(57)【要約】腫瘍細胞自体の性質に基づいて、その腫瘍を有する患者の予後を予測できるバイオマーカーを提供することを課題とする。被検者から採取された膵臓腫瘍細胞内のアディポフィリンを検出する工程を含む、膵臓腫瘍の予後予測マーカーの検出方法により、前記被検者の膵臓腫瘍の予後を予測する。
2020105626.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検者から採取された膵臓腫瘍細胞内のアディポフィリンを検出する工程を含む、膵臓腫瘍の予後予測マーカーの検出方法。
【請求項２】
アディポフィリンが検出された場合に、前記被検者の予後が不良であると決定する工程をさらに含む、請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
予後が生存率である、請求項１又は２に記載の検出方法。
【請求項４】
アディポフィリンの検出が、腫瘍組織の免疫染色によって行われる、請求項１から３のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項５】
膵臓腫瘍の細胞内に存在するアディポフィリンを、前記膵臓腫瘍を有する被検者の予後を予測するためのバイオマーカーとして使用する方法。
【請求項６】
被検者から採取された膵臓腫瘍細胞内に存在するアディポフィリンを、前記被検者の予後を予測するバイオマーカーとして検出するため検査試薬であって、前記検査試薬は、アディポフィリンを検出するための抗体、又は核酸を含む、前記検査試薬。
【請求項７】
アディポフィリンからなる、膵臓腫瘍の予後予測マーカー。
【請求項８】
処理部を備える、膵臓腫瘍の予後予測装置であって、
前記処理部は、
被検者から採取された膵臓腫瘍細胞内のアディポフィリンの測定値を取得し、
取得した測定値を、基準値と比較し、
取得した測定値が、前記基準値よりも高い場合に、前記被検者の予後が不良であることを示すラベルを出力する、及び／又は取得した測定値が、前記基準値よりも低い場合に、前記被検者の予後が良好であることを示すラベルを出力する、
予後予測装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書には、膵臓腫瘍の予後予測マーカーの検出方法、及び膵臓腫瘍の予後予測マーカーを検出するための検査試薬が開示される。
【背景技術】
【０００２】
膵臓癌は、癌の中でも予後が悪く、死亡率が高い癌である。膵臓癌の予後を予測するために、血中ＣＡ１９−９濃度、外科的癌切除後の断端の状態、腫瘍病期等を指標にすることが報告されている（非特許文献１）。また、近年では、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＮＣＣＮ）の再発可能性分類が膵臓癌の予後の予測に有用であることが報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Bilici A. Prognostic factors related with survival in patients with pancreatic adenocarcinoma. World J Gastroenterol 2014; 20: 10802-10812.
【非特許文献２】Murakami Y, Satoi S, Sho M, Motoi F, Matsumoto I, Kawai M, et al. National comprehensive cancer network resectability status for pancreatic carcinoma predicts overall survival. World J Surg 2015; 39: 2306-2314.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、現在報告されている膵臓癌の予後予測因子は、腫瘍の大きさや、腫瘍の遺残等を反映する因子であり、腫瘍細胞自体の性質を反映するものではない。腫瘍細胞自体の悪性度は、腫瘍の大きさ等に関係なく、患者の予後を左右するが、現時点では、腫瘍細胞自体の悪性度に基づいて、予後を予測することはできない。本発明は、腫瘍細胞自体の性質に基づいて、その腫瘍を有する患者の予後を予測できるバイオマーカーを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、鋭意研究を重ねたところ、患者の膵臓腫瘍細胞内にアディポフィリンが検出された場合、患者の予後が不良となることを見出した。
本開示は、以下の態様を含む。【０００６】
項１．被検者から採取された膵臓腫瘍細胞内のアディポフィリンを検出する工程を含む、膵臓腫瘍の予後予測マーカーの検出方法。
項２．アディポフィリンが検出された場合に、前記被検者の予後が不良であると決定する工程をさらに含む、項１に記載の検出方法。
項３．予後が生存率である、項１又は２に記載の検出方法。
項４．アディポフィリンの検出が、腫瘍組織の免疫染色によって行われる、項１から３のいずれか一項に記載の検出方法。
項５．膵臓腫瘍の細胞内に存在するアディポフィリンを、前記膵臓腫瘍を有する被検者の予後を予測するためのバイオマーカーとして使用する方法。
項６．被検者から採取された膵臓腫瘍細胞内に存在するアディポフィリンを、前記被検者の予後を予測するバイオマーカーとして検出するため検査試薬であって、前記検査試薬は、アディポフィリンを検出するための抗体、又は核酸を含む、検査試薬。
項７．アディポフィリンからなる、膵臓腫瘍の予後予測マーカー。
項８．処理部を備える、膵臓腫瘍の予後予測装置であって、前記処理部は、被検者から採取された膵臓腫瘍細胞内のアディポフィリンの測定値を取得し、取得した測定値を、基準値と比較し、取得した測定値が、前記基準値よりも高い場合に、前記被検者の予後が不良であることを示すラベルを出力する、及び／又は取得した測定値が、前記基準値よりも低い場合に、前記被検者の予後が良好であることを示すラベルを出力する、予後予測装置。
【発明の効果】
【０００７】
膵臓腫瘍内のアディポフィリンを検出することにより、膵臓腫瘍を有する患者の予後を予測することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】膵臓腫瘍の予後予測システム１０００の概観図の一例を示す。
【図２】膵臓腫瘍の予後予測装置１０のブロック図の一例を示す。
【図３】膵臓腫瘍の予後予測装置１０の動作の一例を示す。
【図４】透明な細胞質を有する膵臓癌細胞のヘマトキシリン−エオジン染色例を示す。
【図５】膵臓癌組織のアディポフィリンの免疫染色陽性例の染色像を示す。
【図６】膵臓癌患者のKaplan-Meierプロットを示す。Aは、アディポフィリン発現陽性群とアディポフィリン発現陰性群の全期間生存率（OS）を示す。Bは、アディポフィリン発現陽性群とアディポフィリン発現陰性群の無再発生存率（RFS）を示す。
【図７】大腸癌患者のKaplan-Meierプロットを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
１．用語の説明
アディポフィリンは、細胞質内の脂肪滴表面に存在する脂肪滴関連タンパク質である。アディポフィリンは、ペリリピン２とも呼ばれ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎにＧｅｎｅ  ＩＤ：１２３で登録されている遺伝子から発現されるものが代表的である。アディポフィリンからなるバイオマーカーには、前記遺伝子から発現されるタンパク質、又はｍＲＮＡが含まれる。また、バイオマーカーには、前記遺伝子から発現されるタンパク質、又はｍＲＮＡの他、そのバリアントも含む。
【００１０】
膵臓腫瘍は、膵臓に存在する細胞に由来する腫瘍である限り制限されない。膵臓腫瘍には悪性腫瘍及び良性腫瘍が含まれ得るが、組織診断等により悪性であるか良性であるか決定されていない腫瘍であってもよい。膵臓腫瘍は、好ましくは悪性腫瘍である。膵臓腫瘍は、好ましくは癌又は神経内分泌腫瘍である。膵臓癌には、膵管腺癌、粘液性のう胞腺癌、漿液性のう胞腺癌等が含まれ得る。好ましくは膵管腺癌である。膵臓神経内分泌腫瘍には、Ｋｉ−６７指数による分類の膵神経内分泌腫瘍グレード１、膵神経内分泌腫瘍グレード２、膵神経内分泌腫瘍グレード３、膵神経内分泌癌等が含まれ得る。膵臓神経内分泌腫瘍として好ましくは、膵神経内分泌腫瘍グレード２、膵神経内分泌腫瘍グレード３、膵神経内分泌癌である。膵臓腫瘍は、膵臓に存在していてもよいが、リンパ節、門脈、動脈、十二指腸、胆管、肝臓、腹膜、肺等に存在していてもよい。また、膵臓腫瘍は、初発であっても再発であってもよい。好ましくは、初発である。
【００１１】
被検者は、膵臓腫瘍を有する者である限り制限されない。
【００１２】
本開示において、「予後」は、被検者の帰趨を意図する。被検者の帰趨は、その被検者が有する膵臓腫瘍の影響による帰趨である。予後は、好ましくは生存率、腫瘍の再発率、転移の有無、又は腫瘍のグレードであり、より好ましくは、生存率は全期間生存率であり、再発率は無再発生存率であり、転移はリンパ節転移または他臓器転移であり、腫瘍のグレードは分化度である。膵臓腫瘍が膵臓癌の場合には、生存率、腫瘍の再発率で予後を評価することが好ましい。予後が良好であるとは、例えば、診断から３０ヶ月後の生存率が５０％以上、好ましくは診断から３６ヶ月後の生存率が４０％以上を意図する。予後が不良であるとは、例えば、診断から３０ヶ月後の生存率が５０％未満、好ましくは診断から３６ヶ月後の生存率が４０％未満を意図する。また、予後が良好であるとは、例えば、診断から６ヶ月後の無再発生存率が７０％以上、好ましくは診断から１２ヶ月後の無再発生存率が４０％以上を意図する。予後が不良であるとは、例えば、診断から６ヶ月後の無再発生存率が５０％未満、好ましくは診断から１２ヶ月後の無再発生存率が２５％未満を意図する。その他の態様として、予後が良好であるとは、例えば、転移が認められないことを意図する。予後が不良であるとは、例えば、転移が認められることを意図する。その他の態様として、予後が良好であるとは、例えば、腫瘍が高分化型であることを意図する。予後が不良であるとは、例えば、腫瘍が低分化型であることを意図する。
【００１３】
２．膵臓腫瘍の予後予測マーカー及びその検出方法
本開示のある態様は、膵臓腫瘍の予後予測マーカー及びその検出方法に関する。前記検出方法は、膵臓腫瘍細胞内のアディポフィリンを検出することを含む。すなわち、膵臓腫瘍の腫瘍細胞内のアディポフィリンは、前記膵臓腫瘍を有する被検者の予後を予測するためのバイオマーカーとして使用することができる。
【００１４】
膵臓腫瘍内のアディポフィリンの検出は、被検者から採取された膵臓腫瘍細胞又は膵臓腫瘍組織を用いて行う限り制限されない。膵臓腫瘍細胞又は膵臓腫瘍組織は、例えば、原発巣又は転移巣からの手術による切除又は生検、内視鏡下における切除又は生検、腹水からの分離等により採取することができる。腫瘍組織であるか、正常組織であるかの判定は、肉眼的所見、顕微鏡観察等で行うことができる。また、細胞増殖能や、腫瘍マーカー（例えばＣＡ１９−９）の発現があることを指標として腫瘍組織であるか否かを判定してもよい。細胞増殖能を指標として腫瘍組織であるか否かを判定する場合には、例えば検査対象組織のＢｒｄＵやＫｉ−６７タンパク質のラベリングインデックス（「Ｋｉ−６７指数」ともいう）が正常組織と比較して高い場合に、前記検査対象組織が腫瘍組織である可能性が高いと判定することができる。腫瘍マーカーを指標とする場合には、腫瘍マーカーの発現が陽性である組織を腫瘍組織である可能性が高いと判定することができる。
【００１５】
被検者から採取された膵臓腫瘍細胞又は膵臓腫瘍組織は、アディポフィリンの検出方法に応じて前処理される。
【００１６】
膵臓腫瘍内のアディポフィリンは、タンパク質として、又はｍＲＮＡとして検出することができる。
【００１７】
アディポフィリンをタンパク質として検出する方法は、免疫染色、ウエスタンブロッティング等の公知の方法を挙げることができる。また、アディポフィリンをｍＲＮＡとして検出する方法は、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲ（定量的ＲＴ−ＰＣＲを含む）、マイクロアレイ、ＲＮＡ−Ｓｅｑ等の公知の方法を挙げることができる。
【００１８】
膵臓腫瘍組織を使って、免疫染色又はｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションを行う場合には、前処理として、膵臓腫瘍組織をホルマリン、及びパラホルムアルデヒド等の公知の固定液で固定してから、パラフィン包埋ブロックを作製する。あるいは、膵臓腫瘍組織を固定してから、あるいは固定せずに、ＯＣＴコンパウンド（登録商標）等の凍結ブロック作製用の樹脂に包埋し、凍結ブロックを作製する。次に、作製したパラフィン包埋ブロック、又は凍結ブロックを薄切して組織切片を作製し、免疫染色又はｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションに供する。ここで、ブロックに包埋されている膵臓腫瘍組織は、腫瘍部のみであっても良いが例えば正常部位等を含んでいてもよい。
【００１９】
膵臓腫瘍細胞を使って、免疫染色又はｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションを行う場合には、前処理として、細胞をスライドグラスに塗抹又は収集し、ホルマリン、パラホルムアルデヒド、及びエタノール等で固定する。
【００２０】
アディポフィリンをタンパク質としてウエスタンブロッティング等で検出する場合には、前処理として、膵臓腫瘍細胞又は膵臓腫瘍組織を所定の溶解バッファーで溶解する。溶解バッファーで溶解されたサンプルを検査サンプルとする。
【００２１】
アディポフィリンをｍＲＮＡとしてＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ、ＲＮＡ−Ｓｅｑ等で検出する場合には、前処理として、膵臓腫瘍細胞又は膵臓腫瘍組織からｔｏｔａｌ  ＲＮＡ又はｍＲＮＡを抽出する。また、必要に応じて、抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡ又はｍＲＮＡを鋳型として逆転写を行い、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成しても良い。ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ若しくはｍＲＮＡ、又はｃＤＮＡを検査サンプルとする。
【００２２】
免疫染色又はウエスタンブロッティングによってアディポフィリンを検出するための一次抗体は、アディポフィリンを検出できる限り制限されない。例えば、ヒトアディポフィリンのＮ末端側のペプチドを抗原として調製した抗体、特にヒトアディポフィリンの５番目から２７番目のペプチドを抗原として調製した抗体を一次抗体として使用するが好ましい。一次抗体としてより具体的には、ａｎｔｉ−ａｄｉｐｏｐｈｉｌｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＡＰ１２５，Ｐｒｏｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ）等を挙げることができる。アディポフィリンと結合した一次抗体は、一次抗体と結合する酵素標識二次抗体と、前記酵素と基質の反応により検出することができる。免疫染色を行う場合には、脱パラフィン及び浸水処理を行った後に、組織切片をトリプシン等のタンパク分解酵素で処理してから、免疫染色を行ってもよい。
【００２３】
ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションに使用するプローブの作製方法は公知である。また、市販のプローブを使用してもよい。
【００２４】
ＲＴ−ＰＣＲに使用するプライマー（定量的ＲＴ−ＰＣＲの場合にはプローブを含んでいても良い）は市販されているものを使用することができる。また、マイクロアレイも市販されているものを使用することができる。
【００２５】
ＲＮＡ−Ｓｅｑは、次世代シーケンサー（例えば、イルミナ社製）等を使用して、アディポフィリンｍＲＮＡのリード数を得ることができる。
【００２６】
免疫染色又はｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションによってアディポフィリンを検出する場合、免疫染色又はｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションが施された組織標本を顕微鏡、又はスライドスキャナ等を使ってヒトが観察することにより、アディポフィリンの有無を検出することができる。組織標本内の腫瘍細胞内に免疫染色又はｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションのシグナルが確認された場合に、アディポフィリンが検出されたと判定（決定）することができる。細胞内にアディポフィリンを有する腫瘍細胞が組織標本内の腫瘍部に１つでも検出された場合に、「アディポフィリンが検出された」又は、「アディポフィリンの発現が陽性である」と決定しても良い。あるいは、例えば、顕微鏡、又はスライドスキャナの所定の区画に存在している腫瘍細胞の個数を１００％とした時に、細胞内にアディポフィリンを有する腫瘍細胞が１０％以上、好ましくは５％以上、より好ましくは１％以上存在している場合に「アディポフィリンが検出された」又は、「アディポフィリンの発現が陽性である」と決定してもよい。
【００２７】
ウエスタンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡ−Ｓｅｑによって、アディポフィリンを検出する場合、腫瘍細胞又は腫瘍組織から抽出されたサンプルにおいてアディポフィリンが検出された場合に、「アディポフィリンが検出された」又は、「アディポフィリンの発現が陽性である」と決定してもよい。あるいは、腫瘍細胞又は腫瘍組織に由来する検査サンプルと正常細胞又は正常組織由来するアディポフィリンのタンパク質量、又はアディポフィリンのｍＲＮＡ量を比較して、腫瘍細胞又は腫瘍組織に由来する検査サンプルにおけるアディポフィリンのタンパク質量、又はアディポフィリンのｍＲＮＡ量が正常細胞又は正常組織由来するアディポフィリンのタンパク質量、又はアディポフィリンのｍＲＮＡ量よりも高値を示す場合に、「アディポフィリンが検出された」又は、「アディポフィリンの発現が陽性である」と決定してもよい。また、腫瘍細胞又は腫瘍組織に由来する検査サンプルにおけるアディポフィリンのタンパク質量、又はアディポフィリンのｍＲＮＡ量が正常細胞又は正常組織由来するアディポフィリンのタンパク質量、又はアディポフィリンのｍＲＮＡ量と同程度である場合に、「アディポフィリンが検出されていない」又は、「アディポフィリンの発現が陰性である」と決定してもよい。ここで、「高値を示す」とは、１．２倍以上、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは５倍以上高い値を示す場合を例示できる。「同程度」とは、０．８倍から１．１倍程度を例示できる。また、アディポフィリンのタンパク質量、又はアディポフィリンのｍＲＮＡ量を比較する前に、各検査サンプル中のタンパク質量、又はＲＮＡ量を、ＧＡＰＤＨ、β２−ミクログロブリン、β−アクチン等のハウスキーピング遺伝子由来のタンパク質量又はｍＲＮＡ量で正規化してもよい。タンパク質量は質量、又は濃度で表されても良いが、基質の発光強度等で表されても良い。ｍＲＮＡ量は、ｍＲＮＡのコピー数又はリード数であっても良いが、蛍光強度等で表されてもよい。
【００２８】
別の態様として、あらかじめアディポフィリンタンパク質量又はＲＮＡ量の基準値をあらかじめ決定しておき、腫瘍細胞又は腫瘍組織に由来する検査サンプル中のアディポフィリンタンパク質量又はＲＮＡ量が基準値よりも高い場合に、「アディポフィリンが検出された」又は、「アディポフィリンの発現が陽性である」と決定してもよい。また、腫瘍細胞又は腫瘍組織に由来する検査サンプル中のアディポフィリンタンパク質量又はＲＮＡ量が基準値よりも低い場合に、「アディポフィリンが検出されない」又は、「アディポフィリンの発現が陰性である」と決定してもよい。基準値は、アディポフィリンのタンパク質量、又はアディポフィリンのｍＲＮＡ量が検出されているか、又は発現が陽性であるかを判別できる値である限り制限されず、公知の方法により決定することができる。アディポフィリンのタンパク質量、又はアディポフィリンのｍＲＮＡ量が検出されているか、又は発現が陽性であるかを判別できる値は、ＲＯＣ（ｒｅｃｅｉｖｅｒ  ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ  ｃｕｒｖｅ）曲線、判別分析法、モード法、Ｋｉｔｔｌｅｒ法、３σ法、ｐ‐ｔｉｌｅ法等により決定することもできる。また、基準値として、感度、特異度、陰性的中率、陽性的中率、第一四分位数等を例示できる。
【００２９】
予後予測マーカーの検出方法は、さらにアディポフィリンが検出された場合に、前記被検者の予後が不良であると決定する工程を含んでいてもよい。あるいは、アディポフィリンが検出されなかった場合に、前記被検者の予後が良好であると決定する工程を含んでいてもよい。また、予後予測マーカーの検出方法は、膵臓腫瘍細胞内にアディポフィリンが検出されたか否かに応じて、必要な治療方法を決定する工程を含んでいてもよい。例えば、アディポフィリンが検出された場合には、放射線治療及び／又はアジュバント化学療法の適用を行うことを決定してもよい。
【００３０】
３．検査試薬
本開示の別の態様は、被検者から採取された膵臓腫瘍細胞内に存在するアディポフィリンを、前記被検者の予後を予測するためのバイオマーカーとして検出するため検査試薬に関する。
【００３１】
検査試薬は、アディポフィリンタンパク質検出用試薬及び／又はアディポフィリンｍＲＮＡ検出用試薬を含み得る。
【００３２】
アディポフィリンタンパク質検出用試薬は、少なくともアディポフィリンタンパク質の一部に結合可能な一種又は複数の抗体（例えば、一次抗体）を含む。「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及びそれらの断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ）２等）のいずれも用いることができる。免疫グロブリンのクラス及びサブクラスは特に制限されない。また、前記抗体は、抗体ライブラリからスクリーニングされたものであってもよく、キメラ抗体、ｓｃＦｖ等であってもよい。
【００３３】
また、抗体は必ずしも精製されている必要はなく、抗体を含む抗血清、腹水、これらから画分された免疫グロブリン画分等であってもよい。
【００３４】
検査試薬に含まれる抗体は、乾燥状態であってもよく、リン酸緩衝生理食塩水等のバッファーに溶解されていてもよい。さらに、検査試薬は、β−メルカプトエタノール、ＤＴＴ等の安定化剤；アルブミン等の保護剤；ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル等の界面活性剤、アジ化ナトリウム等の防腐剤等の少なくとも一つを含んでいてもよい。
【００３５】
アディポフィリンと結合する抗体は、酵素や蛍光色素で標識されていてもよい。アディポフィリンと結合する抗体はマイクロプレート、磁気ビーズ等に固定されていてもよい。
【００３６】
アディポフィリンタンパク質検出用試薬は、検査試薬と試薬の使用方法を記載した又は試薬の使用方法を記載するウェブページのＵＲＬが記載された添付文書を含む検査キットとして提供されてもよい。また、アディポフィリンと結合する抗体が未標識の一次抗体である場合には、検査キットに酵素又は蛍光色素で標識された二次抗体が含まれていてもよい。さらに、検査キットには前記酵素と反応する基質が含まれていてもよい。
【００３７】
アディポフィリンｍＲＮＡ検出用試薬は、アディポフィリンｍＲＮＡ又はアディポフィリンｃＤＮＡの全体又は一部とハイブリダイズする核酸を含む。核酸は、プライマー、及び／又はプローブとしての機能を有する検出用の核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）であることが好ましい。検出用核酸の長さは、特に制限されない。
【００３８】
検出用核酸が、ＰＣＲ反応に使用されるプライマーであれば、アディポフィリンｍＲＮＡ又はアディポフィリンｃＤＮＡとハイブリダイズする配列が、好ましくは５０  ｍｅｒ以下であり、より好ましくは３０  ｍｅｒ以下であり、さらに好ましくは、１５〜２５  ｍｅｒ程度である。プライマーには、アディポフィリンｍＲＮＡ又はアディポフィリンｃＤＮＡとハイブリダイズしない配列が含まれていてもよい。また、プライマーは、蛍光色素等で標識されていてもよい。
【００３９】
また、ＲＴ−ＰＣＲには、プライマーの他にＰＣＲ産物のリアルタイムの定量のために使用される、ＰＣＲ反応中に分解される定量用プローブを使用することもできる。定量用プローブもアディポフィリンｍＲＮＡ又はアディポフィリンｃＤＮＡとハイブリダイズする限り、制限されない。定量用プローブは、アディポフィリンｍＲＮＡ又はアディポフィリンｃＤＮＡとハイブリダイズする配列を含む、５〜２０  ｍｅｒ程度の核酸であることが好ましい。さらに定量用プローブの一端には、蛍光色素が標識され、定量用プローブのもう一端には、当該蛍光色素のクエンチャーが標識されていることが好ましい。
【００４０】
検出用核酸が、マイクロアレイ等においてキャプチャープローブとして使用されるものであれば、アディポフィリンｍＲＮＡ又はアディポフィリンｃＤＮＡとハイブリダイズする配列が、好ましくは１００  ｍｅｒ程度であり、より好ましくは６０  ｍｅｒ程度であり、さらに好ましくは、２０〜３０  ｍｅｒ程度である。キャプチャープローブには、アディポフィリンｍＲＮＡ又はアディポフィリンｃＤＮＡとハイブリダイズしない配列が含まれていてもよい。さらにキャプチャープローブは、チップに固定化されていることが好ましい。
【００４１】
検出用核酸が、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用のプローブである場合、検出用核酸は、アディポフィリンｍＲＮＡとハイブリダイズする配列が、１５〜１００  ｍｅｒ程度のオリゴヌクレオチドであってもよく、１００  ｍｅｒを超えるポリヌクレオチドであってもよい。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用のプローブには、ジゴキシゲニン、蛍光色素等の標識物質が結合されうる。プローブには、アディポフィリンｍＲＮＡとハイブリダイズしない配列が含まれていてもよい。
【００４２】
アディポフィリンｍＲＮＡ検出用試薬は、検査試薬と試薬の使用方法を記載した又は試薬の使用方法を記載するウェブページのＵＲＬが記載された添付文書を含む検査キットとして提供されてもよい。また、ＲＴ−ＰＣＲによりアディポフィリンｍＲＮＡ又はアディポフィリンｃＤＮＡを検出する場合には、検査キットに核酸増幅試薬（耐熱性ＤＮＡであってもポリメラーゼ、バッファー、ｄＮＴＰ等を含む）、逆転写酵素等を含んでいてもよい。核酸増幅試薬には、必要に応じてＳＹＢＥＲ  ＧＲＥＥＮ（登録商標）等の色素が含まれていてもよい。マイクロアレイによりアディポフィリンｍＲＮＡ又はアディポフィリンｃＤＮＡを検出する場合には、検査キットにハイブリダイゼーション用バッファー、洗浄用バッファー等が含まれていてもよい。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによりアディポフィリンｍＲＮＡを検出する場合には、検査キットに、プロティナーゼＫ等のタンパク質分解酵素、ハイブリダイゼーション用バッファー、洗浄用バッファー等が含まれていてもよい。
【００４３】
４．膵臓腫瘍の予後予測装置
４−１．膵臓腫瘍の予後予測装置の構成
本開示の一実施形態は膵臓腫瘍の予後予測システム１０００及び膵臓腫瘍の予後予測装置１０に関する。
【００４４】
図１は、膵臓腫瘍の予後予測システム１０００の概観図であり、膵臓腫瘍の予後予測システム１０００は一態様として、膵臓腫瘍の予後予測装置１０の他、分析装置５ａ又は分析装置５ｂとを備えていてもよい。
【００４５】
図２に、膵臓腫瘍の予後予測装置１０のブロック図を示す。膵臓腫瘍の予後予測装置１０は、入力部１１１と、出力部１１２と、記憶媒体１１３とに接続されていてもよい。
【００４６】
膵臓腫瘍の予後予測装置１０において、処理部１０１と、主記憶部１０２と、ＲＯＭ（ｒｅａｄ  ｏｎｌｙ  ｍｅｍｏｒｙ）１０３と、補助記憶部１０４と、通信インタフェース（Ｉ／Ｆ）１０５と、入力インタフェース（Ｉ／Ｆ）１０６と、出力インタフェース（Ｉ／Ｆ）１０７と、メディアインターフェース（Ｉ／Ｆ）１０８は、バス１０９によって互いにデータ通信可能に接続されている。主記憶部１０２と補助記憶部１０４とを合わせて、単に記憶部と呼ぶこともある。記憶部は、前記測定値や基準値を揮発性に、又は不揮発性に記憶する。
【００４７】
処理部１０１は、膵臓腫瘍の予後予測装置１０のＣＰＵである。処理部１０１は、ＧＰＵであってもよい。処理部１０１が、補助記憶部１０４又はＲＯＭ１０３に記憶されているコンピュータプログラムを実行し、取得されるデータの処理を行うことにより、膵臓腫瘍の予後予測装置１０が機能する。
【００４８】
ＲＯＭ１０３は、マスクＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭなどによって構成され、処理部１０１により実行されるコンピュータプログラム及びこれに用いるデータが記録されている。処理部１０１はＭＰＵ１０１としてもよい。ＲＯＭ１０３は、膵臓腫瘍の予後予測装置１０の起動時に、処理部１０１によって実行されるブートプログラムや膵臓腫瘍の予後予測装置１０のハードウェアの動作に関連するプログラムや設定を記憶する。
【００４９】
主記憶部１０２は、ＳＲＡＭ又はＤＲＡＭなどのＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ  ａｃｃｅｓｓ  ｍｅｍｏｒｙ）によって構成される。主記憶部１０２は、ＲＯＭ１０３及び補助記憶部１０４に記録されているコンピュータプログラムの読み出しに用いられる。また、主記憶部１０２は、処理部１０１がこれらのコンピュータプログラムを実行するときの作業領域として利用される。
【００５０】
補助記憶部１０４は、ハードディスク、フラッシュメモリ等の半導体メモリ素子、光ディスク等によって構成される。補助記憶部１０４には、オペレーティングシステム及びアプリケーションプログラムなどの、処理部１０１に実行させるための種々のコンピュータプログラム及びコンピュータプログラムの実行に用いる各種設定データが記憶されている。具体的には、基準値等を不揮発性に記憶する。
【００５１】
通信Ｉ／Ｆ１０５は、ＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ−２３２Ｃなどのシリアルインタフェース、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４などのパラレルインタフェース、及びＤ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器などからなるアナログインタフェース、ネットワークインタフェースコントローラ（Ｎｅｔｗｏｒｋ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ：ＮＩＣ）等から構成される。通信Ｉ／Ｆ１０５は、処理部１０１の制御下で、分析装置５ａ，５ｂ又は他の外部機器からのデータを受信し、必要に応じて膵臓腫瘍の予後予測装置１０が保存又は生成する情報を、分析装置５ａ，５ｂ又は外部に送信又は表示する。通信Ｉ／Ｆ１０５は、ネットワークを介して分析装置５ａ，５ｂ又は他の外部機器と通信を行ってもよい。
【００５２】
入力Ｉ／Ｆ１０６は、例えばＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ−２３２Ｃなどのシリアルインタフェース、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４などのパラレルインタフェース、及びＤ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器などからなるアナログインタフェースなどから構成される。入力Ｉ／Ｆ１０６は、入力部１１１から文字入力、クリック、音声入力等を受け付ける。受け付けた入力内容は、主記憶部１０２又は補助記憶部１０４に記憶される。
【００５３】
入力部１１１は、タッチパネル、キーボード、マウス、ペンタブレット、マイク等から構成され、膵臓腫瘍の予後予測装置１０に文字入力又は音声入力を行う。入力部１１１は、膵臓腫瘍の予後予測装置１０の外部から接続されても、膵臓腫瘍の予後予測装置１０と一体となっていてもよい。
【００５４】
出力Ｉ／Ｆ１０７は、例えば入力Ｉ／Ｆ１０６と同様のインタフェースから構成される。出力Ｉ／Ｆ１０７は、処理部１０１が生成した情報を出力部１１２に出力する。出力Ｉ／Ｆ１０７は、処理部１０１が生成し、補助記憶部１０４に記憶した情報を、出力部１１２に出力する。
【００５５】
出力部１１２は、例えばディスプレイ、プリンター等で構成され、分析装置５ａ，５ｂから送信される測定結果及び膵臓腫瘍の予後予測装置１０における各種操作ウインドウ、分析結果等を表示する。
【００５６】
メディアＩ／Ｆ１０８は、記憶媒体１１３に記憶された例えばアプリケーションソフト等を読み出す。読み出されたアプリケーションソフト等は、主記憶部１０２又は補助記憶部１０４に記憶される。また、メディアＩ／Ｆ１０８は、処理部１０１が生成した情報を記憶媒体１１３に書き込む。メディアＩ／Ｆ１０８は、処理部１０１が生成し、補助記憶部１０４に記憶した情報を、記憶媒体１１３に書き込む。
【００５７】
記憶媒体１１３は、フレキシブルディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、又はＤＶＤ−ＲＯＭ等で構成される。記憶媒体１１３は、フレキシブルディスクドライブ、ＣＤ−ＲＯＭドライブ、又はＤＶＤ−ＲＯＭドライブ等によってメディアＩ／Ｆ１０８と接続される。記憶媒体１１３には、コンピュータがオペレーションを実行するためのアプリケーションプログラム等が格納されていてもよい。
【００５８】
処理部１０１は、膵臓腫瘍の予後予測装置１０の制御に必要なアプリケーションソフトや各種設定をＲＯＭ１０３又は補助記憶部１０４からの読み出しに代えて、ネットワークを介して取得してもよい。前記アプリケーションプログラムがネットワーク上のサーバコンピュータの補助記憶部内に格納されており、このサーバコンピュータに膵臓腫瘍の予後予測装置１０がアクセスして、コンピュータプログラムをダウンロードし、これをＲＯＭ１０３又は補助記憶部１０４に記憶することも可能である。
【００５９】
また、ＲＯＭ１０３又は補助記憶部１０４には、例えば米国マイクロソフト社が製造販売するＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）などのグラフィカルユーザインタフェース環境を提供するオペレーションシステムがインストールされている。第２の実施形態に係るアプリケーションプログラムは、前記オペレーティングシステム上で動作するものとする。すなわち、膵臓腫瘍の予後予測装置１０は、パーソナルコンピュータ等であり得る。
【００６０】
膵臓腫瘍の予後予測システム１０００は一カ所に設置されている必要はなく、膵臓腫瘍の予後予測装置１０と分析装置５ａ，５ｂが別所に配置され、これらがネットワークで接続されていてもよい。また、膵臓腫瘍の予後予測装置１０は、入力部１１１や出力部１１２を省略した操作者を必要としない装置であってもよい。
【００６１】
分析装置５ａは、タンパク質の量又は濃度を測定するための装置であり、試料置き場５１と、反応部５２と、検出部５３とを備える。試料置き場５１にセットされた細胞溶解液は、反応部５２に設置された抗原捕捉用抗体が固相されたマイクロプレートに分注されインキュベーションされる。必要に応じて未反応の抗原を除去した後、検出抗体がマイクロプレートに分注され、インキュベーションされる。必要に応じて未反応の抗原を除去した後、検出用抗体を検出するための基質がマイクロプレートに分注され、マイクロプレートが検出部５３に移動され、基質が反応して発生したシグナルが測定される。
【００６２】
また、分析装置５ａの別態様は、マイクロアレイ解析によるｍＲＮＡの発現量を測定するための装置であり、試料置き場５１にセットされた逆転写反応物を反応部５２にセットされたマイクロアレイチップ上に分注し、ハイブリダイゼーションを行い、洗浄した後、検出部５３に移動させシグナルを検出する。
【００６３】
さらに、分析装置５ａの別態様は、ＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡの発現量を測定するための装置であり、試料置き場５１にセットされた逆転写反応物を反応部５２にセットされたマイクロチューブ内に分注し、続いて定量的ＰＣＲ用試薬をマイクロチューブ内に分注する。反応部５２でＰＣＲ反応を行いながら、検出部５３でチューブ内のシグナルを検出する。
【００６４】
分析装置５ｂは、ＲＮＡ−Ｓｅｑ法によってｍＲＮＡの発現量を測定するための装置であり、配列解析部５４を備える。ＲＮＡ−Ｓｅｑ用の反応を行ったサンプルを配列解析部５４にセットし、配列解析部５４内で、塩基配列の解析をおこなう。
【００６５】
分析装置５ｂは、ウエスタンブロッティングによりタンパク質量を測定するための全自動ウエスタンブロッティング装置であり、化学発光シグナル検出部５４を備える。溶解バッファーで溶解された膵臓腫瘍細胞又は膵臓腫瘍組織のサンプルを自動ウエスタンブロッティング装置の所定の位置にセットし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、メンブレンへのブロッティング、抗体反応、化学発光を行い、化学発光シグナル検出部５４にて解析をおこないシグナル強度を定量化する。
【００６６】
分析装置５ａ、及び５ｂは、有線又は無線によって膵臓腫瘍の予後予測装置１０に接続されている。分析装置５ａは、タンパク質の測定値、又はｍＲＮＡの測定値をＡ／Ｄ変換して、デジタルデータとして膵臓腫瘍の予後予測装置１０に送信する。同様に、分析装置５ｂは、ｍＲＮＡの測定値をＡ／Ｄ変換して、デジタルデータとして膵臓腫瘍の予後予測装置１０に送信する。これにより、膵臓腫瘍の予後予測装置１０は、タンパク質の測定値、又はｍＲＮＡの測定値を、演算処理可能なデジタルデータとして取得することができる。
【００６７】
４−２．膵臓腫瘍の予後予測装置の動作
図３に膵臓腫瘍の予後予測装置１０の動作例のフローチャートの一例を示す。
【００６８】
膵臓腫瘍の予後予測装置１０の処理部１０１は、オペレータが入力部１１１から処理開始の入力を行うことにより、被検者の膵臓腫瘍の予後を予測するための処理を開始する。ステップＳ１１において、処理部１０１は、分析装置５ａ又は分析装置５ｂから被検者から採取された膵臓腫瘍細胞内のアディポフィリンのタンパク質量、又はアディポフィリンのｍＲＮＡ量若しくはこれらを反映する値をアディポフィリンの測定値として取得する。あるいは、オペレータが免疫染色又はｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによるアディポフィリンの発現が陽性であるか陰性であるか（あるいは、アディポフィリンが検出されたか否か）を入力部１１１から入力し、処理部１０１がこの入力をアディポフィリンの測定値として取得してもよい。
【００６９】
次に処理部１０１は、ステップＳ１２において、記憶部に記憶されているアディポフィリンの基準値と、ステップＳ１１で取得した測定値とを比較する。
【００７０】
処理部１０１は、ステップＳ１３において、取得した測定値が、前記基準値よりも高い場合には、ステップＳ１４（ＹＥＳ）に進み、前記被検者の予後が不良であると決定し、決定結果を示すラベルを出力部１１２に出力する（ステップＳ１６）。また、ステップＳ１３において、取得した測定値が基準値よりも低い場合に、ステップＳ１５（ＮＯ）に進み、前記被検者の予後が良好であると決定し、決定結果を示すラベルを出力部１１２に出力する（ステップＳ１６）。予後が不良であると決定した場合には、ラベルには、「予後不良」、又は「予後不良を示唆する」ことを示す情報が含まれる。予後が良好であると決定した場合には、ラベルには、「予後良好」、又は「予後良好を示唆する」ことを示す情報が含まれる。前記情報は、×、〇、感嘆符等のマークであってもよい。
【００７１】
基準値、比較方法、測定値が基準値よりも高いか低いかの判定方法等の詳細は、上記２．の説明をここに援用する。
【００７２】
４−３．予後予測プログラム
本実施形態は、ステップＳ１１〜Ｓ１６の処理をコンピュータに実行させる、膵臓腫瘍の予後を予測するためのコンピュータプログラムを含む。
さらに、本実施形態のある実施形態は、前記コンピュータプログラムを記憶した、記憶媒体等のプログラム製品に関する。すなわち、前記コンピュータプログラムは、ハードディスク、フラッシュメモリ等の半導体メモリ素子、光ディスク等の記憶媒体に格納され得る。記憶媒体へのプログラムの記録形式は、訓練装置２００Ａがプログラムを読み取り可能である限り制限されない。前記記憶媒体への記録は、不揮発性であることが好ましい。
【００７３】
５．膵臓癌の治療方法
本開示において、腫瘍組織におけるアディポフィリンの発現が陽性であるか陰性であるかに応じて治療方法を決定することができる。例えば、術前の生検検査等において、アディポフィリンの発現が陽性である場合には、腫瘍摘出手術を行う前に化学療法及び／放射線療法を行うことが好ましい。前記化学療法及び／又は放射線療法は、腫瘍が手術により切除可能であると判断された場合であっても行うことが好ましい。化学療法において、抗がん剤は、フルオロウラシル、レボホリナート、イリノテカン、オキサリプラチン、ゲムシタビン、ナブパクリタキセルよりなる群から選択される少なくとも１つを用いることができる。また、フルオロウラシル、レボホリナート、イリノテカン、及びオキサリプラチンを併用する化学療法、ゲムシタビン及びナブパクリタキセルを併用する化学療法等を行ってもよい。
【００７４】
また、術前の生検検査等において、アディポフィリンの発現が陰性である場合には、術前化学療法を行わずに、腫瘍摘出手術を行ってもよい。
【実施例】
【００７５】
以下に実施例を示して本開示についてより詳細に説明するが、本開示は実施例に限定して解釈されるものではない。【００７６】
今回の検討は、ヘルシンキ宣言に基づいて学校法人関西医科大学の倫理委員会の承認を得て行った。【００７７】
Ｉ．実施例１
１．患者の選択
2008年1月から2015年12月までに関西医科大学附属病院において膵管腺癌（PDAC）の切除手術を受け、継続して受診している213名をピックアップした。他の原因又は合併症で死亡した患者（19名）と、24ヶ月以内に臨床経過をフォローアップできなくなった患者（13名）は、検討から除外した。【００７８】
最終的に、腫瘍遺残度がR0又はR1であった181名の患者について検討を行った。【００７９】
２．組織学的検討
外科的に切除された組織サンプルをホルマリン固定し、組織標本を作製した。組織標本は、固定した組織サンプルをすべてパラフィン包埋し、薄切切片を作製し、ヘマトキシリン−エオジン染色を施し作製した。作製した組織標本を鏡験しWorld Health Organization Classification 2010に基づいて、組織学的な分類（グレーディング）を行い、腫瘍組織を高分化型腺癌、中分化型腺癌、低分化型腺癌に分類した。透明な細胞質を有する腫瘍細胞は、免疫染色において抗アディポフィリン抗体との反応性が高いことが報告されている。この知見に基づいて、組織標本の観察において、腫瘍細胞の細胞質が透明であるか否かも評価した。【００８０】
すべての患者について、TNM臨床病期分類第8版（Union for International Cancer Control）に基づいて、腫瘍の病期分類を行った。【００８１】
３．組織マイクロアレイ
それぞれの患者の組織について、ヘマトキシリン−エオジン染色を施した組織標本内で最も形態学的に癌の特徴を呈している部分を選び、パラフィン包埋ブロックから２つの組織塊（直径2 mm）をパンチで採取した。パンチした組織塊をさらにパラフィンブロック内に並べて包埋し、薄切して組織切片を作製した。【００８２】
４．免疫染色
免疫染色は、自動染色装置(Discovery, Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)を使用し、装置添付のプロトコールにしたがって行った。アディポフィリンを染色するための一次抗体として、anti-adipophilin mouse monoclonal primary antibody (AP125, Progen Biotechnik, Heidelberg, Germany)を使用した。二次抗体は、ペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体を使用し、発色にはジアミノベンチジン（DAB）を使用した。陽性コントロールとして、皮膚の皮脂腺を使用した。アディポフィリンの発現は、細胞内に顆粒状及び／又は球状の発現が認められる腫瘍細胞が、腫瘍組織全体の５％以上である場合に「陽性」と判定した。また、同一患者において２つ採取した細胞塊の１つ以上が陽性となった場合に、その患者の腫瘍がアディポフィリン発現陽性であると判定した。【００８３】
５．統計解析
統計解析には、JMP Start Statistics version 14 (Statistical Discovery Software; SAS Institute, Cary, NC, USA)を使用した。カイ二乗検定は、アディポフィリン発現陽性群とアディポフィリン発現陰性群との間で行った。すべての患者について、少なくとも２年かつ2018年3月16日までフォローアップした。全期間生存率(overall survival: OS)及び無再発生存率（recurrence-free survival (RFS) rates）は、Kaplan-Meier法で評価した。アディポフィリン発現陽性群とアディポフィリン発現陰性群との間での有意差は、log-rank 検定により求めた。p値 < 0.05の場合に、有意差有りと判定した。腫瘍径とCA19-9レベルの連続変数は、ROC (Receiver Operatorating Characteristic)曲線に基づいて求めたカットオフ値によって２値化した。OS及び再発率（6ヶ月以内）のリスク因子（risk factor）は多変量解析であるロジスティック回帰解析によって決定し、ハザード比、95％信頼区間、及びp値によって表した。重要な独立因子を同定するために、単変量解析によって決定された重要因子（Significant factor）を、さらに、多変量ロジスティック回帰解析によって評価した。【００８４】
６．結果
６−１．臨床病理学的特徴
表１に患者の臨床病理学的特徴を示す。検討対象とした181名の患者のうち、74名が女性であり、107名が男性であった。腫瘍切除手術を受けた際の患者の年齢は、36歳から86歳であり、中央値は68歳であった。フォローアップ期間は、25ヶ月から115ヶ月であり、中央値は、48ヶ月であった。122名(67.4%)の患者は、膵管腺癌により死亡した。126名(69.6%)の患者で再発が認められた。117例では、膵頭部に腫瘍が存在しており、64例では、膵体部又は膵尾部に腫瘍が存在していた。National Comprehensive Cancer Network (NCCN)に基づく切除可能性分類では、134例が切除可能(R)に分類され、43例が切除可能境界(BR)であり、4例が切除不能(UR)であった。腫瘍遺残度に基づく分類では、150名の患者がR0に分類され、31名がR1に分類された。TNM分類による臨床病期分類では、pT1b、pT1c、pT2、pT3及びpT4に分類された患者がそれぞれ1名、10名、105名、 63名、 及び2名であった。リンパ節転移は、133 (73.5%)名の患者に認められた。患者の病期の内訳は、IA (5 名)、IB (36名)、IIA (7名)、IIB (69名)、III (63 名)、及びIV (1 名)であった。69 (38.1%) 名の患者に対して、術前化学療法（ネオアジュバント化学療法）が行われた。【００８５】
組織学的な分類では、42 (23.2%)例が高分化型腺癌に分類され、115 (63.5%)例が中分化型腺癌に分類され、24 (13.3%)例が低分化型腺癌に分類された。図４に示すような、透明な細胞質を有する腫瘍細胞は、44(24.3%)例で認められた。【００８６】
【表１】
2020105626.tif 000003
【００８７】
６−２．アディポフィリンの発現
アディポフィリンの発現は、51 (28.2%)例に認められた。図５に、染色例を示す。ほとんどの例において、アディポフィリンは、核内に球状の染色形態を示した。表1に、アディポフィリン発現陽性例とアディポフィリン発現陰性例とに分けて臨床病理学的特徴を示した。アディポフィリン発現陽性は低分化型腺癌と有意な関連性を示した (p = 0.0012)。 また、アディポフィリン発現陽性は術前CA19-9が高値を示した例とも有意な関連性を示した(p = 0.0016)。さらに アディポフィリン発現陽性患者では、腫瘍遺残度R1に分類される割合が、アディポフィリン発現陰性患者よりも高かった (27.5% vs. 13.1%、 p=0.028)。【００８８】
一方で、アディポフィリン発現陽性と、腫瘍径、臨床病期分類、又はリンパ節転移との関連性は認められなかった（p値は、それぞれp = 0.052、p = 0.23、p = 0.57）。また、 アディポフィリン発現と、透明な細胞質を有する腫瘍細胞の出現との間に関連性は認められなかった (p = 0.59)。【００８９】
６−３．アディポフィリン発現の予後的意義
アディポフィリン発現の有無と、患者の生存率との関連性を検討した。
図６Aにアディポフィリン発現陽性患者とアディポフィリン発現陰性患者の全期間生存（OS）曲線を示す。図６Bにアディポフィリン発現陽性患者とアディポフィリン発現陰性患者の無再発生存（RFS）曲線を示す。アディポフィリン発現陽性患者は、アディポフィリン発現陰性患者と比較して、OS及びRFSとも優位に生存率が低かった (OS：p = 0.0007、RFS：p = 0.0022)。アディポフィリン発現陰性患者の生存期間の中央値は31.5ヶ月であったのに対して、アディポフィリン発現陽性患者の生存期間の中央値は16ヶ月であった。また、アディポフィリン発現陰性患者の無再発生存率の中央値は12ヶ月であったのに対して、アディポフィリン発現陽性患者の無再発生存率の中央値は6.5ヶ月であった。【００９０】
表２にOSにおける様々な因子の単変量解析、及び多変量解析の結果を示す。【００９１】
単変量Cox 回帰分析において、アディポフィリン発現は、予後予測因子として使用されることがある術前アルブミン濃度(< 3.8 g/dL)、CA19-9濃度(> 186 U/mL)、NCCNによる治療可能性分類においてBR 又はURであること、より大きな腫瘍サイズ (> 32 mm)、 病期分類においてIII又はIVであること、腫瘍遺残度においてR1であること、及びアジュバント化学療法の適用と同様に優位な予後不良因子であることが示された。さらに、多変量解析において、アディポフィリン発現は、ハザード比 1.64、95%信頼区間1.14-2.34、p = 0.0084を示した。一方、多変量解析において、OSとNCCNによる治療可能性分類においてBR又はURに属することとの関連性は、 ハザード比1.64、 95%信頼区間1.13-2.34、p=0.0088を示した。OSと術前CA19-9の高濃度との関連性は、ハザード比1.48、95%信頼区間1.05-2.07、 p = 0.026であった。OSとアジュバント化学療法適用との関連性は、ハザード比0.45、95%信頼区間0.29-0.73、p = 0.0018を示した。すなわち、アディポフィリン発現以外の因子と比較して、ハザード比又はp値においてアディポフィリン発現の方がOSとの関連性が強いことが示された。この結果から、アディポフィリン発現は、膵臓癌患者のOSにおいて重要因子であり、独立因子であることが示された。また、アディポフィリン発現は、膵臓癌の予後予測マーカーとして使用されている術前CA19-9濃度や、臨床病期分類よりも膵臓癌患者のOSとの関連性が強く、膵臓癌患者の予後を予測するための重要なマーカーであることが示された。【００９２】
【表２】
2020105626.tif 000004
【００９３】
表３にRFSにおける様々な因子の単変量解析、及び多変量解析の結果を示す。
膵管腺癌患者の早期再発においても、アディポフィリン発現は、重要因子であり、独立因子であった (ハザード比2.43；95%信頼区間1.08-5.19；p = 0.030)。したがって、アディポフィリン発現は、膵管腺癌患者の早期再発を予測する上でも重要因子であり、独立因子であることが示された。また、術前CA19-9濃度も、ハザード比2.37；95%信頼区間1.09-5.43；p = 0.030であったが、ハザード比は、アディポフィリン発現の方が高値を示した。【００９４】
【表３】
2020105626.tif 000005
【００９５】
このことから、アディポフィリン発現は、膵臓癌患者における早期再発の予測マーカーであることも示された。【００９６】
以上の結果から、アディポフィリン発現は、他の予後予測マーカーと比較して、全期間生存率及び無再発生存率との関連性が高く、膵臓腫瘍の予後予測マーカーとして優れていることが示された。【００９７】
また、アディポフィリンの発現と、再発可能性分類、腫瘍径、臨床病期分類との間に関連性が認められなかったこと、一方で、アディポフィリン発現陽性患者の無再発生存率がアディポフィリン陰性患者と比較して悪いこと、悪性度の高い低分化型腺癌とアディポフィリン発現の間に関連性が認められたことから、アディポフィリンを発現する細胞そのものが、再発率が高く、患者の予後を不良とする悪性度の高い細胞であると考えられた。【００９８】
ＩＩ．実施例２
膵神経内分泌腫瘍（PNET）及び膵神経内分泌癌（PNEC）は、Ki-67指数や核分裂像等の細胞増殖マーカーの陽性比率を用いた分類により、PNETグレード1（PNET G1）、PNETグレード2（PNET G2）、PNETグレード3（PNET G3）及びPNECに分類される。【００９９】
そこで、PNET及びPNECにおけるアディポフィリンの発現と悪性度の関係を検討した。【０１００】
１．患者及び評価方法
２００７年１月から２０１７年１２月までに関西医科大学附属病院において膵神経内分泌腫瘍の切除手術を受け、継続して受診しているPNET G1患者１５名、及びPNET G2患者１０名をピックアップして検討を行った。また、PNEC患者３名についても検討を行った。【０１０１】
アディポフィリンの染色及び評価は、実施例１と同様に行った。【０１０２】
２．結果
アディポフィリンの染色が陽性であると判定された患者数は、PNET G1患者３名、PNET G2患者４名、PNEC患者３名であった。グレード間でアディポフィリン陽性患者数を比較すると、（PNET G1）vs（PNET G2 + PNEC）は p=0.06、（PNET G1 + PNET G2） vs PNECはp=0.014となり、アディポフィリン陽性例はNET G2以上の症例に多い傾向にあることが示された。【０１０３】
また、リンパ節転移有無で比較すると、表４に示すように、リンパ節転移が溶性であった症例では、アディポフィリン陽性例が多いことが示された。【０１０４】
【表４】
2020105626.tif 000006
これらの結果から、アディポフィリンは、膵臓腫瘍の悪性度をよく反映しており、膵臓腫瘍患者の予後予測マーカーとして有用であることが示された。【０１０５】
ＩＩＩ．比較例
アディポフィリンが大腸癌の予後と相関するか否かを検討した。2014年1月から2014年12月の間に関西医科大学病院において手術を受けた大腸癌患者165名（男性95名、女性70名）の腫瘍組織のパラフィン包埋組織について検討を行った。患者の年齢は33〜99歳であり、中央値は78歳であった。【０１０６】
実施例１と同様の方法によりアディポフィリンの染色を行い、細胞内に顆粒状及び／又は球状の発現が認められる腫瘍細胞が、腫瘍組織全体の５０％以上である場合にアディポフィリンの発現が「陽性」と判定した。しかし、図７に示すように、アディポフィリンの発現と生存率の間に相関は認められなかった（p=0.21）。
【符号の説明】
【０１０７】
１０１  処理部
１０  予後予測装置
【図１】
2020105626.tif 000007
【図２】
2020105626.tif 000008
【図３】
2020105626.tif 000009
【図４】
2020105626.tif 000010
【図５】
2020105626.tif 000011
【図６】
2020105626.tif 000012
【図７】
2020105626.tif 000013
【国際調査報告】
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