(57)【要約】  化学的安定性、特にアルカリに対する安定性が向上した免疫グロブリン結合性タンパク質を提供すること。スタフィロコッカス属細菌由来プロテインＡのドメインＣ等のイムノグロブリン結合ドメインにおける特定位置のアミノ酸残基を他の特定のアミノ酸残基に置換することにより、アルカリに対する安定性を向上させることができ、以て前記課題を解決する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、以下の（１）から（８）より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、免疫グロブリン結合性タンパク質：
（１）配列番号１の２番目のアスパラギン酸に相当するアミノ酸残基がグルタミン酸に置換
（２）配列番号１の４９番目のリジンに相当するアミノ酸残基がメチオニンに置換
（３）配列番号１の２１番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がチロシンに置換
（４）配列番号１の５８番目のリジンに相当するアミノ酸残基がグルタミン酸、バリン、グリシン、またはアスパラギン酸に置換
（５）配列番号１の３番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がイソロイシンまたはスレオニンに置換
（６）配列番号１の１１番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がリジンまたはチロシンに置換
（７）配列番号１の１５番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
（８）配列番号１の４０番目のバリンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換。
【請求項２】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）に記載のタンパク質である、請求項１に記載の免疫グロブリン結合性タンパク質：
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、前記少なくとも１つのアミノ酸置換を有するタンパク質；
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、前記少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、さらに前記少なくとも１つのアミノ酸置換の位置以外の１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含み、かつ、免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において前記少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、前記少なくとも１つのアミノ酸置換が残存したアミノ酸配列を含み、かつ、免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質；
（ｄ）前記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、さらに、以下の（９）から（１３）より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、タンパク質：
（９）配列番号１の２９番目のグリシンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
（１０）配列番号１の４番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアルギニンに置換
（１１）配列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基がグルタミン酸に置換
（１２）配列番号１の６番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がアスパラギン酸に置換
（１３）配列番号１の４２番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアルギニンに置換。
【請求項３】
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、以下の（３−１）および／または（４−１）に示すアミノ酸置換を少なくとも有する、請求項２に記載の免疫グロブリン結合性タンパク質：
（３−１）配列番号１の２１番目のアスパラギンがチロシンに置換
（４−１）配列番号１の５８番目のリジンがグルタミン酸に置換。
【請求項４】
配列番号８、９、１３、１５、１７、１９、および２１のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の免疫グロブリン結合性タンパク質。
【請求項５】
配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、以下の（Ｉ）から（Ｖ）より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、請求項３に記載の免疫グロブリン結合性タンパク質：
（Ｉ）配列番号１７の３番目のアスパラギンがイソロイシンまたはスレオニンに置換
（ＩＩ）配列番号１７の１１番目のアスパラギンがリジンまたはチロシンに置換
（ＩＩＩ）配列番号１７の５８番目のグルタミン酸がバリン、グリシン、またはアスパラギン酸に置換
（ＩＶ）配列番号１７の１５番目のグルタミン酸がアラニンに置換
（Ｖ）配列番号１７の４０番目のバリンがアラニンに置換。
【請求項６】
配列番号２８から３２、３４、３５、および３７から４０のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の免疫グロブリン結合性タンパク質。
【請求項７】
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、以下の（２−１）に示すアミノ酸置換を少なくとも有する、請求項２に記載の免疫グロブリン結合性タンパク質：
（２−１）配列番号１の４９番目のリジンがメチオニンに置換。
【請求項８】
配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の免疫グロブリン結合性タンパク質。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか１項に記載の免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項９に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１１】
請求項９に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１０に記載の発現ベクターを有する形質転換体。
【請求項１２】
エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である、請求項１１に記載の形質転換体。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載の形質転換体を培養することにより請求項１から８のいずれか１項に記載の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現させる工程と、発現した前記タンパク質を回収する工程とを含む、免疫グロブリン結合性タンパク質の製造方法。
【請求項１４】
不溶性担体と、該不溶性担体に固定化された請求項１から８のいずれか１項に記載の免疫グロブリン結合性タンパク質とを備える、免疫グロブリン吸着剤。
【請求項１５】
請求項１４に記載の吸着剤を充填したカラムに免疫グロブリンを含む溶液を添加して当該免疫グロブリンを前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着した免疫グロブリンを溶出させる工程とを含む、免疫グロブリンの分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫グロブリンに特異的に結合するタンパク質に関する。より詳しくは、本発明は、アルカリに対する安定性に優れた免疫グロブリン結合性タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体医薬は生体内の免疫機能を担う分子である抗体（免疫グロブリン）を利用した医薬である。抗体医薬は抗体が有する可変領域の多様性により標的分子に対し高い特異性と親和性をもって結合する。そのため抗体医薬は副作用が少なく、また、近年では適応疾患が広がってきていることもあり市場が急速に拡大している。【０００３】
抗体医薬の製造は培養工程と精製工程を含み、培養工程では生産性を向上させるために抗体産生細胞の改質や培養条件の最適化が図られている。また、精製工程では粗精製としてアフィニティークロマトグラフィーが採用され、その後の中間精製、最終精製、およびウイルス除去を経て製剤化される。【０００４】
精製工程では抗体分子を特異的に認識するアフィニティー担体が用いられ、当該担体で用いられるリガンドタンパク質には抗体（免疫グロブリン）に結合する性質を有したプロテインＡやプロテインＧが用いられている。抗体医薬を製造する際は、その生産コストを低く保つため、これらアフィニティー担体は複数回使用され、使用後は当該担体に残存した不純物を除去する工程を行なう。前記不純物を除去する工程では、通常、水酸化ナトリウムを用いた定置洗浄を行ない、この工程によりアフィニティー担体を再生させる。従って、前記リガンドタンパク質は、前記工程を行なっても、抗体への結合性が維持されるだけの化学的安定性を有する必要がある。【０００５】
化学的安定性を有する、アフィニティー担体で用いられるリガンドタンパク質の一例としては、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来のプロテインＡ（ＳｐＡ）のドメインＣのアミノ酸配列を利用したアルカリ安定クロマトグラフィーリガンド（特許文献１）や、前記プロテインＡのドメインＢ、ドメインＣ、ドメインＺのうち、いずれかのドメインの一部のアミノ酸配列が欠失したアミノ酸配列から構成されるアフィニティークロマトグラフィーリガンド（特許文献２）が挙げられる。また、ドメインＺにおいて２９番目のグリシンをアラニンに置換することにより、構造が安定化することが知られている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２０１０−５０４７５４号公報
【特許文献２】特開２０１２−２５４９８１号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｂｊｏｒｎ  Ｎｉｌｓｓｏｎ他，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１（２），１０７−１１３，１９８７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題はアルカリに対する安定性が向上した免疫グロブリン結合性タンパク質を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意検討した結果、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来のプロテインＡ（ＳｐＡ）のドメインＣにおける安定性向上に関与したアミノ酸残基を特定し、当該アミノ酸残基を他の特定のアミノ酸残基に置換することでアルカリに対して優れた安定性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。【００１０】
すなわち、本発明は以下の態様を包含する。【００１１】
［１］
プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、以下の（１）から（８）より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、免疫グロブリン結合性タンパク質：
（１）配列番号１の２番目のアスパラギン酸に相当するアミノ酸残基がグルタミン酸に置換
（２）配列番号１の４９番目のリジンに相当するアミノ酸残基がメチオニンに置換
（３）配列番号１の２１番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がチロシンに置換
（４）配列番号１の５８番目のリジンに相当するアミノ酸残基がグルタミン酸、バリン、グリシン、またはアスパラギン酸に置換
（５）配列番号１の３番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がイソロイシンまたはスレオニンに置換
（６）配列番号１の１１番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がリジンまたはチロシンに置換
（７）配列番号１の１５番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
（８）配列番号１の４０番目のバリンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換。
［２］
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）に記載のタンパク質である、前記免疫グロブリン結合性タンパク質：
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、前記少なくとも１つのアミノ酸置換を有するタンパク質；
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、前記少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、さらに前記少なくとも１つのアミノ酸置換の位置以外の１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含み、かつ、免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において前記少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、前記少なくとも１つのアミノ酸置換が残存したアミノ酸配列を含み、かつ、免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質；
（ｄ）前記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、さらに、以下の（９）から（１３）より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、タンパク質：
（９）配列番号１の２９番目のグリシンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
（１０）配列番号１の４番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアルギニンに置換
（１１）配列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基がグルタミン酸に置換
（１２）配列番号１の６番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がアスパラギン酸に置換
（１３）配列番号１の４２番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアルギニンに置換。
［３］
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、以下の（３−１）および／または（４−１）に示すアミノ酸置換を少なくとも有する、前記免疫グロブリン結合性タンパク質：
（３−１）配列番号１の２１番目のアスパラギンがチロシンに置換
（４−１）配列番号１の５８番目のリジンがグルタミン酸に置換。
［４］
配列番号８、９、１３、１５、１７、１９、および２１のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む、前記免疫グロブリン結合性タンパク質。
［５］
配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、以下の（Ｉ）から（Ｖ）より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、前記免疫グロブリン結合性タンパク質：
（Ｉ）配列番号１７の３番目のアスパラギンがイソロイシンまたはスレオニンに置換
（ＩＩ）配列番号１７の１１番目のアスパラギンがリジンまたはチロシンに置換
（ＩＩＩ）配列番号１７の５８番目のグルタミン酸がバリン、グリシン、またはアスパラギン酸に置換
（ＩＶ）配列番号１７の１５番目のグルタミン酸がアラニンに置換
（Ｖ）配列番号１７の４０番目のバリンがアラニンに置換。
［６］
配列番号２８から３２、３４、３５、および３７から４０のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む、前記免疫グロブリン結合性タンパク質。
［７］
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、以下の（２−１）に示すアミノ酸置換を少なくとも有する、前記免疫グロブリン結合性タンパク質：
（２−１）配列番号１の４９番目のリジンがメチオニンに置換。
［８］
配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む、前記免疫グロブリン結合性タンパク質。
［９］
前記免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［１０］
前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
［１１］
前記ポリヌクレオチドまたは前記発現ベクターを有する形質転換体。
［１２］
エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である、前記形質転換体。
［１３］
前記形質転換体を培養することにより前記免疫グロブリン結合性タンパク質を発現させる工程と、発現した前記タンパク質を回収する工程とを含む、免疫グロブリン結合性タンパク質の製造方法。
［１４］
不溶性担体と、該不溶性担体に固定化された前記免疫グロブリン結合性タンパク質とを備える、免疫グロブリン吸着剤。
［１５］
前記吸着剤を充填したカラムに免疫グロブリンを含む溶液を添加して当該免疫グロブリンを前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着した免疫グロブリンを溶出させる工程とを含む、免疫グロブリンの分離方法。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、特定の免疫グロブリン結合性タンパク質である。「免疫グロブリン結合性タンパク質」とは、免疫グロブリンに対する結合性を有するタンパク質を意味する。すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、免疫グロブリンに対する結合性を有する。本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、具体的には、免疫グロブリンのＦｃ領域に対する結合性を有するものであってもよい。免疫グロブリンに対する結合性を、「免疫グロブリン結合活性」または「抗体結合活性」ともいう。免疫グロブリン結合活性は、例えば、ＥＬＩＳＡ法により測定することができる。ＥＬＩＳＡ法は、例えば、実施例に記載の条件で実施することができる。
【００１４】
本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質としては、プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、特定位置におけるアミノ酸置換を有するタンパク質が挙げられる。プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列であって、特定位置におけるアミノ酸置換を有さないものを、「非改変型アミノ酸配列」ともいう。プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列であって、特定位置におけるアミノ酸置換を有するものを、「改変型アミノ酸配列」ともいう。すなわち、改変型アミノ酸配列は、特定位置におけるアミノ酸置換を有すること以外は非改変型アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列であってよい。また、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、特定位置におけるアミノ酸置換を有すること以外は非改変型アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含むタンパク質であってよい。また、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、改変型アミノ酸配列を含むタンパク質であってよい。非改変型アミノ酸配列は、天然に見出されるアミノ酸配列であってもよく、そうでなくてもよい。非改変型アミノ酸配列は、例えば、所望の性質を有するように改変されていてもよい。非改変型アミノ酸配列は、例えば、特定位置におけるアミノ酸置換以外のアミノ酸置換を有していてもよい。
【００１５】
プロテインＡとしては、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来のプロテインＡ（ＳｐＡ）が挙げられる。スタフィロコッカス属細菌としては、スタフィロコッカス・オーレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）が挙げられる。イムノグロブリン結合ドメインとしては、ドメインＣ、ドメインＥ、ドメインＤ、ドメインＡ、ドメインＢが挙げられる。イムノグロブリン結合ドメインとしては、特に、ドメインＣが挙げられる。スタフィロコッカス・オーレウス由来のＳｐＡのドメインＣとしては、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＡＡ２６６７６の２７０番目から３２７番目までのアミノ酸残基が挙げられる。当該ドメインＣのアミノ酸配列を配列番号１に示す。また、スタフィロコッカス・オーレウス由来のＳｐＡのドメインＥとしては、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＡＡ２６６７６の３７番目から９２番目までのアミノ酸残基が挙げられる。また、スタフィロコッカス・オーレウス由来のＳｐＡのドメインＤとしては、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＡＡ２６６７６の９３番目から１５３番目のアミノ酸残基が挙げられる。また、スタフィロコッカス・オーレウス由来のＳｐＡのドメインＡとしては、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＡＡ２６６７６の１５４番目から２１１番目のアミノ酸残基が挙げられる。また、スタフィロコッカス・オーレウス由来のＳｐＡのドメインＢとしては、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＡＡ２６６７６の２１２番目から２６９番目のアミノ酸残基が挙げられる。すなわち、非改変型アミノ酸配列として、具体的には、配列番号１に記載のアミノ酸配列等の上記例示したイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列が挙げられる。また、改変型アミノ酸配列として、具体的には、配列番号１に記載のアミノ酸配列等の上記例示したイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列において特定位置におけるアミノ酸置換を有するアミノ酸配列が挙げられる。すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質として、具体的には、配列番号１に記載のアミノ酸配列等の上記例示したイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、特定位置におけるアミノ酸置換を有するタンパク質が挙げられる。言い換えると、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、特定位置におけるアミノ酸置換を有すること以外は配列番号１に記載のアミノ酸配列等の上記例示したイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含むタンパク質であってよい。
【００１６】
タンパク質がアミノ酸配列を含むことを、「タンパク質がアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を含む」ともいう。タンパク質またはアミノ酸配列がアミノ酸置換を有することを、「タンパク質またはアミノ酸配列においてアミノ酸置換が生じる」ともいう。タンパク質またはアミノ酸配列を構成するアミノ酸を、「アミノ酸残基」ともいう。
【００１７】
前記特定位置におけるアミノ酸置換は、具体的には、Ａｓｐ２Ｇｌｕ（この表記は配列番号１の２番目のアスパラギン酸に相当するアミノ酸残基がグルタミン酸に置換されていることを表す、以下同じ）、Ｌｙｓ４９Ｍｅｔ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｌｙｓ５８Ｇｌｕ、Ｌｙｓ５８Ｖａｌ、Ｌｙｓ５８Ｇｌｙ、Ｌｙｓ５８Ａｓｐ、Ａｓｎ３Ｉｌｅ、Ａｓｎ３Ｔｈｒ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ａｓｎ１１Ｔｙｒ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、およびＶａｌ４０Ａｌａから選択される少なくとも一つのアミノ酸置換である。言い換えると、前記特定位置におけるアミノ酸置換は、具体的には、（１）Ａｓｐ２Ｇｌｕ、（２）Ｌｙｓ４９Ｍｅｔ、（３）Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、（４）Ｌｙｓ５８Ｇｌｕ、Ｌｙｓ５８Ｖａｌ、Ｌｙｓ５８Ｇｌｙ、またはＬｙｓ５８Ａｓｐ（５）Ａｓｎ３ＩｌｅまたはＡｓｎ３Ｔｈｒ、（６）Ａｓｎ１１ＬｙｓまたはＡｓｎ１１Ｔｙｒ、（７）Ｇｌｕ１５Ａｌａ、および（８）Ｖａｌ４０Ａｌａから選択される少なくとも一つのアミノ酸置換である。本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、これらのアミノ酸置換から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つのアミノ酸置換を有していてよい。本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、少なくとも、Ａｓｐ２Ｇｌｕおよび／またはＬｙｓ４９Ｍｅｔのアミノ酸置換を有していてもよい。また、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、少なくとも、Ａｓｐ２Ｇｌｕ、Ｌｙｓ４９Ｍｅｔ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、およびＬｙｓ５８Ｇｌｕから選択される少なくとも一つのアミノ酸置換を有していてもよい。また、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、少なくとも、Ａｓｐ２Ｇｌｕ、Ｌｙｓ４９Ｍｅｔ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｌｙｓ５８Ｇｌｕ、Ｌｙｓ５８Ｖａｌ、Ａｓｎ３Ｉｌｅ、Ａｓｎ３Ｔｈｒ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、およびＡｓｎ１１Ｔｙｒから選択される少なくとも一つのアミノ酸置換を有していてもよい。また、中でも、Ａｓｎ２１ＴｙｒおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕは、アルカリに対する安定性が特に向上したアミノ酸置換である。そのため、Ａｓｎ２１ＴｙｒまたはＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換を少なくとも有する免疫グロブリン結合性タンパク質は、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質の好ましい例である。また、Ａｓｎ２１ＴｙｒおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換を少なくとも有する免疫グロブリン結合性タンパク質は、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質の特に好ましい例である。また、Ｌｙｓ４９Ｍｅｔのアミノ酸置換を少なくとも有する免疫グロブリン結合性タンパク質も、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質の好ましい例である。
【００１８】
なお、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、少なくとも１つのその他のアミノ酸置換をさらに有してもよい。他のアミノ酸置換としては、構造安定性が増すことが知られているＧｌｙ２９Ａｌａのアミノ酸置換（Ｂｊｏｒｎ  Ｎｉｌｓｓｏｎ他，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１（２），１０７−１１３，１９８７）が挙げられる。また、他のアミノ酸置換としては、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ６Ａｓｐ、Ｌｙｓ４２Ａｒｇのアミノ酸置換も挙げられる。すなわち、改変型アミノ酸配列としては、上記例示した非改変型アミノ酸配列（例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列）において前記特定位置におけるアミノ酸置換およびＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列も挙げられる。すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質としては、上記例示した非改変型アミノ酸配列（例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列）を含み、ただし当該アミノ酸配列において、前記特定位置におけるアミノ酸置換およびＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換を有するタンパク質も挙げられる。言い換えると、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、前記特定位置におけるアミノ酸置換およびＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換を有すること以外は上記例示した非改変型アミノ酸配列（例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列）と同一のアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。
【００１９】
本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質が２つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有する場合、それらアミノ酸置換の組み合わせは特に制限されない。
【００２０】
アミノ酸置換の組み合わせとして、具体的には、例えば、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ２１ＴｙｒおよびＧｌｙ２９Ａｌａのアミノ酸置換；Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換；Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換；Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｌｙｓ４９ＭｅｔおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換；Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換；Ａｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換；Ａｓｎ３Ｔｈｒ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換；Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換；Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｔｙｒ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換；Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｖａｌのアミノ酸置換；Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換；Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｙのアミノ酸置換；Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換；Ａｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換；Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換；Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｖａｌのアミノ酸置換が挙げられる。
【００２１】
すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質として、より具体的には、下記の免疫グロブリン結合性タンパク質が挙げられる。これらの免疫グロブリン結合性タンパク質はアルカリに対する安定性が向上する点で好ましい。配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＡｓｎ２１Ｔｙｒのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号９に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＬｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ２１ＴｙｒおよびＧｌｙ２９Ａｌａのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＬｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＬｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＬｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｌｙｓ４９ＭｅｔおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号１９に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＬｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号２１に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＡｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号２８に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＡｓｎ３Ｔｈｒ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号２９に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＬｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号３０に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＬｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｔｙｒ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号３１に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＬｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｖａｌのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号３２に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＬｙｓ４９Ｍｅｔのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＬｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号３４に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＬｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｙのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号３５に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＬｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号３７に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＡｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号３８に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＬｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号３９に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＬｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｖａｌのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。
【００２２】
また、アミノ酸置換の組み合わせとして、具体的には、例えば、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕと、以下の（Ｉ）から（Ｖ）より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換との組み合わせが挙げられる：
（Ｉ）Ａｓｎ３ＩｌｅまたはＡｓｎ３Ｔｈｒ
（ＩＩ）Ａｓｎ１１ＬｙｓまたはＡｓｎ１１Ｔｙｒ
（ＩＩＩ）Ｌｙｓ５８Ｖａｌ、Ｌｙｓ５８Ｇｌｙ、またはＬｙｓ５８Ａｓｐ
（ＩＶ）Ｇｌｕ１５Ａｌａ
（Ｖ）Ｖａｌ４０Ａｌａ。
【００２３】
すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質として、より具体的には、配列番号１７に記載のアミノ酸配列（配列番号１に記載のアミノ酸配列においてＬｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列）を含み、ただし当該アミノ酸配列において、前記（Ｉ）から（Ｖ）より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有するタンパク質も挙げられる。そのようなタンパク質としては、特に、上述した配列番号２８から３２、３４、３５、および３７から４０のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質が挙げられる。なお、ここで（ＩＩＩ）を選択した場合、配列番号１７に含まれるＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換はＬｙｓ５８Ｖａｌ等のアミノ酸置換で上書きされるため、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質はＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換を有さない。（Ｉ）から（Ｖ）のアミノ酸置換は、いずれも、配列番号１７を参照配列として適宜読み替えることができる。すなわち、例えば、ここでいう「Ｌｙｓ５８Ｖａｌ」は、配列番号１７の５８番目のグルタミン酸がバリンに置換されるアミノ酸置換として読み替えることができる。他のアミノ酸配列を参照配列とする場合も同様である。
【００２４】
本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質としては、特に、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、以下の（Ａ１）から（Ａ３）より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有するタンパク質も挙げられる：
（Ａ１）Ａｓｎ３ＩｌｅまたはＡｓｎ３Ｔｈｒ
（Ａ２）Ａｓｎ１１ＬｙｓまたはＡｓｎ１１Ｔｙｒ
（Ａ３）Ｌｙｓ５８Ｖａｌ。
【００２５】
また、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質としては、特に、配列番号３０に記載のアミノ酸配列（配列番号１に記載のアミノ酸配列においてＬｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列）を含み、ただし当該アミノ酸配列において、以下の（Ｂ１）および／または（Ｂ２）のアミノ酸置換を有するタンパク質も挙げられる：
（Ｂ１）Ｇｌｕ１５Ａｌａ
（Ｂ２）Ｌｙｓ５８Ｇｌｙ。
【００２６】
また、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質としては、特に、配列番号３４に記載のアミノ酸配列（配列番号１に記載のアミノ酸配列においてＬｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列）を含み、ただし当該アミノ酸配列において、以下の（Ｃ１）から（Ｃ３）より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有するタンパク質も挙げられる：
（Ｃ１）Ａｓｎ３Ｉｌｅ
（Ｃ２）Ｌｙｓ５８ＶａｌまたはＬｙｓ５８Ａｓｐ
（Ｃ３）Ｖａｌ４０Ａｌａ。
【００２７】
配列番号１に記載のアミノ酸配列において上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）を有するアミノ酸配列を、「配列番号１由来置換アミノ酸配列」ともいう。配列番号１由来置換アミノ酸配列は、言い換えると、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）が生じた配列番号１に記載のアミノ酸配列である。また、配列番号１由来置換アミノ酸配列は、言い換えると、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）を有すること以外は配列番号１に記載のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列である。
【００２８】
また、改変型アミノ酸配列としては、上記例示した改変型アミノ酸配列（例えば配列番号１由来置換アミノ酸配列）のバリアント配列も挙げられる。すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質としては、上記例示した改変型アミノ酸配列（例えば配列番号１由来置換アミノ酸配列）のバリアント配列を含み、かつ、免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質も挙げられる。以下、配列番号１由来置換アミノ酸配列のバリアント配列の場合を例示して説明するが、当該説明は任意の改変型アミノ酸配列のバリアント配列にも準用できる。
【００２９】
配列番号１由来置換アミノ酸配列のバリアント配列は、前記特定位置におけるアミノ酸置換が残存するように（すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質が前記特定位置におけるアミノ酸置換を有するように）設定されるものとする。また、配列番号１由来置換アミノ酸配列のバリアント配列は、Ｇｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換が残存するように（すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質がＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換を有するように）設定されてもよい。また、配列番号１由来置換アミノ酸配列のバリアント配列は、例えば、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）から選択される、配列番号１由来置換アミノ酸配列が有さない１つ以上のアミノ酸置換を追加的に有していてもよい。例えば、配列番号１由来置換アミノ酸配列がＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換を有さない場合に、配列番号１由来置換アミノ酸配列のバリアント配列がＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換を有していてもよい。
【００３０】
配列番号１由来置換アミノ酸配列のバリアント配列としては、配列番号１由来置換アミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列が挙げられる。すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、免疫グロブリン結合活性を有する限り、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）に加えて、さらに、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含んでいてもよい。すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）を有し、さらに１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含み、かつ、免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質も挙げられる。言い換えると、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）を有し、さらに１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むこと以外は配列番号１と同一のアミノ酸配列を含み、かつ、免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質であってもよい。なお、上記のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加は、前記特定位置におけるアミノ酸置換が残存するように選択されるものとする。すなわち、上記のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加は、例えば、前記特定位置以外の位置に生じてよい。また、上記のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加は、Ｇｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換が残存するように選択されてもよい。すなわち、上記のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加は、例えば、Ｇｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換以外の位置に生じてもよい。また、上記のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加は、例えば、上記例示したアミノ酸置換から選択される、配列番号１由来置換アミノ酸配列が有さない１つ以上のアミノ酸置換を含んでいてもよい。前記「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には、例えば、１から３０個、１から２０個、１から１０個、１から９個、１から８個、１から７個、１から６個、１から５個、１から４個、１から３個、１から２個、１個のいずれかを意味する。上記のアミノ酸残基の置換の一例としては、物理的性質および／または化学的性質が類似したアミノ酸間で置換が生じる保守的置換が挙げられる。保守的置換の場合、一般に、置換が生じているものと置換が生じていないものとの間でタンパク質の機能が維持されることが当業者において知られている。保守的置換の一例としては、グリシンとアラニン間、セリンとプロリン間、またはグルタミン酸とアラニン間での置換が挙げられる（タンパク質の構造と機能，メディカル・サイエンス・インターナショナル社，９，２００５）。また、上記のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加には、例えば、タンパク質またはそれをコードする遺伝子が由来する微生物の個体差や種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（ｍｕｔａｎｔ又はｖａｒｉａｎｔ）によって生じるものも含まれる。
【００３１】
また、配列番号１由来置換アミノ酸配列のバリアント配列としては、配列番号１由来置換アミノ酸配列に対して高い相同性を有するアミノ酸配列も挙げられる。すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列において上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）を有するアミノ酸配列に対して高い相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質も挙げられる。なお、上記のような相同性の範囲でのアミノ酸配列の変化は、前記特定位置におけるアミノ酸置換が残存するように選択されるものとする。すなわち、上記のような相同性の範囲でのアミノ酸配列の変化は、例えば、前記特定位置以外の位置に生じてよい。また、上記のような相同性の範囲でのアミノ酸配列の変化は、Ｇｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換が残存するように選択されてもよい。すなわち、上記のような相同性の範囲でのアミノ酸配列の変化は、例えば、Ｇｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換以外の位置に生じてもよい。また、上記のような相同性の範囲でのアミノ酸配列の変化は、例えば、上記例示したアミノ酸置換から選択される、配列番号１由来置換アミノ酸配列が有さない１つ以上のアミノ酸置換を含んでいてもよい。「高い相同性」とは、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の相同性を意味してよい。「相同性」とは、類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）または同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を意味してよい。「相同性」とは、特に、同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を意味してもよい。アミノ酸配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ等のアラインメントプログラムを利用して決定することができる。例えば、アミノ酸配列の同一性とは、ｂｌａｓｔｐを用いて算出されるアミノ酸配列間の同一性を意味してよく、具体的には、ｂｌａｓｔｐをデフォルトのパラメータで用いて算出されるアミノ酸配列間の同一性を意味してもよい。
【００３２】
また、改変型アミノ酸配列としては、上記例示したバリアント配列において、さらに、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列も挙げられる。例えば、改変型アミノ酸配列は、少なくとも前記特定位置におけるアミノ酸置換を有するバリアント配列において、さらに、Ｇｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列であってよい。
【００３３】
また、非改変型アミノ酸配列としては、上記例示した非改変型アミノ酸配列（例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列）のバリアント配列も挙げられる。すなわち、改変型アミノ酸配列としては、上記例示した非改変型アミノ酸配列（例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列）のバリアント配列において、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）を有するアミノ酸配列も挙げられる。すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質としては、上記例示した非改変型アミノ酸配列（例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列）のバリアント配列を含み、ただし当該バリアント配列において、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）を有し、かつ、免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質も挙げられる。言い換えると、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、上記例示したアミノ酸置換を有すること以外は上記例示した非改変型アミノ酸配列（例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列）のバリアント配列と同一のアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。以下、配列番号１に記載のアミノ酸配列のバリアント配列の場合を例示して説明するが、当該説明は任意の非改変型アミノ酸配列のバリアント配列にも準用できる。
【００３４】
配列番号１に記載のアミノ酸配列のバリアント配列としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列が挙げられる。すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含み、さらに上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）を有し、かつ、免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質も挙げられる。上記のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加は、例えば、前記特定位置以外の位置に生じてよい。また、上記のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加は、例えば、Ｇｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換以外の位置に生じてもよい。
【００３５】
配列番号１に記載のアミノ酸配列のバリアント配列としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して高い相同性を有するアミノ酸配列も挙げられる。すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して高い相同性を有するアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列（配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して高い相同性を有するアミノ酸配列）において、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）を有し、かつ、免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質も挙げられる。上記のような相同性の範囲でのアミノ酸残基の変化は、例えば、前記特定位置以外の位置に生じてよい。また、上記のような相同性の範囲でのアミノ酸残基の変化は、例えば、Ｇｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換以外の位置に生じてもよい。
【００３６】
その他、配列番号１に記載のアミノ酸配列のバリアント配列については、配列番号１由来置換アミノ酸配列のバリアント配列についての記載を準用できる。
【００３７】
「配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＸ番目のアミノ酸」とは、配列番号１に記載のアミノ酸配列のＮ末端から数えてＸ位の位置に存在するアミノ酸を意味する。或るアミノ酸配列における「配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＸ番目のアミノ酸に相当するアミノ酸残基」とは、当該或るアミノ酸配列におけるアミノ酸残基であって、当該或るアミノ酸配列と配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＸ番目のアミノ酸と同一の位置に配列されるアミノ酸残基を意味する。例えば、Ａｓｐ２Ｇｌｕのアミノ酸置換の場合、或るアミノ酸配列における「配列番号１の２番目のアスパラギン酸に相当するアミノ酸残基」とは、当該或るアミノ酸配列におけるアミノ酸残基であって、当該或るアミノ酸配列と配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて配列番号１に示すアミノ酸配列における２番目のアスパラギン酸と同一の位置に配列されるアミノ酸残基を意味する。なお、配列番号１に記載のアミノ酸配列における「配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＸ番目のアミノ酸に相当するアミノ酸残基」とは、配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＸ番目のアミノ酸そのものを意味する。すなわち、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）の位置は、必ずしも本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質における絶対的な位置を示すものではなく、配列番号１に記載のアミノ酸配列に基づく相対的な位置を示すものである。すなわち、例えば、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質が、上記例示したアミノ酸置換の位置よりもＮ末端側にアミノ酸残基の挿入、欠失、または付加を含む場合、それに応じて当該アミノ酸置換の絶対的な位置は変動し得る。本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質における上記例示したアミノ酸置換の位置は、例えば、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質のアミノ酸配列と配列番号１に記載のアミノ酸配列とのアラインメントにより特定することができる。アラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ等のアラインメントプログラムを利用して実施することができる。配列番号１に記載のアミノ酸配列のバリアント配列等の任意のアミノ酸配列における上記例示したアミノ酸置換の位置についても同様である。また、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）の置換前のアミノ酸残基は、配列番号１に記載のアミノ酸配列における置換前のアミノ酸残基の種類を示すものであって、配列番号１に記載のアミノ酸配列以外の非改変型アミノ酸配列においては保存されていてもよく、いなくてもよい。
【００３８】
本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、改変型アミノ酸配列を１個のみ含んでいてもよく、改変型アミノ酸配列を複数個含んでいてもよい。本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、改変型アミノ酸配列を２個以上、３個以上、４個以上、または５個以上含んでいてもよく、１０個以下、７個以下、５個以下、４個以下、３個以下、または２個以下含んでいてもよく、それらの矛盾しない組み合わせの個数含んでいてもよい。本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質が複数個の改変型アミノ酸配列を含む場合、それら複数個の改変型アミノ酸配列のアミノ酸配列は同一であってもよく、そうでなくてもよい。それら複数個の改変型アミノ酸配列は、例えば、適切なリンカーを介して互いに連結されていてよい。
【００３９】
本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、改変型アミノ酸配列からなるものであってもよく、他のアミノ酸配列（例えばオリゴペプチド）をさらに含んでいでもよい。すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、そのＮ末端側またはＣ末端側に他のアミノ酸配列をさらに含んでいでもよい。言い換えると、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質においては、例えば、改変型アミノ酸配列のＮ末端側またはＣ末端側に他のアミノ酸配列が付加されていてもよい。他のアミノ酸配列は、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質の免疫グロブリン結合性や安定性を損なわない限り、特に制限されない。例えば、他のアミノ酸配列の種類や長さは、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質の免疫グロブリン結合性や安定性を損なわない限り、特に制限されない。
【００４０】
本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、選択したイムノグロブリン結合ドメインに加えて、他のイムノグロブリン結合ドメインの一部を含んでいてもよい。例えば、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質がドメインＣの改変型アミノ酸配列を含む場合、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、さらに、プロテインＡのドメインＣのＮ末端側領域（ドメインＥ、ドメインＤ、ドメインＡ、ドメインＢ／Ｚ）の一部を含んでいてもよく、プロテインＡのドメインＣのＣ末端側領域の一部を含んでいてもよい。
【００４１】
また、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、そのＮ末端側またはＣ末端側に、目的物を特異的に検出または分離する目的で有用なオリゴペプチドを含んでいてもよい。そのようなオリゴペプチドとしては、ポリヒスチジンやポリアルギニンが挙げられる。
【００４２】
また、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、そのＮ末端側またはＣ末端側に、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質をクロマトグラフィー用の支持体等の固相に固定化する際に有用なオリゴペプチドを含んでいてもよい。そのようなオリゴペプチドとしては、リジンやシステインを含むオリゴペプチドが挙げられる。
【００４３】
本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質が上記のような他のアミノ酸配列を含む場合、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、予め他のアミノ酸配列を含む形態で製造されてもよいし、別途製造された上記のような他のアミノ酸配列が付加されてもよい。本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質が上記のような他のアミノ酸配列を含む場合、典型的には、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、上記のような他のアミノ酸配列を含む本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質の全長アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドから発現させることにより、製造することができる。すなわち、例えば、他のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質（例えば他のアミノ酸配列を含まないもの）をコードするポリヌクレオチドとを、他のアミノ酸配列が本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加されるように連結し、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現させてもよい。また、例えば、化学的に合成した他のアミノ酸配列を本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質（例えば他のアミノ酸配列を含まないもの）のＮ末端側またはＣ末端側に化学的に結合させてもよい。
【００４４】
本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドから発現することにより、製造することができる。本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、「本発明のポリヌクレオチド」ともいう。本発明のポリヌクレオチドは、具体的には、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであってよい。
【００４５】
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、化学合成法により、または、ＰＣＲ法等のＤＮＡ増幅法により、取得できる。ＤＮＡ増幅法は、例えば、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするヌクレオチド配列等の増幅すべきヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを鋳型として実施することができる。鋳型とするポリヌクレオチドとしては、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現する生物のゲノムＤＮＡ、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質のｃＤＮＡ、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、例えば、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質のアミノ酸配列からの変換により設計することができる。アミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換する際には、標準のコドンテーブルを使用することができるが、本発明のポリヌクレオチドで形質転換する宿主におけるコドンの使用頻度を考慮して変換するのが好ましい。一例として、宿主がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の場合は、アルギニン（Ａｒｇ）ではＡＧＡ／ＡＧＧ／ＣＧＧ／ＣＧＡが、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡが、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＣＴＡが、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＡが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＣが、それぞれ使用頻度が少ないため（いわゆるレアコドンであるため）、それらのコドンを避けるように変換してよい。コドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のウェブサイトにあるＣｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅなど）を利用することによっても可能である。
【００４６】
また、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）を有さない免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドに、コードされるタンパク質が上記例示したアミノ酸置換を有するように変異を導入することによっても、取得できる。上記例示したアミノ酸置換を有さない免疫グロブリン結合性タンパク質としては、上記例示した非改変型アミノ酸配列（例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列またはそのバリアント配列）を含むタンパク質が挙げられる。上記例示したアミノ酸置換を有さない免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、例えば、化学合成法により、または、ＰＣＲ法等のＤＮＡ増幅法により、取得できる。本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質が２つ以上のアミノ酸置換を有する場合、それらのアミノ酸置換は、例えば、同時に、あるいは順次、導入されてよい。例えば、上記例示したアミノ酸置換から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドに、コードされるタンパク質が上記例示したアミノ酸置換から選択される別の少なくとも１つのアミノ酸置換を有するように変異を導入してもよい。また、或る位置のアミノ酸残基を２回以上改変してもよい。例えば、既にＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質にさらにＬｙｓ５８Ｖａｌのアミノ酸置換を導入してもよい。
【００４７】
また、ポリヌクレオチドは、上記例示したアミノ酸置換を生じる変異に限られず、バリアント配列の構築のための変異等の任意の変異を導入して、本発明のポリヌクレオチドまたはそれを取得するための材料として利用してよい。
【００４８】
ポリヌクレオチドへ変異を導入する方法としては、エラープローンＰＣＲ法が挙げられる。エラープローンＰＣＲ法における反応条件は、ポリヌクレオチドに所望の変異を導入できる条件であれば特に制限されない。例えば、基質である４種類のデオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＧＴＰ）の濃度を不均一にし、ＭｎＣｌ２を０．０１から１０ｍＭ（好ましくは０．１から１ｍＭ）の濃度でＰＣＲ反応液に添加してＰＣＲを行なうことで、ポリヌクレオチドに変異を導入することができる。また、ポリヌクレオチドへ変異を導入する方法としては、エラープローンＰＣＲ法以外にも、ポリヌクレオチドに変異原となる薬剤を作用させることにより、またはポリヌクレオチドに紫外線を照射することにより、ポリヌクレオチドに変異を導入する方法が挙げられる。変異原となる薬剤としては、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン等の、当業者が通常用いる変異原性薬剤が挙げられる。このようなポリヌクレオチドへ変異を導入する方法は、上記例示したアミノ酸置換の導入に限られず、バリアント配列の構築（例えば、アミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加の導入や、上記のような相同性の範囲でのアミノ酸配列の変化）にも利用できる。
【００４９】
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、その全長配列を一括して取得してもよく、その部分配列をそれぞれ取得して連結することにより取得してもよい。上記のような本発明のポリヌクレオチドを取得する手法についての説明は、その全長配列を一括して取得する場合に限られず、その部分配列を取得する場合にも準用できる。
【００５０】
本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、具体的には、例えば、本発明のポリヌクレオチドを有する形質転換体に本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現させることにより製造できる。本発明のポリヌクレオチドを有する形質転換体を、「本発明の形質転換体」ともいう。本発明の形質転換体は、本発明のポリヌクレオチドを有することに依拠して、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現することができる。すなわち、本発明の形質転換体は、言い換えると、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現可能な形質転換体である。
【００５１】
本発明の形質転換体は、例えば、本発明のポリヌクレオチドを用いて宿主を形質転換することにより得られる。すなわち、本発明の形質転換体は、例えば、本発明のポリヌクレオチドで形質転換された宿主であってよく、本発明のポリヌクレオチドを有する宿主であってよく、また、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現可能な宿主であってよい。宿主は、本発明のポリヌクレオチドで形質転換されることにより本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現可能となるものであれば特に制限されない。宿主としては、動物細胞、昆虫細胞、微生物が挙げられる。動物細胞としては、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨＥＫ２９３細胞が挙げられる。昆虫細胞としては、Ｓｆ９、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４が挙げられる。微生物としては、酵母や細菌が挙げられる。酵母としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属酵母、Ｐｉｃｈｉａ  Ｐａｓｔｏｒｉｓ等のＰｉｃｈｉａ属酵母、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ等のＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属酵母が挙げられる。細菌としては、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌が挙げられる。エシェリヒア・コリとしては、ＪＭ１０９株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株が挙げられる。なお、酵母やエシェリヒア・コリを宿主として用いると生産性の面で好ましく、エシェリヒア・コリを宿主として用いるとさらに好ましい。
【００５２】
本発明のポリヌクレオチドは、発現可能に本発明の形質転換体に保持されていればよい。本発明のポリヌクレオチドは、具体的には、宿主で機能するプロモーターの制御下で発現するように保持されていればよい。宿主で機能するプロモーターとしては、例えば、エシェリヒア・コリを宿主とする場合は、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｌｐｐプロモーターが挙げられる。
【００５３】
本発明の形質転換体において、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、ゲノムＤＮＡ外で自律複製するベクター上に存在していてよい。すなわち、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターとして宿主に導入することができる。すなわち、本発明の形質転換体は、一態様において、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを有する形質転換体であってよい。本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを、「本発明の発現ベクター」ともいう。本発明の発現ベクターは、例えば、発現ベクターの適切な位置に本発明のポリヌクレオチドを挿入することにより得られる。なお、発現ベクターは、形質転換する宿主内で安定に存在し複製できるものであれば特に制限されない。発現ベクターとしては、例えば、エシェリヒア・コリを宿主とする場合は、ｐＥＴプラスミドベクター、ｐＵＣプラスミドベクター、ｐＴｒｃプラスミドベクターを例示できる。発現ベクターは、抗生物質耐性遺伝子等の選択マーカーを備えていてよい。また、前記適切な位置とは、発現ベクターの複製機能、選択マーカー、伝達性に関わる領域を破壊しない位置を意味する。前記発現ベクターに本発明のポリヌクレオチドを挿入する際は、発現に必要なプロモーター等の機能性ポリヌクレオチドに連結された状態で挿入すると好ましい。
【００５４】
また、本発明の形質転換体において、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、ゲノムＤＮＡ上に導入されていてもよい。ゲノムＤＮＡへの本発明のポリヌクレオチドの導入は、例えば、相同組み換えによる遺伝子導入法を利用して実施することができる。相同組み換えによる遺伝子導入法としては、Ｒｅｄ−ｄｒｉｖｅｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ法（Ｄａｔｓｅｎｋｏ，  Ｋ．  Ａ，  ａｎｄ  Ｗａｎｎｅｒ，  Ｂ．  Ｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ９７：６６４０−６６４５  （２０００））等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法、温度感受性複製起点を含むベクターを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないベクターを用いる方法、ファージを用いたｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ法が挙げられる。
【００５５】
本発明の発現ベクター等のポリヌクレオチドを用いた宿主の形質転換は、例えば、当業者が通常用いる方法で行なうことができる。例えば、宿主としてエシェリヒア・コリを選択する場合には、コンピテントセル法、ヒートショック法、エレクトロポレーション法等により形質転換することができる。形質転換後に適切な方法でスクリーニングすることにより、本発明の形質転換体を取得することができる。
【００５６】
各種微生物において利用可能な発現ベクターやプロモーター等の遺伝子工学的手法に関する情報については、例えば、「微生物学基礎講座８  遺伝子工学、共立出版、１９８７年」に詳細に記載されており、それらを利用することが可能である。
【００５７】
本発明の形質転換体が本発明の発現ベクターを有する場合、本発明の形質転換体から本発明の発現ベクターを調製することができる。例えば、本発明の形質転換体を培養して得られる培養物からアルカリ抽出法またはＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）等の市販の抽出キットを用いて本発明の発現ベクターを調製することができる。
【００５８】
本発明の形質転換体を培養することにより、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現させることができる。また、本発明の形質転換体を培養することにより本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現させ、発現した前記タンパク質を回収することで、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を製造できる。すなわち、本発明は、例えば、本発明の形質転換体を培養することにより本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現させる工程と、発現された前記タンパク質を回収する工程とを含む、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質の製造方法を提供する。培地組成や培養条件は、宿主の種類や本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質の特性等の諸条件に応じて適宜設定することができる。培地組成や培養条件は、例えば、宿主が増殖でき、且つ、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現できるように設定することができる。培地としては、例えば、炭素源、窒素源、無機塩、その他の各種有機成分や無機成分を適宜含有する培地を用いることができる。例えば、宿主がエシェリヒア・コリの場合、必要な栄養源を補ったＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地（トリプトン  １％（ｗ／ｖ）、酵母エキス  ０．５％（ｗ／ｖ）、塩化ナトリウム  １％（ｗ／ｖ））が好ましい培地の一例として挙げられる。なお、本発明の発現ベクターの導入の有無により本発明の形質転換体を選択的に増殖させるために、培地に当該発現ベクターに含まれる抗生物質耐性遺伝子に対応した抗生物質を添加して培養すると好ましい。例えば、当該発現ベクターがカナマイシン耐性遺伝子を含んでいる場合は培地にカナマイシンを添加すればよい。本発明のポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡ上に導入されている場合も同様である。また、培地は、グルタチオン、システイン、シスタチン、チオグリコレートおよびジチオスレイトールからなる群から選択される一種類以上の還元剤を含有していてもよい。また、培地は、グリシン等の前記形質転換体から培養液へのタンパク質分泌を促す試薬を含有していてもよい。例えば、宿主がエシェリヒア・コリの場合、培地に対してグリシンを２％（ｗ／ｖ）以下で添加すると好ましい。培養温度は、例えば、宿主がエシェリヒア・コリの場合、一般に１０℃から４０℃、好ましくは２０℃から３７℃、より好ましくは２５℃前後であってよい。培地のｐＨは、例えば、宿主がエシェリヒア・コリの場合、ｐＨ６．８からｐＨ７．４、好ましくはｐＨ７．０前後であってよい。また、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を誘導性のプロモーターの制御下で発現する場合は、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質が良好に発現できるように誘導をかけると好ましい。発現誘導には、例えば、プロモーターの種類に応じた誘導剤を用いることができる。誘導剤としては、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を例示することができる。例えば、宿主がエシェリヒア・コリの場合、培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）が約０．５から１．０となったときに適当量のＩＰＴＧを添加し、引き続き培養することで、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質の発現を誘導することができる。ＩＰＴＧの添加濃度は、���えば、０．００５から１．０ｍＭ、好ましくは０．０１から０．５ｍＭであってよい。ＩＰＴＧ誘導等の発現誘導は、例えば、当該技術分野において周知の条件で行なうことができる。
【００５９】
本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、その発現形態に適した方法で培養物から分離して回収することができる。なお、「培養物」とは、培養により得られた培養液の全体またはその一部を意味する。当該一部は、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を含有する部分であれば特に制限されない。当該一部としては、培養された本発明の形質転換体の細胞や培養後の培地（すなわち培養上清）が挙げられる。例えば、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質が培養上清に蓄積する場合、細胞を遠心分離操作によって分離し、得られる培養上清から本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を回収することができる。また、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質が細胞内（ペリプラズムを含む）に蓄積する場合、細胞を遠心分離操作により回収した後、酵素処理剤や界面活性剤等を添加することにより細胞を破砕して、破砕物から本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を回収することができる。培養上清や細胞破砕物からの本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質の回収は、例えば、タンパク質の分離精製に用いられる公知の方法により行うことができる。そのような方法としては、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、等電点沈殿が挙げられる。
【００６０】
本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、免疫グロブリン（抗体）の分離または分析に使用することができる。本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、不溶性担体に固定化して使用することができる。すなわち、免疫グロブリン（抗体）の分離または分析は、具体的には、例えば、不溶性担体と、該不溶性担体に固定化された本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質とを備える、免疫グロブリン吸着剤を用いて実施することができる。不溶性担体と、該不溶性担体に固定化された本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質とを備える、免疫グロブリン吸着剤を、「本発明の免疫グロブリン吸着剤」ともいう。なお、「免疫グロブリンの分離」とは、夾雑物質共存下の溶液からの免疫グロブリンの分離に限らず、構造、性質、または活性等に基づく免疫グロブリン間の分離も包含される。不溶性担体は特に制限されない。不溶性担体としては、アガロース、アルギネート（アルギン酸塩）、カラゲナン、キチン、セルロース、デキストリン、デキストラン、デンプン等の多糖質を原料とした担体や、ポリビニルアルコール、ポリメタクレート、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリウレタン等の合成高分子を原料とした担体や、シリカ等のセラミックスを原料とした担体が例示できる。中でも、多糖質を原料とした担体や合成高分子を原料とした担体が不溶性担体として好ましい。前記好ましい担体の一例として、トヨパール（東ソー社製）等の水酸基を導入したポリメタクリレートゲル、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア社製）等のアガロースゲル、セルファイン（ＪＮＣ社製）等のセルロースゲルが挙げられる。不溶性担体の形状は特に制限されない。不溶性担体は、例えば、カラムに充填できる形状であってよい。不溶性担体は、例えば、粒状物または非粒状物であってよい。また、不溶性担体は、例えば、多孔性または非多孔性であってもよい。
【００６１】
本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、共有結合により不溶性担体に固定化することができる。本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、具体的には、例えば、不溶性担体が有する活性基を介して本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質と不溶性担体とを共有結合させることにより、不溶性担体に固定化することができる。すなわち、不溶性担体は、活性基を有していてよい。不溶性担体は、例えば、その表面に活性基を有していてよい。活性基としては、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）活性化エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、マレイミド基、ハロアセチル基、トレシル基、ホルミル基、ハロアセトアミドが挙げられる。活性基を有する不溶性担体としては、例えば、活性基を有する市販の不溶性担体をそのまま用いてもよいし、不溶性担体に活性基を導入して用いてもよい。活性基を有する市販の担体としては、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＡＦ−Ｅｐｏｘｙ−６５０Ｍ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＡＦ−Ｔｒｅｓｙｌ−６５０Ｍ（いずれも東ソー社製）、ＨｉＴｒａｐ  ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＨＰ  Ｃｏｌｕｍｎｓ、ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｅｐｏｘｙ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６Ｂ（いずれもＧＥヘルスケア社製）、ＳｕｌｆｏＬｉｎｋ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｒｅｓｉｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）が例示できる。
【００６２】
担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在する水酸基、エポキシ基、カルボキシル基、アミノ基等に対して２個以上の活性部位を有する化合物の一方を反応させる方法が例示できる。
【００６３】
例えば、担体表面に存在する水酸基やアミノ基にエポキシ基を導入する化合物としては、エピクロロヒドリン、エタンジオールジグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、ヘキサンジオールジグリシジルエーテルが例示できる。
【００６４】
また、例えば、担体表面に存在するエポキシ基にカルボキシル基を導入する化合物としては、２−メルカプト酢酸、３−メルカプトプロピオン酸、４−メルカプト酪酸、６−メルカプト酪酸、グリシン、３−アミノプロピオン酸、４−アミノ酪酸、６−アミノヘキサン酸を例示できる。
【００６５】
また、例えば、担体表面に存在する水酸基、エポキシ基、カルボキシル基、アミノ基にマレイミド基を導入する化合物としては、Ｎ−（ε−マレイミドカプロン酸）ヒドラジド、Ｎ−（ε−マレイミドプロピオン酸）ヒドラジド、４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酢酸ヒドラジド、２−アミノマレイミド、３−アミノマレイミド、４−アミノマレイミド、６−アミノマレイミド、１−（４−アミノフェニル）マレイミド、１−（３−アミノフェニル）マレイミド、４−（マレイミド）フェニルイソシアナート、２−マレイミド酢酸、３−マレイミドプロピオン酸、４−マレイミド酪酸、６−マレイミドヘキサン酸、Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステル、（ｍ−マレイミドベンゾイル）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、スクシンイミジル−４−（マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボニル−（６−アミノヘキサン酸）、スクシンイミジル−４−（マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸、（ｐ−マレイミドベンゾイル）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、（ｍ−マレイミドベンゾイル）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。
【００６６】
また、例えば、担体表面に存在する水酸基やアミノ基にハロアセチル基を導入する化合物としては、クロロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸クロリド、ブロモ酢酸クロリド、ブロモ酢酸ブロミド、クロロ酢酸無水物、ブロモ酢酸無水物、ヨード酢酸無水物、２−（ヨードアセトアミド）酢酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、３−（ブロモアセトアミド）プロピオン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、４−（ヨードアセチル）アミノ安息香酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。
【００６７】
また、担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在する水酸基やアミノ基にω−アルケニルアルカングリシジルエーテルを反応させた後、ハロゲン化剤でω−アルケニル部位をハロゲン化することにより活性化する方法も例示できる。ω−アルケニルアルカングリシジルエーテルとしては、アリルグリシジルエーテル、３−ブテニルグリシジルエーテル、４−ペンテニルグリシジルエーテルを例示できる。ハロゲン化剤としては、Ｎ−クロロスクシンイミド、Ｎ−ブロモスクシンイミド、Ｎ−ヨードスクシンイミドを例示できる。
【００６８】
また、担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在するカルボキシル基に対して縮合剤と添加剤を用いて活性基を導入する方法も例示できる。縮合剤としては、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、ジシクロヘキシルカルボジアミド、カルボニルジイミダゾールを例示できる。添加剤としては、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）、４−ニトロフェノール、１−ヒドロキシベンズトリアゾールを例示できる。
【００６９】
本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質の不溶性担体への固定化は、例えば、緩衝液中で実施することができる。緩衝液としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＭＥＳ（２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液を例示できる。固定化させるときの反応温度は、例えば、活性基の反応性や免疫グロブリン結合性タンパク質の安定性等の諸条件に応じて適宜設定することができる。固定化させるときの反応温度は、例えば、５℃から５０℃であってよく、好ましくは１０℃から３５℃であってよい。
【００７０】
本発明の免疫グロブリン吸着剤は、例えば、カラムに充填して免疫グロブリン（抗体）の分離に使用することができる。具体的には、例えば、本発明の免疫グロブリン吸着剤を充填したカラムに免疫グロブリンを含む溶液を添加して当該免疫グロブリンを前記吸着剤に吸着させ、前記吸着剤に吸着した免疫グロブリンを溶出させることで、免疫グロブリンを分離することができる。すなわち、本発明は、例えば、本発明の免疫グロブリン吸着剤を充填したカラムに免疫グロブリンを含む溶液を添加して当該免疫グロブリンを前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着した免疫グロブリンを溶出させる工程とを含む、免疫グロブリンの分離方法を提供する。免疫グロブリンを含む溶液は、例えば、ポンプ等の送液手段を用いてカラムに添加することができる。液体をカラムに添加することを、「液体をカラムに送液する」ともいう。なお、免疫グロブリンを含む溶液は、カラムに添加する前に予め適切な緩衝液を用いて溶媒置換してよい。また、免疫グロブリンを含む溶液をカラムに添加する前に、適切な緩衝液を用いてカラムを平衡化してよい。カラムの平衡化により、例えば、免疫グロブリンをより高純度に分離できると期待される。溶媒置換や平衡化に用いる緩衝液としては、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液が例示できる。そのような緩衝液には、例えば、さらに、１０ｍＭから１００ｍＭの塩化ナトリウム等の無機塩を添加してもよい。溶媒置換に用いる緩衝液と平衡化に用いる緩衝液は、同一であってもよく、なくてもよい。また、免疫グロブリンを含む溶液のカラムへの通液後に夾雑物質等の免疫グロブリン以外の成分がカラムに残存している場合、免疫グロブリン吸着剤に吸着した免疫グロブリンを溶出する前に、そのような成分をカラムから除去してよい。免疫グロブリン以外の成分は、例えば、適切な緩衝液を用いてカラムから除去することができる。免疫グロブリン以外の成分の除去に用いる緩衝液については、例えば、溶媒置換や平衡化に用いる緩衝液についての記載を準用できる。免疫グロブリン吸着剤に吸着した免疫グロブリンは、例えば、免疫グロブリンとリガンド（本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質）との相互作用を弱めることにより、溶出することができる。免疫グロブリンとリガンド（本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質）との相互作用を弱める手段としては、緩衝液によるｐＨの低下、カウンターペプチドの添加、温度上昇、塩濃度変化が例示できる。免疫グロブリン吸着剤に吸着した免疫グロブリンは、具体的には、例えば、適切な溶出液を用いて溶出することができる。溶出液としては、溶媒置換や平衡化に用いる緩衝液よりも酸性側の緩衝液が挙げられる。そのような緩衝液としては、クエン酸緩衝液、グリシン塩酸緩衝液、酢酸緩衝液を例示できる。溶出液のｐＨは、例えば、免疫グロブリンの機能（抗原への結合性等）を損なわない範囲で設定することができる。
【００７１】
このようにして免疫グロブリン（抗体）の分離を実施することにより、例えば、分離された免疫グロブリンが得られる。すなわち、免疫グロブリンの分離方法は、一態様において、免疫グロブリンの製造方法であってよく、具体的には、分離された免疫グロブリンの製造方法であってよい。免疫グロブリンは、例えば、免疫グロブリンを含有する溶出画分として得られる。すなわち、溶出された免疫グロブリンを含有する画分を分取することができる。画分の分取は、例えば、常法により行なうことができる。画分を分取する方法としては、一定の時間ごとや、一定の容量ごとに回収容器を交換する方法や、溶出液のクロマトグラムの形状に合わせて回収容器を換える方法や、オートサンプラー等の自動フラクションコレクター等により画分の分取をする方法が挙げられる。さらに、免疫グロブリンを含有する画分から免疫グロブリンを回収することもできる。免疫グロブリンを含有する画分からの免疫グロブリンの回収は、例えば、タンパク質の分離精製に用いられる公知の方法により行うことができる。
【実施例】
【００７２】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は当該実施例に限定されるものではない。【００７３】
実施例１  免疫グロブリン結合性タンパク質発現ベクターの作製
（１）
配列番号１に記載の免疫グロブリン結合性タンパク質のアミノ酸配列から、エシェリヒア・コリ型コドンを用いて変換することで、配列番号３に記載のヌクレオチド配列を設計した。【００７４】
（２）
（１）で設計したヌクレオチド配列を合成した後、ＰＣＲを用いて配列番号３に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを作製した。ＰＣＲは、前記合成したポリヌクレオチドを鋳型ＤＮＡとし、配列番号４（５’−ＴＡＧＣＣＡＴＧＧＧＣＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＧＴＴＣ−３’）および配列番号５（５’−ＣＴＡＣＴＣＧＡＧＴＴＴＣＧＧＡＧＣＴＴＧＣＧＣＡＴＣ−３’）に記載のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、表１に示す組成からなる反応液を調製後、当該反応液を９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で６０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。【００７５】
【表１】
2019093439.tif 000002
【００７６】
（３）
得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＮｃｏＩとＸｈｏＩで消化後、予め制限酵素ＮｃｏＩとＸｈｏＩで消化した発現ベクターｐＥＴ−２８ａにライゲーションし、当該ライゲーション産物を用いてエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。【００７７】
（４）
得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて発現ベクターｐＥＴ−ＳｐＡを抽出した。【００７８】
（５）
得られた抽出物のうち、免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびその周辺領域について、チェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ライフサイエンス社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７００  ＤＮＡ  ａｎａｌｙｚｅｒ（ライフサイエンス社製）にてヌクレオチド配列を解析した。なお当該解析の際、配列番号６（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’）または配列番号７（５’−ＴＡＴＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧ−３’）に記載のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをシークエンス用プライマーとして使用した。【００７９】
配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ−ＳｐＡに配列番号３に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した。【００８０】
実施例２  免疫グロブリン結合性タンパク質への変異導入およびライブラリーの作製
実施例１で作製した発現ベクターｐＥＴ−ＳｐＡに挿入されている免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分（配列番号３）にエラープローンＰＣＲによりランダムに変異を導入した。【００８１】
（１）
実施例１で作製したｐＥＴ−ＳｐＡを鋳型ＤＮＡとして用い、エラープローンＰＣＲを行なった。エラープローンＰＣＲは、表２に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、５０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。前記エラープローンＰＣＲにより免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号３）に良好に変異が導入され、その平均変異導入率は１．１５％から１．２６％であった。【００８２】
【表２】
2019093439.tif 000003
【００８３】
（２）
得られたＰＣＲ産物を精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＸｈｏＩで消化し、予め制限酵素ＮｃｏＩとＸｈｏＩで消化した発現ベクターｐＥＴ−２８ａにライゲーションした。【００８４】
（３）
ライゲーション反応終了後、反応液を用いてエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレート培地で培養（３７℃、１６時間）した後、プレート上に形成したコロニーをランダム変異体ライブラリーとした。【００８５】
実施例３  アルカリ安定化免疫グロブリン結合性タンパク質のスクリーニング（その１）
（１）
実施例２で作製したランダム変異体ライブラリー（形質転換体）約１９００株を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２×ＹＴ液体培地（トリプトン  １．６％（ｗ／ｖ）、酵母エキス  １％（ｗ／ｖ）、塩化ナトリウム  ０．５％（ｗ／ｖ））２５０μＬに接種し、９６ウェルディープウェルプレートを用いて３７℃で終夜振とう培養した。【００８６】
（２）
培養後、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン、０．３％のグリシン、０．０５ｍＭのＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を含む２×ＹＴ液体培地５００μＬに５μＬの培養液を植え継ぎ、９６ウェルディープウェルプレートを用いてさらに２０℃で終夜振とう培養した。【００８７】
（３）
培養後、遠心操作によって得られた培養上清を純水で４０倍に希釈した。希釈した溶液を２Ｍ  ＮａＯＨと等量混合し２５℃で１６時間アルカリ処理を行なった。その後、４倍量の１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．０）で中和した。【００８８】
（４）
アルカリ処理を行なったときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性を下記に示すＥＬＩＳＡ法にて測定し、アルカリ処理を行なったときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性を、アルカリ処理を行わなかったときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで残存活性を算出した。
（４−１）Ｔｒｉｓ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ（ＴＢＳ）を用いて１０μｇ／ｍＬに調製したヒト抗体であるガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）を９６ウェルマイクロプレートのウェルに分注し固定化した（４℃、１６時間）。固定化後、ＴＢＳを用いて１％（ｗ／ｖ）に調製したＢｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いてブロッキングした。
（４−２）洗浄緩衝液（０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％（ｗ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ  ２０（商品名））で９６ウェルマイクロプレートのウェルを洗浄後、抗体結合活性を評価する免疫グロブリン結合性タンパク質を含む溶液を添加し、免疫グロブリン結合性タンパク質と固定化ガンマグロブリンとを反応させた（３０℃、１時間）。
（４−３）反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬに希釈したＡｎｔｉ−６−Ｈｉｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢＥＴＨＹＬ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し反応させた（３０℃、１時間）。
（４−４）反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、ＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。次に１Ｍ  リン酸を５０μＬ／ｗｅｌｌ添加することで反応を停止し、マイクロプレートリーダー（テカン社製）にて４５０ｎｍの吸光度を測定した。【００８９】
（５）
（４）で算出した残存活性より、天然型（アミノ酸置換がない）免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号１）と比較してアルカリ安定性が向上した（残存活性が向上した）免疫グロブリン結合性タンパク質を発現する形質転換体を選択した。【００９０】
（６）
選択した形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて発現ベクターを調製した。【００９１】
（７）
得られた発現ベクターに挿入された免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域のヌクレオチド配列を実施例１（５）に記載の方法により解析し、アミノ酸置換箇所を特定した。【００９２】
選択した形質転換体が発現する免疫グロブリン結合性タンパク質の、天然型（アミノ酸置換がない）免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号１）に対するアミノ酸置換位置および０．５Ｍ  ＮａＯＨを用いて２５℃で１５時間アルカリ処理したときの残存活性［％］をまとめた結果を表３および表４に示す。配列番号１に記載のアミノ酸配列において、Ａｓｐ２Ｇｌｕ（この表記は配列番号１の２番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換されていることを表す、以下同様）、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ４９Ｍｅｔ、Ａｓｎ６Ａｓｐ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｌｙｓ４２Ａｒｇ、Ｌｙｓ５８Ｇｌｕのいずれかのアミノ酸置換が少なくとも１つ生じた免疫グロブリン結合性タンパク質は、天然型免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号１）と比較しアルカリ安定性が向上しているといえる。【００９３】
【表３】
2019093439.tif 000004
【００９４】
【表４】
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【００９５】
表３および表４に示すアミノ酸置換された免疫グロブリン結合性タンパク質のうち、最も残存活性の高い、Ａｓｎ２１Ｔｙｒのアミノ酸置換が生じた免疫グロブリン結合性タンパク質をＳｐＡ１と命名し、ＳｐＡ１をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターをｐＥＴ−ＳｐＡ１と命名した。ＳｐＡ１のアミノ酸配列を配列番号８に、ＳｐＡ１をコードするヌクレオチド配列を配列番号１０に、それぞれ示す。【００９６】
実施例４  アミノ酸置換免疫グロブリン結合性タンパク質の作製
（１）
天然型免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号１）に対し、構造安定化に寄与するＧｌｙ２９Ａｌａのアミノ酸置換（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１，１０７−１１３；非特許文献１）を導入したタンパク質（ＳｐＡ’と命名）をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター（ｐＥＴ−ＳｐＡ’と命名）を作製した。ＳｐＡ’のアミノ酸配列を配列番号１１に、ＳｐＡ’をコードするヌクレオチド配列を配列番号１２に、それぞれ示す。【００９７】
（２）
実施例３で明らかになった、免疫グロブリン結合性タンパク質のアルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換をＳｐＡ’（配列番号１１）に対し集積することで、更なる安定性の向上を図った。具体的には、以下の（ａ）から（ｅ）に示す５種類の免疫グロブリン結合性タンパク質を設計し、作製した。
（ａ）ＳｐＡ’に対し、さらにＬｙｓ７ＧｌｕおよびＡｓｎ２１Ｔｙｒのアミノ酸置換を導入したタンパク質（ＳｐＡ２と命名）
（ｂ）ＳｐＡ２に対し、さらにＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換を導入したタンパク質（ＳｐＡ３ａと命名）
（ｃ）ＳｐＡ３ａに対し、さらにＬｙｓ４Ａｒｇのアミノ酸置換を導入したタンパク質（ＳｐＡ４ａと命名）
（ｄ）ＳｐＡ４ａに対し、さらにＬｙｓ４９Ｍｅｔのアミノ酸置換を導入したタンパク質（ＳｐＡ５ａと命名）
（ｅ）ＳｐＡ’に対し、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７ＧｌｕおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換を導入したタンパク質（ＳｐＡ３ｂと命名）【００９８】
以下、（ａ）から（ｅ）に示す５種類の免疫グロブリン結合性タンパク質の作製方法について説明する。【００９９】
（ａ）ＳｐＡ２
（ａ−１）
実施例３で明らかになった、アルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｌｙｓ７ＧｌｕおよびＡｓｎ２１Ｔｙｒを選択し、それらのアミノ酸置換をＳｐＡ’（配列番号１１）に対し集積したタンパク質ＳｐＡ２を設計した。【０１００】
（ａ−２）
（ａ−１）で設計したＳｐＡ２をコードするヌクレオチド配列を合成した後、ＰＣＲを用いて前記ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを作製した。ＰＣＲは、前記合成したポリヌクレオチドを鋳型ＤＮＡとし、配列番号２３（５’−ＴＡＧＣＣＡＴＧＧＧＣＧＣＧＧＡＣＡＡＣＡＡＡ−３’）および配列番号２６（５’−ＣＴＡＣＴＣＧＡＧＴＴＴＴＧＧＣＧＣＴＴＧＴＧＣＡＴＣ−３’）に記載のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、表１に示す組成からなる反応液を調製後、当該反応液を９８℃で３０秒間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で６０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で２分間熱処理することで行なった。【０１０１】
（ａ−３）
得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＮｃｏIとＸｈｏIで消化した後、予め制限酵素ＮｃｏIとＸｈｏIで消化した発現ベクターｐＥＴ−２８ａにライゲーションし、当該ライゲーション産物を用いてエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。【０１０２】
（ａ−４）
得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて発現ベクター（ｐＥＴ−ＳｐＡ２と命名）を抽出した。【０１０３】
（ａ−５）
ｐＥＴ−ＳｐＡ２のヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ−ＳｐＡ２にＳｐＡ２をコードするポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した。ＳｐＡ２のアミノ酸配列を配列番号１３に、ＳｐＡ２をコードするヌクレオチド配列を配列番号１４に、それぞれ示す。【０１０４】
（ｂ）ＳｐＡ３ａ
（ｂ−１）
実施例３で明らかになった、アルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ２１ＴｙｒおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕを選択し、それらのアミノ酸置換をＳｐＡ’（配列番号１１）に対し集積したタンパク質ＳｐＡ３ａを設計した。【０１０５】
（ｂ−２）
（ｂ−１）で設計したＳｐＡ３ａをコードするポリヌクレオチドを合成した後、ＰＣＲを用いて前記ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを作製した。ＰＣＲは、前記合成したポリヌクレオチドを鋳型ＤＮＡとし、配列番号２３および配列番号２７（５’−ＣＴＡＣＴＣＧＡＧＴＴＣＴＧＧＣＧＣＴＴＧＴＧＣＡＴＣＧＴＴＣＡＧ−３’）に記載のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、（ａ−２）と同様の方法でＰＣＲを行なった。【０１０６】
（ｂ−３）
得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＮｃｏIとＸｈｏIで消化した後、予め制限酵素ＮｃｏIとＸｈｏIで消化した発現ベクターｐＥＴ−２８ａにライゲーションし、当該ライゲーション産物を用いてエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。【０１０７】
（ｂ−４）
得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔを用いて発現ベクター（ｐＥＴ−ＳｐＡ３ａと命名）を抽出した。【０１０８】
（ｂ−５）
ｐＥＴ−ＳｐＡ３ａのヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ−ＳｐＡ３ａにＳｐＡ３ａをコードするポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した。ＳｐＡ３ａのアミノ酸配列を配列番号１５に、ＳｐＡ３ａをコードするヌクレオチド配列を配列番号１６に、それぞれ示す。【０１０９】
（ｃ）ＳｐＡ４ａ
（ｃ−１）
実施例３で明らかになった、アルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ２１ＴｙｒおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕを選択し、それらのアミノ酸置換をＳｐＡ’（配列番号１１）に対し集積したタンパク質ＳｐＡ４ａを設計した。【０１１０】
（ｃ−２）
（ｃ−１）で設計したＳｐＡ４ａをコードするポリヌクレオチドを合成した後、ＰＣＲを用いて前記ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを作製した。ＰＣＲは、前記合成したポリヌクレオチドを鋳型ＤＮＡとし、配列番号２４（５’−ＴＡＧＣＣＡＴＧＧＧＣＧＣＧＧＡＣＡＡＴＣＧＡＴＴＣ−３’）および配列番号２７に記載のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、（ａ−２）と同様の方法でＰＣＲを行なった。【０１１１】
（ｃ−３）
得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＮｃｏIとＸｈｏIで消化した後、予め制限酵素ＮｃｏIとＸｈｏIで消化した発現ベクターｐＥＴ−２８ａにライゲーションし、当該ライゲーション産物を用いてエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。【０１１２】
（ｃ−４）
得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔを用いて発現ベクター（ｐＥＴ−ＳｐＡ４ａと命名）を抽出した。【０１１３】
（ｃ−５）
ｐＥＴ−ＳｐＡ４ａのヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ−ＳｐＡ４ａにＳｐＡ４ａをコードするポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した。ＳｐＡ４ａのアミノ酸配列を配列番号１７に、ＳｐＡ４ａをコードするヌクレオチド配列を配列番号１８に、それぞれ示す。【０１１４】
（ｄ）ＳｐＡ５ａ
（ｄ−１）
実施例３で明らかになった、アルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｌｙｓ４９ＭｅｔおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕを選択し、それらのアミノ酸置換をＳｐＡ’（配列番号１１）に対し集積したタンパク質ＳｐＡ５ａを設計した。【０１１５】
（ｄ−２）
（ｄ−１）で設計したＳｐＡ５ａをコードするポリヌクレオチドを合成した後、ＰＣＲを用いて前記ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを作製した。ＰＣＲは、前記合成したポリヌクレオチドを鋳型ＤＮＡとし、配列番号２５（５’−ＴＡＧＣＣＡＴＧＧＧＣＧＣＧＧＡＣＡＡＣＣＧＣＴＴＣＡＡＣＧＡＡ−３’）および配列番号２７に記載のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、（ａ−２）と同様の方法でＰＣＲを行なった。【０１１６】
（ｄ−３）
得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＮｃｏIとＸｈｏIで消化した後、予め制限酵素ＮｃｏIとＸｈｏIで消化した発現ベクターｐＥＴ−２８ａにライゲーションし、当該ライゲーション産物を用いてエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。【０１１７】
（ｄ−４）
得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔを用いて発現ベクター（ｐＥＴ−ＳｐＡ５ａと命名）を抽出した。【０１１８】
（ｄ−５）
ｐＥＴ−ＳｐＡ５ａのヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ−ＳｐＡ５ａにＳｐＡ５ａをコードするポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した。ＳｐＡ５ａのアミノ酸配列を配列番号１９に、ＳｐＡ５ａをコードするヌクレオチド配列を配列番号２０に、それぞれ示す。【０１１９】
（ｅ）ＳｐＡ３ｂ
（ｅ−１）
実施例３で明らかになった、アルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７ＧｌｕおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕを選択し、それらのアミノ酸置換をＳｐＡ’（配列番号１１）に対し集積したタンパク質ＳｐＡ３ｂを設計した。【０１２０】
（ｅ−２）
（ｅ−１）で設計したＳｐＡ３ｂをコードするポリヌクレオチドを合成した後、ＰＣＲを用いて前記ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを作製した。ＰＣＲは、前記合成したポリヌクレオチドを鋳型ＤＮＡとし、配列番号２５および配列番号２７に記載のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、（ａ−２）と同様の方法でＰＣＲを行なった。【０１２１】
（ｅ−３）
得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＮｃｏIとＸｈｏIで消化した後、予め制限酵素ＮｃｏIとＸｈｏIで消化した発現ベクターｐＥＴ−２８ａにライゲーションし、当該ライゲーション産物を用いてエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。【０１２２】
（ｅ−４）
得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔを用いて発現ベクター（ｐＥＴ−ＳｐＡ３ｂと命名）を抽出した。【０１２３】
（ｅ−５）
ｐＥＴ−ＳｐＡ３ｂのヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ−ＳｐＡ３ｂにＳｐＡ３ｂをコードするポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した。ＳｐＡ３ｂのアミノ酸配列を配列番号２１に、前記ＳｐＡ３ｂをコードするヌクレオチド配列を配列番号２２に、それぞれ示す。【０１２４】
実施例５  アミノ酸置換免疫グロブリン結合性タンパク質のアルカリ安定性評価
（１）
実施例１で作製した天然型免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号１）、および実施例４で作製した変異型（アミノ酸置換した）免疫グロブリン結合性タンパク質（ＳｐＡ２（配列番号１３）、ＳｐＡ３ａ（配列番号１５）、ＳｐＡ４ａ（配列番号１７）、ＳｐＡ５ａ（配列番号１９）、ＳｐＡ３ｂ（配列番号２１））を発現する形質転換体を、それぞれ５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ｍＬの２×ＹＴ液体培地に接種し、３７℃で終夜、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。【０１２５】
（２）
５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した２０ｍＬの２×ＹＴ液体培地に前培養液を２００μＬ接種し、３７℃で好気的に振とう培養を行なった。【０１２６】
（３）
培養開始から３時間後、培養温度を２０℃に変更し、終濃度０．１ｍＭとなるようＩＰＴＧを添加し、２０℃で終夜、好気的に振とう培養した。【０１２７】
（４）
培養終了後、遠心分離により集菌し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（メルク社製）を用いてタンパク質抽出液を調製した。【０１２８】
（５）
（４）で調製したタンパク質抽出液中の天然型免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号１）、および変異型免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号１３、１５、１７、１９および２１）の抗体結合活性を、実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。【０１２９】
（６）
各タンパク質の濃度が等しくなるようＴｒｉｓ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ（ＴＢＳ）を用いて希釈し、得られたタンパク質溶液のうち、一方は１Ｍ  ＮａＯＨと、もう一方はＴＢＳと、それぞれ等量混合後、２５℃で１５時間静置した。【０１３０】
（７）
１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．０）を４倍量加えた後、アルカリ処理（１Ｍ  ＮａＯＨを混合）およびアルカリ未処理（ＴＢＳを混合）のタンパク質溶液の抗体結合活性を実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法によって測定した。アルカリ処理を行なったときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性を、アルカリ処理を行わなかったときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで残存活性を算出し、アルカリ安定性を評価した。【０１３１】
結果を表５に示す。ここで評価した変異型免疫グロブリン結合性タンパク質（ＳｐＡ２（配列番号１３）、ＳｐＡ３ａ（配列番号１５）、ＳｐＡ４ａ（配列番号１７）、ＳｐＡ５ａ（配列番号１９）およびＳｐＡ３ｂ（配列番号２１））はいずれも、天然型免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号１）と比較し、残存活性が高くなっており、これら変異型免疫グロブリン結合性タンパク質のアルカリ安定性が向上していることが確認された。【０１３２】
【表５】
2019093439.tif 000006
【０１３３】
実施例６  アルカリ安定性向上免疫グロブリン結合性タンパク質への変異導入およびライブラリーの作製
実施例５で評価した変異型免疫グロブリン結合性タンパク質のうち、ＳｐＡ４ａ（実施例４（ｃ））を選択し、ＳｐＡ４ａをコードするポリヌクレオチド部分（配列番号１８）にエラープローンＰＣＲによりランダムに変異を導入した。【０１３４】
（１）
実施例４（ｃ）で作製した発現ベクターｐＥＴ−ＳｐＡ４ａを鋳型ＤＮＡとして用い、エラープローンＰＣＲを行なった。エラープローンＰＣＲは、表２に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、５０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。前記エラープローンＰＣＲにより変異型の免疫グロブリン結合性タンパク質（ＳｐＡ４ａ）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１８）に良好に変異が導入され、その平均変異導入率は１．０９％であった。【０１３５】
（２）
得られたＰＣＲ産物を精製後、制限酵素ＮｃｏIとＸｈｏIで消化し、予め制限酵素ＮｃｏIとＸｈｏIで消化した発現ベクターｐＥＴ−２８ａにライゲーションした。【０１３６】
（３）
ライゲーション反応終了後、反応液を用いてエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレート培地で培養（３７℃、１６時間）した後、プレート上に形成したコロニーをランダム変異体ライブラリーとした。【０１３７】
実施例７  アルカリ安定化免疫グロブリン結合性タンパク質のスクリーニング（その２）
（１）
実施例６で作製したランダム変異体ライブラリー（形質転換体）約１０００株を実施例３（１）から（２）に記載の方法で培養することで免疫グロブリン結合性タンパク質を発現させた。【０１３８】
（２）
培養後、遠心操作によって得られた免疫グロブリン結合性タンパク質を含む培養上清を純水で４０倍に希釈した。希釈した溶液を２Ｍ  ＮａＯＨと等量混合し、６０℃で３０分間アルカリ処理を行なった。アルカリ処理後は４倍量の１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．０）で中和した。【０１３９】
（３）
アルカリ処理を行なったときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性とアルカリ処理を行わなかったときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性を、実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法にてそれぞれ測定した。【０１４０】
（４）
アルカリ処理を行なったときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性を、アルカリ処理を行わなかったときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで残存活性を算出し、ＳｐＡ４ａと比較してアルカリ安定性が向上した（残存活性が向上した）免疫グロブリン結合性タンパク質を発現する形質転換体を選択した。【０１４１】
（５）
選択した形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて発現ベクターを調製した。【０１４２】
（６）
得られた発現ベクターに挿入された免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域のヌクレオチド配列を実施例１（５）に記載の方法により解析し、アミノ酸置換箇所を特定した。【０１４３】
（４）で選択した形質転換体が発現する免疫グロブリン結合性タンパク質のＳｐＡ４ａ（配列番号１７）に対するアミノ酸置換位置および０．５Ｍ  ＮａＯＨを用いて２５℃、１５時間アルカリ処理したときの残存活性［％］をまとめた結果を表６および表７に示す。配列番号１７に記載のアミノ酸配列において、Ａｓｎ３Ｉｌｅ、Ａｓｎ３Ｔｈｒ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ａｓｎ１１ＴｙｒおよびＬｙｓ（Ｇｌｕ）５８Ｖａｌ（この表記はＳｐＡ４ａ作製時に配列番号１の５８番目のリジンが一度グルタミン酸に置換されたが、さらにバリンに置換されたことを表す）のいずれかのアミノ酸置換が少なくとも１つ生じた免疫グロブリン結合性タンパク質は、ＳｐＡ４ａ（配列番号１７）と比較しアルカリ安定性が向上しているといえる。【０１４４】
配列番号１７に記載のアミノ酸配列において、Ａｓｎ３１７Ｉｌｅ（この表記は配列番号１７の３番目のアスパラギン酸がイソロイシンに置換されていることを表す、以下同じ）のアミノ酸置換が生じたタンパク質（ＳｐＡ５ｂと命名）のアミノ酸配列を配列番号２８に、Ａｓｎ３１７Ｔｈｒのアミノ酸置換が生じたタンパク質（ＳｐＡ５ｃと命名）のアミノ酸配列を配列番号２９に、Ａｓｎ１１１７Ｌｙｓのアミノ酸置換が生じたタンパク質（ＳｐＡ５ｄと命名）のアミノ酸配列を配列番号３０に、Ａｓｎ１１１７Ｔｙｒのアミノ酸置換が生じたタンパク質（ＳｐＡ５ｅと命名）のアミノ酸配列を配列番号３１に、Ｌｙｓ（Ｇｌｕ）５８１７Ｖａｌのアミノ酸置換が生じたタンパク質（ＳｐＡ４ｂと命名）のアミノ酸配列を配列番号３２に、それぞれ示す。【０１４５】
【表６】
2019093439.tif 000007
【０１４６】
【表７】
2019093439.tif 000008
【０１４７】
実施例８  アルカリ安定性向上免疫グロブリン結合性タンパク質への変異導入およびライブラリーの作製
実施例７で評価した変異型免疫グロブリン結合性タンパク質のうち、ＳｐＡ５ｄ（実施例６）を選択し、ＳｐＡ５ｄをコードするポリヌクレオチド部分（配列番号３３）にエラープローンＰＣＲによりランダムに変異を導入した。【０１４８】
（１）
実施例６で作製したランダム変異体ライブラリーから得たＳｐＡ５ｄの発現ベクターを鋳型ＤＮＡとして用い、エラープローンＰＣＲを行なった。エラープローンＰＣＲは、表２に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、５０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。前記エラープローンＰＣＲにより変異型の免疫グロブリン結合性タンパク質（ＳｐＡ５ｄ）をコードするポリヌクレオチド（配列番号３３）に良好に変異が導入され、その平均変異導入率は０．９２％であった。【０１４９】
（２）
得られたＰＣＲ産物を精製後、制限酵素ＮｃｏIとＸｈｏIで消化し、予め制限酵素ＮｃｏIとＸｈｏIで消化した発現ベクターｐＥＴ−２８ａにライゲーションした。【０１５０】
（３）
ライゲーション反応終了後、反応液を用いてエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレート培地で培養（３７℃、１６時間）した後、プレート上に形成したコロニーをランダム変異体ライブラリーとした。【０１５１】
実施例９  アルカリ安定化免疫グロブリン結合性タンパク質のスクリーニング（その３）
（１）
実施例８で作製したランダム変異体ライブラリー（形質転換体）約１０００株を実施例３（１）から（２）に記載の方法で培養することで免疫グロブリン結合性タンパク質を発現させた。【０１５２】
（２）
培養後、遠心操作によって得られた免疫グロブリン結合性タンパク質を含む培養上清を純水で４０倍に希釈した。希釈した溶液を２Ｍ  ＮａＯＨと等量混合し、６２℃で３０分間アルカリ処理を行なった。アルカリ処理後は４倍量の１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．０）で中和した。【０１５３】
（３）
アルカリ処理を行なったときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性とアルカリ処理を行わなかったときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性を、実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法にてそれぞれ測定した。【０１５４】
（４）
アルカリ処理を行なったときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性を、アルカリ処理を行わなかったときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで残存活性を算出し、ＳｐＡ５ｄと比較してアルカリ安定性が向上した（残存活性が向上した）免疫グロブリン結合性タンパク質を発現する形質転換体を選択した。【０１５５】
（５）
選択した形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて発現ベクターを調製した。【０１５６】
（６）
得られた発現ベクターに挿入された免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域のヌクレオチド配列を実施例１（５）に記載の方法により解析し、アミノ酸置換箇所を特定した。【０１５７】
（４）で選択した形質転換体が発現する免疫グロブリン結合性タンパク質のＳｐＡ５ｄ（配列番号３０）に対するアミノ酸置換位置および０．５Ｍ  ＮａＯＨを用いて２５℃、１５時間アルカリ処理したときの残存活性［％］をまとめた結果を表８に示す。配列番号３０に記載のアミノ酸配列において、Ｇｌｕ１５ＡｌａおよびＬｙｓ（Ｇｌｕ）５８Ｇｌｙのいずれかのアミノ酸置換が少なくとも１つ生じた免疫グロブリン結合性タンパク質は、ＳｐＡ５ｄ（配列番号３０）と比較しアルカリ安定性が向上しているといえる。【０１５８】
配列番号３０に記載のアミノ酸配列において、Ｇｌｕ１５３０Ａｌａ（この表記は配列番号３０の１５番目のグルタミン酸がアラニンに置換されていることを表す、以下同じ）のアミノ酸置換が生じたタンパク質（ＳｐＡ６ａと命名）のアミノ酸配列を配列番号３４に、Ｌｙｓ（Ｇｌｕ）５８３０Ｇｌｙのアミノ酸置換が生じたタンパク質（ＳｐＡ５ｆと命名）のアミノ酸配列を配列番号３５に、それぞれ示す。【０１５９】
【表８】
2019093439.tif 000009
【０１６０】
実施例１０  アルカリ安定性向上免疫グロブリン結合性タンパク質への変異導入およびライブラリーの作製
実施例９で評価した変異型免疫グロブリン結合性タンパク質のうち、ＳｐＡ６ａ（実施例８）を選択し、ＳｐＡ６ａをコードするポリヌクレオチド部分（配列番号３６）にエラープローンＰＣＲによりランダムに変異を導入した。【０１６１】
（１）
実施例８で作製したランダム変異体ライブラリーから得たＳｐＡ６ａの発現ベクターを鋳型ＤＮＡとして用い、エラープローンＰＣＲを行なった。エラープローンＰＣＲは、表２、９、または１０に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、５０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。前記エラープローンＰＣＲにより変異型の免疫グロブリン結合性タンパク質（ＳｐＡ６ａ）をコードするポリヌクレオチド（配列番号３６）に良好に変異が導入され、その平均変異導入率は、表２の条件（組成）でＰＣＲした場合が１．０３％、表９の条件（組成）でＰＣＲした場合が１．４４％、表１０の条件（組成）でＰＣＲした場合が２．８７％であった。【０１６２】
【表９】
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【０１６３】
【表１０】
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【０１６４】
（２）
得られたＰＣＲ産物を精製後、制限酵素ＮｃｏIとＸｈｏIで消化し、予め制限酵素ＮｃｏIとＸｈｏIで消化した発現ベクターｐＥＴ−２８ａにライゲーションした。【０１６５】
（３）
ライゲーション反応終了後、反応液を用いてエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレート培地で培養（３７℃、１６時間）した後、プレート上に形成したコロニーをランダム変異体ライブラリーとした。【０１６６】
実施例１１  アルカリ安定化免疫グロブリン結合性タンパク質のスクリーニング（その４）
（１）
実施例１０で作製したランダム変異体ライブラリー（形質転換体）約２５００株（表２の条件で得たライブラリーから約１０００株、表９の条件で得たライブラリーから約１０００株、および表１０の条件で得たライブラリーから約５００株）を実施例３（１）から（２）に記載の方法で培養することで免疫グロブリン結合性タンパク質を発現させた。【０１６７】
（２）
培養後、遠心操作によって得られた免疫グロブリン結合性タンパク質を含む培養上清を純水で４０倍に希釈した。希釈した溶液を２Ｍ  ＮａＯＨと等量混合し、６５〜６８℃で３０分間アルカリ処理を行なった。アルカリ処理後は４倍量の１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．０）で中和した。【０１６８】
（３）
アルカリ処理を行なったときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性とアルカリ処理を行わなかったときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性を、実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法にてそれぞれ測定した。【０１６９】
（４）
アルカリ処理を行なったときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性を、アルカリ処理を行わなかったときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで残存活性を算出し、ＳｐＡ６ａと比較してアルカリ安定性が向上した（残存活性が向上した）免疫グロブリン結合性タンパク質を発現する形質転換体を選択した。【０１７０】
（５）
選択した形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて発現ベクターを調製した。【０１７１】
（６）
得られた発現ベクターに挿入された免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域のヌクレオチド配列を実施例１（５）に記載の方法により解析し、アミノ酸置換箇所を特定した。【０１７２】
（４）で選択した形質転換体が発現する免疫グロブリン結合性タンパク質のＳｐＡ６ａ（配列番号３４）に対するアミノ酸置換位置および０．５Ｍ  ＮａＯＨを用いて２５℃、１５時間アルカリ処理したときの残存活性［％］をまとめた結果を表１１、表１２、および表１３に示す。配列番号３４に記載のアミノ酸配列において、Ｖａｌ４０Ａｌａ、Ａｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ（Ｇｌｕ）５８Ａｓｐ、およびＬｙｓ（Ｇｌｕ）５８Ｖａｌのいずれかのアミノ酸置換が少なくとも１つ生じた免疫グロブリン結合性タンパク質は、ＳｐＡ６ａ（配列番号３４）と比較しアルカリ安定性が向上しているといえる。【０１７３】
配列番号３４に記載のアミノ酸配列において、Ｖａｌ４０３４Ａｌａ（この表記は配列番号３４の４０番目のバリンがアラニンに置換されていることを表す、以下同じ）のアミノ酸置換が生じたタンパク質（ＳｐＡ７ａと命名）のアミノ酸配列を配列番号３７に、Ａｓｎ３３４Ｉｌｅのアミノ酸置換が生じたタンパク質（ＳｐＡ７ｂと命名）のアミノ酸配列を配列番号３８に、Ｌｙｓ（Ｇｌｕ）５８３４Ａｓｐのアミノ酸置換が生じたタンパク質（ＳｐＡ６ｂと命名）のアミノ酸配列を配列番号３９に、Ｌｙｓ（Ｇｌｕ）５８３４Ｖａｌのアミノ酸置換が生じたタンパク質（ＳｐＡ６ｃと命名）のアミノ酸配列を配列番号４０に、それぞれ示す。【０１７４】
【表１１】
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【０１７５】
【表１２】
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【０１７６】
【表１３】
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【産業上の利用可能性】
【０１７７】
本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、スタフィロコッカス属細菌由来プロテインＡのドメインＣ等のイムノグロブリン結合ドメインの特定位置におけるアミノ酸残基を他の特定のアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列を含むタンパク質である。本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質はアルカリに対する安定性が向上しており、抗体（免疫グロブリン）を分離するための吸着剤におけるリガンドタンパク質として有用である。
【配列表】
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【国際調査報告】
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2019093439.tif 000016
2019093439.tif 000017
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