(57)【要約】  組織切片や塗沫標本などの細胞検体を用いて、迅速かつ高精度に定量的にがんを判別する。より具体的には、細胞のリンのシグナル強度又はリン及びイオウのシグナル強度を測定することにより、細胞の増殖活性又は悪性度を解析するための方法及び装置を提供する。
2020049642.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の細胞を含む試料について、電子線又はX線照射元素分析法によりリンのシグナル強度又はリン及びイオウのシグナル強度を測定する工程と、
測定した前記試料のリンのシグナル強度に応じた細胞分布を、対照のシグナル強度に応じた細胞分布と比較する工程、又は測定した前記試料のリン及びイオウのシグナル強度から算出されたリンとイオウの濃度比を、対照のリンとイオウの濃度比と比較する工程と
を含むことを特徴とする細胞の増殖活性又は悪性度を解析する方法。
【請求項２】
前記複数の細胞を含む試料の走査電子顕微鏡（SEM）画像を取得する工程、及び
前記SEM画像から、前記細胞の核領域を選択する工程をさらに含み、前記核領域におけるリンのシグナル強度を測定する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記複数の細胞を含む試料の走査電子顕微鏡（SEM）画像を取得する工程、及び
前記SEM画像から前記細胞の領域を選択する工程をさらに含み、前記細胞の領域におけるリン及びイオウのシグナル強度を測定する、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記試料が、支持基板に接着した組織切片又は細胞である、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記試料が臓器又は細胞集団由来の複数の細胞を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記対照が、正常細胞、悪性細胞、増殖活性の高い細胞、及びDNAの異常増加を示す細胞からなる群より選択される少なくとも1種を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記対照が正常細胞を含む場合、前記対照よりもリンのシグナル強度の高い細胞の割合と、リンのシグナル強度の範囲を決定する工程、又は前記対照よりもリン：イオウの濃度比の高い細胞若しくは細胞の領域を決定する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
前記SEM画像を取得する工程の前に、前記試料を染色して光学顕微鏡で観察する工程、及び前記試料の画像を取得する範囲を選択する工程をさらに含む、請求項2又は3に記載の方法。
【請求項９】
前記試料を染色して光学顕微鏡画像を取得する工程、
前記試料の走査電子顕微鏡（SEM）画像を取得する工程、
前記SEM画像において、前記測定したリンのシグナル強度、又は前記算出されたリンとイオウの濃度比に応じて細胞を強調表示する工程、
前記SEM画像を、前記光学顕微鏡画像と照合することにより、前記光学顕微鏡画像において、前記測定したリンのシグナル強度、又は前記算出されたリンとイオウの濃度比に応じて細胞を強調表示する工程
をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
試料ががん細胞を含むか否かを判定する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
電子線又はX線照射元素分析法によりリンのシグナル強度又はリン及びイオウのシグナル強度を測定する元素分析部と、
対照のリンのシグナル強度、又は対照のリン及びイオウのシグナル強度若しくはリンとイオウの濃度比が登録されているデータベースと、
前記元素分析部で測定されるリンのシグナル強度に応じた細胞分布と、前記データベースに登録された対照のリンのシグナル強度に応じた細胞分布とを比較する比較部、又は前記元素分析部で測定されるリン及びイオウのシグナル強度から算出されたリンとイオウの濃度比と、前記データベースに登録された対照のリンとイオウの濃度比を比較する比較部と
を備えることを特徴とする細胞の増殖活性又は悪性度の解析装置。
【請求項１２】
元素分析部が、エネルギー分散型X線分光器（EDS）、波長分散型X線分光器（WDS）、又はX線顕微鏡を含む、請求項11に記載の装置。
【請求項１３】
試料の画像を取得する画像取得部をさらに備えることを特徴とする請求項11に記載の装置。
【請求項１４】
画像取得部が、走査電子顕微鏡（SEM）、光学顕微鏡、又はその両方を含む、請求項13に記載の装置。
【請求項１５】
前記比較部による比較結果を出力する出力部をさらに備える又は前記出力部に接続されている、請求項11に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞解析方法及び細胞解析装置に関するものである。より具体的には、本発明は、細胞の増殖活性又は悪性度を解析するための方法及び装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
がんを判別するための病理検査では、スライドガラスに接着した組織切片や塗沫細胞を染色して、細胞検査士や病理診断医が光学顕微鏡観察をして色合いや形を見ることにより、細胞の大きさや形、配列、背景などの異常を判別して、がんの有無を判定した結果が報告される。観察者の主観に起因するばらつきをなくすため、様々な判定基準が設けられている。【０００３】
しかしながら、実際の病理診断では、がんなどの疾患組織の形態は個々に違うため、がんであるかどうかの判別が難しい症例があり、病理医によって診断が異なる場合も少なくない。また、一般的な病理標本は、細胞や組織に含まれる物質を異なる色素で染め分けるため、染色の試験間差や施設間差も問題である。このため、がんの判別を補助する技術が求められており、特に、人や施設による差が生じない定量的な判定基準が必要とされている。【０００４】
従来法として、細胞を定量的に解析する技術としては、細胞のDNAを蛍光染色して、フローサイトメトリを用いて細胞ごとの蛍光強度を求めることにより、がんの悪性度解析を行う方法と装置が知られている（特許文献１）。【０００５】
しかしながら、フローサイトメトリでは、単離細胞を蛍光染色して、染色細胞の懸濁液をフローセルに流すことによって試料からの蛍光強度を測定するため、手術などの侵襲度の高い方法で切除された新鮮組織が必要であること、フローセルに流すためにデッドボリュームを考慮して相当量の細胞数が必要であること、測定後の細胞は廃棄するために標本の保存ができないこと、通常の病理検体である組織切片や塗沫細胞などのルーチン操作とは別に検体を調製しなければならないなどの問題点がある。【０００６】
一方、病理検査を対象としてはいないが、移植用の培養組織の検査において、組織切片に電子線を照射し、組織切片に含まれる元素に由来する特性X線を、X線検出器で検出することにより元素分析を行い、元素の分布をマッピングして、組織の特徴を定量解析する方法と装置が知られている（特許文献２）。また、組織切片や塗沫細胞を含めて、検体の形状を問わずに生体組織表面の元素分析を行う装置例のひとつとして、走査電子顕微鏡(SEM)とエネルギー分散型X線分光法（EDX）元素分析法の組み合わせが知られている（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】US2012/0052491A1
【特許文献２】特開2002-296205号公報
【特許文献３】特開2010-008406号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は上記のような病理分野における問題点を鑑み、組織切片や塗沫細胞などの検体において、迅速かつ高精度に定量的にがんを判別する方法と装置を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、DNA 1塩基あたりにリン原子1個が結合しており、細胞分裂前のDNA合成過程では、比例してDNAに由来するリン原子の数が増えることに着目し、試料に含まれる細胞又は細胞核ごとのリン量の違いを測定し、細胞又は細胞核ごとのDNA量の相対的な違いを定量的に検出することで、試料に含まれる細胞の増殖活性や腫瘍細胞の悪性度を解析することができることを見出した。【００１０】
また本発明者は、蛋白質の構成元素であるイオウに着目し、細胞分裂活性の高い組織では、細胞核の量に対して、相対的に、細胞質や細胞外マトリクスの量が少なくなる場合が多いため、細胞核に多く含まれるリンと、細胞質や細胞外マトリクスで蛋白質やアミノ酸の構成要素となるイオウの濃度比を求めることにより、組織における細胞増殖活性や腫瘍細胞の悪性度を解析することができることを見出した。【００１１】
一態様において、複数の細胞を含む試料について、電子線又はX線照射元素分析法によりリンのシグナル強度を測定する工程と、測定した前記試料のリンのシグナル強度に応じた細胞分布を、対照のシグナル強度に応じた細胞分布と比較する工程とを含むことを特徴とする細胞の増殖活性又は悪性度を解析する方法を提供する。【００１２】
別の態様において、電子線又はX線照射元素分析法によりリンのシグナル強度を測定する元素分析部と、対照のリンのシグナル強度が登録されているデータベースと、前記元素分析部で測定されるリンのシグナル強度に応じた細胞分布と、前記データベースに登録された対照のリンのシグナル強度に応じた細胞分布とを比較する比較部とを備えることを特徴とする細胞の増殖活性又は悪性度の解析装置を提供する。【００１３】
別の態様において、複数の細胞を含む試料、又は細胞と細胞外マトリクスなどの細胞外成分を含む試料について、電子線又はX線照射元素分析法によりリン及びイオウのシグナル強度を測定する工程と、測定した前記試料のリン及びイオウのシグナル強度から算出されたリンとイオウの濃度比を、対照のリンとイオウの濃度比と比較する工程とを含むことを特徴とする細胞の増殖活性又は腫瘍の悪性度を解析する方法を提供する。【００１４】
別の態様において、電子線又はX線照射元素分析法によりリン及びイオウのシグナル強度を測定する元素分析部と、対照のリン及びイオウのシグナル強度若しくはリンとイオウの濃度比が登録されているデータベースと、前記元素分析部で測定されるリン及びイオウのシグナル強度から算出されたリンとイオウの濃度比を、前記データベースに登録された対照のリンとイオウの濃度比と比較する比較部とを備えることを特徴とする細胞の増殖活性又は腫瘍の悪性度の解析装置を提供する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、細胞の増殖活性又は腫瘍の悪性度を解析する方法及び装置が提供される。該方法及び装置は、喀痰や尿中の剥離細胞や、擦過材料、組織捺印標本など、ごく微量の細胞検体、あるいは組織標本などを用いて、迅速かつ高精度に細胞の増殖活性又は悪性度を解析することができる。そのため、がんであるかどうかを定量的に判別することが可能になり、医療分野において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】細胞解析装置の構成例を示す図である。
【図２】細胞解析方法の一例による解析フロー図と、データ表示例を示す。
【図３】細胞解析方法の別の例による解析フロー図と、データ表示例を示す。
【図４】細胞解析方法により培養細胞のリンX線シグナル強度を測定したヒストグラムの例（A及びC）と、同時にDNA蛍光染色強度をフローサイトメトリで測定したヒストグラムの例（B及びD）を示す。A及びBはヒト間葉系幹細胞（hMSC）を、C及びDはヒト子宮頸がん由来株化細胞（HeLa細胞）を用いて得られたヒストグラムである。
【図５】細胞解析法により組織のリンとイオウの濃度比を算出した例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本開示は、細胞の増殖活性又は悪性度を解析する方法（本明細書中、「細胞解析方法」ともいう）、及び細胞の増殖活性又は悪性度の解析装置（本明細書中、「細胞解析装置」ともいう）に関する。
【００１８】
細胞の増殖活性とは、細胞が増殖又は倍化する速度又は程度を指し、細胞の悪性度とは、細胞の増殖活性の高さとも関連しているが、正常細胞とは顕著に異なる増殖活性を示す腫瘍細胞や、1細胞あたりDNAが通常の分裂前合成よりも異常増加を示す腫瘍細胞は悪性度が高い細胞といえる。細胞の増殖活性及び悪性度は、相対的な尺度であり、例えば正常細胞の増殖活性及び悪性度（例えば、腫瘍の由来となった正常細胞の増殖活性及び悪性度を0又は1とした場合の相対値として表すことができるが、これに限定されない）、又は既知の腫瘍細胞の増殖活性及び悪性度に対して決定することができる。
【００１９】
解析対象となる試料は、複数の細胞を含み、細胞の増殖活性又は悪性度の解析が望まれる任意の試料であり、限定されるものではない。例えば、対象に由来する試料（例えば臓器、組織、細胞集団など）であってもよいし、培養して得られる試料（例えば細胞塊、細胞集団、組織など）であってもよい。対象も生物であれば特に限定されるものではなく、動物、例えば哺乳類（ヒトを含む霊長類、ペット動物、家畜動物等）、爬虫類、鳥類、魚類など、及び植物、細菌が含まれる。
【００２０】
細胞の増殖活性又は悪性度の解析が望まれる試料は、例えばがん細胞を含むか否かの判定が望まれる試料、がんの悪性度の判定が望まれる試料など、また培養している細胞（例えばiPS細胞などの幹細胞）が異常増殖しているかどうかを判定する試料などであるが、限定されるものではない。
【００２１】
一実施形態では、対象が哺乳類、例えばヒトであり、試料が対象に由来するもの、又は対象に由来する細胞を培養して得られたものである。対象に由来する試料としては、限定されるものではないが、喀痰、尿中の剥離細胞、擦過材料（口腔粘膜、尿道など）、血液（血液細胞を含む画分）、組織捺印標本、臓器、細胞集団、組織切片などが挙げられる。
【００２２】
試料に含まれる細胞の数は、解析対象の細胞の種類、元素分析を行う装置の種類などに応じて異なり、30〜1000個、30〜500個、30〜300個、30〜200個、30〜100個、40〜200個、40〜100個、50〜200個、50〜100個程度である。
【００２３】
本開示の細胞解析方法の一例による解析フローを図２及び図３に示す。最初に解析対象の試料を調製する。試料の調製は、対象の試料の種類、元素分析を行う装置の種類などに応じて異なるが、当技術分野で慣用の方法により調製することができる。
【００２４】
画像取得及び／又は元素分析に電子線を使用する場合には、試料には、真空環境に設置しても著しい変性や変形を生じない処理をすることが望ましい。例えば、スライドガラスなどの支持基板に組織切片や細胞を接着させ、乾燥させた後、試料室に挿入して、真空環境で電子線を照射する。
【００２５】
一態様において、本開示の細胞解析方法は、複数の細胞を含む試料について、電子線又はX線照射元素分析法によりリンのシグナル強度を測定する工程と、測定した前記試料のリンのシグナル強度に応じた細胞分布を、対照のシグナル強度に応じた細胞分布と比較する工程とを含む。
【００２６】
別の実施形態において、複数の細胞を含む試料、又は細胞と細胞外マトリクスなどの細胞外成分を含む試料について、電子線又はX線照射元素分析法によりリン及びイオウのシグナル強度を測定する工程と、測定した前記試料のリン及びイオウのシグナル強度から算出されたリンとイオウの濃度比を、対照のリンとイオウの濃度比と比較する工程とを含む。また本開示の細胞解析方法は、測定した前記試料のリン及びイオウのシグナル強度からリンとイオウの濃度比を算出する工程を含んでもよい。
【００２７】
まず、試料（各細胞又は細胞の領域）について、電子線又はX線照射元素分析法によりリンのシグナル強度、又はリン及びイオウのシグナル強度を測定する。電子線又はX線照射元素分析法とは、試料に電子線又はX線を照射し、試料から発生した特性X線又は蛍光X線を検出し、その特性X線又は蛍光X線に対応する元素組成を分析する方法であり、当技術分野で公知の技法である（例えば特許文献２又は３）。この元素分析法により、電子線又はX線を照射した部位におけるリンの量、又はリン及びイオウの量を測定することができる。元素分析法に使用される元素分析部は、電子線又はX線照射部と、X線検出部とを含む。X線検出部としては、例えば電子線照射により発生した特性X線を検出するために、エネルギー分散型X線分光器（EDS）、又は波長分散型X線分光器（WDS）を使用することができ、また例えばX線照射により発生した蛍光X線を検出するために、X線顕微鏡を使用することができる。
【００２８】
より具体的には、電子線又はX線照射部から試料に電子線又はX線を照射し、X線検出部においてリンを対象とした特性X線又は蛍光X線測定を行う（図２）。細胞毎又は核毎のリンの定量値として、計測時間内の特性X線シグナル積算値、単位時間あたりの特性X線シグナルの値、あるいは任意の元素を選択した場合に算出される質量濃度を得る。ここで、試料全体ではなく、細胞毎又は細胞核毎のリンのシグナル強度を求めることが重要である。
【００２９】
別の実施形態において、より具体的には、電子線又はX線照射部から試料に電子線又はX線を照射し、X線検出部においてリン及びイオウを対象とした特性X線又は蛍光X線測定を行う（図３）。細胞毎、又は細胞集団、又は細胞と細胞外マトリクスなどの細胞外成分を含む組織（細胞の領域）のリン及びイオウの定量値として、計測時間内の特性X線シグナル積算値、単位時間あたりの特性X線シグナルの値、あるいは任意の元素を選択した場合に算出される質量濃度を得る。ここで、細胞核ではなく、細胞毎、又は細胞集団毎、又は細胞と細胞外マトリクスなどの細胞外成分を含む連続的な組織（細胞の領域）毎のリン及びイオウのシグナル強度を求める。
【００３０】
細胞解析方法は、任意により、試料の走査電子顕微鏡（SEM）画像を取得する工程をさらに含んでもよい。試料のSEM画像を取得することにより、細胞の核領域を選択したり、細胞の形状などを解析することが可能となる。
【００３１】
一実施形態では、リンのシグナル強度を測定する前に、試料の走査電子顕微鏡（SEM）画像を取得する工程、及び前記SEM画像から前記細胞の核領域を選択する工程をさらに含んでもよく、その後、選択した核領域におけるリンのシグナル強度を測定する。SEMを用いて試料の画像を取得する際、細胞核を識別できる観察倍率が望ましく、細胞種によって適切な倍率を調整する。およそ100倍から1000程度であるが、これに限定されることはない。任意の視野のSEM画像を取得した後、視野内の細胞の核の領域を選択する。
【００３２】
一実施形態では、リン及びイオウのシグナル強度を測定する前に、試料の走査電子顕微鏡（SEM）画像を取得する工程、及び前記SEM画像から前記細胞の領域を選択する工程をさらに含んでもよく、その後、選択した細胞の領域におけるリン及びイオウのシグナル強度を測定する。SEMの観察倍率については上述した通りである。
【００３３】
細胞解析方法は、任意により、試料を染色して光学顕微鏡で観察する工程を含んでもよい。この工程により、細胞の核領域を染色したり、細胞の状態を解析することが可能となる。試料の染色は、当技術分野で公知の色素を用いて行うことができる。そのような色素としては、例えばヘマトキシリン、ヘマトキシリン・エオジン、メイ・ギムザ染色液、メチレンブルー、サフラニン、トルイジンブルー、又はDAPI（4′,6-diamidino-2-phenylindole）やPI（Propidium Iodide）などの蛍光色素が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００３４】
一実施形態では、SEM画像を取得する工程の前に、試料を染色して光学顕微鏡で観察する工程、及び試料の画像を取得する範囲を選択する工程をさらに含んでもよく、その後、選択した範囲におけるSEM画像を取得する。
【００３５】
前記操作を繰り返すことにより、複数の視野について、（任意により画像を取得して）、同様に元素分析を行い、細胞又は核領域ごとのリンの相対定量値を求める。あるいは、細胞、細胞集団、又は細胞と細胞外マトリクスなどの細胞外成分を含む連続的な組織ごとのリンとイオウの濃度比を求める。合計の測定細胞数は、少なくとも50細胞であることが望ましいが、これに限定されない。
【００３６】
続いて、本開示の細胞解析方法では、測定した試料のリンのシグナル強度に応じた細胞分布を、対照のシグナル強度に応じた細胞分布と比較する。リンのシグナル強度に応じた細胞分布とは、一定のリンのシグナル強度範囲における細胞の数を、そのシグナル強度範囲ごとに示した分布をいい、ヒストグラムにより表すことができる（例えば図２の右側）。
【００３７】
本開示の別の細胞解析方法では、測定した試料のリン及びイオウのシグナル強度からリンとイオウの濃度比を算出し、対照の試料におけるリンとイオウの濃度比と比較する。
【００３８】
対照は、細胞の増殖活性又は悪性度を解析するにあたって比較の対象となるものであればよく、例えば、正常細胞、悪性細胞、増殖活性の高い細胞、及びDNAの異常増加を示す細胞からなる群より選択される少なくとも1種とすることができる。対照の細胞は、試料が由来する対象と同じ対象に由来するものであってもよいし、異なる対象に由来するものであってもよいが、同じ種（例えばヒト）に由来するものであることが好ましい。また、対照の細胞は、試料と同じ供与源（例えば同じ臓器又は細胞集団）に由来するものであることが好ましい。
【００３９】
対照のリンのシグナル強度又はリン及びイオウのシグナル強度は、試料の測定と同時に又はほぼ同時に測定してもよいし、予め測定したものであってもよい。予め測定された対照のリンのシグナル強度又はリン及びイオウのシグナル強度は、データベースに登録されているものであってもよい。
【００４０】
例えば、対照が正常細胞を含む場合に、正常細胞のリンのシグナル強度に応じた細胞分布は、試料と同一の臓器又は細胞集団から調製した正常細胞を、同様に計測して得られた、リンのシグナル強度に応じた細胞分布である。あるいは、正常細胞のリンのシグナル強度に応じた細胞分布は、試料とは別の、同種の臓器又は細胞集団由来の正常細胞のリンのシグナル強度に応じた細胞分布である。
【００４１】
例えば、対照が正常細胞を含む場合に、正常細胞のリンとイオウの濃度比は、試料と同一の臓器又は細胞集団から調製した正常細胞を、同様に計測して得られた、リンとイオウの濃度比である。あるいは、正常細胞のリンとイオウの濃度比は、試料とは別の、同種の臓器又は細胞集団由来の正常細胞のリンとイオウの濃度比である。
【００４２】
一実施形態では、対照が正常細胞を含む場合、対照におけるリンのシグナル強度に応じた細胞分布に比較して、試料における、リンのシグナル強度が高い細胞として分布する細胞の割合を決める工程を含んでもよい。
【００４３】
一実施形態では、対照が正常細胞を含む場合、各細胞から測定されるリンのシグナル強度の測定値について、正常細胞で検出される測定値の範囲に比較して、試料で検出される測定値が高い範囲を含むかどうかを決定する工程、すなわち試料で検出されるリンのシグナル強度が通常のDNAの倍化よりも高いかどうかを決定する工程をさらに含んでもよい。
【００４４】
一実施形態では、試料としてがんが疑われる検体の細胞と、対照として同じ臓器又は細胞集団由来の正常細胞において、細胞核ごとのリンの相対定量値のヒストグラムを得る。がんが疑われる検体と、同じ臓器又は細胞集団由来の正常細胞におけるリンのシグナル強度分布を比較して、差分を求める。
【００４５】
また、試料としてがんが疑われる検体の強度分布と、対照として同じ臓器又は細胞集団由来の正常細胞の強度分布と、それらの差分を、さらに対照として、データベースに登録された、臓器又は細胞集団由来の正常細胞のリン量の強度分布と、臓器又はがん細胞集団由来のがん細胞のリン量の強度分布と、それらの差分と比較する。
【００４６】
一実施形態では、対照が正常細胞を含む場合、対照よりもリンシグナル強度の高い細胞の割合と、リンのシグナル強度の範囲を決定する工程、又は前記対照よりもリン：イオウの濃度比の高い細胞若しくは細胞の領域を決定する工程をさらに含んでもよい。
【００４７】
一実施形態では、対照が正常細胞を含む場合、対照におけるリンとイオウの濃度比に比較して、試料におけるリンとイオウの濃度比が異なる細胞の数を決定する工程を含んでもよい。
【００４８】
一実施形態では、対照が正常細胞を含む組織である場合、対照におけるリンとイオウの濃度比に比較して、試料における、リンとイオウの濃度比の異なる細胞や細胞外マトリクスの組織分布を決定する工程を含んでもよい。
【００４９】
一実施形態では、試料としてがんが疑われる検体の細胞、細胞集団、又は細胞と細胞外マトリクスなどの細胞外成分を含む連続的な組織と、対照として正常細胞、正常細胞の集団、又は正常細胞と細胞外マトリクスなどの細胞外成分を含む連続的な組織において、リンとイオウの濃度比を求める。がんが疑われる検体におけるとリンとイオウの濃度比と、同じ臓器又は細胞集団由来の正常細胞におけるリンとイオウの濃度比を比較して、差分を求める。
【００５０】
また、本開示の細胞解析方法では、試料を染色して光学顕微鏡画像を取得する工程と、試料の走査電子顕微鏡（SEM）画像を取得する工程の両方を行い、取得されたSEM画像において、測定したリンのシグナル強度、又はリンとイオウの濃度比に応じて細胞を強調表示し、また取得されたSEM画像を、光学顕微鏡画像と照合することにより、光学顕微鏡画像において、測定したリンのシグナル強度（図２の右下）、又はリンとイオウの濃度比に応じて細胞を強調表示してもよい（図３の右下）。このような表示は、細胞の増殖活性又は悪性度を視覚的に理解する手助けとなる。
【００５１】
増殖する細胞は、DNA複製と細胞分裂を繰り返している。その過程は、DNA合成前のG1期、DNAを合成するS期、細胞分裂前のG2期、細胞が分裂するM期に分けられ、G1、S、G2、Mを繰り返している。一方、分裂をしない成熟細胞はG0期である（図２の右側）。
【００５２】
G0/G1期の細胞に含まれるDNA量は種によって一定であり、分裂前のG2/M期にはDNA量は相対的に2倍になる。DNA合成中のS期の細胞には、それらの間の量のDNAが存在する。DNA合成の開始はS期の前に決まるため、分裂をしない細胞集団はG0期であり、増殖が遅い細胞集団にはG0/G1期の細胞が多く含まれ、がん組織のように増殖が速い細胞集団には、相対的にS、G2、M期の細胞が多く含まれる。このため、細胞集団において、G0/G1期のDNA量を含む細胞数と、それより多いDNA量を含む細胞数の比は、細胞の増殖活性を判別する指標になる。
【００５３】
また、がんでは、細胞分裂前のDNA合成以外に、分裂異常などにより1細胞あたりのDNA量が異常に増加した細胞が発生する。このような細胞には、正常細胞の数倍のDNAが存在することもある。このため、DNA量の異常増加もまた、悪性度やがんを判別する指標となる。
【００５４】
DNA 1塩基あたりにリン原子1個が結合しているため、細胞分裂前のDNA合成過程では、比例してDNAに由来するリン原子の数が増える。そこで、本開示の細胞解析方法では、試料に含まれる細胞又は細胞核ごとのリン量の違いを測定し、細胞又は細胞核ごとのDNA量の相対的な違いを、定量的に検出する。細胞又は細胞核におけるリン量からDNA量を導くことにより、試料に含まれる細胞の増殖活性や細胞の悪性度を解析することができる。
【００５５】
増殖活性が高く分裂を繰り返すがん細胞に比較して、正常細胞や分裂活性の低い細胞では、細胞質が発達する傾向がある。このため、細胞あたりの核と細胞質の量比は、増殖活性が高い細胞では核の比率が高く、正常細胞では細胞質の比率が高い傾向がある。このため、核と細胞質の比率はがん細胞識別の指標のひとつである。
【００５６】
DNAに多く含まれる元素であるリンと、蛋白質などに由来するイオウの量を比較した場合、核にはDNA由来のリンが含まれるため、核におけるリン：イオウの比は、細胞質におけるリン：イオウの比よりも高い。このため、細胞全体のリンとイオウの濃度比を計測した場合、細胞あたりの核の量比が高いがん細胞では、正常細胞よりも、細胞あたりのリンの比率が高くなる。リンとイオウの濃度比は、前記の核と細胞質の比を反映し、細胞の増殖活性や細胞の悪性度を解析することができる。
【００５７】
組織を形成する細胞外マトリクスには、コラーゲンなどのS-S結合や、硫酸化多糖などが多いため、比較的イオウが多く含まれる。このため、組織におけるリンとイオウの濃度比は、増殖活性の高い細胞の組織における存在量を判別する指標になる。
【００５８】
試料に含まれる細胞の増殖活性や細胞の悪性度から、試料ががん細胞を含むか否かを判定することができ、がん細胞を含む場合には、そのがん細胞の悪性度が高いか否かを判定することも可能である。そのため、本開示の細胞解析方法は、がんの診断方法及びがんの悪性度の判定方法を補助するために使用することができる。
【００５９】
本開示の細胞解析方法により、試料に含まれる細胞の増殖活性又は悪性度を迅速かつ高精度に解析することができる。また、試料に含まれる細胞ががん細胞を含むか否かを定量的に判定することができる。
【００６０】
別の態様において、本開示の細胞解析装置は、
電子線又はX線照射元素分析法によりリンのシグナル強度又はリン及びイオウのシグナル強度を測定する元素分析部と、
対照のリンのシグナル強度、又は対照のリン及びイオウのシグナル強度若しくはリンとイオウの濃度比が登録されているデータベースと、
前記元素分析部で測定されるリンのシグナル強度に応じた細胞分布と、前記データベースに登録された対照のリンのシグナル強度に応じた細胞分布とを比較する比較部、又は前記元素分析部で測定されるリン及びイオウのシグナル強度から算出されたリンとイオウの濃度比と、前記データベースに登録された対照のリンとイオウの濃度比を比較する比較部と
を備える。
【００６１】
本開示の細胞解析装置の構成例を図１に示す。元素分析部は、上述した電子線又はX線照射元素分析法を行うことができる装置であれば特に限定されるものではない。例えば、電子線又はX線照射部とX線検出部とを備えるものであり、X線検出部としてエネルギー分散型X線分光器（EDS）、波長分散型X線分光器（WDS）又はX線顕微鏡を含む装置を使用することができる。
【００６２】
比較部は、元素分析部から得られたリンのシグナル強度（場合により、計算部により計算されたリンのシグナル強度）から細胞分布を作成し、データベースに登録された対照のリンのシグナル強度の細胞分布と比較することができるデバイス又は装置とすることができる。
【００６３】
また比較部は、元素分析部で測定されるリン及びイオウのシグナル強度から算出されたからリンとイオウの濃度比（場合により計算部により算出されたリンとイオウの質量濃度）を算出し、データベースに登録された対照のリンとイオウの濃度比と比較することができるデバイス又は装置とすることができる。
【００６４】
例えば、コンピュータを適切なソフトウエアで制御又は外部制御することにより比較部として用いることができる。
【００６５】
データベースもまた当該技術分野で公知のデータベースを用いることができる。例えば、コンピュータの記憶部に格納されたデータベース、読み取り可能な記録媒体（CD-ROM等）に記録されたデータベース、インターネットを介してアクセス可能なデータベースなどを用いることができる。データベースに登録される情報は、限定されるものではないが、正常細胞、悪性細胞、増殖活性の高い細胞、及びDNAの異常増加を示す細胞からなる群より選択される少なくとも1種の細胞のリンのシグナル強度及び／又はリンとイオウのシグナル強度若しくはリンとイオウの濃度比である。例えば、ある部位の正常組織及び同部位のがん組織の細胞のリンのシグナル強度及び／又はリンとイオウのシグナル強度若しくはリンとイオウの濃度比がデータベースに登録されている。
【００６６】
本開示の細胞解析装置は、試料の画像を取得する画像取得部をさらに備えてもよい。画像取得部は、細胞の増殖活性又は悪性度の解析に有用な画像を取得するデバイス又は装置であれば任意のものを使用することができる。例えば、そのような画像取得部として、走査電子顕微鏡（SEM）、光学顕微鏡、又はその両方を使用することができる。
【００６７】
本開示の細胞解析装置はさらに、前記比較部による比較結果を出力する出力部を備えてもよいし、又はそのような出力部に接続されていてもよい。出力部は、比較部の結果を出力することができるデバイス又は装置であれば、当技術分野で公知のものを使用することができる。例えば、視覚的に結果を出力する表示部（ディスプレイ、プリンタなど）や、聴覚的に結果を出力する音声部（スピーカーなど）を用いることができる。出力部は、細胞解析装置の構成要素であってもよいし、外部から細胞解析装置に接続されてもよい。
【００６８】
本開示の細胞解析装置を使用することにより、細胞の増殖活性又は悪性度を簡便、迅速かつ高精度に解析することができ、またがんについて簡便に判定することが可能となる。したがって、本開示の細胞解析装置は、がん診断装置としても使用することができる。
【００６９】
以下、本発明の具体的な実施の形態を実施例により説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００７０】
本発明の実施例として、例えば、増殖活性の低い正常ヒト間葉系幹細胞（hMSC）と、増殖活性の高いヒトがん細胞（HeLa細胞）を計測した。用いる細胞種はこれらに限定されるものではない。【００７１】
細胞接着処理を施したカバーガラスを細胞培養シャーレの底面に沈めてから、細胞を播種することにより、細胞をカバーガラス上で接着培養した。細胞がサブコンフルエントになった時にカバーガラスを取り出し、アルコールなどに浸漬してカバーガラスに接着している細胞を固定した。観察時に細胞核の位置をわかりやすくするため、必要に応じて、ヘマトキシリンなどのリンを含まない染色液で核染色した後に、細胞を乾燥させた。【００７２】
乾燥した細胞が接着したカバーガラスをSEM（走査電子顕微鏡）の試料台に載せて、試料室に挿入し、試料室を真空にした。観察倍率1000倍で細胞を観察してSEM画像を取得した。なお倍率はこれに限定されるものではない。続いて、取得したSEM画像で細胞核の領域を選び、EDX（エネルギー分散型X線分光法）でリンの蛍光X線を測定した。細胞解析方法では、細胞全体におけるリンのシグナル強度を測定してもよいが、細胞には、DNA以外に、リン脂質や、その他のリンを含む分子が存在するため、SEM画像で核領域を選択することにより、細胞核ごとのDNA量の違いに応じたリン量の違いをより正確に検出することができる。【００７３】
カバーガラス上に接着した多数の細胞の中から任意の50細胞から100細胞の細胞核をEDXにより計測し、リンのX線シグナル強度に応じた細胞分布をヒストグラムに表示した（図４のA及びC）。なお細胞数はこれに限定されるものではない。【００７４】
分布が大きく2つに分かれ、細胞増殖活性の低い細胞（hMSC）では、リンのX線シグナル強度の小さいグループの細胞の割合が高く（図４のA）、細胞増殖活性の高い細胞（HeLa細胞）では強度が大きいグループの細胞の割合が比較的高いことが示された（図４のC）。また、がん細胞（HeLa細胞）では、G2/M期よりもリンのX線シグナル強度が大きい細胞の割合が、正常細胞（hMSC）よりも高かった。【００７５】
カバーガラスを取り除いたシャーレの底面に接着した細胞を、トリプシン処理でシャーレ底面から剥離し、回収した。細胞をDNAに結合する蛍光色素で染色し、フローサイトメトリを用いて蛍光強度を計測し、蛍光強度の分布をヒストグラムに表示した。フローサイトメトリでは5000細胞の蛍光強度を計測した。【００７６】
フローサイトメトリで計測した細胞では、分布が大きく2つに分かれ、細胞増殖活性の低い細胞（hMSC）では、蛍光強度の小さいグループの細胞の割合が高く（図４のB）、細胞増殖活性の高い細胞（HeLa細胞）では蛍光強度が大きいグループの細胞の割合が比較的高いことが示された（図４のD）。また、がん細胞（HeLa細胞）では、G2/M期よりもリンの蛍光強度が大きい細胞の割合が、正常細胞（hMSC）よりも高かった。【００７７】
前記EDXを用いたリンのX線シグナル強度計測の分布の割合と、フローサイトメトリの蛍光強度計測の分布の割合は類似していた。本発明により、リンのX線シグナル強度を計測することにより、細胞集団におけるDNA量が異なる細胞の割合を定量することが可能であり、これによって細胞集団の増殖活性とDNAの異常増加を判別することが可能となった。【００７８】
培養細胞のように単離できる細胞では、少なくともこれら2種類の方法で細胞あたりのDNA量の相違を計測して、細胞の増殖活性を判別することが可能であり、本発明による、EDXを用いたリンのX線シグナル強度計測では、より少ない細胞数でDNA量の相違を計測することが可能となった。
【実施例２】
【００７９】
がん細胞は細胞分裂により増殖を続けるが、成熟した正常細胞は分裂を停止しているか、あるいは細胞の代謝が活発な臓器では、組織幹細胞や前駆細胞が規則的に分裂をして組織の細胞が新陳代謝している。このため、検体組織で無秩序に増殖している細胞集団があるかどうかは、がん組織を判別する指標となる。【００８０】
がんが疑われる組織と隣接する正常組織の両方が存在する組織切片、あるいはがんが疑われる組織の組織切片と、それとは別に同一臓器の正常組織の組織切片を作製して、スライドガラスなどの支持基板に接着させた。 核の位置をわかりやすくするため、必要に応じてリンやイオウを含まないヘマトキシリン染色液などで核を染色した後に、乾燥させた。【００８１】
がんが疑われる組織切片に連続する組織切片を、通常の病理検査で実施されるヘマトキシリン・エオジン染色などで染色し、カバーガラスで封入した後に、光学顕微鏡観察することにより、組織の中で、無秩序な増殖やそれによる傷害で異常な形態を示す領域を明らかにした。なお、前記のヘマトキシリン染色した切片でも、光学顕微鏡やSEMを用いて組織構造を確認することができるため、連続切片のヘマトキシリン・エオジン染色は必須ではない。【００８２】
がん組織の形態は一様ではないため、事前の観察で得られた形態情報をもとに、リンの元素分析又はリンとイオウの元素分析を行う領域を選択する。血管内の血球や、炎症領域に見られるリンパ球、壊死領域などを除くことが望ましい。【００８３】
がんが疑われる組織を含む組織切片が接着したスライドガラスを、SEMの試料台に載せて、試料室に挿入し、試料室を真空にした。観察倍率600倍で切片を観察して、前記で選んだ元素分析を行う領域のSEM画像を取得した。なお倍率はこれに限定されるものではない。【００８４】
続いて、細胞核あたりのリンを検出する場合は、取得したSEM画像で細胞核の領域を選び、EDXでリンの蛍光X線を測定した。【００８５】
がんが疑われる組織に隣接する正常組織、あるいは同一臓器の正常組織の組織切片を、同様の手順でSEM観察した後に、取得したSEM画像で細胞核の領域を選び、EDXでリンの蛍光X線を測定した。【００８６】
細胞には、DNA以外に、リン脂質や、その他のリンを含む分子が存在するため、SEM画像で核領域を選択することにより、細胞核ごとのDNA量の違いに応じたリン量の違いをより正確に検出することができる。【００８７】
がんが疑われる組織と、正常組織の各々で、任意の50細胞から100細胞の細胞核を計測し、リンのX線シグナル強度に応じた細胞分布をヒストグラムに表示した。 なお細胞数はこれに限定されるものではない。【００８８】
がんが疑われる組織の細胞と、同一臓器由来の正常細胞において、細胞核ごとのリンの相対定量値のヒストグラムを得た。【００８９】
比較部において、がんが疑われる組織の細胞と、同一臓器由来の正常細胞の強度分布を比較して、差分を求めた。【００９０】
比較部において、がんが疑われる検体の強度分布と、検体に隣接する正常細胞の強度分布と、それらの差分を、データベースに登録された、検体と同種の臓器由来の正常細胞のリン量の強度分布と、検体と同種の臓器由来のがん細胞のリン量の強度分布と、それらの差分と比較することにより、対象検体ががんであるかどうかを判別した。【００９１】
測定したリン及びイオウのシグナル強度に基づいてリンとイオウの濃度比を算出する場合は、細胞内に占める核の割合が比較的低い組織Ａと、細胞内に占める核の割合が高い組織Ｂの、取得したSEM画像から、がんが疑われる組織を選び、EDXでリンとイオウの蛍光X線を測定した（図５）。【００９２】
がんが疑われる組織の任意のエリアを計測し、リンとイオウのX線シグナル強度から質量濃度を算出し、図示した（図５）。 細胞内に占める核の割合が比較的低い組織Ａではリンとイオウの質量濃度は同程度であり、間質と類似した濃度比を示した。これに対して、細胞内に占める核の割合が高い組織Ｂでは、リンの質量濃度が高いことが示された。【００９３】
組織切片の様に複数の細胞と細胞外マトリクスから形成される試料では、本発明による、EDXを用いたリンのX線シグナル強度計測でリンとイオウの濃度比を求めることにより、核と細胞質や細胞外マトリクスが組織に占める割合の相違を、従来の染色法に比較して、直接的に迅速に計測することが可能となった。
【実施例３】
【００９４】
内視鏡検査などでブラシなどを用いて組織表面から採取した細胞を、スライドガラス上に塗りつけた後、スライドガラスをアルコールに浸漬して、細胞を固定した。メイ・ギムザ染色液などを用いて細胞を染色した後に、細胞を乾燥させ、光学顕微鏡観察により細胞の形態情報を得た。【００９５】
乾燥した細胞が接着したカバーガラスをSEMの試料台に載せて、試料室に挿入し、試料室を真空にした。観察倍率1000倍で細胞を観察してSEM画像を取得した。なお倍率はこれに限定されるものではない。細胞は一様ではないため、事前の光学顕微鏡観察で得られた形態情報をもとに、リンの元素分析を行う細胞を選択し、血球など計測対象からを除くことが望ましい。【００９６】
取得したSEM画像で細胞核の領域を選び、EDXでリンの蛍光X線を測定した。任意の50細胞から100細胞の細胞核を計測し、リンのX線シグナル強度に応じた細胞分布をヒストグラムに表示した。 なお細胞数はこれに限定されるものではない。【００９７】
比較部において、前記で計測した細胞のリンのX線シグナル強度に応じた細胞分布と、データベースに登録された、検体と同種の臓器由来の正常細胞のリン量の強度分布と、検体と同種の臓器又はがん細胞集団由来のがん細胞のリン量の強度分布を比較することにより、対象検体ががん細胞であるかどうかを判別した。
【図１】
2020049642.tif 000003
【図２】
2020049642.tif 000004
【図３】
2020049642.tif 000005
【図４】
2020049642.tif 000006
【図５】
2020049642.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】令和3年1月18日(2021.1.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の細胞を含む試料について、電子線又はX線照射元素分析法によりリンのシグナル強度を測定する工程と、
測定した前記試料のリンのシグナル強度に応じた細胞分布を、対照のシグナル強度に応じた細胞分布と比較する工程と
を含むことを特徴とする細胞の増殖活性又は悪性度を解析する方法。
【請求項２】
前記複数の細胞を含む試料の走査電子顕微鏡（SEM）画像を取得する工程、及び
前記SEM画像から、前記細胞の核領域を選択する工程をさらに含み、前記核領域におけるリンのシグナル強度を測定する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
複数の細胞を含む試料の走査電子顕微鏡（SEM）画像を取得する工程と、
前記SEM画像から前記細胞の領域を選択する工程と、
前記複数の細胞を含む試料について、電子線又はX線照射元素分析法により、前記選択した細胞の領域におけるリン及びイオウのシグナル強度を測定する工程と、
測定した前記試料のリン及びイオウのシグナル強度から算出されたリンとイオウの濃度比を、対照のリンとイオウの濃度比と比較する工程と
を含むことを特徴とする細胞の増殖活性又は悪性度を解析する方法。
【請求項４】
前記試料が、支持基板に接着した組織切片又は細胞である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
前記試料が臓器又は細胞集団由来の複数の細胞を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
前記対照が、正常細胞、悪性細胞、増殖活性の高い細胞、及びDNAの異常増加を示す細胞からなる群より選択される少なくとも1種を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
前記対照が正常細胞を含む場合、前記対照よりもリンのシグナル強度の高い細胞の割合と、リンのシグナル強度の範囲を決定する工程をさらに含む、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項８】
前記対照が正常細胞を含む場合、前記対照よりもリン：イオウの濃度比の高い細胞若しくは細胞の領域を決定する工程をさらに含む、請求項3に記載の方法。
【請求項９】
前記SEM画像を取得する工程の前に、前記試料を染色して光学顕微鏡で観察する工程、及び前記試料の画像を取得する範囲を選択する工程をさらに含む、請求項2〜8のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
前記試料を染色して光学顕微鏡画像を取得する工程、
前記試料の走査電子顕微鏡（SEM）画像を取得する工程、
前記SEM画像において、前記測定したリンのシグナル強度に応じて細胞を強調表示する工程、
前記SEM画像を、前記光学顕微鏡画像と照合することにより、前記光学顕微鏡画像において、前記測定したリンのシグナル強度に応じて細胞を強調表示する工程
をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
前記試料を染色して光学顕微鏡画像を取得する工程、
前記試料の走査電子顕微鏡（SEM）画像を取得する工程、
前記SEM画像において、前記算出されたリンとイオウの濃度比に応じて細胞を強調表示する工程、
前記SEM画像を、前記光学顕微鏡画像と照合することにより、前記光学顕微鏡画像において、前記算出されたリンとイオウの濃度比に応じて細胞を強調表示する工程
をさらに含む、請求項3に記載の方法。
【請求項１２】
試料ががん細胞を含むか否かを判定する工程をさらに含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
電子線又はX線照射元素分析法によりリンのシグナル強度を測定する元素分析部と、
対照のリンのシグナル強度が登録されているデータベースと、
前記元素分析部で測定されるリンのシグナル強度に応じた細胞分布と、前記データベースに登録された対照のリンのシグナル強度に応じた細胞分布とを比較する比較部と
を備えることを特徴とする細胞の増殖活性又は悪性度の解析装置。
【請求項１４】
電子線又はX線照射元素分析法によりリン及びイオウのシグナル強度を測定する元素分析部と、
対照のリン及びイオウのシグナル強度若しくはリンとイオウの濃度比が登録されているデータベースと、
前記元素分析部で測定されるリン及びイオウのシグナル強度から算出されたリンとイオウの濃度比と、前記データベースに登録された対照のリンとイオウの濃度比を比較する比較部と、
複数の細胞を含む試料の走査電子顕微鏡（SEM）画像を取得する画像取得部と、
前記SEM画像から前記細胞の領域を選択する選択部と
を備え、前記元素分析部は、前記選択部で選択された細胞の領域におけるリン及びイオウのシグナル強度を測定することを特徴とする細胞の増殖活性又は悪性度の解析装置。
【請求項１５】
元素分析部が、エネルギー分散型X線分光器（EDS）、波長分散型X線分光器（WDS）、又はX線顕微鏡を含む、請求項13又は14に記載の装置。
【請求項１６】
試料の画像を取得する画像取得部をさらに備えることを特徴とする請求項13に記載の装置。
【請求項１７】
画像取得部が、走査電子顕微鏡（SEM）、光学顕微鏡、又はその両方を含む、請求項16に記載の装置。
【請求項１８】
前記比較部による比較結果を出力する出力部をさらに備える又は前記出力部に接続されている、請求項13又は14に記載の装置。
【請求項１９】
複数の細胞を含む試料の走査電子顕微鏡（SEM）画像を取得する画像取得部と、
前記SEM画像から前記細胞の核領域を選択する選択部と
をさらに備え、前記元素分析部は、前記選択部で選択された核領域におけるリンのシグナル強度を測定することを特徴とする請求項13に記載の装置。
【国際調査報告】
2020049642.tif 000008
2020049642.tif 000009
2020049642.tif 000010
2020049642.tif 000011