(57)【要約】本願発明者らは、式（Ｉ）の化合物が心筋細胞の保護効果を有することを見出した。従って、式（Ｉ）の化合物またはそのエステル、オキシド、薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含む、心筋細胞保護用の医薬組成物を提供する。当該医薬組成物は、心筋梗塞、慢性心不全、高血圧性心不全または拡張型心筋症などの、心筋細胞死を伴う心疾患の処置または予防のために、特に心筋梗塞の処置のために使用できる。
2019203176.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2019203176.tif 000010
〔式中、
Ｒａはハロ、ヒドロキシ、アルキル、ハロ置換アルキル、アリール、ハロまたはアルキル置換アリール、アルコキシ、ヒドロキシまたはカルボキシ置換アルコキシ、アリールオキシ、ハロまたはアルキル置換アリールオキシ、ＣＨＯ、Ｃ（Ｏ）−アルキル、Ｃ（Ｏ）−アリール、Ｃ（Ｏ）−アルキル−カルボキシル、Ｃ（Ｏ）−アルキレン−カルボキシエステルおよびシアノから成る群から選択され、
ｍは０〜４から選択される整数である〕
の化合物またはそのエステル、オキシド、薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含む、心筋細胞保護用の医薬組成物。
【請求項２】
心筋細胞保護が心筋細胞死の抑制を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
心筋梗塞、慢性心不全、高血圧性心不全または拡張型心筋症の処置用の、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
式（Ｉ）：
【化２】
2019203176.tif 000011
〔式中、
Ｒａはハロ、ヒドロキシ、アルキル、ハロ置換アルキル、アリール、ハロまたはアルキル置換アリール、アルコキシ、ヒドロキシまたはカルボキシ置換アルコキシ、アリールオキシ、ハロまたはアルキル置換アリールオキシ、ＣＨＯ、Ｃ（Ｏ）−アルキル、Ｃ（Ｏ）−アリール、Ｃ（Ｏ）−アルキル−カルボキシル、Ｃ（Ｏ）−アルキレン−カルボキシエステルおよびシアノから成る群から選択され、
ｍは０〜４から選択される整数である〕
の化合物またはそのエステル、オキシド、薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含む、心筋梗塞の処置用の医薬組成物。
【請求項５】
さらに慢性心不全を処置または予防するための、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
Ｒａが、それぞれ独立して、ハロ、ヒドロキシ、アルキル、ハロ置換アルキルおよびアルコキシから成る群から選択される、請求項１〜５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項７】
式（Ｉ）の化合物が、
４−アミノ−３−（６−フェニルピリジン−３−イルアゾ）ナフタレン−１−スルホン酸；
４−アミノ−３−（６−ｐ−トルイルピリジン−３−イルアゾ）ナフタレン−１−スルホン酸；
４−アミノ−３−（６−ｍ−トルイルピリジン−３−イルアゾ）ナフタレン−１−スルホン酸；
４−アミノ−３−（６−ｏ−トルイルピリジン−３−イルアゾ）ナフタレン−１−スルホン酸；
４−アミノ−３−（６−ビフェニル−２−イルピリジン−３−イルアゾ）ナフタレン−１−スルホン酸；
３−［６−（２−アセチルフェニル）ピリジン−３−イルアゾ］−４−アミノナフタレン−１−スルホン酸；
３−［６−（３−アセチルフェニル）ピリジン−３−イルアゾ］−４−アミノナフタレン−１−スルホン酸；
３−［６−（４−アセチルフェニル）ピリジン−３−イルアゾ］−４−アミノナフタレンスルホン酸；
４−アミノ−３−［６−（２,４−ジクロロフェニル）ピリジン−３−イルアゾ］ナフタレン−１−スルホン酸；
４−アミノ−３−［６−（２−トリフルオロメチルフェニル）ピリジン−３−イルアゾ］ナフタレン−１−スルホン酸；
４−アミノ−３−［６−（４−トリフルオロメチルフェニル）ピリジン−３−イルアゾ］ナフタレン−１−スルホン酸；
４−アミノ−３−［６−（２−クロロフェニル）ピリジン−３−イルアゾ］ナフタレン−１−スルホン酸；
４−アミノ−３−［６−（３−クロロフェニル）ピリジン−３−イルアゾ］ナフタレン−１−スルホン酸；
４−アミノ−３−［６−（４−クロロフェニル）ピリジン−３−イルアゾ］ナフタレン−１−スルホン酸；
４−アミノ−３−［６−（２−メトキシフェニル）ピリジン−３−イルアゾ］ナフタレン−１−スルホン酸；
４−アミノ−３−［６−（４−メトキシフェニル）ピリジン−３−イルアゾ］ナフタレン−１−スルホン酸；
４−アミノ−３−［６−（２−イソプロポキシフェニル）ピリジン−３−イルアゾ］ナフタレン−１−スルホン酸；
４−アミノ−３−［６−（４−イソプロポキシフェニル）ピリジン−３−イルアゾ］ナフタレン−１−スルホン酸；
４−アミノ−３−［６−（２−フェノキシフェニル）ピリジン−３−イルアゾ］ナフタレン−１−スルホン酸；
４−アミノ−３−［６−（３−メトキシフェニル）ピリジン−３−イルアゾ］ナフタレン−１−スルホン酸；
４−アミノ−３−［６−（２,３−ジメチルフェニル）ピリジン−３−イルアゾ］ナフタレン−１−スルホン酸；
４−アミノ−３−［６−（２,５−ジメチルフェニル）ピリジン−３−イルアゾ］ナフタレン−１−スルホン酸；
４−アミノ−３−［６−（３,５−ジメチルフェニル）ピリジン−３−イルアゾ］ナフタレン−１−スルホン酸；
４−アミノ−３−［６−（３−トリフルオロメチルフェニル）ピリジン−３−イルアゾ］ナフタレン−１−スルホン酸；
４−｛４−［５−（１−アミノ−４−スルホナフタレン−２−イルアゾ）ピリジン−２−イル］フェニル｝−４−オキソブチル酸；
４−アミノ−３−（６−ビフェニル−３−イルピリジン−３−イルアゾ）ナフタレン−１−スルホン酸；
４−アミノ−３−［６−（３−シアノフェニル）ピリジン−３−イルアゾ］ナフタレン−１−スルホン酸；
４−アミノ−３−［６−（４−シアノフェニル）ピリジン−３−イルアゾ］ナフタレン−１−スルホン酸；
４−アミノ−３−［６−（３,５−ビストリフルオロメチルフェニル）ピリジン−３−イルアゾ］ナフタレンスルホン酸；
４−アミノ−３−［６−（４−ベンゾイルフェニル）ピリジン−３−イルアゾ］ナフタレン−１−スルホン酸；
４−アミノ−３−［６−（２−プロポキシフェニル）ピリジン−３−イルアゾ］ナフタレン−１−スルホン酸；
４−アミノ−３−［６−（４−フルオロ−２−メチルフェニル）ピリジン−３−イルアゾ］ナフタレン−１−スルホン酸；
４−アミノ−３−［６−（５−フルオロ−２−プロポキシフェニル）ピリジン−３−イルアゾ］ナフタレン−１−スルホン酸；
４−アミノ−３−［６−（２−フルオロ−６−プロポキシフェニル）ピリジン−３−イルアゾ］ナフタレン−１−スルホン酸；
４−アミノ−３−［６−（４−フルオロ−２−プロポキシフェニル）ピリジン−３−イルアゾ］ナフタレン−１−スルホン酸；
４−アミノ−３−［６−（５−フルオロ−２−メチルフェニル）ピリジン−３−イルアゾ］ナフタレン−１−スルホン酸；
４−アミノ−３−［６−（２−フルオロ−５−メチルフェニル）ピリジン−３−イルアゾ］ナフタレン−１−スルホン酸；
４−アミノ−３−［６−（２−ブトキシフェニル）ピリジン−３−イルアゾ］ナフタレン−１−スルホン酸；
４−アミノ−３−［６−（２−ヘキシルオキシフェニル）ピリジン−３−イルアゾ］ナフタレン−１−スルホン酸；
４−アミノ−３−［６−（４−ブチルフェニル）ピリジン−３−イルアゾ］ナフタレン−１−スルホン酸；
４−アミノ−３−［６−（２−ヒドロキシフェニル）ピリジン−３−イルアゾ］ナフタレン−１−スルホン酸；
４−アミノ−３−｛６−［２−（６−ヒドロキシヘキシルオキシ）フェニル］ピリジン−３−イルアゾ｝ナフタレン−１−スルホン酸；
４−｛２−［５−（１−アミノ−４−スルホナフタレン−２−イルアゾ）ピリジン−２−イル］フェノキシ｝ブチル酸；
４−アミノ−３−｛６−［２−（３−ヒドロキシプロポキシ）フェニル］ピリジン−３−イルアゾ｝ナフタレン−１−スルホン酸；
４−アミノ−３−［６−（２−イソブトキシフェニル）ピリジン−３−イルアゾ］ナフタレン−１−スルホン酸；
４−アミノ−３−［６−（５−クロロ−２−ヒドロキシフェニル）ピリジン−３−イルアゾ］ナフタレン−１−スルホン酸；
４−アミノ−３−［６−（４−メチルビフェニル−２−イル）ピリジン−３−イルアゾ］ナフタレン−１−スルホン酸；
４−アミノ−３−［６−（４’−クロロ−４−メチルビフェニル−２−イル）ピリジン−３−イルアゾ］ナフタレン−１−スルホン酸；
４−アミノ−３−［６−（４,３’,５’−トリメチルビフェニル−２−イル）ピリジン−３−イルアゾ］ナフタレン−１−スルホン酸；
４−アミノ−３−［６−（３’−クロロ−４−メチルビフェニル−２−イル）ピリジン−３−イルアゾ］ナフタレン−１−スルホン酸；
４−アミノ−３−［６−（２,６−ジメチルフェニル）ピリジン−３−イルアゾ］ナフタレン−１−スルホン酸；
４−アミノ−３−［６−（３−ホルミル−２−イソプロポキシ−５−メチルフェニル）ピリジン−３−イルアゾ］ナフタレン−１−スルホン酸；および、
４−アミノ−３−［６−（３−ホルミル−２−ブトキシ−５−メチルフェニル）ピリジン−３−イルアゾ］ナフタレン−１−スルホン酸；
からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項８】
式（Ｉ）の化合物が、４−アミノ−３−［６−（４−フルオロ−２−メチルフェニル）ピリジン−３−イルアゾ］ナフタレン−１−スルホン酸である、請求項１〜７のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項９】
冠動脈内に投与される、請求項１〜８のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１０】
心筋梗塞後の再灌流時に投与される、請求項１〜９のいずれかに記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、日本国特許出願第２０１８−０７８２７２号について優先権を主張するものであり、ここに参照することによって、その全体が本明細書中へ組み込まれるものとする。
本願は、心筋細胞の保護用の医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
心筋梗塞や拡張型心筋症などの心疾患では、ポンプ機能を担う心筋細胞が障害を受け、最終的には変性または壊死することが知られている。心筋細胞は一般的に自己再生能力を欠くので、障害を受けた心筋細胞を保護して変性や壊死を防止することがこれらの疾患の治療に有効であると考えられるが、その方法は確立されていない。【０００３】
心筋梗塞は、冠動脈血管の閉塞または狭窄により血液の流量が低下し、心筋が虚血状態になり壊死する疾患であり、慢性心不全の主原因の一つである。急性期の心筋梗塞の治療に、バルーンカテーテル、ステント等を用いる外科的療法または血栓溶解療法により冠動脈の血流を再開する再灌流法が用いられるようになり、心筋梗塞による死亡率および予後は改善された。しかしながら、再灌流法には、再灌流時のカルシウムイオンの細胞内流入や活性酸素の産生により、心筋細胞が障害を受ける（再灌流障害）という新たな問題があり、再灌流法の発達に伴って、再灌流障害の抑制が求められてきた。活性酸素種を抑制する薬剤がいくつか報告されているが（非特許文献１および２）、臨床に応用されているものは皆無である。その他のメカニズムによる再灌流障害の抑制も確立されていない。【０００４】
ある種の４−アミノ−ナフタレン−１−スルホン酸誘導体は、ＶＣＰ（valosin-containing protein）ＡＴＰａｓｅ阻害活性を有し、様々な疾患に対する治療効果が期待されている（特許文献１）。特に、眼疾患およびレプチン抵抗性の処置または予防に有効であることが知られている（特許文献２〜５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１２／０１４９９４号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２０１２／０４３８９１号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２０１４／１２９４９５号パンフレット
【特許文献４】国際公開第２０１５／１２９８０９号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２０１５／０３３９８１号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Duan J, et al. Protective effect of butin against ischemia/reperfusion-induced myocardial injury in diabetic mice: involvement of the AMPK/GSK-3β/Nrf2 signaling pathway. Sci Rep. 2017;7:41491.
【非特許文献２】Bae S, Park M, Kang C, Dilmen S, Kang TH, Kang DG, Ke Q, Lee SU, Lee D, Kang PM. Hydrogen Peroxide-Responsive Nanoparticle Reduces Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury. J Am Heart Assoc. 2016 Nov 14;5(11).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本願の目的は、心筋細胞保護用の医薬組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ＶＣＰ阻害剤が心筋細胞の保護効果を有し、心筋梗塞等の心疾患の処置に有効であることを見出した。【０００９】
従って、ある態様では、本願は、式（Ｉ）：
【化１】
2019203176.tif 000003
〔式中、
Ｒａはハロ、ヒドロキシ、アルキル、ハロ置換アルキル、アリール、ハロまたはアルキル置換アリール、アルコキシ、ヒドロキシまたはカルボキシ置換アルコキシ、アリールオキシ、ハロまたはアルキル置換アリールオキシ、ＣＨＯ、Ｃ（Ｏ）−アルキル、Ｃ（Ｏ）−アリール、Ｃ（Ｏ）−アルキル−カルボキシル、Ｃ（Ｏ）−アルキレン−カルボキシエステルおよびシアノから成る群から選択され、
ｍは０〜４から選択される整数である〕
の化合物またはそのエステル、オキシド、プロドラッグ、薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含む、心筋細胞保護用の医薬組成物を提供する。【００１０】
別の態様では、本願は、式（Ｉ）の化合物またはそのエステル、オキシド、プロドラッグ、薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含む、心筋梗塞の処置用の医薬組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本願により、心筋細胞保護用の医薬組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ヒトの各臓器におけるＶＣＰの発現量を示す。
【図２】マウスの各臓器におけるＶＣＰの発現量を示す。
【図３】マウス心臓から単離した心筋細胞および線維芽細胞におけるＶＣＰの発現量を示す。
【図４】ツニカマイシン添加によるＥＲストレス下で培養したラット心筋芽細胞の細胞数およびＡＴＰレベルを示す。ＫＵＳ１２１（＋）群には、２５、５０、１００または２００μＭのＫＵＳ１２１を添加した。＊：Ｐ＜０.０５ ｖｓ.Ｔｍ（＋）ＫＵＳ（−）
【図５】ツニカマイシン添加によるＥＲストレス下で培養したラット心筋芽細胞における、ＣＨＯＰおよびＢｉｐのウェスタンブロットの結果を示す。ＫＵＳ１２１（＋）群には、２００μＭのＫＵＳ１２１を添加した。
【図６】グルコース除去によるＥＲストレス下で培養したラット心筋芽細胞の細胞数およびＡＴＰレベルを示す。ＫＵＳ１２１（＋）群には、２５、５０、１００または２００μＭのＫＵＳ１２１を添加した。＊：Ｐ＜０.０５ ｖｓ.グルコース（−）ＫＵＳ（−）
【図７】グルコース除去によるＥＲストレス下で培養したラット心筋芽細胞における、ＣＨＯＰおよびＢｉｐのウェスタンブロットの結果を示す。ＫＵＳ１２１（＋）群には、２００μＭのＫＵＳ１２１を添加した。
【図８】マウス心臓虚血再灌流障害モデルにおける虚血前および再灌流後の腹腔内ＫＵＳ１２１投与のスケジュールを示す模式図である（虚血前および再灌流後２４時間毎に腹腔内１６０ｍｇ／ｋｇ体重）。
【図９】マウス心臓虚血再灌流障害モデルにおいて、虚血前および再灌流後にＫＵＳ１２１を腹腔内投与した場合の左心室に対する梗塞部の大きさと、ＣＨＯＰの発現量を示す。
【図１０】マウス心臓虚血再灌流障害モデルにおいて、虚血前および再灌流後にＫＵＳ１２１を腹腔内投与した場合の心機能の評価結果を示す。左：左室内径短縮率、右：左室駆出率。
【図１１】A teamマウスの心臓虚血再灌流障害モデルにおいて、虚血前にＫＵＳ１２１を腹腔内投与した場合の心臓のＡＴＰレベルを示す。
【図１２】マウス心臓虚血再灌流障害モデルにおける再灌流後のＫＵＳ１２１投与のスケジュール（再灌流直後に静脈内８０ｍｇ／ｋｇ体重＋冠動脈内８０ｍｇ／ｋｇ体重、その後２４時間毎に腹腔内１６０ｍｇ／ｋｇ体重）、および、術後７日目の左心室に対する梗塞部の大きさを示す。
【図１３】マウス心臓虚血再灌流障害モデルにおける再灌流後のＫＵＳ１２１投与のスケジュール（再灌流直後に静脈内２５ｍｇ／ｋｇ体重＋冠動脈内２５ｍｇ／ｋｇ体重）、および、術後７日目の左心室に対する梗塞部の大きさを示す。
【図１４】マウス心臓虚血再灌流障害モデルにおける再灌流後ＫＵＳ１２１投与のスケジュール（再灌流直後に静脈内８ｍｇ／ｋｇ体重＋冠動脈内８ｍｇ／ｋｇ体重）、および、術後７日目の左心室に対する梗塞部の大きさを示す。
【図１５】ブタ心臓虚血再灌流障害モデルにおけるＫＵＳ１２１投与のスケジュールを示す模式図である（虚血４５分後から３時間の持続点滴４ｍｇ／ｋｇ体重、再灌流直後に冠動脈内０.１６ｍｇ／ｋｇ体重）。
【図１６】ブタ心臓虚血再灌流障害モデルにおける左心室に対する梗塞部の大きさを示す。
【図１７】ブタ心臓虚血再灌流障害モデルにおける心機能の評価結果を示す。ａ：左室駆出率、ｂ：拡張末期容積、ｃ：収縮末期容積、ｄ：心拍出量、ｅ：左室重量。
【図１８】ブタ心臓虚血再灌流障害モデルにおける組織学的評価の結果を示す。左：左心室に対する虚血域の大きさ、右：虚血域に対する梗塞部の大きさ。
【図１９】ブタ心臓虚血再灌流障害モデルにおける再灌流後の冠動脈内ＫＵＳ１２１投与のスケジュール（再灌流後に冠動脈内０．６４、２．５または５．０ｍｇ／ｋｇ体重）、左心室に対する梗塞部の大きさ（左）、左心室に対する虚血域の大きさ（中央）、虚血域に対する梗塞部の大きさ（右）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書では、数値が「約」の用語を伴う場合、その値の±１０％の範囲を含むことを意図する。例えば、「約２０」は、「１８〜２２」を含むものとする。数値の範囲は、両端点の間の全ての数値および両端点の数値を含む。範囲に関する「約」は、その範囲の両端点に適用される。従って、例えば、「約２０〜３０」は、「１８〜３３」を含むものとする。
【００１４】
特に具体的な定めのない限り、本明細書で使用される用語は、有機化学、医学、薬学、分子生物学、微生物学等の分野における当業者に一般に理解されるとおりの意味を有する。以下にいくつかの本明細書で使用される用語についての定義を記載するが、これらの定義は、本明細書において、一般的な理解に優先する。
【００１５】
「アルキル」は、１〜１０個の炭素原子、好ましくは１〜６個の炭素原子を有する、１価飽和脂肪族ヒドロカルビル基を意味する。アルキルは、例えば直鎖および分枝鎖ヒドロカルビル基、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチルおよびネオペンチルを意味するが、これらに限定されない。
【００１６】
基の接頭語「置換」は、当該基の１個以上の水素原子が、同一または異なる指定する置換基によって置換されていることを意味する。
【００１７】
「アルキレン」は、１〜１０個の炭素原子、好ましくは１〜６個の炭素原子を有する、２価飽和脂肪族ヒドロカルビル基を意味する。アルキレン基は、分枝鎖および直鎖ヒドロカルビル基を含む。
【００１８】
「アルコキシ」は、−Ｏ−アルキル（ここで、アルキルは本明細書に定義されている）の基を意味する。アルコキシは、例えばメトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシおよびｎ−ペントキシを意味するが、これらに限定されない。
【００１９】
「アリール」は１個の環（例えばフェニル）または複数の縮合環（例えばナフチルまたはアントリル）を有する６〜１４個の炭素原子の１価芳香族性炭素環式基を意味する。アリール基は典型的には、フェニルおよびナフチルを含む。
「アリールオキシ」は、−Ｏ−アリール（ここで、アリールは本明細書に定義されている）の基を意味し、例えばフェノキシおよびナフトキシを含む。
【００２０】
「シアノ」は、−ＣＮの基を意味する。
「カルボキシル」または「カルボキシ」は−ＣＯＯＨまたはその塩を意味する。
「カルボキシエステル」は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキル（ここで、アルキルは本明細書に定義されている）の基を意味する。
「ハロ」は、ハロゲン、特に、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードを意味する。
「ヒドロキシ」は−ＯＨの基を意味する。
【００２１】
特に定めのない限り、本明細書において明示的に定義されていない置換基の命名法は、官能基の末端部分を命名し、次いで結合点に向かって隣接する官能基を命名して行う。例えば、置換基「アリールアルキルオキシカルボニル」は、（アリール）−（アルキル）−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−を意味する。
【００２２】
式（Ｉ）の化合物には、置換パターンによっては、エナンチオマーまたはジアステレオマーが存在し得る。式（Ｉ）の化合物は、ラセミ体であってもよく、既知方法で立体異性的に純粋な成分に分離したものであってもよい。ある種の化合物は、互変異性体であり得る。
【００２３】
「エステル」は、インビボで加水分解され得るエステルを意味し、人体で容易に分解されて親化合物またはその塩を放出するものを含む。好適なエステル基は、例えば、薬学的に許容し得る脂肪族カルボン酸、特にアルカン酸、アルケン酸、シクロアルカン酸およびアルカン二酸に由来するもの（ここで、各アルキルまたはアルケニル基は、例えば６個以下の炭素原子を有する）を含む。具体的なエステルの例には、ギ酸エステル、酢酸エステル、プロピオン酸エステル、ブチル酸エステル、アクリル酸エステルおよびエチルコハク酸エステルが含まれる。
「オキシド」は、ヘテロアリール基の窒素環原子が酸化され、Ｎ−オキシドを形成しているものを意味する。
【００２４】
「プロドラッグ」は、合理的な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激性、アレルギー性応答等なくヒトまたは動物の組織と接触させて使用するのに適した、合理的な利益／危険比で釣り合った、そして意図した使用に有効な化合物のプロドラッグを意味する。プロドラッグは、インビボで速やかに、例えば血中で加水分解によって変換されて、上記式の親化合物をもたらす化合物である。一般的な説明は、T. Higuchi and V. Stella, Pro drugs as Novel Delivery Systems, Vol. 14 of the A.C.S. Symposium SeriesおよびEdward B. Roche, ed., Bioreversible Carriers in Drug Design, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987 に記載されている（いずれも参照により本明細書に引用する）。
【００２５】
「薬学的に許容し得る塩」は、式（Ｉ）の化合物の無機または有機酸との塩であり得る。好ましい塩は、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸または硫酸との塩、または、有機カルボン酸またはスルホン酸、例えば、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、安息香酸またはメタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸またはナフタレンジスルホン酸との塩である。
【００２６】
また、薬学的に許容し得る塩は、常套の塩基との塩、例えばアルカリ金属塩（例えばナトリウムまたはカリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えばカルシウムまたはマグネシウム塩）、または、アンモニアまたは有機アミン（例えば、ジエチルアミン、トリエチルアミン、エチルジイソプロピルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、ジヒドロアビエチルアミン、メチルピペリジン、Ｌ−アルギニン、クレアチン、コリン、Ｌ−リジン、エチレンジアミン、ベンザチン、エタノールアミン、メグルミンまたはトロメタミン）から誘導されるアンモニウム塩、特にナトリウム塩であり得る。
【００２７】
「溶媒和物」は、固体または液体状態で溶媒分子との配位により錯体を形成している式（Ｉ）の化合物を意味する。好適な溶媒和物は水和物である。
【００２８】
本明細書において「式（Ｉ）の化合物」に言及する場合、文脈中で不適切でない限り、そのエステル、オキシド、プロドラッグ、薬学的に許容される塩および溶媒和物も包含することを意図する。
【００２９】
ある実施態様では、式（Ｉ）中、Ｒａは、それぞれ独立して、ハロ、ヒドロキシ、アルキル、ハロ置換アルキルおよびアルコキシから成る群から選択される。
ある実施態様では、式（Ｉ）中、Ｒａは、それぞれ独立して、ハロおよびアルキルから成る群から選択される。
ある実施態様では、式（Ｉ）中、Ｒａは２個存在し、一方がハロであり、他方がアルキルである。
【００３０】
ある実施態様において、式（Ｉ）の化合物は、下記の表１の化合物から選択される：
【表１−１】
2019203176.tif 000004
【００３１】
【表１−２】
2019203176.tif 000005
【００３２】
【表１−３】
2019203176.tif 000006
【００３３】
ある実施態様では、医薬組成物の有効成分は、下記式
【化２】
2019203176.tif 000007
で表される４−アミノ−３−［６−（４−フルオロ−２−メチルフェニル）ピリジン−３−イルアゾ］ナフタレン−１−スルホン酸、または、そのエステル、オキシド、プロドラッグ、薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物、特にナトリウム塩が好ましい。
【００３４】
式（Ｉ）の化合物、特に、上記の化合物の特性および合成方法は、国際公開第２０１２／０１４９９４号パンフレット（特許文献１）に詳細に記載されている。
【００３５】
後述する実施例により立証される通り、式（Ｉ）の化合物は、心筋細胞を保護し得る。従って、ある態様では、式（Ｉ）の化合物を含む、心筋細胞保護用の医薬組成物が提供される。本明細書で使用されるとき、「心筋細胞を保護する」または「心筋細胞保護」は、心筋細胞の細胞死を抑制すること、および／または、心筋細胞の虚血障害および／または虚血再灌流障害またはその進行を抑制することを意味する。ある実施態様では、心筋細胞を保護することにより、心機能を維持すること、および／または、心機能の低下を抑制することができ、例えば、心筋梗塞、慢性心不全、高血圧性心不全または拡張型心筋症などの心筋細胞死を伴う心疾患を処置または予防し得る。
【００３６】
後述する実施例は、さらに、心筋梗塞の処置における式（Ｉ）の化合物の有用性を詳細に試験し、それが再灌流時の冠動脈内単回投与でさえ有効であり、心機能の低下を抑制し得ることを立証している。従って、ある態様では、式（Ｉ）の化合物を含む、心筋梗塞の処置用の医薬組成物が提供される。また、式（Ｉ）の化合物の投与により、心筋梗塞患者の壊死心筋の量が減少し、心不全に至るリスクが軽減されるので、式（Ｉ）の化合物は、心筋梗塞を原因とする心不全または心筋梗塞後の心不全、特に慢性心不全の処置または予防にも使用され得る。
【００３７】
本明細書で使用されるとき、「処置する」または「処置」は、疾患に罹患している対象において、疾患の原因を軽減または除去すること、その進行を遅延または停止させること、および／または、その症状を軽減、緩和、改善または除去することを意味する。
【００３８】
本明細書で使用されるとき、「予防する」または「予防」は、対象において、特に、疾患に罹る可能性が高いが、未だ罹患していない対象において、疾患への罹患を防止すること、または、疾患に罹る可能性を低減することを意味する。
【００３９】
心疾患に罹る可能性があるが、未だ罹患していない対象には、例えば、加齢、冠動脈疾患の家族歴、喫煙、高血圧、肥満、耐糖能異常、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、低ＨＤＬコレステロール血症、メタボリックシンドローム、ストレス、睡眠不足等のリスク因子を有する対象が含まれる。心筋梗塞に罹る可能性があるが、未だ罹患していない対象には、例えば、喫煙、高コレステロール血症、糖尿病、高血圧、狭心症・心筋梗塞の家族歴、加齢、ストレス、肥満、痛風、高尿酸血症、血液透析、高ホモシステイン血症、歯周病等のリスク因子を有する対象が含まれる。慢性心不全に罹る可能性があるが、未だ罹患していない対象には、例えば、冠動脈疾患、心筋症、弁膜症、高血圧などに罹患している対象、特に心筋梗塞に罹患している対象が含まれる。高血圧性心不全に罹る可能性があるが、未だ罹患していない対象には、例えば、高血圧に罹患している対象が含まれる。拡張型心筋症に罹る可能性があるが、未だ罹患していない対象には、例えば、拡張型心筋症の遺伝的素因を有する対象が含まれる。
【００４０】
疾患の処置または予防の対象としては、動物、典型的には哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル等）、特にヒトが挙げられる。
【００４１】
医薬組成物の投与方法は特に限定されないが、経口投与、非経腸投与、注射、輸液等の一般的な投与経路を経ることができ、組成物は、各投与経路に適する剤形であり得る。ある実施態様では、医薬組成物は冠動脈内に投与される。
【００４２】
経口投与の剤形としては、顆粒剤、細粒剤、粉剤、被覆錠剤、錠剤、坐剤、散剤、カプセル剤、マイクロカプセル剤、チュアブル剤、液剤、懸濁剤、乳濁液などが挙げられる。また注射による投与の剤形としては、冠動脈内投与用、静脈注射用、点滴投与用、活性物質の放出を延長する製剤等などの医薬製剤一般の剤形を採用することができる。冠動脈内投与用、静脈注射用または点滴投与用の剤形としては、水性および非水性の注射溶液（抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、等張化剤等を含んでもよい）；ならびに水性および非水性の注射懸濁液（懸濁剤、増粘剤等を含んでもよい）が挙げられる。注射用の投与形は、密閉したアンプルやバイアル中に提供されてもよく、使用直前に滅菌液体（例えば、注射用水）を加えるだけでよい凍結乾燥物として提供されてもよい。注射溶液または懸濁液を、粉末、顆粒または錠剤から調製してもよい。
【００４３】
これらの剤形は、常法により製剤化することによって製造される。さらに製剤上の必要に応じて、医薬的に許容し得る各種の製剤用物質を配合することができる。製剤用物質は製剤の剤形により適宜選択することができるが、例えば、緩衝化剤、界面活性剤、安定化剤、防腐剤、賦形剤、希釈剤、添加剤、崩壊剤、結合剤、被覆剤、潤滑剤、滑沢剤、風味剤、甘味剤、可溶化剤等が挙げられる。
【００４４】
医薬組成物の投与量および投与回数は、有効量の式（Ｉ）の化合物が対象に投与されるように、投与対象の動物種、投与対象の健康状態、年齢、体重、投与経路、投与形態等に応じて当業者が適宜設定できる。ある状況での有効量は、日常的な実験によって容易に決定することができ、通常の臨床医の技術および判断の範囲内である。例えば、約０.００１〜約１０００ｍｇ／ｋｇ体重／日、約０.０１〜約３００ｍｇ／ｋｇ体重／日、約０.１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、約２〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約２.５〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約２.５〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、あるいは約５〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日の式（Ｉ）の化合物を投与し得る。ある実施態様では、医薬組成物は、心筋梗塞後の再灌流時に１回またはそれ以上の回数で、特に１回、投与される。
【００４５】
ある実施態様では、医薬組成物は、心筋梗塞後の再灌流時に冠動脈内に単回投与される。その場合、例えば、約０.０１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０.０５〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０.１〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０.１〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、約０.１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約２〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約２.５〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約２.５〜約５ｍｇ／ｋｇ体重あるいは約５〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の式（Ｉ）の化合物を投与し得る。
【００４６】
式（Ｉ）の化合物は、単独で、または、１種またはそれ以上のさらなる有効成分、特に、心筋梗塞等の心疾患の処置または予防のための有効成分と併用できる。例えば、医薬組成物は、式（Ｉ）の化合物に加えて、１種またはそれ以上のさらなる有効成分を含み得る。
【００４７】
成分を「併用する」ことは、全成分を含有する投与剤形の使用および各成分を別個に含有する投与剤形の組合せの使用のみならず、それらが心筋細胞の保護または心疾患の予防および／または処置のために使用される限り、各成分を同時に、または、いずれかの成分を遅延して投与することも意味する。２種またはそれ以上のさらなる有効成分を併用することも可能である。併用に適する有効成分には、例えば、抗炎症剤、血管拡張剤、血栓溶解剤、抗血小板薬、抗凝固薬、スタチン系薬剤等が含まれる。
【００４８】
式（Ｉ）の化合物の投与に加えて、薬物療法以外の治療法を実施することもできる。適する治療法には、例えば、バルーンカテーテル、ステントまたは薬剤溶出性ステント（ＤＥＳ）等を用いた冠動脈インターベンション（ＰＣＩ）および血栓吸引法等の外科手術、遺伝子治療、再生医療等が含まれる。
【００４９】
ある態様では、心筋細胞の保護を必要としている対象に式（Ｉ）の化合物を投与することを含む、心筋細胞の保護方法が提供される。
ある態様では、心筋細胞保護用の式（Ｉ）の化合物が提供される。
ある態様では、心筋細胞を保護するための式（Ｉ）の化合物の使用が提供される。
ある態様では、心筋細胞保護用の医薬組成物の製造における、式（Ｉ）の化合物の使用が提供される。
【００５０】
ある態様では、心筋梗塞の処置を必要としている対象に式（Ｉ）の化合物を投与することを含む、心筋梗塞の処置方法が提供される。
ある態様では、心筋梗塞の処置用の式（Ｉ）の化合物が提供される。
ある態様では、心筋梗塞を処置するための式（Ｉ）の化合物の使用が提供される。
ある態様では、心筋梗塞の処置用の医薬組成物の製造における、式（Ｉ）の化合物の使用が提供される。
【００５１】
例えば、下記の実施態様が提供される。
［１］式（Ｉ）：
【化３】
2019203176.tif 000008
〔式中、
Ｒａはハロ、ヒドロキシ、アルキル、ハロ置換アルキル、アリール、ハロまたはアルキル置換アリール、アルコキシ、ヒドロキシまたはカルボキシ置換アルコキシ、アリールオキシ、ハロまたはアルキル置換アリールオキシ、ＣＨＯ、Ｃ（Ｏ）−アルキル、Ｃ（Ｏ）−アリール、Ｃ（Ｏ）−アルキル−カルボキシル、Ｃ（Ｏ）−アルキレン−カルボキシエステルおよびシアノから成る群から選択され、
ｍは０〜４から選択される整数である〕
の化合物またはそのエステル、オキシド、薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含む、心筋細胞保護用の医薬組成物。
［２］心筋細胞保護が心筋細胞死の抑制を含む、第１項に記載の医薬組成物。
［３］心筋梗塞、慢性心不全、高血圧性心不全または拡張型心筋症の処置用の、第１項または第２項に記載の医薬組成物。
［４］心筋梗塞の処置用の、第１項〜第３項のいずれかに記載の医薬組成物。
［５］式（Ｉ）：
【化４】
2019203176.tif 000009
〔式中、
Ｒａはハロ、ヒドロキシ、アルキル、ハロ置換アルキル、アリール、ハロまたはアルキル置換アリール、アルコキシ、ヒドロキシまたはカルボキシ置換アルコキシ、アリールオキシ、ハロまたはアルキル置換アリールオキシ、ＣＨＯ、Ｃ（Ｏ）−アルキル、Ｃ（Ｏ）−アリール、Ｃ（Ｏ）−アルキル−カルボキシル、Ｃ（Ｏ）−アルキレン−カルボキシエステルおよびシアノから成る群から選択され、
ｍは０〜４から選択される整数である〕
の化合物またはそのエステル、オキシド、薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含む、心筋梗塞の処置用の医薬組成物。
［６］さらに心不全を処置または予防するための、第５項に記載の医薬組成物。
［７］さらに慢性心不全を処置または予防するための、第５項または第６項に記載の医薬組成物。
［８］Ｒａが、それぞれ独立して、ハロ、ヒドロキシ、アルキル、ハロ置換アルキルおよびアルコキシから成る群から選択される、第１項〜第７項のいずれかに記載の医薬組成物。
［９］Ｒａが、それぞれ独立して、ハロおよびアルキルから成る群から選択される、第１項〜第８項のいずれかに記載の医薬組成物。
［１０］Ｒａが２個存在し、一方がハロであり、他方がアルキルである、第１項〜第９項のいずれかに記載の医薬組成物。
［１１］式（Ｉ）の化合物が表１に記載の化合物から選択される、第１項〜第１０項のいずれかに記載の医薬組成物。
［１２］式（Ｉ）の化合物が、４−アミノ−３−［６−（４−フルオロ−２−メチルフェニル）ピリジン−３−イルアゾ］ナフタレン−１−スルホン酸である、第１項〜第１１項のいずれかに記載の医薬組成物。
［１３］冠動脈内に投与される、第１項〜第１２項のいずれかに記載の医薬組成物。
［１４］心筋梗塞後の再灌流時に投与される、第１項〜第１３項のいずれかに記載の医薬組成物。
［１５］心筋梗塞後の再灌流時に単回投与される、第１項〜第１４項のいずれかに記載の医薬組成物。
［１６］約０．０１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の式（Ｉ）の化合物を投与するための、第１３項〜第１５項のいずれかに記載の医薬組成物。
［１７］約１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の式（Ｉ）の化合物を投与するための、第１３項〜第１６項のいずれかに記載の医薬組成物。
［１８］約２〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の式（Ｉ）の化合物を投与するための、第１３項〜第１７項のいずれかに記載の医薬組成物。
【００５２】
本明細書で引用するすべての文献は、出典明示により本明細書の一部とする。
以下、実施例にて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこの実施例に限定されない。また、上記の説明は、すべて非限定的なものであり、本発明は添付の特許請求の範囲において定義され、その技術的思想を逸脱しない範囲で種々の変更が可能である。
【実施例】
【００５３】
実施例において、以下の化合物を使用した。
ＫＵＳ１２１：４−アミノ−３−［６−（４−フルオロ−２−メチルフェニル）ピリジン−３−イルアゾ］ナフタレン−１−スルホン酸ナトリウム塩
ＫＵＳ１２１は、国際公開第２０１２／０１４９９４号（特許文献１）に記載の方法により製造した。【００５４】
試験１：ヒト臓器におけるＶＣＰの発現
human Total RNA Master Panel II (Clonthech社)、total RNA: human adipose (Biochain社) を用いて、ヒト臓器でのＶＣＰの発現をｑＰＣＲで定量評価した。まずＲＮＡ１μｇをVerso cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific社) を用いてｃＤＮＡに逆転写した。そのｃＤＮＡから Step One Plus (Thermo Fisher Scientific社)、THUNDERBIRD qPCR Mix (TOYOBO社) を用いてｑＰＣＲを行い、ＶＣＰの発現量を測定した。結果を図１に示す。ヒトの心臓におけるＶＣＰの発現は比較的高く、中枢神経系と同程度であった。【００５５】
試験２：マウス臓器におけるＶＣＰの発現
８週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本ＳＬＣ社）から各臓器を摘出し、TriPure Isolation Reagent（Roche社）を用いて、製造業者のプロトコールに沿ってＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ１μｇを Verso cDNA Synthesis Kit を用いてｃＤＮＡに逆転写した。そのｃＤＮＡから Step One Plus、THUNDERBIRD qPCR Mix を用いてｑＰＣＲを行い、ＶＣＰの発現量を測定した。結果を図２に示す。マウスの心臓におけるＶＣＰの発現は比較的高かった。【００５６】
試験３：マウス心臓におけるＶＣＰの発現
生後１日目の新生児Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスより心臓を摘出し、コラゲナーゼ処理を行い、細胞を単離した。Mito Tracker GreenFM (M7514、Thermo Fisher Scientific)、Thy1.2-APC (eBioscience社) を用いて、ＦＡＣＳで心筋細胞と線維芽細胞に分離した。試験２と同様の手順でｑＰＣＲを行い、ＶＣＰの発現量を定量評価した。結果を図３に示す。マウスの心臓において、ＶＣＰは心筋細胞で多く発現していた。【００５７】
試験４：ラット心筋芽細胞におけるＫＵＳ１２１の効果
Ｈ９Ｃ２（ラット心筋芽細胞）を、５％ウシ胎児血清添加 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) 中、小胞体ストレスを誘導する０.１μｇ／ｍＬツニカマイシン (Sigma Aldrich社) および、２５、５０、１００または２００μＭのＫＵＳ１２１の存在下で２４時間培養した。細胞数を Countess II (Thermo Fisher Scientific社) で測定した。「細胞の」ＡＴＰ測定試薬（東洋ビーネット社）を用いて細胞内のＡＴＰレベルを測定した。ＡＴＰレベルを示すルシフェラーゼ活性を、ARVO X3 (PerkinElmer社) で測定した。結果を図４に示す。細胞数はＫＵＳ１２１の用量に伴って増加した。ツニカマイシンの添加によりＡＴＰレベルが低下したが、ＫＵＳ１２１の用量に伴って改善された。【００５８】
上記の培養細胞をウェスタンブロットに付した。１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH 7.4）、７５ ｍＭ ＮａＣｌ、１％ Triton X-100 (Nacalai Tesque社) からなる溶液に、使用する直前に Complete Mini protease inhibitor cocktail (Roche社)、０.５ ｍＭ ＮａＦ、１０ ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４を加えて細胞溶解液とした。それを用いて培養細胞からタンパク質を抽出し、BCA protein assay kit (Bio-Rad, 5000006JA) でタンパク質濃度を測定した。タンパク質１５μｇを NuPAGE 4-12% Bis-Tris Mini gels (Thermo Fisher Scientific) 中で分離し、Protran nitrocellulose transfer membrane (Whatman) に転写した。５％スキムミルクＰＢＳで３０分間ブロッキングし、一次抗体を４℃で一晩反応させた。ＰＢＳ−０.０５％ Tween-20 (ＰＢＳ−Ｔ) で洗浄し、二次抗体を室温で１時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、Pierce Western Blotting Substrate (Thermo Fisher Scientific)、または Pierce Western Blotting Substrate plus (Thermo Fisher Scientific) を用いて発色し、LAS-4000 Mini system (Fuji Film) を用いて測定した。一次抗体として、ＣＨＯＰ (sc575, Snata Cruz社)、Ｂｉｐ (#3183, Cell Signaling社)、ＧＡＰＤＨ (#2118, Cell Signaling社) およびβ-アクチン (Sigma Aldrich社) を使用した。結果を図５に示す。ＫＵＳ１２１の存在下では、小胞体ストレスマーカーであるＣＨＯＰおよびＢｉｐの発現が抑制された。【００５９】
グルコースを含まない培地で細胞を培養して、同様の実験を行った。結果を図６および７に示す。細胞数はＫＵＳ１２１の用量に伴って増加した。無グルコース下ではＡＴＰレベルが低下したが、ＫＵＳ１２１の用量に伴って改善された。ＫＵＳ１２１の存在下では、小胞体ストレスマーカーであるＣＨＯＰおよびＢｉｐの発現が抑制された。【００６０】
これらの結果から、ＫＵＳ１２１が小胞体ストレス下の心筋細胞および心筋芽細胞においてＡＴＰ消費を抑制し、小胞体ストレスを抑制して細胞死を抑制することが示唆される。【００６１】
試験５：マウス心臓虚血再灌流障害モデル（虚血前ＫＵＳ投与）
ペントバルビタール６４.８ｍｇ／ｋｇの腹腔内投与で麻酔を行った。麻酔導入後に気管内チューブを挿入し、陽圧換気を行った。
８週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを右半側臥位に固定し、左第三肋間で開胸し、心臓を露出させた。心膜を少し剥離し、左房下縁から１、２ｍｍ心尖部寄りの部位でＰＥ１０チューブとともに７−０プロリンで左冠動脈前下行枝を結紮した。心筋の色調が変化するのを観察して、冠動脈血流が遮断できているのを確認した。４５分間の虚血の後にＰＥ１０チューブを抜去し、再灌流を得た。再灌流は心筋の色調が回復することをもって確認した。その後、胸郭を７−０プロリン、皮膚を４−０シルクで縫合した。マウスが覚醒したのを確認して、気管内チューブを抜去した。【００６２】
虚血前ＫＵＳ投与
生理食塩水に溶解したＫＵＳ１２１を虚血前投与した。図８に投与スケジュールの模式図を示す。初回投与は、再灌流の２時間前（虚血開始の約１時間前）にＫＵＳ１２１の１６０ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与を行った。その後は術後１〜６日目まで２４時間毎にＫＵＳ１２１の１６０ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与を行った。【００６３】
組織学的評価
術後７日目に、ペントバルビタールで麻酔後に４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で灌流固定を行い、心臓を摘出した。摘出した心臓は、さらに４％ＰＦＡで一晩浸漬固定を行った。その後にパラフィン包埋を行い、切片を作成した。マッソントリクローム染色で梗塞領域の評価を行った。画像は顕微鏡 (BZ-9000, Keyence) で撮影し、Image J (NIH) で梗塞領域の面積を求めた。結果を図９に示す。ＫＵＳ１２１投与群では、対照群と比較して、梗塞領域が小さかった。ウェスタンブロットによると、投与群においては、境界領域、非虚血領域において小胞体ストレスマーカーのＣＨＯＰの発現が抑制された。【００６４】
心臓超音波検査
マウス心臓虚血再灌流障害モデルにおいて、心機能評価のため心臓超音波検査 (Vevo(登録商標)2100, VISUALSONICS) を行った。２％イソフルラン吸入麻酔下に行い、傍胸骨短軸像において左室内径短縮率および左室駆出率を測定し、左室収縮能を評価した。結果を図１０に示す。ＫＵＳ１２１投与群では、対照群と比較して左室収縮能が良好に保たれ、偽手術群と同程度であった。【００６５】
試験６：マウス心臓虚血再灌流障害モデル（ＡＴＰ可視化マウス）
京都大学医学研究科腎臓内科山本正道氏が開発したＡＴＰ可視化マウス（A teamマウス）を用いた。A teamマウスでは、細胞内ＡＴＰ量に応じてＧＦＰからＯＦＰへの蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が起こり、ＯＦＰ／ＧＦＰ比がＡＴＰ量に比例する。
A teamマウスを４％イソフルランで麻酔導入し、術中は２％で維持した。麻酔導入後に気管内チューブを挿入し、陽圧換気を行った。両側側胸部と両側肋骨下縁を切開し、胸腔を開け、心臓を露出した。左房下縁から１、２ｍｍ心尖部寄りの部位でＰＥ１０チューブとともに７−０プロリンで左冠動脈前下行枝を結紮した。４５分間の虚血の後にＰＥ１０チューブを抜去し、再灌流を得た。ＫＵＳ１２１は再灌流２時間前に１６０ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与した。ＡＴＰ測定では、４７０／４０で励起し、５１５／３０でＧＦＰを、５７５／４０でＯＦＰを検出し、画像を撮影した。MetaMorph (Molecular Devices社) を用いて、ＯＦＰ／ＧＦＰ比を解析した。結果を図１１に示す。対照群では虚血時にＡＴＰレベルが低下したが、ＫＵＳ１２１投与群では維持された。【００６６】
試験７：マウス心臓虚血再灌流障害モデル（再灌流後ＫＵＳ投与）
試験５と同様にマウス心筋梗塞モデルを作成した。
（１）１６０ｍｇ／ｋｇ
初回投与は、再灌流直後にＫＵＳ１２１の８０ｍｇ／ｋｇ静脈内投与、８０ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与を行った。その後は術後１〜４日目まで２４時間毎にＫＵＳ１２１の１６０ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与を行った。術後７日目に、試験５と同様に組織学的評価を行い、梗塞領域の面積を求めた。投与スケジュールの模式図と結果を図１２に示す。ＫＵＳ１２１投与群では、対照群と比較して、梗塞領域が小さかった。【００６７】
（２）５０ｍｇ／ｋｇ
再灌流直後にＫＵＳ１２１の２５ｍｇ／ｋｇ静脈内投与、２５ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与を行った。その後はＫＵＳ１２１を投与しなかった。術後７日目に、試験５と同様に組織学的評価を行い、梗塞領域の面積を求めた。投与スケジュールの模式図と結果を図１３に示す。ＫＵＳ１２１投与群では、対照群と比較して、梗塞領域が小さかった。【００６８】
（３）１６ｍｇ／ｋｇ
再灌流直後にＫＵＳ１２１の８ｍｇ／ｋｇ静脈内投与、８ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与を行った。その後はＫＵＳ１２１を投与しなかった。術後７日目に、試験５と同様に組織学的評価を行い、梗塞領域の面積を求めた。投与スケジュールの模式図と結果を図１４に示す。ＫＵＳ１２１投与群と対照群の梗塞領域の面積に有意差は見られなかった。【００６９】
試験８：ブタ心臓虚血再灌流障害モデル（静脈内および冠動脈内ＫＵＳ投与）
ヨークシャーブタに全身麻酔下でカテーテルを挿入し、バルーンにて左冠動脈を閉塞し、心筋梗塞モデルを作成した。４ｍｇ／ｋｇのＫＵＳ１２１を２５０ｍＬのブドウ糖液に溶解した点滴液を、冠動脈閉塞４５分後より３時間にわたり持続点滴により静脈投与した。閉塞６０分後にバルーンを解除し、冠動脈内に上記点滴液１０ｍＬを注入した。投与スケジュールの模式図を図１５に示す。【００７０】
（１）ＭＲＩによる梗塞サイズと心機能の評価
閉塞の１週間後に、ガドリニウム遅延造影ＭＲＩにより、心筋梗塞巣の大きさを評価した。図１６は、左室あたりの梗塞領域の面積を示す。また、ＭＲＩにより左室駆出率、拡張末期容積、収縮末期容積、心拍出量、左室重量を測定し、心機能を評価した。結果を図１７に示す。ＫＵＳ１２１の投与により、左室収縮能の改善傾向を認めた。【００７１】
（２）組織学的評価
ＭＲＩ撮影後に、左冠動脈の閉塞部をバルーンカテーテルで再度閉塞し、左右両冠動脈に１％エバンスブルーを注入した（左冠動脈は６０ｍＬ、右冠動脈は３０ｍＬ。非梗塞部が青く染まる）。さらに３０ｍＬの１％ＴＴＣ液を閉塞バルーンのガイドワイヤールーメンを用いて注入した。その後、塩化カリウムの静脈注射にてブタを安楽死させた。心臓を取り出し、房室溝と平行に１０ｍｍ厚で断片を作成した。さらに３７℃で１０分間、１％ＴＴＣ液に浸した（心筋梗塞に陥っていない場所が赤く染まる）。すべてのスライスの重さを測定し、写真を撮影した。１０％ホルムアルデヒドで固定し、その後の組織観察に使用した。結果を図１８に示す。左のグラフは、左心室に対する虚血域の大きさを示し、右のグラフは、虚血域に対する梗塞部の大きさを示す。虚血域の大きさは偽手術群とＫＵＳ投与群では差がなかったが、ＫＵＳ投与により、虚血域あたりの梗塞部の大きさは減少した。【００７２】
試験９：ブタ心臓虚血再灌流障害モデル（再灌流後ＫＵＳ投与）
試験８と同様にブタ心筋梗塞モデルを作成した。閉塞６０分後にバルーンを解除し、その直後に冠動脈内に０．６４、２．５または５．０ｍｇ／ｋｇ体重のＫＵＳ１２１を３分間で注入した。術後７日目に、試験８と同様にＭＲＩにより梗塞サイズを評価し、組織学的評価により梗塞領域の面積を求めた。投与スケジュールおよび結果を図１９に示す。ＭＲＩにより評価した梗塞領域／左心室（ＬＶ）領域比は、ＫＵＳ１２１処置群で用量依存的に低下した。ＫＵＳ１２１処置群の虚血域／左心室領域比は対照群と同等であり、ＫＵＳ１２１処置群の梗塞領域／虚血域（ＡＡＲ）比は用量依存的に低下した。さらに、マッソントリクローム染色による梗塞領域の外見が、ＴＴＣ染色により評価した場合と同等であることを確認した。これらのデータは、ブタ心筋梗塞モデルにおいて、心臓の損傷後のＫＵＳ１２１の冠動脈内投与が有効であることを示す。【００７３】
試験１〜９の結果から、式（Ｉ）の化合物は、虚血再灌流時に心筋細胞を保護し、細胞死を抑制することでき、従って、心筋梗塞の処置に有用であることが示唆される。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本願は、心筋細胞の保護方法を提供するものであり、医療の分野で利用され得る。例えば、心筋細胞死を伴う疾患の処置および予防、特に心筋梗塞の処置に利用されることが期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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