(57)【要約】  増殖性疾患を処置するための新規な手段を提供する。（Ａ）増殖性疾患に関与する少なくとも一つの標的遺伝子に結合する少なくとも一つのガイドＲＮＡの鋳型となる塩基配列からなるポリヌクレオチド等、および（Ｂ）Ｃａｓタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド等、を含む、医薬組成物。
2019203317.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）増殖性疾患に関与する少なくとも一つの標的遺伝子に結合する少なくとも一つのガイドＲＮＡの鋳型となる塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および
（Ｂ）Ｃａｓタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、を含む、増殖性疾患を処置するための医薬組成物。
【請求項２】
（Ｃ）転写抑制因子をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターをさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
（Ａ’）増殖性疾患に関与する少なくとも一つの標的遺伝子に結合する少なくとも一つのガイドＲＮＡ、および
（Ｂ’）Ｃａｓタンパク質、を含む、増殖性疾患を処置するための医薬組成物。
【請求項４】
（Ｃ’）転写抑制因子をさらに含む、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
上記標的遺伝子ががん遺伝子である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
上記標的遺伝子が複数である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
上記標的遺伝子がＳＯＸ２、ΔＮｐ６３およびＰＩＫ３ＣＡのいずれからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
上記Ｃａｓタンパク質が上記転写抑制因子と融合している、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
上記Ｃａｓタンパク質がｄＣａｓ９である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
上記ｄＣａｓ９が、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかで示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされる、請求項９に記載の医薬組成物：
（ａ）配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号１で示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、かつ、該ポリヌクレオチドから発現したタンパク質が、上記（Ａ）のガイドＲＮＡ、または、上記（Ａ）のガイドＲＮＡおよび上記（Ｃ）の転写抑制因子と協同して標的遺伝子の発現を抑制する活性を有する、ポリヌクレオチド、および
（ｃ）配列番号１で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつ、該ポリヌクレオチドから発現したタンパク質が、上記（Ａ）のガイドＲＮＡ、または、上記（Ａ）のガイドＲＮＡおよび上記（Ｃ）の転写抑制因子と協同して標的遺伝子の発現を抑制する活性を有する、ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
上記転写抑制因子がＫＲＡＢである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
上記増殖性疾患ががんである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
上記ガイドＲＮＡを複数含み、該各ガイドＲＮＡが上記標的遺伝子の異なる部分に結合する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
上記（Ａ）〜（Ｂ）または（Ａ）〜（Ｃ）の各ポリヌクレオチドが、同一の発現ベクター上に配置されている、請求項１、２および５〜１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
上記発現ベクターがプラスミドベクターまたはウイルスベクターである、請求項１、２および５〜１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
（Ａ）増殖性疾患に関与する少なくとも一つの標的遺伝子に結合する少なくとも一つのガイドＲＮＡの鋳型となる塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、
（Ｂ）Ｃａｓタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および
（Ｃ）転写抑制因子をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、を備える、増殖性疾患を処置するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、増殖性疾患を処置するための医薬組成物に関する。また、本発明は、増殖性疾患を処置するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは、現代における主要な死因の一つである。なかでも肺がんは、世界中で最も頻度の高い死因であり、毎年、１．６百万人の患者が、肺がんが原因で亡くなっている。【０００３】
しかし、最近の次世代シークエンサーの進歩により、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）における遺伝子変異を調べることが可能になってきている。このため、特定のゲノム変異を有する患者は、分子標的治療の恩恵を受けることができる。例えば、進行性ＮＳＣＬＣを患う患者の６９％までが、潜在的な分子標的を有する。ＥＧＦＲ突然変異またはＡＬＫ融合遺伝子のための分子標的薬は、とりわけ、肺腺がんにおける個人治療に著しい改善を見せている。いくつかのドライバー突然変異候補はまた、肺扁平上皮細胞がん（「扁平上皮細胞がん」を「ＳＣＣ」と称することもある。）で同定されているが、ＳＣＣの有効な標的治療は、未だ確立されていない。【０００４】
また、別のがんとして、食道がんは、世界中で８番目に多いがんであり、毎年、４０万人の患者が、食道がんが原因で亡くなっている。診断および治療の進展にもかかわらず、食道がんの５年生存率は、１５％〜２５％と極めて低い。これは、主に、診断の遅れ、および有効な治療手段の欠如による。食道扁平上皮細胞がんは、世界中の食道がんの主要な組織学的タイプである。【０００５】
このような事情のため、肺ＳＣＣおよび食道ＳＣＣの新規治療方法の開発が早急に求められている。【０００６】
ところで、最近、新たな疾患の治療方法として、生体内の細胞における特定の遺伝子の発現を抑制する方法が検討されている。【０００７】
遺伝子の発現を抑制する方法として、生物学および医薬分野の基礎研究で汎用されているものに、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）がある。ｓｉＲＮＡは、ジヌクレオチド３’オーバーハングが付いた２１−２５ｂｐの２本鎖ＲＮＡであり、対象細胞に導入することにより、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）が誘導され，標的遺伝子のｍＲＮＡ発現が抑制される。【０００８】
また、遺伝子の発現抑制に関して、最近開発された方法として、ＣＲＩＳＰＲｉ（ＣＲＩＳＰＲ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）がある（非特許文献１）。ＣＲＩＳＰＲｉは、例えばヌクレアーゼ不活性型のＣａｓ９（以下、適宜「ｄＣａｓ９」と称する。）融合タンパク質と、標的配列に特異的に結合するガイドＲＮＡとを用いて、特定の配列にエフェクタードメインを集積させ、標的遺伝子の発現を抑制するという方法である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Luke A. Gilbert et al.，Cell，159(3):647-661, 2014
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかし、ｓｉＲＮＡは、非特異的な遺伝子の発現抑制効果（ｏｆｆ  ｔａｒｇｅｔ効果）を高い確率で生じることが分かっている。このため、ｓｉＲＮＡを生体に適用した場合には、予期せぬ生物学的反応を惹起する可能性が高く、それ故、臨床への応用は困難であると考えられている。【００１１】
また、ＣＲＩＳＰＲｉは、その技術の詳細が未だ十分に解明されておらず、臨床への適用が可能であるかは不明である。【００１２】
したがって、本発明の一態様は、ＣＲＩＳＰＲｉを用いた増殖性疾患を処置するための新規な手段を提供すること、例えば、ＣＲＩＳＰＲｉを用いた増殖性疾患を処置するための医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討を重ねた結果、ＣＲＩＳＰＲｉを用いた新規のプラスミドベクターおよびアデノウイルスベクターの開発に成功した。また、それらのベクターを用いて、特定のがん細胞内で、がんに関連する遺伝子の発現を特異的に抑制すること、および特定のがん細胞の増殖を抑制することに成功した。そして、これらの知見に基づき、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明の一実施形態は以下の構成を包含する。【００１４】
（Ａ）増殖性疾患に関与する少なくとも一つの標的遺伝子に結合する少なくとも一つのガイドＲＮＡの鋳型となる塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および
（Ｂ）Ｃａｓタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、を含む、増殖性疾患を処置するための医薬組成物。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の一態様によれば、増殖性疾患を処置するための新規な手段を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の一態様におけるＣＲＩＳＰＲｉによるＳＯＸ２および／またはΔＮｐ６３（ＴＰ６３）の発現抑制機構を示す概略図である。
【図２】（ａ）は、肺ＳＣＣ、食道ＳＣＣおよび肺腺がん細胞におけるΔＮｐ６３の発現に関して、イムノブロット解析の結果を示す図である。（ｂ）は、肺ＳＣＣ組織、肺腺がん組織および食道ＳＣＣにおけるΔＮｐ６３の発現に関して、免疫染色の結果を示す図である。
【図３】（ａ）は、本発明の一態様におけるプラスミドベクターの構成を示す略図である。（ｂ）は、ΔＮｐ６３プロモーター領域の配列を示す図である。（ｃ）は、ＳＯＸ２プロモーター領域の配列を示す図である。
【図４】（ａ）は、ルシフェラーゼレポーターコンストラクトの構成を示す略図である。（ｂ）は、本発明の一態様におけるプラスミドベクター（ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ΔＮｐ６３ＡおよびｐＣＲＩＳＰＲｉ  ΔＮｐ６３Ａ／Ｂ）を用いた、ルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示す図である。
【図５】（ａ）は、ルシフェラーゼレポーターコンストラクトの構成を示す略図である。（ｂ）は、本発明の一態様におけるプラスミドベクター（ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ΔＮｐ６３Ａ／Ｂ、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ／Ｂ、およびｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ／Ｂ  ΔＮｐ６３Ａ／Ｂ）を用いた、ルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示す図である。
【図６】（ａ）は、本発明の一態様におけるアデノウイルスベクターの構成を示す略図である。（ｂ）は、本発明の一態様におけるアデノウイルスベクター（Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ΔＮｐ６３）を用いた、イムノブロット解析の結果を示す図である。
【図７】（ａ）は、本発明の一態様におけるアデノウイルスベクターの構成を示す略図である。（ｂ）および（ｃ）は、本発明の一態様におけるアデノウイルスベクター（Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ΔＮｐ６３、Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２、およびＡｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２  ΔＮｐ６３）を用いた、イムノブロット解析の結果を示す図である。
【図８】（ａ）および（ｂ）は、本発明の一態様におけるアデノウイルスベクター（Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ΔＮｐ６３）を用いた、コロニー形成アッセイの結果を示す図である。（ｃ）および（ｄ）は、本発明の一態様におけるアデノウイルスベクター（Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ΔＮｐ６３）を用いた、ＴＵＮＥＬ染色の結果を示す図である。
【図９】（ａ）および（ｂ）は、本発明の一態様におけるアデノウイルスベクター（Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ΔＮｐ６３、Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２、およびＡｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２  ΔＮｐ６３）を用いた、コロニー形成アッセイの結果を示す図である。
【図１０】（ａ）および（ｂ）は、異種移植片マウスモデルにおけるＡｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ΔＮｐ６３の腫瘍抑制効果を示す図である。
【図１１】（ａ）は、ＳＯＸ２プロモーター領域の配列を示す図である。（ｂ）は、ＰＩＫ３ＣＡプロモーター領域の配列を示す図である。（ｃ）は、本発明の一態様におけるプラスミドベクターの構成を示す略図である。
【図１２】（ａ）は、ｐＧＬ４．１４ベクターのベクター地図を示す略図である。（ｂ）は、ルシフェラーゼレポーターコンストラクトの構成を示す略図である。
【図１３】（ａ）および（ｂ）は、本発明の一態様におけるプラスミドベクター（ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ／Ｂ、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＰＩＫ３ＣＡＡ、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＰＩＫ３ＣＡＡ／Ｂ、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ  ＰＩＫ３ＣＡＡ、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ／Ｂ  ＰＩＫ３ＣＡＡ、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ  ＰＩＫ３ＣＡＡ／Ｂ、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ／Ｂ  ＰＩＫ３ＣＡＡ／Ｂ）を用いた、ルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示す図である。
【図１４】（ａ）は、本発明の一態様におけるアデノウイルスベクターの構成を示す略図である。（ｂ）は、ｄＣａｓ９−ＫＲＡＢベクターのベクター地図を示す略図である。（ｃ）は、本発明の一態様におけるアデノウイルスベクター（Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２、Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＰＩＫ３ＣＡ、およびＡｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２  ＰＩＫ３ＣＡ）を用いた、イムノブロット解析の結果を示す図である。
【図１５】本発明の一態様におけるアデノウイルスベクター（Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２  ＰＩＫ３ＣＡ）感染後７２時間での各細胞におけるｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙを計測した結果を示すグラフである。
【図１６】（ａ）および（ｂ）は、本発明の一態様におけるアデノウイルスベクター（Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２、Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＰＩＫ３ＣＡ、およびＡｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２  ＰＩＫ３ＣＡ）を用いた、コロニー形成アッセイの結果を示す図である。
【図１７】本発明の一態様におけるアデノウイルスベクター（Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２、Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＰＩＫ３ＣＡ、およびＡｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２  ＰＩＫ３ＣＡ）を用いた、イムノブロット解析の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明の実施の形態の一例について詳細に説明するが、本発明は、これらに限定されない。
【００１８】
本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意味する。
【００１９】
本明細書において、「遺伝子」とはヌクレオチドの重合体を意図し、「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「核酸分子」と同義で使用される。遺伝子は、ＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）でも存在しうるし、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態でも存在しうる。ＤＮＡまたはＲＮＡは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖）であっても、非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。遺伝子は化学的に合成してもよい。また、本明細書において「ポリヌクレオチド」と記載した場合、ＤＮＡであってもよいし、ＲＮＡであってもよい。
【００２０】
本明細書において、「タンパク質」は、「ペプチド」または「ポリペプチド」と同義で使用される。
【００２１】
本明細書中、塩基およびアミノ酸の表記は、ＩＵＰＡＣおよびＩＵＢの定める１文字表
記または３文字表記を適宜使用する。
【００２２】
〔１．増殖性疾患を処置するための医薬組成物〕
本発明の一実施形態に係る増殖性疾患を処置するための医薬組成物（以下、「本発明の医薬組成物」と称する。）は、（Ａ）増殖性疾患に関与する少なくとも一つの標的遺伝子（単に、「標的遺伝子」と称することもある。）に結合する少なくとも一つのガイドＲＮＡの鋳型となる塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および（Ｂ）Ｃａｓタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、を含む。また、本発明の医薬組成物は、（Ａ）増殖性疾患に関与する少なくとも一つの標的遺伝子に結合する少なくとも一つのガイドＲＮＡの鋳型となる塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、（Ｂ）Ｃａｓタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および（Ｃ）転写抑制因子をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、を含む。
【００２３】
なお、以下において、本発明の医薬組成物に含まれる上記構成（Ａ）〜（Ｃ）を、まとめて、「本発明の医薬組成物におけるポリヌクレオチド等」と称することもある。また、「（Ａ）増殖性疾患に関与する少なくとも一つの標的遺伝子に結合する少なくとも一つのガイドＲＮＡの鋳型となる塩基配列からなるポリヌクレオチド」、「（Ｂ）Ｃａｓタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド」、「（Ｃ）転写抑制因子をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド」を、それぞれ、「（Ａ）のポリヌクレオチド」、「（Ｂ）のポリヌクレオチド」、「（Ｃ）のポリヌクレオチド」と称することもある。
【００２４】
上述したように、非特許文献１には、ＣＲＩＳＰＲｉにより遺伝子発現を抑制する一般的な方法が記載されているが、この技術を、増殖性疾患の治療に応用することは何ら開示されていない。本発明者らは、増殖性疾患を処置する新規手段について詳細な検討を行うなかで、主に以下の知見を得るに至った。
・増殖性疾患を処置し得る、新規プラスミドベクター（ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ΔＮｐ６３Ａ、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ΔＮｐ６３Ａ／Ｂ、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ／Ｂ、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ／Ｂ  ΔＮｐ６３Ａ／Ｂ）、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＰＩＫ３ＣＡＡ、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＰＩＫ３ＣＡＡ／Ｂ、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ  ＰＩＫ３ＣＡＡ、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ／Ｂ  ＰＩＫ３ＣＡＡ、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ  ＰＩＫ３ＣＡＡ／Ｂ、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ／Ｂ  ＰＩＫ３ＣＡＡ／Ｂ）の開発に成功した（図３（ａ）、図１１（ｃ）および図１３）。
・増殖性疾患を処置し得る、新規アデノウイルスベクター（Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ΔＮｐ６３、Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２、Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２  ΔＮｐ６３、Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＰＩＫ３ＣＡ、およびＡｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２  ＰＩＫ３ＣＡ）の開発に成功した（図６（ａ）、図７（ａ）および図１４〜１７）。
・上記ベクターを用いて、特定のがん細胞内で、がんに関連する遺伝子の発現を特異的に抑制することに成功した（実施例２．、実施例３．、実施例６．および実施例７．）。
・上記ベクターを用いて、特定のがん細胞の増殖を抑制することに成功した（実施例４．および実施例９．）。
・上記ベクターを用いて、特定のがん細胞の生存を抑制することに成功した（実施例８．）。
・特定のがん細胞の増殖抑制効果は、マウスモデルを用いたインビボでの実験でも示された（実施例５．）。
・上記ベクターを用いると、特定のがん細胞内でリン酸化ＡＫＴが有意に抑制された（実施例１０．）。
【００２５】
このように、本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲｉを用いて増殖性疾患を処置し得ることを初めて示すことに成功した。したがって、本発明の一態様では、ＣＲＩＳＰＲｉを用いた、増殖性疾患、とりわけ、肺ＳＣＣおよび食道ＳＣＣを処置するための新規かつ有望な手段を提供できる。
【００２６】
また、本発明の一態様におけるプラスミドベクターおよびアデノウイルスベクターは、標的遺伝子の発現を特異的に抑制することができるため、ｏｆｆ  ｔａｒｇｅｔ効果を高い確率で生じるｓｉＲＮＡと比べて、臨床適用に際して、極めて有利である。
【００２７】
さらに、本発明者らは、増殖性疾患に関与する複数の標的遺伝子を対象として、これらに結合する複数のガイドＲＮＡを搭載したアデノウイルスベクターを用いることにより、従来のベクターよりも顕著に優れた抗腫瘍効果を示すことに成功した。本発明の一態様におけるアデノウイルスベクターにより奏される上記効果は、従来の知見からは得られない、驚くべき効果である。
【００２８】
〔１−１  ポリヌクレオチド〕
〔増殖性疾患に関与する少なくとも一つの標的遺伝子に結合する少なくとも一つのガイドＲＮＡの鋳型となる塩基配列からなるポリヌクレオチド〕
本発明の医薬組成物は、増殖性疾患に関与する少なくとも一つの標的遺伝子に結合する少なくとも一つのガイドＲＮＡの鋳型となる塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む。
【００２９】
本発明の一実施形態におけるガイドＲＮＡ（本明細書において、「ｇＲＮＡ」とも称する。）は、Ｃａｓタンパク質および／または転写抑制因子を標的遺伝子に集積させる役割を果たす。ガイドＲＮＡの当該機能により、標的遺伝子に集積したＣａｓタンパク質および／または転写抑制因子の働きにより、標的遺伝子の遺伝子発現が抑制される。標的遺伝子の遺伝子発現抑制は、Ｃａｓタンパク質単独でも生じるし、Ｃａｓタンパク質と転写抑制因との組み合わせでも生じる。
【００３０】
ガイドＲＮＡは、結合させたい標的遺伝子の一部の配列に相補的な配列を有するように設計することができ、それ故、標的遺伝子に特異的に結合することができる。ＲＮＡの設計および合成は、当該分野で既知の任意の方法を用いて行うことができる。
【００３１】
ガイドＲＮＡの構造および長さは、組み合わせて使用されるＣａｓタンパク質の種類等に応じて変わり得る。例えば、化膿レンサ球菌に由来するＣａｓ９と組み合わせて使用される場合、ガイドＲＮＡは、５’側に位置する標的配列に依存的な配列と、３’側に位置する標的配列に依存しない配列とを含む構造を取り得る。ガイドＲＮＡの長さは、標的遺伝子に特異的に結合できるものであれば特に限定されないが、例えば、上記化膿レンサ球菌に由来するＣａｓ９と組み合わせて使用される場合には、一般に、５’側に位置する標的配列に依存的な配列は、１７〜２４塩基程度であり、ガイドＲＮＡ全体としては、１００塩基程度である。
【００３２】
ガイドＲＮＡは、１種類であってもよいし、標的遺伝子の異なる部分に結合する複数種類を組み合わせてもよい。複数種類のガイドＲＮＡを用いる場合、１種類のガイドＲＮＡを用いる場合と比較して、標的遺伝子により多くの転写抑制因子を集積させることができることから、ガイドＲＮＡは複数種類であることがより好ましい。複数種類のガイドＲＮＡを用いることにより、１種類のガイドＲＮＡを用いる場合と比較して、より高い遺伝子発現の抑制効果が見られ、その結果、より高い治療効果が期待できる。
【００３３】
本発明の一実施形態における標的遺伝子は、細胞の増殖に関与する遺伝子であれば、特に限定されない。標的遺伝子としては、例えば、がん遺伝子等が挙げられる。がん遺伝子としては、例えば、ＳＯＸ２、ΔＮｐ６３、ＰＩＫ３ＣＡ等が挙げられる。
【００３４】
好ましい標的遺伝子の種類は、対象となる疾患に応じて変化し得る。例えば、対象となる疾患が扁平上皮細胞がん、例えば、肺扁平上皮細胞がん、食道扁平上皮細胞がん、頭頸部扁平上皮細胞がん等の場合は、染色体の３ｑアンプリコンに含まれる遺伝子（例えば、ＳＯＸ２、ΔＮｐ６３、ＰＩＫ３ＣＡ等のがん遺伝子）が当該疾患の発症、進行等に関与していることが知られているため、これらの遺伝子が標的遺伝子として好ましい。
【００３５】
標的遺伝子は、１種類であっても複数種類であってもよい。標的遺伝子の種類または数は、疾患の種類、進行度等に応じて、適宜設定され得る。
【００３６】
本発明の一実施形態において、ガイドＲＮＡが結合する標的遺伝子は特に限定されない。ガイドＲＮＡが結合する標的遺伝子は、標的とする遺伝子のみならず、当該遺伝子の発現を制御する配列（例えば、プロモーター配列、エンハンサー配列）も含む。
【００３７】
本発明の医薬組成物に含まれるポリヌクレオチドは、特に限定されないが、例えば、以下の態様であり得る。
【００３８】
（ｉ）本発明の一実施形態において、本発明の医薬組成物に含まれるポリヌクレオチドは、増殖性疾患に関与する一つの標的遺伝子に結合する一つのガイドＲＮＡの鋳型となる塩基配列からなるポリヌクレオチドである。すなわち、本実施形態では、一つの標的遺伝子に、一つのガイドＲＮＡが結合する。
【００３９】
（ｉｉ）本発明の一実施形態において、本発明の医薬組成物に含まれるポリヌクレオチドは、増殖性疾患に関与する複数の標的遺伝子に結合する各々一つのガイドＲＮＡの鋳型となる塩基配列からなるポリヌクレオチドである。すなわち、本実施形態では、複数の標的遺伝子に、各々一つのガイドＲＮＡが結合する。
【００４０】
（ｉｉｉ）本発明の一実施形態において、本発明の医薬組成物に含まれるポリヌクレオチドは、増殖性疾患に関与する一つの標的遺伝子に結合する複数のガイドＲＮＡの鋳型となる塩基配列からなるポリヌクレオチドである。すなわち、本実施形態では、一つの標的遺伝子に、複数のガイドＲＮＡが結合する。
【００４１】
（ｉＶ）本発明の一実施形態において、本発明の医薬組成物に含まれるポリヌクレオチドは、増殖性疾患に関与する複数の標的遺伝子に結合する各々複数のガイドＲＮＡの鋳型となる塩基配列からなるポリヌクレオチドである。すなわち、本実施形態では、複数の標的遺伝子に、各々複数のガイドＲＮＡが結合する。
【００４２】
本発明の一実施形態において、「標的遺伝子」および「ガイドＲＮＡ」のいずれか、またはその両方が複数である態様（すなわち、上記（ｉｉ）〜（ｉＶ））が好ましい。
【００４３】
〔Ｃａｓタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド〕
本発明の医薬組成物は、Ｃａｓタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む。
【００４４】
本発明の一実施形態におけるＣａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡと結合して複合体を形成する能力を有し、その結果、ガイドＲＮＡの機能により標的遺伝子に集積する。
【００４５】
Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼ不活性型のＣａｓタンパク質であっても、ヌクレアーゼ活性型のＣａｓタンパク質であってもよい。臨床応用の観点から、ゲノムの切断を回避しつつ、標的遺伝子の発現を抑制することが可能なヌクレアーゼ不活性型のＣａｓタンパク質が好ましく用いられる。ヌクレアーゼ不活性型のＣａｓタンパク質とは、ガイドＲＮＡとの結合能は維持しつつ、かつ、ヌクレアーゼ活性を不活性化してＤＮＡ切断が起こらないように改変させたＣａｓタンパク質である。
【００４６】
Ｃａｓタンパク質としては、例えば、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ９等が挙げられる。また、ヌクレアーゼ不活性型のＣａｓタンパク質としては、例えば、上記Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼ不活性型（すなわち、ヌクレアーゼ不活性型のＣａｓ１２ａ、ヌクレアーゼ不活性型のＣａｓ９（以下、適宜「ｄＣａｓ９」と称する。））等が挙げられる。Ｃａｓタンパク質がヌクレアーゼ活性型のＣａｓタンパク質である場合、ガイドＲＮＡの長さを適宜調節することにより、ヌクレアーゼ不活性型のＣａｓタンパク質と同様の機能を有するＣａｓタンパク質とすることができる。
【００４７】
本発明の一実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ｄＣａｓ９であることが好ましい。
【００４８】
本発明の一実施形態において、上記ｄＣａｓタンパク質は、後述する転写抑制因子と融合している。これにより、転写抑制因子が標的遺伝子へ集積する確率が高まり、その結果、効率的に標的遺伝子の発現を抑制することができる。なお、転写抑制因子を用いることなくＣａｓタンパク質単独で標的遺伝子の遺伝子発現抑制が生じることは、上述した通りである。
【００４９】
本発明の一実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、好ましくは、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかで示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされるｄＣａｓ９である：
（ａ）配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号１で示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、かつ、該ポリヌクレオチドから発現したタンパク質が、上記（Ａ）のガイドＲＮＡ、または、上記（Ａ）のガイドＲＮＡおよび上記（Ｃ）の転写抑制因子と協同して標的遺伝子の発現を抑制する活性を有する、ポリヌクレオチド、および
（ｃ）配列番号１で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつ、該ポリヌクレオチドから発現したタンパク質が、上記（Ａ）のガイドＲＮＡ、または、上記（Ａ）のガイドＲＮＡおよび上記（Ｃ）の転写抑制因子と協同して標的遺伝子の発現を抑制する活性を有する、ポリヌクレオチド。
【００５０】
（ａ）は、
１．野生型のＣａｓ９をコードする塩基配列を人工的に改変することにより、ガイドＲＮＡとの結合能は維持し、かつ、ヌクレアーゼ活性を不活性化してＤＮＡ切断が起こらないようにしたポリヌクレオチド（配列番号１）である。
【００５１】
（ｂ）は、
２．（ａ）と一定以上の配列同一性を有する。
３．（ａ）がコードするタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする。
の両条件を満たしているポリヌクレオチドである。
以下、２．および３．のそれぞれを説明する。
【００５２】
（２．について）
塩基配列の配列同一性は、塩基配列全体（またはｄＣａｓ９の機能に必要な部分をコードしている領域）において、少なくともは９０％以上、より好ましくは９５％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）でありうる。
【００５３】
塩基配列の同一性は、ＢＬＡＳＴＮ等のプログラムを利用して、決定することができる（［Altschul SF (1990) "Basic local alignment search tool", Journal of Molecular Biology, Vol.215 (Issue 3), pp.403-410］を参照）。ＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合のパラメータの一例としては、score=100、wordlength=12の設定が挙げられる。ＢＬＡＳＴＮによる解析を行うための具体的な手法は、当業者に知られている。比較対象の塩基配列を最適な状態にアラインメントするために、付加または欠失（ギャップ等）を許容してもよい。
【００５４】
（３．について）
「（ａ）がコードするタンパク質と同等の機能を有する」か否かは、（ｂ）の配列番号１で示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドから発現したタンパク質（ｄＣａｓ９）が、（Ａ）のガイドＲＮＡ、または、（Ａ）のガイドＲＮＡおよび（Ｃ）の転写抑制因子と協同して標的遺伝子の発現を抑制する活性を有するか否かを試験することにより判定できる。そのような試験は、当分野における通常の方法を用いて行うことができる。
【００５５】
ここで、上述の標的遺伝子の発現を抑制する活性とは、上述のポリヌクレオチドを導入した細胞における標的遺伝子の発現量が、上述のポリヌクレオチドを導入していない細胞における標的遺伝子の発現量よりも、少ないことを意図する。
【００５６】
標的遺伝子の発現量は、ｍＲＮＡの発現量に基づき評価することもできるし、タンパク質の発現量に基づき評価することもできる。ｍＲＮＡの発現量を測定する方法としては、特に限定されないが、例えば、レポーターアッセイ（例えば、ルシフェラーゼアッセイ）、ｑＰＣＲが挙げられる。また、タンパク質の発現量を測定する方法も特に限定されることなく、例えば、イムノブロット、免疫染色、免疫沈降等が挙げられる。
【００５７】
（ｃ）は、
４．（ａ）と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズする。
５．（ａ）がコードするタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする。
の両条件を満たすポリヌクレオチドである。以下、４．について説明する。５．に関する説明は、上記の（３．について）と同様であるため、省略する。
【００５８】
（４．について）
本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、２本のポリヌクレオチド鎖が、塩基配列に特異的な２本鎖のポリヌクレオチドを形成するが、非特異的な２本鎖のポリヌクレオチドは形成しない条件をいう。「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」とは、換言すれば、配列同一性が高い核酸同士（例えば完全にマッチしたハイブリッド）の融解温度（Ｔｍ値）から１５℃低い温度、好ましくは１０℃低い温度、より好ましくは５℃低い温度までの温度範囲において、ハイブリダイズできる条件ともいえる。
【００５９】
ストリンジェントな条件の一例を示すと、以下の通りである。まず、０．２５Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４、７％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１×デンハルト溶液からなる緩衝液（ｐＨ７．２）中、６０〜６８℃（好ましくは６５℃、より好ましくは６８℃）にて、１６〜２４時間、２種類のポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる。その後、２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１％  ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡからなる緩衝液（ｐＨ７．２）中、６０〜６８℃（好ましくは６５℃、より好ましくは６８℃）にて、１５分間の洗浄を２回行う。
【００６０】
他の例としては、以下の方法が挙げられる。まず、２５％ホルムアミド（より厳しい条件では５０％ホルムアミド）、４×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．０）、１０×デンハルト溶液、２０μｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液中、４２℃にて、一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、４２℃で一晩保温することにより、２種類のポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを行う。次に、下記の条件のいずれかで洗浄を行う。
【００６１】
（通常の条件）１×ＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳを洗浄液として、３７℃程度で洗浄する。
【００６２】
（厳しい条件）０．５×ＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳ洗浄液として、４２℃程度で洗浄する。
【００６３】
（さらに厳しい条件）０．２×ＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳを洗浄液として、６５℃程度で洗浄する。
【００６４】
このようにハイブリダイゼーションの洗浄の条件が厳しくなるほど、特異性の高いハイブリダイズとなる。なお、上記ＳＳＣ、ＳＤＳおよび温度の条件の組み合わせは、単なる例示に過ぎない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上述の要素、または他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間等）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することができる。これは、例えば、［Joseph Sambrook & David W. Russell, "Molecular cloning: a laboratory manual 3rd Ed.", New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001］等に記載されている。
【００６５】
〔転写抑制因子をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド〕
本発明の医薬組成物は、転写抑制因子をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む。
【００６６】
本発明の一実施形態における転写抑制因子は、ガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質の機能により標的遺伝子に集積し、当該標的遺伝子の発現抑制を実行する役割を果たす。
【００６７】
転写抑制因子は、標的遺伝子の発現を抑制できるものであれば、特に限定されない。
転写抑制因子としては、例えば、ＫＯＸ、ＫＲＡＢ等が挙げられる。
【００６８】
転写抑制因子のサイズは、標的遺伝子の発現を抑制できるものであれば特に限定されないが、分子量が１〜６０ｋＤａであることが好ましく、５〜１０ｋＤａであることがより好ましい。
【００６９】
また、本発明の一実施形態における転写抑制因子は、ＤＮＡのメチル化を介して標的遺伝子の発現を抑制する、ＤＮＡメチル化因子も含む。ＤＮＡメチル化因子としては、例えば、Ｄｎｍｔ３ａ、Ｄｎｍｔ３ｂ、Ｄｎｍｔ３Ｌ等が挙げられる。本発明の一実施形態における転写抑制因子がＤＮＡメチル化因子である場合、そのサイズは、標的遺伝子の発現を抑制できるものであれば特に限定されないが、分子量が１０〜１００ｋＤａであることが好ましく、２０〜６５ｋＤａであることがより好ましい。
【００７０】
本発明の一実施形態において、転写抑制因子は、Ｃａｓタンパク質と結合する領域と、遺伝子の転写活性を抑制する領域を有していればよい。したがって、本発明の一実施形態における転写抑制因子は、上記で例示した転写抑制因子の全長に限られることなく、その断片であったり、その断片を連結したもの等であってもよい。そのような断片を編集する技術としては、当該分野で公知の任意の技術が使用できる。
【００７１】
〔１−２  ポリヌクレオチドを含む発現ベクター〕
本発明の医薬組成物は、上述したポリヌクレオチドを含むものであってもよいし、該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含むものであってもよい。すなわち、本発明の一実施形態に係る医薬組成物は、上述したポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。
【００７２】
本発明の医薬組成物において、発現ベクターに含まれるポリヌクレオチドは、〔１−１〕で示したものと同様である。
【００７３】
本発明の医薬組成物に含まれる発現ベクターは、臨床で使用可能なベクターでれば、特に限定されない。本発明の一実施形態において、発現ベクターは、例えば、遺伝子治療等の分野で使用されている発現ベクターであり得る。
【００７４】
本発明の医薬組成物に含まれる発現ベクターとしては、例えば、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、センダイウイルスベクター等）、プラスミドベクター、染色体ベクター、エピソームベクター等が挙げられる。標的細胞への高い感染効率の観点から、好ましくは、ウイルスベクターが使用される。また、ウイルスベクターのなかでも、アデノウイルスベクターは、標的細胞への高い感染効率および高い安全性を有することから、特に好ましく使用される。
【００７５】
本発明の医薬組成物に含まれる発現ベクターは、転写開始および転写終結のための部位を含んでおり、かつ、転写領域中にリボソーム結合部位を含んでいることが好ましい。ベクター中の成熟転写物のコード部分は、翻訳されるべきポリペプチドの始めに転写開始コドンＡＵＧを含み、そして終わりに適切に位置される終止コドンを含むことになる。
【００７６】
ＲＮＡまたはタンパク質を発現させるために、本発明の医薬組成物に含まれる発現ベクターは、プロモーター配列を含んでいてもよい。上記プロモーター配列は、導入対象細胞の種類に応じて適宜選択すればよい。導入対象細胞が哺乳動物細胞である場合、プロモーター配列としては、例えば、ＣＡＧプロモーター、Ｕ６プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ１プロモーター等が挙げられる。
【００７７】
本発明の医薬組成物に含まれる発現ベクターは、ＤＮＡからの転写を亢進させるための配列を含んでいてもよい。本発明の一実施形態において、上記ＤＮＡからの転写を亢進させるための配列は、エンハンサー配列である。上記エンハンサーとしては、例えば、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、アデノウイルスエンハンサーが挙げられる。
【００７８】
本発明の医薬組成物に含まれる発現ベクターは、転写されたＲＮＡを安定化させるための配列を含んでいてよい。本発明の一実施形態において、上記転写されたＲＮＡを安定化させるための配列は、ポリＡ付加配列（ポリアデニル化配列、ｐｏｌｙＡ）である。ポリＡ付加配列の例としては、成長ホルモン遺伝子由来のポリＡ付加配列、ウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリＡ付加配列、ヒト成長ホルモン遺伝子由来ポリＡ付加配列、ＳＶ４０ウイルス由来ポリＡ付加配列、ヒトまたはウサギのβグロビン遺伝子由来のポリＡ付加配列が挙げられる。
【００７９】
本発明の医薬組成物に含まれる発現ベクターは、一種類であっても複数種類であってもよい。（Ａ）〜（Ｂ）のポリヌクレオチドについて、発現ベクターが一種類の場合、（Ａ）〜（Ｂ）のポリヌクレオチドは、同一の発現ベクター上に存在する。発現ベクターが二種類の場合、例えば、（Ａ）のポリヌクレオチドと、（Ｂ）のポリヌクレオチドとは、別のベクター上に存在する。また、（Ａ）〜（Ｃ）のポリヌクレオチドについて、発現ベクターが一種類の場合、（Ａ）〜（Ｃ）のポリヌクレオチドは、同一の発現ベクター上に存在する。発現ベクターが二種類の場合、例えば、（ｉ）（Ａ）のポリヌクレオチドおよび（Ｂ）のポリヌクレオチドと、（Ｃ）のポリヌクレオチド、（ｉｉ）（Ａ）のポリヌクレオチドおよび（Ｃ）のポリヌクレオチドと、（Ｂ）のポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）（Ｂ）のポリヌクレオチドおよび（Ｃ）のポリヌクレオチドと、（Ａ）のポリヌクレオチド等の組み合わせで、発現ベクター上に存在する。発現ベクターが三種類の場合、（Ａ）〜（Ｃ）のポリヌクレオチドは、それぞれ別の発現ベクター上に存在し得る。
【００８０】
本発明の一実施形態において、発現ベクターは、一種類であることが好ましい。すなわち、（Ａ）〜（Ｂ）のポリヌクレオチドまたは（Ａ）〜（Ｃ）のポリヌクレオチドが同一の発現ベクター上に存在すると、当該発現ベクターが導入された細胞内で、（Ａ）〜（Ｂ）のポリヌクレオチドまたは（Ａ）〜（Ｃ）のポリヌクレオチドの同時発現が可能となるため、結果として、標的遺伝子の発現を高確率で抑制することが可能になる。
【００８１】
また、本発明の一実施形態において、発現ベクターは、（Ａ）のポリヌクレオチド（すなわち、標的遺伝子に結合するガイドＲＮＡの鋳型となる塩基配列からなるポリヌクレオチド）を複数含むことが好ましい。複数の（Ａ）のポリヌクレオチドを含むことにより、標的遺伝子により多くの転写抑制因子を集積させることができる。
【００８２】
本発明の一実施形態における発現ベクターは、プロモーター配列、（Ｂ）のポリヌクレオチド、（Ｃ）のポリヌクレオチド、プロモーター配列、および（Ａ）のポリヌクレオチドが、この順で連結されたベクターであり得る。本実施形態では、例えば、ＣＡＧプロモーター、ｄＣａｓ９、ＫＲＡＢ、Ｕ６プロモーター、およびＳＯＸ２Ａに結合するガイドＲＮＡが、この順で連結されたベクターが想定され得る。また、本実施形態では、例えば、ＣＡＧプロモーター、ｄＣａｓ９、ＫＲＡＢ、Ｕ６プロモーター、およびΔＮｐ６３Ａに結合するガイドＲＮＡが、この順で連結されたベクターが想定され得る。
【００８３】
また、本発明の一実施形態における発現ベクターは、プロモーター配列、（Ｂ）のポリヌクレオチド、（Ｃ）のポリヌクレオチド、プロモーター配列、（Ａ）のポリヌクレオチド、プロモーター配列、および（Ａ）のポリヌクレオチドが、この順で連結されたベクターであり得る。本実施形態では、例えば、ＣＡＧプロモーター、ｄＣａｓ９、ＫＲＡＢ、Ｕ６プロモーター、ＳＯＸ２Ａに結合するガイドＲＮＡ、Ｕ６プロモーター、およびＳＯＸ２Ｂに結合するガイドＲＮＡが、この順で連結されたベクターが想定され得る。また、本実施形態では、例えば、ＣＡＧプロモーター、ｄＣａｓ９、ＫＲＡＢ、Ｕ６プロモーター、ΔＮｐ６３Ａに結合するガイドＲＮＡ、Ｕ６プロモーター、およびΔＮｐ６３Ｂに結合するガイドＲＮＡが、この順で連結されたベクターが想定され得る。さらに、本実施形態では、例えば、ＣＡＧプロモーター、ｄＣａｓ９、ＫＲＡＢ、Ｕ６プロモーター、ＳＯＸ２Ａに結合するガイドＲＮＡ、Ｕ６プロモーター、およびＰＩＫ３ＣＡＡに結合するガイドＲＮＡが、この順で連結されたベクターが想定され得る。
【００８４】
さらに、本発明の一実施形態における発現ベクターは、プロモーター配列、（Ｂ）のポリヌクレオチド、（Ｃ）のポリヌクレオチド、プロモーター配列、（Ａ）のポリヌクレオチド、プロモーター配列、（Ａ）のポリヌクレオチド、プロモーター配列、および（Ａ）のポリヌクレオチドが、この順で連結されたベクターであり得る。本実施形態では、例えば、ＣＡＧプロモーター、ｄＣａｓ９、ＫＲＡＢ、Ｕ６プロモーター、ＳＯＸ２Ａに結合するガイドＲＮＡ、Ｕ６プロモーター、ＳＯＸ２Ｂに結合するガイドＲＮＡ、Ｕ６プロモーター、およびＰＩＫ３ＣＡＡに結合するガイドＲＮＡが、この順で連結されたベクターが想定され得る。また、本実施形態では、例えば、ＣＡＧプロモーター、ｄＣａｓ９、ＫＲＡＢ、Ｕ６プロモーター、ＳＯＸ２Ａに結合するガイドＲＮＡ、Ｕ６プロモーター、ＰＩＫ３ＣＡＡに結合するガイドＲＮＡ、Ｕ６プロモーター、およびＰＩＫ３ＣＡＡ／Ｂに結合するガイドＲＮＡが、この順で連結されたベクターが想定され得る。
【００８５】
また、本発明の一実施形態における発現ベクターは、プロモーター配列、（Ｂ）のポリヌクレオチド、（Ｃ）のポリヌクレオチド、プロモーター配列、（Ａ）のポリヌクレオチド、プロモーター配列、（Ａ）のポリヌクレオチド、プロモーター配列、（Ａ）のポリヌクレオチド、プロモーター配列、および（Ａ）のポリヌクレオチドが、この順で連結されたベクターであり得る。本実施形態では、例えば、ＣＡＧプロモーター、ｄＣａｓ９、ＫＲＡＢ、Ｕ６プロモーター、ＳＯＸ２Ａに結合するガイドＲＮＡ、Ｕ６プロモーター、ＳＯＸ２Ｂに結合するガイドＲＮＡ、Ｕ６プロモーター、ΔＮｐ６３Ａに結合するガイドＲＮＡ、Ｕ６プロモーター、およびΔＮｐ６３Ｂに結合するガイドＲＮＡが、この順で連結されたベクターが想定され得る。また、本実施形態では、例えば、ＣＡＧプロモーター、ｄＣａｓ９、ＫＲＡＢ、Ｕ６プロモーター、ＳＯＸ２Ａに結合するガイドＲＮＡ、Ｕ６プロモーター、ＳＯＸ２Ｂに結合するガイドＲＮＡ、Ｕ６プロモーター、ＰＩＫ３ＣＡＡに結合するガイドＲＮＡ、Ｕ６プロモーター、およびＰＩＫ３ＣＡＡ／Ｂに結合するガイドＲＮＡが、この順で連結されたベクターが想定され得る。
【００８６】
その他、本発明の一実施形態における発現ベクターは、プロモーター配列、（Ａ）のポリヌクレオチド、プロモーター配列、（Ａ）のポリヌクレオチド、プロモーター配列、（Ｂ）のポリヌクレオチド、および（Ｃ）のポリヌクレオチドが、この順で連結されたベクターであり得る。本実施形態では、例えば、Ｕ６プロモーター、ＳＯＸ２Ａに結合するガイドＲＮＡ、Ｕ６プロモーター、ＳＯＸ２Ｂに結合するガイドＲＮＡ、ＣＡＧプロモーター、ｄＣａｓ９、およびＫＲＡＢが、この順で連結されたベクターが想定され得る。また、本実施形態では、例えば、Ｕ６プロモーター、ΔＮｐ６３Ａに結合するガイドＲＮＡ、Ｕ６プロモーター、ΔＮｐ６３Ｂに結合するガイドＲＮＡ、ＣＡＧプロモーター、ｄＣａｓ９、およびＫＲＡＢが、この順で連結されたベクターが想定され得る。また、本実施形態では、例えば、Ｕ６プロモーター、ＳＯＸ２Ａに結合するガイドＲＮＡ、Ｕ６プロモーター、ＰＩＫ３ＣＡＡに結合するガイドＲＮＡ、ＣＡＧプロモーター、ｄＣａｓ９、およびＫＲＡＢが、この順で連結されたベクターが想定され得る。
【００８７】
また、本発明の一実施形態における発現ベクターは、プロモーター配列、（Ａ）のポリヌクレオチド、プロモーター配列、（Ａ）のポリヌクレオチド、プロモーター配列、（Ａ）のポリヌクレオチド、プロモーター配列、（Ａ）のポリヌクレオチド、プロモーター配列、（Ｂ）のポリヌクレオチド、および（Ｃ）のポリヌクレオチドが、この順で連結されたベクターであり得る。本実施形態では、例えば、Ｕ６プロモーター、ＳＯＸ２Ａに結合するガイドＲＮＡ、Ｕ６プロモーター、ＳＯＸ２Ｂに結合するガイドＲＮＡ、Ｕ６プロモーター、ΔＮｐ６３Ａに結合するガイドＲＮＡ、Ｕ６プロモーター、ΔＮｐ６３Ｂに結合するガイドＲＮＡ、ＣＡＧプロモーター、ｄＣａｓ９、およびＫＲＡＢが、この順で連結されたベクターが想定され得る。
【００８８】
なお、上記した発現ベクターの態様は、あくまでも例示であり、本発明の効果を奏する限りにおいて、当業者により、適宜、変更され得る。
【００８９】
本発明の医薬組成物に含まれる発現ベクターは、当該技術分野における任意の技術を用いて構築することができる。
【００９０】
〔１−３  ＲＮＡおよびタンパク質〕
本発明の医薬組成物は、（Ａ’）増殖性疾患に関与する少なくとも一つの標的遺伝子に結合する少なくとも一つのガイドＲＮＡ、および（Ｂ’）Ｃａｓタンパク質、を含む。また、本発明の医薬組成物は、（Ａ’）増殖性疾患に関与する少なくとも一つの標的遺伝子に結合する少なくとも一つのガイドＲＮＡ、（Ｂ’）Ｃａｓタンパク質、および（Ｃ’）転写抑制因子、を含む。
【００９１】
本発明の医薬組成物は、上記〔１−１〕に記載のポリヌクレオチドによりコードされるＲＮＡおよびタンパク質を含むものであってもよい。
【００９２】
〔１−４  増殖性疾患を処置するための医薬組成物〕
本発明の医薬組成物は、増殖性疾患の処置に使用される。
【００９３】
本明細書において「増殖性疾患」は、細胞の増殖に起因する任意の疾患を意味する。増殖性疾患としては、例えば、各種のがん等が挙げられる。
【００９４】
本明細書において「処置」は、処置を必要とする対象に対して処置効果をもたらす行為を施すことを意味する。処置効果は、予防効果および治療効果を包含し、例えば、以下で示す効果であり得る。
【００９５】
（１）薬剤を投与しなかった場合と比較して、疾患に係る１つ以上の症状の発症を防止する、またはリスクを低減する。
【００９６】
（２）薬剤を投与しなかった場合と比較して、疾患に係る１つ以上の症状の再発を防止する、またはリスクを低減する。
【００９７】
（３）薬剤を投与しなかった場合と比較して、疾患に係る１つ以上の症状の兆候が生じることを防止する、またはリスクを低減する。
【００９８】
（４）薬剤を投与しなかった場合と比較して、疾患に係る１つ以上の症状の重症度を低減する。
【００９９】
（５）薬剤を投与しなかった場合と比較して、疾患に係る１つ以上の症状の重症度の増加もしくは進行を防止する。
【０１００】
（６）薬剤を投与しなかった場合と比較して、疾患に係る１つ以上の症状の重症度の増加速度もしくは進行速度を低減する。
【０１０１】
したがって、本発明の医薬組成物は、予防用医薬組成物（予防剤）および治療用医薬組成物（治療剤）の両方を包含する。
【０１０２】
本発明の医薬組成物は、有効成分として、本発明の医薬組成物におけるポリヌクレオチド等以外に、他の有効成分を含んでいてもよい。そのような他の有効成分としては、本発明の医薬組成物におけるポリヌクレオチド等と組み合わせることで、本発明の医薬組成物におけるポリヌクレオチド等を単独で用いる場合よりも有効な処置効果が望めるものが好ましい。本発明の医薬組成物に含まれる他の有効成分は、一種であってもよいし、複数種であってもよい。
【０１０３】
また、本発明の医薬組成物は、薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤、賦形剤等を含み得る。薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤、賦形剤等は、薬学分野で周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、１９８５）に記載されている。薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤、賦形剤の選択は、薬剤の投与経路および標準的薬学的慣行にしたがって、当業者により容易に選択され得る。また、本発明の医薬組成物は、結合剤、滑沢剤、懸濁剤、被覆剤、可溶化剤等を、さらに含んでいてもよい。
【０１０４】
本発明の医薬組成物は、処置に際して効果的な任意の投与経路により投与される。本発明の医薬組成物の投与経路は、処置対象である増殖性疾患の種類、発症部位、重篤度等に応じて、処置効果が見込まれる好適な経路が選択され得る。本発明の医薬組成物は、例えば、処置対象に対して、経口、筋肉内、静脈内、皮下、腹腔内または経皮的に投与され得る。投与形態としては、例えば、注射剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤等であってもよい。
【０１０５】
本発明の医薬組成物による処置の対象は、増殖性疾患を患っているか、もしくは患うリスクがある対象であって、処置を必要とする対象であれば特に限定されない。処置の対象としては、例えば、哺乳動物、例えば、ヒト、および、マウス、モルモット、ハムスター、ラット、ネズミ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、マーモセット、サル、チンパンジー等の非ヒト哺乳動物が挙げられる。
【０１０６】
本発明の医薬組成物の投与方法は、特に限定されることなく、当該分野で使用される任意の方法を用いて行うことができる。本発明の医薬組成物の処方は、疾患の重症度、有効成分、投与経路等に応じて、当業者により適宜設定され得る。
【０１０７】
〔２．増殖性疾患を処置するためのキット〕
本発明の一実施形態に係る増殖性疾患を処置するためのキット（以下、「本発明のキット」と称する。）は、（Ａ）増殖性疾患に関与する少なくとも一つの標的遺伝子に結合する少なくとも一つのガイドＲＮＡの鋳型となる塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および（Ｂ）Ｃａｓタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、を備える。また、本発明のキットは、（Ａ）増殖性疾患に関与する少なくとも一つの標的遺伝子に結合する少なくとも一つのガイドＲＮＡの鋳型となる塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、（Ｂ）Ｃａｓタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および（Ｃ）転写抑制因子をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、を備える。さらに、本発明のキットは、（Ａ’）増殖性疾患に関与する少なくとも一つの標的遺伝子に結合する少なくとも一つのガイドＲＮＡ、および（Ｂ’）Ｃａｓタンパク質、を備える。その他、本発明のキットは、（Ａ’）増殖性疾患に関与する少なくとも一つの標的遺伝子に結合する少なくとも一つのガイドＲＮＡ、（Ｂ’）Ｃａｓタンパク質、および（Ｃ’）転写抑制因子、を備える。
【０１０８】
本態様において、〔１．増殖性疾患を処置するための医薬組成物〕で説明した事項は、同じ説明を繰り返さない。
【０１０９】
本発明のキットは、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュ等）を備えた包装物が意図される。本発明のキットは、それに含まれる各材料が独立して存在している形態であってもよく、複数の材料が混在している形態（例えば、組成物の形態）であってもよい。キットは、各材料を使用するための指示書を備えていることが好ましい。
【０１１０】
〔３．その他〕
本発明の別の一実施形態において、本発明の医薬組成物におけるポリヌクレオチド等を、処置を必要とする対象に投与することを含む、増殖性疾患の処置方法を提供する。本発明の医薬組成物におけるポリヌクレオチド等を対象に投与することにより、当該対象の体内で標的遺伝子の発現が抑制され、その結果、増殖性疾患を処置することができる。
【０１１１】
本発明の一実施形態において、本発明の医薬組成物におけるポリヌクレオチド等の対象への投与は、遺伝子治療等の分野で用いられる任意の方法が使用できる。
【０１１２】
その他、処置の対象、増殖性疾患等の上記で説明を行ったものは、説明を省略する。
【０１１３】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【０１１４】
〔まとめ〕
本発明の一実施形態は、以下の構成を包含する。
＜１＞（Ａ）増殖性疾患に関与する少なくとも一つの標的遺伝子に結合する少なくとも一つのガイドＲＮＡの鋳型となる塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および
（Ｂ）Ｃａｓタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、を含む、増殖性疾患を処置するための医薬組成物。
＜２＞（Ｃ）転写抑制因子をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターをさらに含む、＜１＞に記載の医薬組成物。
＜３＞（Ａ’）増殖性疾患に関与する少なくとも一つの標的遺伝子に結合する少なくとも一つのガイドＲＮＡ、および
（Ｂ’）Ｃａｓタンパク質、を含む、増殖性疾患を処置するための医薬組成物。
＜４＞（Ｃ’）転写抑制因子をさらに含む、＜３＞に記載の医薬組成物。
＜５＞上記標的遺伝子ががん遺伝子である、＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載の医薬組成物。
＜６＞上記標的遺伝子が複数である、＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載の医薬組成物。
＜７＞上記標的遺伝子がＳＯＸ２およびΔＮｐ６３からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子である、＜１＞〜＜６＞のいずれかに記載の医薬組成物。
＜８＞上記Ｃａｓタンパク質が上記転写抑制因子と融合している、＜１＞〜＜７＞のいずれかに記載の医薬組成物。
＜９＞上記Ｃａｓタンパク質がｄＣａｓ９である、＜１＞〜＜８＞のいずれかに記載の医薬組成物。
＜１０＞上記ｄＣａｓ９が、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかで示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされる、＜９＞に記載の医薬組成物：
（ａ）配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号１で示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、かつ、該ポリヌクレオチドから発現したタンパク質が、上記（Ａ）のガイドＲＮＡ、または、上記（Ａ）のガイドＲＮＡおよび上記（Ｃ）の転写抑制因子と協同して標的遺伝子の発現を抑制する活性を有する、ポリヌクレオチド、および
（ｃ）配列番号１で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつ、該ポリヌクレオチドから発現したタンパク質が、上記（Ａ）のガイドＲＮＡ、または、上記（Ａ）のガイドＲＮＡおよび上記（Ｃ）の転写抑制因子と協同して標的遺伝子の発現を抑制する活性を有する、ポリヌクレオチド。
＜１１＞上記転写抑制因子がＫＲＡＢである、＜１＞〜＜１０＞のいずれかに記載の医薬組成物。
＜１２＞上記増殖性疾患ががんである、＜１＞〜＜１１＞のいずれかに記載の医薬組成物。
＜１３＞上記ガイドＲＮＡを複数含み、該各ガイドＲＮＡが上記標的遺伝子の異なる部分に結合する、＜１＞〜＜１２＞のいずれかに記載の医薬組成物。
＜１４＞上記（Ａ）〜（Ｂ）または（Ａ）〜（Ｃ）の各ポリヌクレオチドが、同一の発現ベクター上に配置されている、＜１＞、＜２＞および＜５＞〜＜１３＞のいずれかに記載の医薬組成物。
＜１５＞上記発現ベクターがプラスミドベクターまたはウイルスベクターである、＜１＞、＜２＞および＜５＞〜＜１４＞のいずれかに記載の医薬組成物。
＜１６＞（Ａ）増殖性疾患に関与する少なくとも一つの標的遺伝子に結合する少なくとも一つのガイドＲＮＡの鋳型となる塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、
（Ｂ）Ｃａｓタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリ
ヌクレオチドを含む発現ベクター、および
（Ｃ）転写抑制因子をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、を備える、増殖性疾患を処置するためのキット。
【実施例】
【０１１５】
以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。【０１１６】
（基本操作）
[細胞および培養条件]
ヒト肺ＳＣＣ細胞（Ｈ５２０およびＨ２２６）、ヒト肺腺がん細胞（Ｈ３５８、Ｈ４４１、Ｈ４６０およびＡ５４９）、ヒト食道ＳＣＣ細胞（ＴＥ４およびＴＥ８）、およびヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ１）は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｔｉｏｎ）から入手した。これらの細胞を、Ｈ２２６、Ｈ３５８、Ｈ４６０、ＴＥ４およびＴＥ８についてはＲＰＭＩ１６４０培地で、Ｈ５２０、Ｈ４４１、Ａ５４９およびＨＦＦ１については１０％熱失活ウシ胎児血清を加えた高グルコースダルベッコ改変イーグル培地で培養した。ヒト食道ＳＣＣ細胞ＫＹＳＥ７０は、ＪＣＲＢ細胞バンク（Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）から入手し、１０％熱失活ウシ胎児血清を加えたＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。肺扁平上皮がん細胞（ＥＢＣ１、ＥＢＣ２、ＳＱ５およびＬＫ２）は、木浦  勝行博士（岡山大学）からご厚意で提供された。これらの細胞を、１０％熱失活ウシ胎児血清を加えたＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。自然に不死化したケラチノサイトＨａＣａＴは、青山裕美博士（川崎医科大学）からご厚意で提供された。この細胞を、１０％熱失活ウシ胎児血清を加えた高グルコースダルベッコ改変イーグル培地で培養した。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入した。この細胞を、同社製のキットを用いて、Ｌｏｗ  Ｓｅｒｕｍ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔが添加された上皮細胞培養培地（Ｍｅｄｉｕｍ  ２００）で培養した。正常なヒト肺線維芽ＮＨＬＦ細胞は、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社から入手した。この細胞を、１０％熱失活ウシ胎児血清を加えた高グルコースダルベッコ改変イーグル培地で培養した。すべての細胞株は、５％ＣＯ２、３７℃で培養した。ヒト気管支内皮細胞（ＨＢＥＰＣ）の細胞ペレットおよびヒト肺微小血管内皮細胞（ＨＰＭＥＣ）は、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社から購入した。【０１１７】
また、肺扁平上皮がん細胞ＨＣＣ９５は、University of Texas SouthwesternのDr Adi Gazdarより、肺腺扁平上皮がん細胞Ｈ５９６は、ＡＴＣＣから入手した。これらの細胞を、ＰＰＭＩ１６４０培地で培養した。肺扁平上皮がん細胞および肺腺扁平上皮がん細胞の、それぞれの細胞株は、５％ＣＯ２、３７℃で培養した。【０１１８】
[コンストラクション]
＜プラスミドベクター＞
ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ΔＮｐ６３Ａ、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ΔＮｐ６３Ａ／Ｂ、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ／Ｂ、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ／Ｂ  ΔＮｐ６３Ａ／Ｂ、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＰＩＫ３ＣＡＡ、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＰＩＫ３ＣＡＡ／Ｂ、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ  ＰＩＫ３ＣＡＡ、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ／Ｂ  ＰＩＫ３ＣＡＡ、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ  ＰＩＫ３ＣＡＡ／Ｂ、およびｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ／Ｂ  ＰＩＫ３ＣＡＡ／Ｂは、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｋｉｔ（キット♯１０００００００５５、Ａｄｄｇｅｎｅ社製）およびＭｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＣＲＩＳＰＲ  ｄＣａｓ９／ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９  Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  Ｐａｃｋ（キット＃１０００００００６２、Ａｄｄｇｅｎｅ社製）を用いて、Sakuma T et al., Sci Rep., 4: 5400, 2014およびNakagawa Y et al., BMC Biotechnol., 15: 33, 2015に記載の方法にいくつかの改変を加えて作製した。【０１１９】
簡潔には、ＰＣＲ増幅およびＩｎ−ＦｕｓｉｏｎＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、上記Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  Ｐａｃｋに含まれるｐＸ３３０Ａ＿ｄＣａｓ９−１ｘ２、ｐＸ３３０Ａ  ｄＣａｓ９−１ｘ３、およびｐＸ３３０Ａ＿ｄＣａｓ９−１ｘ４にＫＲＡＢドメインを付加し、それぞれｐＸ３３０Ａ＿ｄＣａｓ９／ＫＲＡＢ−１ｘ２、ｐＸ３３０Ａ  ｄＣａｓ９／ＫＲＡＢ−１ｘ３、およびｐＸ３３０Ａ＿ｄＣａｓ９／ＫＲＡＢ−１ｘ４を作製した。【０１２０】
続いて、ΔＮｐ６３を標的とするｇＲＮＡの鋳型のためのオリゴヌクレオチド（ΔＮｐ６３＿Ａ：配列番号２と配列番号３、およびΔＮｐ６３＿Ｂ：配列番号４と配列番号５）をアニーリングし、それぞれｐＸ３３０Ａ＿ｄＣａｓ９／ＫＲＡＢ−１ｘ２およびｐＸ３３０Ｓ−２に挿入することで、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ΔＮｐ６３ＡおよびｐＣＲＩＳＰＲｉ  ΔＮｐ６３Ｂを作製した。これらを、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅクローニング法を用いて、Sakuma T et al., Sci Rep., 4: 5400, 2014に記載のプロトコールに従って連結し、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ΔＮｐ６３Ａ／Ｂを作製した（図３（ａ））。【０１２１】
ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２ＡおよびｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ／Ｂについては、ＳＯＸ２を標的とするｇＲＮＡの鋳型のためのオリゴヌクレオチド（ＳＯＸ２＿Ａ：配列番号６と配列番号７、およびＳＯＸ２＿Ｂ：配列番号８と配列番号９）をアニーリングし、それぞれｐＸ３３０Ａ＿ｄＣａｓ９／ＫＲＡＢ−１ｘ２およびｐＸ３３０Ｓ−２に挿入することで、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２ＡおよびｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ｂを作製した。これらを、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅクローニング法を用いて、Sakuma T et al., Sci Rep., 4: 5400, 2014に記載のプロトコールに従って連結し、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ／Ｂを作製した（図３（ａ））。【０１２２】
ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ／Ｂ  ΔＮｐ６３Ａ／Ｂについては、ＳＯＸ２＿Ａのオリゴヌクレオチド（配列番号６と配列番号７）、ＳＯＸ２＿Ｂのオリゴヌクレオチド（配列番号８と配列番号９）、ΔＮｐ６３＿Ａのオリゴヌクレオチド（配列番号２と配列番号３）、およびΔＮｐ６３＿Ｂのオリゴヌクレオチド（配列番号４と配列番号５）をアニーリングし、それぞれｐＸ３３０Ａ＿ｄＣａｓ９／ＫＲＡＢ−１ｘ４、ｐＸ３３０Ｓ−２、ｐＸ３３０Ｓ−３、およびｐＸ３３０Ｓ−４に挿入することで、４種のプラスミドを得た。その後、これらを、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅクローニング法を用いて、Sakuma T et al., Sci Rep., 4: 5400, 2014に記載のプロトコールに従って連結し、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ／Ｂ  ΔＮｐ６３Ａ／Ｂを作製した（図３（ａ））。【０１２３】
ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＰＩＫ３ＣＡＡおよびｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＰＩＫ３ＣＡＡ／Ｂについては、ＰＩＫ３ＣＡを標的とするｇＲＮＡの鋳型のためのオリゴヌクレオチド（ＰＩＫ３ＣＡ＿Ａ：配列番号１７と配列番号１８、およびＰＩＫ３ＣＡ＿Ｂ：配列番号１９と配列番号２０）をアニーリングし、それぞれｐＸ３３０Ａ＿ｄＣａｓ９／ＫＲＡＢ−１ｘ２およびｐＸ３３０Ｓ−２に挿入することで、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＰＩＫ３ＣＡＡおよびｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＰＩＫ３ＣＡＢを作製した。これらを、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅクローニング法を用いて、Sakuma T et al., Sci Rep., 4: 5400, 2014に記載のプロトコールに従って連結し、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＰＩＫ３ＣＡＡ／Ｂを作製した。【０１２４】
ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ  ＰＩＫ３ＣＡＡについては、ＳＯＸ２＿Ａのオリゴヌクレオチド（配列番号６と配列番号７）およびＰＩＫ３ＣＡ＿Ａのオリゴヌクレオチド（配列番号１７と配列番号１８）をアニーリングし、それぞれｐＸ３３０Ａ＿ｄＣａｓ９／ＫＲＡＢ−１ｘ２およびｐＸ３３０Ｓ−２に挿入することで、２種のプラスミドを得た。その後、これらを、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅクローニング法を用いて、Sakuma T et al., Sci Rep., 4: 5400, 2014に記載のプロトコールに従って連結し、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ  ＰＩＫ３ＣＡＡを作製した（図１１（ｃ））。【０１２５】
ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ／Ｂ  ＰＩＫ３ＣＡＡについては、ＳＯＸ２＿Ａのオリゴヌクレオチド（配列番号６と配列番号７）、ＳＯＸ２＿Ｂのオリゴヌクレオチド（配列番号８と配列番号９）、およびＰＩＫ３ＣＡ＿Ａのオリゴヌクレオチド（配列番号１７と配列番号１８）をアニーリングし、それぞれｐＸ３３０Ａ＿ｄＣａｓ９／ＫＲＡＢ−１ｘ３、ｐＸ３３０Ｓ−２、およびｐＸ３３０Ｓ−３に挿入することで、３種のプラスミドを得た。その後、これらを、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅクローニング法を用いて、Sakuma T et al., Sci Rep., 4: 5400, 2014に記載のプロトコールに従って連結し、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ／Ｂ  ＰＩＫ３ＣＡＡを作製した（図１１（ｃ））。【０１２６】
ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ  ＰＩＫ３ＣＡＡ／Ｂについては、ＳＯＸ２＿Ａのオリゴヌクレオチド（配列番号６と配列番号７）、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ａのオリゴヌクレオチド（配列番号１７と配列番号１８）、およびＰＩＫ３ＣＡ＿Ｂのオリゴヌクレオチド（配列番号１９と配列番号２０）をアニーリングし、それぞれｐＸ３３０Ａ＿ｄＣａｓ９／ＫＲＡＢ−１ｘ３、ｐＸ３３０Ｓ−２、およびｐＸ３３０Ｓ−３に挿入することで、３種のプラスミドを得た。その後、これらを、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅクローニング法を用いて、Sakuma T et al., Sci Rep., 4: 5400, 2014に記載のプロトコールに従って連結し、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ  ＰＩＫ３ＣＡＡ／Ｂを作製した（図１１（ｃ））。【０１２７】
ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ／Ｂ  ＰＩＫ３ＣＡＡ／Ｂについては、ＳＯＸ２＿Ａのオリゴヌクレオチド（配列番号６と配列番号７）、ＳＯＸ２＿Ｂのオリゴヌクレオチド（配列番号８と配列番号９）、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ａのオリゴヌクレオチド（配列番号１７と配列番号１８）、およびＰＩＫ３ＣＡ＿Ｂのオリゴヌクレオチド（配列番号１９と配列番号２０）をアニーリングし、それぞれｐＸ３３０Ａ＿ｄＣａｓ９／ＫＲＡＢ−１ｘ４、ｐＸ３３０Ｓ−２、ｐＸ３３０Ｓ−３、およびｐＸ３３０Ｓ−４に挿入することで、４種のプラスミドを得た。その後、これらを、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅクローニング法を用いて、Sakuma T et al., Sci Rep., 4: 5400, 2014に記載のプロトコールに従って連結し、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ／Ｂ  ＰＩＫ３ＣＡＡ／Ｂを作製した（図１１（ｃ））。【０１２８】
上記で使用されたオリゴヌクレオチドを、表１に示す。【０１２９】
【表１−１】
2019203317.tif 000003
【表１−２】
2019203317.tif 000004
＜アデノウイルスベクター＞
Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ΔＮｐ６３（Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ΔＮｐ６３Ａ／Ｂ）は、以下の通り作製した。すなわち、表１で示すＰＣＲプライマー（配列番号１０と配列番号１１）を用いて、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ΔＮｐ６３Ａ／Ｂから増幅したｇＲＮＡの発現カセットおよびｄＣａｓ９／ＫＲＡＢの発現カセットをサブクローン化した。続いて、それらを、Ａｄｅｎｏ−Ｘ Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ  ３  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ（タカラバイオ社製）を用いて、製造者のプロトコールに従い、直線状ｐＡｄｅｎｏＸ  ｖｅｃｔｏｒにサブクローン化した（図６（ａ）および７（ａ））。【０１３０】
Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２（Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ／Ｂ）は、以下の通り作製した。すなわち、表１で示すＰＣＲプライマー（配列番号１０と配列番号１１）を用いて、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ／Ｂから増幅したｇＲＮＡの発現カセットおよびｄＣａｓ９／ＫＲＡＢの発現カセットをサブクローン化した。続いて、それらを、Ａｄｅｎｏ−Ｘ Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ  ３  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ（タカラバイオ社製）を用いて、製造者のプロトコールに従い、直線状ｐＡｄｅｎｏＸ  ｖｅｃｔｏｒにサブクローン化した（図７（ａ））。【０１３１】
Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２  ΔＮｐ６３（Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ／Ｂ  ΔＮｐ６３Ａ／Ｂ）は、以下の通り作製した。すなわち、表１で示すＰＣＲプライマー（配列番号１０と配列番号１１）を用いて、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ／Ｂ  ΔＮｐ６３Ａ／Ｂから増幅したｇＲＮＡの発現カセットおよびｄＣａｓ９／ＫＲＡＢの発現カセットをサブクローン化した。続いて、それらを、Ａｄｅｎｏ−Ｘ Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ  ３  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ（タカラバイオ社製）を用いて、製造者のプロトコールに従い、直線状ｐＡｄｅｎｏＸ  ｖｅｃｔｏｒにサブクローン化した（図７（ａ））。【０１３２】
Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２は、以下の通り作製した。すなわち、表１で示すＰＣＲプライマー（配列番号１０と配列番号１１）を用いて、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ／Ｂから増幅したｇＲＮＡの発現カセットおよびｄＣａｓ９／ＫＲＡＢの発現カセットをサブクローン化した。続いて、それらを、Ａｄｅｎｏ−Ｘ Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ  ３  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ（タカラバイオ社製）を用いて、製造者のプロトコールに従い、直線状ｐＡｄｅｎｏＸ  ｖｅｃｔｏｒにサブクローン化した（図１４）。【０１３３】
Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＰＩＫ３ＣＡは、以下の通り作製した。すなわち、表１で示すＰＣＲプライマー（配列番号１０と配列番号１１）を用いて、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＰＩＫ３ＣＡＡ／Ｂから増幅したｇＲＮＡの発現カセットおよびｄＣａｓ９／ＫＲＡＢの発現カセットをサブクローン化した。続いて、それらを、Ａｄｅｎｏ−Ｘ Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ  ３  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ（タカラバイオ社製）を用いて、製造者のプロトコールに従い、直線状ｐＡｄｅｎｏＸ  ｖｅｃｔｏｒにサブクローン化した（図１４）。【０１３４】
Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２  ＰＩＫ３ＣＡは、以下の通り作製した。すなわち、表１で示すＰＣＲプライマー（配列番号１０と配列番号１１）を用いて、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ／Ｂ  ＰＩＫ３ＣＡＡ／Ｂから増幅したｇＲＮＡの発現カセットおよびｄＣａｓ９／ＫＲＡＢの発現カセットをサブクローン化した。続いて、それらを、Ａｄｅｎｏ−Ｘ Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ  ３  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ（タカラバイオ社製）を用いて、製造者のプロトコールに従い、直線状ｐＡｄｅｎｏＸ  ｖｅｃｔｏｒにサブクローン化した（図１４）。【０１３５】
各ベクターのウイルス力価は、Ａｄｅｎｏ−Ｘ（商標）  Ｒａｐｉｄ  Ｔｉｔｅｒ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）により決定した。また、感染多重度（ＭＯＩ）は、各細胞にＡｄ−ＣＭＶ／ＧＦＰを感染させ、ＧＦＰの発現を評価することにより決定した。【０１３６】
[ルシフェラーゼレポーターアッセイ]
ΔＮｐ６３のプロモーター配列、ＳＯＸ２のプロモーター配列、およびＰＩＫ３ＣＡのプロモーター配列は、ヒトゲノムＤＮＡから得た（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。ΔＮｐ６３の転写開始点の位置（＋１）、ＳＯＸ２の転写開始点の位置（＋１）およびＰＩＫ３ＣＡの転写開始点の位置（＋１）は、Ｅｎｓｅｍｂｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  ｂｒｏｗｓｅｒにより決定された（図３（ｂ）および（ｃ））。【０１３７】
ΔＮｐ６３のルシフェラーゼレポーターコンストラクト（ｐＧＬ.ΔＮｐ６３−２０００／＋１４０およびΔＮｐ６３−６００／＋１４０）は、以下の通り作製した。すなわち、表１で示すＰＣＲプライマー（ΔＮｐ６３−２０００／＋１４０：配列番号１２と配列番号１３、およびΔＮｐ６３−６００／＋１４０：配列番号１４と配列番号１５）を用いて、ゲノムＤＮＡから増幅したΔＮｐ６３プロモーター領域−２０００／＋１４０または−６００／＋１４０をサブクローン化した。続いて、それらを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＧＬ４．２３にサブクローン化した（図４（ａ）および図５（ａ））。【０１３８】
ＳＯＸ２のルシフェラーゼレポーターコンストラクト（ｐＧＬ.ＳＯＸ２−１９９０／＋１１６）は、以下の通り作製した。すなわち、表１で示すＰＣＲプライマー（配列番号１５と配列番号１６）を用いて、ゲノムＤＮＡから増幅したＳＯＸ２プロモーター領域−１９９０／＋１１６をサブクローン化した。続いて、それらを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＧＬ４．２３にサブクローン化した（図５（ａ））。【０１３９】
ＳＯＸ２のルシフェラーゼレポーターコンストラクト（ｐＧＬ.ＳＯＸ２−１９９０／＋４３６）は、以下の通り作製した。すなわち、表１で示すＰＣＲプライマー（配列番号２１と配列番号２２）を用いて、ゲノムＤＮＡから増幅したＳＯＸ２プロモーター領域−１９９０／＋をサブクローン化した。ＮｈｅIおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、同様の処理をしたｐＧＬ４．２３にサブクローン化した（図１２（ｂ））。【０１４０】
ＰＩＫ３ＣＡのルシフェラーゼレポーターコンストラクト（ｐＧＬ．ＰＩＫ３ＣＡ−５９３／＋２２５）は、以下の通り作製した。すなわち、表１で示すＰＣＲプライマー（配列番号２３と配列番号２４）を用いて、ゲノムＤＮＡから増幅したＰＩＫ３ＣＡプロモーター領域−５９３／＋２２５をサブクローン化した。続いて、それらを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、ＮｈｅＩで消化したｐＧＬ４．２３にサブクローン化した（図１２（ｂ））。【０１４１】
全てのトランスフェクションは、６穴プレートで行った。トランスフェクションの１日前に、細胞（ＥＢＣ２、ＴＥ８およびＫＹＳＥ７０）を、１穴あたりに２×１０５細胞の密度で播種した。トランスフェクションは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｔｈｒｍｏ  Ｆｉｓｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、製造者のプロトコールに従い行った。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を回収した。対照ベクターとしては、ｇＲＮＡの発現が欠如したｐＸ３３０Ａ＿ｄＣａｓ９／ＫＲＡＢ−１ｘ２ベクターを用いた。一つの代表的な実験結果を、対照ベクターで観察された結果との比較で、βガラクトシダーゼ活性で標準化された相対的な光ユニットの倍率誘導として示す。各実験は、少なくとも３回繰り返された。エラーバーは、１回の実験における３つのサンプルの平均からのＳＤを示す。【０１４２】
[コロニー形成アッセイ]
ウイルス感染の２４時間前に、細胞（ＥＢＣ２、ＴＥ８、ＫＹＳＥ７０、ＨａＣａＴおよびＨ５９６）を、２×１０５細胞の密度で６穴プレートに播種した。翌日、Ａｄ−ｅｍｐｔｙおよび各種ベクター（Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ΔＮｐ６３、Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２、Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２  ΔＮｐ６３、Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＰＩＫ３ＣＡ、およびＡｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２  ＰＩＫ３ＣＡ）を、６００ＭＯＩでＥＢＣ２に、３００ＭＯＩでＴＥ８に、１５００ＭＯＩでＫＹＳＥ７０およびＨａＣａＴに、３００ＭＯＩでＨ５９６に、それぞれ２４時間感染させた。【０１４３】
ＥＢＣ２およびＫＹＳＥ７０は、トリプシン／ＥＤＴＡを用いたインキュベーションによりディッシュから解離させ、細胞数を計測後、５×１０２細胞の密度で６穴プレートの３穴に播種した。ＴＥ８およびＨａＣａＴは、１×１０３細胞の密度で６穴プレートの３穴に播種した。Ｈ５９６は、２×１０３細胞を播種した。１４日後に細胞を固定し、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋ（シスメックス社製）で染色した。続いて、コロニー（少なくとも５０個の凝集した細胞の集団）の数を計測した。対照群の平均値を１００％に設定して、他の全ての数を標準化し、対照群のコロニー形成と比較した割合特異的細胞毒性を計算した。【０１４４】
[ＴＵＮＥＬ染色]
アポトーシスを検出するために、Ｄｅａｄ  Ｅｎｄ  Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ＴＵＮＥＬ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、製造者のプロトコールに従い、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ仲介ｄＵＴＰ−ｂｉｏｔｉｎ  ｎｉｃｋ  ｅｎｄ  ｌａｂｅｌｉｎｇ（ＴＵＮＥＬ）染色を行った。アデノウイルスベクターの細胞への感染は以下で行った。ＥＢＣ２：６００ＭＯＩ、ＨａＣａＴ：１５００ＭＯＩ、ＮＨＬＦおよびＨＵＶＥＣ：５０ＭＯＩ。【０１４５】
[イムノブロット解析]
Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入した氷冷Ｍ−ＰＥＲ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒにより、細胞を溶解した。４℃、１５，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離により細胞可溶物を浄化し、ＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、タンパク質濃度を決定した。等量のタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した。当該ゲル内のタンパク質を、Ｈｙｂｏｎｄ  ＰＶＤＦ転写膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に転写させた後、Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ（登録商標）Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従い、一次抗体および二次抗体と共にインキュベートした。【０１４６】
ＴＡｐ６３およびΔＮｐ６３に特異的な一次抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から入手し、Ｃａｓ９に特異的な抗体は、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社から入手した。β−アクチンに特異的な抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から入手した。また、ＳＯＸ２に特異的な抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から入手し、ＦＬＡＧに特異的な抗体は、Ｔａｋａｒａ社から入手した。さらに、ＡＫＴおよびｐＡＫＴに特異的な一次抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から入手した。二次抗体のホースラディッシュペルオキシダーゼ共役抗体は、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から入手した。【０１４７】
[免疫染色]
キシレン、段階的エタノールおよび浸水工程を介して、切片を脱パラフィン化した。ｔａｒｇｅｔ  ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｄａｋｏ社製）中で１５分間オートクレーブした後、切片を、３％過酸化水素で５分間インキュベートし、内在性のペルオキシダーゼ活性を阻害した。ΔＮｐ６３（ｃｌｏｎｅ  １１Ｆ１２．１）に特異的な一次抗体は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社から入手した（Ｃａｔ  Ｎｏ：ＭＡＢＳ５１９）。１：５００で希釈した抗体を用いて、試料を４℃で一晩インキュベートし、その後、ＴＢＳで３回洗浄した。ストレプトアビジン−ビオチン複合体（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ［ＨＲＰ］、Ｄａｋｏ社製）を用いて、室温で６０分間、スライドを処理した。免疫反応は、３，３’−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＤＡＢ）  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  ＤＡＢ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｄａｋｏ社製）を用いて可視化し、ヘマトキシリンで対比染色を行った。切片をエタノールおよびキシレン浴に浸し、試験のためにマウントした。免疫組織化学解析のために、４０個の肺ＳＣＣ組織サンプル、４０個の肺腺がん組織サンプル、および組織切片中の４０個の食道ＳＣＣサンプルを、肺ＳＣＣおよび肺腺がんと診断され、川崎医科大学で外科的切除を受けた患者から入手した。実験のプロトコールは、川崎医科大学の倫理審査委員会により承認された（倫理委員会の参照番号：１３１０）。【０１４８】
[ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙアッセイ]
ウイルスベクター感染後７２時間での各細胞におけるｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙを、ｔｒｉｐａｎ  ｂｌｕｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ａｓｓａｙにて計測した。簡潔には、ウイルス感染の前日に、６ウェルプレートに細胞を播き（ＥＢＣ２およびＨＣＣ９５：１×１０５細胞／ウェル、Ｈ５９６：２×１０５細胞／ウェル）、各細胞にウイルベクターを３時間感染させ（ＥＢＣ２およびＨＣＣ９５：１２００ＭＯＩ、Ｈ５９６：３００ＭＯＩ）、その７２時間後における生存細胞数をセルカウンターで計測した。各条件に対して、３ウェルずつを使用し解析を行った。【０１４９】
[マウス実験]
実験のプロトコールは、川崎医科大学の動物実験倫理審査委員会（倫理委員会の参照番号：１５−０４６）により承認された。ＥＢＣ２肺ＳＣＣ細胞を、１５ｃｍディッシュに、１ディッシュあたり４×１０６細胞の密度で播種し、３７℃で一晩培養した。翌日、細胞に、Ａｄ−ｅｍｐｔｙまたはＡｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ΔＮｐ６３を感染させた。感染は、３００ＭＯＩおよび６００ＭＯＩの２パターンで行った。アデノウイルス感染から２４時間後に、細胞を回収して、培養液で再懸濁した。ヒト肺がん異種移植片は、６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（ＣＬＥＡ）の横腹に、アデノウイルス処理ＥＢＣ（２×１０６細胞／１００μｌ）を皮下注射で接種することにより確立した。その後、動物を詳細に観察し、生存試験を行った。１週間に２回、腫瘍を測定し、腫瘍容積を、ａ×ｂ２×０．５（ａおよびｂは、それぞれ大径および小径を示す）として計算した。各群において、１０匹のマウスを試験した。【０１５０】
〈統計解析〉
試験群の統計学的有意差は、ステューデントｔ検定またはフィッシャーの正確確率検定を用いることにより評価した。統計的有意差は、ｐ＜０．０１（＊）およびｐ＜０．０５（＃）として定義した。【０１５１】
（１．各種細胞におけるΔＮｐ６３発現の検出）
肺ＳＣＣおよび食道ＳＣＣにおけるΔＮｐ６３の発現を調べるために、肺がん細胞、食道がん細胞および正常細胞についてイムノブロット解析および免疫染色を行った。【０１５２】
簡潔には、各種細胞を２×１０５細胞の密度で６穴プレートに播種し、７２時間後に細胞を回収し、イムノブロット解析を行った。イムノブロット解析および免疫染色は、上記に記載の方法により行った。結果を図２に示す。なお、図２（ｂ）中のスケールバーは、２００μｍを示す。【０１５３】
図２に示されるように、ΔＮｐ６３の発現は、肺ＳＣＣ細胞（ＥＢＣ２）、食道ＳＣＣ細胞（ＴＥ８およびＫＹＳＥ７０）において検出された。また、ΔＮｐ６３の発現は、ヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥＰＣ）および不死化ヒトケラチノサイト（ＨａＣａＴ）においても検出された。しかし、すべてのヒト肺腺がん細胞（Ｈ３５８、Ｈ４４１、Ｈ４６０およびＡ５４９）、正常ヒト肺線維芽細胞（ＮＨＬＦ）、ヒト肺微小血管内皮細胞（ＨＰＭＥＣ）、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、および正常なヒト包皮繊維芽細胞（ＨＦＥ１）においては、ΔＮｐ６３の発現は検出されなかった。【０１５４】
一方、ＴＡｐ６３の発現は、ＥＢＣ２、Ｈ４４１およびＨ３５８において検出された。【０１５５】
ヒトＳＣＣ細胞の９種の中で、ＥＢＣ２、ＴＥ８およびＫＹＳＥ７０の３種のみでΔＮｐ６３の発現が検出された。しかし、ヒト肺ＳＣＣ切片および食道ＳＣＣ切片において、ΔＮｐ６３の発現は、９２．５％以上の切片で検出された（図２（ｂ））。また、ヒト肺腺がん細胞の３０％において、ΔＮｐ６３の発現が検出された。これらの結果は、ΔＮｐ６３は、主にヒト肺ＳＣＣおよび食道ＳＣＣで発現しているために、ΔＮｐ６３の分子標的薬はＳＣＣの処置に有用であることを示す。【０１５６】
（２．プラスミドベクターによるＳＯＸ２および／またはΔＮｐ６３の発現抑制）
本発明の一態様におけるプラスミドベクター（ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ΔＮｐ６３Ａ、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ΔＮｐ６３Ａ／Ｂ、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ／Ｂ、およびｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ／Ｂ  ΔＮｐ６３Ａ／Ｂ）が、ΔＮｐ６３および／またはＳＯＸ２の発現を抑制するか否かを調べるために、ルシフェラーゼレポーターアッセイを行った。各種プラスミドベクターの構築、ルシフェラーゼレポーターコンストラクトの構築およびルシフェラーゼレポーターアッセイは、上記に記載の方法により行った。結果を図４および５に示す。【０１５７】
図４（ｂ）に示されるように、ｇＲＮＡの発現が欠如した対照ベクターを用いた場合、トランスフェクションから２４時間後に、ｇＲＮＡ標的部位を含むプロモーター領域−２０００／＋１４０および−６００／＋１４０が、ＥＢＣ２肺ＳＣＣ、ＴＥ８食道ＳＣＣ、およびＫＹＳＥ７０食道ＳＣＣにおいて、有意な転写活性を示した（ＥＢＣ２肺ＳＣＣ：それぞれ、５．０３倍および７．３０倍、ＴＥ８食道ＳＣＣ：それぞれ、２４．９倍および１７．８倍、ＫＹＳＥ７０食道ＳＣＣ：それぞれ、３．６５倍および３．４７倍）。【０１５８】
一方、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  Ｎｐ６３ＡおよびｐＣＲＩＳＰＲｉ  ΔＮｐ６３Ａ／Ｂを用いた場合、プロモーター領域−６００／＋１４０において、転写活性が有意に減少していた（ＥＢＣ２肺ＳＣＣ：それぞれ、４．３５倍および３．０８倍、ＴＥ８食道ＳＣＣ：それぞれ、１０．５倍および５．２８倍、ＫＹＳＥ７０食道ＳＣＣ：それぞれ、１．９４倍および０．９５倍）。ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ΔＮｐ６３Ａ／Ｂはまた、プロモーター領域−２０００／＋１４０においても、転写活性が有意に減少していた（ＥＢＣ２肺ＳＣＣ：３．７０倍、ＴＥ８食道ＳＣＣ：８．８５倍、ＫＹＳＥ７０食道ＳＣＣ：１．２３倍）。【０１５９】
さらに、図５（ｂ）に示されるように、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ／ＢおよびｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ／Ｂ  ΔＮｐ６３Ａ／Ｂを用いた場合にも、上記と同様の結果になった。すなわち、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ／ＢおよびｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ／Ｂ  ΔＮｐ６３Ａ／Ｂは、ＥＢＣ２肺ＳＣＣにおいて、ΔＮｐ６３および／またはＳＯＸ２の転写を抑制する効果を示した。【０１６０】
これらの結果は、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ΔＮｐ６３Ａ、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ΔＮｐ６３Ａ／Ｂ、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ／Ｂ、およびｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ／Ｂ  ΔＮｐ６３Ａ／Ｂが、上記の各種細胞において、ΔＮｐ６３および／またはＳＯＸ２の発現を抑制する効果を有することを示す。【０１６１】
（３．アデノウイルスベクターによるＳＯＸ２および／またはΔＮｐ６３の発現抑制）
本発明の一態様におけるアデノウイルスベクター（Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ΔＮｐ６３、Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２、およびＡｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２  ΔＮｐ６３）が、ΔＮｐ６３および／またはＳＯＸ２の発現を抑制するか否かを調べるために、イムノブロット解析を行った。【０１６２】
簡潔には、各種アデノウイルスベクターの構築を、上記に記載の方法により行った。続いて、ウイルス感染の２４時間前に、細胞（ＥＢＣ２、ＴＥ８、ＫＹＳＥ７０およびＨａＣａＴ）を、２×１０５細胞の密度で６穴プレートに播種した。翌日、Ａｄ−ｅｍｐｔｙおよび各種ベクター（Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ΔＮｐ６３、Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２、およびＡｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２  ΔＮｐ６３）を、それぞれ以下の通り、各細胞に感染させた。
・ＥＢＣ２：２００ＭＯＩ、４００ＭＯＩ、６００ＭＯＩ
・ＴＥ８：１００ＭＯＩ、２００ＭＯＩ、３００ＭＯＩ
・ＫＹＳＥ７０およびＨａＣａＴ：５００ＭＯＩ、１０００ＭＯＩ、１５００ＭＯＩ
感染後、２日目の細胞を回収し、上記に記載の方法により、イムノブロット解析を行った。結果を図６および７に示す。【０１６３】
図６（ｂ）に示されるように、Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ΔＮｐ６３は、ＥＢＣ２肺ＳＣＣ、ＴＥ８食道ＳＣＣ、ＫＹＳＥ７０食道ＳＣＣ、およびＨａＴａＴ不死化ケラチノサイトにおいて、感染の４８時間後に、感染量依存的にｄＣａｓ９の発現を増加させた。そのうえ、Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ΔＮｐ６３は、これらの細胞種において、ΔＮｐ６３の発現を明らかに抑制した。【０１６４】
また、図７（ｂ）および（ｃ）に示されるように、Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２およびＡｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２  ΔＮｐ６３は、ＥＢＣ２肺ＳＣＣおよびＴＥ８食道ＳＣＣにおいて、感染の４８時間後に、感染量依存的にｄＣａｓ９の発現を増加させた。そのうえ、Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２およびＡｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２  ΔＮｐ６３は、これらの細胞種において、それぞれＳＯＸ２、およびＳＯＸ２とΔＮｐ６３の発現を明らかに抑制した。【０１６５】
一方、対照ウイルスは、上記の細胞において、効果的にΔＮｐ６３の発現を抑制しなかった（図６（ｂ）、図７（ｂ）および（ｃ））。【０１６６】
これらの結果は、Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ΔＮｐ６３、Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２、およびＡｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２  ΔＮｐ６３が、上記の各種細胞において、ΔＮｐ６３の発現を抑制する効果を有することを示す。【０１６７】
（４．コロニー形成の阻害およびアポトーシスの抑制）
本発明の一態様における各種ベクター（Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ΔＮｐ６３、Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２、およびＡｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２  ΔＮｐ６３）が、コロニー形成の阻害活性およびアポトーシスの抑制活性を有するか否かを調べるために、コロニー形成アッセイおよびＴＵＮＥＬ染色を行った。コロニー形成アッセイおよびＴＵＮＥＬ染色は、上記に記載の方法により行った。結果を図８および９に示す。なお、図８（ｃ）中のスケールバーは、２００μｍを示す。【０１６８】
図８（ａ）および（ｂ）に示されるように、Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ΔＮｐ６３は、ＥＢＣ２、ＴＥ８、ＫＹＳＥ７０およびＨａＣａＴにおいて、コロニー形成を有意に減少させた。また、図９に示されるように、Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２およびＡｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２  ΔＮｐ６３は、ＥＢＣ２において、コロニー形成を有意に減少させた。【０１６９】
さらに、図８（ｃ）および（ｄ）に示されるように、ＴＵＮＥＬ染色は、Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ΔＮｐ６３感染の７２時間後に、ＥＢＣ２およびＨａＣａＴにおいてアポトーシスが誘導されることを示した。ここで重要なことは、Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ΔＮｐ６３の感染後に、ＮＨＬＦおよびＨＵＶＥＣではアポトーシスがほとんど増加しなかったことである。ヘキスト染色はまた、Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ΔＮｐ６３により、ＥＢＣ２ではアポトーシスが誘導されるが、ＮＨＬＦではアポトーシスが誘導されないことを示した。特に、２つの異なる遺伝子を標的としたＡｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２  ΔＮｐ６３を用いた場合は、コロニー減少の効果が最も高かった（Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ΔＮｐ６３およびＡｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２と比較して、有意に効果が高かった。）。これらの結果は、Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ΔＮｐ６３が、ΔＮｐ６３陽性ＳＣＣおよび人工不死化ケラチノサイトにおいて抗腫瘍効果を誘導できることを示す。【０１７０】
（５．マウスモデルにおける効果）
本発明の一態様におけるＡｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ΔＮｐ６３が生体内で腫瘍成長を抑制するか否かを調べるために、ＥＢＣ２肺ＳＣＣ異種移植片を導入したヌードマウス腫瘍モデルを用いて実験を行った。ヌードマウス腫瘍モデルの作製およびそれを用いた実験は、上記に記載の方法により行った。結果を図１０に示す。【０１７１】
図１０に示されるように、腫瘍の成長は、対照群と比較して、ＥＢＣ２に３００ＭＯＩ（図１０（ａ））または６００ＭＯＩ（図１０（ｂ））でＡｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ΔＮｐ６３を感染させた後に、有意に抑制された。これらの結果は、Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ΔＮｐ６３が生体内で肺ＳＣＣに対する抗腫瘍効果を誘導できることを示す。【０１７２】
（６．プラスミドベクターによるＳＯＸ２および／またはＰＩＫ３ＣＡの発現抑制）
本発明の一態様におけるプラスミドベクター（ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ／Ｂ、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＰＩＫ３ＣＡＡ、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＰＩＫ３ＣＡＡ／Ｂ、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ  ＰＩＫ３ＣＡＡ、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ／Ｂ  ＰＩＫ３ＣＡＡ、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ  ＰＩＫ３ＣＡＡ／Ｂ、ｐＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２Ａ／Ｂ  ＰＩＫ３ＣＡＡ／Ｂ）が、ＳＯＸ２および／またはＰＩＫ３ＣＡの発現を抑制するか否かを調べるために、ルシフェラーゼレポーターアッセイを行った。各種プラスミドベクターの構築、ルシフェラーゼレポーターコンストラクトの構築およびルシフェラーゼレポーターアッセイは、上記に記載の方法により行った。結果を図１３に示す。【０１７３】
図１３に示されるように、ｇＲＮＡの発現が欠如した対照ベクターを用いた場合、トランスフェクションから２４時間後に、ｇＲＮＡ標的部位を含むプロモーター領域−１９９０／＋４３６（ＳＯＸ２）および−５９３／＋２２５（ＰＩＫ３ＣＡ）が、ＥＢＣ２肺ＳＣＣにおいて、有意な転写活性を示した。【０１７４】
一方、上記各種ベクターを用いた場合、ｇＲＮＡ標的部位を含むプロモーター領域−１９９０／＋４３６（ＳＯＸ２）および−５９３／＋２２５（ＰＩＫ３ＣＡ）において、転写活性が有意に減少していた。【０１７５】
これらの結果は、上記各種ベクターが、上記の各種細胞において、ＳＯＸ２および／またはＰＩＫ３ＣＡの発現を抑制する効果を有することを示す。【０１７６】
（７．アデノウイルスベクターによるＳＯＸ２および／またはＰＩＫ３ＣＡの発現抑制）
本発明の一態様におけるアデノウイルスベクター（Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２、Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＰＩＫ３ＣＡ、およびＡｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２  ＰＩＫ３ＣＡ）が、ＳＯＸ２および／またはＰＩＫ３ＣＡの発現を抑制するか否かを調べるために、イムノブロット解析を行った。【０１７７】
簡潔には、各種アデノウイルスベクターの構築を、上記に記載の方法により行った。続いて、ウイルス感染の２４時間前に、細胞（ＥＢＣ２、ＨＣＣ５９およびＨ５９６）を、２×１０５細胞の密度で６穴プレートに播種した。翌日、Ａｄ−ｅｍｐｔｙおよび各種ベクター（Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２、Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＰＩＫ３ＣＡ、およびＡｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２  ＰＩＫ３ＣＡ）を、それぞれ以下の通り、各細胞に感染させた。
・ＥＢＣ２：６００ＭＯＩ、１２００ＭＯＩ
・ＨＣＣ５９：６００ＭＯＩ、１２００ＭＯＩ
・Ｈ５９６：３００ＭＯＩ、６００ＭＯＩ
感染後、２日目の細胞を回収し、上記に記載の方法により、イムノブロット解析を行った。結果を図１４に示す。【０１７８】
また、図１４（ｃ）に示されるように、Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２、Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＰＩＫ３ＣＡ、およびＡｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２  ＰＩＫ３ＣＡは、ＥＢＣ２肺ＳＣＣ、Ｈ５９６およびＨＣＣ５９において、感染の４８時間後に、感染量依存的にｄＣａｓ９の発現を増加させた。そのうえ、Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２、Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＰＩＫ３ＣＡ、およびＡｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２  ＰＩＫ３ＣＡは、上記細胞種において、それぞれ、ＳＯＸ２、ＰＩＫ３ＣＡ、およびＳＯＸ２とＰＩＫ３ＣＡの発現を明らかに抑制した。【０１７９】
一方、対照ウイルスは、上記の細胞において、効果的にＳＯＸ２およびＰＩＫ３ＣＡの発現を抑制しなかった。【０１８０】
これらの結果は、Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２、Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＰＩＫ３ＣＡ、およびＡｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２  ＰＩＫ３ＣＡが、上記の各種細胞において、ＳＯＸ２および／またはＰＩＫ３ＣＡの発現を抑制する効果を有することを示す。【０１８１】
（８．ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙアッセイ）
本発明の一態様における各種ベクター（Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２、Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＰＩＫ３ＣＡ、およびＡｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２  ＰＩＫ３ＣＡ）が、細胞の生存を抑制する効果を有するか否かを調べるために、ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙアッセイを行った。ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙアッセイは、上記に記載の方法により行った。結果を図１５に示す。【０１８２】
図１５に示されるように、上記各種ベクターは、ＥＢＣ２、ＨＣＣ５９およびＨ５９６において、細胞の生存を抑制した。特に、２つの異なる遺伝子を標的としたＡｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２  ＰＩＫ３ＣＡを用いた場合は、細胞の生存抑制効果が最も高かった（Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２およびＡｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＰＩＫ３ＣＡと比較して、有意に効果が高かった。）。これらの結果は、上記各種ベクターが、肺扁平上皮がん細胞および肺腺扁平上皮がん細胞において抗腫瘍効果を誘導できることを示す。【０１８３】
（９．コロニー形成の阻害）
本発明の一態様における各種ベクター（Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２、Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＰＩＫ３ＣＡ、およびＡｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２  ＰＩＫ３ＣＡ）が、コロニー形成の阻害活性を有するか否かを調べるために、コロニー形成アッセイを行った。コロニー形成アッセイは、上記に記載の方法により行った。結果を図１６に示す。【０１８４】
図１６（ａ）および（ｂ）に示されるように、上記各種ベクターは、ＥＢＣ２およびＨ５９６において、コロニー形成を有意に減少させた。特に、２つの異なる遺伝子を標的としたＡｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２  ＰＩＫ３ＣＡを用いた場合は、コロニー減少の効果が最も高かった（Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２およびＡｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＰＩＫ３ＣＡと比較して、有意に効果が高かった。）。これらの結果は、上記各種ベクターが、肺扁平上皮がん細胞および肺腺扁平上皮がん細胞において抗腫瘍効果を誘導できることを示す。【０１８５】
（１０．メカニズムの検討）
本発明の一態様における各種ベクター（Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２、Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＰＩＫ３ＣＡ、およびＡｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２  ＰＩＫ３ＣＡ）が、コロニー形成の阻害効果（抗腫瘍効果）を示すメカニズムを検討するために、イムノブロット解析を行った。【０１８６】
簡潔には、上記各種ベクターの構築を、上記に記載の方法により行った。続いて、ウイルス感染の２４時間前に、細胞（ＥＢＣ２）を、２×１０５細胞の密度で６穴プレートに播種した。翌日、Ａｄ−ｅｍｐｔｙおよび各種ベクター（Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２、Ａｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＰＩＫ３ＣＡ、およびＡｄ−ＣＲＩＳＰＲｉ  ＳＯＸ２  ＰＩＫ３ＣＡ）を、６００ＭＯＩおよび１２００ＭＯＩでＥＢＣ２に感染させた。【０１８７】
感染後、２日目の細胞を回収し、上記に記載の方法により、イムノブロット解析を行った。結果を図１７に示す。【０１８８】
図１７に示されるように、リン酸化ＡＫＴは、対照群と比較して、上記各種ベクターを感染させたときに有意に抑制された。この結果は、各種アデノウイルスベクターがリン酸化ＡＫＴの抑制を介して、コロニー形成の阻害効果（抗腫瘍効果）を誘導できることを示す。
【産業上の利用可能性】
【０１８９】
本発明は、増殖性疾患に関与する標的遺伝子の発現を特異的に抑制することができるため、増殖性疾患の処置、とりわけ、肺ＳＣＣおよび食道ＳＣＣの処置に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年10月16日(2019.10.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）増殖性疾患に関与する少なくとも一つの標的遺伝子に結合する少なくとも一つのガイドＲＮＡの鋳型となる塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および
（Ｂ）ｄＣａｓ９をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、を含む、増殖性疾患を処置するための医薬組成物。
【請求項２】
（Ｃ）転写抑制因子をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターをさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
（Ａ’）増殖性疾患に関与する少なくとも一つの標的遺伝子に結合する少なくとも一つのガイドＲＮＡ、および
（Ｂ’）ｄＣａｓ９を含む、増殖性疾患を処置するための医薬組成物。
【請求項４】
（Ｃ’）転写抑制因子をさらに含む、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
上記標的遺伝子ががん遺伝子である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
上記標的遺伝子が複数である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
上記標的遺伝子がＳＯＸ２、ΔＮｐ６３およびＰＩＫ３ＣＡのいずれからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
上記ｄＣａｓ９が上記転写抑制因子と融合している、請求項２および４〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
上記ｄＣａｓ９が、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかで示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物：
（ａ）配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号１で示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、かつ、該ポリヌクレオチドから発現したタンパク質が、上記（Ａ）のガイドＲＮＡ、または、上記（Ａ）のガイドＲＮＡおよび上記（Ｃ）の転写抑制因子と協同して標的遺伝子の発現を抑制する活性を有する、ポリヌクレオチド、および
（ｃ）配列番号１で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつ、該ポリヌクレオチドから発現したタンパク質が、上記（Ａ）のガイドＲＮＡ、または、上記（Ａ）のガイドＲＮＡおよび上記（Ｃ）の転写抑制因子と協同して標的遺伝子の発現を抑制する活性を有する、ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
上記転写抑制因子がＫＲＡＢである、請求項２、４〜８および１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
上記増殖性疾患ががんである、請求項１〜８、１０および１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
上記ガイドＲＮＡを複数含み、該各ガイドＲＮＡが上記標的遺伝子の異なる部分に結合する、請求項１〜８および１０〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
上記（Ａ）〜（Ｂ）または（Ａ）〜（Ｃ）の各ポリヌクレオチドが、同一の発現ベクター上に配置されている、請求項１、２および５〜８および１０〜１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
上記発現ベクターがプラスミドベクターまたはウイルスベクターである、請求項１、２および５〜８および１０〜１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
（Ａ）増殖性疾患に関与する少なくとも一つの標的遺伝子に結合する少なくとも一つのガイドＲＮＡの鋳型となる塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、
（Ｂ）ｄＣａｓ９をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および
（Ｃ）転写抑制因子をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、を備える、増殖性疾患を処置するためのキット。
【手続補正書】
【提出日】令和2年1月14日(2020.1.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）扁平上皮細胞がんに関与する少なくとも一つの標的遺伝子に結合する少なくとも一つのガイドＲＮＡの鋳型となる塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および
（Ｂ）ｄＣａｓ９をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、を含む、
上記標的遺伝子がＳＯＸ２、ΔＮｐ６３およびＰＩＫ３ＣＡからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子である、扁平上皮細胞がんを処置するための医薬組成物。
【請求項２】
（Ｃ）転写抑制因子をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターをさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
（Ａ’）扁平上皮細胞がんに関与する少なくとも一つの標的遺伝子に結合する少なくとも一つのガイドＲＮＡ、および
（Ｂ’）ｄＣａｓ９を含む、
上記標的遺伝子がＳＯＸ２、ΔＮｐ６３およびＰＩＫ３ＣＡからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子である、扁平上皮細胞がんを処置するための医薬組成物。
【請求項４】
（Ｃ’）転写抑制因子をさらに含む、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
上記標的遺伝子が複数である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
上記ｄＣａｓ９が上記転写抑制因子と融合している、請求項２、４および６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
上記ｄＣａｓ９が、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかで示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされる、請求項１〜４、６および８のいずれか１項に記載の医薬組成物：
（ａ）配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号１で示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、かつ、該ポリヌクレオチドから発現したタンパク質が、上記（Ａ）のガイドＲＮＡ、または、上記（Ａ）のガイドＲＮＡおよび上記（Ｃ）の転写抑制因子と協同して標的遺伝子の発現を抑制する活性を有する、ポリヌクレオチド、および
（ｃ）配列番号１で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつ、該ポリヌクレオチドから発現したタンパク質が、上記（Ａ）のガイドＲＮＡ、または、上記（Ａ）のガイドＲＮＡおよび上記（Ｃ）の転写抑制因子と協同して標的遺伝子の発現を抑制する活性を有する、ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
上記転写抑制因子がＫＲＡＢである、請求項２、４、６、８および１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
上記ガイドＲＮＡを複数含み、該各ガイドＲＮＡが上記標的遺伝子の異なる部分に結合する、請求項１〜４、６、８、１０および１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
上記（Ａ）〜（Ｂ）または（Ａ）〜（Ｃ）の各ポリヌクレオチドが、同一の発現ベクター上に配置されている、請求項１、２、６、８、１０、１１および１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
上記発現ベクターがプラスミドベクターまたはウイルスベクターである、請求項１、２、６、８、１０、１１、１３および１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
（Ａ）扁平上皮細胞がんに関与する少なくとも一つの標的遺伝子に結合する少なくとも一つのガイドＲＮＡの鋳型となる塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、
（Ｂ）ｄＣａｓ９をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および
（Ｃ）転写抑制因子をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、を備える、
上記標的遺伝子がＳＯＸ２、ΔＮｐ６３およびＰＩＫ３ＣＡからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子である、扁平上皮細胞がんを処置するためのキット。
【国際調査報告】
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