(57)【要約】【課題】  長期造血幹細胞および短期造血幹細胞を分離する方法、長期造血幹細胞において特異的に発現する遺伝子群を同定する方法、長期造血幹細胞様の長期自己複製能維持に関与する遺伝子を同定する方法、および、そのような遺伝子を用いて造血幹細胞において長期自己複製能維持特性を付与または増強する方法を提供すること。【解決手段】  長期造血幹細胞においてのみ発現する遺伝子としてＨｏｘｂ５遺伝子をマーカーとすることにより、長期造血幹細胞および短期造血幹細胞を分離することが可能となり、これらの細胞群を比較することで、長期自己複製能維持特性に関与する遺伝子をスクリーニングすることが可能となった。実際に、長期造血幹細胞に特異的に発現するＨｏｘｂ５遺伝子を短期造血幹細胞において発現させることにより、自己複製能維持特性が増強されることが確認された。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
造血幹細胞から長期造血幹細胞と短期造血幹細胞を分離する方法。
【請求項２】
長期造血幹細胞において特異的に発現する遺伝子マーカーの発現に基づいて、当該遺伝子を発現する細胞を長期造血幹細胞とし、当該遺伝子を発現しない細胞を短期造血幹細胞として単離する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝子マーカーがＨｏｘｂ５である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法により分離した長期造血幹細胞と短期造血幹細胞の遺伝子発現を比較し、長期造血幹細胞で特異的に発現する遺伝子を同定する方法。
【請求項５】
前記長期造血幹細胞で特異的に発現する遺伝子から、短期造血幹細胞において自己複製能維持特性を付与または増強する遺伝子を同定する工程をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、長期造血幹細胞および短期造血幹細胞の分離方法、当該方法により分離された長期造血幹細胞において特異的に発現する遺伝子の同定方法、さらに当該方法で同定された遺伝子から、長期自己複製能維持に関連する遺伝子を同定する方法、並びに、当該方法により同定された遺伝子の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
造血幹細胞は、自己複製能と多分化能を有する血液の幹細胞である。造血幹細胞は、細胞分裂をする際に、自己複製か細胞分化どちらかを選択し、自己複製した細胞は造血幹細胞のまま留まり、分化した細胞はさらに細胞分裂・分化を続け成熟血液細胞となる。これまで、ＣＤ３４、ｃ−Ｋｉｔ、Ｓｃａ−１、Ｌｉｎｅａｇｅ  ｍａｒｋｅｒ（Ｌｉｎ）等のマーカーを用いて造血幹細胞を区別する試みがなされ、マウス造血幹細胞がＬｉｎ−、ｃ−Ｋｉｔ＋、Ｓｃａ−１＋、ＣＤ１５０＋、ＣＤ３４−／低、Ｆｌｋ２−分画に高度に濃縮されることなどが示されていたものの、当該濃縮された造血幹細胞集団においても、その自己複製能は様々に異なることが知られていた（非特許文献１）。特に、自己複製能の長期維持は、造血幹細胞の中でも長期造血幹細胞と呼ばれる非常にまれな細胞分画にのみ認められる生物学的特徴であり、このような造血幹細胞は、その他の短期造血幹細胞と区別される。しかしながら、長期造血幹細胞が自己複製能を維持する詳細な分子メカニズムは不明であり、これを解明することは、体外での培養技術開発や医療に大きく貢献することものと期待されている（非特許文献１、非特許文献２）。【０００３】
特に、これまで長期造血幹細胞の分子メカニズムの詳細を明らかにする上で大きな問題のひとつは、長期造血幹細胞を分離し純化することが不可能であったことである。例えば、従来、長期造血幹細胞を分離することが不可能であったため、造血幹細胞に特有の性質、例えば自己複製能維持に関与する遺伝子を同定する際には、造血幹細胞と他の分化細胞を比較する方法が採用されていた。しかしながら、造血幹細胞と分化細胞は自己複製能維持特性以外にも様々に異なる特性を有しているため、当該比較によって同定される遺伝子が自己複製能維持特性に関与するものであることを結論付けることは困難であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】日本輸血細胞治療学会誌、２００６年、Ｖｏｌ．５２、Ｎｏ．５、ｐｐ．５８３−５８８
【非特許文献２】臨床血液、２０１６年、Ｖｏｌ．５７、Ｎｏ．１０、ｐｐ．１１−１７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、長期造血幹細胞の分子メカニズムを明らかとするため、長期造血幹細胞および短期造血幹細胞を分離する方法を提供し、これにより、長期造血幹細胞において特異的に発現する遺伝子群を同定する方法を提供することを課題とする。【０００６】
また、本発明は、長期造血幹細胞において特異的に発現する遺伝子群をさらに解析することにより、長期造血幹細胞の長期自己複製能維持に関与する遺伝子を同定することを可能とし、そのような遺伝子を用いて造血幹細胞に長期自己複製能維持特性を付与または増強する方法を提供することを課題とする。
【発明を解決するための手段】
【０００７】
本発明者が鋭意研究を進めたところ、マウスにおいて長期造血幹細胞特異的にＨｏｘｂ５遺伝子が発現していることが見いだされた。Ｈｏｘｂ５を有するキメラマウスから得られた骨髄細胞集団を、別の放射線照射したマウスに移植する２世代移植を行う継代移植法を行った結果、Ｈｏｘｂ５遺伝子を発現する細胞は、当該２世代目の移植受容マウスにおいて、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、顆粒白血球、単球など、様々な細胞に分化していることが確認され、Ｈｏｘｂ５遺伝子を発現する細胞が、長期に亘って造血幹細胞として機能する長期造血幹細胞であることが確認された。
【０００８】
当該知見を受けて、本発明者は造血幹細胞集団からＨｏｘｂ５遺伝子を発現する造血幹細胞集団を分離することで、純化した長期造血幹細胞を得るとともに、Ｈｏｘｂ５遺伝子を発現しない細胞を別に分離することで、純化した短期造血幹細胞を得た。
【０００９】
これら純化した長期造血幹細胞において発現する遺伝子と、短期造血幹細胞において発現する遺伝子とを比較することにより、特に、長期造血幹細胞においてのみ発現する遺伝子を同定することが可能となった。
【００１０】
従来、長期造血幹細胞を分離することが不可能であったため、造血幹細胞に特有の性質、例えば自己複製能維持に関与する遺伝子を同定する際には、造血幹細胞と他の分化細胞を比較する方法が採用されていた。しかしながら、造血幹細胞と分化細胞は自己複製能維持特性以外にも様々に異なる特性を有しているため、当該比較によって同定される遺伝子が自己複製能維持特性に関与するものであることを結論付けることは困難であった。
【００１１】
理論に拘束されるものではないが、本発明の方法により、専ら自己複製能維持特性において異なる長期造血幹細胞と短期造血幹細胞を比較することが可能となり、長期自己複製能維持に関与する遺伝子を同定し得ることが可能となった。
【００１２】
実際に、長期造血幹細胞のみにおいて発現するＨｏｘｂ５遺伝子を、短期造血幹細胞において強制的に発現させると、細胞の分化が抑制され、長期自己複製能維持特性が亢進することが確認された。
【００１３】
したがって、上記長期造血幹細胞においてのみ発現する遺伝子（群）から、長期自己複製能維持特性を付与または増強させる遺伝子をスクリーニングする方法および当該機能を有する遺伝子を提供し得ることが見いだされた。
【００１４】
これら知見に基づき、本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち、本発明は一態様において以下のものを提供する。
【００１６】
［１］造血幹細胞から長期造血幹細胞と短期造血幹細胞を分離する方法。
【００１７】
［２］長期造血幹細胞において特異的に発現する遺伝子マーカーの発現に基いて、当該遺伝子を発現する細胞を長期造血幹細胞とし、当該遺伝子を発現しない細胞を短期造血幹細胞として単離する工程を含む、前記［１］に記載の方法。
【００１８】
［３］前記遺伝子マーカーがＨｏｘｂ５である、前記［２］に記載の方法。
【００１９】
［４］前記［１］〜［３］のいずれかに記載の方法により分離した長期造血幹細胞と短期造血幹細胞の遺伝子発現を比較し、長期造血幹細胞で特異的に発現する遺伝子を同定する方法。
【００２０】
［５］前記長期造血幹細胞で特異的に発現する遺伝子から、短期造血幹細胞において自己複製能維持特性を付与または増強する遺伝子を同定する工程をさらに含む、前記［４］に記載の方法。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、長期造血幹細胞および短期造血幹細胞の分離が可能となり、分離および純化された長期造血幹細胞の特性を研究することで、長期造血幹細胞の有する長期自己複製能維持特性をもたらす分子メカニズムの解明が進むことが期待される。また、当該純化された長期造血幹細胞と短期造血幹細胞の相違点、例えば、遺伝子発現量等を比較することにより、長期自己複製能維持特性に関与する遺伝子を同定することが可能となる。さらに、これら長期自己複製能維持特性に関与する遺伝子（群）から、長期自己複製能維持特性を付与または増強させる遺伝子を単離することが可能となる。当該遺伝子を用いることで、体外細胞培養において細胞分化を抑制することで、より大量の培養造血幹細胞を得ることや、当該遺伝子の発現を制御することで、細胞分化を制御することが可能となる。
また、近年ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞といった多能性幹細胞から様々な細胞を分化させる技術が試みられているところ、本願発明の長期自己複製能維持特性を付与または増強させる遺伝子を用いることにより、これら多能性幹細胞から造血幹細胞を分化作製する際に、自己複製能を付加する遺伝子として使用することが可能となる。
また、造血幹細胞における自己複製能の低下は、老化等による造血能の低下と関連することが知られており、本願発明のＨｏｘｂ５を含む長期自己複製能維持特性を付与または増強させる遺伝子をマーカーとして用いることで、血液細胞老化抑制因子の探索が可能になる。
さらに、本願発明の造血幹細胞に長期自己複製能維持特性を付与または増強させる遺伝子は、他の幹細胞の自己複製能維持においても重要な機能を有する可能性があり、自己複製能増強作用を有する可能性もある。当該遺伝子の機能を様々な幹細胞においても研究することで、幹細胞の自己複製能の分子機構をさらに明らかにすることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】長期造血幹細胞に特異的に発現を認める遺伝子を示す図である。
【図２】Ｈｏｘｂ５遺伝子を形質導入することにより、自己複製能が増強されたことを示す図である。
【図３】スクリーニングに用いるレンチウイルスベクターの模式図を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明の実施形態について説明する。以下の説明は単なる例示であり、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
【００２４】
（定義）
本明細書において、複数の数値の範囲が示された場合、それら複数の範囲の任意の下限値および上限値の組み合わせからなる範囲も同様に意味する。
【００２５】
本明細書において「スクリーニング」とは、目的とするある特定の性質をもつ生物または物質などの標的を、特定の操作／評価方法で多数を含む集団の中から選抜することをいう。本明細書においては、「同定」、「分離」、「単離」、「純化」といった用語も、同様の意味で使用されることがある。
【００２６】
本明細書において、「造血幹細胞」とは、すべての血球（赤血球、白血球、巨核球および血小板等）に最終的に分化し得る多分化能性幹細胞を意味する。造血幹細胞は、前駆細胞もしくは芽細胞への分化の中間段階を包含し得る。「前駆細胞」もしくは「芽細胞」は、本発明において交換可能に使用され、低下した分化能を有するが、特定の系列（例えば、骨髄系統もしくはリンパ系統）の異なる細胞へとなお成熟する能力がある、成熟しつつある細胞を意味する。一態様において、造血幹細胞は、マーカーＬｉｎ−、ｃ−Ｋｉｔ＋、Ｓｃａ−１＋、ＣＤ１５０＋、ＣＤ３４−／低、Ｆｌｋ２−や、マーカーＬｉｎ−、ＣＤ４８−、ＣＤ４１−、ＣＤ１５０＋等で同定することができる（Ｃｅｌｌ、２００５年、Ｖｏｌ．１２１、ｐｐ．１１０９−１１２１）。
【００２７】
本明細書において、「長期造血幹細胞」とは、細胞分裂を経ても自己複製能を長期に維持する造血幹細胞を意味し、細胞分裂によって生み出される２つの娘細胞の少なくとも一方は、分裂前の細胞と同様の造血幹細胞の形質を維持する。一態様において、長期造血幹細胞は生体内の通常の培養環境または生体外の培養環境において、細胞分裂によって自己複製能を全く失わない。また、一態様において、長期造血幹細胞は１００回、５０回、２０回または１０回の細胞分裂を経ても、自己複製能を維持する。
【００２８】
当該自己複製能が維持されていることは、様々な公知の方法によって確認することができる。例えば、一定期間培養した後の細胞群に含まれる未分化細胞集団の含有率を測定することで、自己複製能が維持されていることを確認することができる。未分化細胞集団は、ｃ−Ｋｉｔ、Ｓｃａ−１、ＣＤ１１ｂなどの公知のマーカーにより同定することができる。
【００２９】
また、一態様において、造血幹細胞が細胞分裂を経ても自己複製能を長期に維持していることは、公知の継代移植法によって確認することもできる。一態様において、継代移植法では、長期造血幹細胞の候補細胞を放射線照射した動物（動物１）に移植し、移植から一定期間後に当該移植動物から全骨髄細胞もしくはその一部をさらに別に放射線照射した動物（動物２）に移植する。動物１において細胞分裂する間、自己複製能を維持する造血幹細胞は、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、顆粒球および単球といった分化細胞を産生する一方で、骨髄組織において自己の複製である造血幹細胞を産生し続ける。一方、動物１において自己複製能を維持することができなかった造血幹細胞は、細胞分裂によって、上記ＮＫ細胞等の分化細胞となり、骨髄組織中に自己の複製である造血幹細胞を維持することができない。したがって、動物１において自己複製能を維持した造血幹細胞は、動物１の全骨髄細胞を移植した動物２においても造血幹細胞として維持されつつ、分裂によって上記のような様々な細胞系列の分化細胞を産生することができる。これに対して、動物１において自己複製能を維持することができなかった造血幹細胞は、動物１の全骨髄細胞を移植した動物２において、そのほとんどが分化細胞として移植され、もはや動物２において限定的な造血能を示すにすぎないか、もしくは全く造血能を有しておらず、多様な分化細胞を持続的に産生することはない。一態様において、マウスにおいて継代移植法を行う場合、動物１への候補細胞移植から動物２への移植までの期間は、４、８、１２、１６週である。一態様において、長期造血幹細胞は、動物２において、少なくとも２種類、３種類、４種類以上の細胞型の分化細胞を産生し、産生される分化細胞は、主要な細胞型の分化細胞の他に、全体に対して少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％以上の他の細胞型の分化細胞を含む。一態様において、長期造血幹細胞は動物２において、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、顆粒球および単球から選ばれる１、２、３、４以上の細胞型の細胞を産生する。
【００３０】
本明細書において、「短期造血幹細胞」とは、造血幹細胞のうち、細胞分裂を経る際に自己複製能を長期に維持することができない造血幹細胞を意味する。一態様において、短期造血幹細胞は、上記「長期造血幹細胞」に該当しない造血幹細胞を意味する。また、一態様において、短期造血幹細胞は、上記「長期造血幹細胞」に該当しない造血幹細胞の中でも、特に、自己複製能を維持する期間が短いものを意味する。このような「短期造血幹細胞」の短期自己複製能維持特性は、上記「長期造血幹細胞」について述べたものと同様の方法により、細胞分裂前後の細胞の形質の比較や、継代移植法により確認することができる。
【００３１】
本明細書においてある性質または形質が「長期造血幹細胞に特異的」であるとは、当該性質または形質が、「長期造血幹細胞」には認められる一方、他の細胞や造血幹細胞、例えば、「短期造血幹細胞」には実質的に認められないことを意味する。または、ある性質または形質が「長期造血幹細胞」に特異的であるとは、「長期造血幹細胞」における当該性質または形質の程度が、他の細胞における当該性質または形質に比して顕著であることを意味する。例えば、ある遺伝子の発現が「長期造血幹細胞」に特異的であるという場合、当該遺伝子の発現は「長期造血幹細胞」で検出される一方、他の細胞では検出されない、あるいは、「長期造血幹細胞」における当該遺伝子の発現量は、他の細胞における発現量の１．５倍、２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、２０倍、５０倍以上である。当該遺伝子の発現量は、マイクロアレイやｑＰＣＲ等既知の方法により測定することができる。
【００３２】
（長期造血幹細胞および又は短期造血幹細胞を分離する方法）
本発明において、造血幹細胞の集団から長期造血幹細胞および又は短期造血幹細胞を分離する際には、好ましくは長期造血幹細胞において特異的に発現する遺伝子、例えばＨｏｘｂ５をマーカーとして、長期造血幹細胞を分離し、その他の造血幹細胞を短期造血幹細胞として分離することができる。
【００３３】
遺伝子をマーカーとして利用する際には、例えば当該遺伝子のコードするタンパク質と、標識タンパク質を融合した融合遺伝子を利用することができる。当該遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムなどの公知のシステムを利用することにより、ゲノム上の当該遺伝子を置換することで造血幹細胞に導入することができる。
【００３４】
当該標識としては、様々な蛍光タンパク質の遺伝子が利用可能であり、例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰの改変体、例えばＥＧＦＰ、ｈｒＧＦＰ（アジレント社）、ｍＣｈｅｒｒｙ（クロンテック社）、ｍＫａｔｅ２（Ｗａｋｏ）、ＡｍＣｙａｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＡｓＲｅｄｐ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ｍＯｒａｎｇｅ、ＣＦＰ−、ｍＹＦＰ、ｍＲＦＰ、ｍＢＦＰ、ｍＰｌｕｍ等を含むが、これらに限定されない。複数の標識タンパク質を使用することができ、その数は適宜調整することができる。
【００３５】
一態様において、マーカーＬｉｎ−、ｃ−Ｋｉｔ＋、Ｓｃａ−１＋、ＣＤ１５０＋、ＣＤ３４−／低、Ｆｌｋ２−を有する造血幹細胞から、長期造血幹細胞および又は短期造血幹細胞を分離する。
【００３６】
（長期造血幹細胞に特異的に発現する遺伝子をスクリーニングする方法）
本発明において、長期造血幹細胞に特異的に発現する遺伝子をスクリーニングする際には、上記の方法で分離した長期造血幹細胞と短期造血幹細胞の間で各遺伝子の発現量を比較し、長期造血幹細胞でのみ発現が検出される遺伝子、または、長期造血幹細胞における当該遺伝子の発現量が、短期造血幹細胞における発現量よりも一定の基準を超えて多い遺伝子を同定する。例えば、長期造血幹細胞における発現量が、短期造血幹細胞における発現量の１．５倍、２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、２０倍、５０倍以上であるものを同定する。当該遺伝子の発現量は、マイクロアレイやｑＰＣＲ等既知の方法により測定することができる。
【００３７】
遺伝子の発現量を比較する際には、「位置付けされた１００万個の読み出し断片あたりおよび転写産物１キロ塩基あたりの断片数」（ＦＰＫＭ）を用いて比較することができる。ＦＰＫＭは、ＲＮＡを用いたＲＮＡｓｅｑにより遺伝子の発現量を測定する際等に、全ＲＮＡの発現量およびマップされた読み出し断片についてノーマライズして、異なるサンプル間において、特定のゲノム領域の転写量を評価する際に当業者に汎用される値である。
【００３８】
理論に拘束されるものではないが、本発明において長期造血幹細胞に特異的に発現する遺伝子をスクリーニングする方法は、専ら自己複製能維持特性の差異に基づいて分離された造血幹細胞同士を比較するものであり、当該スクリーニングによって単離される遺伝子は、自己複製能維持特性に直接関連する機能を有する可能性が高いことが理解される。
【００３９】
（短期造血幹細胞において自己複製能維持特性を付与または増強する遺伝子を同定する方法）
本発明において、短期造血幹細胞において自己複製能維持特性を付与または増強する遺伝子を同定する際には、上記長期造血幹細胞に特異的に発現する遺伝子のスクリーニング方法により同定された遺伝子のそれぞれ、またはこれらの組み合わせを、短期造血幹細胞に形質導入し、その自己複製能維持特性を増強する遺伝子を同定することで行うことができる。
【００４０】
短期造血幹細胞に遺伝子を形質導入する際には、公知の方法を用いることができ、例えば、真核細胞において機能する真核生物発現ベクター、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥデキストラン、リポフェクションなどを利用できるがこれらに限定されない。
【００４１】
また、真核生物発現ベクターとしては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、レンチウイルスなどのウイルスベクター、バキュロウイルストランスファーベクターなどを利用できるがこれらに限定されない。一態様において、レンチウイルスを用いることが好ましい。
【００４２】
自己複製能維持特性の付与または増強は、分化培養法などのｅｘ  ｖｉｖｏ法またはマウスへの移植等のｉｎ  ｖｉｖｏ法を用いて確認することができる。分化培養法においては、例えば、一定期間培養した後にｃ−Ｋｉｔ陽性、Ｓｃａ−１陽性、ＣＤ１１ｂ陰性で確認される未分化細胞集団の含有率を確認し、当該含有率の増大により確認することができる。マウスへの移植を用いる場合には、前述の継代移植法により、産生する分化細胞の細胞型種類の増大およびその産生期間の長さにより確認することができる。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【実施例１】
【００４４】
長期造血幹細胞と短期造血幹細胞の分離
長期造血幹細胞特異的レポーターマウス（ゲノム上のＨｏｘｂ５遺伝子を３コピーのｍｃｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質をコードする遺伝子と融合したＨｏｘｂ５遺伝子と置換したマウス；ｎａｔｕｒｅ、２０１６年、Ｖｏｌ．５３０，ｐｐ．２２３−２２７）より、両側脛骨、大腿骨、骨盤、上腕骨を回収し、骨髄細胞を採取した。分化細胞（ｃ−Ｋｉｔ陰性）を除くため、骨髄細胞を抗ｃ−Ｋｉｔ抗体で染色した後、ＭＡＣＳ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｌｔｅｎｙｉｂｉｏｔｅｃ．ｃｏ．ｊｐ／ｊａ−ｊｐ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ−ａｎｄ−ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｍａｃｓ−ｃｅｌｌ−ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ．ａｓｐｘ）を用いて、ｃ−Ｋｉｔ陽性細胞を濃縮した。【００４５】
次に、ｃ−Ｋｉｔ陽性細胞をＳｃａ−１、Ｆｌｋ２、ＣＤ１５０、ＣＤ３４、ＩＬ−７Ｒ、ＣＤ１６／３２、Ｔｅｒ−１１９、Ｂ２２０、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８ａ、Ｇｒ−１、ＣＤ１１ｂに対する抗体を用いて染色した後、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ  ＡｒｉａＩＩ  ＳＯＲＰ）を用いて、長期造血幹細胞（ｃ−Ｋｉｔ＋Ｓｃａ−１＋ＣＤ１５０＋ＣＤ３４−／ｌｏＦｌｋ２−ｍＣｈｅｒｒｙ＋）と短期造血幹細胞（ｃ−Ｋｉｔ＋Ｓｃａ−１＋ＣＤ１５０＋ＣＤ３４−／ｌｏＦｌｋ２−ｍＣｈｅｒｒｙ−）を各々ソートして分離した。データ解析は、ＦｌｏｗＪｏを用いて行った。
【実施例２】
【００４６】
造血幹細胞に特異的に発現する自己複製能関連遺伝子の同定
実施例１において分離した長期造血幹細胞（ＬＴ−ＨＳＣ：ｃ−Ｋｉｔ＋Ｓｃａ−１＋ＣＤ１５０＋ＣＤ３４−／ｌｏＦｌｋ２−ｍＣｈｅｒｒｙ＋）と短期造血幹細胞（ＳＴ−ＨＳＣ：ｃ−Ｋｉｔ＋Ｓｃａ−１＋ＣＤ１５０＋ＣＤ３４−／ｌｏＦｌｋ２−ｍＣｈｅｒｒｙ−）のそれぞれからＲＮＡを精製した後、ＫＡＰＡ  ＲＮＡ  ＨｙｐｅｒＰｒｅｐ  Ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  ＲｉｂｏＥｒａｓｅ  ＨＭＲを用いてライブラリーを作製した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  １５００を用いてシーケンスを行い、トランスクリプトーム解析を行った。遺伝子発現量をＦＰＫＭに基づいて比較し、長期造血幹細胞に特異的（２倍以上）に発現を認める遺伝子として、図１に示す遺伝子、Ｖｗｆ、Ｈｉｎｔ３、Ｓｅｌｐ、Ｒｄｈ１０、Ｈｏｘｂ５、Ｌａｒｇｅ、Ｆａｍ２９９ｂを同定した。
【実施例３】
【００４７】
長期造血幹細胞特異的遺伝子による自己複製能維持特性の付与または増強
長期造血幹細胞特異的に発現する遺伝子として、Ｈｏｘｂ５を短期造血幹細胞に形質導入することで、自己複製能維持特性を付与または増強し得ることを確認した。【００４８】
（３−１）レンチウイルスの作製
Ｈｏｘｂ５をＵｂｃプロモーターおよびＺｓＧｒｅｅｎマーカーを有するレンチウイルスベクターにクローニングした。【００４９】
レンチウイルスは、パッケージングプラスミドともに２９３Ｔ細胞に遺伝子導入し、３７℃２日間培養した培養上清液をウイルス液として作製した。作製したウイルスタイターの測定は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞への連続希釈法による感染を指標に計算した。【００５０】
（３−２）造血幹細胞へのウイルス感染
短期造血幹細胞（Ｈｏｘｂ５陰性）に、Ｈｏｘｂ５遺伝子を含むレンチウイルスまたはベクターウイルスを感染させる。比較のため、長期造血幹細胞（Ｈｏｘｂ５陽性）にも、Ｈｏｘｂ５遺伝子を含むレンチウイルスを感染させた。【００５１】
造血幹細胞へのウイルス感染は、９６ウェルＵ底プレートを用いて行った。５ｘ１０６ｉｆｕのウイルスを各ウェルへ加えプレートへ固着させた後、フローサイトメーターを用いて造血幹細胞をプレート上に直接ソートした。感染は１６時間行い、その後、自己複製能維持特性を確認するための各種試験を行った。【００５２】
（３−３）体外培養
感染した造血幹細胞をプレートより回収した後、フローサイトメーターにてレポーター（ＺｓＧｒｅｅｎ）陽性細胞を２５細胞ずつ、新しい９６ウェルＵ底プレートに再ソートし、３７℃で７日間培養した。【００５３】
造血幹細胞の分化度を、ｃ−Ｋｉｔ、Ｓｃａ−１、ＣＤ１１ｂによる染色により未分化細胞集団（ＫＬＳ：ｃ−Ｋｉｔ陽性、Ｓｃａ−１陽性、ＣＤ１１ｂ陰性）の含有率を決定することで評価した。【００５４】
その結果、短期造血幹細胞（Ｈｏｘｂ５陰性）に、Ｈｏｘｂ５遺伝子を形質導入することにより（短期造血幹細胞／Ｈｏｘｂ５ウイルス）、ベクターを導入した短期造血幹細胞（短期造血幹細胞／対照ウイルス）に比して、未分化細胞含有率の著明な増大（ｐ＝０．０１９）が確認された。また、長期造血幹細胞（長期造血幹細胞／Ｈｏｘｂ５ウイルス）と比して、同程度まで短期造血幹細胞において自己複製能が増強されたことが確認された（図３）。【００５５】
（３−４）マウスへの移植（キメリズム解析）
マウスへの移植は、ＣＤ４５．１マウスをレシピエントマウスとして用いる。レシピエントマウスに対し、致死量（９Ｇｙ）の照射を行った後、ウイルス感染した短期造血幹細胞１０細胞（ＣＤ４５．２）を２ｘ１０５細胞の骨髄細胞（ＣＤ４５．１／ＣＤ４５．２）と共に、眼窩静脈内に注射する。移植した造血幹細胞の造血能を解析するために、移植後４週間毎に末梢血解析（尾静脈より採血）を行う。赤血球を溶解した後、白血球分画をＣＤ４５．１、ＣＤ４５．２、ＣＤ１１ｂ、Ｇｒ−１、Ｂ２２０、ＣＤ３、ＴＣＲβ、ＮＫ１．１にて染色し、各分画（ＮＫ細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、顆粒球および単球）のキメリズムを解析する。ドナー由来はＣＤ４５．２陽性、レシピエント由来はＣＤ４５．１陽性、サポーティング細胞はＣＤ４５．１／ＣＤ４５．２陽性にて区別する。【００５６】
（３−５）統計解析
全ての統計解析は、オンラインソフトウェア（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ／ｑｕｉｃｋｃａｌｃｓ／ｔｔｅｓｔ１．ｃｆｍ）にて、ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｔ検定を用いて行った。
【実施例４】
【００５７】
自己複製能維持特性を付与または増強する遺伝子の同定
（４−１）レンチウイルスの作製
候補遺伝子をクローニングしたレンチウイルスベクターを作製する。
具体的には、マウス骨髄細胞より全ＲＮＡを精製し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを作製する。各遺伝子の配列に適したプライマーを設計し、ＰＣＲ法にて候補遺伝子ｃＤＮＡを増幅する。増幅されたｃＤＮＡをレンチレポータープラスミドにクローニングする（図３）。【００５８】
（４−２）造血幹細胞へのウイルス感染および解析
実施例３と同様の方法により、短期造血幹細胞（Ｈｏｘｂ５陰性）に、候補遺伝子を含むレンチウイルスまたはベクターウイルスを感染させ、体外培養またはマウスへの移植により、短期造血幹細胞（Ｈｏｘｂ５陰性）に対して候補遺伝子導入がもたらす自己複製能維持特性の変化を確認する。【００５９】
ベクターウイルスを感染させた短期造血幹細胞（Ｈｏｘｂ５陰性）に対して、有意な自己複製能維持特性の増大をもたらす候補遺伝子を、自己複製能維持特性を付与または増強する遺伝子として同定する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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