(57)【要約】  この出願は、３ＨＨモノマー単位をより高い組成比率で含む共重合ＰＨＡを生産する形質転換微生物、具体的には、３ＨＨモノマー単位を含む共重合ＰＨＡを合成可能であるＰＨＡ合成酵素遺伝子およびＲ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性を持つタンパク質をコードする遺伝子を有する微生物であって、炭素数６のβ−ケトアシル−ＣｏＡ（すなわち、β−ケトヘキサノイル−ＣｏＡ）に対するチオリシス活性を有する少なくとも１種のβ−ケトチオラーゼ酵素をコードする遺伝子を発現抑制し、該酵素活性を消失または低下させたことを特徴とする、形質転換微生物、ならびに、当該形質転換微生物を培養する工程を含む３ＨＨモノマー単位を含む共重合ＰＨＡの製造方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
３−ヒドロキシヘキサン酸（３ＨＨ）モノマー単位を含む共重合ポリヒドロキシアルカノエート（共重合ＰＨＡ）を合成可能であるＰＨＡ合成酵素遺伝子とＲ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性を持つタンパク質をコードする遺伝子とを含む形質転換微生物であって、炭素数６のβ−ケトアシル−ＣｏＡであるβ−ケトヘキサノイル−ＣｏＡに対するチオリシス活性を有する少なくとも１種のβ−ケトチオラーゼ酵素をコードする遺伝子を発現抑制し、該酵素活性を消失または低下させたことを特徴とする形質転換微生物。
【請求項２】
少なくとも２種のβ−ケトチオラーゼ酵素をコードする遺伝子を発現抑制し、該酵素活性を消失または低下させる、請求項１に記載の形質転換微生物。
【請求項３】
さらに、Ｒ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性を持つタンパク質をコードする遺伝子の発現が強化されている、請求項１または２に記載の形質転換微生物。
【請求項４】
さらに、３ＨＨモノマー単位を含む共重合ＰＨＡを合成可能であるＰＨＡ合成酵素遺伝子の発現が強化されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の形質転換微生物。
【請求項５】
前記微生物が、細菌である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の形質転換微生物。
【請求項６】
前記細菌が、カプリアビダス属に属する細菌である、請求項５に記載の形質転換微生物。
【請求項７】
前記カプリアビダス属に属する細菌が、カプリアビダス・ネカトールである、請求項６に記載の形質転換微生物。
【請求項８】
前記カプリアビダス・ネカトールが、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株である、請求項７に記載の形質転換微生物。
【請求項９】
前記β−ケトチオラーゼをコードする遺伝子が、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株由来のｂｋｔＢ遺伝子もしくはカプリアビダス属細菌由来のそのｂｋｔＢ遺伝子ホモログ、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株由来のＡ１５２８遺伝子もしくはカプリアビダス属細菌由来のそのＡ１５２８遺伝子ホモログ、またはその両方である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の形質転換微生物。
【請求項１０】
前記ｂｋｔＢ遺伝子が配列番号７に示される塩基配列もしくは該塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列を含む、ならびに、前記Ａ１５２８遺伝子が配列番号８に示される塩基配列もしくは該塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の形質転換微生物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の形質転換微生物を、油脂または脂肪酸を含有する炭素源を用いて培養する工程および３ＨＨモノマー単位を含む共重合ＰＨＡを回収する工程を含むことを特徴とする、３ＨＨモノマー単位を含む共重合ＰＨＡの製造方法。
【請求項１２】
前記共重合ＰＨＡが、ポリ（３−ヒドロキシ酪酸−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサン酸）（すなわち、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ））である、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、油脂または脂肪酸を原料として高組成比率の３−ヒドロキシヘキサン酸（以下、「３ＨＨ」と記すこともある。）モノマー単位を含む共重合ポリヒドロキシアルカノエート（以下、「共重合ＰＨＡ」もしくは単に「ＰＨＡ」と記すこともある。）を生産する形質転換微生物、および、当該形質転換微生物による共重合ＰＨＡの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）は、広範な微生物によって生成されるポリエステル型有機ポリマーである。ＰＨＡは生分解性を有する熱可塑性高分子であり、再生可能資源を原料として産生することができる。これらのことから、ＰＨＡを環境調和型素材または生体適合型素材として工業的に生産し、多様な産業へ利用する試みが行われている。【０００３】
現在までに、数多くの微生物がエネルギー貯蔵物質としてＰＨＡを菌体内に蓄積することが知られている。ＰＨＡの代表例としては、３−ヒドロキシ酪酸（以下、「３ＨＢ」と記すこともある。）のホモポリマーであるポリ−３−ヒドロキシ酪酸（以下、「Ｐ（３ＨＢ）」と記すこともある。）が挙げられる。Ｐ（３ＨＢ）は熱可塑性高分子であり、自然環境中で生物的に分解されることから、環境に優しいプラスチックとして注目されている。しかし、Ｐ（３ＨＢ）は結晶性が高いために硬くて脆い性質を持っており、実用的には応用範囲が限られている。応用範囲を広げるためには、Ｐ（３ＨＢ）に柔軟性を付与することが必要であった。【０００４】
そこで、３ＨＢと３−ヒドロキシ吉草酸（以下、「３ＨＶ」と記す。）とからなる共重合ＰＨＡ（以下、「Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）」と記す。）とその製造方法が開発された（例えば、特許文献１および特許文献２）。Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）は、Ｐ（３ＨＢ）に比べると柔軟性に富むため、幅広い用途に応用できると考えられた。しかしながら、実際にはＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）中の３ＨＶモル分率を増加させてもそれに伴う物性の変化が乏しく、特にフィルムやシート、軟質系包装容器等へ加工するために要求される程には柔軟性が向上しないため、シャンプーボトルや使い捨て剃刀の取手等、硬質成型体の限られた分野にしか利用されていない。【０００５】
さらにＰＨＡの柔軟性を高めるために、３ＨＢと３ＨＨからなる共重合ＰＨＡ（以下、「Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）」と記すこともある。）およびその製造方法について研究が行われている（特許文献３および特許文献４）。これらの報告においてＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）は、土壌より単離されたアエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ）の野生株を用い、オレイン酸、パルミチン酸等の脂肪酸を炭素源として発酵生産されている。【０００６】
Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の物性に関する研究も行われている（非特許文献１）。この報告では、炭素数が１２個以上の脂肪酸を唯一の炭素源としてＡ．ｃａｖｉａｅを培養して、様々な３ＨＨ組成比を有するＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を発酵生産している。Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）は３ＨＨ組成比の増加にしたがって、Ｐ（３ＨＢ）の様な硬くて脆い性質から次第に柔軟な性質を示すようになり、３ＨＨ組成比がより高くなるとＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）を上回る柔軟性を示すことが明らかにされた。すなわち、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）は３ＨＨ組成比を変えることで、硬質ポリマーから軟質ポリマーまで応用可能な幅広い物性を持たせることができるため、幅広い分野への応用が期待できる。【０００７】
また、カプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）を宿主とし、プラスミドｐＪＲＤ２１５（ＡＴＣＣ３７５３３）にポリエステル合成酵素遺伝子やＲ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子等を導入したｐＪＲＤＥＥ３２やｐＪＲＤＥＥ３２ｄ１３等のＰＨＡ合成酵素発現プラスミドによって形質転換された微生物のＰＨＡ生産性が調べられている（特許文献５および非特許文献２）。当該菌株の培養後の菌体量はもともと４ｇ／Ｌと低かったが、植物油脂を炭素源とした同菌株の培養条件の改善により菌体量は４５ｇ／Ｌ、ポリマー含量は６２．５％までポリマー生産性が向上し、また、３ＨＨ組成比は８．１ｍｏｌ％まで向上することが分かった。このように、培養条件によってＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の３ＨＨ組成比やポリマー生産性を改善する試みがなされている（特許文献６）。【０００８】
Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現を強化することで、３ＨＨ組成比を向上させた報告もなされている（特許文献７、特許文献８および非特許文献３）。これらの報告では、アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素を有するカプリアビダス・ネカトールに対して、Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子を導入することにより、または、宿主染色体上のＲ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現量を増加させることにより、植物油脂を原料として生産されるＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の３ＨＨ組成比率を最大１４ｍｏｌ％程度にまで向上させている。【０００９】
さらに、β−ケトチオラーゼをコードするｂｋｔＢ遺伝子の発現を強化したＣ．ｎｅｃａｔｏｒ菌株によって、炭素源として植物油と酪酸を用いて、３ＨＨ組成比率が１３ｍｏｌ％にまで向上したＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産した例も報告されている（非特許文献４を参照）。ｂｋｔＢ遺伝子によってコードされるβ−ケトチオラーゼは、炭素数４であるブチリルＣｏＡと炭素数２であるアセチルＣｏＡを縮合して、３ＨＨモノマーの前駆体である炭素数６のβ−ケトヘキサノイルＣｏＡを生成する活性を持つことが知られており、この縮合活性に着目して、β-ケトチオラーゼ遺伝子の強化によってＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の３ＨＨ組成比率を向上させる試みは、他にも報告されている（非特許文献５および非特許文献６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開昭５７−１５０３９３号公報
【特許文献２】特開昭５９−２２０１９２号公報
【特許文献３】特開平５−９３０４９号公報
【特許文献４】特開平７−２６５０６５号公報
【特許文献５】特開平１０−１０８６８２号公報
【特許文献６】特開２００１−３４００７８号公報
【特許文献７】ＰＣＴ国際公開第２０１１／１０５３７９号
【特許文献８】ＰＣＴ国際公開第２０１５／１１５６１９号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｙ．Ｄｏｉ，Ｓ．Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｈ．Ａｂｅ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２８，ｐｐ．４８２２−４８２３（１９９５）
【非特許文献２】Ｔ．Ｆｕｋｕｉ，Ｙ．Ｄｏｉ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１７９，１５，ｐｐ．４８２１−４８３０（１９９７）
【非特許文献３】Ｈ．Ａｒｉｋａｗａ，Ｋ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｃｅｌｌ．Ｆａｃｔ．，１５，ｐｐ．１８４  (２０１６)
【非特許文献４】Ｓ．Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ． Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｅｎｇ．，１２０，ｐｐ．２４６−２５１（２０１５）
【非特許文献５】Ｔ．Ｆｕｋｕｉ，Ｈ．Ａｂｅ，Ｙ．Ｄｏｉ，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，３，ｐｐ．６１８−６２４（２００２）
【非特許文献６】Ｑ．Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．   Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.，９９，ｐｐ．２５９３−２６０２（２０１５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、３ＨＨモノマー単位をより高い組成比率で含む共重合ＰＨＡを生産する形質転換微生物、および、油脂または脂肪酸（好ましくは、植物由来の油脂または脂肪酸）を原料とする当該形質転換微生物を用いた共重合ＰＨＡの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、炭素数６のβ−ケトアシルＣｏＡ（すなわち、β−ケトヘキサノイルＣｏＡ）に対するチオリシス活性を有する少なくとも１種、または少なくとも２種、のβ−ケトチオラーゼ酵素をコードする遺伝子を発現抑制し、当該酵素活性を消失または低下させることによって、３ＨＨモノマー単位をより高い組成比率で含む共重合ＰＨＡの発酵生産が可能となることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１４】
すなわち、本発明は、３ＨＨモノマー単位を含む共重合ＰＨＡを合成可能であるＰＨＡ合成酵素遺伝子とＲ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性を持つタンパク質をコードする遺伝子とを含む形質転換微生物であって、炭素数６のβ−ケトアシル−ＣｏＡであるβ−ケトヘキサノイル−ＣｏＡに対するチオリシス活性を有する少なくとも１種、または少なくとも２種、のβ−ケトチオラーゼ酵素をコードする遺伝子を発現抑制し、該酵素活性を消失または低下させたことを特徴とする、形質転換微生物に関する。【００１５】
本発明の実施形態により、本発明の形質転換微生物ではさらに、Ｒ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性を持つタンパク質をコードする遺伝子の発現が強化されている。【００１６】
本発明の実施形態により、本発明の形質転換微生物ではさらに、３ＨＨモノマー単位を含む共重合ＰＨＡを合成可能であるＰＨＡ合成酵素遺伝子の発現が強化されている。【００１７】
本明細書における遺伝子の「発現抑制」とは、上記β−ケトチオラーゼ酵素の活性を消失または低下させることを意味し、発現抑制には当該酵素をコードする遺伝子の機能を除去することを含む。発現抑制のための方法は特に限定されないが、例えば、上記β−ケトチオラーゼ酵素をコードする遺伝子の全体的若しくは部分的な破壊（例えば、ゲノム編集技術（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）システム、ＴＡＬＥＮ、等）を利用した遺伝子のノックアウト、相同組換え技術を利用した遺伝子破壊、トランスポゾンを利用した遺伝子破壊、等）、当該遺伝子の転写や翻訳の効率の低下、当該遺伝子の転写に関わるプロモーター領域の改変や翻訳に関わるリボソーム結合配列の改変、ｍＲＮＡを不安定化させるような転写領域の塩基配列の改変、ＲＮＡ干渉によるｍＲＮＡの分解もしくは切断、当該酵素の基質特異性の変化、などの方法が挙げられる。また、当該酵素の活性を阻害する薬剤やタンパク質などを用いることもできる。【００１８】
本明細書における遺伝子の「破壊」とは、特に断らない限り、β−ケトチオラーゼ酵素をコードする遺伝子の塩基配列の除去（もしくは欠損）や切断、当該塩基配列の欠失、置換、付加、挿入などの変異により、当該遺伝子によってコードされる酵素タンパク質自体が破壊された状態を指す。【００１９】
本明細書における上記酵素タンパク質の活性の「低下」とは、共重合ＰＨＡの３ＨＨモノマー単位の組成比率が、酵素活性が低下されていない対照と比べてより高くなるような活性低下をいう。あるいは、上記酵素タンパク質の活性は消失することが好ましいが、無傷のタンパク質の活性（１００％）に対する相対活性として非限定的に例えば２０％以下、１０％以下、５％以下、２％以下または１％以下の弱い活性が残存してもよい。【００２０】
本明細書における遺伝子発現の「強化」または「増強」とは、当該遺伝子の発現量が増加する、もしくは高まることをいう。【００２１】
本発明の実施形態により、上記微生物は、細菌（バクテリアともいう。）であることが好ましく、カプリアビダス属に属する細菌であることがより好ましく、カプリアビダス・ネカトール（例えば、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株）であることがさらに好ましい。【００２２】
本発明の実施形態により、上記β−ケトチオラーゼをコードする遺伝子が、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株由来のｂｋｔＢ遺伝子またはそのホモログ、およびカプリアビダス・ネカトールＨ１６株由来のＡ１５２８遺伝子（遺伝子番号「Ｈ１６＿Ａ１５２８」）またはそのホモログからなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子である。【００２３】
本明細書で使用される「ホモログ」は、オーソログおよびパラログのいずれも包含する意味であるが、同種のもしくは異種の微生物がもつβ-ケトチオラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子群である。オーソログおよびパラログは、学術的に一般的に使用される意味を有し、オーソログは、種分化の際に分岐したホモログ（相同体）であり、異なる微生物に存在する相同な機能を持った遺伝子群を指す。一方、パラログは、遺伝子重複によって生じたホモログである。【００２４】
本発明の実施形態により、上記β−ケトチオラーゼをコードする遺伝子が、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株由来のｂｋｔＢ遺伝子もしくはカプリアビダス属細菌（例えばカプリアビダス・ネカトール）由来のそのｂｋｔＢ遺伝子ホモログ、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株由来のＡ１５２８遺伝子もしくはカプリアビダス属細菌（例えばカプリアビダス・ネカトール）由来のそのＡ１５２８遺伝子ホモログ、またはその両方である。【００２５】
本発明の実施形態により、上記ｂｋｔＢ遺伝子が配列番号７に示される塩基配列もしくは該塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列を含む、ならびに、上記Ａ１５２８遺伝子が配列番号８に示される塩基配列もしくは該塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列を含む。【００２６】
本発明はさらに、上記形質転換微生物を、油脂または脂肪酸（好ましくは、植物由来の油脂または脂肪酸）を含有する炭素源を用いて培養する工程および３ＨＨモノマー単位を含む共重合ＰＨＡを回収する工程を含む、３ＨＨモノマー単位を含む共重合ＰＨＡの製造方法に関する。当該共重合ＰＨＡは、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）（別称、ポリ（３−ヒドロキシ酪酸−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサン酸））であることが好ましい。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１８−００５９９８号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【００２７】
本発明により、より高い組成比率の３ＨＨモノマー単位を含む共重合ＰＨＡを生産する形質転換微生物を提供することができる。また、当該形質転換微生物を培養することによって、より高い組成比率の３ＨＨモノマー単位を含む共重合ＰＨＡを発酵生産することが可能となる。そのような共重合ＰＨＡは、向上した柔軟性を有するという利点をもつ。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本発明につき、さらに詳細に説明する。
１．３ＨＨモノマー単位を含む共重合ＰＨＡを生産する形質転換微生物
本発明の一態様によれば、３ＨＨモノマー単位を含む共重合ＰＨＡを合成可能であるＰＨＡ合成酵素遺伝子とＲ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性を持つタンパク質をコードする遺伝子とを含む形質転換微生物であって、炭素数６のβ−ケトアシル−ＣｏＡ（すなわち、β−ケトヘキサノイル−ＣｏＡ）に対するチオリシス活性を有する少なくとも１種、または少なくとも２種、のβ−ケトチオラーゼ酵素をコードする遺伝子を発現抑制し、当該酵素活性を消失または低下させることを特徴とする形質転換微生物を提供する。当該形質転換微生物は、上記酵素活性が消失または低下されていない対照微生物と比べて高い組成比率の３ＨＨモノマー単位を含む共重合ＰＨＡを生産することができる。
【００２９】
本明細書において、３ＨＨモノマー単位に関して「高（い）組成比率」とは、β−ケトヘキサノイル−ＣｏＡに対するチオリシス活性を有するβ−ケトチオラーゼ酵素が無傷（すなわち、ネイティブもしくは天然の状態）である対照微生物、あるいは、当該β一ケトチオラーゼ酵素をコードする遺伝子が発現抑制されていない対照微生物と比べて、生産される共重合ＰＨＡの３ＨＨモノマー単位の組成比率が高いことを意味する。
【００３０】
本明細書において「β−ケトチオラーゼ酵素」とは、脂肪酸のβ酸化において、β−ケトアシル−ＣｏＡが補酵素Ａの存在下でチオリシス（チオール開裂）を起こして２炭素分短くなった脂肪酸アシル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素である。本発明では、β−ケトチオラーゼ酵素の活性を消失または低下させることによって、β−ケトヘキサノイル−ＣｏＡの分解を抑制し、生産される共重合ＰＨＡの３ＨＨモノマー単位の組成比率を高めることを可能にする。
【００３１】
本明細書において「ＰＨＡ合成酵素」とは、ポリヒドロキシアルカン酸を生合成する酵素であり、（Ｒ）−３−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡを含む２種類以上の（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡを重合することによって３ＨＨモノマー単位を含む共重合ＰＨＡを生成することができる。
【００３２】
本明細書において「Ｒ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性を持つタンパク質」とは、脂肪酸β酸化系の中間体であるエノイル−ＣｏＡからＰＨＡモノマーの供給源である（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡに変換する酵素活性を有するタンパク質である。
【００３３】
本発明の形質転換微生物の特徴は、次のとおりである。
（１）形質転換微生物が、３ＨＨモノマー単位を含む共重合ＰＨＡを合成可能であるＰＨＡ合成酵素遺伝子とＲ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性を持つタンパク質をコードする遺伝子とを含む。
（２）好ましくは、Ｒ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性を持つタンパク質をコードする遺伝子の発現が強化されている。そのような強化によって３ＨＨモノマー単位を含む共重合ＰＨＡの３ＨＨモノマー単位の組成比率が、発現強化されていない場合と比べて高くなるが、本発明では、このような性質に下記（４）の性質を追加するとき、意外にも当該組成比率をさらに高くすることができるという特徴が付与される。
（３）好ましくは、３ＨＨモノマー単位を含む共重合ＰＨＡを合成可能であるＰＨＡ合成酵素遺伝子の発現が強化されている。
（４）炭素数６のβ−ケトアシル−ＣｏＡ（すなわち、β−ケトヘキサノイル−ＣｏＡ）に対するチオリシス活性を有する少なくとも１種、または少なくとも２種、のβ−ケトチオラーゼ酵素をコードする遺伝子を発現抑制して当該酵素活性を消失または低下させることを特徴とする、高組成比率の３ＨＨモノマー単位を含む共重合ＰＨＡを生産する能力を有する。ここで上記酵素活性の「低下」とは、上記のとおり、共重合ＰＨＡの３ＨＨモノマー単位の組成比率が、酵素活性が低下されていない対照と比べてより高くなるような活性低下をいう。
（５）上記（１）〜（４）の性質を含むことによって、本発明の形質転換微生物は、高組成比率の３ＨＨモノマー単位を含む共重合ＰＨＡを生産する能力をもつことができる。
【００３４】
上記遺伝子の発現抑制を行う元株（「親株」ともいう。）となる微生物は、上記のとおり、３ＨＨモノマー単位を含む共重合ＰＨＡを合成可能であるＰＨＡ合成酵素遺伝子とＲ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性を持つタンパク質をコードする遺伝子とを含む微生物である限り特に限定されない。このような微生物としては、上記ＰＨＡ合成酵素遺伝子およびＲ体特異的エノイル‐ＣｏＡヒドラターゼ活性を持つタンパク質をコードする遺伝子を本来的に有する野生株だけではなく、そのような野生株を人工的に突然変異処理して得られる変異株や、遺伝子工学的手法により外来のＰＨＡ合成酵素遺伝子および／または外来のＲ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性を持つタンパク質をコードする遺伝子が導入された組み換え微生物株であってもよい。
【００３５】
本発明で使用可能である微生物として、具体的には、カビ、酵母、細菌、放線菌、藍藻、古細菌などが例示され、好ましくは、細菌（バクテリア）である。当該細菌としては、例えば、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、カプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属、ワウテルシア（Ｗａｕｔｅｒｓｉａ）属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属等に属する細菌が好ましい例として挙げられる。安全性および生産性の観点から、より好ましくはラルストニア属、カプリアビダス属、アエロモナス属、ワウテルシア属に属する細菌であり、さらに好ましくはカプリアビダス属またはアエロモナス属に属する細菌であり、さらにより好ましくはカプリアビダス属に属する細菌であり、特に好ましくはカプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）である。
【００３６】
本発明の形質転換微生物では、上記例示の微生物に対し、あるいは上記例示の微生物間で、上記（１）〜（５）の性質をもつように上記標的遺伝子群（すなわち、ＰＨＡ合成酵素遺伝子、Ｒ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性を持つタンパク質をコードする遺伝子、およびβ-ケトチオラーゼ酵素をコードする遺伝子）を改変することができる。当該改変については、以下においてさらに説明する。
【００３７】
本明細書において、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する微生物が３ＨＨモノマー単位を含む共重合ＰＨＡを合成可能であるとは、あらゆる培養条件で３ＨＨモノマー単位を含む共重合ＰＨＡを合成可能であることを意味するものではなく、特定の培養条件で３ＨＨモノマー単位を含む共重合ＰＨＡを合成できるものであれば足りる。例えば、後述する比較例１に記載の菌株（ＫＮＫ００５ｄＺ）は、フルクトースを単一炭素源とする培養条件では、３ＨＨモノマー単位を含む共重合ＰＨＡを合成しないが、炭素源として油脂もしくは脂肪酸を含む培養条件では、３ＨＨモノマー単位を含む共重合ＰＨＡを合成できるので、本発明では、上記微生物は「３ＨＨモノマー単位を含む共重合ＰＨＡを合成可能であるＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する微生物」に該当する。
【００３８】
３ＨＨモノマー単位を含む共重合ＰＨＡを合成可能であるＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する微生物が、遺伝子工学的手法により外来のＰＨＡ合成酵素遺伝子が導入された組み換え微生物株である場合、上記外来のＰＨＡ合成酵素遺伝子としては、３ＨＨを取り込んで、３ＨＨモノマー単位を含む共重合ＰＨＡを生産する機能を有する遺伝子である限り特に限定されない。そのようなＰＨＡ合成酵素遺伝子としては、例えば、配列番号１に記載するアミノ酸配列を有する酵素をコードする、アエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ）由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子、または、該アミノ酸配列に対して８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上の配列同一性を有し、且つ、３ＨＨモノマー単位含有共重合ＰＨＡ合成活性を有するポリペプチドをコードするＰＨＡ合成酵素遺伝子などが挙げられるが、これらに限定されない。これらの中でも、３ＨＨモノマー単位を含む共重合ＰＨＡとしてＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を合成可能であるＰＨＡ合成酵素遺伝子が好ましく、なかでも、例えば配列番号２に記載するアミノ酸配列を含むＰＨＡ合成酵素をコードするＰＨＡ合成酵素遺伝子がより好ましい。
【００３９】
また、上記微生物が、遺伝子工学的手法により外来のＲ体特異的エノイル‐ＣｏＡヒドラターゼ活性を持つタンパク質をコードする遺伝子が導入された組み換え微生物株である場合、上記外来のＲ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性を持つタンパク質をコードする遺伝子として、例えば、配列番号３に記載するアミノ酸配列を有する酵素をコードするアエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ）由来のＲ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子、配列番号４および配列番号５に記載するアミノ酸配列を有する酵素をコードするカプリアビダス・ネカトール由来のＲ体特異的エノイル‐ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子、配列番号６に記載するアミノ酸配列を有する酵素をコードするヤロウィア・リポリティカ由来のＭｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｎｚｙｍｅ ｔｙｐｅ ２（ＭＦＥ２）遺伝子、または、配列番号３〜６に記載する各アミノ酸配列に対して８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上の配列同一性を有し、且つ、Ｒ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性を持つタンパク質をコードする遺伝子などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
Ｒ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性を持つタンパク質をコードする遺伝子の発現を強化するために、例えばＰＣＴ国際公開第２０１５／１１５６１９号に記載されるように、当該遺伝子の発現を増強するための発現調節配列（プロモーター配列および／またはＳＤ配列）の改変を行うことができる。
【００４１】
本発明において、元株となる微生物としては、カプリアビダス・ネカトールにアエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子が導入されてなる組み換え原核微生物株が最も好適である。
【００４２】
次に、上記微生物に対し、炭素数６のβ−ケトアシル−ＣｏＡ（すなわち、β−ケトヘキサノイル−ＣｏＡ）に対するチオリシス活性を有するβ−ケトチオラーゼをコードする遺伝子の発現抑制について説明する。
【００４３】
上記発現抑制される対象遺伝子は、炭素数６のβ−ケトアシル−ＣｏＡに対するチオリシス活性を有するβ−ケトチオラーゼをコードする遺伝子であれば良く、当該β−ケトチオラーゼは、炭素数６でないβ−ケトアシル−ＣｏＡに対するチオリシス活性を同時に有していても良い。例えば、炭素数４〜６のβ−ケトアシル−ＣｏＡに対するチオリシス活性、または、炭素数４〜１８のβ-ケトアシル−ＣｏＡに対するチオリシス活性、あるいは、炭素数６〜２０のβ−ケトアシル−ＣｏＡに対するチオリシス活性を有していても良く、また、これらに限定されない。
【００４４】
当該遺伝子の発現抑制を、上記ＰＨＡ合成酵素遺伝子とＲ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性を持つタンパク質をコードする遺伝子とを含む微生物に対して行うことにより得られる形質転換微生物は、３ＨＨモノマー単位をより高い組成比率で含む共重合ＰＨＡを生産できるようになる。
【００４５】
通常、油脂もしくは脂肪酸（好ましくは、植物由来の油脂もしくは脂肪酸）は微生物内でβ酸化によって代謝され、炭素数２のアシル−ＣｏＡ（すなわち、アセチル−ＣｏＡ）にまで分解される。Ｒ体特異的エノイル‐ＣｏＡヒドラターゼ活性を持つタンパク質をコードする遺伝子を有する微生物においては、この間に、β酸化の中間代謝物である炭素数６の２−エノイル−ＣｏＡの一部が、３ＨＨモノマー単位の前駆体である炭素数６の（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡに変換される。本発明により上記遺伝子の発現抑制を行うことで、油脂もしくは脂肪酸を炭素源とする場合において、β酸化における炭素数６の中間代謝物の分解が抑制され、その結果、炭素数６の（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡへの変換量が増大し、最終合成物の共重合ＰＨＡにおける３ＨＨモノマー単位の組成比率が高まるものと推測される。
【００４６】
一方で、３ＨＨモノマー単位の組成比率の向上に対して、共重合ＰＨＡの生産量が大幅に低下するようなβ−ケトアシル−ＣｏＡ遺伝子の破壊は産業上好ましくない。よって、β−ケトアシル−ＣｏＡ遺伝子の破壊によるＰＨＡ生産量低下率と３ＨＨ組成比率上昇率を考えたとき、これらの積は大きい方が好ましい。例えば、ＰＨＡ生産量が１／２倍に低下し、３ＨＨ組成比率が１．４倍に上昇した場合、積（ＰＨＡ生産量低下率×３ＨＨ組成比率上昇率）は０．７となる。本発明において、実施例に示した培養条件におけるＰＨＡ生産量低下率×３ＨＨ組成比率上昇率の値は、好ましくは０．６５以上、より好ましくは０．７５以上、さらに好ましくは０．８５以上、さらにより好ましくは０．９５以上、最も好ましくは１以上であるがこれに限定されない。なお、上記ＰＨＡ生産量低下率とは、β−ケトヘキサノイル−ＣｏＡに対するチオリシス活性を有するβ−ケトチオラーゼ酵素が無傷である形質転換微生物、あるいは、当該β−ケトチオラーゼ酵素をコードする遺伝子が発現抑制されていない形質転換微生物と比較した共重合ＰＨＡ生産量の割合である。
【００４７】
また、上記３ＨＨ組成比率上昇率とは、β−ケトヘキサノイル−ＣｏＡに対するチオリシス活性を有するβ−ケトチオラーゼ酵素が無傷である形質転換微生物、あるいは、当該β−ケトチオラーゼ酵素をコードする遺伝子が発現抑制されていない形質転換微生物と比較した共重合ＰＨＡにおける３ＨＨ組成比率の割合であり、１を超える値である。１．２以上が好ましく、１．５以上がより好ましく、さらにより好ましくは１．８以上であるが、１を超える値であればこれに限定されない。
【００４８】
β−ケトチオラーゼ活性を特異的に消失または低下させるには、例えば、当該酵素遺伝子を完全に欠失させるか、あるいは、当該酵素遺伝子の配列内部に薬剤耐性遺伝子などの全く別の遺伝子を挿入するか、あるいは、当該酵素遺伝子の配列の一部（好ましくは、酵素活性に関わる領域）を欠失するかまたは、全く異なるＤＮＡ配列により置換、付加もしくは挿入することができるが、当該活性を消失または低下させることができる限り、可能なあらゆる発現抑制が可能である。発現抑制のうち、例えば遺伝子破壊操作は、例えば、破壊用遺伝子もしくは破壊用ＤＮＡを含むベクターを用いる相同組換え技術、トランスポゾンを利用する技術などを含む（下記参照）。あるいは、別の破壊方法として、標的遺伝子を破壊するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）システムやＴＡＬＥＮによるゲノム編集技術（Ｙ．  Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ  Ｂｉｏｌ．  ２０１６，  ５（７）：７２１−７３２；Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ  ａｎｄ  Ｖｏｙｔａｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３３：１８４３−１８４６，２０１１；Ｊｉｎｅｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７：８１６−８２１，２０１２；Ｓｈａｌｅｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３４３：８４−８７，２０１４；Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３４３：８０−８４，２０１４）などの公知の技術によって行うことができる。例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムでは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は破壊すべきβ−ケトチオラーゼ遺伝子の塩基配列の一部に結合しうる配列を有しており、Ｃａｓ９を標的に運ぶ役割をもつ。また、該当遺伝子周辺の塩基配列の欠失、置換、付加、挿入などの変異により、遺伝子の転写・翻訳効率、ｍＲＮＡの安定性を低下させるなどして、当該酵素活性を消失または低下させることもできる。
【００４９】
上記発現抑制される遺伝子としては、炭素数６のβ-ケトアシル−ＣｏＡに対するチオリシス活性を有するβ-ケトチオラーゼをコードする遺伝子である限り特に限定されないが、例えば、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株由来の配列番号７に示される塩基配列を含むｂｋｔＢ遺伝子、あるいは当該塩基配列に対して８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上の配列同一性を有するｂｋｔＢ遺伝子ホモログ、が挙げられる。また、その他の例として、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株由来の配列番号８に示される塩基配列を有する遺伝子座Ｈ１６＿Ａ１５２８の遺伝子（以下、「Ａ１５２８遺伝子」と記載することもある）、あるいは当該塩基配列に対して８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上の配列同一性を有するＡ１５２８遺伝子ホモログ、が挙げられる。一方、後述の比較例で発現抑制（例えば、破壊）される遺伝子は、炭素数６のβ-ケトアシル−ＣｏＡに対するチオリシス活性を持たないβ-ケトチオラーゼをコードする遺伝子である配列番号９に記載の塩基配列を有するｐｈａＡ遺伝子、もしくは当該塩基配列に対して８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上の配列同一性を有するｐｈａＡ遺伝子ホモログ、またその他のβ-ケトチオラーゼ遺伝子である配列番号１０に記載の塩基配列を有する遺伝子座Ｈ１６＿Ａ０４６２の遺伝子（以下、「Ａ０４６２遺伝子」と記載することもある）、もしくは当該塩基配列に対して８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上の配列同一性を有するＡ０４６２遺伝子ホモログである（表１参照）。
【００５０】
さらにまた、上記非特許文献３において、３ＨＨモノマーを取り込み可能なＰＨＡ合成酵素遺伝子を導入したカプリアビダス・ネカトール株に対し、Ｒ体特異的エノイル‐ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子を導入する、あるいは該菌株が元来保持するＲ体特異的エノイル‐ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現を強化することによって、油脂又は脂肪酸（好ましくは、植物由来の油脂又は脂肪酸）を炭素源として、より高い３ＨＨ組成比のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産できることが報告されている。上記のとおり、本発明の形質転換微生物においても、上記遺伝子の発現抑制に加えて、Ｒ体特異的エノイル‐ＣｏＡヒドラターゼ活性を持つタンパク質をコードする遺伝子の追加導入、あるいは既存の該遺伝子の発現強化が行われていても良い。Ｒ体特異的エノイル‐ＣｏＡヒドラターゼ活性を持つタンパク質をコードする遺伝子の追加導入および／または既存の該遺伝子の発現強化により、上述した炭素数６の（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡの合成経路が強化または効率化され、生産される共重合ＰＨＡにおける３ＨＨモノマー単位の組成比率がより向上することになる。
【００５１】
さらにまた、上記遺伝子の発現抑制に加えて、３ＨＨモノマーを取り込み可能なＰＨＡ合成酵素遺伝子の追加導入、あるいは既存の該遺伝子の発現強化が行われていても良い。３ＨＨモノマーを取り込み可能なＰＨＡ合成酵素遺伝子の追加導入および／または既存の該遺伝子の発現強化により、変換量の増大した（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡのＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）への取り込みが強化または効率化され、生産される共重合ＰＨＡにおける３ＨＨモノマー単位の組成比率がより高くなる。
【００５２】
本発明の形質転換微生物において、外来の遺伝子が導入される場合、導入遺伝子は、宿主となる微生物が保有する染色体上、あるいはプラスミド、メガプラスミドなどのＤＮＡ上に存在しても良く、導入遺伝子の保持という観点から、微生物が保有する染色体あるいはメガプラスミド上に存在するのが好ましく、微生物が保有する染色体上に存在するのがより好ましい。また、宿主となる微生物が元来保持している遺伝子の発現量を増加させる場合には、該遺伝子の上流の塩基配列を置換、欠失または付加すること等により、遺伝子の発現量を増加してもよい。
【００５３】
微生物が保有するＤＮＡ上に任意のＤＮＡを部位特異的に置換または挿入する方法、あるいは微生物が保有するＤＮＡの任意の部位を欠失させる方法は当業者に周知であり、本発明の形質転換微生物を製造する際に使用できる。特に限定されないが、代表的な方法としては、トランスポゾンと相同組換えの機構を利用した方法（Ｏｈｍａｎ等，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，ｖｏｌ．１６２：ｐ．１０６８（１９８５））、相同組換えの機構によって起こる部位特異的な組み込みと第二段階の相同組換えによる脱落を原理とした方法（Ｎｏｔｉ等，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，ｖｏｌ．１５４，ｐ．１９７（１９８７））、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のｓａｃＢ遺伝子を共存させて、第二段階の相同組換えによって遺伝子が脱落した微生物株をシュークロース添加培地耐性株として容易に単離する方法（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．６，ｐ．１１９５（１９９２）；Ｌｅｎｚ等，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，ｖｏｌ．１７６，ｐ．４３８５（１９９４））等が挙げられる。また、細胞へのベクターの導入方法としても特に限定されないが、例えば、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、スフェロプラスト法等が挙げられる。
【００５４】
なお、遺伝子クローニングや遺伝子組み換え技術については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９または２００１）などに記載される技術を利用することができる。
【００５５】
上記の各種遺伝子を発現させるためのプロモーターは特に限定されない。カプリアビダス・ネカトールのｐｈａＣ１遺伝子のプロモーター、ｐｈａＰ１遺伝子のプロモーター、大腸菌に由来するｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔｉｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、あるいは人工的に作製された配列番号１１で示される大腸菌由来の改変塩基配列を有するｌａｃＮ１７プロモーター等が使用可能である。
【００５６】
２．共重合ＰＨＡの製造方法
本発明の形質転換微生物を培養することで、共重合ＰＨＡを生産させ、得られた共重合ＰＨＡを回収することを含む方法によって共重合ＰＨＡを製造することができる。
【００５７】
本発明による共重合ＰＨＡの生産においては、炭素源、炭素源以外の栄養源である窒素源、無機塩類、そのほかの有機栄養源を含む培地において、上記形質転換微生物を培養することが好ましい。
【００５８】
炭素源としては、本発明の形質転換微生物が資化可能な、植物油脂あるいは脂肪酸を含む炭素源であればどんな炭素源でも使用可能であるが、好ましくは、パーム油、パーム核油、コーン油、やし油、オリーブ油、大豆油、菜種油、ヤトロファ油などの油脂やその分画油類；ラウリン酸、オレイン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ミリンスチン酸などの脂肪酸やそれらの誘導体等が挙げられる。
【００５９】
窒素源としては、例えば、アンモニア；塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩；ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。無機塩類としては、例えば、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２ナトリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。そのほかの有機栄養源としては、例えば、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸；ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ等のビタミン等が挙げられる。
【００６０】
本発明の形質転換微生物を培養する際の、培養温度、培養時間、培養時ｐＨ、培地等の条件は、宿主の微生物、例えばラルストニア属、カプリアビダス属、ワウテルシア属、アエロモナス属、エシェリキア属、アルカリゲネス属、シュードモナス属等の培養で通常使用されるような条件でよい。
【００６１】
本発明において生産される共重合ＰＨＡの種類としては、３ＨＨモノマー単位を含む共重合ＰＨＡであれば特に限定されないが、炭素数４〜１６の２−ヒドロキシアルカン酸、３−ヒドロキシアルカン酸（３ＨＨを除く）および４−ヒドロキシアルカン酸から選択される１種以上のモノマーと３ＨＨとを重合して得られる共重合ＰＨＡが好ましく、より好ましくは、３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸との共重合体であるＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）である。なお、生産される共重合ＰＨＡの種類は、目的に応じて、使用する微生物の保有するあるいは別途導入されたＰＨＡ合成酵素遺伝子の種類や、その合成に関与する代謝系の遺伝子の種類、培養条件などによって適宜選択しうる。
【００６２】
本発明において、形質転換微生物を培養した後、菌体からの共重合ＰＨＡの回収は、特に限定されないが、例えば次のような方法により行うことができる。培養終了後、培養液から遠心分離機等で菌体を分離し、その菌体を蒸留水およびメタノール等により洗浄し、乾燥させる。この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いて共重合ＰＨＡを抽出する。この共重合ＰＨＡを含んだ有機溶剤溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、そのろ液にメタノールやヘキサン等の貧溶媒を加えて共重合ＰＨＡを沈殿させる。さらに、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させて共重合ＰＨＡを回収する。
【００６３】
得られた共重合ＰＨＡの３ＨＨ等のモノマー組成（ｍｏｌ％）の分析は、例えば、（キャピラリー）ガスクロマトグラフィー法や核磁気共鳴法等により行うことができる。
【実施例】
【００６４】
以下に実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら制限されるものではない。なお全体的な遺伝子操作は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９または２００１））に記載されているように行うことができる。また、遺伝子操作に使用する酵素、クローニング宿主等は、市場の供給者から購入し、その説明に従い使用することができる。なお、酵素としては、遺伝子操作に使用できるものであれば特に限定されない。【００６５】
以下の製造例、実施例、および比較例で使用されるＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株（以下、「ＫＮＫ００５ｄＺ株」と記載することもある。）は、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株の染色体上にアエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子（配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子）が導入され、染色体上のＰＨＡ分解酵素遺伝子であるｐｈａＺ１，２，６遺伝子が欠失した形質転換微生物である。この形質転換微生物は、ＰＣＴ国際公開第２０１４／０６５２５３号に記載の方法に準じて作製することができる。また、ＫＮＫ００５  ｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１,２,６株（以下、「ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ−Ｊ４ｂ株」と記載することもある。）は、ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株において、染色体上のＲ体特異的エノイル‐ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現が強化された形質転換微生物である。この形質転換微生物は、ＰＣＴ国際公開第２０１５/１１５６１９号に記載の方法に準じて作製することができる。具体的には、当該遺伝子の調節配列であるプロモーター配列もしくはシャイン・ダルガルノ（ＳＤ）配列の一部を改変（欠失、置換、付加もしくは送入）するか、または、それらの配列を別の細菌由来のプロモーター配列もしくはＳＤ配列と置換することによって、上記遺伝子の発現を強化することができる。遺伝子発現の強化方法はこれに限定されず、同様の遺伝子あるいは同様の活性を持つ酵素をコードする遺伝子をさらに導入することなどによっても可能である。【００６６】
（製造例１）ＫＮＫ００５ｄＺ／ｄｐｈａＡ株の作製
まず、遺伝子破壊用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、ｐｈａＡ構造遺伝子より上流および下流の塩基配列を有するＤＮＡ断片（配列番号１２）を得た。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化した。このＤＮＡ断片を、同じくＳｗａＩ消化した特開２００７−２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、ｐｈａＡ構造遺伝子より上流および下流の塩基配列を有する遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｐｈａＡＵＤを作製した。【００６７】
次に、遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｐｈａＡＵＤを用いて、以下のようにして遺伝子破壊株ＫＮＫ００５ｄＺ／ｄｐｈａＡ株の作製を行った。【００６８】
遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｐｈａＡＵＤで大腸菌Ｓ１７−１株（ＡＴＣＣ４７０５５）を形質転換し、それによって得た形質転換微生物を、ＫＮＫ００５ｄＺ株とＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）上で混合培養して接合伝達を行った。【００６９】
得られた培養液を、２５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むシモンズ寒天培地（クエン酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水塩０．２ｇ／Ｌ、りん酸二水素アンモニウム１ｇ／Ｌ、りん酸水素二カリウム１ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）に播種し、寒天培地上で生育してきた菌株を選択して、プラスミドがＫＮＫ００５ｄＺ株の染色体上に組み込まれた株を取得した。この株をＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で２世代培養した後、１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ培地上に希釈して塗布し、生育してきた菌株をプラスミドが脱落した株として取得した。さらにＰＣＲおよびＤＮＡシーケンサーによる解析により染色体上のｐｈａＡ構造遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失した菌株１株を単離した。この遺伝子破壊株をＫＮＫ００５ｄＺ／ｄｐｈａＡ株と命名した。得られたＫＮＫ００５ｄＺ／ｄｐｈａＡ株は、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株の染色体上のｐｈａＺ１遺伝子およびｐｈａＺ６遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらにｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、染色体上に配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が導入され、さらにｐｈａＡ構造遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失した株である。【００７０】
（製造例２）ＫＮＫ００５ｄＺ／ｄｂｋｔＢ株の作製
まず、遺伝子破壊用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、ｂｋｔＢ構造遺伝子より上流および下流の塩基配列を有するＤＮＡ断片（配列番号１３）を得た。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化した。このＤＮＡ断片を、同じくＳｗａＩ消化した特開２００７−２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、ｂｋｔＢ構造遺伝子より上流および下流の塩基配列を有する遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｂｋｔＢＵＤを作製した。【００７１】
次に、遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｂｋｔＢＵＤを用いて、ＫＮＫ００５ｄＺ株を親株として、上記と同様の方法で、遺伝子破壊株ＫＮＫ００５ｄＺ／ｄｂｋｔＢ株の作製を行った。【００７２】
得られたＫＮＫ００５ｄＺ／ｄｂｋｔＢ株は、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株の染色体上のｐｈａＺ１遺伝子およびｐｈａＺ６遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらにｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、染色体上に配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が導入され、さらにｂｋｔＢ構造遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失した株である。【００７３】
（製造例３）ＫＮＫ００５ｄＺ／ｄＡ１５２８株の作製
まず、遺伝子破壊用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、Ａ１５２８構造遺伝子より上流および下流の塩基配列を有するＤＮＡ断片（配列番号１４）を得た。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化した。このＤＮＡ断片を、同じくＳｗａＩ消化した特開２００７−２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、Ａ１５２８構造遺伝子より上流および下流の塩基配列を有する遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋Ａ１５２８ＵＤを作製した。【００７４】
次に、遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋Ａ１５２８ＵＤを用いて、ＫＮＫ００５ｄＺ株を親株として、上記と同様の方法で、遺伝子破壊株ＫＮＫ００５ｄＺ／ｄＡ１５２８株の作製を行った。【００７５】
得られたＫＮＫ００５ｄＺ／ｄＡ１５２８株は、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株の染色体上のｐｈａＺ１遺伝子およびｐｈａＺ６遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらにｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、染色体上に配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が導入され、さらにＡ１５２８構造遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失した株である。【００７６】
（製造例４）ＫＮＫ００５ｄＺ／ｄｂｋｔＢ／ｄＡ１５２８株の作製
製造例３で作製した遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋Ａ１５２８ＵＤを用いて、製造例２で作製したＫＮＫ００５ｄＺ／ｄｂｋｔＢ株を親株として、上記と同様の方法で、遺伝子破壊株ＫＮＫ００５ｄＺ／ｄｂｋｔＢ／ｄＡ１５２８株の作製を行った。【００７７】
得られたＫＮＫ００５ｄＺ／ｄｂｋｔＢ／ｄＡ１５２８株は、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株の染色体上のｐｈａＺ１遺伝子およびｐｈａＺ６遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらにｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、染色体上に配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が導入され、ｂｋｔＢ構造遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらにＡ１５２８構造遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失した株である。【００７８】
（製造例５）ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ−Ｊ４ｂ／ｄｐｈａＡ株の作製
製造例１で作製した遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｐｈａＡＵＤを用いて、ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ−Ｊ４ｂ株を親株として、上記と同様の方法で、遺伝子破壊株ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ−Ｊ４ｂ／ｄｐｈａＡ株の作製を行った。【００７９】
得られたＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ−Ｊ４ｂ／ｄｐｈａＡ株は、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株の染色体上のｐｈａＺ１遺伝子およびｐｈａＺ６遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらにｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、染色体上に配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が導入され、染色体上のＲ体特異的エノイル‐ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現が強化され、さらにｐｈａＡ構造遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失した株である。【００８０】
（製造例６）ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ−Ｊ４ｂ／ｄｂｋｔＢ株の作製
製造例２で作製した遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｂｋｔＢＵＤを用いて、ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ−Ｊ４ｂ株を親株として、上記と同様の方法で、遺伝子破壊株ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ−Ｊ４ｂ／ｄｂｋｔＢ株の作製を行った。【００８１】
得られたＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ−Ｊ４ｂ／ｄｂｋｔＢ株は、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株の染色体上のｐｈａＺ１遺伝子およびｐｈａＺ６遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらにｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、染色体上に配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が導入され、染色体上のＲ体特異的エノイル‐ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現が強化され、さらにｂｋｔＢ構造遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失した株である。【００８２】
（製造例７）ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ−Ｊ４ｂ／ｄＡ１５２８株の作製
製造例３で作製した遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋Ａ１５２８ＵＤを用いて、ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ−Ｊ４ｂ株を親株として、上記と同様の方法で、遺伝子破壊株ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ−Ｊ４ｂ／ｄＡ１５２８株の作製を行った。【００８３】
得られたＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ−Ｊ４ｂ／ｄＡ１５２８株は、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株の染色体上のｐｈａＺ１遺伝子およびｐｈａＺ６遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらにｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、染色体上に配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が導入され、染色体上のＲ体特異的エノイル‐ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現が強化され、さらにＡ１５２８構造遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失した株である。【００８４】
（製造例８）ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ−Ｊ４ｂ／ｄｂｋｔＢ／ｄＡ１５２８株の作製
製造例３で作製した遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋Ａ１５２８ＵＤを用いて、製造例６で作製したＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ−Ｊ４ｂ／ｄｂｋｔＢ株を親株として、上記と同様の方法で、遺伝子破壊株ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ−Ｊ４ｂ／ｄｂｋｔＢ／ｄＡ１５２８株の作製を行った。【００８５】
得られたＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ−Ｊ４ｂ／ｄｂｋｔＢ／ｄＡ１５２８株は、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株の染色体上のｐｈａＺ１遺伝子およびｐｈａＺ６遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらにｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、染色体上に配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が導入され、染色体上のＲ体特異的エノイル‐ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現が強化され、ｂｋｔＢ構造遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらにＡ１５２８構造遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失した株である。【００８６】
（製造例９）ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ−Ｊ４ｂ／ｌａｃＮ１７‐ＮＳＤＧ株の作製
まず、遺伝子挿入用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、ｐｈａＺ６構造遺伝子より上流および下流の塩基配列、配列番号１１に記載の塩基配列を有するｌａｃＮ１７プロモーター、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片（配列番号１５）を得た。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化した。このＤＮＡ断片を、同じくＳｗａＩ消化した特開２００７−２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、遺伝子挿入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｌａｃＮ１７‐ＮＳＤＧを作製した。【００８７】
次に、遺伝子挿入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｌａｃＮ１７‐ＮＳＤＧを用いて、ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ−Ｊ４ｂ株を親株として、上記の遺伝子破壊同様の方法で染色体ＤＮＡの改変を行い、遺伝子挿入株ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ−Ｊ４ｂ／ｌａｃＮ１７‐ＮＳＤＧ株の作製を行った。【００８８】
得られたＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ−Ｊ４ｂ／ｌａｃＮ１７‐ＮＳＤＧ株は、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株の染色体上のｐｈａＺ１遺伝子およびｐｈａＺ６遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらにｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、染色体上に配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が２コピー導入され、さらに染色体上のＲ体特異的エノイル‐ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現が強化された株である。【００８９】
（製造例１０）ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ−Ｊ４ｂ／ｌａｃＮ１７‐ＮＳＤＧ／ｄＡ０４６２株の作製
まず、遺伝子破壊用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、Ａ０４６２構造遺伝子より上流および下流の塩基配列を有するＤＮＡ断片（配列番号１６）を得た。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化した。このＤＮＡ断片を、同じくＳｗａＩ消化した特開２００７−２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、Ａ０４６２構造遺伝子より上流および下流の塩基配列を有する遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋Ａ０４６２ＵＤを作製した。【００９０】
次に、遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋Ａ０４６２ＵＤを用いて、製造例９で作製したＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ−Ｊ４ｂ／ｌａｃＮ１７‐ＮＳＤＧ株を親株として、上記と同様の方法で、遺伝子破壊株ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ−Ｊ４ｂ／ｌａｃＮ１７‐ＮＳＤＧ／ｄＡ０４６２株の作製を行った。【００９１】
得られたＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ−Ｊ４ｂ／ｌａｃＮ１７‐ＮＳＤＧ／ｄＡ０４６２株は、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株の染色体上のｐｈａＺ１遺伝子およびｐｈａＺ６遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらにｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、染色体上に配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が２コピー導入され、染色体上のＲ体特異的エノイル‐ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現が強化され、さらにＡ０４６２構造遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失した株である。【００９２】
（製造例１１）ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ−Ｊ４ｂ／ｌａｃＮ１７‐ＮＳＤＧ／ｄｂｋｔＢ株の作製
製造例２で作製した遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｂｋｔＢＵＤを用いて、製造例９で作製したＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ−Ｊ４ｂ／ｌａｃＮ１７‐ＮＳＤＧ株を親株として、遺伝子破壊株ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ−Ｊ４ｂ／ｌａｃＮ１７‐ＮＳＤＧ／ｄｂｋｔＢ株の作製を行った。【００９３】
得られたＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ−Ｊ４ｂ／ｌａｃＮ１７‐ＮＳＤＧ／ｄｂｋｔＢ株は、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株の染色体上のｐｈａＺ１遺伝子およびｐｈａＺ６遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらにｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、染色体上に配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が２コピー導入され、染色体上のＲ体特異的エノイル‐ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現が強化され、さらにｂｋｔＢ構造遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失した株である。【００９４】
（製造例１２）ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ−Ｊ４ｂ／ｌａｃＮ１７‐ＮＳＤＧ／ｄＡ１５２８株の作製
製造例３で作製した遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋Ａ１５２８ＵＤを用いて、製造例９で作製したＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ−Ｊ４ｂ／ｌａｃＮ１７‐ＮＳＤＧ株を親株として、上記と同様の方法で、遺伝子破壊株ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ−Ｊ４ｂ／ｌａｃＮ１７‐ＮＳＤＧ／ｄＡ１５２８株の作製を行った。【００９５】
得られたＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ−Ｊ４ｂ／ｌａｃＮ１７‐ＮＳＤＧ／ｄＡ１５２８株は、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株の染色体上のｐｈａＺ１遺伝子およびｐｈａＺ６遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらにｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、染色体上に配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が２コピー導入され、染色体上のＲ体特異的エノイル‐ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現が強化され、さらにＡ１５２８構造遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失した株である。【００９６】
（製造例１３）ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ−Ｊ４ｂ／ｌａｃＮ１７‐ＮＳＤＧ／ｄｂｋｔＢ／ｄＡ１５２８株の作製
製造例３で作製した遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋Ａ１５２８ＵＤを用いて、製造例１１で作製したＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ−Ｊ４ｂ／ｌａｃＮ１７‐ＮＳＤＧ／ｄｂｋｔＢ株を親株として、上記と同様の方法で、遺伝子破壊株ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ−Ｊ４ｂ／ｌａｃＮ１７‐ＮＳＤＧ／ｄｂｋｔＢ／ｄＡ１５２８株の作製を行った。【００９７】
得られたＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ−Ｊ４ｂ／ｌａｃＮ１７‐ＮＳＤＧ／ｄｂｋｔＢ／ｄＡ１５２８株は、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株の染色体上のｐｈａＺ１遺伝子およびｐｈａＺ６遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらにｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、染色体上に配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が２コピー導入され、染色体上のＲ体特異的エノイル‐ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現が強化され、ｂｋｔＢ構造遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらにＡ１５２８構造遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失した株である。【００９８】
（比較例１）ＫＮＫ００５ｄＺ株によるＰＨＡ生産
種母培地の組成は１ｗ／ｖ％  Ｍｅａｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％  Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎ、０．２ｗ／ｖ％  Ｙｅａｓｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ｗ／ｖ％  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１５ｗ／ｖ％  ＫＨ２ＰＯ４とした。【００９９】
ＰＨＡ生産に使用した生産培地の組成は１．１ｗ／ｖ％  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１９ｗ／ｖ％  ＫＨ２ＰＯ４、０．１３ｗ／ｖ％  （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｗ／ｖ％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１ｖ／ｖ％微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％  ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％  ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの。）とした。炭素源は、パーム核油を１．５ｗ／ｖ％となるように培地に添加した。【０１００】
ＫＮＫ００５ｄＺ株のグリセロールストック（５０μＬ）を種母培地（５ｍＬ）に接種して培養温度３０℃で２４時間振とう培養し、得られた培養液を種母とした。【０１０１】
ＰＨＡ生産培養は、５０ｍＬの生産培地を入れた坂口フラスコに前記種母を１．０ｖ／ｖ％接種し、培養温度３０℃で振とう培養を行った。７２時間培養後、遠心分離によって菌体を回収、メタノールで洗浄、凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。【０１０２】
ＰＨＡ生産量および共重合組成比率は以下のように算出した。得られた乾燥菌体約２０ｍｇに１ｍｌの硫酸−メタノール混液（１５：８５）と１ｍｌのクロロホルムを添加して密栓し、１００℃で１４０分間加熱することでＰＨＡ分解物のメチルエステルを得た。冷却後、これに０．５ｍｌの脱イオン水を加えてよく混合した後、水層と有機層が分離するまで放置した。その後、分取した有機層中のＰＨＡ分解物のモノマー単位組成をキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析した。ガスクロマトグラフは島津製作所ＧＣ−１７Ａ、キャピラリーカラムはＧＬサイエンス社製ＮＥＵＴＲＡ  ＢＯＮＤ−１（カラム長２５ｍ、カラム内径０．２５ｍｍ、液膜厚０．４μｍ）を用いた。キャリアガスとしてＨｅを用い、カラム入口圧１００ｋＰａとし、サンプルは１μｌを注入した。温度条件は、初発温度５０〜２００℃まで８℃／分の速度で昇温し、さらに２００〜２９０℃まで３０℃／分の速度で昇温した。上記条件にて分析した結果、得られたＰＨＡの生産量および３ＨＨ組成比率を表１に示した。【０１０３】
【表１】
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【０１０４】
本比較例で生産されたＰＨＡは、３ＨＨモノマー単位を３．０ｍｏｌ％含むＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）であった。【０１０５】
（比較例２）ＫＮＫ００５ｄＺ／ｄｐｈａＡ株によるＰＨＡ生産
種母培地およびＰＨＡ生産培地の組成、炭素源は比較例１に記載のものと同様とした。【０１０６】
製造例１で作製したＫＮＫ００５ｄＺ／ｄｐｈａＡ株を比較例１と同様の方法で培養し、ＰＨＡ生産量および３ＨＨ組成比率を比較例１と同様の方法で算出した。得られたＰＨＡ生産量および３ＨＨ組成比率を表１に示した。【０１０７】
本比較例で生産されたＰＨＡは、３ＨＨ組成比率が２．９ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）であった。すなわち、ｐｈａＡ遺伝子の破壊によって、生産された共重合ＰＨＡの３ＨＨ組成比は向上せず、３ＨＨ組成比率上昇率は１以下であった。【０１０８】
（実施例１）ＫＮＫ００５ｄＺ／ｄｂｋｔＢ株によるＰＨＡ生産
種母培地およびＰＨＡ生産培地の組成、炭素源は比較例１に記載のものと同様とした。【０１０９】
製造例２で作製したＫＮＫ００５ｄＺ／ｄｂｋｔＢ株を比較例１と同様の方法で培養し、ＰＨＡ生産量および３ＨＨ組成比率を比較例１と同様の方法で算出した。得られたＰＨＡ生産量および３ＨＨ組成比率を表１に示した。【０１１０】
本実施例で生産されたＰＨＡは、３ＨＨ組成比率が６．５ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）であった。すなわち、ｂｋｔＢ遺伝子の破壊によって、生産された共重合ＰＨＡの３ＨＨ組成比が向上した。上述の積（ＰＨＡ生産量低下率×３ＨＨ組成比率上昇率）は、１．９７であった。【０１１１】
（実施例２）ＫＮＫ００５ｄＺ／ｄＡ１５２８株によるＰＨＡ生産
種母培地およびＰＨＡ生産培地の組成、炭素源は比較例１に記載のものと同様とした。【０１１２】
製造例３で作製したＫＮＫ００５ｄＺ／ｄＡ１５２８株を比較例１と同様の方法で培養し、ＰＨＡ生産量および３ＨＨ組成比率を比較例１と同様の方法で算出した。得られたＰＨＡ生産量および３ＨＨ組成比率を表１に示した。【０１１３】
本実施例で生産されたＰＨＡは、３ＨＨ組成比率が３．３ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）であった。すなわち、Ａ１５２８遺伝子の破壊によって、生産された共重合ＰＨＡの３ＨＨ組成比が向上した。上述の積（ＰＨＡ生産量低下率×３ＨＨ組成比率上昇率）は、１．０２であった。【０１１４】
（実施例３）ＫＮＫ００５ｄＺ／ｄｂｋｔＢ／ｄＡ１５２８株によるＰＨＡ生産
種母培地およびＰＨＡ生産培地の組成、炭素源は比較例１に記載のものと同様とした。【０１１５】
製造例４で作製したＫＮＫ００５ｄＺ／ｄｂｋｔＢ／ｄＡ１５２８株を比較例１と同様の方法で培養し、ＰＨＡ生産量および３ＨＨ組成比率を比較例１と同様の方法で算出した。得られたＰＨＡ生産量および３ＨＨ組成比率を表１に示した。【０１１６】
本実施例で生産されたＰＨＡは、３ＨＨ組成比率が１４．３ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）であった。すなわち、ｂｋｔＢ遺伝子およびＡ１５２８遺伝子の破壊によって、生産された共重合ＰＨＡの３ＨＨ組成比が大幅に向上した。上述の積（ＰＨＡ生産量低下率×３ＨＨ組成比率上昇率）は、４．１３であった。【０１１７】
（比較例３）ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ‐Ｊ４ｂ株によるＰＨＡ生産
種母培地およびＰＨＡ生産培地の組成、炭素源は比較例１に記載のものと同様とした。【０１１８】
ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ‐Ｊ４ｂ株を比較例１と同様の方法で培養し、ＰＨＡ生産量および３ＨＨ組成比率を比較例１と同様の方法で算出した。得られたＰＨＡ生産量および３ＨＨ組成比率を表１に示した。【０１１９】
本比較例で生産されたＰＨＡは、３ＨＨ組成比率が１０．１ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）であった。【０１２０】
（比較例４）ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ‐Ｊ４ｂ／ｄｐｈａＡ株によるＰＨＡ生産
種母培地およびＰＨＡ生産培地の組成、炭素源は比較例１に記載のものと同様とした。【０１２１】
製造例５で作製したＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ‐Ｊ４ｂ／ｄｐｈａＡ株を比較例１と同様の方法で培養し、ＰＨＡ生産量および３ＨＨ組成比率を比較例１と同様の方法で算出した。得られたＰＨＡ生産量および３ＨＨ組成比率を表１に示した。【０１２２】
本比較例で生産されたＰＨＡは、３ＨＨ組成比率が１０．１ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）であった。すなわち、ｐｈａＡ遺伝子の破壊によって、生産された共重合ＰＨＡの３ＨＨ組成比は向上せず、３ＨＨ組成比率上昇率は１以下であった。【０１２３】
（実施例４）ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ‐Ｊ４ｂ／ｄｂｋｔＢ株によるＰＨＡ生産
種母培地およびＰＨＡ生産培地の組成、炭素源は比較例１に記載のものと同様とした。【０１２４】
製造例６で作製したＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ‐Ｊ４ｂ／ｄｂｋｔＢ株を比較例１と同様の方法で培養し、ＰＨＡ生産量および３ＨＨ組成比率を比較例１と同様の方法で算出した。得られたＰＨＡ生産量および３ＨＨ組成比率を表１に示した。【０１２５】
本実施例で生産されたＰＨＡは、３ＨＨ組成比率が１４．３ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）であった。すなわち、ｂｋｔＢ遺伝子の破壊によって、生産された共重合ＰＨＡの３ＨＨ組成比が向上した。上述の積（ＰＨＡ生産量低下率×３ＨＨ組成比率上昇率）は、１．４３であった。【０１２６】
（実施例５）ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ‐Ｊ４ｂ／ｄＡ１５２８株によるＰＨＡ生産
種母培地およびＰＨＡ生産培地の組成、炭素源は比較例１に記載のものと同様とした。【０１２７】
製造例７で作製したＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ‐Ｊ４ｂ／ｄＡ１５２８株を比較例１と同様の方法で培養し、ＰＨＡ生産量および３ＨＨ組成比率を比較例１と同様の方法で算出した。得られたＰＨＡ生産量および３ＨＨ組成比率を表１に示した。【０１２８】
本実施例で生産されたＰＨＡは、３ＨＨ組成比率が１０．８ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）であった。すなわち、Ａ１５２８遺伝子の破壊によって、生産された共重合ＰＨＡの３ＨＨ組成比が向上した。上述の積（ＰＨＡ生産量低下率×３ＨＨ組成比率上昇率）は、１．０１であった。【０１２９】
（実施例６）ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ‐Ｊ４ｂ／ｄｂｋｔＢ／ｄＡ１５２８株によるＰＨＡ生産
種母培地およびＰＨＡ生産培地の組成、炭素源は比較例１に記載のものと同様とした。【０１３０】
製造例８で作製したＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ‐Ｊ４ｂ／ｄｂｋｔＢ／ｄＡ１５２８株を比較例１と同様の方法で培養し、ＰＨＡ生産量および３ＨＨ組成比率を比較例１と同様の方法で算出した。得られたＰＨＡ生産量および３ＨＨ組成比率を表１に示した。【０１３１】
本実施例で生産されたＰＨＡは、３ＨＨ組成比率が２３．０ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）であった。すなわち、ｂｋｔＢ遺伝子およびＡ１５２８遺伝子の破壊によって、生産された共重合ＰＨＡの３ＨＨ組成比が大幅に向上した。上述の積（ＰＨＡ生産量低下率×３ＨＨ組成比率上昇率）は、２．０１であった。【０１３２】
（比較例５）ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ‐Ｊ４ｂ／ｌａｃＮ１７‐ＮＳＤＧ株によるＰＨＡ生産
種母培地およびＰＨＡ生産培地の組成、炭素源は比較例１に記載のものと同様とした。【０１３３】
製造例９で作製したＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ‐Ｊ４ｂ／ｌａｃＮ１７‐ＮＳＤＧ株を比較例１と同様の方法で培養し、ＰＨＡ生産量および３ＨＨ組成比率を比較例１と同様の方法で算出した。得られたＰＨＡ生産量および３ＨＨ組成比率を表１に示した。【０１３４】
本比較例で生産されたＰＨＡは、３ＨＨ組成比率が１２．９ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）であった。【０１３５】
（比較例６）ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ‐Ｊ４ｂ／ｌａｃＮ１７‐ＮＳＤＧ／ｄＡ０４６２株によるＰＨＡ生産
種母培地およびＰＨＡ生産培地の組成、炭素源は比較例１に記載のものと同様とした。【０１３６】
製造例１０で作製したＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ‐Ｊ４ｂ／ｌａｃＮ１７‐ＮＳＤＧ／ｄＡ０４６２株を比較例１と同様の方法で培養し、ＰＨＡ生産量および３ＨＨ組成比率を比較例１と同様の方法で算出した。得られたＰＨＡ生産量および３ＨＨ組成比率を表１に示した。【０１３７】
本比較例で生産されたＰＨＡは、３ＨＨ組成比率が１２．４ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）であった。すなわち、Ａ０４６２遺伝子の破壊によって、生産された共重合ＰＨＡの３ＨＨ組成比は向上せず、３ＨＨ組成比率上昇率は１以下であった。【０１３８】
（実施例７）ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ‐Ｊ４ｂ／ｌａｃＮ１７‐ＮＳＤＧ／ｄｂｋｔＢ株によるＰＨＡ生産
種母培地およびＰＨＡ生産培地の組成、炭素源は比較例１に記載のものと同様とした。【０１３９】
製造例１１で作製したＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ‐Ｊ４ｂ／ｌａｃＮ１７‐ＮＳＤＧ／ｄｂｋｔＢ株を比較例１と同様の方法で培養し、ＰＨＡ生産量および３ＨＨ組成比率を比較例１と同様の方法で算出した。得られたＰＨＡ生産量および３ＨＨ組成比率を表１に示した。【０１４０】
本実施例で生産されたＰＨＡは、３ＨＨ組成比率が１７．１ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）であった。すなわち、ｂｋｔＢ遺伝子の破壊によって、生産された共重合ＰＨＡの３ＨＨ組成比が向上した。上述の積（ＰＨＡ生産量低下率×３ＨＨ組成比率上昇率）は、１．２８であった。【０１４１】
（実施例８）ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ‐Ｊ４ｂ／ｌａｃＮ１７‐ＮＳＤＧ／ｄＡ１５２８株によるＰＨＡ生産
種母培地およびＰＨＡ生産培地の組成、炭素源は比較例１に記載のものと同様とした。【０１４２】
製造例１２で作製したＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ‐Ｊ４ｂ／ｌａｃＮ１７‐ＮＳＤＧ／ｄＡ１５２８株を比較例１と同様の方法で培養し、ＰＨＡ生産量および３ＨＨ組成比率を比較例１と同様の方法で算出した。得られたＰＨＡ生産量および３ＨＨ組成比率を表１に示した。【０１４３】
本実施例で生産されたＰＨＡは、３ＨＨ組成比率が１３．６ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）であった。すなわち、Ａ１５２８遺伝子の破壊によって、生産された共重合ＰＨＡの３ＨＨ組成比が向上した。上述の積（ＰＨＡ生産量低下率×３ＨＨ組成比率上昇率）は、０．９６であった。【０１４４】
（実施例９）ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ‐Ｊ４ｂ／ｌａｃＮ１７‐ＮＳＤＧ／ｄｂｋｔＢ／ｄＡ１５２８株によるＰＨＡ生産
種母培地およびＰＨＡ生産培地の組成、炭素源は比較例１に記載のものと同様とした。【０１４５】
製造例１３で作製したＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ‐Ｊ４ｂ／ｌａｃＮ１７‐ＮＳＤＧ／ｄｂｋｔＢ／ｄＡ１５２８株を比較例１と同様の方法で培養し、ＰＨＡ生産量および３ＨＨ組成比率を比較例１と同様の方法で算出した。得られたＰＨＡ生産量および３ＨＨ組成比率を表１に示した。【０１４６】
本実施例で生産されたＰＨＡは、３ＨＨ組成比率が２９．５ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）であった。すなわち、ｂｋｔＢ遺伝子およびＡ１５２８遺伝子の破壊によって、生産された共重合ＰＨＡの３ＨＨ組成比が大幅に向上した。上述の積（ＰＨＡ生産量低下率×３ＨＨ組成比率上昇率）は、０．９５であった。
【産業上の利用可能性】
【０１４７】
本発明により、ＰＨＡ生産量を大幅に低下させることなく、例えば１４ｍｏｌ％以上または２０ｍｏｌ％以上の高組成比率の３ＨＨを含む共重合ＰＨＡを合成することが可能であり、このようなＰＨＡは柔軟性の高いポリマーを必要とする用途に使用できる。
【配列表フリーテキスト】
【０１４８】
配列番号１１：  大腸菌由来の人工的に改変されたプロモーター
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【配列表】
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【国際調査報告】
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