(57)【要約】  本発明の目的は、DKK1とCKAP4の結合を阻害して優れた抗腫瘍効果を奏する抗CKAP4モノクローナル抗体を提供することである。  配列番号１に示すアミノ酸配列（CKAP4のアミノ酸配列）の４５１〜４５５位の領域の少なくとも一部、４８１〜４８５位の領域の少なくとも一部、５０２〜５１０位の領域の少なくとも一部、５０３〜５２４位の領域の少なくとも一部且つ５８５〜５９０位の領域の少なくとも一部、又は５８５〜５９２位の領域の少なくとも一部を、エピトープとして認識する抗CKAP4モノクローナル抗体は、DKK1とCKAP4の結合やS2-CP8細胞のAKTの活性化、S2-CP8細胞の増殖能、又はS2-CP8細胞の遊走能を効果的に阻害して、優れた抗腫瘍効果を奏する。更に、これらの抗CKAP4モノクローナル抗体を用いたELISA法を開発できたことにより、例えば、膵癌患者の血清CKAP4の測定が可能となるため、コンパニオン診断薬の開発にも寄与する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記(i)〜(v)のいずれかに示す部位をエピトープとして認識する、抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片：
(i)配列番号１に示すアミノ酸配列の４５１〜４５５位の領域の少なくとも一部。
(ii)配列番号１に示すアミノ酸配列の４８１〜４８５位の領域の少なくとも一部。
(iii)配列番号１に示すアミノ酸配列の５０２〜５１０位の領域の少なくとも一部。
(iv)配列番号１に示すアミノ酸配列の５０３〜５２４位の領域の少なくとも一部、及び５８５〜５９０位の領域の少なくとも一部。
(v)配列番号１に示すアミノ酸配列の５８５〜５９２位の領域の少なくとも一部。
【請求項２】
アイソタイプがIgGである、請求項１に記載の抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片。
【請求項３】
完全ヒト抗体又はヒト化抗体である、請求項１又は２に記載の抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片を有効成分とする、抗腫瘍剤。
【請求項５】
肺がん、膵がん、又は食道がんの治療に使用される、請求項４に記載の抗腫瘍剤。
【請求項６】
下記(i)〜(v)のいずれかに示す部位をエピトープとして認識する抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片の、抗腫瘍剤の製造のための使用：
(i)配列番号１に示すアミノ酸配列の４５１〜４５５位の領域の少なくとも一部。
(ii)配列番号１に示すアミノ酸配列の４８１〜４８５位の領域の少なくとも一部。
(iii)配列番号１に示すアミノ酸配列の５０２〜５１０位の領域の少なくとも一部。
(iv)配列番号１に示すアミノ酸配列の５０３〜５２４位の領域の少なくとも一部、及び５８５〜５９０位の領域の少なくとも一部。
(v)配列番号１に示すアミノ酸配列の５８５〜５９２位の領域の少なくとも一部。
【請求項７】
腫瘍の治療に使用される、下記(i)〜(v)のいずれかに示す部位をエピトープとして認識する抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片：
(i)配列番号１に示すアミノ酸配列の４５１〜４５５位の領域の少なくとも一部。
(ii)配列番号１に示すアミノ酸配列の４８１〜４８５位の領域の少なくとも一部。
(iii)配列番号１に示すアミノ酸配列の５０２〜５１０位の領域の少なくとも一部。
(iv)配列番号１に示すアミノ酸配列の５０３〜５２４位の領域の少なくとも一部、及び５８５〜５９０位の領域の少なくとも一部。
(v)配列番号１に示すアミノ酸配列の５８５〜５９２位の領域の少なくとも一部。
【請求項８】
腫瘍を罹患している患者に、下記(i)〜(v)のいずれかに示す部位をエピトープとして認識する抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片を投与する工程を含む、腫瘍の治療方法：
(i)配列番号１に示すアミノ酸配列の４５１〜４５５位の領域の少なくとも一部。
(ii)配列番号１に示すアミノ酸配列の４８１〜４８５位の領域の少なくとも一部。
(iii)配列番号１に示すアミノ酸配列の５０２〜５１０位の領域の少なくとも一部。
(iv)配列番号１に示すアミノ酸配列の５０３〜５２４位の領域の少なくとも一部、及び５８５〜５９０位の領域の少なくとも一部。
(v)配列番号１に示すアミノ酸配列の５８５〜５９２位の領域の少なくとも一部。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれかに記載の抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片を用いてCKAP4を測定する工程を含む、CKAP4の測定方法。
【請求項１０】
ELISA法において、請求項１〜３のいずれかに記載の抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片を、キャプチャー抗体及び検出抗体の少なくとも一方に使用する、請求項９に記載のCKAP4の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、DKK1とCKAP4の結合を阻害して優れた抗腫瘍効果を奏する抗CKAP4モノクローナル抗体に関する。また、本発明は、当該抗CKAP4モノクローナル抗体を利用した抗腫瘍剤に関する。更に、本発明は、当該抗CKAP4モノクローナル抗体を利用したCKAP4の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分泌タンパク質Dikkopf 1（DKK1）は、Wntシグナル抑制因子として知られており、胎生期において形態形成を適正化する細胞増殖因子であり、出生後はDKK1が大腸がん細胞の増殖を抑制することが報告されていた。一方、DKK1は、多発性骨髄腫、肝芽腫、ウィムス腫瘍、前立腺がん、腎がん、乳がん、食道がん、肺がん等において過剰発現しており、DKK1にはがん細胞の増殖を促進する機能があると推測されていたが、そのメカニズムは不明であった。【０００３】
このような状況の下、本発明者等は、DKK1によって細胞の増殖を亢進させるシグナル経路について解明している（非特許文献１及び特許文献１）。具体的には、発明者等によって、細胞膜に存在するDKK1結合タンパク質の網羅的な解析の結果、DKK1の新規受容体としてCytoskeleton-associated protein 4（CKAP4）が同定されている。更に、本発明者等によって、(1)DKK1がCKAP4に結合することによりPI3K-AKT経路が活性化され、がん細胞の増殖が促進されること、(2)DKK1とCKAP4の両タンパク質は膵がん、肺がん、及び食道がんで高頻度に腫瘍部特異的に過剰発現しており、これらの両タンパク質が高発現している膵がん、肺がん、及び食道がんは予後不良であること、(3)DKK1又はCKAP4の発現抑制によって、DKK1とCKAP4の両タンパク質が高発現している膵がん細胞株、肺がん細胞株、及び食道がん細胞株においてAKTの活性化を抑制し、マウス皮下での腫瘍形成が抑制されること、等が明らかにされている（非特許文献１及び特許文献１）。また、抗CKAP4ポリクローナル抗体によって、DKK1とCKAP4の結合を阻害して、マウス皮下での膵がん細胞株、肺がん細胞株、及び食道がん細胞株の腫瘍形成を抑制できたことも報告されている（非特許文献１及び特許文献１）。【０００４】
このように、CKAP4ががん細胞の増殖に関与していることが解明されており、CKAP4を標的とする分子標的薬は新たな抗腫瘍剤として注目されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Hirokazu Kimura et al., J. Clin. Invest., 2016, 126(7), p.2689-2705
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１６／１３６３７２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
DKK1とCKAP4の結合を阻害できる抗CKAP4モノクローナル抗体は、CKAP4を標的とする分子標的薬として有用である。また、CKAP4を標的とする分子標的薬として使用する抗CKAP4モノクローナル抗体では、単にCKAP4に結合するだけでなく、DKK1とCKAP4の結合を阻害し、がん細胞の増殖を効果的に抑制することが重要になる。しかしながら、従来技術では、DKK1とCKAP4の結合を阻害してがん細胞の増殖を効果的に抑制するために、CKAP4のどの領域に結合できるモノクローナル抗体が有効であるかについては明らかにされていない。【０００８】
また、CKAP4を標的とする分子標的薬の開発や研究、がんの発症機序の解明、診断等ために、CKAP4の測定法を確立することも必要になる。【０００９】
そこで、本発明の目的の一つは、DKK1とCKAP4の結合を阻害して優れた抗腫瘍効果を奏する抗CKAP4モノクローナル抗体を提供することである。また、本発明の他の目的は、CKAP4の測定方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等は、前記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、配列番号１に示すアミノ酸配列（CKAP4のアミノ酸配列）の４５１〜４５５位の領域の少なくとも一部、４８１〜４８５位の領域の少なくとも一部、５０２〜５１０位の領域の少なくとも一部、５０３〜５２４位の領域の少なくとも一部且つ５８５〜５９０位の領域の少なくとも一部、又は５８５〜５９２位の領域の少なくとも一部を、エピトープとして認識する抗CKAP4モノクローナル抗体は、DKK1とCKAP4の結合を効果的に阻害して、優れた抗腫瘍効果を奏することを見出した。特に、配列番号１に示すアミノ酸配列の５０３〜５２４位の領域の少なくとも一部且つ５８５〜５９０位の領域の少なくとも一部をエピトープとして認識する抗CKAP4モノクローナル抗体は、DKK1-CKAP4シグナルを抑制する作用が格段に高く、顕著に優れた抗腫瘍効果を奏することを見出した。なお、配列番号１に示すアミノ酸配列の５０２〜５１０位の領域の少なくとも一部、５０３〜５２４位の領域の少なくとも一部且つ５８５〜５９０位の領域の少なくとも一部、又は５８５〜５９２位の領域の少なくとも一部をエピトープとして認識する抗CKAP4モノクローナル抗体は、ヒトCKAP4又はその断片を免疫原として通常のマウスに免疫する手法では作製できず、CKAP4をノックアウトしたマウスに対してヒトCKAP4又はその断片を免疫原として免疫するという新規な手法で初めて作製できたものであり、従来技術では容易に作製できない新規なモノクローナル抗体である。【００１１】
また、本発明者等は、前記抗CKAP4モノクローナル抗体を使用した免疫測定法によって、ヒトCKAP4を定量できることをも見出した。【００１２】
本発明は、これらの知見に基づいて、更に検討を重ねることにより完成したものである。即ち、本発明は、以下に掲げる態様の発明を提供する。
項１．  下記(i)〜(v)のいずれかに示す部位をエピトープとして認識する、抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片：
(i)配列番号１に示すアミノ酸配列の４５１〜４５５位の領域の少なくとも一部。
(ii)配列番号１に示すアミノ酸配列の４８１〜４８５位の領域の少なくとも一部。
(iii)配列番号１に示すアミノ酸配列の５０２〜５１０位の領域の少なくとも一部。
(iv)配列番号１に示すアミノ酸配列の５０３〜５２４位の領域の少なくとも一部、及び５８５〜５９０位の領域の少なくとも一部。
(v)配列番号１に示すアミノ酸配列の５８５〜５９２位の領域の少なくとも一部。
項２．  アイソタイプがIgGである、項１に記載の抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片。
項３．  完全ヒト抗体又はヒト化抗体である、項１又は２に記載の抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片。
項４．  項１〜３のいずれかに記載の抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片を有効成分とする、抗腫瘍剤。
項５．  肺がん、膵がん、又は食道がんの治療に使用される、項４に記載の抗腫瘍剤。
項６．  下記(i)〜(v)のいずれかに示す部位をエピトープとして認識する抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片の、抗腫瘍剤の製造のための使用：
(i)配列番号１に示すアミノ酸配列の４５１〜４５５位の領域の少なくとも一部。
(ii)配列番号１に示すアミノ酸配列の４８１〜４８５位の領域の少なくとも一部。
(iii)配列番号１に示すアミノ酸配列の５０２〜５１０位の領域の少なくとも一部。
(iv)配列番号１に示すアミノ酸配列の５０３〜５２４位の領域の少なくとも一部、及び５８５〜５９０位の領域の少なくとも一部。
(v)配列番号１に示すアミノ酸配列の５８５〜５９２位の領域の少なくとも一部。
項７．  腫瘍の治療に使用される、下記(i)〜(v)のいずれかに示す部位をエピトープとして認識する抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片：
(i)配列番号１に示すアミノ酸配列の４５１〜４５５位の領域の少なくとも一部。
(ii)配列番号１に示すアミノ酸配列の４８１〜４８５位の領域の少なくとも一部。
(iii)配列番号１に示すアミノ酸配列の５０２〜５１０位の領域の少なくとも一部。
(iv)配列番号１に示すアミノ酸配列の５０３〜５２４位の領域の少なくとも一部、及び５８５〜５９０位の領域の少なくとも一部。
(v)配列番号１に示すアミノ酸配列の５８５〜５９２位の領域の少なくとも一部。
項８．  腫瘍を罹患している患者に、下記(i)〜(v)のいずれかに示す部位をエピトープとして認識する抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片を投与する工程を含む、腫瘍の治療方法：
(i)配列番号１に示すアミノ酸配列の４５１〜４５５位の領域の少なくとも一部。
(ii)配列番号１に示すアミノ酸配列の４８１〜４８５位の領域の少なくとも一部。
(iii)配列番号１に示すアミノ酸配列の５０２〜５１０位の領域の少なくとも一部。
(iv)配列番号１に示すアミノ酸配列の５０３〜５２４位の領域の少なくとも一部、及び５８５〜５９０位の領域の少なくとも一部。
(v)配列番号１に示すアミノ酸配列の５８５〜５９２位の領域の少なくとも一部。
項９．  項１〜３のいずれかに記載の抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片を用いてCKAP4を測定する工程を含む、CKAP4の測定方法。
項１０．  ELISA法において、項１〜３のいずれかに記載の抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片を、キャプチャー抗体及び検出抗体の少なくとも一方に使用する、項９に記載のCKAP4の測定方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の抗CKAP4モノクローナル抗体は、DKK1とCKAP4の結合を効果的に阻害して、優れた抗腫瘍効果を奏するので、抗腫瘍剤等のCKAP4を標的とする分子標的薬として好適に使用できる。また、本発明の抗CKAP4モノクローナル抗体を使用することによって、CKAP4を定量的又は定性的に測定することが可能になる。また、本発明の抗CKAP4モノクローナル抗体は、優れた免疫沈降能を有しており、CKAP4の結合タンパク質の網羅的解析に使用することが可能であり、CKAP4の機能の分析やCKAP4の結合タンパク質の探索や機能の分析等、基礎研究における重要なツールになり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】抗体83-2C8、73-1C12、52-2G9、及び1G4-4A9について、エピトープマッピング分析によってエピトープを同定した結果を示す図である。
【図２】Ａは、抗HA抗体、抗体83-2C8、73-1C12、及び52-2G9を用いて、ヒトCKAP4の欠失変異体に対してイムノブロッティング（IB）を行った結果を示す図である。Ｂは、抗体52-2G9、及び1G4-4A9を用いて、ヒトCKAP4の欠失変異体に対してイムノブロッティングを行った結果を示す図である。Ｃは、抗体52-2G9、３F11-2B10、及び５A6-17A11を用いて、ヒトCKAP4の欠失変異体に対してイムノブロッティングを行った結果を示す図である。Ｄは、使用したヒトCKAP4の欠失変異体のアミノ酸配列を示す図である。
【図３】抗体83-2C8、73-1C12、52-2G9、1G4-4A9、3F11-2B10、及び5A6-17A11のエピトープを模式的に示した纏めたイメージ図である。
【図４】抗体83-2C8、73-1C12、52-2G9、1G4-4A9、3F11-2B10、5A6-17A11、及び抗CKAP4ポリクローナル抗体を用いて、ヒト、イヌ、及びマウス由来のCKAP4に対してイムノブロッティング（IB）を行った結果を示す図である。
【図５】抗体3F11-2B10を用いてS2-CP8細胞の表面のCKAP4を検出した結果を示す図である。
【図６】抗体83-2C8、73-1C12、52-2G9、1G4-4A9、3F11-2B10、5A6-17A11について、CKAP4の細胞外ドメイン（ECD）に対する結合能を測定した結果を示す図である。
【図７】Ａは、各抗CKAP4モノクローナル抗体を用いて、CKAP4とDKK1の結合阻害能を評価した結果を示す図である。Ｂは、各抗CKAP4モノクローナル抗体を用いて、免疫沈降能を評価した結果を示す図である。Ｃは、抗CKAP4モノクローナル抗体について、ヒト膵がん細胞（S2-CP8細胞）のAKTの活性阻害能を評価した結果を示す図である。Ｄは、各抗CKAP4モノクローナル抗体を用いて、3次元培養下でのS2-CP8細胞の増殖阻害能を評価した結果を示す図である。Ｅは、各抗CKAP4モノクローナル抗体を用いて、S2-CP8細胞の遊走阻害能を評価した結果を示す図である。
【図８】Ａは、DKK1をノックアウトしたS2-CP8細胞（S2-CP8/DKK1 KO細胞）に抗CKAP4モノクローナル抗体、コントロールIgG又はDKK1-FLAGを添加して所定時間培養した後に、細胞膜(PM)と細胞溶解液（lysates）のCKAP4を検出した結果を示す図である。Ｂは、S2-CP8/DKK1 KO細胞を抗CKAP4モノクローナル抗体、又はコントロールIgGを含む培地で培養し、更にDKK1-FLAGを添加して所定時間培養した後に、細胞膜(PM)と細胞溶解液（lysates）のCKAP4を検出した結果を示す図である。
【図９】S2-CP8細胞を皮下注入したヌードマウスに抗体73-1C12、52-2G9、1G4-4A9、3F11-2B10、５A6-17A11又はコントロールIgGを投与して、異種腫瘍組織片の外観観察、並びに体積及び重量の測定を行った結果を示す図である。
【図１０】S2-CP8細胞を皮下注入したヌードマウスに抗体83-2C8又はコントロールIgGを投与して、異種腫瘍組織片の外観観察、並びに体積及び重量の測定を行った結果を示す図である。
【図１１】S2-CP8細胞を皮下注入したヌードマウスに抗体３F11-2B10又はコントロールIgGを図９よりも低用量で投与して、異種腫瘍組織片の外観観察、並びに体積及び重量の測定を行った結果を示す図である。
【図１２】S2-CP8細胞を皮下注入したヌードマウスに抗体３F11-2B10又はコントロールIgGを投与して、異種腫瘍組織片の体積及び重量の測定を行った結果を示す図である。
【図１３】S2-CP8細胞を皮下注入したヌードマウスに抗体３F11-2B10及び／又はゲムシタビン、又はコントロールIgGを投与して、異種腫瘍組織片の外観観察、並びに体積及び重量の測定を行った結果を示す図である。
【図１４】S2-CP8細胞を腹腔内に注入したヌードマウスに抗体３F11-2B10又はコントロールIgGを投与し、生存日数を計測した結果を示す図である。
【図１５】ヒト膵がん細胞（HPAF-II細胞）を皮下注入したヌードマウスに抗体3F11-2B10を投与して、異種腫瘍組織片の外観観察、並びに体積及び重量の測定を行った結果を示す図である。
【図１６】ヒト肺がん細胞（A549細胞）を皮下注入したヌードマウスに抗体3F11-2B、73-1C12又はコントロールIgGを投与して、異種腫瘍組織片の外観観察、並びに体積及び重量の測定を行った結果を示す図である。
【図１７】抗体3F11-2B10をキャプチャー抗体、抗体1G4-4A9を検出抗体としてサンドイッチELISAにより、組み換えヒトCKAP4を段階的に希釈した溶液のCKAP4濃度を求めた結果を示す図である。
【図１８】抗体3F11-2B10をキャプチャー抗体、抗体1G4-4A9を検出抗体としてサンドイッチELISAにより、各種検体溶液のCKAP4濃度を求めた結果を示す図である。各検体の詳細は表２に示す。
【図１９】抗体5A6-17A11を検出抗体としてPS CaptureTM Exosome ELISA Kitを用いてエクソソームELISAにより、各検体中のエクソソーム中のCKAP4を検出した結果を示す図である。各検体の詳細は、表３に示す。
【図２０】Ａは、抗体3F11-2B10をキャプチャー抗体、抗体1G4-4A9を検出抗体としてサンドイッチELISAにおいて、組み換えヒトCKAP4を段階的に希釈した溶液を使用して作製した標準曲線を示す図である。Ｂは、抗体3F11-2B10をキャプチャー抗体、抗体1G4-4A9を検出抗体としてサンドイッチELISAにより、ヒト膵管腺癌患者の血清中のCKAP4濃度を測定した結果を示す図である。Ｃは、抗体5A6-17A11を検出抗体としてエクソソームELISAによりヒト膵管腺癌患者の血清に含まれるエクソソーム中のCKAP4を検出した結果を示す図である。左のレーンは検体を直接、右のレーンは検体を10倍希釈したものである。Ｄは、患者毎に血清中のCKAP4の測定結果とエクソソーム中のCKAP4の測定結果を対比した図である。Ｅは、サンドイッチELISAにより、健常者（HC）、免疫組織化学的にCKAP4陰性であことが確認された膵管腺癌の患者(PDAC IHC(-))、及び免疫組織化学的にCKAP4陽性であことが確認された膵管腺癌の患者(PDAC IHC(+))から得られた血清中のCKAP4を測定した結果を示す図である。Ｆは、抗体5A6-17A11を検出抗体としてエクソソームELISAにより、健常者（HC）、免疫組織化学的にCKAP4陰性であことが確認された膵管腺癌の患者(PDAC IHC(-))、及び免疫組織化学的にCKAP4陽性であことが確認された膵管腺癌の患者(PDAC IHC(+))から得られた血清に含まれるエクソソーム中のCKAP4を測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
１．抗CKAP4モノクローナル抗体及びその抗体断片
本発明は、抗CKAP4モノクローナル抗体及びその抗体断片であって、下記(i)〜(v)のいずれかに示す部位をエピトープとして認識することを特徴とする：(i)配列番号１に示すアミノ酸配列の４５１〜４５５位の領域の少なくとも一部、(ii)配列番号１に示すアミノ酸配列の４８１〜４８５位の領域の少なくとも一部、(iii)配列番号１に示すアミノ酸配列の５０２〜５１０位の領域の少なくとも一部、(iv)配列番号１に示すアミノ酸配列の５０３〜５２４の領域の少なくとも一部及び５８５〜５９０位の領域の少なくとも一部。(v)配列番号１に示すアミノ酸配列の５８５〜５９２位の領域の少なくとも一部。以下、本発明の抗体について詳述する。
【００１６】
本発明の抗体は、ヒトCKAP4に結合する抗体である。CKAP4は、膜貫通型タンパク質として公知であり、ヒトCKAP4のアミノ酸配列は配列番号１に示す通りである。ヒトCKAP4において、配列番号１の１〜１０６位の領域が細胞内ドメイン、１０７〜１２７位の領域が膜貫通ドメイン、１２８〜６０２位の領域は細胞外ドメイン（又は小胞体内ドメイン）を形成している。また、ヒトCKAP4において、配列番号１の１〜２１位の領域は小胞体アンカードメイン、２４〜１０１位の領域は微小管結合ドメイン、３１８〜３２８位の領域はチロシン硫酸化領域、４６８〜５０３位の領域はロイシンジッパー領域、５２５〜６０２位の領域はαへリックス領域を形成している。
【００１７】
本発明の抗体は、(i)配列番号１に示すアミノ酸配列の４５１〜４５５位（LQGRL）の領域の少なくとも一部、(ii)配列番号１に示すアミノ酸配列の４８１〜４８５位（VLYGD）の領域の少なくとも一部、(iii)配列番号１に示すアミノ酸配列の５０２〜５１０位（SLQKVQEQV）の領域の少なくとも一部、(iv)配列番号１に示すアミノ酸配列の５０３〜５２４位(LQKVQEQVHTLLSQDQAQAARL)の領域の少なくとも一部及び５８５〜５９０位（RNDLDR）の領域の少なくとも一部、又は(v)配列番号１に示すアミノ酸配列の５８５〜５９２位の領域（RNDLDRLF）の領域の少なくとも一部を、エピトープとして認識する。このようにCKAP4の特定の部位を認識する抗CKAP4モノクローナル抗体を選択することによって、DKK1とCKAP4の結合を効果的に阻害することができ、格段に優れた抗腫瘍効果を奏することが可能になる。
【００１８】
本発明の抗体が認識するエピトープの内、(i)配列番号１に示すアミノ酸配列の４５１〜４５５位の領域の少なくとも一部、(ii)配列番号１に示すアミノ酸配列の４８１〜４８５位の領域の少なくとも一部、及び(iii)配列番号１に示すアミノ酸配列の５０２〜５１０位の領域の少なくとも一部は、それぞれ線状エピトープとして認識される。ここで、「線状エピトープ」とは、アミノ酸の一次配列が抗原結合部位として認識されるエピトープである。抗CKAP4モノクローナル抗体が認識する線状エピトープは、CKAP4の断片ペプチドを利用したエピトープマッピング解析によって特定することができる。
【００１９】
また、本発明の抗体が認識するエピトープの内、(iv)配列番号１に示すアミノ酸配列の５０３〜５２４の領域の少なくとも一部及び５８５〜５９０位の領域の少なくとも一部、及び(v)配列番号１に示すアミノ酸配列の５８５〜５９２位の領域の少なくとも一部については、立体構造エピトープとして認識される。ここで、「立体構造エピトープ」とは、アミノ酸の一次配列が抗原結合部位として認識されるのではなく、CKAP4が本来有する立体構造を構成した場合に抗体によって認識可能になるエピトープである。
【００２０】
本発明の抗体において、(iv)配列番号１に示すアミノ酸配列の５０３〜５２４位の領域の少なくとも一部及び５８５〜５９０位の領域の少なくとも一部をエピトープとして認識するとは、配列番号１に示すアミノ酸配列の５０３〜５２４位の領域の少なくとも一部と５８５〜５９０位の領域の少なくとも一部との双方によって形成される立体構造部位をエピトープとして認識することを意味する。即ち、当該抗体は、配列番号１に示すアミノ酸配列の５０３〜５２４位の領域又は５８５〜５９０位の領域のいずれか一方を欠失させたCKAP4変異体に対しては、結合能が乏しくなったり喪失したりする。配列番号１に示すアミノ酸配列の５０３〜５２４位の領域の少なくとも一部及び５８５〜５９０位の領域の少なくとも一部が立体構造エピトープとして認識することについては、(1)配列番号１に示すアミノ酸配列の５０３〜５９０位内に含まれるCKAP4の17個のアミノ酸からなる断片ペプチドには結合しないこと、(2)配列番号１に示すアミノ酸配列の５９０〜６０２位の領域を欠失させたCKAP4変異体への結合能に比べ、５８５〜６０２の領域を欠失させたCKAP4変異体への結合能に乏しいこと、（3）配列番号１に示すアミノ酸配列の５８５〜６０２位の領域を欠失させたCKAP4変異体への結合能と５２５〜６０２位の領域を欠失させたCKAP4変異体への結合能が同程度であること、(4)５０３〜６０２位の領域を欠失させたCKAP4変異体には結合しないこと、及び(5)本来の立体構造を有するCKAP4には結合すること、を確認することによって特定できる。
【００２１】
また、同様に、本発明の抗体が、(v)配列番号１に示すアミノ酸配列の５８５〜５９２位の領域の少なくとも一部をエピトープとして認識する場合、一次構造上は当該領域とは離れた位置に存在するアミノ酸残基も当該領域と共にエピトープを構成していることがあり得る。配列番号１に示すアミノ酸配列の５８５〜５９２位の領域の少なくとも一部が立体構造エピトープとして認識することについては、(1)配列番号１に示すアミノ酸配列の５８５〜５９２位を含むCKAP4の断片ペプチド（例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列の５７８〜５９４位の領域からなる断片ペプチド）には結合しないこと、(2)配列番号１に示すアミノ酸配列の５９２〜６０２位の領域を欠失させたCKAP4変異体への結合能に比べ、５９０〜６０２位の領域を欠失させたCKAP4変異体への結合能に乏しいこと、(3)配列番号１に示すアミノ酸配列の５８５〜６０２位の領域を欠失させたCKAP4変異体へは結合しないこと、及び(4)本来の立体構造を有するCKAP4には結合すること、を確認することによって特定できる。
【００２２】
本発明の抗体の中でも、特に、配列番号１に示すアミノ酸配列の５０３〜５２４位の領域の少なくとも一部及び５８５〜５９０位の領域の少なくとも一部を、エピトープとして認識する抗CKAP4モノクローナル抗体は、DKK1-CKAP4シグナルを抑制する作用が格段に高く、顕著に優れた抗腫瘍効果を奏するので、本発明の抗体の中でも特に好適といえる。
【００２３】
また、CKAP4は、種が相違しても配列保存性が高いという特徴があり、例えば、ヒト由来とマウス由来ではアミノ酸配列の同一性が約８割と高くなっている。このような配列保存性に起因して、通常のマウスをヒトCKAP4（配列番号１）で免疫しても、配列番号１の５０３〜５２４位の領域の少なくとも一部且つ５８５〜５９０位の領域の少なくとも一部、又は配列番号１に示すアミノ酸配列の５８５〜５９２位の領域の少なくとも一部をエピトープとして認識する抗CKAP4モノクローナル抗体を得ることは困難である。そこで、当該抗CKAP4抗体を得るには、CKAP4をノックアウトした非ヒト動物（マウス等）を用いて免疫することが重要になる。即ち、配列番号１の５０３〜５２４位の領域の少なくとも一部且つ５８５〜５９０位の領域の少なくとも一部、又は配列番号１に示すアミノ酸配列の５８５〜５９２位の領域の少なくとも一部をエピトープとして認識する抗CKAP4モノクローナル抗体は、通常の抗体作製手法では得られない特有のものであり、実際、マウスCKAP4及びヒトCKAP4の両方を認識可能である。
【００２４】
本発明の抗体は、マウスやラット等に免疫して単離されるマウス抗体やラット抗体等であってもよいが、ヒト体内での抗原性を低減させるという観点から、好ましくは、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、更に好ましくは完全ヒト抗体、ヒト化抗体、特に好ましくは完全ヒト抗体が挙げられる。
【００２５】
ここで、「完全ヒト抗体」とは、可変領域及び定常領域の全ての構成がヒトに由来する抗体である。また、「ヒト化抗体」とは、マウス等の非ヒト哺乳動物に由来する抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）配列をヒト抗体のフレームワーク配列上に移植した抗体であり、ＣＤＲ配列以外はヒト抗体に由来している抗体である。また、「キメラ抗体」とは、可変領域配列がヒト以外の哺乳動物由来であって、定常領域配列がヒト由来である抗体であり、例えば、可変領域配列がマウス抗体体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来するマウス−ヒトキメラ抗体等が挙げられる。完全ヒト抗体、ヒト化抗体、及びキメラ抗体の作製方法は確立しており、これらの抗体は公知の手法で作製できる。
【００２６】
本発明の抗体のアイソタイプについては、特に制限されないが、例えば、IgG（IgG1、IgG2、IgG3及びIgG4）、IgA（IgA1及びIgA2）、IgM、IgD、及びIgE等のいずれであってもよいが、好ましくはIgGが挙げられる。
【００２７】
また、本発明の抗体断片としては、前記エピトープを認識し結合するためのCDRを少なくとも有するものであればよく、Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、scFv-Fc等が挙げられる。
【００２８】
本発明の抗体及びその抗体断片は、公知の抗体作製手法に従って得ることができる。具体的には、本発明の抗体は、CKAP4、CKAP4の細胞外ドメイン（又は小胞体内ドメイン）（配列番号１に示すアミノ酸配列の１２８〜６０２位）、又は前記エピトープを含むペプチドを用いて、マウス等の非ヒト動物を免疫する工程を含む、モノクローナル抗体の作製方法に従って得ることができる。なお、CKAP4のアミノ酸配列は、マウスとヒトの相同性が高いため、通常のマウスを利用して免疫を行っても、配列番号１の５０３〜５２４位の領域の少なくとも一部且つ５８５〜５９０位の領域の少なくとも一部、又は配列番号１に示すアミノ酸配列の５８５〜５９２位の領域の少なくとも一部をエピトープとする抗CKAP4抗体を得ることは困難である。そのため、配列番号１の５０３〜５２４位の領域の少なくとも一部且つ５８５〜５９０位の領域の少なくとも一部、又は配列番号１に示すアミノ酸配列の５８５〜５９２位の領域の少なくとも一部をエピトープとする抗CKAP4抗体を得るには、例えば、CKAP4をノックアウトしたマウスに対して、CKAP4又はCKAP4の細胞外ドメインを免疫すればよい。得られた抗体が認識するエピトープについては、前述する方法で抗原結合部位を確認すればよい。また、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体についても、公知の作製手法で得ることができる。
【００２９】
２．抗腫瘍剤
本発明の抗腫瘍剤は、前記抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片を有効成分とすることを特徴とする。以下、本発明の抗腫瘍剤について詳述する。
【００３０】
（有効成分）
本発明の抗腫瘍剤は、前記抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片を有効成分として使用する。
【００３１】
（用途）
特許文献１に開示されているように、CKAP4は、がん細胞において発現し、がん細胞の増殖を亢進させているので、本発明の抗腫瘍剤では、CKAP4の発現又は機能を抑制することにより、がん細胞の増殖抑制が可能になっている。従って、本発明の抗腫瘍剤は、がんの治療の用途に使用できる。本発明の抗腫瘍剤の適用対象となるがんとしては、特に制限されないが、具体的には、肺がん、膵がん、食道がん、大腸がん、結腸がん、胃がん、直腸がん、肝がん、乳がん、膀胱がん、前立腺がん、子宮頚がん、頭頚部がん、胆管がん、胆嚢がん、口腔がん、舌がん、咽頭がん、喉頭がん、脳腫瘍、神経膠腫（グリオーマ）、膠芽腫、多型性神経膠芽腫、腹膜播種等の固形がん；白血病、悪性リンパ腫等の血液がんが挙げられる。
【００３２】
また、特許文献１に開示されているように、抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片剤は、CKAP4を発現しているがん細胞、特にCKAP4とDKK1の双方を発現しているがん細胞に対して、効果的にがん細胞の増殖抑制効果を奏するので、本発明の抗腫瘍剤では、CKAP4を発現しているがん、とりわけCKAP4とDKK1の双方を発現しているがんが、好適な適用対象といえる。がんの中でも、肺がん、膵がん、及び食道がんは、高い頻度でCKAP4及びDKK1が高発現しており、本発明の抗腫瘍剤の適用対象となるがんとして特に好適である。
【００３３】
がんにおけるCKAP4の発現については、採取したがん組織に対して組織免疫することによって確認することができる。具体的には、採取したがん組織に対して、抗CKAP4抗体を用いて免疫染色し、腫瘍領域においてCKAP4の発現が認められる領域が5％以上存在する場合には、CKAP4が発現されていると判断される。本発明の抗腫瘍剤の適用対象となるがんの好適な例として、腫瘍領域においてCKAP4の発現領域が5％以上存在するがん、更に好ましくは、腫瘍領域においてCKAP4の発現領域が20％以上存在するがん、特に好ましくは、腫瘍領域においてCKAP4の発現領域50％以上存在するがんが挙げられる。
【００３４】
また、がんにおけるCKAP4の発現については、採取したがん組織からRNAを回収し、定量的PCRによって測定することもできる。この場合、CKAP4の発現の有無の判定は、同一症例の非がん組織を指標として行えばよい。具体的には、がん組織の細胞溶解液におけるCKAP4量が、同一症例の非がん組織の細胞溶解液におけるCKAP4量よりも多い場合には、当該がんではCKAP4が高発現されていると判断される。
【００３５】
また、がんにおけるDKK1の発現の確認についても、CKAP4の場合と同様に、採取したがん組織に対して組織免疫する方法、採取したがん組織からRNAを回収し、定量的PCRによって測定する方法等によって確認することができる。
【００３６】
具体的には、採取したがん組織に対して抗DKK1抗体を用いて免疫染色する場合には、腫瘍領域においてDKK1の発現が認められる領域が5％以上存在する場合には、DKK1が発現されていると判断される。本発明の抗腫瘍剤の適用対象となるがんの好適な例として、腫瘍領域においてDKK1の発現領域が5％以上存在するがん、更に好ましくは、腫瘍領域においてDKK1の発現領域が20％以上存在するがん、特に好ましくは、腫瘍領域においてDKK1の発現領域50％以上存在するがんが挙げられる。
【００３７】
また、採取したがん組織からRNAを回収してDKK1を測定する場合には、がん組織の細胞溶解液におけるDKK1量が、同一症例の非がん組織の細胞溶解液におけるDKK1量よりも多い場合には、当該がんではDKK1が発現されていると判断される。
【００３８】
（投与形態）
本発明の抗腫瘍剤の投与形態については、抗腫瘍効果が得られることを限度として、経口投与又は非経口投与のいずれであってもよい。本発明の抗腫瘍剤の投与形態として、具体的には、経口投与；注射投与（静脈注射、皮下注射、筋肉注射、腹腔注射、患部への局所注射等）、座薬投与等の非経口投与、好ましくは注射投与が挙げられる。
【００３９】
本発明の抗腫瘍剤の投与量については、与形態、適用対象となるがんの種類、患者の症状の程度等に応じて適宜設定すればよい。例えば、有効成分として核酸分子を使用する場合であれば、核酸分子の１回量として、通常0.01 μg〜1000 mg／kg体重程度、好ましくは0.1〜100 μg／kg体重程度を投与すればよい。また、例えば、抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片の１回量として、通常0.1 mg〜20 mg／kg体重程度を、1〜3週毎に１回程度の頻度で投与すればよい。
【００４０】
本発明の抗腫瘍剤は、単独で使用してもよいが、１種又は２種以上の抗腫瘍作用を有する他の薬剤及び／又は放射線療法と併用してもよい。本発明の抗腫瘍剤と併用される他の薬剤の一例として、化学療法で使用される抗腫瘍剤が挙げられる。このような抗腫瘍剤としては、具体的には、代謝拮抗剤、アルキル化薬、微小管作用薬、抗癌性抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、白金製剤等が挙げられる。具体的には、ゲムシタビン、５−フルオロウラシル、メソトレキセート、ドキシフルリジン、テガフール、６−メルカプトプリン、シタラビン等の代謝拮抗剤；クロホスファミド、イホスファミド、チオテパ、カルボコン、塩酸ニムスチン等のアルキル化薬；ドセタキセル、パクリタキセル、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン等の微小管作用薬；塩酸ドキソルビシン、マイトマイシン、塩酸アムルビシン、塩酸ピラルビシン、塩酸エピルビシン、塩酸アクラルビシン、塩酸ミトキサントロン、塩酸ブレオマイシン、硫酸ペプロマイシン等の抗癌性抗生物質；イリノテカン、塩酸ノギテカン等のトポイソメラーゼ阻害剤；シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン等の白金製剤等が挙げられる。これらの中でも、代謝拮抗剤（特にゲムシタビン）は、本発明の抗腫瘍剤との併用によって抗腫瘍効果を格段に向上させ得るため、好適である。
【００４１】
（製剤形態）
本発明の抗腫瘍剤は、投与形態に応じた製剤形態に調製される。本発明の抗腫瘍剤の製剤形態としては、例えば、液剤、懸濁剤、乳剤、注射剤等の液状製剤；錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤、坐剤等の固形製剤等が挙げられる。
【００４２】
また、本発明の抗腫瘍剤は、その製剤形態に応じて、薬学的に許容される担体や添加剤を加えて製剤化される。例えば、液状製剤の場合であれば、生理食塩水、緩衝液等を用いて製剤化することができる。また、固形製剤の場合であれば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を用いて製剤化することができる。
【００４３】
３．CKAP4の測定方法
本発明のCKAP4の測定方法は、前記抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片を用いて、CKAP4を測定する工程を含むことを特徴とする。以下、本発明の測定方法について詳述する。
【００４４】
本発明の測定方法では、前記抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片と、検体中のCKAP4との抗原抗体反応を利用して検体中のCKAP4を免疫測定する。
【００４５】
検体としては、CKAP4の測定が求められるものであることを限度として特に制限されないが、例えば、血液、血清、血漿、尿、髄液、腹水、各種組織、各種組織液、精製エクソソーム等の生体由来検体、培養液が挙げられる。
【００４６】
本発明の測定方法は、サンドイッチELISA法、エクソソームELISA法、競合法、凝集法等のいずれの免疫測定を採用してもよい。また、本発明の測定方法は、生体組織の免疫染色に使用することもできる。
【００４７】
サンドイッチELISA法では、抗原を捕獲するキャプチャー抗体と、当該キャプチャー抗体に結合した抗原に対して結合する検出抗体を使用する。本発明の測定方法において、サンドイッチ法を採用する場合には、キャプチャー抗体及び検出抗体の少なくとも一方に、前記抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片を使用すればよい。特に、より高精度にCKAP4を測定するという観点から、キャプチャー抗体及び検出抗体の少なくとも一方に、配列番号１に示すアミノ酸配列の５０３〜５２４位の領域の少なくとも一部及び５８５〜５９０位の領域の少なくとも一部をエピトープとして認識する抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片を使用することが好ましい。
【００４８】
また、本発明の測定方法において、サンドイッチELISA法を採用する場合の好適な態様として、前記抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片の中の１つをキャプチャー抗体に使用し、且つ前記抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片の中の他の１つ（キャプチャー抗体として使用したものとは認識するエピトープが異なるもの）を検出抗体として使用する態様；更に好ましくは、配列番号１に示すアミノ酸配列の５０３〜５２４位の領域の少なくとも一部及び５８５〜５９０位の領域の少なくとも一部をエピトープとして認識する抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片をキャプチャー抗体に使用し、且つ配列番号１に示すアミノ酸配列の４５１〜４５５位の領域の少なくとも一部、４８１〜４８５位の領域の少なくとも一部、又は５０２〜５１０位の領域の少なくとも一部をエピトープとして認識する抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片を検出抗体として使用する態様；特に好ましくは、配列番号１に示すアミノ酸配列の５０３〜５２４位の領域の少なくとも一部及び５８５〜５９０位の領域の少なくとも一部をエピトープとして認識する抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片をキャプチャー抗体に使用し、且つ配列番号１に示すアミノ酸配列の５０２〜５１０位の領域の少なくとも一部をエピトープとして認識する抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片を検出抗体として使用する態様が挙げられる。
【００４９】
エクソソームELISAは、エクソソームの表面に存在する分子（例えば、ホスファチジルセリン等に特異的に結合するタンパク質を固相化したプレートに、エクソソームを反応させて固定化した後に、前記抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片の中の１つを検出抗体として使用することにより、エクソソーム中のCKAP4の測定を行う分析である。エクソソームELISAで使用される検出抗体として、特に好ましくは、配列番号１に示すアミノ酸配列の５８５〜５９２位の領域の少なくとも一部をエピトープとして認識する抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片が挙げられる。
【００５０】
また、免疫測定は、標識の種類に応じて、酵素免疫測定法（ELISA）、蛍光免疫測定法、放射性同位体免疫測定法等があるが、本発明の測定方法では、これらのいずれを使用してもよい。測定の簡易性や迅速性の観点から、好ましくは酵素免疫測定法が挙げられる。
【００５１】
抗原抗体反応を利用した免疫測定自体は公知であり、本発明の測定方法は、免疫測定の測定原理や標識の種類に応じた公知の手法で行うことができる。
【００５２】
また、被験者から採取されたエクソソーム中のCKAP4の有無を指標とすることにより、被験者が癌に罹患しているか否かを診断できることが知られているので、本発明のCKAP4抗体又はその断片を用いるエクソームELISA法は、癌の検査目的で、被験者から採取されたエクソソーム中のCKAP4の測定に使用することができる。検査対象となる癌の種類については、特に制限されないが、具体的には、肺癌、膵癌、大腸癌、結腸癌、胃癌、直腸癌、肝癌、乳癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮頚癌、頭頚部癌、胆管癌、胆嚢癌、口腔癌、舌癌、咽頭癌、喉頭癌、脳腫瘍、神経膠腫（グリオーマ）、膠芽腫、多型性神経膠芽腫等の固形癌；白血病、悪性リンパ腫等の血液癌が挙げられる。これらの中でも、好ましくは肺癌、膵癌及び食道癌が挙げられる。また、癌の検査に使用されるエクソソームの由来については、特に制限されないが、例えば、血清、尿等の体液が挙げられる。これらの中でも、好ましくは血清が挙げられる。
【００５３】
また、被験者から採取された血液検体中のCKAP4の有無を指標とすることにより、被験者が癌に罹患しているか否かを診断できることが知られているので、本発明のCKAP4抗体又はその断片を用いるサンドイッチELISA法は、癌の検査目的で、被験者から採取された血液検体中のCKAP4の測定に使用することができる。検査対象となる癌の種類については、特に制限されないが、具体的には、肺癌、膵癌、大腸癌、結腸癌、胃癌、直腸癌、肝癌、乳癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮頚癌、頭頚部癌、胆管癌、胆嚢癌、口腔癌、舌癌、咽頭癌、喉頭癌、脳腫瘍、神経膠腫（グリオーマ）、膠芽腫、多型性神経膠芽腫等の固形癌；白血病、悪性リンパ腫等の血液癌が挙げられる。これらの中でも、好ましくは肺癌、膵癌及び食道癌が挙げられる。また、癌の検査に使用される血液検体としては、例えば、血清、血漿等が挙げられ、好ましくは血清が挙げられる。
【００５４】
また、癌組織におけるCKAP4の発現量は、癌患者の術後の予後と相関することが知られているので、本発明の測定方法は、癌患者の術後の予後の検査目的で、癌患者から採取した癌組織におけるCKAP4の発現量の測定に使用することができる。予後の検査対象となる癌の種類については、特に制限されないが、具体的には、肺癌、膵癌、大腸癌、結腸癌、胃癌、直腸癌、肝癌、乳癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮頚癌、頭頚部癌、胆管癌、胆嚢癌、口腔癌、舌癌、咽頭癌、喉頭癌、脳腫瘍、神経膠腫（グリオーマ）、膠芽腫、多型性神経膠芽腫等の固形癌；白血病、悪性リンパ腫等の血液癌が挙げられる。これらの中でも、好ましくは肺癌、膵癌及び食道癌が挙げられる。
【００５５】
更に、本発明は、前記測定方法に使用される測定キットについても提供する。本発明の測定キットには、前記抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片が含まれる。
【００５６】
また、本発明の測定キットには、前記抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片以外に、更に免疫測定の測定原理や標識の種類に応じて、他の試薬や器具が含まれていてもよい。例えば、酵素免疫測定法を選択する場合、前記抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片以外に、測定プレート、基質溶液、反応停止液、洗浄液、標準溶液等が含まれていてもよい。また、サンドイッチELISA法を採用する場合には、キャプチャー抗体として使用される抗CKAP4モノクローナル抗体又はその抗体断片は、固相に固定化された状態で提供されてもよい。
【００５７】
本発明の測定キットは、癌の検査キット又は癌患者の術後の予後の検査キットとして使用することができる。
【実施例】
【００５８】
以下、実験データに基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。【００５９】
１．抗CKAP4モノクローナル抗体の作製
CKAP4を特異的に認識するマウスモノクローナル抗体を腸骨リンパ節法又は脾臓法によって作製した。【００６０】
腸骨リンパ節法では、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）とヒトCKAP4の細胞外ドメイン（配列番号１に示すアミノ酸配列の１２８〜６０２位のアミノ酸残基からなるポリペプチド）を融合させた融合タンパク質を0.7 mg/mL、及び完全フロイントアジュバントを含むエマルジョン100μLを、10週齢の雌マウス（野生型）の尾根部に注射して免疫した。更に、１回目の免疫注射から17日後に、前記融合タンパク質を0.7 mg/mLを含むエマルジョン100μLで尾根部に注射して追加免疫した。追加免疫から4日後に、免疫したマウスの腸骨リンパ節から細胞を回収し、50％ポリエチレングリコール中でマウス骨髄腫由来ミエローマSp2/0-Ag14細胞と融合させ、ハイブリドーマを得た。【００６１】
また、脾臓法では、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）とヒトCKAP4の細胞外ドメインのC末端（配列番号１に示すアミノ酸配列の４６８〜６０２位のアミノ酸残基からなるポリペプチド）を融合させた融合タンパク質を1 mg/mL、及び完全フロイントアジュバントを含むエマルジョン100 μLを、CKAP4をノックアウトした８週齢のマウスの腹腔内に注射して免疫した。更に、１回目の免疫注射から14日毎に合計4回、前記融合タンパク質を1 mg/mLを含むエマルジョン100 μLを腹腔内に注射して追加免疫した。最後の追加免疫から14日後に、免疫したマウスの脾臓から細胞を回収し、50％ポリエチレングリコール中でマウス骨髄腫由来ミエローマSp2/0-Ag14細胞と融合させ、ハイブリドーマを得た。【００６２】
得られたハイブリドーマを96ウェルプレートに播種し、HAT選択培地中で培養した。次いで、抗CKAP4抗体を産生するハイブリドーマを、ELISAによる測定、ウエスタンブロッティングによる内因性CKAP4の検出、細胞表面のCKAP4の免疫染色、及びハイブリドーマ培養上清を用いたDKK1とCKAP4の結合阻害能の測定を行うことによって同定した。【００６３】
その結果、最終的に、抗CKAP4モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンとして、腸骨リンパ節法で3株、脾臓法で3株を得た。腸骨リンパ節法で取得したハイブリドーマクローン3株から得られる抗CKAP4モノクローナル抗体を、それぞれ83-2C8、73-1C12、及び52-2G9と命名した。また、脾臓法で取得したハイブリドーマクローン3株から得られる抗CKAP4モノクローナル抗体を、それぞれ1G4-4A9、3F11-2B10及び5A6-17A11と命名した。【００６４】
得られた各抗CKAP4モノクローナル抗体のアイソタイプについて、マウスアイソタイピングキットを用いて同定したところ、抗体83-2C8、73-1C12、1G4-4A9、及び3F11-2B10はIgG2b(k)であり、抗体52-2G9及び5A6-17A11はIgG2a(k)であることが確認された。【００６５】
２．抗CKAP4モノクローナル抗体のエピトープの同定
得られた抗CKAP4モノクローナル抗体についてエピトープの同定を行った。具体的には、ヒトCKAP4の断片ペプチド（各ペプチドのアミノ酸残基は17個、隣接するペプチドは7個のアミノ酸残基でオーバーラッピングしている）をセルロースメンブレン上に固定したペプチドアレイ（PepSpot）を使用して、エピトープマッピング分析を行った。その結果、図１に示すように、抗体83-2C8は配列番号１の３０２〜３１０位の領域、抗体73-1C12は配列番号１の４５１〜４５５位の領域、抗体52-2G9は配列番号１の４８１〜４８５位の領域、抗体1G4-4A9は配列番号１の５０２〜５１０位の領域、をエピトープとして認識することが明らかとなった。一方、抗体3F11-2B10及び5A6-17A11では、エピトープマッピング分析では認識するエピトープを同定できなかった。即ち、抗体3F11-2B10及び5A6-17A11は、立体構造エピトープを認識していることが示唆された。【００６６】
図２のＤに示す野生型ヒトCKAP4（配列番号１、WT）及び野生型ヒトCKAP4の欠失変異体（Δ2-106、Δ2-106/Δ592-602、Δ2-106/Δ587-602、Δ2-106/582-602、Δ525-602、Δ503-602、Δ468-602、Δ318-602、及びΔ221-602）にHAタグを融合させたポリペプチドを一過的に発現する胎児由来正常腎臓細胞(X293T細胞)を作製した。当該X293T細胞の細胞溶解液に対して、抗CKAP4モノクローナル抗体、及び抗HA抗体を用いてイムノブロッティングを行った。結果を図２のＡ〜Ｃに示す。(i)抗体83-2C8ではΔ318-602を検出可能であるも、Δ221-602を検出不可能であったこと、(ii)抗体73-1C12はΔ468-602を検出可能であるも、Δ318-602を検出不可能であったこと、(iii)抗体52-2G9ではΔ503-602を検出可能であるも、Δ468-602を検出不可能であったこと、(iv)抗体1G4-4A9ではΔ525-602を検出可能であるも、Δ503-602を検出不可能であったこと等の結果は、これらの抗体の各CKAP4欠失変異体への結合特性は、前記で同定したエピトープの結果から予想通りであった。一方、抗体3F11-2B10ではΔ587-602で検出能が低下すること、Δ585-602でΔ587-602と比較してさらに検出能が低下すること、Δ580-602、Δ570-602、及びΔ525-602ではΔ585-602と同程度の検出能を示すことから、配列番号１の５８５〜５９０位を含む領域内を立体構造エピトープとして認識していると考えられる。但し、抗体3F11-2B10は、Δ525-602で低いながらも検出可能であったが、Δ503-602を検出不可能であった。これらの結果は、抗体3F11-2B10は、配列番号１の５０３〜５２４位を含む領域内も立体構造エピトープとして認識していることを示している。従って、抗体3F11-2B10は、配列番号１の５０３〜５２４位、及び５８５〜５９０位を含む領域内を立体構造エピトープとして認識していることが確認された。抗体5A6-17A11ではΔ590-602で検出能が低下し、Δ585-602で検出できなくなったことから、配列番号１の５８５〜５９２位を含む領域内を立体構造エピトープとして認識していることが確認された。【００６７】
以上の結果によって各抗CKAP4モノクローナル抗体のエピトープを模式的に示した纏めたイメージ図を図３に示す。図３に示すCKAP4の配列模式図において、Eは小胞体アンカードメイン、MBは微小管結合ドメイン、Mは膜貫通ドメイン、Tはチロシン硫酸化領域、LZはロイシンジッパー領域、αはアルファへリックス領域である。【００６８】
３．抗CKAP4モノクローナル抗体のヒト由来以外のCKAP4への交差性の検証
得られた抗CKAP4モノクローナル抗体について、ヒト、イヌ、及びマウス由来のCKAP4への交差性を検証した。具体的には、ヒト膵がん細胞（S2-CP8細胞）、マウス乳腺上皮細胞（Eph4細胞）、及びイヌ腎臓尿細管上皮細胞由来（MDCK細胞）の溶解液（Input）を1 μg/mLの抗CKAP4モノクローナル抗体又は抗CKAP4ポリクローナル抗体でイムノブロッティング（IB）を行った。【００６９】
得られた結果を示す図４に示す。抗体83-2C8、73-1C12、及び52-2G9はヒトCKAP4に対してのみ結合し、イヌ及びマウスCKAP4には結合しなかった。抗体1G4-4A9は、ヒトCKAP4及びイヌCKAP4に結合し、マウスCKAP4には結合しなかった。抗体3F11-2B10及び5A6-17A11は、ヒト、イヌ、及びマウスの全てのCKAP4に結合した。【００７０】
４．抗CKAP4モノクローナル抗体を用いた細胞表面のCKAP4の検出
S2-CP8細胞の表面（Non-permeabilized）を抗体3F11-2B10（赤色）と抗ファロイジン抗体（緑色）で免疫染色し、その核をDRAQ5 DNA Dye（青色）で染色した。結果を図５に示す。この結果から、抗体3F11-2B10を使用することにより、細胞表面に存在するCKAP4を検出できることが確認された。【００７１】
５．抗CKAP4抗体のCKAP4に対する結合能の測定
（検体溶液の調製）
ビオチン標識した抗CKAP4モノクローナル抗体（抗体83-2C8、73-1C12、52-2G9、1G4-4A9、3F11-2B10、及び5A6-17A11）を、1%BSAを含むPBSで希釈し、0.125、0.25、0.5、1、2.5、及び5 nMの濃度の検体溶液を作製した。【００７２】
（ELISAによる測定）
CKAP4の細胞外ドメイン（ECD）（配列番号１に示すアミノ酸配列の128〜602位）のN末端にグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）を連結させたポリペプチド（GST-CKAP4-ECD）（細胞内ドメインが欠失している改変体）を準備した。96ウェルプレート(9018, Corning)の各ウェルに、1 nMのGST-CKAP4-ECD又はGSTを含む溶液100 μLを添加し、室温で終夜インキュベートした。次いで、0.05% Tween 20を含むPBSで洗浄した後に、ブロッキング溶液（1% BSAを含むPBS）を各ウェルに入れて、室温で1時間インキュベートした。その後、0.05% Tween 20を含むPBSで洗浄し、検体溶液50 μLを各ウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。洗浄後、各ウェルにHRP(horseradish peroxidas)-streptavidin (DY998, R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN)溶液50μLを添加し、室温で20分間インキュベートした。次いで、各ウェルに基質溶液(DY999, R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN)を添加して、10分間反応させた。反応停止溶液(Cell Signaling Technology, Beverly, MA)50 μLを各ウェルに添加して反応を停止し、マイクロプレートリーダーにて波長450 nm及び540 nmの吸光度を測定した。【００７３】
（結果）
結果を図６に示す。なお、図６の縦軸は波長450 nmの吸光度から540 nmの吸光度を引いた値であり、３回の測定結果の平均値である。この結果、抗体83-2C8、73-1C12、52-2G9、1G4-4A9、3F11-2B10、及び5A6-17A11は、濃度依存的にCKAP4の細胞外ドメイン（ECD）に結合することが確認された。また、抗体1G4-4A9はCKAP4に対する結合能が最も高く、抗体83-2C8はCKAP4に対する結合能が最も低かった。【００７４】
６．CKAP4とDKK1の結合阻害能の評価
CKAP4の細胞外ドメイン（ECD）（配列番号１に示すアミノ酸配列の128〜602位）のN末端にグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）を連結させたポリペプチド（GST-CKAP4-ECD）（細胞内ドメインが欠失している改変体）を準備した。NP40バッファー500μL中で、2 nMのGST-CKAP4-ECDと0.75〜3.0 μg/mLの抗CKAP4モノクローナル抗体又はコントロールIgG（富士フィルム和光純薬株式会社製、正常マウスIgG、 コードNo.140-09511）を混合した後に、2 nMのDKK1-FLAG（ヒトDKK1にFLAGタグを付加した融合タンパク質）を添加して4℃で2時間反応させた。次いで、グルタチオンを担持させたアガロースを用いてタンパク質を回収し、抗DKK1抗体を用いてDKK1の検出を行った。その結果を図７のＡに示す。この結果から、抗体73-1C12、52-2G9、1G4-4A9、3F11-2B10及び5A6-17A11では、抗体83-2C8よりもCKAP4の細胞外ドメインとDKK1の結合阻害能が高いことが確認された。【００７５】
７．抗CKAP4抗体がCKAP4のインターナリゼーションに及ぼす効果の検証
DKK1をノックアウトしたS2-CP8細胞（S2-CP8/DKK1 KO細胞）を調製した。S2-CP8/DKK1 KO細胞を3μg/mLの抗CKAP4モノクローナル抗体、コントロールIgG（富士フィルム和光純薬株式会社製、正常マウスIgG、 コードNo.140-09511）又はDKK1-FLAG（ヒトDKK1にFLAGタグを付加した融合タンパク質）を添加して1時間培養した。培養後の細胞の細胞膜(PM)のタンパク質をビオチン化し、ニュートラアビジンビーズを用いて沈降させた。得られた沈降物（PM）と細胞溶解液（lysates）に対して、抗CKAP4ポリクローナル抗体を用いてCKAP4の検出を行った。結果を図８のＡに示す。この結果から、抗体83-2C8、73-1C12、52-2G9、1G4-4A9、3F11-2B10、及び5A6-17A11は、S2-CP8/DKK1 KO細胞におけるCKAP4のインターナリゼーションを誘導しないことが確認された。【００７６】
また、S2-CP8/DKK1 KO細胞を3μg/mLの抗CKAP4モノクローナル抗体又はコントロールIgGを添加して1時間培養した後に、4 nMのDKK1-FLAGを添加して15、30、及び60分間培養した。培養後の細胞の細胞膜(PM)のタンパク質をビオチン化し、ニュートラアビジンビーズを用いて沈降させた。得られた沈降物（IP）と細胞溶解液（lysates）に対して、抗CKAP4ポリクローナル抗体を用いてCKAP4の検出を行った。結果を図８のＢに示す。この結果、抗体52-2G9、73-1C12、1G4-4A9、3F11-2B10、及び5A6-17A11は、DKK1存在下でのCKAP4のインターナリゼーションを阻害したが、抗体83-2C8では、当該インターナリゼーションの阻害は認められなかった。【００７７】
８．免疫沈降能の評価
S2-CP8細胞（東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センターから購入）の溶解液（Input）を1 μg/mLの抗CKAP4モノクローナル抗体又はコントロールIgG（富士フィルム和光純薬株式会社製、正常マウスIgG 140-09511）で免疫沈降させた。次いで、免疫沈降物（IP）に対して、抗CKAP4ポリクローナル抗体を用いてCKAP4の検出を行った。その結果を図７のＢに示す。この結果から、抗体73-1C12、52-2G9、1G4-4A9、3F11-2B10及び5A6-17A11では、抗体83-2C8よりも、S2-CP8細胞の内因性CKAP4を効率的に免疫沈降できており、特に抗体1G4-4A9、3F11-2B10及び5A6-17A11では、S2-CP8細胞の内因性CKAP4を免疫沈降させる作用が高いことが確認された。【００７８】
９．AKTの活性阻害能の評価
S2-CP8細胞を、50 μg/mLの抗CKAP4モノクローナル抗体、又はコントロールIgG（富士フィルム和光純薬株式会社製、正常マウスIgG 140-09511）の存在下で1時間培養した。その後、細胞を回収して細胞の溶解液を作製し、当該溶解液に対して、抗pAKT（リン酸化AKT）抗体、抗AKT抗体、及び抗クラスリン抗体を用いて、pAKT、AKT及びクラスリンの検出を行った。その結果を図７のＣに示す。この結果から、抗体73-1C12、52-2G9、1G4-4A9、3F11-2B10、及び5A6-17A11は、S2-CP8細胞のAKTの活性化を抑制できていることが確認された。また、抗体83-2C8には、AKTの活性化に対する阻害能が認められなかった。【００７９】
１０．がん細胞の増殖阻害能の評価
20 μg/mLの抗CKAP4モノクローナル抗体、又はコントロールIgG（富士フィルム和光純薬株式会社製、正常マウスIgG、コードNo.140-09511）の存在下で、S2-CP8細胞（1×104 cells）をマトリゲル上で三次元的に5日間培養し、対物10倍で1視野当たりの細胞凝集塊の総面積を計測した。その結果を図７のＤに示す。図７のＤにおいて、左図は、5日間培養後のS2-CP8細胞の状態を観察した写真であり、右図は、抗体未添加の条件での１視野当たりの細胞凝集塊の総面積を1として、各条件での1視野当たりの細胞凝集塊の総面積の相対値を算出した結果（5視野、平均値±s.d.；*はP<0.05、**はP<0.01（Student's t test））である。この結果、図７のＡにおいてCKAP4の細胞外ドメインとDKK1の結合阻害能が低い抗体83-2C8では細胞凝集塊数の形成を抑制できなかったが、当該結合阻害能の高い抗体では、細胞凝集塊数の形成を有意に抑制できることが確認された。即ち、抗体73-1C12、52-2G9、1G4-4A9、3F11-2B10、及び5A6-17A11は、S2-CP8細胞のin vitroにおける細胞増殖能を抑制し得ることが明らかとなった。抗体83-2C8には、S2-CP8細胞のin vitroにおける細胞増殖能に対する阻害能が認められなかった。【００８０】
１１．がん細胞の遊走阻害能の評価
抗CKAP4抗体ががん細胞の遊走能に及ぼす影響を確認するために、modified Boyden chamber(tissue culture treated, 6.5 mm in diameter, 10-μm thick, 8-μm pores; Transwell, Costar, Cambridge, MA)を用いたトランスウェルアッセイを行った。具体的には、フィルターの下側表面を10 μg/mLのI型コラーゲンで2時間コートした。その後、0.1％の牛血清アルブミン（BSA）及び20 μg/mLの抗CKAP4モノクローナル抗体又はコントロールIgG（富士フィルム和光純薬株式会社製、正常マウスIgG、コードNo. 140-09511）を含む無血清DMEM培地に1×105 cells /mLとなるようにS2-CP8細胞を懸濁し、この細胞懸濁液200μLを上側チャンバーに添加した。また、下側チャンバーには、前記と同組成の無血清培地を添加した。下側チャンバーの上に上側チャンバーをセットし、37℃で3時間インキュベートした。次いで、下側チャンバー側に移動した細胞を、4% (w/v)のパラフォルムアルデヒドを含むPBSで固定し、DNA染色試（DRAQ5 DNA dye）で細胞を染色して細胞数を計測した。その結果を図７のＥに示す。図７のＥにおいて、左図は、下側チャンバー側に移動した細胞を観察した写真であり、右図は、抗体未添加の条件で下側チャンバー側に移動した細胞数を１として、各条件で下側チャンバー側に移動した細胞数の相対値を算出した結果（n=3、平均値±s.d.；**はP<0.01（Student's t test））である。この結果から、抗体73-1C12、52-2G9、1G4-4A9、3F11-2B10及び5A6-17A11には、S2-CP8細胞の遊走を有意に抑制できることが確認された。抗体83-2C8には、S2-CP8細胞の遊走能に対する阻害能が認められなかった。【００８１】
１２．膵がん細胞のin vivo腫瘍形成に対する中和活性の評価（１）
６週齢の免疫不全ヌードマウス（雄、BALB/cAnNCrj-nu）の背部に、麻酔下でS2-CP8細胞（3×106 cells）を皮下注入した。平均腫瘍サイズが100 mm3に達した時点で、ヌードマウスを無作為に７つのグループに分けた。抗CKAP4モノクローナル抗体(73-1C12（n=6）、52-2G9（n=4）、1G4-4A9（n=9）、3F11-2B10（n=6）、5A6-17A11（n=5）、83-2C8(n=3))又はコントロールIgG（富士フィルム和光純薬株式会社製、正常マウスIgG、コードNo. 140-09511）（n=8）を1週間に2回の頻度で3週間(at days 0, 3, 7, 10,15, 17) 腹腔内に投与した。1回当たりの投与量は、抗体52-2G9及び83-2C8の場合は1 mg/body、それ以外の場合は200 μg/bodyに設定した。抗体投与開始から21日後に、ヌードマウスの移植部位の異種腫瘍組織片を分析した。【００８２】
結果を図９及び１０に示す。図９において、上段図は摘出した異種腫瘍組織片を観察した結果、中段図は異種腫瘍組織片の体積の測定結果、下段図は異種腫瘍組織片の重量の測定結果を示す。図１０において、左図は摘出した異種腫瘍組織片を観察した結果、中央図は異種腫瘍組織片の体積の測定結果、右図は異種腫瘍組織片の重量の測定結果を示す。抗体83-2C8では、S2-CP8細胞による腫瘍形成を阻害できていなかった。一方、抗体73-1C12、3F11-2B10、52-2G9、1G4-4A9、及び５A6-17A11には、S2-CP8細胞による腫瘍形成を阻害でき、特に抗体3F11-2B10ではその作用が高かった。【００８３】
１３．膵がん細胞の腫瘍形成に対する中和活性の評価（２）
６週齢の免疫不全ヌードマウス（雄、BALB/cAnNCrj-nu）の背部に、麻酔下でS2-CP8細胞（3×106 cells）を皮下注入した。平均腫瘍サイズが100 mm3に達した時点で、ヌードマウスを無作為に２つのグループに分けた。抗CKAP4モノクローナル抗体(3F11-2B10（n=3）)又はコントロールIgG（富士フィルム和光純薬株式会社製、正常マウスIgG、コードNo. 140-09511）（n=3）を50 μg/bodyで1週間に2回の頻度で3週間(at days 0, 3, 7, 10,15, 17) 腹腔内に注入した。抗体投与開始から21日後に、ヌードマウスの移植部位の異種腫瘍組織片を分析した。【００８４】
結果を図１１に示す。図１１において、左図は摘出した異種腫瘍組織片を観察した結果、中央図は異種腫瘍組織片の体積の測定結果、右図は異種腫瘍組織片の重量の測定結果を示す。この結果から、抗体3F11-2B10は、S2-CP8細胞による腫瘍形成を低用量でも阻害できることが明らかとなった。【００８５】
１４．膵がん細胞の腫瘍形成に対する中和活性の評価（３）
６週齢の免疫不全ヌードマウス（雄、BALB/cAnNCrj-nu）の背部に、麻酔下でS2-CP8細胞（3×106 cells）を皮下注入した。平均腫瘍サイズが100 mm3に達した時点で、ヌードマウスを無作為に４つのグループに分けた。抗CKAP4モノクローナル抗体(3F11-2B10)を25、50、又は200 μg/body、或はコントロールIgG（富士フィルム和光純薬株式会社製、正常マウスIgG、コードNo. 140-09511）を200 μg/bodyで1週間に2回の頻度で3週間(at days 0, 3, 7, 10,15, 17) 腹腔内に注入した。抗体投与開始から21日後に異種腫瘍組織片の体積及び重量を測定した。【００８６】
結果を図１２に示す。この結果からも、抗体3F11-2B10の投与量を25μg/body又は50μg/bodyに減じても、S2-CP8細胞による腫瘍形成を阻害できることが確認された。【００８７】
１５．膵がん細胞の腫瘍形成に対する中和活性の評価（４）
６週齢の免疫不全ヌードマウス（雄、BALB/cAnNCrj-nu）の背部に、麻酔下でS2-CP8細胞（3×106 cells）を皮下注入した。平均腫瘍サイズが100 mm3に達した時点で、ヌードマウスを無作為に以下の表１に示す６つのグループに分けて、各投与検体を1週間に2回の頻度で3週間(at days 0, 3, 7, 10,15, 17) 腹腔内に注入した。投与検体の投与開始から21日後に、ヌードマウスの移植部位の異種腫瘍組織片を分析した。
【表１】
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【００８８】
結果を図１３に示す。図１３において、上段図は摘出した異種腫瘍組織片を観察した結果、中段図は異種腫瘍組織片の体積の測定結果、下段図は異種腫瘍組織片の重量の測定結果を示す。抗体3F11-2B10の50 μg/bodyとゲムシタビン400 μg/bodyの併用投与は、抗体3F11-2B10の50 μg/bodyの単独投与と同等の抗腫瘍効果であったが、抗体3F11-2B10の50μg/bodyとゲムシタビン1000 μg/bodyの併用投与では格段に優れた抗腫瘍効果が認められた。【００８９】
１６．膵がん細胞の腹膜播種モデルに対する予後延長能の評価
６週齢の免疫不全ヌードマウス（雄、BALB/cAnNCrj-nu）の腹腔内に、麻酔下でS2-CP8細胞（3×106 cells）を注入した。S2-CP8細胞の注入から2日後に、ヌードマウスを無作為に３つのグループに分け、抗CKAP4モノクローナル抗体(３F11-2B10）(n=10)又はコントロールIgG（富士フィルム和光純薬株式会社製、正常マウスIgG、コードNo. 140-09511）（n=10）を50 μg/bodyで1週間に2回の頻度で腹腔内に投与し、ヌードマウスの生存日数を計測した。なお、腹腔内にS2-CP8細胞を注入した前記免疫不全ヌードマウスは、腹膜播種が生じ、腹膜播種モデルとして利用できることが確認されている。【００９０】
結果を図１４に示す。この結果、抗体３F11-2B10、及び52-2Ｇ9には、S2-CP8細胞の腹膜播種に対する予後延長能があることが明らかとなった。【００９１】
１７．膵がん細胞の腫瘍形成に対する中和活性の評価（５）
６週齢の免疫不全ヌードマウス（雄、BALB/cAnNCrj-nu）の背部に、麻酔下でHPAF-II細胞（3×106 cells）を皮下注入した。平均腫瘍サイズが100 mm3に達した時点で、ヌードマウスを無作為に２つのグループに分けた。抗CKAP4モノクローナル抗体(3F11-2B10（n=6）)又はコントロールIgG（富士フィルム和光純薬株式会社製、正常マウスIgG、コードNo. 140-09511）（n=7）を200 μg/bodyで1週間に2回の頻度で3週間(at days 0, 3, 7, 10,15, 17) 腹腔内に注入した。抗体投与開始から21日後に、ヌードマウスの移植部位の異種腫瘍組織片を分析した。【００９２】
結果を図１５に示す。図１５において、上段図は摘出した異種腫瘍組織片を観察した結果、下段左図は異種腫瘍組織片の体積の測定結果、下段右図は異種腫瘍組織片の重量の測定結果を示す。この結果から、抗体3F11-2B10にはHPAF-II細胞による腫瘍形成の阻害作用が確認された。【００９３】
１８．肺がん細胞の腫瘍形成に対する中和活性の評価
６週齢の免疫不全ヌードマウス（雄、BALB/cAnNCrj-nu）の背部に、麻酔下でヒト肺胞基底上皮腺癌細胞（A549細胞）（5×106 cells）を皮下注入した。平均腫瘍サイズが100 mm3に達した時点で、ヌードマウスを無作為に３つのグループに分けた。抗CKAP4モノクローナル抗体(73-1Ｃ12（n=6）、3F11-2B（n=6）)又はコントロールIgG（富士フィルム和光純薬株式会社製、正常マウスIgG、コードNo. 140-09511）（n=6）を200 μg/bodyで1週間に2回の頻度で4週間(at days 0, 3, 8, 10,14, 17, 21, 24) 腹腔内に投与した。1回当たりの投与量は、抗体73-1Ｃ12及びコントロールIgGの場合は200 μg/body、抗体3F11-2Bの場合は50 μg/bodyに設定した。抗体投与開始から28日後に、ヌードマウスの移植部位の異種腫瘍組織片を分析した。【００９４】
結果を図１６に示す。図１６において、左図は摘出した異種腫瘍組織片を観察した結果、中央図は異種腫瘍組織片の体積の測定結果、右図は異種腫瘍組織片の重量の測定結果を示す。この結果から、抗体3F11-2B及び73-1Ｃ12にはA549細胞による腫瘍形成の阻害作用が認められた。特に、抗体3F11-2Bでは、格段に優れた抗腫瘍効果が認められた。【００９５】
１９．サンドイッチELISAによるCKAP4の測定（１）
（検体溶液の調製）
組み換えヒトCKAP4を段階的に希釈した検体溶液を作製した。【００９６】
（サンドイッチELISAによる測定）
96ウェルプレート(9018, Corning)の各ウェルに、1 μg/mLの抗CKAP4モノクローナル抗体(3F11-2B10)溶液100 μLを添加し、室温で終夜インキュベートした。次いで、0.05% Tween 20を含むPBSで洗浄した後に、ブロッキング溶液（1% BSAを含むPBS）を各ウェルに入れて、室温で1時間インキュベートした。その後、0.05% Tween 20を含むPBSで洗浄し、検体溶液50 μLを各ウェルに添加し、室温で2時間インキュベートした。洗浄後、2 μg/mLのビオチン標識抗CKAP4モノクローナル抗体(1G4-4A9)溶液50 μLを添加し、室温で1時間インキュベートした。洗浄後、各ウェルにHRP(horseradish peroxidas)-streptavidin (DY998, R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN)溶液50μLを添加し、室温で20分間インキュベートした。次いで、各ウェルに基質溶液(DY999, R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN)を添加して、10分間反応させた。反応停止溶液(Cell Signaling Technology, Beverly, MA)50 μLを各ウェルに添加して反応を停止し、マイクロプレートリーダーにて波長450 nm及び540 nmの吸光度を測定した。【００９７】
（結果）
結果を図１７に示す。なお、図１７の縦軸は波長450 nmの吸光度から540 nmの吸光度を引いた値である。この結果から、抗体3F11-2B10をキャプチャー抗体、抗体1G4-4A9を検出抗体として使用したサンドイッチELISAによって、1 ng/mL以上のCKAP4を定量できることが確認された。【００９８】
２０．サンドイッチELISAによるCKAP4の測定（２）
表２に示す検体を準備し、前記「１９．サンドイッチELISAによるCKAP4の測定（１）」と同様の方法でサンドイッチELISAを行い、CKAP4の測定を行った。なお、表２に示す血清検体は抗凝固剤フリーの真空採血管にて採取して遠心分離することにより調製した。また、表２に示血漿検体はEDTA添加の真空採血管にて採取し、遠心分離することにより調製した。血清検体及び血漿検体は、使用まで-80℃で保存し、解凍後速やかに試験に用いた。検体の希釈はいずれも1%BSAを含むPBSで行った。また、表２に示す検体Ｃは採血時にがんに対する治療歴のない症例である。【００９９】
【表２】
2019065747.tif 000003
【０１００】
結果を図１８に示す。この結果からも、抗体3F11-2B10をキャプチャー抗体、抗体1G4-4A9を検出抗体として使用したサンドイッチELISAによってCKAP4を定量できることが確認された。【０１０１】
２１．エクソソームELISAによる血清エクソソーム中のCKAP4の測定（PS CaptureTM Exosome ELISA Kitによる測定）
表３に示す検体を準備し、PS CaptureTM Exosome ELISA Kitを使用して、検体に含まれるエクソソーム中のCKAP4の測定を行った。Kit付属のExosome Capture 96 Well Plateの各ウェルを反応/洗浄液で洗浄後、検体溶液100 μLを添加し、室温で2時間インキュベートした。洗浄後、6.25 ng/mLのビオチン標識抗CKAP4モノクローナル抗体(5A6-17A11)溶液100μLを添加し、室温で1時間インキュベートした。洗浄後、各ウェルにPoly-HRP Streptavidin 反応液100μLを添加し、室温で1時間インキュベートした。洗浄後、各ウェルに基質溶液を添加して、30分間反応させた。反応停止溶液100 μLを各ウェルに添加して反応を停止し、マイクロプレートリーダーにて波長450 nm、及び620 nmの吸光度を測定した。抗CKAP4モノクローナル抗体以外はKit付属のものである。【０１０２】
【表３】
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【０１０３】
結果を図１９に示す。なお、図１９の縦軸は波長450 nmの吸光度から620 nmの吸光度を引いた値である。この結果、抗体5A6-17A11を検出抗体として使用することによって、PS CaptureTM Exosome ELISA Kitを使用しサンプルに含まれるエクソソーム中のCKAP4を検出可能であることが確認された。【０１０４】
２２．ヒト膵管腺癌患者の血清中のCKAP4の測定
（検体の準備）
ヒト膵管腺癌患者（47症例）から得られた血清、及び当該血清を10倍稀釈した希釈液を検体溶液として準備した。【０１０５】
（サンドイッチELISAによる血清中CKAP4の測定）
サンドイッチELISAにより、以下の方法でヒト膵管腺癌患者の血清中CKAP4の測定を行った。96ウェルプレート(9018, Corning)の各ウェルに、2 μg/mLの抗CKAP4モノクローナル抗体(3F11-2B10)溶液100μLを添加し、室温で終夜インキュベートした。次いで、0.05% Tween 20を含むPBSで洗浄した後に、ブロッキング溶液（1% BSAを含むPBS）を各ウェルに入れて、室温で1時間インキュベートした。その後、0.05% Tween 20を含むPBSで洗浄し、検体溶液（血清及びその１０倍希釈液）50 μLを各ウェルに添加し、室温で2時間インキュベートした。洗浄後、1 μg/mLのビオチン標識抗CKAP4モノクローナル抗体(1G4-4A9)溶液100 μLを添加し、室温で1時間インキュベートした。洗浄後、各ウェルにHRP(horseradish peroxidas)-streptavidin (DY998, R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN)溶液50 μLを添加し、室温で20分間インキュベートした。次いで、各ウェルに基質溶液(DY999, R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN)を添加して、10分間反応させた。反応停止溶液(Cell Signaling Technology, Beverly, MA)50 μLを各ウェルに添加して反応を停止し、マイクロプレートリーダーにて波長450 nm及び540 nmの吸光度を測定した。また、組み換えヒトCKAP4を段階的に希釈した溶液を使用して同様に測定を行い、標準曲線を作製した。なお、CKAP4の濃度が1 ng/mL（標準曲線の下限値）未満である場合には、濃度は0 ng/mLとした。【０１０６】
（エクソソームELISAによる血清エクソソーム中CKAP4の測定）
PS CaptureTM Exosome ELISA Kitを使用して、以下の方法で血清に含まれるエクソソーム中のCKAP4の測定を行った。Kit付属のExosome Capture 96 Well Plateの各ウェルを反応/洗浄液で洗浄後、検体溶液（血清）100 μLを添加し、室温で2時間インキュベートした。洗浄後、100 ng/mLのビオチン標識抗CKAP4モノクローナル抗体(5A6-17A11)溶液100μLを添加し、室温で1時間インキュベートした。洗浄後、各ウェルにPoly-HRP Streptavidin 反応液100μLを添加し、室温で1時間インキュベートした。洗浄後、各ウェルに基質溶液を添加して、30分間反応させた。反応停止溶液100 μLを各ウェルに添加して反応を停止し、マイクロプレートリーダーにて波長450 nm、及び620 nmの吸光度を測定した。抗CKAP4モノクローナル抗体以外はKit付属のものである。【０１０７】
（結果）
組み換えヒトCKAP4を段階的に希釈した溶液を使用して作製した標準曲線を図２０のＡに示す。なお、図２０のＡの縦軸は波長450 nmの吸光度から540 nmの吸光度を引いた値である。図２０のＡから分かるように、前記条件のサンドイッチELISAでは、1〜25ng/mL濃度範囲内のCKAP4を定量できることが確認された。【０１０８】
ヒト膵管腺癌患者の血清中のCKAP4をサンドイッチELISAで測定した結果を図２０のＢに示す。この結果から、抗体3F11-2B10をキャプチャー抗体、抗体1G4-4A9を検出抗体として使用したサンドイッチELISAによって、ヒト膵管腺癌患者の血清中のCKAP4を測定できることが確認された。【０１０９】
また、ヒト膵管腺癌患者の血清に含まれるエクソソーム中のCKAP4をエクソームELISAで測定した結果を図２０のＣに示す。図２０のＣの縦軸は波長450 nmの吸光度から620 nmの吸光度を引いた値である。この結果、抗体5A6-17A11を検出抗体として使用することによって、ヒト膵管腺癌患者の血清に含まれるエクソソーム中のCKAP4を検出可できることが確認された。【０１１０】
また、患者毎にサンドイッチELISAを用いた血清中のCKAP4の測定結果とエクソームELISAを用いた血清エクソソーム中のCKAP4の測定結果を対比した図を図２０のＤに示す。この結果から、ヒト膵管腺癌患者の血清中のCKAP4の濃度は、血清エクソソーム中のCKAP4の濃度と相関性があることが分かった。【０１１１】
２３．ヒト膵管腺癌患者及び健常者の血清中のCKAP4の測定
（検体の準備）
健常者（HC）（13症例）、免疫組織化学的にCKAP4陰性であことが確認された膵管腺癌の患者(PDAC IHC(-))（9症例）、及び免疫組織化学的にCKAP4陽性であことが確認された膵管腺癌の患者(PDAC IHC(+))（11症例）から得られた血清を検体溶液として準備した。【０１１２】
（血清中CKAP4の測定）
前記「２２．ヒト膵管腺癌患者の血清中のCKAP4の測定」の「サンドイッチELISAによる血清中CKAP4の測定」に記載の方法に従って、血清のCKAP4濃度の測定を行った。【０１１３】
（エクソソーム中CKAP4の測定）
前記「２２．ヒト膵管腺癌患者の血清中のCKAP4の測定」の「エクソソームELISAによるエクソソーム中CKAP4の測定」に記載の方法に従って、血清エクソソーム中のCKAP4濃度の測定を行った。【０１１４】
（結果）
血清中CKAP4の測定を行った結果を図２０のＥに示し、血清エクソソーム中CKAP4の測定を行った結果を図２０のＦに示す。なお、図２０のＦの縦軸は波長450 nmの吸光度から540 nmの吸光度を引いた値である。CKAP4陽性の膵管腺癌患者由来の血清では、CKAP4陰性の膵管腺癌患者及び健常者由来の血清に比べて、有意に高いCKAP4濃度が認められた。また、CKAP4陽性の膵管腺癌患者由来の血清エクソソームでは、CKAP4陰性の膵管腺癌患者由来のエクソソームに比べて、有意に高いCKAP4濃度が認められ、更に健常者由来のエクソソームに対しても、CKAP4濃度が高くなる傾向を認めた（p=0.064）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年3月6日(2019.3.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ｉ）〜（ｖ）のいずれかに示す部位をエピトープとして認識する、抗ＣＫＡＰ４モノクローナル抗体又はその抗体断片：
（ｉ）配列番号１に示すアミノ酸配列の４５１〜４５５位の領域の少なくとも一部。
（ｉｉ）配列番号１に示すアミノ酸配列の４８１〜４８５位の領域の少なくとも一部。
（ｉｉｉ）配列番号１に示すアミノ酸配列の５０２〜５１０位の領域の少なくとも一部。
（ｉｖ）配列番号１に示すアミノ酸配列の５０３〜５２４位の領域の少なくとも一部、及び５８５〜５９０位の領域の少なくとも一部。
（ｖ）配列番号１に示すアミノ酸配列の５８５〜５９２位の領域の少なくとも一部。
【請求項２】
アイソタイプがＩｇＧである、請求項１に記載の抗ＣＫＡＰ４モノクローナル抗体又はその抗体断片。
【請求項３】
完全ヒト抗体又はヒト化抗体である、請求項１又は２に記載の抗ＣＫＡＰ４モノクローナル抗体又はその抗体断片。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の抗ＣＫＡＰ４モノクローナル抗体又はその抗体断片を有効成分とする、抗腫瘍剤。
【請求項５】
肺がん、膵がん、又は食道がんの治療に使用される、請求項４に記載の抗腫瘍剤。
【請求項６】
下記（ｉ）〜（ｖ）のいずれかに示す部位をエピトープとして認識する抗ＣＫＡＰ４モノクローナル抗体又はその抗体断片の、抗腫瘍剤の製造のための使用：
（ｉ）配列番号１に示すアミノ酸配列の４５１〜４５５位の領域の少なくとも一部。
（ｉｉ）配列番号１に示すアミノ酸配列の４８１〜４８５位の領域の少なくとも一部。
（ｉｉｉ）配列番号１に示すアミノ酸配列の５０２〜５１０位の領域の少なくとも一部。
（ｉｖ）配列番号１に示すアミノ酸配列の５０３〜５２４位の領域の少なくとも一部、及び５８５〜５９０位の領域の少なくとも一部。
（ｖ）配列番号１に示すアミノ酸配列の５８５〜５９２位の領域の少なくとも一部。
【請求項７】
腫瘍の治療に使用される、下記（ｉ）〜（ｖ）のいずれかに示す部位をエピトープとして認識する抗ＣＫＡＰ４モノクローナル抗体又はその抗体断片：
（ｉ）配列番号１に示すアミノ酸配列の４５１〜４５５位の領域の少なくとも一部。
（ｉｉ）配列番号１に示すアミノ酸配列の４８１〜４８５位の領域の少なくとも一部。
（ｉｉｉ）配列番号１に示すアミノ酸配列の５０２〜５１０位の領域の少なくとも一部。
（ｉｖ）配列番号１に示すアミノ酸配列の５０３〜５２４位の領域の少なくとも一部、及び５８５〜５９０位の領域の少なくとも一部。
（ｖ）配列番号１に示すアミノ酸配列の５８５〜５９２位の領域の少なくとも一部。
【請求項８】
腫瘍を罹患している患者に、下記（ｉ）〜（ｖ）のいずれかに示す部位をエピトープとして認識する抗ＣＫＡＰ４モノクローナル抗体又はその抗体断片を投与する工程を含む、腫瘍の治療方法：
（ｉ）配列番号１に示すアミノ酸配列の４５１〜４５５位の領域の少なくとも一部。
（ｉｉ）配列番号１に示すアミノ酸配列の４８１〜４８５位の領域の少なくとも一部。
（ｉｉｉ）配列番号１に示すアミノ酸配列の５０２〜５１０位の領域の少なくとも一部。
（ｉｖ）配列番号１に示すアミノ酸配列の５０３〜５２４位の領域の少なくとも一部、及び５８５〜５９０位の領域の少なくとも一部。
（ｖ）配列番号１に示すアミノ酸配列の５８５〜５９２位の領域の少なくとも一部。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれかに記載の抗ＣＫＡＰ４モノクローナル抗体又はその抗体断片ＣＫＡＰ４モノクローナル抗体又はその抗体断片を用いてＣＫＡＰ４を測定する工程を含む、ＣＫＡＰ４の測定方法。
【請求項１０】
ＥＬＩＳＡ法において、請求項１〜３のいずれかに記載の抗ＣＫＡＰ４モノクローナル抗体又はその抗体断片を、キャプチャー抗体及び検出抗体の少なくとも一方に使用する、請求項９に記載のＣＫＡＰ４の測定方法。
【請求項１１】
配列番号１に示すアミノ酸配列の５０２〜５１０位の領域の少なくとも一部をエピトープとして認識する、抗ＣＫＡＰ４モノクローナル抗体又はその抗体断片。
【請求項１２】
配列番号１に示すアミノ酸配列の５０３〜５２４位の領域の少なくとも一部、及び５８５〜５９０位の領域の少なくとも一部をエピトープとして認識する、抗ＣＫＡＰ４モノクローナル抗体又はその抗体断片。
【請求項１３】
配列番号１に示すアミノ酸配列の５８５〜５９２位の領域の少なくとも一部をエピトープとして認識する、抗ＣＫＡＰ４モノクローナル抗体又はその抗体断片。
【国際調査報告】
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