(57)【要約】  ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）等のニコチンアミド誘導体（ＮＡｍ誘導体）を効率的に合成する手法の提供。  ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）として、ヒトＮＡＭＰＴの５倍以上の変換効率を有するＮＡＭＰＴを発現する組換え微生物を用いる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニコチンアミド誘導体を産生するための微生物であって、
前記微生物が、ニコチンアミド及び５−ホスホリボシル−１−ピロリン酸からニコチンアミドモノヌクレオチドを生成するニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）を発現する、及び／又は、前記ＮＡＭＰＴのアミノ酸配列をコードする核酸を担持するベクターにより形質転換されてなるとともに、
前記ＮＡＭＰＴによるニコチンアミドからニコチンアミドモノヌクレオチドへの変換効率が、ヒトＮＡＭＰＴの５倍以上である、組換え微生物。
【請求項２】
前記ＮＡＭＰＴが、配列番号３又は配列番号６に示すアミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するポリペプチドからなる、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項３】
前記微生物が更に、ニコチン酸及び／又はニコチンアミドの細胞内取り込みを促進するナイアシン輸送体を発現する、及び／又は、前記ナイアシン輸送体のアミノ酸配列をコードする核酸を担持するベクターにより形質転換されてなるとともに、
前記ナイアシン輸送体が、宿主微生物によるニコチン酸及び／又はニコチンアミドの細胞内取り込み効率を１．１倍以上に増加させる、請求項１又は２に記載の組換え微生物。
【請求項４】
前記ナイアシン輸送体が、配列番号９又は配列番号１２に示すアミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するポリペプチドからなる、請求項３に記載の組換え微生物。
【請求項５】
前記微生物が更に、ニコチンアミド誘導体の細胞外排出を促進するニコチンアミド誘導体輸送体を発現する、及び／又は、前記ニコチンアミド誘導体輸送体のアミノ酸配列をコードする核酸を担持するベクターにより形質転換されてなるとともに、
前記ニコチンアミド誘導体輸送体が、宿主微生物によるニコチンアミド誘導体の細胞外排出効率を３倍以上に増加させる、請求項１〜４の何れか一項に記載の組換え微生物。
【請求項６】
前記ニコチンアミド誘導体輸送体が、配列番号１５に示すアミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するポリペプチドからなる、請求項５に記載の組換え微生物。
【請求項７】
前記微生物が更に、グルコース−６−リン酸から５−ホスホリボシル−１−ピロリン酸を合成する経路を促進する１又は２以上の酵素を更に発現する、及び／又は、前記１又は２以上の酵素のアミノ酸配列をコードする核酸を担持するベクターにより更に形質転換されてなる、請求項１〜６の何れか一項に記載の組換え微生物。
【請求項８】
前記１又は２以上の酵素が、ホスホグルコースイソメラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、６−ホスホグルコノラクトナーゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、リボース−５−リン酸イソメラーゼ、及びホスホリボシルピロリン酸シンターゼからなる群より選択される１又は２以上の酵素である、請求項７に記載の組換え微生物。
【請求項９】
前記ホスホグルコースイソメラーゼが、配列番号１８に示すアミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するポリペプチドであり、
前記グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼが、配列番号２１に示すアミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するポリペプチドであり、
前記６−ホスホグルコノラクトナーゼが、配列番号２４に示すアミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するポリペプチドであり、
前記６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼが、配列番号２７に示すアミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するポリペプチドであり、
前記リボース−５−リン酸イソメラーゼが、配列番号３０又は３３に示すアミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するポリペプチドであり、
前記ホスホリボシルピロリン酸シンターゼが、配列番号３６に示すアミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するポリペプチドである、請求項８に記載の組換え微生物。
【請求項１０】
前記ニコチンアミド誘導体が、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、ニコチン酸モノヌクレオチド、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、及び、ニコチン酸アデニンジヌクレオチドからなる群より選択される、請求項１〜９の何れか一項に記載の組換え微生物。
【請求項１１】
組換え微生物が大腸菌又は酵母である、請求項１〜１０の何れか一項に記載の組換え微生物。
【請求項１２】
ニコチンアミド誘導体を産生するための方法であって、請求項１〜１１の何れか一項に記載の組換え微生物にニコチンアミドを供給し、前記微生物により生成されたニコチンアミド誘導体を回収することを含む方法。
【請求項１３】
回収されたニコチンアミド誘導体を精製することを更に含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ニコチンアミド及び５−ホスホリボシル−１−ピロリン酸からニコチンアミドモノヌクレオチドを生成するニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）のアミノ酸配列をコードする核酸を担持するベクターであって、前記核酸が、配列番号２又は配列番号５に記載の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むベクター。
【請求項１５】
ニコチン酸及び／又はニコチンアミドの細胞内取り込みを促進するナイアシン輸送体のアミノ酸配列をコードする核酸を担持するベクターであって、前記核酸が、配列番号８又は配列番号１１に記載の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むベクター。
【請求項１６】
ニコチンアミド誘導体の細胞外排出を促進するニコチンアミド誘導体輸送体のアミノ酸配列をコードする核酸を担持するベクターであって、前記核酸が、配列番号１４に記載の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）等のニコチンアミド誘導体（ＮＡｍ誘導体）を製造するための新規な組換え微生物、及び、ＮＡｍ誘導体を製造するための新規な製造方法に関すると共に、これらに用いられる新規なベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）は、リボース及びニコチンアミドに由来するヌクレオチドである。ＮＡＤは、生体内の種々の酸化還元反応において補酵素として機能し、好気呼吸（酸化的リン酸化）の中心的な役割を果たしていることが知られている。生体内において、ＮＡＤは、酸化型（ＮＡＤ＋）及び還元型（ＮＡＤＨ）の２つの状態を取り得る。本明細書において「ＮＡＤ」という用語は、特に断り書きが無い限り、酸化型（ＮＡＤ＋）及び還元型（ＮＡＤＨ）の両者を包括的に表すものとする。【０００３】
ＮＡＤの生合成経路は複数存在するが、哺乳類細胞ではニコチンアミド（ＮＡｍ）を出発物質とし、そこから２段階の酵素反応を経てＮＡＤを合成する経路が主である。第１段階では、細胞内に取り込まれたＮＡｍが、５−ホスホリボシル−１−ピロリン酸（ＰＲＰＰ）の存在下、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ：ＮＭＮ合成酵素）により、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）及びピロリン酸（Ｐ−Ｐｉ）に変換される。続く第２段階では、前段階で得られたＮＭＮが、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の存在下、ニコチンアミド／ニコチン酸モノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（ＮＭＮＡＴ）により、ＮＡＤへと変換される。【０００４】
ここで、上記生合成経路においてＮＡＤの前駆体となるＮＭＮは、ミトコンドリアの活性化や、いわゆる長寿遺伝子であるサーチュイン遺伝子の活性化等、種々の機能を有することが知られている。特に生体内では、加齢に伴うＮＭＮ生成能力の低下により、ＮＡＤも減少し、ミトコンドリアの活性低下や、細胞核の損傷が進むと考えられている。更には、インスリン抵抗性、糖尿病、癌、アルツハイマー病等の老化関連疾患に、ＮＭＮが関与しているとの報告もなされている。このため、ＮＭＮは、種々のリサーチツールやＮＡＤの合成中間体、更には薬効成分等として注目されている。【０００５】
また、ＮＭＮは、ＮＡＤの合成中間体のみならず、ニコチンアミドリボシド（ＮＲ）やニコチン酸モノヌクレオチド（ＮａＭＮ）等の各種のニコチンアミド誘導体（ＮＡｍ誘導体）の合成中間体としても、その利用が見込まれている。【０００６】
【化１】
2020129997.tif 000003
【０００７】
ＮＭＮの合成法としては、従来、有機合成による手法、ＮＡＤの分解による手法、微生物を用いた合成生物学的手法等が知られている。【０００８】
有機合成による手法は、Ｄ−リボースから数工程を経てＮＭＮを合成する手法である（特許文献１：米国特許出願公開第２０１８／０２９１０５４号明細書）。しかし、本手法では、数段階の合成工程を要するために、合成に時間及びコストがかかる。【０００９】
ＮＡＤの分解による手法は、酵母に生合成させたＮＡＤを単離することなくそのまま酵素で分解してＮＭＮを得る手法である（特許文献２：国際公開第２０１７／２０００５０号）。しかし、本手法では、菌体当たりのＮＭＮの生産性が非常に悪い。【００１０】
微生物を用いた合成生物学的手法は、大腸菌等の宿主微生物を遺伝子組換えすることにより、前記の哺乳類におけるＮＡＤの主要生合成系の第１段階、即ち、ＮＡｍ及びＰＲＰＰからＮＡＭＰＴによりＮＭＮへの変換を触媒する酵素（ＮＡＭＰＴ：ＮＭＮ合成酵素）と同様の酵素を発現する組換え微生物を構築し、得られた組換え微生物を用いてＮＭＮを合成する手法である（特許文献３：国際公開第２０１５／０６９８６０号；非特許文献１：Mariescu et al., Scientific reports, August 16, 2018, Vol.8, No.1, pp.12278）。しかし、本手法では、ＮＭＮを生産するために長時間を要する上に、得られるＮＭＮの量が少なく、実用に足る生産性が得られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１８／０２９１０５４号明細書
【特許文献２】国際公開第２０１７／２０００５０号
【特許文献３】国際公開第２０１５／０６９８６０号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Mariescu et al., Scientific reports, August 16, 2018, Vol.8, No.1, pp.12278
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
以上の背景から、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）等のニコチンアミド誘導体（ＮＡｍ誘導体）を効率的に合成することが求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者等は上記課題に鑑み、微生物を用いた従来のＮＭＮの合成生物学的生産系を検証し、これを改良するべく鋭意検討した結果、ＮＭＮの生合成の鍵となる酵素（ＮＡＭＰＴ）として、優れた活性を有する特定の酵素を宿主微生物に組換え導入して発現させ、ＮＭＮの合成効率を強化することにより、ＮＭＮの生産効率が顕著に改善されることを見出した。また、ＮＭＮ合成の反応物であるＮＡｍやその誘導体であるＮＡ（なお、ＮＡｍ及びＮＡを総称して「ナイアシン」という場合がある。）の宿主微生物細胞への取り込みを促進するタンパク質（ナイアシン輸送体）、及び／又は、ＮＭＮ等のＮＡｍ誘導体の宿主微生物細胞からの排出を促進するタンパク質（ＮＡｍ誘導体輸送体）として、優れた活性を有する特定のタンパク質を、宿主微生物に組換え導入して発現させ、ＮＡｍの宿主微生物細胞への取り込み効率を強化することにより、ＮＭＮの生産効率が更に改善されることを見出した。また、ＮＭＮ合成のもう一つの反応物であるＰＲＰＰの生合成系を構成する一連の酵素群のうち１又は２の酵素として、優れた活性を有する特定の酵素を宿主微生物に組換え導入して発現させ、ＰＲＰＰの合成効率を強化することによっても、ＮＭＮの生産効率が更に改善されることを見出した。加えて、斯かるＮＭＮ系を利用すれば、ＮＭＮのみならずＮＡＤ、ＮＲ、ＮａＭＮ等の他のＮＡｍ誘導体についても、高い効率での製造が可能となることを見出した。各種の本発明は、これらの新たな知見に基づきなされたものである。【００１５】
即ち、本発明は以下に関する。
［１］ニコチンアミド誘導体を産生するための微生物であって、
前記微生物が、ニコチンアミド及び５−ホスホリボシル−１−ピロリン酸からニコチンアミドモノヌクレオチドを生成するニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）を発現する、及び／又は、前記ＮＡＭＰＴのアミノ酸配列をコードする核酸を担持するベクターにより形質転換されてなるとともに、
前記ＮＡＭＰＴによるニコチンアミドからニコチンアミドモノヌクレオチドへの変換効率が、ヒトＮＡＭＰＴの５倍以上である、組換え微生物。
［２］前記ＮＡＭＰＴが、配列番号３又は配列番号６に示すアミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するポリペプチドからなる、［１］の組換え微生物。
［３］前記微生物が更に、ニコチン酸及び／又はニコチンアミドの細胞内取り込みを促進するナイアシン輸送体を発現する、及び／又は、前記ナイアシン輸送体のアミノ酸配列をコードする核酸を担持するベクターにより形質転換されてなるとともに、
前記ナイアシン輸送体が、宿主微生物によるニコチン酸及び／又はニコチンアミドの細胞内取り込み効率を１．１倍以上に増加させる、［１］又は［２］の組換え微生物。
［４］前記ナイアシン輸送体が、配列番号９又は配列番号１２に示すアミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するポリペプチドからなる、［３］の組換え微生物。
［５］前記微生物が更に、ニコチンアミド誘導体の細胞外排出を促進するニコチンアミド誘導体輸送体を発現する、及び／又は、前記ニコチンアミド誘導体輸送体のアミノ酸配列をコードする核酸を担持するベクターにより形質転換されてなるとともに、
前記ニコチンアミド誘導体輸送体が、宿主微生物によるニコチンアミド誘導体の細胞外排出効率を３倍以上に増加させる、［１］〜［４］の組換え微生物。
［６］前記ニコチンアミド誘導体輸送体が、配列番号１５に示すアミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するポリペプチドからなる、［５］の組換え微生物。
［７］前記微生物が更に、グルコース−６−リン酸から５−ホスホリボシル−１−ピロリン酸を合成する経路を促進する１又は２以上の酵素を更に発現する、及び／又は、前記１又は２以上の酵素のアミノ酸配列をコードする核酸を担持するベクターにより更に形質転換されてなる、［１］〜［６］の組換え微生物。
［８］前記１又は２以上の酵素が、ホスホグルコースイソメラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、６−ホスホグルコノラクトナーゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、リボース−５−リン酸イソメラーゼ、及びホスホリボシルピロリン酸シンターゼからなる群より選択される１又は２以上の酵素である、［７］の組換え微生物。
［９］前記ホスホグルコースイソメラーゼが、配列番号１８に示すアミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するポリペプチドであり、
前記グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼが、配列番号２１に示すアミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するポリペプチドであり、
前記６−ホスホグルコノラクトナーゼが、配列番号２４に示すアミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するポリペプチドであり、
前記６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼが、配列番号２７に示すアミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するポリペプチドであり、
前記リボース−５−リン酸イソメラーゼが、配列番号３０又は３３に示すアミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するポリペプチドであり、
前記ホスホリボシルピロリン酸シンターゼが、配列番号３６に示すアミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するポリペプチドである、［８］の組換え微生物。
［１０］前記ニコチンアミド誘導体が、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、ニコチン酸モノヌクレオチド、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、及び、ニコチン酸アデニンジヌクレオチドからなる群より選択される、［１］〜［９］の組換え微生物。
［１１］組換え微生物が大腸菌又は酵母である、［１］〜［１０］の組換え微生物。
［１２］ニコチンアミド誘導体を産生するための方法であって、［１］〜［１１］の組換え微生物にニコチンアミドを供給し、前記微生物により生成されたニコチンアミド誘導体を回収することを含む方法。
［１３］回収されたニコチンアミド誘導体を精製することを更に含む［１２］の方法。
［１４］ニコチンアミド及び５−ホスホリボシル−１−ピロリン酸からニコチンアミドモノヌクレオチドを生成するニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）のアミノ酸配列をコードする核酸を担持するベクターであって、前記核酸が、配列番号２又は配列番号５に記載の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むベクター。
［１５］ニコチン酸及び／又はニコチンアミドの細胞内取り込みを促進するナイアシン輸送体のアミノ酸配列をコードする核酸を担持するベクターであって、前記核酸が、配列番号８又は配列番号１１に記載の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むベクター。
［１６］ニコチンアミド誘導体の細胞外排出を促進するニコチンアミド誘導体輸送体のアミノ酸配列をコードする核酸を担持するベクターであって、前記核酸が、配列番号１４に記載の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むベクター。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、ＮＭＮ等のＮＡｍ誘導体を効率的に合成することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、本発明に係るＮＡｍ誘導体の合成生物学的生産系の例を模式的に示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明を具体的な実施の形態に即して詳細に説明する。但し、本発明は以下に開示される実施の形態に束縛されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、任意の形態で実施することが可能である。
【００１９】
なお、本開示で引用する特許公報、特許出願公開公報、及び非特許文献は、何れもその全体が援用により、あらゆる目的において本開示に組み込まれるものとする。
【００２０】
また、本開示において「核酸」には、リボ核酸、デオキシリボ核酸、又は何れの核酸の修飾体も含まれ、また、一本鎖又は二本鎖の何れも含まれる。また、本開示における核酸（遺伝子）は、当業者に公知の公的機関のデータベース又は本明細書に開示する塩基配列に基づき作製したプライマー又はプローブ等を用いて、当業者に公知の任意の方法で調製することができる。例えば、各種のＰＣＲその他の当業者に公知のＤＮＡ増幅技術を用いることにより、該遺伝子のｃＤＮＡとして容易に得ることができる。あるいは、当業者であれば、本明細書中に開示する配列情報に基づいて、適宜既存技術を用いて、核酸を合成することができる。
【００２１】
また、本開示において、核酸又は遺伝子がタンパク質又はポリペプチドを「コードする」とは、斯かるタンパク質又はポリペプチドをその活性を備えた状態で発現させることを意味している。また、本開示における「コードする」には、本発明に係るタンパク質を連続する構造配列（エクソン）としてコードすることと、該タンパク質を適当な介在配列（イントロン）を介してコードすることの両者が含まれる。
【００２２】
また、本開示において、核酸又は遺伝子のクローニングや、ベクターの設計及び作製、細胞への形質転換、タンパク質又はポリペプチドの発現等の遺伝子工学的な手法については、例えばSambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989等の記載を参照することができる。
【００２３】
［Ｉ．概要］
まず、本発明の概要から説明する。
【００２４】
前述のように、微生物を用いてニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）を合成生物学的に製造する試みとして、大腸菌等の宿主微生物を遺伝子組換えすることにより、前記の哺乳類におけるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）の主要生合成系と同様の酵素を発現する組換え微生物を構築し、得られた組換え微生物を用いてＮＭＮを合成する手法が提案されてきた（特許文献３：国際公開第２０１５／０６９８６０号；非特許文献１：Mariescu et al., Scientific reports, August 16, 2018, Vol.8, No.1, pp.12278）。しかし、斯かる従来の手法では、ＮＭＮを生産するために長時間を要する上に、得られるＮＭＮの量が低く、実用に足る生産性が得られていないという課題があった。
【００２５】
本発明は、微生物を用いた従来のＮＭＮの合成生物学的生産系に基づくＮＡｍ誘導体合成系であって、ＮＡｍ誘導体の合成及び／又は輸送に関与する各種の酵素及び／又は輸送体タンパク質を微生物に導入して発現させることにより、ＮＭＮ等のＮＡｍ誘導体の生産効率を向上させるものである。
【００２６】
本発明の一態様に係るＮＡｍ誘導体の合成生物学的生産系の例について、図１を用いてより具体的に説明する。但し、図１はあくまでも例示であり、本発明は図１に示す合成系に限定される訳ではない。
【００２７】
図１に示す合成生物学的ＮＡｍ誘導体合成系は、宿主微生物細胞内に、一連の酵素群からなるＮＡｍ誘導体の合成系を含む。図１に示すように、ＮＭＮ合成系の主反応経路は、ＮＡｍ及びＰＲＰＰを、ＮＭＮ及びＰ−Ｐｉに変換する反応経路である。
【００２８】
ＮＡｍ誘導体合成系の主反応経路の一方の反応物であるＮＡｍは、宿主微生物の細胞外から細胞内に取り込まれる。また、同様に宿主微生物の細胞外から細胞内に取り込まれるＮＡとＮＡｍとは、ニコチンアミダーゼにより相互変換される。
【００２９】
ＮＡｍ誘導体合成系の主反応経路の他方の反応物であるＰＲＰＰは、宿主微生物の細胞外から細胞内に取り込まれたグルコース（Ｇｌｕ）から、以下の一連の反応経路を経て合成される。
・ヘキソキナーゼ（ＨＫ）によるグルコース（Ｇｌｕ）からグルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ）へのリン酸化。
・ホスホグルコースイソメラーゼ（ＰＧＩ）によるフルクトース−６−リン酸（Ｆ６Ｐ）からグルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ）への変換。
・グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）によるＧ６Ｐから６−ホスホグルコノ−１，５−ラクトン（６ＰＧＬ）への変換。
・６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ＰＧＬ）による６ＰＧＬから６−ホスホグルコン酸（６ＰＧ）への変換。
・６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＧＤ）による６ＰＧからリブロース−５−リン酸（Ｒｕ５Ｐ）への変換。
・リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ＲＰＩ）によるＲｕ５Ｐからリボース−５−リン酸（Ｒ５Ｐ）への変換。
・ホスホリボシルピロリン酸シンターゼ（ＰＲＳ）によるＲ５Ｐから５−ホスホリボシル−１−ピロリン酸（ＲＲＰＰ）への変換。
【００３０】
また、上記主反応により生成したＮＭＮは、ＮＭＮＡＴによりＮＡＤへ、ニコチンアミドヌクレオチドアミダーゼ（ＮＡＮＡ）によりニコチン酸モノヌクレオチド（ＮａＭＮ）へ、ニコチンアミドモノヌクレオチド−５−ヌクレオチダーゼ（ＮＭＮＮ）によりニコチンアミドリボシドへとそれぞれ変換され、適宜細胞外へと排出される。
【００３１】
本発明の一態様によれば、ＮＭＮの生合成の鍵となる酵素（ＮＡＭＰＴ：ＮＭＮ合成酵素）として、優れた活性を有する特定の酵素を宿主微生物に組換え導入して発現させ、ＮＭＮの合成効率を強化することにより、ＮＡｍ誘導体の生産効率を改善する。
【００３２】
本発明の好ましい態様によれば、前記ＮＡｍ誘導体合成系に対して、ＮＡｍ及び／又はＮＡ（ナイアシン）の宿主微生物細胞への取り込みを促進する輸送体タンパク質（ナイアシン輸送体）として、優れた活性を有する特定のタンパク質を、宿主微生物に組換え導入して発現させ、ナイアシンの宿主微生物細胞への取り込み効率を強化することにより、ＮＡｍ誘導体の生産効率を更に改善する。
【００３３】
本発明の別の好ましい態様によれば、前記ＮＡｍ誘導体合成系に対して、更にＮＭＮ合成のもう一つの反応物であるＰＲＰＰの生合成系を構成する一連の酵素群（ＧＰＩ、ＧＰＤ、ＰＧＬ、ＰＧＤ、ＲＰＩ、及びＰＲＳ）のうち１又は２の酵素として、優れた活性を有する特定の酵素を宿主微生物に組換え導入して発現させ、ＰＲＰＰの合成効率を強化することにより、ＮＡｍ誘導体の生産効率を更に改善する。
【００３４】
本発明の別の好ましい態様によれば、前記ＮＡｍ誘導体合成系に対して、ＮＡｍ誘導体の宿主微生物細胞からの排出を促進する輸送体タンパク質（ＮＡｍ誘導体輸送体）として、優れた活性を有する特定のタンパク質を、宿主微生物に組換え導入して発現させ、産生されたＮＡｍ誘導体の宿主微生物細胞からの排出効率を強化することにより、ＮＡｍ誘導体の生産効率を更に改善する。
【００３５】
特に、本発明では、前記ＮＡｍ誘導体合成系に対して、前記特定のＮＡＭＰＴ（ＮＭＮ合成酵素）、ナイアシン輸送体、ＮＡｍ誘導体輸送体、及びＰＲＰＰ合成酵素（ＧＰＩ、ＧＰＤ、ＰＧＬ、ＰＧＤ、ＲＰＩ、及びＰＲＳ）のうち複数、好ましくは全てを組合せて組換え微生物に導入することにより、最終的なＮＡｍ誘導体の生産効率は格段に改善されることになる。
【００３６】
本発明の合成系により製造されるＮＡｍ誘導体としては、これらに制限されるものではないが、ＮＭＮの他、ＮＡＤ、ニコチンアミドリボシド（ＮＲ）、ニコチン酸モノヌクレオチド（ＮａＭＮ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）、ニコチン酸アデニンジヌクレオチド等が挙げられる。
【００３７】
次章以降の記載では、主に本発明の合成系によりＮＭＮを合成する場合について説明するが、ＮＭＮ以外のＮＡｍ誘導体を合成する場合についても以下に略述しておく。
【００３８】
例えば、本発明の合成系によるＮＡＤの合成は、ＮＭＮ合成のための一連の遺伝子を組み込んだ宿主微生物に対して、更にＮＭＮをＮＡＤへと変換するニコチンアミド／ニコチン酸モノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（ＮＭＮＡＴ）を、前記と同様の手順により組換え導入して発現させ、ＮＭＮからＮＡＤへの変換効率を強化することにより、達成することができる。
【００３９】
また、本発明の合成系によるＮＡＤＰの合成は、ＮＭＮ合成のための一連の遺伝子を組み込んだ宿主微生物に対して、更に前述のＮＭＮＡＴ、及び、ＮＡＤをＮＡＤＰへと変換するＮＡＤ＋キナーゼを、前記と同様の手順により組換え導入して発現させ、ＮＭＮからＮＡＤへの変換効率及びＮＡＤからＮＡＤＰへの変換効率を強化することにより、達成することができる。
【００４０】
また、本発明の合成系によるＮＲの合成は、ＮＭＮ合成のための一連の遺伝子を組み込んだ宿主微生物に対して、更にＮＭＮをＮＲへと変換するニコチンアミドモノヌクレオチド−５−ヌクレオチダーゼ（ＮＭＮＮ）を、前記と同様の手順により組換え導入して発現させ、ＮＭＮからＮＲへの変換効率を強化することにより、達成することができる。
【００４１】
また、本発明の合成系によるＮａＭＮの合成は、ＮＭＮ合成のための一連の遺伝子を組み込んだ宿主微生物に対して、更にＮＭＮをＮａＭＮへと変換するニコチンアミドヌクレオチドアミダーゼ（ＮＡＮＡ）を、前記と同様の手順により組換え導入して発現させ、ＮＭＮからＮａＭＮへの変換効率を強化することにより、達成することができる。
【００４２】
以上の構成を有する本発明のＮＡｍ誘導体合成系を用いた方法によれば、従来の合成生物学的なＮＭＮの生産方法と比較して、ＮＭＮ等のＮＡｍ誘導体の生産効率を大幅に改善することができる。例えば、後述の実施例に示す結果によれば、本発明のＮＡｍ誘導体合成系を用いた方法では、従来の合成生物学的方法によるＮＭＮの生産量と比較して、１０倍を超える量のＮＭＮが生産されることが分かる。また、本発明のＮＡｍ誘導体の合成系を用いた方法では、副産物が低減され、ＮＭＮ等のＮＡｍ誘導体の選択性にも優れている。
【００４３】
［II．酵素］
次に、本発明で使用されるＮＡｍ誘導体の生産に関与する酵素について説明する。
【００４４】
なお、本開示において、２つのアミノ酸配列の「相同性」とは、両アミノ酸配列をアラインメントした際に各対応箇所に同一又は類似のアミノ酸残基が現れる比率であり、２つのアミノ酸配列の「同一性」とは、両アミノ酸配列をアラインメントした際に各対応箇所に同一のアミノ酸残基が現れる比率である。
【００４５】
なお、２つのアミノ酸配列の「相同性」及び「同一性」は、例えばEMBOSSパッケージ（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277）（好ましくはバージョン５．００又はそれ以降）のNeedleプログラムにより、Needleman-Wunschアルゴリズムを使用して決定することができる（Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453）。
【００４６】
また、類似のアミノ酸としては、例えば以下に記載の構造・特性・側鎖の種類等に基づく分類において、同一の群に属するアミノ酸が挙げられる。
芳香族アミノ酸：Ｆ、Ｈ、Ｗ、Ｙ；
脂肪族アミノ酸：Ｉ、Ｌ、Ｖ；
疎水性アミノ酸：Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ；
荷電アミノ酸：Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ等：
正荷電アミノ酸：Ｈ、Ｋ、Ｒ；
負荷電アミノ酸：Ｄ、Ｅ；
極性アミノ酸：Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ；
小型アミノ酸：Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｖ等：
超小型アミノ酸：Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｓ；
脂肪族側鎖を有するアミノ酸：Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ；
芳香族側鎖を有するアミノ酸：Ｆ、Ｙ、Ｗ；
硫黄含有側鎖を有するアミノ酸：Ｃ、Ｍ；
脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸：Ｓ、Ｔ；
塩基性側鎖を有するアミノ酸：Ｋ、Ｒ、Ｈ；
酸性アミノ酸及びそれらのアミド誘導体：Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｑ。
【００４７】
（１）ＮＡｍ及びＰＲＰＰからのＮＭＮの合成を触媒する酵素（ＮＭＮ合成酵素）：
ＮＡｍ及びＰＲＰＰからのＮＭＮの合成を触媒するＮＭＮ合成酵素（ＮＡＭＰＴ）としては、従来、種々の微生物に由来する種々の酵素が知られている。ひいては、斯かる公知の酵素を適宜選択して使用することが可能である。
【００４８】
本発明では、ＮＭＮ合成酵素（ＮＡＭＰＴ）として優れた活性を有する特定の酵素を使用することが好ましい。ＮＡＭＰＴの活性が低いと、基質であるＮＡｍ及びＰＲＰＰからのＮＭＮ生産の選択率が低下するからである。また、ＮＭＮを生産する時間を要することとなり、ＮＭＮの分解及び変換の影響を受けて、生産量が低下する可能性があるからである。斯かる高活性なＮＭＮ酵素を以下適宜「本発明のＮＭＮ合成酵素」という場合がある。但し、本発明で使用可能なＮＭＮ合成酵素（ＮＡＭＰＴ）は、以下に限定されるものではない。
【００４９】
具体的に、本発明のＮＭＮ合成酵素（ＮＡＭＰＴ）は、ＮＡｍからＮＭＮへの変換効率（ＮＡＭＰＴ変換効率）が、ヒトＮＡＭＰＴのＮＡＭＰＴ変換効率と比較して、通常５倍以上、中でも７倍以上、更には９倍以上であることが好ましい。後述の［実施例］の欄に示すように、本発明者等の検討によれば、変換効率が２倍又は３倍のＮＡＭＰＴを発現させた菌体では、ヒトＮＡＭＰＴを発現させた菌体と同様にＮＭＮの生産が確認されなかったが、変換効率が６倍のＮＡＭＰＴを発現させた菌体では、ヒトＮＡＭＰＴを発現させた菌体と比較して有意なＮＭＮの生産増加が確認された。
【００５０】
ＮＡＭＰＴのＮＡＭＰＴ変換効率を測定する方法の具体例としては、例えば以下の方法が挙げられる。即ち、ｐＲＳＦＤｕｅｔ−１にＮＡＭＰＴを発現させるための遺伝子を挿入したプラスミドを、大腸菌（Escherichia coli：以下適宜「E. Coli」と表記する。）ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換して構築株を作製し、５ｍＬのＬＢ培地が入った試験管に植菌して３７℃、２００ｒｐｍで１２時間培養した後、培養液を２００ｍＬのＬＢ培地が入った５００ｍＬ三角フラスコにＯＤ６００が０．０３となるように植菌して３７℃、２００ｒｐｍで培養し、ＯＤ６００が０．４となった時点で、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシドを終濃度０．１ｍＭとなるように添加し、２５℃、２００ｒｐｍで１６時間培養を行う。培養液３０ｍＬを５０ｍＬコニカル管に移し、３０００ｇで５分間遠心分離し、菌体を回収する。さらに、１×ＰＢＳを加えて洗浄を行い、３０００ｇで５分間遠心分離し、菌体を回収する。この操作を２回実施する。回収菌体をＣｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（ＭＢＬ社製）１５ｍＬで懸濁し、一般に推奨される方法で菌体分解液（Ｌｙｓａｔｅ）を調製する。プロテインアッセイブラッドフォード試薬（和光純薬（株）製）を用いて菌体分解液のＯＤ５９５を測定し、ＯＤ５９５が０．１となるように菌体分解液を水で希釈する。この希釈液をＮＡＭＰＴ溶液として、ＣｙｃＬｅｘＲ ＮＡＭＰＴ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａy Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（ＭＢＬ社製）のＯｎｅ−Ｓｔｅｐ Ａｓｓａｙ Ｍｅｔｈｏｄに準拠してＮＡＭＰＴ活性を測定する。測定には、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＲ ｉＤ３マルチモードマイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス社製）などが使用できる。本発明では、３０℃で５分毎に６０分まで４５０ｎｍの吸光度を測定し、傾きが最大値となる３点の吸光度を選択して得られる傾きを、ＮＡＭＰＴ変換効率と定義する。
【００５１】
但し、ＮＡＭＰＴ変換効率の測定方法は、前記の具体例に限定されるものではなく、同等の値を与える方法であれば、別の評価方法を用いてもよい。
【００５２】
中でも、本発明のＮＭＮ合成酵素は、配列番号３又は配列番号６に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は、これと類似するアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる酵素であることが好ましい。
【００５３】
ここで、配列番号３は、スフィンゴピキシス・ＣＩ株（Sphingopyxis sp. C-1）由来のＮＡＭＰＴのアミノ酸配列であり、配列番号１は、配列番号３のＮＡＭＰＴをコードする天然遺伝子の塩基配列である。なお、当該天然遺伝子の塩基配列を基に、宿主微生物での発現及び作用を改善するように発明者等が最適化を施して作製した、配列番号３のＮＡＭＰＴをコードする塩基配列を、配列番号２に併せて示す。
【００５４】
また、配列番号６は、キチノファーガ・ピネンシス（Chitinophaga pinensis）由来のＮＡＭＰＴのアミノ酸配列であり、配列番号４は、配列番号６のＮＡＭＰＴをコードする天然遺伝子の塩基配列である。なお、当該天然遺伝子の塩基配列を基に、宿主微生物での発現及び作用を改善するように発明者等が最適化を施して作製した、配列番号６のＮＡＭＰＴをコードする塩基配列を、配列番号５に併せて示す。
【００５５】
具体的に、本発明のＮＭＮ合成酵素は、配列番号３又は配列番号６に示すアミノ酸配列に対して、８０％以上、中でも８５％以上、更には９０％以上、とりわけ９５％以上、又は９６％以上、又は９７％以上、又は９９％以上、特に１００％の相同性（好ましくは同一性）を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドからなることが好ましい。
【００５６】
（２）ナイアシンの細胞内取り込みを促進する輸送体タンパク質（ナイアシン輸送体）：
ＮＡｍ及び／又はＮＡ（ナイアシン）の細胞内取り込みを促進する輸送体（ナイアシン輸送体）としても、従来、種々の微生物に由来する種々の輸送体タンパク質が知られている。ひいては、斯かる公知の輸送体タンパク質を適宜選択して使用することが可能である。
【００５７】
本発明では、ナイアシン輸送体として優れた活性を有する特定の輸送体タンパク質を使用することが好ましい。ナイアシン輸送体のナイアシン取り込み効率が低いと、ＰＲＰＰと反応するＮＡｍの細胞内での存在量が少ないため、基質であるＮＡｍ及びＰＲＰＰからのＮＭＮ生産の選択率が低下するからである。また、ＮＭＮを生産する時間を要することとなり、ＮＭＮの分解及び変換の影響を受けて、生産量が低下する可能性があるからである。斯かるナイアシン取り込み効率に優れた輸送体タンパク質を適宜「本発明のナイアシン輸送体」という場合がある。但し、本発明で使用可能なナイアシン輸送体は、以下に限定されるものではない。
【００５８】
具体的に、本発明のナイアシン輸送体は、宿主微生物によるニコチン酸及び／又はニコチンアミドの細胞内取り込み効率（ナイアシン取り込み効率）を、当該ナイアシン輸送体を発現しない宿主微生物のナイアシン取り込み効率と比較して、通常１．１倍以上、中でも１．２倍以上に増加させることが好ましい。ナイアシン取り込み効率が増加すると、ナイアシン輸送体を発現しない宿主微生物と比較して、ＮＡｍの濃度に応じた細胞内の存在量が多くなり、結果として、ＮＭＮ生産量が増加する。
【００５９】
ナイアシン輸送体のナイアシン取り込み効率を測定する方法の具体例としては、例えば以下の方法が挙げられる。即ち、ｐＣＤＦＤｕｅｔ−１に大腸菌（E. Coli）Ｋ１２由来ｐｒｓ、ｒｐｉＢ、ｒｐｉＡ、ｇｎｄ、ｐｇｌ、ｚｗｆ、及びｐｇｉをこの順番で発現させるための遺伝子を挿入したプラスミドを、大腸菌（E. Coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）株をもとに構築した、ＮＡＭＰＴ変換効率が２００以上となるＮＡＭＰＴを発現する株に形質転換した構築株を作製し、さらにその株に、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１にナイアシン輸送体を発現させるための遺伝子を挿入したプラスミドを形質転換した構築株を作製し、使用する。構築株を５ｍＬのＬＢ培地が入った試験管に植菌して３７℃、２００ｒｐｍで１２時間培養した後、培養液を２００ｍＬのＬＢ培地が入った５００ｍＬ三角フラスコにＯＤ６００が０．０３となるように植菌して３７℃、２００ｒｐｍで培養し、ＯＤ６００が０．４となった時点で、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシドを終濃度０．１ｍＭとなるように添加し、２５℃、２００ｒｐｍで１６時間培養を行う。その後、培養液を５０ｍＬコニカル管に移し、３０００ｇで５分間遠心分離し、菌体を回収する。さらに、１×ＰＢＳを加えて洗浄を行い、３０００ｇで５分間遠心分離し、菌体を回収する。この操作を２回実施する。回収した菌体をＯＤ６００が１０となるようにＬＢ培地で懸濁し、１００ｍＬ三角フラスコに１０ｍＬとなるように加え、そこにニコチンアミドを１ｇ／Ｌ、Ｄ−グルコースを０．４ｇ／Ｌ、リン酸バッファー（ｐＨ６．２）を０．００５ｍｏｌ／Ｌとなるように仕込み、３０℃、２００ｒｐｍで反応する。反応から１時間後及び２時間後に反応液を採取し、−３０℃で凍結した後に溶解させ、１２０００ｒｐｍで３分間遠心分離して上清を回収する。これら回収した液体をＨＰＬＣにて分析し、ＮＭＮ量を定量する。得られたＮＭＮ定量値を用いて、下記式（１）により、ナイアシン輸送体のナイアシン取り込み効率を求めることができる。
【００６０】
【数１】
2020129997.tif 000004
【００６１】
但し、ナイアシン輸送体によるナイアシン取り込み効率の測定方法は、前記の具体例に限定されるものではなく、同等の値を与える方法であれば、別の評価方法を用いてもよい。
【００６２】
中でも、本発明のナイアシン輸送体は、配列番号９又は配列番号１２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は、これと類似するアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる酵素であることが好ましい。
【００６３】
ここで、配列番号９は、バークホルデリア・セノセパシア（Burkholderia cenocepacia）由来のナイアシン輸送体のアミノ酸配列であり、配列番号７は、配列番号９のナイアシン輸送体をコードする天然遺伝子の塩基配列である。なお、当該天然遺伝子の塩基配列を基に、宿主微生物での発現及び作用を改善するように発明者等が最適化を施して作製した、配列番号９のナイアシン輸送体をコードする塩基配列を、配列番号８に併せて示す。
【００６４】
また、配列番号１２は、ストレプトコッカス・ヒューモニア（Streptococcus pneumoniae）ＴＩＧＲ４株由来のナイアシン輸送体のアミノ酸配列であり、配列番号１０は、配列番号１２のナイアシン輸送体をコードする天然遺伝子の塩基配列である。なお、当該天然遺伝子の塩基配列を基に、宿主微生物での発現及び作用を改善するように発明者等が最適化を施して作製した、配列番号１２のナイアシン輸送体をコードする塩基配列を、配列番号１１に併せて示す。
【００６５】
具体的に、本発明のナイアシン輸送体は、配列番号９又は配列番号１２に示すアミノ酸配列に対して、８０％以上、中でも８５％以上、更には９０％以上、とりわけ９５％以上、又は９６％以上、又は９７％以上、又は９９％以上、特に１００％の相同性（好ましくは同一性）を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドからなることが好ましい。
【００６６】
（３）ＮＡｍ誘導体の細胞外排出を促進する輸送体タンパク質（ＮＡｍ誘導体輸送体）：
ＮＭＮ合成の生産物であるＮＭＮ、及び／又は、そこから派生して合成されるＮＲやＮａＭＮ等のＮＡｍ誘導体の細胞外排出を促進する輸送体（ＮＡｍ誘導体輸送体）としても、従来、種々の微生物に由来する種々の輸送体タンパク質が知られている。ひいては、斯かる公知の輸送体タンパク質を適宜選択して使用することが可能である。
【００６７】
本発明では、ＮＡｍ誘導体輸送体として優れた活性を有する特定の輸送体タンパク質を使用することが好ましい。ＮＡｍ誘導体輸送体によるＮＡｍ誘導体の排出効率が低いと、ＮＭＮは細胞内に残存するため、ＮＭＮの分解及び変換の影響を受けて、生産量が低下する可能性があるからである。また、ＮＡｍ誘導体輸送体によるＮＡｍ誘導体の排出効率が高いと、生産されるＮＭＮが細胞外に存在するため、回収方法を大幅に簡略化することが期待できるからである。斯かるＮＡｍ誘導体排出効率に優れた輸送体タンパク質を適宜「本発明のＮＡｍ誘導体輸送体」という場合がある。但し、本発明で使用可能なＮＡｍ誘導体輸送体は、以下に限定されるものではない。
【００６８】
具体的に、本発明のＮＡｍ誘導体輸送体は、宿主微生物によるニコチンアミド誘導体の細胞外排出効率（ＮＡｍ誘導体排出効率）を、当該ＮＡｍ誘導体輸送体を発現しない宿主微生物のＮＡｍ誘導体排出効率と比較して、通常３倍以上、中でも５倍以上、更には７倍以上に増加させることが好ましい。
【００６９】
ＮＡｍ誘導体輸送体によるＮＡｍ誘導体排出効率を測定する方法の具体例としては、特にＮＡｍ誘導体としてＮＭＮを排出するＮＡｍ誘導体輸送体（ＮＭＮ輸送体）を例に取ると、例えば以下の方法が挙げられる。即ち、ｐＣＤＦＤｕｅｔ−１に大腸菌（E. Coli）Ｋ１２由来ｐｒｓ、ｒｐｉＢ、ｒｐｉＡ、ｇｎｄ、ｐｇｌ、ｚｗｆ、及びｐｇｉをこの順番で発現させるための遺伝子を挿入したプラスミドを、大腸菌（E. Coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）株をもとに構築した、ＮＡＭＰＴ変換効率が２００以上となるＮＡＭＰＴを発現する株に形質転換した構築株を作製し、さらにその株に、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１にＮＭＮ輸送体を発現させるための遺伝子を挿入したプラスミドを形質転換した構築株を作製し、使用する。構築株を５ｍＬのＬＢ培地が入った試験管に植菌して３７℃、２００ｒｐｍで１２時間培養した後、培養液を２００ｍＬのＬＢ培地が入った５００ｍＬ三角フラスコにＯＤ６００が０．０３となるように植菌して３７℃、２００ｒｐｍで培養し、ＯＤ６００が０．４となった時点で、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシドを終濃度０．１ｍＭとなるように添加し、２５℃、２００ｒｐｍで１６時間培養を行う。その後、培養液を５０ｍＬコニカル管に移し、３０００ｇで５分間遠心分離し、菌体を回収する。さらに、１×ＰＢＳを加えて洗浄を行い、３０００ｇで５分間遠心分離し、菌体を回収する。この操作を２回実施する。回収した菌体をＯＤ６００が１０となるようにＬＢ培地で懸濁し、１００ｍＬ三角フラスコに１０ｍＬとなるように加え、そこにニコチンアミドを１ｇ／Ｌ、Ｄ−グルコースを０．４ｇ／Ｌ、リン酸バッファー（ｐＨ６．２）を０．００５ｍｏｌ／Ｌとなるように仕込み、３０℃、２００ｒｐｍで反応する。反応２時間後に反応液を採取し、１つは−３０℃で凍結した後に溶解させ、１２０００ｒｐｍで３分間遠心分離して上清を回収する。もう１つは凍結処理せず、１２０００ｒｐｍで３分間遠心分離して上清を回収する。これら回収した液体をＨＰＬＣにて分析し、ＮＭＮ量を定量する。得られたＮＭＮ定量値を用いて、下記式（２）により、ＮＭＮ輸送体のＮＭＮ排出効率を求めることができる。
【００７０】
【数２】
2020129997.tif 000005
【００７１】
また、ＮＭＮ以外のＮＡｍ誘導体を排出するＮＡｍ誘導体輸送体の場合も、これに準じた手法によりＮＡｍ誘導体の排出効率を求めることができる。
【００７２】
但し、ＮＡｍ誘導体輸送体によるＮＡｍ誘導体排出効率の測定方法は、前記の具体例に限定されるものではなく、同等の値を与える方法であれば、別の評価方法を用いてもよい。
【００７３】
中でも、本発明のＮＡｍ誘導体輸送体は、配列番号１５に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は、これと類似するアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる酵素であることが好ましい。
【００７４】
ここで、配列番号１５は、バチルス・ミコイデス（Bacillus mycoides）由来のＮＡｍ誘導体輸送体（ＮＭＮ輸送体）のアミノ酸配列であり、配列番号１３は、配列番号１５のＮＡｍ誘導体輸送体をコードする天然遺伝子の塩基配列である。なお、当該天然遺伝子の塩基配列を基に、宿主微生物での発現及び作用を改善するように発明者等が最適化を施して作製した、配列番号１５のＮＡｍ誘導体輸送体をコードする塩基配列を、配列番号１４に併せて示す。
【００７５】
具体的に、本発明のＮＡｍ誘導体輸送体は、配列番号１５に示すアミノ酸配列に対して、８０％以上、中でも８５％以上、更には９０％以上、とりわけ９５％以上、又は９６％以上、又は９７％以上、又は９９％以上、特に１００％の相同性（好ましくは同一性）を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドからなることが好ましい。
【００７６】
（４）Ｇ６ＰからのＰＲＰＰの合成に関与する酵素（ＧＰＩ、ＧＰＤ、ＰＧＬ、ＰＧＤ、ＲＰＩ、及びＰＲＳ）：
Ｇ６ＰからのＰＲＰＰの合成に関与する酵素である、ホスホグルコースイソメラーゼ（ＰＧＩ）、グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）、６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ＰＧＬ）、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＧＤ）、リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ＲＰＩ）、及びホスホリボシルピロリン酸シンターゼ（ＰＲＳ）（これらを総称して適宜「ＰＲＰＰ合成関連酵素」と称する。）としても、従来、種々の微生物に由来する種々の酵素が知られており、各種の宿主微生物に応じた最適化も種々なされている。ひいては、斯かる公知の酵素を適宜選択して使用することが可能である。
【００７７】
本発明で特に使用が好ましいＰＲＰＰ合成関連酵素の例を以下に挙げる。但し、本発明で使用可能なＰＲＰＰ合成関連酵素は、以下に限定されるものではない。
【００７８】
ホスホグルコースイソメラーゼ（ＰＧＩ）としては、配列番号１８に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は、これと類似するアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる酵素である。
【００７９】
ここで、配列番号１８は、大腸菌（E. coli）由来の酵素ｐｇｉのアミノ酸配列であり、配列番号１６は、配列番号１８の酵素ｐｇｉをコードする天然遺伝子の塩基配列である。なお、当該天然遺伝子の塩基配列を基に、宿主微生物での発現及び作用を改善するように発明者等が最適化を施して作製した、配列番号１８の酵素ｐｇｉをコードする塩基配列を、配列番号１７に併せて示す。
【００８０】
具体的には、配列番号１８に示すアミノ酸配列に対して、８０％以上、中でも８５％以上、更には９０％以上、とりわけ９５％以上、又は９６％以上、又は９７％以上、又は９９％以上、特に１００％の相同性（好ましくは同一性）を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドからなるＰＧＩを使用することが好ましい。
【００８１】
グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）としては、配列番号２１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は、これと類似するアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる酵素である。
【００８２】
ここで、配列番号２１は、大腸菌（E. coli）由来の酵素ｚｗｆのアミノ酸配列であり、配列番号１９は、配列番号２１の酵素ｚｗｆをコードする天然遺伝子の塩基配列である。なお、当該天然遺伝子の塩基配列を基に、宿主微生物での発現及び作用を改善するように発明者等が最適化を施して作製した、配列番号２１の酵素ｚｗｆをコードする塩基配列を、配列番号２０に併せて示す。
【００８３】
具体的には、配列番号２１に示すアミノ酸配列に対して、８０％以上、中でも８５％以上、更には９０％以上、とりわけ９５％以上、又は９６％以上、又は９７％以上、又は９９％以上、特に１００％の相同性（好ましくは同一性）を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドからなるＧＰＤを使用することが好ましい。
【００８４】
６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ＰＧＬ）としては、配列番号２４に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は、これと類似するアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる酵素である。
【００８５】
ここで、配列番号２４は、大腸菌（E. coli）由来の酵素ｐｇｌのアミノ酸配列であり、配列番号２２は、配列番号２４の酵素ｐｇｌをコードする天然遺伝子の塩基配列である。なお、当該天然遺伝子の塩基配列を基に、宿主微生物での発現及び作用を改善するように発明者等が最適化を施して作製した、配列番号２４の酵素ｐｇｌをコードする塩基配列を、配列番号２３に併せて示す。
【００８６】
具体的には、配列番号２４に示すアミノ酸配列に対して、８０％以上、中でも８５％以上、更には９０％以上、とりわけ９５％以上、又は９６％以上、又は９７％以上、又は９９％以上、特に１００％の相同性（好ましくは同一性）を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドからなるＰＧＬを使用することが好ましい。
【００８７】
６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＧＤ）としては、配列番号２７に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は、これと類似するアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる酵素である。
【００８８】
ここで、配列番号２７は、大腸菌（E. coli）由来の酵素ｇｎｄのアミノ酸配列であり、配列番号２５は、配列番号２７の酵素ｇｎｄをコードする天然遺伝子の塩基配列である。なお、当該天然遺伝子の塩基配列を基に、宿主微生物での発現及び作用を改善するように発明者等が最適化を施して作製した、配列番号２７の酵素ｇｎｄをコードする塩基配列を、配列番号２６に併せて示す。
【００８９】
具体的には、配列番号２７に示すアミノ酸配列に対して、８０％以上、中でも８５％以上、更には９０％以上、とりわけ９５％以上、又は９６％以上、又は９７％以上、又は９９％以上、特に１００％の相同性（好ましくは同一性）を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドからなるＰＧＤを使用することが好ましい。
【００９０】
リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ＲＰＩ）としては、配列番号３０又は配列番号３３に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は、これと類似するアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる酵素である。
【００９１】
ここで、配列番号３０は、大腸菌（E. coli）由来の酵素ｒｐｉＡのアミノ酸配列であり、配列番号２８は、配列番号３０の酵素ｒｐｉＡをコードする天然遺伝子の塩基配列である。なお、当該天然遺伝子の塩基配列を基に、宿主微生物での発現及び作用を改善するように発明者等が最適化を施して作製した、配列番号３０の酵素ｒｐｉＡをコードする塩基配列を、配列番号２９に併せて示す。
【００９２】
また、配列番号３３は、大腸菌（E. coli）由来の酵素ｒｐｉＢのアミノ酸配列であり、配列番号３１は、配列番号３３の酵素ｒｐｉＢをコードする天然遺伝子の塩基配列である。なお、当該天然遺伝子の塩基配列を基に、宿主微生物での発現及び作用を改善するように発明者等が最適化を施して作製した、配列番号３３の酵素ｒｐｉＢをコードする塩基配列を、配列番号３２に併せて示す。
【００９３】
具体的には、配列番号３０又は配列番号３３に示すアミノ酸配列に対して、８０％以上、中でも８５％以上、更には９０％以上、とりわけ９５％以上、又は９６％以上、又は９７％以上、又は９９％以上、特に１００％の相同性（好ましくは同一性）を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドからなるＲＰＩを使用することが好ましい。
【００９４】
ホスホリボシルピロリン酸シンターゼ（ＰＲＳ）としては、配列番号３６に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は、これと類似するアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる酵素である。
【００９５】
ここで、配列番号３６は、大腸菌（E. coli）由来の酵素ｐｒｓのアミノ酸配列であり、配列番号３４は、配列番号３６の酵素ｐｒｓをコードする天然遺伝子の塩基配列である。なお、当該天然遺伝子の塩基配列を基に、宿主微生物での発現及び作用を改善するように発明者等が最適化を施して作製した、配列番号３６の酵素ｐｒｓをコードする塩基配列を、配列番号３５に併せて示す。
【００９６】
具体的には、配列番号３６に示すアミノ酸配列に対して、８０％以上、中でも８５％以上、更には９０％以上、とりわけ９５％以上、又は９６％以上、又は９７％以上、又は９９％以上、特に１００％の相同性（好ましくは同一性）を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドからなるＰＲＳを使用することが好ましい。
【００９７】
なお、前述したＮＭＮ合成酵素、ナイアシン輸送体、ＮＡｍ誘導体輸送体、及び／又は、ＰＲＰＰ合成酵素（ＧＰＩ、ＧＰＤ、ＰＧＬ、ＰＧＤ、ＲＰＩ、及びＰＲＳ）の由来は問わない。即ち、これらの酵素及び輸送体は各々、宿主生物が内因的に有するものでもよく、宿主生物に対して外因性のものを遺伝子組換え等により人為的に発現させてもよい。
【００９８】
また、前述した高い活性を有する本発明の酵素及び輸送体、特に本発明のＮＭＮ合成酵素は、宿主生物内で発現させたものを抽出や単離等の一般的な方法で回収して、酵素反応等の他の用途にも好適に使用することができる。
【００９９】
［III．ベクター］
次に、本発明で使用されるＮＭＮの生産に関与する酵素を発現するためのベクターについて説明する。
【０１００】
本発明の一側面によれば、前述したＮＭＮ合成酵素、ナイアシン輸送体、ＮＡｍ誘導体輸送体、及び／又は、ＰＲＰＰ合成酵素（ＧＰＩ、ＧＰＤ、ＰＧＬ、ＰＧＤ、ＲＰＩ、及びＰＲＳ）のアミノ酸配列をコードする核酸を担持するベクターを作製し、斯かるベクターを用いて宿主生物にこれらの酵素・輸送体を導入する。ベクターに担持させる酵素・輸送体の組み合わせは制限されない。各酵素・輸送体をそれぞれ個別のベクターに担持させてもよく、二以上の酵素・輸送体を一つのベクターに纏めて担持させてもよい。
【０１０１】
本発明におけるベクターの一例は、前述した本発明のＮＭＮ合成酵素（ＮＡＭＰＴ）のアミノ酸配列をコードする核酸を担持するベクターである。斯かるベクターを適宜「本発明のＮＭＮ合成酵素ベクター」又は「本発明のＮＡＭＰＴベクター」という場合がある。
【０１０２】
中でも、本発明のＮＭＮ合成酵素ベクターは、本発明のＮＭＮ合成酵素をコードする核酸として、配列番号２又は配列番号５に示す塩基配列と、８０％以上、中でも８５％以上、更には９０％以上、とりわけ９５％以上、又は９６％以上、又は９７％以上、又は９９％以上、特に１００％の同一性を有する塩基配列を有する核酸を担持することが好ましい。
【０１０３】
本発明におけるベクターの別の一例は、前述した本発明のナイアシン輸送体のアミノ酸配列をコードする核酸を担持するベクターである。斯かるベクターを適宜「本発明のナイアシン輸送体ベクター」という場合がある。
【０１０４】
中でも、本発明のナイアシン輸送体ベクターは、本発明のナイアシン輸送体をコードする核酸として、配列番号８又は配列番号１１に示す塩基配列と、８０％以上、中でも８５％以上、更には９０％以上、とりわけ９５％以上、又は９６％以上、又は９７％以上、又は９９％以上、特に１００％の同一性を有する塩基配列を有する核酸を担持することが好ましい。
【０１０５】
本発明におけるベクターの別の一例は、前述した本発明のナイアシン輸送体のアミノ酸配列をコードする核酸を担持するベクターである。斯かるベクターを適宜「本発明のＮＡｍ誘導体輸送体ベクター」という場合がある。
【０１０６】
中でも、本発明のＮＡｍ誘導体輸送体ベクターは、本発明のＮＡｍ誘導体輸送体をコードする核酸として、配列番号１４に示す塩基配列と、８０％以上、中でも８５％以上、更には９０％以上、とりわけ９５％以上、又は９６％以上、又は９７％以上、又は９９％以上、特に１００％の同一性を有する塩基配列を有する核酸を担持することが好ましい。
【０１０７】
本発明におけるベクターの別の一例は、前述したＰＲＰＰ合成酵素、具体的には、ＧＰＩ、ＧＰＤ、ＰＧＬ、ＰＧＤ、ＲＰＩ、及びＰＲＳのうち１又は２以上のアミノ酸配列をコードする核酸を担持するベクターである。斯かるベクターを適宜「本発明のＰＲＰＰ合成酵素ベクター」と総称する場合がある。また、具体的な酵素ベクターを、担持される核酸に対応する酵素名を付して、適宜「本発明のＧＰＩ酵素ベクター」等という場合がある。
【０１０８】
中でも、本発明のＧＰＩベクターは、本発明のＧＰＩをコードする核酸として、配列番号１７に示す塩基配列と、８０％以上、中でも８５％以上、更には９０％以上、とりわけ９５％以上、又は９６％以上、又は９７％以上、又は９９％以上、特に１００％の同一性を有する塩基配列を有する核酸を担持することが好ましい。
【０１０９】
また、本発明のＧＰＤベクターは、本発明のＧＰＤをコードする核酸として、配列番号２０に示す塩基配列と、８０％以上、中でも８５％以上、更には９０％以上、とりわけ９５％以上、又は９６％以上、又は９７％以上、又は９９％以上、特に１００％の同一性を有する塩基配列を有する核酸を担持することが好ましい。
【０１１０】
また、本発明のＰＧＬベクターは、本発明のＰＧＬをコードする核酸として、配列番号２３に示す塩基配列と、８０％以上、中でも８５％以上、更には９０％以上、とりわけ９５％以上、又は９６％以上、又は９７％以上、又は９９％以上、特に１００％の同一性を有する塩基配列を有する核酸を担持することが好ましい。
【０１１１】
また、本発明のＰＧＤベクターは、本発明のＰＧＤをコードする核酸として、配列番号２６に示す塩基配列と、８０％以上、中でも８５％以上、更には９０％以上、とりわけ９５％以上、又は９６％以上、又は９７％以上、又は９９％以上、特に１００％の同一性を有する塩基配列を有する核酸を担持することが好ましい。
【０１１２】
また、本発明のＲＰＩベクターは、本発明のＲＰＩをコードする核酸として、配列番号２９又は３２に示す塩基配列と、８０％以上、中でも８５％以上、更には９０％以上、とりわけ９５％以上、又は９６％以上、又は９７％以上、又は９９％以上、特に１００％の同一性を有する塩基配列を有する核酸を担持することが好ましい。
【０１１３】
また、本発明のＰＲＳベクターは、本発明のＰＲＳをコードする核酸として、配列番号３５に示す塩基配列と、８０％以上、中でも８５％以上、更には９０％以上、とりわけ９５％以上、又は９６％以上、又は９７％以上、又は９９％以上、特に１００％の同一性を有する塩基配列を有する核酸を担持することが好ましい。
【０１１４】
なお、本開示において、二つ以上の酵素の核酸を担持するベクターは、酵素名をスラッシュで区切って表す。例えば「ＧＰＩ／ＧＰＤ／ＰＧＬ／ＰＧＤ／ＲＰＩ／ＰＲＳベクター」とは、ＧＰＩ、ＧＰＤ、ＰＧＬ、ＰＧＤ、ＲＰＩ、及びＰＲＳのアミノ酸配列をコードする核酸を担持するベクターを意味する。
【０１１５】
本開示において、ベクターは、対応する酵素のアミノ酸配列をコードする核酸領域（以下適宜「コーディング領域」という場合がある。）を有していれば、その形態は制限されず、例えば直鎖状ベクターでも、閉鎖環状ベクターでもよい。また、宿主細胞のゲノムに取り込まれるべきＤＮＡは、単一のベクターにまとめて含まれていてもよく、複数のベクターに分割して含まれていてもよい。
【０１１６】
本開示では、ベクターの複製能も特に制限されない。例えば、ベクターは自己複製型ベクター、即ち、宿主細胞の染色体外に存在し、染色体複製とは独立に複製されるベクターであってもよい。斯かる自己複製型ベクターの例としては、プラスミドベクター、染色体外要素、ミニ染色体、人工染色体等が挙げられる。この場合、ベクターは通常、前記の酵素をコードする核酸に加えて、自己複製に必要な機能要素、例えば複製起点等を含む。複製起点の種類は制限されないが、大腸菌宿主細胞内で使用可能な複製起点の例としては、ｐＵＣ起点、ＲＳＦ起点、ｐ１５Ａ起点、ＣｏｌＤＦ１３起点、ＣｏｌＥ１起点、ｐＢＲ３２２起点、ｐＡＣＹＣ起点、ｐＳＣ１０１起点、ｆ１起点、Ｍ１３起点、ＢＡＣベクターの起点、ＰＡＣベクターの起点、及びコスミドベクター起点等が挙げられ、酵母宿主細胞内で使用可能な複製起点の例としては、２μ起点、ＡＲＳ等が挙げられる。
【０１１７】
或いは、本開示におけるベクターは、自己複製能を有さず、宿主細胞内に導入されると宿主細胞のゲノム内に組み込まれ、宿主ゲノムと一緒に複製されるものであってもよい。この場合、宿主細胞のゲノムに取り込まれるべき核酸は、単一のベクターにまとめて含まれていてもよく、複数のベクターに分割して含まれていてもよい。斯かる自己複製能を有さないベクターの例としては、ウイルスベクター、ファージベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター等が挙げられる。
【０１１８】
斯かる自己複製能を有さないベクターは、宿主細胞の所望の染色体内の所望の位置に対して、相同組換により正確に組み込まれるように構成してもよい。この場合、当該所望の組み込み位置の両側の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する一対のフランキング配列によって、宿主細胞のゲノムに取り込まれるべき核酸を挟み込むように構成すればよい。各フランキング配列の長さは特に制限されないが、例えば５０塩基以上、又は１００塩基以上、又は２００塩基以上とすることができる。同組換には、各種の公知の組換え酵素を用いることもでき、λファージのＲｅｄ組換え酵素やＲａｃプロファージのＲｅｃＥ／ＲｅｃＴ組換え酵素などが例示される。
【０１１９】
或いは、斯かる自己複製能を有さないベクターは、宿主細胞のゲノムに対して、非相同組換により組み込まれるように構成してもよい。この場合、アグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡ由来のＲＢ配列及びＬＢ配列や、各種の公知のトランスポゾン配列によって、宿主細胞のゲノムに取り込まれるべき核酸を挟み込むように構成すればよい。また、ゲノム編集技術を用いて所望の核酸を宿主細胞のゲノム内に挿入してもよい。
【０１２０】
本発明におけるベクターは、前述の酵素のコーディング領域と、自己複製用の配列やゲノムへの組み込み用の配列とに加えて、他の機能を有する核酸領域を有していてもよい。例としては、コーディング領域の発現を制御する調節配列や、選択マーカー遺伝子、マルチクローニングサイト等が挙げられる。
【０１２１】
調節配列としては、プロモーター、リボソーム結合配列、エンハンサー、シスエレメント、ターミネーター等が挙げられる。斯かる調節配列としては、使用する宿主細胞の種類や酵素のサイズ等に応じて、任意の配列を適宜選択して使用することができる。具体例としては、限定されるものではないが、例えば、以下のものが挙げられる。
【０１２２】
大腸菌宿主細胞内で使用可能なプロモーターの例としては、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター等が挙げられ、酵母宿主細胞内で使用可能なプロモーターの例としては、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター等が挙げられる。
【０１２３】
各種の宿主細胞内で使用可能なリボソーム結合配列は、タンパク質が生合成を開始する際に、ＤＮＡから転写されたｍＲＮＡが宿主細胞内でリボソームに結合できるようにするリボソームの結合部位であれば、公知の任意の配列を用いることができる。
【０１２４】
大腸菌宿主細胞内で使用可能なターミネーターの例としては、Ｔ７ターミネーター、ｆｄファージターミネーター、Ｔ４ターミネーター、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネーター、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネーター等が挙げられ、酵母宿主細胞内で使用可能なターミネーターの例としては、ＰＧＫ１ターミネーター、ＣＹＣ１ターミネーター、ＤＩＴ１ターミネーター等が挙げられる。
【０１２５】
なお、これらのプロモーター、リボソーム結合配列、ターミネーター等の調節配列は、前述の酵素のコーディング領域と作動式に連結し、これらの調節配列の制御下で、前述のコーディング領域から酵素が発現されるように構成することが好ましい。
【０１２６】
或いは、宿主細胞又はベクターが有するプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の調節配列と、前述の酵素のコーディング領域とが作動式に連結されるように構成し、これらの宿主細胞又はベクターが有する調節配列の制御下で、前述のコーディング領域から酵素が発現されるように構成してもよい。
【０１２７】
選択マーカー遺伝子は、ベクターの宿主細胞への導入や（自己複製能を有さないベクターの場合には）ゲノム内への組み込みが適切に行われたことを確認するために使用される。斯かる選択マーカー遺伝子としては、使用する宿主細胞の種類等に応じて、任意の配列を適宜選択して使用することができる。具体例としては、限定されるものではないが、大腸菌宿主細胞内で使用可能な選択マーカーの例としては、Ａｍｐｒ、Ｔｅｔｒ、Ｃｍｒ、Ｋｍｒ、Ｓｐｃｒ、Ｓｍｒ、Ｈｙｇｒ、Ｇｍｒ、Ｒｉｆｒ、Ｚｅｏｃｉｎｒ、Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎｒ等が挙げられ、酵母宿主細胞内で使用可能な選択マーカーの例としては、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、ＳＵＰ４、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＫＡＮＭＸ、ＡＵＲ１−Ｃ、ＣＹＨ２、ＣＡＮ１、ＰＤＲ４、及びｈｐｈＭＸ等が挙げられる。
【０１２８】
なお、斯かる選択マーカー遺伝子は、宿主細胞内で適切に発現するように、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の調節配列と作動式に連結し、自律的に発現可能なカセットとして構成することが好ましい。斯かる選択マーカー遺伝子の発現のための調節配列は、前述の酵素の発現のための調節配列とは個別に用意してもよいが、共通の調節配列を用いてもよい。
【０１２９】
ベクターによる宿主細胞の形質転換後、選択マーカーを発現する細胞のみが生存できる選択条件下で形質転換細胞を培養することにより、ベクターの宿主細胞への導入や（自己複製能を有さないベクターの場合には）ゲノム内への組み込みが適切に行われた形質転換細胞のみを選択することが可能となる。
【０１３０】
［IV．組換え微生物］
次に、本発明においてＮＭＮを生産するために使用される組換え微生物について説明する。
【０１３１】
本発明の一側面は、前述した本発明のＮＭＮ合成酵素、ナイアシン輸送体、ＮＡｍ誘導体輸送体、及び／又はＰＲＰＰ合成酵素（ＧＰＩ、ＧＰＤ、ＰＧＬ、ＰＧＤ、ＲＰＩ、及び／又はＰＲＳ）を発現する組換え微生物に関する。斯かる酵素を適宜「本発明の組換え微生物」という場合がある。
【０１３２】
本発明の組換え微生物は、前述した本発明のベクターを用いて、宿主微生物を形質転換することにより得られる。本発明の組換え微生物及びその宿主微生物の生物種は特に限定されないが、細菌又は真菌であることが好ましい。具体例としては、限定されるものではないが、細菌の例としては、エシェリキア（大腸菌）属（Escherichia）、スタフィロコッカス（ブドウ球菌）属（Staphylococcus）、バシラス属（Bacillus）、シュードモナス属（Pseudomonas）、プロテウス属（Proteus）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、アクチノマイセス属（Actinomyces）等が挙げられるが、大腸菌（E. coli）等のエシェリキア（大腸菌）属や、コリネバクテリウム属等が好ましい。一方、真菌の例としては、酵母、糸状菌等が挙げられるが、酵母が好ましい。酵母の例としては、サッカロミケス属（Saccharomyces）、カンジダ属（Candida）、ヤロウィア属（Yarrowia）、ピキア属（Pichia）、クルイベロミセス属（Kluyveromyces）等が挙げられる。
【０１３３】
なお、宿主微生物の種類によっては、ＮＡＭＰＴ、ナイアシン輸送体、ＮＡｍ誘導体輸送体、及び／又はＰＲＰＰ合成酵素に相当する内因性の酵素を発現する能力を有している場合がある。その場合には、斯かる内因性のＮＡＭＰＴ、ナイアシン輸送体、ＮＡｍ誘導体輸送体、及び／又はＰＲＰＰ合成酵素を利用して、ＮＭＮの生合成を行うことが可能である。但し、宿主微生物がＮＡＭＰＴ、ナイアシン輸送体、ＮＡｍ誘導体輸送体、及び／又はＰＲＰＰ合成酵素に相当する内因性の酵素を発現する能力を有している場合であっても、これらの酵素・輸送体をより高発現させ、最終的なＮＡｍ誘導体の生産効率を向上させる観点からは、これらの酵素・輸送体を発現するように宿主微生物を遺伝子組換えすることが好ましい。
【０１３４】
具体的に、本発明の一態様によれば、組換え微生物は、少なくとも本発明のＮＭＮ合成酵素を発現するように遺伝子組換えされていることが望ましい。また、本発明の組換え微生物は、本発明のＮＡｍ誘導体輸送体及び／又はナイアシン輸送体を発現するように遺伝子組換えされていることがより好ましい。また、本発明の組換え微生物は、ＰＲＰＰ合成酵素、具体的には、ＧＰＩ、ＧＰＤ、ＰＧＬ、ＰＧＤ、ＲＰＩ、及びＰＲＳのうち少なくとも何れか１つを発現するように遺伝子組換えされていることが好ましく、中でも何れか２つ、３つ、４つ、又は５つを発現するように遺伝子組換えされていることがより好ましく、ＧＰＩ、ＧＰＤ、ＰＧＬ、ＰＧＤ、ＲＰＩ、及びＰＲＳの６つ全てを発現するように遺伝子組換えされていることが更に好ましい。
【０１３５】
また、本発明の組換え微生物を増殖させることにより得られる子孫も、前述した本発明のＮＭＮ合成酵素、ナイアシン輸送体、ＮＡｍ誘導体輸送体、及び／又はＰＲＰＰ合成酵素を発現する能力を維持している限り、本発明の組換え微生物に該当する。
【０１３６】
本発明の組換え微生物は、前述した本発明のＮＭＮ合成酵素、ナイアシン輸送体、ＮＡｍ誘導体輸送体、及び／又はＰＲＰＰ合成酵素を発現する能力を有していればよいが、目的とするＮＡｍ誘導体の生産効率を考慮して種々の改変を加えてもよい。
【０１３７】
斯かる改変の例としては、目的とするＮＡｍ誘導体の産生効率の低下を招く各種酵素を遺伝子組み換えによりノックアウト又はノックダウンすることが挙げられる。
【０１３８】
例えば、製造目的のＮＡｍ誘導体がＮＭＮである場合は、前述したＮＭＮを他の各種のＮＡｍ誘導体へと変換する酵素、具体的にはＮＭＮをＮＡＤへと変換するニコチンアミド／ニコチン酸モノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（ＮＭＮＡＴ）、ＮＭＮをニコチン酸モノヌクレオチド（ＮａＭＮ）へと変換するニコチンアミドヌクレオチドアミダーゼ（ＮＡＮＡ）、ＮＭＮをニコチンアミドリボシド（ＮＲ）へと変換するニコチンアミドモノヌクレオチド−５−ヌクレオチダーゼ（ＮＭＮＮ）等の酵素は、何れも不要であり、むしろこれらの酵素の存在はＮＭＮの生産効率の低下につながるおそれがある。よって、これらの酵素の遺伝子をノックアウト又はノックダウンしてその発現を防止又は低減し、合成されたＮＭＮが他のＮＡｍ誘導体へと変換されないようにすることが好ましい。
【０１３９】
また、製造目的のＮＡｍ誘導体がＮＭＮ以外の誘導体、例えばＮＡＤ、ＮａＭＮ、ＮＲ等である場合は、ＮＭＮを所望のＮＡｍ誘導体へと変換する酵素の遺伝子を（例えば外部からの遺伝子導入等の手段によって）促進すると共に、ＮＭＮをそれ以外の誘導体へと変換する酵素の遺伝子をノックアウト又はノックダウンしてその発現を防止又は低減し、合成されたＮＭＮが所望のＮＡｍ誘導体以外のＮＡｍ誘導体へと変換されないようにすることが好ましい。さらに、本発明の菌体が生産したＮＭＮを用いて、所望のＮＡｍ誘導体へと変換する酵素反応あるいは化学反応により、製造することもできる。
【０１４０】
なお、各種酵素の遺伝子を組み換えによりノックアウト又はノックダウンする方法は、本技術分野では種々公知である。
【０１４１】
別の改変の例としては、ＮＭＮ合成反応の反応物であるＮＡｍの細胞内取り込みや、生産されたＮＭＮの細胞からの排出を促進するために、前述のナイアシン輸送体及び／又はＮＡｍ誘導体輸送体等の組換え導入発現に替えて、或いはこれらの組換え導入発現と共に、組換え微生物の細胞表面に対して物理的処理や化学的処理あるいはその両方を行うことが挙げられる。斯かる物理的処理としては、これらに制限されるものではないが、例えば、菌体の凍結処理、乾燥処理、超音波処理等の手段が挙げられる。斯かる化学的処理としては、これらに制限されるものではないが、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４、ＮＰ−４０、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｗｅｅｎ−８０、ＣＨＡＰＳ等の界面活性剤の添加、アルコール類やキシレン等の有機溶剤の添加、Ｍｎ２＋制限培養等の手段が挙げられる。
【０１４２】
［Ｖ．ＮＡｍ誘導体の製造方法］
次に、上述の組換え微生物を用いてＮＡｍ誘導体を生産する方法について説明する。
【０１４３】
本発明の一側面は、ＮＡｍ誘導体を産生するための方法であって、上述の本発明の組換え微生物にＮＡｍを供給し、前記微生物により生成されたＮＡｍ誘導体を回収することを含む製造方法に関する。斯かる製造方法を適宜「本発明のＮＡｍ誘導体の製造方法」という場合がある。
【０１４４】
以下、本発明のＮＡｍ誘導体の製造方法の各種の手順及び条件について、主にＮＡｍ誘導体がＮＭＮであり、宿主微生物が大腸菌である場合を例に挙げて説明するが、本発明のＮＡｍ誘導体の製造方法の手順及び条件は以下に説明するものに限定されず、適宜変更を加えて実施することが可能である。
【０１４５】
本発明の組換え微生物にＮＡｍを供給する手法は、特に制限されない。例えば、本発明の組換え微生物が培地中で培養されている状態で、培地に対してＮＡｍを直接加えればよい。但し、ＮＡｍ誘導体の生産効率及び回収効率を考慮すると、培地を遠心分離等で除去し、得られた本発明の組換え微生物を別途、反応に適した組成を有する反応液に加えて発酵 することが好ましい。また、供給は一括でもよいが、連続的あるいは断続的に供給してもよい。
【０１４６】
ＮＡｍ誘導体生産時の反応液の組成は制限されるものではないが、例えば、培養に使用する各種培地、リン酸バッファー、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の水溶液もしくは水に、本発明の組換え微生物と、ＮＡｍ誘導体合成反応の基質となるＮＡｍとを、最少成分として含んでいればよい。但し、ＮＡｍ誘導体の製造を促進するため、組換え微生物の栄養源となる、グルコース、グリセロール、フルクトース、でんぷん、廃糖蜜等の有機炭素源や炭酸塩等の無機炭素源と、リン酸二水素カリウムやリン酸水素二カリウム等のリン酸塩をリン成分として含むことが好ましい。また、適宜、ミネラル、窒素源、ＡＴＰ等を加えることができる。
【０１４７】
各種培地としては、ＮＡｍ誘導体生産に悪影響しない培地であれば、一般に公知な合成培地や天然培地を使用することができる。
【０１４８】
反応液の成分比率は、制限されないが、例えば以下のとおりである。
本発明の組換え微生物の細胞数は、特に制限されないが、少なすぎると希釈状態での反応となるため、十分に反応が進行せず、多すぎると目的のＮＡｍ誘導体生産以外の副反応が起こる場合がある。そのため、細胞数をその微生物に適した波長で測定した光学濃度（ＯＤ）で表すと、一般に、ＯＤが１以上が好ましく、ＯＤが５以上がより好ましく、ＯＤが１０以上がさらに好ましい。また、ＯＤが５００以下が好ましく、ＯＤが３００以下がより好ましい。例えば、大腸菌の場合、６００ｎｍの波長で測定したＯＤを用いる。
【０１４９】
ＮＡｍの濃度は、特に制限されないが、濃度が低いと、微生物内に取り込まれるＮＡｍ量が少なくなるため、所望の反応が有意に進行しない場合がある。また、濃度が高いと、微生物に対して負荷となる場合がある。そのため、通常１０ｍｇ／Ｌ以上、中でも１００ｍｇ／Ｌ以上、更には１０００ｍｇ／Ｌ以上とすることが好ましく、また、通常３００ｇ／Ｌ以下、中でも２５０ｇ／Ｌ以下、更には２００ｇ／Ｌ以下とすることが好ましい。
【０１５０】
炭素源の濃度は、特に制限されないが、濃度が低いと、微生物内で十分な代謝が進行しない場合がある。また、濃度が高いと、微生物に対して負荷となる場合がある。そのため、通常１０ｍｇ／Ｌ以上、中でも５０ｍｇ／Ｌ以上、更には１００ｍｇ／Ｌ以上とすることが好ましく、また、通常３００ｇ／Ｌ以下、中でも２５０ｇ／Ｌ以下、更には２００ｇ／Ｌ以下とすることが好ましい。
【０１５１】
リン成分は、特に制限されないが、濃度が低いと、微生物内で十分な代謝が進行しない場合がある。また、濃度が高いと、微生物に対して負荷となる場合がある。そのため、通常０．１ｍｍｏｌ／Ｌ以上、中でも０．５ｍｍｏｌ／Ｌ以上、更には１ｍｍｏｌ／Ｌ以上とすることが好ましく、また、通常１０ｍｏｌ／Ｌ以下、中でも５ｍｏｌ／Ｌ以下、更には１ｍｏｌ／Ｌ以下とすることが好ましい。
【０１５２】
その他の成分についても、使用する微生物や反応液の成分量に合わせて、適量を加えることが好ましい。
【０１５３】
反応液のこれらの成分は、全てを同時に混合してもよく、任意の順序で逐次的に混合してもよい。例えば、まずは本発明の組換え微生物及びＮＡｍ以外の成分を混合して基本組成の反応液を調製し、そこに本発明の組換え微生物を加え、本発明の組換え微生物が細胞活動及び増殖を開始した時点で、反応物であるＮＡｍを加えてＮＡｍ誘導体の合成反応を開始してもよい。
【０１５４】
なお、ＮＡｍ誘導体合成反応の妨げとならない範囲であれば、本発明の組換え微生物の事前培養時に使用していた培地が、多少残存して反応液に混入していてもよい。
【０１５５】
反応液のｐＨは、本発明の組換え微生物の至適ｐＨとなるように適宜調整すればよいが、組換え微生物の耐久性やＮＡｍ誘導体の安定性の観点から、通常２以上、中でも３以上とすることが好ましく、また同様の理由で、通常９以下、中でも８以下とすることが好ましい。なお、ｐＨ調整のために、例えば炭酸カルシウム、無機もしくは有機の酸、アルカリ溶液、アンモニア、ｐＨ緩衝液等のｐＨ調製剤を使用できる。
【０１５６】
ＮＡｍ誘導体生産時の反応条件は、制限されないが、例えば以下のとおりである。
反応時の温度は、本発明の組換え微生物の至適温度となるように適宜調整すればよいが、反応を進行させる観点から、通常１５℃以上、中でも２０℃以上とすることが好ましく、また、組換え微生物の耐久性やＮＡｍ誘導体の安定性の観点から、通常５０℃以下、中でも４０℃以下とすることが好ましい。
【０１５７】
反応時の圧力も特に制限されないが、通常は常圧である。
反応時の雰囲気は、本発明の組換え微生物の至適雰囲気を選択すればよいが、例えば環境雰囲気下、好気性雰囲気下、低酸素雰囲気下、嫌気性雰囲気下等である。
反応時には適宜、反応液に対して震盪や攪拌を加えてもよい。
【０１５８】
反応時間は、本発明の組換え微生物の種類や反応液の組成、反応条件等によっても異なるが、反応時間が短すぎると、十分にＮＡｍ誘導体生産が進行していない場合がある。また、反応時間が長すぎると、産生したＮＡｍ誘導体の変換や分解が起こる可能性がある。そのため、通常０．１時間以上、中でも０．３時間以上、更には０．５時間以上反応させることが好ましく、また、通常１２０時間以下、中でも９６時間以下、更には７２時間以下の反応時間とすることが好ましい。
【０１５９】
反応方式は、使用する微生物や反応条件に応じて、一般に公知な方法を用いることができる。例えば、バッチ式、連続バッチ式、フローマイクロリアクター式、ループリアクター式、シングルユース式等が挙げられる。
【０１６０】
反応後、本発明の組換え微生物により生産されたＮＡｍ誘導体を回収する。通常、生産されたＮＡｍ誘導体は本発明の組換え微生物の細胞膜を透過し、反応液に分泌されるので、反応液からＮＡｍ誘導体を単離・精製すればよい。
【０１６１】
単離・精製の手法はとくに制限されるものではないが、菌体の除去、発酵培養上清の不純物除去、精製及び目的物の回収工程などの一般的な方法を用いることができる。また、これら工程は単独で使用することもできるが、２つ以上を組み合わせて使用することが好ましい。
【０１６２】
菌体の除去工程は、一般に公知な方法を用いることができる。具体的には、遠心分離、膜分離などが挙げられる。
【０１６３】
発酵培養上清の不純物除去工程は、一般に公知な方法を用いることができる。具体的には、活性炭処理、ろ過（具体的には逆浸透膜、ナノろ過膜、精密ろ過膜、限外膜ろ過膜、精密ろ過膜等によるろ過を含む）処理、イオン交換樹脂などが挙げられる。
【０１６４】
精製及び目的物の回収工程は、一般に公知な方法を用いることができる。具体的には、アフィニティカラムクロマトグラフィー、減圧濃縮、膜濃縮、凍結乾燥、溶媒抽出、蒸留、クロマトカラムで分離する方法、イオン交換カラムで分離する方法、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）法、再結晶で析出させる方法等が挙げられる。
【０１６５】
これらの工程は組み合わせて用いることができる。例えば、遠心分離、活性炭処理、イオン交換樹脂、ナノろ過膜処理、再結晶を組み合わせることによる単離・精製等を好適に用いることができる。
【０１６６】
単離・精製を行う際のｐＨの範囲は特に限定されないが、ＮＡｍ誘導体の安定性の観点から、通常２以上、中でも３以上が好ましく、また、通常９以下、中でも８以下の範囲が好ましい。なお、ｐＨの調整は一般に公知な方法を用いることができ、例えば、炭酸カルシウム、無機又は有機の酸、アルカリ溶液、アンモニア、ｐＨ緩衝液等のｐＨ調製剤を用いることができる。
【０１６７】
単離・精製を行う際の温度は特に限定されないが、下限としては、通常１０℃以上、中でも１５℃以上、更には２０℃以上が好ましい。前記下限よりも低いと、ＮＡｍ誘導体が析出して所望の単離・精製工程が困難となる場合がある。一方、上限としては、通常５０℃以下、中でも４５℃以下、更には４０℃以下が好ましい。前記上限よりも高いと、ＮＡｍ誘導体が分解してしまう場合がある。但し、各種の単離・精製工程において加熱や冷却を行う場合には、一時的に前記の好適な範囲を外れてもよい。
【０１６８】
単離・精製において再結晶を行う際のｐＨは特に限定されないが、ＮＡｍ誘導体の安定性ならびに結晶化のし易さの観点から、ｐＨを２から５の範囲に調整することが好ましく、ｐＨを２から４の範囲に調整することがより好ましい。ｐＨの調整に際して用いる酸は限定されないが、例えば塩酸、リン酸、酒石酸、リンゴ酸、安息香酸、酢酸、コハク酸、グルコン酸等の酸を用いることができる。中でも塩酸を好適に用いることができる。
【０１６９】
なお、本発明の組換え微生物の細胞内にＮＡｍ誘導体が残存している場合には、ホモジナイゼーション、リゾチーム、超音波処理、凍結融解、フレンチプレス、及び他の化学的、機械的又は物理的細胞破壊方法等の手法で細胞膜を破壊し、ＮＡｍ誘導体を反応液に放出させてから、ＮＡｍ誘導体の単離・精製に供してもよい。
【０１７０】
［VI．その他］
以上、本発明を具体的な実施の形態に即して詳細に説明したが、本発明は上述した実施の形態に束縛されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、任意の形態で実施することが可能である。
【実施例】
【０１７１】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。但し、本発明は以下の実施例にも束縛されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、任意の形態で実施することが可能である。【０１７２】
［Ｉ．測定条件］
・ＮＭＮ定量：
装置：ＬＣＭＳ−２０２０（（株）島津製作所製）
検出器：２５４ｎｍ
カラム：ＴＳＫｇｅｌ Ａｍｉｄｅ−８０、３μｍ、４．６ｍｍ×５０ｍｍ
カラム温度：３０℃
注入量：５μｌ
移動相：
Ａ：０．１％ギ酸水
Ｂ：０．１％ギ酸含有アセトニトリル／メタノール（７５／２５）【０１７３】
〈条件〉
流量：１ｍＬ／分一定
移動相比：０→２分（Ｂ＝９８％一定）、２→６分（Ｂ＝９８→６０％）、６→８分（Ｂ＝６０→４５％）、８→１２分（Ｂ＝４５→６０％）、１２→１５分（Ｂ＝６０→９８％）
測定時間：１５．１分
定量方法：ＮＭＮ標品を水で０ｇ／Ｌ、０．０１ｇ／Ｌ、０．０５ｇ／Ｌ、０．１ｇ／Ｌ、０．２５ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌに調製し、これらの測定によって得られたＮＭＮ面積値から検量線を作成し、各サンプルのＮＭＮ面積値からＮＭＮを定量した。なお、０．０１ｇ／Ｌ未満は定量限界とした。【０１７４】
・菌体濃度（ＯＤ）：
装置：ＵＶｍｉｎｉ−１２４０（（株）島津製作所製）
測定波長：６００ｎｍ
セル：１．５ｍＬディスポセル（材質：ＰＳ）
測定方法：測定値が０．０５から１．０未満の範囲に入るように菌体液を水で希釈する。同様の混合比で希釈した培地１ｍＬをセルに加えて装置にセットしゼロ点補正した後、調製したサンプル液１ｍＬをセルに加えて装置にセットし、ＯＤ６００を測定した。【０１７５】
［II．材料］
・大腸菌：
ＢＬ２１（ＤＥ３）株（ＮＥＢ社製）【０１７６】
・ベクター：
ｐＲＳＦＤｕｅｔ−１（Novagen社製）
ｐＣＤＦＤｕｅｔ−１（Novagen社製）
ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１（Novagen社製）【０１７７】
・合成遺伝子：
キチノファーガ・ピネンシス（Chitinophaga pinensis）由来ＮＡＭＰＴ（ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ：ＮＭＮ合成酵素）
スフィンゴピキシス・ＣＩ株（Sphingopyxis sp. C-1）由来ＮＡＭＰＴ
ホモサピエンス（Homo sapiens）由来ＮＡＭＰＴ
バークホルデリア・セノセパシア（Burkholderia cenocepacia）由来ｎｉａＰ（ナイアシン輸送体）
ストレプトコッカス・ヒューモニア（Streptococcus pneumoniae）ＴＩＧＲ４株由来ｎｉａＸ（ナイアシン輸送体）
バチルス・ミコイデス（Bacillus mycoides）由来ｐｎｕＣ（ニコチンアミノモノヌクレオチド輸送体）
大腸菌（E. Coli）Ｋ１２由来ｐｇｉ（ホスホグルコースイソメラーゼ）
大腸菌（E. Coli）Ｋ１２由来ｚｗｆ（グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ）
大腸菌（E. Coli）Ｋ１２由来ｐｇｌ（６−ホスホグルコノラクトナーゼ）
大腸菌（E. Coli）Ｋ１２由来ｇｎｄ（６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ）
大腸菌（E. Coli）Ｋ１２由来ｒｐｉＡ（リボース−５−リン酸イソメラーゼ）
大腸菌（E. Coli）Ｋ１２由来ｒｐｉＢ（リボース−５−リン酸イソメラーゼ）
大腸菌（E. Coli）Ｋ１２由来ｐｒｓ（ホスホリボシルピロリン酸シンターゼ）【０１７８】
なお、配列番号３９は、ホモサピエンス（Homo sapiens）由来ＮＡＭＰＴのアミノ酸配列であり、配列番号３７は、配列番号３９のＮＡＭＰＴをコードする天然遺伝子の塩基配列である。なお、当該天然遺伝子の塩基配列を基に、宿主微生物での発現及び作用を改善するように発明者等が最適化を施して作製した、配列番号３９のＮＡＭＰＴをコードする塩基配列を、配列番号３８に併せて示す。【０１７９】
・培地成分、基質成分：
Ｄ−グルコース（ナカライテスク（株）製）
ニコチンアミド（東京化成工業（株）製）
ＰＢＳ（（株）ニッポンジーン製）
リン酸バッファー：リン酸二水素カリウム（ナカライテスク（株）製）１Ｍとリン酸水素二カリウム（ナカライテスク（株）製）１Ｍを調製し、ｐＨ６．２となるように混合し、オートクレーブ滅菌して調製した。
ＬＢ培地：塩化ナトリウム（ナカライテスク（株）製）１０ｇ／Ｌ、トリプトン（ナカライテスク（株）製）１０ｇ／Ｌ、乾燥酵母エキス（ナカライテスク（株）製）５ｇ／Ｌとなるように混合し、オートクレーブ滅菌して調製した。
Ｍ９培地：リン酸水素二ナトリウム（ナカライテスク（株）製）４８ｍＭ、リン酸二水素カリウム（ナカライテスク（株）製）２２ｍＭ、塩化アンモニウム（ナカライテスク（株）製）１９ｍＭ、塩化ナトリウム（ナカライテスク（株）製）８．６ｍＭとなるように混合し、オートクレーブ滅菌して調製した。【０１８０】
［III．ベクターの構築］
・ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰの構築：
大腸菌（E. Coli）で発現させるためにコドンを最適化したキチノファーガ・ピネンシス（Chitinophaga pinensis）由来ＮＡＭＰＴの合成遺伝子（配列番号５）を、制限酵素ＮｃｏＩとＥｃｏＲＩとで消化処理したｐＲＳＦＤｕｅｔ−１に連結可能な相同域をそれぞれ含む下記プライマー対を用いてＰＣＲにより増幅した。これを、制限酵素ＮｃｏＩとＥｃｏＲＩにより消化処理したｐＲＳＦＤｕｅｔ−１と、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング法を用いて連結してｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰを得た。【０１８１】
（ＮＡＭＰＴ ＣＰ用プライマー対）
・フォワード（配列番号４０）：
ＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＡＡＧＡＡＡＡＣＣＴＧＡＴＴＣＴＧＣＴＧＧＣＡＧＡＴＧＣＡ
・リバース（配列番号４１）：
ＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＴＴＡＧＡＴＧＧＴＴＧＣＧＴＴＴＴＴＡＣＧＧＡＴＣＴＧＣＴＣＡＡＡ【０１８２】
・ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＳＳＣの構築
大腸菌（E. Coli）で発現させるためにコドンを最適化したスフィンゴピキシス・ＣＩ株（Sphingopyxis sp. C-1）由来ＮＡＭＰＴの合成遺伝子（配列番号２）を、制限酵素ＮｃｏＩとＥｃｏＲＩとで消化処理したｐＲＳＦＤｕｅｔ−１に連結可能な相同域をそれぞれ含む下記プライマー対を用いてＰＣＲにより増幅した。これを、制限酵素ＮｃｏＩとＥｃｏＲＩにより消化処理したｐＲＳＦＤｕｅｔ−１と、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング法を用いて連結してｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＳＳＣを得た。【０１８３】
（ＮＡＭＰＴ ＳＳＣ用プライマー対）
・フォワード（配列番号４２）：
ＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＡＡＧＡＡＴＣＴＧＡＴＴＣＴＧＧＣＣＡＣＣＧＡＴＡＧＣＴＡＴＡＡＡ
・リバース（配列番号４３）：
ＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＴＴＡＡＣＧＡＣＣＴＴＣＧＣＴＡＣＧＴＴＴＡＣＧＡＡＣＴＧＣＡＴＣ【０１８４】
・ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＨＳの構築
大腸菌（E. Coli）で発現させるためにコドンを最適化したホモサピエンス（Homo sapiens）由来ＮＡＭＰＴの合成遺伝子（配列番号３８）を、制限酵素ＮｃｏＩとＥｃｏＲＩとで消化処理したｐＲＳＦＤｕｅｔ−１に連結可能な相同域をそれぞれ含む下記プライマー対を用いてＰＣＲにより増幅した。これを、制限酵素ＮｃｏＩとＥｃｏＲＩにより消化処理したｐＲＳＦＤｕｅｔ−１と、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング法を用いて連結してｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＨＳを得た。【０１８５】
（ＮＡＭＰＴ ＨＳ用プライマー対）
・フォワード（配列番号４４）：
ＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＡＡＴＣＣＧＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＧＡＡＴＴＴＡＡＣＡＴＴＣＴＧ
・リバース（配列番号４５）：
ＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＴＴＡＡＴＧＡＴＧＴＧＣＴＧＣＴＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＴＧＴＴＣＡＧ【０１８６】
・ｐＣＤＦ−ｐｒｓ→ｐｇｉの構築：
大腸菌（E. Coli）で発現させるためにコドンを最適化した大腸菌（E. Coli）Ｋ１２由来のｐｇｉ、ｚｗｆ、ｐｇｌ、ｇｎｄ、ｒｐｉＡ、ｒｐｉＢ、及びｐｒｓの各合成遺伝子（配列番号１７、２０、２３、２６、２９、３２、３５）を、それぞれ連結可能な相同域ならびにｐｒｓ以外はｐＣＤＦＤｕｅｔ−１と同じＲＢＳ領域を含む下記プライマー対を用いてＰＣＲにより増幅した。最初に、ｐｒｓ、ｒｐｉＢ、ｒｐｉＡ、及びｇｎｄの断片を、制限酵素ＮｃｏＩとＳａｃＩにより消化処理したｐＣＤＦＤｕｅｔ−１と、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙシステムを用いて連結した。次に、得られたベクターを制限酵素ＳａｃＩにより消化処理し、ｐｇｌ、ｚｗｆ、及びｐｇｉの断片を、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙシステムを用いて連結し、ｐＣＤＦ−ｐｒｓ→ｐｇｉを得た。【０１８７】
（ｐｇｉ用プライマー対）
・フォワード（配列番号４６）：
ＣＧＴＧＡＴＧＧＴＣＧＴＡＧＣＴＧＧＡＡＴＧＡＡＴＴＴＧＡＡＴＡＡＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＡＡＧＡＡＣＡＴＴＡＡＴＣＣＧＡＣＡＣＡＧ
・リバース（配列番号４７）：
ＡＣＴＴＡＡＧＣＡＴＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＣＴＴＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＧＣＧＣＣＧＴＴＡＡＣＣＡＣＧＣＣＡＧＧＣＴＴＴＡＴＡＡＣ【０１８８】
（ｚｗｆ用プライマー対）
・フォワード（配列番号４８）：
ＧＴＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＴＧＴＧＧＧＴＴＧＴＴＧＴＴＡＡＴＧＣＡＣＡＴＴＡＡＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＧＣＡＧＴＴＡＣＣＣＡＧＡＣＣＧ
・リバース（配列番号４９）：
ＴＴＡＴＴＣＡＡＡＴＴＣＡＴＴＣＣＡＧＣＴＡＣＧ【０１８９】
（ｐｇｌ用プライマー対）
・フォワード（配列番号５０）：
ＡＧＡＡＧＧＴＧＴＧＴＴＴＣＡＴＡＣＡＧＡＡＴＧＧＣＴＧＧＡＣＴＡＡＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＡＡＡＣＡＧＡＣＣＧＴＧＴＡＴＡＴＴＧＣ
・リバース（配列番号５１）：
ＴＴＡＡＴＧＴＧＣＡＴＴＡＡＣＡＡＣＡＡＣＣＣ【０１９０】
（ｇｎｄ用プライマー対）
・フォワード（配列番号５２）：
ＴＧＧＴＡＣＡＣＣＧＧＡＴＧＧＴＧＴＴＡＡＡＡＣＣＡＴＴＧＴＧＡＡＡＴＡＡＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＡＧＣＡＡＡＣＡＧＣＡＧＡＴＴＧＧ
・リバース（配列番号５３）：
ＣＡＴＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＣＴＴＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＧＣＧＣＣＧＡＧＣＴＣＴＴＡＧＴＣＣＡＧＣＣＡＴＴＣＴＧＴＡＴＧＡＡＡＣ【０１９１】
（ｒｐｉＡ用プライマー対）
・フォワード（配列番号５４）：
ＣＡＡＴＴＡＣＣＧＣＡＡＴＴＧＡＡＣＡＧＣＧＴＣＧＣＡＡＴＴＡＡＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＡＣＣＣＡＧＧＡＴＧＡＡＣＴＧＡＡＡＡＡＡＧ
・リバース（配列番号５５）：
ＴＴＡＴＴＴＣＡＣＡＡＴＧＧＴＴＴＴＡＡＣＡＣＣＡＴＣ【０１９２】
（ｒｐｉＢ用プライマー対）
・フォワード（配列番号５６）：
ＡＡＴＧＡＡＧＡＡＡＧＣＡＴＴＡＧＣＧＣＣＡＴＧＴＴＴＧＡＡＣＡＴＴＡＡＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＴＣＧＣＣＴＴＴＧＧＣ
・リバース（配列番号５７）：
ＴＴＡＡＴＴＧＣＧＡＣＧＣＴＧＴＴＣ【０１９３】
（ｐｒｓ用プライマー対）
・フォワード（配列番号５８）：
ＡＴＴＣＣＣＣＴＧＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＴＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＧＴＧＣＣＧＧＡＴＡＴＧＡＡＡＣＴＧＴＴＴＧ
・リバース（配列番号５９）：
ＴＴＡＡＴＧＴＴＣＡＡＡＣＡＴＧＧＣＧＣ【０１９４】
・ｐＣＤＦ−ｐｇｉ→ｐｒｓの構築：
大腸菌（E. Coli）で発現させるためにコドンを最適化した大腸菌（E. Coli）Ｋ１２由来ｐｇｉ、ｚｗｆ、ｐｇｌ、ｇｎｄ、ｒｐｉＡ、ｒｐｉＢ、及びｐｒｓの合成遺伝子（配列番号１７、２０、２３、２６、２９、３２、３５）を、それぞれ連結可能な相同域ならびにｐｇｉ以外はｐＣＤＦＤｕｅｔ−１と同じＲＢＳ領域を含む下記プライマー対を用いてＰＣＲにより増幅した。最初に、ｐｇｉ、ｚｗｆ、ｐｇｌ、及びｇｎｄの断片を、制限酵素ＮｃｏＩとＳａｃＩにより消化処理したｐＣＤＦＤｕｅｔ−１と、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙシステムを用いて連結した。次に、得られたベクターを制限酵素ＳａｃＩにより消化処理し、ｒｐｉＡ、ｒｐｉＢ、及びｐｒｓの断片を、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙシステムを用いて連結し、ｐＣＤＦ−ｐｇｉ→ｐｒｓを得た。【０１９５】
（ｐｇｉ用プライマー対）
・フォワード（配列番号６０）：
ＴＣＣＣＣＴＧＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＴＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＡＡＧＡＡＣＡＴＴＡＡＴＣＣＧＡＣＡＣＡＧ
・リバース（配列番号６１）：
ＴＴＡＡＣＣＡＣＧＣＣＡＧＧＣＴＴＴＡＴＡＡＣ【０１９６】
（ｚｗｆ用プライマー対）
・フォワード（配列番号６２）：
ＡＴＧＧＴＣＴＧＡＴＴＡＡＴＣＧＴＴＡＴＡＡＡＧＣＣＴＧＧＣＧＴＧＧＴＴＡＡＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＧＣＡＧＴＴＡＣＣＣＡＧＡＣＣＧ
・リバース（配列番号６３）：
ＴＴＡＴＴＣＡＡＡＴＴＣＡＴＴＣＣＡＧＣＴＡＣＧ【０１９７】
（ｐｇｌ用プライマー対）
・フォワード（配列番号６４）：
ＣＣＧＴＧＡＴＧＧＴＣＧＴＡＧＣＴＧＧＡＡＴＧＡＡＴＴＴＧＡＡＴＡＡＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＡＡＡＣＡＧＡＣＣＧＴＧＴＡＴＡＴＴＧＣ
・リバース（配列番号６５）：
ＴＴＡＡＴＧＴＧＣＡＴＴＡＡＣＡＡＣＡＡＣＣＣ【０１９８】
（ｇｎｄ用プライマー対）
・フォワード（配列番号６６）：
ＴＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＴＧＴＧＧＧＴＴＧＴＴＧＴＴＡＡＴＧＣＡＣＡＴＴＡＡＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＡＧＣＡＡＡＣＡＧＣＡＧＡＴＴＧＧ
・リバース（配列番号６７）：
ＣＡＴＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＣＴＴＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＧＣＧＣＣＧＡＧＣＴＣＴＴＡＧＴＣＣＡＧＣＣＡＴＴＣＴＧＴＡＴＧＡＡＡＣ【０１９９】
（ｒｐｉＡ用プライマー対）
・フォワード（配列番号６８）：
ＡＡＧＧＴＧＴＧＴＴＴＣＡＴＡＣＡＧＡＡＴＧＧＣＴＧＧＡＣＴＡＡＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＡＣＣＣＡＧＧＡＴＧＡＡＣＴＧＡＡＡＡＡＡＧ
・リバース（配列番号６９）：
ＴＴＡＴＴＴＣＡＣＡＡＴＧＧＴＴＴＴＡＡＣＡＣＣＡＴＣ【０２００】
（ｒｐｉＢ用プライマー対）
・フォワード（配列番号７０）：
ＧＧＴＡＣＡＣＣＧＧＡＴＧＧＴＧＴＴＡＡＡＡＣＣＡＴＴＧＴＧＡＡＡＴＡＡＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＴＣＧＣＣＴＴＴＧＧＣ
・リバース（配列番号７１）：
ＴＴＡＡＴＴＧＣＧＡＣＧＣＴＧＴＴＣ【０２０１】
（ｐｒｓ用プライマー対）
・フォワード（配列番号７２）：
ＡＡＧＣＡＡＴＴＡＣＣＧＣＡＡＴＴＧＡＡＣＡＧＣＧＴＣＧＣＡＡＴＴＡＡＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＧＴＧＣＣＧＧＡＴＡＴＧＡＡＡＣＴＧＴＴＴＧ
・リバース（配列番号７３）：
ＴＣＧＡＣＴＴＡＡＧＣＡＴＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＣＴＴＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＧＣＧＣＣＧＴＴＡＡＴＧＴＴＣＡＡＡＣＡＴＧＧＣＧＣ【０２０２】
・ｐＡＣＹＣ−ｐｇｉ→ｐｒｓの構築：
大腸菌（E. Coli）で発現させるためにコドンを最適化した大腸菌（E. Coli）Ｋ１２由来ｐｇｉ、ｚｗｆ、ｐｇｌ、ｇｎｄ、ｒｐｉＡ、ｒｐｉＢ、及びｐｒｓの合成遺伝子（配列番号１７、２０、２３、２６、２９、３２、３５）を、それぞれ連結可能な相同域ならびにｐｇｉ以外はｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１と同じＲＢＳ領域を含む下記プライマー対を用いてＰＣＲにより増幅した。最初に、ｐｇｉ、ｚｗｆ、ｐｇｌ、及びｇｎｄの断片を、制限酵素ＮｃｏＩとＳａｃＩにより消化処理したｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１と、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙシステムを用いて連結した。次に、得られたベクターを制限酵素ＳａｃＩにより消化処理し、ｒｐｉＡ、ｒｐｉＢ、及びｐｒｓの断片を、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙシステムを用いて連結し、ｐＡＣＹＣ−ｐｇｉ→ｐｒｓを得た。【０２０３】
（ｐｇｉ用プライマー対）
・フォワード（配列番号６０：前出）
・リバース（配列番号６１：前出）【０２０４】
（ｚｗｆ用プライマー対）
・フォワード（配列番号６２：前出）
・リバース（配列番号６３：前出）【０２０５】
（ｐｇｌ用プライマー対）
・フォワード（配列番号６４：前出）
・リバース（配列番号６５：前出）【０２０６】
（ｇｎｄ用プライマー対）
・フォワード（配列番号６６：前出）
・リバース（配列番号６７：前出）【０２０７】
（ｒｐｉＡ用プライマー対）
・フォワード（配列番号６８：前出）
・リバース（配列番号６９：前出）【０２０８】
（ｒｐｉＢ用プライマー対）
・フォワード（配列番号７０：前出）
・リバース（配列番号７１：前出）【０２０９】
（ｐｒｓ用プライマー対）
・フォワード（配列番号７２：前出）
・リバース（配列番号７３：前出）【０２１０】
・ｐＡＣＹＣ−ｐｒｓ→ｐｇｉの構築：
大腸菌（E. Coli）で発現させるためにコドンを最適化した大腸菌（E. Coli）Ｋ１２由来のｐｇｉ、ｚｗｆ、ｐｇｌ、ｇｎｄ、ｒｐｉＡ、ｒｐｉＢ、及びｐｒｓの各合成遺伝子（配列番号１７、２０、２３、２６、２９、３２、３５）を、それぞれ連結可能な相同域ならびにｐｒｓ以外はｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１と同じＲＢＳ領域を含む下記プライマー対を用いてＰＣＲにより増幅した。最初に、ｐｒｓ、ｒｐｉＢ、ｒｐｉＡ、及びｇｎｄの断片を、制限酵素ＮｃｏＩとＳａｃＩにより消化処理したｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１と、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙシステムを用いて連結した。次に、得られたベクターを制限酵素ＳａｃＩにより消化処理し、ｐｇｌ、ｚｗｆ、及びｐｇｉの断片を、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙシステムを用いて連結し、ｐＡＣＹＣ−ｐｒｓ→ｐｇｉを得た。【０２１１】
（ｐｇｉ用プライマー対）
・フォワード（配列番号４６：前出）
・リバース（配列番号４７：前出）【０２１２】
（ｚｗｆ用プライマー対）
・フォワード（配列番号４８：前出）
・リバース（配列番号４９：前出）【０２１３】
（ｐｇｌ用プライマー対）
・フォワード（配列番号５０：前出）
・リバース（配列番号５１：前出）【０２１４】
（ｇｎｄ用プライマー対）
・フォワード（配列番号５２：前出）
・リバース（配列番号５３：前出）【０２１５】
（ｒｐｉＡ用プライマー対）
・フォワード（配列番号５４：前出）
・リバース（配列番号５５：前出）【０２１６】
（ｒｐｉＢ用プライマー対）
・フォワード（配列番号５６：前出）
・リバース（配列番号５７：前出）【０２１７】
（ｐｒｓ用プライマー対）
・フォワード（配列番号５８：前出）
・リバース（配列番号５９：前出）【０２１８】
・ｐＡＣＹＣ−ｎｉａＰ ＢＣの構築：
大腸菌（E. Coli）で発現させるためにコドンを最適化したバークホルデリア・セノセパシア（Burkholderia cenocepacia）由来ｎｉａＰの合成遺伝子（配列番号８）を、制限酵素ＮｃｏＩとＥｃｏＲＩとで消化処理したｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１に連結可能な相同域をそれぞれ含む下記プライマー対を用いてＰＣＲにより増幅した。これを、制限酵素ＮｃｏＩとＥｃｏＲＩにより消化処理したｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１と、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング法を用いて連結してｐＡＣＹＣ−ｎｉａＰ ＢＣを得た。【０２１９】
（ｎｉａＰ ＢＣ用プライマー対）
・フォワード（配列番号７４）：
ＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＣＡＡＣＣＧＣＡＣＣ
・リバース（配列番号７５）：
ＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＴＴＡＧＣＴＴＧＣＴＴＴＡＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＴＧＣＣＧＧＡＴＡＡＣ【０２２０】
・ｐＡＣＹＣ−ｎｉａＸ ＳＰＴの構築：
大腸菌（E. Coli）で発現させるためにコドンを最適化したストレプトコッカス・ヒューモニア（Streptococcus pneumoniae）ＴＩＧＲ４株由来ｎｉａＸの合成遺伝子（配列番号１１）を、制限酵素ＮｃｏＩとＥｃｏＲＩとで消化処理したｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１に連結可能な相同域をそれぞれ含む下記プライマー対を用いてＰＣＲにより増幅した。これを、制限酵素ＮｃｏＩとＥｃｏＲＩにより消化処理したｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１と、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング法を用いて連結してｐＡＣＹＣ−ｎｉａＸ ＳＰＴを得た。【０２２１】
（ｎｉａＸ ＳＰＴ用プライマー対）
・フォワード（配列番号７６）：
ＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＴＴＧＡＧＣＧＧＴＣＴＧＣＴＧＴＡＴＣＡＣＡＣＣＡＧＣＧＴＴＴＡＴＧＣＡＧ
・リバース（配列番号７７）：
ＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＴＴＡＧＣＧＡＣＧＴＴＴＡＣＧＣＡＧＡＡＣＴＴＴＡＴＡＡＡＣＴＧＣＣ【０２２２】
・ｐＡＣＹＣ−ｐｎｕＣ ＢＭの構築：
大腸菌（E. Coli）で発現させるためにコドンを最適化したバチルス・ミコイデス（Bacillus mycoides）由来ｐｎｕＣの合成遺伝子（配列番号１４）を、制限酵素ＮｃｏＩとＥｃｏＲＩとで消化処理したｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１に連結可能な相同域をそれぞれ含む下記プライマー対を用いてＰＣＲにより増幅した。これを、制限酵素ＮｃｏＩとＥｃｏＲＩにより消化処理したｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１と、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング法を用いて連結してｐＡＣＹＣ−ｐｎｕＣ ＢＭを得た。【０２２３】
（ｐｎｕＣ ＢＭ用プライマー対）
・フォワード（配列番号７８）：
ＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＧＴＴＣＧＴＡＧＴＣＣＧＣＴＧＴＴＴＣＴＧＣＴＧＡＴＴＡＧＣＡＧＣ
・リバース（配列番号７９）：
ＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＴＴＡＧＡＴＧＴＡＧＴＴＧＴＴＣＡＣＧＣＧＴＴＣＡＣＧＴＴＣＴＴＴＡＴＧ【０２２４】
・ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ＋ｐｎｕＣ ＢＭの構築：
大腸菌（E. Coli）で発現させるためにコドンを最適化したバチルス・ミコイデス（Bacillus mycoides）由来ｐｎｕＣの合成遺伝子（配列番号１４）を、制限酵素ＢｇｌＩＩとＡｖｒＩＩとで消化処理したｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰに連結可能な相同域をそれぞれ含む下記プライマー対を用いてＰＣＲにより増幅した。これを、制限酵素ＢｇｌＩＩとＡｖｒＩＩにより消化処理したｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰと、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング法を用いて連結してｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ＋ｐｎｕＣ ＢＭを得た。【０２２５】
（ｐｎｕＣ ＢＭ用プライマー対ｐａｒｔ２）
・フォワード（配列番号８０）：
ＴＡＴＴＡＧＴＴＡＡＧＴＡＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＡＴＧＧＴＴＣＧＴＡＧＴＣＣＧＣＴＧＴＴＴＣＴＧＣＴＧＡＴＴＡＧＣＡＧＣ
・リバース（配列番号８１）：
ＡＴＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧＣＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＴＴＡＧＡＴＧＴＡＧＴＴＧＴＴＣＡＣＧＣＧＴＴＣＡＣＧＴＴＣＴＴＴＡＴＧ【０２２６】
・ｐＣＤＦ−ｐｇｉ→ｐｒｓ＋ｎｉＰ ＢＣの構築：
大腸菌（E. Coli）で発現させるためにコドンを最適化したバークホルデリア・セノセパシア（Burkholderia cenocepacia）由来ｎｉａＰの合成遺伝子（配列番号８）を、制限酵素ＢｇｌＩＩとＡｖｒＩＩとで消化処理したｐＣＤＦ−ｐｇｉ→ｐｒｓに連結可能な相同域をそれぞれ含む下記プライマー対を用いてＰＣＲにより増幅した。これを、制限酵素ＢｇｌＩＩとＡｖｒＩＩにより消化処理したｐＣＤＦ−ｐｇｉ→ｐｒｓと、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング法を用いて連結して、ｐＣＤＦ−ｐｇｉ→ｐｒｓ＋ｎｉＰ ＢＣを得た。【０２２７】
（ｎｉａＰ ＢＣ用プライマー対ｐａｒｔ２）
・フォワード（配列番号８２）：
ＴＡＴＴＡＧＴＴＡＡＧＴＡＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＣＡＡＣＣＧＣＡＣＣ
・リバース（配列番号８３）：
ＡＴＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧＣＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＴＴＡＧＣＴＴＧＣＴＴＴＡＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＴＧＣＣＧＧＡＴＡＡＣ【０２２８】
・ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＨＳ＋ｐｎｕＣ ＢＭの構築：
大腸菌（E. Coli）で発現させるためにコドンを最適化したバチルス・ミコイデス（Bacillus mycoides）由来ｐｎｕＣの合成遺伝子（配列番号１４）を、制限酵素ＢｇｌＩＩとＡｖｒＩＩとで消化処理したｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＨＳに連結可能な相同域をそれぞれ含む下記プライマー対を用いてＰＣＲにより増幅した。これを、制限酵素ＢｇｌＩＩとＡｖｒＩＩにより消化処理したｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＨＳと、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング法を用いて連結してｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＨＳ＋ｐｎｕＣ ＢＭを得た。【０２２９】
（ｐｎｕＣ ＢＭ用プライマー対ｐａｒｔ２）
・フォワード（配列番号８０：前出）
・リバース（配列番号８１：前出）【０２３０】
［IV．生産株の構築］
・ＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ株（実施例１）の作製：
ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰを、ヒートショック法によりＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、ＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ株を得た。【０２３１】
・ＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＳＳＣ株の作製：
ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＳＳＣを、ヒートショック法によりＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、ＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＳＳＣ株を得た。【０２３２】
・ＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ／ｐＣＤＦ−ｐｒｓ→ｐｇｉ株（実施例２、７）の作製：
ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰとｐＣＤＦ−ｐｒｓ→ｐｇｉを、ヒートショック法によりＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、ＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ／ｐＣＤＦ−ｐｒｓ→ｐｇｉ株を得た。【０２３３】
・ＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ／ｐＣＤＦ−ｐｒｓ→ｐｇｉ／ｐＡＣＹＣ−ｐｇｉ→ｐｒｓ株（実施例３）の作製：
ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ及びｐＣＤＦ−ｐｒｓ→ｐｇｉとｐＡＣＹＣ−ｐｇｉ→ｐｒｓを、ヒートショック法によりＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、ＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ／ｐＣＤＦ−ｐｒｓ→ｐｇｉ／ｐＡＣＹＣ−ｐｇｉ→ｐｒｓ株を得た。【０２３４】
・ＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ／ｐＣＤＦ−ｐｒｓ→ｐｇｉ／ｐＡＣＹＣ−ｎｉａＰ ＢＣ株（実施例４、８）の作製：
ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ及びｐＣＤＦ−ｐｒｓ→ｐｇｉとｐＡＣＹＣ−ｎｉａＰ ＢＣを、ヒートショック法によりＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、ＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ／ｐＣＤＦ−ｐｒｓ→ｐｇｉ／ｐＡＣＹＣ−ｎｉａＰ ＢＣ株を得た。【０２３５】
・ＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ／ｐＣＤＦ−ｐｒｓ→ｐｇｉ／ｐＡＣＹＣ−ｎｉａＸ ＳＰＴ株（実施例５、９）の作製：
ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ及びｐＣＤＦ−ｐｒｓ→ｐｇｉとｐＡＣＹＣ−ｎｉａＸ ＳＰＴを、ヒートショック法によりＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、ＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ／ｐＣＤＦ−ｐｒｓ→ｐｇｉ／ｐＡＣＹＣ−ｎｉａＸ ＳＰＴ株を得た。【０２３６】
・ＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ／ｐＣＤＦ−ｐｒｓ→ｐｇｉ／ｐＡＣＹＣ−ｐｎｕＣ ＢＭ株（実施例６、１０）の作製：
ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ及びｐＣＤＦ−ｐｒｓ→ｐｇｉとｐＡＣＹＣ−ｐｎｕＣ ＢＭを、ヒートショック法によりＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、ＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ／ｐＣＤＦ−ｐｒｓ→ｐｇｉ／ｐＡＣＹＣ−ｐｎｕＣ ＢＭ株を得た。【０２３７】
・ＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ＋ｐｎｕＣ ＢＭ／ｐＣＤＦ−ｐｇｉ→ｐｒｓ＋ｎｉａＰ ＢＣ／ｐＡＣＹＣ−ｐｒｓ→ｐｇｉ株（実施例１１）の作製：
ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ＋ｐｎｕＣ ＢＭ及びｐＣＤＦ−ｐｇｉ→ｐｒｓ＋ｎｉａＰ ＢＣとｐＡＣＹＣ−ｐｒｓ→ｐｇｉを、ヒートショック法によりＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、ＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ＋ｐｎｕＣ ＢＭ／ｐＣＤＦ−ｐｇｉ→ｐｒｓ＋ｎｉａＰ ＢＣ／ｐＡＣＹＣ−ｐｒｓ→ｐｇｉ株を得た。【０２３８】
・ＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＨＳ株（比較例２）の作製：
ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＨＳを、ヒートショック法によりＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、ＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＨＳ株を得た。【０２３９】
・ＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＨＳ＋ｐｎｕＣ ＢＭ／ｐＣＤＦ−ｐｇｉ→ｐｒｓ＋ｎｉａＰ ＢＣ／ｐＡＣＹＣ−ｐｒｓ→ｐｇｉ株（比較例３）の作製：
ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＨＳ＋ｐｎｕＣ ＢＭ及びｐＣＤＦ−ｐｇｉ→ｐｒｓ＋ｎｉａＰ ＢＣとｐＡＣＹＣ−ｐｒｓ→ｐｇｉを、ヒートショック法によりＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、ＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＨＳ＋ｐｎｕＣ ＢＭ／ｐＣＤＦ−ｐｇｉ→ｐｒｓ＋ｎｉａＰ ＢＣ／ｐＡＣＹＣ−ｐｒｓ→ｐｇｉ株を得た。【０２４０】
［Ｖ−１．ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）生産１］
・実施例１（ＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ株を用いたＮＭＮ生産）：
ＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ株を、５ｍＬのＬＢ培地が入った試験管に植菌し、３７℃、２００ｒｐｍで１２時間培養した。培養液を２００ｍＬのＬＢ培地が入った５００ｍＬ三角フラスコにＯＤ６００が０．０３となるように加え、３７℃、２００ｒｐｍで培養し、ＯＤ６００が０．４となった時点で、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ナカライテスク（株）製）を終濃度０．１ｍＭとなるように添加し、２５℃、２００ｒｐｍで１６時間培養した。その後、培養液を５０ｍＬコニカル管に移し、３０００ｇで５分間遠心分離し、菌体を回収した。さらに、１×ＰＢＳを加えて洗浄を行い、３０００ｇで５分間遠心分離し、菌体を回収した。この操作を２回実施した。回収した菌体をＯＤ６００が１０となるようにＬＢ培地で懸濁し、１００ｍＬ三角フラスコに１０ｍＬとなるように加え、そこにニコチンアミドを１ｇ／Ｌ、Ｄ−グルコースを０．４ｇ／Ｌ、リン酸バッファー（ｐＨ６．２）を０．００５ｍｏｌ／Ｌとなるように仕込み、３０℃、２００ｒｐｍで反応した。２時間後に反応液を採取し、−３０℃で凍結した後に溶解させ、１２０００ｒｐｍで３分間遠心分離して上清を回収した。この回収した液体をＨＰＬＣにて分析したところ、ＮＭＮ量は０．０３ｇ／Ｌであった。【０２４１】
・実施例２（ＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ／ｐＣＤＦ−ｐｒｓ→ｐｇｉ株を用いたＮＭＮ生産）：
ＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ株をＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ／ｐＣＤＦ−ｐｒｓ→ｐｇｉ株に変更した以外は実施例１と同様に反応を行い、回収した液体をＨＰＬＣにて分析したところ、ＮＭＮ量は０．１８ｇ／Ｌであった。【０２４２】
・実施例３（ＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ／ｐＣＤＦ−ｐｒｓ→ｐｇｉ／ｐＡＣＹＣ−ｐｇｉ→ｐｒｓ株を用いたＮＭＮ生産）：
ＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ株をＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ／ｐＣＤＦ−ｐｒｓ→ｐｇｉ／ｐＡＣＹＣ−ｐｇｉ→ｐｒｓ株に変更した以外は実施例１と同様に反応を行い、回収した液体をＨＰＬＣにて分析したところ、ＮＭＮ量は０．２２ｇ／Ｌであった。【０２４３】
・実施例４（ＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ／ｐＣＤＦ−ｐｒｓ→ｐｇｉ／ｐＡＣＹＣ−ｎｉａＰ ＢＣ株を用いたＮＭＮ生産）：
ＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ株をＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ／ｐＣＤＦ−ｐｒｓ→ｐｇｉ／ｐＡＣＹＣ−ｎｉａＰ ＢＣ株に変更した以外は実施例１と同様に反応を行い、回収した液体をＨＰＬＣにて分析したところ、ＮＭＮ量は０．２１ｇ／Ｌであった。【０２４４】
・実施例５（ＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ／ｐＣＤＦ−ｐｒｓ→ｐｇｉ／ｐＡＣＹＣ−ｎｉａＸ ＳＰＴ株を用いたＮＭＮ生産）：
ＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ株をＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ／ｐＣＤＦ−ｐｒｓ→ｐｇｉ／ｐＡＣＹＣ−ｎｉａＸ ＳＰＴ株に変更した以外は実施例１と同様に反応を行い、回収した液体をＨＰＬＣにて分析したところ、ＮＭＮ量は０．２３ｇ／Ｌであった。【０２４５】
・実施例６（ＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ／ｐＣＤＦ−ｐｒｓ→ｐｇｉ／ｐＡＣＹＣ−ｐｎｕＣ ＢＭ株を用いたＮＭＮ生産）：
ＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ株をＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ／ｐＣＤＦ−ｐｒｓ→ｐｇｉ／ｐＡＣＹＣ−ｐｎｕＣ ＢＭ株に変更した以外は実施例１と同様に反応を行い、回収した液体をＨＰＬＣにて分析したところ、ＮＭＮ量は０．３６ｇ／Ｌであった。【０２４６】
・実施例７（ＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ／ｐＣＤＦ−ｐｒｓ→ｐｇｉ株を用いたＮＭＮ生産）：
ニコチンアミドを１ｇ／Ｌから２ｇ／Ｌ、Ｄ−グルコースを０．４ｇ／Ｌから１．０ｇ／Ｌ、リン酸バッファー（ｐＨ６．２）を０．００５ｍｏｌ／Ｌから０．０１ｍｏｌ／Ｌに変更した以外は実施例２と同様に反応を行い、回収した液体をＨＰＬＣにて分析したところ、ＮＭＮ量は０．２０ｇ／Ｌであった。【０２４７】
・実施例８（ＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ／ｐＣＤＦ−ｐｒｓ→ｐｇｉ／ｐＡＣＹＣ−ｎｉａＰ ＢＣ株を用いたＮＭＮ生産）：
ＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ／ｐＣＤＦ−ｐｒｓ→ｐｇｉ株をＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ／ｐＣＤＦ−ｐｒｓ→ｐｇｉ／ｐＡＣＹＣ−ｎｉａＰ ＢＣ株に変更した以外は実施例７と同様に反応を行い、回収した液体をＨＰＬＣにて分析したところ、ＮＭＮ量は０．３１ｇ／Ｌであった。【０２４８】
・実施例９（ＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ／ｐＣＤＦ−ｐｒｓ→ｐｇｉ／ｐＡＣＹＣ−ｎｉａＸ ＳＰＴ株を用いたＮＭＮ生産）：
ＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ／ｐＣＤＦ−ｐｒｓ→ｐｇｉ株をＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ／ｐＣＤＦ−ｐｒｓ→ｐｇｉ／ｐＡＣＹＣ−ｎｉａＸ ＳＰＴ株株に変更した以外は実施例７と同様に反応を行い、回収した液体をＨＰＬＣにて分析したところ、ＮＭＮ量は０．３３ｇ／Ｌであった。【０２４９】
・実施例１０（ＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ／ｐＣＤＦ−ｐｒｓ→ｐｇｉ／ｐＡＣＹＣ−ｐｎｕＣ ＢＭ株を用いたＮＭＮ生産）：
回収した菌体をＯＤ６００が１０となるようにＬＢ培地の代わりにＭ９培地で懸濁した以外は実施例６と同様に反応を行い、回収した液体をＨＰＬＣにて分析したところ、ＮＭＮ量は０．１２ｇ／Ｌであった。【０２５０】
・比較例１（ＢＬ２１（ＤＥ３）株を用いたＮＭＮ生産）：
ＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ株をＢＬ２１（ＤＥ３）株に変更した以外は実施例１と同様に反応を行い、回収した液体をＨＰＬＣにて分析したところ、ＮＭＮ量は定量限界以下であった。【０２５１】
・比較例２（ＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＨＳ株を用いたＮＭＮ生産）：
ＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ株をＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＨＳ株に変更した以外は実施例１と同様に反応を行い、回収した液体をＨＰＬＣにて分析したところ、ＮＭＮ量は定量限界以下であった。【０２５２】
［Ｖ−２．ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）生産２］
・実施例１１（ＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ＋ｐｎｕＣ ＢＭ／ｐＣＤＦ−ｐｇｉ→ｐｒｓ＋ｎｉａＰ ＢＣ／ｐＡＣＹＣ−ｐｒｓ→ｐｇｉ株を用いたＮＭＮ生産）：
ＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ株をＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ＋ｐｎｕＣ ＢＭ／ｐＣＤＦ−ｐｇｉ→ｐｒｓ＋ｎｉａＰ ＢＣ／ｐＡＣＹＣ−ｐｒｓ→ｐｇｉ株に変更した以外は実施例１と同様に菌体を回収した。回収した菌体をＯＤ６００が４０となるようにＭ９培地で懸濁し、１００ｍＬ三角フラスコに１０ｍＬとなるように加え、そこにニコチンアミドを７ｇ／Ｌ、Ｄ−グルコースを２１ｇ／Ｌ、リン酸バッファー（ｐＨ６．２）を０．０５ｍｏｌ／Ｌとなるように仕込み、３０℃、２００ｒｐｍで反応した。８時間後に反応液を採取し、−３０℃で凍結した後に溶解させ、１２０００ｒｐｍで３分間遠心分離して上清を回収した。この回収した液体をＨＰＬＣにて分析したところ、ＮＭＮ量は６．５２ｇ／Ｌであった。【０２５３】
・比較例３（ＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＨＳ＋ｐｎｕＣ ＢＭ／ｐＣＤＦ−ｐｇｉ→ｐｒｓ＋ｎｉａＰ ＢＣ／ｐＡＣＹＣ−ｐｒｓ→ｐｇｉ株を用いたＮＭＮ生産）：
ＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ＋ｐｎｕＣ ＢＭ／ｐＣＤＦ−ｐｇｉ→ｐｒｓ＋ｎｉａＰ ＢＣ／ｐＡＣＹＣ−ｐｒｓ→ｐｇｉ株をＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＨＳ＋ｐｎｕＣ ＢＭ／ｐＣＤＦ−ｐｇｉ→ｐｒｓ＋ｎｉａＰ ＢＣ／ｐＡＣＹＣ−ｐｒｓ→ｐｇｉ株に変更した以外は実施例１１と同様に反応を行い、回収した液体をＨＰＬＣにて分析したところ、ＮＭＮ量は０．０４ｇ／Ｌであった。【０２５４】
［VI．ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）精製１］
前処理されたＮＭＮ含有ＬＢ培地５００ｍＬを４００ｒｐｍで撹拌しながら２時間かけてＮＦ膜ろ過（ＳＹＮＤＥＲ社製、ＮＦ−Ｓ）し、５０ｍＬまで膜濃縮を行った。得られた濃縮液を、終夜凍結乾燥行うことで、ＮＭＮ含有粗体６．３ｇを得た。得られた粗体を１５ｍＬのｍｉｌｉＱ水に溶解し、０．２２μｍのフィルター濾過後ＨＰＬＣ分取を行うことで、ＮＭＮ含有フラクションを得た（純度：６４．５６％）。ＮＭＮ含有フラクションを再度凍結乾燥後、ＨＰＬＣ分取を行い、得られた高含有ＮＭＮフラクションを１Ｎ ＨＣｌを用いてｐＨ＝３に調整し凍結乾燥してＮＭＮを得た（純度：＞９９％）。
MS(ESI) :m/z 335[M+H]+ 1H-NMR (D2O) δ: 9.49 (1H, s), 9.30 (1H, d, J = 6.4 Hz), 9.00 (1H, d, J = 7.8 Hz) 8.31 (1H, dd, J = 7.8, 6.4), 6.32 (1H, d, J = 5.0 Hz), 4.79-4.65 (1H, m), 4.59 (1H, t, J = 5.0 Hz), 4.47-4.45 (1H, m)4.34-4.30 (1H, m), 4.18-4.13 (1H, m).【０２５５】
・分取条件：
装置：        Agilent Infinity 1200分取ＨＰＬＣ
溶媒：        Ａ ＝ １００％Ｈ２Ｏ ＋ ０．１％ＣＨ３ＣＯＯＨ
Ｂ ＝ ９５％ＭｅＣＮ／５％Ｈ２Ｏ ＋ ０．１％ＣＨ３ＣＯＯＨ
カラム：      zic-HILIC、２１．２ｍｍＩ．Ｄ．×１５０ｍｍ、５μｍ、２本連結
ガードカラム：InertSustain Amide、７．６ｍｍＩ．Ｄ．×３０ｍｍ
カラム温度：  ＲＴ℃
流速：        ２２．０ｍＬ／分
検出波長：    ２６０、２００ｎｍ（ＰＤＡ）（２６０ｎｍでＵＶトリガー分取）
グラジエント条件：  時間（分）      Ｂｓｏｌｖ．（％）
０．００        ８４．００
５０．０          ８４．００
５０．１          ４５．００
５８．０          ４５．００
５８．１          ８４．００
６５．０            ＳＴＯＰ
フラクションボリューム：８．０ｍＬ【０２５６】
・分析条件：
装置：      島津ＩＴ−ＴＯＦ／ＭＳ
溶媒：      Ａ ＝ １００％Ｈ２Ｏ ＋ ０．１％ＣＨ３ＣＯＯＨ
Ｂ ＝ ９５％ＭｅＣＮ／５％Ｈ２Ｏ ＋ ０．１％ＣＨ３ＣＯＯＨ
カラム：    zic-HILIC、４．６ｍｍＩ．Ｄ．×１５０ｍｍ、５．０μｍ
カラム温度：２５℃
流速：      １．２ｍＬ／分
検出波長：  ２００、２６０ｎｍ（ＰＤＡ）
グラジエント条件：  時間（分）      Ｂｓｏｌｖ．（％）
０．００        ９０．００
４．００        ９０．００
２１．０          ５０．００
２５．０          ５０．００
２５．１          ９０．００
３０．０            ＳＴＯＰ
ネプライザガス流量：１．５ｍＬ／分
ＣＤＬ温度：        ２００℃
ヒートブロック温度：２００℃
検出器電圧：        １．６５ｋＶ
ＭＳ検出範囲：      Ｅｖｅｎｔ１  ＭＳ        １００〜６００
Ｅｖｅｎｔ２  ＭＳ／ＭＳ    ７０〜５００【０２５７】
［VII．参考評価］
・ＮＡＭＰＴ変換効率の評価：
ＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ株を５ｍＬのＬＢ培地が入った試験管に植菌して３７℃、２００ｒｐｍで１２時間培養した後、培養液を２００ｍＬのＬＢ培地が入った５００ｍＬ三角フラスコにＯＤ６００が０．０３となるように植菌して３７℃、２００ｒｐｍで培養し、ＯＤ６００が０．４となった時点で、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシドを終濃度０．１ｍＭとなるように添加し、２５℃、２００ｒｐｍで１６時間培養を行った。培養液３０ｍＬを５０ｍＬコニカル管に移し、３０００ｇで５分間遠心分離し、菌体を回収した。さらに、１×ＰＢＳを加えて洗浄を行い、３０００ｇで５分間遠心分離し、菌体を回収した。この操作を２回実施した。回収菌体をＣｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（ＭＢＬ社製）１５ｍＬで懸濁し、一般に推奨される方法でＬｙｓａｔｅを調製した。プロテインアッセイブラッドフォード試薬（和光純薬（株）製）を用いてＬｙｓａｔｅのＯＤ５９５を測定し、ＯＤ５９５が０．１となるようにＬｙｓａｔｅ液を水で希釈した。この希釈液をＮＡＭＰＴ溶液として、ＣｙｃＬｅｘＲ ＮＡＭＰＴ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａy Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（ＭＢＬ社製）のＯｎｅ−Ｓｔｅｐ Ａｓｓａｙ Ｍｅｔｈｏｄに準拠してＮＡＭＰＴ変換効率を測定した。測定には、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＲ ｉＤ３マルチモードマイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス社製）を用いた。結果、ＮＡＭＰＴ変換効率は２３０であった。【０２５８】
次に、ＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ株をＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＳＳＣ株に変更した以外は同様にしてＮＡＭＰＴ変換効率を測定した。結果、ＮＡＭＰＴ変換効率は１７０であった。【０２５９】
比較として、ＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ株をＢＬ２１（ＤＥ３）株に変更した以外は同様にしてＮＡＭＰＴ変換効率を測定した。結果、ＮＡＭＰＴ変換効率は９であった。【０２６０】
また、ヒトＮＡＭＰＴ（ＣｙｃＬｅｘＲ ＮＡＭＰＴ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａy Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（ＭＢＬ社製）のヒトＮＡＭＰＴを使用）をＯＤ５９５が０．１となるように水で希釈し、得られた希釈液をＮＡＭＰＴ溶液として、ＣｙｃＬｅｘＲ ＮＡＭＰＴ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａy Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（ＭＢＬ社製）のＯｎｅ−Ｓｔｅｐ Ａｓｓａｙ Ｍｅｔｈｏｄに準拠してＮＡＭＰＴ変換効率を測定した。結果、ＮＡＭＰＴ変換効率は２２であった。【０２６１】
・ｎｉａＰのニコチンアミド取り込み効率の評価：
ＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ／ｐＣＤＦ−ｐｒｓ→ｐｇｉ／ｐＡＣＹＣ−ｎｉａＰ ＢＣ株を５ｍＬのＬＢ培地が入った試験管に植菌して３７℃、２００ｒｐｍで１２時間培養した後、培養液を２００ｍＬのＬＢ培地が入った５００ｍＬ三角フラスコにＯＤ６００が０．０３となるように植菌して３７℃、２００ｒｐｍで培養し、ＯＤ６００が０．４となった時点で、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシドを終濃度０．１ｍＭとなるように添加し、２５℃、２００ｒｐｍで１６時間培養を行った。その後、培養液を５０ｍＬコニカル管に移し、３０００ｇで５分間遠心分離し、菌体を回収した。さらに、１×ＰＢＳを加えて洗浄を行い、３０００ｇで５分間遠心分離し、菌体を回収した。この操作を２回実施した。回収した菌体をＯＤ６００が１０となるようにＬＢ培地で懸濁し、１００ｍＬ三角フラスコに１０ｍＬとなるように加え、そこにニコチンアミドを１ｇ／Ｌ、Ｄ−グルコースを０．４ｇ／Ｌ、リン酸バッファー（ｐＨ６．２）を０．００５ｍｏｌ／Ｌとなるように仕込み、３０℃、２００ｒｐｍで反応した。反応１時間後と２時間後に反応液を採取し、−３０℃で凍結した後に溶解させ、１２０００ｒｐｍで３分間遠心分離して上清を回収した。これら回収した液体をＨＰＬＣにて分析し、ＮＭＮ量を定量した。結果、ｎｉａＰのニコチンアミド取り込み効率は８１％であった。【０２６２】
また、ＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ／ｐＣＤＦ−ｐｒｓ→ｐｇｉ株を用いて同様に評価したところ、ｎｉａＰのニコチンアミド取り込み効率は６６％であった。【０２６３】
・ｐｎｕＣのニコチンアミドモノヌクレオチド排出効率の評価：
ＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ／ｐＣＤＦ−ｐｒｓ→ｐｇｉ／ｐＡＣＹＣ−ｐｎｕＣ ＢＭ株を５ｍＬのＬＢ培地が入った試験管に植菌して３７℃、２００ｒｐｍで１２時間培養した後、培養液を２００ｍＬのＬＢ培地が入った５００ｍＬ三角フラスコにＯＤ６００が０．０３となるように植菌して３７℃、２００ｒｐｍで培養し、ＯＤ６００が０．４となった時点で、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシドを終濃度０．１ｍＭとなるように添加し、２５℃、２００ｒｐｍで１６時間培養を行った。その後、培養液を５０ｍＬコニカル管に移し、３０００ｇで５分間遠心分離し、菌体を回収した。さらに、１×ＰＢＳを加えて洗浄を行い、３０００ｇで５分間遠心分離し、菌体を回収した。この操作を２回実施した。回収した菌体をＯＤ６００が１０となるようにＬＢ培地で懸濁し、１００ｍＬ三角フラスコに１０ｍＬとなるように加え、そこにニコチンアミドを１ｇ／Ｌ、Ｄ−グルコースを０．４ｇ／Ｌ、リン酸バッファー（ｐＨ６．２）を０．００５ｍｏｌ／Ｌとなるように仕込み、３０℃、２００ｒｐｍで反応した。反応２時間後に反応液を採取し、１つは−３０℃で凍結した後に溶解させ、１２０００ｒｐｍで３分間遠心分離して上清を回収した。もう１つは凍結処理せず、１２０００ｒｐｍで３分間遠心分離して上清を回収した。これら回収した液体をＨＰＬＣにて分析し、ＮＭＮ量を定量した。結果、ｐｎｕＣのニコチンアミドモノヌクレオチド排出効率は８１％であった。【０２６４】
また、ＢＬ２１／ｐＲＳＦ−ＮＡＭＰＴ ＣＰ／ｐＣＤＦ−ｐｒｓ→ｐｇｉ株を用いて同様に評価したところ、ｐｎｕＣのニコチンアミドモノヌクレオチド排出効率は１１％であった。【０２６５】
・ＮＭＮ以外のＮＡｍ誘導体の生産：
実施例１１で得られた反応８時間後のＮＭＮを含む反応液に、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ１（ＮＭＮＡＴ１）（ＣｙｃＬｅｘＲ ＮＡＭＰＴ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａy Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（ＭＢＬ社製）のＡＴＰ及びＮＭＮＡＴ１を使用）を加えて、３０℃で反応させたところ、ＮＡＤ＋の生成が確認された。さらに、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）とエタノール（ＣｙｃＬｅｘＲ ＮＡＭＰＴ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａy Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（ＭＢＬ社製）のＡＤＨ及びエタノールを使用）を加えて、３０℃で反応させたところ、ＮＡＤＨの生成が確認された。【０２６６】
・ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）精製２：
遠心分離で菌体除去したＮＭＮ含有ＬＢ培地を活性炭処理し、その後、活性炭を分離除去した処理液を得た。その処理液から高分子量の不純物を除去するためにＮＦ膜ろ過を行い、さらに不純物を除去するため、ろ液をイオン交換樹脂にて処理した。次に、処理液をＮＦ膜を用いて濃縮し、さらにその濃縮液を遠心濃縮することでＮＭＮ含有濃縮液を得た。最終的に、ＮＭＮ含有濃縮液に５ｍｏｌ／Ｌの塩酸水を添加してｐＨ＝３〜４に調整した後、エタノールを適量添加し再結晶操作を行った。析出した固体を回収し、ＮＭＮの結晶を高純度で得た（ＨＰＬＣ純度＞９５％）。
【産業上の利用可能性】
【０２６７】
本発明によれば、ＮＭＮ等のＮＡｍ誘導体を効率的に生産することが可能である。中でもＮＭＮは、種々のリサーチツールやＮＡＤの合成中間体、更には薬効成分等として有用性を有することから、本発明の産業上の価値は高い。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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