(57)【要約】本発明は、例えばチオストレプトンのような、低分子ＦｏｘＭ１阻害剤を有効成分とする、関節炎治療剤を提供する。ＦｏｘＭ１は、関節炎の炎症性滑膜に特異的に出現する破骨前駆細胞に発現し、健常者の骨髄中にあって通常の骨代謝に関与する破骨細胞の機能には関与していないので、ＦｏｘＭ１阻害剤を用いることで、副作用を伴うことなく、関節炎の予防および／または治療が可能である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦｏｘＭ１の阻害剤を有効成分とする、関節炎治療剤。
【請求項２】
ＦｏｘＭ１の阻害剤が、ＦｏｘＭ１活性の阻害剤である請求項１に記載の治療剤。
【請求項３】
ＦｏｘＭ１活性の阻害剤がチオストレプトンである、請求項２に記載の関節炎治療剤。
【請求項４】
ＦｏｘＭ１活性の阻害剤がＲＣＭ−１である、請求項２に記載の関節炎治療剤。
【請求項５】
関節炎が関節リウマチである、請求項１〜４のいずれかに記載の治療剤。
【請求項６】
経口投与製剤である、請求項１〜５のいずれかに記載の治療剤。
【請求項７】
治療を必要とする患者に、請求項１〜６のいずれかに記載の治療剤の治療上有効な量を投与することを含む、関節炎または関節リウマチの治療方法。
【請求項８】
関節炎または関節リウマチの治療薬を製造するための、請求項１〜４のいずれかに記載のＦｏｘＭ１阻害剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な関節炎治療剤に関する。より詳しくは、転写因子ＦｏｘＭ１の阻害剤を有効成分とする関節炎治療剤、好ましくは関節リウマチ治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節炎は、関節の炎症をともなう疾病の総称であり、例えば関節リウマチの他、脊椎関節炎、組織球増殖症等が病的な骨破壊に帰結する慢性の炎症性疾患として例示される。
中でも、関節リウマチは膠原病の一種であり、免疫調節剤や免疫抑制剤、または生物学的製剤がその治療に用いられてきた。しかしながら、これら治療剤では免疫反応を抑制することで重篤な感染症に罹患するリスクが上昇することが示されている（後記非特許文献１）。
一方、ＦｏｘＭ１（Forkhead box M1）は細胞増殖に重要な遺伝子の発現を調整する転写因子の一つであり、発癌や細胞増殖の制御に関連していることが広く知られていて、ＦｏｘＭ１を制御して、癌を治療する方法も提案されている。例えば、ＦｏｘＭ１の抗体（後記特許文献１）や、その発現を制御してがんの治療、予防及び／又は進行の遅延のために使用すること（後記特許文献２および３）や、また、ＦｏｘＭ１の活性を阻害する化合物を用いる癌治療方法（後記特許文献３）が提案されている。
その他、アレルゲンに曝露されたマウスにおいて胚細胞の異形成を抑制し、ＩＬ１３とＳＴＡＴ６のシグナル伝達を妨げるＦｏｘＭ１阻害因子・ＲＣＭ−１の報告があり、ここで同定された低分子のＲＣＭ−１については、喘息などの慢性気道疾患の治療剤としての用途が示唆されている（後記非特許文献２）。
しかしながら、後述する破骨前駆細胞にＦｏｘＭ１が発現されていることはこれまで報告がなく、ＦｏｘＭ１阻害剤を用いる関節炎の治療方法は全く知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１４−１９３８９３号公報
【特許文献２】特表２０１８−５０５８８０号公報
【特許文献３】特表２０１６−５０９５９６号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Singh, J.A., Lancet, 2015
【非特許文献２】L.Sun et al., Science Signal, 10, eaai8583(2017)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
現在、膠原病の治療に用いられている免疫調節剤、免疫抑制剤または生物学的製剤は、免疫を抑制することで病勢を制御することを目的としているが、一方で外来微生物に対する免疫反応も同時に抑えてしまうので、重篤な感染症に罹患するリスクが上昇する。本発明の目的は、かかる副作用のない、新しいメカニズムに基づく新規な関節炎治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、関節炎モデルマウスを用いた研究により、炎症性滑膜に特異的に出現する破骨前駆細胞を同定し、転写因子ＦｏｘＭ１が該細胞の病原性を司ることを明らかにした。さらに、関節リウマチモデルにおいて、ＦｏｘＭ１阻害剤がin vitroでの破骨細胞の分化とin vivoでの関節破壊を抑制すること、また、ヒトにおいても、関節リウマチ患者の検体から採取された単球・マクロファージ系細胞の破骨細胞分化が同阻害剤により抑制されることを確認し、本発明を完成するに至った。
【発明の効果】
【０００７】
転写因子ＦｏｘＭ１は、関節炎の炎症性滑膜に特異的に出現する破骨前駆細胞に発現し、健常者の骨髄中にあって通常の骨代謝に関与する破骨細胞の機能には関与していない。よってＦｏｘＭ１阻害剤を用いることで、副作用を伴うことなく、関節炎の予防および／または治療が可能である。
また、ＦｏｘＭ１阻害剤を有効成分とする治療剤を用いることで、前述した外来微生物による重篤な感染症に罹患するリスクが回避され、また、ＦｏｘＭ１阻害剤として、例えばチオストレプトンのような低分子化合物を用いることで、既存の生物学的製剤による治療より医療経済に対する負担を減らすことも可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】関節炎モデルマウスの血液と滑膜のＣＤ４５陽性細胞をフローサイトメトリーでゲートし、ＣＸ３ＣＲ１−ＥＧＦＰとＬｙ６Ｃ−ＡＰＣの蛍光で細胞分画を識別した結果を示す。
【図１Ｂ】炎症滑膜に存在する破骨前駆細胞（以後Ｒ３と表記する）と骨髄中に存在する破骨前駆細胞（ＢＭ−ＯＰ）の細胞表面マーカーの違いを示す。
【図１Ｃ】Ｒ３の網羅的なトランスクリプトーム解析・上流解析を行った結果を示している。
【図２】Ｒ３の破骨細胞分化に及ぼすチオストレプトンの効果（in vitro）を示す図である。写真は、破骨細胞分化（赤が破骨細胞、緑が前駆細胞を示す）がチオストレプトン投与により抑制されることを表す。グラフの縦軸は三つ以上の核を持つ細胞を破骨細胞と定義し、一視野中の破骨細胞に含まれる核の数を示している。
【０００９】
【図３Ａ】関節炎モデルマウス（ＣＩＡモデル）に対して、チオストレプトンを投与し、関節炎スコアでその効果を評価した結果を示すグラフである。
【図３Ｂ】同様に関節炎モデルマウス（ＣＩＡモデル）へチオストレプトンを投与し、マイクロＣＴで撮像した骨破壊スコアにより、関節の骨破壊程度を評価した結果を示す。「Thio」はチオストレプトンを表す。写真は、マイクロＣＴで撮影した骨組織の画像、グラフの縦軸はびらんスコア(Erosion Score)で、骨破壊の程度を示している。
【図４Ａ】タモキシフェン投与により誘導されるＦｏｘＭ１ノックアウトマウスに対し、関節炎を惹起するプロトコールを示す図である。タモキシフェン２mgを五日間腹腔内投与し、５mgのＣＡＩＡ抗体を静脈注射してから二週間後に関節炎を評価することを表す。
【図４Ｂ】図４Ａで示したプロトコールに従って作製したＦｏｘＭ１ノックアウトマウスにおいて関節炎を惹起し、骨破壊程度を確認した。写真は、マイクロＣＴで撮影した骨組織の画像、グラフの縦軸はびらんスコア(Erosion Score)で、骨破壊の程度を示している。
【図５Ａ】関節リウマチ患者（ヒト）の血液、関節液および関節組織の検体をフローサイトメトリーにより対比した結果である。関節液と関節組織にＣＸ３ＣＲ１陽性ＨＬＡ−ＤＲhiの細胞が認められる。
【図５Ｂ】図５Ａで示した関節リウマチ患者のＣＸ３ＣＲ１陽性ＨＬＡ−ＤＲｈｉの細胞分画の破骨細胞分化に及ぼす、チオストレプトンの効果を示す。写真は、破骨細胞分化がチオストレプトン投与により阻害されることを表す。グラフの縦軸は三つ以上の核を持つ細胞を破骨細胞と定義した場合、一視野中の破骨細胞に含まれる核の数を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明で用いられるＦｏｘＭ１阻害剤は、好ましくは、チオストレプトンやＲＣＭ−１（前記非特許文献２）のような低分子化合物よりなる、ＦｏｘＭ１活性の阻害剤である。
他方、ＦｏｘＭ１の発現を抑制できる化合物も、本発明のＦｏｘＭ１阻害剤として使用可能であり、例えば、その遺伝子の転写、ＲＮＡの成熟化、ｍＲＮＡの翻訳、そのタンパク質の翻訳後修飾等を阻害するあらゆる化合物が対象である。具体的には、ＦｏｘＭ１遺伝子のスプライシングモディファイヤー（前記特許文献１参照）やｓｉＲＮＡ（前記特許文献２参照）等を例示できる。
本発明のＦｏｘＭ１阻害剤を有効成分とする関節炎治療剤は、広く、関節の炎症をともなう疾病の治療および／または予防に用いることができ、例えば関節リウマチ、脊椎関節炎、組織球増殖症等が対象疾患として例示されるが、好ましくは、関節リウマチの治療および／または予防に用いられる。
【００１１】
本発明のＦｏｘＭ１阻害剤は、経口投与、非経口投与または局所的投与に適した従来の薬学製剤（医薬組成物）の形態に調製することができる。
経口投与のための製剤は、錠剤、顆粒、粉末、カプセルなどの固形剤、およびシロップなどの液体製剤を含む。これらの製剤は従来の方法によって調製することができる。固形剤は、ラクトース、コーンスターチなどのデンプン、微結晶性セルロースなどの結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルシウムカルボキシメチルセルロース、タルク、ステアリン酸マグネシウムなどのような従来の薬学的担体を用いることによって調製することができる。カプセルは、このように調製した顆粒または粉末をカプセルに包むことによって調製することができる。シロップは、ショ糖、カルボキシメチルセルロースなどを含む水溶液中で、ＦｏｘＭ１阻害剤を溶解または懸濁することによって調製することができる。
【００１２】
非経口投与のための製剤は、点滴注入などの注入物を含む。注入製剤もまた従来の方法によって調製することができ、等張化剤（例えば、マンニトール、塩化ナトリウム、グルコース、ソルビトール、グリセロール、キシリトール、フルクトース、マルトース、マンノース）、安定化剤（例えば、亜硫酸ナトリウム、アルブミン）、防腐剤（例えば、ベンジルアルコール、ｐ−オキシ安息香酸メチル）中に適宜組み入れることができる。
局所又は経皮投与用の剤形には、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、散剤、溶液剤、スプレー剤、吸入剤、又はパッチ剤が含まれる。有効成分のＦｏｘＭ１阻害剤は、無菌条件の下で、医薬的に許容される担体と、必要とされる保存剤又は必要とされ得る緩衝液と一緒に混合される。
【００１３】
本発明のＦｏｘＭ１阻害剤の用量は、当該阻害活性化合物、疾患の種類、重症度、患者の年齢、性別、および体重、投薬形態などに従って変化させることができるが、通常は成人において１日あたり１ｍｇ〜１，０００ｍｇの範囲であり、それは経口経路または非経口経路によって、１回、または２回もしくは３回に分割して投与することができる。
本発明によればまた、前期ＦｏｘＭ１阻害剤を用いる関節炎の治療方法が提供される。この場合、前期ＦｏｘＭ１阻害剤は単独で、または１種以上の他の治療剤と組合せて使用することができる。組み合わせて用いられる薬剤としては、例えば、疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）、疼痛管理薬、ステロイド、非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、サイトカインアンタゴニスト、骨同化作用薬、骨抗吸収薬及びそれらの組合せなどの少なくとも１つの関節炎治療薬と併用して（二剤併用療法または三剤併用療法）、投与することができる。１つ又は複数の追加の薬剤と併用投与する場合、前期ＦｏｘＭ１阻害剤は他の薬剤と同時または連続して投与することができる。連続して投与する場合、主治医がＦｏｘＭ１阻害剤を他の薬剤と併用投与する適切な順序を決定する。
ＦｏｘＭ１阻害剤と併用されるＤＭＡＲＤとしては、メトトレキセート、抗マラリア薬（例えば、ヒドロキシクロロキン及びクロロキン）、スルファサラジン、レフルノミド、アザチオプリン、シクロスポリン、金塩、ミノサイクリン、シクロホスファミド、Ｄ−ペニシラミン、ミノサイクリン、オーラノフィン、タクロリムス、ミオクリシン、クロラムブシル等；ステロイドとしては、プ レドニゾロン、プレドニゾン、デキサメタゾン、コルチソル、コルチゾン、ヒドロコルチ ゾン、メチルプレドニゾロン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、ベクロメタゾン、フル ドロコチゾン、デオキシコルチコステロン、アルドステロン等；疼痛管理薬または非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）としては、ルミラコキシブ、イブプロフェン、フェノプロフェン、ケトプロフェン、フルルビプロフェン、オキサプロジン、インドメタシン、スリンダック、エトドラック、ケトロラック、ナブメトン、アスピリン、ナプロキセン、バルデコキシブ、エトリコキシブ、ロフェコキシブ、アセトミノフェン、セレコキシブ、ジクロフェナク、トラマドール、ピロキシカム、メロキシカム、テノキシカム、ドロキシカム、ロルノキシカム、イソキシカム、メフェナム酸、メクロフェナム酸、フルフェナム酸、トルフェナミック、バルデコキシブ、パレコキシブ、エトドラク、インドメタシン、アスピリン、イブプロフェン、フィロコキシブ等が例示されるが、これらに限定はされない。
以下に実施例を示して、本発明を具体的に説明するが、これら実施例は本発明を限定するものでは決してない。
【実施例１】
【００１４】
試験例１  破骨前駆細胞におけるＦｏｘＭ１の発現
Ａ）コラーゲン誘発関節炎モデルマウス（ＣＩＡモデル）の血液と滑膜のＣＤ４５陽性細胞をフローサイトメトリーで選び出し、ＣＸ３ＣＲ１−ＥＧＦＰとＬｙ６Ｃ−ＡＰＣの蛍光で細胞分画を識別した。血液中のＣＸ３ＣＲ１ｌｏｗＬｙ６Ｃｈｉの分画をＲ１とし、炎症滑膜中のＣＸ３ＣＲ１ｌｏｗＬｙ６Ｃｈｉの分画をＲ２とし、ＣＸ３ＣＲ１ｈｉＬｙ６Ｃｉｎｔの分画をＲ３とした（図１Ａ）。
Ｂ）Ｒ３の分画はこれまで骨髄中の破骨前駆細胞（ＢＭ−ＯＰ）と報告されてきた分画とは異なり、フローサイトメトリーによる解析の結果ＣＤ８０，ＣＤ８６，Ｉ−Ａ／Ｉ−Ｅ，ＣＤ１１ｃが発現していた（図１Ｂ）。
Ｃ）上記Ａ）で示したＲ１、Ｒ２およびＲ３の分画のｍＲＮＡの発現状況を網羅的に解析するため、ＲＮＡ−シーケンス解析を行った（Illumina HiSeq 2500 platform in 75-base single-end mode）。Ｒ３で上昇している転写因子をリストアップし、上流解析（Up-stream analysis）にかけたところ、ＦｏｘＭ１が最上位に位置し、ＦｏｘＭ１が本細胞の制御因子として示された（図１Ｃ）。【００１５】
試験例２  破骨細胞への分化の抑制（in vitro）
Ｒ３の細胞をフローサイトメトリー（セルソーターSH800、ソニー社）を用いて回収し、９６ウエルプレート上でＭ−ＣＳＦ １０ng/ml、ＲＡＮＫＬ 100ng/mlおよびＦｏｘＭ１阻害薬であるチオストレプトン（ＳＩＧＭＡ社）0.5、1または2μMを加えて培養したところ、破骨細胞へ分化する能力がチオストレプトン投与群では顕著に抑制された（図２）。【００１６】
試験例３  モデルマウスにおける効果（in vivo）
コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）マウスを３群に分け、チオストレプトン20mg/kg、50mg/kgまたは基剤（対照）を２１日目から隔日で腹腔内投与した。ＣＩＡマウスの作製と評価方法は以下のとおりである。
８〜１０週齢のＤＢＡ−１／Ｊマウスを用いて関節炎を惹起した。ニワトリII型コラーゲンを0.05M酢酸水溶液に溶解し、4℃で終夜回転させて濃度4.0mg/mlとし、等量のフロインドの完全アジュバントと混合した。初日に、上記ＤＢＡ−１／Ｊマウスにエマルジョン１００μlを尾部に注入して免役し、同様に21日目に投与を繰り返した。関節炎の重症度は確立済みの５ポイントスケールからなる半定量的スコア法に従って評価した。０：腫れなし、１：踵または足根骨にのみ僅かな腫れ、２：踵から足根骨にかけて僅かな腫れ、３：踵から中足関節にかけてかなりの腫れ、４：踵、足、指を含めて広がる重篤な腫れ。
各マウス四肢の累積スコア（最大１６）を関節炎スコアとして用いた〔Brand, D. D., Latham, K. A. & Rosloniec, E. F. Collagen-induced arthritis. Nat. Protoc. 2, 1269-1275 (2007)参照〕。
また、マイクロＣＴを用いた画像解析を実施した。骨破壊スコアは先行研究を参考に行った（O’Brien, Arthritis Rheumatol. 2016参照)。上記関節炎スコアとマイクロＣＴで撮像した骨破壊スコアが、コントロール群に比べ有意に減少した（図３Ａ、３Ｂ）。【００１７】
試験例４  ノックアウトマウスにおける評価
ＦｏｘＭ１ノックアウトマウスは胎性致死となるため、タモキシフェンを用いて時間特異的にＦｏｘＭ１をノックアウトするマウス（ＲｏｓａＥＲＴ２Ｃｒｅ；ＦｏｘＭ１ｆｌ／ｆｌ）を用い、ＣＡＩＡモデルを評価した。これまでのＣＩＡモデルはＤＢＡ１／Ｊという系統では関節炎を惹起するが、ノックアウトマウスのＢ６という系統では関節炎を惹起しにくいため、Ｂ６でも関節炎を安定して惹起するＣＡＩＡモデルを用いた。
ノックアウトモデルの作製は図４Ａに示すプロトコールに従った。即ち、初日に、５クローンArthrogen-CAIA抗体（コンドレックス社）５mgをiv投与し、３および１０日目にＬＰＳ４０ μgを腹腔内投与して関節炎を惹起した。関節炎の重症度は上記ＣＩＡモデルと同じ半定量的方法で評価した。この関節炎モデルマウスを、コントロール群、タモキシフェン２ mgを五日間腹腔内投与群、さらにタモキシフェン投与後にＦｏｘＭ１がノックアウトされていない単球を養子移植する群にわけ、１４日目に骨破壊スコアを比較した。
すると、タモキシフェン投与群では、骨破壊スコアがコントロール群と比較して有意に抑制されており、ここにＦｏｘＭ１がノックアウトされていない単球を養子移植すると骨破壊が増悪した（図４Ｂ）。【００１８】
試験例５
関節リウマチ患者（ヒト）の血液と関節液、および関節組織の検体をフローサイトメトリーを用いて評価すると、試験１のＲ３と同様、関節液と関節組織にＣＸ３ＣＲ１陽性ＨＬＡ−ＤＲhiの細胞を認めた（マウスではＩ−Ａ／Ｉ−ＥがヒトＨＬＡ−ＤＲに相当し、Ｒ３でもＨＬＡ−ＤＲが高発現することが図１Ｂで示された）。フローサイトメトリーによってこれらの細胞を回収し、Ｍ−ＣＳＦ 50 ng/ml、ＲＡＮＫＬ 100 ng/ml、およびチオストレプトン 0.5 μMを加えて９６ウエルプレートで培養すると、チオストレプトン投与により破骨細胞への分化が有意に抑制された（図５Ａ、５Ｂ）。
【産業上の利用可能性】
【００１９】
ＦｏｘＭ１の阻害剤を有効成分とすることで、重篤な感染症に罹患するリスクのない関節炎治療剤が製造されるから、本発明は産業上利用することができる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2020091052.tif 000012
【国際調査報告】
2020091052.tif 000013
2020091052.tif 000014
2020091052.tif 000015
2020091052.tif 000016