(57)【要約】  本発明の課題は、目的とする分化細胞へと効率よく分化させることができる多能性幹細胞の製造方法を提供することである。本発明によれば、体細胞に初期化因子を導入して得られる未分化細胞であって、特定の分化細胞に分化する能力が相対的に低い細胞を得る第一工程；および上記細胞を、未分化状態を維持しながら処理して、上記特定の分化細胞に分化する能力が相対的に高い細胞を得る第二工程、を含む、細胞の製造方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
体細胞に初期化因子を導入して得られる未分化細胞であって、特定の分化細胞に分化する能力が相対的に低い細胞を得る第一工程；および
前記細胞を、未分化状態を維持しながら処理して、前記特定の分化細胞に分化する能力が相対的に高い細胞を得る第二工程、
を含む、細胞の製造方法。
【請求項２】
第二工程で得られる細胞が有する、内胚葉、中胚葉および外胚葉の何れか一つ以上に分化する能力が、第一工程で得られる細胞が有する、内胚葉、中胚葉および外胚葉の何れか一つ以上に分化する能力よりも向上している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第二工程で得られる細胞が有する内胚葉および外胚葉に分化する能力が、第一工程で得られる細胞が有する内胚葉および外胚葉に分化する能力よりもそれぞれ向上している；または
第二工程で得られる細胞が有する内胚葉および中胚葉に分化する能力が、第一工程で得られる細胞が有する内胚葉および中胚葉に分化する能力よりもそれぞれ向上している；
請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第二工程で得られる細胞が、内胚葉、中胚葉および外胚葉の全てに分化することができる細胞である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記特定の分化細胞が、中胚葉細胞または外胚葉細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記特定の分化細胞が、血球細胞、心筋細胞または神経細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
第二工程で得られる細胞におけるＳＴＥＬＬＡの発現量が、第一工程で得られる細胞におけるＳＴＥＬＬＡの発現量よりも高い、請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
第二工程で得られる細胞におけるＫＬＦ１７の発現量が、第一工程で得られる細胞におけるＫＬＦ１７の発現量よりも高い、請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記第二工程が、前記細胞を、未分化状態を維持しながらヒストン脱アセチル化酵素阻害剤で処理する工程である、請求項１から８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第二工程が、前記細胞を、未分化状態を維持しながらヒストン脱アセチル化酵素阻害剤および塩基性線維芽細胞増殖因子で処理する工程である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
第二工程が、細胞を、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤、および白血病阻止因子を含む培地で培養した後に、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含まずに、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤、プロテインキナーゼＣ阻害剤、およびＷｎｔシグナル阻害剤、および白血病阻止因子を含む培地で培養する工程を含む、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が、バルプロ酸又はその塩である、請求項９から１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第二工程における培地が、アスコルビン酸を含まない、請求項１から１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記体細胞が、成人由来の体細胞である、請求項１から１３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
第二工程で得られた細胞を分化させる第三工程をさらに含む、請求項１から１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６】
プライム型多能性幹細胞を、未分化状態を維持しながらヒストン脱アセチル化酵素阻害剤で処理する工程を含む、プライム型多能性幹細胞と比べて三胚葉分化能が向上している多能性幹細胞を製造する方法。
【請求項１７】
プライム型多能性幹細胞を、未分化状態を維持しながらヒストン脱アセチル化酵素阻害剤で処理する工程を含む、プライム型多能性幹細胞と比べて特定の分化細胞への分化能が向上している多能性幹細胞を製造する方法。
【請求項１８】
特定の分化細胞が、血球細胞、心筋細胞または神経細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
未分化状態を維持しながらヒストン脱アセチル化酵素阻害剤で処理する工程が、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤、および白血病阻止因子を含む培地で培養した後に、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含まずに、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤、プロテインキナーゼＣ阻害剤、およびＷｎｔシグナル阻害剤、および白血病阻止因子を含む培地で培養する工程を含む、請求項１６から１８の何れか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が、バルプロ酸又はその塩である、請求項１６から１９の何れか一項に記載の方法。
【請求項２１】
未分化状態を維持しながらヒストン脱アセチル化酵素阻害剤で処理する工程における培地が、アスコルビン酸を含まない、請求項１６から２０の何れか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内胚葉、中胚葉および外胚葉の何れか一つ以上に分化する能力を有する細胞の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多能性幹細胞としては、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ；ｉＰＳ細胞とも言う）、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：ＥＳ細胞とも言う）などが知られている。再生医療分野においては、特にｉＰＳ細胞の実用化に向けた研究が進められている。【０００３】
ｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞には、ナイーブ型の細胞とプライム型の細胞とが存在することが知られている。ナイーブ型の細胞は、発生初期の状態に近く、プライム型の細胞はより発生が進んだ細胞である。【０００４】
非特許文献１には、ヒストン脱アセチル化阻害剤により多能性幹細胞をリセットして、ナイーブ型の細胞に転換する方法が記載されている。【０００５】
特許文献１には、細胞を多能性幹細胞にするよう誘導するのに十分な条件下で、非多能性細胞を、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ５阻害剤；ＭＥＫ阻害剤；およびＲＯＣＫ阻害剤と接触させる段階を含む、非多能性哺乳動物細胞を誘導多能性幹細胞へと誘導する方法が記載されており、細胞をヒストン脱アセチル化酵素阻害剤とさらに接触させることが記載されている。特許文献２には、細胞が多能性幹細胞になるよう誘導するのに十分な条件の下で、非多能性細胞を３’−ホスホイノシチド依存性キナーゼ−１（ＰＤＫ１）活性化剤と接触させる工程であって、それにより、非多能性哺乳動物細胞を誘導多能性幹細胞へ誘導する工程を含む、非多能性哺乳動物細胞を誘導多能性幹細胞へ誘導する方法が記載され、非多能性細胞をヒストンデアセチラーゼ阻害剤と接触させる工程をさらに含んでもよいことが記載されている。【０００６】
特許文献３には、ＮａｎｏｇおよびＫｌｆ２をプライム型多能性幹細胞に一時的に発現させ、かつＬＩＦ、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ｃＡＭＰ産生促進剤、ＴＧＦ−β阻害剤およびＰＫＣ阻害剤を含む培地で培養することを含む、ナイーブ型多能性幹細胞の製造方法が記載されている。【０００７】
特許文献４には、ヒト幹細胞をよりナイーブな状態にリセットする方法であって、（ａ）初期化されるべきヒト幹細胞を提供すること、（ｂ）（ｉ）所望により１以上の異種の初期化因子を細胞に発現または導入し、（ｉｉ）ＭＥＫ阻害剤を含み、さらに所望によりＳＴＡＴ３活性化剤、および所望により１以上のさらなる阻害剤を含むリセット培地中で細胞を培養することにより、よりナイーブな状態を誘発すること、（ｃ）ＭＥＫ阻害剤、ＰＫＣ阻害剤および所望によりＧＳＫ３インヒビター、およびＳＴＡＴ３活性化剤を含むナイーブ培地中に細胞を維持することを含む方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１６−２７８０８号公報
【特許文献２】特開２０１６−１７１７９８号公報
【特許文献３】国際公開ＷＯ２０１６／１４８２５３号
【特許文献４】国際公開ＷＯ２０１６／０２７０９９号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｇｕｏ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０１７ Ａｕｇ  １；１４４（１５）：２７４８−２７６３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らのこれまでの検討により、体細胞に初期化因子を導入することにより作製されたｉＰＳ細胞について、ｉＰＳ細胞としてのマーカーが発現している場合であっても、三胚葉全てに分化できないｉＰＳ細胞が存在することが見出されている。【００１１】
本発明は、目的とする分化細胞へと効率よく分化させることができる多能性幹細胞の製造方法を提供することを解決すべき課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、体細胞に初期化因子を導入して得られる未分化細胞であって、特定の分化細胞に分化する能力が相対的に低い細胞を得た後に、上記細胞を、未分化状態を維持しながら処理して、上記特定の分化細胞に分化する能力が相対的に高い細胞を得ることによって、目的とする分化細胞へと効率よく分化させることができる多能性幹細胞を製造することに成功した。本発明は、上記の知見に基づいて完成したものである。【００１３】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）体細胞に初期化因子を導入して得られる未分化細胞であって、特定の分化細胞に分化する能力が相対的に低い細胞を得る第一工程；および
上記細胞を、未分化状態を維持しながら処理して、上記特定の分化細胞に分化する能力が相対的に高い細胞を得る第二工程、
を含む、細胞の製造方法。
（２）第二工程で得られる細胞が有する、内胚葉、中胚葉および外胚葉の何れか一つ以上に分化する能力が、第一工程で得られる細胞が有する、内胚葉、中胚葉および外胚葉の何れか一つ以上に分化する能力よりも向上している、（１）に記載の方法。
（３）第二工程で得られる細胞が有する内胚葉および外胚葉に分化する能力が、第一工程で得られる細胞が有する内胚葉および外胚葉に分化する能力よりもそれぞれ向上している；または
第二工程で得られる細胞が有する内胚葉および中胚葉に分化する能力が、第一工程で得られる細胞が有する内胚葉および中胚葉に分化する能力よりもそれぞれ向上している；
（１）に記載の方法。
（４）第二工程で得られる細胞が、内胚葉、中胚葉および外胚葉の全てに分化することができる細胞である、（２）または（３）に記載の方法。
（５）上記特定の分化細胞が、中胚葉細胞または外胚葉細胞である、（１）に記載の方法。
（６）上記特定の分化細胞が、血球細胞、心筋細胞または神経細胞である、（１）に記載の方法。
（７）第二工程で得られる細胞におけるＳＴＥＬＬＡの発現量が、第一工程で得られる細胞におけるＳＴＥＬＬＡの発現量よりも高い、（１）から（６）の何れか一に記載の方法。
（８）第二工程で得られる細胞におけるＫＬＦ１７の発現量が、第一工程で得られる細胞におけるＫＬＦ１７の発現量よりも高い、（１）から（７）の何れか一に記載の方法。
（９）上記第二工程が、上記細胞を、未分化状態を維持しながらヒストン脱アセチル化酵素阻害剤で処理する工程である、（１）から（８）の何れか一に記載の方法。
（１０）上記第二工程が、上記細胞を、未分化状態を維持しながらヒストン脱アセチル化酵素阻害剤および塩基性線維芽細胞増殖因子で処理する工程である、（９）に記載の方法。
（１１）第二工程が、細胞を、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤、および白血病阻止因子を含む培地で培養した後に、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含まずに、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤、プロテインキナーゼＣ阻害剤、およびＷｎｔシグナル阻害剤、および白血病阻止因子を含む培地で培養する工程を含む、（９）または（１０）に記載の方法。
（１２）ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が、バルプロ酸又はその塩である、（９）から（１１）の何れか一に記載の方法。
（１３）上記第二工程における培地が、アスコルビン酸を含まない、（１）から（１２）の何れか一に記載の方法。
（１４）上記体細胞が、成人由来の体細胞である、（１）から（１３）の何れか一に記載の方法。
（１５）第二工程で得られた細胞を分化させる第三工程をさらに含む、（１）から（１４）の何れか一に記載の方法。【００１４】
（１６）プライム型多能性幹細胞を、未分化状態を維持しながらヒストン脱アセチル化酵素阻害剤で処理する工程を含む、プライム型多能性幹細胞と比べて三胚葉分化能が向上している多能性幹細胞を製造する方法。
（１７）プライム型多能性幹細胞を、未分化状態を維持しながらヒストン脱アセチル化酵素阻害剤で処理する工程を含む、プライム型多能性幹細胞と比べて特定の分化細胞への分化能が向上している多能性幹細胞を製造する方法。
（１８）特定の分化細胞が、血球細胞、心筋細胞または神経細胞である、（１７）に記載の方法。
（１９）未分化状態を維持しながらヒストン脱アセチル化酵素阻害剤で処理する工程が、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤、および白血病阻止因子を含む培地で培養した後に、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含まずに、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤、プロテインキナーゼＣ阻害剤、およびＷｎｔシグナル阻害剤、および白血病阻止因子を含む培地で培養する工程を含む、（１６）から（１８）の何れか一に記載の方法。
（２０）ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が、バルプロ酸又はその塩である、（１６）から（１９）の何れか一に記載の方法。
（２１）未分化状態を維持しながらヒストン脱アセチル化酵素阻害剤で処理する工程における培地が、アスコルビン酸を含まない、（１６）から（２０）の何れか一に記載の方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、目的とする分化細胞へと効率よく分化させることができる多能性幹細胞を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、未処理および処理を施したヒトｉＰＳ細胞株（２５３Ｇ１株）における未分化性を定義する遺伝子の発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲにて測定した結果を示す。
【図２】図２は、三胚葉系譜に分化させた細胞（２５３Ｇ１株）における各胚葉特異的遺伝子発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲにて測定した結果を示す。
【図３】図３は、三胚葉系譜に分化させた別のｉＰＳ細胞株（２０１Ｂ７株およびＡ株）における各胚葉特異的遺伝子発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲにて測定した結果を示す。
【図４】図４は、未処理および処理後のｉＰＳ細胞をそれぞれ血液細胞に分化させ、血液細胞のマーカーであるＣＤ３４とＫＤＲの発現細胞の割合をフローサイトメーターにて解析した結果を示す。
【図５】図５は、ｉＰＳ細胞の定量的ＲＴ−ＰＣＲによる三胚葉分化能の評価の結果を示す。
【図６】図６は、ｉＰＳ細胞の三胚葉分化能の評価の結果のまとめを示す。
【図７】図７は、ＭＥＫ阻害剤の濃度を変化させた場合についてフローサイトメトリーによる処理効率を評価した結果を示す。
【図８】図８は、ＭＥＫ阻害剤の濃度を変化させた場合について染色体の特定領域のコピー数を評価した結果を示す。
【図９】図９は、未処理及び処理後のｉＰＳ細胞をそれぞれ心筋細胞に誘導させ、フローサイトメトリーにて生細胞中のｃＴｎＴ陽性率を比較した結果を示す。
【図１０】図１０は、ｉＰＳ細胞株を心筋細胞へ誘導した場合のｃＴｎＴの陽性率を測定した結果を示す。
【図１１】図１１は、神経幹細胞への分化誘導で得られた細胞を蛍光顕微鏡で観察した画像を示す。
【図１２】図１２は、神経幹細胞への分化誘導で得られた細胞を蛍光顕微鏡で観察した画像の輝度を定量化した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を実施するための形態を、詳細に説明する。
本明細書における略号は以下の意味を有する。
Ｋｌｆ：Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ  ｆａｃｔｏｒ
ＬＩＦ：Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ
ＭＥＫ：ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ（ＭＡＰＫ：ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ；ＥＲＫ：  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ）
ＧＳＫ３：ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎ−ｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ−３
ＴＧＦ：Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ
ＰＫＣ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ
ＲＴ−ＰＣＲ：Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ
ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ
ＫＤＲ：ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｓｅｒｔ  ｄｏｍａｉｎ-ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ
Ｔｅｒｔ：Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ
Ｆｂｘ１５：Ｆ−Ｂｏｘ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  １５
ＥＣＡＴ：ＥＳ  ｃｅｌｌ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ
Ｄｎｍｔ３Ｌ：ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ３  Ｌｉｋｅ
Ｇｄｆ３：Ｇｒｏｗｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ−３
Ｆｔｈｌ１７：Ｆｅｒｒｉｔｉｎ  ｈｅａｖｙ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ−ｌｉｋｅ  １７
Ｓａｌｌ４：Ｓａｌ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４
Ｒｅｘ１：Ｒｅｄｕｃｅｄ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  １
ＵＴＦ１：Ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  １
Ｓｔａｔ３：Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ３
Ｇｒｂ２：Ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｏｕｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２
Ｐｒｄｍ１４：ＰＲ／ＳＥＴ  ｄｏｍａｉｎ  ｆａｍｉｌｙ  １４
Ｎｒ５ａ１：ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  ５，ｇｒｏｕｐ  Ａ，ｍｅｍｂｅｒ  １
Ｎｒ５ａ２：ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  ５，ｇｒｏｕｐ  Ａ，ｍｅｍｂｅｒ  ２
ｂＦＧＦ：ｂａｓｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ
ＰＯＵ５Ｆ１：ＰＯＵ  ｄｏｍａｉｎ，  ｃｌａｓｓ  ５，  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  １
ＤＮＭＴ３Ｂ：ＤＮＡ（ｃｙｔｏｓｉｎｅ−５−）−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ３  ｂｅｔａ
ＧＡＰＤＨ：Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ
ＦＯＸＡ２：ｆｏｒｋｈｅａｄ  ｂｏｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ２
Ｔ：Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ
ＰＤＧＦＲＡ：ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ
ＰＡＸ６：ｐａｉｒｅｄ  ｂｏｘ  ６
ＭＡＰ：ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ
ＢＭＰ：Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ
ＶＥＧＦ：ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ
ＩＬ：ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ
ＩＧＦ：Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ
ＳＣＦ：Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ
ＲＯＣＫ：Ｒｈｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｋｉｎａｓｅ／Ｒｈｏ結合キナーゼ
ＡＬＫ５：ＴＧＦ−ｂｅｔａ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ
ＣＤ３４：Ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ３４
Ｓｏｘ：ＳＲＹ−ｂｏｘｅｓ
ＥＲａｓ：ＥＳ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｒａｓ
Ｔｃｌ１：Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ／ｌｙｍｐｈｏｍａ  １Ａ
【００１８】
多能性幹細胞には、ナイーブ型多能性幹細胞およびプライム型多能性幹細胞という２つの異なる状態の細胞が知られている。ナイーブ型多能性幹細胞およびプライム型多能性幹細胞は、分子特徴および細胞特徴により区別することができる。
ナイーブ型多能性幹細胞は、典型的には、高レベルの多能性因子Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ２およびＫｌｆ４を発現し、Ｌｉｆ／Ｓｔａｔ３または２ｉ（ＥＲＫｉ／ＧＳＫｉ）のいずれかに応答して自己再生し、Ｆｇｆ／Ｅｒｋに応答して分化し、ＸａＸａのＸ染色体状態を呈するという特徴を有する。プライム型多能性幹細胞は、典型的には、高レベルの多能性因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびＮａｎｏｇを発現し、Ｌｉｆ／Ｓｔａｔ３に応答せず、Ｆｇｆ／Ｅｒｋに応答して自己再生し、ＸａＸｉのＸ染色体活性化状態を呈するという特徴を有する（Ｎｉｃｈｏｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ４（６）：４８７−４９２）。なお、Ｘａは活性型Ｘ染色体を示し、Ｘｉは不活性型Ｘ染色体を示す。
【００１９】
本発明の第一の態様による細胞の製造方法は、
体細胞に初期化因子を導入して得られる未分化細胞であって、特定の分化細胞に分化する能力が相対的に低い細胞を得る第一工程；および
上記細胞を、未分化状態を維持しながら処理して、上記特定の分化細胞に分化する能力が相対的に高い細胞を得る第二工程、
を含む。同じ培養条件で同一の操作をした細胞は、個体として別であっても同一の性質を持つ細胞とみなす。
【００２０】
本発明の第二の態様による細胞の製造方法は、プライム型多能性幹細胞を、未分化状態を維持しながらヒストン脱アセチル化酵素阻害剤で処理する工程を含む、プライム型多能性幹細胞と比べて三胚葉分化能または特定の分化細胞への分化能が向上している多能性幹細胞を製造する方法である。
【００２１】
特許文献１および２には、非多能性細胞から多能性細胞に誘導する際に、細胞をヒストン脱アセチル化酵素阻害剤と接触させることが記載されている。特許文献３には、プライム型多能性幹細胞を所定の条件下において培養することによりナイーブ型多能性幹細胞を製造することが記載されている。しかしながら、体細胞に初期化因子を導入することにより作製されたｉＰＳ細胞について、ｉＰＳ細胞としてのマーカーが発現している場合であっても、三胚葉全てに分化できないｉＰＳ細胞が存在することについての知見はない。特許文献４には、ヒト幹細胞をよりナイーブな状態にリセットする方法が記載され、得られた幹細胞が神経細胞、内胚葉および平滑筋細胞に分化することが記載されているが、ナイーブな状態にリセットすることにより、分化能が向上することは記載されていない。また、特許文献４における培地はアスコルビン酸を含む培地である。
【００２２】
本発明においては、体細胞に初期化因子を導入して得られる未分化細胞の中には、特定の分化細胞に分化する能力が相対的に低い細胞が存在することを同定した。その上で、上記細胞を、未分化状態を維持しながら処理することによって、上記特定の分化細胞に分化する能力が相対的に高い細胞を得ることに成功したものである。
【００２３】
［第一工程について］
本発明における第一工程は、体細胞に初期化因子を導入して得られる未分化細胞であって、特定の分化細胞に分化する能力が相対的に低い細胞を得る工程である。
体細胞としては、特に限定されず、任意の体細胞を利用することができる。例えば、胎児期の体細胞のほか、成人由来の体細胞（即ち、成熟した体細胞）を用いてもよい。体細胞としては、例えば、（１）  神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（２）  組織前駆細胞、（３）線維芽細胞（皮膚細胞等）、上皮細胞、肝細胞、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞）、内皮細胞、筋肉細胞、毛細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞（膵外分泌細胞等）、脳細胞、肺細胞、腎細胞、皮膚細胞等の分化した細胞が挙げられる。
【００２４】
体細胞の由来となる生体としては、特に限定されないが、例えば、ヒト、非ヒト動物（例えば、サル、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス）が挙げられる。好ましくは、ヒトである。
【００２５】
体細胞に導入される初期化因子としては特に限定されないが、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ２、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ５、Ｌｉｎ２８、Ｔｅｒｔ、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５−１、ＥＣＡＴ１５−２、Ｔｃｌ１、β−カテニン、ＥＣＡＴ１、Ｅｓｇ１、Ｄｎｍｔ３Ｌ、ＥＣＡＴ８、Ｇｄｆ３、Ｓｏｘ１５、Ｆｔｈｌ１７、Ｓａｌｌ４、Ｒｅｘ１、ＵＴＦ１、Ｓｔｅｌｌａ、Ｓｔａｔ３、Ｇｒｂ２、Ｐｒｄｍ１４、Ｎｒ５ａ１、Ｎｒ５ａ２、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎが挙げられる。ここで、これらの遺伝子群の中から２以上の遺伝子を選択して任意に組み合わせて導入することができる。なかでも、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃを少なくとも有する組み合わせ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびＬ−Ｍｙｃを少なくとも有する組み合わせ、またはＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８を少なくとも有する組み合わせが好ましい。
【００２６】
また、導入する遺伝子の種は、導入先の細胞の種と同一であることが好ましい。例えば、ヒト由来の細胞へ導入される遺伝子はヒト遺伝子であることが好ましい。例えば、ヒト由来の体細胞へ導入される遺伝子としては、ヒトＯｃｔ３／４、ヒトＳｏｘ２、ヒトＫｌｆ４およびヒトｃ−Ｍｙｃを少なくとも有する組み合わせ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびL−Ｍｙｃを少なくとも有する組み合わせ、またはヒトＯｃｔ３／４、ヒトＳｏｘ２、ヒトＮａｎｏｇおよびヒトＬｉｎ２８を少なくとも有する組み合わせが好ましい。
【００２７】
初期化因子の遺伝子は、遺伝子発現ベクターを用いて体細胞に導入することができる。遺伝子発現ベクターとしては、特に限定されないが、例えば、ウイルスベクター、プラスミドベクター、人工染色体ベクター、トランスポゾンベクターが挙げられる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、センダイウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターが挙げられる。
【００２８】
体細胞に初期化因子を導入して得られる未分化細胞であって、特定の分化細胞に分化する能力が相対的に低い細胞は、体細胞に初期化因子を導入することによって自ら作製してもよいが、研究機関や企業から提供または販売されている細胞を入手してもよい。即ち、本発明における第一の工程は、人工多能性幹細胞バンクから人工多能性幹細胞を得る工程でもよい。
【００２９】
例えば、京都大学ｉＰＳ細胞研究所から提供されている２０１Ｂ７、２５３Ｇ１、２５３Ｇ４、１２０１Ｃ１、１２０５Ｄ１、１２１０Ｂ２、１２３１Ａ３、１３８３Ｄ２、１３８３Ｄ６、ｉＰＳ−ＴＩＧ１２０−３ｆ７、ｉＰＳ−ＴＩＧ１２０−４ｆ１、ｉＰＳ−ＴＩＧ１１４−４ｆ１、ＣｉＲＡ０８６Ａｉ−ｍ１、ＣｉＲＡ１８８Ａｉ−Ｍ１、またはｉＲＡ１８８Ａｉ−Ｗ１を入手して、使用することができる。
【００３０】
また、ＮＩＨ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）やＣａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂａｎｋ  ｆｏｒ  ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ等が作成しているｉＰＳ細胞バンクから入手することもできる。
【００３１】
「体細胞に初期化因子を導入して得られる未分化細胞」における未分化細胞とは、最終分化していない細胞を意味し、好ましくは内胚葉、中胚葉および外胚葉の何れか一つ以上に分化する能力を有する細胞である。「特定の分化細胞に分化する能力が相対的に低い細胞」における「特定の分化細胞」とは内胚葉、中胚葉および外胚葉の何れか、又は、内胚葉、中胚葉および外胚葉の何れかに由来する、任意の特定の分化した細胞、例えば血球細胞、心筋細胞、または神経細胞である。「特定の分化細胞に分化する能力が相対的に低い」とは、本発明における後記する第二工程において得られる、「特定の分化細胞に分化する能力が相対的に高い細胞」と比較して、特定の分化細胞に分化する能力が低いことを意味する。
【００３２】
第一工程で得られる「体細胞に初期化因子を導入して得られる未分化細胞であって、特定の分化細胞に分化する能力が相対的に低い細胞」は、フィーダー細胞をコートしたプレートまたはマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（登録商標）などの足場をコートしたプレート上で、適当な培地にて維持培養することができる。フィーダー細胞としては、特に限定されないが、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ細胞）、マウス胎児繊維芽細胞（ＳＴＯ細胞）が挙げられる。
【００３３】
維持培養の際の培地としては、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＳｔｅｍＦｌｅｘ（登録商標）などの市販の培地を使用することができる。あるいはまた、例えば、基礎培地として、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ）、ＤＭＥＭとＦ１２の混合培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＝１：１）、ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭ  Ｄ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などが挙げられ、代替血清（ＫＳＲ；ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社））、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、Ｌ−グルタミン、２−メルカプトエタノール、抗生物質（例えば、ストレプトマイシン、ペニシリン、ピューロマイシン、マイトマイシン）、ｂＦＧＦ等の添加成分を任意に組み合わせて、上記いずれかの基礎培地に添加して調製したものが挙げられる。
維持培養の際の培地は、アスコルビン酸を含まないことは好ましい。
【００３４】
維持培養の培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２、１０％Ｏ２条件下などが好ましいが、特に限定されない。
【００３５】
［第二工程について］
本発明における第二工程は、第一工程で得られた細胞を、未分化状態を維持しながら処理して、特定の分化細胞に分化する能力が相対的に高い細胞を得る工程である。以下、第二工程と称する場合には、本発明の第二の態様における「未分化状態を維持しながらヒストン脱アセチル化酵素阻害剤で処理する工程」を包含するものとする。
【００３６】
「特定の分化細胞に分化する能力が相対的に高い細胞」における「特定の分化細胞」とは、内胚葉、中胚葉および外胚葉の何れかに属する、任意の特定の分化した細胞を意味する。「特定の分化細胞に分化する能力が相対的に高い」とは、本発明における第一工程において得られる、「特定の分化細胞に分化する能力が相対的に低い細胞」と比較して、特定の分化細胞に分化する能力が高いことを意味する。
【００３７】
第二工程における「未分化状態を維持しながら処理する」とは、第一工程で得られた細胞を、未分化状態を維持できる培地において、特定の分化細胞に分化する能力が相対的に高い細胞が得られる条件下において培養することを意味する。
第二工程は、第一工程で得られた細胞を、未分化状態を維持しながらヒストン脱アセチル化酵素阻害剤で処理する工程であることが好ましい。即ち、第二工程は、第一工程で得られた細胞を、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含む培地で培養することを含む工程であることが好ましい。
第二工程は、第一工程で得られた細胞を、未分化状態を維持しながらヒストン脱アセチル化酵素阻害剤および塩基性線維芽細胞増殖因子で処理する工程であることがより好ましい。
第二工程（または、未分化状態を維持しながらヒストン脱アセチル化酵素阻害剤で処理する工程）における培地は、アスコルビン酸を含まないことが好ましい。
【００３８】
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤としては、バルプロ酸又はその塩（バルプロ酸ナトリウムなど）、酪酸またはその塩（酪酸ナトリウムなど）、トリコスタチンＡ、およびアピシジンなどを使用することができるが、特に限定されない。
【００３９】
培地におけるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の濃度は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の種類などに応じて適宜設定することができる。例えば、バルプロ酸の場合には、好ましくは０．１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１０ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは０．２ｍｍｏｌ／Ｌ〜５ｍｍｏｌ／Ｌであり、さらに好ましくは０．５ｍｍｏｌ／Ｌ〜２ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００４０】
第一工程で得られた細胞を、未分化状態を維持しながらヒストン脱アセチル化酵素阻害剤で処理する工程において使用する培地を調製するために使用する基礎培地としては、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ）、ＤＭＥＭとＦ１２の混合培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＝１：１）、ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭ  Ｄ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などが挙げられる。第二工程で使用する培地としては、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、Ｂ２７（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、Ｎ２（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、１−チオグリセロール、およびＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）またはＬ−Ｇｌｕｔａｍｉｎ  （Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）などの添加成分を任意に組み合わせて（好ましは上記の添加成分の全てを）、上記の基礎培地に添加し、さらに、ＬＩＦ、およびＭＥＫ阻害剤を添加した培地であることが好ましい。
【００４１】
ＭＥＫ阻害剤としては、特に限定されないが、例えば、ＰＤ０３２５９０１（Ｎ−［（２Ｒ）−２，３−ジヒドロキシプロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−ベンズアミド；ＣＡＳ登録番号：３９１２１０−１０−９）、Ｕ０１２６（１，４−ジアミノ−２，３−ジシアノ−１，４−ビス［２−アミノフェニルチオ］ブタジエン；ＣＡＳ登録番号：１０９５１１−５８−２）、ＰＤ９８０５９（２−（２−アミノ−３−メトキシフェニル）−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン；ＣＡＳ登録番号：１６７８６９−２１−８）、ＰＤ１８４３５２（２−(２−クロロ−４−ヨードフェニルアミノ)−Ｎ−シクロプロピルメトキシ−３，４−ジフルオロベンズアミド；ＣＡＳ登録番号：２１２６３１−７９−３が挙げられる。なかでも、ＰＤ０３２５９０１が好ましい。
【００４２】
第二工程は、第一工程で得られた細胞を、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含む培地で培養した後に、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含まない培地で培養することを含んでいてもよい。ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含まない培地としては、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、Ｂ２７（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、Ｎ２（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、１−チオグリセロール、およびＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）またはＬ−Ｇｌｕｔａｍｉｎ  （Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）などの添加成分を任意に組み合わせて（好ましくは上記の添加成分の全てを）、上記の基礎培地に添加し、さらに、ＬＩＦ、ＭＥＫ阻害剤（具体例は上記の通り）、ＰＫＣ阻害剤、ＧＳＫ３−β阻害剤、およびＷｎｔシグナル阻害剤を添加した培地を使用することができる。
【００４３】
好ましくは、第二工程（または、未分化状態を維持しながらヒストン脱アセチル化酵素阻害剤で処理する工程）は、細胞を、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤、および白血病阻止因子を含む培地で培養した後に、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含まずに、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤、プロテインキナーゼＣ阻害剤、およびＷｎｔシグナル阻害剤、および白血病阻止因子を含む培地で培養する工程を含む。
【００４４】
ＰＫＣ阻害剤としては、特に限定されないが、例えば、Ｇｏ６９８３（３−［１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−５−メトキシ−１Ｈ−インドール−３−イル］−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；ＣＡＳ登録番号：１３３０５３−１９−７）、ＧＦ１０９２０３Ｘ（３−（１−（３−ジメチルアミノ）プロピル）−１Ｈ−インドール−３−イル）−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；ＣＡＳ登録番号：１３３０５２−９０−１）が挙げられる。なかでも、Ｇｏ６９８３が好ましい。
【００４５】
ＧＳＫ３−β阻害剤としては、特に限定されないが、ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＡＳ登録番号：２５２９２７−０６−９）が好ましい。
Ｗｎｔシグナル阻害剤としては、特に限定されないが、ＸＡＶ９３９（ｔａｎｋｙｒａｓｅ阻害剤）（ＣＡＳ登録番号：２８４０２８−８９−３）、ＩＷＰ−１、ＩＷＰ−２、ＩＷＰ−３、ＩＷＰ−４、ＩＷＲ−１、５３ＡＨ（以上ｐｏｒｃｕｐｉｎｅ阻害剤）、ＫＹ０２１１１などの低分子化合物およびそれらの誘導体や、ＩＧＦＢＰ４、ＤＫＫ１、Ｗｎｔ−Ｃ５９などのタンパク質が挙げられる。なかでも、ＸＡＶ９３９が好ましい。
【００４６】
ＬＩＦの培地中の濃度は特に限定されないが、例えば、０．１ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬであり、好ましくは０．２ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬである。
【００４７】
ＭＥＫ阻害剤の培地中の濃度は特に限定されないが、例えば、５０ｎｍｏｌ／Ｌ〜１００μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは１００ｎｍｏｌ／Ｌ〜１０μｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは２００ｎｍｏｌ／Ｌ〜５μｍｏｌ／Ｌであり、さらに好ましくは５００ｎｍｏｌ／Ｌ〜２μｍｏｌ／Ｌであり、特に好ましくは８００ｎｍｏｌ／Ｌ〜１．２μｍｏｌ／Ｌである。
【００４８】
ＰＫＣ阻害剤の培地中の濃度は特に限定されないが、例えば、５０ｎｍｏｌ／Ｌ〜１００μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは１００ｎｍｏｌ／Ｌ〜１０μｍｏｌ／Ｌである。
ＧＳＫ３−β阻害剤の培地中の濃度は特に限定されないが、好ましくは０ｎｍｏｎ／Ｌ〜０．３ｎｍｏｌ／Ｌである。
Ｗｎｔシグナル阻害剤の培地中の濃度は特に限定されないが、例えば、５０ｎｍｏｌ／Ｌ〜１００μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは１００ｎｍｏｌ／Ｌ〜１０μｍｏｌ／Ｌである。
【００４９】
第二工程における培養条件は、当業者には自明であり、一例としては、３７℃、５％ＣＯ２条件下を挙げることができる、低酸素（５％Ｏ２）の条件下で培養することが好ましい。
【００５０】
第二工程における培養期間は特に限定されないが、例えば、１日〜１４日、好ましくは２日〜１４日培養することができる。
【００５１】
ナイーブ化効率をみる指標として、特異的な細胞表面マーカーであるＣＤ７５（ST6GAL1）が一般的に知られている。従って、第二工程の処理が完了したことは、細胞表面マーカーＣＤ７５の陽性率で評価することができる。第二工程の処理を行った細胞を培養容器から回収し、蛍光標識抗ＣＤ７５抗体（例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７  Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＣＤ７５抗体）で染色し、フローサイトメトリーによりＣＤ７５の陽性率を解析することができる。ＣＤ７５の陽性率は、例えば、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、または７０％以上であればよい。
【００５２】
また、第二工程の処理後に得られる細胞は、ＤＮＡ変異の発生率が低いことが好ましい。ＤＮＡ変異の発生率が低いことは、例えば、２０番染色体長腕領域のコピー数を、常法（例えば、リアルタイムＰＣＲなど）により測定することにより評価することができる。第二工程の処理後に得られる細胞における２０番染色体長腕領域のコピー数は、好ましくは１．５〜４．５であり、より好ましくは１．５〜３．５であり、さらに好ましくは１．５〜２．５である。
【００５３】
第一工程で得られる細胞、および第二工程で得られる細胞の未分化性は、特に限定されないが、未分化性を定義する遺伝子の発現を測定することにより評価することができる。未分化性を定義する遺伝子の発現の測定方法は特に限定されないが、例えば、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定を行うことができる。ＲＴ−ＰＣＲは、測定対象となるｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅する方法である。定量的ＲＴ−ＰＣＲとしては、例えば、クエンチャー蛍光色素とレポーター蛍光色素が結合されたプライマーを用いてＰＣＲを行って各サイクル毎に増幅産物量を定量し、検出される蛍光強度が急激に増大するサイクル数から、試料中の鋳型ＤＮＡ量を測定する方法（リアルタイムＰＣＲ）等を挙げることができる。定量的ＲＴ−ＰＣＲの手法は本技術分野において周知であり、市販のキットを使用して実施することもできる。定量的ＲＴ−ＰＣＲによれば、遺伝子の発現量またはコピー数を、対照となるハウスキーピング遺伝子（例えば、ＧＡＰＤＨ遺伝子）の発現量またはコピー数に対する相対値として測定することができる。なお、遺伝子のｍＲＮＡの測定は、通常のＲＴ−ＰＣＲなどによりｍＲＮＡの増幅を行うことにより得た増幅産物をゲル電気泳動にかけ、染色後、バンド強度を測定することによっても行うことができる。あるいは、ＤＮＡチップを用いて遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを検出又は定量することもできる。
【００５４】
未分化性を定義する遺伝子としては、特に限定されないが、ＮＡＮＯＧ、ＰＯＵ５Ｆ１、ＬＩＮ２８、ＳＯＸ２、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＳＴＥＬＬＡおよびＫＬＦ１７などを挙げることができる。
【００５５】
好ましくは、第二工程で得られる細胞におけるＳＴＥＬＬＡの発現量は、第一工程で得られる細胞におけるＳＴＥＬＬＡの発現量よりも高い。
好ましくは、第二工程で得られる細胞におけるＫＬＦ１７の発現量は、第一工程で得られる細胞におけるＫＬＦ１７の発現量よりも高い。
好ましくは、第二工程で得られる細胞におけるＳＯＸ２の発現量は、第一工程で得られる細胞におけるＳＯＸ２の発現量よりも高い。
【００５６】
第二工程で得られる細胞におけるＳＴＥＬＬＡの発現コピー数は、ＧＡＰＤＨの発現コピー数に対する比率として、好ましくは０．００１以上であり、より好ましくは０．００２以上であり、さらに好ましくは０．００３以上であり、特に好ましくは０．００４以上である。
【００５７】
第二工程で得られる細胞におけるＫＬＦ１７の発現コピー数は、ＧＡＰＤＨの発現コピー数に対する比率として、好ましくは５．０×１０−５以上であり、より好ましくは１．０×１０−４以上であり、さらに好ましくは１．１×１０−４以上であり、特に好ましくは１．２×１０−４以上である。
【００５８】
好ましくは、第二工程で得られる細胞におけるＳＯＸ２の発現コピー数は、ＧＡＰＤＨの発現コピー数に対する比率として、好ましくは５．０×１０−５以上であり、より好ましくは６．０×１０−５以上であり、さらに好ましくは７．０×１０−５以上であり、特に好ましくは８．０×１０−５以上である。
【００５９】
第二工程で得られる細胞が有する、内胚葉、中胚葉および外胚葉の何れか一つ以上に分化する能力は、第一工程で得られる細胞が有する、内胚葉、中胚葉および外胚葉の何れか一つ以上に分化する能力よりも向上している。
より好ましくは、第二工程で得られる細胞が有する内胚葉および外胚葉に分化する能力は、第一工程で得られる細胞が有する内胚葉および外胚葉に分化する能力よりもそれぞれ向上しているか、または第二工程で得られる細胞が有する内胚葉および中胚葉に分化する能力は、第一工程で得られる細胞が有する内胚葉および中胚葉に分化する能力よりもそれぞれ向上している。
【００６０】
さらに好ましくは、第二工程で得られる細胞は、内胚葉、中胚葉および外胚葉の全てに分化することができる細胞である。
【００６１】
本発明における特定の分化細胞は、好ましくは、中胚葉細胞または外胚葉細胞であり、より好ましくは、血球細胞、心筋細胞または神経細胞である。
また、本発明における三胚葉分化能の向上とは、内胚葉、中胚葉および外胚葉の何れか一つ以上への分化能が向上していればよいが、好ましくは、中胚葉および外胚葉のうちの一以上への分化能の向上であり、より好ましくは、中胚葉および外胚葉への分化能の向上である。
【００６２】
本発明において、細胞が有する内胚葉に分化する能力、細胞が有する中胚葉に分化する能力、および細胞が有する外胚葉に分化する能力は、細胞を内胚葉、中胚葉または外胚葉に分化させ、上記の三胚葉系譜に分化させた細胞における各胚葉特異的遺伝子の発現を測定することにより評価することができる。
【００６３】
各胚葉特異的遺伝子の発現の測定方法は特に限定されないが、例えば、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により測定を行うことができる。
内胚葉特異的遺伝子としては、特に限定されないが、ＳＯＸ１７およびＦＯＸＡ２などを挙げることができる。
中胚葉特異的遺伝子としては、特に限定されないが、ＴおよびＰＤＧＦＲＡなどを挙げることができる。
外胚葉特異的遺伝子としては、特に限定されないが、ＰＡＸ６およびＭＡＰ２などを挙げることができる。
【００６４】
第二工程で得られる細胞が有する、内胚葉に分化する能力が、第一工程で得られる細胞が有する内胚葉に分化する能力よりも向上している場合としては、第一工程で得られた細胞を内胚葉に分化させた細胞におけるＳＯＸ１７の発現量に対する、第二工程で得られた細胞を内胚葉に分化させた細胞におけるＳＯＸ１７の相対発現量が、好ましくは２以上であり、より好ましくは４以上、６以上、８以上、１０以上、１２以上、または１５以上である場合を挙げることができる。
【００６５】
第二工程で得られる細胞が有する、内胚葉に分化する能力が、第一工程で得られる細胞が有する内胚葉に分化する能力よりも向上している場合としては、第一工程で得られた細胞を内胚葉に分化させた細胞におけるＦＯＸＡ２の発現量に対する、第二工程で得られた細胞を内胚葉に分化させた細胞におけるＦＯＸＡ２の相対発現量が、好ましくは３以上であり、より好ましくは５以上、１０以上、１５以上、１８以上、２０以上、または２２以上である場合を挙げることができる。
【００６６】
第二工程で得られる細胞が有する、中胚葉に分化する能力が、第一工程で得られる細胞が有する中胚葉に分化する能力よりも向上している場合としては、第一工程で得られた細胞を中胚葉に分化させた細胞におけるＴの発現量に対する、第二工程で得られた細胞を内胚葉に分化させた細胞におけるＴの相対発現量が、好ましくは２以上であり、より好ましくは３以上、５以上、８以上、９以上、または１０以上である場合を挙げることができる。
【００６７】
第二工程で得られる細胞が有する、中胚葉に分化する能力が、第一工程で得られる細胞が有する中胚葉に分化する能力よりも向上している場合としては、第一工程で得られた細胞を中胚葉に分化させた細胞におけるＰＤＧＦＲＡの発現量に対する、第二工程で得られた細胞を内胚葉に分化させた細胞におけるＰＤＧＦＲＡの相対発現量が、好ましくは１．１以上であり、より好ましくは１．２以上、１．３以上または１．４以上である場合を挙げることができる。
【００６８】
第二工程で得られる細胞が有する、外胚葉に分化する能力が、第一工程で得られる細胞が有する外胚葉に分化する能力よりも向上している場合としては、第一工程で得られた細胞を外胚葉に分化させた細胞におけるＰＡＸ６の発現量に対する、第二工程で得られた細胞を外胚葉に分化させた細胞におけるＰＡＸ６の相対発現量が、好ましくは１．１以上であり、より好ましくは１．２以上、１．３以上、１．４以上または１．５以上である場合を挙げることができる。
【００６９】
第二工程で得られる細胞が有する、外胚葉に分化する能力が、第一工程で得られる細胞が有する外胚葉に分化する能力よりも向上している場合としては、第一工程で得られた細胞を外胚葉に分化させた細胞におけるＭＡＰ２の発現量に対する、第二工程で得られた細胞を外胚葉に分化させた細胞におけるＭＡＰ２の相対発現量が、好ましくは１．１以上であり、より好ましくは１．２以上、または１．３以上である場合を挙げることができる。
【００７０】
［第三工程について］
本発明による細胞の製造方法は、第二工程で得られた細胞を分化させる第三工程をさらに含んでいてもよい。但し、本発明による細胞の製造方法は、上記した第三工程を含んでいなくてもよい。
【００７１】
本発明において、第二工程で得られた細胞を分化誘導することにより得られる細胞の種類は、特に限定されない。所望により、内胚葉系細胞、中胚葉系細胞、または外胚葉系細胞に分化誘導することができる。
【００７２】
第二工程で得られた細胞を分化誘導する方法は、特に限定されない。例えば、市販のＳｔｅｍＤｉｆｆ(登録商標)Ｔｒｉｌｉｎｅａｇｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、内胚葉、中胚葉および外胚葉のそれぞれに分化誘導することができる。
【００７３】
また、血液細胞への分化誘導は、後記する実施例２に記載の条件で細胞を培養することにより行うことができる。具体的には、１日目は、ＢＭＰ４およびＹ２７６３４（ＲＯＣＫ阻害剤）を含む培地で培養し、２日目にｂＦＧＦおよびＢＭＰ４を添加し、３日目に細胞がスフェロイド状のコロニーを形成していることを確認して、ＳＢ４３１５４２（ＴＧＦ-β受容体阻害剤）、ＣＨＩＲ９９０２１（ＧＳＫ３阻害剤）、ｂＦＧＦおよびＢＭＰ４を含む培地で培養し（３日目および４日目）、５日目〜６日目は、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦを含む培地で培養し、７日目〜１０日目はＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＩＬ−６、ＩＧＦ−１、ＩＬ−１１およびＳＣＦを含む培地で培養することにより、血液細胞に分化誘導することができる。なお、血液細胞への分化誘導は、血液細胞のマーカーであるＣＤ３４とＫＤＲの発現をフローサイトメーターにて解析することにより確認することができる。
【００７４】
心筋細胞への分化誘導は、例えば、後記する実施例５に記載の条件で細胞を培養することにより行うことができる。具体的には、細胞を、ＰＳＣ  Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて手順書に従い、心筋細胞に分化誘導することができる。心筋細胞への分化導は、心筋細胞マーカーであるＣａｒｄｉａｃ  Ｔｒｏｐｏｎｉｎ  Ｔ（ｃＴｎＴ）の発現をフローサイトメトリーで測定することにより確認することができる。後記する実施例５の手順に準じて、分化誘導後１４日目の細胞について、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７  Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉ−Ｃａｒｄｉａｃ  Ｔｒｏｐｏｎｉｎ  Ｔ抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）にて細胞内を染色し、フローサイトメトリーＡｔｔｕｎｅ  ＮｘＴ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にてｃＴｎＴの陽性率を解析すればよい。上記方法で解析したｃＴｎＴの陽性率は、好ましくは５％以上であり、より好ましくは１０％以上であり、さらに好ましくは２０％以上であり、さらに一層好ましくは３０％以上であり、特に好ましくは４０％以上であり、最も好ましくは４５％以上である。本発明の処理（即ち、細胞を、未分化状態を維持しながら処理して、特定の分化細胞に分化する能力が相対的に高い細胞を得る第二工程）を行うことにより、上記の処理を行わない場合と比べて、ｃＴｎＴの陽性率が１．１〜１００倍上昇することが好ましく、１．２〜１００倍上昇することがさらに好ましく、２〜５０倍上昇することが最も好ましい。
【００７５】
神経幹細胞への分化誘導は、例えば、後記する実施例６に記載の条件で細胞を培養することにより行うことができる。具体的には、細胞をＰＳＣ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｃｎｔｉｆｉｃ）を用いて手順書に従い、神経幹細胞に分化誘導することができる。神経幹細胞への分化誘導は、例えば、神経幹細胞のＭａｒｋｅｒであるＳＯＸ１蛋白質を免疫染色することにより確認することができる。ＳＯＸ1蛋白質を免疫染色して輝度を定量化した場合、本発明の処理（即ち、細胞を、未分化状態を維持しながら処理して、特定の分化細胞に分化する能力が相対的に高い細胞を得る第二工程）を行うことにより、上記の処理を行わない場合と比べて、輝度が１．１〜１０倍上昇することが好ましく、１．５〜５倍上昇することがさらに好ましい。
【００７６】
第二工程で得られた細胞は、内胚葉系細胞分化条件にて培養することにより、内胚葉系細胞へ分化することができる。内胚葉系細胞としては、特に限定されないが、例えば、消化器系細胞（肝細胞、胆管細胞、膵内分泌細胞、腺房細胞、導管細胞、吸収細胞、杯細胞、パネート細胞、腸内分泌細胞等）、肺、甲状腺等の組織の細胞が挙げられる。
【００７７】
第二工程で得られた細胞は、上記以外の中胚葉系細胞分化条件にて培養することにより、中胚葉系細胞へ分化することができる。中胚葉系細胞としては、特に限定されないが、血球・リンパ球系細胞（造血幹細胞、赤血球、血小板、マクロファージ、顆粒球、ヘルパーＴ細胞、キラーＴ細胞、Ｂリンパ球等）、脈管系細胞（血管内皮細胞等）、心筋細胞（例えば心房筋細胞、心室筋細胞等）、骨芽細胞、骨細胞，軟骨細胞，腱細胞，脂肪細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞等が挙げられる。
【００７８】
第二工程で得られた細胞は、上記以外の外胚葉系細胞分化条件にて培養することにより、外胚葉系細胞へ分化することができる。外胚葉系細胞としては、特に限定されないが、神経系細胞、感覚器細胞（水晶体、網膜、内耳など）、皮膚表皮細胞、毛包などが挙げられる。
【００７９】
本発明において、第二工程で得られた細胞を用いて分化誘導した細胞は、各種疾患の治療用医薬品候補化合物のスクリーニングに用いることができる。例えば、単独でまたは他の薬剤と組み合わせて、医薬品候補化合物を、分化誘導した細胞に添加することによって、細胞の形態または機能的な変化、各種因子の増減、遺伝子発現プロファイリング等を検出することにより、評価を行うことができる。ここで、細胞は、治療対象となる疾患と同様の表現型を有する細胞が好ましく、より好ましくは、疾患に罹患した患者に由来する体細胞を用いて本発明の方法により製造した細胞から分化誘導した細胞である。
【００８０】
本発明において、第二工程で得られた細胞を用いて分化誘導した細胞から組織を作製して、再生医療の分野で使用することができる。作製した組織の患者への移植方法としては、当業者であれば自明である。
【００８１】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００８２】
実施例１
ヒトｉＰＳ細胞の三胚葉分化能を改善および向上させるために以下の実験を行った。
［方法］
＜細胞＞
ヒトｉＰＳ細胞株について、２５３Ｇ１株および２０１Ｂ７株はｉＰＳポータル株式会社より購入した（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ．２００７，Ｎａｋａｇａｗａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｍｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８）。Ａ株はＣｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ＣＤＩ）より分譲を受けた。【００８３】
＜細胞培養および化合物処理＞
ヒトｉＰＳ細胞は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（マトリゲル）（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）をコートした６ウェルプレート上でＳｔｅｍＦｌｅｘ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）培地にて３７℃、５％ＣＯ２、１０％Ｏ２条件下で維持培養した。ここで得られた細胞は、プライム型多能性幹細胞であり、特定の分化細胞に分化する能力が相対的に低い細胞である。【００８４】
０日目：分化能改善効果を検討するために、培養中のヒトｉＰＳ細胞をＴｒｐＬＥＴＭ  Ｓｅｌｅｃｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３７℃、５分処理により剥離し、シングルセル化した。マウス胎仔由来線維芽細胞（ＭＥＦ、Ｌｏｎｚａ）を０．５ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）で播種済またはマトリゲルコート済のウェルに、ヒトｉＰＳ細胞を、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＳｔｅｍＦｌｅｘ（登録商標）にＹ−２７６８４（１０μｍｏｌ／Ｌ、Ｗａｋｏ）を添加した培地で１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ播種した。以降９日目まで３７℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２条件下で培養した。【００８５】
１日目：表１の培地１に培地を交換した。
２〜３日目：新たな培地１に半量交換した。
４〜８日目：表１の培地２に培地を交換し、８日目まで１日おきに同培地に交換した。
９日目：ＴｒｙｐＬＥＴＭ  Ｓｅｌｅｃｔで３７℃で５分処理して細胞を剥離し、培地２にＹ−２７６８４（１０μｍｏｌ／Ｌ、Ｗａｋｏ）を添加した培地でＭＥＦを播種済またはマトリゲル（登録商標）コートしたプレートに継代した。以降、培地２により細胞を維持培養した。【００８６】
【表１】
2019151386.tif 000002
【００８７】
＜三胚葉分化＞
三胚葉への分化能を検討するために、上記の処理を施した細胞をマトリゲルコート済プレート上でＳｔｅｍＦｌｅｘ（登録商標）にて必要細胞数に増殖するまで４〜７日間培養した。三胚葉分化には、未処理あるいは上記の処理を施したヒトｉＰＳ細胞をＳｔｅｍＤｉｆｆ（登録商標）Ｔｒｉｌｉｎｅａｇｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて手順書に従い分化させた。【００８８】
１日目：ＴｒｙｐＬＥＴＭＳｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｃｎｔｉｆｉｃ）を用いて３７℃で５分処理して細胞を剥離した。マトリゲルコートした２４ウェルプレートに表２の培地を０．５ｍＬ／ｗｅｌｌ入れ、ｉＰＳ細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２、１０％Ｏ２条件下で培養した。【００８９】
２日目：新たなＳｔｅｍＤｉｆｆ（登録商標）Ｔｒｉｌｉｎｅａｇｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｋｉｔの各分化用培地に培地交換した。以降、内胚葉および中胚葉は５日目まで、外胚葉は７日目まで同操作を毎日繰り返した。【００９０】
【表２】
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【００９１】
＜定量的ＲＴ−ＰＣＲによる未分化性および三胚葉分化能の評価＞
ｉＰＳ細胞および三胚葉系譜に分化させた細胞からＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡＴＭ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて逆転写反応を行いｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡに、表３に示す未分化性の指標となる遺伝子または各胚葉に特異的な遺伝子のＴａｑＭａｎ（登録商標）ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を添加し、Ｖｉｉａ７ＴＭ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によりＰＣＲ反応を行った。表３のＰｒｏｂｅ  ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔに示すものは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社のＴａｑｍａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｓｓａｙにてある遺伝子のＰＣＲを行うためのＰｒｏｂｅ  ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔのコード名である。【００９２】
【表３】
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【００９３】
［結果］
未処理および上記処理を施したヒトｉＰＳ細胞株（２５３Ｇ１株）における未分化性を定義する遺伝子の発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲにて測定した結果を図１に示す。
図１に示す通り、ＮＡＮＯＧ、ＰＯＵ５Ｆ１、ＬＩＮ２８、ＤＮＭＴ３Ｂの発現は未処理と処理後の細胞とで有意な変化はなかった。一方、図１から分かる通り、ＳＯＸ２およびナイーブＥＳ／ｉＰＳ細胞に特異的に発現するＳＴＥＬＬＡおよびＫＬＦ１７の発現は処理後ｉＰＳ細胞において有意に上昇していた。【００９４】
三胚葉系譜に分化させた細胞（２５３Ｇ１株）における各胚葉特異的遺伝子発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲにて測定した結果を図２に示す。
図２に示す通り、未処理の細胞と比較して処理を施した細胞では内胚葉特異的遺伝子（ＳＯＸ１７およびＦＯＸＡ２）および外胚葉特異的遺伝子（ＰＡＸ６およびＭＡＰ２）の発現が顕著に上昇した。【００９５】
三胚葉系譜に分化させた別のｉＰＳ細胞株（２０１Ｂ７株およびＡ株）における各胚葉特異的遺伝子発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲにて測定した結果を図３に示す。
図３に示す通り、別のｉＰＳ細胞株（２０１Ｂ７およびＡ）において、未処理の細胞と比較して処理を施した細胞では、内胚葉特異的遺伝子（ＳＯＸ１７およびＦＯＸＡ２）および中胚葉特異的遺伝子（ＴおよびＰＤＧＦＲＡ）の発現が有意に上昇した。【００９６】
上記の結果から、ｉＰＳ細胞に上記処理を施すことにより三胚葉分化能が改善したことが示唆された。今回、評価検討を行ったｉＰＳ細胞株は、従来の培養法では一部分化能が低下していたが、上記処理を施すことで低下した分化能を改善させることが明らかになった。【００９７】
実施例２
実施例１で行った処理が中胚葉系譜の１種である血液細胞への分化能に及ぼす影響を検証した。
［方法］
＜細胞＞
使用したｉＰＳ細胞Ｂ株はＣＤＩより分譲を受けた。【００９８】
＜細胞培養および化合物処理＞
実施例１と同様に行った。【００９９】
＜血液細胞への分化＞
１日目：ＴｒｙｐＬＥＴＭＳｅｌｅｃｔを用いて３７℃で５分処理して細胞を剥離した。表４のＤａｙ１培地に懸濁し、スフェロイド形成用のＥＺＳＰＨＥＲＥ（登録商標）（ＡＧＣ）６ウェルプレートの１ウェルへｉＰＳ細胞を２ｘ１０６ｃｅｌｌｓ播種した。以降細胞は、３７℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２条件下で培養した。【０１００】
２日目：ｂＦＧＦ（５ｎｇ／ｍＬ）とＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍＬ）を添加した。
３日目：細胞がスフェロイド状のコロニーを形成していることを確認し、Ｄａｙ３培地に培地交換した。【０１０１】
５日目：Ｄａｙ５培地に培地交換した。
７日目〜：Ｄａｙ７培地に交換し、以降８〜１０日目まで１日おきにＤａｙ７培地に交換した。【０１０２】
【表４】
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【０１０３】
＜フローサイトメトリーによる血液細胞の検出＞
スフェロイド状の細胞を回収し、ＴｒｙｐＬＥＴＭＳｅｌｅｃｔを用いて３７℃、５分の処理で細胞をシングルセル化した。細胞をＰｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）−Ｃｙ７ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ３４（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）（Ｃｙは登録商標）およびＰＥａｎｔｉ−ｈｕｍａｎＣＤ３０９（ＫＤＲ）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）にて染色し、フローサイトメーター（Ａｔｔｕｎｅ（登録商標）Ｎｘｔ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＦＡＣＳＡｒｉａ（登録商標）ＩＩＩ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）にて解析した。【０１０４】
［結果］
未処理および処理後のｉＰＳ細胞Ｂ株をそれぞれ血液細胞に分化させ、血液細胞のマーカーであるＣＤ３４とＫＤＲの発現細胞の割合をフローサイトメーターにて解析した結果を図４に示す。図４に示す通り、未処理と比較して処理済のｉＰＳ細胞から分化させた方が、ＣＤ３４およびＫＤＲ陽性細胞の割合が約１７．７倍増加した。【０１０５】
実施例３
三胚葉分化能改善処理におけるＶａｌｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ（ＶＰＡ）およびｂＦＧＦの必要性を検証するために、以下の実験を行った。
［方法］
＜細胞＞
使用したヒトｉＰＳ細胞２５３Ｇ１株はｉＰＳポータル株式会社から購入した。【０１０６】
＜細胞培養および化合物処理＞
ヒトｉＰＳ細胞はマトリゲルをコートした６ウェルプレート上でＳｔｅｍＦｌｅｘ（登録商標）培地にて３７℃、５％ＣＯ２、１０％Ｏ２条件下で維持した。
０日目：分化能改善効果を検討するために、培養中のヒトｉＰＳ細胞をＴｌｙｐＬＥＴＭＳｅｌｅｃｔで３７℃で５分処理することにより剥離し、シングルセル化した。マトリゲル（登録商標）コート済の６ウェルプレート中１ウェルにヒトｉＰＳ細胞をＳｔｅｍＦｌｅｘ（登録商標）にＹ−２７６８４（１０μｍｏｌ／Ｌ、Ｗａｋｏ）を添加した培地で１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ播種した。以降９日目まで３７℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２条件下で培養した。【０１０７】
１日目：表５の培地１に培地を交換した。
２〜３日目：新たな培地１に半量交換した。
４〜８日目：表５の培地２に培地を交換し、８日目まで１日おきに同培地に交換した。
９日目：全条件の細胞をＳｔｅｍＦｌｅｘ（登録商標）に培地交換し、約４日間培養した。【０１０８】
【表５】
2019151386.tif 000006
【０１０９】
＜三胚葉分化＞
実施例１と同様に行った。【０１１０】
＜定量的ＲＴ−ＰＣＲによる三胚葉分化能の評価＞
実施例１と同様に行った。【０１１１】
［結果］
定量的ＲＴ−ＰＣＲによる三胚葉分化能の評価の結果を図５に示す。
２５３Ｇ１株の内胚葉分化について、条件（１）Ｖａｌｐｒｏｉｃ ａｃｉｄ（ＶＰＡ）＋阻害剤（ＰＤ０３２５９０１、Ｇｏ６９８３およびＸＡＶ９３９）処理により内胚葉特異的遺伝子（ＳＯＸ１７およびＦＯＸＡ２）の発現が有意に上昇した。これらの遺伝子発現の上昇は、条件（１）にｂＦＧＦを添加した場合（条件（２））およびＶＰＡを除去した場合（条件（３））では認められなかったことから、内胚葉分化の向上にはＶＰＡの添加およびｂＦＧＦの除去が必要であることが示唆された。【０１１２】
次に、中胚葉分化について、条件（１）ＶＰＡ＋阻害剤および条件（２）ＶＰＡ＋阻害剤＋ｂＦＧＦの処理により中胚葉特異的遺伝子（ＴおよびＰＤＧＦＲＡ）の発現が顕著に上昇した。一方、条件（３）のＶＰＡを除去した場合には遺伝子発現は低下したことから、中胚葉分化の向上にはＶＰＡの添加が必要であることが示唆された。【０１１３】
外胚葉分化については、条件（１）ＶＰＡ＋阻害剤処理では外胚葉特異的遺伝子（ＰＡＸ６およびＭＡＰ２）の発現上昇は認められなかった一方、条件（２）ＶＰＡ＋阻害剤＋ｂＦＧＦおよび（３）阻害剤のみで顕著な発現上昇が認められた。従って、ＶＰＡ処理したｉＰＳ細胞を外胚葉に分化させるには、ｂＦＧＦの添加が必要であることが示唆された。【０１１４】
図５の結果のまとめを図６に示す。【０１１５】
上記の結果から、ヒトｉＰＳ細胞を、ＶＰＡ処理かつｂＦＧＦを除去することにより内胚葉分化能が向上し、ＶＰＡおよびｂＦＧＦで処理すると外胚葉分化能が向上し、中胚葉分化能はどちらの処理によっても向上することが示された。【０１１６】
実施例４
ヒトｉＰＳ細胞におけるＭＥＫ阻害剤ＰＤ０３２５９０１の濃度の違いが処理効果に及ぼす影響を検証した。
［方法］
＜細胞＞
ヒトｉＰＳ細胞株について、２５３Ｇ１株、２０１Ｂ７株は京都大学ｉＰＳ研究所（ＣｉＲＡ）より提供された（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌ．  ２００７，Ｎａｋａｇａｗａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８）。Ｃ株とＤ株はＣｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  （ＣＤＩ）より提供された。【０１１７】
＜細胞培養および化合物処理＞
実施例１と同様であるが、ＰＤ０３２５９０１について０．３〜１．０μｍｏｌ／Ｌの濃度条件にて処理し９日目以降約２週間継代培養を行った。【０１１８】
＜フローサイトメトリーによる処理効率の評価法＞
実施例１の処理が完了したことを細胞表面マーカーＣＤ７５の陽性率で評価した。培養したヒトｉＰＳ細胞をＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔにて剥離し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７  Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＣＤ７５抗体で染色した。フローサイトメトリーＡｔｔｕｎｅ  ＮｘＴでＣＤ７５の陽性率を解析した。【０１１９】
＜染色体の特定領域のコピー数評価＞
ｉＰＳ細胞に添加するＰＤ０３２５９０１の濃度の違いがＤＮＡ変異発生率に及ぼす影響を確認するためにヒト多能性幹細胞でＤＮＡ変異が起こりやすい領域のコピー数をリアルタイムＰＣＲ法にて評価した。ｉＰＳ細胞からＰｕｒｅＬｉｎｋ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡをｈＰＳＣ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、ＶｉｉＡ７（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にてリアルタイムＰＣＲを行い染色体領域のコピー数を算出した。【０１２０】
［結果］
フローサイトメトリーによる処理効率の評価の結果を図７に示す。ＰＤ０３２５９０１の濃度を０．３〜１．０μｍｏｌ／Ｌで３株のヒトｉＰＳ細胞を処理した結果、３株ともＰＤ０３２５９０１の濃度依存的に処理が完了したことの指標であるＣＤ７５の陽性率が上昇した（図７）。０．３〜０．５μｍｏｌ／Ｌの範囲ではどの細胞株においてもＣＤ７５が陽性にならなかったことから、ＰＤ０３２５９０１の濃度は０．６〜１．０μｍｏｌ／Ｌが望ましいことが示された。【０１２１】
染色体の特定領域のコピー数評価の結果を図８に示す。２０番染色体長腕領域のコピー数をリアルタイムＰＣＲにて算出した結果、ＰＤ０３２５９０１の濃度依存的にコピー数が減少し正常コピー数１．５〜２．５に近づいた（図８）。以上の結果から、ＤＮＡ変異を最小限に抑えるためにはＰＤ０３２５９０１を０．８〜１．２μｍｏｌ／Ｌで添加することが望ましいことが示された。【０１２２】
実施例５
実施例１で行った処理がヒトｉＰＳ細胞の心筋細胞への分化能に及ぼす影響を検証した。
［方法］
＜細胞＞
ヒトｉＰＳ細胞株について、２５３Ｇ１株は京都大学ｉＰＳ研究所（ＣｉＲＡ）より提供された（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ．２００７，Ｎａｋａｇａｗａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ  Ｍｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８）。Ｄ，Ｅ，Ｇ，Ｈ，Ｉ株はＣｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ＣＤＩ）より提供された。【０１２３】
＜細胞培養および化合物処理＞
ヒトｉＰＳ細胞に実施例１と同様の処理を行い、培地２にて約２週間継代培養を行った。その後に処理済の細胞をマトリゲルコートしたプレート上に継代し、ＳｔｅｍＦｌｅｘまたはｍＴｅＳＲ１培地で約２週間継代培養を行った。【０１２４】
＜心筋細胞への分化＞
未処理または上記処理を行ったヒトｉＰＳ細胞をＰＳＣ  Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて手順書に従い分化させた。【０１２５】
＜評価法＞
心筋細胞への誘導効率は心筋細胞マーカーであるＣａｒｄｉａｃ  Ｔｒｏｐｏｎｉｎ  Ｔ（ｃＴｎＴ）の発現をフローサイトメトリーにて評価した。分化誘導後１４日目の細胞をＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔにて剥離し、Ｇｈｏｓｔ  Ｄｙｅ  Ｖｉｏｌｅｔ  ５１０（ＴＯＮＢＯ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）にて死細胞を染色した。洗浄後、ＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒとＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）にて細胞を固定・透過した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７  Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉ−Ｃａｒｄｉａｃ  Ｔｒｏｐｏｎｉｎ  Ｔ抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）にて細胞内を染色し、フローサイトメトリーＡｔｔｕｎｅ  ＮｘＴ  （ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にてｃＴｎＴの陽性率を解析した。【０１２６】
［結果］
未処理及び処理後のｉＰＳ細胞をそれぞれ心筋細胞に誘導させ、フローサイトメトリーにて生細胞中のｃＴｎＴ陽性率を比較した結果を図９に示す。未処理細胞では３８．２％の陽性率が処理細胞では４９．４％であり、１．２９倍上昇した（図９）。また、その他５  ｉＰＳ細胞株においても、同条件下で心筋細胞へ誘導した場合のｃＴｎＴの陽性率を測定した結果を図１０に示す。５株でｃＴｎＴの陽性率が上昇した（図１０）。【０１２７】
実施例６
本発明の方法による神経幹細胞への分化改善効果を検証した。
［方法］
＜細胞＞
Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ＣＤＩ）より分譲を受けた５株（Ｊ株，Ｋ株，Ｌ株，Ｍ株，Ｎ株）を実施例１の方法により処理して、細胞を入手した。【０１２８】
＜神経幹細胞誘導＞
神経幹細胞への分化能を検討するために、上記の処理を施した細胞をＧｅｌｔｒｅｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｃｎｔｉｆｉｃ）コート済プレート上でｍＴｅＳＲ（登録商標）にて必要細胞数に増殖するまで１〜２日間培養した。神経幹細胞分化には、未処理あるいは上記の処理を施したヒトｉＰＳ細胞をＰＳＣ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｃｎｔｉｆｉｃ）を用いて手順書に従い分化させた。【０１２９】
＜評価＞
誘導七日目にＴｒｙｐＬＥＴＭＳｅｌｅｃｔまたはＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｃｎｔｉｆｉｃ）を用いて３７℃で５分処理して細胞を剥離した。Ｇｅｌｔｒｅｘした８Ｗｅｌｌチャンバープレートに３×１０５細胞／ｗｅｌｌを播種し、３７℃、５％ＣＯ２、１０％Ｏ２条件下で培養した。２４時間後、Ｈｕｍａｎ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｃｎｔｉｆｉｃ）で神経幹細胞のＭａｒｋｅｒであるＳＯＸ１蛋白質を免疫染色した。観察は蛍光顕微鏡（キーエンス）を用いた。【０１３０】
＜画像定量化＞
蛍光顕微鏡画像からランダムに２０個細胞の輝度をＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）で定量化した。平均化したものをグラフで示す。【０１３１】
［結果］
蛍光顕微鏡観察の結果を図１１に示し、画像の輝度を定量化した結果を図１２に示す。５細胞中５細胞にて処理前後において、ＳＯＸ１の発現が増強・均一化された。５株において有意に改善することが示された。処理後において、輝度は平均して３倍増強した（図１１および１２）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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