(57)【要約】ウベニメクスの抗がん効果、特に固形がんに対する抗がん効果を向上させる技術を提供すること、を課題とし、該課題を、鎖状高分子に複数のウベニメクスが連結してなる鎖状構造を含む、化合物、により解決する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
鎖状高分子に複数のウベニメクスが連結してなる鎖状構造を含む、化合物。
【請求項２】
前記鎖状高分子がポリペプチドである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記ポリペプチドが塩基性アミノ酸残基を含む、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
前記連結が、前記ポリペプチド上のアミノ基と前記ウベニメクス上のカルボキシ基とから形成されるアミド結合である、請求項２又は３に記載の化合物。
【請求項５】
前記鎖状高分子の平均分子量が500〜30000である、請求項１〜４のいずれかに記載の化合物。
【請求項６】
前記鎖状高分子に連結している前記ウベニメクスの数が2〜100である、請求項１〜５のいずれかに記載の化合物。
【請求項７】
さらに、ポリエチレングリコール鎖構造を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の化合物。
【請求項８】
一般式（1A）：
【化１】
2019151320.tif 000008
［式中：R1はポリエチレングリコール鎖構造又はヒドロキシ基を示す。R21は各出現において独立して、R21a（アミノ酸残基の側鎖）、又はR21b（ウベニメクスが連結してなる該側鎖）を示す。nは5〜200の整数を示す。］
で表される化合物、その塩、又はそれらの溶媒和物である、請求項１〜７のいずれかに記載の化合物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の化合物を含有する、医薬。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれかに記載の化合物を含有する、試薬。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれかに記載の化合物を含有する、抗がん剤。
【請求項１２】
対象がんが固形がんである、請求項１１に記載の抗がん剤。
【請求項１３】
さらに、他の抗がん化合物を含有する、請求項１１又は１２に記載の抗がん剤。
【請求項１４】
他の抗がん化合物と併用投与されるように用いられる、請求項１１又は１２に記載の抗がん剤。
【請求項１５】
請求項１〜８のいずれかに記載の化合物を含有する、CD13/APN活性抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗がん剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウベニメクスは、マクロファージの細胞膜上に存在するCD13/APNに結合して、免疫を賦活化させることが知られており、成人の急性白血病の緩解維持療法に用いられている薬剤である。また、近年、ウベニメクスが、いくつかの固形がんにおいてもCD13/APNの活性を抑制することが報告されている。【０００３】
しかし、ウベニメクスは、固形がんに対しては、急性白血病に対して使用される場合よりも非常に高濃度で投与しないと、有効な抗がん効果を発揮することができない。肝細胞がんの細胞株（HuH7、PLC）に対するウベニメクスのIC30は、HuH7で394.8μg/ml、PLCで498.8μg/mlである（非特許文献１）。一方、先述の急性白血病で使用される投与量は1日1回30mgの経口投与であり、これにより得られる最高血中濃度は2.21μg/mlである。したがって、ウベニメクスを肝細胞がん等の固形がんに適用する場合は、急性白血病治療において臨床的に得られる血中濃度の数百倍という高い濃度になるように使用しないと、有効な抗がん効果を発揮できないと考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Yamashita M, Wada H, Eguchi H, Ogawa H, Yamada D, Noda T, et al. A CD13 inhibitor, ubenimex, synergistically enhances the effects of anticancer drugs in hepatocellular carcinoma. Int J Oncol 2016;49:89-98.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ウベニメクスの抗がん効果、特に固形がんに対する抗がん効果を向上させる技術を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は上記課題に鑑みて鋭意研究を進めた結果、鎖状高分子に複数のウベニメクスを連結させることにより、ウベニメクスの抗がん効果、特に固形がんに対する抗がん効果が向上することを見出した。この知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明を完成させた。【０００７】
即ち、本発明は、下記の態様を包含する：
項１．  鎖状高分子に複数のウベニメクスが連結してなる鎖状構造を含む、化合物．
項２．  前記鎖状高分子がポリペプチドである、項１に記載の化合物．
項３．  前記ポリペプチドが塩基性アミノ酸残基を含む、項２に記載の化合物．
項４．  前記連結が、前記ポリペプチド上のアミノ基と前記ウベニメクス上のカルボキシ基とから形成されるアミド結合である、項２又は３に記載の化合物．
項５．  前記鎖状高分子の平均分子量が500〜30000である、項１〜４のいずれかに記載の化合物．
項６．  前記鎖状高分子に連結している前記ウベニメクスの数が2〜100である、項１〜５のいずれかに記載の化合物．
項７．  さらに、ポリエチレングリコール鎖構造を含む、項１〜６のいずれかに記載の化合物．
項８．  一般式（1A）：【０００８】
【化１】
2019151320.tif 000002
【０００９】
［式中：R1はポリエチレングリコール鎖構造又はヒドロキシ基を示す。R21は各出現において独立して、R21a（アミノ酸残基の側鎖）、又はR21b（ウベニメクスが連結してなる該側鎖）を示す。nは5〜200の整数を示す。］
で表される化合物、その塩、又はそれらの溶媒和物である、項１〜７のいずれかに記載の化合物．
項９．  項１〜８のいずれかに記載の化合物を含有する、医薬．
項１０．  項１〜８のいずれかに記載の化合物を含有する、試薬．
項１１．  項１〜８のいずれかに記載の化合物を含有する、抗がん剤．
項１２．  対象がんが固形がんである、項１１に記載の抗がん剤．
項１３．  さらに、他の抗がん化合物を含有する、項１１又は１２に記載の抗がん剤．
項１４．  他の抗がん化合物と併用投与されるように用いられる、項１１又は１２に記載の抗がん剤．
項１５．  項１〜８のいずれかに記載の化合物を含有する、CD13/APN活性抑制剤．
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、鎖状高分子に複数のウベニメクスが連結してなる鎖状構造を含む化合物を用いることにより、ウベニメクスに比べてより高い抗がん効果、特に固形がんに対してより高い抗がん効果を発揮することができる。該化合物を、他の抗がん剤と併用することにより、相乗効果を発揮することもできる。また、該化合物は、CD13/APN活性抑制剤等としても有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】APN/CD13の構造を表す模式図である。
【図２】A及びBは、ポリエチレングリコールとポリリシンのブロック共重合体（PEG-b-Plys）の一部のリシン残基の側鎖上のアミノ基と、ウベニメクスのカルボキシ基とが、アミド結合により連結してなる鎖状構造からなる化合物（合成例1-3）の構造式、及び模式図である。Cは、試験例1の3D培養系を用いたアッセイの結果を示し、Dは、試験例2のMTTアッセイの結果を示し、C及びD中、横軸は、培地中の被検物質のウベニクス換算濃度を示し、*はP値が0.05未満であることを示す。
【図３】Aは、試験例3のCD13/APN酵素活性の測定結果を示し、A中、*はP値が0.05未満であることを示す。Bは、試験例4のMTTアッセイの結果を示し、B中、横軸は、培地中の被検物質（PEG-b-Plys (Ube) 50）濃度を示し、*はP値が0.05未満であることを示す。
【図４】Aは、試験例5のROSレベル解析結果を示し、Bは、試験例6のアポトーシス解析結果を示し、A及びB中、*はP値が0.05未満であることを示す。
【図５】Aは、HuH7細胞を用いた場合の、アイソボログラム分析（試験例7）の結果を示し、Bは、HepG2細胞を用いた場合の同結果を示す。
【図６】抗腫瘍効果のin vivo解析（試験例8）の結果を示す。
【図７】薬物動態の解析（試験例10）の結果を示す。
【図８】他の抗がん剤との併用効果の解析（試験例14）の結果（皮下腫瘍体積の測定結果）を示す。
【図９】他の抗がん剤との併用効果の解析（試験例14）の結果（ヘマトキシリン-エオジン染色結果）を示す。
【図１０】他の抗がん剤との併用効果の解析（試験例14）の結果（免疫組織化学染色結果）を示す。
【図１１】他の抗がん剤との併用効果の解析（試験例14）の結果（細胞増殖マーカーの定量結果）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
【００１３】
1．化合物
本発明は、鎖状高分子に複数のウベニメクスが連結してなる鎖状構造を含む、化合物（本明細書において、「本発明の化合物」と示す場合もある。）に関する。以下にこれについて説明する。
【００１４】
ウベニメクスは、下記式：
【００１５】
【化２】
2019151320.tif 000003
【００１６】
で表される化合物であり、その化学名は(2S)-2-[(2S,3R)-3-アミノ-2-ヒドロキシ-4-フェニルブタノイルアミノ]-4-メチルペンタン酸である。
【００１７】
鎖状高分子は、ウベニメクスを連結可能であるものであれば、特に制限されない。鎖状高分子としては、ウベニメクスの連結容易性の観点からは、ウベニメクスの有する官能基（例えば、カルボキシ基、アミノ基、ヒドロキシ基等）と反応性を有する官能基、例えばアミノ基、カルボキシ基、ヒドロキシ基、アルデヒド基、カルボニル基、有機ハロゲン化物等を保持する鎖状高分子が好ましい。また、鎖状高分子としては、通常は負に帯電している細胞膜に対してより相互作用し易いという観点から、カチオン性鎖状高分子が好ましく、例えばアミノ基、グアニジノ基、イミダゾール基、アミジン構造等を保持するカチオン性鎖状高分子が好ましい。
【００１８】
鎖状高分子の好ましい具体例としては、ポリペプチド、多糖類、合成高分子（例えば、ビニルポリマー、ポリエチレンイミン、ポリアクリルアミド、ポリエーテル、ポリエステル、ポリウレタン等）等の重合体高分子、これら2種以上が連結してなる連結体が挙げられる。これらの中でも、より好ましい具体例としては、ポリペプチドが挙げられる。
【００１９】
鎖状高分子の平均分子量は、特に制限されないが、例えば500〜30000、好ましくは1000〜20000、より好ましくは2000〜15000、さらに好ましくは3000〜10000、よりさらに好ましくは4000〜8000、特に好ましくは5000〜7000である。
【００２０】
鎖状高分子が重合体高分子である場合、その重合数（整数）は、例えば5〜200、好ましくは10〜150、より好ましくは20〜100、さらに好ましくは30〜80、よりさらに好ましくは35〜50である。
【００２１】
ポリペプチドは、1種又は2種以上のアミノ酸残基を含む。
【００２２】
アミノ酸残基としては、天然アミノ酸残基及び合成アミノ酸残基のいずれでもよく、例えばアミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることを意味する。例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性側鎖を有するアミノ酸残基；  アスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性側鎖を有するアミノ酸残基；  グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインといった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基；  アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンといった非極性側鎖を有するアミノ酸残基；  スレオニン、バリン、イソロイシンといったβ−分枝側鎖を有するアミノ酸残基；  チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンといった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基等が挙げられる。
【００２３】
これらのアミノ酸残基の中でも、通常は負に帯電している細胞膜に対してより相互作用し易いという観点から、好ましくは塩基性側鎖を有するアミノ酸残基（塩基性アミノ酸残基、例えば側鎖にアミノ基を有する塩基性アミノ酸残基）が挙げられ、より好ましくは側鎖が式（A）：−LA−NH2（式中：LAは置換されていてもよいアルキレン基を示す。−は単結合を示す。）で表される基であるアミノ酸残基が挙げられ、さらに好ましくはリシン残基が挙げられる。
【００２４】
LAで示されるアルキレン基は、特に制限されないが、例えば炭素原子数1〜8、好ましくは2〜6、より好ましくは3〜5の直鎖状又は分岐鎖状（好ましくは直鎖状）のアルキレン基が挙げられる。該アルキレン基としては、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、ペンチレン基、ヘキシレン基等が挙げられる。
【００２５】
ポリペプチドが塩基性アミノ酸残基を含む場合、その残基の割合は、ポリペプチドを構成する全アミノ酸残基100％に対して、好ましくは50％以上、より好ましくは70％以上、さらに好ましくは90％以上、よりさらに好ましくは95％以上、特に好ましくは100％である。
【００２６】
また、通常は負に帯電している細胞膜に対してより相互作用し易いという観点から、ポリペプチドは、酸性側鎖を有するアミノ酸残基の割合がより少ないことが好ましく、例えば該残基の割合が、ポリペプチドを構成する全アミノ酸残基100％に対して、好ましくは30％以下、より好ましくは10％以下、さらに好ましくは5％以下、よりさらに好ましくは0％であることが望ましい。
【００２７】
鎖状構造は、鎖状高分子に複数のウベニメクスが連結してなる構造である。限定的な解釈を望むものではないが、本発明の化合物は、該化合物中の複数のウベニメクスがCD13/APNに多価結合することによって、単量体ウベニメクスに比べてより高い抗がん効果、特に固形がんに対してより高い抗がん効果を発揮すると考えられる。
【００２８】
鎖状高分子とウベニメクスとの連結の態様は、特に制限されない。該連結は、例えば、鎖状高分子上の（好ましくは側鎖上の）官能基とウベニメクス上の官能基とが反応することにより形成される結合であり、好ましくは鎖状高分子上の（好ましくは側鎖上の）官能基とウベニメクス上のカルボキシ基とが反応することにより形成される結合であり、より好ましくは鎖状高分子上の（好ましくは側鎖上の）アミノ基とウベニメクス上のカルボキシ基とのアミド結合である。
【００２９】
鎖状高分子に連結しているウベニメクスの数は、例えば2〜500、好ましくは2〜100、より好ましくは5〜50、さらに好ましくは5〜30、よりさらに好ましくは10〜25である。
【００３０】
鎖状高分子が重合体高分子である場合、その重合数100％に対する、鎖状高分子に連結しているウベニメクスの数は、特に制限されないが、例えば5〜90％、好ましくは10〜80％、より好ましくは20〜70％、さらに好ましくは30〜60％、よりさらに好ましくは30〜55％である。
【００３１】
本発明の化合物は、上記「鎖状構造」のみからなるものであってもよいし、さらに他の構造を含むものであってもよい。他の構造としては、例えば本発明の化合物の血中安定性を向上させ得る構造、本発明の化合物のがん組織集積性を向上させ得る構造等が挙げられる。他の構造としては、例えばポリエチレングリコール鎖等のポリマー構造（好ましくは水溶性ポリマー構造）、側鎖に双性イオン構造を有する高分子、がん細胞に親和性を示すアプタマー、ペプチド分子、抗体、抗体フラグメント、及びそれらを組み合わせたもの等が挙げられる。
【００３２】
他の構造の平均分子量は、特に制限されないが、血中安定性、がん組織集積性等の観点から、例えば2000〜50000、好ましくは5000〜20000である。
【００３３】
他の構造が連結する上記「鎖状構造」上の位置は特に制限されないが、好ましくは他の構造は上記「鎖状構造」の末端（主鎖の末端）に連結していることが好ましい。
【００３４】
本発明の化合物のより具体的な態様として、好ましくは一般式（1）：
【００３５】
【化３】
2019151320.tif 000004
【００３６】
［式中：R1は「他の構造」、ヒドロキシ基、又は水素原子を示す。R2は各出現において独立して、R2a（重合体高分子である鎖状高分子を構成する単量体）、又はR2b（ウベニメクスが連結してなる該単量体）を示す。nは鎖状高分子の重合数を示す。］
で表される化合物が挙げられ、より好ましくは一般式（1A）：
【００３７】
【化４】
2019151320.tif 000005
【００３８】
［式中：R1は「他の構造」又はヒドロキシ基を示す。R21は各出現において独立して、R21a（アミノ酸残基の側鎖）、又はR21b（ウベニメクスが連結してなる該側鎖）を示す。nは鎖状高分子の重合数を示す。］
で表される化合物が挙げられる。
【００３９】
一般式を規定する各用語については、上記で説明したとおりである。一般式中、nの数100％に対する、R2b又はR21bの数は、特に制限されないが、例えば5〜90％、好ましくは10〜80％、より好ましくは20〜70％、さらに好ましくは30〜60％、よりさらに好ましくは30〜55％である。
【００４０】
本発明の化合物は、塩の形態も包含する。塩は、薬学的に許容される塩である限り特に限定されず、酸性塩及び塩基性塩のいずれも採用することができる。例えば酸性塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；  酢酸塩、プロピオン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩等の有機酸塩；  アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等のアミノ酸塩等が挙げられる。また、塩基性塩の例として、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；  カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩等が挙げられる。
【００４１】
本発明の化合物は、溶媒和物の形態も包含する。溶媒は、薬学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば水、エタノール、グリセロール、酢酸等が挙げられる。
【００４２】
本発明の化合物は、様々な方法で合成することができる。例えば、鎖状構造又は鎖状構造と他の構造の連結構造体と、ウベニメクスとを、反応させることによって得ることができる。該反応の種類、条件等は、鎖状高分子の種類、特に鎖状高分子が有する官能基等に応じて、さらには該官能基と反応させるウベニメクス上の官能基の種類等に応じて、適切に設計することが可能である。例えば、本発明の化合物の中でも、一般式（1A）で表される化合物の内、ウベニメクスと鎖状高分子との連結がアミド結合である場合であれば、例えば以下の反応スキームI：
【００４３】
【化５】
2019151320.tif 000006
【００４４】
［式中、R21aa以外の各記号は前述のとおりである。R21aaは、アミノ基を有する、アミノ酸残基の側鎖を示す。］
に従って又は準じて、合成することができる。以下に、この反応スキームIについて詳述する。
【００４５】
本反応では、化合物aとウベニメクスとを反応させることで、一般式（1A）で表される化合物を得ることができる。なお、必要に応じて、ウベニメクスに代えて、ウベニメクスの保護体（例えばトリフルオロ酢酸保護体）を使用することが望ましい。
【００４６】
ウベニメクス及び／又はその保護体の使用量は、収率等の観点から、化合物aの1重量部に対して、通常、0.1〜2重量部が好ましく、0.3〜1.2重量部がより好ましい。
【００４７】
本反応は、縮合剤の存在下で行うことが好ましい。縮合剤としては、特に制限されるものではなく、例えば公知の縮合剤を広く使用することができる。縮合剤としては、好ましくはDMT-MM（4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウム=クロリドn水和物）等のトリアジン系縮合体が挙げられる。縮合剤は、1種単独で用いてもよいし、2種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００４８】
縮合剤の使用量は、縮合剤の種類によっても異なるが、一例として、ウベニメクス及び／又はその保護体の1モルに対して、0.7〜1.5モルが好ましく、1.0〜1.2モルがより好ましい。
【００４９】
本反応は、通常、反応溶媒の存在下で行われる。反応溶媒としては、特に制限されないが、例えば水等が挙げられる。溶媒は単独で使用してもよく、また、複数併用してもよい。また、溶媒には、炭酸緩衝剤等の緩衝剤を添加することが好ましい。
【００５０】
反応温度は、加熱下、常温下及び冷却下のいずれでも行うことができ、通常、0〜50℃（特に10〜30℃）で行うことが好ましい。反応時間は特に制限されず、通常、4時間〜48時間、特に8時間〜24時間とすることができる。
【００５１】
反応の進行は、クロマトグラフィーのような通常の方法で追跡することができる。反応終了後、必要に応じて脱保護処理をした後、溶媒を留去し、生成物はクロマトグラフィー法、再結晶法等の通常の方法で単離精製することができる。また、生成物の構造は、元素分析、MS（FD-MS）分析、IR分析、1H-NMR、13C-NMR等により同定することができる。
【００５２】
2．用途
本発明の化合物は、細胞増殖抑制効果、アポトーシス促進効果、CD13/APN酵素活性抑制効果、細胞内活性酸素種向上効果等を有する。このため、本発明の化合物は、医薬、試薬等（本明細書において、「本発明の薬剤」と示すこともある。）の有効成分として、より具体的には、抗がん剤、細胞増殖抑制剤、アポトーシス促進剤、CD13/APN酵素活性抑制剤、細胞内活性酸素種向上化剤等の有効成分としての利用が可能である。
【００５３】
本発明の薬剤は、本発明の化合物を含有する限りにおいて特に制限されず、必要に応じてさらに他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、薬学的に許容される成分であれば特に限定されるものではない。他の成分としては、薬理作用を有する成分のほか、添加剤も含まれる。添加剤としては、例えば基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保湿剤、着色料、香料、キレート剤等が挙げられる。
【００５４】
なお、本発明の化合物は、単独で、上記効果等を発揮し得る。そのため、本発明の薬剤は、これらの効果及び／又は作用を有する他の成分を含まなくとも、その所望の効果を発揮することができるが、薬理作用を有する他の成分が含有されていてもよい。
【００５５】
本発明の化合物は、他の抗がん剤と併用することができる。これにより、より向上した効果を発揮することも可能である。他の抗がん剤としては、特に制限されず、各種抗がん剤を用いることができる。抗がん剤としては、例えばアルキル化剤、代謝拮抗剤、微小管阻害剤、抗生物質抗がん剤、トポイソメラーゼ阻害剤、白金製剤、分子標的薬、ホルモン剤、生物製剤などが挙げられ、好ましくは代謝拮抗剤、抗生物質抗がん剤、白金製剤等が挙げられる。
【００５６】
アルキル化剤としては、例えばシクロホスファミド、イホスファミド、ニトロソウレア、ダカルバジン、テモゾロミド、ニムスチン、ブスルファン、メルファラン、プロカルバジン、ラニムスチンなどが挙げられる。
【００５７】
代謝拮抗剤としては、例えば、エノシタビン、カルモフール、カペシタビン、テガフール、テガフール・ウラシル、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム、ゲムシタビン、シタラビン、シタラビンオクホスファート、ネララビン、フルオロウラシル、フルダラビン、ペメトレキセド、ペントスタチン、メトトレキサート、クラドリビン、ドキシフルリジン、ヒドロキシカルバミド、メルカプトプリンなどが挙げられる。
【００５８】
微小管阻害剤としては、例えば、ビンクリスチンなどのアルカロイド系抗がん剤、ドセタキセル、パクリタキセルなどのタキサン系抗がん剤が挙げられる。
【００５９】
抗生物質抗がん剤としては、例えば、マイトマイシンC、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、ブレオマイシン、アクチノマイシンD、アクラルビシン、イダルビシン、ピラルビシン、ペプロマイシン、ミトキサントロン、アムルビシン、ジノスタチンスチマラマーなどが挙げられる。
【００６０】
トポイソメラーゼ阻害剤としてはトポイソメラーゼI阻害作用を有するCPT-11、イリノテカン、ノギテカン、トポイソメラーゼII阻害作用をもつエトポシド、ソブゾキサンが挙げられる。
【００６１】
白金製剤としては、例えば、シスプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチンなどが挙げられる。
【００６２】
ホルモン剤としては、例えば、デキサメタゾン、フィナステリド、タモキシフェン、アストロゾール、エキセメスタン、エチニルエストラジオール、クロルマジノン、ゴセレリン、ビカルタミド、フルタミド、ブレドニゾロン、リュープロレリン、レトロゾール、エストラムスチン、トレミフェン、ホスフェストロール、ミトタン、メチルテストステロン、メドロキシプロゲステロン、メピチオスタンなどが挙げられる。
【００６３】
生物製剤としては、例えば、インターフェロンα、βおよびγ、インターロイキン2、ウベニメクス、乾燥BCGなどが挙げられる。
【００６４】
分子標的薬としては、例えば、リツキシマブ、アレムツズマブ、トラスツズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、イマチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、テムシロリムス、ベバシズマブ、VEGF trap、スニチニブ、ソラフェニブ、トシツズマブ、ボルテゾミブ、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、イブリツモマブ・オゾガマイシン、イブリツモマブチウキセタン、タミバロテン、トレチノインなどが挙げられる。ここに特定する分子標的薬以外にも、ヒト上皮性増殖因子受容体2阻害剤、上皮性増殖因子受容体阻害剤、Bcr-Ablチロシンキナーゼ阻害剤、上皮性増殖因子チロシンキナーゼ阻害剤、mTOR阻害剤、血管内皮増殖因子受容体2阻害剤（α-VEGFR-2抗体）などの血管新生を標的にした阻害剤、MAPキナーゼ阻害剤などの各種チロシンキナーゼ阻害剤、サイトカインを標的とした阻害剤、プロテアソーム阻害剤、抗体−抗がん剤配合体などの分子標的薬なども含めることができる。これら阻害剤には抗体も含む。
【００６５】
本発明の薬剤の使用態様は、特に制限されず、その種類に応じて適切な使用態様を採ることができる。本発明の薬剤は、その用途に応じて、例えばin vitroで使用する（例えば、培養細胞の培地に添加する。）こともできるし、in vivoで使用する（例えば、動物に投与する。）こともできる。
【００６６】
本発明の薬剤の適用対象は特に限定されないが、哺乳動物では、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカ等が挙げられる。また、細胞としては、動物細胞等が挙げられる。細胞の種類も特に制限されず、例えば血液細胞、造血幹細胞・前駆細胞、配偶子（精子、卵子）、線維芽細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、神経細胞、肝細胞、ケラチン生成細胞、筋細胞、表皮細胞、内分泌細胞、ES細胞、iPS細胞、組織幹細胞、がん細胞等が挙げられる。
【００６７】
本発明の薬剤を抗がん剤として用いる場合、及びがん細胞に用いる場合、対象がんとしては、特に制限されず、例えば肝細胞がん、すい臓がん、腎臓がん、白血病、食道がん、胃がん、大腸がん、肺がん、前立腺がん、皮膚がん、乳がん、子宮頚がん等が挙げられる。これらの中でも、固形がんが好ましく、肝細胞がんがより好ましい。
【００６８】
本発明の薬剤は、任意の剤形、例えば錠剤（口腔内側崩壊錠、咀嚼可能錠、発泡錠、トローチ剤、ゼリー状ドロップ剤などを含む）、丸剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、ドライシロップ剤、液剤（ドリンク剤、懸濁剤、シロップ剤を含む）、ゼリー剤などの経口製剤形態、注射用製剤（例えば、点滴注射剤（例えば点滴静注用製剤等）、静脈注射剤、筋肉注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤）、外用剤（例えば、軟膏剤、パップ剤、ローション剤）、坐剤吸入剤、眼剤、眼軟膏剤、点鼻剤、点耳剤、リポソーム剤等の非経口製剤形態を採ることができる。
【００６９】
本発明の薬剤の投与経路としては、所望の効果が得られる限り特に制限されず、経口投与、経管栄養、注腸投与等の経腸投与；  経静脈投与、経動脈投与、筋肉内投与、心臓内投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与等の非経口投与等が挙げられる。
【００７０】
本発明の薬剤中の有効成分の含有量は、使用態様、適用対象、適用対象の状態等に左右されるものであり、限定はされないが、例えば0.0001〜100重量％、好ましくは0.001〜50重量％とすることができる。
【００７１】
本発明の薬剤を動物に投与する場合の投与量は、薬効を発現する有効量であれば特に限定されず、通常は、有効成分の重量として、一般に経口投与の場合には一日あたり0.1〜1000 mg/kg体重、好ましくは一日あたり0.5〜500 mg/kg体重であり、非経口投与の場合には一日あたり0.01〜100 mg/kg体重、好ましくは0.05〜50 mg/kg体重である。上記投与量は、年齢、病態、症状等により適宜増減することもできる。
【実施例】
【００７２】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。【００７３】
合成例1．PEG-b-Plys (Ube) 20の合成
ポリエチレングリコールとポリリシンのブロック共重合体（PEG-b-Plys）の20％のリシン残基の側鎖上のアミノ基と、ウベニメクスのカルボキシ基とが、アミド結合により連結してなる鎖状構造からなる化合物、具体的には、図２Ａ及び図２Ｂに示される構造式においてn＝8である化合物を、以下の様にして合成した。【００７４】
合成例1-1．PEG-b-Plysの合成
片末端にメトキシ基、もう一方の末端にアミノ基を有するポリエチレングリコール（PEG）（平均分子量が10000）を1.1gとり、10mLのジメチルスルホキシドに溶解した。1.3gのN−epsilon−Trifxuoroacetyl−L−lyshine−N−carboxy anhydride（Lys（TFA）−NCA）をジメチルスルホキシド10mLに溶解した。得られた2つの溶液をアルゴン雰囲気下で混合し、室温にて一晩攪拌した。続いて、反応溶液を過剰量のジエチルエーテルに注ぐことで生成物を再沈殿させて回収し、減圧乾燥を行った。得られた白色粉末を100mLのメタノール／1M NaOH水溶液（9／1［v／v］）の混合溶液に溶解し、35℃にて一晩撹拌した。反応溶液のpHを塩酸にて中和し、1〜2とした。さらに透析処理を行い、凍結乾燥を経て白色粉末を得た（1.1g、収率61％）。
1H NMR解析により構造を確認し、リシン鎖の平均重合度が40のPEG-b-Plysであることを確認した（D2O、内部標準TSPA、δ（ppm）：1.3−1.9（240H、m、CO−CH−CH2−CH2−CH2−CH2−NH2）、3.0（80H、m、CO−CH−CH2−CH2−CH2−CH2−NH2）、3.6−3.8（912H、m、CH3−O−（CH2−CH2−O）−CH2−CH2−CH2）、4.3（40H、m、CO−CH−CH2−CH2−CH2−CH2−NH2）。【００７５】
合成例1-2．ウベニメクスのトリフルオロ酢酸保護体の合成
1.5gのウベニメクスを15mLのメタノールに溶解した。得られた溶液に、トリエチルアミンを900mg、トリフルオロ酢酸エチルを1350mg加え、室温にて2日間攪拌した。続いて、減圧下にて液体成分を除去し、10mLの塩酸（0.01M）に再沈殿した。得られた白色粉末を減圧乾燥することで目的物を得た（1.8g、92％）。
1H NMR解析により目的の構造であることを確認した（MeOD、内部標準TMS、δ（ppm）：0.9（6H、d、（CH3）2−CH−CH2）、1.3（1H、m、（CH3）2−CH−CH2−CH−COOH）、1.6（2H、t、（CH3）2−CH−CH2−CH−COOH）、2.9−3.1（2H、m、C6H5−CH2−CH−CH−OH）、4.1（1H、d、C6H5−CH2−CH−CH−OH）、4.5（1H、m、C6H5−CH2−CH−CH−OH）、4.6（1H、t、（CH3）2−CH−CH2−CH−COOH）、7.1−7.3（5H、m、C6H5−CH2−CH−CH−OH）。【００７６】
合成例1-3．PEG-b-Plys (Ube) 20の合成
300mgのPEG-b-Plysを20mLの炭酸バッファー（50mM、pH7.4）に溶解した。160mgのウベニメクスのトリフルオロ酢酸保護体と125mgのDMT−MMを加え、室温にて一晩攪拌した。さらに、得られた水溶液を純水にて透析処理し、凍結乾燥を行うことで白色粉末を得た。続いて、得られた白色粉末を10mLのメタノール／水（1／2［v／v］）の混合溶液に溶解し、炭酸カリウムを130mg加えた後に37℃にて三日間静置した。得られた溶液を純水にて透析した後に凍結乾燥を行うことで白色粉末を得た（280mg、収率76％）。
1H NMR解析を行い、PEG-b-Plysのリシン側鎖の20％にウベニメクスが導入された構造（PEG-b-Plys (Ube) 20）であることを確認した（MeOD、内部標準TMS、δ（ppm）：0.9（48H、m、（CH3）2−CH−CH2−CH−CONH）、1.3−2.3（264H、m、（CH3）2−CH−CH2−CH−CONH、CO−CH−CH2−CH2−CH2−CH2−NHCO）、2.9−3.2（96H、m、C6H5−CH2−CH−CH−OH、CO−CH−CH2−CH2−CH2−CH2−NHCO）、3.6−3.8（912H、m、CH3−O−（CH2−CH2−O）−CH2−CH2−CH2）、3.9−4.7（64H、m、C6H5−CH2−CH−CH−OH、C6H5−CH2−CH−CH−OH、（CH3）2−CH−CH2−CH−CONH、CO−CH−CH2−CH2−CH2−CH2−NHCO）、7.1−7.3（40H、m、C6H5−CH2−CH−CH−OH）。【００７７】
合成例2．PEG-b-Plys (Ube) 35の合成
PEG-b-Plysの35％のリシン残基の側鎖上のアミノ基と、ウベニメクスのカルボキシ基とが、アミド結合により連結してなる鎖状構造からなる化合物、具体的には、図２Ａ及び図２Ｂに示される構造式においてn＝14である化合物を、以下の様にして合成した。【００７８】
100mgのPEG-b-Plysを10mLの炭酸バッファー（50mM、pH7.4）に溶解した。54mgのウベニメクスのトリフルオロ酢酸保護体と41mgのDMT−MMを加え、室温にて一晩攪拌した。さらに、得られた水溶液を純水にて透析処理し、凍結乾燥を行うことで白色粉末を得た。続いて、得られた白色粉末を5mLのメタノール／水（1／2［v／v］）の混合溶液に溶解し、炭酸カリウムを46mg加えた後に40℃にて二日間攪拌した。得られた溶液を純水にて透析した後に凍結乾燥を行うことで白色粉末を得た（80mg、収率63％）。
1H NMR解析を行い、PEG-b-Plysのリシン側鎖の35％にウベニメクスが導入された構造（PEG-b-Plys (Ube) 35）であることを確認した（MeOD、内部標準TMS、δ（ppm）：0.9（84H、m、（CH3）2−CH−CH2−CH−CONH）、1.3−2.3（282H、m、（CH3）2−CH−CH2−CH−CONH、CO−CH−CH2−CH2−CH2−CH2−NHCO）、2.9−3.2（108H、m、C6H5−CH2−CH−CH−OH、CO−CH−CH2−CH2−CH2−CH2−NHCO）、3.6−3.8（912H、m、CH3−O−（CH2−CH2−O）−CH2−CH2−CH2）、3.9−4.7（82H、m、C6H5−CH2−CH−CH−OH、C6H5−CH2−CH−CH−OH、（CH3）2−CH−CH2−CH−CONH、CO−CH−CH2−CH2−CH2−CH2−NHCO）、7.1−7.3（70H、m、C6H5−CH2−CH−CH−OH）。【００７９】
合成例3．PEG-b-Plys (Ube) 50の合成
PEG-b-Plysの50％のリシン残基の側鎖上のアミノ基と、ウベニメクスのカルボキシ基とが、アミド結合により連結してなる鎖状構造からなる化合物、具体的には、図２Ａ及び図２Ｂに示される構造においてn＝20である化合物を、以下の様にして合成した。【００８０】
300mgのPEG-b-Plysを20mLの炭酸バッファー（50mM、pH7.4）に溶解した。320mgのウベニメクスのトリフルオロ酢酸保護体と250mgのDMT−MMを加え、室温にて一晩攪拌した。さらに、得られた水溶液を純水にて透析処理し、凍結乾燥を行うことで白色粉末を得た。続いて、得られた白色粉末を10mLのメタノール／水（1／2［v／v］）の混合溶液に溶解し、炭酸カリウムを260mg加えた後に37℃にて三日間静置した。得られた溶液を純水にて透析した後に凍結乾燥を行うことで白色粉末を得た（360mg、収率81％）。
1H NMR解析を行い、PEG-b-Plysのリシン側鎖の50％にウベニメクスが導入された構造（PEG-b-Plys (Ube) 50）であることを確認した（MeOD、内部標準TMS、δ（ppm）：0.9（120H、m、（CH3）2−CH−CH2−CH−CONH）、1.3−2.3（300H、m、（CH3）2−CH−CH2−CH−CONH、CO−CH−CH2−CH2−CH2−CH2−NHCO）、2.9−3.2（120H、m、C6H5−CH2−CH−CH−OH、CO−CH−CH2−CH2−CH2−CH2−NHCO）、3.6−3.8（912H、m、CaH3−O−（CH2−CH2−O）−CH2−CH2−CH2）、3.9−4.7（100H、m、C6H5−CH2−CH−CH−OH、C6H5−CH2−CH−CH−OH、（CH3）2−CH−CH2−CH−CONH、CO−CH−CH2−CH2−CH2−CH2−NHCO）、7.1−7.3（100H、m、C6H5−CH2−CH−CH−OH）。【００８１】
試験例1．3D培養系を用いた抗腫瘍効果の評価
細胞の培養は、500μg/ml の抗生剤ペニシリン-ストレプトマイシンと10%FBSを含んだDulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)を使用し（以下コンプリートメディウムと呼ぶ）、37℃、5% CO2に調節された培養器で行った（以下の試験例においても同様である）。3D培養するために、HuH7細胞を96wellのCell-able（Toyo Gosei、登録商標）に8×103個の細胞を播種し、37℃で3日間培養した。Well上に半球がほぼ均一に形成されたことを顕微鏡で確認した後、被検物質（ウベニメクス（free ubenimex）、PEG-b-Plys (Ube) 35、又はPEG-b-Plys (Ube) 50）を各ウェルに加え、37℃でさらに2日間培養した。 その後、細胞をDAPI溶液で30分間染色し、マイクロプレートリーダーでプレートの吸光度を570nmで測定し、650nmの吸光度を測定した。結果は、無治療コントロールに対する吸光度の百分率として表した。【００８２】
結果を図２Ｃに示す。図２Ｃに示されるように、PEG-b-Plys (Ube) 35、又はPEG-b-Plys (Ube) 50は、ウベニメクスよりも低濃度で顕著に高い抗腫瘍効果を発揮することが分かった。【００８３】
試験例2．MTTアッセイによる抗腫瘍効果の評価
96well 培養プレートを用いて、被検物質（ウベニメクス、PEG-b-Plys (Ube) 35、又はPEG-b-Plys (Ube) 50）を含む培地中でHuH7細胞を培養した。72時間培養した後、10μl（50μg）のMTTを各ウェルに加え、37℃で4時間培養した。次に、培地を除去して酸性イソプロパノール100μlを添加してホルマザン結晶を溶解させ、マイクロプレートシェーカーにより、15分間穏やかに振盪した。プレートの吸光度はマイクロプレートリーダーで570nmで測定し、650nmでの吸光度を測定した。結果は、無治療コントロールに対する吸光度の百分率として表した。【００８４】
結果を図２Ｄに示す。MTTアッセイによる評価においても、図２Ｃと同様の結果が得られた。【００８５】
試験例3．CD13 / APN酵素活性に対する効果の評価
CD13/APN酵素活性を、CD13/APNの基質であるL-ロイシン-p-ニトロアニリド（Peptide Institute、Inc）を用いて分光光度的に測定した。HepG2細胞懸濁液を、200μlのPBS中の5×105細胞で96wellプレートの各ウェルに播種した。そして先述の基質を最終濃度1.6mMになるように加え、さらに被検物質（ウベニメクス、又はPEG-b-Plys (Ube) 50）をウベニクス換算の最終濃度が100μg/mlになるように加えた。37℃で60分培養した後、マイクロプレートリーダー（Perkin Elmer EnSpire 2300 Multimode Plate Reader）を用いて405nmの吸光度を測定することにより、CD13 / APN酵素活性を評価した。【００８６】
結果を図３Ａに示す。図３Ａに示されるように、PEG-b-Plys (Ube) 50は、ウベニメクスよりも、CD13/APN酵素活性を顕著に抑制することが分かった。【００８７】
試験例4．CD13/APNノックダウンが抗腫瘍効果に与える影響の解析
CD13/APNを標的とする2つのshRNA（sh1：配列番号1、及びsh2：配列番号2）をレンチウイルスベクターpLKOにクローニングした。ベクターは、gag / pol、rev、およびvg遺伝子を含む発現ベクターとともにHuH7細胞に同時にトランスフェクトした。 トランスフェクションした48時間後にレンチウイルスを採取し、5μg/mLポリブレンを添加した。 HuH7細胞を採取したレンチウイルスに感染させ、1μg/mLピューロマイシンで2週間セレクションを行った。得られた細胞のCD13/APN発現量について、定量的RT-PCT及びウェスタンブロッティングに確認し、CD13/APNがノックダウンされていることを確認した。CD13/APNノックダウン細胞及びその親株であるHuH7細胞（Parent）を用いて、試験例2と同様にしてMTTアッセイを行った。【００８８】
結果を図３Ｂに示す。図３Ｂに示されるように、PEG-b-Plys (Ube) 50の抗腫瘍効果は、CD13/APNノックダウンにより減弱することが分かった。この結果及び試験例3の結果（図３Ａ）より、PEG-b-Plys (Ube) 50の抗腫瘍効果は、CD13/APNの酵素活性の抑制を介して発揮されることが示唆された。【００８９】
試験例5．細胞内活性酸素種（ROS）量に与える影響の解析
CellROX Deep Red Reagentは、Invitrogen（Carlsbad、CA）から購入し、細胞内のROSレベルを測定した。HepG2細胞を被検物質（ウベニメクス、又はPEG-b-Plys (Ube) 50）100μg/ mlで処理した。37℃で6時間培養し、サンプルの細胞濃度を5×103細胞/ mlに調整した。その後、CellROX Deep Red Reagent（1mM、Invitrogen）を用いて、細胞を光から保護しながら37℃で30分間培養した。さらにSYTOX Blue Dead Cell Stain（5mM、Invitrogen）で染色することによりフローサイトメトリーで死細胞を除外してカウントした。フローサイトメトリー分析は、Canto IIフローサイトメーター（BD Biosciences）で行った。【００９０】
結果を図４Ａに示す。図４Ａに示されるように、ウベニメクスは細胞内ROSレベルを向上させる効果があること、さらにはPEG-b-Plys (Ube) 50は該効果がウベニメクスよりも顕著に優れていることが分かった。【００９１】
試験例6．アポトーシスに与える影響の解析
HepG2細胞を試験例5と同様にして被検物質（ウベニメクス、又はPEG-b-Plys (Ube) 50）で処理した。この細胞のアポトーシスアッセイは、Annexin V-FITCアポトーシス検出キット（BioVision、Mountain View、CA）を製造元のプロトコールに従って使用し、フローサイトメトリーを行った。フローサイトメトリー分析のために、HepG2細胞（5×105細胞）をトリプシン処理し、PBSで2回穏やかに洗浄し、続いて500μLの1×binding buffer中で再懸濁した。 5μLのAnnexin V-FITCおよびヨウ化プロピジウム（PI）を加えて暗所/室温で5分間かけて細胞を染色した。 FITC結合アネキシンVの緑色蛍光、およびDNA結合PIの赤色蛍光を、Canto IIフローサイトメーター（BD Biosciences）を用いて測定した。【００９２】
結果を図４Ｂに示す。図４Ｂに示されるように、ウベニメクスはアポトーシスを誘導させる効果があること、さらにはPEG-b-Plys (Ube) 50は該効果がウベニメクスよりも顕著に優れていることが分かった。【００９３】
試験例7．他の抗がん剤との併用効果の解析1
被検物質として、各種濃度のPEG-b-Plys (Ube) 50と、各種濃度の他の抗がん剤（5-FU、CDDP、又はDXR）との組み合わせを用い、且つHuH7細胞又はHepG2細胞を用いて、試験例2と同様にしてMTTアッセイを行った。得られた結果に基づいて、アイソボログラム分析を行った。組み合わせ指数（Combination Index；CI）は、中央効果プロット分析を用いて複合効果を分析する手段として行った。CIは、式［CI =（dA / D30A）+（dB / D30B）］に従って計算した。ここで、D30Aは、効果の30％を生成するのに必要な薬物A（PEG-b-Plys (Ube) 50）の濃度であり、dAは、dBと組み合わせたときに効果の30％を生成するのに必要な薬物Aの濃度である。同様に、D30Bは、効果の30％を生成するのに必要な薬剤B（他の抗がん剤）の濃度であり、dBは、dAと組み合わせたときに効果の30％を生成するのに必要な薬剤Bの濃度である。CI値は以下のように定義した：<0.8 =相乗作用; 0.8〜1.2 =相加効果; > 1.2 =拮抗作用。【００９４】
結果を図５Ａ及び図５Ｂに示す。該結果から、算出されたCIは、全て0.8未満であった。このことから、PEG-b-Plys (Ube) 50は、他の抗がん剤（5-FU、CDDP、又はDXR）と併用することにより、相乗効果を発揮することが分かった。【００９５】
試験例8．抗腫瘍効果のin vivo解析
8週齢のNOD/SCIDをCLEA Japanから購入し、病原体のない環境で飼育した。 HuH7細胞（5×106cell）を、50μLのPBSおよび50μLのMatrigel（BD Biosciences）に混合してマウスの背部に皮下移植した。皮下腫瘍体積が100mm3に達した後、PBS、PEG-b-PlysおよびPEG-b-Plys (Ube) 50のいずれかを1日おきに腹腔内投与した。皮下腫瘍体積は、（最大直径）×（最短直径）2÷2として計算した。全ての群において、投与量は100μLとし、PEG-b-Plys (Ube) 50の濃度は1mg / mlとした。 なおPEG-b-Plysの濃度は、1mg / mlの PEG-b-Plys (Ube) 50溶液に含まれるPEG-b-Plysの濃度と同じ濃度になるように調整した。PEG-b-PlysおよびPEG-b-Plys (Ube) 50治療群マウスは投与開始21日目まで治療し、24日目に安楽死させた。 PBS処理群マウスは、最初PEG-b-PlysおよびPEG-b-Plys (Ube) 50処置群と同様の処置後に安楽死を計画していた。しかし、一匹のマウスの腫瘍が2cmを超えてしまったため、倫理的な観点から安楽死の時期を早めざるを得ず、投与開始後18日目で安楽死させることとした。【００９６】
結果を図６に示す。図６に示されるように、PEG-b-Plys (Ube) 50の投与により、腫瘍が顕著に縮小することが分かった。【００９７】
試験例9．膜透過性の解析
PEG-b-Plys (Ube) 50をAlexa647で標識して、標識化合物を得た。標識化合物のDMSO溶液（2.5mM）10μLとHBSS（pH6.5）990μLとを混合して、10分間ボルテックスして、試験溶液（500μM 標識化合物溶液）を得た。試験溶液300μLをCaco-2細胞（トランスウェルで21日間培養）に添加し、1mLのBSA入りHBSS（pH7.4）をウェルの下に添加し、37℃で2時間インキュベーションした。ウェル上下それぞれの液を改修し、ウェルの上サンプル（S）：10μL（＋ BSA入りHBSS：140μL）とウェルの下サンプル（M)：150μLそれぞれについて、蛍光測定器（M1000、TECAN社製）で蛍光（650nm/668 nm）測定後、得られた蛍光強度に基づいて透過係数（apparent permeability coefficient；Papp）を計算した。【００９８】
その結果、標識化合物の透過係数（Papp(10-6cm/sec)）は0.1未満であり、標識化合物はほとんど膜を透過しないことが分かった。【００９９】
試験例10．CYP阻害性の解析
反応溶液の組成は以下の通りである。
PEG-b-Plys (Ube) 50：終濃度0.1, 1, 10μM
肝ミクロソーム：終濃度0.1mg protein/mL
補酵素群（NADPH, G-6-P, MgCl2）
G6PDH
モデル基質MiX（時間依存的阻害の場合は、上記を60分反応後に加える）
上記を混合（最終容量200μL）して、反応溶液を得た。37℃で20分間インキュベーション後、アセトニトリル200μLを添加し、30秒間ボルテックスした。遠心（3500 rpm, 20分間）後、上清をLC/MSで解析して、各モデル基質のピークエリアを算出した。各モデル基質の残量から、CYP阻害性を算出（10μMでの阻害率と、算出できる場合はIC50値）した。【０１００】
結果を表１に示す。表１の通り、各CYP種に対する阻害活性は認められなかった。【０１０１】
【表１】
2019151320.tif 000007
【０１０２】
試験例11．薬物動態の解析
Alexa647標識PEG-b-Plys (Ube) 50を1mg/mLになるようにPBSで溶解した。Alexa647標識PEG-b-Plys (Ube) 50溶液をC57BL/6JJclマウス(10-20週齢)の腹腔内に3.33mg/kgで投与した (n=5)。投与から0.5, 2, 8, 48時間後に各マウスの中心静脈から採血後に心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓を摘出した。摘出した組織はPBSで洗浄し、水分を除去した後に、秤量した。臓器の重さ(mg)×4μLのlysis buffer（和光純薬工業株式会社）を加えてマルチビーズショッカーで破砕した。破砕後、8,400×g, 5 min, ４℃で遠心分離し、上澄みの50μLを96 wellプレート（黒色）に移して、蛍光測定器（Enspire、PerkinElmer社）で蛍光（610nm/670 nm）測定した。血液は採血後に、860×g, 15 min, ４℃で遠心分離することで血漿と血球成分に分離し、血漿中の薬物濃度を定量した。無処置のマウスの各組織にAlexa647標識PEG-b-Plys (Ube) 50をスパイクすることで、検量線を作成し、各組織中の薬物を定量した。【０１０３】
その結果、投与されたAlexa647標識PEG-b-Plys (Ube) 50の大部分は４８時間以内に消失していた。Alexa647標識PEG-b-Plys (Ube) 50は腎臓に最も多く分布していた。【０１０４】
結果を図７に示す。【０１０５】
試験例12．心毒性の解析
ヒトiPS細胞由来心筋細胞：CarmyA-human（Myoridge）をマトリゲルコート済み384 well plateに播種し（8,000 cells/well）、毎日培地交換して1週間培養した。染色試薬：Cal520 AM（ AAT Bioquest, Inc. ）を添加した（終濃度5μM）。PEG-b-Plys (Ube) 50を添加した（終濃度：2、6.7、20μM（n=2））。PEG-b-Plys (Ube) 50の添加前、添加後10、30分後に、Ca fluxアッセイ（FDSS7000（浜松ホトニクス）を使用）を行った。【０１０６】
その結果、化合物添加によりピーク間隔がやや広がる傾向が見られたが、QT延長や頻脈を引き起こすような傾向は認められなかった。【０１０７】
試験例13．溶解度の解析
試験例9で得られた標識化合物のDMSO溶液（10mM）10μLとPBS 990μLとを混合して（＝1％ DMSO）、10分間ボルテックスして、試験溶液（Alexa647標識化合物の1% DMSO/PBS溶液（100μM））を得た。試験溶液250μLをろ過プレート（Multi Screen HTS-PCF）でろ過して、得られたろ過サンプル200μLについて、蛍光測定器（M1000、TECAN社製）で蛍光（650nm/668 nm）測定した。また、コントロールとして化合物の5% DMSO/PBS溶液で同様の操作を行った。コントロール（100μM）の蛍光値とサンプルの蛍光値を比較した。【０１０８】
その結果、PEG-b-Plys (Ube) 50のPBSに対する溶解度は73.7μMであると算出された。【０１０９】
試験例14．他の抗がん剤との併用効果の解析2
8週齢のNOD/SCIDをCLEA Japanから購入し、SPF環境下で飼育した。 HuH7細胞（5×106cell）を、50μLのPBSおよび50μLのMatrigel（BD Biosciences）に混合してマウスの背部に皮下移植した。皮下腫瘍体積が100mm3に達した後、PBS、CDDP、又はCDDPとPEG-b-Plys (Ube) 50との両方を1日おきに腹腔内投与した。皮下腫瘍体積は、（最大直径）×（最短直径）2÷2として計算した。結果を図８に示す。【０１１０】
全てのマウスの組織は10%ホルムアルデヒドを24時間処理することで固定され、パラフィン中に包埋し、5μm切片にスライスされた。得られた切片を用いてヘマトキシリン-エオジン染色及び免疫組織化学染色を行った。Anti-Bax antibody (Cat. No. ab32503; Abcam, Cambridge, UK) はBax陽性細胞のカウントに用いた。 Anti-Ki67 (Cat. No. ab15580; Abcam)及びanti-PCNA antibody (Cat. No. ab18197; Abcam)も同様に用いた。Bax、PCNA及びKi67発現は無作為な3つの異なる視野で分析し、陽性細胞の平均割合を評価した。結果を図９〜１１に示す。【０１１１】
その結果、PEG-b-Plys (Ube) 50併用群はCDDP単独よりも有意に腫瘍体積を縮小させ、in vivoにおいてもPEG-b-Plys (Ube) 50が既存の抗がん剤と相乗効果を示すことが明らかとなった。また、PEG-b-Plys (Ube) 50の投与は肝臓、腎臓及び肺には組織学的に明らかな悪影響を及ぼさなかった。PEG-b-Plys (Ube) 50併用群ではCDDP単独群よりもBaxの発現は有意に高く、細胞増殖マーカーは有意に低かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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