(57)【要約】ＭＤＣＫ細胞を宿主とするインフルエンザウイルスの培養方法において、より効率的にインフルエンザウイルスを培養する方法を提供する。ＭＤＣＫ細胞が対数増殖期を超えた後、プロテアーゼを含まない培地条件下でインフルエンザウイルスを接種することによる。プロテアーゼによるＭＤＣＫ細胞の凝集や損傷を防ぎ、効率的にインフルエンザウイルスを培養することができる。更に、鶏卵を宿主としてインフルエンザウイルスを増殖させるよりも、高い収量のウイルスタンパク質が予想される。
2020004425.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＤＣＫ細胞を宿主とするインフルエンザウイルスの培養方法において、プロテアーゼを含まない培地条件下で、ＭＤＣＫ細胞が対数増殖期を超えた後、インフルエンザウイルスを接種する、インフルエンザウイルスの培養方法。
【請求項２】
ＭＤＣＫ細胞を宿主とするインフルエンザウイルスの培養方法において、プロテアーゼを含む培地条件下でインフルエンザウイルスを接種するよりも高いウイルス収量を示す、請求項１に記載のインフルエンザウイルスの培養方法。
【請求項３】
ＭＤＣＫ細胞を宿主とするインフルエンザウイルスの培養方法において、当該ＭＤＣＫ細胞の倍加時間が１７時間を超えた後、プロテアーゼを含まない培地条件下でインフルエンザウイルスを接種する、インフルエンザウイルスの培養方法。
【請求項４】
ＭＤＣＫ細胞を宿主とするインフルエンザウイルスの培養方法において、ＭＤＣＫ細胞の培養方法が三次元培養方法である、請求項１〜３のいずれかに記載のインフルエンザウイルスの培養方法。
【請求項５】
前記三次元培養方法が、マイクロキャリアを用いた三次元培養方法である、請求項４に記載のインフルエンザウイルスの培養方法。
【請求項６】
プロテアーゼがトリプシンである、請求項１〜５のいずれかに記載のインフルエンザウイルスの培養方法。
【請求項７】
ＭＤＣＫ細胞が、プロテアーゼ非依存性ＭＤＣＫ細胞である、請求項１〜６のいずれかに記載のインフルエンザウイルスの培養方法。
【請求項８】
プロテアーゼ非依存性ＭＤＣＫ細胞が、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０１４にて特定されるクローニングしたＭＤＣＫ細胞である、請求項７に記載のインフルエンザウイルスの培養方法。
【請求項９】
プロテアーゼを含まない培地条件下で、ＭＤＣＫ細胞が対数増殖期を超えた後、インフルエンザウイルスを接種するＭＤＣＫ細胞であって、プロテアーゼを含む培地条件下でインフルエンザウイルスを接種するよりも、インフルエンザウイルス培養において高いウイルス収量を示すＭＤＣＫ細胞。
【請求項１０】
プロテアーゼ非依存性ＭＤＣＫ細胞である、請求項９に記載のＭＤＣＫ細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インフルエンザウイルスの培養方法に関する。具体的には、ＭＤＣＫ細胞を宿主細胞とするインフルエンザウイルスの培養方法に関し、より効率的にインフルエンザウイルスを培養する方法に関する。【０００２】
本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願特願２０１８−１２１７３９号優先権を請求する。
【背景技術】
【０００３】
インフルエンザは毎年世界中で流行する感染症であり、インフルエンザウイルスにより引き起こされる。インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科に属し、脂質二重膜構造をもつエンベロープを有する。Ａ型、Ｂ型およびＣ型の３属に分類され、各々インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルス、インフルエンザＣ型ウイルスという。一般にインフルエンザウイルスは、Ａ型またはＢ型をいう場合が多い。Ａ型、Ｂ型およびＣ型の違いは、ウイルス粒子を構成するタンパク質のうち、Ｍ１タンパク質とＮＰタンパク質の抗原性の違いに基づく。また、同じＡ型やＢ型であっても、エンベロープの表面上の分子である赤血球凝集素（ヘマグルチニン：以下、「ＨＡ」）やノイラミニダーゼ（以下、「ＮＡ」）の抗原性の違いから、複数の亜型と株に分類される。【０００４】
Ａ型インフルエンザウイルスは、それらのＨＡおよびＮＡの抗原性に基づいて１６種のＨＡ（Ｈ１〜Ｈ１６）亜型および９種のＮＡ（Ｎ１〜Ｎ９）亜型に分類される。Ａ型インフルエンザウイルスの３種のＨＡ（Ｈ１、Ｈ２およびＨ３）亜型は特に重要な病原体である。Ａ型インフルエンザウイルスのＨ１Ｎ１亜型およびＨ３Ｎ２亜型は季節的に広まり、ヒト感染を引き起こしている。インフルエンザワクチンは、上述した流行状況や幅広い年齢層に跨る接種対象者、抗原株として要求されるウイルスの種類の多さ等の理由より、大量のワクチン抗原を必要とするところに特殊性がある。すなわち、より効率的にインフルエンザワクチンを製造可能な方法が求められている。【０００５】
インフルエンザワクチンの製造には、発育鶏卵を利用してインフルエンザウイルスを増殖させる方法や、培養細胞でインフルエンザウイルスを増殖させる方法などがある。培養細胞として、マディン−ダービーイヌ腎臓由来細胞（以下、「ＭＤＣＫ細胞」）やアフリカミドリザル腎臓由来細胞（以下、「Ｖｅｒｏ細胞」）等が挙げられる。【０００６】
インフルエンザウイルスの増殖には、ウイルスのＨＡを開裂し活性化することが必要である。特許文献１には、宿主細胞を用いてインフルエンザウイルスを培養する際に、プロテアーゼを用いてインフルエンザウイルスを培養するのが好適であることが記載されている。また、ウイルスの活性化を増強する物質は、ＨＡを開裂させるプロテアーゼであることが好ましいと記載されている。プロテアーゼとして、トリプシン、キモトリプシン、サーモリシン、プロナーゼ、サブチリシンＡ、エラスターゼ、ペプシン、パンクレアチン、カルボキシペプチダーゼ、およびフリン等が例示されている。非特許文献１には、エラスターゼ、キモトリプシン、サーモリシンによって、非特許文献２にはトリプシン、キモトリプシン、プラスミンによってインフルエンザウイルスが活性化されると記載されている。【０００７】
非特許文献３には、宿主として種々のＭＤＣＫ細胞を用いてインフルエンザウイルスを培養したときに、一部のＭＤＣＫ細胞において、トリプシンがない場合でもインフルエンザウイルスが増殖したことが報告されている。しかしながら、トリプシンがない場合には、トリプシンを添加して培養したときに比べてウイルスのプラークが小さいことが報告されている。【０００８】
非特許文献４には、トリプシン非要求性にインフルエンザウイルスが増殖するＭＤＣＫ変異細胞株について報告がある。非特許文献５には、ＭＤＣＫ変異細胞株に発現しているプロテアーゼを解析したところ、ＴＭＰＲＳＳ（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ／ｓｅｒｉｎｅ）サブファミリーに分類されるＴＭＰＲＳＳ２が同定され、インフルエンザウイルスの一部はＴＭＰＲＳＳ２によって開裂活性化されることが明らかとなったことが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許３１５８１５７号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７６  ：６２５−６３３，１９９５
【非特許文献２】歯科学報，１０６（２）：７５−８０
【非特許文献３】ＰＬＯＳ  ＯＮＥ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２０１３，Ｖｏｌｕｍｅ  ８，Ｉｓｓｕｅ９，ｅ７５０１４
【非特許文献４】Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４３：１８９３−１９０９，１９９８
【非特許文献５】第３２回中四国ウイルス研究会抄録，２０１７年６月，演題番号７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、ＭＤＣＫ細胞を宿主とするインフルエンザウイルスの培養方法において、より効率的にインフルエンザウイルスを培養する方法を提供することを課題とする。具体的には、プロテアーゼを含まない培地条件下において、より効率的にインフルエンザウイルスを培養する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、インフルエンザウイルスの宿主細胞であるＭＤＣＫ細胞が対数増殖期を超えた後、プロテアーゼを含まない培地条件下でＭＤＣＫ細胞にインフルエンザウイルスを接種することによって、上記課題を達成しうることを見出した。【００１３】
本発明は、すなわち以下よりなる。
１．ＭＤＣＫ細胞を宿主とするインフルエンザウイルスの培養方法において、プロテアーゼを含まない培地条件下で、ＭＤＣＫ細胞が対数増殖期を超えた後、インフルエンザウイルスを接種する、インフルエンザの培養方法。
２．ＭＤＣＫ細胞を宿主とするインフルエンザウイルスの培養方法において、プロテアーゼを含む培地条件下でインフルエンザウイルスを接種するよりも高いウイルス収量を示す、前項１に記載のインフルエンザウイルスの培養方法。
３．ＭＤＣＫ細胞を宿主とするインフルエンザウイルスの培養方法において、当該ＭＤＣＫ細胞の倍加時間が１７時間を超えた後、プロテアーゼを含まない培地条件下でインフルエンザウイルスを接種することを特徴とする、インフルエンザウイルスの培養方法。
４．ＭＤＣＫ細胞を宿主とするインフルエンザウイルスの培養方法において、ＭＤＣＫ細胞の培養方法が三次元培養方法である、前項１〜３のいずれかに記載のインフルエンザウイルスの培養方法。
５．前記三次元培養方法が、マイクロキャリアを用いた三次元培養方法である、前項４に記載のインフルエンザウイルスの培養方法。
６．プロテアーゼがトリプシンである、前項１〜５のいずれかに記載のインフルエンザウイルスの培養方法。
７．ＭＤＣＫ細胞が、プロテアーゼ非依存性ＭＤＣＫ細胞である、前項１〜６のいずれかに記載のインフルエンザウイルスの培養方法。
８．プロテアーゼ非依存性ＭＤＣＫ細胞が、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０１４にて特定されるクローニングしたＭＤＣＫ細胞である、前項７に記載のインフルエンザウイルスの培養方法。
９．プロテアーゼを含まない培地条件下で、ＭＤＣＫ細胞が対数増殖期を超えた後、インフルエンザウイルスを接種するＭＤＣＫ細胞であって、プロテアーゼを含む培地条件下でインフルエンザウイルスを接種するよりも、インフルエンザウイルス培養において高いウイルス収量を示すＭＤＣＫ細胞。
１０．プロテアーゼ非依存性ＭＤＣＫ細胞である、前項９に記載のＭＤＣＫ細胞。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の、プロテアーゼを含まない培地条件下でＭＤＣＫ細胞にインフルエンザウイルスを接種するインフルエンザウイルスの培養方法によれば、プロテアーゼによるＭＤＣＫ細胞の凝集や損傷を防ぎ、効率的にインフルエンザウイルスを培養することができる。ＭＤＣＫ細胞が対数増殖期を超えた後にインフルエンザウイルスを接種することで、更に効率的にインフルエンザウイルスを培養することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】プロテアーゼの有無によるウイルスタンパク質量の違いを示す図である（実施例１−１、比較例１−１、実施例１−２）。
【図２】２Ｌ培養液量でのインフルエンザウイルスの培養に関し、ウイルス接種後、培養１日目のＭＤＣＫ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−３４由来）の様子を示す図である。
【図３】各種インフルエンザウイルス株のウイルスタンパク質量を示す図である（実施例１−３）。
【図４】２Ｌ培養液量で、細胞培養５日目の対数増殖期を超えた時点の細胞株Ａの様子を示す図である。（実施例２）
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、ＭＤＣＫ細胞を宿主とするインフルエンザウイルスの培養方法に関する。具体的には、インフルエンザウイルスの培養方法において、ＭＤＣＫ細胞が対数増殖期を超えた後、プロテアーゼを含まない培地条件下でインフルエンザウイルスを接種することを特徴とする。さらには、当該ＭＤＣＫ細胞の倍加時間が１７時間を超えた後、プロテアーゼを含まない培地条件下でインフルエンザウイルスを接種することを特徴とする、インフルエンザウイルスの培養方法に関する。
【００１７】
一般的に、インフルエンザウイルスの増殖には、インフルエンザウイルスのＨＡを開裂し活性化することが必要であることから、宿主細胞を用いてインフルエンザウイルスを培養する際には特許文献１に示されているようにプロテアーゼを用いてインフルエンザウイルスを培養するのが好適であるとされる。また、ウイルスの感染性を増強する物質は、ＨＡを開裂させることにより、ウイルスと宿主細胞膜の融合をもたらすプロテアーゼが好ましいことが知られている。一方で、インフルエンザウイルス培養時において、培養液中にプロテアーゼが存在することにより、ＭＤＣＫ細胞への損傷や、細胞が細胞外マトリクスから剥離し、細胞凝集が起こりやすくなる。ＭＤＣＫ細胞の損傷や凝集が起こることで、インフルエンザウイルスが感染するＭＤＣＫ細胞数が減少するという不利益があると本発明者らは考えた。そこで本発明者らは鋭意検討した結果、驚くべきことに、プロテアーゼを含まない培地条件下でＭＤＣＫ細胞にインフルエンザウイルスを接種することでインフルエンザウイルスを効率的に増殖しうることを見出した。
【００１８】
本発明のインフルエンザウイルスの培養方法において、プロテアーゼを含まない培地とは、インフルエンザウイルスの培養のために従来添加していた任意のプロテアーゼを添加していない培地をいう。プロテアーゼを含まない培地は、例えば、インフルエンザウイルスをＭＤＣＫ細胞に接種する前、または同時に使用することができる。プロテアーゼを含まない培地にてインフルエンザウイルスを増殖させることで、ＭＤＣＫ細胞の損傷や凝集が抑制され、インフルエンザウイルスの増殖に寄与する細胞数の増加が見込まれる。更に、製造において高額なプロテアーゼを必要としないため、大幅なコストダウンも期待される。培地に含まれないプロテアーゼの例として、トリプシン、キモトリプシン、プラスミン、サーモリシン、プロナーゼ、サブチリシンＡ、エラスターゼ、ペプシン、パンクレアチン、カルボキシペプチダーゼ、フリン、およびＴＭＰＲＳＳ（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ／ｓｅｒｉｎｅ）サブファミリーに分類されるプロテアーゼ等が挙げられる。培地に含まれないプロテアーゼとしては、ＭＤＣＫ細胞の損傷や凝集を起こすものであれば特に限定されないが、好ましくはトリプシン、キモトリプシン、プラスミン、エラスターゼ、サーモリシン、更に好ましくはトリプシンが挙げられる。本発明において培地に含まれないプロテアーゼは、各種プロテアーゼ活性を示すものであれば由来する生物は特に限定されず、また組み換え体でもよい。各種プロテアーゼの活性は当業者に通常知られているものを意味するが、例えばトリプシンは、リジンまたはアルギニンなどの塩基性残基のＣ末側でペプチド鎖を切断するエンドペプチダーゼとしての活性を有する。
【００１９】
本発明のインフルエンザウイルスの培養方法においてプロテアーゼを含まない培地条件とは、例えば宿主細胞をマイクロキャリアのような細胞外マトリクスを用いて培養した場合に、細胞がマイクロキャリアから剥離しない程度のプロテアーゼであって、添加には依らずに混入しているプロテアーゼが含まれていてもよい。例えば、細胞由来のプロテアーゼが混入している場合であっても、本発明のプロテアーゼを含まない培地条件下に包含される。細胞がマイクロキャリアから剥離しない状態とは、マイクロキャリアを用いて細胞を一定時間培養した際の培養液中の細胞浮遊率が２０％以下、好ましくは１５％以下の状態をいう。細胞浮遊率の計算方法は後述する。本発明においてプロテアーゼを含まない培地とは、培地成分がプロテアーゼ活性を示さない培地であってもよい。プロテアーゼ活性は当業者に公知の方法で測定することができ、例えば吸光度で測定することができる。
【００２０】
本発明のインフルエンザウイルスの培養方法において、プロテアーゼを含まない培地にて、宿主細胞であるＭＤＣＫ細胞をマイクロキャリアのような細胞外マトリクスを用いて培養した場合に、マイクロキャリア上でのＭＤＣＫ細胞密度が高い状態、すなわちＭＤＣＫ細胞が対数増殖期を超えた状態が効率的に維持される。プロテアーゼを含む培地にてＭＤＣＫ細胞を培養すると、プロテアーゼによってＭＤＣＫ細胞がマイクロキャリアから剥離し、マイクロキャリア上でのＭＤＣＫ細胞密度が高い状態を維持することが難しい。一方、プロテアーゼを含まない培地を用いることで、ＭＤＣＫ細胞の損傷や凝集が抑制されるため、マイクロキャリア上でのＭＤＣＫ細胞密度が高い状態、すなわちＭＤＣＫ細胞が対数増殖期を超えた状態が維持されやすくなる。その結果、長期間の効率的なウイルス増殖が可能となり、高収量のウイルスタンパク質を取得することができる。なお、ＭＤＣＫ細胞が対数増殖期を超えた状態は、マイクロキャリア上での細胞間接触が強く、剥離しにくいため、インフルエンザウイルス増殖に適した環境を形成しうると考えられる。更に、ＭＤＣＫ細胞が対数増殖期を超えた状態に達した時点は細胞周期の休止期に該当する可能性が高い。当該状態の細胞にウイルスを接種することで、インターフェロン（ＩＦＮ）等のウイルス抵抗因子の産生速度が遅くなることで、ウイルス感染が起こりやすくなると推測される。
【００２１】
本発明のインフルエンザウイルスの培養方法において、プロテアーゼを含まない培地に用いられる好適な培地は、特に限定されないが、例えば動物由来の血清が添加されていない無血清培地が好ましい。無血清培地はいかなるものを用いてもよいが、例えばイーグルＭＥＭ培地（日水製薬株式会社）、Ｏｐｔｉ  ＰＲＯ  ＳＦＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＶＰ−ＳＦＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＥＸ−ＣＥＬＬ  ＭＤＣＫ（ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＵｌｔｒａＭＤＣＫ（Ｌｏｎｚａ）、ＰｒｏＶｅｒｏ  １（Ｌｏｎｚａ）、ＢａｌａｎＣＤ  ＭＤＣＫ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）等を用いることができる。
【００２２】
本発明のインフルエンザウイルスの培養方法において、インフルエンザウイルスは、ＭＤＣＫ細胞が対数増殖期を超えた後に接種するのが好ましい。ＭＤＣＫ細胞が対数増殖期を超えた後とは、ＭＤＣＫ細胞密度が高く、増殖速度が低下した状態、すなわちＭＤＣＫ細胞がコンフルエントになった時点である。具体的には例えばＭＤＣＫ細胞の倍加時間が１７時間、更に好ましくは２０時間を超えた後が好適である。細胞の倍加時間とは、細胞数が２倍に増えるために要する時間をいう。本発明においては細胞播種時からウイルス接種時までの時間における、細胞数が２倍に増えるために要した時間を指す。ＭＤＣＫ細胞が対数増殖期を超えることで倍加時間は長くなるが、当該時間は用いるＭＤＣＫ細胞や培養方法によって異なる。本発明では、プロテアーゼを含まない培地条件下でインフルエンザウイルスの培養を行うため、細胞由来のプロテアーゼを利用してインフルエンザウイルスがＭＤＣＫ細胞へ感染すると思われる。ＭＤＣＫ細胞が対数増殖期を超えた状態、例えばＭＤＣＫ細胞の倍加時間が１７時間を超えるような、高い密接状態で培養した細胞にインフルエンザウイルスを接種することにより、細胞由来のプロテアーゼがインフルエンザウイルスに作用しやすい環境を作り出すことが可能となる。
【００２３】
本発明においてインフルエンザウイルスは、スケールアップ前のＭＤＣＫ細胞に接種してもよいし、スケールアップ後のＭＤＣＫ細胞に接種してもよい。スケールアップ後の培養液量は、１〜１００００Ｌ、好ましくは５〜５０００Ｌである。本発明の方法によりスケールアップ後のＭＤＣＫ細胞にインフルエンザウイルスを接種することで、大量のインフルエンザウイルスの取得が可能となるため、効率的なワクチン製造につながる。ＭＤＣＫ細胞の培養を行う容器は、目的の容量を満たす容器であれば特に限定されない。
【００２４】
本発明のインフルエンザウイルスの培養方法において、宿主細胞であるＭＤＣＫ細胞にインフルエンザウイルスを接種した後、ＭＤＣＫ細胞をインキュベート、即ち一定時間、ある温度条件に維持するのが好適である。一定の温度条件下に置くことによりＭＤＣＫ細胞が増殖するかしないかは問わない。インキュベートの条件はＭＤＣＫ細胞を培養するのと同様の条件下で行うこともできるが、感染させたインフルエンザウイルスの至適条件下で行うのが好適である。インフルエンザウイルス培養の至適条件は、３１〜３７℃、好ましくは３２〜３６℃、更に好ましくは３３〜３５℃である。
【００２５】
本発明のインフルエンザウイルスの培養方法に使用されるＭＤＣＫ細胞は、プロテアーゼを含まない培地条件下でインフルエンザウイルスが増殖可能な細胞であればよく、特に限定はないが、ウイルス産生時におけるプロテアーゼ非依存性ＭＤＣＫ細胞であることが好ましい。ウイルス産生時におけるプロテアーゼ非依存性ＭＤＣＫ細胞とは、プロテアーゼを含まない培地条件下でインフルエンザウイルスが増殖可能なＭＤＣＫ細胞をいう。当該細胞は、クローニングされた細胞でもよく、クローニングされていない細胞を含む細胞集団でもよい。本発明においてプロテアーゼとは、外来的に添加するものを対象とし、細胞が発現するものは対象としない。本発明の当該プロテアーゼ非依存性に係るプロテアーゼは、トリプシン、キモトリプシン、プラスミン、サーモリシン、プロナーゼ、サブチリシンＡ、エラスターゼ、ペプシン、パンクレアチン、カルボキシペプチダーゼ、フリン、およびＴＭＰＲＳＳサブファミリーに分類されるプロテアーゼより選択される１種または複数種のプロテアーゼが挙げられる。プロテアーゼとしては特に限定されないが、トリプシン、キモトリプシン、プラスミン、エラスターゼ、サーモリシンが好ましく、トリプシンが更に好ましい。係るプロテアーゼ非依存性ＭＤＣＫ細胞であれば、いかなるＭＤＣＫ細胞であってもよい。
【００２６】
本発明のインフルエンザウイルスの培養方法は、特に培養槽を用いた三次元培養の際に効果を発揮しうる。更に、細胞の大量培養を目的としたスケールアップ条件下での培養の際にも効果を発揮しうる。当該培養法の場合、細胞への環境負荷が大きく、プロテアーゼによる細胞への損傷や凝集が激しい。一方、フラスコ等を用いた静置培養など、実験室レベルの規模の培養では、プロテアーゼによる損傷を受けにくいが、細胞の大量培養には向かない条件である。本発明のプロテアーゼを含まない培地条件下での培養の効果は、三次元培養条件や細胞の大量培養を目的としたスケールアップ条件の際に、特に好適に確認される。
【００２７】
ＭＤＣＫ細胞の三次元培養は、マイクロキャリアを用いて培養してもよいし、マイクロキャリアを用いない場合は浮遊化させたＭＤＣＫ細胞の浮遊培養であってもよい。特にＭＤＣＫ細胞が接着したマイクロキャリアを浮遊および撹拌しながら培養するのが好適である。マイクロキャリアの密度、撹拌数や溶存酸素濃度、培養温度等の培養条件は細胞が増殖可能なものであればよく、適宜調節することができる。本発明の培養方法においては、高速撹拌でも、細胞がマイクロキャリアに良好に接着し、効率よく増殖することが可能である。
【００２８】
本発明のインフルエンザウイルスの培養方法に使用されるマイクロキャリアの形状は球状や円盤状のものであってもよいし、多孔性であってもよい。球状のマイクロキャリアの大きさ（直径）は、例えば約０．０１〜１ｍｍ、好ましくは約０．０５〜０．５ｍｍ、より好ましくは約０．１〜０．３ｍｍである。マイクロキャリアは多孔性であってもよい。本発明で用いられる球状のマイクロキャリアとしては、例えば、Ｃｙｔｏｄｅｘ  １（商品名）、Ｃｙｔｏｄｅｘ  ３（商品名）、Ｃｙｔｏｐｏｒｅ（商品名）（以上、ＧＥ  Ｈｅｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）などが挙げられる。円盤状のマイクロキャリアとしては、例えば、Ｃｙｔｏｌｉｎｅ  １（商品名）、Ｃｙｔｏｌｉｎｅ  ２（商品名）（以上、ＧＥ  Ｈｅｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）などが挙げられる。多孔性のマイクロキャリアとしては、例えば、Ｃｙｔｏｐｏｒｅ（商品名）、Ｃｙｔｏｌｉｎｅ  １（商品名）、Ｃｙｔｏｌｉｎｅ  ２（商品名）（以上、ＧＥ  Ｈｅｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）などが挙げられる。その他市販のマイクロキャリアとして、Ｂｉｏｓｉｌｏｎ（商品名）（ＮＵＮＣ社）、Ｈｉｌｌｅｘ（商品名）（ソロヒル社）、Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｒ）マイクロキャリア（コーニング社）等が挙げられる。本発明で用いられるマイクロキャリアとしては、特に球状のデキストラン製マイクロキャリアが好ましい。球状のデキストラン製マイクロキャリアとしては、Ｃｙｔｏｄｅｘ  １（商品名）、Ｃｙｔｏｄｅｘ  ３（商品名）およびＣｙｔｏｐｏｒｅ（商品名）が好ましく、さらにＣｙｔｏｄｅｘ  １（商品名）およびＣｙｔｏｄｅｘ  ３（商品名）が好ましく、特にＣｙｔｏｄｅｘ  １（商品名）が好ましい。
【００２９】
本発明のインフルエンザウイルスの培養方法に使用されるＭＤＣＫ細胞は、いかなるものを用いてもよく、細胞バンクから入手したＭＤＣＫ細胞を用いてもよい。例えば、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−３４にて特定されるＭＤＣＫ細胞を用いることができる。更に、マイクロキャリアへの接着力が強いＭＤＣＫ細胞を用いることが好適である。細胞のマイクロキャリアへの接着力は、マイクロキャリアを含む培養液中で細胞を培養した場合の細胞浮遊率で表すことができる。例えば、細胞浮遊率が２０％以下、好ましくは１５％以下、更に好ましくは１０％以下、特に好ましくは５％以下を示すＭＤＣＫ細胞を用いることを特徴とする。細胞浮遊率とは、マイクロキャリア存在下でＭＤＣＫ細胞を一定時間培養した後の浮遊細胞密度を播種細胞密度で割った値であり、細胞浮遊率が低いほど、マイクロキャリアへの接着力が高いことを示す。本発明のＭＤＣＫ細胞の細胞浮遊率は、培養時間が４８時間以下、好ましくは２４時間以下、好ましくは６時間以下、更に好ましくは１．５時間以下、特に好ましくは０．５時間以下経過した時点のものである。より具体的には、０．５時間経過した時点で細胞浮遊率が２０％以下、または１．５時間経過した時点で細胞浮遊率が５％以下を示すＭＤＣＫ細胞を用いることが好ましい。
【００３０】
本発明のインフルエンザウイルスの培養方法に使用されるＭＤＣＫ細胞は、拡張倍率が４．５以上、好ましくは６．５以上、更に好ましくは８．５以上を示すＭＤＣＫ細胞を用いるのが好適である。拡張倍率とは、細胞を一定時間培養した後の細胞密度を、播種した細胞密度で割った値であり、増殖のしやすさを表す指標となるものである。本発明のインフルエンザウイルスの培養方法に使用されるＭＤＣＫ細胞の拡張倍率は、マイクロキャリアにより培養された際のものであり、培養時間が４８時間以上、好ましくは６０時間以上、更に好ましくは７２時間以上、また、１４４時間以下、好ましくは１２０時間以下、更に好ましくは９６時間以下経過した時点のものである。本発明のインフルエンザウイルスの培養方法に使用されるＭＤＣＫ細胞は、低い播種密度であっても、速やかに細胞を増殖させることができる細胞が好適である。
【００３１】
上記条件を満たす本発明のインフルエンザウイルスの培養方法に使用されるＭＤＣＫ細胞は、具体的には、国際寄託の受領番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０１４で特定されるＭＤＣＫ細胞（ＭＤＣＫ−Ｆ  Ｐ６９）が挙げられる。係る細胞は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（日本国  〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室）に平成２７年３月４日に受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２０１４として国内寄託された後、平成２８年２月１５日に独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターにて、ブダペスト条約に基づく国際寄託に移管請求され、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０１４により受託されたものである。
【００３２】
本発明のインフルエンザウイルスの培養方法に使用されるＭＤＣＫ細胞を、マイクロキャリアを用いて培養する場合の細胞の播種密度は、特に限定されるものではなく、適宜調節が可能である。本明細書における播種密度とは、細胞を播種する際の、培養表面積当たりの細胞数（細胞／ｃｍ２）や培養体積当たりの細胞数（細胞／ｍＬ）を意味する。なお培地中の細胞の密度は、自体公知の手法により確認できるが、例えば、血球計算盤や自動セルカウンターなどを用いた測定方法により確認することができる。
【００３３】
本発明のインフルエンザウイルスの培養方法に使用されるＭＤＣＫ細胞は、継代前の細胞を用いても、継代後の細胞を用いてもよい。ＭＤＣＫ細胞の継代は自体公知の手法により行うことができる。マイクロキャリアを用いた三次元培養を行う際は、細胞が増殖した結果、当該マイクロキャリア表面上に密集して接着している細胞を、新しいマイクロキャリア表面上へ移動させてもよい。
【００３４】
本発明の培養方法に使用されるインフルエンザウイルスであって、宿主細胞に接種するインフルエンザウイルスは、シードウイルスと呼ばれる。インフルエンザウイルスは、生体から分離された後、または、何らかの改変を加えられて作出された後、鶏卵や各種細胞を用いて継代されて増殖し、シードウイルスとなる。本発明において用いられるシードウイルスは、鶏卵や各種細胞のいずれで継代されたものであってもよく、特に限定されない。より好ましくは、ＭＤＣＫ細胞によって継代して増殖・馴化したシードウイルスを、本発明の培養方法において再度ＭＤＣＫ細胞に接種し、インフルエンザウイルスを増殖させることが好ましい。
【００３５】
本発明の培養方法で培養されるインフルエンザウイルスは、特に限定されるものではなく、例えば現在知られているすべての亜型、および将来単離、同定される亜型をも含む。Ａ型インフルエンザウイルスの場合、それらのＨＡ分子およびＮＡ分子の抗原性に基づいて亜型（すなわち１６種のＨＡ（Ｈ１〜Ｈ１６）亜型および９種のＮＡ（Ｎ１〜Ｎ９）亜型）に分類され、ＨＡの亜型とＮＡの亜型との組み合わせを含むインフルエンザウイルスが考えられる。Ｂ型インフルエンザウイルスの場合、ビクトリア系統と山形系統との組み合わせを含むインフルエンザウイルスが考えられる。
【００３６】
Ａ型インフルエンザウイルスの各亜型は、ＲＮＡゲノムの変異性が高いため、新しい株が頻繁に生じている。２００９年４月にメキシコでの流行が認知された後、世界的に流行したとされるインフルエンザは、新型インフルエンザ、ブタインフルエンザ、パンデミックインフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）、ｓｗｉｎｅ  ｆｌｕ、Ａ／Ｈ１Ｎ１  ｐｄｍなどと呼ばれている。ブタの間で流行していたウイルスが、農場などでブタからヒトに直接感染し、その後ヒトの間で広まったとされる新型インフルエンザは、従前より存在していた季節性のＡソ連型インフルエンザ（インフルエンザＡ型ウイルスＨ１Ｎ１亜型）や、Ａ香港型インフルエンザ（インフルエンザＡ型ウイルスＨ３Ｎ２亜型）とは、区別される。またＲＮＡゲノムの変異性が高いことから、インフルエンザＡ型ウイルスの同じ亜型の中でも、単離された時期や場所によって、ウイルス株が区別されている。
【００３７】
Ｂ型インフルエンザウイルスは、非可逆的な抗原変異が続いているが、Ａ型インフルエンザウイルスにおける変異よりも比較的遅く、流行の周期は２年程度である。Ｂ型インフルエンザウイルスは１９４０年ニューヨークにおける中程度の規模のインフルエンザ流行中初めて分離されて以来、たびたび流行を繰り返し、それによる死亡率の上昇も記録されている。ヒトの間でのみ感染が確認されているが、亜型は存在せず、山形系統とビクトリア系統という２つの系統のみが存在する。
【００３８】
本発明で培養されるインフルエンザウイルスは、上述のような生体から分離されたインフルエンザウイルスの他、インフルエンザワクチンに適用可能なように、弱毒化、鶏卵増殖適合化、細胞培養増殖適合化、温度感受性表現形質化、粘膜投与適合化等の改変を加えて作出した組換えウイルスであっても良い。また、改変を加えるための手段として、インフルエンザウイルスの抗原部位やポリメラーゼ部位等の８本のＲＮＡ分節に変異を導入する方法やリバースジェネティクスにより増殖力の高い株のＲＮＡ分節と目的の抗原性を示すＲＮＡ分節を組み換える方法、低温継代によって弱毒ウイルスを作成する方法、ウイルス培養系への変異誘発剤を添加することによる方法等の様々な方法が挙げられる。
【００３９】
本発明の培養方法により増殖したインフルエンザウイルスは、インフルエンザワクチンの製造に用いることができる。インフルエンザウイルスをＭＤＣＫ細胞から精製する工程については、自体公知の手法または今後開発されるいずれの手法を用いてもよい。
【００４０】
本発明の培養方法により、ＭＤＣＫ細胞を宿主としてインフルエンザウイルスを増殖させることで、高収量のウイルスタンパク質を取得することができる。高収量のウイルスタンパク質とは、ウイルス培養後の培養液におけるウイルスタンパク質量が、６．０μｇ／ｍＬ以上、好ましくは１０μｇ／ｍＬ以上、更に好ましくは２０μｇ／ｍＬ以上のことである。更に、鶏卵を宿主としてインフルエンザウイルスを増殖させるよりも、高収量のウイルスタンパク質を取得できる。なお、ウイルス培養後の培養液におけるウイルスタンパク質量は、培養するウイルス株によって大幅に変動する。
【実施例】
【００４１】
本発明の理解を助けるために、以下に実施例を示して具体的に本発明を説明するが、本発明は本実施例に限定されるものでないことはいうまでもない。【００４２】
（実施例１−１）２Ｌ培養液量でのインフルエンザウイルスの培養
本実施例では、２Ｌの培養液量にてプロテアーゼを含まない培地でインフルエンザウイルスを培養したときのインフルエンザウイルスのＨＡ価およびウイルスタンパク質量を確認する。【００４３】
本実施例において、インフルエンザウイルスの培養には宿主細胞としてＭＤＣＫ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−３４由来）を使用した。【００４４】
２Ｌ培養液量にて、ＭＤＣＫ細胞を無血清培地で培養した。細胞は０．２０×１０６細胞／ｍＬの播種密度で播種した。マイクロキャリアは、Ｃｙｔｏｄｅｘ  １（ＧＥ  Ｈｅｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を、３．５ｇ／Ｌの密度で用いた。培養条件として、温度３７℃で撹拌しながら細胞を培養した。【００４５】
ＭＤＣＫ細胞が対数増殖期を超えた時点で、インフルエンザウイルス（Ｂ／Ｍｉｅ／３／２０１５）をｍ．ｏ．ｉ＝０．０１にて接種した。インフルエンザウイルス接種時のＭＤＣＫ細胞の倍加時間は１７時間を超えていた。インフルエンザウイルス接種時の培養液量は２Ｌで、培地はプロテアーゼを含まないイーグルＭＥＭ培地（日水製薬）を用いた。【００４６】
ウイルス接種後、ｐＨ７．０±０．２、温度３４．０℃で撹拌しながら培養を行った。ウイルス接種後、培養４日目まで培養上清をサンプリングし、ＨＡ価およびウイルスタンパク質量を測定した。インフルエンザウイルスのＨＡ価の確認は、国立感染症研究所著「インフルエンザ診断マニュアル（第３版、平成２６年９月）」の「Ｐａｒｔ  ＩＶ」に開示される方法に従って行った。ウイルスタンパク質量は、ウイルス培養上清から遠心により高分子を除去後、３０％ショ糖クッション法により低分子の除去を行い、沈渣のタンパク質含量をＭｏｄｉｆｉｅｄ  Ｌｏｗｒｙ法にて測定することにより算出した。ウイルス接種後、培養４日目のインフルエンザウイルスのＨＡ価は１０２４だった。ウイルスタンパク質量の測定結果を図１に示した。【００４７】
プロテアーゼを含まない培地でインフルエンザウイルスを培養することで、高収量のウイルスタンパク質量を得ることができた（図１）。【００４８】
（比較例１−１）
比較例として、プロテアーゼを含む培地条件下でウイルス培養を行った。プロテアーゼとしてトリプシンを用い、トリプシンを含む培地を用いた点以外は実施例１−１と同様の条件下でインフルエンザウイルスを培養した。トリプシンは、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社）を０．１倍の最終濃度で使用した。ウイルス接種後、培養４日目のインフルエンザウイルスのＨＡ価は１０２４だった。ウイルスタンパク質量の測定結果を図１に示した。【００４９】
プロテアーゼを含まない培地でインフルエンザウイルスを培養した場合に、トリプシンを含む培地で培養した場合と比べてインフルエンザウイルスのウイルスタンパク質量は高い収量であった（図１）。上述の条件にて、プロテアーゼを含まない培地またはトリプシンを含む培地において、２Ｌ培養液量にてＭＤＣＫ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−３４由来）を培養後、インフルエンザウイルス接種後１日目の細胞の様子を図２に示した。【００５０】
トリプシンを含む培地を用いたウイルス培養では細胞がマイクロキャリアから剥離し、細胞凝集による細胞塊を形成するが、プロテアーゼを含まない培地を用いたウイルス培養ではこれが認められず、ＣＰＥが生じた細胞のみがマイクロキャリアから剥離していると考えられた。プロテアーゼを含まない培地を用いることにより、マイクロキャリアからの細胞剥離や細胞凝集を抑制することができ、インフルエンザウイルスが感染するＭＤＣＫ細胞数の減少を抑制できうることが示された。【００５１】
（実施例１−２）５Ｌ培養液量でのインフルエンザウイルスの培養
本実施例では、５Ｌ培養液量にてプロテアーゼを含まない培地でインフルエンザウイルスを培養したときのインフルエンザウイルスのＨＡ価およびウイルスタンパク質量を確認する。【００５２】
本実施例において、インフルエンザウイルスの培養には宿主細胞としてクローニングしたＭＤＣＫ細胞（以下、「細胞株Ａ」）を使用した。細胞株Ａは、国際寄託の受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０１４で特定されるＭＤＣＫ細胞である。当該ＭＤＣＫ細胞は、ＭＤＣＫ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−３４由来）を基にして、限界希釈法によりシングルセルクローニングを行なった後、選出されたものである。【００５３】
細胞株Ａを、無血清培地を用いて５Ｌ培養液量にて培養した。細胞は０．２０×１０６細胞／ｍＬの播種密度で播種した。マイクロキャリアは、Ｃｙｔｏｄｅｘ  １（ＧＥ  Ｈｅｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を、３．５ｇ／Ｌの密度で用いた。培養条件としては、温度３７℃で撹拌しながら細胞を培養した。【００５４】
ＭＤＣＫ細胞の継代およびマイクロキャリアの移注後、細胞株Ａが対数増殖期を超えた時点で、インフルエンザウイルス（Ｂ／Ｍｉｅ／３／２０１５）をｍ．ｏ．ｉ＝０．０１にて接種した。インフルエンザウイルス接種時のＭＤＣＫ細胞の倍加時間は、１７時間を超えていた。インフルエンザウイルス接種時の培地はプロテアーゼを含まないイーグルＭＥＭ培地（日水製薬）を使用した。【００５５】
ウイルス接種後、ｐＨ７．０±０．２、温度３４．０℃で撹拌しながらウイルス培養を行った。ウイルス接種後、培養４日目まで培養上清をサンプリングし、ＨＡ価およびウイルスタンパク質量を実施例１と同様に測定した。ウイルス接種後、培養４日目のインフルエンザウイルスのＨＡ価は２０４８だった。ウイルスタンパク質量の測定結果を図１に示した。【００５６】
プロテアーゼを含まない培地でインフルエンザウイルスを培養することで、培養４日目のウイルスタンパク質量は２０μｇ／ｍＬ以上となり、高収量のウイルスタンパク質量を得ることができた。【００５７】
（実施例１−３）５０Ｌ培養液量での各種インフルエンザウイルスの培養
本実施例では、５０Ｌ培養液量にてプロテアーゼを含まない培地でインフルエンザウイルスを培養したときのインフルエンザウイルスのＨＡ価およびウイルスタンパク質量を確認する。【００５８】
本実施例において、実施例１−２と同様にインフルエンザウイルスの培養には宿主細胞として細胞株Ａを使用した。【００５９】
細胞株Ａを、５０Ｌ培養液量にて、実施例１−２と同様に培養した。細胞株Ａが対数増殖期を超えた時点で、各種インフルエンザウイルス（Ａ／Ｙｏｋｏｈａｍａ／５０／２０１５、Ａ／Ｓａｐｐｏｒｏ／３８／２０１５、Ｂ／Ｈｙｏｇｏ／３２１０／２０１５、Ｂ／Ｍｉｅ／３／２０１５）をｍ．ｏ．ｉ＝０．０１にて接種した。インフルエンザウイルス接種時のＭＤＣＫ細胞の倍加時間は１７時間を超えていた。インフルエンザウイルス接種時の培地はプロテアーゼを含まないイーグルＭＥＭ培地（日水製薬）を使用した。【００６０】
ウイルス接種後、ｐＨ７．０±０．２、温度３４．０℃で撹拌しながらウイルス培養を行った。ウイルス接種後、培養４日目まで培養上清をサンプリングし、ＨＡ価およびウイルスタンパク質量を実施例１と同様に測定した。培養４日目のインフルエンザウイルスのＨＡ価は、Ａ／Ｙｏｋｏｈａｍａ／５０／２０１５では１２８、Ａ／Ｓａｐｐｏｒｏ／３８／２０１５では１２８、Ｂ／Ｈｙｏｇｏ／３２１０／２０１５では５１２、Ｂ／Ｍｉｅ／３／２０１５では１２８０だった。ウイルスタンパク質量の測定結果を図３に示した。【００６１】
プロテアーゼを含まない培地で各種インフルエンザウイルスを培養することで、培養４日目のウイルスタンパク質量は２０μｇ／ｍＬ以上となり、高収量のウイルスタンパク質量を得ることができた。【００６２】
（実施例２）対数増殖期を超えた細胞でのインフルエンザウイルスの培養
本実施例では、ＭＤＣＫ細胞が対数増殖期を超えた後および対数増殖期を超える前に、インフルエンザウイルスを接種してプロテアーゼを含まない培地で培養したときの、インフルエンザウイルスのＨＡ価およびウイルスタンパク質量を確認する。【００６３】
本実施例において、実施例１−２と同様にインフルエンザウイルスの培養には宿主細胞として細胞株Ａを使用した。【００６４】
細胞株Ａを、２Ｌ培養液量で、無血清培地を用いて培養した。細胞株Ａが培養４日目の対数増殖期を超えた時点および培養２日目の対数増殖期を超える前の時点で、インフルエンザウイルス（Ａ／Ｙｏｋｏｈａｍａ／５０／２０１５）をｍ．ｏ．ｉ＝０．０１にて接種した。対数増殖期を超えた時点における、インフルエンザウイルス接種時のＭＤＣＫ細胞の倍加時間は１７時間を超えていたが、対数増殖期を超える前の時点では倍加時間は１７時間を超えていなかった。インフルエンザウイルス接種時の培地はプロテアーゼを含まないイーグルＭＥＭ培地（日水製薬）を使用した。細胞培養４日目の対数増殖期を超えた時点での細胞の様子を図４に示した。単位面積当たりの細胞数が上限に達し、細胞間接着がより強固になっていると考えられた。【００６５】
ウイルス接種後、ｐＨ７．０、温度３４．０℃で撹拌しながらウイルス培養を行った。ウイルス接種後、培養４日目まで毎日培養上清をサンプリングし、ウイルスタンパク質量を実施例１と同様に測定した。ウイルス接種後、培養４日目のウイルスタンパク質量は、細胞培養４日目にウイルス接種した場合は２２．９μｇ／ｍＬであり、細胞培養２日目にウイルス接種した場合は１０．４μｇ／ｍＬであった。【００６６】
細胞が対数増殖期を超えた後にインフルエンザウイルスを接種してプロテアーゼを含まない培地で培養することで、対数増殖期を超える前にウイルスを接種するよりも、インフルエンザウイルスタンパク質量は高い収量であった。【００６７】
（実施例３）細胞の三次元培養時のインフルエンザウイルスの培養
本実施例では、マイクロキャリアを用いた三次元培養で細胞を培養し、プロテアーゼを含まない培地でインフルエンザウイルスを培養したときのインフルエンザウイルスのＨＡ価およびウイルスタンパク質量を確認する。【００６８】
本実施例において、実施例１−２と同様にインフルエンザウイルスの培養には宿主細胞として細胞株Ａを使用した。【００６９】
細胞株Ａを、ガラススピナーフラスコを用い培養液量２００ｍＬにて培養した。細胞培養５日目の対数増殖期を超えた時点の細胞株Ａに、インフルエンザウイルス（Ｂ／Ｍｉｅ／３／２０１５）をｍ．ｏ．ｉ＝０．０１にて接種した。インフルエンザウイルス接種時のＭＤＣＫ細胞の倍加時間は１７時間を超えていた。インフルエンザウイルス接種時の培地はプロテアーゼを含まないイーグルＭＥＭ培地（日水製薬）を使用した。【００７０】
ウイルス接種後、ｐＨ７．０±０．２、温度３４．０℃で撹拌しながらウイルス培養を行った。ウイルス接種後、培養４日目の培養上清をサンプリングし、ＨＡ価およびウイルスタンパク質量を実施例１と同様に測定した。培養４日目のインフルエンザウイルスのＨＡ価は２０４８、ウイルスタンパク質量は４５．８５μｇ／ｍＬであった。【００７１】
（比較例３）
比較例として、Ｔ２２５フラスコを用いた静置培養でＭＤＣＫ細胞を培養し、対数増殖期を超えた時点の細胞株Ａにプロテアーゼを含まない培地でインフルエンザウイルスを接種したときのインフルエンザウイルスのＨＡ価およびウイルスタンパク質量を実施例１と同様に測定した。培養４日目のインフルエンザウイルスのＨＡ価は２５６、ウイルスタンパク質量は２．１２μｇ／ｍＬであった。実施例３と比較例３における細胞数とウイルスタンパク質量の比較を表１に示した。本比較例において、実施例１−２と同様にインフルエンザウイルスの培養には宿主細胞として細胞株Ａを使用した。【００７２】
【表１】
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【００７３】
マイクロキャリアを用いた三次元培養で細胞株Ａを培養したほうが、静置培養で細胞株Ａを培養した場合に比べてインフルエンザウイルスのＨＡ価およびウイルスタンパク質量は高い収量であった。また、インフルエンザウイルス接種時の細胞数でウイルスタンパク質量を割った値である、細胞１個あたりが産生するウイルスタンパク質量は、細胞を三次元培養することで５倍以上となった（表１）。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
以上詳述したように、本発明のＭＤＣＫ細胞が対数増殖期を超えた後プロテアーゼを含まない培地でインフルエンザウイルスを接種する培養方法によれば、効率的にインフルエンザウイルスを培養することができる。その結果、インフルエンザウイルスのウイルスタンパク質を高い収量で得ることができる。本発明は製造スケールでも応用可能であるため、効率的なワクチン製造を可能とすることができ、産業上優れている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2020004425.tif 000007
【国際調査報告】
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2020004425.tif 000010
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