(57)【要約】  神経発達の異常を病態とした精神疾患に対する新規治療薬を提供することを課題とする。Rhoキナーゼ阻害剤を有効成分として含有する抗精神病薬が提供される。当該抗精神病薬は、例えば、統合失調症、自閉スペクトラム症、双極性障害又はうつ病の治療に利用され得る。
2020079993.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Rhoキナーゼ阻害剤又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する抗精神病薬。
【請求項２】
ARHGAP10の機能異常を正常化する、請求項１に記載の抗精神病薬。
【請求項３】
前記Rhoキナーゼ阻害剤がファスジル又はリパスジルである、請求項１又は２に記載の抗精神病薬。
【請求項４】
神経発達の異常を病態とした精神疾患の治療に使用される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗精神病薬。
【請求項５】
前記精神疾患がARHGAP10の機能異常により引き起こされる、請求項４に記載の抗精神病薬。
【請求項６】
前記精神疾患が統合失調症、自閉スペクトラム症、双極性障害又はうつ病である、請求項４又は５に記載の抗精神病薬。
【請求項７】
治療又は予防が必要な患者に対してRhoキナーゼ阻害剤を治療上有効量投与するステップを含む、神経発達の異常を病態とした精神疾患の治療法。
【請求項８】
前記精神疾患がARHGAP10の機能異常により引き起こされる、請求項７に記載の治療法。
【請求項９】
前記精神疾患が統合失調症、自閉スペクトラム症、双極性障害又はうつ病である、請求項７又は８に記載の治療法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗精神病薬（精神疾患治療薬）に関する。詳しくは、神経発達の異常を病態とした精神疾患に対する治療薬及びその用途等に関する。本出願は、２０１８年１０月１５日に出願された日本国特許出願第２０１８−１９４６８２号に基づく優先権を主張するものであり、当該特許出願の全内容は参照により援用される。
【背景技術】
【０００２】
総合失調症は、幻覚妄想などの陽性症状、会話や表情の乏しさ、意欲の欠如を特徴とする陰性症状、及び記憶・集中力などの認知機能障害を示す精神障害であり、その有病率は一般人口の約1％である。我が国だけでも約70万人の統合失調症患者が治療中であるが、現在の治療では十分な効果が得られない難治例も多く、その結果、治療中のうち15.3万人の患者が精神科病床に入院（2017年）を余儀なくされている。また統合失調症患者は一般人口と比較して、寿命も10年から25年ほど短い。以上を勘案し、我が国の統合失調症による経済損失は毎年2兆8千億円（2013年）と算出されている。【０００３】
統合失調症が早期に死亡する原因として心循環系疾患が多いことから、脳と心臓の双方に関与する分子が病態の背景にあると推測され、さらに効果に優れると同時に心循環系等への副作用の少ない治療薬の開発が待望されている。しかし統合失調症の病態の詳細は未だ不明であり、病態に基づく治療薬開発が進んでいないのが現状である。【０００４】
統合失調症の病態は未だ不詳であるが、発症への遺伝因子の関与が他の精神疾患に比して高いことが疫学研究の結果から判明している。本発明者らの研究グループは、日本人統合失調症患者を対象としたゲノムコピー数変異（CNV）解析を実施し、統合失調症の発症に関与する頻度の稀なCNVを患者全体の9％で同定した（非特許文献１）。また、さらなる解析の結果、神経発達や心循環系機能に関連するRhoGAPファミリーに属するARHGAP10遺伝子のCNVを患者5名（欠失4名、重複1名）で同定し、統合失調症の発症に統計学的に関連することを見出した。ARHGAP10遺伝子の欠失をもつ患者の中の1名は、同時に対立遺伝子のRhoGAPドメインにアミノ酸置換（Ser490→Pro）を起こす一塩基変異（SNV）を有していた（図１Ａ）。【０００５】
ARHGAP10タンパク質は、低分子量Gタンパク質であるRhoAやCdc42を不活性化する機能を有するGTPase活性化タンパク質であり、脳や心筋などを含む生体内に広く分布し、エフェクターであるRhoキナーゼ等の活性制御を通して、アクチン細胞骨格制御など様々な生理機能の調節に重要な役割を果たしている。ARHGAP10遺伝子の欠失によるARHGAP10発現量の減少により、RhoAやCdc42の活性型が細胞内で増加し、Rhoキナーゼの活性亢進が示唆されている。また、統合失調症患者1名で同定されたRhoGAPドメイン内のSNVの影響をin vitro結合実験で検討したところ、SNV変異型はRhoAとの結合能を喪失することがわかり、ARHGAP10 SNV変異型はRhoAを基質として不活性化できないことを明らかにした（図１Ｂ）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Kushima I. et al., High-resolution copy number variation analysis of schizophrenia in Japan. Mol Psychiatry 22:430-440, 2017.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記背景の下で本発明は、統合失調症に代表される、神経発達の異常を病態とした精神疾患に対する新規治療薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、統合失調症の病態に基づく新規治療薬の開発を目指し、更に研究を進めた。モデルマウスと患者由来iPS細胞から誘導したドパミン神経細胞を利用した詳細な実験の結果、Rhoキナーゼ阻害剤が優れた抗精神病作用を示し、統合失調症の病態に基づく新規の治療薬として有用であることが示された。一方、実験結果に加え、各種精神疾患に関連する既知のゲノム変異、更には、既存の統合失調症治療薬の適用範囲（統合失調症治療薬が双極性障害等の他の精神疾患にも適用されている事実など）を併せて考察した結果、Rhoキナーゼ阻害剤は、神経発達の異常を病態とした各種精神疾患（統合失調症、自閉スペクトラム症、双極性障害、うつ病等）に対する治療薬になり得ると合理的に期待できるものであった。
以下の発明は上記の成果及び考察に基づく。
［１］Rhoキナーゼ阻害剤又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する抗精神病薬。
［２］ARHGAP10の機能異常を正常化する、［１］に記載の抗精神病薬。
［３］前記Rhoキナーゼ阻害剤がファスジル又はリパスジルである、［１］又は［２］に記載の抗精神病薬。
［４］神経発達の異常を病態とした精神疾患の治療に使用される、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の抗精神病薬。
［５］前記精神疾患がARHGAP10の機能異常により引き起こされる、［４］に記載の抗精神病薬。
［６］前記精神疾患が統合失調症、自閉スペクトラム症、双極性障害又はうつ病である、［４］又は［５］に記載の抗精神病薬。
［７］治療又は予防が必要な患者に対してRhoキナーゼ阻害剤を治療上有効量投与するステップを含む、神経発達の異常を病態とした精神疾患の治療法。
［８］前記精神疾患がARHGAP10の機能異常により引き起こされる、［７］に記載の治療法。
［９］前記精神疾患が統合失調症、自閉スペクトラム症、双極性障害又はうつ病である、［７］又は［８］に記載の治療法。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】患者で同定されたARHGAP10の一塩基多型（Ser490→Pro）（A）とその影響（B）。ARHGAP10 SNV変異型はRhoAとの結合能が低下していた。
【図２】患者型ARHGAP10変異マウス神経細胞（A）、及び患者iPS細胞由来神経細胞（B）での形態異常。患者型ARHGAP10変異マウス（KI/NHEJ)の初代培養の神経細胞にて神経突起の長さと分枝数が低下した。また、ARHGAP10変異患者（症例#4）iPS細胞由来のドパミン神経細胞では、健常者（コントロール）よりも神経突起の長さと分枝数が低下した。
【図３】ファスジルの血漿内及び脳内濃度。Aは実験スキーム。
【図４】自発運動量に対するファスジルの作用。Aは実験スキーム。
【図５】C57BL/6マウス（野生型）及びARHGAP10遺伝子変異マウスにおけるMETH誘発性視覚弁別学習障害とファスジルによる改善効果。Bは実験スキーム。
【図６】MK-801処置マウスの運動過多に対するファスジルの抑制作用。Aは実験スキーム。
【図７】MK-801処置マウスの社会性行動障害に対するファスジルの改善効果。Aは実験スキーム。
【図８】MK-801処置マウスの視覚弁別学習障害に対するファスジルの改善効果。Aは実験スキーム。
【図９】神経突起の自動検出例。
【図１０】ヒトiPS細胞由来神経細胞を用いたRhoキナーゼ阻害剤の効果検討。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の第１の局面は抗精神病薬に関する。「抗精神病薬」とは、標的の疾病ないし病態である、精神病／精神疾患に対する治療的又は予防的効果を示す医薬のことをいう。治療的効果には、精神病／精神疾患に特徴的な症状又は随伴症状を緩和すること（軽症化）、症状の悪化を阻止ないし遅延すること等が含まれる。後者については、重症化を予防するという点において予防的効果の一つと捉えることができる。このように、治療的効果と予防的効果は一部において重複する概念であり、明確に区別して捉えることは困難であり、またそうすることの実益は少ない。尚、予防的効果の典型的なものは、精神病／精神疾患に特徴的な症状の再発発現（発症）を阻止ないし遅延することである。尚、精神病／精神疾患に対して何らかの治療的効果又は予防的効果、或いはこの両者を示す限り、抗精神病薬に該当する。
【００１１】
本発明の抗精神病薬はRhoキナーゼ阻害剤を有効成分として含有する。Rhoキナーゼ阻害剤は、蛋白リン酸化酵素の１つであるRhoキナーゼ（ROCK）を選択的に阻害する。セリン／チロシンキナーゼであるRhoキナーゼは低分子量GTP結合タンパク質Rhoの標的となり、様々な細胞の機能に関与する。Rhoキナーゼ阻害剤の例を挙げると、ファスジル（fasudil）、ヒドロキシファスジル（hydroxyfasudil）、リパスジル（ripasudil）、ネタルスジル（netarsudil）、チアゾビビン（thiazovivin）、(1-ベンジルピロリジン-3-イル)-(1H-インダゾール-5-イル)アミン、(1-ベンジルピペリジン-4-イル)-(1H-インダゾール-5-イル)アミン、N-[2-(4-フルオロフェニル)-6,7-ジメトキシ-4-キナゾリニル]-N-(1H-インダゾール-5-イル）アミン、N-4-(1H-インダゾール-5-イル)-6,7-ジメトキシ-N-2-ピリジン-4-イル−キナゾリン-2,4-ジアミン、4-メチル-5-(2-メチル-[1,4]ジアゼパン-1-スルホニル)イソキノリン、Y-27632（(R)-(+)-trans-N-(4-ピリジル)-4-(1-アミノエチル)-シクロヘキサンカルボキサミド）、RKI 1447（N-[（3-ヒドロキシフェニル）メチル]-N’-[4-（4-ピリジニル）-2-チアゾリル]ウレア）、GSK429286A（N-(6-フルオロ-1H-インダゾール-5-イル)-1,4,5,6-テトラヒドロ-2-メチル-6-オキソ-4-[4-(トリフルオロメチル)フェニル]-3-ピリジンカルボキサミド）、Y 30141（4-(1-アミノエチル)-N-(1H-ピロロ(2,3-b)ピリジン-4-イル)シクロヘキサンカルボキサミド）、Y-39983（4-[(1R)-1-アミノエチル]-N-1H-ピロロ [2,3-b]ピリジン-4-イルベンズアミド二塩酸塩）である。本発明においてファスジル及びリパスジルは特に好ましいRhoキナーゼ阻害剤である。尚、ファスジル塩酸塩水和物（hexahydro-1-(5-isoquinolinesulfonyl)-1H-1,4-diazepine monohydrochloride hemihydrate）を有効成分とした製剤（エリル（登録商標）は、くも膜下出血術後の脳血管攣縮及びこれに伴う脳虚血症状の改善に適用されており、リパスジル塩酸塩水和物（4-Fluoro-5-{[(2S)-2-methyl-1,4-diazepan-1-yl]sulfonyl}isoquinoline monohydrochloride dihydrate）を有効成分とした製剤（グラナテック（登録商標）は、緑内障・抗眼圧症の治療に適用されている。
【００１２】
本発明の抗精神病薬の有効成分は、薬理学的に許容される限りにおいて、塩、水和物、溶媒和物等、様々な形態を採り得る。例えば、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性アミノ酸との塩、酸性アミノ酸との塩など、様々な塩を採用することができる。無機塩基との塩の例は、アル力リ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩、マグネシウム塩など）、アルミニウム塩、アンモニウム塩であり、有機塩基との塩の例は、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロへキシルアミン、N,N'-ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩であり、無機酸との塩の例は、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩であり、有機酸との塩の例は、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸などとの塩であり、塩基性アミノ酸との塩の例は、アルギニン、リジン、オル二チンなどとの塩であり、酸性アミノ酸との塩の例は、アスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩である。これらの塩の調製は慣用手段によって行なうことができる。尚、以上の例示は、「薬理学的に許容される塩」が限定解釈されるために用いられるべきではない。即ち、「薬理学的に許容される塩」は、広義に解釈されるべきであり、各種の塩を含む用語である。
【００１３】
本発明の抗精神病薬の有効成分をプロドラッグの形態としてもよい。「プロドラッグ」とは、不活性又は活性の低い形態の化合物であり、生体に投与されると活性体に変換されて薬効を示すものをいう。例えば、バイオアベイラビリティ（bioavailability）の改善や副作用の軽減等を目的としてプロドラッグが利用される。プロドラッグとしては、活性体である本来の薬剤に対してアミノ基やスルフィド基などのスルホニル化、アシル化、アルキル化、リン酸化、ホウ酸化、炭酸化、エステル化、アミド化、ウレタン化等が施された化合物が挙げられる。
【００１４】
Rhoキナーゼ阻害剤とは作用機序の異なる成分の抗精神病薬（以下、「他の有効成分」と呼ぶ）を併用することにしてもよい。他の有効成分を2種類以上用いることにしてもよい。他の有効成分の例として、アリピプラゾール、アセナピン、オランザピン、クエチアピン、クロザピン、パリペリドン、ペロスピロン、ブロナンセリン、リスペリドン、クロルプロマジン、レボメプロマジン、ペルフェナジン、フルフェナジン、プロペリシアジン、ハロペリドール、ブロムペリドール、スピペロン、モペロン、ピモジド、スルピリド、スルトプリド、チアプリド、ネモナプリド、カルピプラミン、クロカプラミン、モサプラミン、ゾピデンを挙げることができる。
【００１５】
併用の形態は特に限定されず、各有効成分を混合した配合剤の他、Rhoキナーゼ阻害剤を含む第1構成要素と他の有効成分を含む第2構成要素（他の有効成分を2種類以上用いる場合には、他の有効成分の全てをまとめて第2構成要素にする態様、他の有効成分を各々、別の構成要素にする態様など、様々な態様を採り得る）からなるキットの形態で本発明の抗精神病薬を提供することができる。キットの形態の場合、治療期間内に各構成要素が最低1回ずつは投与されることになる。各構成要素の投与スケジュールは個別に設定することができる。両構成要素を同時に投与することにしてもよい。ここでの「同時」は厳密な同時性を要求するものではない。従って、両構成要素を混合した後に対象へ投与する等、両構成要素の投与が時間差のない条件下で実施される場合は勿論のこと、片方の投与後、速やかに他方を投与する等、両構成要素の投与が実質的な時間差のない条件下で実施される場合もここでの「同時」の概念に含まれる。
【００１６】
理論に拘泥する訳ではないが、後述の実験結果（実施例の欄）に鑑みれば、本発明の抗精神病薬は、ARHGAP10の機能異常の正常化を介して薬効を発揮し得る。従って、典型的には、ARHGAP10の機能異常により引き起こされる精神疾患（換言すれば、ARHGAP10遺伝子の変異に起因する精神疾患）が、本発明の抗精神病薬による治療又は予防の対象（以下、「標的疾患」と呼ぶ）となる。標的疾患は、好ましくは、神経発達の異常を病態とした精神疾患である。神経発達の異常を病態とした精神疾患の例は、統合失調症、自閉スペクトラム症、双極性障害及びうつ病である。
【００１７】
本発明の抗精神病薬の製剤化は常法に従って行うことができる。製剤化する場合には、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、界面活性剤、滑沢剤、稀釈剤、被覆剤、糖衣剤、矯味矯臭剤、乳化・可溶化・分散剤、pH調製剤、等張剤、可溶化剤、香料、着色剤、溶解補助剤、生理食塩水など）を含有させることができる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、D-マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。無痛化剤としてはベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトール等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。
【００１８】
製剤化する場合の剤形も特に限定されない。剤形の例は錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、液剤、懸濁剤、乳剤、ゼリー剤、注射剤、外用剤、吸入剤、点鼻剤、点眼剤及び座剤である。本発明の抗精神病薬には、期待される治療効果（又は予防効果）を得るために必要な量（即ち治療上有効量）の有効成分が含有される。本発明の抗精神病薬中の有効成分量は一般に剤形によって異なるが、所望の投与量を達成できるように有効成分量を例えば約0.01重量％〜約95重量％の範囲内で設定する。
【００１９】
本発明の抗精神病薬はその剤形に応じて経口投与又は非経口投与（静脈内、動脈内、皮下、皮内、筋肉内、又は腹腔内注射、経皮、経鼻、経粘膜など）によって対象に適用される。これらの投与経路は互いに排他的なものではなく、任意に選択される二つ以上を併用することもできる（例えば、経口投与と同時に又は所定時間経過後に静脈注射等を行う等）。全身投与によらず、局所投与することにしてもよい。ドラッグデリバリーシステム（DDS）を利用して標的組織特異的に有効成分が送達されるように投与してもよい。
【００２０】
本発明の更なる局面は、本発明の抗精神病薬を使用した、精神病／精神疾患に対する治療法（予防的処置も治療法の概念に含まれる）。本発明の治療法は、上記本発明の抗精神病薬を、治療又は予防が必要な患者に投与するステップを含む。例えば、治療又は予防の対象となる精神病／精神疾患（標的疾患）に関し、罹患していると診断された者、罹患が疑われる者、特徴的な病態ないし症状を呈するか若しくは兆候が認められる者、又は再発の兆候が認められる者等が「治療又は予防が必要な患者」に該当する。抗精神病薬の投与量は一般に、患者の症状、年齢、性別、及び体重などによって変動し得るが、当業者であれば適宜適当な投与量を設定することが可能である。投与スケジュールとしては例えば一日一回〜数回、二日に一回、或いは三日に一回などを採用できる。投与スケジュールの設定においては、患者の症状や有効成分の効果持続時間などを考慮することができる。
【実施例】
【００２１】
1. 背景・目的
過去の報告及びこれまでの研究成果（背景技術の欄を参照）に加え、遺伝統計学的及び生化学的な知見を踏まえ、ARHGAP10遺伝子変異の病態生理学的意義を明らかにするために、ARHGAP10欠失とSNVを両方有している患者の遺伝子型をモデルとして、ゲノム編集技術により遺伝子改変マウスを新規に作製した。そのARHGAP10欠失/SNVモデルマウスの行動解析においては、統合失調症様の表現型が認められ、培養神経細胞のin vitro形態解析においては、神経突起の枝分かれが減少しており、神経発達において幼弱な傾向が認められた（図２Ａ）。ARHGAP10遺伝子が統合失調症の発症と関連する可能性は、動物モデルを用いた表現型解析結果からも強く支持された。【００２２】
加えて、ARHGAP10変異（欠失/SNV）をもつ患者から樹立したiPS細胞を用いてヒト神経細胞における当該変異の影響を解析した。ARHGAP10変異をもつヒト神経細胞では、マウスと同様に、神経突起の長さ及びその分枝数の減少が認められた（図２Ｂ）。【００２３】
以上の知見は、患者で同定されたARHGAP10遺伝子の変異が、恒常的なRhoキナーゼ活性化をもたらすことで統合失調症病態に関与する可能性を示唆する。そこで、Rhoキナーゼ阻害剤が抗精神病薬として適用できるかどうか、モデルマウス及び患者由来iPS細胞を用いて検討することにした。【００２４】
ドパミン受容体刺激作用を示すメタンフェタミン（METH）などの覚醒剤が統合失調症と類似した幻覚、妄想症状を発現することが知られている（Lieberman et al., 1987）。また、一般に抗精神病薬はドパミンD2受容体遮断作用を有することから、統合失調症の発現にはドパミン伝達過剰が関与していると考えられている（Howes et al., 2015）。しかし、陰性症状は従来の抗精神病薬に抵抗性を示すこと、陰性症状はMETHやアンフェタミンなどによる覚醒剤精神病ではまれであることから陰性症状の発現には、ドパミン伝達の亢進とは異なるメカニズムが関与していると示唆されている。一方、N-methyl-D-aspartate（NMDA）受容体拮抗作用を有するフェンシクリジン（PCP）は健常者において統合失調症様の陽性、陰性症状及び認知機能障害を誘発し、統合失調症患者においても精神症状を増悪させる（Javitt, D. C. et al., 1991; Volkow, N. D. et al., 1992）。また、麻酔薬であるケタミンも健常者において統合失調症様の症状を誘発することから（Krystal et al., 1994）、統合失調症の病因・病態生理、臨床症状にグルタミン酸神経伝達が重要な役割を果たしていると考えられている（Tamminga et al., 1995）。MK-801は、グルタミン酸の受容体の一つであるNMDA受容体の非競合的拮抗薬であり、MK-801を投与した実験動物は過活動、社会性行動障害及び認知障害など統合失調症様の陽性、陰性症状及び認知機能障害に類似した行動異常を示すため、薬理学的な統合失調症モデルとして利用されている（Neill et al., 2010; Cadinu et al., 2017）。以下、精神障害の発症に関わるARHGAP10変異を起点とした統合失調症の治療法を開発するため、患者型ARHGAP10変異（欠失/SNV）を有する遺伝子変異モデルマウス、ドパミン及びグルタミン酸仮説に基づいてMETH及びMK-801を投与して作製した薬理学的モデルマウスで観察される行動異常に対するRhoキナーゼ阻害薬ファスジルの効果について検討した。【００２５】
2. 方法
2.1. 実験動物
患者型ARHGAP10変異を有する遺伝子変異モデルマウスはTALEN法により独自に作製した（未発表データ）。また、ファスジルの血中及び脳内濃度測定及びMETHあるいはMK-801を投与した薬理学的モデルマウスの作製には、7週齢の雄性C57BL/6J slcマウス（日本Slc, 静岡, 日本）を使用した。動物は室温23±1℃、湿度50±5%、9:00-21:00明期の明暗サイクルで飼育し、水及び餌は自由に摂取させた。【００２６】
2.2. 試薬
ファスジル塩酸塩水和物は旭化成ファーマ（東京, 日本）から供与を受けた。METH塩酸塩（大日本住友製薬, 大阪, 日本）及び(+)-MK-801マレイン酸塩（SIGMA, セントルイス, ミズーリ州, 米国）は購入した。【００２７】
2.3. 血液及び脳内におけるファスジルの測定
2.3.1. 血液サンプルの調製
採血した血液はヘパリンで処理し、遠心分離（4℃, 1000×g, 10分）した。上清を回収した後、再び遠心分離（4℃, 2000 rpm, 20分）を行い、上清を血漿サンプルとして-80℃で保管した。室温にて融解した血漿サンプル200 μlに1%ギ酸-メタノール溶液 800 μl及び内部標準溶液 [125 ng/ml 1-(5-isoquinolinesulfonyl)piperazine, dihydrochloride, Sigma-Aldrich] 160 μlを加えて、遠心分離した（4℃, 10000 rpm, 5分）。上清を回収した後、phree-SPE（Phenomenex, Torrance, CA, USA）を用いて固相抽出を行い、抽出液を40℃で蒸発乾固した。純水で再溶解した後、遠心分離（室温, 13000 rpm, 5分）を行い、回収した上清20 μlをliquid chromatograph-tandem mass spectrometer（LC/MS/MS）を使用してファスジルの含量を測定した。【００２８】
2.3.2. 脳サンプルの調製
マウスから摘出した脳を生理食塩液にて洗浄し、小脳を除く脳部位を-80℃で保管した。脳サンプル 1 mgに対して1%ギ酸-メタノール溶液 20 μl及び内部標準溶液 4 μlの割合で加え、超音波ホモジナイザーで脳組織を粉砕し、遠心分離（4℃, 10000 rpm, 5分）を行った。上清を回収した後、抽出液を40℃で蒸発乾固した。純水で再溶解した後、遠心分離（室温, 13000 rpm, 5分）を行い、回収した上清20 μlをLC/MS/MSを使用してファスジルの含量を測定した。【００２９】
2.3.3. LC/MS/MS測定
分離カラムはACQUITY UPLC CSH C18 カラム（100 mm × 2.1 mm, waters, ミルフォード, マサチューセッツ州, 米国）を使用、35℃に加温した。移動相は、Ａ溶媒（5mM 酢酸アンモニウム水溶液）及びＢ溶媒（メタノール）を使用し、流速0.2 ml/minで%B（5-80/90 sec）の条件で設定した。PositiveイオンモードのESIによりサンプルをイオン化し、multiple reaction monitoring測定法で292.13 m/z→98.706 m/z、292.13 m/z→98.703 m/z、292.13 m/z→69.5m/zをファスジルとして検出した。ファスジル及び内部標準物質について得られたピーク面積をもとに、ファスジルのピーク面積/内部標準物質比を算出し、検量線用いて血漿及び脳中のファスジル濃度を算出した。ヒト新鮮凍結血漿に溶解したファスジルの標準溶液を用いて作成した検量線は1-1000 ng/mLの濃度範囲で相関係数0.99、日内変動及び日間変動は5%未満であった。また、マウス脳のホモジネート溶液で調製したファスジル標準液で作成した検量線は0.03-3 ng/脳組織重量（mg）の濃度範囲で相関係数0.99、日内変動及び日間変動は5%未満であった。【００３０】
2.4. 行動試験
2.4.1. 自発運動量測定
マウスを一匹ずつ測定ケージ（25 cm × 30 cm × 18 cm）に入れ、その直後から赤外線を備えた測定装置（ブレインサイエンス・イデア, 大阪, 日本）を使用してマウスの運動量を計測した（Ibi et al., 2010）。【００３１】
2.4.2. 視覚弁別試験
タッチスクリーン型オペラント装置（Phenosys, ベルリン, ドイツ; ブレインサイエンス・イデア, 大阪, 日本）を使用した。装置の内部に設置されたタッチスクリーンモニター（5 × 4インチ）の前面には2箇所に正方形の穴が空いたアクリル板が備え付けられており、マウスがこの穴からタッチスクリーンモニターを触ることができる。後面には報酬となる牛乳を供給する給水ノズルが設置されている。行動実験を開始する1週間前より1日2時間のみ餌と水を摂取させ、訓練期間中は食餌制限を継続した。タッチスクリーンに提示された白色の正方形を触り、餌を得る訓練を行い、75%以上の正答率を2日間連続して達成したマウスを以後の視覚弁別実験に使用した。実験にはスクリーンの左右の穴に扇型と玉模様の図柄を同時に提示し、どちらか一方の図柄をタッチすると報酬が与えられるが他方は報酬が得られないように設定した。なお、試験期間中は図柄の提示は左右ランダムとし、図柄と報酬の組み合わせは固定して行なった。1回の試験で30回の図柄が提示され、この時の正答率、試験完遂率、正答反応するまでの潜時及び報酬を獲得するまでの潜時を記録した（Wulaer et al., 2018）。【００３２】
2.4.3. 社会性行動試験
実験を行う前に被験マウスを一匹ずつ飼育ケージで2日間飼育した。3日目に、侵入マウスとして別の飼育ケージで通常の集団飼育を行なったマウスを被験マウスのケージに入れ、被験マウスの追尾行動や匂い嗅ぎ行動などの社会性行動を5分間測定した（Ibi et al., 2010）。【００３３】
2.5. iPS細胞を用いた解析
2.5.1 iPS細胞からの神経細胞誘導
健常者及びARHGAP10変異患者iPS細胞からドパミン神経細胞を誘導した。誘導法は、既報（Transl Psychiatry. 2018 Jul 19;8(1):129.及び特許出願（PCT/JP2018/015304））で述べた方法に準じた。概要を説明すると、iPS細胞をSB431542（3μM）、CHIR99021（3μM）、dorsomorphin（3μM）を添加したiPS細胞培地にて7日間培養した（0日目〜7日目）。その後、TrypLETM select（Thermo Fisher Scientific Inc.）によって分散させ、セルストレイナーに通したものをニューロスフィア培地（DMEM/F12に1×N2サプリメント, 0.6% グルコース, ペニシリン／ストレプトマイシン, 5mM HEPESを添加した培地（MHM培地）に、1×B27サプリメント, 20 ng/ml bFGF, 10 ng/ml human LIF, 10μM Y27632, 3μM CHIR99021, 2μM SB431542, 100 ng/ml FGF8及び1μM プルモルファミンを添加したもの）にて2週間浮遊培養することでニューロスフィアを形成させた（7日目〜21日目）。FGF8とプルモルファミンは10日目から添加した。また、14日目にニューロスフィアを回収し、分散させて単一細胞化した後、再度浮遊培養し、ニューロスフィア（二次ニューロスフィア）を再形成させた。21日目にニューロスフィアをMatrigel TM（BD）コート又はポリ-L-オルニチン/ラミニン/フィブロネクチンコートした培養皿に播種し、ドパミン神経細胞用培地（MHM培地にB27サプリメント, 10μM DAPT, 20 ng/ml BDNF, 20 ng/ml GDNF, 0.2 mM アスコルビン酸, 1 ng/ml TGF-β3及び0.5 mM dbcAMPを添加したもの）にて培養することでドパミン神経細胞へと分化誘導させた（21日目以降）。尚、全ての培養は、通常のCO2インキュベータ（5%CO2。酸素濃度は18.5%〜19.5%（調整していない））内で培養した。【００３４】
2.5.2 Rhoキナーゼ阻害剤
ファスジル塩酸塩水和物は旭化成ファーマ（東京, 日本）から供与を受けた。Y-27632（和光純薬）及びリパスジル（セレックケミカルズ社）については購入した。【００３５】
2.5.3 神経突起長の測定
ドパミン神経前駆細胞をポリーL-オルニチン/ラミニン/フィブロネクチンコートした培養皿に播種し、同時にRhoキナーゼ阻害剤を添加した。コントロール（＝0 μM）には阻害剤の溶媒である水を添加した。72時間後の神経突起長をIncuCyte（登録商標）のNeuroTrackにて自動測定した。【００３６】
3. 結果及び考察
3.1. ファスジルの血漿中及び脳内濃度
図３Ａに示した実験スケジュールに従い、C57BL/6マウスにファスジルを腹腔内投与して血漿及び脳サンプルを採取した。10 mg/kg ファスジルを腹腔内投与したC57BL/6マウスの血漿中のファスジル濃度は、投与5分後で約1600 ng/mlと最も高い値を示し、その後血中濃度は減少した（図３Ｂ）。投与5、10及び20分後の濃度はファスジルのRhoキナーゼに対するKi値 104 ng/mlよりも高い値を示した。また、脳内のファスジル濃度は投与5分後から20分後まで約0.2 ng/mg tissueと高値を示し、ファスジル投与40後にはファスジルのRhoキナーゼに対するKi値 0.104 ng/mg tissueまで減少した（図３Ｃ）。ファスジルを投与して5分後の血漿中及び脳中のファスジル濃度は用量依存的に増加し、血漿中では3 mg/kg以上、脳中では10 mg/kg以上の用量でファスジルのRhoキナーゼに対するKi値を上回る濃度であった（図３Ｄ，Ｅ）。これらの結果から、10 mg/kg以上のファスジルを腹腔内投与した場合には、投与後5分から40分まではRhoキナーゼを十分に阻害する濃度のファスジルが脳内に存在すると考えられる。【００３７】
3.2. 自発運動量に対するファスジルの作用
C57BL/6マウスに生理食塩水またはファスジル（20または30 mg/kg）を腹腔内投与し、その直後からマウスの自発運動量を測定した（図４Ａ）。生理食塩水を投与したマウスに比較して、30 mg/kg ファスジルを投与したマウスは投与直後から自発運動量が有意に減少した（図４Ｂ）。一方、20 mg/kg ファスジルを投与したマウスは生理食塩水を投与したマウスと同程度の自発運動量を示したことから（図４Ｃ）、マウスに30 mg/kg以上のファスジルを投与すると運動機能が障害されると考えられる。【００３８】
3.3. C57BL/6マウス（野生型）及びARHGAP10遺伝子変異マウスにおけるMETH誘発性視覚弁別学習障害とファスジルによる改善効果
本発明者らの研究グループは、METH 1.0 mg/kgを試験の30分前に投与したC57BL/6マウス（野生型）では視覚弁別学習障害が認められることをこれまでに見出している（図５Ａ）。また、ARHGAP10遺伝子変異マウスでは、METH誘発性視覚弁別学習障害がより低用量のMETH（0.3 mg/kg）で惹起されることも明らかにした（図３Ａ）。そのため、両マウスで観察されるMETH誘発性視覚弁別学習障害に対するファスジルによる改善効果について検討した（図５Ｂ）。生理食塩水を投与したC57BL/6マウスの視覚弁別学習試験の正答率は約90%であったのに対して、1.0 mg/kg METHを投与したマウスの正答率は約70％であり学習障害が認められた。C57BL/6マウスで認められるMETH誘発性視覚弁別学習障害は、ファスジル（10 mg/kg または20 mg/kg）をマウスに投与することにより改善された（図５Ｃ）。また、ファスジル（20 mg/kg）は、ARHGAP10遺伝子変異マウスで認められるMETH誘発性視覚弁別学習障害も有意に改善した（図５Ｄ）。これらの結果は、ファスジルがARHGAP10ゲノム変異を伴う遺伝学的モデル動物及びMETHを使用した薬理学的モデル動物が呈する認知機能障害を改善することを示している。【００３９】
3.4. MK-801処置マウスの運動過多に対するファスジルの抑制作用
生理食塩水またはファスジル（10または20 mg/kg）をC57BL/6マウスに腹腔内投与した。その5分後にMK-801（0.3 mg/kg）を腹腔内投与し、直ちに運動量の測定を開始した（図６Ａ）。ファスジル（20 mg/kg）を投与したマウスにおいてMK-801誘発性運動過多が有意に抑制された（図６Ｂ）。したがって、ファスジルはMK-801を用いたモデル動物の精神運動興奮を抑制すると考えられる。【００４０】
3.5. MK-801処置マウスの社会性行動障害に対するファスジルの改善効果
実験開始30分前に生理食塩水またはMK-801（0.1 mg/kg）、5分前に生理食塩水またはファスジル（5または10 mg/kg）をC57BL/6マウスに腹腔内投与し、社会性行動を測定した（図７Ａ）。コントロールマウスと比較してMK-801処置マウスは社会性行動の時間が有意に減少した（図７Ｂ）。MK-801処置マウスで認められた社会性行動の障害は、ファスジル（10 mg/kg）を投与することによりコントロールマウスと同レベルまで回復した（図７Ｂ）。この結果から、MK-801を用いたモデル動物が呈する社会性行動障害に対してファスジルが改善作用を有することが示された。【００４１】
3.6. MK-801処置マウスの視覚弁別学習障害に対するファスジルの改善効果
実験開始30分前に生理食塩水またはMK-801（0.1 mg/kg）、5分前に生理食塩水またはファスジル（3, 10または20 mg/kg）をC57BL/6マウスに腹腔内投与し、視覚弁別試験を実施した（図８Ａ）。生理食塩水を投与したC57BL/6マウスの視覚弁別学習試験の正答率は約90%であったのに対して、MK-801を投与したマウスの正答率は約70％であり学習障害が認められた（図８Ｂ）。C57BL/6マウスで認められるMK-801誘発性視覚弁別学習障害は、ファスジル（20 mg/kg）を投与することによりコントロールレベルまで回復した（図８Ｂ）。この時、試験完遂率、正答反応するまでの潜時及び報酬を獲得するまでの潜時についてはいずれの群でも有意な変化は認められなかった（図８Ｃ−Ｅ）。したがって、ファスジルは注意力や動機付けに有害な作用を及ぼすことなく、MK-801を用いたモデル動物が呈する認知機能障害を改善することが示された。【００４２】
3.7. ヒトiPS細胞を用いたRhoキナーゼ阻害剤添加実験
健常者及びARHGAP10変異患者由来のiPS細胞からドパミン神経細胞を誘導し、Rhoキナーゼ阻害剤（ファスジル、リパスジル、Y-27632）の効果を調べた。神経突起の長さを評価の指標とし、神経突起の長さはIncuCyte（登録商標）のNeuroTrack（エッセンバイオサイエンス社）によって自動検出及び自動測定した。図９に神経突起の検出例を示す。【００４３】
視野ごとに1mm2あたりの神経突起の長さ（mm）を算出し、各群18視野での解析を実施した。ARHGAP10患者神経細胞では神経突起の長さが健常者よりも短いが、Rhoキナーゼ阻害剤の添加によって濃度依存的な改善傾向が認められた（図１０、グラフは平均値±SDを示す）。【００４４】
4. まとめ
本研究で得られた結果を表１に示した。これらの結果から患者型ARHGAP10変異（欠失/SNV）を有する遺伝子変異モデル、ドパミン仮説モデル及びグルタミン酸仮説モデルで認められる行動異常に対してRhoキナーゼ阻害剤であるファスジルは改善効果を有することが明らかとなった。また、患者iPS細胞から誘導した神経細胞に対してファスジルを含む３種のRhoキナーゼ阻害剤による改善効果（突起長の改善）が認められた。【００４５】
以上から、Rhoキナーゼ阻害剤は統合失調症の病態に基づく新規の治療薬として有用である可能性が示唆された。また同一のゲノム変異（特に神経発達関連遺伝子）が統合失調症のみならず、自閉スペクトラム症や双極性障害のリスクであること、既存の統合失調症治療薬である抗精神病薬は、自閉スペクトラム症、双極性障害、うつ病の治療薬としても使われていること、等を鑑みてRhoキナーゼ阻害剤も統合失調症のみならず、神経発達に関連する自閉スペクトラム症、双極性障害、うつ病の治療薬となり得ることが期待できる。
【表１】
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【００４６】
＜参考文献＞
Cadinu D. et al. NMDA receptor antagonist rodent models for cognition in schizophrenia and identification of novel drug treatments, un update. Neuropharmacology pii: S0028-3908(17)30584-1, 2017.
Howes O., McCutcheon R, Stone J. Glutamate and dopamine in schizophrenia: an update for the 21st century. J Psychopharmacol 29:97-115, 2015.
Ibi D. et al. Combined effect of neonatal immune activation and mutant DISC1 on phenotypic changes in adulthood. Behav Brain Res 206:32-37, 2010.
Javitt D. C. et al. Recent advances in the phencyclidine model of schizophrenia. Am J Psychiatry 148:1301-1308, 1991.
Krystal J.H. et al. Subanesthetic effects of the noncompetitive NMDA antagonist, ketamine, in humans. Psychotomimetic, perceptual, cognitive, and neuroendocrine responses. Arch Gen Psychiatry 51:199-214, 1994.
Kushima I. et al., High-resolution copy number variation analysis of schizophrenia in Japan. Mol Psychiatry 22:430-440, 2017.
Lieberman J.A., Kane J.M., Alvir J. Provocative tests with psychostimulant drugs in schizophrenia. Psychopharmacology 91:415-33, 1987.
Neill J.C. et al. Animal models of cognitive dysfunction and negative symptoms of schizophrenia: Focus on NMDA receptor antagonism. Pharmacol Ther 128:419-432, 2010.
Tamminga C.A. et al. Glutamate pharmacology and the treatment of schizophrenia: current status and future directions. Int Clin Psychopharmacol 10:29-37, 1995.
Volkow N.D. et al. Neuropsychiatric disorders: investigation of schizophrenia and substance abuse. Semin Nucl Med 22:254-267, 1992.
Wulaer B. et al. Repetitive and compulsive-like behaviors lead to cognitive dysfunction in Disc1Δ2-3/Δ2-3 mice. Genes Brain Behav Apr 10:e12478, 2018.
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明の抗精神病薬は、神経発達の異常を病態とした各種精神疾患に対し、病態に基づく治療薬となり得る。即ち、本発明は統合失調症の治療の他、自閉スペクトラム症、双極性障害、うつ病等の治療へも適用され得るものであり、その利用価値及び臨床上の意義は極めて大きい。【００４８】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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