(57)【要約】  本発明は、検体中のアポリポプロテインＡ−ＩＶ（ＡＰＯＡ４）を正確に測定できる抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメント、該抗体又はその抗体フラグメントを用いるＡＰＯＡ４の免疫測定方法、及び該抗体又はその抗体フラグメントを含むＡＰＯＡ４測定用キットを提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むアポリポプロテインＡ−ＩＶ（ＡＰＯＡ４）の８９番目〜１１０番目のアミノ酸配列、及び２００番目〜２２４番目のアミノ酸配列と特異的に結合する抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項２】
配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１；
配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；
配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；
配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；
配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；及び、
配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；
を含む、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＡＰＯＡ４に特異的に結合する抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項３】
配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び
配列番号３１で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
を含む、請求項２に記載の抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項４】
配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＡＰＯＡ４のモノマー及びダイマーに結合する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項５】
配列番号２で表されるＡＰＯＡ４の１２２番目〜１４４番目のアミノ酸配列、１５６番目〜１７７番目のアミノ酸配列、及び２４２番目〜２５２番目のアミノ酸配列と特異的に結合する抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項６】
配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；
配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；
配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；
配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；
配列番号１９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；及び
配列番号２０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＡＰＯＡ４に特異的に結合する抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項７】
配列番号２８で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び
配列番号３２で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
を含む、請求項６に記載の抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項８】
配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＡＰＯＡ４のモノマー及びダイマーに結合する請求項５〜７のいずれか一項に記載の抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項９】
配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；
配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；
配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；
配列番号２１で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；
配列番号２２で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；及び
配列番号２３で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；
を含む、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＡＰＯＡ４に特異的に結合する抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項１０】
配列番号２９で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び
配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
を含む、請求項９に記載の抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項１１】
配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＡＰＯＡ４のモノマー及びダイマーに結合する請求項９又は１０に記載の抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項１２】
配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；
配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；
配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；
配列番号２４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；
配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；及び
配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；
を含む、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＡＰＯＡ４に特異的に結合する抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項１３】
配列番号３０で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び
配列番号３４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
を含む、請求項１２に記載の抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項１４】
配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＡＰＯＡ４のモノマー及びダイマーに結合する請求項１２又は１３に記載の抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項１５】
検体中の配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＡＰＯＡ４と、前記ＡＰＯＡ４に特異的に結合する捕捉抗体とを結合させた後、前記ＡＰＯＡ４に特異的に結合する検出抗体に標識が結合した標識化検出抗体を添加し、前記ＡＰＯＡ４、捕捉抗体、及び標識化検出抗体からなる免疫複合体を生成させ、生成した前記免疫複合体中の標識量を測定する、検体中のＡＰＯＡ４の免疫測定方法であって、前記捕捉抗体及び前記検出抗体が、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントから選択され、前記捕捉抗体と前記検出抗体とが異なる、検体中のＡＰＯＡ４の免疫学的測定方法。
【請求項１６】
前記捕捉抗体が、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントである、請求項１５に記載の測定方法。
【請求項１７】
前記検出抗体が、請求項５〜１４のいずれか一項に記載の抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントである、請求項１５又は１６に記載の測定方法。
【請求項１８】
前記捕捉抗体が、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントであり、前記検出抗体が、請求項５〜８のいずれか一項に記載の抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントである、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の測定方法。
【請求項１９】
前記捕捉抗体が、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントであり、前記検出抗体が、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントである、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の測定方法。
【請求項２０】
前記捕捉抗体が、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントであり、前記検出抗体が、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントである、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の測定方法。
【請求項２１】
前記標識が酵素である、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の測定方法。
【請求項２２】
前記捕捉抗体が、固体支持体に固定化されている、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の測定方法。
【請求項２３】
前記検体が、血液、リンパ液、組織液及び体腔液からなる群から選ばれる、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の測定方法。
【請求項２４】
前記検体が、血液である請求項１５〜２３のいずれか一項に記載の測定方法。
【請求項２５】
前記血液が、全血、血漿又は血清である請求項２４に記載の測定方法。
【請求項２６】
配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＡＰＯＡ４と特異的に結合する捕捉抗体と、前記ＡＰＯＡ４と特異的に結合する検出抗体に標識が結合した標識化検出抗体と、を含む、検体中のＡＰＯＡ４測定用キットであって、前記捕捉抗体及び前記検出抗体が、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントから選択され、前記捕捉抗体と前記検出抗体とが異なる、検体中のＡＰＯＡ４測定用キット。
【請求項２７】
前記捕捉抗体が、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントである、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
前記検出抗体が、請求項５〜１４のいずれか一項に記載の抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントである、請求項２６又は２７に記載のキット。
【請求項２９】
前記捕捉抗体が、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントであり、前記検出抗体が、請求項５〜８のいずれか一項に記載の抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントである、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３０】
前記捕捉抗体が、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントであり、前記検出抗体が、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントである、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３１】
前記捕捉抗体が、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントであり、前記検出抗体が、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントである、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３２】
前記標識が酵素である、請求項２６〜３１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３３】
前記捕捉抗体が、固体支持体に固定化されている、請求項２６〜３２のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−ＩＶ；以下、ＡＰＯＡ４と称する）に結合するモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を用いるＡＰＯＡ４の免疫学的測定方法、及び該モノクローナル抗体を含む測定用キットに関する。
本願は、２０１８年２月２７日に、日本に出願された特願２０１８−３３１１３号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＰＯＡ４は、分子量４６ｋＤａの糖タンパク質である。血漿中のＡＰＯＡ４のほとんどは小腸由来であると考えられている（非特許文献１〜３）。ＡＰＯＡ４は、脂質の吸収、輸送及び代謝に関与する他、抗酸化効果あるいは食欲減退効果等、多数の機能を有することが知られている（非特許文献４）。また、ＡＰＯＡ４は、初期腎機能障害の診断、肝疾患の診断及び腫瘍の診断におけるバイオマーカーとしても知られている（特許文献１〜３）。【０００３】
ＡＰＯＡ４は、血液中では、遊離したモノマー、ダイマー、カイロミクロン（Ｃｈｙｌｏｍｉｃｒｏｎｓ）又は高比重リポタンパク質（Ｈｉｇｈ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ：ＨＤＬ）に結合した脂質結合状態で存在する（非特許文献２及び５）。【０００４】
さらに、溶液中では、ＡＰＯＡ４モノマー及びＡＰＯＡ４ダイマーは、保存温度、濃度、凍結融解などによって相互変換（ｉｎｔｅｒｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）するため、その比率は一定ではない（非特許文献６）。【０００５】
ＡＰＯＡ４のＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）による測定方法がいくつか報告されている。Ｒｏｓｓｅｎｅｕら及びＫｒｏｎｅｎｂｅｒｇらは、ヒト血漿を４Ｍ尿素で処理し、その後希釈を行ってから、抗ＡＰＯＡ４ポリクローナル抗体を使用したＥＬＩＳＡでヒト血漿中のＡＰＯＡ４を測定し、再現性がよくなったことを報告している（非特許文献７及び８）。また、変性剤を使用せずに、抗ＡＰＯＡ４ポリクローナル抗体を使用したＥＬＩＳＡでＡＰＯＡ４を測定した報告もある（特許文献１〜３）。
一方、Ｏｍｏｒｉらは、血清の変性剤処理を行わずに、抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体を使用したＥＬＩＳＡでヒト血清中のＡＰＯＡ４を測定している（非特許文献９）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００３／０１０５４４号
【特許文献２】国際公開第２００７／０５７５４８号
【特許文献３】国際公開第２００７／０１６７１６号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｗｕ，  Ａ．−Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．：  Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ｂｙ  ｌｉｖｅｒ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  ｔｏ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｐｌａｓｍａ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５４，７３１６−７３２２，１９７９
【非特許文献２】Ｇｒｅｅｎ， Ｐ.Ｈ.Ｒ.， ｅｔ ａｌ．: Ｈｕｍａｎ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−ＩＶ．，Ｊ.Ｃｌｉｎ.Ｉｎｖｅｓｔ.，６５（４） ９１１−９１９，１９８０
【非特許文献３】Ｇｏｒｄｏｎ，  Ｊ．Ｉ．，  ｅｔ  ａｌ．：Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｒｅａｐｏｌｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−ＩＶ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９，４６８−４７４，１９８４
【非特許文献４】Ｓｔａｎ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．：Ａｐｏ  Ａ−ＩＶ：ａｎ ｕｐｄａｔｅ ｏｎ ｒｅｇμＬａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１６３１，１７７−１８７，２００３
【非特許文献５】Ｂｉｓｇａｉｅｒ，  Ｃ．Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．: Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−ＩＶ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ,  Ｊ．  Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．,  ２６（１）, １１−２５, １９８５
【非特許文献６】Ｄｅｎｇ，  Ｘ．，  ｅｔ  ａｌ．：  Ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｄｉｍｅｒｉｃ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−ＩＶ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ２０（５），７６７−７７９，２０１２
【非特許文献７】Ｒｏｓｓｅｎｅｕ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．：  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−ＩＶ  ｂｙ  “Ｓａｎｄｗｉｃｈ”−ｔｙｐｅ  ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．，３４（４）  ７３９−７４３, １９８８
【非特許文献８】Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ  Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．：  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｓａｍｐｌｅ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ「ａ」，  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｂ  ａｎｄ  Ａ−ＩＶ，  ｔｏｔａｌ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉn ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ａｎｄ  ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ，  Ｊ．  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．，３５（７），１３１８−１３２８，１９９４
【非特許文献９】Ｏｍｏｒｉ Ｍ., ｅｔ ａｌ.,： Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｓｅｒｕｍ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−ＩＶ  ａｓ  ａ  ｍａｒｋｅｒ  ｏｆ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃμＬａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｈｅｍｏｄｉａｌｙｓｉｓ ｐａｔｉｅｎｔｓ，  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ，１４（３），３４１−３４８，  ２０１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、検体中において、モノマー、ダイマーなどの多様なフォームで存在するＡＰＯＡ４を正確に測定するための抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体、該抗体を用いるＡＰＯＡ４の免疫学的測定方法及び該抗体を含むＡＰＯＡ４測定用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ＡＰＯＡ４を認識して結合する抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体を作製し、その中から、一旦変性剤で変性させた後、希釈してリフォールドさせたＡＰＯＡ４−Ｈｉｓモノマーを抗原として用いて抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体をスクリーニングし、ＡＰＯＡ４モノマー及びダイマーに結合する抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体を見出し、該抗体を用いるＡＰＯＡ４の免疫学的測定方法、及び該抗体を用いるＡＰＯＡ４測定用キットを構築した。【００１０】
すなわち本発明は、上記知見に基づくものであり、以下の態様を包含する。
［１］配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＡＰＯＡ４の８９番目〜１１０番目のアミノ酸配列、及び２００番目〜２２４番目のアミノ酸配列と特異的に結合する抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメント。
［２］配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１；
配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；
配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；
配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；
配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；及び、
配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；
を含む、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＡＰＯＡ４に特異的に結合する抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメント。
［３］配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び
配列番号３１で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
を含む、［２］に記載の抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメント。
［４］配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＡＰＯＡ４のモノマー及びダイマーに結合する、［１］〜［３］のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗体フラグメント。
［５］配列番号２で表されるＡＰＯＡ４の１２２番目〜１４４番目のアミノ酸配列、１５６番目〜１７７番目のアミノ酸配列、及び２４２番目〜２５２番目のアミノ酸配列と特異的に結合する抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメント。
［６］配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；
配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；
配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；
配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；
配列番号１９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；及び
配列番号２０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＡＰＯＡ４に特異的に結合する抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメント。
［７］配列番号２８で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び
配列番号３２で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
を含む、［６］に記載の抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメント。
［８］配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＡＰＯＡ４のモノマー及びダイマーに結合する［５］〜［７］のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗体フラグメント。
［９］配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；
配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；
配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；
配列番号２１で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；
配列番号２２で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；及び
配列番号２３で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；
を含む、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＡＰＯＡ４に特異的に結合する抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメント。
［１０］配列番号２９で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び
配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
を含む、［９］に記載の抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメント。
［１１］配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＡＰＯＡ４のモノマー及びダイマーに結合する［９］又は［１０］に記載のモノクローナル抗体又はその抗体フラグメント。
［１２］配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；
配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；
配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；
配列番号２４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；
配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；及び
配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；
を含む、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＡＰＯＡ４に特異的に結合する抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメント。
［１３］配列番号３０で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び
配列番号３４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
を含む、［１２］に記載の抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメント。
［１４］配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＡＰＯＡ４のモノマー及びダイマーに結合する［１２］又は［１３］に記載のモノクローナル抗体又はその抗体フラグメント。
［１５］検体中の配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＡＰＯＡ４と、前記ＡＰＯＡ４に特異的に結合する捕捉抗体とを結合させた後、前記ＡＰＯＡ４に特異的に結合する検出抗体に標識が結合した標識化検出抗体を添加し、前記ＡＰＯＡ４、捕捉抗体、及び標識化検出抗体からなる免疫複合体を生成させ、生成した前記免疫複合体中の標識量を測定する、検体中のＡＰＯＡ４の免疫測定方法であって、前記捕捉抗体及び前記検出抗体が、［１］〜［１４］のいずれか一項に記載の抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントから選択され、前記捕捉抗体と前記検出抗体とが異なる、検体中のＡＰＯＡ４の免疫学的測定方法。
［１６］前記捕捉抗体が、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントである、［１５］に記載の測定方法。
［１７］前記検出抗体が、［５］〜［１４］のいずれか一項に記載の抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントである、［１５］又は［１６］に記載の測定方法。
［１８］前記捕捉抗体が、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントであり、前記検出抗体が、［５］〜［８］のいずれか一項に記載の抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントである、［１５］〜［１７］のいずれか一項に記載の測定方法。
［１９］前記捕捉抗体が、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントであり、前記検出抗体が、［９］〜［１１］のいずれか一項に記載の抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントである、［１５］〜［１７］のいずれか一項に記載の測定方法。
［２０］前記捕捉抗体が、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントであり、前記検出抗体が、［１２］〜［１４］のいずれか一項に記載の抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントである、［１５］〜［１７］のいずれか一項に記載の測定方法。
［２１］前記標識が酵素である、［１５］〜［２０］のいずれか一項に記載の測定方法。
［２２］前記捕捉抗体が、固体支持体に固定化されている、［１５］〜［２１］のいずれか一項に記載の測定方法。
［２３］前記検体が、血液、リンパ液、組織液及び体腔液からなる群から選ばれる、［１５］〜［２２］のいずれか一項に記載の測定方法。
［２４］前記検体が、血液である［１５］〜［２３］のいずれか一項に記載の測定方法。
［２５］前記血液が、全血、血漿又は血清である［２４］に記載の測定方法。
［２６］配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＡＰＯＡ４と特異的に結合する捕捉抗体と、前記ＡＰＯＡ４と特異的に結合する検出抗体に標識が結合した標識化検出抗体と、を含む、検体中のＡＰＯＡ４測定用キットであって、前記捕捉抗体及び前記検出抗体が、［１］〜［１４］のいずれか一項に記載の抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントから選択され、前記捕捉抗体と前記検出抗体とが異なる、検体中のＡＰＯＡ４測定用キット。
［２７］前記捕捉抗体が、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントである、［２６］に記載のキット。
［２８］前記検出抗体が、［５］〜［１４］のいずれか一項に記載の抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントである、［２６］又は［２７］に記載のキット。
［２９］前記捕捉抗体が、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントであり、前記検出抗体が、［５］〜［８］のいずれか一項に記載の抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントである、［２６］〜［２８］のいずれか一項に記載のキット。
［３０］前記捕捉抗体が、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントであり、前記検出抗体が、［９］〜［１１］のいずれか一項に記載の抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントである、［２６］〜［２８］のいずれか一項に記載のキット。
［３１］前記捕捉抗体が、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントであり、前記検出抗体が、［１２］〜［１４］のいずれか一項に記載の抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントである、［２６］〜［２８］のいずれか一項に記載のキット。
［３２］前記標識が酵素である、［２６］〜［３１］のいずれか一項に記載のキット。
［３３］前記捕捉抗体が、固体支持体に固定化されている、［２６］〜［３２］のいずれか一項に記載のキット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、検体中のＡＰＯＡ４を正確に測定できる抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体、該抗体を用いるＡＰＯＡ４の免疫学的測定方法及び該抗体を含むＡＰＯＡ４測定用キットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体のｒｈＡＰＯＡ４−Ｈｉｓのモノマー及びダイマーに対する反応性を示した図である。
【図２】ヒト血清中のＡＰＯＡ４のモノマー及びダイマーのウエスタンブロティングによる解析結果を示した図である。
【図３】本発明の抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡによる、ヒト血清中のＡＰＯＡ４の測定結果を示した図である。
【図４】本発明の抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡによる検体希釈用サンプル中のＡＰＯＡ４の測定結果を示した図である。
【図５】ヒト血清中のＡＰＯＡ４の、本発明の抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡによる測定値と、ＬＣ／ＭＳによる測定値との相関性を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施形態を具体的に説明する。
【００１４】
＜ＡＰＯＡ４＞
「ＡＰＯＡ４遺伝子」は、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶをコードする遺伝子であり、ヒトのほか、マウス、ラット等のげっ歯類などでも発現することが知られている。ヒトＡＰＯＡ４をコードする遺伝子配列としては、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０００４８２で登録されている塩基配列、又は配列番号１で表される塩基配列が挙げられる。ヒトＡＰＯＡ４のアミノ酸配列としては、ＧｅｎＢａｎｋ ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＮＰ＿０００４７３で登録されているアミノ酸配列、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列が挙げられる。以下、ＡＰＯＡ４は、特に言及しない限りは、ヒトＡＰＯＡ４を示す。
【００１５】
本発明の一態様において、ＡＰＯＡ４は、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、又は、当該アミノ酸配列において１個又は複数個のアミノ酸が置換・付加・欠失したアミノ酸配列で表されるペプチドを含む。本発明において、ＡＰＯＡ４について使用される「複数個」は、その基となるアミノ酸配列によって示されるペプチドと同等の機能特性を保持する限り限定されないが、２個〜４０個、例えば２個〜３５個、２個〜３０個、２個〜２５個、２個〜２０個、２個〜１５個、２個〜１０個、又は２個〜５個である。本発明の別の態様において、ＡＰＯＡ４は、配列番号２に記載のアミノ酸配列と、少なくとも９０％、例えば９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列で表されるペプチドを含む。
【００１６】
本発明において、アミノ酸配列の「相同性」とは、以下のパラメーター設定の下に、ＣＬＵＳＴＡＬＷアルゴリズムを用いて２配列間比較（Ｐａｉｒｗｉｓｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）を行った場合の相同性を意味する。
Ｋ−ｔｕｐｌｅ（ｗｏｒｄ）ｓｉｚｅ：１
Ｗｉｎｄｏｗ  ｓｉｚｅ：５
Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ：３
Ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  Ｔｏｐ  Ｄｉａｇｏｎａｌｓ：５
Ｓｃｏｒｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄ：ＰＥＲＣＥＮＴ
【００１７】
本発明において使用されるＡＰＯＡ４は、市販のものであってもよいし、血液中から抽出・生成したものであってもよいし、遺伝子組換え技術によって製造されたものであってもよい。遺伝子組換え技術によるＡＰＯＡ４の製造は、例えば、ＡＰＯＡ４をコードする遺伝子をクローニングし、当該遺伝子を含むベクターを作製し、これを宿主細胞に導入して形質転換させることによって、ＡＰＯＡ４を発現する細胞を取得し、これを細胞培養することによって製造することができる。この調製に使用される細胞、ベクターの種類、細胞の種類、培養条件等は、当業者の技術的範囲内であり、適宜適切な条件を設定することができる。
【００１８】
本発明の一実施形態において、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むヒトＡＰＯＡ４に対するモノクローナル抗体を作製するため、及び該抗体を用いる免疫学的測定方法における標準品とするため、ヒトＡＰＯＡ４のＣ末端にヒスチジンタグを結合したリコンビナントヒトＡＰＯＡ４（以下、ｒｈＡＰＯＡ４−Ｈｉｓとも称する）を使用することができる。ｒｈＡＰＯＡ４−Ｈｉｓの調製に使用される細胞、ベクターの種類、細胞の種類、培養条件等は、当業者の技術的範囲内であり、適宜適切な条件を設定することができる。
【００１９】
＜モノクローナル抗体＞
本明細書において「抗体」とは、天然に存在するか、遺伝子組換え技術によって産生される、全長の免疫グロブリン分子をいい、「抗体フラグメント」とはかかる免疫グロブリン分子の抗原結合性のフラグメントをいう。かかる抗体および抗体フラグメントは、慣用技術を用いて作製することができる。抗体フラグメントとしては、Ｆ(ａｂ’) ２、Ｆ(ａ ｂ) ２、Ｆａｂ’ 、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、それらの変異体、抗体部分を含む融合タンパク質又は融合ペプチド、及びＡＰＯＡ４結合部位を含む、免疫グロブリン分子以外の修飾構造体等を挙げることができる。
【００２０】
本明細書において、抗体が「特異的に結合する」とは、ＡＰＯＡ４とは異なる他のポリペプチドに実質的に結合することなく、ＡＰＯＡ４に結合することを意味する。
【００２１】
本発明において、「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体のポピュレーションから得られる抗体を意味し、そのポピュレーションに含まれる個々の抗体は、若干存在し得る可能性のある天然の突然変異体を除いて同一である。モノクローナル抗体は、抗原の特定のエピトープに対して1つの結合特異性及び親和性を示す抗体である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体ポピュレーションから得られる抗体の特性を示し、特定の方法による抗体の生産を必要とするものとして限定的に解されるべきではない。
【００２２】
本明細書において使用する、抗体の「重鎖」は、その天然に存在するコンフォメーションで全ての抗体分子に存在するポリペプチド鎖の２つのタイプのうち、より大きいほうを指す。本明細書において用いられる、抗体「軽鎖」は、その天然に存在するコンフォメーションで全ての抗体分子に存在するポリペプチド鎖の２つのタイプのうち、より小さいほうを指す。
本明細書において使用する、「抗ＡＰＯＡ４抗体」は、ＡＰＯＡ４に結合する抗体をいう。本発明の抗ＡＰＯＡ４抗体又はその抗体フラグメントは、ＡＰＯＡ４と特異的に結合する抗体又はその抗体フラグメントであることが好ましい。また、本発明の抗ＡＰＯＡ４抗体又はその抗体フラグメントは、好ましくは、抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントである。
【００２３】
本発明において、抗ＡＰＯＡ４抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ若しくはＩｇＭ又はそれらのサブクラスなどの任意のクラスであってよく、特定のクラスに限定されない。重鎖（Ｈ鎖と称することもある）の定常領域の抗体アミノ酸配列により、免疫グロブリンは、異なるクラスに分類される。５つの主な免疫グロブリンのクラスとしては、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらの幾つかは、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４（マウスの場合は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＧ３）、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２（マウスの場合は、ＩｇＡ）というサブクラス（アイソタイプ）にさらに細分化され得る。異なるクラスの免疫グロブリンの対応する重鎖の定常領域は、それぞれ、α鎖、δ鎖、ε鎖、γ鎖及びμ鎖と呼ばれている。また、抗体の軽鎖（Ｌ鎖と称することもある）の種類にはλ鎖及びκ鎖が存在する。
【００２４】
本発明において、抗体可変領域は、抗体軽鎖の可変領域、抗体重鎖の可変領域、又はその両方を意味する。また、本発明において、抗体の定常領域は、抗体軽鎖の定常領域、抗体重鎖の定常領域、又はその両方を意味する。重鎖及び軽鎖の可変領域は、それぞれ、超可変領域としても知られる３つの相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲ）とＣＤＲにより連結される４つのフレームワーク領域（ＦＲ）からなる。各鎖におけるＣＤＲは、ＦＲにより、近傍に保持されており、他方の鎖におけるＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している。
【００２５】
ＣＤＲを決定するための技術としては、限定はされないが、例えば、（１）異種間配列可変性に基づくアプローチ（例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈ  ｅｄ．，  １９９１、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ）；及び（２）抗原−抗体複合体の結晶構造学的研究に基づくアプローチ（Ａｌ−ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．  ２７３，９２７−９４８，１９９７）を挙げることができる。これらのアプローチや、他のアプローチを組み合わせて用いてもよい。
【００２６】
本発明の抗ＡＰＯＡ４抗体又はその抗体フラグメントは、公知の方法に従って作製することができる。抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントは、例えば、ＡＰＯＡ４又はＡＰＯＡ４フラグメントで免疫した非ヒト哺乳動物から抗体産生細胞を単離し、これを骨髄腫細胞等と融合させてハイブリドーマを作製し、このハイブリドーマが産生した抗体を精製することによって得ることができる。ＡＰＯＡ４フラグメントはＡＰＯＡ４の部分ペプチドであり、ＡＰＯＡ４フラグメントに対するモノクローナル抗体又はその抗体フラグメントは、ＡＰＯＡ４と結合する。また、免疫原としては、例えば、ヒトやサルなどの霊長類、ラットやマウスなどのげっ歯類などのＡＰＯＡ４又はＡＰＯＡ４フラグメントが挙げられるが、好ましくはヒトのＡＰＯＡ４又はＡＰＯＡ４フラグメントが挙げられる。
また、本発明の抗ＡＰＯＡ４抗体又はその抗体フラグメントは、公知の遺伝子組換え技術を用いて製造することもできる。具体的には、前記で作製したハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体、当該抗体の重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖ＣＤＲ、軽鎖ＣＤＲ等をコードする遺伝子をクローニングし、当該遺伝子を含むベクターを作製し、これを宿主細胞に導入して形質転換させることによって、本発明の抗ＡＰＯＡ４抗体又はその抗体フラグメントを発現する細胞を取得し、これを細胞培養することにより製造することができる。この調製に使用される細胞、ベクターの種類、細胞の種類、培養条件等は、当業者の技術的範囲内であり、適宜適切な条件を設定することができる。
【００２７】
本発明の抗ＡＰＯＡ４抗体又はその抗体フラグメントとしては、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＡＰＯＡ４の８９番目〜１１０番目のアミノ酸配列、及び２００番目〜２２４番目のアミノ酸配列と特異的に結合する抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメント、配列番号２で表されるＡＰＯＡ４の１２２番目〜１４４番目のアミノ酸配列、１５６番目〜１７７番目のアミノ酸配列、及び２４２番目〜２５２番目のアミノ酸配列と特異的に結合する抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメント等が挙げられる。
【００２８】
配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＡＰＯＡ４の８９番目〜１１０番目のアミノ酸配列、及び２００番目〜２２４番目のアミノ酸配列と特異的に結合する抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントとしては、例えば、
配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；
配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；
配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；
配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；
配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；及び、
配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；
を含む、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＡＰＯＡ４に特異的に結合する抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体Ｎｏ．３０（以下、抗体Ｎｏ．３０と略記する）又はその抗体フラグメント等が挙げられる。
【００２９】
配列番号２で表されるＡＰＯＡ４の１２２番目〜１４４番目のアミノ酸配列、１５６番目〜１７７番目のアミノ酸配列、及び２４２番目〜２５２番目のアミノ酸配列と特異的に結合する抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントとしては、例えば、
配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；
配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；
配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；
配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；
配列番号１９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；及び
配列番号２０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＡＰＯＡ４に特異的に結合する抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体Ｎｏ．３３（以下、抗体Ｎｏ．３３と略記する）又はその抗体フラグメント等が挙げられる。
【００３０】
また、本発明の抗ＡＰＯＡ４抗体又はその抗体フラグメントとしては、上記抗体Ｎｏ．３０及び抗体Ｎｏ．３３、並びにそれらの抗体フラグメントの他、例えば、
配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；
配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；
配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；
配列番号２１で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；
配列番号２２で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；及び
配列番号２３で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；
を含む、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＡＰＯＡ４に特異的に結合する抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体Ｎｏ．３６（以下、抗体Ｎｏ．３６と略記する）又はその抗体フラグメント、
配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；
配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；
配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；
配列番号２４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；
配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；及び
配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；
を含む、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＡＰＯＡ４に特異的に結合する抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体Ｎｏ．３７（以下、抗体Ｎｏ．３７と略記する）又はその抗体フラグメント等が挙げられる。
【００３１】
これらの重鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３及び軽鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を含む、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＡＰＯＡ４に特異的に結合する抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントは、公知の遺伝子組換え技術を用いて製造することができる。具体的には、重鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３及び軽鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３をそれぞれコードする遺伝子を、前記抗体のＦＲと前記抗体の定常領域をそれぞれコードする遺伝子を含むベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入して形質転換させることによって、前記抗体を発現する細胞を取得し、これを細胞培養することによって製造することができる。この調製に使用される細胞、ベクターの種類、細胞の種類、培養条件等は、当業者の技術的範囲内であり、適宜適切な条件を設定することができる。
【００３２】
前記抗体Ｎｏ．３０は、配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号３１で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００３３】
前記抗体Ｎｏ．３３は、配列番号２８で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号３２で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００３４】
前記抗体Ｎｏ．３６は、配列番号２９で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００３５】
前記抗体Ｎｏ．３７は、配列番号３０で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号３４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００３６】
これらの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＡＰＯＡ４に特異的に結合する抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントは、公知の遺伝子組換え技術を用いて作製することができる。具体的には、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をそれぞれコードする遺伝子を、前記抗体の定常領域をコードする遺伝子を含むベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入して形質転換させることによって、前記抗体を発現する細胞を取得し、これを細胞培養することによって製造することができる。この調製に使用される細胞、ベクターの種類、細胞の種類、培養条件等は、当業者の技術的範囲内であり、適宜適切な条件を設定することができる。
【００３７】
前記抗体Ｎｏ．３０、前記抗体Ｎｏ．３３、前記抗体Ｎｏ．３６及び前記抗体Ｎｏ．３７、並びにそれらの抗体フラグメントは、いずれもＡＰＯＡ４のモノマー及びダイマーに特異的に結合する。
【００３８】
＜測定方法＞
本発明の一実施形態において、ＡＰＯＡ４の測定方法は、検体中のＡＰＯＡ４と、前記ＡＰＯＡ４に特異的に結合する捕捉抗体とを結合させた後、前記ＡＰＯＡ４に特異的に結合する検出抗体に標識が結合した標識化検出抗体を添加し、前記ＡＰＯＡ４、捕捉抗体、及び標識化検出抗体からなる免疫複合体を生成させ、生成した前記免疫複合体中の標識量を測定する、検体中のＡＰＯＡ４の免疫学的測定方法である。ここで、「捕捉抗体」及び「検出抗体」は、それぞれ、ＡＰＯＡ４に特異的に結合する抗ＡＰＯＡ４抗体又はその抗体フラグメントであり、好ましくは、抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメント。
【００３９】
本発明の検体中のＡＰＯＡ４の測定方法において、検体としては、体液等が挙げられ、体液としては、非限定的に、血清、血漿又は全血等の血液、リンパ液、組織液、髄液、体腔液、消化液、鼻水、涙液、汗及び尿等が挙げられるが、これらに限定されない。取得及び処理の簡便さから、前記検体として血清又は血漿を用いることが好ましい。また、前記体液は、対象から採取した体液そのものであっても、採取した体液に通常行われる希釈、濃縮等の処理を行ったものであってもよい。また、本発明に用いる検体は、本発明の実施時に採取又は調製されたものでもよく、予め採取又は調製され保存されたものであってもよい。
【００４０】
前記免疫学的測定方法としては、前記標識化検出抗体の標識により、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ又はＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ(ＦＩＡ) 、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）、電気化学発光イムノアッセイ等に分類され、これらのいずれも本発明の測定方法に用いることができるが、ＥＬＩＳＡが、簡便且つ迅速に検出対象を測定することができ好ましい。
【００４１】
本発明の免疫学的測定方法において、捕捉抗体は、固体支持体に固定化されていることが好ましい。当該固体支持体に固定化された捕捉抗体に、適宜処理した生体試料を添加して反応させた後、さらに、前記捕捉抗体とは異なる、ＡＰＯＡ４に特異的に結合する検出抗体に標識が結合した標識化検出抗体を添加して、前記ＡＰＯＡ４、捕捉抗体、及び標識化検出抗体からなる免疫複合体を生成させる。
【００４２】
前記固体支持体としては、抗体又は抗体フラグメントを安定に保持できるものであれば特に制限はない。固体支持体の好ましい素材としてはポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ゼラチン、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、セルロースアセテート、酢酸セルロース、ポリエチレンテレフタレート等の高分子素材、ガラス、セラミックス、磁性粒子や金属等が挙げられる。固体支持体の好ましい形状としてはチューブ、ビーズ、プレート、ラテックス等の微粒子、スティック等が挙げられる。
【００４３】
当該免疫複合体を洗浄後、免疫複合体中の標識を測定することにより、検体中のＡＰＯＡ４を測定する。例えば、ＥＬＩＳＡの場合、標識である酵素と当該酵素の基質とを反応させ、発色した生成物の吸光度を測定することにより、検体中のＡＰＯＡ４を測定することができる。また、固体支持体に固定した捕捉抗体と検体中のＡＰＯＡ４とを反応させた後、非標識の抗ＡＰＯＡ４抗体又はその抗体フラグメント（一次抗体）を添加し、酵素等で標識された一次抗体に対する抗体又はその抗体フラグメント（二次抗体）をさらに添加し、当該二次抗体の標識を測定することにより、検体中のＡＰＯＡ４を測定することもできる。また、当該二次抗体をビオチンで標識し、酵素等で標識したアビジン又はストレプトアビジンをビオチンと結合させて、当該二次抗体を酵素等で標識し、当該二次抗体の標識を測定することにより検体中のＡＰＯＡ４を測定することもできる。
【００４４】
前記標識としては、ＥＬＩＳＡでは、パーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素、ＲＩＡ法では、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３Ｈ等の放射性物質、ＦＰＩＡ法では、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ダンシルクロリド、フィコエリスリン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、近赤外蛍光材料等の蛍光物質、ＣＬＩＡ法では、ルシフェラーゼ、β‐ガラクトシダーゼ等の酵素と各酵素で発光物質に変化する発光基質、及びルシフェリン、エクオリン等の発光物質を用いることができる。その他、金コロイド、量子ドットなどのナノ粒子を標識として用いることもできる。
【００４５】
ＥＬＩＳＡにおいて、標識となる酵素の基質は、酵素がパーオキシダーゼの場合３、３’−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ (ＤＡＢ) 、３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ (ＴＭＢ) 、Ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ (ＯＰＤ) 等を用いることができ、アルカリホスファターゼの場合、ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ (ｐＮＰＰ)等を用いることができる。
【００４６】
前記ＡＰＯＡ４に特異的に結合する捕捉抗体としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＡＰＯＡ４の８９番目〜１１０番目のアミノ酸配列、及び２００番目〜２２４番目のアミノ酸配列と特異的に結合する抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメント等が挙げられる。当該捕捉抗体としては、ＡＰＯＡ４のモノマー及びダイマーに特異的に結合する抗ＡＰＯＡ４抗体又はその抗体フラグメントが好ましく、例えば、抗体Ｎｏ．３０、抗体Ｎｏ．３３、抗体Ｎｏ．３６、抗体Ｎｏ．３７、それらの抗体フラグメント等が挙げられるが、抗体Ｎｏ．３０又はその抗体フラグメントが好ましい。
【００４７】
また、前記捕捉抗体とは異なる、ＡＰＯＡ４に特異的に結合する検出抗体としては、前記捕捉抗体とは異なるエピトープと結合する抗ＡＰＯＡ４抗体又はその抗体フラグメントが挙げられ、例えば、配列番号２で表されるＡＰＯＡ４の１２２番目〜１４４番目のアミノ酸配列、１５６番目〜１７７番目のアミノ酸配列、及び２４２番目〜２５２番目のアミノ酸配列と特異的に結合する抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメント等が挙げられる。当該検出抗体としては、ＡＰＯＡ４のモノマーに特異的に結合する抗ＡＰＯＡ４抗体又はその抗体フラグメントが好ましく、例えば、抗体Ｎｏ．３０、抗体Ｎｏ．３３、抗体Ｎｏ．３６、抗体Ｎｏ．３７、それらの抗体フラグメント等が挙げられるが、抗体Ｎｏ．３３、抗体Ｎｏ．３６、抗体Ｎｏ．３７、又はそれらの抗体フラグメントが好ましく、抗体Ｎｏ．３３又はその抗体フラグメントがより好ましい。
【００４８】
前記捕捉抗体と前記検出抗体の組み合わせとしては、捕捉抗体と検出抗体が異なれば、特に制限はないが、例えば、捕捉抗体を抗体Ｎｏ．３０又はその抗体フラグメントとし、検出抗体を抗体Ｎｏ．３３又はその抗体フラグメントとする組み合わせ、捕捉抗体を抗体Ｎｏ．３０又はその抗体フラグメントとし、検出抗体を抗体Ｎｏ．３６又はその抗体フラグメントとする組み合わせ、捕捉抗体を抗体Ｎｏ．３０又はその抗体フラグメントとし、検出抗体を抗体Ｎｏ．３７又はその抗体フラグメントとする組み合わせ等が挙げられるが、捕捉抗体を抗体Ｎｏ．３０又はその抗体フラグメントとし、検出抗体を抗体Ｎｏ．３３又はその抗体フラグメントとする組み合わせが好ましい。
【００４９】
＜キット＞
本発明のキットは、本発明のＡＰＯＡ４の測定方法に用いられるキットであって、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＡＰＯＡ４と特異的に結合する捕捉抗体と、前記ＡＰＯＡ４と特異的に結合する検出抗体に標識が結合した標識化検出抗体とを含む。
【００５０】
本発明のキットに用いられる前記捕捉抗体と前記検出抗体は、異なっており、例えば、前記捕捉抗体と前記検出抗体とはそれぞれＡＰＯＡ４上の異なるエピトープと結合する。
本発明のキットに用いられる前記捕捉抗体と前記検出抗体としては、上記＜測定方法＞の項で挙げた捕捉抗体と検出抗体が挙げられる。また、本発明のキットに用いられる前記捕捉抗体と前記検出抗体の組み合わせとしては、上記＜測定方法＞の項で挙げた捕捉抗体と検出抗体の組み合わせが挙げられる。
【００５１】
本発明のキットは、本発明の検体中のＡＰＯＡ４の免疫学的測定方法によって、検体中のＡＰＯＡ４を測定するために必要な試薬及び装置をさらに含んでもよい。
【００５２】
本発明のキットは、一実施形態において、前記捕捉抗体及び前記標識化検出抗体の他、マイクロタイタープレート等の固体支持体、及び、標識を測定するための試薬を含む。標識を測定するための試薬としては、例えば、標識が酵素の場合、パラニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）等のアルカリホスファターゼの基質、又は３，３’−ジアミノベンジジン四塩酸塩（ＤＡＢ）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、ｏ-フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）等のパーオキシダーゼの基質等が挙げられる。
【００５３】
このようなキットの場合、まず、マイクロタイタープレート等の固体支持体に捕捉抗体を固定し、ここに適宜処理し希釈した検体を添加した後インキュベートし、捕捉抗体に未結合の検体を洗浄により除去する。次に、標識化検出抗体を添加した後インキュベートし、固体支持体上の標識を測定する。例えば、標識が酵素の場合、当該酵素の基質を加えて発色させ、マイクロタイタープレートリーダ一等を用いて発色を測定することにより、検体中のＡＰＯＡ４を測定することができる。
【００５４】
本発明のキットは、別の実施形態において、抗ＡＰＯＡ４抗体又はその抗体フラグメントに対して結合する抗体又はその抗体フラグメントである二次抗体を含んでいてもよい。このようなキットとしては、マイクロタイタープレート等の固体支持体、捕捉抗体、一次抗体としての抗ＡＰＯＡ４抗体又はその抗体フラグメント、二次抗体としての抗ＡＰＯＡ４抗体又はその抗体フラグメントに対する、アルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼ等の酵素で標識化された標識化二次抗体、及びｐＮＰＰ等のアルカリホスファターゼの基質、又は、ＤＡＢ、ＴＭＢ、ＯＰＤ等のパーオキシダーゼの基質を含むキット等が挙げられる。
【００５５】
このようなキットの場合、まず、マイクロタイタープレート等の固体支持体に捕捉抗体を固定し、ここに適宜処理し希釈した検体を添加した後インキュベートし、捕捉抗体に結合しなかった検体を洗浄により除去する。続いて、一次抗体を添加してインキュベートした後、洗浄を行い、さらに、一次抗体を認識する、酵素標識した二次抗体を添加してインキュベートを行う。その後、標識酵素の基質を加えて発色させ、マイクロタイタープレートリーダ一等を用いて発色を測定することにより、検体中のＡＰＯＡ４を測定することができる。このような二次抗体を用いることにより、反応が増幅され検出感度を高めることができる。
【００５６】
本発明のキットは、さらに、必要な緩衝液、酵素反応停止液、マイクロプレートリーダー、製品説明書等を含んでいてもよい。
【００５７】
前記標識としては、特に制限はなく、パーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３Ｈ等の放射性物質、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ダンシルクロリド、フィコエリスリン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、近赤外蛍光材料等の蛍光物質、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、エクオリン等の発光物質、金コロイド、量子ドット等のナノ粒子等が挙げられる。また検出抗体としてビオチン化抗ＡＰＯＡ４抗体又はその抗体フラグメントを用い、キットに標識したアビジン又はストレプトアビジンを含めることもできる。
【００５８】
なお、本明細書において用いられる用語は、特定の実施形態を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
【００５９】
また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。
【００６０】
異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、または、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
【実施例】
【００６１】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明する。しかしながら、本発明はいろいろな形態により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。【００６２】
実施例１： ヒスチジンタグ結合リコンビナントヒトＡＰＯＡ４の調製
配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むヒトＡＰＯＡ４に対するモノクローナル抗体を作製するため、ヒトＡＰＯＡ４のＣ末端にヒスチジンタグを結合したリコンビナントタンパク質を以下の工程により調製した。
ヒトＡＰＯＡ４をコードする遺伝子は、ヒトの肝臓のｃＤＮＡよりＰＣＲにて増幅した。この遺伝子を、ヒスチジンタグをコードする遺伝子を挿入したｐｃＤＮＡ３．４ベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩサイトに挿入した。作製したベクターを、Ｅｘｐｉ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）標準の方法に従ってＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞に形質転換し、ヒトＡＰＯＡ４のＣ末端にヒスチジンタグを結合したリコンビナントタンパク質（ｒｈＡＰＯＡ４−Ｈｉｓという）を培養上清中に分泌させた。培養上清中に分泌させたｒｈＡＰＯＡ４−Ｈｉｓを、培養上清からＴＡＬＯＮ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｓｉｎ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）にて精製後、Ｄ−ＰＢＳ（和光純薬工業社製）に対して透析した。【００６３】
実施例２： ｒｈＡＰＯＡ４−Ｈｉｓモノマーおよびダイマーの調製
実施例１において精製したｒｈＡＰＯＡ４−Ｈｉｓをサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＳＥＣ）にてサイズ分画を行った。ＳＥＣカラムはＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ１０ｓクロマトグラフィーシステムに接続したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００  １０／３００  ＧＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用い、４℃にて実施した。溶媒はＤ−ＰＢＳ（−）（和光純薬工業社製）を用い、流速は０．５ｍｌ／ｍｉｎで行った。タンパク質の溶出プロファイルは２８０ｎｍの吸光度で検出し、溶出画分は０．３ｍＬずつ９６ウェルプレートに分取した。Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  １１．８ｍｌのピークをダイマー、Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  １４．２ｍｌのピークをモノマーとして溶出画分を回収した。ダイマーおよびモノマー画分のタンパク質量は、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて濃度既知のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準物質とした検量線より算出した。【００６４】
実施例３：マウス抗ヒトＡＰＯＡ４モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの調製（１）ハイブリドーマの調製
ｒｈＡＰＯＡ４−Ｈｉｓの１０μｇを、同量のＴｉｔｅｒＭａｘ  Ｇｏｌｄアジュバント（ＴｉｔｅｒＭａｘ  ＵＳＡ社製）又はＭａｇｉｃ  Ｍｏｕｓｅアジュバント（Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）と混合し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ及びＢａｌｂ／ｃＡマウスの足蹠へ皮下注射した。その後、３、７、１０、１７、２５及び３１日目に同様にｒｈＡＰＯＡ４−Ｈｉｓを投与した。このとき、ＴｉｔｅｒＭａｘ  Ｇｏｌｄアジュバント（ＴｉｔｅｒＭａｘ  ＵＳＡ社製）及びＭａｇｉｃ  Ｍｏｕｓｅアジュバント（Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）は３、１０、１７及び３１日目に使用した。３４日目にマウスを屠殺し（ｓａｃｒｉｆｉｃｅｄ）、末梢リンパ節を回収してリンパ節細胞を調製した。ＧｅｎｏｍｅＯＮＥ−ＣＦ（石原産業社製）の存在下で、調製したリンパ節細胞とＰ３Ｕ１ミエローマ細胞とを５：１の割合で融合した。前記ハイブリドーマは、９６ウェルプラスチックプレートで培養した。７日間、５％ＣＯ２、３７°Ｃでインキュベーション後、培養上清を回収した。【００６５】
（２）抗ヒトＡＰＯＡ４モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング
（１）で得られたハイブリドーマの培養上清を用いて、ｒｈＡＰＯＡ４−Ｈｉｓに対する反応性を以下のようにしてＥＬＩＳＡで評価した。
抗６×Ｈｉｓウサギポリクローナル抗体（抗６×Ｈｉｓ抗体、Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）２μｇ／ｍＬを含む５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）を９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ社製）のウェルに５０μＬ／ウェル添加して４℃で一晩インキュベートした。抗６×Ｈｉｓ抗体溶液を除去した後、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０及び５％スキムミルク含有５０ｍＭトリス緩衝生理食塩液（ｐＨ７．５）を１００μＬ／ウェル加えてブロッキングし、室温で１時間放置した。０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝生理食塩液（ｐＨ７．５）（洗浄液）でウェルを３回洗浄した後、実施例１において調製したｒｈＡＰＯＡ４−Ｈｉｓ又は次に記載する方法により調製したリフォールドｒｈＡＰＯＡ４−Ｈｉｓモノマーを４５０ｎｇ／ｍＬ（１０ｎＭ）の濃度で５０μＬ／ウェル添加した後、室温で１時間インキュベートした。リフォールドｒｈＡＰＯＡ４−Ｈｉｓモノマーは、実施例１において調製したｒｈＡＰＯＡ４−Ｈｉｓを、８Ｍ  尿素（和光純薬工業社製）含有５０ｍＭ  トリス緩衝生理食塩液(ｐＨ７．５)で２倍に希釈し、室温で３０分間放置した後、４％ ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル社製）及び０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有する５０ｍＭ  トリス緩衝生理食塩液(ｐＨ７．５)（反応溶液）で５０倍希釈して調製した。ウェルを洗浄液で３回洗浄した後、前記ハイブリドーマの培養上清をウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。添加した培養上清を除去した後、ウェルを洗浄液で３回洗浄した。反応溶液で適度に希釈した西洋ワサビパーオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を５０μＬ／ウェル加え、室温で１時間インキュベートした後、ウェルを洗浄液で５回洗浄した。ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）溶液を５０μＬ／ウェルを加え、室温で３０分間インキュベートした。ＴＭＢ溶液と等容量の１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を５０μＬ／ウェル加えて反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）により４５０ｎｍの吸光度を測定した。【００６６】
（３）マウス抗ヒトＡＰＯＡ４抗体を発現するハイブリドーマのクローニング
上記（２）で、ｒｈＡＰＯＡ４−Ｈｉｓに対する反応性を示したハイブリドーマの培養上清を含むウェルより限界希釈法にてハイブリドーマをクローニングし、リフォールドｒｈＡＰＯＡ４−Ｈｉｓモノマーに対する反応活性を有するマウス抗ヒトＡＰＯＡ４抗体を発現するハイブリドーマクローンを得た。【００６７】
（４）抗ヒトＡＰＯＡ４モノクローナル抗体の精製
得られたハイブリドーマクローンを培養し、培養上清からＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて精製し、抗ヒトＡＰＯＡ４モノクローナル抗体Ｎｏ．２７〜Ｎｏ．３７を得た。【００６８】
実施例４：抗ヒトＡＰＯＡ４モノクローナル抗体のｒｈＡＰＯＡ４−Ｈｉｓのモノマー及びダイマーに対する反応性
抗６×Ｈｉｓウサギポリクローナル抗体（抗６×Ｈｉｓ抗体、Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）２μｇ／ｍＬを含む５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）を９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ社製）のウェルに５０μＬ／ウェル添加して４℃で一晩インキュベートした。抗６×Ｈｉｓ抗体溶液を除去した後、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０及び５％スキムミルク含有５０ｍＭトリス緩衝生理食塩液（ｐＨ７．５）を１００μＬ／ウェル加えてブロッキングし、室温で１時間放置した。０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝生理食塩液（ｐＨ７．５）（洗浄液）でウェルを３回洗浄した後、実施例２において調製したｒｈＡＰＯＡ４−Ｈｉｓモノマー又はダイマーを、1％ ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル社製）及び０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有する５０ｍＭ  トリス緩衝生理食塩液(ｐＨ７．５)（反応溶液）で４５０ｎｇ／ｍＬとなるよう希釈し、５０μＬ／ウェル添加した。室温で１時間インキュベート後、ウェルを洗浄液で３回洗浄した後、実施例３で得られた抗ヒトＡＰＯＡ４モノクローナル抗体を１μｇ／ｍＬとなるよう反応溶液で希釈し５０μＬ／ウェル添加した。室温で１時間インキュベート後、ウェルを洗浄液で３回洗浄した。次に、反応溶液で適度に希釈した西洋ワサビパーオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を５０μＬ／ウェル加え、室温で１時間インキュベートした後、ウェルを洗浄液で５回洗浄した。ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）溶液を５０μＬ／ウェルを加え、室温で１５分間インキュベートした。ＴＭＢ溶液と等容量の１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を５０μＬ／ウェル加えて反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）により４５０ｎｍの吸光度を測定した。
抗ヒトＡＰＯＡ４モノクローナル抗体Ｎｏ.２７〜３７のＡＰＯＡ４モノマー及びダイマーへの反応性を図１に示す。【００６９】
実施例５： ヒト血清のＡＰＯＡ４のモノマー及びダイマーの解析
ヒト検体として２名の血清サンプル（Ｎ６５Ｓ及びＮ６７Ｓ）を用いた。血清分離後４℃あるいは−８０℃において２週間保存した血清１５０μＬをサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＳＥＣ）にてサイズ分画を行った。溶出フラクション中のＡＰＯＡ４はウェスタンブロット法により検出した。ＳＥＣカラムはＡＫＴＡ ｐｕｒｅ２５クロマトグラフィーシステムに接続したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００  １０／３００  ＧＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用い、４℃にて実施した。溶媒はＤ−ＰＢＳ（−）（和光純薬工業社製）を用い、流速は０．５ｍｌ／ｍｉｎで行った。ＡＰＯＡ４の溶出プロファイルは２８０ｎｍの吸光度で検出し、溶出画分は０．３ｍＬずつ９６ウェルプレートに分取した。ＡＰＯＡ４の溶出位置の確認及び各フラクションのＡＰＯＡ４タンパク質量を測定するため、タンパク質の溶出が開始されるポイント（Ｃ１）より２ウェル分ずつまとめたフラクション１〜１６(３２ウェル分)をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。フラクションはすべて３×ＳＤＳサンプルバッファーで１．５倍希釈したものを１５μＬ、さらにＡＰＯＡ４タンパク質測定の標準物質として、濃度既知のｒｈＡＰＯＡ４−Ｈｉｓの希釈系列をＣｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＴＧＸ  ４−２０％ゲルの各レーンにアプライした。ウェスタンブロッティングによるＡＰＯＡ４の検出は、以下の工程に従って行った。【００７０】
泳動後のゲルを、ｉＢＬＯＴ２ドライブロッティングシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いてニトロセルロース膜上に転写し、５％スキムミルク及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５０ｍＭトリス緩衝食塩液（以下、ブロッキング液という)中で室温にて１時間以上振とうし、ブロッキングを行った。一次抗体としてブロッキング液にて希釈したウサギポリクローナル抗ＡＰＯＡ４抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社製、＃７０Ｒ−５４２９）を用い、４℃にて１晩振とうした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５０ｍＭトリス緩衝食塩液（洗浄液）にて３回洗浄後、二次抗体としてブロッキング液にて希釈した西洋ワサビパーオキシダーゼ標識ロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用い室温にて１時間振とうした。洗浄液で４回洗浄後の膜に化学発光基質（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を反応させて、発光シグナルをＣＣＤイメージャー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）で検出した。【００７１】
検出されたＡＰＯＡ４のバンドのタンパク質量は、同じゲルに泳動した標準物質の希釈系列のバンド強度からＩｍａｇｅＬａｂ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて定量し、フラクション６〜９に溶出するダイマーと、フラクション１０〜１４に溶出するモノマーの比を算出した。ＳＥＣの結果を図２に示す。４℃保存血清中のダイマーはＮ６５Ｓ及びＮ６７Ｓが１７．９％及び１７．０％であるのに対し、凍結融解した血清ではそれぞれ０％及び０．０８％であった。【００７２】
実施例６：パーオキシダーゼ標識モノクローナル抗体の調製
抗ヒトＡＰＯＡ４モノクローナル抗体Ｎｏ．３３、Ｎｏ．３６及びＮｏ．３７をＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２（同人化学研究所社製）を用いて、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ：Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）で標識を行った（以下、それぞれ「ＨＲＰ標識抗体Ｎｏ．３３」、「ＨＲＰ標識抗体Ｎｏ．３６」及び「ＨＲＰ標識抗体Ｎｏ．３７」という）。【００７３】
実施例７：ヒト血清ＡＰＯＡ４のＥＬＩＳＡによる測定
抗ヒトＡＰＯＡモノクローナル抗体Ｎｏ．３０を、５０ｍＭ トリス緩衝液 (ｐＨ７．５)で２μｇ／ｍＬの濃度に調製した。その抗体Ｎｏ．３０溶液をマキシソープカップ（ＮＵＮＣ、Ｃ８  Ｍａｘｉｓｏｒｐ社製）に１００μＬ／ウェル添加した後、マキシソープカップを湿潤ボックスに入れ、４℃で一夜放置して、抗体Ｎｏ．３０をウェルにコートした。抗体Ｎｏ．３０溶液を吸引除去後、５％ スキムミルク、０．１％アジ化ナトリウム及び０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０含有５０ｍＭ  トリス緩衝生理食塩液(ｐＨ７．５)（ブロッキング液）を２００μＬ／ウェル添加後、室温で２時間又は４℃で１日以上放置した（以下、調製したマキシソーカップを「抗体Ｎｏ．３０カップ」という）。ブロッキング液を吸引除去後、抗体Ｎｏ．３０カップを０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０含有５０ｍＭトリス緩衝生理食塩液(ｐＨ７．５）（洗浄液）で３回洗浄し、−８０℃で１日又は２週間冷凍保存しておいたヒト血清サンプル（Ｎ６４〜Ｎ６８）を解凍し、４％ ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル社製）、０．２％ＰｒｏＣｌｉｎ１５０（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）及び０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有する５０ｍＭ  トリス緩衝生理食塩液(ｐＨ７．５)（反応溶液）で適度に希釈して１００μＬ／ウェル添加し、室温で２時間反応させた。洗浄液で３回洗浄後、反応溶液で５０００倍希釈したＨＲＰ標識抗体Ｎｏ．３３を１００μＬ／ウェル添加し、室温で１時間反応させた。洗浄液で３回洗浄後、３,３',５,５'−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ(ＴＭＢ）Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＥＬＩＳＡ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）を１００μＬ／ウェル添加し、室温で３０分間反応させた。０．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４を１００μＬ／ウェル注入して反応を停止させた後、波長４５０ｎｍで吸光度を測定し、濃度既知のｒｈＡＰＯＡ４−Ｈｉｓを標準物質としてＡＰＯＡ濃度を算出した。その結果を図３に示す。
図３に示したように、捕捉抗体として抗体Ｎｏ．３０を用い、標識化検出抗体としてＨＲＰ標識抗体Ｎｏ．３３を用いたＥＬＩＳＡにより、冷凍保存した血清中のＡＰＯＡ４を測定できることが確認された。【００７４】
実施例８：検体希釈試験
捕捉抗体として抗体Ｎｏ．３０を用い、標識化検出抗体としてＨＲＰ標識抗体Ｎｏ．３３を用いたＥＬＩＳＡ、及び捕捉抗体として抗体Ｎｏ．３０を用い、標識化検出抗体としてＨＲＰ標識抗体Ｎｏ．３７を用いたＥＬＩＳＡを、健常人８人の血清サンプル（Ｎ５４〜Ｎ６１）を反応溶液で３２０００、６４０００、１２８０００、２５６０００倍に希釈した検体希釈試験用サンプルを、それぞれ血清サンプルの代わりに用いる以外は、実施例６と同様に行い、検体希釈試験用サンプル中のＡＰＯＡ４を測定した。その結果を図４（Ａ）及び図４（Ｃ）に示す。
また、捕捉抗体として抗体Ｎｏ．３０を用い、標識化検出抗体としてＨＲＰ標識抗体Ｎｏ．３６を用いたＥＬＩＳＡを、健常人８人の血清サンプル（Ｎ５４〜Ｎ６１）を反応溶液で１６０００、３２０００、６４０００、１２８０００倍希釈した検体希釈試験用サンプルを、血清サンプルの代わりに用いる以外は、実施例６と同様に行い、検体希釈試験用サンプル中のＡＰＯＡ４を測定した。その結果を図４（Ｂ）に示す。
理想曲線は、２倍系列の数値を記入したグラフ化したものである。検体希釈試験用サンプルの実測値のグラフが理想曲線のグラフと平行であれば、正確な希釈試験結果であることを示す。
図４に示したように、２倍系列の数値をグラフ化した理想曲線と比較して、いずれのＥＬＩＳＡにおいても、希釈直線が理想曲線と平行な直線となっていることから、試験した範囲で検体の希釈倍率に応じて、検体中のＡＰＯＡ４が正確に測定されていることが確認された。【００７５】
実施例９：添加回収試験
標準物としてのｒｈＡＰＯＡ−Ｈｉｓの１ｎｇ／ｍＬ又は２ｎｇ／ｍＬと、健常人８人の血清サンプル（Ｎ５４〜Ｎ６１）を反応溶液で３２０００倍又は６４０００倍に希釈した希釈検体とを等量混合した混合検体を、検体希釈試験用サンプルの代わりに用いる以外は、実施例７と同様に行い、混合検体中のＡＰＯＡ４を測定した。また、標準物及び希釈検体も同様に測定を行い、下記式で算出される添加回収率（％）を、それぞれのＥＬＩＳＡで算出した。添加回収率が１００％に近い程、正確に測定できることを意味する。【００７６】
添加回収率（％）＝（混合検体実測値−希釈検体測定値）÷標準物測定値×１００【００７７】
捕捉抗体として抗体Ｎｏ．３０を用い、標識化検出抗体としてＨＲＰ標識抗体Ｎｏ．３３を用いたＥＬＩＳＡを表１に、捕捉抗体として抗体Ｎｏ．３０を用い、標識化検出抗体としてＨＲＰ標識抗体Ｎｏ．３６を用いたＥＬＩＳＡを表２に、捕捉抗体として抗体Ｎｏ．３０を用い、標識化検出抗体としてＨＲＰ標識抗体Ｎｏ．３７を用いたＥＬＩＳＡを表３に示す。【００７８】
【表１】
2019167874.tif 000003
【００７９】
【表２】
2019167874.tif 000004
【００８０】
【表３】
2019167874.tif 000005
【００８１】
表１〜表３に示したように、捕捉抗体として抗体Ｎｏ．３０を用い、標識化検出抗体としてＨＲＰ標識抗体Ｎｏ．３３を用いたＥＬＩＳＡ、捕捉抗体として抗体Ｎｏ．３０を用い、標識化検出抗体としてＨＲＰ標識抗体Ｎｏ．３６を用いたＥＬＩＳＡ及び捕捉抗体として抗体Ｎｏ．３０を用い、標識化検出抗体としてＨＲＰ標識抗体Ｎｏ．３７を用いたＥＬＩＳＡのいずれのＥＬＩＳＡにおいても、添加回収率が７９％以上となり、いずれのＥＬＩＳＡにおいても、検体中のＡＰＯＡ４が正確に測定できることが確認された。【００８２】
実施例１０：ＥＬＩＳＡ及びＬＣ／ＭＳによるヒト血清ＡＰＯＡ４測定値の相関性
健常人血清５検体を用い、実施例６と同様にして、血清中のＡＰＯＡ４を測定した。また、同じ検体のＡＰＯＡ４をＬＣ／ＭＳ（Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）を用いた選択反応モニタリング法により定量し、ＥＬＩＳＡによるヒト血清ＡＰＯＡ４測定値とＬＣ／ＭＳによるヒト血清ＡＰＯＡ４測定値との相関性を調べた。その結果を図５に示す。
図５に示したように、相関係数は、０．８０１５となり、本発明のＥＬＩＳＡでのＡＰＯＡ４の測定値と、ＬＣ／ＭＳによる測定値との間には良好な相関性が認められた。
更に相関係数回帰式の傾きが１に近く、ほぼ原点を通る直線になっているため、ＥＬＩＳＡによる測定値とＬＣ／ＭＳによる測定値は絶対値として近似していることが確かめられた。
この結果から、本発明のＥＬＩＳＡは、正確に検体中のＡＰＯＡ４を測定できることが確認された。【００８３】
実施例１１：抗体Ｎｏ．３０、抗体Ｎｏ．３３、抗体Ｎｏ．３６及び抗体Ｎｏ．３７の可変領域のアミノ酸配列解析
抗体Ｎｏ．３０、抗体Ｎｏ．３３、抗体Ｎｏ．３６及び抗体Ｎｏ．３７のそれぞれの重鎖及び軽鎖のシグナル配列、及び可変領域をコードするＤＮＡ配列を、５’−ＲＡＣＥ（５’−ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ）法により以下のようにして増幅した。
実施例３で得られたハイブリドーマから、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて全ＲＮＡを調製し、ＤＮａｓｅ（ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  ｓｅｔ、ＱＩＡＧＥＮ社製）で処理した。得られた全ＲＮＡからＳＭＡＲＴＥＲＴＭＲＡＣＥ ５’／３’ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を用いて、二本鎖ｃＤＮＡを調製した。調製したｃＤＮＡから、同キットに付属している５’フォワードプライマー（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍｉｘ）及び３’リバースプライマー（マウスＩｇＧ重鎖の増幅には配列番号３５で表される塩基配列からなるリバースプライマーを用い、マウスＩｇκ軽鎖の増幅には配列番号３６で表される塩基配列からなるリバースプライマーを用いた）を用い、抗体のシグナル配列及び可変領域をコードする遺伝子配列を増幅した。増幅された遺伝子配列を、ｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に挿入した。抗体Ｎｏ．３０、抗体Ｎｏ．３３、抗体Ｎｏ．３６及び抗体、Ｎｏ．３７の遺伝子配列を、ＡＢＩ３１３０ＸＬを用いて解析した。本解析により、各抗体のシグナル配列及びＣＤＲ配列を含む可変領域をコードする遺伝子配列を決定し、遺伝子解析ソフトフェアＧｅｎｅｔｙｘ（Ｇｅｎｅｔｙｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）にてアミノ酸配列に変換した。【００８４】
その結果、各抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列は以下のように決定された。
（１）抗体Ｎｏ．３０
重鎖可変領域：配列番号２７で表されるアミノ酸配列
軽鎖可変領域：配列番号３１で表されるアミノ酸配列
（２）抗体Ｎｏ．３３
重鎖可変領域：配列番号２８で表されるアミノ酸配列
軽鎖可変領域：配列番号３２で表されるアミノ酸配列
（３）抗体Ｎｏ．３６
重鎖可変領域：配列番号２９で表されるアミノ酸配列
軽鎖可変領域：配列番号３３で表されるアミノ酸配列
（４）抗体Ｎｏ．３７
重鎖可変領域：配列番号３０で表されるアミノ酸配列
軽鎖可変領域：配列番号３４で表されるアミノ酸配列【００８５】
実施例１２：抗体Ｎｏ．３０、抗体Ｎｏ．３３、抗体Ｎｏ．３６及び抗体Ｎｏ．３７のＣＤＲのアミノ酸配列解析
抗体Ｎｏ．３０、抗体Ｎｏ．３３、抗体Ｎｏ．３６及び抗体Ｎｏ．３７のＣＤＲは、それぞれの抗体のアミノ酸配列をＫａｂａｔの番号付システム（Ｋａｂａｔ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）に従い、Ａｂｙｓｉｓソフトフェア（ＵＣＬからのライセンス）を用いて番号付けし、この番号を基に、ＣＤＲの同定のためのＫａｂａｔの定義（Ｋａｂａｔ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ）に従って決定した。
抗体Ｎｏ．３０、抗体Ｎｏ．３３、抗体Ｎｏ．３６及び抗体Ｎｏ．３７のＣＤＲのアミノ酸配列は、以下のように決定された。【００８６】
（１）抗体Ｎｏ．３０
重鎖ＣＤＲ１：配列番号３で表されるアミノ酸配列
重鎖ＣＤＲ２：配列番号４で表されるアミノ酸配列
重鎖ＣＤＲ３：配列番号５で表されるアミノ酸配列
軽鎖ＣＤＲ１：配列番号１５で表されるアミノ酸配列
軽鎖ＣＤＲ２：配列番号１６で表されるアミノ酸配列
軽鎖ＣＤＲ３：配列番号１７で表されるアミノ酸配列  【００８７】
（２）抗体Ｎｏ．３３
重鎖ＣＤＲ１：配列番号６で表されるアミノ酸配列
重鎖ＣＤＲ２：配列番号７で表されるアミノ酸配列
重鎖ＣＤＲ３：配列番号８で表されるアミノ酸配列
軽鎖ＣＤＲ１：配列番号１８で表されるアミノ酸配列
軽鎖ＣＤＲ２：配列番号１９で表されるアミノ酸配列
軽鎖ＣＤＲ３：配列番号２０で表されるアミノ酸配列【００８８】
（３）抗体Ｎｏ．３６
重鎖ＣＤＲ１：配列番号９で表されるアミノ酸配列
重鎖ＣＤＲ２：配列番号１０で表されるアミノ酸配列
重鎖ＣＤＲ３：配列番号１１で表されるアミノ酸配列
軽鎖ＣＤＲ１：配列番号２１で表されるアミノ酸配列
軽鎖ＣＤＲ２：配列番号２２で表されるアミノ酸配列
軽鎖ＣＤＲ３：配列番号２３で表されるアミノ酸配列【００８９】
（３）抗体Ｎｏ．３７
重鎖ＣＤＲ１：配列番号１２で表されるアミノ酸配列
重鎖ＣＤＲ２：配列番号１３で表されるアミノ酸配列
重鎖ＣＤＲ３：配列番号１４で表されるアミノ酸配列
軽鎖ＣＤＲ１：配列番号２４で表されるアミノ酸配列
軽鎖ＣＤＲ２：配列番号２５で表されるアミノ酸配列
軽鎖ＣＤＲ３：配列番号２６で表されるアミノ酸配列【００９０】
実施例１３：抗体Ｎｏ．３０、抗体Ｎｏ．３３、抗体Ｎｏ．３６及び抗体Ｎｏ．３７のアイソタイプ
実施例２（３）で得られたハイブリドーマクローンを培養し、培養上清からＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて抗体Ｎｏ．３０、抗体Ｎｏ．３３、抗体Ｎｏ．３６、抗体Ｎｏ．３７を精製した。アイソタイプは、モノクローナル抗体アイソタイピングキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて決定した。その結果、抗体Ｎｏ．３０のアイソタイプは、ＩｇＧ２ｂ、κであった。また、抗体Ｎｏ．３３、抗体Ｎｏ．３６及び抗体Ｎｏ．３７のアイソタイプは、ＩｇＧ１、κであった。【００９１】
実施例１４：抗体Ｎｏ．３０、抗体Ｎｏ．３３のＨＤＸ−ＭＳによるエピトープマップ
１０μＭのｒｈＡＰＯＡ４−Ｈｉｓ、及びｒｈＡＰＯＡ４−Ｈｉｓに約１０μＭの抗体Ｎｏ．３０又は抗体Ｎｏ．３３を加えて混合した溶液を、ＰＢＳ重水素溶液で２０倍に希釈し、重水素化反応を開始した。コントロールとしてはＰＢＳ溶液を用いた。
２３℃で１分間、１０分間、６０分間、２４０分間置いた後、等量の冷却した２Ｍグアニジン塩酸を含む５００ｍＭＴＣＥＰ溶液（ｐＨ３以下）を添加し、反応を停止させた。反応溶液をペプシンカラムで消化後、Ｃ１８カラムを用いて逆相液体クロマトグラフィーによりペプチドを分離溶出し、質量分析計でＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定を行った。
質量データからｒｈＡＰＯＡ４−Ｈｉｓ由来の各ペプチドを同定し、各反応時間における重水素交換量を質量値から算出した。抗体の有無により重水素交換量に変化が見られたペプチドを推定エピトープ領域として抽出した。その結果、抗体Ｎｏ．３０については、配列番号２で表されるアミノ酸配列の８９番目〜１１０番目のアミノ酸配列、及び２００番目〜２２４番目のアミノ酸配列、抗体Ｎｏ．３３については、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１２２番目〜１４４番目のアミノ酸配列、１５６番目〜１７７番目のアミノ酸配列、及び２４２番目〜２５２番目のアミノ酸配列を含むペプチドに顕著な重水素化の抑制が観測された。【００９２】
この結果から、抗体Ｎｏ．３０のエピトープは、配列番号２で表されるアミノ酸配列の８９番目〜１１０番目のアミノ酸配列、及び２００番目〜２２４番目のアミノ酸配列であると同定された。また、抗体Ｎｏ．３３のエピトープは、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１２２番目〜１４４番目のアミノ酸配列、１５６番目〜１７７番目のアミノ酸配列、及び２４２番目〜２５２番目のアミノ酸配列であると同定された。
それらの同定されたペプチドを報告されているＡＰＯＡ４ダイマーのＸ線結晶構造にマッピングしたところ、抗体Ｎｏ．３０と抗体Ｎｏ．３３のエピトープペプチドは、それぞれ立体構造上1か所のエピトープ領域を構成し、そのエピトープ部位は、抗体Ｎｏ．３０と抗体Ｎｏ．３３では異なっていることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明によれば、検体中のＡＰＯＡ４を正確に測定できる抗ＡＰＯＡ４モノクローナル抗体又はその抗体フラグメント、及び該モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントを用いるＡＰＯＡ４の免疫学的測定方法、及び該モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントを含むＡＰＯＡ４測定用キットが提供される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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