折り返し部分に存在し、かつタンパク質の表面に露出している部位を選択し、
生理活性ペプチドを融合する当該部位を構成する２つのアミノ酸残基に相当する塩基配列を選択し、該選択された塩基配列間に存在する塩基を必要に応じて削除し、選択された生理活性ペプチド由来のアミノ酸配列に相当する塩基配列を挿入して組み込んだ塩基配列を有する核酸を準備し、
該核酸を翻訳する、人工タンパク質の製造方法である。
【００３７】
本発明においては、少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質に、生理活性ペプチドを提示する方法であって、当該タンパク質における抗原結合活性を担う構造領域における二次構造の折り返し部分に存在し、かつタンパク質の表面に露出している部位に、当該生理活性ペプチドを融合することで、タンパク質に生理活性ペプチドを提示する方法をも提供する。
本発明における、少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質における抗原結合活性を担う構造領域内の二次構造の折り返し部分に存在し、かつタンパク質の表面に露出している部位に、生理活性ペプチドが融合されている、人工タンパク質においては、「少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質」の「抗原結合活性を担う構造領域内の二次構造の折り返し部分に存在し、かつタンパク質の表面に露出している部位」に、「生理活性ペプチド」が融合されているため、本発明の人工タンパク質について説明したところと同様に、タンパク質に生理活性ペプチドを提示する方法が提供され得る。
「少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質に、生理活性ペプチドを提示する方法」が、当該タンパク質の抗原結合活性を担う構造領域における二次構造の折り返し部分に存在し、かつタンパク質の表面に露出している部位に、当該生理活性ペプチドを融合することで、「少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質に、生理活性ペプチドを融合させて、当該タンパク質に多重特異性を付与する方法」と、本発明を理解することも可能である。
すなわち、好適には、抗体由来の抗原結合活性を保持し、かつ融合された生理活性ペプチドに由来する機能を付与させることにより少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質は多重特異性を有する。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例を示して具体的に本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００３９】
抗原結合部位であるＦａｂ領域と生理活性ペプチドの融合
生理活性ペプチドを、ＩｇＧ全長タンパク質（以下、「ＩｇＧ」と呼ぶ）の抗原結合部位であるＦａｂ領域に挿入してペプチド融合タンパク質を、以下のとおり調製した。
抗体（１ＨＺＨ）の構造を例示として図１に示す。図７、図８、図１４及び図１５に、図１で示した抗体の構造を参考に、生理活性ペプチドの挿入サイトを示す。【００４０】
［実施例１］
１．ペプチド融合タンパク質の調製
ニューロピリン１に対するヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体（Ｎ１抗体、クローン名ＹＷ６４．３）のＨ鎖のうちＦａｂ領域をコードするＤＮＡとＨｉｓｘ６タグをコードするＤＮＡを発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に組み込んだ（抗体Ｈ鎖Ｆａｂ領域発現ベクター）。
このベクターから生産されるＮ１抗体Ｈ鎖Ｆａｂ領域のアミノ酸配列（配列番号２）を図４８に示す。なお、Ｎ１抗体Ｈ鎖のアミノ酸配列（配列番号１）を図４７として示す。
Ｎ１抗体のＬκ鎖全長領域をコードするＤＮＡを発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１に組み込んだ（抗体Ｌκ鎖発現ベクター）。ただしこちらはタグなしで組み込んだ。このベクターから生産されるＮ１抗体Ｌκ鎖のアミノ酸配列（配列番号３）を図４９に示す。
生理活性ペプチドとして、ヒトプレキシンＢ１に対して結合する活性を有するｍＰ６−９を選択した。ｍＰ６−９は、Ｄ−Ｔｒｐ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ｉｌｅ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｔｒｐ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｖａｌ  Ｃｙｓのアミノ酸配列（配列番号４）を有する環状ペプチドであって、クロロアセチル化されたＤ−ＴｒｐがＣｙｓと環状構造を形成している。Ｆａｂ領域の各サイトに挿入されたｍＰ６−９のアミノ酸配列（配列番号５）は、Ｔｒｐ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ｉｌｅ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｔｒｐ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｖａｌである。
なお、図６及び図１３に示すとおり、挿入したアミノ酸配列のＮ末及びＣ末には、リンカーとしてＧｌｙを用いた（配列番号６〜３２）。
抗体Ｈ鎖−ペプチド融合ベクターは、上記抗体Ｈ鎖Ｆａｂ領域発現ベクターを元に、そのＦａｂ領域のエルボウ（Ｅ）サイト、ループ領域として、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ２―２、Ｂ３、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ２−２、Ｍ３、Ｍ３―２、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ６サイトを選び、そこにｍＰ６−９配列に相当するＤＮＡ配列を挿入することにより作製した。例えばＨ鎖のエルボウ（Ｅ）サイト挿入は以下に示す様に１１３位のセリン（Ｓ）と１１４位のアラニン（Ａ）（アミノ酸残基番号はＣｈｏｔｈｉａのナンバリングを使用）の間に括弧内のｍＰ６−９配列を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を挿入した（配列番号２０）。
．．．ＶＴＶＳＳ１１３−（ＧＷＲＰＹＩＥＲＷＴＧＲＬＩＶＧ）−Ａ１１４ＳＴＫＧ．．．
同様にＨ鎖の各サイトの挿入位置を図１３に示す。
ペプチド融合型抗体Ｈ鎖を含むＦａｂタンパク質は、抗体Ｈ鎖−ペプチド融合ベクターと、未融合の抗体Ｌκ鎖発現ベクターを共発現することにより構成し、それぞれＮ１＿Ｆａｂ＿ｍＰ６−９＿Ｍ１ＨのようにＮ１＿Ｆａｂ＿ペプチド名＿サイト名と命名した（図１６〜図１８）。
抗体Ｌ鎖−ペプチド融合ベクターは、上記抗体Ｌκ鎖発現ベクターを元に、その領域のエルボウ（Ｅ）サイト、ループ領域として、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ２―２、Ｂ３、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ２−２、Ｍ３、Ｍ３―２、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ５−２、Ｍ６サイトを選び、そこにｍＰ６−９配列に相当するＤＮＡ配列を挿入することにより作製した。例えばＬ鎖のエルボウ（Ｅ）サイト挿入は以下に示す様に１０８位のアルギニン（Ｒ）と１０９位のトレオニン（Ｔ）（アミノ酸残基番号はＣｈｏｔｈｉａのナンバリングを使用）の間に括弧内のｍＰ６−９配列を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を挿入した（配列番号６）。
．．．ＶＥＩＫＲ１０８−（ＧＷＲＰＹＩＥＲＷＴＧＲＬＩＶＧ）−Ｔ１０９ＶＡＡＰ．．．
同様にＬ鎖の各サイトの挿入位置を図６に示す。
ペプチド融合型抗体Ｌ鎖を含むＦａｂタンパク質は、抗体Ｌ鎖−ペプチド融合ベクターと、未融合の抗体Ｈ鎖Ｆａｂ領域発現ベクターを共発現することにより構成し、それぞれＮ１＿Ｆａｂ＿ｍＰ６−９＿Ｍ１ＬのようにＮ１＿Ｆａｂ＿ペプチド名＿サイト名と命名した（図９〜図１２）。
なお、ペプチド融合型抗体Ｈ鎖及びペプチド融合型Ｌ鎖であることを、サイト名において下付文字のＨ及びＬを用いて示した。
ペプチド融合型抗体Ｈ鎖又はペプチド融合型抗体Ｌ鎖を含むペプチド融合型Ｆａｂタンパク質（Ｆａｂｂｏｄｙ）は、抗体Ｈ鎖−ペプチド融合ベクターと未融合の抗体Ｌκ鎖発現ベクター、もしくは抗体Ｌ鎖−ペプチド融合ベクターと未融合の抗体Ｈ鎖Ｆａｂ領域発現ベクターを、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて共発現させることにより、その培養上清中に分泌させることで調製した。細胞の培養やトランスフェクションはサーモフィッシャーサイエンティフィック社の標準プロトコールに従っておこなった。
回収した培養上清０．２５ｍＬにＮｉ−ＮＴＡセファロース（キアゲン社製）を４０μＬ加え、２時間回転混和した。遠心分離によってセファロースを沈殿させて上清を除き、１ｍＬのＴｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＴＢＳ，２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．５）で２回セファロースを洗浄し、ＴＢＳに５００ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ｐＨ８．０を１２．５μＬ加え溶出し、さらにＳＤＳサンプルバッファー１２．５μＬを加えて９５℃で２分間加熱して試料を得た。溶出した試料の５μＬを非還元条件下で電気泳動に供し、クマシーブリリアントブルーで染色した。結果を図９及び図１６に示す。【００４１】
２．ペプチド融合タンパク質の標的分子に対する結合
様々なサイトにｍＰ６−９ペプチドを融合したＮ１＿Ｆａｂ（ｍＰ６−９ペプチド融合型Ｎ１＿Ｆａｂ）について、融合前のＮ１抗体が有していたニューロピリン１に対する結合能及び融合前のｍＰ６−９ペプチドが有していたヒトプレキシンＢ１に対する結合能をそれぞれ保持しているかどうかを調べるため、プルダウン型の結合試験を行った。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐ．  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２０１４；９５：２４０−２４７に記載された方法に準じて、ヒトプレキシンＢ１の細胞外領域のＣ末端にＰＡタグ（和光純薬工業社製）が付加された融合タンパク質をコードするコンストラクト、及びマウスニューロピリン１の細胞外領域のＣ末端にＰＡタグが付加された融合タンパク質をコードするコンストラクトをそれぞれ作成し、これを発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に組み込んだ。このベクターを用いて前述の方法によりＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞で一過性発現させ、可溶性受容体断片であるプレキシンＢ１−ＰＡ及びニューロピリン１−ＰＡを含む培養上清を調製した。
前述の様にｍＰ６−９ペプチド融合型Ｎ１＿ＦａｂをＮｉ−ＮＴＡセファロースにキャプチャーした後、上記の方法で別に調製したプレキシンＢ１−ＰＡ又はニューロピリン１−ＰＡを含む培養上清を反応させた。セファロースを洗浄し、前述のように結合蛋白質を溶出した後、非還元条件下で電気泳動に供し、クマシーブリリアントブルーで染色した。結果を、図１０及び図１１並びに図１７及び図１８に示す。
これらのデータは、ｍＰ６−９ペプチド融合型Ｎ１＿Ｆａｂが、ニューロピリン１とヒトプレキシンＢ１に対する結合能をそれぞれ有することを示唆する実験結果を示している。【００４２】
ｍＰ６−９ペプチド融合型Ｎ１＿Ｆａｂが、ニューロピリン１とヒトプレキシンＢ１に対して同時に結合能を有するかどうかを調べるため、プルダウン型の結合試験を行った。
マウスニューロピリン１の細胞外領域のＣ末端にＤＹＫＤＤＤＤＫタグ（配列番号３３）が付加された融合タンパク質をコードするコンストラクトを作成し、これを発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に組み込んだ。このベクターを用いて前述の方法によりＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞で一過性発現させ、可溶性受容体断片であるニューロピリン１−ＤＹＫＤＤＤＤＫを含む培養上清を調製した。ニューロピリン１−ＤＹＫＤＤＤＤＫを含む培養上清０．２５ｍＬをＡｎｔｉ  ＤＹＫＤＤＤＤＫ  ｔａｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｂｅａｄｓセファロース（和光純薬工業社製）４０μＬにキャプチャーした。遠心分離によってセファロースを沈殿させて上清を除き、１ｍＬのＴｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＴＢＳ，２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．５）で１回セファロースを洗浄した後、ｍＰ６−９ペプチド融合Ｆａｂを含む培養上清０．２５ｍＬを加え、さらに１時間回転混和して反応させた。再び遠心分離によってセファロースを沈殿させ、１ｍＬのＴＢＳで１回セファロースを洗浄し、続いてヒトプレキシンＢ１−ＰＡを含む培養上清０．２５ｍＬを加え、さらに１時間回転混和して反応させた。その後１ｍＬのＴＢＳで２回セファロースを洗浄し、ＴＢＳ１２．５μＬとＳＤＳサンプルバッファー１２．５μＬを加えて溶出を行い、９５℃で２分間加熱して試料を得た。溶出した試料の１０μＬを非還元条件下で電気泳動に供し、クマシーブリリアントブルーで染色した。結果を、図１２及び図１９に示す。
これらのデータは、ｍＰ６−９ペプチド融合型Ｎ１＿Ｆａｂが、ニューロピリン１とヒトプレキシンＢ１に対して同時に結合能を有することを示唆する実験結果を示している。【００４３】
３．ペプチド融合タンパク質の２種の標的分子への同時結合能
３−１．サンドイッチ型分子間架橋試験の原理と標的抗原の調製
ｍＰ６−９ペプチド融合型Ｎ１＿Ｆａｂが２種の標的分子に同時に結合できることを示すため、サンドイッチＥＬＩＳＡタイプのアッセイ系を構築した。原理を図２０Ａに示す。まずＰｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐ．  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２０１４；９５：２４０−２４７に記載された方法に準じて、第２標的分子としてのヒトプレキシンＢ１の細胞外領域のＣ末端にＰＡタグ（和光純薬工業社製）が付加された融合タンパク質をコードするコンストラクトを作成し、これを発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に組み込んだ。このベクターを用いて上記「２．」と同様の方法によりＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞で一過性発現させ、可溶性受容体断片であるプレキシンＢ１−ＰＡを含む培養上清を調製し、それらを抗ＰＡタグ抗体ビーズ（和光純薬工業社製）を用いて精製した。第１抗原側は、ＡＰ融合発現ベクターであるｐＡＰｔａｇ−５（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ社）を用いてＡＰのＮ末端（ニューロピリン１）にその細胞外領域の配列を融合し、上記「２．」と同様の方法によりＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞で一過性発現させ、可溶性受容体―ＡＰ融合物であるＮｒｐ１ｅｃ−ＡＰをそれぞれ含む培養上清を調製した。【００４４】
３−２．サンドイッチ型分子間架橋試験
ｍＰ６−９ペプチド融合型Ｎ１＿Ｆａｂによる２種の標的分子間の架橋は、図２０Ａに示す原理に基づき、以下のプロトコールに従って評価した。
（１）１０μｇ／ｍＬに希釈した精製第２標的抗原溶液５０μＬを９６ｗｅｌｌプレートに加え室温で、３時間静置した。
（２）精製第２標的抗原溶液を除去し、ＴＢＳにて１０倍希釈したＢｌｏｃｋｉｎｇ  Ｏｎｅ（ナカライテスク社製）（ＴＢＳ；２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．５）を２００μＬ／ｗｅｌｌ加えて４℃で一晩静置した。
（３）２００μＬ／ｗｅｌｌのＴＢＳで１回洗浄した。
（３）ｍＰ６−９ペプチド融合型Ｎ１＿Ｆａｂ発現上清を５０μＬ加えて室温で２．５時間静置した。
（４）２００μＬ／ｗｅｌｌのＴＢＳで３回洗浄した。
（５）ＡＰ融合第１標的抗原を発現する上清を５０μＬ加えて室温で２時間静置した。
（６）２００μＬ／ｗｅｌｌのＴＢＳで４回洗浄し、最後に１００μＬ／ｗｅｌｌのＴＢＳを加えた。
（７）発色基質（Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、シグマアルドリッチ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌでさらに加え、３７℃で３０分静置後、各ｗｅｌｌ中の溶液の４０５ｎｍの吸光度を測定した。結果を図２０Ｂに示す。
ｍＰ６−９ペプチド融合型Ｎ１＿Ｆａｂは、それぞれの第２標的抗原を固定化したプレートにキャプチャーされ、後から加えた第１標的抗原−ＡＰ融合タンパク質を結合して基質を発色させた。一方、ペプチド挿入をしていないＮ１＿Ｆａｂは陽性シグナルを与えなかった。このことは、ペプチド融合型Ｆａｂタンパク質であるＦａｂｂｏｄｙが第１及び第２標的に対して個別にでは無く、同時に結合できることを示している。【００４５】
［実施例２］
１．ペプチド融合タンパク質の調製
ペプチド融合型抗体Ｈ鎖又はペプチド融合型抗体Ｌ鎖を含むペプチド融合型ＩｇＧタンパク質は、抗体Ｈ鎖−ペプチド融合ベクターと未融合の抗体Ｌκ鎖発現ベクター、もしくは抗体Ｌ鎖−ペプチド融合ベクターと未融合の抗体Ｈ鎖ＩｇＧ領域発現ベクターを、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて共発現させることにより、その培養上清中に分泌させることで調製した。
回収した培養上清０．２５ｍＬにＰｒｏｔｅｉｎＡセファロース（ＧＥヘルスケア社製）を４０μＬ加え、１時間回転混和した。遠心分離によってセファロースを沈殿させて上清を除き、１ｍＬのＴｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＴＢＳ，２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．５）で２回セファロースを洗浄し、ＴＢＳを１２．５μＬとＳＤＳサンプルバッファー１２．５μＬを加えて溶出し、さらに９５℃で２分間加熱して試料を得た。溶出した試料の５μＬを還元条件下で電気泳動に供し、クマシーブリリアントブルーで染色した。結果を図２１に示す。【００４６】
２．ペプチド融合タンパク質の標的分子に対する結合
様々なサイトにｍＰ６−９ペプチドを融合したＮ１＿ＩｇＧ（ｍＰ６−９ペプチド融合型Ｎ１＿ＩｇＧ）について、融合前のＮ１抗体が有していたニューロピリン１に対する結合能及び融合前のｍＰ６−９ペプチドが有していたヒトプレキシンＢ１に対する結合能をそれぞれ保持しているかどうかを調べるため、プルダウン型の結合試験を行った。
ｍＰ６−９ペプチド融合型Ｎ１＿ＩｇＧをＰｒｏｔｅｉｎＡセファロースにキャプチャーした後、実施例１と同様の方法で別に調製したプレキシンＢ１−ＰＡ又はニューロピリン１−ＰＡを含む培養上清を反応させた。セファロースを洗浄し、前述のように結合蛋白質を溶出した後、還元条件下で電気泳動に供し、クマシーブリリアントブルーで染色した。結果を図２２及び図２３に示す。
これらのデータは、ｍＰ６−９ペプチド融合ＩｇＧが、ニューロピリン１とヒトプレキシンＢ１に対する結合能をそれぞれ有することを示唆する実験結果を示している。【００４７】
［実施例３］
生理活性ペプチドとして、ヒトプレキシンＢ１に対して結合する活性を有するｍＰ６−９に代えて、ヒトＭｅｔ受容体（Ｍｅｔ）に対して結合する活性を有するａＭＤ４を用いて、実施例１と同様に行った。
ａＭＤ４は、Ｄ−Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ｈｉｓ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｔｒｐ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｃｙｓのアミノ酸配列（配列番号３４）を有する環状ペプチドであって、クロロアセチル化されたＤ−ＴｙｒがＣｙｓと環状構造を形成している。Ｆａｂ領域の各サイトに挿入されたａＭＤ４のアミノ酸配列（配列番号３５）は、Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ｈｉｓ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｔｒｐ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ａｓｐである。
なお、図２４及び図２８に示すとおり、挿入したアミノ酸配列のＮ末及びＣ末には、リンカーとしてＧｌｙを用いた（配列番号３６〜５１）。
結果を図２５〜図２７及び図２９〜図３２に示す。【００４８】
［実施例４］
１．ペプチド融合タンパク質の調製
Ｆａｂタンパク質として、Ｎ１抗体に代えて、抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３抗体）のＦａｂを用いて、実施例１と同様に行った。
抗体Ｈ鎖−ペプチド融合ベクターは、ＯＫＴ３抗体Ｈ鎖Ｆａｂ領域発現ベクターを元に、ループ領域として、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ２−２、Ｂ３サイトを選び、そこに実施例３で用いたａＭＤ４配列又はａＭＤ５配列に相当するＤＮＡ配列を挿入することにより作製した。抗体Ｌ鎖−ペプチド融合ベクターは、ＯＫＴ３抗体Ｌκ鎖発現ベクターを元に、ループ領域として、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ２―２、Ｂ３サイトを選び、そこにａＭＤ４配列又はａＭＤ５配列に相当するＤＮＡ配列を挿入することにより作製した。Ｈ鎖又はＬ鎖における生理活性ペプチドの挿入部位は図２４及び図２８に示す挿入部位とＣｈｏｔｈｉａのアミノ酸残基番号に基づいたナンバリングにより、ＯＫＴ３抗体のＦａｂにおいて対応する部位である。
ａＭＤ４については、実施例３と同様である。
ａＭＤ５は、Ｄ−Ｔｙｒ  Ｔｒｐ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｐｒｏ  Ｃｙｓのアミノ酸配列（配列番号５２）を有する環状ペプチドであって、クロロアセチル化されたＤ−ＴｙｒがＣｙｓと環状構造を形成している。Ｆａｂ領域の各サイトに挿入されたａＭＤ５のアミノ酸配列（配列番号５３）は、Ｔｙｒ  Ｔｒｐ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｐｒｏである。  挿入したアミノ酸配列のＮ末及びＣ末には、リンカーとしてＧｌｙを用いた。
実施例１と同様の方法でＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて共発現させ、その培養上清中をＮｉ−ＮＴＡセファロースにキャプチャーし、洗浄・溶出後に電気泳動することにより得られた結果を図３３に示す。【００４９】
２．ペプチド融合タンパク質の標的分子に対する結合
融合前のａＭＤ４又はａＭＤ５ペプチドが有していたヒトＭｅｔ受容体（Ｍｅｔ）に対する結合能を、それぞれ保持しているかどうかを調べるため、プルダウン型の結合試験を行った。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞で一過性発現させた可溶性受容体断片であるＭｅｔ−ＰＡを含む培養上清１．０ｍＬを抗ＰＡタグ抗体ビーズ（和光純薬工業社製）でキャプチャーし、遠心分離によってセファロースを沈殿させて上清を除き、１ｍＬのＴｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＴＢＳ，２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．５）で１回セファロースを洗浄した後、製造したペプチド融合Ｆａｂ含む培養上清０．８ｍＬを加え、さらに１時間回転混和して反応させた。再び遠心分離によってセファロースを沈殿させ、１ｍＬのＴＢＳで２回セファロースを洗浄し、ＴＢＳを１２．５μＬとＳＤＳサンプルバッファー１２．５μＬを加えて溶出し、さらに９５℃で２分間加熱して試料を得た。溶出した試料の１２μＬを非還元条件下で電気泳動に供し、クマシーブリリアントブルーで染色した。結果を図３４に示す。【００５０】
３．ペプチド融合タンパク質の細胞表面の標的分子に対する結合
様々な位置にａＭＤ４ペプチドを挿入したａＭＤ４ペプチド融合型ＯＫＴ３＿Ｆａｂについて、ヒトＭｅｔ受容体（Ｍｅｔ）に対する結合能を保持しているかどうかを調べるため、フローサイトメトリーによる結合試験を行った。ＯＫＴ３＿Ｆａｂ及び６種類のａＭＤ４ペプチド融合型ＯＫＴ３＿Ｆａｂの発現上清を、ＣＤ３を発現するヒトＴリンパ球性白血病由来Ｊｕｒｋａｔ細胞あるいはヒトＭｅｔ受容体安定発現ＣＨＯ細胞と反応させ、結合したＦａｂをＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）で染色し、ＥＣ８００型フローサイトメーター（ＳＯＮＹ社製）で分析した。結果を図３５に示す。
上段ではＣＤ３を細胞表面上に発現するＪｕｒｋａｔ細胞に対してｐｌａｉｎ−Ｆａｂ（ＯＫＴ３−Ｆａｂ）及びａＭＤ４ペプチド融合型ＯＫＴ３＿Ｆａｂが結合するかを確認しており、ｎｏ−Ｆａｂの灰色の領域に対して水色で示した領域は右にシフトしており、結合が確認できる。このことからａＭＤ４ペプチド融合型ＯＫＴ３＿Ｆａｂにおいても本来のＣＤ３抗原への結合能は失われていない。下段では、ａＭＤ４ペプチド挿入によって付加されたＭｅｔへの結合能を調べており、Ｍｅｔ−ＣＨＯ（細胞表面上に  Ｍｅｔを発現）に対し、ａＭＤ４ペプチド融合型ＯＫＴ３＿Ｆａｂではシフトしており結合が確認できる。一方、ｐｌａｉｎ−Ｆａｂ（ＯＫＴ３−Ｆａｂ）では、シフトは見られない。このことから、ａＭＤ４ペプチド融合型ＯＫＴ３＿Ｆａｂにおいて、ａＭＤ４ペプチドを融合したことにより、新たにＭｅｔ特異的結合能が付加されていることが確認できる。            【００５１】
［実施例５］
Ｆａｂタンパク質として、Ｎ１抗体に代えて、抗ＣＤ３抗体（ＵＣＨＴ１抗体）のＦａｂを用いて、実施例４と同様に行った。結果を図３６〜図３８に示す。
ａＭＤ４ペプチドを融合したことにより、ａＭＤ４ペプチド融合型ＵＣＨＴ１＿Ｆａｂにおいても、新たにＭｅｔ特異的結合能が付加されていることが確認できる。【００５２】
［実施例６］
１．ペプチド融合タンパク質の調製
Ｆａｂタンパク質として、Ｎ１抗体に代えて、抗ＣＤ１６抗体（３Ｇ８抗体）のＦａｂを用いて、実施例４と同様に行った。結果を図３９に示す。【００５３】
２．ペプチド融合タンパク質の標的分子に対する結合
融合前の３Ｇ８抗体が有していたＣＤ１６に対する結合能を保持しているかどうかを調べるため、プルダウン型の結合試験を行った。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞で一過性発現させた可溶性受容体断片であるＣＤ１６−ＰＡを含む培養上清０．５ｍＬを抗ＰＡタグ抗体ビーズ（和光純薬工業社製）でキャプチャーし、遠心分離によってセファロースを沈殿させて上清を除き、１ｍＬのＴｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＴＢＳ，２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．５）で１回セファロースを洗浄した後、製造したペプチド融合Ｆａｂ含む培養上清０．２５ｍＬを加え、さらに１時間回転混和して反応させた。再び遠心分離によってセファロースを沈殿させ、１ｍＬのＴＢＳで２回セファロースを洗浄し、ＴＢＳを１２．５μＬとＳＤＳサンプルバッファー１２．５μＬを加えて溶出し、さらに９５℃で２分間加熱して試料を得た。溶出した試料の２０μＬを非還元条件下で電気泳動に供し、クマシーブリリアントブルーで染色した。結果を図４０に示す。【００５４】
融合前のａＭＤ４又はａＭＤ５ペプチドが有していたヒトＭｅｔ受容体（Ｍｅｔ）に対する結合能を、それぞれ保持しているかどうかを調べるため、プルダウン型の結合試験を行った。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞で一過性発現させた可溶性受容体断片であるＭｅｔ−ＰＡを含む培養上清０．５ｍＬを抗ＰＡタグ抗体ビーズ（和光純薬工業社製）でキャプチャーし、遠心分離によってセファロースを沈殿させて上清を除き、１ｍＬのＴｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＴＢＳ，２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．５）で１回セファロースを洗浄した後、製造したペプチド融合Ｆａｂ含む培養上清０．２５ｍＬを加え、さらに１時間回転混和して反応させた。再び遠心分離によってセファロースを沈殿させ、１ｍＬのＴＢＳで２回セファロースを洗浄し、ＴＢＳを１２．５μＬとＳＤＳサンプルバッファー１２．５μＬを加えて溶出し、さらに９５℃で２分間加熱して試料を得た。溶出した試料の２０μＬを非還元条件下で電気泳動に供し、クマシーブリリアントブルーで染色した。結果を図４１に示す。【００５５】
［実施例７］
１．ペプチド融合タンパク質（三重特異性）の調製
抗体Ｈ鎖−ｍＰ６−９ペプチド融合ベクターは、実施例１に記載の抗体Ｈ鎖Ｆａｂ領域発現ベクターを元に、そのＦａｂ領域のエルボウ（Ｅ）サイト、ループ領域として、Ｂ１、Ｂ２―２、Ｍ４、サイトを選び、そこにｍＰ６−９配列に相当するＤＮＡ配列を組み込むことにより作製した。
抗体Ｌ鎖−ｍＰ６−９ペプチド融合ベクターは、実施例１に記載の抗体Ｌκ鎖発現ベクターを元に、そのＦａｂ領域のエルボウ（Ｅ）サイト、ループ領域として、Ｂ１、Ｍ１、Ｍ２−２サイトを選び、そこにｍＰ６−９配列に相当するＤＮＡ配列を組み込むことにより作製した。
抗体Ｈ鎖−ａＭＤ４ペプチド融合ベクターは、実施例１に記載の抗体Ｈ鎖Ｆａｂ領域発現ベクターを元に、そのＦａｂ領域のエルボウ（Ｅ）サイト、ループ領域として、Ｂ１、Ｂ２、Ｍ４、Ｍ５、サイトを選び、そこにａＭＤ４配列に相当するＤＮＡ配列を組み込むことにより作製した。
抗体Ｌ鎖−ａＭＤ４ペプチド融合ベクターは、実施例１に記載の抗体Ｌκ鎖発現ベクターを元に、そのＦａｂ領域のエルボウ（Ｅ）サイト、ループ領域として、Ｂ２−２、Ｍ２、Ｍ２−２サイトを選び、そこにａＭＤ４配列に相当するＤＮＡ配列を組み込むことにより作製した。
Ｈ鎖又はＬ鎖における生理活性ペプチドの挿入部位は図６及び図１３に示す挿入部位である。
三重特異性ペプチド融合型Ｆａｂタンパク質は、抗体Ｈ鎖−ｍＰ６−９ペプチド融合ベクターと抗体Ｌ鎖−ａＭＤ４ペプチド融合ベクター、もしくは抗体Ｈ鎖−ａＭＤ４ペプチド融合ベクターと抗体Ｌ鎖−ｍＰ６−９ペプチド融合ベクターを、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて共発現させることにより、その培養上清中に分泌させることで調製した。細胞の培養やトランスフェクションはサーモフィッシャーサイエンティフィック社の標準プロトコールに従っておこなった。
回収した培養上清０．２５ｍＬにＮｉ−ＮＴＡセファロース（キアゲン社製）を４０μＬ加え、１時間回転混和した。遠心分離によってセファロースを沈殿させて上清を除き、１ｍＬのＴｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＴＢＳ，２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．５）で２回セファロースを洗浄し、ＴＢＳに５００ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ｐＨ８．０を１２．５μＬ加え溶出し、さらにＳＤＳサンプルバッファー１２．５μＬを加えて９５℃で２分間加熱して試料を得た。溶出した試料の５μＬを非還元条件下で電気泳動に供し、クマシーブリリアントブルーで染色した。結果を図４２に示す。【００５６】
２．ペプチド融合タンパク質（三重特異性）の標的分子に対する結合
三重特異性ペプチド融合型Ｆａｂタンパク質について、それぞれニューロピリン１に対する結合能、融合前のｍＰ６−９ペプチドが有していたヒトプレキシンＢ１に対する結合能、融合前のａＭＤ４ペプチドが有していたヒトＭｅｔ受容体（Ｍｅｔ）に対して結合能を、それぞれ保持しているかどうかを調べるため、プルダウン型の結合試験を行った。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐ．  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２０１４；９５：２４０−２４７に記載された方法に準じて、ヒトプレキシンＢ１の細胞外領域のＣ末端にＰＡタグ（和光純薬工業社製）が付加された融合タンパク質をコードするコンストラクト、ヒトＭｅｔ受容体の細胞外領域のＣ末端にＰＡタグ（和光純薬工業社製）が付加された融合タンパク質をコードするコンストラクト、及びマウスニューロピリン１の細胞外領域のＣ末端にＰＡタグが付加された融合タンパク質をコードするコンストラクトをそれぞれ作成し、これを発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に組み込んだ。このベクターを用いて前述の方法によりＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞で一過性発現させ、可溶性受容体断片であるプレキシンＢ１−ＰＡ、Ｍｅｔ−ＰＡ及びニューロピリン１−ＰＡを含む培養上清を調製した。
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞で一過性発現させた可溶性受容体断片であるプレキシンＢ１−ＰＡ、Ｍｅｔ−ＰＡもしくはニューロピリン１−ＰＡのいずれかを含む培養上清１．０ｍＬを抗ＰＡタグ抗体ビーズ（和光純薬工業社製）でキャプチャーし、遠心分離によってセファロースを沈殿させて上清を除き、１ｍＬのＴｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＴＢＳ，２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．５）で１回セファロースを洗浄した後、製造したペプチド融合Ｆａｂ含む培養上清１．０ｍＬを加え、さらに１時間回転混和して反応させた。再び遠心分離によってセファロースを沈殿させ、１ｍＬのＴＢＳで２回セファロースを洗浄し、ＴＢＳを１２．５μＬとＳＤＳサンプルバッファー１２．５μＬを加えて溶出し、さらに９５℃で２分間加熱して試料を得た。溶出した試料の５μＬを非還元条件下で電気泳動に供し、クマシーブリリアントブルーで染色した。ニューロピリン１−ＰＡとの結果を図４３に、プレキシンＢ１−ＰＡとの結果を図４４に、Ｍｅｔ−ＰＡとの結果を図４５Ｎに示す。
図４３〜図４５の結果から、三重特異性ペプチド融合型Ｆａｂが、ニューロピリン１に対する結合能、融合前のｍＰ６−９ペプチドが有していたヒトプレキシンＢ１に対する結合能、融合前のａＭＤ４ペプチドが有していたヒトＭｅｔ受容体に対して結合能を、それぞれ保持していることが確認できる。【００５７】
３．ペプチド融合タンパク質の２種の標的分子への同時結合能
３−１．サンドイッチ型分子間架橋試験の原理と標的抗原の調製
三重特異性ペプチド融合型Ｆａｂが２種の標的分子に同時に結合できることを示すため、サンドイッチＥＬＩＳＡタイプのアッセイ系を構築した。原理を図４６Ａに示す。まずＰｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐ．  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  ２０１４，  ９５，  ２４０−２４７に記載された方法に準じて、第２標的分子としてのヒトプレキシンＢ１又はヒトＭｅｔ受容体の細胞外領域のＣ末端にＰＡタグ（和光純薬工業社製）が付加された融合タンパク質をコードするコンストラクトを作成し、これを発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に組み込んだ。このベクターを用いて実施例１と同様の方法によりＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞で一過性発現させ、可溶性受容体断片であるプレキシンＢ１−ＰＡ及びＭｅｔ−ＰＡをそれぞれ含む培養上清を調製し、それらを抗ＰＡタグ抗体ビーズ（和光純薬工業社製）で精製した。第１抗原側は、ＡＰ融合発現ベクターであるｐＡＰｔａｇ−５（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ社）を用いてＡＰのＮ末端（ニューロピリン１）にその細胞外領域の配列を融合し、実施例１と同様の方法によりＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞で一過性発現させ、可溶性受容体―ＡＰ融合物であるＮｒｐ１ｅｃ−ＡＰをそれぞれ含む培養上清を調製した。【００５８】
３−２．サンドイッチ型分子間架橋試験
三重特異性ペプチド融合型Ｆａｂ（三重特異性のＦａｂｂｏｄｙ）による標的分子間の架橋は、図２０Ａに示す原理に基づき、以下のプロトコールに従って評価した。
（１）１０μｇ／ｍＬに希釈した精製第２標的抗原溶液５０μＬを９６ｗｅｌｌプレートに加え室温で、３時間静置した。
（２）精製第２標的抗原溶液を除去し、ＴＢＳにて１０倍希釈したＢｌｏｃｋｉｎｇ  Ｏｎｅ（ナカライテスク社製）（ＴＢＳ；２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．５）を２００μＬ／ｗｅｌｌ加えて４℃で一晩静置した。
（３）２００μＬ／ｗｅｌｌのＴＢＳで１回洗浄した。
（３）三重特異性ペプチド融合型Ｆａｂ発現上清を５０μＬ加えて室温で２．５時間静置した。
（４）２００μＬ／ｗｅｌｌのＴＢＳで３回洗浄した。
（５）ＡＰ融合第１標的抗原を発現する上清を５０μＬ加えて室温で２時間静置した。
（６）２００μＬ／ｗｅｌｌのＴＢＳで４回洗浄し、最後に１００μＬ／ｗｅｌｌのＴＢＳを加えた。
（７）発色基質（Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、シグマアルドリッチ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌで加え、３７℃で３０分静置後、各ｗｅｌｌ中の溶液の４０５ｎｍの吸光度を測定した。結果を図４６Ｂに示す。
三重特異性ペプチド融合型Ｆａｂはそれぞれの第２標的抗原を固定化したプレートにキャプチャーされ、後から加えた第１標的抗原−ＡＰ融合タンパク質を結合して基質を発色させた。一方、ペプチド挿入をしていないＮ１＿Ｆａｂは陽性シグナルを与えなかった。このことは、三重特異性ペプチド融合型ＦａｂであるＦａｂｂｏｄｙがプレキシンＢ１とニューロピリン、もしくはＭｅｔとニューロピリンに同時に結合できることを示している。すなわち、本実験結果は、製造されたＦａｂｂｏｄｙが三重特異性を有することを示唆している。【００５９】
ＩｇＧの抗原結合部位であるＦａｂ領域に１つの生理活性ペプチドを融合することにより、Ｆａｂ領域における本来の抗原結合部位を活かしつつ、融合された生理活性ペプチドの生理活性に基づく新たな結合能をペプチド融合タンパク質に付加することができた。
ＩｇＧの抗原結合部位であるＦａｂ領域を有するタンパク質として、Ｆａｂを用いた場合には、二重特異性Ｆａｂを簡便に構築することができた。本明細書において、二重特異性Ｆａｂは、Ｆａｂｂｏｄｙの一種である。
Ｆａｂはヘテロダイマーで存在するのでＨ鎖及びＬ鎖へそれぞれ異なる生理活性ペプチド由来のアミノ酸配列を挿入することが可能である。したがって、三重特異性Ｆａｂや、四重特異性以上のＦａｂ等の、多重特異性Ｆａｂの開発に繋げることが可能である。実際、三重特異性Ｆａｂについては、Ｆａｂ領域における本来の抗原結合部位を活かしつつ、融合された２種の生理活性ペプチドの生理活性に基づく新たな結合能をペプチド融合タンパク質に付加することができたことを確認している。
また、ＩｇＧやＦａｂだけではなく、図３〜５に示すような抗原決定部位の異なるＢｉｓｐｅｃｉｆｉｃな抗体又はその小型断片や誘導体に対して生理活性ペプチド由来のアミノ酸配列を挿入して、多重特異性抗体として開発することも可能である。
生理活性ペプチドが、アゴニスト活性を有する場合には、生理活性由来ペプチドのアゴニスト活性を有するＦａｂの開発に繋がる。また、生理活性ペプチドがアゴニスト活性を有していない場合であっても、生理活性ペプチドを融合した本発明の人工タンパク質とすることで、人工タンパク質としてアゴニスト活性を有することも可能である。
ＦａｂのＦｖ領域においてもＬ鎖及びＨ鎖共に、生理活性ペプチド由来のアミノ酸配列の挿入及び活性の維持が可能なことが確かめられているため、ｓｃＦｖ、Ｄｉａｂｏｄｙ、ｔａＦｖ等のＦｖ領域を少なくとも有するフラグメントに対しても生理活性ペプチドを挿入することが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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