(57)【要約】  本発明はカロリー制限やメトフォルミン投与以外の方法で、ヒトあるいはヒト以外の生物の老化の防止や寿命の延長を可能とすることを課題とする。  Ａ）キサンチンオキシダーゼ／キサンチンデヒドロゲナーゼ阻害剤を含む剤を投与することによりヒト、あるいはヒト以外の生物の老化を防止し、寿命の延長を可能とする。  また、Ａ）キサンチンオキシダーゼ／キサンチンデヒドロゲナーゼ阻害剤と、Ｂ）ヒポキサンチン、または体内でヒポキサンチンに変換され得る化合物を組み合わせ、同時に投与したり、合剤、またはキット剤として投与したりすることによりヒト、あるいはヒト以外の生物の老化を防止し、寿命の延長を可能とする。
2020149218.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のＡ）を含む老化防止剤または寿命延長剤。
Ａ）キサンチンオキシダーゼ／キサンチンデヒドロゲナーゼ阻害剤
【請求項２】
以下のＡ）およびＢ）を組み合わせてなる老化防止剤または寿命延長剤。
Ａ）キサンチンオキシダーゼ／キサンチンデヒドロゲナーゼ阻害剤
Ｂ）ヒポキサンチン、または体内でヒポキサンチンに変換され得る化合物
【請求項３】
Ａ）が、フェブキソスタット、トピロキソスタット、アロプリノール、ヒドロキシアルカン、カルプロフェンおよびY-700からなる群から選ばれるいずれか１以上である請求項１または２に記載の老化防止剤または寿命延長剤。
【請求項４】
Ｂ）の体内でヒポキサンチンに変換され得る化合物が、イノシン、イノシン酸、アデノシン、AMP、ADP、ATP、サクシニルアデノシン、S-アデノシルメチオニン、S-アデノシルホモシステインおよびそれらの薬学的に許容される塩から選ばれるいずれか１以上の化合物である請求項２または３に記載の老化防止剤または寿命延長剤。
【請求項５】
Ａ）およびＢ）の組み合わせが、Ａ）およびＢ）を含む合剤またはキット剤である、請求項２〜４のいずれかに記載の老化防止剤または寿命延長剤。
【請求項６】
フェブキソスタットを含む老化防止剤または寿命延長剤。
【請求項７】
フェブキソスタットおよびイノシンを組み合わせてなる老化防止剤または寿命延長剤。
【請求項８】
フェブキソスタット10〜80mgおよびイノシン0.5〜4gを含む合剤またはキット剤である請求項７に記載の老化防止剤または寿命延長剤。
【請求項９】
イノシンと組み合わせて使用される、フェブキソスタットの老化防止剤または寿命延長剤としての使用。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトまたは他の生物の老化（加齢）を抑制し、寿命を延ばすための剤に関する。より詳細には、本発明は、ヒト、または他の生物に対し、Ａ）キサンチンオキシダーゼ／キサンチンデヒドロゲナーゼ阻害剤単独、またはＡ）キサンチンオキシダーゼ／キサンチンデヒドロゲナーゼ阻害剤と、Ｂ）ヒポキサンチン、または体内でヒポキサンチンに変換され得る化合物、例えばイノシン、との組み合わせを投与することによって、老化を抑制し、寿命を延ばすための剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
老化は、時間が経つにつれて個体に起こる生物学的変化である。その中でも、特に、生物が死ぬ前に起きる様々な機能低下とその過程を指す。ヒトでは、老化は、しばしば、皮膚のしわ、筋力の低下、聴力障害、視力の低下、および認知症などの神経障害によって特徴付けられる。カロリー制限は老化を減少させ寿命を延長させることが報告されており（非特許文献1）、老化の抑制は、寿命の延長につながる可能性がある。しかし、確実に人間の老化を防止し、寿命を延長させる治療法は知られていない。ただし、さまざまな要因が老化および寿命に関与することが報告されている。その中でも、ミトコンドリアの機能不全や機能障害によるエネルギー低下が、老化のメカニズムであることが示唆されている(非特許文献2-7)。【０００３】
ヒトではミトコンドリアの数と機能は10歳で8%低下することが知られており(非特許文献8)、老人ではミトコンドリアの機能が生体の正常機能を支えるに十分でなくなる可能性がある。ミトコンドリアの機能はエネルギーであるATPを産生する事なので、ミトコンドリア機能の低下は細胞エネルギー低下につながり、それが老化を促進している可能性がある。ミトコンドリア病は遺伝子が原因でミトコンドリアに障害が起きる疾患の総称である（非特許文献5-7）。ミトコンドリア病では難聴、脳障害、筋肉障害、心筋症、糖尿病などが起きるが、これらは老化によって起きる障害と類似している。【０００４】
既にアロプリノールやフェブキソスタットなどのキサンチンオキシダーゼ／キサンチンデヒドロゲナーゼ阻害剤を高用量で用いることにより、心臓障害(非特許文献9)、筋肉萎縮(非特許文献10)、認知症の発症(非特許文献11)を抑制するという報告がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Taylor RC, Dillin A (2011). "Aging as an event of proteostasis collapse". Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (5): a004440.
【非特許文献２】Srivastava S. The Mitochondrial Basis of Aging and Age-Related Disorders. Genes (Basel). 2017 Dec 19;8(12). pii: E398.
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【非特許文献２８】Garrett, R. H. & Grisham, C. M. in Biochemistry 927-956 (Cengage Learning, 2016).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前記の症状は、全て老化でみられる症状である。これらの論文では著者らは主としてキサンチンオキシダーゼ／キサンチンデヒドロゲナーゼ阻害剤が活性酸素を抑えるというメカニズムに注目しているが、我々は、この作用がプリンの分解を阻害し、エネルギーを節約することによるものであると考えた。つまり、この作用は図1のXORを阻害しヒポキサンチン（hypoxanthine）の分解を抑えることによると考えた。ヒポキサンチンは図1のHGPRTの作用でIMPに変換され、ATP増強が起きる。もし、このメカニズムが正しければ、キサンチンオキシダーゼ／キサンチンデヒドロゲナーゼ阻害剤にイノシンを加えることでさらにATP増強効果が発揮できる。我々は既にキサンチンオキシダーゼ／キサンチンデヒドロゲナーゼ阻害剤単独より、キサンチンオキシダーゼ／キサンチンデヒドロゲナーゼ阻害剤にイノシンを加えたほうがヒポキサンチンを増加させ、ATPを増強させることを論文で報告している（非特許文献12）。
キサンチンオキシダーゼ／キサンチンデヒドロゲナーゼ阻害剤単独による治療は、老化に似た心臓病、認知症、筋肉萎縮を抑制する。従って、この治療法は老化を抑制し、寿命を延ばす可能性があると考えた。また、このメカニズムはヒポキサンチンを増加させATPを増強することによると考えられるので、ヒトではキサンチンオキシダーゼ／キサンチンデヒドロゲナーゼ阻害剤にイノシンを加えることでさらに老化を抑制し、寿命を延ばす可能性があると考えた。ヒトでは寿命延長の研究は容易ではない。しかし、C. elegansのように寿命が非常に短い生物を使用することにより寿命延長の効果を調べることが可能である。
後述のように小さい生物であるC. elegansの重量当たり代謝速度はヒトよりはるかに速く、そのためヒポキサンチンの産生速度もはるかに速いと考えられる。従って、C. elegansを用いた実験ではイノシンを加えず、キサンチンオキシダーゼ／キサンチンデヒドロゲナーゼ阻害剤のみを投与し寿命延長の有無を調べることにした。【０００７】
ヒトの老化のモデルとしてはミトコンドリア病が考えられることは前述した。そこで、ミトコンドリア病患者にキサンチンオキシダーゼ／キサンチンデヒドロゲナーゼ阻害剤とイノシンの同時投与を行いヒポキサンチンとATPの上昇の有無を調べることにした。
老化や死はヒトのみならず、ペットなど様々な生物の最大の悲劇の一つである。これを防止し、あるいは抑制できればヒト、あるいはペットなど様々な生物に幸福をもたらす。しかし、実際には老化を防止し、寿命を延長することは困難である。
これまでカロリー制限、メトフォルミン投与などが老化を防止し、寿命を延長すると報告されている。しかし、その効果が確実であり、しかも十分であるかどうかは不明である。本発明が解決すべき問題は、ヒト、あるいはヒト以外の生物の老化の進行と限られた寿命である。従って、本発明はカロリー制限やメトフォルミン投与以外の方法で、ヒトあるいはヒト以外の生物の老化の防止や寿命の延長を可能とすることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らはＡ）キサンチンオキシダーゼ／キサンチンデヒドロゲナーゼ阻害剤を含む剤を投与することによりヒト、あるいはヒト以外の生物の老化を防止し、寿命を延長できることを見出した。
また、本発明者らはＡ）キサンチンオキシダーゼ／キサンチンデヒドロゲナーゼ阻害剤と、Ｂ）ヒポキサンチン、または体内でヒポキサンチンに変換され得る化合物を組み合わせ、同時に投与したり、合剤、またはキット剤として投与したりすることによりヒト、あるいはヒト以外の生物の老化を防止し、寿命を延長できることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００９】
すなわち本発明は以下の構成を有する。
（１）以下のＡ）を含む老化防止剤または寿命延長剤。
Ａ）キサンチンオキシダーゼ／キサンチンデヒドロゲナーゼ阻害剤
（２）以下のＡ）およびＢ）を組み合わせてなる老化防止剤または寿命延長剤。
Ａ）キサンチンオキシダーゼ／キサンチンデヒドロゲナーゼ阻害剤
Ｂ）ヒポキサンチン、または体内でヒポキサンチンに変換され得る化合物
（３）Ａ）が、フェブキソスタット、トピロキソスタット、アロプリノール、ヒドロキシアルカン、カルプロフェンおよびY-700からなる群から選ばれるいずれか１以上である（１）または（２）に記載の老化防止剤または寿命延長剤。
（４）Ｂ）の体内でヒポキサンチンに変換され得る化合物が、イノシン、イノシン酸、アデノシン、AMP、ADP、ATP、サクシニルアデノシン、S-アデノシルメチオニン、S-アデノシルホモシステインおよびそれらの薬学的に許容される塩から選ばれるいずれか１以上の化合物である（２）または（３）に記載の老化防止剤または寿命延長剤。
（５）Ａ）およびＢ）の組み合わせが、Ａ）およびＢ）を含む合剤またはキット剤である、（２）〜（４）のいずれかに記載の老化防止剤または寿命延長剤。
（６）フェブキソスタットを含む老化防止剤または寿命延長剤。
（７）フェブキソスタットおよびイノシンを組み合わせてなる老化防止剤または寿命延長
剤。
（８）フェブキソスタット10〜80mgおよびイノシン0.5〜4gを含む合剤またはキット剤である（７）に記載の老化防止剤または寿命延長剤。
（９）イノシンと組み合わせて使用される、フェブキソスタットの老化防止剤または寿命延長剤としての使用。
また、本発明は以下の方法も含む。
（１０１）以下のＡ）を対象生物に投与する工程を含む老化防止または寿命延長方法。
Ａ）キサンチンオキシダーゼ／キサンチンデヒドロゲナーゼ阻害剤
（１０２）以下のＡ）およびＢ）を組み合わせて対象生物に投与する工程を含む老化防止または寿命延長方法。
Ａ）キサンチンオキシダーゼ／キサンチンデヒドロゲナーゼ阻害剤
Ｂ）ヒポキサンチン、または体内でヒポキサンチンに変換され得る化合物
（１０３）Ａ）が、フェブキソスタット、トピロキソスタット、アロプリノール、ヒドロキシアルカン、カルプロフェンおよびY-700からなる群から選ばれるいずれか１以上である（１０１）または（１０２）に記載の老化防止または寿命延長方法。
（１０４）Ｂ）の体内でヒポキサンチンに変換され得る化合物が、イノシン、イノシン酸、アデノシン、AMP、ADP、ATP、サクシニルアデノシン、S-アデノシルメチオニン、S-アデノシルホモシステインおよびそれらの薬学的に許容される塩から選ばれるいずれか１以上の化合物である（１０２）または（１０３）に記載の老化防止または寿命延長方法。
（１０５）Ａ）およびＢ）の組み合わせが、Ａ）およびＢ）を含む合剤またはキット剤である、（１０２）〜（１０４）のいずれかに記載の老化防止または寿命延長方法。
（１０６）フェブキソスタットを対象生物に投与する工程を含む老化防止または寿命延長方法。
（１０７）フェブキソスタットおよびイノシンを組み合わせて対象生物に投与する工程を含む老化防止または寿命延長方法。
（１０８）フェブキソスタットおよびイノシンの組み合わせが、フェブキソスタット10〜80mgおよびイノシン0.5〜4gである（１０７）に記載の老化防止または寿命延長方法。
（１０９）対象生物が、ヒト又はヒト以外の哺乳動物である（１０１）〜（１０８）のいずれかに記載の老化防止または寿命延長方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、Ａ）キサンチンオキシダーゼ／キサンチンデヒドロゲナーゼ阻害剤を含む剤を投与することによりヒト、あるいはヒト以外の生物の老化を防止し、寿命を延長できる。
また、次のＡ）およびＢ）の併用投与によりヒト、あるいはヒト以外の生物の老化を防止し、寿命を延長できる。
Ａ）キサンチンオキシダーゼ／キサンチンデヒドロゲナーゼ阻害剤
Ｂ）ヒポキサンチン、または体内でヒポキサンチンに変換され得る化合物、例えばイノシン、イノシン酸、アデノシン、AMP、ADP、ATP、サクシニルアデノシン、S-アデノシルメチオニン、S-アデノシルホモシステインおよびそれらの薬学的に許容される塩から選ばれるいずれか１以上の化合物
現在、ヒト、あるいはヒト以外の生物の老化を防止し、寿命を延長するために有効な方法や剤が知られているが、その効果は十分とは言えない。従って、本発明の老化防止剤または寿命延長剤は極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】プリン代謝経路を示す図である。プリンヌクレオチドの新たな合成（de novo synthesis）は解糖系由来の五炭糖リン酸シャント（pentose monophosphate shunt）から得られるリボース5リン酸（ribose-5-phosphate）から始まる。6つのATPが使用される一連の酵素反応を経てIMPが合成される。6つのATPが使用される反応のうち1つはADPではなくAMPを生じるので実際には7分子のATPを消費することになる。筋運動などによりATPが消費されADPになると、解糖系（glycolysis）やミトコンドリア内の酸化的リン酸化（oxidative phosphorylation）によりADPはATPに変換される。しかし、2分子のADPをAK（adenylate kinase）の作用によりATPとAMPに変換することもできる。この反応は解糖系や酸化的リン酸化の関与なしにATPを合成するが、その副産物としてAMPが生じ、これがエネルギーチャージを低下させる。これを避けるため、細胞はAMPをAMPD（AMP deaminase）によりIMPに変換し、最終的にヒポキサンチン（hypoxanthine）を経てxanthine oxidoreductase（xanthine oxidoreductase）により尿酸（uric acid）に変換させる。ヒポキサンチンの段階であればHGPRTの作用でIMPに戻すことができ、最終的にATPに変換することができる。しかし、キサンチンオキシダーゼ／キサンチンデヒドロゲナーゼにより分解されるとプリンヌクレオチドに戻すことはできず、新たに7分子のATPを消費して合成しなければならないことを示す図である。
【図２】C. elegansのN2ストレインを用いた、線虫の寿命に対するフェブキソスタット（FBX）の影響を示す図である。1条件につき50匹の線虫を観察した実験におけるKaplan-Meier曲線を示す。P値はすべてlog-rank (Mantel-Cox)検定による。
【図３】C. elegansのdaf-16遺伝子変異体株を用いた、線虫の寿命に対するフェブキソスタット（FBX）の影響を示す図である。1条件につき50匹の線虫を観察した実験におけるKaplan-Meier曲線を示す。P値はすべてlog-rank (Mantel-Cox)検定による。
【図４】C. elegans の野生株N2を用いた、線虫の寿命に対するフェブキソスタット（FBX）の影響を示す図である。1条件につき50匹の線虫を観察した実験におけるKaplan-Meier曲線を示す。
【図５】線虫をフェブキソスタット（FBX）の非存在下（FBX(-)）、あるいは存在下（20μg/mL FBX）で１８日間培養した後、尾部を固定し、電子顕微鏡により筋肉内を観察した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（老化防止剤または寿命延長剤）
本発明の老化防止剤または寿命延長剤は、ヒトまたはヒト以外の他の生物を対象として、老化（加齢）を抑制し、寿命を延ばすための剤のことをいう。本発明の剤は医薬品として用いることができる。
ヒト以外の生物としては、無脊椎動物、鳥類、魚類、両生類、爬虫類、哺乳類などの脊髄動物、特に哺乳動物そのうちでも例えばウシ、イヌ科、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウサギ、マウスなどが含まれる。
【００１３】
寿命延長効果の確認については、これまでにも糖尿病治療薬のメトフォルミンはC. elegansで寿命を延ばすことが報告されているが(非特許文献13-16)、同じ薬物がショウジョウバエ(非特許文献17)、あるいはヒト(非特許文献18)でも老化を防ぎ、様々な原因による死を防ぐことが示唆されている。従って、C. elegansで示された寿命延長効果は、ヒトやそれ以外の生物でも期待できる。
【００１４】
重量当たりのエネルギー代謝速度は体の大きい哺乳動物では小さい哺乳動物より小さい。一般に、哺乳動物の個体のエネルギー代謝速度はKleiberの法則によると体重の3/4乗に比例する（非特許文献19, 20）ので、重量当たりのエネルギー代謝速度は体重の-1/4乗に比例することになる。例えばヒトのエネルギー代謝（重量当たり）はマウスの1/8程度と考えられる。哺乳動物が重量当たり一生に消費するエネルギーはほぼ一定であり、そのため、体の大きな哺乳動物は重量当たり、時間当たりのエネルギー消費が少なく、従って寿命が長いと考えられている（非特許文献20）。生物の体内のエネルギーのほとんどはATPとして消費されるので、エネルギー消費はATPの消費とほぼ一致すると考えられる。尿酸産生はATPの消費と関連し、ATPの消費が多いと尿酸生速度は速い傾向がある（非特許文献21）。マウスのATP消費がヒトより著しく速いため、マウスの尿酸産生速度はヒトの約25倍である(非特許文献22)。従って、マウスではキサンチンオキシダーゼ／キサンチンデヒドロゲナーゼ阻害剤単独でも血液中ヒポキサンチンの大幅な増加がみられるが(非特許文献23)、ヒトではわずかな増加しかなく、イノシンの同時投与によってヒポキサンチンの著しい増加がみられることがわかっている(非特許文献12)。従って、特にヒトなどの体のサイズの大きな生物ではキサンチンオキシダーゼ／キサンチンデヒドロゲナーゼ阻害剤単独投与より、キサンチンオキシダーゼ／キサンチンデヒドロゲナーゼ阻害剤にイノシンなどの体内でヒポキサンチンに変換され得る化合物を同時に投与することにより、さらに強い老化防止、寿命延長を行える可能性がある（非特許文献12）。
【００１５】
なお、メトフォルミンによる寿命延長のメカニズムとしてAMP activated protein kinase（AMPK）の活性化が考えられている（非特許文献13）。メトフォルミンはAMP deaminase（AMPD）を抑制することによりAMPを蓄積させ、それがAMPKを活性化する可能性が考えられる（図1）（非特許文献24）。AMPKはAMPの蓄積を察知し、細胞のエネルギー状態を維持するためにATPの消費を抑え、産生を促す作用があると考えられている。なお、ヒトの遺伝的AMPD欠損症ではAMPの蓄積が起き、ATPの増強（あるいは低下の抑制）が起きることが報告されている（図1）。即ち、ヒトのAMPDをコードする遺伝子はAMPD1、AMPD2、AMPD3と3個知られており、それぞれホモ接合体を含む欠損症が報告されているが、AMPD1、AMPD3欠損症のホモ接合体では、それぞれ筋肉（非特許文献25）、赤血球（非特許文献26）のATPが増強されることが報告されている。前者では運動時にATPの低下が抑制され、後者では赤血球中のATPの量が増加する。ATPが急激に消費されるとATPが不足し、ADPが蓄積する（図1）。この状態ではAKが2分子のADPからAMPとATPを合成する方向に働き、AMPが蓄積する。蓄積したAMPはAMPDによりIMPに分解され、最終的にキサンチンオキシダーゼ／キサンチンデヒドロゲナーゼにより尿酸となる（図1）。実際にATPを急激に消費するエネルギークライシスの状態では血清尿酸値が上昇することが報告されている（非特許文献21, 27）。キサンチンオキシダーゼ／キサンチンデヒドロゲナーゼに分解されキサンチン、尿酸となるとヌクレオチドに戻ることは不可能であるが、ヒポキサンチンの状態であればHGPRTの作用によりヌクレオチドに戻ることが可能である（図1）。キサンチン、尿酸となり失われたプリンヌクレオチドを再生するためにはペントースリン酸側路（pentose monophosphate shunt）から得られるリボース-5-リン酸（ribose-5-phosphate）からIMPを合成する必要がある（purine de novo synthesis）が、これには7分子のATPを消費する必要がある（非特許文献28）（図1）。
【００１６】
キサンチンオキシダーゼ／キサンチンデヒドロゲナーゼ阻害剤は図1のキサンチンオキシダーゼ／キサンチンデヒドロゲナーゼを阻害し、プリン体の分解を抑制し、HGPRTを通じプリンヌクレオチドの減少を抑える作用がある（図1）。即ち、ヒポキサンチンを増加させ、HGPRTを通じIMPを増加させ、さらにAMP、ATPを増加させると考えられる（非特許文献12）。ATPが急速に使用され、低下する状況では、その低下を抑制する。メトフォルミンもAMPDの阻害を通じ、プリンヌクレオチドの減少を抑える作用がある（図1）。即ち、フェブキソスタット、あるいはフェブキソスタットとイノシンの同時投与による寿命延長作用とメトフォルミンの寿命延長作用には共通点がある可能性がある。
【００１７】
(有効成分）
本発明の１つの有効成分は、Ａ）キサンチンオキシダーゼ／キサンチンデヒドロゲナーゼ阻害剤である。キサンチンオキシダーゼ／キサンチンデヒドロゲナーゼ阻害剤としては、フェブキソスタット（商品名フェブリク）、トピロキソスタット（富士薬品）、アロプリノール（商品名ザイロリック、アロシト−ルなど）、ヒドロキシアルカン、カルプロフェンおよびY-700（田辺三菱製薬）が挙げられ、このうちでもフェブキソスタットが望ましい。本発明の老化防止剤または寿命延長剤は、この有効成分を含むものであればよく、この有効成分のみを単独で含むものであっても良い。
本発明のもう１つの有効成分は、Ｂ）ヒポキサンチン、または体内でヒポキサンチンに変換され得る化合物、例えばイノシン、イノシン酸、アデノシン、AMP、ADP、ATP、サクシニルアデノシン、S-アデノシルメチオニン、S-アデノシルホモシステインおよびそれらの薬学的に許容される塩から選ばれるいずれか１以上の化合物である。このうちでもイノシンが望ましい。本発明の老化防止剤または寿命延長剤は、上記Ａ）の有効成分に加えて、この有効成を含むものであることが好ましい。
【００１８】
（組み合わせ）
本発明の「Ａ）およびＢ）を組み合わせてなる」とは、Ａ）の成分とＢ）の成分が組み合わされた態様をすべて含む意味で用いられる。したがって、Ａ）の成分とＢ）の成分が混合されて組成物を形成している合剤、あるいは混合されることなく、物理的に別々に存在するが、投与される際に同時期に投与されるようにまとめられて存在する薬剤の両者を含む。Ａ）の成分とＢ）の成分が混合されて組成物を形成している合剤の例としては、混合されて製剤化されたものが挙げられる。製剤化の例としては、顆粒、粉体、固形剤、液体などの経口剤および坐薬が挙げられる。物理的に別々に存在するが、投与される際に同時期に投与されるようにまとめられて存在する薬剤としては、いわゆるキット剤や、１つの袋に取りまとめられる形態が挙げられる。同時期とは、必ずしも厳密な意味での同時を意味せず、効果が発揮される範囲で間隔を置く場合も本発明の同時期に含むものとする。例えば、経口剤の場合、一方を食前、一方を食後に飲むような場合は本発明の同時期に投与される場合に相当する。
上記のとおり、Ａ）とＢ）をそれぞれ単独の製剤として服用することも可能である。しかし、Ｂ）を単独で服用すると高尿酸血症を来すので有害となることがあり、Ａ）とＢ）は必ず同時期に服用する必要があり、この点からキット剤または合剤がより望ましく、合剤がよりいっそう望ましい。
本発明のＡ）およびＢ）を組み合わせてなる老化防止剤または寿命延長剤の発明は、換言すれば、前記Ａ）およびＢ）を組み合わせて投与する工程を含む老化防止方法、または寿命延長方法の発明と言える。それぞれを投与するタイミングは、前述のとおりである。
【００１９】
（投与量）
本発明の剤の投与量は、有効量であればよく、それぞれ以下の投与量が望ましい。例えば、Ａ）のフェブキソスタットは、10〜80mg／日、トピロキソスタットは、40〜160mg／日、アロプリノール、約50mg〜約800mg／日が望ましい。また、Ｂ）のイノシンは、0.5〜4.0g／日が望ましく、Ｂ）ヒポキサンチン、または体内でヒポキサンチンに変換され得る化合物の有効量も前記イノシンの量に相当する量を分子量により換算して求めることができる。
【００２０】
（投与方法）
投与方法は、上記投与量をそれぞれ１日１回または２回以上に分けて投与することが可能である。このうちでも、フェブキソスタットは、従来のフェブキソスタットの用法のように１日１回投与ではなく、１日２回の投与を行うことが望ましい。また、イノシンも１日１回よりも２回の投与が望ましい。したがって、イノシン、フェブキソスタットともに１日２回にわけて投与することがさらに望ましい。
合剤とする場合は、１日の投与量、投与方法を考慮して調整すればよく、フェブキソスタットとイノシンを、フェブキソスタット20mg、または40mgにイノシン0.5g、1g、1.5g、または2gを加えたものなどが望ましい。１錠にフェブキソスタット20mg、イノシン0.5gを加えたものがさらに望ましい。
【００２１】
（投与形態）
本発明医薬の投与形態は特に限定されず、経口または非経口のいずれの投与形態でもよい。また、投与形態に応じて適当な剤形とすることができ、例えば注射剤、あるいはカプセル剤、錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤、細粒剤などの経口剤、直腸投与剤、油脂性坐剤、水性坐剤などの各種製剤に調製することができる。
本発明の剤のうち、有効成分Ａ）およびＢ）を含む剤の投与形態は、有効成分Ａ）の投与形態とＢ）の投与形態が同じであってもよいし、異なってもよい。同じ投与形態の例としては、両方を錠剤で経口投与する場合、両者を合わせた合剤として経口投与する場合、両者を混合した注射剤で投与する場合などが挙げられる。また、異なる投与形態の例としては、一方を経口剤、一方を注射剤などで投与する場合が挙げられる。
【００２２】
（従来の老化防止剤または寿命延長剤との併用）
本発明の老化防止剤または寿命延長剤は、細胞内のATPの増強効果を奏するものであり、本作用に影響を与えない範囲ですでに処方されている既存の老化防止剤または寿命延長剤と併用することができる。
【００２３】
以下、本発明の老化防止剤または寿命延長剤の効果について、実施例をもとに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定して解釈されるものではない。
【実施例】
【００２４】
〔実施例１〕
フェブキソスタットによるC. elegans（線虫）の寿命の延長の検討
野生型株（N2, Bristrol）とdaf-16遺伝子（ヒト転写因子FOXOの線虫オーソログ；インスリンシグナルで抑制を受ける転写因子で、線虫の変異体では寿命が短くなる代表例）変異体株（mu86）を使用し、フェブキソスタットによる寿命の延長を検討した。いずれの株も飼育は全て20℃で行った。【００２５】
１．試験方法
（１）事前準備
寿命測定に使用する株の発生段階を一定にするために、餌（大腸菌）がなくなり１齢幼虫で成長が止まるまで待った。この線虫を餌のあるシャーレに寒天ごと切り植えた。
（２）前日
6cm NGMプレート（線虫培養用の標準的な培地）に餌の大腸菌株の成長とそれに関連する代謝を阻害するためにアンピシリン（100μg/ml)を加え、OP50（餌の大腸菌株）とFBXを加えた（FBXの濃度は0,10,20または40mg/L）。
（３）第0日
切り植えた線虫が成虫になった段階でM9バッファーを用いてシャーレから洗い出し回収した。線虫はエッペンドルフチューブに懸濁した。線虫懸濁液と等量のブリーチ液（4N NaOH、次亜塩素酸液、M9バッファーを2:3:5で混合したもの）を加えて混和した。400xgで遠心して上清を廃棄した。成虫は破裂して死に、受精卵のみが生存回収された。この卵を前日に準備しておいたNGMプレート（アンピシリン入り、FBX有／無）にのせて培養を開始した。
（４）第4日
ブリーチした卵が成長して卵ができる時期になった段階でFUdR（終濃度0.5mg/ml）を培地に添加した。これによって成虫が不妊となることで産卵による寿命への影響を除去した。
（５）第5日
予め大腸菌を塗布し、アンピシリンとフェブキソスタットを入れた35mm NGMシャーレに上記（４）と同様にFUdR（終濃度 0.5mg/ml）を添加したシャーレを用意しておき、1枚のシャーレに5匹の成虫を置いて飼育を開始した。どのサンプルも1回の実験で10枚以上のシャーレを同時に観察に供した。
（６）第6日以降
1日おきに各個体について生死を判定し、データを記載した。この際の生死判定方法は次のように行った。「動いている線虫や餌を摂取するために咽頭筋がポンピングしている個体は生きていると見做す。動かない線虫がいた場合は白金線（線虫ピッカー）で静かに触れて、反応するかどうかを観察した。」
（７）観察終了
全ての線虫が死滅したと判断された段階で寿命追跡を終了した。【００２６】
２．結果
野生型株（N2,Bristrol）でも（図2）、daf-16遺伝子変異体株（mu86）（図3）でもフェブキソスタット10mg/ml存在下では寿命の延長が認められたが、daf-16遺伝子変異体株（mu86）にフェブキソスタットを投与しても野生型株の寿命と同等の長さには至らなかった。従って、フェブキソスタットの作用はdaf-16遺伝子とは異なる経路で働いていることが推測された。【００２７】
〔実施例２〕
ミトコンドリア病患者におけるフェブキソスタットとイノシンの同時投与によるヒポキサンチンおよびATPの上昇の検討
ATP欠乏が起きる事が確実に病因に関連しているのはミトコンドリア病である。そこで、ミトコンドリア病であることが確定している患者にキサンチンオキシダーゼ／キサンチンデヒドロゲナーゼ阻害剤であるフェブキソスタットとイノシンの同時投与を行うことにより、実際にATPが上昇するか否かを調べた。【００２８】
１．試験方法
症例は80歳の男性で、診断はミトコンドリア心筋症である。重度の心不全および複数の早期心室収縮（PVC）が60歳で検出された。血液からのミトコンドリアDNA（mtDNA）の直接配列決定により、ヒスチジンのミトコンドリアtRNA遺伝子（MT-TH）のホモプラスミー変異（m.12192G> A）が判明したことによりミトコンドリア心筋症と診断された。
フェブキソスタット20mgとイノシン0.5gを1日2回14日間この患者に投与した。【００２９】
２．プリン体（ATP、hypoxanthine）の測定方法
末梢血中の種々のプリンの測定は、次の参考文献に従って行った。
簡潔に述べると、EDTA-2Naを含有する試験管に末梢血を採取し、500μLの血液を500μLの氷冷8％ PCAと混合し、混合物を直ちにボルテックスした。その後、12,000xgで4℃、5秒間遠心分離し、上清を-80℃で保存した。6M KOH、2M K2CO3を含む溶液40μLを上記の検体溶液650μLに添加してPCAを沈殿させ、同時に溶液を中和した。これを4℃、12,000×gで10分間遠心分離した後、上清40μLに移動相160μLを加えてHPLCに供した。HPLCの条件は、下記の参考文献1に記載したものと同じである。プリン体の量は、PCAを除去した後の溶液中に含まれるモル量で表した。
［参考文献1］
Kamatani N, Hashimoto M, Sakurai K, Gokita K, Yoshihara J, Sekine M, Mochii M, Fukuuchi T, Yamaoka N, Kaneko K. Clinical studies on changes in purine compounds in blood and urine by the simultaneous administration of febuxostat and inosine, or by single administration of each. Gout and Nucleic Acid Metabolism 41, 171-181, 2017.【００３０】
３．結果
治療の前後で血清尿酸値、BNP値、血液中のATP量、ヒポキサンチン量およびキサンチン量を測定した。血清尿酸値は3.04mg/dLが1.29mg/dLとなり、BNP値も295.1pg/mLが204.4pg/mLとなり、31％減少したことが確認できた。なお、心電図ではPVCが消失したが、心房細動は残っていた。また、収縮期血圧および拡張期血圧は有害事象なしに減少した。
さらに、表１に示すように、血液中のATP量は1.3倍、ヒポキサンチン量は6.5倍、キサンチン量は19.1倍増加した。
従って、キサンチンオキシダーゼ／キサンチンデヒドロゲナーゼ阻害剤の一つであるフェブキソスタットと、ヒポキサンチンに体内で変換され得るイノシンの同時投与によりヒポキサンチンおよびATPが血中で増加することが確認できた。【００３１】
【表１】
2020149218.tif 000003
【００３２】
〔実施例３〕
C. elegans（線虫）の寿命とミトコンドリアの形態変化に与えるフェブキソスタットの影響の検討
線虫としてC. elegansの野生型株（N2, Bristrol）を使用し、フェブキソスタットの寿命に与える影響を検討した。また、フェブキソスタットの非存在下、および存在下で培養された線虫のミトコンドリアを電子顕微鏡で比較した。【００３３】
１．試験方法
（１）フェブキソスタットが線虫の寿命に与える影響
線虫（N2）の培養法と培養条件は、培地中に加える餌の処理方法以外は実施例１とほぼ同様に行った。通常、線虫の餌としてNGMプレート中に大腸菌を加えるが、大腸菌が生育すると代謝物などに影響を与える可能性がある。そのため、抗生物質アンピシリンを加え大腸菌の生育を停止させる方法が行われる。しかし、アンピシリンがNGMプレート中に存在する事が何らかの影響を与えたことが完全に否定できないと考えた。
そこで、アンピシリンを加える代わりに大腸菌に紫外線照射を加え死滅させ、更にカナマイシンを加えた。このように餌である大腸菌に実施例１と異なる処理を施し、実施例１と同じ実験結果が得られるかを確認した。
NGMプレートに加えたフェブキソスタットの濃度は5、10、20μg/mLとした。【００３４】
（２）フェブキソスタットが線虫の筋肉内のミトコンドリアの形態に与える影響
培養第１８日目に、以下の方法で線虫を固定した。8% エタノールを入れたM9 バッファーをスライドガラスにたらし、その中に線虫を入れ、線虫が動かなくなるまで静置した（約５分間）。次に、別のスライドガラス上に固定液を乗せ、その中に動かなくなった虫を移した。固定液は2%パラホルムアルデヒド+2%グルタルアルデヒド/0.1Mリン酸緩衝液（pH7.4)であり、使用前に調整した。
続いて22Gの注射針を使用し、線虫を次の手順で切断した。
まず、咽頭より頭側を切断し、次に、Vulvaのあたりで切断した。本実験ではVulvaより後ろの筋肉のミトコンドリアを電子顕微鏡で観察するため、尾側のみを集め、固定液（4℃）を入れたエッペンドルフチューブに入れた。
電子顕微鏡による観察は花市電子顕微鏡技術研究所（愛知県岡崎市）に依頼し電子顕微鏡HITACHI H-7600 (100 kV)を用いて行った。【００３５】
２．結果
（１）フェブキソスタットが線虫の寿命に与える影響
図4に示す通り、線虫の寿命は、フェブキソスタットを加えることにより延長することが示された。この結果は実施例1とほぼ同様であり、フェブキソスタットが線虫の寿命を延長することが示された。【００３６】
（２）フェブキソスタットが線虫の筋肉内のミトコンドリアの形態に与える影響
線虫は死亡が近くなると動きが鈍くなるが、その原因の一部は筋肉のミトコンドリアが障害され、筋力が低下することによる。
フェブキソスタットを添加しない状態で18日間培養した線虫の筋肉内の電子顕微鏡写真を図５「FBX(-)」に示した。この図の中にミトコンドリアが２個確認されるが、いずれも正常の形態が破壊されていた。即ち、ミトコンドリアの外膜、内膜の構造もはっきり見えず、クリステ（cristae）も一部は確認できるもののその形が崩れていた（図５写真中、黒い矢印部分）。
図５ 「20μｇ/ｍL FBX」にフェブキソスタット20μg/mLの存在下で同じ18日間培養した同じ線虫の筋肉内のミトコンドリアの電子顕微鏡写真を示した。図５「FBX(-)」に比較して外膜、内膜、クリステなどの構造が明確に確認できた（図５写真中、黒い矢印部分）。すなわち、ミトコンドリアの形態がほぼ正常に保たれていることを示している。【００３７】
３．考察
既に実施例１で、線虫の寿命をフェブキソスタットが延長させることを示した。即ち、野生型株（N2, Bristol））とdaf-16遺伝子変異体株（mu86）の二つの線虫株を用い、フェブキソスタットの存在下で寿命が延長されることを示した。
また、実施例２においてミトコンドリア病患者にフェブキソスタットと、ヒポキサンチンを体内で生じるイノシンを同時投与することにより、血液中のヒポキサンチンとATPを上昇させることを示した。更に、ミトコンドリア病患者にフェブキソスタットと、ヒポキサンチンを体内で生じるイノシンを同時投与することにより、疾患のバイオマーカーであるBNPとインスリンインデックスを劇的に改善したことは既に発表されている（下記、参考文献2）。
上記実施例３において、フェブキソスタットの線虫の野生型株（N2）を用いた寿命延長効果が再確認され、更に老化した線虫の筋肉内ミトコンドリアの老化による形態変化をフェブキソスタットが抑制する事が示された。
ミトコンドリアはATPを再生する細胞内小器官であり、以上の実施例を統合することにより生物の老化と寿命にミトコンドリアの劣化が関連している可能性が高いことが示された。更にミトコンドリアの劣化をフェブキソスタットが抑制する事も示された。フェブキソスタットの作用がキサンチン酸化還元酵素を阻害することによる事は従来の膨大なデータにより示されており、一般的にキサンチン酸化還元酵素を阻害することにより線虫のミトコンドリアの劣化を防ぐことができ、そのため老化を抑制し寿命を延長できることが推定される。一方、メトフォルミンが線虫の寿命を延長するという実験結果から、ショウジョウバエとマウスの実験が行われ、同様の結果が得られた。その結果により、ヒトの老化を防ぎ寿命を延長するという事が示唆され、大規模な臨床試験が計画されている。メトフォルミンで行われた一連の実験と、試験計画を総合すると、本出願で明らかになったデータの統合によりキサンチン酸化還元酵素阻害薬が一般的に生物の老化を防ぎ、寿命を延長すると考えられる。キサンチン酸化還元酵素阻害薬によるこの効果はATPを増強することに基づくと考えられるが、プリン代謝の種間の違いは著しく、ヒトの尿酸産生速度はマウスの1/25でしかない。これは生物のサイズとエネルギー消費量が反比例するためと考えられ、前述の通り、ヒトや大型の生物ではキサンチン酸化還元酵素阻害薬のみでは効果が弱いと考えられ、これにヒポキサンチンまたはそれを体内で生じる物質、例えばイノシンを同時投与することがより望ましい。
［参考文献2］
Kamatani N, Kushiyama A, Toyo-Oka L, Toyo-Oka T. Treatment of two mitochondrial disease patients with a combination of febuxostat and inosine that enhances cellular ATP. J Hum Genet. 2019 Apr;64(4):351-353.【００３８】
〔製剤例１〕合剤の例
１錠あたり下記を含む経口投与用の合剤(錠剤タイプ)を製造した。
フェブキソスタット                      20mg
イノシン                                0.5g
アルファ化デンプン（崩壊バンダー）      70mg
ケイ化微結晶セルロース（充填剤）        32.656mg
クロスカルメロースナトリウム（崩壊剤）  10mg
ステアリン酸マグネシウム（潤滑剤）      0.8mg【００３９】
〔製剤例２〕キット剤の例
フェブキソスタットを含む下記Ａ．の組成の錠剤とイノシンを含む下記Ｂの組成の剤を、それぞれ混ざらないように区切った同一袋に入れ、１回分を調整した。これを２回分すなわち１日分を同一の箱に梱包しキット剤を製造した。
Ａ．フェブキソスタット錠
フェブキソスタット                      20mg
アルファ化デンプン（崩壊バンダー）      70mg
ケイ化微結晶セルロース（充填剤）        32.656mg
クロスカルメロースナトリウム（崩壊剤）  10mg
ステアリン酸マグネシウム（潤滑剤）       0.8mg
Ｂ．イノシン
イノシン                                 0.5g
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明によれば、Ａ）キサンチンオキシダーゼ／キサンチンデヒドロゲナーゼ阻害剤を含む剤を投与することによりヒト、あるいはヒト以外の生物の老化を防止し、寿命を延長できる。
また、次のＡ）およびＢ）の併用投与によりヒト、あるいはヒト以外の生物の老化を防止し、寿命を延長できる。
Ａ）キサンチンオキシダーゼ／キサンチンデヒドロゲナーゼ阻害剤
Ｂ）ヒポキサンチン、または体内でヒポキサンチンに変換され得る化合物、例えばイノシン、イノシン酸、アデノシン、AMP、ADP、ATP、サクシニルアデノシン、S-アデノシルメチオニン、S-アデノシルホモシステインおよびそれらの薬学的に許容される塩から選ばれるいずれか１以上の化合物 
【図１】
2020149218.tif 000004
【図２】
2020149218.tif 000005
【図３】
2020149218.tif 000006
【図４】
2020149218.tif 000007
【図５】
2020149218.tif 000008
【国際調査報告】
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2020149218.tif 000011
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