(57)【要約】  本発明は、酸化型グルタチオンを還元することによる、工業的にも実施可能な還元型グルタチオンの製造方法を提供することを目的とする。本発明に係る還元型グルタチオンの製造方法は、酸化型グルタチオンのジスルフィド結合を亜硫酸イオンまたは亜硫酸水素イオンにより開裂してＳ−スルホグルタチオンおよび還元型グルタチオンを得る工程、および、上記Ｓ−スルホグルタチオンを還元する工程を含むことを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
還元型グルタチオンを製造するための方法であって、
酸化型グルタチオンのジスルフィド結合を亜硫酸イオンまたは亜硫酸水素イオンにより開裂してＳ−スルホグルタチオンおよび還元型グルタチオンを得る工程、および、
上記Ｓ−スルホグルタチオンを還元する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
還元剤を用いて上記Ｓ−スルホグルタチオンを還元する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記還元剤として水素化ホウ素アルカリ金属塩を用いる請求項２に記載の方法。
【請求項４】
上記水素化ホウ素アルカリ金属塩として水素化ホウ素ナトリウムを用いる請求項３に記載の方法。
【請求項５】
上記酸化型グルタチオンに対して０．１倍モル当量以上の上記亜硫酸イオンまたは亜硫酸水素イオンを用いる請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
亜硫酸イオンまたは亜硫酸水素イオンを含む化合物として亜硫酸塩または亜硫酸水素塩を用いる請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
亜硫酸塩または亜硫酸水素塩として、アルカリ金属塩またはアンモニウム塩を用いる請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、工業的にも実施可能な還元型グルタチオンの製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
還元型グルタチオンは、グルタミン酸、システインおよびグリシンからなるトリペプチドであり、フリーラジカルや過酸化物といった活性酸素種から細胞を保護する補助的役割を有する抗酸化物質として、日本では医薬品として扱われている。
還元型グルタチオンは、酸化型グルタチオンのジスルフィド結合を還元的に開裂することにより製造できることが知られている。例えば特許文献１には、酸化型グルタチオンを水素化ホウ素アルカリ塩により還元する還元型グルタチオンの製造方法が開示されている。また、特許文献２には、酸化型グルタチオンを鉄化合物、硫黄および硫化水素により還元する還元型グルタチオンの製造方法が開示されている。特許文献３には、隔膜で隔てられた陰極槽と陽極槽を用いて酸化型グルタチオンを電解還元する還元型グルタチオンの製造方法が開示されている。
また、還元型グルタチオンを製造するものではないが、非特許文献１には、２つのシステインがジスルフィド結合を介して結合したシスチンのアミノ基をｐ−ニトロカルボベンゾキシ基で修飾した後、Ｐｄ／Ｃの存在下、常温常圧で接触還元してシステインを得る方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特公昭４６−３３９３９号公報
【特許文献２】特開２００７−２５４３２５号公報
【特許文献３】国際公開第２０１４／１３３１２９号パンフレット
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】ＣＡＳＩＭＩＲ  ＢＥＲＳＥら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２２（７），ｐｐ．８０５−８０８（１９５７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述したように、酸化型グルタチオンを還元して還元型グルタチオンを製造するための様々な方法が開発されている。しかし従来方法を工業的に実施するには、無視できない問題があった。
例えば特許文献１に記載の方法には試薬を大過剰量である１０倍モル当量も使用しなければならないという問題がある。また、特許文献２に記載の方法は、酸化型グルタチオンから還元型グルタチオンへの変換率が低く、収率に課題があり、特許文献３の方法では電解槽が必要である。また、非特許文献１に記載の還元方法では、ｐ−ニトロカルボベンゾキシ基によるアミノ基の修飾という工程が余分に必要であるし、トリペプチドである還元型グルタチオンにおいてシステインは２番目に存在しているため、非特許文献１の技術を還元型グルタチオンの製造に適用できるかについては疑問がある。
そこで本発明は、酸化型グルタチオンを還元することによる、工業的にも実施可能な還元型グルタチオンの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、亜硫酸イオンまたは亜硫酸水素イオンにより酸化型グルタチオンのジスルフィド結合を開裂すれば、開裂により生じたＳ−スルホグルタチオンは容易に還元できることを見出して、本発明を完成した。
以下、本発明を示す。【０００７】
［１］  還元型グルタチオンを製造するための方法であって、
酸化型グルタチオンのジスルフィド結合を亜硫酸イオンまたは亜硫酸水素イオンにより開裂してＳ−スルホグルタチオンおよび還元型グルタチオンを得る工程、および、
上記Ｓ−スルホグルタチオンを還元する工程を含むことを特徴とする方法。
［２］  還元剤を用いて上記Ｓ−スルホグルタチオンを還元する上記［１］に記載の方法。
［３］  上記還元剤として水素化ホウ素アルカリ金属塩を用いる上記［２］に記載の方法。
［４］  上記水素化ホウ素アルカリ金属塩として水素化ホウ素ナトリウムを用いる上記［３］に記載の方法。
［５］  上記酸化型グルタチオンに対して０．１倍モル当量以上の上記亜硫酸イオンまたは亜硫酸水素イオンを用いる上記［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］  亜硫酸イオンまたは亜硫酸水素イオンを含む化合物として亜硫酸塩または亜硫酸水素塩を用いる上記［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］  亜硫酸塩または亜硫酸水素塩として、アルカリ金属塩またはアンモニウム塩を用いる上記［６］に記載の方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明方法で必須的に用いる試薬は、原料である酸化型グルタチオンの他、安価な亜硫酸イオンまたは亜硫酸水素イオンである。これらは水溶性を示すことから、本発明方法では溶媒として水を用いることができる。また、本発明方法では先ず亜硫酸イオンまたは亜硫酸水素イオンにより酸化型グルタチオンのジスルフィド結合を開裂し、得られるＳ−スルホグルタチオンが酸化型グルタチオンよりも還元され易いことから、従来方法に比して、試薬量の低減が可能である。また、本発明方法によれば、高収率で還元型グルタチオンを製造することができる。よって本発明方法は、還元型グルタチオンの工業的な大量合成に適するものであり、産業上極めて優れたものである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明方法を工程ごとに詳細に述べる。
工程Ａ：  ジスルフィド結合の開裂工程
本工程では、酸化型グルタチオンのジスルフィド結合を亜硫酸イオンまたは亜硫酸水素イオンにより開裂してＳ−スルホグルタチオンおよび還元型グルタチオンを得る。
【００１０】
本発明で原料として用いる酸化型グルタチオンは、特に制限されない。例えばその由来は限定されず、酸化型グルタチオンを含有する微生物培養液から抽出した抽出液でもよいし、精製品を用いてもよい。また、酸化型グルタチオンに還元型グルタチオンが任意の割合で混入していてもよい。
【００１１】
亜硫酸イオン（ＳＯ32-）および亜硫酸水素イオン（ＨＳＯ3-）も特に制限されず、亜硫酸塩または亜硫酸水素塩を水に溶解しても、二酸化硫黄を水に溶解させても得ることができる。亜硫酸イオンまたは亜硫酸水素イオンを含む試薬は安価である。なお亜硫酸イオンと亜硫酸水素イオンは水溶液中において平衡状態で存在しており、低ｐＨでは二酸化硫黄として存在することが知られている。亜硫酸塩および亜硫酸水素塩としては、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩、バリウム塩などの第２族金属塩；アンモニウム塩；鉄塩などの遷移金属塩などを挙げることができる。
【００１２】
亜硫酸イオンおよび亜硫酸水素イオンの使用量は特に制限されず適宜決定すればよいが、本反応においては触媒として働くため、酸化型グルタチオンに対して０．１倍モル当量以上用いることが好ましく、０．５倍モル当量以上または１倍モル当量以上がより好ましく、２倍モル当量以上がより更に好ましい。上記割合の上限は特に制限されないが、例えば１０倍モル当量以下とすることができる。なお、亜硫酸イオンにより、酸化型グルタチオンはＳ−スルホグルタチオンと還元型グルタチオンへ開裂されると考えられる。但し下記反応式の通り、Ｓ−スルホグルタチオンの亜硫酸基は−Ｓ−ＳＯ3-になっていてもよく、還元型グルタチオンのチオール基は−Ｓ-になっていてもよい。
【００１３】
【化１】
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【００１４】
本工程は、溶媒中で実施することが好ましい。溶媒は反応を阻害しないものであれば特に制限はないが、好ましくは水を用いることができる。水としては、例えば、超純水、純水、蒸留水、精製水、逆浸透水、脱イオン水、工業用水、水道水、井戸水などを特に制限無く用いることができる。
【００１５】
反応中における酸化型グルタチオンの濃度は、適宜調整すればよく特に制限されないが、例えば１ｇ／Ｌ以上、２５０ｇ／Ｌ以下とすることができ、５ｇ／Ｌ以上が好ましく、１０ｇ／Ｌ以上がより好ましい。
【００１６】
反応温度は反応が進行する温度であれば特に制限はないが、例えば、０℃以上、８０℃以下とすることができる。当該温度としては、５℃以上が好ましく、また、６０℃以下が好ましく、４０℃以下がより好ましく、３０℃以下がより更に好ましい。また、温度調節をせず常温で反応を行ってもよい。
【００１７】
本工程におけるジスルフィド結合の上記開裂反応はｐＨ依存の平衡反応であり、過剰な低ｐＨ条件では亜硫酸イオンまたは亜硫酸水素イオンが二酸化硫黄となって反応が進行せず、過剰な高ｐＨ条件でも逆反応に平衡が傾く。そのため、反応ｐＨとしては、２以上、１０以下が好ましい。当該ｐＨとしては、４以上がより好ましく、５以上がより更に好ましく、また、９以下がより好ましく、８．５または８以下がより更に好ましい。なお、反応液のｐＨは、硫酸、塩化水素、水酸化ナトリウム、それらの水溶液などで調整することができる。
【００１８】
本反応は非常に速やかに進行するため、次の還元反応と同時に実施することも可能である。
【００１９】
工程Ｂ：  還元工程
本工程では、少なくともＳ−スルホグルタチオンを還元することにより還元型グルタチオンを得る。なお、上記工程Ａで亜硫酸イオンまたは亜硫酸水素イオンにより酸化型グルタチオンのジスルフィド結合はＳ−スルホグルタチオンと還元型グルタチオンへ開裂しており、Ｓ−スルホグルタチオンは酸化型グルタチオンより還元され易いため、本工程では従来方法よりも簡便かつ穏和な条件で還元を行うことが可能であり、還元剤の使用量を低減することができる。
【００２０】
還元方法は、酸化型グルタチオンのジスルフィド開裂反応で生成したＳ−スルホグルタチオンを還元可能な方法であれば特に制限されないが、例えば、還元剤を用いる方法や電解還元方法などを挙げることができる。なお、上記工程Ａの反応液において還元型グルタチオンのチオール基が−Ｓ-として存在している場合であっても、−Ｓ-はプロトンにより容易にチオール基になり、また、Ｓ−スルホグルタチオンが還元される条件であれば容易にチオール基になる。更に、上記工程Ａでジスルフィド結合が開裂されず酸化型グルタチオンが残留している場合には、本工程で当該酸化型グルタチオンを還元型グルタチオンへ直接還元できる可能性もある。
【００２１】
本工程で用いることができる還元剤は、酸化型グルタチオンのジスルフィド開裂反応で生成したＳ−スルホグルタチオンを還元可能なものであれば特に制限されないが、例えば、水素化ホウ素アルカリ塩、硫化水素、金属触媒と水素との組み合わせ、ホスフィン、ヨウ化物塩、亜酸化銅、などを挙げることができる。
【００２２】
水素化ホウ素アルカリ塩としては、例えば、水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素カリウム、水素化ホウ素リチウムなどを挙げることができる。金属触媒としては、例えば、ニッケル、ルテニウム、パラジウム、白金、ロジウム、銅などを含む触媒を挙げることができる。金属触媒は、これら元素を含むものであれば、これら元素の酸化物や塩であってもよい。ホスフィンとしては、例えば、トリブチルホスフィン、トリフェニルホスフィンなどを挙げることができる。ヨウ化物塩としては、ヨウ化ホスホニウムなどを挙げることができる。
【００２３】
還元剤の使用量は適宜調整すればよく特に制限されないが、例えば、酸化型グルタチオンに対して０．５倍モル当量以上とすることができ、１．０倍モル当量以上が好ましく、１．５倍モル当量以上がより好ましい。還元剤の使用量の上限は特に制限されないが、例えば、酸化型グルタチオンに対して１０．０倍モル当量以下とすることができ、５．０倍モル当量以下が好ましい。
【００２４】
Ｓ−スルホグルタチオンの還元反応は亜硫酸イオンまたは亜硫酸水素イオンによる酸化型グルタチオンのジスルフィド開裂反応液をそのまま使用して実施される。即ち、例えば、上記工程Ａの反応後溶液に還元剤を添加して、工程Ａと工程Ｂを同一系内（ワンポット）で実施することができる。また、ジスルフィド開裂反応は非常に速い反応であるため、ジスルフィド開裂反応と還元反応を同時に実施しても問題なく反応は進行する。
【００２５】
還元剤によるＳ−スルホグルタチオンの還元反応は、例えば、亜硫酸イオンまたは亜硫酸水素イオンによる酸化型グルタチオンのジスルフィド開裂反応液に還元剤を加え、混合することにより実施される。還元剤は、そのまま反応液に添加してもよいし、水などの溶媒に分散または溶解し、分散液または溶液として添加してもよい。
【００２６】
還元剤は、溶液または分散液の形態でＳ−スルホグルタチオンを含む反応液へ添加することが好ましい。還元剤の溶液または分散液を添加することにより、局所的な副反応を抑制でき、より少ない量の還元剤で少なくともＳ−スルホグルタチオンを効率的に還元することができる。当該溶液または分散液における還元剤の濃度は、還元が効率的に進行する範囲で適宜調整すればよいが、例えば１質量％以上、２０質量％以下とすることができる。また、水素化ホウ素アルカリ塩などを用いる場合には、上記溶液または分散液の溶媒としては、水の他、塩基性水溶液を用いてもよい。当該塩基性水溶液の塩基は特に制限されないが、例えば、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等、アルカリ金属の水酸化物；炭酸水素ナトリウムや炭酸水素カリウム等、アルカリ金属の炭酸水素塩；炭酸ナトリウムや炭酸カリウム等、アルカリ金属の炭酸塩；水酸化カルシウム等、第２属金属の水酸化物；トリエチルアミンやピリジン等の有機塩基が挙げられる。上記塩基性水溶液における塩基の濃度は適宜調整すればよいが、例えば０．０１質量％以上、５０質量％以下とすることができる。
【００２７】
反応温度は還元反応が進行する温度であれば特に制限されないが、例えば、０℃以上、８０℃以下とすることができる。当該温度としては、５℃以上が好ましく、また、６０℃以下が好ましく、４０℃以下がより好ましく、３０℃以下がより更に好ましい。また、温度調節をせず常温で反応を行ってもよい。
【００２８】
反応液のｐＨについては、過剰な低ｐＨ条件では還元剤が水と反応して消費される場合があり得るため、４以上、１０以下が好ましい。当該ｐＨとしては、６以上がより好ましく、６．５以上がより更に好ましく、また、９以下がより好ましく、８．５以下がより更に好ましく、８以下が特に好ましい。
【００２９】
反応時間は反応条件により異なるが、１時間以上、５時間以下程度で十分である。
【００３０】
反応終了後、還元型グルタチオンは公知の方法に従って精製してもよい。例えば、亜酸化銅を加えて水不溶性の還元型グルタチオン銅塩を形成させ、沈殿物を濾別する。得られた沈殿物を水に懸濁し、硫化水素で還元型グルタチオンを遊離させる。得られた還元型グルタチオン水溶液を濃縮して冷却した後、種晶とエタノールを加えて還元型グルタチオンの結晶を析出させることができる。
【００３１】
本願は、２０１８年３月２６日に出願された日本国特許出願第２０１８−５７９７０号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１８年３月２６日に出願された日本国特許出願第２０１８−５７９７０号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。【００３３】
実施例１：  亜硫酸ナトリウムと水素化ホウ素ナトリウムによる還元
酸化型グルタチオン（４．５ｇ，７．３５ｍｍｏｌ）を水（２９５．５ｇ）に溶解し、１５ｇ／Ｌの酸化型グルタチオン水溶液を調製した。酸化型グルタチオンに対して４倍モル当量の亜硫酸ナトリウム（３．７ｇ，２９．４ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で５分間撹拌した。得られた反応液のｐＨは７．０であった。反応液に、酸化型グルタチオンに対して１．５倍モル当量の水素化ホウ素ナトリウム（４１．６ｍｇ，１１．０ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で１０分撹拌した。次いで、２５％硫酸を用いて反応液のｐＨを６．０に調整し、更に２時間撹拌した。得られた反応液を高速液体クロマトグラフィで分析した結果、還元型グルタチオンが４．４８ｇ（転換率：９９．３％）生成していることを確認した。【００３４】
比較例１：  水素化ホウ素ナトリウム単独による還元
酸化型グルタチオン（４．５ｇ，７．３５ｍｍｏｌ）を水（２９５．５ｇ）に溶解し、１５ｇ／Ｌの酸化型グルタチオン水溶液を調製した。当該水溶液のｐＨを１０％水酸化ナトリウム溶液で７．０に調整後、酸化型グルタチオンに対して１．５倍モル当量の水素化ホウ素ナトリウム（４１．６ｍｇ，１１．０ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で１０分撹拌した。次いで、反応液のｐＨを２５％硫酸で６．０に調整し、更に２時間撹拌した。得られた反応液を高速液体クロマトグラフィで分析した結果、還元型グルタチオンの生成量は０．３３ｇ（転換率：７．３％）であった。【００３５】
実施例２：  Ｓ−スルホグルタチオンの還元反応
酸化型グルタチオン（１６．５４ｍｇ，０．０２７０ｍｍｏｌ）を水（９８３．５ｍｇ）に溶解し、１６．５ｇ／Ｌの酸化型グルタチオン水溶液を調製した。酸化型グルタチオンに対して６倍モル当量の亜硫酸ナトリウム（２０．４ｍｇ，０．１６２ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で５分間撹拌した。次いで、酸化型グルタチオンに対して１７倍モル当量の水素化ホウ素ナトリウム（１７．４ｍｇ，０．４５９ｍｍｏｌ）を加え、３０℃で６０分間撹拌した。得られた反応液を高速液体クロマトグラフィで分析し、酸化型グルタチオンの残留量と還元型グルタチオンの生成量を求め、還元型グルタチオンの収率を算出した。結果を表１に示す。表中、「ＧＳＨ」は還元型グルタチオンを示し、「ＧＳＳＧ」は酸化型グルタチオンを示す。【００３６】
比較例２：  Ｓ−スルホグルタチオンの酸加水分解
酸化型グルタチオン（１６．５４ｍｇ，０．０２７０ｍｍｏｌ）を水（９８３．５ｍｇ）に溶解し、１６．５ｇ／Ｌの酸化型グルタチオン水溶液を調製した。酸化型グルタチオンに対して６倍モル当量の亜硫酸ナトリウム（２０.４ｍｇ，０．１６２ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で５分間撹拌した。次いで、塩酸を加えて反応液のｐＨを１．０に調整し、３０℃で６０分間撹拌した。得られた反応液を上記実施例２と同様に分析した。結果を表１に示す。【００３７】
比較例３：  Ｓ−スルホグルタチオンの酸加水分解
塩酸を加えた後の反応温度を６０℃とする以外は上記比較例２と同様にして、Ｓ−スルホグルタチオンの酸加水分解を行い、反応液を分析した。結果を表１に示す。【００３８】
【表１】
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【００３９】
表１に示す結果の通り、亜硫酸ナトリウムにより酸化型グルタチオンのジスルフィド結合を開裂した後、還元剤として水素化ホウ素ナトリウムを用いた場合には、塩酸を用いて加水分解した場合に比べて、還元型グルタチオンの収率が圧倒的に高かった。【００４０】
参考例１：  亜硫酸ナトリウムの使用量の検討
酸化型グルタチオン産生菌の培養液を熱水抽出して得た酸化型グルタチオンの粗水溶液に、含有酸化型グルタチオンに対して０．５〜４倍モル当量の亜硫酸ナトリウムを加え、２５℃で５分間撹拌した。反応液のｐＨは６であった。反応液を高速液体クロマトグラフィで分析し、酸化型グルタチオンのジスルフィド結合の開裂率を求めた。なお、本実験においては、１モルの酸化型グルタチオンから１モルの還元型グルタチオンと１モルのＳ−スルホグルタチオンが生成するため、酸化型グルタチオンから還元型グルタチオンへのモル変換率がＧＳＳＧ開裂率とみなせる。結果を表２に示す。【００４１】
【表２】
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【００４２】
表２に示す結果の通り、酸化型グルタチオンに対する亜硫酸ナトリウムの使用量が０．５倍モル当量でも酸化型グルタチオンのジスルフィド結合は開裂し、実施例３でも示す通り還元反応には十分であることが明らかになった。【００４３】
実施例３：  Ｓ−スルホグルタチオンの還元反応におけるｐＨの影響
酸化型グルタチオン（１４５ｍｇ，０．２３７ｍｍｏｌ）を水（９．８５５ｇ）に溶解し、１４．５ｇ／Ｌの酸化型グルタチオン水溶液を調製した。酸化型グルタチオンに対して４倍モル当量の亜硫酸ナトリウム（１１９．５ｍｇ，０．９４８ｍｍｏｌ）または０．５倍モル当量の亜硫酸ナトリウム（１４．９ｍｇ，０．１１９ｍｍｏｌ）を加え、２５％硫酸または１０％水酸化ナトリウム水溶液を用いて反応液のｐＨを６．０、７．０または８．０に調整した後、２５℃で５分間撹拌した。次に、酸化型グルタチオンに対して１．５倍モル当量の水素化ホウ素ナトリウム（１３．４ｍｇ，０．３５６ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で１０分間撹拌した。更に、水素化ホウ素ナトリウムの添加から１０分後に２５％硫酸により反応液のｐＨを６．０に調整し、２５℃で６０分間撹拌した。得られた反応液を高速液体クロマトグラフィで分析し、酸化型グルタチオンの残留量と還元型グルタチオンの生成量を求め、還元型グルタチオンの収率を算出した。結果を表３に示す。【００４４】
比較例４：酸化型グルタチオンの還元反応におけるｐＨの影響
比較のため亜硫酸イオンによる開裂反応を行わず、直接酸化型グルタチオンの還元を実施した。酸化型グルタチオン（１４５ｍｇ，０．２３７ｍｍｏｌ）を水（９．８５５ｇ）に溶解し、１４．５ｇ／Ｌの酸化型グルタチオン水溶液を調製した。酸化型グルタチオン水溶液を２５％硫酸又は１０％水酸化ナトリウムによりｐＨを６．０、７．０または８．０に調整した後、酸化型グルタチオンに対して１．５倍モル量の水素化ホウ素ナトリウム（１３．４ｍｇ，０．３５６ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で１０分間撹拌した。更に、水素化ホウ素ナトリウムの添加から１０分後に２５％硫酸により反応液のｐＨを６．０に調整し、２５℃で６０分間撹拌した。得られた反応液を高速液体クロマトグラフィで分析し、酸化型グルタチオンの残留量と還元型グルタチオンの生成量を求め、還元型グルタチオンの収率を算出した。結果を表３に示す。【００４５】
【表３】
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【００４６】
表３に示す結果の通り、亜硫酸ナトリウムを使用することなく水素化ホウ素ナトリウムのみを用いた場合、酸化型グルタチオンの還元反応はほとんど進行しなかった。
それに対して、亜硫酸ナトリウムに続いて水素化ホウ素ナトリウムを用いた場合には、酸化型グルタチオンは還元型グルタチオンへ良好に還元された。【００４７】
実施例４：  Ｓ−スルホグルタチオンの還元反応における水素化ホウ素ナトリウムの使用量の影響確認
酸化型グルタチオン（１４５ｍｇ，０．２３７ｍｍｏｌ）を水（９．８５５ｇ）に溶解し、１４．５ｇ／Ｌの酸化型グルタチオン水溶液を調製した。酸化型グルタチオンに対して２倍モル当量の亜硫酸ナトリウム（５９．７ｍｇ，０．４７４ｍｍｏｌ）を加え、ｐＨを７．０に調整した後、２５℃で５分間撹拌した。次に、表４に示す量の水素化ホウ素ナトリウムを９質量倍の０．５％水酸化ナトリウム水溶液に溶解した後、得られた溶液を上記反応液に加え、２５℃で１０分間撹拌した。その後、２５％硫酸により反応液のｐＨを７．０に調整し、２５℃で６０分間撹拌した。反応液を高速液体クロマトグラフィで分析し、還元型グルタチオンの生成量を求め、還元型グルタチオンの収率を算出した。結果を表４に示す。【００４８】
比較例５：酸化型グルタチオンの還元反応における水素化ホウ素ナトリウムの使用量の影響確認
比較のため亜硫酸イオンによる開裂反応を行わず、直接酸化型グルタチオンの還元を実施した。酸化型グルタチオン（１４５ｍｇ，０．２３７ｍｍｏｌ）を水（９．８５５ｇ）に溶解し、１４．５ｇ／Ｌの酸化型グルタチオン水溶液を調製した。１０％水酸化ナトリウムにより反応液のｐＨを７．０に調整した後、表４に示す量の水素化ホウ素ナトリウムを９質量倍の０．５％水酸化ナトリウム水溶液に溶解した後、得られた溶液を上記溶液に加え、２５℃で１０分間撹拌した。次に、２５％硫酸により反応液のｐＨを７．０に調整し、２５℃で６０分間撹拌した。その後、反応液を高速液体クロマトグラフィで分析し、還元型グルタチオンの生成量を求め、還元型グルタチオンの収率を算出した。結果を表４に示す。【００４９】
【表４】
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【００５０】
表４に示す結果の通り、酸化型グルタチオンに対して０．５倍モル当量以上の水素化ホウ素ナトリウムを用いることが好ましく、０．７倍モル当量以上の水素化ホウ素ナトリウムを用いることが特に好ましいことが明らかになった。
【国際調査報告】
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