(57)【要約】  中枢神経系疾患の発症メカニズムや病態の研究、或いは治療法の開発などにおいて特に有用な新規評価系を提供することを課題とする。細胞集団を構成する個々の細胞の移動変動で規定される移動パターンを指標として、被験物質の薬効を評価する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞集団を構成する個々の細胞の移動変動で規定される移動パターンを指標とした、薬剤評価方法。
【請求項２】
以下のステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む、請求項１に記載の薬剤評価方法：
（ｉ）移動能を示す細胞の集団を用意し、被験物質の存在下で培養を開始した後、移動した個々の細胞の位置を経時的に計測するステップ、
（ｉｉ）計測した位置の情報から各細胞の移動変動を分析して集計し、前記細胞集団の移動パターンを決定するステップ、
（ｉｉｉ）決定した移動パターンに基づき被験物質の薬効又は毒性を判定するステップ。
【請求項３】
以下の（Ａ）で算出される距離比、以下の（Ｂ）で求められる角度θ、又は以下の（Ｃ）で算出される速度をステップ（ｉｉ）の分析に用いる、請求項２に記載の薬剤評価方法：
（Ａ）計測時間ｔでの細胞の総移動距離をＤ（ｔ）、移動開始点と移動終了点の２点間の直線距離をｄ（ｔ）とし、距離比ｄ（ｔ）／Ｄ（ｔ）を算出する、
（Ｂ）計測時間ｔに対して計測時間間隔ｔ／ｎ（但し、ｎは２以上の整数）を設定して細胞の位置を計測し、各時点における細胞の位置ベクトルと基準軸との間の角度θを求める、
（Ｃ）計測時間tでの細胞の総移動距離をＤ（ｔ）とし、速度Ｄ（ｔ）/ｔを算出する。
【請求項４】
（Ｂ）の基準軸として、時間ｔまでの細胞の移動軌跡から計算した平均の位置ベクトルが用いられる、請求項３に記載の薬剤評価方法。
【請求項５】
ステップ（ｉ）の細胞が非正常細胞であり、ステップ（ｉｉｉ）では、移動パターンの正常化を指標として被験物質の薬効が判定される、請求項２〜４のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
【請求項６】
ステップ（ｉ）の細胞が正常細胞であり、ステップ（ｉｉｉ）では、移動パターンの異常化を指標として被験物質の毒性が判定される、請求項２〜４のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
【請求項７】
ステップ（ｉ）の細胞が非正常細胞であり、ステップ（ｉｉｉ）では、移動パターンの更なる異常化を指標として被験物質の毒性が判定される、請求項２〜４のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
【請求項８】
非正常細胞が、標的疾患の遺伝的特徴を有する疾患細胞である、請求項５又は７に記載の薬剤評価方法。
【請求項９】
疾患細胞が患者由来の細胞又は遺伝子操作によって作成された細胞である、請求項８に記載の薬剤評価方法。
【請求項１０】
患者由来の細胞が、患者の細胞から作成した人工多能性幹細胞を分化誘導して得られた細胞である、請求項９に記載の薬剤評価方法。
【請求項１１】
ステップ（ｉ）の細胞が、方向性をもった移動能力を示す細胞である、請求項２〜１０のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
【請求項１２】
方向性をもった移動能力を示す細胞が、神経細胞、心筋細胞又は血球である、請求項１１に記載の薬剤評価方法。
【請求項１３】
神経細胞がドパミン神経細胞、グルタミン作動性神経細胞、セロトニン神経細胞又はGABA作動性神経細胞である、請求項１２に記載の薬剤評価方法。
【請求項１４】
ドパミン神経細胞が、以下のステップ（１）〜（３）を含む方法で調製される、請求項１３に記載の薬剤評価方法：
（１）多能性幹細胞をTGF-βファミリー阻害剤、GSK3β阻害剤及びBMP阻害剤の存在下で培養するステップ、
（２）ステップ（１）で得られた細胞をTGF-βファミリー阻害剤、GSK3β阻害剤、FGF8及びヘッジホッグシグナルアゴニストの存在下且つ通常の酸素分圧下で浮遊培養し、ニューロスフィアを形成させるステップ、
（３）ニューロスフィアを構成する細胞を回収し、ドパミン神経細胞へ分化誘導する、或いは、ニューロスフィアを直接ドパミン神経細胞へ誘導するステップ。
【請求項１５】
細胞集団を構成する個々の細胞の移動変動で規定される移動パターンによって、該細胞集団の品質を評価する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞ベースのアッセイ系に関する。詳しくは、細胞の移動特性を利用した薬剤評価方法及びその応用に関する。本出願は、２０１８年２月２８日に出願された日本国特許出願第２０１８−０３５７５８号に基づく優先権を主張するものであり、当該特許出願の全内容は参照により援用される。
【背景技術】
【０００２】
統合失調症（SCZ）や自閉スペクトラム症(ASD)の病態仮説として、神経発達の障害が重要な役割を果たしていると考えられている。発達期から既に特性が顕在化するASDのみならず、SCZにおいても、明白な精神症状が現れていない発症前からいくつかの認知機能障害や神経生理学的或いは神経画像的変化があることや（非特許文献１）、SCZやASDの死後脳を用いた検討の結果、神経細胞による脳構築の障害が認められたことが報告されている（非特許文献２）。これらの報告からすると、胎児期から始まる神経発達の障害がSCZやASDの発症病因になることが推測されるが、SCZやASD患者の脳内病態の詳細は不明である。【０００３】
SCZやASDのゲノム解析研究により、両疾患ともに神経発達に関与する遺伝子上の変異が複数同定されており、そのひとつがRELNにおける変異である（例えば非特許文献３を参照）。RELNによってコードされるタンパク質Reelinは巨大な分泌タンパク質であり、発達期の脳の層構造形成に必須とされている。ヒトではRELNのホモ欠失変異を有すると、発達遅延を伴う滑脳症を呈し、Reelinの減少は神経発達障害の発症との関連性が報告されている（非特許文献４）。同様に、Reln変異マウスであるreelerマウスでは脳層構造の乱れや異常行動が報告されている（例えば非特許文献５を参照）。これらの報告から、ヒトにおいても、脳内のReelinが減少すると、不安定な神経遊走が起こる可能性が示唆され、SCZやASDに関与する神経発達の障害を来すことが予想される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Schizophrenia bulletin, 29(4):653-669, 2003
【非特許文献２】Dialogues Clin Neurosci, 2(4):349-357, 2000
【非特許文献３】Mol Psychiatry 22(3) 430-440, 2017
【非特許文献４】Nat Genet 26(1):93-96, 2000
【非特許文献５】Nature Rev Neurosci, 4(6):496-505, 2003
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
Reelinを発現する神経細胞種は複数存在するが、その中でもチロシンヒドロキシラーゼ（tyrosin hydroxylase; TH）陽性のドパミン神経細胞は、出生前後の限定された時期にのみReelinを発現することがマウスを用いた研究で報告されている。Reelinは限定的な時期にしか発現しないにもかかわらず、Relnが変異したreelerマウスではドパミン神経細胞の異常が確認されている。一方、SCZやASDの病態にドパミン系が関与するとの報告が多数存在することから、ドパミン神経細胞とReelinの関係を調べることで、SCZやASDの発症メカニズム解明への手掛かりが得られる可能性が示唆される。【０００６】
本発明者らは、SCZやASDの発症メカニズムの解明及び治療法の確立を目指し、Reelinに着目して研究を進めてきた。そして、研究成果の一つとして、iPS細胞からドパミン神経細胞を特異的且つ効率的に調製する方法の確立に成功した（特願２０１７−８２６００）。【０００７】
以上の背景の下、本発明は、中枢神経系疾患（例えば精神疾患）の発症メカニズムや病態の研究、或いは治療法の開発などにおいて特に有用な新規評価系を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の通り、本発明者らはドパミン神経細胞の新規調製方法を確立した。当該方法では分化誘導の過程でニューロスフィア（神経細胞凝集塊）が形成されるが、神経細胞へ分化誘導する条件下でニューロスフィアを培養すると、周囲へ細胞（ドパミン神経細胞）が移動する。移動した個々の細胞の移動距離や移動方向等に着目して検討を重ねた結果、健常者由来の細胞の移動パターンに特徴があること（特定の移動パターンを示すこと）と、RELN欠損精神疾患患者由来の細胞が健常者由来の細胞とは異なる移動パターンを示すことが見出された。この知見は、細胞集団を構成する個々の細胞の移動特性（特に移動方向）で規定される移動パターンが疾患状態を反映するものであることを意味し、当該移動パターンを指標とした評価系が、基礎研究（疾患メカニズムの解明など）はもとより、病態の把握、治療薬の開発などに有用であることを示す。治療薬の開発に利用した場合は移動パターンの正常化が薬効を裏付けるとともに、移動パターンの異常化が毒性を裏付けることになる。例えば、RELN欠損精神疾患患者由来細胞を用いた場合は、移動パターンが正常化すれば、内在性のReelinをレスキューさせる薬効を示すものとなりうる。ここで、中枢神経系に限らず様々な組織や器官／臓器等の正常な形成や再生のプロセスに細胞の移動能が重要であることからすれば、細胞の移動特性に注目した上記評価系の適用範囲（対象とする細胞、用途・応用など）は広く、即ち、薬効又は毒の評価系として広く利用できるものであり、その実用上の価値及び意義は極めて高い。尚、本発明者らの更なる検討によって、上記評価系を実用化する上で有用かつ重要な各種知見も得られた。【０００９】
以下に示す発明は、主として上記の知見及び考察に基づく、
［１］細胞集団を構成する個々の細胞の移動変動で規定される移動パターンを指標とした、薬剤評価方法。
［２］以下のステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む、［１］に記載の薬剤評価方法：
（ｉ）移動能を示す細胞の集団を用意し、被験物質の存在下で培養を開始した後、移動した個々の細胞の位置を経時的に計測するステップ、
（ｉｉ）計測した位置の情報から各細胞の移動変動を分析して集計し、前記細胞集団の移動パターンを決定するステップ、
（ｉｉｉ）決定した移動パターンに基づき被験物質の薬効又は毒性を判定するステップ。
［３］以下の（Ａ）で算出される距離比、以下の（Ｂ）で求められる角度θ、又は以下の（Ｃ）で算出される速度をステップ（ｉｉ）の分析に用いる、［２］に記載の薬剤評価方法：
（Ａ）計測時間ｔでの細胞の総移動距離をＤ（ｔ）、移動開始点と移動終了点の２点間の直線距離をｄ（ｔ）とし、距離比ｄ（ｔ）／Ｄ（ｔ）を算出する、
（Ｂ）計測時間ｔに対して計測時間間隔ｔ／ｎ（但し、ｎは２以上の整数）を設定して細胞の位置を計測し、各時点における細胞の位置ベクトルと基準軸との間の角度θを求める、
（Ｃ）計測時間tでの細胞の総移動距離をＤ（ｔ）とし、速度Ｄ（ｔ）/ｔを算出する。
［４］（Ｂ）の基準軸として、時間ｔまでの細胞の移動軌跡から計算した平均の位置ベクトルが用いられる、［３］に記載の薬剤評価方法。
［５］ステップ（ｉ）の細胞が非正常細胞であり、ステップ（ｉｉｉ）では、移動パターンの正常化を指標として被験物質の薬効が判定される、［２］〜［４］のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
［６］ステップ（ｉ）の細胞が正常細胞であり、ステップ（ｉｉｉ）では、移動パターンの異常化を指標として被験物質の毒性が判定される、［２］〜［４］のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
［７］ステップ（ｉ）の細胞が非正常細胞であり、ステップ（ｉｉｉ）では、移動パターンの更なる異常化を指標として被験物質の毒性が判定される、［２］〜［４］のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
［８］非正常細胞が、標的疾患の遺伝的特徴を有する疾患細胞である、［５］又は［７］に記載の薬剤評価方法。
［９］疾患細胞が患者由来の細胞又は遺伝子操作によって作成された細胞である、［８］に記載の薬剤評価方法。
［１０］患者由来の細胞が、患者の細胞から作成した人工多能性幹細胞を分化誘導して得られた細胞である、［９］に記載の薬剤評価方法。
［１１］ステップ（ｉ）の細胞が、方向性をもった移動能力を示す細胞である、［２］〜［１０］のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
［１２］方向性をもった移動能力を示す細胞が、神経細胞、心筋細胞又は血球である、［１１］に記載の薬剤評価方法。
［１３］神経細胞がドパミン神経細胞、グルタミン作動性神経細胞、セロトニン神経細胞又はGABA作動性神経細胞である、［１２］に記載の薬剤評価方法。
［１４］ドパミン神経細胞が、以下のステップ（１）〜（３）を含む方法で調製される、［１３］に記載の薬剤評価方法：
（１）多能性幹細胞をTGF-βファミリー阻害剤、GSK3β阻害剤及びBMP阻害剤の存在下で培養するステップ、
（２）ステップ（１）で得られた細胞をTGF-βファミリー阻害剤、GSK3β阻害剤、FGF8及びヘッジホッグシグナルアゴニストの存在下且つ通常の酸素分圧下で浮遊培養し、ニューロスフィアを形成させるステップ、
（３）ニューロスフィアを構成する細胞を回収し、ドパミン神経細胞へ分化誘導する、或いは、ニューロスフィアを直接ドパミン神経細胞へ誘導するステップ。
［１５］細胞集団を構成する個々の細胞の移動変動で規定される移動パターンによって、該細胞集団の品質を評価する方法。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】距離比を利用した移動方向の評価方法（左）と当該評価方法による評価結果（経時的計測）の一例（右）。細胞が時間ｔの間に移動した際、実際の総移動距離をＤ（ｔ）、開始点と終了点の2点間の直線距離をｄ（ｔ）と定義し、ｄ（ｔ）／Ｄ（ｔ)値によって移動方向を評価した。完全に直線移動していた場合はｄ（ｔ）／Ｄ（ｔ）値が１となり、蛇行するほど値が小さくなる。健常者（+/+)：健常者iPS細胞由来の神経細胞、RELN欠失患者（+/-)：RELN欠失患者由来の神経細胞、健常者（-/-)：ゲノム編集によってRELNホモ欠失にした健常者株由来の神経細胞。
【図２】ベクトル及び角度を利用した移動方向の評価方法（左）と当該評価方法による評価結果の一例（右）。細胞が一定時間内に移動したときに、移動開始点から終了点までの平均の移動ベクトルを計算した。移動途中にある細胞の、ある時間における位置ベクトルと平均の移動ベクトルとの間の角度（θ）を求め、θの分布を細胞種ごとにヒストグラム及び円ヒストグラム（又はレーダープロット）で表した。
【図３】健常者iPS細胞由来神経細胞の移動パターンの評価結果。CON1：健常者女性から誘導したドパミン神経細胞、CON2:健常者男性から誘導したドパミン神経細胞。
【図４】RELN欠失患者iPS細胞由来神経細胞（RELN-del1）の移動パターンと健常者iPS細胞由来神経細胞（CON1）の移動パターンの比較。
【図５】RELN欠失の移動パターンと健常者の移動パターンの比較。
【図６】移動パターンの自動検出結果。個々の細胞の移動変動を自動検出／自動数値化する計測系を構築した。
【図７】自動検出システムを利用した移動パターンの評価。健常者iPS細胞由来神経細胞（CON1）とRELN欠失群（RELN欠失患者iPS細胞由来神経細胞（RELN-del1及びRELNホモ欠失アイソジェニックiPS細胞由来神経細胞（CON1(-/-)）の間で移動パターンを比較した。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、被験物質の薬効又は毒性の評価に利用される薬剤評価方法（以下、「本発明の評価方法」とも呼ぶ）を提供する。本明細書では、薬効の評価と毒性の評価を総称する用語として「薬剤評価」を使用する。従って、本発明では被験物質の薬効又は毒性が評価されることになる。用語「毒性」は広義に解釈されるべきであり、一般毒性（急性毒性、亜急性毒性、慢性毒性）の他、副作用、発がん性、変異原性、催奇形性等も毒性の一つである。
【００１２】
本発明の評価方法は細胞を利用した評価系であり、特定の細胞集団を用意し、細胞集団を構成する個々の細胞の移動変動で規定される移動パターン（細胞の移動方向の変動の程度（大きさ）や移動速度（速さ）が関連づけられたもの）を指標として被験物質の薬効又は毒性を評価する。本発明者らの検討によって、細胞集団を構成する個々の細胞の移動変動に注目すれば、細胞集団の移動特性を表す「移動パターン」を規定することができ、しかも、「移動パターン」が細胞集団の正常性（別に言えば異常性）に相関し、薬効又は毒性の評価に有用であることが明らかとなった（後述の実施例を参照）。
【００１３】
典型的には、本発明の評価方法では以下のステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）を行う。
（ｉ）移動能を示す細胞の集団を用意し、被験物質の存在下で培養を開始した後、移動した個々の細胞の位置を経時的に計測するステップ
（ｉｉ）計測した位置の情報から各細胞の移動変動を分析して集計し、前記細胞集団の移動パターンを決定するステップ
（ｉｉｉ）決定した移動パターンに基づき被験物質の薬効又は毒性を判定するステップ
【００１４】
ステップ（ｉ）では、移動能を示す細胞の集団を用意し、被験物質の存在下で培養を開始する。本発明では移動パターンを指標として被験物質の薬効又は毒性を評価することから、移動能を示す細胞（より具体的には方向性をもった移動能力を示す細胞）で構成された細胞集団が用いられる。但し、細胞集団を構成する全ての細胞が移動能を示すことは必須ではない。即ち、移動能を示さない細胞が混在することを妨げるものではない。ここでの「混在する」とは、細胞集団内に存在するものの、主要な構成細胞ではないことを意味する。従って、その存在量（混在率）は例えば細胞集団全体の40％以下、好ましくは細胞集団全体の30％以下、更に好ましくは細胞集団全体の20％以下、更に更に好ましくは細胞集団全体の10%以下である。
【００１５】
生体の組織や器官／臓器等の構造体の正常な発生ないし形成、或いは再生のプロセスにおいて所定の移動能を発揮する細胞（特に、一定の方向性で移動し、特定の組織や器官／臓器等の構成成分となる細胞）は「方向性をもった移動能力を示す細胞」に該当し、本発明の方法における細胞集団を構成する細胞として好適である。方向性をもった移動能力を示す細胞の例として、神経細胞（ドパミン神経細胞、グルタミン作動性神経細胞、セロトニン神経細胞、GABA作動性神経細胞）、心筋細胞、血球系細胞（白血球）を挙げることができる。
【００１６】
細胞集団は、細胞種の異なる２種類以上の細胞で構成されていてもよい。また、分化度の異なる２種類以上の細胞で構成されていてもよい。
【００１７】
細胞集団を構成する細胞として正常細胞又は非正常細胞を用いることができる。「正常細胞」とは、本発明の方法で評価される薬効（細胞移動障害の改善、それに基づく治療効果）又は毒性との関係において異常を認めない細胞である。正常細胞の典型例は健常者由来の細胞であるが、例えば、評価対象の薬効が治療効果を発揮し得る疾患、換言すれば、細胞移動障害がその発症や進展の原因の少なくとも一つとなる疾患（以下、「標的疾患」と呼ぶ）に罹患していない者由来の細胞も正常細胞として用いられ得る。「非正常細胞」は正常細胞と対照をなす細胞であり、遺伝子変異や染色体異常などよって本来の状態ではなくなっている細胞をいう。非正常細胞の例は、標的疾患に特徴的な遺伝的異常を有する細胞であり、標的疾患に罹患した患者由来の細胞が非正常細胞に該当する。患者由来の細胞の例は、患者から採取した細胞又はその継代細胞、及び患者由来人工多能性幹（iPS）細胞（患者から採取した細胞を利用して作成したiPS細胞）を分化誘導して得られた分化細胞である。患者由来の細胞の他、標的疾患に特徴的な遺伝的異常が導入された細胞（例えば、iPS細胞などの未分化細胞にゲノム編集等の遺伝子操作で遺伝子変異を導入した後、分化誘導して得られた分化細胞）や、分化細胞に対して遺伝子変異を導入して得られた細胞も非正常細胞として採用し得る。尚、標的疾患の例は自閉症スペクトラム障害（ASD）や統合失調症などの神経発達障害疾患、白血球遊走障害を示す血液疾患などであり、遺伝的異常の例はReelin遺伝子の欠失、染色体3q29領域の欠失、染色体22q11領域の欠失などである。
【００１８】
非正常細胞として患者由来の細胞を用いた場合、治療薬候補のスクリーニング（探索）等を目的とした薬効の評価に加え、治療薬又は治療薬候補の毒性の評価も可能になる（詳細は後述する）。このように本発明の方法は、使用する細胞を選択することにより、薬効評価系と毒性評価系のいずれにも利用可能になるという、ユニークな特徴を有する。各評価系の詳細は後述する。
【００１９】
好ましい一態様では、ステップ（ｉ）の細胞として、以下のステップ（１）〜（３）を含む方法で調製されるドパミン神経細胞が用いられる。
（１）多能性幹細胞をTGF-βファミリー阻害剤、GSK3β阻害剤及びBMP阻害剤の存在下で培養するステップ
（２）ステップ（１）で得られた細胞をTGF-βファミリー阻害剤、GSK3β阻害剤、FGF8及びヘッジホッグシグナルアゴニストの存在下且つ通常の酸素分圧下で浮遊培養し、ニューロスフィアを形成させるステップ
（３）ニューロスフィアを構成する細胞を回収し、ドパミン神経細胞へ分化誘導する、或いは、ニューロスフィアを直接ドパミン神経細胞へ誘導するステップ
【００２０】
ステップ（１）
ステップ（１）では多能性幹細胞を使用する。「多能性幹細胞」とは、生体を構成するすべての細胞に分化しうる能力（分化多能性）と、細胞分裂を経て自己と同一の分化能を有する娘細胞を生み出す能力（自己複製能）とを併せ持つ細胞をいう。分化多能性は、評価対象の細胞を、ヌードマウスに移植し、三胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）のそれぞれの細胞を含むテラトーマ形成の有無を試験することにより、評価することができる。
【００２１】
多能性幹細胞として、胚性幹細胞（ES細胞）、胚性生殖細胞（EG細胞）、人工多能性幹細胞（iPS細胞）等を挙げることができるが、分化多能性及び自己複製能を併せ持つ細胞である限り、これに限定されない。好ましくはES細胞又はiPS細胞を用いる。更に好ましくはiPS細胞を用いる。多能性幹細胞は、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒトやチンパンジーなどの霊長類、マウスやラットなどのげっ歯類）の細胞、特に好ましくはヒトの細胞である。従って、本発明の最も好ましい態様では、多能性幹細胞として、ヒトiPS細胞が用いられる。
【００２２】
ES細胞は、例えば、着床以前の初期胚、当該初期胚を構成する内部細胞塊、単一割球等を培養することによって樹立することができる（Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual， Second Edition， Cold Spring Harbor Laboratory Press（1994） ;Thomson，J. A. et al.，Science，282， 1145-1147（1998））。初期胚として、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を用いてもよい（Wilmut et al.（Nature， 385， 810（1997））、Cibelli et al. （Science， 280， 1256（1998））、入谷明ら（蛋白質核酸酵素， 44， 892 （1999））、Baguisi et al. （Nature Biotechnology， 17， 456 （1999））、Wakayama et al. （Nature， 394， 369 （1998）; Nature Genetics， 22， 127 （1999）; Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 96， 14984 （1999））、Rideout III et al. （Nature Genetics， 24， 109 （2000）、Tachibana et al. （Human Embryonic Stem Cells Derived by Somatic Cell Nuclear Transfer, Cell （2013） in press）。初期座として、単為発生胚を用いてもよい（Kim et al. （Science， 315， 482-486 （2007））、Nakajima et al. （Stem Cells， 25， 983-985 （2007））、Kim et al. （Cell Stem Cell， 1， 346-352 （2007））、Revazova et al. （Cloning Stem Cells， 9， 432-449 （2007））、Revazova et al.（Cloning Stem Cells， 10， 11-24 （2008））。上掲の論文の他、ES細胞の作製についてはStrelchenko N., et al. Reprod Biomed Online. 9: 623-629, 2004；Klimanskaya I., et al. Nature 444: 481-485, 2006；Chung Y., et al. Cell Stem Cell 2: 113-117, 2008；Zhang X., et al Stem Cells 24: 2669-2676, 2006；Wassarman, P.M. et al. Methods in Enzymology, Vol.365, 2003等が参考になる。尚、ES細胞と体細胞の細胞融合によって得られる融合ES細胞も胚性幹細胞に含まれる。
【００２３】
ES細胞の中には、保存機関から入手可能なもの、或いは市販されているものもある。例えば、ヒトES細胞については京都大学再生医科学研究所（例えばKhES-1、KhES-2及びKhES-3）、WiCell Research Institute、ESI BIOなどから入手可能である。
【００２４】
EG細胞は、始原生殖細胞を、LIF、bFGF、SCFの存在下で培養すること等により樹立することができる（Matsui et al.， Cell， 70， 841-847 （1992）、Shamblott et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 95 （23）, 13726-13731 （1998）、Turnpenny et al.， Stem Cells， 21（5）， 598-609， （2003））。
【００２５】
「人工多能性幹細胞（iPS細胞）」とは、初期化因子の導入などにより体細胞（例えば線維芽細胞、皮膚細胞、リンパ球等）をリプログラミングすることによって作製される、分化多能性と自己複製能を有する細胞である。iPS細胞はES細胞に近い性質を示す。iPS細胞の作製に使用する体細胞は特に限定されず、分化した体細胞でもよいし、未分化の幹細胞でもよい。iPS細胞は、これまでに報告された各種方法によって作製することができる。また、今後開発されるiPS細胞作製法を適用することも当然に想定される。iPS細胞の作製に利用可能な細胞、即ち、iPS細胞の由来である細胞の例として、リンパ球（T細胞、B細胞）、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、粘膜上皮細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、脂肪幹細胞、歯髄幹細胞、神経幹細胞を挙げることができる。
【００２６】
iPS細胞作製法の最も基本的な手法は、転写因子であるOct3/4、Sox2、Klf4及びc-Mycの４因子を、ウイルスを利用して細胞へ導入する方法である（Takahashi K, Yamanaka S: Cell 126 (4), 663-676, 2006; Takahashi, K, et al: Cell 131 (5), 861-72, 2007）。ヒトiPS細胞についてはOct4、Sox2、Lin28及びNonogの４因子の導入による樹立の報告がある（Yu J, et al: Science 318(5858), 1917-1920, 2007）。c-Mycを除く３因子（Nakagawa M, et al: Nat. Biotechnol. 26 (1), 101-106, 2008）、Oct3/4及びKlf4の２因子（Kim J B, et al: Nature 454 (7204), 646-650, 2008）、或いはOct3/4のみ（Kim J B, et al: Cell 136 (3), 411-419, 2009）の導入によるiPS細胞の樹立も報告されている。また、遺伝子の発現産物であるタンパク質を細胞に導入する手法（Zhou H, Wu S, Joo JY, et al: Cell Stem Cell 4, 381-384, 2009; Kim D, Kim CH, Moon JI, et al: Cell Stem Cell 4, 472-476, 2009）も報告されている。一方、ヒストンメチル基転移酵素G9aに対する阻害剤BIX-01294やヒストン脱アセチル化酵素阻害剤バルプロ酸（VPA）或いはBayK8644等を使用することによって作製効率の向上や導入する因子の低減などが可能であるとの報告もある（Huangfu D, et al: Nat. Biotechnol. 26 (7), 795-797, 2008; Huangfu D, et al: Nat. Biotechnol. 26 (11), 1269-1275, 2008; Silva J, et al: PLoS. Biol. 6 (10), e 253, 2008）。遺伝子導入法についても検討が進められ、レトロウイルスの他、レンチウイルス（Yu J, et al: Science 318(5858), 1917-1920, 2007）、アデノウイルス（Stadtfeld M, et al: Science 322 (5903), 945-949, 2008）、プラスミド（Okita K, et al: Science 322 (5903), 949-953, 2008）、トランスポゾンベクター（Woltjen K, Michael IP, Mohseni P, et al: Nature 458, 766-770, 2009; Kaji K, Norrby K, Pac a A, et al: Nature 458, 771-775, 2009; Yusa K, Rad R, Takeda J, et al: Nat Methods 6, 363-369, 2009）、或いはエピソーマルベクター（Yu J, Hu K, Smuga-Otto K, Tian S, et al: Science 324, 797-801, 2009）を遺伝子導入に利用した技術が開発されている。
【００２７】
iPS細胞への形質転換、即ち初期化（リプログラミング）が生じた細胞はFbxo15、Nanog、Oct/4、Fgf-4、Esg-1及びCript等の多能性幹細胞マーカー（未分化マーカー）の発現などを指標として選択することができる。
【００２８】
iPS細胞は、例えば、国立大学法人京都大学又は独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターから提供を受けることもできる。
【００２９】
多能性幹細胞は公知の方法により、生体外（in vitro）で維持することができる。臨床応用を視野に入れた場合等、安全性の高い細胞を提供することが望まれる場合には、多能性幹細胞を、血清代替物を用いた無血清培養や、無フィーダー細胞培養により維持することが好ましい。血清を使用（又は併用）するのであれば、自己血清（即ちレシピエントの血清）を使用するとよい。血清代替物は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール又は3'チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などを含有し得る。公知の方法（例えば、Ｗ０  ９８／３０６７９を参照）により血清代替物を調製することができる。市販の血清代替物を用いることもできる。市販の血清代替物の例として、KSR（Invitrogen社製）、Chemically-defined Lipid concentrated （Gibco社製）、Glutamax （Gibco社製）が挙げられる。
【００３０】
ステップ（１）では、以上のようにして用意した多能性幹細胞を、TGF-βファミリー阻害剤、GSK3β阻害剤及びBMP阻害剤の存在下で培養する。即ち、TGF-βファミリー阻害剤、GSK3β阻害剤及びBMP阻害剤が添加された培地を用いて多能性幹細胞を培養する。尚、ステップ（１）は多能性幹細胞の神経分化能の亢進を目的とする。
【００３１】
培地は、哺乳動物細胞の培養に用いる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、BME培地、BGJb培地、CMRL1066培地、Glasgow MEM培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地、ハム培地、Ham's F-12培地、RPMI1640培地、Fischer's培地、Neurobasal培地、及びこれらの混合培地など、哺乳動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。一態様において、IMDM培地及びHam's F-12培地の混合培地が用いられる。混合比は、容量比で、例えば、IMDM：Ham's F-12＝O.8〜1.2：1.2〜0.8である。
【００３２】
培地にはTGF-βファミリー阻害剤、GSK3β阻害剤及びBMP阻害剤が添加される。TGF-βファミリー阻害剤とは、TGF-βとTGF-β受容体との結合を介するTGF-βシグナル伝達を阻害する物質である。TGF-β阻害剤にはタンパク質性阻害剤及び低分子阻害剤がある。タンパク質性阻害剤の例は、抗TGF-β中和抗体、抗TGF-β受容体中和抗体である。低分子阻害剤の例は、SB431542（４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミド又はその水和物）、SB202190(４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−ヒドロキシフェニル）−５−（４−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール)、SB505124(GlaxoSmithKline)、NPC30345、SD093、SD908、SD208(Scios)、LY2109761、LY364947、LY580276(Lilly Research Laboratories)である。好ましくは、SB431542を用いる。TGF-βファミリー阻害剤の濃度（培地への添加量）は、多能性幹細胞の神経分化能の亢進という目的が達成される限り特に限定されないが、SB431542を例としてその濃度を示すと、例えば0.5μM〜20μM、好ましくは1μM〜10μMである。尚、最適な濃度は予備実験を通して設定することができる。全培養期間を通してTGF-βファミリー阻害剤濃度を一定にするのではなく、例えば段階的にTGF-βファミリー阻害剤濃度を増加させるなど、TGF-βファミリー阻害剤濃度に変化を設けても良い。
【００３３】
GSK3β阻害剤としては、CHIR99021（６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］ニコチノニトリル）、SB-415286（３−［（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニル）アミノ］−４−（２−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）、SB-2167、indirubin-3’-Monoxime、Kenpaullone、BIO（６−ブロモインジルビン−３'−オキシム）等を用いることができる。好ましくは、CHIR99021を用いる。GSK3β阻害剤の濃度（培地への添加量）は、多能性幹細胞の神経分化能の亢進という目的が達成される限り特に限定されないが、CHIR99021を例としてその濃度を示すと、例えば0.5μM〜20μM、好ましくは1μM〜10μMである。尚、最適な濃度は予備実験を通して設定することができる。全培養期間を通してGSK3β阻害剤濃度を一定にするのではなく、例えば段階的にGSK3β阻害剤濃度を増加させるなど、GSK3β阻害剤濃度に変化を設けても良い。
【００３４】
BMP阻害剤とは、BMP(bone morphogenetic protein)とBMP受容体（I型又はII型）との結合を介するBMPシグナル伝達（BMP signaling）を阻害する物質である。BMP阻害剤にはタンパク質性阻害剤と低分子阻害剤がある。タンパク質性阻害剤の例は、天然の阻害剤であるNoggin、chordin、follistatin等である。低分子阻害剤の例は、Dorsomorphin（６−［４−（２−ピペリジン−１−イルエトキシ）フェニル］−３−ピリジン−４−イルピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン）及びその誘導体、LDN-193189（4-(6-(4-piperazin-1-yl)phenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl）quinoline）及びその誘導体である。これらの化合物は市販されており（例えばSigma-AldrichやStemgent社から入手できる）、容易に入手可能である。好ましくは、Dorsomorphinを用いる。BMP阻害剤の濃度（培地への添加量）は、多能性幹細胞の神経分化能の亢進という目的が達成される限り特に限定されないが、Dorsomorphinを例としてその濃度を示すと、例えば0.5μM〜20μM、好ましくは1μM〜10μMである。尚、最適な濃度は予備実験を通して設定することができる。全培養期間を通してBMP阻害剤濃度を一定にするのではなく、例えば段階的にBMP阻害剤濃度を増加させるなど、BMP阻害剤濃度に変化を設けても良い。
【００３５】
必要に応じて、培地にその他の成分を添加してもよい。添加され得る成分の例として、インスリン、鉄源（例えばトランスフェリン等）、ミネラル（例えばセレン酸ナトリウム等）、糖類（例えばグルコース等）、有機酸（例えばピルビン酸、乳酸等）、血清蛋白質（例えばアルブミン等）、アミノ酸（例えばL-グルタミン等）、還元剤（例えば2-メルカプトエタノール等）、ビタミン類（例えばアスコルビン酸、d-ビオチン等）、抗生物質（例えばストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、緩衝剤（例えばHEPES等）等を挙げることができる。
【００３６】
多能性幹細胞は、通常、接着培養に供される。接着培養は浮遊培養と対照をなす培養であり、典型的には接着条件下で二次元培養（平面培養）する。但し、マトリゲルTM（BD）などを使用し、三次元的に培養することにしてもよい。接着培養には、例えば、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ等を用いることができる。培養面への細胞の接着性を高めるために、マトリゲルTM（BD）、ポリ-D-リジン、ポリ-L-リジン、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン、或いはこれらの中の二つ以上の組み合わせによってコーティング処理された培養器を用いるとよい。
【００３７】
フィーダー細胞の存在下/非存在下いずれの条件で多能性幹細胞の培養を行ってもよいが、臨床応用を視野に入れた場合等、安全性の高い細胞を提供することが望まれる場合には、フィーダー細胞の非存在下で培養（無フィーダー細胞培養）するとよい。尚、フィーダー細胞の例は、MEF（マウス胎仔線維芽細胞）、STO細胞（マウス胎仔線維芽細胞株）、SNL細胞（STO細胞のサブクローン）である。
【００３８】
培養温度、C02濃度、02濃度等の他の培養条件は適宜設定できる。培養温度は例えば約30〜40℃、好ましくは約37℃である。CO2濃度は例えば約1〜10%、好ましくは約5%である。また、通常の酸素分圧下で培養すればよい。尚、他の条件（湿度、CO2の濃度等）によって変動し得るが、「通常の酸素分圧下」の場合の酸素濃度は典型的には約18％〜約22％となる。尚、「通常の酸素分圧下」の詳細は後述する。
【００３９】
ステップ（１）の期間（培養期間）は４日以上とし、具体的には例えば４日間〜２０日間、好ましくは６日間〜１４日間である。培養期間が短すぎることはニューロスフェア形成能低下を引き起こす。
【００４０】
必要に応じて継代することにしてもよい。例えばサブコンフルエント又はコンフルエントの状態になった段階で細胞を回収し、一部の細胞を別の培養器に播種し、培養を継続する。細胞の回収には細胞解離液などを利用すればよい。細胞解離液としては、例えば、EDTA-トリプシン、コラゲナーゼIV、メタロプロテアーゼ等のタンパク分解酵素等を単独で又は適宜組み合わせて用いることができる。細胞障害性が少ないものが好ましい。このような細胞解離液として、例えば、ディスパーゼ（エーディア）、TrypLE （Invitrogen）又はアキュターゼ（MILLIPORE）等の市販品が入手可能である。分散（離散）状態となるように、回収後の細胞をセルストレイナーなどで処理した後に継代培養に供するとよい。
【００４１】
ステップ（１）の結果、多能性幹細胞の神経分化能が亢進する。神経分化能が亢進したことは、ステップ（１）の開始前と比較して神経系マーカー（Sox2、nestin、Sox1等）の発現が上昇することを指標に確認できる。また、神経分化能が亢進したことの評価に未分化マーカーの発現を利用してもよい。
【００４２】
通常、ステップ（１）後の細胞を一旦回収し、次の培養（ステップ（２））へ進む。回収操作は、継代培養の際の回収操作と同様に行うことができる。
【００４３】
ステップ（２）
このステップでは、ステップ（１）で得られた細胞をTGF-βファミリー阻害剤、GSK3β阻害剤、FGF8及びヘッジホッグシグナルアゴニストの存在下且つ通常の酸素分圧下で浮遊培養し、ニューロスフィアを形成させる。即ち、TGF-βファミリー阻害剤、GSK3β阻害剤、FGF8及びヘッジホッグシグナルアゴニストが添加された培地を用い、且つ通常の酸素分圧下という条件を採用し、ステップ（１）後の細胞を培養する。ステップ（２）は、神経細胞系譜に沿った分化を誘導することを目的とする。尚、特に言及しない事項（使用可能な基礎培地、使用可能なTGF-βファミリー阻害剤やGSK3β阻害剤、培地に添加可能な他の成分等）はステップ（１）と同様であり、その説明を省略する。
【００４４】
浮遊培養には、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトル等を用いることができる。非接着性の条件下での培養を可能にするため、細胞非接着性の培養面を有する培養器を用いることが好ましい。該当する培養器としては、細胞非接着性になるようにその表面（培養面）を処理したもの、細胞の接着性向上のための処理（例えば、細胞外マトリクス等によるコーティング処理）がその表面（培養面）に施されていないもの、を挙げることができる。浮遊培養では、細胞の培養器に対する非接着状態を維持できればよく、静置培養を採用しても、あるは、旋回培養や振とう培養を採用してもよい。
【００４５】
培地に添加する成分の内、TGF-βファミリー阻害剤とGSK3β阻害剤は上記の通りである。このステップにおいても、TGF-βファミリー阻害剤としてはSB431542を、GSK3β阻害剤としてはCHIR99021を用いることが好ましい。SB431542を用いた場合の培地中の濃度は、例えば0.5μM〜20μM、好ましくは1μM〜10μMである。同様に、CHIR99021を用いた場合の培地中の濃度は、例えば0.5μM〜20μM、好ましくは1μM〜10μMである。
【００４６】
FGF8は線維芽細胞増殖因子ファミリーの一つである。FGF8は脊椎動物の脳形成の制御に関与し、中脳への領域化に必要である。本発明の目的を達成し得る限り、各種哺乳動物由来のFGF8を使用することが可能である。但し、使用する多能性幹細胞との間で由来（動物種）を合わせることが好ましい。従って、ヒト多能性幹細胞を用いる場合には、好ましくはヒトFGF8を採用する。ヒトFGF8とは、ヒトが生体内で天然に発現するFGF8のアミノ酸配列を有することを意味し、組換え体であってもよい。ヒトFGF8の代表的なアミノ酸配列としては、NCBIのアクセッション番号でNP_006110.1（fibroblast growth factor 8 isoform B precursor [Homo sapiens].）を例示することができる。FGF8の濃度（培地への添加量）は、神経細胞系譜に沿った分化誘導という目的が達成される限り特に限定されないが、例えば1 ng/ml〜5μg/ml、好ましくは10〜500 ng/ml、更に好ましくは50〜400 ng/mlである。尚、最適な濃度は予備実験を通して設定することができる。
【００４７】
ヘッジホッグシグナルアゴニストは、ソニックヘッジホッグ（SHH）シグナルを促進するものであれば特に限定されない。例えば、腹側化の誘導に有用なプルモルファミン（９−シクロヘキシル−Ｎ−［４−（４−モルホリニル）フェニル］−２−（１−ナフタレニルオキシ）−９Ｈ−プリン−６−アミン）を用いるとよい。プルモルファミンの濃度（培地への添加量）は、神経細胞系譜に沿った分化誘導という目的が達成される限り特に限定されないが、例えば1 ng/ml〜5μg/ml、好ましくは10〜500 ng/ml、更に好ましくは50〜400 ng/mlである。尚、最適な濃度は予備実験を通して設定することができる。ヘッジホッグシグナルアゴニストとして、SAG（Ｎ−メチル−Ｎ′−（３−ピリジニルベンジル）−Ｎ′−（３−クロロベンゾ［ｂ］チオフェン−２−カルボニル）−１，４−ジアミノシクロヘキサン）を用いることもできる。SAGを用いる場合の濃度（培地への添加量）は、神経細胞系譜に沿った分化誘導という目的が達成される限り特に限定されないが、例えば10 nM〜100μM、好ましくは100 nM〜10μM、更に好ましくは100 nM〜2μMである。尚、最適な濃度は予備実験を通して設定することができる。
【００４８】
全培養期間を通して各成分（TGF-βファミリー阻害剤、GSK3β阻害剤、FGF8及びヘッジホッグシグナルアゴニスト）の濃度が一定であることは必須ではなく、特定の成分（二以上の成分であってもよい）又は全ての成分の濃度が培養途中で変化するようにしてもよい。例えば、FGF8及びヘッジホッグシグナルアゴニストの添加をステップ（２）の２日目〜６日目に開始する。当該条件によれば、細胞への急激な刺激を緩和することができる。好ましくは、FGF8及びヘッジホッグシグナルアゴニストの添加をステップ（２）の３日目〜５日目に開始する。
【００４９】
神経細胞系譜に沿った分化誘導を促進するため、好ましくは、白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor (LIF)）も添加された培地を使用する。その目的を達成し得る限り、各種哺乳動物由来のLIFを使用することが可能である。但し、使用する多能性幹細胞との間で由来（動物種）を合わせることが好ましい。従って、ヒト多能性幹細胞を用いる場合には、好ましくはヒトLIFを採用する。LIFの濃度は特に限定されないが、例えば0.25 ng/ml〜1μg/ml、好ましくは1 ng/ml〜50 ng/ml、更に好ましくは5 ng/ml〜20 ng/mlである。尚、最適な濃度は予備実験を通して設定することができる。
【００５０】
神経細胞系譜に沿った分化誘導を促進するため、好ましくは、bFGF（塩基性線維芽細胞増殖因子）も添加された培地を使用する。bFGFはFGF2とも呼ばれる。本発明の目的を達成し得る限り、各種哺乳動物由来のbFGFを使用することが可能である。但し、使用する多能性幹細胞との間で由来（動物種）を合わせることが好ましい。従って、ヒト多能性幹細胞を用いる場合には、好ましくはヒトbFGFを採用する。ヒトFGF2とは、ヒトが生体内で天然に発現するFGF2のアミノ酸配列を有することを意味する。ヒトFGF2の代表的なアミノ酸配列としては、NCBIのアクセッション番号でNP_001997.5（fibroblast growth factor 2 [Homo sapiens]）を例示することができる。bFGFの濃度は特に限定されないが、例えば0.25 ng/ml〜1μg/ml、好ましくは1 ng/ml〜50 ng/ml、更に好ましくは3 ng/ml〜30 ng/mlである。尚、最適な濃度は予備実験を通して設定することができる。
【００５１】
細胞死抑制のために、好ましくは、ROCK阻害剤（Rho-associated coiled-coil forming kinase/Rho結合キナーゼ）（例えばY-27632やFasudil(HA-1077)）も添加された培地を使用する。ROCK阻害剤としてY-27632を使用する場合の濃度は、例えば約1μM〜約50μMである。尚、最適な濃度は予備実験を通して設定することができる。
【００５２】
ROCK阻害剤は細胞が分散状態にあるときの細胞死を強力に抑止する。従って、ステップ（２）の全培養期間にわたってROCK阻害剤を使用するのではなく、細胞を播種する際（即ち、培養開始時）や、例えば継代培養のために細胞を回収して分散させる際にのみ、ROCK阻害剤を含有する培地で細胞を処理することにしてもよい。
【００５３】
好ましくは、神経細胞系譜に沿った分化誘導に有利となるように、毛様体神経栄養因子（CNTF）、脳由来神経栄養因子（BDNF）、ニューロトロフィン３（NT-3）、ウシ胎児血清、N2サプリメント、B27サプリメント等を添加した培地を使用する。尚、N2サプリメントはGibco（製品名  N2 supplement(x100)）等から入手することができ、B27サプリメントはGibco（製品名  B27 supplement(x100)）等から入手することができる。
【００５４】
更に、必要に応じて、培地にその他の成分を添加してもよい。添加され得る成分の例として、インスリン、鉄源（例えばトランスフェリン等）、ミネラル（例えばセレン酸ナトリウム等）、糖類（例えばグルコース等）、有機酸（例えばピルビン酸、乳酸等）、血清蛋白質（例えばアルブミン等）、アミノ酸（例えばL-グルタミン等）、還元剤（例えば2-メルカプトエタノール等）、ビタミン類（例えばアスコルビン酸、d-ビオチン等）、抗生物質（例えばストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、緩衝剤（例えばHEPES等）等を挙げることができる。
【００５５】
このステップ（２）ではニューロスフィアを形成させるため浮遊培養を行う。例えば、無血清凝集浮遊培養法（SFEB法／SFEBq法。Watanabeら， Nature Neuroscience 8，288-296 (2005)、WO 2005/123902）やニューロスフィア法（Reynolds BA and Weiss S.,Science,USA,1992 Mar 27;255(5052):1707-10）などを採用することができる。
【００５６】
本発明では、ステップ（２）を通常の酸素分圧下で実施する。細胞培養の際、生体内の環境を考慮して酸素濃度を低くした条件（低酸素分圧／低酸素濃度）が用いられることがあるが、本発明における「通常の酸素分圧下」はこのような特殊な条件と対照をなす。即ち、「通常の酸素分圧下」とは、酸素濃度を意図的に調整していない条件である。尚、他の条件（湿度、共存するCO2の濃度等）によって変動し得るが、「通常の酸素分圧下」の場合の酸素濃度は典型的には約18％〜約22％となる。
【００５７】
ステップ（２）を通常の酸素分圧下で実施することは全培養期間（ステップ（１）〜ステップ（３））を通して特殊な酸素条件（典型的には低酸素環境）の設定を不要とし、さらにグリア細胞などの不要な細胞への分化誘導を抑制できることから、極めて実用性の高い調製方法となる。
【００５８】
その他の培養条件（培養温度、C02濃度等）は適宜設定できる。培養温度は例えば約30〜40℃、好ましくは約37℃である。CO2濃度は例えば約1〜10%、好ましくは約5%である。
【００５９】
ステップ（２）の期間（培養期間）は例えば７日間〜２１日間、好ましくは１０日間〜１６日間である。培養期間が短すぎたり或いは長すぎたりすると、分化効率の低下のおそれがある。
【００６０】
形成されたニューロスフィアを回収して細胞を解離させた後、更なる浮遊培養に供することにしてもよい。即ち、継代培養を行ってもよい。但し、継代培養の回数は少ない方がよく、好ましくは継代培養の回数を１回又は０回（即ち、継代培養をしない）とする。継代培養の回数が少ないことは、短期間でのドパミン神経細胞の調製に有利であり、また、意図しない分化誘導（例えばグリア細胞への分化誘導）が促されることを回避するためにも有効と考えられる。その一方で、継代培養は細胞の純度向上に有効であるため、継代培養の回数は１回が最適といえる。継代培養を１回にする場合には、ステップ（２）の開始から６日目〜１０日目に継代するとよい。尚、継代培養に際してニューロスフィアを回収するときには、培養器表面に接着した細胞の混入を防ぐと良い。このような操作は、ドパミン神経細胞の調製効率や純度の向上に寄与し得る。
【００６１】
ステップ（３）
ステップ（２）によって形成されるニューロスフィアは神経系未分化細胞及び中脳系神経未分化細胞を含有する。ステップ（３）では、ニューロスフィアを構成する細胞を回収し、ドパミン神経細胞へと分化誘導する。或いは、ニューロスフィアを直接（即ち、細胞塊のまま）ドパミン神経細胞へと分化誘導する。ドパミン神経細胞への分化誘導に適した培地や培養条件は公知であり、また、基本的な培養方法や操作については、例えばThermoFisher社が提供するプロトコル（ThermoFisher社のウェブページで公開されている）等を参考にすることができる。具体的には、例えば、γ−セクレターゼ阻害剤、神経栄養因子、アスコルビン酸、TGF-β3、及びcAMP又はcAMPアナログを含有する培地で接着培養することにより、ドパミン神経細胞への分化を誘導する。好ましくは、γ−セクレターゼ阻害剤としてＮ−［Ｎ−（３，５‐ジフルオロフェナセチル−Ｌ−アラニル）］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステルを、神経栄養因子として脳由来神経栄養因子（BDNF）とグリア細胞由来神経栄養因子（GDNF）を、cAMPアナログとしてジプチリルcAMPを用いる。
【００６２】
一態様では、ステップ（２）で形成されたニューロスフィアを回収し、細胞を解離（単一細胞化）させ、培養器に播種して培養する。別の態様では、このような分散培養ではなく、回収したニューロスフィアを細胞塊のまま接着培養に供する。この場合、通常は培養を継続するとニューロスフィアから周囲へと細胞が移動し、移動した細胞の中にドパミン神経細胞を認めることができる。
【００６３】
ここでの接着培養には、例えば、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ等を用いることができる。培養面への細胞の接着性を高めるために、マトリゲルTM（BD）、ポリ-D-リジン、ポリ-L-リジン、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン、或いはこれらの中の二つ以上の組み合わせによってコーティング処理された培養器を用いるとよい。
【００６４】
培養温度、C02濃度、02濃度等の他の培養条件は適宜設定できる。培養温度は例えば約30〜40℃、好ましくは約37℃である。CO2濃度は例えば約1〜10%、好ましくは約5%である。また、通常の酸素分圧下で培養すればよい。
【００６５】
ステップ（３）の期間（培養期間）は特に限定されないが、例えば５日以上、好ましくは７日以上の培養を行う。過度に長い期間の培養は、細胞の疲弊ないし活性の低下、細胞死等を引き起こし得るが、一般に、培養期間が長いほど分化・成熟化が進む。従って、このステップの培養期間の上限は特に限定されないが、例えば培養期間を５日間〜２１日間とする。必要に応じて継代することにしてもよい。例えばサブコンフルエント又はコンフルエントの状態になった段階で細胞を回収し、一部の細胞を別の培養器に播種し、培養を継続する。
【００６６】
ステップ（３）によって、ドパミン神経細胞が得られる。ドパミン神経細胞はドパミンマーカー（チロシンヒドロキシラーゼ、ドパミントランスポーター）の発現、中脳マーカーとしてのFOXA2等を指標として、或いはドパミン産生能の評価によって同定ないし確認することができる。
【００６７】
使用する細胞の種類や細胞の状態、及び各ステップの培養条件によって変動し得るが、本発明の調製方法によれば、２１日間〜３０日間程度で多能性幹細胞からドパミン神経細胞を得ることが可能である。
【００６８】
ステップ（ｉ）では、用意した細胞集団を被験物質の存在下で培養することになるが、培養条件は使用する細胞の生存、増殖に適した一般的なものを採用すればよい。但し、例えば、細胞移動能を阻害する物質（例えばRhoシグナル刺激剤）の存在下など、特殊な培養条件を採用することにしてもよい。２次元培養の他、ハイドロゲル（動物細胞外マトリックス抽出ハイドロゲル、タンパク質ハイドロゲル、ペプチドハイドロゲル、ポリマーハイドロゲル）等の足場材料を用いた３次元培養を採用することもできる。当業者であれば、本明細書中の教示（特に実施例の記載）や公知の情報（例えば、使用する細胞又はそれと同等／類似の細胞を用いた研究報告や総説など）を参照することにより、適切な培養条件を設定することが可能である。また、最適な培養条件は予備実験を通して決定することができる。
【００６９】
ステップ（ｉ）における被験物質は特に限定されない。その薬効又は毒性の評価が必要とされる様々な物質が被験物質となり得る。被験物質には様々な分子サイズの有機化合物又は無機化合物を用いることができる。有機化合物の例として核酸、ペプチド、タンパク質、脂質（単純脂質、複合脂質（ホスホグリセリド、スフィンゴ脂質、グリコシルグリセリド、セレブロシド等）、プロスタグランジン、イソプレノイド、テルペン、ステロイド、ポリフェノール、カテキン、ビタミン（B1、B2、B3、B5、B6、B7、B9、B12、C、A、D、E等）を例示できる。医薬品、栄養食品、食品添加物、農薬、香粧品（化粧品）等の既存成分或いは候補成分も好ましい被験物質の一つである。植物抽出液、細胞抽出液、培養上清などを被検物質として用いてもよい。２種類以上の被験物質を同時に添加することにより、被験物質間の相互作用、相乗作用などを調べることにしてもよい。被験物質は天然物由来であっても、或いは合成によるものであってもよい。後者の場合には例えばコンビナトリアル合成の手法を利用して効率的なアッセイ系を構築することができる。
【００７０】
培養開始後、移動した個々の細胞の位置が計測される。本発明の評価方法では、細胞集団を構成する細胞の中で移動した細胞、即ち、培養開始時の位置から周囲へと移動した細胞が計測対象となる。また、細胞毎にその位置を計測する点も本発明の特徴である。移動した細胞の全てを計測対象にすることは必須ではないが、より有益な評価結果をもたらす高品質の移動パターンを決定するため、好ましくは移動した細胞の50％以上、更に好ましくは移動した細胞の60％以上、更に更に好ましくは移動した細胞の70％以上、より一層好ましくは移動した細胞の80％以上を計測対象にする。細胞の位置の計測においては、光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、スチルカメラ、ビデオカメラ等を適宜組み合わせ、経時的な計測を可能にすればよい。
【００７１】
計測対象の細胞（即ち、移動能を有し、細胞集団を構成する細胞）を予め標識しておけば、標識を指標として細胞の位置を計測することが可能でさる。ここでの標識としては、GFPやRFP等の蛍光標識を例示することができる。
【００７２】
薬効又は毒性の評価により適した移動パターンの決定が可能となるように、各細胞の位置を経時的に複数回（通常は、時間軸に沿って連続的に）計測する。即ち、細胞を追跡（トラッキング）し、その位置を連続的に計測、記録する。このようにすれば細胞の移動方向の経時的な変化を捉えることが可能になる。連続的な計測を行う場合の間隔は、例えば数秒〜数時間、好ましくは数分〜数十分（例えば、１分、２分、３分、４分、５分、１０分、１５分、２０分、２５分）である。計測間隔は、得られる位置情報の量及び品質を規定し、ひいては位置情報を基に決定される移動パターンの品質に影響する。より高品質な移動パターンを作成するためには、可能な限り計測間隔を短くすることが望まれるが、過度に短い計測間隔を採用すればデータ量及びデータ処理時間が膨大となり、実用上の問題を生じうる。従って、それに基づき薬効又は毒性の評価（ステップ（ｉｉｉ））を可能にする十分な品質の移動パターンが得られることを条件としつつ、計測対象の細胞の数、使用する計測機器やデータ解析用ソフトウエア等の処理能力等を考慮して適切な計測間隔を設定するとよい。尚、経時的計測ないしトラッキングには、例えばFijiにあるParticle Tracker等のソフトウエアを利用することができる。
【００７３】
連続的な計測を行う場合の計測開始のタイミングは特に限定されず、細胞が移動を開始する前から計測することにしても、細胞が移動を開始した後に計測を開始することにしてもよい。好ましくは、細胞が移動を開始する前又は移動を開始した直後に計測を開始し、移動過程を最初から記録できるようにする。尚、培養開始後の経過時間で計測開始のタイミングを設定してもよく、例えば、培養開始後数時間経過した時点で計測を開始する。
【００７４】
連続的な計測を行う場合の最初の計測から最終の計測までの時間（「トラッキング時間」と呼ぶ）も特に限定されない。例えば、トラッキング時間を４時間〜１２時間の範囲内で設定することができる。
【００７５】
ステップ（ｉｉ）では、計測した位置の情報から各細胞の移動変動を分析して集計し、細胞集団の移動パターンを決定する。移動変動の分析には、例えば、以下の（Ａ）で算出される距離比が用いられる（図１を参照）。
（Ａ）計測時間ｔでの細胞の総移動距離をＤ（ｔ）、移動開始点と移動終了点の２点間の直線距離をｄ（ｔ）とし、距離比ｄ（ｔ）／Ｄ（ｔ）を算出する。
【００７６】
（Ａ）で算出される距離比は移動方向の変動を反映する。距離比の値が小さいほど移動方向の変動（揺らぎ）が大きいことになる。移動パターンは、個々の細胞についての分析結果（この場合は距離比）の集計によって決定される。集計の際には、通常、統計処理（例えば、平均値と標準偏差又は標準誤差が用いられる）を行う。集計の結果、距離比の値が小さい傾向であれば移動方向の変動（揺らぎ）が大きい移動パターンとなり、距離比の値が大きい傾向であれば移動方向の変動（揺らぎ）が小さい移動パターンとなる。
【００７７】
ステップ（ｉ）において細胞の位置を経時的に計測し、計測時毎に（Ａ）の距離比を算出することにより、距離比の経時的な変化（即ち、移動方向の変動）を捉えることができる。
【００７８】
別の態様では、移動変動の分析に、以下の（Ｂ）で求められる角度θが用いられる（図２を参照）。
（Ｂ）計測時間ｔに対して計測時間間隔ｔ／ｎ（但し、ｎは２以上の整数）を設定して細胞の位置の計測を行い、各時点における細胞の位置ベクトルと基準軸との間の角度θを求める。
【００７９】
（Ｂ）では、計測開始時（（ｔ／ｎ）×０）における基準となる細胞の位置を基準点として、ある時点における細胞の位置関係を反映する位置ベクトルを求め、基準軸との角度θを計算して利用する。まず、計測開始時の細胞の位置を基準点として設定する（開始時）。計測時間ｔに対して計測時間間隔ｔ／ｎ（但し、ｎは２以上の整数）を設定し、各計測時（（ｔ／ｎ）×１、（ｔ／ｎ）×２、（ｔ／ｎ）×３、・・・（ｔ／ｎ）×ｎ）について、細胞の位置ベクトルを計測する。次に、各計測時の細胞の位置ベクトルと基準軸（典型的には、基準点を通る直線を基準軸とする）との間の角度θを求める。このようにして得られた個々の細胞についての角度θの値（１個の細胞につきｎ個の値が得られる）を計測対象細胞全体で集計し、角度θの度数分布を作成する。基準軸は任意に設定可能であるが、例えば、上記で求めた各計測時の細胞の位置ベクトル（即ち、（ｔ／ｎ）×１、（ｔ／ｎ）×２、（ｔ／ｎ）×３、・・・（ｔ／ｎ）×ｎでの細胞の位置ベクトル）を合計してｎで割り、平均の位置ベクトルを計算し、これを基準軸にする。尚、基準点と基準軸は細胞毎に設定される。
【００８０】
計測時間間隔は例えば１０秒〜１２０分とする。また、計測時間間隔を規定する整数ｎは、総計測時間（即ち、所定時間ｔ）との関係で決定すればよく、例えば、ｔは1時間〜２４０時間とし、２≦ｎ≦１００００００とする。
【００８１】
（Ｂ）の場合、角度θの度数分布が移動パターンを規定することになる。角度θと細胞の移動方向の変動は正の相関を示す。従って、角度（θ）の小さい範囲に度数が多い場合、変動（揺らぎ）が小さい移動パターンとなり、角度（θ）の大きい範囲に度数が多い場合、変動（揺らぎ）が大きい移動パターンとなる。ヒストグラムを作成し、その形状で移動パターンを決定してもよい。また、角度θの平均からのばらつきを調べ、ばらつきの中央値や平均値を変動（揺らぎ）の程度や傾向の判定に利用してもよい。
【００８２】
更に別の態様では、移動変動の分析に、以下の（Ｃ）で算出される速度が用いられる。
（Ｃ）計測時間tでの細胞の総移動距離をＤ（ｔ）とし、速度Ｄ（ｔ）/ｔを算出する。
【００８３】
速度も細胞の移動変動を反映する。ある定時の速度、あるいは経時的な速度変化が正常パターンから逸脱していることは、移動変動の異常を表す。
【００８４】
移動パターンは表やグラフ、或いはプロット図等の形式で表現することができる。例えば、距離比の値の範囲に関して複数の区分を設け、各区分に変動の程度を数字や記号等を用いて関連づけておけば、移動方向の変動のレベルを数字や記号等で表現することもできる。
【００８５】
ステップ（ｉｉ）に続くステップ（ｉｉｉ）では、決定した移動パターンに基づき被験物質の薬効又は毒性を判定する。上記の通り、本発明の方法は薬効評価系又は毒性評価系として利用可能なものであり、前者の場合にはこのステップで被験物質の薬効が判定され、後者の場合にはこのステップで被験物質の毒性が判定される。以下、評価系毎にその特徴を説明する。
【００８６】
＜薬効評価系＞
本発明の一態様では被験物質の薬効を評価する手段、即ち薬剤評価系として本発明の評価方法が構成される。この態様によれば、細胞遊走障害がその発症や進展の原因の少なくとも一つとなる各種疾患（標的疾患）に有効な医薬の成分又はその候補をスクリーニングすることが可能となる。
【００８７】
この態様では、典型的には、ステップ（ｉ）の細胞として非正常細胞が用いられる。そして、ステップ（ｉｉｉ）では、ステップ（ｉｉ）で決定した移動パターンの正常化を指標として被験物質の薬効が判定される。移動パターンの正常化とは、非正常細胞の集団が示す異常な移動パターンが改善されることを意味する。移動パターンが正常化すると、対応する正常細胞の移動パターン（通常は変動（揺らぎ）の少ない移動パターン）に近づくことになる。従って、ステップ（ｉｉ）で決定した移動パターン（「試験群の移動パターン」と呼ぶ）が、被験物質の非存在下で培養すること以外は同様の手順に従って決定した移動パターン（「コントロール群の移動パターン」と呼ぶ）に比較して、対応する正常細胞の移動パターン（通常は変動（揺らぎ）の少ない移動パターン）により近いこと、即ち、被験物質の存在（影響）によって、対応する正常細胞の移動パターンに近似したことが、被験物質が有効であることを表すことになる。試験群の移動パターン、コントロール群の移動パターン及び正常群の移動パターンの三者を比較ないし対比することによって移動パターンの正常化の有無を把握し、それに基づき被験物質の有効性を判定することができる。また、移動パターンの正常化の程度は有効性（薬効）の程度を反映することから、正常化の程度に基づき有効性の程度ないし強さを判定することもできる。有効性が認められた被験物質は、細胞移動障害が原因となる疾患に対する医薬の成分又はその候補として有望であるといえる。
【００８８】
「対応する正常細胞」とは、典型的には健常者由来の同種の細胞である。例えば、非正常細胞が統合失調症患者由来のドパミン神経細胞の場合、対応する正常細胞は健常者由来のドパミン神経細胞（典型的には健常者から採取した末梢血から作成したiPS細胞を分化誘導させて得られるドパミン神経細胞）である。別の例を挙げれば、非正常細胞がレット症候群患者由来のグルタミン酸作動性神経細胞の場合、対応する正常細胞は健常女性由来のグルタミン酸作動性神経細胞である。
【００８９】
＜毒性評価系＞
本発明の別の態様では被験物質の毒性を評価する手段、即ち毒性評価系として本発明の評価方法が構成される。この態様によれば、医薬品の成分又はその候補、栄養補助食品（サプリメント）又はその候補、食品添加物又はその候補等の被験物質について、細胞移動能に影響を及ぼすことで毒性を示すか否か、或いはその毒性の程度を評価することができる。
【００９０】
この態様ではステップ（ｉ）の細胞として正常細胞又は非正常細胞が用いられる。正常細胞を用いる場合のステップ（ｉｉｉ）では、ステップ（ｉｉ）で決定した移動パターンの異常化を指標として被験物質の毒性が判定される。移動パターンの異常化とは、移動パターンが変化すること、即ち、正常な移動パターンと異なる移動パターンになることである。従って、典型的には、ステップ（ｉｉ）で決定した移動パターン（試験群の移動パターン）と、被験物質の非存在下で培養すること以外は同様の手順に従って決定した移動パターン（コントロール群の移動パターン）を比較して相違が認められることが、被験物質に毒性があることを表す。また、移動パターンの変化の程度は毒性の程度を反映することから、相違の程度に基づき毒性の程度ないし強さを判定することもできる。
【００９１】
毒性評価の目的を考慮して適切な細胞を正常細胞として選択するとよい。例えば、被験物質の神経毒性（但し、細胞移動能への影響に起因する神経毒性が評価されることになる）を評価するのであれば、通常、神経細胞（ドパミン神経細胞、グルタミン作動性神経細胞、セロトニン神経細胞、GABA作動性神経細胞等）が選択される。
【００９２】
一方、非正常細胞を用いる場合のステップ（ｉｉｉ）では、ステップ（ｉｉ）で決定した移動パターンの更なる異常化を指標として被験物質の毒性が判定される。更なる異常化とは、正常な移動パターンとの相違がより顕著になることであり、更なる異常化が生じると、典型的には、移動方向の変動（揺らぎ）がより大きい移動パターンになる。ステップ（ｉｉ）で決定した移動パターン（試験群の移動パターン）、被験物質の非存在下で培養すること以外は同様の手順に従って決定した移動パターン（コントロール群の移動パターン）、及び対応する正常細胞の移動パターン（正常群の移動パターン）の三者を比較ないし対比することによって移動パターンの更なる異常化が生じたか否か、或いは異常化の程度を判定することができる。
【００９３】
非正常細胞には、例えば、患者由来の細胞を用いればよい。特定の疾患の患者由来の疾患細胞を非正常細胞として採用すれば、当該疾患を標的とした治療薬又はその候補の毒性を評価可能な評価系となる。このような評価系は、例えば、治療薬又はその候補の副作用を評価する手段として有用である。
【００９４】
以上の説明から明らかなように、本発明の薬剤評価方法で指標として用いる「細胞集団を構成する個々の細胞の移動方向の変動で規定される移動パターン」は細胞の状態を反映する。この点に注目すれば、細胞の移動パターンは細胞集団の品質（正常性、異常性、均一性など）の評価にも有用である。そこで本発明は、別の局面として、細胞集団を構成する個々の細胞の移動方向の変動で規定される移動パターンによって当該細胞集団の品質を評価する方法も提供する。
【実施例】
【００９５】
中枢神経系疾患の発症メカニズムや病態の研究、治療法の開発などに有用な新規評価系の開発を目指し、以下の検討を行った。【００９６】
１．材料と方法
（１）iPS細胞樹立対象者
RELN欠失１名（RELN-del1）
健常男性１名（CON2）【００９７】
（２）iPS細胞の樹立
健常者女性対照（CON1）は理化学研究所バイオリソースセンター（BRC）から入手した。RELN欠失を含め、ゲノム異常がないことを事前に確認した。RELN欠失者からのiPS細胞については、既報（Okita, K. et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature methods 8, 409-412 (2011)）に準じて末梢リンパ球からエピソーマルベクターを用いて樹立した。樹立したiPS細胞はフィーダー細胞（mitomycin-C処理したマウス胎児線維芽細胞：MEF）上でiPS細胞培地（20% KSR, 2mM L-グルタミン, 0.1 mM 非必須アミノ酸, 2-メルカプトエタノール, ペニシリン／ストレプトマイシン及びbFGFを含有するDMEM/F12）を用いて培養した。フィーダーフリー培養の際は、MatrigelTM（BD）コートをした培養皿上でiPS細胞を培養した。培地は一晩フィーダー細胞に暴露したiPS細胞培地（MEFコンディション培地）を使用した。【００９８】
（３）RELN欠失アイソジェニックiPS細胞株の作製
CRISPR/Cas9システムを用い、健常対照（CON1）から人工的にRELN欠失アイソジェニックiPS細胞（Isogenic(-/-)及びIsogenic(+/-)）を作製した。Cas9発現ベクターとsgRNA発現ベクターはAddgeneより入手した。Lipofectamine3000を用いてCas9発現ベクターとsgRNA発現ベクターをコトランスフェクションし、48時間後、ピューロマイシンによる選択を行った。10μMのY-27632にて前処理した後、TrypLETM select（Thermo Fisher Scientific Inc.）を用いて分散させた。その後、FuGENE（登録商標） HD（プロメガ社）を用いてCas9発現ベクターとsgRNA発現ベクターをコトランスフェクションし、1 × 106個/ウェルにてMatrigelTM（BD）コーティングした6ウェルプレート上に播種した。24時間後、ピューロマイシンによる選択を行った。【００９９】
（４）ニューロスフィアの形成
以下のプロトコルで健常者iPS細胞、RELN欠失患者iPS細胞、及びRELN欠失アイソジェニックiPS細胞から各々ニューロスフィアを形成させた。まず、iPS細胞をSB431542（3μM）、CHIR99021（3μM）、dorsomorphin（3μM）を添加したiPS細胞培地にて7日間培養した（0日目〜7日目）。その後、TrypLETM select（Thermo Fisher Scientific Inc.）によって分散させ、セルストレイナーに通したものをニューロスフィア培地（DMEM/F12に1×N2サプリメント, 0.6% グルコース, ペニシリン／ストレプトマイシン, 5mM HEPESを添加した培地（MHM培地）に、1×B27サプリメント, 20 ng/ml bFGF, 10 ng/ml human LIF, 10μM Y27632, 3μM CHIR99021, 2μM SB431542, 100 ng/ml FGF8及び1μM プルモルファミンを添加したもの）にて2週間浮遊培養することでニューロスフィアを形成させた（7日目〜21日目）。FGF8とプルモルファミンは10日目から添加した。また、14日目にニューロスフィアを回収し、分散させて単一細胞化した後、再度浮遊培養し、ニューロスフィア（二次ニューロスフィア）を再形成させた。【０１００】
（５）神経細胞の移動能試験
二次ニューロスフィア（21日目）を一つずつMatrigel M（BD）コート培養皿上へ播種し、ドパミン神経細胞用培地（MHM培地にB27サプリメント, 10μM DAPT, 20 ng/ml BDNF, 20 ng/ml GDNF, 0.2 mM アスコルビン酸, 1 ng/ml TGF-β3及び0.5 mM dbcAMPを添加したもの）で培養した。動画はIncuCyte（登録商標）（ESSEN BIOSCIENCE）にて撮影した。細胞トラッキングのために、播種後48時間〜52時間の計4時間の間、15分おきに連続撮影し、ImageJを用いて解析した（タイムラプス解析）。移動距離は各撮影点におけるXY座標によって計算した。尚、ドパミン神経細胞への分化は既報（Fujimori, K. et al. Modeling neurological diseases with induced pluripotent cells reprogrammed from immortalized lymphoblastoid cell lines. Molecular brain 9, 88 (2016)）に改良を加えて行った。【０１０１】
（６）移動方法の評価１（距離比）（図１を参照）
細胞の総移動距離と、開始点と終了点の2点間の直線距離の比によって移動方向を評価した。【０１０２】
（７）移動方法の評価２（ベクトル及び角度）（図２を参照）
細胞の位置ベクトルと基準軸（平均の位置ベクトル）との間の角度によって移動方向を評価した。位置ベクトルの測定間隔は15分とした。【０１０３】
（８）自動検出法（図６を参照）
ニューロスフィアを構成する細胞の一部をGFP標識した。具体的には、CellLight Reagent（Thermo Fisher社）を用いた。標識後のニューロスフィアを移動能試験に供し、タイムラプス観察し（IncuCyteを使用）、自動粒子ソフトウエア（Particle Tracker, Fiji）で解析した。この方法によれば、自動検出のため人為的操作によるバイアスがない。また、XY座標軸値を用いることで神経細胞動態の数値化が可能となる。【０１０４】
（９）統計解析
平均値の比較は、二群間の場合はStudentのt検定（両側検定）、三群間の場合はANOVA検定後Dunnett法を用いた。分布の比較は、ピアソンのカイの二乗検定を用いた。いずれもp<0.05を有意とした。【０１０５】
２．結果
（１）健常者の移動パターン
健常者iPS細胞から誘導したドパミン神経細胞の位置をトラッキングし、上記「移動方法の評価２（ベクトル及び角度）」に従い、特に方向性に着目した移動パターンを評価した（図３）。健常者由来神経細胞はin vitroにおいても一定の移動パターン（直進性を特徴とする）を示した。個々の細胞でその方向性のルールに差がほとんどなかった。【０１０６】
（２）RELN欠失の移動パターンと健常者の移動パターンの比較
RELN欠失患者iPS細胞から誘導したドパミン神経細胞の位置をトラッキングし、上記「移動方法の評価２（ベクトル及び角度）」に従い、移動パターンを評価した（図４）。RELN欠失患者由来神経細胞は、健常者由来神経細胞とは対照的に、個々の細胞で移動方向が異なるパターンを示した。即ち、移動パターンの異常の検出が可能であった。【０１０７】
RELN欠失アイソジェニックiPS細胞から誘導したドパミン神経細胞についても移動パターンを解析し、健常者の移動パターンとRELN欠失の移動パターン（RELN欠失患者、RELN欠失アイソジェニック（Isogenic(-/-)及びIsogenic(+/-)）を比較した（図５）。健常者は、角度θが狭い範囲に分布する（角度θの約80％が-20°〜+20°の範囲内）、変動（揺らぎ）の少ない移動パターンを示す。対照的に、RELN欠失の移動パターンは変動が大きく、-20°〜+20°の範囲内に角度θの約45％〜65％が含まれるに留まる。【０１０８】
（３）自動検出システムによる評価
薬剤評価系への応用などを考慮し、移動パターンを自動検出／自動数値化する計測系（自動検出システム）を構築し（図６）、その有効性を検証した。健常者由来神経細胞、RELN欠失患者由来神経細胞、及びRELN欠失アイソジェニック由来神経細胞について、自動検出による軌道プロット（12時間）を実施し、上記「移動方法の評価１（距離比）」に従い、移動パターンの比較評価を行った（図７）。健常者（201B7(+/+)）に比べ、RELN欠失群（RELN-del1(+/-)と201B7(-/-)）で距離比の明らかな低下が認められた。【０１０９】
以上の通り、自動検出システムによっても、RELN欠失群に特徴的な移動パターンの異常を検出可能であった（再現性が得られた）。また、個々の細胞の長期間における移動現象の測定が可能となった。
【産業上の利用可能性】
【０１１０】
様々な組織や器官／臓器等の正常な形成や再生のプロセスに細胞の移動能が重要であることから、細胞の移動パターンを指標とした本発明の薬剤評価系の利用・応用分野は広い。例えば、中枢神経系疾患の病態研究、神経発生や回路形成の基礎研究、中枢神経系薬の開発、脊髄損傷、末梢神経障害、器官形成(例えば先天性心疾患）の治療法／治療薬の開発、妊娠時や授乳中の母親の服用による胎児・子供脳や器官形成への影響の予測に本発明が利用されることを期待できる。【０１１１】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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