(57)【要約】  本発明は、Ｘｗ１−Ｗ−Ｘｗ２−Ｗ構造（Ｘｗ１及びＸｗ２は、それぞれ独立して、Ｔ、Ｓ、Ｉ、Ｌ、若しくはＶ、又はそのＮ−アルキルアミノ酸である。）を有するか、又はＰ−Ｘｐ１−Ｘｐ２−Ｈ構造（Ｘｐ１は、任意のアミノ酸であり、Ｘｐ２は、Ｉ、Ｌ、若しくはＶ、又はそのＮ−アルキルアミノ酸である。）を有する環状ペプチド又はその医薬的に許容可能な塩を含む、タウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチド（ＮＴＣＰ：Sodium Taurocholate Cotransporting Polypeptide）阻害剤、を提供する。
2019139126.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｘｗ１−Ｗ−Ｘｗ２−Ｗ構造（Ｘｗ１及びＸｗ２は、それぞれ独立して、Ｔ、Ｓ、Ｉ、Ｌ、若しくはＶ、又はそのＮ−アルキルアミノ酸である。）を有するか、又はＰ−Ｘｐ１−Ｘｐ２−Ｈ構造（Ｘｐ１は、任意のアミノ酸であり、Ｘｐ２は、Ｉ、Ｌ、若しくはＶ、又はそのＮ−アルキルアミノ酸である。）を有する環状ペプチド又はその医薬的に許容可能な塩を含む、タウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチド（ＮＴＣＰ：Sodium Taurocholate Cotransporting Polypeptide）阻害剤。
【請求項２】
環状ペプチドが、Ｘｗ１−Ｗ−Ｘｗ２−Ｗ−Ｘｗ３−Ｗ構造（Ｘｗ１及びＸｗ２は前記と同義であり、Ｘｗ３は、Ｔ、Ｓ、Ｉ、Ｌ、若しくはＶ、又はそのＮ−アルキルアミノ酸である。）を有する、請求項１に記載のＮＴＣＰ阻害剤。
【請求項３】
Ｘｗ１が、Ｔ若しくはＬ又はそのＮ−アルキルアミノ酸であり、Ｘｗ２が、Ｔ若しくはＩ又はそのＮ−アルキルアミノ酸である、請求項１又は２に記載のＮＴＣＰ阻害剤。
【請求項４】
環状ペプチドが、Ｐ−Ｘｐ１−Ｘｐ２−Ｈ−Ｘｐ３−Ｆ（Ｘｐ１及びＸｐ２は前記と同義であり、Ｘｐ３は、Ｉ、Ｌ、若しくはＶ、又はそのＮ−アルキルアミノ酸である。）構造を有する、請求項１に記載のＮＴＣＰ阻害剤。
【請求項５】
Ｘｐ２及びＸｐ３が、それぞれ独立して、Ｉ若しくはＬ又はそのＮ−アルキルアミノ酸である、請求項４に記載のＮＴＣＰ阻害剤。
【請求項６】
環状ペプチドが、Ｎ−ＣＯ−ＣＨ2−Ｓ構造を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＮＴＣＰ阻害剤。
【請求項７】
前記Ｎが、トリプトファンのアミノ基に由来する、請求項６に記載のＮＴＣＰ阻害剤。
【請求項８】
前記Ｓが、システインのチオール基に由来する、請求項６又は７に記載のＮＴＣＰ阻害剤。
【請求項９】
環状ペプチドが、１０〜２０のアミノ酸で構成される環構造を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＮＴＣＰ阻害剤。
【請求項１０】
ＮＴＣＰがヒトＮＴＣＰである、請求項１〜９のいずれか１項に記載のＮＴＣＰ阻害剤。
【請求項１１】
細胞内へのＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）又はＤ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）の侵入阻害剤である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＮＴＣＰ阻害剤。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のＮＴＣＰ阻害剤を含む、医薬組成物。
【請求項１３】
Ｂ型肝炎ウイルス又はＤ型肝炎ウイルスに関連する疾患の治療又は予防に用いられる、
請求項１２に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＴＣＰ阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ：Hepatitis B Virus）は、現在利用可能な治療法には有効なものが少なく、新しい治療法の開発が必要とされている。ここで、近年、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）又はＤ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ：Hepatitis D Virus）は、タウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチド（ＮＴＣＰ：Sodium Taurocholate Cotransporting Polypeptide）を介して細胞に侵入することにより、ヒトに感染してＢ型肝炎を発症させることが知られている。これに対して、ＮＴＣＰを阻害することによりＢ型肝炎を治療する試みとして、例えば、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ：Cyclosporin A）やＭｙｒｃｌｕｄｅｘ  Ｂを用いることが検討されている（例えば、非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Nkongolo, S. et al. Cyclosporin A inhibits hepatitis B and hepatitis D virus entry by cyclophilin-independent interference with the NTCP receptor. Journal of hepatology 60, 723-731 (2014).
【非特許文献２】Ni Y et al. Hepatitis B and D viruses exploit sodium taurocholate co-transporting polypeptide for species-specific entry into hepatocytes. Gastroenterology 146: 1070-1083 (2014).
【非特許文献３】Yan H et al. Viral entry of hepatitis B and D viruses and bile salts transportation share common molecular determinants on sodium taurocholate cotransporting polypeptide. J Virol 88: 3273-3284 (2014).
【非特許文献４】Watashi K et al. Interleukin-1 and tumor necrosis factor-alpha trigger restriction of hepatitis B virus infection via a cytidine deaminase activation-induced cytidine deaminase (AID). Hepatology 59: 1726-1737 (2014).
【非特許文献５】Blank A et al. The NTCP-inhibitor Myrcludex B: Effects on Bile Acid Disposition and Tenofovir Pharmacokinetics. Clin Pharmacol Ther 00: 1-8 (2017)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、これら従来の阻害剤は、ＨＢＶ又はＨＤＶがＮＴＣＰを介して細胞に侵入することを阻害することだけではなく、胆汁酸等を輸送するようなＮＴＣＰの本来の機能をも阻害してしまう（例えば、非特許文献２〜５）。【０００５】
そこで、本発明が解決しようとする課題は、環状ペプチドによる新規ＮＴＣＰ阻害剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、特定の構造を有する環状ペプチドが、ＨＢＶ又はＨＤＶがＮＴＣＰを介して細胞に侵入することを阻害することを見出し、本発明を完成した。【０００７】
すなわち、本発明は、以下に示す通りである。
［１］
Ｘｗ１−Ｗ−Ｘｗ２−Ｗ構造（Ｘｗ１及びＸｗ２は、それぞれ独立して、Ｔ、Ｓ、Ｉ、Ｌ、若しくはＶ、又はそのＮ−アルキルアミノ酸である。）を有するか、又はＰ−Ｘｐ１−Ｘｐ２−Ｈ構造（Ｘｐ１は、任意のアミノ酸であり、Ｘｐ２は、Ｉ、Ｌ、若しくはＶ、又はそのＮ−アルキルアミノ酸である。）を有する環状ペプチド又はその医薬的に許容可能な塩を含む、タウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチド（ＮＴＣＰ：Sodium Taurocholate Cotransporting Polypeptide）阻害剤。
［２］
環状ペプチドが、Ｘｗ１−Ｗ−Ｘｗ２−Ｗ−Ｘｗ３−Ｗ構造（Ｘｗ１及びＸｗ２は前記と同義であり、Ｘｗ３は、Ｔ、Ｓ、Ｉ、Ｌ、若しくはＶ、又はそのＮ−アルキルアミノ酸である。）を有する、［１］に記載のＮＴＣＰ阻害剤。
［３］
Ｘｗ１が、Ｔ若しくはＬであり、Ｘｗ２が、Ｔ若しくはＩである、［１］又は［２］に記載のＮＴＣＰ阻害剤。
［４］
環状ペプチドが、Ｐ−Ｘｐ１−Ｘｐ２−Ｈ−Ｘｐ３−Ｆ（Ｘｐ１及びＸｐ２は前記と同義であり、Ｘｐ３は、Ｉ、Ｌ、若しくはＶ、又はそのＮ−アルキルアミノ酸である。）構造を有する、［１］に記載のＮＴＣＰ阻害剤。
［５］
Ｘｐ２及びＸｐ３が、それぞれ独立して、Ｉ若しくはＬである、［４］に記載のＮＴＣＰ阻害剤。
［６］
環状ペプチドが、Ｎ−ＣＯ−ＣＨ2−Ｓ構造を有する、［１］〜［５］のいずれかに記載のＮＴＣＰ阻害剤。
［７］
前記Ｎが、トリプトファンのアミノ基に由来する、［６］に記載のＮＴＣＰ阻害剤。
［８］
前記Ｓが、システインのチオール基に由来する、［６］又は［７］に記載のＮＴＣＰ阻害剤。
［９］
環状ペプチドが、１０〜２０のアミノ酸で構成される環構造を有する、［１］〜［８］のいずれかに記載のＮＴＣＰ阻害剤。
［１０］
ＮＴＣＰがヒトＮＴＣＰである、［１］〜［９］のいずれかに記載のＮＴＣＰ阻害剤。
［１１］
細胞内へのＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）又はＤ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）の侵入阻害剤である、［１］〜［１０］のいずれかに記載のＮＴＣＰ阻害剤。
［１２］
［１］〜［１１］のいずれかに記載のＮＴＣＰ阻害剤を含む、医薬組成物。
［１３］
Ｂ型肝炎ウイルス又はＤ型肝炎ウイルスに関連する疾患の治療又は予防に用いられる、［１２］に記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、環状ペプチドによる新規ＮＴＣＰ阻害剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】選択された環状ペプチドの抗ＨＢＶ活性を示す図である。（ａ）〜（ｃ）ＨｅｐＧ２−ｈＮＴＣＰ−Ｃ４細胞を、１００ｎＭエンテカビル又は３０μＭシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）又はペプチド（Ｄ１及びＤ２）又は焦点化ライブラリーから同定されたペプチド（ＷＤ１、ＷＬ２及びＷＬ４）で処理した（図２（ａ）に示す）。培養上清（ａ）中に分泌されたＨＢｓ抗原及び細胞（ｂ）中のＨＢｃ抗原は、それぞれＥＬＩＳＡ及び免疫蛍光法によって検出された。細胞生存率は、細胞総ＤＮＡ（ｃ）を定量することによって測定した。（ｂ）の染色はそれぞれＨＢｃ抗原と核を示す。（ｄ）ＨｅｐＧ２−ｈＮＴＣＰ−Ｃ４細胞を図２（ａ）のように様々な濃度（０．３，１，３及び１０μＭ）のＣｓＡ又はペプチド（ＷＤ１、ＷＬ２又はＷＬ４）で処理した。培養上清中に分泌されたＨＢｓ抗原をＥＬＩＳＡによって検出した。データは平均±ＳＤとして示される。統計的有意性は、すべての数字についてスチューデントのｔ検定を用いて決定した（*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、Ｎ．Ｓ．：有意ではない）。
【図２】初期スクリーニングからのペプチドの抗ＨＢＶ効果を示す図である。（ａ）ＨｅｐＧ２−ｈＮＴＣＰ−Ｃ４感染実験の模式図である。ＨｅｐＧ２−ｈＮＴＣＰ−Ｃ４細胞をペプチドで２時間前処理し、次いでペプチドの存在下でＨＢＶを１６時間接種した。遊離ＨＢＶ及びペプチドを洗い流した後、ペプチドの非存在下で細胞をさらに１２日間培養し、培養上清中のＨＢｓ抗原の測定に基づいてＨＢＶ感染を評価した。塗りつぶされたボックス及び破線のボックスは、それぞれ処置を施した期間及び施さなかった期間を示す。（ｂ）初代ヒト肝細胞を、（ａ）のように１００μＭＣｓＡ又は最初のスクリーニングから同定したペプチドで処理した。ＨＢＶ感染は、ＥＬＩＳＡによって接種後１２日目に培養上清中に分泌されたＨＢｓ抗原をモニターすることによって評価した。（ｃ）ＭＴＴアッセイによって細胞生存率を測定した。
【図３】集束ライブラリースクリーニングによるペプチドの抗ＨＢＶ効果を示す図である。（ａ）〜（ｂ）初代ヒト肝細胞又はＨｅｐＧ２−ｈＮＴＣＰ−Ｃ４細胞を図２（ａ）に示すプロトコールに従って１０μＭのＣｓＡ又は示された環状ペプチドで処理した。ＨＢe抗原の測定（ａ）によってＨＢＶ感染を評価し、図２に示すようにＭＴＴアッセイによって細胞生存率（ｂ）を評価した。
【図４】選択された環状ペプチドのＮＴＣＰトランスポーター活性阻害及び広汎な遺伝子型への抗ＨＢＶ活性を示す図である。（ａ）胆汁酸取り込みは、様々な濃度（３，１０、及び３０μＭ）のＣｓＡ、ＷＤ１、ＷＬ２又はＷＬ４の存在下でナトリウム含有緩衝液中で基質として［3Ｈ］−タウロコール酸（ＴＣＡ）とＨｅｐＧ２−ｈＮＴＣＰ−Ｃ４細胞をインキュベートし、［3Ｈ］取り込みを定量した。（ｂ）ＨｅｐＧ２−ｈＮＴＣＰ−Ｃ４細胞を１００ｎＭのｐｒｅＳ１ペプチド（陽性対照）又は３０μＭＷＤ１、ＷＬ２又はＷＬ４と共にＨＤＶとともに１６時間処理した。遊離のＨＤＶ及びペプチドを洗浄した後、ペプチドの非存在下で細胞をさらに６日間培養し、細胞内ＨＤＶ  ＲＮＡの量をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析によって定量した。（ｃ）Ｈｕｈ−７．５．１細胞を２０ｎＭのバフィロマイシンＡ１（陽性対照）又は３０μＭのＷＤ１、ＷＬ２又はＷＬ４で処理し、ＨＣＶ擬似粒子を４時間接種した。感染７２時間後、細胞内ルシフェラーゼ活性を測定し、ＨＣＶ感染を評価した。（ｄ）初代ヒト肝細胞を１００ｎＭのｐｒｅＳ１ペプチド（陽性対照）又は３０μＭのＷＤ１又はＷＬ４で処理し、異なるＨＢＶ分離株（遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ及びＬ１８０Ｍ／Ｓ２０２Ｇ／Ｍ２０４Ｖ変異を有する遺伝子型Ｃ、又はＧ１４５Ｒ変異株）を、図２（ａ）に示されるプロトコールに従って単離した。ＨＢＶ感染は、培養上清中に分泌されたＨＢｓ抗原を検出することによって評価した。
【図５】環状ペプチドスクリーニングの戦略を示す図である。（ａ）ＲａＰＩＤスクリーニングアプローチの概略図である：（１）合成オリゴヌクレオチドから組み立てたＤＮＡライブラリーをＲＮＡに転写し、３´末端にピューロマイシンに連結した。（２）遺伝学的に再プログラミングされた翻訳反応におけるこのライブラリーの翻訳は、各ペプチドがピューロマイシン部分を介してその同族ｍＲＮＡに共有結合し、次いで逆転写されて結合したペプチド−ＲＮＡ：ＤＮＡ分子を生成する環状ペプチドライブラリーの形成を導いた。（３）カウンター選択を使用して、ビーズ表面に非特異的に結合するペプチドを除去した後、磁気ビーズに固定化したＮＴＣＰに対するライブラリーのパンニングによるＮＴＣＰ結合ペプチドの単離を行った。（４）濃縮されたＤＮＡライブラリーをＰＣＲによって回収し、標的結合の増加した速度が観察されるまでプロセスを繰り返した。ライブラリーのデコンボリューションは、最終的な（及び中間体の）富化されたＤＮＡライブラリーの配列決定によって達成された。（ｂ）環状チオエステル戦略を使用した：開始コドン、可変（４−１５コドン）ＮＮＫコドン領域（Ｎ＝任意のアミノ酸及びＫ＝Ｕ又はＧ）からなる半無作為化ＲＮＡライブラリー、開始アミノ酸がＮ−クロロアセチル−チロシン（ＣｌＡｃ−Ｔｙｒ）であり、翻訳後に下流のＣｙｓと自発的に反応してチオエーテル環化ペプチドを生じるように、Ｃｙｓコドン及びＧｌｙ−Ｓｅｒリンカー配列を再プログラムした。（ｃ）Ｌ−又はＤ−ＣｌＡｃ−Ｔｙｒのいずれかで開始したライブラリーを用いた。
【図６】同定されたペプチドにおけるＭｅｔコドン誤読の評価を示す図である。ＮＴＣＰ親和性についての最初のスクリーニングから同定されたペプチドのいくつかは、翻訳反応においてＭｅｔが存在しないにもかかわらずＭｅｔコドンを含んでいた。どのアミノ酸がＭｅｔコドンで誤って読み取られたかを評価するために、各ｃＤＮＡをＭｅｔ欠損翻訳反応で翻訳し、その質量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって決定した。Ｔｈｒ(*)又はＩｌｅ／Ｌｅｕ(†)に対応する誤読及びそれらに対応するＫ付加物（**及び††）が観察された。ＮＴＣＰ結合に対する各誤読の影響を評価するために、個々のクローンをプライマーアセンブリにより合成し、磁性ビーズ又はビーズ単独に固定化したＮＴＣＰに対する親和性を親和性選択自体について評価した（すなわち、関連するｍＲＮＡピューロマイシン、インビトロ翻訳、親和性選択及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる定量化）。Ｄ１（Ｍ５Ｉ）、Ｄ４（Ｍ１２Ｌ）及びＬ４（Ｍ１０Ｔ）は全て、その後の検証のために選択した。
【図７】最初のＲａＰＩＤスクリーニングにより同定されたペプチドのＮＴＣＰ結合定数を示す図である。様々な濃度の環状ペプチド分析物を含む表面（ＮＴＡ−Ｎｉ2+）固定化ＮＴＣＰを用いて、単一サイクル反応速度論実験を行った。それぞれの場合において、図で示すように２００又は１０００ｎＭの最高濃度から出発して、ペプチドの４倍連続希釈を試験した。解離定数（ＫD）は、１：１結合モデルを用いて決定した。
【図８】α−Ｎ−メチル化、集束型ペプチドライブラリーのデザインの一例を示す図である。（ａ）ＭｅＬｅｕ＝Ｎ−メチル−ロイシン、ＭｅＧｌｙ＝Ｎ−メチル−グリシン、ＭｅＡｌａ＝Ｎ−メチルアラニン、ＭｅＹＭｅ＝Ｎ−メチル−４−フェニルアラニンを含む集束ライブラリーの翻訳のためのコドン表である。ＭｅＰｈｅ＝Ｎ−メチル−フェニルアラニン、ＭｅＳｅｒ＝Ｎ−メチル−セリン）である。（ｂ）初期スクリーンヒットのコンセンサスに基づく集束したライブラリーの設計：２つのライブラリー「Ｗ」ライブラリー及び「Ｐ」ライブラリーは、（Ｔ／Ｌ）Ｗ（Ｔ／Ｉ）Ｗ及びＰＸ（Ｉ／Ｌ））Ｈ（Ｉ／Ｌ）Ｆモチーフである。各々は開始ＣｌＡｃ−Ｔｙｒ残基、続いて半ランダム化領域、Ｃｙｓ残基及びＴｈｒ−Ｇｌｎリンカーを含んでいた。「Ｗ」ライブラリーは、可変数のＮＮＳコドンに隣接するＡＹＳ−ＴＧＧ−ＡＹＳ−ＴＧＧのＤＮＡモチーフであった（Ｙ＝Ｃ又はＴ、Ｓ＝Ｃ又はＧ）（パネルａのいずれかのアミノ酸をコードし、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ又はＭｅＬｅｕが保存されたモチーフ内で翻訳され得るように、「Ｘ」として示される。）。Ｐライブラリーは、可変数のＮＮＳコドン（アミノ酸のいずれかをコードする）に隣接するＣＣＧ−ＮＮＳ−ＶＴＳ−ＣＡＣ−ＶＴＳ−ＴＴＣのＤＮＡモチーフであった（Ｖ＝Ｃ、Ａ又はＧ、Ｓ＝Ｃ又はＧ）（Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ又はＭｅＬｅｕが保存されたモチーフ内で翻訳され得るように、パネルａにおいて「Ｘ」として示される。）。
【図９】集束ライブラリーＲａＰＩＤスクリーニングにより同定されたペプチドのＮＴＣＰ結合定数を示す図である。様々な濃度の環状ペプチド分析物を含む表面（ＮＴＡ−Ｎｉ２  ＋）固定化ＮＴＣＰを用いて、単一サイクル結合定数の実験を行った。それぞれの場合において、図で示すように２００又は１０００ｎＭの最高濃度から出発して、ペプチドの４倍連続希釈を試験した。解離定数（ＫD）は、１：１結合モデルを用いて決定した。
【図１０】ＨＢＶ生活環の概略を示す図である。ＨＢＶ生活環は、吸着、侵入、核内移行、及びｃｃｃＤＮＡ形成を含む感染の初期段階と、転写、キャプシド形成、逆転写、エンベロープ獲得及び放出を含む後期段階とに分けられる。
【図１１】選択された環状ペプチドによるＨＢＶ侵入阻害を示す図である。（ａ）ＨＢＶ複製は、１００ｎＭのエンテカビル又は３０μＭの各ペプチドでテトラサイクリン除去後６日間処理したＨｅｐ３８．７−Ｔｅｔ細胞におけるＨＢＶ  ＤＮＡのリアルタイムＰＣＲ分析によって評価した。（ｂ）ＨＢＶの宿主細胞への吸着を評価する、蛍光ｐｒｅＳ１プローブ（アミノ酸２〜４８）を用いたｐｒｅＳ１結合アッセイの模式図である。（ｃ）〜（ｄ）ＣｓＡ、ＷＤ１、ＷＬ２又はＷＬ４の濃度を変化させて（１，３，１０及び３０μＭ）、３７℃で３０分間、ＨｅｐＧ２−ｈＮＴＣＰ−Ｃ４細胞でＰｒｅＳ１吸着を評価した。赤、青シグナルはそれぞれｐｒｅＳ１プローブ及び核を示す。ＰｒｅＳ１蛍光強度（ｄ）をダイナミックセルカウント（ＫＥＹＥＮＣＥ社）を用いて定量し、（ｃ）に示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明を、発明を実施するための形態により具体的に説明するが、本発明は、以下の発明を実施するための形態に限定されるものではなく、種々変形して実施することができる。
本発明において参照される文献に開示されている内容は、本発明に参照として取り込まれる。
【００１１】
本明細書において、「環状ペプチド」とは、４以上のアミノ酸により形成される環状構造を分子内に少なくとも有することを意味する。環状ペプチドの分子構造として、環状構造以外に、アミノ酸がペプチド結合により連結した鎖状構造を有していてもよく、また、ペプチド構造以外の構造を有していてもよい。
本明細書において、「環状構造」とは、直鎖状ペプチドにおいて、２アミノ酸残基以上離れた２つのアミノ酸が直接に、又はリンカー等を介して結合することによって分子内に形成される閉環構造を意味する。
本明細書において、「２アミノ酸残基以上離れた」とは、２つのアミノ酸の間に少なくとも２残基のアミノ酸が存在することを意味する。
【００１２】
環状構造における閉環構造は、特に限定されないが、２つのアミノ酸が、共有結合することにより形成される。
２つのアミノ酸間の共有結合としては、例えば、ジスルフィド結合、ペプチド結合、アルキル結合、アルケニル結合、エステル結合、チオエステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ホスホネートエーテル結合、アゾ結合、Ｃ−Ｓ−Ｃ結合、Ｃ−Ｎ−Ｃ結合、Ｃ＝Ｎ−Ｃ結合、アミド結合、ラクタム架橋、カルバモイル結合、尿素結合、チオ尿素結合、アミン結合、及びチオアミド結合等が挙げられる。
２つのアミノ酸がアミノ酸の主鎖において結合すると、ペプチド結合により閉環構造が形成されるが、２つのアミノ酸の側鎖同士、側鎖と主鎖の結合等により、２つのアミノ酸間の共有結合は形成されてもよい。
【００１３】
環状構造は、直鎖状ペプチドのＮ末端とＣ末端のアミノ酸の結合に限られず、末端のアミノ酸と末端以外のアミノ酸の結合、又は末端以外のアミノ酸同士の結合により形成されてもよい。環状構造を形成のために結合するアミノ酸の一方が末端アミノ酸で、他方が非末端アミノ酸である場合、環状ペプチドは、環状構造に直鎖のペプチドが尾のように付いた構造を有する。
【００１４】
環状構造を形成するアミノ酸としては、天然アミノ酸に加え、人工のアミノ酸変異体や誘導体を含み、例えば、天然タンパク質性Ｌ−アミノ酸、非天然アミノ酸、及びアミノ酸の特徴である当業界で公知の特性を有する化学的に合成された化合物等が挙げられる。
タンパク質性アミノ酸（ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）は、当業界に周知の３文字表記により表すと、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＶａｌである。
非タンパク質性アミノ酸（ｎｏｎ−ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）としては、タンパク質性アミノ酸以外の天然又は非天然のアミノ酸を意味する。
非天然アミノ酸としては、例えば、主鎖の構造が天然型と異なる、α，α−二置換アミノ酸（α−メチルアラニンなど）、Ｎ−アルキル−α−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、β−アミノ酸、α−ヒドロキシ酸や、側鎖の構造が天然型と異なるアミノ酸（ノルロイシン、ホモヒスチジンなど）、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸、ホモフェニルアラニン、ホモヒスチジンなど）、及び側鎖中のカルボン酸官能基がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸など）等が挙げられる。非天然アミノ酸の具体例としては、国際公開第２０１５／０３００１４号に記載のアミノ酸が挙げられる。
【００１５】
環状構造を形成するアミノ酸の数は４以上であれば特に限定されないが、例えば、５以上、８以上、１０以上であってもよく、３０以下、２５以下、２０以下、１５以下であってもよい。
環状構造を形成するアミノ酸の数としては、４以上３０以下であることが好ましく、４以上３０以下の範囲内で、環状構造を形成するアミノ酸の数を５以上、８以上、１０以上としてもよく、３０以下、２５以下、２０以下、１５以下としてもよい。
環状構造を形成するアミノ酸の数は、８以上２０以下としてもよく、１０以上２０以下としてもよく、１０以上１５以下としてもよい。
【００１６】
本発明において、環状ペプチドは、リン酸化、メチル化、アセチル化、アデニリル化、ＡＤＰリボシル化、及び糖鎖付加等の修飾が加えられたものであってもよく、他のペプチドやタンパク質と融合させたものであってもよい。また、環状ペプチドは、適当なリンカーを介して、ビオチン化されていてもよい。
また、本発明において、環状ペプチドは、２つの、１つの環状構造を有する環状ペプチドがリンカー構造を介して結合した分子内に２つの環状構造を有する二量体であってもよく、分子内でラクタム構造を形成した分子内ラクタムブリッジ構造を有していてもよい。
２つの環状ペプチドを繋ぐリンカー構造としては、特に限定されず、ペプチド合成分野においてペプチド同士を繋ぐリンカーとして周知の構造のものを採用することができる。
分子内ラクタムブリッジ構造は、環状ペプチドを構成するアミノ酸の側鎖同士が結合することによって形成されてよく、例えば、Ｌｙｓの側鎖のアミノ基と、Ａｓｐ又はＧｌｕの側鎖のカルボキシル基が結合して、ペプチド結合を形成することにより、分子内ラクタム構造が形成され、環状ペプチドは、分子内にブリッジ構造として、もう１つの環構造を有する。Ｌｙｓに代えて、例えば、ＤＡＰ、ＤＡＢ、及びＯｒｎがＡｓｐ又はＧｌｕと結合していてもよい。
【００１７】
本発明は、環状ペプチドによる新規ＮＴＣＰ阻害剤である。特に、本発明は、ＮＴＣＰの本来の機能に対する阻害作用がより弱いＮＴＣＰ阻害剤、ＨＢＶ又はＨＤＶとＮＴＣＰの相互作用をより強く阻害するＮＴＣＰ阻害剤、又はその両方であるＮＴＣＰ阻害剤である。
【００１８】
本発明においては、Ｘｗ１−Ｗ−Ｘｗ２−Ｗ構造を有するか、又はＰ−Ｘｐ１−Ｘｐ２−Ｈ構造を有する環状ペプチドが、Ｘｗ１−Ｗ−Ｘｗ２−Ｗ構造又はＰ−Ｘｐ１−Ｘｐ２−Ｈ構造を介してＮＴＣＰに結合してアロステリックにＮＴＣＰの機能の少なくとも一部を阻害すると考えられる。中でも、本発明におけるＮＴＣＰ阻害剤は、好適には、細胞内へのＨＢＶ又はＨＤＶの侵入を阻害するための侵入阻害剤として機能する。
【００１９】
ＨＢＶの生活環は、概して細胞に対する感染初期と感染後期の段階に分けられる。より具体的には、感染初期においてＨＢＶは肝細胞上のＮＴＣＰに結合して、ＮＴＣＰを介して細胞に侵入し、核へ輸送され、ｃｃｃＤＮＡ(covalently closed circular DNA)を形成する。また、感染後期においては、ｃｃｃＤＮＡからＲＮＡの転写、キャプシド形成、逆転写、エンベロープ獲得、ウイルス放出が行われる。
本発明のＮＴＣＰ阻害剤は、ＮＴＣＰの機能の少なくとも一部を阻害することにより、ＨＢＶ又はＨＤＶの感染初期におけるＮＴＣＰへの結合とＮＴＣＰを介した細胞侵入を阻害し、ＨＢＶ又はＨＤＶに関連する疾患の治療又は予防に用いることができる。
本発明のＮＴＣＰ阻害剤は、ＮＴＣＰ、好ましくはヒトＮＴＣＰの少なくとも一部を阻害する。
ＨＢＶ又はＨＤＶに関連する疾患としては、例えば急性肝炎、慢性肝炎、劇症肝炎、肝硬変、肝不全、及び肝細胞癌が挙げられる。
【００２０】
本発明において、環状ペプチドは、医薬的に許容可能な塩として用いてもよい。環状ペプチドの医薬的に許容可能な塩としては、例えば、医薬として許容される塩基や酸との塩が挙げられる。
医薬的に許容可能な塩の具体例としては、無機酸（塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、リン酸等）の付加塩、有機酸（ｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、ｐ−ブロモフェニルスルホン酸、カルボン酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、酢酸等）の付加塩、無機塩基（水酸化アンモニウム又はアルカリ若しくはアルカリ土類金属水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩等）、アミノ酸の付加塩等が挙げられる。
【００２１】
本発明のＮＴＣＰ阻害剤としての環状ペプチドは、Ｘｗ１−Ｗ−Ｘｗ２−Ｗ構造を介してアロステリックに、中でも、ＨＢＶ又はＨＤＶがＮＴＣＰを介して細胞に侵入することを阻害すると考えられるので、Ｘｗ１−Ｗ−Ｘｗ２−Ｗ構造を含む環状ペプチドであれば、特に限定されるものではなく、以下の一般式で表すことのできるアミノ酸配列を有する。
（Ｘ４）ｍ−Ｘｗ１−Ｗ−Ｘｗ２−Ｗ−（Ｘ５）ｎ
【００２２】
上記一般式において、Ｘｗ１及びＸｗ２は、それぞれ独立して、Ｔ、Ｓ、Ｉ、Ｌ、若しくはＶ、又はそのＮ−アルキルアミノ酸である。
Ｘｗ１は、Ｔ若しくはＬ又はそのＮ−アルキルアミノ酸であることが好ましい。
Ｘｗ２は、Ｔ若しくはＩ又はそのＮ−アルキルアミノ酸であることが好ましい。
Ｎ−アルキルアミノ酸としては、例えばＮ−メチルアミノ酸が挙げられる。
【００２３】
Ｘ４とＸ５は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸であり、ｍ及びｎは、少なくとも一方が１以上の整数である。Ｘ４とＸ５が環状構造を形成することにより、環状ペプチドとなるが、環状構造は、Ｎ末端のＸ４が、Ｃ末端のＸ５と結合して形成されていてもよく、Ｎ末端のＸ４が、非Ｃ末端のＸ５と結合して形成されていてもよく、非Ｎ末端のＸ４が、Ｃ末端のＸ５と結合して形成されていてもよく、非Ｎ末端のＸ４が、非Ｃ末端のＸ５と結合して形成されていてもよい。
また、Ｘ４及びＸ５が、リンカーを介して環状構造となっていてもよい。
ｍが０である場合、Ｘｗ１が、Ｘ５と結合し、ｎが０である場合、Ｘ４がＷと結合する。
ｍ及びｎは、ｍ＋ｎが１以上であれば特に限定されないが、ｍ＋ｎが１以上２６以下となるように、ｍとｎは、それぞれ独立して選択される整数であることが好ましく、ｍとｎが１以上２６以下の範囲内で環状構造を形成するアミノ酸の数の範囲内で適宜選択される。
【００２４】
環状ペプチドは、Ｘｗ１−Ｗ−Ｘｗ２−Ｗ−Ｘｗ３−Ｗ構造を有していてもよい。
Ｘｗ３は、Ｔ、Ｓ、Ｉ、Ｌ、若しくはＶ、又はそのＮ−アルキルアミノ酸である。
Ｘｗ３は、Ｔ若しくはＩ又はそのＮ−アルキルアミノ酸であることが好ましい。
【００２５】
本発明のＮＣＴＰ阻害剤としての環状ペプチドは、Ｐ−Ｘｐ１−Ｘｐ２−Ｈ構造を介してアロステリックに、中でも、ＨＢＶ又はＨＤＶがＮＴＣＰを介して細胞に侵入することを阻害すると考えられるので、Ｐ−Ｘｐ１−Ｘｐ２−Ｈ構造を含む環状ペプチドであれば、特に限定されるものではなく、以下の一般式で表すことのできるアミノ酸配列を有する。
（Ｘ４）ｍ−Ｐ−Ｘｐ１−Ｘｐ２−Ｈ−（Ｘ５）ｎ
【００２６】
上記一般式において、Ｘｐ１は、任意のアミノ酸であり、Ｘｐ２は、Ｉ、Ｌ、若しくはＶ、又はそのＮ−アルキルアミノ酸である。
Ｘｐ２は、Ｉ若しくはＬ又はそのＮ−アルキルアミノ酸であることが好ましい。
【００２７】
Ｘ４とＸ５は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸であり、ｍ及びｎは、少なくとも一方が１以上の整数である。Ｘ４とＸ５が環状構造を形成することにより、環状ペプチドとなるが、環状構造は、Ｎ末端のＸ４が、Ｃ末端のＸ５と結合して形成されていてもよく、Ｎ末端のＸ４が、非Ｃ末端のＸ５と結合して形成されていてもよく、非Ｎ末端のＸ４が、Ｃ末端のＸ５と結合して形成されていてもよく、非Ｎ末端のＸ４が、非Ｃ末端のＸ５と結合して形成されていてもよい。
また、Ｘ４及びＸ５が、リンカーを介して環状構造となっていてもよい。
ｍが０である場合、Ｘｐ１が、Ｘ５と結合し、ｎが０である場合、Ｘ４がＨと結合する。
ｍ及びｎは、ｍ＋ｎが１以上であれば特に限定されないが、ｍ＋ｎが１以上２６以下となるように、ｍとｎは、それぞれ独立して選択される整数であることが好ましく、ｍ＋ｎが１以上２６以下の範囲内で環状構造を形成するアミノ酸の数の範囲内で適宜選択される。
【００２８】
環状ペプチドは、Ｐ−Ｘｐ１−Ｘｐ２−Ｈ−Ｘｐ３−Ｆ構造を有していてもよい。
Ｘｐ３は、Ｉ、Ｌ、若しくはＶ、又はそのＮ−アルキルアミノ酸である。
Ｘｐ３は、Ｉ若しくはＬ又はそのＮ−アルキルアミノ酸であることが好ましい。
【００２９】
環状ペプチドは、Ｎ−ＣＯ−ＣＨ2−Ｓ構造により環構造を形成していてもよく、当該構造は、Ｎ末端のＸ４のアミノ基にクロロアセチル基等の、脱離基でＨが置換されたアセチル基と、Ｃ末端のＸ５のシステインのチオール基との結合により形成されることが好ましく、その場合、一般式は、
ＸＣＨ2ＣＯ−（Ｘ６）−（Ｘ７）ｐ−Ｘｗ１−Ｗ−Ｘｗ２−Ｗ−（Ｘ８）ｑ−Ｃｙｓ−（Ｘ９）ｒで表されるか、ＸＣＨ2ＣＯ−（Ｘ６）−（Ｘ７）ｐ−Ｐ−Ｘｐ１−Ｘｐ２−Ｈ−（Ｘ８）ｑ−Ｃｙｓ−（Ｘ９）ｒで表されることが好ましい。
Ｘ６〜Ｘ９は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸であり、ｐ＋ｑが、好ましくは０以上２４以下の範囲内で環状構造を形成するアミノ酸の数の範囲内で適宜選択される。
Ｘ６は、Ｔｒｐであることが好ましく、Ｃ末端のＸ９は、Ｇｌｙ又はＳｅｒであることが好ましく、ｒは０以上の整数であれば特に限定されないが、２０以下であってもよく、１０以下であってもよく、０または１であることが好ましい。
本明細書において、ｒが０である場合には、環状ペプチドは、Ｘ９を有さず、ｒが２以上の整数である場合、環状ペプチドにおける（Ｘ９）ｒは、アミノ酸がペプチド結合により連結した鎖状構造に相当する。
【００３０】
Ｘｗ１−Ｗ−Ｘｗ２−Ｗ−Ｘｗ３−Ｗ構造を有する環状ペプチドとして、一般式は、ＸＣＨ2ＣＯ−（Ｘ６）−（Ｘ１０）ｓ−Ｘｗ１−Ｗ−Ｘｗ２−Ｗ−Ｘｗ３−Ｗ−（Ｘ１１）ｔ−Ｃｙｓ−（Ｘ９）ｒで表されることが好ましく、
ＸＣＨ2ＣＯ−Ｔｒｐ−（Ｘ１０）ｓ−Ｘｗ１−Ｗ−Ｘｗ２−Ｗ−Ｘｗ３−Ｗ−（Ｘ１１）ｔ−Ｃｙｓ−（Ｘ９）ｒで表されることがより好ましい。
なお、ここで、Ｎ末端のＸ６又はＴｒｐのアミノ基に結合する−ＣＯ−ＣＨ2−Ｘ基と、Ｃｙｓのチオール基が結合して、Ｎ−ＣＯ−ＣＨ2−Ｓ構造により環構造を形成する。
Ｘ６、Ｘ９〜Ｘ１１は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸であり、ｓ＋ｔが、好ましくは０以上２２以下の範囲内で環状構造を形成するアミノ酸の数の範囲内で適宜選択される。
Ｘ６は、Ｔｒｐであることが好ましく、Ｃ末端のＸ９は、Ｇｙｓ又はＳｅｒであることが好ましく、ｒは０以上の整数であれば特に限定されないが、２０以下であってもよく、１０以下であってもよく、０又は１であることが好ましい。
【００３１】
Ｐ−Ｘｐ１−Ｘｐ２−Ｈ−Ｘｐ３−Ｆ構造を有する環状ペプチドとして、一般式は、ＸＣＨ2ＣＯ−（Ｘ６）−（Ｘ１０）ｓ−Ｐ−Ｘｐ１−Ｘｐ２−Ｈ−Ｘｐ３−Ｆ−（Ｘ１２）ｕ−Ｃｙｓ−（Ｘ９）ｒで表されることが好ましく、
ＸＣＨ2ＣＯ−Ｔｒｐ−（Ｘ１０）ｓ−Ｐ−Ｘｐ１−Ｘｐ２−Ｈ−Ｘｐ３−Ｆ−（Ｘ１２）ｕ−Ｃｙｓ−（Ｘ９）ｒで表されることがより好ましい。
なお、ここで、Ｎ末端のＸ６又はＴｒｐのアミノ基に結合する−ＣＯ−ＣＨ2−Ｘ基と、Ｃｙｓのチオール基が結合して、Ｎ−ＣＯ−ＣＨ2−Ｓ構造により環構造を形成する。
Ｘ６、Ｘ９、Ｘ１０及びＸ１２は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸であり、ｓ＋ｕが、好ましくは０以上２２以下の範囲内で環状構造を形成するアミノ酸の数の範囲内で適宜選択される。
Ｘ６は、Ｔｒｐであることが好ましく、Ｃ末端のＸ９は、Ｇｌｙア又はＳｅｒであることが好ましく、ｒは０以上の整数であれば特に限定されないが、２０以下であってもよく、１０以下であってもよく、０又は１であることが好ましい。
【００３２】
本発明の環状ペプチドの具体例として、以下のものが挙げられる。
【化１】
2019139126.tif 000003
上記構造において、DＴｒｐは、ＴｒｐのＤ体であることを意味し、Ｓは、Ｃｙｓのチオール基を意味する。Ｘ９とｒは、前記と同義である。
式中のＶａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ（可変領域）は、
ＡＬＷＩＷＰＱＶＹＷＴＲＦＳ
ＷＷＡＩＮＰＨＩＨＶＦＴＷＰ
ＩＬＶＹＰＥＬＨＬＦＬＬＹＳ
ＬＹＴＷＴＷＨＳＮＷＴＶＴＳＬ
ＬＹＬＷＴＷＰＮＴＳＹＡＹＮＶ
ＳＹＩＤＴＦＴＷＩＷＬＹ
ＦＩＩＶMeＧＴＷＴＷＴＷＳ
ＴＷＩＷMeＧMeＧＬＹＶＶＹＦＰ
ＡＬＩＷＴＷMeＳＱＹＹＱＹMeＹMeMeＳ
ＴＦＴＹMeＡＱＩＷＩＷＹＹMeＧ
ＴＹＫＹＳMeＧＩＷＩＷＩＷ
ＩＷＩＷＰＧＹＶＩＹ
ＴＷＴＷＨMeＳＡＹＬＹＶＦ
ＶＩＷＩＷＰＮＨＦＹＹ
ＴＷＴＷＱＮＳＦＩＷＩＹ
ＴＷＴＷＮMeＳＡＦＬＹＶＹ
ＮＹＩＹＹＰMeＳＩＨＩＦＹＬ
ＨＷＦＹＰMeＳＩＨＶＦＴＷMeＡ
が挙げられる。
【００３３】
これらのアミノ酸配列から、Ｘｗ１−Ｗ−Ｘｗ２−Ｗ構造か、Ｐ−Ｘｐ１−Ｘｐ２−Ｈ構造を含む限り、好ましくは、Ｘｗ１−Ｗ−Ｘｗ２−Ｗ−Ｘｗ３−Ｗ構造を含む限り、また、好ましくは、Ｐ−Ｘｐ１−Ｘｐ２−Ｈ−Ｘｐ３−Ｆ構造を含む限り、１又は数個、好ましくは１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１又は２個のアミノ酸が付加、置換、又は欠失したアミノ酸配列を含み、ＨＢＶ又はＨＤＶがＮＴＣＰを介して細胞に侵入することを阻害する効果を有する環状ペプチドであってもよい。
また、これらのアミノ酸配列と、Ｘｗ１−Ｗ−Ｘｗ２−Ｗ構造か、Ｐ−Ｘｐ１−Ｘｐ２−Ｈ構造を含む限り、好ましくは、Ｘｗ１−Ｗ−Ｘｗ２−Ｗ−Ｘｗ３−Ｗ構造を含む限り、また、好ましくは、Ｐ−Ｘｐ１−Ｘｐ２−Ｈ−Ｘｐ３−Ｆ構造を含む限り、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、又は９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＨＢＶ又はＨＤＶがＮＴＣＰを介して細胞に侵入することを阻害する効果を有する環状ペプチドであってもよい。
【００３４】
本発明の環状ペプチドは、無細胞翻訳系による翻訳合成法により好適に製造できる。
環状化するペプチドをコードする核酸を調製し、当該核酸を無細胞翻訳系で翻訳することによって調製することができる。環状化するペプチドをコードする核酸は、生体の翻訳系で用いられる遺伝暗号、リプログラミングした遺伝暗号、又はこれらの組み合わせを用いて、当業者が適宜設計することができる。核酸は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。
【００３５】
無細胞翻訳系を用いる方法によれば、非天然アミノ酸でアミノアシル化したｔＲＮＡを使用して、天然アミノ酸に加え、非天然アミノ酸をペプチドに効率よく導入することができる。例えば、本発明者らが開発した人工アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素フレキシザイムを用いれば、任意の天然又は非天然のアミノ酸で、任意のアンチコドンを有するｔＲＮＡをアミノアシル化することが可能である。したがって、この技術を用いて、ｍＲＮＡのトリプレットからなる遺伝暗号が、生体の翻訳系とは異なるアミノ酸をコードするように、リプログラミングすることができる（国際公開第２００８／０５９８２３号）。
【００３６】
本発明のＮＴＣＰ阻害剤は、それを含む医薬組成物として用いることができる。
医薬組成物の投与形態は特に限定されず、経口投与でも非経口投与でもよい。非経口投与としては、例えば、筋肉内注射、静脈内注射、及び皮下注射等の注射投与、経皮投与、並びに経粘膜投与等が挙げられる。
経粘膜投与の投与経路としては、例えば、経鼻、経口腔、経眼、経肺、経膣、及び経直腸等が挙げられる。
医薬組成物中の環状ペプチドに対し、代謝や排泄等の薬物動態の観点から、各種の修飾を行ってよい。例えば、環状ペプチドにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）や糖鎖を付加して血中滞留時間を長くし、抗原性を低下させることができる。
また、ポリ乳酸・グリコール（ＰＬＧＡ）等の生体内分解性の高分子化合物、多孔性ヒドロキシアパタイト、リポソーム、表面修飾リポソーム、不飽和脂肪酸で調製したエマルジョン、ナノパーティクル、ナノスフェア等を徐放化基剤として用い、これらに環状ペプチドを内包させてもよい。経皮投与する場合、弱い電流を皮膚表面に流して角質層を透過させることもできる（イオントフォレシス法）。
【００３７】
医薬組成物は、有効成分として環状ペプチドをそのまま用いてもよいし、医薬的に許容可能な添加剤等を加えて製剤化してもよい。
医薬製剤の剤形としては、例えば、液剤（例えば注射剤）、分散剤、懸濁剤、錠剤、・BR>ロ剤、粉末剤、坐剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤、吸入剤、軟膏剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、及びパップ剤等が挙げられる。
製剤化は、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、溶解剤、溶解補助剤、着色剤、矯味矯臭剤、安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、湿潤剤、分散剤、及び抗酸化剤等の添加剤を適宜使用して、常法により行うことができる。
製剤化に用いられる添加剤としては、特に限定されるものではないが、例えば、精製水、食塩水、リン酸緩衝液、デキストロース、グリセロール、エタノール等の医薬的に許容可能な有機溶剤、動植物油、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、ソルビトール、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、コーンスターチ、無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、トラガント、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ミリスチン酸オクチルドデシル、ミリスチン酸イソプロピル、高級アルコール、ステアリルアルコール、ステアリン酸、及びヒト血清アルブミン等が挙げられる。
経粘膜吸収における吸収促進剤として、ポリオキシエチレンラウリルエーテル類、ラウリル硫酸ナトリウム、及びサポニン等の界面活性剤；グリココール酸、デオキシコール酸、及びタウロコール酸等の胆汁酸塩；ＥＤＴＡ及びサリチル酸類等のキレート剤；カプロン酸、カプリン酸、ラウリン酸、オレイン酸、リノール酸、及び混合ミセル等の脂肪酸類；エナミン誘導体、Ｎ−アシルコラーゲンペプチド、Ｎ−アシルアミノ酸、シクロデキストリン類、キトサン類、並びに一酸化窒素供与体等を用いてもよい。
【００３８】
錠剤又は丸剤は、糖衣、胃溶性、及び腸溶性物質等で被覆されたコート錠等であってもよい。
液剤は、注射用蒸留水、生理食塩水、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、及びアルコール類等を含んでもよい。湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解剤、溶解補助剤、及び防腐剤等を加えてもよい。
【００３９】
本発明は、ＮＴＣＰ阻害剤を、それ必要とする患者に投与して、患者における疾患を治療又は予防する方法も提供する。
【００４０】
本発明のＮＴＣＰ阻害剤の投与量は、当業者が、それを必要とする患者の症状、年齢、性別、体重、感受性差、投与方法、投与間隔、及び製剤の種類等に応じて、適宜決定することができる。
患者は、哺乳動物であり、ヒトであることが好ましい。
【実施例】
【００４１】
以下、実施例を示して具体的に本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものでない。【００４２】
＜材料及び方法＞
材料
Ｆｍｏｃ保護アミノ酸はＭｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから購入した。オリゴヌクレオチドは、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｊａｐａｎから購入した。特に指示していない限り、他の試薬はＮａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ、Ｉｎｃ．から入手した。【００４３】
ＲａＰＩＤ選択
公知の方法（Morimoto, J., Hayashi, Y. & Suga, H. Discovery of Macrocyclic Peptides Armed with a Mechanism-Based Warhead: Isoform-Selective Inhibition of Human Deacetylase SIRT2. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 51, 3423-3427 (2012).及びKawakami, T., Murakami, H. & Suga, H. Messenger RNA-programmed incorporation of multiple N-methyl-amino acids into linear and cyclic peptides. Chem. Biol. 15, 32-42 (2008).に記載の方法）で、シアノメチルエステル（ＣＭＥ）又はジニトロベンジルエステル（ＤＢＥ）活性化アミノ酸を合成した。フレキシザイムアミノアシル化リボザイム及びｔＲＮＡは、ＰＣＲ生成ＤＮＡ鋳型（下記表１）からＣＭＣ又はＤＢＥ活性化アミノ酸を用いたｔＲＮＡのアミノアシル化からのインビトロ転写によって調製した（Goto, Y., Katoh, T. & Suga, H. Flexizymes for genetic code reprogramming. Nat. Protoc. 6, 779-790 (2011).）。具体的には、ＲＮＡ分子は、ＰＣＲによって組み立てられたＤＮＡ鋳型からのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ反応によって合成され（表１）、ＰＡＧＥによって精製された。氷上で４０ｍＭの各ｔＲＮＡ基質及びフレキシザイムアミノアシル化リボザイム、６００ｍＭのＭｇＣｌ、２、５ｍＭの活性化アミノ酸基質及び１００ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）を２時間（Ｎ−クロロアセチル−チロシン−ＣＭＥ、Ｎ−メチル−グリシン−ＤＢＥ、Ｎ−メチル−アラニン−ＤＢＥ）又は６時間（Ｎ−メチル−４−Ｏ−メチル−チロシン−ＣＭＥ、Ｎ−メチル−セリン−ＤＢＥ、Ｎ−メチル−フェニルアラニン−ＣＭＥ及びＮ−メチル−ロイシン−ＤＢＥ）を添加した後、酢酸ナトリウム及びエタノールで沈殿させて回収した。ピューロマイシン結合オリゴヌクレオチド（表１）及びＴ４  ＲＮＡリガーゼをフェノール：クロロホルム抽出及びエタノール沈殿により精製して、ピューロマイシン結合ｍＲＮＡを調製した。【００４４】
【表１】
2019139126.tif 000004
【表２】
2019139126.tif 000005
【００４５】
環状ペプチドライブラリーのリボソームは、公知の方法（Hayashi, Y., Morimoto, J. & Suga, H. In vitro selection of anti-Akt2 thioether-macrocyclic peptides leading to isoform-selective inhibitors. ACS Chem. Biol. 7, 607-613 (2012).に記載の方法）で合成した。具体的には、最初の選択のために、１．２μＭのピューロマイシン結合ｍＲＮＡライブラリーを、２５μＭのＬ−又はＤ−ＣｌＡｃ−Ｔｙｒ−ｔＲＮＡｆＭｅｔを含有するＭｅｔ欠損ＦＩＴ反応において３７℃で３０分間翻訳した。この生成物を２５℃で１２分間インキュベートした後、２０ｍＭのＥＤＴＡの存在下、３７℃で３０分間インキュベートすることにより、リボソーム−ｍＲＮＡ複合体を破壊した。次いで、得られたペプチド結合ｍＲＮＡをＲＮａｓｅＨ−逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて４２℃で１時間逆転写し、緩衝液を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５ｖｏｌ％のＴｗｅｅｎ−２０及び１ｍＭのβＤＤＭに交換した。Ｈｉｓ  ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社の商品名）上の６連続継代（４℃で各３０分のカウンター選択）で行い、続いて４℃で３０分間同じビーズに固定した２００ｎＭのＮＴＣＰに対する親和性選択を行った。９５℃で５分間加熱してビーズからｃＤＮＡを溶出させ、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ社）上でＳｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを用いた定量的ＰＣＲにより、最終カウンター選択（ネガティブコントロール）及びアフィニティー選択ステップからの分別回収を評価した。富化されたＤＮＡライブラリーをＰＣＲにより回収し、スクリーニングの次のラウンドのためにｍＲＮＡライブラリーを生成する転写反応のための入力として使用した。後述する集束した選択のために、次のＦＩＴ反応を除いて選択した。そのＦＩＴ反応は、Ｍｅｔ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ及びＡｒｇ並びにそれらの同族アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを欠損し、６．２５μＭのＬ−又はＤ−ＣｌＡｃ−Ｔｙｒ−ｔＲＮＡｆＭｅｔ並びに各１２．５μＭのＥｎＧｌｕＧＵＣ−ＭｅＧｌｙ、ＥｎＧｌｕＣＵＣ−ＭｅＡｌａ、ＥｎＧｌｕＧＣＧ−ＭｅＴｙｒ（Ｍｅ）、ＥｎＧｌｕＣＣＧ−ＭｅＰｈｅ及びＥｎＧｌｕＣＣＵ−ＭｅＳｅｒを含む。【００４６】
最初の選択の配列決定のために、ＤＮＡサンプルをＤＮＡライゲーションキットＭｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社）を用いてｐＧＥＭ−Ｔ−ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）にクローニングし、コンピテントＤＨ５ａ  Ｅ．Ｃｏｌｉに形質転換し、各サンプルから２４クローンを配列決定した。集束した選択物のハイスループットシーケンシングのために、ＤＮＡサンプルをネストプライマー（表１）でＰＣＲ増幅し、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎカラム（Ｍａｃｈｅｒｙ−Ｎａｇｅｌ社）を用いて精製し、ＭｉＳｅｑハイスループットシーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用いて配列決定した。データ分析は、ＣＬＣワークベンチソフトウェア（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて行った。【００４７】
固相ペプチド合成
環状ペプチドは、Ｓｙｒｏ  Ｗａｖｅ自動合成機を用いて標準的なＦｍｏｃ固相合成によって合成した。Ｎ−メチル−Ｏ−メチル−チロシン残基の合成のために、Ｏ−メチル−チロシンカップリングの後に、Ｆｍｏｃ脱保護、得られた遊離アミンのＮｏｓｙｌ保護、及び硫酸ジメチルを用いた樹脂上のメチル化を次のように行った。Ｆｍｏｃ脱保護、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）及び２，４，６−トリメチルピリジン（３３μＬ、０．２５ｍｍｏｌ）中の塩化ニトロベンゼンスルホニル（２２ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を樹脂に加え、反応を１５分間進行させて室温で樹脂を洗浄し、樹脂をＮＭＰで５回洗浄した。ＮＭＰ中の１，８−ジアザビシクロ（５．４．０）ウンデカ−７−エン（１１．２５μＬ、０．０７５ｍｍｏｌ）及びジメチルサルフェート（２２．２５μＬ、０．２５ｍｍｏｌ）を５分間使用してメチル化を２回行い、その後樹脂を５回洗浄した。）をＮＭＰで置き換えた。ノシル脱保護をＮＭＰ中で１，８−ジアザビシクロ（５．４．０）ウンデカ−７−エン（１８．７５μＬ、０．１２５ｍｍｏｌ）及び２−メルカプトエタノール（１７．５μＬ、０．２５ｍｍｏｌ）を用いて５分間処理することを２回行った後、樹脂をＮＭＰで５回洗浄し、固相ペプチドの合成を続けた。最後のＦｍｏｃ脱保護工程の後、各ペプチドのＮ末端を８当量のクロロアセチル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンアミドと室温で１時間反応させることによりクロロアセチル化した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中の各トリイソプロピルシラン、エタンジチオール及び水を２．５容量％用いて、樹脂からの切断及び側鎖脱保護を行った。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解したジエチルエーテルで沈殿させてペプチドを回収し、Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリエチルアミンで塩基性にして環化させた。水：アセトニトリル勾配（０．１％ＴＦＡ含有）を用いてＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ＨＰＬＣシステム（Ｓｈｉｍａｄｚｕ社）で行った。最終ＴＦＡ塩を５ｍＭのＨＣｌ水溶液から３回凍結乾燥してＨＣｌ塩を得て、これを次の検証のためにＤＭＳＯに溶解して、精製した。【００４８】
表面プラズモン共鳴
ヒトＮＴＣＰに対する各ペプチドの結合定数をＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて測定した。ランニング緩衝液は、０．１容量％のＤＭＳＯ及び１ｍＭのβ−ドデシル−マルトシドを含むＨＢＳ−Ｐ＋（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び０．０５容量％の界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４）を用いた。１００ｎＭの組換えＮＴＣＰをＮｉ2+で処理したＮＴＡチップ上に、製造者の指示（ベースライン応答：１０００〜３０００屈折単位）に従って固定化した。ペプチドを分析物として６０μＬ／分の流速で注入し、結合定数を１：１結合モデルを用いてモデル化した。【００４９】
組換えＮＴＣＰタンパク質の調製
Ｈｉｓタグ付加組換えＮＴＣＰタンパク質は、公知の方法（Watashi, K. et al. Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP). Hepatology 59, 1726-1737 (2014).及びShimura, S. et al. Cyclosporin derivatives inhibit hepatitis B virus entry without interfering with NTCP transporter activity. Journal of hepatology 66, 685-692 (2017).に記載の方法）の小麦胚芽無細胞タンパク質合成システムを用いて合成した。合成されたＮＴＣＰタンパク質の構造及び機能は、次の３つの方法（Watashi, K. et al. Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP). Hepatology 59, 1726-1737 (2014).に記載の方法）によって確認した。
１）ＮＴＣＰタンパク質は、シンチレーション近接アッセイにおいて［3Ｈ］−タウロコール酸と相互作用した。
２）ＮＴＣＰタンパク質はＨＢＶ−Ｌ表面抗原と特異的に相互作用し、この相互作用は過剰量のｐｒｅＳ１ペプチドの存在下で解離し、アルファスクリーンアッセイで調べた。
３）ＨＢＶ感染細胞培養アッセイ中のＮＴＣＰタンパク質の添加は、細胞に対するＨＢＶ感染を有意に阻害した。【００５０】
細胞培養
ＨｅｐＧ２−ｈＮＴＣＰ−Ｃ４、Ｈｅｐ３８．７−Ｔｅｔ、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ−７．５．１（Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＦｒａｎｃｉｓ  Ｃｈｉｓａｒｉ博士より供与）細胞及び初代ヒト肝細胞（ＰｈｏｅｎｉｘＢｉｏ  Ｃｏ．、Ｌｔｄ．）を、公知の方法（Iwamoto, M. et al. Evaluation and identification of hepatitis B virus entry inhibitors using HepG2 cells overexpressing a membrane transporter NTCP. Biochemical and biophysical research communications 443, 808-813 (2014).、Ogura, N., Watashi, K., Noguchi, T. & Wakita, T. Formation of covalently closed circular DNA in Hep38.7-Tet cells, a tetracycline inducible hepatitis B virus expression cell line. Biochemical and biophysical research communications 452, 315-321 (2014).及びIshida, Y. et al. Novel robust in vitro hepatitis B virus infection model using fresh human hepatocytes isolated from humanized mice. The American journal of pathology 185, 1275-1285 (2015).に記載の方法）のように培養した。【００５１】
ＨＢＶの調製と感染
この研究で主に用いられたＨＢＶ遺伝子型Ｄ（図１〜図３）は、Ｈｅｐ３８．７−Ｔｅｔ細胞の培養上清由来であり、公知の方法（Tsukuda, S. et al. Dysregulation of retinoic acid receptor diminishes hepatocyte permissiveness to hepatitis B virus infection through modulation of sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) expression. The Journal of biological chemistry 290, 5673-5684 (2015).及びOgura, N., Watashi, K., Noguchi, T. & Wakita, T. Formation of covalently closed circular DNA in Hep38.7-Tet cells, a tetracycline inducible hepatitis B virus expression cell line. Biochemical and biophysical research communications 452, 315-321 (2014).に記載の方法）で調製した。限外ろ過によって精製ＨＢＶ（図１（ｄ））を調製して、ＦＢＳ及び培地中の過剰量の成分を除去した。ＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ及びＬ１８０Ｍ／Ｓ２０２Ｇ／Ｍ２０４Ｖ変異（ヌクレオシドアナログ耐性ＨＢＶ）及びＧ１４５Ｒ置換（ワクチン逃避ＨＢＶ）を有する遺伝子型Ｃ（図４（ｄ））を、対応する発現プラスミドにトランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞の培養上清から調製した。４％ポリエチレングリコール８０００（ＰＥＧ８０００）の存在下でＨＢＶを１２，０００（図１（ａ）、（ｂ）、（ｄ））、１０００−２０００（図２（ｂ））又は５００（図３（ａ）、図４（ｄ））ゲノム等価量（ＧＥｑ）／細胞に接種した３７℃で１６時間、公知の方法（Watashi, K. et al. Interleukin-1 and tumor necrosis factor-alpha trigger restriction of hepatitis B virus infection via a cytidine deaminase activation-induced cytidine deaminase (AID). The Journal of biological chemistry 288, 31715-31727 (2013). に記載の方法）でインキュベートした。【００５２】
ＨＢｓ及びＨＢｅ抗原の検出
ＨＢｅ抗原は、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）（ＬＳＩ  Ｍｅｄｉｅｎｃｅ社）によって検出した。ＨＢｓ抗原は、公知の方法（Watashi, K. et al. Interleukin-1 and tumor necrosis factor-alpha trigger restriction of hepatitis B virus infection via a cytidine deaminase activation-induced cytidine deaminase (AID). The Journal of biological chemistry 288, 31715-31727 (2013). に記載の方法）のように酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）により定量した。【００５３】
ＭＴＴアッセイ
細胞生存度の測定のための３−（４，５−ジメチルチアール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイを、公知の方法（Watashi, K. et al. Interleukin-1 and tumor necrosis factor-alpha trigger restriction of hepatitis B virus infection via a cytidine deaminase activation-induced cytidine deaminase (AID). The Journal of biological chemistry 288, 31715-31727 (2013).に記載の方法）のように行った。【００５４】
間接免疫蛍光分析
免疫蛍光分析は、１：１００の希釈で抗ＨＢｃ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＲＢ−１４１３−Ａ）を用いて公知の方法（Watashi, K. et al. Interleukin-1 and tumor necrosis factor-alpha trigger restriction of hepatitis B virus infection via a cytidine deaminase activation-induced cytidine deaminase (AID). The Journal of biological chemistry 288, 31715-31727 (2013). に記載の方法）のように行った。【００５５】
ＨＢＶ複製アッセイ
テトラサイクリン存在下で細胞を播種した３日後、Ｈｅｐ３８．７−Ｔｅｔ細胞をテトラサイクリンの非存在下で、ペプチドを６日間処理した。培養上清中に放出されたＨＢＶ  ＤＮＡを回収し、公知の方法（Ogura, N., Watashi, K., Noguchi, T. & Wakita, T. Formation of covalently closed circular DNA in Hep38.7-Tet cells, a tetracycline inducible hepatitis B virus expression cell line. Biochemical and biophysical research communications 452, 315-321 (2014).に記載の方法）のようにリアルタイムＰＣＲによって定量化した。【００５６】
リアルタイムＰＣＲ
ＨＢＶ  ＤＮＡの定量のためのリアルタイムＰＣＲは、公知の方法（Watashi, K. et al. Interleukin-1 and tumor necrosis factor-alpha trigger restriction of hepatitis B virus infection via a cytidine deaminase activation-induced cytidine deaminase (AID). The Journal of biological chemistry 288, 31715-31727 (2013). に記載の方法）のように行った。【００５７】
ＰｒｅＳ１結合アッセイ
ｐｒｅＳ１ペプチドと宿主細胞との間の相互作用を、４０ｎＭの６−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）標識ｐｒｅＳ１ペプチド（ｐｒｅＳ１プローブ）とＨｅｐＧ２−ｈＮＴＣＰ−Ｃ４細胞を３７℃で３０分間インキュベートすることによって評価した。細胞を洗浄し、固定し、公知の方法（Kaneko, M. et al. A Novel Tricyclic Polyketide, Vanitaracin A, Specifically Inhibits the Entry of Hepatitis B and D Viruses by Targeting Sodium Taurocholate Cotransporting Polypeptide. Journal of virology 89, 11945-11953 (2015).に記載の方法）のように４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で核染色した。【００５８】
ＮＴＣＰトランスポーターアッセイ
ペプチドで３０分間前処理したＨｅｐＧ２−ｈＮＴＣＰ−Ｃ４細胞を、ペプチドの存在下、３７℃で１５分間、［3Ｈ］−タウロコール酸（ＴＣＡ）とインキュベートして細胞に取り込ませた。遊離の［3Ｈ］−ＴＣＡを洗浄した後、細胞を溶解して細胞内放射能を公知の方法（Kaneko, M. et al. A Novel Tricyclic Polyketide, Vanitaracin A, Specifically Inhibits the Entry of Hepatitis B and D Viruses by Targeting Sodium Taurocholate Cotransporting Polypeptide. Journal of virology 89, 11945-11953 (2015).に記載の方法）で測定した。【００５９】
ＨＤＶ感染アッセイ
公知の方法（Kaneko, M. et al. A Novel Tricyclic Polyketide, Vanitaracin A, Specifically Inhibits the Entry of Hepatitis B and D Viruses by Targeting Sodium Taurocholate Cotransporting Polypeptide. Journal of virology 89, 11945-11953 (2015).に記載の方法）のように発現プラスミドでトランスフェクトされたＨｕｈ−７細胞の培養上清から、ＨＤＶを調製した（ＨＤＶ発現プラスミドｐＳＶＬＤ３はＦｏｘ  Ｃｈａｓｅ  Ｃａｎｃｅｒ  ＣｅｎｔｅｒのＪｏｈｎ  Ｔａｙｌｏｒ博士から提供）。４％ＰＥＧ８０００の存在下、ＨＤＶを３７℃で１６時間、５  ＧＥｑ／細胞で接種し（図４（ｂ））、細胞内ＨＤＶ  ＲＮＡを測定することで感染を評価した。【００６０】
ＨＣＶ擬似粒子アッセイ
ＨＣＶエンベロープ依存的な侵入を、ＨＣＶ擬似粒子システム（リヨン大学のＦｒａｎｃｏｉｓ−Ｌｏｉｃ  Ｃｏｓｓｅｔ博士から提供）で評価した（Bartosch, B., Dubuisson, J. & Cosset, F.L. Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes. The Journal of experimental medicine 197, 633-642 (2003).）。Ｈｕｈ−７．５．１細胞を１時間ペプチドで前処理し、ペプチドの存在下で４時間ＨＣＶ擬似粒子を接種した。感染後７２時間で、公知の方法（Nakajima, S. et al. Specific inhibition of hepatitis C virus entry into host hepatocytes by fungi-derived sulochrin and its derivatives. Biochemical and biophysical research communications 440, 515-520 (2013).に記載の方法）でルシフェラーゼ活性を測定した。【００６１】
統計
統計学的有意性はスチューデントのｔ検定を用いて決定した（*Ｐ＜０．０５、**＜０．０１、Ｎ．Ｓ．：有意ではない）。【００６２】
＜結果＞
ＮＴＣＰに対する初期ＲａＰＩＤ選択
ＨＢＶの細胞侵入に対して環状ペプチドが阻害することを検証するために、精製されたＨｉｓ付加ＮＴＣＰ（これの構造及び機能について少なくとも一部は、Watashi, K. et al. Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP). Hepatology 59, 1726-1737 (2014).及び上述した＜材料及び方法＞の記載から確認できる。）を標的として用いたＲａＰＩＤシステムによる選択を実施して、ペプチドライブラリーを得た。得られたペプチドライブラリーは、ＡＵＧ開始コドン、４〜１５の連続したＮＮＫコドンのランダム領域（Ｎ＝Ａ、Ｇ、Ｃ又はＴ、Ｋ＝Ｔ又はＧ）、Ｃｙｓコドン、及びＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーの３回繰り返しをコードする配列を含む準ランダムのＤＮＡテンプレートから、転写及び翻訳によって生成された（図５（ｂ））。各ペプチドの開始ｆｏｒｍｙｌ−Ｍｅｔを、Ｌ−又はＤ−Ｎ−ｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｙｌａｔｅｄ−Ｔｙｒに置き換えられた後、下流のＣｙｓと反応してチオエーテル結合の環状構造を形成するような、遺伝子的にリプログラミングされた翻訳系を用いた（図５（ｂ））。このように、それぞれ１０12を超える種類の環状ペプチドが含まれる、２つのライブラリーを調製して選択した（一つはＬ−開始、一つはＤ−開始）。【００６３】
７回のラウンドの選択後、５回目、６回目、及び７回目後の富化されたＤＮＡライブラリーの配列解析によって、１０ペプチドが共通する又はホモロジーであることが分かった（６つは、Ｌ−ライブラリーで、４つはＤ−ライブラリーである。下記表２）。そのうち、内部にＭｅｔコドンが含まれる３つは（ＮＴＣＰ−Ｄ１，Ｄ４，Ｌ４）、翻訳系からＭｅｔが除かれているため、Ｉｌｅ／Ｌｅｕ及び／又はＴｈｒに置き換わっていた。このことは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳでＦＩＴシステムで翻訳された特定のペプチドを測定することにより確認した（図６）。Ｍｅｔコドンの代わりにＩｌｅ、Ｌｅｕ又はＴｈｒコドンを含むように変異されたこれらのペプチドの個々のクローンのＮＴＣＰに対する親和性の分析は、Ｍ５Ｉ、Ｍ１２Ｌ及びＭ１０Ｔ変異体がそれぞれＮＴＣＰ−Ｄ１、ＮＴＣＰ−Ｄ４及びＮＴＣＰ−Ｌ４の活性形態であるものを用いたが、結合親和性のわずかな変化しか観察されなかった（図６）。【００６４】
【表３】
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【００６５】
同定された環状ペプチドをさらに特徴付けるために、表２に示す１０個のペプチドは、（ＧＳ）3リンカー配列を含まない固相ペプチド方法論（かつＮＴＣＰ−Ｄ１、Ｄ４、Ｌ４のそれぞれに対してＭｅｔ変異体とした活性体を伴って）によって合成した。表面プラズモン共鳴によってこれらの各々のＮＴＣＰに対する結合定数を評価した（表２及び図７）。３つのペプチドが１００ｎＭより大きいＫＤ値でより弱い結合を示したことに対して、いくつかのペプチド（ＮＴＣＰ−Ｄ２、Ｄ３、Ｌ１、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５及びＬ６）は４〜５０ｎＭの解離定数（ＫＤ）で強い結合を示した。【００６６】
次いで、本発明者らは、初代ヒト肝細胞におけるＨＢＶ感染に対する上記の１０種のペプチドの効果を評価した。これらのアッセイでは、細胞をペプチドで前処理を２時間行い、次いでペプチド存在下でＨＢＶを１６時間接種した後、洗浄し、ペプチドの非存在下でさらに１２日間細胞を培養した（図２（ａ））。ＨＢＶ感染は、培養上清中のＨＢｓ抗原を測定することによって評価した。ＮＴＣＰに結合することによりＨＢＶの侵入を阻害する天然型環状ペプチドであるＣｓＡを陽性対照として用いた（図２（ｂ））。すべての場合において、１００μＭでの各ペプチドの処理は、顕著な細胞傷害作用を伴わず、ＨＢｓ抗原レベル（図２（ｂ））を有意に減少させた（図２（ｃ））。このことは、新たに発見されたチオエーテル−マクロサイクルを含む全てのペプチドが、抗ＨＢＶ活性を有していることを示している。【００６７】
集束したライブラリーＲａＰＩＤ選択
スクリーニング及び活性の検証の最初のラウンドからのペプチド配列の検査で、本発明者らはＨＢＶ感染性アッセイ中の最も活性なペプチドのうちの２つＮＴＣＰ−Ｄ２及びＤ４がＰＸ（Ｉ／Ｌ）Ｈ（Ｉ（Ｔ／Ｉ）Ｗ（Ｔ／Ｉ）Ｗモチーフ（以下「Ｗモチーフ」という。）を含み、他の３つのＮＴＣＰ−Ｌ１、Ｌ４及びＤ１が、（Ｔ／Ｌ）Ｗ（Ｔ／Ｉ）Ｐモチーフ（以下「Ｐモチーフ」という。）を含むことを確認した。この観察に基づいて、Ｐ又はＷモチーフに基づいて４つの集束したペプチドライブラリー（２つのＬ−ＣｌＡｃ−Ｔｙｒ開始及び２つのＤ−ＣｌＡｃ−Ｔｙｒ開始）を構築するためにＦＩＴ翻訳を使用した（図８）。これらのライブラリーは、Ｍｅｔ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ及びＡｒｇがＮ−メチル−Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ及びＰｈｅ、及びＮ−メチル−Ｏ−メチル−Ｔｙｒで置換されて再プログラミングされた遺伝暗号を用いて生成された。これらのライブラリーは、同定されたペプチドの「薬物類似性」（例えば、より良好なペプチダーゼ耐性及びオクタノール−水分配係数）を改善するために使用することができる。ＮＴＣＰをベイトとして使用するライブラリーでのＲａＰＩＤ選択の７回のラウンド後、選択の各ラウンドから得られたＤＮＡライブラリーを、ハイスループットシーケンサーを用いて分析した。最終ラウンドの選択から同定されたペプチド配列のアライメントは、４つのライブラリーの全てにおいて相同配列の強い富化を示した。これらから、化学合成及びその後の特徴付け（表２中のＷＤ１−４、ＷＬ１−６、ＰＤ１及びＰＬ１）のために、相対的濃縮及び配列多様性に基づいて、１２のペプチドを選択した。ＮＴＣＰに対するこれらのそれぞれの結合動力学を表面プラズモン共鳴（表２及び図９）によって評価し、大部分は１０〜１００ｎＭの範囲のＫＤ値を示した。【００６８】
次に、本発明者らは、目的のＷモチーフ及びＰモチーフを含む最初のＲａＰＩＤ選択由来のペプチドに加えて、集束したライブラリーＲａＰＩＤ選択から同定された１２個のペプチドの影響を、１０μＭの濃度で初代ヒト肝細胞のＨＢＶ感染を評価した（上記参照）。図３に示すように、集中スクリーニングによって同定された１２の環状ペプチドのうち１０個は、ＨＢＶ抗原を有意に減少させ、そのうち７つは初期スクリーニング中に同定されたペプチドよりも高い効力を示した。特に、ＷＤ１、ＷＬ２、及びＷＬ４ペプチドは、有意な細胞傷害効果を示さず（図３（ｂ））、ＨＢＶ抗原を最も顕著に減少させた（図３（ａ））。【００６９】
シクロスポリンＡより高い抗ＨＢＶ活性を有する環状ペプチド
３つのペプチドＷＤ１、ＷＬ２、及びＷＬ４の抗ＨＢＶ活性を評価するために、ヒトＮＴＣＰ遺伝子を過剰発現し、ＨＢＶ感染感受性ＨｅｐＧ２−ｈＮＴＣＰ−Ｃ４細胞を用いてＨＢＶ感染アッセイを、公知の方法（Iwamoto, M. et al. Evaluation and identification of hepatitis B virus entry inhibitors using HepG2 cells overexpressing a membrane transporter NTCP. Biochemical and biophysical research communications 443, 808-813 (2014).に記載の方法）で行った。ＨＢＶ接種後、ＨＢｓ抗原を培養上清中で測定し、ＨＢｃ抗原を細胞で評価して、図２（ａ）に示すようにＨＢＶ感染を確認した。このアッセイでは、ＣｓＡはＨＢｓ及びＨＢｃ抗原によってモニターされるＨＢＶ感染を減少させたが、ＨＢＶ複製阻害剤として知られるヌクレオシド類似体であるエンテカビルは有意な減少を示さなかった。ＷＤ１、ＷＬ２、及びＷＬ４での処置は、顕著に細胞毒性を示さず（図１（ａ））、細胞内のＨＢｃ（図１（ｂ））および上清中のＨＢｓレベルを低下させた（図１（ｃ））。特に、ＷＤ１、ＷＬ２及びＷＬ４ペプチドの抗ＨＢＶ効果は、最初のスクリーニングから得られたＤ１及びＤ２の抗ＨＢＶ効果よりも高かった。【００７０】
より生理的な条件で抗ＨＢＶ活性を評価するために、初代ヒト肝細胞を用いてＨＢＶ感染アッセイを行い、接種材料として精製ＨＢＶを使用した（上記＜材料及び方法＞参照）。各ペプチドによる処理は、培養上清中のＨＢｓ抗原レベルを用量依存的に減少させた（図１（ｄ））。このアッセイにおけるＷＤ１、ＷＬ２、ＷＬ４及びＣｓＡの50%阻害濃度（ＩＣ50）はそれぞれ０．８５±０．０１，２．５４±０．１１，０．６６±０．０３及び３．１７±０．３０μＭと算出された。これは、この実験で発見されたチオエーテル−マクロサイクルがＣｓＡよりも最大約５倍程度高い抗ＨＢＶ効果を有することを示している。【００７１】
ＮＴＣＰトランスポーター機能に影響しないＨＢＶ細胞吸着の阻害
本発明者らは次に、ＷＤ１、ＷＬ２及びＷＬ４環状ペプチドで観察された抗ＨＢＶ効果が、細胞へのウイルス侵入の阻害によるものであるかどうかを確認した。ＨＢＶ生活環は、吸着、侵入、核内移行、及び共有結合した環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）形成を含む感染の初期段階、さらに後期段階である転写、キャプシド形成、逆転写、エンベロープ獲得、ウイルス放出を含むＨＢＶ複製過程から成る（図１０、Watashi, K. et al. Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP). Hepatology 59, 1726-1737 (2014).及びLocarnini, S. & Zoulim, F. Molecular genetics of HBV infection. Antiviral therapy 15 Suppl 3, 3-14 (2010).）。ペプチドのＨＢＶ生活環後期段階に及ぼす効果を調べるために、テトラサイクリンの非存在下でＨＢＶ複製を再現するが、ＮＴＣＰ発現欠如のため感染初期段階は起こらないＨｅｐ３８．７−Ｔｅｔ細胞を使用した。ペプチドの存在下又は非存在下で、テトラサイクリン除去後の細胞内ＨＢＶ  ＤＮＡを６日間定量することによって、ＨＢＶ複製を評価した。これらの条件下で、ポジティブコントロールとして使用したヌクレオシド類似体であるエンテカビルと異なり、３つの環状ペプチドはＨＢＶ  ＤＮＡレベルにほとんど効果を示さなかった（図１０（ａ））。【００７２】
次に、宿主細胞へのウイルス吸着を調べた。ＨＢＶ−Ｌ表面抗原のｐｒｅＳ１領域は、ウイルス−宿主の吸着及びそれ以降の侵入過程に必須である（Barrera, A., Guerra, B., Notvall, L. & Lanford, R.E. Mapping of the hepatitis B virus pre-S1 domain involved in receptor recognition. Journal of virology 79, 9786-9798 (2005).、Glebe, D. et al. Mapping of the hepatitis B virus attachment site by use of infection-inhibiting preS1 lipopeptides and tupaia hepatocytes. Gastroenterology 129, 234-245 (2005).、Gripon, P., Cannie, I. & Urban, S. Efficient inhibition of hepatitis B virus infection by acylated peptides derived from the large viral surface protein. Journal of virology 79, 1613-1622 (2005).、Yan, H. et al. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus. eLife 1, e00049 (2012).、及びLe Seyec, J., Chouteau, P., Cannie, I., Guguen-Guillouzo, C. & Gripon, P. Infection process of the hepatitis B virus depends on the presence of a defined sequence in the pre-S1 domain. Journal of virology 73, 2052-2057 (1999).）。ｐｒｅＳ１の宿主細胞への吸着を評価するために蛍光標識したｐｒｅＳ１ペプチド（ｐｒｅＳ１プローブ）を用いて、ＷＤ１、ＷＬ２、及びＷＬ４での処理が用量依存的に細胞への標識ｐｒｅＳ１の吸着を減少させるかどうかを観察した。これは、ポジティブコントロールとして使用したＣｓＡの効果に匹敵した（図１０（ｃ）：定量データ及び図１０（ｄ）：画像）。つまり、Ｈｅｐ３８．７−Ｔｅｔアッセイ及びｐｒｅＳ１結合アッセイの結果は、ＷＤ１、ＷＬ２、及びＷＬ４がＮＴＣＰへの結合を介して宿主細胞へのｐｒｅＳ１によるＨＢＶ吸着を阻害することを強く裏付ける結果である。【００７３】
ＮＴＣＰの内因性機能にはナトリウム依存性胆汁酸取り込みが関与しており（Anwer, M.S. & Stieger, B. Sodium-dependent bile salt transporters of the SLC10A transporter family: more than solute transporters. Pflugers Archiv : European journal of physiology 466, 77-89 (2014).及びHagenbuch, B., Stieger, B., Foguet, M., Lubbert, H. & Meier, P.J. Functional expression cloning and characterization of the hepatocyte Na+/bile acid cotransport system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 88, 10629-10633 (1991).）、上述のＨＢＶ侵入阻害剤はこの活性を阻害することが示されている（Konig, A. et al. Kinetics of the bile acid transporter and hepatitis B virus receptor Na+/taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) in hepatocytes. Journal of hepatology 61, 867-875 (2014).、Ni, Y. et al. Hepatitis B and D viruses exploit sodium taurocholate co-transporting polypeptide for species-specific entry into hepatocytes. Gastroenterology 146, 1070-1083 (2014).、Watashi, K. et al. Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP). Hepatology 59, 1726-1737 (2014).、Yan, H. et al. Viral entry of hepatitis B and D viruses and bile salts transportation share common molecular determinants on sodium taurocholate cotransporting polypeptide. Journal of virology 88, 3273-3284 (2014).、Nkongolo, S. et al. Cyclosporin A inhibits hepatitis B and hepatitis D virus entry by cyclophilin-independent interference with the NTCP receptor. Journal of hepatology 60, 723-731 (2014).、 Shimura, S. et al. Cyclosporin derivatives inhibit hepatitis B virus entry without interfering with NTCP transporter activity. Journal of hepatology 66, 685-692 (2017).及びKaneko, M. et al. A Novel Tricyclic Polyketide, Vanitaracin A, Specifically Inhibits the Entry of Hepatitis B and D Viruses by Targeting Sodium Taurocholate Cotransporting Polypeptide. Journal of virology 89, 11945-11953 (2015).）。しかしながら、ＷＤ１、ＷＬ２、及びＷＬ４の存在下又は非存在下で基質として［3Ｈ］−タウロコール酸（ＴＣＡ）を使用してＨｅｐＧ２−ｈＮＴＣＰ−Ｃ４細胞におけるＮＴＣＰトランスポーター活性を評価すると、ペプチド濃度３０μＭ（これはほぼ水性媒体中での溶解度であった）でさえ観察されたにもかかわらず、ＮＴＣＰトランスポーター活性の有意な阻害は観察されなかった（図４（ａ））。対照的に、ＣｓＡは、３つの環状ペプチドよりも抗ＨＢＶ活性が低いにもかかわらず、この濃度の１０分の１であってもＮＴＣＰによるＴＣＡ取り込みを強く阻害した。したがって、ＷＤ１、ＷＬ２及びＷＬ４は、胆汁酸取り込みに影響を及ぼさずにＨＢＶ侵入を特異的に阻害し、ＮＴＣＰのウ・BR>Cルス受容体機能がその胆汁酸輸送体機能とは独立して創薬標的となり得ることが実証された。【００７４】
ウイルス侵入阻害は、ＮＴＣＰ依存性で様々な遺伝子型に広く作用する。
次に、さまざまなＨＢＶ株及び関連するＨＤＶに対するＷＤ１、ＷＬ２、及びＷＬ４の効果を評価した。図４（ｂ）及び図４（ｃ）に示すように、３つのペプチドは、ＨＤＶ（ＨＢＶのように、ＮＴＣＰ依存性に細胞侵入する）の感染を有意に阻害し、ＨＣＶ（ＮＴＣＰ非依存的に細胞に侵入する）の感染には影響を与えなかった（Yan, H. et al. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus. eLife 1, e00049 (2012).）。結論として、これらのペプチドはＮＴＣＰ依存的なウイルス感染を阻害することがわかった。これらのペプチドの臨床応用の可能性を評価するために、様々な異なるＨＢＶ単離株について、最も強力な２つのペプチドであるＷＤ１及びＷＬ４の抗ＨＢＶ効果を調べた。これまで観察されていたＨＢＶ遺伝子型Ｄに対する抗ウイルス効果（図１）に加えて、ＷＤ１及びＷＬ４は試験したすべてのＨＢＶ遺伝子型（遺伝子型Ａ、Ｂ及びＣ）に対して有効であった（図４（ｄ））。さらに、これらは、ヌクレオシド類似体に耐性のあるＬ１８０Ｍ／Ｓ２０２Ｇ／Ｍ２０４Ｖ変異を保有するＨＢＶ分離株及びワクチン逃避Ｇ１４５Ｒ置換を持つＨＢＶ分離株の感染も有意に阻害していた。したがって、本検証において同定されたチオエーテル−環状ペプチドが、臨床的に問題となる様々なＨＢＶ株に対して広く活性を持つと結論付けた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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