(57)【要約】  未分化細胞の段階で、細胞が分化したときに未分化細胞が混入する可能性を予測する手法を提供する。下記の(i)及び／又は(ii)を測定することにより、未分化細胞の分化抵抗性を評価する。(i)ZNF354C、C12orf56、ZNF578、DPP6及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベル及び／又はプロモーター活性(ii) ZNF354C、C12orf56、ZNF578、DPP6及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のプロモーターのメチル化状態
2020149391.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の(i)及び／又は(ii)を測定することを含む、未分化細胞の分化抵抗性を評価する方法。
(i)ZNF354C、C12orf56、ZNF578、DPP6及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベル及び／又はプロモーター活性
(ii) ZNF354C、C12orf56、ZNF578、DPP6及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のプロモーターのメチル化状態
【請求項２】
ZNF354C、C12orf56、ZNF578及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベル及び／又はプロモーター活性が高い場合に、未分化細胞の分化抵抗性が低いと評価し、ZNF354C、C12orf56、ZNF578及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベル及び／又はプロモーター活性が低い場合に、未分化細胞の分化抵抗性が高いと評価する請求項１記載の方法。
【請求項３】
DPP6の発現レベル及び／又はプロモーター活性が高い場合に、未分化細胞の分化抵抗性が高いと評価し、DPP6の発現レベル及び／又はプロモーター活性が低い場合に、未分化細胞の分化抵抗性が低いと評価する請求項１記載の方法。
【請求項４】
ZNF354C、C12orf56、ZNF578及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のプロモーターのメチル化状態が低い場合に、未分化細胞の分化抵抗性が低いと評価し、ZNF354C、C12orf56、ZNF578及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のプロモーターのメチル化状態が高い場合に、未分化細胞の分化抵抗性が高いと評価する請求項１記載の方法。
【請求項５】
DPP6のプロモーターのメチル化状態が低い場合に、未分化細胞の分化抵抗性が高いと評価し、DPP6のプロモーターのメチル化状態が高い場合に、未分化細胞の分化抵抗性が低いと評価する請求項１記載の方法。
【請求項６】
未分化細胞が、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）又は胚性生殖細胞（ＥＧ細胞)である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
遺伝子の発現レベルをmRNAの量又はタンパク質の量として測定する請求項１〜３又は６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
遺伝子の発現レベルを測定する方法が、qPCR、デジタルPCR、免疫染色、in situ hybridization、RNAシークエンス、マイクロアレイ、NanoString、抗体アレイ、FlowCytometry、質量分析又はそれらの組み合わせである請求項７記載の方法。
【請求項９】
遺伝子のプロモーターのメチル化状態を測定する方法が、メチル化 DNA を濃縮した後に、濃縮されたDNAを検出する方法、バイサルファイト処理による塩基置換した後の塩基配列を解読(シークエンス)する方法、バイサルファイト処理による塩基置換した後の塩基配列をハイブリダイゼーションにより検出する方法、メチル化特異的PCR(MSP)法、メチル化感受性の制限酵素による切断の有無で検出する方法、メチル化シトシンをグルコシル化し、グルコシル化シトシン感受性の酵素で検出する方法又はそれらの組み合わせである請求項１、４〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
未分化細胞集団における、下記の(i)及び／又は(ii)を測定することによって、分化抵抗性の低いあるいは高い未分化細胞株を選別する方法。
(i)ZNF354C、C12orf56、ZNF578、DPP6及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベル及び／又はプロモーター活性
(ii) ZNF354C、C12orf56、ZNF578、DPP6及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のプロモーターのメチル化状態
【請求項１１】
ZNF354C、C12orf56、ZNF578及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベル及び／又はプロモーター活性が高い場合に、分化抵抗性が低い未分化細胞株として選別し、ZNF354C、C12orf56、ZNF578及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベル及び／又はプロモーター活性が低い場合に、分化抵抗性が高い未分化細胞株として選別する請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
DPP6の発現レベル及び／又はプロモーター活性が高い場合に、分化抵抗性が高い未分化細胞株として選別し、DPP6の発現レベル及び／又はプロモーター活性が低い場合に、分化抵抗性が低い未分化細胞株として選別する請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
ZNF354C、C12orf56、ZNF578及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のプロモーターのメチル化状態が低い場合に、分化抵抗性が低い未分化細胞株として選別し、ZNF354C、C12orf56、ZNF578及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のプロモーターのメチル化状態が高い場合に、分化抵抗性が高い未分化細胞株として選別する請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
DPP6のプロモーターのメチル化状態が低い場合に、分化抵抗性が高い未分化細胞株として選別し、DPP6のプロモーターのメチル化状態が高い場合に、分化抵抗性が低い未分化細胞株として選別する請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
未分化細胞株が、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）株、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）株、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）株又は胚性生殖細胞（ＥＧ細胞)株である請求項１０〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
未分化細胞集団中に存在する、分化抵抗性の低いあるいは高い未分化細胞を検出するために、ZNF354C、C12orf56、ZNF578、DPP6及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子をマーカーとして使用する方法。
【請求項１７】
下記の(i)及び／又は(ii)を測定可能な試薬を含む、未分化細胞の分化抵抗性を評価するためのキット。
(i)ZNF354C、C12orf56、ZNF578、DPP6及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベル及び／又はプロモーター活性
(ii) ZNF354C、C12orf56、ZNF578、DPP6及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のプロモーターのメチル化状態
【請求項１８】
遺伝子の発現レベルを測定可能な試薬が、プライマー、プローブ又は抗体である請求項１７記載のキット。
【請求項１９】
遺伝子のプロモーター活性を測定可能な試薬が、プロモーター下流にレポータータンパク質を連結した遺伝子配列又はこの遺伝子配列を組み込んだベクターである請求項１７記載のキット。
【請求項２０】
遺伝子のプロモーターのメチル化状態を測定可能な試薬が、バイサルファイト（亜硫酸水素塩）、メチル化解析用マイクロアレイ試薬、Sanger法によるシークエンス試薬、次世代シークエンサー用シークエンス試薬、5-mC抗体、5-hmC抗体、メチルアデノシン抗体、5’-methyl-2’-deoxycytidine抗体、HRP標識DNA抗体、5-hmC グルコシルトランスフェラーゼ、グルコシル-5hmC感受性制限酵素エンドヌクレアーゼ、MBD1 (Methyl-CpG Binding Domain Protein1)、MBD2 (Methyl-CpG Binding Domain Protein2)、特異的PCRプライマー、特異的プローブ又はDNA精製キットである請求項１７記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、未分化細胞の分化抵抗性評価法に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療に用いる未分化多能性幹細胞の分化抵抗性、すなわち分化誘導した細胞集団における未分化細胞の残存/混入のしやすさを評価することは癌化リスクの観点から極めて重要である。【０００３】
未分化細胞の分化抵抗性(分化しにくさ)の関与についてはDNAメチル化および遺伝子発現の報告がある（非特許文献１、２）。【０００４】
また、これまでに、分化細胞での未分化iPS細胞の残存/混入を検出、評価する手法は報告があるが（非特許文献３、４）、未分化iPS細胞の段階で未分化細胞の残存/混入リスクを評価する手法は存在しない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 ;110(51):20569-74.
【非特許文献２】Cell Stem Cell. 2016; 19(3):341-54.
【非特許文献３】PLoS One. 2012;7(5):e37342.
【非特許文献４】PLoS One. 2014 27;9(10):e110496.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来技術の中で、再培養法は混入する未分化iPS細胞からコロニーを形成させるため正確性が高いという利点が有る一方、検出までに1週間以上かかることから、定量PCRを用いた方法が簡便・迅速に実施可能な点で優れている。
また、分化細胞に未分化細胞が残存するか否かは、分化過程だけで無く、未分化iPS細胞の段階ですでに規定されていると考えられる。実際に、iPS細胞のクローンによって分化抵抗性があることが報告されており、分化抵抗性クローンに特徴的なメチル化や発現遺伝子も解析されている。
一方、本発明者らの研究から、分化能が高いiPS細胞クローンであっても継代を重ねることなどによって、分化能に変化が生じ、未分化iPS細胞が混入しやすくなる場合が有ることが明らかとなってきた。したがって、分化能が良好なクローンであっても、未分化iPS細胞混入リスクを日常的に評価することが重要である。
しかしながら、これまでに未分化iPS細胞の段階で分化細胞に未分化iPS細胞が混入する可能性を予測する手法は存在しなかった。
本発明は、未分化細胞の段階で、細胞が分化したときに未分化なままの細胞が残存/混入する可能性を予測する手法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明では未分化細胞を対象とし、分化誘導した際に分化細胞に未分化iPS細胞が残存/混入するリスクを評価するためのマーカー遺伝子の同定を行った。【０００８】
継代回数などが異なる同一iPS細胞クローンの分化細胞における未分化iPS細胞残存量を評価し、未分化iPS細胞が残存するiPS細胞と残存しないiPS細胞におけるDNAメチル化解析を実施し、DNAメチル化状態に差が有る遺伝子について、未分化残存と相関する遺伝子を特定した。
その結果、ZNF354C, C12orf56, ZNF578, MIR886は未分化iPS細胞が残存しないiPS細胞において発現が有り、DPP6は未分化iPS細胞が残存するiPS細胞において発現することを見出した。さらに、メチル化解析に用いなかった別のiPS細胞クローンにおいても、これらクローンの分化細胞における未分化iPS細胞残存の有無と、今回同定した遺伝子の発現に相関が有ることが明らかとなった。【０００９】
これら遺伝子を用いることで、従来評価不可能であった未分化iPS細胞段階で、分化誘導した細胞への未分化iPS細胞の残存/混入の予測が可能となる。この手法は、iPS細胞だけでなく、ES細胞など他の未分化細胞についても応用可能である。【００１０】
本発明の要旨は以下の通りである。
（１）下記の(i)及び／又は(ii)を測定することを含む、未分化細胞の分化抵抗性を評価する方法。
(i)ZNF354C、C12orf56、ZNF578、DPP6及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベル及び／又はプロモーター活性
(ii) ZNF354C、C12orf56、ZNF578、DPP6及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のプロモーターのメチル化状態
（２）ZNF354C、C12orf56、ZNF578及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベル及び／又はプロモーター活性が高い場合に、未分化細胞の分化抵抗性が低いと評価し、ZNF354C、C12orf56、ZNF578及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベル及び／又はプロモーター活性が低い場合に、未分化細胞の分化抵抗性が高いと評価する（１）記載の方法。
（３）DPP6の発現レベル及び／又はプロモーター活性が高い場合に、未分化細胞の分化抵抗性が高いと評価し、DPP6の発現レベル及び／又はプロモーター活性が低い場合に、未分化細胞の分化抵抗性が低いと評価する（１）記載の方法。
（４）ZNF354C、C12orf56、ZNF578及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のプロモーターのメチル化状態が低い(メチル化状態が高いと発現(=プロモーター活性)が低いため)場合に、未分化細胞の分化抵抗性が低いと評価し、ZNF354C、C12orf56、ZNF578及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のプロモーターのメチル化状態が高い(メチル化状態が高いと発現が低いため)場合に、未分化細胞の分化抵抗性が高いと評価する（１）記載の方法。
（５）DPP6のプロモーターのメチル化状態が低い場合に、未分化細胞の分化抵抗性が高いと評価し、DPP6のプロモーターのメチル化状態が高い場合に、未分化細胞の分化抵抗性が低いと評価する（１）記載の方法。
（６）未分化細胞が、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）又は胚性生殖細胞（ＥＧ細胞)である（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）遺伝子の発現レベルをmRNAの量又はタンパク質の量として測定する（１）〜（３）又は（６）のいずれかに記載の方法。
（８）遺伝子の発現レベルを測定する方法が、qPCR、デジタルPCR、免疫染色、in situ hybridization、RNAシークエンス、マイクロアレイ、NanoString、抗体アレイ、FlowCytometry、質量分析又はそれらの組み合わせである（７）記載の方法。
（９）遺伝子のプロモーターのメチル化状態を測定する方法が、メチル化 DNA を濃縮した後に、濃縮されたDNAを検出する方法、バイサルファイト処理による塩基置換した後の塩基配列を解読(シークエンス)する方法、バイサルファイト処理による塩基置換した後の塩基配列をハイブリダイゼーションにより検出する方法、メチル化特異的PCR(MSP)法、メチル化感受性の制限酵素による切断の有無で検出する方法、メチル化シトシンをグルコシル化し、グルコシル化シトシン感受性の酵素で検出する方法又はそれらの組み合わせである（１）、（４）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（１０）未分化細胞集団における、下記の(i)及び／又は(ii)を測定することによって、分化抵抗性の低いあるいは高い未分化細胞株を選別する方法。
(i)ZNF354C、C12orf56、ZNF578、DPP6及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベル及び／又はプロモーター活性
(ii) ZNF354C、C12orf56、ZNF578、DPP6及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のプロモーターのメチル化状態
（１１）ZNF354C、C12orf56、ZNF578及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベル及び／又はプロモーター活性が高い場合に、分化抵抗性が低い未分化細胞株として選別し、ZNF354C、C12orf56、ZNF578及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベル及び／又はプロモーター活性が低い場合に、分化抵抗性が高い未分化細胞株として選別する（１０）記載の方法。
（１２）DPP6の発現レベル及び／又はプロモーター活性が高い場合に、分化抵抗性が高い未分化細胞株として選別し、DPP6の発現レベル及び／又はプロモーター活性が低い場合に、分化抵抗性が低い未分化細胞株として選別する（１０）記載の方法。
（１３）ZNF354C、C12orf56、ZNF578及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のプロモーターのメチル化状態が低い場合に、分化抵抗性が低い未分化細胞株として選別し、ZNF354C、C12orf56、ZNF578及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のプロモーターのメチル化状態が高い場合に、分化抵抗性が高い未分化細胞株として選別する（１０）記載の方法。
（１４）DPP6のプロモーターのメチル化状態が低い場合に、分化抵抗性が高い未分化細胞株として選別し、DPP6のプロモーターのメチル化状態が高い場合に、分化抵抗性が低い未分化細胞株として選別する（１０）記載の方法。
（１５）未分化細胞株が、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）株、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）株、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）株又は胚性生殖細胞（ＥＧ細胞)株である（１０）〜（１４）のいずれかに記載の方法。
（１６）未分化細胞集団中に存在する、分化抵抗性の低いあるいは高い未分化細胞を検出するために、ZNF354C、C12orf56、ZNF578、DPP6及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子をマーカーとして使用する方法。
（１７）下記の(i)及び／又は(ii)を測定可能な試薬を含む、未分化細胞の分化抵抗性を評価するためのキット。
(i)ZNF354C、C12orf56、ZNF578、DPP6及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベル及び／又はプロモーター活性
(ii) ZNF354C、C12orf56、ZNF578、DPP6及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のプロモーターのメチル化状態
（１８）遺伝子の発現レベルを測定可能な試薬が、プライマー、プローブ又は抗体である（１７）記載のキット。
（１９）遺伝子のプロモーター活性を測定可能な試薬が、プロモーター下流にレポータータンパク質を連結した遺伝子配列又はこの遺伝子配列を組み込んだベクターである（１７）記載のキット。
（２０）遺伝子のプロモーターのメチル化状態を測定可能な試薬が、バイサルファイト（亜硫酸水素塩）、メチル化解析用マイクロアレイ試薬、Sanger法によるシークエンス試薬、次世代シークエンサー用シークエンス試薬、5-mC抗体、5-hmC抗体、メチルアデノシン抗体、5’-methyl-2’-deoxycytidine抗体、HRP標識DNA抗体、5-hmC グルコシルトランスフェラーゼ、グルコシル-5hmC感受性制限酵素エンドヌクレアーゼ、MBD1 (Methyl-CpG Binding Domain Protein1)、MBD2 (Methyl-CpG Binding Domain Protein2)、特異的PCRプライマー、特異的プローブ又はDNA精製キットである（１７）記載のキット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、未分化細胞（例えば、未分化多能性幹細胞）の良否の早期判定による製造コストの抑制および未分化細胞から形成されるオルガノイド（例えば、肝臓器官芽(iPS細胞肝芽など)）の安全性の確保が達成される。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2019‐005892の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】各マーカー遺伝子の発現量と、再培養法にて評価した肝内胚葉細胞(HE)での残存未分化iPS細胞数の相関。未分化残存しやすい株では、再培養法で未分化iPS細胞の残存が見られ、未分化残存し難い株では未分化残存しやすい株で、未分化iPS細胞の残存が検出されない。各マーカー遺伝子は未分化残存した時(未分化残存し難い株)と未分化残存しなかった時(未分化残存しやすい株)の間で明確な発現の違いが有る。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
本発明は、下記の(i)及び／又は(ii)を測定することを含む、未分化細胞の分化抵抗性を評価する方法を提供する。
(i)ZNF354C、C12orf56、ZNF578、DPP6及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベル及び／又はプロモーター活性
(ii) ZNF354C、C12orf56、ZNF578、DPP6及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のプロモーターのメチル化状態
発現レベル、プロモーター活性及びプロモーターのメチル化状態を測定する遺伝子は、１種類であってもよいし、２種類以上の組み合わせでもよい。
【００１５】
評価の対象とする未分化細胞は、多能性を有する細胞であるとよく、例えば、未分化細胞は、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性生殖細胞(EG細胞)である。未分化細胞は、ヒトあるいはヒト以外のいかなる動物に由来するものであってもよい。
【００１６】
本明細書において、「分化抵抗性」とは、分化しにくさをいい、肝細胞への分化しにくさであることが好ましい。
未分化細胞の分化抵抗性は、細胞株によって異なることが知られているが、継代回数、継代方法や継代時の細胞密度などの培養条件によって、変化する可能性がある。あるいは培養用基質や培地によっても変化する可能性がある。
分化抵抗性は、分化誘導後に一定の細胞数の分化細胞を再播種し、未分化培養条件下で培養し、増殖したコロニーを未分化マーカー(SOX2など)による免疫染色で、未分化iPS細胞であることを確認し、1コロニーを1個の未分化iPS細胞であるとして算出することで評価できる。
【００１７】
ZNF354C、C12orf56、ZNF578及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベル及び／又はプロモーター活性が高い場合に、未分化細胞の分化抵抗性が低いと評価し、ZNF354C、C12orf56、ZNF578及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベル及び／又はプロモーター活性が低い場合に、未分化細胞の分化抵抗性が高いと評価することができる。
【００１８】
DPP6の発現レベル及び／又はプロモーター活性が高い場合に、未分化細胞の分化抵抗性が高いと評価し、DPP6の発現レベル及び／又はプロモーター活性が低い場合に、未分化細胞の分化抵抗性が低いと評価することができる。
【００１９】
ZNF354C、C12orf56、ZNF578及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のプロモーターのメチル化状態が低い場合に、未分化細胞の分化抵抗性が低いと評価し、ZNF354C、C12orf56、ZNF578及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のプロモーターのメチル化状態が高い場合に、未分化細胞の分化抵抗性が高いと評価することができる。
【００２０】
DPP6のプロモーターのメチル化状態が低い場合に、未分化細胞の分化抵抗性が高いと評価し、DPP6のプロモーターのメチル化状態が高い場合に、未分化細胞の分化抵抗性が低いと評価することができる。
【００２１】
本明細書において、遺伝子の発現レベルが「高い」あるいは「低い」とは、未分化細胞の分化抵抗性の高いものと低いものを判別できる所定の数値よりも高いあるいは低いことを意味する。その数値は、求める感度や特異度によって異なるものであり、また、未分化細胞の種類（例えば、iPS細胞かES細胞かといった違い）、細胞のクローンの違いなどによって変化しうる。遺伝子のプロモーター活性が「高い」あるいは「低い」、メチル化状態の「高い」あるいは「低い」も同様である。
【００２２】
後述の実施例での実験によれば、遺伝子の発現レベルをqPCRで測定した場合、ZNF354Cの発現レベルの値が18Sを内部標準としたとき2x10^-7以上である場合に、未分化細胞の分化抵抗性が低いと評価でき、ZNF354Cの発現レベルの値が18Sを内部標準としたとき1x10^-7以下又は未満である場合に、未分化細胞の分化抵抗性が高いと評価できる。同じ測定法によれば、C12orf56の発現レベルの値が18Sを内部標準としたとき2.5x10^-7以上、ZNF578の発現レベルの値が18Sを内部標準としたとき1x10^-7以上、DPP6の発現レベルの値が18Sを内部標準としたとき3x10^-7以下又は未満、MIR886の発現レベルの値が18Sを内部標準としたとき1x10^-6以上である場合に、未分化細胞の分化抵抗性が低いと評価でき、C12orf56の発現レベルの値が18Sを内部標準としたとき2x10^-7以下又は未満、ZNF578の発現レベルの値が18Sを内部標準としたとき5x10^-8以下又は未満、DPP6の発現レベルの値が18Sを内部標準としたとき3x10^-7以上、MIR886の発現レベルの値が18Sを内部標準としたとき1x10^-7以下又は未満である場合に、未分化細胞の分化抵抗性が高いと評価できる。
【００２３】
また、後述の実施例での実験によれば、バイサルファイト処理実施後のイルミナ社Infinium MethylationEPIC BEadChip Kitを用いて遺伝子のプロモーターのメチル化状態を測定した場合、ZNF354Cのプロモーターのメチル化状態の値が40%以下又は未満である場合に、未分化細胞の分化抵抗性が低いと評価し、ZNF354Cのプロモーターのメチル化状態の値が60%以上である場合に、未分化細胞の分化抵抗性が高いと評価することができる。同じ測定法によれば、C12orf56のプロモーターのメチル化状態の値が40%以下又は未満、ZNF578のプロモーターのメチル化状態の値が40%以下又は未満、DPP6のプロモーターのメチル化状態の値が60%以上、MIR886のプロモーターのメチル化状態の値が40%以下又は未満、である場合に、未分化細胞の分化抵抗性が低いと評価し、C12orf56のプロモーターのメチル化状態の値が60%以上、ZNF578のプロモーターのメチル化状態の値が60%以上、DPP6のプロモーターのメチル化状態の値が40%以下又は未満、MIR886のプロモーターのメチル化状態の値が60%以上である場合に、未分化細胞の分化抵抗性が高いと評価することができる。
【００２４】
遺伝子の発現レベルは、遺伝子から転写されたmRNAの量あるいはmRNAから翻訳されたタンパク質の量として測定することができる。具体的には、遺伝子の発現レベルは、qPCR、デジタルPCR、免疫染色、in situ hybridization、RNAシークエンス、マイクロアレイ、NanoString、抗体アレイ、FlowCytometry、質量分析、それらの組み合わせなどで測定することができる。
【００２５】
遺伝子のプロモーターのメチル化状態を解析する手法としては、１． 抗メチル化シトシンやアデノシン抗体などを用いてメチル化 DNA を濃縮し、濃縮後にシークエンス、マイクロアレイ、qPCR等によって、濃縮されたDNAを検出、定量する方法、２． バイサルファイト処理による塩基置換した後、塩基配列を解読(シークエンス)あるいはマイクロアレイ、MLPAR（Multiplex Ligation Probe Amplification）法等のハイブリダイズを用いて検出する方法、３．バイサルファイト処理による塩基置換した後、PCRによる増幅の有無で検出する方法（メチル化特異的PCR(MSP)法）、４． メチル化感受性の制限酵素を利用して切断の有無で検出する方法、５．メチル化シトシンをグルコシル化し、グルコシル化シトシン感受性の酵素で検出する方法等があり、これらのいずれかの方法あるいはその組み合わせなどを用いることができる。
【００２６】
未分化細胞集団における、上記の(i)及び／又は(ii)を測定することによって、分化抵抗性の低いあるいは高い未分化細胞株を選別することができる。よって、本発明は、未分化細胞集団における、下記の(i)及び／又は(ii)を測定することによって、分化抵抗性の低いあるいは高い未分化細胞株を選別する方法を提供する。
(i)ZNF354C、C12orf56、ZNF578、DPP6及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベル及び／又はプロモーター活性
(ii) ZNF354C、C12orf56、ZNF578、DPP6及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のプロモーターのメチル化状態
発現レベル、プロモーター活性及びプロモーターのメチル化状態を測定する遺伝子は、１種類であってもよいし、２種類以上の組み合わせでもよい。
【００２７】
選別の対象とする未分化細胞株は、多能性を有する細胞株であるとよく、例えば、未分化細胞株は、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）株、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）株、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）株又は胚性生殖細胞（ＥＧ細胞)株であり、ｉＰＳ細胞株が好ましい。未分化細胞株は、ヒトあるいはヒト以外のいかなる動物に由来するものであってもよい。
【００２８】
ZNF354C、C12orf56、ZNF578及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベル及び／又はプロモーター活性が高い場合に、分化抵抗性が低い未分化細胞株として選別し、ZNF354C、C12orf56、ZNF578及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベル及び／又はプロモーター活性が低い場合に、分化抵抗性が高い未分化細胞株として選別することができる。
【００２９】
DPP6の発現レベル及び／又はプロモーター活性が高い場合に、分化抵抗性が高い未分化細胞株として選別し、DPP6の発現レベル及び／又はプロモーター活性が低い場合に、分化抵抗性が低い未分化細胞株として選別することができる。
【００３０】
ZNF354C、C12orf56、ZNF578及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のプロモーターのメチル化状態が低い場合に、分化抵抗性が低い未分化細胞株として選別し、ZNF354C、C12orf56、ZNF578及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のプロモーターのメチル化状態が高い場合に、分化抵抗性が高い未分化細胞株として選別することができる。
【００３１】
DPP6のプロモーターのメチル化状態が低い場合に、分化抵抗性が高い未分化細胞株として選別し、DPP6のプロモーターのメチル化状態が高い場合に、分化抵抗性が低い未分化細胞株として選別することができる。
【００３２】
遺伝子の発現レベル、プロモーター活性及び遺伝子のプロモーターのメチル化状態の「高い」あるいは「低い」については上述した通りである。
【００３３】
ZNF354C、C12orf56、ZNF578、DPP6及びMIR886は、未分化細胞集団中に存在する、分化抵抗性の低いあるいは高い未分化細胞を検出するためのマーカー遺伝子として使用できる。よって、本発明は、未分化細胞集団中に存在する、分化抵抗性の低いあるいは高い未分化細胞を検出するために、ZNF354C、C12orf56、ZNF578、DPP6及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子をマーカーとして使用する方法を提供する。
マーカーとして使用する遺伝子は、１種類であってもよいし、２種類以上の組み合わせでもよい。
【００３４】
また、本発明は、下記の(i)及び／又は(ii)を測定可能な試薬を含む、未分化細胞の分化抵抗性を評価するためのキットを提供する。
(i)ZNF354C、C12orf56、ZNF578、DPP6及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベル及び／又はプロモーター活性
(ii) ZNF354C、C12orf56、ZNF578、DPP6及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のプロモーターのメチル化状態
発現レベル、プロモーター活性及びプロモーターのメチル化状態を測定する遺伝子は、１種類であってもよいし、２種類以上の組み合わせでもよい。
【００３５】
遺伝子の発現レベルを測定可能な試薬としては、プライマー、プローブ及び抗体などを挙げることができ、例えば、ZNF354C、C12orf56、ZNF578、DPP6及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の転写産物（mRNA）又はcDNAを特異的に増幅できるオリゴヌクレオチドプライマーのセット、ZNF354C、C12orf56、ZNF578、DPP6及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の転写産物（mRNA）又はcDNAに特異的にハイブリダイズするヌクレオチドプローブ、ZNF354C、C12orf56、ZNF578、DPP6及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の転写産物（mRNA）から翻訳されたタンパク（翻訳産物）に特異的に結合する抗体である。オリゴヌクレオチドプライマーのセットは、ZNF354C、C12orf56、ZNF578、DPP6及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の転写産物（mRNA）又はcDNAのヌクレオチド配列中の標的配列（通常、５０〜１８０ｂｐ程度）を増幅できるものであるとよく、標的配列の両末端と相補的な配列を有するように設計されるとよい。オリゴヌクレオチドプライマーの長さは、例えば、１５〜３５ヌクレオチドであるとよく、１８〜２７ヌクレオチドが好ましい。ヌクレオチドプローブは、ZNF354C、C12orf56、ZNF578、DPP6及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の転写産物（mRNA）又はcDNAにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものであるとよく、前記mRNA又はcDNAのヌクレオチド配列の一部又は全部又はそれに相補的な配列を有するように設計されるとよい。ストリンジェントな条件は適宜決定することができる。ヌクレオチドプローブの長さは、通常１０００ヌクレオチド以下、好ましくは、１００ヌクレオチド以下、より好ましくは５０ヌクレオチド以下、さらにより好ましくは、１４〜３０ヌクレオチドである。ヌクレオチドプローブは、一本鎖であっても、二本鎖であってもよい。抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれであってもよい。本明細書において、抗体とは、全長抗体の他、Fab、F(ab)’2、ScFv、Diabody、VH、VL、Sc(Fv)2、Bispecific sc(Fv)2、Minibody、ScFv-Fc monomer、ScFv-Fc dimerなどの低分子化されたものも含む概念である。プローブや抗体は、固相（例えば、基板、ビーズ、膜など）上に固定されていてもよい。
【００３６】
本発明の試薬は標識されてもよい。例えば、プライマーは、蛍光物質や消光物質などにより標識されていてもよく、プローブ及び抗体は、放射性同位元素、酵素、発光物質、蛍光物質、ビオチンなどで標識されてもよい。また、ターゲット分子（本発明では、ZNF354C、C12orf56、ZNF578、DPP6及びMIR886からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現産物であるタンパク質）に特異的に結合する一次抗体の反応後、この一次抗体に結合する二次抗体を反応させて、ターゲット分子の検出を行う場合には、二次抗体を標識するとよい（一次抗体は標識しない）。
【００３７】
遺伝子のプロモーター活性を測定可能な試薬としては、プロモーター下流にレポータータンパク質を連結した遺伝子配列又はこの遺伝子配列を組み込んだベクターなどを挙げることができる。レポータータンパク質としては、ルシフェラーゼ、GFPなどの蛍光タンパク質、CD抗原などの細胞膜に発現するタンパク質などを例示することができる。ベクターはプラスミドベクターが好ましい。
【００３８】
遺伝子のプロモーターのメチル化状態を測定可能な試薬としては、バイサルファイト（亜硫酸水素塩）、Illumina 社 Infinium MethylationEPIC BeadChip等のメチル化解析用マイクロアレイ試薬、Sanger法によるシークエンス試薬、次世代シークエンサー用シークエンス試薬、5-mC抗体、5-hmC抗体、メチルアデノシン抗体、5’-methyl-2’-deoxycytidine抗体、HRP標識DNA抗体、5-hmC グルコシルトランスフェラーゼ、グルコシル-5hmC感受性制限酵素エンドヌクレアーゼ（GSRE: MspI、GlaI、Csp6I、HaeIII、TaqαI、MboI、McrBC)、MBD1 (Methyl-CpG Binding Domain Protein1)、MBD2 (Methyl-CpG Binding Domain Protein2)、特異的PCRプライマー、特異的プローブ又はDNA精製キットなどを例示することができる。
【００３９】
本発明のキットは、さらに、プライマーで検出するための試薬（ＤＮＡポリメラーゼ、バッファー、マグネシウムイオン、ｄＮＴＰｓ、プローブなど）、プローブで検出するための試薬（バッファー、抗体、基質など）、抗体で検出するための試薬（二次抗体、基質、バッファーなど）、遺伝子のプロモーター活性を測定するための試薬（バッファー、発光基質、抗体など）、器具（反応容器、ピペットなど）、キットの使用説明書、対照用の試料、測定結果を解析するための対照データなどを含んでもよい。
【００４０】
本発明のマーカー遺伝子（ZNF354C、C12orf56、ZNF578、DPP6及びMIR886）は以下のようにして見出された。継代回数が異なる同一iPS細胞クローンの分化細胞における未分化iPS細胞残存量を評価し、未分化iPS細胞が残存するiPS細胞と残存しないiPS細胞におけるDNAメチル化解析を実施し、DNAメチル化状態に差が有る遺伝子について、分化させる前のiPS細胞時点での遺伝子発現を調べ、未分化残存し易いクローンと未分化残存し難いクローンの間で発現に相違のある遺伝子を同定する。同定された遺伝子がマーカー遺伝子の候補となる。よって、本発明は、継代回数などの培養状態が異なる同一未分化細胞クローンの分化細胞における未分化細胞残存量を評価し、未分化細胞が残存するクローンと未分化細胞が残存しないクローンにおけるDNAメチル化解析を実施し、DNAメチル化状態に差が有る遺伝子について、分化させる前の未分化細胞で遺伝子発現を調べ、未分化のまま残存し易いクローンと未分化のまま残存し難いクローンの間で発現に相違のある遺伝子を同定することを含む、未分化細胞集団中に存在する、分化抵抗性の低いあるいは高い未分化細胞を検出するためのマーカー遺伝子を探索する方法を提供する。"DNAメチル化状態に差が有る遺伝子"が他のクローンなどでも共通して、未分化細胞の残存と相関が有れば、遺伝子発現ではなくメチル化状態を評価することによって予測することが出来るマーカーとなる。
【００４１】
未分化細胞は、多能性を有する細胞であるとよく、例えば、未分化細胞は、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性生殖細胞(EG細胞)である。未分化細胞は、ヒトあるいはヒト以外のいかなる動物に由来するものであってもよい。
【００４２】
培養状態としては、継代回数、継代方法や継代時の細胞密度などの培養条件、培養用基質や培地などを例示することができる。
未分化細胞の継代回数は、少なくとも１回以上であればよく、未分化細胞の分化抵抗性が高い場合の継代数は、４０〜１００が好ましく、未分化細胞の分化抵抗性が低い場合の継代数は８〜３０が好ましい。iPS細胞は無限に増殖すると考えられているので継代数は何回でも無限でも可能である。
【００４３】
分化細胞は、内胚葉、中胚葉及び外胚葉のいずれの分化細胞であってもよい。内胚葉の分化細胞としては、肝内胚葉細胞などを例示することができるが、これに限定されるわけではない。中胚葉の分化細胞としては、横中隔間充織細胞、間葉系細胞、血管内皮細胞などを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。外胚葉の分化細胞としては、神経幹細胞、神経堤細胞、神経細胞などを例示することができるが、これに限定されるわけではない。
【００４４】
未分化細胞残存量の評価は後述の実施例に記載の方法で行うことができるが、これに限定されるわけではない
。
【００４５】
DNAメチル化解析、遺伝子発現の測定法は上述の通りである。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。本発明の範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕iPS細胞時点で未分化残存の評価が可能なマーカーの同定
目的
再生医療応用に資するiPS(ES)細胞由来分化細胞における未分化細胞の混入の検出および排除は、すべてのiPS(ES)細胞由来細胞加工製品の安全性の確保における重要な課題である。これまでに網膜色素上皮細胞(RPE)におけるLIN28Aの発現検証による迅速な未分化細胞の混入評価が報告されているが、我々は複数の細胞加工製品においてLIN28Aでの評価が不適であることを見出している。また、製造の最終段階における品質評価では、その時点で規格外となった場合に、時間および経済的に多大な損失が生じるという問題があり、製造の遅れは時に患者の予後をも左右することも考えられる。
iPS(ES)細胞由来細胞加工製品の安全性の確保のため、最終製品の迅速・超高感度な評価手法の開発が必要である。さらに時間的、経済的観点から製造のより早い段階すなわち、未分化iPS細胞の段階で未分化細胞が最終製品に残存する可能性を予測することが望まれる。
そこで本発明では未分化iPS細胞の段階で最終製品に残存する可能性を予測することが可能な評価手法を開発した。
これまでにiPS細胞から分化誘導した三胚葉いずれの分化細胞においても利用可能な、汎用性の高い未分化マーカーを同定している（「未分化細胞検出法」(特願2018-115025))。この研究の中で継代回数が長いiPS細胞において未分化残存が起こりやすいクローンを同定している。さらに、この未分化残存の起こりやすさはジェネティックな変異（遺伝子変異）ではなく、エピジェティックな修飾であることを強く示唆するデータを得た。そこで、未分化残存が起こりやすいiPS細胞クローンと未分化残存が起こりにくいiPS細胞クローンのDNAメチル化状態に違いがある遺伝子を抽出し、さらに定量PCRにより発現と未分化残存に相関がある遺伝子(MIR886(VTRNA2-1)、DPP6、ZNF578、C12orf56、ZNF354C)を抽出した。【００４７】
方法
[分化抵抗性評価のための未分化残存試験]
ヒトiPS細胞から肝細胞を分化誘導し、iPS細胞肝芽の作製に最適なタイミングで胚体内胚葉（DE)の2-6日後(HEとする)にPLoS One. 2014 Oct 27;9(10):e110496に記載の方法を一部改変し、ディッシュコーティング剤としてLaminin511E8(iMatrix,ニッピ)、培養培地としてStemFitを用いて1週間培養し、出現したコロニーをSOX2, TRA1-60などの未分化iPS細胞マーカーで免疫染色することにより、出現したコロニーが未分化iPS細胞コロニーであることを確認する。未分化コロニー1つは分化細胞に含まれる未分化iPS細胞1細胞より形成されたコロニーとして、分化細胞に含まれる未分化iPS細胞の細胞数を評価する。
ヒトiPS細胞から肝細胞の分化誘導はNature. 499(7459):481-4.(2013); Cell Rep. 21(10):2661-2670.(2017)、に記載の通りに行った。
[メチル化解析]
メチル化解析は各分化段階の細胞のDNA について、バイサルファイト処理実施後、イルミナ社Infinium MethylationEPIC BeadChip Kit を用いて、DNA メチル化解析を行った。
[発現定量評価]
定量PCRはNature. 499(7459):481-4.(2013); Cell Rep. 21(10):2661-2670.(2017)、に記載の通りに行った。【００４８】
結果
各マーカー遺伝子の発現量と、再培養法にて評価した肝内胚葉細胞(HE)での残存未分化iPS細胞数の相関を図１に示す。未分化残存しやすい株では、再培養法で未分化iPS細胞の残存が見られ、未分化残存し難い株では、未分化iPS細胞の残存が検出されない。各マーカー遺伝子は未分化残存した時(未分化残存し難い株)と未分化残存しなかった時(未分化残存しやすい株)の間で明確な発現の違いが有る。すなわち、ZNF354C、C12orf56、ZNF578及びMIR886では、未分化残存が無い場合に、未分化残存が有る場合に比べ、遺伝子発現が高く、一方DPP6では、未分化残存が無い場合に、未分化残存が有る場合に比べ、遺伝子発現が低い。【００４９】
まとめ
・iPS細胞はクローンの特性によるもの以外に、培養状態(継代回数など)によって、分化細胞に未分化iPS細胞が残存する場合が有る。
・継代回数の増加によって生じる未分化iPS細胞が残存しやすいiPS細胞はエピジェネティックな変化によって生じる。
・メチル化変異によって遺伝子発現が変化し、未分化iPS細胞の残存しやすさと相関する遺伝子を同定した。この遺伝子は、iPS細胞の段階で分化細胞における未分化iPS細胞の残存のしやすさを類推するマーカーとなる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明は、再生医療に用いるiPS細胞などの未分化細胞の品質評価に利用できる。具体的には、iPS細胞の樹立工程と、マスターセルバンク、ワーキングセルバンクの製造工程、再生医療等製品の製造工程などにおける、未分化細胞の残存/混入の検出や評価に利用することができる。
【図１】
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【国際調査報告】
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