(57)【要約】  被験者に由来する口腔内細菌叢を分析して、癌リスク群に属するかを判定する方法であって、複数人の癌患者由来菌叢比率Ｐｐのデータ群（Ｐｐデータ群）に被験者由来の菌叢比率Ｐｔのデータを加えたデータ群からの菌叢比率Ｐｔのマハラノビス距離（Ｄｐ）を算出する工程、複数人の健常人由来の菌叢比率Ｐｎのデータ群（Ｐｎデータ群）に被験者由来の菌叢比率Ｐｔのデータを加えたデータ群からの菌叢比率Ｐｔのマハラノビス距離（Ｄｎ）を算出する工程、ＤｐがＤｎよりも小さい場合に、被験者に由来する口腔内細菌叢の菌叢構造が、癌リスク群に属すると判定する工程、を含む、判定方法によって、癌の発見のために使用可能な、新規な判定方法を提供する。
2019208738.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者に由来する口腔内細菌叢を分析して、癌リスク群に属するかを判定する方法であって、
口腔内細菌叢の菌の存在比（百分率）を特定し、得られた存在比の数列のデータを、菌叢比率Ｐとしたときに、
癌患者に由来する口腔内細菌叢の菌についての菌叢比率Ｐｐを、複数人の癌患者について得る工程、
健常人に由来する口腔内細菌叢の菌についての菌叢比率Ｐｎを、複数人の健常人について得る工程、
被験者に由来する口腔内細菌叢の菌についての菌叢比率Ｐｔを、得る工程、
複数人の癌患者由来菌叢比率Ｐｐのデータ群（Ｐｐデータ群）に被験者由来の菌叢比率Ｐｔのデータを加えたデータ群からの菌叢比率Ｐｔのマハラノビス距離（Ｄｐ）を算出する工程、
複数人の健常人由来の菌叢比率Ｐｎのデータ群（Ｐｎデータ群）に被験者由来の菌叢比率Ｐｔのデータを加えたデータ群からの菌叢比率Ｐｔのマハラノビス距離（Ｄｎ）を算出する工程、
ＤｐがＤｎよりも小さい場合に、被験者に由来する口腔内細菌叢の菌叢構造が、癌リスク群に属すると判定する工程、を含む、判定方法。
【請求項２】
請求項１に記載の判定方法であって、
口腔内細菌叢の菌について、次の分類に従ってその存在比（百分率）を特定し、
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ                          ：  ｐａ
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ，Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ：  ｐｂ
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ，Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ：  ｐｃ
Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ                                ：  ｐｄ
Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ      ：  ｐｅ
Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ，Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ    ：  ｐｆ
Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ                                ：  ｐｇ
Ｕｎｋｎｏｗｎ                                      ：  ｐｈ
得られた数列（ｐａ，ｐｂ，ｐｃ，ｐｄ，ｐｅ，ｐｆ，ｐｇ，ｐｈ）を、菌叢比率Ｐとしたときに、
癌患者に由来する口腔内細菌叢の菌についての菌叢比率Ｐｐを、複数人の癌患者について得る工程、
健常人に由来する口腔内細菌叢の菌についての菌叢比率Ｐｎを、複数人の健常人について得る工程、
被験者に由来する口腔内細菌叢の菌についての菌叢比率Ｐｔを、得る工程、
複数人の癌患者由来菌叢比率Ｐｐのデータ群（Ｐｐデータ群）に被験者由来の菌叢比率Ｐｔのデータを加えたデータ群からの菌叢比率Ｐｔのマハラノビス距離（Ｄｐ）を算出する工程、
複数人の健常人由来の菌叢比率Ｐｎのデータ群（Ｐｎデータ群）に被験者由来の菌叢比率Ｐｔのデータを加えたデータ群からの菌叢比率Ｐｔのマハラノビス距離（Ｄｎ）を算出する工程、
ＤｐがＤｎよりも小さい場合に、被験者に由来する口腔内細菌叢の菌叢構造が、癌リスク群に属すると判定する工程、を含む、判定方法。
【請求項３】
癌が、口腔癌である、請求項１〜２のいずれかに記載の判定方法。
【請求項４】
請求項２〜３のいずれかに記載の判定方法であって、
癌患者に由来する口腔内細菌叢の菌についての菌叢比率Ｐｐを、ｉ人（ただし、ｉは２０以上の整数）の癌患者について得る工程、
健常人に由来する口腔内細菌叢の菌についての菌叢比率Ｐｎを、ｊ人（ただし、ｊは５以上の整数）の健常人について得る工程、
被験者に由来する口腔内細菌叢の菌についての菌叢比率Ｐｔを、得る工程、
ｉ人の癌患者由来菌叢比率Ｐｐのデータ群（Ｐｐデータ群）に被験者由来の菌叢比率Ｐｔのデータを加えたデータ群からの菌叢比率Ｐｔのマハラノビス距離（Ｄｐ）を算出する工程、
ｊ人の健常人由来の菌叢比率Ｐｎのデータ群（Ｐｎデータ群）に被験者由来の菌叢比率Ｐｔのデータを加えたデータ群からの菌叢比率Ｐｔのマハラノビス距離（Ｄｎ）を算出する工程、
ＤｐがＤｎよりも小さい場合に、被験者に由来する口腔内細菌叢の菌叢構造が、癌リスク群に属すると判定する工程、を含む、判定方法。
【請求項５】
ｉが、２４以上の整数であり、ｊが、７以上の整数である、請求項４に記載の判定方法。
【請求項６】
口腔内細菌叢の菌の存在比（百分率）の特定が、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に対する制限酵素切断断片の分析によって行われる、請求項１〜５のいずれかに記載の判定方法。
【請求項７】
制限酵素切断に使用される制限酵素が、以下の制限酵素からなる群から選択された制限酵素を含む、請求項６に記載の判定方法：
ＨｈａＩ、Ｍｓｐ（Ｉ）、及びＡｌｕ（Ｉ）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験者に由来する口腔内細菌叢を分析して、癌リスク群に属するかを判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌を早期に発見して治療することは、癌治療のために重要である。癌の発見のために、より負担が少なく、より簡便な検査方法やスクリーニング方法が求められている。【０００３】
口腔内の細菌叢が、虫歯や歯周病に対して影響があることが知られている。この観点から口腔内の細菌叢を、改善しようとする試みがなされている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−３２０２７５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、癌の発見のために使用可能な、新規な判定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、癌治療の臨床に携わり、長年の間、鋭意研究してきたところ、被験者に由来する口腔内の細菌叢に存在する細菌の組成を、後述の手段で解析すると、癌リスク群に属するか否かを高い信頼性で判定できることを見いだして、本発明に到達した。【０００７】
したがって、本発明は次の（１）以下を含む。
（１）
被験者に由来する口腔内細菌叢を分析して、癌リスク群に属するかを判定する方法であって、
口腔内細菌叢の菌の存在比（百分率）を特定し、得られた存在比の数列のデータを、菌叢比率Ｐとしたときに、
癌患者に由来する口腔内細菌叢の菌についての菌叢比率Ｐｐを、複数人の癌患者について得る工程、
健常人に由来する口腔内細菌叢の菌についての菌叢比率Ｐｎを、複数人の健常人について得る工程、
被験者に由来する口腔内細菌叢の菌についての菌叢比率Ｐｔを、得る工程、
複数人の癌患者由来菌叢比率Ｐｐのデータ群（Ｐｐデータ群）に被験者由来の菌叢比率Ｐｔのデータを加えたデータ群からの菌叢比率Ｐｔのマハラノビス距離（Ｄｐ）を算出する工程、
複数人の健常人由来の菌叢比率Ｐｎのデータ群（Ｐｎデータ群）に被験者由来の菌叢比率Ｐｔのデータを加えたデータ群からの菌叢比率Ｐｔのマハラノビス距離（Ｄｎ）を算出する工程、
ＤｐがＤｎよりも小さい場合に、被験者に由来する口腔内細菌叢の菌叢構造が、癌リスク群に属すると判定する工程、を含む、判定方法。
（２）
（１）に記載の判定方法であって、
口腔内細菌叢の菌について、次の分類に従ってその存在比（百分率）を特定し、
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ                          ：  ｐａ
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ，Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ：  ｐｂ
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ，Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ：  ｐｃ
Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ                                ：  ｐｄ
Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ      ：  ｐｅ
Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ，Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ    ：  ｐｆ
Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ                                ：  ｐｇ
Ｕｎｋｎｏｗｎ                                      ：  ｐｈ
得られた数列（ｐａ，ｐｂ，ｐｃ，ｐｄ，ｐｅ，ｐｆ，ｐｇ，ｐｈ）を、菌叢比率Ｐとしたときに、
癌患者に由来する口腔内細菌叢の菌についての菌叢比率Ｐｐを、複数人の癌患者について得る工程、
健常人に由来する口腔内細菌叢の菌についての菌叢比率Ｐｎを、複数人の健常人について得る工程、
被験者に由来する口腔内細菌叢の菌についての菌叢比率Ｐｔを、得る工程、
複数人の癌患者由来菌叢比率Ｐｐのデータ群（Ｐｐデータ群）に被験者由来の菌叢比率Ｐｔのデータを加えたデータ群からの菌叢比率Ｐｔのマハラノビス距離（Ｄｐ）を算出する工程、
複数人の健常人由来の菌叢比率Ｐｎのデータ群（Ｐｎデータ群）に被験者由来の菌叢比率Ｐｔのデータを加えたデータ群からの菌叢比率Ｐｔのマハラノビス距離（Ｄｎ）を算出する工程、
ＤｐがＤｎよりも小さい場合に、被験者に由来する口腔内細菌叢の菌叢構造が、癌リスク群に属すると判定する工程、を含む、判定方法。
（３）
癌が、口腔癌である、（１）〜（２）のいずれかに記載の判定方法。
（４）
（２）〜（３）のいずれかに記載の判定方法であって、
癌患者に由来する口腔内細菌叢の菌についての菌叢比率Ｐｐを、ｉ人（ただし、ｉは２０以上の整数）の癌患者について得る工程、
健常人に由来する口腔内細菌叢の菌についての菌叢比率Ｐｎを、ｊ人（ただし、ｊは５以上の整数）の健常人について得る工程、
被験者に由来する口腔内細菌叢の菌についての菌叢比率Ｐｔを、得る工程、
ｉ人の癌患者由来菌叢比率Ｐｐのデータ群（Ｐｐデータ群）に被験者由来の菌叢比率Ｐｔのデータを加えたデータ群からの菌叢比率Ｐｔのマハラノビス距離（Ｄｐ）を算出する工程、
ｊ人の健常人由来の菌叢比率Ｐｎのデータ群（Ｐｎデータ群）に被験者由来の菌叢比率Ｐｔのデータを加えたデータ群からの菌叢比率Ｐｔのマハラノビス距離（Ｄｎ）を算出する工程、
ＤｐがＤｎよりも小さい場合に、被験者に由来する口腔内細菌叢の菌叢構造が、癌リスク群に属すると判定する工程、を含む、判定方法。
（５）
ｉが、２４以上の整数であり、ｊが、７以上の整数である、（４）に記載の判定方法。
（６）
口腔内細菌叢の菌の存在比（百分率）の特定が、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に対する制限酵素切断断片の分析によって行われる、（１）〜（５）のいずれかに記載の判定方法。
（７）
制限酵素切断に使用される制限酵素が、以下の制限酵素からなる群から選択された制限酵素を含む、（６）に記載の判定方法：
ＨｈａＩ、Ｍｓｐ（Ｉ）、及びＡｌｕ（Ｉ）。【０００８】
本発明は、上述の判定方法を含む。さらに上述の工程を含む、癌のスクリーニング方法、検査方法、菌叢比率マハラノビス距離判定法、菌叢比率距離判定法、菌叢判別分析距離判定法、菌叢判別分析マハラノビス距離判定法をも含む。【０００９】
好適な実施の態様において、本発明は、上記の判定方法を含み、この判定方法からなる予測方法、推定方法、評価方法、検出方法、決定方法、分析方法、検査方法、診断方法、分類方法、分別方法、選別方法、識別方法、及び判別方法を含む。【００１０】
好適な実施の態様において、口腔内細菌叢の菌の存在比（百分率）の特定に先だって、癌患者及び健常人に由来する口腔内細菌叢を、分析のための試料として、癌患者の口腔内のプラークから採取する工程を行うことができる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、被験者に由来する口腔内細菌叢を分析して、癌リスク群に属するかを高い信頼性で判定することができる。口腔内細菌叢は、口腔内のプラークから採取して同定することができ、被験者の負担が少なく簡便に採取することができ、癌のスクリーニングのために、好適に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１はデンタルプラーク採取からＴ−ＲＦＬＰまでの実験プロトコールの流れを示す説明図である。
【図２】図２はデンタルプラーク採取の様子を示す説明画像である。
【図３】図３は判別分析法による未治療の口腔癌患者群と健常人群における口腔内細菌叢の占有率の検討の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
具体的な実施の形態をあげて、以下に本発明を詳細に説明する。本発明は、以下にあげる具体的な実施の形態に限定されるものではない。
【００１４】
［癌リスク群に属するかの判定方法］
本発明によれば、口腔内細菌叢の菌の存在比（百分率）を特定し、得られた存在比の数列のデータを、菌叢比率Ｐとしたときに、癌患者に由来する口腔内細菌叢の菌についての菌叢比率Ｐｐを、複数人の癌患者について得る工程、健常人に由来する口腔内細菌叢の菌についての菌叢比率Ｐｎを、複数人の健常人について得る工程、被験者に由来する口腔内細菌叢の菌についての菌叢比率Ｐｔを、得る工程、複数人の癌患者由来菌叢比率Ｐｐのデータ群（Ｐｐデータ群）に被験者由来の菌叢比率Ｐｔのデータを加えたデータ群からの菌叢比率Ｐｔのマハラノビス距離（Ｄｐ）を算出する工程、複数人の健常人由来の菌叢比率Ｐｎのデータ群（Ｐｎデータ群）に被験者由来の菌叢比率Ｐｔのデータを加えたデータ群からの菌叢比率Ｐｔのマハラノビス距離（Ｄｎ）を算出する工程、ＤｐがＤｎよりも小さい場合に、被験者に由来する口腔内細菌叢の菌叢構造が、癌リスク群に属すると判定する工程、を含む方法によって、被験者に由来する口腔内細菌叢を分析して、癌リスク群に属するかを判定することができる。
【００１５】
本発明の好適な実施の態様において、癌が口腔癌であり、癌患者が口腔癌患者であり、癌リスク群が口腔癌リスク群である。
【００１６】
［口腔内細菌叢の菌の存在比］
好適な実施の態様において、口腔内細菌叢の菌について、次の分類に従ってその存在比（百分率）を特定し、
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ                            ：  ｐａ  
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ，Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ    ：  ｐｂ  
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ，Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ    ：  ｐｃ  
Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ                                  ：  ｐｄ  
Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ        ：  ｐｅ  
Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ，Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ      ：  ｐｆ  
Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ                                  ：  ｐｇ  
Ｕｎｋｎｏｗｎ                                        ：  ｐｈ  
得られた数列（ｐａ，ｐｂ，ｐｃ，ｐｄ，ｐｅ，ｐｆ，ｐｇ，ｐｈ）を、菌叢比率Ｐとして使用して、統計分析に供することができる。上記分類において、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓはこの比率ｐａとして存在比が特定されるが、例えば、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓとＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍとは、これらをあわせた比率ｐｂとして、その存在比が特定される。Ｕｎｋｎｏｗｎの分類には、上記の菌として特定できなかったその他の菌が分類される。上記の細菌の分類に着目して、統計分析することによって、癌との関連が明らかにした先行研究は、これまでにない。特に、口腔癌患者特有の口腔内細菌叢の構造（比率）が存在していて、それが健常人の口腔内細菌叢の構造（比率）とは異なることを高い精度で判別できることを示した先行研究は、これまでにない。したがって、判別分析の手法として、上述したマハラノビス距離の算出と本質的に同じ対比を行って判別する技術もまた、本発明の範囲内にある。
【００１７】
好適な実施の態様において、癌患者に由来する口腔内細菌叢の菌についての菌叢比率Ｐｐを、ｉ人（ただし、ｉは２０以上の整数）の癌患者について得るものとすることができ、好ましくは、ｉは２４以上の整数とすることができる。ｉは特に上限はないが、例えば１０００以下、１００以下とすることができる。
【００１８】
好適な実施の態様において、健常人に由来する口腔内細菌叢の菌についての菌叢比率Ｐｎを、ｊ人（ただし、ｊは５以上の整数）の健常人について得るものとすることができ、好ましくは、ｊは７以上の整数とすることができる。ｊは特に上限はないが、例えば１０００以下、１００以下とすることができる。
【００１９】
［マハラノビス距離］
マハラノビス距離は、公知の手段によって算出することができ、例えば統計解析ソフトを用いて算出することができる。統計解析ソフトとして、例えばＪＭＰ  ｖｅｒ１２．０（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｕｔｅ  Ｊａｐａｎ株式会社製）をあげることができる。
【００２０】
マハラノビス距離は、データ群のなかのあるデータが、そのデータ群の重心からどの程度の距離かを示す指標となっている。したがって、複数人の癌患者由来菌叢比率Ｐｐのデータ群（Ｐｐデータ群）に被験者由来の菌叢比率Ｐｔのデータを加えたデータ群について、その重心からの菌叢比率Ｐｔのマハラノビス距離（Ｄｐ）を算出することで、Ｐｔが癌患者由来菌叢比率にどの程度近いかを示す指標を算出することができる。同様に、複数人の健常人由来の菌叢比率Ｐｎのデータ群（Ｐｎデータ群）に被験者由来の菌叢比率Ｐｔのデータを加えたデータ群について、その重心からの菌叢比率Ｐｔのマハラノビス距離（Ｄｎ）を算出することで、Ｐｔが健常人由来菌叢比率にどの程度近いかを示す指標を算出することができる。本発明においては、このＤｐがＤｎよりも小さい場合に、被験者に由来する口腔内細菌叢の菌叢構造が、癌リスク群に属すると判定する。
【００２１】
一見して明らかであるように、このデータ群に含まれるデータ数が増加すればするほど、この判定の信頼性が高まってゆくことが期待される。そこで、Ｐｐデータ群に含まれる人数は、例えば、２０人以上、２４人以上とすることができるが、上限なく使用することができる。また、Ｐｎデータ群に含まれる人数は、例えば、５人以上、７人以上とすることができるが、上限なく使用することができる。
【００２２】
［口腔内細菌叢の菌の存在比の特定手段］
好適な実施の態様において、口腔内細菌叢の菌の存在比の特定を、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に対する制限酵素切断断片の分析によって行うことができる。１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に対する制限酵素切断断片の分析としては、公知の手段を用いることができる。例えば、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の該当部位を公知のプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行って、制限酵素切断を行ってその断片を分析することで行うことができる。制限酵素としては、例えば、ＨｈａＩ（５′−ＧＣＧ｜Ｃ−３′）、Ｍｓｐ（Ｉ）（Ｃ／ＣＧＧ）（ＧＧＣ／Ｃ）、Ａｌｕ（Ｉ）（ＡＧ／ＣＴ）（ＴＣ／ＧＡ）をあげることができる。
【実施例】
【００２３】
以下に実施例をあげて、本発明を詳細に説明する。本発明は、以下に例示する実施例に限定されるものではない。【００２４】
［臨床研究］
口腔内細菌叢の菌叢構造と、口腔癌との関連を検討するために、臨床研究を行った。
癌患者の登録は、広島大学臨床研究倫理審査委員会承認臨床研究（許可番号Ｃ−１０２）、健常人の登録は同疫学研究（許可番号疫受−１９７９）に基づき、それぞれ同意を得た後に行った。【００２５】
［口腔癌患者ならびに健常人の背景］
口腔癌患者ならびに健常人の背景を、以下の表１及び表２にまとめて示す。【００２６】
【表１】
2019208738.tif 000003
【００２７】
【表２】
2019208738.tif 000004
【００２８】
［デンタルプラークの採取］
治療開始前の口腔癌患者２４名ならびに健常人７名よりデンタルプラーク（歯垢）を採取した。デンタルプラーク採取は滅菌綿棒を用いて歯面より採取し、−８０℃にて保存した。なお、デンタルプラークからの細菌叢を口腔内細菌叢とした。この実験プロトコールを図１にまとめて示す。デンタルプラーク採取の様子を示す写真を図２に示す。【００２９】
［Ｔ−ＲＦＬＰ法による菌叢比率の特定］
デンタルプラーク検体から、以下の手順によって菌叢中の菌の存在比率を特定した。
デンタルプラークのＤＮＡ抽出はＭＯＲＡ−ＥＸＴＲＡＣＴ  ｋｉｔ（Ｋｙｏｋｕｔｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｒｉｃａｌ，Ｊａｐａｎ）を用いて行い、ライシスバッファー２００μＬ中に採取に用いた綿棒を浸漬した。液全量をビーズ充填チューブに移し、７０℃、１０分保ち溶菌を促進させた。ディスラプター・ジェニー（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を用いて２分間破砕処理した。破砕処理後、ＳＤＳ溶液２００μＬを加え、再び７０℃、１０分にて溶菌を促進させた。フェノール４００μＬを加え１分間Ｖｏｒｔｅｘした後、１５，０００ｒｐｍで３分間遠心、上清をＤＮＡ液として回収した。ＤＮＡ精製はエタノール沈殿法により行った。
デンタルプラーク検体の１６ＳｒＤＮＡのＰＣＲ増幅はＳａｋａｍｏｔｏらの方法に準じて行った（Ｓａｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。ＰＣＲ反応は２４００  ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒを用い、Ｈｏｔ−Ｓｔａｒ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いた。
プライマーセットには６−ＦＡＭ標識した２７Ｆ（５′−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３′）と１４９２Ｒ（５′−ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３′）を用いた。プレヒーティング９５℃で１５分行い、９５℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で９０秒を１サイクルとした増幅反応を３０サイクル行い、末端伸長反応を７２℃で１０分行いＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ産物は、ＰＥＧ沈殿法（Ｈｉｒａｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）によって精製した。
制限酵素はＳａｋａｍｏｔｏらの方法に準じて選択した（Ｓａｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。２０Ｕ／１０μＬのＨｈａＩ（５′−ＧＣＧ｜Ｃ−３′，Ｔａｋａｒａ  Ｓｈｕｚｏ）を３７℃で３時間消化した。得られた蛍光標識された末端制限断片（Ｔ−ＲＦ）をＡＢＩＰＲＩＳＭ  ３１３０ｘｌ遺伝子解析装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で解析し、遺伝子型ソフトウェアＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ  ４．０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてその長さおよびピーク面積を決定した。ＯＴＵは、全ＯＴＵ領域あたりの個々のＯＴＵのパーセンテージとして定量化し、これは曲線下面積のパーセンテージ（％ＡＵＣ）として表した。各分類単位について細菌を予測し、対応するＯＴＵを坂本らの報告に従って同定した（Ｓａｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
上記検出された口腔内細菌叢の細菌を、表３に示す。
上記実験条件の詳細を、表４にまとめて示す。
上記得られた口腔内細菌叢の菌の組成を、表５にまとめて示す。【００３０】
【表３】
2019208738.tif 000005
【００３１】
【表４】
2019208738.tif 000006
【００３２】
【表５】
2019208738.tif 000007
【００３３】
［統計学的解析］
統計学的解析として、異なる群間における菌叢構造の違いを検討するためマハラノビスの距離を求めて、判別分析を行った。判別分析は、多種類のデータに基づいて被検者を特定の群に判別することや、判別に強い影響を及ぼすデータを検討するのに用いられる多変量解析法である。判別分析は統計解析ソフトＪＭＰ  ｖｅｒ１２．０（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｕｔｅ  Ｊａｐａｎ株式会社製）を使用した。統計解析ソフトＪＭＰ  ｖｅｒ１２．０は、特に記載のない限り、デフォルトの設定を使用した。【００３４】
マハラノビス距離を用いた判別分析によって、以下のマハラノビス距離を算出し、距離が小さい群の方を予測値として判定した。すなわち、マハラノビス距離が小さい方の群に属すると判定した。
ＳｑＤｉｓｔ（口腔癌患者群）：  口腔癌患者群の重心から各測定値までのマハラノビス距離
ＳｑＤｉｓｔ（健常人群）：  健常人群の重心から各測定値までのマハラノビス距離【００３５】
判別分析法による未治療の口腔癌患者群と健常人群における口腔内細菌叢の占有率の検討の結果を、図３に示す。
判別分析法において、未治療の口腔がん患者群の口腔内細菌叢の構成比率を示す９５％信頼楕円（点線）と健常人群の口腔内細菌叢の構成比率を示す９５％信頼楕円（実線）が重なっていないことから、未治療の口腔癌患者の口腔内細菌叢は、健常人群の口腔内細菌叢の構成比率とは有意に異なり、構造異常（ｄｙｓｂｉｏｓｉｓ）の状態であった。【００３６】
マハラノビス距離を用いた基準データの判別分析の結果を、表６にまとめて示す。表６の最上段の用語の意味は、次の通りである。
ＳｑＤｉｓｔ（口腔癌患者）：  口腔癌患者群の重心から各測定値までのマハラノビス距離
ＳｑＤｉｓｔ（健常人）：  健常人群の重心から各測定値までのマハラノビス距離
Ｐｒｏｂ（口腔癌患者）：  口腔癌患者群カテゴリーに含まれる確率
Ｐｒｏｂ（健常人）：  口腔癌患者群カテゴリーに含まれる確率
Ｐｒｅｄ列２：  属している確率が最も高いと判断された群【００３７】
【表６】
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【００３８】
［マハラノビス距離による新たな被験者の判定試験］
３１名（口腔癌患者２４名、健常人７名）の口腔内細菌叢のデータから作成した判別分析が口腔癌患者の診断として有用かどうかを検討するために、３１名（口腔癌患者２４名、健常人７名）以外の新たな口腔癌患者の口腔内細菌叢のデータをマハラノビス距離にて判別分析で解析したところ、９人中８人を正しく判定することが可能であった。【００３９】
新たな被験者９名の口腔内細菌叢の菌叢の組成を、表７にまとめて示す。この菌叢の組成に基づいて、新たな被験者に対して行った判定試験の結果を、表８にまとめて示す。【００４０】
【表７】
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【００４１】
【表８】
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【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明は、癌の発見のために使用可能な、新規な判定方法を提供する。本発明は、産業上有用な発明である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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