(57)【要約】微生物の発酵プロセス利用による有用物質の産生方法に関し、より効果的に有用物質を産生させ、製造する方法を提供する。非光合成原核生物に生物工学的に光リン酸化能を付与することによる。非光合成原核生物に生物工学的に光リン酸化能を付与することで非光合成原核生物でありながら光駆動高エネルギー作用を有する細胞が得られる。かかる形質転換非光合成原核生物を用いることでより効果的に有用物質を産生し、製造可能である。より詳しくは、遺伝子工学的にロドプシンをコードする遺伝子を導入して発現させた形質転換非光合成原核生物を光照射下で培養することで、微生物の発酵プロセスを利用してより効果的に有用物質を製造しうる。
2020050113.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子工学的にロドプシンをコードする遺伝子を導入して発現させた非光合成原核生物を光照射下で培養することを特徴とする、有用物質の製造方法。
【請求項２】
前記遺伝子工学的にロドプシンをコードする遺伝子を導入して発現させた非光合成原核生物が、光照射下で培養したときの有用物質の生産量が、暗所で培養したときの有用物質の生産量より高い産生量を示す非光合成原核生物である、請求項１記載の有用物質の製造方法。
【請求項３】
前記非光合成原核生物が、非光合成細菌である、請求項１又は２記載の有用物質の製造方法。
【請求項４】
前記非光合成原核生物が、大腸菌、乳酸菌、酢酸菌、枯草菌、放線菌、コリネ型細菌、シュードモナス属細菌、メタン生成菌、古細菌より選択されるいずれかである、請求項１又は２記載の有用物質の製造方法。
【請求項５】
前記非光合成原核生物が、大腸菌である、請求項１〜４のいずれか記載の有用物質の製造方法。
【請求項６】
前記非光合成原核生物の光照射下での培養が、1〜2000μmol/m2/sの光量の光照射下での培養である、請求項１〜５のいずれか記載の有用物質の製造方法。
【請求項７】
以下の工程を含む、大腸菌の培養産物由来有用物質の製造方法：
１）ロドプシンをコードする遺伝子を、大腸菌に導入する工程；
２）前記１）の遺伝子が組み込まれた大腸菌を1〜2000μmol/m2/sの光量の光照射下で、4〜40℃、4〜72時間培養する工程；
３）前記２）の工程で培養した大腸菌の培養産物を培養液から回収する工程。
【請求項８】
ロドプシンが、バクテリオロドプシン又はプロテオロドプシンである、請求項１〜７のいずれか記載の有用物質の製造方法。
【請求項９】
ロドプシンが、デルタロドプシンである、請求項１〜７のいずれか記載の有用物質の製造方法。
【請求項１０】
前記有用物質が、有機酸、ペプチド、アミノ酸、タンパク質、核酸、ビタミン、糖、糖アルコール、アルコール、イソプレノイド類及び脂質から選択される１種又は複数種である、請求項１〜９のいずれかに記載の有用物質の製造方法。
【請求項１１】
前記有用物質が、酢酸及び／又はグルタチオンである、請求項１〜９のいずれかに記載の有用物質の製造方法。
【請求項１２】
前記有用物質が、メバロン酸、イソプレノール、３ヒドロキシプロピオン酸から選択される１種又は複数種である、請求項１〜９のいずれかに記載の有用物質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光リン酸化能を付与した非光合成原核生物を培養することによる有用物質の製造方法に関する。より詳しくは、遺伝子工学的にロドプシン（Rhodopsin）をコードする遺伝子を導入して発現させた非光合成原核生物を明条件下で培養することを特徴とする、有用物質の製造方法に関する。【０００２】
本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願特願２０１８−１６４９０７号優先権を請求する。
【背景技術】
【０００３】
生体や環境にやさしいクリーンなエネルギーが望まれる時代にあって、無尽蔵に存在する光エネルギーを利用する太陽電池や、光エネルギーを有機物として蓄積した植物体をエネルギー源や化成品の発酵原料として用いようとするバイオリファイナリーの研究が盛んである。そして光合成細菌（photosynthetic bacteria）や藍藻（cyanobacterium）などの光合成能を有する微生物について、光エネルギーを利用して有用物質を生産させる研究が行なわれている。しかしながら、これらの微生物は概して増殖速度が遅いことや、代謝経路の全貌が不明確であることが、実用化するうえでの課題となっている。一方で、増殖速度が速い大腸菌や出芽酵母などの発酵微生物に代謝工学的な改良を施し、医薬品や食品、化粧品、燃料、ポリマー原料等の様々な有用物質の発酵生産性を向上させる研究が行なわれている。しかしながら、目的物質の生産性が向上するにつれて、野生株とは異なる偏った負荷を課せられたこれらの発酵微生物はしばしば細胞内エネルギー（ATP：Adenosine triphosphate）不足に陥り、生育の低下や目的物質の生産性の頭打ちに直面することが多い。【０００４】
真核生物（eukaryote）の植物及び藻類、並びに原核生物（prokaryote）の藍藻類、緑色硫黄細菌、緑色非硫黄細菌、紅色硫黄細菌、及び紅色非硫黄細菌植物や藻類、光合成菌などの光独立栄養微生物（photoautotoroph）にプロテオロドプシンを導入することで、高光合成生物（hyper photosynthetic organism）に変換することを可能にすることが開示されている（特許文献１）。特許文献１に示す光独立栄養微生物とは、光合成を通じてエネルギーを取得する生物をいい、非光合成原核生物とは全く相違する。【０００５】
大腸菌にロドプシンを発現させて、プロテオロドプシン（PR：proteorhodopsin）の大量生産を見込んだ迅速かつ安価な生産方法が開示されている（特許文献２、非特許文献１）。光利用プロトン駆動力の形成には触れているが、ロドプシンを発現した大腸菌が有用物質の生産に必要なATPのエネルギー生産に良好な作用を示すことや、さらには有用物質の生産に高い効力を示すことは記載されていない。【０００６】
光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母の作製方法について開示がある（特許文献３）。ここでは、出芽酵母にデルタロドプシン（dR：Delta-rhodopsin）を発現させ、光利用プロトン駆動力の形成、ATPの産生を介して有用物質の生産に良好な作用を示したことが開示されている。しかしながら、特許文献３ではサッカロミセス亜門酵母のみを対象としており、ロドプシンの他にミトコンドリア局在化シグナルをコードする核酸（遺伝子）を組み込むことを要件としている。【０００７】
微生物の発酵プロセスを利用する方法において、より効果的に有用物質を産生及び製造する方法の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開2014-87360号公報（特願2013-269377）
【特許文献２】特表2004-521604号（特願2001-580311）
【特許文献３】再公表公報WO2015/170609号（特願2016-517869）
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Biochemical and Biophysical Research Communications341: 2006, 285-290
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、微生物の発酵プロセス利用による有用物質の産生方法に関し、より効果的に有用物質を産生させ、製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、非光合成原核生物に生物工学的に光リン酸化能を付与することで非光合成原核生物でありながら光駆動高エネルギー作用を有する微生物を作製し、有用物質をより効果的に産生させることに成功し、本発明を完成した。より詳しくは、遺伝子工学的にロドプシンをコードする遺伝子を導入して発現させた非光合成原核生物を明条件下で培養することで、微生物の発酵プロセスを利用して有用物質をより効果的に産生させ、製造させることができ、本発明を完成した。【００１２】
すなわち本発明は、以下よりなる。
１．遺伝子工学的にロドプシンをコードする遺伝子を導入して発現させた非光合成原核生物を光照射下で培養することを特徴とする、有用物質の製造方法。
２．前記遺伝子工学的にロドプシンをコードする遺伝子を導入して発現させた非光合成原核生物が、光照射下で培養したときの有用物質の生産量が、暗所で培養したときの有用物質の生産量より高い産生量を示す非光合成原核生物である、前項１記載の有用物質の製造方法。
３．前記非光合成原核生物が、非光合成細菌である、前項１又は２記載の有用物質の製造方法。
４．前記非光合成原核生物が、大腸菌、乳酸菌、酢酸菌、枯草菌、放線菌、コリネ型細菌、シュードモナス属細菌、メタン生成菌、古細菌より選択されるいずれかである、前項１又は２記載の有用物質の製造方法。
５．前記非光合成原核生物が、大腸菌である、前項１〜４のいずれか記載の有用物質の製造方法。
６．前記非光合成原核生物の光照射下での培養が、1〜2000μmol/m2/sの光量の光照射下での培養である、前項１〜５のいずれか記載の有用物質の製造方法。
７．以下の工程を含む、大腸菌の培養産物由来有用物質の製造方法：
１）ロドプシンをコードする遺伝子を、大腸菌に導入する工程；
２）前記１）の遺伝子が組み込まれた大腸菌を1〜2000μmol/m2/sの光量の光照射下で、4〜40℃、4〜72時間培養する工程；
３）前記２）の工程で培養した大腸菌の培養産物を培養液から回収する工程。
８．ロドプシンが、バクテリオロドプシン又はプロテオロドプシンである、前項１〜７のいずれか記載の有用物質の製造方法。
９．ロドプシンが、デルタロドプシンである、前項１〜７のいずれか記載の有用物質の製造方法。
１０．前記有用物質が、有機酸、ペプチド、アミノ酸、タンパク質、核酸、ビタミン、糖、糖アルコール、アルコール、イソプレノイド類及び脂質から選択される１種又は複数種である、前項１〜９のいずれかに記載の有用物質の製造方法。
１１．前記有用物質が、酢酸及び／又はグルタチオンである、前項１〜９のいずれかに記載の有用物質の製造方法。
１２．前記有用物質が、メバロン酸、イソプレノール、３ヒドロキシプロピオン酸から選択される１種又は複数種である、前項１〜９のいずれかに記載の有用物質の製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
通常、非光合成原核生物は有用物質の生産が生きる目的ではないため、非光合成原核生物を用いた有用物質の生産性は低い。大腸菌などの非光合成原核生物に代謝工学的な改良を施し、医薬品や食品、化粧品、燃料、ポリマー原料等の様々な有用物質の発酵生産性を向上するにつれ、微生物が細胞内エネルギー不足に陥り、生育の低下や目的物質の生産性の頭打ちに直面することが少なくない。これは微生物の発酵プロセスで「細胞自身の材料（Cell mass)」、「目的産物の産生」、「細胞内エネルギー」等により炭素源が消費されることによると考えられる。非光合成原核生物に光リン酸化能を付与した本発明の光駆動非光合成原核生物によれば、エネルギー再生型有用物質生産宿主になり得る。これにより、これまでのエネルギー源に加えて、光をエネルギー源にできることから、有用物質の生産性を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】形質転換大腸菌（dR発現株１）について、プロトン輸送活性を確認した結果を示す図である。光照射によるpHの変動を確認した結果を示す図である。（実験例３−１）
【図２】形質転換大腸菌（dR発現株１）について、光照射の違いによる大腸菌細胞におけるATP生産を確認した結果を示す図である。（実験例３−２）
【図３】形質転換大腸菌（dR発現株１）による代謝産物の産生を確認した結果を示す図である。（実験例３−３）
【図４】形質転換大腸菌（dR発現株１）について、グルコース又はグリセロールを炭素源とした大腸菌細胞の増殖の結果を示す図である。rpmは、攪拌速度（1分間の回転数）を示す。（実験例３−４）
【図５】形質転換大腸菌（dR発現株１）について、グルコース又はグリセロールを炭素源としたグルタチオン産生の結果を示す図である。rpmは、攪拌速度（1分間の回転数）を示す。（実験例３−４）
【図６】形質転換大腸菌（pR発現株１）について、グルタチオン産生結果を示す図である。（実験例３−５）
【図７】形質転換大腸菌（dR発現株２〜４）による代謝産物の産生を確認した結果を示す図である。（実施例４〜６）
【図８】形質転換大腸菌（dR発現株２）による代謝産物（メバロン酸）の産生量を確認した結果を示す図である。（実施例４）
【図９】形質転換大腸菌（dR発現株３）による代謝産物（イソプレノール）の産生量を確認した結果を示す図である。（実施例５）
【図１０】形質転換大腸菌（dR発現株４）による代謝産物（3HP：3ヒドロキシプロピオン酸）の産生量を確認した結果を示す図である。（実施例６）
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の有用物質の製造方法は、遺伝子工学的にロドプシンをコードする遺伝子を導入して発現させた非光合成原核生物を明条件（光照射）下で培養する工程を含むことを特徴とする。
【００１６】
本明細書において「非光合成原核生物」とは、通常光合成を行わない原核生物であり、例えば非光合成細菌（non-photosynthetic bacteria）、非光合成古細菌（non-photosynthetic archea）、非光合成放線菌（non-photosynthetic actinomycetes）等が挙げられる。具体的には、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、乳酸菌（Lactobacillus）、酢酸菌（Acetobacteraceae）、コリネ型細菌（Corynebacterium）、シュードモナス属細菌（Pseudomonas bacteria）、メタン生成菌（Methanobacterium、Methanosarcina）、ストレプトミセス属（Streptomyces）、アクチノマイセス属（Actinomyces）等が挙げられ、特に大腸菌が好適である。使用可能な非光合成原核生物は、遺伝子工学的にロドプシンを発現可能であれば野生株であってもよいし、変異導入や株化された原核生物であってもよい。例えば、大腸菌の場合には大腸菌MG1655(DE3)株（Journal of Bioscience and Bioengineering Vol. 123 No. 2, 177 e182, 2017）を使用することもできるし、発現方法、例えば構成的発現やプロピオン酸、アラビノース、無水酢酸などによる誘導発現などを適用する場合に、野生株や適宜適切な株を選択して使用することができる。
【００１７】
本明細書において「ロドプシン」とは、オプシン（Opsin）というタンパク質とレチナール（Retinal）の複合体であり、光受容体タンパク質をいう。ロドプシンの種類としては、例えばデルタロドプシン（dR）、バクテリオロドプシン（アーキアロドプシン、クルックスロドプシンを含む）、センサリーロドプシンI、センサリーロドプシンII、プロテオロドプシン(pR)、チャンネルロドプシンI、チャンネルロドプシンII、ハロロドプシン、キサントロドプシン、ナトリウムポンプ型ロドプシン、ヘリオロドプシンなどが挙げられる。例えば、デルタロドプシンやバクテリオロドプシンは明条件（光照射）によりプロトンを原核生物の内部から外部へ汲み出す機能を有し、ハロロドプシンは光により塩素イオンを取り込む機能を有する。本発明のロドプシンは、好ましくはデルタロドプシン、バクテリオロドプシンやプロテオロドプシンであり、より好ましくはデルタロドプシンである。デルタロドプシンは、ハロテリジェナ・タークメニカ（Haloterrigena turkmenica, Haloterrigena sp. Arg-4）由来のものが挙げられる。大腸菌に発現させたH. turkmenica由来のデルタロドプシンについて報告がある（BiochemBiophys Res Commun 2006, 341: 285-290, GeneBank Accession No. AB00962）。
【００１８】
本明細書において、「ロドプシンをコードする遺伝子」とは、上述のロドプシンを発現可能な塩基配列からなる核酸配列を含む。また、発現されるロドプシンは、必ずしも完全長のロドプシンでなくてもよく、光エネルギーにより活性化し、電子伝達系の活性化によりプロトン濃度勾配やATPなどの細胞内エネルギーが産生しうる長さであればよい。また、人工的に設計したロドプシンでもよい。このような機能を有するロドプシンをコードする遺伝子であればよい。
【００１９】
遺伝子工学的にロドプシンをコードする遺伝子を導入する方法は、自体公知の方法、又は今後開発されるあらゆる方法を適用することができる。本発明の有用物質の製造方法において、本発明の遺伝子工学的にロドプシンをコードする遺伝子を導入して発現させた非光合成原核生物（以下、「形質転換非光合成原核生物」ともいう。）は、予め作製したものを使用することもできるし、当該形質転換非光合成原核生物を作製して有用物質の製造をしてもよい。
【００２０】
本発明の有用物質の製造方法は、前記形質転換非光合成原核生物を前培養する工程と、当該形質転換非光合成原核生物を明条件（光照射）下で培養し、有用物質を産生させる工程が含まれる。さらに当該産生した有用物質を回収する工程を含めることもできる。産生した有用物質を回収する工程は、当該形質転換非光合成原核生物を培養する工程と同時であってもよいし、培養後であってもよい。
【００２１】
前記形質転換非光合成原核生物を、常法により培養、増殖させることで当該形質転換非光合成原核生物を回収することができる。培養の条件は、使用する当該形質転換非光合成原核生物の生育に適した条件において適宜設定することができる。当該形質転換非光合成原核生物の培養に用いられる培地としては、炭素源、窒素源、無機イオン、及び本発明の目的産物である有用物質を生産するために形質転換非光合成原核生物が要求する有機微量元素、核酸、ビタミン類等が含まれた通常用いられる培地であれば特に制限はない。本発明の培養に際して、pH、温度条件は使用する形質転換非光合成原核生物の増殖に最も適した条件を選べばよい。例えばpH 2〜9、好ましくはpH 4〜9、より好ましくはpH 5〜8とすることができ、培養温度は4〜50℃、好ましくは15〜45℃、より好ましくは30〜40℃とすることができる。培養期間は、目的産物の生産が確認可能な期間であればよく特に制限されないが、例えば4〜144時間、好ましくは4〜72時間、より好ましくは4〜36時間培養することができる。また必要に応じて継代培養してもよい。形質転換非光合成原核生物の増殖を確認する方法は特に制限はないが、例えば培養物を採取して顕微鏡で観察してもよいし、吸光度で観察してもよい。また、形質転換非光合成原核生物培養時の培地の溶存酸素濃度には特に制限はないが、通常は、0.5〜20ppmが好ましい。そのために、通気量を調節したり、撹拌したり、通気に酸素を追加することができる。培養法としては、前記条件で特に限定されないが、液体培養法がよく、回分培養、流加培養、連続培養又は灌流培養のいずれを用いてもよい。また、振盪又は通気攪拌して培養することができる。以下、形質転換非光合成原核生物培養時の培地を、単に「培養液」という場合もある。
【００２２】
本発明の形質転換非光合成原核生物から本発明の有用物質を産生させるために、当該形質転換非光合成原核生物を明条件（光照射）下で培養することが好ましい。光照射下で培養することで、形質転換非光合成原核生物内のエネルギーを有効活用し、より効果的に有用物質を産生することができる。有用物質を産生する際の光照射は、1〜2000μmol/m2/sの光量の光照射下が好適であり、好ましくは10〜200μmol/m2/sの光量の光照射下がより好適であり、50μmol/m2/sの光照射（明条件）下が最も好適である。光照射を施す時期は、培養開始からでもよいし、培養途中からでもよい。照射時間は培養中に常時照射してもよいし、間欠的に照射してもよい。照射光の光源は、蛍光灯、LED、太陽光等いずれの光源を用いてもよいが波長を限定する場合には、300〜800 nmが好適であり、好ましくは450〜650 nmがより好適であり、550 nmが最も好適である。
【００２３】
前記有用物質は、例えば上記明条件（光照射）下で培養した形質転換非光合成原核生物を含む培養槽から生産物を含む培養液を連続的に抜き取りながら、回収することができる。形質転換非光合成原核生物を含む培養槽には、培地を連続的に供給することもできる。前記培養液を該培養槽から連続的に抜き取りながら、前記形質転換非光合成原核生物を有用物質生産期に安定的に増殖する条件で培養することができる。前記形質転換非光合成原核生物の連続的な培養と有用物質の産生は、基質液としての培地の供給及び培養液の抜き取りと、増殖条件下での培養とにより達成される。これにより、有用物質の生産期でも前記形質転換非光合成原核生物の増殖能が維持され、結果的に、連続培養であっても有用物質の生産を維持することができる。
【００２４】
本明細書において「有用物質」とは、本発明の形質転換非光合成原核生物の発酵プロセスにより産生可能な物質であって、工業上有用とされている物質であれば特に限定されない。有用物質の例として、例えば有機酸、ペプチド、アミノ酸、タンパク質、ヌクレオシド、ビタミン、糖、糖アルコール、アルコール、イソプレノイド類及び脂質などをあげることができる。より具体的には以下があげられる。有機酸としては、酢酸、乳酸、コハク酸などをあげることができる。ペプチドとしてはグルタチオン、アラニルグルタミン、γグルタミルバリルグリシンなどをあげることができ、ポリペプチドとしては、ポリリジン、ポリグルタミン酸をあげることができる。アミノ酸としては、L-アラニン、グリシン、L-グルタミン、L-グルタミン酸、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-リジン、L-メチオニン、L-スレオニン、L-ロイシン、L-バリン、L-イソロイシン、L-プロリン、L-ヒスチジン、L-アルギニン、L-チロシン、L-トリプトファン、L-フェニルアラニン、L-セリン、L-システイン、L-3-ヒドロキシプロリン、L-4-ヒドロキシプロリン、5-アミノレブリン酸などをあげることができる。タンパク質としては、ルシフェラーゼ、イノシンキナーゼ、Glutamate 5-kinase (EC 2.7.2.11)、Glutamate-5-semialdehydedehydrogenase (EC 1.2.1.41)、Pyrroline-5-carboxylatereductase (EC 1.5.1.2)、γ−グルタミルシステイン合成酵素(EC 6.3.2.2)、グルタチオン合成酵素(EC 6.3.2.3)、ヒト顆粒球コロニー刺激因子、キシロースレダクターゼ、P450などをあげることができる。ヌクレオシドとしては、イノシン、グアノシン、イノシン酸、グアニル酸、アデニル酸などをあげることができる。ビタミンとしては、リボフラビン、チアミン、アスコルビン酸などをあげることができる。糖としては、キシロース、マンノースなどをあげることができ、糖アルコールとしては、キシリトール、マンニトールなどをあげることができ、アルコールとしてはエタノールなどをあげることができる。イソプレノイド類としては、メバロン酸（MVA：Mevalonate）、イソプレノール、アスタキサンチン、イソプレン、イソペンテノール、リモネン、ピネン、ファルネセン、ビサボレンなどをあげることができる。脂質としては、プロピオン酸、ヒドロキシプロピオン酸、EPA（エイコサペンタエン酸）やDHA（ドコサヘキサエン酸）などをあげることができる。本発明における有用物質では、有機酸では酢酸、ペプチドではグルタチオン、イソプレノイド類ではメバロン酸、イソプレノール、脂質ではヒドロキシプロピオン酸が特に好適である。
【００２５】
前記生産物を含む培養液から有用物質の単離方法は特に限定されず、自体公知の方法又は今後開発されるあらゆる方法を適用することができる。
【実施例】
【００２６】
本発明の理解を深めるために、本発明の内容を実施例及び実験例を示して具体的に説明するが、本発明はこれら実施例等の記載内容に限定されるものではないことは明らかである。【００２７】
（実施例１）形質転換大腸菌（dR発現株）の作製
実施例１ではデルタロドプシン（dR）の形質転換大腸菌の作製方法について示す。本実施例では、大腸菌MG1655(DE3)株（Journal of Bioscience andBioengineering Vol. 123 No. 2, 177 e182, 2017）に、以下に示すデルタロドプシン（dR）を発現可能な形質転換大腸菌を作製した。本実施例で作製した形質転換大腸菌を、以下「dR発現株１」という。【００２８】
本実施例において、大腸菌に発現させるデルタロドプシン（dR）は、以下の配列番号１に示すアミノ酸配列からなる。
MCCAALAPPMAATVGPESIWLWIGTIGMTLGTLYFVGRGRGVRDRKMQEFYIITIFITTIAAAMYFAMATGFGVTEVMVGDEALTIYWARYADWLFTTPLLLLDLSLLAGANRNTIATLIGLDVFMIGTGAIAALSSTPGTRIAWWAISTGALLALLYVLVGTLSENARNRAPEVASLFGRLRNLVIALWFLYPVVWILGTEGTFGILPLYWETAAFMVLDLSAKVGFGVILLQSRSVLERVATPTAAPT（配列番号１）【００２９】
上記アミノ酸配列を、geneArt(R)GeneOptimizer(R)プログラム（ThermoFisher）を用いて、大腸菌用にコドンを最適化し、以下の配列番号２に示す塩基配列からなる核酸（遺伝子）を取得した。
ATGTGTTGTGCAGCACTGGCACCGCCTATGGCAGCAACCGTTGGTCCGGAAAGCATTTGGCTGTGGATTGGCACCATTGGTATGACCCTGGGCACCCTGTATTTTGTTGGTCGTGGTCGCGGTGTTCGTGATCGTAAAATGCAAGAGTTTTACATCATCACCATCTTTATCACCACCATTGCAGCAGCAATGTATTTCGCAATGGCAACCGGTTTTGGTGTTACCGAAGTTATGGTTGGTGATGAAGCACTGACCATTTATTGGGCACGTTATGCAGATTGGCTGTTTACCACACCTCTGCTGCTGCTGGATCTGAGCCTGCTGGCAGGCGCAAATCGTAATACCATTGCAACCCTGATTGGTCTGGATGTTTTTATGATTGGTACAGGTGCAATTGCCGCACTGAGCAGCACACCGGGTACACGTATTGCATGGTGGGCAATTAGTACCGGTGCACTGCTGGCCCTGCTGTATGTTCTGGTTGGCACCCTGAGCGAAAATGCACGTAATCGTGCACCGGAAGTTGCAAGTCTGTTTGGTCGTCTGCGTAATCTGGTTATTGCACTGTGGTTTCTGTATCCGGTTGTTTGGATTCTGGGCACCGAAGGTACATTTGGTATTCTGCCGCTGTATTGGGAAACCGCAGCATTTATGGTTCTGGATCTGTCAGCAAAAGTTGGTTTTGGCGTTATTCTGCTGCAAAGCCGTAGCGTTCTGGAACGTGTTGCAACCCCGACCGCAGCACCGACCTAA（配列番号２）【００３０】
上記配列番号２に示す配列の両端に制限酵素NdeIとKpnIの認識サイトを付けてpCDFDuetTM-1 vector（Novagen）に挿入し、大腸菌MG1655(DE3)を形質転換して細胞内に導入し、dR発現株１を作製した。【００３１】
（実施例２）形質転換大腸菌（pR発現株）の作製
実施例２では実施例１と同様に大腸菌MG1655(DE3)株に、以下に示すプロテオロドプシン（pR）を発現可能な形質転換大腸菌を作製した。本実施例で作製した形質転換大腸菌を、以下「pR発現株１」という。【００３２】
本実施例において、大腸菌に発現させるプロテオロドプシン（pR）は、以下の配列番号３に示すアミノ酸配列からなる（Biochimica et Biophysica Acta 1777: 2008, 504-513 参照）。
MKLLLILGSVIALPTFAAGGGDLDASDYTGVSFWLVTAALLASTVFFFVERDRVSAKWKTSLTVSGLVTGIAFWHYMYMRGVWIETGDSPTVFRYIDWLLTVPLLICEFYLILAAATNVAGSLFKKLLVGSLVMLVFGYMGEAGIMAAWPAFIIGCLAWVYMIYELWAGEGKSACNTASPAVQSAYNTMMYIIIVGWAIYPVGYFTGYLMGDGGSALNLNLIYNLADFVNKILFGLIIWNVAVKESSNA（配列番号３）【００３３】
上記アミノ酸配列を、geneArt(R)GeneOptimizer(R)プログラム（ThermoFisher）を用いて、大腸菌用にコドンを最適化し、以下の配列番号４に示す塩基配列からなる核酸（遺伝子）を取得した。
ATGAAACTGCTGCTGATTCTGGGTAGCGTTATTGCACTGCCGACCTTTGCAGCCGGTGGTGGTGATCTGGATGCAAGCGATTATACCGGTGTTAGCTTTTGGCTGGTTACCGCAGCACTGCTGGCAAGCACCGTTTTTTTCTTTGTTGAACGTGATCGTGTTAGCGCCAAATGGAAAACCAGCCTGACCGTTAGCGGTCTGGTGACCGGTATTGCATTTTGGCATTATATGTATATGCGTGGCGTTTGGATTGAAACCGGTGATAGCCCGACCGTTTTTCGTTATATTGATTGGCTGCTGACCGTTCCGCTGCTGATCTGTGAATTTTATCTGATCCTGGCAGCAGCAACCAATGTTGCAGGTAGCCTGTTCAAAAAACTGCTGGTTGGTAGCCTGGTTATGCTGGTGTTTGGTTATATGGGTGAAGCAGGTATTATGGCAGCATGGCCTGCATTTATCATTGGTTGTCTGGCATGGGTGTATATGATTTATGAACTGTGGGCAGGCGAAGGTAAAAGCGCATGTAATACCGCAAGTCCGGCAGTTCAGAGCGCCTATAATACCATGATGTACATTATTATCGTTGGCTGGGCAATTTATCCGGTGGGTTATTTCACCGGCTATCTGATGGGTGATGGTGGTAGCGCACTGAATCTGAACCTGATTTATAATCTGGCCGACTTCGTGAACAAAATTCTGTTTGGTCTGATTATTTGGAACGTGGCCGTTAAAGAAAGCAGCAATGCATAA（配列番号４）【００３４】
上記配列番号４に示す配列の両端に制限酵素NdeIとKpnIの認識サイトを付けてpCDFDuetTM-1 vector（Novagen）に挿入し、大腸菌MG1655(DE3)を形質転換して細胞内に導入し、pR発現株１を作製した。【００３５】
（実施例３）形質転換大腸菌の培養
実施例３では実施例１及び実施例２で作製した形質転換大腸菌（dR発現株１、pR発現株１）の培養方法を示す。【００３６】
各形質転換大腸菌は、LB培地（Luria-Bertani medium）中で37℃、撹拌200 rpmで前培養し、その後炭素源としてグルコース（4〜8%）又はグリセロール（8%）を含むM9培地中で37℃、200 rpmにて本培養を行った。培地にはストレプトマイシンを適量含み、以下各実施例、実験例の培養においても同様である。形質転換大腸菌の増殖は、大腸菌細胞を含む培養液をOD600の吸光度を紫外可視分光光度計（UVmini-1240; Shimadzu）で測定することで、細胞濃度から確認した。細胞濃度（OD600）が0.6になるまで培養した後、0.025〜1mMのイソプロピル-β-チオガラクトピラノシド（Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside）と10μMのall-trans-レチナール（all-trans-Retinal）を加えて誘導発現を行った後、明条件として0〜135μmol/m2/sの光照射にて、37℃、50〜200 rpmで24時間培養した。【００３７】
前培養  培地  LB培地量  5 ml
培地への形質転換大腸菌の添加量  LB寒天プレートより１個のコロニーを植菌
温度  37℃
培養時間  15時間
光照射なし【００３８】
本培養  培地  炭素源としてグルコース（4〜8%）又はグリセロール（8%）を含むM9培地量  100 ml
培地への形質転換大腸菌の添加量  2 ml
温度  37℃
培養時間  24時間
撹拌      50〜200 rpm
光照射    0〜135μmol/m2/s【００３９】
（実験例３−１）プロトン輸送活性
上記培養した形質転換大腸菌（dR発現株１）について、プロトン輸送活性を確認した。
dR発現株１を含む培養液（100 ml）を遠心分離し、上清を除去して取得した大腸菌細胞に5〜10 mlの生理食塩水（100 mMNaCl）を加え、10分間平衡化した。これを３回繰り返し、プロトン輸送活性測定用の試料とした。【００４０】
上記作製した試料に、ハロゲンランププロジェクター（JCD100V-300WL）を用いて、光量50、70、200及び1500μmol/m2/sの光を照射し、ロドプシンのイオン輸送に伴って生じるpHの変化をpHメーター（F-72;HORIBA）を用いて測定した。pHの変化により形質転換大腸菌（dR発現株１）のプロトン輸送活性を確認し、光駆動型細菌といえるかについて確認した。pH変化がロドプシンのプロトンポンプ活性由来であることは、溶液中にプロトンイオノフォアであるCCCP（Carbonyl Cyanide3-Chlorophenylhydrazone）を加えることで確認した。その結果を図１及び表１に示した。【００４１】
【表１】
2020050113.tif 000003
【００４２】
照射した光量の増加に伴って上記作製した試料でのpH減少速度が増加しており、デルタロドプシンが光依存的に細胞外にプロトンを輸送していることが確認された。【００４３】
（実験例３−２）ATPの測定
本実験例では、上記実施例３で培養した形質転換大腸菌（dR発現株１）について、光照射の違いによる大腸菌細胞におけるATP生産を確認した。上記実験例３−１のプロトン輸送活性測定用試料と同手法で作製した試料について、ハロゲンランププロジェクター（JCD100V-300WL）を用いて、光量25、50及び100μmol/m2/sの光を照射した。本実施例以降において、暗条件とは0.02μmol/m2/s以下をいう。【００４４】
dR発現株１を含む培養液（100 ml）を3000g、室温で5分間遠心分離し、上清を除去して取得した大腸菌細胞に1 mlの100 mM Tris-HCl、1 mM EDTA（pH 7.5）を加え、混和後再び遠心分離して上清を除去した。大腸菌細胞に対して500μlの100 mM Tris-HCl、1 mM EDTA（pH7.5）を加え、細胞破砕用チューブに移し替えた。直径0.6 mmのジルコニアビーズを加え、細胞破砕装置（shake master neo）にて、1500rpm、0分間細胞破砕処理を行った。細胞破砕後の大腸菌細胞溶液を16000g、20分、4℃にて遠心分離後し、上清をATP測定用試料とした。【００４５】
ATP生産は、市販のATP Bioluminescent Assay Kit（FLAA-1KT; Sigma）を用いてマニュアルに記載の方法に従い、ルシフェラーゼ発光法で測定した。光照射量に応じてATP生産量は増加することが確認された（図２）。【００４６】
（実験例３−３）形質転換大腸菌による代謝産物の測定
本実験例では、上記実施例３で培養した形質転換大腸菌（dR発現株１）による代謝産物の産生を確認した。本実験例では、明条件として光量50μmol/m2/sの光を照射し、暗条件は0.02μmol/m2/s以下とした。【００４７】
dR発現株１を含む培養液（100 ml）を15000g、4℃で5分間遠心分離し、上清を回収して0.45μmのフィルター（Millex HV; Merck KGaA）でろ過して-30℃で保存したものを培養液試料とした。次に、培養液試料と等量の内部標準液（5 mM イソ酪酸）を混合し、代謝産物測定用試料とした。【００４８】
上記調製した試料を高速液体クロマトグラフィー（HPLC; Shimadzu）により分析した。以下の条件でHPLCを運転し、酢酸を含む中枢代謝産物を測定した。
・カラム：Aminex HPX-87X column（Bio-Rad）、カラム温度：65℃
・分離溶媒：1.5 mM H2SO4、流速：0.5 ml/分
・検出器：UV/vis検出器（SPD-20A; Shimadzu）、RI検出器（RID-10A; Shimadzu）
・検出波長：210 nm【００４９】
【表２】
2020050113.tif 000004
【００５０】
分析結果を図３及び表２に示した。その結果、炭素源であるグルコースから、ほとんどの代謝産物への産生速度は明条件及び暗条件で同程度であったが、明条件では暗条件と比較して、TCAサイクルへの炭素流量が減少し、酢酸への炭素流量が増加した。明条件及び暗条件での大腸菌細胞増殖速度はほとんど変わらなかったが、明条件では代謝サイクルにおいてグルコース消費量が減少し、その結果、酢酸の産生量が明条件により約1.3倍増加したことが確認された。【００５１】
（実験例３−４）形質転換大腸菌によるグルタチオン産生１
本実験例では、上記実施例３で培養した形質転換大腸菌（dR発現株１）によるグルタチオン（GSH）の産生を確認した。本実験例では、明条件として光量50μmol/m2/sの光を照射し、暗条件は0.02μmol/m2/s以下とした。【００５２】
培養24時間後の大腸菌細胞濃度（OD600）を図４に示した。グルコースを炭素源として用いて好気的に撹拌200 rpmで培養した場合には、明条件では1.37、暗条件では1.14であった。グリセロールを炭素源として用いて好気的に撹拌200 rpmで培養した場合には、明条件では2.54、暗条件では2.28であった。グリセロールを炭素源として嫌気的に50 rpmで培養した場合には、明条件では1.13、暗条件では2.28であった。【００５３】
培養24時間後の培養液を分取し、遠心分離により培養液上清を除去した大腸菌細胞（dR発現株）を100 mM Tris-HCl（pH7.5）、2 mM EDTAにて洗浄した。その後、100 mM Tris-HCl（pH7.5）、2 mM EDTAを適量加え、細胞懸濁液を調製した。次にジルコニアビーズ（直径=0.6mm）を細胞懸濁液に加え、細胞破砕装置（shake master Neo; バイオメディカルサイエンス）にて1500 rpmの条件で10分間細胞を破砕した。遠心分離により細胞破砕物を除去したものをGSH測定用試料とした。【００５４】
GSH量は、市販のGSH測定キット（同仁化学）を用いてDTNB（5-5'-dithiobis[2-nitrobenzoic acid]）による呈色法で測定した。【００５５】
培養24時間後の細胞当たりのGSH濃度を図５上段に示した。グルコースを炭素源として用い、好気的に撹拌200 rpmで培養した場合には、明条件では0.221 mg/l/OD、暗条件では0.117 mg/l/ODであった。グリセロールを炭素源として用い、好気的に撹拌200rpmで培養した場合には、明条件では1.18 mg/l/OD、暗条件では0.60 mg/l/ODであった。グリセロールを炭素源として嫌気的に50 rpmで培養した場合には、明条件では4.01 mg/l/OD、暗条件では2.52 mg/l/ODであった。また、培養24時間後の培養液当たりのGSH濃度を図５下段に示した。グルコースを炭素源として用い、好気的に撹拌200 rpmで培養した場合には、明条件では0.302 mg/l、暗条件では0.135 mg/lであった。グリセロールを炭素源として用い、好気的に撹拌200 rpmで培養した場合には、明条件では2.17 mg/l、暗条件では1.55 mg/lであった。グリセロールを炭素源として嫌気的に50 rpmで培養した場合には、明条件では4.53 mg/l、暗条件では2.07 mg/lであった。【００５６】
（実施例３−５）形質転換大腸菌によるグルタチオン産生２
本実験例では、上記実施例３で培養した形質転換大腸菌（pR発現株１）によるグルタチオン（GSH）の産生を確認した。【００５７】
本実験例では、明条件として光量50μmol/m2/sの光を照射し、暗条件は0.02μmol/m2/s以下とした。グルコースを炭素源として用い、好気的に撹拌150 rpmで培養した。実験例３−４と同様に、大腸菌細胞（pR発現株１）についてGSH測定用試料を調製し、GSH量は、市販のGSH測定キット（同仁化学）を用いてDTNB（5-5'-dithiobis[2-nitrobenzoic acid]）による呈色法で測定した。培養24時間後の細胞当たりのGSH濃度を図６に示した。明条件では0.91 mg/l/OD、暗条件では0.54 mg/l/ODであった。【００５８】
（実施例４）形質転換大腸菌（dR発現株２）の作製
実施例４では、実施例１と同様に大腸菌MG1655(DE3)株に、配列番号２で特定する塩基配列からなる核酸を導入し、形質転換大腸菌（dR発現株２）を作製した。大腸菌MG1655(DE3)にpCOLADuet-1-mvaES及びpBbS7a-dRを導入し、MVADR株を作製し、dR発現株２とした。以下、dR発現株２の作製方法について示す。【００５９】
pCOLADuet-1-mvaESは、Journal of Bioscience and Bioengineering 124: 2017, 177-182に示す方法に従い、pCOLADuet-1（Merck KGaA）のMCS2のNdeI-XhoIサイトに、制限酵素NdeIとKpnIの認識サイトを付けてコドン最適化した配列番号５及び配列番号６に示す塩基配列を導入して作製した。mvaE及びmvaSは、いずれもメバロン酸合成酵素である。【００６０】
コドン最適化したmvaEをコードする遺伝子の塩基配列
ATGAAAACCGTGGTGATTATTGATGCACTGCGTACCCCGATTGGTAAATACAAAGGTAGCCTGAGCCAGGTTAGCGCAGTTGATCTGGGCACCCATGTTACCACCCAGCTGCTGAAACGTCATAGCACCATTAGCGAAGAAATTGATCAGGTGATTTTTGGCAATGTTCTGCAGGCAGGTAATGGTCAGAATCCGGCACGTCAGATTGCAATTAATAGCGGTCTGAGCCATGAAATTCCGGCAATGACCGTTAATGAAGTTTGTGGTAGCGGTATGAAAGCAGTTATTCTGGCAAAACAGCTGATCCAGCTGGGCGAAGCCGAAGTTCTGATTGCCGGTGGTATTGAAAATATGAGCCAGGCACCGAAACTGCAGCGTTTCAATTATGAAACCGAAAGCTATGATGCACCGTTTAGCAGCATGATGTATGATGGTCTGACCGATGCATTTAGCGGTCAGGCAATGGGTCTGACAGCAGAAAATGTTGCAGAAAAATATCATGTGACCCGTGAAGAACAGGATCAGTTTAGCGTTCATAGCCAGCTGAAAGCAGCACAGGCACAGGCCGAAGGTATTTTTGCAGATGAAATTGCACCGCTGGAAGTTAGCGGCACCCTGGTTGAAAAAGATGAAGGTATTCGTCCGAATAGCAGCGTTGAAAAACTGGGTACACTGAAAACGGTGTTTAAAGAAGATGGCACCGTTACCGCAGGCAATGCAAGTACCATTAATGATGGTGCAAGCGCACTGATTATTGCCAGCCAAGAATATGCCGAAGCACATGGTCTGCCGTATCTGGCAATTATTCGTGATAGCGTTGAAGTTGGTATTGATCCGGCATATATGGGTATTAGCCCGATTAAAGCAATTCAGAAACTGCTGGCACGTAATCAGCTGACCACCGAAGAAATCGACCTGTATGAAATTAATGAAGCATTTGCCGCAACCAGCATTGTTGTTCAGCGTGAACTGGCACTGCCGGAAGAAAAAGTTAACATTTATGGTGGTGGTATCAGCCTGGGTCATGCAATTGGTGCAACCGGTGCACGTCTGCTGACCAGCCTGAGCTATCAGCTGAATCAGAAAGAGAAAAAATACGGCGTTGCAAGCCTGTGTATTGGTGGTGGCCTGGGTCTGGCAATGCTGCTGGAACGCCCTCAACAGAAAAAAAACAGCCGTTTTTATCAGATGAGTCCGGAAGAACGTCTGGCCAGCCTGCTGAATGAAGGTCAGATTAGCGCAGATACCAAAAAAGAATTTGAAAACACCGCACTGAGCAGCCAGATTGCCAATCACATGATTGAAAATCAGATCAGCGAAACCGAAGTGCCGATGGGTGTTGGTCTGCATCTGACCGTGGATGAAACGGATTATCTGGTTCCGATGGCAACCGAAGAACCGAGCGTTATTGCAGCCCTGAGCAATGGTGCAAAAATTGCACAGGGCTTTAAAACCGTGAATCAGCAGCGTCTGATGCGTGGTCAGATTGTTTTTTATGATGTTGCCGATGCAGAAAGCCTGATTGATGAACTGCAGGTTCGTGAAACAGAAATTTTCCAGCAGGCAGAACTGAGTTATCCGAGCATTGTTAAACGCGGTGGTGGTCTGCGTGATCTGCAGTATCGTGCATTTGATGAAAGCTTTGTTAGCGTGGATTTTCTGGTGGATGTTAAAGATGCAATGGGTGCCAATATTGTTAATGCAATGCTGGAAGGTGTTGCCGAACTGTTTCGTGAATGGTTTGCAGAACAAAAAATCCTGTTTAGCATCCTGAGTAACTATGCCACCGAAAGCGTTGTTACCATGAAAACAGCAATTCCGGTTAGCCGTCTGAGCAAAGGTAGTAATGGTCGTGAAATTGCCGAAAAAATTGTTCTGGCAAGCCGTTATGCCAGCCTGGACCCGTATCGTGCCGTTACCCATAATAAAGGTATTATGAATGGCATTGAAGCAGTTGTGCTGGCCACCGGTAATGATACCCGTGCAGTTAGCGCAAGCTGTCATGCATTTGCAGTTAAAGAAGGTCGTTATCAGGGTCTGACCAGCTGGACCCTGGATGGTGAGCAGCTGATTGGTGAAATTAGCGTTCCGCTGGCACTGGCAACCGTTGGTGGTGCCACCAAAGTTCTGCCGAAAAGCCAGGCAGCAGCCGATCTGCTGGCAGTTACCGATGCAAAAGAACTGAGCCGTGTTGTTGCAGCAGTTGGTCTGGCACAGAATCTGGCAGCACTGCGTGCACTGGTTAGCGAAGGCATTCAGAAAGGTCACATGGCACTGCAGGCACGTTCACTGGCCATGACCGTGGGTGCGACCGGTAAAGAAGTTGAAGCCGTTGCACAGCAACTGAAACGCCAGAAAACAATGAATCAGGATCGTGCCCTGGCAATTCTGAATGATCTGCGTAAACAGTAA（配列番号５）【００６１】
コドン最適化したmvaSをコードする遺伝子の塩基配列
ATGACCATCGGCATCGACAAAATCAGCTTTTTTGTTCCGCCTTACTATATCGACATGACCGCACTGGCCGAAGCACGTAATGTTGATCCGGGTAAATTTCATATTGGTATTGGTCAGGATCAGATGGCCGTTAATCCGATTAGCCAGGATATTGTTACCTTTGCAGCAAATGCAGCAGAAGCAATTCTGACCAAAGAAGATAAAGAAGCCATCGATATGGTTATTGTTGGCACCGAAAGCAGCATTGATGAAAGCAAAGCAGCCGCAGTTGTTCTGCATCGTCTGATGGGTATTCAGCCGTTTGCACGTAGCTTTGAAATTAAAGAAGCATGTTACGGCGCAACCGCAGGTCTGCAGCTGGCAAAAAATCATGTTGCACTGCATCCGGATAAAAAAGTTCTGGTTGTTGCAGCAGATATTGCCAAATATGGTCTGAATAGCGGTGGTGAACCGACCCAGGGTGCCGGTGCAGTTGCAATGCTGGTTGCAAGCGAACCGCGTATTCTGGCACTGAAAGAGGATAATGTTATGCTGACGCAGGACATCTATGATTTTTGGCGTCCGACCGGTCATCCGTATCCGATGGTTGATGGTCCGCTGAGCAATGAAACCTATATTCAGAGCTTTGCACAGGTGTGGGATGAACATAAAAAACGTACCGGTCTGGATTTCGCAGATTATGATGCACTGGCCTTTCATATTCCGTATACCAAAATGGGTAAAAAAGCACTGCTGGCGAAAATTAGCGATCAGACCGAAGCCGAACAAGAACGTATCCTGGCACGTTATGAAGAAAGCATTATCTATAGCCGTCGTGTGGGTAATCTGTATACCGGTAGCCTGTATCTGGGTCTGATTAGCCTGCTGGAAAATGCAACCACCCTGACCGCTGGTAATCAGATTGGTCTGTTTAGCTATGGTAGCGGTGCCGTTGCAGAATTCTTTACCGGTGAACTGGTTGCAGGTTATCAGAATCATCTGCAGAAAGAAACCCATCTGGCCCTGCTGGATAATCGTACCGAACTGAGCATTGCAGAATATGAAGCAATGTTTGCAGAAACCCTGGATACCGATATTGATCAGACCCTGGAAGATGAACTGAAATATAGCATTAGCGCCATTAATAACACCGTGCGTAGCTATCGTAACTAA（配列番号６）【００６２】
pBbS7a-dRは、pBbS7a-RFP（Plasmid #35313; Addgene）を制限酵素NdeIとKpnIで処理し、pBbS7a-RFPのうちRFP遺伝子を配列番号２で特定する塩基配列からなるRd遺伝子に置き換えて作製した。精製したプラスミドをAvrIIとSacIを用いて処理し、BbS47a-RFP（Plasmid #35301; Addgene）の複製起点SC101に置き換えた。上記プラスミドを用いて大腸菌MG1655(DE3)を形質転換し、dR発現株２を作製した。【００６３】
（実験例４−１）形質転換大腸菌（dR発現株２）の培養方法及びメバロン酸の産生
上記作製したdR発現株２は、以下の培養条件で前培養及び本培養を行った。本実験例では、dR発現株２の代謝産物であるメバロン酸の産生についても確認した。メバロン酸の代謝経路は、図７に示すとおりである。【００６４】
前培養では炭素源として4g/Lのグルコースを含む20 mlのM9培地を用い、初期細胞濃度OD660＝0.05、温度37℃、攪拌165rpm、で20時間培養した。このとき、光照射は行わなかった。【００６５】
本培養では炭素源として4g/Lのグルコースを含む40 mlのM9培地を用い、初期細胞濃度OD660＝0.05、温度37℃、攪拌165rpm、明条件では光照射（50μmol/m2/s）で4時間近く培養し、細胞濃度がOD660＝0.5に到達後、0.1 mMのIPTG（Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside）と10μMレチナールを添加した。さらに培養開始6及び7時間目に5μMレチナールを添加した。【００６６】
dR発現株２を含む培養液（100 ml）を15000g、4℃で5分間遠心分離し、上清を回収して0.45μmのフィルター（Millex HV; Merck KGaA）でろ過して-30℃で保存したものをメバロン酸測定用試料とした。高速液体クロマトグラフィー（HPLC）にてメバロン酸濃度の測定を行った。【００６７】
上記調製した試料を高速液体クロマトグラフィー（HPLC; Shimadzu）により分析した。以下の条件でHPLCを運転し、メバロン酸を含む中枢代謝産物を測定した。
・カラム：Aminex HPX-87X column（Bio-Rad）、カラム温度：65℃
・分離溶媒：1.5 mM H2SO4、流速：0.5 ml/分
・検出器：UV/vis検出器（SPD-20A; Shimadzu）、RI検出器（RID-10A; Shimadzu）
・検出波長：210 nm【００６８】
細胞濃度及びメバロン酸濃度の測定結果を図８に示した。メバロン酸の産生速度は、明条件で培養したときは0.64±0.07 mmol/g/hであったのに対し、暗条件で培養したときは0.49±0.02 mmol/g/hであった。メバロン酸の産生速度は、細胞濃度とメバロン酸濃度が直線的に増加しているフェーズ（培養時間6〜7.5時間目）の間での細胞濃度及び時間（1.5時間）あたりの増加したメバロン酸量を換算して得た。メバロン酸は、多様な構造や生理機能を有する天然色素、医薬品中間体であるイソプレノイド類の中間ハブ化合物として極めて重要な化合物である。【００６９】
（実施例５）形質転換大腸菌（dR発現株３）の作製
実施例５では、実施例１と同様に大腸菌MG1655(DE3)株に、配列番号２で特定する塩基配列からなる核酸を導入し、形質転換大腸菌（dR発現株３）を作製した。大腸菌MG1655(DE3)に、ADP-リボースピロホスファターゼ発現遺伝子を挿入したpCOLADuet-1-mvaES-nudFと、pMevB及びpBbS7a-dRを導入し、IPDR株を作製しdR発現株３とした。【００７０】
以下、dR発現株３の作製方法について示す。ADP-リボースピロホスファターゼ発現遺伝子として、Bacillus subtilisのゲノムから取得したnudF配列（配列番号７）を用いた。pCOLADuet-1-mvaES-nudFは、実施例４で作製したpCOLADuet-1-mvaESのMCS1のNco1-BamH1サイトにnudF配列を導入して作製した。【００７１】
コドン最適化したnudFをコードする遺伝子の塩基配列
ATGAAATCATTAGAAGAAAAAACAATTGCCAAAGAACAGATTTTTTCGGGTAAAGTCATTGATCTTTATGTCGAGGATGTAGAGCTGCCAAACGGCAAAGCCAGTAAACGTGAAATTGTGAAACACCCTGGAGCTGTAGCGGTACTAGCCGTCACAGATGAAGGGAAAATCATCATGGTCAAACAATTCCGTAAGCCGCTTGAGCGGACGATCGTTGAAATTCCGGCCGGTAAGCTTGAAAAAGGTGAGGAGCCGGAGTATACGGCACTTCGGGAACTTGAAGAGGAAACCGGTTATACAGCAAAAAAACTGACAAAAATAACTGCGTTTTATACATCACCCGGATTTGCAGATGAAATGTTCACGTTTTTCTTGCTGAGGAGCTTTCTGTGCTTGAAGAAAAACGGGAGCTTGATGAGGACGAGTTTGTTGAAGTGATGGAGGTGACGCTTGAAGATGCGCTAAAGCTGGTTGAATCGCGTGAAGTATATGATGCTAAAACAGCCTACGCGATTCAGTATCTTCAGCTGAAAGAAGCGCTCCAAGCACAAAAATGA（配列番号７）【００７２】
pMevBはPlasmid #17819（Addgene）から取得した。pBbS7a-dRは、実施例４と同手法により作製した。上記プラスミドを用いて大腸菌MG1655(DE3)を形質転換し、dR発現株３を作製した。【００７３】
（実験例５−１）形質転換大腸菌（dR発現株３）の培養方法及びイソプレノールの産生
上記作製したdR発現株３は、以下の培養条件で前培養及び本培養を行った。本実験例では、dR発現株３の代謝産物であるイソプレノールの産生についても確認した。イソプレノールの代謝経路は、図７及に示すとおりである。【００７４】
前培養では100 mlのLB培地を用い、初期細胞濃度OD660＝0.1、温度37℃、攪拌165rpmで約18時間培養した。このとき、光照射は行わなかった。培養液から大腸菌細胞を遠心分離（7000g、25℃、4分間）にて回収した。【００７５】
本培養では炭素源として4g/Lのグルコースを含む50 mlのM9培地を用い、細胞濃度OD660＝5、温度37℃、攪拌165rpm、明条件では光照射（50μmol/m2/s）で培養した。0.1 mMのIPTGと10μMレチナールは本培養開始時に添加した。【００７６】
dR発現株３を含む培養液（100 ml）を15000g、4℃で5分間遠心分離し、上清を回収して0.45μmのフィルター（Millex HV; Merck KGaA）でろ過して-30℃で保存したものを培養液試料とした。次に、培養液試料と等量の内部標準液（0.1% 3-methyl-1-butanol）を混合し、イソプレノール測定用試料とした。【００７７】
イソプレノールはGC（Gas Chromatography）-FID（Flame Ionization Detector, 水素炎イオン化型検出器）により測定した。以下の条件でGC-FIDを運転し、イソプレノールを測定した。
・カラム：Stabiliwax（長さ 60 m、内径0.32 mm、膜厚1μm）(Restek)
・キャリアガス：ヘリウム
・昇温条件：70℃ (3 min)〜10℃/min〜200℃
・Injector温度および検出温度：250℃【００７８】
細胞濃度、グルコース濃度、及びイソプレノール濃度の測定結果を図９に示した。イソプレノールの収率は、培養0時間目と10時間目のイソプレノール濃度及びグルコース濃度の変化量から換算した。その結果、培養10時間目では明条件で1.78±0.14 C-mol %であり、暗条件で1.17±0.10 C-mol %であった。イソプレノールは、エタノール（19.6 MJ/L）に対して1.8倍程度のエネルギー密度（35 MJ/L）を持ち、ガソリン（32 MJ/L）の代替燃料として期待されている。また、イソプレノールは化学プロセスによりイソプレンなどの一般化成品原料に変換可能である。イソプレンは合成ゴムの原料であるが、合成ゴムは全世界で1,500万トン、我が国でも163.8万トンを生産していることから、合成石油代替バイオマテリアルとしても大きな市場を形成していると予想される。【００７９】
（実施例６）形質転換大腸菌（dR発現株４）の作製
実施例６では、実施例１と同様に大腸菌MG1655(DE3)株に、配列番号２で特定する塩基配列からなる核酸を導入し、形質転換大腸菌（dR発現株４）を作製した。大腸菌MG1655(DE3)にpETM6-mcrNC及びpBbS7a-dRを導入し、MVADR株を作製しdR発現株４とした。以下、dR発現株４の作製方法について示す。【００８０】
pETM6-mcrNCは、Metabolic Engineering 52: 2019, 215-223に示す方法に従い、Chloroflexus aurantiacus由来のMalonyl-CoA reductaseのN末端側（mcrN, アミノ酸番号 1-549）とC末端側（mcrC, アミノ酸番号550-1219）に分割したもので、大腸菌用にコドン最適化した配列を導入して作製した。pBbS7a-dRは、実施例４と同手法により作製した。上記プラスミドを用いて大腸菌MG1655(DE3)を形質転換し、dR発現株４を作製した。【００８１】
（実験例６−１）形質転換大腸菌（dR発現株４）の培養方法及び3HPの産生
上記作製したdR発現株４は、以下の培養条件で前培養及び本培養を行った。本実験例では、dR発現株４の代謝産物である3HP（3ヒドロキシプロピオン酸）の産生についても確認した。3HPの代謝経路は、図７に示すとおりである。【００８２】
前培養では炭素源として10g/Lグルコースを含む50 mlのM9培地を用い、初期細胞濃度OD660＝0.05、温度37℃、攪拌150rpmで培養した。このとき、光照射は行わなかった。【００８３】
本培養では炭素源として4g/Lグルコースを含む50 mlのM9培地を用い、初期細胞濃度OD660＝0.05、温度37℃、攪拌150rpm、明条件では光照射（50μmol/m2/s）で約4.5時間培養した。細胞濃度OD660＝0.5に到達後、0.1 mMのIPTGと10μMレチナールを添加した。さらに培養開始6及び8時間目に10μMレチナールを添加した。【００８４】
dR発現株４を含む培養液（100 ml）を15000g、4℃で5分間遠心分離し、上清を回収して0.45μmのフィルター（Millex HV; Merck KGaA）でろ過して-30℃で保存したものを、メバロン酸測定用試料とした。高速液体クロマトグラフィー（HPLC）にて3HPの測定を行った。【００８５】
上記調製した試料を高速液体クロマトグラフィー（HPLC; Shimadzu）により分析した。以下の条件でHPLCを運転し、3HPを含む中枢代謝産物を測定した。
・カラム：Aminex HPX-87X column（Bio-Rad）、カラム温度：65℃
・分離溶媒：1.5 mM H2SO4、流速：0.5 ml/分
・検出器：UV/vis検出器（SPD-20A; Shimadzu）、RI検出器（RID-10A; Shimadzu）
・検出波長：210 nm【００８６】
細胞濃度及び3HP濃度の測定結果を図１０に示した。3HPの産生速度は、明条件で培養したときは1.2±0.05 mmol/g/hであったのに対し、暗条件で培養したときは1.0±0.09 mmol/g/hであった。3HPの産生速度は、細胞濃度と3HP濃度が直線的に増加しているフェーズ（培養時間6〜10時間目）の間での細胞濃度及び時間（4時間）あたりに増加した3HP量を換算して得た。3HP及びそのエステルは、脂肪族ポリエステルの原料として有用な化合物であり、また、これから合成されるポリエステルは生分解性のポリエステルとして注目されている。そのため、近年の海洋汚染や人体への悪影響が懸念されるマイクロプラスチック問題の解決にもつながる。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
以上詳述したように、遺伝子工学的にロドプシンをコードする遺伝子を導入して発現させた非光合成原核生物によれば、光エネルギーを利用可能にする新しい光駆動エネルギー再生型有用物質生産宿主になり得る点で優位である。【００８８】
通常の非光合成原核生物を用いた有用物質の生産では、通常非光合成原核生物は有用物質の生産が生きる目的ではないため、その生産性は低い。大腸菌などの非光合成原核生物に代謝工学的な改良を施し、医薬品や食品、化粧品、燃料、ポリマー原料等の様々な有用物質の発酵生産性を向上させる研究が行なわれている。しかし、目的物質の生産性が向上するにつれ、微生物が細胞内エネルギー不足に陥り、生育の低下や目的物質の生産性の頭打ちに直面することが少なくない。これは、発酵そのものがインプットである炭素源を、「細胞自身の材料（Cell mass)」、「目的産物の産生」、「細胞内エネルギー」の３つのアウトプットに振り分けるプロセスであり、これらがトレードオフの関係にあることに、根本的な原因が存在すると考えられる。そこで本発明技術は、この三つ巴の状態にある発酵プロセスから「細胞内エネルギー」を切り離すことができ、本来は光エネルギーを利用できない非光合成原核生物に、光リン酸化能を付与することで、光エネルギーを利用可能にする新しい光駆動エネルギー再生型有用物質生産宿主になりうる点で優位である。【００８９】
本発明の技術は、前述のとおり、これまでのエネルギー源に加えて、光をエネルギー源にできることから、有用物質の生産性を向上させることができる。競合技術としては、省エネ型微生物が挙げられる（特開2017-55777号公報参照）。当該技術では、基礎代謝を行う遺伝子を削除することで、基礎代謝のエネルギーを削除し、有用物生産のエネルギーを向上させることができる。しかしながら、基礎代謝エネルギーの節減には限界があり、基礎代謝のエネルギーを削減することで増殖スピードが遅くなることが想定され、生産性の向上は限定的であると思われる。【００９０】
なお、大腸菌等微生物以外で有用物産生に活用される微細藻類（例えばユーグレナ）も、有用物生産の競合となり得る。また、微細藻類は元来光エネルギーを活用できるため、本技術を提供する先にならない。しかしながら、微細藻類は増殖速度が遅く、大腸菌等非光合成原核生物と比較した場合、物質生産宿主としての実用化は困難であると考えられる。そこで、非光合成原核生物に光リン酸化能を付与し、光エネルギーを活用できる微生物を生み出す本発明の技術によれば、これまでのエネルギー源に加えて、光をエネルギー源にできることから、有用物質の生産性を向上させることができる。有用物質としては、微生物の発酵プロセスを利用して産生しうる物質であり、例えばタンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、糖アルコール、アルコール、有機酸、イソプレノイド類、生理活性低分子化合物及び脂質などをあげることができる。本発明における有用物質は、ペプチドとしてグルタチオン、有機酸として酢酸が特に好適である。【００９１】
一方、本発明の方法により産生された有用物質は、医薬品や食品、化粧品、燃料、ポリマー等の原料に有効利用することができ、産業上の利用可能性も非常に優れている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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