(57)【要約】  下記工程（１）〜（３）を含む、嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊の製造方法：多能性幹細胞を、第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、細胞凝集体を形成させる工程（１）、前記工程（１）で得られた細胞凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下で浮遊培養する工程（２）、前記工程（２）で得られた細胞凝集体を浮遊培養して、前記細胞塊を得る工程（３）であって、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質の存在下で浮遊培養する工程（３ａ）、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養する工程（３ｂ）、及びＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の存在下で培養する工程（３ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つの工程を含む、工程（３）。
2020039732.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程（１）〜（３）を含む、嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊の製造方法：
多能性幹細胞を、第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、細胞凝集体を形成させる工程（１）、
前記工程（１）で得られた細胞凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下で浮遊培養する工程（２）、
前記工程（２）で得られた細胞凝集体を浮遊培養して、前記細胞塊を得る工程（３）であって、
ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質の存在下で浮遊培養する工程（３ａ）、
ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養する工程（３ｂ）、及び
ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養する工程（３ｃ）
からなる群より選ばれる少なくとも１つの工程を含む、工程（３）。
【請求項２】
前記工程（３）は前記工程（３ａ）を含み、前記工程（３ａ）の後に、前記工程（３ｃ）をさらに含む、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記工程（３）は、前記工程（３ｂ）又は前記工程（３ｃ）を含み、前記工程（３ｂ）又は前記工程（３ｃ）の後に、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の非存在下で浮遊培養する工程（３ｄ）をさらに含む、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記工程（３）において、ＥＧＦシグナル伝達経路作用物質がさらに存在する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記工程（１）の前に、前記多能性幹細胞をフィーダー細胞非存在下で、１）ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも１つと、２）未分化維持因子と、を含む培地で培養する工程（ａ）をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質は、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、ＢＭＰ１３及びＧＤＦ７からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記工程（３）は、前記工程（３ａ）及び前記工程（３ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つの工程を含み、前記ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質は、ＦＧＦ２及びＦＧＦ８、並びに、これらの改変体からなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項８】
前記工程（３）の開始時期は、前記工程（２）のＢＭＰシグナル伝達経路作用物質添加から１２時間以降７２時間以内である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項９】
前記工程（２）及び前記工程（３）からなる群より選ばれる少なくとも１つの工程において、前記第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質が存在する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質は、非古典的Ｗｎｔ経路に対する阻害活性を有する物質を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質は、ＰＯＲＣＮ阻害剤を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質は、ＫＹ０２１１１及びＫＹ０３−Ｉからなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記工程（３）は、前記工程（３ｂ）及び前記工程（３ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つの工程を含み、前記ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質は、Ｉ型ＢＭＰ受容体阻害剤を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１４】
前記工程（１）、前記工程（２）及び前記工程（３）からなる群より選ばれる少なくとも１つの工程において、ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質がさらに存在する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１５】
前記ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質は、Ａｌｋ５／ＴＧＦβＲ１阻害剤を含む、請求項１４に記載の製造方法。
【請求項１６】
前記工程（１）、前記工程（２）及び前記工程（３）からなる群より選ばれる少なくとも１つの工程において、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質がさらに存在する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１７】
前記Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質は、前記第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の作用点よりも下流のシグナル伝達因子に作用する、請求項１６に記載の製造方法。
【請求項１８】
前記Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質は、Ｗｎｔ−Ｃａｎｏｎｉｃａｌ経路を活性化させる物質を含む、請求項１６又は１７に記載の製造方法。
【請求項１９】
前記Ｗｎｔ−Ｃａｎｏｎｉｃａｌ経路を活性化させる物質は、βカテニンの分解を阻害又はβカテニンの安定化を促進する、請求項１８に記載の製造方法。
【請求項２０】
前記Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質はＧＳＫ３阻害剤を含む、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項２１】
前記第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質はＰＯＲＣＮ阻害剤を含み、前記Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質はＧＳＫ３阻害剤を含む、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項２２】
前記工程（３）において、ＴＡＫ１阻害物質がさらに存在する、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項２３】
前記工程（３）は、前記工程（３ａ）、前記工程（３ｂ）又は前記工程（３ｃ）の後に、さらに培養を行う工程（３ｅ）を含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項２４】
前記工程（３ｅ）において、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質、ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＥＧＦシグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも１つが存在する、請求項２３に記載の製造方法。
【請求項２５】
前記工程（３ｅ）において、レチノイン酸伝達経路作用物質、血清、インスリン様成長因子受容体作用物質、神経栄養因子受容体作用物質からなる群より選ばれる少なくとも１つがさらに存在する、請求項２３又は２４に記載の製造方法。
【請求項２６】
前記工程（３ｅ）を、増粘剤を含む培地中で行う、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項２７】
前記増粘剤を含む培地は、１００ｍＰａ・ｓ以上の粘度を有する、請求項２６に記載の製造方法。
【請求項２８】
前記工程（３ｅ）において、接着培養を行う、請求項２３〜２７のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項２９】
細胞外基質、基底膜標品及び合成細胞接着分子からなる群より選ばれる少なくとも１つでコートされた培養器材上で前記接着培養を行う、請求項２８に記載の製造方法。
【請求項３０】
前記工程（３ｅ）において、気相液相境界面培養法により培養を行う、請求項２３〜２９のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項３１】
前記工程（３）において、細胞凝集体をゲル中に包埋して培養する工程を含む、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項３２】
前記ゲルはマトリゲルである、請求項３１に記載の製造方法。
【請求項３３】
前記工程（３）において、基底膜標品を含有する培地中で浮遊培養を行う工程を含む、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項３４】
前記基底膜標品がマトリゲルであり、培地中の前記マトリゲルの濃度が０．５％〜４％である、請求項３３に記載の製造方法。
【請求項３５】
前記工程（３）において、前記第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質とは異なる第二Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質がさらに存在する、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項３６】
前記第二Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質は、古典的Ｗｎｔ経路に対する阻害活性を有する物質を含む、請求項３５に記載の製造方法。
【請求項３７】
前記第二Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質は、Ｔａｎｋｙｒａｓｅ阻害剤を含む、請求項３５又は３６に記載の製造方法。
【請求項３８】
請求項１〜３７のいずれか１項に記載の製造方法により得られる嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊。
【請求項３９】
１）嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む非神経上皮組織部、及び、
２）神経系細胞又はその前駆細胞を含む神経組織部を含み、
前記神経系細胞又はその前駆細胞は、中枢神経系を構成する神経系細胞又はその前駆細胞を含み、前記神経組織部の表面の少なくとも一部が前記非神経上皮組織部で被覆されている、細胞塊。
【請求項４０】
前記嗅神経細胞又はその前駆細胞は、Ｔｕｊ１、ＥｐＣＡＭ及びＬｈｘ２を発現している、請求項３９に記載の細胞塊。
【請求項４１】
非神経上皮組織部は基底膜様構造をさらに含み、前記基底膜様構造は前記非神経上皮組織部と前記神経組織部との間に形成されている、請求項３９又は４０に記載の細胞塊。
【請求項４２】
前記非神経上皮組織部は、多列上皮又は重層上皮を形成している、請求項３９に記載の細胞塊。
【請求項４３】
前記非神経上皮組織部は、嗅上皮様組織を含み、前記嗅神経細胞又はその前駆細胞は、前記嗅上皮様組織に含まれる、請求項３９〜４２のいずれか１項に記載の細胞塊。
【請求項４４】
前記嗅上皮様組織は、基底細胞又はその前駆細胞を含む、請求項４３に記載の細胞塊。
【請求項４５】
前記嗅上皮様組織は、前記神経組織部に対向している基底面と、前記基底面とは反対側に位置する頂端面とを有し、
前記基底面は基底膜に面し、
前記頂端面はＰＫＣζ又はＥｚｒｉｎ陽性である、請求項４３又は４４に記載の細胞塊。
【請求項４６】
前記嗅上皮様組織は、嗅上皮内側部と、前記嗅上皮内側部の周囲に設けられた嗅上皮周縁部とを含み、
前記嗅上皮内側部は、Ｓｏｘ２、Ｔｕｊ１及びＡｓｃｌ１陽性細胞を含み、
前記嗅上皮周縁部は、Ｐａｘ６及びＰｂｘ陽性細胞を含む、請求項４３〜４５のいずれか１項に記載の細胞塊。
【請求項４７】
前記嗅上皮様組織は、嗅神経鞘細胞又はその前駆細胞をさらに含む、請求項４３〜４６のいずれか１項に記載の細胞塊。
【請求項４８】
前記非神経上皮組織部は、前記嗅上皮様組織以外の非神経上皮組織をさらに含む、請求項４３〜４７のいずれか１項に記載の細胞塊。
【請求項４９】
前記神経系細胞又はその前駆細胞は、網膜を構成する細胞又はその前駆細胞をさらに含む、請求項３９〜４８のいずれか１項に記載の細胞塊。
【請求項５０】
前記神経系細胞又はその前駆細胞は大脳を含む、請求項３９〜４９のいずれか１項に記載の細胞塊。
【請求項５１】
請求項３８〜５０のいずれか１項に記載の細胞塊に含まれる細胞又は組織を含む、嗅覚系の障害に基づく疾患の治療薬。
【請求項５２】
請求項３８〜５０のいずれか１項に記載の細胞塊に含まれる細胞又は組織を含む、神経組織の障害に基づく疾患の治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インビトロにおいて嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊、及びその製造方法に関するものである。さらに、細胞塊中に神経系細胞と非神経上皮組織をともに含んでいる、嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｐａｔｈｏｌ  ２０１７；１０（７）：８０７２−８０８１（非特許文献１）において、マウスｉＰＳ細胞から形成させた胚様体を、マウスから採取した嗅上皮又は嗅球の初代培養細胞と共培養することにより、一部の嗅神経細胞マーカーを発現する神経細胞が分化誘導されることが報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｐａｔｈｏｌ  ２０１７；１０（７）：８０７２−８０８１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、多能性幹細胞から嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊を効率よく製造する手法を提供することである。特に、フィーダーフリー培養された多能性幹細胞を出発材料として、生体から分離された嗅上皮又は嗅球の初代培養細胞を用いることなく、効率よく嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊を製造する手法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決すべく検討を重ねたところ、多能性幹細胞を第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、一度ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を添加して一定期間培養したのちに、さらにＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の少なくとも１つを添加することにより、嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊を効率よく製造できることを見出した。加えて、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の添加条件を最適化し、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を多能性幹細胞の浮遊培養開始から７２時間以内に添加し、続けてＦＧＦシグナル伝達経路作用物質あるいはＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質をＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の添加から９６時間以内に添加するという最適な添加時期を同定することにより、嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊のより効率的な製造に成功した。加えて、多能性幹細胞をフィーダー細胞非存在下で、ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも１つで前培養することにより、嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊の製造効率を改善できることを見出した。すなわち、本発明は以下に例示されるものに関する。【０００６】
［１］下記工程（１）〜（３）を含む、嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊の製造方法：
多能性幹細胞を、第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、細胞凝集体を形成させる工程（１）、
前記工程（１）で得られた細胞凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下で浮遊培養する工程（２）、
前記工程（２）で得られた細胞凝集体を浮遊培養して、前記細胞塊を得る工程（３）であって、
ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質の存在下で浮遊培養する工程（３ａ）、
ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養する工程（３ｂ）、及び
ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養する工程（３ｃ）
からなる群より選ばれる少なくとも１つの工程を含む、工程（３）。
［２］前記工程（３）は前記工程（３ａ）を含み、前記工程（３ａ）の後に、前記工程（３ｃ）をさらに含む、［１］に記載の製造方法。
［３］前記工程（１）において、前記多能性幹細胞は単一細胞に分散されている、［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］前記工程（３）は、前記工程（３ｂ）又は前記工程（３ｃ）を含み、前記工程（３ｂ）又は前記工程（３ｃ）の後に、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の非存在下で浮遊培養する工程（３ｄ）をさらに含む、［１］〜［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］前記工程（３）において、ＥＧＦシグナル伝達経路作用物質がさらに存在する、［１］〜［４］のいずれかに記載の製造方法。
［６］前記工程（１）の前に、前記多能性幹細胞をフィーダー細胞非存在下で、１）ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも１つと、２）未分化維持因子と、を含む培地で培養する工程（ａ）をさらに含む、［１］〜［５］のいずれかに記載の製造方法。
［７］前記工程（２）の開始時期は、前記工程（１）における多能性幹細胞の浮遊培養開始から０．５時間以降７２時間以内である、［１］〜［６］のいずれかに記載の製造方法。
［８］前記工程（２）の開始時期は、前記工程（１）において形成された前記細胞凝集体の表層における１割以上の細胞が互いに密着結合を形成している時期である、［１］〜［７］のいずれかに記載の製造方法。
［９］前記ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質は、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、ＢＭＰ１３及びＧＤＦ７からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質を含む、［１］〜［８］のいずれかに記載の製造方法。
［１０］前記ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質はＢＭＰ４を含み、前記ＢＭＰ４の濃度が２５ｐＭ〜５ｎＭである培地中で前記工程（２）の培養を開始する、［１］〜［９］のいずれかに記載の製造方法。
［１１］前記工程（３）は、前記工程（３ａ）及び前記工程（３ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つの工程を含み、前記ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質は、ＦＧＦ２及びＦＧＦ８、並びに、これらの改変体からなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、［１］〜［１０］のいずれかに記載の製造方法。
［１２］前記工程（３）の開始時期は、前記工程（２）のＢＭＰシグナル伝達経路作用物質添加から１２時間以降７２時間以内である、［１］〜［１１］のいずれかに記載の製造方法。
［１３］前記工程（２）及び前記工程（３）からなる群より選ばれる少なくとも１つの工程において、前記第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質が存在する、［１］〜［１２］のいずれかに記載の製造方法。
［１４］前記第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質は、非古典的Ｗｎｔ経路に対する阻害活性を有する物質を含む、［１］〜［１３］のいずれかに記載の製造方法。
［１５］前記第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質は、ＰＯＲＣＮ阻害剤を含む、［１］〜［１４］のいずれかに記載の製造方法。
［１６］前記ＰＯＲＣＮ阻害剤は、ＩＷＰ−２、ＩＷＰ−３、ＩＷＰ−４、ＩＷＰ−Ｌ６、ＩＷＰ−１２、ＬＧＫ−９７４、Ｗｎｔ−Ｃ５９、ＥＴＣ−１５９及びＧＮＦ−６２３１からなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、［１５］に記載の製造方法。
［１７］前記ＰＯＲＣＮ阻害剤はＩＷＰ−２を含み、前記ＩＷＰ−２の濃度が１０ｎＭ〜５０μＭである培地中で前記工程（１）の培養を開始する、［１５］又は［１６］に記載の製造方法。
［１８］前記第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質は、ＫＹ０２１１１及びＫＹ０３−Ｉからなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、［１］〜［１７］のいずれかに記載の製造方法。
［１９］前記第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質はＫＹ０２１１１を含み、前記ＫＹ０２１１１の濃度が１０ｎＭ〜５０μＭである培地中で前記工程（１）の培養を開始する、［１］〜［１８］のいずれかに記載の製造方法。
［２０］前記工程（３）は、前記工程（３ｂ）及び前記工程（３ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つの工程を含み、前記ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質は、Ｉ型ＢＭＰ受容体阻害剤を含む、［１］〜［１９］のいずれかに記載の製造方法。
［２１］前記Ｉ型ＢＭＰ受容体阻害剤は、Ｋ０２２８８、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、ＬＤＮ−１９３１８９、ＬＤＮ−２１２８５４、ＬＤＮ−２１４１１７、ＭＬ３４７、ＤＭＨ１及びＤＭＨ２からなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、［２０］に記載の製造方法。
［２２］前記Ｉ型ＢＭＰ受容体阻害剤はＫ０２２８８を含み、前記Ｋ０２２８８の濃度が１０ｎＭ〜５０μＭである培地中で前記工程（３）を開始する、［２０］又は［２１］に記載の製造方法。
［２３］前記工程（１）、前記工程（２）及び前記工程（３）からなる群より選ばれる少なくとも１つの工程において、ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質がさらに存在する、［１］〜［２２］のいずれかに記載の製造方法。
［２４］前記ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質は、Ａｌｋ５／ＴＧＦβＲ１阻害剤を含む、［２３］に記載の製造方法。
［２５］前記Ａｌｋ５／ＴＧＦβＲ１阻害剤は、ＳＢ４３１５４２、ＳＢ５０５１２４、ＳＢ５２５３３４、ＬＹ２１５７２９９、ＧＷ７８８３８８、ＬＹ３６４９４７、ＳＤ−２０８、ＥＷ−７１９７、Ａ８３−０１、ＲｅｐＳｏｘからなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、［２４］に記載の製造方法。
［２６］前記Ａｌｋ５／ＴＧＦβＲ１阻害剤はＳＢ４３１５４２を含み、培地中の前記ＳＢ４３１５４２の濃度が１０ｎＭ〜１００μＭである、［２４］又は［２５］に記載の製造方法。
［２７］前記ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質がＳＡＧ、Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ及びＧＳＡ−１０からなる群から選ばれる少なくとも１つを含む、［６］に記載の製造方法。
［２８］前記ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質は、１０ｎＭから７００ｎＭのＳＡＧに相当するソニック・ヘッジホッグシグナル伝達促進活性を有する濃度である、［６］又は［２７］に記載の製造方法。
［２９］前記工程（１）、前記工程（２）及び前記工程（３）からなる群より選ばれる少なくとも１つの工程において、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質がさらに存在する、［１］〜［２８］のいずれかに記載の製造方法。
［３０］前記Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質は、前記第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の作用点よりも下流のシグナル伝達因子に作用する、［２９］に記載の製造方法。
［３１］前記Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質は、Ｗｎｔ−Ｃａｎｏｎｉｃａｌ経路を活性化させる物質を含む、［２９］又は［３０］に記載の製造方法。
［３２］前記Ｗｎｔ−Ｃａｎｏｎｉｃａｌ経路を活性化させる物質は、βカテニンの分解を阻害又はβカテニンの安定化を促進する、［３１］に記載の製造方法。
［３３］前記Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質はＧＳＫ３阻害剤を含む、［２９］〜［３２］のいずれかに記載の製造方法。
［３４］前記第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質はＰＯＲＣＮ阻害剤を含み、前記Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質はＧＳＫ３阻害剤を含む、［２９］〜［３３］のいずれかに記載の製造方法。
［３５］前記ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１、ＣＨＩＲ９８０１４、ＴＷＳ１１９、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、ＢＩＯ、ＡＺＤ２８５８、ＡＺＤ１０８０、ＡＲ−Ａ０１４４１８、ＴＤＺＤ−８、ＬＹ２０９０３１４、ＩＭ−１２、Ｉｎｄｉｒｕｂｉｎ、Ｂｉｋｉｎｉｎ、Ａ  １０７０７２２、３Ｆ８、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ、１０Ｚ−Ｈｙｍｅｎｉａｌｄｉｓｉｎｅ、Ｉｎｄｉｒｕｂｉｎ−３’−ｏｘｉｍｅ、ＮＳＣ  ６９３８６８、ＴＣ−Ｇ  ２４、ＴＣＳ  ２００２、ＴＣＳ  ２１３１１、ＣＰ２１Ｒ７及びこれらの化合物の誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、［３３］又は［３４］に記載の製造方法。
［３６］前記ＧＳＫ３阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１を含み、培地中の前記ＣＨＩＲ９９０２１の濃度が１０ｎＭ〜５０μＭである、［３３］〜［３５］のいずれかに記載の製造方法。
［３７］前記Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質は、ＢＭＬ−２８４、ＳＫＬ２００１からなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、［２９］〜［３６］のいずれかに記載の製造方法。
［３８］前記工程（３）において、ＴＡＫ１阻害物質がさらに存在する、［１］〜［３７］のいずれかに記載の製造方法。
［３９］前記ＴＡＫ１阻害物質は、（５Ｚ）−７−Ｏｘｏｚｅａｅｎｏｌ、Ｎ−Ｄｅｓ（ａｍｉｎｏｃａｒｂｏｎｙｌ）ＡＺ−ＴＡＫ１  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、Ｔａｋｉｎｉｂ、ＮＧ２５及びこれら化合物の誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、［３８］に記載の製造方法。
［４０］前記ＴＡＫ１阻害物質は、（５Ｚ）−７−Ｏｘｏｚｅａｅｎｏｌを含み、培地中の前記（５Ｚ）−７−Ｏｘｏｚｅａｅｎｏｌの濃度が１０ｎＭ〜５０μＭである、［３８］又は［３９］に記載の製造方法。
［４１］前記工程（３）は、前記工程（３ａ）、前記工程（３ｂ）又は前記工程（３ｃ）の後に、さらに培養を行う工程（３ｅ）を含む、［１］〜［４０］のいずれかに記載の製造方法。
［４２］前記工程（３ｅ）において、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質、ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＥＧＦシグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも１つが存在する、［４１］に記載の製造方法。
［４３］前記工程（３ｅ）において、レチノイン酸伝達経路作用物質がさらに存在する、［４１］又は［４２］に記載の製造方法。
［４４］前記レチノイン酸伝達経路作用物質は、オールトランスレチノイン酸、イソトレチノイン、９−ｃｉｓレチノイン酸、ＴＴＮＰＢ、Ｃｈ５５、ＥＣ１９、ＥＣ２３、Ｆｅｎｒｅｔｉｎｉｄｅ、Ａｃｉｔｒｅｔｉｎ、Ｔｒｉｆａｒｏｔｅｎｅ、Ａｄａｐａｌｅｎｅからなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、［４３］に記載の製造方法。
［４５］前記レチノイン酸伝達経路作用物質は、ＥＣ２３を含み、培地中の前記ＥＣ２３の濃度が１０ｐＭ〜１０μＭである、［４３］又は［４４］に記載の製造方法。
［４６］前記工程（３ｅ）において、血清がさらに存在する、［４１］〜［４５］のいずれかに記載の製造方法。
［４７］培地中の前記血清の濃度が１％〜２０％である、［４６］に記載の製造方法。
［４８］前記工程（３ｅ）において、インスリン様成長因子受容体作用物質がさらに存在する、［４１］〜［４７］のいずれかに記載の製造方法。
［４９］前記工程（３ｅ）において、神経栄養因子受容体作用物質がさらに存在する、［４１］〜［４８］のいずれかに記載の製造方法。
［５０］前記工程（３ｅ）を、増粘剤を含む培地中で行う、［４１］〜［４９］のいずれかに記載の製造方法。
［５１］前記増粘剤を含む培地は、１００ｍＰａ・ｓ以上の粘度を有する、［５０］に記載の製造方法。
［５２］前記増粘剤は、メチルセルロース、ペクチン、グアーガム、キサンタンガム、タマリンドガム、カラギーナン、ローカストビーンガム、ジェランガム、デキストリン、ダイユータンガム、デンプン、タラガム、アルギン酸、カードラン、カゼインナトリウム、カロブビーンガム、キチン、キトサン、グルコサミン、プルラン、アガロース、食物繊維及びこれらの化学修飾された物質又は誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、［５０］又は［５１］に記載の製造方法。
［５３］前記増粘剤はメチルセルロースを含み、培地中の前記メチルセルロースの濃度が１％以上である、［５０］〜［５２］のいずれかに記載の製造方法。
［５４］前記工程（３ｅ）において、接着培養を行う、［４１］〜［５３］のいずれかに記載の製造方法。
［５５］細胞外基質、基底膜標品及び合成細胞接着分子からなる群より選ばれる少なくとも１つでコートされた培養器材上で前記接着培養を行う、［５４］に記載の製造方法。
［５６］前記工程（３ｅ）において、セルカルチャーインサート又は多孔性メンブレン上で培養を行う、［４１］〜［５５］のいずれかに記載の製造方法。
［５７］前記工程（３ｅ）において、気相液相境界面培養法により培養を行う、請求項［４１］〜［５６］のいずれかに記載の製造方法。
［５８］前記工程（３）において、細胞凝集体をゲル中に包埋して培養する工程を含む、［１］〜［５７］のいずれかに記載の製造方法。
［５９］前記ゲルはマトリゲルである、［５８］に記載の製造方法。
［６０］前記工程（３）において、基底膜標品を含有する培地中で浮遊培養を行う工程を含む、［１］〜［５９］のいずれかに記載の製造方法。
［６１］前記基底膜標品がマトリゲルであり、培地中の前記マトリゲルの濃度が０．５％〜４％である、［６０］に記載の製造方法。
［６２］前記工程（３）において、前記第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質とは異なる第二Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質がさらに存在する、［１］〜［６１］のいずれかに記載の製造方法。
［６３］前記第二Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質は、古典的Ｗｎｔ経路に対する阻害活性を有する物質を含む、［６２］に記載の製造方法。
［６４］前記第二Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質は、Ｔａｎｋｙｒａｓｅ阻害剤を含む、［６２］又は［６３］に記載の製造方法。
［６５］前記Ｔａｎｋｙｒａｓｅ阻害剤は、ＸＡＶ９３９、ＩＷＲ１−ｅｎｄｏ、ＭＮ−６４、ＷＩＫＩ４、ＴＣ−Ｅ  ５００１、ＪＷ  ５５及びＡＺ６１０２からなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、［６４］に記載の製造方法。
［６６］前記Ｔａｎｋｙｒａｓｅ阻害剤はＸＡＶ９３９を含み、培地中の前記ＸＡＶ９３９の濃度が１０ｎＭ〜５０μＭである、［６４］又は［６５］に記載の製造方法。
［６７］前記第二Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質は、前記工程（１）における浮遊培養開始から２８日以内に培地に添加される、［６２］〜［６６］のいずれかに記載の製造方法。
［６８］前記工程（１）、前記工程（２）及び前記工程（３）からなる群より選ばれる少なくとも１つの工程を、マトリゲルの非存在下で行う、［１］〜［５８］のいずれかに記載の製造方法。
［６９］［１］〜［６８］のいずれかに記載の製造方法により得られる嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊。
［７０］１）嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む非神経上皮組織部、及び、
２）神経系細胞又はその前駆細胞を含む神経組織部を含み、
前記神経系細胞又はその前駆細胞は、中枢神経系を構成する神経系細胞又はその前駆細胞を含み、前記神経組織部の表面の少なくとも一部が前記非神経上皮組織部で被覆されている、細胞塊。
［７１］前記嗅神経細胞又はその前駆細胞は、Ｔｕｊ１、ＥｐＣＡＭ及びＬｈｘ２を発現している、［７０］に記載の細胞塊。
［７２］非神経上皮組織部は基底膜様構造をさらに含み、前記基底膜様構造は前記非神経上皮組織部と前記神経組織部との間に形成されている、［７０］又は［７１］に記載の細胞塊。
［７３］前記非神経上皮組織部は、多列上皮又は重層上皮を形成している、［７０］に記載の細胞塊。
［７４］前記非神経上皮組織部は、嗅上皮様組織を含み、前記嗅神経細胞又はその前駆細胞は、前記嗅上皮様組織に含まれる、［７０］〜［７３］のいずれかに記載の細胞塊。
［７５］前記嗅上皮様組織は、支持細胞、基底細胞及びボーマン腺細胞、並びにこれらの前駆細胞からなる群より選ばれる少なくとも２種の細胞をさらに含む、［７４］に記載の細胞塊。
［７６］前記嗅上皮様組織は、基底細胞又はその前駆細胞を含む、［７４］又は［７５］に記載の細胞塊。
［７７］前記嗅上皮様組織は、前記神経組織部に対向している基底面と、前記基底面とは反対側に位置する頂端面とを有し、
前記基底面は基底膜に面し、
前記頂端面はＰＫＣζ陽性である、［７４］〜［７６］のいずれかに記載の細胞塊。
［７８］前記嗅上皮様組織は、嗅上皮内側部と、前記嗅上皮内側部の周囲に設けられた嗅上皮周縁部とを含み、
前記嗅上皮内側部は、Ｓｏｘ２、Ｔｕｊ１及びＡｓｃｌ１陽性細胞を含み、
前記嗅上皮周縁部は、Ｐａｘ６及びＰｂｘ陽性細胞を含む、［７４］〜［７７］のいずれかに記載の細胞塊。
［７９］前記嗅上皮様組織は、嗅神経鞘細胞又はその前駆細胞をさらに含む、［７４］〜［７８］のいずれかに記載の細胞塊。
［８０］前記非神経上皮組織部は、前記嗅上皮様組織以外の非神経上皮組織をさらに含む、［７４］〜［７９］のいずれかに記載の細胞塊。
［８１］前記非神経上皮組織は、呼吸器上皮細胞を含む、［８０］に記載の細胞塊。
［８２］前記神経組織部は、上皮構造を形成している、［７０］〜［８１］のいずれかに記載の細胞塊。
［８３］前記神経系細胞又はその前駆細胞は、網膜を構成する細胞又はその前駆細胞をさらに含む、［７０］〜［８２］のいずれかに記載の細胞塊。
［８４］前記神経系細胞又はその前駆細胞は大脳を含む、［７０］〜［８３］のいずれかに記載の細胞塊。
［８５］前記大脳は嗅球を含む、［８４］に記載の細胞塊。
［８６］骨組織を含まない、［７０］〜［８５］のいずれかに記載の細胞塊。
［８７］［６９］〜［８６］のいずれかに記載の細胞塊に含まれる細胞又は組織を含む、嗅覚系の障害に基づく疾患の治療薬。
［８８］［６９］〜［８６］のいずれかに記載の細胞塊に含まれる細胞又は組織を含む、神経組織の障害に基づく疾患の治療薬。
［８９］［６９］〜［８６］のいずれかに記載の細胞塊に含まれる神経細胞又は神経組織を含む、神経毒性又は薬効評価用キット。
［９０］［６９］〜［８６］のいずれかに記載の細胞塊に含まれる嗅神経細胞又は嗅上皮様組織を含む、嗅覚受容体のスクリーニングキット。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、多能性幹細胞から嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊を効率よく製造することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】Ａは嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊の構造を模式的に表した図である。ＢはＡ中の点線で囲った部分を拡大した模式図である。Ｃ〜Ｅは、本発明の細胞塊の別の様態を模式的に表した図である。
【図２】上段は、予備実験１において、培養２８日目の細胞塊の凍結切片の抗Ｌｈｘ２抗体による蛍光免疫染色結果を示す。下段は、上段中の線分Ａ−Ａ’で示す関心領域の線形の蛍光強度プロファイルを出力したグラフである。
【図３】上段は、比較実験１において、ヒトＥＳ細胞から神経細胞を含む細胞凝集体を作製する際の手順を模式的に示した図である。下段Ａは比較実験１において浮遊培養開始２８日後の細胞凝集体の倒立顕微鏡の明視野観察像を示す図である。下段Ｂ〜Ｇは、浮遊培養開始２８日後の凝集体における各細胞マーカーの発現状況を蛍光免疫染色により調べた結果を示す図である。Ｂ〜Ｅは、Ｄｌｘ５、Ｓｏｘ１、ＰａｎＣＫの染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ｆ及びＧは、Ｔｕｊ１の染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ａ中のスケールバーは５００μｍを、Ｂ中のスケールバーは２００μｍを、Ｆ中のスケールバーは１００μｍを示す。Ｈは培養２８日目の細胞凝集体の構造を模式的に表した図である。
【図４】上段は、比較実験２において、ヒトＥＳ細胞から神経組織及び非神経上皮組織を含む細胞凝集体を作製する際の手順を模式的に示した図である。下段Ａは比較実験２において浮遊培養開始２８日後の細胞塊の倒立顕微鏡の明視野観察像を示す図である。下段Ｂ〜Ｍは、浮遊培養開始２８日後の細胞塊における各細胞マーカーの発現状況を蛍光免疫染色により調べた結果を示す図である。Ｂ〜Ｅは、Ｔｕｊ１、Ｓｏｘ２、ＰａｎＣＫの染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ｆ〜Ｉは、Ｓｉｘ１、Ｓｐ８、Ｎ−Ｃａｄｈｅｒｉｎの染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ｊ〜Ｍは、ＥｐＣＡＭ、Ｐａｘ６、Ｃｈｘ１０の染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ａ、Ｂ、Ｆ、Ｊ中のスケールバーは２００μｍを示す。
【図５】Ｏ〜Ｕは、比較実験２において浮遊培養開始２８日後の細胞凝集体における各細胞マーカーの発現状況を蛍光免疫染色により調べた結果を示す図である。Ｏ及びＰはＣｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  αＡの染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ｑ及びＲはＰｒｏｘ１の染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ｓ〜ＵはＣ−Ｍａｆ、Ｓｏｘ１の染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ｏ、Ｓ中のスケールバーは１００μｍを示す。下段Ｖは培養２８日目の細胞凝集体の構造を模式的に表した図である。
【図６】上段は、実験１において、ヒトＥＳ細胞から嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊を作製する際の手順を模式的に示した図である。下段Ａは実験１において浮遊培養開始１３日後の細胞塊の倒立顕微鏡の明視野観察像を示す図である。Ｂ〜Ｌは、実験１において浮遊培養開始１３日後の細胞塊における各細胞マーカーの発現状況を蛍光免疫染色により調べた結果を示す図である。Ｂ〜Ｅは、Ｄｌｘ５、Ｓｏｘ１、ＰａｎＣＫの染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ｆ〜Ｉは、Ｐａｘ６、ＡＰ２α、Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎの染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ｊ〜Ｌは、Ｏｔｘ２、Ｓｏｘ２の染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ａ中のスケールバーは５００μｍを示す。Ｂ中のスケールバーは１００μｍを、Ｆ、Ｊ中のスケールバーは２００μｍを示す。
【図７】Ｍ〜Ｒは、実験１において浮遊培養開始１３日後の細胞凝集体における各細胞マーカーの発現状況を蛍光免疫染色により調べた結果を示す図である。Ｍ〜Ｏは、Ｓｉｘ１、Ｓｐ８の染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ｐ〜Ｒは、Ｓｏｘ３、Ｎ−Ｃａｄｈｅｒｉｎの染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ｍ、Ｐ中のスケールバーは２００μｍを示す。下段Ｓは、培養１３日目のプラコード由来組織を含む細胞凝集体の構造を模式的に表した図である。
【図８】上段は、実験２において、ヒトＥＳ細胞から嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊を作製する際の手順を模式的に示した図である。下段Ａは実験２において浮遊培養開始２８日後の細胞塊の倒立顕微鏡の明視野観察像を示す図である。Ｂ〜Ｍは、実験２において浮遊培養開始２８日後の細胞塊における各細胞マーカーの発現状況を蛍光免疫染色により調べた結果を示す図である。Ｂ〜Ｅは、Ｂｆ１、Ｓｐ８、Ｓｏｘ２の染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ｆ〜Ｉは、Ｓｉｘ１、Ｅｂｆ２、ＮＣＡＭの染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ｊ〜Ｍは、Ｏｔｘ２、ＮｅｕｒｏＤ、Ｔｕｊ１の染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ａ中のスケールバーは５００μｍを、Ｂ、Ｆ、Ｊ中のスケールバーは１００μｍを示す。
【図９】Ｎ〜ＡＩは、実験２において浮遊培養開始２８日後の細胞塊における各細胞マーカーの発現状況を蛍光免疫染色により調べた結果を示す図である。Ｎ〜Ｑは、Ｐａｘ６、Ｐｂｘ１／２／３／４、Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎの染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ｒ〜Ｕは、Ｄｌｘ５、Ｅｍｘ２、ＰａｎＣＫの染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ｖ〜Ｘは、Ｃｈｘ１０、Ｎ−Ｃａｄｈｅｒｉｎの染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ｙ〜ＡＡは、Ｌｈｘ２、Ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎの染色像とその核染色像をそれぞれ示す。ＡＢ〜ＡＥは、図８のＦ〜Ｉの一部を拡大した図をそれぞれ示す。ＡＦ〜ＡＬは、図８のＪ〜Ｍの一部を拡大した図をそれぞれ示す。Ｎ、Ｒ、Ｖ、Ｙ中のスケールバーは１００μｍを、ＡＢ、ＡＦ中のスケールバーは５０μｍを示す。
【図１０】Ａは培養２８日目の嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊の構造を模式的に表した図である。ＢはＡ中の点線で囲った部分を拡大した模式図である。
【図１１】上段は、実験３において、ヒトｉＰＳ細胞から嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊を作製する際の手順を模式的に示した図である。下段Ａ及びＢは実験３において浮遊培養開始２１日後の細胞塊の倒立顕微鏡の明視野観察像を示す図である。Ｃ〜Ｎは、実験３において浮遊培養開始２８日後の細胞塊における各細胞マーカーの発現状況を蛍光免疫染色により調べた結果を示す図である。Ｃ〜Ｆは、Ｔｕｊ１、Ｓｏｘ２、ＰａｎＣＫの染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ｇ〜Ｊは、Ｓｉｘ１、Ｓｐ８、Ｎ−Ｃａｄｈｅｒｉｎの染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ｋ〜Ｎは、Ｐａｘ６、Ｃｈｘ１０、ＥｐＣＡＭの染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ａ、Ｂ中のスケールバーは５００μｍを、Ｃ、Ｇ、Ｋ中のスケールバーは１００μｍを示す。
【図１２】Ｏ〜Ｚは、実験３において浮遊培養開始２１日後の細胞塊における各細胞マーカーの発現状況を蛍光免疫染色により調べた結果を示す図である。Ｏ〜Ｒは、Ｏｔｘ２、ＮＣＡＭ、Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎの染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ｓ〜Ｖは、Ｔｕｊ１、Ｅｂｆ１、ＰａｎＣＫの染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ｗ〜Ｚは、Ｓｉｘ１、Ｅｂｆ２、ＮＣＡＭの染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ｏ中のスケールバーは１００μｍを、Ｓ、Ｗ中のスケールバーは５０μｍを示す。下段ＡＡは、培養２１日目の嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊の構造を模式的に表した図である。
【図１３】上段は、実験４において、ヒトｉＰＳ細胞から嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊を作製する際の手順を模式的に示した図である。下段Ａは実験３において浮遊培養開始２８日後の細胞塊の倒立顕微鏡の明視野観察像を示す図である。Ｂ〜Ｍは、実験３において浮遊培養開始２８日後の細胞塊における各細胞マーカーの発現状況を蛍光免疫染色により調べた結果を示す図である。Ｂ〜Ｅは、Ｄｌｘ５、ＮｅｕｒｏＤ１、ＮＣＡＭの染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ｆ〜Ｉは、ｐ６３、Ｓｏｘ２、Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎの染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ｊ〜Ｍは、Ｐａｘ６、Ｃｈｘ１０、Ｎ−Ｃａｄｈｅｒｉｎの染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ａ中のスケールバーは５００μｍを、Ｂ、Ｆ中のスケールバーは１００μｍを、Ｊ中のスケールバーは５０μｍを示す。
【図１４】Ｎ〜Ｕは、実験４において浮遊培養開始２８日後の細胞塊における各細胞マーカーの発現状況を蛍光免疫染色により調べた結果を示す図である。Ｎ〜Ｑは、Ｓｉｘ１、Ｓｐ８、ＥｐＣＡＭの染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ｒ〜Ｕは、Ｔｕｊ１、Ｅｂｆ２、ＰａｎＣＫの染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ｎ、Ｒ中のスケールバーは１００μｍを示す。Ｖは、実験４に記載の方法によって製造された培養２８日目の嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊の構造を模式的に表した図である。
【図１５】上段は、実験５において、ヒトｉＰＳ細胞から嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊を作製する際の手順を模式的に示した図である。下段Ａは実験５において浮遊培養開始２８日後の細胞塊の倒立顕微鏡の明視野観察像を示す図である。Ｂ〜Ｍは、実験５において浮遊培養開始２８日後の細胞塊における各細胞マーカーの発現状況を蛍光免疫染色により調べた結果を示す図である。Ｂ〜Ｅは、Ｄｌｘ５、ＮｅｕｒｏＤ１、ＮＣＡＭの染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ｆ〜Ｉは、ｐ６３、Ｓｏｘ２、Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎの染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ｊ〜Ｍは、Ｐａｘ６、Ｃｈｘ１０、Ｎ−Ｃａｄｈｅｒｉｎの染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ａ中のスケールバーは５００μｍを、Ｂ、Ｆ、Ｊ中のスケールバーは１００μｍを表す。
【図１６】Ｎ〜Ｕは、実験５において浮遊培養開始２８日後の細胞塊における各細胞マーカーの発現状況を蛍光免疫染色により調べた結果を示す図である。Ｎ〜Ｑは、Ｓｉｘ１、Ｓｐ８、ＥｐＣＡＭの染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ｒ〜Ｕは、Ｔｕｊ１、Ｅｂｆ２、ＰａｎＣＫの染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ｎ、Ｒ中のスケールバーは１００μｍを表す。
【図１７】上段は、実験６において、ヒトｉＰＳ細胞から嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊を作製する際の手順を模式的に示した図である。下段Ａは実験６において浮遊培養開始２８日後の細胞塊の倒立顕微鏡の明視野観察像を示す図である。Ｂ〜Ｍは、実験６において浮遊培養開始２８日後の細胞塊における各細胞マーカーの発現状況を蛍光免疫染色により調べた結果を示す図である。Ｂ〜Ｅは、Ｄｌｘ５、ＮｅｕｒｏＤ１、ＮＣＡＭの染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ｆ〜Ｉは、ｐ６３、Ｓｏｘ２、Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎの染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ｊ〜Ｍは、Ｐａｘ６、Ｃｈｘ１０、Ｎ−Ｃａｄｈｅｒｉｎの染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ａ中のスケールバーは５００μｍを、Ｂ中のスケールバーは１００μｍを表す。
【図１８】Ｎ〜ＡＥは、実験６において浮遊培養開始２８日後の細胞塊における各細胞マーカーの発現状況を蛍光免疫染色により調べた結果を示す図である。Ｎ〜Ｑは、Ｓｉｘ１、Ｓｐ８、ＥｐＣＡＭの染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ｒ〜Ｕは、Ｔｕｊ１、Ｅｂｆ２、ＰａｎＣＫの染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ｖ〜Ｙは、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｉｓｌｅｔ、β−Ｃａｔｅｎｉｎの染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ｚ〜ＡＢは、ＰＫＣζ、Ｌａｍｉｎｉｎの染色像とその核染色像をそれぞれ示す。ＡＣ〜ＡＥは、Ｌｈｘ２、Ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎの染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ｎ、Ｒ、Ｖ、Ｚ、ＡＣ中のスケールバーは１００μｍを表す。
【図１９】ＡＦ〜ＡＪは、実験６において浮遊培養開始２８日後の細胞塊における各細胞マーカーの発現状況を蛍光免疫染色により調べた結果を示す図である。ＡＦ〜ＡＨは、Ｏｔｘ２、ＣＫ８の染色像とその核染色像をそれぞれ示す。ＡＩ、ＡＪはＥｙａ２の染色像とその核染色像をそれぞれ示す。ＡＫは実験６に記載の方法によって製造された培養２８日目の嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊の構造を模式的に表した図である。ＡＦ、ＡＩ中のスケールバーは１００μｍを表す。
【図２０】上段のＡ〜Ｄは、実験７においてヒトＥＳ細胞から嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊を作製する際に、ＢＭＰ４の添加濃度を変化させた時の浮遊培養開始２８日後の細胞塊の倒立顕微鏡の明視野観察像を示す図である。Ａは、Ｇｒａｄｅ１の細胞塊、Ｂは、Ｇｒａｄｅ２の細胞塊、Ｃは、Ｇｒａｄｅ３の細胞塊、Ｇｒａｄｅ４の細胞塊の例である。Ｅは各ＢＭＰ４濃度において形成された細胞塊の品質評価結果をグラフ化したものである。
【図２１】上段は、実験８において、ヒトｉＰＳ細胞から嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊の製造における分化誘導に供するヒトｉＰＳ細胞の化合物前処理の効果を調べる手順を模式的に示した図である。下段Ａ〜Ｇは実験８において浮遊培養開始１３日後の凝集体の倒立顕微鏡の明視野観察像を示す図である。ＡからＤは前処理として溶媒であるＤＭＳＯのみを添加したコントロールの、Ｅ〜Ｇはそれぞれ異なる条件で前処理を行ったヒトｉＰＳ細胞から形成された浮遊培養開始後１３日目の細胞塊の倒立顕微鏡の明視野観察像を示す図である。Ａ及びＥ中のスケールバーは５００μｍを示す。Ｈは各前処理条件において形成された細胞塊の品質評価結果をグラフ化したものである。
【図２２】上段は、実験９において、ヒトｉＰＳ細胞から嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊の製造における各第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の効果を調べる手順を模式的に示した図である。下段Ａ〜Ｆは実験９において浮遊培養開始２８日後の凝集体の倒立顕微鏡の明視野観察像を示す図である。Ａは第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質を添加しないコントロールの、Ｂ〜Ｆは浮遊培養開始時に第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質をその種類を変えて添加した時の、浮遊培養開始後２８日目の細胞塊の倒立顕微鏡の明視野観察像を示す図である。Ａ中のスケールバーは、５００μｍを示す。
【図２３】Ｇは、実験９において、浮遊培養開始後２８日の細胞塊における各細胞マーカーの発現状況を蛍光免疫染色により調べた結果を示す図である。パネルの行は第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の条件、パネルの列は左から順にそれぞれＳｉｘ１、Ｓｏｘ２、汎サイトケラチン（ＰａｎＣＫ）とその核染色像をそれぞれ示す。左上のパネル中のスケールバーは、１００μｍを表す。
【図２４】上段は、実験１０において、三次元培養器を用いてヒトｉＰＳ細胞から嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊を製造する手順を模式的に示した図である。下段Ａ及びＢは実験１０において浮遊培養開始２１日後の凝集体の倒立顕微鏡の明視野観察像を示す図である。Ａ中のスケールバーは５００μｍ、Ｂ中のスケールバーは２００μｍを示す。
【図２５】上段は、実験１１において、ヒトｉＰＳ細胞から嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊の製造におけるＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の添加時期の差による効果を調べる手順を模式的に示した図である。下段Ａ〜Ｅは実験１１において浮遊培養開始１３日後の細胞凝集体の倒立顕微鏡の明視野観察像を示す図である。Ａ及びＤ中のスケールバーは５００μｍを示す。
【図２６】上段は、実験１２において、ヒトｉＰＳ細胞から嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊の製造におけるＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の最適な添加時期を調べる手順を模式的に示した図である。下段Ａ〜Ｄは実験１２において浮遊培養開始２日から６日後の凝集体の倒立顕微鏡の明視野観察像を示す図である。Ｅ〜Ｈは、浮遊培養開始２日から６日後の細胞凝集体のＺＯ−１染色像を示し、Ｉ〜Ｌは、それぞれの核の対比染色像を示す図である。Ａ中のスケールバーは５００μｍを、Ｅ及びＩ中のスケールバーは１００μｍを表す。
【図２７】Ａ〜Ｐは、実験１３において、ラット胎生１４．５日胚の冠状切片を作製し、各マーカーの発現を免疫染色により解析した結果である。Ａは低倍率の核染色の染色図である。Ｂ〜Ｓは、Ａの破線部の領域に相当する領域の連続切片の高倍率の染色図である。Ｂ〜ＥはＴｕｊ１、Ｅｂｆ２、ＰａｎＣＫの染色像とその核染色像、Ｆ〜ＩはＯｔｘ２、Ｅｂｆ１、β−Ｃａｔｅｎｉｎの染色像とその核染色像、Ｊ〜ＬはＥ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｓｏｘ２の染色像とその核染色像、ＭとＮはＤｌｘ５の染色像とその核染色像、ＯとＰはＰＫＣζの染色像とその核染色像、Ｑ〜Ｓはラミニン、ＥｐＣＡＭの染色像とその核染色像を示す図である。Ａ中のスケールバーは５００μｍを、Ｂ、Ｆ、Ｊ、Ｍ、Ｑ中のスケールバーは１００μｍを表す。
【図２８】上段は、実験１４において、ヒトｉＰＳ細胞から嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊の製造におけるＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質とＷｎｔシグナル伝達経路作用物質との併用条件を模式的に示した図である。下段Ａ、Ｂは実験１４において浮遊培養開始２１日目の細胞塊の倒立顕微鏡の明視野観察像を示す図である。Ａ中のスケールバーは５００μｍを、Ｂ中のスケールバーは２００μｍを表す。
【図２９】上段は、実験１５において、ヒトｉＰＳ細胞から嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊の製造におけるＴＡＫ１阻害物質の使用条件を模式的に示した図である。下段Ａ、Ｂは実験１５において浮遊培養開始２１日目の細胞塊の倒立顕微鏡の明視野観察像を示す図である。Ａ中のスケールバーは５００μｍを、Ｂ中のスケールバーは２００μｍを表す。
【図３０】上段は、実験１６において、ヒトｉＰＳ細胞から製造した嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊を、粘性を有する培地中で培養した手順を表す図である。下段Ａは実験１６において浮遊培養開始４５日目の細胞塊の倒立顕微鏡の明視野観察像を示す図である。Ａ中のスケールバーは２００μｍを表す。
【図３１】上段は、実験１７において、ヒトｉＰＳ細胞から嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊の製造における基底膜標品の添加条件を模式的に示した図である。下段Ａ〜Ｄは実験１７において浮遊培養開始２１日目の細胞塊の倒立顕微鏡の明視野観察像を示す図である。Ａ中のスケールバーは５００μｍを表す。
【図３２】上段は、実験１８において、ヒトｉＰＳ細胞から嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊を基底膜標品中で包埋培養した手順を模式的に示した図である。下段Ａは実験１８において浮遊培養開始２１日目の細胞塊の倒立顕微鏡の明視野観察像を示す図である。Ａ中のスケールバーは５００μｍを表す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
［１．定義］
「幹細胞」とは、分化能及び増殖能（特に自己複製能）を有する未分化な細胞を意味する。幹細胞には、分化能力に応じて、多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、複能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、単能性幹細胞（ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）等の亜集団が含まれる。多能性幹細胞とは、インビトロにおいて培養することが可能で、かつ、生体を構成するすべての細胞（三胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）由来の組織）に分化しうる能力（分化多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ））を有する幹細胞をいう。複能性幹細胞とは、全ての種類ではないが、複数種の組織及び細胞へ分化し得る能力を有する幹細胞を意味する。単能性幹細胞とは、特定の組織や細胞へ分化し得る能力を有する幹細胞を意味する。
【００１０】
多能性幹細胞は、受精卵、クローン胚、生殖幹細胞、組織内幹細胞、体細胞等から誘導することができる。多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞：Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、ＥＧ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞：ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）等を挙げることができる。間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：ＭＳＣ）から得られるＭｕｓｅ細胞（Ｍｕｌｔｉ−ｌｉｎｅａｇｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｅｎｄｕｒｉｎｇ  ｃｅｌｌ）や、生殖細胞（例えば精巣）から作製されたＧＳ細胞も多能性幹細胞に包含される。
【００１１】
胚性幹細胞は、１９８１年に初めて樹立され、１９８９年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。１９９８年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。ＥＳ細胞は、内部細胞塊をフィーダー細胞上又はｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ）を含む培地中で培養することにより製造することができる。ＥＳ細胞の製造方法は、例えば国際公開第９６／２２３６２号、国際公開第０２／１０１０５７号、米国特許第５，８４３，７８０号明細書、米国特許第６，２００，８０６号明細書、米国特許第６，２８０，７１８号明細書等に記載されている。胚性幹細胞は、所定の機関より入手でき、また、市販品を購入することもできる。例えばヒト胚性幹細胞であるＫｈＥＳ−１、ＫｈＥＳ−２及びＫｈＥＳ−３は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。いずれもマウス胚性幹細胞である、ＥＢ５細胞は国立研究開発法人理化学研究所より、Ｄ３株はＡＴＣＣより、入手可能である。ヒト胚を破壊すること無く、ヒト胚性幹細胞培養（細胞株）を提供する方法が、例えばＣｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，２００８：２（２）：１１３−１１７、国際公開第０３／０４６１４１号に記載されている。ＥＳ細胞の一つである核移植ＥＳ細胞（ｎｔＥＳ細胞）は、細胞株を取り除いた卵子に体細胞の細胞核を移植して作ったクローン胚から樹立することができる。
【００１２】
ＥＧ細胞は、始原生殖細胞をｍＳＣＦ、ＬＩＦ及びｂＦＧＦを含む培地中で培養することにより製造することができる（Ｃｅｌｌ，７０：８４１−８４７，１９９２）。
【００１３】
「人工多能性幹細胞」とは、体細胞を、公知の方法等により初期化（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）することにより、多能性を誘導した細胞である。具体的には、線維芽細胞や末梢血単核球等分化した体細胞をＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｍｙｃ（ｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃ）、Ｇｌｉｓ１、Ｎａｎｏｇ、Ｓａｌｌ４、ｌｉｎ２８、Ｅｓｒｒｂ等を含む初期化遺伝子群から選ばれる複数の遺伝子の組み合わせのいずれかの発現により初期化して多分化能を誘導した細胞が挙げられる。２００６年、山中らによりマウス細胞で人工多能性幹細胞が樹立された（Ｃｅｌｌ，２００６，１２６（４）ｐｐ．６６３−６７６）。人工多能性幹細胞は、２００７年にヒト線維芽細胞でも樹立され、胚性幹細胞と同様に多能性と自己複製能を有する（Ｃｅｌｌ，２００７，１３１（５）  ｐｐ．８６１−８７２；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００７，３１８（５８５８）  ｐｐ．１９１７−１９２０；Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００８，２６（１）  ｐｐ．１０１−１０６）。人工多能性幹細胞として、遺伝子発現による直接初期化で製造する方法以外に、化合物の添加等により体細胞より人工多能性幹細胞を誘導することもできる（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，３４１  ｐｐ．６５１−６５４）。
【００１４】
人工多能性幹細胞を製造する際に用いられる体細胞としては、特に限定は無いが、組織由来の線維芽細胞、血球系細胞（例えば末梢血単核球やＴ細胞）、肝細胞、膵臓細胞、腸上皮細胞、平滑筋細胞、等が挙げられる。
【００１５】
人工多能性幹細胞を製造する際に、数種類の遺伝子（例、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びＭｙｃの４因子）の発現により初期化する場合、遺伝子の発現させるための手段は特に限定されない。前記手段としては、ウイルスベクター（例えばレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター）を用いた感染法、プラスミドベクター（例えばプラスミドベクター、エピソーマルベクター）を用いた遺伝子導入法（例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、レトロネクチン法、エレクトロポレーション法）、ＲＮＡベクターを用いた遺伝子導入法（例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法）、タンパク質の直接注入法、等が挙げられる。
【００１６】
人工多能性幹細胞は、所定の機関より入手でき、また、市販品を購入することもできる。例えばヒト人工多能性幹細胞株２０１Ｂ７株は京都大学より、ＨＣ−６＃１０株は国立研究開発法人理化学研究所より入手できる。
【００１７】
本発明に用いられる多能性幹細胞は、好ましくは胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞である。
【００１８】
複能性幹細胞としては、造血幹細胞、神経幹細胞、網膜幹細胞、間葉系幹細胞等の組織幹細胞（組織性幹細胞、組織特異的幹細胞又は体性幹細胞とも呼ばれる）を挙げることができる。
【００１９】
遺伝子改変された多能性幹細胞は、例えば相同組換え技術を用いることにより作製できる。改変される染色体上の遺伝子としては、例えば細胞マーカー遺伝子、組織適合性抗原の遺伝子、神経系細胞の障害に基づく疾患関連遺伝子等があげられる。染色体上の標的遺伝子の改変は、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４）、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、バイオマニュアルシリーズ８，ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製、羊土社（１９９５）等に記載の方法を用いて行うことができる。
【００２０】
具体的には、例えば改変する標的遺伝子（例えば細胞マーカー遺伝子、組織適合性抗原の遺伝子や疾患関連遺伝子等）のゲノム遺伝子を単離し、単離されたゲノム遺伝子を用いて標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターを作製する。作製されたターゲットベクターを幹細胞に導入し、標的遺伝子とターゲットベクターの間で相同組換えを起こした細胞を選択することにより、染色体上の遺伝子が改変された幹細胞を作製することができる。
【００２１】
標的遺伝子のゲノム遺伝子を単離する方法としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）やＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）等に記載された公知の方法があげられる。ゲノムＤＮＡライブラリースクリーニングシステム（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製）やＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ  Ｋｉｔｓ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ製）等を用いることにより、標的遺伝子のゲノム遺伝子を単離することもできる。
【００２２】
標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターの作製、及び相同組換え体の効率的な選別は、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、バイオマニュアルシリーズ８，ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（１９９５）等に記載の方法にしたがって行うことができる。ターゲットベクターは、リプレースメント型又はインサーション型のいずれでも用いることができる。選別方法としては、ポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、又はポリＡ選択等の方法を用いることができる。
選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法等があげられる。
【００２３】
「哺乳動物」には、げっ歯類、有蹄類、ネコ目、霊長類等が包含される。げっ歯類には、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等が包含される。有蹄類には、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等が包含される。ネコ目には、イヌ、ネコ等が包含される。「霊長類」とは、霊長目に属するほ乳類動物をいい、霊長類としては、キツネザルやロリス、ツバイ等の原猿亜目と、サル、類人猿、ヒト等の真猿亜目が挙げられる。
【００２４】
本発明に用いる多能性幹細胞は、哺乳動物の多能性幹細胞であり、好ましくはげっ歯類（例えばマウス、ラット）又は霊長類（例えばヒト、サル）の多能性幹細胞であり、最も好ましくはヒトの多能性幹細胞である。
【００２５】
「細胞接着（Ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ）」とは、細胞と細胞同士の接着、及び細胞と細胞外マトリックスとの接着を言う。インビトロの人工培養環境下で生じる、細胞の培養器材等への接着も細胞接着に含有される。細胞接着の種類として、固定結合（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）、連絡結合（ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｎｇ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）、閉鎖結合（ｏｃｃｌｕｄｉｎｇ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）が挙げられる。
【００２６】
「密着結合（Ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）」とは、細胞間の接着のうち、脊椎動物及び脊索動物で見られる閉鎖結合のことを表す。密着結合は上皮細胞間に形成される。生体由来の組織中及び本発明の製造方法等で作製された細胞塊中に密着結合が存在しているかどうかは、例えば密着接合の構成成分に対する抗体（抗クローディン抗体、抗ＺＯ−１抗体等）を用いた免疫組織化学等の手法により検出することができる。
【００２７】
本発明における「浮遊培養」とは、細胞、細胞凝集体又は細胞塊が培養液に浮遊して存在する状態を維持しつつ培養することを言う。すなわち浮遊培養は、細胞、細胞凝集体又は細胞塊を培養器材等に接着させない条件で行われ、培養器材等に接着させる条件で行われる培養（接着培養）は、浮遊培養の範疇に含まれない。この場合、細胞が接着するとは、細胞、細胞凝集体又は細胞塊と培養器材との間に、細胞接着の一種である強固な細胞−基質間結合（ｃｅｌｌ−ｓｕｂｓｔｒａｔｕｍ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）ができることをいう。より詳細には、浮遊培養とは、細胞、細胞凝集体又は細胞塊と培養器材等との間に強固な細胞−基質間結合を作らせない条件での培養をいい、接着培養とは、細胞、細胞凝集体又は細胞塊と培養器材等との間に強固な細胞−基質間結合を作らせる条件での培養をいう。
【００２８】
浮遊培養中の細胞凝集体又は細胞塊においては、細胞と細胞とが面接着する。浮遊培養中の細胞凝集体又は細胞塊では、細胞−基質間結合が細胞と培養器材等との間にはほとんど形成されないか、形成されていてもその寄与が小さい。一部の態様では、浮遊培養中の細胞凝集体又は細胞塊では、内在の細胞−基質間結合が凝集体又は細胞塊の内部に存在するが、細胞−基質間結合が細胞と培養器材等との間にはほとんど形成されないか、形成されていてもその寄与が小さい。
細胞と細胞とが面接着（ｐｌａｎｅ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）するとは、細胞と細胞とが面で接着することをいう。より詳細には、細胞と細胞とが面接着するとは、ある細胞の表面積のうち別の細胞の表面と接着している割合が、例えば１％以上、好ましくは３％以上、より好ましくは５％以上であることをいう。細胞の表面は、膜を染色する試薬（例えばＤｉＩ）による染色、細胞接着因子（例えばＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）の免疫染色等により、観察できる。
【００２９】
浮遊培養を行う際に用いられる培養器は、「浮遊培養する」ことが可能なものであれば特に限定されず、当業者であれば適宜決定することが可能である。このような培養器としては、例えばフラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、スピナーフラスコ又はローラーボトルが挙げられる。これらの培養器は、浮遊培養を可能とするために、細胞非接着性であることが好ましい。細胞非接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば基底膜標品、ラミニン、エンタクチン、コラーゲン、ゼラチン等の細胞外マトリクス、もしくはポリリジン、ポリオルニチン等の高分子を用いたコーティング処理、又は正電荷処理等の表面加工）されていないものなどを使用できる。細胞非接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を低下させる目的で人工的に処理（例えば２‐ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｙｌｏｘｙｅｔｈｙｌ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ（ＭＰＣ）ポリマー等の超親水性処理、タンパク低吸着処理等）されたものなどを使用できる。スピナーフラスコやローラーボトル等を用いて回転培養してもよい。培養器の培養面は、平底でもよいし、凹凸があってもよい。
【００３０】
浮遊培養を行う際に生じる剪断力等の物理的ストレスから細胞凝集体を保護し、また細胞が分泌する増殖因子・サイトカイン類の局所濃度を高め、組織の発達を促進する目的から、細胞凝集体をゲルに包埋、又は物質透過性のあるカプセルに封入したのちに浮遊培養を実施することもできる（Ｎａｔｕｒｅ，２０１３，５０１．７４６７：３７３）。包埋に用いるゲル又はカプセルは生体由来又は合成高分子製のいずれであってもよい。このような目的に用いるゲル又はカプセルとしては、例えばマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）、ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（３Ｄ  Ｍａｔｒｉｘ社製）、ＶｉｔｒｏＧｅｌ  ３Ｄ（ＴｈｅＷｅｌｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、コラーゲンゲル（新田ゼラチン株式会社製）、アルギン酸ゲル（株式会社ＰＧリサーチ製）、Ｃｅｌｌ−ｉｎ−ａ−Ｂｏｘ（Ａｕｓｔｒｉａｎｏｖａ社製）等が挙げられる。
【００３１】
細胞の培養に用いられる培地は、動物細胞の培養に通常用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えばＢａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ（ＢＭＥ）、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ  １０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ）、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９、Ｅａｇｌｅ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｅａｇｌｅ  ＭＥＭ）、Ａｌｐｈａ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（αＭＥＭ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、Ｆ−１２培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＩＭＤＭ／Ｆ１２、ハム培地、ＲＰＭＩ  １６４０、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、又はこれらの混合培地等が挙げられる。
多能性幹細胞の培養には、上記基礎培地をベースとした多能性幹細胞培養用の培地、好ましくは公知の胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞の培地、フィーダーフリー下で多能性幹細胞を培養するための培地（フィーダーフリー培地）等を用いることができる。フィーダーフリー培地としては、例えばＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ８培地、ＴｅＳＲ培地、ｍＴｅＳＲ培地、ｍＴｅＳＲ−Ｅ８培地、ＳｔｅｍＦｉｔ培地等を挙げることができる。
【００３２】
本発明における「無血清培地」とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味する。本発明では、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば増殖因子）が混入している培地も、無調整又は未精製の血清を含まない限り無血清培地に含まれる。
【００３３】
無血清培地は、血清代替物を含有していてもよい。血清代替物としては、例えばアルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール、３’チオールグリセロール又はこれらの均等物等を適宜含有するものを挙げることができる。かかる血清代替物は、例えばＷＯ９８／３０６７９に記載の方法により調製することができる。血清代替物としては市販品を利用してもよい。市販の血清代替物としては、例えばＫｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製：以下、「ＫＳＲ」と記すこともある。）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ−ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、Ｂ２７  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、Ｎ２  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）等が挙げられる。
【００３４】
浮遊培養で用いる無血清培地は、適宜、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有してもよい。
【００３５】
調製の煩雑さを回避するために、無血清培地として、市販のＫＳＲ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を適量（例えば約０．５％から約３０％、好ましくは約１％から約２０％）添加した無血清培地（例えばＦ−１２培地とＩＭＤＭ培地の１：１混合液に１×ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ−ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ、５％ＫＳＲ及び４５０μＭ  １−モノチオグリセロールを添加した培地）を使用してもよい。また、ＫＳＲ同等品として特表２００１−５０８３０２に開示された培地が挙げられる。
【００３６】
本発明における「血清培地」とは、無調整又は未精製の血清を含む培地を意味する。当該培地は、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２−メルカプトエタノール、１−モノチオグリセロール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有してもよい。例えばマトリゲル等の基底膜標品を使用して多能性幹細胞を網膜組織等に分化誘導する場合には、血清培地を用いることができる（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，１０（６），７７１−７７５（２０１２））。
【００３７】
本発明における培養は、好ましくはゼノフリー条件で行われる。「ゼノフリー」とは、培養対象の細胞の生物種とは異なる生物種由来の成分が排除された条件を意味する。
【００３８】
本発明に用いる培地は、化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、好ましくは含有成分が化学的に決定された培地（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ：ＣＤＭ）である。
【００３９】
「基底膜（Ｂａｓｅｍｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）様構造」とは、細胞外マトリックスより構成される薄い膜状の構造を意味する。基底膜は生体においては、上皮細胞の基底側（ｂａｓａｌ）に形成される。基底膜の成分としては、ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（パールカン）、エンタクチン／ニドゲン、サイトカイン、成長因子等が挙げられる。生体由来の組織中並びに本発明の製造方法等で作製された細胞塊中に基底膜が存在しているかどうかは、例えばＰＡＭ染色等の組織染色、並びに基底膜の構成成分に対する抗体（抗ラミニン抗体、抗ＩＶ型コラーゲン抗体等）を用いた免疫組織化学等の手法により検出することができる。
【００４０】
「基底膜標品」とは、その上に基底膜形成能を有する所望の細胞を播種して培養した場合に、上皮細胞様の細胞形態、分化、増殖、運動、機能発現等を制御する機能を有する基底膜構成成分を含むものをいう。例えば本発明により製造された細胞及び組織を分散させ、さらに接着培養を行う際には、基底膜標品存在下で培養することができる。ここで、「基底膜構成成分」とは、動物の組織において、上皮細胞層と間質細胞層等との間に存在する薄い膜状をした細胞外マトリクス分子をいう。基底膜標品は、例えば基底膜を介して支持体上に接着している基底膜形成能を有する細胞を、該細胞の脂質溶解能を有する溶液やアルカリ溶液等を用いて支持体から除去することで作製することができる。基底膜標品としては、基底膜調製物として市販されている商品（例えばＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製：以下、マトリゲルと記すこともある））やＧｅｌｔｒｅｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、基底膜成分として公知の細胞外マトリックス分子（例えばラミニン、ＩＶ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン等）を含むものが挙げられる。
【００４１】
本発明において、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫等の組織又は細胞から抽出、可溶化されたマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）等の基底膜標品を細胞又は組織の培養に用いることができる。同様に細胞培養に用いる基底膜成分として、ヒト可溶化羊膜（株式会社生物資源応用研究所製）、ＨＥＫ２９３細胞に産生させたヒト組み換えラミニン（ＢｉｏＬａｍｉｎａ社製）、ヒト組み換えラミニン断片（ニッピ社製）、ヒト組み換えビトロネクチン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）等も用いることができるが、異なる生物種由来の成分混入を回避する観点、及び感染症のリスクを回避する観点から、好ましくは成分の明らかな組み換えタンパク質である。
【００４２】
本発明において、「物質Ｘを含む培地」「物質Ｘの存在下」とは、外来性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）の物質Ｘが添加された培地もしくは外来性の物質Ｘを含む培地、又は外来性の物質Ｘの存在下を意味する。すなわち、当該培地中に存在する細胞又は組織が当該物質Ｘを内在的（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）に発現、分泌又は産生していても、内在的な物質Ｘは外来性の物質Ｘとは区別され、外来性の物質Ｘを含んでいない培地は「物質Ｘを含む培地」の範疇には該当しないと解する。また、培地中の物質Ｘは、物質Ｘの分解又は培地の蒸発による微量な濃度の変化が起こっていてもよい。
例えば「ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含む培地」とは、外来性のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質が添加された培地又は外来性のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含む培地である。
【００４３】
物質Ｘの濃度がＹである培地中での培養開始時とは、好ましくは培地中の物質Ｘの濃度がＹで均一となった時点を指すが、培養容器が十分に小さい（例えば９６ウェルプレートや、培養液が２００μＬ以下での培養）場合、濃度がＹとなるように後述する培地添加操作、半量培地交換操作又は全量培地交換操作を行った時点を濃度Ｙでの培養開始時と解釈する。また、培地中の物質Ｘの濃度がＹであるとは、一定の培養期間を通じたＸの平均の濃度がＹである場合、物質ＸをＹの濃度で含む期間が培養期間の５０％以上である場合、物質ＸをＹの濃度で含む期間が各工程において想定される培養期間のうち最も短い期間以上である場合等を含む。
【００４４】
本発明において、「物質Ｘの非存在下」とは、外来性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）の物質Ｘが添加されていない培地もしくは外来性の物質Ｘを含まない培地、又は外来性の物質Ｘの存在しない状態を意味する。
【００４５】
本発明において、「Ａ時間（Ａ日）以降」とはＡ時間（Ａ日）を含み、Ａ時間（Ａ日）から後のことをいう。「Ｂ時間（Ｂ日）以内」とは、Ｂ時間（Ｂ日）を含み、Ｂ時間（Ｂ日）から前のことをいう。
【００４６】
本発明において、フィーダー細胞とは、幹細胞を培養するときに共存させる当該幹細胞以外の細胞を指す。多能性幹細胞の未分化維持培養に用いられるフィーダー細胞としては、例えばマウス線維芽細胞（ＭＥＦ）、ヒト線維芽細胞、ＳＮＬ細胞等が挙げられる。フィーダー細胞としては、増殖抑制処理したフィーダー細胞が好ましい。増殖抑制処理としては、増殖抑制剤（例えばマイトマイシンＣ等）処理又はＵＶ照射等が挙げられる。多能性幹細胞の未分化維持培養に用いられるフィーダー細胞は、液性因子（好ましくは未分化維持因子）の分泌や、細胞接着用の足場（細胞外基質）の作製により、多能性幹細胞の未分化維持に貢献する。
【００４７】
本発明において、フィーダー細胞非存在下（フィーダーフリー）とは、フィーダー細胞非存在下にて培養することである。フィーダー細胞非存在下とは、例えばフィーダー細胞を添加していない条件、又はフィーダー細胞を実質的に含まない（例えば全細胞数に対するフィーダー細胞数の割合が３％以下）の条件が挙げられる。
【００４８】
本発明において、「細胞凝集体」（ｃｅｌｌ  ａｇｇｒｅｇａｔｅ）とは、培地中に分散していた細胞が集合して形成された塊であって、細胞同士が接着している塊をいう。胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙ）、スフェア（Ｓｐｈｅｒｅ）、スフェロイド（Ｓｐｈｅｒｏｉｄ）、オルガノイド（Ｏｒｇａｎｏｉｄ）も細胞凝集体に包含される。好ましくは細胞凝集体において、細胞同士が面接着している。一部の態様において、凝集体の一部分又は全部において、細胞同士が細胞−細胞間結合（ｃｅｌｌ−ｃｅｌｌ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）又は細胞接着（ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ）、例えば接着結合（ａｄｈｅｒｅｎｃｅ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）を形成している場合がある。本発明における「細胞凝集体」として具体的には、後述する「２．嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊の製造方法」における、工程（１）で生成する、浮遊培養開始時に分散していた細胞が形成する凝集体が挙げられる。
【００４９】
本発明において、「均一な凝集体」とは、複数の凝集体を培養する際に各凝集体の大きさが一定であることを意味し、凝集体の大きさを最大径の長さで評価する場合、均一な凝集体とは、最大径の長さの分散が小さいことを意味する。より具体的には、凝集体の集団全体のうちの７５％以上の凝集体が、当該凝集体の集団における最大径の平均値±１００％、好ましくは平均値±５０％の範囲内、より好ましくは平均値±２０％の範囲内であることを意味する。
【００５０】
本発明において、「均一な凝集体を形成させる」とは、細胞を集合させて細胞凝集体を形成させ浮遊培養する際に、「一定数の分散した細胞を迅速に凝集」させることで大きさが均一な細胞凝集体を形成させることをいう。
【００５１】
分散とは、細胞や組織を酵素処理や物理処理等の分散処理により、小さな細胞片（２細胞以上１００細胞以下、好ましくは５０細胞以下）又は単一細胞まで分離させることをいう。一定数の分散した細胞とは、細胞片又は単一細胞を一定数集めたもののことをいう。
多能性幹細胞を分散させる方法としては、例えば機械的分散処理、細胞分散液処理、細胞保護剤添加処理等が挙げられる。これらの処理を組み合わせて行ってもよい。好ましくは細胞分散液処理を行い、次いで機械的分散処理をするとよい。
【００５２】
機械的分散処理の方法としては、ピペッティング処理、スクレーパーでの掻き取り操作等が挙げられる。
細胞分散液処理に用いられる細胞分散液としては、例えばトリプシン、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、プロナーゼ、ＤＮａｓｅ、パパイン等の酵素類や、エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤のいずれかを含む溶液等を挙げることができる。市販の細胞分散液、例えばＡｃｃｕｍａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）やＴｒｉｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ  （Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いることもできる。
細胞保護剤添加処理に用いられる細胞保護剤としては、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質、ヘパリン、Ｒｈｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ（ＲＯＣＫ）阻害物質、血清、血清代替物等を挙げることができる。好ましい細胞保護剤としては、ＲＯＣＫ阻害物質が挙げられる。
多能性幹細胞を分散させる方法としては、例えば多能性幹細胞のコロニーをＲＯＣＫ阻害物質の存在下で細胞分散液（Ａｃｃｕｍａｘ）で処理し、さらにピペッティングにより分散させる方法が挙げられる。
【００５３】
本発明の製造方法においては、多能性幹細胞を迅速に集合させて多能性幹細胞の凝集体を形成させることが好ましい。このように多能性幹細胞の凝集体を形成させると、形成された凝集体から分化誘導される細胞において上皮様構造を再現性よく形成させることができる。細胞の凝集体を形成させる実験的な操作としては、例えばウェルの小さなプレート（例えばウェルの底面積が平底換算で０．１〜２．０ｃｍ２程度のプレート）やマイクロポア等を用いて小さいスペースに細胞を閉じ込める方法、小さな遠心チューブを用いて短時間遠心することで細胞を凝集させる方法が挙げられる。ウェルの小さなプレートとして、例えば２４ウェルプレート（面積が平底換算で１．８８ｃｍ２程度）、４８ウェルプレート（面積が平底換算で１．０ｃｍ２程度）、９６ウェルプレート（面積が平底換算で０．３５ｃｍ２程度、内径６〜８ｍｍ程度）、３８４ウェルプレートが挙げられる。好ましくは９６ウェルプレートが挙げられる。ウェルの小さなプレートの形状として、ウェルを上から見たときの底面の形状としては、多角形、長方形、楕円、真円が挙げられ、好ましくは真円が挙げられる。ウェルの小さなプレートの形状として、ウェルを横から見たときの底面の形状としては、外周部が高く内凹部が低くくぼんだ構造が好ましく、例えばＵ底、Ｖ底、Ｍ底が挙げられ、好ましくはＵ底又はＶ底、最も好ましくはＶ底が挙げられる。ウェルの小さなプレートとして、細胞培養皿（例えば６０ｍｍ〜１５０ｍｍディッシュ、カルチャーフラスコ）の底面に凹凸又はくぼみがあるものを用いてもよい。ウェルの小さなプレートの底面は、細胞非接着性の底面、好ましくは上記の細胞非接着性コートした底面を用いるのが好ましい。
【００５４】
多能性幹細胞の凝集体が形成されたことや、凝集体を形成する各細胞において上皮様構造が形成されたことは、凝集体のサイズ及び細胞数、巨視的形態、組織染色解析による微視的形態及びその均一性、分化及び未分化マーカーの発現並びにその均一性、分化マーカーの発現制御及びその同期性、分化効率の凝集体間の再現性等に基づき判断することが可能である。
【００５５】
「組織」とは、形態や性質が異なる複数種類の細胞が一定のパターンで立体的に配置した構造を有する細胞集団の構造体をさす。
【００５６】
「神経組織」とは、発生期又は成体期の大脳、中脳、小脳、脊髄、網膜、感覚神経、末梢神経等の、神経系細胞によって構成される組織を意味する。
本発明において、「神経上皮組織」とは、神経組織が層構造をもつ上皮構造を形成したもののことをいい、神経組織中の神経上皮組織は光学顕微鏡を用いた明視野観察等により存在量を評価することができる。
【００５７】
「中枢神経系」とは、神経組織が集積し、情報処理の中心をなす領域を表す。脊椎動物では、脳と脊髄が中枢神経系に含まれる。
【００５８】
「神経系細胞（Ｎｅｕｒａｌ  ｃｅｌｌ）」とは、外胚葉由来組織のうち表皮系細胞以外の細胞を表す。すなわち、神経系細胞には、神経系前駆細胞、ニューロン（神経細胞）、グリア細胞、神経幹細胞、ニューロン前駆細胞、グリア前駆細胞等の細胞を含む。神経系細胞には、後述する網膜組織を構成する細胞（網膜細胞）、網膜前駆細胞、網膜層特異的神経細胞、神経網膜細胞、網膜色素上皮細胞も包含される。神経系細胞は、Ｎｅｓｔｉｎ、βＩＩＩチューブリン（Ｔｕｊ１）、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ、Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ等をマーカーとして同定することができる。
【００５９】
ニューロンは、神経回路を形成し情報伝達に貢献する機能的な細胞であり、ＴｕＪ１、Ｄｃｘ、ＨｕＣ／Ｄ等の幼若神経細胞マーカー、及び／又はＭａｐ２、ＮｅｕＮ等の成熟神経細胞マーカーの発現を指標に同定することができる。
【００６０】
グリア細胞としては、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミュラーグリア等が挙げられる。アストロサイトのマーカーとしてはＧＦＡＰ、オリゴデンドロサイトのマーカーとしてはＯ４、ミュラーグリアのマーカーとしてはＣＲＡＬＢＰ等が挙げられる。
【００６１】
神経幹細胞とは、神経細胞及びグリア細胞への分化能（多分化能）と、多分化能を維持した増殖能（自己複製能ということもある）を持つ細胞である。神経幹細胞のマーカーとしてはＮｅｓｔｉｎ、Ｓｏｘ２、Ｍｕｓａｓｈｉ、Ｈｅｓファミリー、ＣＤ１３３等が挙げられるが、これらのマーカーは前駆細胞全般のマーカーであり神経幹細胞特異的なマーカーとは考えられていない。神経幹細胞の数は、ニューロスフェアアッセイやクローナルアッセイ等により評価することができる。
【００６２】
ニューロン前駆細胞とは、増殖能をもち、神経細胞を産生し、グリア細胞を産生しない細胞である。ニューロン前駆細胞のマーカーとしては、Ｔｂｒ２、Ｔα１等が挙げられる。あるいは、幼若神経細胞マーカー（ＴｕＪ１、Ｄｃｘ、ＨｕＣ／Ｄ）陽性かつ増殖マーカー（Ｋｉ６７、ｐＨ３、ＭＣＭ）陽性の細胞を、ニューロン前駆細胞として同定することもできる。
グリア前駆細胞とは、増殖能もち、グリア細胞を産生し、神経細胞を産生しない細胞である。
【００６３】
神経系前駆細胞（Ｎｅｕｒａｌ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌ）は、神経幹細胞、ニューロン前駆細胞及びグリア前駆細胞を含む前駆細胞の集合体であり、増殖能とニューロン及びグリア産生能をもつ。神経系前駆細胞はＮｅｓｔｉｎ、ＧＬＡＳＴ、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｍｕｓａｓｈｉ、Ｐａｘ６等をマーカーとして同定することができる。神経系細胞のマーカー陽性かつ増殖マーカー（Ｋｉ６７、ｐＨ３、ＭＣＭ）陽性の細胞を、神経系前駆細胞として同定することもできる。
【００６４】
「網膜組織」とは、生体網膜において各網膜層を構成する視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜神経節細胞、これらの前駆細胞、又は網膜前駆細胞等の細胞が、少なくとも複数種類、層状で立体的に配列した網膜組織を意味する。それぞれの細胞がいずれの網膜層を構成する細胞であるかは、公知の方法、例えば細胞マーカーの発現有無、その程度等により確認できる。
【００６５】
「網膜前駆細胞」とは、視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞のいずれの成熟な網膜細胞にも分化しうる前駆細胞をいう。
視細胞前駆細胞、水平細胞前駆細胞、双極細胞前駆細胞、アマクリン細胞前駆細胞、網膜節細胞前駆細胞、網膜色素上皮前駆細胞とは、それぞれ、視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞への分化が決定付けられている前駆細胞をいう。
【００６６】
「網膜層特異的神経細胞」とは、網膜層を構成する細胞であって網膜層に特異的な神経細胞を意味する。網膜層特異的神経細胞としては、双極細胞、網膜神経節節細胞、アマクリン細胞、水平細胞、視細胞、網膜色素上皮細胞、杆体細胞及び錐体細胞を挙げることができる。
【００６７】
「網膜細胞」には、上述の網膜前駆細胞及び網膜層特異的神経細胞が包含される。
網膜細胞マーカーとしては、網膜前駆細胞で発現するＲｘ（Ｒａｘとも言う）、Ａｌｄｈ１ａ３、及びＰａｘ６、視床下部ニューロンの前駆細胞では発現するが網膜前駆細胞では発現しないＮｋｘ２．１、視床下部神経上皮で発現し網膜では発現しないＳｏｘ１、視細胞の前駆細胞で発現するＣｒｘ、Ｂｌｉｍｐ１等が挙げられる。網膜層特異的神経細胞のマーカーとしては、双極細胞で発現するＣｈｘ１０、ＰＫＣα及びＬ７、網膜神経節細胞で発現するＴｕｊ１及びＢｒｎ３、アマクリン細胞で発現するＣａｌｒｅｔｉｎｉｎ、水平細胞で発現するＣａｌｂｉｎｄｉｎ、成熟視細胞で発現するＲｈｏｄｏｐｓｉｎ及びＲｅｃｏｖｅｒｉｎ、杆体細胞で発現するＮｒｌ、錐体細胞で発現するＲｘｒ−ｇａｍｍａ、網膜色素上皮細胞で発現するＲＥＰ６５及びＭｉｔｆ等が挙げられる。
【００６８】
「大脳組織」とは、胎児期又は成体の大脳を構成する細胞（例えば大脳神経系前駆細胞（ｃｏｒｔｉｃａｌ  ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌ）、背側大脳神経系前駆細胞、腹側大脳神経系前駆細胞、大脳層構造特異的神経細胞（ニューロン）、第一層ニューロン、第二層ニューロン、第三層ニューロン、第四層ニューロン、第五層ニューロン、第六層ニューロン、グリア細胞（アストロサイト及びオリゴデンドロサイト）、これらの前駆細胞等）が、一種類又は複数種類、層状で立体的に配列した組織を意味する。胎児期の大脳は、前脳又は終脳とも呼ばれる。それぞれの細胞の存在は、公知の方法、例えば細胞マーカーの発現有無、その程度等により確認できる。
【００６９】
「大脳層」とは、成体大脳又は胎児期大脳を構成する各層を意味し、具体的には、分子層、外顆粒層、外錐体細胞層、内顆粒層、神経細胞層（内錐体細胞層）、多型細胞層、第一層、第二層、第三層、第四層、第五層、第六層、皮質帯、中間帯、脳室下帯及び脳室帯（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｚｏｎｅ）を挙げることができる。
【００７０】
「大脳神経系前駆細胞」としては、ニューロン前駆細胞、第一層ニューロン前駆細胞、第二層ニューロン前駆細胞、第三層ニューロン前駆細胞、第四層ニューロン前駆細胞、第五層ニューロン前駆細胞、第六層ニューロン前駆細胞、アストロサイト前駆細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞等を挙げることができる。それぞれの細胞は、第一層ニューロン、第二層ニューロン、第三層ニューロン、第四層ニューロン、第五層ニューロン、第六層ニューロン、アストロサイト、及びオリゴデンドロサイトへの分化が決定付けられている前駆細胞である。
「大脳神経系前駆細胞」は、第一層ニューロン、第二層ニューロン、第三層ニューロン、第四層ニューロン、第五層ニューロン、第六層ニューロン、アストロサイト、及びオリゴデンドロサイトのうちの少なくとも複数の分化系譜への分化能（多分化能）をもつ複能性幹細胞（複能性神経幹細胞、ｍｕｌｔｉ−ｐｏｔｅｎｔ  ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）を含む。
【００７１】
「大脳層特異的神経細胞」とは、大脳層を構成する細胞であって大脳層に特異的な神経細胞を意味する。大脳層特異的神経細胞としては、第一層ニューロン、第二層ニューロン、第三層ニューロン、第四層ニューロン、第五層ニューロン、第六層ニューロン、大脳興奮性ニューロン、大脳抑制性ニューロン等を挙げることができる。
【００７２】
大脳細胞マーカーとしては、大脳細胞で発現するＦｏｘＧ１（別名Ｂｆ１）、大脳神経系前駆細胞で発現するＳｏｘ２及びＮｅｓｔｉｎ、背側大脳神経系前駆細胞で発現するＰａｘ６及びＥｍｘ２、腹側大脳神経系前駆細胞で発現するＤｌｘ１、Ｄｌｘ２及びＮｋｘ２．１、ニューロン前駆細胞で発現するＴｂｒ２、Ｎｅｘ、Ｓｖｅｔ１、第六層ニューロンで発現するＴｂｒ１、第五層ニューロンで発現するＣｔｉｐ２、第四層ニューロンで発現するＲＯＲβ、第三層ニューロン又は第二層ニューロンで発現するＣｕｘ１又はＢｒｎ２、第一層ニューロンで発現するＲｅｅｌｉｎ等が挙げられる。
【００７３】
「嗅皮質」とは、嗅球からの単シナプス性入力を受け、嗅覚情報の処理に関わる大脳の一領域である。
嗅皮質で発現する遺伝子及びマーカーとしては、Ｔｂｒ１、ＦｏｘＰ２、Ｃｔｉｐ２、Ｎｏｒ１（ＮＲ４ａ３）、ＤＡＡＲＰ−３２、ＣＵＸ１、Ｂｒｎ２、ＣＡＲＴ等が挙げられる。
【００７４】
「大脳基底核」とは、大脳の一領域に存在する神経核の集合体である。大脳基底核に含まれる神経核として、線条体、淡蒼球、視床下核、黒質等が挙げられる。
「大脳基底核原基」とは、発生中の胚の脳室内に形成される神経系細胞からなる構造である。大脳基底核原基は成体の大脳基底核の基となることに加え、複数種の神経細胞を産生し、それらの細胞は発生中に中枢神経系の各所へと遊走する。
【００７５】
「吻側移動経路（ｒｏｓｔｒａｌ  ｍｉｇｒａｔｏｒｙ  ｓｔｒｅａｍ）」とは、脳室下帯の神経幹細胞から産生された新生ニューロンが、嗅球へと遊走する現象及びその経路を表す。吻側移動経路を移動中のニューロンは、例えばＰＳＡ−ＮＣＡＭ、Ｄｃｘのような遊走中の神経細胞マーカーを用いて検出することができる。
【００７６】
「嗅球」とは、大脳の先端部に存在し、嗅上皮に存在する嗅覚受容細胞から入力を受け、嗅覚情報の処理に関わる中枢神経系の一領域を意味する。嗅球に存在する細胞は層構造を形成しており、表層から順に、嗅神経層（ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｎｅｒｖｅ  ｌａｙｅｒ）、糸球体層（ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｌａｙｅｒ）、外網状層（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｐｌｅｘｉｆｏｒｍ  ｌａｙｅｒ）、僧帽細胞層（ｍｉｔｒａｌ  ｃｅｌｌ  ｌａｙｅｒ）、内網状層（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｐｌｅｘｉｆｏｒｍ  ｌａｙｅｒ）、顆粒細胞層（ｇｒａｎｕｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌａｙｅｒ）と呼称される。嗅球の神経細胞には、興奮性ニューロンとして僧帽細胞（ｍｉｔｒａｌ  ｃｅｌｌ）と房飾細胞（ｔｕｆｔｅｄ  ｃｅｌｌ）があり、抑制性ニューロン（介在ニューロン）として傍糸球体細胞（ｐｅｒｉｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｃｅｌｌ）と顆粒細胞（ｇｒａｎｕｌｅ  ｃｅｌｌ）がある。
嗅球で発現する遺伝子及びマーカーとしては、Ａｒｘ、Ｔｂｒ１、Ｔｂｒ２／ＥＯＭＥＳ、Ｔｂｘ２１、Ｉｂａ１等が挙げられる。
【００７７】
「非神経上皮組織」とは、上皮構造を有する組織のうち神経上皮組織以外の組織を表す。上皮組織は外胚葉、中胚葉、内胚葉、栄養外胚葉のいずれの胚葉からも形成される。上皮組織には上皮、中皮、内皮が含まれる。非神経上皮組織に含まれる組織の例としては、表皮、角膜上皮、鼻腔上皮（嗅上皮を含む）、口腔上皮、気管上皮、気管支上皮、気道上皮、腎上皮、腎皮質上皮、胎盤上皮等が挙げられる。
上皮組織は通常種々の細胞間結合によりつながれており、単層又は重層化した層構造を有する組織を形成する。これら上皮組織の有無の確認、存在量の定量は光学顕微鏡による観察か、上皮細胞マーカーに対する抗体（抗Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体、抗Ｎ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体、抗ＥｐＣＡＭ抗体等）を用いた免疫組織化学等の手法により可能である。
【００７８】
「プラコード（ｐｌａｃｏｄｅ）」とは、主に脊椎動物の発生過程において表皮外胚葉の一部が肥厚して形成される器官の原基のことを表す。プラコードに由来する組織としては、水晶体、嗅上皮、内耳、三叉神経、下垂体等が挙げられる。プラコード又はその前駆組織である前プラコード領域（ｐｒｅｐｌａｃｏｄｅ  ｒｅｇｉｏｎ）のマーカーとしては、Ｓｉｘ１、Ｓｉｘ４、Ｄｌｘ５、Ｅｙａ２等が挙げられる。
【００７９】
「嗅上皮」とは鼻腔中にある上皮組織であり、生体が匂いの情報を感知する嗅覚器官を表す。嗅上皮はプラコードに由来する組織の一つであり、嗅覚受容体を発現し、空気中の揮発性分子を感知する嗅神経細胞と、嗅神経細胞を支える支持細胞、嗅上皮の幹細胞及び前駆細胞である基底細胞、粘液を分泌するボーマン腺細胞等の細胞から構成されている。嗅上皮は形態的に表層・中間層・基底層に分類され、表層には支持細胞、中間層には嗅神経細胞、基底層には基底細胞が存在する。ボーマン腺は嗅上皮内に分枝管状の胞状腺を形成し、点在している。
【００８０】
「嗅上皮の前駆組織」とは嗅上皮プラコードを含む。嗅上皮及び嗅上皮プラコードで発現する遺伝子及びマーカーとしては、前記したプラコード領域及び前プラコード領域のマーカーに加え、Ｐａｘ６、Ｏｔｘ２、ＦｏｘＧ１（別名Ｂｆ１）、Ｓｏｘ２、Ｐｏｕ２ｆ１、Ｓｐ８、Ｃｈｄ７、Ｎ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＥｐＣＡＭ、ＣＫ１８、ＰＤＧＦＲβ等が挙げられる。
【００８１】
鋤鼻器は嗅覚系組織の一種であり、生体が嗅上皮とは別に持つ嗅覚器官である。鋤鼻器はヤコブソン器官あるいはヤコプソン器官とも称される。哺乳類における鋤鼻器は、一般的な揮発性物資を感知する嗅上皮とは役割が異なり、フェロモン様物質を受容する神経細胞がより多く存在している。
【００８２】
「嗅覚系組織」とは、胎児期又は成体の嗅覚系組織、例えば嗅上皮を構成する細胞（例えば嗅神経細胞、支持細胞、基底細胞、ボーマン腺細胞、嗅神経鞘細胞及びこれらの前駆細胞等）、嗅球を構成する細胞、嗅皮質を構成する細胞等が、一種類又は少なくとも複数種類、層状で立体的に配列した組織を意味する。それぞれの細胞の存在は、公知の方法、例えば細胞特異的遺伝子の発現有無若しくはその程度等により確認できる。
【００８３】
「嗅神経細胞」（ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎ：ＯＲＮ）とは、鼻腔粘膜の嗅上皮中間層にある嗅覚を受容する神経細胞のことを表す。嗅神経細胞は表面の線毛にある嗅覚受容体で空気中の揮発性分子をとらえる。嗅神経細胞は双極性の感覚細胞であり、末梢側で発現している嗅覚受容体でとらえられた嗅覚情報は中枢側の嗅糸と呼ばれる神経軸索に伝搬される。嗅糸は数十本ずつ集まって一つの束を形成し、嗅神経はこれらの束すべてを指す。嗅糸は頭蓋骨の篩骨篩板にある篩骨孔を通って脳の嗅球に達し、そこで僧帽細胞等にシナプス結合して、脳内の嗅覚中枢へ嗅覚情報を伝達する。
【００８４】
嗅神経細胞及び前駆細胞で発現する遺伝子及びマーカーとしては、環状ヌクレオチド感受性チャンネルα２サブユニット（ＣＮＧＡ２）、環状ヌクレオチド感受性チャンネルα４サブユニット（ＣＮＧＡ４）、環状ヌクレオチド感受性チャンネルβ１ｂサブユニット、嗅覚特異性Ｇタンパク質（Ｇｏｌｆ）アデニル酸シクラーゼ、Ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  Ｍａｒｋｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＯＭＰ）、ＮＣＡＭ、ＯＣＡＭ（ＮＣＡＭ−２）、Ｅｂｆ１、Ｅｂｆ２、Ｅｂｆ３、ＮｅｕｒｏＤ、ＰＧＰ９．５、Ｎｅｕｒｏｎ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｅｎｏｌａｓｅ（ＮＳＥ）、Ｇｒｏｗｔｈ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ４３（ＧＡＰ−４３／Ｂ５０）、ビメンチン、Ｌｈｘ２、Ｉｄ３、β−Ｔｕｂｕｌｉｎ  ＩＩＩ（Ｔｕｊ）、Ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ、ＴｒｋＢ、Ｃｔｉｐ２、Ｕｎｃｘ及び嗅覚受容体（ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＯＲ）等が挙げられる。
【００８５】
「支持細胞」（Ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ  Ｃｅｌｌ）とは、嗅上皮の最も頂端面側に存在する多列円柱上皮様の細胞を表す。支持細胞は嗅神経細胞等の他の細胞の機能の発揮、生存や上皮構造の維持等に関わる。嗅上皮の支持細胞は、支持細胞（Ｓｕｓｔｅｎｔａｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ）及び微絨毛細胞（Ｍｉｃｒｏｖｉｌｌａｒ  ｃｅｌｌ）の二種の細胞から構成されている。
支持細胞で発現する遺伝子及びマーカーとしては、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、Ｃａｒｂｏｎｙｌ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ２（Ｃｂｒ２）、Ｓ−１００、Ｅｚｒｉｎ、Ｒｅｅｐ６、Ｓｏｘ２、Ｔｙｒｏ３、ＣＹＰ２Ａ６、ＳＵＳ−１、ＳＵＳ−４、ＥＰＡＳ１等が挙げられる。
【００８６】
「基底細胞」（ｂａｓａｌ  ｃｅｌｌ）とは、嗅上皮の基底層に存在する細胞を表す。基底細胞は形態的に球状基底細胞（ｇｌｏｂｏｓｅ  ｂａｓａｌ  ｃｅｌｌ：ＧＢＣ）と水平基底細胞（ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ  ｂａｓａｌ  ｃｅｌｌ：ＨＢＣ）に分けられる。これら二種の細胞のうち、球状基底細胞は恒常的に細胞分裂を生じ、新しい嗅神経細胞を供給する活動中の前駆細胞、幹細胞である。一方で、水平基底細胞は通常では細胞分裂の細胞周期が停止した状態にあり、嗅上皮の大規模な損傷等が生じた際に活性化される休眠状態の幹細胞である。
水平基底細胞で発現する遺伝子及びマーカーとしては、ｐ６３、サイトケラチン５、サイトケラチン１４、ＩＣＡＭ−１等が挙げられる。
球状基底細胞で発現する遺伝子及びマーカーとしては、ＧＡＰ４３、ＧＢＣ−１、Ｌｇｒ５、Ａｓｃｌ１、ＬＳＤ１、ＳＥＣ８等が挙げられる。
【００８７】
「ボーマン腺細胞」（Ｂｏｗｍａｎ’ｓ  ｇｌａｎｄ  ｃｅｌｌ）とは、ボーマン腺（嗅腺）を構成する細胞を表す。ボーマン腺は嗅上皮に存在する分岐した細い管上の組織であり、嗅上皮を保護する粘液の分泌等の機能を有する。
ボーマン腺細胞で発現する遺伝子及びマーカーとしては、Ｓｏｘ９、Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ａｑｕａｐｏｒｉｎ５、Ａｓｃｌ３、サイトケラチン１８等が挙げられる。
【００８８】
「嗅神経鞘細胞」（ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｅｎｓｈｅａｔｉｎｇ  ｇｌｉａ：ＯＥＧ）とは、嗅上皮及び嗅球に存在するグリア細胞の一種を表す。嗅神経鞘細胞はＢＤＮＦ、ＮＧＦ等の神経栄養因子を放出し、嗅神経の恒常的な再生に関わる細胞である。
嗅神経鞘細胞で発現する遺伝子及びマーカーとしては、ｐ７５ＮＴＲ、Ｓ１００β、Ｓｏｘ１０、ＧＦＡＰ、ＢＬＢＰ、Ａｑｕａｐｏｒｉｎ１、Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  α７等が挙げられる。
【００８９】
「嗅上皮周縁部」（ｌａｔｅｒａｌ  ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）とは、嗅上皮の周縁の領域であり、嗅上皮以外の非神経上皮と連続している領域を表す。本発明における「嗅上皮内側部」（ｍｅｄｉａｌ  ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）とは、嗅上皮周縁部に囲われた嗅上皮の中心領域を表す。嗅上皮周縁部と嗅上皮内側部では構成している細胞の割合が異なることが知られている（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０１０，１３７：２４７１−２４８１）。嗅上皮周縁部で発現が高い遺伝子としてＰｂｘ１／２／３、Ｍｅｉｓ１、βＩＶＴｕｂｕｌｉｎが挙げられる。嗅上皮内側部で発現が高い遺伝子としてＴｕｊ１、Ａｓｃｌ１、Ｓｏｘ２が挙げられる。
【００９０】
「性腺刺激ホルモン放出ホルモン陽性神経細胞」とは、主として中枢神経系の視床下部に存在し、生殖系の器官の制御に関与する性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ  ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ：ＧｎＲＨ）を分泌する神経細胞である。性腺刺激ホルモン放出ホルモン陽性神経細胞は胎生期に嗅上皮で発生したのちに、中枢神経系へと移動する。
性腺刺激ホルモン放出ホルモンで発現する遺伝子及びマーカーとしては、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ  ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ：ＧｎＲＨ）等が挙げられる。
【００９１】
「骨組織」とは、骨を構成する細胞と、リン酸カルシウム、Ｉ型コラーゲン等から構成される骨基質を表す。骨を構成する細胞には、骨細胞、破骨細胞、骨芽細胞等が含まれる。
【００９２】
「頭蓋骨」とは、頭部に存在する骨組織を表す。頭蓋骨は顔面及び頭部の形態及び構造の維持、中枢神経系の保護等の機能を有する。
【００９３】
「篩骨」とは、頭蓋骨を構成する骨組織のうちの一つを表す。ヒトの篩骨は両眼窩の間に存在する。
【００９４】
頭蓋骨を含む骨を構成する細胞で発現する遺伝子及びマーカーとしては、Ｍｓｘ２、Ｒｕｎｘ２、Ｏｓｔｅｒｉｘ、Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ、Ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ等が挙げられる。加えて、アリザリンレッド染色、アルカリホスファターゼ染色等の手法により、組織中に骨組織が存在するかどうか判別することができる。
【００９５】
「受容体タンパク質」とは、細胞膜、細胞質又は核内にあるタンパク質であり、ホルモン、サイトカイン、細胞増殖因子、化合物等の物質と結合し、各種の細胞の反応を惹起するタンパク質を表す。
【００９６】
「嗅覚受容体」とは、嗅神経細胞及びその他の細胞で発現し、化合物等の感知に関わる受容体タンパク質を表す。
【００９７】
［２．嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊の製造方法］
本発明は、嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊の製造方法を提供する。以下、本発明の製造方法とも称する。
本発明の製造方法の一態様は、下記工程を含む嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊の製造方法である。
多能性幹細胞を、第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、細胞凝集体を形成させる工程（１）、
工程（１）で得られた細胞凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下で浮遊培養する工程（２）、
工程（２）で得られた細胞凝集体を、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質の存在下で浮遊培養し、上記細胞塊を得る工程（３ａ）。
【００９８】
本発明の製造方法の好ましい一態様は、下記工程を含む、嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊の製造方法である。
工程（１）の前に、多能性幹細胞をフィーダー細胞非存在下で、１）ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも１つと、２）未分化維持因子と、を含む培地で培養する工程（ａ）、
多能性幹細胞を、第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、細胞凝集体を形成させる工程（１）、
工程（１）で得られた細胞凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下で浮遊培養する工程（２）、
工程（２）で得られた細胞凝集体を、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質の存在下で浮遊培養し、上記細胞塊を得る工程（３ａ）。
【００９９】
本発明の製造方法の好ましい一態様は、下記工程を含む、嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊の製造方法である。
多能性幹細胞を、第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、細胞凝集体を形成させる工程（１）、
工程（１）で得られた細胞凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下で浮遊培養する工程（２）、
工程（２）で得られた細胞凝集体を、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質の存在下で浮遊培養する工程（３ａ）、
工程（３ａ）で得られた細胞凝集体を、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の存在下で培養し、上記細胞塊を得る工程（３ｃ）。
【０１００】
本発明の製造方法の好ましい一態様は、下記工程を含む、嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊の製造方法である。
工程（１）の前に、多能性幹細胞をフィーダー細胞非存在下で、１）ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも１つと、２）未分化維持因子と、を含む培地で培養する工程（ａ）、
多能性幹細胞を、第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、細胞凝集体を形成させる工程（１）、
工程（１）で得られた細胞凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下で浮遊培養する工程（２）、
工程（２）で得られた細胞凝集体を、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質の存在下で浮遊培養する工程（３ａ）、
工程（３ａ）で得られた細胞凝集体を、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の存在下で培養し、上記細胞塊を得る工程（３ｃ）。
【０１０１】
本発明の製造方法のさらなる一態様は、下記工程を含む、嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊の製造方法である。
多能性幹細胞を、第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、細胞凝集体を形成させる工程（１）、
工程（１）で得られた細胞凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下で浮遊培養する工程（２）、
工程（２）で得られた細胞凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、上記細胞塊を得る工程（３ｂ）。
【０１０２】
本発明の製造方法の好ましい一態様は、下記工程を含む、嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊の製造方法である。
多能性幹細胞を、第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、細胞凝集体を形成させる工程（１）、
工程（１）で得られた細胞凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下で浮遊培養する工程（２）、
工程（２）で得られた細胞凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養する工程（３ｂ）、
工程（３ｂ）で得られた細胞凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の非存在下で浮遊培養し、上記細胞塊を得る工程（３ｄ）。
【０１０３】
本発明の製造方法のより好ましい一態様は、下記工程を含む、嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊の製造方法である。
工程（１）の前に、多能性幹細胞をフィーダー細胞非存在下で、１）ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも１つと、２）未分化維持因子と、を含む培地で培養する工程（ａ）、
多能性幹細胞を、第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、細胞凝集体を形成させる工程（１）、
工程（１）で得られた細胞凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下で浮遊培養する工程（２）、
工程（２）で得られた細胞凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、上記細胞塊を得る工程（３ｂ）。
【０１０４】
本発明の製造方法のさらに好ましい一態様は、下記工程を含む、嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊の製造方法である。
工程（１）の前に、多能性幹細胞をフィーダー細胞非存在下で、１）ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも１つと、２）未分化維持因子と、を含む培地で培養する工程（ａ）、
多能性幹細胞を、第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、細胞凝集体を形成させる工程（１）、
工程（１）で得られた細胞凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下で浮遊培養する工程（２）、
工程（２）で得られた細胞凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養する工程（３ｂ）、
工程（３ｂ）で得られた細胞凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の非存在下で浮遊培養し、上記細胞塊を得る工程（３ｄ）。
【０１０５】
本発明の製造方法のさらなる一態様は、下記工程を含む、嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊の製造方法である。
多能性幹細胞を、第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、細胞凝集体を形成させる工程（１）、
工程（１）で得られた細胞凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下で浮遊培養する工程（２）、
工程（２）で得られた細胞凝集体を、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、上記細胞塊を得る工程（３ｃ）。
【０１０６】
本発明の製造方法の好ましい一態様は、下記工程を含む、嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊の製造方法である。
多能性幹細胞を、第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、細胞凝集体を形成させる工程（１）、
工程（１）で得られた細胞凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下で浮遊培養する工程（２）、
工程（２）で得られた細胞凝集体を、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養する工程（３ｃ）、
工程（３ｃ）で得られた細胞凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の非存在下で浮遊培養し、上記細胞塊を得る工程（３ｄ）。
【０１０７】
本発明の製造方法のより好ましい一態様は、下記工程を含む、嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊の製造方法である。
工程（１）の前に、多能性幹細胞をフィーダー細胞非存在下で、１）ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも１つと、２）未分化維持因子と、を含む培地で培養する工程（ａ）、
多能性幹細胞を、第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、細胞凝集体を形成させる工程（１）、
工程（１）で得られた細胞凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下で浮遊培養する工程（２）、
工程（２）で得られた細胞凝集体を、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、上記細胞塊を得る工程（３ｃ）。
【０１０８】
本発明の製造方法のさらに好ましい一態様は、下記工程を含む、嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊の製造方法である。
工程（１）の前に、多能性幹細胞をフィーダー細胞非存在下で、１）ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも１つと、２）未分化維持因子と、を含む培地で培養する工程（ａ）、
多能性幹細胞を、第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、細胞凝集体を形成させる工程（１）、
工程（１）で得られた細胞凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下で浮遊培養する工程（２）、
工程（２）で得られた細胞凝集体を、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養する工程（３ｃ）、
工程（３ｃ）で得られた細胞凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の非存在下で浮遊培養し、上記細胞塊を得る工程（３ｄ）。
【０１０９】
上記の製造方法によって製造される細胞塊とは、後述する「３．嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊」に記載するとおりである。
【０１１０】
＜工程（ａ）＞
多能性幹細胞をフィーダー細胞非存在下で、１）ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも１つと、２）未分化維持因子と、を含む培地で培養する工程（ａ）について説明する。
【０１１１】
工程（ａ）において、多能性幹細胞をＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの存在下で培養してから、工程（１）の浮遊培養に付すことにより、多能性幹細胞の状態が変わり、非神経上皮組織の形成効率が改善し、凝集体の質が向上し、分化しやすく、細胞死が生じにくく、凝集体の内部が密な未分化性を維持した細胞凝集体を高効率で製造することができる。
【０１１２】
工程（ａ）は、フィーダー細胞非存在下で実施する。本発明におけるフィーダー細胞非存在下（フィーダーフリー）とは、フィーダー細胞を実質的に含まない（例えば全細胞数に対するフィーダー細胞数の割合が３％以下である）条件を意味する。
【０１１３】
工程（ａ）において用いられる培地は、フィーダーフリー条件下で、多能性幹細胞の未分化維持培養を可能にする培地（フィーダーフリー培地）であれば、特に限定されない。
フィーダーフリー培地として、多くの合成培地が開発・市販されており、例えばＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ８培地が挙げられる。Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に、添加剤として、Ｌ−ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ−２−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｍａｇｎｅｓｉｕｍ（６４ｍｇ／ｌ）、ｓｏｄｉｕｍ  ｓｅｌｅｎｉｕｍ（１４μｇ／１），ｉｎｓｕｌｉｎ（１９．４ｍｇ／ｌ）、ＮａＨＣＯ３（５４３ｍｇ／ｌ）、ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（１０．７ｍｇ／ｌ）、ｂＦＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）、及びＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路作用物質（ＴＧＦβ１（２ｎｇ／ｍＬ）又はＮｏｄａｌ（１００ｎｇ／ｍＬ））を含む（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，８，４２４−４２９（２０１１））。市販のフィーダーフリー培地としては、例えばＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ８（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、Ｓ−ｍｅｄｉｕｍ（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）、ＳｔｅｍＰｒｏ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、ｈＥＳＦ９、ｍＴｅＳＲ１（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ｍＴｅＳＲ２（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＴｅＳＲ−Ｅ８（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＳｔｅｍＦｉｔ（味の素株式会社製）等が挙げられる。工程（ａ）ではこれらを用いることにより、簡便に本発明を実施することができる。ＳｔｅｍＦｉｔ培地は未分化維持成分としてｂＦＧＦを含有する（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１４）４，３５９４）。
【０１１４】
工程（ａ）において用いられる培地は、血清培地であっても無血清培地であってもよい。化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、工程（ａ）において用いられる培地は、好ましくは無血清培地である。培地は、血清代替物を含んでいてもよい。
【０１１５】
工程（ａ）において用いられる培地は、未分化維持培養を可能にするため、未分化維持因子を含む。未分化維持因子は、多能性幹細胞の分化を抑制する作用を有する物質であれば特に限定されない。当業者に汎用されている未分化維持因子としては、プライムド多能性幹細胞（Ｐｒｉｍｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）（例えばヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞）の場合、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質、ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路作用物質、ｉｎｓｕｌｉｎ等を挙げることができる。ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質として具体的には、線維芽細胞増殖因子（例えばｂＦＧＦ、ＦＧＦ４やＦＧＦ８）が挙げられる。また、ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路作用物質としては、ＴＧＦβシグナル伝達経路作用物質、Ｎｏｄａｌ／Ａｃｔｉｖｉｎシグナル伝達経路作用物質が挙げられる。ＴＧＦβシグナル伝達経路作用物質としては、例えばＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２が挙げられる。Ｎｏｄａｌ／Ａｃｔｉｖｉｎシグナル伝達経路作用物質としては、例えばＮｏｄａｌ、ＡｃｔｉｖｉｎＡ、ＡｃｔｉｖｉｎＢが挙げられる。これらの物質は単独又は組み合わせて用いてもよい。ヒト多能性幹細胞（例えばヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞）を培養する場合、工程（ａ）における培地は、好ましくは未分化維持因子として、ｂＦＧＦを含む。
【０１１６】
本発明に用いる未分化維持因子は、通常哺乳動物の未分化維持因子である。哺乳動物としては、上記のものを挙げることができる。未分化維持因子は、哺乳動物の種間で交差反応性を有し得るので、培養対象の多能性幹細胞の未分化状態を維持可能な限り、いずれの哺乳動物の未分化維持因子を用いてもよい。本発明に用いる未分化維持因子は、好ましくは培養する細胞と同一種の哺乳動物の未分化維持因子である。例えばヒト多能性幹細胞の培養には、ヒト未分化維持因子（例えばｂＦＧＦ、ＦＧＦ４、ＦＧＦ８、ＥＧＦ、Ｎｏｄａｌ、ＡｃｔｉｖｉｎＡ、ＡｃｔｉｖｉｎＢ、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２等）が用いられる。ここで「ヒトタンパク質Ｘ」とは、タンパク質Ｘ（未分化維持因子等）が、ヒト生体内で天然に発現するタンパク質Ｘのアミノ酸配列を有することを意味する。
【０１１７】
本発明に用いる未分化維持因子は、好ましくは単離されている。
「単離」とは、目的とする成分や細胞以外の因子を除去する操作がなされ、天然に存在する状態を脱していることを意味する。従って、「単離されたタンパク質Ｘ」には、培養対象の細胞や組織から産生され細胞や組織及び培地中に含まれている内在性のタンパク質Ｘは包含されない。「単離されたタンパク質Ｘ」の純度（総タンパク質重量に占めるタンパク質Ｘの重量の百分率）は、通常７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９９％以上、最も好ましくは１００％である。
本発明は、一態様において、単離された未分化維持因子を提供する工程を含む。また、一態様において、工程（ａ）に用いる培地中へ、単離された未分化維持因子を外来的（又は外因的）に添加する工程を含む。あるいは、工程（ａ）に用いる培地に予め未分化維持因子が添加されていてもよい。
【０１１８】
工程（ａ）において用いられる培地中の未分化維持因子濃度は、培養する多能性幹細胞の未分化状態を維持可能な濃度であり、当業者であれば適宜設定することができる。例えばフィーダー細胞非存在下で未分化維持因子としてｂＦＧＦを用いる場合、その濃度は、通常約４ｎｇ／ｍＬ〜約５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約１０ｎｇ／ｍＬ〜約２００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約３０ｎｇ／ｍＬ〜約１５０ｎｇ／ｍＬである。
【０１１９】
工程（ａ）における多能性幹細胞の培養は、浮遊培養及び接着培養のいずれの条件で行われてもよいが、好ましくは接着培養により行われる。
【０１２０】
工程（ａ）におけるフィーダーフリー条件での多能性幹細胞の培養においては、フィーダー細胞に代わる足場を多能性幹細胞に提供するため、適切なマトリクスを足場として用いてもよい。足場であるマトリクスにより、表面をコーティングした細胞容器中で、多能性幹細胞を接着培養する。
【０１２１】
足場として用いることのできるマトリクスとしては、ラミニン（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２８，６１１−６１５（２０１０））、ラミニン断片（Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３，１２３６（２０１２））、基底膜標品（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９，９７１−９７４（２００１））、ゼラチン、コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン、ビトロネクチン（Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ）等が挙げられる。
【０１２２】
「ラミニン」とは、α、β、γ鎖からなるヘテロ三量体分子であり、サブユニット鎖の組成が異なるアイソフォームが存在する細胞外マトリックスタンパク質である。具体的には、ラミニンは、５種のα鎖、４種のβ鎖及び３種のγ鎖のヘテロ三量体の組合せで約１５種類のアイソフォームを有する。α鎖（α１〜α５）、β鎖（β１〜β４）及びγ鎖（γ１〜γ４）のそれぞれの数字を組み合わせて、ラミニンの名称が定められている。例えばα５鎖、β１鎖、γ１鎖の組合せによるラミニンをラミニン５１１という。本発明においては、好ましくはラミニン５１１が用いられる（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２８，６１１−６１５（２０１０））。
【０１２３】
本発明で用いるラミニン断片は、多能性幹細胞への接着性を有しており、フィーダーフリー条件での多能性幹細胞の維持培養を可能とするものであれば特に限定されないが、好ましくはＥ８フラグメントである。ラミニンＥ８フラグメントは、ラミニン５１１をエラスターゼで消化して得られたフラグメントの中で、強い細胞接着活性をもつフラグメントとして同定されたものである（ＥＭＢＯ  Ｊ．，３：１４６３−１４６８，１９８４、Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１０５：５８９−５９８，１９８７）。本発明においては、好ましくはラミニン５１１のＥ８フラグメントが用いられる（Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３，１２３６（２０１２）、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ４，３５４９（２０１４））。本発明に用いられるラミニンＥ８フラグメントは、ラミニンのエラスターゼ消化産物であることを要するものではなく、組換え体であってもよい。あるいは、遺伝子組み換え動物（カイコ等）に産生させたものであってもよい。未同定成分の混入を回避する観点から、本発明においては、好ましくは組換え体のラミニン断片が用いられる。ラミニン５１１のＥ８フラグメントは市販されており、例えばニッピ株式会社等から購入可能である。
【０１２４】
未同定成分の混入を回避する観点から、本発明において用いられるラミニン又はラミニン断片は、単離されていることが好ましい。
【０１２５】
工程（ａ）におけるフィーダーフリー条件での多能性幹細胞の培養においては、好ましくは単離されたラミニン５１１又はラミニン５１１のＥ８フラグメントによって、より好ましくはラミニン５１１のＥ８フラグメントによって表面をコーティングした細胞容器中で、多能性幹細胞を接着培養する。
【０１２６】
工程（ａ）における多能性幹細胞の培養時間は、続く工程（１）において形成される凝集体の質を向上させる効果が達成可能な範囲で特に限定されないが、通常０．５〜１４４時間、好ましくは２〜９６時間、より好ましくは６〜４８時間、さらに好ましくは１２〜４８時間、特に好ましくは１８〜２８時間であり、例えば２４時間である。
すなわち、工程（１）開始の０．５〜１４４時間、好ましくは１８〜２８時間前に工程（ａ）を開始し、工程（ａ）を完了した後引き続き工程（１）が行われる。
【０１２７】
工程（ａ）における培養温度、ＣＯ２濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約３０℃から約４０℃、好ましくは約３７℃である。またＣＯ２濃度は、例えば約１％から約１０％、好ましくは約５％である。
【０１２８】
好ましい一態様において、ヒト多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、ｂＦＧＦを含有する無血清培地中で、接着培養する。当該接着培養は、好ましくはラミニン５１１、ラミニン５１１のＥ８フラグメント又はビトロネクチンで表面をコーティングした細胞容器中で実施される。当該接着培養は、好ましくはフィーダーフリー培地としてＳｔｅｍＦｉｔを用いて実施される。
【０１２９】
好ましい一態様において、ヒト多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、ｂＦＧＦを含有する無血清培地中で、浮遊培養する。当該浮遊培養では、ヒト多能性幹細胞は、ヒト多能性幹細胞の凝集体を形成してもよい。
【０１３０】
ソニック・ヘッジホッグシグナル（以下、「Ｓｈｈ」と記すことがある。）伝達経路作用物質とは、Ｓｈｈにより媒介されるシグナル伝達を増強し得る物質である。Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質としては、例えばＨｅｄｇｅｈｏｇファミリーに属するタンパク質（例えばＳｈｈやＩｈｈ）、Ｓｈｈ受容体、Ｓｈｈ受容体アゴニスト、Ｓｍｏアゴニスト、Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ（９−ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−Ｎ−［４−（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］−２−（１−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｙｌｏｘｙ）−９Ｈ−ｐｕｒｉｎ−６−ａｍｉｎｅ）、ＧＳＡ−１０（Ｐｒｏｐｙｌ  ４−（１−ｈｅｘｙｌ−４−ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｏｘｏ−１，２−ｄｉｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）ｂｅｎｚｏａｔｅ）、Ｈｈ−Ａｇ１．５、２０（Ｓ）−Ｈｙｄｒｏｘｙｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、ＳＡＧ（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ  Ａｇｏｎｉｓｔ：Ｎ−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ’−（３−ｐｙｒｉｄｉｎｙｌｂｅｎｚｙｌ）−Ｎ’−（３−ｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−２−ｃａｒｂｏｎｙｌ）−１，４−ｄｉａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ）等が挙げられる。これらの物質は単独又は組み合わせて用いてもよい。
【０１３１】
Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質は、好ましくはＳＡＧ、Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ、ＧＳＡ−１０からなる群より含まれる少なくとも１つを含み、より好ましくはＳＡＧを含む。培地中のＳｈｈシグナル伝達経路作用物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。ＳＡＧは、工程（ａ）においては通常約１ｎＭ〜約２０００ｎＭ、好ましくは約１０ｎＭ〜約１０００ｎＭ、より好ましくは約１０ｎＭ〜約７００ｎＭ、さらに好ましくは約５０ｎＭ〜約７００ｎＭ、特に好ましくは約１００ｎＭ〜約６００ｎＭ、最も好ましくは約１００ｎＭ〜約５００ｎＭの濃度で使用される。また、ＳＡＧ以外のＳｈｈシグナル伝達経路作用物質を使用する場合、前記濃度のＳＡＧと同等のＳｈｈシグナル伝達促進活性を示す濃度で用いられることが望ましい。ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達促進活性は、当業者に周知の方法、例えばＧｌｉ１遺伝子の発現に着目したレポータージーンアッセイにて決定することができる（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００７）２６，５１６３−５１６８）。
【０１３２】
ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路（すなわちＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達経路）とは、形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）、Ｎｏｄａｌ／Ａｃｔｉｖｉｎ、又はＢＭＰをリガンドとし、細胞内でＳｍａｄファミリーにより伝達されるシグナル伝達経路である。
【０１３３】
ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質とは、ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路、すなわちＳｍａｄファミリーにより伝達されるシグナル伝達経路を阻害する物質を表し、具体的にはＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質、Ｎｏｄａｌ／Ａｃｔｉｖｉｎシグナル伝達経路阻害物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質を挙げることができる。ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質としては、ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質が好ましい。
【０１３４】
ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質としては、ＴＧＦβに起因するシグナル伝達経路を阻害する物質であれば特に限定は無く、核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。当該物質として例えばＴＧＦβに直接作用する物質（例えばタンパク質、抗体、アプタマー等）、ＴＧＦβをコードする遺伝子の発現を抑制する物質（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ等）、ＴＧＦβ受容体とＴＧＦβの結合を阻害する物質、ＴＧＦβ受容体によるシグナル伝達に起因する生理活性を阻害する物質（例えばＴＧＦβ受容体の阻害剤、Ｓｍａｄの阻害剤等）を挙げることができる。ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質として知られているタンパク質として、Ｌｅｆｔｙ等が挙げられる。
【０１３５】
ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質として、当業者に周知の化合物を使用することができる。具体的には、ＳＢ４３１５４２（本明細書及び図面中、ＳＢ４３１と略記する場合がある）（４−［４−（３，４−Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−（２−ｐｙｒｉｄｙｌ）−１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌ−２−ｙｌ］ｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、ＳＢ５０５１２４（２−［４−（１，３−Ｂｅｎｚｏｄｉｏｘｏｌ−５−ｙｌ）−２−（１，１−ｄｉｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ）−１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌ−５−ｙｌ］−６−ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎｅ）、ＳＢ５２５３３４（６−［２−（１，１−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ）−５−（６−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）−１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌ−４−ｙｌ］ｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｅ）、ＬＹ２１５７２９９（４−［５，６−Ｄｉｈｙｄｒｏ−２−（６−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）−４Ｈ−ｐｙｒｒｏｌｏ［１，２−ｂ］ｐｙｒａｚｏｌ−３−ｙｌ］−６−ｑｕｉｎｏｌｉｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ＬＹ２１０９７６１（４−［５，６−ｄｉｈｙｄｒｏ−２−（２−ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）−４Ｈ−ｐｙｒｒｏｌｏ［１，２−ｂ］ｐｙｒａｚｏｌ−３−ｙｌ］−７−［２−（４−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌ）ｅｔｈｏｘｙ］−ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）、ＧＷ７８８３８８（４−｛４−［３−（Ｐｙｒｉｄｉｎ−２−ｙｌ）−１Ｈ−ｐｙｒａｚｏｌ−４−ｙｌ］−ｐｙｒｉｄｉｎ−２−ｙｌ｝−Ｎ−（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−２Ｈ−ｐｙｒａｎ−４−ｙｌ）ｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、ＬＹ３６４９４７（４−［３−（２−Ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）−１Ｈ−ｐｙｒａｚｏｌ−４−ｙｌ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）、ＳＤ−２０８（２−（５−Ｃｈｌｏｒｏ−２−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｔｅｒｉｄｉｎ−４−ｙｌ）ｐｙｒｉｄｉｎ−４−ｙｌ  ａｍｉｎｅ）、ＥＷ−７１９７（Ｎ−（２−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−（６−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）−４−［１，２，４］ｔｒｉａｚｏｌｏ［１，５−ａ］ｐｙｒｉｄｉｎ−６−ｙｌ−１Ｈ−Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ−２−ｍｅｔｈａｎａｍｉｎｅ）、Ａ８３−０１（３−（６−Ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎ−２−ｙｌ）−４−（４−ｑｕｉｎｏｌｙｌ）−１−ｐｈｅｎｙｌｔｈｉｏｃａｒｂａｍｏｙｌ−１Ｈ−ｐｙｒａｚｏｌｅ）、ＲｅｐＳｏｘ（２−［５−（６−Ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎ−２−ｙｌ）−１Ｈ−ｐｙｒａｚｏｌ−４−ｙｌ］−１，５−ｎａｐｈｔｈｙｒｉｄｉｎｅ）等のＡｌｋ５／ＴＧＦβＲ１阻害剤、ＳＩＳ３（１−（３，４−ｄｉｈｙｄｒｏ−６，７−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−２（１Ｈ）−ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｙｌ）−３−（１−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｐｈｅｎｙｌ−１Ｈ−ｐｙｒｒｏｌｏ［２，３−ｂ］ｐｙｒｉｄｉｎ−３−ｙｌ）−２−ｐｒｏｐｅｎ−１−ｏｎｅ）等のＳＭＡＤ３阻害剤が挙げられる。これらの物質は単独又は組み合わせて用いてもよい。ここでＳＢ４３１５４２は、ＴＧＦβ受容体（ＡＬＫ５）及びＡｃｔｉｖｉｎ受容体（ＡＬＫ４／７）の阻害剤（すなわちＴＧＦβＲ阻害剤）として公知の化合物である。ＳＩＳ３は、ＴＧＦβ受容体の制御下にある細胞内シグナル伝達因子であるＳＭＡＤ３のリン酸化を阻害するＴＧＦβシグナル伝���経路阻害物質である。
【０１３６】
本発明で用いられるＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質は、好ましくはＡｌｋ５／ＴＧＦβＲ１阻害剤を含む。Ａｌｋ５／ＴＧＦβＲ１阻害剤は、好ましくはＳＢ４３１５４２、ＳＢ５０５１２４、ＳＢ５２５３３４、ＬＹ２１５７２９９、ＧＷ７８８３８８、ＬＹ３６４９４７、ＳＤ−２０８、ＥＷ−７１９７、Ａ８３−０１、ＲｅｐＳｏｘからなる群より選ばれる少なくとも１つを含み、さらに好ましくはＳＢ４３１５４２又はＡ８３−０１を含む。
【０１３７】
培地中のＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。工程（ａ）におけるＴＧＦβ伝達経路阻害物質としてＳＢ４３１５４２を用いる場合は、通常約１ｎＭ〜約１００μＭ、好ましくは約１０ｎＭ〜１００μＭ、より好ましくは約１０ｎＭ〜約５０μＭ、さらに好ましくは約１００ｎＭ〜約５０μＭ、特に好ましくは約１μＭ〜約１０μＭの濃度で使用される。また、ＳＢ４３１５４２以外のＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質を使用する場合、前記濃度のＳＢ４３１５４２と同等のＴＧＦβシグナル伝達経路阻害活性を示す濃度で用いられることが望ましい。
【０１３８】
工程（ａ）及び下記工程（１）〜（３）における培養温度、ＣＯ２濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約３０℃から約４０℃、好ましくは約３７℃である。ＣＯ２濃度は、例えば約１％から約１０％、好ましくは約５％である。
【０１３９】
＜工程（１）＞
未分化で維持された多能性幹細胞、好ましくは工程（ａ）で培養した多能性幹細胞を、第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、細胞凝集体を形成させる工程（１）について説明する。
【０１４０】
本発明中において、後掲する第二Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質と区別するために、工程（１）において添加されるＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質を第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質とも呼称する。
【０１４１】
Ｗｎｔシグナル伝達経路とは、Ｗｎｔファミリー・タンパク質をリガンドとし、主としてＦｒｉｚｚｌｅｄを受容体とするシグナル伝達経路である。当該シグナル経路としては、β−Ｃａｔｅｎｉｎによって伝達される古典的Ｗｎｔ経路（Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｗｎｔ  ｐａｔｈｗａｙ）、非古典的Ｗｎｔ経路（Ｎｏｎ−Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｗｎｔ  ｐａｔｈｗａｙ）等が挙げられる。非古典的Ｗｎｔ経路としては、Ｐｌａｎａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｐｏｌａｒｉｔｙ（ＰＣＰ）経路、Ｗｎｔ／Ｃａｌｃｉｕｍ経路、Ｗｎｔ−ＲＡＰ１経路、Ｗｎｔ−Ｒｏｒ２経路、Ｗｎｔ−ＰＫＡ経路、Ｗｎｔ−ＧＳＫ３ＭＴ経路、Ｗｎｔ−ａＰＫＣ経路、Ｗｎｔ−ＲＹＫ経路、Ｗｎｔ−ｍＴＯＲ経路等が挙げられる。非古典的Ｗｎｔ経路では、Ｗｎｔ以外の他のシグナル伝達経路でも活性化される共通のシグナル伝達因子が存在するが、本発明ではそれらの因子もＷｎｔシグナル伝達経路の構成因子とし、それらの因子に対する阻害物質もＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質に含まれる。
【０１４２】
本発明において、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質とはＷｎｔファミリー・タンパク質により惹起されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り限定されない。阻害物質は、核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。当該物質として例えばＷｎｔのプロセシングと細胞外への分泌を阻害する物質、Ｗｎｔに直接作用する物質（例えばタンパク質、抗体、アプタマー等）、Ｗｎｔをコードする遺伝子の発現を抑制する物質（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ等）、Ｗｎｔ受容体とＷｎｔの結合を阻害する物質、Ｗｎｔ受容体によるシグナル伝達に起因する生理活性を阻害する物質を挙げることができる。
【０１４３】
Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質として知られているタンパク質として、ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ｓＦＲＰ）クラスに属するタンパク質（ｓＦＲＰ１〜５、Ｗｎｔ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒ−１（ＷＩＦ−１）、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ（Ｄｋｋ）クラスに属するタンパク質（Ｄｋｋ１〜４、Ｋｒｅｍｅｎ）等が挙げられる。
【０１４４】
Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質としては、当業者に周知の化合物を使用することができる。Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質として例えばＰｏｒｃｕｐｉｎｅ（ＰＯＲＣＮ）阻害剤、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ阻害剤、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ（Ｄｖｌ）阻害剤、Ｔａｎｋｙｒａｓｅ（ＴＡＮＫ）阻害剤、カゼインキナーゼ１阻害剤、カテニン応答性転写阻害剤、ｐ３００阻害剤、ＣＲＥＢ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＢＰ）阻害剤、ＢＣＬ−９阻害剤（Ａｍ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２０１５；５（８）：２３４４−２３６０）等が挙げられる。また、非古典的Ｗｎｔ経路の阻害物質として、例えばＣａｌｃｉｕｍ／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）阻害剤、（ＴＧＦ−β−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ  １（ＴＡＫ１）阻害剤、Ｎｅｍｏ−Ｌｉｋｅ  Ｋｉｎａｓｅ（ＮＬＫ）阻害剤、ＬＩＭ  Ｋｉｎａｓｅ阻害剤、ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｒａｐａｍｙｃｉｎ（ｍＴＯＲ）阻害剤、ｃ−Ｊｕｎ  ＮＨ  ２−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｋｉｎａｓｅ（ＪＮＫ）阻害剤、ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ（ＰＫＣ）阻害剤、Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  Ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ２（ＭｅｔＡＰ２）阻害剤、Ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ阻害剤、ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ（ＮＦＡＴ）阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤等が挙げられる。また、作用機序は報告されていないが、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質としてＫＹ０２１１１（Ｎ−（６−Ｃｈｌｏｒｏ−２−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｙｌ）−３，４−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｅｎｅｐｒｏｐａｎａｍｉｄｅ）、ＫＹ０３−Ｉ（２−（４−（３，４−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｂｕｔａｎａｍｉｄｅ）−６−Ｉｏｄｏｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｅ）が挙げられる。これらの物質は単独又は組み合わせて用いてもよい。
【０１４５】
ＰＯＲＣＮ阻害剤として例えばＩＷＰ−２（Ｎ−（６−Ｍｅｔｈｙｌ−２−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｙｌ）−２−［（３，４，６，７−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−４−ｏｘｏ−３−ｐｈｅｎｙｌｔｈｉｅｎｏ［３，２−ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−２−ｙｌ）ｔｈｉｏ］−ａｃｅｔａｍｉｄｅ）、ＩＷＰ−３（２−［［３−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−３，４，６，７−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−４−ｏｘｏｔｈｉｅｎｏ［３，２−ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−２−ｙｌ］ｔｈｉｏ］−Ｎ−（６−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｙｌ）−ａｃｅｔａｍｉｄｅ）、ＩＷＰ−４（Ｎ−（６−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｙｌ）−２−［［３，４，６，７−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−３−（２−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−４−ｏｘｏｔｈｉｅｎｏ［３，２−ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−２−ｙｌ］ｔｈｉｏ］−ａｃｅｔａｍｉｄｅ）、ＩＷＰ−Ｌ６（Ｎ−（５−ｐｈｅｎｙｌ−２−ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）−２−［（３，４，６，７−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−４−ｏｘｏ−３−ｐｈｅｎｙｌｔｈｉｅｎｏ［３，２−ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−２−ｙｌ）ｔｈｉｏ］−ａｃｅｔａｍｉｄｅ）、ＩＷＰ−１２（Ｎ−（６−Ｍｅｔｈｙｌ−２−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｙｌ）−２−［（３，４，６，７−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−３，６−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−４−ｏｘｏｔｈｉｅｎｏ［３，２−ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−２−ｙｌ）ｔｈｉｏ］ａｃｅｔａｍｉｄｅ）、ＬＧＫ−９７４（２−（２’，３−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２，４’−ｂｉｐｙｒｉｄｉｎ−５−ｙｌ）−Ｎ−（５−（ｐｙｒａｚｉｎ−２−ｙｌ）ｐｙｒｉｄｉｎ−２−ｙｌ）ａｃｅｔａｍｉｄｅ）、Ｗｎｔ−Ｃ５９（２−［４−（２−Ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎ−４−ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］−Ｎ−［４−（ｐｙｒｉｄｉｎ−３−ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］ａｃｅｔａｍｉｄｅ）、ＥＴＣ−１５９（１，２，３，６−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−１，３−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２，６−ｄｉｏｘｏ−Ｎ−（６−ｐｈｅｎｙｌ−３−ｐｙｒｉｄａｚｉｎｙｌ）−７Ｈ−ｐｕｒｉｎｅ−７−ａｃｅｔａｍｉｄｅ）、ＧＮＦ−６２３１（Ｎ−［５−（４−Ａｃｅｔｙｌ−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ）−２−ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ］−２’−ｆｌｕｏｒｏ−３−ｍｅｔｈｙｌ［２，４’−ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ］−５−ａｃｅｔａｍｉｄｅ）等が挙げられる。これらの物質は単独又は組み合わせて用いてもよい。
【０１４６】
本発明で用いられる第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質は、好ましくはＰＯＲＣＮ阻害剤、ＫＹ０２１１１及びＫＹ０３−Ｉからなる群より選ばれる少なくとも１つを含み、より好ましくはＰＯＲＣＮ阻害剤を含む。第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質は、Ｗｎｔの非古典的Ｗｎｔ経路への阻害活性を有する物質を含むこともまた好ましい。本発明で用いられるＰＯＲＣＮ阻害剤は、好ましくはＩＷＰ−２、ＩＷＰ−３、ＩＷＰ−４、ＩＷＰ−Ｌ６、ＩＷＰ−１２、ＬＧＫ−９７４、Ｗｎｔ−Ｃ５９、ＥＴＣ−１５９及びＧＮＦ−６２３１からなる群より選ばれる少なくとも１つを含み、より好ましくはＩＷＰ−２又はＷｎｔ−Ｃ５９を含み、さらに好ましくはＩＷＰ−２を含む。
【０１４７】
培地中の第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊の製造効率の観点からは、例えば第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質としてＰＯＲＣＮ阻害剤の１種であるＩＷＰ−２を用いる場合は、その濃度は通常約１０ｎＭ〜約５０μＭであり、好ましくは約１０ｎＭ〜約３０μＭであり、さらに好ましくは約１００ｎＭ〜約１０μＭであり、最も好ましくは約２μＭである。ＰＯＲＣＮ阻害剤の１種であるＷｎｔ−Ｃ５９を用いる場合は、その濃度は通常約１０ｎＭ〜約３０μＭであり、好ましくは約２０ｎＭ〜約１０μＭであり、より好ましくは約５００ｎＭである。ＫＹ０２１１１を用いる場合は、その濃度は通常約１０ｎＭ〜約５０μＭであり、好ましくは１０ｎＭ〜約３０μＭであり、より好ましくは約１００ｎＭ〜約１０μＭであり、さらに好ましくは約５μＭである。
【０１４８】
第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の添加時期は、通常工程（１）の多能性幹細胞の浮遊培養開始より４８時間以内、好ましくは２４時間以内、より好ましくは１２時間以内、さらに好ましくは浮遊培養開始と同時である。
【０１４９】
工程（１）の培地中には、ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質がさらに存在することが好ましい。
工程（１）において用いられるＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質としては工程（ａ）で例示したものと同様のものが用いられる。工程（ａ）及び工程（１）のＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質は同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは同一である。
培地中のＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。ＴＧＦβ伝達経路阻害物質としてＳＢ４３１５４２を用いる場合は、通常約１ｎＭ〜約１００μＭ、好ましくは約１０ｎＭ〜約１００μＭ、より好ましくは約１００ｎＭ〜約５０μＭ、さらに好ましくは約５００ｎＭ〜約１０μＭの濃度で使用される。また、ＳＢ４３１５４２以外のＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質を使用する場合、前記濃度のＳＢ４３１５４２と同等のＴＧＦβシグナル伝達経路阻害活性を示す濃度で用いられることが望ましい。
【０１５０】
工程（１）において用いられる培地は、上記定義の項で記載したようなものである限り特に限定されない。工程（１）において用いられる培地は血清培地又は無血清培地であり得る。化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、本発明においては、無血清培地が好適に用いられる。調製の煩雑さを回避するには、例えば市販のＫＳＲ等の血清代替物を適量添加した無血清培地（例えばＩＭＤＭとＦ−１２の１：１の混合液に５％ＫＳＲ、４５０μＭ  １−モノチオグリセロール及び１ｘＣｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅが添加された培地、又はＧＭＥＭに５％〜２０％ＫＳＲ、ＮＥＡＡ、ピルビン酸、２−メルカプトエタノールが添加された培地）を使用することが好ましい。無血清培地へのＫＳＲの添加量としては、例えばヒトＥＳ細胞の場合は、通常約１％から約３０％であり、好ましくは約２％から約２０％である。
【０１５１】
工程（１）の開始時において、多能性幹細胞は単一細胞に分散されていることが好ましい。このために、工程（１）の開始前に、工程（ａ）で得られた多能性幹細胞を単一細胞に分散する操作（工程（ｂ）とも呼ぶ）を行うことが好ましい。「単一細胞に分散されている」とは、例えば全細胞の７割以上が単一細胞であり、２〜５０細胞の塊が３割以下存在する状態が挙げられる。単一細胞に分散された細胞として、好ましくは８割以上が単一細胞であり、２〜５０細胞の塊が２割以下存在する状態が挙げられる。単一細胞に分散された細胞とは、細胞同士の接着（例えば面接着）がほとんどなくなった状態が挙げられる。一部の態様において、単一細胞に分散された細胞とは、細胞―細胞間結合（例えば接着結合）がほとんどなくなった状態が挙げられる。
【０１５２】
工程（ａ）で得られた多能性幹細胞の分散操作は、前述した、機械的分散処理、細胞分散液処理、細胞保護剤添加処理を含んでよい。これらの処理を組み合わせて行ってもよい。好ましくは細胞保護剤添加処理と同時に、細胞分散液処理を行い、次いで機械的分散処理をするとよい。
【０１５３】
細胞保護剤添加処理に用いられる細胞保護剤としては、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質、ヘパリン、ＲＯＣＫ阻害物質、ミオシン阻害物質、血清、又は血清代替物を挙げることができる。好ましい細胞保護剤としては、ＲＯＣＫ阻害物質が挙げられる。分散により誘導される多能性幹細胞（特に、ヒトの多能性幹細胞）の細胞死を抑制するために、ＲＯＣＫ阻害物質を工程（１）の培養開始時から添加してもよい。ＲＯＣＫ阻害物質としては、Ｙ−２７６３２（（Ｒ）−（＋）−ｔｒａｎｓ−４−（１−Ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）−Ｎ−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ，ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、Ｆａｓｕｄｉｌ（ＨＡ１０７７）（１−（５−Ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ）ｈｏｍｏｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ，ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、Ｈ−１１５２（５−［［（２Ｓ）−ｈｅｘａｈｙｄｒｏ−２−ｍｅｔｈｙｌ−１Ｈ−１，４−ｄｉａｚｅｐｉｎ−１−ｙｌ］ｓｕｌｆｏｎｙｌ］−４−ｍｅｔｈｙｌ−ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ，ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＨＡ−１１００（Ｈｙｄｒｏｘｙｆａｓｕｄｉｌ）（［１−（１−Ｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ）ｈｏｍｏｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ，ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）等を挙げることができる。細胞保護材としては、調製済みの細胞保護剤を用いることもできる。調製済みの細胞保護剤としては、例えばＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、ＣｌｏｎｅＲ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）が挙げられる。これらの物質は単独又は組み合わせて用いてもよい。
【０１５４】
細胞分散液処理に用いられる細胞分散液としては、トリプシン、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、プロナーゼ、ＤＮａｓｅ、パパイン等の酵素及びエチレンジアミン四酢酸等のキレート剤の少なくとも１つを含む溶液を挙げることができる。市販の細胞分散液、例えばＴｒｉｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）やＴｒｉｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、Ａｃｃｕｍａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いることもできる。
【０１５５】
機械的分散処理の方法としては、ピペッティング処理又はスクレーパーでの掻き取り操作が挙げられる。分散された細胞は上記培地中に懸濁される。
【０１５６】
そして、分散された多能性幹細胞の懸濁液を上記培養器中に播き、分散させた多能性幹細胞を、培養器に対して非接着性の条件下で培養することにより、複数の細胞を集合及び凝集させて細胞凝集体を形成する。
【０１５７】
この際、分散された多能性幹細胞を、１０ｃｍディッシュのような比較的大きな培養容器に播種することにより、１つの培養器中に複数の細胞凝集体を同時に形成させてもよいが、凝集体ごとの大きさのばらつきを生じにくくする観点で、例えば非細胞接着性の９６ウェルマイクロプレートのようなマルチウェルプレート（Ｕ底、Ｖ底）の各ウェルに一定数の分散された多能性幹細胞を播種することが好ましい。これを静置培養すると、細胞が迅速に凝集することにより、各ウェルに１個の細胞凝集体を形成させることができる。マルチウェルプレートとしては、例えばＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ  ９６Ｖ底プレート（ＭＳ−９０９６Ｖ、住友ベークライト株式会社製）が挙げられる。より迅速に細胞凝集体を形成させるために遠心操作を行ってもよい。各ウェルで形成された凝集体を複数のウェルから回収することにより、均一な凝集体の集団を得ることができる。
【０１５８】
培養容器としては、各ウェル内に細胞凝集体又は細胞塊が入ったままの状態でプレート全体の培地を一度に交換することが可能な三次元細胞培養容器を用いることもまた好ましい。このような三次元細胞培養容器としては、例えばＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ  ９６スリットウェルプレート（住友ベークライト株式会社製）等が挙げられる。このプレートには９６ウェルのそれぞれの上部に培地が出入りできる細い開口部（スリット）が設けられている。スリットは細胞凝集体又は細胞塊が通過しにくい幅に設定されているため、細胞凝集体又は細胞塊同士の癒着を防止しながら、プレート全体の培地を一度に交換することができ、操作の効率性及び細胞塊の質を向上させることができる。
【０１５９】
工程（１）における多能性幹細胞の濃度は、細胞凝集体をより均一に、効率的に形成させるように適宜設定することができる。例えば９６ウェルマイクロウェルプレートを用いてヒト多能性幹細胞（例えば工程（ａ）から得られたヒトｉＰＳ細胞）を浮遊培養する場合、１ウェルあたり通常約１×１０３から約１×１０５細胞、好ましくは約３×１０３から約５×１０４細胞、より好ましくは約４×１０３から約２×１０４細胞、さらに好ましくは約４×１０３から約１．６×１０４細胞、特に好ましくは約８×１０３から約１．２×１０４細胞となるように調製した液を各ウェルに添加し、プレートを静置して凝集体を形成させる。細胞数は、血球計算盤で計数することによって求めることができる。
【０１６０】
工程（１）及び以降の工程において、培地交換操作を行う場合、例えば元ある培地を捨てずに新しい培地を加える操作（培地添加操作）、元ある培地を半量程度（元ある培地の体積量の３０〜９０％程度、例えば４０〜６０％程度）捨てて新しい培地を半量程度（元ある培地の体積量の３０〜９０％、例えば４０〜６０％程度）加える操作（半量培地交換操作）、元ある培地を全量程度（元ある培地の体積量の９０％以上）捨てて新しい培地を全量程度（元ある培地の体積量の９０％以上）加える操作（全量培地交換操作）が挙げられる。
【０１６１】
ある時点で、特定の成分を添加する場合、例えば終濃度を計算した上で、元ある培地を半量程度捨てて、特定の成分を終濃度よりも高い濃度で含む新しい培地を半量程度加える操作（半量培地交換操作）を行ってもよい。
ある時点で、元の培地に含まれる成分を希釈して濃度を下げる場合、例えば培地交換操作を、１日に複数回、好ましくは１時間以内に複数回（例えば２〜３回）行ってもよい。また、ある時点で、元の培地に含まれる成分を希釈して濃度を下げる場合、細胞又は凝集体を別の培養容器に移してもよい。
培地交換操作に用いる道具は特に限定されないが、例えばピペッター、ピペットマン（登録商標）、マルチチャンネルピペット、連続分注器等が挙げられる。例えば培養容器として９６ウェルプレートを用いる場合、マルチチャンネルピペットを使ってもよい。
【０１６２】
細胞凝集体を形成させるために必要な浮遊培養の時間は、用いる多能性幹細胞によって適宜決定可能であるが、均一な細胞凝集体を形成するためにはできる限り短時間であることが望ましい。分散された細胞が、細胞凝集体が形成されるに至るまでの工程は、細胞が集合する工程、及び集合した細胞が凝集体を形成する工程にわけられる。分散された細胞を播種する時点（すなわち浮遊培養開始時）から細胞が集合するまでは、例えばヒト多能性幹細胞（ヒトｉＰＳ細胞等）の場合には、好ましくは約２４時間以内、より好ましくは約１２時間以内に集合した細胞を形成させる。分散された細胞を播種する時点（すなわち浮遊培養開始時）から細胞凝集体が形成されるまでの工程では、例えばヒト多能性幹細胞（ヒトｉＰＳ細胞等）の場合には、好ましくは約７２時間以内、より好ましくは約４８時間以内に凝集体が形成される。この凝集体形成までの時間は、細胞を凝集させる用具や、遠心条件等を調整することにより適宜調節することが可能である。
【０１６３】
細胞凝集体が形成されたことは、凝集体のサイズ及び細胞数、巨視的形態、組織染色解析による微視的形態及びその均一性、分化及び未分化マーカーの発現及びその均一性、分化マーカーの発現制御及びその同期性、分化効率の凝集体間の再現性等に基づき判断することが可能である。
【０１６４】
細胞凝集体が形成された後、そのまま、凝集体の培養を継続してもよい。工程（１）における浮遊培養の時間は、通常８時間〜６日間程度、好ましくは１２時間〜４８時間程度である。
【０１６５】
細胞塊内部の神経系細胞又は組織の生存及び増殖を促進する観点から、工程（１）〜（３）のいずれか１つ以上の工程を、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質の存在下で行うこともできる。前述の通り、Ｗｎｔシグナル伝達経路として古典的Ｗｎｔ経路（Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｗｎｔ  ｐａｔｈｗａｙ）、非古典的Ｗｎｔ経路（Ｎｏｎ−Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｗｎｔ  ｐａｔｈｗａｙ）等が挙げられる。非古典的Ｗｎｔ経路としては、Ｐｌａｎａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｐｏｌａｒｉｔｙ（ＰＣＰ）経路、Ｗｎｔ／Ｃａｌｃｉｕｍ経路、Ｗｎｔ−ＲＡＰ１経路、Ｗｎｔ−Ｒｏｒ２経路、Ｗｎｔ−ＰＫＡ経路、Ｗｎｔ−ＧＳＫ３ＭＴ経路、Ｗｎｔ−ａＰＫＣ経路、Ｗｎｔ−ＲＹＫ経路、Ｗｎｔ−ｍＴＯＲ経路等が挙げられる。
【０１６６】
Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質とはＷｎｔファミリー・タンパク質により惹起されるシグナル伝達を活性化し得るものである限り限定されない。核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。当該物質として例えば、Ｗｎｔの自己分泌を促進する物質、Ｗｎｔを安定化させて分解を抑制する物質、Ｗｎｔの組み換えタンパク質、Ｗｎｔの部分配列ペプチド及びその派生物や誘導体、Ｗｎｔ受容体に作用し活性化させる物質、Ｗｎｔの細胞内シグナル伝達機構を活性化させる物質、Ｗｎｔの細胞内シグナル伝達因子及びその改変体（β−Ｃａｔｅｎｉｎ  Ｓ３３Ｙ等）、Ｗｎｔ応答配列下流の遺伝子発現を活性化させる物質等を挙げることができる。Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質として知られているタンパク質として、Ｗｎｔ、Ｒ−Ｓｐｏｎｄｉｎ等が挙げられる。
【０１６７】
Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質として、当業者に周知の化合物を使用することもできる。Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質としての活性を有する化合物として例えば塩化リチウム、ＡＭＢＭＰ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＳＧＣ  ＡＡＫ１  １、Ｆｏｘｙ  ５、ＣＨＩＲ９９０２１、ＣＨＩＲ９８０１４、ＴＷＳ１１９、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、ＢＩＯ、ＡＺＤ２８５８、ＡＺＤ１０８０、ＡＲ−Ａ０１４４１８、ＴＤＺＤ−８、ＬＹ２０９０３１４、ＩＭ−１２、Ｉｎｄｉｒｕｂｉｎ、Ｂｉｋｉｎｉｎ、Ａ  １０７０７２２、３Ｆ８、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ、１０Ｚ−Ｈｙｍｅｎｉａｌｄｉｓｉｎｅ、Ｉｎｄｉｒｕｂｉｎ−３’−ｏｘｉｍｅ、ＮＳＣ  ６９３８６８、ＴＣ−Ｇ  ２４、ＴＣＳ  ２００２、ＴＣＳ  ２１３１１、ＣＰ２１Ｒ７、ＢＭＬ−２８４、ＳＫＬ２００１、ＷＡＹ  ２６２６１１、ＩＩＩＣ３ａ、Ｍｅｔｈｙｌ  Ｖａｎｉｌｌａｔｅ、ＩＱ−１及びこれら化合物の誘導体等が挙げられる。
【０１６８】
工程（１）において、第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質を添加しているが、作用点の異なるＷｎｔシグナル伝達経路作用物質とＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質を併用することで、前述の複数あるＷｎｔシグナル伝達経路のうち特定の経路のみを活性化、あるいは阻害することができる。Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質は、工程（１）にて添加する第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の下流の因子に作用する物質であることが好ましい。添加するＷｎｔシグナル伝達経路作用物質が古典的Ｗｎｔ経路（Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｗｎｔ  ｐａｔｈｗａｙ）を活性化させる物質であることもまた好ましく、細胞内のＷｎｔシグナル伝達因子であるβカテニンの分解の阻害、安定化作用によりＷｎｔシグナル伝達経路を活性化させる物質であることがさらに好ましい。βカテニンの分解の阻害、安定化作用を有する物質としては、例えばＧＳＫ３阻害剤及びＢＭＬ−２８４、ＳＫＬ２００１等が挙げられる。添加するＷｎｔシグナル伝達経路作用物質がβカテニン応答性転写（β−ｃａｔｅｎｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ：ＣＲＴ）を促進又は活性化させる物質であることもまた好ましい。
【０１６９】
ＧＳＫ３阻害剤としては、ＣＨＩＲ９９０２１、ＣＨＩＲ９８０１４、ＴＷＳ１１９、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、ＢＩＯ、ＡＺＤ２８５８、ＡＺＤ１０８０、ＡＲ−Ａ０１４４１８、ＴＤＺＤ−８、ＬＹ２０９０３１４、ＩＭ−１２、Ｉｎｄｉｒｕｂｉｎ、Ｂｉｋｉｎｉｎ、Ａ  １０７０７２２、３Ｆ８、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ、１０Ｚ−Ｈｙｍｅｎｉａｌｄｉｓｉｎｅ、Ｉｎｄｉｒｕｂｉｎ−３’−ｏｘｉｍｅ、ＮＳＣ  ６９３８６８、ＴＣ−Ｇ  ２４、ＴＣＳ  ２００２、ＴＣＳ  ２１３１１、ＣＰ２１Ｒ７及びこれらの化合物の誘導体が挙げられる。
【０１７０】
好ましいＷｎｔシグナル伝達経路作用物質と第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質との組み合わせとして、ＧＳＫ３阻害剤とＰＯＲＣＮ阻害剤が挙げられる。ＧＳＫ３阻害剤とＰＯＲＣＮ阻害剤を併用した場合、古典的Ｗｎｔ経路は活性化され、非古典的Ｗｎｔ経路は阻害される。ＧＳＫ３阻害剤とＰＯＲＣＮ阻害剤とを併用した場合、ＧＳＫ３阻害剤は、好ましくはＣＨＩＲ９９０２１、ＣＨＩＲ９８０１４、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、ＢＩＯからなる群より選ばれる少なくとも１つを含み、さらに好ましくはＣＨＩＲ９９０２１を含む。ＧＳＫ３阻害剤とＰＯＲＣＮ阻害剤とを併用した場合、ＰＯＲＣＮ阻害剤は、好ましくはＩＷＰ−２、ＩＷＰ−３、ＩＷＰ−４、ＩＷＰ−Ｌ６、ＩＷＰ−１２、ＬＧＫ−９７４、ＥＴＣ−１５９、ＧＮＦ−６２３１、Ｗｎｔ−Ｃ５９からなる群より選ばれる少なくとも１つを含み、さらに好ましくはＩＷＰ−２を含む。また、ＧＳＫ３阻害剤とＫＹ０２１１１乃至その誘導体等を組み合わせて用いてもよい。ＧＳＫ３阻害剤とは作用機序の異なるβカテニンの分解の阻害、安定化作用を有する物質としては例えばＢＭＬ−２８４、ＳＫＬ２００１が挙げられ、これら化合物及びその誘導体もＰＯＲＣＮ阻害剤、ＫＹ０２１１１乃至その誘導体等と組み合わせて用いてもよい。
【０１７１】
培地中のＷｎｔシグナル伝達経路作用物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。細胞塊内部の神経系細胞又は組織の生存及び増殖の促進の観点からは、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質としてＣＨＩＲ９９０２１を用いる場合は、通常約１０ｐＭ〜約１０ｍＭ、好ましくは約１００ｐＭ〜約１ｍＭ、より好ましくは約１ｎＭ〜約１００μＭ、さらに好ましくは約１０ｎＭ〜約３０μＭ、最も好ましくは約１００ｎＭ〜約３μＭの濃度で使用される。また、ＣＨＩＲ９９０２１以外のＷｎｔシグナル伝達経路作用物質を使用する場合、上記濃度のＣＨＩＲ９９０２１と同等のＷｎｔシグナル伝達経路促進活性を示す濃度で用いられることが望ましい。
【０１７２】
＜工程（２）＞
工程（１）で得られた細胞凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下で浮遊培養する工程（２）について説明する。
【０１７３】
ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質とは、ＢＭＰ（骨形成タンパク質）により媒介されるシグナル伝達経路を増強し得る物質である。ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質としては、例えばＢＭＰ２、ＢＭＰ４もしくはＢＭＰ７等のＢＭＰタンパク質、ＧＤＦ７等のＧＤＦタンパク質、抗ＢＭＰ受容体抗体、又はＢＭＰ部分ペプチド等が挙げられる。これらの物質は単独又は組み合わせて用いてもよい。生物学的活性の見地からのＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の定義として、例えばマウス前駆軟骨細胞株ＡＴＤＣ５、マウス頭蓋冠由来細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１、マウス横紋筋由来細胞株Ｃ２Ｃ１２等の細胞に対する骨芽細胞様細胞への分化誘導能、及びアルカリホスファターゼ産生誘導能を有する物質が挙げられる。上記活性を有する物質としては、例えばＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１３／ＧＤＦ−６、ＢＭＰ−１４／ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−７等が挙げられる。
【０１７４】
ＢＭＰ２タンパク質及びＢＭＰ４タンパク質は例えばＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから、ＢＭＰ７タンパク質は例えばＢｉｏｌｅｇｅｎｄ社から、ＧＤＦ７タンパク質は例えば富士フィルム和光純薬株式会社から入手可能である。ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質は、好ましくはＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、ＢＭＰ１３及びＧＤＦ７からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質を含み、より好ましくはＢＭＰ４を含む。
【０１７５】
培地中のＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊の製造効率の観点から、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質としてＢＭＰ４を用いる場合は、通常約１ｐＭ〜約１００ｎＭ、好ましくは約１０ｐＭ〜約５０ｎＭ、より好ましくは約２５ｐＭ〜約２５ｎＭ、さらに好ましくは約２５ｐＭ〜約５ｎＭ、特に好ましくは約１００ｐＭ〜約５ｎＭ、最も好ましくは約５００ｐＭ〜約２ｎＭの濃度で使用される。また、ＢＭＰ４以外のＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を使用する場合、上述の濃度のＢＭＰ４と同等のＢＭＰシグナル伝達経路促進活性を示す濃度で用いられることが望ましい。当業者であれば、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質として例えば市販の組み換えＢＭＰタンパク質等を用いる場合、製品添付書類に記載の活性、例えばマウス前駆軟骨細胞株ＡＴＤＣ５に対するアルカリホスファターゼ産生誘導能のＥＤ５０等の値と上述のＢＭＰ４の濃度と活性を比較することにより、添加するＢＭＰシグナル伝達経路作用物質濃度を容易に決定することができる。
【０１７６】
工程（２）において用いられる培地は、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む限り特に限定されない。工程（２）において用いられる培地は血清培地又は無血清培地であり得る。化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、無血清培地が好適に用いられる。調製の煩雑さを回避するには、例えば市販のＫＳＲ等の血清代替物を適量添加した無血清培地（例えばＩＭＤＭとＦ−１２の１：１の混合液に５％ＫＳＲ、４５０μＭ１−モノチオグリセロール及び１ｘＣｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅが添加された培地、又はＧＭＥＭに５％〜２０％ＫＳＲ、ＮＥＡＡ、ピルビン酸、２−メルカプトエタノールが添加された培地）を使用することが好ましい。無血清培地へのＫＳＲの添加量としては、例えばヒトＥＳ細胞の場合は、通常約１％から約３０％であり、好ましくは約２％から約２０％である。
【０１７７】
嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊の製造効率の観点から、工程（２）の開始時期は、工程（１）における浮遊培養開始から好ましくは０．５時間以降６日以内であり、より好ましくは０．５時間以降７２時間以内であり、さらに好ましくは２４時間以降６０時間以内である。
【０１７８】
嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊の製造効率の観点から、工程（２）の開始時期は、好ましくは工程（１）において形成された凝集体の表層における１割以上１０割以下、より好ましくは３割以上１０割以下、さらに好ましくは５割以上１０割以下の細胞が互いに密着結合を形成している時期である。
【０１７９】
工程（２）におけるＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下での培養開始は、工程（１）を行った培養容器を用いて、上述の培地交換操作（例えば培地添加操作、半量培地交換操作、全量培地交換操作等）を行ってもよいし、細胞凝集体を別の培養容器に移してもよい。
【０１８０】
工程（２）におけるＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む培地での浮遊培養の期間は、適宜設定できる。工程（２）における浮遊培養の時間は、通常８時間〜６日間程度、好ましくは１０時間〜９６時間程度、より好ましくは１２時間〜７２時間程度、さらに好ましくは１４時間〜４８時間程度、最も好ましくは１６時間〜３６時間程度である。
【０１８１】
工程（２）において、工程（ａ）又は工程（１）において用いた添加物、例えばＳｈｈシグナル伝達経路作用物質、第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質、ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質等を引き続き添加することもまた好ましい。工程（２）で添加するＳｈｈシグナル伝達経路作用物質、第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質又はＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質は、それ以前の工程に用いられた物質と同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは同一である。添加物の濃度及び種類については、適宜調整することができる。これらの物質の添加時期は、工程（２）の開始と同時であってもよいし、異なっていてもよい。
【０１８２】
＜工程（３）＞
工程（２）で得られた細胞凝集体を浮遊培養する工程を含み、嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊を得る工程（３）について説明する。工程（３）は、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質の存在下で培養する工程（３ａ）、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の存在下で培養する工程（３ｂ）及びＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の存在下で培養する工程（３ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つの工程を含む。
【０１８３】
＜工程（３ａ）＞
工程（２）で得られた細胞凝集体を、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質の存在下で浮遊培養する工程（３ａ）について説明する。工程（３ａ）は、外的要因に基づくＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の非存在下で行う。さらに外的要因に基づくＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の存在下で行う場合は、工程（３ｃ）として後述する。ここで、「外的要因に基づく」とは、人為的に添加することに起因することを意味する。
【０１８４】
ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質とは、ＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子）により媒介されるシグナル伝達経路を増強し得る物質である限り特に限定はされない。ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質としては、例えばＦＧＦ１、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦと称することもある）、ＦＧＦ８等のＦＧＦタンパク質、抗ＦＧＦ受容体抗体、ＦＧＦ部分ペプチド等が挙げられる。これらの物質は単独又は組み合わせて用いてもよい。
【０１８５】
ＦＧＦ２タンパク質及びＦＧＦ８タンパク質は、例えば富士フィルム和光純薬株式会社から入手可能である。ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質は、好ましくはＦＧＦ２及びＦＧＦ８、並びに、これらの改変体からなる群より選ばれる少なくとも１つを含み、より好ましくはＦＧＦ２を含み、さらに好ましくは組み換えヒトＦＧＦ２を含む。
【０１８６】
培地中のＦＧＦシグナル伝達経路作用物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。神経組織部の上皮構造形成、プラコードへの分化及び細胞の生存と増殖の促進の観点からは、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質としてＦＧＦ２を用いる場合は、通常約１ｐｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌ、好ましくは約１０ｐｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ、より好ましくは約１００ｐｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは約５００ｐｇ／ｍｌ〜約１μｇ／ｍｌ、最も好ましくは約１ｎｇ／ｍｌ〜約２００ｎｇ／ｍｌの濃度で使用される。また、ＦＧＦ２以外のＦＧＦシグナル伝達経路作用物質を使用する場合、上記濃度のＦＧＦ２と同等のＦＧＦシグナル伝達経路促進活性を示す濃度で用いられることが望ましい。
【０１８７】
培地中でのＦＧＦタンパク質の活性を保持する目的から、ＦＧＦタンパク質を含む培地中にヘパリン、ヘパラン硫酸を添加することも好ましい。ヘパリンはナトリウム塩として例えば富士フィルム和光純薬株式会社から入手可能である。培地中のヘパリン又はヘパラン硫酸の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。培地中のヘパリンナトリウムの濃度は、通常約１ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約１００ｎｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは約５００ｎｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約１μｇ／ｍｌ〜約２００μｇ／ｍｌである。ヘパラン硫酸を用いる場合、上記濃度のヘパリンと同様のＦＧＦタンパク質保護の活性をもつ濃度であることが好ましい。３７℃等での細胞培養環境下でＦＧＦタンパク質の活性を保持する目的から、例えば米国特許ＵＳ８７７２４６０Ｂ２号に記載のＴｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ＦＧＦ２等のＦＧＦの改変体や生分解性ポリマーにＦＧＦ２を結合させたＳｔｅｍＢｅａｄｓ  ＦＧＦ２等のＦＧＦ２徐放性ビーズを用いることもまた好ましい。Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ＦＧＦ２は、例えばＨｕｍａｎＺｙｍｅ社から入手可能である。ＳｔｅｍＢｅａｄｓ  ＦＧＦ２は例えばＳｔｅｍＣｕｌｔｕｒｅ社から入手可能である。
【０１８８】
＜工程（３ｂ）＞
工程（２）で得られた細胞凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養する工程（３ｂ）について説明する。工程（３ｂ）は、外的要因に基づくＦＧＦシグナル伝達経路作用物質の非存在下で行う。さらに外的要因に基づくＦＧＦシグナル伝達経路作用物質の存在下で行う場合は、工程（３ｃ）として後述する。
【０１８９】
ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質とはＢＭＰファミリータンパク質により惹起されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り限定されない。核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。当該物質として例えばＢＭＰのプロセシングと細胞外への分泌を阻害する物質、ＢＭＰに直接作用する物質（例えばタンパク質、抗体、アプタマー等）、ＢＭＰをコードする遺伝子の発現を抑制する物質（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ等）、ＢＭＰ受容体とＢＭＰの結合を阻害する物質、ＢＭＰ受容体によるシグナル伝達に起因する生理活性を阻害する物質を挙げることができる。ＢＭＰ受容体にはＩ型ＢＭＰ受容体とＩＩ型ＢＭＰ受容体が存在し、Ｉ型ＢＭＰ受容体としてはＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＶＲ、ＩＩ型ＢＭＰ受容体としてはＴＧＦ−ｂｅｔａ  Ｒ−ＩＩ、ＡｃｔＲ−ＩＩ、ＡｃｔＲ−ＩＩＢ、ＢＭＰＲ２、ＭＩＳＲ−ＩＩが知られている。
【０１９０】
ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質として知られているタンパク質として、例えばＮｏｇｇｉｎ、Ｃｈｏｒｄｉｎ、Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ、Ｇｒｅｍｌｉｎ、Ｉｎｈｉｂｉｎ、Ｔｗｉｓｔｅｄ  Ｇａｓｔｒｕｌａｔｉｏｎ、Ｃｏｃｏ、ＤＡＮファミリーに属する分泌タンパク質等が挙げられる。上記工程（２）において培養液中にＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を添加していることから、以降のＢＭＰシグナル伝達経路をより効果的に阻害するという観点から、工程（３ｂ）におけるＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質は、細胞外へのＢＭＰの分泌よりも後のシグナル伝達経路を阻害する物質、例えばＢＭＰ受容体とＢＭＰの結合を阻害する物質、ＢＭＰ受容体によるシグナル伝達に起因する生理活性を阻害する物質等を含むことが好ましく、より好ましくはＩ型ＢＭＰ受容体の阻害剤を含む。
【０１９１】
ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質として、当業者に周知の化合物を使用することもできる。ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質としては、例えばＫ０２２８８（３−［（６−Ａｍｉｎｏ−５−（３，４，５−ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−３−ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ］ｐｈｅｎｏｌ，３−［６−Ａｍｉｎｏ−５−（３，４，５−ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−３−ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ］−ｐｈｅｎｏｌ）、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（６−［４−［２−（１−Ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ）ｅｔｈｏｘｙ］ｐｈｅｎｙｌ］−３−（４−ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５−ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）、ＬＤＮ−１９３１８９（４−［６−［４−（１−Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５−ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−３−ｙｌ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ  ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＬＤＮ−２１２８５４（５−［６−［４−（１−Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５−ａ］ｐｙｒｉＭｉｄｉｎ−３−ｙｌ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）、ＬＤＮ−２１４１１７（１−（４−（６−ｍｅｔｈｙｌ−５−（３，４，５−ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒｉｄｉｎ−３−ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ）、ＭＬ３４７（５−［６−（４−Ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５−ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−３−ｙｌ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ））、ＤＭＨ１（４−（６−（４−Ｉｓｏｐｒｏｐｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５−ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−３−ｙｌ）ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）、ＤＭＨ２（４−［６−［４−［２−（４−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌ）ｅｔｈｏｘｙ］ｐｈｅｎｙｌ］ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５−ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−３−ｙｌ］−ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）等が挙げられる。これらの物質は単独又は組み合わせて用いてもよい。
【０１９２】
本発明で用いられるＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質は、好ましくはＩ型ＢＭＰ受容体阻害剤であり、より好ましくはＫ０２２８８、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、ＬＤＮ−１９３１８９、ＬＤＮ−２１２８５４、ＬＤＮ−２１４１１７、ＭＬ３４７、ＤＭＨ１及びＤＭＨ２からなる群より選ばれる少なくとも１つを含み、さらに好ましくはＫ０２２８８を含む。
【０１９３】
培地中のＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。嗅上皮様組織の形成効率の観点から、工程（３ｂ）におけるＢＭＰ伝達経路阻害物質としてＫ０２２８８を用いる場合は、通常約１ｎＭ〜約１００μＭ、好ましくは約１０ｎＭ〜約５０μＭ、より好ましくは約１００ｎＭ〜約５０μＭ、さらに好ましくは約５００ｎＭ〜約２５μＭの濃度で使用される。ＢＭＰ伝達経路阻害物質としてＬＤＮ−１９３１８９を用いる場合は、通常約１ｎＭ〜約１００μＭ、好ましくは約１０ｎＭ〜約１０μＭ、より好ましくは約２５ｎＭ〜約１μＭ、さらに好ましくは約１００ｎＭ〜約５００ｎＭの濃度で使用される。ＢＭＰ伝達経路阻害物質としてＬＤＮ−２１２８５４を用いる場合は、通常約１ｎＭ〜約１００μＭ、好ましくは約１０ｎＭ〜約１０μＭ、より好ましくは約２５ｎＭ〜約５μＭ、さらに好ましくは約２５０ｎＭ〜約３μＭの濃度で使用される。ＢＭＰ伝達経路阻害物質としてＭＬ−３４７を用いる場合は、通常約１ｎＭ〜約１００μＭ、好ましくは約１０ｎＭ〜約５０μＭ、より好ましくは約１００ｎＭ〜約５０μＭ、さらに好ましくは約１μＭ〜約２５μＭの濃度で使用される。ＢＭＰ伝達経路阻害物質としてＤＭＨ２を用いる場合は、通常約１ｎＭ〜約１００μＭ、好ましくは約１０ｎＭ〜約１０μＭ、より好ましくは約２５ｎＭ〜約５μＭ、さらに好ましくは約２５０ｎＭ〜約３μＭの濃度で使用される。また、Ｋ０２２８８以外のＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質を使用する場合、上記濃度のＫ０２２８８と同等のＢＭＰシグナル伝達経路阻害活性を示す濃度で用いられることが望ましい。
【０１９４】
＜工程（３ｃ）＞
工程（２）で得られた細胞凝集体を、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養する工程（３ｃ）について説明する。
【０１９５】
工程（３ｃ）に用いられるＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の種類、濃度等は、工程（３ａ）又は工程（３ｂ）と同様の条件で行うこともできるし、異なる条件で実施することもできる。工程（３ｃ）において、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質としてＦＧＦ２を用いる場合は、通常約１ｐｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌ、好ましくは約１０ｐｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ、より好ましくは約１００ｐｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは約５００ｐｇ／ｍｌ〜約１μｇ／ｍｌ、最も好ましくは約１ｎｇ／ｍｌ〜約２００ｎｇ／ｍｌの濃度で使用される。工程（３ｃ）において、ＢＭＰ伝達経路阻害物質としてＫ０２２８８を用いる場合は、通常約１ｎＭ〜約１００μＭ、好ましくは約１０ｎＭ〜約５０μＭ、より好ましくは約５０ｎＭ〜約５０μＭ、さらに好ましくは約１００ｎＭ〜約２５μＭの濃度で使用される。
【０１９６】
工程（３ｃ）は、工程（３ａ）又は工程（３ｂ）の後に行ってもよいし、工程（３ｃ）のみを行ってもよい。細胞塊中に網膜組織を形成させることを企図しない場合は、工程（３ｃ）を最初から行うことが好ましい。細胞塊中に網膜組織を形成させることを企図する場合は、まず工程（３ａ）を行い、その後工程（３ｃ）を行うことが好ましい。工程（３ａ）を行ってから工程（３ｃ）を行う場合は、工程（３ａ）の培養期間は通常１日〜４０日、好ましくは２日〜３０日、より好ましくは３日〜２５日、さらに好ましくは６日〜２５日間培養である。その際に用いるＦＧＦシグナル伝達経路作用物質の種類、濃度等は、工程（３ａ）のみを行うときと同様の条件でもよいし、異なる条件でもよい。
【０１９７】
細胞塊中に網膜組織を形成させることを企図し、工程（３ａ）を行ってから工程（３ｃ）を行う場合は、工程（３ａ）の培養期間は細胞塊中に網膜組織が形成されるまで実施することが好ましい。細胞塊中に網膜組織が形成されたかどうかを調べるためには、顕微鏡等により細胞塊内部に上皮様の組織が形成されたかを観察、又は細胞塊の切片を作製し、Ｒｘ、Ｃｈｘ１０、Ｎ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ等の網膜組織で発現するマーカーに対する蛍光免疫染色等の手法により行うことができる。
【０１９８】
嗅上皮様組織の形成効率の観点から、工程（３ａ）、工程（３ｂ）又は工程（３ｃ）の開始時期は、工程（２）のＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の添加から好ましくは０．５時間以降９６時間以内であり、より好ましくは１２時間以降７２時間以内であり、さらに好ましくは１２時間以降４８時間以内である。
【０１９９】
嗅上皮様組織の形成効率の観点から、工程（３ａ）、工程（３ｂ）又は工程（３ｃ）の開始時期は、工程（２）のＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の添加後に細胞塊の表面に非神経上皮組織が形成されるよりも前に開始することが好ましい。細胞塊の表面に非神経上皮組織が形成されたかを調べるためには、顕微鏡等により細胞塊表面に上皮様の組織が形成されたかを観察、又は細胞塊の切片を作製し、サイトケラチン、Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＥｐＣＡＭ等の非神経上皮組織で発現するマーカーに対する蛍光免疫染色等の手法により行うことができる。
【０２００】
工程（３ａ）、工程（３ｂ）又は工程（３ｃ）の培養開始は、工程（２）を行った培養容器を用いて、上述の培地交換操作（例えば培地添加操作、半量培地交換操作、全量培地交換操作等）を行ってもよいし、細胞凝集体を別の培養容器に移してもよい。
【０２０１】
工程（３ａ）、工程（３ｂ）又は工程（３ｃ）の浮遊培養の期間は、適宜設定できる。工程（３ａ）、工程（３ｂ）又は工程（３ｃ）における浮遊培養の時間は、通常８時間〜２００日間程度、好ましくは１０時間〜１８０日間程度、より好ましくは１２時間〜１５０日間程度、さらに好ましくは１４時間〜１２０日間程度、最も好ましくは２０時間〜１００日間程度である。工程（３ｂ）又は工程（３ｃ）の後に下記工程（３ｄ）を実施する場合、工程（３ｂ）又は工程（３ｃ）における浮遊培養の時間は、通常８時間〜１２日間程度、好ましくは１０時間〜６日間程度である。
【０２０２】
＜工程（３ｄ）＞
工程（３）は、工程（３ｂ）又は工程（３ｃ）の後に、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の非存在下で浮遊培養する工程（３ｄ）をさらに含んでもよい。すなわち、工程（３ｂ）又は工程（３ｃ）で得られた細胞凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の非存在下で浮遊培養して細胞塊を得る工程（３ｄ）について説明する。工程（３ｂ）又は工程（３ｃ）で得られた細胞塊を、さらにＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の非存在下で浮遊培養してもよい。
【０２０３】
工程（３ｄ）においてＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の非存在下で浮遊培養を行うためには、工程（３ｂ）又は工程（３ｃ）にて添加されたＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質を培養環境中より除く必要がある。その為の操作として、例えば半量培地交換操作、全量培地交換操作が挙げられる。上記の培地交換操作を、１日に複数回、好ましくは１時間以内に複数回（例えば２〜３回）行ってもよい。培地交換操作を複数回行う際の最終回、工程（３ｄ）以降の培養を行う培地以外は、細胞塊の製造にかかる費用を低減する観点から、例えば生理食塩水、ＫＳＲ及び増殖因子等の添加物を含まない培地等を用いてもよい。
【０２０４】
また、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の非存在下で浮遊培養を行うための別の操作として、細胞凝集体を別の滅菌済み容器（１５ｍｌチューブ、浮遊培養用シャーレ等）に回収し、培地又は生理食塩水等で洗浄したのちに、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の非存在下の培養環境に移す操作（細胞凝集体の移設操作）が挙げられる。その際の移設後の培養に用いる培養容器は、工程（３ｂ）又は工程（３ｃ）までで用いていたものと同様の物（９６ウェルプレート等）でもよいし、別の容器（浮遊培養用ディッシュ等）でもよい。
【０２０５】
工程（３ｄ）においてＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の非存在下での浮遊培養を実施するに当たり、培地交換操作又は細胞塊の移設操作の煩雑さを回避する観点から、各ウェル内に細胞凝集体又は細胞塊が入ったままの状態でプレート全体の培地を一度に交換することが可能な三次元細胞培養容器を用いることもまた好ましい。
【０２０６】
工程（３ｄ）において、工程（３ｂ）又は工程（３ｃ）で得られた細胞凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の非存在下で浮遊培養することで、細胞死が生じにくく、細胞の増殖がより促進され、嗅上皮様組織の形成効率及び神経組織部の上皮構造形成効率が向上した細胞塊を得ることができる。
【０２０７】
工程（３ｄ）において、好ましくはＦＧＦシグナル伝達経路作用物質が存在する。工程（３ｄ）で添加するＦＧＦシグナル伝達経路作用物質は、工程（３ａ）又は（３ｃ）において用いられた物質と同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは同一である。ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質の濃度及び種類については、適宜調整することができる。
【０２０８】
神経組織の上皮構造形成及び増殖の促進の観点からは、工程（３ｄ）の開始時期は、工程（３ｂ）又は（３ｃ）のＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の添加から好ましくは０．５時間以降６０日以内であり、より好ましくは０．５時間以降３０日以内であり、さらに好ましくは１２時間以降９６時間以内である。
【０２０９】
工程（３ｄ）におけるＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の非存在下での浮遊培養の期間は、適宜設定できる。工程（３ｄ）における浮遊培養の時間は、通常８時間〜２００日間程度、好ましくは１０時間〜１８０日間程度、より好ましくは１２時間〜１５０日間程度、さらに好ましくは１４時間〜１２０日間程度、最も好ましくは２０日間〜１００日間程度である。
【０２１０】
工程（３）において用いられる培地は、特に限定されないが、血清培地又は無血清培地であり得る。化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、無血清培地が好適に用いられる。調製の煩雑さを回避するには、例えば市販のＫＳＲ等の血清代替物を適量添加した無血清培地を用いることが好ましい。無血清培地へのＫＳＲの添加量としては、例えばヒトＥＳ細胞の場合は、通常約１％から約３０％であり、好ましくは約２％から約２０％である。工程（３）に用いられる培地としては、例えばＩＭＤＭとＦ−１２の１：１の混合液に５％ＫＳＲ、４５０μＭ  １−モノチオグリセロール及び１ｘＣｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅが添加された培地、ＧＭＥＭに５％〜２０％ＫＳＲ、ＮＥＡＡ、ピルビン酸、２−メルカプトエタノールが添加された培地、ＮｅｕｒｏｂａｓａｌにＢ２７  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔが添加された培地、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２にＮ２  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔが添加された培地、ＳｔｅｍＰｒｏ  ＮＳＣ  ＳＦＭ  無血清ヒト神経幹細胞培養培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）等の調製済の神経細胞培養用の培地が挙げられる。
【０２１１】
工程（３）において、工程（ａ）、工程（１）及び工程（２）の何れかの工程において細胞塊の製造に用いた添加物、例えばＳｈｈシグナル伝達経路作用物質、第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質、ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質等を引き続き添加することもまた好ましい。工程（３）で添加するＳｈｈシグナル伝達経路作用物質、第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質及びＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質は、それぞれ工程（ａ）、工程（１）及び工程（２）の何れかの工程において用いられた物質と同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは同一である。添加物の濃度及び種類については、適宜調整することができる。工程（３）において使用される添加物は、より好ましくは第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質を含み、さらに好ましくは第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質及びＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質を含む。
【０２１２】
神経組織部の上皮構造形成並びに細胞の生存及び増殖促進の観点からは、工程（３）は、ＥＧＦシグナル伝達経路作用物質の存在下で行うこともまた好ましい。ＥＧＦシグナル伝達経路作用物質とは、上皮成長因子（ＥＧＦ）により媒介されるシグナル伝達経路を増強し得る物質である。ＥＧＦシグナル伝達経路作用物質としては、例えばＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＡＲ（アンフィレギュリン）、ＥＰＧ、ＨＢ−ＥＧＦ（ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子）、ＢＴＣ（ベータセルリン）、ＥＰＲ（エピレグリン）等のＥＧＦＲリガンドタンパク質、ＮＲＧ（ニューレグリン）１〜４のＥｒｂＢ３／４（上皮成長因子受容体、ＨＲＥ）リガンドタンパク質、アルプレノール、カルベジロール等の低分子化合物等が挙げられる。これらの物質は単独又は組み合わせて用いてもよい。ＥＧＦタンパク質は例えばＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社及びＰｒｉｍｅＧｅｎｅ社から入手可能である。ＨＢ−ＥＧＦタンパク質は、例えばＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社から入手可能である。ＥＧＦシグナル伝達経路作用物質は、好ましくはＥＧＦを含む。
【０２１３】
培地中のＥＧＦシグナル伝達経路作用物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。ＥＧＦシグナル伝達経路作用物質としてＥＧＦを用いる場合は、通常約１ｐｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌ、好ましくは約１０ｐｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ、より好ましくは約１００ｐｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは約５００ｐｇ／ｍｌ〜約１μｇ／ｍｌ、最も好ましくは約１ｎｇ／ｍｌ〜約２００ｎｇ／ｍｌの濃度で使用される。またＥＧＦ以外のＥＧＦシグナル伝達経路作用物質を使用する場合、上記濃度のＥＧＦと同等のＥＧＦシグナル伝達経路促進活性を示す濃度で用いられることが望ましい。
【０２１４】
上記の物質は、工程（３）のうち、工程（３ａ）〜（３ｄ）からなる群より選ばれる少なくとも１つの工程において存在してもよいし、工程（３ａ）〜（３ｄ）の全ての工程において存在してもよい。上記の物質の添加時期は、工程（３ａ）、工程（３ｂ）、工程（３ｃ）又は工程（３ｄ）の開始と同時であってもよいし、異なっていてもよい。
【０２１５】
工程（３）において、製造された細胞塊を長期培養することにより、分化の進んだ細胞を含む、より成熟した細胞塊を得ることもできる。このような培養を成熟培養とも称する。工程（３）の成熟培養過程において、化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、無血清培地が好適に用いられる。工程（３）の成熟培養において、用いる培地は工程（１）から工程（３）で用いたものと同様の物を用いることもできる。また、神経細胞等の培養に用いる既知の培地、例えばＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地の１：１混合液に０．５％  Ｎ２  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔと１％  Ｂ２７  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔが添加された培地（Ｎ２Ｂ２７培地）、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地にＳｔｅｍＰｒｏ  ＮＳＣ  ＳＦＭ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔが添加された培地（ＳｔｅｍＰｒｏ  ＮＳＣ  ＳＦＭ培地）等を用いることもできる。成熟培養を実施する際には、浮遊培養の開始時に用いた培養容器で培養を継続することもできる。また、新しい培養容器、例えば浮遊培養用ディッシュ、浮遊培養用フラスコ等に細胞塊を移し培養を実施することもできる。成熟培養過程において、培養条件を大きく変更する場合は、特に工程（３ｅ）として後述する。
【０２１６】
＜工程（３ｅ）＞
工程（３）は、前記工程（３ａ）、前記工程（３ｂ）又は前記工程（３ｃ）の後に、さらに培養を行う工程（３ｅ）を含んでもよい。工程（３ｄ）の後に、工程（３ｅ）を含んでもよい。工程（３ｅ）により、より分化段階が進んだ嗅神経細胞を得ることができる。
【０２１７】
工程（３ｅ）において、用いる培地は工程（１）から工程（３）、あるいは工程（３）の成熟培養で用いたものと同様の物を用いることもできる。また、神経細胞等の培養に用いる既知の培地、例えばＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地の１：１混合液に０．５％  Ｎ２  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔと１％  Ｂ２７  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔが添加された培地（Ｎ２Ｂ２７培地）、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地にＳｔｅｍＰｒｏ  ＮＳＣ  ＳＦＭ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔが添加された培地（ＳｔｅｍＰｒｏ  ＮＳＣ  ＳＦＭ培地）、中枢神経系オルガノイド用の培地（ＳＴＥＭｄｉｆｆ  Ｃｅｒｅｂｒａｌ  Ｏｒｇａｎｏｉｄ  Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）、上皮細胞培養用の培地（ＰｎｅｕｍｏＣｕｌｔ  ＡＬＩ  ｍｅｄｉｕｍ、ＣｎＴ−Ｐｒｉｍｅ、Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）等を用いることもできる。
【０２１８】
工程（３ｅ）において、上記工程の何れかの工程において細胞塊の製造に用いた添加物、例えばＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質、ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質、Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質、第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質、ＥＧＦシグナル伝達経路作用物質等を引き続き添加することもまた好ましい。工程（３ｅ）で添加するこれらの物質は、それぞれ上記工程の何れかの工程において用いられた物質と同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは同一である。添加物の濃度及び種類については、適宜調整することができる。工程（３ｅ）において使用される添加物は、より好ましくはＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質、ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＥＧＦシグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも１つを含む。
【０２１９】
嗅上皮様組織の成熟促進の観点からは、工程（３ｅ）において、好ましくはレチノイン酸伝達経路作用物質がさらに存在する。レチノイン酸伝達経路作用物質としては、例えばオールトランスレチノイン酸、イソトレチノイン、９−ｃｉｓレチノイン酸、ＴＴＮＰＢ、Ｃｈ５５、ＥＣ１９、ＥＣ２３、Ｆｅｎｒｅｔｉｎｉｄｅ、Ａｃｉｔｒｅｔｉｎ、Ｔｒｉｆａｒｏｔｅｎｅ、Ａｄａｐａｌｅｎｅ等が挙げられる。これらの物質は単独又は組み合わせて用いてもよい。
【０２２０】
レチノイン酸伝達経路作用物質は、好ましくはＥＣ２３を含む。培地中のレチノイン酸伝達経路作用物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲であれば特に限定されないが、レチノイン酸伝達経路作用物質としてＥＣ２３を用いる場合は、例えばＥＣ２３の濃度が約１０ｐＭ〜約１０μＭであり、好ましくは約１００ｐＭ〜約５μＭであり、より好ましくは約１ｎＭ〜約１μＭであり、さらに好ましくは約１０ｎＭ〜約５００ｎＭである。また、ＥＣ２３以外のレチノイン酸伝達経路作用物質を使用する場合、上記濃度のＥＣ２３と同等のレチノイン酸伝達経路作用物質を示す濃度で用いられることが望ましい。
【０２２１】
嗅上皮様組織の成熟促進の観点からは、工程（３ｅ）において、好ましくは血清がさらに存在する。血清としては特に限定されないが、細胞培養において通常用いられる血清を用いることができる。培地中の血清の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲であれば特に限定されないが、例えば約１％〜２０％であり、好ましくは約３％〜約１５％である。
【０２２２】
工程（３ｅ）において、細胞の保護と生体の物理的環境を模して嗅上皮様組織の製造効率を向上させる観点から、増粘剤を含有し、粘性を有する培地中で細胞塊を培養することが好ましい。
【０２２３】
培地に粘性を付与する手段は特に制限されないが、例えば、一般に増粘剤として知られる物質を適当な濃度で培地に添加することにより実施されうる。増粘剤としては、培地に上記の適度な粘度を付与し得るものであって、当該粘度を付与し得る濃度範囲において、細胞に悪影響を及ぼさない（細胞毒性がない）ものであれば、いかなる増粘剤も使用することができる。増粘剤としては、例えばメチルセルロース、ペクチン、グアーガム、キサンタンガム、タマリンドガム、カラギーナン、ローカストビーンガム、ジェランガム、デキストリン、ダイユータンガム、デンプン、タラガム、アルギン酸、カードラン、カゼインナトリウム、カロブビーンガム、キチン、キトサン、グルコサミン、プルラン、アガロース、食物繊維及びこれらの化学修飾された物質又は誘導体、セルロース、アガロースなどの多糖、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルエチルセルロース、ヒドロキシプロピルエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、ジヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルヒドロキシプロピルセルロースなどの多糖のエーテル、ポリアクリルアミド、ポリエチレンオキシド、及びポリビニルピロリドン、エチレングリコール／プロピレングリコール共重合体、ポリエチレンイミンポリビニルメチルエーテル、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、マレイン酸共重合体などの合成高分子、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、デキストラン、カラゲーナンなどの生体高分子、あるいはそれらを模倣した人工高分子（例えば、エラスチン様ペプチドなど）が挙げられる。好ましくは、これら増粘剤は単独で用いてもよいし、何種類かの増粘剤の混合物として用いることもできる。また、増粘剤として用いられる水溶性高分子の共重合体を用いてもよい。好ましくは、メチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースまたはそれらの混合物、より好ましくはメチルセルロースを用いることができる。
【０２２４】
粘性を有する培地は、培養環境として好適に用いられる３７℃条件下で、通常１００ｍＰａ・Ｓ以上、好ましくは５００ｍＰａ・Ｓ以上、より好ましくは１０００ｍＰａ・Ｓ以上、さらに好ましくは２０００ｍＰａ・Ｓ以上の粘性を有するものが用いられる。
【０２２５】
培地に添加される増粘剤の濃度は、粘性を付与可能であり細胞に対する障害性を有しない限り適宜調製可能である。増粘剤としてメチルセルロース（４０００ｃＰ）を用いる場合は、通常０．５％から１０％、好ましくは１％から７．５％、さらに好ましくは２％から５％の濃度で用いられる。
【０２２６】
工程（３ｅ）において、形成された細胞塊中の嗅神経細胞を含む組織の菲薄化を抑制し、組織の製造効率を向上させる観点から、形成された細胞凝集体を接着培養することもまた好ましい。
【０２２７】
細胞を接着させる培養器材として平面の細胞培養ディッシュ、あるいはＴｒａｎｓｗｅｌｌ等の薄膜状の細胞培養器材のいずれの形態でも用いることができる。これら細胞培養ディッシュもしくは細胞培養器材は、細胞の接着を促進するために基底膜標品、ラミニン等の細胞外基質、ポリ−Ｄ−リジン等の合成細胞接着分子等でコーティングされていてもよい。
【０２２８】
工程（３ｅ）において、細胞塊中の嗅神経細胞を含む組織の生存及び成熟を促進する観点から、細胞凝集体を気相液相境界面培養法で培養することもまた好ましい。気相液相境界面培養法（Ａｉｒ  ｌｉｑｕｉｄ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ）とは、細胞又は組織の少なくとも一面が大気に暴露されているか、極めて近い位置にある条件での培養を表す。気相液相境界面培養法を実施するためには、例えば細胞又は組織を多孔性メンブレン上又はカルチャーインサート内で培養し、インサート内（内腔側）の培養液を抜き取り、インサート外側のウェル内の培養液のみで培養する、あるいはアガロース等のハイドロゲルを培養ディッシュ内に置き、その上に細胞又は組織等を置いてディッシュ内の培地から露出しつつ乾燥しない条件下で培養する等の方法が挙げられる。主として酸素による大気への暴露の毒性を軽減する目的から、ＰＤＭＳ等の酸素透過性の膜や板を細胞又は組織等の上に置き、暴露条件を調節することもできる。
【０２２９】
嗅上皮様組織の成熟及び増殖の促進の観点からは、工程（３ｅ）の開始時期は、工程（３）の開始から例えば６０日以内であり、好ましくは３０日以内であり、例えば１２時間以降であり、好ましくは９６時間以降である。
【０２３０】
工程（３ｅ）における培養の期間は、適宜設定できる。工程（３ｅ）における培養期間は、通常８時間〜２００日間程度、好ましくは１日〜１５０日間程度、さらに好ましくは２日〜１２０日間程度、最も好ましくは４日間〜１００日間程度である。
【０２３１】
工程（３）において、嗅神経細胞及び中枢神経系細胞の成熟促進の観点から、細胞凝集体をゲル中に包埋して培養する工程を含んでもよい。ゲルとしては、例えばアガロース、メチルセルロース、コラーゲン、マトリゲル等を用いたゲルが挙げられ、マトリゲルを用いることが好ましい。
【０２３２】
異種成分及び未決定因子の混入を回避する観点からは、工程（１）、工程（２）及び工程（３）からなる群より選ばれる少なくとも１つの工程をマウス肉腫由来基底膜標品（マトリゲル）の非存在下で行うことが好ましい。嗅上皮様組織の成長促進の観点からは、工程（３）は、マトリゲルの存在下で行ってもよい。培地中の基底膜標品の濃度は、マトリゲルを用いた場合には好ましくは０．５％以上４％以下であり、実験操作の点からより好ましくは０．５％以上１．５％以下である。基底膜標品の添加時期は、細胞凝集体の状態により異なるが、例えば工程（１）の開始から７日以降であり、より好ましくは９日目以降である。基底膜標品の添加時期は、例えば工程（３ａ）、（３ｂ）又は（３ｃ）の開始から４日目以降であり、６日目以降である。
【０２３３】
細胞塊の表面に形成された嗅上皮様組織の菲薄化及びプラコード由来組織以外の組織への分化転換の抑止の観点から、工程（３）において、工程（１）、工程（２）及び／又は工程（３）において添加された第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質とは異なるＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質（本発明において、第二Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質とも呼ぶ）が存在していてもよい。第二Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質は、好ましくは第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質とは作用機序が異なり、工程（１）において第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質としてＰＯＲＣＮ阻害剤を用いた場合は、第二Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質は、好ましくは古典的Ｗｎｔ経路（ｃａｎｏｎｉｃａｌ−Ｗｎｔ  ｐａｔｈｗａｙ）に対する阻害活性を有する物質を含み、より好ましくはＴＡＮＫ阻害剤を含む。第二Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質を添加する際には、工程（１）においてＷｎｔシグナル伝達経路作用物質が添加されていないことが好ましい。
【０２３４】
古典的Ｗｎｔ経路の細胞内シグナル伝達機構に対する阻害活性を有する物質として、例えばＦｒｉｚｚｌｅｄ阻害剤、Ｄｖｌ阻害剤、ＴＡＮＫ阻害剤、カゼインキナーゼ１阻害剤、カテニン応答性転写阻害剤、ｐ３００阻害剤、ＣＢＰ阻害剤、ＢＣＬ−９阻害剤が挙げられる。
【０２３５】
ＴＡＮＫ阻害剤としては、例えばＩＷＲ１−ｅｎｄｏ（４−［（３ａＲ，４Ｓ，７Ｒ，７ａＳ）−１，３，３ａ，４，７，７ａ−ｈｅｘａｈｙｄｒｏ−１，３−ｄｉｏｘｏ−４，７−ｍｅｔｈａｎｏ−２Ｈ−ｉｓｏｉｎｄｏｌ−２−ｙｌ］−Ｎ−８−ｑｕｉｎｏｌｉｎｙｌ−ｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、ＸＡＶ９３９（３，５，７，８−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−２−［４−（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］−４Ｈ−ｔｈｉｏｐｙｒａｎｏ［４，３−ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−４−ｏｎｅ）、ＭＮ−６４（２−［４−（１−ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］−４Ｈ−１−ｂｅｎｚｏｐｙｒａｎ−４−ｏｎｅ）、ＷＩＫＩ４（１−［（１Ｓ）−１−（４−Ｃｈｌｏｒｏ−３−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ］−４−［２−［（２−ｍｅｔｈｙｌｐｙｒａｚｏｌ−３−ｙｌ）ａｍｉｎｏ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−４−ｙｌ］ｐｙｒｉｄｉｎ−２−ｏｎｅ）、ＴＣ−Ｅ  ５００１（３−（４−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−［［［４−（４−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−ｍｅｔｈｙｌ−４ｈ−１，２，４−ｔｒｉａｚｏｌ−３−ｙｌ］ｔｈｉｏ］ｍｅｔｈｙｌ］−１，２，４−ｏｘａｄｉａｚｏｌｅ）、ＪＷ  ５５（Ｎ−［４−［［［［Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−４−（４−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２Ｈ−ｐｙｒａｎ−４−ｙｌ］ｍｅｔｈｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｃａｒｂｏｎｙｌ］ｐｈｅｎｙｌ］−２−ｆｕｒａｎｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ＡＺ６１０２（ｒｅｌ−２−［４−［６−［（３Ｒ，５Ｓ）−３，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］−４−ｍｅｔｈｙｌ−３−ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ］ｐｈｅｎｙｌ］−３，７−ｄｉｈｙｄｒｏ−７−ｍｅｔｈｙｌ−４Ｈ−ｐｙｒｒｏｌｏ［２，３−ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−４−ｏｎｅ）等が挙げられる。これらの物質は単独又は組み合わせて用いてもよい。
【０２３６】
第二Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質として用いられるＴＡＮＫ阻害剤は、好ましくはＩＷＲ１−ｅｎｄｏ、ＸＡＶ９３９及びＭＮ−６４からなる群より選ばれる少なくとも１つを含み、より好ましくはＸＡＶ９３９を含む。培地中の第二Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。プラコード様組織の維持と菲薄化の防止の観点からは、例えば第二Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質としてＴＡＮＫ阻害剤の１種であるＸＡＶ９３９を用いる場合は、その濃度は通常約０．０１μＭ〜約３０μＭであり、好ましくは約０．１μＭ〜約３０μＭであり、より好ましくは約０．３μＭである。
【０２３７】
第二Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の添加時期は、工程（３）において細胞塊表面のプラコード様組織の菲薄化と分化転換が起きるよりも前の段階であればよく、工程（１）の多能性幹細胞の浮遊培養開始から通常１２時間以降であり、通常２８日以内であり、好ましくは２４日以内であり、より好ましくは２１日以内である。
【０２３８】
工程（３）において、第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質と第二Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質とは同時に培地中に存在しても良いし、第二Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質のみが培地中に添加されていてもよい。また、半量培地交換時に第二Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質のみを添加することにより、第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質を段階的に希釈しても良い。
【０２３９】
第二Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質は、工程（３）のうち、工程（３ａ）〜（３ｄ）からなる群より選ばれる少なくとも１つの工程において存在してもよいし、工程（３ａ）〜（３ｄ）の全ての工程において存在してもよい。第二Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の添加時期は、工程（３ａ）、工程（３ｂ）、工程（３ｃ）又は工程（３ｄ）の開始と同時であってもよいし、異なっていてもよい。
【０２４０】
工程（３）において、中内胚葉への分化を抑制し、プラコードへの分化効率と嗅上皮様組織の製造効率を向上させる観点から、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ  １（ＴＡＫ１）に対する阻害物質を添加することもまた好ましい。ＴＡＫ１はＴＧＦβ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、インターロイキン１（ＩＬ−１）、ＴＮＦ−α等により活性化されるシグナル伝達を媒介する、ＭＡＰ  キナーゼキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫＫ）ファミリーのセリンスレオニンタンパク質キナーゼである。
【０２４１】
ＴＡＫ１阻害物質とはＴＡＫ１が媒介するシグナル伝達を抑制し得るものである限り限定されない。核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。当該物質として例えばＴＡＫ１と基質の結合を阻害する物質、ＴＡＫ１のリン酸化を阻害する物質、ＴＡＫ１の脱リン酸化を促進する物質、ＴＡＫ１の転写や翻訳を阻害する物質、ＴＡＫ１の分解を促進する物質等が挙げられる。
【０２４２】
ＴＡＫ１阻害物質として例えば（５Ｚ）−７−Ｏｘｏｚｅａｅｎｏｌ（（３Ｓ，５Ｚ，８Ｓ，９Ｓ，１１Ｅ）−３，４，９，１０−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−８，９，１６−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１４−ｍｅｔｈｏｘｙ−３−ｍｅｔｈｙｌ−１Ｈ−２−ｂｅｎｚｏｘａｃｙｃｌｏｔｅｔｒａｄｅｃｉｎ−１，７（８Ｈ）−ｄｉｏｎｅ）、Ｎ−Ｄｅｓ（ａｍｉｎｏｃａｒｂｏｎｙｌ）  ＡＺ−ＴＡＫ１  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（３−Ａｍｉｎｏ−５−［４−（４−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌｍｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］−２−ｔｈｉｏｐｈｅｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、Ｔａｋｉｎｉｂ（Ｎ１−（１−Ｐｒｏｐｙｌ−１Ｈ−ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌ−２−ｙｌ）−１，３−ｂｅｎｚｅｎｅｄｉｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ＮＧ２５（Ｎ−［４−［（４−Ｅｔｈｙｌ−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］−３−（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］−４−ｍｅｔｈｙｌ−３−（１Ｈ−ｐｙｒｒｏｌｏ［２，３−ｂ］ｐｙｒｉｄｉｎ−４−ｙｌｏｘｙ）−ｂｅｎｚａｍｉｄｅ  ｔｒｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）及びこれら化合物の誘導体、類縁体が挙げられる。これらの物質は単独又は組み合わせて用いてもよい。
【０２４３】
本発明で用いられるＴＡＫ１阻害物質は、好ましくは（５Ｚ）−７−Ｏｘｏｚｅａｅｎｏｌである。工程（３）におけるＴＡＫ１阻害物質として（５Ｚ）−７−Ｏｘｏｚｅａｅｎｏｌを用いる場合は、通常約１ｎＭ〜約１００μＭ、好ましくは約１０ｎＭ〜約５０μＭ、より好ましくは約１００ｎＭ〜約２５μＭ、さらに好ましくは約５００ｎＭ〜約１０μＭの濃度で使用される。また、（５Ｚ）−７−Ｏｘｏｚｅａｅｎｏｌ以外のＴＡＫ１阻害物質を使用する場合、上記濃度の（５Ｚ）−７−Ｏｘｏｚｅａｅｎｏｌと同等のＴＡＫ１阻害活性を示す濃度で用いられることが好ましい。
【０２４４】
工程（３）において、細胞死を抑制し、細胞の増殖を促進する観点から、培地中にさらなる増殖因子を添加することもまた好ましい。添加される増殖因子の種類は、上記目的を達成可能な限り特に限定されない。かかる目的で用いられる増殖因子としては、インスリン様成長因子（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＩＧＦ）、神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（Ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ：ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン３、ニューロトロフィン４／５、毛様体神経栄養因子（Ｃｉｌｉａｒｙ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ：ＣＮＴＦ）、血管内皮細胞増殖因子（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）、色素上皮由来因子（Ｐｉｇｍｅｎｔ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆａｃｔｏｒ：ＰＥＤＦ）、肝細胞増殖因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＨＧＦ）等が挙げられる。これらの増殖因子は、上記目的を達成可能な濃度で添加すればよい。
【０２４５】
工程（３）において、細胞死を抑制し、細胞の増殖を促進する観点から、血小板由来成長因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＰＤＧＦ）等の血小板由来成長因子受容体作用物質を培地中に添加することもまた好ましい。ＰＤＧＦにはＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄの四種類の遺伝子が存在し、ＡＡ、ＡＢ、ＢＢ、ＣＣ、ＤＤのホモまたは特定の組み合わせのヘテロの二量体を形成してリガンドとして機能する。ＰＤＧＦ受容体にはα及びβの二種類の遺伝子が存在し、αα、αβ、ββの組み合わせのホモ又はヘテロの二量体を形成して受容体として機能する。このうち、プラコードを含む非神経外胚葉ではＰＤＧＦＲβがよく発現しており、本発明で用いる血小板由来成長因子受容体作用物質は好ましくはＰＤＧＦＲββ又はＰＤＧＦＲαβに対する作用を有しており、より好ましくはＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣ及びＰＤＧＦ−ＤＤのからなる群より選ばれる少なくとも１つを含み、さらに好ましくはＰＤＧＦ−ＢＢ及びＰＤＧＦ−ＣＣからなる群より選ばれる少なくとも１つを含む。ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣ及びＰＤＧＦ−ＤＤは、組み換えタンパク質としてＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社等から入手可能である。
【０２４６】
工程（１）、工程（２）及び／又は工程（３）において、嗅上皮様組織の製造効率を向上させる観点から、プラコード領域への分化を促進する化合物を添加することもまた好ましい。上記のような作用を有する化合物として、例えば米国特許ＵＳ２０１６０３２６４９１Ａ１号に記載のＢＲＬ−５４４４３、Ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅ、Ｐａｒｔｈｅｎｏｌｉｄｅ等が挙げられる。プラコード領域への分化を促進する化合物としてＢＲＬ−５４４４３を用いる場合は通常１０ｎＭ〜１００μＭ、Ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅを用いる場合は通常１０ｎＭ〜１００μＭ、Ｐａｒｔｈｅｎｏｌｉｄｅを用いる場合は通常１０ｎＭ〜１００μＭの濃度で用いられる。
【０２４７】
工程（３）において、細胞死を抑制し、細胞の増殖を促進する観点から、高酸素の雰囲気下で培養することもまた好ましい。培養過程における高酸素条件は、例えば細胞を培養するインキュベーターに酸素ボンベを接続し、人工的に酸素を供給することにより実現できる。かかる目的での酸素濃度は、通常２５％から８０％であり、より好ましくは３０％から６０％である。
【０２４８】
工程（３）において、細胞塊を培養する培地中への酸素供給量を増やす観点から、ガス交換効率の高い培養器材を用いることもできる。このような培養器材の例として、細胞培養ディッシュ、プレートの底面をガス透過性のフィルムとしたＬｕｍｏｘディッシュ（ザルスタット株式会社製）、ＶＥＣＥＬＬ  ９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（株式会社ベセル製）等が挙げられる。
【０２４９】
［３．嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊］
本発明において、「細胞」及び「組織」という表記は、それぞれ生体内に存在する対応する細胞及び組織と同様のマーカーによる免疫染色その他特定の方法によってその存在を確認することができるが、「細胞」及び「組織」の機能、構造等は生体内に存在する細胞及び組織と必ずしも同一であるとは限らない。例えば、本発明の細胞塊に含まれる「嗅神経細胞」は、生体内に存在する嗅神経細胞と同様のマーカーで染色することができるが、その遺伝子発現の状態やシナプス結合は、必ずしも生体内の嗅神経細胞と同一の状態にあるとは限らない。
【０２５０】
本発明における細胞塊とは、
１）嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む非神経上皮組織部、及び、
２）神経系細胞又はその前駆細胞を含む神経組織部を含み、
上記神経系細胞又はその前駆細胞は、中枢神経系を構成する神経系細胞又はその前駆細胞を含み、
上記神経組織部の表面の少なくとも一部が上記非神経上皮組織部で被覆されている凝集体をいう。
【０２５１】
細胞塊は、人工的に形成された細胞の集団であり、一定の細胞種、細胞数、形状及び構成を有する。本発明の細胞塊を構成する細胞数は特に限定されないが、複数の細胞種からなる細胞塊を形成する観点からは、好ましくは３０個以上、より好ましくは５００個以上である。本発明の細胞塊の形状は特に限定されず、球状、楕円状、シート状であってもよいが、好ましくは球状である。本発明の細胞塊は、好ましくは上記の本発明の製造方法により製造することができる。
【０２５２】
以下、本発明に係る細胞塊を図１を適宜用いて説明する。本発明に係る細胞塊の一形態を図１のＡ〜Ｅに示す。細胞塊は非神経上皮組織部と、神経組織部とを含む。神経組織部の少なくとも一部は非神経上皮組織部に覆われている。神経組織部の表面は、好ましくは３割以上、より好ましくは６割以上、さらに好ましくは８割以上、最も好ましくは全体が非神経上皮組織部に覆われている。非神経上皮組織部と神経組織部の間の少なくとも一部に間隙が形成されていてもよい。非神経上皮組織部は、嗅神経細胞又は嗅神経前駆細胞を含む。神経組織部は中枢神経系を構成する神経系細胞又はその前駆細胞を含み、網膜を構成する神経系細胞又はその前駆細胞を含んでもよい。
【０２５３】
＜嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む非神経上皮組織部＞
本発明の細胞塊は、非神経上皮組織部を含む。非神経上皮組織部は、上皮構造を有する組織であって、神経上皮組織を含まないものをいう。上皮構造とは細胞同士が細胞間結合によりつながれており、層を形成している構造をいう。層は単層であってもよいし、多層であってもよいが、好ましくは２層以上５層以下であり、より好ましくは３層以上４層以下である。また、上皮構造の一部が多層であってもよい。本発明の細胞塊に係る非神経上皮組織部は、非神経上皮組織部のうち、好ましくは５割以上９割以下、より好ましくは８割以上１０割以下、最も好ましくは全体が上皮構造を有する。非神経上皮組織部は、細胞外基質を含んでいてもよい。
【０２５４】
非神経上皮組織部は、嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む。嗅神経細胞又はその前駆細胞は、神経系細胞のマーカーであるＴｕｊ１、ＮＣＡＭ、Ｎ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎからなる群より選ばれる少なくとも１つと、非神経系細胞のマーカーであるＥｐＣＡＭ、Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、サイトケラチンからなる群より選ばれる少なくとも１つとを同時に発現している細胞と定義することができ、嗅神経細胞又はその前駆細胞で特異的に発現する転写因子であるＥｂｆ１、Ｅｂｆ２、Ｅｂｆ３、ＮｅｕｒｏＤ、Ｌｈｘ２、Ａｓｃｌ１からなる群より選ばれる少なくとも１つをさらに発現していることが好ましい。非神経上皮組織部に含まれる嗅神経細胞は、好ましくは嗅覚受容体を発現しており、より好ましくは生体内の嗅上皮に局在する嗅神経細胞と同様に嗅覚情報を受容し、中枢神経系へ情報を伝達することができる。嗅神経細胞の前駆細胞とは、成熟すると嗅神経細胞となる細胞を指し、嗅神経細胞への分化能を有する細胞も含む。嗅神経細胞の前駆細胞は、好ましくは嗅上皮プラコードに存在する神経細胞と同様の性質を示す。非神経上皮組織部を構成する細胞のうち、好ましくは１％以上、より好ましくは５％以上、さらに好ましくは１０％以上５０％以下の細胞が嗅神経細胞又はその前駆細胞である。
【０２５５】
非神経上皮組織部は、基底膜様構造をさらに含むことが好ましく、基底膜様構造は非神経上皮組織部と神経組織部との間に形成されていることがより好ましく、基底膜様構造上に非神経上皮組織部に含まれる細胞が接着していることがさらに好ましい。基底膜様構造とは細胞外マトリックスより構成される薄い膜状の構造を指し、ラミニンの免疫染色によって判断することができる。基底膜様構造は、好ましくは生体内の基底膜と同様に非神経上皮組織部の構造の維持、非神経上皮組織部と神経組織部との機械的な分離、物質の選択的透過等に寄与する。
【０２５６】
非神経上皮組織部は、好ましくは多列上皮又は重層上皮を形成しており、より好ましくは多列上皮を形成している。多列上皮とは細胞が基底膜様構造上で複数の層を形成しているが、すべての細胞は突起を伸ばして基底膜様構造に接触している上皮構造であり、偽重層上皮とも称される。重層上皮とは、細胞が基底膜様構造上で複数の層を形成している上皮構造をいう。非神経上皮組織部の一部が多列上皮又は重層上皮を形成していてもよいし、全体が多列上皮又は重層上皮を形成していてもよい。
【０２５７】
非神経上皮組織部は、嗅上皮様組織を含み、嗅神経細胞又はその前駆細胞は嗅上皮様組織に含まれることが好ましい。嗅上皮様組織は嗅上皮又はその前駆組織（嗅上皮プラコード）で発現するＳｉｘ１、Ｓｐ８、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｄｌｘ５、Ｅｍｘ２、Ｐａｘ６、Ｏｔｘ２、ＰＤＧＦＲβ、サイトケラチン、ＥｐＣＡＭ、Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ及びＮ−Ｃａｄｈｅｒｉｎからなる群より選ばれる少なくとも１つを発現している領域を指し、Ｏｔｘ２、Ｓｐ８、Ｓｏｘ２、ＥｐＣＡＭ、Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ及びサイトケラチンを発現していることが好ましい。
【０２５８】
嗅上皮様組織は、支持細胞、基底細胞及びボーマン腺細胞、並びにこれらの前駆細胞からなる群より選ばれる少なくとも２種の細胞をさらに含むことが好ましく、基底細胞又はその前駆細胞を含むことがより好ましい。支持細胞又はその前駆細胞は、ＨＩＦ２α、Ｓｏｘ２、Ｈｅｓ１、Ｈｅｓ５及びＳｉｘ１からなる群より選ばれる少なくとも１つを発現している細胞を指す。基底細胞又はその前駆細胞は、ｐ６３、Ｗｔ１及びＬｇｒ５からなる群より選ばれる少なくとも１つを発現している細胞を指す。ボーマン腺細胞又はその前駆細胞は、サイトケラチン及びＡｓｃｌ３からなる群より選ばれる少なくとも１つを発現している細胞を指す。
また、嗅上皮様組織は、嗅神経鞘細胞又はその前駆細胞をさらに含んでいることが好ましい。嗅神経鞘細胞又はその前駆細胞はＳ１００、Ｓｏｘ１０及びビメンチンからなる群より選ばれる少なくとも１つを発現している細胞を指す。嗅神経鞘細胞又はその前駆細胞のマーカーとして、例えばＢｒａｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ２２２．４（２０１７）：１８７７−１８９５．に記載のマーカーを用いることもできる。
支持細胞、基底細胞、ボーマン腺細胞もしくは嗅神経鞘細胞又はこれらの前駆細胞は、好ましくは生体内の嗅上皮又は嗅上皮プラコードに存在する支持細胞、基底細胞、ボーマン腺細胞もしくは嗅神経鞘細胞又はこれらの前駆細胞と同様の性質を示す。
【０２５９】
嗅上皮様組織は、好ましくは基底膜様構造を含み、より好ましくは多列上皮構造又は重層上皮構造を形成している。嗅上皮様組織は、神経組織部に対向している基底面と、基底面とは反対側に位置する頂端面とを有し、基底面は嗅神経前駆細胞及び基底細胞を含み、頂端面は支持細胞及び嗅神経細胞を含むことが好ましい。基底面（又は嗅神経前駆細胞）はラミニン陽性の非細胞性の構造である基底膜に接していることが好ましい。頂端面に存在する細胞はＰＫＣζを発現していることが好ましい。
【０２６０】
本発明に係る細胞塊の一形態の非神経上皮組織部を拡大した様子を図１のＢに示す。図１のＢを参照して、非神経上皮組織部は、好ましくは神経組織部に対向する基底面と、基底面とは反対側に位置する頂端面とを有する。基底面には、好ましくは嗅神経細胞の前駆細胞（嗅神経前駆細胞）が存在する。
【０２６１】
嗅上皮様組織は、嗅上皮内側部と、前記嗅上皮内側部の周囲に設けられた嗅上皮周縁部とを含み、Ｌａｔｅｒａｌ−Ｍｅｄｉａｌの領域化が生じていることが好ましい。嗅上皮様組織は、嗅上皮内側部及び嗅上皮周縁部からなってもよい。嗅上皮内側部は、Ｓｏｘ２、Ｔｕｊ１及びＡｓｃｌ１からなる群より選ばれる少なくとも１つを発現している細胞が局在している領域を指す。嗅上皮周縁部は、Ｐｂｘ、Ｍｅｉｓ１、Ｐａｘ６、βＩＶｔｕｂｕｌｉｎからなる群より選ばれる少なくとも１つ、好ましくはＰａｘ６及びＰｂｘを発現している細胞が局在している領域を指す。
【０２６２】
非神経上皮組織部は、嗅上皮様組織以外の非神経上皮組織を含んでいてもよい。非神経上皮組織は、嗅神経細胞又はその前駆細胞を含まず、サイトケラチン、Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ及びＥｐＣＡＭからなる群より選ばれる少なくとも１つを発現し、Ｅｂｆ１、Ｅｂｆ２、Ｅｂｆ３、ＮｅｕｒｏＤ、Ｌｈｘ２、Ａｓｃｌ１を発現していない領域を指す。非神経上皮組織は、呼吸器上皮及び角膜細胞、並びにこれらの前駆細胞細胞を含むことが好ましい。
【０２６３】
本発明に係る細胞塊の一形態を図１のＣに示す。図１のＣを参照して、細胞塊は、神経組織部の全体が非神経上皮組織部に覆われており、非神経上皮組織部の一部に嗅上皮様組織が形成されていてもよい。嗅上皮様組織は、嗅上皮内側部と、前記嗅上皮内側部の周囲に設けられた嗅上皮周縁部とを含んでもよい。非神経上皮組織部で覆われた細胞塊の表面の６０％以上８０％以下が嗅上皮内側部であってもよい。嗅上皮様組織及び非神経上皮組織の構造、大きさ及び位置関係等は特に限定されない。嗅上皮様組織と非神経上皮組織部との間に間隙が形成されていてもよい。また、図１のＤに示すように、神経組織部の一部が非神経上皮組織部に覆われていてもよい。
【０２６４】
＜神経系細胞又はその前駆細胞を含む神経組織部＞
本発明の細胞塊は神経組織部を含む。神経組織部は神経系細胞又はその前駆細胞を含む。神経系細胞又はその前駆細胞は、中枢神経系を構成する神経系細胞又はその前駆細胞を含む。中枢神経系を構成する神経系細胞又はその前駆細胞は、Ｐａｘ６、Ｂｆ１、Ｓｐ８、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｅｍｘ２、Ｔｕｊ１、Ｎ−Ｃａｄｈｅｒｉｎからなる群より選ばれる少なくとも１つを発現し、かつサイトケラチンを発現していない細胞と定義することができ、Ｐａｘ６、Ｓｏｘ２及びＴｕｊ１を発現していることが好ましい。中枢神経系を構成する神経系細胞又はその前駆細胞は、好ましくは生体内の中枢神経系における神経細胞、グリア細胞、神経幹細胞等又はこれらの前駆細胞と同様の性質を示す。
【０２６５】
神経組織部は、上皮構造を形成していてもよい。本発明に係る細胞塊の一形態を図１のＥに示す。神経組織部は非神経上皮組織部に覆われており、神経組織部は上皮構造を形成している。上皮構造は、神経組織部の一部に形成されていてもよいし、全体に形成されていてもよい。非神経上皮組織部と神経組織部の間の少なくとも一部に間隙が形成されていてもよい。
【０２６６】
神経系細胞又はその前駆細胞は、好ましくは網膜を構成する神経系細胞又はその前駆細胞を含む。網膜を構成する神経系細胞又はその前駆細胞はＲａｘ、Ｓｉｘ３、Ｃｈｘ１０、Ｐａｘ６、Ｌｈｘ２、Ａｌｄｈ１ａ３からなる群より選ばれる少なくとも１つを発現している細胞と定義することができ、Ｒａｘ及びＣｈｘ１０を発現していることが好ましい。網膜を構成する神経系細胞又はその前駆細胞は、好ましくは生体内の網膜細胞、網膜前駆細胞、網膜特異的神経細胞等又はこれらの前駆細胞と同様の性質を示す。
【０２６７】
中枢神経系は大脳を含むことが好ましい。大脳（大脳を構成している細胞を含む）は、Ｅｍｘファミリー遺伝子、Ｏｔｘ２、Ｂｆ１及びＰａｘ６からなる群より選ばれる少なくとも１つを発現している組織を指す。また、大脳は層構造を有していることが好ましい。
大脳は、嗅皮質を含むことが好ましい。嗅皮質は、Ｔｂｒ１、Ｃｔｉｐ２及びＦｏｘＰ２からなる群より選ばれる少なくとも１つを発現している組織を指す。
大脳は、大脳基底核又はその原基を含むことが好ましい。大脳基底核又はその原基はＤｌｘファミリー遺伝子、Ｇｓｈ２、Ｎｋｘ２．１及びＩｓｌｅｔ１からなる群より選ばれる少なくとも１つを発現している組織を指す。
大脳基底核又はその原基は外側基底核原基であることが好ましい。外側基底核原基はＥｒ８１及びＩｓｌｅｔ１からなる群より選ばれる少なくとも１つを発現している組織を指す。
大脳は、嗅球又はその前駆組織を含むことが好ましい。嗅球又はその前駆組織はＡｒｘ、Ｔｂｒ１及びＴｂｘ２１からなる群より選ばれる少なくとも１つを発現している組織を指す。
【０２６８】
細胞塊は、性腺刺激ホルモン放出ホルモン陽性神経細胞を含むことが好ましい。性腺刺激ホルモン放出ホルモン陽性神経細胞は、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）を発現している細胞及びその前駆細胞を指す。
【０２６９】
生体の鼻腔組織と異なり、本発明の細胞塊には通常骨組織は形成されないが、細胞塊中に骨組織を含んでいてもよい。骨組織、骨細胞又はその前駆細胞はＲｕｎｘ２、Ｏｓｔｅｒｉｘ及びＡＴＦからなる群より選ばれる少なくとも１つを発現していることが好ましい。形成された細胞塊中に骨組織が形成されているか否かは、当業者に周知の方法、例えばアリザリンレッド染色、アルカリホスファターゼ染色、又は上記骨組織特異的遺伝子に対する免疫染色等の手法により判別できる。
【０２７０】
製造された細胞塊中に含まれる細胞及び組織を検出する手法については特に限定されないが、信頼性と再現性が高く簡便に実施できる手法が好ましい。一例として顕微鏡による光学的な観察、各細胞又は組織マーカーに対する抗体を用いた免疫染色、マーカー遺伝子に対するリアルタイムＰＣＲ法等の遺伝子発現解析、嗅覚受容体作用物質を用いた機能アッセイ、マウス、ラット等への移植等が挙げられ、好ましくは上記記載のマーカーに対する抗体を用いた免疫染色である。
【０２７１】
免疫染色の結果の解釈は、当業者の目視による判別、あるいは撮影した画像に対する画像解析ソフト等を用いた定量的な解析等、当業者に周知の方法により行うことができる。免疫染色の結果の解釈に当たっては、例えば蛋白質核酸酵素Ｖｏｌ．５４  Ｎｏ．２（２００９）Ｐ１８５−１９２等を参照し、自家蛍光、二次抗体の非特異的吸着、多重染色時の蛍光の漏れこみ等により生じる偽陽性を排除せねばならない。本発明において、タンパク質の発現の有無は、後述の予備実験１に示す方法に従って判断した。
【０２７２】
［４．嗅覚受容体作用物質評価用試薬としての使用方法］
本発明は、上述の「嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊」を用いた嗅覚受容体作用物質の評価方法を提供することができる。
嗅覚受容体作用物質の評価方法として、例えば上記細胞塊より調製した嗅神経細胞又は嗅上皮様組織と被験物質とを接触させる工程と、該被験物質が該細胞又は該組織に及ぼす影響を検定する工程とを含む嗅覚受容体作用物質の評価方法であり、評価対象の化合物に反応する特定の嗅覚受容体の同定方法である。本発明の嗅覚受容体作用物質評価の実施方法の一態様として、例えばＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ６，１９９３４（２０１６）に記載の方法を参考に実施することができる。
本発明の嗅覚受容体作用物質評価の実施方法の一態様は、下記工程（Ａ）〜（Ｄ）を含む、嗅覚受容体作用物質評価の実施方法である。
（Ａ）嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊から嗅覚受容体を発現している細胞を分取する工程、
（Ｂ）分取した嗅覚受容体を発現している細胞に被検物質を接触させる工程、
（Ｃ）被検物質との接触により活性化された細胞を同定する工程、
（Ｄ）被検物質との接触により活性化された細胞に発現している嗅覚受容体を同定する工程。
【０２７３】
＜工程（Ａ）＞
嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊から嗅覚受容体を発現している細胞を分取する工程について説明する。
【０２７４】
嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊において、嗅覚受容体を発現しているのは嗅神経細胞であるから、工程（Ａ）における分取方法は細胞塊より嗅神経細胞を分取できる方法であればよい。分取方法は細胞へ与えるダメージが少なく、目的外の細胞の混入が少ないことが望ましい。工程（Ａ）における分取方法の一態様として、組織を処理し単一細胞へと分散する工程を含んでいてもよい。上記分散方法として、例えばタンパク質分解酵素を用いた酵素処理による分散、カルシウムキレート剤処理による分散、機械的分散等が挙げられ、望ましくは酵素処理による分散である。分取方法の一態様として、細胞表面マーカーを用いて目的の細胞のみを精製、分取することもできる。上記目的の細胞の分取方法として、例えば嗅神経細胞特異的細胞表面マーカーに対する抗体を用いた蛍光活性化セルソーティング（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ：ＦＡＣＳ）、磁気細胞分離（ＭＡＣＳ）が挙げられる。嗅神経細胞特異的細胞表面マーカーとして、例えばＯＣＡＭが挙げられる。あるいはＰｌｏＳ  ｏｎｅ，１０（１），ｅ０１１３１７０等を参考に嗅神経細胞の細胞膜に発現しているタンパク質、糖鎖、脂質等をマーカーにすることもできる。分取した細胞は、通常の細胞培養に用いる培地中で培養することができる。その際に、細胞死を抑制するために、増殖因子及び細胞保護剤を添加することもできる。
【０２７５】
また、細胞塊から嗅上皮様組織を分離して評価に用いることもできる。上述の細胞塊からは、顕微鏡観察下でピンセット等を用い、細胞塊の外側に形成される嗅上皮様組織を剥離・回収することができる。嗅上皮様組織は、例えばＮａｔｕｒｅ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２０１６，７．に記載されているように、得られた細胞塊の表層にある半透明な薄い上皮として判別することができる。嗅上皮様組織の回収方法として、凍結融解、好ましくは緩慢凍結法を用いることもできる。当該方法は、外側に嗅上皮様組織及び内側に神経上皮組織を有する細胞塊を凍結融解することで物理的処理を施すことなく外側の嗅上皮様組織が細胞塊から剥離されるというものである。
【０２７６】
＜工程（Ｂ）＞
分取した嗅覚受容体を発現している細胞又は組織に被検物質を接触させる工程について説明する。
【０２７７】
工程（Ｂ）で被検物質と接触させる細胞又は組織は、浮遊状態、接着状態のいずれでもよいが、嗅神経細胞の生存率を高め、後の工程の洗浄等の作業を行いやすくする観点から、接着状態の細胞が好ましい。細胞を接着させる培養器材として平面の細胞培養ディッシュ、あるいはＴｒａｎｓｗｅｌｌ等の薄膜状の細胞培養器材のいずれの形態でも用いることができる。これら細胞培養ディッシュもしくは細胞培養器材は、細胞の接着を促進するためにラミニン等の細胞外基質、ポリ−Ｄ−リジン等の合成基質等でコーティングされていてもよい。
工程（Ｂ）で用いる被験物質は原体のまま、あるいは溶媒で希釈して用いることもできる。その際に用いる希釈に用いる溶媒としては、試験結果に影響を与えないものが好ましく、例えば生理食塩水、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）、Ｈａｎｋｓ’  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）、ＤＭＥＭ等の細胞培養用の培地を用いることができる。被験物質が培養液に不溶で、かつ良好な懸濁性が得られない場合には、必要に応じてＤＭＳＯ、エタノール、ミネラルオイル等を可溶化溶媒として用いることができる。
【０２７８】
工程（Ｂ）における被験物質の曝露条件における培養温度、ＣＯ２濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約３０℃から約４０℃、好ましくは約３７℃である。またＣＯ２濃度は、例えば約１％から約１０％、好ましくは約５％である。工程（Ｂ）における被験物質の曝露期間についても適宜設定できる。曝露期間は、例えば３０秒から２日間であり、好ましくは１分間から１日間である。
【０２７９】
＜工程（Ｃ）＞
被検物質との接触により活性化された細胞を同定する工程について説明する。
【０２８０】
工程（Ｃ）で実施する手法は、被検物質との接触により活性化された細胞を同定できる限り限定はされないが、簡便で低コストに大量の検体を一度に処理できる手法が好ましい。一例として、膜電位の変化を検出する手法、遺伝子発現の変化を検出する手法、細胞内イオン濃度の変化を検出する手法等が挙げられ、好ましくはＦｌｕｏ４  ＡＭ等のカルシウム指示薬を用いた細胞内イオン濃度の変化を検出する手法である。
【０２８１】
＜工程（Ｄ）＞
被検物質との接触により活性化された細胞に発現している嗅覚受容体を同定する工程について説明する。
【０２８２】
工程（Ｄ）で実施する手法は、活性化された細胞に発現している嗅覚受容体を同定できる限り限定はされないが、簡便で低コストに大量の検体を一度に処理できる手法が好ましい。一例として、シングルセルＲＮＡシークエンス法が挙げられる。
【０２８３】
［５．嗅覚受容体作用物質の評価用キット又は嗅覚受容体のスクリーニングキット］
本発明は、上述の「４．嗅覚受容体作用物質評価用試薬としての使用方法」を実施するための嗅覚受容体作用物質の評価用キット又は嗅覚受容体のスクリーニングキットを提供することができる。
本試薬又はキットには、本発明の細胞塊、又は上述の工程（Ａ）等によって細胞塊から分取された嗅神経細胞もしくは嗅上皮様組織と、上述の工程（Ｂ）〜（Ｄ）を行うために用いられる試薬、培養液、培養容器、解析プログラムの少なくとも１つとを含み、好ましくはポジティブコントロール若しくはネガティブコントロールとして用いられる試薬、又は被検物質との接触により活性化された細胞を同定する試薬を含む。本キットには、さらにスクリーニングの手順を記載した書面や説明書が含まれていてもよい。
本発明は、上述の「４．嗅覚受容体作用物質評価用試薬としての使用方法」又は「５．嗅覚受容体作用物質の評価用キット又は嗅覚受容体のスクリーニングキット」と同様に、細胞塊に含まれる神経細胞又は神経組織を被検物質と接触させて、神経毒性又は薬効を評価する方法及びキットを提供することができる。
【０２８４】
［６．治療薬及び疾患の治療方法］
本発明は、上記細胞塊又は上記細胞塊に含まれる細胞若しくは組織を含む、神経組織の障害又は感覚器の障害、好ましくは嗅覚系の障害に基づく疾患の治療薬を提供することができる。神経組織の障害としては、中枢神経系の障害、例えば脊髄損傷、脳損傷、又は神経変性疾患等が挙げられる。脳損傷としては、例えば出血性発作、虚血性発作、脳症による脳損傷、外傷性脳損傷、脳梗塞や脳出血による脳損傷等が挙げられる。神経変性疾患としては、例えばアルツハイマー病、多発性硬化症（ＭＳ）、末梢神経障害、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病等が挙げられる。これらの疾患は、非ヒト動物の疾患であってもよい。嗅上皮に存在する細胞（嗅神経細胞及びその前駆細胞を含む）は、他の神経組織由来の細胞よりも再生能力が高いため、神経損傷の治療薬として優れている。
【０２８５】
治療薬としては、例えば本発明の細胞塊又は細胞塊に含まれる細胞若しくは組織を含む懸濁液、並びにこれらを含む移植片（移植用担体）が挙げられる。懸濁液としては、例えば細胞塊を人工涙液または生理食塩水に懸濁した液が挙げられる。懸濁液は、細胞塊から単離された非神経上皮細胞を含んでいてもよく、細胞の接着を促進する因子、例えば細胞外基質やヒアルロン酸等を含んでいてもよい。
【０２８６】
さらに、本発明の細胞塊に含まれる細胞又は組織を、治療上必要とされる有効量、移植を必要とする対象に移植する工程を含む、疾患の治療方法が提供され得る。治療上有効な細胞量の移植により、神経組織が回復し、典型的には、疾患に関連する症状が軽減され得る。
【実施例】
【０２８７】
以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。また、使用する試薬及び材料は特に限定されない限り商業的に入手可能である。【０２８８】
［予備実験１：免疫染色結果の定量化と判断基準］
蛍光免疫染色標本の陽性・陰性の判別のための蛍光強度の定量化を行った。染色強度の定量化手法としては、後述する試験例２において作製した培養２８日目の細胞塊の凍結切片の抗Ｌｈｘ２抗体による蛍光免疫染色結果の撮影像（図２の上段）（最大励起波長４９０ｎｍ、最大蛍光波長５２５ｎｍ）に対し、線分Ａ−Ａ’で示す関心領域の線形の蛍光強度プロファイルを出力し、組織の凍結切片がある領域と組織の存在しない領域の蛍光強度を比較した。図２の下段に示した解析結果では、組織の存在しない領域の蛍光強度が２１９であり、目視で陽性と判別された蛍光強度の強い領域の数値は４０５３．３３３、上記よりも蛍光強度の弱い陽性領域の数値は２０４３．６６７であった。よって、図２の下段のグラフに破線で示す通り、明視野中で組織が存在しないと確認した領域の蛍光強度の平均値に対し、５倍以上高い数値を示した所を陽性とすることにより、抗原の染色結果の陽性又は陰性の判別を定量的に行えることが分かった。以下の実験は、本予備実験と同様の方法によって発現の陽性又は陰性の判断を行った。【０２８９】
［比較実験１：神経組織を含む細胞凝集体の作製］
図３の上段に示す手順に従って、多能性幹細胞をＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、細胞凝集体を作製した。ヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ−１株、京都大学より入手）を、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，４，３５９４（２０１４）に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（ＡＫ０２Ｎ、味の素社製）、フィーダーフリー足場にはＬａｍｉｎｉｎ５１１−Ｅ８（ニッピ社製）を用いた。【０２９０】
具体的な維持培養操作としては、まずサブコンフレントになったヒトＥＳ細胞を、ＰＢＳにて洗浄後、Ａｃｃｕｍａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて酵素処理を行った後、ＳｔｅｍＦｉｔ培地を添加し、セルスクレーパーを用いて培養ディッシュ表面より細胞を剥がし、ピペッティングにより単一細胞へ分散した。その後、単一細胞へ分散されたヒトＥＳ細胞を、Ｌａｍｉｎｉｎ５１１−Ｅ８にてコートしたプラスチック培養ディッシュに播種し、Ｙ２７６３２（ＲＯＣＫ阻害物質、富士フィルム和光純薬株式会社製、１０μＭ）存在下、ＳｔｅｍＦｉｔ培地にてフィーダーフリー培養した。プラスチック培養ディッシュとして、６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、細胞培養用、培養面積９．５ｃｍ２）を用いた場合、単一細胞へ分散されたヒトＥＳ細胞の播種細胞数は１．２×１０４とした。播種した１日後に、Ｙ２７６３２を含まないＳｔｅｍＦｉｔ培地に全量培地交換した。以降、１日〜２日に１回、Ｙ２７６３２を含まないＳｔｅｍＦｉｔ培地にて全量培地交換した。播種後７日間、サブコンフレント（培養面積の６割が細胞に覆われる程度）になるまで培養した。【０２９１】
培養した細胞を分化誘導に用いる際には、播種した６日後にＳｔｅｍＦｉｔ培地の培地交換と同時にＳＢ−４３１５４２（ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害物質、富士フィルム和光純薬株式会社製、終濃度５μＭ）とＳＡＧ（Ｓｈｈシグナル経路作用物質、Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、終濃度３００ｎＭ）を添加して２４時間培養した（工程（ａ））。【０２９２】
調製したサブコンフレントのヒトＥＳ細胞を、ＰＢＳにて洗浄後、Ａｃｃｕｍａｘを用いて酵素処理を行った後、分化誘導用の無血清培地を添加しセルスクレーパーを用いて培養ディッシュ表面から細胞を剥がし、ピペッティングにより単一細胞へ分散した。
その後、単一細胞に分散されたヒトＥＳ細胞を非細胞接着性の９６ウェル培養プレート（ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ  ９６Ｖ底プレート、ＭＳ−９０９６Ｖ、住友ベークライト株式会社製）に、１ウェルあたり１．２×１０４細胞になるように１００μｌの無血清培地に浮遊させ、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で浮遊培養した。その際の無血清培地（ｇｆＣＤＭ＋ＫＳＲ）には、Ｆ−１２＋Ｇｌｕｔａｍａｘ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）とＩＭＤＭ＋Ｇｌｕｔａｍａｘ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）の体積比１：１混合液に５％  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、４５０μＭ  １−モノチオグリセロール（富士フィルム和光純薬株式会社社製）、１ｘ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｌｉｐｉｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、５０ｕｎｉｔ／ｍｌペニシリン−５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ナカライテスク株式会社製）を添加した無血清培地を用いた。【０２９３】
浮遊培養開始時（浮遊培養開始後０日目、工程（１）開始）に、上記無血清培地にＹ２７６３２（終濃度２０μＭ）、ＩＷＰ−２（第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質、Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、終濃度２μＭ）、ＳＢ−４３１５４２（ＴＧＦシグナル伝達経路阻害物質、富士フィルム和光純薬株式会社製、終濃度１μＭ）を添加した。【０２９４】
その後、浮遊培養開始後３日目にＹ２７６３２を含まず、ＩＷＰ−２及びＳＢ−４３１５４２（ＳＢ４３１とも略記する）を含む無血清培地を１ウェルあたり１００μｌ加えた。その後、浮遊培養開始後６、１０、１３、１７、２１、２４日目にＹ２７６３２を含まず、ＩＷＰ−２とＳＢ−４３１５４２とを含む無血清培地を用いて半量培地交換を行った。【０２９５】
浮遊培養開始後２８日目に凝集体をディッシュに回収し、倒立顕微鏡（株式会社キーエンス製、ＢＩＯＲＥＶＯ）を用いて、明視野観察を行った（図３のＡ）。その結果、上記分化誘導法によりヒト多能性幹細胞の凝集体が形成された。【０２９６】
浮遊培養開始後２８日目の細胞凝集体を、先端口径が太い２００μｌチップで培養用チューブに回収し、ＰＢＳで２回洗浄作業を行った後、４％パラホルムアルデヒド・りん酸緩衝液（富士フィルム和光純薬株式会社社製）で室温１５分固定した。固定後の細胞凝集体をＰＢＳで３回洗浄した後、２０％スクロース／ＰＢＳに４℃で一晩浸漬し凍結保護処理を行った。凍結保護処理後の凝集体をクリオモルド＜３号＞（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ社製）に移し、細胞凝集体の周囲の余分な２０％スクロース／ＰＢＳをマイクロピペッターで除いた後にＯ．Ｃ．Ｔコンパウンド（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ社製）に包埋し、ドライアイスで冷却したアルミヒートブロック上で急速凍結し、凍結切片作製用のブロックを作製した。上記凝集体を包埋したブロックからライカＣＭ１９５０クライオスタット（Ｌｅｉｃａ社製）により１０μｍ厚の凍結切片を作製し、プラチナプロコートスライドグラス（松浪硝子工業株式会社製）に張り付けた。スライドグラス上の凍結切片の周囲をウルトラパップペン（株式会社バイオメディカルサイエンス製）で囲んだ後、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００／ＴＢＳで室温１０分間透過処理し、続けてブロッキング試薬Ｎ−１０２（日油株式会社製）とＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ  （ＴＢＳ）  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）の体積比１：４混合液で室温３０分間ブロッキング処理を行った。【０２９７】
ブロッキング処理後の凍結切片に関し、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｉｌｕｅｎｔ  ＯＰ  Ｑｕａｎｔｏ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で希釈した一次抗体をスライドグラス１枚あたり３００μｌ添加し、湿箱中にて４℃で一晩反応させた。一次抗体処理後の凍結切片を０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０／ＴＢＳで室温１０分間処理する洗浄操作を３回行った後に、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｏｎｅ  Ｈｉｓｔｏ（ナカライテスク株式会社製）と０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００／ＴＢＳを体積比１：１９の割合で混合した緩衝液で二次抗体を希釈し、希釈液をスライドグラス１枚あたり３００μｌ凍結切片に添加し、室温で１時間反応させた。二次抗体処理後の凍結切片を０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０／ＴＢＳで室温１０分間処理する洗浄操作を３回行った後に、純水で凍結切片を一回洗浄し、その後、ＮＥＯカバーグラス（松浪硝子工業株式会社製）とスライドグラス１枚当たり３０μｌのＰｒｏｌｏｎｇ  Ｄｉａｍｏｎｄ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて凍結切片を封入した。上記封入後の標本を室温の暗所で一晩静置してＰｒｏｌｏｎｇ  Ｄｉａｍｏｎｄを固化させたのち、透明のマニキュアでカバーグラスの周囲をコーティングし室温の暗所で風乾後、蛍光顕微鏡による観察を行った。標本の観察及び画像の取得には正立蛍光顕微鏡Ａｘｉｏ  Ｉｍａｇｅｒ  Ｍ２（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社製）及び附属ソフトウェアのＡｘｉｏ  Ｖｉｓｉｏｎを用いた。【０２９８】
一次抗体としては、表１に記載された、プラコード及び中枢神経系の細胞を染色する抗Ｄｌｘ５抗体、中枢神経系の細胞を染色する抗Ｓｏｘ１抗体、プラコードを含む非神経組織を染色する汎サイトケラチン（ＰａｎＣＫ）抗体、神経細胞を染色する抗Ｔｕｊ１抗体を用いた。蛍光標識二次抗体としては、表２に記載のＡｌｅｘａ４８８標識ロバ抗ウサギ抗体、ＣＦ５５５標識ロバ抗ヤギ抗体、ＣＦ５５５標識ロバ抗マウス抗体、Ａｌｅｘａ６４７標識ロバ抗マウス抗体を用いて多重染色を行い、核の対比染色には１μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を二次抗体希釈液中に添加した。【０２９９】
染色結果を図３に示す。細胞凝集体にはＳｏｘ１及びＤｌｘ５を発現する中枢神経系の細胞が含まれていた（図３のＢ、Ｃ）。また、細胞凝集体の表面に汎サイトケラチン陽性の組織が確認できず、細胞凝集体がＴｕｊ１陽性であることから、非神経上皮組織を含まず、中枢神経系の細胞のみからなる細胞凝集体が形成されたことが分かった（図３のＤ、Ｆ）。染色結果から想定される細胞凝集体の模式図を図３のＨに示す。【０３００】
［比較実験２：神経組織及び非神経上皮組織を含む細胞凝集体の作製］
比較実験１にＢＭＰシグナル伝達経路作用物質存在下で培養する工程（工程（２））を追加し、図４の上段に示す手順に従って、細胞凝集体を作製した。まず、ヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ−１株）を、比較実験１と同様の操作で維持培養及び工程（ａ）を行った後、Ｙ２７６３２（終濃度２０μＭ）、ＩＷＰ−２（終濃度２μＭ）及びＳＢ−４３１５４２（終濃度１μＭ）存在下で浮遊培養を開始した（浮遊培養開始後０日目、工程（１）開始）。【０３０１】
浮遊培養開始後２日目にＹ２７６３２を含まず、ＩＷＰ−２、ＳＢ−４３１５４２及びＢＭＰ４（ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を含む無血清培地を１ウェルあたり１００μｌ加えた（工程（２）開始）。ＢＭＰ４は添加する培地に３ｎＭ添加し、ウェル中の終濃度が１．５ｎＭとなるようにした。その後、浮遊培養開始後６、１０、１３、１７、２１、２４日目にＹ２７６３２とＢＭＰ４を含まず、ＩＷＰ−２とＳＢ−４３１５４２とを含む無血清培地を用いて半量培地交換を行った。【０３０２】
浮遊培養開始後２８日目に細胞凝集体をディッシュに回収し、倒立顕微鏡を用いて、明視野観察を行った（図４のＡ）。その結果、上記分化誘導法によりヒトＥＳ細胞から神経組織及び非神経上皮組織を含む凝集体が形成され、さらに浮遊培養２１日目から２８日目にかけて外側の非神経上皮組織が急速に膨張し、内側の神経組織との間に空間が形成されることが分かった。【０３０３】
比較実験１と同様の方法に従って、浮遊培養開始後２８日目の細胞凝集体を蛍光免疫染色を行った。一次抗体としては、表１に記載された、神経細胞を染色する抗Ｔｕｊ１抗体、プラコード及び中枢神経系を染色する抗Ｓｏｘ２抗体、プラコードを含む非神経上皮組織を染色する抗ＰａｎＣＫ抗体、抗Ｓｉｘ１抗体及び抗ＥｐＣＡＭ抗体、嗅上皮プラコード及び中枢神経系を染色する抗Ｓｐ８抗体、プラコード及び神経上皮組織を染色する抗Ｎ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体、網膜を含む中枢神経系並びにプラコード及び嗅上皮周縁部を染色する抗Ｐａｘ６抗体、網膜を染色する抗Ｃｈｘ１０抗体、水晶体プラコードを染色する抗Ｐｒｏｘ１抗体、抗Ｃ−Ｍａｆ抗体及び抗ＣｒｙｓｔａｌｌｉｎｅαＡ抗体、水晶体プラコード及び中枢神経系を染色する抗Ｓｏｘ１抗体を用いた。蛍光標識二次抗体としては、表２に記載のＡｌｅｘａ４８８標識ロバ抗ウサギ抗体、ＣＦ５５５標識ロバ抗マウス抗体、ＣＦ５５５標識ロバ抗ヤギ抗体、Ａｌｅｘａ６４７標識ロバ抗マウス抗体、Ａｌｅｘａ６４７標識ロバ抗ヤギ抗体を用いて多重染色を行い、核の対比染色にはＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いた。【０３０４】
染色結果を図４及び図５に示す。上記培養方法で製造された浮遊培養開始後２８日目の細胞凝集体の内側はＴｕｊ１、Ｎ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｐａｘ６、Ｃｈｘ１０陽性の神経網膜の上皮組織であり（図４のＢ、Ｈ、Ｋ、Ｌ）、外側はＥｐＣＡＭ、Ｓｉｘ１、汎サイトケラチン陽性の角膜又は眼表面外胚葉の非神経上皮組織であることが分かった（図４のＪ、Ｆ、Ｄ）。加えて、非神経上皮組織の一部が肥厚しており、肥厚部分はＣ−Ｍａｆ、Ｓｏｘ１、Ｐｒｏｘ１、Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  αＡ陽性（図５のＯ〜Ｕ）であることから、上記培養方法により細胞凝集体中に水晶体プラコードが形成されたことが分かった。また、Ｃｈｘ１０陽性の内側の網膜組織と汎サイトケラチン陽性の外側の非神経上皮組織との間に、汎サイトケラチン陽性で上皮を形成しない間葉系細胞が存在することが分かった（図４のＤ、Ｅ）。以上の染色結果から想定される細胞凝集体の模式図を図５のＶに示す。【０３０５】
［実験１：ＥＳ細胞から嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊の作製］
比較実験２に、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の存在下で培養する工程（３ｂ）を追加して、図６の上段に示す手順に従って、細胞塊を作製した。実験１では、浮遊培養開始から１３日目の細胞凝集体の観察を行った。【０３０６】
まず、ヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ−１株）を、比較実験１と同様の操作で維持培養及び工程（ａ）を行った後、Ｙ２７６３２（終濃度２０μＭ）、ＩＷＰ−２（終濃度２μＭ）及びＳＢ−４３１５４２（終濃度１μＭ）存在下で、ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ  ９６Ｖ底プレートを用いて浮遊培養を開始した（浮遊培養開始後０日目、工程（１）開始）。【０３０７】
浮遊培養開始後２日目にＹ２７６３２を含まず、ＩＷＰ−２、ＳＢ−４３１５４２、ＢＭＰ４を含む無血清培地を１ウェルあたり１００μｌ加えた（工程（２）開始）。ＢＭＰ４は添加する培地に３ｎＭ添加し、ウェル中の終濃度が１．５ｎＭとなるようにした。【０３０８】
さらに、浮遊培養開始後３日目にＹ２７６３２とＢＭＰ４を含まず、ＩＷＰ−２、ＳＢ−４３１５４２及びＫ０２２８８（ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質、ＡｄｏｏＱ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を含む無血清培地を用いて半量培地交換を行った（工程（３ｂ）開始）。Ｋ０２２８８は添加する培地に２０μＭ添加し、ウェル中の終濃度が１０μＭとなるようにした。その後、浮遊培養開始後６日目と１０日目にＹ２７６３２とＢＭＰ４を含まず、ＩＷＰ−２、ＳＢ−４３１５４２及びＫ０２２８８を含む無血清培地を用いて半量培地交換を行った。【０３０９】
浮遊培養開始後１３日目に倒立顕微鏡を用いて、明視野観察を行った（図６のＡ）。その結果、上記分化誘導法によりヒトＥＳ細胞から直径約６００μｍ前後の球状の細胞凝集体が形成されていた。【０３１０】
比較実験１と同様の方法に従って、浮遊培養開始後１３日目の細胞凝集体の蛍光免疫染色を行った。一次抗体としては、表１に記載された、プラコード及び非神経上皮組織を染色する抗Ｄｌｘ５抗体、抗Ｓｉｘ１抗体、抗汎サイトケラチン（ＰａｎＣＫ）抗体及び抗Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体、プラコード及び神経上皮組織を染色する抗Ｎ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体、プラコード及び神経系細胞を染色する抗Ｓｏｘ１抗体、抗Ｓｏｘ２抗体、抗Ｓｏｘ３抗体、抗Ｐａｘ６抗体及び抗Ｓｐ８抗体、胚発生の早期に外胚葉を染色する抗ＡＰ２α抗体、胚の前方領域を染色する抗Ｏｔｘ２抗体を用いた。蛍光標識二次抗体としては、比較実験２に記載の抗体を用いて多重染色を行い、核の対比染色にはＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いた。染色結果の陽性と陰性の判断は、予備実験１と同様に行った。【０３１１】
染色結果を図６及び図７に示す。上記分化誘導法で誘導された浮遊培養開始後１３日目の細胞凝集体の内側はＳｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｐ８、Ｎ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ陽性の中枢神経系の細胞又はその前駆細胞より構成される組織であり、外側はＤｌｘ５、Ｐａｘ６、ＡＰ２α、Ｓｉｘ１、Ｓｐ８、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、汎サイトケラチン、Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｎ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ陽性の非神経上皮組織又はプラコードであることが分かった（図６のＢ〜Ｌ、図７のＭ〜Ｒ）。外側に形成された上皮組織はほぼ単層であり、肥厚が見られないことから、培養１３日目では前プラコード領域及びプラコード前駆細胞の状態であることが分かった。また、いずれの細胞もＯｔｘ２陽性であることから、胚の前方領域が誘導されていることが分かった（図６のＪ）。内側のＳｏｘ１陽性の中枢神経系の細胞又はその前駆細胞と、外側に形成された汎サイトケラチン陽性の非神経上皮組織の間とに骨前駆細胞様の細胞は観察できなかった。上記培養方法により形成された細胞凝集体の模式図を図７のＳに示す。【０３１２】
［実験２：ＥＳ細胞から嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊の作製］
実験２では、実験１と同様の実験操作を行い、図８の上段に示すように、実験１よりも培養期間を延長して、嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊を作製した。実験１と同様に、工程（ａ）、工程（１）及び工程（２）を行った後、浮遊培養開始後３日目にＹ２７６３２とＢＭＰ４を含まず、ＩＷＰ−２、ＳＢ−４３１５４２、Ｋ０２２８８を含む無血清培地を用いて半量培地交換を行った（工程（３ｂ）開始）。その後、浮遊培養開始後６、１０、１３、１７、２１、２４日目にＹ２７６３２とＢＭＰを含まず、ＩＷＰ−２、ＳＢ−４３１５４２及びＫ０２２８８を含む無血清培地を用いて半量培地交換を行った。【０３１３】
浮遊培養開始後２８日目に倒立顕微鏡を用いて明視野観察を行った（図８のＡ）。その結果、実験１と同様にヒトＥＳ細胞から直径約６００μｍ前後の球状の細胞塊が形成されることが分かった。【０３１４】
比較実験１と同様の方法に従って、浮遊培養開始後２８日目の細胞塊の蛍光免疫染色を行った。一次抗体としては、表１に記載された、嗅上皮プラコードを染色する抗Ｄｌｘ５抗体、抗Ｓｉｘ１抗体、抗汎サイトケラチン（ＰａｎＣＫ）抗体、抗Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体及び抗Ｏｔｘ２抗体、嗅上皮周縁部を染色する抗Ｐａｘ６抗体及びＰｂｘ１／２／３／４、嗅上皮プラコード及び中枢神経系の細胞を染色する抗Ｎ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体、抗Ｓｏｘ２抗体、抗Ｓｐ８抗体及び抗Ｅｍｘ２抗体、嗅神経細胞及びその前駆細胞を染色する抗Ｅｂｆ１抗体、抗ＮＣＡＭ抗体、抗Ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ抗体及び抗ＮｅｕｒｏＤ抗体、中枢神経系の細胞を染色する抗Ｂｆ１抗体、中枢神経系の細胞及び嗅神経細胞を染色する抗Ｔｕｊ１抗体、神経網膜を染色する抗Ｃｈｘ１０抗体、神経網膜及び嗅神経細胞を染色する抗Ｌｈｘ２抗体を用いた。蛍光標識二次抗体としては比較実験２に記載の抗体を用いて多重染色を行い、核の対比染色にはＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いた。染色結果の陽性と陰性の判断は、予備実験１と同様に行った。【０３１５】
染色結果を図８及び図９に示す。浮遊培養開始２８日目には、外側がＥ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｎ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、汎サイトケラチン、Ｓｏｘ２、Ｓｉｘ１、Ｄｌｘ５、Ｓｐ８、Ｐａｘ６、Ｏｔｘ２陽性のプラコード様（嗅上皮様組織）の非神経上皮組織部、内側がＥ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、汎サイトケラチン陰性かつＮ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｓｏｘ２、Ｓｐ８、Ｂｆ１、Ｅｍｘ２、Ｔｕｊ１陽性の中枢神経系（大脳）を構成する神経系細胞又はその前駆細胞を含む神経組織部である細胞塊が形成された。また、外側のプラコード様の上皮組織（嗅上皮様組織）中の一部の細胞はＬｈｘ２、Ｅｂｆ２、Ｔｕｊ１、ＮＣＡＭ、Ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ陽性の嗅神経細胞又はその未成熟な前駆細胞であった。細胞塊の外側には、Ｐａｘ６陽性の嗅上皮周縁部が形成されていた。また、嗅上皮様組織の基底面には、ＮｅｕｒｏＤ陽性の細胞がみられた（図８Ｂ〜Ｍ、図９Ｎ〜ＡＩ）。以上より、多能性幹細胞を第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、得られた細胞凝集体をＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下で培養したのちに、さらにＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の存在下で培養することにより、１）嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む非神経上皮組織部、及び、２）神経系細胞又はその前駆細胞を含む神経組織部を含み、神経系細胞又はその前駆細胞は、中枢神経系を構成する神経系細胞又はその前駆細胞を含み、神経組織部の表面の少なくとも一部が非神経上皮組織部で被覆されている細胞塊を製造できることが分かった。また、非神経上皮組織部は嗅神経細胞又はその前駆細胞が存在する嗅上皮様組織を含み、嗅上皮様組織は、嗅上皮内側部と嗅上皮周縁部とを含んでいた。上記製造方法により形成された細胞塊の模式図を図１０に示す。【０３１６】
［実験３：ヒトｉＰＳ細胞から嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊の作製］
実験３では、図１１の上段に示すように、実験２で行ったＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の存在下での培養工程（３ｂ）の代わりに、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質であるＦＧＦ２の存在下での培養工程（３ａ）を行い、嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊を作製した。また、多能性幹細胞として、ヒトｉＰＳ細胞（ＨＣ−６＃１０株、理化学研究所より入手）を用いた。加えて、培養期間を２１日とした。特に示された操作以外は実験１と同様の操作を行った。【０３１７】
具体的には、維持培養されたヒトｉＰＳ細胞を用いて、工程（ａ）、工程（１）及び工程（２）を行った後、浮遊培養開始後３日目にＹ２７６３２とＢＭＰ４を含まず、ＩＷＰ−２、ＳＢ−４３１５４２、ＦＧＦ２及びＨｅｐａｒｉｎ  Ｓｏｄｉｕｍを含む無血清培地を用いて半量培地交換を行った（工程（３ａ）開始）。ＦＧＦ２（ＦＧＦシグナル経路作用物質、富士フィルム和光純薬株式会社製）とＨｅｐａｒｉｎ  Ｓｏｄｉｕｍ（富士フィルム和光純薬株式会社製）は添加する培地にそれぞれ４０ｎｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ添加し、ウェル中の終濃度が２０ｎｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌとなるようにした。その後、浮遊培養開始後６、１０、１３、１７日目にＹ２７６３２とＢＭＰ４を含まず、ＩＷＰ−２、ＳＢ−４３１５４２、ＦＧＦ２及びＨｅｐａｒｉｎ  Ｓｏｄｉｕｍを含む無血清培地を用いて半量培地交換を行った。【０３１８】
浮遊培養開始後２１日目に倒立顕微鏡を用いて明視野観察を行った（図１１のＡ、Ｂ）。その結果、実験１でヒトＥＳ細胞から形成された場合と同様に、ヒトｉＰＳ細胞から直径約６００μｍ前後の球状の細胞塊が形成されることが分かった。【０３１９】
比較実験１と同様の方法に従って、浮遊培養開始後２１日目の細胞塊の蛍光免疫染色を行った。一次抗体としては、表１に記載された、神経系の細胞を染色する抗Ｔｕｊ１抗体及び抗ＮＣＡＭ抗体、神経網膜及びその前駆細胞を染色する抗Ｃｈｘ１０抗体、プラコード及び非神経上皮組織を染色する抗Ｓｉｘ１抗体、抗汎サイトケラチン（ＰａｎＣＫ）抗体、抗Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体及び抗ＥｐＣＡＭ抗体、プラコード及び神経上皮組織を染色する抗Ｎ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体、プラコード及び神経系細胞を染色する抗Ｓｏｘ２抗体及び抗Ｐａｘ６抗体、嗅上皮プラコード及び中枢神経系細胞を染色する抗Ｓｐ８抗体、胚の前方領域を染色する抗Ｏｔｘ２抗体、嗅神経細胞及びその前駆細胞を染色する抗Ｅｂｆ１抗体及び抗Ｅｂｆ２抗体用いた。蛍光標識二次抗体として比較実験２に記載の抗体を用いて多重染色を行った。核の対比染色にはＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いた。染色結果の陽性と陰性の判断は、予備実験１と同様に行った。【０３２０】
染色結果を図１１及び図１２に示す。浮遊培養開始２１日目には、外側がＥ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｎ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、汎サイトケラチン、ＥｐＣＡＭ、Ｓｏｘ２、Ｓｉｘ１、Ｓｐ８陽性のプラコード様（嗅上皮様組織）の非神経上皮組織部、内側がＥ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、汎サイトケラチン、ＥｐＣＡＭ陰性かつＮ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＮＣＡＭ、Ｔｕｊ１、Ｃｈｘ１０陽性の神経網膜の神経上皮組織である細胞塊が形成された。Ｏｔｘ２陽性であることから、胚の前方領域の組織が形成されていることが分かった。また、外側のプラコード様の上皮組織（嗅上皮様組織）中の一部の細胞はＥｂｆ１、Ｅｂｆ２、Ｔｕｊ１、ＮＣＡＭ陽性の嗅神経細胞又はその未成熟な前駆細胞であった（図１１Ｃ〜Ｎ、図１２Ｏ〜Ｚ）。以上より、多能性幹細胞を第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、得られた細胞凝集体をＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下で培養したのちに、さらにＦＧＦシグナル伝達経路作用物質の存在下で培養することにより、１）嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む非神経上皮組織部、及び、２）神経系細胞又はその前駆細胞を含む神経組織部を含み、神経系細胞又はその前駆細胞は、中枢神経系を構成する神経系細胞又はその前駆細胞を含み、神経組織部の表面の少なくとも一部が前記非神経上皮組織部で被覆されている細胞塊が製造できることが分かった。また、細胞塊の内部の神経組織部は上皮構造を形成しており、神経系細胞又はその前駆細胞は網膜を構成する細胞を含んでいることが分かった。上記製造方法により形成された細胞塊の模式図を図１２のＡＡに示す。【０３２１】
［実験４：ヒトｉＰＳ細胞から嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊の作製］
実験４では、図１３の上段に示すように、工程（３）において、まずＦＧＦシグナル伝達経路作用物質の存在下で培養する工程（３ａ）の後に、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の存在下で培養する工程（３ｃ）を行い、嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊を作製した。培養期間は２８日とした。特に示された操作以外は実験３と同様の操作を行った。【０３２２】
具体的には、維持培養されたヒトｉＰＳ細胞を用いて、工程（ａ）、工程（１）及び工程（２）を行った後、浮遊培養開始後３日目にＹ２７６３２とＢＭＰ４を含まず、ＩＷＰ−２、ＳＢ−４３１５４２、ＦＧＦ２及びＨｅｐａｒｉｎ  Ｓｏｄｉｕｍを含む無血清培地を用いて半量培地交換を行った（工程（３ａ）開始）。ＦＧＦ２とＨｅｐａｒｉｎ  Ｓｏｄｉｕｍは添加する培地にそれぞれ４０ｎｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ添加し、ウェル中の終濃度が２０ｎｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌとなるようにした。その後、浮遊培養開始後６、１０日目にＹ２７６３２とＢＭＰ４を含まず、ＩＷＰ−２、ＳＢ−４３１５４２、ＦＧＦ２及びＨｅｐａｒｉｎ  Ｓｏｄｉｕｍを含む無血清培地を用いて半量培地交換を行った。さらに浮遊培養開始後１３日目に上記物質に加えＫ０２２８８を終濃度１μＭを含む培地で培養を開始し（工程（３ｃ）開始）、１７、２１、２４日目にＩＷＰ−２、ＳＢ−４３１５４２、ＦＧＦ２、Ｈｅｐａｒｉｎ  Ｓｏｄｉｕｍ及びＫ０２２８８を含む培地で半量培地交換を実施した。【０３２３】
浮遊培養開始後２８日目に倒立顕微鏡を用いて明視野観察を行った（図１３のＡ）。その結果、実験１でヒトＥＳ細胞から形成された場合と同様にヒトｉＰＳ細胞から直径約６００μｍ前後の球状の細胞塊が形成されることが分かった。【０３２４】
比較実験１と同様の方法に従って、浮遊培養開始後２８日目の細胞塊の蛍光免疫染色を行った。一次抗体としては、表１に記載された、Ｄｌｘ５、ＮｅｕｒｏＤ１、ＮＣＡＭ、ｐ６３、Ｓｏｘ２、Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｐａｘ６、Ｃｈｘ１０、Ｎ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｓｉｘ１、Ｓｐ８、ＥｐＣＡＭ、Ｔｕｊ１、Ｅｂｆ２、汎サイトケラチンに対する抗体を用いた。蛍光標識二次抗体として比較実験２に記載の抗体を用いて多重染色を行った。核の対比染色には、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いた。染色結果の陽性と陰性の判断は、予備実験１と同様に行った。【０３２５】
染色結果を図１３及び図１４に示す。浮遊培養開始２８日目には、外側がＥ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｎ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、汎サイトケラチン、ＥｐＣＡＭ、Ｓｏｘ２、Ｓｉｘ１、Ｓｐ８陽性のプラコード様（嗅上皮様組織）の非神経上皮組織部、内側がＥ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、汎サイトケラチン、ＥｐＣＡＭ陰性かつＮ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＮＣＡＭ、Ｔｕｊ１、Ｃｈｘ１０陽性の神経網膜の神経上皮組織である細胞塊が形成された。また、外側のプラコード様の上皮組織（嗅上皮様組織）中の一部の細胞はＮｅｕｒｏＤ１、Ｅｂｆ２、Ｔｕｊ１、ＮＣＡＭ陽性の嗅神経細胞又はその未成熟な前駆細胞であった（図１３Ｂ〜Ｍ、図１４Ｎ〜Ｕ）。以上より、多能性幹細胞を第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、得られた細胞凝集体をＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下で一定期間培養したのちに、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質の存在下で培養し、さらにＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の存在下で培養することにより、実験３と同様の細胞塊が製造できた。また、その細胞塊の内部の神経系細胞又はその前駆細胞は神経網膜の神経上皮組織を形成していた。さらに、実験３と比較したところ、浮遊培養開始１３日目からＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の両方の存在下で培養することにより、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質のみの存在下で培養した時よりも安定して嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む非神経上皮組織部が形成されることが分かった。上記製造法により形成された細胞塊の模式図を図１４のＶに示す。【０３２６】
［実験５：ヒトｉＰＳ細胞から嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞の塊の作製］
実験５では、図１５の上段に示すように、実験４の条件にさらに工程（３ｃ）においてＥＧＦシグナル伝達経路作用物質を添加して、ヒトｉＰＳ細胞から嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊を作製した。特に示された操作以外は実験３と同様の操作を行った。【０３２７】
具体的には、維持培養されたヒトｉＰＳ細胞を用いて、工程（ａ）を行った後、細胞を非細胞接着性の９６ウェル培養プレート（ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ  ９６Ｖ底プレート）に播種して、工程（１）、工程（２）及び工程（３ａ）を行った後、浮遊培養開始後１３日目に上記物質に加えＫ０２２８８を終濃度１μＭ、ヒト組み換えＥＧＦ（ＥＧＦシグナル伝達経路作用物質、ＰｒｉｍｅＧｅｎｅ社製）を終濃度２０ｎｇ／ｍｌで添加し（工程（３ｃ）開始）、１７、２１、２４日目にＩＷＰ−２、ＳＢ−４３１５４２、ＦＧＦ２、Ｈｅｐａｒｉｎ  Ｓｏｄｉｕｍ、Ｋ０２２８８及びＥＧＦを含む培地で半量培地交換を実施した。【０３２８】
浮遊培養開始後２８日目に倒立顕微鏡を用いて明視野観察を行った（図１５のＡ）。その結果、実験１でヒトＥＳ細胞から形成された場合と同様にヒトｉＰＳ細胞から直径約６００μｍ前後の球状の細胞塊が形成されることが分かった。【０３２９】
比較実験１と同様の方法に従って、浮遊培養開始後２８日目の細胞塊の蛍光免疫染色を行った。一次抗体としては、表１に記載されたＤｌｘ５、ＮｅｕｒｏＤ１、ＮＣＡＭ、ｐ６３、Ｓｏｘ２、Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｐａｘ６、Ｃｈｘ１０、Ｎ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｓｉｘ１、Ｓｐ８、ＥｐＣＡＭ、Ｔｕｊ１、Ｅｂｆ２、汎サイトケラチンに対する抗体を用いた。蛍光標識二次抗体として、比較実験２に記載の抗体を用いて多重染色を行い、核の対比染色には、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いた。染色結果の陽性と陰性の判断は、予備実験１と同様に行った。【０３３０】
染色結果を図１５及び図１６に示す。浮遊培養開始２８日目には、外側がＥ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｎ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、汎サイトケラチン、ＥｐＣＡＭ、Ｓｏｘ２、Ｓｉｘ１、Ｓｐ８陽性のプラコード様（嗅上皮様組織）の非神経上皮組織部、内側がＥ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、汎サイトケラチン、ＥｐＣＡＭ陰性かつＮ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＮＣＡＭ、Ｔｕｊ１、Ｃｈｘ１０陽性の神経網膜の神経上皮組織である細胞塊が形成された。また、外側のプラコード様の上皮組織（嗅上皮様組織）中の一部の細胞はＮｅｕｒｏＤ１、Ｅｂｆ２、Ｔｕｊ１、ＮＣＡＭ陽性の嗅神経細胞又はその未成熟な前駆細胞であった（図１５Ｂ〜Ｍ、図１６Ｎ〜Ｕ）。以上より、多能性幹細胞を第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、得られた細胞凝集体をＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下で培養したのちに、さらにＦＧＦシグナル伝達経路作用物質の存在下で一定期間培養したのちに、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質及びＥＧＦシグナル伝達経路作用物質の存在下で培養することにより、実験３と同様の細胞塊が製造できた。また、その細胞塊の内部の神経系細胞又はその前駆細胞は神経網膜の神経上皮組織を形成していることが分かった。さらに、実験３と比較したところ、浮遊培養開始１３日目からＦＧＦシグナル伝達経路作用物質、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質に加えてＥＧＦシグナ伝達経路作用物質の存在下で培養することにより、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質のみの存在下で培養した時に比べて、より安定して嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む非神経上皮組織部が形成されることが分かった。【０３３１】
［実験６：ヒトｉＰＳ細胞から嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊の作製］
実験６では、図１７の上段に示すように、工程（３）として最初から工程（３ｃ）を行い、工程（３ｃ）の途中からＥＧＦを添加し、さらにその後第二Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質としてＸＡＶ９３９の存在下で培養を行い、嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊を作製した。特に示された操作以外は実験３と同様の操作を行った。【０３３２】
具体的には、維持培養されたヒトｉＰＳ細胞を用いて、工程（ａ）、工程（１）及び工程（２）を開始した後、浮遊培養開始後３日目にＹ２７６３２とＢＭＰ４を含まず、ＩＷＰ−２、ＳＢ−４３１５４２、ＦＧＦ２、Ｈｅｐａｒｉｎ  Ｓｏｄｉｕｍ及びＫ０２２８８を含む無血清培地を用いて半量培地交換を行った（工程（３ｃ）開始）。ＦＧＦ２とＨｅｐａｒｉｎ  Ｓｏｄｉｕｍ及びＫ０２２８８は、ウェル中の終濃度が２０ｎｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ及び１μＭとなるようにした。その後、浮遊培養開始後６、１０日目にＹ２７６３２とＢＭＰ４を含まず、ＩＷＰ−２、ＳＢ−４３１５４２、ＦＧＦ２、Ｈｅｐａｒｉｎ  Ｓｏｄｉｕｍ及びＫ０２２８８を含む無血清培地を用いて半量培地交換を行った。さらに浮遊培養開始後１３日目に上記因子に加え、ＥＧＦ（ＰｒｉｍｅＧｅｎｅ社製）を終濃度２０ｎｇ／ｍｌとなるように添加した。さらに浮遊培養開始後１７日目にＩＷＰ−２、ＳＢ−４３１５４２、ＦＧＦ２、Ｈｅｐａｒｉｎ  Ｓｏｄｉｕｍ、Ｋ０２２８８及びＥＧＦに加え、ＸＡＶ９３９（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）を終濃度３００ｎＭとなるように添加し、浮遊培養開始後２１日目及び２４日目に半量培地交換を実施した。【０３３３】
浮遊培養開始後２８日目に倒立顕微鏡を用いて明視野観察を行った（図１７のＡ）。その結果、実験１でヒトＥＳ細胞から形成された場合と同様にヒトｉＰＳ細胞から直径約６００μｍ前後の球状の細胞塊が形成されることが分かった。【０３３４】
比較実験１と同様の方法に従って、浮遊培養開始後２８日目の細胞塊の蛍光免疫染色を行った。一次抗体として、表１に記載のＤｌｘ５、ＮｅｕｒｏＤ１、ＮＣＡＭ、ｐ６３、Ｓｏｘ２、Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｐａｘ６、Ｃｈｘ１０、Ｎ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｓｉｘ１、Ｓｐ８、ＥｐＣＡＭ、Ｔｕｊ１、Ｅｂｆ２、汎サイトケラチン、Ｌｈｘ２、Ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ、Ｏｔｘ２に対する抗体に加え、未成熟な神経細胞及び神経堤を染色する抗Ｎｅｓｔｉｎ抗体、嗅上皮プラコード及び中枢神経系の一部の神経核を染色する抗Ｉｓｌｅｔ−１抗体、上皮細胞を染色する抗β−ｃａｔｅｎｉｎ抗体、頂端面を染色する抗ＰＫＣζ抗体、基底膜を染色する抗Ｌａｍｉｎｉｎ抗体、非神経上皮を染色する抗ＣＫ８抗体、プラコードを染色する抗Ｅｙａ２抗体を用いた。蛍光標識二次抗体として比較実験２に記載の抗体を用いて多重染色を行った。核の対比染色には、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いた。染色結果の陽性と陰性の判断は、予備実験１と同様に行った。【０３３５】
染色結果を図１７〜図１９に示す。浮遊培養開始２８日目には、外側がＥ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｎ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、汎サイトケラチン、ＥｐＣＡＭ、Ｓｏｘ２、Ｓｉｘ１、Ｓｐ８、Ｅｙａ２、Ｉｓｌｅｔ−１、β−Ｃａｔｅｎｉｎ陽性のプラコード様（嗅上皮様組織）の非神経上皮組織部、内側がＥ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、汎サイトケラチン、ＥｐＣＡＭ陰性かつＮ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＮＣＡＭ、Ｔｕｊ１、Ｃｈｘ１０陽性の神経網膜の神経上皮組織が一部に形成されている細胞塊が形成された。細胞塊の外側の嗅上皮様組織は、外側がＰＫＣζ陽性の頂端面、内側がＬａｍｉｎｉｎ陽性の基底面であり、頂端面−基底面の極性が生じていた。また、外側のプラコード様の上皮組織（嗅上皮様組織）中の一部の細胞はＬｈｘ２、ＮｅｕｒｏＤ１、Ｅｂｆ２、Ｔｕｊ１、Ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ及びＮＣＡＭ陽性の嗅神経細胞又はその未成熟な前駆細胞であった。（図１７Ｂ〜Ｍ、図１８Ｎ〜ＡＥ、図１９ＡＦ〜ＡＪ）。上記の結果より、多能性幹細胞を第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、得られた細胞凝集体をＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下で培養したのちに、さらにＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の存在下で培養し、また、ＥＧＦシグナル伝達経路作用物質及び第二Ｗｎｔシグナル伝達経路素材物質を添加することで、実験３と同様の細胞塊が製造できることが分かった。また、その細胞塊の内部の神経系細胞又はその前駆細胞は神経網膜の神経上皮組織を形成していることが分かった。さらに、実験３と比較したところ、浮遊培養開始１３日目にＥＧＦを添加し、浮遊培養開始１７日目に新たな第二のＷｎｔ経路阻害物質を添加することにより、これらを添加しない条件よりも安定して嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む非神経上皮組織部が形成されることが分かった。形成された細胞塊の模式図を図１９のＡＫに示す。【０３３６】
［実験７：細胞塊の製造におけるＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の添加濃度の検討］
実験７では、ヒトＥＳ細胞を用いて、工程（２）におけるＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の濃度による、細胞塊の製造効率の検討を行った。実験２（図８上段を参照）と同様の実験操作を行い、工程（２）において、ＢＭＰ４の培地中の濃度は０．０２５ｎＭ、０．１ｎＭ、０．２５ｎＭ、０．５ｎＭ、１．５ｎＭ、５ｎＭ及び無添加コントロールの７条件とした。【０３３７】
浮遊培養開始後２８日目に倒立顕微鏡を用いて明視野観察を行った。その結果、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を添加しないコントロールを除くいずれのＢＭＰ４濃度によっても、実験１と同様にヒトＥＳ細胞から直径約６００μｍ前後の球状の細胞塊が形成されることが分かった。【０３３８】
さらに、各濃度のＢＭＰ４を添加して形成された細胞塊について、全周の８０％以上が非神経上皮組織部に被覆されており、球状に近い形態をした細胞塊（Ｇｒａｄｅ１、例＝図２０のＡ）、全周４０％から８０％が非神経上皮組織部に被覆されている細胞塊又は形がいびつな細胞塊（Ｇｒａｄｅ２、例＝図２０のＢ）、細胞塊表面の非神経上皮組織部の割合が４０％以下である細胞塊（Ｇｒａｄｅ３、例＝図２０のＣ）、まったく非神経上皮組織部が形成されていない細胞塊（Ｇｒａｄｅ４、例＝図２０のＤ）の４段階に評価した。評価は、倒立顕微鏡を用いた明視野観察により行った。その結果、図２０のＥに示すように、ＢＭＰ４を添加しない培養条件では、非神経上皮組織部は観察されなかった。工程（２）において０．５ｎＭ以上のＢＭＰ４を添加した培養条件では、全周の８０％以上が非神経上皮組織部に被覆されており、球状に近い形態をしたＧｒａｄｅ１の細胞塊が高効率で形成された。よって、嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む非神経上皮組織部を含む、細胞塊の効率的な製造において、工程（２）において添加するＢＭＰ４の濃度は０．５ｎＭ以上が好ましいことが分かった。【０３３９】
［実験８：細胞塊の製造における分化誘導開始前の前処理の検討］
実験８では、ヒトｉＰＳ細胞を用いて、前処理工程（ａ）の有無による、細胞塊の製造効率の検討を行った。実験は、図２１の上段に示す手順に従って行い、特に示された操作以外は実験１と同様の実験操作を行った。維持培養されたヒトｉＰＳ細胞を、６ウェルプレートに播種した６日後に、ＳｔｅｍＦｉｔ培地の培地交換と同時に、（１）他の条件と同量のＤＭＳＯのみ（ｃｏｎｔｒｏｌ）、（２）３００ｎＭ  ＳＡＧのみ、（３）５μＭ  ＳＢ−４３１５４２のみ、（４）５μＭ  ＳＢ４３１５４２及び３００ｎＭ  ＳＡＧを添加する４つの条件にわけて前処理を行った。【０３４０】
工程（ａ）の開始から２４時間後、実験１と同様にしてＹ２７６３２（終濃度２０μＭ）、ＳＢ−４３１５４２（終濃度１μＭ）及びＩＷＰ−２（終濃度２μＭ）の存在下で浮遊培養を開始し（工程（１）開始）、浮遊培養開始後２日目にＹ２７６３２を含まず、ＩＷＰ−２、ＳＢ−４３１５４２及びＢＭＰ４（終濃度１．５ｎＭ）を含む培地で半量培地交換を行った（工程（２）開始）。浮遊培養開始後３日目にＹ２７６３２とＢＭＰ４を含まず、ＩＷＰ−２、ＳＢ−４３１５４２、ＦＧＦ２、Ｈｅｐａｒｉｎ  Ｓｏｄｉｕｍ及びＫ０２２８８を含む無血清培地を用いて半量培地交換を行った（工程（３ｃ）開始）。ＦＧＦ２、Ｈｅｐａｒｉｎ  Ｓｏｄｉｕｍ及びＫ０２２８８のウェル中の終濃度が２０ｎｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ及び１μＭとなるようにした。その後、浮遊培養開始後６、１０日目にＹ２７６３２とＢＭＰ４を含まず、ＩＷＰ−２、ＳＢ−４３１５４２、ＦＧＦ２、Ｈｅｐａｒｉｎ  Ｓｏｄｉｕｍ及びＫ０２２８８を含む無血清培地を用いて半量培地交換を行った。【０３４１】
浮遊培養開始後１３日目に倒立顕微鏡を用いて明視野観察を行った（図２１のＡ〜Ｇ）。前処理を実施しないヒトｉＰＳ細胞より形成された細胞凝集体は、（２）〜（４）で前処理を行った細胞凝集体に比べて凝集体の直径が小さかった。また、細胞凝集体の外側の非神経上皮組織の形成具合についても、ウェル間でばらつきが見られ、非神経上皮組織が形成された細胞凝集体も、形成されない細胞凝集体も観察された（図２１のＡ〜Ｄ）。一方で、（２）ＳＡＧのみ、（３）ＳＢ−４３１５４２のみ、（４）ＳＡＧ＋ＳＢ−４３１５４２のいずれかの条件で前処理を実施した細胞から形成された細胞凝集体のうち、９０％以上はコントロールよりも直径が大きく、表面の非神経上皮組織も効率よく形成されていた（図２１のＥ〜Ｇ）。【０３４２】
さらに、各条件で前処理を行ったヒトｉＰＳ細胞から形成された凝集塊について、実験７と同様にＧｒａｄｅ１〜４の４段階に評価した。その結果、図２１のＨに示すように、（２）ＳＡＧのみ、（３）ＳＢ−４３１５４２のみ、（４）ＳＡＧ＋ＳＢ−４３１５４２のいずれかの条件で前処理を実施した場合に、全周の８０％以上が非神経上皮組織部に被覆されており、球状に近い形態をしたＧｒａｄｅ１の細胞凝集体が高効率に安定して得られた。よって、嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊の効率的な製造において、（２）ＳＡＧのみ、（３）ＳＢ−４３１５４２のみ、（４）ＳＡＧ＋ＳＢ−４３１５４２のいずれかの条件で前処理を実施することが好ましいことが分かった。【０３４３】
［実験９：細胞塊の製造における第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の検討］
実験９では、ヒトｉＰＳ細胞を用いて、第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の種類による、細胞塊の製造効率の検討を行った。図２２の上段に示す手順に従って実験を行い、特に示された操作以外は、実験３と同様の実験操作を行った。維持培養及び工程（ａ）を行ったヒトｉＰＳ細胞を、第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質、Ｙ２７６３２（終濃度２０μＭ）及びＳＢ−４３１５４２（終濃度１μＭ）を添加した培地で浮遊培養を開始した。【０３４４】
第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質として、ＩＷＰ−２（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、終濃度２μＭ）、ＩＷＰ−３（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製、終濃度２μＭ）、ＩＷＰ−４（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製、終濃度２μＭ）、Ｗｎｔ  Ｃ−５９（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製、終濃度２０ｎＭ）、ＫＹ０２１１１（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製、終濃度１μＭ）を用いた。第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質無添加のコントロールとしては、ＤＭＳＯを添加した。【０３４５】
浮遊培養開始後２日目にＹ２７６３２を含まず、各第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質、ＳＢ−４３１５４２及びＢＭＰ４（終濃度１．５ｎＭ）を含む無血清培地を１ウェルあたり１００μｌ加えた。さらに、浮遊培養開始後３日目にＹ２７６３２とＢＭＰ４を含まず、ＳＢ−４３１５４２、Ｋ０２２８８、ＦＧＦ２、Ｈｅｐａｒｉｎ  Ｓｏｄｉｕｍ及びＥＧＦを含む無血清培地を用いて半量培地交換を行った。Ｋ０２２８８、ＦＧＦ２、Ｈｅｐａｒｉｎ  Ｓｏｄｉｕｍ、ＥＧＦはウェル中の終濃度が１０μＭ、２０ｎｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ及び２０ｎｇ／ｍｌとなるようにした。浮遊培養開始後６、１０、１３、１７、２１、２４日目にＹ２７６３２とＢＭＰ４を含まず、各第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質とＳＢ−４３１５４２、Ｋ０２２８８、ＦＧＦ２、Ｈｅｐａｒｉｎ  Ｓｏｄｉｕｍ及びＥＧＦを含む無血清培地を用いて半量培地交換を行った。【０３４６】
浮遊培養開始後２８日目に、倒立顕微鏡を用いて、明視野観察を行った（図２２のＡ〜Ｆ）。第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質を添加しない条件を除き、実験３と同様に、外側に非神経上皮様の組織が形成された球状の細胞塊が形成されることが分かった。【０３４７】
比較実験１と同様の方法に従って、浮遊培養開始後２８日目の細胞塊の蛍光免疫染色を行った。一次抗体として、表１に記載のプラコード及び非神経上皮組織を染色する抗Ｓｉｘ１抗体及び抗汎サイトケラチン抗体、プラコード及び神経系細胞を染色する抗Ｓｏｘ２抗体を用いた。蛍光標識二次抗体として、表２に記載のＡｌｅｘａ４８８標識ロバ抗ウサギ抗体、ＣＦ５５５標識ロバ抗ヤギ抗体及びＡｌｅｘａ６４７標識ロバ抗マウス抗体を用いて多重染色を行った。核の対比染色にはＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いた。染色結果の陽性と陰性の判断は、予備実験１と同様に行った。【０３４８】
染色結果を図２３に示す。第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質を添加しない条件では、浮遊培養開始より２日目にＢＭＰ４を添加しても細胞凝集体の表面に非神経上皮組織が形成されなかった。一方で、浮遊培養開始時点よりＩＷＰ−２、ＩＷＰ−３、ＩＷＰ−４、Ｗｎｔ  Ｃ−５９、ＫＹ０２１１１を添加した各条件では、内側に神経上皮様の凝集体が存在し、表面に非神経上皮組織を有する凝集体が形成された。さらに、蛍光免疫染色の結果、各種の第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質を添加した条件では、Ｓｉｘ１、Ｓｏｘ２、サイトケラチン陽性で肥厚している嗅上皮プラコード様の組織が細胞塊表面の非神経上皮中に形成されることが分かった（図２３Ｇ）。上記の結果より、第一Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の添加が、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の添加による嗅上皮プラコード様の非神経上皮組織を含む細胞塊の製造に有用であることが分かった。【０３４９】
［実験１０：三次元培養器を用いた細胞塊の製造］
実験１０では、ヒトｉＰＳ細胞を実験５とは異なる培養容器を用いて培養し、浮遊培養開始４日目にＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の洗浄を行って細胞塊の製造を行った。実験は、図２４の上段に示す手順に従い、特に示された実験操作以外は実験３と同様に行った。【０３５０】
具体的には、維持培養されたヒトｉＰＳ細胞を用いて、工程（ａ）を行った後、単一細胞に分散されたヒトｉＰＳ細胞を非細胞接着性の９６ウェル三次元培養器（ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ  ９６スリットウェルプレート、ＭＳ−９０９６Ｓ、住友ベークライト株式会社製）に１ウェルあたり１×１０４細胞になるように１００μｌの無血清培地に浮遊させ、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で浮遊培養した。浮遊培養開始時（浮遊培養開始後０日目、工程（１）開始）に、上記無血清培地にＹ２７６３２（終濃度２０μＭ）、ＩＷＰ−２（終濃度２μＭ）、ＳＢ−４３１５４２（終濃度１μＭ）を添加した。【０３５１】
浮遊培養開始後２日目にＹ２７６３２を含まず、ＩＷＰ−２、ＳＢ−４３１５４２及びＢＭＰ４を含む無血清培地を１プレートあたり１９．２ｍｌ添加した（工程（２）開始）。ＢＭＰ４は添加する培地に２．２５ｎＭ添加し、培地中の終濃度が１．５ｎＭとなるようにした。【０３５２】
浮遊培養開始後３日目にＹ２７６３２及びＢＭＰ４を含まず、ＩＷＰ−２、ＳＢ−４３１５４２、Ｋ０２２８８（終濃度１０μＭ）、ＦＧＦ２（終濃度２０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（終濃度２０ｎｇ／ｍｌ）及びＨｅｐａｒｉｎ  Ｓｏｄｉｕｍ（終濃度１０μｇ／ｍｌ）を含む無血清培地を用いて半量培地交換を行った（工程（３ｃ）開始）。Ｋ０２２８８、ＦＧＦ２、ＥＧＦ及びＨｅｐａｒｉｎ  Ｓｏｄｉｕｍは添加する培地に２倍の濃度で添加し、ウェル中の終濃度が記載の濃度となるようにした。次に、浮遊培養開始後４日目にプレート中の培地をピペットで吸引して除き、１５ｍｌのＩＭＤＭとＦ−１２の１：１混合液による洗浄操作を３回行い、さらにＹ２７６３２、ＢＭＰ４及びＫ０２２８８を含まず、ＩＷＰ−２、ＳＢ−４３１５４２、ＦＧＦ２、ＥＧＦ及びＨｅｐａｒｉｎ  Ｓｏｄｉｕｍを含む培地を３０ｍｌ添加し、プレート中のＫ０２２８８を可能な限り除去した（工程（３ｄ）開始）。浮遊培養開始後１０、１３、１７日目にＹ２７６３２、ＢＭＰ４及びＫ０２２８８を含まず、ＩＷＰ−２、ＳＢ−４３１５４２、ＦＧＦ２、ＥＧＦ及びＨｅｐａｒｉｎ  Ｓｏｄｉｕｍを含む無血清培地を用いて半量培地交換を行った。【０３５３】
浮遊培養開始後２８日目に、倒立顕微鏡を用いて、明視野観察を行った（図２４のＡ及びＢ）。三次元培養器であるスリットウェルプレートを用い、培養途中でＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質を培地中から除去する分化誘導条件においても、外側に肥厚した嗅上皮様の非神経上皮組織を有する細胞塊が形成された。【０３５４】
［実験１１：細胞塊の製造におけるＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の添加時期の検討］
実験１１では、ヒトｉＰＳ細胞を用いて、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の添加時期、すなわち工程（２）の開始時期を浮遊培養開始後１日目から６日目まで変化させ、細胞塊の製造効率の検討を行った。実験は、図２５上段に示す手順に従って行い、特に記載された実験操作以外は実験１と同様に行った。【０３５５】
維持培養されたヒトｉＰＳ細胞を用いて、工程（ａ）を行った後、単一細胞に分散されたヒトｉＰＳ細胞を非細胞接着性の９６ウェル三次元培養器（ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ  ９６スリットウェルプレート、ＭＳ−９０９６Ｓ、住友ベークライト株式会社製）に１ウェルあたり１×１０４細胞になるように１００μｌの無血清培地に浮遊させ、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で浮遊培養した。浮遊培養開始時（浮遊培養開始後０日目、工程（１）開始）に、上記無血清培地にＹ２７６３２（終濃度２０μＭ）、ＩＷＰ−２（終濃度２μＭ）、ＳＢ−４３１５４２（終濃度１μＭ）を添加した。【０３５６】
浮遊培養開始後１、２、３、４、６日目のいずれかの時点でＹ２７６３２を含まず、ＩＷＰ−２、ＳＢ−４３１５４２、ＢＭＰ４を含む無血清培地を１ウェルあたり１００μｌ加えた（工程（２）開始）。ＢＭＰ４は添加する培地に３ｎＭ添加し、ウェル中の終濃度が１．５ｎＭとなるようにした。【０３５７】
さらに、ＢＭＰ４を含む無血清培地を添加した翌日にＹ２７６３２とＢＭＰ４を含まず、ＳＢ−４３１５４２、Ｋ０２２８８、ＦＧＦ２及びＨｅｐａｒｉｎ  Ｓｏｄｉｕｍ、ＥＧＦを含む無血清培地を用いて半量培地交換を行った（工程（３ｃ）開始）。Ｋ０２２８８、ＦＧＦ２、Ｈｅｐａｒｉｎ  Ｓｏｄｉｕｍ及びＥＧＦは添加する培地にそれぞれ２０μＭ、４０ｎｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ添加し、ウェル中の終濃度が１０μＭ、２０ｎｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌとなるようにした。その後、浮遊培養開始後６、１０日目にＹ２７６３２とＢＭＰ４を含まず、ＩＷＰ−２、ＳＢ−４３１５４２、ＦＧＦ２、Ｈｅｐａｒｉｎ  Ｓｏｄｉｕｍ及びＫ０２２８８を含む無血清培地を用いて半量培地交換を行った。浮遊培養開始後４及び６日目にＢＭＰ４を添加する条件では、浮遊培養開始後３日目にＳＢ−４３１５４２とＩＷＰ−２のみを含む培地を１００μｌ添加し、ＢＭＰ４を添加した培地を加える直前にウェルから１００μｌの培地を除いた。【０３５８】
浮遊培養開始後１３日目に倒立顕微鏡を用いて明視野観察を行った（図２５のＡ〜Ｅ）。浮遊培養開始後１、２、３日目のいずれかの時点でＢＭＰ４を添加した条件では、細胞凝集体の表面に非神経上皮組織が形成されており、さらに浮遊培養開始後２日目にＢＭＰ４を添加した条件が細胞凝集体の直径がより大きく、最も効率よく安定して表面に非神経上皮組織を有する細胞凝集体が形成されていた（図２５のＡ〜Ｃ）。一方で、浮遊培養開始後４又は６日目にＢＭＰ４を添加した条件では、神経網膜の分厚い神経上皮のみが形成されており、細胞凝集体の表面に非神経上皮組織の形成が見られなかった（図２５のＤ、Ｅ）。上記の結果から、神経組織部及び非神経上皮組織部を含む細胞塊を製造するためには、浮遊培養開始後９６時間以内にＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を添加して工程（２）を開始することが好ましく、遊培養開始後２４時間以降７２時間以内にＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を添加することがより好ましいことが分かった。【０３５９】
［実験１２：細胞塊の製造における工程（２）の開始時期の検討］
実験１２は、浮遊培養開始後２日目から６日目の細胞凝集塊の表面を観察し、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の適切な添加時期の検討を行った。実験は、図２６上段に示す手順に従って行い、特に示された実験操作以外は、比較実験１と同様に行った。【０３６０】
維持培養されたヒトｉＰＳ細胞を用いて、工程（ａ）を行った後、単一細胞に分散されたヒトｉＰＳ細胞を非細胞接着性の９６ウェル三次元培養器（ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ  ９６スリットウェルプレート、ＭＳ−９０９６Ｓ、住友ベークライト株式会社製）に１ウェルあたり１×１０４細胞になるように１００μｌの無血清培地に浮遊させ、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で浮遊培養した。浮遊培養開始時（浮遊培養開始後０日目、工程（１）開始）には、上記無血清培地にＹ２７６３２（終濃度２０μＭ）、ＩＷＰ−２（終濃度２μＭ）及びＳＢ−４３１５４２（終濃度１μＭ）を添加した。【０３６１】
浮遊培養開始後２、３、４、６日目のいずれかの時点で倒立顕微鏡を用いて明視野観察を行った（図２６のＡ〜Ｄ）。浮遊培養開始後２日目の凝集体は表面に凹凸がみられ、歪な形状であるのに対し、浮遊培養開始後３、４、６日目の凝集体は２日目に見られた凹凸が減少し、球体に近い形状を呈していた（図２６のＢ〜Ｄ）。【０３６２】
比較実験１と同様の方法に従って、浮遊培養開始後２、３、４、６日目の細胞塊の蛍光免疫染色を行った。一次抗体としては、表１に記載の密着結合を染色する抗ＺＯ−１抗体を用いた。蛍光標識二次抗体として、Ａｌｅｘａ４８８標識ロバ抗ウサギ抗体を用い、核の対比染色にはＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いた。染色結果の陽性と陰性の判断は、予備実験１と同様に行った。【０３６３】
染色結果を図２６に示す。浮遊培養開始後２日目の細胞凝集体では、凝集体の最も表層の細胞の一部がＺＯ−１陽性であり、密着結合を形成していた（図２６のＥ）。浮遊培養開始後３、４、６日目の細胞凝集体では、表層のＺＯ−１陽性の細胞の割合が顕著に減少していた（図２６のＦ〜Ｈ）。実験１１に記載の通り、嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊の製造において浮遊培養開始後２日目は好ましいＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の添加時期であり、実験１２の結果より、嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊の製造過程におけるＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の添加時期を決定するための手法として、細胞凝集体の最も表層の細胞における密着結合の検出が利用可能であることが分かった。【０３６４】
［実験１３：生体の嗅上皮において発現している遺伝子の解析］
実験１３では、胎生１４．５日目ラット胚より嗅上皮を含む頭部の冠状切片を作製し、免疫染色を行い、本願に記載の製造法に製造された嗅上皮と比較した。妊娠１４．５日目ラットより子宮内の胚を回収し、ＰＢＳで洗浄後、４％パラホルムアルデヒド・りん酸緩衝液（富士フィルム和光純薬株式会社製）で室温１時間固定した。固定後の胚をＰＢＳで洗浄後、凍結時の組織の保護のために１０％、２０％、３０％スクロース／ＰＢＳ溶液に固定後の胚を沈降するまで順に浸漬した。凍結保護処理後の胚の頸部を解剖用ハサミで切断し、その頭部をクリオモルド＜２号＞（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ社製）に移し、頭部の周囲の余分な３０％スクロース／ＰＢＳをマイクロピペッターで除いた後にＯ．Ｃ．Ｔコンパウンド（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ社製）に包埋し、ドライアイスで冷却したアルミヒートブロック上で急速凍結し、凍結切片作製用のブロックを作製した。上記胚を包埋したブロックからライカＣＭ１９５０クライオスタット（Ｌｅｉｃａ社製）により１０μｍ厚の凍結切片を作製し、プラチナプロコートスライドグラス（松浪硝子工業株式会社製）に張り付けた。スライドグラス上の凍結切片の周囲をウルトラパップペン（株式会社バイオメディカルサイエンス製）で囲んだ後、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００／ＴＢＳで室温１０分間透過処理し、続けてブロッキング試薬Ｎ−１０２（日油株式会社製）とＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ  （ＴＢＳ）  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）の体積比１：４混合液で室温３０分間ブロッキング処理を行った。【０３６５】
ブロッキング処理後の凍結切片に関し、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｉｌｕｅｎｔ  ＯＰ  Ｑｕａｎｔｏ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で希釈した一次抗体をスライドグラス１枚あたり３００μｌ添加し、湿箱中にて４℃で一晩反応させた。一次抗体処理後の凍結切片を０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０／ＴＢＳで室温１０分間処理する洗浄操作を３回行った後に、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｏｎｅ  Ｈｉｓｔｏ（ナカライテスク株式会社製）と０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００／ＴＢＳを１：１９の割合で混合した緩衝液で二次抗体を希釈し、希釈液をスライドグラス１枚あたり３００μｌ凍結切片に添加し、室温で１時間反応させた。二次抗体処理後の凍結切片を０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０／ＴＢＳで室温１０分間処理する洗浄操作を３回行った後に、純水で凍結切片を一回洗浄し、その後、ＮＥＯカバーグラス（松浪硝子工業株式会社製）とスライドグラス１枚当たり３０μｌのＰｒｏｌｏｎｇ  Ｄｉａｍｏｎｄ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて凍結切片を封入した。封入後の標本を室温の暗所で一晩静置してＰｒｏｌｏｎｇ  Ｄｉａｍｏｎｄを固化させたのち、透明のマニキュアでカバーグラスの周囲をコーティングし室温の暗所で風乾後、蛍光顕微鏡による観察を行った。標本の観察及び画像の取得には正立蛍光顕微鏡Ａｘｉｏ  Ｉｍａｇｅｒ  Ｍ２（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社製）及び附属ソフトウェアのＡｘｉｏ  Ｖｉｓｉｏｎを用いた。【０３６６】
蛍光免疫染色で用いる一次抗体として、表１に記載のＳｏｘ２、Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｏｔｘ２、β−Ｃａｔｅｎｉｎ、Ｄｌｘ５、Ｔｕｊ１、Ｅｂｆ２、汎サイトケラチン、ＰＫＣζ、ＥｐＣＡＭ、ラミニンに対する抗体、及び嗅神経細胞を染色する抗Ｅｂｆ１抗体を用いた。蛍光標識二次抗体としては、表２に記載の抗体を用い、核の対比染色のために１μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を二次抗体希釈液中に添加した。染色結果の陽性と陰性の判断は、予備実験１と同様に行った。【０３６７】
染色結果を図２７に示す。生体の嗅上皮はサイトケラチン、ＥｐＣＡＭ、β−Ｃａｔｅｎｉｎ、Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ陽性の非神経上皮であると同時に、Ｅｂｆ１、Ｅｂｆ２、Ｔｕｊ１陽性の嗅神経細胞が存在することが分かった。さらに、Ｏｔｘ２、Ｄｌｘ５、Ｓｏｘ２といった胚の前方領域のプラコードマーカー遺伝子を発現していた。加えて、嗅上皮の表面はＰＫＣζ陽性の頂端面であり、内側はＬａｍｉｎｉｎ陽性の基底面であり、頂端−基底軸の極性があることが分かった。上記の結果と比較したところ、本願に記載の方法で製造された嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊中の組織は、生体の嗅上皮と極めてよく似た構造を再現することに成功していることが分かった。【０３６８】
［実験１４：細胞塊の製造におけるＷｎｔシグナル伝達経路作用物質と阻害物質の併用の検討］
図２８上段に示す手順に従って、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質と阻害物質とを併用して細胞塊を作製した。ヒトｉＰＳ細胞（ＨＣ−６＃１０株、理化学研究所より入手）は、実験１と同様の方法により維持培養及び工程（ａ）を行った。１ウェルあたりの細胞数が９×１０３細胞となるようにした以外は、実験１と同様の方法により９６ウェル培養プレートにて浮遊培養を開始した。【０３６９】
浮遊培養開始時（浮遊培養開始後０日目、工程（１）開始）に、上記無血清培地にＹ２７６３２（終濃度２０μＭ）、ＩＷＰ−２（終濃度２μＭ）、ＳＢ−４３１５４２（終濃度１μＭ）を添加した。加えて、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質としてＣＨＩＲ９９０２１（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）を終濃度３００ｎＭとなるように添加した。Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質であるＩＷＰ−２とＷｎｔシグナル伝達経路作用物質であるＣＨＩＲ９９０２１とを併用した場合、βカテニン依存的なＷｎｔ−Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｐａｔｈｗａｙは活性化され、βカテニン非依存的なＷｎｔ−ｎｏｎ−Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｐａｔｈｗａｙは阻害される。【０３７０】
浮遊培養開始後２日目にＹ２７６３２を含まず、ＳＢ−４３１５４２、ＢＭＰ４、ＩＷＰ−２及びＣＨＩＲ９９０２１を含む無血清培地を１ウェルあたり１００μｌ加えた（工程（２）開始）。ＢＭＰ４は添加する培地に３ｎＭ添加し、ウェル中の終濃度を１．５ｎＭとした。【０３７１】
浮遊培養開始後３日目にＹ２７６３２及びＢＭＰ４を含まず、ＩＷＰ−２、ＳＢ−４３１５４２、ＦＧＦ２及びＣＨＩＲ９９０２１を含む無血清培地を用いて半量培地交換を行った（工程（３ａ）開始）。その後、浮遊培養開始後６日目と１０日目にＹ２７６３２及びＢＭＰ４を含まず、ＩＷＰ−２、ＳＢ−４３１５４２、ＦＧＦ２、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｋ０２２８８を含む無血清培地を用いて半量培地交換を行った（工程（３ｃ）開始）。Ｋ０２２８８の濃度及び添加時期は、ヒトｉＰＳ細胞株ＨＣ−６＃１０株向けに調整し、浮遊培養開始後６日目に添加する培地に２μＭ添加し、ウェル中の終濃度が１μＭとなるようにした。浮遊培養開始後１３日目にＩＷＰ−２、ＳＢ−４３１５４２、ＦＧＦ２、ＣＨＩＲ９９０２１及びＫ０２２８８を含む培地に、終濃度が２０ｎｇ／ｍｌになるようにＥＧＦを２倍量添加した培地で半量培地交換を行った。浮遊培養開始後１７日目にＩＷＰ−２、ＳＢ−４３１５４２、ＦＧＦ、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｋ０２２８８、ＥＧＦを含む培地で半量培地交換を行い、浮遊培養開始後２１日目まで培養した。浮遊培養開始後２１日目に倒立顕微鏡を用いて、得られた細胞塊の明視野観察を行った。【０３７２】
ヒトｉＰＳ細胞株ＨＣ−６＃１０より上記分化誘導法で誘導された浮遊培養開始後２１日目の細胞塊は、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質であるＩＷＰ−２を添加した条件でそのシグナル伝達下流のＷｎｔシグナル伝達経路活性化物質ＣＨＩＲ９９０２１を添加しても、嗅上皮様組織が細胞塊の外側に形成されることが分かった。さらに、ヒトｉＰＳ細胞株由来細胞塊の内部の神経系組織の死細胞が減少し、より高品質な嗅上皮様組織を含む細胞塊が形成されていた（図２８のＡ、Ｂ）。この結果から、１）ＰＯＲＣＮ阻害剤の非神経上皮組織形成促進作用は、βカテニン依存的なＷｎｔ−Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｐａｔｈｗａｙの阻害によるものではないこと、２）一定の程度（３μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１以下程度）のβカテニン依存的なＷｎｔ−Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｐａｔｈｗａｙの活性は、細胞塊内部の神経組織の生存と上皮形成の促進に作用し、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞の株の性質によってはＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質とＷｎｔシグナル伝達経路活性化物質との併用が、良質な細胞塊の製造に有効であることが示された。【０３７３】
［実験１５：細胞塊の製造におけるＴＡＫ１阻害剤の効果の検討］
図２９上段に示す手順に従って、工程（３）においてＴＡＫ１阻害剤を添加して細胞塊を作製した。ヒトｉＰＳ細胞（ＨＣ−６＃１０株、理化学研究所より入手）は、実験１と同様の方法により維持培養及び工程（ａ）を行った。１ウェルあたりの細胞数が９×１０３細胞となるようにした以外は、実験１と同様の方法により９６ウェル培養プレートにて浮遊培養を開始した。【０３７４】
浮遊培養開始時（浮遊培養開始後０日目、工程（１）開始）に、上記無血清培地にＹ２７６３２（終濃度２０μＭ）、ＩＷＰ−２（終濃度２μＭ）、ＳＢ−４３１５４２（終濃度１μＭ）及びＣＨＩＲ９９０２１（終濃度３００ｎＭ）を添加した。【０３７５】
浮遊培養開始後２日目にＹ２７６３２を含まず、ＳＢ−４３１５４２、ＢＭＰ４、ＩＷＰ−２及びＣＨＩＲ９９０２１を含む無血清培地を１ウェルあたり１００μｌ加えた（工程（２）開始）。ＢＭＰ４は添加する培地に３ｎＭ添加し、ウェル中の終濃度を１．５ｎＭとした。【０３７６】
浮遊培養開始後３日目にＹ２７６３２及びＢＭＰ４を含まず、ＩＷＰ−２、ＳＢ−４３１５４２、ＦＧＦ２、Ｈｅｐａｒｉｎ  Ｓｏｄｉｕｍ及びＣＨＩＲ９９０２１を含む無血清培地を用いて半量培地交換を行った。さらにＴＡＫ１阻害剤である５ｚ−７−ｏｘｏｚｅａｅｎｏｌ（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）を添加する培地に４μＭ添加し、ウェル中の終濃度が２μＭとなるようにした（工程（３ａ）開始）。その後、浮遊培養開始後６日目と１０日目にＹ２７６３２とＢＭＰ４を含まず、ＩＷＰ−２、ＳＢ−４３１５４２、ＦＧＦ２、Ｈｅｐａｒｉｎ  Ｓｏｄｉｕｍ、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｋ０２２８８及び５ｚ−７−ｏｘｏｚｅａｅｎｏｌを含む無血清培地を用いて半量培地交換を行った（工程（３ｃ）開始）。浮遊培養開始後１３日目にＩＷＰ−２、ＳＢ−４３１５４２、ＦＧＦ２、Ｈｅｐａｒｉｎ  Ｓｏｄｉｕｍ、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｋ０２２８８及び５ｚ−７−ｏｘｏｚｅａｅｎｏｌを含む培地にＥＧＦを終濃度が２０ｎｇ／ｍｌになるように２倍量添加した培地で半量培地交換を行った。浮遊培養開始後１７日目にＩＷＰ−２、ＳＢ−４３１５４２、ＦＧＦ２、Ｈｅｐａｒｉｎ  Ｓｏｄｉｕｍ、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｋ０２２８８、５ｚ−７−ｏｘｏｚｅａｅｎｏｌ及びＥＧＦを含む培地で半量培地交換を行い、浮遊培養開始後２１日目まで培養した。浮遊培養開始後２１日目に倒立顕微鏡を用いて、得られた細胞塊の明視野観察を行った。【０３７７】
ヒトｉＰＳ細胞株ＨＣ−６＃１０より上記分化誘導法で誘導された浮遊培養開始後２１日目の細胞塊は、ＴＡＫ１阻害剤を添加しない条件で製造された細胞塊よりもさらに効率よく細胞塊の表面に嗅上皮様組織が形成されていた（図２９のＡ、Ｂ）。この結果から、工程（３）において、ＴＧＦ−β受容体阻害剤、ＢＭＰ受容体阻害剤に加え、ＴＧＦ−β受容体とＢＭＰ受容体の下流の細胞内シグナル伝達因子であるＴＡＫ１を阻害することにより、さらに効率よくプラコードと嗅上皮様組織への分化誘導が生じることが分かった。【０３７８】
［実験１６：粘性を有する培地での細胞塊の製造及び同培地中での細胞塊の成熟培養］
図３０上段に示す方法に従って、細胞塊を粘性を有する培地で成熟培養させた。特許第６１７６７７０号公報を参照し、粘性を有する培地を調製した。具体的には、メチルセルロース（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製、ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ：４０００ｃＰ、Ｍ０５１２）を３ｇ秤量し、撹拌子を入れた５００ｍｌの広口メディウム瓶中でオートクレーブにより滅菌した後、１００ｍｌの培地を添加した。培地としては、Ｆ−１２＋Ｇｌｕｔａｍａｘ培地とＩＭＤＭ＋Ｇｌｕｔａｍａｘ培地の体積比１：１混合液に５％  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、１０％ウシ胎児血清（Ｂｉｏｓｅｒａ社製）、４５０μＭ  １−モノチオグリセロール、１ｘ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｌｉｐｉｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ、５０ｕｎｉｔ／ｍｌペニシリン−５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−ＴＳ、２０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌ  ＩＧＦ−１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、１０μｇ／ｍｌ  Ｈｅｐａｒｉｎ  Ｓｏｄｉｕｍ、１μＭ  ＳＢ４３１５４２、１μＭ  Ｋ０２２８８、３００ｎＭ  ＣＨＩＲ９９０２１、１００ｎＭ  ＥＣ２３（レチノイン酸シグナル伝達経路作用物質）を添加した培地を用いた。培地を添加したメチルセルロース入りのメディウム瓶を、低温室内で高粘度液体対応のスターラー（アサヒ理化製作所製、ＡＭＧ−Ｈ）を用いて一晩攪拌した。翌日にメチルセルロースの溶け残りがないか確認した後に、冷蔵庫内に３日間静置し、培養液中の気泡を除去した。この方法により調製された３％メチルセルロースを含有する培地は、水あめ状の高い粘性を有する液体であった。【０３７９】
ガス透過性のフィルム底６ｃｍディッシュ（ｌｕｍｏｘディッシュ、９４．６０７７．３３３、ザルスタット社製）に上記方法で調製した粘性を有する培地をポジティブディスプレイスメント方式のピペット（Ｍｉｃｏｒｏｍａｎ  Ｍ１０００、ギルソン社製）を用いて８ｍｌ添加し、ＣＯ２インキュベーター内で平衡化した。その後、実験１５に記載の方法で調製した培養２１日目の細胞塊を９６ウェルプレートから１５ｍｌチューブへと回収し、５％ＫＳＲ  ｇｆＣＤＭ培地で一度洗浄した後、５％ＫＳＲ  ｇｆＣＤＭ培地が入った浮遊培養用６ｃｍディッシュへと移した。さらに、広口のピペットチップを用いてディッシュ中の細胞塊を回収し、培地８μｌと一緒に粘性を有する培地が入ったディッシュ中に１個ずつ吐出した。６ｃｍディッシュ１枚当たりの細胞塊の数は２４個とした。細胞塊を移し終えたディッシュをＣＯ２インキュベーター内に戻し、培養した（工程（３ｅ）開始）。培養開始後３日又は４日に一回、４００ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−ＴＳ、４００ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦを含む５％ＫＳＲ  ｇｆＣＤＭ  ５００μｌを均一になるように滴下した。高粘性培養開始後２４日目、分化誘導開始より４５日目に倒立顕微鏡を用いて明視野観察を行った。【０３８０】
ヒトｉＰＳ細胞株ＨＣ−６＃１０より上記分化誘導法で誘導された浮遊培養開始後４５日目の細胞塊は、細胞塊の表面により肥厚した嗅上皮様組織が形成されていた（図３０のＡ）。この結果から、粘性を有する培地中で細胞塊を培養することは、組織の物理的損傷を抑制し、長期間の培養に有効であることが分かった。また、その際の培地には、分化誘導の際に用いた因子に加え、ＩＧＦ、血清及びレチノイン酸シグナル伝達経路作用物質を添加すると嗅上皮様組織をさらに効率よく維持できることが分かった。【０３８１】
［実験１７：細胞塊の製造における基底膜標品の効果の検討］
図３１上段に示す手順に従って、工程（３）において基底膜標品存在下で細胞塊を作製した。ヒトｉＰＳ細胞（ＨＣ−６＃１０株、理化学研究所より入手）は、実験１と同様の方法により維持培養及び工程（ａ）を行った。１ウェルあたりの細胞数が９×１０３細胞となるようにした以外は、実験１と同様の方法により９６ウェル培養プレートにて浮遊培養を開始した。【０３８２】
浮遊培養開始時（浮遊培養開始後０日目、工程（１）開始）に、上記無血清培地にＹ２７６３２（終濃度２０μＭ）、ＩＷＰ−２（終濃度２μＭ）、ＳＢ−４３１５４２（終濃度１μＭ）及びＣＨＩＲ９９０２１（終濃度３００ｎＭ）を添加した。【０３８３】
浮遊培養開始後２日目にＹ２７６３２を含まず、ＳＢ−４３１５４２、ＢＭＰ４、ＩＷＰ−２及びＣＨＩＲ９９０２１を含む無血清培地を１ウェルあたり１００μｌ加えた（工程（２）開始）。ＢＭＰ４は添加する培地に３ｎＭ添加し、ウェル中の終濃度を１．５ｎＭとした。【０３８４】
浮遊培養開始後３日目にＹ２７６３２とＢＭＰ４を含まず、ＩＷＰ−２、ＳＢ−４３１５４２、ＦＧＦ２、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｈｅｐａｒｉｎ  Ｓｏｄｉｕｍ及び５ｚ−７−ｏｘｏｚｅａｅｎｏｌを含む無血清培地を用いて半量培地交換を行った（工程（３ａ）開始）。その後、浮遊培養開始後６日目と１０日目にＹ２７６３２とＢＭＰ４を含まず、ＩＷＰ−２、ＳＢ−４３１５４２、ＦＧＦ２、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｈｅｐａｒｉｎ  Ｓｏｄｉｕｍ、Ｋ０２２８８及び５ｚ−７−ｏｘｏｚｅａｅｎｏｌを含む無血清培地を用いて半量培地交換を行った（工程（３ｃ）開始）。浮遊培養開始後１３日目にＩＷＰ−２、ＳＢ−４３１５４２、ＦＧＦ２、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｈｅｐａｒｉｎ  Ｓｏｄｉｕｍ、Ｋ０２２８８、５ｚ−７−ｏｘｏｚｅａｅｎｏｌを含む培地にＥＧＦを終濃度が２０ｎｇ／ｍｌになるように２倍量添加した培地で半量培地交換を行った。浮遊培養開始後１７日目にＩＷＰ−２、ＳＢ−４３１５４２、ＦＧＦ２、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｈｅｐａｒｉｎ  Ｓｏｄｉｕｍ、Ｋ０２２８８、５ｚ−７−ｏｘｏｚｅａｅｎｏｌ及びＥＧＦを含む培地で半量培地交換を行い、浮遊培養開始後２１日目まで培養した。上記培養条件をコントロールとし、浮遊培養開始６、１０又は１３日目に終濃度が１％となるようにＣｏｒｎｉｎｇ  マトリゲル基底膜マトリックスグロースファクターリデュースト（ＧＦＲ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）を添加した培地で半量培地交換を行った条件と比較した。浮遊培養開始後２１日目に倒立顕微鏡を用いて、得られた細胞塊の明視野観察を行った。【０３８５】
ヒトｉＰＳ細胞株ＨＣ−６＃１０より上記分化誘導法で誘導された浮遊培養開始後２１日目の細胞塊において、浮遊培養開始６日目にマトリゲルを添加した条件では無添加のコントロールに対し細胞塊が大きく成長する一方、表面の嗅上皮様の上皮の割合は低下していた（図３１のＡ、Ｂ）。浮遊培養開始１０日目又は１３日目にマトリゲルを添加した条件では表面の嗅上皮様の上皮がおおいに肥厚し、増殖していた（図３１のＣ、Ｄ）。上記の結果から、細胞塊の製造工程において基底膜標品を添加することにより嗅上皮様組織の成長を促進できることが分かった。またその際の基底膜標品の濃度は、マトリゲルを用いた際には０．５％以上４％以下であることが好ましく、実験操作の点から０．５％以上１．５％以下である際が最も好ましかった。【０３８６】
［実験１８：細胞塊の製造における基底膜標品中での包埋培養の効果の検討］
図３２上段の手順に従って、マトリゲル包埋培養を行った。実験１５に記載の方法で調製した培養１０日目又は培養１３日目の細胞塊を９６ウェルプレートから１５ｍｌチューブへと回収し、５％ＫＳＲ  ｇｆＣＤＭ培地で一度洗浄した後、５％ＫＳＲ  ｇｆＣＤＭ培地が入った浮遊培養用６ｃｍディッシュへと移し、３７℃に置いた。４℃で保冷しておいた保冷剤の上に置いた浮遊培養用６ｃｍディッシュ中に氷上で解凍したマトリゲルを３０μｌずつ滴下し、２０個程度の液滴を作成した。回収した上記細胞塊をワイドボアチップにより１個ずつディッシュ中のマトリゲル内に吐出した後、３７℃に３０分間置き、マトリゲルをゲル化させた。マトリゲルが固まったのち、５％ＫＳＲ  ｇｆＣＤＭに２０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−ＴＳ、２０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ、１０μｇ／ｍｌ  Ｈｅｐａｒｉｎ  Ｓｏｄｉｕｍ、２μＭ  ＩＷＰ−２、１μＭ  ＳＢ４３１５４２、１μＭ  Ｋ０２２８８、３００ｎＭ  ＣＨＩＲ９９０２１、２μＭ  ５ｚ−７−Ｏｘｏｚｅａｅｎｏｌを添加した培地を５ｍｌ加え、培養した（工程（３ｅ）開始）。マトリゲル包埋培養開始後１１日目、分化誘導開始より２１日目に倒立顕微鏡を用いて明視野観察を行った。【０３８７】
その結果、培養１０日目に細胞塊のマトリゲル包埋培養を実施したサンプルでは、嗅上皮様の上皮組織の外側に神経堤細胞又は頭部間葉系細胞様の組織が形成されていた（図３２のＡ）。培養１３日目に包埋培養を実施したサンプルでも同様であった。上記の結果から、マトリゲル包埋培養により嗅上皮と中枢神経系に加え将来の嗅神経鞘細胞となる神経堤細胞又は頭部間葉系組織を備えた細胞塊を形成することができることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【０３８８】
本発明によれば、多能性幹細胞から嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊を低コストに効率よく製造することが可能になる。【０３８９】
【表１】
2020039732.tif 000003
【０３９０】
【表２】
2020039732.tif 000004
【図１】
2020039732.tif 000005
【図２】
2020039732.tif 000006
【図３】
2020039732.tif 000007
【図４】
2020039732.tif 000008
【図５】
2020039732.tif 000009
【図６】
2020039732.tif 000010
【図７】
2020039732.tif 000011
【図８】
2020039732.tif 000012
【図９】
2020039732.tif 000013
【図１０】
2020039732.tif 000014
【図１１】
2020039732.tif 000015
【図１２】
2020039732.tif 000016
【図１３】
2020039732.tif 000017
【図１４】
2020039732.tif 000018
【図１５】
2020039732.tif 000019
【図１６】
2020039732.tif 000020
【図１７】
2020039732.tif 000021
【図１８】
2020039732.tif 000022
【図１９】
2020039732.tif 000023
【図２０】
2020039732.tif 000024
【図２１】
2020039732.tif 000025
【図２２】
2020039732.tif 000026
【図２３】
2020039732.tif 000027
【図２４】
2020039732.tif 000028
【図２５】
2020039732.tif 000029
【図２６】
2020039732.tif 000030
【図２７】
2020039732.tif 000031
【図２８】
2020039732.tif 000032
【図２９】
2020039732.tif 000033
【図３０】
2020039732.tif 000034
【図３１】
2020039732.tif 000035
【図３２】
2020039732.tif 000036
【国際調査報告】
2020039732.tif 000037
2020039732.tif 000038
2020039732.tif 000039
2020039732.tif 000040