(57)【要約】  MSIを用いて、生体組織上のGSH分布を精度良く測定する方法を提供する。（１）試料にＳＨ基酸化保護剤を噴霧する工程、（２）ＳＨ基酸化保護剤を噴霧した試料にマトリックス剤を塗布する工程、及び（３）マトリックス剤を塗布した試料をポジティブモードあるいはネガティブモードの多段階MSIに供する工程を含む、MSIにより生体組織上のGSH分布を測定する方法。
2020262297.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）試料にＳＨ基酸化保護剤を噴霧する工程、
（２）ＳＨ基酸化保護剤を噴霧した試料にマトリックス剤を塗布する工程、及び
（３）マトリックス剤を塗布した試料を多段階質量分析イメージングに供する工程
を含む、質量分析イメージングにより生体組織上の還元型グルタチオン分布を測定する方法。
【請求項２】
多段階質量分析イメージングがポジティブモードである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
マトリックス剤がα-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
多段階質量分析イメージングがネガティブモードである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
マトリックス剤が2,5-ジヒトロキシ安息香酸及び1,5-ジアミノナフタレンからなる群より選択される少なくとも１種を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＳＨ基酸化保護剤がN-置換マレイミド誘導体、ピリジン誘導体及び２-ニトロ安息香酸誘導体からなる群より選択される少なくとも１種を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＳＨ基酸化保護剤及びマトリックス剤を備える、多段階質量分析イメージングにより生体組織上での還元型グルタチオン分布を測定するためのキット。
【請求項８】
マトリックス剤がα-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸を含む、ポジティブモードの多段階質量分析イメージングを用いるための請求項７に記載のキット。
【請求項９】
マトリックス剤が2,5-ジヒトロキシ安息香酸及び1,5-ジアミノナフタレンからなる群より選択される少なくとも１種を含む、ネガティブモードの多段階質量分析イメージングを用いるための請求項７に記載のキット。
【請求項１０】
ＳＨ基酸化保護剤がN-置換マレイミド誘導体、ピリジン誘導体及び２-ニトロ安息香酸誘導体からなる群より選択される少なくとも１種を含む、請求項７〜９のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、質量分析イメージング（MSI）を用いて生体組織上の還元型グルタチオン（GSH）の分布を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
GSHは酸化ストレスマーカーであり、その定量により様々な疾患の評価が試みられている重要な物質である。その評価方法の1つとして、組織切片上でのGSHの定量的可視化、特にMSIを用いた技術開発が熱望されているが、前処理中にGSHが酸化し、正しく評価できないという課題があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Aesif et al., Protocols for the Detection of S-Glutathionylated and S-Nitrosylated Proteins In Situ  Methods in Enzymology, Volume 474
【非特許文献２】Baez et al., Mass spectrometry in studies of protein thiol chemistry and signaling: Opportunities and caveats FreeRadicalBiologyandMedicine80(2015)191-211
【非特許文献３】Nazari et al., Quantitative mass spectrometry imaging of glutathione in healthy and cancerous hen ovarian tissue sections by infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization (IR-MALDESI) Analyst, 2018, 143, 654
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、MSIを用いて、試料上のGSH分布を精度良く測定する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
かかる状況の下、本発明者らは、鋭意検討した結果、試料に分布するGSHを多段階MSIで検出する際に、試料にＳＨ基酸化保護剤を噴霧する工程と、
ＳＨ基酸化保護剤を噴霧した試料にマトリックス剤を塗布する工程とを行った後に当該マトリックス剤塗布試料を多段階MSIに供することにより、上記課題を解決できることを見出した。また、本発明は、本発明者らの上記新規の知見に基づくものである。本発明者らは、当該知見に基づき、GSHを誘導体化するためのＳＨ基酸化保護剤、イオン化を支援するためのマトリックス剤等、種々検討し、本発明を完成させた。従って、本発明は、以下の項を提供する：
項１．（１）試料にＳＨ基酸化保護剤を噴霧する工程、
（２）ＳＨ基酸化保護剤を噴霧した試料にマトリックス剤を塗布する工程、及び
（３）マトリックス剤を塗布した試料を多段階質量分析イメージングに供する工程を含む、質量分析イメージングにより生体組織上の還元型グルタチオン分布を測定する方法。  【０００６】
項２．多段階質量分析イメージングがポジティブモードである、項１に記載の方法。  【０００７】
項３．マトリックス剤がα-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸を含む、項２に記載の方法。  【０００８】
項４．多段階質量分析イメージングがネガティブモードである、項１に記載の方法。  【０００９】
項５．マトリックス剤が2,5-ジヒトロキシ安息香酸及び1,5-ジアミノナフタレンからなる群より選択される少なくとも１種を含む、項４に記載の方法。  【００１０】
項６．ＳＨ基酸化保護剤がN-置換マレイミド誘導体、ピリジン誘導体及び２-ニトロ安息香酸誘導体からなる群より選択される少なくとも１種を含む、項１〜５のいずれか一項に記載の方法。  【００１１】
項７．ＳＨ基酸化保護剤及びマトリックス剤を備える、多段階質量分析イメージングにより生体組織上での還元型グルタチオン分布を測定するためのキット。  【００１２】
項８．マトリックス剤がα-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸を含む、ポジティブモードの多段階質量分析イメージングを用いるための項７に記載のキット。  【００１３】
項９．マトリックス剤が2,5-ジヒトロキシ安息香酸及び1,5-ジアミノナフタレンからなる群より選択される少なくとも１種を含む、ネガティブモードの多段階質量分析イメージングを用いるための項７に記載のキット。  【００１４】
項１０．ＳＨ基酸化保護剤がN-置換マレイミド誘導体、ピリジン誘導体、２-ニトロ安息香酸誘導体からなる群より選択される少なくとも１種を含む、項７〜９のいずれか一項に記載のキット。  【００１５】
これに対し、非特許文献１には、組織切片上でのS-グルタチオニル化システイン残基の検出方法において、非修飾システイン残基をN-エチルマレイミド（NEM）を利用してブロックする際に当該組織切片をNEM溶液に浸漬することが記載されているに止まり、GSHの検出方法についても、マススペクトロメトリ（MS）を用いて目的物質を測定する方法についても記載されていない。また、非特許文献２には、NEMでチオール基が修飾されたタンパク質等をMSに供することが記載されているに止まり、MSIを用いて目的物質の分布を測定する方法について記載されていない。また、非特許文献２にはGSHをMSに供することについて記載されていない。そして、非特許文献３には、ネガティブモードのMSIによりGSHを評価することが記載されているに止まり、組織上で誘導体化したGSHの分布をMSIを用いて測定する方法ついて記載されていない。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、MSIを用いて、試料上のGSH分布を精度良く測定する方法を提供することができる。また、従来は多段階MSIではなく、GSHそのものの検出を試みる例がほとんどであった。かかる状況の下、本発明者らは、上記工程を含む方法においてGSHのSH基を組織上で誘導体化した後に更に試料にマトリックス剤を塗布し、その後に当該マトリックス剤塗布試料を多段階MSIに供することにより、イオン化の際のGSHの酸化を抑えつつ精度よくGSH分布を測定できることを見出した。従って、本発明のかかる効果は、従来技術から予想し得ないものである。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の典型的な実施形態の概略を示す。
【図２】GSHとNEMとの反応式、ならびにGSH及びNEM誘導体化GSHについてフラグメント化前後のm/zを示す。
【図３】実施例１の結果を示す。
【図４】実施例２の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
１．GSH分布の測定方法
一実施形態において、本発明は、（１）試料にＳＨ基酸化保護剤を噴霧する工程、
（２）ＳＨ基酸化保護剤を噴霧した試料にマトリックス剤を塗布する工程、及び
（３）マトリックス剤を塗布した試料を多段階MSIに供する工程を含む、MSIにより生体組織上のGSH分布を測定する方法を提供する。本発明の典型的な実施形態の概略を図１に示す。  
【００１９】
１．１．ＳＨ基酸化保護剤を噴霧する工程
本発明の方法においては、まず、試料にＳＨ基酸化保護剤を噴霧する工程を行う（図１、（１））。  
【００２０】
測定対象の試料としては、GSHを含むものであれば特に限定されず、例えば、動物又は植物の生体組織切片、加工食品、岩石、工業製品等が挙げられる。試料として生体組織切片を用いる場合、当該生体組織切片を採取する動物は限定されないが、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ヤギ等の哺乳動物；線虫、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ等の非哺乳類動物；シロイヌナズナ、アブラナ、米、小麦等の植物等が挙げられる。加工食品としては、例えば、パン、魚肉練り製品、食肉加工品等が挙げられる。工業製品としては、例えば、電子基板等が挙げられる。本発明において好ましくは、試料は生体組織切片であり、より好ましくはマウス、ラット又はヒトの生体組織切片であり、さらに好ましくはヒトの生体組織切片である。試料として生体組織切片を用いる場合、当該生体組織切片を採取する組織も特に限定されないが、例えば、肺、大腸（直腸、結腸）、小腸、胃、肝臓、膵臓、胆嚢、胆管、喉頭、皮膚、子宮、脳、腎臓、前立腺、卵巣、脾臓、リンパ節、甲状腺、心臓、骨格筋、腸、食道、副腎、精巣、脂肪組織、眼球、脊髄、内耳、胸腺、血管、毛髪、骨、胎児、全身等が挙げられる。  
【００２１】
本発明の方法に供する試料の調製方法は特に限定されないが、例えば、試料として生体組織切片を用いる場合、生体組織を冷凍し、これをクリオスタット等を用いて平板状の凍結切片とし、得られた凍結切片を乾燥させること等により調製することができる。試料の厚みは特に限定されないが、例えば、例えば、1〜500μｍ、好ましくは4〜100μｍの範囲で設定できる。また、試料の形状の形状としては、平板状が好ましいが、特に限定されず、例えば、略円形、多角形（三角形、四角形、五角形、六角形等）等の平板が挙げられる。試料が平板状の場合、平面部分の面積も特に限定されないが、例えば、5μm x 5μm 〜 26mm x 76mmの範囲で設定できる。  
【００２２】
ＳＨ基酸化保護剤としては、GSHが有するＳＨに結合して、これを保護し得るものであれば特に限定されないが、例えば、N-置換マレイミド誘導体、ピリジン誘導体、２-ニトロ安息香酸誘導体が挙げられる。N-置換マレイミド誘導体としては、例えば、Ｎ−エチルマレイミド（NEM）、N-メチルマレイミド（NMM）、N-プロピルマレイミド（NPM）、N-ベンジルマレイミド(NBM)等が挙げられ、NEM等が好ましい。ピリジン誘導体としては、2-ビニルピリジン（2-VP）、ジチオジピリジン（PDS）等が挙げられる。２-ニトロ安息香酸誘導体としては、5,5’-ジチオビス（２-ニトロ安息香酸）（DTNB）等が挙げられる。これらのＳＨ基酸化保護剤のうち、N-置換マレイミド誘導体、特に、NEMが好ましい。これらのＳＨ基酸化保護剤は、１種単独で又は２種以上を組み合せて使用することができる。本発明の好ましい実施形態において、これらのＳＨ基酸化保護剤は、例えば、溶媒に溶解した溶液として噴霧することができる。かかる実施形態において、溶媒は、ＳＨ基酸化保護剤がGSHを保護する反応を妨げないものであれば特に限定されず、使用するＳＨ基酸化保護剤に応じて適宜選択すればよいが、例えば、水、エタノール、メタノール、２-プロパノール、アセトニトリル等が挙げられる。これらのＳＨ基酸化保護剤は、１種単独で又は２種以上を組み合せて使用することができる。かかる実施形態において、溶液中のＳＨ基酸化保護剤のモル濃度は特に限定されないが、例えば、0.1〜100ｍＭ、好ましくは10〜500ｍＭの範囲で設定できる。  
【００２３】
噴霧方法も特に限定されないが、例えば、試料をスライドグラス上に配置し、当該試料に対して、ＳＨ基酸化保護剤を適宜含有する溶液をエアブラシ等で噴霧することができる。ＳＨ基酸化保護剤の噴霧量は、試料にGSHが存在した場合に、当該GSHが有するＳＨが保護され得る量であれば、特に限定されないが、例えば、８×１０−４ｃｍ３（例えば、1.0ｃｍ×1.0ｃｍ×8.0μｍ）の試料あたり、ＳＨ基酸化保護剤を1マイクロ〜100マイクロモル、好ましくは1マイクロ〜10マイクロモル噴霧するよう設定できる。ＳＨ基酸化保護剤の全量の噴霧を１度で行ってもよいが、複数回に分けて噴霧と自然乾燥とを繰り返すことがＳＨ基酸化保護剤を効率的に試料に付着、浸透させるために好ましい。噴霧時間はとくに限定されないが、例えば、1〜120分、好ましくは15〜60分の範囲で設定できる。当該噴霧工程を行う際の温度も特に限定されないが、例えば、0〜60℃、好ましくは10〜30℃の範囲で設定できる。当該噴霧工程を行う際のエアスプレーに接続したエアポンプの圧力も特に限定されないが、例えば、0.01〜0.2MＰａ、好ましくは0.1〜0.15MＰａの範囲で設定できる。当該噴霧工程によりGSHのＳＨ基が保護された誘導体を形成することができ、それにより、GSHを酸化から保護することができる。非特許文献1ではスライドガラス上に固定された組織切片をNEM溶液により誘導体化している。この方法では溶媒に不溶な状態としたタンパク質のシステイン残基にNEMを反応させるため、NEM溶液中に組織切片全体を浸すという比較的簡便な方法が採用されている。一方、本発明は試料表面に存在する低分子化合物であるGSHを直接誘導体化する工程を含むものである。試料表面上に存在するGSHは容易に水などの溶媒に溶解するため、非特許文献1の方法を試料中のGSHの測定に用いようとしてもGSHがNEM溶液により洗い流されることが予想される。これに対し、本発明によれば、ＳＨ基酸化保護剤を組織表面上に噴霧することにより、試料表面上に存在するGSHを洗い流すことなく、当該GSHを直接誘導体化することができる。  
【００２４】
噴霧工程の後、試料をマトリックス剤塗布工程に供する。噴霧工程とマトリックス剤塗布工程との間に、ＳＨ基酸化保護剤を噴霧した試料におけるGSHの誘導体化(保護反応)を確実にするために当該試料を放置する、インキュベーション工程を、任意選択で行っても良い。インキュベーションを行う場合、その温度は、特に限定されないが、例えば、4〜60℃、好ましくは10〜30℃の範囲で設定できる。時間もとくに限定されないが、例えば、5〜360分、好ましくは5〜60分の範囲で設定できる。インキュベーションの間の圧力も特に限定されないが、例えば、900〜1200Ｐａ、好ましくは900〜1100Ｐａの範囲で設定できる。インキュベーション工程の間にGSHの誘導体化が進む点で当該工程を行うことが好ましい。  
【００２５】
１．２．マトリックス剤を塗布する工程
本発明の方法においては、次に、ＳＨ基酸化保護剤を噴霧した試料に、多段階質量分析イメージングにおける誘導体化GSHのイオン化を支援するためにマトリックス剤を塗布する工程を行う（図１（２））。  
【００２６】
マトリックス剤としては、MALDI-MSIに使用し得るものであれば特に限定されないが、例えば、レーザー光を吸収して誘導体化GSHのイオン化を支援し得るものが好ましい。例えば、355 nmのレーザー光を用いる場合は、例えばα-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸（CHCA）、2,5-ジヒトロキシ安息香酸（DHB）、シナピン酸（SA）、1,5-ジアミノナフタレン（1,5-DAN）等が挙げられる。これらのマトリックス剤は、１種単独で又は２種以上を組み合せて使用することができる。  
【００２７】
また、本発明者らは、多段階MSIをポジティブモードで行う場合、マトリクス剤のうち例えばCHCAを用いればNEM誘導体化GSHのMSI測定をより効率よくできることを見出した。GSH分布の測定をポジティブモードで行う際にこれらの特定のマトリクス剤が適していることはこれまで全く知られておらず、従来技術から予想し得ない事項である。  
【００２８】
更にまた、本発明者らは、多段階MSIをネガティブモードで行う場合も、マトリクス剤のうちを例えばDHB、1,5-DAN等を用いれば、NEM誘導体化GSHのMSI測定をネガティブモードで行う際により効率よくできることを見出した。GSH分布に測定をネガティブモードで行う際にこれらの特定のマトリクス剤が適していることはこれまで全く知られておらず、従来技術から予想し得ない事項である。  
【００２９】
試料に対し、塗布するマトリックス剤の厚みは特に限定されないが、例えば、0.1〜5.0μｍ、好ましくは1.0〜2.0μｍの範囲で設定できる。  
【００３０】
マトリックス剤を塗布する方法としては特に限定されないが、マトリックス剤の性質に応じて、例えば、蒸着、噴霧、蒸着と噴霧との組合せ、蒸着あるいは噴霧後の再結晶等が挙げられ、好ましくは、蒸着が挙げられる。マトリックス剤の塗布工程は、主に、次の多段階質量分析イメージングにおける誘導体化GSHのイオン化を支援するために必要な工程である。塗布工程は、本発明が属する技術分野において知られている、マトリックス剤を塗布するための装置を適宜使用して行うことができる。  
【００３１】
１．３．多段階質量分析イメージング（多段階MSI）を行う工程
本発明の方法においては、次に、マトリックス剤を塗布した試料を多段階MSIに供する工程を行う。  
【００３２】
多段階MSIとは、質量電荷比（m/z）値により選択されたイオンに対するプロダクトまたはプリカーサーのマススペクトル、あるいは特定のm/z値の増減が生じたプリカーサーイオンのマススペクトルを２回以上繰り返し取得する技法を利用したMSIである。典型的な実施形態において、イオン化した分子のうち特定の質量数のイオンと不活性ガス（Ar、He、Xe等）との衝突を行って、2次的なイオンであるプロダクトイオンを生成し、プロダクトイオンを検出することにより、目的物質の測定を行う。  
【００３３】
本発明の典型的な実施形態においては、MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization )の手法が用いられる。具体的には、マトリックス剤を塗布した試料にレーザーを照射して、マトリックスの励起及び目的物質であるGSH誘導体の脱離、イオン化を生じさせる。イオン化したGSH誘導体を、上記のように質量分析計で検出する。これによりGSH誘導体由来のイオン強度及び座標を得ることができる。レーザーの照射位置、角度を変えて測定することにより、試料の各箇所のGSHの相対的な量を測定することができる。従って、試料におけるGSHの分布を可視化することができる。  
【００３４】
本発明の一実施態様においては、多段階MSIをポジティブモードで行うことができる。GSHをMSIで検出しようとした場合、GSHがチオール基およびカルボキシル基を有することから、従来は、ネガティブモードでの測定が試みられてきた。従って、ポジティブモードの多段階MSIを行うことによりGSHの分布を好適に測定できることはこれまで全く知られておらず、従来技術から予想し得ない事項である。ポジティブモード（ポジティブイオンモード）とは、測定対象の化合物又はそのフラグメントの正イオンを発生、検出する方法をいい、ネガティブモード（ネガティブイオンモード）とは、測定対象の化合物又はそのフラグメントの負イオンを発生、検出する方法をいう。本実施形態は、誘導体化したGSHを特定のマトリックス剤を塗布した試料から多段階MSIでイオン化し、このイオンをポジティブモード又はネガティブモードで測定することを特徴とする。  
【００３５】
多段階MSI工程は、本発明が属する技術分野において知られている、多段階MSIをするための装置を適宜使用して行うことができる。検出器電圧、照射径、（レーザー）強度等の条件は、装置及び試料の種類等によって異なるが、例えば、検出器電圧としては、0.5〜2.1kVが好ましく、1.00〜2.10 kVがより好ましい。照射径としては、5〜100μmが好ましく、5μm〜25μmがより好ましい。（レーザー）強度としては0  〜100(注：この場合の０とは、多段階MSI装置（典型的には、本願実施例で用いたiMScope（島津製作所製））におけるレーザー高強度のメモリが０という意味で、当該装置における最弱レーザー光強度を意味する。同様に、レーザー強度の数値は、上記多段階MSI装置のメモリの数値を意味する。)が好ましく、40.0〜60.0が好ましい。多段階MSI工程により、試料におけるGSHの分布を示す画像データを得ることができる。
上記のように本発明の方法によれば、試料におけるGSHの分布を示す画像データを得ることができる。また、GSHは細胞内に高濃度に存在する抗酸化物質であり、活性酸素、フリーラジカル等による酸化ストレスに対する防御に寄与することが知られている。これに関連して、GSHの変動で評価し得る疾患があることも知られている。具体的には、癌；アルツハイマー病、パーキンソン病等の神経変異性疾患；C型肝炎、非アルコール性脂肪肝炎などの肝疾患；薬物中毒などが挙げられる。従って、本発明の方法により得られる試料におけるGSHの分布を示す画像データは、上記疾患の診断に有用である。従って、本発明の方法は、診断用データの取得方法として使用することもできる。GSHの変動で評価し得る疾患としては、特に限定されないが、癌、神経変異疾患、免疫疾患、薬物中毒等が挙げられる。癌としては、例えば、肺癌、大腸癌（直腸癌、結腸癌）、小腸癌、胃癌、肝癌臓、膵臓癌、胆嚢癌、胆管癌、喉頭癌、皮膚癌、子宮癌、脳腫瘍、腎臓癌、前立腺癌、卵巣癌、脾臓癌、甲状腺癌、筋肉腫、食道癌、乳癌、膀胱癌等の固形癌；悪性リンパ腫等が挙げられる。  
【００３６】
また、本発明の一実施態様としては、
（１）試料にＳＨ基酸化保護剤を噴霧する工程、
（２）ＳＨ基酸化保護剤を噴霧した試料にマトリックス剤を塗布する工程、及び
（３）マトリックス剤を塗布した試料をネガティブモードの多段階MSIに供する工程を含む、MSIにより生体組織上のGSH分布を測定する方法であって、
マトリックス剤がDHB及び1,5-DANからなる群より選択される少なくとも１種を含む、方法を提供する。  
【００３７】
当該実施形態においては、ネガティブモードの多段階MSIを用いた場合であっても、マトリックス剤として上記のものを使用することにより、MSIを用いて、試料上のGSH分布を精度良く測定する方法を提供することができる。  
【００３８】
多段階MSIをネガティブモードで行うこと及びマトリックス剤として上記のものを用いる以外の条件、例えば、測定試料、ＳＨ基酸化保護剤の種類、量、マトリックス剤の塗布方法、多段階MSIにおける当該実施形態における検出器電圧、照射径、（レーザー）強度等の条件等は、ポジティブモードで多段階MSIを行う実施形態において前述したのと同様のものを採用し得る。  
【００３９】
また、本発明によるMALDI-MSI 測定におけるシグナルの組織表面上での強度情報は予め撮影した光学顕微鏡画像の位置情報をもとに二次元画像として再構成し、MSI 画像とすることにより、組織上の GSH の分布が明らかな画像が得られる。  
【００４０】
（２．キット）
別の実施形態において本発明は、ＳＨ基酸化保護剤及びマトリックス剤を備える、ポジティブモードの多段階MSIにより生体組織上でのGSH分布を測定するためのキット、及びＳＨ基酸化保護剤及びマトリックス剤を備える、ネガティブモードの多段階MSIにより生体組織上でのGSH分布を測定するためのキットであって、
マトリックス剤がCHCA、DHB及び1,5-DANからなる群より選択される少なくとも１種を含む、キット
を提供する。  
【００４１】
ＳＨ基酸化保護剤、マトリックス剤、多段階MSIの用語の意味等は、前記と同様である。本発明のキットは、前述のGSH分布の測定方法等に用いることができる。また、本発明のキットには、必要に応じて他の成分を含めることができる。他の成分としては、例えば検体を採取するための道具、ＳＨ基酸化保護剤及び／又はマトリックス剤を各工程に使用する装置に移すためのシリンジ、ポジティブコントロール試料、ネガティブコントロール試料等が挙げられるが、これに限定されない。前述の本発明方法を行うための手順を書き記した指示書等を含むこともできる。  
【００４２】
以下、実施例を用いて本発明の一実施形態を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されない。
【実施例】
【００４３】
略語
本実施例で用いた略語の説明は以下の通り：
MALDI-MSI: matrix assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry imaging; マトリックス支援レーザー脱離イオン化-イメージング質量分析 
NEM: N-methylmaleimide; N-メチルマレイミド
CHCA: α-cyano-4-hydroxycinnamic acid; α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸GSH: glutathione; グルタチオン
GSH-NEM: NEM誘導体化 GSH
MS/MS: mass spectrometry/mass spectrometry; タンデム質量分析
実施例１
材料および方法
［MALDI-MSI 用試薬］
メタノールは関東化学社より購入し、NEM は東京化成工業社より購入した。また、CHCA は メルク（旧Sigma-Aldrich）社より購入した。  【００４４】
［動物組織］
本実施例に用いる組織切片は C57BL/6J マウス（雌、7ヶ月齢；日本エスエルシー社より購入）より作成した。全てのマウスの扱い及び実験は東北大学大学院医学系研究科及び動物実験専門委員会のガイドラインに従って行った。  【００４５】
［組織上誘導体化および MALDI-MSI 用試料の調製］
マウス未固定凍結脳組織をクリオスタット （CM3050S; Leica Microsystems社製）を用いて厚さ 8 μmの凍結切片とし、インジウムスズ酸化物コートスライドグラス（SI0100N; 松浪硝子工業社製）に貼り付けてシリカゲルを含む 50 mLプラスチックチューブ中で乾燥させた。次にスライドグラス上の組織切片に NEM の 100 mM 15% (v/v) メタノール溶液をエアブラシ（Mr. hobby Procon boy FWA Platinum 0.2 double action; GSIクレイオス社製）を用いてスプレーした。スプレーと自然乾燥を繰り返した。スライドグラス 1 枚当たりのスプレー量は 100 μLとし、全量をスプレーするのに約 30 分を要するようニードルストッパーを調節した。全ての NEM 溶液をスライドグラス上にスプレーした後室温で 1 時間放置し、組織切片に含まれるGSHの誘導体化反応を完了した。この試料にマトリックスとして CHCA を自動前処理装置 iMLayer (島津製作所製) を用いて0.7 μmの厚さで蒸着して MALDI-MSI 用試料とした。対照実験として NEM による誘導体化を行わないこと以外は上記したことと同様にして得た切片に CHCA を 上記と同様の方法により0.7 μm の厚さで蒸着した試料を調製した。  【００４６】
[MS/MS を利用しない MALDI-MSI 測定法]
CHCA 蒸着後の試料に対して速やかに質量顕微鏡 iMScope（島津製作所製）を用いてMALDI- MSI 測定を行った。MS/MS を利用しない MALDI-MSI 測定条件は以下の通りである。イオン種: 陽イオン、測定範囲: m/z  300〜315（非誘導体化試料）、 m/z 400〜500（誘導体化試料）、積算回数: 1 回/pixel、サンプル電圧: 3.50 kV、検出器電圧: 2.10 kV、 MS段数: 1。レーザー照射条件は以下の通りである。照射回数: 100 shots、繰り返し周波数: 1000 Hz、照射径: 2 (25μm)、強度: 48.0。  【００４７】
[MS/MSを利用した MALDI-MSI 測定法]
MS/MS を利用した MALDI-MSI 測定条件は以下の通りである。イオン種: 陽イオン、測定範囲: m/z  85〜315 （非誘導体化試料）、m/z  250〜435 （誘導体化試料）、積算回数: 1 回/pixel、サンプル電圧: 3.50 kV、検出器電圧: 2.10 kV、 MS段数: 2、CID: ON、プリカーサ: m/z 308.09 （非誘導体化試料）、433.14 （誘導体化試料）、幅: 2.0000 amu、エネルギー: 50%（非誘導体化試料）、120 （誘導体化試料）、ガス量: 50%、アイソレーション時間: 20 msec、CID時間: 30 msec。レーザー照射条件は以下の通りである。照射回数: 100 shots、繰り返し周波数: 1000 Hz、照射径: 2 (25 μm)、強度: 50.0。  【００４８】
[解析]
MALDI-MSI 測定におけるシグナルの組織表面上での強度情報は予め撮影した光学顕微鏡画像の位置情報をもとに二次元画像として再構成し、MSI 画像を得た。解析ソフトウエアは Imaging MS Solution（島津製作所製）を用いた。  【００４９】
[結果]
MS/MS を利用しない MALDI-MSI 測定において GSHの水素付加イオンのシグナルは m/z 308.10、GSH-NEM の水素付加イオンのシグナルは m/z 433.14に観測された。MS/MS を利用した MALDI-MSI 測定において GSH をプリカーサーに選択したプロダクトイオンのシグナルは m/z 179.05、GSH-NEM をプリカーサーに選択したプロダクトイオンのシグナルは m/z 304.10 に観測された（図２、図３ A〜D）。非誘導体化試料の MS/MS を利用しない MALDI-MSI 測定では測定範囲内全域において CHCA 由来の強いシグナルが観測され、GSH の組織上分布が明らかな画像は得られなかった（図３ A）。非誘導体化試料の MS/MS を利用した MALDI-MSI 測定および誘導体化試料の MS/MS を利用しない MALDI-MSI 測定では組織上特異的にシグナルが観測されたものの、強度が小さく良好な画像は得られなかった（図３ B, C）。一方、誘導体化試料の MS/MS を利用した MALDI-MSI 測定では十分なシグナル強度で組織上の GSH の分布が明らかな画像が得られた。（図３ D）。  【００５０】
実施例２
CHCA を1.5 μmの厚さで蒸着する以外、実施例１と同様にして、試料の調製、前処理を行い、誘導体化試料の MS/MSを利用した MALDI-MSI 測定を行った。結果を図４に示す。図４に示すように、CHCAの厚みを1.5 μmとし、レーザー強度を54とした場合、当該厚みを0.7μmとした場合（図３Ｄ）よりもさらにシグナル強度が向上し、試料表面のGSHの分布がより鮮明となった。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明の方法により、生体組織上のGSH分布を精度良く測定する方法を提供することができる。前述のように、GSHの変動により様々な疾患の評価を行うことができるため、本発明は、特に医療等の技術分野において、高い産業上利用可能性を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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