(57)【要約】溶液に含まれる測定対象物質を検出するバイオセンサであって、測定対象物質を検出するセンシング基板と、センシング基板表面上に非最密に配置され、非測定対象物質を阻害する分子鎖とを備えるバイオセンサが提供される。【選択図】図１
2019188902.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液に含まれる測定対象物質を検出するセンサであって、
前記測定対象物質を電気的に検出するセンシング電極と、
前記センシング電極表面上に非最密に配置され、非測定対象物質を阻害する分子鎖と
を備えるバイオセンサ。
【請求項２】
前記分子鎖は親水性ポリマーを含む、請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項３】
前記センシング電極に接続され、電極の電気的状態を検出する電気測定回路を更に備える、請求項１又は２に記載のバイオセンサ。
【請求項４】
溶液に含まれる測定対象物質を検出するセンサであって、
前記測定対象物質を電気的に検出するセンシング電極と、
前記センシング電極表面上に非最密に配置され、非測定対象物質を阻害する分子鎖と、
参照電極と、
前記電極に接続された表面電位測定器と、
を備えるバイオセンサ。
【請求項５】
溶液に含まれる測定対象物質を検出するセンサであって、
前記測定対象物質と結合するように構成されたセンシング電極の対と、
前記センシング電極上に非最密に配置され、非測定対象物質を阻害する分子鎖と、
前記センシング電極対間に電圧を印加する交流電源と、
前記センシング電極対間に接続されたインピーダンス測定器と、
を備えるバイオセンサ。
【請求項６】
コントロール電極の対と、
前記コントロール電極対間に電圧を印加する交流電源と、
前記コントロール電極対間に接続されたコントロール用インピーダンス測定器と、
を更に備える、
請求項５に記載のバイオセンサ。
【請求項７】
前記センシング用インピーダンス測定器と前記コントロール用インピーダンス測定器は同一のインピーダンス測定器である、請求項６に記載のバイオセンサ。
【請求項８】
溶液に含まれる測定対象物質を検出するセンサであって、
前記測定対象物質を検出するセンシング作用電極と、
前記作用電極の表面に非最密に配置され、非測定対象物質を阻害する分子鎖と、
対電極と、
参照電極と、
前記センシング作用電極と、前記対電極と、前記参照電極に接続されたインピーダンス測定器と、
を備えるバイオセンサ。
【請求項９】
コントロール作用電極を更に備える、請求項８に記載のセンサ。
【請求項１０】
溶液に含まれる測定対象物質を検出するセンサであって、
センシング基板と、
前記センシング基板表面上に非最密に配置され、非測定対象物質を阻害する分子鎖と
を備えるバイオセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、バイオセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、様々なバイオセンサが研究・開発され、医療、創薬、臨床検査等の分野で利用されている。バイオセンサは、生物の持つ優れた分子識別力を利用して外界の情報（例えば、化学的要素）を何らかの物理的な信号として認識するもので、様々な原理や測定対象がある。より詳細には、バイオセンサは、化学物質を測定対象とする化学センサの一種であり、測定対象物質を認識する分子識別素子と、認識したという情報を電気的な信号等の物理的な信号に変換する信号変換素子とで構成される。一般には、分子識別素子には、酵素、抗体、ＤＮＡ、細胞、微生物等の生体分子や生体分子を捉える化合物を用いるため、これらのセンサはバイオセンサと呼ばれる。【０００３】
体液などの生体由来の液体を初めとする試料には、マーカーとする化学物質以外にも種々の物質が含有されており、これが測定ノイズや偽信号となり、測定精度に影響を及ぼしている。生体由来の測定対象以外にも、同様に溶液内に存在する物質が測定精度を下げ、あるいは測定精度の向上を阻害することが知られている。
【発明の概要】
【０００４】
本開示の一実施形態によれば、溶液に含まれる測定対象物質を検出するセンサであって、測定対象物質を検出するセンシング基板と、センシング基板表面上に非最密に配置され、非測定対象物質を阻害する分子鎖とを備えるセンサが提供される。
【０００５】
「溶液」は、体液であってもよい。溶液は、メディエータを含んでいてもよい。
【０００６】
「体液」は、リンパ液であってもよく、組織間液、細胞間液、間質液組などの織液であってもよく、体腔液、漿膜腔液、胸水、腹水、心嚢液、脳脊髄液（髄液）、関節液（滑液）、眼房水（房水）であってもよい。体液は、唾液、胃液、胆汁、膵液、腸液などの消化液であってもよく、汗、涙、鼻水、尿、精液、膣液、羊水、乳汁であってもよい。溶液は、測定対象物質を含む、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）やN−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−2−アミノエタンスルホン酸緩衝液（ＴＥＳ）などの生理緩衝液であってもよい。溶液は測定対象物質が含まれていれば特に限定されるものではない。
【０００７】
「測定対象物質」は、測定の目的となる分子、イオンなどの物質又は被測定物質をいう。「非測定対象物質」は、測定対象物質以外の物質であり、測定の目的とする物質以外の物質をいう。「溶液」は、測定対象物質を含んでいてもよい。測定対象物質を測定しない場合、例えば較正時や洗浄時などは測定対象物質を含んでいなくてもよい。測定対象物質は、無機分子であってもよく、有機分子であってもよく、生体分子であってもよく、それらの結合した分子であってもよい。測定対象物質は、一種類であっても複数種類であってもよい。例えば、溶液は涙であって、測定対象物質は涙に含まれるグリコアルブミンであってもよい。あるいは、測定対象物は、血液又は血清中のグルコース、アルブミン、グリコアルブミン、尿酸、グリコヘモグロビン、間質液中のグルコース、涙のグルコース、アルブミン、尿のアルブミン、グルコースなどであってもよい。測定対象物質は核酸であってもよい。
【０００８】
「センサ」はバイオセンサであってもよく、生体分子センサでもよい。センサはタンパク質センサであってもよく、アルブミンセンサであってもよい。センサは、電気化学センサでもよい。電気化学センサは、ポテンショメトリックセンサ、アンペロメトリックセンサ、インピーダンスセンサであってもよい。センサは、プラズモンセンサであっても光センサであってもよい。センサは、測定対象物質の存在を検出してもよく、測定対象物質の濃度などのパラメータを測定、推定、確定してもよく、測定対象物質の濃度などのパラメータの時間変化を計測してもよい。
【０００９】
「電極」では、測定物質が近接、接触、吸着、結合などすることにより電気的状態が変化する。あるいは電極は、測定対象物質が近接すること等による電気的状態の変化又は電気的変化が生じるように構成されている。
【００１０】
ある実施形態では、電極の電気的状態の変化は、測定対象物質が電極表面と結合し、その際に発生する電子の授受による電荷又は電位の変化であってもよい。例えば、システインサイト、チオール基又はＳＨ基を有するタンパク質などに生体分子が、電極の原子（例えば金原子）と結合した際に生じる電荷が検出されてもよい。例えば、測定対象物質である、チオール（ＳＨ）基を有するタンパク質が、電極である金の表面に吸着し、Ａｕ−Ｓ結合が生じる。
【００１１】
別の実施形態では、電荷を有する生体分子が電極近傍に接近した際に生じる反対電荷が検出されてもよい。
【００１２】
更に別の実施形態では、溶液が測定対象物質以外のメディエータを含み、このメディエータが電極で酸化還元反応を起こす際の電荷が検出されてもよい。この電荷の時間的計測又は時間変化を電流として検出してもよい。たとえば、測定対象物質が電極に吸着、結合などすることにより、電極の有効面積が減少する。電極では、測定対象物質の電極表面に近接などした量に応じた電流が流れる。メディエータは、金属錯体であってもよく、遷移金属錯体であってもよい。メディエータは、二価又は三価の鉄（Ｆｅ）イオン（Ｆｅ２＋，Ｆｅ３＋）、クロム（Ｃｒ）イオン（Ｃｒ３＋，Ｃｒ４＋など）、コバルト（Ｃｏ）イオン（Ｃｒ２＋，Ｃｒ３＋など）、ニッケル（Ｎｉ２＋，Ｎｉ３＋など）イオン、パラジウム（Ｐｄ）イオン（Ｐｄ２＋，Ｐｄ４＋など）であってもよい。
【００１３】
ある実施形態では、電極は、電気伝導性を有する物質を含んでいてもよい。例えば、電極は、金属、金、銀、白金、銅、パラジウムなどの貴金属又は金属の合金を含んで形成されてもよい。電極は、導電性金属酸化物（ＩＴＯ，ＩＧＺＯなど）を含んでいてもよく、グラフェンなどのカーボン素材を含んでいてもよい。
【００１４】
「センシング基板」は、センシング部であってもよく、基板であってよい。センシング基板は、電極であってもよく、センシング電極であってもよい。測定対象物質の存在や非測定対象物質の影響は電気的に検出されてもよく、他の手法で検出されてもよい。
【００１５】
別の実施形態では、センシング基板は、電気伝導性を有する電極でなくてもよい。一般に電極と呼ばれない材質を用いて電気的な手法で測定を行ってもよい。センシング基板は、半導体や非導電性（非電気伝導性）物質で構成されていてもよく、これらを含んで構成されてもよい。例えば、センシング基板は、絶縁性の金属酸化物（Ｔａ２Ｏ５，ＳｉＯ２など）を含んでいてもよい。絶縁性のセンシング基板は、例えばインピーダンス測定に用いることができる。
【００１６】
センシングは、電気的である以外にも、プラズモンや光を用いて行ってもよく、これらの複数を組み合わせて用いて行ってもよい。例えば、センシング基板に例えば裏面から光を照射し、屈折率の変化を検出してもよい。屈折率は、センシング基板上に吸着等した測定対象物質によって変化する。
【００１７】
「分子鎖」は、無機分子鎖であってもよく、有機分子鎖であってもよい。一例として、無機分子鎖は、ポリジメチルシロキ酸の架橋により形成された分子鎖であってもよい。
【００１８】
分子鎖は、少なくとも部分的に親水性を有していてもよく、少なくとも溶液に向かう一端又はその近傍が親水性を有していてもよい。分子鎖が親水性を有する場合、特に分子鎖の端部又はその近傍が親水性を有している場合、電荷を有するタンパク質は、親水性を有する部位により弾かれ、センシング基板や電極に近接しにくくなる。
【００１９】
分子鎖は、親水性ポリマーであってもよい。親水性モノマーを重合させて親水性ポリマーを作成してもよい。分子鎖は、重合開始分子と親水性ポリマーとが結合した分子鎖であってもよい。親水性ポリマーは、例示的に、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（２−Ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｙｌｏｘｙｅｔｈｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、ＭＰＣ）、ヒドロキシエチルメタクリレート、エチレングリコールメタクリレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ−Ｎａ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）などのセルロース誘導体；アルギン酸、ヒアルロン酸、アガロース、デンプン、デキストラン、プルラン等の多糖類及びその誘導体；カルボキシビニルポリマー、ポリエチレンオキサイド、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリ（メタ）アクリル酸等のホモポリマー、当該ホモポリマーと多糖類等との共重合体、及び当該ホモポリマーを構成するモノマーと他のモノマーとの共重合体；コラーゲン、ゼラチン等のタンパク質及びその誘導体；ヘパリン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、デキストラン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸等のグリコサミノグリカン、キチン、キトサン等の多糖類やムコ多糖類を挙げることができる。
【００２０】
有機分子鎖は、ラジカル重合法、リビングラジカル重合法などの手法を用いて形成されてもよい。ある実施形態では、有機分子鎖は、原子移動ラジカル重合法（Ａｔｏｍ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｒａｄｉｃａｌ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ， ＡＴＲＰ）を用いて形成されてもよい。ある実施形態では、まず金属電極面上に有機ハロゲン化合物を重合開始剤として形成し、これにＡＴＲＰにより所望の長さの親水性分子鎖を形成してもよい。
【００２１】
この有機ハロゲン化合物は、一端に金、銀、白金、銅などの金属と比較的強固な結合を形成するチオール基やジスルフィド基を有する分子またはチオール誘導体やジスルフィド誘導体であって、他端に臭素（Ｂｒ）などのハロゲン原子を有する分子であってもよい。例えば、チオール基は金表面でＳ−Ａｕ結合を形成し、分子鎖は金表面に立つことができる。有機ハロゲン化合物の分子鎖の長さは、炭素数で規定される。その炭素数は、調節されてもよい。例えば炭素数は、６個、１１個、１０個、１１個、１６個などであってもよい。炭素数が短すぎると、電極表面上に形成する際に、分子鎖が互いに相互作用がなくなり、適切な密度での形成が難しくなる可能性がある。炭素数が長すぎると、分子鎖が密になりすぎる可能性がある。電極が導電性金属酸化物（ＩＴＯ，ＩＧＺＯなど）、グラフェンなどのカーボン素材、絶縁性の金属酸化物（Ｔａ２Ｏ５，ＳｉＯ２など）の場合は、一端にハロゲン原子を有するシランカップリング剤を用いてもよい。
【００２２】
本開示では、分子鎖は、溶液に接触する電極表面を完全又は最密に覆うのではなく、溶液に接触する電極表面その一部を覆う。分子鎖は、電極表面上に部分的に配置されてもよい。別の言い方をすれば、分子鎖は、溶液と接触する電極表面に配置可能な最大密度（最密）より小さい密度で配置される。さらに別の言い方をすれば、分子鎖は、溶液に接触する電極表面において、最密未満の密度で又は非最密に電極表面を覆うように、当該電極表面に配置される。分子鎖の電極表面上の密度は、測定対象物質が電極表面に到達することを実質的に許し、非測定対象物質が電極表面に到達することを実質的に阻害する密度であることが好ましい。電極表面への測定対象の到達頻度は、電極表面に分子鎖が配置されていない場合に比べて、分子鎖が配置されたに場合には小さくなってもよい。分子鎖は、すべての種類の非測定対象物質を阻害することができなくてもよい。例えば、分子鎖は、一つ又は２つ以上の種類の非測定対象物質を実質的に阻害することができる。
【００２３】
分子鎖間のスペースは、それ以下又は未満のサイズを有する物質又は所望の測定対象物質が電極表面に近づくことを許容しつつ、それ以上又はそれより大きいサイズの物質又は非測定対象物質が電極表面に近づくことをブロック又は阻害することができる。
【００２４】
分子鎖の密度は、重合開始分子の濃度、溶媒の種類、電極の表面状態や作成条件（例えば、金電極作成のスパッタ法（スパッタ蒸着）の条件）、溶液への電極の含侵の条件、例えば含侵時間、温度などにより制御することができる。
【００２５】
例えばＡｕ−Ｓ結合の分子鎖の密度は、電極に電圧を掛け、分子鎖がはがれていくときにＡｕ−Ｓから放出される電荷又はその電荷の時間変位である電流を、サイクリックボルタンメトリーを用いて測定することができる。あるいは、分子鎖の密度は、原子間力顕微鏡法（Ａｔｏｍｉｃ Ｆｏｒｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ＡＦＭ）、走査型トンネル顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｔｕｎｎｅｌｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ＳＴＭ）などで特定することができる。分子鎖の密度の測定法は、これらに限らず他の方法を用いてもよい。
【００２６】
密度以外にも、分子鎖の長さ、種類、親水性、電荷などの性質により、測定対象物質と非測定対象物質のフィルタリング特性や選択性を調節することができる。
【００２７】
「阻害」は、非測定対象物質の電極表面への到達を完全に阻止してもよく、その一部を阻止してもよい。「阻害」とは、非測定対象物質の電極への接触、結合など近接を抑制し、または電極表面への到達確率を減少させることを意味する。あるいは「阻害」は、目的となる測定対象物質の検出や定量が十分に遂行できる程度に、又は対象物質を十分に選択的に検出などできる程度に、非測定対象物質の影響を回避又は低減することを意味してもよい。
【００２８】
測定対象物質のすべてが分子鎖に阻止されずに電極に到達してもよく、その一部が電極に到達してもよい。例えば、涙液中のアルブミンを測定する場合に、アルブミンを含む涙液中のタンパク質の多くが、分子鎖の影響を受けると考えられる。分子鎖により弾かれ、金属表面に到達できないアルブミン分子鎖が存在し得る。
【００２９】
ある実施形態によれば、センサは、電極又はセンシング電極に接続され、測定対象物質による電極における電気的状態の変化を検出する電気回路（測定回路、測定器、検出器）を更に備えていてもよい。別の実施形態では、センサは、電気回路に電気的に接続されるように構成されていてもよい。センサは、電気回路を含む別ユニットに対して互いに取り外し可能に構成されてもよい。センサは、センサチップであってもよい。
【００３０】
電気回路は、電位測定回路であってもよい。電位測定回路はポテンショスタットを含んでいてもよい。電位測定回路は、電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）を含んでいてもよい。電極はＦＥＴのゲートに接続され、電極での電位によりトランジスタのソース―ドレイン間の電流を制御することができる。別の実施形態では、電気回路は、電流測定回路であってもよく、インピーダンス測定器であってもよく、アンペロメトリー測定器であってもよい。
【００３１】
例えば、溶液中に含有させたメディエータを用いてインピーダンス測定する場合には、メディエータは、電極に接触すると酸化還元反応により、電荷を作用電極に渡す。これが電流として電流測定回路によって検出又は測定される。測定対象物質が、作用電極上に到達し吸着または結合すると、電極の実質面積が減少する、すなわちメディエータが到達できる電極の表面積が減少する。したがって一般的に、時間とともに電極に到達した非測定対象物質の量は増加し、電極の実質面積が減少し、メディエータによる電流値（Ｉ）が降下していく。この電流値の降下の傾き（ｄＩ／ｄｔ）やある所定時刻までの電流値（Ｉ）の降下量（ΔＩ）などから、溶液内の測定対象物質の濃度を求めることができる。あるいはまた、電極表面に近接した測定対象物質は、電気二重層などを変化させ、界面の容量成分に変化をもたらす。すなわち、界面での等価回路のインピーダンスが変化する。したがって、交流の位相差を測定することにより、電極近傍にある測定対象物質の量、あるいは溶液中の測定対象物質の濃度を換算により求めることができ、あるいは推定、特定することができる。
【００３２】
本開示により、潜在的に又は一例として、比較的低濃度の測定対象物質を非測定対象物質の存在下でも検出又は測定することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本開示の第一の実施形態に係るセンサの構成を示す模式図である。
【図２】本開示の第二の実施形態に係るセンサの構成を示す模式図である。
【図３】本開示の第三の実施形態に係るセンサの構成を示す模式図である。
【図４】本開示の第四の実施形態に係るセンサの構成を示す模式図である。
【図５】本開示の第五の実施形態に係るセンサの構成を示す模式図である。
【図６】本開示の第六の実施形態に係るセンサの構成を示す模式図である。
【図７】分子鎖の形成の一例を示す概念図である。
【図８】疑似涙液中のタンパク質の測定結果を示すグラフである。
【図９】疑似涙液中のタンパク質の測定結果を示すグラフである。
【図１０】アルブミンの濃度と表面電位変化量の相関関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
＜第一の実施形態＞
図１は、本開示の一実施形態（第一の実施形態）に係るバイオセンサ１００の構成を示す模式図である。図１に示すバイオセンサ１００は、電極１０１と、電極１０１上に非最密に配置された分子鎖１０２を有する。バイオセンサ１００は、溶液１０３を収容する容器１０４を有している。電極１０１と分子鎖１０２は、容器１０４内に配置されている。溶液１０３は測定対象物質１０５と非測定対象物質１０６とを含んでいる。分子鎖１０２の存在により、非測定対象物質１０６は電極１０１表面に到達又は接近しにくくなる。測定対象物質１０５は、実質的に電極１０１の表面に到達することができる。
【００３５】
分子鎖１０２の存在により、分子鎖１０２がなければ電極１０１表面に到達しえた量より少ない量の測定対象物質１０５が、電極１０１表面に到達してもよい。すなわち、分子鎖１０２の影響により、電極１０１表面上に到達することができない測定対象物質１０５があってもよい。測定対象物質１０５の一部が電極１０１表面上に到達してもよい。非測定対象物質１０６は、分子鎖１０２により実質的に電極１０１表面への到達が阻害される。非測定対象物質１０６の一部が、電極１０１表面に到達してもよい。
【００３６】
図１に示すセンサは、電極１０１に電気的に接続された電気回路又は電気測定回路１０７を更に備え、電極１０１の電気的状態を検出する。電極１０１の電気状態は、測定対象物質１０５が近接、接触などすることにより変化する。電気回路１０７はその電気的変化を検出することができる。
【００３７】
＜第二の実施形態＞
図２は、本開示の一つの実施形態（第二の実施形態）に係るバイオセンサ２００の構成を示す模式図である。図２に示すバイオセンサ２００は、電極２０１と、電極２０１上に配置された分子鎖２０２を有する。バイオセンサ２００は、溶液２０３を収容する容器２０４を有している。電極２０１と分子鎖２０２は、容器２０４内に配置されている。溶液２０３は測定対象物質２０５と非測定対象物質２０６とを含んでいる。図２に示すセンサ２００は、更に電極に接続された表面電位測定器２０７と、参照電極２１１とを備えている。図２に示す表面電位測定器２０７は、一段目のオペアンプ、ローパスフィルタ及び二段目のオペアンプを有して構成されている。表面電位測定器２０７は、さらにＡ／Ｄコンバータを含んでいてもよく、Ａ／Ｄコンバータに接続されていてもよい（図示せず）。図２に示すセンサ２００は更に、参照電極２１１を備えている。参照電極２１１は、容器２０３に配置され溶液２０３と接触するように構成されている。図２に示す参照電極２１１は、参照電圧を提供する電源２１２に接続されている。
【００３８】
＜第三の実施形態＞
図３は、本開示の一つの実施形態（第三の実施形態）に係るバイオセンサ３００の構成を示す模式図である。バイオセンサ３００は、容器３０４内に、作用電極３０１と参照電極３１１と対電極３２１とを備えている。作用電極３０１の溶液３０３と接触する表面には、分子鎖３０２が設けられ、溶液３０３に含まれる非測定対象物質３０６が作用極３０１に接近することを阻害し、選択的に測定対象物質３０５が電極に接近できるように構成されている。作用電極３０１は、電流測定回路３７３に接続されている。
【００３９】
図３に示す参照電極３１１と対電極３２１とは、オペアンプ３７１に接続されている。より詳細には、参照電極３１１はオペアンプ３７１の反転入力（−ＩＮ）に接続され、対電極３２１はオペアンプ３７１の出力（ＯＵＴ）に接続されている。オペアンプ３７１の非反転入力（＋ＩＮ）には交流電源３７２に接続されている。
【００４０】
図３の構成はいわゆる三電極法の測定システムであるといってもよい。電源３７２より電圧を印加すると、オペアンプ３７１の出力から、対極３２１、溶液３０３、参照極３１１を経て、再びオペアンプ３７１の反転入力（−ＩＮ）に戻ってくるフィードバックループが形成される。このフィードバックループの働きで、参照極３２１から対極３２１に伝わる電圧が電源３７２により与えられる基準電圧と等しくなるように対極３２１に印可される電圧が制御される。オペアンプ３７１はフィードバック回路の１つの構成要素であるがが、別の実施形態では、同様の機能を有する他の回路部品を用いてもよい。
【００４１】
図３に示す溶液３０３は、鉄イオン（Ｆｅ２＋又はＦｅ３＋）などのメディエータ３０８を含んでいる。メディエータ３０８が作用電極３０１に接触すると酸化還元反応により、電荷を作用電極３０１に渡す。これが電流として電流測定回路３７３によって検出又は測定される。測定対象物質３０５が、作用電極３０１上に到達し吸着または結合すると、作用電極３０１の実質面積が減少する、すなわちメディエータ３０８が到達できる作用電極３０１の表面積が減少する。したがって一般的に、時間とともに作用電極３０１に到達した非測定対象物質３０６の量は増加し、作用電極３０１の実質面積が減少し、メディエータ３０８による電流値（Ｉ）が降下していく。この電流値の降下の傾き（ｄＩ／ｄｔ）やある所定時刻までの電流値（Ｉ）の降下量（ΔＩ）などから、溶液３０３内の測定対象物質３０５の濃度を推定又は特定することができる。あるいはまた、電極３０１表面に近接した測定対象物質３０５は、電気二重層などを変化させ、界面の容量成分に変化をもたらす。すなわち、界面での等価回路のインピーダンスが変化する。したがって、電流値と交流の位相差を測定することにより、電極３０１近傍にある測定対象物質３０５の量、あるいは溶液３０３中の測定対象物質３０５の濃度を換算により求めることができる。上記の測定メカニズムの説明は例示であって、他のメカニズムや測定原理を用いてもよい。
【００４２】
図３に示すシステムでは交流電圧の印加によるインピーダンス測定を行うが、他の実施形態では、交流電源３７２に変えて直流電源を配置して、アンペロメトリー測定を行ってもよい。
【００４３】
分子鎖３０２が配置された電極３０１に対して、分子鎖を配置することなく同様の電極をコントロール電極としてさらに備えてもよい。分子鎖を介した電極からの信号と、分子鎖のない電極からの信号（電流値、電位値など）とを比較しあるいはその差分を取ることにより、溶液中の非対象測定物質や分子鎖により阻害できない低分子物質やイオンなどの影響によるノイズを除去又は低減することができる。例えば、涙に含まれるアルブミンを対象として測定する場合に、涙にはアスコルビン酸や尿酸など低分子を、分子鎖が配置された電極が感知しうる。これらの非測定対象物質による信号がノイズの原因となり得る。分子鎖のない電極からの信号との差分により、これらのノイズを減少し目的とする測定の感度や効率を向上することができる。
【００４４】
＜第四の実施形態＞
図４は、本開示の一つの実施形態（第四の実施形態）に係るバイオセンサ４００の構成を示す模式図である。バイオセンサ４００は、容器４０４内に、センシング作用電極４０１、コントロール作用電極４３１、参照電極４１１及び対電極４２１を備えている。センシング作用電極４０１の溶液４０３と接触する表面には、分子鎖４０２が設けられ、非測定対象物質４０６が作用極４０１に接近することを阻害するように構成されている。センシング作用電極４０１とコントロール作用電極４３１は、それぞれ電流測定回路４７３、４７４に接続されている。これは、図３に示す第三の実施形態と同様に三電極法の構成であるが、本実施形態に係るセンサ４００は、分子鎖４０２を備えるセンシング作用電極４０１に加え、分子鎖を有しない作用電極すなわち作用電極４３１を備えている。電流測定回路４７３、４７４からの測定値の差分をとることができる。差分はアナログで行ってもよく、デジタルで行ってもよい。
【００４５】
図４に示す参照電極４１１と対電極４２１とは、オペアンプ４７１に接続されている。より詳細には、参照電極４１１はオペアンプ４７１の反転入力（−ＩＮ）に接続され、対電極４２１はオペアンプ４７１の出力（ＯＵＴ）に接続されている。オペアンプ４７１の非反転入力（＋ＩＮ）には電圧電源４７２に接続されている。このフィードバック回路の構成と機能は、第三の実施形態と同様である。
【００４６】
図４では交流電圧印加によるインピーダンス測定を行うが、他の実施形態では、交流電源４７２に変えて直流電源を配置して、アンペロメトリー測定を行うこともできる（図示せず）。
【００４７】
＜第五の実施形態＞
図５は、本開示の一つの実施形態（第五の実施形態）に係るバイオセンサ５００の構成を示す模式図である。溶液５０３は、測定対象物質５０４、非測定対象物質５０５、メディエータ５０８を含んでいる。図５に示すバイオセンサ５００は、対になった二つの電極（センシング電極）５０１，５１１を備えている。容器５０４内に配置された第１電極５０１と第２電極５１１とには、それぞれの電極表面上に第１分子鎖５０２と第２分子鎖５１２が配置されている。第１電極５０１と第２電極５１１とは、インピーダンス測定器（測定回路）５０７に接続されている。例えば、交流電界を印加した際の、電流値と電流の位相差から測定対象物質５０５の溶液５０３中の濃度を求めることができる。第１分子鎖と第２分子鎖は、非測定対象物質５０６が、それぞれ電極５０１、５１１に結合することを阻害するように構成されている。ある実施形態では、第１電極５０１と第２電極５０２とは複数対設けられてもよい。
【００４８】
図５に示す溶液５０３は、鉄イオン（Ｆｅ２＋又はＦｅ３＋）などのメディエータ５０８を含んでいる。メディエータ５０８が電極５０１，５１１に接触すると、酸化還元反応により電荷を電極５０１，５１１に渡す。これが電流として電流測定回路５０７によって検出又は測定される。測定対象物質５０５が、電極５０１，５１１上に到達し吸着または結合すると、電極５０１，５１１の実質面積が減少するとともに、電気二重層などを変化させ、界面の容量成分に変化をもたらす。すなわち、界面での等価回路のインピーダンスが変化する。したがって、電流値と交流の位相差を測定することにより、電極５０１近傍にある測定対象物質５０５の量、あるいは溶液５０３中の測定対象物質５０５の濃度を換算により求めることができる。上記の測定メカニズムの説明は例示であって、他のメカニズムや測定原理を用いてもよい。
【００４９】
図５のように互いに関連して作動する二電極システムは、測定中の測定パラメータのドリフト、測定毎のばらつき、電極の配置の仕方などの影響を低減することができる。さらには、比較的容易にかつコンパクトに製造することが可能である。
【００５０】
＜第六の実施形態＞
分子鎖が配置された電極に対して、分子鎖を配置することなく同様の電極をコントロール電極としてさらに備えてもよい。分子鎖を介した電極からの信号と、分子鎖のない電極からの信号とを比較しあるいはその差分を取ることにより、溶液中の非対象測定物質などの影響によるノイズを除去し又はノイズを低減することができる。例えば、涙に含まれるアルブミンを対象として測定する場合に、涙にはアスコルビン酸や尿酸など低分子を、分子鎖が配置された電極が感知しうる。これらの非測定対象物質による信号がノイズの原因となり得る。
【００５１】
図６は、本開示の一つの実施形態（第六の実施形態）に係るバイオセンサ６００の構成を示す模式図である。溶液６０３は、測定対象物質６０４、非測定対象物質６０５、メディエータ６０８を含んでいる。図５に示す第五の実施形態の構成に、分子鎖のない電極が追加されている。すなわち、図６に示すバイオセンサ６００において、容器６０４内に配置されたセンシング電極対、第１センシング電極６０１と第２センシング電極６１１とは、それぞれの電極表面上に非最密に配置された第１分子鎖６０２と第２分子鎖６１２を有している。第１センシング電極６０１と第２電極６１１とは、インピーダンス測定器（測定回路）６７１に接続されている。図６のバイオセンサ６００はさらに、分子鎖を有していないコントロール電極対、第１コントロール電極６２１と第２コントロール電極６３１とを有している。第１コントロール電極６２１と第２コントロール電極６３１とは、インピーダンス測定器（測定回路）６７２に接続されている。センシング用のインピーダンス測定器６７１とコントロール用のインピーダンス測定器６７２とを併せて、電気測定回路６７０と呼んでもよい。
【００５２】
ある実施形態では、インピーダンス測定器は、交流電圧源と電流測定回路とを有し、電力測定回路は、第１電極と第２電極との間を流れる電流を測定してもよい。交流電源と電流測定回路とは、直列に配置されていてもよい。別の実施形態では、インピーダンス測定器は、交流電流源と電圧測定回路とを有していてもよい。図６では、センシング用のインピーダンス測定器６７１とコントロール用のインピーダンス測定器６７２とは別個のインピーダンス測定器として設けられている。しかし、ある実施形態では、一つのインピーダンス測定器（図示せず）を設け、これをスイッチを介してコントロール電極対とセンシング電極対とに、交互または選択的に接続されるように構成されてもよい。これにより、センサ又は電気測定システムを小型化することができる。
【００５３】
＜製造例＞
以下に、金電極表面上に親水性ポリマー分子鎖を有するセンサの製造方法の一例を説明する。
【００５４】
まず、ガラス基板上に、直径１０ｍｍの領域にスパッタ法で厚さ１００ｎｍ（ナノメートル）の金薄膜を形成した。次に、この金電極表面上に重合開始分子をその一端で結合させた。次に、この重合開始分子の他端から、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ法）により親水性ポリマー分子鎖を形成した。以下各工程をより詳細に説明する。
【００５５】
重合開始分子の金電極上への形成は以下のとおりである。まず、金電極が形成されたガラス基板を、１ｍＭビス［２−（２−ブロモイソブチリロキシ）ウンデシル］ジスルフィド／エタノール溶液に浸漬させて、金電極上に重合開始分子を結合させた。これにより、図７Ａに示すように、重合開始分子は一端で電極表面７０１の金原子とＡｕ−Ｓ結合を形成して固定化し、他端である自由端に臭素（Ｂｒ）を有する、炭素１０原子程度の長さの重合開始分子鎖７０３を形成した。この分子鎖は疎水性である。上述のビス［２−（２−ブロモイソブチリロキシ）ウンデシル］ジスルフィド／エタノール溶液（重合開始分子溶液）への浸漬時間により、分子鎖の密度を制御することができる。以下の実施例１及び実施例２では、室温で当該浸漬時間が２時間、４８時間で作成されたセンサを用いた。その後、基板を重合開始分子溶液から取り出し、エタノールと純粋で洗浄した。
【００５６】
親水性ポリマー分子鎖の形成は以下のとおりである。まず、2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）１６ｍｍｏｌと、Ｎ−３−（ジメチルアミノ）プロピルメタクリルアミド４ｍｍｏｌをジメチルホルムアミド１１２ｍｌと超純水４８ｍｌに溶解させた。その後、臭化銅（ＩＩ）０．１６ｍｍｏｌおよびトリス（２−ピリジルメチル）アミン０．８ｍｍｏｌを加えた。次に、アスコルビン酸０．８ｍｍｏｌを加えた溶液を準備した。この溶液（モノマー溶液）中に、重合開始分子が結合された金電極を備えるガラス基板を浸漬させた。
【化１】
2019188902.tif 000003
【００５７】
その後、モノマー溶液の周りの雰囲気を真空に維持して、室温にて２０時間重合反応させた。これにより、図７Ａの臭素で重合が開始し、複数のＭＰＣが連なる分子鎖７０２を形成した（図７Ｂ）。分子鎖７０２のＭＰＣの部分（親水性部７０４）は親水性を有している。ＭＰＣ部の長さは、重合反応の温度、時間、ＭＰＣモノマー濃度、溶媒で決まる。上記の製造方法では、約１０００個のＭＰＣが連なる親水性ポリマー７０４が形成された。
【００５８】
したがって、分子鎖７０２は、固定端側の炭素鎖の部分７０３では疎水性だが、親水性ポリマー分子鎖ということができる。この親水性を有する部分が重合開始分子鎖７０３の先端にあることで、親水性の低いタンパク質ははじかれ、電極７０１に近づく確率が低下する。
【００５９】
続いて、親水性ポリマーが表面に形成された金薄膜を、配線を介して表面電位測定器であるポテンショスタットに電気的に接続した。
【００６０】
なお、比較例１に用いたセンサには、実施例１や実施例２に用いたセンサと同様に金電極を作成したが、分子鎖を形成しなかった。すなわち、比較例１に用いたセンサは、裸の金電極を有するセンサであり、重合開始分子溶液への浸漬時間がゼロのセンサともいえる。
【００６１】
＜実施例１および比較例１：アルブミン以外の涙液タンパク質の排除効果の測定例＞
上記のように作成した親水性ポリマーを有する金電極の表面を、生体緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ，ｐＨ７．４）に４８時間浸した。続いて、涙液に含まれるタンパク質として、以下のタンパク質を溶液に、溶液内の濃度が以下に示す値となるように各濃縮液を投入した。投入は、以下の記載の順に行った。
リゾチーム        ２．４ｍｇ／ｍＬ
ラクトフェリン    １．８ｍｇ／ｍＬ
γ―グロブリン    ０．５ｍｇ／ｍＬ
これらの濃度は、涙液中での濃度に対応する。これらの測定対象物質の添加に伴う表面電位変化を、リアルタイム計測装置にて計測した。
【００６２】
図８は、涙液タンパク質の添加に伴う、電極での表面電位の経時変化を示している。図８の縦軸は、金電極からの出力電力（ｍＶ）を示し、横軸は、計測時間（秒）を示している。点線（Ａ）は、測定結果金電極表面に分子鎖がない場合（比較例１）の測定結果を示し、実線（Ｂ４８）は、金電極表面に分子鎖を設けた場合（実施例１）の測定結果を示す。図８における両測定結果の表示は時間軸で各タンパク質の投入時間が揃い、縦軸で可読性が良くなるように調節されている。比較例１（点線Ａ）では、リゾチーム、ラクトフェリン、γ―グロブリンの添加で、それぞれ３ｍＶ、１２ｍＶ、１３ｍＶの電位変化が観察された。これに対し、実施例１（実線Ｂ４８）では、リゾチーム、ラクトフェリン、γ―グロブリンの添加で、それぞれ１ｍＶ、５ｍＶ、７ｍＶの電位変化が観察された。すなわち、実施例１でのリゾチーム、ラクトフェリン、γ―グロブリンの電位変化は、比較例１の場合の２分の１から３分の１程度であった。実施例１では、分子鎖の存在により、これらのタンパク質が電極表面への到着を阻害していることが分かった。分子鎖の親水性がタンパク質を弾くように機能していると考えられる。
【００６３】
＜実施例２：疑似涙液中のアルブミンの検出及び定量＞
本実施例では、金電極上の親水性ポリマー分子鎖を複数の密度で形成し、複数のタンパク質に対する選択性を評価した。すなわち、分子鎖の密度と、各タンパク質の金電極への到達による電位変化との関係を調べた。
【００６４】
具体的な測定に至る手順を改めて説明する。まず、製造例１で説明したように、ガラス基板上に金電極を準備し、金電極上に親水性ポリマー分子鎖を作成した。ただし、本実施例では、重合開始分子の密度を、１ｍＭビス［２−（２−ブロモイソブチリロキシ）ウンデシル］ジスルフィド／エタノール溶液の浸漬時間により複数用意した。当該浸漬時間が長ければ長いほど、重合開始分子の密度は高くなる。本実施例では、当該浸漬時間が２時間、４８時間である２種類の親水性ポリマー分子鎖のセンサ（それぞれセンサＢ０２、センサＢ４８）と、比較例１と同じ分子鎖のない金電極（センサＡ）とを準備した。
【００６５】
次に、各電極表面を、生体緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ，ｐＨ７．４）で満たした。続いて、各種タンパク質を、この溶液に添加していった。測定に使用したタンパク質と投与後の溶液内の濃度は以下の通りである。溶液への添加は以下の記載の順に行った。
ラクトフェリン        １．８ｍｇ／ｍＬ
γ―グロブリン        ０．５ｍｇ／ｍＬ
ヒト血清アルブミン    ０．１ｍｇ／ｍＬ
ヒト血清アルブミン    １．１ｍｇ／ｍＬ
ヒト血清アルブミン    ２．９ｍｇ／ｍＬ
ヒト血清アルブミン    ６．８ｍｇ／ｍＬ
ヒト血清アルブミン  １６．１ｍｇ／ｍＬ
そして、これらのタンパク質の溶液への添加に伴って生じる表面電位変化をリアルタイム計測装置にて計測した。
【００６６】
図９は、上記各タンパク質を添加した際の表面電位の時間変化を示している。図９の縦軸は、出力電圧（ｍＶ）を示し、横軸は、計測時間（秒）を示している。図８における両測定結果の表示は時間軸で各タンパク質の投入時間が揃い、縦軸で可読性が良くなるように調節されている。
【００６７】
分子鎖のない金電極（センサＡ）では、ラクトフェリンの添加から一番高い濃度のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の添加まで表面電位を検出した。表面電位変化は、金電極とＡｕ−Ｓ結合が形成された際の電子の授受による電位変化を示していると考えられる。重合開始分子浸漬時間が２時間のセンサ（センサＢ０２）でも、ラクトフェリンの添加から一番高い濃度のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の添加まで、電極での表面電位変化が観測された。
【００６８】
一方、重合開始分子浸漬時間が４８時間のセンサ（センサＢ４８）では、ラクトフェリン、グロブリンの添加では、電極での実質的な電位変化は観測されず、ＨＳＡの添加による電極での表面電位変化が観測された。本実施例のような親水性ポリマー分子鎖を備えるバイオセンサは、金電極に結合する他のタンパク質の影響を低減しつつ、アルブミンと金の結合を表面電位変化として選択的に検出することが示された。すなわち実質的に、センサＢ４８は、ラクトフェリン、γ―グロブリンを検出せず、アルブミンを検出していることが確認された。言い換えれば、センサＢ４８は、涙液中のタンパク質の中でも、ラクトフェリン、γ―グロブリンなどと比して、アルブミンに対して選択的な検出感度を備えているともいえる。このようなセンサは、アルブミン以外の、ラクトフェリン、γ―グロブリンなどの他のタンパク質（非測定対象物質）を阻害し、選択的にアルブミン（測定対象物質）を検出することができる。このようなセンサは、一例として、涙液中のアルブミンセンサとして使用することができる。
【００６９】
＜アルブミンの定量＞
図１０は、図９のように添加された各アルブミンの濃度と、それに対応して生じた表面電位シフト幅を、複数収集しプロットした図である。図１０に示すように、アルブミンの濃度と、表面電位変化量との間には、実質的に１対１の相関関係があることが分かった。したがって、本実施例に示すようなセンサを用いて、アルブミン以外のタンパク質を含む疑似涙液中であっても、アルブミンの濃度を定量できることが示された。
【００７０】
本開示は以下の実施形態を非限定的に含む：
Ａ１． 溶液に含まれる測定対象物質を検出するセンサであって、
前記測定対象物質を電気的に検出するセンシング電極と、
前記センシング電極表面上に非最密に配置され、非測定対象物質を阻害する分子鎖と
を備えるセンサ。
Ａ１ｂ．
前記分子鎖は親水性ポリマーを含む、請求項１に記載のセンサ。
Ａ２．前記センシング電極に接続され、電極の電気的状態を検出する電気測定回路を更に備える、請求項Ａ１又はＡ１ｂに記載のセンサ。
Ａ１０．溶液に含まれる測定対象物質を検出するセンサであって、
センシング基板と、
前記センシング基板表面上に非最密に配置され、非測定対象物質の前記センシング基板表面への接近を阻害するように構成された分子鎖と
を備えるセンサ。
Ａ１１．前記センシング基板は、前記測定対象物質の近接による電気状態の変化を反映するセンシング電極を含む、
請求項Ａ１０に記載のセンサ。
Ａ１ｃ．溶液に含まれる測定対象物質を検出するセンサであって、
センシング電極と、
前記センシング電極表面上に非最密に配置され、非測定対象物質の前記センシング電極表面への接近を阻害するように構成された分子鎖と
を備えるセンサ。
Ｂ１．溶液に含まれる測定対象物質を検出するセンサであって、
前記測定対象物質を電気的に検出するセンシング電極と、
前記センシング電極表面上に非最密に配置され、非測定対象物質を阻害する分子鎖と、
参照電極と、
前記電極に接続された表面電位測定器と、
を備えるセンサ。
Ｃ１．溶液に含まれる測定対象物質を検出するセンサであって、
前記測定対象物質と結合するように構成されたセンシング電極の対と、
前記センシング電極上に非最密に配置され、非測定対象物質を阻害する分子鎖と、
前記センシング電極対間に電圧を印加する交流電源と、
前記センシング電極対間に接続されたセンシング用インピーダンス測定器と、
を備えるセンサ。
Ｃ２．コントロール電極の対と、
前記コントロール電極対間に電圧を印加する交流電源と、
前記コントロール電極対間に接続されたコントロール用インピーダンス測定器と、
を更に備える、
請求項Ｃ１に記載のセンサ。
Ｃ３．前記センシング用インピーダンス測定器と前記コントロール用インピーダンス測定器は同一のインピーダンス測定器である、請求項Ｃ２に記載のセンサ。
Ｄ１．溶液に含まれる測定対象物質を検出するセンサであって、
前記測定対象物質を検出するセンシング作用電極と、
前記作用電極の表面に非最密に配置され、非測定対象物質を阻害する分子鎖と、
対電極と、
参照電極と、
前記センシング作用電極と、前記対電極と、前記参照電極に接続されたインピーダンス測定器と、
を備えるセンサ。
Ｄ２．前記インピーダンス測定器に接続されたコントロール作用電極を更に備える、請求項Ｄ１に記載のセンサ。
【００７１】
以上、本開示の幾つかの実施形態及び実施例について説明したが、これらの実施形態及び実施例は、本開示を例示的に説明するものである。例えば、上記各実施形態は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必要に応じて回路を追加してもよい。特許請求の範囲は、本開示の技術的思想から逸脱することのない範囲で、実施形態に対する多数の変形形態を包括するものである。したがって、本明細書に開示された実施形態及び実施例は、例示のために示されたものであり、本開示の範囲を限定するものと考えるべきではない。
【符号の説明】
【００７２】
１００，２００，３００，４００，５００，６００  バイオセンサ
１０１，２０１，７０１  電極
１０２，２０２，５０２，６０２，７０２  分子鎖
１０３，２０３，３０３，４０３，５０３，６０３溶液
１０４，２０４，３０４，４０４，５０４，６０４  容器
１０５，２０５  測定対象物質
１０６，２０６  非測定対象物質
１０７  電気回路，電気測定回路
２０７  表面電位測定器
２１１  参照電極
３０１，４０１  作用電極
３１１，４１１  参照電極
３２１，４２１  対電極
４０１  作用電極
３７３，４７３，４７４電流測定回路
３７１，４７１  オペアンプ
３７２，４７２電圧電源
４０１  センシング作用電極
４３１  コントロール作用電極
５０１  第１電極
５０２  第１分子鎖
５０７  インピーダンス測定器（測定回路）
５１１  第２電極
５１２  第２分子鎖
６０１  第１センシング電極
６１１  第２センシング電極
６０２  第１分子鎖
６１２  第２分子鎖
６７１  測定用インピーダンス測定器（測定回路）
６７２  コントロール用インピーダンス測定器（測定回路）
６２１  第１コントロール電極
６３１  第２コントロール電極
６７０  電気測定回路
７０３  重合開始分子鎖
７０４  親水性部
【図１】
2019188902.tif 000004
【図２】
2019188902.tif 000005
【図３】
2019188902.tif 000006
【図４】
2019188902.tif 000007
【図５】
2019188902.tif 000008
【図６】
2019188902.tif 000009
【図７】
2019188902.tif 000010
【図８】
2019188902.tif 000011
【図９】
2019188902.tif 000012
【図１０】
2019188902.tif 000013
【国際調査報告】
2019188902.tif 000014
2019188902.tif 000015
2019188902.tif 000016
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