(57)【要約】  筋線維芽細胞のマーカータンパク質を同定し、線維化疾患を予防または治療する技術を提供する。  GPR176の阻害物質を有効成分として含有する、線維化疾患の予防または治療剤に関する。
2020171206.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Gタンパク質共役受容体176（GPR176）の阻害物質を有効成分として含有する、線維化疾患を予防または治療するための医薬組成物。
【請求項２】
GPR176の阻害物質が、GPR176発現の阻害物質またはGPR176機能の阻害物質である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
GPR176の阻害物質が、GPR176発現の阻害物質である、請求項２記載の医薬組成物。
【請求項４】
GPR176発現の阻害物質が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに示される遺伝子または核酸の発現を阻害する物質である、請求項２記載の医薬組成物：
（ａ）配列表の配列番号２、４または６のいずれかに示されるGPR176遺伝子、
（ｂ）配列表の配列番号２、４または６のいずれかに示されるGPR176遺伝子において１個若しくは数個の塩基が欠失、置換または付加されている塩基配列を含む核酸、
（ｃ）配列表の配列番号２、４または６のいずれかに示されるGPR176遺伝子と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸。
【請求項５】
遺伝子または核酸の発現を阻害する物質が、siRNA、アンチセンスおよびリボザイムからなる群から選ばれる請求項４記載の医薬組成物。
【請求項６】
GPR176の阻害物質が、GPR176機能の阻害物質である、請求項２記載の医薬組成物。
【請求項７】
GPR176機能の阻害物質が、GPR176タンパク質に対する特異的結合物質である、請求項６記載の医薬組成物。
【請求項８】
GPR176タンパク質に対する特異的結合物質が、抗体、抗体断片およびアプタマーからなる群から選ばれる、請求項７記載の医薬組成物。
【請求項９】
抗体断片が、Fv、FabおよびscFvからなる群から選ばれる、請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１０】
（ａ）配列表の配列番号２、４または６のいずれかに示されるGPR176遺伝子、
（ｂ）配列表の配列番号２、４または６のいずれかに示されるGPR176遺伝子において１個若しくは数個の塩基が欠失、置換または付加されている塩基配列を含む核酸、
（ｃ）配列表の配列番号２、４または６のいずれかに示されるGPR176遺伝子と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸、
の発現を阻害する、siRNA、アンチセンスおよびリボザイムからなる群から選ばれる核酸。
【請求項１１】
請求項１０記載の遺伝子または核酸を含む、ベクター。
【請求項１２】
請求項１１記載のベクターを含む、細胞。
【請求項１３】
（ａ）配列表の配列番号２、４、６または８のいずれかに示されるGPR176遺伝子、
（ｂ）配列表の配列番号２、４、６または８のいずれかに示されるGPR176遺伝子において１個若しくは数個の塩基が欠失、置換または付加されている塩基配列を含む核酸、
（ｃ）配列表の配列番号２、４、６または８のいずれかに示されるGPR176遺伝子と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸、またはそれらが導入されている細胞を用いることを特徴とする、該遺伝子若しくは核酸の発現が阻害されることを確認することによって、GPR176の阻害物質をスクリーニングする方法。
【請求項１４】
（１）候補化合物を用意し、
（２）
（ａ）配列表の配列番号２、４、６または８のいずれかに示されるGPR176遺伝子、
（ｂ）配列表の配列番号２、４、６または８のいずれかに示されるGPR176遺伝子において１個若しくは数個の塩基が欠失、置換または付加されている塩基配列を含む核酸、
（ｃ）配列表の配列番号２、４、６または８のいずれかに示されるGPR176遺伝子と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸のいずれかに示される遺伝子または核酸を有する細胞に該候補化合物を接触させ、
（３）該候補化合物が該遺伝子または核酸の発現を抑制するか否かを判定することを含む、GPR176の阻害物質をスクリーニングするための請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
配列表の配列番号２、４または６のいずれかに示されるGPR176遺伝子を用いる請求項１３または１４記載の方法。
【請求項１６】
配列表の配列番号１、３、５または７のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するGPR176タンパク質、または該GPR176タンパク質において１個または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加を有する変異GPR176タンパク質であって、該GPR176タンパク質と同等の活性を有する該変異GPR176タンパク質を用いることを特徴とする、該タンパク質の機能を阻害する物質のスクリーニング方法。
【請求項１７】
（１）候補化合物を用意し、
（２）配列表の配列番号１、３、５または７のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するGPR176タンパク質、または該GPR176タンパク質において１個または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加を有する変異GPR176タンパク質であって、該GPR176タンパク質と同等の活性を有する該変異GPR176タンパク質、または該GPR176タンパク質もしくは該変異GPR176タンパク質を発現する細胞に該候補化合物を接触させ、
（３）該候補化合物が該GPR176タンパク質または該変異GPR176タンパク質の機能を阻害するか否かを判定することを含む、GPR176タンパク質の機能を阻害する物質をスクリーニングする方法。
【請求項１８】
配列表の配列番号１、３または５のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するGPR176タンパク質、または該GPR176タンパク質において１個または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加を有する変異GPR176タンパク質であって、該GPR176タンパク質と同等の活性を有する該変異GPR176タンパク質を用いる、請求項１６または１７記載の方法。
【請求項１９】
候補化合物の存在下で筋線維芽細胞を培養する工程と、培養した該筋線維芽細胞におけるGPR176遺伝子のmRNAまたはGPR176タンパク質の発現量を定量する工程と、定量した該GPR176遺伝子のmRNAまたは該GPR176タンパク質の発現量が、対照と比較して低下していた場合に、該候補化合物は線維化疾患の予防または治療剤であると判定する工程と、を備える、線維化疾患の予防または治療剤のスクリーニング方法。
【請求項２０】
線維化疾患における重篤度を判定する方法であって、
（ａ１０）被検者の筋線維芽細胞のGPR176の量（被検バイオマーカー量）を測定する工程、
（ｂ１０）被検バイオマーカー量と、健常者の筋線維芽細胞のGPR176の量（対照バイオマーカー量）とを比較する工程、および
（ｃ１０）被検バイオマーカー量が対照バイオマーカー量よりも多い場合に、被検者を、線維化疾患が重篤化すると判定する方法。
【請求項２１】
線維化疾患における重篤度を判定することができる、筋線維芽細胞のGPR176であるバイオマーカー。
【請求項２２】
GPR176のcDNAを増幅するためのプライマーセット、GPR176のmRNAに特異的にハイブリダイズするプローブ、または、GPR176タンパク質に対する特異的結合物質を含む、筋線維芽細胞の検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、線維化疾患を予防または治療するための医薬組成物に関する。詳細には、本発明は、線維化疾患を予防または治療する物質および核酸分子、ならびにそれらをスクリーニングするための方法、そのためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
線維化とは、生体組織において、コラーゲン等の細胞外マトリックスが過剰に産生された状態である。線維化は、心臓、肝臓、腎臓、肺臓等の様々な臓器の病態を悪化させる原因となることが知られている。しかしながら、従来、線維化疾患の有効な治療薬はほとんど存在せずその開発が求められている。【０００３】
組織の線維化はコラーゲン等を産生する、筋線維芽細胞という細胞群によって実行されることが知られている。また、筋線維芽細胞は、組織が正常な時にはほとんど存在せず、炎症を契機にして、様々な細胞が分化する事により生じることが知られている。【０００４】
従来、筋線維芽細胞のマーカーとしては、α-Smooth Muscle Actin（α-SMA）等のタンパク質が知られている（例えば特許文献１を参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−８１１２２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、α-SMAは、血管平滑筋で強く発現している等、細胞特異性、発現時期の観点から、厳密な意味で筋線維芽細胞特異的なマーカータンパク質とはいえない場合がある。このため、厳密な意味での筋線維芽細胞のマーカータンパク質の同定は、筋線維芽細胞研究のボトルネックとなっている。【０００７】
本発明は、筋線維芽細胞のマーカータンパク質を同定し、線維化疾患を予防または治療する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
Gタンパク質共役受容体176（G Protein-Coupled Receptor 176（以下、GPR176と称する）は、オーファン受容体の一つとしてNCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=GPR176）に登録されている。これまで、GPR176は、概日行動のペースを設定するＧｚ共役型オーファンＧタンパク質共役受容体として特定されているのみである（NATURE COMMUNICATIONS | 7:10583 | DOI: 10.1038/ncomms10583 | Published 17 Feb 2016）。
本発明者らは、線維化疾患を予防または治療することを目的として、鋭意研究を行った結果、GPR176が臓器の線維化に強く関係していることを見出した。さらに研究を進めた結果、GPR176の発現および機能を阻害または抑制すると線維化が低減または抑止されることを見出し、本発明を完成させた。【０００９】
すなわち、本発明は以下の態様を含む。
＜線維化疾患を予防または治療するための医薬組成物＞
［１］
Gタンパク質共役受容体176（GPR176）の阻害物質を有効成分として含有する、線維化疾患を予防または治療するための医薬組成物；
［２］
GPR176の阻害物質が、GPR176発現の阻害物質またはGPR176機能の阻害物質である、［１］記載の医薬組成物；
［３］
GPR176の阻害物質が、GPR176発現の阻害物質である、［２］記載の医薬組成物；
［４］
GPR176発現の阻害物質が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに示される遺伝子または核酸の発現を阻害する物質である、［２］記載の医薬組成物：
（ａ）配列表の配列番号２、４または６のいずれかに示されるGPR176遺伝子、
（ｂ）配列表の配列番号２、４または６のいずれかに示されるGPR176遺伝子において１個若しくは数個の塩基が欠失、置換または付加されている塩基配列を含む核酸、
（ｃ）配列表の配列番号２、４または６のいずれかに示されるGPR176遺伝子と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸；
［５］
遺伝子または核酸の発現を阻害する物質が、siRNA、アンチセンスおよびリボザイムからなる群から選ばれる［４］記載の医薬組成物；
［６］
GPR176の阻害物質が、GPR176機能の阻害物質である、［２］記載の医薬組成物；
［７］
GPR176機能の阻害物質が、GPR176タンパク質に対する特異的結合物質である、［６］記載の医薬組成物；
［８］
GPR176タンパク質に対する特異的結合物質が、抗体、抗体断片およびアプタマーからなる群から選ばれる、［７］記載の医薬組成物；
［９］
抗体断片が、Fv、FabおよびscFvからなる群から選ばれる、［８］記載の医薬組成物；
＜核酸等＞
［１０］
（ａ）配列表の配列番号２、４または６のいずれかに示されるGPR176遺伝子、
（ｂ）配列表の配列番号２、４または６のいずれかに示されるGPR176遺伝子において１個若しくは数個の塩基が欠失、置換または付加されている塩基配列を含む核酸、
（ｃ）配列表の配列番号２、４または６のいずれかに示されるGPR176遺伝子と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸、
の発現を阻害する、siRNA、アンチセンスおよびリボザイムからなる群から選ばれる核酸；
［１１］
［１０］記載の遺伝子または核酸を含む、ベクター；
［１２］
［１１］記載のベクターを含む、細胞；
＜スクリーニング方法＞
［１３］
（ａ）配列表の配列番号２、４、６または８のいずれかに示されるGPR176遺伝子、
（ｂ）配列表の配列番号２、４、６または８のいずれかに示されるGPR176遺伝子において１個若しくは数個の塩基が欠失、置換または付加されている塩基配列を含む核酸、
（ｃ）配列表の配列番号２、４、６または８のいずれかに示されるGPR176遺伝子と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸、またはそれらが導入されている細胞を用いることを特徴とする、該遺伝子若しくは核酸の発現が阻害されることを確認することによって、GPR176の阻害物質をスクリーニングする方法；
［１４］
（１）候補化合物を用意し、
（２）
（ａ）配列表の配列番号２、４、６または８のいずれかに示されるGPR176遺伝子、
（ｂ）配列表の配列番号２、４、６または８のいずれかに示されるGPR176遺伝子において１個若しくは数個の塩基が欠失、置換または付加されている塩基配列を含む核酸、
（ｃ）配列表の配列番号２、４、６または８のいずれかに示されるGPR176遺伝子と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸のいずれかに示される遺伝子または核酸を有する細胞に該候補化合物を接触させ、
（３）該候補化合物が該遺伝子または核酸の発現を抑制するか否かを判定することを含む、GPR176の阻害物質をスクリーニングするための［１３］記載の方法；
［１５］
配列表の配列番号２、４または６のいずれかに示されるGPR176遺伝子を用いる［１３］または［１４］記載の方法；
［１６］
配列表の配列番号１、３、５または７のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するGPR176タンパク質、または該GPR176タンパク質において１個または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加を有する変異GPR176タンパク質であって、該GPR176タンパク質と同等の活性を有する該変異GPR176タンパク質を用いることを特徴とする、該タンパク質の機能を阻害する物質のスクリーニング方法；
［１７］
（１）候補化合物を用意し、
（２）配列表の配列番号１、３、５または７のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するGPR176タンパク質、または該GPR176タンパク質において１個または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加を有する変異GPR176タンパク質であって、該GPR176タンパク質と同等の活性を有する該変異GPR176タンパク質、または該GPR176タンパク質もしくは該変異GPR176タンパク質を発現する細胞に該候補化合物を接触させ、
（３）該候補化合物が該GPR176タンパク質または該変異GPR176タンパク質の機能を阻害するか否かを判定することを含む、GPR176タンパク質の機能を阻害する物質をスクリーニングする方法；
［１８］
配列表の配列番号１、３または５のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するGPR176タンパク質、または該GPR176タンパク質において１個または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加を有する変異GPR176タンパク質であって、該GPR176タンパク質と同等の活性を有する該変異GPR176タンパク質を用いる、［１６］または［１７］記載の方法；
［１９］
候補化合物の存在下で筋線維芽細胞を培養する工程と、培養した該筋線維芽細胞におけるGPR176遺伝子のmRNAまたはGPR176タンパク質の発現量を定量する工程と、定量した該GPR176遺伝子のmRNAまたは該GPR176タンパク質の発現量が、対照と比較して低下していた場合に、該候補化合物は線維化疾患の予防または治療剤であると判定する工程と、を備える、線維化疾患の予防または治療剤のスクリーニング方法；
＜バイオマーカー等＞
［２０］
線維化疾患における重篤度を判定する方法であって、
（ａ１０）被検者の筋線維芽細胞のGPR176の量（被検バイオマーカー量）を測定する工程、
（ｂ１０）被検バイオマーカー量と、健常者の筋線維芽細胞のGPR176の量（対照バイオマーカー量）とを比較する工程、および
（ｃ１０）被検バイオマーカー量が対照バイオマーカー量よりも多い場合に、被検者を、線維化疾患が重篤化すると判定する方法；
［２１］
線維化疾患における重篤度を判定することができる、筋線維芽細胞のGPR176であるバイオマーカー；
＜キット＞
［２２］
GPR176のcDNAを増幅するためのプライマーセット、GPR176のmRNAに特異的にハイブリダイズするプローブ、または、GPR176タンパク質に対する特異的結合物質を含む、筋線維芽細胞の検出用キット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、筋線維芽細胞のマーカータンパク質を同定し、線維化疾患を予防または治療する技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１Ａは、心筋梗塞モデルマウスおよび対照マウスの心臓組織におけるGPR176のmRNA発現量を測定した結果を示すグラフである。図１Ｂは、心筋梗塞モデルマウスおよび対照マウスの心臓組織におけるα-SMAのmRNA発現量を測定した結果を示すグラフである。
【００１２】
【図２Ａ】図２Ａは、偽処置または心筋梗塞処置後7日目のWT（野生型）マウスの心臓切片におけるGPR176 mRNAを評価したIn situ ハイブリダイゼーション（In situ hybridization）法の結果を示す写真である。核はヘマトキシリンで対比染色した。黒い矢印はGPR176 mRNAを示す。スケールバー：50μm。
【図２Ｂ】図２Ｂは、心筋梗塞処理後の心臓の血球系細胞（Hem）と筋線維芽細胞（Myo）を選別するためのFACSでのゲートの設定を示す。血球系細胞および筋線維芽細胞を含む細胞は、心筋梗塞処理後の3日目にWTマウスの心臓から単離した。すぐに単離した細胞を、抗PDGFR-αおよび抗CD45抗体で染色し、FACSによって分析した。
【図２Ｃ】図２Ｃは、血球系細胞（Hem）と筋線維芽細胞（Myo）として選別した細胞における図示した遺伝子（Cd68、Acta2およびCol1a1）のmRNA発現レベルを示すグラフである。Cd68およびCol1a1/Acta2は、それぞれマクロファージおよび筋線維芽細胞のマーカーとして使用した。n = 3。GAPDHを内部コントロールとして使用した。* P <0.05、** P <0.01、*** P <0.001、非ペア両側スチューデントt検定。
【図２Ｄ】図２Ｄは、血球系細胞（Hem）と筋線維芽細胞（Myo）として選別した細胞におけるGPR176のmRNA発現レベルを示すグラフである。n = 3。GAPDHを内部コントロールとして使用した。* P <0.05、** P <0.01、*** P <0.001、非ペア両側スチューデントt検定。
【図２Ｅ】図２Ｅは、MACSを用いた心筋梗塞処置心臓からの細胞選別を示す概略図である。
【図２Ｆ】図２Ｆは、血球系細胞（Hem）と筋線維芽細胞（Myo）として選別した細胞における図示した遺伝子（Cd68、Acta2およびCol1a1）のmRNA発現レベルを示すグラフである。Cd68およびCol1a1/Acta2は、それぞれマクロファージおよび筋線維芽細胞のマーカーとして使用した。n = 5。GAPDHを内部コントロールとして使用した。* P <0.05、** P <0.01、*** P <0.001、非ペア両側スチューデントt検定。
【図２Ｇ】図２Ｇは、血球系細胞（Hem）と筋線維芽細胞（Myo）として選別した細胞におけるGPR176のmRNA発現レベルを示すグラフである。n = 5。GAPDHを内部コントロールとして使用した。* P <0.05、** P <0.01、*** P <0.001、非ペア両側スチューデントt検定。
【００１３】
【図３】図３Ａ〜図３Ｃは、In situ ハイブリダイゼーション法(GPR176mRNA)および免疫染色(α-SMA)の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【００１４】
【図４】図４Ａは、心筋梗塞処置後の28日目の野生型（WT）マウスおよびGPR176 KOマウスからのパラフィン包埋心室切片のピクロシリウスレッド染色の結果を示す写真である。スケールバー、1mm。図４Ｂ：心筋梗塞処置後の28日目のWTおよびGPR176 KOマウスのコラーゲン体積分率（CVF）の定量的データを示すグラフである。CVSは、コラーゲン沈着領域を定量することにより決定した。WT; n = 6、GPR176 KO; n = 6。エラーバーは平均±SEMを表す。図４Ｂ：* P <0.05、非ペア両側スチューデントt検定。
【００１５】
【図５】図５は、GPR176欠損が梗塞処置後の心機能を改善することを示している。図５Ａ：心筋梗塞処置後の28日目の野生型（WT）マウスおよびGPR176 KOマウスの心臓の心エコー分析の結果を示すグラフである。HR; 心拍数、IVSTd; 拡張期心室中隔厚、LVIDd; 左心室拡張末期内径、LVID; 左心室収縮末期内径、LVPWd; 左室後壁拡張期、EF; 駆出率、FS; 左室内径短縮率。WT-Sh(偽処置); n = 18、KO-Sh(偽処置); n = 16、WT-MI(梗塞処置); n = 12、GPR176 KO-MI(梗塞処置); n = 9。エラーバーは平均±SEMを表す。* P <0.05、** P <0.01、*** P <0.001、非ペア両側スチューデントt検定。図５Ｂ：心筋梗塞処置後の28日目のWTおよびGPR176 KOマウスにおける体重に対する心臓の重量比および体重に対する肺の重量比を示すグラフである。WT-Sh(偽処置); n = 18、KO-Sh(偽処置); n = 16、WT-MI(梗塞処置); n = 12、GPR176 KO-MI(梗塞処置); n = 9。エラーバーは平均±SEMを表す。* P <0.05、** P <0.01、*** P <0.001、非ペア両側スチューデントt検定。
【００１６】
【図６】図６は、GPR176欠損が心筋梗塞後の線維症を軽減することを示している。図６Ａ、Ｂ：心筋梗塞処置後7日目のWTおよびGPR176 KOマウスの心臓における線維化関連因子（Ctgf、PostnおよびFn1）（Ａ）、心肥大遺伝子（Igf1、NppaおよびNppb）（Ｂ）のmRNA発現レベルを示すグラフである。GAPDHを内部コントロールとして使用した。WT-Sh(偽処置); n = 5、WT-In(梗塞処置); n = 5、GPR176 KO-Sh(偽処置); n = 4、GPR176 KO 梗塞処置; n = 5。 エラーバーは平均±SEMを表す。「Sh」は偽処置群、「In」は心筋梗塞処置後７日目の心臓の梗塞部分、「Re」は、心筋梗塞処置後７日目の心臓の梗塞部分から離れた部分をそれぞれ示す。* P <0.05、** P <0.01、*** P <0.001、非ペア両側スチューデントt検定。
【００１７】
【図７Ａ】図７Ａは、WTマウスからCD45(-)Thy1.2(+)の細胞画分をソーティングした様子を示すグラフである。図中、「WT」は野生型マウス、「myofibroblast」は筋線維芽細胞を含む細胞集団、の結果をそれぞれ表す。「Viability Dye」は死細胞判定用染料である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、GPR176ノックアウトマウスからCD45(-)Thy1.2(+)の細胞画分をソーティングした様子を示すグラフである。図中、「GPR176 KO」はGPR176ノックアウトマウス、「myofibroblast」は筋線維芽細胞を含む細胞集団、の結果をそれぞれ表す。「Viability Dye」は死細胞判定用染料である。
【００１８】
【図８】図８は、各細胞画分における線維化関連因子の発現量を測定した結果を示すグラフである。図８ＡはActa2遺伝子、ＢはCol1a1遺伝子、ＣはCtgf遺伝子、ＤはPostn遺伝子のそれぞれの発現量の測定結果を示す。図中、「WT」は野生型マウスの結果であることを示し、「KO」はGPR176ノックアウトマウスの結果であることを示す。各遺伝子の発現量はGAPDH遺伝子の発現量に対する相対値で示す。
【００１９】
【図９Ａ】図９Ａは、使用した筋線維芽細胞特異的なGPR176欠損マウスの概略図を示す。ペリオスチン遺伝子のプロモーターの下流にCre（DNA組換え酵素）を発現するマウスとGPR176のエクソン2をLoxP配列（Creリコンビナーゼ標的配列）で挟んだ遺伝子改変マウスを掛け合わせることにより、筋線維芽細胞特異的なGPR176欠損マウスを作成した。
【図９Ｂ】図９Ｂは、心筋梗塞処置後7日目のCtrl(対照)および筋線維芽細胞特異的なGPR176 KOマウスの心臓における線維化関連因子（Ctgf、PostnおよびFn1）のmRNA発現レベルを示すグラフである。「Sh」は偽処置群、「In」は心筋梗塞処置後７日目の心臓の梗塞部分、「Re」は、心筋梗塞処置後７日目の心臓の梗塞部分から離れた部分をそれぞれ示す。GAPDHを内部コントロールとして使用した。Ctrl-Sh(偽処置); n = 8、Ctrl-In(梗塞処置); n = 6、GPR176 cKO-Sh(偽処置); n = 7、GPR176 cKO-In(梗塞処置); n = 7。 エラーバーは平均±SEMを表す。* P <0.05、** P <0.01、*** P <0.001、非ペア両側スチューデントt検定。
【図９Ｃ】図９Ｃは、心筋梗塞処置後7日目のCtrl(対照)および筋線維芽細胞特異的なGPR176 KOマウスの心臓における心肥大遺伝子（Igf1、NppaおよびNppb）のmRNA発現レベルを示すグラフである。「Sh」は偽処置群、「In」は心筋梗塞処置後７日目の心臓の梗塞部分、「Re」は、心筋梗塞処置後７日目の心臓の梗塞部分から離れた部分をそれぞれ示す。GAPDHを内部コントロールとして使用した。Ctrl-Sh(偽処置); n = 8、Ctrl-In(梗塞処置); n = 6、GPR176 cKO-Sh(偽処置); n = 7、GPR176 cKO-In(梗塞処置); n = 7。 エラーバーは平均±SEMを表す。* P <0.05、** P <0.01、*** P <0.001、非ペア両側スチューデントt検定。
【図９Ｄ】図９Ｄは、梗塞処置後28日目のCtrlおよびGPR176 cKOマウスにおけるKaplan-Meier生存曲線を示すグラフである。Ctrl-MIとGPR176 cKO-MIの違いは、ログ・ランク・テストによって評価した。 Ctrl; n = 20、GPR176 KO; n = 20。
【図９Ｅ】図９Ｅは、梗塞処置後28日目のCtrlおよびGPR176 cKOマウスからのパラフィン包埋心室切片のピクロシリウスレッド染色を示す写真である。 スケールバー、1mm。
【図９Ｆ】図９Ｆは、梗塞処置後28日目のCtrlおよびGPR176 cKOマウスのコラーゲン体積分率（CVF）の定量的データを示すグラフである。Ctrl-Sh(偽処置); n = 12、GPR176 cKO-Sh(偽処置); n = 8、Ctrl-MI(梗塞処置); n = 9、cKO-MI(梗塞処置); n = 10。 エラーバーは平均±SEMを表す。* P <0.05、** P <0.01、*** P <0.001、非ペア両側スチューデントt検定。
【００２０】
【図１０Ａ】図１０Ａは、梗塞処置後28日目のCtrlおよびGPR176 cKOマウスの心臓の心エコー分析の結果を示すグラフである。HR; 心拍数、IVSTd; 心室中隔厚拡張期、LVIDd; 左心室拡張末期内径、LVID; 左心室収縮末期内径、LVPWd; 左室後壁拡張期、EF; 駆出率、FS; 分数短縮。Ctrl-Sh(偽処置); n = 13、GPR176 cKO-Sh(偽処置); n = 8 Ctrl-MI(梗塞処置); n = 15、GPR176 cKO-MI(梗塞処置); n = 14。エラーバーは平均±SEMを表す。* P <0.05、N.S. 有意差なし、非ペア両側スチューデントt検定。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、梗塞処置後28日目のCtrlおよびGPR176 cKOマウスの梗塞処置心臓における体重に対する心臓の比率および体重に対する肺の比率を示すグラフである。Ctrl-Sh(偽処置); n = 13、GPR176 cKO-Sh(偽処置); n = 8 Ctrl-MI(梗塞処置); n = 15、GPR176 cKO-MI(梗塞処置); n = 14。エラーバーは平均±SEMを表す。* P <0.05、N.S. 有意差なし、非ペア両側スチューデントt検定。
【００２１】
【図１１Ａ】図１１Ａは、四塩化炭素投与による肝障害マウス肝臓の各細胞画分（HC:Hepatocyte, KC: Kupffer cell, HSC: Hepatic Stellate Cell）における筋線維芽細胞のマーカー分子、肝細胞マーカー分子、マクロファージのマーカー分子の発現量を測定した結果を示すグラフである。α-SMA（Acta2）、Col1a1（Col1a1）、Cyp7a1（Cyp7a1）、CD68（Cd68）の各遺伝子の発現量はGAPDH遺伝子の発現量に対する相対値で示している。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、四塩化炭素投与による肝障害マウス肝臓の各細胞画分（HC: Hepatocyte, KC: Kupffer cell, HSC: Hepatic Stellate Cell）におけるGPR176の発現量を測定した結果を示すグラフである。発現量はGAPDH遺伝子の発現量に対する相対値で示している。
【００２２】
【図１２Ａ】図１２Ａは、四塩化炭素を投与していない対照群（n = 4 - 6）、四塩化炭素を４週間投与した群（n = 6）および四塩化炭素を４週間投与した後に投与を中止して４週間飼育した群（n = 5）のマウスの肝臓におけるα-SMAの発現量をリアルタイムRT-PCRで定量した結果を示すグラフである。図中、「対照」は対照群の結果を示し、「CCl4」は四塩化炭素を４週間投与した群の結果を示し、「投与中止後」は四塩化炭素を４週間投与した後に投与を中止して４週間飼育した群の結果を示す。*** P <0.001、非ペア両側スチューデントt検定。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、四塩化炭素（CCl4）を投与していない対照群（n = 4 - 6）、四塩化炭素を４週間投与した群（n = 6）および四塩化炭素を４週間投与した後に投与を中止して４週間飼育した群（n = 5）のマウスの肝臓におけるGPR176の発現量をリアルタイムRT-PCRで定量した結果を示すグラフである。図中、「対照」は対照群の結果を示し、「CCl4」は四塩化炭素を４週間投与した群の結果を示し、「投与中止後」は四塩化炭素を４週間投与した後に投与を中止して４週間飼育した群の結果を示す。*** P <0.001、非ペア両側スチューデントt検定。
【００２３】
【図１３Ａ】図１３Ａは、通常食を与えた対照マウス（n = 5）およびNASH作製用飼料を与えたNASHモデルマウス（n = 5）の肝臓におけるCOl1a1の発現量をリアルタイムRT-PCRで定量した結果を示すグラフである。*** P <0.001、非ペア両側スチューデントt検定。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、通常食を与えた対照マウス（n = 5）およびNASH作製用飼料を与えたNASHモデルマウス（n = 5）の肝臓におけるGPR176の発現量をリアルタイムRT-PCRで定量した結果を示すグラフである。*** P <0.001、非ペア両側スチューデントt検定。
【００２４】
【図１４Ａ】図１４Ａは、マウスにブレオマイシンを経気管投与し、肺線維症を誘発するための概略図を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、生理食塩水またはBLM処理マウスの肺における線維化関連因子（Acta2、CtgfおよびPostn）のmRNA発現レベルを示すグラフである。18S rRNAを内部コントロールとして使用した。生理食塩水; n = 6、BLM; n =8。エラーバーは平均±SEMを表す。** P <0.01、*** P <0.001、非ペア両側スチューデントt検定。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、生理食塩水またはBLM処理マウスの肺におけるGPR176のmRNA発現レベルを示すグラフである。18S rRNAを内部コントロールとして使用した。生理食塩水; n = 6、BLM; n =8。エラーバーは平均±SEMを表す。** P <0.01、*** P <0.001、非ペア両側スチューデントt検定。
【図１４Ｄ】図１４Ｄは、マウスに片側尿管結紮（unilateral ureteral obstruction; UUO）処置し、腎線維症を誘発するための模式図である。
【図１４Ｅ】図１４Ｅは、偽処置またはUUO処理マウスにおける腎臓の線維化関連因子（Acta2、Col1a1、Ctgf）のmRNA発現レベルを示すグラフである。GAPDHを内部コントロールとして使用した。偽処置; n = 5、UUO; n =5。エラーバーは平均±SEMを表す。** P <0.01、*** P <0.001、非ペア両側スチューデントt検定。
【図１４Ｆ】図１４Ｆは、偽処置またはUUO処理マウスにおける腎臓のGPR176のmRNA発現レベルを示すグラフである。GAPDHを内部コントロールとして使用した。偽処置; n = 5、UUO; n =5。エラーバーは平均±SEMを表す。** P <0.01、*** P <0.001、非ペア両側スチューデントt検定。
【００２５】
【図１５】図１５は、GPR176は肺の線維化病態時においても筋線維芽細胞に発現することを示している。図１５Ａ：BLM投与後7日目のWT（野生型）マウスの肺切片におけるGPR176 mRNAをIn situ ハイブリダイゼーション法で検出した結果（左）および抗αSMA抗体で免疫染色した結果（中央）を示す写真である。右の「Merge」はそれらの重ね合わせである。図１５Ｂ、Ｃ、Ｄ：BLM投与後7日目のWTマウスの肺切片におけるGPR176 mRNAをIn situ ハイブリダイゼーション法で検出した結果（それぞれ左）および抗αSMA（Ｂ）、CD31（Ｃ）およびCD45抗体（Ｄ）で免疫染色した結果（それぞれ中央）を示す写真である。それぞれ右の「Merge」はそれらの重ね合わせである。スケールバー; 50μm。
【００２６】
【図１６Ａ】図１６Ａは、GPR176に対するsiRNAで処理した心臓筋線維芽細胞におけるGPR176、線維化関連因子（Ctgf、Postn、Fn1、およびTgfb2）および心肥大遺伝子（Igf1）のmRNA発現レベルを示すグラフである。18S rRNAを内部コントロールとして使用した。n = 7-8。エラーバーは平均±SEMを表す。* P <0.05、** P <0.01、*** P <0.001、非ペア両側スチューデントt検定。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、GPR176を過剰発現している心筋線維芽細胞におけるGPR176、線維化関連因子（Ctgf、Postn、Fn1およびTgfb2）および肥大遺伝子（Igf1）のmRNA発現レベルを示すグラフである。18S rRNAを内部コントロールとして使用した。n = 4。エラーバーは平均±SEMを表す。* P <0.05、** P <0.01、*** P <0.001、非ペア両側スチューデントt検定。
【００２７】
【図１７】図１７は、心筋梗塞処置後のマウス心臓のBorder（梗塞周辺部）あるいはInfarct（梗塞領域）においてGPR176mRNAを発現する細胞がα-SMAを発現することを示す写真、およびBorder（梗塞周辺部）あるいはInfarct（梗塞領域）においてGPR176陽性細胞がα-SMAを発現する割合を定量したグラフである。
【００２８】
【図１８Ａ】図１８Ａは、梗塞処置後３日目のマウス心臓から単離した筋線維芽細胞におけるGPR176 mRNAおよびPostn mRNAのIn situ ハイブリダイゼーション法による検出（左、中央）、ならびに抗αSMA抗体で免疫染色した結果を示す写真である。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、梗塞処置後３日目にマウスから単離した血球系細胞[CD45陽性細胞]における、GPR176 mRNAのIn situ ハイブリダイゼーション法による検出（左）および抗CD68抗体で免疫染色した結果（中央）を示す写真である。右の「Merge」はそれらの重ね合わせである。
【図１８Ｃ】図１８Ｃは、マーカー陽性[αSMA陽性、Postn陽性、またはCD68陽性]細胞の中でGPR176 mRNA陽性細胞である細胞を定量化したグラフである。データは5つの心臓から平均化し、それぞれ100個を超える細胞を定量化した。
【図１８Ｄ】図１８Ｄは、GPR176 mRNA陽性細胞の中でαSMA陽性細胞である細胞を定量化したグラフである。データは5つの心臓から平均化し、それぞれ100個を超える細胞を定量化した。
【図１８Ｅ】図１８Ｅは、GPR176 mRNA陽性細胞の中でPostn mRNA陽性細胞である細胞を定量化したグラフである。データは5つの心臓から平均化し、それぞれ100個を超える細胞を定量化した。
【００２９】
【図１９Ａ】図１９Ａは、BLM処置後7日目にWTマウスからMACSを用いて筋線維芽細胞[CD45(-), CD31(-), CD326(-)細胞]と血球系細胞[CD45(＋)細胞]を単離する手法を示す。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、BLM処置後7日目のマウス肺から単離した筋線維芽細胞[CD45(-), CD31(-), CD326(-)細胞]における、GPR176 mRNAの発現をIn situ ハイブリダイゼーション法により検出し、かつ抗αSMA抗体で免疫染色した結果（中央）を示す写真である。
【図１９Ｃ】図１９Ｃは、BLM処置後7日目のマウス肺から単離した血球系細胞[CD45(+)細胞]における、GPR176 mRNA の発現をIn situ ハイブリダイゼーション法により検出し（左）、かつ抗CD68抗体で免疫染色した結果（中央）を示す写真である。
【図１９Ｄ】図１９Ｄは、αSMA陽性またはCD68陽性細胞の中でGPR176 mRNA陽性細胞である細胞を定量化したグラフである。データは5つの心臓から平均化し、それぞれ100個を超える細胞を定量化した。
【図１９Ｅ】図１９Ｅは、GPR176 mRNA陽性細胞の中でαSMA陽性細胞である細胞を定量化したグラフである。データは5つの心臓から平均化し、それぞれ100個を超える細胞を定量化した。
【００３０】
【図２０】図２０は、GPR176がヒト心臓においても筋線維芽細胞に特異的に発現していることを示している。図２０Ａ：非心筋梗塞患者の心臓切片におけるGPR176 mRNA（左から2つ目：GPR176）の発現をIn situ ハイブリダイゼーションによって検出した結果、および抗αSMA抗体（右から2つ目：αSMA）による免疫染色の結果を示す写真である。Bright Fieldは明視野観察像の結果を示す写真である。図２０Ｂ：心筋梗塞患者の心臓切片におけるGPR176 mRNA（左から2つ目：GPR176）の発現をIn situ ハイブリダイゼーションによって検出した結果、および抗αSMA抗体（右から2つ目：αSMA）で免疫染色した結果を示す写真である。矢印はGPR176 mRNAを示している。スケールバー; 20 μm
【００３１】
【図２１】図２１は、GPR176レポーターマウスの心筋梗塞処置後の心臓におけるほとんどのtdTomato標識細胞が筋線維芽細胞であることを示している。図２１Ａ：使用するマウス系統の概略図である。GPR176プロモーターの下流にCreをノックインした遺伝子改変マウスを作製し、このマウスをRosa26-tdTomatoマウス(Jackson Laboratory Stock No: 007914)とかけ合わせることにより、GPR176発現細胞がtdTomatoによって標識されるレポーターマウスを作製した。図２１Ｂ：tdTomatoによって標識されるGPR176（左端）、αSMA（左から2つ目）、CD68（中央）を染色した梗塞処置心臓切片の画像を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
＜線維化疾患の予防または治療剤＞
本発明は一実施態様において、タンパク質共役受容体１７６（GPR176）の阻害物質、具体的にはGPR176発現の阻害物質またはGPR176機能の阻害物質を有効成分として含有する、線維化疾患を予防または治療するための医薬組成物を提供する。本発明において、GPR176はヒトGPR176およびマウスGPR176を含む、さらにそれらのバリアントも含む。ヒトGPR176のバリアント１、バリアント２およびバリアント３のアミノ酸配列および核酸配列をそれぞれ、バリアント１について配列表の配列番号１および２に、バリアント２について配列表の配列番号３および４に、そしてバリアント３について配列表の配列番号５および６に示す。マウスGPR176のアミノ酸配列および核酸配列をそれぞれ、配列表の配列番号７および８に示す。実施例において後述するように、GPR176は、筋線維芽細胞特異的な膜表面マーカー分子であり、線維化を促進する分子である。したがって、GPR176の阻害物質は、線維化疾患を予防または治療に用いることができる。
【００３３】
本発明において、線維化とは皮膚や内臓に膠原線維（コラーゲン）などの細胞外基質と呼ばれる物質が増加し、その結果、皮膚や内臓が硬くなる現象を指し、「硬化」とも呼ばれる。本発明における線維化疾患とは、心臓線維症、肝臓線維症、腎臓線維症、肺線維症、全身性強皮症、皮膚硬化症を意味する。
【００３４】
本発明において、「阻害物質」の「阻害」とは、GPR176発現またはGPR176機能を阻害または抑制することにより、（１）GPR176活性の発症を遅延させる；（２）GPR176活性の症状の進行、増悪または悪化を減速または停止させる；（３）GPR176活性の症状の寛解をもたらす；あるいは（４）GPR176活性の症状を治癒させることを可能ならしめるプロセスを意味する。
【００３５】
本発明において、GPR176発現の阻害物質として、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに示される遺伝子または核酸の発現を阻害する物質が挙げられる：
（ａ）配列表の配列番号２、４または６のいずれかに示されるGPR176遺伝子、
（ｂ）配列表の配列番号２、４または６のいずれかに示されるGPR176遺伝子において１個若しくは数個の塩基が欠失、置換または付加されている塩基配列を含む核酸、
（ｃ）配列表の配列番号２、４または６のいずれかに示されるGPR176遺伝子と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸。
【００３６】
本発明において、遺伝子または核酸の発現を阻害する態様において遺伝子または核酸（以下「標的核酸」ということがある。）とは、筋線維芽細胞特異的な膜表面マーカー分子であり、線維化を促進する分子であることが本発明者らにより発見された配列番号２、４または６のいずれか記載の塩基配列に示されるGPR176遺伝子であるか、または配列表の配列番号２、４または６のいずれかに示される塩基配列を含む核酸において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列を含む核酸、若しくは配列表の配列番号２、４または６のいずれかに示す塩基配列を含む核酸と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸であって、配列番号１記載のアミノ酸配列で示されるタンパク質、または該タンパク質と同じ機能を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する核酸であれば、何れでもよい。好ましくは、配列表の配列番号２、４または６のいずれかに示されるGPR176遺伝子である。
【００３７】
本発明においてmRNAとは、標的核酸によりコードされるmRNA、または標的核酸によりコードされるタンパク質をコードするものであればいずれでもよい。好ましくはGPR176遺伝子でコードされるmRNAである。
【００３８】
本発明の標的核酸は、以下のようにして得ることができる。まず、GPR176タンパク質を産生するヒト細胞または組織、例えばヒト筋線維芽細胞から既知の方法によりmRNAを抽出する。GPR176タンパク質の産生能力を有する細胞または組織は、GPR176タンパク質をコードする塩基配列を有する核酸またはその一部を用いたノーザンブロッティング法、GPR176タンパク質に特異的な抗体を用いたウエスタンブロッティング法などにより特定することができる。本発明において抽出法としては、グアニジン・チオシアネート・ホット・フェノール法、グアニジン・チオシアネート−グアニジン・塩酸法等が使用可能であるが、好ましくはグアニジン・チオシアネート塩化セシウム法が挙げられる。本発明においてmRNAの精製は常法に従えばよく、GPR176タンパク質を産生するヒト細胞または組織、例えばヒト乳癌組織から既知の方法により抽出したmRNAを、例えば、オリゴ（dT）セルロースカラムに吸着、溶出させ、精製する方法、またはショ糖密度勾配遠心法等によりmRNAを分画する方法等が使用可能である。また、mRNAを抽出せずに市販されている抽出済mRNAを用いてもよい。
【００３９】
本発明の一実施態様では、GPR176発現の阻害物質として、好ましくは、siRNA、アンチセンスおよびリボザイムからなる群から選ばれるものが挙げられる。
【００４０】
本発明のリボザイムとはDNA制限エンドヌクレアーゼと類似の機構により他の一本鎖RNA分子を特異的に切断するRNA分子を意味する。既知の手法によりRNAの核酸配列を適宜修飾することにより、RNA一本鎖中の特定の塩基配列を認識し切断するリボザイムを作製することができる（Science, 239, p. １412-1416, 1988）。
【００４１】
本発明の siRNAとは標的核酸の発現を抑制する二本鎖RNAを指し、「RNAi剤」、「短鎖干渉性RNA」、「短鎖干渉性核酸」、「siNA」を意味し、配列特異的なRNA干渉（RNAi）または遺伝子サイレンシングを介して遺伝子発現またはウイルス複製を阻害または下向き調節することのできる核酸分子である。これは、RNAのみからなるものであってもよいし、DNAとRNAとの融合体であってもよい。例えば、配列表の配列番号９および１０に示されるRNA配列を有するsiRNAが挙げられる。該siRNAは標的核酸およびNCBIデータベースの検索により得られた情報から常法に従い作製することができる。siRNAオリゴヌクレオチドの設計においては、標的核酸がコードするmRNAのコーディング領域のうち、できるだけＧＣ含有率が５０％に近い配列を選択する。ＧＣ含有率は４５％から５５％の間が理想的である。ＡＵＧスタートコドン付近の５０から１００ヌクレオチドまたはターミネーションコドン付近の５０から１００ヌクレオチドの領域は避け、AA（アデニン・アデニン）に続く１９ヌクレオチドを選択し、このセンス鎖１９ヌクレオチドの３’末端にはdTdT（デオキシチミン・デオキシチミン）をオーバーハングとして付加する。オーバーハングは、RNAオリゴまたはRNA／DNAのキメラオリゴから選択できる。２塩基のオーバーハングとして通常、チミン（TT）やウラシル（UU）が使用されるが、その他のオーバーハングを使用することもできる。しかし、 siRNA末端を平滑にする、５’末端のみをオーバーハングにする、オーバーハングの長さを変えることにより、RNAｉ効果に影響を与える場合がある。該ヌクレオチドの塩基配列中には３ 個以上のグアノシンまたはシトシンが連続している配列は避けるべきであり、他のどの遺伝子とも相同性がないことを確認する必要がある。アンチセンス鎖はセンス１９ヌクレオチドの相補鎖とし、３’末端にはdTdTを付加する。こうして設計された塩基配列に基づき、センス鎖、アンチセンス鎖をDNA／RNA合成機で合成する。合成されたセンス鎖およびアンチセンス鎖は、NAP-10カラムなどによって精製後、濃縮乾燥し、再度バッファーに溶解して加熱し、アニーリングさせて二本鎖のsiRNAとする。DNA／RNA合成機によるsiRNAの調製法以外に、本発明のsiRNA標的配列をループ配列とともに発現ベクターに組み込み、細胞内で発現させて標的核酸の発現を抑制することも可能である。また、本発明のsiRNA標的配列のセンス鎖、アンチセンス鎖を別々に細胞内で発現させて、細胞内でハイブリダイズさせてsiRNAとし標的核酸の発現を抑制することも可能である。更には本発明のsiRNA標的配列を含む長いｄｓRNAを細胞内に導入して、細胞内で切断してsiRNAとし、標的核酸の発現を抑制することも可能である。
【００４２】
本発明のsiRNAは標的核酸（GPR176遺伝子）の発現を阻害することから、標的核酸の発現を調節する物質として、線維化阻害剤、ひいては線維化疾患を予防または治療する医薬組成物として利用可能である。かかるsiRNAは例えば、配列表の配列番号９および１０に示されるRNA配列を有するsiRNAが挙げられる。
【００４３】
本発明のアンチセンス配列を有する核酸とは、標的核酸の発現を抑制する塩基配列を有する核酸であり、常法に従って作製される。まず、標的核酸がコードするmRNAの標的候補部位を選択するが、この選択方法としては、エネルギー計算に基づくmRNA高次構造予測法（Methods in Enzymol., 180, p. 262, 1989; Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem., 17, p. 167, 1988）、ランダムオリゴ／ＲＮａｓｅ Ｈ法（Nucleic Acid Res., 25, p. 5010, 1997）、逆転写酵素法（Nature Biotech, 15, p. 537, 1997）、蛍光核酸プローブ法（Nucleic Acid Res., 27, p. 2387, 1999）、ＦＲＥＴ法（Biochemistry, 31, p. 12055, 1992）などが使用できる。次に選択したmRNAの候補領域からアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列を決定する。このとき、アンチセンスオリゴヌクレオチドの鎖長は１５〜３０量体が一般的であり、アンチセンスオリゴヌクレオチド自体が自ら二重鎖や自己ステム−ループ構造を形成しないようにし、Ｇが４個以上連続して並ぶ配列はタンパク質と相互作用する可能性が高いので避け、アンチセンスオリゴヌクレオチド中の「CpG」配列はＢ細胞のレセプターに結合するので避けて設計する。アンチセンスオリゴヌクレオチドの構造としては、リン酸結合型（天然型、ホスホロチオエート型、メチルホスホネート型、ホスホロアミデート型、2'-O-メチル型）や非リン酸型（モルフォリデート型、ポリアミド核酸）などの選択肢がある。また、細胞透過性を高めるためにペプチドやコレステロールを導入し、またはアルキル化剤や光架橋剤を導入して架橋性能を持たせることも可能である。このように設計したアンチセンスオリゴヌクレオチドはDNA合成機などによって調製し、逆相HPLC、イオン交換HPLC、ゲル電気泳動法、エタノール沈殿などによって精製する。
【００４４】
本発明のアンチセンス配列を有する核酸は標的核酸（GPR176遺伝子） の発現を阻害することから、標的核酸の発現を調節する物質として、線維化阻害剤、ひいては線維化疾患を予防または治療する医薬組成物として利用可能である。
【００４５】
本発明の一実施態様では、本発明の医薬組成物にはGPR176機能の阻害物質が含まれる。GPR176機能の阻害物質として、GPR176タンパク質に対する特異的結合物質が挙げられる。本発明では、GPR176タンパク質に対する特異的結合物質として、抗体、抗体断片およびアプタマーからなる群から選ばれるものが挙げられる。
【００４６】
標的核酸によりコードされるタンパク質の機能を阻害することにより線維化を阻害する態様においてタンパク質（以下「標的タンパク質」という。）とは、標的核酸によりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質であって、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、並びに該アミノ酸配列において１〜１０個、好ましくは１〜７個、更に好ましくは１〜５個のアミノ酸が置換、欠失または挿入されているアミノ酸配列を有し、かつ、配列番号１記載のアミノ酸配列に示されるGPR176タンパク質と同じく、癌細胞の増殖機構に関与しているか、少なくともその存在が線維化機構に関与しているタンパク質である。
【００４７】
本発明において、抗体とは、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体が含まれる。抗体の例には、全長の抗体、単鎖分子、二機能性分子、scFv、ダイアボディー(diabody)、シングルドメイン抗体（VHH）、キメラ抗体、および免疫付着因子が含まれる。「抗体断片」には、Fv、Fv'、Fab、Fab'およびF(ab')2の断片が含まれる。「抗体」は、それが本発明に関連する場合、目的の抗原のエピトープと結合する領域を１つまたは複数含有するポリペプチドを意味する。
【００４８】
「抗体断片」は、抗体を酵素、例えばパパイン、ペプシン等のプロテアーゼにより処理して得ることができる（Morimoto et al., J. Biochem. Biophys. Methods (1992) 24: 107-17; Brennan et al., Science (1985) 229: 81参照）。また、該抗体断片のアミノ酸配列を基に、遺伝子組換えにより製造することもできる。
【００４９】
「抗体断片」を改変した構造を有する低分子化抗体は、酵素処理若しくは遺伝子組換えにより得られた抗体断片を利用して構築することができる。または、低分子化抗体全体をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させることもできる（例えば、Co et al., J. Immunol. (1994) 152: 2968-76; Better and Horwitz, Methods Enzymol. (1989) 178: 476-96; Pluckthun and Skerra, Methods Enzymol.(1989) 178: 497-515; Lamoyi, Methods Enzymol. (1986) 121: 652-63; Rousseaux et al., Methods Enzymol. (1986) 121: 663-9; Bird and Walker, Trends Biotechnol. (1991) 9: 132-7参照）。
【００５０】
「scFv」は、２つの可変領域を、必要に応じリンカー等を介して結合させた一本鎖ポリペプチドである。scFvに含まれる２つの可変領域は、通常、１つの重鎖可変領域（VH）と１つの軽鎖可変領域（VL）であるが、２つのVHまたは２つのVLであってもよい。一般にscFvポリペプチドは、VHおよびVL領域の間にリンカーを含み、それにより抗原結合のために必要なVHおよびVLの対部分が形成される。通常、同じ分子内でVHおよびVLの間で対部分を形成させるために、一般に、VHおよびVLを連結するリンカーを１０アミノ酸以上の長さのペプチドリンカーとする。しかしながら、本発明におけるscFVのリンカーは、scFvの形成を妨げない限り、このようなペプチドリンカーに限定されるものではない。scFvの総説として、Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibody, Vol.113 (Rosenburg and Moore ed., Springer Verlag, NY,pp.269-315 (1994))を参照することができる。
【００５１】
本発明において、アプタマーとは、特定の標的分子に結合する、核酸分子またはペプチド分子である。アプタマーは通常、大きなランダム配列プールからそれらを選択して作成されるが、天然アプタマーもまた、リボスイッチ（riboswitches）に存在する。アプタマーは高分子薬物として、基礎研究や臨床目的の両方に使用することができる。アプタマーは、それらの標的分子の存在下で、自己切断するリボザイムと組み合わせることができる。より特異的には、アプタマーは、DNA若しくはRNAアプタマーのような核酸アプタマー、またはペプチドアプタマーとして分類することができる。前者は、通常、オリゴヌクレオチドの（通常は短い）の鎖から構成され、一方、後者は、好ましくは、タンパク質の足場（scaffold）の両端に取り付けられた、短い可変ペプチドドメインからなる。核酸アプタマーは、原則として、小分子、タンパク質、核酸、および、さらには細胞、組織および生物自体でさえも含む様々な分子標的に結合するように、インビトロでの選択または同等なSELEX（指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment））の繰り返しラウンドを通して操作された核酸種である。ペプチドアプタマーは通常、細胞内の他のタンパク質相互作用を妨害するように設計されたペプチドまたはタンパク質である。それらは、タンパク質の足場（scaffold）の両端に取り付けられた可変ペプチドループからなる。この二重構造的な制約が、大きく、抗体の（ナノモル範囲）に匹敵するレベルへと、ペプチド  アプタマーの結合親和性を増大させる。可変ペプチドループは、典型的には、１０〜２０個のアミノ酸を含み、そして、足場（scaffold）は、良好な溶解特性を有する任意のタンパク質であってもよい。現在、細菌タンパク質のチオレドキシン−Ａは、最も一般的に使用される足場（scaffold）タンパク質であって、野生型タンパク質において、-Cys-Gly-Pro-Cys-ループである、酸化還元活性部位内に挿入される可変ペプチドループであって、側鎖の二つのシステインは、ジスルフィド架橋を形成することができる。ペプチド  アプタマーの選択は、異なるシステムを用いて作製することができるが、最も広く使用されているものは、現在、酵母ツーハイブリッド システム（yeast two-hybrid system）である。
【００５２】
アプタマーは、一般的に使用される生体分子、特に抗体、に匹敵する分子認識特性を提供するので、生物工学および治療用途のためのユーティリティを提供する。それらの区別認識に加えて、アプタマーは、それらは試験管内で完全に操作することができ、容易に化学合成によって産生され、望ましい貯蔵特性を有し、そして、治療用途においてほとんどまたは全く免疫原性を誘発しないので、抗体を上回る利点を提供する。非修飾アプタマーは、アプタマーは本質的に低分子量であることの結果、主として、ヌクレアーゼ分解および腎臓によって体内からクリアランスされるため、および、数分乃至数時間の半減期で、血流から急速に消失する。未修飾アプタマーの用途は、現在、血液凝固などの一過的状態の治療、または局所的送達が可能である眼などの臓器の治療に焦点を当てている。この急速なクリアランスは、インビボでの画像診断などの用途で有利である。２’−フッ素置換ピリミジン、ポリエチレングリコール（PEG）結合、アルブミンまたは他の半減期延長タンパク質などとの融合などのいくつかの修飾は、アプタマーの半減期を数日または数週間さえも増加させることができるように利用可能である。
【００５３】
簡潔には、GPR176の阻害物質は、例えば、GPR176の発現をmRNAレベルまたはタンパク質レベルで抑制する物質であってもよいし、GPR176に対するアンタゴニスト等であってもよいし、GPR176の活性を阻害する物質であってもよい。
【００５４】
GPR176に対するアンタゴニストは、GPR176に対する特異的結合物質のうち、GPR176を活性化させない物質、GPR176に対するリガンドの結合を阻害する物質等が挙げられる。
【００５５】
GPR176に対する特異的結合物質としては、例えば、抗体、抗体断片、アプタマー等が挙げられる。抗体断片としては、Fv、Fab、scFv等が挙げられる。上記の抗体または抗体断片は、ポリクローナルであってもよく、モノクローナルであってもよい。また、アプタマーとしては、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。
【００５６】
GPR176に対する特異的結合物質である抗体、抗体断片、アプタマーの用途として、以下を挙げることできる。薬剤を付加した抗体、あるいはGPR176中和抗体は、線維化の治療に応用できる。蛍光ラベルや放射ラベルを付した抗体は、筋線維芽細胞や線維化部の検出や診断に応用できる。そして、抗体薬物複合体技術を適用すれば、GPR176を発現し線維化を引き起こし得る筋線維芽細胞を特異的に死滅させることができる。
【００５７】
本明細書において、「治療」とは、（１）線維化疾患または線維化状態の発症を遅延させる; （２）線維化疾患または線維化状態の症状の進行、増悪または悪化を減速または停止させる; （３）線維化疾患または線維化状態の症状の寛解をもたらす; あるいは（４）線維化疾患または線維化状態を治癒させることを目的とする方法またはプロセスを意味する。治療は、予防的措置として疾患または状態の発症前に施してもよいし、あるいはまた、治療は、疾患の開始後に施してもよい。
【００５８】
本明細書において、「予防」とは、線維化疾患または線維化状態の発症を予防することを意味する。
【００５９】
本発明において医薬組成物とは、通常、疾患の治療もしくは予防、あるいは検査・診断のための薬剤を意味する。
【００６０】
本発明の医薬組成物は、当業者に公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は、指示された範囲の適当な容量が得られるように設定する。
【００６１】
注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなビヒクルを用いて通常の調剤に従って処方することができる。
【００６２】
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬（例えばD-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウム）を含む等張液が挙げられる。適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート80（TM）、HCO-50等）を併用してもよい。
【００６３】
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジルおよび／またはベンジルアルコールを併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液および酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩酸プロカイン）、安定剤（例えば、ベンジルアルコールおよびフェノール）、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填する。
【００６４】
本発明の医薬組成物は、好ましくは非経口投与により投与される。例えば、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型の組成物とすることができる。例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。
【００６５】
投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択することができる。ポリペプチドを含有する医薬組成物の投与量は、例えば、１回につき体重1kgあたり0.0001mgから1000mgの範囲に設定することが可能である。または、例えば、患者あたり0.001〜100000mgの投与量とすることもできるが、本発明はこれらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量および投与方法は、患者の体重、年齢、症状などにより変動するが、当業者であればそれらの条件を考慮し適当な投与量および投与方法を設定することが可能である。
【００６６】
本発明は別の態様として、線維化疾患を予防または治療するための方法であって、タンパク質共役受容体176（GPR176）の阻害物質、具体的にはGPR176発現の阻害物質またはGPR176機能の阻害物質を、そのような処置等を必要としている患者に、その有効量を投与することを含む方法に関する。
【００６７】
さらに、本発明は別の態様として、線維化疾患を予防または治療するための本発明のタンパク質共役受容体176（GPR176）の阻害物質、具体的にはGPR176発現の阻害物質またはGPR176機能の阻害物質に関する。
本発明はさらなる別の態様として、線維化疾患を予防または治療するための医薬を製造するための、本発明のタンパク質共役受容体176（GPR176）の阻害物質、具体的にはGPR176発現の阻害物質またはGPR176機能の阻害物質の使用に関する。
【００６８】
＜核酸分子等＞
本発明は、別の実施態様として、
（ａ）配列表の配列番号２、４または６のいずれかに示されるGPR176遺伝子、
（ｂ）配列表の配列番号２、４または６のいずれかに示されるGPR176遺伝子において１個若しくは数個の塩基が欠失、置換または付加されている塩基配列を含む核酸、
（ｃ）配列表の配列番号２、４または６のいずれかに示されるGPR176遺伝子と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸、
の発現を阻害する、siRNA、アンチセンスおよびリボザイムからなる群から選ばれる核酸分子を提供する。上記の通り、本発明のsiRNA、アンチセンスおよびリボザイムからなる群から選ばれる核酸分子は標的核酸（GPR176遺伝子）の発現を阻害することから、標的核酸の発現を調節する物質として、線維化阻害剤、ひいては線維化疾患を予防または治療する医薬組成物として利用可能である。
【００６９】
好ましくは、本発明の核酸分子は、遺伝子治療ベクターに導入される。遺伝子治療とは多くの場合、遺伝的障害に対する治療を指すが、本発明においては、線維化疾患を予防または治療、あるいは線維化疾患の進行を抑止するための治療を意味する。本発明において、遺伝子治療は、線維化疾患を有する患者の細胞内へインビボでの遺伝子のコピー挿入を含んでもよい。遺伝子治療はまた、遺伝子を停止させることを含んでもよい。遺伝子組換えがまた、エキソビボ遺伝子治療において使用されてもよい。例えば、ヒト幹細胞、免疫細胞または癌細胞は、種々の用途のために遺伝的に修飾されてもよい。細胞は、分化、分化転換または再プログラミングを誘導するように修飾される。また、細胞は治療タンパク質を送達するビヒクルとして役立つように修飾されてもよい。
【００７０】
本発明はさらに、本発明のベクターを含む細胞を提供する。本発明の細胞は、線維化疾患を予防または治療、あるいは線維化疾患の進行を抑止するための細胞療法に利用することができる。
【００７１】
＜スクリーニング方法＞
本発明は別の実施態様において、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに示される遺伝子若しくは核酸、またはそれらが導入された細胞を用いることを特徴とする、該遺伝子若しくは核酸の発現が阻害されることを確認することによって、GPR176の阻害物質をスクリーニングする方法を提供する：
（ａ）配列表の配列番号２、４、６または８のいずれかに示されるGPR176遺伝子、
（ｂ）配列表の配列番号２、４、６または８のいずれかに示されるGPR176遺伝子において１個若しくは数個の塩基が欠失、置換または付加されている塩基配列を含む核酸、
（ｃ）配列表の配列番号２、４、６または８のいずれかに示されるGPR176遺伝子と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸。
配列表の配列番号２、４および６は、ヒトGPR176遺伝子の塩基配列であり、配列番号８はマウスGPR遺伝子の塩基配列である。本発明におけるGPR176の阻害物質をスクリーニングする方法では、ヒトGPR176遺伝子、マウスGPR176遺伝子のいずれも使用することができる。好ましくは、ヒトGPR176遺伝子である。
【００７２】
単離された遺伝子または核酸は、適当なベクターに組込むことにより、真核生物および原核生物の宿主細胞を形質転換させることができる。更に、これらのベクターに適当なプロモーターおよび形質発現にかかわる配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞において標的核酸がコードするmRNAまたはタンパク質を発現させることが可能である。本発明においてベクターとしてはプラスミドやラムダ系などのファージベクターを使用することができ、標的核酸を挿入させたものである。なお、プラスミドとしては、自己複製可能で転写プロモーター領域を含むプラスミドまたは動物細胞の染色体に組み込まれるようなプラスミドのいずれでもよい。本発明で使用可能な脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、RNAのスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写終結配列等を有するものを使用でき、これは更に必要により複製起点を有してもよい。該発現ベクターの例としては、SV40の初期プロモーターを有するpSV2dhfr（Mol. Cell. Biol., 1, p.854-864, 1981）、ヒトの延長因子プロモーターを有するpEF-BOS（Nucleic Acids Res., 18, p.5322, 1990）、サイトメガロウイルスプロモーターを有するpCEP4（Invitrogen社）等を例示できるが、これに限定されない。例えば、真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えばサルの細胞であるCOS細胞（Cell, 23, p.175-182, 1981）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（CHO）のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, p.４216-4220, 1980）、ヒト胎児腎臓由来HEK293細胞および同細胞にエプスタイン・バーウイルス（Epstein-Barr virus）のEBNA-1遺伝子を導入した293-EBNA細胞（Invitrogen社）等が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００７３】
遺伝子若しくは核酸の発現が阻害されることを確認するには典型的には、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 、DNAマイクロアレイ法を使用して行うことができる。
【００７４】
本発明のスクリーニング方法はより具体的には、
（１）候補化合物を用意し、
（２）
（ａ）配列表の配列番号２、４、６または８のいずれかに示されるGPR176遺伝子、
（ｂ）配列表の配列番号２、４、６または８のいずれかに示されるGPR176遺伝子において１個若しくは数個の塩基が欠失、置換または付加されている塩基配列を含む核酸、
（ｃ）配列表の配列番号２、４、６または８のいずれかに示されるGPR176遺伝子と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸のいずれかに示される遺伝子または核酸を有する細胞に該候補化合物を接触させ、
（３）該候補化合物が該遺伝子または核酸の発現を抑制するか否かを判定することを含む、GPR176の阻害物質をスクリーニングするための方法である。
【００７５】
上記により得られる細胞の内から、標的核酸がトランスフェクトされた株を選択する方法としては、以下に示す各種方法を採用することができる。即ち直接核酸の存在を確認する方法、mRNAを発現する株として選択する方法などがある。
工程（３）において「該候補化合物が該遺伝子または核酸の発現を抑制するか否かを判定する」には、例えばFoster et al., 2019, Cell 179, 895-908に記載されている手法を用いることができる。
【００７６】
合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるスクリーニング法
標的核酸に対応するオリゴヌクレオチドを合成する。この場合コドン使用頻度を用いて導いたヌクレオチド配列、または考えられるヌクレオチド配列を組合せた複数個のヌクレオチド配列のどちらでもよく、また後者の場合、イノシンを含ませてその種類を減らすこともできる。これをプローブ（32Ｐまたは33Ｐで標識する）として、形質転換体のDNAを変性固定したニトロセルロースフィルターとハイブリダイズさせ、得られたポジティブ株を検索して、これを選択する。
【００７７】
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により作製したプローブを用いるスクリーニング法
標的核酸の一部に対応するセンスプライマーとアンチセンスプライマーのオリゴヌクレオチドを合成し、これらを組合せてＰＣＲ（Science, 239, p. 487-491, 1988）を行い、標的核酸を増幅する。ここで用いる鋳型DNAとしては、創薬標的分子を産生する細胞のmRNAより逆転写反応にて合成したcDNA、またはゲノムDNAを用いることができる。このようにして調製したDNA断片を32Ｐまたは33Ｐで標識し、これをプローブとして用いてコロニーハイブリダイゼーションまたはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより目的の標的核酸を有する株を選択する。
【００７８】
本発明はさらなる別の実施態様において、配列表の配列番号１、３、５または７のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するGPR176タンパク質、または配列表の配列番号１、３、５または７のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するGPR176タンパク質において１個または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加を有する変異GPR176タンパク質であって、該GPR176タンパク質と同等の活性を有する該変異GPR176タンパク質を用いることを特徴とする、GPR176タンパク質の機能を阻害する物質のスクリーニング方法、より具体的には、
（１）候補化合物を用意し、
（２）配列表の配列番号１、３、５または７のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するGPR176タンパク質、または該GPR176タンパク質において１個または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加を有する変異GPR176タンパク質であって、該GPR176タンパク質と同等の活性を有する該変異GPR176タンパク質、または該GPR176タンパク質もしくは該変異GPR176タンパク質を発現する細胞に該候補化合物を接触させ、
（３）該候補化合物が該GPR176タンパク質または該変異GPR176タンパク質の機能を阻害するか否かを判定することを含む、GPR176タンパク質の機能を阻害する物質をスクリーニングする方法を提供する。
配列表の配列番号１、３および５は、ヒトGPR176タンパク質のアミノ酸配列であり、配列番号７はマウスGPRタンパク質のアミノ酸配列である。本発明におけるGPR176の阻害物質をスクリーニングする方法では、ヒトGPR176タンパク質、マウスGPR176タンパク質のいずれも使用することができる。好ましくは、ヒトGPR176タンパク質である。
【００７９】
標的タンパク質はマーカータンパク質とインフレームで融合して発現させることで、発現の確認、細胞内局在の確認、精製等が可能になる。マーカータンパク質としては、例えば、FLAG エピトープ、ヘキサヒスチジンタグ（Hexa-Histidine Tag）、ヘマグルチニンタグ、mycエピトープ等がある。また、マーカータンパク質と標的タンパク質のアミノ酸配列の間にエンテロキナーゼ、ファクターXa、トロンビンなどの、プロテアーゼが認識する特異的なアミノ酸配列を挿入することにより、マーカータンパク質部分をこれらのプロテアーゼにより切断除去することが可能である。例えば、ムスカリンアセチルコリン受容体とヘキサヒスチジンタグとをトロンビン認識配列で連結した報告がある（J. Biochem., 120, p. １232-1238, 1996）。これらマーカータンパク質をコードする塩基配列と標的核酸とをインフレームで融合させたものをベクターに組み込んだ形質転換細胞は、標的核酸または標的タンパク質の機能を調節する物質のスクリーニングに用いることができる。
【００８０】
本発明のスクリーニング方法は、さらに具体的には、候補化合物の存在下で筋線維芽細胞を培養する工程と、培養した該筋線維芽細胞におけるGPR176遺伝子のmRNAまたはGPR176タンパク質の発現量を定量する工程と、定量した該GPR176遺伝子のmRNAまたは該GPR176タンパク質の発現量が、対照と比較して低下していた場合に、該候補化合物は線維化疾患の予防または治療剤であると判定する工程と、を備える、線維化疾患の予防または治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【００８１】
候補化合物としては、例えば化合物ライブラリー等を用いることができる。また、対照としては、例えば、候補化合物の非存在下で培養した筋線維芽細胞等が挙げられる。GPR176遺伝子のmRNAの定量は、例えばマイクロアレイ解析等により行ってもよいし、リアルタイムRT-PCR等により行ってもよい。また、GPR176タンパク質の発現量の定量は、例えばプロテインチップを用いた解析等により行ってもよいし、ウエスタンブロッティング等により行ってもよい。
【００８２】
＜バイオマーカー等＞
本発明は別の態様として、線維化疾患における重篤度を判定する方法であって、
（ａ１０）被検者の筋線維芽細胞のGPR176の量（被検バイオマーカー量）を測定する工程、
（ｂ１０）被検バイオマーカー量と、健常者の筋線維芽細胞のGPR176の量（対照バイオマーカー量）とを比較する工程、および
（ｃ１０）被検バイオマーカー量が対照バイオマーカー量よりも多い場合に、被検者を、線維化疾患が重篤化すると判定する方法、を提供する。
これに関連し、本発明はさらに別の態様として、線維化疾患における重篤度を判定することができる、筋線維芽細胞のGPR176であるバイオマーカーを提供する。さらに、本発明は、線維化疾患における重篤度を判定することができるバイマーカーとしてのGPR176の使用を提供する。
【００８３】
本発明者らは、GPR176が筋線維芽細胞特異的な膜表面マーカー分子であり、線維化を促進する分子であり、それが線維化疾患、特に重篤な線維化疾患に関連していることを見出した。本発明の方法、バイオマーカーおよびGPR176の使用により、事前に、被験者の重症度が判定できれば、線維化疾患が重篤化する患者を予め予測することが可能となり、線維化疾患の予防にとって有益である。
【００８４】
筋線維芽細胞のGPR176量は、GPR176に対する抗体があれば、免疫学的手法により測定することができる。例えば、当業者に周知のＥＬＩＳＡ法によって測定することができる。GPR176に対するmRNAの検出は、例えば、超好感度なin situハイブリダイゼーションの一種であるRNA scope法（Advanced Cell Diagnostics）によって行うことができる。RNA scope法では、目的分子のmRNAが発現していれば、その分子に特異的なプローブを用いる事により、ドット状に検出することができる。筋線維芽細胞からRNAを回収し、リアルタイムRT-PCR法により測定することもできる。
【００８５】
被検者の筋線維芽細胞は生検（バイオプシー）によって採取し、GPR176量を測定する。
【００８６】
＜筋線維芽細胞の検出用キット＞
実施態様において、本発明は、GPR176のcDNAを増幅するためのプライマーセット、GPR176のmRNAに特異的にハイブリダイズするプローブ、または、GPR176タンパク質に対する特異的結合物質を備える、筋線維芽細胞の検出用キットを提供する。
【００８７】
実施例において後述するように、発明者らは、GPR176が正常時の生体の心臓、肝臓、腎臓にはほとんど発現せず、それぞれの臓器が線維化した時にのみ発現が顕著に増加することを明らかにした。また、GPR176の発現が線維化を実行する筋線維芽細胞に特異的であることを明らかにした。したがって、GPR176は、新規の筋線維芽細胞特異的マーカータンパク質である。
【００８８】
本実施態様のキットにおいて、プライマーセットとしては、診断対象の動物種のGPR176遺伝子のcDNAを増幅することができるものであれば特に限定されない。また、GPR176のmRNAに特異的にハイブリダイズするプローブとしては、GPR176遺伝子のmRNAに特異的にハイブリダイズするものであれば特に限定されない。プローブは、担体上に固定されてDNAマイクロアレイ等を構成していてもよい。また、特異的結合物質については上述したものと同様である。特異的結合物質は、担体上に固定されてプロテインチップ等を構成していてもよい。
【００８９】
線維化の実行細胞である筋線維芽細胞のマーカーとして、従来、α-SMA、ペリオスチン等のタンパク質が用いられてきた。しかしながら、これらは全て細胞内タンパク質であった。すなわち、従来、筋線維芽細胞に特異的に発現する細胞膜タンパク質は知られていなかった。
【００９０】
これに対し、実施例において後述するように、GPR176は、起源細胞には発現せず、筋線維芽細胞に分化すると発現が上昇する細胞膜タンパク質である。細胞膜タンパク質であることから、例えば、GPR176に特異的な抗体等を蛍光または放射性同位元素で標識することにより、筋線維芽細胞を侵襲的または非侵襲的に可視化することが可能となる。
【００９１】
＜その他の実施態様＞
GPR176は、細胞膜タンパク質であるため、例えば、GPR176に特異的な抗体等を利用して、筋線維芽細胞に特異的に薬剤を送達することができる。
【００９２】
本明細書に引用されている、刊行物、特許文献等を含むすべての参考文献は、本明細書における引用により、それらが個々に具体的に参考として援用されかつその内容全体が具体的に記載されているのと同程度にまで、本明細書に援用される。
【００９３】
以下、本発明を実施例により、より詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものでなく、単なる例示である点に留意すべきである。
【実施例】
【００９４】
実施例１
心筋梗塞モデルマウスを用いたマイクロアレイ解析
マイクロアレイ解析により、線維化に関与する細胞膜タンパク質の探索を行った。具体的には、マウスの心臓の左冠動脈前下行枝を縫合糸で結紮した心筋梗塞モデルマウスから摘出した心臓組織、および、対照として偽処置マウスから摘出した心臓組織を用いたマイクロアレイ解析を行い、心筋梗塞処置群においてのみ発現量が顕著に増加する細胞膜タンパク質を探索した。更に、筋線維芽細胞に顕著に発現するタンパク質を選別した。その結果、線維化に関与する細胞膜タンパク質として、従来機能が未知であったオーファン受容体であるGPR176を見出した。【００９５】
実施例２
心筋梗塞モデルマウスにおけるGPR176の発現
心筋梗塞モデルマウスを用いてGPR176の発現を確認した。具体的には、実施例１と同様の心筋梗塞モデルマウス（n = 5〜６）を用いて、心筋梗塞処置の直後（０日後）、３、７、２８日後の心臓組織におけるGPR176の発現量をリアルタイムRT-PCRにより定量した。対照として、偽処置マウス（n = ３〜４）の処置直後（０日後）、３、７、２８日後の心臓組織におけるGPR176のmRNA発現量をリアルタイムRT-PCRにより定量した。【００９６】
図１Ａは、心筋梗塞モデルマウスおよび対照マウスの心臓組織におけるGPR176のmRNA発現量を測定した結果を示すグラフである。その結果、GPR176は、正常時の心臓には発現せず、心筋梗塞処置後７日目をピークとして顕著に発現量が増加することが明らかとなった。【００９７】
また、上記と同じ試料を用いて、臓器の線維化を担う筋線維芽細胞のマーカーとして知られている、α-SMAの発現量を測定した。図１Ｂは、心筋梗塞モデルマウスおよび対照マウスの心臓組織におけるα-SMAの発現量を測定した結果を示すグラフである。その結果、α-SMAの発現量の推移は、GPR176の発現量の推移と酷似していることが明らかとなった。【００９８】
以上の結果は、GPR176が線維化に関与することを支持するものである。【００９９】
実施例３
筋線維芽細胞におけるGPR176の発現
GPR176がどの細胞から発現されているかを検討した。
GPR176に対する、免疫染色が可能な抗体は存在しないため、RNA scope (Advanced Cell Diagnostics)という手法を用いて、マウス心臓切片上のGPR176 mRNAの検出を行った。RNA scopeとは超高感度なin situ ハイブリダイゼーション法の一種であり、目的分子のmRNAが発現していれば、その分子に特異的なプローブを用いる事により、ドット状に検出される（Wang, F. et al., J. Mol. Diagnostics 14, 22−29 (2012)）。まず、偽処置群（sham）の心臓において、GPR176mRNAの発現を検討したが、シグナルは全く検出されなかった（図２Ａ）。すなわち、GPR176は定常状態の心臓における心筋細胞、常在性の線維芽細胞、内皮細胞等には発現しないことが明らかとなった。一方で、GPR176の発現量がピークを迎える梗塞処置後7日目の心臓において、GPR176mRNAの発現を検討したところ、組織の間質において多くの陽性シグナルを検出することができた（図２Ａ右, 黒色の矢印）。心筋梗塞後の心臓の間質には、マクロファージや好中球、T細胞といった様々な血球系細胞、また様々な細胞から分化した筋線維芽細胞が新たに存在するようになる（Davis, J. & Molkentin, J. D.,. J. Mol. Cell. Cardiol. 70, 9−18 (2014); Liehn, E. A., Postea, O., Curaj, A. & Marx, N., J. Am. Coll. Cardiol. 58, 2357−2362 (2011)）。したがって、GPR176は心筋梗塞後の心臓の間質に存在する血球系細胞または筋線維芽細胞に発現していると考えられる。【０１００】
そこで、心筋梗塞後のマウスの心臓から血球系細胞あるいは筋線維芽細胞を含む細胞画分を、CD45（血球系細胞の膜表面マーカー分子）あるいはPDGFRα（筋線維芽細胞を含む、全ての線維芽細胞の膜表面マーカー分子）の発現を指標に分取し、それら細胞群におけるGPR176の発現量を比較した。具体的には、梗塞処置後3日目の心臓をコラゲナーゼ溶液で消化することで細胞を単離した後、FACS AriaIIIを用いて血球系細胞[CD45(+)PDGFR-α(-)細胞]および筋線維芽細胞を含む細胞画分[CD45(-)PDGFR-α(+)細胞]をそれぞれ回収した（Takeda, N. et al., J. Clin. Invest. 120, 254−265 (2010).）（図２Ｂ）。はじめに、生存細胞を選択するために死細胞判定用染料とSSC-A、次いでdoublet細胞を排除するためにFSC-HとFSC-WおよびSSC-HとSSC-Wでゲーティングした。CD45(-)PDGFR-α(+)細胞（筋線維芽細胞を含む線維芽細胞）およびCD45(+)PDGFR-α(-)細胞（血球系細胞）をそれぞれ分取し、次いで各細胞画分からRNAを抽出した。このように回収した細胞画分が純度良く回収されたかについてリアルタイム RT-PCR法を用いて検討した。マクロファージのマーカーであるCD68の発現を調べたところ、CD68（Cd68）は血球系細胞（Hem）の画分にのみ発現していた（図２Ｃ）。一方で、筋線維芽細胞のマーカー分子であるα-SMA（Acta2）の発現は筋線維芽細胞（Myo）を含む細胞画分[CD45(-)PDGFR-α(+)細胞]に多かった（図２Ｃ）。またCol1a1 (Col1a1) の発現も筋線維芽細胞[CD45(-)PDGFR-α(+)細胞]を含む画分に多かった（図２Ｃ）。これらのことから、ソーティングが適切に行えたことが確認できた。その上で、それぞれの画分におけるGPR176の発現量を測定したところ、GPR176は血球系細胞（Hem）にはほとんど発現せず、筋線維芽細胞（Myo）を含む細胞画分に強く発現することが明らかとなった（図２Ｄ）。しかしながら近年、筋線維芽細胞への分化に伴い、すべての線維芽細胞の表面マーカーであるPDGFRαの発現量が減少するという報告もなされ（Kanisicak, O. et al., Nat. Commun. 7, 1−14 (2016)）、PDGFRα陽性細胞は筋線維芽細胞の一部の集団である可能性も考えられた。したがって、筋線維芽細胞を含む線維芽細胞画分の分取に用いられるCD45(-),CD31(-)のネガティブソーティングによる筋線維芽細胞画分の分取を行い（Kanisicak, O. et al., Nat. Commun. 7, 1−14 (2016)）、再度検討を行った（図２Ｅ）。酵素処理により細胞を単離し、一晩、培養し、非接着細胞を除去した。その後、CD45(-)CD31(-)細胞（筋線維芽細胞を含む線維芽細胞：Myo）およびCD45(+)細胞（血球系細胞：Hem）を、MACSを使用してそれぞれ分取し、各細胞からRNAを抽出した。先述の実験と同様に、Cd68、Acta2、Col1a1の発現をリアルタイムRT-PCR法を用いて調べたところ、各細胞分画が適切に分取できていることが確認できた（図２Ｆ）。その上で、それぞれの画分におけるGPR176の発現量を測定したところ、やはりGPR176は筋線維芽細胞[CD45(-)CD31(-)細胞]に高発現していることが確かめられた（図２Ｇ）。総じて、図２は、GPR176が筋線維芽細胞に高度に発現されていることを示している。【０１０１】
実施例４
GPR176とα-SMAとの比較
マウス心臓切片を用いて、In situ ハイブリダイゼーション法によるGPR176 mRNAの検出と、筋線維芽細胞のマーカー分子であるα-SMA抗体（ThermoFisher scientific）による免疫染色を同時に行った。【０１０２】
図３Ａ〜Ｃは、検討結果を示す蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは５０μｍである。図３ＡはGPR176 mRNAを検出した結果を示す写真であり、図３Ｂはα-SMAを検出した結果を示す写真であり、図３Ｃは図３ＡおよびＢをマージした写真である。図３Ａ〜Ｃ中、白矢印はα-SMAが検出された位置を示し、黒矢印はGPR176 mRNAが検出された位置を示し、「ｂｖ」は血管を示す。【０１０３】
その結果、α-SMA陽性の筋線維芽細胞においてGPR176 mRNAのシグナルが観察された。α-SMAは筋線維芽細胞のマーカー分子である一方、血管平滑筋細胞にも多く発現することが知られている。実際に、図３Ａ〜Ｃに示すように筋線維芽細胞と血管平滑筋細胞の両方を含む視野で観察すると、血管周囲に輪状に並んだ血管平滑筋細胞がα-SMAを極めて強く発現しており、そのシグナル強度は、筋線維芽細胞におけるシグナル強度よりも強かった。【０１０４】
大変興味深いことに、α-SMA陽性の血管平滑筋細胞においては、GPR176 mRNAのシグナルは、ほとんど認められなかった。したがって、GPR176は、α-SMAとは異なり、血管平滑筋細胞には発現せず、筋線維芽細胞にのみ特異的に発現していることが明らかとなった。このことは、GPR176は筋線維芽細胞のマーカー分子としてα-SMAより優れた、真の筋線維芽細胞特異的なマーカー分子であることを示している。【０１０５】
実施例５
GPR176の欠損が心筋梗塞後のコラーゲンの蓄積に与える影響
GPR176ノックアウトマウスを作製し、GPR176の欠損が心筋梗塞後のコラーゲンの蓄積に与える影響を検討した。GPR176ノックアウトマウスは、野生型の対照マウスと比較して、通常時においては大きな表現型の変化は認められなかった。また、GPR176ノックアウトマウスは、野生型の対照マウスと比較して、通常時においては心臓の機能においても違いは認められなかった。【０１０６】
続いて、GPR176ノックアウトマウス（n = 6）および野生型の対照マウス（n = 6）に実施例２と同様の心筋梗塞処置を施し、心筋梗塞処置後２８日目に心臓を摘出し、コラーゲンを染色するピクロシリウスレッド染色により、各群の心臓の線維化の程度を評価した。【０１０７】
図４Ａは野生型マウス（WT）およびGPR176ノックアウトマウス（GPR176 KO）の心臓組織切片のピクロシリウスレッド染色の結果を示す写真である。図４Ｂは、図４Ａの結果を数値化したグラフである。その結果、GPR176ノックアウトマウスでは、対照マウスと比較して、心筋梗塞処置後の線維化が有意に減少していることが明らかとなった。【０１０８】
この結果は、GPR176が線維化を促進するタンパク質であり、GPR176に対する中和抗体または阻害薬が、新たな抗線維化薬となり得ることを示す。【０１０９】
実施例６
GPR176の欠損が心筋梗塞後の心機能に与える影響
線維化は、心臓の機能を低下させる。例えば、ペリオスチンKOマウスの心筋梗塞後の心機能は、線維化が抑制されることで改善するとの報告がある（Oka, T. et al., Circ. Res. 101, 313−321 (2007)）。GPR176KOマウスにおいて梗塞処置後の線維化が抑制されていたことから、GPR176KOマウスにおいて、線維化の抑制に伴う心機能の改善が認められるかについて調べた。野生型（WT）マウスおよびGPR176KOマウスの梗塞処置後28日目の心臓における心機能を、心エコー法により形態的に測定した。その結果、GPR176KOマウスにおいてWTマウスと比較し、収縮期左室内径（LVIDs）、左室駆出率（EF）および左室内径短縮率（FS）の有意な改善が認められた（図５Ａ）。また、これらの結果と相関し、梗塞処置後の心重量（HW/BW）および肺重量（LW/BW）を測定した所、GPR176KOマウスにおいて、WTマウスと比較し、梗塞処置後の重量増加が有意に減少していた（図５Ｂ）。以上の結果から、GPR176は心筋梗塞後の線維化を亢進させ、心機能を悪化させる分子であることが明らかになった。【０１１０】
実施例７
GPR176欠損による心筋梗塞後の線維化関連因子の発現誘導の抑制
インビトロ実験においてGPR176が線維化を促進させていたことから、GPR176KOマウスを作成し、個体レベルでGPR176が線維化に関与するかについて検討した。まず、GPR176の発現量が最大となる梗塞処置後7日目の野生型（WT：対照）マウスおよびGPR176KOマウスの心臓における線維化関連因子の発現量を測定した。測定は、偽処置した心室（Sh）および梗塞（In）または梗塞処置した心臓の梗塞部分から離れた領域（Re）から抽出された全RNAをリアルタイムRT-PCRにかけて行った。その結果、WTマウスおよびKOマウス共に、線維化促進因子であるCTGF（Ctgf）、フィブロネクチン（Fn1）およびペリオスチン（Postn）の発現量は、梗塞処置により有意に増加することが確認された（図６Ａ）。しかしながら、それらの発現誘導は、GPR176KOマウスにおいて、WTマウスと比較して有意に減弱していた（図６Ａ）。先述の通り、筋線維芽細胞は線維化の実行のみならず、心筋梗塞後や高血圧による心肥大病態時には液性因子等を産生し心筋細胞の肥大に影響を与える。そこで、筋線維芽細胞におけるGPR176の欠損がこれら液性因子の発現および梗塞処置後の心筋細胞の肥大に与える影響を調べた。具体的には、梗塞処置後7日目の心臓において、心肥大のマーカー分子、ANP（Nppa）およびBNP（Nppb）および心肥大促進因子IGF-1（Igf1）の発現量を測定した。その結果、いずれも梗塞処置により発現量が有意に増加し、その発現増加はGPR176KOマウスにおいて有意に減弱していた（図６Ｂ）。この結果から、GPR176の欠損は、筋線維芽細胞からのIGF-1産生を抑制し、心筋細胞の肥大を抑制すると考えられた。以上の結果から、GPR176は線維化関連因子の発現誘導を介し線維化を促進するとともに、心筋梗塞後の心肥大を促進し、病態を悪化させる可能性が考えられた。【０１１１】
実施例８
インビボにおける検討
インビボでも、筋線維芽細胞におけるGPR176の発現が線維化を促進していると考えられる。そこで、実際にGPR176ノックアウトマウスの筋線維芽細胞において線維化関連因子の発現が減少しているかを検討した。
心筋梗塞処置後３日目の野生型（WT）マウスおよびGPR176ノックアウトマウス、それぞれ２匹の心臓からコラゲナーゼ処理により細胞を単離し、その直後に血球系細胞のマーカー分子であるCD45および全ての線維芽細胞のマーカー分子であるＴｈｙ１．２に対する抗体（Biolegend）で染色した。続いて、セルソーター（型式「FACSAria」、ＢＤバイオサイエンス社）を用いて筋線維芽細胞を含む、CD45(-)Thy1.2(+)の細胞画分をソーティングした。【０１１２】
図７ＡおよびＢは野生型マウスおよびGPR176ノックアウトマウスからCD45(-)Thy1.2(+)の細胞画分をソーティングした様子を示すグラフである。【０１１３】
続いて、野生型マウスおよびGPR176ノックアウトマウスからから回収したCD45(-)Thy1.2(+)細胞画分における線維化関連因子の発現量を比較した。発現量はリアルタイムRT-PCRによって測定した。死細胞判定用染料である「Viability Dye」は具体的にはFixable viability dye eFluor780であり、eBiosciencesから入手した。【０１１４】
図８は、線維化関連因子の発現量を測定した結果を示すグラフである。
その結果、α-SMA（Acta2）や、Col1a1（Col1a1）、CTGF（Ctgf）、ペリオスチン（Postn）等の線維化関連因子の発現量は、GPR176ノックアウトマウスにおいて、総じて減少している傾向が観察された。したがって、筋線維芽細胞が発現するGPR176が心筋梗塞後の線維化関連因子の発現を促進させる可能性が考えられた。【０１１５】
実施例９
筋線維芽細胞特異的なGPR176欠損は心筋梗塞後の線維化関連因子の発現を抑制する
実施例１−９において、GPR176は筋線維芽細胞特異的に発現し、心筋梗塞後の線維化を促進することを明らかにした。これらの結果を裏付けるため、心臓の筋線維芽細胞研究分野で近年よく用いられている、筋線維芽細胞特異的にCreリコンビナーゼを発現するPostn-creマウス18とGPR176flox/floxマウスを交配し、筋線維芽細胞特異的にGPR176を欠損させたマウス、Postn-cre; GPR176flox / floxマウスを作製した（図９Ａ）。そして、このマウスにおいても、心筋梗塞後の線維化が抑制されるかを検討した。対照（Ctrl）マウス（以下、Ctrlマウス）としてPostn+/+;GPR176flox/floxマウスを、GPR176コンディショナルノックアウト（cKO）マウス（以下、GPR176cKOマウス）としてPostn+/cre;GPR176flox/floxマウスを用いて実験を行った。【０１１６】
まず、GPR176全身欠損マウスを用いた検討と同様に、梗塞処置後7日目のCtrlマウスおよびGPR176cKOマウスの心臓における線維化関連因子の発現量を測定した。測定は、偽処置した心室（Sh）および梗塞（In）または梗塞処置した心臓の梗塞部分から離れた領域（Re）から抽出された全RNAをリアルタイムRT-PCRにかけて行った。その結果、CtrlマウスおよびcKOマウス共に、線維化促進因子であるCTGF（Ctgf）、フィブロネクチン（Fn1）、ペリオスチン（Postn）の発現量は、梗塞処置により有意に増加していた（図９Ｂ）。しかしながら、それらの発現誘導は、GPR176cKOマウスにおいて、Ctrlマウスと比較して有意に減弱していた（図９Ｂ）。また、心肥大マーカーであるANP（Nppa）、BNP（Nppb）および心肥大促進因子であるIGF-1（Igf1）の発現量もCtrlマウスおよびcKOマウス共に心筋梗塞処置による有意な増加が認められた（図９Ｃ）。しかしながら、IGF1（Igf1）の発現誘導は、GPR176cKOマウスにおいて、Ctrlマウスと比較して有意に減弱し、ANP（Nppa）、BNP（Nppb）の発現はcKOマウスにおいて減少傾向が認められた（図９Ｂ）。以上の結果から、GPR176が筋線維芽細胞における線維化関連因子の発現誘導を促進し、心臓の線維化に寄与することが明らかになった。【０１１７】
実施例１０
筋線維芽細胞特異的なGPR176欠損は心筋梗塞後の線維化を抑制する
筋線維芽細胞特異的にGPR176を欠損したマウスにおいても心筋梗塞処置後の線維化関連因子発現量の減少が認められたことから、筋線維芽細胞特異的なGPR176の欠損が心筋梗塞処置後の生存率および線維化の進行に与える影響についても検討を行った。CtrlマウスおよびGPR176cKOマウスに心筋梗塞処置を施し、処置後28日目における生存率を調べた。その結果、CtrlマウスおよびGPR176cKOマウスとの間で生存率に差は認められなかった（図９Ｄ）。【０１１８】
次に、梗塞処置後28日目のCtrlマウス心臓およびGPR176cKOマウス心臓においてコラーゲンを赤く染めるピクロシリウスレッド染色を行い、梗塞処置後の線維化領域の程度を評価した（図９Ｅ）。実際に、コラーゲンの蓄積量（CVF; Collagen Volume Fraction）を定量化したものが図９Ｆである。CVSは、コラーゲン沈着領域をカウントすることにより決定した。この結果から、GPR176cKOマウスはCtrlマウスと比較し、コラーゲンの蓄積量が有意に減少していることが明らかになった。総じて、図９は、筋線維芽細胞特異的なGPR176欠損が心筋梗塞後の線維症を軽減することを示している。
以上の結果から、GPR176が線維化関連因子の発現を促進し、線維化を悪化させるという機能は筋線維芽細胞を介したものである可能性が高いことが示された。【０１１９】
実施例１１
筋線維芽細胞特異的なGPR176欠損により心筋梗塞後の線維化は抑制される
GPR176cKOマウスにおいて心筋梗塞処置後の線維化が抑制されていたことから、GPR176cKOマウスにおいて線維化の抑制に伴う心機能の改善が認められるかについて調べた。
具体的には、CtrlマウスおよびGPR176cKOマウスの心筋梗塞処置後28日目の心臓における心機能を、心エコー法により形態的に測定した。その結果、GPR176を全身欠損マウスと同様に、cKOマウスにおいて、左室駆出率（EF）および左室内径短縮率（FS）の有意な改善が認められた（図１０Ａ）。さらに、梗塞処置後の心重量（HW/BW）および肺重量（LW/BW）を測定したが、CtrlマウスとcKOマウスで、梗塞処置後の重量増加に有意な差は認められなかった（図１０Ｂ）。総じて、図１０は、筋線維芽細胞特異的なGPR176欠損が梗塞処置後の心機能を改善することを示している。
以上の結果から、筋線維芽細胞に発現するGPR176がin vivoにおいて線維化の促進に寄与することが明らかになった。【０１２０】
実施例１２
肝臓における検討
肝臓の病態時においても筋線維芽細胞がGPR176を顕著に発現するか否かについて検討した。肝臓においては、筋線維芽細胞は肝星細胞（Hepatic Stellate cells、HSC）と呼ばれている。肝星細胞がコラーゲンなどの細胞外マトリックスタンパク質を過剰に産生し線維化を実行する。そこで、肝星細胞（HSC）、肝臓を構成する肝細胞（Hepatocytes、HC）および肝臓常在性マクロファージであるクッパー細胞（Kupffer cells、KC）におけるGPR176の発現量を比較した。【０１２１】
具体的には、四塩化炭素を投与したマウスの肝臓をコラゲナーゼ処理し、細胞を分散した後に、遠心とＭＡＣＳ磁気細胞分離法により、HSC、HCおよびKCの各細胞画分を回収した。【０１２２】
続いて、各細胞画分における筋線維芽細胞のマーカー分子、肝細胞マーカー分子、マクロファージのマーカー分子の発現量を測定した。発現量はリアルタイムRT-PCRによって測定した。結果を図１１Ａに示す。【０１２３】
図１１Ａは、筋線維芽細胞のマーカー分子であるα-SMA（Acta2）およびCol1a1（Col1a1）は、肝星細胞（HSC）画分においてのみ顕著に発現することを示している。また、肝細胞マーカー分子であるCyp7a1（Cyp7a1）は肝細胞（HC）画分においてのみ顕著に発現することが確認された。また、マクロファージのマーカーであるCD68（Cd68）は、クッパー細胞（KC）画分においてのみ顕著に発現することが確認された。これらの結果から、それぞれの細胞の分取が適切に行われたことが確認できた。【０１２４】
そこで、同じ細胞サンプルを用いて、GPR176の発現量を測定した。図１１ＢはGPR176の発現量を測定した結果を示すグラフである。遺伝子の発現量はGAPDH遺伝子の発現量に対する相対値で示す。【０１２５】
その結果、GPR176は肝星細胞（HSC）画分で顕著に発現することが明らかとなった。したがって、GPR176は肝臓線維化時においても線維化の実行細胞である肝星細胞（筋線維芽細胞）に多く発現することが明らかになり、GPR176が肝臓線維化病態と密接に関与することが確認された。【０１２６】
実施例１３
肝臓線維化モデルマウスにおけるGPR176の発現
肝臓の線維化において、GPR176の発現上昇が観察されるか否かを検討した。マウスに四塩化炭素を４週間投与すると肝臓の線維化が誘導され、四塩化炭素の投与を中止して４週間飼育を続けると、肝臓の線維化が消失することが知られている。そこで、この肝臓線維化モデルを用いて、α-SMAとGPR176の発現量を検討した。【０１２７】
図１２Ａは、四塩化炭素を投与していない対照群（n = 4 - 6）、四塩化炭素を４週間投与した群（n = 6）および四塩化炭素を４週間投与した後に投与を中止して４週間飼育した群（n = 5）のマウスの肝臓におけるα-SMAの発現量をリアルタイムRT-PCRで定量した結果を示すグラフである。【０１２８】
また、図１２Ｂは、四塩化炭素（CCl4）を投与していない対照群（n = 4 - 6）、四塩化炭素を４週間投与した群（n = 6）および四塩化炭素を４週間投与した後に投与を中止して４週間飼育した群（n = 5）のマウスの肝臓におけるGPR176の発現量をリアルタイムRT-PCRで定量した結果を示すグラフである。【０１２９】
その結果、α-SMAおよびGPR176の発現量は、四塩化炭素の投与により顕著に増加することが明らかとなった。また、α-SMAおよびGPR176の発現量は、四塩化炭素を４週間投与した後に投与を中止して４週間飼育すると低下することが明らかとなった。この結果から、GPR176は、肝臓においても線維化病態に関与することが明らかとなった。【０１３０】
実施例１４
非アルコール性脂肪肝炎モデルマウスにおけるGPR176の発現
C57BL/6Jマウスに非アルコール性脂肪肝炎（NASH）作製用飼料である「A06071302（60Kcal％fat）」（超高脂肪コリン欠損メチオニン減量飼料（Research Diets）を５週間与えるとNASH様病態を発症するNASHモデルマウスが知られている。【０１３１】
そこで、このモデルマウスを用いて、NASH様病態におけるGPR176の発現量を検討した。また、比較のためにNASHのマーカーであるCOl1a1の発現量を検討した。発現量はリアルタイムRT-PCRによって測定した。【０１３２】
図１３Ａは、通常食を与えた対照マウス（n = 5）およびNASH作製用飼料を与えたNASHモデルマウス（n = 5）の肝臓におけるCOl1a1の発現量をリアルタイムRT-PCRで定量した結果を示すグラフである。また、図１３Ｂは、通常食を与えた対照マウス（n = 5）およびNASH作製用飼料を与えたNASHモデルマウス（n = 5）の肝臓におけるGPR176の発現量をリアルタイムRT-PCRで定量した結果を示すグラフである。【０１３３】
その結果、COl1a1およびGPR176の発現量は、NASHモデルマウスにおいて顕著に増加することが明らかとなった。この結果から、GPR176がNASH様病態における肝臓の線維化に関与することが明らかとなった。【０１３４】
実施例１５
GPR176の発現量は肺および腎臓の線維化病態時においても増加する
臓器の線維化は、心臓のみならず、腎臓、肝臓、肺など様々な臓器においても認められる。そこで、心臓以外の臓器の線維化病態時においてもGPR176の発現量が増加するか検討した。
肺の線維化疾患である特発性肺線維症は診断から2〜5年のうちに約半数が死に至るといわれ（Carrington, R., Jordan, S., Pitchford, S. C. & Page, C. P., Pulm. Pharmacol. Therauptics 51, 73−78 (2018)）、新規治療法の開発が急がれる。ブレオマイシン（BLM）は、リンパ腫、頭頸部扁平上皮癌、精巣癌、卵巣癌など、いくつかの腫瘍性疾患の治療に使用される化学療法薬である。BLMは鉄と酸素の存在下、活性酸素種（ROS）と反応性窒素種（RNS）を生成する。これらによりDNA鎖切断が行われ、急性間質性および肺胞内炎症が惹起され、それにより線維化が誘導される。BLM投与による肺線維症モデルは、動物モデルで肺線維症の研究を行う際に最も広く使用されている方法である30（Bleomycin in the setting of lung fibrosis induction: From biological mechanisms to counteractions. PMID:
25959210 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25959210）。【０１３５】
GPR176の肺線維化時における発現について検討すべく、BLMを気管から単回投与することにより、肺線維症モデルの作成を試みた（図１４Ａ）。BLM投与後14日目の肺における線維化関連因子の発現量をリアルタイムRT-PCR法により測定したところ、ブレオマイシン投与群は、対照としての生理食塩水（Saline）投与群と比較してActa2、Col1a1、Ctgfの発現量が有意に増加しており、BLM投与による肺線維症の誘導が適切に行えていることが確認できた（図１４Ｂ）。同じサンプルを用いてGPR176の発現量を測定した結果、BLM投与群において、GPR176の有意な発現増加が認められた（図１４Ｃ）。したがって、心臓のみならず、肺においてもGPR176が線維化に関与する可能性が示唆された。【０１３６】
一方で、慢性腎不全は70歳以上の成人の約半数に見られ、その病態時には線維化が生じ、腎臓の機能障害に寄与する31（Humphreys, B. D. Mechanisms of Renal Fibrosis. (2018). https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29068765）。したがって肺と同様、腎臓の線維化も研究が盛んにおこなわれている。片側尿管結紮（Unilateral ureteral obstruction: UUO）は、片側の尿管を結紮することにより尿の排泄が阻害され、尿細管拡張や間質性拡張などの機械的伸張による血行動態の変化、上皮尿細管細胞のアポトーシス、酸化ストレスによって炎症が生じ、腎間質における線維化が誘導される（Martinez-Klimova, E., Aparicio-Trejo, O. E., Tapia, E. & Pedraza-Chaverri, J., Biomolecules 9, (2019)）。GPR176の腎臓の線維化病態時における発現について検討すべく、UUOによる腎線維化モデルの作成を試みた（図１４Ｄ）。腎線維症は右尿管の結紮により誘発させた。偽処置を対照として使用した。UUO処置後7日目の腎臓における線維化関連因子の発現量をリアルタイムRT-PCR法により測定したところ、筋線維芽細胞のマーカー分子であるα-SMA（Acta2）および線維化のマーカー分子であるCol1a1（Col1a1）、CTGF（Ctgf）の発現量は、偽処置群と比較してUUO群において顕著に増加しており、線維化の誘導が行えていることが確認できた（図１４Ｅ）。同じサンプルを用いて、GPR176の発現量を測定したところ、UUO群の腎臓において、偽処置群と比較して発現量が顕著に増加していることが明らかになった（図１４Ｆ）。総じて、図１４は、GPR176の発現量は肺および腎臓の線維化病態時においても増加することを示している。
以上の結果から、GPR176は心臓においてだけでなく、肺や腎臓をはじめとする、他臓器における線維化にも関与する可能性が示唆された。【０１３７】
実施例１６
GPR176は肺の線維化病態時においても筋線維芽細胞に発現する
心臓と同様に、肺においてもGPR176が筋線維芽細胞に発現しているかを検討した。まず初めに、正常時の肺においてIn situ ハイブリダイゼーション法によるGPR176mRNAの検出を行ったところ、心臓と同様に、肺においても正常時の組織においてGPR176の発現は認められなかった（図１５Ａ）。次に、BLMの投与により線維化を誘導したマウスの肺切片においてIn situ ハイブリダイゼーション法によるGPR176mRNAの検出と各種細胞マーカーに対する抗体を用いた免疫染色を同時に行った。GPR176のシグナルはCD31陽性の内皮細胞およびCD45陽性の血球系細胞においてはほとんど認められず、αSMA陽性の筋線維芽細胞にのみ認められた。【０１３８】
実施例１７
筋線維芽細胞においてGPR176は線維化関連因子の発現を促進させる
GPR176が筋線維芽細胞に強く発現していることから、筋線維芽細胞においてGPR176が線維化関連因子の発現を調節するかについて検討した。
初めに、心筋梗塞処置後のマウス心臓から単離した筋線維芽細胞にGPR176に対するsiRNA（siGPR176）を導入し、GPR176をノックダウンした際に線維化関連因子の発現量が変化するかをリアルタイムRT-PCRにより調べた。詳細には、心筋線維芽細胞を、梗塞処置後3日目にWTマウスの梗塞心臓から分離し、次いでGPR176に対するsiRNAを、分離した心筋線維芽細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの96時間後、これらの細胞から抽出された全RNAをリアルタイムRT-PCRにかけた。GPR176の発現量を測定したところ、GPR176に対するsiRNAで処理した心筋線維芽細胞におけるGPR176 mRNA発現が減少していることが確認された。その発現はsiGPR176導入により約30%にまで抑制されていることが確認できた（図１６Ａ）。この条件下で、線維化促進因子であるCTGF（Ctgf）、 フィブロネクチン（Fn1）、ペリオスチン（Postn）、TGF-β2（Tgfb2）の発現量は、siGPR176導入群において有意に減少していた（図１６Ａ）。【０１３９】
対照siRNAは、SilencerTM Select Negative Control No. 1 siRNA #4390843 配列を使用した(ThermoFischer)。また、GPR176に対するsiRNAはSilencerTM Select siRNA #117673であり、その配列は、センス:GAUAUUUCCUGAUAAGUAUtt（配列表の配列番号９）、アンチセンス:AUACUUAUCAGGAAAUAUCcc（配列表の配列番号１０）である(ThermoFischer)。【０１４０】
筋線維芽細胞は線維化の実行のみならず、心筋梗塞後や高血圧による心肥大病態時には液性因子などを産生し心筋細胞の肥大に影響を与える（Takeda, N. & Manabe, I., Int. J. Inflam. 2011, 1−13 (2011)）。そこで、筋線維芽細胞におけるGPR176のノックダウンがこれら液性因子の発現に与える影響についても検討した。具体的には、心筋細胞に作用し、心肥大をもたらす因子であるIGF-1（Igf1）の発現量について検討したところ、siGPR176導入群においてその発現は有意に減少していた（図１６Ａ）。【０１４１】
次に、心筋梗塞処置後のマウス心臓から単離した筋線維芽細胞にレトロウイルスを用いてGPR176を過剰発現させ、ノックダウン時とは逆に、線維化関連因子の発現量が上昇するかをリアルタイムRT-PCRにより評価した。詳細には、梗塞処置後の3日目にWTマウスの梗塞心臓から心筋線維芽細胞を単離し、次いで単離した心筋線維芽細胞へGPR176のレトロウイルスを感染させた。感染48時間後に、これらの細胞から抽出した全RNAをリアルタイムRT-PCRにかけた。その結果、線維化促進因子であるCTGF (Ctgf)、ペリオスチン (Postn)、TGF-β2（Tgfb2）の発現量は、GPR176の過剰発現により有意に増加していた（図１６Ｂ）。また、フィブロネクチン（Fn1）の発現量は、GPR176の過剰発現により増加の傾向が見られた（図１６Ｂ）。さらに、心肥大促進因子であるIGF-1（Igf1）の発現量もGPR176過剰発現により有意に増加していた（図１６Ｂ）。総じて、図１６は、GPR176が筋線維芽細胞において線維化関連因子の発現を促進することを示している。
以上の筋線維芽細胞におけるGPR176ノックダウンおよび過剰発現実験の結果より、筋線維芽細胞に発現するGPR176は線維化を促進させる分子であることが明らかになった。【０１４２】
実施例１８
GPR176を発現する細胞がα-SMAを発現するかについて詳細に検討した。
In situ ハイブリダイゼーション手法を用いて、マウス心臓切片上のGPR176 mRNAの検出を行った。In situ ハイブリダイゼーション法では、目的分子のmRNAが発現していれば、その分子に特異的なプローブを用いる事により、ドット状に検出することができる。心筋梗塞処置後7日目のマウス心臓切片上におけるGPR176 mRNAとα-SMAタンパク質の共検出を行なった。その結果、マウス心臓の梗塞部位周辺部（Border）および梗塞領域（Infarct）においてGPR176陽性細胞のほぼ全ての細胞が、α-SMAを発現することが明らかとなった。結果を図１７に示す。1切片につき、梗塞周辺部（Border zone）では片側12視野（計24視野）、梗塞領域（Infarct region）では11視野において、GPR176陽性細胞におけるα-SMAの発現、α-SMA陽性細胞におけるGPR176の発現の割合を定量した。独立した3切片のデータを平均し、平均値 ± 標準誤差で表した。スケールバーは20μmである。【０１４３】
実施例１９
心臓におけるGPR176の発現細胞と既存の筋線維芽細胞マーカーの発現細胞との関係
GPR176の筋線維芽細胞のマーカーとしての妥当性を検討するために、GPR176の発現と既存の筋線維芽細胞のマーカーの発現を比較した。
筋線維芽細胞のマーカーとしては、従来αSMAがよく用いられてきたが、近年心臓に関してはペリオスチン (Postn)という分子が、より特異性の高いマーカーとして報告されている（Kanisicak, O. et al., Nat. Commun. 7, 1−14 (2016)）。そこで、梗塞処置を行ったマウスの心臓から単離した筋線維芽細胞[CD45(-), CD31(-)細胞]を用いてIn situ ハイブリダイゼーション によるGPR176mRNA およびPostn mRNAの検出と、αSMA 抗体を用いた免疫染色を同時に行い、それらの発現を検討した（図１８Ａ）。具体的にはαSMA 陽性細胞およびPostn陽性細胞におけるGPR176mRNA陽性細胞数の定量と、GPR176mRNA陽性細胞における、αSMA陽性細胞数またはPostn陽性細胞数の定量を行った。また、αSMA 陽性細胞およびPostn陽性細胞におけるGPR176mRNA陽性細胞数についても同様に定量を行った。その結果、各マーカー陽性細胞の約99%がGPR176mRNA陽性細胞であった（図１８Ｃ）。したがって、既存の筋線維芽細胞マーカー発現細胞のほとんどがGPR176mRNAを発現していることが明らかになった。【０１４４】
一方で、いずれのマーカーに関しても、GPR176mRNA陽性細胞におけるマーカー陽性細胞は約98%であった(図１８Ｄ、Ｅ)。したがって、GPR176mRNA陽性細胞のほとんどは、筋線維芽細胞マーカー陽性細胞であることが明らかとなった。また、同様の検討を血球系細胞[CD45陽性細胞]でも行ったが（図１８Ｂ）、GPR176mRNA陽性細胞はほとんど認められなかった（図１８Ｃ）。総じて、図１８は、GPR176の発現が心臓の既存の筋線維芽細胞マーカー（α-SMAおよびペリオスチン）の発現と高い相関があることを示している。
従って、GPR176発現細胞は既存の筋線維芽細胞マーカー発現細胞とほぼ一致しており、GPR176が真の筋線維芽細胞のマーカーとなりえることが考えられた。【０１４５】
実施例２０
GPR176の発現細胞は、肺においても既存の筋線維芽細胞マーカーの発現細胞とほぼ一致する
次に、GPR176が心臓のみならず、肺においても筋線維芽細胞のマーカーとして妥当であるかを検討するために、BLM投与を行ったマウスの肺から筋線維芽細胞[CD45(-), CD31(-), CD326(-)細胞]を単離し（図１９Ａ）、心臓における検討と同様、In situ ハイブリダイゼーションによるGPR176mRNAの検出と、αSMA 抗体を用いた免疫染色を同時に行い、それらの共局在性を検討した（図１９Ｂ）。初めに、αSMA陽性細胞におけるGPR176mRNA陽性細胞の数を定量した。その結果、αSMA陽性細胞の約97%がGPR176陽性細胞であることが明らかになった（図１９Ｄ）。逆に、GPR176陽性細胞におけるαSMA陽性細胞数についても同様に定量した結果、GPR176陽性細胞の98%がαSMA陽性細胞であることが明らかになった（図１９Ｅ）。これらの結果から、GPR176が心臓のみならず、肺においても筋線維芽細胞のマーカー受容体となる可能性が示唆された。また、同様の検討を血球系細胞[CD45陽性細胞]でも行ったが、GPR176mRNA陽性細胞はほとんど認められなかった(図１９Ｂ、Ｄ)。総じて、図１９は、GPR176の発現細胞は、肺においても既存の筋線維芽細胞マーカーであるα-SMAの発現細胞とほぼ一致することを示している。
したがって、GPR176は肺の筋線維芽細胞のほぼすべてに発現しており、肺においても真の筋線維芽細胞のマーカーとなりえることが考えられた。【０１４６】
実施例２１
ヒト心臓においてもGPR176は筋線維芽細胞に特異的に発現する
マウスのみならず、ヒトにおいてもGPR176が筋線維芽細胞に発現しているかについて検討すべく、心筋梗塞患者および非心筋梗塞患者の心臓切片においてIn situ ハイブリダイゼーションによるGPR176mRNAの検出とαSMAに対する抗体を用いた免疫染色を同時に行った。その結果、非心筋梗塞患者の心臓切片においてGPR176のシグナルはほとんど認められなかった（図２０Ａ）。一方、心筋梗塞患者の心臓切片におけるGPR176のシグナルはαSMA陽性の筋線維芽細胞において認められた（図２０Ｂ）。したがって、GPR176はマウスのみならず、ヒトの心臓においても線維化が生じていない心臓においては発現せず、線維化時に出現する筋線維芽細胞に発現していることが明らかになった。【０１４７】
実施例２２
梗塞処置後のGPR176レポーターマウスの心臓における標識細胞の多くは筋線維芽細胞である
心臓においてはもちろん、様々な臓器においてGPR176が筋線維芽細胞の新規マーカーとなりえることが考えられたため、GPR176プロモーターの下流にCreをノックインした遺伝子改変マウスGPR176-creマウスを作製し、このマウスをRosa26-tdTomatoマウスと交配することにより（Swonger, J. M., Liu, J. S., Ivey, M. J. & Tallquist, M. D., Differentiation 92, 66−83 (2016)）、GPR176発現細胞がtdTomatoによって標識されるGPR176レポーターマウスを作製した（図２１Ａ）。このマウスに対し梗塞処置を行い、3日目の心臓切片におけるtdTomato標識細胞について免疫組織染色により検討した。その結果、tdTomato標識細胞は間質で認められた。さらに、そのほとんどがαSMA陽性であり、一方で単球・マクロファージのマーカーであるCD68は陰性であることが確認できた（図２１Ｂ）。
【産業上の利用可能性】
【０１４８】
本発明によれば、筋線維芽細胞のマーカータンパク質を同定し、線維化疾患を予防または治療する技術を提供することができる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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