(57)【要約】  本発明は、免疫グロブリンκ鎖可変領域含有タンパク質に特異的に結合し、かつ、特にアルカリ溶液に対する化学的安定性に優れた、免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド、当該ペプチドをリガンドとして有するアフィニティ分離マトリックス、および当該アフィニティ分離マトリックスを用いたκ鎖可変領域含有タンパク質の製造方法を提供することを目的とする。また、本発明は、当該ペプチドをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含むベクター、および当該ベクターにより形質転換された形質転換体を提供することも目的とする。ペプトストレプトコッカス・マグヌス株由来プロテインＬのκ鎖可変領域結合ドメインに対して、適切な部位に変異を導入したペプチドをアフィニティ・リガンドとして利用することで、上記課題を解決する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記アミノ酸配列（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれかのアミノ酸配列を有することを特徴とする免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド。
（Ｉ）  配列番号１のアミノ酸配列において、（ａ）〜（ｈ）の少なくとも１つ以上のアミノ酸置換変異を導入したアミノ酸配列（但し、（ｂ）または（ｅ）の変異と（ｇ）の変異、および、（ｃ）または（ｄ）の変異と（ｈ）の変異を同時に導入しないものとする）：
（ａ）  第３位のＬｙｓをＡｒｇに置換；
（ｂ）  第９位のＬｙｓをＡｒｇに置換；
（ｃ）  第１６位のＡｓｐをＧｌｕに置換；
（ｄ）  第１８位のＴｈｒをＬｙｓまたはＡｒｇに置換；
（ｅ）  第２３位のＴｈｒをＧｌｕに置換；
（ｆ）  第２５位のＬｙｓをＡｒｇに置換；
（ｇ）  第９位のＬｙｓをＡｓｐまたはＧｌｕ、かつ、第２３位のＴｈｒをＬｙｓまたはＡｒｇに置換；
（ｈ）  第１６位のＡｓｐをＬｙｓまたはＡｒｇ、かつ、第１８位のＴｈｒをＡｓｐまたはＧｌｕに置換；
（ＩＩ）  上記（Ｉ）に規定されるアミノ酸配列において、Ｎ末端および／もしくはＣ末端の１個もしくは２個のアミノ酸が欠失および／もしくは置換されたアミノ酸配列、並びに／または、Ｎ末端および／もしくはＣ末端に１個以上２０個以下のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列；
（ＩＩＩ）  上記（Ｉ）に規定されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列（但し、配列番号１における第３位、第９位、第１６位、第１８位、第２３位、および、第２５位から選択される１以上の位置のアミノ酸残基は、さらに変異しないものとする）。
【請求項２】
上記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれかに規定されるアミノ酸配列において、（ｉ）〜（ｊ）の少なくとも１つ以上のアミノ酸置換変異を導入したアミノ酸配列を有する請求項１に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド；
（ｉ）  配列番号１における第４４位のＬｙｓをＡｒｇに置換；
（ｊ）  配列番号１における第４８位のＬｙｓをＡｒｇに置換。
【請求項３】
請求項１または２に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドを２個以上有することを特徴とする免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド多量体。
【請求項４】
２個以上の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドが、単一の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドである請求項３に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド多量体。
【請求項５】
請求項１もしくは２に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドまたは請求項３もしくは４に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド多量体、および水不溶性担体を有し、免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドまたは免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド多量体がリガンドとして水不溶性担体に固定化されたものであることを特徴とするアフィニティ分離マトリックス。
【請求項６】
免疫グロブリンκ鎖可変領域を含むタンパク質を製造する方法であって、
請求項５に記載のアフィニティ分離マトリックスと、免疫グロブリンκ鎖可変領域を含むタンパク質を含む液体試料とを接触させる工程、および、
アフィニティ分離マトリックスに結合した免疫グロブリンκ鎖可変領域を含むタンパク質を、アフィニティ分離マトリックスから分離する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１もしくは２に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドまたは請求項３もしくは４に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド多量体をコードすることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項８】
請求項７に記載のＤＮＡを含むことを特徴とするベクター。
【請求項９】
請求項８に記載のベクターにより形質転換されたものであることを特徴とする形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルカリ溶液に対する化学的安定性が改良された免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド、当該ペプチドをリガンドとして有するアフィニティ分離マトリックス、当該アフィニティ分離マトリックスを用いる免疫グロブリンκ鎖可変領域含有タンパク質の製造方法、当該ペプチドをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含むベクター、および、当該ベクターにより形質転換された形質転換体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の重要な機能の一つとして、特定の分子に特異的に結合する機能が挙げられる。この機能は、生体内における免疫反応やシグナル伝達に重要な役割を果たしている。この機能を有用物質の分離精製に利用する技術開発も盛んになされている。実際に産業的に利用されている一例として、抗体医薬を動物細胞培養物から一度に高い純度でキャプチャリングして精製するために利用されるプロテインＡアフィニティ分離マトリックス（以下、プロテインＡを「ＳｐＡ」と略記する場合がある）が挙げられる（非特許文献１，２）。【０００３】
抗体医薬として開発されているのは基本的にモノクローナル抗体であり、組換え培養細胞技術などを用いて大量に生産されている。「モノクローナル抗体」とは、単一の抗体産生細胞に由来するクローンから得られた抗体を指す。現在上市されている抗体医薬のほとんどは、分子構造的には免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）サブクラスである。また、免疫グロブリンを断片化した分子構造を有する断片抗体からなる抗体医薬も盛んに臨床開発されており、様々な断片抗体医薬の臨床開発が進んでいる（非特許文献３）。【０００４】
抗体医薬製造工程における初期精製工程には、先述のＳｐＡアフィニティ分離マトリックスが利用されている。しかし、ＳｐＡは基本的にＩｇＧのＦｃ領域に特異的に結合するタンパク質である。よって、Ｆｃ領域を含まない断片抗体は、ＳｐＡアフィニティ分離マトリックスを利用したキャプチャリングができない。従って、抗体医薬精製プロセスのプラットフォーム開発の観点から、ＩｇＧのＦｃ領域を含まない断片抗体をキャプチャリング可能なアフィニティ分離マトリックスに対する産業的なニーズは高い。【０００５】
ＩｇＧのＦｃ領域以外に結合するペプチドはすでに複数知られている（非特許文献４）。それらの中でも、結合できる断片抗体フォーマットの種類の多さ、および、ＩｇＭやＩｇＡなどにも結合可能という観点からは、可変領域（抗原結合ドメイン）に結合できるペプチドが最も好ましく、例えば、プロテインＬ（以下、プロテインＬを「ＰｐＬ」と略記する場合がある）がよく知られている。ＰｐＬは、複数のκ鎖可変領域結合ドメイン（以下、κ鎖可変領域を「ＶＬ−κ」と略記する場合がある）を含むタンパク質であり、個々のＶＬ−κ結合性ドメインのアミノ酸配列は異なる。また、菌株の種類によっても、ＶＬ−κ結合性ドメインの数、および個々のアミノ酸配列は異なる。例えば、ペプトストレプトコッカス・マグヌス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｇｎｕｓ）３１２株のＰｐＬに含まれるＶＬ−κ結合性ドメインの数は５個であり、ペプトストレプトコッカス・マグヌス株３３１６のＰｐＬに含まれるＶＬ−κ結合性ドメインの数は４個である（非特許文献５〜７，特許文献１〜２）。そして、それら計９個のＶＬ−κ結合性ドメインの中に、互いに同じアミノ酸配列であるドメインは無い。【０００６】
ＳｐＡの場合には、部位特異的に変異を導入し、アフィニティ分離マトリックス用リガンドとしての機能を改良するタンパク工学研究が盛んに進められており（非特許文献１，８，特許文献３〜８）、特にＳｐＡアフィニティ分離マトリックスの洗浄に広く用いられる水酸化ナトリウム溶液に対する化学的安定性の向上を目的とした研究が多い。具体的には、アルカリ性条件下で脱アミド化反応を受け易いことが知られるアスパラギン残基、および、アスパラギン残基の後ろのグリシン残基へのアミノ酸置換変異が化学的安定性の向上に効果がある。しかし、ＳｐＡ中の全てのアスパラギン残基に関し、このような変異がアルカリ耐性向上効果を示すわけではない（非特許文献８）。【０００７】
ＰｐＬをリガンドとするアフィニティ分離マトリックスもすでに複数市販されている。ＰｐＬの結合力や結合様式を解析することを目的とした変異導入の報告は複数存在し（非特許文献７，９，１０）、アフィニティリガンドとしての機能改変を意図した研究の報告も存在する（特許文献９，１０）。しかし、ＳｐＡの場合に比較するとＰｐＬの変異導入報告例は限られており、特にアルカリ溶液に対する化学的安定性は、ＳｐＡアフィニティ分離マトリックスの場合には、ＳｐＡの改良によって０．１〜０．５Ｍ水酸化ナトリウムでの洗浄が可能となっているのに対し、ＰｐＬアフィニティ分離マトリックスの場合には、０．０２〜０．０５Ｍ水酸化ナトリウムが推奨されている（非特許文献１１）。近年になって、ＰｐＬのアルカリ溶液に対する化学的安定性が高いＶＬ−κ結合性ドメインのアミノ酸配列（特許文献１１，１２，１３）、および、当該特性を改良する変異（特許文献１４，１５，１６）に関する報告もなされている。しかし、ＳｐＡの化学的安定性を指標とした場合には、ＰｐＬのアルカリ溶液に対する化学的安定性は、更なる改良が必要と言える。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表平７−５０６５７３号公報
【特許文献２】特表平７−５０７６８２号公報
【特許文献３】米国特許第５１４３８４４号公報
【特許文献４】特表２００６−３０４６３３号公報
【特許文献５】欧州特許第１１２３３８９号公報
【特許文献６】国際公開第０３／０８０６５５号パンフレット
【特許文献７】米国公開第２００６／０１９４９５０号公報
【特許文献８】国際公開第２０１１／１１８６９９号パンフレット
【特許文献９】国際公開第２０１６／１２１７０３号パンフレット
【特許文献１０】国際公開第２００８／１１５１５１号パンフレット
【特許文献１１】特開２０１６−０７９１４９号公報
【特許文献１２】国際公開第２０１６／１２１７０３号パンフレット
【特許文献１３】国際公開第２０１６／０９６６４３号パンフレット
【特許文献１４】国際公開第２０１６／０９６６４４号パンフレット
【特許文献１５】国際公開第２０１７／０６９１５８号パンフレット
【特許文献１６】国際公開第２０１７／１９１７４８号パンフレット
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Hober S．ら，J．Chromatogr．B，2007，848巻，40-47頁
【非特許文献２】Shukla A．A．ら，Trends Biotechnol．，2010，28巻，253-261頁
【非特許文献３】Nelson A．N．ら，Nat．Biotechnol．，2009，27巻，331-337頁
【非特許文献４】Bouvet P．J．，Int．J．Immunopharmac．，1994，16巻，419-424頁
【非特許文献５】Kastern W．ら，J．Biol．Chem．，1992，267巻，12820-12825頁
【非特許文献６】Murphy J．P．ら，Mol．Microbiol．, 1994，12巻，911-920頁
【非特許文献７】Housden N．G．ら，Biochemical Society Transactions，2003，31巻，716-718頁
【非特許文献８】Linhult M. ら, PROTEINS, 2004, 55巻, 407-416頁
【非特許文献９】Housden N．G．ら，J．Biol．Chem．，2004，279巻，9370-9378頁
【非特許文献１０】Tadeo X．ら，Biophys．J．，2009，97巻，2595-2603頁
【非特許文献１１】Rodrigo G．ら，Antibodies，2015，4巻，259-277頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
免疫グロブリンのκ鎖に結合性を示し、アルカリ溶液に対する化学的安定性に優れた、新規な改変型プロテインＬ（ＰｐＬ）、および、当該改変型ＰｐＬをリガンドとして有するアフィニティ分離マトリックス、および当該アフィニティ分離マトリックスを用いたκ鎖可変領域含有タンパク質の製造方法を提供することが、本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために、ＰｐＬのＶＬ−κ結合性ドメインの変異体を分子設計し、タンパク質工学的手法および遺伝子工学的手法を用いて、該変異体を、形質転換細胞から取得し、取得した該変異体の物性を比較する検討を行った。
その結果として完成した本発明を以下に示す。【００１２】
［１］  下記アミノ酸配列（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれかのアミノ酸配列を有することを特徴とする免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド。
（Ｉ）  配列番号１のアミノ酸配列において、（ａ）〜（ｈ）の少なくとも１つ以上のアミノ酸置換変異を導入したアミノ酸配列（但し、（ｂ）または（ｅ）の変異と（ｇ）の変異、および、（ｃ）または（ｄ）の変異と（ｈ）の変異を同時に導入しないものとする）：
（ａ）  第３位のＬｙｓをＡｒｇに置換；
（ｂ）  第９位のＬｙｓをＡｒｇに置換；
（ｃ）  第１６位のＡｓｐをＧｌｕに置換；
（ｄ）  第１８位のＴｈｒをＬｙｓまたはＡｒｇに置換；
（ｅ）  第２３位のＴｈｒをＧｌｕに置換；
（ｆ）  第２５位のＬｙｓをＡｒｇに置換；
（ｇ）  第９位のＬｙｓをＡｓｐまたはＧｌｕ、かつ、第２３位のＴｈｒをＬｙｓまたはＡｒｇに置換；
（ｈ）  第１６位のＡｓｐをＬｙｓまたはＡｒｇ、かつ、第１８位のＴｈｒをＡｓｐまたはＧｌｕに置換；
（ＩＩ）  上記（Ｉ）に規定されるアミノ酸配列において、Ｎ末端および／もしくはＣ末端の１個もしくは２個のアミノ酸が欠失および／もしくは置換されたアミノ酸配列、並びに／または、Ｎ末端および／もしくはＣ末端に１個以上２０個以下のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列；
（ＩＩＩ）  上記（Ｉ）に規定されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列（但し、配列番号１における第３位、第９位、第１６位、第１８位、第２３位、および、第２５位から選択される１以上の位置のアミノ酸残基は、さらに変異しないものとする）。【００１３】
［２］  上記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれかに規定されるアミノ酸配列において、（ｉ）〜（ｊ）の少なくとも１つ以上のアミノ酸置換変異を導入したアミノ酸配列を有する上記［１］に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド；
（ｉ）  配列番号１における第４４位のＬｙｓをＡｒｇに置換；
（ｊ）  配列番号１における第４８位のＬｙｓをＡｒｇに置換。【００１４】
［３］  上記［１］または［２］に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドを２個以上有することを特徴とする免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド多量体。【００１５】
［４］  ２個以上の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドが、単一の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドである上記［３］に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド多量体。【００１６】
［５］  上記［１］もしくは［２］に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドまたは上記［３］もしくは［４］に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド多量体、および水不溶性担体を有し、免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドまたは免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド多量体がリガンドとして水不溶性担体に固定化されたものであることを特徴とするアフィニティ分離マトリックス。【００１７】
［６］  免疫グロブリンκ鎖可変領域を含むタンパク質を製造する方法であって、
上記［５］に記載のアフィニティ分離マトリックスと、免疫グロブリンκ鎖可変領域を含むタンパク質を含む液体試料とを接触させる工程、および、
アフィニティ分離マトリックスに結合した免疫グロブリンκ鎖可変領域を含むタンパク質を、アフィニティ分離マトリックスから分離する工程を含むことを特徴とする方法。【００１８】
［７］  上記［１］もしくは［２］に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドまたは上記［３］もしくは［４］に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド多量体をコードすることを特徴とするＤＮＡ。【００１９】
［８］  上記［７］に記載のＤＮＡを含むことを特徴とするベクター。【００２０】
［９］  上記［８］に記載のベクターにより形質転換されたものであることを特徴とする形質転換体。
【発明の効果】
【００２１】
本発明で得られた改変型ＰｐＬを固定化したアフィニティ精製用クロマトグラフィ担体は、アルカリ処理のダメージによるκ鎖結合活性の低下が少ないため、繰返し使用に際してのクリーニング時に、クロマトグラフィ担体に残留した有機物等の不純物除去効果が高い水酸化ナトリウムでの効果的な（具体的には高濃度または長時間での）洗浄が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】各々のペプチドのアルカリ処理後の残存活性値をプロットしたグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、下記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれかのアミノ酸配列を有する免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドに関する。以下、アミノ酸配列（Ｉ）〜（ＩＩＩ）を有する免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドを「免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド（Ｉ）〜（ＩＩＩ）」や「ＶＬ−κ結合性ペプチド（Ｉ）〜（ＩＩＩ）」と略記する場合がある。
（Ｉ）  配列番号１のアミノ酸配列において、（ａ）〜（ｈ）の少なくとも１つ以上のアミノ酸置換変異を導入したアミノ酸配列（但し、（ｂ）または（ｅ）の変異と（ｇ）の変異、および、（ｃ）または（ｄ）の変異と（ｈ）の変異を同時に導入しないものとする）：
（ａ）  第３位のＬｙｓをＡｒｇに置換；
（ｂ）  第９位のＬｙｓをＡｒｇに置換；
（ｃ）  第１６位のＡｓｐをＧｌｕに置換；
（ｄ）  第１８位のＴｈｒをＬｙｓまたはＡｒｇに置換；
（ｅ）  第２３位のＴｈｒをＧｌｕに置換；
（ｆ）  第２５位のＬｙｓをＡｒｇに置換；
（ｇ）  第９位のＬｙｓをＡｓｐまたはＧｌｕ、かつ、第２３位のＴｈｒをＬｙｓまたはＡｒｇに置換；
（ｈ）  第１６位のＡｓｐをＬｙｓまたはＡｒｇ、かつ、第１８位のＴｈｒをＡｓｐまたはＧｌｕに置換；
（ＩＩ）  上記（Ｉ）に規定されるアミノ酸配列において、Ｎ末端および／もしくはＣ末端の１個もしくは２個のアミノ酸が欠失もしくは置換されたアミノ酸配列、並びに／または、Ｎ末端および／もしくはＣ末端に１個以上２０個以下のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列；
（ＩＩＩ）  上記（Ｉ）に規定されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列（但し、配列番号１における第３位、第９位、第１６位、第１８位、第２３位、および、第２５位から選択される１以上の位置のアミノ酸残基は、さらに変異しないものとする）。
【００２４】
「免疫グロブリン（Ｉｇ）」は、リンパ球のＢ細胞が産生する糖タンパク質であり、特定のタンパク質などの分子を認識して結合する働きを持つ。免疫グロブリンは、この特定の分子（抗原）に特異的に結合する機能と、他の生体分子や細胞と協同して抗原を有する因子を無毒化・除去する機能を有する。免疫グロブリンは、一般的に「抗体」と呼ばれるが、それはこのような機能に着目した名称である。全ての免疫グロブリンは、基本的には同じ分子構造からなり、“Ｙ”字型の４本鎖構造（軽鎖・重鎖の２本のポリペプチド鎖が２本ずつ）を基本構造としている。軽鎖（Ｌ鎖）には、λ鎖とκ鎖の２種類があり、すべての免疫グロブリンはこのどちらかを持つ。重鎖（Ｈ鎖）には、γ鎖、μ鎖、α鎖、δ鎖、ε鎖のという構造の異なる５種類があり、この重鎖の違いによって免疫グロブリンの種類（アイソタイプ）が変わる。免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は、単量体型の免疫グロブリンで、２本の重鎖（γ鎖）と２本の軽鎖から構成され、２箇所の抗原結合部位を持っている。
【００２５】
免疫グロブリンの“Ｙ”字の下半分の縦棒部分にあたる場所をＦｃ領域と呼び、上半分の“Ｖ”字の部分をＦａｂ領域と呼ぶ。Ｆｃ領域は抗体が抗原に結合した後の反応を惹起するエフェクター機能を有し、Ｆａｂ領域は抗原と結合する機能を有する。重鎖のＦａｂ領域とＦｃ領域はヒンジ部でつながっており、パパイヤに含まれるタンパク分解酵素パパインは、このヒンジ部を分解して２つのＦａｂ領域と１つのＦｃ領域に切断する。Ｆａｂ領域のうち“Ｙ”字の先端に近い部分は、多様な抗原に結合できるように、アミノ酸配列に多彩な変化が見られるため、可変領域（Ｖ領域）と呼ばれている。軽鎖の可変領域をＶＬ領域、重鎖の可変領域をＶＨ領域と呼ぶ。Ｖ領域以外のＦａｂ領域とＦｃ領域は、比較的変化の少ない領域であり、定常領域（Ｃ領域）と呼ばれる。軽鎖の定常領域をＣＬ領域と呼び、重鎖の定常領域をＣＨ領域と呼ぶが、ＣＨ領域はさらにＣＨ１〜ＣＨ３の３つに分けられる。重鎖のＦａｂ領域はＶＨ領域とＣＨ１からなり、重鎖のＦｃ領域はＣＨ２とＣＨ３からなる。ヒンジ部はＣＨ１とＣＨ２の間に位置する。プロテインＬは、軽鎖がκ鎖である可変領域（本明細書では「ＶＬ−κ」と省略する場合がある）に結合する（非特許文献５〜７）。
【００２６】
本発明に係るペプチドは、免疫グロブリンのκ鎖可変領域（ＶＬ−κ領域）に結合する。本発明で得られたペプチドが結合すべきＶＬ−κ領域含有タンパク質は、ＶＬ−κ領域を含むものであればよく、Ｆａｂ領域とＦｃ領域を不足なく含有するＩｇＧであってもよいし、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＡなどの他のＩｇ類であってもよいし、それらをタンパク質工学的に改変した免疫グロブリン分子の誘導体であってもよい。本発明に係るＶＬ−κ領域結合性ペプチドが結合する免疫グロブリン分子誘導体は、ＶＬ−κ領域を有する誘導体であれば特に制限されない。例えば、免疫グロブリンＧのＦａｂ領域のみに断片化されたＦａｂフラグメント、免疫グロブリンＧの可変領域のみからなるｓｃＦｖ、ヒト免疫グロブリンＧの一部のドメインを他生物種の免疫グロブリンＧのドメインに置き換えて融合させたキメラ型免疫グロブリンＧ、Ｆｃ領域の糖鎖に分子改変を加えた免疫グロブリンＧ、薬剤を共有結合したｓｃＦｖ断片などを挙げることができる。
【００２７】
本発明において「ペプチド」とは、ポリペプチド構造を有するあらゆる分子を含むものであって、いわゆるタンパク質のみならず、断片化されたものや、ペプチド結合によって他のペプチドが連結されたものも包含されるものとする。本明細書においては、ペプチドとタンパク質は基本的に同義である。「ドメイン」とは、タンパク質の高次構造上の単位であり、数十から数百のアミノ酸残基から構成され、なんらかの物理化学的または生物化学的な機能を発現するに十分なタンパク質の単位をいう。タンパク質やペプチドの「変異体」は、野生型のタンパク質やペプチドの配列に対し、アミノ酸レベルで、少なくとも１つ以上の置換、付加または欠失が導入されたタンパク質またはペプチドをいう。アミノ酸を置換する変異の表記について、置換位置の番号の前に、野生型または非変異型のアミノ酸を付し、置換位置の番号の後に、変異したアミノ酸を付して表記する。例えば、第２９位のＧｌｙをＡｌａに置換する変異は、Ｇ２９Ａと記載する。
【００２８】
「プロテインＬ（ＰｐＬ）」は、ペプトストレプトコッカス属（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）に属する嫌気性グラム陽性球菌の細胞壁に由来するタンパク質である。好ましくは、ペプトストレプトコッカス・マグヌス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｇｎｕｓ）に由来するＰｐＬであり、ペプトストレプトコッカス・マグヌス３１２株、および、ペプトストレプトコッカス・マグヌス３３１６株に由来する２種類のＰｐＬが好ましいが、これらに限定されない（非特許文献４〜６）。なお、本明細書では、ペプトストレプトコッカス・マグヌス３１２株のＰｐＬを「ＰｐＬ３１２」、ペプトストレプトコッカス・マグヌス３３１６株由来のＰｐＬを「ＰｐＬ３３１６」と省略することがある。
【００２９】
ＰｐＬは、７０〜８０残基からなる複数のＶＬ−κ結合性ドメインを含有する。ＰｐＬ３１２に含まれるＶＬ−κ結合性ドメインの数は５個であり、ＰｐＬ３３１６に含まれるＶＬ−κ結合性ドメインの数は４個である。ＰｐＬ３１２のＶＬ−κ結合性ドメインは、Ｎ末端から順に、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５ドメインと呼び、ＰｐＬ３３１６のＶＬ−κ結合性ドメインは、Ｎ末端から順に、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４ドメインと呼ぶ（非特許文献５〜６）。本発明を適用するのは、これらのＶＬ−κ結合性ドメインの中のＢ５ドメインが好ましい。
【００３０】
本発明を適用するのは、Ｂ５ドメインに特許文献６に記載の変異を導入した配列番号１に示すアミノ酸配列が好ましいが、例えば、野生型Ｂ５ドメインのアミノ酸配列（配列番号２）でもよく、ＰｐＬ３１２のＢ４ドメインより後ろを全て含んだＢ５ドメインのアミノ酸配列（配列番号３）でもよく、特許文献１２に記載のアミノ酸数が異なるＢ５ドメインのアミノ酸配列（配列番号４）でもよい。Ｂ５ドメインのアミノ酸配列のアミノ酸数が文献によって異なるのは、Ｎ末端の約２０残基は特定の二次構造を取らないことが要因である。Ｎ末端領域を欠失させた場合にも、ＶＬ−κ結合性ドメインとして三次元構造を保持し、ＶＬ−κ結合性を示す（非特許文献７）。したがって、配列番号１で示すＢ５ドメインについても、Ｎ末端領域１〜５残基を欠失させることは可能である。配列番号１で示すアミノ酸配列の第１位は、非特許文献７〜８および特許文献９に倣って残基番号を付与すると第１６位となる。
【００３１】
本発明は、野生型のＰｐＬのＶＬ−κ結合性ドメインに対し、特定のアミノ酸置換変異を導入することによって、アルカリ性水溶液に対する化学的安定性が、変異導入前に比べて向上していることを特徴とする変異体を創製する技術である。
【００３２】
改変型ＶＬ−κ結合性ペプチドは、後記の実施例において確かめられている通り、アルカリ性水溶液で処理（浸潤）した後の、アルカリによるダメージがより少なく、結合性能を高いレベルで維持している。
【００３３】
本発明に係るアミノ酸残基の置換部位は、配列番号１のアミノ酸配列における第３位、第９位、第１６位、第１８位、第２３位、および、第２５位から選択される１つ以上のアミノ酸残基である。配列番号１の第３位はＬｙｓ、第９位はＬｙｓ、第１６位はＡｓｐ、第１８位はＴｈｒ、第２３位はＴｈｒ、および、第２５位はＬｙｓである。変異導入前のＢ５ドメインのアミノ酸配列のアミノ酸数が異なる場合においても、配列同一性が９０％以上である場合に、配列番号１の第３位、第９位、第１６位、第１８位、第２３位、および、第２５位に相当する位置を同定することは、当業者であれば容易に可能である。具体的には、アミノ酸配列多重アラインメント用プログラムであるＣｌｕｓｔａｌ（http://www.clustal.org/omega/）、または、遺伝情報処理ソフトウエアであるＧＥＮＥＴＹＸ（https://www.genetyx.co.jp/）で、アラインメントをとって確かめることが可能である。なお、非特許文献７〜８および特許文献９に記載の残基番号に従えば、本発明に係るアミノ酸残基の置換部位はそれぞれ、第１８位、第２４位、第３１位、第３３位、第３８位、および、第４０位に相当する。
【００３４】
本発明に係るＶＬ−κ結合性ペプチド（Ｉ）〜（ＩＩＩ）は、上述の第３位、第９位、第１６位、第１８位、第２３位、および、第２５位から選択される１つ以上のアミノ酸残基が置換された配列番号１のアミノ酸配列を有する。置換される位置は、第３位、第９位、第１６位、第１８位、および、第２５位が好ましく、第３位、第９位、第１６位、および、第２５位がさらにより好ましく、第３位、第９位、および、第２５位がさらにより好ましく、第９位、および、第２５位がさらにより好ましい。置換されるアミノ酸変異の数は、特に限定されないが、１つ以上が好ましく、２つ以上がより好ましく、３つ以上がさらにより好ましく、４つ以上がさらにより好ましい。当該変異数の上限は特に制限されず、６であってもよい。
【００３５】
本発明においてペプチドが「（特定の）アミノ酸配列を有する」とは、そのペプチドのアミノ酸配列が特定されたアミノ酸配列を含んでいればよく、且つ、そのペプチドの機能が維持されていることを意味する。ペプチドにおいて特定されたアミノ酸配列以外の配列としては、ヒスチジンタグや固定化のためのリンカー配列の他、−Ｓ−Ｓ−結合などの架橋構造などが挙げられる。
【００３６】
変異するアミノ酸の種類は、非タンパク質構成アミノ酸や非天然アミノ酸への置換を含め、特に限定されるものではないが、遺伝子工学的生産の観点から、天然型アミノ酸を好適に用いることができる。さらに、天然型アミノ酸は、中性アミノ酸；ＡｓｐとＧｌｕの酸性アミノ酸；Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓの塩基性アミノ酸に分類される。中性アミノ酸は、脂肪族アミノ酸；Ｐｒｏのイミノ酸；Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐの芳香族アミノ酸に分類される。脂肪族アミノ酸は、さらに、Ｇｌｙ；Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅの分枝アミノ酸；Ｓｅｒ、Ｔｈｒのヒドロキシアミノ酸；Ｃｙｓ、Ｍｅｔの含硫アミノ酸；Ａｓｎ、Ｇｌｎの酸アミドアミノ酸に分類される。また、Ｔｙｒはフェノール性水酸基を有することから、芳香族アミノ酸のみでなくヒドロキシアミノ酸に分類してもよい。さらに、別の観点からは、天然アミノ酸を、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅの疎水性の高い非極性アミノ酸類；Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒの中性の極性アミノ酸類；Ａｓｐ、Ｇｌｕの酸性の極性アミノ酸類；Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓの塩基性の極性アミノ酸類に分類することもできる。本発明においては、上記特定位置のアミノ酸を同一の群に分類されるアミノ酸に置換してもよいし、異なる群に分類されるアミノ酸に置換してもよい。
【００３７】
（ａ）〜（ｆ）のアミノ酸置換変異については、単独でもアルカリに対する化学的安定性の向上に効果が期待できるが、複数導入しても同様の効果が期待できる。特に、（ｂ）と（ｅ）、および／または、（ｃ）と（ｄ）は、アミノ酸の側鎖が立体構造上近接しており、複数導入することで相乗効果が期待される。ゆえに、（ｇ）や（ｈ）のような変異も同様の効果が期待できる。
【００３８】
本発明に係るＶＬ−κ結合性ペプチドは、上述のアミノ酸置換変異が導入されたアミノ酸配列（Ｉ）に対し、Ｎ末端および／もしくはＣ末端の１個または２個のアミノ酸が欠失および／もしくは置換されたアミノ酸配列、並びに／または、Ｎ末端および／もしくは末端に１個以上２０個以下のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列（ＩＩ）を有していても良い。
上記の欠失および／もしくは置換の変異の数としては、１または２が好ましく、１がより好ましい。付加の変異の数としては、１５以下または１０以下が好ましく、７以下、５以下または３以下がより好ましく、１または２がさらに好ましく、１が特に好ましい。アミノ酸残基の欠失／置換／付加の位置としては、例えば、Ｎ末端および／またはＣ末端を挙げることができる。これら部位は、特に欠失および／または付加の部位として好ましい。したがって、例えば、かかる変異を配列番号３や配列番号４のアミノ酸配列に適用できるが、これらに限定されない。例えば、ＰｐＬ３１２のＢ１〜Ｂ４ドメインのＮ末端領域の配列を付加してもよく、例えば、配列番号１のＮ末端領域をＢ２ドメインのＮ末端領域のアミノ酸配列に置き換えた配列番号５に示すアミノ酸配列を有するペプチドであってもよい。この場合、配列番号１のアミノ酸配列の第１位は、配列番号５のアミノ酸配列においては第７位となる。付加配列の実施形態の一つとして、開始コドンに相当するＭｅｔのＮ末端への付加、および、リンカー残基やマトリックス固定化残基の役割を期待して、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、および／またはＬｙｓを含むアミノ酸配列のＮ末端および／もしくはＣ末端への付加が挙げられる。
【００３９】
本発明に係るＶＬ−κ結合性ペプチドは、上述のアミノ酸置換変異が導入されたアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列（ＩＩＩ）を有していても良い。例えば、配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチドであってもよい。但し、配列番号１における第３位、第９位、第１６位、第１８位、第２３位、および、第２５位から選択される１以上の位置のアミノ酸残基は、さらに変異しないものとする。したがって、本発明で得られたアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有する限りにおいては、さらに変異を導入しても良い。上記配列同一性としては、９０％以上または９２％以上が好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がさらに好ましく、９９％以上または９９．５％以上がより更に好ましい。上記の配列同一性は、上述の通り、Ｃｌｕｓｔａｌなどを使って評価することができる。
【００４０】
上述の特定のアミノ酸置換変異が導入されたアミノ酸配列に対して、更に（ｉ）〜（ｊ）の少なくとも１つ以上のアミノ酸置換変異を導入したアミノ酸配列を有するＶＬ−κ結合性ペプチドもまた本発明に含まれる。
（ｉ）  配列番号１における第４４位のＬｙｓをＡｒｇに置換；
（ｊ）  配列番号１における第４８位のＬｙｓをＡｒｇに置換。
本変異によって、例えば特許文献１０で開示されるような、アミノ酸配列中のＬｙｓを限定して、マトリックスへの固定化のされ方を制御することが可能となる。
【００４１】
本発明に係るＶＬ−κ結合性ペプチドは、そのアルカリ性水溶液に対する化学的安定性が、置換導入前に比べて向上していることを特徴とする。
【００４２】
「アルカリ性水溶液」とは、洗浄または殺菌の目的を達成し得る程度のアルカリ性を指す。より具体的には、０．０１Ｍ以上１．０Ｍ以下または０．０１Ｎ以上１．０Ｎ以下の水酸化ナトリウム水溶液などが該当するが、これに限定されるものではない。水酸化ナトリウムを例とした場合、その濃度の下限は、０．０１Ｍが好ましく、０．０２Ｍがより好ましく、０．０５Ｍがさらにより好ましい。一方、水酸化ナトリウムの濃度の上限は、１．０Ｍが好ましく、０．５Ｍがより好ましく、０．３Ｍがさらにより好ましく、０．２Ｍがさらにより好ましく、０．１Ｍがさらにより好ましい。アルカリ性水溶液としては、水酸化ナトリウム水溶液である必要はないが、そのｐＨは１２以上１４以下が好ましい。ｐＨの下限に関し、ｐＨ１２．０以上が好ましく、ｐＨ１２．５以上がより好ましい。ｐＨの上限に関し、ｐＨ１４以下が好ましく、ｐＨ１３．５以下がさらにより好ましく、ｐＨ１３．０以下がさらにより好ましい。
【００４３】
「化学的安定性」とは、タンパク質がアミノ酸残基の化学変化などの化学修飾、および、アミド結合の転移や切断などの化学変性に対して、タンパク質の機能を保持する性質を指す。本発明においては、タンパク質の機能保持とは、ＶＬ−κへの結合活性の維持を指すものであり、すなわち、「化学的安定性」が高い程、アルカリ性水溶液への浸漬処理の後も、ＶＬ−κへの結合活性が低下する度合いが小さい。ＶＬ−κへの結合活性は、具体的には、化学変性を受けずにＶＬ−κへの親和性を保持しているポリペプチドの割合をいう。なお、本明細書中における「アルカリ耐性」という用語も、「アルカリ性条件下における化学的安定性」と同義である。
【００４４】
アルカリに浸漬する時間は、アルカリの濃度や浸漬時の温度によってペプチドの受けるダメージは大きく異なるので、特に限定はされない。例えば、水酸化ナトリウムの濃度が０．０５Ｍで、浸漬時の温度が室温の場合、アルカリに浸漬する時間の下限は、１時間が好ましく、２時間がより好ましく、４時間がより好ましく、１０時間がより好ましく、２０時間がより好ましいが、特に限定はされない。上記時間の上限も特に限定されないが、例えば５０時間とすることができる。
【００４５】
免疫グロブリンに対する親和性は、表面プラズモン共鳴原理を用いたＢｉａｃｏｒｅシステム(ＧＥヘルスケア社)や、バイオレイヤー干渉法を用いたＯｃｔｅｔ（ポール社）などのバイオセンサーによって試験することができるが、これに限定されるものではない。測定条件としては、本発明のペプチドがＶＬ−κに結合した時の結合シグナルが検出できれば良い。測定条件としては、温度は２０〜４０℃の一定温度にし、結合状態を見るときのｐＨは５以上、８以下の中性条件にすることが好ましい。緩衝液の成分としては、中性の場合には、リン酸、トリス、ビストリスなどが挙げられるが、これらに限定されない。緩衝液の塩化ナトリウム濃度は、特に限定はされないが、０〜０．１５Ｍ程度が好ましい。
【００４６】
ＶＬ−κに結合していることを示すパラメータとしては、例えば、親和定数（ＫA）や解離定数（ＫD）を用いることができる（永田他  著、「生体物質相互作用のリアルタイム解析実験法」、シュプリンガー・フェアラーク東京、１９９８年、４１頁）。本発明のタンパク質のＶＬ−κに対する親和定数は、Ｂｉａｃｏｒｅシステムを利用して、センサーチップにヒトＩｇＧを固定化して、温度２５℃、ｐＨ７．４の条件下にて、各ドメイン変異体を流路添加する実験系で求めることができる。本発明に係るタンパク質について、ヒトＶＬ−κへの親和定数（ＫA）が好ましくは１×１０5（Ｍ-1）以上、より好ましくは１×１０6（Ｍ-1）以上であるタンパク質を好適に用いることができる。しかし、親和定数は、ＶＬ−κ含有ペプチドの種類や、ＶＬ−κ結合性ペプチドのドメイン数によっても変わるので、これに限定されない。
【００４７】
ただし、アルカリ処理後の残存結合活性を求める場合には、結合パラメータとして、ＫAやＫDは不適切である。アルカリ処理によって、ＶＬ−κに結合できる分子の比率が変化しても、ペプチド１分子のＶＬ−κに対する結合能は変化しない場合には、パラメータとしては変化が見られないからである。ペプチドの残存結合活性を求める場合には、例えば、ペプチドを、センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）またはバイオセンサー（Ｏｃｔｅｔ）に固定化し、ペプチドを化学処理する前と後で、同一濃度のＶＬ−κ含有タンパク質を添加したときの、結合レスポンスの大きさを指標とするのが良い。結合レスポンスの大きさを示す単位は、Ｂｉａｃｏｒｅではレゾナンスユニット（ＲＵ）であり、Ｏｃｔｅｔではナノメートル（ｎｍ）であるが、これらに限定されるものではない。例えば、ＶＬ−κ含有タンパク質を固定化した系に対し、同じ濃度のアルカリ処理していないペプチドとアルカリ処理したペプチドを添加して、結合レスポンスの大きさを比較しても良い。
【００４８】
残存結合活性は、アルカリ処理前後の比較なので、基本的には、アルカリ処理前の結合活性を分母とし、アルカリ処理後の結合活性を分子とする、比率（パーセンテージ）で表すことができる。その数値は、同じ条件でアルカリ処理した本発明の変異が導入されていないペプチドと比較して高ければ、特に限定はされないが、その比率が５％以上であるのが好ましく、１０％以上であるのが好ましく、２０％以上であるのがより好ましく、３０％以上であるのがさらにより好ましく、４０％以上であるのがさらにより好ましく、５０％以上であるのがさらにより好ましい。上記比率の上限は、勿論１００％が好ましい。
【００４９】
この際に重要なことは、比較対照とするサンプルは、本発明の変異が含まれていないという点だけが異なり、それ以外のアミノ酸配列は同じであり、かつ、アルカリ処理および残存結合活性の測定の条件を全て一緒にすることである。また、本発明のペプチドは、アルカリ性水溶液中（アルカリ条件下）ではＶＬ−κ結合性は示さないので、アルカリ処理の後で酸による中和によってｐＨを中性にするなどの適切な処理が必要である。
【００５０】
ＰｐＬは、ＶＬ−κ結合性ドメインが４個または５個タンデムに並んだ形で含んだタンパク質である。したがって、本発明に係るＶＬ−κ結合性ペプチドも、実施形態の１つとして、単量体または単ドメインである当該ＶＬ−κ結合性ペプチドが２個以上、好ましくは３個以上、より好ましくは４個以上、より好ましくは５個以上連結された複数ドメインの多量体であってもよい。連結されるドメイン数の上限としては、１０個以下、好ましくは８個以下、より好ましくは６個以下である。これらの多量体は、単一のＶＬ−κ結合性ペプチドの連結体であるホモダイマー、ホモトリマー等のホモポリマーであってもよいし、複数種類のＶＬ−κ結合性ペプチドの連結体であるヘテロダイマー、ヘテロトリマー等のヘテロポリマーであってもよい。
【００５１】
本発明に係るＶＬ−κ結合性ペプチド多量体における複数ドメインの連結のされ方としては、１または複数のアミノ酸残基で連結する方法、および、アミノ酸残基を挟まず直接連結する方法が挙げられるが、これらの方法に限定されるものではない。連結するアミノ酸残基数に特に制限は無いが、好ましくは２０残基以下であり、より好ましくは１５残基以下であり、さらにより好ましくは１０残基以下であり、さらにより好ましくは５残基以下であり、さらにより好ましくは２残基以下である。これらのアミノ酸配列は、単量体タンパク質の３次元立体構造を不安定化しないものが好ましい。
【００５２】
その他、実施形態の１つとして、本発明により得られるＶＬ−κ結合性ペプチドまたはその多量体が、１つの構成成分として、機能の異なる他のペプチドと融合されていることを特徴とする融合ペプチドが挙げられる。融合ペプチドの例としては、アルブミンやグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）が融合したペプチドを例として挙げることができるが、これに限定されるものではない。また、ＤＮＡアプタマーなどの核酸、抗生物質などの薬物、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの高分子が融合されている場合も、本発明で得られたペプチドの有用性を利用するものであれば、本発明に包含される。
【００５３】
本発明は、本発明ペプチドを、免疫グロブリンやその断片、特にＶＬ−κに親和性を有することを特徴とするアフィニティリガンドとして利用することも、実施形態の１つとして包含する。同様に、当該リガンドを水不溶性担体に固定化したことを特徴とするアフィニティ分離マトリックスも、実施形態の１つとして包含する。
【００５４】
本発明に係るアフィニティ分離マトリックスは、本発明に係る上記ＶＬ−κ結合性ペプチドまたは上記ＶＬ−κ結合性ペプチド多量体が、リガンドとして水不溶性担体に固定化されたものであることを特徴とする。
【００５５】
本発明において「リガンド」とは、抗原と抗体の結合に代表される、特異的な分子間の親和力に基づいて、ある分子の集合から目的の分子を選択的に捕集または結合する物質や官能基を指す用語であり、本発明においては、ＶＬ−κに対して特異的に結合するペプチドを指す。本発明においては、単に「リガンド」と表記した場合も、「アフィニティリガンド」と同意である。
【００５６】
本発明において「アフィニティリガンド」とは、抗原と抗体の結合に代表される、特異的な分子間の親和力に基づいて、ある分子の集合から目的の分子を選択的に捕集または結合する物質や官能基を指す用語であり、本発明においては、ＶＬ−κに対して特異的に結合するペプチドを指す。本発明においては、単に「リガンド」と表記した場合も、「アフィニティリガンド」と同意である。
【００５７】
本発明に用いる水不溶性担体としては、無機担体、有機担体、さらにはこれらの組み合わせによって得られる有機担体−有機担体、有機担体−無機担体などの複合担体などが挙げられる。無機担体の材料としては、ガラスビーズ、シリカゲルなどが挙げられる。有機担体の材料としては合成高分子や多糖類などが挙げられ、合成高分子としては架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどが挙げられ、多糖類としては結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストランなどが挙げられる。市販品としては、多孔質セルロースゲルであるＧＣＬ２０００、アリルデキストランとメチレンビスアクリルアミドを共有結合で架橋したＳｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）  Ｓ−１０００、アクリレート系の担体であるＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）、アガロース系の架橋担体であるＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）  ＣＬ４Ｂ、および、セルロース系の架橋担体であるＣｅｌｌｕｆｉｎｅ（登録商標）などを例示することができる。但し、本発明における水不溶性担体は、例示したこれらの担体のみに限定されるものではない。
【００５８】
また、本発明に用いる水不溶性担体は、本アフィニティ分離マトリックスの使用目的および方法からみて、表面積が大きいことが望ましく、適当な大きさの細孔を多数有する多孔質であることが好ましい。担体の形態としては、ビーズ状、モノリス状、繊維状、膜状（中空糸を含む）などいずれも可能であり、任意の形態を選ぶことができる。
【００５９】
上記リガンドは、直接またはリンカー基を介して、共有結合により上記水不溶性担体に固定化されている。当該リンカー基としては、例えば、Ｃ1-6アルキレン基、アミノ基（−ＮＨ−）、エーテル基（−Ｏ−）、カルボニル基（−Ｃ（＝Ｏ）−）、エステル基（−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−または−ＯＣ（＝Ｏ）−）、アミド基（−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−または−ＮＨＣ（＝Ｏ）−）、ウレア基（−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−）；Ｃ1-6アルキレン基、アミノ基、エーテル基、カルボニル基、エステル基、アミド基およびウレア基からなる群より選択される２以上１０以下の基が連結された基；アミノ基、エーテル基、カルボニル基、エステル基、アミド基およびウレア基からなる群より選択される基を一端または両端に有するＣ1-6アルキレン基を挙げることができる。上記の連結数としては、８以下または６以下が好ましく、５以下がより好ましく、４以下がさらに好ましい。また、上記Ｃ1-6アルキレン基は、水酸基などの置換基などにより置換されていてもよい。
【００６０】
本発明に係るアフィニティ分離マトリックスは、上記リガンドを上記水不溶性担体に固定化することにより製造することができる。
【００６１】
リガンドの固定化方法については、例えば、リガンドに存在するアミノ基、カルボキシ基またはチオール基を利用した、従来のカップリング法で担体に結合してよい。カップリング法としては、臭化シアン、エピクロロヒドリン、ジグリシジルエーテル、トシルクロライド、トレシルクロライド、ヒドラジンまたは過ヨウ素酸ナトリウムなどと担体とを反応させて担体を活性化するか、或いは担体表面に反応性官能基を導入し、リガンドとして固定化する化合物とカップリング反応を行い固定化する方法、また、担体とリガンドとして固定化する化合物が存在する系にカルボジイミドのような縮合試薬、または、グルタルアルデヒドのように分子中に複数の官能基を持つ試薬を加えて縮合、架橋することによる固定化方法が挙げられる。
【００６２】
また、リガンドと担体の間に複数の原子からなるスペーサー分子を導入してもよいし、担体にリガンドを直接固定化してもよい。従って、固定化のために、本発明に係るＶＬ−κ結合性ペプチドを化学修飾してもよいし、固定化に有用なアミノ酸残基を加えてもよい。固定化に有用なアミノ酸としては、側鎖に固定化の化学反応に有用な官能基を有しているアミノ酸が挙げられ、例えば、側鎖にアミノ基を含むＬｙｓや、側鎖にチオール基を含むＣｙｓが挙げられる。本発明の本質は、本発明においてペプチドに付与したＶＬ−κ結合性が、当該ペプチドをリガンドとして固定化したマトリックスにおいても同様に付与されることにあり、固定化のためにいかように修飾・改変しても、本発明の範囲に含まれる。
【００６３】
本発明のアフィニティ分離マトリックスを利用して、免疫グロブリンのκ鎖可変領域を含むタンパク質（ＶＬ−κ含有タンパク質）をアフィニティカラム・クロマトグラフィ精製法により分離精製することが可能となる。これらのＶＬ−κ含有タンパク質の精製法は、免疫グロブリンのアフィニティカラム・クロマトグラフィ精製法、例えばＳｐＡアフィニティ分離マトリックスを利用した精製法に準じる手順により達成することができる（非特許文献１）。
【００６４】
即ち、ＶＬ−κ含有タンパク質の溶液を調製（ｐＨは中性付近）した後、当該溶液を本発明のアフィニティ分離マトリックスを充填したアフィニティカラムに通過させ、ＶＬ−κ含有タンパク質を吸着させる。次いで、アフィニティカラムに純粋な緩衝液を適量通過させ、カラム内部を洗浄する。この時点では所望のＶＬ−κ含有タンパク質はカラム内の本発明に係るアフィニティ分離マトリックスに吸着されている。そして、本発明で得られたペプチドをリガンドとして固定化したアフィニティ分離マトリックスは、このサンプル添加の工程からマトリックス洗浄の工程において、目的とするＶＬ−κ含有タンパク質を吸着保持する性能に優れる。次いで、適切なｐＨに調整した酸性緩衝液をカラムに通液し、所望のＶＬ−κ含有タンパク質を溶出することにより、高純度な精製が達成される。ペプチドを溶出するために用いられる上記酸性緩衝液には、マトリックスからの解離を促進する物質を添加してもよい。
【００６５】
本発明のアフィニティ分離マトリックスは、リガンド化合物や担体の基材が完全に機能を損なわない程度の、適当な強酸性、または、強アルカリ性の純粋な緩衝液を通過させて洗浄することにより、再利用が可能である。上記の再生用緩衝液には、適当な変性剤や有機溶剤を配合してもよい。本発明のアフィニティ分離マトリックスは、アルカリ性水溶液に対する化学的安定性に優れるので、強アルカリの純粋な緩衝液を通過させて洗浄することで再利用することが好ましい。しかし、強アルカリの純粋な緩衝液で再生する操作をするタイミングは、使用後に毎回である必要は無く、例えば、５回に１回、１０回に１回でも構わない。
【００６６】
本発明は、上記改変型ＶＬ−κ結合性ペプチドをコードするＤＮＡにも関する。かかるＤＮＡの塩基配列は、例えば、上記ペプチドのアミノ酸配列を逆翻訳することにより決定することができる。本発明ペプチドをコードするＤＮＡは、その塩基配列を翻訳したアミノ酸配列が、当該ペプチドを構成するものであればいずれでもよい。そのような塩基配列は、通常用いられる公知の方法、例えば、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（以下、「ＰＣＲ」と略記する）法を利用して取得できる。また、公知の化学合成法で合成することも可能であり、さらに、ＤＮＡライブラリーから得ることもできる。当該塩基配列は、コドンが縮重コドンで置換されていてもよく、翻訳されたときに同一のアミノ酸をコードしている限り、本来の塩基配列と同一である必要性は無い。当該塩基配列を一つ又はそれ以上有する組換えＤＮＡ、または、当該組換えＤＮＡを含む、プラスミドおよびファージなどのベクター、さらには、当該ＤＮＡを有するベクターにより形質転換された形質転換微生物／細胞、または、当該ＤＮＡを導入した遺伝子改変生物、または、当該ＤＮＡを転写の鋳型ＤＮＡとする無細胞タンパク質合成系を得ることができる。
【００６７】
また、本発明に係るＶＬ−κ結合性ペプチドは、タンパク質発現を補助する作用または精製を容易にするという利点がある公知のタンパク質との融合ペプチドとして取得することができる。即ち、本発明に係るＶＬ−κ結合性ペプチドを含む融合ペプチドをコードする組換えＤＮＡを少なくとも一つ含有する微生物、または、細胞を得ることができる。上記タンパク質の例としては、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）等が挙げられるが、それらのタンパク質に限定されるものではない。
【００６８】
本発明のペプチドをコードするＤＮＡを改変するための部位特異的な変異の導入は、以下のように、組換えＤＮＡ技術、ＰＣＲ法等を用いて行うことができる。
【００６９】
即ち、組換えＤＮＡ技術による変異の導入は、例えば、本発明ペプチドをコードする遺伝子中において、変異導入を希望する目的の部位の両側に適当な制限酵素認識配列が存在する場合に、それら制限酵素認識配列部分を前記制限酵素で切断し、変異導入を希望する部位を含む領域を除去した後、化学合成等によって目的の部位のみに変異導入したＤＮＡ断片を挿入するカセット変異法によって行うことができる。
【００７０】
また、ＰＣＲによる部位特異的変異の導入は、例えば、本発明ペプチドをコードする二本鎖プラスミドを鋳型として、＋鎖および−鎖に相補的な変異を含む２種の合成オリゴプライマーを用いてＰＣＲを行うダブルプライマー法により行うことができる。
【００７１】
また、本発明の単量体ペプチド（１つのドメイン）をコードするＤＮＡを、意図する数だけ直列に連結することにより、多量体ペプチドをコードするＤＮＡを作製することもできる。例えば、多量体ペプチドをコードするＤＮＡの連結方法として、ＤＮＡ配列に適当な制限酵素部位を導入し、制限酵素で断片化した２本鎖ＤＮＡをＤＮＡリガーゼで連結することができる。制限酵素部位は１種類でもよいが、複数の異なる種類の制限酵素部位を導入することもできる。また、多量体ペプチドをコードするＤＮＡにおいて、各々の単量体ペプチドをコードする塩基配列が同一の場合には、宿主にて相同組み換えを誘発する可能性があるので、連結されている単量体ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列間の配列同一性が９０％以下、好ましくは８５％以下、より好ましくは８０％以下、さらにより好ましくは７５％以下であることが好ましい。なお、塩基配列の同一性も、アミノ酸配列と同様に、常法により決定することが可能である。
【００７２】
本発明の「発現ベクター」は、前述した本発明ペプチドまたはその部分アミノ酸配列をコードする塩基配列、およびその塩基配列に作動可能に連結された宿主で機能しうるプロモーターを含む。通常は、本発明ペプチドをコードする遺伝子を、適当なベクターに連結もしくは挿入することにより得ることができ、遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で自律複製可能なものであれば特に限定されず、プラスミドＤＮＡやファージＤＮＡをベクターとして用いることができる。例えば、大腸菌を宿主として用いる場合には、ｐＱＥ系ベクター（キアゲン社）、ｐＥＴ系ベクター（メルク社）およびｐＧＥＸ系ベクター（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）のベクターなどが挙げられる。
【００７３】
本発明の形質転換細胞は、宿主となる細胞へ本発明の組換えベクターを導入することにより得ることができる。宿主への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、アグロバクテリウム感染法、パーティクルガン法およびポリエチレングリコール法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、得られた遺伝子の機能を宿主で発現する方法としては、本発明で得られた遺伝子をゲノム（染色体）に組み込む方法なども挙げられる。宿主となる細胞については、特に限定されるものではないが、安価に大量生産する上では、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）等のバクテリア（真正細菌）を好適に使用しうる。
【００７４】
本発明に係るＶＬ−κ結合性ペプチドは、前記した形質転換細胞を培地で培養し、培養菌体中（菌体ぺリプラズム領域中も含む）、または、培養液中（菌体外）に本発明に係るペプチドを生成蓄積させ、該培養物から所望のペプチドを採取することにより製造することができる。また、本発明ペプチドは、前記した形質転換細胞を培地で培養し、培養菌体中（菌体ぺリプラズム領域中も含む）、または、培養液中（菌体外）に、本発明ペプチドを含む融合ペプチドを生成蓄積させ、当該培養物から当該融合ペプチドを採取し、当該融合ペプチドを適切なプロテアーゼによって切断し、所望のペプチドを採取することにより製造することができる。
【００７５】
本発明の形質転換細胞を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。得られた形質転換体の培養に用いる培地は、本発明ペプチドを高効率、高収量で生産できるものであれば特に制限は無い。具体的には、グルコース、蔗糖、グリセロール、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸などの炭素源や窒素源を使用することができる。その他、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩等の無機塩類が必要に応じて添加される。栄養要求性の宿主細胞を用いる場合は、生育に要求される栄養物質を添加すればよい。また、必要であればペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシンなどの抗生物質が添加されてもよい。
【００７６】
さらに、菌体内外に存在する宿主由来のプロテアーゼによる当該目的ペプチドの分解を抑えるために、公知の各種プロテアーゼ阻害剤、すなわち、Ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）、Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ、４−（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）−ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＡＥＢＳＦ）、Ａｎｔｉｐａｉｎ、Ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ、Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ  Ａ、Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｏｎ、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（ＥＤＴＡ）および／またはその他市販されているプロテアーゼ阻害剤を適当な濃度で添加してもよい。
【００７７】
さらに、本発明に係るＶＬ−κ結合性ペプチドを正しくフォールディングさせるために、例えば、ＧｒｏＥＬ／ＥＳ、Ｈｓｐ７０／ＤｎａＫ、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１０４／ＣｌｐＢなどの分子シャペロンを利用してもよい。かかる分子シャペロンは、例えば、共発現、または、融合タンパク質化などの手法で、本発明のペプチドと共存させる。なお、本発明ペプチドの正しいフォールディングを目的とする場合には、正しいフォールディングを助長する添加剤を培地中に加える、および、低温にて培養するなどの手法もあるが、これらに限定されるものではない。
【００７８】
大腸菌を宿主として得られた形質転換細胞を培養する培地としては、ＬＢ培地（トリプトン１％，酵母エキス０．５％，ＮａＣｌ１％）、または、２×ＹＴ培地（トリプトン  １．６％，酵母エキス１．０％，ＮａＣｌ０．５％）等が挙げられる。
【００７９】
また、培養温度は、１５〜４２℃、好ましくは２０〜３７℃で、通気攪拌条件で好気的に数時間〜数日培養することにより本発明ペプチドを、培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）、または、培養溶液（細胞外）に蓄積させて回収する。場合によっては、通気を遮断し嫌気的に培養してもよい。組換えペプチドが分泌生産される場合には、培養終了後に、遠心分離、ろ過などの一般的な分離方法で、培養細胞と分泌生産されたペプチドを含む上清を分離することにより生産された組換えペプチドを回収することができる。また、培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）に蓄積される場合にも、例えば、培養液から遠心分離、ろ過などの方法により菌体を採取し、次いで、この菌体を超音波破砕法、フレンチプレス法などにより破砕し、および／または、界面活性剤等を添加して可溶化することにより、細胞内に蓄積生産されたペプチドを回収することができる。
【００８０】
本発明に係るペプチドの精製はアフィニティクロマトグラフィ、陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ等を単独で、または、適宜組み合わせることによって行うことができる。得られた精製物質が目的のペプチドであることの確認は、通常の方法、例えばＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、Ｎ末端アミノ酸配列分析、ウエスタンブロッティング等により行うことができる。
【００８１】
本願は、２０１８年３月２９日に出願された日本国特許出願第２０１８−６４８９０号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１８年３月２９日に出願された日本国特許出願第２０１８−６４８９０号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
【実施例】
【００８２】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００８３】
以下の実施例で取得した変異ペプチドは「ペプチド名−導入した変異」の形で表記し、変位を導入しない野生型ペプチドは「ペプチド名−Ｗｉｌｄ」の形で表記する。例えば、配列番号３で示される野生型ＰｐＬ３１２のＢ５ドメインは「ＬＢ５−Ｗｉｌｄ」で示す。また、本実施例においては、配列番号１で示されるＰｐＬ３１２のＢ５ドメインを実験でメインに利用した。配列番号１のアミノ酸配列は、配列番号３のアミノ酸配列のＮ末端において二次構造を形成しない７残基を欠失させ、且つＴ２１Ｈの変異を導入したものである。配列番号１で示されるＰｐＬ３１２のＢ５ドメインを配列番号３のＢ５ドメインと区別するため、「ＬＢ５ｍ−Ｔ２１Ｈ」と表記する。複数の変異を同時に導入した変異体の表記については、スラッシュを用いて併記する。例えば、変異Ｔ２１ＨおよびＫ２５Ｒを導入した場合は、「ＬＢ５ｍ−Ｔ２１Ｈ／Ｋ２５Ｒ」と表記する。また、ドメイン数に関しては、ピリオドに続けて連結した数に「ｄ」をつけて併記する。単ドメインからなる変異体の場合には、「ＬＢ５ｍ−Ｔ２１Ｈ．１ｄ」と表記する。ただし、本明細書では、基本的にはＬＢ５ｍ−Ｔ２１Ｈが変異前の配列であり、かつ、ドメイン数も１なので、単にＴ２１Ｈ以外の変異のみを記載する場合がある。例えば表１では、ＬＢ５ｍ−Ｔ２１Ｈ／Ｋ２５Ｒ．１ｄの変異体ペプチドを単にＫ２５Ｒと表記している。【００８４】
実施例１：  各種改変型ＶＬ−κ結合性ペプチドの調製
（１）発現プラスミド調製
ＬＢ５ｍ−Ｔ２１Ｈ．１ｄ（配列番号１）のアミノ酸配列から逆翻訳を行い、当該ペプチドをコードする塩基配列（配列番号６）を設計し、本コードＤＮＡを全合成してベクターに挿入したプラスミドｐＥＸ−ＬＢ５ｍを購入した（ユーロフィンジェノミクス社）。次に表１に示すオリゴＤＮＡをプライマーとして用いるＰＣＲ反応を行い、各種変異体の発現プラスミドを調製した。まず、Ｂｌｅｎｄ  Ｔａｑ  −Ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、表１の５’−ｐｒｉｍｅｒ（Ｂ）と３’−ｐｒｉｍｅｒの２種をプライマーとし、ｐＥＸ−ＬＢ５ｍを鋳型プラスミドとして、添付のプロトコルに従いＰＣＲ反応を行った。次に、表１の５’−ｐｒｉｍｅｒ（Ａ）と３’−ｐｒｉｍｅｒの２種をプライマーとし、先のＰＣＲ反応によって生成した二本鎖ＤＮＡを鋳型として含む反応液を用い、同様のＰＣＲ反応を行った。なお、表１のＬＢ５ｍ−Ｋ０３Ｒ．１ｄの場合のみ、最初のＰＣＲ反応は省略し、表１の５’−ｐｒｉｍｅｒ（Ａ）と３’−ｐｒｉｍｅｒの２種をプライマーとし、ｐＥＸ−ＬＢ５ｍを鋳型としたＰＣＲ反応を行った。【００８５】
【表１】
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【００８６】
合成・抽出した二本鎖ＤＮＡを、制限酵素ＳｐｅＩとＸｈｏＩ（いずれもタカラバイオ社）により切断した。次に、プラスミドベクターｐＥＴ−４９ｂ（＋）（メルクミリポア社）のマルチクローニングサイト中のＳｐｅＩ／ＸｈｏＩサイトに制限酵素処理した二本鎖ＤＮＡをサブクローニングした。サブクローニングにおけるライゲーション反応は、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、製品に添付のプロトコルに準ずる形で実施した。【００８７】
上記ライゲーション反応液を用いて、コンピテント細胞ＤＨ５α（タカラバイオ社）の形質転換を、本コンピテント細胞製品に付属のプロトコルに従って行った。次いで、プラスミド精製キット（プロメガ社製「Ｗｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ」）を用い、キット付属の標準プロトコルに従って、形質転換した細胞を培養し、プラスミドＤＮＡを増幅し、抽出した。発現プラスミドのコードＤＮＡの塩基配列確認は、ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製「３１３０ｘｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ」）を用いて行った。遺伝子解析キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製「ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ．１．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ」）と、シークエンシング用ＤＮＡプライマー（配列番号４５）を用いて、添付のプロトコルに従いシークエンシングＰＣＲ反応を行った。そのシークエンシング産物を、プラスミド精製キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製「ＢｉｇＤｙｅ  ＸＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」）を用いて、添付のプロトコルに従い精製し、塩基配列解析に用いた。コードＤＮＡの塩基配列を確認した発現プラスミドを用いて、コンピテント細胞ＢＬ２１（ＤＥ３）（バイオダイナミクス社）の形質転換を行い、各種改変型ＶＬ−κ結合性ペプチドの発現用形質転換細胞を調製した。【００８８】
（２）タンパク質の発現と精製
上記（１）で得られた各種形質転換細胞を、カナマイシンを３０μｇ／ｍＬの濃度で含有するオート・インダクション培地Ｍａｇｉｃ  Ｍｅｄｉａ（ライフテクノロジーズ社）を用いて、３０℃で２４時間培養した。培養終了後、遠心にて集菌し、ＰＢＳ緩衝液に再懸濁した。超音波破砕にて細胞を破砕し、遠心分離して上清画分（無細胞抽出液）と不溶性画分に分画した。ｐＥＴ−４９ｂ（＋）ベクターのマルチクローニングサイトに目的の遺伝子を導入すると、ＧＳＴがＮ末端に付与した融合ペプチドとして発現される。【００８９】
ＧＳＴ融合ペプチドを含む各々の無細胞抽出液から、ＧＳＴに対して親和性のあるＧＳＴｒａｐ  ＨＰカラム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いたアフィニティクロマトグラフィにて、ＧＳＴ融合ペプチドを粗精製した。具体的には、各々の無細胞抽出液をＧＳＴｒａｐ  ＨＰカラムに添加し、標準緩衝液（２０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）にてカラムを洗浄し、続いて溶出用緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２０ｍＭグルタチオン，ｐＨ８．０）にて目的のＧＳＴ融合ペプチドを溶出した。【００９０】
表１の５’−ｐｒｉｍｅｒ（Ａ）を用いてサブクローニングすると、目的のペプチド配列のＮ末端とＧＳＴとの間に、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇというアミノ酸配列が付加される。このアミノ酸配列は、配列特異的プロテアーゼＦａｃｔｏｒ  Ｘａ（メルクミリポア社）の認識配列であり、このプロテアーゼを作用させるとＡｒｇの後ろで切断されるため、ＧＳＴを含むＮ末端側のベクター由来配列を切断して除去することが可能である。ＧＳＴ融合ペプチド含有溶出液をＦａｃｔｏｒ  Ｘａ消化用緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ2、ｐＨ８．０）にて透析し、添付プロトコルに従い酵素反応を行った。【００９１】
本反応液から、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００  ＧＬカラム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いたゲルろ過クロマトグラフィにて、目的のペプチドを精製した。具体的には、標準緩衝液にて平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００  ＧＬカラムに、各々の反応溶液を添加し、目的のペプチドを、切断したＧＳＴ含有ベクター由来配列やＦａｃｔｏｒ  Ｘａから分離精製した。なお、以上のカラムを用いたクロマトグラフィによるペプチド精製は、全てＡＫＴＡｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓシステム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を利用して実施した。【００９２】
比較例１：  変異導入前のペプチド（ＬＢ５ｍ−Ｔ２１Ｈ．１ｄ）の取得・評価
ｐＥＸ−ＬＢ５ｍを鋳型とし、配列番号８の５’−ｐｒｉｍｅｒ（Ａ）と配列番号１９の３’−ｐｒｉｍｅｒをプライマーとし、実施例１に記載のＰＣＲ反応を行い、その後は実施例１に記載の流れに沿って、配列番号１に示す変異導入前のペプチドＬＢ５ｍ−Ｔ２１Ｈ．１ｄを調製した。【００９３】
実施例２：  各種改変型ＶＬ−κ結合性ペプチドのＩｇＧ結合レスポンスを指標としたアルカリ処理後の残存結合活性評価
バイオレイヤー干渉法を用いて分子間相互作用を解析する装置Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ  ３８４システム（ポール・フォルテバイオ社）を用いて、各種ペプチドをバイオセンサーに固定化し、それらのバイオセンサーを一定時間アルカリ溶液に浸漬した前後での、同一濃度のＩｇＧに対する結合レスポンスの比から、アルカリ処理後の残存結合活性を評価した。【００９４】
バイオセンサーとして、ペプチドのアミノ基を介して、ペプチドをセンサーに共有結合で固定化できるＡＲ２Ｇバイオセンサーを用いた。実施例１および比較例１で精製した各種精製ペプチド溶液を、ＵＶ吸光度を基に１０μＭに濃度調整し、１０ｍＭ  ＡｃＯＨ−ＡｃＯＮａ、ｐＨ４．５に透析した。各種ペプチドを、バイオセンサー標準のプロトコル（ＴＥＣＨＮＩＣＡＬ  ＮＯＴＥ  ２６）に従って固定化した。標準緩衝液（２０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）を測定用緩衝液とし、軽鎖がκ鎖からなる抗ＩｇＥモノクローナルＩｇＧ製剤（一般名：オマリズマブ，製品名：ゾレア，以後ａＩｇＥ−ＩｇＧと略す）を標準緩衝液で１０μＭに濃度調整した。標準緩衝液でベースラインを取り、その後、１０００ｒｐｍの条件でａＩｇＥ−ＩｇＧと２分間接触させ、結合レスポンス（付属の解析ソフトでＲｅｓｐｏｎｓｅとして算出）を求め、これをアルカリ処理前の結合レスポンスとした。各種ペプチドを固定化したセンサーについて、測定ごとに再生用酸性緩衝液（５０ｍＭ  ＡｃＯＨ−ＡｃＯＮａ，ｐＨ３．０）で再生し、それぞれのセンサーについて３サイクル（Ｎ＝３）で測定した。そして、上記測定後のセンサーを２０ｍＭ  ＮａＯＨに室温下で８時間浸漬し、その後標準緩衝液に浸漬した。そして、同様の流れでａＩｇＥ−ＩｇＧに対する結合レスポンスを求めた。そして、アルカリ処理後の残存結合活性を、アルカリ処理後の結合レスポンス値をアルカリ処理前の結合レスポンスで除算した値とした。各サイクルごと（１番目、２番目、３番目）で分けて、それぞれ残存活性を求め、計Ｎ＝３の残存活性の平均値を各ペプチドの残存活性値とした。【００９５】
各々のペプチドの残存活性値をプロットしたグラフを図１に示す。なお、比較例１で得られたペプチドを、変異導入前の対照用ペプチドという意味で、Ｃｏｎｔ．と表記する。測定は２回に分けて２セットで別の日に行っており、グラフもスペースで２つに分割し、それぞれのセットで比較例（ＬＢ５ｍ−Ｔ３６Ｈ．１ｄ，Ｃｏｎｔ．）の残存活性値を左端に示した。２セットでＣｏｎｔ．の値が違うのは、室温下でアルカリ処理したため、実施した日によって違いが出たと考えられるが、同一セット内では同一の処理条件になっていることは担保されている。全てのペプチドがａＩｇＥ−ＩｇＧへの結合活性を示し、かつ、アルカリ処理後の残存活性値が変異導入前のペプチドよりも有意に高い値（アルカリ耐性）を示すことが分かった。Ｋ０３Ｒ/Ｋ０９Ｒ/Ｔ１８Ｒ/Ｋ２５Ｒなど、複数の変異を導入したペプチドも高いアルカリ耐性を示し、かつ、変異を単独で導入した場合よりもアルカリ耐性が高い傾向を示した。また、４４位や４８位に変異を導入しても、高いアルカリ耐性は維持されることも分かった。【００９６】
特許文献１５には、ＰｐＬ３１２のＢ１〜Ｂ５、および、ＰｐＬ３３１６のＣ１〜Ｃ４の間で保存されているＬｙｓ残基（例えば、配列番号１の第２５位のＬｙｓ）を変異した例が示されているが、同文献では、当該変異の効果が見られたのはＣ１〜Ｃ４のみであって、Ｂ１〜Ｂ５では変異の効果が無かったと明記されている。そのような知見がある中で、変異の効果が見い出せる配列を特定し、さらに、似たような部位に対して適切な置換アミノ酸の種類も特定したことは、容易に着想・想定できないと考えられ、本発明が単なる最適化に止まらない重要な発見であることの証左と言える。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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