(57)【要約】  閉鎖系内で細胞を培養又は誘導することを含む、細胞の培養又は誘導方法が提供される。
2020040135.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
閉鎖系内で細胞を培養又は誘導することを含む、細胞の培養又は誘導方法。
【請求項２】
前記誘導が、リプログラミング、初期化、分化転換、分化誘導及び細胞の運命変更の少なくともいずれかを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記閉鎖系内と外部との間でガスの交換が生じない、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記閉鎖系内の温度を制御することをさらに含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記培養することにおいて、前記閉鎖系が密閉されている、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記閉鎖系が密閉された状態で、前記閉鎖系内に外気が進入しない、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記閉鎖系が密閉された状態で、前記閉鎖系内に前記閉鎖系外の細胞、微生物、ウイルス、及び塵が進入しない、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記閉鎖系が密閉された状態で、前記閉鎖系内の物質が前記閉鎖系外に流出しない、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記閉鎖系内に二酸化炭素ガス、窒素ガス、及び酸素ガスの少なくともいずれかが供給されない、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記閉鎖系内の培地のｐＨが所定の範囲内に保たれる、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記閉鎖系の少なくとも一部が、ガス非透過性物質に埋め込まれることにより形成されている、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記閉鎖系の少なくとも一部が、ガス非透過性物質からなる、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記閉鎖系内で培地を補充又は交換しながら前記細胞を培養又は誘導する、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記閉鎖系内で培地を循環しながら前記細胞を培養又は誘導する、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記閉鎖系が前記細胞を培養する培養槽を備え、
前記培養槽内に流体を供給するための供給口と、前記閉鎖系内の流体を排出するための排出口と、が、前記培養槽に設けられており、
前記供給口及び前記排出口が密閉可能である、
請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記供給口に流体を供給するための供給器が着脱可能であり、
前記排出口に流体を排出するための排出器が着脱可能であり、
前記供給器から前記培養槽内に流体を供給すると、前記培養槽内の流体が前記排出器内に移動する、
請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記供給器から前記培養槽内に培地を供給すると、前記培養槽内の空気が前記排出器内に移動する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記供給器から前記培養槽内に培地を供給すると、前記培養槽内の培地が前記排出器内に移動する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記培地が細胞を含有する、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記供給器から前記培養槽内に流体を供給する際に、外気が前記培養槽内に進入しない、請求項１６から１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記培養することにおいて、前記閉鎖系内の二酸化炭素濃度が制御されない、請求項１から２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記培養することにおいて、前記閉鎖系外の二酸化炭素濃度が制御されない、請求項１から２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記培養することにおいて、前記閉鎖系内の半透膜を介して前記閉鎖系内の物質が移動する、請求項１から２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記閉鎖系が、前記細胞を培養する培養槽と、前記培養槽に接続された流路と、を備え、
培地が前記培養槽と前記流路を循環する、
請求項１から２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記流路において外部とガスの交換が生じない、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記培地が循環することにより、前記培養槽内の培地のｐＨが所定の範囲内に保たれる、請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記培養が浮遊培養である、請求項１から２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記培養が接着培養である、請求項１から２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記閉鎖系内のゲル培地中で前記細胞を培養する、請求項１から２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記閉鎖系内の液体培地中で前記細胞を培養する、請求項１から２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記閉鎖系内の培地が攪拌される、請求項１から３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記閉鎖系内の培地が攪拌されない、請求項１から３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞を継代することをさらに含む、請求項１から３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
播種と継代の間に培地の追加及び交換をしない、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
播種と継代の間に培地の追加又は交換をする、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
継代と継代の間に培地の追加及び交換をしない、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
継代と継代の間に培地の追加又は交換をする、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞が幹細胞である、請求項１から３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記幹細胞がｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、又は体性幹細胞である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記培養することにおいて、前記幹細胞が未分化状態を維持する、請求項３８又は３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記培養することにおいて、前記幹細胞が多能性を維持する、請求項３８から４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞が体細胞である、請求項１から３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記細胞が血液系細胞である、請求項１から３７及び４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞が誘導因子を導入された細胞である、請求項１から４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記閉鎖系内の培地に誘導因子を添加し、前記閉鎖系内で培養されている前記細胞に前記誘導因子を導入する、請求項１から４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記細胞が幹細胞に誘導される、請求項４４又は４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記幹細胞がｉＰＳ細胞である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記細胞が血液系細胞である、請求項４４から４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記細胞が別種の細胞に誘導される、請求項４４又は４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記細胞が血液系細胞であり、
前記閉鎖系内の培地に誘導因子を添加し、前記閉鎖系内で培養されている前記血液系細胞に前記誘導因子を導入し、前記血液系細胞をｉＰＳ細胞に誘導する、請求項１から４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記誘導因子がプラスミドに含まれる、請求項４４から５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記誘導因子がＲＮＡである、請求項４４から５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記誘導因子がセンダイウイルスに含まれる、請求項４４から５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
培養成分が透過可能な培養成分透過部材と、
前記培養成分透過部材の一方の面を覆う、細胞含有培地を保持し、細胞を培養するための培養槽と、
前記培養成分透過部材の他方の面を覆う、培地を保持するための培地保持槽と、
を備える、細胞培養器を用意することと、
前記培養槽中で細胞を培養又は誘導することと、
を含む、細胞の培養又は誘導方法。
【請求項５５】
前記誘導が、リプログラミング、初期化、分化転換、分化誘導及び細胞の運命変更の少なくともいずれかを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記細胞培養器の内部が外部から閉鎖されている、請求項５４又は５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記細胞培養器内の培地のｐＨが所定の範囲内に保たれる、請求項５４から５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記培養が浮遊培養である、請求項５４から５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記細胞が幹細胞である、請求項５４から５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記細胞が体細胞である、請求項５４から５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記細胞が血液系細胞である、請求項５４から５８及び６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記細胞が誘導因子を導入された細胞である、請求項５４から６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記培養槽内の培地に誘導因子を添加し、前記培養槽内で培養されている前記細胞に前記誘導因子を導入する、請求項５４から６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記細胞が別種の細胞に誘導される、請求項６２又は６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記細胞培養器が、前記培養成分透過部材の前記培養槽側の面に重ねられた、開口が設けられた培養側プレートをさらに備える、請求項５４から６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
前記細胞培養器が、前記培養成分透過部材の前記培地保持槽側の面に重ねられた、開口が設けられた培地側プレートをさらに備える、請求項５４から６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記培養側プレートが濃色である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
前記培養側プレートの前記開口が設けられていない部分を背景にして前記細胞又は前記細胞からなる細胞塊を観察することをさらに含む、請求項６５又は６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記培養側プレートの前記開口が設けられていない部分を背景にして前記細胞又は前記細胞からなる細胞塊を撮影することをさらに含む、請求項６５又は６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記培地保持槽の前記培地を補充又は置換することをさらに含む、請求項５４から６９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞技術に関し、細胞の培養又は誘導方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、ヒトやマウスの初期胚から樹立された幹細胞である。ＥＳ細胞は、生体に存在する全ての細胞へと分化できる多能性を有する。現在、ヒトＥＳ細胞は、パーキンソン病、若年性糖尿病、及び白血病等、多くの疾患に対する細胞移植療法に利用可能である。しかし、ＥＳ細胞の移植には障害もある。特に、ＥＳ細胞の移植は、不成功な臓器移植に続いて起こる拒絶反応と同様の免疫拒絶反応を惹起しうる。また、ヒト胚を破壊して樹立されるＥＳ細胞の利用に対しては、倫理的見地から批判や反対意見が多い。【０００３】
このような背景の状況の下、京都大学の山中伸弥教授は、４種の遺伝子：ＯＣＴ３／４、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、及びＳＯＸ２を体細胞に導入することにより、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を樹立することに成功した。これにより、山中教授は、２０１２年のノーベル生理学・医学賞を受賞した（例えば、特許文献１、２参照。）。ｉＰＳ細胞は、拒絶反応や倫理的問題のない理想的な多能性細胞である。したがって、ｉＰＳ細胞は、細胞移植療法への利用が期待されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第４１８３７４２号公報
【特許文献２】特開２０１４−１１４９９７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ｉＰＳ細胞に限らず、様々な細胞を効率よく簡便に培養又は誘導可能な方法が望まれている。そこで、本発明は、細胞を効率よく簡便に培養又は誘導可能な方法を提供することを目的の一つとする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の態様によれば、閉鎖系内で細胞を培養又は誘導することを含む、細胞の培養又は誘導方法が提供される。【０００７】
上記の方法において、誘導が、リプログラミング、初期化、分化転換、分化誘導及び細胞の運命変更の少なくともいずれかを含んでもよい。【０００８】
上記の方法において、閉鎖系内と外部との間でガスの交換が生じなくともよい。【０００９】
上記の方法が、閉鎖系内の温度を制御することをさらに含んでいてもよい。【００１０】
上記の方法の培養することにおいて、閉鎖系が密閉されていてもよい。【００１１】
上記の方法において、閉鎖系が密閉された状態で、閉鎖系内に外気が進入しなくともよい。【００１２】
上記の方法において、閉鎖系が密閉された状態で、閉鎖系内に閉鎖系外の細胞、微生物、ウイルス、及び塵が進入しなくともよい。【００１３】
上記の方法において、閉鎖系が密閉された状態で、閉鎖系内の物質が閉鎖系外に流出しなくともよい。【００１４】
上記の方法において、閉鎖系内に二酸化炭素ガス、窒素ガス、及び酸素ガスの少なくともいずれかが供給されなくともよい。【００１５】
上記の方法において、閉鎖系内の培地のｐＨが所定の範囲内に保たれてもよい。【００１６】
上記の方法において、閉鎖系の少なくとも一部が、ガス非透過性物質に埋め込まれることにより形成されていてもよい。【００１７】
上記の方法において、閉鎖系の少なくとも一部が、ガス非透過性物質からなってもよい。【００１８】
上記の方法において、閉鎖系内で培地を補充又は交換しながら細胞を培養又は誘導してもよい。【００１９】
上記の方法において、閉鎖系内で培地を循環しながら細胞を培養又は誘導してもよい。【００２０】
上記の方法において、閉鎖系が細胞を培養する培養槽を備え、培養槽内に流体を供給するための供給口と、閉鎖系内の流体を排出するための排出口と、が、培養槽に設けられており、供給口及び排出口が密閉可能であってもよい。【００２１】
上記の方法において、供給口に流体を供給するための供給器が着脱可能であり、排出口に流体を排出するための排出器が着脱可能であり、供給器から培養槽内に流体を供給すると、培養槽内の流体が排出器内に移動してもよい。【００２２】
上記の方法において、供給器から培養槽内に培地を供給すると、培養槽内の空気が排出器内に移動してもよい。【００２３】
上記の方法において、供給器から培養槽内に培地を供給すると、培養槽内の培地が排出器内に移動してもよい。【００２４】
上記の方法において、培地が細胞を含有してもよい。【００２５】
上記の方法において、供給器から培養槽内に流体を供給する際に、外気が培養槽内に進入しなくともよい。【００２６】
上記の方法において、培養することにおいて、閉鎖系内の二酸化炭素濃度が制御されなくともよい。【００２７】
上記の方法の培養することにおいて、閉鎖系外の二酸化炭素濃度が制御されなくともよい。【００２８】
上記の方法の培養することにおいて、閉鎖系内の半透膜を介して閉鎖系内の物質が移動してもよい。【００２９】
上記の方法において、閉鎖系が、細胞を培養する培養槽と、培養槽に接続された流路と、を備え、培地が培養槽と流路を循環してもよい。【００３０】
上記の方法において、流路において外部とガスの交換が生じなくともよい。【００３１】
上記の方法において、培地が循環することにより、培養槽内の培地のｐＨが所定の範囲内に保たれてもよい。【００３２】
上記の方法において、培養が浮遊培養であってもよい。【００３３】
上記の方法において、培養が接着培養であってもよい。【００３４】
上記の方法において、閉鎖系内のゲル培地中で細胞を培養してもよい。【００３５】
上記の方法において、閉鎖系内の液体培地中で細胞を培養してもよい。【００３６】
上記の方法において、閉鎖系内の培地が攪拌されてもよい。【００３７】
上記の方法において、閉鎖系内の培地が攪拌されなくともよい。【００３８】
上記の方法が、細胞を継代することをさらに含んでもよい。【００３９】
上記の方法において、播種と継代の間に培地の追加及び交換をしなくともよい。【００４０】
上記の方法において、播種と継代の間に培地の追加又は交換をしてもよい。【００４１】
上記の方法において、継代と継代の間に培地の追加及び交換をしなくともよい。【００４２】
上記の方法において、継代と継代の間に培地の追加又は交換をしてもよい。【００４３】
上記の方法において、細胞が幹細胞であってもよい。【００４４】
上記の方法において、幹細胞がｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、又は体性幹細胞であってもよい。【００４５】
上記の方法の培養することにおいて、幹細胞が未分化状態を維持してもよい。【００４６】
上記の方法において、培養することにおいて、幹細胞が多能性を維持してもよい。【００４７】
上記の方法において、細胞が体細胞であってもよい。【００４８】
上記の方法において、細胞が、血液系細胞、神経系細胞、心筋系細胞、上皮系細胞、間葉系細胞、肝細胞、インスリン産生細胞、網膜色素上皮細胞、及び角膜細胞から選択される少なくとも一つであってもよい。【００４９】
上記の方法において、細胞が誘導因子を導入された細胞であってもよい。【００５０】
上記の方法において、閉鎖系内の培地に誘導因子を添加し、閉鎖系内で培養されている細胞に誘導因子を導入してもよい。【００５１】
上記の方法において、細胞が幹細胞に誘導されてもよい。【００５２】
上記の方法において、幹細胞がｉＰＳ細胞であってもよい。【００５３】
上記の方法において、細胞が血液系細胞であってもよい。【００５４】
上記の方法において、細胞が別種の細胞に誘導されてもよい。【００５５】
上記の方法において、細胞が血液系細胞であり、閉鎖系内の培地に誘導因子を添加し、閉鎖系内で培養されている血液系細胞に誘導因子を導入し、血液系細胞をｉＰＳ細胞に誘導してもよい。【００５６】
上記の方法において、誘導因子がプラスミドに含まれていてもよい。【００５７】
上記の方法において、誘導因子がＲＮＡであってもよい。【００５８】
上記の方法において、誘導因子がセンダイウイルスに含まれていてもよい。【００５９】
また、本発明の態様によれば、培養成分が透過可能な培養成分透過部材と、培養成分透過部材の一方の面を覆う、細胞含有培地を保持し、細胞を培養するための培養槽と、培養成分透過部材の他方の面を覆う、培地を保持するための培地保持槽と、を備える、細胞培養器を用意することと、培養槽中で細胞を培養又は誘導することと、を含む、細胞の培養又は誘導方法が提供される。【００６０】
上記の方法において、誘導が、リプログラミング、初期化、分化転換、分化誘導及び細胞の運命変更の少なくともいずれかを含んでいてもよい。【００６１】
上記の方法において、細胞培養器の内部が外部から閉鎖されていてもよい。【００６２】
上記の方法において、細胞培養器内の培地のｐＨが所定の範囲内に保たれてもよい。【００６３】
上記の方法において、培養が浮遊培養であってもよい。【００６４】
上記の方法において、細胞が幹細胞であってもよい。【００６５】
上記の方法において、細胞が体細胞であってもよい。【００６６】
上記の方法において、細胞が、血液系細胞、神経系細胞、心筋系細胞、上皮系細胞、間葉系細胞、肝細胞、インスリン産生細胞、網膜色素上皮細胞、及び角膜細胞から選択される少なくとも一つであってもよい。【００６７】
上記の方法において、細胞が誘導因子を導入された細胞であってもよい。【００６８】
上記の方法において、培養槽内の培地に誘導因子を添加し、培養槽内で培養されている細胞に誘導因子を導入してもよい。【００６９】
上記の方法において、細胞が別種の細胞に誘導されてもよい。【００７０】
上記の方法において、細胞培養器が、培養成分透過部材の培養槽側の面に重ねられた、開口が設けられた培養側プレートをさらに備えていてもよい。【００７１】
上記の方法において、細胞培養器が、培養成分透過部材の培地保持槽側の面に重ねられた、開口が設けられた培地側プレートをさらに備えていてもよい。【００７２】
上記の方法において、培養側プレートが濃色であってもよい。【００７３】
上記の方法が、培養側プレートの開口が設けられていない部分を背景にして細胞又は細胞からなる細胞塊を観察することをさらに含んでいてもよい。【００７４】
上記の方法が、培養側プレートの開口が設けられていない部分を背景にして細胞又は細胞からなる細胞塊を撮影することをさらに含んでいてもよい。【００７５】
上記の方法が、培地保持槽の培地を補充又は置換することをさらに含んでいてもよい。
【発明の効果】
【００７６】
本発明によれば、細胞を効率よく簡便に培養又は誘導可能な方法を提供可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】実施形態に係る細胞培養器の分解斜視図である。
【図２】実施形態に係る細胞培養器の斜視図である。
【図３】実施形態に係る細胞培養器の一部の正面図である。
【図４】実施形態に係る細胞培養器の一部の斜視図である。
【図５】実施形態に係る細胞培養器の一部の正面図である。
【図６】実施形態に係る細胞培養器の背面図である。
【図７】実施形態に係る細胞培養器の分解斜視図である。
【図８】実施例１に係る培養方法で培養された細胞の光学顕微鏡写真である。
【図９】実施例１に係る培養方法で培養された細胞をフローサイトメトリーで分析した結果を示すヒストグラムである。
【図１０】図１０（ａ）は、実施例２に係る培養方法で使用されたチューブの写真である。図１０（ｂ）は、実施例２に係る培養方法で培養された細胞の光学顕微鏡写真である。
【図１１】実施例２に係る培養方法で培養された細胞をフローサイトメトリーで分析した結果を示すヒストグラムである。
【図１２】実施例３に係る培養方法で培養された細胞の光学顕微鏡写真である。
【図１３】実施例３に係る培養方法で培養された細胞をフローサイトメトリーで分析した結果を示すヒストグラムである。
【図１４】実施例４に係る人工多能性幹細胞の作製方法で使用されたフラスコの写真である。
【図１５】実施例４に係る人工多能性幹細胞の作製方法で作製された細胞の光学顕微鏡写真である。
【図１６】実施例４に係る人工多能性幹細胞の作製方法で作製された細胞のコロニー数をコロニーの形態ごとに示すグラフである。
【図１７】実施例４に係る人工多能性幹細胞の作製方法で作製された細胞をフローサイトメトリーで分析した結果を示すヒストグラムである。
【図１８】実施例５に係る人工多能性幹細胞の作製方法で作製された細胞の光学顕微鏡写真である。
【図１９】実施例５に係る人工多能性幹細胞の作製方法で作製された細胞をフローサイトメトリーで分析した結果を示すヒストグラムである。
【図２０】実施例６に係る細胞培養器の分解斜視図である。
【図２１】実施例６に係る細胞培養器の斜視図である。
【図２２】実施例６に係る細胞塊の顕微鏡写真である。
【図２３】実施例６に係るｉＰＳ細胞のフローサイトメトリーの結果を示すヒストグラムである。
【図２４】実施例７に係る細胞塊の顕微鏡写真である。
【図２５】実施例７に係るｉＰＳ細胞のフローサイトメトリーの結果を示すヒストグラムである。
【図２６】実施例８に係る細胞塊の顕微鏡写真である。
【図２７】実施例８に係るｉＰＳ細胞のフローサイトメトリーの結果を示すヒストグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００７８】
実施形態に係る細胞の培養方法は、閉鎖系内で細胞を培養することを含む。閉鎖系とは、例えば、完全に閉鎖された系であり、閉鎖系内と外部との間でガスの交換が生じない。閉鎖系は、例えば密閉されており、閉鎖系内に外気が進入しない。例えば、閉鎖系内に閉鎖系外の細胞、微生物、ウイルス、及び塵が進入しない。例えば、閉鎖系内の物質が閉鎖系外に流出しない。
【００７９】
細胞は、閉鎖系内の液体培地中で培養されてもよいし、ゲル培地中で培養されてもよい。また、細胞は、閉鎖系内で接着培養されてもよいし、浮遊培養されてもよい。閉鎖系内で細胞を培養している間、培地は攪拌されてもよいし、攪拌されなくともよい。細胞を接着培養する際には、フィーダー細胞を用いてもよいし、フィーダー細胞を用いなくともよい。細胞を浮遊培養する際には、フィーダー細胞を用いなくともよい。
【００８０】
閉鎖系内で培養される細胞は、ヒトを含む動物細胞であってもよいし、昆虫細胞であってもよいし、植物細胞であってもよい。
【００８１】
閉鎖系内で培養される細胞は、例えば体細胞であってもよいし、分化細胞であってもよいし、未分化細胞であってもよいし、幹細胞であってもよい。閉鎖系内で培養される細胞は、特に限定されないが、例えば、血液系細胞、神経系細胞、心筋系細胞、上皮系細胞、血管内皮細胞、間葉系細胞、線維芽細胞、肝細胞、インスリン産生細胞、網膜色素上皮細胞、及び角膜細胞であってもよい。
【００８２】
血液系細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、メガカリオサイト、マクロファージ、顆粒球、好中球、好酸球、造血幹細胞、血液幹・前駆細胞、赤血球、白血球及び血小板等の血液細胞であってもよい。神経系細胞は、神経細胞及びグリア細胞、オリゴデンドロサイト、神経幹細胞であってもよい。心筋系細胞は、心筋幹細胞及び心筋細胞、ペースメーカー細胞であってもよい。上皮系細胞は、ケラチノサイト、腸管上皮細胞、口腔上皮、角膜上皮細胞上皮細胞であってもよい。間葉系細胞は、真皮細胞、骨芽細胞、脂肪細胞、筋細胞、及び軟骨細胞等であってもよい。
【００８３】
幹細胞は、例えば、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）及び体性幹細胞である。体性幹細胞は、間葉系幹細胞であってもよい。細胞が幹細胞である場合、幹細胞は、培地中で、未分化の状態を維持し、多能性を維持したまま増殖する。
【００８４】
例えば、幹細胞は、浮遊培養される前に、シングルセル又は細胞塊に分解され、シングルセル又は細胞塊に分解された幹細胞が、培地に入れられる。シングルセル又は細胞塊は、クローナリティを保ったまま増殖し、培地中でコロニーを形成する。
【００８５】
幹細胞は、例えば、幹細胞用培地中で培養される。幹細胞用培地としては、例えば、ｍＴｅＳＲ１（登録商標、ＳＴＥＭＣＥＬＬ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）等のヒトＥＳ／ｉＰＳ培地を使用可能である。
【００８６】
ただし、幹細胞用培地は、これに限定されず、種々の幹細胞培地が使用可能である。例えば、２０％ＫｎｏｃｋＯｕｔ  ＳＲ（登録商標、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）、ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）、及び非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）を含む培地を幹細胞培地として使用してもよい。あるいは、Ｐｒｉｍａｔｅ  ＥＳ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｄｉｕｍ、Ｒｅｐｒｏｓｔｅｍ、ＲｅｐｒｏＦＦ、ＲｅｐｒｏＦＦ２、ＲｅｐｒｏＸＦ（Ｒｅｐｒｏｃｅｌｌ）、ＴｅＳＲ２、ＴｅＳＲＥ８、ＲｅｐｒｏＴｅＳＲ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＰｌｕｒｉＳＴＥＭ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  ＥＳ／ｉＰＳ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｅｒｃｋ）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ  （登録商標）ＸＦ／ＦＦ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  ｉＰＳ  ａｎｄ  ＥＳ  Ｃｅｌｌｓ、Ｐｌｕｒｉｔｏｎ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、ＰｌｕｒｉＳＴＥＭ（登録商標）、Ｓｔｅｍｆｉｔ  ＡＫ０２Ｎ、Ｓｔｅｍｆｉｔ  ＡＫ０３（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ）、ＥＳＣ−Ｓｕｒｅ（登録商標）ｓｅｒｕｍ  ａｎｄ  ｆｅｅｄｅｒ  ｆｒｅｅ  ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  ｈＥＳＣ／ｉＰＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＳｔｅｍＣｅｌｌ）、及びＬ７（登録商標）ｈＰＳＣ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  （ＬＯＮＺＡ）等を幹細胞培地として使用してもよい。
【００８７】
閉鎖系内の培地は、閉鎖系内で培養される細胞の種類に応じて、適宜選択される。例えば、細胞が血液系細胞である場合、血液系細胞に適した培地が閉鎖系に入れられる。例えば、細胞が間葉系細胞である場合、間葉系細胞に適した培地が閉鎖系に入れられる。
【００８８】
培地は、例えば、ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ）等の成長因子を含まなくともよい。あるいは、培地は、ｂＦＧＦ等の成長因子を、４００μｇ／Ｌ以下、４０μｇ／Ｌ以下、あるいは１０μｇ／Ｌ以下の低濃度で含んでもよい。
【００８９】
また、培地は、ｔｇｆ−βを含まなくともよい。あるいは、培地は、ｔｇｆ−βを２μｇ／Ｌ（２ｎｇ／ｍＬ）以下、６００ｎｇ／Ｌ以下、３００ｎｇ／Ｌ以下、あるいは１００ｎｇ／Ｌ以下の低濃度で含んでもよい。
【００９０】
培地は、カドヘリン、ラミニン、フィブロネクチン、及びビトロネクチンからなる群から選択される少なくとも１種の物質を含んでいてもよい。
【００９１】
培地がゲル培地である場合、ゲル培地は、例えば、培地に脱アシル化ジェランガムを終濃度が０．００１重量％から０．５重量％、０．００５重量％から０．１重量％、あるいは０．０１重量％から０．０５重量％となるよう添加することにより調製される。
【００９２】
ゲル培地は、ジェランガム、ヒアルロン酸、ラムザンガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン、フコイダン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリチン硫酸、ケラト硫酸、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸、ラムナン硫酸、及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種の高分子化合物を含んでいてもよい。また、ゲル培地は、メチルセルロースを含んでいてもよい。メチルセルロースを含むことにより、細胞同士の凝集がより抑制される。
【００９３】
あるいは、ゲル培地は、poly(glycerol monomethacrylate) (PGMA)、poly(2-hydroxypropyl methacrylate) (PHPMA）、Poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAM)、amine terminated、carboxylic acid terminated、maleimide terminated、N-hydroxysuccinimide (NHS) ester terminated、triethoxysilane terminated、Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylamide)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylic acid)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-butylacrylate)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid-co-octadecyl acrylate)、及びN-Isopropylacrylamideから選択される少なくの温度感受性ゲルを含んでいてもよい。
【００９４】
なお、本開示において、ゲル状の培地あるいはゲル培地とは、ポリマー培地を包含する。
【００９５】
閉鎖系内で細胞を培養している間、閉鎖系内の培地の温度は、例えば、０℃以上、４℃以上、１５℃以上、２０℃以上、あるいは３４℃以上に保たれる。また、閉鎖系内で細胞を培養している間、閉鎖系内の培地の温度は、例えば、４５℃以下、３９℃以下、あるいは２０℃以下に保たれる。閉鎖系内で細胞を培養している間、ヒーター及びクーラー等の温度制御装置を用いて、閉鎖系内の培地の温度を制御してもよい。
【００９６】
閉鎖系に入れられる培地のｐＨは、例えば、４．０以上、５．０以上、６．０以上、７．０以上、あるいは８．０以上である。また、閉鎖系に入れられる培地のｐＨは、例えば、１０．０以下、９．０以下、８．８以下、あるいは８．０以下である。閉鎖系内に入れられた培地は、閉鎖系内に存在することにより、細胞を培養している間、ｐＨが上記範囲内に保たれる傾向にある。閉鎖系に入れられる培地のｐＨが７．０以上あるいは８．０以上であると、閉鎖系内で細胞を培養中に乳酸を中和してｐＨの低下を抑制するので、好ましい。
【００９７】
閉鎖系内で細胞を培養している間、閉鎖系内に二酸化炭素ガス、窒素ガス、及び酸素ガスの少なくともいずれか、あるいは全てを供給しなくともよい。また、閉鎖系内で細胞を培養している間、閉鎖系内の二酸化炭素濃度を制御しなくともよい。閉鎖系内で細胞を培養している間、閉鎖系外の二酸化炭素濃度を制御しなくともよい。例えば、閉鎖系を、二酸化炭素（ＣＯ２）インキュベーター内に配置しなくともよい。ただし、閉鎖系を、二酸化炭素（ＣＯ２）インキュベーター内に配置することは妨げられない。
【００９８】
閉鎖系内で細胞を培養する際には、閉鎖系内に空気層等のガス層がないか、少ないことが好ましい。そのため、閉鎖系内にはガス層が残らないか、少なくなるように、閉鎖系内に培地が充填されることが好ましい。
【００９９】
閉鎖系内で細胞を培養している間、培地は、外気に触れないように、閉鎖系内で循環させてもよい。閉鎖系内において、細胞懸濁液と、循環する培地との間に、半透膜を配置し、半透膜を介して、培地の有効成分を細胞懸濁液に浸透させてもよい。
【０１００】
閉鎖系内で、細胞は、例えば、３時間以上、１日以上、１４日以上、あるいは３０日以上培養される。ただし、継代、培地の交換、及び培地の追加の際には、閉鎖系は開放されてもよい。
【０１０１】
なお、細胞の播種と継代に間に、培地の交換及び追加を行わなくともよい。この場合、播種と継代の間では、閉鎖系が全く開放されることなく、閉鎖系内の細胞は培養される。播種と継代の間、例えば、１日以上、５日以上、あるいは１０日以上、閉鎖系が全く開放されることなく、閉鎖系内の細胞は培養される。
【０１０２】
細胞の継代と継代に間に、培地の交換及び追加を行わなくともよい。この場合、継代と継代の間では、閉鎖系が全く開放されることなく、閉鎖系内の細胞は培養される。継代と継代の間、例えば、１日以上、５日以上、あるいは１０日以上、閉鎖系が全く開放されることなく、閉鎖系内の細胞は培養される。
【０１０３】
あるいは、細胞の播種と継代に間に、閉鎖系を開放し、培地の追加又は交換をしてもよい。また、細胞の継代と継代に間に、閉鎖系を開放し、培地の追加又は交換をしてもよい。培地の追加又は交換は、１日以上おき、２日以上おき、あるいは５日以上おきにしてもよい。培地に追加又は交換と継代のとき以外は、閉鎖系が全く開放されることなく、閉鎖系内の細胞は培養される。
【０１０４】
また、実施形態に係る細胞の誘導方法は、閉鎖系内で細胞を誘導することを含む。閉鎖系は、上述したとおりである。誘導とは、リプログラミング、初期化、分化転換(Transdifferentiation or Lineage reprogramming)、分化誘導及び細胞の運命変更(Cell fate reprogramming)等を指す。
【０１０５】
閉鎖系内で誘導される細胞は、予め閉鎖系外で誘導因子を導入された細胞であってもよい。あるいは、閉鎖系内の培地に誘導因子を添加し、閉鎖系内で培養されている誘導因子を導入されていない細胞に誘導因子を導入して、閉鎖系内で細胞を誘導してもよい。
【０１０６】
閉鎖系内で誘導される細胞は、動物細胞であってもよいし、植物細胞であってもよい。
【０１０７】
細胞は、閉鎖系内の液体培地中で誘導されてもよいし、閉鎖系内のゲル培地中で誘導されてもよい。また、細胞は、閉鎖系内で接着培養されながら誘導されてもよいし、浮遊培養されながら誘導されてもよい。閉鎖系内で細胞を誘導している間、培地は攪拌されてもよいし、攪拌されなくともよい。細胞を接着培養しながら誘導する際には、フィーダー細胞を用いてもよいし、フィーダー細胞を用いなくともよい。細胞を浮遊培養しながら誘導する際には、フィーダー細胞を用いなくともよい。
【０１０８】
閉鎖系内で細胞は、ｉＰＳ細胞等の幹細胞に誘導されてもよい。閉鎖系内で細胞は、幹細胞以外の別種の細胞に誘導されてもよい。閉鎖系内でｉＰＳ細胞及びＥＳ細胞等の幹細胞が、別種の細胞に誘導されてもよい。
【０１０９】
閉鎖系内でｉＰＳ細胞に誘導される細胞は、血液細胞等の血液系細胞であってもよい。あるいは、閉鎖系内でｉＰＳ細胞に誘導される細胞は、繊維芽細胞、髄幹細胞、ケラチノサイト、毛乳頭細胞、口腔上皮細胞、及び体性幹前駆細胞等であってもよい。閉鎖系内で細胞は、例えば、血液系細胞、神経系細胞、心筋系細胞、上皮系細胞、間葉系細胞、肝細胞、インスリン産生細胞、網膜色素上皮細胞、及び角膜細胞に誘導されてもよい。
【０１１０】
血液細胞は、血液から分離される。血液は、例えば末梢血及び臍帯血であるが、これらに限定されない。血液は、成年から採取されてもよいし、未成年から採取されてもよい。採血の際には、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ヘパリン、及び生物学的製剤基準血液保存液Ａ液（ＡＣＤ−Ａ）液等の抗凝固剤を用いる。
【０１１１】
血液細胞は、例えば、単核球細胞（Ｍｏｎｏ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ）、好中球、好酸球、リンパ球、マクロファージ、血液幹・前駆細胞、及び血管内皮細胞等の有核細胞であり、赤血球、及び血小板を含まない。血液細胞は、例えば血管内皮前駆細胞、血液幹・前駆細胞、Ｔ細胞、又はＢ細胞であってもよい。Ｔ細胞は、例えばαβＴ細胞である。
【０１１２】
単核球細胞は、血液細胞の分離用媒体、及び遠心分離装置等を用いて、血液から分離される。血液細胞の分離用媒体としてＦｉｃｏｌｌ（ＧＥヘルスケア）を使用する場合の、単核球細胞の分離方法は、以下のとおりである。
【０１１３】
低温では単核球細胞の分離精度が悪くなる傾向にあるため、遠心機を４℃から４２℃好ましくは１８℃に設定する。成年又は未成年のヒトから１０μＬから５０ｍＬの血液を採血し、血液が固まらないように血液にＥＤＴＡを含むキレート剤を加えて優しく混ぜる。また、ヒトリンパ球分離用の媒体（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＲＥＭＩＵＭ、ＧＥヘルスケアジャパン）を５ｍＬずつ２本の１５ｍＬチューブに分注する。５ｍＬの血液に対して５ｍＬのＰＢＳを加えて希釈し、チューブ中のヒトリンパ球分離用の媒体の上に５ｍＬずつ重層する。この時、界面を乱さないように、希釈血液をチューブの管壁を伝わらせてゆっくりと媒体上に加える。
【０１１４】
チューブ中の溶液を、１０×ｇから１０００×ｇ、好ましくは４００×ｇで、４℃から４２℃好ましくは１８℃で５分から２時間、好ましくは３０分間遠心する。遠心後、チューブ中に白く濁った中間層が現れる。この白く濁った中間層は、単核球細胞を含んでいる。チューブ中の白く濁った中間層をピペットマンでゆっくりと回収し、新しい１５ｍＬチューブに移す。この際、下層は吸い取らないようにする。白く濁った中間層は、１本のチューブより１ｍＬ程度回収できる。２本分の中間層をまとめて１本のチューブに移す。
【０１１５】
回収した単核球細胞に対し、１ｍＬから４８ｍＬ、好ましくは１２ｍＬのＰＢＳを加えて、溶液をさらに１０×ｇから１０００×ｇ、好ましくは２００×ｇ、４℃から４２℃、好ましくは１８℃で１分から６０分、好ましくは１０分間遠心する。その後、アスピレータを用いて溶液の上清を吸引して除去し、１ｍＬから１２ｍＬ、好ましくは３ｍＬの既知組成無血清造血細胞培地（Ｘ−ＶＩＶＯ（登録商標）１０、ロンザ）を加えて懸濁し、単核球細胞懸濁液を得る。そのうち１０μＬの単核球細胞懸濁液をトリパンブルーで染色して血球計算盤でカウントする。
【０１１６】
採血管としてバキュテイナ（登録商標、ＢＤ）を使用する場合の、単核球細胞の分離方法は、以下のとおりである。
【０１１７】
低温では単核球細胞の分離精度が悪くなる傾向にあるため、遠心機を４℃から４２℃、好ましくは１８℃に設定する。成年又は未成年のヒトから、採血管（バキュテイナ（登録商標）、ＢＤ）を用いて８ｍＬ採血し、転倒混和して抗凝固剤と混和する。その後、バランスを調整し、溶液を４℃から４２℃、好ましくは１８℃、１００×ｇから３０００×ｇ、好ましくは１５００×ｇから１８００×ｇでスイングロータで１分から６０分、好ましくは２０分間遠心する。遠心後、血漿層である上層を取り除き、ピペッティングして単核球層とゲルに張り付いている血球を懸濁して懸濁液を得る。得られた懸濁液を、別の１５ｍＬチューブに移す。
【０１１８】
１５ｍＬチューブの懸濁液に１ｍＬから１４ｍＬ、好ましくは１２ｍＬのＰＢＳを加えて、懸濁液を４℃から４２℃、好ましくは１８℃、１００×ｇから３０００×ｇ、好ましくは２００×ｇで１分から６０分、好ましくは５分間遠心する。遠心後、上清をアスピレータで除去する。また、溶血剤（ＰｈａｒｍＬｙｓｅ（登録商標）、１０倍濃度、ＢＤ）を滅菌水で１倍濃度に希釈する。１５ｍＬチューブ中のペレットをタッピングでほぐし、１ｍＬから１４ｍＬ、好ましくは１ｍＬの溶血剤を加える。その後、室温で遮光し、１分間から６０分間、好ましくは１分間溶液を静置する。
【０１１９】
次に、１５ｍＬチューブに１ｍＬから１４ｍＬ、好ましくは１２ｍＬのＰＢＳを加えて、４℃から４２℃、好ましくは室温で、１００×ｇから３０００×ｇ、好ましくは２００×ｇで１分から６０分、５分間遠心する。遠心後、上清をアスピレータで除去し、１ｍＬから１５ｍＬ、好ましくは３ｍＬの既知組成無血清造血細胞培地（Ｘ−ＶＩＶＯ（登録商標）１０、ロンザ）を加えて懸濁し、単核球細胞懸濁液を得る。そのうち１０μＬの単核球細胞懸濁液をトリパンブルーで染色して血球計算盤でカウントする。
【０１２０】
血液から単核球細胞を分離する方法は、上記の方法に限られず、例えば、透析膜を使用して、血液から単核球を分離してもよい。また、全血単核球濃縮用ピュアセルセレクトシステム（登録商標、ＰＡＬＬ）、血球細胞除去用浄化器（セルソーバＥ、登録商標、旭化成）、及び血小板製剤用白血球除去フィルター（セパセルＰＬ、登録商標、ＰＬＸ−５Ｂ−ＳＣＤ、旭化成）等のフィルターも使用可能である。
【０１２１】
単核球細胞は、赤血球を重力沈降又は遠心分離することにより有核細胞を分離することが可能な赤血球沈降剤を用いて分離されてもよい。赤血球沈降剤の例としては、ＨｅｔａＳｅｐ（登録商標、ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＨＥＳ４０（ＮＩＰＲＯ）が挙げられる。
【０１２２】
また、単核球細胞としては、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄ社から販売されているＣＴＬ−ＵＰ１や、Ｓａｎｇｕｉｎｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＰＢＭＣ−００１等を使用してもよい。
【０１２３】
あるいは、血液細胞としては、セルバンカー１、ステムセルバンカー  ＧＭＰグレード、及びステムセルバンカー  ＤＭＳＯフリー  ＧＭＰグレード（ゼノアック）等の細胞凍結保存液を用いて凍結保存された血液細胞を解凍して用いてもよい。
【０１２４】
単核球細胞を解凍する際には、まず、１５ｍＬチューブに１ｍＬから１５ｍＬ、好ましくは８ｍＬの既知組成無血清造血細胞培地（Ｘ−ＶＩＶＯ（登録商標）１０、ロンザ）を入れておき、凍結した単核球細胞の入ったチューブを４℃から４２℃、好ましくは３７℃の温浴槽にいれて、単核球細胞を溶かし始める。その後、少し氷が残っている状態で、単核球細胞の入ったチューブを温浴槽から引きあげ、単核球細胞を既知組成無血清造血細胞培地の入ったチューブに移す。そのうち１０μＬの単核球細胞懸濁液をトリパンブルーで染色して血球計算盤でカウントする。
【０１２５】
血液細胞は、細胞表面マーカーに基づいて分離されてもよい。血液幹・前駆細胞は、ＣＤ３４が陽性である。Ｔ細胞は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８のいずれかが陽性である。Ｂ細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０のいずれかが陽性である。血液幹・前駆細胞、Ｔ細胞、又はＢ細胞は、例えば、自動磁気細胞分離装置及び免疫磁気ビーズを用いて、血液細胞から分離される。あるいは、予め分離された単核球細胞を用意してもよい。ただし、細胞表面マーカーに基づいて分離されていない血液細胞を用いてもよい。
【０１２６】
ＣＤ３４陽性細胞は、幹・前駆細胞であり、リプログラミングされやすい傾向にある。また、ＣＤ３陽性細胞であるＴ細胞を用いてｉＰＳ細胞を作製すると、Ｔ細胞由来のｉＰＳ細胞はＴＣＲリコンビネーションの型を保持しているので、Ｔ細胞に効率的に分化誘導できる傾向にある。
【０１２７】
接着培養されている細胞に、誘導因子を導入する。あるいは、ゲル培地で浮遊培養されている細胞に、誘導因子を導入する。誘導因子はＲＮＡであってもよい。誘導因子は、センダイウイルスに含まれていてもよい。あるいは、誘導因子は、トランスフェクションにより細胞に導入されてもよい。誘導因子はＤＮＡであってもよい。誘導因子は、プラスミドに含まれていてもよい。
【０１２８】
誘導因子は、例えば、アデノウイルス、レンチウイルス、及びレトロウイルスに含まれていてもよい。
【０１２９】
誘導因子はタンパク質であってもよい。
【０１３０】
センダイウイルスとしては、ＣｙｔｏＴｕｎｅ（登録商標、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が使用可能である。センダイウイルスの力価（タイター）の指標としては、感染多重度（ＭＯＩ）が挙げられる。センダイウイルスのＭＯＩは、例えば、０．１から１００．０、あるいは１．０から５０．０である。
【０１３１】
細胞を幹細胞に誘導する場合、例えば細胞に導入される誘導因子は、ＯＣＴ３／４のｍＲＮＡ、ＳＯＸ２のｍＲＮＡ、ＫＬＦ４のｍＲＮＡ、及びｃ−ＭＹＣのｍＲＮＡを含む。誘導因子として、ＯＣＴ４を改良したＭ３Ｏを使用してもよい。また、誘導因子は、ＬＩＮ２８Ａ、ＦＯＸＨ１、ＬＩＮ２８Ｂ、ＧＬＩＳ１、ｐ５３−ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ、ｐ５３−Ｐ２７５Ｓ、Ｌ−ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＤＰＰＡ２、ＤＰＰＡ４、ＤＰＰＡ５、ＺＩＣ３、ＢＣＬ−２、Ｅ−ＲＡＳ、ＴＰＴ１、ＳＡＬＬ２、ＮＡＣ１、ＤＡＸ１、ＴＥＲＴ、ＺＮＦ２０６、ＦＯＸＤ３、ＲＥＸ１、ＵＴＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ５、ＥＳＲＲＢ、ｍｉＲ−２９１−３ｐ、ｍｉＲ−２９４、ｍｉＲ−２９５、ＮＲ５Ａ１、ＮＲ５Ａ２、ＴＢＸ３、ＭＢＤ３ｓｈ、ＴＨ２Ａ、ＴＨ２Ｂ、及びＰ５３ＤＤからなる群から選択される少なくとも一つの因子のｍＲＮＡをさらに含んでいてもよい。これらのｍＲＮＡは、ＴｒｉＬｉｎｋから入手可能である。
【０１３２】
誘導因子に含まれるｍＲＮＡは、プソイドウリジン（Ψ）、５−メチルシトシン（ｍ５Ｃ）、５−メチルウリジン（５ｍｅＵ又はｍ５Ｕ）、Ｎ１−メチルシュードウリジン（ｍｅ１Ψ）、５−メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、５−ヒドロキシメチルウリジン（５ｈｍＵ）、５−フォーミルウリジン（５ｆＵ）、５−カルボキシメチルエステルウリジン（５ｃａｍＵ）、チエノグアノシン（ｔｈＧ）、Ｎ４−メチルシチジン（ｍｅ４Ｃ）、５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、５−メチオキシチジン（５ｍｏＣ）、５−ヒドロキシメチルシチジン（５ｈｍＣ）、５−ヒドロキシシチジン（５ｈｏＣ）、５−フォルムシチジン（５ｆＣ）、５−カルボキシシチジン（５ｃａＣ）、Ｎ６−メチル−２−アミノアデノシン（ｍ６ＤＡＰ）、ジアミノプリン（ＤＡＰ）、２’−Ｏ−メチルウリジン（Ｕｍ又はｍ２’−ＯＵ）、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）、及びＮ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）からなる群から選択される少なくとも１つで修飾されていてもよい。
【０１３３】
シトシンは５−メチルシトシン（ｍ５Ｃ）で置換されてもよい。ウラシルはシュードウラシルで置換されてもよい。
【０１３４】
誘導因子に含まれるｍＲＮＡは、ポリアデニル化されていてもよい。
【０１３５】
誘導因子に含まれるｍＲＮＡは、インビトロで転写される（ＩＶＴ）ＲＮＡのポリアデニル化によって調製されてもよい。ｍＲＮＡは、ポリ（Ａ）末端をコードするＤＮＡテンプレートを用いることによって、ＩＶＴの間にポリアデニル化されてもよい。ｍＲＮＡがキャッピングされてもよい。細胞における発現の効率性を最大化するために、大部分のｍＲＮＡ分子がキャップを含有することが好ましい。ｍＲＮＡは５’ｃａｐ［ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ］構造を有していてもよい。当該配列はｍＲＮＡを安定化させ、転写を促進させる配列である。５’ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅをもつｍＲＮＡからは、脱リン酸化処理により５’ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅを取り除いてもよい。ｍＲＮＡはＡｎｔｉ−Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｃａｐ  Ａｎａｌｏｇ（ＡＲＣＡ）として［３’Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ］を有していてもよい。ＡＲＣＡは転写開始点より前に挿入される配列であり、転写されるｍＲＮＡの効率は二倍となる。ｍＲＮＡはＰｏｌｙＡテールを有していてもよい。
【０１３６】
誘導因子に含まれるｍＲＮＡは、リボヌクレアーゼＩＩＩ（ＲＮａｓｅＩＩＩ）で処理されていてもよい。
【０１３７】
また、誘導因子に含まれるｍＲＮＡは、自己増殖能を持つリプリケイティブＲＮＡであってもよい。リプリケイティブＲＮＡとは、自己増殖能を持つＲＮＡであり、通常のＲＮＡと異なり、ＲＮＡの複製に必要なタンパク質を発現させる能力を併せ持っている。リプリケイティブＲＮＡはアルファウイルスの一種であるベネズエラ馬脳炎（ＶＥＥ）ウイルス由来である。リプリケイティブＲＮＡを細胞にトランスフェクションすると、リプログラミング因子を作り続けるＲＮＡを細胞に発現させることができるため、誘導因子ＲＮＡを細胞に複数回導入することを省くことが可能となる。
【０１３８】
リプリケイティブＲＮＡの配列は、アルファウイルスレプリコンＲＮＡ、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）、エバーグレーズ（Ｅｖｅｒｇｌａｄｅｓ）ウイルス、ムカンボ（Ｍｕｃａｍｂｏ）ウイルス、ピクスナ（Ｐｉｘｕｎａ）ウイルス、及び西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥ）からなる群から選択されるアルファウイルスから得られる配列を含んでいてよい。
【０１３９】
また、リプリケイティブＲＮＡは、シンドビス（Ｓｉｎｄｂｉｓ）ウイルス、セムリキ森林（Ｓｅｍｌｉｋｉ  Ｆｏｒｅｓｔ）ウイルス、ミデルブルグ（Ｍｉｄｄｅｌｂｕｒｇ）ウイルス、チクングニア（Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ）ウイルス、オニョンニョン（Ｏ’ｎｙｏｎｇ−ｎｙｏｎｇ）ウイルス、ロスリバー（Ｒｏｓｓ  Ｒｉｖｅｒ）ウイルス、バーマフォレスト（Ｂａｒｍａｈ  Ｆｏｒｅｓｔ）ウイルス、ゲタ（Ｇｅｔａｈ）ウイルス、サギヤマ（Ｓａｇｉｙａｍａ）ウイルス、ベバル（Ｂｅｂａｒｕ）ウイルス、マヤロ（Ｍａｙａｒｏ）ウイルス、ウナ（Ｕｎａ）ウイルス、アウラ（Ａｕｒａ）ウイルス、ワタロア（Ｗｈａｔａｒｏａ）ウイルス、ババンキ（Ｂａｂａｎｋｉ）ウイルス、Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈウイルス、ハイランドＪ（Ｈｉｇｈｌａｎｄｓ  Ｊ）ウイルス、フォートモーガン（Ｆｏｒｔ  Ｍｏｒｇａｎ）ウイルス、ヌドゥム（Ｎｄｕｍｕ）ウイルス、及びバギークリーク（Ｂｕｇｇｙ  Ｃｒｅｅｋ）ウイルスからなる群から選択されるアルファウイルスから得られる配列を含んでいてよい。
【０１４０】
リプリケイティブＲＮＡは、例えば、５’から３’に向かって、（ＶＥＥ  ＲＮＡレプリカーゼ）−（プロモーター）−（ＲＦ１）−（自己切断型ペプチド）−（ＲＦ２）−（自己切断型ペプチド）−（ＲＦ３）−（ＩＲＥＳもしくはコアプロモーター）−（ＲＦ４）−（ＩＲＥＳもしくは任意のプロモーター）−（任意に選択可能なマーカー）−（ＶＥＥ  ３’ＵＴＲ及びポリＡテール）−（任意に選択可能なマーカー）−プロモーターを含んでいる。上記のＲＦ１−４は、多能性細胞への細胞の脱分化を誘導する因子である。上記のＲＦ２−３、ＲＦ３−４、ＲＦ４は任意である。上記のＲＦ１−４は、ＯＣＴ−４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ−２、ｃ−ＭＹＣ、ＬＩＮ２８Ａ、ＬＩＮ２８Ｂ、ＧＬＩＳ１、ＦＯＸＨ１、ｐ５３−ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ、ｐ５３−Ｐ２７５Ｓ、Ｌ−ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＤＰＰＡ２、ＤＰＰＡ４、ＤＰＰＡ５、ＺＩＣ３、ＢＣＬ−２、Ｅ−ＲＡＳ、ＴＰＴ１、ＳＡＬＬ２、ＮＡＣ１、ＤＡＸ１、ＴＥＲＴ、ＺＮＦ２０６、ＦＯＸＤ３、ＲＥＸ１、ＵＴＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ５、ＥＳＲＲＢ、ｍｉＲ−２９１−３ｐ、ｍｉＲ−２９４、ｍｉＲ−２９５、ＮＲ５Ａ１、ＮＲ５Ａ２、ＴＢＸ３、ＭＢＤ３ｓｈ、ＴＨ２Ａ、及びＴＨ２Ｂからなる群から選択されてもよい。
【０１４１】
誘導因を導入される細胞が培養される培地は、誘導因を導入される細胞の種類に応じて適宜選択される。また、誘導因を導入された細胞が培養される培地は、誘導因を導入された細胞の種類に応じて適宜選択される。
【０１４２】
上述したように、培地は、例えば、ｂＦＧＦ等の成長因子を含まなくてもよいし、あるいは、成長因子を低濃度で含んでいてもよい。また、培地は、ｔｇｆ−βを含まないか、ｔｇｆ−βを低濃度で含んでいてもよい。培地は、カドヘリン、ラミニン、フィブロネクチン、及びビトロネクチンからなる群から選択される少なくとも１種の物質を含んでいてもよい。
【０１４３】
培地がゲル培地である場合、培地は、上述したように少なくとも１種の高分子化合物を含んでいてもよい。また、ゲル培地は、メチルセルロースを含んでいてもよい。あるいは、ゲル培地は、上述したように、温度感受性ゲルを含んでいてもよい。
【０１４４】
閉鎖系内で細胞を誘導している間、閉鎖系内の培地の温度は、例えば、上述した閉鎖系内で細胞を培養している間の温度と同様である。
【０１４５】
細胞が誘導される閉鎖系に入れられる培地のｐＨは、例えば、上述した細胞が培養される閉鎖系に入れられる培地のｐＨと同様である。
【０１４６】
閉鎖系内で細胞を誘導している間、閉鎖系内に二酸化炭素ガス、窒素ガス、及び酸素ガスの少なくともいずれか、あるいは全てを供給しなくともよい。また、閉鎖系内で細胞を誘導している間、閉鎖系内の二酸化炭素濃度を制御しなくともよい。閉鎖系内で細胞を誘導している間、閉鎖系外の二酸化炭素濃度を制御しなくともよい。例えば、閉鎖系を、二酸化炭素（ＣＯ２）インキュベーター内に配置しなくともよい。ただし、閉鎖系を、二酸化炭素（ＣＯ２）インキュベーター内に配置することは妨げられない。
【０１４７】
閉鎖系内で細胞を誘導する際には、閉鎖系内に空気層等のガス層がないか、少ないことが好ましい。そのため、閉鎖系内にはガス層が残らないか、少なくなるように、閉鎖系内に培地が充填されることが好ましい。
【０１４８】
閉鎖系内で細胞を誘導している間、培地は、外気に触れないように、閉鎖系内で循環させてもよい。閉鎖系内において、細胞懸濁液と、循環する培地との間に、半透膜を配置し、半透膜を介して、培地の有効成分を細胞懸濁液に浸透させてもよい。
【０１４９】
閉鎖系内で、細胞は、例えば、１日以上、１４日以上、あるいは３０日以上培養されながら誘導される。ただし、継代、培地の交換、及び培地の追加の際には、閉鎖系は開放されてもよい。
【０１５０】
なお、細胞の播種と継代に間に、培地の交換及び追加を行わなくともよい。この場合、播種と継代の間では、閉鎖系が全く開放されることなく、閉鎖系内の細胞は培養されながら誘導される。播種と継代の間、例えば、１日以上、５日以上、あるいは１０日以上、閉鎖系が全く開放されることなく、閉鎖系内の細胞は培養されながら誘導される。
【０１５１】
細胞の継代と継代に間に、培地の交換及び追加を行わなくともよい。この場合、継代と継代の間では、閉鎖系が全く開放されることなく、閉鎖系内の細胞は培養されながら誘導される。継代と継代の間、例えば、１日以上、５日以上、あるいは１０日以上、閉鎖系が全く開放されることなく、閉鎖系内の細胞は培養されながら誘導される。
【０１５２】
あるいは、細胞の播種と継代に間に、閉鎖系を開放し、培地の追加又は交換をしてもよい。また、細胞の継代と継代に間に、閉鎖系を開放し、培地の追加又は交換をしてもよい。培地の追加又は交換は、１日以上おき、２日以上おき、あるいは５日以上おきにしてもよい。培地に追加又は交換と継代のとき以外は、閉鎖系が全く開放されることなく、閉鎖系内の細胞は培養されながら誘導される。
【０１５３】
誘導因子を導入された細胞がｉＰＳ細胞に誘導（リプログラミング）されたか否かは、例えば、細胞の形態から確認することができる。あるいは、細胞がｉＰＳ細胞に誘導されたか否かは、サイトフローメータで、未分化であることを示す細胞表面マーカーであるＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＳＳＥＡ−１、及びＳＳＥＡ５から選択される少なくとも一つの表面マーカーが陽性であるか否かを分析することにより行うことができる。ＴＲＡ−１−６０は、ｉＰＳ／ＥＳ細胞に特異的な抗原であり、分化細胞では検出されない。ｉＰＳ細胞はＴＲＡ−１−６０陽性画分からのみできることから、ＴＲＡ−１−６０陽性細胞はｉＰＳ細胞の種と考えられる。
【０１５４】
実施形態に係る内部で細胞を培養又は誘導するための閉鎖系は、例えば、図１に示すような細胞培養器を備えていてもよい。細胞培養器は、培養成分が透過可能な培養成分透過部材１０と、培養成分透過部材１０の一方の面を覆う、細胞含有培地を保持し、細胞を培養するための培養槽３０と、培養成分透過部材１０の他方の面を覆う、培地を保持するための培地保持槽４０と、を備える。培養槽３０内の細胞含有培地は、培養成分透過部材１０に接触可能である。また、培地保持槽４０内の培地は、培養成分透過部材１０に接触可能である。培地保持槽４０内の培地は、細胞を含有していない。
【０１５５】
培養成分透過部材１０は、培地保持槽４０内の培地の有効成分を、培養槽３０内の細胞含有培地中に透過させる。また、培養成分透過部材１０は、培養槽３０内の細胞含有培地中の老廃物を、培地保持槽４０内の培地中に透過させてもよい。培養成分透過部材１０としては、例えば、半透膜及びメッシュが使用可能である。半透膜は、透析膜を含む。
【０１５６】
培養成分透過部材１０が半透膜である場合、半透膜の分画分子量は、例えば、０．１ＫＤａ以上、１０ＫＤａ以上、あるいは５０ＫＤａ以上である。半透膜は、例えば、セルロースエステル、エチルセルロース、セルロースエステル類、再生セルロース、ポリスルホン、ポリアクリルニトリル、ポリメチルメタクリレート、エチレンビニルアルコール共重合体、ポリエステル系ポリマーアロイ、ポリカーボネート、ポリアミド、セルロースアセテート、セルロースジアセテート、セルローストリアセテート、銅アンモニウムレーヨン、鹸化セルロース、ヘモファン膜、フォスファチジルコリン膜、及びビタミンＥコーティング膜等からなる。
【０１５７】
培養成分透過部材１０がメッシュである場合、メッシュは、培養槽３０内で培養される細胞又は細胞塊よりも小さい孔を有する。これにより、培養槽３０内の細胞又は細胞塊が培地保持槽４０内に移動することが妨げられる。メッシュの材料は、例えば樹脂及び金属であるが、特に限定されない。培養成分透過部材１０の表面は、細胞非接着性であってもよい。
【０１５８】
実施形態に係る細胞培養器は、培養成分透過部材１０を挟む、それぞれ開口が設けられた培養側プレート２１及び培地側プレート２２と、をさらに備えていてもよい。培養側プレート２１及び培地側プレート２２は、培養槽３０内の細胞含有培地及び培地保持槽４０内の培地の圧力により、培養成分透過部材１０が変動することを抑制するよう、培養成分透過部材１０を挟み込むようにして、培養成分透過部材１０を保持する。これにより、圧力変動により、培養成分透過部材１０が培養槽３０あるいは培地保持槽４０の内壁に接触することが抑制される。培養側プレート２１及び培地側プレート２２は、培養槽３０内の細胞含有培地及び培地保持槽４０内の培地から受ける圧力で変動しない硬さを有する。培養側プレート２１及び培地側プレート２２の材料は、例えば樹脂及び金属であるが、特に限定されない。培養側プレート２１の表面は、細胞非接着性であってもよい。なお、培養成分透過部材１０が培養槽３０内の細胞含有培地及び培地保持槽４０内の培地から受ける圧力により変動しない場合、培養側プレート２１及び培地側プレート２２は省略されてもよい。
【０１５９】
培養側プレート２１には、培養槽３０内の細胞含有培地が培養成分透過部材１０に接することができるよう、開口が設けられている。また、培地側プレート２２には、培地保持槽４０内の培地が培養成分透過部材１０に接することができるよう、開口が設けられている。培養側プレート２１の開口を介して、培養槽３０内の細胞含有培地の成分及び培地保持槽４０内の培地の成分が培養成分透過部材１０を透過可能である。培養側プレート２１及び培地側プレート２２のそれぞれに設けられた開口の形状は、例えば円であるが、特に限定されない。培養側プレート２１及び培地側プレート２２のそれぞれに設けられた開口は、培養成分透過部材１０が変動することを抑制できる範囲内の大きさを有する。開口は、例えば、格子状に、あるいはランダムに、培養側プレート２１及び培地側プレート２２のそれぞれに設けられる。
【０１６０】
培養側プレート２１は、例えば黒色等の濃色を有していてもよい。培養側プレート２１が濃色を有していると、培養側プレート２１を背景として、細胞含有培地中の細胞を高いコントラストで視認したり、画像化したりすることが可能である。培養側プレート２１の開口が設けられていない部分の面積等の大きさが、細胞あるいは細胞塊よりも大きいと、培養側プレート２１の開口が設けられていない部分を背景として細胞あるいは細胞塊を高いコントラストで視認したり、画像化したりすることが容易になる。ただし、細胞あるいは細胞塊に照射する光を調整することにより、培養成分透過部材１０や培養側プレート２１が透明であっても、細胞あるいは細胞塊を視認したり、画像化したりすることも可能である。
【０１６１】
培養槽３０と、培地保持槽４０と、は、ネジ、ピンあるいは電磁石等で固定されてもよい。培養槽３０の接触部と、培養側プレート２１の一方の面の少なくとも一部と、が密着する。培養側プレート２１の他方の面の少なくとも一部と、培養成分透過部材１０の一方の面の少なくとも一部と、が密着する。培養成分透過部材１０の他方の面の少なくとも一部と、培地側プレート２２の一方の面の少なくとも一部と、が密着する。培地側プレート２２の他方の面の少なくとも一部と、培地保持槽４０の接触部と、が密着する。密着させる際には、適宜、パッキン等を使用してもよい。パッキンは、例えば、培養成分透過部材１０と培養槽３０の間に配置されてもよい。パッキンは、培養成分透過部材１０の外周と培養槽３０の間に配置されてもよい。培養成分透過部材１０と培養槽３０の間に配置されるパッキンの外径は、培養成分透過部材１０の外径より大きくてもよい。また、パッキンは、例えば、培養成分透過部材１０と培地保持槽４０の間に配置されてもよい。パッキンは、培養成分透過部材１０の外周と培地保持槽４０の間に配置されてもよい。培養成分透過部材１０と培地保持槽４０の間に配置されるパッキンの外径は、培養成分透過部材１０の外径より大きくてもよい。
【０１６２】
培養槽３０は、例えば、筐体３１及び筐体３１を覆うカバー３２を備える。筐体３１及びカバー３２は一体化していてもよい。培養槽３０の内壁には、細胞が接着しないよう、ｐｏｌｙ−ＨＥＭＡ（ｐｏｌｙ  ２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ  ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）等の細胞非接着性物質をコーティングして、培養槽３０の内壁を細胞非接着性にしてもよい。筐体３１には、培養側プレート２１の開口を介して培養成分透過部材１０を露出させるための開口１３１が設けられている。図２に示すように、培養槽３０のカバー３２には、培養槽３０内の細胞含有培地を観察可能な窓１３２が設けられている。窓１３２の材料としては、例えば、ガラス及び樹脂が使用可能である。
【０１６３】
実施形態に係る細胞培養器は、窓１３２を加熱及び冷却するための、温度調節部を備えていてもよい。温度調節部は、窓１３２に配置され、窓を加熱する透明導電膜等の透明ヒーターであってもよい。あるいは、実施形態に係る細胞培養器は、培養槽３０の筐体３１又はカバー３２を加熱及び冷却するための温度調節部を備えていてもよい。筐体３１、カバー３２、及び窓１３２のいずれかを温度調節部で温度調節することにより、培養槽３０内の細胞含有培地を温度調節することが可能である。実施形態に係る細胞培養器は、培養槽３０内の細胞含有培地の温度を測る温度計をさらに備えていてもよい。温度計は、細胞含有培地に接触することなく培養槽３０の温度に基づいて細胞含有培地の温度を測ってもよいし、細胞含有培地に接触して細胞含有培地の温度を直接測ってもよい。この場合、細胞含有培地の温度が所定の温度となるよう、温度調節部がフィードバック制御されてもよい。
【０１６４】
図１に示すように、培養槽３０には、培養槽３０内に流体を供給するための供給口２３１と、培養槽３０内の流体を排出するための排出口３３１と、が、設けられている。例えば、供給口２３１に、流体を供給するためのバッグ、蛇腹及びシリンジ等の供給器を接続可能な図２に示すプラグ３３が挿入される。供給器は、ポンプ等の流体機械であってもよい。ただし、図１に示す供給口２３１に、注入装置が直接接続されてもよい。供給器は供給口２３１に着脱可能であり、供給器が供給口２３１に接続されていない場合は、供給口２３１は密閉可能であり、供給口２３１を介した培養槽３０内外の流体の交換が生じない。
【０１６５】
プラグ３３は、ニードルレスコネクターであってもよい。ニードルレスコネクターは、スプリットセプタム型であってもよいし、メカニカルバルブ型であってもよい。プラグ３３がスプリットセプタム型のニードレスコネクターである場合、プラグ３３は、スリットが設けられたディスク弁を備える。培養槽３０内に流体を供給する際には、ディスク弁のスリットに供給器あるいは供給器に接続された流路が挿入される。スリットに供給器あるいは供給器に接続された流路が挿入されていない場合、スリットは密閉する。スリットに供給器あるいは供給器に接続された流路が挿入された場合、ディスク弁は供給器あるいは供給器に接続された流路の外周に密着する。したがって、プラグ３３に供給器あるいは供給器に接続された流路が挿入された場合も、プラグ３３を介して外気が培養槽３０内に進入しない。ただし、プラグ３３は、針が刺入されるコネクターであってもよい。
【０１６６】
また、例えば、排出口３３１に、培養槽３０内の流体を排出するためのバッグ、蛇腹及びシリンジ等の排出器が接続可能な図２に示すプラグ３４が挿入される。排出器は、ポンプ等の流体機械であってもよい。ただし、図１に示す排出口３３１に、排出器が直接接続されてもよい。排出器は、能動的に培養槽３０内の流体を吸引してもよい。あるいは、排出器は、培養槽３０内の圧力に応じて受動的に内部容積を増加させ、培養槽３０から押し出された流体を受容してもよい。排出器は排出口３３１に着脱可能であり、排出器が排出口３３１に接続されていない場合は、排出口３３１は密閉可能であり、排出口３３１を介した培養槽３０内外の流体の交換が生じない。プラグ３４は、ニードルレスコネクターであってもよい。ニードルレスコネクターは、スプリットセプタム型であってもよいし、メカニカルバルブ型であってもよい。プラグ３４に排出器あるいは排出器に接続された流路が挿入された場合も、プラグ３４を介して外気が培養槽３０内に進入しない。ただし、プラグ３４は、針が刺入されるコネクターであってもよい。
【０１６７】
例えば、培養槽３０が、培養側プレート２１、培養成分透過部材１０、及び培地側プレート２２を間に挟んで培地保持槽４０に密着している状態であり、培養槽３０内に空気が入っている場合、排出口３３１から培養槽３０内の空気を排出しながら、供給口２３１から培養槽３０内に細胞含有培地を注入することにより、図２に示す培養槽３０内に細胞含有培地を入れることが可能である。また、培養槽３０内の空気層を完全になくすことも可能である。ただし、培養槽３０内に空気層が残っていてもよい。培養槽３０内に既に細胞含有培地が入っている場合、図１に示す排出口３３１から培養槽３０内の細胞含有培地を排出しながら、供給口２３１から培養槽３０内に別の細胞含有培地を注入することにより、図２に示す培養槽３０内の細胞含有培地の少なくとも一部を置換することが可能である。
【０１６８】
実施形態に係る細胞培養器は、培養槽３０を保持可能であり、培養槽３０の傾きを調整可能な培養槽保持部材をさらに備えていてもよい。培養槽３０の傾きを調整することにより、培養槽３０内の空気等のガスを排出することが容易になる。
【０１６９】
培養槽３０の供給口２３１及び排出口３３１は、栓等により閉塞可能である。あるいは、培養槽３０の供給口２３１及び排出口３３１にそれぞれ接続されるプラグ３３及びプラグ３４が閉塞可能である。また、あるいは、培養槽３０の供給口２３１は供給器に接続されることによって、外部から遮蔽され、培養槽３０の排出口３３１は排出器に接続されることによって、外部から遮蔽されることが可能である。供給口２３１及び排出口３３１が閉塞され、図２に示すように培養槽３０が培地保持槽４０に密着させられた場合、培養槽３０内は培養槽３０外の空気から密閉される。これにより、培養槽３０内に外気が進入することが抑制され、培養槽３０内の細胞含有培地のｐＨの変化が抑制され、所定の範囲内に保たれる。なお、本発明者らの知見により、細胞は、完全に閉鎖された密閉空間で培養可能であるため、培養槽３０内に、二酸化炭素ガス、窒素ガス、及び酸素ガス等を積極的に供給しなくともよい。そのため、培養槽３０をＣＯ２インキュベーター内に配置しなくともよい。また、密閉されている培養槽３０内に、培養槽３０外に存在する細胞、微生物、ウイルス、及び塵等が進入しないため、培養槽３０内の清浄度が保たれる。そのため、培養槽３０をクリーンルーム内に配置しなくともよい。培養槽３０は、ガス非透過性物質で包埋されていてもよい。換言すれば、培養槽３０は、ガス非透過性物質中に埋め込まれていてもよい。
【０１７０】
図１に示す培地保持槽４０には、培地側プレート２２の開口を介して培養成分透過部材１０を露出させるための図３に示す開口１４０が設けられている。開口１４０は、図１に示す培養成分透過部材１０で覆われる。また、図３に示す培地保持槽４０には、培地保持槽４０内に流体を導入するための導入口２４０と、培地保持槽４０内の流体を排出するための排出口３４０が設けられている。さらに、培地保持槽４０内には、複数の整流板４１が配置されていてもよい。複数の整流板４１は、例えば、培地保持槽４０の対向する内壁から、交互に突出するように配置されている。
【０１７１】
例えば、培地保持槽４０が、図１に示す培地側プレート２２、培養成分透過部材１０、及び培養側プレート２１を間に挟んで培養槽３０に密着している状態であり、培地保持槽４０内に空気が入っている場合、図３に示す排出口３４０から培地保持槽４０内の空気を排出しながら、導入口２４０から培地保持槽４０内に細胞培地を注入することにより、培地保持槽４０内に細胞培地を入れることが可能である。また、培地保持槽４０内に既に培地が入っている場合、排出口３４０から培地保持槽４０内の細胞培地を排出しながら、導入口２４０から培地保持槽４０内に細胞培地を注入することにより、培地保持槽４０内に細胞培地を流すことが可能である。
【０１７２】
複数の整流板４１が培地保持槽４０内に配置されている場合、培地保持槽４０内において、培地は、導入口２４０から排出口３４０に向かって、複数の整流板４１に沿って流れる。そのため、培地の成分が、培養成分透過部材１０に接触する機会が確保される。
【０１７３】
あるいは、図４に示すように、培地保持槽４０の内壁に、図３に示す導入口２４０に連通する１又は複数の吐出口２４１を設けてもよい。図４に示す複数の吐出口２４１は、例えば、横一列に設けられる。複数の吐出口２４１の数や、配列は、均等に配置されてもよいし、ランダムに配置されてもよい。複数の吐出口２４１の数や、配列は、培地の粘度等の特性に応じて設定される。図５に示すように、培地を複数の吐出口２４１から吐出することにより、培地保持槽４０内において、培養成分透過部材１０に接触する培地の均一性を向上することが可能である。
【０１７４】
培地保持槽４０の内壁には、１又は複数の吐出口２４１が設けられた吐出ブロック１４５が挿入可能であってもよい。例えば、複数の吐出口２４１の数や配列等のパターンが異なる吐出ブロック１４５を用意して、培地や培養される細胞の特性に応じて使い分けてもよい。培地保持槽４０の内壁の重力に対して上側は、上方又は下方に屈曲又は湾曲していてもよい。培地保持槽４０の内壁の重力に対して下側は、上方又は下方に屈曲又は湾曲していてもよい。
【０１７５】
図４及び図５に示すように、培地保持槽４０の内壁の複数の吐出口２４１近傍には、開口２４２が設けられていてもよい。複数の吐出口２４１から吐出された培地が培地保持槽４０内に貯まるにつれて、培地保持槽４０内の空気が開口２４２から外部に流出する。培地を培地保持槽４０に入れた後、開口２４２は密閉してもよい。
【０１７６】
図３に示すように、培地保持槽４０の導入口２４０と排出口３４０は、培地流路２００で接続され、培地保持槽４０と、培地流路２００と、の間を培地が循環可能であってもよい。培地流路２００は、樹脂チューブやシリコンチューブ等を備えていてもよい。培地流路２００は、ガス非透過性物質で包埋されていてもよい。換言すれば、培地流路２００は、ガス非透過性物質中に埋め込まれていてもよい。例えば、培地流路２００は、樹脂、ガラス、及び金属等からなる部材中に設けられた孔であってもよい。この場合、例えば、凹部が設けられた部材同士を貼りあわせることにより、培地流路２００が形成される。培地流路２００には、培地を培地保持槽４０内に導入し、培地を培地保持槽４０内から排出するための流体機械が設けられていてもよい。流体機械は、例えば、培地を培地保持槽４０内に導入するための導入用流体機械５１と、培地を培地保持槽４０内から排出するための排出用流体機械５２と、を備える。
【０１７７】
図１に示す導入用流体機械５１及び排出用流体機械５２としては、容積式ポンプが使用可能である。容積式ポンプの例としては、ピストンポンプ、プランジャーポンプ、及びダイヤフラムポンプを含む往復ポンプ、あるいは、ギアポンプ、ベーンポンプ、及びネジポンプを含む回転ポンプが挙げられる。ダイヤフラムポンプの例としては、チュービングポンプ及び圧電（ピエゾ）ポンプが挙げられる。チュービングポンプは、ペリスタルティックポンプと呼ばれる場合もある。また、様々な種類のポンプを組み合わせたマイクロ流体チップモジュールを用いてもよい。
【０１７８】
ペリスタポンプ（登録商標）、チュービングポンプ、及びダイヤフラムポンプ等の密閉型ポンプを用いると、図３に示す培地流路２００内部の培地にポンプが直接接触することなく、送液することが可能である。あるいは、導入用流体機械５１及び排出用流体機械５２としては、シリンジポンプを使用してもよい。密閉型ポンプ以外のポンプであっても、加熱滅菌処理等により再利用が可能である。
【０１７９】
導入用流体機械５１が密閉型ポンプである場合、図１に示すように、導入用流体機械５１は、ポンプヘッド１５１と、モーター等の駆動部２５１と、を備える。ポンプヘッド１５１と、駆動部２５１と、は、着脱可能である。ポンプヘッド１５１は、チューブ等の培地流路を外側からしごくローラーを備える。駆動部２５１は、ポンプヘッド１５１のローラーを回転させる。排出用流体機械５２が密閉型ポンプである場合、排出用流体機械５２は、ポンプヘッド１５２と、モーター等の駆動部２５２と、を備える。ポンプヘッド１５２と、駆動部２５２と、は、着脱可能である。ポンプヘッド１５２は、チューブ等の培地流路を外側からしごくローラーを備える。駆動部２５２は、ポンプヘッド１５２のローラーを回転させる。
【０１８０】
図３に示すように、培地流路２００には、培地が入ることができる培地タンク６０が設けられていてもよい。培地流路２００から培地タンク６０に入った培地は、再び、培地流路２００に流れ出ていく。培地タンク６０を設けることにより、培地流路２００と培地保持槽４０との間を循環する培地の容量を大きくすることが可能である。
【０１８１】
培地タンク６０には、培地タンク６０内に流体を供給するための供給口と、培地タンク６０内の流体を排出するための排出口と、が、設けられていてもよい。例えば、培地タンク６０の供給口に、流体を供給するためのバッグ、蛇腹及びシリンジ等の供給器を接続可能な図６に示すプラグ６１が挿入される。供給器は、ポンプ等の流体機械であってもよい。ただし、培地タンク６０の供給口に、供給器が直接接続されてもよい。供給器は供給口に着脱可能であり、供給器が供給口に接続されていない場合は、供給口は密閉可能であり、供給口を介した培地流路２００内外の流体の交換が生じない。あるいは、供給口は、供給器に接続されることによって、外部から遮蔽される。プラグ６１は、ニードルレスコネクターであってもよい。ニードルレスコネクターは、スプリットセプタム型であってもよいし、メカニカルバルブ型であってもよい。プラグ６１に供給器あるいは供給器に接続された流路が挿入された場合も、プラグ６１を介して外気が培地タンク６０内に進入しない。ただし、プラグ６１は、針が刺入されるコネクターであってもよい。
【０１８２】
また、例えば、培地タンク６０の排出口に、培地タンク６０内の流体を排出するためのバッグ、蛇腹及びシリンジ等の排出器が接続可能なプラグ６２が挿入される。排出器は、ポンプ等の流体機械であってもよい。ただし、培地タンク６０の排出口に、排出器が直接接続されてもよい。排出器は、能動的に培地流路内の流体を吸引してもよい。あるいは、排出器は、培地流路内の圧力に応じて受動的に内部容積を増加させ、培地流路から押し出された流体を受容してもよい。排出器は排出口に着脱可能であり、排出器が排出口に接続されていない場合は、排出口は密閉可能であり、排出口を介した培地流路２００内外の流体の交換が生じない。あるいは、排出口は、排出器に接続されることによって、外部から遮蔽される。プラグ６２は、ニードルレスコネクターであってもよい。ニードルレスコネクターは、スプリットセプタム型であってもよいし、メカニカルバルブ型であってもよい。プラグ６２に排出器あるいは排出器に接続された流路が挿入された場合も、プラグ６２を介して外気が培地タンク６０内に進入しない。ただし、プラグ６２は、針が刺入されるコネクターであってもよい。
【０１８３】
例えば、図１に示す培地保持槽４０が、培地側プレート２２、培養成分透過部材１０、及び培養側プレート２１を間に挟んで培養槽３０に密着している状態であり、図３に示す培地保持槽４０、培地流路２００及び培地タンク６０内に空気が入っている場合、培地タンク６０の排出口から培地保持槽４０、培地流路２００及び培地タンク６０内の空気を排出しながら、培地タンク６０の供給口から培地保持槽４０、培地流路２００及び培地タンク６０内に培地を注入することにより、培地保持槽４０、培地流路２００及び培地タンク６０内に培地を入れることが可能である。培地保持槽４０、培地流路２００及び培地タンク６０内の空気層を完全になくしてもよいし、空気層が残っていてもよい。
【０１８４】
培地流路２００に、培地が充填された供給器と空の排出器を接続し、流体機械を駆動させて、供給器から培地流路２００に培地を導入させ、排出器に空気を導入させてもよい。この際、供給器が能動的に培地流路２００に培地を注入してもよいし、流体機械の駆動により低圧になった培地流路２００に供給器内の培地が吸引され、供給器内の内部容積が受動的に減少しもよい。また、排出器が能動的に培地流路２００内の空気を吸引してもよいし、流体機械の駆動により高圧になった培地流路２００内の空気が排出器に流入し、排出器の内部容積が受動的に増加してもよい。
【０１８５】
また、培地保持槽４０、培地流路２００及び培地タンク６０内に既に培地が入っている場合、培地タンク６０の排出口から培地タンク６０内の培地を排出しながら、培地タンク６０の供給口から培地タンク６０内に培地を注入することにより、培地タンク６０内に細胞培地を置換することが可能である。
【０１８６】
培地流路２００に、培地が充填された供給器と空の排出器を接続し、流体機械を駆動させて、供給器から培地流路２００に新しい培地を導入させ、排出器に古い培地を導入させてもよい。この際、供給器が能動的に培地流路２００に新しい培地を注入してもよいし、流体機械の駆動により低圧になった培地流路２００に供給器内の新しい培地が吸引され、供給器内の内部容積が受動的に減少しもよい。また、排出器が能動的に培地流路２００内の古い培地を吸引してもよいし、流体機械の駆動により高圧になった培地流路２００内の古い培地が排出器に流入し、排出器の内部容積が受動的に増加してもよい。
【０１８７】
培地流路２００及び培地保持槽４０内に培地を供給するための供給口と、培地流路２００及び培地保持槽４０内の空気を排出するための排出口は、培地流路２００の培地タンク６０が設けられた部分以外に設けられていてもよい。例えば、培地流路２００及び培地保持槽４０内に培地を供給するための供給口と、培地流路２００及び培地保持槽４０内の空気を排出するための排出口は、培地流路２００に設けられていてもよい。
【０１８８】
実施形態に係る細胞培養器は、培地保持槽４０、培地流路２００、及び培地タンク６０の少なくともいずれかを加熱及び冷却するための、温度調節部を備えていてもよい。培地保持槽４０、培地流路２００、及び培地タンク６０のいずれかを温度調節部で温度調節することにより、培地を温度調節することが可能である。実施形態に係る細胞培養器は、培地の温度を測る温度計をさらに備えていてもよい。温度計は、培地に接触することなく培地保持槽４０、培地流路２００、及び培地タンク６０の少なくともいずれかの温度に基づいて培地の温度を測ってもよいし、培地に接触して培地の温度を直接測ってもよい。この場合、培地の温度が所定の温度となるよう、温度調節部がフィードバック制御されてもよい。
【０１８９】
図３に示すように、培地保持槽４０、培地流路２００、ポンプヘッド１５１、ポンプヘッド１５２、及び培地タンク６０は、流路ケース７０内に格納されてもよい。流路ケース７０内において、培地保持槽４０、培地流路２００、ポンプヘッド１５１、ポンプヘッド１５２、及び培地タンク６０は、ガス非透過性物質中に完全に埋め込まれていてもよい。培地流路２００は、ガス非透過性物質中にトンネル状に設けられていてもよい。例えば、流路ケース７０には、ポンプヘッド１５１に軸を挿入するための穴、ポンプヘッド１５２に軸を挿入するための穴、培地タンク６０の供給口にプラグ６１を挿入するための穴、及び培地タンク６０の排出口にプラグ６２を挿入するための穴が設けられている。培地タンク６０の供給口にプラグ６１を挿入するための穴、及び培地タンク６０の排出口にプラグ６２を挿入するための穴は、塞ぐことが可能であってもよい。
【０１９０】
図７に示すように、導入用流体機械５１の駆動部２５１及び排出用流体機械５２の駆動部２５２は、基板状の駆動部保持部材８０に配置されてもよい。駆動部保持部材８０には、培地タンク６０の供給口にプラグ６１を挿入するための穴、及び培地タンク６０の排出口にプラグ６２を挿入するための穴８２が設けられている。培地タンク６０の供給口にプラグ６１を挿入するための穴、及び培地タンク６０の排出口にプラグ６２を挿入するための穴８２は、塞ぐことが可能であってもよい。
【０１９１】
駆動部保持部材８０は、図１に示すパッキン９０を介して、流路ケース７０に密着させられる。パッキン９０は、流路ケース７０と駆動部保持部材８０の接触部から流路ケース７０内に空気が進入することを抑制する。
【０１９２】
培地を培地保持槽４０内に導入し、培地を培地保持槽４０内から排出するための流体機械を流体機械用外気遮断部材で覆ってもよい。流体機械用外気遮断部材は、例えば、図７に示すように、駆動部保持部材８０に配置された導入用流体機械５１の駆動部２５１を覆う導入用流体機械用外気遮断部材３５１と、駆動部保持部材８０に配置された排出用流体機械５２の駆動部２５２を覆う排出用流体機械用外気遮断部材３５２と、を備える。
【０１９３】
流路ケース７０と、駆動部保持部材８０と、は、着脱可能である。駆動部保持部材８０を流路ケース７０に密着させ、培地タンク６０の供給口にプラグ６１を挿入するための穴、及び培地タンク６０の排出口にプラグ６２を挿入するための穴を塞ぎ、導入用流体機械５１の駆動部２５１を導入用流体機械用外気遮断部材３５１で覆い、排出用流体機械５２の駆動部２５２を排出用流体機械用外気遮断部材３５２で覆うと、流路ケース７０内が外気から遮断され、流路ケース７０内に外気が進入することができなくなる。そのため、流路ケース７０内外のガスの交換が生じなくなる。したがって、培地保持槽４０及び培地流路２００内に外気が進入しなくなる。培地流路用外気遮断部材の少なくとも一部を構成する流路ケース７０内を外気から遮断することにより、培地流路２００がガス透過性のチューブであっても、培地保持槽４０及び培地流路２００内の培地のｐＨの変動を抑制し、所定の範囲内に保つことが可能となる。
【０１９４】
なお、本発明者らの知見により、細胞は、完全に閉鎖された密閉空間で培養可能であるため、培地保持槽４０及び培地流路２００内に、二酸化炭素ガス、窒素ガス、及び酸素ガス等を積極的に供給しなくともよい。そのため、培地保持槽４０及び培地流路２００をＣＯ２インキュベーター内に配置しなくともよい。また、密閉されている培地保持槽４０及び培地流路２００内に、培地保持槽４０及び培地流路２００外に存在する細胞、微生物、ウイルス、及び塵等が進入しないため、培地保持槽４０及び培地流路２００内の清浄度が保たれる。そのため、培地保持槽４０及び培地流路２００をクリーンルーム内に配置しなくともよい。培地保持槽４０は、ガス非透過性物質で包埋されていてもよい。換言すれば、培地保持槽４０は、ガス非透過性物質中に埋め込まれていてもよい。
【０１９５】
流路ケース７０から駆動部保持部材８０を外した際、培地タンク６０の供給口にプラグ６１を挿入するための流路ケース７０の穴、及び培地タンク６０の排出口にプラグ６２を挿入するための流路ケース７０の穴を塞ぐことにより、流路ケース７０内を密閉し、流路ケース７０内部の物質が外部に流出したり、流路ケース７０内に外気が進入したりすることを抑制することが可能である。
【０１９６】
内部に培地流路２００及びポンプヘッド１５１、１５２を含む流路ケース７０は、使い捨て可能である。一方、駆動部２５１、２５２を保持している駆動部保持部材８０は、繰り返し利用することが可能である。
【０１９７】
例えば、図２に示す導入用流体機械５１によって培地保持槽４０内に送液される培地の量と、排出用流体機械５２によって培地保持槽４０から排出される培地の量と、が同じになるよう、導入用流体機械５１及び排出用流体機械５２は制御される。導入用流体機械５１及び排出用流体機械５２は、培地保持槽４０内に、常時、培地を送液してもよいし、適宜間隔をおいて、培地を送液してもよい。
【０１９８】
培地を、常時、培地保持槽４０内に送液する場合、培地保持槽４０内に送液される培地の流量は、一定であっても、一定でなくてもよい。例えば、培地及び培地中の細胞塊を撮影装置で監視し、培地及び培地中の細胞塊の状態に応じて、培地保持槽４０内に送液される培地の流量を増加させたり、減少させたりしてもよい。
【０１９９】
また、培地保持槽４０内に培地を常時送液せずに、例えば、培地の状態、培地中の細胞塊の状態、細胞数、細胞塊数、培地の濁度、及びｐＨの変化に応じて、培地の送液の開始及び終了をしてもよい。この場合も、培地及び培地中の細胞塊の状態に応じて、送液される培地の流量を増加させたり、減少させたりしてもよい。
【０２００】
攪拌されている培地中では、細胞同士がランダムに衝突し、結合して、様々な大きさの細胞塊（コロニー）が形成される場合がある。そのためコロニー間の均質性が保てない場合がある。さらに、大きすぎるコロニーにおいては、コロニーの中まで栄養や成長因子が届かず、内部から分化、細胞死してしまう場合がある。その一方で、小さすぎるコロニーは、継代培養には適さない場合がある。これに対し、図２に示す培養槽３０内では、培地の流速が遅いか、培地が流動しないため、細胞同士が衝突する頻度が低い。そのため、コロニーにおいてクローナリティを維持することが可能である。したがって、例えば、細胞がｉＰＳ細胞等の幹細胞である場合、１つの細胞由来の幹細胞のクローナリティを担保することが可能である。また、幹細胞同士が衝突する頻度が低いため、幹細胞のコロニーの大きさを均質に保つことが可能である。
【０２０１】
実施形態に係る細胞培養器は、培養槽３０のカバー３２の窓１３２を介して、培養槽３０内の細胞含有培地を撮影する写真カメラやビデオカメラ等の撮影装置をさらに備えていてもよい。
【０２０２】
実施形態に係る細胞培養器によれば、例えば、完全閉鎖系で細胞が培養されるため、培養装置からの細胞の漏れ出しによるクロスコンタミネーションのリスクを低減することが可能である。また、例えば、細胞がＨＩＶ肝炎ウイルス等のウイルスに感染している場合であっても、細胞の漏れ出しによるオペレーターへの感染のリスクを低減することが可能である。さらに、細胞培養器内の培地が、細胞培養器外の空気中の細菌、ウイルス及びカビ等にコンタミネーションするリスクを低減することが可能である。またさらに、実施形態に係る細胞培養器によれば、ＣＯ２インキュベーターを用いることなく、細胞を培養することも可能である。
【０２０３】
なお、例えば、培地の循環が不要な場合は、図３に示す培地保持槽４０に培地流路２００を接続しなくともよい。また、培養槽３０内で細胞は浮遊培養されてもよいし、接着培養されてもよい。細胞が接着培養される場合、図１に示す培養側プレート２１の表面が細胞接着性であってもよいし、培養成分透過部材１０の表面が細胞接着性であってもよい。また、実施形態に係る細胞培養器の培養槽３０内で、細胞を培養しながら誘導してもよい。さらに、培地流路が培地保持槽や培養槽に接続されずに使用され、閉鎖系としての培地流路内で細胞を培養又は誘導してもよい。
【０２０４】
閉鎖系は、図１から図７に示した細胞培養器に限定されない。例えば、閉鎖系は容器であってもよい。容器は、チューブやフラスコであってもよい。容器は、樹脂製であってもよいし、ガラス製であってもよい。容器内部を完全に閉鎖するために、容器のキャップや蓋等の周囲を、パラフィンフィルム等のフィルムで巻き付けてもよい。
【実施例】
【０２０５】
（実施例１）
幹細胞培地（２０％ＫｎｏｃｋＯｕｔ  ＳＲ（登録商標、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２）をゲル化してゲル培地を作製した。ゲル培地のｐＨは、４．０から１０．０の間に調整した。ゲル培地にシングルセル又は細胞塊にされたｉＰＳ細胞を２×１０５個／ｍＬを添加した。１５ｍＬファルコンチューブ（登録商標、コーニング）にｉＰＳ細胞を含むゲル培地を入れた。その後、一部のファルコンチューブのキャップを固く締め、さらにファルコンチューブ及びキャップの周囲をパラフィンフィルム（パラフィルム、登録商標、Ｂｅｍｉｓ）で巻きつけ、ファルコンチューブ内を外気から遮断し、ファルコンチューブ内のガス（空気）が完全に外気と交換されないようにした。他のファルコンチューブは、キャップを締めるのみで、パラフィンフィルムを巻きつけなかった。【０２０６】
パラフィンフィルムで巻きつけなかったファルコンチューブを３７℃、二酸化炭素濃度が５％のインキュベーター内に配置し、ｉＰＳ細胞の浮遊培養を開始した。また、パラフィンフィルムで巻きつけたファルコンチューブを３７℃の恒温槽に配置し、ＣＯ２インキュベーターには入れずにｉＰＳ細胞の浮遊培養を開始した。恒温槽としては、温度を電子的に制御することができるビーズバス、ウォーターバス及び恒温機を使用した。恒温槽は、実験室内に配置され、実験室内の空気から遮蔽されていなかった。その後、２日に一度、それぞれのファルコンチューブのキャップを開け、２ｍＬのｐＨが４．０から１０．０の間のゲル培地をファルコンチューブ内に追加した。ゲル培地を追加した後は、上記のとおり、キャップを締め、恒温槽に配置するファルコンチューブは、キャップの周囲をパラフィンフィルムで巻きつけた。【０２０７】
ファルコンチューブ内での培養を開始してから７から１０日後、ファルコンチューブのキャップを開け、ゲル培地中に形成されたｉＰＳ細胞の細胞塊をフィルターを用いて回収し、ＰＢＳで洗浄し、ファルコンチューブに入れた。さらに、細胞塊に５００μＬの細胞解離試薬（ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ、登録商標、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を添加し、ＣＯ２インキュベーター内で細胞塊を５分間インキュベートした。次に、インキュベーターからファルコンチューブを取り出し、ファルコンチューブ内に５００μＬの幹細胞培地（２０％ＫｎｏｃｋＯｕｔ  ＳＲ（登録商標、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２）を入れ、細胞塊を懸濁して、ｉＰＳ細胞をシングルセルにした。ファルコンチューブ内に２ｍＬの幹細胞培地（２０％ＫｎｏｃｋＯｕｔ  ＳＲ（登録商標、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２）を添加し、遠心機を用いて２００ｇでファルコンチューブを遠心した。遠心後、ファルコンチューブ内の上清を除去し、ｉＰＳ細胞をゲル培地をファルコンチューブに入れた。その後、上記と同様に、２日に一度ゲル培地を追加しながら、７から１０日間、ｉＰＳ細胞を密閉されたファルコンチューブ内で浮遊培養した。【０２０８】
以後、上記と同様に、継代及び７から１０日間の浮遊培養を繰り返し、合計して１か月以上、ｉＰＳ細胞を密閉されたファルコンチューブ内で浮遊培養した。【０２０９】
ファルコンチューブをインキュベーター内に配置して培養したｉＰＳ細胞、及びファルコンチューブをビーズバスに配置して培養したｉＰＳ細胞を顕微鏡で観察したところ、図８に示すように、いずれも、均一な細胞塊を形成していることが確認された。ビーズバス以外の恒温槽に配置されたファルコンチューブ内で培養されたｉＰＳ細胞でも同様の結果が得られた。【０２１０】
また、継代時に、一部のシングルセルのｉＰＳ細胞を分注し、４％−パラホルムアルデヒドを用いてｉＰＳ細胞を固定した。さらに、フローサイトメーターを用いて、固定されたｉＰＳ細胞における細胞表面抗原ＴＲＡ−１−６０の発現量を測定した。ＴＲＡ−１−６０は、多能性幹細胞の代表的な表面抗原であり、分化した細胞では発現量が減少することが知られている。【０２１１】
その結果、図９に示すように、培養開始から８日目、２８日目、及び３８日目において、ファルコンチューブをインキュベーター内に配置して培養したｉＰＳ細胞、及びファルコンチューブをビーズバスに配置して培養したｉＰＳ細胞は、いずれも、ほぼ１００％ＴＲＡ１−６０陽性であった。ビーズバス以外の恒温槽に配置されたファルコンチューブ内で培養されたｉＰＳ細胞でも同様の結果が得られた。したがって、容器を密閉して閉鎖系にすると、容器内の二酸化炭素濃度を制御せずとも、幹細胞を長期間にわたって、未分化状態で多能性を保ちながら培養できることが示された。【０２１２】
（実施例２）
実施例１と同様にゲル培地を作製した。ゲル培地にシングルセルにされたｉＰＳ細胞を２×１０５個／ｍＬを添加した。２ｍＬゴムパッキン付きガス非透過性チューブに、内部に空気層が残らないように２ｍＬのｉＰＳ細胞を含むゲル培地を入れた。その後、チューブのキャップを固く締め、さらにチューブ及びキャップの周囲をパラフィンフィルムで巻きつけ、チューブ内を外気から遮断し、チューブ内に外気が侵入しないようにした。これにより、培養中に、ゲル培地がガス（空気）層に接触しないようにした。【０２１３】
パラフィンフィルムで巻きつけたチューブのそれぞれを３７℃のＣＯ２インキュベーター内及びＣＯ２インキュベーター外の３７℃の恒温槽に配置し、ｉＰＳ細胞の浮遊培養を開始した。恒温槽としては、温度を電子的に制御することができるビーズバス、ウォーターバス及び恒温機を使用した。恒温槽は、実験室内に配置され、実験室内の空気から遮蔽されていなかった。培養の途中、培地の追加又は交換をしなかった。チューブ内での培養を開始してから１０から１１日後、チューブのキャップを開け、ゲル培地中に形成されたｉＰＳ細胞の細胞塊をフィルターを用いて回収し、ＰＢＳで洗浄し、チューブに入れた。さらに、細胞塊に５００μＬの細胞解離試薬（ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ、登録商標、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を添加し、ＣＯ２インキュベーター内で細胞塊を５分間インキュベートした。次に、インキュベーターからチューブを取り出し、チューブ内に５００μＬの幹細胞培地（２０％ＫｎｏｃｋＯｕｔ  ＳＲ（登録商標、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２）を入れ、細胞塊を懸濁して、ｉＰＳ細胞をシングルセルにした。チューブ内に２ｍＬの幹細胞培地（２０％ＫｎｏｃｋＯｕｔ  ＳＲ（登録商標、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２）を添加し、遠心機を用いて２００ｇでチューブを遠心した。遠心後、チューブ内の上清を除去し、ｉＰＳ細胞の細胞数が２×１０５個／ｍＬとなるよう、ゲル培地をチューブに入れた。その後、上記と同様に、ゲル培地の追加又は交換をせずに、５から１１日間、ｉＰＳ細胞を密閉されたチューブ内で浮遊培養した。【０２１４】
以後、上記と同様に、継代及び５から１１日間の浮遊培養を繰り返し、合計して１か月以上、ｉＰＳ細胞を密閉されたチューブ内で浮遊培養した。【０２１５】
チューブをインキュベーター内に配置して培養したｉＰＳ細胞をカメラ及び顕微鏡で観察したところ、図１０に示すように、均一な細胞塊を形成していることが確認された。インキュベーター外の恒温槽に配置されたチューブ内で培養されたｉＰＳ細胞でも同様の結果が得られた。【０２１６】
また、継代時に、一部のシングルセルのｉＰＳ細胞を分注し、４％−パラホルムアルデヒドを用いてｉＰＳ細胞を固定した。さらに、フローサイトメーターを用いて、固定されたｉＰＳ細胞における細胞表面抗原ＴＲＡ−１−６０の発現量を測定した。その結果、図１１に示すように、培養開始から１０日目、２１日目、及び３０日目において、チューブをインキュベーター内に配置して培養したｉＰＳ細胞は、９０％以上ＴＲＡ１−６０陽性であった。インキュベーター外の恒温槽に配置されたチューブ内で培養されたｉＰＳ細胞でも同様の結果が得られた。したがって、容器を密閉すると、容器内の二酸化炭素濃度を制御せず、かつ培地の追加及び交換をせずとも、幹細胞を長期間にわたって、未分化状態で多能性を保ちながら培養できることが示された。【０２１７】
（実施例３）
実施例１と同様にゲル培地を作製した。ゲル培地にシングルセルにされたｉＰＳ細胞を添加した。１５ｍＬファルコンチューブに２ｍＬのｉＰＳ細胞を含むゲル培地を入れた。その後、ファルコンチューブのキャップを固く締めた。【０２１８】
ファルコンチューブを３７℃、ＣＯ２インキュベーター内に配置し、ｉＰＳ細胞の浮遊培養を開始した。その後、２日に一度、ファルコンチューブのキャップを開け、２ｍＬのｐＨが４．０から１０．０の間のゲル培地をファルコンチューブ内に追加した。ゲル培地を追加した後は、上記のとおり、キャップを締めた。【０２１９】
ファルコンチューブ内での培養を開始してから７から１０日後、ファルコンチューブのキャップを開け、ゲル培地中に形成されたｉＰＳ細胞の細胞塊をフィルターを用いて回収し、ＰＢＳで洗浄し、ファルコンチューブに入れた。さらに、細胞塊に５００μＬの細胞解離試薬（ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ、登録商標、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を添加し、ＣＯ２インキュベーター内で細胞塊を５分間インキュベートした。次に、インキュベーターからファルコンチューブを取り出し、ファルコンチューブ内に２０％ＫｎｏｃｋＯｕｔ  ＳＲ（登録商標、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）、ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）、及び非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）を含む５００μＬの培地を入れ、細胞塊を懸濁して、ｉＰＳ細胞をシングルセルにした。ファルコンチューブ内に２ｍＬの幹細胞培地（２０％ＫｎｏｃｋＯｕｔ  ＳＲ（登録商標、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２）を添加し、遠心機を用いて２００ｇでファルコンチューブを遠心した。遠心後、ファルコンチューブ内の上清を除去し、ｉＰＳ細胞の細胞数が２×１０５個／ｍＬとなるよう、ゲル培地をファルコンチューブに入れた。その後、上記と同様に、２日に一度ゲル培地を追加しながら、７から１０日間、ｉＰＳ細胞を密閉されたファルコンチューブ内で浮遊培養した。【０２２０】
以後、上記と同様に、継代及び７から１０日間の浮遊培養を繰り返し、合計して１か月以上、ｉＰＳ細胞を密閉されたファルコンチューブ内で浮遊培養した。【０２２１】
ファルコンチューブ内で培養したｉＰＳ細胞を顕微鏡で観察したところ、図１２に示すように、いずれも、細胞塊を形成していることが確認された。また、実施例３と同様に、フローサイトメーターを用いて、ｉＰＳ細胞における細胞表面抗原ＴＲＡ−１−６０の発現量を測定したところ、図１３に示すように、培養開始から７から２１日目におけるｉＰＳ細胞は、ほぼ１００％ＴＲＡ−１−６０陽性であった。【０２２２】
（実施例４）
増殖因子を培地（ＳｔｅｍＳｐａｎ  Ｈ３０００、登録商標、ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）に添加し、さらに培地に脱アシル化ゲランガムを添加して、ゲル培地を用意した。【０２２３】
用意したゲル培地を１５ｍＬチューブに入れ、ゲル培地に２×１０５個の血液細胞（単核球）を播種した。その後、１５ｍＬチューブを３７℃のＣＯ２インキュベーター内に配置し、７日間、血液細胞を培養した。その後、ゲル培地にＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃＭＹＣを搭載するセンダイウイルスベクター（ＣｙｔｏＴｕｎｅ−ｉＰＳ２．０、株式会社ＩＤファーマ）を感染多重度（ＭＯＩ）が１０．０となるよう添加し、血液細胞をセンダイウイルスに感染させた。【０２２４】
ゲル培地にセンダイウイルスを添加した後、ゲル培地に３０ｍＬの幹細胞培地（２０％ＫｎｏｃｋＯｕｔ  ＳＲ（登録商標、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２）を添加し、フィーダー細胞を播種したフラスコに、センダイウイルスに感染した細胞を含む培地を入れ、１５日間、フラスコを放置し、センダイウイルスに感染した細胞を接着培養した。フラスコ内には、空気層が全くなかった。その間、図１４に示すように、フラスコのキャップ周辺をパラフィンフィルムで巻き付け、フラスコ内を完全に閉鎖し、培地交換及びガス交換を全く行わず、フラスコ内のＣＯ２濃度の制御もしなかった。【０２２５】
１５日後、細胞を顕微鏡で観察したところ、図１５に示すように、ＥＳ細胞様コロニーを形成していることが確認された。図１６に示すように、コロニーのうち１００％近くがＥＳ細胞様コロニーであった。また、４％−パラホルムアルデヒドを用いて細胞を固定し、フローサイトメーターを用いて、固定された細胞における細胞表面抗原ＴＲＡ−１−６０の発現量を測定したところ、図１７（ａ）に示すように、誘導前の細胞においては、ほぼ１００％ＴＲＡ−１−６０陰性であったのに対し、図１７（ｂ）に示すように、誘導後の細胞においては、ほぼ１００％ＴＲＡ−１−６０陽性であり、ほぼ完全にリプログラミングされていることが確認された。したがって、完全に閉鎖された環境下において、培地交換及びガス交換をすることなく、幹細胞以外の細胞からｉＰＳ細胞を誘導できることが示された。【０２２６】
（実施例５）
実施例４と同様に用意したゲル培地を１５ｍＬチューブに入れ、ゲル培地に２×１０５個の血液細胞（単核球）を播種した。その後、１５ｍＬチューブを３７℃のＣＯ２インキュベーター内に配置し、７日間、血液細胞を培養した。その後、ゲル培地にＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃＭＹＣを搭載するセンダイウイルスベクター（ＣｙｔｏＴｕｎｅ−ｉＰＳ２．０、株式会社ＩＤファーマ）を感染多重度（ＭＯＩ）が１０．０となるよう添加し、血液細胞をセンダイウイルスに感染させた。【０２２７】
ゲル培地にセンダイウイルスを添加した後、ゲル培地に１５ｍＬのゲル化した幹細胞培地（２０％ＫｎｏｃｋＯｕｔ  ＳＲ（登録商標、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２）を添加し、そのうち１５ｍＬのセンダイウイルスに感染した細胞を含む培地を１５ｍＬチューブに入れ、１５日間、１５ｍＬチューブを放置し、センダイウイルスに感染した細胞を浮遊培養した。１５ｍＬチューブ内には、空気層が全くなかった。その間、１５ｍＬチューブ内を完全に閉鎖し、培地交換及びガス交換を全く行わず、１５ｍＬチューブ内のＣＯ２濃度の制御もしなかった。【０２２８】
１５日後、細胞を顕微鏡で観察したところ、図１８に示すように、ＥＳ細胞様コロニーを形成していることが確認された。また、４％−パラホルムアルデヒドを用いて細胞を固定し、フローサイトメーターを用いて、固定された細胞における細胞表面抗原ＴＲＡ−１−６０の発現量を測定したところ、図１９に示すように、ほぼ１００％ＴＲＡ−１−６０陽性であり、ほぼ完全にリプログラミングされていることが確認された。したがって、完全に閉鎖された環境下において、培地交換及びガス交換をすることなく、幹細胞以外の細胞からｉＰＳ細胞を誘導できることが示された。【０２２９】
（実施例６）
図２０及び図２１に示すように、半透膜１１０（旭化成株式会社又はＳＰＥＣＴＲＵＭ）を、培養側プレート２１及び培地側プレート２２で挟み、さらに、半透膜１１０、培養側プレート２１及び培地側プレート２２を、培養槽３０及び培地保持槽４０で挟み込んだ。【０２３０】
２０％の代替血清（ＫｎｏｃｋＯｕｔ  ＳＲ、登録商標、Ｇｉｂｃｏ）を含む幹細胞培地（リプロセル）をゲル化してゲル培地を作製した。ゲル培地にシングルセルにされたｉＰＳ細胞を２×１０５個／ｍＬを添加して、細胞含有培地を調製した。【０２３１】
細胞含有培地をシリンジに入れ、シリンジをプラグ３３を介して培養槽３０の供給口２３１に接続した。また、空のシリンジをプラグ３４を介して培養槽３０の排出口３３１に接続した。次に、培養槽３０の供給口２３１から培養槽３０内に、シリンジ内の細胞含有培地を注入した。培養槽３０内の圧力上昇により、排出口３３１に接続されたシリンジのピストンが受動的に上昇し、培養槽３０内の空気は、培養槽３０の排出口３３１に接続されたシリンジ内に移動した。培養槽３０内の空気層が完全になくなるまで、培養槽３０内に細胞含有培地を注入した。その後、培養槽３０の供給口２３１及び排出口３３１を遮蔽した。【０２３２】
ゲル培地をシリンジに入れ、シリンジをプラグ６１を介して培地保持槽４０の導入口２４０に接続した。また、空のシリンジをプラグ６２を介して培地保持槽４０の排出口３４０に接続した。次に、培地保持槽４０の導入口２４０から培地保持槽４０内に、シリンジ内のゲル培地を注入した。培地保持槽４０内の圧力上昇により、培地保持槽４０の排出口３４０に接続されたシリンジが受動的に上昇し、培地保持槽４０内の空気は、培地保持槽４０の排出口３４０に接続されたシリンジ内に移動した。培地保持槽４０内の空気層が完全になくなるまで、培地保持槽４０内にゲル培地を注入した。その後、培地保持槽４０の導入口２４０及び排出口３４０を遮蔽した。これにより、培養槽３０及び培地保持槽４０内部を密閉し、培養槽３０及び培地保持槽４０の内部と外部とで、ガス交換が完全に生じないようにした。【０２３３】
培養槽３０内でｉＰＳ細胞の浮遊培養を開始した。その後、２日に一度、培地保持槽４０内の２ｍＬのゲル培地を、２ｍＬの新鮮なゲル培地に交換した。培養槽３０内での培養を開始してから７から１０日後、培養槽３０内の細胞含有培地をシリンジで排出し、ゲル培地中に形成されたｉＰＳ細胞の細胞塊をフィルターを用いて回収し、ＰＢＳで洗浄し、ファルコンチューブに入れた。さらに、細胞塊に５００μＬの細胞解離酵素（ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を添加し、ＣＯ２インキュベーター内で細胞塊を５分間インキュベートした。次に、インキュベーターからファルコンチューブを取り出し、ファルコンチューブ内に５００μＬの細胞培地を入れ、細胞塊を懸濁して、ｉＰＳ細胞をシングルセルにした。ファルコンチューブ内に２ｍＬの細胞培地を添加し、遠心機を用いて２００ｇでファルコンチューブを遠心した。遠心後、ファルコンチューブ内の上清を除去し、ｉＰＳ細胞とゲル培地をファルコンチューブに入れて、細胞含有培地を調製した。その後、上記と同様に、細胞含有培地を培養槽３０に注入し、２日に一度、培地保持槽４０内の２ｍＬのゲル培地を交換しながら、７から１０日間、ｉＰＳ細胞を浮遊培養した。【０２３４】
以後、上記と同様に、継代及び７から１０日間の浮遊培養を繰り返し、合計して１か月以上、ｉＰＳ細胞を密閉された培養槽３０内で浮遊培養した。【０２３５】
培養槽３０で培養したｉＰＳ細胞を顕微鏡で観察したところ、図２２に示すように、いずれも、均一な細胞塊を形成していることが確認された。【０２３６】
また、継代時に、一部のシングルセルのｉＰＳ細胞を分注し、４％−パラホルムアルデヒドを用いてｉＰＳ細胞を固定した。さらに、フローサイトメーターを用いて、固定されたｉＰＳ細胞における細胞表面抗原ＴＲＡ−１−６０の発現量を測定した。その結果、図２３に示すように、培養開始から３９日目におけるｉＰＳ細胞は、９０％以上ＴＲＡ−１−６０陽性であった。したがって、容器を密閉すると、容器内の二酸化炭素濃度を制御せずとも、幹細胞を長期間にわたって、未分化状態で多能性を保ちながら培養できることが示された。【０２３７】
（実施例７）
実施例６と同様に細胞含有培地を調製した。また、図２に示した細胞培養器と同様の細胞培養器を用意した。培養槽３０内の空気層が完全になくなるまで、培養槽３０内に細胞含有培地を注入した。その後、培養槽３０の供給口及び排出口を遮蔽した。また、培地保持槽４０、培地流路２００、及び培地タンク６０をゲル培地で充填した。その後、培地タンク６０の導入口及び排出口を遮蔽した。これにより、培養槽３０及び培地保持槽４０内部を密閉し、培養槽３０及び培地保持槽４０の内部と外部とで、ガス交換が完全に生じないようにした。【０２３８】
培地保持槽４０、培地流路２００、及び培地タンク６０内でゲル培地を循環させ、培養槽３０内でｉＰＳ細胞の浮遊培養を開始した。その後、２から６日に一度、培地タンク６０内の１０ｍＬのゲル培地を、１０ｍＬの新鮮なゲル培地に交換した。培養槽３０内での培養を開始してから７から１０日後、培養槽３０内の細胞含有培地をシリンジで排出し、実施例６と同様の継代処理をして、上記と同様に、細胞含有培地を培養槽３０に注入し、４日に一度、培地タンク６０内の１０ｍＬのゲル培地を交換しながら、７から１０日間、ｉＰＳ細胞を浮遊培養した。【０２３９】
以後、上記と同様に、継代及び７から１０日間の浮遊培養を繰り返し、合計して１か月以上、ｉＰＳ細胞を密閉された培養槽３０内で浮遊培養した。【０２４０】
培養槽３０で培養したｉＰＳ細胞を顕微鏡で観察したところ、図２４に示すように、いずれも、均一な細胞塊を形成していることが確認された。また、実施例６と同様に、フローサイトメーターを用いて、ｉＰＳ細胞における細胞表面抗原ＴＲＡ−１−６０の発現量を測定したところ、図２５に示すように、培養開始から１５日目におけるｉＰＳ細胞は、ほぼ１００％ＴＲＡ−１−６０陽性であった。【０２４１】
（実施例８）
増殖因子を培地（ＳｔｅｍＳｐａｎ  Ｈ３０００、登録商標、ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）に添加し、さらに培地に脱アシル化ゲランガムを添加して、ゲル培地を用意した。【０２４２】
用意したゲル培地を１５ｍＬチューブに入れ、ゲル培地に２×１０５個の血液細胞を播種した。その後、１５ｍＬチューブをＣＯ２インキュベーター内に配置し、７日間、血液細胞（単核球）を培養した。その後、ゲル培地にＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃＭＹＣを搭載するセンダイウイルスベクター（ＣｙｔｏＴｕｎｅ−ｉＰＳ２．０、株式会社ＩＤファーマ）を感染多重度（ＭＯＩ）が１０．０となるよう添加し、血液細胞をセンダイウイルスに感染させた。【０２４３】
ゲル培地にセンダイウイルスを添加した後、ゲル培地に１５ｍＬのゲル化した幹細胞培地（２０％ＫｎｏｃｋＯｕｔ  ＳＲ（登録商標、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２）を添加し、そのうち１５ｍＬのセンダイウイルスに感染した細胞を含む培地を図２０及び図２１に示す培養槽３０に入れ、ゲル培地を培地保持槽４０に注入した。実施例６と同様に、培養槽３０及び培地保持槽４０内部を密閉し、培養槽３０及び培地保持槽４０の内部と外部とで、ガス交換が完全に生じないようにした。【０２４４】
培養槽３０内で誘導因子を導入された細胞の浮遊培養を開始した。その後、２日に一度、培地保持槽４０内の２ｍＬのゲル培地を、２ｍＬの新鮮なゲル培地に交換した。【０２４５】
１５日後、細胞を顕微鏡で観察したところ、図２６に示すように、ＥＳ細胞様コロニーを形成していることが確認された。また、４％−パラホルムアルデヒドを用いて細胞を固定し、フローサイトメーターを用いて、固定された細胞における細胞表面抗原ＴＲＡ−１−６０の発現量を測定したところ、図２７に示すように、９０％以上ＴＲＡ−１−６０陽性であり、ほぼ完全にリプログラミングされていることが確認された。したがって、完全に閉鎖された環境下において、培地交換及びガス交換をすることなく、幹細胞以外の細胞からｉＰＳ細胞を誘導できることが示された。
【符号の説明】
【０２４６】
１０・・・培養成分透過部材、２１・・・培養側プレート、２２・・・培地側プレート、３０・・・培養槽、３１・・・筐体、３２・・・カバー、３３・・・プラグ、３４・・・プラグ、４０・・・培地保持槽、４１・・・整流板、５１・・・導入用流体機械、５２・・・排出用流体機械、６０・・・培地タンク、６１・・・プラグ、６２・・・プラグ、７０・・・流路ケース、８０・・・駆動部保持部材、８２・・・穴、９０・・・パッキン、１１０・・・半透膜、１３１・・・開口、１３２・・・窓、１４０・・・開口、１４５・・・吐出ブロック、１５１・・・ポンプヘッド、１５２・・・ポンプヘッド、２００・・・培地流路、２３１・・・供給口、２４０・・・導入口、２４１・・・吐出口、２４２・・・開口、２５１・・・駆動部、２５２・・・駆動部、３３１・・・排出口、３４０・・・排出口、３５１・・・導入用流体機械用外気遮断部材、３５２・・・排出用流体機械用外気遮断部材、４０１・・・入力装置、４０２・・・出力装置、４０３・・・関係記憶装置、５０１・・・画像処理部、５１１・・・輪郭定義部、５１２・・・細胞評価部、５１３・・・統計処理部、５１４・・・密度算出部、５１５・・・培地評価部
【図１】
2020040135.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年2月24日(2021.2.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
空気層がない閉鎖系内で細胞を培養又は誘導することを含む、細胞の培養又は誘導方法。
【請求項２】
前記誘導が、リプログラミング、初期化、分化転換、分化誘導及び細胞の運命変更の少なくともいずれかを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記閉鎖系内と外部との間でガスの交換が生じない、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記閉鎖系内の温度を制御することをさらに含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記培養することにおいて、前記閉鎖系が密閉されている、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記閉鎖系が密閉された状態で、前記閉鎖系内に外気が進入しない、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記閉鎖系が密閉された状態で、前記閉鎖系内に前記閉鎖系外の細胞、微生物、ウイルス、及び塵が進入しない、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記閉鎖系が密閉された状態で、前記閉鎖系内の物質が前記閉鎖系外に流出しない、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記閉鎖系内に二酸化炭素ガス、窒素ガス、及び酸素ガスの少なくともいずれかが供給されない、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記閉鎖系内の培地のｐＨが所定の範囲内に保たれる、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記閉鎖系の少なくとも一部が、ガス非透過性物質に埋め込まれることにより形成されている、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記閉鎖系の少なくとも一部が、ガス非透過性物質からなる、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記閉鎖系内で培地を補充又は交換しながら前記細胞を培養又は誘導する、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記閉鎖系内で培地を循環しながら前記細胞を培養又は誘導する、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記閉鎖系が前記細胞を培養する培養槽を備え、
前記培養槽内に流体を供給するための供給口と、前記閉鎖系内の流体を排出するための排出口と、が、前記培養槽に設けられており、
前記供給口及び前記排出口が密閉可能である、
請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記供給口に流体を供給するための供給器が着脱可能であり、
前記排出口に流体を排出するための排出器が着脱可能であり、
前記供給器から前記培養槽内に流体を供給すると、前記培養槽内の流体が前記排出器内に移動する、
請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記供給器から前記培養槽内に培地を供給すると、前記培養槽内の空気が前記排出器内に移動する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記供給器から前記培養槽内に培地を供給すると、前記培養槽内の培地が前記排出器内に移動する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記培地が細胞を含有する、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記供給器から前記培養槽内に流体を供給する際に、外気が前記培養槽内に進入しない、請求項１６から１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記培養することにおいて、前記閉鎖系内の二酸化炭素濃度が制御されない、請求項１から２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記培養することにおいて、前記閉鎖系外の二酸化炭素濃度が制御されない、請求項１から２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記培養することにおいて、前記閉鎖系内の半透膜を介して前記閉鎖系内の物質が移動する、請求項１から２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記閉鎖系が、前記細胞を培養する培養槽と、前記培養槽に接続された流路と、を備え、
培地が前記培養槽と前記流路を循環する、
請求項１から２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記流路において外部とガスの交換が生じない、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記培地が循環することにより、前記培養槽内の培地のｐＨが所定の範囲内に保たれる、請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記培養が浮遊培養である、請求項１から２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記培養が接着培養である、請求項１から２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記閉鎖系内のゲル培地中で前記細胞を培養する、請求項１から２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記閉鎖系内の液体培地中で前記細胞を培養する、請求項１から２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記閉鎖系内の培地が攪拌される、請求項１から３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記閉鎖系内の培地が攪拌されない、請求項１から３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞を継代することをさらに含む、請求項１から３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
播種と継代の間に培地の追加及び交換をしない、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
播種と継代の間に培地の追加又は交換をする、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
継代と継代の間に培地の追加及び交換をしない、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
継代と継代の間に培地の追加又は交換をする、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞が幹細胞である、請求項１から３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記幹細胞がｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、又は体性幹細胞である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記培養することにおいて、前記幹細胞が未分化状態を維持する、請求項３８又は３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記培養することにおいて、前記幹細胞が多能性を維持する、請求項３８から４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞が体細胞である、請求項１から３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記細胞が血液系細胞である、請求項１から３７及び４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞が誘導因子を導入された細胞である、請求項１から４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記閉鎖系内の培地に誘導因子を添加し、前記閉鎖系内で培養されている前記細胞に前記誘導因子を導入する、請求項１から４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記細胞が幹細胞に誘導される、請求項４４又は４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記幹細胞がｉＰＳ細胞である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記細胞が血液系細胞である、請求項４４から４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記細胞が別種の細胞に誘導される、請求項４４又は４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記細胞が血液系細胞であり、
前記閉鎖系内の培地に誘導因子を添加し、前記閉鎖系内で培養されている前記血液系細胞に前記誘導因子を導入し、前記血液系細胞をｉＰＳ細胞に誘導する、請求項１から４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記誘導因子がプラスミドに含まれる、請求項４４から５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記誘導因子がＲＮＡである、請求項４４から５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記誘導因子がセンダイウイルスに含まれる、請求項４４から５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
培養成分が透過可能な培養成分透過部材と、
前記培養成分透過部材の一方の面を覆う、細胞含有培地を保持し、細胞を培養するための培養槽と、
前記培養成分透過部材の他方の面を覆う、培地を保持するための培地保持槽と、
を備える、細胞培養器を用意することと、
空気層がない前記培養槽中で細胞を培養又は誘導することと、
を含む、
細胞の培養又は誘導方法。
【請求項５５】
前記誘導が、リプログラミング、初期化、分化転換、分化誘導及び細胞の運命変更の少なくともいずれかを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記細胞培養器の内部が外部から閉鎖されている、請求項５４又は５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記細胞培養器内の培地のｐＨが所定の範囲内に保たれる、請求項５４から５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記培養が浮遊培養である、請求項５４から５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記細胞が幹細胞である、請求項５４から５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記細胞が体細胞である、請求項５４から５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記細胞が血液系細胞である、請求項５４から５８及び６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記細胞が誘導因子を導入された細胞である、請求項５４から６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記培養槽内の培地に誘導因子を添加し、前記培養槽内で培養されている前記細胞に前記誘導因子を導入する、請求項５４から６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記細胞が別種の細胞に誘導される、請求項６２又は６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記細胞培養器が、前記培養成分透過部材の前記培養槽側の面に重ねられた、開口が設けられた培養側プレートをさらに備える、請求項５４から６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
前記細胞培養器が、前記培養成分透過部材の前記培地保持槽側の面に重ねられた、開口が設けられた培地側プレートをさらに備える、請求項５４から６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記培養側プレートが濃色である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
前記培養側プレートの前記開口が設けられていない部分を背景にして前記細胞又は前記細胞からなる細胞塊を観察することをさらに含む、請求項６５又は６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記培養側プレートの前記開口が設けられていない部分を背景にして前記細胞又は前記細胞からなる細胞塊を撮影することをさらに含む、請求項６５又は６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記培地保持槽の前記培地を補充又は置換することをさらに含む、請求項５４から６９のいずれか１項に記載の方法。
【国際調査報告】
2020040135.tif 000030
2020040135.tif 000031
2020040135.tif 000032
2020040135.tif 000033