(57)【要約】  S-アデノシルメチオニンが、脱メチル化された後、メタノール由来のメチル基を転移して得られたメチオニンから変換して再生されることを特徴とする、S-アデノシルメチオニンのリサイクル方法。本発明によれば、メタノールを添加することで、S-アデノシルメチオニン（SAM）を再生することが可能になるため、各種のメチル化反応への適用拡大が図られることから、医薬品製造、化学品製造、機能性化合物製造などに関連する分野に極めて有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
S-アデノシルメチオニンが、脱メチル化された後、メタノール由来のメチル基を転移して得られたメチオニンから変換して再生されることを特徴とする、S-アデノシルメチオニンのリサイクル方法。
【請求項２】
S-アデノシルメチオニンが、脱メチル化されてS-アデノシルホモシステインに変換され、次いでホモシステインに変換される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
S-アデノシルメチオニンの脱メチル化が、S-アデノシルメチオニン依存性のメチラーゼを介して行われる、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
メタノール由来のメチル基が、メタノールにメタノールデヒドロゲナーゼまたはメタノールオキシダーゼを反応させて得られる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
メチラーゼ及びメタノールデヒドロゲナーゼを共発現してなる宿主生物を用いる、請求項３又は４記載の方法。
【請求項６】
メチラーゼ及びメタノールオキシダーゼを共発現してなる宿主生物を用いる、請求項３又は４記載の方法。
【請求項７】
宿主生物が、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞及び微生物から選ばれる、請求項５又は６記載の方法。
【請求項８】
宿主生物が、メチオニン又はS-アデノシルメチオニン量が増加するよう改変されたものである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
更に、アデノシン三リン酸再生用エネルギー源を添加して得られたアデノシン三リン酸を介してメチオニンから変換させる、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の方法により再生されたS-アデノシルメチオニンを、メチル基供与体として利用してメチル化反応を行うことを特徴とする、メチル化体の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の方法において使用されるための、メチラーゼとメタノールデヒドロゲナーゼまたはメタノールオキシダーゼを共発現してなる宿主生物。
【請求項１２】
メチラーゼとメタノールデヒドロゲナーゼまたはメタノールオキシダーゼとが導入された、請求項１１記載の宿主生物。
【請求項１３】
更に、メチオニン又はS-アデノシルメチオニン量が増加するよう改変された、請求項１２記載の宿主生物。
【請求項１４】
改変が、メチオニン又はS-アデノシルメチオニンの合成酵素の過剰発現、メチオニン又はS-アデノシルメチオニンの合成酵素の機能を向上させる変異、メチオニン又はS-アデノシルメチオニンの合成酵素遺伝子の発現を抑制する酵素またはタンパク質の機能を抑制する変異、メチオニン又はS-アデノシルメチオニンの合成においてフィードバック阻害を被る酵素の機能を向上する変異、S-アデノシルホモシステインの分解酵素の機能を向上させる変異、及び、ホルムアルデヒドの分解酵素の機能を抑制する変異、から選ばれる、請求項１３記載の宿主生物。
【請求項１５】
メチラーゼとメタノールデヒドロゲナーゼまたはメタノールオキシダーゼとが導入された、発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、S-アデノシルメチオニンのリサイクル方法に関する。より詳しくは、S-アデノシルメチオニンを再生してリサイクルする方法及びその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
S-アデノシルメチオニン（S-Adenosylmethionine、以降SAMと記載する）は、生体内におけるメチル基供与体としての役割を有し、核酸やタンパク質、リン脂質、ホルモン、神経伝達物質など多様な化合物のメチル化反応に関与する。SAMをメチル基供与体としたメチル化反応は、メチラーゼと呼ばれる酵素群によって触媒されるが、代謝反応データベースであるKEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）によれば、200種類以上ものメチル化酵素が存在する。この中には、ゲンタマイシンなどの抗生物質の生合成経路内で働く酵素（非特許文献１参照）や、ヒドロキシクマリン類、フラボノイド類などの多環式芳香族のメチル化を触媒する酵素（非特許文献２参照）など、複雑骨格を有した機能性分子の生合成、修飾に関与するものも多く含まれる。そこで、これらのメチラーゼ群とSAMを利用した多様な機能性分子の創出が期待されるが、SAM依存型メチラーゼが産業上応用された事例は未だない。その理由として、生体内におけるSAM再生の複雑さが挙げられる。【０００３】
SAMは、メチラーゼ反応により基質にメチル基を受け渡した後、S-アデノシルホモシステイン（S-Adenosylhomosystein、以降SAHと記載する）を経て、ホモシステインとアデニン、リボースにまで分解される（図１）。SAMの再生には、ここで生じたホモシステインを再度メチオニンへとメチル化する必要があるが、この際S-メチルメチオニンやベタイン、5-メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸など、別のメチル基供与体が要求される。しかしながら、これらのメチル基供与体の合成にはSAMが必要であり、SAMを再生するためにSAMを利用するという、代謝反応の「堂々巡り」が生じる。一方、メチル基供与体として利用可能な5-メチルテトラヒドロ葉酸（5-メチルTHF）は合成にSAMを利用しないが、その合成にはアミノ酸であるセリンやグリシンを利用する。アミノ酸はタンパク質などの生合成に重要な役割を果たすため、これらのアミノ酸をSAMの再生のみに利用することは実質的に不可能である。【０００４】
このようなSAMの供給困難性から、SAMのリサイクルに焦点をあてた研究は無く、前駆体であるメチオニンの添加や代謝阻害に関する技術（特許文献１〜２参照）や、SAMの合成・分解に関連する遺伝子の高発現や変異導入など（特許文献３〜４参照）、SAMの高生産という観点でのみ研究が行われてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−１７８４９号
【特許文献２】特開２０１１−１７７１２５号
【特許文献３】特開２００８−１７７５６号
【特許文献４】特開２００９−３４０４３号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Kim HJ, et al., J Am Chem Soc, 2013, 135, 8093-8096
【非特許文献２】Dhar K, et al., Appl Environ Microbiol, 2000, 66, 4877-4882
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、従来の方法では、ホモシステインのメチル化のためのメチル基供給という、SAMの再生に不可欠な問題の根本的解決がなされておらず、生産可能なSAMの量には限りがある。また、SAMを試薬として使用するには高価なため、更なる技術の開発が求められていた。【０００８】
本発明は、S-アデノシルメチオニン（SAM）を再生してリサイクルする方法及びその利用に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するため鋭意検討した結果、本発明者らは、メタノールを初発メチル基供与体として供給し、ホモシステインからSAMへの再生を促す経路を稼動させることにより、SAMのメチル基の入口（供給側）と出口（需要側）が一本化されたSAMリサイクル経路を初めて作製することに成功した。【００１０】
すなわち、本発明は、以下の〔１〕〜〔１５〕に関する。
〔１〕  S-アデノシルメチオニンが、脱メチル化された後、メタノール由来のメチル基を転移して得られたメチオニンから変換して再生されることを特徴とする、S-アデノシルメチオニンのリサイクル方法。
〔２〕  S-アデノシルメチオニンが、脱メチル化されてS-アデノシルホモシステインに変換され、次いでホモシステインに変換される、前記〔１〕記載の方法。
〔３〕  S-アデノシルメチオニンの脱メチル化が、S-アデノシルメチオニン依存性のメチラーゼを介して行われる、前記〔１〕又は〔２〕記載の方法。
〔４〕  メタノール由来のメチル基が、メタノールにメタノールデヒドロゲナーゼまたはメタノールオキシダーゼを反応させて得られる、前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕  メチラーゼ及びメタノールデヒドロゲナーゼを共発現してなる宿主生物を用いる、前記〔３〕又は〔４〕記載の方法。
〔６〕  メチラーゼ及びメタノールオキシダーゼを共発現してなる宿主生物を用いる、前記〔３〕又は〔４〕記載の方法。
〔７〕  宿主生物が、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞及び微生物から選ばれる、前記〔５〕又は〔６〕記載の方法。
〔８〕  宿主生物が、メチオニン又はS-アデノシルメチオニン量が増加するよう改変されたものである、前記〔７〕記載の方法。
〔９〕  更に、アデノシン三リン酸再生用エネルギー源を添加して得られたアデノシン三リン酸を介してメチオニンから変換させる、前記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の方法。
〔１０〕  前記〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の方法により再生されたS-アデノシルメチオニンを、メチル基供与体として利用してメチル化反応を行うことを特徴とする、メチル化体の製造方法。
〔１１〕  前記〔１〕〜〔１０〕のいずれかに記載の方法において使用されるための、メチラーゼ及びメタノールデヒドロゲナーゼまたはメタノールオキシダーゼを共発現してなる宿主生物。
〔１２〕  メチラーゼとメタノールデヒドロゲナーゼまたはメタノールオキシダーゼとが導入された、前記〔１１〕記載の宿主生物。
〔１３〕  更に、メチオニン又はS-アデノシルメチオニン量が増加するよう改変された、前記〔１２〕記載の宿主生物。
〔１４〕  改変が、メチオニン又はS-アデノシルメチオニンの合成酵素の過剰発現、メチオニン又はS-アデノシルメチオニンの合成酵素の機能を向上させる変異、メチオニン又はS-アデノシルメチオニンの合成酵素遺伝子の発現を抑制する酵素またはタンパク質の機能を抑制する変異、メチオニン又はS-アデノシルメチオニンの合成においてフィードバック阻害を被る酵素の機能を向上する変異、S-アデノシルホモシステインの分解酵素の機能を向上させる変異、及び、ホルムアルデヒドの分解酵素の機能を抑制する変異、から選ばれる、前記〔１３〕記載の宿主生物。
〔１５〕  メチラーゼとメタノールデヒドロゲナーゼまたはメタノールオキシダーゼとが導入された、発現ベクター。【００１１】
また、本発明は、以下の〔１６〕〜〔１８〕を包含する。
〔１６〕  前記〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の方法により再生されたS-アデノシルメチオニンを使用することを特徴とする、メチル化促進方法。
〔１７〕  前記〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の方法により再生されたS-アデノシルメチオニンを使用することを特徴とする、医薬品、化学品又は機能性化合物の製造方法。
〔１８〕  前記〔１７〕記載の方法により得られた、医薬品、化学品又は機能性化合物。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、メタノールを添加することで、S-アデノシルメチオニン（SAM）を再生することが可能になるため、各種のメチル化反応への適用拡大が図られるという優れた効果が奏される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、SAMの再生経路の模式的な一例を示す図である。
【図２】図２は、本発明のSAMのリサイクル方法の一態様を示す図である。
【図３】図３は、本発明のSAMのリサイクル方法の一態様を示す図である。
【図４】図４は、導入した酵素の活性を測定した結果を示す図である。
【図５】図５は、微生物に内在性の酵素活性を確認した結果を示す図である。
【図６】図６は、大腸菌BW25113株の形質転換体による、SAMリサイクル経路を利用したエスクレチンのメチル化反応の結果を示す図である。
【図７】図７は、大腸菌BW25113株の形質転換体による、グルコースを別途添加した場合のSAMリサイクル経路を利用したエスクレチンのメチル化反応の結果を示す図である。
【図８】図８は、大腸菌BL21(DE3)株の形質転換体による、SAMリサイクル経路を利用したエスクレチンのメチル化反応の結果を示す図である。図（A）はSaOMTの単独発現株の結果、図（B）はSaOMTとCnMDH2の共発現株の結果を示す。
【図９】図９は、大腸菌におけるメチオニンおよびSAMの合成経路と、そのマスターレギュレータータンパク質であるMetJにより発現抑制を被る遺伝子を示す図である。
【図１０】図１０は、大腸菌BL21(DE3)株のmetJ遺伝子、およびfrmA遺伝子破壊による、エスクレチンのメチル化反応の強化の結果を示す図である。
【図１１】図１１は、大腸菌BL21(DE3)の派生株に、CysEおよびMetAのフィードバック阻害耐性酵素遺伝子を過剰発現した際の、エスクレチンのメチル化反応の強化の結果を示す図である。図（A）はΔmetJ株の結果、図（B）はΔmetJ ΔfrmA株の結果を示す。
【図１２】図１２は、大腸菌BL21(DE3)ΔmetJ ΔfrmAのmetA(fdr)過剰発現株において、メタノールをホルムアルデヒドに変換する様々な酵素を導入した際のエスクレチンのメチル化反応の結果を示す図である。
【図１３】図１３は、大腸菌BW25113株またはBL21(DE3)ΔmetJ ΔfrmAのmetA(fdr)過剰発現株の形質転換体による、SAMリサイクル経路を利用した様々な化合物のメチル化反応の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の、S-アデノシルメチオニン（SAM）のリサイクル方法に関して、基本原理を図２に示す。以降、SAMのメチル基の入口（供給側）と出口（需要側）が一本化されたリサイクル経路のことを、単にSAMリサイクル経路と記載することもある。ここでは、先ず、SAM依存性のメチラーゼによって、SAMがS-アデノシルホモシステイン（SAH）へと脱メチル化された後、ホモシステイン、アデニン、リボースへと分解される。一方、得られたホモシステインに対して、添加したメタノールのメチル基が、メタノールデヒドロゲナーゼによって、メチル基供与前駆体を介して転移することによりメチオニンが合成されて、当該メチオニンにアデノシン三リン酸（ATP）が作用して最終的にSAMが再生されると考えられる。なお、前記経路においては、メタノールをホルムアルデヒドに変換してメチル基を転移することができる酵素であれば使用可能であることから、メタノールデヒドロゲナーゼの代わりに、例えば、メタノールオキシダーゼを使用した場合も図２と同様の経路が確立されることになる。本発明のリサイクル経路においては、メチラーゼの種類によって多様なメチル化反応が可能になり、ひいては、様々な物質へのメチル化技術を提供することができる。
【００１５】
また、図２に示すように、メチオニンからSAMへ変換される際にATPが使用されるが、このATPは、SAMからホモシステインへ分解される際に生じたアデニンやリボースから、グルコースなどの、アデノシン二リン酸（ADP）をATPに変換するための適当なエネルギー源が存在すれば再合成することが可能であると考えられる。そこで、本発明の別の態様として、ATP再生用エネルギー源（例えば、グルコースなど）を別途添加する系として、例えば、図３に示すリサイクル経路を挙げることができる。ここでは、SAM依存性のメチラーゼによって、SAMがS-アデノシルホモシステイン（SAH）へと脱メチル化された後、ホモシステイン、アデニン、リボースへと分解される。その際に、得られたアデニン、リボースから、添加されたグルコースの代謝によって得られるエネルギーを用いることで駆動するアデノシンサルベージ合成経路を経て、ATPが再合成される。一方、得られたホモシステインに対しては、前記と同様に、添加したメタノールのメチル基が、メタノールデヒドロゲナーゼによって、メチル基供与前駆体を介して転移することによりメチオニンが合成されて、当該メチオニンに別途再合成されたATPが作用して最終的にSAMが再生されると考えられる。前記系において、メタノールデヒドロゲナーゼの代わりに、例えば、メタノールオキシダーゼを使用した場合も図３と同様の経路が確立されることが分かる。これにより、高価なATPの外部からの投入も不要となるため、より効率の高いリサイクル方法を提供することができる。アデニンとリボース、AMP、ADPを添加する場合も同様にATPが再生されて、効率よいリサイクル方法とすることができる。
【００１６】
なお、前記したリサイクル経路は一連して駆動すればよく、同じ系内で駆動するものであっても、酵素によって別々の系内で駆動するものであっても、本発明に含まれる。ただし、これらの推測は、本発明を限定するものではない。
【００１７】
本発明のS-アデノシルメチオニン（SAM）のリサイクル方法は、S-アデノシルメチオニン（SAM）が、脱メチル化された後、メタノール由来のメチル基を転移して得られたメチオニンから変換して再生されることを特徴とする。ここで、メタノール由来のメチル基とは、メタノールの反応により得られ、メタノールから脱離したメチル基を意味する。
【００１８】
本発明のリサイクル方法は、SAMが存在する系であれば特に限定なく実施することができる。SAMが存在する系としては、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、微生物（酵母、大腸菌、枯草菌、コリネ型細菌、乳酸菌等を含む）などが挙げられる。また、生きた細胞に限定されず、酵素だけを用いた物質生産系や、無細胞タンパク質合成系を利用した物質生産系など、いわゆるin vitroでの物質生産系も挙げられるが、以下には、SAMが存在する細胞における態様を例に挙げて説明する。
【００１９】
先ず、SAMから脱メチル化が行われるが、これはSAM依存性のメチラーゼ（SAM依存性のメチルトランスフェラーゼ）を介して行われる。以降、「SAM依存性のメチラーゼ」や「SAM依存性のメチルトランスフェラーゼ」のことをまとめて、単に「メチラーゼ」と記載することもある。
【００２０】
メチラーゼとしては、SAM依存性のものであれば、前記細胞に元来内在するものであっても、外来のものを導入したものであってもよい。外来のものとしては、公知のものであれば特に限定されず、被メチル化対象物に応じて公知技術に従って適宜選択して使用することができる。具体的には、DNAをメチル化する際には、公知のDNAメチラーゼを使用すればよく、例えば、Lyko, 2018, Nature Review, 19: 81-92（ヒトのDNAメチル化とエピジェネティクス（DNA塩基配列の変化を伴わない、遺伝子発現や細胞表現型の変化）の関係についての総説）やVasu and Nagaraja, 2013, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 77: 53-72.（バクテリアの制限修飾系（DNAをメチル化し、そのメチル化パターンで自己のDNAを認識し、外来のDNAを破壊する機構）に関する総説）に記載のものを使用することができる。タンパク質をメチル化する際には、公知のタンパク質メチラーゼを使用でき、例えば、Boriack-Sjodin and Swinger, 2016, Biochemistry, 55: 1557-1569（タンパク質のメチル化とエピジェネティクスに関する総説）に記載のものを使用することができる。低分子化合物や多環式芳香族をメチル化する際には、公知のメチラーゼを使用でき、例えば、Struck et al., 2012, ChemBioChem, 13: 2642-2655（カテコールのようなベンゼン環を有する化合物や、フラボノイドやアルカロイドなど多環式芳香族化合物生産など、多様なメチラーゼの応用利用についての総説）に記載のものを使用することができる。また、データベースから検索して用いてもよく、例えば、酵素情報データベースの一つであるBRENDA（https://www.brenda-enzyme）を用いて、methylaseやmethyltransferaseをキーワードに検索を行うと、400種以上の酵素種が登録されているので、これらの酵素種よりSAM依存性のメチラーゼを参照してもよい。同様に、KEGGの化合物検索（http://www.genome.jp/kegg/compound/）でSAMをキーワードに検索を行い（化合物登録番号：C00019）、SAMが関与する400種以上の反応から、Reactionの項目を参照して選択することができる。また、これらの外来メチラーゼは、被メチル化対象物をメチル化できるのであれば、その活性や機能を向上させるよう変異したものであってもよい。
【００２１】
以下にメチラーゼの具体例を示す。例えば、低分子化合物や多環式芳香族をメチル化する酵素としては、被メチル化対象物のメチル化を行う原子の種類に応じて、O-、N-、C-、S-、Se-、As-メチラーゼなどに分類される。O-メチラーゼの例としては、カフェ酸 O-メチルトランスフェラーゼ、カテコール O-メチルトランスフェラーゼ、アセチルセロトニン O-メチルトランスフェラーゼ、アピゲニン 4’-O-メチルトランスフェラーゼ、カフェロイルCoA O-メチルトランスフェラーゼ、クロロフェノール O-メチルトランスフェラーゼ、コルンバミン O-メチルトランスフェラーゼ、デメチルマクロシン O-メチルトランスフェラーゼ、3'-デメチルスタウロスポリン O-メチルトランスフェラーゼ、12-ヒドロキシジヒドロケリルビン 12-O-メチルトランスフェラーゼ、6-ヒドロキシメレイン O-メチルトランスフェラーゼ、3'-ヒドロキシ-N-メチル-(S)-コクラウリン 4'-O-メチルトランスフェラーゼ、8-ヒドロキシケルセチン 8-O-メチルトランスフェラーゼ、ヨードフェノール O-メチルトランスフェラーゼ、イソブチルアルドキシム O-メチルトランスフェラーゼ、(イソ)オイゲノール O-メチルトランスフェラーゼ、イソフラボン 4'-O-メチルトランスフェラーゼ、イソフラボン 7-O-メチルトランスフェラーゼ、イソリクイリチゲニン 2'-O-メチルトランスフェラーゼ、イソオリエンチン 3'-O-メチルトランスフェラーゼ、ジャスモン酸 O-メチルトランスフェラーゼ、ケンペロール 4'-O-メチルトランスフェラーゼ、リドカイン 2'-O-メチルトランスフェラーゼ、ロガン酸 O-メチルトランスフェラーゼ、ルテオリン O-メチルトランスフェラーゼ、マクロシン O-メチルトランスフェラーゼ、メチルケルセタゲニン 6-O-メチルトランスフェラーゼ、3-メチルケルセチン 7-O-メチルトランスフェラーゼ、ミリセチン O-メチルトランスフェラーゼ、N-ベンゾイル-4-ヒドロキシアントラニル酸 4-O-メチルトランスフェラーゼ、O-デメチルピューロマイシン O-メチルトランスフェラーゼ、6-O-メチルノルラウダノソリン 5'-O-メチルトランスフェラーゼ、フェノール O-メチルトランスフェラーゼ、ケルセチン 3-O-メチルトランスフェラーゼ、(RS)-ノルコクラウリン 6-O-メチルトランスフェラーゼ、(S)-スコウレリン 9-O-メチルトランスフェラーゼ、ステリグマトシスチン 8-O-メチルトランスフェラーゼ、タベルソニン 16-O-メチルトランスフェラーゼ、テトラヒドロコルンバミン 2-O-メチルトランスフェラーゼ、トコフェロール O-メチルトランスフェラーゼ、キサントトキソール O-メチルトランスフェラーゼなどが挙げられる。窒素原子のメチル化を行うN-メチラーゼとしては、ヒスチジン-N-α-メチルトランスフェラーゼ、(RS)-1-ベンジル-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン N-メチルトランスフェラーゼ、3-ヒドロキシ-16-メトキシ-2,3-ジヒドロタベルソニン N-メチルトランスフェラーゼ、アミン N-メチルトランスフェラーゼ、アントラニル酸 N-メチルトランスフェラーゼ、カルノシン N-メチルトランスフェラーゼ、(S)-コクラウリン N-メチルトランスフェラーゼ、ジメチルヒスチジン N-メチルトランスフェラーゼ、グリシン N-メチルトランスフェラーゼ、グアニジノ酢酸 N-メチルトランスフェラーゼ、ヒスタミン N-メチルトランスフェラーゼ、メチルアミン-グルタミン酸 N-メチルトランスフェラーゼ、ニコチンアミド N-メチルトランスフェラーゼ、ニコチン酸 N-メチルトランスフェラーゼ、フェニルエタノールアミン N-メチルトランスフェラーゼ、ホスファチジルエタノールアミン N-メチルトランスフェラーゼ、ホスファチジル-N-メチルエタノールアミン N-メチルトランスフェラーゼ、ホスホエタノールアミン N-メチルトランスフェラーゼ、プトレシン N-メチルトランスフェラーゼ、ピリジン N-メチルトランスフェラーゼ、(S)-テトラヒドロプロトベルベリン N-メチルトランスフェラーゼ、トリミチルスルホニウム-テトラヒドロ葉酸 N-メチルトランスフェラーゼ、トリプタミン N-メチルトランスフェラーゼ、チラミン N-メチルトランスフェラーゼなどが挙げられる。炭素原子のメチル化を行うC-メチラーゼとしては、フェニルピルビン酸 3C-メチルトランスフェラーゼ、3-ヒドロキシアントラニル酸 4C-メチルトランスフェラーゼ、24-メチレンステロール C-メチルトランスフェラーゼ 、ステロール 24C-メチルトランスフェラーゼ、トリプトファン 2C-メチルトランスフェラーゼ、グルタミン酸 3C-メチルトランスフェラーゼ、2-メチル-6-フィチル-1,4-ヒドロキノン メチルトランスフェラーゼなどが挙げられる。また、作用する化合物に対しての名称は付けられていないが、Streptomyces rishiriensis由来のCouO（GenBank accession number AAG29793.1）、Streptomyces spheroids由来のNovO（GenBank accession number AAF67508.1）、Streptomyces griseoviridis由来のSgvM（GenBank accession number JX508597.1）、Streptomyces chrysomallus由来のAcmI（GenBank accession number ADG27364.1）やAcmL（GenBank accession number ADG27351.1）なども挙げられる。なお、これらのメチラーゼの多くは作用する基質に対しての名称が付与されているが、メチラーゼは概して基質特性が広いことが多く、酵素の名称に記載の基質以外の基質に対しても作用が可能である。
【００２２】
前記したメチラーゼとして外来のものを使用する場合は、由来する細胞と導入対象の細胞との組み合わせは、公知の遺伝子導入方法などにより導入できるものであれば特に限定はない。
【００２３】
メチラーゼの反応条件は、実施態様の細胞と用いるメチラーゼの種類に応じて、公知技術に従って適宜選択して設定することができる。例えば、宿主生物として大腸菌や枯草菌、乳酸菌を利用する場合は、メチラーゼの種類によって特に制限されず、好ましくは30〜45℃、より好ましくは35〜40℃、更に好ましくは36〜38℃の条件で培養すればよい。宿主生物としてコリネ型細菌や酵母を利用する場合は、メチラーゼの種類によって特に制限されず、好ましくは20〜40℃、より好ましくは25〜35℃、更に好ましくは29〜31℃の条件で培養すればよい。なお、以降の反応においても、前記条件を参照して設定することができる。
【００２４】
これにより、SAMが脱メチル化されて、S-アデノシルホモシステイン（SAH）が産生される。
【００２５】
SAHは、当該細胞に存在する加水分解酵素によって分解されて、ホモシステインへと変換される。その際に、SAHがホモシステインとアデノシンに直接変換されても、SAHがS-リボシルホモシステインとアデニンに変換された後、ホモシステインとリボースに変換されてもよい。前記加水分解酵素としては、SAHを加水分解できれば特に限定はなく、例えば、ホモシステインに直接変換する場合は、アデノシルホモシステイナーゼが挙げられる。また、S-リボシルホモシステインに変換する場合は、S-アデノシルホモシステインヌクレオシダーゼが挙げられる。ここで、得られたS-リボシルホモシステインは、同じく当該細胞に存在する加水分解酵素によって分解されて、ホモシステインとリボースに変換される。前記加水分解酵素としては、S-リボシルホモシステインを加水分解できれば特に限定はなく、例えば、S-リボシルホモシステインリアーゼが挙げられる。
【００２６】
これにより、SAMが消費されて、ホモシステインが蓄積されることになる。本発明では、このホモシステインをメチオニンに変換して、SAMを再生させる。
【００２７】
ホモシステインからメチオニンへの変換は、ホモシステインにメチル基を導入すればよいが、本発明では、メタノールからホルムアルデヒドへの酸化反応を利用して行う。具体的には、メタノールに該メタノールをホルムアルデヒドに酸化する酵素として、例えば、メタノールデヒドロゲナーゼやメタノールオキシダーゼを作用させてホルムアルデヒドが得られる。こうして得られたホルムアルデヒドに付随するメチル基を、メチル基供与前駆体を介してホモシステインに転移させる。
【００２８】
メタノールからホルムアルデヒドへの酸化反応は、ホルムアルデヒドに付随するメチル基を転移させるメチル基供与前駆体が存在する系で行われる。メチル基供与前駆体としては、メチル基を受け取ることでメチル基供与体として機能するものであれば特に限定はなく、前記したSAMが存在する系と同一の系にて機能するものでも異なる系にて機能するものでもよい。例えば、同一の系にて機能するものであれば、受け取ったメチル基をそのままホモシステインに転移することができ、異なる系にて機能するものであれば、受け取ったメチル基をSAMが存在する系にてホモシステインに転移することができる。具体的には、例えば、テトラヒドロ葉酸（THF）が挙げられ、これはメチル基を受け取ると、5,10-メチレンテトラヒドロ葉酸（5,10-メチレンTHF）のメチル基供与体に変換される。
【００２９】
メタノールをホルムアルデヒドに酸化する酵素の中で、メタノールデヒドロゲナーゼとしては、アルコールデヒドロゲナーゼの中でも、メタノールをホルムアルデヒドに酸化する酵素であればよく、SAMが存在する系と同一の系に存在するものでも異なる系に存在するものでも特に限定されず、例えば、前記細胞に元来内在するものであっても、外来のものを導入してもよい。具体的には、例えば、NAD(P)+依存性アルコールデヒドロゲナーゼのうちメタノールに対して酸化活性を有する酵素、あるいはメタノールの利用性が向上した変異酵素；ピロロキノリンキノン（PQQ）依存性メタノールデヒドロゲナーゼが挙げられる。これらは、具体的には、NAD+依存性の酵素としては、Bacillus methanolicus （Krog et al., 2013, PLOS one, 8: e59188）、Bacillus stearothermophilus （Sheehan et al., 1988, Biochem. J., 252: 661-666）、Cupriavidus necator（Wu et al., 2016, Appl. Microbiol. Biotechnol., 100: 4969-4983）由来の酵素等を使用することができる。その他、Acidomonas methnolica、Bacillus coagulans、Beggiatoa alba、Desulfitobacterium hafniense、Desulfotomaculum kuznetsovii、Lysinbacillus fusiformis、Lysinibacillus sphaericus、Methylobacterium lusitanum、Methylobacterium oryzae、Methylobacterium salsuginis、Mehylococcus capsulatus、Methylomicrobium album由来の酵素等も使用することができる。NADP+依存性の酵素としては、Thermococcus hydrothermalis（Antonie et al., 1988, Eur. J. Biochem., 264: 880-889）由来の酵素等を使用することができる。本発明においては、NAD+依存性の酵素が好ましく、アクチベータータンパク質と呼ばれる、酵素活性の向上に必要なパートナータンパク質を必要とせず、単独でメタノールの酸化活性を示す酵素がより好ましい。
【００３０】
前記酵素を利用したメタノールの酸化反応としては、具体的には、例えば、NAD+依存性メタノールデヒドロゲナーゼを使用した場合、メタノールのホルムアルデヒドへの酸化反応にてNAD+がNADHに還元されるが、ここで、細胞内のNADHとNAD+の酸化還元バランスを保つためには、生じたNADHをNAD+に酸化する必要があり、5,10-メチレンTHFが5-メチルテトラヒドロ葉酸（5-メチルTHF）に変換される反応でNADHをNAD+へと酸化できる。他の酵素を使用した場合は、別途NAD+をNADHに還元するための経路設計を行うことが好ましい。
【００３１】
また、NADP+依存性の酵素では、メタノールの酸化に伴いNADPHを生じるため、NADPHをNADP+に酸化するための経路設計を要する。あるいは、PQQ依存性メタノールデヒドロゲナーゼを使用する場合には、宿主株がPQQを生産できる（あるいは生産できるように遺伝子改変を行った）株を利用することが好ましい。
【００３２】
メタノールをホルムアルデヒドに酸化する酵素の中で、メタノールオキシダーゼとしては、アルコールオキシダーゼの中でも、メタノールをホルムアルデヒドに酸化する酵素であればよく、SAMが存在する系と同一の系に存在するものでも異なる系に存在するものでも特に限定されず、例えば、前記細胞に元来内在するものであっても、外来のものを導入してもよい。具体的には、Aspergillus ochraceus、Aspergillus terreus、Byssochlamys spectabilis、Candida boidinii、Candida methanosorbosa、Candida sithepensis、Komagataella pastoris（Pichia pastoris)、Ogataea angusta（Hansenula polymorpha)、Ogataea methanolica、Ogataea minuta、Ogataea pini、Ogataea siamensis、Penicillium chrysogenum、Penicillium purpurascens、Phanerochaete chrysosporium、Phlebiopsis gigantea、Pichia putida、Poria contigua、Thermoascus aurantiacusなどの微生物由来の酵素が挙げられる。なお、メタノールオキシダーゼを使用する場合には、電子の受容体として酸素が必要であり、かつ反応で生じた過酸化水素を水へと変換できる株、あるいは変換できるように代謝改変を施された株であることが好ましい。
【００３３】
前記したメタノールをホルムアルデヒドに酸化する酵素としては、メタノールをホルムアルデヒドに酸化する活性が高いものが好ましく、例えば、予め当該活性を公知技術に従って評価して選択したものを用いてもよい。
【００３４】
また、前記したメタノールデヒドロゲナーゼやメタノールオキシダーゼとして外来のものを使用する場合は、由来する細胞と導入対象の細胞との組み合わせは、公知の遺伝子導入方法などにより導入できるものであれば特に限定はない。
【００３５】
メタノールデヒドロゲナーゼやメタノールオキシダーゼの反応条件は、実施態様の細胞と用いる酵素の種類に応じて、公知技術に従って適宜選択して設定することができる。例えば、好ましくは30〜45℃、より好ましくは35〜40℃、更に好ましくは36〜38℃の条件で培養すればよい。
【００３６】
メチル基を受け取ったメチル基供与体から、ホモシステインへのメチル基の転移は、例えば、ホルムアルデヒドよりメチル基を受け取ったメチル基供与体が、5,10-メチレンTHFの場合、生物に内在性あるいは外部より導入した5,10-メチレンTHFレダクターゼ等の酵素によって5-メチルTHFへと変換した後、メチオニン合成酵素等の酵素が作用することで行うことができる。
【００３７】
これにより、添加されたメタノールから、メチル基供与前駆体を介してホモシステインにメチル基を転移させて、メチオニンが産生される。
【００３８】
産生されたメチオニンからSAMへの変換は、ATPの存在下でSAM合成酵素の作用により行われる。ここで、ATPは別途添加して用いてもよく、前記したように、SAMからホモシステインへ分解される際に生じたアデニンやリボースを元に、グルコースなど適当なエネルギー源を反応系に添加して再合成して用いてもよい。アデニンやリボースを元にATPを再合成する方法としては、例えば、生物に内在性あるいは外部より導入したリボキナーゼの作用によりリボースをリボース5-リン酸へと変換し、ホスホリボシルピロリン酸（PRPP）合成酵素の作用によりPRPPと変換した後、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼの作用によってアデニンと縮合させ、アデノシン一リン酸（AMP）へと変換する。その後、アデニル酸キナーゼの作用によってAMPをアデノシン二リン酸（ADP）へと変換した後、グルコースが代謝される際の様々なATP合成反応（例えばホスホグリセリン酸キナーゼによる1,3-ビスホスホグリセリン酸の3-ホスホグリセリン酸への変換反応や、ホスホエノールピルビン酸のピルビン酸への変換反応）を利用して行うことができる。
【００３９】
このように、本発明では、メチラーゼ（メチルトランスフェラーゼ）とメタノールデヒドロゲナーゼまたはメタノールオキシダーゼのそれぞれが機能することでSAMを再生することができるが、これらの酵素が共発現している系（宿主）であれば、より好適にSAMの再生を行うことができる。なお、これらの酵素は、内在しているものが共発現しているものであっても、いずれか一方を、あるいは両方を導入して共発現させたものであってもよい。
【００４０】
具体的な宿主としては、例えば、原核細胞および単離された真核細胞のいずれであってもよく、好ましくは、工業用微生物（好ましくは大腸菌、コリネ菌、バチルス、シアノバクテリア、乳酸菌、酵母、糸状菌、放線菌）の細胞、植物細胞、昆虫細胞または動物細胞が挙げられる。工業用微生物の具体例としては、Escherichia属、Cupriavidus属、Pseudomonas属、Thermus属、Corynebacterium属、Bacillus属、Geobacillus属、Synechococcus属、Synechocystis属、Lactobacillus属、Lactococcus属、Bifidobacterium属、Saccharomyces属、Shizosaccharomyces属、Pichia属、Yarrowia属、Kluyveromyces属、Ogataea属、Hansenula属、Aspergillus属、Rhizopus属、Streptomyces属に属する微生物などが挙げられる。具体的には、例えば、Escherichia coli、Cupriavidus necator、Pseudomonas putida、Pseudomonas fluorescens、Thermus thermophilus、Corynebacterium glutamicum、Bacillus subtilis、Geobacillus stearothermophilus、Synechococcus sp.、Synechocystis sp.、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus casei、Lactococcus lactis、Bifidobacterium longum、Saccharomyces cerevisiae、Shizosaccharomyces pombe、Komagataella pastoris（Pichia pastoris）、Yarrowia lipolytica、Kluyveromyce lactis、Ogataea angusta（Hansenula polymorpha）、Ogataea methanolica、Ogataea minuta、Aspergillus oryzae、Rhizopus oryzae、Streptomyces lividansなどが挙げられ、なかでも、Escherichia coli、Saccharomyces cerevisiae 、Corynebacterium glutamicum、Bacillus subtilis、Lactobacillus plantarum、Lactococcus lactisが好ましい。
【００４１】
また、これらの宿主は、SAMそのものの量やリサイクル反応に供される原料を増加させる観点から、メチオニン又はSAM量（メチオニン又はSAMの存在量、産生量ともいう）が増加するよう改変されたものであってもよい。具体的には、例えば、細胞内のメチオニンやSAMの合成活性やSAHのホモシステインへの分解活性を向上させるよう改変したものであってもよいし、ホルムアルデヒドの分解活性を低下させるよう改変したものであってもよく、一例としては、メチオニン又はSAMの合成酵素を過剰発現させる改変やメチオニン又はSAMの合成酵素の機能を向上させる変異、メチオニン又はSAM合成酵素遺伝子の発現を抑制する酵素またはタンパク質の機能を抑制する変異、メチオニン又はSAMの合成においてフィードバック阻害を被る酵素の機能を向上する変異、SAHの分解酵素の機能を向上させる変異、ホルムアルデヒドの分解酵素の機能を抑制する変異などが導入されたものであってもよい。また、メチオニンやSAMの合成活性を向上させる方法としては、メチオニンやSAMの合成経路のマスターレギュレータータンパク質（例えば、MetJ）の機能を欠失させる変異を導入する手法や、該合成経路における生成反応を促進する酵素の遺伝子を過剰発現する手法、該合成経路に関係する酵素のうちフィードバック阻害を被る酵素（例えば、MetA、CysE）の遺伝子をフィードバック阻害耐性酵素遺伝子で置換する手法、フィードバック阻害耐性酵素遺伝子を過剰発現する手法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。SAHのホモシステインへの分解活性を向上させる手法としては、前記したSAHを加水分解させる酵素群の活性を向上させる手法が挙げられる（例えば、LuxS、Mtn）。また、ホルムアルデヒドの分解活性を低下させる手法としては、ホルムアルデヒドを直接ギ酸へと変換するホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（例えば、FdhA）の活性を低下させる手法、ホルムアルデヒドをグルタチオンと結合させてギ酸へと変換するための、S-ヒドロキシメチルグルタチオン合成酵素（例えば、Gfa）、S-ヒドロキシメチルグルタチオンデヒドロゲナーゼ（例えば、FrmA、ADH5、AdhC）、S-ホルミルグルタチオンヒドロラーゼ（例えば、FrmB、ESD、FghA）のいずれかの活性を低下させる手法などが挙げられる。
【００４２】
これらの宿主に、前記酵素として外来のものを導入する際には、自体公知の遺伝子工学的技術を適用できる。例えば、所望の核酸を含む発現ベクターを導入する方法が挙げられ、所望の核酸を適当な制限酵素により処理して特定部位で切断し、次いで同様に処理したプラスミドDNAと混合し、リガーゼにより再結合して得られたプラスミドDNAを導入する方法が用いられる。あるいは、目的遺伝子に適当なリンカーをライゲーションし、これを目的に適したプラスミドのマルチクローニングサイトへ挿入することによって得られた所望のプラスミドDNAを用いてもよい。また、Giboson assemblyやin-fusion、Gene-artなど、線状化したプラスミドDNAと所望の核酸との相同配列を利用して、シームレスにクローニングを行う方法を用いてもよい。このプラスミドには、細胞で発現できるのであれば、所望により、公知のプロモーター領域やリプレッサー領域を組み組むことができる。例えば、本発明においては、メチラーゼ（メチルトランスフェラーゼ）とメタノールデヒドロゲナーゼまたはメタノールオキシダーゼの遺伝子が挿入された発現ベクターを用いることができる。また、前記遺伝子以外に、細胞内のメチオニンやSAMの合成活性や、SAHのホモシステインへの分解活性を向上させる変異を導入する遺伝子を更に組み込んだ発現ベクターを用いることもできる。例えば、メチラーゼ（メチルトランスフェラーゼ）とメタノールデヒドロゲナーゼまたはメタノールオキシダーゼに加えて、MetAまたはCysEのフィードバック阻害耐性酵素、これらの一部または全ての遺伝子を組み込んだプラスミドDNAを挙げることができる。また、メチオニンやSAMの合成経路の酵素遺伝子の発現抑制を行うMetJなどの制御因子や、ホルムアルデヒドの分解酵素遺伝子を破壊するためのプラスミドや、MetAやCysEなどの内在性の遺伝子をフィードバック阻害耐性酵素遺伝子のような機能改変を行った遺伝子で置換するためのプラスミドを別途で導入することもできる。
【００４３】
得られたプラスミドDNAの宿主への導入方法は、宿主細胞にプラスミドDNAを導入して宿主細胞中で目的遺伝子を発現させ得る導入方法であれば特に限定されず、宿主細胞の種により適宜選択した公知の方法のいずれを使用してもよい。例えば、ヒートショック法、エレクトロポレーション法、酢酸リチウム法、塩化カルシウム法、リポフェクション法などを例示できる。
【００４４】
かくして得られた宿主細胞は、宿主細胞の種に適した条件で培養し、その際に、少なくともメタノールを存在させれば、本発明のSAMのリサイクル方法を実施することができる。具体的には、例えば、宿主細胞として大腸菌を用いる場合、公知の細胞培養用培地に、メタノール1mM〜10M、ATP 1〜100mM又はグルコース1mM〜1M、Tris-HCl 1〜100mM、MgSO4 0.1〜100mMを添加して培養すればよい。なお、SAMを物質のメチル化反応のメチル基供与体として利用する際には、宿主細胞そのもの、細胞抽出液、培養液又はその上清、あるいは、それらの混合物を、被メチル化対象物のメチル化反応系に混合して用いることができる。
【００４５】
よって、本発明はまた、前記本発明のリサイクル方法により再生されたSAMを、メチル基供与体として利用してメチル化反応を行うことを特徴とする、メチル化体の製造方法を提供する。被メチル化対象物としては、特に制限はなく、例えば、核酸やタンパク質、リン脂質、ホルモン、神経伝達物質、カテコール、フラボノイドやクマリンといったポリフェノール類、アルカロイド類などを挙げることができる。これらのメチル化反応は、公知技術に従って行うことができる。
【００４６】
このように、メチラーゼ（メチルトランスフェラーゼ）とメタノールデヒドロゲナーゼまたはメタノールオキシダーゼなどのメタノールをホルムアルデヒドに酸化する酵素の両酵素が機能した系において、安価なメタノールをメチル基の供給源として利用することでSAMを繰り返し用いることが可能となり、多様な物質のメチル化を効率的に実施でき、産業上においても有用であるということは、本願発明者らが初めて見出したことである。このような技術は、医薬品製造、化学品製造、機能性化合物製造などの分野において好適に実施することができる。例えば、ポリフェノール類には人体にとって様々な有用な効果が知られているが、非メチル化体は生体に吸収されにくく、体外に排出されやすい性質を有する。一方、メチル化により生体への吸収が促進され、生体内での有効性が向上することが知られている。また、メチル化により新規の機能性が付与される例も多数見出されている。例えば、アンチエイジング効果を有するレスベラトロールは、メチル化により血糖値上昇抑制効果など新たな機能が見いだされている。本発明の応用により、多様なポリフェノール類のメチル化反応を効率良く実施することが可能となることから、生体内での吸収性・有効性や機能性が向上した医薬品や機能性食品の生産が可能となり、更なる市場拡大が期待できる。また、本技術は上述のような既存の物質をメチル化して高機能化を図る用途以外にも、既存のメチル化化合物を発酵生産するための技術としても利用可能である。例えば、バニラの香りの主要成分であるバニリンは香料や香水として利用され、数億ドルもの市場を有している。安定供給が可能な糖を原料とした発酵生産にはSAMを用いたメチル化反応を必要とし、本技術の適用により効率的な発酵生産が可能になる。また、医薬品として非常に重要なオピエート（麻薬性鎮痛薬）の発酵生産にも利用できると考えられる。モルヒネやコデインは、ケシの実から抽出により得られるオピオイドであるが、天然物を原料とするため、安定的な生産・流通が困難であることが問題視されている。一方、近年ではオピオイドを大腸菌（A Nakagawa et al., Nat Commun, 2016, 7, 10390参照）や酵母（S. Galanie et al., Science, 2015, 349, 1095-1100参照）を用いて発酵生産する試みがなされている。オピオイドの合成経路は、複数回SAMを利用したメチル化反応を必要とする。現状、発酵生産では数mg/L程度のオピオイドしか得られず、実用化に至ってはいない。本技術の適用によりオピオイドの発酵生産が実用化できれば、数百億ドルという巨大なオピオイド市場へ参入することが可能になるとともに、気候変動に左右されない安定的なオピオイドの供給が可能となる。一方で、このようなSAM依存性メチラーゼを用いた物質生産においては、極めて高価なSAMを直接添加するのは現実的ではない。また、既存技術のようなSAM前駆体であるメチオニンを添加する方法では、メチル化反応を促進することはできるものの、メチオニンからSAMへの変換に必要なATPが欠乏するため、その効果は限定的である。SAMと同様、ATPもまた高価であり、その添加はやはり現実的でない。従って、安価なメタノールの添加のみでSAMをリサイクルし、また更にはグルコースなどのエネルギー源を追加して添加することで、メチル化反応に利用でき��本技術は、既存技術に対してコスト面での優勢を持つと言える。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例によって本発明を詳述するが、これらの実施例は本発明の一例であり、本発明はこれらに限定されるものではない。【００４８】
調製例１
（１）  プラスミド構築
表１に本研究で用いたプライマー配列のリスト(全て、IDT社より入手)を示す。プラスミド構築用の大腸菌宿主にはZymo Research社製Escherichia coli TG1株を用いた。O-メチルトランスフェラーゼ（OMT）、メタノールデヒドロゲナーゼ（MDH）の共発現プラスミドの構築に先立ち、ラムダPRプロモーター、およびCI857リプレッサーを用いた熱誘導型の遺伝子発現を可能とするpRCI（Ninh PH, et al., Biotechnol Bioeng., 2015, 112, 189-196参照）にマルチクローニングサイトの導入を行った。pRCIを鋳型DNAとし、プライマーpRCI-MCS_FとpRCI-MCS_Rを用いてPCRを行い、SpeIで消化した後、セルフライゲーションさせることでpRCI-MCSを構築した。構築したpRCI-MCSのマルチクローニングサイトを利用し、OMTとMDH遺伝子の導入を行った。IDT社のgblocks人工遺伝子合成受託により大腸菌様にコドン最適化を行ったStreptomyces avermitilis MA-4680由来のOMT（SaOMT5）遺伝子（NCBI accession number NC_003155）（Yoon Y, et a., J Microbiol Biotechnol, 2010, 20, 1359-136参照）を、プライマーSaOMT5_FとSaOMT5_Rを用いてPCRにより増幅した。なお、SaOMT5遺伝子は、SAM依存性のOMTである。その後、SpeIおよびSacIで消化した後、pRCI-MCSの同サイトに挿入し、pRCI-SaOMT5を得た。また、同様にしてCupriavidus necator N-1由来のMDH（CnMDH2）（GenBank accession number CP002878）のA26V、A31V、A169Vの三重変異酵素遺伝子（Wu TY, et al., Appl Microbiol Biotechnol, 2016, 100, 4969-4983参照）をコドン最適化して、人工合成した。本酵素はNAD+依存性のアルコールデヒドロゲナーゼのメタノールの利用性を向上させた変異酵素である。同遺伝子をプライマーCnMDH2_FとCnMDH2_Rを用いてPCRにより増幅し、SacIおよびXhoIで消化した後、pRCI-SaOMT5の同サイトに挿入することで、pRCI-SaOMT5-CnMDH2を得た。【００４９】
【表１】
2019160059.tif 000002
【００５０】
（２）  酵素の発現誘導
構築した種々のプラスミドをE. coli BW25113株（国立遺伝学研究所より提供）に導入した。得られた組換え大腸菌を100μg/mLのアンピシリンを含むLuria-Bertani培地を用い、30℃で好気的に培養した後、M9最小培地に10％（v/v）添加した。非誘導条件である30℃で好気的に2h培養した後、42℃にシフトさせることでSaOMT5、CnMDH2の発現誘導を行った。42℃で4h培養後、遠心分離にて菌体を回収し、50mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）で2回洗浄した後、酵素活性測定やメチル化反応実験に用いた。【００５１】
（３）  外来酵素の活性測定
調製した大腸菌菌体を用いてOMTおよびMDHのin vivoでの活性を測定した。SaOMT5の活性測定は、0.2mM エスクレチンまたはプロトカテク酸、1mM SAM、50mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）、10mM MgSO4と適当量の大腸菌菌体からなる反応液中で実施し、生成するエスクレチンやプロトカテク酸のメチル化体をHPLCにて定量した。分離用のカラムにはナカライテスク社製5C18AR-IIカラム（4.6 ID×250 mm）を、溶出液には5％（v/v）のギ酸を含む20％（v/v）アセトニトリル溶液を用いた。流速は1mL/minに、カラム温度は40℃に保ち、溶出液は254nmでモニターした。CnMDH2の活性測定は、1M メタノール、1mM NAD+、50mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）、10mM MgSO4と適当量の大腸菌菌体からなる反応液中で実施し、NADHの生成に伴う340nmにおける吸光度の上昇をモニターした。反応速度の算定には同波長におけるNADHのモル吸光度係数6.2mM-1 cm-1を使用した。反応は37℃で行い、各酵素の活性は、本測定条件下で1分間に1μmolの生成物の生成を触媒する量を1ユニット（U）と定義した。【００５２】
（４）  内在性酵素の活性確認
調製した大腸菌菌体を用いて大腸菌内在性の酵素である、メチオニン合成酵素、5-メチルTHFホモシステイントランスメチラーゼ、メチレンTHFレダクターゼ、SAHヌクレオシダーゼ、S-リボシルホモシステインリアーゼの活性確認、およびホルムアルデヒドとTHFの自発的な縮合反応の進行の有無の確認を行った。基本組成として、0.2mM エスクレチン、50mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）、1mM ATP、10mM MgSO4と適当量の大腸菌菌体からなる反応液を用いて、メチオニン合成酵素の活性確認には1mM メチオニンを添加、5-メチルTHFホモシステイントランスメチラーゼとメチレンTHFレダクターゼの活性確認には1mM 5,10-メチレンTHF、1mM ホモシステイン、1mM NADHを添加、ホルムアルデヒドとTHFの自発的な縮合反応の確認には1mM ホルムアルデヒド、1mM THF、1mM ホモシステイン、1mM NADHを添加、SAHヌクレオシダーゼとS-リボシルホモシステインリアーゼの活性確認には1mM ホルムアルデヒド、1mM THF、1mM SAH、1mM NADHを添加し、それぞれ生成するエスクレチンのメチル化体を前項（３）に記載の方法に従って、HPLCにて定量した。【００５３】
（５）  SAMリサイクル経路を利用したメチル化反応
調製した大腸菌菌体を用いてエスクレチンのメチル化反応を行った。メチル化反応は、基質である1mM エスクレチン、メチル基供給源である1M メタノール、50mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）、1mM ATP、10mM MgSO4、20mg-wet cell/mLの大腸菌菌体からなる反応液中で実施した。反応は37℃で18時間行い、生成したスコポレチンとイソスコポレチンを前述の（３）に記載の方法に従ってHPLCにより定量した。また、本メチル化反応では大腸菌の生菌体を利用するため、ATPを外部より添加せずとも、解糖系酵素やアデノシンサルベージ合成系のような内在性の酵素群の働きによってATPを自立的に生産できる可能性がある。そこで、ATPの代わりに10mMのグルコースを添加した実験も行った。【００５４】
実施例１  外来酵素の活性評価
pRCI-SaOMT5-CnMDH2または空ベクターであるpRCIを導入したE. coli BW25113を用いて（以後pRCI-SaOMT5-CnMDH2/BW25113、pRCI/BW25113と記載する）、OMTおよびMDHの活性測定を行った。SAMリサイクル経路を利用したメチル化反応を最終的に生菌体を用いて行う場合を想定して、酵素活性は菌体あたりの活性として評価を行った。なお、OMTによるメチル化反応でエスクレチンからは、6位の水酸基のメチル化体であるスコポレチン、7位の水酸基のメチル化体であるイソスコポレチンが、プロトカテク酸からはバニリン酸とイソバニリン酸を生成しうる（下記に示す）。【００５５】
【化１】
2019160059.tif 000003
【００５６】
pRCI-SaOMT5-CnMDH2/BW25113を用いて、エスクレチンを基質、SAMを補基質としてメチル化反応を行った結果、エスクレチンの6位の水酸基のメチル化体であるスコポレチン、7位の水酸基のメチル化体であるイソスコポレチンの生成がHPLCで確認され、OMTの活性値は5.9mU/mg-wet cellとなった（図４）。一方、ネガティブコントロールであるpRCI/BW25113ではスコポレチン、イソスコポレチンの生成は認められなかった。また基質として、プロトカテク酸を用いた場合、pRCI-SaOMT5-CnMDH2/BW25113においてバニリン酸やイソバニリン酸の生産が確認された。【００５７】
続いてメタノールを基質、NAD+を補基質として、MDH活性の測定を行った。pRCI-SaOMT5-CnMDH2/BW25113ではメタノールの酸化に伴うNADHの上昇が見られ、MDHの活性値は4.7mU/mg-wet cellとなった（図４）。一方、pRCI/BW25113ではNADHの生成はほとんど起こらず、MDHの活性値は0.08mU/mg-wet cellとなった。以上の結果より、SaOMT5およびCnMDH2の機能的な発現に成功したと言える。【００５８】
実施例２  内在性酵素の活性確認
pRCI-SaOMT5-CnMDH2/BW25113を用いて、大腸菌内在性酵素の活性確認、およびホルムアルデヒドとTHFの自発的な縮合反応の確認を行った。結果を図５に示す。メチオニンを出発物質とした場合にもスコポレチンとイソスコポレチンの生成が見られたことから、メチオニン合成酵素が活性を有することが確認できた。また、5,10-メチレンTHFとホモシステイン、NADHを出発物質とした場合にも、メチル化体の生産が確認できたことから、5-メチルTHFホモシステイントランスメチラーゼとメチレンTHFレダクターゼが活性を有することが確認できた。更に、ホルムアルデヒド、THF、ホモシステイン、NADHを出発物質としてメチル化体の生産が確認できたことから、ホルムアルデヒドとTHFの自発的な縮合反応が進行していることが確認できた。SAHヌクレオシダーゼ、S-リボシルホモシステインリアーゼについても、ホルムアルデヒド、THF、SAH、NADHを出発物質としてメチル化体の生産が確認でき、活性を確認することができた。【００５９】
実施例３  SAMリサイクル経路を利用したメチル化反応
続いてメタノールをメチル基供与体とし、SAMのリサイクルを伴った、エスクレチンのメチル化反応を行った。結果を図６に示す。pRCI/BW25113はOMT活性を有さないため、スコポレチン、イソスコポレチンの生成は一切認められなかった。OMTのみを発現するpRCI-SaOMT5/BW25113では、18時間で0.055mMのメチル化化合物の生成が認められた。この結果より、SaOMT5が細胞内に微量に存在するSAMを利用することで、エスクレチンのメチル化反応を行っていることが示唆された。一方、pRCI-SaOMT5-CnMDH2/BW25113では、18時間で0.17mMのメチル化化合物の生成が見られ、SaOMT5の単独発現株よりも多量のメチル化化合物を生産することができた。この結果より、SaOMT5とCnMDH2の共発現により、メタノールをメチル基供給源としたSAMリサイクル経路が機能していることが示された。【００６０】
続いてATPの代わりにグルコースを添加することでも、SAMのリサイクルを伴った、エスクレチンのメチル化反応が可能であるかの検討を行った。図７に示すようにATPを添加した際よりもスコポレチン、イソスコポレチンの生成量は下がるものの、グルコースを用いた場合でも反応が進行することが確認できた。スコポレチン、イソスコポレチンの生成量は18時間で0.085mMとなった。【００６１】
調製例２
上記の温度誘導型の発現システム以外に、大腸菌で汎用されるIPTG誘導型の発現システムでもSAMリサイクル経路を利用したメチル化反応の強化が可能かを確認するため、E. coli BL21(DE3)株を用いたエスクレチンのメチル化反応を実施した。【００６２】
（１）  プラスミド構築
表２に用いたプライマー配列のリスト(全て、IDT社より入手)を示す。調製例１で用いたSaOMT5遺伝子をプライマーSaOMT5_F2とSaOMT5_R2を用いてPCRにより増幅した。その後、NcoIおよびHindIIIで消化した後、pETDuet1（Novagen）の同サイトに挿入し、pETDuet-SaOMT5を得た。次に、調製例１で用いたCnMDH2のA26V、A31V、A169Vの三重変異酵素遺伝子をプライマーCnMDH2_F2とCnMDH2_R2を用いてPCRにより増幅した。その後、NdeIおよびXhoIで消化した後、pETDuet-SaOMT5の同サイトに挿入し、pETDuet-SaOMT5-CnMDH2を得た。【００６３】
【表２】
2019160059.tif 000004
【００６４】
（２）  酵素の発現誘導
構築した種々のプラスミドをE. coli BL21(DE3)株（Merck Millipore）に導入した。得られた組換え大腸菌を100μg/mLのアンピシリンを含むLuria-Bertani培地を用い、37℃で好気的に培養した後、M9最小培地に5％（v/v）添加した。好気的に2h培養した後、終濃度0.2mMとなるようにIPTGを添加することでSaOMT5、CnMDH2の発現誘導を行った。3h培養後、遠心分離にて菌体を回収し、50mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）で2回洗浄した後、メチル化反応実験に用いた。【００６５】
（３）  SAMリサイクル経路を利用したメチル化反応
調製した大腸菌菌体を用いてエスクレチンのメチル化反応を行った。メチル化反応は、基質である0.5mM エスクレチン、50mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）、1mM ATP、10mM MgSO4、10mg-wet cell/mLの大腸菌菌体からなる反応液中で実施した。メチル基供給源であるメタノールについては、濃度を0〜200mMの間で様々に変化させ、反応を行った。反応は37℃で24時間行い、生成したスコポレチンとイソスコポレチンを調製例１に記載の方法に従ってHPLCにより定量した。【００６６】
実施例４  SAMリサイクル経路を利用したメチル化反応
メタノールをメチル基供与体とし、SAMのリサイクルを伴った、エスクレチンのメチル化反応を行った。結果を図８に示す。pETDuet/BL21(DE3)はOMT活性を有さないため、スコポレチン、イソスコポレチンの生成は一切認められなかった。OMTのみを発現するpETDuet-SaOMT5/BL21(DE3)では、メタノール100mMの条件において、24時間で0.084mMのメチル化化合物の生成が認められたが、メタノール濃度の変化による生産物濃度の違いは見られなかった。一方、pETDuet-SaOMT5-CnMDH2/BL21(DE3)では、メタノール濃度100mMまではメタノール濃度の増加に伴い、メチル化化合物の生産量が増加し、メタノール依存的なSAMリサイクル系が機能していることが示された。メタノール100mMの条件において、24時間で0.22mMのメチル化化合物の生成が見られ、SaOMT5の単独発現株よりも多量のメチル化化合物を生産することができた。この結果より、IPTGを用いた誘導発現系においても、SaOMT5とCnMDH2の共発現により、メタノールをメチル基供給源としたSAMリサイクル経路が機能することが示された。【００６７】
調製例３
上述の通り、SaOMT5とCnMDH2の共発現により、メタノールをメチル基供給源としたSAMリサイクル経路を駆動させ、メチル化反応を効率的に行うことができることが判明した。よって、宿主株のSAM合成経路の強化により、更にその効率の向上が期待できる。図９は例示として、大腸菌におけるメチオニンおよびSAMの合成経路を示す。SAMはアスパラギン酸とセリンを出発物質として生産されるが、経路中の多くの酵素遺伝子がマスターレギュレーターであるMetJタンパク質により発現抑制を受ける。従って、metJ遺伝子の破壊により細胞内のSAM合成系遺伝子の発現抑制が解除され、SAM合成量が増加すると考えられる。その結果として、リサイクルおよびメチル化反応に供されるSAM量が増加すると期待できるため、metJ遺伝子の破壊を行うこととした。また、メタノールデヒドロゲナーゼによってメタノールより変換されるホルムアルデヒドは、細胞にとって毒性を有するため、微生物は元来その分解経路を有している。従って、ホルムアルデヒドの分解を抑制することで、図２に示すSAMのリサイクルに利用されるホルムアルデヒド量が増加するものと期待される。そこで、ホルムアルデヒド分解経路の酵素の一つであるS-ヒドロキシメチルグルタチオンデヒドロゲナーゼをコードするfrmA遺伝子の破壊の効果も併せて検証することとした。【００６８】
（１）  metJおよびfrmA遺伝子破壊のためのプラスミド構築
metJおよびfrmA遺伝子の破壊にはCRISPR-Cas9システムを用いた（Jiang Y, et al., Appl. Environ. Microbiol., 2015, 81, 2506-2514参照）。Cas9ヌクレアーゼおよびλ組換え酵素を発現するプラスミドpCasと、single-guide RNA（sgRNA）の発現および相同組換えの鋳型配列挿入のためのプラスミドpTargetFはaddgeneより購入した（Plasmid#62225とPlasmid#62226）。表３に用いたプライマー配列のリスト(全て、IDT社より入手)を示す。pTargetFを鋳型DNAとして、プライマーsgRNA(metJ)_FとpTargetF_Rを用いてPCRを行い、SpeIで消化した後、セルフライゲーションすることでpTargetFにmetJ遺伝子破壊のためのsgRNAが挿入されたプラスミド、pTargetF-metJ(sgRNA)を構築した。次に大腸菌BL21(DE3)株のゲノムよりmetJ遺伝子の上流448bpをプライマーmetJ up_FとmetJ up_Rを、下流549bpをプライマーmetJ down_FとmetJ down_Rを用いて増幅した。その後、プライマーmetJ up_FとmetJ down_Rを用いたオーバーラップPCRにより、metJ遺伝子の上流領域と下流領域が連結した断片を調製し、HindIIIとXhoIで消化した後、pTargetF-metJ(sgRNA)の同サイトに挿入し、pTargetF-ΔmetJを得た。同様にしてプライマーsgRNA(frmA)_FとpTargetF_Rを用いることでpTargetF-metJ(sgRNA)を、プライマーfrmA up_FとfrmA up_R、frmA down_FとfrmA down_Rを用いることでpTargetF-ΔfrmAを得た。【００６９】
【表３】
2019160059.tif 000005
【００７０】
（２）  metJおよびfrmA遺伝子の破壊
まず、Cas9ヌクレアーゼおよびλ組換え酵素を発現するpCasをE. coli BL21(DE3)株に導入した。得られた組換え大腸菌をアラビノース添加培地にて培養し、λ組換え酵素の発現誘導を行った状態で、pTargetF-ΔmetJまたはpTargetF-ΔfrmAを導入した。本工程により、metJまたはfrmA遺伝子が欠損した株だけがコロニーを形成することができる。得られた遺伝子破壊株を、IPTGを添加した培地で培養することでpCas上にコードされたTargetF上の配列を認識するsgRNAの発現誘導を行い、pTargetFを脱落させた。続いて、pCasの温度感受性を利用し、pCasが複製できない37℃で大腸菌を培養することで、pCasを脱落させた。同様の手法によりE. coli BL21(DE3)株のmetJ frmAの二重破壊株の構築も行った。その後、E. coli BL21(DE3)株、およびそのΔmetJ株、ΔfrmA株、ΔmetJ ΔfrmA株に、調製例２で調製したpETDuet-SaOMT5-CnMDH2を導入し、100μg/mLのアンピシリンを含むLuria-Bertani培地を用い、37℃で好気的に培養した後、M9最小培地に5％（v/v）添加した。好気的に2h培養した後、終濃度0.2mMとなるようにIPTGを添加することでSaOMT5、CnMDH2の発現誘導を行った。3h培養後、遠心分離にて菌体を回収し、50mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）で2回洗浄した後、メチル化反応実験に用いた。【００７１】
（３）  SAMリサイクル経路を利用したメチル化反応
調製した大腸菌菌体を用いてエスクレチンのメチル化反応を行った。メチル化反応は、基質である0.5mM エスクレチン、メチル基供給源である100mM メタノール、50mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）、1mM ATP、10mM MgSO4、10mg-wet cell/mLの大腸菌菌体からなる反応液中で実施した。反応は37℃で18時間行い、生成したスコポレチンとイソスコポレチンを調製例１に記載の方法に従ってHPLCにより定量した。【００７２】
実施例５  種々の遺伝子破壊株を用いたメチル化反応
宿主株の遺伝子破壊がエスクレチンのメチル化反応に及ぼす影響を検討した。結果を図１０に示す。pETDuet-SaOMT5-CnMDH2/BL21(DE3)が18時間で0.21mMのメチル化化合物を生成したのに対し、pETDuet-SaOMT5-CnMDH2/ΔmetJは18時間で0.26mMと生成物量の増加が認められた。このことより、metJ遺伝子の破壊によりメチオニン（SAM）合成経路の遺伝子発現抑制が解除され、細胞内のSAMのプール量が向上することで、メチル化反応の効率が向上していることが示唆された。一方、pETDuet-SaOMT5-CnMDH2/ΔfrmAでは18時間で0.19mMと生成物量が減少した。これは、frmAの破壊によりホルムアルデヒドの分解が抑制されるが、SAMの再生速度が十分でないため、細胞にとって有毒なホルムアルデヒドが蓄積したためと考えられる。そこで、SAMの再生速度が向上したΔmetJにおいてfrmAを破壊することで、frmA破壊の効果が十分に得られると考えた。その結果、pETDuet-SaOMT5-CnMDH2/ΔmetJ ΔfrmAでは18時間で0.30mMと最も多量のメチル化物を生成した。以上の結果より、メチオニン（SAM）合成経路の強化やホルムアルデヒド分解経路の遮断により、メタノールをメチル基供給源としたSAMリサイクル経路がより効率的に機能することが示された。【００７３】
調製例４
メチオニンおよびSAM合成経路の強化の他の方法として、経路中の酵素でフィードバック阻害を被る酵素について、阻害耐性のある酵素を過剰発現する方法が挙げられる。図９のメチオニンおよびSAMの合成経路において、セリンをO-アセチルセリンに変換するセリン-O-アセチルトランスフェラーゼ（CysE）はシステインに、ホモセリンをO-スクシニルホモセリンに変換するホモセリン-O-スクシニルトランスフェラーゼ（MetA）はSAMによってフィードバック阻害を受ける。そこで、CysEとMetAのフィードバック耐性阻害酵素をコードする遺伝子（cysE(fdr)、metA(fdr)と表記）をΔmetJ ΔfrmAにおいて過剰発現することで、SAMの合成量が更に向上し、SAMリサイクルおよびメチル化に供されるSAM量が増加することが期待され、検証を行った。【００７４】
（１）  cysE(fdr)とmetA(fdr)過剰発現のためのプラスミド構築
表４に用いたプライマー配列のリスト(全て、IDT社より入手)を示す。IDT社のgblocks人工遺伝子合成受託によりMetAのフィードバック阻害耐性変異体（R27C、I296S、P298L）遺伝子（Usuda and Kurahashi, Appl. Environ. Microbiol., 2005, 71, 3228-3234参照）を人工合成し、プライマーmetA-fdr_FとmetA-fdr_Rを用いてPCRにより増幅した。その後、NcoIおよびHindIIIで消化した後、pACYCDuet-1（Novagen）の同サイトに導入し、pACYCDuet-metA(fdr)を得た。同様にして、CysEのフィードバック阻害耐性変異体（V95R、D96P）遺伝子（Kai et al., Protein Eng. Des. Sel., 2006, 19, 163-167参照）を人工合成し、プライマーcysE-fdr_FとcysE-fdr_Rを用いてPCRにより増幅した。その後、NdeIおよびXhoIで消化した後、pACYCDuet-1およびpACYCDuet-metA(fdr)の同サイトに導入し、pACYCDuet-cysE(fdr)およびpACYCDuet-metA(fdr)-cysE(fdr)を得た。【００７５】
【表４】
2019160059.tif 000006
【００７６】
（２）  酵素の発現誘導
構築した種々のプラスミドをpETDuet-SaOMT5-CnMDH2/ΔmetJまたはpETDuet-SaOMT5-CnMDH2/ΔmetJ ΔfrmAに導入した。得られた組換え大腸菌を100μg/mLのアンピシリンおよび17μg/mLのクロラムフェニコールを含むLuria-Bertani培地を用い、37℃で好気的に培養した後、M9最小培地に5％（v/v）添加した。好気的に2h培養した後、終濃度0.2mMとなるようにIPTGを添加することでSaOMT5、CnMDH2、MetA(fdr)、CysE(fdr)の発現誘導を行った。3h培養後、遠心分離にて菌体を回収し、50mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）で2回洗浄した後、メチル化反応実験に用いた。【００７７】
（３）  SAMリサイクル経路を利用したメチル化反応
調製した大腸菌菌体を用いてエスクレチンのメチル化反応を行った。メチル化反応は、基質である0.5mM エスクレチン、メチル基供給源である100mM メタノール、50mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）、1mM ATP、10mM MgSO4、10mg-wet cell/mLの大腸菌菌体からなる反応液中で実施した。反応は37℃で18時間行い、生成したスコポレチンとイソスコポレチンを前述の調製例１に記載の方法に従ってHPLCにより定量した。【００７８】
実施例６  フィードバック阻害耐性酵素遺伝子の過剰発現株を用いたメチル化反応
宿主株におけるフィードバック阻害耐性酵素遺伝子の過剰発現がエスクレチンのメチル化反応に及ぼす影響を検討した。結果を図１１に示す。pETDuet-SaOMT5-CnMDH2/ΔmetJ 株が18時間で0.26mMのメチル化化合物を生成したのに対し、metA(fdr)を過剰発現した株では18時間で0.32mMと生成物量の増加が認められた。また、cysE(fdr)を過剰発現した株も、18時間で0.31mMとメチル化物の生成量の増加が認められた。一方でmetA(fdr)とcysE(fdr)の両方を過剰発現した場合、メチル化物の生成量に若干の低下が見られた。本菌株はSaOMT5、CnMDH2、metA(fdr)、cysE(fdr)の4つの遺伝子を過剰発現する菌株であり、菌体への負荷がかかり過ぎたため、各々の酵素の生成量が減少しているのではないかと考えられた。また、pETDuet-SaOMT5-CnMDH2/ΔmetJ ΔfrmA株においてもmetA(fdr)の過剰発現の効果を検証したところ、メチル化化合物の濃度が0.30mMから0.33mMへと上昇した。以上の結果より、フィードバック阻害耐性酵素の発現により、メタノールをメチル基供給源としたSAMリサイクル経路がより効率的に機能することが示された。【００７９】
調製例５
本発明におけるSAMのリサイクルは、メタノールをホルムアルデヒドに酸化する酵素であれば、原理的にどの酵素でも利用可能と考えられる。そこで、他の微生物由来のメタノールデヒドロゲナーゼとしてBacillus methanolicus由来の酵素（BmMDH3）を、メタノールオキシダーゼとしてメタノール資化性酵母Ogataea minuta由来の酵素(OmAOX1)を用いてその検証を行った。【００８０】
（１）  プラスミド構築
表５に用いたプライマー配列のリスト(全て、IDT社より入手)を示す。IDT社のgblocks人工遺伝子合成受託によりBacillus methanolicus由来のメタノールデヒドロゲナーゼ3遺伝子（Genbank accession number AIE60275.1）を人工合成し、プライマーBmMDH3_FとBmMDH3_Rを用いてPCRにより増幅した。その後、NdeIおよびXhoIで消化した後、調製例２に記載のpETDuet-SaOMT5の同サイトに導入し、pETDuet-SaOMT5-BmMDH3を得た。同様にして、Ogataea minuta由来のアルコールデヒドロゲナーゼ1遺伝子（Genbank accession number AB242209.1）を人工合成し、プライマーOmAOX1_FとOmMOX1_Rを用いてPCRにより増幅した。その後、NdeIおよびXhoIで消化した後、調製例２に記載のpETDuet-SaOMT5の同サイトに導入し、pETDuet-SaOMT5-OmAOX1を得た。【００８１】
【表５】
2019160059.tif 000007
【００８２】
（２）  酵素の発現誘導
構築した種々のプラスミド、および調製例４で構築したpACYCDuet-metA(fdr)を調製例３で構築したΔmetJ ΔfrmA株に導入した。得られた組換え大腸菌を100μg/mLのアンピシリンおよび17μg/mLのクロラムフェニコールを含むLuria-Bertani培地を用い、37℃で好気的に培養した後、M9最小培地に5％（v/v）添加した。好気的に2h培養した後、終濃度0.2mMとなるようにIPTGを添加することでSaOMT5、BmMDH3、OmAOX1、CysE(fdr)の発現誘導を行った。3h培養後、遠心分離にて菌体を回収し、50mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）で2回洗浄した後、メチル化反応実験に用いた。【００８３】
（３）  SAMリサイクル経路を利用したメチル化反応
調製した大腸菌菌体を用いてエスクレチンのメチル化反応を行った。メチル化反応は、基質である0.5mM エスクレチン、メチル基供給源である100mM メタノール、50mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）、1mM ATP、10mM MgSO4、10mg-wet cell/mLの大腸菌菌体からなる反応液中で実施した。反応は37℃で18時間行い、生成したスコポレチンとイソスコポレチンを前述の調製例１に記載の方法に従ってHPLCにより定量した。【００８４】
実施例７  メタノールをホルムアルデヒドに酸化する種々の酵素を用いたメチル化反応
結果を図１２に示す。SaOMT5の単発現株であるpETDuet-SaOMT5/pACYCDuet-metA(fdr)/ΔmetJ ΔfrmA株が18時間で0.077mMのメチル化化合物を生成したのに対し、pETDuet-SaOMT5-BmMDH3/pACYCDuet-metA(fdr)/ΔmetJ ΔfrmA株では18時間で0.10mM、pETDuet-SaOMT5-OmAOX1/pACYCDuet-metA(fdr)/ΔmetJ ΔfrmA株では18時間で0.17mMと生成物量の増加が認められた。この結果から、本発明におけるSAMのリサイクル経路は酵素の由来によらず、メタノールをホルムアルデヒドに酸化する活性のある酵素とメチラーゼを共発現すれば機能することが示された。【００８５】
調製例６
本発明におけるSAMリサイクルによるメチル化反応の強化は、SAM依存性のメチラーゼであれば、原理的にどの酵素でも利用が可能と考えられる。そこで、メタノールデヒドロゲナーゼと種々のメチラーゼを共発現することで、エスクレチン以外の化合物のメチル化反応も強化することが可能か検証を行った。【００８６】
（１）  プラスミド構築
表６に用いたプライマー配列のリスト(全て、IDT社より入手)を示す。IDT社のgblocks人工遺伝子合成受託によりHomo sapiens由来のカテコール-O-メチルトランスフェラーゼ（HsOMT; Genbank accession number NM_000754）、Arabidopsis thaliana由来のカフェ酸-O-メチルトランスフェラーゼ（AtOMT; Genbank accession number AY062837.1）、Mycobacterium smegmatis由来のヒスチジン-N-α-メチルトランスフェラーゼ（EgtD; Genbank accession number ABK75457.1）を人工合成し、それぞれプライマーHsOMT_FとHsOMT_R、AtOMT_FとAtOMT_R、EgtD_FとEgtD_Rを用いてPCRにより増幅した。その後、HsOMTおよびAtOMT はSpeIおよびSacIで消化した後、調製例1で構築したpRCI-MCSの同サイトに挿入し、pRCI-AtOMTおよびpRCI-HsOMTを得た。次に、調製例1で構築したpRCI-SaOMT5-CnMDH2をSacIおよびXhoIで消化することで、CnMDH2遺伝子を切り出し、pRCI-AtOMTおよびpRCI-HsOMT の同サイトに挿入し、pRCI-AtOMT-CnMDH2およびpRCI-HsOMT-CnMDH2を得た。また、EgtDについては、NcoIおよびHindIIIで消化した後、pETDuetの同サイトに導入し、pETDuet-EgtDを得た。次に、調製例２で構築したpETDuet-SaOMT5-CnMDH2をNdeIおよびXhoIで消化することで、CnMDH2遺伝子を切り出し、pETDuet-EgtDの同サイトに挿入し、pETDuet-EgtD-CnMDH2を得た。【００８７】
【表６】
2019160059.tif 000008
【００８８】
（２）  酵素の発現誘導
構築したpRCI-AtOMT、pRCI-AtOMT-CnMDH2、pRCI-HsOMT、pRCI-HsOMT-CnMDH2については、大腸菌BW25113株に導入した。pETDuet-EgtD、pETDuet-EgtD-CnMDH2については、調製例４で構築した大腸菌BL21(DE3)ΔmetJ ΔfrmAのmetA(fdr)過剰発現株に導入した。得られたBW25113株の形質転換体については100μg/mLのアンピシリンを含むLuria-Bertani培地を用い、30℃で好気的に培養した後、M9最小培地に5％（v/v）添加した。非誘導条件である30℃で好気的に3h培養した後、42℃にシフトさせることでメチラーゼとCnMDH2の発現誘導を行い、更に4h培養を行った。BL21(DE3)株の形質転換体については、100μg/mLのアンピシリンおよび17μg/mLのクロラムフェニコールを含むLuria-Bertani培地を用い、37℃で好気的に培養した後、M9最小培地に5％（v/v）添加した。好気的に2h培養した後、終濃度0.2mMとなるようにIPTGを添加することでEgtD、CnMDH2、MetA(fdr)の発現誘導を行った。3h培養後、遠心分離にて菌体を回収し、50mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）で2回洗浄した後、メチル化反応実験に用いた。【００８９】
（３）  SAMリサイクル経路を利用したメチル化反応
調製した大腸菌菌体を用いて様々な基質のメチル化反応を行った。酸素原子に対してメチル化を行うO-メチルトランスフェラーゼであるAtOMTは、例えば、カフェ酸のフェルラ酸やイソフェルラ酸へのメチル化や、レスベラトロールのピノスチルベン、プテロスチルベンへの二段階のメチル化反応を、HsOMTは、例えば、プロトカテク酸のバニリン酸とイソバニリン酸へのメチル化を行う（下記に示す）。酸素原子以外のメチル化の一例として、窒素原子に対してメチル化を行うN-メチルトランスフェラーゼであるEgtDは、例えば、ヒスチジンを3段階でメチル化し、ヘルシニンを生成する。メチル化反応は、0.5mMの各酵素に対する基質、メチル基供給源である100mM メタノール、50mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）、1mM ATP、10mM MgSO4、10mg-wet cell/mLの大腸菌菌体からなる反応液中で実施した。反応は37℃で18時間行い、生成したメチル化物をHPLCにより定量した。イソフェルラ酸とフェルラ酸については、調製例１に記載の方法に従って定量した。イソバニリン酸とバニリン酸については調製例１に記載の方法の移動相組成におけるアセトニトリルの含量を10％（v/v）とし、分析を行った。。ピノスチルベン、プテロスチルベンについては調製例１に記載の方法の移動相組成におけるアセトニトリルの含量を50％（v/v）とし、分析を行った。ヘルシニンについては、分離用のカラムにナカライテスク社製5C18AR-IIカラム（4.6 ID×250 mm）を、溶出液に10mMのNa2HPO4を用いた。流速は1mL/minに、カラム温度は40℃に保ち、溶出液は210nmでモニターした。【００９０】
【化２】
2019160059.tif 000009
【００９１】
実施例８  種々のメチラーゼを用いたメチル化反応
結果を図１３に示す。カフェ酸のメチル化反応については、AtOMTの単独発現株が18時間で0.061mMのメチル化化合物を生成したのに対し、CnMDH2と共発現した株では18時間で0.12mMと生成物量の増加が認められた。レスベラトロールのメチル化反応については、AtOMTの単独発現株が18時間で0.040mMのメチル化化合物を生成したのに対し、CnMDH2と共発現した株では0.051mMと生成物量の増加が認められた。プロトカテク酸のメチル化反応については、HsOMTの単独発現株が18時間で0.059mMのメチル化化合物を生成したのに対し、CnMDH2と共発現した株では0.15mMと生成物量の増加が認められた。ヒスチジンのメチル化反応については、EgtDの単独発現株が18時間で0.18mMのメチル化化合物を生成したのに対し、CnMDH2と共発現した株では0.29mMと生成物量の増加が認められた。以上の結果から、本発明におけるSAMのリサイクル系を利用したメチル化反応は、メチル化反応の種類によらず有効であり、多様なメチル化反応への応用が期待される。【００９２】
調製例７
本発明におけるSAMリサイクルによるメチル化反応効率の強化は大腸菌に限らず、あらゆる宿主で利用が可能である。一例として、枯草菌B. subtilisにおいてもSAMリサイクル経路を利用したメチル化反応の強化が機能するかの検証を行った。【００９３】
（１）  プラスミド構築
表７に用いたプライマー配列のリスト(全て、IDT社より入手)を示す。調製例１で用いたSaOMT5遺伝子を、プライマーSaOMT5_F3とSaOMT5_R3を用いてPCRにより増幅した。その後、EcoRVおよびSalIで消化した後、大腸菌や枯草菌、乳酸菌など様々な宿主で複製可能なベクターであるpCU（Okano et al., Appl. Microbiol. Biotechnol, 2007, 75, 1007-1013参照）の同サイトに挿入し、pCU-SaOMT5を得た。また、調製例１で用いたCnMDH2のA26V、A31V、A169Vの三重変異酵素遺伝子をプライマーCnMDH2_F3とCnMDH2_Rを用いてPCRにより増幅した。その後、SalIおよびXhoIで消化した後、pCU-SaOMT5の同サイトに挿入し、pCU-SaOMT5-CnMDH2を得た。【００９４】
【表７】
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【００９５】
（２）  組換え枯草菌の作成と培養
構築した種々のプラスミドを枯草菌B. subtilis 168株に二段階飢餓法で導入した。得られた組換えB. subtilisを25μg/mLのエリスロマイシン、50μg/mLのトリプトファン、ロイシン、アルギニン、スレオニンを含むM9培地を用い、37℃で好気的に6h培養した後、遠心分離にて菌体を回収し、50mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）で2回洗浄した後、メチル化反応実験に用いた。【００９６】
（３）  SAMリサイクル経路を利用したメチル化反応
調製したB. subtilis菌体を用いてエスクレチンのメチル化反応を行った。メチル化反応は、基質である1mM エスクレチン、メチル基供給源である100mM メタノール、50mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）、1mM ATP、10mM MgSO4、40mg-wet cell/mLのB. subtilis菌体からなる反応液中で実施した。反応は37℃で18時間行い、生成したスコポレチンとイソスコポレチンを前述の調製例１に記載の方法に従ってHPLCにより定量した。【００９７】
実施例９  SAMリサイクル経路を利用したメチル化反応
メタノールをメチル基供与体とし、SAMのリサイクルを伴った、エスクレチンのメチル化反応を行った。pCU/B. subtilis株はOMT活性を有さないため、スコポレチン、イソスコポレチンの生成は一切認められなかった。一方、SaOMT5発現株ではメチル化化合物の生成が見られ、CnMDH2との共発現株では、SaOMT5単発現株に比べ1.4倍のメチル化化合物の生成が見られた。この結果より、大腸菌以外の微生物においても、SaOMT5とCnMDH2の共発現により、メタノールをメチル基供給源としたSAMリサイクル経路が機能することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
本発明によれば、メタノールを添加することで、S-アデノシルメチオニン（SAM）を再生することが可能になるため、各種のメチル化反応への適用拡大が図られることから、医薬品製造、化学品製造、機能性化合物製造などに関連する分野に極めて有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年8月22日(2019.8.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓ−アデノシルメチオニンが、脱メチル化された後、メタノール由来のメチル基を転移して得られたメチオニンから変換して再生されることを特徴とする、Ｓ−アデノシルメチオニンのリサイクル方法。
【請求項２】
Ｓ−アデノシルメチオニンが、脱メチル化されてＳ−アデノシルホモシステインに変換され、次いでホモシステインに変換される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ｓ−アデノシルメチオニンの脱メチル化が、Ｓ−アデノシルメチオニン依存性のメチラーゼを介して行われる、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
メタノール由来のメチル基が、メタノールにメタノールデヒドロゲナーゼまたはメタノールオキシダーゼを反応させて得られる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
メチラーゼ及びメタノールデヒドロゲナーゼを共発現してなる宿主生物を用いる、請求項３又は４記載の方法。
【請求項６】
メチラーゼ及びメタノールオキシダーゼを共発現してなる宿主生物を用いる、請求項３又は４記載の方法。
【請求項７】
宿主生物が、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞及び微生物から選ばれる、請求項５又は６記載の方法。
【請求項８】
宿主生物が、メチオニン又はＳ−アデノシルメチオニン量が増加するよう改変されたものである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
更に、アデノシン三リン酸再生用エネルギー源を添加して得られたアデノシン三リン酸を介してメチオニンから変換させる、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の方法により再生されたＳ−アデノシルメチオニンを、メチル基供与体として利用してメチル化反応を行うことを特徴とする、メチル化体の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の方法において使用されるための、メチラーゼと、生物内在性の反応と組み合わさってメタノール由来のメチル基を産生するメタノールデヒドロゲナーゼまたはメタノールオキシダーゼを共発現してなる宿主生物。
【請求項１２】
メチラーゼとメタノールデヒドロゲナーゼまたはメタノールオキシダーゼとが導入された、請求項１１記載の宿主生物。
【請求項１３】
更に、メチオニン又はＳ−アデノシルメチオニン量が増加するよう改変された、請求項１２記載の宿主生物。
【請求項１４】
改変が、メチオニン又はＳ−アデノシルメチオニンの合成酵素の過剰発現、メチオニン又はＳ−アデノシルメチオニンの合成酵素の機能を向上させる変異、メチオニン又はＳ−アデノシルメチオニンの合成酵素遺伝子の発現を抑制する酵素またはタンパク質の機能を抑制する変異、メチオニン又はＳ−アデノシルメチオニンの合成においてフィードバック阻害を被る酵素の機能を向上する変異、Ｓ−アデノシルホモシステインの分解酵素の機能を向上させる変異、及び、ホルムアルデヒドの分解酵素の機能を抑制する変異、から選ばれる、請求項１３記載の宿主生物。
【請求項１５】
メチラーゼと、生物内在性の反応と組み合わさってメタノール由来のメチル基を産生するメタノールデヒドロゲナーゼまたはメタノールオキシダーゼとが導入された、発現ベクター。
【手続補正書】
【提出日】令和2年3月4日(2020.3.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓ−アデノシルメチオニン依存性メチラーゼとメタノールデヒドロゲナーゼまたはメタノールオキシダーゼとが導入された宿主生物を、
（ｉ）メタノールおよび導入されたメチラーゼの基質を添加したグルコース含有培地で培養する工程、または
（ｉｉ）グルコース含有培地で培養し、回収した宿主生物をメタノール、導入されたメチラーゼの基質およびＡＴＰもしくはグルコースを含む溶液に添加して反応させる工程を含み、
Ｓ−アデノシルメチオニン依存性メチラーゼが、Ｓ−アデノシルメチオニン依存性のＯ−メチラーゼ、Ｎ−メチラーゼ、Ｃ−メチラーゼ、Ｓ−メチラーゼ、Ｓｅ−メチラーゼおよびＡｓ−メチラーゼからなる群より選択されることを特徴とする、メチル化体の製造方法。
【請求項２】
宿主生物が大腸菌または枯草菌である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
培地が最小培地である、請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
メタノール濃度が１ｍＭ〜１０Ｍである、請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
メチル化体が医薬品、化学品または機能性化合物である、請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
Ｓ−アデノシルメチオニン依存性のＯ−メチラーゼ、Ｎ−メチラーゼ、Ｃ−メチラーゼ、Ｓ−メチラーゼ、Ｓｅ−メチラーゼおよびＡｓ−メチラーゼからなる群より選択されるＳ−アデノシルメチオニン依存性メチラーゼとメタノールデヒドロゲナーゼまたはメタノールオキシダーゼとが導入された宿主生物。
【請求項７】
宿主生物が大腸菌又は枯草菌である、請求項６に記載の宿主生物。
【請求項８】
ホルムアルデヒド分解酵素の機能を抑制する変異が導入された、請求項６または７に記載の宿主生物。
【請求項９】
メチオニン合成経路の酵素遺伝子の発現抑制を行うタンパク質の機能を抑制する変異が導入された、請求項６〜８のいずれかに記載の宿主生物。
【請求項１０】
メタノールデヒドロゲナーゼがＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ  Ｎ−１由来のメタノールデヒドロゲナーゼ（ＣｎＭＤＨ２）のＡ２６Ｖ、Ａ３１Ｖ、Ａ１６９Ｖの三重変異酵素である、請求項６〜９のいずれかに記載の宿主生物。
【国際調査報告】
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2019160059.tif 000025
2019160059.tif 000026
2019160059.tif 000027