(57)【要約】  ２以上の細胞培養容器２を積層して構成される多層細胞培養容器１であって、前記各細胞培養容器２は、気体を内部に流入させるための流入口３と、気体を外部に流出させるための流出口４とを備え、一の前記細胞培養容器２の底面５と、その直下に配置される他の前記細胞培養容器２の前記流入口３の辺縁部６の上面７とから形成される隙間である隙間部８の断面積が、5.0mm２以上40.0mm２以下である、多層細胞培養容器１を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
２以上の細胞培養容器を積層して構成される多層細胞培養容器であって、
前記各細胞培養容器は、気体を内部に流入させるための流入口と、気体を外部に流出させるための流出口とを備え、
一の前記細胞培養容器の底面と、その直下に配置される他の前記細胞培養容器の前記流入口の辺縁部の上面とから形成される隙間である隙間部の断面積が、5.0mm２以上40.0mm２以下である、多層細胞培養容器。
【請求項２】
前記流入口と前記流出口とが、前記細胞培養容器の平面視中心に対して点対称に配置されている、請求項１に記載の多層細胞培養容器。
【請求項３】
積層された前記細胞培養容器の高さが400mm以上である、請求項１また２に記載の多層細胞培養容器。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載の多層細胞培養容器と、強制通気システムとを備える、細胞培養装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多層細胞培養容器および細胞培養装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞は、培地を入れた培養容器の中で増殖させる。培養容器としては、フラスコ、ディッシュ、プレートなどが挙げられるが、限られた培養スペースで、ある程度の量の培養細胞を生産する必要がある場合、複数のスタックプレートを重ねて構成される多層細胞培養容器が使用される。例えば、特許文献１には、支柱と支持部によって、培地を排出する際に回転可能なように支持される多層平板培養槽が記載されている。【０００３】
近年、大量培養装置を用いた培養までは必要としないものの、ある程度の量の細胞を、限られたスペースの中で培養することができる、多層細胞培養容器の必要性が高まってきている。例えば、発症率の極めて低い疾病の治療薬の開発などに、ある程度の量の細胞が必要とされる場合が挙げられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開昭６２−２９４０７７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このような多層細胞培養容器は、複数のスタックプレート（細胞培養容器）を重ねて構成されるため、下層側のスタックプレートは通気気体によるガス交換効率が低下し、最上層のスタックプレートと最下層のスタックプレートでは、ＣＯ２濃度などの培養環境にばらつきが生じるという問題がある。【０００６】
本発明は、上述した実情に鑑みてなされたものであり、培地の排出効率を損なうことなく、最上層から最下層までの各細胞培養容器の気体濃度を均一にして培養効率を向上させる多層細胞培養容器を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記目的を達成するために鋭意検討を行った。その結果、積層されている複数の細胞培養容器のうち、一の細胞培養容器の底面と、その直下に配置される他の細胞培養容器の流入口の辺縁部の上面とから形成される隙間（隙間部）の辺縁部に沿った断面の大きさを制御することにより、培地の排出効率を損なうことなく、最上層から最下層までの細胞培養容器の気体濃度を均一にして培養効率を向上できることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００８】
本発明は、上記の新規な知見に基づきなされたものであって、上記課題を有利に解決することを目的とするものであり、本発明の第１の態様は、２以上の細胞培養容器を積層して構成される多層細胞培養容器であって、前記各細胞培養容器は、気体を内部に流入させるための流入口と、気体を外部に流出させるための流出口とを備え、一の前記細胞培養容器の底面と、その直下に配置される他の前記細胞培養容器の前記流入口の辺縁部の上面とから形成される隙間である隙間部の断面積（細胞培養容器の底面に対して垂直方向の、辺縁部に沿った隙間部の断面の面積）が、5.0mm２以上40.0mm２以下であることを特徴とする。
多層細胞培養容器内で形成される、全ての隙間部の各断面積を上記の範囲に制御することにより、培地の排出効率を損なうことなく、最上層から最下層までの細胞培養容器の気体濃度を均一にして培養効率を向上させることができる。【０００９】
また、上記第１の態様では、前記流入口と前記流出口とが、前記細胞培養容器の平面視中心に対して点対称に配置されていることが好ましい。
このような配置とすることで、流入口から流出口にかけての気体の拡散効率が高まるため、最上層から最下層までの各細胞培養容器の気体濃度をより均一にすることができる。【００１０】
また、上記第１の態様では、積層された前記細胞培養容器の高さが400mm以上であることが好ましい。
このような高さを有する多層細胞培養容器では、隙間部の断面積を制御することにより最上層から最下層までの細胞培養容器の気体濃度を均一にするという本願発明の効果がより高く発揮されるためである。
また、サイズが大きくなったり重量が重くなるなど取り扱いの利便性が悪化する、重量が容器の最下層にかかるため容器の耐久性に問題が生じる、という観点から、多層細胞培養容器の高さは、1000mm以下であることが好ましい。【００１１】
本発明の第２の態様は、上記第１の態様の多層細胞培養容器と、強制通気システムとを備える、細胞培養装置である。
強制通気システムを備えることにより、各細胞培養容器の流入口から流出口を経て、最上層から最下層までの全ての細胞培養容器に、培養細胞に必要な環境を形成するための気体を強制的に流通させることができる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、培地の排出効率を損なうことなく、多層細胞培養容器において、最上層から最下層までの各細胞培養容器の気体濃度を均一にして培養効率を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、本発明の一実施形態に係る多層細胞培養容器の斜視図である。
【図２】図２は、本発明の一実施形態に係る細胞培養容器の斜視図である。
【図３】図３は、本発明の別の一実施形態に係る多層細胞培養容器の斜視図である。
【図４】図４は、本発明の別の一実施形態に係る細胞培養容器の斜視図である。
【図５】図５は、本発明の一実施形態に係る細胞培養容器の流入口の拡大斜視図である。
【図６】図６は、本発明の一実施形態に係る細胞培養容器の流入口の拡大平面図である。
【図７】図７は、本発明の一実施形態に係る多層細胞培養容器の部分断面図である。
【図８】図８は、本発明の一実施形態に係る多層細胞培養容器の部分断面斜視図である。
【図９】図９は、本発明の一実施形態に係る細胞培養容器の流入口の拡大平面図である。
【図１０】図１０は、本発明の一実施形態に係る多層細胞培養容器の部分断面図である。
【図１１】図１１は、本発明の一実施形態に係る多層細胞培養容器の部分断面斜視図である。
【図１２】図１２は、流入口の辺縁部の変形例（円形）を示す拡大図である。
【図１３】図１３は、流入口の辺縁部の別の変形例（周辺部湾曲なし）を示す拡大図である。
【図１４】図１４は、本発明の一実施形態に係る細胞培養装置の概略図である。
【図１５】図１５は、本発明の別の一実施形態に係る細胞培養装置の概略図である。
【図１６】図１６は、ＣＯ２センサーの設置位置を示す細胞培養容器の概略図である。
【図１７】図１７は、培地の排出方法を説明するための多層細胞培養容器の概略図である。
【図１８】図１８は、細胞培養容器の最上層と最下層とのＣＯ２濃度差および培地の排出速度と、隙間部の断面積との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
＜多層細胞培養容器＞
本発明の一実施形態に係る多層細胞培養容器１は、図１に示されるように、積層された細胞培養容器２で構成される。本実施形態では41枚の細胞培養容器２を積層し、40段で高さが701.1mmの多層細胞培養容器１としている。
【００１５】
＜細胞培養容器＞
各細胞培養容器２は、図２に示されるように、気体を流通させるための流入口３と流出口４とを有する。本実施形態では、各細胞培養容器２は平面視略矩形であるが、細胞培養に適しているものであれば平面視円形や平面視正方形であってもよく、実施形態の形状に限定されない。また、各細胞培養容器２を積層して多層細胞培養容器１を構成し、上下に隣り合う細胞培養容器２間で隙間部を形成することができれば、細胞培養容器２の側面視の形状についても限定されない。
【００１６】
また、流入口３と流出口４は、図１および図２に示されるように、細胞培養容器２の平面視中心に対して点対称に配置されていることが好ましい。図３および図４に示されるように、流入口３と流出口４とが隣り合う角部に配置されている場合と比較して、流入口から流出口にかけての気体の拡散効率が高まるため、最上層から最下層までの各細胞培養容器の気体濃度をより均一にすることができるからである。
【００１７】
図５は、流入口３の拡大斜視図である。流入口３の辺縁部６は、細胞培養容器２の外周よりも底面５からの高さが低くなっており、細胞培養容器２を積層したとき、図６のＡ方向から断面を観察した場合に図７に示されるように、また、図６のＢ方向から断面を観察した場合に図８に示されるように、また、図９のＣ方向から断面を観察した場合に図１０および１１に示されるように、一の細胞培養容器２の底面５と、その直下に配置される他の細胞培養容器２の流入口３の辺縁部６の上面７との間に隙間、つまり隙間部８が形成される。
【００１８】
この隙間部８の断面積は、（辺縁部の延べ長さ）×（隙間部の高さ）により求めるものとする。ここで、「辺縁部」とは、図５において符号６Ａで示される円周部（流入口３の円周に沿う部分）と符号６Ｂで示される周辺部（流入口３の円周に沿う部分以外の部分）を指し、「辺縁部の延べ長さ」とは、円周部６Ａと２ヶ所の周辺部６Ｂを足した長さを指す。また、「隙間部の高さ」とは、図７〜８および図１０〜１１に示される隙間部８を形成する隙間の高さ、すなわち、一の細胞培養容器２の底面５と、その直下に配置される他の細胞培養容器２の流入口３の辺縁部６の上面７とから形成される隙間の高さを指す。培地の排出効率の観点、および最上層から最下層までの各細胞培養容器２における気体濃度を均一にする観点から、各隙間部８の断面積は5.0mm２以上40.0mm２以下とする。より好ましくは5.0mm２以上14.0mm２以下である。
【００１９】
なお、流入口３の辺縁部６は、図１２に示されるように、平面視で略円形とすることとしてもよく、図１３に示されるように、周辺部６Ｂが平面視で湾曲していないこととしてもよく、底面５との配置関係で隙間部８を形成することができれば、どのような形状であってもよい。
【００２０】
細胞培養容器２の素材は特に限定されず、種々の樹脂、またはガラスで形成されることとしてもよい。成形が容易であること、また、透明性を確保する観点からシクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）が好ましい。シクロオレフィンポリマーとは、主鎖及び側鎖の片方または両方に脂環式構造を有するポリマーである。
多層細胞培養容器１を構成する各細胞培養容器２の成形方法は、細胞培養容器２の形状に応じて任意に選択することができる。成形方法の具体例としては、射出成形法、押出成形法、キャスト成形法、インフレーション成形法、ブロー成形法、真空成形法、プレス成形法、圧縮成形法、回転成形法、カレンダー成形法、圧延成形法、切削成形法、紡糸等が挙げられ、これらの成形法を組み合わせたり、成形後必要に応じて延伸等の後処理をすることもできる。
【００２１】
また、流出口４の大きさは、培地の排出効率の観点から、流入口３の直径以上であることが好ましい。
なお、流入口３および流出口４の形状は、本実施形態では円形であるが、このような形状に限定されず、気体を流通させることができる孔が形成されており、強制通気システム１０と接続することができれば、楕円形、矩形等、どのような形状であってもよい。
【００２２】
＜細胞培養装置＞
本発明の一実施形態に係る細胞培養装置９は、図１４に示されるように、強制通気システム１０とこれに接続される多層細胞培養容器１で構成され得る。強制通気システム１０は、流出した気体のＣＯ２等の濃度を測定し、流入する気体のＣＯ２等の濃度を調製する。強制通気システム１０は、必要に応じて、気体の流路の途中にフィルター１１を設置することとしてもよい。気体が流入する側の流路にフィルター１１を配置することで、流入する気体に異物が含まれていた場合であっても、培養容器内への異物の流入を防ぐことができる。また、気体が流出する側の流路にフィルター１１を配置することで、培養容器内の気体が汚染されてしまった場合に、汚染物質の流出を防ぐことができる。強制通気システム１０の具体例としては、タイテック株式会社製強制通気式大型ＣＯ２インキュベーターＰｒｅｓｃｙｔｏ  ＭＧ−１３００−２Ａ、ワケンビーテック社製ＭａｘＣｅｌｌ  ＭＬＦなどが挙げられるが、各細胞培養容器２内に気体を流通させることができればよく、これらに限定されない。また、図１４では、流出する気体は、細胞培養装置９外に流出するように構成されているが、これに代えて、図１５に示されるように、培養に使用された気体は、いったん細胞培養装置９内に流出させ、その後、細胞培養装置９外に流出させることとしてもよい。
細胞培養装置９では、多層細胞培養容器１を強制通気システム１０と接続させることにより、各細胞培養容器２内に強制的に通気させ、短時間で培養細胞に適する環境を形成することができる。
【００２３】
＜滅菌処理＞
多層細胞培養容器１は、細胞培養に使用する前に滅菌処理を施すことが好ましい。
滅菌処理の方法に格別な制限はなく、高圧蒸気法や乾熱法などの加熱法、γ線や電子線などの放射線を照射する放射線法、高周波を照射する照射法、酸化エチレンガス（ＥＯＧ）などのガスを接触させるガス法、滅菌フィルタを用いる濾過法など、医療分野で一般的に採用される方法から、培養容器の形状や用いる細胞に応じて、選択することができる。なかでも、表面の極性状態の変化が少ないことから、ガス法が好ましい。
【００２４】
＜細胞培養＞
本実施形態においては、細胞を懸濁させた培地を各細胞培養容器２内に移し、多層細胞培養容器１を静置して培養する。
また、培養する細胞の種類は、例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＭＲＣ５細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞およびｉＰＳ細胞から分化誘導した細胞、神経堤細胞や脂肪幹細胞等のヒト由来の幹細胞、Ｓｆ９細胞や、ヒト組織から分離した細胞などが挙げられるが、特に限定されず、目的に応じて任意に選択することができる。
細胞の培養条件は特に限定されず、用いる細胞や目的に応じて適宜決定することができる。例えば、20℃〜40℃の温度範囲で、二酸化炭素濃度が5％程度で、加湿された環境となるように通気し、細胞を培養することができる。
【００２５】
液体培地を用いて、上記のような細胞を培養する。例えば、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地、ＤＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、それらに血清を添加した培地、アミノ酸、核酸、ビタミン類等を調合したケミカルディファインの培地、それらにインスリンやＦＧＦ等の増殖因子やアルブミンなどのタンパク質を添加したもの、代謝阻害剤や受容体阻害剤や抗生物質などの化合物を添加したもの、カゼインなどのタンパク質分解物を添加した培地、他の細胞や組織の培養上清を利用したコンディション培地などが挙げられる。
液体培地としては、通常、ｐＨ緩衝作用があり、浸透圧が細胞に好適なものであり、細胞の栄養成分を含み、かつ、細胞に対して毒性がないものが用いられる。
液体培地にｐＨ緩衝作用を付与する成分としては、トリス塩酸塩、各種リン酸塩、各種炭酸塩等が挙げられる。
液体培地の浸透圧調整は、通常、細胞の浸透圧とほぼ同じになるように、カリウムイオン、ナトリウムイオン、カルシウムイオン、グルコース等の濃度を調整した水溶液を用いて行われる。かかる水溶液としては、具体的には、リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水等の生理食塩水；乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、重炭酸リンゲル液等のリンゲル液；等が挙げられる。
細胞の栄養成分としては、アミノ酸、核酸、ビタミン類、ミネラル類等が挙げられる。
液体培地としては、市販の、各種細胞に好適な培地を利用することができる。
【００２６】
液体培地には、添加剤を配合することもできる。
用いる添加剤としては、ペプチド；ミネラル；金属；ビタミン成分；細胞表面の受容体に作用する、リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト；核内受容体の、リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト；コラーゲンやファイブネクチンなどの細胞外マトリックス；細胞外マトリックスの一部分あるいは、細胞外マトリックスを模擬した化合物；細胞内の情報伝達経路に関わるタンパク質に作用する成分；細胞内の１次代謝または２次代謝の酵素に作用する成分；細胞内の核内またはミトコンドリア内の遺伝子の発現に影響を与える成分；等が挙げられる。
これらの添加剤は、一種を単独で、あるいは二種以上を組み合わせて用いることができる。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００２８】
●容器作成方法
素材として、ゼオノア１０６０Ｒ（日本ゼオン社製、ノルボルネン系単量体の開環重合体水素化物）を用いて、射出形成法により、1つの角に口径φ25mmとなる流出口４を持ち、当該流出口４と点対称となる位置に、口径φ12.5mm、隙間部８の断面積が6.9mm2となる流入口３を持つ、短辺205mm×長辺334mm×高さ17.1mmの細胞培養容器２を作製した。
ここで、上記隙間部８の断面積は、（辺縁部６の延べ長さ）×（隙間部８の高さ）、すなわち、（円周部６Ａ：8.5mm＋周辺部６Ｂ：7.3mm×２）×0.3mm＝6.9mm2のようにして算出した。
その後、熱溶着装置を用いて、高さ方向に41枚の上記細胞培養容器２を積層して40段とし、幅205mm×奥行334mm×高さ701.1mmの多層細胞培養容器１を作製した（実施例１）。
同様に、表１に示されるように条件を変更して、（実施例２）〜（実施例９）および（比較例１）〜（比較例６）の多層細胞培養容器１を作製した。
なお、表１における点対称とは、図２に示されるように、流入口３と流出口４とが、細胞培養容器２の平面視中心に対して点対称に配置されていることを指し、また、非点対称とは、図４に示されるように、流入口３と流出口４とが、細胞培養容器２の短辺側の隣り合う角部に配置されていることを指す。【００２９】
●評価方法
・ＣＯ２濃度差
多層細胞培養容器１の最上層および最下層の細胞培養容器２に、図１６に示されるように、流入口３から遠い側の短辺中央部にタイテック株式会社製非破壊二酸化炭素測定用センサーチップＳＰ−ＣＤ１−Ｄ５−ｒＭｙ―ＵＳ（ＣＯ２センサー）を設置した。その後、強制通気システム１０（ワケンビーテック社製ＭａｘＣｅｌｌ  ＭＬＦ）を用いて37℃二酸化炭素濃度5％の気体を多層細胞培養容器１に通気させ、２時間経過後に、最上層と最下層の細胞培養容器２における二酸化炭素濃度をそれぞれ計測し、これらの差（ＣＯ２濃度差（％））を算出し、Ａ：0.6％以下、Ｂ：0.6％超1.5％未満、Ｃ：1.5％以上のように評価した（濃度差評価）。
・培地の排出速度
多層細胞培養容器１を構成する各細胞培養容器２に、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地をそれぞれ170mlずつ注入した後、図１７に示されるように、流出口４を下にして培地を排出した。排出開始から5秒間の培地の排出量を計測し、単位時間当たりの排出量（排出速度（mｌ/sec））を算出した。
評価結果を表１および図１８（表１のデータのうち、実施例１〜８および比較例１〜４をプロットした）に示す。
なお、排出速度は65mｌ/sec以上が好ましく、75mｌ/sec以上がより好ましい。かかる排出速度を下回ると、排出作業効率が悪くなってしまったり、排出開始直後から外部環境に曝された細胞と、終了直前で外部環境に曝された細胞との間で、外部環境に曝される時間が大きく異なることとなり、これに起因して、両者の細胞の生存率や産生物の特性が変わる可能性がある。【００３０】
【表１】
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【００３１】
表１および図１８に示されるように、隙間部８の断面積が、5.0mm２以上40.0mm２以下の範囲である場合に、培地の排出効率を維持したまま、最上層から最下層までの細胞培養容器２の気体濃度を均一にすることができた。
また、流入口３と流出口４とを平面視中心に対して点対称に配置することにより、流入口３から流出口４にかけての気体の拡散効率がより高められていることがわかる。隙間部８の断面積が、上記5.0mm２以上40.0mm２以下の範囲を逸脱している比較例５では、積層の段数が２０段（積層２０段）であり、ＣＯ２濃度差評価はＢだったが、同じ断面積で、比較例６（積層３０段）と比較例２（積層４０段）のように積層の段数を増やすと、ＣＯ２濃度差評価はＣとなり、気体濃度の均一性が低下した。
具体的には、図１８において■で示される、流入口３と流出口４とが平面視中心に対して点対称配置である場合の培地の排出速度「排出速度（点対称）」は、隙間部８の断面積が5.0mm２以上40.0mm２以下の範囲にある場合に高く保たれ、かつ、最上層から最下層までの細胞培養容器２のＣＯ２濃度差（◆で示される「濃度差（点対称）」）が1.3％以下に維持された。また、点対称配置である場合のＣＯ２濃度差（◆で示される「濃度差（点対称）」）と非点対称配置であるＣＯ２濃度差（▲で示される「濃度差（非点対称）」）とを比較すると、「濃度差（点対称）」の方がＣＯ２濃度差が低く、気体の拡散効率がより高められていた。
【符号の説明】
【００３２】
１  多層細胞培養容器
２  細胞培養容器
３  流入口
４  流出口
５  底面
６  辺縁部
６Ａ  円周部
６Ｂ  周辺部
７  上面
８  隙間部
９  細胞培養装置
１０  強制通気システム
１１  フィルター
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明の多層細胞培養容器および細胞培養装置によれば、培地の排出効率を損なうことなく、最上層から最下層までの細胞培養容器の気体濃度を均一にして培養効率を向上させることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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