(57)【要約】配列番号１で示されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を示し、かつ、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から２７番目から３３番目、３９番目、５６番目、１０６番目、１２９番目、１４４番目、１６５番目、１７０番目、及び、１７２番目から１８７番目のアミノ酸のうち、少なくとも１つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異を含むアミノ酸配列を有する、変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を示し、かつ、下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれか１以上の変異を含むアミノ酸配列を有する、変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素。
変異（Ａ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から２７番目から３３番目のアミノ酸のうち、少なくとも１つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異
変異（Ｂ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から３９番目、５６番目、１０６番目、１２９番目、１４４番目、１６５番目、及び１７０番目のアミノ酸のうち、少なくとも１つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異
変異（Ｃ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から１７２番目から１８７番目のアミノ酸のうち、少なくとも１つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異
【請求項２】
前記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれか１以上の変異が、下記（ａ）〜（ｑ）のいずれか１以上の変異である、請求項１に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素。
変異（ａ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から２７番目のグルタミンが、他のアミノ酸に置換された変異
変異（ｂ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から２９番目のグルタミン酸が、他のアミノ酸に置換された変異
変異（ｃ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から３０番目のアルギニンが、他のアミノ酸に置換された変異
変異（ｄ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から３１番目のトレオニンが、他のアミノ酸に置換された変異
変異（ｅ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から３３番目のグルタミンが、他のアミノ酸に置換された変異
変異（ｆ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から３９番目のアスパラギンが、他のアミノ酸に置換された変異
変異（ｇ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から５６番目のグルタミンが、他のアミノ酸に置換された変異
変異（ｈ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から１０６番目のプロリンが、他のアミノ酸に置換された変異
変異（ｉ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から１２９番目のロイシンが、他のアミノ酸に置換された変異
変異（ｊ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から１４４番目のトレオニンが、他のアミノ酸に置換された変異
変異（ｋ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から１６５番目のリシンが、他のアミノ酸に置換された変異
変異（ｌ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から１７０番目のセリンが、他のアミノ酸に置換された変異
変異（ｍ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から１７６番目のバリンが、他のアミノ酸に置換された変異
変異（ｎ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から１７９番目のロイシンが、他のアミノ酸に置換された変異
変異（ｏ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から１８０番目のアラニンが、他のアミノ酸に置換された変異
変異（ｐ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から１８１番目のロイシンが、他のアミノ酸に置換された変異
変異（ｑ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から１８７番目のグルタミン酸が、他のアミノ酸に置換された変異
【請求項３】
変異（ａ）が、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から２７番目のグルタミンがセリンに置換された変異である、請求項２に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素。
【請求項４】
変異（ｂ）が、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から２９番目のグルタミン酸がアスパラギン又はセリンに置換された変異である、請求項２又は３に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素。
【請求項５】
変異（ｃ）が、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から３０番目のアルギニンがグリシン又はプロリンに置換された変異である、請求項２〜４のいずれか１項に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素。
【請求項６】
変異（ｄ）が、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から３１番目のトレオニンがプロリンに置換された変異である、請求項２〜５のいずれか１項に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素。
【請求項７】
変異（ｅ）が、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から３３番目のグルタミンがイソロイシン、ロイシン、又はバリンに置換された変異である、請求項２〜６のいずれか１項に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素。
【請求項８】
変異（ｆ）が、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から３９番目のアスパラギンがアラニン、システイン、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、グルタミン、又はトリプトファンに置換された変異である、請求項２〜７のいずれか１項に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素。
【請求項９】
変異（ｇ）が、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から５６番目のグルタミンがプロリンに置換された変異である、請求項２〜８のいずれか１項に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素。
【請求項１０】
変異（ｈ）が、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から１０６番目のプロリンがアラニンに置換された変異である、請求項２〜９のいずれか１項に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素。
【請求項１１】
変異（ｉ）が、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から１２９番目のロイシンがグルタミンに置換された変異である、請求項２〜１０のいずれか１項に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素。
【請求項１２】
変異（ｊ）が、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から１４４番目のトレオニンがロイシンに置換された変異である、請求項２〜１１のいずれか１項に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素。
【請求項１３】
変異（ｋ）が、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から１６５番目のリシンがバリンに置換された変異である、請求項２〜１２のいずれか１項に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素。
【請求項１４】
変異（ｌ）が、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から１７０番目のセリンがグルタミンに置換された変異である、請求項２〜１３のいずれか１項に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素。
【請求項１５】
変異（ｍ）が、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から１７６番目のバリンがトリプトファンに置換された変異である、請求項２〜１４のいずれか１項に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素。
【請求項１６】
変異（ｎ）が、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から１７９番目のロイシンがアルギニン又はグルタミンに置換された変異である、請求項２〜１５のいずれか１項に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素。
【請求項１７】
変異（ｏ）が、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から１８０番目のアラニンがグリシン、リシン又はアルギニンに置換された変異である、請求項２〜１６のいずれか１項に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素。
【請求項１８】
変異（ｐ）が、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から１８１番目のロイシンがチロシンに置換された変異である、請求項２〜１７のいずれか１項に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素。
【請求項１９】
変異（ｑ）が、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から１８７番目のグルタミン酸がバリンに置換された変異である、請求項２〜１８のいずれか１項に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素。
【請求項２０】
前記変異を含むアミノ酸配列が、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から１４９番目のアスパラギンがセリンに置換された変異をさらに含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素。
【請求項２１】
前記変異を含むアミノ酸配列が、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から１７１番目のアスパラギン酸がグリシンに置換された変異をさらに含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素。
【請求項２２】
前記変異を含むアミノ酸配列が、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から３８９番目のセリンがシステイン、イソロイシン、トレオニン、又はバリンに置換された変異をさらに含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン合成酵素をコードする遺伝子。
【請求項２４】
請求項２３に記載の遺伝子を有する形質転換体。
【請求項２５】
宿主が真正細菌である請求項２４に記載の形質転換体。
【請求項２６】
真正細菌がカプリアビダス属に属する細菌である請求項２５に記載の形質転換体。
【請求項２７】
真正細菌がカプリアビダス  ネカトールである請求項２５に記載の形質転換体。
【請求項２８】
真正細菌がカプリアビダス  ネカトールＨ１６である請求項２５に記載の形質転換体。
【請求項２９】
請求項２４〜２８のいずれか１項に記載の形質転換体を培養する工程を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
【請求項３０】
ポリヒドロキシアルカン酸が、３−ヒドロキシヘキサン酸をモノマーユニットとして含有する、請求項２９に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
【請求項３１】
ポリヒドロキシアルカン酸が、３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸との共重合体である、請求項２９に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素、該酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を有する形質転換体、及び該形質転換体を用いたポリヒドロキシアルカン酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリヒドロキシアルカン酸（Ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ；以下、「ＰＨＡ」と略す）は、多くの微生物種の細胞内にエネルギー貯蔵物質として生産、蓄積される熱可塑性ポリエステルである。微生物によって様々な天然の炭素源から生産されるＰＨＡは、土中や水中の微生物により完全に生分解される環境調和型のプラスチックである。【０００３】
ＰＨＡとして、３−ヒドロキシ酪酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ；以下、「３ＨＢ」と略す）のホモポリマーであるポリヒドロキシブチレート（Ｐｏｌｙ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ；以下、「ＰＨＢ」と略す）が知られているが、ＰＨＢは高結晶性であり、結晶化度が高いため硬くて脆く、また、溶融加工性が低いという問題点を有している。【０００４】
ＰＨＢの脆性や溶融加工性が改善されたＰＨＡとしては、３ＨＢと３−ヒドロキシヘキサン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏａｔｅ；以下、「３ＨＨ」と略す）の共重合ポリエステルＰｏｌｙ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）（以下、「ＰＨＢＨ」と略す）が報告されている。ＰＨＢＨは、３ＨＨをモノマーユニットとして有することで、ＰＨＢと比べて結晶化度が低くなり、しやなかで柔らかい物性を有する共重合体である。【０００５】
ＰＨＢＨの製造方法としては、土壌細菌カプリアビダス  ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）を宿主としてアエロモナス  キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ）由来のＰＨＡ合成酵素を導入した形質転換体を用いた発酵生産によるものが報告されているが、ＰＨＢＨの柔軟性を高めるため、ＰＨＢＨにおける３ＨＨ比率を高める検討が行なわれている。【０００６】
非特許文献１及び２では、ＰＨＢＨにおける３ＨＨ比率を高めるために、ＰＨＡ合成酵素に変異を導入する方法が検討されている。具体的には、非特許文献１では、Ａ．ｃａｖｉａｅ由来のＰＨＡ合成酵素に対し、１４９番目のアスパラギンのセリンへの置換、又は、１７１番目のアスパラギン酸のグリシンへの置換という変異を導入することによって、ＰＨＡ合成酵素の活性と３ＨＨ−ＣｏＡに対する基質特異性が向上して、最大１８モル％の３ＨＨ比率を有するＰＨＢＨを製造できることが報告されている。【０００７】
さらに非特許文献２では、この二つの変異を重複させたＰＨＡ合成酵素（以下、「ＮＳＤＧ」と略す）によって、さらに３ＨＨ比率の高いＰＨＢＨを生産できることが報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｔ．Ｋｉｃｈｉｓｅ，Ｓ．Ｔａｇｕｃｈｉ，Ｙ．Ｄｏｉ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６８，ｐｐ．２４１１−２４１９（２００２）
【非特許文献２】Ｔ．Ｔｓｕｇｅ，Ｓ．Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｄ．Ｓｈｉｍａｄａ，Ｈ．Ａｂｅ，Ｙ．Ｄｏｉ，Ｓ．Ｔａｇｕｃｈｉ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２７７，ｐｐ．２１７−２２２（２００７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
現在、形質転換体の培養によって生産できるＰＨＡ共重合体の３ＨＨ比率は限定的である。このため、３ＨＨ比率がより高いＰＨＡ共重合体を製造できるＰＨＡ合成酵素ライブラリーの構築が望まれている。【００１０】
そこで、本発明は、ＰＨＡの生産性を維持したまま、３ＨＨ比率が高いＰＨＡ共重合体の製造を実現する変異型ＰＨＡ合成酵素、該酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を有する形質転換体、及び、該形質転換体を用いたＰＨＡの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、配列番号１で示されるアミノ酸配列から構成されるＡｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ由来のＰＨＡ合成酵素ＰｈａＣＡｃにおいて、Ｎ末端から２７番目から３３番目のアミノ酸、３９番目、５６番目、１０６番目、１２９番目、１４４番目、１６５番目、及び１７０番目のアミノ酸、並びに、１７２番目から１８７番目のアミノ酸のうち少なくとも１つのアミノ酸に対し変異を導入することによって、ＰＨＡの生産性を維持したまま、３ＨＨ比率が高いＰＨＡ共重合体を製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１２】
すなわち、本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を示し、かつ、下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれか１以上の変異を含むアミノ酸配列を有する、変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素に関する。
変異（Ａ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から２７番目から３３番目のアミノ酸のうち、少なくとも１つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異
変異（Ｂ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から３９番目、５６番目、１０６番目、１２９番目、１４４番目、１６５番目、及び１７０番目のアミノ酸のうち、少なくとも１つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異
変異（Ｃ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から１７２番目から１８７番目のアミノ酸のうち、少なくとも１つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異。【００１３】
好ましくは、前記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれか１以上の変異が、下記（ａ）〜（ｑ）のいずれか１以上の変異である。
変異（ａ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から２７番目のグルタミンが、他のアミノ酸に置換された変異
変異（ｂ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から２９番目のグルタミン酸が、他のアミノ酸に置換された変異
変異（ｃ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から３０番目のアルギニンが、他のアミノ酸に置換された変異
変異（ｄ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から３１番目のトレオニンが、他のアミノ酸に置換された変異
変異（ｅ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から３３番目のグルタミンが、他のアミノ酸に置換された変異
変異（ｆ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から３９番目のアスパラギンが、他のアミノ酸に置換された変異
変異（ｇ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から５６番目のグルタミンが、他のアミノ酸に置換された変異
変異（ｈ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から１０６番目のプロリンが、他のアミノ酸に置換された変異
変異（ｉ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から１２９番目のロイシンが、他のアミノ酸に置換された変異
変異（ｊ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から１４４番目のトレオニンが、他のアミノ酸に置換された変異
変異（ｋ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から１６５番目のリシンが、他のアミノ酸に置換された変異
変異（ｌ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から１７０番目のセリンが、他のアミノ酸に置換された変異
変異（ｍ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から１７６番目のバリンが、他のアミノ酸に置換された変異
変異（ｎ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から１７９番目のロイシンが、他のアミノ酸に置換された変異
変異（ｏ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から１８０番目のアラニンが、他のアミノ酸に置換された変異
変異（ｐ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から１８１番目のロイシンが、他のアミノ酸に置換された変異
変異（ｑ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から１８７番目のグルタミン酸が、他のアミノ酸に置換された変異。【００１４】
以下、具体的な実施形態を例示する。変異（ａ）が、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から２７番目のグルタミンがセリンに置換された変異である。変異（ｂ）が、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から２９番目のグルタミン酸がアスパラギン又はセリンに置換された変異である。変異（ｃ）が、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から３０番目のアルギニンがグリシン又はプロリンに置換された変異である。変異（ｄ）が、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から３１番目のトレオニンがプロリンに置換された変異である。変異（ｅ）が、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から３３番目のグルタミンがイソロイシン、ロイシン、又はバリンに置換された変異である。変異（ｆ）が、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から３９番目のアスパラギンがアラニン、システイン、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、グルタミン、又はトリプトファンに置換された変異である。変異（ｇ）が、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から５６番目のグルタミンがプロリンに置換された変異である。変異（ｈ）が、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から１０６番目のプロリンがアラニンに置換された変異である。変異（ｉ）が、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から１２９番目のロイシンがグルタミンに置換された変異である。変異（ｊ）が、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から１４４番目のトレオニンがロイシンに置換された変異である。変異（ｋ）が、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から１６５番目のリシンがバリンに置換された変異である。変異（ｌ）が、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から１７０番目のセリンがグルタミンに置換された変異である。変異（ｍ）が、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から１７６番目のバリンがトリプトファンに置換された変異である。変異（ｎ）が、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から１７９番目のロイシンがアルギニン又はグルタミンに置換された変異である。変異（ｏ）が、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から１８０番目のアラニンがグリシン、リシン又はアルギニンに置換された変異である。変異（ｐ）が、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から１８１番目のロイシンがチロシンに置換された変異である。変異（ｑ）が、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から１８７番目のグルタミン酸がバリンに置換された変異である【００１５】
ある実施形態では、前記変異を含むアミノ酸配列が、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から１４９番目のアスパラギンがセリンに置換された変異をさらに含んでもよい。別の実施形態では、前記変異を含むアミノ酸配列が、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から１７１番目のアスパラギン酸がグリシンに置換された変異をさらに含んでもよい。さらに別の実施形態では、前記変異を含むアミノ酸配列が、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から３８９番目のセリンがシステイン、イソロイシン、トレオニン、又はバリンに置換された変異をさらに含んでもよい。【００１６】
また本発明は、前記変異型ポリヒドロキシアルカン合成酵素をコードする遺伝子に関する。さらに、該遺伝子を有する形質転換体にも関する。該形質転換体の宿主が真正細菌であってもよい。該真正細菌がカプリアビダス属に属する細菌であってもよく、カプリアビダス  ネカトールであってもよく、カプリアビダス  ネカトールＨ１６であってもよい。【００１７】
さらに本発明は、前記記載の形質転換体を培養する工程を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法にも関する。前記ポリヒドロキシアルカン酸が、３−ヒドロキシヘキサン酸をモノマーユニットとして含有することが好ましく、３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸との共重合体であることがより好ましい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、ＰＨＡの生産性を維持したまま、３ＨＨ比率が高いＰＨＡ共重合体の製造を実現する変異型ＰＨＡ合成酵素、該酵素をコードする遺伝子、及び該遺伝子を有する形質転換体を提供することができる。また、該形質転換体を培養することにより、ＰＨＡの生産性を低下させることなく、３ＨＨ比率が高いＰＨＡ共重合体を発酵生産することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下に本発明を詳細に説明する。
（変異型ＰＨＡ合成酵素）
本発明に係る変異型ＰＨＡ合成酵素は、配列番号１で示されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を示し、かつ、下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれか１以上の変異を含むアミノ酸配列を有するものである。また、本発明は、該変異型ＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子（以下、「変異型ＰＨＡ合成酵素遺伝子」と略す）も提供する。
【００２０】
本発明の変異型ＰＨＡ合成酵素は、ＰＨＡ合成活性を有する酵素であって、配列番号１で示されるアミノ酸配列に対し８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。配列番号１で示されるアミノ酸配列は、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ由来のＰＨＡ合成酵素ＰｈａＣＡｃのアミノ酸配列である。本発明の変異型ＰＨＡ合成酵素は、上記配列同一性を満足する範囲において、下記（Ａ）〜（Ｃ）の変異以外の変異を有するものであってよい。
【００２１】
本発明の変異型ＰＨＡ合成酵素は、異なる機能を有する異種タンパク質と結合して融合タンパク質を形成したものであってもよい。この場合、異種タンパク質のアミノ酸配列は、上記配列同一性を算出する際に考慮しない。
【００２２】
本発明の変異型ＰＨＡ合成酵素において、配列番号１で示されるアミノ酸配列に対する配列同一性は、８５％以上であればよいが、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、よりさらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。
【００２３】
本発明の変異型ＰＨＡ合成酵素遺伝子の塩基配列は、本発明の変異型ＰＨＡ合成酵素を構成するアミノ酸配列をコードする塩基配列である限り特に限定されない。
【００２４】
本発明の変異型ＰＨＡ合成酵素および変異型ＰＨＡ合成酵素遺伝子の由来については、特に限定されないが、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属由来であることが好ましく、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ由来であることがより好ましい。
【００２５】
次に、本発明の変異型ＰＨＡ合成酵素が含む変異（Ａ）〜（Ｃ）について説明する。本発明の変異型ＰＨＡ合成酵素は、変異（Ａ）〜（Ｃ）のうちいずれか１つを含むものであってもよいし、これら変異を２つ以上含むものであっても良い。
【００２６】
変異（Ａ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から２７番目から３３番目のアミノ酸のうち、少なくとも１つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換される。置換されるアミノ酸は、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から２７番目、２８番目、２９番目、３０番目、３１番目、３２番目、又は３３番目のアミノ酸のいずれであってもよい。好ましくは、２７番目、２９番目、３０番目、３１番目、又は３３番目のアミノ酸のいずれかである。置換後のアミノ酸は、ＰＨＡ生産性及び、生産されるＰＨＡの３ＨＨ比率を考慮して選択することができる。
変異（Ｂ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から３９番目、５６番目、１０６番目、１２９番目、１４４番目、１６５番目、及び１７０番目のアミノ酸のうち、少なくとも１つ以上のアミノ酸が、他のアミノ酸に置換される。なかでも、３９番目のアミノ酸が最も好ましい。置換後のアミノ酸は、ＰＨＡ生産性及び、生産されるＰＨＡの３ＨＨ比率を考慮して選択することができる。
変異（Ｃ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から１７２番目から１８７番目のアミノ酸配列のうち、少なくとも１つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換される。置換されるアミノ酸は、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から１７２番目、１７３番目、１７４番目、１７５番目、１７６番目、１７７番目、１７８番目、１７９番目、１８０番目、１８１番目、１８２番目、１８３番目、１８４番目、１８５番目、１８６番目、又は１８７番目のアミノ酸のいずれかである。好ましくは、１７６番目から１８７番目のアミノ酸のいずれかであり、より好ましくは、１７６番目、１７９番目、１８０番目、１８１番目、又は１８７番目のアミノ酸のいずれかである。置換後のアミノ酸は、ＰＨＡ生産性及び、生産されるＰＨＡの３ＨＨ比率を考慮して選択することができる。
【００２７】
また、本発明の一実施形態に係る変異型ＰＨＡ合成酵素は、配列番号１で示されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を示し、かつ、下記（ａ）〜（ｑ）のいずれか１以上の変異を含むアミノ酸配列を有するものである。
【００２８】
次に、本発明の変異型ＰＨＡ合成酵素が含む変異（ａ）〜（ｑ）について説明する。本発明の変異型ＰＨＡ合成酵素は、変異（ａ）〜（ｑ）のうちいずれか１つを含むものであってもよいし、これら変異を２つ以上含むものであってもよい。
【００２９】
変異（ａ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から２７番目のグルタミンが、他のアミノ酸に置換される。置換後のアミノ酸は、ＰＨＡ生産性及び、生産されるＰＨＡの３ＨＨ比率を考慮して選択することができる。ＰＨＡ生産性を維持したまま、３ＨＨ比率が高いＰＨＡを生産するには、２７番目のグルタミンが、グルタミン以外の非極性アミノ酸（例えばアスパラギン、セリン、又はトレオニン）に置換された変異が好ましく、セリンに置換された変異がより好ましい。
【００３０】
変異（ｂ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から２９番目のグルタミン酸が、他のアミノ酸に置換される。置換後のアミノ酸は、ＰＨＡ生産性及び、生産されるＰＨＡの３ＨＨ比率を考慮して選択することができる。ＰＨＡ生産性を維持したまま、３ＨＨ比率が高いＰＨＡを生産するには、２９番目のグルタミン酸が、非極性アミノ酸（例えばアスパラギン、セリン、トレオニン又はグルタミン）に置換された変異が好ましく、アスパラギン又はセリンに置換された変異がより好ましい。
【００３１】
変異（ｃ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から３０番目のアルギニンが、他のアミノ酸に置換される。置換後のアミノ酸は、ＰＨＡ生産性及び、生産されるＰＨＡの３ＨＨ比率を考慮して選択することができる。ＰＨＡ生産性を維持したまま、３ＨＨ比率が高いＰＨＡを生産するには、３０番目のアルギニンが、αヘリックスを構成しにくいアミノ酸（例えばグリシン、プロリン、セリン、又はチロシン）に置換された変異が好ましく、グリシン又はプロリンに置換された変異がより好ましい。
【００３２】
変異（ｄ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から３１番目のトレオニンが、他のアミノ酸に置換される。置換後のアミノ酸は、ＰＨＡ生産性及び、生産されるＰＨＡの３ＨＨ比率を考慮して選択することができる。ＰＨＡ生産性を維持したまま、３ＨＨ比率が高いＰＨＡを生産するには、３１番目のトレオニンが、αヘリックスを構成しにくいアミノ酸（例えばグリシン、プロリン、セリン、又はチロシン）に置換された変異が好ましく、グリシン又はプロリンに置換された変異がより好ましく、プロリンに置換された変異がさらに好ましい。
【００３３】
変異（ｅ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から３３番目のグルタミンが、他のアミノ酸に置換される。置換後のアミノ酸は、ＰＨＡ生産性及び、生産されるＰＨＡの３ＨＨ比率を考慮して選択することができる。ＰＨＡ生産性を維持したまま、３ＨＨ比率が高いＰＨＡを生産するには、３３番目のグルタミンが、疎水性アミノ酸（例えばアラニン、グリシン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、バリン、トリプトファン又はチロシン）に置換された変異が好ましく、側鎖の大きさの観点から、疎水性の脂肪族アミノ酸（例えばアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン又はバリン）に置換された変異がより好ましく、イソロイシン、ロイシン又はバリンに置換された変異がさらに好ましい。
【００３４】
変異（ｆ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から３９番目のアスパラギンが、他のアミノ酸に置換される。置換後のアミノ酸は、ＰＨＡ生産性及び、生産されるＰＨＡの３ＨＨ比率を考慮して選択することができる。ＰＨＡ生産性を維持したまま、３ＨＨ比率が高いＰＨＡを生産するには、３９番目のアスパラギンが、アラニン、システイン、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、グルタミン又はトリプトファンに置換された変異が好ましい。
【００３５】
変異（ｇ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から５６番目のグルタミンが、他のアミノ酸に置換される。置換後のアミノ酸は、ＰＨＡ生産性及び、生産されるＰＨＡの３ＨＨ比率を考慮して選択することができる。ＰＨＡ生産性を維持したまま、３ＨＨ比率が高いＰＨＡを生産するには、５６番目のグルタミンが、αヘリックスを構成しにくいアミノ酸（例えばグリシン、プロリン、セリン、又はチロシン）に置換された変異が好ましく、グリシン又はプロリンに置換された変異がより好ましく、プロリンに置換された変異がさらに好ましい。
【００３６】
変異（ｈ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から１０６番目のプロリンが、他のアミノ酸に置換される。置換後のアミノ酸は、ＰＨＡ生産性及び、生産されるＰＨＡの３ＨＨ比率を考慮して選択することができる。ＰＨＡ生産性を維持したまま、３ＨＨ比率が高いＰＨＡを生産するには、１０６番目のプロリンが、疎水性アミノ酸（例えばアラニン、グリシン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、バリン、トリプトファン又はチロシン）に置換された変異が好ましく、側鎖の大きさの観点から疎水性の脂肪族アミノ酸（例えばアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン又はバリン）に置換された変異がより好ましく、アラニンに置換された変異がさらに好ましい。
【００３７】
変異（ｉ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から１２９番目のロイシンが、他のアミノ酸に置換される。置換後のアミノ酸は、ＰＨＡ生産性及び、生産されるＰＨＡの３ＨＨ比率を考慮して選択することができる。ＰＨＡ生産性を維持したまま、３ＨＨ比率が高いＰＨＡを生産するには、１２９番目のロイシンが、非極性アミノ酸（例えばアスパラギン、セリン、トレオニン又はグルタミン）に置換された変異が好ましく、グルタミンに置換された変異がより好ましい。
【００３８】
変異（ｊ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から１４４番目のトレオニンが、他のアミノ酸に置換される。置換後のアミノ酸は、ＰＨＡ生産性及び、生産されるＰＨＡの３ＨＨ比率を考慮して選択することができる。ＰＨＡ生産性を維持したまま、３ＨＨ比率が高いＰＨＡを生産するには、１４４番目のトレオニンが、疎水性アミノ酸（例えばアラニン、グリシン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、バリン、トリプトファン又はチロシン）に置換された変異が好ましく、側鎖の大きさの観点から疎水性の脂肪族アミノ酸（例えばアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン又はバリン）に置換された変異がより好ましく、ロイシンに置換された変異がさらに好ましい。
【００３９】
変異（ｋ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から１６５番目のリシンが、他のアミノ酸に置換される。置換後のアミノ酸は、ＰＨＡ生産性及び、生産されるＰＨＡの３ＨＨ比率を考慮して選択することができる。ＰＨＡ生産性を維持したまま、３ＨＨ比率が高いＰＨＡを生産するには、１６５番目のリシンが、疎水性アミノ酸（例えばアラニン、グリシン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、バリン、トリプトファン又はチロシン）に置換された変異が好ましく、側鎖の大きさの観点から疎水性の脂肪族アミノ酸（例えばアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン又はバリン）に置換された変異がより好ましく、バリンに置換された変異がさらに好ましい。
【００４０】
変異（ｌ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から１７０番目のセリンが、他のアミノ酸に置換される。置換後のアミノ酸は、ＰＨＡ生産性及び、生産されるＰＨＡの３ＨＨ比率を考慮して選択することができる。ＰＨＡ生産性を維持したまま、３ＨＨ比率が高いＰＨＡを生産するには、１７０番目のセリンが、セリン以外の非極性アミノ酸（例えばアスパラギン、トレオニン又はグルタミン）に置換された変異が好ましく、グルタミンに置換された変異がより好ましい。
【００４１】
変異（ｍ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から１７６番目のバリンが、他のアミノ酸に置換される。置換後のアミノ酸は、ＰＨＡ生産性及び、生産されるＰＨＡの３ＨＨ比率を考慮して選択することができる。ＰＨＡ生産性を維持したまま、３ＨＨ比率が高いＰＨＡを生産するには、１７６番目のバリンが、バリン以外の疎水性アミノ酸（例えばアラニン、グリシン、フェニルアラニン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、トリプトファン又はチロシン）に置換された変異が好ましく、疎水性の芳香族アミノ酸（例えばフェニルアラニン、トリプトファン又はチロシン）に置換された変異がより好ましく、トリプトファンに置換された変異がさらに好ましい。
【００４２】
変異（ｎ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から１７９番目のロイシンが、他のアミノ酸に置換される。置換後のアミノ酸は、ＰＨＡ生産性及び、生産されるＰＨＡの３ＨＨ比率を考慮して選択することができる。ＰＨＡ生産性を維持したまま、３ＨＨ比率が高いＰＨＡを生産するには、１７９番目のロイシンが、非極性アミノ酸（例えばアスパラギン、グルタミン、セリン又はトレオニン）又は塩基性アミノ酸（例えばヒスチジン、リシン、又はアルギニン）に置換された変異が好ましく、グルタミン又はアルギニンに置換された変異がより好ましい。
【００４３】
変異（ｏ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から１８０番目のアラニンが、他のアミノ酸に置換される。置換後のアミノ酸は、ＰＨＡ生産性及び、生産されるＰＨＡの３ＨＨ比率を考慮して選択することができる。ＰＨＡ生産性を維持したまま、３ＨＨ比率が高いＰＨＡを生産するには、１８０番目のアラニンが、αヘリックスを構成しにくいアミノ酸（例えばグリシン、プロリン、セリン、又はチロシン）、又は塩基性アミノ酸（例えばヒスチジン、リシン、又はアルギニン）に置換された変異が好ましく、グリシン、リシン又はアルギニンに置換された変異がより好ましい。
【００４４】
変異（ｐ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から１８１番目のロイシンが、他のアミノ酸に置換される。置換後のアミノ酸は、ＰＨＡ生産性及び、生産されるＰＨＡの３ＨＨ比率を考慮して選択することができる。ＰＨＡ生産性を維持したまま、３ＨＨ比率が高いＰＨＡを生産するには、１８１番目のロイシンが、ロイシン以外の疎水性アミノ酸（例えばアラニン、グリシン、フェニルアラニン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、バリン、トリプトファン又はチロシン）に置換された変異が好ましく、疎水性の芳香族アミノ酸（例えばフェニルアラニン、トリプトファン、又はチロシン）に置換された変異がより好ましく、チロシンに置換された変異がより好ましい。
【００４５】
変異（ｑ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から１８７番目のグルタミン酸が、他のアミノ酸に置換される。置換後のアミノ酸は、ＰＨＡ生産性及び、生産されるＰＨＡの３ＨＨ比率を考慮して選択することができる。ＰＨＡ生産性を維持したまま、３ＨＨ比率が高いＰＨＡを生産するには、１８７番目のグルタミン酸が、疎水性アミノ酸（例えばアラニン、グリシン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、バリン、トリプトファン又はチロシン）に置換された変異が好ましく、側鎖の大きさの観点から疎水性の脂肪族アミノ酸（例えばアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン又はバリン）に置換された変異がより好ましく、バリンに置換された変異がさらに好ましい。
【００４６】
本発明の変異型ＰＨＡ合成酵素のアミノ酸配列は、ＰＨＡの３ＨＨ比率をより高めるため、以上で説明した変異に加えて、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から１４９番目のアスパラギンがセリンに置換された変異をさらに含むこと、及び／又は、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から１７１番目のアスパラギン酸がグリシンに置換された変異をさらに含むことが好ましい。
【００４７】
また、本発明の変異型ＰＨＡ合成酵素のアミノ酸配列は、ＰＨＡの３ＨＨ比率をより高めるため、以上で説明した変異に加えて、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から３８９番目のセリンがシステイン、イソロイシン、トレオニン、又はバリンに置換された変異をさらに含むことが好ましい。
【００４８】
（３ＨＨ単位含有共重合ＰＨＡを生産する形質転換体）
本発明の形質転換体は、本発明の変異型ＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子を有する形質転換体であり、該遺伝子を宿主の微生物に導入することにより製造される。
【００４９】
本発明の形質転換体の宿主としては特に限定はなく、真菌（カビ、きのこ、酵母など）、真正細菌（バクテリア）、古細菌など任意の微生物を利用できるが、真正細菌が好ましい。当該真正細菌としては、例えば、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、カプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属、ワウテルシア（Ｗａｕｔｅｒｓｉａ）属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属等に属する細菌が好ましい例として挙げられる。安全性及び生産性の観点から、より好ましくはラルストニア属、カプリアビダス属、アエロモナス属、又は、ワウテルシア属に属する細菌であり、さらに好ましくはカプリアビダス属又はアエロモナス属に属する細菌であり、さらにより好ましくはカプリアビダス属に属する細菌であり、特に好ましくはカプリアビダス  ネカトールであり、最も好ましくはカプリアビダス  ネカトールＨ１６株である。
【００５０】
本発明の形質転換体を製造するにあたって、本発明の変異型ＰＨＡ合成酵素遺伝子を宿主の微生物に導入する方法としては、任意の方法を利用することができる。一例として、公知の遺伝子組換え技術を用いて、本発明の変異型ＰＨＡ合成酵素遺伝子を、宿主となる微生物が保有する染色体、プラスミド、メガプラスミドなどのＤＮＡ上に導入してもよいし、また、該遺伝子を導入したプラスミドベクター又は人工染色体を宿主の微生物に導入してもよい。しかし、導入された遺伝子の保持という観点から、微生物が保有する染色体あるいはメガプラスミド上に該遺伝子を導入する方法が好ましく、微生物が保有する染色体上に該遺伝子を導入する方法がより好ましい。
【００５１】
微生物が保有するＤＮＡ上に任意の塩基配列を部位特異的に置換又は挿入する方法、又は、微生物が保有するＤＮＡ中の任意の塩基配列を欠失させる方法は当業者に広く知られており、本発明の形質転換体を製造する際に使用できる。特に限定されないが、代表的な方法としては、トランスポゾンと相同組換えの機構を利用した方法（Ｏｈｍａｎ等，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，ｖｏｌ．１６２：ｐ．１０６８（１９８５））、相同組換えの機構によって起こる部位特異的な組み込みと第二段階の相同組換えによる脱落を原理とした方法（Ｎｏｔｉ等，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，ｖｏｌ．１５４，ｐ．１９７（１９８７））、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のｓａｃＢ遺伝子を共存させて、第二段階の相同組換えによって遺伝子が脱落した微生物株をシュークロース添加培地耐性株として容易に単離する方法（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．６，ｐ．１１９５（１９９２）；Ｌｅｎｚ等，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，ｖｏｌ．１７６，ｐ．４３８５（１９９４））等が挙げられる。また、微生物へのベクターの導入方法としても特に限定されないが、例えば、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、スフェロプラスト法等が挙げられる。
【００５２】
なお、遺伝子クローニングや遺伝子組み換え技術については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９又は２００１）などに記載される技術を利用することができる。
【００５３】
本発明の変異型ＰＨＡ合成酵素遺伝子を導入するにあたっては、該遺伝子を任意の発現調節配列に連結することができる。本明細書において、発現調節配列は、プロモーターとシャイン・ダルガノ配列から構成される配列として記載する。このような発現調節配列としては、例えばカプリアビダス  ネカトールのｐｈａＣ１遺伝子の発現調節配列（配列番号２）やｐｈａＰ１遺伝子の発現調節配列（配列番号３）が使用できる。又は、大腸菌に由来するｌａｃプロモーター（配列番号４）やｔｒｐプロモーター（配列番号５）、あるいは人工的に作製されたｌａｃＵＶ５プロモーター（配列番号６）、ｔｒｃプロモーター（配列番号７）、ｔｉｃプロモーター（配列番号８）、ｔａｃプロモーター（配列番号９）、ｌａｃＮ１７プロモーター（配列番号１０）等を、カプリアヴィダス  ネカトールＨ１６株由来のＳＤ配列（配列番号１１）と連結し、発現調節配列として使用することもできる。
【００５４】
（ＰＨＡの製造方法）
本発明の形質転換体を培養することで、該形質転換体にＰＨＡを生産させ、得られたＰＨＡを回収することでＰＨＡを製造することができる。
【００５５】
本発明によるＰＨＡの生産においては、炭素源、炭素源以外の栄養源である窒素源、無機塩類、そのほかの有機栄養源を含む培地において、前記形質転換体を培養することが好ましい。
【００５６】
炭素源としては、本発明の形質転換体が資化可能な、油脂および／又は脂肪酸などを含む炭素源であれば特に限定されず、どのような炭素源でも使用可能である。具体的には、パーム油、パーム核油、コーン油、やし油、オリーブ油、大豆油、菜種油、ヤトロファ油などの油脂やその分画油類；ラウリン酸、オレイン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ミリンスチン酸などの脂肪酸やそれらの誘導体等が挙げられる。
【００５７】
窒素源としては、例えば、アンモニア；塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩；ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。
【００５８】
無機塩類としては、例えば、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２ナトリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。
【００５９】
そのほかの有機栄養源としては、例えば、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸；ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ等のビタミン等が挙げられる。
【００６０】
本発明の形質転換体を培養する際の、培養温度、培養時間、培養時ｐＨ、培地等の条件は、宿主の微生物、例えばラルストニア属、カプリアビダス属、ワウテルシア属、アエロモナス属、エシェリキア属、アルカリゲネス属、シュードモナス属等の微生物の培養で通常使用されるような条件であってよく、特に限定されない。
【００６１】
本発明において生産されるＰＨＡの種類としては、３ＨＨをモノマーユニットとして含有するＰＨＡ共重合体であれば特に限定されない。なかでも、炭素数４〜１６の２−ヒドロキシアルカン酸、３−ヒドロキシアルカン酸（３ＨＨを除く）および４−ヒドロキシアルカン酸から選択される１種以上のモノマーと３ＨＨとを重合して得られるＰＨＡ共重合体が好ましく、３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸との共重合体であるＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）が最も好ましい。なお、生産されるＰＨＡの種類は、使用する微生物の保有する又は別途導入されたＰＨＡ合成酵素遺伝子の種類や、ＰＨＡ合成に関与する代謝系の遺伝子の種類、培養に使用する炭素源、その他の培養条件などによって適宜選択しうる。
【００６２】
本発明において、形質転換体を培養した後、菌体からのＰＨＡの回収は、特に限定されず、公知の方法によって実施することができる。一例として、次のような方法によってＰＨＡを回収することができる。培養終了後、培養液から遠心分離機等で菌体を分離し、その菌体を蒸留水、メタノール等により洗浄し、乾燥させる。この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いてＰＨＡを抽出する。このＰＨＡを含んだ有機溶剤溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、そのろ液にメタノールやヘキサン等の貧溶媒を加えてＰＨＡを沈殿させる。さらに、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させてＰＨＡを回収する。
【００６３】
得られたＰＨＡに含まれる３ＨＨ単位等のモノマー単位組成（ｍｏｌ％）の分析は、例えば、ガスクロマトグラフ法や核磁気共鳴法等により実施することができる。
【実施例】
【００６４】
以下に実施例を掲げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。【００６５】
以下で説明する遺伝子操作は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９））の記載を参照して実施することができる。また、遺伝子操作に使用する酵素、クローニング宿主等は、市場の供給者から購入し、その説明に従い使用することができる。なお、前記酵素としては、遺伝子操作に使用できるものであれば特に限定されない。【００６６】
（製造例１）Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６株の作製
まず、ｐｈａＣ１遺伝子破壊用プラスミドを作製した。合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、ｐｈａＣ１遺伝子より上流および下流の塩基配列を有するＤＮＡ断片（配列番号１２）を得た。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化した。このＤＮＡ断片を、同じくＳｗａＩで消化した特開２００７−２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢと連結し、ｐｈａＣ１より上流および下流の塩基配列を有する遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ−ｐｈａＣ１ＵＬを作製した。【００６７】
次に、ｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ−ｐｈａＣ１ＵＬを用いてΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６株を作製した。ｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ−ｐｈａＣ１ＵＬを大腸菌Ｓ１７−１株（ＡＴＣＣ４７０５５）に導入した。得られた形質転換体を、ＫＮＫ００５  ｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ΔｐｈａＺ１,２,６株（国際公開第２０１５／１１５６１９号参照）とＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）上で混合培養して接合伝達を行った。【００６８】
得られた培養液を、２５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むシモンズ寒天培地（クエン酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水塩０．２ｇ／Ｌ、りん酸二水素アンモニウム１ｇ／Ｌ、りん酸水素二カリウム１ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）に播種し、ｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ−ｐｈａＣ１ＵＬがＫＮＫ００５  ｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ΔｐｈａＺ１,２,６株の染色体上に組み込まれた株を取得した。この株をＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で２世代培養した後、１５％のショ糖を含むＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ培地上に希釈して塗布し、プラスミドが脱落した株を取得した。得られた形質転換体から、ＰＣＲおよびＤＮＡシーケンサーによる解析により染色体上のｐｈａＣ１遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失した菌株１株を単離した。この遺伝子破壊株をＨ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６株と命名した。【００６９】
得られたＨ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６株は、カプリアビダス  ネカトールＨ１６株の染色体上のｐｈａＺ１遺伝子及びｐｈａＺ６遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらにｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、染色体上のＲ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現が強化され、さらにｐｈａＣ１遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失した菌株である。【００７０】
（製造例２）ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧの作製
合成オリゴＤＮＡ等を用いたＰＣＲにより、配列番号１３で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅した。取得したＤＮＡ断片を、特開２００７−２５９７０８号公報記載のｐＣＵＰ２ベクターをＭｕｎＩとＳｐｅＩで消化したＤＮＡ断片と、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ）にて連結し、ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧを得た。  ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧは、ｔｒｐプロモーター下でＮＳＤＧを発現するプラスミドである。【００７１】
ＮＳＤＧとは、配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなる変異型ＰＨＡ合成酵素であって、配列番号１で示されるアミノ酸配列に対し、Ｎ末端から１４９番目のアスパラギンのセリンへの置換、及び、１７１番目のアスパラギン酸のグリシンへの置換という２種類の変異が導入された変異型ＰＨＡ合成酵素である。【００７２】
（製造例３）ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｑ２７Ｓの作製
製造例２で作製したｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ等を用いたＰＣＲにより、配列番号１５で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅した。これを製造例２と同様の方法でｐＣＵＰ２ベクターにクローニングし、ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｑ２７Ｓを得た。ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｑ２７Ｓは、ｔｒｐプロモーター下でＮＳＤＧ−Ｑ２７Ｓを発現するプラスミドである。【００７３】
ＮＳＤＧ−Ｑ２７Ｓとは、配列番号１４で示されるアミノ酸配列に対し、Ｎ末端から２７番目のグルタミンがセリンに置換された変異型ＰＨＡ合成酵素である。【００７４】
（製造例４）ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｎの作製
製造例２で作製したｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ等を用いたＰＣＲにより、配列番号１６で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅した。これを製造例２と同様の方法でｐＣＵＰ２ベクターにクローニングし、ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｎを得た。ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｎは、ｔｒｐプロモーター下でＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｎを発現するプラスミドである。【００７５】
ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｎとは、配列番号１４で示されるアミノ酸配列に対し、Ｎ末端から２９番目のアスパラギン酸がアスパラギンに置換された変異型ＰＨＡ合成酵素である。【００７６】
（製造例５）ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｓの作製
製造例２で作製したｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ等を用いたＰＣＲにより、配列番号１７で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅した。これを製造例２と同様の方法でｐＣＵＰ２ベクターにクローニングし、ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｓを得た。ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｓは、ｔｒｐプロモーター下でＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｓを発現するプラスミドである。【００７７】
ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｓとは、配列番号１４で示されるアミノ酸配列に対し、Ｎ末端から２９番目のアスパラギン酸がセリンに置換された変異型ＰＨＡ合成酵素である。【００７８】
（製造例６）ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｒ３０Ｇの作製
製造例２で作製したｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ等を用いたＰＣＲにより、配列番号１８で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅した。これを製造例２と同様の方法でｐＣＵＰ２ベクターにクローニングし、ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｒ３０Ｇを得た。ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｒ３０Ｇは、ｔｒｐプロモーター下でＮＳＤＧ−Ｒ３０Ｇを発現するプラスミドである。【００７９】
ＮＳＤＧ−Ｒ３０Ｇとは、配列番号１４で示されるアミノ酸配列に対し、Ｎ末端から３０番目のアルギニンがグリシンに置換された変異型ＰＨＡ合成酵素である。【００８０】
（製造例７）ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｒ３０Ｐの作製
製造例２で作製したｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ等を用いたＰＣＲにより、配列番号１９で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅した。これを製造例２と同様の方法でｐＣＵＰ２ベクターにクローニングし、ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｒ３０Ｐを得た。ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｒ３０Ｐは、ｔｒｐプロモーター下でＮＳＤＧ−Ｒ３０Ｐを発現するプラスミドである。【００８１】
ＮＳＤＧ−Ｒ３０Ｐとは、配列番号１４で示されるアミノ酸配列に対し、Ｎ末端から３０番目のアルギニンがプロリンに置換された変異型ＰＨＡ合成酵素である。【００８２】
（製造例８）ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｔ３１Ｐの作製
製造例２で作製したｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ等を用いたＰＣＲにより、配列番号２０で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅した。これを製造例２と同様の方法でｐＣＵＰ２ベクターにクローニングし、ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｔ３１Ｐを得た。ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｔ３１Ｐは、ｔｒｐプロモーター下でＮＳＤＧ−Ｔ３１Ｐを発現するプラスミドである。【００８３】
ＮＳＤＧ−Ｔ３１Ｐとは、配列番号１４で示されるアミノ酸配列に対し、Ｎ末端から３１番目のトレオニンがプロリンに置換された変異型ＰＨＡ合成酵素である。【００８４】
（製造例９）ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｑ３３Ｉの作製
製造例２で作製したｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ等を用いたＰＣＲにより、配列番号２１で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅した。これを製造例２と同様の方法でｐＣＵＰ２ベクターにクローニングし、ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｑ３３Ｉを得た。ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｑ３３Ｉは、ｔｒｐプロモーター下でＮＳＤＧ−Ｑ３３Ｉを発現するプラスミドである。【００８５】
ＮＳＤＧ−Ｑ３３Ｉとは、配列番号１４で示されるアミノ酸配列に対し、Ｎ末端から３３番目のグルタミンがイソロイシンに置換された変異型ＰＨＡ合成酵素である。【００８６】
（製造例１０）ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｑ３３Ｌの作製
製造例２で作製したｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ等を用いたＰＣＲにより、配列番号２２で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅した。これを製造例２と同様の方法でｐＣＵＰ２ベクターにクローニングし、ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｑ３３Ｌを得た。ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｑ３３Ｌは、ｔｒｐプロモーター下でＮＳＤＧ−Ｑ３３Ｌを発現するプラスミドである。【００８７】
ＮＳＤＧ−Ｑ３３Ｌとは、配列番号１４で示されるアミノ酸配列に対し、Ｎ末端から３３番目のグルタミンがロイシンに置換された変異型ＰＨＡ合成酵素である。【００８８】
（製造例１１）ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｑ３３Ｖの作製
製造例２で作製したｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ等を用いたＰＣＲにより、配列番号２３で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅した。これを製造例２と同様の方法でｐＣＵＰ２ベクターにクローニングし、ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｑ３３Ｖを得た。ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｑ３３Ｖは、ｔｒｐプロモーター下でＮＳＤＧ−Ｑ３３Ｖを発現するプラスミドである。【００８９】
ＮＳＤＧ−Ｑ３３Ｖとは、配列番号１４で示されるアミノ酸配列に対し、Ｎ末端から３３番目のグルタミンがバリンに置換された変異型ＰＨＡ合成酵素である。【００９０】
（製造例１２）ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｎ３９Ａの作製
製造例２で作製したｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ等を用いたＰＣＲにより、配列番号２４で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅した。これを製造例２と同様の方法でｐＣＵＰ２ベクターにクローニングし、ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｎ３９Ａを得た。ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｎ３９Ａは、ｔｒｐプロモーター下でＮＳＤＧ−Ｎ３９Ａを発現するプラスミドである。【００９１】
ＮＳＤＧ−Ｎ３９Ａとは、配列番号１４で示されるアミノ酸配列に対し、Ｎ末端から３９番目のアスパラギンがアラニンに置換された変異型ＰＨＡ合成酵素である。【００９２】
（製造例１３）ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｎ３９Ｃの作製
製造例２で作製したｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ等を用いたＰＣＲにより、配列番号２５で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅した。これを製造例２と同様の方法でｐＣＵＰ２ベクターにクローニングし、ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｎ３９Ｃを得た。ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｎ３９Ｃは、ｔｒｐプロモーター下でＮＳＤＧ−Ｎ３９Ｃを発現するプラスミドである。【００９３】
ＮＳＤＧ−Ｎ３９Ｃとは、配列番号１４で示されるアミノ酸配列に対し、Ｎ末端から３９番目のアスパラギンがシステインに置換された変異型ＰＨＡ合成酵素である。【００９４】
（製造例１４）ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｎ３９Ｆの作製
製造例２で作製したｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ等を用いたＰＣＲにより、配列番号２６で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅した。これを製造例２と同様の方法でｐＣＵＰ２ベクターにクローニングし、ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｎ３９Ｆを得た。ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｎ３９Ｆは、ｔｒｐプロモーター下でＮＳＤＧ−Ｎ３９Ｆを発現するプラスミドである。【００９５】
ＮＳＤＧ−Ｎ３９Ｆとは、配列番号１４で示されるアミノ酸配列に対し、Ｎ末端から３９番目のアスパラギンがフェニルアラニンに置換された変異型ＰＨＡ合成酵素である。【００９６】
（製造例１５）ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｎ３９Ｈの作製
製造例２で作製したｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ等を用いたＰＣＲにより、配列番号２７で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅した。これを製造例２と同様の方法でｐＣＵＰ２ベクターにクローニングし、ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｎ３９Ｈを得た。ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｎ３９Ｈは、ｔｒｐプロモーター下でＮＳＤＧ−Ｎ３９Ｈを発現するプラスミドである。【００９７】
ＮＳＤＧ−Ｎ３９Ｈとは、配列番号１４で示されるアミノ酸配列に対し、Ｎ末端から３９番目のアスパラギンがヒスチジンに置換された変異型ＰＨＡ合成酵素である。【００９８】
（製造例１６）ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｎ３９Ｉの作製
製造例２で作製したｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ等を用いたＰＣＲにより、配列番号２８で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅した。これを製造例２と同様の方法でｐＣＵＰ２ベクターにクローニングし、ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｎ３９Ｉを得た。ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｎ３９Ｉは、ｔｒｐプロモーター下でＮＳＤＧ−Ｎ３９Ｉを発現するプラスミドである。【００９９】
ＮＳＤＧ−Ｎ３９Ｉとは、配列番号１４で示されるアミノ酸配列に対し、Ｎ末端から３９番目のアスパラギンがイソロイシンに置換された変異型ＰＨＡ合成酵素である。【０１００】
（製造例１７）ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｎ３９Ｍの作製
製造例２で作製したｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ等を用いたＰＣＲにより、配列番号２９で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅した。これを製造例２と同様の方法でｐＣＵＰ２ベクターにクローニングし、ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｎ３９Ｍを得た。ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｎ３９Ｍは、ｔｒｐプロモーター下でＮＳＤＧ−Ｎ３９Ｍを発現するプラスミドである。【０１０１】
ＮＳＤＧ−Ｎ３９Ｍとは、配列番号１４で示されるアミノ酸配列に対し、Ｎ末端から３９番目のアスパラギンがメチオニンに置換された変異型ＰＨＡ合成酵素である。【０１０２】
（製造例１８）ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｎ３９Ｑの作製
製造例２で作製したｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ等を用いたＰＣＲにより、配列番号３０で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅した。これを製造例２と同様の方法でｐＣＵＰ２ベクターにクローニングし、ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｎ３９Ｑを得た。ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｎ３９Ｑは、ｔｒｐプロモーター下でＮＳＤＧ−Ｎ３９Ｑを発現するプラスミドである。【０１０３】
ＮＳＤＧ−Ｎ３９Ｑとは、配列番号１４で示されるアミノ酸配列に対し、Ｎ末端から３９番目のアスパラギンがグルタミンに置換された変異型ＰＨＡ合成酵素である。【０１０４】
（製造例１９）ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｎ３９Ｗの作製
製造例２で作製したｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ等を用いたＰＣＲにより、配列番号３１で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅した。これを製造例２と同様の方法でｐＣＵＰ２ベクターにクローニングし、ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｎ３９Ｗを得た。ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｎ３９Ｗは、ｔｒｐプロモーター下でＮＳＤＧ−Ｎ３９Ｗを発現するプラスミドである。【０１０５】
ＮＳＤＧ−Ｎ３９Ｗとは、配列番号１４で示されるアミノ酸配列に対し、Ｎ末端から３９番目のアスパラギンがトリプトファンに置換された変異型ＰＨＡ合成酵素である。【０１０６】
（製造例２０）ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｑ５６Ｐの作製
製造例２で作製したｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ等を用いたＰＣＲにより、配列番号３２で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅した。これを製造例２と同様の方法でｐＣＵＰ２ベクターにクローニングし、ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｑ５６Ｐを得た。ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｑ５６Ｐは、ｔｒｐプロモーター下でＮＳＤＧ−Ｑ５６Ｐを発現するプラスミドである。【０１０７】
ＮＳＤＧ−Ｑ５６Ｐとは、配列番号１４で示されるアミノ酸配列に対し、Ｎ末端から５６番目のグルタミンがプロリンに置換された変異型ＰＨＡ合成酵素である。【０１０８】
（製造例２１）ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｐ１０６Ａの作製
製造例２で作製したｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ等を用いたＰＣＲにより、配列番号３３で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅した。これを製造例２と同様の方法でｐＣＵＰ２ベクターにクローニングし、ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｐ１０６Ａを得た。ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｐ１０６Ａは、ｔｒｐプロモーター下でＮＳＤＧ−Ｐ１０６Ａを発現するプラスミドである。【０１０９】
ＮＳＤＧ−Ｐ１０６Ａとは、配列番号１４で示されるアミノ酸配列に対し、Ｎ末端から１０６番目のプロリンがアラニンに置換された変異型ＰＨＡ合成酵素である。【０１１０】
（製造例２２）ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｌ１２９Ｑの作製
製造例２で作製したｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ等を用いたＰＣＲにより、配列番号３４で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅した。これを製造例２と同様の方法でｐＣＵＰ２ベクターにクローニングし、ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｌ１２９Ｑを得た。ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｌ１２９Ｑは、ｔｒｐプロモーター下でＮＳＤＧ−Ｌ１２９Ｑを発現するプラスミドである。【０１１１】
ＮＳＤＧ−Ｌ１２９Ｑとは、配列番号１４で示されるアミノ酸配列に対し、Ｎ末端から１２９番目のロイシンがグルタミンに置換された変異型ＰＨＡ合成酵素である。【０１１２】
（製造例２３）ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｔ１４４Ｌの作製
製造例２で作製したｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ等を用いたＰＣＲにより、配列番号３５で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅した。これを製造例２と同様の方法でｐＣＵＰ２ベクターにクローニングし、ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｔ１４４Ｌを得た。ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｔ１４４Ｌは、ｔｒｐプロモーター下でＮＳＤＧ−Ｔ１４４Ｌを発現するプラスミドである。【０１１３】
ＮＳＤＧ−Ｔ１４４Ｌとは、配列番号１４で示されるアミノ酸配列に対し、Ｎ末端から１４４番目のトレオニンがロイシンに置換された変異型ＰＨＡ合成酵素である。【０１１４】
（製造例２４）ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｋ１６５Ｖの作製
製造例２で作製したｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ等を用いたＰＣＲにより、配列番号３６で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅した。これを製造例２と同様の方法でｐＣＵＰ２ベクターにクローニングし、ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｋ１６５Ｖを得た。ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｋ１６５Ｖは、ｔｒｐプロモーター下でＮＳＤＧ−Ｋ１６５Ｖを発現するプラスミドである。【０１１５】
ＮＳＤＧ−Ｋ１６５Ｖとは、配列番号１４で示されるアミノ酸配列に対し、Ｎ末端から１６５番目のリシンがバリンに置換された変異型ＰＨＡ合成酵素である。【０１１６】
（製造例２５）ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｓ１７０Ｑの作製
製造例２で作製したｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ等を用いたＰＣＲにより、配列番号３７で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅した。これを製造例２と同様の方法でｐＣＵＰ２ベクターにクローニングし、ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｓ１７０Ｑを得た。ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｓ１７０Ｑは、ｔｒｐプロモーター下でＮＳＤＧ−Ｓ１７０Ｑを発現するプラスミドである。【０１１７】
ＮＳＤＧ−Ｓ１７０Ｑとは、配列番号１４で示されるアミノ酸配列に対し、Ｎ末端から１７０番目のセリンがグルタミンに置換された変異型ＰＨＡ合成酵素である。【０１１８】
（製造例２６）ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｖ１７６Ｗの作製
製造例２で作製したｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ等を用いたＰＣＲにより、配列番号３８で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅した。これを製造例２と同様の方法でｐＣＵＰ２ベクターにクローニングし、ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｖ１７６Ｗを得た。ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｖ１７６Ｗは、ｔｒｐプロモーター下でＮＳＤＧ−Ｖ１７６Ｗを発現するプラスミドである。【０１１９】
ＮＳＤＧ−Ｖ１７６Ｗとは、配列番号１４で示されるアミノ酸配列に対し、Ｎ末端から１７６番目のバリンがトリプトファンに置換された変異型ＰＨＡ合成酵素である。【０１２０】
（製造例２７）ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｌ１７９Ｑの作製
製造例２で作製したｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ等を用いたＰＣＲにより、配列番号３９で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅した。これを製造例２と同様の方法でｐＣＵＰ２ベクターにクローニングし、ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｌ１７９Ｑを得た。ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｌ１７９Ｑは、ｔｒｐプロモーター下でＮＳＤＧ−Ｌ１７９Ｑを発現するプラスミドである。【０１２１】
ＮＳＤＧ−Ｌ１７９Ｑとは、配列番号１４で示されるアミノ酸配列に対し、Ｎ末端から１７９番目のロイシンがグルタミンに置換された変異型ＰＨＡ合成酵素である。【０１２２】
（製造例２８）ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｌ１７９Ｒの作製
製造例２で作製したｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ等を用いたＰＣＲにより、配列番号４０で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅した。これを製造例２と同様の方法でｐＣＵＰ２ベクターにクローニングし、ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｌ１７９Ｒを得た。ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｌ１７９Ｒは、ｔｒｐプロモーター下でＮＳＤＧ−Ｌ１７９Ｒを発現するプラスミドである。【０１２３】
ＮＳＤＧ−Ｌ１７９Ｒとは、配列番号１４で示されるアミノ酸配列に対し、Ｎ末端から１７９番目のロイシンがアルギニンに置換された変異型ＰＨＡ合成酵素である。【０１２４】
（製造例２９）ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ａ１８０Ｇの作製
製造例２で作製したｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ等を用いたＰＣＲにより、配列番号４１で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅した。これを製造例２と同様の方法でｐＣＵＰ２ベクターにクローニングし、ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ａ１８０Ｇを得た。ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ａ１８０Ｇは、ｔｒｐプロモーター下でＮＳＤＧ−Ａ１８０Ｇを発現するプラスミドである。【０１２５】
ＮＳＤＧ−Ａ１８０Ｇとは、配列番号１４で示されるアミノ酸配列に対し、Ｎ末端から１８０番目のアラニンがグリシンに置換された変異型ＰＨＡ合成酵素である。【０１２６】
（製造例３０）ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ａ１８０Ｋの作製
製造例２で作製したｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ等を用いたＰＣＲにより、配列番号４２で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅した。これを製造例２と同様の方法でｐＣＵＰ２ベクターにクローニングし、ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ａ１８０Ｋを得た。ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ａ１８０Ｋは、ｔｒｐプロモーター下でＮＳＤＧ−Ａ１８０Ｋを発現するプラスミドである。【０１２７】
ＮＳＤＧ−Ａ１８０Ｋとは、配列番号１４で示されるアミノ酸配列に対し、Ｎ末端から１８０番目のアラニンがリシンに置換された変異型ＰＨＡ合成酵素である。【０１２８】
（製造例３１）ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ａ１８０Ｒの作製
製造例２で作製したｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ等を用いたＰＣＲにより、配列番号４３で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅した。これを製造例２と同様の方法でｐＣＵＰ２ベクターにクローニングし、ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ａ１８０Ｒを得た。ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ａ１８０Ｒは、ｔｒｐプロモーター下でＮＳＤＧ−Ａ１８０Ｒを発現するプラスミドである。【０１２９】
ＮＳＤＧ−Ａ１８０Ｒとは、配列番号１４で示されるアミノ酸配列に対し、Ｎ末端から１８０番目のアラニンがアルギニンに置換された変異型ＰＨＡ合成酵素である。【０１３０】
（製造例３２）ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｌ１８１Ｙの作製
製造例２で作製したｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ等を用いたＰＣＲにより、配列番号４４で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅した。これを製造例２と同様の方法でｐＣＵＰ２ベクターにクローニングし、ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｌ１８１Ｙを得た。ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｌ１８１Ｙは、ｔｒｐプロモーター下でＮＳＤＧ−Ｌ１８１Ｙを発現するプラスミドである。【０１３１】
ＮＳＤＧ−Ｌ１８１Ｙとは、配列番号１４で示されるアミノ酸配列に対し、Ｎ末端から１８１番目のロイシンがチロシンに置換された変異型ＰＨＡ合成酵素である。【０１３２】
（製造例３３）ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ１８７Ｖの作製
製造例２で作製したｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ等を用いたＰＣＲにより、配列番号４５で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅した。これを製造例２と同様の方法でｐＣＵＰ２ベクターにクローニングし、ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ１８７Ｖを得た。ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ１８７Ｖは、ｔｒｐプロモーター下でＮＳＤＧ−Ｅ１８７Ｖを発現するプラスミドである。【０１３３】
ＮＳＤＧ−Ｅ１８７Ｖとは、配列番号１４で示されるアミノ酸配列に対し、Ｎ末端から１８７番目のアスパラギン酸がバリンに置換された変異型ＰＨＡ合成酵素である。【０１３４】
（製造例３４）ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｎ−Ａ１８０Ｋの作製
製造例２で作製したｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ等を用いたＰＣＲにより、配列番号４６で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅した。これを製造例２と同様の方法でｐＣＵＰ２ベクターにクローニングし、ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｎ−Ａ１８０Ｋを得た。ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｎ−Ａ１８０Ｋは、ｔｒｐプロモーター下でＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｎ−Ａ１８０Ｋを発現するプラスミドである。【０１３５】
ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｎ−Ａ１８０Ｋとは、配列番号１４で示されるアミノ酸配列に対し、Ｎ末端から２９番目のアスパラギン酸がアスパラギンに置換され、１８０番目のアラニンがリシンに置換された変異型ＰＨＡ合成酵素である。【０１３６】
（製造例３５）ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｎ−Ａ１８０Ｒの作製
製造例２で作製したｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ等を用いたＰＣＲにより、配列番号４７で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅した。これを製造例２と同様の方法でｐＣＵＰ２ベクターにクローニングし、ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｎ−Ａ１８０Ｒを得た。ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｎ−Ａ１８０Ｒは、ｔｒｐプロモーター下でＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｎ−Ａ１８０Ｒを発現するプラスミドである。【０１３７】
ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｎ−Ａ１８０Ｒとは、配列番号１４で示されるアミノ酸配列に対し、Ｎ末端から２９番目のアスパラギン酸がアスパラギンに置換され、１８０番目のアラニンがアルギニンに置換された変異型ＰＨＡ合成酵素である。【０１３８】
（製造例３６）ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｓ−Ａ１８０Ｋの作製
製造例２で作製したｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ等を用いたＰＣＲにより、配列番号４８で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅した。これを製造例２と同様の方法でｐＣＵＰ２ベクターにクローニングし、ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｓ−Ａ１８０Ｋを得た。ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｓ−Ａ１８０Ｋは、ｔｒｐプロモーター下でＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｓ−Ａ１８０Ｋを発現するプラスミドである。【０１３９】
ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｓ−Ａ１８０Ｋとは、配列番号１４で示されるアミノ酸配列に対し、Ｎ末端から２９番目のアスパラギン酸がセリンに置換され、１８０番目のアラニンがリシンに置換された変異型ＰＨＡ合成酵素である。【０１４０】
（製造例３７）ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｓ−Ａ１８０Ｒの作製
製造例２で作製したｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ等を用いたＰＣＲにより、配列番号４９で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅した。これを製造例２と同様の方法でｐＣＵＰ２ベクターにクローニングし、ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｓ−Ａ１８０Ｒを得た。ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｓ−Ａ１８０Ｒは、ｔｒｐプロモーター下でＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｓ−Ａ１８０Ｒを発現するプラスミドである。【０１４１】
ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｓ−Ａ１８０Ｒとは、配列番号１４で示されるアミノ酸配列に対し、Ｎ末端から２９番目のアスパラギン酸がセリンに置換され、１８０番目のアラニンがアルギニンに置換された変異型ＰＨＡ合成酵素である。【０１４２】
（製造例３８）ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｎ−Ａ１８０Ｋ−Ｓ３８９Ｔの作製
製造例２で作製したｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ等を用いたＰＣＲにより、配列番号５０で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅した。これを製造例２と同様の方法でｐＣＵＰ２ベクターにクローニングし、ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｎ−Ａ１８０Ｋ−Ｓ３８９Ｔを得た。ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｎ−Ａ１８０Ｋ−Ｓ３８９Ｔは、ｔｒｐプロモーター下でＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｎ−Ａ１８０Ｋ−Ｓ３８９Ｔを発現するプラスミドである。【０１４３】
ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｎ−Ａ１８０Ｋ−Ｓ３８９Ｔとは、配列番号１４で示されるアミノ酸配列に対し、Ｎ末端から２９番目のアスパラギン酸がアスパラギンに置換され、１８０番目のアラニンがリシンに置換され、３８９番目のセリンがトレオニンに置換された変異型ＰＨＡ合成酵素である。【０１４４】
（製造例３９）ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｎ−Ａ１８０Ｒ−Ｓ３８９Ｔの作製
製造例２で作製したｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ等を用いたＰＣＲにより、配列番号５１で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅した。これを製造例２と同様の方法でｐＣＵＰ２ベクターにクローニングし、ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｎ−Ａ１８０Ｒ−Ｓ３８９Ｔを得た。ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｎ−Ａ１８０Ｒ−Ｓ３８９Ｔは、ｔｒｐプロモーター下でＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｎ−Ａ１８０Ｒ−Ｓ３８９Ｔを発現するプラスミドである。【０１４５】
ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｎ−Ａ１８０Ｒ−Ｓ３８９Ｔとは、配列番号１４で示されるアミノ酸配列に対し、Ｎ末端から２９番目のアスパラギン酸がアスパラギンに置換され、１８０番目のアラニンがアルギニンに置換され、３８９番目のセリンがトレオニンに置換された変異型ＰＨＡ合成酵素である。【０１４６】
（製造例４０）ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｓ−Ａ１８０Ｋ−Ｓ３８９Ｔの作製
製造例２で作製したｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ等を用いたＰＣＲにより、配列番号５２で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅した。これを製造例２と同様の方法でｐＣＵＰ２ベクターにクローニングし、ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｓ−Ａ１８０Ｋ−Ｓ３８９Ｔを得た。ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｓ−Ａ１８０Ｋ−Ｓ３８９Ｔは、ｔｒｐプロモーター下でＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｓ−Ａ１８０Ｋ−Ｓ３８９Ｔを発現するプラスミドである。【０１４７】
ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｓ−Ａ１８０Ｋ−Ｓ３８９Ｔとは、配列番号１４で示されるアミノ酸配列に対し、Ｎ末端から２９番目のアスパラギン酸がセリンに置換され、１８０番目のアラニンがリシンに置換され、３８９番目のセリンがトレオニンに置換された変異型ＰＨＡ合成酵素である。【０１４８】
（製造例４１）ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｓ−Ａ１８０Ｒ−Ｓ３８９Ｔの作製
製造例２で作製したｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ等を用いたＰＣＲにより、配列番号５３で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅した。これを製造例２と同様の方法でｐＣＵＰ２ベクターにクローニングし、ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｓ−Ａ１８０Ｒ−Ｓ３８９Ｔを得た。ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｓ−Ａ１８０Ｒ−Ｓ３８９Ｔは、ｔｒｐプロモーター下でＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｓ−Ａ１８０Ｒ−Ｓ３８９Ｔを発現するプラスミドである。【０１４９】
ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｓ−Ａ１８０Ｒ−Ｓ３８９Ｔとは、配列番号１４で示されるアミノ酸配列に対し、Ｎ末端から２９番目のアスパラギン酸がセリンに置換され、１８０番目のアラニンがアルギニンに置換され、３８９番目のセリンがトレオニンに置換された変異型ＰＨＡ合成酵素である。【０１５０】
（製造例４２）Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６に対する各プラスミドの導入
まず、製造例１で作製したＨ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６株をＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ培地（ＤＩＦＣＯ）で一晩培養した。得られた培養液０．５ｍＬをＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ培地１００ｍＬに接種し、３０℃で３時間培養した。得られた培養液を氷上で速やかに冷却し、菌体を回収して氷冷した蒸留水で良く洗浄した後、得られた菌体を２ｍＬの蒸留水に懸濁した。菌体液を、製造例２で作製したｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧプラスミド溶液と混合し、キュベットに注入してエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションは、ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒエレクトロポレーター（バイオ・ラッド）を使用し、電圧１.５ｋＶ、抵抗８００Ω、電流２５μＦの条件で行った。エレクトロポレーション後、菌体溶液を回収して５ｍＬのＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ培地を添加し、３０℃で３時間培養した。得られた培養液を、１００ｍｇ／Ｌのカナマイシン硫酸塩を含むＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ培地に塗布した。３０℃で３日間培養し、得られたコロニーからプラスミドが導入された菌株を取得した。得られた菌株をＨ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ株と命名した。【０１５１】
同様の方法で製造例３〜４１で作製した各プラスミドを導入し、得られた菌株をそれぞれ、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｑ２７Ｓ株、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｎ株、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｓ株、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｒ３０Ｇ株、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｒ３０Ｐ株、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｔ３１Ｐ株、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｑ３３Ｉ株、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｑ３３Ｌ株、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｑ３３Ｖ株、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｎ３９Ａ株、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｎ３９Ｃ株、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｎ３９Ｆ株、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｎ３９Ｈ株、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｎ３９Ｉ株、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｎ３９Ｍ株、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｎ３９Ｑ株、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｎ３９Ｗ株、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｑ５６Ｐ株、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｐ１０６Ａ株、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｌ１２９Ｑ株、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｔ１４４Ｌ株、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｋ１６５Ｖ株、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｓ１７０Ｑ株、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｖ１７６Ｗ株、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｌ１７９Ｑ株、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１��２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−１７９Ｒ株、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ａ１８０Ｇ株、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ａ１８０Ｋ株、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ａ１８０Ｒ株、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｌ１８１Ｙ株、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ１８７Ｖ株、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｎ−Ａ１８０Ｋ株、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｎ−Ａ１８０Ｒ株、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｓ−Ａ１８０Ｋ株、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｓ−Ａ１８０Ｒ株、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｎ−Ａ１８０Ｋ−Ｓ３８９Ｔ株、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｎ−Ａ１８０Ｒ−Ｓ３８９Ｔ株、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｓ−Ａ１８０Ｋ−Ｓ３８９Ｔ株、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｓ−Ａ１８０Ｒ−Ｓ３８９Ｔ株、と命名した。【０１５２】
（ＰＨＡにおける３ＨＨ比率の分析方法）
ＰＨＡを含む乾燥菌体約２０ｍｇに１ｍＬの硫酸−メタノール混液（１５：８５）と１ｍＬのクロロホルムを添加して密栓し、１００℃で１４０分間加熱することでＰＨＡ分解物のメチルエステルを得た。冷却後、これに０．５ｍＬの脱イオン水を加えてよく混合した後、水層と有機層が分離するまで放置した。その後、分取した有機層中のＰＨＡ分解物のモノマー単位組成をキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析した。得られたピーク面積から、３ＨＨ比率を算出した。【０１５３】
ガスクロマトグラフは島津製作所製ＧＣ−１７Ａ、キャピラリーカラムはＧＬサイエンス社製ＮＥＵＴＲＡ  ＢＯＮＤ−１（カラム長２５ｍ、カラム内径０．２５ｍｍ、液膜厚０．４μｍ）を用いた。キャリアガスとしてＨｅを用い、カラム入口圧１００ｋＰａとし、サンプルは１μＬを注入した。温度条件は、初発温度５０℃から２００℃までは８℃／分の速度で昇温し、さらに２００℃から２９０℃までは３０℃／分の速度で昇温した。【０１５４】
（比較例１）Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ株によるＰＨＡ生産
種母培地の組成は、１０ｇ／Ｌ  肉エキス、１０ｇ／Ｌ  バクトトリプトン、２ｇ／Ｌ  酵母エキス、９ｇ／Ｌ  リン酸二水素ナトリウム１２水和物、１．５ｇ／Ｌ  リン酸水素二カリウム、１００μｇ／Ｌ  カナマイシン硫酸塩とした。【０１５５】
ＰＨＡ生産培地の組成は、１１ｇ／Ｌ  リン酸水素二ナトリウム１２水和物、１．９ｇ／Ｌ  リン酸水素二カリウム、１．３ｇ／Ｌ  硫酸アンモニウム、５ｍＬ／Ｌ  マグネシウム溶液、１ｍＬ／Ｌ  微量金属塩溶液とした。マグネシウム溶液は、水に２００ｇ／Ｌ  硫酸マグネシウム七水和物を溶かして調製した。微量金属塩溶液は、０．１Ｎ塩酸に、０．２１８ｇ／Ｌ  塩化コバルト六水和物、１６．２ｇ／Ｌ  塩化鉄（ＩＩＩ）六水和物、１０．３ｇ／Ｌ  塩化カルシウム二水和物、０．１１８ｇ／Ｌ  塩化ニッケル六水和物、０．１５６ｇ／Ｌ  硫酸銅五水和物を溶かして調製した。【０１５６】
製造例４２で作製したＨ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ株のグリセロールストック溶液５０μＬを種母培地１０ｍＬに接種し、３０℃で２４時間振盪培養した。得られた培養液を前培養液とした。【０１５７】
ＰＨＡ生産培養は、フラスコで行った。５００ｍＬ容量の振盪フラスコにＰＨＡ生産培地５０ｍＬを入れた。植菌直前に、マグネシウム溶液を２５０μＬ、微量金属溶液を５０μＬ、パーム核油を１ｇ添加した。培地調製後、振盪フラスコに前培養液を５００μＬ接種し、３０℃で７２時間振盪培養を行った。培養終了後、培養液１０ｍＬから菌体を回収、エタノールで洗浄後、６０℃で真空乾燥し、ＰＨＡを含む乾燥菌体を取得し、乾燥菌体重量を測定した。
乾燥菌体重量、および３ＨＨ比率の結果を表１及び表２に示した。【０１５８】
（実施例１〜３９）各プラスミド導入株によるＰＨＡ生産
製造例４２で作製したＨ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｑ２７Ｓ株（実施例１）、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｎ株（実施例２）、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｓ株（実施例３）、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｒ３０Ｇ株（実施例４）、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｒ３０Ｐ株（実施例５）、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｔ３１Ｐ株（実施例６）、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｑ３３Ｉ株（実施例７）、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｑ３３Ｌ株（実施例８）、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｑ３３Ｖ株（実施例９）、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｎ３９Ａ株（実施例１０）、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｎ３９Ｃ株（実施例１１）、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｎ３９Ｆ株（実施例１２）、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｎ３９Ｈ株（実施例１３）、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｎ３９Ｉ株（実施例１４）、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｎ３９Ｍ株（実施例１５）、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｎ３９Ｑ株（実施例１６）、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｎ３９Ｗ株（実施例１７）、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｑ５６Ｐ株（実施例１８）、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｐ１０６Ａ株（実施例１９）、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｌ１２９Ｑ株（実施例２０）、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｔ１４４Ｌ株（実施例２１）、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｋ１６５Ｖ株（実施例２２）、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｓ１７０Ｑ株（実施例２３）、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｖ１７６Ｗ株（実施例２４）、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｌ１７９Ｑ株（実施例２５）、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−１７９Ｒ株（実施例２６）、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ａ１８０Ｇ株（実施例２７）、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ａ１８０Ｋ株（実施例２８）、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ａ１８０Ｒ株（実施例２９）、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｌ１８１Ｙ株（実施例３０）、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ１８７Ｖ株（実施例３１）、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｎ−Ａ１８０Ｋ株（実施例３２）、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｎ−Ａ１８０Ｒ株（実施例３３）、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｓ−Ａ１８０Ｋ株（実施例３４）、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｓ−Ａ１８０Ｒ株（実施例３５）、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｎ−Ａ１８０Ｋ−Ｓ３８９Ｔ株（実施例３６）、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｎ−Ａ１８０Ｒ−Ｓ３８９Ｔ株（実施例３７）、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｓ−Ａ１８０Ｋ−Ｓ３８９Ｔ株（実施例３８）、Ｈ１６  ΔｐｈａＣ１  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ｄＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−Ｐｔｒｐ−ＮＳＤＧ−Ｅ２９Ｓ−Ａ１８０Ｒ−Ｓ３８９Ｔ株（実施例３９）を用いて、比較例１と同様の方法で培養を行い、乾燥菌体重量および３ＨＨ比率を分析した。結果を表１及び表２に示した。【０１５９】
【表１】
2019240155.tif 000002
【０１６０】
【表２】
2019240155.tif 000003
【０１６１】
＜考察＞
表１の結果から、Ｑ２７Ｓ，Ｅ２９Ｎ，Ｅ２９Ｓ，Ｒ３０Ｇ，Ｒ３０Ｐ，Ｔ３１Ｐ，Ｑ３３Ｉ，Ｑ３３Ｌ，Ｑ３３Ｖ，Ｎ３９Ａ，Ｎ３９Ｃ，Ｎ３９Ｆ，Ｎ３９Ｈ，Ｎ３９Ｉ，Ｎ３９Ｍ，Ｎ３９Ｑ，Ｎ３９Ｗ，Ｑ５６Ｐ，Ｐ１０６Ａ，Ｌ１２９Ｑ，Ｔ１４４Ｌ，Ｋ１６５Ｖ，Ｓ１７０Ｑ，Ｖ１７６Ｗ，Ｌ１７９Ｑ，Ｌ１７９Ｒ，Ａ１８０Ｇ，Ａ１８０Ｋ，Ａ１８０Ｒ，Ｌ１８１Ｙ，又はＥ１８７Ｖの変異を有する実施例１〜３１のＰＨＡ合成酵素では、３ＨＨ比率の上昇が認められた。また、いずれの実施例においても乾燥菌体重量は比較例１と同程度であったことからＰＨＡ生産性に変化は無いと考えられた。以上の結果から、これら変異を有するＰＨＡ合成酵素は、ポリマー生産性を維持したまま、３ＨＨ比率が高いＰＨＡを製造するのに有用であることが分かる。【０１６２】
また実施例１〜９より、ＰＨＡ合成酵素のアミノ酸配列のＮ末端から２７〜３３番目のアミノ酸に対する変異導入は、３ＨＨ比率を向上させるために特に有効であることが分かる。さらに実施例１０〜１７より、ＰＨＡ合成酵素のアミノ酸配列のＮ末端から３９番目のアスパラギンに対する変異導入は、３ＨＨ比率を向上させるために特に有効であることが分かる。また実施例１８〜２３より、ＰＨＡ合成酵素のアミノ酸配列のＮ末端から５６番目、１０６番目、１２９番目、１４４番目、１６５番目、及び１７０番目のアミノ酸に対する変異導入は、３ＨＨ比率を向上させるために有効であることが分かる。加えて実施例２４〜３１より、ＰＨＡ合成酵素のアミノ酸配列のＮ末端から１７２〜１８７番目のアミノ酸に対する変異導入は、３ＨＨ比率を向上させるために特に有効であることが分かる。以上の結果から、ＰＨＡ合成酵素のアミノ酸配列のＮ末端から２７〜３３番目、３９番目、５６番目、１０６番目、１２９番目、１４４番目、１６５番目、１７０番目、及び１７２〜１８７番目のアミノ酸が、３ＨＨ組成を向上させる上で極めて有効な変異導入部位であることは、当業者であれば容易に類推できる。【０１６３】
次に、表２で示した実施例３２〜３５より、Ｅ２９Ｎ又はＥ２９Ｓの変異と、Ａ１８０Ｋ又はＡ１８０Ｒの変異の組合せは、いずれも、変異重複により相加的な効果が得られることが分かる。このことから、ＰＨＡ合成酵素のアミノ酸配列のＮ末端から２７〜３３番目、３９番目、５６番目、１０６番目、１２９番目、１４４番目、１６５番目、１７０番目、及び１７２〜１８７番目のアミノ酸に対する変異のうち２以上の変異を任意に組み合わせて重複導入することにより、３ＨＨ組成をさらに向上させるために有用な変異型ＰＨＡ合成酵素を取得できることは明らかである。【０１６４】
同じく表２で示した実施例３６〜３９より、Ｅ２９Ｎ−Ａ１８０Ｋ，Ｅ２９Ｎ−Ａ１８０Ｒ，Ｅ２９Ｓ−Ａ１８０Ｋ、又は、Ｅ２９Ｓ−Ａ１８０Ｒの変異と、Ｓ３８９Ｔの変異を組み合わせて重複導入することにより、３ＨＨ比率がさらに向上することが分かる。これまでにＳ３８９に対する変異として、Ｓ３８９Ｃ，Ｓ３８９Ｆ，Ｓ３８９Ｉ及びＳ３８９Ｔが３ＨＨ組成の向上に有効であることが分かっている。以上より、ＰＨＡ合成酵素のアミノ酸配列のＮ末端から２７〜３３番目、３９番目、５６番目、１０６番目、１２９番目、１４４番目、１６５番目、１７０番目、及び１７２〜１８７番目のアミノ酸に対する変異と、Ｓ３８９Ｃ，Ｓ３８９Ｆ，Ｓ３８９Ｉ，又はＳ３８９Ｔ変異のいずれかを組み合わせて重複導入することにより、３ＨＨ組成をさらに向上させるために有用な変異型ＰＨＡ合成酵素を取得できることは明らかである。
【配列表】
2019240155000001.app
【国際調査報告】
2019240155.tif 000004
2019240155.tif 000005
2019240155.tif 000006
2019240155.tif 000007