(57)【要約】  本発明の課題は、均一性の高いコラゲナーゼ活性を有するポリペプチドの生産を可能とする新規ポリペプチドを提供することである。  本発明のポリペプチドは、コラゲナーゼＧ、コラゲナーゼＨにアミノ酸置換を導入することにより、酵母を生産宿主とする発現系において分泌生産される場合にＮ結合型糖鎖の修飾を受けない変異ポリペプチドであることを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ１）または（ａ２）のアミノ酸配列を含み、かつ（ｂ）の条件を満足するポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が（ｃ１）、（ｃ２）のいずれかひとつから選択されるアミノ酸配列であることを特徴とするポリペプチド。
（ａ１）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列。
（ａ２）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、及び/又は付加したアミノ酸配列。
（ｂ）コラゲナーゼ活性を有する。
（ｃ１）（ａ１）または（ａ２）において、配列番号１に示すアミノ酸配列における第１４９位、第２５１位、第３３０位、第４１９位、第７０４位、第８５７位、第９１５位、第９４４位、第９６６位、第９９２位、第１０１３位、及び第１０２６位に相当するアミノ酸残基が全てＮ結合型糖鎖修飾を受けない状態にあるアミノ酸配列。
（ｃ２）（ａ１）または（ａ２）において、配列番号２に示すアミノ酸配列における第８９位、第１８０位、第５１４位、及び第６０１位に相当するアミノ酸残基が全てＮ結合型糖鎖修飾を受けない状態にあるアミノ酸配列。
【請求項２】
前記アミノ酸配列が以下の（ｄ１）、（ｄ２）のいずれかひとつから選択されることを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
（ｄ１）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、第１４９位、第１５０位、第１５１位のいずれか１つ以上のアミノ酸に、第１４９位はアスパラギン以外のアミノ酸へ置換、第１５０位はプロリンへ置換、第１５１位はセリンまたはスレオニン以外のアミノ酸へ置換のいずれか１つ以上のアミノ酸置換が導入されている、かつ、第２５１位、第２５２位、第２５３位のいずれか１つ以上のアミノ酸に、第２５１位はアスパラギン以外のアミノ酸へ置換、第２５２位はプロリンへ置換、第２５３位はセリンまたはスレオニン以外のアミノ酸へ置換のいずれか１つ以上のアミノ酸置換が導入されている、かつ、第３３０位、第３３１位、第３３２位のいずれか１つ以上のアミノ酸に、第３３０位はアスパラギン以外のアミノ酸へ置換、第３３１位はプロリンへ置換、第３３２位はセリンまたはスレオニン以外のアミノ酸へ置換のいずれか１つ以上のアミノ酸置換が導入されている、かつ、第４１９位、第４２０位、第４２１位のいずれか１つ以上のアミノ酸に、第４１９位はアスパラギン以外のアミノ酸へ置換、第４２０位はプロリンへ置換、第４２１位はセリンまたはスレオニン以外のアミノ酸へ置換のいずれか１つ以上のアミノ酸置換が導入されている、かつ、第７０４位、第７０５位、第７０６位のいずれか１つ以上のアミノ酸に、第７０４位はアスパラギン以外のアミノ酸へ置換、第７０５位はプロリンへ置換、第７０６位はセリンまたはスレオニン以外のアミノ酸へ置換のいずれか１つ以上のアミノ酸置換が導入されている、かつ、第８５７位、第８５８位、第８５９位のいずれか１つ以上のアミノ酸に、第８５７位はアスパラギン以外のアミノ酸へ置換、第８５８位はプロリンへ置換、第８５９位はセリンまたはスレオニン以外のアミノ酸へ置換のいずれか１つ以上のアミノ酸置換が導入されている、かつ、第９１５位、第９１６位、第９１７位のいずれか１つ以上のアミノ酸に、第９１５位はアスパラギン以外のアミノ酸へ置換、第９１６位はプロリンへ置換、第９１７位はセリンまたはスレオニン以外のアミノ酸へ置換のいずれか１つ以上のアミノ酸置換が導入されている、かつ、第９４４位、第９４５位、第９４６位のいずれか１つ以上のアミノ酸に、第９４４位はアスパラギン以外のアミノ酸へ置換、第９４５位はプロリンへ置換、第９４６位はセリンまたはスレオニン以外のアミノ酸へ置換のいずれか１つ以上のアミノ酸置換が導入されている、かつ、第９６６位、第９６７位、第９６８位のいずれか１つ以上のアミノ酸に、第９６６位はアスパラギン以外のアミノ酸へ置換、第９６７位はプロリンへ置換、第９６８位はセリンまたはスレオニン以外のアミノ酸へ置換のいずれか１つ以上のアミノ酸置換が導入されている、かつ、第９９２位、第９９３位、第９９４位のいずれか１つ以上のアミノ酸に、第９９２位はアスパラギン以外のアミノ酸へ置換、第９９３位はプロリンへ置換、第９９４位はセリンまたはスレオニン以外のアミノ酸へ置換のいずれか１つ以上のアミノ酸置換が導入されている、かつ、第１０１３位、第１０１４位、第１０１５位のいずれか１つ以上のアミノ酸に、第１０１３位はアスパラギン以外のアミノ酸へ置換、第１０１４位はプロリンへ置換、第１０１５位はセリンまたはスレオニン以外のアミノ酸へ置換のいずれか１つ以上のアミノ酸置換が導入されている、かつ、第１０２６位、第１０２７位、第１０２８位のいずれか１つ以上のアミノ酸に、第１０２６位はアスパラギン以外のアミノ酸へ置換、第１０２７位はプロリンへ置換、第１０２８位はセリンまたはスレオニン以外のアミノ酸へ置換のいずれか１つ以上のアミノ酸置換が導入されているアミノ酸配列。
(ｄ２)配列番号２に記載のアミノ酸配列において、第８９位、第９０位、第９１位のいずれか１つ以上のアミノ酸に、第８９位はアスパラギン以外のアミノ酸へ置換、第９０位はプロリンへ置換、第９１位はセリンまたはスレオニン以外のアミノ酸へ置換のいずれか１つ以上のアミノ酸置換が導入されている、かつ、第１８０位、第１８１位、第１８２位のいずれか１つ以上のアミノ酸に、第１８０位はアスパラギン以外のアミノ酸へ置換、第１８１位はプロリンへ置換、第１８２位はセリンまたはスレオニン以外のアミノ酸へ置換のいずれか１つ以上のアミノ酸置換が導入されている、かつ、第５１４位、第５１５位、第５１６位のいずれか１つ以上のアミノ酸に、第５１４位はアスパラギン以外のアミノ酸へ置換、第５１５位はプロリンへ置換、第５１６位はセリンまたはスレオニン以外のアミノ酸へ置換のいずれか１つ以上のアミノ酸置換が導入されている、かつ、第６０１位、第６０２位、第６０３位のいずれか１つ以上のアミノ酸に、第６０１位はアスパラギン以外のアミノ酸へ置換、第６０２位はプロリンへ置換、第６０３位はセリンまたはスレオニン以外のアミノ酸へ置換のいずれか１つ以上のアミノ酸置換が導入されているアミノ酸配列。
【請求項３】
請求項１または２に記載のポリペプチドと前記ポリペプチドの酵母からの分泌を可能にするシグナルペプチドとをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４】
請求項１または２に記載のポリペプチドと前記ポリペプチドの酵母からの分泌を可能にするシグナルペプチドとをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む酵母。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コラゲナーゼ活性を有するポリペプチド、当該ポリペプチドとシグナルペプチドをコードする塩基配列を含むベクター、当該ポリペプチドとシグナルペプチドをコードする塩基配列を含む酵母に関する。
【背景技術】
【０００２】
クロストリジウム・ヒストリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来のコラゲナーゼＧまたはＨは、三重らせん構造を有するコラーゲンを特異的に分解することができるため、主に細胞学分野における細胞分散用資材として利用されている。クロストリジウム・ヒストリティカムを用いたコラゲナーゼＧまたはＨの生産の場合、コラゲナーゼＧおよびＨが同時に分泌生産され、分解物が副生されてしまい（非特許文献１）、均一性の高いコラゲナーゼＧまたはＨを得るためには、それぞれを分離する必要があった。大腸菌を生産宿主としたコラゲナーゼＧまたはＨの組換え生産の場合、コラゲナーゼＧまたはＨの分解物が副生しており、均一性の高いコラゲナーゼＧまたはＨを得るためには、タグ配列を利用したアフィニティー精製により分解物を除去する必要があった（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】日本国特許第５６９８５３６号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ,  Ｏ  ｅｔ．  ａｌ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．  （１９９９），  １８１，  ９２３−９３３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、均一性の高いコラゲナーゼ活性を有するポリペプチドの生産を可能とする新規ポリペプチドを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らはクロストリジウム・ヒストリティカム由来のコラゲナーゼＧまたはＨを均一かつ大量に生産する技術を確立するため、酵母を宿主とする発現系で発現させた場合、他の発現系で見られたような分解物（非特許文献１、特許文献１）が見られないことを見出した。【０００７】
また酵母でポリペプチドを発現させた場合にＮ結合型糖鎖修飾を受ける場合があることが知られている。Ｎ結合型糖鎖は糖鎖構造に基づく不均一性が知られている。更に、本明細書に記載の実験では、クロストリジウム・ヒストリティカム由来の野生型コラゲナーゼはＧ、ＨともにＮ結合型糖鎖が付加されたポリペプチドとして分泌生産されていることが認められた。本発明ではＮ結合型糖鎖修飾部位を発見し、それを回避するようにアミノ酸置換を導入する事でＮ結合型糖鎖を有さないコラゲナーゼを生産する技術を研究し、以下の本発明を完成させた。【０００８】
（１）以下の（ａ１）または（ａ２）のアミノ酸配列を含み、かつ（ｂ）の条件を満足するポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が（ｃ１）、（ｃ２）のいずれかひとつから選択されるアミノ酸配列であることを特徴とするポリペプチド。
（ａ１）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列。
（ａ２）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、及び/又は付加したアミノ酸配列。
（ｂ）コラゲナーゼ活性を有する。
（ｃ１）（ａ１）または（ａ２）において、配列番号１に示すアミノ酸配列における第１４９位、第２５１位、第３３０位、第４１９位、第７０４位、第８５７位、第９１５位、第９４４位、第９６６位、第９９２位、第１０１３位、及び第１０２６位に相当するアミノ酸残基が全てＮ結合型糖鎖修飾を受けない状態にあるアミノ酸配列。
（ｃ２）（ａ１）または（ａ２）において、配列番号２に示すアミノ酸配列における第８９位、第１８０位、第５１４位、及び第６０１位に相当するアミノ酸残基が全てＮ結合型糖鎖修飾を受けない状態にあるアミノ酸配列。【０００９】
（２）前記アミノ酸配列が以下の（ｄ１）、（ｄ２）のいずれかひとつから選択されることを特徴とする（１）に記載のポリペプチド。
（ｄ１）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、第１４９位、第１５０位、第１５１位のいずれか１つ以上のアミノ酸にアミノ酸置換（第１４９位はアスパラギン以外、第１５０位はプロリンのみ、第１５１位はセリンまたはスレオニン以外）が導入されている、かつ、第２５１位、第２５２位、第２５３位のいずれか１つ以上のアミノ酸にアミノ酸置換（第２５１位はアスパラギン以外、第２５２位はプロリンのみ、第２５３位はセリンまたはスレオニン以外）が導入されている、かつ、第３３０位、第３３１位、第３３２位のいずれか１つ以上のアミノ酸にアミノ酸置換（第３３０位はアスパラギン以外、第３３１位はプロリンのみ、第３３２位はセリンまたはスレオニン以外）が導入されている、かつ、第４１９位、第４２０位、第４２１位のいずれか１つ以上のアミノ酸にアミノ酸置換（第４１９位はアスパラギン以外、第４２０位はプロリンのみ、第４２１位はセリンまたはスレオニン以外）が導入されている、かつ、第７０４位、第７０５位、第７０６位のいずれか１つ以上のアミノ酸にアミノ酸置換（第７０４位はアスパラギン以外、第７０５位はプロリンのみ、第７０６位はセリンまたはスレオニン以外）が導入されている、かつ、第８５７位、第８５８位、第８５９位のいずれか１つ以上のアミノ酸にアミノ酸置換（第８５７位はアスパラギン以外、第８５８位はプロリンのみ、第８５９位はセリンまたはスレオニン以外）が導入されている、かつ、第９１５位、第９１６位、第９１７位のいずれか１つ以上のアミノ酸にアミノ酸置換（第９１５位はアスパラギン以外、第９１６位はプロリンのみ、第９１７位はセリンまたはスレオニン以外）が導入されている、かつ、第９４４位、第９４５位、第９４６位のいずれか１つ以上のアミノ酸にアミノ酸置換（第９４４位はアスパラギン以外、第９４５位はプロリンのみ、第９４６位はセリンまたはスレオニン以外）が導入されている、かつ、第９６６位、第９６７位、第９６８位のいずれか１つ以上のアミノ酸にアミノ酸置換（第９６６位はアスパラギン以外、第９６７位はプロリンのみ、第９６８位はセリンまたはスレオニン以外）が導入されている、かつ、第９９２位、第９９３位、第９９４位のいずれか１つ以上のアミノ酸にアミノ酸置換（第９９２位はアスパラギン以外、第９９３位はプロリンのみ、第９９４位はセリンまたはスレオニン以外）が導入されている、かつ、第１０１３位、第１０１４位、第１０１５位のいずれか１つ以上のアミノ酸にアミノ酸置換（第１０１３位はアスパラギン以外、第１０１４位はプロリンのみ、第１０１５位はセリンまたはスレオニン以外）が導入されている、かつ、第１０２６位、第１０２７位、第１０２８位のいずれか１つ以上のアミノ酸にアミノ酸置換（第１０２６位はアスパラギン以外、第１０２７位はプロリンのみ、第１０２８位はセリンまたはスレオニン以外）が導入されているアミノ酸配列。
（ｄ２）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、第８９位、第９０位、第９１位のいずれか１つ以上のアミノ酸にアミノ酸置換（第８９位はアスパラギン以外、第９０位はプロリンのみ、第９１位はセリンまたはスレオニン以外）が導入されている、かつ、第１８０位、第１８１位、第１８２位のいずれか１つ以上のアミノ酸にアミノ酸置換（第１８０位はアスパラギン以外、第１８１位はプロリンのみ、第１８２位はセリンまたはスレオニン以外）が導入されている、かつ、第５１４位、第５１５位、第５１６位のいずれか１つ以上のアミノ酸にアミノ酸置換（第５１４位はアスパラギン以外、第５１５位はプロリンのみ、第５１６位はセリンまたはスレオニン以外）が導入されている、かつ、第６０１位、第６０２位、第６０３位のいずれか１つ以上のアミノ酸にアミノ酸置換（第６０１位はアスパラギン以外、第６０２位はプロリンのみ、第６０３位はセリンまたはスレオニン以外）が導入されているアミノ酸配列。【００１０】
（３）（１）または（２）に記載のポリペプチドと前記ポリペプチドの酵母からの分泌を可能にするシグナルペプチドとをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含むベクター。【００１１】
（４）（１）または（２）に記載のポリペプチドと前記ポリペプチドの酵母からの分泌を可能にするシグナルペプチドとをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む酵母。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１８−０５８８４５号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に従えば、均一性の高いコラゲナーゼ活性を有するポリペプチドをＮ結合型糖鎖を付加することなく生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の比較例４に係る酵母培養液上清中の野生型コラゲナーゼＧ（レーン１）及び野生型コラゲナーゼＧのＮ結合型糖鎖を切断したポリペプチド（レーン２）の電気泳動の図である。
【図２】本発明の実施例５に係る酵母培養液上清中の野生型コラゲナーゼＧ（レーン１）、野生型コラゲナーゼＧのＮ結合型糖鎖を切断したポリペプチド（レーン２）、変異コラゲナーゼＧ（レーン３）と変異コラゲナーゼＧのＮ結合型糖鎖の脱糖鎖処理をしたポリペプチド（レーン４）の電気泳動の図である。
【図３】本発明の比較例４に係る酵母培養液上清中の野生型コラゲナーゼＨ（レーン１）及び野生型コラゲナーゼＨのＮ結合型糖鎖を切断したポリペプチド（レーン２）の電気泳動の図である。
【図４】本発明の実施例５に係る酵母培養液上清中の野生型コラゲナーゼＨ（レーン１）、野生型コラゲナーゼＨのＮ結合型糖鎖を切断したポリペプチド（レーン２）、変異コラゲナーゼＨ（レーン３）と変異コラゲナーゼＨのＮ結合型糖鎖の脱糖鎖処理をしたポリペプチド（レーン４）の電気泳動の図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を好ましい実施形態を用いて詳細に説明する。
【００１５】
１．用語の定義
本発明において、アミノ酸の表記は下記の通りである。
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン、Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン、Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸、Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸、Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン、Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン、Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン、Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン、Ｋ＝Ｌｙｓ＝リシン、Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン、Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン、Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン、Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン、Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン、Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン、Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン、Ｔ＝Ｔｈｒ＝スレオニン、Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン、Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン、Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン
【００１６】
本発明において、アミノ酸、蛋白質は下記に示すＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（ＣＢＮ）で採用された略号を用いて表される。また、特に明示しない限り、蛋白質のアミノ酸残基の配列は、左端から右端にかけてＮ末端からＣ末端となるように表される。また、参照を容易にするため、一般的に用いられている下記の命名法を適用する。１つは、「もとのアミノ酸；位置；置換したアミノ酸」と記述する方法であり、例えば、第６４位におけるチロシンのアスパラギン酸への置換は「Ｙ６４Ｄ」と表される。多重変異については、ハイフン記号「−」により分けることで表記する。例えば、「Ｓ４１Ａ−Ｙ６４Ｄ」とは、第４１位のセリンをアラニンへ、かつ、第６４位のチロシンをアスパラギン酸へ置換することを示す。
【００１７】
本発明において、塩基配列やアミノ酸配列の配列同一性は、当業者に周知の方法、配列解析ソフトウェア等を使用して求めることができる。例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムのｂｌａｓｔｎプログラムやｂｌａｓｔｐプログラム、ＦＡＳＴＡアルゴリズムのｆａｓｔａプログラムが挙げられる。本発明において、ある評価対象塩基配列の、塩基配列Ｘとの「配列同一性」とは、塩基配列Ｘと評価対象塩基配列とを整列（アライメント）させ、必要に応じてギャップを導入して、両者の塩基一致度が最も高くなるようにしたときの、ギャップ部分も含んだ塩基配列において同一部位に同一の塩基が出現する頻度を％で表示した値である。なお、ＤＮＡの塩基配列とＲＮＡの塩基配列とを比較するとき、ＴとＵは同一の塩基配列とみなす。本発明において、ある評価対象アミノ酸配列の、アミノ酸配列Ｘとの「配列同一性」とは、アミノ酸配列Ｘと評価対象アミノ酸配列とを整列させ、必要に応じてギャップを導入して、両者のアミノ酸一致度が最も高くなるようにしたときの、ギャップ部分も含んだアミノ酸配列において同一部位に同一の塩基が出現する頻度を％で表示した値である。
【００１８】
本発明において「ポリヌクレオチド」とは核酸と呼ぶこともでき、ＤＮＡ又はＲＮＡを指し、典型的にはＤＮＡを指す。本発明において「ポリヌクレオチド」は、その相補鎖と二本鎖化された形態で存在していてもよい。特に「ポリヌクレオチド」がＤＮＡである場合、所定の塩基配列を含むＤＮＡが、その相補塩基配列を含むＤＮＡと二本鎖化された形態で存在することが好ましい。
【００１９】
本発明において、「ポリペプチド」とは、２個以上のアミノ酸がペプチド結合したものを指し、蛋白質の他、ペプチドやオリゴペプチドと呼ばれる鎖長の短いものが含まれる。
【００２０】
本発明においてポリペプチドを「コードする塩基配列」とは、転写及び翻訳によってポリペプチドの生成をもたらすポリヌクレオチドの塩基配列を指し、例えば、アミノ酸配列からなるポリペプチドに対してコドン表に基づいて設計された塩基配列を指す。
【００２１】
本発明において、「宿主」とは、ポリヌクレオチドが導入され形質転換される細胞をいい、「宿主細胞」又は「形質転換体」とも呼ばれる。
【００２２】
「発現」とは、ポリペプチドの生成をもたらす塩基配列の転写及び翻訳を指す。また、その発現は外部刺激や生育条件等に依存せずにほぼ一定の状態でもよいし、依存してもよい。発現を駆動するプロモーターは、ポリペプチドをコードする塩基配列の発現を駆動するプロモーターであれば特に限定されない。
【００２３】
「ポリペプチド発現系」は、ポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドが導入され、前記ポリペプチドを発現し分泌生産可能な宿主を含む。
【００２４】
本発明において、宿主の生物種は酵母が好ましい。酵母としてはサッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、クイベロマイセス属、ヤロウィナ属等のメタノール資化性を有さない酵母であってもよいし、メタノール資化性酵母であってもよいが、メタノール資化性酵母がより好ましい。一般に、メタノール資化性酵母は、唯一の炭素源としてメタノールを利用して培養可能な酵母と定義されるが本来メタノール資化性酵母であったが、人為的な改変あるいは変異によりメタノール資化能を喪失した酵母も、本発明におけるメタノール資化性酵母に包含される。
【００２５】
メタノール資化性酵母としては、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、オガタエア（Ｏｇａｔａｅａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属、コマガタエラ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）属などに属する酵母が挙げられる。ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属ではピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、オガタエア（Ｏｇａｔａｅａ）属ではオガタエア・アングスタ（Ｏｇａｔａｅａ  ａｎｇｕｓｔａ）、オガタエア・ポリモルファ（Ｏｇａｔａｅａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、オガタエア・パラポリモルファ（Ｏｇａｔａｅａ  ｐａｒａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、オガタエア・ミヌータ（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ）、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属ではキャンディダ・ボイディニ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ）、コマガタエラ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）属ではコマガタエラ・パストリス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、コマガタエラ・ファフィ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐｈａｆｆｉｉ）などが好ましい例として挙げられる。
【００２６】
上記のメタノール資化性酵母のなかでも、ピキア属酵母、コマガタエラ属酵母又はオガタエア属酵母が特に好ましい。
【００２７】
コマガタエラ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）属酵母としては、コマガタエラ・パストリス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、コマガタエラ・ファフィ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐｈａｆｆｉｉ）が好ましい。コマガタエラ・パストリスおよびコマガタエラ・ファフィはどちらもピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）の別名を有する。
【００２８】
具体的に宿主として使用できる株として、コマガタエラ・パストリスＡＴＣＣ７６２７３（Ｙ−１１４３０、ＣＢＳ７４３５）、コマガタエラ・パストリスＸ−３３などの株が挙げられる。これらの株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションやサーモフィッシャーサイエンティフィック社等から入手することができる。
【００２９】
オガタエア（Ｏｇａｔａｅａ）属酵母としては、オガタエア・アングスタ（Ｏｇａｔａｅａ  ａｎｇｕｓｔａ）、オガタエア・ポリモルファ（Ｏｇａｔａｅａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、オガタエア・パラポリモルファ（Ｏｇａｔａｅａ  ｐａｒａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）が好ましい。これら３つは近縁種であり、いずれも、別名ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、または別名ピキア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ）でも表される。
【００３０】
具体的に使用できる菌株として、オガタエア・アングスタＮＣＹＣ４９５（ＡＴＣＣ１４７５４）、オガタエア・ポリモルファ８Ｖ（ＡＴＣＣ３４４３８）、オガタエア・パラポリモルファＤＬ−１（ＡＴＣＣ２６０１２）等の菌株が挙げられる。これらの菌株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション等から入手できる。
【００３１】
また、宿主としてはピキア属酵母、コマガタエラ属酵母、オガタエア属酵母等の酵母の菌株からの誘導株も使用でき、例えばヒスチジン要求性であればコマガタエラ・パストリスＧＳ１１５株（サーモフィッシャーサイエンティフィック社より入手可能）、ロイシン要求性株であれば、ＮＣＹＣ４９５由来のＢＹ４３２９、８Ｖ由来のＢＹ５２４２、ＤＬ−１由来のＢＹ５２４３（これらはＮａｔｉｏｎａｌ  ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔから分譲可能）等が挙げられる。本発明においては、これらの株からの誘導株等も使用できる。
【００３２】
「分泌生産」とは、ポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリペプチドを含む宿主細胞が、前記ポリペプチドを発現して細胞外に分泌することにより前記ポリペプチドを生産することを指す。
【００３３】
本発明において「均一性が高い」とは、クロストリジウム・ヒストリティカム由来のコラゲナーゼＧまたはＨの推定分子量より低分子量側にコラゲナーゼの分解物が存在しないことを指し、より好ましくは糖鎖構造が不均一なＮ結合型糖鎖が付加されていないコラゲナーゼ活性を有するポリペプチドのことを指す。
【００３４】
２．本発明のポリペプチド
アミノ酸配列中に、Ａｓｎ−Ｘ１−Ｘ２（ここではＸ１はプロリン以外のアミノ酸残基であり、Ｘ２はセリン又はスレオニンである）からなる保存配列を含むポリペプチドを酵母で発現させ分泌する場合、該保存配列中のＡｓｎにＮ結合型糖鎖が付加される。ただし、前記保存配列が存在するからといって前記酵母は必ずしも前記ＡｓｎにＮ結合型糖鎖を付加するとは限らず、ポリペプチド中の前記保存配列の近傍の三次元構造等の影響により前記ＡｓｎにＮ結合型糖鎖を付加しない場合もある。配列番号１に記す、クロストリジウム・ヒストリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来の野生型コラゲナーゼＧのアミノ酸配列においては、第３８〜４０位のＡｓｎ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ、第５２〜５４位のＡｓｎ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ、第１４９〜１５１位のＡｓｎ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ、第２５１〜２５３位のＡｓｎ−Ａｌａ−Ｓｅｒ、第３３０〜３３２位のＡｓｎ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ、第４１９〜４２１位のＡｓｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ、第７０４〜７０６位のＡｓｎ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ、第８５７〜８５９位のＡｓｎ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ、第９１５〜９１７位のＡｓｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、第９４４〜９４６位のＡｓｎ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ、第９６６〜９６８位のＡｓｎ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ、第９９２〜９９４位のＡｓｎ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ、第１０１３〜１０１５位のＡｓｎ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ、第１０２６〜１０２８位のＡｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒが前記保存配列に相当する。本発明者らは、クロストリジウム・ヒストリティカム由来の野生型コラゲナーゼＧを、酵母を宿主とする発現系において分泌生産する場合、前記保存配列のうち第１４９〜１５１位のＡｓｎ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ（Ｎ１４９）、第２５１〜２５３位のＡｓｎ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（Ｎ２５１）、第３３０〜３３２位のＡｓｎ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ（Ｎ３３０）、第４１９〜４２１位のＡｓｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（Ｎ４１９）、第７０４〜７０６位のＡｓｎ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ（Ｎ７０４）、第８５７〜８５９位のＡｓｎ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ（Ｎ８５７）、第９１５〜９１７位のＡｓｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（Ｎ９１５）、第９４４〜９４６位のＡｓｎ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（Ｎ９４４）、第９６６〜９６８位のＡｓｎ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ（Ｎ９６６）、第９９２〜９９４位のＡｓｎ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ（Ｎ９９２）、第１０１３〜１０１５位のＡｓｎ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ（Ｎ１０１３）、第１０２６〜１０２８位のＡｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ（Ｎ１０２６）にＮ結合型糖鎖が付加されることを見出した。また、配列番号２に記す、クロストリジウム・ヒストリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来の野生型コラゲナーゼＨのアミノ酸配列においては、第２３〜２５位のＡｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ、第３６〜３８位のＡｓｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒ、第４３〜４５位のＡｓｎ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ、第８９〜９１位のＡｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ、第１８０〜１８２位のＡｓｎ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ、第１９０〜１９２位のＡｓｎ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ、第２６５〜２６７位のＡｓｎ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ、第５１４〜５１６位のＡｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ、第６０１〜６０３位のＡｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ、第７３３〜７３５位のＡｓｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ、第７６９〜７７１位のＡｓｎ−Ｌｙｓ��Ｓｅｒ、第９１２〜９１４位のＡｓｎ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ、第９３４〜９３６位のＡｓｎ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ、第９８４〜９８６位のＡｓｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ、第１００５〜１００７位のＡｓｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒが前記保存配列に相当する。本発明者らは、クロストリジウム・ヒストリティカム由来の野生型コラゲナーゼＨを、酵母を宿主とする発現系において分泌生産する場合、前記保存配列中の第８９〜９１位のＡｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ（Ｎ８９）、第１８０〜１８２位のＡｓｎ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ（Ｎ１８０）、第５１４〜５１６位のＡｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ（Ｎ５１４）、第６０１〜６０３位のＡｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ（Ｎ６０１）にＮ結合型糖鎖が付加されることを見出した。一方で本発明者らが確認したところ、従来技術において配列番号１，２に示すアミノ酸配列からなるクロストリジウム・ヒストリティカム由来の野生型コラゲナーゼを、クロストリジウム・ヒストリティカムや大腸菌を宿主とする発現系で発現させた場合にはＮ結合型糖鎖は付加されないが、分解物の存在が確認され、化学構造は不均一である。
【００３５】
これらの知見をもとに、本発明者らは、酵母を宿主とするポリペプチド発現系により、クロストリジウム・ヒストリティカム由来の野生型コラゲナーゼの均一性の高いポリペプチドを得るため、以下に詳述する本発明のポリペプチドを完成させた。
【００３６】
本発明は、以下の（ａ１）または（ａ２）のアミノ酸配列を含み、かつ(ｂ)の条件を満足するポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が（ｃ１）、（ｃ２）のいずれかひとつから選択されるアミノ酸配列であるポリペプチドに関する。
（ａ１）配列番号１または２に示すアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
（ａ２）配列番号１または２に示すアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、及び/又は付加したアミノ酸配列
（ｂ）コラゲナーゼ活性を有する
（ｃ１）配列番号１に示すアミノ酸配列における第１４９位、第２５１位、第３３０位、第４１９位、第７０４位、第８５７位、第９１５位、第９４４位、第９６６位、第９９２位、第１０１３位、及び第１０２６位に相当するアミノ酸残基が全てＮ結合型糖鎖修飾を受けない状態にあるアミノ酸配列
（ｃ２）配列番号２に示すアミノ酸配列における第８９位、第１８０位、第５１４位、及び第６０１位に相当するアミノ酸残基が全てＮ結合型糖鎖修飾を受けない状態にあるアミノ酸配列。
【００３７】
前記（ａ１）においてアミノ酸配列の配列同一性は、好ましくは８６％以上であり、好ましくは８７％以上であり、好ましくは８８％以上であり、好ましくは８９％以上であり、好ましくは９０％以上であり、好ましくは９１％以上であり、好ましくは９２％以上であり、好ましくは９３％以上であり、好ましくは９４％以上であり、好ましくは９５％以上であり、好ましくは９６％以上であり、好ましくは９７％以上であり、好ましくは９８％以上であり、好ましくは９９％以上である。ただし、前記（ａ１）のアミノ酸配列は、配列番号１または２に示すアミノ酸配列の変異配列であり、配列番号１または２に示すアミノ酸配列とのアミノ酸配列の配列同一性は１００％未満である。
【００３８】
前記（ａ２）において、「１もしくは複数個」とは、例えば１〜４０個、好ましくは１〜３５個、好ましくは１〜３０個、好ましくは１〜２５個、好ましくは１〜２０個、好ましくは１〜１５個、好ましくは１〜１１個、好ましくは２〜４０個、好ましくは２〜３５個、好ましくは２〜３０個、好ましくは２〜２５個、好ましくは２〜２０個、好ましくは２〜１５個、好ましくは２〜１１個、好ましくは３〜４０個、好ましくは３〜３５個、好ましくは３〜３０個、好ましくは３〜２５個、好ましくは３〜２０個、好ましくは３〜１５個、好ましくは３〜１１個、好ましくは４〜４０個、好ましくは４〜３５個、好ましくは４〜３０個、好ましくは４〜２５個、好ましくは４〜２０個、好ましくは４〜１５個、好ましくは４〜１２個をいう。
【００３９】
前記（ｂ）において、「コラゲナーゼ活性を有する」とは、三重らせん構造を有するコラーゲン分子内に存在するアミノ酸配列Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＹのＧｌｙ残基のＮ末端側を切断する酵素活性を有することを指す。
【００４０】
上記のポリペプチドは、酵母を宿主とするポリペプチド発現系を用いて分泌生産する場合に、上述の保存配列中のＡｓｎに相当するアミノ酸残基がＮ結合型糖鎖修飾を受けない状態にあるため、Ｎ結合型糖鎖を有さないポリペプチドとして分泌生産される。ここで、酵母としてはコマガタエラ属酵母等の、ポリペプチドの生産のための宿主として用いようとする１種以上の酵母であればよい。コマガタエラ属酵母としては、コマガタエラ・パストリス（＝ピキア・パストリス）が例示できる。
【００４１】
前記アミノ酸配列は、以下の（ｄ１）、（ｄ２）のいずれかひとつから選択されることが好ましい。このようなアミノ酸置換が導入されることにより、Ｎ結合型糖鎖修飾を受けないポリペプチドを得ることができる。
【００４２】
（ｄ１）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、第１４９位、第１５０位、第１５１位のいずれか１つ以上のアミノ酸にアミノ酸置換（具体的には、第１４９位はアスパラギン以外のアミノ酸へ置換、第１５０位はプロリンへ置換、第１５１位はセリンまたはスレオニン以外のアミノ酸へ置換のいずれか１つ以上のアミノ酸置換）が導入されている、かつ、第２５１位、第２５２位、第２５３位のいずれか１つ以上のアミノ酸にアミノ酸置換（具体的には、第２５１位はアスパラギン以外のアミノ酸へ置換、第２５２位はプロリンへ置換、第２５３位はセリンまたはスレオニン以外のアミノ酸へ置換のいずれか１つ以上のアミノ酸置換）が導入されている、かつ、第３３０位、第３３１位、第３３２位のいずれか１つ以上のアミノ酸にアミノ酸置換（具体的には、第３３０位はアスパラギン以外のアミノ酸へ置換、第３３１位はプロリンへ置換、第３３２位はセリンまたはスレオニン以外のアミノ酸へ置換のいずれか１つ以上のアミノ酸置換）が導入されている、かつ、第４１９位、第４２０位、第４２１位のいずれか１つ以上のアミノ酸にアミノ酸置換（具体的には、第４１９位はアスパラギン以外のアミノ酸へ置換、第４２０位はプロリンへ置換、第４２１位はセリンまたはスレオニン以外のアミノ酸へ置換のいずれか１つ以上のアミノ酸置換）が導入されている、かつ、第７０４位、第７０５位、第７０６位のいずれか１つ以上のアミノ酸にアミノ酸置換（具体的には、第７０４位はアスパラギン以外のアミノ酸へ置換、第７０５位はプロリンへ置換、第７０６位はセリンまたはスレオニン以外のアミノ酸へ置換のいずれか１つ以上のアミノ酸置換）が導入されている、かつ、第８５７位、第８５８位、第８５９位のいずれか１つ以上のアミノ酸にアミノ酸置換（具体的には、第８５７位はアスパラギン以外のアミノ酸へ置換、第８５８位はプロリンへ置換、第８５９位はセリンまたはスレオニン以外のアミノ酸へ置換のいずれか１つ以上のアミノ酸置換）が導入されている、かつ、第９１５位、第９１６位、第９１７位のいずれか１つ以上のアミノ酸にアミノ酸置換（具体的には、第９１５位はアスパラギン以外のアミノ酸へ置換、第９１６位はプロリンへ置換、第９１７位はセリンまたはスレオニン以外のアミノ酸へ置換のいずれか１つ以上のアミノ酸置換）が導入されている、かつ、第９４４位、第９４５位、第９４６位のいずれか１つ以上のアミノ酸にアミノ酸置換（具体的には、第９４４位はアスパラギン以外のアミノ酸へ置換、第９４５位はプロリンへ置換、第９４６位はセリンまたはスレオニン以外のアミノ酸へ置換のいずれか１つ以上のアミノ酸置換）が導入されている、かつ、第９６６位、第９６７位、第９６８位のいずれか１つ以上のアミノ酸にアミノ酸置換（具体的には、第９６６位はアスパラギン以外のアミノ酸へ置換、第９６７位はプロリンへ置換、第９６８位はセリンまたはスレオニン以外のアミノ酸へ置換のいずれか１つ以上のアミノ酸置換）が導入されている、かつ、第９９２位、第９９３位、第９９４位のいずれか１つ以上のアミノ酸にアミノ酸置換（具体的には、第９９２位はアスパラギン以外のアミノ酸へ置換、第９９３位はプロリンのみ、第９９４位はセリンまたはスレオニン以外のアミノ酸へ置換のいずれか１つ以上のアミノ酸置換）が導入されている、かつ、第１０１３位、第１０１４位、第１０１５位のいずれか１つ以上のアミノ酸にアミノ酸置換（具体的には、第１０１３位はアスパラギン以外のアミノ酸へ置換、第１０１４位はプロリンへ置換、第１０１５位はセリンまたはスレオニン以外のアミノ酸へ置換のいずれか１つ以上のアミノ酸置換）が導入されている、かつ、第１０２６位、第１０２７位、第１０２８位のいずれか１つ以上のアミノ酸にアミノ酸置換（具体的には、第１０２６位はアスパラギン以外のアミノ酸へ置換、第１０２７位はプロリンへ置換、第１０２８位はセリンまたはスレオニン以外のアミノ酸へ置換のいずれか１つ以上のアミノ酸置換）が導入されているアミノ酸配列。
【００４３】
（ｄ２）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、第８９位、第９０位、第９１位のいずれか１つ以上のアミノ酸にアミノ酸置換（具体的には、第８９位はアスパラギン以外のアミノ酸へ置換、第９０位はプロリンへ置換、第９１位はセリンまたはスレオニン以外のアミノ酸へ置換のいずれか１つ以上のアミノ酸置換）が導入されている、かつ、第１８０位、第１８１位、第１８２位のいずれか１つ以上のアミノ酸にアミノ酸置換（具体的には、第１８０位はアスパラギン以外のアミノ酸へ置換、第１８１位はプロリンへ置換、第１８２位はセリンまたはスレオニン以外のアミノ酸へ置換のいずれか１つ以上のアミノ酸置換）が導入されている、かつ、第５１４位、第５１５位、第５１６位のいずれか１つ以上のアミノ酸にアミノ酸置換（具体的には、第５１４位はアスパラギン以外のアミノ酸へ置換、第５１５位はプロリンへ置換、第５１６位はセリンまたはスレオニン以外のアミノ酸へ置換のいずれか１つ以上のアミノ酸置換）が導入されている、かつ、第６０１位、第６０２位、第６０３位のいずれか１つ以上のアミノ酸にアミノ酸置換（具体的には、第６０１位はアスパラギン以外のアミノ酸へ置換、第６０２位はプロリンへ置換、第６０３位はセリンまたはスレオニン以外のアミノ酸へ置換のいずれか１つ以上のアミノ酸置換）が導入されているアミノ酸配列。
【００４４】
本発明のポリペプチドは、そのＮ末端側及びＣ末端側の一方又は両方に、更に他のポリペプチドが連結された融合ポリペプチドの形態で存在していてもよい。他のポリペプチドとしては、シグナルペプチド、タグペプチド等が例示できるがこれらに限定されない。シグナルペプチドの具体例は後述する通りである。タグペプチドとしては複数（例えば６〜１０個）のヒスチジン残基からなるタグペプチド（ヒスチジンタグ）や、ＦＬＡＧタグペプチドが例示できる。
【００４５】
３．ベクター
本発明の一実施形態は、本発明のポリペプチドと該ポリペプチドの酵母からの分泌を可能にするシグナルペプチドとをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００４６】
本発明のベクターとは人為的に構築された核酸分子であって、通常は、核酸分子内に異種生物に由来する塩基配列を含む。本発明のベクターは酵母に導入され酵母を形質転換するために用いることができる。
【００４７】
本発明のベクターに含まれる、本発明のポリペプチドの酵母からの分泌を可能にするシグナルペプチドは特に限定されないが、サッカロマイセス・セレビシエに由来するＭａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ  α（ＭＦα）が挙げられる。また、オガタエア・アングスタの酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ１）、コマガタエラ・パストリスの酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ１）、サッカロマイセス・セレビシエのインベルターゼ（ＳＵＣ２）、又はサッカロマイセス・セレビシエのＰＬＢ１のシグナル配列もまた、本発明のポリペプチドの酵母からの分泌を可能にするシグナルペプチドとして利用可能である。
【００４８】
本発明のベクターでは、本発明のポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドの５‘末端に、前記シグナルペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを配置すればよい。本発明のベクターは更に、本発明のポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドの５’末端及び３‘末端の一方又は両方に、前記タグペプチドをコードする塩基配列を含んでいてもよい。
【００４９】
本発明のポリペプチド及びシグナルペプチドをコードする塩基配列は発現カセットに挿入された形態でベクター中に収めることができる。「発現カセット」とは、本発明のポリペプチド及びシグナルペプチドをコードする塩基配列を含み、それをポリペプチドとして発現可能な状態にすることのできる発現システムをいう。「発現可能な状態」とは、当該発現カセットに含まれる前記塩基配列が、宿主である酵母において発現可能なように、遺伝子発現に必要なエレメントの制御下に配置されている状態をいう。遺伝子発現に必要なエレメントには、プロモーター、ターミネータ等が挙げられる。
【００５０】
本発明のベクターは環状ベクター、直鎖状ベクター、人工染色体等であることができる。
【００５１】
ここで、「プロモーター」とは、本発明のポリペプチド及びシグナルペプチドをコードする塩基配列の上流に位置する塩基配列領域をいい、ＲＮＡポリメラーゼのほか、転写の促進や抑制に関わる様々な転写調節因子が該領域に結合又は作用することによって鋳型である本発明のポリペプチド及びシグナルペプチドをコードする塩基配列を読み取って相補的なＲＮＡを合成（転写）する。
【００５２】
ポリペプチドを発現させるプロモーターは、選択した炭素源にて発現が起こりうるプロモーターを適切に使用すればよく、特に限定されない。
【００５３】
本発明のベクターの前記発現カセットにおいて、ターミネーターは、本発明のポリペプチド及びシグナルペプチドをコードする塩基配列の下流に位置する。ターミネーターは、使用するプロモーター及び宿主酵母に応じて適宜選択することができる。
【００５４】
本発明のベクターでは、更に、１つ以上の制限酵素認識部位を含むクローニングサイト、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のＩｎ−ＦｕｓｉｏｎクローニングシステムやＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社のＧｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙシステム等を利用するためのオーバーラップ領域、選択マーカー遺伝子（栄養要求性相補遺伝子、薬剤耐性遺伝子等）の塩基配列等を含むことができる。本発明のベクターは更に、宿主に応じて、自律複製配列（Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（ＡＲＳ）、セントロメアＤＮＡ配列、テロメアＤＮＡ配列を含むことができる。
【００５５】
４．酵母
本発明はまた、本発明のポリペプチドと、前記ポリペプチドの酵母からの分泌を可能にするシグナルペプチドとをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む酵母に関する。ここで本発明の酵母は、前記ポリヌクレオチドを、上記の本発明のベクターの一部として含むことができる。
【００５６】
宿主として用いることができる酵母の具体的な種類について既述の通りである。
【００５７】
前記ポリヌクレオチドを酵母へ導入する方法、すなわち形質転換法は公知の方法を適宜用いることができ、エレクトロポレーション法、酢酸リチウム法、スフェロプラスト法等が挙げられるが特にこれらに限定されるものではない。例えば、コマガタエラ・パストリスの形質転換法としては、Ｈｉｇｈ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｌｉｔｈｉｕｍａｃｅｔａｔｅ  ａｎｄ  ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．  ２００４  Ｊａｎ；３６（１）：１５２−４．）に記載されているエレクトロポレーション法が一般的である。
【００５８】
５．本発明のポリペプチドの製造方法
本発明のポリペプチドの製造方法には、酵母を培養する培養工程が含まれる。前記培養工程で得られた前記酵母の培養物から目的とする本発明のポリペプチドを回収すればよい。ここで「培養物」とは、培養液上清のほか、培養細胞又は細胞の破砕物を包含する。本発明の酵母は本発明のポリペプチドを細胞外に分泌生産することができるから、培養物としては特に培養液上清が好ましい。すなわち本発明の酵母を用いて本発明のポリペプチドを製造する方法としては、本発明の酵母を培養し、その培養液上清中に本発明のポリペプチドを蓄積させる方法が好ましい。酵母の培養条件は特に限定されず、細胞に応じて適宜選択すればよい。該培養においては、細胞が資化しうる栄養源を含む培地であれば何でも使用できる。
【００５９】
酵母の培養条件は特に限定されず、細胞に応じて適宜選択すればよい。該培養においては、細胞が資化しうる栄養源を含む培地であれば何でも使用できる。該栄養源としては、グルコース、スクロース、マルトース等の乳糖、酢酸、クエン酸、プロピオン酸等の有機酸類、メタノール、エタノール、グリセロール等のアルコール類、パラフィン等の炭化水素類、大豆油、菜種油等の油類、又はこれら混合物の炭素源、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、尿素、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、コーンスターチープリカー等の窒素源、更に、その他の無機塩、ビタミン類等の栄養源を適宜混合・配合した通常の培地を用いることができる。また、培養はバッチ培養や連続培養のいずれでも可能である。
【００６０】
本発明の好ましい様態として、酵母にピキア属酵母又はオガタエア属酵母を用いた場合、上記炭素源は、グルコース、グリセロール、メタノールのうち１種でもよく、又は２種以上であってもよい。また、これらの炭素源は培養初期から存在していてもよいし、培養途中に添加してもよい。
【００６１】
酵母の培養は通常一般の条件により行うことができ、例えば、ｐＨ２．５〜１０．０、温度範囲１０℃〜４８℃の範囲で、好気的に１０時間〜１０日間培養することにより行うことができる。
【００６２】
前記培養物からの本発明のポリペプチドの回収方法については、公知の精製法を適当に組み合わせて用いることができる。例えば、まず、本発明の酵母と培地とを含む培養液を遠心分離、あるいは、ろ過処理して、液体画分、すなわち培養液上清から酵母細胞を除く。得られた培養液上清を、塩析（硫酸アンモニウム沈澱、リン酸ナトリウム沈澱等）、溶媒沈澱（アセトン又はエタノール等による蛋白質分画沈澱法）、透析、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、限外ろ過等の手法を単独で、又は組み合わせて用いることにより、該培養液上清から本発明のポリペプチドを回収する。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。なお、以下の実施例において用いた組換えＤＮＡ技術に関する詳細な方法などは、次の成書に記載されている：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）。【００６４】
また、以下の実施例において、酵母の形質転換に用いるプラスミドは、構築したベクターを大腸菌Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＨＳＴ１６ＣＲコンピテントセル（タカラバイオ社製）に導入し、得られた形質転換体を培養して増幅することによって調整した。プラスミド保持株からのプラスミドの調整は、ＱＩＡｐｒｅｐ  ｓｐｉｎ  ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて行った。【００６５】
ベクターの構築において利用した、ＡＯＸ１プロモーター（配列番号３）、ＡＯＸ１ターミネーター（配列番号４）、ＨＩＳ４遺伝子（配列番号５）はコマガタエラ・パストリスＡＴＣＣ７６２７３株の染色体ＤＮＡ（塩基配列はＥＭＢＬ（Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）ＡＣＣＳＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．ＦＲ８３９６２８〜ＦＲ８３９６３１に記載）混合物をテンプレートにしてＰＣＲで調整した。【００６６】
ベクターの構築において利用したＭａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒαシグナル配列（ＭＦ配列）（配列番号６）が付与されたＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍの野生型コラゲナーゼ遺伝子は公開配列情報（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号：Ｑ９Ｘ７２１（コラゲナーゼＧ）、Ｑ４６０８５（コラゲナーゼＨ））に基づいて合成ＤＮＡを調整した。【００６７】
ＰＣＲにはＰｒｉｍｅ  ＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）等を用い、反応条件は添付のマニュアルに記載の方法で行った。染色体のＤＮＡの調整は、コマガタエラ・パストリスＡＴＣＣ７６２７３株からＧｅｎとるくんＴＭ（タカラバイオ社製）等を用いて、これに記載の条件で実施した。【００６８】
＜比較例１：野生型コラゲナーゼ発現ベクターの構築＞
ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ−ＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩのマルチクローニングサイトをもつ遺伝子断片（配列番号７）を全合成し、これをｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩサイト間に挿入して、ｐＵＣ−１を構築した。【００６９】
また、ＡＯＸ１プロモーターの両側にＢａｍＨＩ認識配列を付加した核酸断片を、前記染色体ＤＮＡ混合物を鋳型としたとしプライマー１（配列番号８）及び２（配列番号９）を用いたＰＣＲにより調整し、ＢａｍＨＩ処理後にｐＵＣ−１のＢａｍＨＩサイトに挿入して、ｐＵＣＰａｏｘを構築した。【００７０】
次に、ＡＯＸ１ターミネーターの両側にＸｂａＩ認識配列を付加した核酸断片を、前記染色体ＤＮＡ混合物を鋳型としプライマー３（配列番号１０）及び４（配列番号１１）を用いたＰＣＲにより調整し、ＸｂａＩ処理後にｐＵＣ−ＰａｏｘＴａｏｘを構築した。【００７１】
次に、ＨＩＳ４遺伝子の両側にＥｃｏＲＩ認識配列を付加した核酸断片を、前記染色体ＤＮＡ混合物を鋳型としプライマー５（配列番号１２）及び６（配列番号１３）を用いたＰＣＲにより調整し、ＥｃｏＲＩ処理後にｐＵＣ−ＰａｏｘＴａｏｘＥｃｏＲＩサイトに挿入して、ｐＵＣ−ＰａｏｘＴａｏｘＨＩＳ４を構築した。【００７２】
次に、ＭＦ配列が付加されたコラゲナーゼＧまたは遺伝子の両側にＢｇｌＩＩ認識配列を付加した核酸断片を、前記合成ＤＮＡを鋳型とし、コラゲナーゼＧはプライマー７（配列番号１４）及び８（配列番号１５）または、コラゲナーゼＨはプライマー７（配列番号１４）及び９（配列番号１６）を用いたＰＣＲにより調製し、ＢｇｌＩＩ処理後にｐＵＣ−ＰａｏｘＴａｏｘＨＩＳ４のＢｇｌＩＩサイトに挿入して、ｐＵＣ−ＰａｏｘＣｏｌＧＴａｏｘＨＩＳ４（コラゲナーゼＧ）またはｐＵＣ−ＰａｏｘＣｏｌＨＴａｏｘＨＩＳ４（コラゲナーゼＨ）を構築した。このｐＵＣ−ＰａｏｘＣｏｌＧＴａｏｘＨＩＳ４（コラゲナーゼＧ）及びｐＵＣ−ＰａｏｘＣｏｌＨＴａｏｘＨＩＳ４（コラゲナーゼＨ）は、野生型コラゲナーゼＧまたはＨ遺伝子がＡＯＸ１プロモーター制御下で分泌発現するように設計されている。【００７３】
＜比較例２：形質転換酵母の取得＞
比較例１で構築した野生型コラゲナーゼ発現ベクターを用いて、以下のようにコマガタエラ・パストリスを形質転換した。【００７４】
コマガタエラ・パストリスＡＴＣＣ７６２７３株由来ヒスチジン要求性株を３ｍＬのＹＰＤ培地（１％  ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ  ｂａｃｔｏ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％  ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ（日本製薬社製）、２％  ｇｌｕｃｏｓｅ）に接種し、３０℃で一晩振盪培養して、前培養液５００μＬを５０ｍＬのＹＰＤ培地に接種し、ＯＤ６００が１〜１．５になるまで振盪培養後、集菌（３０００×ｇ、１０分、２０℃）し、２５０μＬの１Ｍ  ＤＴＴ（終濃度２５ｍＭ）を含む１０ｍＬの５０ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．５に再懸濁した。【００７５】
この懸濁液を３０℃で１５分インキュベート後、集菌（３０００×ｇ、１０分、２０℃）し、予め予冷した５０ｍＬのＳＴＭバッファー（２７０ｍＭ  スクロース、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ塩化マグネシウム、ｐＨ７．５）で洗浄した。洗浄液を集菌（３０００×ｇ、１０分、４℃）し、２５ｍＬのＳＴＭバッファーで再度洗浄したのち、集菌（３０００×ｇ、１０分、４℃）した。最終的に、２５０μＬの氷冷ＳＴＭバッファーに懸濁し、これをコンピテントセル溶液とした。【００７６】
比較例１で構築した野生型コラゲナーゼ発現ベクターｐＵＣ−ＰａｏｘＣｏｌＧＴａｏｘＨＩＳ４またはｐＵＣ−ＰａｏｘＣｏｌＨＴａｏｘＨＩＳ４を用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体を２ｍＬのアンピシリン含有ＬＢ培地（１％  Ｔｒｙｐｔｏｎｅ（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．５％  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ社製）、１％  塩化ナトリウム（Ｄｉｆｃｏ社製））で培養し、得られた菌体からＱＩＡｐｒｅｐ  ｓｐｉｎ  ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、ｐＵＣ−ＰａｏｘＣｏｌＧＴａｏｘＨＩＳ４またはｐＵＣ−ＰａｏｘＣｏｌＨＴａｏｘＨＩＳ４を取得した。本プラスミドをＳａｌＩ処理し、ＨＩＳ４遺伝子内のＳａｌＩ認識配列で切断された直鎖状ベクターを調整した。【００７７】
上述のコンピテントセル溶液６０μＬと直鎖状のｐＵＣ−ＰａｏｘＣｏｌＧＴａｏｘＨＩＳ４溶液またはｐＵＣ−ＰａｏｘＣｏｌＨＴａｏｘＨＩＳ４溶液１μＬを混合し、エレクトロポレーション用キュベット（ディスポキュベット電極、電極間隔２ｍｍ（ビーエム機器社製））に移し入れ、７．５ｋＶ/ｃｍ、２５μＦ、２００Ωに供した後、菌体を１ｍＬのＹＰＤ培地で懸濁し、３０℃で１時間静置した。１時間静置後、集菌（３０００×ｇ、５分、２０℃）し、１ｍＬのＹＮＢ培地（０．６７％  ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ（Ｄｉｆｃｏ社製））に懸濁後、再度集菌（３０００×ｇ、５分、２０℃）した。菌体を適当量のＹＮＢ培地で再懸濁後、ＹＮＢ選択寒天プレート（０．６７％  ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％アガロース、２％グルコース）に塗布し、３０℃、３日間の静置培養で生育する株を選択し、野生型コラゲナーゼＧまたはＨ発現酵母を取得した。【００７８】
＜比較例３：形質転換酵母の培養＞
比較例２で得られた野生型コラゲナーゼ発現酵母を３ｍＬのＢＭＧＭＹ培地（１％  ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ｂａｃｔｏ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％  ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ（日本製薬社製）、０．３４％ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗｉｔｈｏｕｔ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ、１％  硫酸アンモニウム、０．４ｍｇ／Ｌ  ビオチン、１００ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ７．０）、１％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１％  メタノール）に接種し、これを３０℃、７２時間振盪培養後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、５分、４℃）により培養液上清を回収した。【００７９】
＜比較例４：培養液上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ＞
比較例３で得られた培養液上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を実施した。【００８０】
８μＬの培養液上清と８μＬの２×サンプルバッファー（０．２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、４０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、８％  ドデシル硫酸ナトリウム、０．０２％  ブロモフェノールブルー）を混合し、９５℃、８分間処理した。本サンプルを分子量マーカー（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ ＰｒｏｔｅｉｎＴＭ Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ、バイオラッド社製）と共に、ｅ−ＰＡＧＥＬゲル（Ｅ−Ｒ７．５Ｌ、ＡＴＴＯ社製）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に供した。泳動後、ゲルを１５分間水洗し、３０分染色したのち、水で脱色した。その結果、アミノ酸配列から推定される分子量よりも高分子量側にスメアなバンドを確認した（コラゲナーゼＧは図１−レーン１、コラゲナーゼＨは図３−レーン１）。この培養液上清を、Ｎ結合型糖鎖切断キット（Ｅｎｄｏ Ｈｆ，  ＢｉｏＬａｂｓ社製）で処理すると、高分子量側に存在したスメアなバンドは消失し、アミノ酸配列から推定される分子量位置にバンドを確認した（コラゲナーゼＧは図１−レーン２、コラゲナーゼＨは図３−レーン２）。野生型コラゲナーゼＧまたはＨをコマガタエラ酵母で分泌生産した本実験では、大腸菌を宿主として発現させた場合に見られた推定分子量より低分子量側に存在する分解物（特許文献１）は確認されなかった（図１−レーン１、図３−レーン１）。しかし、Ｎ結合型糖鎖切断キットによりコラゲナーゼＧおよびＨは低分子量側にバンドがシフトしたことから（図１−レーン２、図３−レーン２）、コマガタエラ酵母では、野生型コラゲナーゼＧおよびＨはＮ結合型糖鎖修飾された修飾体として生産されていることが確認された。【００８１】
＜実施例１：変異コラゲナーゼ発現ベクターの構築＞
ＭＦ配列が付与された野生型コラゲナーゼＧまたはＨ遺伝子の合成遺伝子、或いは、以下のＰＣＲで調製された変異遺伝子、をテンプレートに各種変異体遺伝子をＰＣＲで調製した。
まず、以下の表１に示した、ＭＦ配列が付与された野生型コラゲナーゼＧまたはＨ遺伝子、或いは、ＭＦ配列が付与された変異遺伝子（ｍｕｔａｎｔ  １からｍｕｔａｎｔ  １６のいずれか）をテンプレートとし、各プライマーの組合せ（1ｓｔＰＣＲ−１、１ｓｔＰＣＲ−２）を用いてＰＣＲを行い、得られた各断片を混合したものをテンプレートに、コラゲナーゼＧに関してはプライマー７およびプライマー８、コラゲナーゼＨに関してはプライマー７及びプライマー９でＰＣＲを行い、ＭＦ配列が付与された各種変異コラゲナーゼ遺伝子の両端にＢｇｌＩＩ認識配列が付加されたＤＮＡ断片を調製した。【００８２】
上記で調製した変異コラゲナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片をＢｇｌＩＩ処理し、比較例１で調製したｐＵＣ−ＰａｏｘＴａｏｘＨＩＳ４のＢｇｌＩＩサイトに挿入して、ＭＦ配列が付与された各種変異コラゲナーゼ遺伝子発現ベクターを構築した。【００８３】
【表１】
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2019187691.tif 000003
【００８４】
＜実施例２：形質転換酵母の取得＞
実施例１で構築したＭＦ配列を付加した変異コラゲナーゼ発現ベクターを用いて、比較例２に示した方法と同様に、コマガタエラ・パストリスを形質転換した。【００８５】
実施例１で構築した変異コラゲナーゼ発現ベクターを用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体を２ｍＬのアンピシリン含有ＬＢ培地で培養し、得られた菌体からプラスミドを取得した。本プラスミドをＳａｌＩ処理し、直鎖状にした。【００８６】
コンピテントセルの調製および形質転換および形質転換体の選択は比較例２に記載の方法で実施した。【００８７】
＜実施例３：形質転換酵母の培養＞
実施例２で得られた変異コラゲナーゼ発現酵母を、比較例３に記載の方法で培養し、培養液上清を回収した。【００８８】
＜実施例４：培養液上清中のコラゲナーゼ活性の測定＞
実施例３で得られた変異コラゲナーゼ発現酵母の培養液上清中のコラゲナーゼ活性を以下の方法で測定した。【００８９】
微量透析器（Ｍｉｎｉ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｋｉｔ  ８  ｋＤａ  ｃｕｔ−ｏｆｆ，  ｕｐ  ｔｏ  ２５０μＬ、ＧＥヘルスケア社製）に各種培養液上清を２００μＬ添加し、透析バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で４℃で一晩撹拌し、透析をした。透析した溶液を遠心により回収した。【００９０】
反応バッファー（０．８Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．１）、０．２Ｍ  ＣａＣｌ２  １．２３ｍＭ  ４−フェニルアゾベンジルオキシカルボニル−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｒｇ（シグマアルドリッチ社製））２００μＬを３７℃にインキュベートした。そこに透析回収液１０μＬを加えて混合した後に３７℃に３０分間インキュベートした。その後２５ｍＭ  クエン酸溶液を加えて反応を停止させ、酢酸エチル２．５ｍＬ加えた。１５秒間転倒攪拌させ、有機層（上層）を別のチューブに移した。そこに、１５０ｍｇの硫酸ナトリウムを混合させた。溶液を分光光度計（Ｕ−２９００、ＨＩＴＡＣＨＩ社製）にて、３２０ｎｍの吸光度を測定した。【００９１】
反応開始後３０分間後の３２０ｎｍの吸光度変化から、培養液中のコラゲナーゼ活性を算出した。なお、コラゲナーゼ活性のユニットの定義は、３７℃で１μｍｏｌの反応基質（フェニルアゾベンジルオキシカルボニル−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｒｇ）を反応させ１分間に３２０ｎｍの吸収を１．０向上させる活性を１ユニットとした。【００９２】
各種変異コラゲナーゼ発現株の培養液上清中に、コラゲナーゼ活性があることを確認した。【００９３】
【表２】
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【００９４】
＜実施例５：培養液上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ＞
実施例３で得られた培養液上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を実施した。方法は、比較例４と同様の方法で実施した。【００９５】
その結果、各種変異コラゲナーゼは、野生型コラゲナーゼ（野生型コラゲナーゼＧは図２−レーン１、野生型コラゲナーゼＨは図４−レーン１）と異なり、推定分子量に相当する位置に特異的なバンドが認められ（図２−レーン３は、コラゲナーゼＧの変異体であるｍｕｔａｎｔ１２のレーンである。図４−レーン３は、コラゲナーゼＨの変異体であるｍｕｔａｎｔ１６のレーンである。図２−レーン２、４はそれぞれ野生型コラゲナーゼＧ、ｍｕｔａｎｔ１２からＮ結合型糖鎖を切断したポリペプチドのレーンである。図４−レーン２、４はそれぞれ野生型コラゲナーゼＨ、ｍｕｔａｎｔ１６からＮ結合型糖鎖を切断したポリペプチドのレーンである。図２のレーン２、３、４及び図４のレーン２、３、４のバンド位置は、いずれも、推定分子量に相当する）、Ｎ結合型糖鎖修飾のない状態で分泌していることを確認した。また、大腸菌で発現させた場合には推定分子量より低分子量側に存在した分解物（特許文献１）と思われるバンドは本実施例では確認されなかった。【００９６】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2019187691.tif 000010
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