(57)【要約】短鎖アルデヒドを含むウルトラファインバブル水を用いて植物の免疫を誘導する方法を提供する。本開示の植物の免疫誘導方法は、短鎖アルデヒドと、油性物質とを含むウルトラファインバブル水に植物を暴露することを備える。ウルトラファインバブル水において、ウルトラファインバブルが水中に分散している。油性物質の働きによってウルトラファインバブル水におけるウルトラファインバブルの寿命が長くなりやすい。このため、植物の周辺に短鎖アルデヒドを安定的に存在させることができ、植物の免疫が誘導されやすい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
短鎖アルデヒドと、油性物質とを含むウルトラファインバブル水に植物を暴露することを備えた、
植物の免疫誘導方法。
【請求項２】
前記短鎖アルデヒドは、（Ｅ）−２−ヘキセナール及び（Ｚ）−３−ヘキセナールから選ばれる少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記油性物質は、天然由来である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記油性物質は、スクワレンを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記油性物質は、オレイン酸を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記ウルトラファインバブル水における前記短鎖アルデヒドの濃度は、１μｍｏｌ／リットル以上１０００μｍｏｌ／リットル以下である、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記植物の少なくとも一部を、前記ウルトラファインバブル水に浸す、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記植物の根を、前記ウルトラファインバブル水に浸す、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ウルトラファインバブル水と、
前記ウルトラファインバブル水に含まれる短鎖アルデヒドと、
前記ウルトラファインバブル水に含まれる油性物質と、を備えた、
植物用免疫誘導剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、植物の免疫誘導方法及び植物用免疫誘導剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、植物の生育を助けるための方法又は植物に付加価値を付与するための方法が提案されている。【０００３】
例えば、特許文献１には、所定の植物用抵抗性誘導剤に植物を曝露する植物の抵抗性誘導方法が記載されている。植物用抵抗性誘導剤は、植物が外的刺激を受けたときに合成され、その外的刺激に関する情報伝達を担う植物由来情報伝達物質を含む。植物由来情報伝達物質は、例えば、短鎖アルデヒド、イソプレノイド、又は植物ホルモンである。直接噴霧、対象植物の近隣への設置、又はビニルハウス若しくは温室における空調の利用等の方法によって植物が植物用抵抗性誘導剤に曝露されている。【０００４】
特許文献２には、所定の物質を含むウルトラファインバブル液を植物に吸収させる植物処理方法が記載されている。所定の物質は、山椒、和山椒、トリュフ、柚子、レモン水、及びブラックペッパー等の香り物質である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−４１７８２号公報
【特許文献２】特開２０１４−１７１４６３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１及び２には、短鎖アルデヒドを含むウルトラファインバブル水を用いて植物の免疫を誘導することは記載されていない。そこで、本開示は、短鎖アルデヒドを含むウルトラファインバブル水を用いて植物の免疫を誘導する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、
短鎖アルデヒドと、油性物質とを含むウルトラファインバブル水に植物を暴露することを備えた、
植物の免疫誘導方法を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
上記の方法によれば、短鎖アルデヒドを含むウルトラファインバブル水を用いて植物の免疫を誘導できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、実施例及び比較例に係るサンプルにおけるSIPR1遺伝子の発現量を示すグラフである。
【図２】図２は、実施例及び比較例に係るサンプルにおけるTPP3遺伝子の発現量を示すグラフである。
【図３】図３は、実施例及び比較例に係るサンプルにおけるNP24遺伝子の発現量を示すグラフである。
【図４】図４は、実施例及び比較例に係るサンプルにおけるSIOSM遺伝子の発現量を示すグラフである。
【図５】図５は、実施例及び比較例に係るサンプルにおけるSITSRF1遺伝子の発現量を示すグラフである。
【図６】図６は、実施例及び比較例に係るサンプルにおけるPR5L遺伝子の発現量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（本開示の基礎となった知見）
例えば、食害を被った植物は、所定の情報伝達物質を放出する。周辺の植物が、この情報伝達物質を受容するとその植物の免疫が誘導される。このように、植物が所定の物質を用いて情報伝達を行う仕組みは、植物間コミュニケーションと呼ばれている。この仕組みを応用して、短鎖アルデヒド等の情報伝達物質に植物を暴露すれば、植物の免疫を誘導できると考えられる。例えば、特許文献１に記載の方法によれば、短鎖アルデヒド等の植物由来情報伝達物質に植物が曝露されている。一方、本発明者らは、ウルトラファインバブル水を用いて植物の周辺に短鎖アルデヒドを安定的に存在させることができる技術を開発すべく多大な試行錯誤を重ねた。その結果、本発明者らは、ウルトラファインバブル水に短鎖アルデヒドとともに油性物質を含ませることによって、植物の周辺に短鎖アルデヒドが安定的に存在し、植物の免疫が誘導されやすいことを新たに見出した。本発明者らは、この新たな知見に基づいて本開示の方法を案出した。
【００１１】
（本開示に係る態様の概要）
本開示の第１態様に係る植物の免疫誘導方法は、短鎖アルデヒドと、油性物質とを含むウルトラファインバブル水に植物を暴露することを備える。
【００１２】
第１態様によれば、油性物質の働きによってウルトラファインバブル水におけるウルトラファインバブルの寿命が長くなりやすい。このため、植物の周辺に短鎖アルデヒドを安定的に存在させることができ、植物の免疫が誘導されやすい。
【００１３】
本開示の第２態様において、第１態様に係る方法では、前記短鎖アルデヒドは、（Ｅ）−２−ヘキセナール及び（Ｚ）−３−ヘキセナールから選ばれる少なくとも１つを含んでいてもよい。第２態様によれば、より確実に植物の免疫が誘導されやすい。
【００１４】
本開示の第３態様において、第１態様又は第２態様に係る方法では、前記油性物質は、天然由来であってもよい。第３態様によれば、ウルトラファインバブル水に含まれる油性物質が天然由来であるので、ウルトラファインバブル水に含まれる油性物質に植物が触れても、植物がダメージを受けにくい。
【００１５】
本開示の第４態様において、第３態様に係る方法では、前記油性物質は、スクワレンを含んでいてもよい。第４態様によれば、スクワレンの働きにより、より確実に、植物の周辺に短鎖アルデヒドを安定的に存在させることができる。
【００１６】
本開示の第５態様において、第３態様に係る方法では、前記油性物質は、オレイン酸を含んでいてもよい。第５態様によれば、オレイン酸の働きにより、より確実に、植物の周辺に短鎖アルデヒドを安定的に存在させることができる。
【００１７】
本開示の第６態様において、第１態様から第５態様のいずれか１つの態様に係る方法では、前記ウルトラファインバブル水における前記短鎖アルデヒドの濃度は、１μｍｏｌ／リットル以上１０００μｍｏｌ／リットル以下であってもよい。第６態様によれば、植物の周辺に所望の量の短鎖アルデヒドを安定的に存在させることができる。
【００１８】
本開示の第７態様において、第１態様から第６態様のいずれか１つの態様に係る方法では、前記植物の少なくとも一部を、前記ウルトラファインバブル水に浸してもよい。第６態様によれば、植物の周辺において高い濃度で短鎖アルデヒドを安定的に存在させることができる。
【００１９】
本開示の第８態様によれば、第７態様に係る方法では、前記植物の根を、前記ウルトラファインバブル水に浸してもよい。第８態様によれば、短鎖アルデヒドが植物の根から吸収されることによって植物全体に短鎖アルデヒドが運ばれやすい。このため、植物全体において免疫が誘導されやすい。
【００２０】
本開示の第９態様に係る植物用免疫誘導剤は、ウルトラファインバブル水と、前記ウルトラファインバブル水に含まれる短鎖アルデヒドと、前記ウルトラファインバブル水に含まれる油性物質と、を備えている。植物用免疫誘導剤を用いて、第１態様に係る植物の免疫誘導方法を実施できる。
【００２１】
（実施形態）
以下、本開示の実施形態について説明する。なお、以下の実施形態は例示に過ぎず、本開示の植物の免疫誘導方法及び植物用免疫誘導剤は、以下の実施形態に限定されない。
【００２２】
本開示の植物の免疫誘導方法において、植物用免疫誘導剤が用いられる。植物用免疫誘導剤は、ウルトラファインバブル水と、短鎖アルデヒドと、油性物質とを備えている。短鎖アルデヒドは、ウルトラファインバブル水に含まれている。油性物質は、ウルトラファインバブル水に含まれている。植物用免疫誘導剤を用いて、短鎖アルデヒドと、油性物質とを含むウルトラファインバブル水に植物を暴露する。本明細書において、油性物質は、典型的には、常温（２０℃±１５℃：日本工業規格JIS Z 8703）において流動性を示し、かつ、水に不溶な物質であり、スクワレン及び脂肪酸などを含む物質である。
【００２３】
油性物質の働きによってウルトラファインバブル水におけるウルトラファインバブルの寿命が長くなりやすい。このため、植物の周辺に短鎖アルデヒドを安定的に存在させることができ、植物の免疫が誘導されやすい。
【００２４】
ウルトラファインバブル水において、ウルトラファインバブルが水中に分散している。本明細書において、「ウルトラファインバブル」は、ISO 20480-1:2017に従い、１μｍ未満の気泡径を有する気泡である。ウルトラファインバブル水における最頻気泡径は、例えば１０００ｎｍ未満であり、５００ｎｍ以下であってもよく、３００ｎｍ以下であってもよく、２００ｎｍ以下であってもよく、５０ｎｍ以上１５０ｎｍ以下でありうる。ウルトラファインバブル水におけるウルトラファインバブルの最頻気泡径は、例えば、ナノ粒子トラッキング解析法によって決定できる。
【００２５】
ウルトラファインバブル中の気体は、ウルトラファインバブルを形成できる限り特定の気体に限定されない。ウルトラファインバブル中の気体は、例えば、空気、酸素ガス、窒素ガス、炭酸ガス、オゾンガス、ネオンガス、及びアルゴンガスからなる群より選ばれる少なくとも１つである。ウルトラファインバブル中の気体は、空気、酸素ガス、又は窒素ガスであってもよい。ウルトラファインバブル中の気体は、酸素ガスであってもよい。
【００２６】
ウルトラファインバブル水における分散媒としての水は、例えば、水道水、精製水、イオン交換水、純水、超純水、脱イオン水、又は蒸留水である。
【００２７】
ウルトラファインバブル水におけるウルトラファインバブルの濃度は、植物の免疫を誘導できる限り、特定の濃度に限定されない。ウルトラファインバブル水におけるウルトラ
ファインバブルの濃度は、例えば１×１０5個／ｍＬ（ミリリットル）以上であり、１×
１０6個／ｍＬ以上であってもよく、１×１０7個／ｍＬ以上であってもよく、１×１０8
個／ｍＬ以上であってもよく、１×１０8個／ｍＬ以上１×１０9個／ｍＬ以下であってもよい。ウルトラファインバブル水におけるウルトラファインバブルの濃度は、例えば、ナノ粒子トラッキング解析法によって決定できる。
【００２８】
ウルトラファインバブル水は、例えば、気液混合せん断方式、スタティックミキサー式、ベンチュリ式、キャビテーション式、蒸気凝縮式、超音波方式、旋回流方式、加圧溶解方式、又は微細孔方式などの公知の方法によって調製できる。
【００２９】
短鎖アルデヒドは、典型的には、１０個以下の炭素原子を有する。短鎖アルデヒドは、植物の免疫を誘導できる限り特に制限されない。短鎖アルデヒドは、６個の炭素原子を有するアルデヒドを含んでいてもよい。短鎖アルデヒドは、（Ｅ）−２−ヘキセナール及び（Ｚ）−３−ヘキセナールから選ばれる少なくとも１つを含んでいてもよい。これらの短鎖アルデヒドは、植物が放つ匂いに含まれることが多く、植物の免疫を活性化しやすい。
【００３０】
ウルトラファインバブル水における短鎖アルデヒドの濃度は、植物の免疫を誘導できる限り特定の濃度に制限されない。ウルトラファインバブル水における短鎖アルデヒドの濃度は、例えば１μｍｏｌ／Ｌ以上１０００μｍｏｌ／Ｌ以下である。これにより、植物の免疫が誘導されやすい。
【００３１】
ウルトラファインバブル水に含まれる油性物質は、例えば、天然由来である。油性物質は、動物又は植物から抽出又は精製されたものでありうる。この場合、ウルトラファインバブル水に含まれる油性物質に植物が触れても、植物がダメージを受けにくい。
【００３２】
油性物質としての脂肪酸は、例えば、５以上１２以下の炭素原子を有する飽和脂肪酸、又は、１２以上の炭素原子を有する不飽和脂肪酸である。油性物質は、１２以上の炭素原子を有していてもよい。油性物質としての脂肪酸は、オレイン酸、オクタン酸、ノナン酸、パルミトレイン酸、リノール酸、α−リノレン酸、及びアラキドン酸からなる群より選択される少なくとも１つでありうる。油性物質としての脂肪酸は、オレイン酸を含んでいてもよい。油性物質は、スクワレンを含んでいてもよい。これらの油性物質は、ウルトラファインバブルに吸着し、ウルトラファインバブル水中にて凝集することなく安定して分散できる。これにより、ウルトラファインバブル水におけるウルトラファインバブルの濃度を高く保つことができる。加えて、ウルトラファインバブルの長寿命化が可能になる。
【００３３】
ウルトラファインバブル水に含まれる油性物質の濃度は、植物の免疫を誘導できる限り特定の濃度に制限されない。ウルトラファインバブル水における油性物質の濃度は、例えば、質量基準で１×１０-3ｐｐｍ（parts per million）以上である。これにより、ウル
トラファインバブル水におけるウルトラファインバブルの濃度が高く保たれやすい。ウルトラファインバブル水における油性物質の濃度は、例えば、５０ｐｐｍ以下である。
【００３４】
ウルトラファインバブル水に植物を暴露する方法は、植物の免疫を誘導できる限り、特定の方法に限定されない。例えば、植物の少なくとも一部がウルトラファインバブル水に浸される。この場合、植物がウルトラファインバブル水に浸されているときに、植物の周辺において高い濃度で短鎖アルデヒドが安定的に存在する。これにより、より確実に、植物の免疫が誘導されやすい。
【００３５】
植物の根がウルトラファインバブル水に浸されてもよい。この場合、短鎖アルデヒドが植物の根から吸収されることによって植物全体に短鎖アルデヒドが運ばれやすい。このため、植物全体において免疫が誘導されやすい。
【００３６】
ウルトラファインバブル水に浸される植物の部位は、根以外の部位であってもよい。例えば、植物の茎、枝、葉、花、又は果実がウルトラファインバブル水に浸されてもよい。
【００３７】
ウルトラファインバブル水を植物に対して散布することによってウルトラファインバブル水に植物を暴露してもよい。
【００３８】
本開示の免疫誘導方法が適用される植物は、特定の植物に限定されない。例えば、食用植物、観賞植物、飼料用植物、又は工業原料を得るために栽培される植物に本開示の免疫誘導方法を適用できる。
【実施例】
【００３９】
実施例により、本開示の植物の免疫誘導方法及び植物用免疫誘導剤をより詳細に説明する。なお、本開示の植物の免疫誘導方法及び植物用免疫誘導剤は、以下の実施例に限定されない。【００４０】
（実施例）
加圧溶解方式のマイクロバブル発生装置を用いて、（Ｅ）−２−ヘキセナール及びスクワレンが添加された水を処理して、（Ｅ）−２−ヘキセナール及びスクワレンを含むウルトラファインバブル水を調製した。２５℃及び１気圧の条件において、ナノ粒子解析システム（Nanosight社製、製品名：ＬＭ１０）を用いて、ナノ粒子トラッキング解析法に従
って、上記のウルトラファインバブル水における微細気泡の気泡径及び濃度を測定した。ナノ粒子トラッキング解析法によれば、レーザー散乱光で確認されたブラウン運動をしている微細気泡の移動速度から、ストークス・アインシュタインの式に基づいて、気泡径及びウルトラファインバブルの数（濃度）が算出される。測定の結果、上記のウルトラファインバブル水における最頻気泡径は、７０．３ｎｍであった。【００４１】
（Ｅ）−２−ヘキセナールの添加量で換算して、（Ｅ）−２−ヘキセナールの濃度が１μＭ、１０μＭ、及び１ｍＭ（ミリモーラー：１０-3ｍｏｌ／ｄｍ3）となるように上記
のウルトラファインバブル水をMilli-Ｑ水で希釈して、それぞれ、免疫誘導剤Ａ、免疫誘導剤Ｂ、及び免疫誘導剤Ｃを調製した。免疫誘導剤Ａにおけるウルトラファインバブルの濃度は、４．５×１０5個／ｍＬであった。免疫誘導剤Ａにおけるスクワレンの濃度は、
質量基準で２．９×１０-2ｐｐｍであった。【００４２】
水で湿潤したスポンジ上にマイクロトムの種子をまき、発芽まで室温暗所で静置した。発芽後は栽培養液としてハイポニカ液体肥料を用いて水耕栽培により栽培した。栽培養液はＡ剤とＢ剤を水道水で５００倍に希釈したものを使用し、２０℃の温度、明期１２時間、及び暗期１２時間の条件下で２週間栽培した。２週齢のマイクロトムの根部分を水道水ですすぎ洗浄した後、３０ｍＬの免疫誘導剤Ａ、免疫誘導剤Ｂ、又は免疫誘導剤Ｃに３時間浸漬させた。このようにして、免疫誘導剤Ａ、免疫誘導剤Ｂ、及び免疫誘導剤Ｃにマイクロトムを暴露し、それぞれ、マイクロトムのサンプルＡ、サンプルＢ、及びサンプルＣを得た。【００４３】
（比較例１）
加圧溶解方式のマイクロバブル発生装置を用いて、スクワレンが添加された水を処理して、スクワレンを含むウルトラファインバブル水を調製した。２５℃及び１気圧の条件において、ナノ粒子解析システム（Nanosight社製、製品名：ＬＭ１０）を用いて、ナノ粒
子トラッキング解析法に従って、上記のウルトラファインバブル水における微細気泡の気泡径及び濃度を測定した。上記のウルトラファインバブル水における最頻気泡径は、９８ｎｍであった。【００４４】
上記のウルトラファインバブル水をMilli-Ｑ水で希釈して、比較例１に係る浸漬液を調製した。比較例１に係る浸漬液におけるウルトラファインバブルの濃度は、２．９×１０8個／ｍＬであり、比較例１に係る浸漬液におけるスクワレンの濃度は、質量基準で５ｐ
ｐｍであった。【００４５】
免疫誘導剤Ａ、免疫誘導剤Ｂ、又は免疫誘導剤Ｃの代わりに、比較例１に係る浸漬液を用いた以外は、実施例と同様にして、比較例１に係る浸漬液にマイクロトムを暴露し、比較例１に係るマイクロトムのサンプルを得た。【００４６】
（比較例２）
免疫誘導剤Ａ、免疫誘導剤Ｂ、又は免疫誘導剤Ｃの代わりに、Milli-Ｑ水を用いた以外は、実施例と同様にして、Milli-Ｑ水にマイクロトムを暴露し、比較例２に係るマイクロトムのサンプルを得た。【００４７】
（比較例３）
スクワレンを添加せずに（Ｅ）−２−ヘキセナールのみを添加したこと以外は実施例と同様にして（Ｅ）−２−ヘキセナールを含むウルトラファインバブル水を調製しようと試みた。しかし、十分なウルトラファインバブルの濃度を有するウルトラファインバブル水を調製できなかった。【００４８】
＜遺伝子発現解析＞
マイクロトムのサンプルＡ、サンプルＢ、及びサンプルＣ並びに比較例１及び２に係るマイクロトムのサンプルのそれぞれに対し、以下の処理を行った。マイクロトムの葉を切断し、RNA extraction kit; ISOSPIN Plant RNA(ニッポンジーン社製)を用いて、total RNAを抽出した。次に、このtotal RNA からTranscriptor 1st strand cDNA synthesis kit(ロシュ・ダイアグノスティックス社製)を用いてcDNAを合成した。操作はキットプロトコルに従って実施した。このcDNAを用いて遺伝子発現解析を行った。対象とした遺伝子及び遺伝子特異的プライマー配列を表１に示す。プライマー配列は、Journal of Plant Physiology 2016 v.202 pp.107-120を参照した。一部のプライマー配列は、ＰＣＲプライマー設計ツール（Primer 3）を用いて設計した。合成したcDNAとプライマーをMaxima SYBR Green qPCR Master Mix (2X), with separate ROX vial(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)を用い、標準プロトコルにて発現解析を行った。装置はQuantStudio3 System(Applied Biosystems 社製)を用い、解析にはQuantStudio Design & Analysisソフトウェア(Applied Biosystems 社製)を用いた。EF1aを内部標準として遺伝子発現量の相対値を求めた。結果を図１から図６に示す。【００４９】
図１から図６に示す通り、それぞれ免疫誘導剤Ａ、免疫誘導剤Ｂ、及び免疫誘導剤Ｃに浸漬されたサンプルＡ、サンプルＢ、及びサンプルＣにおいて、SIPR1、TPP3、NP24、SIOSM、SITSRF1、及びPR5L遺伝子の発現亢進が確認された。このように、スクワレン及び（Ｅ）−２−ヘキセナールを含むウルトラファインバブル水に植物の根を暴露させたサンプルにおいて、６種類の感染関連遺伝子の発現亢進が確認された。このことから、スクワレンの含有によりウルトラファインバブルが長時間保たれ、（Ｅ）−２−ヘキセナールにマイクロトムを適切に暴露でき、マイクロトムの免疫活性が向上することが示唆された。【００５０】
【表１】
2019225173.tif 000002
【図１】
2019225173.tif 000003
【図２】
2019225173.tif 000004
【図３】
2019225173.tif 000005
【図４】
2019225173.tif 000006
【図５】
2019225173.tif 000007
【図６】
2019225173.tif 000008
【配列表】
2019225173000001.app
【国際調査報告】
2019225173.tif 000009
2019225173.tif 000010
2019225173.tif 000011