(57)【要約】  （Ａ）（ａ１）スペーサー配列の５’末端に１個以上のヌクレオチド残基が付加されたガイドＲＮＡ、（ａ２）標的配列に対して１塩基又は複数塩基のミスマッチを有するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ、及び（ａ３）前記（ａ１）若しくは前記（ａ２）のガイドＲＮＡを発現し得る発現ベクターからなる群より選択される少なくとも１種と、（Ｂ）Ｃａｓタンパク質及び前記Ｃａｓタンパク質を発現し得る発現ベクターからなる群より選択される少なくとも１種と、を細胞に導入する工程を含む、片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）（ａ１）スペーサー配列の５’末端に１個以上のヌクレオチド残基が付加されたガイドＲＮＡ、（ａ２）標的配列に対して１塩基又は複数塩基のミスマッチを有するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ、及び（ａ３）前記（ａ１）若しくは前記（ａ２）のガイドＲＮＡの発現ベクターからなる群より選択される少なくとも１種と、
（Ｂ）Ｃａｓタンパク質及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも１種と、
を細胞に導入する工程を含む、片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法。
【請求項２】
前記（Ａ）が、スペーサー配列の５’末端に１個以上のヌクレオチド残基が付加され、且つ前記スペーサー配列が、標的配列に対して１塩基又は複数塩基のミスマッチを有するスペーサー配列である、ガイドＲＮＡ又はそれをコードする発現ベクターである、請求項１に記載の片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法。
【請求項３】
前記スペーサー配列の５’末端に付加されたヌクレオチド残基が、全て同一のヌクレオチド残基である、請求項１又は２に記載の片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法。
【請求項４】
前記スペーサー配列の５’末端に付加されたヌクレオチド残基が、シトシン残基又はグアニン残基である、請求項３に記載の片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法。
【請求項５】
さらに、（Ｃ）ドナーベクターを細胞に導入する工程を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法。
【請求項６】
前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９タンパク質である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法。
【請求項７】
スペーサー配列の５’末端に１個以上のヌクレオチド残基が付加されたガイドＲＮＡ。
【請求項８】
前記スペーサー配列が、標的配列に対して１塩基又は複数塩基のミスマッチを有する、請求項７に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項９】
請求項７又は８に記載のガイドＲＮＡの発現ベクター。
【請求項１０】
さらに、Ｃａｓタンパク質を発現可能な、請求項９に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９タンパク質である、請求項１０に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
（Ａ）（ａ１）スペーサー配列の５’末端に１個以上のヌクレオチド残基が付加されたガイドＲＮＡ、（ａ２）標的配列に対して１塩基又は複数塩基のミスマッチを有するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ、及び（ａ３）前記（ａ１）若しくは前記（ａ２）のガイドＲＮＡの発現ベクター、からなる群より選択される少なくとも１種を含む、片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造キット。
【請求項１３】
（Ｂ）Ｃａｓタンパク質及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも１種をさらに含む、請求項１２に記載の製造キット。
【請求項１４】
（ｉ）ガイドＲＮＡ若しくはその発現ベクター、及びＣａｓタンパク質若しくはその発現ベクターを細胞に導入してゲノム編集を行う工程、
（ｉｉ）前記ゲノム編集を行った細胞からＤＮＡを抽出する工程、
（ｉｉｉ）前記ＤＮＡから標的領域を含むＤＮＡ断片を増幅する工程、
（ｉｖ）前記増幅したＤＮＡ断片の配列解析を行い、前記標的領域へのｉｎｄｅｌ誘導率（Ｐ）を求める工程、及び
（ｖ）下記式（ｍ）若しくは（ｍ１）及び（ｂ）若しくは（ｂ１）により、片側アレルのみへのｉｎｄｅｌ誘導率（ｍｏｎｏ）及び両側アレルへのｉｎｄｅｌ誘導率（ｂｉ）を求める工程、
を含む、ゲノム編集パターンの予測方法。
ｍｏｎｏ＝２×Ｐ×（１−Ｐ）  ・・・（ｍ）  ｂｉ＝Ｐ２                    ・・・（ｂ）
ｍｏｎｏ＝−１．３０３Ｐ２＋１．２７６１Ｐ＋０．０２７４  ・・・（ｍ１）
ｂｉ＝０．６５１５Ｐ２＋０．３６１９Ｐ−０．０１３７  ・・・（ｂ１）
【請求項１５】
一方のアレルに、局在化タンパク質コード配列と、切断部位と、第１の蛍光タンパク質コード配列と、がこの順にインフレームで連結されたキメラ遺伝子を含み、
他方のアレルに、前記局在化タンパク質コード配列と、前記切断部位と、第２の蛍光タンパク質コード配列と、がこの順にインフレームで連結されたキメラ遺伝子を含む、
細胞。
【請求項１６】
（Ｉ）請求項１５に記載の細胞に、前記切断部位を標的とするガイドＲＮＡ若しくはその発現ベクター、及びＣａｓタンパク質若しくはその発現ベクターを導入してゲノム編集を行う工程、
（ＩＩ）前記工程（Ｉ）の後、前記細胞の蛍光パターンを解析する工程、並びに
（ＩＩＩ）前記工程（ＩＩ）で解析した蛍光パターンに基づいて、ゲノム編集パターンを判定する工程、
を含む、ゲノム編集パターンの解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゲノム編集の分野に関する。本発明は、特に、片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法、当該製造方法に使用可能なガイドＲＮＡ、発現ベクター、及びキット、並びにゲノム編集パターンの予測方法、に関する。さらに、本発明は、ゲノム編集パターンの解析方法、及び当該解析方法に使用可能な細胞に関する。
本願は、２０１８年１２月１２日に、日本に出願された特願２０１８−２３２９４６号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
クラスター化した規則的な配置の短い回文反復配列（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ：ＣＲＩＳＰＲ）は、Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）遺伝子と共に、細菌及び古細菌において侵入外来核酸に対する獲得耐性を提供する適応免疫系を構成することが知られている。ＣＲＩＳＰＲは、ファージ又はプラスミドＤＮＡに起因することが多く、大きさの類似するスペーサーと呼ばれる独特の可変ＤＮＡ配列が間に入った、２４〜４８ｂｐの短い保存された反復配列からなる。また、リピート及びスペーサー配列の近傍には、Ｃａｓタンパク質ファミリーをコードする遺伝子群が存在する。【０００３】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて、外来性のＤＮＡは、Ｃａｓタンパク質ファミリーによって３０ｂｐ程度の断片に切断され、ＣＲＩＳＰＲに挿入される。Ｃａｓタンパク質ファミリーの一つであるＣａｓ１及びＣａｓ２タンパク質は、外来性ＤＮＡのｐｒｏｔｏ−ｓｐａｃｅｒ  ａｄｊａｃｅｎｔ  ｍｏｔｉｆ（ＰＡＭ）と呼ばれる塩基配列を認識して、その上流を切り取って、宿主のＣＲＩＳＰＲ配列に挿入し、これが細菌の免疫記憶となる。免疫記憶を含むＣＲＩＳＰＲ配列が転写されて生成したＲＮＡ（ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡと呼ぶ。）は、一部相補的なＲＮＡ（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ）と対合し、Ｃａｓタンパク質ファミリーの一つであるＣａｓ９タンパク質に取り込まれる。Ｃａｓ９に取り込まれたｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡはＲＮＡａｓｅＩＩＩにより切断され、外来配列（ガイド配列）を含む小さなＲＮＡ断片（ＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＡｓ：ｃｒＲＮＡｓ）となり、Ｃａｓ９−ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体が形成される。Ｃａｓ９−ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体はｃｒＲＮＡと相補的な外来侵入性ＤＮＡに結合し、ＤＮＡを切断する酵素（ｎｕｃｌｅａｓｅ）であるＣａｓ９タンパク質が、外来侵入性ＤＮＡを切断することよって、外から侵入したＤＮＡの機能を抑制及び排除する。【０００４】
Ｃａｓ９タンパク質は外来侵入性ＤＮＡ中のＰＡＭ配列を認識して、その上流で二本鎖ＤＮＡを平滑末端になるように切断する。ＰＡＭ配列の長さや塩基配列は細菌種によってさまざまであり、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）では「ＮＧＧ」の３塩基を認識する。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）は２つのＣａｓ９を持っており、それぞれ「ＮＧＧＮＧ」又は「ＮＮＡＧＡＡ」の５〜６塩基をＰＡＭ配列として認識する。(Ｎは任意の塩基を表す)。ＰＡＭ配列の上流の何ｂｐのところを切断するかも細菌種によって異なるが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓを含め大部分のＣａｓ９オルソログはＰＡＭ配列の３塩基上流を切断する。【０００５】
近年、細菌でのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを、ゲノム編集に応用する技術が盛んに開発されている。ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを融合させて、ｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡキメラ（ｓｇＲＮＡ）として発現させ、活用している。これによりＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｎｕｃｌｅａｓｅ：ＲＧＮ）を呼び込み、目的の部位でゲノムＤＮＡを切断する。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムには、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型があるが、ゲノム編集で用いるのはもっぱらＩＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムであり、ＩＩ型ではＲＧＮとしてＣａｓ９タンパク質が用いられている。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９タンパク質はＮＧＧという３つの塩基をＰＡＭ配列として認識するため、グアニンが２つ並んだ配列がありさえすればその上流を切断できる。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いた方法は、標的ＤＮＡ配列と相同な配列を有する短いｓｇＲＮＡを合成するだけでよく、単一のタンパク質であるＣａｓ９タンパク質を用いてゲノム編集ができる。そのため、従来用いられていたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）やトランス活性化因子様作動体（ＴＡＬＥＮ）のようにＤＮＡ配列ごとに異なる大きなタンパク質を合成する必要がなく、簡便かつ迅速にゲノム編集を行うことができる。
例えば、特許文献１には、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを活用したゲノム編集技術が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１４／０９３６６１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ゲノム編集により二本鎖切断されたＤＮＡは、相同組み換え修復（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｒｅｐａｉｒ：ＨＤＲ）又は非相同末端再結合（Ｎｏｎ−Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  Ｅｎｄ−Ｊｏｉｎｉｎｇ  Ｒｅｐａｉｒ：ＮＨＥＪ）により修復されることが知られている。ＮＨＥＪの際には、修復の際に挿入及び／又は欠失（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ／ｄｅｌｅｔｉｏｎ：ｉｎｄｅｌ）が高頻度で誘導されるため、予期せぬ遺伝子変異が生じるおそれがある。
例えば、疾患遺伝子と正常遺伝子とをヘテロに有する場合、ゲノム編集により疾患遺伝子をノックアウトしようとすると、正常遺伝子にも高頻度で変異が誘導されるおそれがある。また、ＨＤＲにより正常遺伝子をノックインしようとしても、両アレルでノックインが生じる確率は極めて低い。そのため、ノックインが誘導されなかったアレルでは、ＮＨＥＪによりｉｎｄｅｌが導入されるおそれがある。
そのため、ゲノム編集により両方のアレルで二本鎖切断が生じた場合、片方のアレルに予期せぬ変異が誘導されるリスクがある。【０００８】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法、並びに前記方法に使用可能なガイドＲＮＡ、発現ベクター、キットを提供することを目的とする。さらに、ゲノム編集パターンの予測方法、並びにゲノム編集パターンの解析方法、及び前記解析方法に使用可能な細胞を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は以下の態様を含む。
［１］（Ａ）（ａ１）スペーサー配列の５’末端に１個以上のヌクレオチド残基が付加されたガイドＲＮＡ、（ａ２）標的配列に対して１塩基又は複数塩基のミスマッチを有するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ、及び（ａ３）前記（ａ１）若しくは前記（ａ２）のガイドＲＮＡの発現ベクターからなる群より選択される少なくとも１種と、（Ｂ）Ｃａｓタンパク質及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも１種と、を細胞に導入する工程を含む、片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法。
［２］前記（Ａ）が、スペーサー配列の５’末端に１個以上のヌクレオチド残基が付加され、且つ前記スペーサー配列が、標的配列に対して１塩基又は複数塩基のミスマッチを有するスペーサー配列である、ガイドＲＮＡ又はそれをコードする発現ベクターである、［１］に記載の片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法。
［３］前記スペーサー配列の５’末端に付加されたヌクレオチド残基が、全て同一のヌクレオチド残基である、［１］又は［２］に記載の片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法。
［４］前記スペーサー配列の５’末端に付加されたヌクレオチド残基が、シトシン残基又はグアニン残基である、［３］に記載の片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法。
［５］さらに、（Ｃ）ドナーベクターを細胞に導入する工程を含む、［１］〜［４］のいずれかに記載の片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法。
［６］前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９タンパク質である、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法。
［７］スペーサー配列の５’末端に１個以上のヌクレオチド残基が付加されたガイドＲＮＡ。
［８］前記スペーサー配列が、標的配列に対して１塩基又は複数塩基のミスマッチを有する、［７］に記載のガイドＲＮＡ。
［９］［７］又は［８］に記載のガイドＲＮＡの発現ベクター。
［１０］さらに、Ｃａｓタンパク質を発現可能な、［９］に記載の発現ベクター。
［１１］前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９タンパク質である、［１０］に記載の発現ベクター。
［１２］（Ａ）（ａ１）スペーサー配列の５’末端に１個以上のヌクレオチド残基が付加されたガイドＲＮＡ、（ａ２）標的配列に対して１塩基又は複数塩基のミスマッチを有するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ、及び（ａ３）前記（ａ１）若しくは前記（ａ２）のガイドＲＮＡの発現ベクター、からなる群より選択される少なくとも１種を含む、片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造キット。
［１３］（Ｂ）Ｃａｓタンパク質及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも１種をさらに含む、［１２］に記載の製造キット。
［１４］（ｉ）ガイドＲＮＡ若しくはその発現ベクター、及びＣａｓタンパク質若しくはその発現ベクターを細胞に導入してゲノム編集を行う工程、（ｉｉ）前記ゲノム編集を行った細胞からＤＮＡを抽出する工程、（ｉｉｉ）前記ＤＮＡから標的領域を含むＤＮＡ断片を増幅する工程、（ｉｖ）前記増幅したＤＮＡ断片の配列解析を行い、前記標的領域へのｉｎｄｅｌ誘導率（Ｐ）を求める工程、及び（ｖ）下記式（ｍ）若しくは（ｍ１）及び（ｂ）若しくは（ｂ１）により、片側アレルのみへのｉｎｄｅｌ誘導率（ｍｏｎｏ）及び両側アレルへのｉｎｄｅｌ誘導率（ｂｉ）を求める工程、を含む、ゲノム編集パターンの予測方法。
ｍｏｎｏ＝２×Ｐ×（１−Ｐ）  ・・・（ｍ）
ｂｉ＝Ｐ２                    ・・・（ｂ）
ｍｏｎｏ＝−１．３０３Ｐ２＋１．２７６１Ｐ＋０．０２７４  ・・・（ｍ１）
ｂｉ＝０．６５１５Ｐ２＋０．３６１９Ｐ−０．０１３７  ・・・（ｂ１）
［１５］一方のアレルに、局在化タンパク質コード配列と、切断部位と、第１の蛍光タンパク質コード配列と、がこの順にインフレームで連結されたキメラ遺伝子を含み、他方のアレルに、前記局在化タンパク質コード配列と、前記切断部位と、第２の蛍光タンパク質コード配列と、がこの順にインフレームで連結されたキメラ遺伝子を含む、細胞。
［１６］（Ｉ）［１５］に記載の細胞に、前記切断部位を標的とするガイドＲＮＡ若しくはその発現ベクター、及びＣａｓタンパク質若しくはその発現ベクターを導入してゲノム編集を行う工程、（ＩＩ）前記工程（Ｉ）の後、前記細胞の蛍光パターンを解析する工程、並びに（ＩＩＩ）前記工程（ＩＩ）で解析した蛍光パターンに基づいて、ゲノム編集パターンを判定する工程、を含む、ゲノム編集パターンの解析方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法、並びに前記方法に使用可能なガイドＲＮＡ、発現ベクター、キットが提供される。さらに、ゲノム編集パターンの予測方法、並びにゲノム編集パターンの解析方法、及び前記解析方法に使用可能な細胞が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】実施例で構築したＡＩＭＳの概要を説明する図である。図１Ａは、実施例で作製したＡＩＭＳ細胞が有する遺伝子構成を説明する図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＡＩＭＳによるｉｎｄｅｌの評価方法を説明する図である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、実施例でＡＩＭＳ細胞の作製に使用したＰ２Ａペプチドコード配列、及び前記配列にサイレント変異を導入したａＰ２Ａ配列を示す。
【図２Ａ】実施例でゲノム編集に用いたプラスミドの構成を示す図である。
【図２Ｂ】実施例でゲノム編集に用いプラスミドのトランスフェクション後の操作手順を示す図である。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｂは、ｓｇＲＮＡのスペーサー配列に、標的配列に対する１塩基ミスマッチを導入することにより、両側アレルｉｎｄｅｌ及び片側アレルｉｎｄｅｌの導入率が変化するかを調べた結果を示す。図３Ａは、実施例で用いたスペーサー配列の一例を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＡＩＭＳ細胞としてＴｂｘ３−Ｐ２Ａ−ＡＩＭＳを用いてｉｎｄｅｌパターン解析を行った結果である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ＡＩＭＳ細胞としてＴｂｘ３−Ｐ２Ａ−ＡＩＭＳを用いてｉｎｄｅｌパターン解析を行った結果である。
【図３Ｄ】図３Ｄは、ＡＩＭＳ細胞としてＣｄｈ１−ａＰ２Ａ−ＡＩＭＳを用いてｉｎｄｅｌパターン解析を行った結果である。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｆは、ｓｇＲＮＡのスペーサー配列の５’末端に、ヌクレオチド残基を付加することにより、両側アレルｉｎｄｅｌ及び片側アレルｉｎｄｅｌの導入率が変化するかを調べた結果を示す。図４Ａは、実施例で用いたｓｇＲＮＡの一例を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＡＩＭＳ細胞としてＣｄｈ１−Ｐ２Ａ−ＡＩＭＳを用いてｉｎｄｅｌパターン解析を行った結果である。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＡＩＭＳ細胞としてＣｄｈ１−Ｐ２Ａ−ＡＩＭＳを用いてｉｎｄｅｌパターン解析を行った結果である。
【図４Ｄ】図４Ｄは、トランスフェクションするｓｇＲＮＡ発現プラスミドの量を変化させることにより、両側アレルｉｎｄｅｌ及び片側アレルｉｎｄｅｌの導入率が変化するかを調べた結果を示す。
【図４Ｅ】図４Ｅは、トランスフェクションするｓｇＲＮＡ発現プラスミドの量を変化させることにより、両側アレルｉｎｄｅｌ及び片側アレルｉｎｄｅｌの導入率が変化するかを調べた結果を示す。Ｃａｓ９及びピューロマイシン耐性遺伝子発現プラスミドとｓｇＲＮＡ発現プラスミドを別々のプラスミドに分離し、ｓｇＲＮＡ発現プラスミドの量のみを変化させた。
【図４Ｆ】図４Ｆは、Ｒｏｓａ２６及びアルブミン遺伝子（Ａｌｂ）を標的としてゲノム編集を行った結果を示す。スペーサー配列の５’末端にシトシン（Ｃ）を付加したｓｇＲＮＡを用いた。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｃは、ＡＩＭＳ細胞を用いて、ｉｎｄｅｌを含まない相同組換えの導入率を評価した結果を示す。図５Ａは、実施例５で用いた方法の概略を説明する図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、１塩基ミスマッチを有するスペーサー配列を含むｓｇＲＡＮを用いて相同組換えを行った結果を示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、スペーサー配列の５’末端にシトシンを付加したｓｇＲＡＮを用いて相同組換えを行った結果を示す。
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｃは、１塩基ミスマッチの導入と５’末端へヌクレオチド残基付加を組み合わせることにより、両側アレルｉｎｄｅｌ及び片側アレルｉｎｄｅｌの導入率が変化するかを調べた結果を示す。図６Ａは、標的配列に対して１塩基ミスマッチを有するｓｇＲＮＡを用いた結果を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、標的配列に対して１塩基ミスマッチを有し、且つ５’末端に１０個のシトシンを付加したスペーサー配列を含むｓｇＲＮＡを用いた結果を示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、標的配列に対して１塩基ミスマッチを有し、且つ５’末端に２５個のシトシンを付加したスペーサー配列を含むｓｇＲＮＡを用いた結果を示す。
【図７】実施例７に記載の式（ｍ）により算出された片側アレルｉｎｄｅｌの頻度と、図３Ｂ〜３Ｄ、図４Ｂ、及び図６Ａ〜６Ｃにおいて実際に検出された片側アレルｉｎｄｅｌの頻度との相関関係を示す。
【図８Ａ】図８Ａ〜８Ｂは、Ｐｒｅ−Ｄｅｍｏ−Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎの予測値と実測値との比較を行った結果を示す。図８Ａは、Ｐｒｅ−Ｄｅｍｏ−Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎの操作プロトコールを示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、Ｐｒｅ−Ｄｅｍｏ−Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎの予測値（左図）及び実測値（右図）を示す。
【図９Ａ】スペーサー配列の５’末端にヌクレオチド残基を付加することにより、オフターゲット効果を抑制できるかを調べた結果を示す。図９Ａは、図６Ａ〜６Ｃのデータに基づき、実施例７に記載の式（１）によりｉｎｄｅｌ誘導率（Ｐ）を算出した結果を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、スペーサー配列の５’末端へのシトシン付加による、オフターゲット作用の抑制効果を検証した結果を示す。ＥＭＸ１遺伝子中の標的配列（ＧＡＧＴＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ：配列番号８３の５〜２４番目）に対するスペーサー配列の５’末端に０個、１０個又は２５個のシトシンを付加したｓｇＲＮＡ発現ベクターを、ＨＥＫ２９３Ｔに導入し、オンターゲット領域、及びオフターゲット領域であるＭＦＡＰ１遺伝子領域（ＧＡＧＴＣｔａＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ：配列番号９１；ＥＭＸ１遺伝子中の標的配列とは異なる部分を小文字で示す）におけるｉｎｄｅｌを検証した結果である。
【図９Ｃ】図９Ｂは、スペーサー配列の５’末端へのシトシン付加による、オフターゲット作用の抑制効果を検証した結果を示す。図９Ｂと同じ条件で、スペーサー配列の５’末端のシトシン付加の数を、０個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個又は３０個とした。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜１０Ｃは、進行性骨化性線維異形成症（ＦＯＰ）における遺伝性疾患変異の修復試験の結果を示す。図１０Ａは、ＦＯＰ遺伝性疾患変異修復方法の概要を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ＦＯＰ遺伝性疾患変異（ｗｔ／Ｒ２０６Ｈ）を有するヒトｉＰＳ細胞を用いて、変異アレル（Ｒ２０６Ｈ）を修復するＨＤＲ誘導したときのＨＤＲ誘導効率を評価した結果である。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、ＦＯＰ遺伝性疾患変異（ｗｔ／Ｒ２０６Ｈ）を有するヒトｉＰＳ細胞において、変異アレル（Ｒ２０６Ｈ）を標的としたゲノム編集によるｉｎｄｅｌ導入効率を評価した結果である。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜１１Ｄは、ＦＯＰ遺伝性疾患モデルの作製試験の結果を示す。図１１Ａは、ＦＯＰ遺伝性疾患変異誘導方法の概要を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、マウスＥＳ細胞（ｗｔ／ｗｔ）を用いて、変異アレル（Ｒ２０６Ｈ）を誘導するＨＤＲ誘導したときのＨＤＲ誘導効率を評価した結果である。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、マウスＥＳ細胞（ｗｔ／ｗｔ）において、Ａｃｖｒ１遺伝子（ｗｔ）を標的としたゲノム編集によるｉｎｄｅｌ導入効率を評価した結果である。
【図１１Ｄ】図１１Ｄは、ＨＤＲ誘導により作製したＦＯＰ遺伝性疾患変異（ｗｔ／Ｒ２０６Ｈ）を有するマウスＥＳ細胞をマウス受精卵にマイクロインジェクションして作製したキメラマウスで形成された異常な骨（矢印）を示す写真である。
【図１２Ａ】図１２Ａは、ＡＩＭＳを用いた細胞毒性評価試験の結果を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、ＡＣＶＲ１を標的としたゲノム編集による細胞毒性評価試験の結果を示す。
【図１３Ａ】ＡＩＭＳによる２５３個のデータから算出したＰ値を横軸とし、両側アレルｉｎｄｅｌ割合（Ｂｉ；上図）、片側アレルｉｎｄｅｌ（Ｍｏｎｏ；中図）、及びｉｎｄｅｌなし（Ｎｏｎｏ；下図）の割合を縦軸としてプロットしたグラフである。
【図１３Ｂ】図１３Ａのグラフから得られた数式で、両側アレルｉｎｄｅｌ割合（Ｂｉ；上図）、片側アレルｉｎｄｅｌ（Ｍｏｎｏ；中図）、及びｉｎｄｅｌなし（Ｎｏｎｅ；下図）の割合を予測した結果を示す。実際の実測値（横軸）と。数式による予測値（縦軸）とは、高い相関を示した。
【図１３Ｃ】Ｃｄｈ１−Ｐ２Ａ−ＡＩＭＳでＰ２Ａを標的としてゲノム編集を行った結果を示す。上図は、Ｃｄｈ１−Ｐ２Ａ−ＡＩＭＳでＰ２Ａを標的としてゲノム編集を行った場合の実際のデータを示す。中図は、得られたデータから、上記式（１）で算出されたＰ値を図１３Ａの数式（Ｐ＝ｘ）に当てはめて作成した予測グラフを示す。下図は、本発明の１実施形態にかかるゲノム編集パターンの予測方法に基づいて得られたｉｎｄｅｌパターン予測グラフを示す。
【図１４Ａ】Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓの作製方法の概略を示す。Ｐ２Ａ−ｓｇＲＮＡ１及びＣｄｈ１−ｓｇＲＮＡ４の標的位置を示す。
【図１４Ｂ】Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓの作製方法の概略を示す。Ｐ２Ａ−ｓｇＲＮＡ１及びＣｄｈ１−ｓｇＲＮＡ４によるゲノム編集後のゲノム構成と、各プライマーのアニーリング位置を示す。
【図１５】０個、１０個、又は２５個のシトシンを付加したｓｇＲＮＡによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ切断アッセイの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
［定義］
本明細書において、「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、相互に互換的に使用され、ヌクレオチドがホスホジエステル結合によって結合したヌクレオチドポリマーを指す。「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、ＤＮＡとＲＮＡとの組み合わせから構成されてもよい。また、「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、天然ヌクレオチドのポリマーであってもよく、天然ヌクレオチドと非天然ヌクレオチド（天然ヌクレオチドの類似体、塩基部分、糖部分及びリン酸部分のうち少なくとも一つの部分が修飾されているヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート骨格）等）とのポリマーであってもよく、非天然ヌクレオチドのポリマーであってもよい。
本明細書において、「ポリヌクレオチド」又は「核酸」の塩基配列は、特に明示しない限り、一般的に認められている１文字コードで記載される。特に明示しない限り、塩基配列は、５’側から３’側に向かって記載する。
本明細書において、「ポリヌクレオチド」又は「核酸」を構成するヌクレオチド残基は、単に、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、又はウラシル等、あるいはそれらの１文字コードで記載される場合がある。
【００１３】
本明細書において、「遺伝子」という用語は、特定のタンパク質をコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドを指す。遺伝子は、エクソン及びイントロンの両方を含み得る。
【００１４】
本明細書において、「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、相互に互換的に使用され、アミド結合によって結合したアミノ酸のポリマーを指す。「ポリペプチド」、「ペプチド」又は「タンパク質」は、天然アミノ酸のポリマーであってもよく、天然アミノ酸と非天然アミノ酸（天然アミノ酸の化学的類似体、修飾誘導体等）とのポリマーであってもよく、非天然アミノ酸のポリマーであってもよい。特に明示しない限り、アミノ酸配列は、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって記載する。
【００１５】
本明細書において、「アレル」という用語は、１対の染色体上の同一遺伝子座に存在する１対の遺伝子又は同一座位に存在する１対の塩基配列を指す。前記１対の遺伝子は、必ずしも対立遺伝子である必要はなく、前記１対の塩基配列は、必ずしも異なる塩基配列である必要はない。「両側アレル」という用語は、前記１対の遺伝子又は１対の塩基配列の両方を指し、「片側アレル」という用語は、前記１対の遺伝子又は１対の塩基配列のうちのいずれか一方を指す。
【００１６】
本明細書において、「ゲノム編集」という用語は、ゲノム上の所望の位置（標的領域）に変異を誘導することを指す。ゲノム編集は、標的領域のＤＮＡを切断するように操作されたヌクレアーゼの使用を含み得る。典型的には、部位特異的ヌクレアーゼの使用により、標的領域のＤＮＡに二本鎖切断（ＤＳＢ）が誘導され、その後、相同組み換え修復（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｒｅｐａｉｒ：ＨＤＲ）及び非相同末端再結合（Ｎｏｎ−Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  Ｅｎｄ−Ｊｏｉｎｉｎｇ  Ｒｅｐａｉｒ：ＮＨＥＪ）のような、細胞の内因性プロセスによってゲノムが修復される。ＮＨＥＪは、修復用鋳型ＤＮＡを用いずに二本鎖切断された末端を連結する修復方法であり、修復の際に挿入及び／又は欠失（ｉｎｄｅｌ）が高頻度で誘導される。ＨＤＲは、修復用鋳型ＤＮＡを用いた修復機構であり、標的領域に所望の変異を導入することも可能である。ゲノム編集技術としては、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが好ましく例示される。
【００１７】
本明細書において、「修復用鋳型ＤＮＡ」という用語は、ＤＮＡの二本鎖切断の修復に用いられるＤＮＡであって、標的領域周辺のＤＮＡと相同組換え可能なＤＮＡを指す。
本明細書において、「ドナーベクター」という用語は、修復用鋳型ＤＮＡとして用いられる外来性ＤＮＡを指す。ドナーベクターは、ホモロジーアームとして標的領域に隣接する塩基配列を含む。本明細書においては、標的領域の５’側に隣接する塩基配列からなるホモロジーアームを「５’アーム」、標的配列の３’側に隣接する塩基配列からなるホモロジーアームを「３’アーム」と記載する場合がある。ドナーベクターは、５’アームと３’アームとの間に、所望の塩基配列を含むことができる。各ホモロジーアームの長さは、３ｋｂ以上が好ましく、通常５〜１０ｋｂ程度である。５’アーム及び３’アームの長さは、同じであってもよく、異なっていてもよいが、同じであることが好ましい。
【００１８】
本明細書において、「セーフ・ハーバー領域」という用語は、細胞に対して有害な効果を示すことなく外来ＤＮＡの挿入が可能であることが実証されているゲノム上の領域を指す。セーフ・ハーバー領域としては、例えば、ヒトにおけるＡＡＶＳ１、マウスにおけるＲｏｓａ２６等が知られている。
【００１９】
本明細書において、「Ｃａｓタンパク質」という用語は、ＣＲＩＳＰＲ関連（ＣＲＩＳＰＲ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）タンパク質を指す。好ましい態様において、Ｃａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡと複合体を形成し、エンドヌクレアーゼ活性又はニッカーゼ活性を示す。Ｃａｓタンパク質としては、特に限定されないが、例えば、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質、Ｃ２ｃ１タンパク質、Ｃ２ｃ２タンパク質、及びＣ２ｃ３タンパク質等が挙げられる。Ｃａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡと協働してエンドヌクレアーゼ活性又はニッカーゼ活性を示す限り、野生型Ｃａｓタンパク質及びそのホモログ（パラログ及びオーソログ）、並びにそれらの変異体を包含する。
好ましい態様において、Ｃａｓタンパク質は、クラス２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に関与するものであり、より好ましくはＩＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に関与するものである。Ｃａｓタンパク質の好ましい例としては、Ｃａｓ９タンパク質が例示される。
【００２０】
本明細書において、「Ｃａｓ９タンパク質」という用語は、ＩＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に関与するＣａｓタンパク質を指す。Ｃａｓ９タンパク質は、ガイドＲＮＡと複合体を形成し、ガイドＲＮＡと協働して標的領域のＤＮＡを切断する活性を示す。Ｃａｓ９タンパク質は、前記の活性を有する限り、野生型Ｃａｓ９タンパク質及びそのホモログ（パラログ及びオーソログ）、並びにそれらの変異体を包含する。野生型Ｃａｓ９タンパク質は、ヌクレアーゼドメインとしてＲｕｖＣドメイン及びＨＮＨドメインを有するが、本明細書におけるＣａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣドメイン及びＨＮＨドメインのいずれか一方が不活性化されたものであってもよい。
Ｃａｓ９タンパク質が由来する生物種は特に限定されないが、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属、又はトレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）属に属する細菌等が好ましく例示される。より具体的には、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、又はＴ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ等に由来するＣａｓ９タンパク質が好ましく例示される。好ましい態様において、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９タンパク質である。
【００２１】
各種Ｃａｓタンパク質のアミノ酸配列、及びそのコード配列の情報は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ等の各種データベース上で得ることができる。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、アクセッション番号Ｑ９９ＺＷ２としてＵｎｉＰｒｏｔに登録されたもの等を用いることができる。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９タンパク質のコード配列の一例を配列番号９に示す。配列番号９に示す塩基配列は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９タンパク質の５’末端に３×Ｆｌａｇ及び核移行シグナルが付加されており、３’末端に核移行シグナルが付加されたものである。
【００２２】
本明細書において、「ガイドＲＮＡ」及び「ｇＲＮＡ」という用語は、相互に互換的に使用され、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、Ｃａｓタンパク質を標的領域に誘導することができるＲＮＡを指す。好ましい態様において、ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化型ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。ｃｒＲＮＡは、ゲノム上の標的領域への結合に関与し、ｔｒａｃｒＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質との結合に関与する。好ましい態様において、ｃｒＲＮＡは、スペーサー配列とリピート配列とを含み、スペーサー配列が標的領域において標的配列の相補鎖と結合する。好ましい態様において、ｔｒａｃｒＲＮＡは、アンチリピート配列と３’テイル配列とを含む。アンチリピート配列はｃｒＲＮＡのリピート配列と相補的な配列を有し、リピート配列と塩基対を形成し、３’テイル配列は通常３つのステムループを形成する。
ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの３’末端にｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端を連結した一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であってもよく、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを別々のＲＮＡ分子とし、リピート配列及びアンチリピート配列で塩基対を形成させたものであってもよい。好ましい態様において、ガイドＲＮＡはｓｇＲＮＡである。
【００２３】
ｃｒＲＮＡのリピート配列及びｔｒａｃｒＲＮＡの配列は、Ｃａｓタンパク質の種類に応じて適宜選択することができ、Ｃａｓタンパク質と同じ細菌種に由来するものを用いることができる。
例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９タンパク質を用いる場合、ｓｇＲＮＡの長さは、５０〜２２０ヌクレオチド（ｎｔ）程度とすることができ、６０〜１８０ｎｔ程度が好ましく、８０〜１２０ｎｔ程度がより好ましい。ｃｒＲＮＡの長さは、スペーサー配列を含めて約２５〜７０塩基長とすることができ、２５〜５０ｎｔ程度が好ましい。ｔｒａｃｒＲＮＡの長さは１０〜１３０ｎｔ程度とすることができ、３０〜８０ｎｔ程度が好ましい。
ｃｒＲＮＡのリピート配列は、Ｃａｓタンパク質が由来する細菌種におけるものと同じであってもよく、３’末端の一部を削除したものであってもよい。ｔｒａｃｒＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質が由来する細菌種における成熟ｔｒａｃｒＲＮＡと同じで配列を有していてもよく、当該成熟ｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端及び／又は３’末端を切断した末端切断型であってもよい。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡは、成熟ｔｒａｃｒＲＮＡの３’末端から１〜４０個程度のヌクレオチド残基を除去した末端切断型であり得る。また、ｔｒａｃｒＲＮＡは、成熟ｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端から１〜８０個程度のヌクレオチド残基を除去した末端切断型であり得る。また、ｔｒａｃｒＲＮＡは、例えば、５’末端から１〜２０程度のヌクレオチド残基を除去し、かつ３’末端から１〜４０個程度のヌクレオチド残基を除去した末端切断型であり得る。
ｓｇＲＮＡ設計のためのｃｒＲＮＡリピート配列及びｔｒａｃｒＲＮＡの配列は、種々提案されており、当業者は、公知技術に基づいてｓｇＲＮＡを設計することができる（例えば、Jinek et al. (2012) Science, 337, 816-21; Mali et al. (2013) Science, 339: 6121, 823-6; Cong et al. (2013) Science, 339: 6121, 819-23; Hwang et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31: 3, 227-9; Jinek et al. (2013) eLife, 2, e00471）。
【００２４】
本明細書において、「標的配列」という用語は、Ｃａｓタンパク質による切断の対象となるゲノム中のＤＮＡ配列を指す。Ｃａｓタンパク質としてＣａｓ９タンパク質を用いる場合、標的配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’側に隣接する配列である必要がある。標的配列は、通常、ＰＡＭの５’側直前に隣接する１７〜３０塩基（好ましくは１８〜２５塩基、より好ましくは１９〜２２塩基、さらに好ましくは２０塩基）の配列が選択される。標的配列の設計には、ＣＲＩＳＰＲ  ＤＥＳＩＧＮ（ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／）等の公知のデザインツールを利用することができる。
【００２５】
本明細書において、「標的領域」という用語は、標的配列及びその相補鎖を含むゲノム領域を指す。
【００２６】
本明細書において、「プロトスペーサー隣接モチーフ」及び「ＰＡＭ」という用語は、相互に互換的に使用され、Ｃａｓタンパク質によるＤＮＡ切断の際に、Ｃａｓタンパク質に認識される配列を指す。ＰＡＭの配列及び位置は、Ｃａｓタンパク質の種類によって異なる。例えば、Ｃａｓ９タンパク質の場合、ＰＡＭは標的配列の３’側直後に隣接する必要がある。Ｃａｓ９タンパク質に対応するＰＡＭの配列は、Ｃａｓ９タンパク質が由来する細菌種によって異なっている。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９タンパク質に対応するＰＡＭは「ＮＧＧ」であり、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＣａｓ９タンパク質に対応するＰＡＭは「ＮＮＡＧＡＡ」であり、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのＣａｓ９タンパク質に対応するＰＡＭは「ＮＮＧＲＲＴ」又は「ＮＮＧＲＲ（Ｎ）」であり、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＣａｓ９タンパク質に対応するＰＡＭは「ＮＮＮＮＧＡＴＴ」であり、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａのＣａｓ９タンパク質に対応する「ＮＡＡＡＡＣ」である（「Ｒ」はＡ又はＧ；「Ｎ」は、Ａ、Ｔ、Ｇ又はＣ）。
【００２７】
本明細書において、「スペーサー配列」及び「ガイド配列」という用語は、相互に互換的に使用され、ガイドＲＮＡに含まれる配列であって、標的配列の相補鎖と結合し得る配列を指す。通常、スペーサー配列は、標的配列と同一の配列である（但し、標的配列中のＴは、スペーサー配列ではＵとなる）。本発明の実施態様において、スペーサー配列は、標的配列に対して１塩基又は複数塩基のミスマッチを含むことができる。複数塩基のミスマッチを含む場合、隣接した位置にミスマッチを有していてもよく、離れた位置にミスマッチを有していてもよい。好ましい態様において、スペーサー配列は、標的配列に対して１〜５塩基のミスマッチを含み得る。特に好ましい態様において、スペーサー配列は、標的配列に対して１塩基のミスマッチを含み得る。
ガイドＲＮＡにおいて、スペーサー配列は、ｃｒＲＮＡの５’側に配置される。
【００２８】
本明細書において、「ミスマッチ」という用語は、スペーサー配列が、標的配列と異なる塩基を含むこと、又はその異なる塩基を指す。例えば、「スペーサー配列が１塩基ミスマッチを含む」とは、スペーサー配列が、標的配列と比較して、１塩基異なっていることを意味する。
【００２９】
本明細書において、「ｉｎｄｅｌ」という用語は、挿入及び／又は欠失（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ／ｄｅｌｅｔｉｏｎ）を意味する。
本明細書において、「両側アレルｉｎｄｅｌ」という用語は、ゲノム編集により両側アレルの標的領域にｉｎｄｅｌが生じた状態を指す。
本明細書において、「片側アレルｉｎｄｅｌ」という用語は、ゲノム編集により片側アレルの標的領域のみにｉｎｄｅｌが生じた状態を指す。
本明細書において、「フレームシフトｉｎｄｅｌ」という用語は、フレームシフトを生じるｉｎｄｅｌを指す。
本明細書において、「インフレームｉｎｄｅｌ」という用語は、フレームシフトを生じないｉｎｄｅｌを指す。
【００３０】
本明細書において、「ＡＩＭＳ」という用語は、Ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｎｄｅｌ  Ｍｏｎｉｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍを意味し、アレル特異的にｉｎｄｅｌを検出することができる技術を指す。
本明細書において、「ＡＩＭＳ細胞」という用語は、ＡＩＭＳを行うために構築された細胞を意味し、アレル特異的にｉｎｄｅｌを検出することができる細胞を指す。
【００３１】
本明細書において、「キメラ遺伝子」という用語は、２つ以上の異なるタンパク質のコード配列がインフレームで連結されたポリヌクレオチドを指す。「キメラタンパク質」という用語は、キメラ遺伝子から発現されるタンパク質を指す。
【００３２】
本明細書において、「局在化タンパク質」という用語は、細胞におけるある部分（たとえば、核又は細胞膜）に局在して存在するタンパク質を指す。「核局在化タンパク質」とは、核に局在して存在するタンパク質を意味し、「細胞膜局在化タンパク質」とは、細胞膜に局在して存在するタンパク質を意味する。
【００３３】
本明細書で用いられる「切断部位」という用語は、例えばそれが切断酵素により認識され、かつ／または分割できるため、この配列が分割を方向付ける、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列を指す。典型的には、切断部位において、ポリペプチド鎖はアミノ酸を結合する一以上のペプチド結合の加水分解により切断される。また、切断部位において、ポリヌクレオチド鎖はヌクレオチド間の一以上のホスホジエステル結合の加水分解により切断される。ペプチド結合又はホスホジエステル結合の切断は、化学的又は酵素的切断に由来してもよい。酵素的切断は、ポリヌクレオチド鎖の場合には、例えば、制限エンドヌクレアーゼ（例えばＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型または人工的な制限酵素）により達成される、ポリヌクレオチドの切断を指す。ポリペプチド鎖の場合には、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ又はプロテアーゼ（例えばセリン−プロテアーゼ、システイン−プロテアーゼ、メタロ−プロテアーゼ、トレオニン−プロテアーゼ、アスパルテート−プロテアーゼ、グルタミン酸−プロテアーゼ）等が挙げられるがそれらに限定されない、タンパク質分解酵素により達成される、ポリペプチドの切断を指す。典型的には、酵素的切断は、自己切断に起因して起こるか、又は独立したタンパク質分解酵素により達成される。タンパク質又はポリペプチドの酵素的切断は、翻訳と同時に又は翻訳後のいずれかに起こり得る。したがって、本明細書で用いられる「エンドペプチダーゼ切断部位」という用語は、この配列がエンドペプチダーゼ（例えばトリプシン、ペプシン、エラスターゼ、トロンビン、コラゲナーゼ、フューリン、サーモリシン、エンドペプチダーゼＶ８、カテプシン）により切断される又は切断可能である、アミノ酸配列内の切断部位を指す。切断部位は、自己プロテアーゼ、すなわちプロテアーゼも含む同一のタンパク質分子内のペプチド結合を切断するプロテアーゼにより、切断されてもよい。かかる自己プロテアーゼの例としては、フラビウイルスのＮＳ２プロテアーゼ又はビルナウイルスのＶＰ４プロテアーゼが挙げられる。あるいは、「切断部位」という用語は、アミノ酸間のペプチド結合又はヌクレオチド間のホスホジエステル結合の形成を妨げる、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列を指す。例えば、ペプチド結合の形成は、単一のオープンリーディングフレームの単一の翻訳事象に由来する２つの非連続的な翻訳産物をもたらす、ポリペプチドの翻訳と同時に起こる自己プロセシングに起因して、妨げられ得る。典型的には、かかる自己プロセシングは、ペプチド結合を形成せずに１つのコドンから次に移動するように翻訳複合体を誘導する、偽終止コドン（ｐｓｅｕｄｏ ｓｔｏｐ−ｃｏｄｏｎ）配列により引き起こされる「リボスームスキップ」により達成される。リボソームスキップを誘導する配列の例には、ピコルナウイルス、昆虫ウイルス、アフトウイルス科（Ａｐｈｔｏｖｉｒｉｄａｅ）、ロタウイルスおよびトリパノソーマを含む、ウイルスの数種のファミリーにより用いられる、ウイルス２Ａペプチド又は２Ａ様ペプチド（本明細書において、両者をまとめて「２Ａペプチド」と称する）が挙げられるが、それらに限定されない。最も知られているのは、単一の��ＲＦから複数のポリペプチドを産生するために典型的に用いられる、ピコルナウイルス科ファミリーのライノウイルス及び口蹄疫ウイルスの２Ａペプチドである。
したがって、本明細書で用いられる「自己切断部位」という用語は、当該配列が任意のさらなる分子を伴うことなく切断される又は切断可能である、あるいは、当該配列内のペプチド結合又はホスホジエステル結合の形成が最初の段階で（例えば、上述のような翻訳と同時の自己プロセシングを介して）妨げられる、アミノ酸配列内又はヌクレオチド配列内の切断部位を指す。切断部位は典型的に数個のアミノ酸を含む、または数個のコドンによりコードされる（例えば、そのような場合、「切断部位」はタンパク質へ翻訳されないが翻訳の妨害を引き起こす）ことが理解される。それゆえ、切断部位はまた、ペプチドリンカーという目的に適う、すなわち二つのペプチドを立体的に分離する。したがって、いくつかの実施形態では、「切断部位」は、ペプチドリンカーでもあり、上述の切断機能を提供するものでもある。この実施形態では、切断部位はさらなるＮ及び／又はＣ末端アミノ酸を包含してもよい。
【００３４】
本明細書において、「２Ａペプチド」という用語は、ウイルスの２Ａペプチド又は２Ａ様ペプチドを指す。２Ａペプチドは、ペプチダーゼ又はリボソームスキップ機構により、切断されるペプチドである。２Ａペプチドとしては、例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）由来の２Ａペプチド（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）由来の２Ａペプチド（Ｅ２Ａ）、Ｐｏｒｃｉｎｅ  ｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ（ＰＴＶ−１）由来の２Ａペプチド（Ｐ２Ａ）及びＴｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ  ｖｉｒｕｓ（ＴａＶ）由来の２Ａペプチド（Ｔ２Ａ）等が挙げられる。
【００３５】
本明細書において、「ゲノム編集パターン」という用語は、ゲノム編集の対象となった細胞の標的領域の各アレルにおけるゲノム編集の誘導状態を指す。すなわち、両側アレルでゲノム編集が誘導されているか、片側アレルのみでゲノム編集が誘導されているか、という状態を意味する。
【００３６】
本明細書において、ポリヌクレオチドに関して用いる「機能的に連結」という用語は、第一の塩基配列が第二の塩基配列に十分に近くに配置され、第一の塩基配列が第二の塩基配列又は第二の塩基配列の制御下の領域に影響を及ぼしうることを意味する。例えば、ポリヌクレオチドがプロモーターに機能的に連結するとは、当該ポリヌクレオチドが、当該プロモーターの制御下で発現するように連結されていることを意味する。
【００３７】
本明細書において、「発現可能な状態」という用語は、ポリヌクレオチドが導入された細胞内で、該ポリヌクレオチドが転写され得る状態にあることを指す。
本明細書において、「発現ベクター」という用語は、対象ポリヌクレオチドを含むベクターであって、該ベクターを導入した細胞内で、対象ポリヌクレオチドを発現可能な状態にするシステムを備えたベクターを指す。例えば、「Ｃａｓタンパク質の発現ベクター」とは、該ベクターを導入した細胞内で、Ｃａｓタンパク質を発現可能なベクターを意味する。また、例えば、「ガイドＲＮＡの発現ベクター」とは、該ベクターを導入した細胞内で、ガイドＲＮＡを発現可能なベクターを意味する。
【００３８】
本明細書において、「サイレント変異」という用語は、コードするタンパク質のアミノ酸配列が変化しない遺伝子変異を指す。
【００３９】
本明細明細書において、塩基配列どうし又はアミノ酸配列どうしの配列同一性（又は相同性）は、２つの塩基配列又はアミノ酸配列を、対応する塩基又はアミノ酸が最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除く、塩基配列全体又はアミノ酸配列全体に対する一致した塩基又はアミノ酸の割合として求められる。塩基配列又はアミノ酸配列どうしの配列同一性は、当該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。例えば、塩基配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＮにより得られたアライメントを元にした計算によって得ることができ、アミノ酸配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＰにより得られたアライメントを元にした計算によって得ることができる。
【００４０】
［片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法］
１実施形態において、本発明は、（Ａ）（ａ１）スペーサー配列の５’末端に１個以上のヌクレオチド残基が付加されたガイドＲＮＡ、（ａ２）標的配列に対して１塩基又は複数塩基のミスマッチを有するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ、及び（ａ３）前記（ａ１）若しくは前記（ａ２）のガイドＲＮＡの発現ベクターからなる群より選択される少なくとも１種と、
（Ｂ）Ｃａｓタンパク質及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも１種と、を細胞に導入する工程を含む、片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法を提供する。
【００４１】
＜（Ａ）ガイドＲＮＡ＞
本実施形態の製造方法では、（ａ１）スペーサー配列の５’末端に１個以上のヌクレオチド残基が付加されたガイドＲＮＡ、（ａ２）標的配列に対して１塩基又は複数塩基のミスマッチを有するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ、及び（ａ３）前記（ａ１）若しくは前記（ａ２）のガイドＲＮＡの発現ベクターからなる群より選択される少なくとも１種、を用いる。
【００４２】
≪（ａ１）のガイドＲＮＡ≫
（ａ１）のガイドＲＮＡは、スペーサー配列の５’末端に１個以上のヌクレオチド残基が付加されたガイドＲＮＡである。当該ガイドＲＮＡを用いてゲノム編集を行うことにより、片側アレルのみでゲノム編集される割合が向上し、片側アレルのみがゲノム編集された細胞を製造することができる。
【００４３】
スペーサー配列は、任意の標的配列を標的とするスペーサー配列であればよく、特に限定されない。スペーサー配列の長さは、標的配列に対応する長さでればよく、通常、１７〜３０塩基、好ましくは１８〜２５塩基、より好ましくは１９〜２１塩基、さらに好ましくは２０塩基の配列が選択される。
通常、スペーサー配列は、標的配列と同一配列であるが（但し、標的配列中の「Ｔ」はスペーサー配列では「Ｕ」となる）、標的配列の相補鎖に対する結合能を有する限り、ミスマッチを有していてもよい。一般的に、スペーサー配列の５’側におけるミスマッチは許容性を示す。本実施形態の製造方法では、後述の（ａ２）のガイドＲＮＡのように、標的配列に対して１塩基ミスマッチを有するスペーサー配列が好ましい。
【００４４】
スペーサー配列の５’末端に付加されるヌクレオチド残基（以下、「付加ヌクレオチド残基」という場合がある）は、１個以上であり、特に限定されないが、例えば１〜５０個の範囲が挙げられる。付加されるヌクレオチド残基の数は、スペーサー配列の種類に応じて、適宜設定することができる。例えば、付加されるヌクレオチド残基の数は、５個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、又は２５個以上等とすることができる。付加ヌクレオチド残基の数が、前記下限値以上であると、片側アレルのみでゲノム編集される割合をより高めることができる。付加ヌクレオチド残基数の上限は、特に限定されないが、片側アレルのみでゲノム編集される割合が変わらなくなることから、たとえば５０個以下とすることができ、４０個以下が好ましく、３５個以下がより好ましい。付加ヌクレオチド残基数の好ましい範囲としては、例えば、５〜５０個が例示され、５~４０個、５〜３５個、１０〜４０個、１０〜３５個、１５〜３５個、又は２０〜３０個等であることが好ましい。
【００４５】
付加ヌクレオチド残基の種類は、特に限定されないが、例えば、全て同一のヌクレオチド残基とすることができる。例えば、付加ヌクレオチド残基は、ポリアデニン（ポリＡ）、ポリウラシル（ポリＵ）、ポリシトシン（ポリＣ）、及びポリグアニン（ポリＧ）からなる群より選択することができる。中でも、付加ヌクレオチド残基の種類は、片側アレルのみでゲノム編集される割合が向上することから、ポリＣ（全てシトシン残基）又はポリＧ（全てグアニン残基）であることが好ましく、ポリＣであることがより好ましい。
後述の（ａ３）の発現ベクターのように、（ａ１）のガイドＲＮＡをコードする発現ベクターを用いる場合、付加ポリヌクレオチド残基は、通常、使用するプロモーターからの転写がストップするターミネーター配列の相補配列を含まない。例えば、Ｕ６プロモーターを用いる場合、チミンが５個連続すると転写がストップするため、付加ヌクレオチド残基は、通常、５個以上連続するウラシルの配列を含まない。
【００４６】
≪（ａ２）のガイドＲＮＡ≫
（ａ２）のガイドＲＮＡは、標的配列に対して１塩基又は複数塩基のミスマッチを有するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡである。当該ガイドＲＮＡを用いてゲノム編集を行うことにより、片側アレルのみでゲノム編集される割合が向上し、片側アレルのみがゲノム編集された細胞を製造することができる。
【００４７】
（ａ２）のガイドＲＮＡのスペーサー配列は、任意の標的配列に対して１塩基又は複数塩基のミスマッチを有する。複数塩基のミスマッチは、例えば、２〜５塩基のミスマッチであり、２〜４塩基のミスマッチが好ましく、２又は３塩基のミスマッチがより好ましく、２塩基のミスマッチがさらに好ましい。スペーサー配列の長さは、上記（ａ１）のガイドＲＮＡと同様であるが、２０塩基が特に好ましい。
スペーサー配列が標的配列に対して１塩基又は複数塩基のミスマッチを有する位置は、特に限定されない。例えば、スペーサー配列が２０塩基である場合、３’末端側から５’末端側に数えて１〜２０番目の塩基のいずれにミスマッチがあってもよく、例えば１〜１７番目の塩基にミスマッチを有することができる。スペーサー配列が前記範囲に１塩基ミスマッチを有することにより、片側アレルのみでゲノム編集される割合をより高めることができる。一例として、３’末端側から５’末端側に数えて２〜６番目、８〜９播目、及び１５〜１７番目からなる群より選択される１塩基又は複数塩基にミスマッチを有することができる。
【００４８】
ミスマッチ塩基における塩基は、標的配列における塩基と異なる塩基であれば、特に限定されない。スペーサー配列におけるミスマッチ塩基は、例えば、標的配列における塩基がプリン塩基（アデニン又はグアニン）であれば、ピリミジン塩基（シトシン又はウラシル）とすることができる。同様に、スペーサー配列におけるミスマッチ塩基は、例えば、標的配列における塩基がピリミジン塩基（シトシン又はチミン）であれば、プリン塩基（アデニン又はグアニン）とすることができる。例えば、スペーサー配列におけるミスマッチ塩基は、標的配列における塩基がアデニンであればウラシル、標的配列における塩基がチミンであればアデニン、標的配列における塩基がグアニンであればシトシン、標的配列における塩基がシトシンであればグアニン、とすることができる。
【００４９】
≪（ａ１）及び（ａ２）の特徴を有するガイドＲＮＡ（ａ１２）≫
本実施形態の製造方法に用いるガイドＲＮＡは、上記（ａ１）及び（ａ２）のガイドＲＮＡの特徴を併せ持つものであってもよい。すなわち、ガイドＲＮＡは、スペーサー配列の５’末端に１個以上のヌクレオチド残基が付加され、且つ前記スペーサー配列が、標的配列に対して１塩基又は複数塩基のミスマッチを有するスペーサー配列である、ガイドＲＮＡであってもよい。
上記（ａ１）及び（ａ２）の特徴を併せ持つことにより、片側アレルのみでゲノム編集される割合を向上させることができる。付加ヌクレオチド残基の数及び種類は、上記「≪（ａ１）のガイドＲＮＡ≫」で挙げたものと同様である。また、ミスマッチ塩基の位置及び種類は、上記≪（ａ２）のガイドＲＮＡ≫」で挙げたものと同様である。
【００５０】
≪（ａ３）ガイドＲＮＡの発現ベクター≫
本実施形態の製造方法では、上記（ａ１）、（ａ２）又は（ａ１２）のガイドＲＮＡに代えて、上記（ａ１）、（ａ２）又は（ａ１２）のガイドＲＮＡの発現ベクターを用いてもよい。好ましい態様において、本実施形態の製造方法は、上記（ａ１）、（ａ２）又は（ａ１２）のガイドＲＮＡの発現ベクターを用いる。
【００５１】
上記（ａ１）、（ａ２）又は（ａ１２）のガイドＲＮＡの発現ベクターは、上記（ａ１）、（ａ２）又は（ａ１２）のガイドＲＮＡをコードする配列と、前記ガイドＲＮＡコード配列の発現を制御するプロモーターを含んでいることが好ましい。発現ベクターにおいて、ガイドＲＮＡコード配列は、プロモーターに機能的に連結している。
【００５２】
プロモーターは、特に限定されず、例えば、ｐｏｌ  ＩＩ系プロモーターを使用することもできるが、比較的短いＲＮＡの転写をより正確に行わせるという観点から、ｐｏｌ  
ＩＩＩ系プロモーターが好ましい。ｐｏｌ  ＩＩＩ系プロモーターとしては、特に制限されないが、例えばマウス及びヒトのＵ６−ｓｎＲＮＡプロモーター、ヒトＨ１−ＲＮａｓｅ  Ｐ  ＲＮＡプロモーター、ヒトバリン−ｔＲＮＡプロモーター等が挙げられる。Ｕ６プロモーターを用いる場合、転写開始のためにガイドＲＮＡの５’末端が「Ｇ」であることが好ましい。そのため、ガイドＲＮＡが上記（ａ１）又は（ａ１２）のガイドＲＮＡである場合、スペーサー配列の５’末端に付加した５〜５０個のヌクレオチド残基の５’末端にさらに「Ｇ」を付加することが好ましい。また、ガイドＲＮＡが上記（ａ２）のガイドＲＮＡである場合、５’末端が「Ｇ」であるスペーサー配列を選択するか、スペーサー配列の５’末端に「Ｇ」を付加することが好ましい。
【００５３】
発現ベクターは、ガイドＲＮＡのコード配列及びプロモーターの他に、所望によりエンハンサー、ポリＡ付加シグナル、マーカー遺伝子、複製開始点、複製開始点に結合して複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子等を含んでいてもよい。「マーカー遺伝子」とは、該マーカー遺伝子を細胞に導入することにより、細胞の選別や選択を可能とするような遺伝子を指す。マーカー遺伝子の具体例としては、例えば、薬剤耐性遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、発光酵素遺伝子、発色酵素遺伝子等が挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。前記薬剤耐性遺伝子の具体例としては、例えば、ピューロマイシン耐性遺伝子、ジェネティシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子等が挙げられる。前記蛍光タンパク質遺伝子の具体例としては、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）遺伝子、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）遺伝子等が挙げられる。前記発光酵素遺伝子の具体例としては、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子などが挙げられる。前記発色酵素遺伝子の具体例としては、例えば、βガラクトシターゼ遺伝子、βグルクロニダーゼ遺伝子、アルカリフォスファターゼ遺伝子等が挙げられる。
【００５４】
発現ベクターの種類は、特に限定されず、公知の発現ベクターを用いることができる。
発現ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、及びウイルスベクター等が挙げられる。
【００５５】
プラスミドベクターは、ゲノム編集対象となる細胞内で発現可能なプラスミドベクターであれば、特に限定されない。例えば、動物細胞である場合、動物細胞発現用プラスミドベクターとして、一般的に用いられているものを用いることができる。動物細胞発現用プラスミドベクターとしては、例えば、ｐＸ４５９、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）ベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ポリオウイルスベクター、シルビスウイルスベクター、ラブドウイルスベクター、パラミクソウイルスベクター、オルソミクソウイルスベクター等が挙げられる。
【００５７】
中でも、発現ベクターとしては、プラスミドベクターが好ましい。
【００５８】
＜（Ｂ）Ｃａｓタンパク質＞
≪Ｃａｓタンパク質≫
Ｃａｓタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて用いられるものであれば、特に限定されない。例えば、ガイドＲＮＡと複合体を形成し、ガイドＲＮＡにより標的領域に誘導されて、標的領域のＤＮＡを２本鎖切断できるものを各種使用することができる。
本実施形態の製造方法において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質が好ましく、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９タンパク質がより好ましい。
【００５９】
Ｃａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡと複合体を形成し、エンドヌクレアーゼ活性又はニッカーゼ活性を示す（以下、「Ｃａｓタンパク質活性」という）ものであれば、野生型Ｃａｓタンパク質の変異体であってもよい。Ｃａｓタンパク質の変異体としては、例えば、以下の（ｂ１）又は（ｂ２）のタンパク質が例示される。
（ｂ１）野生型Ｃａｓタンパク質のアミノ酸配列と、例えば８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つＣａｓタンパク質活性を有するタンパク質。
（ｂ２）野生型Ｃａｓタンパク質のアミノ酸配列に対して１個若しくは複数個（例えば２〜１００個、好ましくは２〜５０個、より好ましくは２〜２０個、さらに好ましくは２〜１０個、よりさらに好ましくは２〜５個、特に好ましくは２個）のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つＣａｓタンパク質活性を有するタンパク質。
【００６０】
≪Ｃａｓタンパク質の発現ベクター≫
本実施形態の製造方法では、上記Ｃａｓタンパク質に代えて、Ｃａｓタンパク質の発現ベクターを用いてもよい。好ましい態様において、本実施形態の製造方法は、Ｃａｓタンパク質の発現ベクターを用いる。
【００６１】
Ｃａｓタンパク質の発現ベクターは、Ｃａｓタンパク質のコード配列と、前記Ｃａｓタンパク質コード配列の発現を制御するプロモーターを含んでいることが好ましい。発現ベクターにおいて、Ｃａｓタンパク質コード配列は、プロモーターに機能的に連結している。
【００６２】
プロモーターは、特に限定されず、例えば、ｐｏｌ  ＩＩ系プロモーターを各種使用することができる。ｐｏｌ  ＩＩ系プロモーターとしては、特に制限されないが、例えばＣＭＶプロモーター、ＥＦ１プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＳＣＶプロモーター、ｈＴＥＲＴプロモーター、βアクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＣＢｈプロモーター等が挙げられる。
【００６３】
発現ベクターは、Ｃａｓタンパク質コード配列及びプロモーターの他に、所望によりエンハンサー、ポリＡ付加シグナル、マーカー遺伝子、複製開始点、複製開始点に結合して複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子等を含んでいてもよい。マーカー遺伝子としては、上記と同様のものが挙げられる。
【００６４】
発現ベクターの種類は、特に限定されず、公知の発現ベクターを用いることができる。
発現ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、及びウイルスベクター等が挙げられる。これらのベクターとしては、上記と同様のものが例示される。
中でも、発現ベクターとしては、プラスミドベクターが好ましい。
【００６５】
発現ベクターに含まれるＣａｓタンパク質コード配列は、当該発現ベクターを導入する細胞が由来する生物種に応じて、コドン最適化されていてもよい。一般に、コドン最適化とは、元のアミノ酸配列を維持しつつ、元の塩基配列の少なくとも１つのコドンを、対象の生物種においてより頻繁に使用されるコドンで置き換えることを指す。コドン使用頻度表は、例えば、公益財団法人かずさＤＮＡ研究所が提供する「Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  
Ｄａｔａｂａｓｅ」（ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／）において容易に入手可能であり、これらの表を用いて、コドンを最適化することができる。特定の動物種における発現のために特定の配列をコドン最適化するためのコンピューターアルゴリズムについても、例えば、Ｇｅｎｅ  Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ社；Ｊａｃｏｂｕｓ、ＰＡ）等において入手可能である。
【００６６】
ガイドＲＮＡの発現ベクターと、Ｃａｓタンパク質の発現ベクターとは、同一の発現ベクターであってもよい。すなわち、本実施形態の製造方法では、ガイドＲＮＡコード配列と、Ｃａｓタンパク質コード配列とを、それぞれ発現可能な状態で含む発現ベクターを用いることができる。当該発現ベクターにおいて、ガイドＲＮＡコード配列と、Ｃａｓタンパク質コード配列とは、それぞれ異なるプロモーターに機能的に連結されていることが好ましい。
【００６７】
＜導入工程＞
本実施形態の製造方法では、（Ａ）上記（ａ１）、（ａ２）若しくは（ａ１２）のガイドＲＮＡ又はその発現ベクター、及び（Ｂ）Ｃａｓタンパク質又はその発現ベクターを、細胞に導入する工程を含む。
【００６８】
上記（Ａ）及び（Ｂ）を導入する細胞は、特に限定されず、ゲノム編集の対象とする所望の細胞を用いることができる。細胞が由来する生物は、特に限定されず、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ、ヒツジ等の哺乳類動物；ニワトリ等の鳥類動物；ヘビ、トカゲ等の爬虫類動物；アフリカツメガエル等の両生類動物；ゼブラフィッシュ、メダカ、トラフグ等の魚類動物；ホヤ等の脊索動物；ショウジョウバエ、カイコ等の節足動物；等の動物；シロイヌナズナ、イネ、コムギ、タバコ等の植物；酵母、アカパンカビ等の菌類；大腸菌、枯草菌、藍藻等の細菌等が挙げられる。
細胞の種類は、特に限定されず、例えば、各種組織由来又は各種性質の細胞、例えば血液細胞、造血幹細胞・前駆細胞、配偶子（精子、卵子）、受精卵、線維芽細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、神経細胞、肝細胞、ケラチン生成細胞、筋細胞、表皮細胞、内分泌細胞、組織幹細胞、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、がん細胞等が挙げられる。また、鎌形赤血球症、ハンチントン舞踏病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、進行性骨化性線維異形成症（ＦＯＰ）等の各種遺伝性疾患を有する細胞等が挙げられる。
【００６９】
上記（Ａ）及び（Ｂ）の導入方法は、特に限定されず、対象細胞、材料の種類（核酸であるのか、タンパク質であるのか等）に応じて、適宜選択することができる。
発現ベクターの細胞への導入方法としては、例えば、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、遺伝子銃法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法などが挙げられる。発現ベクターがウイルスベクターである場合には、ウイルスベクターを細胞に感染させる方法としては、例えば、ポリブレン法が挙げられる。
【００７０】
ＲＮＡを細胞に導入する方法は、特に限定されず、公知の方法を適宜選択して用いることができる。例えば、ＲＮＡは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）などの、市販のＲＮＡトランスフェクション試薬などを用いることができる。
【００７１】
タンパク質を細胞に導入する方法は、特に限定されず、公知の方法を適宜選択して用いることができる。そのような方法としては、例えば、タンパク質導入試薬を用いる方法、タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）融合タンパク質を用いる方法、マイクロインジェクション法などが挙げられる。
【００７２】
上記（Ａ）及び（Ｂ）は、同時に細胞に導入してもよく、逐次的に導入してもよく、又は一定期間を空けて別々に導入してもよい。好ましい態様において、上記（Ａ）及び（Ｂ）は、同時に細胞に導入される。
【００７３】
＜任意工程＞
本実施形態の製造方法は、上記導入工程に加えて、任意の工程を含んでいてもよい。任意の工程としては、例えば、（Ｃ）ドナーベクターを細胞に導入する工程が挙げられる。
【００７４】
≪（Ｃ）ドナーベクター≫
ドナーベクターは、ホモロジーアームとして標的領域に隣接する塩基配列を含む。ドナーベクターは、５’アームと３’アームとの間に所望の塩基配列（以下、「ノックイン配列」という場合がある）を含むことができる。ノックイン配列は、特に限定されず、任意の配列とすることができる。ノックイン配列は、例えば、遺伝子ノックアウト用の配列であってもよく、塩基置換用の配列であってもよく、任意の遺伝子配列であってもよい。ノックイン配列が、任意の遺伝子配列である場合、セーフ・ハーバー領域内に標的配列を設定することが好ましい。
【００７５】
ドナーベクターは、環状ＤＮＡベクター（例えばプラスミドベクター）であってもよく、線状ＤＮＡベクターであってもよい。ドナーベクターは、ホモロジーアーム及びノックイン配列に加えて、他の配列を含んでいてもよい。他の配列としては、例えば、マーカー遺伝子、複製開始点、複製開始点に結合して複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子等が挙げられる。マーカー遺伝子としては、上記と同様のものが挙げられる。
【００７６】
ドナーベクターの導入方法は、特に限定されず、対象細胞に応じて、適宜選択することができる。ドナーベクターの細胞への導入方法としては、例えば、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、遺伝子銃法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法などが挙げられる。
【００７７】
ドナーベクターは、上記（Ａ）及び（Ｂ）と同時に細胞に導入してもよく、逐次的に導入してもよく、又は（Ａ）及び（Ｂ）の導入後に一定期間を空けて導入してもよい。好ましい態様において、ドナーベクターは、上記（Ａ）及び（Ｂ）は、同時に細胞に導入される。
【００７８】
≪培養工程≫
任意の工程は、上記（Ａ）及び（Ｂ）、並びに必要に応じて上記（Ｃ）を細胞に導入後、細胞を培養する工程であってもよい。細胞の培養は、細胞の種類に応じて、適切な培養条件下で行えばよい。上記（Ａ）、（Ｂ）及び／又は（Ｃ）が、薬剤耐性マーカーを含むベクターである場合には、培養は、当該薬剤の存在下で行ってもよい。当該薬剤の存在下で培養を行うことにより、ゲノム編集された細胞を効率よく選択することができる。また、細胞培養液の希釈又はプレーティング等により、細胞のクローン化を行ってもよい。
【００７９】
≪ゲノム編集パターン解析工程≫
任意の工程は、前記（Ａ）及び（Ｂ）、並びに必要に応じて上記（Ｃ）を細胞に導入後、ゲノム編集パターンを解析する工程であってもよい。
ゲノム編集パターンの解析方法は特に限定されないが、上記導入工程後、例えば、適宜、培養工程を行った後、細胞培養液のプレーティングを行い、生じたコロニーからＤＮＡを抽出して標的領域の配列解析を行う方法等が挙げられる。
両アレルの標的領域の配列解析を行うことにより、当該細胞が、片側アレルのみがゲノム編集された細胞であるか否かを確認することができる。
【００８０】
本実施形態の製造方法は、ガイドＲＮＡとして、（ａ１）スペーサー配列の５’末端に１個以上のヌクレオチド残基が付加されたガイドＲＮＡ、又は（ａ２）標的配列に対して１塩基又は複数塩基のミスマッチを有するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡを用いることにより、ゲノム編集の際に、片側アレルのみでゲノム編集された細胞の割合を高めることができる。そのため、本実施形態の製造方法によれば、片側アレルのみでゲノム編集された細胞を効率よく製造することができる。また、本実施形態の製造方法によれば、ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９等の導入に起因する細胞毒性を抑制することができる。
【００８１】
他の態様において、本発明は、（Ａ）（ａ１）スペーサー配列の５’末端に１個以上のヌクレオチド残基が付加されたガイドＲＮＡ、（ａ２）標的配列に対して１塩基又は複数塩基のミスマッチを有するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ、及び（ａ３）前記（ａ１）若しくは前記（ａ２）のガイドＲＮＡの発現ベクターからなる群より選択される少なくとも１種と、（Ｂ）Ｃａｓタンパク質及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも１種と、を細胞に導入する工程を含む、片側アレルのみをゲノム編集する方法、を提供する。
【００８２】
［ガイドＲＮＡ、ベクター、キット］
１実施形態において、本発明は、スペーサー配列の５’末端に１個以上のヌクレオチド残基が付加されたガイドＲＮＡを提供する。
本実施形態のガイドＲＮＡは、上記［片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法］＜（Ａ）ガイドＲＮＡ＞の項で説明した（ａ１）のガイドＲＮＡと同様である。
本実施形態のガイドＲＮＡは、そのスペーサー配列が、標的配列に対して１塩基又は複数塩基のミスマッチを有する配列であることが好ましい。すなわち、上記（ａ１２）のガイドＲＮＡであることが好ましい。
【００８３】
１実施形態において、本発明は、スペーサー配列の５’末端に１個以上のヌクレオチド残基が付加されたガイドＲＮＡの発現ベクターを提供する。
本実施形態の発現ベクターは、上記［片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法］＜（Ａ）ガイドＲＮＡ＞の項で説明した（ａ１）又は（ａ１２）のガイドＲＮＡの発現ベクターと同様である。
本実施形態の発現ベクターは、さらに、Ｃａｓタンパク質コード配列（好ましくは、Ｃａｓ９タンパク質コード配列）を発現可能な状態で含んでいてもよい。
【００８４】
１実施形態において、本発明は、（Ａ）（ａ１）スペーサー配列の５’末端に１個以上のヌクレオチド残基が付加されたガイドＲＮＡ、（ａ２）標的配列に対して１塩基又は複数塩基のミスマッチを有するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ、及び（ａ３）前記（ａ１）若しくは前記（ａ２）のガイドＲＮＡの発現ベクターからなる群より選択される少なくとも１種を含む、片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造キットを提供する。前記製造キットは、さらに、（Ｂ）Ｃａｓタンパク質及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも１種、を含むことが好ましい。
（ａ１）及び（ａ２）のガイドＲＮＡは、上記［片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法］＜（Ａ）ガイドＲＮＡ＞の項で説明した（ａ１）及び（ａ２）のガイドＲＮＡと同様である。ガイドＲＮＡは、上記（ａ１２）のガイドＲＮＡであってもよい。
（ａ３）の発現ベクターは、上記［片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法］＜（Ａ）ガイドＲＮＡ＞の項で説明した（ａ３）のガイドＲＮＡの発現ベクターと同様である。
（Ｂ）のＣａｓタンパク質及びその発現ベクターは、上記［片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法］＜（Ｂ）Ｃａｓタンパク質＞の項で説明したものと同様である。
（Ａ）及び（Ｂ）が発現ベクターである場合、ガイドＲＮＡコード配列及びＣａｓタンパク質コード配列は、同一の発現ベクターに、それぞれ発現可能な状態で含まれていてもよい。
本実施形態のキットは、前記（Ａ）及び（Ｂ）に加えて、他の構成を備えていてもよい。他の構成は、特に制限されず、例えば、片側アレルのみがゲノム編集された細胞を作製するための説明書や、発現ベクターを細胞に導入するために用いる試薬等が挙げられる。
【００８５】
［ゲノム編集パターンの予測方法］
１実施形態において、本発明は、（ｉ）ガイドＲＮＡ若しくはその発現ベクター、及びＣａｓタンパク質若しくはその発現ベクターを細胞に導入してゲノム編集を行う工程、（ｉｉ）前記ゲノム編集を行った細胞からＤＮＡを抽出する工程、（ｉｉｉ）前記ＤＮＡから標的領域を含むＤＮＡ断片を増幅する工程、（ｉｖ）前記増幅したＤＮＡ断片の配列解析を行い、前記標的領域へのｉｎｄｅｌ誘導率（Ｐ）を求める工程、及び（ｖ）下記式（ｍ）若しくは（ｍ１）及び（ｂ）若しくは（ｂ１）により、片側アレルのみへのｉｎｄｅｌ誘導率（ｍｏｎｏ）及び両側アレルへのｉｎｄｅｌ誘導率（ｂｉ）を求める工程、を含む、ゲノム編集パターンの予測方法を提供する。
ｍｏｎｏ＝２×Ｐ×（１−Ｐ）  ・・・（ｍ）
ｂｉ＝Ｐ２                    ・・・（ｂ）
ｍｏｎｏ＝−１．３０３Ｐ２＋１．２７６１Ｐ＋０．０２７４  ・・・（ｍ１）
ｂｉ＝０．６５１５Ｐ２＋０．３６１９Ｐ−０．０１３７  ・・・（ｂ１）
【００８６】
＜工程（ｉ）＞
工程（ｉ）は、ガイドＲＮＡ若しくはその発現ベクター、及びＣａｓタンパク質若しくはその発現ベクターを細胞に導入してゲノム編集を行う工程である。
【００８７】
ガイドＲＮＡは、特に限定されず、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムで使用可能なガイドＲＮＡを用いればよい。スペーサー配列は、任意の標的配列を標的配列とするスペーサー配列であればよく、特に限定されない。
ガイドＲＮＡの発現ベクターは、上記［片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法］＜（Ａ）ガイドＲＮＡ＞の項で説明した発現ベクターと同様に作製することができる。
【００８８】
Ｃａｓタンパク質は、特に限定されず、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムで使用可能なＣａｓタンパク質を用いればよい。Ｃａｓタンパク質は、好ましくはＣａｓ９タンパク質であり、より好ましくはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９タンパク質である。
Ｃａｓタンパク質の発現ベクターは、上記［片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法］＜（Ｂ）Ｃａｓタンパク質＞の項で説明した発現ベクターと同様に作製することができる。
【００８９】
ガイドＲＮＡ及びＣａｓタンパク質、又はそれらの発現ベクターの細胞への導入は、上記［片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法］＜導入工程＞で説明した方法と同様に行うことができる。
細胞への導入後は、適宜、培養を行ってもよい。ガイドＲＮＡ及びＣａｓタンパク質の発現ベクターを細胞に導入し、当該発現ベクターが薬剤耐性マーカーを有する場合には、当該薬剤の存在下で細胞を培養することにより、発現ベクターが導入された細胞を選択してもよい。
【００９０】
＜工程（ｉｉ）＞
工程（ｉｉ）は、工程（ｉ）でゲノム編集を行った細胞からＤＮＡを抽出する工程である。
【００９１】
ＤＮＡの抽出方法は、特に限定されず、公知のＤＮＡ抽出方法を用いればよい。ＤＮＡ抽出方法としては、例えば、フェノール・クロロホルム抽出法、アルカリ条件下で加熱する方法（例えば、５０ｍＭ  ＮａＯＨ存在下で９９℃１０分など）等を挙げることができる。また、市販のＤＮＡ抽出キット等も利用可能である。
【００９２】
＜工程（ｉｉｉ）＞
工程（ｉｉｉ）は、工程（ｉｉ）で抽出したＤＮＡから標的領域を含むＤＮＡ断片を増幅する工程である。
【００９３】
標的領域の増幅方法は、特に限定されず、公知の核酸断片増幅方法を用いればよい。核酸断片増幅方法としては、例えば、ＰＣＲ法、等温増幅法等が挙げられる。例えば、標的領域を増幅可能なプライマーを設計し、ＰＣＲ法又は等温増幅法等により、標的領域のＤＮＡ断片を増幅することができる。
増幅ＤＮＡ断片の長さは、標的領域を含む限り、特に限定されないが、例えば、２０〜１０００ｂｐ程度、通常３５０〜７５０ｂｐ程度とすることができる。
【００９４】
増幅ＤＮＡ断片は、市販のクローニングベクター等を用いて、クローニングしてもよい。さらに、増幅ＤＮＡ断片を挿入したクローニングベクターを大腸菌等に導入し、当該大腸菌を培養してコロニーを形成させてもよい。そのようにして得られたコロニーからＤＮＡを抽出し、工程（ｉｖ）における配列解析に供してもよい。配列解析を行うコロニー数は、特に限定されないが、例えば、１０〜２００個程度、２０〜１００個程度、又は２０〜５０個程度等とすることができる。
【００９５】
＜工程（ｉｖ）＞
工程（ｉｖ）は、工程（ｉｉｉ）で増幅したＤＮＡ断片の配列解析を行い、標的領域へのｉｎｄｅｌ誘導率（Ｐ）を求める工程である。
【００９６】
ＤＮＡ断片の配列解析の方法は、特に限定されず、公知の配列解析方法を用いればよい。配列解析には、市販のシークエンサーを用いることができ、製造業者の推奨する方法に従ってＤＮＡシークエンシングを行うことができる。また、増幅したＤＮＡ断片におけるｉｎｄｅｌの有無の解析は、Ｔ７Ｅ１アッセイにより行ってもよく、シークエンサーによる配列解析とＴ７Ｅ１アッセイとを併用してもよい。
【００９７】
標的領域へのｉｎｄｅｌ誘導率（Ｐ）は、配列解析の結果に基づき、以下の式（ｐ）により算出することができる。
【００９８】
【数１】
2020122195.tif 000002
【００９９】
＜工程（ｖ）＞
工程（ｖ）は、下記式（ｍ）及び（ｂ）により、片側アレルのみへのｉｎｄｅｌ誘導率（ｍｏｎｏ）及び両側アレルへのｉｎｄｅｌ誘導率（ｂｉ）を求める工程である。
ｍｏｎｏ＝２×Ｐ×（１−Ｐ）  ・・・（ｍ）
ｂｉ＝Ｐ２                    ・・・（ｂ）
【０１００】
上記式（ｍ）及び（ｂ）に替えて、下記式（ｍ１）及び（ｂ１）を用いてもよい。
ｍｏｎｏ＝−１．３０３Ｐ２＋１．２７６１Ｐ＋０．０２７４  ・・・（ｍ１）
ｂｉ＝０．６５１５Ｐ２＋０．３６１９Ｐ−０．０１３７  ・・・（ｂ１）
【０１０１】
工程（ｉｖ）で求めたｉｎｄｅｌ誘導率（Ｐ）の値を、上記式（ｍ）若しくは（ｍ１）及び（ｂ）若しくは（ｂ１）に代入することにより、片側アレルのみへのｉｎｄｅｌ誘導率（ｍｏｎｏ）及び両側アレルへのｉｎｄｅｌ誘導率（ｂｉ）をそれぞれ求めることができる。後述する実施例で示されるように、本実施形態の方法により求められるｉｎｄｅｌ誘導率（ｍｏｎｏ）及びｉｎｄｅｌ誘導率（ｂｉ）の値は、実際の試験により確認されたそれぞれのｉｎｄｅｌ誘導率と近似している。
【０１０２】
本実施形態の予測方法によれば、簡易な操作で、片側アレルのみへのｉｎｄｅｌ誘導率及び両側アレルへのｉｎｄｅｌ誘導率を予測することができる。したがって、任意のガイドＲＮＡを用いて本実施形態の予測方法を実施することにより、当該ガイドＲＮＡを用いたゲノム編集によるゲノム編集パターンを予測することができる。
【０１０３】
［ＡＩＭＳ細胞］
１実施形態において、本発明は、一方のアレルに、局在化タンパク質コード配列と、切断部位コード配列と、第１の蛍光タンパク質コード配列と、がこの順にインフレームで連結されたキメラ遺伝子を含み、他方のアレルに、前記局在化タンパク質コード配列と、前記切断部位コード配列と、第２の蛍光タンパク質コード配列と、がこの順にインフレームで連結されたキメラ遺伝子を含む、細胞を提供する。なお、本明細書において、「第１の」および「第２の」という用語は便宜的な記載である。
【０１０４】
本実施形態の細胞は、後述するＡＩＭＳによるゲノム編集パターンの解析に使用することができる細胞（ＡＩＭＳ細胞）である。本実施形態の細胞を用いれば、両側アレルでゲノム編集が誘導されたか、片側アレルのみでゲノム編集が誘導されたか、を簡易に調べることができる。
【０１０５】
＜局在化タンパク質コード配列＞
局在化タンパク質は、ゲノム編集の対象となる細胞に応じて、適宜選択することができる。局在化タンパク質は、細胞内で局在するタンパク質であれば、天然のタンパク質であってもよく、人工タンパク質（例えば、天然局在化タンパク質の変異型タンパク質や切断型タンパク質、局在化シグナルを含むペプチドなど）であってもよい。局在化タンパク質が天然タンパク質である場合、前記天然タンパク質は、対象細胞の内因性タンパク質であってもよく、外因性タンパク質（他の生物由来の局在化タンパク質）であってもよい。局在化タンパク質は、対象細胞の内因性タンパク質であって、常に発現しているタンパク質であることが好ましい。局在化タンパク質は、核局在化タンパク質であってもよく、細胞膜局在化タンパク質であってもよい。
【０１０６】
ヒト細胞である場合、核局在化タンパク質としては、例えば、各種転写因子、各種転写調節因子等が挙げられる。具体例としては、ＴＢＸ３タンパク質などのＴＢＸファミリー、ＳＯＸ２タンパク質などのＳＯＸファミリー等が挙げられる。また、細胞膜局在化タンパク質としては、例えば、各種細胞膜レセプター、各種細胞膜抗原等が挙げられる。具体例としては、Ｅ−カドヘリンなどのカドヘリンファミリー、ＳＳＥＡ４などのＳＳＥＡファミリー等が挙げられる。
【０１０７】
局在化タンパク質コード配列は、局在化タンパク質をコードする塩基配列を有する限り特に限定されず、サイレント変異を含んでいてもよい。局在化タンパク質コード配列は、内因性局在化タンパク質の内在性遺伝子配列を利用したものであってもよく、外来性ＤＮＡであってもよい。局在化タンパク質コード配列が外来性ＤＮＡ（例えば、外因性天然局在化タンパク質コード配列、人工局在化タンパク質コード配列など）である場合、当該局在化タンパク質コード配列は、対象細胞で構成的に発現するプロモーターに機能的に連結されたものであってもよい。
【０１０８】
＜切断部位＞
切断部位は、特に限定されないが、例えば、自己切断部位又はエンドペプチダーゼ切断部位が挙げられ、具体例としては、２Ａペプチドコード配列が例示される。
２Ａペプチドは、特に限定されず、公知の２Ａペプチド又は２Ａ様ペプチドを用いることができる。例えば、Ｐ２Ａペプチド、Ｆ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド、及びＴ２Ａペプチドからなる群より選択される２Ａペプチドを用いることができる。
切断部位が、リボソームスキップのような自己切断配列又はペプチダーゼ認識配列のようなアミノ酸配列をコードする場合、サイレント変異を含んでいてもよい。例えば、２Ａペプチドコード配列は、２Ａペプチドをコードする塩基配列を有する限り特に限定されず、サイレント変異を含んでいてもよい。また、２Ａペプチドコード配列は、対象細胞に応じて、コドン最適化されたものであってもよい。２Ａペプチドコード配列の具体例として、Ｐ２Ａペプチドコード配列、及び前記Ｐ２Ａペプチドコード配列にサイレント変異を含むコード配列（ａＰ２Ａ）を、それぞれ配列番号１４及び配列番号１５に示す。
【０１０９】
＜第１の蛍光タンパク質コード配列＞
第１の蛍光タンパク質は、特に限定されず、公知の蛍光タンパク質を用いることができる。蛍光タンパク質としては、例えば、Ｓｉｒｉｕｓ、ＢＦＰ、ＥＢＦＰ、ＥＣＦＰ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ＴａｇＣＦＰ、ＡｍＣｙａｎ、ｍＴＦＰ１、ＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉＣｙａｎ、ＣＦＰ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＴａｇＧＦＰ、Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＥｍＧＦＰ、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＧＦＰ２、ＨｙＰｅｒ、ＴａｇＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ−ｍ、ＴｕｒｂｏＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ｍＢａｎａｎａ、ＫｕｓａｂｉｒａＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ、ＴｕｒｂｏＲＦＰ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＴａｇＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＡｓＲｅｄ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＴｕｒｂｏＦＰ６０２、ＲＦＰ、ＥＲＦＰ、ｍＲＦＰ１、ＪＲｅｄ、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＨｃＲｅｄ、ＫｅｉｍａＲｅｄ、ＴｕｒｂｏＦＰ６５０、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＰｌｕｍ、ＰＳ−ＣＦＰ、Ｄｅｎｄｒａ２、Ｋａｅｄｅ、ＥｏｓＦＰ、ＫｉｋｕｍｅＧＲ等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１０】
第１の蛍光タンパク質コード配列は、蛍光タンパク質をコードする塩基配列を有する限り特に限定されず、サイレント変異を含んでいてもよい。また、対象細胞に応じて、コドン最適化されたものであってもよい。蛍光タンパク質コード配列の具体例として、ｔｄＴｏｍａｔｏコード配列、及びＶｅｎｕｓコード配列を、それぞれ配列番号１６及び配列番号１７に示す。
【０１１１】
＜第２の蛍光タンパク質コード配列＞
第２の蛍光タンパク質は、第１の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質である。第２の蛍光タンパク質は、第１の蛍光タンパク質と異なるものである限り、特に限定されず、公知の蛍光タンパク質を用いることができる。蛍光タンパク質としては、上記第１の蛍光タンパク質で例示したものと同様のものが挙げられる。第２の蛍光タンパク質は、第１の蛍光タンパク質と蛍光波長が異なるものが好ましい。
【０１１２】
第２の蛍光タンパク質コード配列は、蛍光タンパク質をコードする塩基配列を有する限り特に限定されず、サイレント変異を含んでいてもよい。また、対象細胞に応じて、コドン最適化されたものであってもよい。
【０１１３】
＜キメラ遺伝子＞
本実施形態の細胞は、一方のアレル（以下、「第１アレル」という場合がある）に、局在化タンパク質コード配列と、切断部位（例えば、２Ａペプチドコード配列）と、第１の蛍光タンパク質コード配列と、がこの順にインフレームで連結されたキメラ遺伝子（以下、「第１のキメラ遺伝子」という場合がある）を含んでいる。他方のアレル（以下、「第２アレル」という場合がある）には、局在化タンパク質コード配列と、切断部位（例えば、２Ａペプチドコード配列）と、第２の蛍光タンパク質コード配列と、がこの順にインフレームで連結されたキメラ遺伝子（以下、「第２のキメラ遺伝子」という場合がある）を含んでいる。
第１のキメラ遺伝子及び第２のキメラ遺伝子が有する切断部位（例えば、２Ａペプチドコード配列）は、同一のものである。第１のキメラ遺伝子及び第２のキメラ遺伝子が有する局在化タンパク質コード配列は、同一であることが好ましい。
【０１１４】
好ましい態様において、第１のキメラ遺伝子及び第２のキメラ遺伝子は、細胞の内在性局在化タンパク質遺伝子の遺伝子座に位置している。あるいは、第１のキメラ遺伝子及び第２のキメラ遺伝子は、セーフ・ハーバー領域内の同一座位に位置していてもよい。
第１のキメラ遺伝子及び第２のキメラ遺伝子は、細胞内において、それぞれ発現可能な状態で、第１アレル及び第２アレル上にそれぞれ存在している。
【０１１５】
＜ＡＩＭＳ細胞の作製方法＞
上記第１のキメラ遺伝子及び第２のキメラ遺伝子を含むＡＩＭＳ細胞は、ゲノム編集等の技術を用いて作製することができる。以下に、ＡＩＭＳ細胞の作製方法の具体例を記載するが、これに限定されるわけではない。
【０１１６】
まず、第１のキメラ遺伝子及び第２のキメラ遺伝子を対象細胞のゲノムにノックインするためのベクターとして、第１のキメラ遺伝子及び第２のキメラ遺伝子を含むドナーベクター（ノックインベクター）をそれぞれ作製する。ノックインベクターは、公知の方法により、作製することができる。ホモロジーアームは、キメラ遺伝子を挿入するゲノム上の位置に応じて適宜設計することができる。ホモロジーアームは、内在性局在化タンパク質遺伝子及び当該局在化タンパク質遺伝子に隣接する領域の塩基配列であることが好ましい。
【０１１７】
次いで、キメラ遺伝子をノックインする領域内の配列を標的配列とするガイドＲＮＡを設計する。ノックインベクターのホモロジーアームが、内在性局在化タンパク質遺伝子及び当該局在化タンパク質遺伝子に隣接する領域の塩基配列である場合、標的配列は、例えば、内在性局在化タンパク質遺伝子内の配列から選択される。
【０１１８】
次いで、前記ガイドＲＮＡ若しくはその発現ベクター、及びＣａｓタンパク質若しくはその発現ベクター、並びに第１のキメラ遺伝子のノックインベクター及び第２のキメラ遺伝子のノックインベクターを、細胞に導入する。ガイドＲＮＡ及びＣａｓタンパク質の発現ベクターを用いる場合、それらの発現ベクターは同一の発現ベクターであってもよい。
導入方法は、上記［片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法］＜導入工程＞の項で説明した方法と同様の方法が挙げられる。
細胞への導入後は、適宜、培養を行ってもよい。ガイドＲＮＡ及びＣａｓタンパク質の発現ベクターを細胞に導入し、当該発現ベクターが薬剤耐性マーカーを有する場合には、当該薬剤の存在下で細胞を培養することにより、発現ベクターが導入された細胞を選択してもよい。第１及び第２のキメラ遺伝子の各ノックインベクターが薬剤耐性マーカーを有する場合も、当該薬剤の存在下で細胞を培養することにより、ノックインベクターが導入された細胞を選択してもよい。
【０１１９】
次いで、第１の蛍光タンパク質及び第２の蛍光タンパク質の両方の蛍光が観察さる細胞を採取する。蛍光細胞の選別は、公知の方法で行うことができ、例えば、フローサイトメーター、蛍光顕微鏡等を用いて行うことができる。
取得した細胞は、ＰＣＲ等により、第１アレル及び第２アレルの各目的遺伝子座に、第１のキメラ遺伝子及び第２のキメラ遺伝子がそれぞれ挿入されていることを確認することができる。
【０１２０】
本実施形態の細胞では、第１のキメラ遺伝子及び第２のキメラ遺伝子から発現されるキメラタンパク質は、切断部位（例えば２Ａペプチド）で切断される。第１の蛍光タンパク質及び第２の蛍光タンパク質は、それぞれ局在化タンパク質から分離されるため、細胞内で局在化することなく、細胞全体に分布する（図１Ａ「ｗｔ」参照）。
一方、切断部位（例えば、２Ａペプチドコード配列）を標的としてゲノム編集を行った結果、切断部位（例えば、２Ａペプチドコード配列）にフレームシフトｉｎｄｅｌが生じると、蛍光タンパク質が生成されなくなる。そのため、フレームシフトｉｎｄｅｌが生じたアレルに導入された蛍光タンパク質の蛍光は消失する（図１Ａ「ｆｒａｍｅ−ｓｈｉｆｔ」参照）。
一方、切断部位（例えば２Ａペプチド）を標的としてゲノム編集を行った結果、切断部位（例えば、２Ａペプチドコード配列）にインフレームｉｎｄｅｌが生じると、２Ａペプチドでの切断が起こらなくなる。そのため、フレームシフトｉｎｄｅｌが生じたアレルに導入された蛍光タンパク質は、局在化タンパク質と分離されることなく、局在化タンパク質に従って局在化する（図１Ａ「ｉｎ−ｆｒａｍｅ」参照）。
【０１２１】
ＡＩＭＳ細胞の作製に用いられる対象細胞は、特に限定されず、所望の細胞を用いることができる。細胞が由来する生物は、特に限定されず、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ、ヒツジ等の哺乳類動物；ニワトリ等の鳥類動物；ヘビ、トカゲ等の爬虫類動物；アフリカツメガエル等の両生類動物；ゼブラフィッシュ、メダカ、トラフグ等の魚類動物；ホヤ等の脊索動物；ショウジョウバエ、カイコ等の節足動物；等の動物；シロイヌナズナ、イネ、コムギ、タバコ等の植物；酵母、アカパンカビ等の菌類；大腸菌、枯草菌、藍藻等の細菌等が挙げられる。
対象細胞の種類は、特に限定されず、例えば、各種組織由来又は各種性質の細胞、例えば血液細胞、造血幹細胞・前駆細胞、配偶子（精子、卵子）、受精卵、線維芽細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、神経細胞、肝細胞、ケラチン生成細胞、筋細胞、表皮細胞、内分泌細胞、組織幹細胞、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、がん細胞等が挙げられる。また、鎌形赤血球症、ハンチントン舞踏病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー等の各種遺伝性疾患を有する細胞等が挙げられる。
対象細胞は、初代培養細胞であっても、不死化処理が施された株化細胞であってもよい。株化細胞の例としては、ヒト由来のＨｅｌａ細胞、アフリカミドリザル由来のＣＯＳ７細胞、マウス由来の３Ｔ３細胞、ハムスター由来のＣＨＯ細胞、ラット由来のＰＣ１２細胞などが挙げられる。
【０１２２】
後述のゲノム編集パターンの解析方法では、本実施形態の細胞の上記特性を利用して、ゲノム編集パターンの解析を行う。
【０１２３】
［ゲノム編集パターンの解析方法］
１実施形態において、本発明は、（Ｉ）前記実施形態の細胞（ＡＩＭＳ細胞）に、前記切断部位（例えば、２Ａペプチドコード配列）を標的とするガイドＲＮＡ若しくはその発現ベクター、及びＣａｓタンパク質若しくはその発現ベクターを導入してゲノム編集を行う工程、（ＩＩ）前記工程（Ｉ）の後、前記細胞の蛍光パターンを解析する工程、並びに（ＩＩＩ）前記工程（ＩＩ）で解析した蛍光パターンに基づいて、ゲノム編集パターンを判定する工程を含む、ゲノム編集パターンの解析方法を提供する。
【０１２４】
本実施形態のゲノム編集パターンの解析方法は、上記ＡＩＭＳ細胞を用いることを特徴とする。上記ＡＩＭＳ細胞を用いることにより、簡易な方法で、ゲノム編集パターンを解析することができる。
【０１２５】
＜工程（Ｉ）＞
工程（Ｉ）は、ＡＩＭＳ細胞に、切断部位（例えば、２Ａペプチドコード配列）を標的とするガイドＲＮＡ若しくはその発現ベクター、及びＣａｓタンパク質若しくはその発現ベクターを導入してゲノム編集を行う工程である。
【０１２６】
切断部位（例えば、２Ａペプチドコード配列）を標的とするガイドＲＮＡは、使用するＡＩＭＳ細胞が有する切断部位（例えば、２Ａペプチドコード配列）の塩基配列に応じて、適宜設計することができる。例えば、切断部位として用いる２ＡペプチドがＰ２Ａペプチドである場合、標的配列としては、配列番号１４に記載の配列が例示される。
ガイドＲＮＡ若しくはその発現ベクター、及びＣａｓタンパク質若しくはその発現ベクター導入方法は、上記［片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法］＜導入工程＞の項で説明した方法と同様の方法が挙げられる。ガイドＲＮＡ及びＣａｓタンパク質の発現ベクターを用いる場合、それらの発現ベクターは同一の発現ベクターであってもよい。
細胞への導入後は、適宜、培養を行ってもよい。ガイドＲＮＡ及びＣａｓタンパク質の発現ベクターを細胞に導入し、当該発現ベクターが薬剤耐性マーカーを有する場合には、当該薬剤の存在下で細胞を培養することにより、発現ベクターが導入された細胞を選択してもよい。また、細胞培養液の希釈又はプレーティング等により、細胞のクローン化を行ってもよい。
【０１２７】
＜工程（ＩＩ）＞
工程（ＩＩ）は、前記工程（Ｉ）の後、ＡＩＭＳ細胞の蛍光パターンを解析する工程である。
【０１２８】
ゲノム編集後のＡＩＭＳ細胞の蛍光パターンの解析は、公知の方法により行うことができる。蛍光パターンの解析方法としては、例えば、蛍光顕微鏡による観察、フローサイトメーターを用いる方法等が挙げられる。蛍光パターンを精度よく解析できる観点からは、例えば、蛍光顕微鏡による観察が好ましい。ただし、蛍光パターンを解析できれば、解析手法は特に限定されない。
本工程により検出され得る蛍光パターンを表１に示す。
【０１２９】
【表１】
2020122195.tif 000003
【０１３０】
＜工程（ＩＩＩ）＞
工程（ＩＩＩ）は、前記工程（ＩＩ）で解析した蛍光パターンに基づいて、ゲノム編集パターンを判定する工程である。
【０１３１】
工程（ＩＩ）で解析した蛍光パターンに基づいて、表２のようにゲノム編集パターンを判定することができる。
【０１３２】
【表２】
2020122195.tif 000004
【０１３３】
上記のように、蛍光パターン（２）及び（３）では、第２アレルのみがゲノム編集されていると判定される。蛍光パターン（４）及び（７）では、第１アレルのみがゲノム編集されていると判定される。蛍光（５）、（６）、（８）及び（９）では、第１アレル及び第２アレルの両方でゲノム編集されていると判定される。蛍光パターン（１）では、いずれのアレルもゲノム編集されていないと判定される。
【０１３４】
本実施形態の方法によれば、簡易な方法で、ゲノム編集パターンを解析することができる。さらに、個々の細胞で解析されたゲノム編集パターンを集計し、両側アレルでゲノム編集される割合、及び片側アレルのみでゲノム編集される割合をそれぞれ求めることができる。そのため、例えば、新規に設計したガイドＲＮＡが、両側アレルでゲノム編集を誘導しやすいか、片側アレルのみでゲノム編集を誘導しやすいか、等を解析することができる。したがって、本実施形態の方法は、所望のゲノム編集パターンを誘導するための新規ガイドＲＮＡの開発に有用である。
【０１３５】
［片側アレルのゲノム編集による遺伝性疾患の治療、緩和及び／又は予防］
１実施形態において、本発明は、上述した本発明の実施形態により達成される片側アレルのゲノム編集による遺伝性疾患の治療、緩和及び／又は予防を提供する。すなわち、遺伝性疾患の原因とされるホモ接合変異もしくはヘテロ接合変異（複合ヘテロ接合変異（ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）を含む）を、上記本発明の実施形態により達成される片側アレルのゲノム編集により修復することで、当該疾患を治療、緩和及び／又は予防しうる。対象が疾患遺伝子と正常遺伝子とをヘテロで有する場合、疾患遺伝子のみを上記本発明の実施形態にかかる片側アレルのみをゲノム編集方法によりゲノム編集することで、遺伝性疾患を治療、緩和及び／又は予防することができる。対象が疾患遺伝子をホモで有する場合、一方のアレルを本発明の実施形態にかかる片側アレルのみをゲノム編集方法によりゲノム編集することでホモ接合型の疾患遺伝子を疾患遺伝子と正常遺伝子とのヘテロ接合型にし、それによって修復アレルから正常タンパク質が発現されることで遺伝性疾患を治療、緩和及び／又は予防することができる。上記本発明の実施形態により達成される片側アレルのゲノム編集は、後述するように、オンターゲットのゲノム編集活性は維持しつつ、オフターゲット効果を抑制し得るため、治療安全性が高い。上記本発明の実施形態にかかる片側アレルのゲノム編集により治療、緩和及び／又は予防されうる遺伝性疾患は、遺伝子変異に起因して生じる疾患であれば特に限定されず、例えば、がん、鎌形赤血球症、ハンチントン舞踏病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、進行性骨化性線維異形成症（ＦＯＰ）等が挙げられるが、これらに限定されない。上記実施形態の片側アレルのゲノム編集方法は、ゲノム編集に起因する細胞毒性が抑制されるため、遺伝性疾患の治療を好適に行うことができる。特に、後述の（ａ１）疾患遺伝子中の標的配列に対するスペーサー配列の５’末端に１個以上のヌクレオチド残基が付加されたガイドＲＮＡ、又は前記ガイドＲＮＡの発現ベクターを用いるゲノム編集では、ゲノム編集に起因する細胞毒性を抑制することができる。
【０１３６】
本発明は、例えば、
（Ａ）（ａ１）疾患遺伝子中の標的配列に対するスペーサー配列の５’末端に１個以上のヌクレオチド残基が付加されたガイドＲＮＡ、（ａ２）前記標的配列に対して１塩基又は複数塩基のミスマッチを有するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ、及び（ａ３）前記（ａ１）若しくは前記（ａ２）のガイドＲＮＡの発現ベクターからなる群より選択される少なくとも１種と、
（Ｂ）Ｃａｓタンパク質及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも１種と、
を対象に投与する工程を含む、遺伝性疾患の治療、緩和及び／又は予防方法を提供する。
【０１３７】
当該疾患は、ヘテロ接合変異（複合ヘテロ接合変異を含む）に起因する疾患であってもよく、ホモ接合変異に起因する疾患であってもよい。（Ａ）及び（Ｂ）の投与方法は、片側アレルのゲノム編集が起こり得る方法であれば、特に限定されず、経口投与であってもよく、非経口投与であってもよい。非経口投与の形態として、例えば静脈内注射、点滴静注、皮下注射、皮内注射、又は腹腔内注射などが挙げられる。（Ａ）及び（Ｂ）は同時に投与してもよく、別個に投与してもよい。（Ａ）及び（Ｂ）の投与量は、疾患の程度、対象の年齢、性別、体重、感受性差、投与方法、投与時期、投与間隔、投与期間、製剤の性質、有効成分の種類等によって異なるが、当業者であれば適宜設定することができる。
【０１３８】
本発明は、例えば、
（Ａ）（ａ１）疾患遺伝子中の標的配列に対するスペーサー配列の５’末端に１個以上のヌクレオチド残基が付加されたガイドＲＮＡ、（ａ２）前記標的配列に対して１塩基又は複数塩基のミスマッチを有するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ、及び（ａ３）前記（ａ１）若しくは前記（ａ２）のガイドＲＮＡの発現ベクターからなる群より選択される少なくとも１種、
を含む、遺伝性疾患を治療、緩和及び／又は予防するための医薬組成物を提供する。
【０１３９】
当該医薬組成物は、さらに、
（Ｂ）Ｃａｓタンパク質及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも１種、
を含んでもよい。
あるいは、当該医薬組成物は、
（Ｂ）Ｃａｓタンパク質及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも１種、
を含む、別の医薬組成物と組み合わせて用いられてもよい。この場合、当該別の医薬組成物は、前記本発明の医薬組成物と同時に投与されてもよく、別個に投与されてもよい。
【０１４０】
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体などを配合して製剤化してもよい。薬学的に許容される担体としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤、安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、および抗酸化剤などが挙げられる。
当該疾患は、ヘテロ接合変異（複合ヘテロ接合変異を含む）に起因する疾患であってもよく、ホモ接合変異に起因する疾患であってもよい。本発明の医薬組成物の投与形態は特に限定されず、経口又は非経口的に投与することができる。非経口投与の形態として、例えば静脈内注射、点滴静注、皮下注射、皮内注射、又は腹腔内注射などが挙げられる。本発明の医薬組成物の投与量は、疾患の程度、対象の年齢、性別、体重、感受性差、投与方法、投与時期、投与間隔、投与期間、製剤の性質、有効成分の種類等によって異なるが、当業者であれば適宜設定することができる。
【０１４１】
本発明は、例えば、
遺伝性疾患の治療、緩和及び／又は予防における使用のための
（Ａ）（ａ１）疾患遺伝子中の標的配列に対するスペーサー配列の５’末端に１個以上のヌクレオチド残基が付加されたガイドＲＮＡ、（ａ２）前記標的配列に対して１塩基又は複数塩基のミスマッチを有するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ、及び（ａ３）前記（ａ１）若しくは前記（ａ２）のガイドＲＮＡの発現ベクターからなる群より選択される少なくとも１種、及び
（Ｂ）Ｃａｓタンパク質及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも１種、
を提供する。
当該疾患は、ヘテロ接合変異（複合ヘテロ接合変異を含む）に起因する疾患であってもよく、ホモ接合変異に起因する疾患であってもよい。
【０１４２】
本発明は、例えば、
遺伝性疾患の治療薬、緩和薬及び／又は予防薬の製造における、
（Ａ）（ａ１）疾患遺伝子中の標的配列に対するスペーサー配列の５’末端に１個以上のヌクレオチド残基が付加されたガイドＲＮＡ、（ａ２）当該標的配列に対して１塩基又は複数塩基のミスマッチを有するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ、及び（ａ３）前記（ａ１）若しくは前記（ａ２）のガイドＲＮＡの発現ベクターからなる群より選択される少なくとも１種、及び
（Ｂ）Ｃａｓタンパク質及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも１種、
の使用を提供する。
当該疾患は、ヘテロ接合変異（複合ヘテロ接合変異を含む）に起因する疾患であってもよく、ホモ接合変異に起因する疾患であってもよい。
【０１４３】
上述した［片側アレルのゲノム編集による遺伝性疾患の治療、緩和及び／又は予防］において、（Ａ）および（Ｂ）に代えて、（Ａ）および（Ｂ）を導入することで疾患遺伝子が修復された対象由来の細胞を用いてもよい。すなわち、対象から取得した細胞に上記の（Ａ）および（Ｂ）を導入することで、細胞中の遺伝性疾患の原因とされるホモ接合変異もしくはヘテロ接合変異（複合ヘテロ接合変異を含む）を、上記本発明の実施形態により達成される片側アレルのゲノム編集により修復する。この疾患遺伝子が修復された細胞（以下、「修復細胞」という）を対象内に戻すことで、修復細胞から正常タンパク質が発現されることで遺伝性疾患を治療、緩和及び／又は予防することができる。
【０１４４】
［遺伝性疾患モデル細胞］
１実施形態において、本発明は、上記本発明の実施形態により達成される片側アレルのゲノム編集により、遺伝性疾患モデル細胞を製造する方法、及び当該方法によって製造されるモデル細胞を提供する。すなわち、遺伝性疾患の原因遺伝子であることが既知である遺伝子又は遺伝性疾患の原因遺伝子である疑いのある遺伝子について、当該遺伝子の正常遺伝子を標的として、上記本発明の実施形態により達成される片側アレルのゲノム編集により、片側アレルにｉｎｄｅｌ又は所望の変異を導入することで、遺伝性疾患モデル細胞を製造することができる。ゲノム編集の対象とする細胞は、正常遺伝子をホモ接合型で有するものであってもよく、正常遺伝子と疾患遺伝子とをヘテロ接合型で有するものであってもよい。本実施形態の遺伝性疾患モデル細胞が有する遺伝性疾患は、遺伝子変異に起因して生じる疾患であれば特に限定されず、例えば、がん、鎌形赤血球症、ハンチントン舞踏病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、進行性骨化性線維異形成症（ＦＯＰ）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４５】
本発明は、例えば、
（Ａ）（ａ１）遺伝性疾患の原因遺伝子又はその疑いのある遺伝子の正常遺伝子中の標的配列に対するスペーサー配列の５’末端に１個以上のヌクレオチド残基が付加されたガイドＲＮＡ、（ａ２）前記標的配列に対して１塩基又は複数塩基のミスマッチを有するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ、及び（ａ３）前記（ａ１）若しくは前記（ａ２）のガイドＲＮＡの発現ベクターからなる群より選択される少なくとも１種と、
（Ｂ）Ｃａｓタンパク質及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも１種と、
をインビトロで細胞に投与（導入）する工程を含む、遺伝性疾患モデル細胞を製造する方法を提供する。
【０１４６】
当該疾患は、ヘテロ接合変異（複合ヘテロ接合変異を含む）に起因する疾患であってもよく、ホモ接合変異に起因する疾患であってもよい。
（Ａ）及び（Ｂ）が投与される細胞は、初代培養細胞であっても、不死化処理が施された株化細胞であってもよい。株化細胞の例としては、ヒト由来のＨｅｌａ細胞、アフリカミドリザル由来のＣＯＳ７細胞、マウス由来の３Ｔ３細胞、ハムスター由来のＣＨＯ細胞、ラット由来のＰＣ１２細胞などが挙げられる。（Ａ）及び（Ｂ）が投与される細胞は、多能性幹細胞、複能性幹細胞、単能性幹細胞、ＥＳ細胞、又はｉＰＳ細胞であってもよい。（Ａ）及び（Ｂ）が投与される細胞は、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル、又はニワトリの細胞である。（Ａ）及び（Ｂ）は同時に投与してもよく、別個に投与してもよい。（Ａ）及び（Ｂ）の細胞への投与方法（導入方法）は、特に限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、上記［片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法］＜導入工程＞の項で説明した方法と同様の方法が挙げられる。
【０１４７】
［遺伝性疾患の非ヒトモデル動物］
１実施形態において、本発明は、上記本発明の実施形態により達成される片側アレルのゲノム編集により、遺伝性疾患の非ヒトモデル動物を製造する方法、及び当該方法によって製造された非ヒトモデル動物を提供する。すなわち、遺伝性疾患の原因遺伝子であることが既知である遺伝子又は遺伝性疾患の原因遺伝子である疑いのある遺伝子について、当該遺伝子の正常遺伝子を標的として、上記本発明の実施形態により達成される片側アレルのゲノム編集により、片側アレルにｉｎｄｅｌ又は所望の変異を導入することで、遺伝性疾患非ヒトモデル動物を製造することができる。ゲノム編集の対象とする動物は、正常遺伝子をホモ接合型で有するものであってもよく、正常遺伝子と疾患遺伝子とをヘテロ接合型で有するものであってもよい。本実施形態の遺伝性疾患モデル動物が有する遺伝性疾患は、遺伝子変異に起因して生じる疾患であれば特に限定されず、例えば、がん、鎌形赤血球症、ハンチントン舞踏病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、進行性骨化性線維異形成症（ＦＯＰ）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４８】
本発明は、例えば、
（Ａ）（ａ１）遺伝性疾患の原因遺伝子又はその疑いのある遺伝子の正常遺伝子中の標的配列に対するスペーサー配列の５’末端に１個以上のヌクレオチド残基が付加されたガイドＲＮＡ、（ａ２）前記標的配列に対して１塩基又は複数塩基のミスマッチを有するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ、及び（ａ３）前記（ａ１）若しくは前記（ａ２）のガイドＲＮＡの発現ベクターからなる群より選択される少なくとも１種と、
（Ｂ）Ｃａｓタンパク質及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも１種と、
を非ヒト動物に投与する工程を含む、遺伝性疾患の非ヒトモデル動物を製造する方法を提供する。
【０１４９】
また、１実施形態において、本発明は、前記遺伝性疾患モデル細胞を非ヒト動物に投与する工程を含む、遺伝性疾患の非ヒトモデル動物を製造する方法であってもよい。また、１実施形態において、本発明は、前記（Ａ）及び（Ｂ）、又は前記遺伝性疾患モデル細胞を、非ヒト動物の受精卵にインジェクションする工程を含む、遺伝性疾患の非ヒトモデル動物を製造する方法であってもよい。
【０１５０】
当該疾患は、ヘテロ接合変異（複合ヘテロ接合変異を含む）に起因する疾患であってもよく、ホモ接合変異に起因する疾患であってもよい。
（Ａ）及び（Ｂ）が投与される非ヒト動物としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル、ニワトリ等の、当該技術分野において入手可能な任意の実験動物を用いることができる。（Ａ）及び（Ｂ）の投与方法は、片側アレルのゲノム編集が起こり得る方法であれば、特に限定されず、経口投与であっても非経口投与であってもよい。非経口投与の形態として、例えば静脈内注射、点滴静注、皮下注射、皮内注射、又は腹腔内注射などが挙げられる。（Ａ）及び（Ｂ）は同時に投与してもよく、別個に投与してもよい。（Ａ）及び（Ｂ）の投与量は、投与される非ヒト動物の種類、週齢／月齢、性別、体重、感受性差、投与方法、投与時期、投与間隔、投与期間等によって異なるが、当業者であれば適宜設定することができる。
【実施例】
【０１５１】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【０１５２】
下記の実施例において用いられる主な略語等の意味を以下に示す。
Ｐ２Ａ−ｔｄＴｏｍａｔｏアレル：Ｐ２Ａ−ｔｄＴｏｍａｔｏキメラ遺伝子がノックインされたアレル
Ｐ２Ａ−Ｖｅｎｕｓアレル：Ｐ２Ａ−Ｖｅｎｕｓキメラ遺伝子がノックインされたアレル
Ｐ２Ａ−Ｎｅｏアレル：Ｐ２Ａ−Ｎｅｏキメラ遺伝子がノックインされたアレル
オールインワンＣＲＩＳＰＲプラスミド：Ｃａｓ９、ｓｇＲＮＡ、及び選択マーカーを発現するプラスミド
ｐ：ＲＣＰ：選択マーカーとしてピューロマイシン耐性遺伝子（Ｐｕｒｏ）を有するオールインワンＣＲＩＳＰＲプラスミド
ＰＸ４５９：ｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）−２Ａ−Ｐｕｒｏ（ＰＸ４５９）Ｖ２．０  ｐｌａｓｍｉｄ（Ａｄｄｇｅｎｅ，ｐｌａｓｍｉｄ  ＃６２９８８）
Ｐ２Ａ＿ＰＸ４５９：Ｐ２Ａペプチドコード配列を標的とするスペーサー配列が、ＢｐｉＩサイトに挿入されたＰＸ４５９
ａＰ２Ａ＿ＰＸ４５９：ａＰ２Ａ配列を標的とするスペーサー配列が、ＢｐｉＩサイトに挿入されたＰＸ４５９
ＰＸ４５９（ｄｅｌ＿Ｃａｓ９−Ｔ２Ａ−Ｐｕｒｏ）：ＰＸ４５９からＣａｓ９−Ｔ２Ａ−Ｐｕｒｏキメラ遺伝子が除去されたプラスミド
Ｃｄｈ１−Ｐ２Ａ−ｔｄＴｏｍａｔｏ  ＫＩベクター：Ｃｄｈ１遺伝子下流にＰ２Ａ−ｔｄＴｏｍａｔｏキメラ遺伝子をノックインするためのノックインベクター
Ｃｄｈ１−Ｐ２Ａ−Ｖｅｎｕｓ  ＫＩベクター：Ｃｄｈ１遺伝子下流にＰ２Ａ−Ｖｅｎｕｓキメラ遺伝子をノックインするためのノックインベクター
Ｔｂｘ３−Ｐ２Ａ−ｔｄＴｏｍａｔｏ  ＫＩベクター：Ｔｂｘ３遺伝子下流にＰ２Ａ−ｔｄＴｏｍａｔｏキメラ遺伝子をノックインするためのノックインベクター
Ｔｂｘ３−Ｐ２Ａ−Ｖｅｎｕｓ  ＫＩベクター：Ｔｂｘ３遺伝子下流にＰ２Ａ−Ｖｅｎｕｓキメラ遺伝子をノックインするための鋳型プラスミド
Ｃｄｈ１−ａＰ２Ａ−ｔｄＴｏｍａｔｏ  ＫＩベクター：Ｃｄｈ１遺伝子下流にａＰ２Ａ−ｔｄＴｏｍａｔｏキメラ遺伝子をノックインするためのノックインベクター
Ｃｄｈ１−ａＰ２Ａ−Ｖｅｎｕｓ  ＫＩベクター：Ｃｄｈ１遺伝子下流にａＰ２Ａ−Ｖｅｎｕｓキメラ遺伝子をノックインするためのノックインベクター
Ｔｂｘ３−Ｐ２Ａ−Ｎｅｏ  ＫＩベクター：Ｔｂｘ３遺伝子下流にＰ２Ａ−Ｎｅｏキメラ遺伝子をノックインするためのノックインベクター
Ｃｄｈ１−Ｐ２Ａ−ＡＩＭＳ：両アレルのＣｄｈ１遺伝子座に、それぞれＣｄｈ１−Ｐ２Ａ−ｔｄＴｏｍａｔｏキメラ遺伝子及びＣｄｈ１−Ｐ２Ａ−Ｖｅｎｕｓキメラ遺伝子を有するＡＩＭＳ細胞
Ｔｂｘ３−Ｐ２Ａ−ＡＩＭＳ：両アレルのＴｂｘ３遺伝子座に、それぞれＴｂｘ３−Ｐ２Ａ−ｔｄＴｏｍａｔｏキメラ遺伝子及びＴｂｘ３−Ｐ２Ａ−Ｖｅｎｕｓキメラ遺伝子を有するＡＩＭＳ細胞
Ｃｄｈ１−ａＰ２Ａ−ＡＩＭＳ：両アレルのＣｄｈ１遺伝子座に、それぞれＣｄｈ１−ａＰ２Ａ−ｔｄＴｏｍａｔｏキメラ遺伝子及びＣｄｈ１−ａＰ２Ａ−Ｖｅｎｕｓキメラ遺伝子を有するＡＩＭＳ細胞
Ｐ２Ａ（ミスマッチ）：Ｐ２Ａペプチドコード配列内の標的配列に対して１塩基ミスマッチを有するスペーサー配列
ａＰ２Ａ（ミスマッチ）：ａＰ２Ａ配列内の標的配列に対して１塩基ミスマッチを有するスペーサー配列
Ｐ２Ａ（ｎＸ）：５’末端にｎ個のヌクレオチド残基Ｘが付加された、Ｐ２Ａペプチドコード配列を標的とするスペーサー配列
ａＰ２Ａ（ｎＸ）：５’末端にｎ個のヌクレオチド残基Ｘが付加された、ａＰ２Ａ配列を標的とするスペーサー配列
Ｐ２Ａ（５’付加）：５’末端に任意数のヌクレオチド残基が付加された、Ｐ２Ａペプチドコード配列を標的とするスペーサー配列
ａＰ２Ａ（５’付加）：５’末端に任意数のヌクレオチド残基が付加された、ａＰ２Ａ配列を標的とするスペーサー配列
Ｐ２Ａ（ミスマッチ＿ｎＸ）：Ｐ２Ａペプチドコード配列内の標的配列に対して１塩基ミスマッチを有し、且つ５’末端にｎ個のヌクレオチド残基Ｘが付加されたスペーサー配列。【０１５３】
下記の実施例で用いたプラスミド、リンカー及びプライマー等を表３〜５に示す。
【表３】
2020122195.tif 000005
【０１５４】
【表４】
2020122195.tif 000006
【０１５５】
【表５】
2020122195.tif 000007
【０１５６】
［実施例１］マウスＥＳ細胞の培養
マウスＥＳ細胞を、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地；Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ）で培養した。培養に用いたＤＭＥＭは、２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ）、１×非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ）、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、及び１５％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（ＧＩＢＣＯ）を含み、さらに、１μＭもしくは０．２μＭのＰＤ０３２５９０１（Ｓｉｇｍａ）、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１（Ｃａｙｍａｎ）及び１，０００Ｕ／ｍＬの組換えマウスＬＩＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を添加したものである。細胞は、フィーダーフリー条件下、３７℃、５％ＣＯ２で維持した。細胞を継代した際に、Ｙ−２７６３２（１０μＭ、Ｓｉｇｍａ）を添加した。【０１５７】
［実施例２］ＡＩＭＳの構築
（ＡＩＭＳの概要）
図１は、本実施例で構築したＡＩＭＳの概要を説明する図である。図１Ａは、本実施例で作製したＡＩＭＳ細胞が有する遺伝子構成を説明する図であり、図１ＢはＡＩＭＳによるｉｎｄｅｌの評価方法を説明する図である。【０１５８】
本実施例のＡＩＭＳ細胞では、局在化タンパク質コード配列としてＣｄｈ１（Ｅ−カドヘリン遺伝子）又はＴｂｘ３（ＴＢＸ３タンパク質遺伝子）を用いている。切断部位コード配列として、Ｐ２Ａペプチドコード配列を用いている。第１の蛍光タンパク質コード配列としてｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子を用いており、第２の蛍光タンパク質コード配列としてＶｅｎｕｓ遺伝子を用いている。したがって、第１アレルにおける第１のキメラ遺伝子は、Ｃｄｈ１−Ｐ２Ａ−ｔｄＴｏｍａｔｏ又はＴｂｘ３−Ｐ２Ａ−ｔｄＴｏｍａｔｏの構造を有しており、第２アレルにおける第２のキメラ遺伝子は、Ｃｄｈ１−Ｐ２Ａ−Ｖｅｎｕｓ又はＴｂｘ３−Ｐ２Ａ−Ｖｅｎｕｓの構造を有している（図１Ａ）。【０１５９】
図１Ａの遺伝子構成を有するＡＩＭＳ細胞において、各キメラ遺伝子から発現されたキメラタンパク質は、Ｐ２Ａペプチド配列で切断されて、局在化タンパク質と、蛍光タンパク質とに分離される。そのため、蛍光タンパク質は局在化することなく、細胞全体に分布する（図２Ｂ「ｗｔ」）。したがって、野生株（ｗｔ）のＡＩＭＳ細胞を蛍光顕微鏡等で観察すると、細胞全体に蛍光が観察される。【０１６０】
一方、Ｐ２Ａコード配列を標的とするｓｇＲＮＡを用いて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによるゲノム編集を行うと、当該ゲノム編集によりＰ２Ａペプチドコード配列に導入されたｉｎｄｅｌの種類により蛍光タンパク質の発現及び局在が変化する。すなわち、Ｐ２Ａコード配列にフレームシフトｉｎｄｅｌが導入された場合、当該フレームシフトにより蛍光タンパク質は発現しなくなる（図１Ｂ  ｆｒａｍｅ−ｓｈｉｆｔ）。【０１６１】
また、Ｐ２Ａペプチドコード配列にインフレームｉｎｄｅｌが導入された場合、Ｐ２Ａペプチドで切断されなくなる。そのため、第１又は第２のキメラ遺伝子から発現されたキメラタンパク質は、Ｐ２Ａペプチド配列で切断されることなく、局在化タンパク質の種類に応じて、細胞内で局在化する。局在化タンパク質がＴｂｘ３である場合、ＡＩＭＳタンパク質は核に局在化する（図１Ｂ  ｉｎ―ｆｒａｍｅ，Ｔｂｘ３−ＡＩＭＳ）。局在化タンパク質がＣｄｈ１である場合、ＡＩＭＳタンパク質は細胞膜に局在化する（図１Ｂ  ｉｎ―ｆｒａｍｅ，Ｃｄｈ１−ＡＩＭＳ）。【０１６２】
したがって、ｔｄＴｏｍａｔｏ及びＶｅｎｕｓの両方の蛍光が、消失又は局在化した場合には、第１アレル（Ｐ２Ａ−ｔｄＴｏｍａｔｏアレル）及び第２アレル（Ｐ２Ａ−Ｖｅｎｕｓアレル）の両方でｉｎｄｅｌが生じたと判定できる。ｔｄＴｏｍａｔｏ及びＶｅｎｕｓのいずれか一方の蛍光のみが、消失又は局在化した場合には、Ｐ２Ａ−ｔｄＴｏｍａｔｏアレル及びＰ２Ａ−Ｖｅｎｕｓアレルのいずれか一方のみでｉｎｄｅｌが生じたと判定できる。ｔｄＴｏｍａｔｏ及びＶｅｎｕｓの両方の蛍光が、消失も局在化もしなかった場合には、Ｐ２Ａ−ｔｄＴｏｍａｔｏアレル及びＰ２Ａ−Ｖｅｎｕｓアレルのいずれでもｉｎｄｅｌが生じなかったと判定できる。
以上のように、ＡＩＭＳ細胞を用いることにより、両側アレルｉｎｄｅｌ導入率、及び片側アレルｉｎｄｅｌ導入率をそれぞれ評価することができる。【０１６３】
図１Ｃは、本実施例でＡＩＭＳ細胞の作製に使用したＰ２Ａコード配列を示す。図中「ｔａｒｇｅｔ」として囲んだ領域はｓｇＲＮＡの標的配列である。図中、ａＰ２Ａとして示す配列は、Ｐ２Ａコード配列にサイレント突然変異を導入した配列である。後述のＡＩＭＳ細胞の作製では、Ｐ２Ａコード配列及びａＰ２Ａコード配列のいずれかを使用した。【０１６４】
（ＡＩＭＳ細胞作製用ノックインプラスミドの構築）
Ｐ２Ａ−Ｖｅｎｕｓキメラ遺伝子を含むプラスミド、又はＰ２Ａ−ｔｄＴｏｍａｔｏキメラ遺伝子を含むプラスミドに、Ｃｄｈ１の５’アーム及び３’アームをライゲーションし、Ｃｄｈ１−Ｐ２Ａ−ｔｄＴｏｍａｔｏ  ＫＩベクター及びＣｄｈ１−Ｐ２Ａ−ｔｄＴｏｍａｔｏ  ＫＩベクターを作製した。Ｅ−カドヘリン（Ｃｄｈ１）及び蛍光タンパク質（ｔｄＴｏｍａｔｏ又はＶｅｎｕｓ）をそれぞれ独立に産生するように、Ｃｄｈ１コード配列末端がインフレームでＰ２Ａコード配列に連結するように、Ｃｄｈ１の５’アームを設計した。
Ｃｄｈ１の５’アーム及び３’アームに代えて、Ｔｂｘ３の５’アーム及び３’アームを用いたこと以外は、上記と同様の方法で、Ｔｂｘ３−Ｐ２Ａ−ｔｄＴｏｍａｔｏ  ＫＩベクター及びＴｂｘ３−Ｐ２Ａ−ｔｄＴｏｍａｔｏ  ＫＩベクターを作製した。
Ｐ２Ａ配列に代えて、ａＰ２Ａ配列を用いたことを以外は、上記と同様の方法で、Ｃｄｈ１−ａＰ２Ａ−ｔｄＴｏｍａｔｏ  ＫＩベクター及びＣｄｈ１−ａＰ２Ａ−ｔｄＴｏｍａｔｏ  ＫＩベクターを作製した。【０１６５】
（オールインワンＣＲＩＳＰＲプラスミドの構築）
ＰＸ４５９のＢｐｉＩサイトに、Ｔｂｘ中の標的配列（３’−ＣＣＡＧＴＴＴＧＧＴＣＡＡＡＴＣＴＧＣＣＡＧＴ−５’（配列番号９４））を標的とするスペーサー配列のコード配列を含むｓｇＲＮＡ用アダプターリンカー（配列番号６３，６４）をライゲーションし、ＡＩＭＳ細胞作製用のオールインワンＣＲＩＳＰＲプラスミドを作製した。同様に、ＰＸ４５９のＢｐｉＩサイトに、をＣｄｈ中の配列を標的とするスペーサー配列のコード配列を含むｓｇＲＮＡ用アダプターリンカー（配列番号６５，６６）をライゲーションし、ＡＩＭＳ細胞作製用のオールインワンＣＲＩＳＰＲプラスミドを作製した。ストップコドンの下流を標的とするｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ  ＤＥＳＩＧＮ（ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／）を用いて設計した。【０１６６】
（ＡＩＭＳ細胞の作製）
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）  ３０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を用いて、上記で作製したオールインワンＣＲＩＳＰＲプラスミド、Ｃｄｈ１−Ｐ２Ａ−ｔｄＴｏｍａｔｏ  ＫＩベクター及びＣｄｈ１−Ｐ２Ａ−Ｖｅｎｕｓ  ＫＩベクターを、マウスＥＳ細胞に同時導入した。ゼラチンコートした２４ウェルプレートに分注した５００μＬの２ｉＬ＋Ｙ培地に、トリプシン（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ）で分離したＥＳ細胞を播種した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００の標準プロトコールに従い、核酸−リポフェクタミン３０００複合体を調製した。１μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００を２５μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）に添加した。また、２５０ｎｇの前記３種のプラスミド及び１μＬのＰ３０００試薬を別の２５μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地に添加して混合した。これらの混合液を一緒にして混合し、室温で５分間インキュベートした。その後、ＥＳ細胞を播種した２４ウェルプレートに添加した。細胞が自然にプレートの底に沈降した後、プレートを６００ｇ、３７℃で１時間遠心分離し、次いで、一晩、インキュベートした。１〜２日間のトランスフェクションの後、細胞をピューロマイシン（１２μｇ／ｍＬ）で２４〜４８時間処理した。ピューロマイシン処理で選択されたピューロマイシン耐性細胞を、ピューロマイシン非存在下で数日間培養し、二色陽性（ｄｕａｌ  ｃｏｌｏｒ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ）のコロニーを採取した。採取したコロニーの遺伝子型をＰＣＲで確認した。両アレルにおいて、それぞれ、Ｃｄｈ１−Ｐ２Ａ−ｔｄＴｏｍａｔキメラ遺伝子及びＣｄｈ１−Ｐ２Ａ−Ｖｅｎｕｓキメラ遺伝子の導入が確認された細胞を、Ｃｄｈ１−Ｐ２Ａ−ＡＩＭＳとして用いた。【０１６７】
Ｃｄｈ１−Ｐ２Ａ−Ｖｅｎｕｓ  ＫＩベクター及びＣｄｈ１−Ｐ２Ａ−ｔｄＴｏｍａｔｏ  ＫＩベクターに代えて、Ｔｂｘ３−Ｐ２Ａ−Ｖｅｎｕｓ  ＫＩベクター及びＴｂｘ３−Ｐ２Ａ−ｔｄＴｏｍａｔｏ  ＫＩベクターを用いたこと以外は、上記と同様の方法で、Ｔｂｘ３−Ｐ２Ａ−ＡＩＭＳを作製した。【０１６８】
Ｃｄｈ１−Ｐ２Ａ−Ｖｅｎｕｓ  ＫＩベクター及びＣｄｈ１−Ｐ２Ａ−ｔｄＴｏｍａｔｏ  ＫＩベクターに代えて、Ｃｄｈ１−ａＰ２Ａ−Ｖｅｎｕｓ  ＫＩベクター及びＣｄｈ１−ａＰ２Ａ−ｔｄＴｏｍａｔｏ  ＫＩベクターを用いたこと以外は、上記と同様の方法で、Ｃｄｈ１−ａＰ２Ａ−ＡＩＭＳを作製した。【０１６９】
（ＡＩＭＳ細胞を用いたｉｎｄｅｌパターン解析）
ＡＩＭＳ細胞を用いたｉｎｄｅｌパターンの解析は、以下のように行った。
Ｐ２Ａペプチドコード配列内又はａＰ２Ａ配列内に標的配列を設定し、ｓｇＲＮＡを設計した。当該ｓｇＲＮＡのスペーサー配列のコード配列を、ＰＸ４５９のＢｐｉＩサイトにライゲーションし、ｐ：ＲＣＰを作製した。実施例で用いたｐ：ＲＣＰの構造を図２Ａに示す。【０１７０】
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）  ３０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を用いて、ｐ：ＲＣＰを、ＡＩＭＳ細胞（Ｃｄｈ１−Ｐ２Ａ−ＡＩＭＳ、Ｔｂｘ３−Ｐ２Ａ−ＡＩＭＳ、又はＣｄｈ１−ａＰ２Ａ−ＡＩＭＳ）にトランスフェクションした。細胞としてＡＩＭＳ細胞を用い、プラスミドとしてｐ：ＲＣＰを用いたこと以外は、上記の「（ＡＩＭＳ細胞の作製）」で記載した方法と同様にトランスフェクション及びピューロマイシン処理を行った。ピューロマイシン処理により選択されたピューロマイシン耐性細胞を、ピューロマイシン非存在下で数日間培養した後、継代してクローン化した。クローン化した細胞について、蛍光顕微鏡（倒立型リサーチ顕微鏡 IX73、オリンパス）を用いて、ｔｄＴｏｍａｔｏ及びＶｅｎｕｓの蛍光を観察し、両アレルにおけるｉｎｄｅｌの評価を行った。図２Ｂに、トランスフェクションから蛍光解析までのタイムラインを示す。
１回のトランスフェクションで、３０〜１７０個のクローンのｉｎｄｅｌパターン解析を行った。１種類のｓｇＲＮＡについて、トランスフェクション及びその後のｉｎｄｅｌパターン解析を最低３回行った。【０１７１】
［実施例３］ミスマッチ法の評価
ｓｇＲＮＡのスペーサー配列に、標的配列に対する１塩基ミスマッチを導入することにより、両側アレルｉｎｄｅｌ及び片側アレルｉｎｄｅｌの導入率が変化するかを調べた。
Ｐ２Ａの標的配列（ＴＡＡＣＴＴＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣ：配列番号９５）のいずれか１個の塩基を、異なる塩基に置換した１塩基ミスマッチスペーサー配列をそれぞれ設計した（図３Ａ参照）。ＰＡＭに隣接する塩基（１位）に１塩基ミスマッチを有するスペーサー配列のコード配列に、ＰＸ４５９のＢｐｉＩサイトにライゲーションするためのアダプター配列を付加して、１塩基ミスマッチｓｇＲＮＡ用アダプターリンカーを作製した（配列番号６９，７０）。同様のアダプター配列を付加して、ミスマッチ塩基の位置が２〜２０位（ＰＡＭに隣接する塩基を１位とし、３’→５’に向かって２位→２０位とする）である１塩基ミスマッチｓｇＲＮＡ用アダプターリンカーをそれぞれ作製した。
Ｐ２Ａ標的配列にミスマッチを有さないｓｇＲＮＡ用アダプターリンカーの配列を配列番号６７，６８に示す。
同様に、ａＰ２Ａの標的配列（ＴＡＧＴＣＴＡＣＴＡＡＡＡＣＡＡＧＣＣＧ：配列番号９６）のいずれか１個を、異なる塩基に置換した１塩基ミスマッチスペーサー配列をそれぞれ設計し、当該スペーサー配列のコード配列にアダプター配列を付加して、１塩基ミスマッチｓｇＲＮＡ用アダプターリンカーをそれぞれ作製した。ａＰ２Ａの標的配列に対して、ＰＡＭに隣接する塩基（１位）に１塩基ミスマッチを有する、１塩基ミスマッチｓｇＲＮＡ用アダプターリンカーの配列を配列番号７３，７４に示す。他の１塩基ミスマッチｓｇＲＮＡ用アダプターリンカーも、ミスマッチの位置が異なる以外は同様である。ａＰ２Ａ標的配列にミスマッチを有さないｓｇＲＮＡ用アダプターリンカーの配列を配列番号７１，７２に示す。
これらの１塩基ミスマッチｓｇＲＮＡ用アダプターリンカーを、ＰＸ４５９プラスミドのＢｐｉＩサイトにそれぞれ挿入し、各Ｐ２Ａ（ミスマッチ）＿ＰＸ４５９を作製した。
これらの各Ｐ２Ａ（ミスマッチ）＿ＰＸ４５９を、ＡＩＭＳ細胞にそれぞれ導入して、ｉｎｄｅｌの評価を行った。【０１７２】
結果を図３に示す。図３Ｂは、ＡＩＭＳ細胞としてＴｂｘ３−Ｐ２Ａ−ＡＩＭＳを用いてｉｎｄｅｌパターン解析を行った結果である。
図３Ｂのグラフの横軸はＰ２Ａ標的配列を示し、その下にＰ２Ａ（ミスマッチ）における置換後の塩基を示した。グラフの上部に、置換した塩基のＰＡＭからの距離（ＰＡＭに隣接する塩基を１としたときの各塩基の位置）を示した。「Ｐ」は、Ｐ２Ａ＿ＰＸ４５９（ミスマッチなし）を用いた場合であり、「Ｎ」はＰＸ４５９（スペーサー配列なし）を用いた場合である。
図３Ｂに示すように、Ｐ２Ａ＿ＰＸ４５９を用いた場合には、ほぼ１００％両側アレルｉｎｄｅｌが導入された。一方、Ｐ２Ａ（ミスマッチ）＿ＰＸ４５９を用いた場合には、片側アレルｉｎｄｅｌの導入率が高くなった。また、ミスマッチを導入する位置により、ｉｎｄｅｌの導入傾向に差が見られた。【０１７３】
図３Ｃは、ＡＩＭＳ細胞としてＴｂｘ３−Ｐ２Ａ−ＡＩＭＳを用いてｉｎｄｅｌパターン解析を行った結果である。図３Ｃのグラフの上部に、標的配列のＰＡＭからの位置を示し、グラフの横軸には、当該位置に対応するスペーサー配列における塩基を示した。下線で示す塩基は、標的配列に一致する塩基である。
図３Ｃに示すように、ミスマッチを導入する位置及びミスマッチ塩基の種類により、ｉｎｄｅｌ導入率、両側アレルｉｎｄｅｌ導入率、及び片側アレルｉｎｄｅｌ導入率に差が見られた。【０１７４】
図３Ｄは、ＡＩＭＳ細胞としてＣｄｈ１−ａＰ２Ａ−ＡＩＭＳを用いてｉｎｄｅｌパターン解析を行った結果である。図３Ｄのグラフの表記は、図３Ｂと同様である。
図３Ｄに示すように、完全一致ｓｇＲＮＡを用いた場合には、ほぼ１００％両側アレルｉｎｄｅｌが導入された。一方、ａＰ２Ａ（ミスマッチ）＿ＰＸ４５９を用いた場合には、片側アレルｉｎｄｅｌの導入率が高くなった。また、ミスマッチを導入する位置により、ｉｎｄｅｌの導入傾向に差が見られた。図３Ｂとは、ｉｎｄｅｌの導入傾向に差が見られた。【０１７５】
以上の結果より、１塩基ミスマッチを導入する位置及びミスマッチ塩基の種類を選択することにより、片側アレルｉｎｄｅｌの割合を調節できることが確認された。【０１７６】
［実施例４］５’ヌクレオチド付加法の評価
（Ｐ２Ａ（５’付加）＿ＰＸ４５９によるｉｎｄｅｌ導入）
ｓｇＲＮＡのスペーサー配列の５’末端に、ヌクレオチド残基を付加することにより、両側アレルｉｎｄｅｌ及び片側アレルｉｎｄｅｌの導入率が変化するかを調べた。
Ｐ２Ａ標的配列の５’側に、０〜４０個のシトシンを付加したスペーサー配列をそれぞれ設計した（図４Ａ参照）。これらのスペーサー配列のコード配列に、ＰＸ４５９のＢｐｉＩサイトにライゲーションするためのアダプター配列を付加して、５’Ｃ付加ｓｇＲＮＡ用アダプターリンカーをそれぞれ作製した。
同様に、Ｐ２Ａの標的配列の５’側に、１５個のグアニン、アデニン、又はウラシルを付加したスペーサー配列をそれぞれ設計し、当該スペーサー配列のコード配列にアダプター配列を付加して、Ｐ２Ａ（１５Ｇ）、Ｐ２Ａ（１５Ａ）、Ｐ２Ａ（１５Ｕ）ｓｇＲＮＡ用アダプターリンカーをそれぞれ作製した。これらのｓｇＲＮＡ用アダプターリンカーを、ＰＸ４５９プラスミドのＢｐｉＩサイトにそれぞれ挿入し、Ｐ２Ａ（５’付加）＿ＰＸ４５９をそれぞれ作製した。
上記プラスミドの作製に用いたｓｇＲＮＡ用アダプターリンカーの一例として、スペーサー配列の５’末端に１５Ｇを付加するｓｇＲＮＡ用アダプターリンカーの配列を配列番号７５，７６に示す。他のｓｇＲＮＡ用アダプターリンカーも、スペーサー配列の５’末端に付加されるヌクレオチド残基の数及び種類が異なる以外は、全て同様の配列を有する。なお、ａＰ２Ａを標的とするスペーサー配列の５’末端に５Ｃを付加するｓＲＮＡ用アダプターリンカーの配列を配列番号８１，８２に示す。
上記で作製したＰ２Ａ（５’付加）＿ＰＸ４５９を、ＡＩＭＳ細胞にそれぞれ導入し、ｉｎｄｅｌの評価を行った。【０１７７】
結果を図４Ｂ及び図４Ｃに示す。図４Ｂは、ＡＩＭＳ細胞としてＣｄｈ１−Ｐ２Ａ−ＡＩＭＳを用いてｉｎｄｅｌパターン解析を行った結果である。
図４Ｂのグラフの横軸には、標的配列の５’末端に付加したヌクレオチド残基を示した。図４Ｂに示すように、Ｐ２Ａ＿ＰＸ４５９（０Ｃ）を用いた場合には、ほぼ１００％両側アレルｉｎｄｅｌが導入された。一方、付加したシトシンの個数が多くなるに従い、ｉｎｄｅｌ導入率は減少した。また、付加したシトシンの個数が多くなるに従い、片側アレルｉｎｄｅｌの導入率が高くなった。ただし、シトシン付加数が２５個以上では、ｉｎｄｅｌ導入傾向に差が見られなくなった。【０１７８】
図４Ｃは、ＡＩＭＳ細胞としてＣｄｈ１−Ｐ２Ａ−ＡＩＭＳを用いてｉｎｄｅｌパターン解析を行った結果である。図４Ｃのグラフの表記は、図４Ｂと同様である。図４Ｃに示すように、付加するヌクレオチドの種類により、ｉｎｄｅｌ導入率及び片側アレルｉｎｄｅｌの導入率に差が見られた。アデノシン（Ａ）を付加した場合には、ｉｎｄｅｌ導入率はほとんど低下せず、片側アレルｉｎｄｅｌの導入率も低かった。グアノシン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）の順に、ｉｎｄｅｌ導入率が低下し、片側アレルｉｎｄｅｌの導入率が高くなった。ウリジン（Ｕ）を付加した場合には、ｉｎｄｅｌ導入率が著しく低下し、両側アレルｉｎｄｅｌの導入はほとんど認められなかった。【０１７９】
さらに、ｓｇＲＮＡのスペーサー配列の３’末端に、ヌクレオチド残基を付加することにより、ｉｎｄｅｌの導入率が変化するかについても確認した。スペーサー配列の３’末端に５Ｃ又は１０Ｃを付加するｓｇＲＮＡ用アダプターリンカーの配列（配列番号７７〜８０）を用いたこと以外は、上記と同様の方法で、Ｐ２Ａ（３’付加）＿ＰＸ４５９を作製し、ＡＩＭＳ細胞に導入して、ｉｎｄｅｌ導入率の評価を行った。その結果、５Ｃ及び１０Ｃのいずれを３’末端に付加した場合においても、ｉｎｄｅｌ導入率はほぼ０％であった。これは、スペーサー配列の３’末端に配列を付加した場合、スペーサー配列とＰＡＭ配列との間に余計な配列が介在することになるためと考えられる。【０１８０】
（ｉｎｄｅｌ導入率に及ぼすｓｇＲＮＡ発現プラスミド使用量の影響）
標的配列の５’側にヌクレオチド残基を付加することによりｉｎｄｅｌ導入率が低下するのは、付加ヌクレオチド残基によりｓｇＲＮＡの転写が抑制されることに起因する可能性がある。そこで、トランスフェクションに用いるｓｇＲＮＡ発現プラスミドの使用量が、ｉｎｄｅｌ導入率に及ぼす影響を評価した。【０１８１】
〔トランスフェクション時のｐ：ＲＣＰ使用量の影響〕
ＡＩＭＳ用マウスＥＳ細胞としてＴｂｘ３−Ｐ２Ａ−ＡＩＭＳを用い、Ｐ２Ａ＿ＰＸ４５９をトランスフェクションした。トランスフェクションに用いたＰ２Ａ＿ＰＸ４５９の使用量は、２．５ｎｇ、２５ｎｇ、２５０ｎｇ、又は２５００ｎｇとした。【０１８２】
結果を図４Ｄに示す。図４Ｄ中、左図はｉｎｄｅｌ解析の結果を示し、右図はＰ２Ａ＿ＰＸ４５９のトランスフェクション後に得られたコロニー数を示す。図４Ｄ右図に示されるように、Ｐ２Ａ＿ＰＸ４５９の使用量を減らすと、コロニー数は減少した。これは、トランスフェクション時のｐ：ＲＣＰの使用量の減少に伴い、ＡＩＭＳ細胞へのＰ２Ａ＿ＰＸ４５９の導入率が低下し、ピューロマイシン耐性となる細胞数が減少するためと考えられた。一方、ピューロマイシン耐性となった細胞では、ほぼ１００％両側アレルｉｎｄｅｌが導入されていた。【０１８３】
〔トランスフェクション時のｓｇＲＮＡ発現プラスミド使用量の影響〕
上記の試験では、ｓｇＲＮＡ、Ｃａｓ９、及びピューロマイシン耐性遺伝子の全てを発現するｐ：ＲＣＰを用いたため、トランスフェクション後に得られたピューロマイシン耐性細胞では、ほぼ１００％両側アレルｉｎｄｅｌが導入されていた可能性がある。そこで、ＰＸ４５９をＫｐｎＩ及びＮｏｔＩで切断した後、切断末端をＴ４ポリメラーゼで平滑化し、ライゲーションすることにより、ＰＸ４５９（ｄｅｌ＿Ｃａｓ９−Ｔ２Ａ−Ｐｕｒｏ）を作製した。ＰＸ４５９（ｄｅｌ＿Ｃａｓ９−Ｔ２Ａ−Ｐｕｒｏ）のＢｐｉＩサイトに、ａＰ２Ａを標的とするスペーサー配列のコード配列を挿入し、ａＰ２Ａ＿ＰＸ４５９（ｄｅｌ＿Ｃａｓ９−Ｔ２Ａ−Ｐｕｒｏ）を作製した。ａＰ２Ａ＿ＰＸ４５９（ｄｅｌ＿Ｃａｓ９−Ｔ２Ａ−Ｐｕｒｏ）の量（０〜２５０ｎｇ）を変化させて、一定量（２５０ｎｇ）のＰＸ４５９（スペーサー配列なし）とともに、ＡＩＭＳ細胞にコトランスフェクションした。ＡＩＭＳ細胞にはＣｄｈ１−ａＰ２Ａ−ＡＩＭＳを用いた。【０１８４】
結果を図４Ｅに示す。ａＰ２Ａ＿ＰＸ４５９（ｄｅｌ＿Ｃａｓ９−Ｔ２Ａ−Ｐｕｒｏ）の使用量の減少に伴い、ｉｎｄｅｌ導入率は低下したが、片側アレルｉｎｄｅｌの導入率は、ほとんど増えなかった。【０１８５】
これらの結果から、トランスフェクション時に、ｓｇＲＮＡ発現プラスミドの使用量を減らしても、片側アレルｉｎｄｅｌの導入率は増えないことが確認された。【０１８６】
（Ｒｏｓａ２６及びアルブミン遺伝子に対するゲノム編集）
ＰＸ４５９のＢｐｉＩサイトに、下記のアダプターリンカー配列をそれぞれ挿入し、１０Ｃ（８Ａ）リンカーＰＸ４５９及び２５Ｃ（２３Ａ）リンカーＰＸ４５９をそれぞれ作製した。これらのプラスミドのＢＰｉＩサイトに、所望のスペーサー配列のコード配列を挿入することにより、５’側に１０Ｃ及び２３Ｃが付加されたｓｇＲＮＡをそれぞれ発現させることができる。ただし、これらのプラスミドでは、ＢＰｉＩサイトへのライゲーション用のオーバーハング配列ＣＡＣＣを導入するために、１０Ｃの８番目及び２５Ｃの２３番目のＣがそれぞれＡに置換されている。
１０Ｃ（８Ａ）アダプターリンカー：
（Ｆ）５’−ＣＡＣＣＧＣＣＣＣＣＣＣＡＣＣＧＧＧＴＣＴＴＣＧＡＧＡＡＧＡＣＣＴ−３’（配列番号５９）
（Ｒ）５’−ＡＡＡＣＡＧＧＴＣＴＴＣＴＣＧＡＡＧＡＣＣＣＧＧＴＧＧＧＧＧＧＧＣ−３’（配列番号６０）
２５Ｃ（２３Ａ）アダプターリンカー：
（Ｆ）５’−ＣＡＣＣＧＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＡＣＣＧＧＧＴＣＴＴＣＧＡＧＡＡＧＡＣＣＴ−３’（配列番号６１）
（Ｒ）５’−ＡＡＡＣＡＧＧＴＣＴＴＣＴＣＧＡＡＧＡＣＣＣＧＧＴＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＣ−３’（配列番号６２）【０１８７】
前記１０Ｃ（８Ａ）リンカーＰＸ４５９又は２５Ｃ（２３Ａ）リンカーＰＸ４５９のＢＰｉＩサイトに、Ｒｏｓａ２６を標的とするスペーサー配列のコード配列又はアルブミン遺伝子（Ａｌｂ）を標的とするスペーサー配列のコード配列を挿入し、Ｒｏｓａ２６＿ＰＸ４５９（１０Ｃ（８Ａ））、Ｒｏｓａ２６＿ＰＸ４５９（２５Ｃ（２３Ａ））、Ａｌｂ＿ＰＸ４５９（１０Ｃ（８Ａ））、及びＡｌｂ＿ＰＸ４５９（２５Ｃ（２３Ａ））をそれぞれ作製した。Ｒｏｓａ２６を標的とするｓｇＲＮＡ作製用リンカーの配列を配列番号８７，８８に示す。Ａｌｂを標的とするｓｇＲＮＡ作製用リンカーの配列を配列番号８９，９０に示す。【０１８８】
上記で作製したＲｏｓａ２６＿ＰＸ４５９（１０Ｃ（８Ａ））、Ｒｏｓａ２６＿ＰＸ４５９（２５Ｃ（２３Ａ））、Ａｌｂ＿ＰＸ４５９（１０Ｃ（８Ａ））、又はＡｌｂ＿ＰＸ４５９（２５Ｃ（２３Ａ））を、野生型ＥＳ細胞に導入した。上記の「（ＡＩＭＳ細胞の作製）」で記載した方法と同様にトランスフェクション及びピューロマイシン処理を行った。ピューロマイシン処理により選択されたピューロマイシン耐性細胞を、ピューロマイシン非存在下で数日間培養した後、継代してクローン化した。クローン化した細胞のコロニーからゲノムを回収し、ＰＣＲ及びシークエンス解析により各アレルのｉｎｄｅｌの有無を判定した。【０１８９】
結果を図４Ｆに示す。Ｒｏｓａ２６及びＡｌｂのようなゲノム領域を標的とした場合においても、スペーサー配列の５’末端にシトシンを付加することにより、片側アレルｉｎｄｅｌの導入率が上昇することが確認された。【０１９０】
トランスフェクション用細胞として野生型マウスＥＳ細胞を使用し、トランスフェクション用プラスミドとして上記で作製したプラスミドを使用したこと以外は、実施例２の「（ＡＩＭＳ細胞を用いたｉｎｄｅｌパターン解析）」で記載した方法と同様にトランスフェクション及びピューロマイシン処理を行い、ピューロマイシン耐性細胞を選択した。得られたピューロマイシン耐性細胞をピューロマイシン非存在下で数日間培養した後、継代してクローン化されたコロニーを得た。前記コロニーからゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲにより、ｓｇＲＮＡの標的配列を含むＤＮＡ断片を増幅してシークエンス解析を行い、ｉｎｄｅｌの有無を判定した。Ｒｏｓａ２６を標的とした場合のｉｎｄｅｌ解析用ＰＣＲプライマーの配列を配列番号５５，５６に示す。アルブミン遺伝子を標的とした場合のｉｎｄｅｌ解析用ＰＣＲプライマーの配列を配列番号５７，５８に示す。【０１９１】
結果を図４Ｆに示す。図４Ｆのグラフの横軸には、標的配列の５’末端に付加したヌクレオチド残基を示した。
図４Ｂにおける結果と同様に、ヌクレオチド付加を行わない場合（０Ｃ）には、ほぼ１００％両側アレルｉｎｄｅｌが導入された。一方、Ｒｏｓａ２６及びアルブミン遺伝子（Ａｌｂ）のいずれにおいても、付加したシトシンの個数が多くなるに従い、ｉｎｄｅｌ導入率は減少した。また、シトシン付加により、片側アレルｉｎｄｅｌの導入率が高くなった。
これらの結果から、内在性遺伝子を標的とした場合も、標的配列の５’末端にヌクレオチド残基を付加することにより、片側アレルｉｎｄｅｌの導入率が上昇することが確認された。【０１９２】
［実施例５］ＡＩＭＳ細胞を用いた相同組換え試験
（評価方法の概要）
次に、ＡＩＭＳ細胞を用いて、ｉｎｄｅｌを含まない相同組換えの導入率を評価した。
図５Ａは、本試験で用いた方法の概略を説明する図である。本試験では、Ｐ２Ａコード配列内の配列を標的とするｐ：ＲＣＰと、Ｔｂｘ３−Ｐ２Ａ−Ｎｅｏ  ＫＩベクターとを、Ｔｂｘ３−Ｐ２Ａ−ＡＩＭＳにコトランスフェクションする。両プラスミドが導入されたＴｂｘ３−Ｐ２Ａ−ＡＩＭＳでは、まず、オールインワンＣＲＩＳＰＲプラスミドからＰ２Ａを標的とするｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９が発現し、これらによりＰ２Ａコード配列が切断される。次いで、Ｔｂｘ３−Ｐ２Ａ−Ｎｅｏ  ＫＩベクターとの相同組換えにより、Ｔｂｘ３遺伝子下流にＰ２Ａ−Ｎｅｏキメラ遺伝子がノックインされる（図５Ａ左図参照）。コトランスフェクション後、ピューロマイシン存在下で培養し、次いでジェネティシン存在下で培養することにより、ゲノム編集によりＰ２Ａ−Ｎｅｏキメラ遺伝子がノックインされた細胞を選択することができる。【０１９３】
Ｐ２Ａ−ｔｄＴｏｍａｔアレルにＰ２Ａ−Ｎｅｏキメラ遺伝子がノックインされ、且つＰ２Ａ−Ｖｅｎｕｓアレルにｉｎｄｅｌを含まない細胞では、ｔｄＴｏｍａｔｏの蛍光が消失し、Ｖｅｎｕｓの蛍光が細胞全体に検出される（図５Ａ右図（ａ））。Ｐ２Ａ−ＶｅｎｕｓアレルにＰ２Ａ−Ｎｅｏキメラ遺伝子がノックインされ、且つＰ２Ａ−ｔｄＴｏｍａｔｏアレルにｉｎｄｅｌを含まない細胞では、Ｖｅｎｕｓの蛍光が消失し、ｔｄＴｏｍａｔｏの蛍光が細胞全体に検出される（図５Ａ右図（ｂ））。Ｐ２Ａ−Ｖｅｎｕｓアレル又はＰ２Ａ−ｔｄＴｏｍａｔｏアレルにＰ２Ａ−Ｎｅｏキメラ遺伝子がノックインされ、且つＰ２Ａ−ｔｄＴｏｍａｔｏアレル又はＰ２Ａ−Ｖｅｎｕｓアレルにフレームシフトｉｎｄｅｌを含む細胞では、Ｖｅｎｕｓ及びｔｄＴｏｍａｔｏの両方の蛍光が消失する（図５Ａ右図（ｃ）左）。Ｐ２Ａ−ｔｄＴｏｍａｔｏアレルにＰ２Ａ−Ｎｅｏキメラ遺伝子がノックインされ、且つＰ２Ａ−Ｖｅｎｕｓアレルにインフレームｉｎｄｅｌを含む細胞では、ｔｄＴｏｍａｔｏの蛍光が消失し、Ｖｅｎｕｓの蛍光が核局在する（図５Ａ右図（ｃ）中）。Ｐ２Ａ−ＶｅｎｕｓアレルにＰ２Ａ−Ｎｅｏキメラ遺伝子がノックインされ、且つＰ２Ａ−ｔｄＴｏｍａｔｏアレルにインフレームｉｎｄｅｌを含む細胞では、Ｖｅｎｕｓの蛍光が消失し、ｔｄＴｏｍａｔｏの蛍光が核局在する（図５Ａ右図（ｃ）右）。
このようにして、ノックインされていない方のアレルにｉｎｄｅｌを含むか否かを評価することができる。両アレルに同時にノックインされることは非常に稀であるため、ｔｄＴｏｍａｔｏおよびＶｅｎｕｓの両方の蛍光が消失したものは全て、一方のアレルにＰ２Ａ−Ｎｅｏキメラ遺伝子がノックインされ、他方のアレルにフレームシフトｉｎｄｅｌが生じたものとみなした。【０１９４】
（試験方法）
Ｒｏｓａ２６  ｍＴ／ｍＧ  ｐｌａｓｍｉｄ  （Ａｄｄｇｅｎｅ，ｐｌａｓｍｉｄ＃１７７８７）をテンプレートとして、ＰＣＲにより、Ｐ２Ａ−Ｎｅｏキメラ遺伝子を増幅した。ＰＣＲに用いたプライマーの配列を配列番号３０，３２に示す。前記Ｐ２Ａ−Ｎｅｏキメラ遺伝子を、Ｔｂｘ３−Ｐ２Ａ−ｔｄＴｏｍａｔｏ  ＫＩベクターのＰ２Ａ−ｔｄＴｏｍａｔｏキメラ遺伝子と置換して、Ｔｂｘ３−Ｐ２Ａ−Ｎｅｏ  ＫＩベクターを作製した。
試験対象のスペーサー配列のコード配列を含むｐ：ＲＣＰと、Ｔｂｘ３−Ｐ２Ａ−Ｎｅｏ  ＫＩベクターとを、Ｔｂｘ３−Ｐ２Ａ−ＡＩＭＳに、コトランスフェクションし、ピューロマイシン処理を行った。コトランスフェクション及びピューロマイシン処理の条件は、実施例２の「（ＡＩＭＳ細胞を用いたｉｎｄｅｌパターン解析）」で記載した方法と同様である。
コトランスフェクションから３日後に、ピューロマイシンを除去し、ジェネティシン（４００μｇ／ｍＬ，ＧＩＢＣＯ）を含む培地を添加して、ジェネティシンン耐性細胞を選択した。得られたジェネティシン耐性細胞をクローン化し、９クローンのジェノタイピングを行った。その結果、９クローン全てにおいて、Ｐ２Ａ−Ｎｅｏキメラ遺伝子のノックインが確認された。この結果から、ジェネティシン耐性クローンの多くが、Ｐ２Ａ−Ｎｅｏキメラ遺伝子のノックインクローンであることが確認された。また、９クローン全てにおいてＴｏｍａｔｏの蛍光が観察されたため、Ｐ２Ａ−Ｖｅｎｕｓアレルへの片側ノックインであると判定された。【０１９５】
上記の方法でコトランスフェクションし、ピューロマイシン処理及びジェネティシン処理を行い、ジェネティシン耐性細胞を選択した。これらの細胞について、蛍光顕微鏡（倒立型リサーチ顕微鏡  ＩＸ７３、オリンパス）を用いて、ｔｄＴｏｍａｔｏ及びＶｅｎｕｓの蛍光を観察し、ノックインされていない方のアレルにｉｎｄｅｌを含むかを評価した。１回のコトランスフェクションで、４０〜２３０個のクローンの解析を行った。１種類のｓｇＲＮＡについて、トランスフェクション及びその後のｉｎｄｅｌ解析を最低３回行った。【０１９６】
（ミスマッチ法の評価）
実施例３と同様に、Ｐ２Ａの標的配列（配列番号９５）のいずれか１個を、異なる塩基に置換した１塩基ミスマッチスペーサー配列をそれぞれ設計し、当該スペーサー配列のコード配列にアダプター配列を付加して１塩基ミスマッチｓｇＲＮＡ用アダプターリンカーを作製した。これらの１塩基ミスマッチｓｇＲＮＡ用アダプターリンカーを、ＰＸ４５９プラスミドのＢｐｉＩサイトにそれぞれ挿入し、各Ｐ２Ａ（ミスマッチ）＿ＰＸ４５９を作製した。これらの各Ｐ２Ａ（ミスマッチ）＿ＰＸ４５９を、コトランスフェクション用のｐ：ＲＣＰとして用いた。【０１９７】
結果を図５Ｂに示す。図５Ｂのグラフの横軸は、Ｐ２Ａの標的配列に対して置換した塩基の位置（ＰＡＭに隣接する塩基を１としたときの各塩基の位置）を示した。スペーサー配列では、標的配列のＡをＴに、ＴをＡに、ＣをＧに、ＧをＣに置換した。「Ｐ」は、Ｐ２Ａ＿ＰＸ４５９（ミスマッチなし）を用いた場合である。図中、「ＨＲ＋ｗｔ」は、一方のアレルに相同組換え（ＨＲ）を有し、且つ他方のアレルにｉｎｄｅｌを含まないものであり、「ＨＲ＋ｉｎｄｅｌ」は、一方のアレルに相同組換え（ＨＲ）を有し、且つ他方のアレルにｉｎｄｅｌ含むものである。「ｕｎｋｎｏｗｎ」は、それら以外のものである。
図５Ｂに示すように、Ｐ２Ａ＿ＰＸ４５９を用いた場合には、ほぼ１００％ｉｎｄｅｌを伴う相同組換えであった。一方、Ｐ２Ａ（ミスマッチ）＿ＰＸ４５９を用いた場合には、ｉｎｄｅｌを伴わない相同組換えの割合が増加した。また、ミスマッチの位置により、ｉｎｄｅｌを伴わない相同組換えの割合に差が見られた。
以上の結果から、ミスマッチ法は、ｉｎｄｅｌを伴わない相同組換えの誘導方法として有効であることが確認された。【０１９８】
（５’ヌクレオチド付加法の評価）
Ｐ２Ａ標的配列（配列番号９５）の５’側に、１０個又は２０個のシトシンを付加したスペーサー配列をそれぞれ設計し、これらのスペーサー配列のコード配列にアダプター配列を付加して、５’Ｃ付加ｓｇＲＮＡ用アダプターリンカーをそれぞれ作製した。これらのｓｇＲＮＡ用アダプターリンカーを、ＰＸ４５９プラスミドのＢｐｉＩサイトにそれぞれ挿入し、Ｐ２Ａ（５’付加）＿ＰＸ４５９をそれぞれ作製した。これらの各Ｐ２Ａ（５’付加）＿ＰＸ４５９を、コトランスフェクション用のｐ：ＲＣＰとして用いた。【０１９９】
結果を図５Ｃに示す。図５Ｃのグラフの横軸は、標的配列の５’末端に付加したヌクレオチド残基を示した。「０Ｃ」は、Ｐ２Ａ＿ＰＸ４５９（５’付加なし）を用いた場合である。図中、「ＨＲ＋ｗｔ」、「ＨＲ＋ｉｎｄｅｌ」、及び「ｕｎｋｎｏｗｎ」の意味は、図５Ｂと同様である。
図５Ｃに示すように、Ｐ２Ａ＿ＰＸ４５９を用いた場合には、ほぼ１００％ｉｎｄｅｌを伴う相同組換えであった。一方、Ｐ２Ａ（５’）＿ＰＸ４５９を用いた場合には、ｉｎｄｅｌを伴わない相同組換えの割合が増加した。また、付加したシトシンの個数の増加に伴い、ｉｎｄｅｌを伴わない相同組換えの割合が増加した。
以上の結果から、５’ヌクレオチド付加法は、ｉｎｄｅｌを伴わない相同組換えの誘導方法として有効であることが確認された。【０２００】
［実施例６］ミスマッチ法と５’ヌクレオチド付加法との組み合わせ
実施例３で評価したミスマッチ法と、実施例４で評価した５’ヌクレオチド付加法とを組み合わせることにより、片側アレルｉｎｄｅｌの導入率が増加するかを試験した。ＡＩＭＳ細胞として、Ｔｂｘ３−Ｐ２Ａ−ＡＩＭＳを用いた。【０２０１】
図６Ａは、Ｐ２Ａの標的配列（配列番号９５）に対して１塩基ミスマッチを有するｓｇＲＮＡを用いた結果を示す。Ｐ２Ａ（ミスマッチ）＿ＰＸ４５９をＴｂｘ３−Ｐ２Ａ−ＡＩＭＳに導入し、ｉｎｄｅｌの評価を行った。グラフの上部に、置換した塩基のＰＡＭからの距離（ＰＡＭに隣接する塩基を１としたときの各塩基の位置）を示した。「Ｐ」は、Ｐ２Ａ＿ＰＸ４５９（ミスマッチなし）を用いた場合である。スペーサー配列では、標的配列のＡをＴに、ＴをＡに、ＣをＧに、ＧをＣに置換した。
実施例３の図３Ｂと同様に、Ｐ２Ａ＿ＰＸ４５９を用いた場合には、ほぼ１００％両側アレルｉｎｄｅｌが導入された。一方、Ｐ２Ａ（ミスマッチ）＿ＰＸ４５９を用いた場合には、片側アレルｉｎｄｅｌの導入率が高くなった。【０２０２】
図６Ｂは、Ｐ２Ａの標的配列（配列番号９５）に対して１塩基ミスマッチを有し、且つ５’末端に１０個のシトシンを付加したスペーサー配列を含むｓｇＲＮＡを用いた結果を示す。Ｐ２Ａ（ミスマッチ＿１０Ｃ）＿ＰＸ４５９をＴｂｘ３−Ｐ２Ａ−ＡＩＭＳに導入し、ｉｎｄｅｌの評価を行った。グラフの記載方法及び塩基の置換方法は、図６Ａの場合と同様である。「Ｐ」は、Ｐ２Ａ（１０Ｃ（８Ａ））＿ＰＸ４５９を用いた場合である。前記において、「Ｐ２Ａ（１０Ｃ（８Ａ））」は、Ｐ２Ａの標的配列の５’末端に付加した１０個のシトシンのうち、８番目のシトシンがアデノシンに置換されていることを表す。
図６Ｂでは、図６Ａの結果と比較して、片側アレルｉｎｄｅｌの導入率が全体的に増加した。【０２０３】
図６Ｃは、Ｐ２Ａの標的配列（配列番号９５）に対して１塩基ミスマッチを有し、且つ５’末端に２５個のシトシンを付加したスペーサー配列を含むｓｇＲＮＡを用いた結果を示す。Ｐ２Ａ（ミスマッチ＿２５Ｃ）＿ＰＸ４５９をＴｂｘ３−Ｐ２Ａ−ＡＩＭＳに導入し、ｉｎｄｅｌの評価を行った。グラフの記載方法及び塩基の置換方法は、図６Ａの場合と同様である。「Ｐ」は、Ｐ２Ａ（２５Ｃ（２３Ａ））＿ＰＸ４５９を用いた場合である。前記において、「Ｐ２Ａ（２５Ｃ（２３Ａ））」は、Ｐ２Ａの標的配列の５’末端に付加した２５個のシトシンのうち、２３番目のシトシンがアデノシンに置換されていることを表す。
図６Ｃでは、図６Ａ及び図６Ｂの結果と比較して、ｉｎｄｅｌ導入率が低下した。特に、両側アレルｉｎｄｅｌの導入率が大きく低下した。その結果、片側アレルｉｎｄｅｌのみが誘導されるミスマッチ位置が増加した。【０２０４】
これらの結果より、ミスマッチ法及び５’ヌクレオチド付加法を組み合わせることにより、片側アレルｉｎｄｅｌの導入率を制御できることが示された。【０２０５】
［実施例７］ｉｎｄｅｌ誘導率（Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ：Ｐ）の算出及び片側アレルｉｎｄｅｌ頻度の予測
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９による標的領域へのｉｎｄｅｌ誘導率をＰとすると、片側アレルｉｎｄｅｌの頻度、両側アレルｉｎｄｅｌの頻度、及びｉｎｄｅｌなしの頻度は、それぞれ以下の式（ｍ）、（ｂ）、及び（ｎ）で表すことができる。
片側アレルｉｎｄｅｌの頻度（ｍｏｎｏ）＝２×Ｐ×（１−Ｐ）  ・・・（ｍ）
両側アレルｉｎｄｅｌの頻度（ｂｉ）＝Ｐ２                    ・・・（ｂ）
ｉｎｄｅｌなしの頻度（ｎｏｎｅ）＝（１−Ｐ）２              ・・・（ｎ）【０２０６】
ここで、ｍｏｎｏ＋ｂｉ＋ｎｏｎｅ＝１とすると、Ｐは、以下の式（１）により求めることができる。
Ｐ＝（２×ｂｉ＋ｍｏｎｏ）／２            ・・・（１）【０２０７】
そこで、図３Ｂ〜３Ｄ、図４Ｂ、及び図６Ａ〜６Ｃの結果から、各ｓｇＲＮＡにおけるＰ値を前記式（１）により算出した。これらのＰ値を用いて、各ｓｇＲＮＡにおける片側アレルｉｎｄｅｌの頻度を、前記式（ｍ）により算出した。
前記式（ｍ）により算出された片側アレルｉｎｄｅｌの頻度と、図３Ｂ〜３Ｄ、図４Ｂ、及び図６Ａ〜６Ｃにおいて実際に検出された片側アレルｉｎｄｅｌの頻度との相関関係を図７に示した。【０２０８】
図７に示すように、式（ｍ）により予測される片側アレルｉｎｄｅｌの頻度と、実際に検出された片側アレルｉｎｄｅｌの頻度とは、高い相関（Ｒ２＝０．８９４３）を示した。この結果から、片側アレルｉｎｄｅｌの頻度は、式（ｍ）により予測可能であることが示された。【０２０９】
［実施例８］ｉｎｄｅｌパターンの予測
（Ｐｒｅ−Ｄｅｍｏ−Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ）
Ｐｒｅ−Ｄｅｍｏ−Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎは、前記式（１）によりＰ値を算出するための簡易な試験方法である。Ｐｒｅ−Ｄｅｍｏ−Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎは、図８Ａに示すプロトコールに従って行った。
任意の標的配列に対するスペーサー配列のコード配列を、ＰＸ４５９のＢｐｉＩサイトにライゲーションし、ｐ：ＲＣＰを作製した。前記ｐ：ＲＣＰを、実施例２の「（ＡＩＭＳ細胞を用いたｉｎｄｅｌパターン解析）」で記載した方法と同様に細胞にトランスフェクションし、ピューロマイシン処理を行い、ピューロマイシン耐性細胞を選択した。
得られたピューロマイシン耐性細胞のＤＮＡを抽出し、標的配列を含む領域をＰＣＲにより増幅し、増幅断片をＴ−Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ（ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ；Ｐｒｏｍｅｇａ）に挿入してクローニングした。２０〜３０個のクローンの配列解析を行い、ｉｎｄｅｌが確認されたクローンの割合を算出した。この値をｉｎｄｅｌ誘導率（Ｐ）とした。さらに、算出したＰ値を用いて、前記式（ｍ）、（ｂ）、及び（ｎ）により、片側アレルｉｎｄｅｌの頻度、両側アレルｉｎｄｅｌの頻度、及びｉｎｄｅｌなしの頻度をそれぞれ予測した。【０２１０】
（ｉｎｄｅｌパターン予測の評価）
ゲノム編集の標的遺伝子として、アルブミン遺伝子（Ａｌｂ）を選択し、Ａｌｂを標的とするスペーサー配列のコード配列を含むｓｇＲＮＡ用リンカー（配列番号８９，９０）を用いて、ｐ：ＲＣＰとしてＡｌｂ＿ＰＸ４５９、Ａｌｂ（１０Ｃ（８Ａ））＿ＰＸ４５９及びＡｌｂ（２５Ｃ（２３Ａ））＿ＰＸ４５９を作製した。これらを野生型ＥＳ細胞にそれぞれ導入し、上記のようにＰｒｅ−Ｄｅｍｏ−Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎを行った。その予測結果を図８Ｂの左図に示す。【０２１１】
また、同様に、Ａｌｂ＿ＰＸ４５９のトランスフェクション及びピューロマイシン処理を行い、ピューロマイシン耐性細胞のコロニーを得た。個々のピューロマイシン耐性細胞コロニーから、それぞれＤＮＡを抽出し、標的配列を含む領域の配列解析を行い、個々のクローンにおけるｉｎｄｅｌパターンを解析した。その結果から、片側アレルｉｎｄｅｌの頻度、両側アレルｉｎｄｅｌの頻度、及びｉｎｄｅｌなしの頻度をそれぞれ求めた。その結果を図８Ｂ右図に示す。【０２１２】
図８Ｂに示すように、Ｐｒｅ−Ｄｅｍｏ−Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎによる予測値は、実際のｉｎｄｅｌパターンと類似していた。この結果から、Ｐｒｅ−Ｄｅｍｏ−Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎにより、ｉｎｄｅｌパターンを予測できることが示された。【０２１３】
［実施例９］５’ヌクレオチド付加法によるオフターゲット効果の抑制（１塩基ミスマッチを有するｓｇＲＮＡを用いた試験）
１塩基ミスマッチを有するｓｇＲＮＡによる標的配列のゲノム編集は、標的配列とスペーサー配列とが一致していないため、オフターゲットのゲノム編集と考えることができる。そこで、５’ヌクレオチド付加法により、オフターゲット効果を抑制できるかを検討した。
図９Ａは、図６Ａ〜６Ｃのデータに基づき、前記式（１）によりｉｎｄｅｌ誘導率（Ｐ）を算出した結果を示す。１〜２０の位置に１塩基ミスマッチを有するｓｇＲＮＡによる標的配列のゲノム編集は、オフターゲットのゲノム編集とみなすことができる。
図９Ａに示すように、５’末端にシトシンを付加することにより、オフターゲット作用を抑制することができた。例えば、１の位置にミスマッチを有するｓｇＲＮＡを用いた場合、シトシンを付加していないと、ｉｎｄｅｌ誘導率（Ｐ）は、ほぼ１である。しかし、スペーサー配列の５’末端にシトシンを１０個付加すると、ｉｎｄｅｌ誘導率（Ｐ）が有意に低下する。一方、ミスマッチを有さないｓｇＲＮＡを用いた場合、１０個のシトシンを付加しても、ｉｎｄｅｌ誘導率（Ｐ）はそれほど低下しない。この結果は、５’ヌクレオチド付加法により、オンターゲットのゲノム編集活性は維持しつつ、オフターゲット効果を抑制し得ることを示している。【０２１４】
（ゲノム中のオフターゲット領域でのオフターゲット効果の検証）
ＥＭＸ１遺伝子中の標的配列（ＧＡＧＴＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ：配列番号８３（ｓｇＲＮＡ作製用リンカー）の５〜２４番目）に対して、オフターゲット領域であるＭＦＡＰ１遺伝子領域（ＧＡＧＴＣｔａＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ：配列番号９１；ＥＭＸ１遺伝子中の標的配列とは異なる部分を小文字で示す）におけるｉｎｄｅｌをＨＥＫ２９３Ｔ細胞で検証した。
上記実施例４で作製した１０Ｃ（８Ａ）リンカーＰＸ４５９又は２５Ｃ（２３Ａ）リンカーＰＸ４５９に、前記ＥＭＸ１遺伝子を標的とするスペーサー配列のコード配列を挿入し、ＥＭＸ１＿ＰＸ４５９（１０Ｃ（８Ａ））、及びＥＭＸ１＿ＰＸ４５９（２５Ｃ（２３Ａ））をそれぞれ作製した。プラスミドの作製に使用したリンカーを配列番号８３、８４に示す。これらのプラスミドを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入した。上記の「（ＡＩＭＳ細胞の作製）」で記載した方法と同様にトランスフェクション及びピューロマイシン処理を行った。Ｉｎｄｅｌの確認はＴ７Ｅ１アッセイとシークエンス解析により行った。
トランスフェクション及びピューロマイシン処理を行ったＨＥＫ２９３Ｔ細胞から抽出したＤＮＡを、ＰＣＲ（ＥＭＸ１オンターゲット領域増幅用プライマー：配列番号８５，８６；ＭＦＡＲオフターゲット領域増幅用プライマー：配列番号９２，９３）で増幅し、０Ｃに関しては増幅断片をＴ−ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒに挿入してクローニングした。次いで、Ｔ７Ｅ１酵素（ＮＥＢ）でのアッセイ及びシークエンス解析によりｉｎｄｅｌの誘導率（Ｐ）を決定した。０Ｃ以外の（Ｐ）は増幅させたＰＣＲ産物を直接Ｔ７Ｅ１アッセイし、切断バンド量の比率から（Ｐ）値を算出し、図９Ｂに示した。
スペーサー配列の５’末端にシトシンを付加することにより、オンターゲットであるＥＭＸ１遺伝子中の標的配列（オンターゲット領域）よりも、ＭＦＡＰ１遺伝子中のオフターゲット領域において、ｉｎｄｅｌ誘導率の顕著な低下が確認された。この結果から、５’末端にヌクレオチドを付加することにより、オフターゲット効果を低減できることが示された。【０２１５】
上記で作製した１０Ｃ（８Ａ）リンカーＰＸ４５９又は２５Ｃ（２３Ａ）リンカーＰＸ４５９に加え、５Ｃ（３Ａ）リンカーＰＸ４５９、１５Ｃ（１３Ａ）リンカーＰＸ４５９、２０Ｃ（１８Ａ）リンカーＰＸ４５９、及び３０Ｃ（２８Ａ）リンカーＰＸ４５９を作製し、前記ＥＭＸ１遺伝子を標的とするスペーサー列のコード配列を挿入し、ＥＭＸ１＿ＰＸ４５９（５Ｃ（３Ａ））、ＥＭＸ１＿ＰＸ４５９（１０Ｃ（８Ａ））、ＥＭＸ１＿ＰＸ４５９（１５Ｃ（１３Ａ））、ＥＭＸ１＿ＰＸ４５９（２０Ｃ（１８Ａ））、ＥＭＸ１＿ＰＸ４５９（２５Ｃ（２３Ａ））、及びＥＭＸ１＿ＰＸ４５９（３０Ｃ（２８Ａ））、をそれぞれ作製した。プラスミドの作製に使用したリンカーを配列番号１１７〜１２４に示す。これらのプラスミドを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入した。上記の「（ＡＩＭＳ細胞の作製）」で記載した方法と同様にトランスフェクション及びピューロマイシン処理を行った。Ｉｎｄｅｌの確認はＴ７Ｅ１アッセイとシークエンス解析により行った。
トランスフェクション及びピューロマイシン処理を行ったＨＥＫ２９３Ｔ細胞から抽出したＤＮＡを、ＰＣＲ（ＥＭＸ１オンターゲット領域増幅用プライマー：配列番号８５，８６；ＭＦＡＲオフターゲット領域増幅用プライマー：配列番号９２，９３）で増幅し、０Ｃに関しては増幅断片をＴ−ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒに挿入してクローニングした。次いで、Ｔ７Ｅ１酵素（ＮＥＢ）でのアッセイ及びシークエンス解析によりｉｎｄｅｌの誘導率（Ｐ）を決定した。０Ｃ以外の（Ｐ）は増幅させたＰＣＲ産物を直接Ｔ７Ｅ１アッセイし、切断バンド量の比率から（Ｐ）値を算出し、図９Ｃに示した。
スペーサー配列の５’末端にシトシンを付加することにより、オンターゲットであるＥＭＸ１遺伝子中の標的配列（オンターゲット領域）よりも、ＭＦＡＰ１遺伝子中のオフターゲット領域において、ｉｎｄｅｌ誘導率の顕著な低下が確認された。この結果から、５’末端にヌクレオチドを付加することにより、オフターゲット効果を低減できることが示された。【０２１６】
［実施例１０］進行性骨化性線維異形成症（ＦＯＰ）における遺伝性疾患変異の修復試験
（細胞株）
ＡＣＶＲ１遺伝子のアレルの一方に、ＦＯＰ遺伝性疾患変異（（２０６位のアルギニン（ＣＧＣ）がヒスチジン（ＣＡＣ）に変異：Ｒ２０６Ｈ））を有するヒトｉＰＳ細胞（ｗｔ／Ｒ２０６Ｈ）を用いた。【０２１７】
（ＦＯＰ遺伝性疾患変異修復方法）
ＦＯＰ遺伝性疾患変異修復方法の概要を図１０Ａに示した。
ＡＣＶＲ１遺伝子の変異アレル（Ｒ２０６Ｈ）に対する選択的標的配列として、（ＧＧＣＴＣ［Ａ］ＣＣＡＧＡＴＴＡＣＡＣＴＧＴ：配列番号１１２；［］は変異塩基を示す。）を選択し、前記標的配列にアダプター配列を付加したＤＮＡ（配列番号１００、１０１）を作製した。これをＰＸ４５９、５Ｃ（３Ａ）リンカーＰＸ４５９、１０Ｃ（８Ａ）リンカーＰＸ４５９、及び１５Ｃ（１３Ａ）リンカーＰＸ４５９のＢＰｉＩサイトに挿入し、ＡＣＶＲ１（Ｒ２０６Ｈ）＿ＰＸ４５９、ＡＣＶＲ１（Ｒ２０６Ｈ）＿ＰＸ４５９（５Ｃ（３Ａ））、ＡＣＶＲ１（Ｒ２０６Ｈ）＿ＰＸ４５９（１０Ｃ（８Ａ））、及びＡＣＶＲ１（Ｒ２０６Ｈ）＿ＰＸ４５９（１５Ｃ（１３Ａ））をそれぞれ作製した。その結果、スペーサー配列の５’末端に０個、５個（内１個がＡ）、１０個（内１個がＡ）又は１５個（内１個がＡ）のシトシンが付加された配列を含むｓｇＲＮＡと、Ｃａｓ９を発現する変異アレル（Ｒ２０６Ｈ）編集用プラスミドを得た。これらのプラスミドをヒトｉＰＳ細胞（ｗｔ／Ｒ２０６Ｈ）に導入すると、Ｃａｓ９により変異アレル（Ｒ２０６Ｈ）が優先的に切断される（図１０Ａドット矢印）。【０２１８】
次に、前記変異アレルの修復用鋳型ＤＮＡとして、配列番号１０２に示す塩基配列を有する一本鎖オリゴドナーＤＮＡ（ｓｓＯＤＮ）を作製した。前記ｓｓＯＤＮは、Ｒ２０６Ｈの変異を修復する［Ｇ］に加えて、前記［Ｇ］の２塩基５’上流にサイレント変異［Ｇ］を有する。前記サイレント変異［Ｇ］により、ゲノム修復後のさらなるｉｎｄｅｌ導入が阻止される（図１０Ａ黒矢印）。また、ｗｔのアレルと修復されたアレル（ｃｏｒｒｅｃｔ）とを有するＡＣＶＲ１遺伝子（ｗｔ／ｃｏｒｒｅｃｔ）の存在を確認することができる。変異アレル（Ｒ２０６Ｈ）のゲノム編集を行うと、Ｃａｓ９の作用により、変異アレル（Ｒ２０６Ｈ）の欠失やｌｏｎｇ  ｄｅｌｅｔｉｏｎがしばしば起こる（ｕｎｋｎｏｗｎ  ｉｎｄｅｌ）。この時、サイレント変異［Ｇ］が存在しない場合、ｗｔ／ｕｎｋｎｏｗｎ  ｉｎｄｅｌを有するクローンを、ｗｔ／ｃｏｒｒｅｃｔを有するクローンであると誤認する恐れがある。さらに、サイレント変異［Ｇ］により、制限酵素ＢｓｔＵＩの切断サイトが導入されるため、修復クローンのｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇを簡易に行うことができる。【０２１９】
前記各プラスミド及び前記ｓｓＯＤＮをヒトｉＰＳ細胞（ｗｔ／Ｒ２０６Ｈ）に導入し、ＨＤＲ（Ｈｏｍｏｌｏｇｙ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｒｅｐａｉｒ）を誘導した。【０２２０】
（ｇｅｎｏｔｙｐｅ解析）
上記の方法によりＨＤＲを誘導したｉＰＳ細胞クローンについて、ｇｅｎｏｔｙｐｅ解析を行い、ＨＤＲの誘導効率を確認した。ＨＤＲ誘導後のクローンについて、プライマーＰｒ．ＫＷ１１８１（配列番号Ｎｏ．１０３）及びＰｒ．ＫＷ１１８２（配列番号Ｎｏ．１０４）を用いて、前記標的部位のＤＮＡをＰＣＲで増幅した。増幅断片がＢｕｓｔＵＩで切断されたものに関して、Ｐｒ．ＫＷ１１８１を用いてシークエンス解析を行った。【０２２１】
（結果）
結果を図１０Ｂに示す。図１０Ｂ中、「ｏｖｅｒａｌｌ」は、ＨＤＲが誘導されたクローンのうち、ｗｔ／ｃｏｒｒｅｃｔ以外のｇｅｎｏｔｙｐｅ（ｉｎｄｅｌ／ｃｏｒｒｅｃｔ、ｗｔ／ｃｏｒｒｅｃｔ＋ｉｎｄｅｌ等）を含むクローンの割合である。図１０Ｂに示すように、５’末端にシトシンが付加されていないｓｇＲＮＡ（０Ｃ）では、正しく修復されたｗｔ／ｃｏｒｒｅｃｔのクローンは取得できなかった。一方、５個又は１０個のシトシンを付加したｓｇＲＮＡ（５Ｃ、１０Ｃ）では、ｗｔ／ｃｏｒｒｅｃｔのクローンを取得することができた。【０２２２】
（標的ゲノム切断効率の評価）
前記変異アレル（Ｒ２０６Ｈ）編集用の各プラスミドのいずれかを、ヒトｉＰＳ細胞（ｗｔ／Ｒ２０６Ｈ）に導入し、ＡＣＶＲ１遺伝子配列内の変異アレル（Ｒ２０６Ｈ）を標的としてゲノム編集を行った。次いで、細胞からゲノムを回収し、プライマーＰｒ．ＫＷ１１８１及びＰｒ．ＫＷ１１８２を用いて、ＤＮＡをＰＣＲ増幅した。次いで、増幅断片を用いて、Ｔ７  Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ（Ｔ７Ｅ１）（ＮＥＢ社から購入）による切断アッセイを行い、ｉｎｄｅｌ誘導効率を測定した。【０２２３】
その結果を図１０Ｃに示す。５’末端にシトシンが付加されていないｓｇＲＮＡ（０Ｃ）と比較して、シトシン付加したｓｇＲＮＡ（５Ｃ、１０Ｃ、１５Ｃ）ではｉｎｄｅｌ誘導効率が著しく低下していることが確認された。このｉｎｄｅｌ誘導効率の低下が、ｗｔ／ｃｏｒｒｅｃｔクローンの取得（図１０Ｂ）に必要であることが示された。【０２２４】
［実施例１１］ＦＯＰ遺伝性疾患モデルの作製試験
（細胞株）
Ａｃｖｒ１遺伝子の変異を有さないマウスＥＳ細胞（ｗｔ／ｗｔ）を用いた。【０２２５】
（ＦＯＰ遺伝性疾患変異の誘導方法）
ＦＯＰ遺伝性疾患変異誘導方法の概要を図１１Ａに示した。
Ａｃｖｒ１遺伝子（ｗｔ／ｗｔ）に対する標的配列として、（ＧＧＣＴＣＧＣＣＡＧＡＴＡＡＣＣＣＴＧＴ：配列番号１１５）を選択し、前記標的配列にアダプター配列を付加したＤＮＡ（配列番号１０５、１０６）を作製した。これをＰＸ４５９、５Ｃ（３Ａ）リンカーＰＸ４５９、１０Ｃ（８Ａ）リンカーＰＸ４５９、１５Ｃ（１３Ａ）リンカーＰＸ４５９、２０Ｃ（１８Ａ）リンカーＰＸ４５９、２５Ｃ（２３Ａ）リンカーＰＸ４５９、及び３０Ｃ（２８Ａ）リンカーＰＸ４５９のＢＰｉＩサイトに挿入し、ＡＣＶＲ１（Ｒ２０６Ｈ）＿ＰＸ４５９、ＡＣＶＲ１（Ｒ２０６Ｈ）＿ＰＸ４５９（５Ｃ（３Ａ））、ＡＣＶＲ１（Ｒ２０６Ｈ）＿ＰＸ４５９（１０Ｃ（８Ａ））、ＡＣＶＲ１（Ｒ２０６Ｈ）＿ＰＸ４５９（１５Ｃ（１３Ａ））、ＡＣＶＲ１（Ｒ２０６Ｈ）＿ＰＸ４５９（２０Ｃ（１８Ａ））、ＡＣＶＲ１（Ｒ２０６Ｈ）＿ＰＸ４５９（２５Ｃ（２３Ａ））、及びＡＣＶＲ１（Ｒ２０６Ｈ）＿ＰＸ４５９（３０Ｃ（２８Ａ））をそれぞれ作製した。その結果、スペーサー配列の５’末端に０個、５個（内１個がＡ）、１０個（内１個がＡ）、１５個（内１個がＡ）、２０個（内１個がＡ）、２５個（内１個がＡ）又は３０個（内１個がＡ）のシトシンが付加された配列を含むｓｇＲＮＡと、Ｃａｓ９を発現するＡｃｖｒ１遺伝子（ｗｔ／ｗｔ）編集用プラスミドを得た。これらのプラスミドをマウスＥＳ細胞に導入すると、Ｃａｓ９によりＡｃｖｒ１遺伝子のｗｔアレルが切断される（図１１Ａドット矢印）。【０２２６】
次に、変異誘導用鋳型ＤＮＡとして、配列番号１０７に示す塩基配列を有するｓｓＯＤＮを作製した。前記ｓｓＯＤＮは、Ｒ２０６Ｈの変異を誘導する［Ａ］を有する。【０２２７】
前記各プラスミド及び前記ｓｓＯＤＮをマウスＥＳ細胞（ｗｔ／ｗｔ）に導入し、ＨＤＲ（Ｈｏｍｏｌｏｇｙ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｒｅｐａｉｒ）を誘導した。前記プラスミドは、ヘテロ型変異クローン（ｗｔ／Ｒ２０６Ｈ）の変異アレル（Ｒ２０６Ｈ）に対してもｉｎｄｅｌを誘導し得るが（図１１Ａ白矢印）、５’ヌクレオチド付加ｓｇＲＮＡのオフターゲット抑制効果により、変異アレル（Ｒ２０６Ｈ）に対するｉｎｄｅｌの誘導は抑制される。そのため、効率的に、ヘテロ型変異クローン（ｗｔ／Ｒ２０６Ｈ）の取得が可能となると考えられた。【０２２８】
（ｇｅｎｏｔｙｐｅ解析）
上記の方法によりＨＤＲを誘導したＥＳ細胞クローンについて、ｇｅｎｏｔｙｐｅ解析を行い、ＨＤＲの誘導効率を確認した。ＨＤＲ誘導後のクローンについて、プライマーＰｒ．ＫＷ１２０１（配列番号Ｎｏ．１０８）及びＰｒ．ＫＷ１２０２（配列番号Ｎｏ．１０９）を用いて、前記標的部位のＤＮＡをＰＣＲで増幅した。増幅断片について、Ｐｒ．ＫＷ１２０１を用いてシークエンス解析を行った。【０２２９】
（結果）
結果を図１１Ｂに示す。図１１Ｂ中、「ｏｖｅｒａｌｌ」は、ＨＤＲが誘導されたクローンのうち、ｗｔ／Ｒ２０６Ｈ以外のｇｅｎｏｔｙｐｅ（ｉｎｄｅｌ／Ｒ２０６Ｈ、ｗｔ／Ｒ２０６Ｈ＋ｉｎｄｅｌ等）を含むクローンの割合である。図１１Ｂに示すように、５’末端に５個のシトシンを付加したｓｇＲＮＡ（５Ｃ）において、ＨＤＲ誘導効率が最も高かった。シトシン付加数の増加によるＣａｓ９の活性低下（図１１Ｃ）に伴い、ＨＤＲ誘導効率も低くなった。一方、ヘテロ型変異クローン（ｗｔ／Ｒ２０６Ｈ）の取得率は、シトシン付加数の増加によるＣａｓ９活性の低下（図１１Ｃ）に伴い増加した。【０２３０】
（標的ゲノム切断効率の評価）
前記ｗｔアレル編集用の各プラスミドのいずれかを、マウスＥＳ細胞（ｗｔ／ｗｔ）に導入し、Ａｃｖｒ１遺伝子配列を標的としてゲノム編集を行った。次いで、細胞からゲノムを回収し、プライマーＰｒ．ＫＷ１２０１及びＰｒ．ＫＷ１２０２を用いて、ＤＮＡをＰＣＲ増幅した。次いで、増幅断片を用いて、Ｔ７  Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ（Ｔ７Ｅ１）（ＮＥＢ社から購入）による切断アッセイを行い、ｉｎｄｅｌ誘導効率を測定した。【０２３１】
その結果を図１１Ｃに示す。シトシン付加数の増加に伴い、ｉｎｄｅｌ誘導効率が低下することが確認された。図１１Ｃ中、ｐＸ４５９は、スペーサー配列を有さないｓｇＲＮＡを用いたネガティブコントロールである。【０２３２】
（ＦＯＰ遺伝性疾患モデル動物の作製）
上記試験で取得したヘテロ型変異クローン（ｗｔ／Ｒ２０６Ｈ）を、マウスの受精卵にマイクロインジェクションし、キメラマウスを作製した。前記キメラマウスでは、ＥＳ細胞が寄与した部位で異常な骨の形成が観察された（図１１Ｄの矢印）。以上の結果より、ＦＯＰ遺伝性疾患モデル動物を作製できることが実証された。【０２３３】
［実施例１２］細胞毒性評価試験
（ＡＩＭＳを用いた細胞毒性評価試験）
実施例４と同様の方法で、Ｐ２Ａの標的配列（ＴＡＡＣＴＴＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣ：配列番号９５）を標的として、ＡＩＭＳ細胞のゲノム編集を行った。スペーサー配列として、前記Ｐ２Ａ標的配列の５’末端に０〜２０個のシトシンを付加した配列を用いた。ゲノム編集後、細胞数をカウントした。【０２３４】
その結果を図１２Ａに示す。シトシンが付加されていないｓｇＲＮＡ（０Ｃ）では、シトシン５個を付加したｓｇＲＮＡ（５Ｃ）と比較して、細胞数が１／５に低下した。上記図４Ｂに示すように、ｓｇＲＮＡ（０Ｃ）及びｓｇＲＮＡ（５Ｃ）におけるｉｎｄｅｌ誘導効率は、いずれもほぼ１００％であった。そのため、シトシン付加により、ゲノム切断及びｉｎｄｅｌ誘導効率に関与しない細胞毒性を、抑制できることが示唆された。【０２３５】
（ＡＣＶＲ１を標的としたゲノム編集による細胞毒性評価試験）
ＡＣＶＲ１遺伝子に対する標的配列として、（ＧＧＣＴＣＧＣＣＡＧＡＴＴＡＣＡＣＴＧＴ：配列番号１１３）を選択し、前記標的配列にアダプター配列を付加したＤＮＡ（配列番号１１０、１１１）を作製した。これをＰＸ４５９、５Ｃ（３Ａ）リンカーＰＸ４５９、１０Ｃ（８Ａ）リンカーＰＸ４５９、１５Ｃ（１３Ａ）リンカーＰＸ４５９、及び２０Ｃ（１８Ａ）リンカーＰＸ４５９のＢpｉＩサイトに挿入し、ＡＣＶＲ１（Ｒ２０６Ｈ）＿ＰＸ４５９、ＡＣＶＲ１（Ｒ２０６Ｈ）＿ＰＸ４５９（５Ｃ（３Ａ））、ＡＣＶＲ１（Ｒ２０６Ｈ）＿ＰＸ４５９（１０Ｃ（８Ａ））、ＡＣＶＲ１（Ｒ２０６Ｈ）＿ＰＸ４５９（１５Ｃ（１３Ａ））、及びＡＣＶＲ１（Ｒ２０６Ｈ）＿ＰＸ４５９（２０Ｃ（１８Ａ））をそれぞれ作製した。その結果、スペーサー配列の５’末端に０個、５個（内１個がＡ）、１０個（内１個がＡ）、１５個（内１個がＡ）又は２０個（内１個がＡ）のシトシンが付加された配列を含むｓｇＲＮＡと、Ｃａｓ９を発現するｗｔ／ｗｔ編集用プラスミドを得た。これらのプラスミドをヒトｉＰＳ細胞（ｗｔ／ｗｔ）に導入し、ゲノム編集を行った。ゲノム編集後、細胞数をカウントした。【０２３６】
その結果を図１２Ｂに示す。シトシンが付加されていないｓｇＲＮＡ（０Ｃ）では、シトシン５個を付加したｓｇＲＮＡ（５Ｃ）と比較して、細胞数が１／２２に低下した。【０２３７】
［実施例１３］ｉｎｄｅｌ誘導率（Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ：Ｐ）の算出及びｉｎｄｅｌ頻度の予測
ＡＩＭＳから得られた２５３個のデータ（Ｃ付加ｇＲＮＡ、ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｇＲＮＡ、Ｃ付加＋ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｇＲＮＡの全てからなる）を取得し、これらのデータに基づいて、前記式（１）によりＰ値を算出した。この算出したＰ値を横軸とし、Ｂｉ，Ｍｅｎｏ，Ｎｏｎｅそれぞれのｉｎｄｅｌデータ値Ｐを縦軸としてプロットした。このグラフから、二次関数の数式を得た（図１３Ａ）。これらの得られた数式にＰ値を当てはめると、Ｂｉ，  Ｍｏｎｏ，  Ｎｏｎｅのｉｎｄｅｌ割合がそれぞれ予測できる。【０２３８】
図１３Ｂに、実際の実測値と上記式による予測値との関係を示した。実際の実測値Ｂｉ  ｉｎｄｅｌ（Ｐ）、Ｍｏｎｏ  ｉｎｄｅｌ（Ｐ）、Ｎｏｎｅ  （Ｐ）を横軸とし、予測値（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ）を縦軸としてプロットした。実測値と予測値は、高い相関を示した。
図１３Ｂの下図は、Ｂｉ  ｉｎｄｅｌ（Ｐ）＋Ｍｏｎｏ  ｉｎｄｅｌ（Ｐ）＋Ｎｏｎｅ（Ｐ）＝１であるため、Ｎｏｎｅ（Ｐ）＝１−Ｂｉ  ｉｎｄｅｌ（Ｐ）−Ｍｏｎｏ  ｉｎｄｅｌ（Ｐ）として作製した。【０２３９】
図１３Ｃ上図に、Ｃｄｈ１−Ｐ２Ａ−ＡＩＭＳでＰ２Ａを標的としてゲノム編集を行った場合の実際のデータを示す。
図１３Ｃ中図に、得られたデータから、上記式（１）で算出されたＰ値を図１３Ａの数式（Ｐ＝ｘ）に当てはめて作成した予測グラフを示す。
図１３Ｃ下図に、図１３Ｃ上図の実験の際に抽出したゲノムに対してＰＣＲを行い、上記「［ゲノム編集パターンの予測方法］」に従って行ったバクテリア（大腸菌）アッセイ（実施例８：Ｐｒｅ−Ｄｅｍｏ−Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ）からＰ値を求め、図１３Ａの数式に当てはめて得られたｉｎｄｅｌパターン予測グラフを示す。図１３Ｃ下図が、図１３Ｃ上図とほぼ一致することから、図１３Ａの数式の正確性に加え、バクテリアアッセイの有効性が証明された。したがって、ＡＩＭＳを使用しなくても、内在性遺伝子（ゲノム）をターゲットとする場合でも、ゲノム編集誘導後の細胞ゲノムに対してＰＣＲを行い、バクテリアアッセイを行うことで、アレル別ｉｎｔｅｌパターンが正確に予測することができる。【０２４０】
［実施例１４］Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓによる予測
Ｃｄｈ１−Ｐ２Ａ−ＡＩＭＳ  ＥＳ細胞に対してＰ２Ａ−ｓｇＲＮＡ１（リンカーの配列番号６７，６８）とＣｄｈ１−ｓｇＲＮＡ４（リンカーの配列番号１２５，１２６）の２箇所の標的配列を設定した（図１４Ａ）。それぞれの片側アレルｉｎｄｅｌを、異なるアレル（トランスの関係）に発生させて、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ  ｉｎｄｅｌクローンを１度の組換え操作で作製した（図１４Ｂ）。蛍光パターン（Ｐ２Ａ部位に関して：シークエンスの必要なし）と、設定プライマー（内在性Ｃｄｈ１遺伝子領域）でのＰＣＲによるＰＣＲ産物のシークエンスにより、遺伝子型を決定した。Ｔｏｍａｔｏ  ａｌｌｅｌｅのＣｄｈ１−ｓｇＲＮＡ４  ｔａｒｇｅｔ領域のｇｅｎｏｔｙｐｅは、Ｐｒ．ＫＷ１２８７（配列番号１２７）とＰｒ．ＫＷ１１１８（配列番号５４）である。Ｖｅｎｕｓ  ａｌｌｅｌｅのＣｄｈ１−ｓｇＲＮＡ４  ｔａｒｇｅｔ領域のｇｅｎｏｔｙｐｅは、Ｐｒ．ＫＷ５５８（配列番号３９）とＰｒ．ＫＷ１１１８  （配列番号５４）である。【０２４１】
表６に、結果を示す。【０２４２】
【表６】
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【０２４３】
Ｐ２Ａ−ｓｇＲＮＡ１とＣｄｈ１−ｓｇＲＮＡ４は、０個のシトシンを付加したｓｇＲＮＡ（０Ｃ）と２５個のシトシンを付加したｓｇＲＮＡ（２５Ｃ）の組み合わせで実験した。［０Ｃ］同士又はＣｄｈ１のみが［２５Ｃ］であっても、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ  ｉｎｄｅｌクローンは取得できなかった。［２５Ｃ］同士では、２１クローン取得できた。したがって、活性の低下によるＭｏｎｏ  ｉｎｄｅｌの誘導が、両標的に必須であることが示された。【０２４４】
２１／３６３クローンの片側アレルｉｎｄｅｌの発生確率より、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ  ｉｎｄｅｌ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙはＰ＝０．０５０と算出される。このＰ値が、図１３に従ったバクテリアアッセイによるＭｏｎｏ  Ｐ値から予測可能であるかを検証した。Ｐ２Ａ−ｓｇＲＮＡ１とＣｄｈ１−ｓｇＲＮＡ４の［０Ｃ］のｓｇＲＮＡと［２５Ｃ］のｓｇＲＮＡとを用いて、それぞれ予測Ｍｏｎｏ  Ｐ値をバクテリアアッセイからの図１３Ａの数式で求めた（表６のＭｏｎｏ（Ｐ））。Ｃｏｍｐｏｕｎｄ予測Ｐ値は、Ｐ２Ａ  Ｍｏｎｏ（Ｐ）ｘＣｄｈ１  Ｍｏｎｏ（Ｐ）ｘ１／２（トランスになる確率）より求められ、０．０４７となった。この予測Ｐ値０．０４７は、実測Ｐ値０．０５０とほぼ一致していることから、ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ  ｉｎｄｅｌの発生割合も、バクテリアアッセイで正確に予測できることが証明された。【０２４５】
本試験では、一遺伝子内におけるｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓを作製したが、同様の原理で、例えば異なる複数の遺伝子に関して全てｈｅｔｅｒｏ型、全てｈｏｍｏ型または混合型として、ｉｎｄｅｌを誘導する際の確率を予測することなどにも応用できる。【０２４６】
例えば、Ｇｅｎｅ  Ａ〜Ｃの３遺伝子ならば、以下のように予測できる。
全てｈｅｔｅｒｏ型Ｐ＝Ｇｅｎｅ  Ａ  Ｍｏｎｏ（Ｐ）  ｘ  Ｇｅｎｅ  Ｂ  Ｍｏｎｏ（Ｐ）  ｘ  Ｇｅｎｅ  Ｃ  Ｍｏｎｏ（Ｐ）
全てｈｏｍｏ型Ｐ＝Ｇｅｎｅ  Ａ  Ｂｉ（Ｐ）  ｘ  Ｇｅｎｅ  Ｂ  Ｂｉ（Ｐ）  ｘ  Ｇｅｎｅ  Ｃ  Ｂｉ（Ｐ）  
混合型Ｐ＝Ｇｅｎｅ  Ａ  Ｂｉ（Ｐ）  ｘ  Ｇｅｎｅ  Ｂ  Ｍｏｎｏ（Ｐ）  ｘ  Ｇｅｎｅ  Ｃ  Ｎｏｎｅ（Ｐ）【０２４７】
［実施例１５］ｉｎ  ｖｉｔｒｏ切断アッセイ
Ｐ．ＫＷ１３−３プラスミド（配列番号４）を鋳型とし、Ｐｒ．ＫＷ５４１（配列番号４１）とＰｒ．ＫＷ６０７（配列番号１２８）をプライマーとして、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物３００ｎｇ（９５１ｂｐ）に対して、ｓｇＲＮＡとＣａｓ９の複合体をｉｎ  ｖｉｔｒｏで作用させて、Ｃ付加ｇＲＮＡ−Ｃａｓ９のＤＮＡ切断活性を測定した（切断ＤＮＡ：７４１ｂｐと２１０ｂｐ）。
［０Ｃ］ｓｇＲＮＡ、［１０Ｃ］ｓｇＲＮＡ、及び［２５Ｃ］ｓｇＲＮＡは、以下の手順で作製した。Ｐ２Ａ−ｇＲＮＡ１リンカー（配列番号６７，６８）が挿入されたＰＸ４５９プラスミドを鋳型として、それぞれフォワードプライマー（Ｐｒ．ＫＷ１１０５（配列番号１２９），Ｐｒ．ＫＷ１１０６（配列番号１３０），Ｐｒ．ＫＷ１１０７（配列番号１３１））と、リバースプライマー（Ｐｒ．ＫＷ１１０８（配列番号１３２））を用いてＰＣＲを行った。このＰＣＲ産物に対してＴ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を行うことで、上記各ｓｇＲＮＡを得た。Ｃａｓ９タンパク質はＩＤＴ社より購入した。【０２４８】
結果を図１５に示す。同一のモル濃度ｇＲＮＡ（２００ｎＭ）作用下において、Ｃ鎖長依存的にＤＮＡ切断活性が低下することが確認された。したがって、５’ヌクレオチド付加法は、ｉｎ  ｖｉｖｏ（細胞レベル）に限らず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（試験管内）でも有効であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０２４９】
本発明によれば、片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法、並びに前記方法に使用可能なガイドＲＮＡ、発現ベクター、キットが提供される。さらに、ゲノム編集パターンの予測方法、並びにゲノム編集パターンの解析方法、及び前記解析方法に使用可能な細胞が提供される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年6月11日(2021.6.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）（ａ１）スペーサー配列の５’末端に１個以上のヌクレオチド残基が付加されたガイドＲＮＡ、（ａ２）標的配列に対して１塩基又は複数塩基のミスマッチを有するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ、及び（ａ３）前記（ａ１）若しくは前記（ａ２）のガイドＲＮＡの発現ベクターからなる群より選択される少なくとも１種と、
（Ｂ）Ｃａｓタンパク質及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも１種と、
を細胞に導入する工程を含む、ゲノム編集された細胞の製造方法。
【請求項２】
前記（Ａ）が、スペーサー配列の５’末端に１個以上のヌクレオチド残基が付加され、且つ前記スペーサー配列が、標的配列に対して１塩基又は複数塩基のミスマッチを有するスペーサー配列である、ガイドＲＮＡ又はそれをコードする発現ベクターである、請求項１に記載のゲノム編集された細胞の製造方法。
【請求項３】
前記スペーサー配列の５’末端に付加されたヌクレオチド残基が、全て同一のヌクレオチド残基である、請求項１又は２に記載のゲノム編集された細胞の製造方法。
【請求項４】
前記スペーサー配列の５’末端に付加されたヌクレオチド残基が、シトシン残基、グアニン残基、アデニン残基、又はウリジン残基である、請求項３に記載のゲノム編集された細胞の製造方法。
【請求項５】
さらに、（Ｃ）ドナーベクターを細胞に導入する工程を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のゲノム編集された細胞の製造方法。
【請求項６】
前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９タンパク質である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のゲノム編集された細胞の製造方法。
【請求項７】
スペーサー配列の５’末端に１個以上のヌクレオチド残基が付加されたガイドＲＮＡ。
【請求項８】
前記スペーサー配列が、標的配列に対して１塩基又は複数塩基のミスマッチを有する、請求項７に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項９】
請求項７又は８に記載のガイドＲＮＡの発現ベクター。
【請求項１０】
さらに、Ｃａｓタンパク質を発現可能な、請求項９に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９タンパク質である、請求項１０に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
（Ａ）（ａ１）スペーサー配列の５’末端に１個以上のヌクレオチド残基が付加されたガイドＲＮＡ、（ａ２）標的配列に対して１塩基又は複数塩基のミスマッチを有するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ、及び（ａ３）前記（ａ１）若しくは前記（ａ２）のガイドＲＮＡの発現ベクター、からなる群より選択される少なくとも１種を含む、ゲノム編集された細胞の製造キット。
【請求項１３】
（Ｂ）Ｃａｓタンパク質及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも１種をさらに含む、請求項１２に記載の製造キット。
【請求項１４】
（ｉ）ガイドＲＮＡ若しくはその発現ベクター、及びＣａｓタンパク質若しくはその発現ベクターを細胞に導入してゲノム編集を行う工程、
（ｉｉ）前記ゲノム編集を行った細胞からＤＮＡを抽出する工程、
（ｉｉｉ）前記ＤＮＡから標的領域を含むＤＮＡ断片を増幅する工程、
（ｉｖ）前記増幅したＤＮＡ断片の配列解析を行い、前記標的領域へのｉｎｄｅｌ誘導率（Ｐ）を求める工程、及び
（ｖ）下記式（ｍ）若しくは（ｍ１）及び（ｂ）若しくは（ｂ１）により、片側アレルのみへのｉｎｄｅｌ誘導率（ｍｏｎｏ）及び両側アレルへのｉｎｄｅｌ誘導率（ｂｉ）を求める工程、
を含む、ゲノム編集パターンの予測方法。
ｍｏｎｏ＝２×Ｐ×（１−Ｐ）  ・・・（ｍ）
ｂｉ＝Ｐ２                    ・・・（ｂ）
ｍｏｎｏ＝−１．３０３Ｐ２＋１．２７６１Ｐ＋０．０２７４  ・・・（ｍ１）
ｂｉ＝０．６５１５Ｐ２＋０．３６１９Ｐ−０．０１３７  ・・・（ｂ１）
【請求項１５】
一方のアレルに、局在化タンパク質コード配列と、切断部位と、第１の蛍光タンパク質コード配列と、がこの順にインフレームで連結されたキメラ遺伝子を含み、
他方のアレルに、前記局在化タンパク質コード配列と、前記切断部位と、第２の蛍光タンパク質コード配列と、がこの順にインフレームで連結されたキメラ遺伝子を含む、
細胞。
【請求項１６】
（Ｉ）請求項１５に記載の細胞に、前記切断部位を標的とするガイドＲＮＡ若しくはその発現ベクター、及びＣａｓタンパク質若しくはその発現ベクターを導入してゲノム編集を行う工程、
（ＩＩ）前記工程（Ｉ）の後、前記細胞の蛍光パターンを解析する工程、並びに
（ＩＩＩ）前記工程（ＩＩ）で解析した蛍光パターンに基づいて、ゲノム編集パターンを判定する工程、
を含む、ゲノム編集パターンの解析方法。
【国際調査報告】
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