(57)【要約】  リシン、アルギニンおよびヒスチジンからなる群より選択される１種または２種以上の塩基性アミノ酸残基を４０％以上７５％以下含み、かつロイシン、イソロイシン、グリシン、アラニン、バリン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファンおよびメチオニンからなる群より選択される１種または２種以上の疎水性アミノ酸残基を２５％以上含むペプチドを含むペプチド群により基材表面が修飾されてなる細胞接着性材料。免疫反応を惹起しにくく、かつ細胞接着効果を長く持続し得る細胞接着性材料を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リシン、アルギニンおよびヒスチジンからなる群より選択される１種または２種以上の塩基性アミノ酸残基を４０％以上７５％以下含み、かつロイシン、イソロイシン、グリシン、アラニン、バリン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファンおよびメチオニンからなる群より選択される１種または２種以上の疎水性アミノ酸残基を２５％以上含むペプチドを含むペプチド群により基材表面が修飾されてなる細胞接着性材料。
【請求項２】
前記ペプチド群が、規則性を持つアミノ酸配列を有しないペプチドからなる、請求項１に記載の細胞接着性材料。
【請求項３】
前記ペプチド群が、前記塩基性アミノ酸残基および前記疎水性アミノ酸残基のみからなるペプチドの集合である、請求項１または２に記載の細胞接着性材料。
【請求項４】
前記ペプチド群が、リシンまたはアルギニン残基を４０％以上７５％以下含み、フェニルアラニン、ロイシンおよびバリン残基のいずれかを２５％以上含む、請求項１〜３のいずれかに記載の細胞接着性材料。
【請求項５】
前記基材表面における前記ペプチド群の修飾密度が０．０４０μｇ／ｃｍ２以上である、請求項１〜４のいずれかに記載の細胞接着性材料。
【請求項６】
前記基材の表面に前記ペプチドが化学結合を介さずに吸着している、請求項１〜５のいずれかに記載の細胞接着性材料。
【請求項７】
前記基材の表面に前記ペプチドが疎水性相互作用のみで吸着している、請求項６に記載の細胞接着性材料。
【請求項８】
前記ペプチド群の重量平均分子量が１０００以上３００００以下である、請求項１〜７のいずれかに記載の細胞接着性材料。
【請求項９】
前記基材の材料が、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、ポリラクチドグリコシド、ポリエーテルエーテルケトン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレートおよびポリブチレンテレフタレートおよびこれらのコポリマーから選択された材料である、請求項１〜８のいずれかに記載の細胞接着性材料。
【請求項１０】
前記基材の材料が、乳酸、カプロラクトンおよびグリコール酸からなる群より選択される２種以上のモノマーの共重合体である、請求項１〜９のいずれかに記載の細胞接着性材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養プレートや細胞足場材料として好適な細胞接着性材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
移植用デバイスなどに用いられる医療用基材には、高分子、金属、セラミックスなど様々なものがあり、デバイスの用途によってそれぞれ適した物性のものが選択される。それらの基材に共通して要求されるのが生体適合性である。生体適合性が高い基材は移植後体内において免疫反応を惹起することが無く、基材表面が素早く細胞に覆われる。そのため、基材表面の細胞接着性を向上させる技術が古くから開発されてきた。特に、基材表面に特定の分子を修飾することで細胞接着性を向上させた基材の開発が行われている。細胞接着性を向上させる分子としては、細胞接着タンパク質であるコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンなどの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分子が知られている。また、これらＥＣＭ分子の一部アミノ酸配列を抽出したペプチドも知られている。アミノ酸のリシンを重合させたポリリシンが生体外においては高い細胞接着性を示すことも知られている。さらに、、特定の細胞との親和性を高める配列を有するペプチドを固定化した基材が知られている。例えば特許文献１では細胞表面のタンパク質や糖鎖に強い親和性を発現するアミノ酸配列を有する合成ペプチドを化学結合で基材表面に固定化している。特許文献２では細胞の遊走性や増殖を促進する機能を有するアミノ酸配列のペプチドを化学的に結合させたゲルが開発されている。基材表面への固定方法も様々な開発が行われてきた。例えば特許文献３では抗菌性の機能を持つ特定配列のペプチドにスペーサー分子を付与した上で、スペーサーを介して基材に固定化している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００７−１５９８７４
【特許文献２】特開２００６−２７２００２
【特許文献３】特開２０１０−１８４０２２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＥＣＭ分子は生物由来であるため、生体内で分解されると免疫反応を惹起する抗原ペプチドとなる可能性がある。また、特許文献１−３のような特定の配列を有するペプチドを製造するには、特別な装置や高いコストが必要となる。一方、単純な配列であるポリリシンは安全面やコスト面では優れているが、生体内においては不安定で基材表面から遊離してしまう。安定的にペプチドを固定化する方法として化学結合を介した修飾法が用いられているが、反応条件によって基材物性が変化したり、分解したりする問題点がある。【０００５】
本発明は、免疫反応を惹起しにくく、かつ細胞接着効果を長く持続し得る細胞接着性材料を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の課題を解決するため、本発明は、リシン、アルギニンおよびヒスチジンからなる群より選択される１種または２種以上の塩基性アミノ酸残基を４０％以上７５％以下含み、かつロイシン、イソロイシン、グリシン、アラニン、バリン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファンおよびメチオニンからなる群より選択される１種または２種以上の疎水性アミノ酸残基を２５％以上含むペプチドを含むペプチド群により基材表面が修飾されてなる細胞接着性材料である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、免疫反応を惹起しにくく、かつ細胞接着効果を長く持続し得る細胞接着性材料が得られる。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、本発明の細胞接着性材料（以下、単に「材料」という場合がある）について説明する。なお、本明細書においては、単一分子のペプチドを指す用語として「ペプチド」を用い、複数のペプチドの集合物を指す用語として「ペプチド群」を用いる。
【０００９】
＜細胞接着性材料＞
〔基材〕
本発明において、細胞接着性材料とは、基材表面が前記特定のペプチド群により修飾されたものであり、基材表面上または材料の内部に細胞を付着させて、基材表面上で細胞を増殖させたり、細胞特有の機能を発現させたりするために用いるためのものである。
【００１０】
基材の原料は特に限定されないが、後述するようにペプチドを疎水性相互作用で安定して吸着できるポリマーであることが好ましい。このようなポリマーとしては、具体的には、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、ポリラクチドグリコシド、ポリエーテルエーテルケトン、ポリスルフォン、ポリフッ化ビニリデン、ポリフェニレンサルファイド、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、およびこれらのコポリマーが挙げられる。基材の材料は、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、ポリラクチドグリコシド、ポリエーテルエーテルケトン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレートおよびこれらのコポリマーから選択された材料であることがより好ましい。
【００１１】
また、生体内に任意の期間留置して細胞増殖の足場として利用する医療器具の材料とする場合には、基材の原料として、いわゆる生体吸収性ポリマーを用いることが特に好ましい。生体吸収性ポリマーとは、生体内において分解され、その分解物が消費または排出されるポリマーである。特に、分解物の毒性が低く臨床実績が高い、乳酸、カプロラクトンおよびグリコール酸からなる群より選択される１種類のモノマーの重合体または２種以上のモノマーの共重合体は、生体吸収性ポリマーとして優れた使用実績を有するため、好ましく用いられる。
【００１２】
基材の形状は限定されるものではなく、本発明の細胞接着性材料の用途に適した形状を選択できる。たとえば、ｅｘ  ｖｉｖｏで細胞を培養するために用いられる細胞足場材料の形状として、編物、織物、不織布などの繊維構造体；中空糸、フィルム状、チューブ状、スポンジ状、ビーズ状、多孔質状、ゲル状、ディッシュ、プレートなどの形状を選択できる。また、細胞を除去または回収するための精製装置に用いられる基材の形状として、編物、織物、不織布などの繊維構造体；フィルム状、中空糸、スポンジ状、ビーズ状、多孔質状などの形状を選択できる。その他には、体内に移植して治療するデバイスの基材の形状として、編物、織物、不織布などの繊維構造体；中空糸、フィルム状、チューブ状、スポンジ状、ビーズ状、多孔質状、ゲル状などの形状を選択することができる。
【００１３】
〔ペプチド〕
「ペプチド」は、一般には５０残基程度までのアミノ酸がペプチド結合した化合物を指すが、本明細書においてはアミノ酸の残基数に関わらず、５０残基を超えるアミノ酸が結合したいわゆるポリペプチドも含めて「ペプチド」と呼称する。また、本明細書中におけるペプチド中のアミノ酸残基の含有率は、ペプチドを構成する全アミノ酸残基数に対する、対象とするアミノ酸残基数の百分率である。
【００１４】
本発明の細胞接着性材料は、上記のような基材の表面がペプチド群により修飾されており、当該ペプチド群を構成するペプチドとして、リシン、アルギニンおよびヒスチジンからなる群より選択される１種または２種以上の塩基性アミノ酸残基を４０％以上７５％以下含み、かつロイシン、イソロイシン、グリシン、アラニン、バリン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファンおよびメチオニンからなる群より選択される１種または２種以上の疎水性アミノ酸残基を２５％以上含むペプチドを選択することを特徴とする。
【００１５】
塩基性アミノ酸としては、静電相互作用により細胞と強く結合することから、等電点が高いアルギニンまたはリシンが好ましい。すなわち、ペプチドは、リシンおよびアルギニンからなる群より選択される１種または２種の塩基性アミノ酸残基を４０％以上７５％以下含むことが好ましい。
【００１６】
疎水性アミノ酸としては、基材表面と疎水性相互作用を形成しやすいことから、ロイシン、イソロイシン、バリンおよびフェニルアラニンのいずれか１種類以上が好ましい。すなわち、ペプチドは、ロイシン、イソロイシン、バリンおよびフェニルアラニンからなる群より選択される１種または２種以上の疎水性アミノ酸残基を２５％以上含むことが好ましい。
【００１７】
ペプチドは、疎水性相互作用による基材への吸着力を強くするために、上記の疎水性アミノ酸残基を４０％以上含むことが好ましい。また、一方で塩基性アミノ酸残基による細胞接着性を十分に維持し、かつ水への溶解性を十分確保するために、疎水性アミノ酸残基を５０％以下含むことが好ましい。
【００１８】
ペプチドは、塩基性アミノ酸残基と疎水性アミノ酸残基を前述の範囲で含んでいれば、さらにその他のアミノ酸残基を含んでも良い。ただし、塩基性アミノ酸残基の静電作用が中和されないようにするため、塩基性アミノ酸残基および疎水性アミノ酸残基のみからなるペプチドが好ましい。
【００１９】
塩基性アミノ酸と疎水性アミノ酸の組み合わせとしては、リシンとフェニルアラニン、リシンとロイシン、リシンとバリン、アルギニンとフェニルアラニン、アルギニンとロイシン、アルギニンとバリンの組み合わせが好ましい例として挙げられる。すなわち、ペプチドとしては、リシンまたはアルギニン残基のいずれかを４０％以上７５％以下含み、フェニルアラニン、ロイシンおよびバリン残基のいずれかを２５％以上含むペプチドが好ましい。
【００２０】
基材を修飾するペプチド群は、前述の塩基性アミノ酸残基と疎水性アミノ酸残基を含む構成アミノ酸残基が規則性を持つアミノ酸配列を有しないペプチドからなることが特に好ましい。ここで、規則性を持つアミノ酸配列とは生物の遺伝子にコードされたアミノ酸配列の全部または一部に基づく配列、もしくは、それを模して人工的に設計されたアミノ酸配列のことを言う。すなわち、規則性を持つアミノ酸配列を有しないペプチドからなるペプチド群とは、このような特定のアミノ酸配列を有しないペプチドからなるペプチド群である。規則性を持つアミノ酸配列を有しないペプチドとしては、具体的には、前記の塩基性アミノ酸と疎水性アミノ酸のランダム共重合体もしくは交互共重合体が好ましい。このような特定の配列を有しないペプチド群は、免疫反応を惹起しにくく、かつ、後述する液相合成で容易に合成できるため、低コストで細胞接着性材料を製造できる。中でも、ランダム共重合体が特に好ましい。
【００２１】
ペプチド群の重量平均分子量は、１０００以上であることが好ましく、細胞接着機能を高めるためには１５００以上がより好ましく、５０００以上がさらに好ましい。一方、分子量が大きくなりすぎるとペプチドの立体構造が変化して機能が発現されにくくなる可能性があるため、ペプチドの重量平均分子量は３００００以下が好ましく、１５０００以下がより好ましく、１００００以下がさらに好ましい。ペプチドの重量平均分子量は、後述する測定例１のように、ＧＰＣ（ゲルパーミエーションクロマトグラフィー）法により測定し、ポリスチレンを標準物質とする換算値として求めることができる。
【００２２】
なお、基材表面に吸着したペプチドのアミノ酸残基の割合や分子量を測定する場合、ドデシル硫酸ナトリウム等の界面活性剤溶液によって基材表面からペプチドを回収した後、エドマン分解法やＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計でアミノ酸配列を分析することで測定することができる。
【００２３】
本発明において、ペプチド群により基材表面が修飾されている状態としては、ペプチドが基材表面に化学結合を介さずに吸着していることが好ましく、さらには疎水性相互作用のみで吸着していることが好ましい。ペプチドと基材の間に化学結合が無ければ、ペプチドや基材の分解物は既知の物しか生成されないため、未知成分に対する安全性試験が不要となる。
【００２４】
本発明に用いられるペプチドは、液相合成、固相合成、または遺伝子工学的合成のいずれの手法を用いてもよいが、産業化において低コストで実施可能な利点があることから、簡単な設備で合成可能な液相合成を用いることが好ましい。液相合成を用いる場合は、実施例に示した手法でペプチドを合成することができる。
【００２５】
基材表面にペプチド群を吸着させるには、基材表面にペプチド群を接触させた後に必要に応じて乾燥させればよい。基材表面にペプチド群を接触させる方法としては、特に限定されないが、ペプチド群の水溶液に基材を浸漬する方法が好ましい。具体的には、例えば５０μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬの濃度に調製したペプチド群の水溶液に基材を浸漬し、温度４℃〜室温の環境下で１時間〜１２時間程度静置した後、上清を除去して１０分以上風乾する方法が挙げられる。
【００２６】
基材表面におけるペプチドの修飾密度は、０．０４０μｇ／ｃｍ２以上であることが好ましく、基材表面にムラ無く修飾されるよう０．０８０μｇ／ｃｍ２以上がより好ましく、０．１００μｇ／ｃｍ２以上がさらに好ましい。ペプチドの修飾密度は、例えば色素吸着法を用いて確認できる。色素吸着法とは、アニオン性色素であるＯｒａｎｇｅ２の基材に対する吸着量を測定する方法であり、具体的には後述する測定例３の方法で行うことができる。カチオン性残基（アルギニン、リシン）１モルに対してＯｒａｎｇｅ２が１モル結合するため、吸着したＯｒａｎｇｅ２の量から、基材表面の単位面積あたりカチオン性残基の量を算出できる。基材表面の単位面積あたりカチオン性残基の量と、ペプチド中のカチオン性残基の比率と各残基の分子量から基材表面の単位面積あたりに吸着したペプチド量であるペプチド修飾密度（μｇ／ｃｍ２）を算出できる。
【実施例】
【００２７】
［測定例１］ペプチド群の重量平均分子量
保護基の付いたペプチド群を移動相に溶解し、０．４５μｍのシリンジフィルター（ＤＩＳＭＩＣ−１３ＨＰ；ＡＤＶＡＮＴＥＣ）を通過させて不純物等を除去した後、ＧＰＣ法により測定し、ペプチドの重量平均分子量を算出した。ＧＰＣ測定の条件は下記の通りである。
機器名：Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所）
移動相：１０ｍＭ  臭化リチウム（和光純薬工業）のジメチルホルムアミド（ＨＰＬＣ）（和光純薬工業）溶液
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
カラム：Ｔｓｋｇｅｌ  Ｓｕｐｅｒ  ＡＷ３０００（φ６．０ｍｍＸ１５０ｍｍ；東ソー）
検出器：ＵＶ（２５４ｎｍ）、ＲＩ
カラム、検出器温度：４０℃
標準物質：ポリスチレン。【００２８】
［測定例２］ペプチド群におけるアミノ酸残基の含有率
ＮＭＲ測定装置（ＪＮＭ−ＥＸ２７０，日本電子）を用いて測定した。合成したペプチド群を重水に溶解し、１Ｈ−ＮＭＲより測定した。６．５〜７．５ｐｐｍのスペクトルがフェニルアラニンのフェニル基のプロトン、１〜２ｐｐｍのスペクトルがリシンの側鎖の炭素に結合するプロトンをそれぞれ表している。フェニルアラニンのスペクトルの強度の積分値をフェニルアラニンのプロトン数で除した値をＦ、リシンのスペクトルの強度の積分値をリシンのプロトン数で除した値をＫとすると、フェニルアラニン残基の含有率とリシン残基の含有率はそれぞれ下記の様に算出できる。
フェニルアラニン残基含有の百分率  ＝  Ｆ／（Ｆ＋Ｋ）×１００
リシン残基含有の百分率  ＝  Ｋ／（Ｆ＋Ｋ）×１００。【００２９】
［測定例３］ペプチド修飾密度
Ｏｒａｎｇｅ２（和光純薬工業）を１０ｍｇ秤量し、ｐＨ４．０の酢酸緩衝液５０ｍＬに溶解し染色液とした。ペプチド群で表面修飾した１２ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ社）のペプチド修飾密度を測定する場合は、まず各ウェルに染色液を１ｍＬずつ添加し、３７℃で１時間静置させ、その後に染色液を吸引して水分を取り除き、各ウェルに１ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液を１．５ｍＬ添加し、３０分振盪させ、Ｏｒａｎｇｅ２抽出液を作成した。また、ペプチド群で表面修飾したフィルムのペプチド修飾密度を測定する場合は、ペプチド群で表面修飾したフィルムを１２ウェルプレートの各ウェルに１枚ずつ配置し、それぞれに染色液１ｍＬを添加し、３７℃で１時間振盪後、染色液を吸引して水分を取り除いた。その後、フィルムを新しい１２ウェルプレートに移して各ウェルに１ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液を１．５ｍＬ添加し、３０分振盪させ、Ｏｒａｎｇｅ２抽出液を作成した。【００３０】
染色液を１ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液で２．０，１．５，１．０，０．５，０．２，０．１５，０．１０，０．０５μｇ／ｍＬとなるようそれぞれ希釈し、検量線のサンプルとした。【００３１】
上記のようにして得られたＯｒａｎｇｅ２抽出液および検量線サンプルを３００μＬずつ、９６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ）にとり、マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５）を用いて、波長４８２ｎｍと６５０ｎｍにおける吸光度を測定した。６５０ｎｍの吸光度をベースラインとして、４８２ｎｍの吸光度を補正した。検量線サンプルの４８２ｎｍの吸光度の補正値と濃度から一次近似で検量線を作成した。Ｏｒａｎｇｅ２抽出液サンプルの吸光度の補正値を該検量線に当てはめ、Ｏｒａｎｇ２抽出液におけるＯｒａｎｇ２の濃度を計算した。Ｏｒａｎｇｅ２の濃度をＣ（μｇ／ｍＬ）、染色液が接触した基材の表面積をＳ（ｃｍ２）とした時のＯｒａｎｇｅ２の吸着量密度Ｘ（μｇ／ｃｍ２）は下記式で計算する。
Ｘ  ＝  Ｃ×１．５／Ｓ
Ｏｒｅｎｇｅ２の分子量を３５０．３２、ペプチド内のリシン残基の分子量を１２８．１７、ペプチド内のフェニルアラニン残基の分子量を１４７．１８としたとき、ペプチド修飾密度Ｙ（μｇ／ｃｍ２）は下記式で計算できる。
Ｙ  ＝  （Ｘ／３５０．３２）×１２８．１７＋（Ｘ／３５０．３２）×（Ｆ／Ｋ）×１４７．１８。【００３２】
［測定例４］細胞接着率
細胞接着の性能は細胞接着率を以下の手順で算出することで評価した。２４ウェルプレートの各ウェル内に５００００個／ｍＬの濃度で調製したＩＭＳ−３２（コスモバイオ社）の細胞懸濁液を１ｍＬ添加し、温度３７℃、５％ＣＯ２環境下のインキュベータ（サーモフィッシャー社）で培養した。翌日に上清を除去し、４％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）溶液（和光純薬）を各ウェル内に５００μＬずつ添加し、５分間静置して細胞を固定した。上清を除去し、ＰＢＳ（和光純薬）を各ウェル内に５００μＬずつ添加して洗浄することを３回繰り返した。洗浄後、１μｇ／ｍＬに調製したＤＡＰＩ（和光純薬  品番）水溶液を各ウェル内に２００μＬ添加し、核を染色した。蛍光顕微鏡（オリンパス）を用いて、各ウェルをランダムに５点撮影した。画像解析ソフト（ＩｍａｇｅＪ）を用いて写真中の細胞数をカウントし、細胞密度（個／ｍｍ２）を測定した。測定した細胞密度を播種細胞数に基づく理論値の細胞密度で除し、百分率で表記したのが細胞接着率である。【００３３】
＜ペプチド修飾細胞培養プレート＞
［実施例１］
〔ペプチドの合成〕
Ｎ−Ｃｂｚ−Ｌｙｓ−ＮＰＣ（渡辺化学）３００ｍｇと、Ｐｈｅ−ＮＰＣ（渡辺化学）２１４ｍｇを１００ｍＬ二口ナスフラスコに採取し、アルゴン雰囲気下とした。これを１．５ｍＬのジメチルアセトアミド（和光純薬工業）に溶解し、ジメチルアセトアミドで１Ｍの濃度に調製したノルマルブチルアミン３８μＬを添加し、１００℃で８時間反応させた。反応後の混合物を４０ｍＬのジエチルエーテルに添加し、保護基が付いたペプチド群を沈殿させた。精製のために、沈殿物を回収し、４ｍＬのクロロホルムで溶解し、４０ｍＬのジエチルエーテルに添加し、再沈殿させる操作を２回実施し、保護基が付いたペプチド群を得た。得られた保護基付きペプチド群２００ｍｇを５．７ｍＬのトリフルオロ酢酸に溶解したサンプルを用いて、前記測定例１および２に従って、重量平均分子量および各アミノ酸残基の含有率を測定した。【００３４】
脱保護のために、保護基の付いたペプチド群をそれぞれ１００ｍＬナスフラスコに採取し、トリフルオロ酢酸（和光純薬工業）に溶解させた後、トリフルオロ酢酸の１０分の１の量の臭化水素（３０％酢酸溶液、和光純薬工業）を添加し、室温で２時間反応させた。反応後の混合物を１００ｍＬのジエチルエーテルに添加し、ペプチド群を沈殿させた。精製のために、沈殿物を４ｍＬの５０％メタノール水溶液で溶解し、６０ｍＬのジエチルエーテルに添加し、再沈殿させる操作を２回実施した。精製後の沈殿物を水に溶かし、凍結乾燥することでペプチド群を得た。【００３５】
〔基材の修飾〕
精製したペプチド群を１０ｍｇ秤量し、ＰＢＳ（−）（和光純薬工業）１０ｍＬで溶解し、濃度１ｍｇ／ｍＬのペプチド原液を調製した。このペプチド原液をさらに２０倍に希釈し、修飾用ペプチド溶液を調製した。【００３６】
この修飾用ペプチド溶液を、ポリスチレン製１２ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）に１ウェルあたり１ｍＬずつ入れ、室温で終夜静置した後、ペプチド溶液を除去した。その後、各ウェル内にイオン交換水１ｍＬを添加、除去する操作を３回繰り返して洗浄し、風乾して、ウェルの底面がリシン／フェニルアラニンがランダムに配列したペプチド群により修飾された細胞培養プレートを得た。【００３７】
［実施例２］
ノルマルブチルアミンの添加量を１９μＬに変更した点以外は実施例１と同様にして細胞培養プレートを得た。重量平均分子量および各アミノ酸残基の含有率は、得られた保護基付きペプチド群２６０ｍｇを７．４ｍＬのトリフルオロ酢酸に溶解したサンプルを用いて測定した。【００３８】
［実施例３］
ノルマルブチルアミンの添加量を７５μＬに変更した点以外は実施例１と同様にして細胞培養プレートを得た。重量平均分子量および各アミノ酸残基の含有率は、得られた保護基付きペプチド群２７０ｍｇを７．７ｍＬのトリフルオロ酢酸に溶解したサンプルを用いて測定した。【００３９】
［実施例４］
ノルマルブチルアミンの添加量を１５０μＬに変更した点以外は実施例１と同様にして細胞培養プレートを得た。重量平均分子量および各アミノ酸残基の含有率は、得られた保護基付きペプチド群１７０ｍｇを４．８ｍＬのトリフルオロ酢酸に溶解したサンプルを用いて測定した。【００４０】
［実施例５］
Ｎ−Ｃｂｚ−Ｌｙｓ−ＮＰＣを１５０ｍｇ、Ｐｈｅ−ＮＰＣを３２１ｍｇに変更した点以外は実施例１と同様にして細胞培養プレートを得た。重量平均分子量および各アミノ酸残基の含有率は、得られた保護基付きペプチド群１３８ｍｇを３．９ｍＬのトリフルオロ酢酸に溶解したサンプルを用いて測定した。【００４１】
［実施例６］
Ｎ−Ｃｂｚ−Ｌｙｓ−ＮＰＣを４５０ｍｇ、Ｐｈｅ−ＮＰＣを１０７ｍｇに変更した点以外は実施例１と同様にして細胞培養プレートを得た。重量平均分子量および各アミノ酸残基の含有率は、得られた保護基付きペプチド群２８２ｍｇを８．０ｍＬのトリフルオロ酢酸に溶解したサンプルを用いて測定した。【００４２】
［実施例７］
ペプチド群として、シグマアルドリッチ社にて委託合成した、リシン残基とフェニルアラニン残基が交互に繰り返す配列である１０アミノ酸残基からなるペプチド（重量平均分子量１４１７）を用いて修飾用ペプチド溶液を調製した点以外は実施例１と同様にして細胞培養プレートを得た。【００４３】
［比較例１］
ペプチド群を市販のポリリシン（シグマアドリッチ）を用いて修飾用ペプチド溶液を調製した点以外は実施例１と同様にして細胞培養プレートを得た。【００４４】
＜ペプチド修飾ＰＣＬ／ＰＬＡフィルム＞
［実施例８］
〔Ｌ−乳酸／εーカプロラクトンコポリマー（ＬＡ／ＣＬコポリマー）からなるフィルムの作製〕
５０．０ｇのＬ−ラクチド（ＰＵＲＡＳＯＲＢ  Ｌ；ＰＵＲＡＣ）と、３８．５ｍＬのε−カプロラクトン（和光純薬工業）とを、モノマーとしてセパラブルフラスコに採取した。アルゴン雰囲気下とし、触媒として１４．５ｍＬのトルエン（超脱水）（和光純薬工業）に溶解した０．８１ｇのオクチル酸スズ（ＩＩ）（和光純薬工業）、および助開始剤としてイオン交換水をモノマー／助開始剤比が１４２．９となるよう添加し、９０℃で１時間助触媒反応を行った後、１５０℃で６時間重合反応させて、粗コポリマーを得た。【００４５】
得られた粗コポリマーを１００ｍＬのクロロホルムに溶解し、攪拌状態にある１４００ｍＬのメタノールに滴下して、沈殿物を得た。この操作を３回繰り返して精製し、沈殿物を７０℃で減圧乾燥してマクロマーを得た。【００４６】
当該マクロマー６５ｇと、触媒である２．４ｇのｐ−トルエンスルホン酸４，４−ジメチルアミノピリジニウム（合成品）と、０．８６ｇの４，４−ジメチルアミノピリジン（和光純薬工業）を採取した。これらをアルゴン雰囲気下とし、３０重量％の濃度となるようジクロロメタン（脱水）（和光純薬工業）に溶解し、４０ｍＬのジクロロメタンに溶解した縮合剤である１２ｇのジシクロヘキシルカルボジイミド（シグマアルドリッチ）を添加し、室温で２日間縮合重合させた。【００４７】
反応混合物に２５０ｍＬのクロロホルムを添加し、攪拌状態にある４０００ｍＬのメタノールに滴下して、沈殿物を得た。この沈殿物を４００ｍＬのクロロホルムに溶解し、攪拌状態にある４０００ｍＬのメタノールに滴下して、沈殿物を得た。この操作を２回繰り返して精製し、沈殿物としてＬＡ／ＣＬコポリマーを得た。【００４８】
このＬＡ／ＣＬコポリマーを減圧乾燥し、これを濃度が５重量％になるようにクロロホルムに溶解させ、その溶液をテフロン（登録商標）製シャーレ上に移し、常圧、室温下で１昼夜乾燥させた。これを減圧乾燥し、ＬＡ／ＣＬコポリマーからなるフィルムを得た。【００４９】
〔ペプチドによる修飾〕
得られたポリマーフィルムを１ｃｍ四方に切り出し、１．５ｍＬサイズの低吸着チューブ（エッペンドルフ）に入れ、実施例１と同様に調整した１ｍＬの修飾用ペプチド溶液を加えた。室温で終夜静置した後、新たに用意した１．５ｍＬサイズの低吸着チューブにフィルムを移し、続いて、イオン交換水１ｍＬを添加、除去する操作を３回繰り返して洗浄した後、風乾することで、表面がリシン／フェニルアラニンがランダムに配列したペプチド群により修飾された細胞接着性フィルムを得た。得られたフィルムを１２ウェルプレート内に設置し、測定例４に従って細胞接着率評価を実施した。【００５０】
［実施例９］
ペプチド群として、シグマアルドリッチ社にて委託合成した、リシン残基とフェニルアラニン残基が交互に繰り返す配列である１０アミノ酸残基からなるペプチド（重量平均分子量１４１７）を用いて修飾用ペプチド溶液を調製した点以外は実施例８と同様にして、細胞接着性フィルムを得た。【００５１】
［比較例２］
ペプチド群として市販のポリリシン（重量平均分子量２２５００）（シグマアドリッチ）を用いて修飾用ペプチド溶液を調製した点以外は実施例８と同様に、細胞接着性フィルムを得た。【００５２】
［実施例１０］
Ｎ−Ｃｂｚ−Ｌｙｓ−ＮＰＣを２９１ｍｇに変更し、Ｐｈｅ−ＮＰＣの代わりにＧｌｙ−ＮＰＣ（渡辺化学）を７１ｍｇとＬｅｕ−ＮＰＣ（渡辺化学）を９１ｍｇ用いた点以外は実施例４と同様にして細胞培養プレートを得た。重量平均分子量および各アミノ酸残基の含有率は、得られた保護基付きペプチド群１６９．１ｍｇを４．８ｍＬのトリフルオロ酢酸に溶解したサンプルを用いて測定した。【００５３】
［実施例１１］
Ｌｅｕ−ＮＰＣの代わりにＡｓｐ−ＮＰＣ（渡辺化学）を１１２ｍｇ用いた点以外は実施例１０と同様にして細胞培養プレートを得た。重量平均分子量および各アミノ酸残基の含有率は、得られた保護基付きペプチド群１５８．９ｍｇを４．５ｍＬのトリフルオロ酢酸に溶解したサンプルを用いて測定した。【００５４】
［実施例１２］
Ｎ−Ｃｂｚ−Ｌｙｓ−ＮＰＣを２４１ｍｇ、Ｇｌｙ−ＮＰＣを５９ｍｇ、Ｌｅｕ−ＮＰＣを７６ｍｇ、Ａｓｐ−ＮＰＣを９３ｍｇに変更した点以外は実施例１０と同様にして細胞培養プレートを得た。重量平均分子量および各アミノ酸残基の含有率は、得られた保護基付きペプチド群１３９．７ｍｇを４．０ｍＬのトリフルオロ酢酸に溶解したサンプルを用いて測定した。【００５５】
［実施例１３］
フェニルアラニンをロイシンに変更した点以外は実施例７と同様にして細胞培養プレートを得た。【００５６】
［実施例１４］
フェニルアラニンをバリンに変更した点以外は実施例７と同様にして細胞培養プレートを得た。【００５７】
［実施例１５］
リシンをアルギニンに変更した点以外は実施例７と同様にして細胞培養プレートを得た。【００５８】
［実施例１６］
リシンをアルギニンに変更した点以外は実施例１３と同様にして細胞培養プレートを得た。【００５９】
［実施例１７］
リシンをアルギニンに変更した点以外は実施例１４と同様にして細胞培養プレートを得た。【００６０】
［比較例３］
Ｎ−Ｃｂｚ−Ｌｙｓ−ＮＰＣを１６２ｍｇ、Ｇｌｙ−ＮＰＣを７９ｍｇ、Ｌｅｕ−ＮＰＣを１０２ｍｇ、Ａｓｐ−ＮＰＣを１２５ｍｇに変更した点以外は実施例１２と同様にして細胞培養プレートを得た。重量平均分子量および各アミノ酸残基の含有率は、得られた保護基付きペプチド群７６．２ｍｇを２．２ｍＬのトリフルオロ酢酸に溶解したサンプルを用いて測定した。【００６１】
各実施例、比較例におけるペプチドと基材の情報および得られた材料のペプチド修飾密度および細胞接着率を表１に示す。【００６２】
［比較例４］
ペプチド群として、シグマアルドリッチ社にて委託合成した、アルギニン残基、グリシン残基およびアスパラギン酸残基がこの順に３回繰り返す配列である９アミノ酸残基からなるペプチド（重量平均分子量１１４６）を用いて修飾用ペプチド溶液を調製した点以外は実施例７と同様にして細胞培養プレートを得た。【００６３】
【表１】
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【国際調査報告】
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