(57)【要約】【課題】  ペクトバクテリウム属細菌を、単一反応系であっても、その菌種を識別しつつ検出できる方法を提供する。【解決手段】  下記（ｉ）または（ｉｉ）の塩基配列の全部または一部を含む、ペクトバクテリウム属細菌を検出するための核酸プローブ；（ｉ）ペクトバクテリウム属細菌のセルラーゼＢのアミノ末端から１〜４０番目のアミノ酸配列に相当する塩基配列、（ｉｉ）（ｉ）と相補的な塩基配列。本発明によれば、ペクトバクテリウム属細菌を菌種レベルで迅速・簡便に検出することができ、もって当該細菌に起因する植物病害の発生予防や被害抑制に寄与することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ｉ）または（ｉｉ）の塩基配列の全部または一部を含む、ペクトバクテリウム属細菌（Pectobacterium)を検出するための核酸プローブ；
（ｉ）ペクトバクテリウム属細菌のセルラーゼＢのアミノ末端から１〜４０番目のアミノ酸配列に相当する塩基配列、
（ｉｉ）（ｉ）と相補的な塩基配列。
【請求項２】
前記ペクトバクテリウム属細菌のセルラーゼＢのアミノ末端から１〜４０番目のアミノ酸配列が、配列番号１に示す配列である、請求項１に記載の核酸プローブ。
【請求項３】
前記ペクトバクテリウム属細菌が、ペクトバクテリウム ワサビエ（Pectobacterium wasabie (Pw))、ペクトバクテリウム カロトボラム  亜種  カロトボラム（Pectobacterium carotovorum subspecies carotovorum (Pcc))、ペクトバクテリウム アトロセプティカ（Pectobacterium atroseptica (Pa)）およびペクトバクテリウム カロトボラム  亜種  ブラジリエンス（Pectobacterium carotovorum subspecies brasiliense (Pcb))からなる群から選択される１以上である、請求項１または請求項２に記載の核酸プローブ。
【請求項４】
前記ペクトバクテリウム属細菌が、ジャガイモの黒あし病または軟腐病の病原細菌である、請求項１〜３のいずれかに記載の核酸プローブ。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の核酸プローブを検出する工程を有する、ペクトバクテリウム属細菌の検出方法。
【請求項６】
さらに、前記核酸プローブをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅させる工程を有する、請求項５に記載の検出方法。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれかに記載の核酸プローブを含む、ペクトバクテリウム属細菌検出用キット。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれかに記載の核酸プローブを固定した、ペクトバクテリウム属細菌検出用担体。
【請求項９】
ペクトバクテリウム属細菌（Pectobacterium）のセルラーゼＢのアミノ末端から１〜４０番目のアミノ酸配列に相当する塩基配列の全部または一部を含む、ペクトバクテリウム属細菌を検出するためのＰＣＲプライマー。
【請求項１０】
前記ペクトバクテリウム属細菌のセルラーゼＢのアミノ末端から１〜４０番目のアミノ酸配列が、配列番号１に示す配列である、請求項９に記載のＰＣＲプライマー。
【請求項１１】
前記ペクトバクテリウム属細菌が、ペクトバクテリウム ワサビエ（Pectobacterium wasabie (Pw))、ペクトバクテリウム カロトボラム  亜種  カロトボラム（Pectobacterium carotovorum subspecies carotovorum (Pcc))、ペクトバクテリウム アトロセプティカ（Pectobacterium atroseptica (Pa)）およびペクトバクテリウム カロトボラム  亜種  ブラジリエンス（Pectobacterium carotovorum subspecies brasiliense (Pcb))からなる群から選択される１以上である、請求項９または請求項１０に記載のＰＣＲプライマー。
【請求項１２】
前記ペクトバクテリウム属細菌が、ジャガイモの黒あし病または軟腐病の病原微生物である、請求項９〜１１のいずれかに記載のＰＣＲプライマー。
【請求項１３】
下記の第１のＰＣＲプライマーと、前記第１のＰＣＲプライマーと対で使用される下記の第２のＰＣＲプライマーとを含むＰＣＲプライマーセット；
第１のプライマー：請求項９〜１２のいずれかに記載のＰＣＲプライマー、
第２のプライマー：ペクトバクテリウム属細菌のセルラーゼＢのアミノ末端から４１番目以降のアミノ酸配列に相当する塩基配列と相補的な塩基配列の一部を含む、ＰＣＲプライマー。
【請求項１４】
前記ペクトバクテリウム属細菌のセルラーゼＢのアミノ末端から４１番目以降のアミノ酸配列が、配列番号２に示す配列である、請求項１３に記載のＰＣＲプライマーセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物病原細菌の検出および識別方法に関し、特に、ペクトバクテリウム属細菌（Pectobacterium）を、その菌種を識別しつつ検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペクトバクテリウム属細菌は、植物に病害を引き起こす細菌として知られている。例えば、ペクトバクテリウム ワサビエ（Pectobacterium wasabie)（以下「Ｐｗ」と略記する場合がある。）やペクトバクテリウム アトロセプティカ（Pectobacterium atroseptica）（以下「Ｐａ」と略記する場合がある。）、ペクトバクテリウム カロトボラム  亜種  ブラジリエンス（Pectobacterium carotovorum subspecies brasiliense)（以下「Ｐｃｂ」と略記する場合がある。）は、ジャガイモの黒あし病を引き起こす。黒あし病を発病したジャガイモは、根茎の腐敗や地上部の萎凋などの症状を呈する。また、ペクトバクテリウム カロトボラム  亜種  カロトボラム（Pectobacterium carotovorum subspecies carotovorum (Pcc))（以下「Ｐｃｃ」と略記する場合がある。）には、上述のジャガイモ黒あし病の他、ダイコン、ハクサイ、キャベツ、カリフラワー、レタス、ショウガ、セロリ、パセリ、ネギ、タマネギ、ニンジン、ジャガイモ、トマト、ピーマン、チンゲンサイ、コマツナ、ニラ、カブ、ニンニク等の多数の農作物において軟腐病を引き起こすものも含まれている。軟腐病を発病した農作物では、地上部や地下部の新鮮な柔組織(果実、花、葉、茎、根など)が侵され、軟化腐敗して悪臭を放つようになる。【０００３】
係る病害の発生を予防ないし最小限に抑えるためには、ペクトバクテリウム属細菌を迅速に検出し、その結果に基づいた効果的な防除、発生原因の究明、発生予防等の対策をとる必要がある。従来、ペクトバクテリウム属細菌の検出方法としては、増菌ＰＣＲ法が用いられている。これは、土壌や植物組織等の試料に含まれる微生物を、まず培養して増やし、そこから抽出したＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことにより、当該微生物を検出する方法である（非特許文献１、２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】R. Czajkowski et al., Annals of Applied Biology 166 (2015), pp.18-38
【非特許文献２】青野ら、北日本病虫研報、第６７巻、第８５−８９頁、２０１６年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、非特許文献１や非特許文献２に記載されるような従来法では、検出対象菌種ごとに別個にＰＣＲを行う必要があり、迅速性や簡便性に欠けるという課題があった。その理由としては、後述する実施例７で示すように、従来法のＰＣＲでは増幅対象とする遺伝子が菌種ごとに異なるため、単一反応系でＰＣＲを行った場合は特異的な増幅が著しく減少してしまい、判定に足る検出感度を達成できないことが挙げられる。本発明は係る課題を解決するために成されたものであって、ペクトバクテリウム属細菌を、単一反応系であっても、その菌種を識別しつつ検出できる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、鋭意研究の結果、ペクトバクテリウム属細菌のセルラーゼＢのアミノ末端から１〜４０番目が、菌種に特有の配列であることを見出した。以下、本発明において、ペクトバクテリウム属細菌のセルラーゼＢのアミノ末端から１〜４０番目のアミノ酸配列を「ＰｅｃセルＢ非保存領域」といい、同４１番目以降のアミノ酸配列を「ＰｅｃセルＢ保存領域」という場合がある。【０００７】
そして、ＰｅｃセルＢ非保存領域に相当する塩基配列の全部または一部を検出することにより、単一反応系であっても、ペクトバクテリウム属細菌を、その菌種を識別しつつ検出できること、および、Ｐｃｃをも識別しつつ検出できることを見出した。そこで、この知見に基づいて、下記の各発明を完成した。【０００８】
（１）本発明に係る核酸プローブは、ペクトバクテリウム属細菌を検出するための核酸プローブであって、下記（ｉ）または（ｉｉ）の塩基配列の全部または一部を含む；（ｉ）ＰｅｃセルＢ非保存領域に相当する塩基配列、（ｉｉ）（ｉ）と相補的な塩基配列。【０００９】
（２）本発明に係る核酸プローブにおいて、ＰｅｃセルＢ非保存領域は、配列番号１に示すものであってもよい。【００１０】
（３）本発明に係る核酸プローブにおいて、ペクトバクテリウム属細菌は、Ｐｗ、Ｐｃｃ、ＰａおよびＰｃｂからなる群から選択される１以上であってもよい。【００１１】
（４）本発明に係る核酸プローブにおいて、ペクトバクテリウム属細菌は、ジャガイモの黒あし病または軟腐病の病原細菌であってもよい。【００１２】
（５）本発明に係るペクトバクテリウム属細菌の検出方法は、本発明に係る核酸プローブを検出する工程を有する。【００１３】
（６）本発明に係るペクトバクテリウム属細菌の検出方法は、さらに、本発明に係る核酸プローブをＰＣＲによって増幅させる工程を有するものであってもよい。【００１４】
（７）本発明に係るペクトバクテリウム属細菌検出用キットは、本発明に係る核酸プローブを含む。【００１５】
（８）本発明に係るペクトバクテリウム属細菌検出用担体は、本発明に係る核酸プローブを固定したものである。【００１６】
（９）本発明に係るＰＣＲプライマーは、ペクトバクテリウム属細菌を検出するためのＰＣＲプライマーであって、ＰｅｃセルＢ非保存領域に相当する塩基配列の全部または一部を含む。【００１７】
（１０）本発明に係るＰＣＲプライマーにおいて、ＰｅｃセルＢ非保存領域は、配列番号１に示すものであってもよい。【００１８】
（１１）本発明に係るＰＣＲプライマーにおいて、ペクトバクテリウム属細菌は、Ｐｗ、Ｐｃｃ、ＰａおよびＰｃｂからなる群から選択される１以上であってもよい。【００１９】
（１２）本発明に係るＰＣＲプライマーにおいて、ペクトバクテリウム属細菌は、ジャガイモの黒あし病または軟腐病の病原細菌であってもよい。【００２０】
（１３）本発明に係るＰＣＲプライマーセットは、下記の第１のＰＣＲプライマーと、前記第１のＰＣＲプライマーと対で使用される下記の第２のＰＣＲプライマーとを含む；第１のプライマー：本発明に係るＰＣＲプライマー、第２のプライマー：ＰｅｃセルＢ保存領域に相当する塩基配列と相補的な塩基配列の一部を含む、ＰＣＲプライマー。【００２１】
（１４）本発明に係るＰＣＲプライマーセットにおいて、ＰｅｃセルＢ保存領域は、配列番号２に示すものであってもよい。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、ペクトバクテリウム属細菌を、単一の反応系であっても、その菌種を識別しつつ検出することができる。よって、本発明によれば、ペクトバクテリウム属細菌を菌種レベルで迅速・簡便に検出することができ、もって当該細菌に起因する植物病害の発生予防や被害抑制に寄与することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ペクトバクテリウム属細菌のセルラーゼＢのアミノ酸配列マルチプルアラインメントを示す図である。図中、囲まれた部分がＰｅｃセルＢ非保存領域である。また、アミノ酸配列中の「．」の表記は最上段のアミノ酸と同じアミノ酸であることを示す。
【図２】ペクトバクテリウム属細菌のセルラーゼＢ遺伝子（ｃｅｌＢ）の５’末端から１〜１２０ｍｅｒにおいて、フォワードプライマーの設計領域（下線部）を示す図である。
【図３】ディケヤ属細菌およびペクトバクテリウム属細菌の各種菌株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、ディケヤ属細菌のペクチン酸リアーゼ遺伝子（ｐｅｌＡＤＥ）またはペクトバクテリウム属細菌のセルラーゼＢ遺伝子（ｃｅｌＢ）を増幅対象遺伝子として行ったＰＣＲの産物のアガロースゲル電気泳動図である。
【図４】左側が、４菌種検出用メンブレンにおける、各ＤＮＡのスポット位置を示す写真である。右側が、６菌種検出用メンブレンにおける、各ＤＮＡのスポット位置を示す写真である。
【図５】上側が、ディケヤ属細菌およびペクトバクテリウム属細菌の各菌種または菌株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、７種類のプライマーを混合して単一の反応系で行ったＰＣＲの産物を、４菌種検出用メンブレンで検出した結果を示す写真である。下側が、当該ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動図である。
【図６】上側が、ディケヤ属細菌およびペクトバクテリウム属細菌の各菌種または菌株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、８種類のプライマーを混合して単一の反応系で行ったＰＣＲの産物を、６菌種検出用メンブレンで検出した結果を示す写真である。下側が、当該ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動図である。
【図７】従来型４菌種検出用メンブレンにおける、各ＤＮＡのスポット位置を示す写真である。
【図８】Ｐｗ  Ｅｃｃ−２株の接種により、種イモが腐敗する症状を呈したジャガイモの苗における、切片の採取位置を示す写真である。
【図９】上側が、ジャガイモ罹病組織から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、従来用いられている８種類のプライマーを混合して単一の反応系で行ったＰＣＲの産物を、従来型４菌種検出用メンブレンで検出した結果を示す写真である。下側が、当該ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動図である。
【図１０】上側が、ジャガイモ罹病組織から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、７種類のプライマーを混合して単一の反応系で行ったＰＣＲの産物を、４菌種検出用メンブレンで検出した結果を示す写真である。下側が、当該ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動図である。
【００２４】
以下、本発明について詳細に説明する。本発明において「単一の反応系」とは、一の相（多くの場合は液相）において一の反応条件下で行う反応をいう。また、「菌種を識別しつつ検出する」とは、微生物を、それが属する種を特定できる態様で、検出することをいう。【００２５】
本発明において、「ペクトバクテリウム属細菌」は、ペクトバクテリウム属に属する細菌をいう。係る細菌は、上述のとおりジャガイモの黒あし病や、種々の農作物の軟腐病を引き起こす病原細菌であることが知られている。その種としては、上述のＰｗ、Ｐａ、Ｐｃｂ、Ｐｃｃなどを例示することができる。【００２６】
ＰｅｃセルＢ非保存領域は、菌種に特有の配列であるから、これに相当する塩基配列またはそれと相補的な塩基配列を検出することにより、ペクトバクテリウム属細菌を菌種を識別しつつ検出することができる。すなわち、本発明に係る核酸プローブは、ペクトバクテリウム属細菌を検出するための核酸プローブであって、下記（ｉ）または（ｉｉ）の塩基配列の全部または一部を含む；
（ｉ）ＰｅｃセルＢ非保存領域に相当する塩基配列、
（ｉｉ）（ｉ）と相補的な塩基配列。【００２７】
プローブとは、一般に、ある物質を検出するために用いる物質をいう。すなわち、本発明において「核酸プローブ」とは、ペクトバクテリウム属細菌を検出するために用いる核酸をいう。なお、核酸は、塩基、糖およびリン酸からなるヌクレオチドがホスホジエステル結合で連なった生体高分子をいう。【００２８】
ペクトバクテリウム属細菌のセルラーゼＢは、ペクトバクテリウム属細菌が生来有するセルラーゼＢをいう。ペクトバクテリウム属細菌のセルラーゼＢをコードする遺伝子は、セルラーゼＢ遺伝子（ｃｅｌＢ）のほか、本発明においては、ｃｅｌＢと相同性が高くペクトバクテリウム属細菌ＳＣＣ３１９３が有するとされるセルラーゼＳ遺伝子（ｃｅｌＳ）も、同遺伝子に含むものとする（GenbankアクセッションナンバーＭ32399およびKoskinen et al.(2012）vol.194, no.21 p6004、Genbank アクセッションナンバーCP003415)。【００２９】
ペクトバクテリウム属細菌のセルラーゼＢのアミノ酸配列は、図１に示すＰｃｃ、Ｐａ、ＰｃｂおよびＰｗのもの（全長２６４ａａ）や配列番号１２〜２０を例示することができる。図１に例示する配列や配列番号１２〜２０に基づけば、ＰｅｃセルＢ非保存領域は配列番号１、Ｐｅｃセルラーゼ保存領域は配列番号２のように表すことができる。その他、ペクトバクテリウム属細菌のセルラーゼ、Ｐｅｃセルラーゼ非保存領域およびＰｅｃセルラーゼ保存領域のアミノ酸配列情報は、ＰＩＲ（ｈｔｔｐ：／／ｐｉｒ．ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ．ｅｄｕ／）やＵｎｉＰｒｏｔＫＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／）、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝Ｐｒｏｔｅｉｎ）などのアミノ酸配列データベースから入手することができる。【００３０】
本発明において「アミノ酸配列に相当する塩基配列」とは、そのアミノ酸配列を、コドン（遺伝子コード）に従って変換することにより特定される塩基配列をいう。すなわち、上記（ｉ）の塩基配列は、ＰｅｃセルＢ非保存領域のアミノ酸配列情報をコドンに従って変換することにより、特定することができる。【００３１】
また、所定の塩基配列と「相補的な塩基配列」とは、ワトソン・クリック塩基対に従って、前記所定の塩基配列とは逆方向であり、かつ、前記所定の塩基配列のアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）に対して、それぞれＴ、Ｃ、ＡおよびＧとなるよう塩基が並んだ塩基配列をいう。すなわち、上記（ｉｉ）の塩基配列は、（ｉ）の塩基配列情報をワトソン・クリック塩基対に従って変換することにより、特定することができる。【００３２】
本発明に係る核酸プローブに含まれる（ｉ）または（ｉｉ）の塩基配列の長さは特に限定されないが、検出感度の観点からは、（ｉ）または（ｉｉ）の塩基配列のうちの１８ｍｅｒ以上を含むことが好ましい。また、核酸プローブは、検出や精製等のため、放射性リン酸塩、ビオチン、蛍光色素分子、酵素といった各種の物質により標識・修飾してもよい。【００３３】
次に、核酸プローブの使い方について例示する。核酸プローブは、例えば、土壌や植物組織等の天然から採取した試料に含まれるペクトバクテリウム属細菌を検出するために使用することができる。【００３４】
具体的には、試料からＤＮＡを抽出して、その塩基配列を解読する。解読して得られた配列の中に、本発明に係る核酸プローブがあるか無いかを検出する。ある場合は、試料にペクトバクテリウム属細菌が含まれると判定することができ、無い場合は、試料にペクトバクテリウム属細菌が含まれないと判定することができる。【００３５】
そして、試料から抽出したＤＮＡ塩基配列中に核酸プローブがある場合において、当該核酸プローブの塩基配列が、既知のＰｗの核酸プローブの塩基配列（例えば配列番号３〜５の１〜１２０番目）と高い同一性を呈する場合は、試料にはＰｗが含まれると判定することができ、既知のＰｃｃの核酸プローブの塩基配列（例えば配列番号６、７の１〜１２０番目）と高い同一性を呈する場合は、試料にはＰｃｃが含まれると判定することができ、既知のＰａの核酸プローブの塩基配列（例えば配列番号８、９の１〜１２０番目）と高い同一性を呈する場合は、試料にはＰａが含まれると判定することができ、既知のＰｃｂの核酸プローブの塩基配列（例えば配列番号１０、１１の１〜１２０番目）と高い同一性を呈する場合は、試料にはＰｃｂが含まれると判定することができる。【００３６】
あるいは、別の使い方として、上記の試料から抽出したＤＮＡを鋳型として、本発明に係る核酸プローブを増幅させるためのＰＣＲを行う方法を挙げることができる。このＰＣＲでは、（ｉ）の塩基配列のうちの２０〜３０ｍｅｒ程度からなる核酸プローブを、フォワードプライマーとして用いる。ＰＣＲ産物中に核酸プローブが検出されれば、試料にペクトバクテリウム属細菌が含まれると判定することができ、ＰＣＲ産物中に核酸プローブが検出されなければ、試料にペクトバクテリウム属細菌が含まれないと判定することができる。【００３７】
そして、ＰＣＲ産物中に核酸プローブが検出された場合において、その塩基配列が、既知のＰｗの核酸プローブの塩基配列（例えば配列番号３〜５の１〜１２０番目）と高い同一性を呈する場合は、試料にはＰｗが含まれると判定することができ、既知のＰｃｃの核酸プローブの塩基配列（例えば配列番号６、７の１〜１２０番目）と高い同一性を呈する場合は、試料にはＰｃｃが含まれると判定することができ、既知のＰａの核酸プローブの塩基配列（例えば配列番号８、９の１〜１２０番目）と高い同一性を呈する場合は、試料にはＰａが含まれると判定することができ、既知のＰｃｂの核酸プローブの塩基配列（例えば配列番号１０、１１の１〜１２０番目）と高い同一性を呈する場合は、試料にはＰｃｂが含まれると判定することができる。【００３８】
以上述べたように、本発明は、本発明に係る核酸プローブを検出する工程を有する、ペクトバクテリウム属細菌の検出方法も提供する。本検出方法は、核酸プローブをＰＣＲによって増幅させる工程をさらに有するものであってもよい。また、本発明は、ＰｅｃセルＢ非保存領域に相当する塩基配列の全部または一部を含む、ペクトバクテリウム属細菌を検出するためのＰＣＲプライマーも提供する。【００３９】
ところで、試料から抽出したＤＮＡ、あるいは、それを鋳型とするＰＣＲ産物における核酸プローブの検出は、例えば、塩基配列の解読（シークエンシング）によって行うこともできるが、ハイブリダイゼーションによって行うこともできる。【００４０】
ハイブリダイゼーションによって検出する場合は、予め、既知の各菌種の一本鎖核酸プローブを、菌種ごとに異なる位置に固定した担体を用意する。試料から抽出したＤＮＡあるいはＰＣＲ産物といったサンプルに含まれる核酸を、ビオチン等の標識物質で標識したのち、担体にハイブリダイゼーションさせる。標識物質に応じた検出反応を行い、担体上でシグナルが検出された位置を確認する。Ｐｗの核酸プローブを固定した位置にシグナルが検出されれば、サンプルにはＰｗが含まれると判定することができ、Ｐａの核酸プローブを固定した位置にシグナルが検出されれば、サンプルにはＰａが含まれると判定することができ、Ｐｃｂの核酸プローブを固定した位置にシグナルが検出されれば、サンプルにはＰｃｂが含まれると判定することができ、Ｐｃｃの核酸プローブを固定した位置にシグナルが検出されれば、サンプルにはＰｃｃが含まれると判定することができる。【００４１】
以上述べたように、本発明は、本発明に係る核酸プローブを固定した、ペクトバクテリウム属細菌検出用担体も提供する。本担体に用いる核酸プローブの支持体は核酸を固定できるものであればよく、樹脂製の薄膜（メンブレン）や、樹脂製やガラス製の基盤（チップ）などを例示することができる。また、本発明は、本発明に係る核酸プローブを含むペクトバクテリウム属細菌検出用キットも提供する。 本キットには、ペクトバクテリウム属細菌の各菌種の核酸プローブあるいはペクトバクテリウム属細菌検出用担体の他、検出方法に応じて、他の試薬（培地、ＤＮＡ抽出緩衝液、ＰＣＲ酵素、ＰＣＲ反応緩衝液、洗浄液、精製カラムなど）や容器、器具、取り扱い説明書等を含めてもよい。【００４２】
ジャガイモの黒あし病を引き起こす代表的な細菌には、ペクトバクテリウム属細菌の他に、ディケヤ属細菌のディケヤ ディアンティコラDickeya dianthicola（以下「Ｄｄｉ」と略記する場合がある。）がある。Ｄｄｉの検出には、従来、ペクチン酸リアーゼ遺伝子を増幅対象とする増菌ＰＣＲ法が行われおり、そのＰＣＲプライマーには、ＡＤＥ１（フォワードプライマー：配列番号２７）およびＡＤＥ２（リバースプライマー：配列番号２９）が用いられている（Nassar et al.(1996), Applied and Enviromental Microbiology 62 p2228-2235）。【００４３】
後述する実施例６で示すように、本発明に係る核酸プローブは、ＡＤＥ１プライマーおよびＡＤＥ２プライマーや、Ｄｄｉのペクチン酸リアーゼ遺伝子の部分配列と単一反応系で使用しても、非特異的な反応の増加や、特異的反応の低下を生じない。従って、ペクトバクテリウム属細菌検出用担体には、核酸プローブのほかに、Ｄｄｉのペクチン酸リアーゼ遺伝子の部分配列を固定してもよい。同様に、ペクトバクテリウム属細菌検出用キットには、核酸プローブのほかに、ＡＤＥ１プライマーやＡＤＥ２プライマー、Ｄｄｉのペクチン酸リアーゼ遺伝子の塩基配列の全部または一部を含めてもよい。係るキットや担体によれば、単一反応系によりジャガイモ黒あし病の病原細菌を網羅的に検出ないし識別することができる。【００４４】
最後に、本発明は、ＰＣＲプライマーセットを提供する。本ＰＣＲプライマーセットは、下記の第１のＰＣＲプライマーと、前記第１のＰＣＲプライマーと対で使用される下記の第２のＰＣＲプライマーとを含む；
第１のプライマー：本発明に係るＰＣＲプライマー、
第２のプライマー：ＰｅｃセルＢ保存領域に相当する塩基配列と相補的な塩基配列の一部を含む、ＰＣＲプライマー。【００４５】
第２のプライマーは、ペクトバクテリウム属細菌の菌種間で共通のものとなる。このため、単一反応系で複数菌種の核酸プローブを増幅するためのＰＣＲにおいて、上記プライマーセットを用いることにより、プライマーの種類数が抑えられる。すなわち、本プライマーセットによれば、単一反応系であっても、より効果的に、非特異的な増幅や特異的増幅の減少を生じることなく、各菌種の核酸プローブを増幅させることができる。【００４６】
以下、本発明について、各実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。
【実施例】
【００４７】
＜試験方法＞
本実施例では、特段の記載のない限り以下に示す試験方法を用いた。また、本実施例において、「％」は、特段の記載のない限り質量％を表す。【００４８】
（１）菌株
菌株は表１に示すものを用いた。なお、ＰｃｃＳＲ  ＨＳ−ＳＲ株は、ホクサン株式会社において分離したものであり、他は地方独立行政法人北海道立総合研究機構  農業研究本部  十勝農業試験場より分譲されたものである。
【表１】
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【００４９】
（２）菌株からの核酸の抽出
Ｋｉｎｇ’ｓＢ寒天培地（※注１）上の各菌株の単コロニーをＫｉｎｇ’ｓＢ液体培地（注１）に接種し、２５℃の暗所にて１〜２日間培養し、培養液を得た。培養液を遠心分離に供して上清を除去し、菌体ペレットを回収した。菌体ペレットから、ＣＴＡＢ法（※注２）によりＤＮＡを抽出し、１００ｎｇ／ｕＬのＤＮＡ液を滅菌水にて調製した。【００５０】
※注１：Ｋｉｎｇ’ｓＢ培地
Ｋｉｎｇ’ｓＢ液体培地（１Ｌ組成；ペプトンが２０ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４が１．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏが１．５ｇ、グリセリンが１０ｍＬ、蒸留水が９９０ｍＬ、ｐＨ７．２）に、１．５％（ｗ/ｖ）量の寒天を添加し、１２１℃で３０分間オートクレーブに供したものをＫｉｎｇ’ｓＢ寒天培地とした。【００５１】
※注２：ＣＴＡＢ法
試料に、少なくとも５倍量の核酸抽出緩衝液（組成；２％の臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１．４ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、０．１％の２−メルカプトエタノール）を添加し、６５℃で加熱した。室温になるまで静置した後、添加した核酸抽出緩衝液と等量のクロロホルム：イソアミルアルコール（体積比２４：１）を加え、１分間以上、混合攪拌した。その後、遠心分離して上清（水層）を回収し、市販のシリカカラム（Qiagen社等）を用いて精製した。なお、抽出核酸としてＲＮＡを選択する場合、シリカカラム精製に先立ち、ＤＮａｓｅ処理を行う他、塩化リチウム沈殿処理等でＲＮＡを分画した。【００５２】
（３）ＰＣＲ
ＰＣＲ酵素はAmpliTaq  Gold360（Thermo Fisher Scientific）を用いた。反応液量は２５μＬもしくは５０μＬとし、反応液組成はＰＣＲ酵素が０．０２Ｕ／μＬ、プライマーが０．２〜０．４μＭおよび鋳型ＤＮＡが１００ｍｇとした。ＰＣＲ温度サイクルは、１周目が９５℃で１０分間、２周目から３５周目が９５℃で３０秒、５６℃で３０秒および７２℃で３０秒を１サイクルとして３４サイクル、最後が７２℃で１０分間とした。鋳型核酸としてＲＮＡを供試する場合は、ＰＣＲに先立ち、M-MLV逆転写酵素（Invirtogen)処理をする他、PrimeScript  One Step RT-PCR kit ver.2（ＴＡＫＡＲＡ）等のキットを使用した。【００５３】
（４）マクロアレイ用メンブレンの作製
ＰＣＲ産物を精製してＤＮＡ断片を得た。これに滅菌水およびキシレンシアノール（ＸＣ）含有色素液を添加して、ＤＮＡ濃度が５０ｎｇ／μＬでＸＣ濃度が０．０１ｍｇ／ｍＬであるスポット溶液を調製した。ＨＹＤＲ９６  ＤＮＡスポッターを用いて、ナイロンメンブレン（Biodyne  Pall）にスポット溶液を０．２μＬずつスポットした。スポット後のナイロンメンブレンは、ろ紙に挟んだ状態で１２０℃で３０分置くことによりＤＮＡを熱変性させ、一本鎖とした。続いて、スポット面を上にした状態でＵＶクロスリンカー（CL-1000；UVP）にセットし、１２０ｍＪ／ｃｍ２の紫外線を照射してＤＮＡをメンブレンへ固定した。このメンブレンを、スポットしたＤＮＡの配置に応じて切り分けて使用した。【００５４】
（５）マクロアレイ用メンブレンにおけるシグナル検出
検査対象試料をマクロアレイ用メンブレンに供してシグナルを検出する操作は、以下の１〜４により行った。
１．プレハイブリダイゼーション
PerfectHyb溶液（TOYOBO）１．７ｍＬを２ｍＬ容量のマイクロチューブに入れ、６９℃に設定したヒートブロックに２０分以上置くことにより加温した。このマイクロチューブに、ホルダーで固定したマクロアレイ用メンブレンを入れ、６９℃で少なくとも４０分間インキュベートした。【００５５】
２．ハイブリダイゼーション
検査対象試料（ビオチン標識ＤＮＡ断片）を９９℃で５分間置くことにより熱変性させた後、氷上に３分間置くことにより急冷した。プレハイブリダイゼーション済みのメンブレンを抜き取ったマイクロチューブに検査対象試料１５μＬを加え、続いて、そこに再度メンブレンを入れた。その後、６９℃で２時間〜１６時間インキュベートを行った。【００５６】
３．洗浄
洗浄液１（２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）を１．７ｍＬ入れた２ｍＬ容量マイクロチューブおよび洗浄液２（０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）を１．７ｍＬ入れた２ｍＬ容量マイクロチューブをそれぞれ１サンプルにつき３本ずつ用意し、６９℃のヒートブロックに立てて２０分間加温した。１本目の洗浄液１にハイブリダイゼーション後のメンブレンを入れ、１分間インキュベートした後、５回程転倒混和した。メンブレンを２本目の洗浄液１に移し、１分間インキュベートした後、５回程転倒混和した。メンブレンを３本目の洗浄液１に移し、１０分間インキュベートした後、５回程転倒混和した。メンブレンを１本目の洗浄液２に移し、１分間インキュベートした後、５回程転倒混和した。メンブレンを２本目の洗浄液２に移し、１分間インキュベートした後、５回程転倒混和した。メンブレンを３本目の洗浄液２に移し、１０分間インキュベートした。【００５７】
４．発色反応
ｉ）１５ｍＬのＢＬＯＣＫ液（５％ＳＤＳ、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）を入れた容器に、洗浄後のメンブレンを入れて軽くすすいだ。ＢＬＯＣＫ液を捨て、新しいＢＬＯＣＫ液１５ｍＬを加えて５分間振とうした。
ｉｉ）ＢＬＯＣＫ液を捨て、１５ｍＬのアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン溶液（ＳＡＰ溶液；１５ｍＬのＢＬＯＣＫ液に対して１０μＬのStreptavidin-Alkaline Phosphataase(BioRad)を加えることにより調製）を加えて５分間振とうした。
ｉｉｉ）ＳＡＰ溶液を捨て、１５ｍＬの洗浄液３（０．５％ＳＤＳ、１２．５ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）ですすぐことを２回繰り返した。３回目に洗浄液３を入れた後、５分間振とうした。
ｉｖ）洗浄液３を捨て、洗浄液４（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、１０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２）ですすぐことを２回繰り返した。３回目に洗浄液４を入れた後、５分間振とうした。  
ｖ）NBT/BCIP ready-to-use tablet（Roche）１粒（０．３４ｇ）を１０ｍＬの蒸留水に溶かしたものを新しい容器に入れ、そこに洗浄液４から取り出したメンブレンを浸し、容器を軽くゆすりながら１分間放置した。
ｖｉ）メンブレンを取り出して直ちにラップで包み、１５分以内を目安に発色したスポットの有無ないし発色強度を目視で確認した。【００５８】
＜実施例１＞マルチプルアライメント
（１）セルラーゼＢ遺伝子の配列決定
ペクトバクテリウム属細菌のセルラーゼＢに関する既報論文やＧｅｎＢａｎｋに登録された塩基配列情報に基づき、プライマーを設計した。表１の菌株のゲノムＤＮＡを鋳型として、このプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をダイレクトシークエンスすることにより、各菌株のセルラーゼＢ遺伝子（ｃｅｌＢ）の塩基配列を決定し、それに基づいてセルラーゼＢのアミノ酸配列を決定した。その結果を表２および配列番号３〜２０に示す。なお、Ｐｗについては、塩基配列の相同性の高さから、セルラーゼＳ遺伝子として報告されているものがセルラーゼＢ遺伝子に該当すると推測される（Koskinen et al.(2012）vol.194, no.21 p6004、Genbank アクセッションナンバーCP003415）。
【表２】
2019244860.tif 000004
【００５９】
続いて、Genbankに登録されているペクトバクテリウム属細菌Ｐｃｃ  ＬＹ３４のセルラーゼＢ遺伝子（Genbank アクセッションナンバーAF025769)やＰｓｐ  ＳＣＣ３１９３のセルラーゼＳ遺伝子（Genbank アクセッションナンバー M32399)の塩基配列に基づいて得られたアミノ酸配列と、上述により決定したセルラーゼＢのアミノ酸配列とをＧｅｎｅｔｙｘ  ｖｅｒ．１２によりマルチプルアライメントを行った。その結果を図１に示す。【００６０】
図１に示すように、セルラーゼＢのアミノ末端から１〜４０番目（配列番号１）において、菌種間で多様性が存在することが明らかになった。この結果から、ペクトバクテリウム属細菌のセルラーゼＢのアミノ末端から１〜４０番目のアミノ酸配列（ＰｅｃセルＢ非保存領域）に相当する塩基配列、またはこれと相補的な塩基配列の全部または一部を検出することにより、ペクトバクテリウム属細菌を、その菌種を識別しつつ、検出できることが明らかになった。【００６１】
＜実施例２＞ＰＣＲプライマーの設計
配列番号３〜１１の５’末端から１〜１２０番目の領域（ＰｅｃセルＢ非保存領域に相当する塩基配列）において、２１〜３１ｍｅｒの長さのフォワードプライマー（Ｆｗプライマー）を設計した。このＦｗプライマーは、各菌種に特有の配列となった。また、５’末端から１２１番目以降の領域（ＰｅｃセルＢ保存領域に相当する塩基配列）において、菌種間で共通の配列となるようＦｗプライマーおよびリバースプライマー（Ｒｖプライマー）を設計した。これらのプライマーの配列を表３に示す。表３には、Ｄｄｉ検出用のＰＣＲプライマーであるＡＤＥ１（配列番号２７）およびＡＤＥ２（配列番号２９）も合わせて示す。また、Ｆｗプライマーの設計領域を図２に示す。
【表３】
2019244860.tif 000005
【００６２】
＜実施例３＞特異的ＤＮＡ増幅の確認
表１の菌株のゲノムＤＮＡ（［１］Ｄｄｉ  Ｅｃｈｒ９３４３１、［２］Ｄｄｉ  Ｅｃｈｒ８２６３、［３］Ｐｗ  ＥｃｃＮＲ−２、［４］Ｐｗ  ＢＮＳ２−２、［５］Ｐｗ  ４−１−１、［６］Ｐｃｃ  ＨＳ−ＳＲ、［７］Ｐａ  Ｅｃａ２、［８］Ｐａ  Ｐ−１４、［９］Ｐｃｂ  Ｋｂｓ−１）を鋳型として、表３のプライマーを用いてＰＣＲを行い、アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物の有無およびサイズを確認した。用いたプライマーセットを下記［ｉ］〜［ｖｉ］に示す。また、鋳型ＤＮＡを含まない対照試料について同様にＰＣＲを行った。その結果を図３に示す。
《プライマーセット》
［ｉ］Ｆｗ；配列番号２７、Ｒｖ；配列番号２９（増幅断片長：４２０ｂｐ、増幅対象遺伝子：ｐｅｌＡＤＥ、検出対象菌種：Ｄｄｉ）、
［ｉｉ］Ｆｗ；配列番号２６、Ｒｖ；配列番号２８（増幅断片長：５２５ｂｐ、増幅対象遺伝子：ｃｅｌＢ、検出対象菌種：ペクトバクテリウム属細菌）、
［ｉｉｉ］Ｆｗ；配列番号２１、Ｒｖ；配列番号２８（増幅断片長：７５５ｂｐ、増幅対象遺伝子：ｃｅｌＢ、検出対象菌種：Ｐｗ）、
［ｉｖ］Ｆｗ；配列番号２２、Ｒｖ；配列番号２８（増幅断片長：７５３ｂｐ、増幅対象遺伝子：ｃｅｌＢ、検出対象菌種：Ｐｃｃ）
［ｖ］Ｆｗ；配列番号２３、Ｒｖ；配列番号２８（増幅断片長：７１６ｂｐ、増幅対象遺伝子：ｃｅｌＢ、検出対象菌種：Ｐａ）
［ｖｉ］Ｆｗ；配列番号２４、Ｒｖ；配列番号２８（増幅断片長：７１８ｂｐ、増幅対象遺伝子：ｃｅｌＢ、検出対象菌種：Ｐｃｂ Ｋｂｓ−１）【００６３】
図３に示すように、［ｉ］のプライマーセットでは、［１］［２］のレーンで４２０ｂｐ相当のサイズのバンドが確認され、［３］〜［１０］のレーンで当該バンドは確認されなかった。また、［ｉｉ］のプライマーセットでは、［３］〜［９］のレーンで５２５ｂｐ相当のサイズのバンドが確認され、［１］［２］［１０］のレーンで当該バンドは確認されなかった。［ｉｉｉ］のプライマーセットでは、［３］〜［５］のレーンで７５５ｂｐ相当のサイズのバンドが確認され、［１］［２］［６］〜［１０］のレーンで当該バンドは確認されなかった。［ｉｖ］のプライマーセットでは、［６］のレーンで７５３ｂｐ相当のサイズのバンドが確認され、［１］〜［５］および［７］〜［１０］のレーンで当該バンドは確認されなかった。［ｖ］のプライマーセットでは、［７］［８］のレーンで７１６ｂｐ相当のサイズのバンドが確認され、［１］〜［６］、［９］および［１０］のレーンで当該バンドは確認されなかった。［ｖｉ］のプライマーセットでは、［９］のレーンで７１８ｂｐ相当のサイズのバンドが確認され、［１］〜［８］［１０］のレーンで当該バンドは確認されなかった。【００６４】
すなわち、［ｉ］〜［ｖｉ］のプライマーセットを用いたＰＣＲでは、各菌種のＤＮＡが特異的に増幅され、非特異的増幅は無かった。この結果から、ＰｅｃセルＢ非保存領域に相当する塩基配列を増幅対象としてＰＣＲを行うことにより、ペクトバクテリウム属細菌を、菌種を識別しつつ検出できることが明らかになった。【００６５】
＜実施例４＞マクロアレイ用メンブレンの作製
Ｐｗ、ＰｃｃおよびＰａの３菌種ならびにＰｃｂ Ｋｂｓ−１およびＰｃｂ  ＳＵＰＰ２５６４の２菌株それぞれのセルラーゼＢ遺伝子において、５’末端から１〜１２０番目の領域（ＰｅｃセルＢ非保存領域に相当する塩基配列）の５’末端側８０ｍｅｒをＦｗプライマーとし、３’末端８０ｍｅｒと相補的な塩基配列をＲｖプライマーとしたプライマーを設計した。また、Ｄｄｉのペクチン酸リアーゼ遺伝子の部分配列を増幅するためのプライマーを設計した（Nassar et al.(1996), Applied and Enviromental Microbiology 62 p2228-2235）。これらのプライマーの配列を表４に示す。
【表４】
2019244860.tif 000006
【００６６】
Ｄｄｉの各菌株のゲノムＤＮＡを混合して菌種のゲノムＤＮＡを調製した。このＤｄｉゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号３０および３１のプライマーセットを用いてＰＣＲを行いＰＣＲ産物を得た。Ｐｗ、Ｐｃｃ、Ｐａ、Ｐｃｂ Ｋｂｓ−１およびＰｃｂ  ＳＵＰＰ２５６４については、表４のプライマーセットが鋳型でもあるため、ＦｗプライマーとＲＶプライマーを菌種毎に混合し、ＰＣＲを行いＰＣＲ産物を得た。続いて、試験方法（４）により、Ｐｗ、Ｐａ、Ｐｃｂ Ｋｂｓ−１およびＰｃｃのセルラーゼＢ遺伝子増幅断片をスポットしたマクロアレイ用メンブレン（４菌種検出用メンブレン）を作成した。また、同様にＤｄｉのペクチン酸リアーゼ遺伝子増幅断片ならびにＰｗ、Ｐａ、Ｐｃｂ Ｋｂｓ−１、Ｐｃｂ  ＳＵＰＰ２５６４およびＰｃｃのセルラーゼＢ遺伝子増幅断片をスポットしたマクロアレイ用メンブレン（６菌種検出用メンブレン）を作成した。各メンブレンにおけるスポット位置は図４に示すとおりとした。【００６７】
＜実施例５＞単一の反応系での検出：４菌種検出用メンブレン
Ｄｄｉ、ＰｗおよびＰａの各菌株のゲノムＤＮＡを菌種毎に混合して、菌種ゲノムＤＮＡを調製した。この菌種ゲノムＤＮＡならびにＰｃｂ Ｋｂｓ−１、Ｐｃｃ  ＨＳ−ＳＲおよびＰｃｃ  ＥｃｃＳ−１ＢのゲノムＤＮＡ（［１］Ｄｄｉ、［２］Ｐｗ、［３］Ｐａ、［４］Ｐｃｂ  Ｋｂｓ−１、［５］Ｐｃｃ  ＨＳ−ＳＲ、［６］Ｐｃｃ  ＥｃｃＳ−１Ｂ）を鋳型として、ＰＣＲを行った。また、［７］鋳型ＤＮＡを含まない対照試料について同様にＰＣＲを行った。プライマーは、実施例３の［ｉ］〜［ｖｉ］のプライマーセットを混合したもの（配列番号２１〜２４および２７〜２９の７種類のプライマー）を用いた。また、配列番号２７および配列番号２８のプライマーは、予めビオチン標識したものを用いた。その後、アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物の有無およびサイズを確認した。また、実施例４の４菌種検出用メンブレンに供してシグナルの有無および位置を確認した。その結果を図５に示す。【００６８】
図５に示すように、鋳型がＤｄｉゲノムＤＮＡの場合（［１］）、電気泳動で４２０ｂｐ相当のバンドが確認されたが、４菌種検出用メンブレンではシグナルが検出されなかった。
一方、鋳型がＰｗゲノムＤＮＡの場合（［２］）、電気泳動で７５５ｂｐ相当のバンドが確認され、４菌種検出用メンブレンでもＰｗのセルラーゼＢ遺伝子増幅断片をスポットした位置にシグナルが検出され、他の位置にはシグナルが検出されなかった。
鋳型がＰａゲノムＤＮＡの場合（［３］）も、電気泳動で７５３ｂｐ相当のバンドが確認され、４菌種検出用メンブレンでもＰａのセルラーゼＢ遺伝子増幅断片をスポットした位置にシグナルが検出され、他の位置にはシグナルが検出されなかった。
鋳型がＰｃｂ  Ｋｂｓ−１ゲノムＤＮＡの場合（［４］）も、電気泳動で７１６ｂｐ相当のバンドが確認され、４菌種検出用メンブレンでもＰｃｂ  Ｋｂｓ−１のセルラーゼＢ遺伝子増幅断片をスポットした位置にシグナルが検出され、他の位置にはシグナルが検出されなかった。
鋳型がＰｃｃ  ＨＳ−ＳＲゲノムＤＮＡの場合（［５］）、電気泳動で７５３ｂｐ相当のバンドが確認され、４菌種検出用メンブレンでもＰｃｃのセルラーゼＢ遺伝子増幅断片をスポットした位置にシグナルが検出され、他の位置にはシグナルが検出されなかった。
鋳型がＰｃｃ  ＥｃｃＳ−１ＢゲノムＤＮＡの場合（［６］）、電気泳動で７５３ｂｐ相当のバンドが確認され、４菌種検出用メンブレンでもＰｃｃのセルラーゼＢ遺伝子増幅断片をスポットした位置にシグナルが検出され、他の位置にはシグナルが検出されなかった。
鋳型ＤＮＡが無い対照試料の場合（［７］）、電気泳動でバンドは確認されず、４菌種検出用メンブレンでもシグナルは検出されなかった。【００６９】
すなわち、７種類のプライマーを混合して単一の反応系で行ったＰＣＲでも、Ｄｄｉ、Ｐｗ、Ｐａ、ＰｃｂおよびＰｃｃの各菌種特異的に、検出するのに充分量のＤＮＡが増幅され、非特異的な増幅や、特異的増幅の減少は見られなかった。この結果から、ＰｅｃセルＢ非保存領域に相当する塩基配列、またはこれと相補的な塩基配列の全部または一部を検出することにより、ペクトバクテリウム属細菌を、その菌種を識別しつつ、検出できることが明らかになった。【００７０】
＜実施例６＞単一の反応系での検出：６菌種検出用メンブレン
Ｄｄｉ、ＰｗおよびＰａの各菌株のゲノムＤＮＡを菌種毎に混合して、各菌種のゲノムＤＮＡを調製した。この菌種ゲノムＤＮＡならびにＰｃｂ Ｋｂｓ−１、Ｐｃｂ ＳＵＰＰ２５６４、Ｐｃｃ  ＨＳ−ＳＲおよびＰｃｃ  ＥｃｃＳ−１ＢのゲノムＤＮＡ（［１］Ｄｄｉ、［２］Ｐｗ、［３］Ｐａ、［４］Ｐｃｂ  Ｋｂｓ−１、［５］Ｐｃｂ  ＳＵＰＰ２５６４、［６］Ｐｃｃ  ＨＳ−ＳＲ、［７］Ｐｃｃ  ＥｃｃＳ−１Ｂ）を鋳型として、ＰＣＲを行った。また、［８］鋳型ＤＮＡを含まない対照試料について同様にＰＣＲを行った。プライマーは、実施例３の［ｉ］〜［ｖｉ］のプライマーセットに加えて、下記［ｖｉｉ］のプライマーセットを混合したもの（配列番号２１〜２５および２７〜２９の８種類のプライマー）を混合したものを用いた。また、配列番号２７および配列番号２８のプライマーは、予めビオチン標識したものを用いた。その後、アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物の有無およびサイズを確認した。また、実施例４の６菌種検出用メンブレンに供してシグナルの有無および位置を確認した。その結果を図６に示す。
［ｖｉｉ］Ｆｗ；配列番号２５、Ｒｖ；配列番号２８（増幅断片長：７４８ｂｐ、増幅対象遺伝子：ｃｅｌＢ、検出対象菌種：Ｐｃｂ  ＳＵＰＰ２５６４）【００７１】
図６に示すように、鋳型がＤｄｉゲノムＤＮＡの場合（［１］）、電気泳動で４２０ｂｐ相当のバンドが確認され、６菌種検出用メンブレンでもＤｄｉのペクチン酸リアーゼ遺伝子増幅断片をスポットした位置にシグナルが検出され、他の位置にはシグナルが検出されなかった。
また、鋳型がＰｗゲノムＤＮＡの場合（［２］）、電気泳動で７５５ｂｐ相当のバンドが確認され、６菌種検出用メンブレンでもＰｗのセルラーゼＢ遺伝子増幅断片をスポットした位置にシグナルが検出され、他の位置にはシグナルが検出されなかった。
鋳型がＰａゲノムＤＮＡの場合（［３］）も、電気泳動で７５３ｂｐ相当のバンドが確認され、６菌種検出用メンブレンでもＰａのセルラーゼＢ遺伝子増幅断片をスポットした位置にシグナルが検出され、他の位置にはシグナルが検出されなかった。
鋳型がＰｃｂ  Ｋｂｓ−１ゲノムＤＮＡの場合（［４］）も、電気泳動で７１６ｂｐ相当のバンドが確認され、６菌種検出用メンブレンでもＰｃｂ  Ｋｂｓ−１のセルラーゼＢ遺伝子増幅断片をスポットした位置にシグナルが検出され、他の位置にはシグナルが検出されなかった。
鋳型がＰｃｂ  ＳＵＰＰ２５６４ゲノムＤＮＡの場合（［５］）も、電気泳動で７４８ｂｐ相当のバンドが確認され、６菌種検出用メンブレンでもＰｃｂ  ＳＵＰＰ２５６４のセルラーゼＢ遺伝子増幅断片をスポットした位置にシグナルが検出され、他の位置にはシグナルが検出されなかった。
鋳型がＰｃｃ  ＨＳ−ＳＲゲノムＤＮＡの場合（［６］）、電気泳動で７５３ｂｐ相当のバンドが確認され、６菌種検出用メンブレンでもＰｃｃのセルラーゼＢ遺伝子増幅断片をスポットした位置にシグナルが検出され、他の位置にはシグナルが検出されなかった。
鋳型がＰｃｃ  ＥｃｃＳ−１ＢゲノムＤＮＡの場合（［７］）、電気泳動で７５３ｂｐ相当のバンドが確認され、６菌種検出用メンブレンでもＰｃｃのセルラーゼＢ遺伝子増幅断片をスポットした位置にシグナルが検出され、他の位置にはシグナルが検出されなかった。
鋳型ＤＮＡが無い対照試料の場合（［８］）、電気泳動でバンドは確認されず、６菌種検出用メンブレンでもシグナルは検出されなかった。【００７２】
すなわち、８種類のプライマーを混合して単一の反応系で行ったＰＣＲでも、Ｄｄｉ、Ｐｗ、Ｐａ、ＰｃｂおよびＰｃｃの各菌種特異的に、検出するのに充分量のＤＮＡが増幅され、非特異的な増幅や、特異的増幅の減少は見られなかった。この結果から、ＰｅｃセルＢ非保存領域に相当する塩基配列、またはこれと相補的な塩基配列の全部または一部を検出することにより、ペクトバクテリウム属細菌を、その菌種を識別しつつ、検出できることが明らかになった。また、ＰｅｃセルＢ非保存領域の遺伝子断片を増幅するためのＰＣＲプライマーあるいはＰｅｃセルＢ非保存領域の遺伝子断片と、Ｄｄｉのペクチン酸リアーゼ遺伝子断片を増幅するためのＰＣＲプライマープライマーあるいはＤｄｉのペクチン酸リアーゼ遺伝子断片とを単一の反応系で使用して、ジャガイモ黒あし病の病原細菌を網羅的に検出ないし識別できることが明らかになった。【００７３】
＜比較例１＞従来の検出系に基づくマクロアレイ用メンブレンの作成
Ｄｄｉを検出するために従来用いられているプライマーとして、Ｄｄｉのペクチン酸リアーゼ遺伝子を増幅対象とするもの（Ｆｗ；ＡＤＥ１（配列番号２７）、Ｒｖ；ＡＤＥ２（配列番号２９））を用意した。また、Ｐｗを検出するために従来用いられているプライマーとして、Ｐｗのユニバーサル  ライス  プライマー（ＵＲＰ）を増幅対象とするもの（Ｆｗ；ｃｏｎｔｉｇ１Ｆ、Ｒｖ；ｃｏｎｔｉｇ１Ｒ、de Haan et al.(2008), European Journal of Plant Pathology 122 p561-569）を用意した。また、Ｐａを検出するために従来用いられているプライマーとして、Ｐａ特異的ＤＮＡプローブを増幅対象とするもの（Ｆｗ；ＥＣＡ１ｆ、Ｒｖ；ＥＣＡ２ｒ、de Bore & Ward(1995), Phytopathology 85 p854-858）を用意した。また、Ｐｃｂを検出するために従来用いられているプライマーとして、１６Ｓ  ｒＲＮＡと２３Ｓ  ｒＲＮＡの遺伝子間スペーサー領域（１６Ｓ−２３Ｓ  ＩＧＳ）を増幅対象とするもの（Ｆｗ；ＢＲ１ｆ、Ｒｖ；Ｌ１ｒ、Duarte et al.(2004), Jounal of Applied Microbiology 96 p535-545）を用意した。その配列を表５に示す。
【表５】
2019244860.tif 000007
【００７４】
また、マクロアレイ用メンブレンに固定するために、表５に示すプライマーが増幅対象とする遺伝子の部分配列を増幅するためにプライマーを設計した。これらのプライマーの配列を表６に示す。
【表６】
2019244860.tif 000008
【００７５】
Ｄｄｉ、Ｐｗ、ＰａおよびＰｃｂの各菌株のゲノムＤＮＡを、菌種毎に混合して菌種のゲノムＤＮＡを調製した。この菌種ゲノムＤＮＡを鋳型として、表６のプライマーセットを用いてＰＣＲを行いＰＣＲ産物を得た。続いて、試験方法（４）により、Ｄｄｉのペクチン酸リアーゼ遺伝子増幅断片、ＰｗのＵＲＰ増幅断片、Ｐａ特異的ＤＮＡプローブ増幅断片およびＰｃｂの１６Ｓ−２３Ｓ  ＩＧＳ増幅断片をスポットしたマクロアレイ用メンブレン（従来型４菌種検出用メンブレン）を作成した。各メンブレンにおけるスポット位置は図７に示すとおりとした。【００７６】
＜実施例７＞罹病ジャガイモ組織における検出
（１）ジャガイモ組織からのＤＮＡ抽出
Ｐｗ  Ｅｃｃ−２株を接種し、種イモが腐敗する症状を呈したジャガイモの苗（地方独立行政法人北海道立総合研究機構  農業研究本部  十勝農業試験場より分譲）を用意した。図８に示すように、このジャガイモの異なる３箇所の組織から切片を採取して、ＣＴＡＢ法によりＤＮＡを抽出し、１００ｎｇ／ｕＬのＤＮＡ液を滅菌水にて調製して、これを罹病組織ＤＮＡ１〜３とした。また、健全なジャガイモの苗から切片を採取して同様にＤＮＡ液を調製し、これを健全組織ＤＮＡとした。【００７７】
（２）マクロアレイ用メンブレンによる検出
［２−１］比較例１のマクロアレイ用メンブレン
本実施例７（１）のＤＮＡ液（［１］罹病組織ＤＮＡ１、［２］罹病組織ＤＮＡ２、［３］罹病組織ＤＮＡ３、［４］健全組織ＤＮＡ）を鋳型として、ＰＣＲを行った。また、［５］鋳型ＤＮＡを含まない対照試料について同様にＰＣＲを行った。プライマーは、表６の８種類のプライマー（配列番号３０、３１および４８〜５３）を混合したものを用いた。また、それぞれのＦｗプライマーは予めビオチン標識したものを用いた。その後、アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物の有無およびサイズを確認した。また、比較例１の従来型４菌種検出用メンブレンに供してシグナルの有無および位置を確認した。その結果を図９に示す。【００７８】
図９に示すように、鋳型が罹病組織ＤＮＡ１〜３の場合（［１］〜［３］）、電気泳動でバンドは確認されず、従来型４菌種検出用メンブレンでＰｗのＵＲＰ増幅断片をスポットした位置に極僅かにシグナルが検出されたが、陽性か陰性かを判定するに足りる強度はなかった。また、鋳型が健全組織ＤＮＡの場合（［４］）および鋳型ＤＮＡが無い対照試料の場合（［５］）はいずれも、電気泳動でバンドは確認されず、従来型４菌種検出用メンブレンでもシグナルは検出されなかった。すなわち、従来の増幅対象遺伝子やＰＣＲプライマーを用いて、Ｄｄｉ、Ｐｗ、ＰａおよびＰｃｂを単一の反応系により検出ないし識別することは、困難であることが明らかになった。【００７９】
［２−２］本発明のマクロアレイ用メンブレン
本実施例７（１）のＤＮＡ液（［１］罹病組織ＤＮＡ１、［２］罹病組織ＤＮＡ２、［３］罹病組織ＤＮＡ３、［４］健全組織ＤＮＡ）を鋳型として、ＰＣＲを行った。また、［５］鋳型ＤＮＡを含まない対照試料について同様にＰＣＲを行った。プライマーは、実施例３の［ｉ］〜［ｖｉ］のプライマーセットを混合したもの（配列番号２１〜２４および２７〜２９の７種類のプライマー）を用いた。また、配列番号２７および配列番号２８のプライマーは、予めビオチン標識したものを用いた。その後、アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物の有無およびサイズを確認した。また、実施例４の４菌種検出用メンブレンに供してシグナルの有無および位置を確認した。その結果を図１０に示す。【００８０】
図１０に示すように、鋳型が罹病組織ＤＮＡ１〜３の場合（［１］〜［３］）、電気泳動で７５５ｂｐ相当のバンドが確認され、４菌種検出用メンブレンでもＰｗのセルラーゼＢ遺伝子増幅断片をスポットした位置にシグナルが検出され、他の位置にはシグナルが検出されなかった。また、鋳型が健全組織ＤＮＡの場合（［４］）および鋳型ＤＮＡが無い対照試料の場合（［５］）はいずれも、電気泳動でバンドは確認されず、従来型４菌種検出用メンブレンでもシグナルは検出されなかった。すなわち、罹病組織から抽出したＤＮＡを鋳型としても、病原細菌を検出するのに充分量のＤＮＡを特異的に増幅でき、非特異的な増幅や、特異的増幅の減少は見られなかった。この結果から、ＰｅｃセルＢ非保存領域に相当する塩基配列、またはこれと相補的な塩基配列の全部または一部を検出することにより、ペクトバクテリウム属細菌を、その菌種を識別しつつ、検出できることが明らかになった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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