(57)【要約】  始原生殖細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで原始卵胞に分化する方法は、始原生殖細胞及び前記始原生殖細胞に隣接する支持細胞を、加圧条件下又は低酸素濃度条件下で培養する方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
始原生殖細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで原始卵胞に分化する方法であって、
始原生殖細胞及び前記始原生殖細胞に隣接する支持細胞を、加圧条件下又は低酸素濃度条件下で培養する方法。
【請求項２】
前記培養を、加圧条件下及び低酸素濃度条件下で行う請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記培養を、ＰＩ３キナーゼ阻害剤存在下で行う請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＰＩ３キナーゼ阻害剤がＬＹ２９４００２である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記培養を、エストロジェン又は前記エストロジェンと類似の機能を有する因子の影響を排除する条件下で行う請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記低酸素濃度条件が、培養雰囲気中の酸素濃度が７％以下の条件である請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記低酸素濃度条件が、培養雰囲気中の酸素濃度が３％以上７％以下の条件である請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記加圧条件が、２３ｋＰａ超４０ｋＰａ以下の条件である請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記加圧条件が、２８ｋＰａ以上３８ｋＰａ以下の条件である請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
得られた前記原始卵胞が以下の（１）及び（２）の条件を満たす請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
（１）卵母細胞が偏平な顆粒膜細胞に囲まれている；
（２）前記卵母細胞の核内に、卵胞成熟を休止期に維持する機能を有する転写因子が局在する
【請求項１１】
前記転写因子がＦｏｘｏ３ａである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
得られた前記原始卵胞が以下の（３）の条件を更に満たす請求項１０又は１１に記載の方法。
（３）直径が２０μｍ以下である
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、始原生殖細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで原始卵胞に分化する方法に関する。本願は、２０１８年６月２１日に、日本に出願された特願２０１８−１１７９８８号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
生体内には、体を構成する体細胞と遺伝情報を次世代へとつなぐ生殖細胞が存在する。特に雌性生殖細胞である卵子は初期発生を遂行する役割を担う重要な細胞である。哺乳類における雌性生殖細胞は、胎生期に始原生殖細胞が増殖した後に減数分裂へと移行し、出生とほぼ同時に大部分の細胞死を経る。生き残った卵母細胞は、周囲の顆粒膜細胞と共に原始卵胞を形成する。このように雌性生殖細胞は、胎生期の始原生殖細胞をピークに減少し、出生後は限られた数の卵母細胞を維持しながら、一部を周期的に活性化させることで排卵サイクルを維持している。この排卵サイクルの起点となるのが原始卵胞であり、卵母細胞が一層の扁平な顆粒膜細胞に囲まれた状態で卵巣皮質に存在する。また、排卵サイクルにおいて、原始卵胞は、一次卵胞、二次卵胞、胞状卵胞、グラーフ卵胞（成熟卵胞）と発育し、排卵する。しかしながら、原始卵胞の維持、活性化機構の全容はいまだ明らかにされていない。したがって、始原生殖細胞から原始卵胞を分化させる体外培養法の確立は、原始卵胞の維持、活性化機構を解明するアプローチとなり得る。さらにこのような培養法が確立できると体内及び体外における継続可能な卵子形成が可能となる。【０００３】
近年、始原生殖細胞から機能的に成熟した卵母細胞へと分化させる培養方法が確立された（例えば、特許文献１及び非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１７／０４７７９９号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Morohaku K. et al., “Complete in vitro generation of fertile oocytes from mouse primordial germ cells.”, Proc Natl Acad Sci, Vol. 113, No. 32, p9021-9026, 2016.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１及び非特許文献１に記載の方法では、原始卵胞の形成は確認されておらず、機能的な卵子形成は一過的であった。【０００７】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、始原生殖細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで原始卵胞に分化する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、始原生殖細胞及び前記始原生殖細胞に隣接する支持細胞を、加圧条件又は低酸素濃度条件下で培養することで原始卵胞を形成できることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００９】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
本発明の第１態様に係る方法は、始原生殖細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで原始卵胞に分化する方法であって、始原生殖細胞及び前記始原生殖細胞に隣接する支持細胞を、加圧条件下又は低酸素濃度条件下で培養する方法である。
上記第１態様に係る方法において、前記培養を、加圧条件下及び低酸素濃度条件下で行ってもよい。
上記第１態様に係る方法において、前記培養を、ＰＩ３キナーゼ阻害剤存在下で行ってもよい。
上記第１態様に係る方法において、前記ＰＩ３キナーゼ阻害剤がＬＹ２９４００２であってもよい。
上記第１態様に係る方法において、前記培養を、エストロジェン又は前記エストロジェンと類似の機能を有する因子の影響を排除する条件下で行ってもよい。
上記第１態様に係る方法において、前記低酸素濃度条件が、培養雰囲気中の酸素濃度が７％以下の条件であってもよい。
上記第１態様に係る方法において、前記低酸素濃度条件が、培養雰囲気中の酸素濃度が３％以上７％以下の条件であってもよい。
上記第１態様に係る方法において、前記加圧条件が、２３ｋＰａ超４０ｋＰａ以下の条件であってもよい。
上記第１態様に係る方法において、前記加圧条件が、２８ｋＰａ以上３８ｋＰａ以下の条件であってもよい。
上記第１態様に係る方法において、得られた前記原始卵胞が以下の（１）及び（２）の条件を満たしてもよい。
（１）卵母細胞が偏平な顆粒膜細胞に囲まれている；
（２）前記卵母細胞の核内に、卵胞成熟を休止期に維持する機能を有する転写因子が局在する
上記第１態様に係る方法において、前記転写因子がＦｏｘｏ３ａであってもよい。
上記第１態様に係る方法において、得られた前記原始卵胞が以下の（３）の条件を更に満たしてもよい。
（３）直径が２０μｍ以下である
【発明の効果】
【００１０】
上記態様の方法によれば、始原生殖細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで原始卵胞に分化することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ａ〜ｄは、参考例１における生後３．５日齢の雌マウスの生殖巣切片の免疫染色像である。スケールバーは１０μｍである。ａは、生殖細胞マーカーのＭｏｕｓｅ  Ｖａｓａ  ｈｏｍｏｌｏｇ（ＭＶＨ）に対する抗体を用いた免疫染色像である。ｂは、細胞外基質であるフィブロネクチンに対する抗体を用いた免疫染色像である。ｃは、ストレスファイバーであるＦ−ａｃｔｉｎに特異的に結合するＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識ファロイジン（Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ）を用いた染色像である。また、ｄは、ａ〜ｃにおける染色像に、４’,６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）による核染色像を重ねた画像である。また、ａ’〜ｄ ’は、それぞれａ〜ｄ内の四角で囲った部分の拡大像である。スケールバーは１０μｍである。ｅ〜ｈは、参考例１における受精後１２．５日齢の雌マウスの生殖巣切片の免疫染色像である。スケールバーは１０μｍである。ｅは、生殖細胞マーカーのＭＶＨに対する抗体を用いた免疫染色像である。ｆは、細胞外基質であるフィブロネクチンに対する抗体を用いた免疫染色像である。ｇは、ストレスファイバーであるＦ−ａｃｔｉｎに対する抗体を用いた免疫染色像である。また、ｈは、ａ〜ｃにおける免疫染色像に、ＤＡＰＩによる核染色像を重ねた画像である。また、ｅ’〜 ｈ ’は、それぞれｅ〜ｈ内の四角で囲った部分の拡大像である。
【図２】ａ〜ｃは、実施例１における受精後１２．５日齢の雌マウスの生殖巣を加圧条件下で培養し、培養開始から２１日目に採取した生殖巣切片の免疫染色像である。ａは、生殖細胞マーカーのＭＶＨに対する抗体を用いた免疫染色像である。ｂは、転写因子Ｆｏｘｏ３ａに対する抗体を用いた免疫染色像である。ｃは、ａ及びｂにおける免疫染色像に、ＤＡＰＩによる核染色像を重ねた画像である。スケールバーは１０μｍである。
【図３】実施例１における受精後１２．５日齢の雌マウスの生殖巣を定常条件下（Ｃｏｎｔｒｏｌ）及び加圧条件下（Ｐｒｅｓｓｕｒｅｄ）で培養し、培養開始から２１日目に採取した生殖巣切片の蛍光実体顕微鏡による撮影像である。卵母細胞マーカーであるＳｔｅｌｌａの発現制御下に発現させているシアン蛍光タンパク質（ｃｙａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＣＦＰ）の蛍光により、卵母細胞を可視化した。スケールバーは５０μｍである。
【図４Ａ】実施例１における生理食塩水（ＰＢＳ）、タンパク質分解酵素処理（ＣＴＫ）、及び、加圧条件下におけるタンパク質分解酵素処理（ＣＴＫ（Ｐ））を１時間行い、固定した生後７．５日齢の雌マウスの生殖巣の免疫染色像である。ａ、ｅ及びｉは、生殖細胞マーカーＳｔｅｌｌａの発現制御下に発現するＣＦＰに対する染色像である。ｂ、ｆ及びｊは、転写因子Ｆｏｘｏ３ａに対する抗体を用いた免疫染色像である。ｃ、ｇ及びｋは、生殖細胞マーカーのＭＶＨに対する抗体を用いた免疫染色像である。ｄは、上記ａ〜ｃにおける染色像に、ＤＡＰＩによる核染色像を重ねた画像である。ｈは、上記ｅ〜ｇにおける染色像に、ＤＡＰＩによる核染色像を重ねた画像である。ｌは、上記ｉ〜ｋにおける染色像に、ＤＡＰＩによる核染色像を重ねた画像である。スケールバーは１０μｍである。
【図４Ｂ】実施例１における生理食塩水（ＰＢＳ）、タンパク質分解酵素処理（ＣＴＫ）、及び、加圧条件下におけるタンパク質分解酵素処理（ＣＴＫ（Ｐ））を１時間行い、固定した生後７．５日齢の雌マウスの生殖巣での転写因子Ｆｏｘｏ３ａを核内局在する卵母細胞の割合を示すグラフである。
【図５】ａ〜ｃは、実施例２における受精後１２．５日齢の雌マウスの生殖巣を低酸素濃度条件下で培養し、培養開始から２１日目に採取した生殖巣切片の免疫染色像である。ａは、生殖細胞マーカーのＭＶＨに対する抗体を用いた免疫染色像である。ｂは、転写因子Ｆｏｘｏ３ａに対する抗体を用いた免疫染色像である。ｃは、ａ及びｂにおける免疫染色像に、ＤＡＰＩによる核染色像を重ねた画像である。スケールバーは１０μｍである。
【図６Ａ】参考例２における受精後１２．５日齢の雌マウスの生殖巣を培養し、培養開始から６日目からＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２（以下、「Ｌｙ」と略記する場合がある）を添加し、培養開始から１６日目に採取した生殖巣切片の蛍光実体顕微鏡による撮影像である。上段の図は明視野像、中段の図は蛍光像、下段の図はそれぞれ中段の図の拡大像である。中段及び下段の図では、卵母細胞マーカーであるＳｔｅｌｌａの発現制御下に発現させているＣＦＰの蛍光により、卵母細胞を可視化した。スケールバーは５０μｍである。
【図６Ｂ】上記図６Ａに示す蛍光像を用いて、Ｓｔｅｌｌａ−ＣＦＰの発現を指標に卵母細胞の数をカウントすることで算出された各サイズの卵母細胞の割合を示すグラフである。
【図７】実施例３における受精後１２．５日齢の雌マウスの生殖巣を培養し、培養開始から６日目からＬｙを添加し、さらに加圧条件下（Ｐｒｅｓｓ（３３．３ｋＰａ））で培養し、培養開始から１６日目に採取した生殖巣切片の免疫染色像である。ａ及びｅは、生殖細胞マーカーＳｔｅｌｌａの発現制御下に発現するＣＦＰに対する染色像である。ｂ及びｆは、転写因子Ｆｏｘｏ３ａに対する抗体を用いた免疫染色像である。ｃ及びｇは、生殖細胞マーカーのＭＶＨに対する抗体を用いた免疫染色像である。ｄは、上記ａ〜ｃにおける染色像に、ＤＡＰＩによる核染色像を重ねた画像である。ｈは、上記ｅ〜ｇにおける染色像に、ＤＡＰＩによる核染色像を重ねた画像である。スケールバーは１０μｍである。
【図８Ａ】図７のｂ及びｆに示す免疫染色像を解析し、２０μｍ以下の卵母細胞における転写因子Ｆｏｘｏ３ａを細胞核に局在する卵母細胞の割合を示すグラフである。
【図８Ｂ】図７のｂ及びｆに示す免疫染色像を解析し、２０μｍ以下の卵母細胞における転写因子Ｆｏｘｏ３ａを細胞質基質に局在する卵母細胞の割合を示すグラフである。
【図９】実施例４における出生後３．５日齢の卵巣、及び受精後１２．５日齢の雌マウスの生殖巣を各条件下で培養し、培養開始から２１日目に採取した生殖巣切片のフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。上段は細胞の大きさを示す前方散乱光（ＦＳＣ）と、生殖細胞マーカーＳｔｅｌｌａの発現制御下に発現するＣＦＰの蛍光との二次元ヒストグラムである。下段はＣＦＰ発現細胞におけるＦＳＣの分布を示すヒストグラムである。下段の左端の「Ｍｅｒｇｅ」は、下段の４つのヒストグラムを重ね合わせたものである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
≪始原生殖細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで原始卵胞に分化する方法≫
本実施形態の方法は、始原生殖細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで原始卵胞に分化する方法であって、始原生殖細胞及び前記始原生殖細胞に隣接する支持細胞を、加圧条件下又は低酸素濃度条件下で培養する方法である。なお、この培養する工程を、以下において「工程（Ａ）」と称する場合がある。
【００１３】
本実施形態の方法によれば、始原生殖細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで原始卵胞に分化することができる。
従来の体外培養法では、原始卵胞の形成は確認されておらず、機能的な卵子形成は一過的であった。これに対し、本実施形態の方法によれば、効率的に、始原生殖細胞及び前記始原生殖細胞に隣接する支持細胞を、原始卵胞に分化させることができる。また、一次卵胞、二次卵胞等、分化が進んだ卵胞は、胎内に戻して分化誘導することが困難であるのに対し、原始卵胞は胎内に戻して分化誘導させることができる。よって、本実施形態の方法によれば、持続可能な卵子形成が可能となる。なお、ここでいう「卵胞」とは、卵細胞とそれを取り巻く体細胞（顆粒膜細胞及び莢膜細胞）とからなるものである。また、本実施形態の方法は、卵母細胞の維持及び活性化のメカニズムの解明に役立てることができる。
【００１４】
なお、本明細書において、「始原生殖細胞」とは、生殖細胞へ分化する予定の細胞であり、減数分裂を経て最終的に卵子や精子に分化する細胞を意味する。
始原生殖細胞は、生体由来のものであってもよく、多能性幹細胞より分化誘導した始原生殖細胞様細胞（ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌ：ＰＧＣＬＣ）であってもよい。生体より始原生殖細胞を回収する場合には、例えば、雌マウスの胎仔（１１．５日齢から１２．５日齢まで）より生殖巣とともに回収することができる。なお、生体より生殖巣を回収する際には、中腎を伴う形で回収してもよく、中腎を切り離しても回収してもよい。
【００１５】
また、上述の通り、本明細書において「始原生殖細胞」には多能性幹細胞より分化した始原生殖細胞様細胞が含まれる。ここで、「多能性幹細胞」とは、未分化状態を保持したまま増殖できる「自己再生能」と三胚葉系列すべてに分化できる「分化多能性」とを有する未分化細胞を意味する。多能性幹細胞としては、以下に限定されないが、例えば、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、始原生殖細胞に由来する胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、精巣組織からのＧＳ細胞の樹立培養過程で単離されるｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｇｅｒｍｌｉｎｅ ＳＴＥＭ細胞（ｍＧＳ細胞）、骨髄間葉系細胞から単離されるＭｕｓｅ細胞等が挙げられる。なお、ＥＳ細胞は体細胞から核初期化されて生じたＥＳ細胞であってもよい。上記に列挙した多能性幹細胞は、それぞれ公知の方法により得ることができる。
【００１６】
ここでいう「ｉＰＳ細胞」とは、分化した体細胞にいくつかの遺伝子を導入することによって様々な組織や器官の細胞へのリプログラミングが可能となった細胞を意味する。本実施形態の方法において、始原生殖細胞を分化誘導するために用いられるｉＰＳ細胞は、適当なドナーから採取した体細胞の初代培養細胞由来であってもよく、樹立細胞株由来であってもよい。ｉＰＳ細胞は、いかなる胚葉系細胞にも分化誘導が可能であることから、ｉＰＳ細胞の調製に用いる体細胞は、原則的には外胚葉系及び内胚葉系のいずれの胚葉系細胞由来のものであってもよい。侵襲性が低く採取が容易な皮膚、髪の毛、歯肉、血液等の細胞は、ｉＰＳ細胞の調製に用いる体細胞として好適である。ｉＰＳ細胞の調製方法については、当該分野で公知の方法に従えばよい。具体的には、例えば、「Okita K. et al.,  “Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.”, Nature, Vol. 448, p313-317, 2007.」（参考文献１）、「Hamanaka S. et al., “Generation of germline-competent rat induced pluripotent stem cells.”, PLoS One, Vol. 6, Issue 7, e22008, 2011.」（参考文献２）等の公知の文献に記載されている調製方法を利用できる。
【００１７】
また、本実施形態の方法において、始原生殖細胞を分化誘導するために用いられるＥＳ細胞は、公知の方法により得ることができる。例えば、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を採取し、当該内部細胞塊を繊維芽細胞に由来するフィーダー細胞上で培養することによって樹立することができる。その他、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立したＥＳ細胞も使用することができる。
【００１８】
また、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞から始原生殖細胞様細胞を分化誘導する方法は、公知の方法、例えば、Hayashi K. et al., “Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells.”, Cell, Vol. 146, No. 4, p519-532,  2011.」（参考文献３）等を参考にして行うことができる。
【００１９】
なお、多能性幹細胞由来ＰＧＣＬＣを始原生殖細胞として用いる場合には、分化誘導させた多能性幹細胞集団から未分化な状態の細胞を予め取り除くことが好ましい。このような方法は公知であり、例えば、多能性幹細胞に、始原生殖細胞のマーカー遺伝子であるＢｌｉｍｐ１とレポータータンパクとが結合した融合タンパクをコードする核酸を導入しておくことで、多能性幹細胞より分化誘導されたＰＧＣＬＣと未分化な細胞とをＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ）法等により容易に分離することができる。
【００２０】
ここで、本明細書における「始原生殖細胞」には上記に列挙した生体由来の始原生殖細胞や多能性幹細胞由来の始原生殖細胞様細胞であって、当該細胞の遺伝子を遺伝子工学の手法を用いて改変した細胞も含まれる。
【００２１】
生体由来の始原生殖細胞及び多能性幹細胞由来の始原生殖細胞様細胞の遺伝子を改変する方法としては、ＣＲＩＳＰＲシステム、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−Ｌｉｋｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ（ＴＡＬＥＮ）を用いた方法、ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いた方法、相同組み換え法等の公知のゲノム編集法を用いて、目的とする核酸やベクター等の導入を行うことができる。核酸やベクター等の導入法としては、例えば、顕微注入法（マイクロインジェクション）、エレクトロポーレーション法、リポフェクション法、ウイルスベクターを用いた核酸導入法等が挙げられる。また、外来遺伝子や外来の核酸フラグメントの導入法は、遺伝子改変された始原生殖細胞が本実施形態の方法により機能的な卵母細胞へ分化できる限りにおいて、上記に列挙した方法に限定されない。
【００２２】
なお、始原生殖細胞に対する遺伝子改変は、始原生殖細胞の培養期間中の適切なタイミングで行うことができる。例えば、マウスにおいては、１１．５日齢から１２．５日齢までの期間に行うことができる。また、多能性幹細胞由来の始原生殖細胞様細胞を用いる場合には、始原生殖細胞様細胞への分化誘導前の多能性幹細胞を公知の方法により遺伝子改変することもできる。
【００２３】
また、本明細書において、「支持細胞」とは、始原生殖細胞を取り囲んでいる細胞であり、性分化した卵巣においては、顆粒膜細胞や莢膜細胞へ分化する細胞を意味する。支持細胞は、将来、卵胞を構成する顆粒膜細胞や莢膜細胞へ分化するため、始原生殖細胞の共培養に用いる。よって、始原生殖細胞の培養は生殖巣をそのまま、又は、始原生殖細胞と支持細胞が接するように共培養することが好ましい。また、多能性幹細胞由来ＰＧＣＬＣを始原生殖細胞として用いる際には、生体から採取した生殖巣由来の体細胞を支持細胞として用いることができる。
【００２４】
なお、支持細胞として生体から採取した生殖巣由来の体細胞を用いる際には、上記工程（Ａ）より前に、予め、多能性幹細胞由来ＰＧＣＬＣと生殖巣由来の体細胞とからなる凝集塊を作製する培養工程を行うことが好ましい。
【００２５】
なお、生殖巣由来の体細胞を採取する方法、及び、多能性幹細胞由来ＰＧＣＬＣと生殖巣由来の体細胞とからなる凝集塊を作製する方法は、参考文献３に記載の方法に従って行うことができる。
【００２６】
例えば、生殖巣由来の体細胞を採取する方法は、生体より外科的に生殖巣を採取し、トリプシン処理等により生殖巣を構成する体細胞を解離させることができる。なお、このとき、生体由来の生殖巣に内在する生殖細胞を取り除くことが好ましい。生殖巣に内在する生殖細胞を取り除く方法は、公知の方法により行うことができ、例えば、抗ＳＳＥＡ１抗体や抗ＣＤ３１抗体を用いたＭａｇｎｅｔｉｃ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ法により内在する生殖細胞を取り除くことができる。ここで、支持細胞として体細胞を採取するための生殖巣は胎仔由来のものが好ましい。マウスの場合であれば、例えば、胎齢（「胚齢」ともいう）１２．５日のマウス胎仔由来の生殖巣を使用することができる。また、当業者であれば、本開示及び当該技術分野における技術常識から、由来する動物種により適宜好ましい時期の生殖巣を選択することができる。
【００２７】
また、多能性幹細胞由来ＰＧＣＬＣと生殖巣由来の体細胞とからなる凝集塊を作製する方法は、例えば、Ｒｅｔｉｎｏｉｃ  Ａｃｉｄを含有するＧＫ１５培地（ＧＭＥＭに１５％ＫＳＲ（ＫｎｏｃｋＯｕｔ（登録商標）  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、１×ＧｌｕｔａＭａｘ（登録商標）、１×ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（１００Ｕ／ｍＬのＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ及び０．１ｍｇ／ｍＬのｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ)、１００μＭの２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（２ＭＥ）、１μＭのＲｅｔｉｎｏｉｃ  Ａｃｉｄを添加した培地）中で、多能性幹細胞由来ＰＧＣＬＣと生殖巣由来の体細胞とを混合及び凝集させて培養することで実施することができる。培養には低吸着の培養皿を用いることが好ましい。
【００２８】
マウスの場合であれば、例えば、凝集塊を作製するための培養期間を２日以上３日以下程度とすることができ、２日が好ましい。また、当業者であれば、由来する動物種により適宜好ましい培養期間を設定することができる。
【００２９】
また、多能性幹細胞由来ＰＧＣＬＣと生殖巣由来の体細胞との混合時の割合は、作製された凝集塊が原始卵胞を形成する限りにおいて限定されないが、例えばマウスの場合においては、多能性幹細胞由来ＰＧＣＬＣと生殖巣由来の体細胞との細胞数の比を、約１：１０とすることが好ましい。
【００３０】
また、始原生殖細胞や支持細胞、又は、始原生殖細胞と支持細胞とを含む生殖巣は、凍結保存したものを用いることもできる。凍結保存方法は、公知の方法により行うことができる。例えば、始原生殖細胞や支持細胞の凍結保存は１０％ＤＭＳＯ溶液や市販の凍結剤（セルバンカー（登録商標）等）を用いた緩慢凍結法等により行うことができる。
【００３１】
なお、本実施形態の方法で使用される始原生殖細胞は、哺乳動物に由来するものを用いる。哺乳動物としては、以下に限定されないが、例えば、ヒト、チンパンジー及びその他の霊長類；イヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、ラット（ヌードラットも包含する）、マウス（ヌードマウス及びスキッドマウスも包含する）、ハムスター、モルモット等の家畜動物、愛玩動物及び実験用動物等が挙げられ、これらに限定されない。
【００３２】
次いで、本実施形態の方法の工程について、以下に詳細を説明する。
【００３３】
＜工程（Ａ）＞
工程（Ａ）では、始原生殖細胞及び前記始原生殖細胞に隣接する支持細胞を、加圧条件下又は低酸素濃度条件下で培養して、原始卵胞を形成させる。また、工程（Ａ）において、生体より採取した生殖巣を用いる場合、生殖巣より始原生殖細胞及び支持細胞を単離させる必要はなく、生殖巣をそのまま、又は、単離した始原生殖細胞と支持細胞の凝集塊、若しくは、いくつかの組織切片にして培養することができる。
【００３４】
また、本明細書において、工程（Ａ）における「始原生殖細胞及び前記始原生殖細胞に隣接する支持細胞の培養」というとき、始原生殖細胞及び支持細胞を含む生殖巣、単離した始原生殖細胞と支持細胞の凝集塊、又は、その一部を培養することを含む。なお、原始卵胞が得られる限りにおいて、生殖巣より始原生殖細胞及び支持細胞を単離させて培養することもできる。また、多能性幹細胞由来の始原生殖細胞様細胞を用いる場合には、上述のように、予め多能性幹細胞由来ＰＧＣＬＣと生殖巣由来の体細胞とからなる凝集塊を作製しておくことが好ましい。
【００３５】
加圧条件として具体的には、始原生殖細胞や支持細胞、又は、始原生殖細胞と支持細胞とを含む生殖巣を含む培養液に２３ｋＰａ超４０ｋＰａ以下の静水圧を負荷した条件が好ましく、２８ｋＰａ以上３８ｋＰａ以下の静水圧を負荷した条件がより好ましく、３０ｋＰａ以上３５ｋＰａ以下の静水圧を負荷した条件がさらに好ましく、３２ｋＰａ以上３４ｋＰａ以下の静水圧を負荷した条件が特に好ましい。
負荷する静水圧が上記範囲内であることで、より効率的に始原生殖細胞を原始卵胞に分化することができる。
また、加圧方法としては、例えば、後述の実施例に記載のとおり、ＳＴＲＥＸ社のＡＧＰ−３００１Ｓ（登録商標）等の市販の加圧培養装置を用いる方法等が挙げられる。
【００３６】
低酸素濃度条件として具体的には、培養雰囲気中の酸素濃度が７％以下の条件が好ましく、３％以上７％以下の条件がより好ましく、４％以上６％以下の条件がさらに好ましく、５％の条件が特に好ましい。
酸素濃度が上記範囲内であることで、より効率的に始原生殖細胞を原始卵胞に分化することができる。
また、低酸素濃度条件での培養方法としては、例えば、後述の実施例に記載のとおり、アステック社製のＡＰＭ３０Ｄ等の市販の酸素濃度を調整可能なインキュベーターを用いて培養する方法等が挙げられる。
【００３７】
加圧条件及び低酸素濃度条件を開始するタイミングとしては、始原生殖細胞及び前記始原生殖細胞に隣接する支持細胞の培養の開始時点から行ってもよく、原始卵胞の形成が開始される時期に合わせて培養途中から開始してもよい。
【００３８】
また、工程（Ａ）において、培養温度は、例えば２５℃以上４０℃以下とすることができ、例えば３０℃以上３７℃以下とすることができる。
【００３９】
始原生殖細胞から原子卵胞を形成させるための培養期間は、培養する始原生殖細胞の由来する動物種等により異なるが、始原生殖細胞が生体内で原子卵胞を形成するまでの期間を目安とすることが好ましい。マウスの始原生殖細胞を培養する場合には、生後１０日齢前後に相当する日数まで培養することが好ましい。例えば、胎齢１２．５日の雌マウス胎仔より始原生殖細胞を採取して培養を開始した場合には、１４日間以上２１日間以下が好ましく、１６日間以上２１日間以下がより好ましく、１８日間以上２１日間以下がさらに好ましい。また、マウスの多能性幹細胞由来ＰＧＣＬＣと体細胞との凝集塊とを培養する際には、予め作製した凝集塊の培養開始から数えて１１日間以上２１日間以下が好ましい。
【００４０】
使用する培地は、公知の基本培地を用いることができ、例えば、α−ＭＥＭ、ＰＲＭＩ１６４０、１９９、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）−３４  ＳＦＭ等が挙げられ、これら基本培地に血清又は代替血清を添加して用いることができる。しかしながら、工程（Ａ）に用いられる基本培地としては、始原生殖細胞が原始卵胞へ分化する限りにおいて上記に列挙したものに限定されない。なお、基本培地には、始原生殖細胞の原始卵胞への分化を妨げない限りにおいて、アスコルビン酸やペニシリン等の他の成分を適宜含んでよい。
【００４１】
また、始原生殖細胞から原始卵胞を形成させるための培養においては、上記に列挙するような基本培地の２つ以上を組み合わせて使用することもできる。例えば、始原生殖細胞から原始卵胞を形成させるための前半の培養にα−ＭＥＭを基本培地として用い、後半の培養にＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）−３４  ＳＦＭを基本培地として用いることができる。なお、基本的に一つの基本培地の使用により始原生殖細胞から原始卵胞の形成は達成することができるが、使用する基本培地を変えることで、顆粒膜細胞の増殖をより促進でき、形成した原始卵胞を単離する際に卵胞構造が壊れにくくなるため好ましい。このような顆粒膜細胞の増殖をより促進できる効果は、特に多能性幹細胞由来ＰＧＣＬＣと生殖巣由来の体細胞との細胞凝集塊から原始卵胞を形成させる場合に望ましい。例えば、マウスの多能性幹細胞由来ＰＧＣＬＣと生殖巣由来の体細胞との細胞凝集塊の培養においてα−ＭＥＭ及びＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）−３４  ＳＦＭの２つの基本培地を用いる場合には、凝集塊の培養開始後４日目から８日目までにα−ＭＥＭからＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）−３４  ＳＦＭへ培地の切り替えを行うことができ、培養開始後４日目がより好ましい。また、マウスの生殖巣由来始原生殖細胞を培養する場合にも、同様の時期に培地の切り替えを行うことができる。
【００４２】
また、上記のとおり、培養温度、培養期間及び使用する培地を例示したが、当業者であれば、由来する動物種により適宜好ましい培養温度、培養期間及び使用する培地の種類を設定することができる。
【００４３】
また、工程（Ａ）における始原生殖細胞の培養は、６ウェルプレート等の培養皿にＴｒａｎｓｗｅｌｌ−ＣＯＬメンブレン等の公知のインサートメンブレンを使用して行うことが好ましい。また、培養期間中、培養に用いる培地は１日おきに約半分の量を新しい培地に交換することが好ましい。培養皿やインサートメンブレン、培地交換のタイミング等については、培養する始原生殖細胞の由来する動物種等により、当業者は適宜設計して実施することができる。
【００４４】
また、本実施形態の方法において、工程（Ａ）を加圧条件下及び低酸素濃度条件下で行ってもよい。これにより、より効率的に始原生殖細胞を原始卵胞に分化することができる。また、後述する実施例に示すように、加圧条件下又は低酸素濃度条件下で培養した場合よりもサイズの小さい卵母細胞の割合がより多くなる傾向がみられる。
【００４５】
また、本実施形態の方法において、工程（Ａ）を加圧条件下又は低酸素濃度条件下に加えて、更に、ＰＩ３キナーゼ阻害剤存在下で行ってもよい。
【００４６】
なお、一般に、「ＰＩ３キナーゼ（phosphatidylinositol-3 kinase；ＰＩ３Ｋ）」とは、細胞膜の構成成分であるイノシトールリン脂質のイノシトール環３位のリン酸化を媒介する脂質キナーゼである。哺乳類では、クラスＩＡ、クラスＩＢ、クラスＩＩ、クラスＩＩＩの４つのサブクラスに分類される。近年、ＰＩ３Ｋシグナルを活性化することで、卵母細胞の成熟が進むことが報告されている（参考文献４：「Li J et al., “Activation of dormant ovarian follicles to generate mature eggs.”, PNAS, Vol. 107, No. 22, p10280-10284, 2010.」）。
発明者らは、工程（Ａ）において、加圧条件及びＰＩ３キナーゼ阻害剤の添加を組み合わせて行うことで、後述する実施例に示すように、より効率的に始原生殖細胞を原始卵胞に分化することができることを明らかにした。
【００４７】
ＰＩ３Ｋ阻害剤としては、ＰＩ３Ｋの機能を阻害するものが挙げられる。ＰＩ３Ｋ阻害剤として具体的には、例えば、低分子化合物、ＰＩ３Ｋ発現阻害剤、ＰＩ３Ｋ特異的結合物質等が挙げられる。
【００４８】
ＰＩ３Ｋ阻害剤である低分子化合物としては、例えば、Pictilisib（GDC-0941）（CAS No. 957054-30-7）、LY294002（CAS No. 154447-36-6）、Idelalisib （CAL-101, GS-1101）（CAS No. 870281-82-6）、Buparlisib（BKM120, NVP-BKM120）（CAS No. 944396-07-0）、PI-103（CAS No. 371935-74-9）、TGX-221（CAS No. 663619-89-4）、IC-87114（CAS No. 371242-69-2）、Wortmannin（CAS No. 19545-26-7）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
ＰＩ３Ｋ発現阻害剤としては、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸、低分子化合物等が挙げられる。これらのＰＩ３Ｋ発現阻害剤を投与することにより、ＰＩ３Ｋの発現量を低下させて、ＰＩ３Ｋシグナルを抑制することができる。その結果、卵母細胞の成熟を抑制することができ、さらに加圧条件及び低酸素条件のうち少なくともいずれか一方を組み合わせることで、始原生殖細胞を原始卵胞に分化誘導しながら、原始卵胞の状態を維持することができる。
【００５０】
ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉による遺伝子サイレンシングのために用いられる２１塩基対以上２３塩基対以下の低分子２本鎖ＲＮＡである。細胞内に導入されたｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体はｓｉＲＮＡと相補的な配列を持つｍＲＮＡに結合し切断する。これにより、配列特異的に遺伝子の発現を抑制する。
【００５１】
ｓｉＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドをＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、例えば、適当なアニーリング緩衝液中、９０℃以上９５℃以下程度で約１分程度変性させた後、３０℃以上７０℃以下程度で約１時間以上８時間以下アニーリングさせることにより調製することができる。
【００５２】
ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム及びアンチセンス核酸は、安定性や活性を向上させるために、種々の化学修飾を含んでいてもよい。例えば、ヌクレアーゼ等の加水分解酵素による分解を防ぐために、リン酸残基を、例えば、ホスホロチオエート（ＰＳ）、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換してもよい。また、少なくとも一部をペプチド核酸（ＰＮＡ）等の核酸類似体により構成してもよい。
【００５３】
ＰＩ３Ｋ特異的結合物質としては、ＰＩ３Ｋに特異的に結合してＰＩ３Ｋの機能を阻害するものが挙げられ、例えば、抗体、抗体断片、アプタマー等が挙げられる。抗体は、例えば、マウス等の動物に、ＰＩ３Ｋタンパク質又はその断片を抗原として免疫することによって作製することができる。或いは、例えば、ファージライブラリーのスクリーニングにより作製することができる。抗体断片としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。上記の抗体は、モノクローナル抗体であることが好ましい。また、市販の抗体であってもよい。
【００５４】
アプタマーとは、標的物質に対する特異的結合能を有する物質である。アプタマーとしては、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。標的ペプチドに特異的結合能を有する核酸アプタマーは、例えば、ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＳＥＬＥＸ）法等により選別することができる。また、標的ペプチドに特異的結合能を有するペプチドアプタマーは、例えば酵母を用いたＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法等により選別することができる。
【００５５】
ＰＩ３Ｋ阻害剤の添加量としては、使用する阻害剤の種類に応じて適宜選択することができるが、例えば、低分子化合物（特に、LY294002）である場合には、培地中の終濃度が０．０１μＭ以上３００μＭ以下程度とすることができ、０．１μＭ以上１００μＭ以下程度とすることができる。ＰＩ３Ｋ阻害剤の添加量が上記範囲内であることで、より効果的に卵母細胞の成熟を抑制することができる。
【００５６】
ＰＩ３Ｋ阻害剤を添加するタイミングとしては、始原生殖細胞及び前記始原生殖細胞に隣接する支持細胞の培養の開始時点から行ってもよく、原始卵胞の形成が開始される時期に合わせて培養途中から開始してもよい。
【００５７】
また、本実施形態の方法において、工程（Ａ）を加圧条件下又は低酸素濃度条件下に加えて、更に、エストロジェン又は前記エストロジェンと類似の機能を有する因子の影響を排除する条件下で行ってもよい。
【００５８】
なお、本明細書において、「エストロジェン」とは、性ステロイドホルモンの一種であり、卵巣の顆粒膜細胞においてアンドロジェンからの代謝で生じるものを意味する。放出されたエストロジェンは、エストロジェンレセプターに結合することにより、特定の遺伝子の転写を活性化する。エストロジェンには、エストロン（Ｅ１）、エストラジオール（Ｅ２）、及び、エストリオール（Ｅ３）の三種類が知られており、本明細書においてエストロジェンというとき、これらが含まれる。また、本明細書において、「性ステロイドホルモン」とは、エストロジェンの他、テストステロン、デヒドロテストステロン、アンドロステロン等のアンドロジェンを含む。
【００５９】
また、本明細書において、「エストロジェンと類似の機能を有する因子」、又は、「性ステロイドホルモンと類似の機能を有する因子」というとき、当該因子はエストロジェン、又は、性ステロイドホルモンの機能と同じであるか類似する機能を有するものを意味する。
【００６０】
また、本明細書において、「エストロジェンと類似の機能」又は「性ステロイドホルモンと類似の機能」というとき、始原生殖細胞を体外培養する際に、以下の（ｉ）又は（ｉｉ）を意味する。
（ｉ）始原生殖細胞由来の卵母細胞における卵母細胞シストの崩壊を阻害する機能；
（ｉｉ）原始卵胞の形成を阻害する機能の少なくとも１つの機能
【００６１】
このようなエストロジェンや性ステロイドホルモンの機能と類似する機能を有する因子としては、例えば、エストロジェン又はアンドロジェン等の性ステロイドホルモンレセプターに結合する因子が挙げられ、具体的には、培地中のフェノールレッド等が挙げられる。なお、血清中には、エストロジェンやアンドロジェンが含まれている他、未同定のエストロジェンの機能と類似する機能を有する因子が含まれている場合があるため、このようなエストロジェンや性ステロイドホルモンの機能と類似する機能を有する因子の影響を排除できる培養条件とすることが好ましい。なお、ここでいう「卵母細胞シスト」とは、胎生期に不完全な細胞質分裂により細胞間橋でつながった状態を示す。
【００６２】
ここで、「性ステロイドホルモンの影響（例えば、エストロジェン、又は、エストロジェンと類似の機能を有する因子）の影響を排除する条件下」での培養には、「性ステロイドホルモン阻害剤」の存在下で培養することが含まれる。また、その一例として、「エストロジェン阻害剤」の存在下で培養することが含まれる。なお、「性ステロイドホルモン阻害剤」には、エストロジェン阻害剤やアンドロジェン阻害剤の他、アンドロジェン阻害剤とエストロジェン阻害剤との組み合わせも含まれる。本実施形態の方法において使用する「エストロジェン阻害剤」又は「性ステロイドホルモン阻害剤」とは、エストロジェンのレセプター又は性ステロイドホルモンのレセプターの活性化を阻害できる作用を有するものである。
【００６３】
当該阻害剤として具体的には、例えば、エストロジェンレセプターのアンタゴニスト、ICI 182,780（(7R,9S,13S,14S,17S)-7-(9-(4,4,5,5,5-Pentafluoropentylsulfinyl)nonyl)-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-decahydro-13-methyl-6H-cyclopenta[a]phenanthrene-3,17-diol）が含まれる。また、同様の阻害剤として具体的には、例えば、タモキシフェンクエン酸塩、4-ヒドロキシタモキシフェン、MPP（4-[1-(4-hydroxyphenyl)-4-methyl-5-[4-[2-(1-piperidinyl)ethoxy]phenyl]-1H-pyrazol-3-yl]-phenol）、PHTPP (4-[2-Phenyl-5,7-bis(trifluoromethyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]phenol)、G15（(3aS,4R,9bR)-4-(6-Bromo-1,3-benzodioxol-5-yl)-3a,4,5,9b-3H-cyclopenta[c]quinoline）等、市販のものを使用することができる。
【００６４】
また、例えば、性ステロイドホルモン阻害剤のうち、アンドロジェンレセプターの阻害剤としては、KW-365（N-[4-[(Benzyl)(4-nitrophenyl)amino]-1-methylpyrrole-2-carbonyl]pyrrolidine）等、市販のものを使用することができる。エストロジェンや性ステロイドホルモン阻害剤としては、上記のものに限定されず、エストロジェンや性ステロイドホルモンレセプターの活性化を阻害できる作用を有し、且つ、始原生殖細胞を原始卵胞へ分化可能なものである限り使用することができる。
【００６５】
なお、エストロジェンや性ステロイドホルモン阻害剤の添加によるエストロジェンや性ステロイドホルモンレセプターの活性化阻害は、卵母細胞シスト崩壊及び原始卵胞の形成のうち少なくともいずれか一方を制御できると考えられる。そのため、エストロジェン阻害剤の添加は、卵母細胞シスト崩壊及び原始卵胞の形成のうち少なくともいずれか一方が行われるタイミングよりも、前のタイミングで添加することが好ましい。また、始原生殖細胞及び前記始原生殖細胞に隣接する支持細胞の培養の開始時点から「性ステロイドホルモンの影響（例えば、エストロジェン、又は、エストロジェンと類似の機能を有する因子の影響）を排除する条件下」で培養する必要はなく、少なくとも卵母細胞シスト崩壊及び原始卵胞の形成のうち少なくともいずれか一方が行われる時期に「性ステロイドホルモンの影響（例えば、エストロジェン、又は、エストロジェンと類似の機能を有する因子の影響）を排除する条件下」で培養することが好ましい。
【００６６】
以下、性ステロイドホルモン阻害剤としてエストロジェン阻害剤を使用し、動物種としてマウスを用いる場合を例にして説明する。例えば、マウスであれば、１７．５日齢から出生前後に多くの卵母細胞シストが崩壊する。よって、そのような胎齢の時期に相当する培養日数の日より添加することが好ましい。なお、胎齢１２．５日に生殖巣を採取し、採取日より始原生殖細胞の培養を開始した場合、体外培養５日目は胎齢１７．５日目に相当すると考える。また、エストロジェン阻害剤を含有する培地での培養期間は、卵母細胞シストの崩壊と原始卵胞の形成とが完了する期間とすることが好ましい。マウスの始原生殖細胞を培養する際には、培養５日目から培養１１日目の６日間とすることが好ましいが、この期間に限定されない。また、マウスの多能性幹細胞由来ＰＧＣＬＣと体細胞との凝集塊とを培養する際には、予め作製した凝集塊の培養開始から数えて培養７日目から培養１０日目の４日間とすることが好ましいが、この期間に限定されない。
【００６７】
なお、マウスを例にして説明したが、当業者であれば、用いる動物種ごとの卵母細胞シストの崩壊と原始卵胞の形成との時期を考慮して、「エストロジェン阻害剤」の培養期間を適宜設定することができる。また、「エストロジェン阻害剤」の使用に限らず、「性ステロイドホルモンの影響（例えば、エストロジェン、又は、エストロジェンと類似の機能を有する因子の影響）を排除する条件下」で培養する期間は、卵母細胞シストの崩壊と原始卵胞の形成とが完了する期間とすることが好ましい。なお、当該条件下での培養は、機能的な卵母細胞が得られる限りにおいて、卵母細胞シストの崩壊が始まってから初めてもよく、また、原始卵胞の形成が完全に完了する前に止めてもよい。
【００６８】
エストロジェン阻害剤や性ステロイドホルモン阻害剤は、始原生殖細胞を培養するのに用いられる公知の基本培地に添加して使用することができる。このような基本培地としては、上記に例示された基本培地と同様のものが挙げられる。
【００６９】
なお、マウスの始原生殖細胞を培養する際に、エストロジェン阻害剤として、例えば、ＩＣＩ１８２，７８０を用いる場合には、０．０１μＭ以上５０μＭ以下（終濃度）の範囲で培地に添加することが好ましく、０．１μＭ以上１０μＭ以下（終濃度）の範囲がより好ましい。なお、当業者であれば、始原生殖細胞の由来となる動物種や用いる基本培地、使用するエストロジェン阻害剤等により適宜エストロジェン阻害剤の添加のタイミングや濃度を調整して用いることができる。なお、エストロジェン阻害剤を添加していない期間の培養には、上記に例示された基本培地を用いて培養すればよい。
【００７０】
また、「性ステロイドホルモンの影響（例えば、エストロジェン、又は、エストロジェンと類似の機能を有する因子の影響）を排除する条件下」で培養する別の方法としては、無血清培地での培養が挙げられる。ここで、無血清培地とは、公知の無血清培地（例えば、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）−３４  ＳＦＭのように、そのまま使用可能に調製された無血清培地）であってもよく、又は、代替血清を使用して調製した無血清培地であってもよい。
【００７１】
代替血清を使用して無血清培地を調製する際には、例えば、ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ）の代わりに、ＳＰＳ（Ｓｅｒｕｍ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ）、ＫＳＲ、ＳＳＳ（ｓｅｒｕｍ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（登録商標）等の市販の代替血清を基本培地に添加して調製することができる。代替血清としては、ＳＰＳ又はＫＳＲが好ましい。
【００７２】
無血清培地の調製に使用する基本培地としては、上記に例示された基本培地と同様のものが挙げられる。しかしながら、工程（Ａ）に用いられる基本培地としては、始原生殖細胞が原始卵胞へ分化する限りにおいて上記に列挙したものに限定されない。
【００７３】
なお、マウスの始原生殖細胞を培養する際に、性ステロイドホルモンの影響（例えば、エストロジェン、又は、エストロジェンと類似の機能を有する因子の影響）を排除する培養条件として、例えば、ＦＢＳ等の血清の代わりにＳＰＳを用いる場合には、５％以上２０％以下（終濃度）の範囲で培地に添加することが好ましく、１０％（終濃度）がより好ましい。なお、当業者であれば、始原生殖細胞の由来となる動物種や用いる基本培地、使用する代替血清等により適宜代替血清の濃度を調整して用いることができる。
【００７４】
また、無血清培地を用いて培養を行う期間は、卵母細胞シストの崩壊と原始卵胞の形成とが完了する期間とすることが好ましい。また、工程（Ａ）における始原生殖細胞の培養期間中、終始無血清培地を用いて培養することもできる。
なお、当業者であれば、始原生殖細胞の由来となる動物種や、使用する無血清培地により、適宜血清培地から無血清培地へ切り替えるタイミングを調整して用いることができる。なお、無血清培地を用いない期間の培養には、上記に列挙した基本培地にＦＢＳ等の血清を添加した培地を用いて培養することが好ましいが、上述のように、生殖巣の培養中、終始無血清培地を用いて培養することもできる。なお、基本培地には、始原生殖細胞の原始卵胞への分化を妨げない限りにおいて、アスコルビン酸やペニシリン等の他の成分を適宜含んでよい。
【００７５】
また、本実施形態の方法を用いて得られた原始卵胞は、以下の（１）及び（２）の条件を満たすことが好ましい。
（１）卵母細胞が偏平な顆粒膜細胞に囲まれている；
（２）前記卵母細胞の核内に、卵胞成熟を休止期に維持する機能を有する転写因子が局在する
【００７６】
上記条件を満たすことにより、生体内で形成される原子卵胞により近しいものであると評価することができる。
【００７７】
卵胞成熟を休止期に維持する機能を有する転写因子としては、例えば、Ｆｏｘｏ３ａ（Ｆｋｈｒ２、Ｃ７６８５６、ＦＫＨＲＬ１、１１１００４８Ｂ１６Ｒｉｋ、２０１０２０３Ａ１７Ｒｉｋ等とも呼ばれる）等が挙げられる。
【００７８】
また、本実施形態の方法を用いて得られた原始卵胞は、上記（１）及び（２）の条件に加えて、以下の（３）の条件を更に満たすことが好ましい。
（３）直径が２０μｍ以下である
【００７９】
なお、上記（１）及び上記（３）の条件については、例えば、顕微鏡等を用いた目視により評価することができる。また、上記（１）の条件については、顆粒膜細胞が発現するタンパク質（例えば、フィブロネクチン等）に対する抗体を用いた免疫染色等により評価することができる。
【００８０】
上記（２）の条件については、例えば、上記転写因子に対する抗体（例えば、抗Ｆｏｘｏ３ａ抗体）を用いた免疫染色等により評価することができる。また、核内に局在していることを確かめるために、必要に応じて、例えば、上記免疫染色に、市販の核染色試薬（例えば、４’,６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ））を組み合わせて用いてもよい。
【００８１】
＜使用用途＞
本実施形態の方法を用いて得られた原始卵胞は、不妊治療に好適に用いられる。すなわち、一実施形態において、本発明は、上記方法で得られた原始卵胞を用いる、不妊治療方法を提供する。
また、本実施形態の方法を用いて得られた原始卵胞は、産業動物の効率的な育種、希少動物の繁殖のために好適に用いられる。すなわち、一実施形態において、本発明は、上記方法で得られた原始卵胞を用いる、産業動物の育種方法又は希少動物の繁殖方法を提供する。
なお、上記適用対象となる動物としては、哺乳動物が好ましい。哺乳動物としては、上記に例示されたものと同様のものが挙げられる。
また、本実施形態の方法を用いて得られた原始卵胞は、不妊原因の究明、閉経疾患のメカニズム解明に役立てることができる。
【実施例】
【００８２】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００８３】
＜実験材料＞
下記の実施例において用いた全ての動物は、日本エスエルシー株式会社より購入した。また、１２．５日齢の雌マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６  Ｓｔｅｌｌａ−ＣＦＰトランスジェニックマウス雄とＩＣＲマウス雌とを交配させることにより得た。また、全ての試験は九州大学動物実験委員会によって承認されたものである。【００８４】
［参考例１］マウス生体内における原始卵胞の形成過程の確認
まず、生体内において原始卵胞が形成される過程について確認した。【００８５】
（１）組織切片の作製
生後３．５日齢の雌マウス及び雌マウスの胎仔（受精後１２．５日齢）からそれぞれ生殖巣を摘出し、凍結切片を作製した。具体的には、生殖巣を４％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳに浸漬し、４℃で３時間、固定処理を行った。次いで、１０％、１５％及び２０％のスクロースで段階的に処理し、Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ社製）で包埋し凍結した。次いで、凍結した生殖巣から７μｍ厚の切片を作製した。【００８６】
（２）免疫染色
次いで、（１）で得られた生殖巣の組織切片を２００倍希釈したマウス抗Ｄｄｘ４／ＭＶＨポリクローナル抗体（ａｂｃａｍ社製）、５００倍希釈したウサギ抗フィブロネクチン抗体（Ｓｉｇｍａ社製）を含む溶液に浸漬し、４℃で一晩１次抗体抗原反応させた。次いで、各１次抗体溶液を除去し、ＰＢＳで洗浄した後、生殖巣の組織切片を５００倍希釈したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ  ６４７標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｏｂｅｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｒｅｓ社製）、及び、５００倍に希釈したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ Ｐｌｕｓ ５５５標識抗ウサギＩｇＧ抗体をそれぞれ含む溶液に浸漬し、室温で３時間２次抗体抗原反応させた。次いで、各２次抗体溶液を除去し、ＰＢＳで洗浄した後、生殖巣の組織切片を、１０００倍希釈したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎを含む溶液に浸漬し、室温で１時間反応させた。さらに、ＰＢＳで洗浄した後、生殖巣の組織切片を、４’,６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（和光純薬工業社製）を用いて染色した。【００８７】
（３）観察
（２）で免疫染色した生殖巣の組織切片は、共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社製、型番：Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ７００）下で観察した。結果を図１に示す。図１において、ａ〜ｄは、生後３．５日齢の雌マウスの生殖巣切片の免疫染色像である。スケールバーは１０μｍである。ａは、生殖細胞マーカーのＭＶＨに対する抗体を用いた免疫染色像である。ｂは、細胞外基質であるフィブロネクチンに対する抗体を用いた免疫染色像である。ｃは、ストレスファイバーであるＦ−ａｃｔｉｎに対する抗体を用いた免疫染色像である。また、ｄは、ａ〜ｃにおける免疫染色像に、ＤＡＰＩによる核染色像を重ねた画像である。また、ａ’〜ｄ ’は、それぞれａ〜ｄ内の四角で囲った部分の拡大像である。スケールバーは１０μｍである。ｅ〜ｈは、受精後１２．５日齢の雌マウスの生殖巣切片の免疫染色像である。スケールバーは１０μｍである。ｅは、生殖細胞マーカーのＭＶＨに対する抗体を用いた免疫染色像である。ｆは、細胞外基質であるフィブロネクチンに対する抗体を用いた免疫染色像である。ｇは、ストレスファイバーであるＦ−ａｃｔｉｎに対する抗体を用いた免疫染色像である。また、ｈは、ａ〜ｃにおける免疫染色像に、ＤＡＰＩによる核染色像を重ねた画像である。また、ｅ’〜 ｈ ’は、それぞれｅ〜ｈ内の四角で囲った部分の拡大像である。【００８８】
図１のａ〜ｄ及びａ’〜ｄ’から、生後３．５日齢の雌マウス生殖巣内においては扁平な一層の顆粒膜細胞に覆われた原始卵胞が存在し、その周囲には発達した細胞外基質が確認された。
その一方で、図１のｅ〜ｈ及びｅ’〜 ｈ ’から、受精後１２．５日齢の雌マウス生殖巣内においては、始原生殖細胞の周囲には発達した細胞外基質は確認されなかった。
この細胞外基質の発達は、ストレスファイバーであるＦ−ａｃｔｉｎの集積と一致した。【００８９】
［実施例１］始原生殖細胞の加圧条件下での体外培養
次いで、体外培養系において１２．５日齢の雌マウス生殖巣を人為的加圧条件下において培養することを試みた。【００９０】
（１）生殖巣及び培地の準備
体外培養で用いられる培地として、αＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を基本培地として、αＭＥＭに２％のウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ）、５５μＭの２−メルカプトエタノール（２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ：２ＭＥ）（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１× ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及び、１×ＧｌｕｔａＭａｘ（登録商標）（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加したもの（以下、当該培地を「αＭ２」と称する場合がある）、並びに、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、を基本培地として、ＳｔｅｍＰｒｏに１０％のＦＢＳ、５５μＭの２ＭＥ（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１× ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及び、１×ＧｌｕｔａＭａｘ（登録商標）（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加したもの（以下、当該培地を「Ｓ１０」と称する場合がある）を準備した。
また、培養に用いた生殖巣は、雌マウスの胎仔（受精後１２．５日齢）又は生後７．５日齢の雌マウスから、中腎を伴わない状態で採取した。【００９１】
（２）生殖巣の体外培養
次いで、（１）で準備した培地を用いて、人為的加圧条件下で、１２．５日齢の雌マウスから採取された生殖巣を培養した。
具体的には、まず、６ウェルプレートの各ウェルに、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ−ＣＯＬメンブレン（３．０μｍ  ｐｏｒｅ  ｓｉｚｅ、２４ｍｍ  ｄｉａｍｅｔｅｒ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）をセットし、メンブレン上に（１）で採取した生殖巣をのせた。次いで、各ウェルに対して１．３ｍＬの培地を添加して、２１日間培養した。人為的加圧は、ＳＴＲＥＸ社のＡＧＰ−３００１Ｓ（登録商標）を用いて、３３．３３ｋＰａの静水圧を負荷した。また、培地は、αＭ２で４日間培養し、その後はＳ１０で培養した。また、培養開始から５日目から９日目の期間にエストロジェン受容体のアンタゴニストであるＩＣＩ  １８２，  ７８０（７α，１７β−［９−［（４，４，５，５，５−ｐｅｎｔａｆｌｕｏｒｏｐｅｎｔｙｌ）ｓｕｌｆｉｎｙｌ］ｎｏｎｙｌ］ｅｓｔｒａ−１，３，５（１０）−ｔｒｉｅｎｅ−３，１７−ｄｉｏｌ）（ＴｏｃｒｉｓＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を培地中の終濃度が５００ｎＭとなるように添加した。なお、培地は、１日おきに約半分の量を新しい培地に交換した。また、対照として、加圧せずに同様に培養したもの（定常条件で培養したもの）も準備した。【００９２】
（３）組織切片の作製
（２）で培養した生殖巣について、参考例１の（１）と同様の方法を用いて、生殖巣の組織切片を作製した。【００９３】
（４）免疫染色
次いで、（３）で得られた生殖巣の組織切片について免疫組織学的染色を行った。具体的には、まず、生殖巣の組織切片を２００倍希釈したマウス抗Ｄｄｘ４／ＭＶＨポリクローナル抗体（ａｂｃａｍ社製）、及び、２００倍希釈したウサギ抗Ｆｏｘｏ３ａポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）をそれぞれ含む溶液に浸漬し、４℃で一晩１次抗体抗原反応させた。次いで、各１次抗体溶液を除去し、ＰＢＳで洗浄した後、生殖巣の組織切片を５００倍希釈したＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｏｂｅｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｒｅｓ社製）、及び、５００倍希釈したＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  Ｐｌｕｓ  ５５５標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｏｂｅｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｒｅｓ社製）をそれぞれ含む溶液に浸漬し、室温で３時間２次抗体抗原反応させた。次いで、各２次抗体溶液を除去し、ＰＢＳで洗浄した後、生殖巣の組織切片は、さらに、４’,６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（和光純薬工業社製）を用いて染色した。【００９４】
（５）観察
（４）で免疫染色した生殖巣の組織切片は、共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社製、型番：Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ７００）下で観察した。加圧条件下で培養した生殖巣の代表的な結果を図２に示す。図２において、ａ〜ｃは、受精後１２．５日齢の雌マウスの生殖巣を加圧条件下で培養し、培養開始から２１日目に採取した生殖巣切片の免疫染色像である。倍率は、６３倍である。ａは、生殖細胞マーカーのＭＶＨに対する抗体を用いた免疫染色像である。ｂは、転写因子Ｆｏｘｏ３ａに対する抗体を用いた免疫染色像である。ｃは、ａ及びｂにおける免疫染色像に、ＤＡＰＩによる核染色像を重ねた画像である。スケールバーは１０μｍである。【００９５】
また、（２）で培養した生殖巣の切片作製前の蛍光実体顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製、型番：ＳＺＸ１６）による撮影像を図３に示す。図３において、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は定常条件で培養した生殖巣であり、「Ｐｒｅｓｓｕｒｅｄ」は加圧条件下で培養した生殖巣である。スケールバーは５０μｍである。【００９６】
図３から、培養から２１日目において、定常条件下で培養した生殖巣では、ほとんどの始原生殖細胞は成長した２次卵胞へと分化していた。これに対し、加圧条件下で培養した生殖巣では、２０μｍ以下の小さな卵胞が存在することが明らかとなった。【００９７】
この小さな卵胞について組織切片を作製し、免疫染色により詳細に検討したところ、周囲が一層の扁平な顆粒膜細胞に囲まれており、転写因子Ｆｏｘｏ３ａが卵子の核内に局在していることが確かめられた（図２のａ〜ｃ参照）。
これらのことから、加圧条件下で、始原生殖細胞から原始卵胞へ分化誘導されたことが示唆された。【００９８】
（６）タンパク質分解酵素（ＣＴＫ）処理試験
次いで、生後７．５日齢の雌マウスの生殖巣の人為的加圧条件下でのタンパク質分解酵素（ＣＴＫ）処理を試みた。【００９９】
（６−１）タンパク質分解酵素（ＣＴＫ）処理
具体的には、まず、生後７．５日齢の雌マウスの生殖巣を、６ウェルプレートの各ウェルにおいて、０．５ｍＬのＰＢＳ（ＣＴＫ含有）を添加して、１時間培養した。なお、ＣＴＫの組成は、１μＭ  ＣａＣｌ２、０．１ｍｇ／ｍＬ  Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ＩＶ、２０％  ＫＳＲ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．０２５％  Ｔｒｙｐｓｉｎ  ＥＤＴＡ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。人為的加圧は、ＳＴＲＥＸ社のＡＧＰ−３００１Ｓ（登録商標）を用いて、３３．３３ｋＰａの静水圧を負荷した。また、対照として、ＣＴＫ不含のＰＢＳで人為的加圧を行わずに１時間培養した生殖巣、及び、ＣＴＫ含有ＰＢＳで人為的加圧を行わずに１時間培養した生殖巣を準備した。【０１００】
（６−２）組織切片の作製
（６−１）でＣＴＫ処理した生殖巣について、参考例１の（１）と同様の方法を用いて、生殖巣の組織切片を作製した。【０１０１】
（６−３）免疫染色
次いで、（３）で得られた生殖巣の組織切片について免疫組織学的染色を行った。  【０１０２】
（６−４）観察
（６−３）で免疫染色した生殖巣の組織切片は共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社製、型番：Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ７００）下で観察した。結果を図４Ａに示す。図４Ａにおいて、「ＰＢＳ」はＣＴＫ不含のＰＢＳで人為的加圧を行わずに１時間培養した生殖巣である。「ＣＴＫ」は、ＣＴＫ含有ＰＢＳで人為的加圧を行わずに１時間培養した生殖巣である。「ＣＴＫ（Ｐ）」は、ＣＴＫ含有ＰＢＳで人為的加圧条件下で１時間培養した生殖巣である。ａ、ｅ及びｉは、生殖細胞マーカーＳｔｅｌｌａの発現制御下に発現するＣＦＰに対する染色像である。ｂ、ｆ及びＪは、転写因子Ｆｏｘｏ３ａに対する抗体を用いた免疫染色像である。ｃ、ｇ及びｋは、生殖細胞マーカーのＭＶＨに対する抗体を用いた免疫染色像である。ｄは、上記ａ〜ｃにおける染色像に、ＤＡＰＩによる核染色像を重ねた画像である。ｈは、上記ｅ〜ｇにおける染色像に、ＤＡＰＩによる核染色像を重ねた画像である。ｌは、上記ｉ〜ｋにおける染色像に、ＤＡＰＩによる核染色像を重ねた画像である。スケールバーは１０μｍである。
また、図４Ｂは、図４Ａにおける転写因子Ｆｏｘｏ３ａに対する抗体を用いた免疫染色像から、転写因子Ｆｏｘｏ３ａを核内局在する卵母細胞の割合を算出し、グラフ化したものである。【０１０３】
図４Ａ及び図４Ｂから、生後７．５日齢の雌マウスの生殖巣をタンパク質分解酵素（ＣＴＫ）で処理することによって細胞外基質を消化すると、原始卵胞卵子のＦｏｘｏ３ａが核外へと移行すること、及び、卵胞の成熟が誘導されることが明らかとなった。さらに、このＦｏｘｏ３ａの核外移行は、同様のタンパク質分解酵素処理を人為的加圧条件下において行うことにより抑制できることが明らかとなった。【０１０４】
これらのことから、生体内において、原始卵胞の維持には物理的圧力が関与していることが示唆された。【０１０５】
［実施例２］始原生殖細胞の低酸素濃度条件下での体外培養
次いで、体外培養系において、受精後１２．５日齢の胎仔生殖巣を低酸素条件下で培養することを試みた。【０１０６】
（１）生殖巣及び培地の準備
実施例１の（１）と同様の方法を用いて、生殖巣及び培地を準備した。【０１０７】
（２）生殖巣の体外培養
人工的加圧条件下の代わりに、低酸素濃度条件下で培養した以外は、実施例１の（２）と同様の方法を用いて、生殖巣を体外培養した。また、低酸素濃度条件下として、アステック社製ＡＰＭ３０Ｄを用いて、５％酸素濃度条件下で培養を行った。また、対照として、低酸素濃度条件下とせずに同様に培養したものも準備した。【０１０８】
（３）組織切片の作製
（２）で培養した生殖巣について、参考例１の（１）と同様の方法を用いて、生殖巣の組織切片を作製した。【０１０９】
（４）免疫染色
次いで、（３）で得られた生殖巣の組織切片を実施例１の（４）と同様の方法を用いて、免疫染色した。【０１１０】
（５）観察
（４）で免疫染色した生殖巣の組織切片は、共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社製、型番：Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ７００）下で観察した。低酸素濃度条件下で培養した生殖巣の代表的な結果を図５に示す。図５において、ａ〜ｃは、受精後１２．５日齢の雌マウスの生殖巣を低酸素濃度条件下で培養し、培養開始から２１日目に採取した生殖巣切片の免疫染色像である。倍率は、６３倍である。ａは、生殖細胞マーカーのＭＶＨに対する抗体を用いた免疫染色像である。ｂは、転写因子Ｆｏｘｏ３ａに対する抗体を用いた免疫染色像である。ｃは、ａ及びｂにおける免疫染色像に、ＤＡＰＩによる核染色像を重ねた画像である。スケールバーは１０μｍである。【０１１１】
培養開始から２１日目において、通常の酸素濃度条件下で培養した生殖巣では、ほとんどの始原生殖細胞は成長した２次卵胞へと分化していた（図示せず）。これに対し、低酸素濃度条件下で培養した生殖巣では、２０μｍ以下の小さな卵胞が存在することが明らかとなった。この小さな卵胞について組織切片を作製し、免疫染色により詳細に検討したところ、周囲を一層の扁平な顆粒膜細胞に囲まれており、転写因子Ｆｏｘｏ３ａが卵子の核内に局在していることが確かめられた（図５のａ〜ｃ参照）。
これらのことから、低酸素濃度条件下で、始原生殖細胞から原始卵胞へ分化誘導されたことが示唆された。【０１１２】
［参考例２］始原生殖細胞のＰＩ３Ｋ阻害剤存在下での体外培養
次いで、体外培養系において、受精後１２．５日齢の胎仔生殖巣をＰＩ３Ｋ阻害剤存在下で培養することによる影響を確認した。【０１１３】
（１）生殖巣及び培地の準備
実施例１の（１）と同様の方法を用いて、生殖巣及び培地を準備した。【０１１４】
（２）生殖巣の体外培養
まず、６ウェルプレートの各ウェルに、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ−ＣＯＬメンブレン（３．０μｍ  ｐｏｒｅ  ｓｉｚｅ、２４ｍｍ  ｄｉａｍｅｔｅｒ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）をセットし、メンブレン上に（１）で採取した生殖巣をのせた。次いで、各ウェルに対して１．３ｍＬの培地を添加して、１６日間培養した。また、培地は、αＭ２で４日間培養し、その後はＳ１０で培養した。また、培養開始から６日目から１６日目の期間に、ＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２（以下、「Ｌｙ」と略記する場合がある）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、型番：９９０１）を培地中の終濃度２５μＭとなるように添加した。また、培養開始から５日目から９日目の期間にエストロジェン受容体のアンタゴニストであるＩＣＩ  １８２，  ７８０（７α，１７β−［９−［（４，４，５，５，５−ｐｅｎｔａｆｌｕｏｒｏｐｅｎｔｙｌ）ｓｕｌｆｉｎｙｌ］ｎｏｎｙｌ］ｅｓｔｒａ−１，３，５（１０）−ｔｒｉｅｎｅ−３，１７−ｄｉｏｌ）（ＴｏｃｒｉｓＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を培地中の終濃度が５００ｎＭとなるように添加した。なお、培地は、１日おきに約半分の量を新しい培地に交換した。また、対照として、Ｌｙを添加せずに同様に培養したもの（定常条件で培養したもの）も準備した。【０１１５】
（３）観察
培養開始から１６日目の生殖巣を蛍光実体顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製、型番：ＳＺＸ１６）下で観察した。結果を図６Ａに示す。図６Ａにおいて、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は定常条件（Ｌｙ非存在）下で培養した生殖巣であり、「Ｌｙ」はＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２存在下で培養した生殖巣である。スケールバーは５０μｍである。【０１１６】
また、図６Ｂは、図６Ａにおいて、Ｓｔｅｌｌａ−ＣＦＰの発現を指標に、卵母細胞の数をカウントし、２０μｍ未満、２０μｍ以上５０μｍ以下、及び５０μｍ超の卵母細胞の割合を算出したグラフである。【０１１７】
図６Ａから、培養から１６日目において、定常条件下（Ｌｙ非存在下）で培養した生殖巣では、ほとんどの始原生殖細胞は成長した２次卵胞へと分化していた。これに対して、Ｌｙ存在下で培養した生殖巣では、２０μｍ未満の小さな卵胞が存在することが確かめられた。
図６Ｂから、定常条件下（Ｌｙ非存在下）で培養した生殖巣では、全卵母細胞中２０μｍ未満のサイズの卵母細胞の割合が約５％、２０μｍ以上５０μｍ以下のサイズの卵母細胞の割合が約１５％、５０μｍ超のサイズの卵母細胞の割合が約８０％であり、５０μｍ超の大きな卵母細胞が多く存在していた。これに対して、Ｌｙ存在下で培養した生殖巣では、全卵母細胞中２０μｍ未満のサイズの卵母細胞の割合が約２９％、２０μｍ以上５０μｍ以下のサイズの卵母細胞の割合が約４８％、５０μｍ超のサイズの卵母細胞の割合が約２３％であり、定常条件下よりも小さい卵胞が多く存在することが確かめられた。【０１１８】
［実施例３］始原生殖細胞の加圧条件下及びＰＩ３Ｋ阻害剤存在下での体外培養
次いで、体外培養系において１２．５日齢の雌マウス生殖巣を人為的加圧条件下及びＰＩ３Ｋ阻害剤存在下において培養することを試みた。【０１１９】
（１）生殖巣及び培地の準備
実施例１の（１）と同様の方法を用いて、生殖巣及び培地を準備した。【０１２０】
（２）生殖巣の体外培養
次いで、（１）で準備した培地を用いて、人為的加圧条件下及びＰＩ３Ｋ阻害剤存在下で、１２．５日齢の雌マウスから採取された生殖巣を培養した。
具体的には、まず、６ウェルプレートの各ウェルに、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ−ＣＯＬメンブレン（３．０μｍ  ｐｏｒｅ  ｓｉｚｅ、２４ｍｍ  ｄｉａｍｅｔｅｒ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）をセットし、メンブレン上に（１）で採取した生殖巣をのせた。次いで、各ウェルに対して１．３ｍＬの培地を添加して、１６日間培養した。人為的加圧は、培養開始から６日目から１６日目の期間に、ＳＴＲＥＸ社のＡＧＰ−３００１Ｓ（登録商標）を用いて、３３．３３ｋＰａの静水圧を負荷した。また、培養開始から６日目から１６日目の期間に、Ｌｙを培地中の終濃度２５μＭとなるように添加した。また、培地は、αＭ２で４日間培養し、その後はＳ１０で培養した。また、培養開始から５日目から９日目の期間にエストロジェン受容体のアンタゴニストであるＩＣＩ  １８２，  ７８０（７α，１７β−［９−［（４，４，５，５，５−ｐｅｎｔａｆｌｕｏｒｏｐｅｎｔｙｌ）ｓｕｌｆｉｎｙｌ］ｎｏｎｙｌ］ｅｓｔｒａ−１，３，５（１０）−ｔｒｉｅｎｅ−３，１７−ｄｉｏｌ）（ＴｏｃｒｉｓＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を培地中の終濃度が５００ｎＭとなるように添加した。なお、培地は、１日おきに約半分の量を新しい培地に交換した。また、対照として、Ｌｙ存在下で加圧せずに同様に培養したものも準備した。【０１２１】
（３）組織切片の作製
（２）で培養した生殖巣について、参考例１の（１）と同様の方法を用いて、生殖巣の組織切片を作製した。【０１２２】
（４）免疫染色
次いで、（３）で得られた生殖巣の組織切片について、実施例１の（４）と同様の方法を用いて、免疫組織学的染色を行った。【０１２３】
（５）観察
（４）で免疫染色した生殖巣の組織切片は、共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社製、型番：Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ７００）下で観察した。結果を図７に示す。図７において、「Ｎｏ  Ｐｒｅｓｓ（０ｋＰａ）」は、Ｌｙ存在下で加圧せずに培養した生殖巣である。「Ｐｒｅｓｓ（３３．３ｋＰａ）」は人為的加圧条件下及びＬｙ存在下で培養した生殖巣である。ａ及びｅは、生殖細胞マーカーＳｔｅｌｌａの発現制御下に発現するＣＦＰに対する染色像である。ｂ及びｆは、転写因子Ｆｏｘｏ３ａに対する抗体を用いた免疫染色像である。ｃ及びｇは、生殖細胞マーカーのＭＶＨに対する抗体を用いた免疫染色像である。ｄは、上記ａ〜ｃにおける染色像に、ＤＡＰＩによる核染色像を重ねた画像である。ｈは、上記ｅ〜ｇにおける染色像に、ＤＡＰＩによる核染色像を重ねた画像である。スケールバーは１０μｍである。【０１２４】
また、図８Ａは、図７における転写因子Ｆｏｘｏ３ａに対する抗体を用いた免疫染色像から、転写因子Ｆｏｘｏ３ａを核内に局在する卵母細胞の割合を算出し、グラフ化したものである。図８Ｂは、図７における転写因子Ｆｏｘｏ３ａに対する抗体を用いた免疫染色像から、転写因子Ｆｏｘｏ３ａを細胞質基質に局在する卵母細胞の割合を算出し、グラフ化したものである。【０１２５】
図７から、Ｌｙ存在下で加圧せずに培養した生殖巣では、卵母細胞がその周囲を一層の扁平な顆粒膜細胞で囲まれているが、転写因子Ｆｏｘｏ３ａが卵子の核内だけでなく細胞質基質にも局在していた。これに対して、人為的加圧条件下及びＬｙ存在下で培養した生殖巣では、卵母細胞がその周囲を一層の扁平な顆粒膜細胞で囲まれており、転写因子Ｆｏｘｏ３ａが卵子の核内に局在していることが確かめられた。【０１２６】
図８Ａ及び図８Ｂから、Ｌｙ存在下で加圧せずに培養した生殖巣では、転写因子Ｆｏｘｏ３ａを核内に局在する卵母細胞の割合は約５２％であり、細胞質基質に局在する卵母細胞の割合は約４８％であった。これに対して、人為的加圧条件下及びＬｙ存在下で培養した生殖巣では、転写因子Ｆｏｘｏ３ａを核内に局在する卵母細胞の割合は約８２％であり、細胞質基質に局在する卵母細胞の割合は約１８％であり、Ｆｏｘｏ３ａの核外移行が抑制されていることが明らかとなった。【０１２７】
［実施例４］始原生殖細胞の加圧条件及び低酸素濃度条件下での体外培養
次いで、体外培養系において、受精後１２．５日齢の胎仔生殖巣を人工的加圧条件及び低酸素条件下で培養することを試みた。【０１２８】
（１）生殖巣及び培地の準備
実施例１の（１）と同様の方法を用いて、生殖巣及び培地を準備した。【０１２９】
（２）生殖巣の体外培養
人工的加圧条件下及び低酸素濃度条件下で培養した以外は、実施例１の（２）と同様の方法を用いて、生殖巣を体外培養した。人為的加圧は、ＳＴＲＥＸ社のＡＧＰ−３００１Ｓ（登録商標）を用いて、３３．３３ｋＰａの静水圧を負荷した。また、低酸素濃度条件下として、アステック社製ＡＰＭ３０Ｄを用いて、５％酸素濃度条件下で培養を行った。また、対照として、（１）出生後３．５日齢の卵巣、（２）人工的加圧条件下で同様に培養したもの、（３）低酸素濃度条件下で同様に培養したものも準備した。【０１３０】
（３）フローサイトメトリー
（２）で培養した生殖巣を破砕し、細胞浮遊液を調製した。次いで、フローサイトメーター（型番：ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩＩ（６４８２８２Ｂ５）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて解析した。結果を図９に示す。上段は細胞の大きさを示す前方散乱光（ＦＳＣ）と、生殖細胞マーカーＳｔｅｌｌａの発現制御下に発現するＣＦＰの蛍光との二次元ヒストグラムである。下段はＣＦＰ発現細胞におけるＦＳＣの分布を示すヒストグラムである。下段の左端の「Ｍｅｒｇｅ」は、下段の４つのヒストグラムを重ね合わせたものである。【０１３１】
フローサイトメトリーを行なう前に蛍光実体顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製、型番：ＳＺＸ１６）下で各生殖巣を観察したところ、人工的加圧条件下及び低酸素濃度条件下においても、人工的加圧条件下又は低酸素濃度条件下と同様に、始原生殖細胞から原始卵胞へ分化誘導されたことが示唆された（図示せず）。【０１３２】
また、図９から、人工的加圧条件下又は低酸素濃度条件下で培養した生殖巣では、出生後３．５日齢の卵巣と同程度の大きさの卵母細胞が得られたのに対して、人工的加圧条件下及び低酸素濃度条件下で培養した生殖巣では、それらよりも小さいサイズの卵母細胞の割合が増える傾向がみられた。【０１３３】
以上のことから、本実施形態の方法は、生体生殖巣内の環境を再現しており、始原生殖細胞を原始卵胞に分化できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１３４】
本実施形態の方法によれば、始原生殖細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで原始卵胞に分化することができる。本実施形態の方法で得られた原始卵胞は、例えば、不妊治療、産業動物の効率的な育種、希少動物の繁殖、不妊原因の究明、閉経疾患のメカニズム解明等に、好適に用いられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【国際調査報告】
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