(57)【要約】外来物質及び細胞を含有する溶液（液滴）を油中で往復運動させることでエレクトロポレーションを行う装置に比べ、反応後の試料を回収する操作を簡単にした電気穿孔装置及び外来物質導入細胞の製造方法を提供すること。電気穿孔装置（１）は、保持部（２）、放電発生部（３）、導電部（４）、及び電力量制御部（５）を備える。保持部（２）は、外来物質及び細胞を含有する溶液を保持する。放電発生部（３）は、所定間隔で配置された一対の電極を有し、一対の電極間にアーク放電を発生させる。導電部（４）は、保持部（２）と、放電発生部（３）とを電気的に接続し、放電発生部（３）にて発生されたパルス電流を保持部（２）に供給する。電力量制御部（５）は、保持部（２）に供給されるパルス電流の電力量を制御する。
2020130106.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
外来物質及び細胞を含有する溶液を保持する保持部と、
所定間隔で配置された一対の電極を有し、前記一対の電極間にアーク放電を発生させる放電発生部と、
前記保持部と、前記放電発生部とを電気的に接続し、前記放電発生部にて発生された前記アーク放電によるパルス電流を前記保持部に供給する導電部と、
前記保持部に供給される前記パルス電流の電力量を制御する電力量制御部と
を備えることを特徴とする電気穿孔装置。
【請求項２】
前記電力量制御部は、電源部と、前記放電発生部とに電気的に接続され、前記電源部によって電圧が印加されることで蓄電し、蓄電された電荷を前記放電発生部に放出するコンデンサと
を備えることを特徴とする請求項１に記載の電気穿孔装置。
【請求項３】
前記放電発生部は、電源部と電気的に接続され、
前記電力量制御部は、前記保持部と電気的に接続され、前記保持部に供給された前記パルス電流を蓄電するコンデンサを備えることを特徴とする請求項１に記載の電気穿孔装置。
【請求項４】
３ｋＶ以上の直流高電圧を供給可能な前記電源部を更に備えることを特徴とする請求項２又は３に記載の電気穿孔装置。
【請求項５】
前記放電発生部は前記所定間隔を変更可能であることを特徴とする請求項１から４の何れかに記載の電気穿孔装置。
【請求項６】
前記放電発生部の前記一対の電極は、先端が球状に形成されることを特徴とする請求項１から５の何れかに記載の電気穿孔装置。
【請求項７】
前記電力量制御部は、前記放電発生部に生じる暗流を制御する暗流制御部を更に備えることを特徴とする請求項１から６の何れかに記載の電気穿孔装置。
【請求項８】
所定のインターバルで周期的に前記放電発生部に電圧を印加する周期調整部を更に備えることを特徴とする請求項１から７の何れかに記載の電気穿孔装置。
【請求項９】
前記電力量制御部は、前記保持部及び前記コンデンサと並列に接続されたインダクタを備えることを特徴とする請求項３に記載の電気穿孔装置。
【請求項１０】
前記電力量制御部は、前記保持部と並列に接続され、前記コンデンサから放電された電流が流れる方向を順方向とするダイオードを備えることを特徴とする請求項９に記載の電気穿孔装置。
【請求項１１】
外来物質及び細胞を含有する溶液を、請求項１から１０の何れかの電気穿孔装置の保持部に保持させる保持工程と、
アーク放電にてパルス電流を発生させ、発生された前記パルス電流を前記保持部に供給する供給工程と、
前記供給工程を経た前記溶液を、前記保持部から回収する回収工程とを備えることを特徴とする外来物質導入細胞の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞懸濁液に含まれる細胞に外来物質を電気穿孔にて導入可能な電気穿孔装置及び外来物質が導入された外来物質導入細胞の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
絶縁性油中の液滴内でエレクトロポレーションを行う電気穿孔装置が研究されている（例えば、特許文献１参照）。エレクトロポレーションは、ＤＮＡ及びＲＮＡ等の核酸分子、タンパク質等の生体物質、並びに薬剤の有効成分となる化合物等を外来物質として、外来物質を標的細胞内に導入する方法の１つである。一般的なエレクトロポレーションでは、高電圧の特殊パルスジェネレーターにより標的細胞に高電圧のパルス状の電流が与えられ、細胞膜に外来物質が通過できる小孔を一過性に作って外来物質を標的細胞に取り込ませる。特許文献１に記載の装置は、絶縁性油中の液滴が電極間を往復運動する際に電極に接触することで、従来の電気穿孔装置よりも低い電力量のパルス電流を標的細胞に与え、エレクトロポレーションを行う。特許文献１に記載の装置は、標的細胞の試料量を従来の電気穿孔装置よりも少なくでき、標的細胞の生存率を従来の電気穿孔装置よりも向上できると報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第６２６９９６８号公報
【発明の概要】
【０００４】
従来の油中の液滴内でエレクトロポレーションを行う装置では、反応後の試料を油から回収する操作が煩雑である。
【０００５】
本発明の目的は、外来物質及び細胞を含有する溶液（液滴）を油中で往復運動させることでエレクトロポレーションを行う装置に比べ、反応後の試料を回収する操作を簡単にした電気穿孔装置及び外来物質導入細胞の製造方法を提供することを目的とする。
【０００６】
本発明の第一態様に係る電気穿孔装置は、外来物質及び細胞を含有する溶液を保持する保持部と、所定間隔で配置された一対の電極を有し、前記一対の電極間にアーク放電を発生させる放電発生部と、前記保持部と、前記放電発生部とを電気的に接続し、前記放電発生部にて発生された前記アーク放電によるパルス電流を前記保持部に供給する導電部と、前記保持部に供給される前記パルス電流の電力量を制御する電力量制御部とを備える。
【０００７】
第一態様の電気穿孔装置は、外来物質及び細胞を含有する溶液（液滴）を油中で往復運動させることなく、短時間のパルス状の高電圧電流を溶液に付与できる。したがって該電気穿孔装置は、油から試料を回収する必要が無く、油中の液滴内でエレクトロポレーションを行う装置に比べ、反応後の試料を回収する操作を簡単にできる。
【０００８】
第一態様に係る電気穿孔装置の前記電力量制御部は、電源部と、前記放電発生部とに電気的に接続され、前記電源部によって電圧が印加されることで蓄電し、蓄電された電荷を前記放電発生部に放出するコンデンサを備えてもよい。該電気穿孔装置は、保持部に供給されるパルス電流の電力量をコンデンサの静電容量により規定できる。
【０００９】
第一態様に係る電気穿孔装置の前記放電発生部は、電源部と電気的に接続され、前記電力量制御部は、前記保持部と電気的に接続され、前記保持部に供給された前記パルス電流を蓄電するコンデンサを備えてもよい。該電気穿孔装置は、保持部に供給されるパルス電流の電力量をコンデンサの静電容量により規定できる。
【００１０】
第一態様に係る電気穿孔装置は、３ｋＶ以上の直流高電圧を供給可能な前記電源部を更に備えてもよい。該電気穿孔装置は、電源部を別途準備する必要が無い。
【００１１】
第一態様に係る電気穿孔装置の前記放電発生部は前記所定間隔を変更可能であってもよい。該電気穿孔装置は保持部に供給するパルス電流の大きさ等の条件を簡単に変更できる。故に該電気穿孔装置では、試料に適した反応条件の設定が容易である。
【００１２】
第一態様に係る電気穿孔装置の前記放電発生部の前記一対の電極は、先端が球状に形成されてもよい。該電気穿孔装置は他の形状の電極を有する場合に比べ、放電発生部に安定してアーク放電を生じさせることができる。
【００１３】
第一態様に係る電気穿孔装置の前記電力量制御部は、前記放電発生部に生じる暗流を制御する暗流制御部を更に備えてもよい。該電気穿孔装置は放電発生部に暗流が生じる場合であっても、安定して放電発生部にアーク放電を生じさせることができる。
【００１４】
第一態様に係る電気穿孔装置は、所定のインターバルで周期的に前記放電発生部に電圧を印加する周期調整部を更に備えてもよい。該電気穿孔装置はインターバルの長さ及び繰り返し回数の条件を簡単に変更できる。故に該電気穿孔装置では、試料に適した反応条件の設定が容易である。
【００１５】
第一態様に係る電気穿孔装置において、前記電力量制御部は、前記保持部及び前記コンデンサと並列に接続されたインダクタを備えてもよい。この場合の電気穿孔装置は、インダクタの作用により保持部を介して標的細胞に正逆双方向の電圧を印加できる。
【００１６】
第一態様に係る電気穿孔装置において、前記電力量制御部は、前記保持部と並列に接続され、前記コンデンサから放電された電流が流れる方向を順方向とするダイオードを備えてもよい。この場合の電気穿孔装置は、保持部に印加されるパルス電流の波形を、ダイオードの整流作用により減衰振動波のパルス電流の内のマイナス電荷部分が削除された波形にすることができる。
【００１７】
第二態様に係る外来物質導入細胞の製造方法は、外来物質及び細胞を含有する溶液を、第一態様の電気穿孔装置の保持部に保持させる保持工程と、アーク放電にてパルス電流を発生させ、発生された前記パルス電流を前記保持部に供給する供給工程と、前記供給工程を経た前記溶液を、前記保持部から回収する回収工程とを備える。第二態様に係る外来物質導入細胞の製造方法によれば、第一態様の電気穿孔装置と同様の効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】電気穿孔装置１の概念図である。
【図２】電気穿孔装置１の回路の一例を示す図である。
【図３】電気穿孔装置１の回路の一例を示す図である。
【図４】電気穿孔装置１０の概念図である。
【図５】電気穿孔装置１０の回路の一例を示す図である。
【図６】電気穿孔装置１０の回路の一例を示す図である。
【図７】電気穿孔装置１０の回路の一例を示す図である。
【図８】電気穿孔装置１０の回路の一例を示す図である。
【図９】実施例１の電気穿孔装置１の保持部２、放電発生部３、及び導電部４の模式図である。
【図１０】組み立て前の実施例１の電気穿孔装置１の保持部２、放電発生部３、及び導電部４との写真である。
【図１１】組み立て後の実施例１の電気穿孔装置１の保持部２及び放電発生部３の写真である。
【図１２】組み立て後の実施例１の電気穿孔装置１の写真である。
【図１３】実施例１の電気穿孔装置１により、条件１〜３で蛍光蛋白コード遺伝子を導入した７日後の観察画像であって、明視野における顕微鏡観察画像（観察倍率、対物レンズ２０倍）、蛍光視野における蛍光画像（観察倍率２０倍）、及び明視野の画像と蛍光視野の蛍光画像とを重ね合わせた重ね合わせ画像を示す図である。
【図１４】実施例２の電気穿孔装置１の保持部２、放電発生部３、及び導電部４の模式図である。
【図１５】組み立て後の実施例２の電気穿孔装置１の保持部２及び放電発生部３の写真である。
【図１６】実施例２の電気穿孔装置１を用いて遺伝子導入操作された標的細胞（条件４）の導入操作の翌日の蛍光観察結果と、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００試薬を用いて遺伝子導入操作された標的細胞（ポジティブコントロール）の蛍光観察結果とを示す図である。
【図１７】変形例の電気穿孔装置１の保持部２、放電発生部３、及び導電部４の模式図である。
【図１８】変形例の電気穿孔装置１の保持部２、放電発生部３７、及び導電部４の模式図である。
【図１９】組み立て後の実施例３の電気穿孔装置１０の写真である。
【図２０】実施例３の電気穿孔装置１０により、条件６〜８の各々で蛍光蛋白コード遺伝子を導入した操作から４日後の観察画像であって、明視野における顕微鏡観察画像（観察倍率２０倍）、及び蛍光視野における蛍光画像（観察倍率２０倍）を示す図である。
【図２１】実施例３の電気穿孔装置１０により、条件９〜１１の各々で蛍光蛋白コード遺伝子を導入した操作から９日後の観察画像であって、明視野における顕微鏡観察画像（観察倍率２０倍）、及び蛍光視野における蛍光画像（観察倍率２０倍）を示す図である。
【図２２】組み立て後の実施例４の電気穿孔装置１０の写真である。
【図２３】実施例４の電気穿孔装置１０の保持部２の模式図である。
【図２４】実施例４の電気穿孔装置１０により、条件１２、１３の各々で蛍光蛋白コード遺伝子を導入した操作から１日後、３日後、１３日後の観察画像であって、明視野における顕微鏡観察画像（観察倍率２０倍）、及び蛍光視野における蛍光画像（観察倍率２０倍）を示す図である。
【図２５】比較例と実施例５の電気穿孔装置１０との各々で蛍光蛋白コード遺伝子を導入した操作から２日後の観察画像であって、明視野における顕微鏡観察画像（観察倍率２０倍）、及び蛍光視野における蛍光画像（観察倍率２０倍）を示す図である。
【図２６】比較例と、実施例５の電気穿孔装置１０と、ネガティブコントロールとの各々で蛍光蛋白コード遺伝子を導入した操作から２日後の観察画像であって、明視野における顕微鏡観察画像に基づき、全細胞に対する死んでいる細胞の数である細胞の死亡率を比較した結果を示すグラフである。
【図２７】実施例６の電気穿孔装置１０により、ネガティブコントロール、条件１４、１５の各々で、血液のリンパＴ細胞に、山中因子遺伝子、及び山中因子遺伝子が細胞に導入され、未分化になると緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）が発現するＥＯＳ−ＥＧＦＰベクターを導入した操作から１６日後の観察画像であって、明視野における顕微鏡観察画像（観察倍率２０倍）、及び蛍光視野における蛍光画像（観察倍率２０倍）を示す図である。
【図２８】実施例７の電気穿孔装置１０により、条件１６〜１８の各々で蛍光蛋白コード遺伝子を導入した操作から２日後の観察画像から作成した画像であって、明視野における顕微鏡観察画像（観察倍率２０倍）と、ＧＦＰ及びＲＦＰの蛍光視野における蛍光画像（観察倍率２０倍）を重ね合わせた重ね合わせ画像である。
【図２９】実施例８の電気穿孔装置１０により、条件１９及び条件２０の各々で蛍光蛋白コード遺伝子を導入した操作から１日後及び５日後の、明視野における顕微鏡観察画像（観察倍率２０倍）と、ＧＦＰの蛍光視野における蛍光画像（観察倍率２０倍）である。
【図３０】組み立て後の変形例の電気穿孔装置１０の写真である。
【図３１】変形例の電気穿孔装置１０の保持部２の模式図である。
【図３２】組み立て後の変形例の電気穿孔装置１０の写真である。
【図３３】変形例の電気穿孔装置１０を模式図である。
【図３４】外来物質導入細胞の製造工程のフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
１．電気穿孔装置１、１０
以下、本発明の好ましい実施の形態について、図面を参照して説明する。図１〜図８を参照して、本発明の電気穿孔装置１、１０について説明する。電気穿孔装置１、１０（以下、装置１、１０ともいう。）は、標的細胞内に目的の外来物質を電気的作用によって導入するよう構成された装置である。標的細胞は、外来物質を導入する対象となる細胞である。装置１、１０では、プログラムに従って矩形状のパルス電流を出力する機能を備えた高価なパルスジェネレーターは不要である。装置１、１０は、１回の処理に必要な試料の容量（標的細胞数及び外来物質量）を極めて低用量化できるよう構成されている。
【００２０】
図１〜図８に示すように、装置１、１０は各々、保持部２、放電発生部３、導電部４、電力量制御部５、及び電源部６を備える。保持部２は、外来物質及び細胞を含有する溶液（例えば、細胞懸濁液）を保持する。溶液は外来物質及び標的細胞を水系の溶液に懸濁した液体である。外来物質としては、既存の電気穿孔法で標的細胞に導入できる物質が含まれ、例えば、通常の状態では標的細胞の細胞膜を透過できない各種生理活性物質、薬剤、治療薬、核酸物質、ペプチド、及びタンパク質等が例示される。核酸物質は、例えば、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ及びガイド  ＲＮＡを含む）、ウイルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、オリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー）、及びペプチド核酸であってよい。ＤＮＡとしては、標的細胞内に導入したい核酸配列を備えたＤＮＡが適宜選択され、例えば、遺伝子の全長配列（ｃＤＮＡ配列、ゲノム配列）、部分配列、調節領域、スペーサー領域、及び変異を加えた配列等、目的に応じて設計されたＤＮＡが用いられる。ＤＮＡにコードされたポリペプチドは、該ＤＮＡが導入された標的細胞によって産生され得る。溶液に含有させる外来物質の量は、従来の電気穿孔法を実施可能な量であればよい。細胞懸濁液中の外来物質の濃度は、標的細胞の生存率と外来物質の導入効率との観点から好適には０．０５〜３（μｇ／μＬ）であり、更に好適には０．２〜３（μｇ／μＬ）であり、外来物質に応じて適宜調整される。溶液中に含まれる外来物質は１種類に限られず、溶液中に複数種類の外来物質が含まれてもよい。
【００２１】
標的細胞の種類は、特に制限されず、標的細胞として各種細胞を用いることができる。標的細胞として、例えば、植物細胞、ヒト由来細胞を含む動物細胞、及びバクテリア等が例示できる。装置１、１０は、従来の電気穿孔法にて外来物質を導入できる細胞に外来物質を導入可能である。従来の電気穿孔法にて外来物質を導入できる細胞としては、例えば、ヒト由来及びヒト以外の動物由来の体細胞、胚細胞（ＥＳ細胞）、受精卵、動物胎児組織細胞等の組織細胞、及び臓器細胞が例示される。処理に必要な標的細胞の数は、保持部２に保持させる溶液中に含まれる数だけあれば十分であり、例えば、溶液の体積が２〜５（μＬ）である場合、標的細胞の数は１×１０３〜１０５（ｃｅｌｌｓ）あればよい。
【００２２】
溶液は、水系の溶液であり、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、以下単に「ＰＢＳ緩衝液」と略す）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）等の通常の電気穿孔法で用いることのできるバッファー、及び通常の緩衝液である。溶液は、標的細胞に応じて適宜調整されればよい。標的細胞が動物細胞である場合、溶液として、動物細胞の培養に使用できる液体培地（例えば、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地、α−ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地、Ｗｉｌｌｉａｍｓ培地、ＥＳ培地等）を用いることができる。これらの液体培地は、血清濃度が低い方が血清濃度が高い場合に比べ導入効率の点で好ましく、特には無血清培地であることが望ましい。一般には、抗生物質を含まない液体培地の方が溶液として好ましい。装置１による外来物質を導入する処理の後は、液体培地に血清又は抗生物質が自由に添加されてよい。導入効率及び細胞への影響の観点からは、溶液として、ＰＢＳ緩衝液が用いられることが好ましい。溶液ｐＨは、細胞への影響を考慮して調製されるのが好ましく、例えば、ｐＨ７．０〜７．６に調製されるのが好ましい。
【００２３】
保持部２は、導電部４を介して放電発生部３と電気的に接続された一対の電極２１、２２とを備え、一対の電極２１、２２の間に溶液を保持するよう構成されてもよい。保持部２は、容器２３と、導電部４を介して放電発生部３と電気的に接続された一対の電極２１、２２とを備え、一対の電極２１、２２の間に溶液を保持するよう構成されてもよい。容器２３は、プラスチック、ガラス、及びセラミックス等の絶縁性の素材で形成され、溶液を収容する。保持部２の形状は、溶液を保持できる形状であれば、如何なる形状であってもよい。保持部２の容器形状は、例えば、円柱状、四角柱状、多角柱状、及び半球状等であってもよい。保持部２の大きさは、保持部２が保持する溶液の体積に応じて設定される。保持部２の体積は、例えば、溶液の体積の０．３〜５０倍の体積を有し、好ましくは、溶液の体積の０．５〜２０倍の体積を有し、更に好ましくは、溶液の体積の０．８〜１０倍の体積を有する。溶液の体積は、例えば、０．１（μＬ）〜１（ｍＬ）である。溶液の体積は、液滴を形成可能な量であってもよく、例えば、０．１〜５０（μＬ）の中から選択され、好ましくは、０．５〜１０（μＬ）の範囲であり、更に好ましくは１．０〜５．０（μＬ）の範囲である。溶液が保持部２によって保持されている状態で、容器２３の上端は溶液の上端よりも上に設定されることが望ましい。一対の電極２１、２２は、適度な間隔をあけて溶液に接触可能に配置されるのが望ましく、一対の電極２１、２２の間隔は例えば、０．２〜１０（ｍｍ）であり、好ましくは、０．３〜５．０（ｍｍ）であり、更に好ましくは、０．５〜２．０（ｍｍ）から選択される。一対の電極２１、２２の形状は適宜設定されればよく、例えば、棒状、板状、及び先端が半球状等であってもよい。一対の電極２１、２２の容器２３に対する配置は適宜設定されればよく、一対の電極２１、２２は各々容器２３の底面に対して交差する方向に延びる壁部に沿って配置されてもよい。一対の電極２１、２２は、容器２３の開口から底部まで延設されてもよいし、一対の電極２１、２２は、容器２３の底部から離間していてもよい。一対の電極２１、２２の厚みは適宜設定されればよく、例えば、０．１〜１０（ｍｍ）であり、好ましくは、０．２〜５．０（ｍｍ）であり、更に好ましくは、０．５〜２．０（ｍｍ）から選択される。一対の電極２１、２２の材料は、導電性を有する材料であればよく、例えば、アルミニウム、銅等の炭素よりも導電性の優れた金属が例示される。
【００２４】
溶液が比較的少量（例えば、１．０（μＬ））である場合、保持部２に保持された溶液に、放電発生部３にて発生されたアーク放電によるパルス電流が印加された場合に、溶液が蒸発する可能性がある。これを考慮し保持部２は、溶液の蒸発を防ぐため、溶液を外気から隔離するための油（オイル）で覆うための油槽を備えてもよい。油槽は、絶縁性の材料で形成され、溶液を覆う油を貯留可能な構成であればよい。油槽に貯留される油は、水と相分離し、溶液（水）よりも疎水性の物質であって、常温近傍で液体であり、絶縁性の性質を具有することが好ましい。油として、例えば、石油由来のアルカン類である鉱油、アルキルベンゼンを主成分とする絶縁油、ポリブテンを主成分とする絶縁油、アルキルナフタレンを主成分とする絶縁油、アルキルジフェニルアルカンを主成分とする絶縁油、及びシリコーンオイル等が例示される。油として、これらの油が１種又は複数種を混合して用いられてもよい。油は、絶縁性であり、且つ、溶液と混和しない疎水性液体であれば、これらの例示に限られない。油は、フッ素系不活性液体等の絶縁性不活性液体でもよい。本発明では、溶液は保持部２に保持され、容器２３の底部に沿った方向（水平方向）の移動が規制される。故に、保持部２が油槽を備える場合にも、保持部２に保持された溶液は容器２３中にあり、一対の電極２１、２２に電圧が印加されることで保持部２に保持された溶液が油槽中で移動することはない。一対の電極２１、２２、及び容器２３の少なくとも一部は、使用による劣化を考慮し、交換可能に設けられてもよい。
【００２５】
放電発生部３は、アーク放電にてパルス電流を発生し、発生されたパルス電流を、導電部４を介して、保持部２に供給するよう構成されている。放電発生部３は、所定間隔をあけて配置された一対の電極３１、３２を有する。所定間隔は、放電発生部３の設置環境、保持部２に供給するパルス電流の大きさ、インターバル、及び回数等を考慮して、適宜調整されればよく、例えば、０．２〜１５（ｍｍ）であり、好ましくは、０．３〜５．０（ｍｍ）であり、更に好ましくは、０．５〜２．０（ｍｍ）から選択される。一対の電極３１、３２の厚み（幅）は適宜設定されればよく、例えば、０．１〜１０（ｍｍ）であり、好ましくは、０．２〜５．０（ｍｍ）であり、更に好ましくは、０．５〜２．０（ｍｍ）から選択される。一対の電極３１、３２の間隔は変更可能でもよい。一対の電極３１、３２の距離が変更可能である場合、一対の電極３１、３２の内の少なくとも一方を他方に対してスライド可能にしてもよいし、電極３１、３２間の距離が互いに異なる電極対を複数用意し、複数の電極対の内の１つを螺子等で取り外し可能に固定してもよい。電極３１、３２の形状は適宜設定されればよく、先端が曲面状、球状、針状等であってもよい。一対の電極３１、３２の材料は、炭素よりも導電性の優れた材料であればよく、例えば、白金、金、アルミニウム、銅等の導電性金属が例示される。一対の電極３１、３２は、使用による劣化を考慮し、交換可能に設けられてもよい。
【００２６】
一対の電極３１、３２の周囲のイオン粒子により、一対の電極３１、３２間に暗流が生じる場合がある。放電発生部３にアーク放電が生じる条件は、暗流の影響を受けやすい。これを考慮し、装置１、１０の内の少なくとも放電発生部３が備える一対の電極３１、３２は、例えば、アルゴン等の希ガス中に配置されてもよい。
【００２７】
導電部４は、保持部２と、放電発生部３とを電気的に接続し、放電発生部３にて発生されたパルス電流を保持部２に供給する。導電部４は導電性を有する材料にて形成されればよく、例えば、アルミニウム、銅等の炭素よりも導電性の優れた金属で形成される。導電部４の幅、長さ、形状等は適宜設定されればよく、例えば、放電発生部３を形成する一対の電極３１、３２の所定間隔の５〜５００倍の長さである。導電部４は放電発生部３の電極３２と保持部２の電極２１と一体に形成されてもよい。
【００２８】
電力量制御部５は、保持部２に供給されるパルス電流の電力量を制御する。電力量制御部５は、コンデンサ５１を備える。図２及び図３に示すように、装置１のコンデンサ５１は、電源部６と、放電発生部３とに電気的に接続され、電源部６によって電圧が印加されることで蓄電し、蓄電された電荷を放電発生部３に放出する。装置１のコンデンサ５１は、電源部６に対して、放電発生部３及び保持部２と並列に接続される。図５に示すように、装置１０のコンデンサ５１は、保持部２と電気的に接続され、保持部２に供給されたパルス電流を蓄電する。装置１０のコンデンサ５１は、電源部６に対して、放電発生部３及び保持部２と直列に接続される。装置１、１０のコンデンサ５１の静電容量は各々、保持部２に供給されるパルス電流の電力量を規定する。したがって、コンデンサ５１の静電容量は、保持部２が保持する溶液に印加される静電容量を考慮して設定される。例えば、コンデンサ５１の静電容量はシリコーンオイル中の液滴３μＬが持つ静電容量の１．０〜５００倍に設定され、好ましくはコンデンサ５１の静電容量はシリコーンオイル中の液滴３μＬが持つ静電容量の１．２〜５．０倍に設定され、更に好ましくは、２．５〜３．５倍に設定される。
【００２９】
保持部２に保持された溶液に印加される静電容量は、例えば、式（１）を用いて計算できる。溶液が、体積Ｖが３．０（μＬ）であり、半径ｒの球状であると仮定した場合、溶液の静電容量Ｃは、式（１）から７．７６（ｐＦ）と算出できる。ただし真空の誘電率ε０を８．８５４×１０−１２とし、溶液の比誘電率εｓを７８とする。
Ｃ＝４πε０εｓｒ                                ・・・式（１）
＝４πε０εｓ  （（３Ｖ／４π））１／３
＝４×π×８．８５４×１０−１２×７８×（（（３×３×１０−６×１０−３）／４π））１／３
≒７．７６（ｐＦ）
溶液の体積Ｖが３．０（μＬ）である場合、コンデンサ５１の静電容量は、好ましくは９．３１〜３８．８（ｐＦ）に設定され、更に好ましくは１９．４〜２７．２（ｐＦ）に設定される。
【００３０】
図２、図５、及び図６に示すように、電力量制御部５は、更に暗流制御部５２を備えてもよい。暗流制御部５２は、電源部６より供給される電流を、空気中のイオン等の荷電物質を介して一対の電極３１、３２間に発生する暗流と、保持部２へ電力供給するためのコンデンサ５１を蓄電する電流との２つのみに制限することで、暗流による影響を抑制する。更に、暗流制御部５２は、コンデンサ５１を蓄電するための電流を制御することもできる。コンデンサ５１の蓄電が完了するまでの時間はコンデンサ５１に供給される電流に比例するため、暗流制御部５２により、コンデンサ５１に供給される電流を制御することで、暗流制御部５２を備える装置１、１０は、一対の電極３１、３２で発生するアーク放電のインターバルを調整可能である。図２に示す装置１の暗流制御部５２は、電源部６と放電発生部３との間に設ける。一方、図５に示す装置１０の暗流制御部５２は、保持部２に対し、コンデンサ５１と並列に接続される。図６に示す装置１０の暗流制御部５２は、放電発生部３に対し、コンデンサ５１と並列に接続される。
【００３１】
暗流制御部５２は例えば公知の電気抵抗である。電気抵抗Ｒの大きさは、式（２）から算出できる。ただし、電源部６が印加する電圧の大きさをＥ、コンデンサ５１の静電容量をＣ、暗流の大きさをＩｄとする。
Ｒ＝Ｅ／（Ｃ×ｄＶ／ｄｔ＋Ｉｄ）      ・・・式（２）
暗流制御部５２は、放電発生部３でアーク放電が発生するための最適な電気抵抗値を検討することを考慮し、可変抵抗器を備えてもよい。
【００３２】
図７に示すように、電力量制御部５は、放電発生部３に対し、逆起電力をかけるためのインダクタ（コイル）５３を、保持部２及びコンデンサ５１と並列に設けてもよい。放電発生部３において放電が生じる前は、インダクタ５３に流れる電流は理論上暗流の分の電流だけである。放電発生部３の一対の電極間の電圧が、放電発生部３の一対の電極距離（例えば１（ｍｍ））における空気の絶縁破壊電圧を超えると放電発生部３の一対の電極間で放電が生じ、放電発生部３の一対の電極が導通する。インダクタ５３は電流を一定に保とうとするので（レンツの法則）、インダクタ５３は放電発生部３に急激な電流変化が生じる場合、インダクタ５３には電流が流れないように作用する。故に、放電発生部３で放電が生じた直後はインダクタ５３へ電流が流れず、保持部２を介してコンデンサ５１へ電荷がチャージされる。コンデンサ５１へ電荷が蓄積されると、コンデンサ５１の両端電圧（コンデンサ５１に接続する２本の配線の間の電位差）がコンデンサ５１へ電荷が蓄積されていない場合に比べ高くなる。このため、コンデンサ５１に接続する配線のうち、保持部２に接続されている方の配線の電位と直流電源装置のプラス側の電位との差が小さくなり、放電発生部３での放電は停止する。インダクタ５３は電流変化を妨げる性質があるが、一定の時間（インダクタンスの時定数）が経過すると、インダクタ５３に電流が流れ始めるため、放電発生部３での放電が停止されると、コンデンサ５１の蓄積電荷はインダクタ５３を通じて放電される。この時の電流の向きは電源装置からの供給により印加される電圧とは逆向きであるため、保持部２に印加される電圧は逆方向になる。コンデンサ５１へ蓄積された電荷が放電されると、放電発生部３と保持部２との間の配線の電位が低下するため、放電発生部３の一対の電極間電圧は再度上昇する。
【００３３】
インダクタ５３のインダクタンス値は、コンデンサ５１が静電容量分の電荷を蓄積するまでインダクタ５３に電流が流れることを妨げること、及びコンデンサ５１に静電容量分の電荷が蓄積された後にインダクタ５３に電流が流れることの双方を考慮して設定される。つまり、インダクタ５３のインダクタンス値は、コンデンサ５１の充電と放電とが可能なインダクタンス値に設定される。インダクタ５３に発生する起電力は電流変化とインダクタンス値の積で表される。つまり、コイルに発生する起電力は式（３）で表される。
コイルに発生する起電力  ＝  インダクタンス値×（電流変化の大きさ／電流変化に要した時間）      ・・・式（３）
溶液中の標的細胞へ遺伝子等の外来物質を導入するために印加されるパルス電流のエネルギーは、装置１０のインダクタ５３のインダクタンス値を用いて調整できる可能性がある。
【００３４】
図８に示すように、電力量制御部５は、放電発生部３に対しインダクタ５３を、保持部２及びコンデンサ５１と並列に設け、且つ、ダイオード５４を保持部２と並列に設けてもよい。ダイオード５４は、コンデンサ５１から放電された電流が流れる方向を順方向とする。ダイオード５４の種類は適宜設定されればよく、超高速スイッチング及び高周波の整流に適したダイオードであることが好ましく、例えば、ショットキーバリアダイオードがダイオード５４として用いられる。図７に示す、ダイオード５４を備えない装置１０では、保持部２に印加されるパルス電流の波形は、減衰振動波状を示すのに対し、図８に示すダイオード５４を備える装置１０では、保持部２に印加されるパルス電流の波形は、ダイオード５４の作用により減衰振動波状のパルス電流の内のマイナス部分（コンデンサ５１からインダクタ５３へ流れる方向の電流部分）が削除された波形となる。
【００３５】
電源部６は、放電発生部３に電圧を印加するよう構成されている。電源部６は、放電発生部３にアーク放電を発生させることが可能な電圧を印加できればよく、例えば、３ｋＶ以上の直流高電圧電源である。電源部６の最大出力電圧は例えば、５ｋＶ以上であり、電源部６の最大出力電流は１．０ｍＡ以上である。図示しないが、電源部６は、電圧印加をオンとオフとに切り替えるためのスイッチと、供給される電圧を調整するためのダイヤルと、任意の時間をセットするためのタイマーとを備えてもよい。この場合装置１は、作業者により、供給される電圧がダイヤルによって設定され、タイマーに任意の時間がセットされると、スイッチがオンとなって電圧印加が開始され、タイマーにセットされた時間が終了するとスイッチがオフとなって電圧出力が停止するよう構成されてもよい。装置１、１０は各々、直流高電圧を放電発生部３に印加するための構成として、例えば、公知のインバータ回路（例えば、冷陰極管インバータ（ＣＣＦＬ回路））及び高電圧発生回路（例えば、コッククロフト・ウォルトン回路（ＣＣＷ回路））等を適宜組み合わせて用いてもよい。図８に示すように、電源部６は、コンデンサ６０を、放電発生部３及び保持部２に対し直列に設けてもよい。このようにした場合、電源部６は、コンデンサ６０の値によって放電発生部３での放電周期を変更できる。
【００３６】
電源部６から放電発生部３に印加される電圧の条件は適宜調整されてよい。装置１は、例えば、図３に例示する装置１のように所定のインターバルで周期的に放電発生部３に電圧を印加するための周期調整部９を更に備え、所定周期で放電発生部３に電圧を印加してもよい。所定周期は適宜設定されればよく、例えば、１５０〜３００（ｍｓ）の周期で、ＯＮ時間をＯＦＦ時間よりも短く設定してもよいし、ＯＮ時間をＯＦＦ時間の１／３０〜１／３程度に設定してもよい。所定周期で放電発生部３に電圧を印加する回数は、放電発生部３にてアーク放電によりパルス電流を発生させる回数と対応する。放電発生部３にてパルス電流を発生させる回数は、外来物質の導入効率と標的細胞の生存率との両立を考慮して適宜設定される。放電発生部３にてパルス電流を発生させる回数は、例えば、１〜５００回であり、好ましくは３〜２００回であり、更に好ましくは、５〜１００回である。
【００３７】
２．装置１を用いた外来物質導入細胞の製造方法
図３４に示すように、作業者は保持部２に外来物質及び細胞を含有する溶液を保持させる（保持工程、Ｓ１）。電源部６にて直流高電圧が電力量制御部５に印加されると、コンデンサ５１に蓄電される。コンデンサ５１の電圧が所定電圧に達するまで、放電発生部３の一対の電極３１、３２には電流が流れない。コンデンサ５１の電圧が所定電圧に達すると、コンデンサ５１は蓄電された電荷を放電発生部３に放出し、放電発生部３にアーク放電を生じさせる。アーク放電にて生じたパルス電流は、導電部４を介して、保持部２に供給される（供給工程、Ｓ２）。保持部２に供給されたパルス電流は保持部２の一対の電極２１、２２間を流れる。放電発生部３により所定回数アーク放電が発生された場合、処理を終了する。作業者は、保持部２に保持された溶液を回収する（回収工程、Ｓ３）。
【００３８】
３．装置１０を用いた外来物質導入細胞の製造方法
図３４に示すように、作業者は保持部２に外来物質及び細胞を含有する溶液を保持させる（保持工程、Ｓ１）。電源部６にて直流高電圧が放電発生部３に印加されると、コンデンサ５１の両端の電位差が所定値よりも大きい場合に、放電発生部３にアーク放電を生じさせる。アーク放電にて生じたパルス電流は、導電部４を介して、保持部２に供給される（供給工程、Ｓ２）。保持部２に供給されたパルス電流は保持部２の一対の電極２１、２２間を流れる。電力量制御部５のコンデンサ５１は保持部２に供給されたパルス電流を蓄電する。コンデンサ５１に蓄電された荷電がコンデンサ５１の静電容量に達すると、コンデンサ５１の両端の電位差が電源部６の供給電圧と等しくなり、放電発生部３でのアーク放電が停止する。よって、保持部２を介して流れることのできる電荷量は、保持部２に対して直列接続されたコンデンサ５１が蓄えることのできる電荷量だけとなる。放電発生部３のアーク放電が停止すると、電力量制御部５の暗流制御部５２を通してコンデンサ５１に蓄積された電荷が放電され、コンデンサ５１の両端電圧が低下し放電発生部３の電極３１、３２間の電位差が上昇する。再び放電発生部３の電極３１、３２間電位差が所定値より大きくなるとアーク放電が生じる。図７及び図８に示すように、装置１０がインダクタ５３を備える場合、保持部２及びコンデンサ５１に対し、並列接続されたインダクタ５３がコンデンサ５１に蓄積された電荷を放電する。インダクタ５３による放電時も、保持部２を介して流れる電流（保持部２に保持された溶液を通過する電荷量）はコンデンサ５１に蓄積された電荷量の分だけであるため、放電時の電力量制御もされる。放電発生部３により所定回数アーク放電が発生された場合、処理を終了する。作業者は、保持部２に保持された溶液を回収する（回収工程、Ｓ３）。
【００３９】
装置１、１０を用いた外来物質導入細胞の製造方法では、保持部２の一対の電極間に配置された液滴Ｗには、放電発生部３でアーク放電が生じた瞬間にパルス状の強電界が形成されると考えられる。液滴Ｗに形成された強電界の作用により、標的細胞の細胞膜に一過的に微小な孔が形成され、形成された孔から標的細胞に外来物質が導入されると推定される。アーク放電により発生されたパルス電流が保持部２に流れる時間は、従来のパルスジェネレーターで発生されるパルス電流のＯＮ時間に比べ、十分に小さい。より具体的には、装置１、１０は、従来のパルスジェネレーターでは発生させることが不可能なほど印加時間が短いパルス電流を発生できる。したがって、保持部２に保持された溶液中の標的細胞に印加される電力量は、従来の電気穿孔装置に比べ小さく、標的細胞に与えるダメージを小さくできると考えられる。
【００４０】
４．実施例１
図２、図９〜図１２に示す装置１を製作し、製作された装置１を用いて、外来物質導入細胞を製造した。図２に示すように、実施例１の装置１は、保持部２、放電発生部３、導電部４、電力量制御部５、及び電源部６を備える。保持部２は一対の電極２１、２２、及び容器２３を備える。放電発生部３は一対の電極３１、３２を備える。図９に示すように、一対の電極２１、２２、導電部４、及び一対の電極３１、３２は、厚みの１．０（ｍｍ）のアルミニウム板（Ａ１０００系、純アルミニウム系）を加工して製作された。一対の電極２１、２２は、鉛直方向に延びる矩形状に形成された。一対の電極３１、３２は、側面形状が向かい合う端部に向かって細い三角形状に形成された。図１０に示すように、厚さ５．０（ｍｍ）の絶縁性樹脂板（アクリル板）８に、一対の電極２１、２２、及び一対の電極３１、３２の形状、配置に合わせて鉛直方向に延びるスリットが形成された。図１１に示すように、形成されたスリットに一対の電極２１、２２、及び一対の電極３１、３２が配置された。スリットに配置された一対の電極２１、２２は、鉛直方向に延び、１．６（ｍｍ）の間隔Ｄ２をあけて配置された。一対の電極３１、３２は鉛直方向に延び、１．０（ｍｍ）の間隔Ｄ１をあけて配置された。電力量制御部５は、コンデンサ５１と、暗流制御部５２とを備える。コンデンサ５１の静電容量は２２（ｐＦ）とし、暗流制御部５２は４５（ＭΩ）の電気抵抗とした。電源部６は、３ｋＶ以上の直流高電圧電源を用いた。図１２に示すように、安全性に考慮し高電圧発生部品であるコンデンサ５１、暗流制御部５２、電源部６はプラスチックケースへ収納された。電極３１の端部１１と、電極２２の端部１２とに、プラスチックケースへ収納した部品が導電性のクリップで電気的に接続された。装置１は、全体として縦、横、高さが各々、１０（ｃｍ）、１０（ｃｍ）、１０（ｃｍ）程度の大きさであり、手のひらに載せることが可能であった。
【００４１】
溶液（細胞懸濁液）について、標的細胞はＨＥＫ２９３細胞とし、外来物質はフォルテッシモ・ルシフェラーゼ（ｆｆＬｕｃ）遺伝子とし、水系の溶液は培地ＯＰＴＩ−ＭＥＭ又はＰＢＳ緩衝液とした。ｆｆＬｕｃ遺伝子は、サイトメガロバイラス（ＣＭＶ）のプロモーター領域の下流に黄色蛍光タンパク質Ｖｅｎｕｓ（オワンクラゲ由来）と発光蛋白ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（蛍由来）の融合蛋白コード遺伝子を組み換え技術によって連結した組み換え配列を、プラスミドＤＮＡ上に持つ遺伝子である。この組み換え遺伝子を標的細胞に遺伝子導入することにより、標的細胞は蛍光シグナルを帯びる。
【００４２】
ＨＥＫ２９３細胞が直径１０（ｃｍ）のプラスチック製培養容器（培養ｄｉｓｈ）に１．５×１０５（ｃｅｌｌ／ｄｉｓｈ）の細胞密度でまかれ、高グルコースＤＭＥＭ培地で温度摂氏３７度、ＣＯ２濃度５％にてインキュベーター内で培養された。培養されたＨＥＫ２９３細胞はトリプシン処理により培養ｄｉｓｈからはがされ、ＨＥＫ２９３細胞の濃度を５×１０３（ｃｅｌｌ／μＬ）とし、ＨＥＫ２９３発現プラスミドＤＮＡの濃度を１１２（ｎｇ／  μＬ）とし、水系の溶液を培地ＯＰＴＩ−ＭＥＭ又はＰＢＳ緩衝液として細胞懸濁液が調製された。調製された細胞懸濁液で３（μＬ）の液滴Ｗが形成され、装置１０の一対の電極２１、２２、絶縁性樹脂板８で囲まれた容器２３に投入された。保持部２に保持された液滴Ｗが２０（ｃＳｔ）のシリコーンオイルにより外部から封止された条件（条件１）と、保持部２に保持された液滴Ｗがシリコーンオイルで封止されない条件（条件２、３）とが設定された。
【００４３】
保持部２に直結した放電発生部３に電圧が印加される時間は、１５秒又は３０秒に設定された。具体的には、条件１では３０秒、条件２では１５秒、条件３では３０秒間放電発生部３に電圧が印加された。放電発生部３に電圧が印加された場合、理論上３ｋＶでアーク放電される。電源部６によって放電発生部３に電圧が印加されている間、高電圧及び短時間（数マイクロ秒）のアーク放電が断続的に発生した。ネガティブコントロールとして、保持部２に電圧が印加されない条件の試料が同様に用意された。
【００４４】
保持部２に電圧を印加後、保持部２に保持された溶液が回収された。回収された溶液は、調製培地が注入された６〜２４ｗｅｌｌプラスチックボトムプレートに添加され、３７℃、ＣＯ２濃度５％の条件下で溶液中の標的細胞が培養された。培養開始２〜７日後の標的細胞は蛍光顕微鏡を用いて観察された。標的細胞は４９０ｎｍＬＥＤを光源として励起され、５１０ｎｍ付近の蛍光シグナルが２０倍の対物レンズを用いた蛍光顕微鏡を用いて計測された。図１３に示すように、条件１〜３の各々について蛍光シグナルをもつ細胞が観察され、装置１を用いた方法により標的細胞に融合蛋白コード遺伝子を形質導入できたことが確認された。図１３には示していないが、ネガティブコントロールの細胞では融合蛋白コード遺伝子による蛍光シグナルは認められなかった。
【００４５】
蛍光観察に用いた細胞を集め、全細胞数と閾値以上の蛍光シグナルを発する細胞数をイメージサイトメーター（Ｔａｌｉ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）によって計測した。蛍光シグナルの閾値は、バックグラウンドシグナルの平均値に標準偏差の２倍の値を加算した値（Ｍｅａｎ＋２ＳＤ）を用いた。バックグラウンドシグナルは、ネガティブコントロールの自家蛍光シグナルとした。全細胞数に対する上記閾値以上の蛍光シグナルを有する細胞の割合を形質導入効率として算出した。条件２の形質導入効率は１７．６７％であり、条件３の形質導入効率は１２．４２％であった。
【００４６】
以上説明したように、装置１によれば、電気的作用によって良好な導入効率で外来物質を標的細胞に導入できることが確認された。装置１は、電気的作用を利用するため、特別な試薬を必要とせず、化学的手法と比較してランニングコストを抑制できる。更に装置１は、ウイルスを用いる生物学的手法のように標的細胞に対する毒性及び抗原性に起因する癌化等の懸念がなく、良好な生存率で導入細胞を得ることができる。装置１では、汎用の電気穿孔装置に必須のプログラムに従って矩形状のパルス電流を出力する機能を備えた高価なパルスジェネレーターは不要である。装置１の構成は、簡素であるため装置１は、低コストで製造される。装置１は、オイルを使用する必要が無いため、オイルを使用しないことが好ましい試料にも適用できる。
【００４７】
５．実施例２
実施例１の装置１は、絶縁破壊電圧を無限面積の平行平板で設計した装置である。このため、先端が尖った形状を有する一対の電極３１、３２では絶縁破壊電圧が想定された電圧よりも低くなる可能性が考えられる。そこで実施例２では、図３、図１４、及び図１５に示すように、放電発生部３の一対の電極３１、３２の先端形状を半円状に設計した装置１を製作し、製作された装置１を用いて、外来物質導入細胞を製造した。実施例２の装置１は、保持部２、放電発生部３、導電部４、電力量制御部５、及び電源部６を備える。図１４、図１５に示すように、保持部２は一対の電極２１、２２、容器２３、及び油槽２７を備える。放電発生部３は、一対の電極３１、３２を備える。一対の電極２１、２２、導電部４、及び一対の電極３１、３２、厚みの１．０（ｍｍ）のアルミニウム板（Ａ１０００系、純アルミニウム系）を加工することで、製作された。
【００４８】
容器２３は絶縁性樹脂板（アクリル板）８が加工されることで、直径Ｄ４が１．６（ｍｍ）、深さＨ１が２．０（ｍｍ）の円柱状に形成された。油槽２７は、容器２３の上端を底面の高さとする、直径Ｄ５が１０〜１２（ｍｍ）、深さＨ２が６〜１０（ｍｍ）の円柱状に形成された。容器２３は油槽２７の底部の略中心に設けられた。一対の電極２１、２２は、容器２３に収容される部分は鉛直方向に延び、油槽２７に収容される部分は、上下方向において容器２３から離れるほど（上側ほど）互いに離間する円弧状に形成された。一対の電極３１、３２は、互いに対向する側の面が凸となる半球状に形成された。厚さ１０（ｍｍ）の絶縁性樹脂板８に、一対の電極２１、２２、及び一対の電極３１、３２の形状、配置、及び形状に合わせてスリットが形成された。図１５に示すように、形成されたスリットに一対の電極２１、２２、及び一対の電極３１、３２が配置された。一対の電極２１、２２は、鉛直方向に延び、１．０（ｍｍ）の間隔Ｄ４をあけて配置された。一対の電極３１、３２は鉛直方向に延び、１．０（ｍｍ）の間隔Ｄ３をあけて配置された。電力量制御部５は、コンデンサ５１を備える。コンデンサ５１の静電容量は２００（ｐＦ）とした。実施例１の装置１と同様に、安全性に考慮し高電圧発生部品であるコンデンサ５１はプラスチックケースへ収納した。電極３１の端部１１と、電極２２の端部１２とに、プラスチックケースへ収納した部品が導電性のクリップで電気的に接続された。
【００４９】
実施例２の装置１は更に、放電発生部３に電圧を印加するインターバル期間を作るための周期調整部９を備える。周期調整部９は、制御システム（Ａｒｄｕｉｎｏ（登録商標））を含む。周期調整部９は、周期を２００（ｍｓ）に設定し、インターバルとして１９０（ｍｓ）（条件４）、１８０（ｍｓ）（条件５）の２つの条件が設定された。
【００５０】
溶液（細胞懸濁液）について、標的細胞はＨＥＫ２９３細胞とし、外来物質はｐＣＸＬＥ−ＥＧＦＰ遺伝子とし、水系の溶液は培地ＯＰＴＩ−ＭＥＭバッファーとした。ｐＣＸＬＥ−ＥＧＦＰ遺伝子は、ＣＭＶ（サイトメガロバイラス）のプロモーター領域の下流に緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰコード遺伝子を組み換え技術によって連結した組み換え配列をプラスミドＤＮＡ上に持つ遺伝子である。この組み換え遺伝子を細胞に遺伝子導入することにより、細胞が蛍光シグナルを帯びる。
【００５１】
ＨＥＫ２９３細胞が直径１０（ｃｍ）のプラスチック製培養ｄｉｓｈに１．５×１０４（ｃｅｌｌ／ｄｉｓｈ）の細胞密度でまかれ、高グルコースＤＭＥＭ培地で温度摂氏３７度、ＣＯ２濃度５％の条件にてインキュベーター内で培養された。
【００５２】
培養されたＨＥＫ２９３細胞がトリプシン処理により培養ｄｉｓｈからはがされ、ＨＥＫ２９３細胞の濃度を１×１０４（ｃｅｌｌ／μＬ）とし、ｐＣＸＬＥ−ＥＧＦＰプラスミドＤＮＡの濃度を１００（ｎｇ／  μＬ）とし、水系の溶液を培地ＯＰＴＩ−ＭＥＭバッファーとする条件で細胞懸濁液が調製された。調製された細胞懸濁液の４（μＬ）の液滴Ｗが、装置１の容器２３に投入された。条件４、５は何れも、保持部２に保持された液滴Ｗがシリコーンオイル等のオイルで封止されない条件とされた。
【００５３】
保持部２に導電部４を介して電気的に接続された放電発生部３に上記条件４、５の周期で１０回電圧が印加された。ネガティブコントロールとして、電圧を印加しない細胞懸濁液が用意された。ポジティブコントロールとしてリポソームとしてｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ）を用いたリポフェクション法にてｐＣＸＬＥ−ＥＧＦＰ遺伝子が形質導入された細胞が用意された。
【００５４】
各条件で処理された試料は、温度摂氏３７度、５％ＣＯ２の条件で細胞が培養された後、４９０ｎｍＬＥＤを光源として励起され、標的細胞の５１０ｎｍ付近の蛍光シグナルが２０倍の対物レンズの蛍光顕微鏡を用いて計測された。ネガティブコントロールでは、標的細胞から蛍光タンパク質の発現による蛍光シグナルが検出されず、図１６に示すように、ポジティブコントロールでは、標的細胞から蛍光タンパク質の発現による蛍光シグナルが検出された。条件５では、蛍光タンパク質の発現が確認されなかったが、図１６に示すように、条件４では、ポジティブコントロールと比べると、形質導入効率が低いものの、蛍光タンパク質の発現が確認できた。装置１０においても、装置１と同様の結果が得られると考えられる。
【００５５】
６．実施例３
実施例３では、図７、図１９に示すように、市販の１（ｍｍ）のギャップを持つキュベットを放電発生部３として使用した装置１０を製作し、製作された装置１０を用いて、外来物質導入細胞を製造した。実施例３の装置１０は、保持部２、放電発生部３、導電部４、電力量制御部５、及び電源部６を備える。保持部２として、図１４及び図１５に示す実施例２と同様の保持部２が使用された（図１９の写真中央下部）。放電発生部３として、一対の電極間の距離が１（ｍｍ）であるネッパジーン株式会社製品ＥＣ−００１Ｓが用いられた。キュベット電極は、キュベット電極用チャンバーに収容された（図１９の写真左上部）。電力量制御部５は、コンデンサ５１及びインダクタ５３を備える。インダクタ５３は、保持部２及びコンデンサ５１と並列に設けられた。実施例１の装置１と同様に、安全性に考慮し高電圧発生部品である電源部６及び電力量制御部５はプラスチックケースへ収納された（図１９の写真右上部）。電源部６として、冷陰極管インバータ（ＣＣＦＬ）とコッククロフト・ウォルトン回路（ＣＣＷ回路）とを組み合わせことで３ｋＶ以上の電圧を発生できる直流電源装置が用いられた。
【００５６】
コンデンサ５１の静電容量と、印加時間と、インダクタ５３のインダクタンスとが互いに異なる条件６〜条件１１の各々において、標的細胞はＨＥＫ２９３細胞とし、外来物質はｐＣＸＬＥ−ＥＧＦＰ遺伝子とし、水系の溶液は培地ＯＰＴＩ−ＭＥＭバッファーとし、実施例２と同様の手順で、遺伝子導入実験を行った。条件６では、コンデンサ５１の静電容量が７．３（ｐＦ）であり、印加時間が３０（ｓ）であり、インダクタ５３のインダクタンスが１０００（μＨ）である。条件７では、コンデンサ５１の静電容量が２２（ｐＦ）であり、印加時間が３０（ｓ）であり、インダクタ５３のインダクタンスが４７０（μＨ）である。条件８では、コンデンサ５１の静電容量が１１（ｐＦ）であり、印加時間が３０（ｓ）であり、インダクタ５３のインダクタンスが４７０（μＨ）である。条件９では、コンデンサ５１の静電容量が７．３（ｐＦ）であり、印加時間が２（ｍｉｎ）であり、インダクタ５３のインダクタンスが１０００（μＨ）である。条件１０では、コンデンサ５１の静電容量が７．３（ｐＦ）であり、印加時間が３０（ｓ）であり、インダクタ５３のインダクタンスが４７０（μＨ）である。条件１１では、コンデンサ５１の静電容量が７．３（ｐＦ）であり、印加時間が２（ｍｉｎ）であり、インダクタ５３のインダクタンスが４７０（μＨ）である。
【００５７】
条件６〜１１の各々について、遺伝子導入操作から４日後又は９日後、蛍光タンパク質の発現の有無を確認したところ、ネガティブコントロールでは、標的細胞から蛍光タンパク質の発現による蛍光シグナルが検出されず、図２０及び図２１に示すように、条件６〜１１の各々において、標的細胞から蛍光タンパク質の発現による蛍光シグナルが検出され、蛍光タンパク質の発現が確認された。実施例３の装置１０を用いた場合の遺伝子導入効率は、１３〜２７％であった（ｎ＝１２）。このことから、実施例３の装置１０を用いることで、標的細胞の核内に、遺伝子導入できることが確認された。
【００５８】
７．実施例４
実施例４〜８では、図８、図２２、図２３に示すように、１（ｍｍ）のギャップを持つ市販のキュベットを放電発生部３として使用した装置１０を製作し、製作された装置１０を用いて、実施例２と同様の手順で（ただし、周期調整部９による放電周期の調整は行わない）、外来物質導入細胞を製造した。実施例４の装置１０は、保持部２、放電発生部３、導電部４、電力量制御部５、及び電源部６を備える。図２３に示すように、保持部２は、一対の電極２１、２２、及び載置部２４を備える。一対の電極２１、２２は、厚みの１．０（ｍｍ）のアルミニウム板（Ａ１０００系、純アルミニウム系）を加工することで、製作された。一対の電極２１、２２は、所定の間隔Ｄ２を開けて絶縁性樹脂板（アクリル板）８に保持された（図２２の写真左下部）。載置部２４は、絶縁性樹脂板８の上面の内の、一対の電極２１、２２の間となる部分である。放電発生部３として、一対の電極間の距離が１（ｍｍ）であるネッパジーン株式会社製品ＥＣ−００１Ｓが用いられた。キュベット電極は、キュベット電極用チャンバーに収容された（図２２の写真右下部）。電力量制御部５は、コンデンサ５１、インダクタ５３、及びダイオード５４を備える。インダクタ５３は、保持部２及びコンデンサ５１と並列に設けられた。ダイオード５４は、保持部２に対して並列に、且つ、コンデンサ５１からインダクタ５３に向かう方向を順方向として設けられた。ダイオード５４は、超高速スイッチング及び高周波の整流に適するショットキーバリアダイオード（ローム社製、ＳＣＳ２０５ＫＧＣ）が用いられた。実施例１の装置１と同様に、安全性に考慮し、高電圧発生部品である電源部６及び電力量制御部５はプラスチックケースへ収納した（図２２の写真上部）。電源部６として、冷陰極管インバータ（ＣＣＦＬ）とコッククロフト・ウォルトン回路（ＣＣＷ回路）とを組み合わせることで３ｋＶ以上の電圧を発生できる直流電源装置が用いられた。
【００５９】
コンデンサ５１の静電容量が互いに異なり、コンデンサ６０の静電容量と、印加時間と、インダクタ５３のインダクタンスとが互いに同じ条件１２、条件１３の各々において、標的細胞はＨＥＫ２９３細胞とし、外来物質はｐＣＸＬＥ−ＥＧＦＰ遺伝子とし、水系の溶液は培地ＯＰＴＩ−ＭＥＭバッファーとし、実施例２と同様の手順で、遺伝子導入実験を行った。４（μＬ）の細胞懸濁液の液滴Ｗは、一対の電極２１、２２の間の載置部２４に載置された。条件１２、条件１３では、コンデンサ６０の静電容量が０（ｐＦ）であり、印加時間が３０（ｓ）であり、インダクタ５３のインダクタンスが５（μＨ）である。条件１２では、コンデンサ５１の静電容量が３０００（ｐＦ）であり、条件１３では、コンデンサ５１の静電容量が１０００（ｐＦ）である。比較例として、従来の遺伝子導入装置であるＮＥＰＡ２１（ネッパジーン社）を用いて同様の実験を行った。
【００６０】
条件１２、１３の各々について、遺伝子導入操作から１日後、３日後、及び１３日後の各々で、蛍光タンパク質の発現の有無を確認したところ、電圧を印加しないネガティブコントロールでは、標的細胞から蛍光タンパク質の発現による蛍光シグナルが検出されず、図２４に示すように、条件１２、１３の各々において、遺伝子導入操作後、標的細胞から蛍光タンパク質の発現による蛍光シグナルが検出され、蛍光タンパク質の発現が確認された。条件１２及び条件１３では、遺伝子導入操作から１日後に導入遺伝子の発現が観察された。比較例の装置と、実施例４の装置１０を用いた場合とで、遺伝子導入操作から２日後の蛍光シグナルを蛍光顕微鏡にて観察したところ、比較例の装置の場合と、実施例４の装置１０の場合とで、遺伝子導入効率はほぼ変わらなかった。実施例４の装置１０の場合は、遺伝子導入操作から２日以降にも液体培地のｐＨ指示薬の色が、細胞が増殖し酸性に傾くことに起因するとみられる色に変化し、遺伝子導入操作後も細胞が増殖していると考えられた。これに対し、比較例の装置の場合は、遺伝子導入操作から２日以降の液体培地の色の変化は僅かであり、遺伝子導入操作後に細胞は増殖していないと考えられた。このことから、実施例４の装置１０の場合は、比較例の装置の場合に比べ、細胞毒性が非常に低く、細胞の状態がよいと考えられ、例えば、遺伝子導入操作による細胞毒性が低いことが要求される、植物細胞への遺伝子導入等にも好適に適用可能であることが示唆された。
【００６１】
８．実施例５
実施例５では、実施例４と同様の装置１０を用いて、外来物質導入細胞を製造した。標的細胞は浮遊型のヒトＨＬ６０細胞株とし、外来物質はｐＣＸＬＥ−ＥＧＦＰ遺伝子とし、水系の溶液は培地ＯＰＴＩ−ＭＥＭバッファーとし、実施例２と同様の手順で、遺伝子導入実験を行った。４（μＬ）の細胞懸濁液の液滴Ｗは、一対の電極２１、２２の間の載置部２４に載置された。コンデンサ６０の静電容量が０（ｐＦ）であり、コンデンサ５１の静電容量が２０００（ｐＦ）であり、印加時間が３０（ｓ）であり、インダクタ５３のインダクタンスが５（μＨ）とした。比較例として、従来の遺伝子導入装置であるＮＥＰＡ２１（ネッパジーン社）を用いて同様の実験を行った。
【００６２】
図２５に示すように、比較例の装置を用いた場合と、実施例５の装置１０を用いた場合とで、遺伝子導入操作から２日後の蛍光シグナルを蛍光顕微鏡にて観察したところ、比較例と、実施例５の各々において、標的細胞から蛍光タンパク質の発現による蛍光シグナルが検出され、蛍光タンパク質の発現が確認された。電圧を印加しないネガティブコントロールでは、標的細胞から蛍光タンパク質の発現による蛍光シグナルが検出されなかった。比較例の装置と、実施例５の装置１０を用いた場合とで、遺伝子導入操作から２日後の蛍光シグナルを蛍光顕微鏡にて観察したところ、比較例の装置と、実施例５の装置１０とで、遺伝子導入効率はほぼ変わらなかった。しかしながら、死細胞をトリパンブルーにて染色し、明視野画像を用い、全細胞に対する死細胞の数である細胞の死亡率を比較した結果、両者に大きな差がみられた。具体的には、図２６に示すように、比較例の装置の場合は、細胞の死亡率が１５．８％（±６．５）であるのに対し、実施例５の装置１０の場合は、細胞の死亡率が３．４％（±０．８）であり、比較例の装置の場合に比べ、実施例５の装置１０の場合は、細胞毒性が非常に低く、細胞の状態がよいと考えられた。実施例５の装置１０の場合の細胞の死亡率は、細胞懸濁液に電圧を印加しないネガティブコントロールの細胞の死亡率である４．４％（±０．１）と同等であった（ｎ＝３）。
【００６３】
９．実施例６
実施例６では、実施例４と同様の装置１０を用いて、ｉＰＳ細胞を製造した。標的細胞は、血液のリンパＴ細胞とし、外来物質は山中因子遺伝子（ＯＣＴ−３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｌ−ＭＹＣ）と、山中因子遺伝子が細胞に導入され、未分化になると緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）が発現するマーカーであるＥＯＳ−ＥＧＦＰベクターとし、水系の溶液は培地ＯＰＴＩ−ＭＥＭバッファーとした。標的細胞は、４（μＬ）の細胞懸濁液の液滴Ｗ内に約８万個となるように調製し、実施例２と同様の手順で、遺伝子導入実験を行った。４（μＬ）の細胞懸濁液の液滴Ｗは、一対の電極２１、２２の間の載置部２４に載置された。条件１４では、コンデンサ６０の静電容量が４０００（ｐＦ）であり、コンデンサ５１の静電容量が１０００（ｐＦ）であり、印加時間が１５（ｓ）であり、インダクタ５３のインダクタンスが５（μＨ）とした。条件１５では、コンデンサ６０の静電容量が１５００（ｐＦ）であり、コンデンサ５１の静電容量が５００（ｐＦ）であり、印加時間が１５（ｓ）であり、インダクタ５３のインダクタンスが１０（μＨ）とした。細胞懸濁液に電圧を印加しない条件をネガティブコントロールとした。
【００６４】
図２７に示すように、各条件について、遺伝子導入操作から１６日後の蛍光シグナルを蛍光顕微鏡にて観察したところ、実施例６の条件１４及び条件１５の各々において、標的細胞から蛍光タンパク質の発現による蛍光シグナルが検出され、遺伝子導入後蛍光タンパク質の発現が確認された。電圧を印加しないネガティブコントロールでは、標的細胞から蛍光タンパク質の発現による蛍光シグナルが検出されなかった。実施例６の結果から、実施例６の装置１０は、ｉＰＳ細胞の製造にも好適に利用できることが確認された。
【００６５】
１０．実施例７
実施例７では、実施例４と同様の装置１０を用いて、ゲノム編集と多重遺伝子導入とが可能であるかを確認した。標的細胞は、ＨＥＫ２９３細胞とし、外来物質は、ゲノム編集を行うためのＣＡＳ９酵素と赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）が発現するＣａｓ９−ＲＦＰ  Ｌｅｎｔｉ  Ｐｌａｓｍｉｄ  （Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）と、ゲノム編集された場合にＧＦＰが発現する２種類のｐｌａｓｍｉｄＤＮＡであるｐＸ３３０−Ｃｅｔｎ１／１及びｐＣＡＧ−ＥＧｘｘＦＰ−Ｃｅｔｎ１（Ａｄｄｇｅｎｅ社製、大阪大学井川研究室提供）とし、水系の溶液は培地ＯＰＴＩ−ＭＥＭバッファーとし、実施例２と同様の手順で、遺伝子導入実験を行った。４（μＬ）の細胞懸濁液の液滴Ｗは、一対の電極２１、２２の間の載置部２４に載置された。条件１６では、コンデンサ６０の静電容量が０（ｐＦ）であり、コンデンサ５１の静電容量が３０００（ｐＦ）であり、印加時間が６０（ｓ）であり、インダクタ５３のインダクタンスが５（μＨ）とした。条件１７では、コンデンサ６０の静電容量が０（ｐＦ）であり、コンデンサ５１の静電容量が２０００（ｐＦ）であり、印加時間が６０（ｓ）であり、インダクタ５３のインダクタンスが５（μＨ）とした。条件１８では、コンデンサ６０の静電容量が４０００（ｐＦ）であり、コンデンサ５１の静電容量が１０００（ｐＦ）であり、印加時間が６０（ｓ）であり、インダクタ５３のインダクタンスが５（μＨ）とした。細胞懸濁液に電圧を印加しない条件をネガティブコントロールとした。
【００６６】
条件１６〜１８について、遺伝子導入操作から２日後の蛍光シグナルを蛍光顕微鏡にて観察した。ＧＦＰの蛍光シグナルは、水銀ランプ光源が光源とされ、４９０ｎｍ波長付近の励起光がフィルターを介して照射されて、５１０ｎｍ波長付近の緑蛍光シグナルがフィルターを介して観察された。ＲＦＰの蛍光シグナルは、水銀ランプ光源が光源とされ、５９０ｎｍ波長付近の励起光がフィルターを介して照射され、６１０ｎｍ波長付近の赤蛍光シグナルがフィルターを介して観察された。条件１６〜１８の各々において、ＧＦＰの蛍光シグナルを示す標的細胞が確認された。電圧を印加しないネガティブコントロールでは、標的細胞からＧＦＰの発現による蛍光シグナルが検出されなかった。このことより、実施例７の装置１０を用いて、ＨＥＫ２９３細胞のゲノム編集が可能であることが確認された。更に、１つの標的細胞において、ＧＦＰの蛍光シグナルと  ＲＦＰの蛍光シグナルとの各々を示す細胞が確認された。図２８の最も右側の列の画像は、明視野画像、蛍光ＧＦＰ画像及び蛍光ＲＦＰ画像を重ね合わせた重ね合わせ画像であり、図２８の重ね合わせ画像において白色様で表される黄色のシグナルを示す標的細胞は、３種類のｐｌａｓｍｉｄＤＮＡが導入されたことを示す。図２８に示すように、条件１６〜１８の各々において、重ね合わせ画像から黄色のシグナルを示す細胞が確認された。このことから、実施例７の装置１０を用いて、ＨＥＫ２９３細胞に複数の外来物質を一度の遺伝子操作で導入可能（つまり、多重遺伝子導入が可能）であることが確認された。
【００６７】
１１．実施例８
実施例８では、実施例４と同様の装置１０を用いて、外来物質導入細胞を製造し、哺乳類ＨＥＫ細胞における遺伝子導入成功率を確認した。標的細胞は哺乳類ＨＥＫ細胞とし、外来物質はｐＣＭＶ−ＥＧＦＰ遺伝子とし、水系の溶液は培地ＯＰＴＩ−ＭＥＭバッファーとし、実施例２と同様の手順で、遺伝子導入実験を行った。４（μＬ）の細胞懸濁液の液滴Ｗは、一対の電極２１、２２の間の載置部２４に載置された。条件１９では、コンデンサ６０の静電容量が４０００（ｐＦ）であり、コンデンサ５１の静電容量が１０００（ｐＦ）であり、印加時間が１５（ｓ）であり、インダクタ５３のインダクタンスが５（μＨ）とした。条件２０では、コンデンサ６０の静電容量が４０００（ｐＦ）であり、コンデンサ５１の静電容量が１０００（ｐＦ）であり、印加時間が３０（ｓ）であり、インダクタ５３のインダクタンスが５（μＨ）とした。条件２１では、コンデンサ６０の静電容量が０（ｐＦ）であり、コンデンサ５１の静電容量が３０００（ｐＦ）であり、印加時間が１５（ｓ）であり、インダクタ５３のインダクタンスが５（μＨ）とした。条件２２では、コンデンサ６０の静電容量が０（ｐＦ）であり、コンデンサ５１の静電容量が３０００（ｐＦ）であり、印加時間が３０（ｓ）であり、インダクタ５３のインダクタンスが５（μＨ）とした。
【００６８】
条件１９〜２２の各々について、遺伝子導入操作から２日後の蛍光シグナルを蛍光顕微鏡にて観察したところ、実施例８の各条件において、遺伝子導入後蛍光タンパク質の発現が確認され、遺伝子導入効率は、０．０２〜０．１３％であった。各条件における遺伝子導入成功率は１００％であった。遺伝子導入成功率は、１つの細胞懸濁液を１サンプルとし、サンプル毎で遺伝子導入が成功したか否かを集計し、観察した全サンプルに対する遺伝子導入に成功したサンプル数である。従来の油中の液滴内でエレクトロポレーションを行う装置では、遺伝子導入中に装置がショートする等により、一つの液滴を回収したときの遺伝子導入成功率は、５０％程度であった。また従来の油中の液滴内でエレクトロポレーションを行う装置を用いた場合、遺伝子導入操作後２日後までに導入遺伝子の発現はほとんどみられず、遺伝子導入操作から３日後から導入遺伝子の発現が確認された。これに対し、装置１０では、実施例８における遺伝子導入成功率は１００％である。更に図２９に示すように、実施例８の装置１０を用いた場合、遺伝子導入操作から１日後には標的細胞から蛍光タンパク質の発現による蛍光シグナルが検出され、導入遺伝子の発現が確認された。このことから、装置１０を用いた場合、従来の油中の液滴内でエレクトロポレーションを行う装置に比べ、遺伝子導入成功率は安定していると言える。
【００６９】
上記実施形態の装置１、１０及び外来物質導入細胞の製造方法では、以下の効果が得られる。装置１、１０は、外来物質及び細胞を含有する溶液を油中で往復運動させることなく、短時間のパルス状の高電圧電流を溶液に付与できる。したがって装置１、１０は、油から試料を回収する必要が無く、油中の液滴内でエレクトロポレーションを行う装置に比べ、反応後の試料を回収する操作を簡単にできる。装置１、１０は、汎用の電気穿孔装置に必須の、プログラムに従って、矩形状のパルス電流を出力可能な高価なパルスジェネレーターは不要である。装置１、１０の構成は、簡素であるため、低コストで製造される。放電発生部３は、所定間隔で配置された一対の電極３１、３２を有し、一対の電極３１、３２間にアーク放電を発生させる。故に装置１、１０は、比較的簡単な構成で、従来に比べＯＮ時間の短いパルス状の高電圧電流を保持部２に供給できる。
【００７０】
装置１、１０では、電気穿孔と遺伝子導入の反応が、静置された溶液で行われ、溶液の往復運動の状態の影響を受けず、安定的に実施される。装置１、１０は、保持部２に保持された溶液に加わる電気的作用を利用するため、特別な試薬を必要とせず、化学的手法により標的細胞に外来物質を導入する場合と比較してランニングコストを抑制できる。更に装置１、１０は、ウイルスを用いる生物学的手法のように標的細胞に対する毒性及び抗原性に起因する、標的細胞の癌化等の懸念がない。装置１、１０は、アーク放電を利用してパルス電流を発生させることで、従来装置に比べ、標的細胞に加わるパルス電流のＯＮ時間を短時間（数マイクロ秒程度）にできる。故に、装置１、１０は、標的細胞に与える瞬間的な電力を従来装置に比べ大きくしつつ、標的細胞に加わる総電力量を従来装置に比べて小さくできるので、標的細胞に与えるダメージを従来装置に比べ抑制でき、良好な生存率で形質導入細胞を得ることができると考えられる。装置１、１０は、オイルを使用する必要が無いため、オイルの未使用が好ましい標的細胞にも適用できる。オイルの未使用が好ましい標的細胞は、例えば、特定の植物細胞が挙げられる。
【００７１】
図３に示す装置１の電力量制御部５は、電源部６と、放電発生部３とに電気的に接続され、電源部６によって電圧が印加されることで蓄電し、蓄電された電荷を放電発生部３に放出するコンデンサ５１を備える。図３に示す装置１は、保持部２に供給されるパルス電流の電力量をコンデンサ５１の静電容量により規定できる。図５〜図８に示す装置１０の放電発生部３は、電源部６と電気的に接続される。電力量制御部５は、保持部２と電気的に接続され、保持部２に供給されたパルス電流を蓄電するコンデンサ５１を備える。図５〜図８に示す装置１０は、保持部２に供給されるパルス電流の電力量をコンデンサ５１の静電容量により規定できる。装置１、１０は、３ｋＶ以上の直流高電圧を供給可能な電源部６を備える。装置１、１０は、電源部６を別途準備する必要が無い。
【００７２】
実施例２の装置１の放電発生部３の一対の電極３１、３２は、先端が球状に形成される。実施例２の装置１は他の形状の電極を有する場合に比べ、より高い放電電圧で放電発生部３にアーク放電を生じさせることができる。
【００７３】
実施例１の装置１の電力量制御部５は、放電発生部３で発生する暗流の影響を抑えるための暗流制御部５２を備える。実施例１の装置１は放電発生部３の一対の電極３１、３２間に暗流が生じる場合であっても、安定して放電発生部３にアーク放電を生じさせることができる。
【００７４】
実施例２の装置１は、周期調整部９を有し、所定のインターバルで周期的に放電発生部３に電圧を印加する。装置１はインターバルの長さ及び繰り返し回数の条件を簡単に変更できる。故に実施例２の装置１では、試料に適した反応条件の設定が容易である。実施例３の装置１０の電力量制御部５は、保持部２及びコンデンサ５１と並列に接続された、放電発生部３に対し、逆起電力をかけるためのインダクタ５３を備える。該装置１０は、インダクタ５３の作用により保持部２を介して標的細胞に正逆双方向の電圧を印加できる。
【００７５】
実施例４の装置１０の電力量制御部５は、保持部２及と並列に接続され、コンデンサ５１から放電された電流が流れる方向を順方向とするダイオード５４を備える。実施例４の装置１０では、保持部２に印加されるパルスの波形は、ダイオード５４の整流作用により減衰振動波状のパルスの内のマイナス部分が削除された波形にできる。ダイオード５４を備えない実施例３の装置１０では、遺伝子導入操作から１０日後に導入遺伝子の発現が確認されたのに対し、ダイオード５４を備える実施例４の装置１０では、遺伝子導入操作から１日後には導入遺伝子の発現が確認された。このことから、ダイオード５４を備える実施例４の装置１０は、ダイオード５４を備えない装置１０に比べ、遺伝子導入操作による標的細胞へのダメージを小さくできると考えられる。
【００７６】
従来の油中の液滴内でエレクトロポレーションを行う装置は、液滴が電極間を往復運動する際に、電極と接触した液滴に電荷を与えることで、液滴内の標的細胞にエレクトロポレーションを行う（例えば、特許第６２６９９６８号公報参照）。このため該装置は、絶縁油による回路の遮断が行われ、従来の装置に比べ、低い細胞毒性での極少量の試料に対し遺伝子導入が可能である。しかしながら、上記従来の装置は、液滴の往復運動が不安定になりがちであり、遺伝子導入が安定しないという課題がある。これに対し、装置１、１０は、反応場である溶液（細胞懸濁液）を静置した状態で、油中液滴で形質導入を行う場合と類似の条件の下で、溶液に電荷を与えることを可能にした。つまり、装置１、１０は、従来の油中液滴を用いる装置での反応条件を、液滴を油中で往復運動させること無く再現することに成功した。装置１、１０は、絶縁オイルフリーの状態で溶液に電荷を付与できるので、標的細胞へのオイルの影響をなくすことができる。更に装置１、１０では、アーク放電の各種条件（保持部２に供給するパルス電流の電力量、電圧の大きさ、及び放電発生部３に電圧を印加する周期など）を自由に設定することが可能であり、試料に最適な条件をシステマティックに探索できる。故に装置１、１０は、従来の装置に比べ、より汎用性が高い。しかも装置１、１０は、全体として１０（ｃｍ）×１０（ｃｍ）×１０（ｃｍ）程度の大きさに収めることができ、携帯可能である。
【００７７】
本発明の電気穿孔装置及び外来物質導入細胞の製造方法は、上記した実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において種々変更が加えられてもよい。電気穿孔装置は保持部、放電発生部、導電部、及び電力量制御部を備えればよく、他の構成は適宜変更、省略されてよい。実施例１〜８に示した技術は、それぞれ電気回路形態と放電発生部の形状等が異なるが、装置の一部又は全部を適宜組み合わせても使用可能である。標的細胞に供給される電力量が高まることで、細胞毒性が高まることを抑制するために、放電発生部と保持部との間には、電気抵抗、分圧用又は静電容量の制限を行うコンデンサの少なくとも何れかを設けてもよい。電気穿孔装置の大きさは処理対象となる溶液の体積等に応じて適宜変更されてよい。電気穿孔装置の保持部、放電発生部、導電部、及び電力量制御部の数は適宜変更されてよい。例えば、電気穿孔装置は、１つの放電発生部に対し、複数個の保持部を直列又は並列接続してもよい。
【００７８】
放電発生部３は一対の電極の所定間隔を変更可能に形成されてもよい。装置１は、例えば、放電発生部３の一対の電極の内の少なくとも一方を他方に対してスライド可能にしてもよい。具体的には、図９に示す装置１の構成を図１７に示す変形例のように変更してもよい。図１７に示す変形例の放電発生部３は、電極３１を配置するためのスリット８１の左右方向の長さを電極３５のスライド可能範囲に合わせて形成することで、一対の電極３１、３２の内の一方の電極３１を他方の電極３２に対してスライド可能である。同様に保持部２は一対の電極２１、２２の間隔を変更可能に形成されてもよい。例えば、図９に示す装置１０の構成を図１７に示すように変更してもよい。図１７に示す変形例の保持部２は、電極２２を配置するためのスリット８２の左右方向の長さを電極２２のスライド可能範囲に合わせて形成することで、一対の電極２１、２２の内の一方の電極２２を他方の電極２１に対してスライド可能である。電気穿孔装置は、保持部及び放電発生部の少なくとも何れかが備える一対の電極の双方を電極間の距離を変更する方向にスライド可能としてもよい。
【００７９】
他の例では、放電発生部が備える一対の電極間の距離が互いに異なる電極対を複数用意し、複数の電極対の内の１つを螺子等で取り外し可能に固定することで、一対の電極の所定間隔を変更可能に形成されてもよい。例えば、図１４に示す装置１の構成を図１８に示すように変更してもよい。変形例の放電発生部３７は、電線３９、装着部６３、電極３２、複数の電極３５、３６、取付板６１を備え、アーク放電を発生させる一対の電極の内の一方の電極として、複数の電極３５、３６の中から選択された１つを装着部６３に取り外し可能に固定する。装着部６３は電線３９の近傍に設ける。複数の電極３５、３６は各々、取付板６１に固定されている。複数の電極の数は適宜変更されてよい。取付板６１は螺子６４で装着部６３に固定される。取付板６１が装着部６３に固定された状態では、各複数の電極３５、３６は、電線３９と電気的に接続される。取付板６１が装着部６３に固定された状態では、各複数の電極３５、３６と電極３２の間の距離Ｄ１は互いに異なる。作業者は、複数の電極３５、３６の中から放電発生部３７が備える一対の電極間の所定距離が所望の長さになる電極を選択し、装着部６３に固定する。取付板６１を装着部６３で固定する場合、電極３２に対して、電極間の距離が所望の距離になるように、一方の電極の位置を決めやすい。電気穿孔装置は、放電発生部が備える一対の電極の双方を、該一対の電極と電気的に接続する電線に対して取り外し可能に構成してもよい。図１７及び図１８に示す変形例において、放電発生部の電極の先端形状、大きさ、及び配置、並びに保持部の電極の形状、大きさ、及び配置は適宜変更されてよい。
【００８０】
放電発生部の一対の電極にアーク放電が発生する条件は、周囲に存在する気体の組成、湿度等により影響を受ける。このため、周囲の雰囲気の影響を低減させて、安定してアーク放電を生じさせるために、放電発生部は、密閉容器に配置され、乾燥空気、アルゴン等の希ガス雰囲気中に配置されてもよい。その場合、例えば、図１８に示すように電気穿孔装置は、放電発生部３７を囲う空間を密閉可能な容器８５を備え、容器８５内を乾燥空気、希ガス等で充たしてもよい。放電発生部を外界の環境とできる限り分離するために、放電発生部は、一対の電極を備える市販のエレクトロポレーション用キュベット、及びフィラメントを切断した電球等であってもよい。
【００８１】
電気穿孔装置は、保持部、放電発生部、導電部、及び電力量制御部の少なくとも何れかを着脱可能に構成してもよい。電気穿孔装置は、例えば、図１４に示す装置１の構成を図１８に示すように変更し、保持部２の容器２３及び一対の電極２１、２２を着脱可能としてもよい。図１８に示す変形例では、電気穿孔装置の保持部２は、着脱可能な容器２３及び一対の電極２１、２２を有する。容器２３は、絶縁性部材で有底円筒状に形成される。一対の電極２１、２２は容器２３の側面に沿って上下方向に延びる。図１８下に示すように、容器２３は、凹部２５に着脱可能に収容される。容器２３が凹部２５に収容された場合には、一対の電極２１、２２は各々導電部４に電気的に接続する。電気穿孔装置が着脱可能な保持部を備える場合、例えば、他試料のコンタミネーション等を考慮して、保持部を使い捨てることもできる。電気穿孔装置は、保持部の劣化等に応じて、保持部を取り替えることができる。放電発生部を取り替え可能とした場合、放電発生部一対の電極の表面に酸化皮膜が生じる等の劣化が生じる場合にも、新たな部品に取り替えることで、放電発生部の劣化の影響を排除した同様の条件にて一対の電極間でアーク放電させることができる。電気穿孔装置は、電源部を省略してもよい。その場合、電源部は電気穿孔装置とは別途準備され、電気穿孔装置と接続されればよい。
【００８２】
電気穿孔装置において、保持部、放電発生部、導電部、及び電力量制御部の配置は適宜変更されてよい。例えば、図３０及び図３１に示す変形例の電気穿孔装置のように、実施例４の装置１０において、保持部２、導電部４及び電力量制御部５は、放電発生部３の周囲を囲い、上下方向に延びる壁面に固定されてもよい。この場合、保持部２は、一対の電極２１、２２、及び載置部２４を備え、一対の電極２１、２２は、上下方向に所定の間隔Ｄ２を開けて絶縁性樹脂板８に保持されてもよい（図３０の写真中央下部）。図３１に示すように、所定量の細胞懸濁液の液滴Ｗが載置される載置部２４は、一対の電極２１、２２の内の、下側に配置された電極２１の上面であってもよい。図３０及び図３１に示す変形例の装置１０では、保持部２、導電部４及び電力量制御部５を、放電発生部３の近縁に配置することで、実施例４の装置１０に比べ導電部４の抵抗を小さくでき、保持部２に印加されるパルス電流を安定させることができる。実施例４の装置１０において、コンデンサ６０は適宜省略されてよい。図３２及び図３３に示す変形例の装置１０に示すように、装置１０は、保持部２、コンデンサ５１、及びインダクタ５３を備える液滴保持ユニット４１、コンデンサ６０を備える追加コンデンサユニット４２、電源ＳＷを含む電源部６と、放電発生部３と、ダイオード５４とを備える本体ユニット４３の３ユニットで構成されてもよい。液滴保持ユニット４１と追加コンデンサユニット４２とは、本体ユニット４３へマグネットなどで取り外し可能に固定されてもよい。装置１０は、各ユニット４１〜４３間の電気的接続のため、本体ユニット４３の上面にポゴピン電極などを備えてもよく、ポゴピン電極を介して、液滴保持ユニット４１の底面に備えた電極と、追加コンデンサユニット４２の底面に備えた電極との各々に接続されてもよい。図３２及び図３３に示す変形例の装置１０では、コンデンサ５１、インダクタ５３の条件を変更した液滴保持ユニット４１と、コンデンサ６０の静電容量の条件を変更した追加コンデンサユニット４２を複数作製することで、条件の変更が容易となる。
【符号の説明】
【００８３】
１、１０：電気穿孔装置
２：保持部
３、３７：放電発生部
４：導電部
５：電力量制御部
６：電源部
８：絶縁性樹脂板
９：周期調整部
２１、２２、３１、３２、３５、３６：電極
２３：容器
２７：油槽
３９：電線
５１、６０：コンデンサ
５２：暗流制御部
５４：ダイオード
【図１】
2020130106.tif 000003
【図２】
2020130106.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2020130106.tif 000017
【図１６】
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【図１７】
2020130106.tif 000019
【図１８】
2020130106.tif 000020
【図１９】
2020130106.tif 000021
【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
2020130106.tif 000024
【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年6月22日(2021.6.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞懸濁液に含まれる細胞に外来物質を電気穿孔にて導入可能な電気穿孔装置及び外来物質が導入された外来物質導入細胞の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
絶縁性油中の液滴内でエレクトロポレーションを行う電気穿孔装置が研究されている（例えば、特許文献１参照）。エレクトロポレーションは、ＤＮＡ及びＲＮＡ等の核酸分子、タンパク質等の生体物質、並びに薬剤の有効成分となる化合物等を外来物質として、外来物質を標的細胞内に導入する方法の１つである。一般的なエレクトロポレーションでは、高電圧の特殊パルスジェネレーターにより標的細胞に高電圧のパルス状の電流が与えられ、細胞膜に外来物質が通過できる小孔を一過性に作って外来物質を標的細胞に取り込ませる。特許文献１に記載の装置は、絶縁性油中の液滴が電極間を往復運動する際に電極に接触することで、従来の電気穿孔装置よりも低い電力量のパルス電流を標的細胞に与え、エレクトロポレーションを行う。特許文献１に記載の装置は、標的細胞の試料量を従来の電気穿孔装置よりも少なくでき、標的細胞の生存率を従来の電気穿孔装置よりも向上できると報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第６２６９９６８号公報
【発明の概要】
【０００４】
従来の油中の液滴内でエレクトロポレーションを行う装置では、反応後の試料を油から回収する操作が煩雑である。
【０００５】
本発明の目的は、外来物質及び細胞を含有する溶液（液滴）を油中で往復運動させることでエレクトロポレーションを行う装置に比べ、反応後の試料を回収する操作を簡単にした電気穿孔装置及び外来物質導入細胞の製造方法を提供することを目的とする。
【０００６】
本発明の第一態様に係る電気穿孔装置は、外来物質及び細胞を含有する溶液を保持する保持部と、所定間隔で配置された一対の電極を有し、前記一対の電極間にアーク放電を発生させる放電発生部と、前記保持部と、前記放電発生部とを電気的に接続し、前記放電発生部にて発生された前記アーク放電によるパルス電流を前記保持部に供給する導電部と、前記保持部に供給される前記パルス電流の電力量を制御する電力量制御部とを備える。
【０００７】
第一態様の電気穿孔装置は、外来物質及び細胞を含有する溶液（液滴）を油中で往復運動させることなく、短時間のパルス状の高電圧電流を溶液に付与できる。したがって該電気穿孔装置は、油から試料を回収する必要が無く、油中の液滴内でエレクトロポレーションを行う装置に比べ、反応後の試料を回収する操作を簡単にできる。
【０００８】
第一態様に係る電気穿孔装置の前記電力量制御部は、電源部と、前記放電発生部とに電気的に接続され、前記電源部によって電圧が印加されることで蓄電し、蓄電された電荷を前記放電発生部に放出するコンデンサを備えてもよい。該電気穿孔装置は、保持部に供給されるパルス電流の電力量をコンデンサの静電容量により規定できる。
【０００９】
第一態様に係る電気穿孔装置の前記放電発生部は、電源部と電気的に接続され、前記電力量制御部は、前記保持部と電気的に接続され、前記保持部に供給された前記パルス電流を蓄電するコンデンサを備えてもよい。該電気穿孔装置は、保持部に供給されるパルス電流の電力量をコンデンサの静電容量により規定できる。
【００１０】
第一態様に係る電気穿孔装置は、３ｋＶ以上の直流高電圧を供給可能な前記電源部を更に備えてもよい。該電気穿孔装置は、電源部を別途準備する必要が無い。
【００１１】
第一態様に係る電気穿孔装置の前記放電発生部は前記所定間隔を変更可能であってもよい。該電気穿孔装置は保持部に供給するパルス電流の大きさ等の条件を簡単に変更できる。故に該電気穿孔装置では、試料に適した反応条件の設定が容易である。
【００１２】
第一態様に係る電気穿孔装置の前記放電発生部の前記一対の電極は、先端が球状に形成されてもよい。該電気穿孔装置は他の形状の電極を有する場合に比べ、放電発生部に安定してアーク放電を生じさせることができる。
【００１３】
第一態様に係る電気穿孔装置の前記電力量制御部は、前記放電発生部に生じる暗流を制御する暗流制御部を更に備えてもよい。該電気穿孔装置は放電発生部に暗流が生じる場合であっても、安定して放電発生部にアーク放電を生じさせることができる。
【００１４】
第一態様に係る電気穿孔装置は、所定のインターバルで周期的に前記放電発生部に電圧を印加する周期調整部を更に備えてもよい。該電気穿孔装置はインターバルの長さ及び繰り返し回数の条件を簡単に変更できる。故に該電気穿孔装置では、試料に適した反応条件の設定が容易である。
【００１５】
第一態様に係る電気穿孔装置において、前記電力量制御部は、前記保持部及び前記コンデンサと並列に接続されたインダクタを備えてもよい。この場合の電気穿孔装置は、インダクタの作用により保持部を介して標的細胞に正逆双方向の電圧を印加できる。
【００１６】
第一態様に係る電気穿孔装置において、前記電力量制御部は、前記保持部と並列に接続され、前記コンデンサから放電された電流が流れる方向を順方向とするダイオードを備えてもよい。この場合の電気穿孔装置は、保持部に印加されるパルス電流の波形を、ダイオードの整流作用により減衰振動波のパルス電流の内のマイナス電荷部分が削除された波形にすることができる。
【００１７】
第二態様に係る外来物質導入細胞の製造方法は、外来物質及び細胞を含有する溶液を、第一態様の電気穿孔装置の保持部に保持させる保持工程と、アーク放電にてパルス電流を発生させ、発生された前記パルス電流を前記保持部に供給する供給工程と、前記供給工程を経た前記溶液を、前記保持部から回収する回収工程とを備える。第二態様に係る外来物質導入細胞の製造方法によれば、第一態様の電気穿孔装置と同様の効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】電気穿孔装置１の概念図である。
【図２】電気穿孔装置１の回路の一例を示す図である。
【図３】電気穿孔装置１の回路の一例を示す図である。
【図４】電気穿孔装置１０の概念図である。
【図５】電気穿孔装置１０の回路の一例を示す図である。
【図６】電気穿孔装置１０の回路の一例を示す図である。
【図７】電気穿孔装置１０の回路の一例を示す図である。
【図８】電気穿孔装置１０の回路の一例を示す図である。
【図９】実施例１の電気穿孔装置１の保持部２、放電発生部３、及び導電部４の模式図である。
【図１０】組み立て前の実施例１の電気穿孔装置１の保持部２、放電発生部３、及び導電部４との写真である。
【図１１】組み立て後の実施例１の電気穿孔装置１の保持部２及び放電発生部３の写真である。
【図１２】組み立て後の実施例１の電気穿孔装置１の写真である。
【図１３】実施例１の電気穿孔装置１により、条件１〜３で蛍光蛋白コード遺伝子を導入した７日後の観察画像であって、明視野における顕微鏡観察画像（観察倍率、対物レンズ２０倍）、蛍光視野における蛍光画像（観察倍率２０倍）、及び明視野の画像と蛍光視野の蛍光画像とを重ね合わせた重ね合わせ画像を示す図である。
【図１４】実施例２の電気穿孔装置１の保持部２、放電発生部３、及び導電部４の模式図である。
【図１５】組み立て後の実施例２の電気穿孔装置１の保持部２及び放電発生部３の写真である。
【図１６】実施例２の電気穿孔装置１を用いて遺伝子導入操作された標的細胞（条件４）の導入操作の翌日の蛍光観察結果と、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００試薬を用いてリポフェクション法により遺伝子導入操作された標的細胞（ポジティブコントロール）の蛍光観察結果とを示す図である。
【図１７】変形例の電気穿孔装置１の保持部２、放電発生部３、及び導電部４の模式図である。
【図１８】変形例の電気穿孔装置１の保持部２、放電発生部３７、及び導電部４の模式図である。
【図１９】組み立て後の実施例３の電気穿孔装置１０の写真である。
【図２０】実施例３の電気穿孔装置１０により、条件６〜８の各々で蛍光蛋白コード遺伝子を導入した操作から４日後の観察画像であって、明視野における顕微鏡観察画像（観察倍率２０倍）、及び蛍光視野における蛍光画像（観察倍率２０倍）を示す図である。
【図２１】実施例３の電気穿孔装置１０により、条件９〜１１の各々で蛍光蛋白コード遺伝子を導入した操作から９日後の観察画像であって、明視野における顕微鏡観察画像（観察倍率２０倍）、及び蛍光視野における蛍光画像（観察倍率２０倍）を示す図である。
【図２２】組み立て後の実施例４の電気穿孔装置１０の写真である。
【図２３】実施例４の電気穿孔装置１０の保持部２の模式図である。
【図２４】実施例４の電気穿孔装置１０により、条件１２、１３の各々で蛍光蛋白コード遺伝子を導入した操作から１日後、３日後、１３日後の観察画像であって、明視野における顕微鏡観察画像（観察倍率２０倍）、及び蛍光視野における蛍光画像（観察倍率２０倍）を示す図である。
【図２５】比較例と実施例５の電気穿孔装置１０との各々で蛍光蛋白コード遺伝子を導入した操作から２日後の観察画像であって、明視野における顕微鏡観察画像（観察倍率２０倍）、及び蛍光視野における蛍光画像（観察倍率２０倍）を示す図である。
【図２６】比較例と、実施例５の電気穿孔装置１０と、ネガティブコントロールとの各々で蛍光蛋白コード遺伝子を導入した操作から２日後の観察画像であって、明視野における顕微鏡観察画像に基づき、全細胞に対する死んでいる細胞の数である細胞の死亡率を比較した結果を示すグラフである。
【図２７】実施例６の電気穿孔装置１０により、ネガティブコントロール、条件１４、１５の各々で、血液のリンパＴ細胞に、山中因子遺伝子、及び山中因子遺伝子が細胞に導入され、未分化になると蛍光シグナル増強改良型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）が発現するＥＯＳ−ＥＧＦＰベクターを導入した操作から１６日後の観察画像であって、明視野における顕微鏡観察画像（観察倍率２０倍）、及び蛍光視野における蛍光画像（観察倍率２０倍）を示す図である。
【図２８】実施例７の電気穿孔装置１０により、条件１６〜１８の各々で蛍光蛋白コード遺伝子を導入した操作から２日後の観察画像から作成した画像であって、明視野における顕微鏡観察画像（観察倍率２０倍）と、ＧＦＰ及びＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）の蛍光視野における蛍光画像（観察倍率２０倍）を重ね合わせた重ね合わせ画像である。
【図２９】実施例８の電気穿孔装置１０により、条件１９及び条件２０の各々で蛍光蛋白コード遺伝子を導入した操作から１日後及び５日後の、明視野における顕微鏡観察画像（観察倍率２０倍）と、ＧＦＰの蛍光視野における蛍光画像（観察倍率２０倍）である。
【図３０】組み立て後の変形例の電気穿孔装置１０の写真である。
【図３１】変形例の電気穿孔装置１０の保持部２の模式図である。
【図３２】組み立て後の変形例の電気穿孔装置１０の写真である。
【図３３】変形例の電気穿孔装置１０を模式図である。
【図３４】外来物質導入細胞の製造工程のフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
１．電気穿孔装置１、１０
以下、本発明の好ましい実施の形態について、図面を参照して説明する。図１〜図８を参照して、本発明の電気穿孔装置１、１０について説明する。電気穿孔装置１、１０（以下、装置１、１０ともいう。）は、標的細胞内に目的の外来物質を電気的作用によって導入するよう構成された装置である。標的細胞は、外来物質を導入する対象となる細胞である。装置１、１０では、プログラムに従って矩形状のパルス電流を出力する機能を備えた高価なパルスジェネレーターは不要である。装置１、１０は、１回の処理に必要な試料の用量（標的細胞数及び外来物質量）を極めて低用量化できるよう構成されている。
【００２０】
図１〜図８に示すように、装置１、１０は各々、保持部２、放電発生部３、導電部４、電力量制御部５、及び電源部６を備える。保持部２は、外来物質及び細胞を含有する溶液（例えば、細胞懸濁液）を保持する。溶液は外来物質及び標的細胞を水系の溶液に懸濁した液体である。外来物質としては、既存の電気穿孔法で標的細胞に導入できる物質が含まれ、例えば、通常の状態では標的細胞の細胞膜を透過できない各種生理活性物質、薬剤、治療薬、核酸物質、ペプチド、及びタンパク質等が例示される。核酸物質は、例えば、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ及びガイド  ＲＮＡを含む）、ウイルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、オリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー）、及びペプチド核酸であってよい。ＤＮＡとしては、標的細胞内に導入したい核酸配列を備えたＤＮＡが適宜選択され、例えば、遺伝子の全長配列（ｃＤＮＡ配列、ゲノム配列）、部分配列、調節領域、スペーサー領域、及び変異を加えた配列等、目的に応じて設計されたＤＮＡが用いられる。ＤＮＡにコードされたポリペプチドは、該ＤＮＡが導入された標的細胞によって産生され得る。溶液に含有させる外来物質の量は、従来の電気穿孔法を実施可能な量であればよい。細胞懸濁液中の外来物質の濃度は、標的細胞の生存率と外来物質の導入効率との観点から好適には０．０５〜３（μｇ／μＬ）であり、更に好適には０．２〜３（μｇ／μＬ）であり、外来物質に応じて適宜調整される。溶液中に含まれる外来物質は１種類に限られず、溶液中に複数種類の外来物質が含まれてもよい。
【００２１】
標的細胞の種類は、特に制限されず、標的細胞として各種細胞を用いることができる。標的細胞として、例えば、植物細胞、ヒト由来細胞を含む動物細胞、及びバクテリア等が例示できる。装置１、１０は、従来の電気穿孔法にて外来物質を導入できる細胞に外来物質を導入可能である。従来の電気穿孔法にて外来物質を導入できる細胞としては、例えば、ヒト由来及びヒト以外の動物由来の体細胞、胚細胞（ＥＳ細胞）、受精卵、動物胎児組織細胞等の組織細胞、及び臓器細胞が例示される。処理に必要な標的細胞の数は、保持部２に保持させる溶液中に含まれる数だけあれば十分であり、例えば、溶液の体積が２〜５（μＬ）である場合、標的細胞の数は１×１０３〜１０５（ｃｅｌｌｓ）あればよい。
【００２２】
溶液は、水系の溶液であり、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、以下単に「ＰＢＳ緩衝液」と略す）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）等の通常の電気穿孔法で用いることのできるバッファー、及び通常の緩衝液である。溶液は、標的細胞に応じて適宜調整されればよい。標的細胞が動物細胞である場合、溶液として、動物細胞の培養に使用できる液体培地（例えば、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地、α−ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地、Ｗｉｌｌｉａｍｓ培地、ＥＳ培地等）を用いることができる。これらの液体培地は、血清濃度が低い方が血清濃度が高い場合に比べ導入効率の点で好ましく、特には無血清培地であることが望ましい。一般には、抗生物質を含まない液体培地の方が溶液として好ましい。装置１による外来物質を導入する処理の後は、液体培地に血清又は抗生物質が自由に添加されてよい。導入効率及び細胞への影響の観点からは、溶液として、ＰＢＳ緩衝液が用いられることが好ましい。溶液ｐＨは、細胞への影響を考慮して調製されるのが好ましく、例えば、ｐＨ７．０〜７．６に調製されるのが好ましい。
【００２３】
保持部２は、導電部４を介して放電発生部３と電気的に接続された一対の電極２１、２２とを備え、一対の電極２１、２２の間に溶液を保持するよう構成されてもよい。保持部２は、容器２３と、導電部４を介して放電発生部３と電気的に接続された一対の電極２１、２２とを備え、一対の電極２１、２２の間に溶液を保持するよう構成されてもよい。容器２３は、プラスチック、ガラス、及びセラミックス等の絶縁性の素材で形成され、溶液を収容する。保持部２の形状は、溶液を保持できる形状であれば、如何なる形状であってもよい。保持部２の容器形状は、例えば、円柱状、四角柱状、多角柱状、及び半球状等であってもよい。保持部２の大きさは、保持部２が保持する溶液の体積に応じて設定される。保持部２の体積は、例えば、溶液の体積の０．３〜５０倍の体積を有し、好ましくは、溶液の体積の０．５〜２０倍の体積を有し、更に好ましくは、溶液の体積の０．８〜１０倍の体積を有する。溶液の体積は、例えば、０．１（μＬ）〜１（ｍＬ）である。溶液の体積は、液滴を形成可能な量であってもよく、例えば、０．１〜５０（μＬ）の中から選択され、好ましくは、０．５〜１０（μＬ）の範囲であり、更に好ましくは１．０〜５．０（μＬ）の範囲である。溶液が保持部２によって保持されている状態で、容器２３の上端は溶液の上端よりも上に設定されることが望ましい。一対の電極２１、２２は、適度な間隔をあけて溶液に接触可能に配置されるのが望ましく、一対の電極２１、２２の間隔は例えば、０．２〜１０（ｍｍ）であり、好ましくは、０．３〜５．０（ｍｍ）であり、更に好ましくは、０．５〜２．０（ｍｍ）から選択される。一対の電極２１、２２の形状は適宜設定されればよく、例えば、棒状、板状、及び先端が半球状等であってもよい。一対の電極２１、２２の容器２３に対する配置は適宜設定されればよく、一対の電極２１、２２は各々容器２３の底面に対して交差する方向に延びる壁部に沿って配置されてもよい。一対の電極２１、２２は、容器２３の開口から底部まで延設されてもよいし、一対の電極２１、２２は、容器２３の底部から離間していてもよい。一対の電極２１、２２の厚みは適宜設定されればよく、例えば、０．１〜１０（ｍｍ）であり、好ましくは、０．２〜５．０（ｍｍ）であり、更に好ましくは、０．５〜２．０（ｍｍ）から選択される。一対の電極２１、２２の材料は、導電性を有する材料であればよく、例えば、アルミニウム、銅等の炭素よりも導電性の優れた金属が例示される。
【００２４】
溶液が比較的少量（例えば、１．０（μＬ））である場合、保持部２に保持された溶液に、放電発生部３にて発生されたアーク放電によるパルス電流が印加された場合に、溶液が蒸発する可能性がある。これを考慮し保持部２は、溶液の蒸発を防ぐため、溶液を外気から隔離するための油（オイル）で覆うための油槽を備えてもよい。油槽は、絶縁性の材料で形成され、溶液を覆う油を貯留可能な構成であればよい。油槽に貯留される油は、水と相分離し、溶液（水）よりも疎水性の物質であって、常温近傍で液体であり、絶縁性の性質を具有することが好ましい。油として、例えば、石油由来のアルカン類である鉱油、アルキルベンゼンを主成分とする絶縁油、ポリブテンを主成分とする絶縁油、アルキルナフタレンを主成分とする絶縁油、アルキルジフェニルアルカンを主成分とする絶縁油、及びシリコーンオイル等が例示される。油として、これらの油が１種又は複数種を混合して用いられてもよい。油は、絶縁性であり、且つ、溶液と混和しない疎水性液体であれば、これらの例示に限られない。油は、フッ素系不活性液体等の絶縁性不活性液体でもよい。本発明では、溶液は保持部２に保持され、容器２３の底部に沿った方向（水平方向）の移動が規制される。故に、保持部２が油槽を備える場合にも、保持部２に保持された溶液は容器２３中にあり、一対の電極２１、２２に電圧が印加されることで保持部２に保持された溶液が油槽中で移動することはない。一対の電極２１、２２、及び容器２３の少なくとも一部は、使用による劣化を考慮し、交換可能に設けられてもよい。
【００２５】
放電発生部３は、アーク放電にてパルス電流を発生し、発生されたパルス電流を、導電部４を介して、保持部２に供給するよう構成されている。放電発生部３は、所定間隔をあけて配置された一対の電極３１、３２を有する。所定間隔は、放電発生部３の設置環境、保持部２に供給するパルス電流の大きさ、インターバル、及び回数等を考慮して、適宜調整されればよく、例えば、０．２〜１５（ｍｍ）であり、好ましくは、０．３〜５．０（ｍｍ）であり、更に好ましくは、０．５〜２．０（ｍｍ）から選択される。一対の電極３１、３２の厚み（幅）は適宜設定されればよく、例えば、０．１〜１０（ｍｍ）であり、好ましくは、０．２〜５．０（ｍｍ）であり、更に好ましくは、０．５〜２．０（ｍｍ）から選択される。一対の電極３１、３２の間隔は変更可能でもよい。一対の電極３１、３２の距離が変更可能である場合、一対の電極３１、３２の内の少なくとも一方を他方に対してスライド可能にしてもよいし、電極３１、３２間の距離が互いに異なる電極対を複数用意し、複数の電極対の内の１つを螺子等で取り外し可能に固定してもよい。電極３１、３２の形状は適宜設定されればよく、先端が曲面状、球状、針状等であってもよい。一対の電極３１、３２の材料は、炭素よりも導電性の優れた材料であればよく、例えば、白金、金、アルミニウム、銅等の導電性金属が例示される。一対の電極３１、３２は、使用による劣化を考慮し、交換可能に設けられてもよい。
【００２６】
一対の電極３１、３２の周囲のイオン粒子により、一対の電極３１、３２間に暗流が生じる場合がある。放電発生部３にアーク放電が生じる条件は、暗流の影響を受けやすい。これを考慮し、装置１、１０の内の少なくとも放電発生部３が備える一対の電極３１、３２は、例えば、アルゴン等の希ガス中に配置されてもよい。
【００２７】
導電部４は、保持部２と、放電発生部３とを電気的に接続し、放電発生部３にて発生されたパルス電流を保持部２に供給する。導電部４は導電性を有する材料にて形成されればよく、例えば、アルミニウム、銅等の炭素よりも導電性の優れた金属で形成される。導電部４の幅、長さ、形状等は適宜設定されればよく、例えば、放電発生部３を形成する一対の電極３１、３２の所定間隔の５〜５００倍の長さである。導電部４は放電発生部３の電極３２と保持部２の電極２１と一体に形成されてもよい。
【００２８】
電力量制御部５は、保持部２に供給されるパルス電流の電力量を制御する。電力量制御部５は、コンデンサ５１を備える。図２及び図３に示すように、装置１のコンデンサ５１は、電源部６と、放電発生部３とに電気的に接続され、電源部６によって電圧が印加されることで蓄電し、蓄電された電荷を放電発生部３に放出する。装置１のコンデンサ５１は、電源部６に対して、放電発生部３及び保持部２と並列に接続される。図５に示すように、装置１０のコンデンサ５１は、保持部２と電気的に接続され、保持部２に供給されたパルス電流を蓄電する。装置１０のコンデンサ５１は、電源部６に対して、放電発生部３及び保持部２と直列に接続される。装置１、１０のコンデンサ５１の静電容量は各々、保持部２に供給されるパルス電流の電力量を規定する。したがって、コンデンサ５１の静電容量は、保持部２が保持する溶液に印加される静電容量を考慮して設定される。例えば、コンデンサ５１の静電容量はシリコーンオイル中の液滴３μＬが持つ静電容量の１．０〜５００倍に設定され、好ましくはコンデンサ５１の静電容量はシリコーンオイル中の液滴３μＬが持つ静電容量の１．２〜５．０倍に設定され、更に好ましくは、２．５〜３．５倍に設定される。
【００２９】
保持部２に保持された溶液に印加される静電容量は、例えば、式（１）を用いて計算できる。溶液が、体積Ｖが３．０（μＬ）であり、半径ｒの球状であると仮定した場合、溶液の静電容量Ｃは、式（１）から７．７６（ｐＦ）と算出できる。ただし真空の誘電率ε０を８．８５４×１０−１２とし、溶液の比誘電率εｓを７８とする。
Ｃ＝４πε０εｓｒ                                ・・・式（１）
＝４πε０εｓ×（３Ｖ／４π）１／３
＝４×π×８．８５４×１０−１２×７８×（（３×３×１０−６×１０−３）／４π）１／３
≒７．７６（ｐＦ）
溶液の体積Ｖが３．０（μＬ）である場合、コンデンサ５１の静電容量は、好ましくは９．３１〜３８．８（ｐＦ）に設定され、更に好ましくは１９．４〜２７．２（ｐＦ）に設定される。
【００３０】
図２、図５、及び図６に示すように、電力量制御部５は、更に暗流制御部５２を備えてもよい。暗流制御部５２は、電源部６より供給される電流を、空気中のイオン等の荷電物質を介して一対の電極３１、３２間に発生する暗流と、保持部２へ電力供給するためのコンデンサ５１を蓄電する電流との２つのみに制限することで、暗流による影響を抑制する。更に、暗流制御部５２は、コンデンサ５１を蓄電するための電流を制御することもできる。コンデンサ５１の蓄電が完了するまでの時間はコンデンサ５１に供給される電流に比例するため、暗流制御部５２により、コンデンサ５１に供給される電流を制御することで、暗流制御部５２を備える装置１、１０は、一対の電極３１、３２で発生するアーク放電のインターバルを調整可能である。図２に示す装置１の暗流制御部５２は、電源部６と放電発生部３との間に設ける。一方、図５に示す装置１０の暗流制御部５２は、保持部２に対し、コンデンサ５１と並列に接続される。図６に示す装置１０の暗流制御部５２は、放電発生部３に対し、コンデンサ５１と並列に接続される。
【００３１】
暗流制御部５２は例えば公知の電気抵抗である。電気抵抗Ｒの大きさは、式（２）から算出できる。ただし、電源部６が印加する電圧の大きさをＥ、コンデンサ５１の静電容量をＣ、暗流の大きさをＩｄとする。
Ｒ＝Ｅ／（Ｃ×ｄＶ／ｄｔ＋Ｉｄ）      ・・・式（２）
暗流制御部５２は、放電発生部３でアーク放電が発生するための最適な電気抵抗値を検討することを考慮し、可変抵抗器を備えてもよい。
【００３２】
図７に示すように、電力量制御部５は、放電発生部３に対し、逆起電力をかけるためのインダクタ（コイル）５３を、保持部２及びコンデンサ５１と並列に設けてもよい。放電発生部３において放電が生じる前は、インダクタ５３に流れる電流は理論上暗流の分の電流だけである。放電発生部３の一対の電極間の電圧が、放電発生部３の一対の電極距離（例えば１（ｍｍ））における空気の絶縁破壊電圧を超えると放電発生部３の一対の電極間で放電が生じ、放電発生部３の一対の電極が導通する。インダクタ５３は電流を一定に保とうとするので（レンツの法則）、インダクタ５３は放電発生部３に急激な電流変化が生じる場合、インダクタ５３には電流が流れないように作用する。故に、放電発生部３で放電が生じた直後はインダクタ５３へ電流が流れず、保持部２を介してコンデンサ５１へ電荷がチャージされる。コンデンサ５１へ電荷が蓄積されると、コンデンサ５１の両端電圧（コンデンサ５１に接続する２本の配線の間の電位差）がコンデンサ５１へ電荷が蓄積されていない場合に比べ高くなる。このため、コンデンサ５１に接続する配線のうち、保持部２に接続されている方の配線の電位と直流電源装置のプラス側の電位との差が小さくなり、放電発生部３での放電は停止する。インダクタ５３は電流変化を妨げる性質があるが、一定の時間（インダクタンスの時定数）が経過すると、インダクタ５３に電流が流れ始めるため、放電発生部３での放電が停止されると、コンデンサ５１の蓄積電荷はインダクタ５３を通じて放電される。この時の電流の向きは電源装置からの供給により印加される電圧とは逆向きであるため、保持部２に印加される電圧は逆方向になる。コンデンサ５１へ蓄積された電荷が放電されると、放電発生部３と保持部２との間の配線の電位が低下するため、放電発生部３の一対の電極間電圧は再度上昇する。
【００３３】
インダクタ５３のインダクタンス値は、コンデンサ５１が静電容量分の電荷を蓄積するまでインダクタ５３に電流が流れることを妨げること、及びコンデンサ５１に静電容量分の電荷が蓄積された後にインダクタ５３に電流が流れることの双方を考慮して設定される。つまり、インダクタ５３のインダクタンス値は、コンデンサ５１の充電と放電とが可能なインダクタンス値に設定される。インダクタ５３に発生する起電力は電流変化とインダクタンス値の積で表される。つまり、コイルに発生する起電力は式（３）で表される。
コイルに発生する起電力  ＝  インダクタンス値×（電流変化の大きさ／電流変化に要した時間）      ・・・式（３）
溶液中の標的細胞へ遺伝子等の外来物質を導入するために印加されるパルス電流のエネルギーは、装置１０のインダクタ５３のインダクタンス値を用いて調整できる可能性がある。
【００３４】
図８に示すように、電力量制御部５は、放電発生部３に対しインダクタ５３を、保持部２及びコンデンサ５１と並列に設け、且つ、ダイオード５４を保持部２と並列に設けてもよい。ダイオード５４は、コンデンサ５１から放電された電流が流れる方向を順方向とする。ダイオード５４の種類は適宜設定されればよく、超高速スイッチング及び高周波の整流に適したダイオードであることが好ましく、例えば、ショットキーバリアダイオードがダイオード５４として用いられる。図７に示す、ダイオード５４を備えない装置１０では、保持部２に印加されるパルス電流の波形は、減衰振動波状を示すのに対し、図８に示すダイオード５４を備える装置１０では、保持部２に印加されるパルス電流の波形は、ダイオード５４の作用により減衰振動波状のパルス電流の内のマイナス部分（コンデンサ５１からインダクタ５３へ流れる方向の電流部分）が削除された波形となる。
【００３５】
電源部６は、放電発生部３に電圧を印加するよう構成されている。電源部６は、放電発生部３にアーク放電を発生させることが可能な電圧を印加できればよく、例えば、３ｋＶ以上の直流高電圧電源である。電源部６の最大出力電圧は例えば、５ｋＶ以上であり、電源部６の最大出力電流は１．０ｍＡ以上である。図示しないが、電源部６は、電圧印加をオンとオフとに切り替えるためのスイッチと、供給される電圧を調整するためのダイヤルと、任意の時間をセットするためのタイマーとを備えてもよい。この場合装置１は、作業者により、供給される電圧がダイヤルによって設定され、タイマーに任意の時間がセットされると、スイッチがオンとなって電圧印加が開始され、タイマーにセットされた時間が終了するとスイッチがオフとなって電圧出力が停止するよう構成されてもよい。装置１、１０は各々、直流高電圧を放電発生部３に印加するための構成として、例えば、公知のインバータ回路（例えば、冷陰極管インバータ（ＣＣＦＬ回路））及び高電圧発生回路（例えば、コッククロフト・ウォルトン回路（ＣＣＷ回路））等を適宜組み合わせて用いてもよい。図８に示すように、電源部６は、コンデンサ６０を、放電発生部３及び保持部２に対し直列に設けてもよい。このようにした場合、電源部６は、コンデンサ６０の値によって放電発生部３での放電周期を変更できる。
【００３６】
電源部６から放電発生部３に印加される電圧の条件は適宜調整されてよい。装置１は、例えば、図３に例示する装置１のように所定のインターバルで周期的に放電発生部３に電圧を印加するための周期調整部９を更に備え、所定周期で放電発生部３に電圧を印加してもよい。所定周期は適宜設定されればよく、例えば、１５０〜３００（ｍｓ）の周期で、ＯＮ時間をＯＦＦ時間よりも短く設定してもよいし、ＯＮ時間をＯＦＦ時間の１／３０〜１／３程度に設定してもよい。所定周期で放電発生部３に電圧を印加する回数は、放電発生部３にてアーク放電によりパルス電流を発生させる回数と対応する。放電発生部３にてパルス電流を発生させる回数は、外来物質の導入効率と標的細胞の生存率との両立を考慮して適宜設定される。放電発生部３にてパルス電流を発生させる回数は、例えば、１〜５００回であり、好ましくは３〜２００回であり、更に好ましくは、５〜１００回である。
【００３７】
２．装置１を用いた外来物質導入細胞の製造方法
図３４に示すように、作業者は保持部２に外来物質及び細胞を含有する溶液を保持させる（保持工程、Ｓ１）。電源部６にて直流高電圧が電力量制御部５に印加されると、コンデンサ５１に蓄電される。コンデンサ５１の電圧が所定電圧に達するまで、放電発生部３の一対の電極３１、３２には電流が流れない。コンデンサ５１の電圧が所定電圧に達すると、コンデンサ５１は蓄電された電荷を放電発生部３に放出し、放電発生部３にアーク放電を生じさせる。アーク放電にて生じたパルス電流は、導電部４を介して、保持部２に供給される（供給工程、Ｓ２）。保持部２に供給されたパルス電流は保持部２の一対の電極２１、２２間を流れる。放電発生部３により所定回数アーク放電が発生された場合、処理を終了する。作業者は、保持部２に保持された溶液を回収する（回収工程、Ｓ３）。
【００３８】
３．装置１０を用いた外来物質導入細胞の製造方法
図３４に示すように、作業者は保持部２に外来物質及び細胞を含有する溶液を保持させる（保持工程、Ｓ１）。電源部６にて直流高電圧が放電発生部３に印加されると、コンデンサ５１の両端の電位差が所定値よりも大きい場合に、放電発生部３にアーク放電を生じさせる。アーク放電にて生じたパルス電流は、導電部４を介して、保持部２に供給される（供給工程、Ｓ２）。保持部２に供給されたパルス電流は保持部２の一対の電極２１、２２間を流れる。電力量制御部５のコンデンサ５１は保持部２に供給されたパルス電流を蓄電する。コンデンサ５１に蓄電された荷電がコンデンサ５１の静電容量に達すると、コンデンサ５１の両端の電位差が電源部６の供給電圧と等しくなり、放電発生部３でのアーク放電が停止する。よって、保持部２を介して流れることのできる電荷量は、保持部２に対して直列接続されたコンデンサ５１が蓄えることのできる電荷量だけとなる。放電発生部３のアーク放電が停止すると、電力量制御部５の暗流制御部５２を通してコンデンサ５１に蓄積された電荷が放電され、コンデンサ５１の両端電圧が低下し放電発生部３の電極３１、３２間の電位差が上昇する。再び放電発生部３の電極３１、３２間電位差が所定値より大きくなるとアーク放電が生じる。図７及び図８に示すように、装置１０がインダクタ５３を備える場合、保持部２及びコンデンサ５１に対し、並列接続されたインダクタ５３がコンデンサ５１に蓄積された電荷を放電する。インダクタ５３による放電時も、保持部２を介して流れる電流（保持部２に保持された溶液を通過する電荷量）はコンデンサ５１に蓄積された電荷量の分だけであるため、放電時の電力量制御もされる。放電発生部３により所定回数アーク放電が発生された場合、処理を終了する。作業者は、保持部２に保持された溶液を回収する（回収工程、Ｓ３）。
【００３９】
装置１、１０を用いた外来物質導入細胞の製造方法では、保持部２の一対の電極間に配置された液滴Ｗには、放電発生部３でアーク放電が生じた瞬間にパルス状の強電界が形成されると考えられる。液滴Ｗに形成された強電界の作用により、標的細胞の細胞膜に一過的に微小な孔が形成され、形成された孔から標的細胞に外来物質が導入されると推定される。アーク放電により発生されたパルス電流が保持部２に流れる時間は、従来のパルスジェネレーターで発生されるパルス電流のＯＮ時間に比べ、十分に小さい。より具体的には、装置１、１０は、従来のパルスジェネレーターでは発生させることが不可能なほど印加時間が短いパルス電流を発生できる。したがって、保持部２に保持された溶液中の標的細胞に印加される電力量は、従来の電気穿孔装置に比べ小さく、標的細胞に与えるダメージを小さくできると考えられる。
【００４０】
４．実施例１
図２、図９〜図１２に示す装置１を製作し、製作された装置１を用いて、外来物質導入細胞を製造した。図２に示すように、実施例１の装置１は、保持部２、放電発生部３、導電部４、電力量制御部５、及び電源部６を備える。保持部２は一対の電極２１、２２、及び容器２３を備える。放電発生部３は一対の電極３１、３２を備える。図９に示すように、一対の電極２１、２２、導電部４、及び一対の電極３１、３２は、厚みの１．０（ｍｍ）のアルミニウム板（Ａ１０００系、純アルミニウム系）を加工して製作された。一対の電極２１、２２は、鉛直方向に延びる矩形状に形成された。一対の電極３１、３２は、側面形状が向かい合う端部に向かって細い三角形状に形成された。図１０に示すように、厚さ５．０（ｍｍ）の絶縁性樹脂板（アクリル板）８に、一対の電極２１、２２、及び一対の電極３１、３２の形状、配置に合わせて鉛直方向に延びるスリットが形成された。図１１に示すように、形成されたスリットに一対の電極２１、２２、及び一対の電極３１、３２が配置された。スリットに配置された一対の電極２１、２２は、鉛直方向に延び、１．６（ｍｍ）の間隔Ｄ２をあけて配置された。一対の電極３１、３２は鉛直方向に延び、１．０（ｍｍ）の間隔Ｄ１をあけて配置された。電力量制御部５は、コンデンサ５１と、暗流制御部５２とを備える。コンデンサ５１の静電容量は２２（ｐＦ）とし、暗流制御部５２は４５（ＭΩ）の電気抵抗とした。電源部６は、３ｋＶ以上の直流高電圧電源を用いた。図１２に示すように、安全性に考慮し高電圧発生部品であるコンデンサ５１、暗流制御部５２、電源部６はプラスチックケースへ収納された。電極３１の端部１１と、電極２２の端部１２とに、プラスチックケースへ収納した部品が導電性のクリップで電気的に接続された。装置１は、全体として縦、横、高さが各々、１０（ｃｍ）、１０（ｃｍ）、１０（ｃｍ）程度の大きさであり、手のひらに載せることが可能であった。
【００４１】
溶液（細胞懸濁液）について、標的細胞はＨＥＫ２９３細胞とし、外来物質はフォルテッシモ・ルシフェラーゼ（ｆｆＬｕｃ）遺伝子とし、水系の溶液は培地ＯＰＴＩ−ＭＥＭ又はＰＢＳ緩衝液とした。ｆｆＬｕｃ遺伝子は、サイトメガロバイラス（ＣＭＶ）のプロモーター領域の下流に黄色蛍光タンパク質Ｖｅｎｕｓ（オワンクラゲ由来）と発光蛋白ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（蛍由来）の融合蛋白コード遺伝子を組み換え技術によって連結した組み換え配列を、プラスミドＤＮＡ上に持つ遺伝子である。この組み換え遺伝子を標的細胞に遺伝子導入することにより、標的細胞は蛍光シグナルを帯びる。
【００４２】
ＨＥＫ２９３細胞が直径１０（ｃｍ）のプラスチック製培養容器（培養ｄｉｓｈ）に１．５×１０５（ｃｅｌｌ／ｄｉｓｈ）の細胞密度でまかれ、高グルコースＤＭＥＭ培地で温度摂氏３７度、ＣＯ２濃度５％にてインキュベーター内で培養された。培養されたＨＥＫ２９３細胞はトリプシン処理により培養ｄｉｓｈからはがされ、ＨＥＫ２９３細胞の濃度を５×１０３（ｃｅｌｌ／μＬ）とし、ＨＥＫ２９３発現プラスミドＤＮＡの濃度を１１２（ｎｇ／  μＬ）とし、水系の溶液を培地ＯＰＴＩ−ＭＥＭ又はＰＢＳ緩衝液として細胞懸濁液が調製された。調製された細胞懸濁液で３（μＬ）の液滴Ｗが形成され、装置１０の一対の電極２１、２２、絶縁性樹脂板８で囲まれた容器２３に投入された。保持部２に保持された液滴Ｗが２０（ｃＳｔ）のシリコーンオイルにより外部から封止された条件（条件１）と、保持部２に保持された液滴Ｗがシリコーンオイルで封止されない条件（条件２、３）とが設定された。
【００４３】
保持部２に直結した放電発生部３に電圧が印加される時間は、１５秒又は３０秒に設定された。具体的には、条件１では３０秒、条件２では１５秒、条件３では３０秒間放電発生部３に電圧が印加された。放電発生部３に電圧が印加された場合、理論上３ｋＶでアーク放電される。電源部６によって放電発生部３に電圧が印加されている間、高電圧及び短時間（数マイクロ秒）のアーク放電が断続的に発生した。ネガティブコントロールとして、保持部２に電圧が印加されない条件の試料が同様に用意された。
【００４４】
保持部２に電圧を印加後、保持部２に保持された溶液が回収された。回収された溶液は、調製培地が注入された６〜２４ｗｅｌｌプラスチックボトムプレートに添加され、３７℃、ＣＯ２濃度５％の条件下で溶液中の標的細胞が培養された。培養開始２〜７日後の標的細胞は蛍光顕微鏡を用いて観察された。標的細胞は４９０ｎｍＬＥＤを光源として励起され、５１０ｎｍ付近の蛍光シグナルが２０倍の対物レンズを用いた蛍光顕微鏡を用いて計測された。図１３に示すように、条件１〜３の各々について蛍光シグナルをもつ細胞が観察され、装置１を用いた方法により標的細胞に融合蛋白コード遺伝子を形質導入できたことが確認された。図１３には示していないが、ネガティブコントロールの細胞では融合蛋白コード遺伝子による蛍光シグナルは認められなかった。
【００４５】
蛍光観察に用いた細胞を集め、全細胞数と閾値以上の蛍光シグナルを発する細胞数をイメージサイトメーター（Ｔａｌｉ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）によって計測した。蛍光シグナルの閾値は、バックグラウンドシグナルの平均値に標準偏差の２倍の値を加算した値（Ｍｅａｎ＋２ＳＤ）を用いた。バックグラウンドシグナルは、ネガティブコントロールの自家蛍光シグナルとした。全細胞数に対する上記閾値以上の蛍光シグナルを有する細胞の割合を形質導入効率として算出した。条件２の形質導入効率は１７．６７％であり、条件３の形質導入効率は１２．４２％であった。
【００４６】
以上説明したように、装置１によれば、電気的作用によって良好な導入効率で外来物質を標的細胞に導入できることが確認された。装置１は、電気的作用を利用するため、特別な試薬を必要とせず、化学的手法と比較してランニングコストを抑制できる。更に装置１は、ウイルスを用いる生物学的手法のように標的細胞に対する毒性及び抗原性に起因する癌化等の懸念がなく、良好な生存率で導入細胞を得ることができる。装置１では、汎用の電気穿孔装置に必須のプログラムに従って矩形状のパルス電流を出力する機能を備えた高価なパルスジェネレーターは不要である。装置１の構成は、簡素であるため装置１は、低コストで製造される。装置１は、オイルを使用する必要が無いため、オイルを使用しないことが好ましい試料にも適用できる。
【００４７】
５．実施例２
実施例１の装置１は、絶縁破壊電圧を無限面積の平行平板で設計した装置である。このため、先端が尖った形状を有する一対の電極３１、３２では絶縁破壊電圧が想定された電圧よりも低くなる可能性が考えられる。そこで実施例２では、図３、図１４、及び図１５に示すように、放電発生部３の一対の電極３１、３２の先端形状を半円状に設計した装置１を製作し、製作された装置１を用いて、外来物質導入細胞を製造した。実施例２の装置１は、保持部２、放電発生部３、導電部４、電力量制御部５、及び電源部６を備える。図１４、図１５に示すように、保持部２は一対の電極２１、２２、容器２３、及び油槽２７を備える。放電発生部３は、一対の電極３１、３２を備える。一対の電極２１、２２、導電部４、及び一対の電極３１、３２、厚みの１．０（ｍｍ）のアルミニウム板（Ａ１０００系、純アルミニウム系）を加工することで、製作された。
【００４８】
容器２３は絶縁性樹脂板（アクリル板）８が加工されることで、直径Ｄ４が１．６（ｍｍ）、深さＨ１が２．０（ｍｍ）の円柱状に形成された。油槽２７は、容器２３の上端を底面の高さとする、直径Ｄ５が１０〜１２（ｍｍ）、深さＨ２が６〜１０（ｍｍ）の円柱状に形成された。容器２３は油槽２７の底部の略中心に設けられた。一対の電極２１、２２は、容器２３に収容される部分は鉛直方向に延び、油槽２７に収容される部分は、上下方向において容器２３から離れるほど（上側ほど）互いに離間する円弧状に形成された。一対の電極３１、３２は、互いに対向する側の面が凸となる半球状に形成された。厚さ１０（ｍｍ）の絶縁性樹脂板８に、一対の電極２１、２２、及び一対の電極３１、３２の配置、及び形状に合わせてスリットが形成された。図１５に示すように、形成されたスリットに一対の電極２１、２２、及び一対の電極３１、３２が配置された。一対の電極２１、２２は、鉛直方向に延び、１．０（ｍｍ）の間隔Ｄ４をあけて配置された。一対の電極３１、３２は鉛直方向に延び、１．０（ｍｍ）の間隔Ｄ３をあけて配置された。電力量制御部５は、コンデンサ５１を備える。コンデンサ５１の静電容量は２００（ｐＦ）とした。実施例１の装置１と同様に、安全性に考慮し高電圧発生部品であるコンデンサ５１はプラスチックケースへ収納した。電極３１の端部１１と、電極２２の端部１２とに、プラスチックケースへ収納した部品が導電性のクリップで電気的に接続された。
【００４９】
実施例２の装置１は更に、放電発生部３に電圧を印加するインターバル期間を作るための周期調整部９を備える。周期調整部９は、制御システム（Ａｒｄｕｉｎｏ（登録商標））を含む。周期調整部９は、周期を２００（ｍｓ）に設定し、インターバルとして１９０（ｍｓ）（条件４）、１８０（ｍｓ）（条件５）の２つの条件が設定された。
【００５０】
溶液（細胞懸濁液）について、標的細胞はＨＥＫ２９３細胞とし、外来物質はｐＣＸＬＥ−ＥＧＦＰ遺伝子とし、水系の溶液は培地ＯＰＴＩ−ＭＥＭバッファーとした。ｐＣＸＬＥ−ＥＧＦＰ遺伝子は、ＣＭＶ（サイトメガロバイラス）のプロモーター領域の下流に緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰコード遺伝子を組み換え技術によって連結した組み換え配列をプラスミドＤＮＡ上に持つ遺伝子である。この組み換え遺伝子を細胞に遺伝子導入することにより、細胞が蛍光シグナルを帯びる。
【００５１】
ＨＥＫ２９３細胞が直径１０（ｃｍ）のプラスチック製培養ｄｉｓｈに１．５×１０４（ｃｅｌｌ／ｄｉｓｈ）の細胞密度でまかれ、高グルコースＤＭＥＭ培地で温度摂氏３７度、ＣＯ２濃度５％の条件にてインキュベーター内で培養された。
【００５２】
培養されたＨＥＫ２９３細胞がトリプシン処理により培養ｄｉｓｈからはがされ、ＨＥＫ２９３細胞の濃度を１×１０４（ｃｅｌｌ／μＬ）とし、ｐＣＸＬＥ−ＥＧＦＰプラスミドＤＮＡの濃度を１００（ｎｇ／  μＬ）とし、水系の溶液を培地ＯＰＴＩ−ＭＥＭバッファーとする条件で細胞懸濁液が調製された。調製された細胞懸濁液の４（μＬ）の液滴Ｗが、装置１の容器２３に投入された。条件４、５は何れも、保持部２に保持された液滴Ｗがシリコーンオイル等のオイルで封止されない条件とされた。
【００５３】
保持部２に導電部４を介して電気的に接続された放電発生部３に上記条件４、５の周期で１０回電圧が印加された。ネガティブコントロールとして、電圧を印加しない細胞懸濁液が用意された。ポジティブコントロールとしてリポソームとしてｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ）を用いたリポフェクション法にてｐＣＸＬＥ−ＥＧＦＰ遺伝子が形質導入された細胞が用意された。
【００５４】
各条件で処理された試料は、温度摂氏３７度、５％ＣＯ２の条件で細胞が培養された後、４９０ｎｍＬＥＤを光源として励起され、標的細胞の５１０ｎｍ付近の蛍光シグナルが２０倍の対物レンズの蛍光顕微鏡を用いて計測された。ネガティブコントロールでは、標的細胞から蛍光タンパク質の発現による蛍光シグナルが検出されず、図１６に示すように、ポジティブコントロールでは、標的細胞から蛍光タンパク質の発現による蛍光シグナルが検出された。条件５では、蛍光タンパク質の発現が確認されなかったが、図１６に示すように、条件４では、ポジティブコントロールと比べると、形質導入効率が低いものの、蛍光タンパク質の発現が確認できた。装置１０においても、装置１と同様の結果が得られると考えられる。
【００５５】
６．実施例３
実施例３では、図７、図１９に示すように、市販の１（ｍｍ）のギャップを持つキュベットを放電発生部３として使用した装置１０を製作し、製作された装置１０を用いて、外来物質導入細胞を製造した。実施例３の装置１０は、保持部２、放電発生部３、導電部４、電力量制御部５、及び電源部６を備える。保持部２として、図１４及び図１５に示す実施例２と同様の保持部２が使用された（図１９の写真中央下部）。放電発生部３として、一対の電極間の距離が１（ｍｍ）であるネッパジーン株式会社製品ＥＣ−００１Ｓが用いられた。キュベット電極は、キュベット電極用チャンバーに収容された（図１９の写真左上部）。電力量制御部５は、コンデンサ５１及びインダクタ５３を備える。インダクタ５３は、保持部２及びコンデンサ５１と並列に設けられた。実施例１の装置１と同様に、安全性に考慮し高電圧発生部品である電源部６及び電力量制御部５はプラスチックケースへ収納された（図１９の写真右上部）。電源部６として、冷陰極管インバータ（ＣＣＦＬ）とコッククロフト・ウォルトン回路（ＣＣＷ回路）とを組み合わせことで３ｋＶ以上の電圧を発生できる直流電源装置が用いられた。
【００５６】
コンデンサ５１の静電容量と、印加時間と、インダクタ５３のインダクタンスとが互いに異なる条件６〜条件１１の各々において、標的細胞はＨＥＫ２９３細胞とし、外来物質はｐＣＸＬＥ−ＥＧＦＰ遺伝子とし、水系の溶液は培地ＯＰＴＩ−ＭＥＭバッファーとし、実施例２と同様の手順で、遺伝子導入実験を行った。条件６では、コンデンサ５１の静電容量が７．３（ｐＦ）であり、印加時間が３０（ｓ）であり、インダクタ５３のインダクタンスが１０００（μＨ）である。条件７では、コンデンサ５１の静電容量が２２（ｐＦ）であり、印加時間が３０（ｓ）であり、インダクタ５３のインダクタンスが４７０（μＨ）である。条件８では、コンデンサ５１の静電容量が１１（ｐＦ）であり、印加時間が３０（ｓ）であり、インダクタ５３のインダクタンスが４７０（μＨ）である。条件９では、コンデンサ５１の静電容量が７．３（ｐＦ）であり、印加時間が２（ｍｉｎ）であり、インダクタ５３のインダクタンスが１０００（μＨ）である。条件１０では、コンデンサ５１の静電容量が７．３（ｐＦ）であり、印加時間が３０（ｓ）であり、インダクタ５３のインダクタンスが４７０（μＨ）である。条件１１では、コンデンサ５１の静電容量が７．３（ｐＦ）であり、印加時間が２（ｍｉｎ）であり、インダクタ５３のインダクタンスが４７０（μＨ）である。
【００５７】
条件６〜１１の各々について、遺伝子導入操作から４日後又は９日後、蛍光タンパク質の発現の有無を確認したところ、ネガティブコントロールでは、標的細胞から蛍光タンパク質の発現による蛍光シグナルが検出されず、図２０及び図２１に示すように、条件６〜１１の各々において、標的細胞から蛍光タンパク質の発現による蛍光シグナルが検出され、蛍光タンパク質の発現が確認された。実施例３の装置１０を用いた場合の遺伝子導入効率は、１３〜２７％であった（ｎ＝１２）。このことから、実施例３の装置１０を用いることで、標的細胞の核内に、遺伝子導入できることが確認された。
【００５８】
７．実施例４
実施例４〜８では、図８、図２２、図２３に示すように、１（ｍｍ）のギャップを持つ市販のキュベットを放電発生部３として使用した装置１０を製作し、製作された装置１０を用いて、実施例２と同様の手順で（ただし、周期調整部９による放電周期の調整は行わない）、外来物質導入細胞を製造した。実施例４の装置１０は、保持部２、放電発生部３、導電部４、電力量制御部５、及び電源部６を備える。図２３に示すように、保持部２は、一対の電極２１、２２、及び載置部２４を備える。一対の電極２１、２２は、厚みの１．０（ｍｍ）のアルミニウム板（Ａ１０００系、純アルミニウム系）を加工することで、製作された。一対の電極２１、２２は、所定の間隔Ｄ２を開けて絶縁性樹脂板（アクリル板）８に保持された（図２２の写真左下部）。載置部２４は、絶縁性樹脂板８の上面の内の、一対の電極２１、２２の間となる部分である。放電発生部３として、一対の電極間の距離が１（ｍｍ）であるネッパジーン株式会社製品ＥＣ−００１Ｓが用いられた。キュベット電極は、キュベット電極用チャンバーに収容された（図２２の写真右下部）。電力量制御部５は、コンデンサ５１、インダクタ５３、及びダイオード５４を備える。インダクタ５３は、保持部２及びコンデンサ５１と並列に設けられた。ダイオード５４は、保持部２に対して並列に、且つ、コンデンサ５１からインダクタ５３に向かう方向を順方向として設けられた。ダイオード５４は、超高速スイッチング及び高周波の整流に適するショットキーバリアダイオード（ローム社製、ＳＣＳ２０５ＫＧＣ）が用いられた。実施例１の装置１と同様に、安全性に考慮し、高電圧発生部品である電源部６及び電力量制御部５はプラスチックケースへ収納した（図２２の写真上部）。電源部６として、冷陰極管インバータ（ＣＣＦＬ）とコッククロフト・ウォルトン回路（ＣＣＷ回路）とを組み合わせることで３ｋＶ以上の電圧を発生できる直流電源装置が用いられた。
【００５９】
コンデンサ５１の静電容量が互いに異なり、コンデンサ６０の静電容量と、印加時間と、インダクタ５３のインダクタンスとが互いに同じ条件１２、条件１３の各々において、標的細胞はＨＥＫ２９３細胞とし、外来物質はｐＣＸＬＥ−ＥＧＦＰ遺伝子とし、水系の溶液は培地ＯＰＴＩ−ＭＥＭバッファーとし、実施例２と同様の手順で、遺伝子導入実験を行った。４（μＬ）の細胞懸濁液の液滴Ｗは、一対の電極２１、２２の間の載置部２４に載置された。条件１２、条件１３では、コンデンサ６０の静電容量が０（ｐＦ）であり、印加時間が３０（ｓ）であり、インダクタ５３のインダクタンスが５（μＨ）である。条件１２では、コンデンサ５１の静電容量が３０００（ｐＦ）であり、条件１３では、コンデンサ５１の静電容量が１０００（ｐＦ）である。比較例として、従来の遺伝子導入装置であるＮＥＰＡ２１（ネッパジーン社）を用いて同様の実験を行った。
【００６０】
条件１２、１３の各々について、遺伝子導入操作から１日後、３日後、及び１３日後の各々で、蛍光タンパク質の発現の有無を確認したところ、電圧を印加しないネガティブコントロールでは、標的細胞から蛍光タンパク質の発現による蛍光シグナルが検出されず、図２４に示すように、条件１２、１３の各々において、遺伝子導入操作後、標的細胞から蛍光タンパク質の発現による蛍光シグナルが検出され、蛍光タンパク質の発現が確認された。条件１２及び条件１３では、遺伝子導入操作から１日後に導入遺伝子の発現が観察された。比較例の装置と、実施例４の装置１０を用いた場合とで、遺伝子導入操作から２日後の蛍光シグナルを蛍光顕微鏡にて観察したところ、比較例の装置の場合と、実施例４の装置１０の場合とで、遺伝子導入効率はほぼ変わらなかった。実施例４の装置１０の場合は、遺伝子導入操作から２日以降にも液体培地のｐＨ指示薬の色が、細胞が増殖し酸性に傾くことに起因するとみられる色に変化し、遺伝子導入操作後も細胞が増殖していると考えられた。これに対し、比較例の装置の場合は、遺伝子導入操作から２日以降の液体培地の色の変化は僅かであり、遺伝子導入操作後に細胞は増殖していないと考えられた。このことから、実施例４の装置１０の場合は、比較例の装置の場合に比べ、細胞毒性が非常に低く、細胞の状態がよいと考えられ、例えば、遺伝子導入操作による細胞毒性が低いことが要求される、植物細胞への遺伝子導入等にも好適に適用可能であることが示唆された。
【００６１】
８．実施例５
実施例５では、実施例４と同様の装置１０を用いて、外来物質導入細胞を製造した。標的細胞は浮遊型のヒトＨＬ６０細胞株とし、外来物質はｐＣＸＬＥ−ＥＧＦＰ遺伝子とし、水系の溶液は培地ＯＰＴＩ−ＭＥＭバッファーとし、実施例２と同様の手順で、遺伝子導入実験を行った。４（μＬ）の細胞懸濁液の液滴Ｗは、一対の電極２１、２２の間の載置部２４に載置された。コンデンサ６０の静電容量が０（ｐＦ）であり、コンデンサ５１の静電容量が２０００（ｐＦ）であり、印加時間が３０（ｓ）であり、インダクタ５３のインダクタンスが５（μＨ）とした。比較例として、従来の遺伝子導入装置であるＮＥＰＡ２１（ネッパジーン社）を用いて同様の実験を行った。
【００６２】
図２５に示すように、比較例の装置を用いた場合と、実施例５の装置１０を用いた場合とで、遺伝子導入操作から２日後の蛍光シグナルを蛍光顕微鏡にて観察したところ、比較例と、実施例５の各々において、標的細胞から蛍光タンパク質の発現による蛍光シグナルが検出され、蛍光タンパク質の発現が確認された。電圧を印加しないネガティブコントロールでは、標的細胞から蛍光タンパク質の発現による蛍光シグナルが検出されなかった。比較例の装置と、実施例５の装置１０を用いた場合とで、遺伝子導入操作から２日後の蛍光シグナルを蛍光顕微鏡にて観察したところ、比較例の装置と、実施例５の装置１０とで、遺伝子導入効率はほぼ変わらなかった。しかしながら、死細胞をトリパンブルーにて染色し、明視野画像を用い、全細胞に対する死細胞の数である細胞の死亡率を比較した結果、両者に大きな差がみられた。具体的には、図２６に示すように、比較例の装置の場合は、細胞の死亡率が１５．８％（±６．５）であるのに対し、実施例５の装置１０の場合は、細胞の死亡率が３．４％（±０．８）であり、比較例の装置の場合に比べ、実施例５の装置１０の場合は、細胞毒性が非常に低く、細胞の状態がよいと考えられた。実施例５の装置１０の場合の細胞の死亡率は、細胞懸濁液に電圧を印加しないネガティブコントロールの細胞の死亡率である４．４％（±０．１）と同等であった（ｎ＝３）。
【００６３】
９．実施例６
実施例６では、実施例４と同様の装置１０を用いて、ｉＰＳ細胞を製造した。標的細胞は、血液のリンパＴ細胞とし、外来物質は山中因子遺伝子（ＯＣＴ−３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｌ−ＭＹＣ）と、山中因子遺伝子が細胞に導入され、未分化になると緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）が発現するマーカーであるＥＯＳ−ＥＧＦＰベクターとし、水系の溶液は培地ＯＰＴＩ−ＭＥＭバッファーとした。標的細胞は、４（μＬ）の細胞懸濁液の液滴Ｗ内に約８万個となるように調製し、実施例２と同様の手順で、遺伝子導入実験を行った。４（μＬ）の細胞懸濁液の液滴Ｗは、一対の電極２１、２２の間の載置部２４に載置された。条件１４では、コンデンサ６０の静電容量が４０００（ｐＦ）であり、コンデンサ５１の静電容量が１０００（ｐＦ）であり、印加時間が１５（ｓ）であり、インダクタ５３のインダクタンスが５（μＨ）とした。条件１５では、コンデンサ６０の静電容量が１５００（ｐＦ）であり、コンデンサ５１の静電容量が５００（ｐＦ）であり、印加時間が１５（ｓ）であり、インダクタ５３のインダクタンスが１０（μＨ）とした。細胞懸濁液に電圧を印加しない条件をネガティブコントロールとした。
【００６４】
図２７に示すように、各条件について、遺伝子導入操作から１６日後の蛍光シグナルを蛍光顕微鏡にて観察したところ、実施例６の条件１４及び条件１５の各々において、標的細胞から蛍光タンパク質の発現による蛍光シグナルが検出され、遺伝子導入後蛍光タンパク質の発現が確認された。電圧を印加しないネガティブコントロールでは、標的細胞から蛍光タンパク質の発現による蛍光シグナルが検出されなかった。実施例６の結果から、実施例６の装置１０は、ｉＰＳ細胞の製造にも好適に利用できることが確認された。
【００６５】
１０．実施例７
実施例７では、実施例４と同様の装置１０を用いて、ゲノム編集と多重遺伝子導入とが可能であるかを確認した。標的細胞は、ＨＥＫ２９３細胞とし、外来物質は、ゲノム編集を行うためのＣＡＳ９酵素と赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）が発現するＣａｓ９−ＲＦＰ  Ｌｅｎｔｉ  Ｐｌａｓｍｉｄ  （Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）と、ゲノム編集された場合にＧＦＰが発現する２種類のｐｌａｓｍｉｄＤＮＡであるｐＸ３３０−Ｃｅｔｎ１／１及びｐＣＡＧ−ＥＧｘｘＦＰ−Ｃｅｔｎ１（Ａｄｄｇｅｎｅ社製、大阪大学井川研究室提供）とし、水系の溶液は培地ＯＰＴＩ−ＭＥＭバッファーとし、実施例２と同様の手順で、遺伝子導入実験を行った。４（μＬ）の細胞懸濁液の液滴Ｗは、一対の電極２１、２２の間の載置部２４に載置された。条件１６では、コンデンサ６０の静電容量が０（ｐＦ）であり、コンデンサ５１の静電容量が３０００（ｐＦ）であり、印加時間が６０（ｓ）であり、インダクタ５３のインダクタンスが５（μＨ）とした。条件１７では、コンデンサ６０の静電容量が０（ｐＦ）であり、コンデンサ５１の静電容量が２０００（ｐＦ）であり、印加時間が６０（ｓ）であり、インダクタ５３のインダクタンスが５（μＨ）とした。条件１８では、コンデンサ６０の静電容量が４０００（ｐＦ）であり、コンデンサ５１の静電容量が１０００（ｐＦ）であり、印加時間が６０（ｓ）であり、インダクタ５３のインダクタンスが５（μＨ）とした。細胞懸濁液に電圧を印加しない条件をネガティブコントロールとした。
【００６６】
条件１６〜１８について、遺伝子導入操作から２日後の蛍光シグナルを蛍光顕微鏡にて観察した。ＧＦＰの蛍光シグナルは、水銀ランプ光源が光源とされ、４９０ｎｍ波長付近の励起光がフィルターを介して照射されて、５１０ｎｍ波長付近の緑蛍光シグナルがフィルターを介して観察された。ＲＦＰの蛍光シグナルは、水銀ランプ光源が光源とされ、５９０ｎｍ波長付近の励起光がフィルターを介して照射され、６１０ｎｍ波長付近の赤蛍光シグナルがフィルターを介して観察された。条件１６〜１８の各々において、ＧＦＰの蛍光シグナルを示す標的細胞が確認された。電圧を印加しないネガティブコントロールでは、標的細胞からＧＦＰの発現による蛍光シグナルが検出されなかった。このことより、実施例７の装置１０を用いて、ＨＥＫ２９３細胞のゲノム編集が可能であることが確認された。更に、１つの標的細胞において、ＧＦＰの蛍光シグナルと  ＲＦＰの蛍光シグナルとの各々を示す細胞が確認された。図２８の最も右側の列の画像は、明視野画像、蛍光ＧＦＰ画像及び蛍光ＲＦＰ画像を重ね合わせた重ね合わせ画像であり、図２８の重ね合わせ画像において白色様で表される黄色のシグナルを示す標的細胞は、３種類のｐｌａｓｍｉｄＤＮＡが導入されたことを示す。図２８に示すように、条件１６〜１８の各々において、重ね合わせ画像から黄色のシグナルを示す細胞が確認された。このことから、実施例７の装置１０を用いて、ＨＥＫ２９３細胞に複数の外来物質を一度の遺伝子操作で導入可能（つまり、多重遺伝子導入が可能）であることが確認された。
【００６７】
１１．実施例８
実施例８では、実施例４と同様の装置１０を用いて、外来物質導入細胞を製造し、哺乳類ＨＥＫ細胞における遺伝子導入成功率を確認した。標的細胞は哺乳類ＨＥＫ細胞とし、外来物質はｐＣＭＶ−ＥＧＦＰ遺伝子とし、水系の溶液は培地ＯＰＴＩ−ＭＥＭバッファーとし、実施例２と同様の手順で、遺伝子導入実験を行った。４（μＬ）の細胞懸濁液の液滴Ｗは、一対の電極２１、２２の間の載置部２４に載置された。条件１９では、コンデンサ６０の静電容量が４０００（ｐＦ）であり、コンデンサ５１の静電容量が１０００（ｐＦ）であり、印加時間が１５（ｓ）であり、インダクタ５３のインダクタンスが５（μＨ）とした。条件２０では、コンデンサ６０の静電容量が４０００（ｐＦ）であり、コンデンサ５１の静電容量が１０００（ｐＦ）であり、印加時間が３０（ｓ）であり、インダクタ５３のインダクタンスが５（μＨ）とした。条件２１では、コンデンサ６０の静電容量が０（ｐＦ）であり、コンデンサ５１の静電容量が３０００（ｐＦ）であり、印加時間が１５（ｓ）であり、インダクタ５３のインダクタンスが５（μＨ）とした。条件２２では、コンデンサ６０の静電容量が０（ｐＦ）であり、コンデンサ５１の静電容量が３０００（ｐＦ）であり、印加時間が３０（ｓ）であり、インダクタ５３のインダクタンスが５（μＨ）とした。
【００６８】
条件１９〜２２の各々について、遺伝子導入操作から２日後の蛍光シグナルを蛍光顕微鏡にて観察したところ、実施例８の各条件において、遺伝子導入後蛍光タンパク質の発現が確認され、遺伝子導入効率は、０．０２〜０．１３％であった。各条件における遺伝子導入成功率は１００％であった。遺伝子導入成功率は、１つの細胞懸濁液を１サンプルとし、サンプル毎で遺伝子導入が成功したか否かを集計し、観察した全サンプルに対する遺伝子導入に成功したサンプル数である。従来の油中の液滴内でエレクトロポレーションを行う装置では、遺伝子導入中に装置がショートする等により、一つの液滴を回収したときの遺伝子導入成功率は、５０％程度であった。また従来の油中の液滴内でエレクトロポレーションを行う装置を用いた場合、遺伝子導入操作後２日後までに導入遺伝子の発現はほとんどみられず、遺伝子導入操作から３日後から導入遺伝子の発現が確認された。これに対し、装置１０では、実施例８における遺伝子導入成功率は１００％である。更に図２９に示すように、実施例８の装置１０を用いた場合、遺伝子導入操作から１日後には標的細胞から蛍光タンパク質の発現による蛍光シグナルが検出され、導入遺伝子の発現が確認された。このことから、装置１０を用いた場合、従来の油中の液滴内でエレクトロポレーションを行う装置に比べ、遺伝子導入成功率は安定していると言える。
【００６９】
上記実施形態の装置１、１０及び外来物質導入細胞の製造方法では、以下の効果が得られる。装置１、１０は、外来物質及び細胞を含有する溶液を油中で往復運動させることなく、短時間のパルス状の高電圧電流を溶液に付与できる。したがって装置１、１０は、油から試料を回収する必要が無く、油中の液滴内でエレクトロポレーションを行う装置に比べ、反応後の試料を回収する操作を簡単にできる。装置１、１０は、汎用の電気穿孔装置に必須の、プログラムに従って、矩形状のパルス電流を出力可能な高価なパルスジェネレーターは不要である。装置１、１０の構成は、簡素であるため、低コストで製造される。放電発生部３は、所定間隔で配置された一対の電極３１、３２を有し、一対の電極３１、３２間にアーク放電を発生させる。故に装置１、１０は、比較的簡単な構成で、従来に比べＯＮ時間の短いパルス状の高電圧電流を保持部２に供給できる。
【００７０】
装置１、１０では、電気穿孔と遺伝子導入の反応が、静置された溶液で行われ、溶液の往復運動の状態の影響を受けず、安定的に実施される。装置１、１０は、保持部２に保持された溶液に加わる電気的作用を利用するため、特別な試薬を必要とせず、化学的手法により標的細胞に外来物質を導入する場合と比較してランニングコストを抑制できる。更に装置１、１０は、ウイルスを用いる生物学的手法のように標的細胞に対する毒性及び抗原性に起因する、標的細胞の癌化等の懸念がない。装置１、１０は、アーク放電を利用してパルス電流を発生させることで、従来装置に比べ、標的細胞に加わるパルス電流のＯＮ時間を短時間（数マイクロ秒程度）にできる。故に、装置１、１０は、標的細胞に与える瞬間的な電力を従来装置に比べ大きくしつつ、標的細胞に加わる総電力量を従来装置に比べて小さくできるので、標的細胞に与えるダメージを従来装置に比べ抑制でき、良好な生存率で形質導入細胞を得ることができると考えられる。装置１、１０は、オイルを使用する必要が無いため、オイルの未使用が好ましい標的細胞にも適用できる。オイルの未使用が好ましい標的細胞は、例えば、特定の植物細胞が挙げられる。
【００７１】
図３に示す装置１の電力量制御部５は、電源部６と、放電発生部３とに電気的に接続され、電源部６によって電圧が印加されることで蓄電し、蓄電された電荷を放電発生部３に放出するコンデンサ５１を備える。図３に示す装置１は、保持部２に供給されるパルス電流の電力量をコンデンサ５１の静電容量により規定できる。図５〜図８に示す装置１０の放電発生部３は、電源部６と電気的に接続される。電力量制御部５は、保持部２と電気的に接続され、保持部２に供給されたパルス電流を蓄電するコンデンサ５１を備える。図５〜図８に示す装置１０は、保持部２に供給されるパルス電流の電力量をコンデンサ５１の静電容量により規定できる。装置１、１０は、３ｋＶ以上の直流高電圧を供給可能な電源部６を備える。装置１、１０は、電源部６を別途準備する必要が無い。
【００７２】
実施例２の装置１の放電発生部３の一対の電極３１、３２は、先端が球状に形成される。実施例２の装置１は他の形状の電極を有する場合に比べ、より高い放電電圧で放電発生部３にアーク放電を生じさせることができる。
【００７３】
実施例１の装置１の電力量制御部５は、放電発生部３で発生する暗流の影響を抑えるための暗流制御部５２を備える。実施例１の装置１は放電発生部３の一対の電極３１、３２間に暗流が生じる場合であっても、安定して放電発生部３にアーク放電を生じさせることができる。
【００７４】
実施例２の装置１は、周期調整部９を有し、所定のインターバルで周期的に放電発生部３に電圧を印加する。装置１はインターバルの長さ及び繰り返し回数の条件を簡単に変更できる。故に実施例２の装置１では、試料に適した反応条件の設定が容易である。実施例３の装置１０の電力量制御部５は、保持部２及びコンデンサ５１と並列に接続された、放電発生部３に対し、逆起電力をかけるためのインダクタ５３を備える。該装置１０は、インダクタ５３の作用により保持部２を介して標的細胞に正逆双方向の電圧を印加できる。
【００７５】
実施例４の装置１０の電力量制御部５は、保持部２と並列に接続され、コンデンサ５１から放電された電流が流れる方向を順方向とするダイオード５４を備える。実施例４の装置１０では、保持部２に印加されるパルスの波形は、ダイオード５４の整流作用により減衰振動波状のパルスの内のマイナス部分が削除された波形にできる。ダイオード５４を備えない実施例３の装置１０では、遺伝子導入操作から１０日後に導入遺伝子の発現が確認されたのに対し、ダイオード５４を備える実施例４の装置１０では、遺伝子導入操作から１日後には導入遺伝子の発現が確認された。このことから、ダイオード５４を備える実施例４の装置１０は、ダイオード５４を備えない装置１０に比べ、遺伝子導入操作による標的細胞へのダメージを小さくできると考えられる。
【００７６】
従来の油中の液滴内でエレクトロポレーションを行う装置は、液滴が電極間を往復運動する際に、電極と接触した液滴に電荷を与えることで、液滴内の標的細胞にエレクトロポレーションを行う（例えば、特許第６２６９９６８号公報参照）。このため該装置は、絶縁油による回路の遮断が行われ、従来の装置に比べ、低い細胞毒性での極少量の試料に対し遺伝子導入が可能である。しかしながら、上記従来の装置は、液滴の往復運動が不安定になりがちであり、遺伝子導入が安定しないという課題がある。これに対し、装置１、１０は、反応場である溶液（細胞懸濁液）を静置した状態で、油中液滴で形質導入を行う場合と類似の条件の下で、溶液に電荷を与えることを可能にした。つまり、装置１、１０は、従来の油中液滴を用いる装置での反応条件を、液滴を油中で往復運動させること無く再現することに成功した。装置１、１０は、絶縁オイルフリーの状態で溶液に電荷を付与できるので、標的細胞へのオイルの影響をなくすことができる。更に装置１、１０では、アーク放電の各種条件（保持部２に供給するパルス電流の電力量、電圧の大きさ、及び放電発生部３に電圧を印加する周期など）を自由に設定することが可能であり、試料に最適な条件をシステマティックに探索できる。故に装置１、１０は、従来の装置に比べ、より汎用性が高い。しかも装置１、１０は、全体として１０（ｃｍ）×１０（ｃｍ）×１０（ｃｍ）程度の大きさに収めることができ、携帯可能である。
【００７７】
本発明の電気穿孔装置及び外来物質導入細胞の製造方法は、上記した実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において種々変更が加えられてもよい。電気穿孔装置は保持部、放電発生部、導電部、及び電力量制御部を備えればよく、他の構成は適宜変更、省略されてよい。実施例１〜８に示した技術は、それぞれ電気回路形態と放電発生部の形状等が異なるが、装置の一部又は全部を適宜組み合わせても使用可能である。標的細胞に供給される電力量が高まることで、細胞毒性が高まることを抑制するために、放電発生部と保持部との間には、電気抵抗、分圧用又は静電容量の制限を行うコンデンサの少なくとも何れかを設けてもよい。電気穿孔装置の大きさは処理対象となる溶液の体積等に応じて適宜変更されてよい。電気穿孔装置の保持部、放電発生部、導電部、及び電力量制御部の数は適宜変更されてよい。例えば、電気穿孔装置は、１つの放電発生部に対し、複数個の保持部を直列又は並列接続してもよい。
【００７８】
放電発生部３は一対の電極の所定間隔を変更可能に形成されてもよい。装置１は、例えば、放電発生部３の一対の電極の内の少なくとも一方を他方に対してスライド可能にしてもよい。具体的には、図９に示す装置１の構成を図１７に示す変形例のように変更してもよい。図１７に示す変形例の放電発生部３は、電極３１を配置するためのスリット８１の左右方向の長さを電極３１のスライド可能範囲に合わせて形成することで、一対の電極３１、３２の内の一方の電極３１を他方の電極３２に対してスライド可能である。同様に保持部２は一対の電極２１、２２の間隔を変更可能に形成されてもよい。例えば、図９に示す装置１０の構成を図１７に示すように変更してもよい。図１７に示す変形例の保持部２は、電極２２を配置するためのスリット８２の左右方向の長さを電極２２のスライド可能範囲に合わせて形成することで、一対の電極２１、２２の内の一方の電極２２を他方の電極２１に対してスライド可能である。電気穿孔装置は、保持部及び放電発生部の少なくとも何れかが備える一対の電極の双方を電極間の距離を変更する方向にスライド可能としてもよい。
【００７９】
他の例では、放電発生部が備える一対の電極間の距離が互いに異なる電極対を複数用意し、複数の電極対の内の１つを螺子等で取り外し可能に固定することで、一対の電極の所定間隔を変更可能に形成されてもよい。例えば、図１４に示す装置１の構成を図１８に示すように変更してもよい。変形例の放電発生部３７は、電線３９、装着部６３、電極３２、複数の電極３５、３６、取付板６１を備え、アーク放電を発生させる一対の電極の内の一方の電極として、複数の電極３５、３６の中から選択された１つを装着部６３に取り外し可能に固定する。装着部６３は電線３９の近傍に設ける。複数の電極３５、３６は各々、取付板６１に固定されている。複数の電極の数は適宜変更されてよい。取付板６１は螺子６４で装着部６３に固定される。取付板６１が装着部６３に固定された状態では、各複数の電極３５、３６は、電線３９と電気的に接続される。取付板６１が装着部６３に固定された状態では、各複数の電極３５、３６と電極３２の間の距離Ｄ１は互いに異なる。作業者は、複数の電極３５、３６の中から放電発生部３７が備える一対の電極間の所定距離が所望の長さになる電極を選択し、装着部６３に固定する。取付板６１を装着部６３で固定する場合、電極３２に対して、電極間の距離が所望の距離になるように、一方の電極の位置を決めやすい。電気穿孔装置は、放電発生部が備える一対の電極の双方を、該一対の電極と電気的に接続する電線に対して取り外し可能に構成してもよい。図１７及び図１８に示す変形例において、放電発生部の電極の先端形状、大きさ、及び配置、並びに保持部の電極の形状、大きさ、及び配置は適宜変更されてよい。
【００８０】
放電発生部の一対の電極にアーク放電が発生する条件は、周囲に存在する気体の組成、湿度等により影響を受ける。このため、周囲の雰囲気の影響を低減させて、安定してアーク放電を生じさせるために、放電発生部は、密閉容器に配置され、乾燥空気、アルゴン等の希ガス雰囲気中に配置されてもよい。その場合、例えば、図１８に示すように電気穿孔装置は、放電発生部３７を囲う空間を密閉可能な容器８５を備え、容器８５内を乾燥空気、希ガス等で充たしてもよい。放電発生部を外界の環境とできる限り分離するために、放電発生部は、一対の電極を備える市販のエレクトロポレーション用キュベット、及びフィラメントを切断した電球等であってもよい。
【００８１】
電気穿孔装置は、保持部、放電発生部、導電部、及び電力量制御部の少なくとも何れかを着脱可能に構成してもよい。電気穿孔装置は、例えば、図１４に示す装置１の構成を図１８に示すように変更し、保持部２の容器２３及び一対の電極２１、２２を着脱可能としてもよい。図１８に示す変形例では、電気穿孔装置の保持部２は、着脱可能な容器２３及び一対の電極２１、２２を有する。容器２３は、絶縁性部材で有底円筒状に形成される。一対の電極２１、２２は容器２３の側面に沿って上下方向に延びる。図１８下に示すように、容器２３は、凹部２５に着脱可能に収容される。容器２３が凹部２５に収容された場合には、一対の電極２１、２２は各々導電部４に電気的に接続する。電気穿孔装置が着脱可能な保持部を備える場合、例えば、他試料のコンタミネーション等を考慮して、保持部を使い捨てることもできる。電気穿孔装置は、保持部の劣化等に応じて、保持部を取り替えることができる。放電発生部を取り替え可能とした場合、放電発生部一対の電極の表面に酸化皮膜が生じる等の劣化が生じる場合にも、新たな部品に取り替えることで、放電発生部の劣化の影響を排除した同様の条件にて一対の電極間でアーク放電させることができる。電気穿孔装置は、電源部を省略してもよい。その場合、電源部は電気穿孔装置とは別途準備され、電気穿孔装置と接続されればよい。
【００８２】
電気穿孔装置において、保持部、放電発生部、導電部、及び電力量制御部の配置は適宜変更されてよい。例えば、図３０及び図３１に示す変形例の電気穿孔装置のように、実施例４の装置１０において、保持部２、導電部４及び電力量制御部５は、放電発生部３の周囲を囲い、上下方向に延びる壁面に固定されてもよい。この場合、保持部２は、一対の電極２１、２２、及び載置部２４を備え、一対の電極２１、２２は、上下方向に所定の間隔Ｄ２を開けて絶縁性樹脂板８に保持されてもよい（図３０の写真中央下部）。図３１に示すように、所定量の細胞懸濁液の液滴Ｗが載置される載置部２４は、一対の電極２１、２２の内の、下側に配置された電極２１の上面であってもよい。図３０及び図３１に示す変形例の装置１０では、保持部２、導電部４及び電力量制御部５を、放電発生部３の近縁に配置することで、実施例４の装置１０に比べ導電部４の抵抗を小さくでき、保持部２に印加されるパルス電流を安定させることができる。実施例４の装置１０において、コンデンサ６０は適宜省略されてよい。図３２及び図３３に示す変形例の装置１０に示すように、装置１０は、保持部２、コンデンサ５１、及びインダクタ５３を備える液滴保持ユニット４１、コンデンサ６０を備える追加コンデンサユニット４２、電源ＳＷを含む電源部６と、放電発生部３と、ダイオード５４とを備える本体ユニット４３の３ユニットで構成されてもよい。液滴保持ユニット４１と追加コンデンサユニット４２とは、本体ユニット４３へマグネットなどで取り外し可能に固定されてもよい。装置１０は、各ユニット４１〜４３間の電気的接続のため、本体ユニット４３の上面にポゴピン電極などを備えてもよく、ポゴピン電極を介して、液滴保持ユニット４１の底面に備えた電極と、追加コンデンサユニット４２の底面に備えた電極との各々に接続されてもよい。図３２及び図３３に示す変形例の装置１０では、コンデンサ５１、インダクタ５３の条件を変更した液滴保持ユニット４１と、コンデンサ６０の静電容量の条件を変更した追加コンデンサユニット４２を複数作製することで、条件の変更が容易となる。
【符号の説明】
【００８３】
１、１０：電気穿孔装置
２：保持部
３、３７：放電発生部
４：導電部
５：電力量制御部
６：電源部
８：絶縁性樹脂板
９：周期調整部
２１、２２、３１、３２、３５、３６：電極
２３：容器
２７：油槽
３９：電線
５１、６０：コンデンサ
５２：暗流制御部
５４：ダイオード
【国際調査報告】
2020130106.tif 000037
2020130106.tif 000038
2020130106.tif 000039
2020130106.tif 000040