(57)【要約】  本発明は、分子インプリンティング技術において標的分子が有していた表面情報を正確に受け継ぐことができる、標的分子のポリマーレプリカを提供する。少なくとも結合性基ＢＧ１及び結合性基ＢＧ２を含む複数種の結合性基を表面に有する標的物質のポリマーレプリカであって、前記標的物質を鋳型とする第１分子インプリントポリマーを鋳型とする第２分子インプリントポリマーで構成されており、前記ポリマーレプリカが、その表面において、前記標的物質の表面の前記結合性基ＢＧ１の位置に応じた位置に結合性基ｂｇ１、及び前記結合性基ＢＧ２の位置に応じた位置に結合性基ｂｇ２を少なくとも有する、標的物質のポリマーレプリカは、標的分子が有していた表面情報を正確に受け継いでいるため、標的物質の特異的認識部位を有する分子インプリントポリマー合成時の鋳型として使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも結合性基ＢＧ１及び結合性基ＢＧ２を含む複数種の結合性基を表面に有する標的物質のポリマーレプリカであって、前記標的物質を鋳型とする第１分子インプリントポリマーを鋳型とする第２分子インプリントポリマーで構成されており、
前記ポリマーレプリカが、その表面において、前記標的物質の表面の前記結合性基ＢＧ１の位置に応じた位置に結合性基ｂｇ１、及び前記結合性基ＢＧ２の位置に応じた位置に結合性基ｂｇ２を少なくとも有する、標的物質のポリマーレプリカ。
【請求項２】
基板と、前記基板の表面上に設けられた、凸部を有するポリマー膜とを更に含み、
前記凸部が、前記第２分子インプリントポリマーで構成されている、請求項１に記載の標的物質のポリマーレプリカ。
【請求項３】
前記標的物質がタンパク質であり、
前記結合性基ＢＧ１及び結合性基ＢＧ２が、カルボキシル基、アミノ基及び糖基の少なくとも２種であり、
前記結合性基ｂｇ１及び結合性基ｂｇ２が、カルボキシル基、チオール基及び糖基の少なくとも２種である、請求項１又は２に記載の標的物質のポリマーレプリカ。
【請求項４】
複数種の結合性基を表面に有する標的物質に、前記結合性基のうちの少なくとも結合性基ＢＧ１を介して、ビニル基及び可逆的連結基ＲＶ１を有する機能性モノマーＦＭ１を結合させる工程１と、
基板Ｓ１上に、前記結合性基のうちの結合性基ＢＧ２を反応させ、可逆的連結基ＲＶ２を介して前記標的物質を固定する工程２と、
前記基板Ｓ１上でビニルモノマーを添加し、前記ビニル基と共重合させることで分子インプリンティングを行う工程３と、
前記可逆的連結基ＲＶ１及び可逆的連結基ＲＶ２を切断して前記標的物質を除去することにより、前記標的物質を鋳型とする凹部と前記凹部表面に切断残基である結合性基ｂｇ１’及び結合性基ｂｇ２’とを含む第１分子インプリントポリマーを得る工程４と、
前記第１分子インプリントポリマーの結合性基ｂｇ１’と結合性基ｂｇ２’とに、それぞれ、前記結合性基ｂｇ１’と反応して可逆的連結基ＲＶ１を形成する反応性基及びビニル基を有する機能性モノマーＦＭ５１と、前記結合性基ｂｇ２’と反応して可逆的連結基ＲＶ２を形成する反応性基及びビニル基を有する機能性モノマーＦＭ５２を反応させる工程５と、
前記第１分子インプリントポリマー上にビニルモノマーを添加し、前記機能性モノマーＦＭ５１，ＦＭ５２の前記ビニル基と共重合させることで分子インプリンティングを行う工程６と、
前記可逆的連結基ＲＶ１及び前記可逆的連結基ＲＶ２を切断して前記第１分子インプリントポリマーを除去することにより、切断残基である結合性基ｂｇ１及び結合性基ｂｇ２を有する第２分子インプリントポリマーを得る工程７と、を含む、標的物質のポリマーレプリカの製造方法。
【請求項５】
前記工程６において、前記第１分子インプリントポリマー上に前記ビニルモノマーを添加し、前記ビニルモノマーを介して基板Ｓ２を積層し、前記機能性モノマーＦＭ５１，ＦＭ５２の前記ビニル基と共重合させることで分子インプリンティングを行い、
前記工程７において、前記可逆的連結基ＲＶ１及び前記可逆的連結基ＲＶ２を切断して前記第１分子インプリントポリマーを除去することにより、基板Ｓ２と、前記基板Ｓ２の表面上に切断残基である結合性基ｂｇ１及び結合性基ｂｇ２を有する第２分子インプリントポリマーを得る、請求項４に記載の標的物質のポリマーレプリカの製造方法。
【請求項６】
前記標的物質がタンパク質であり、
前記工程３において、前記ビニルモノマーが、塩基性基及びビニル基を有する機能性モノマーＦＭ３を含み、
前記工程６において、前記ビニルモノマーが、酸性基ｂｇ３及びビニル基を有する機能性モノマーＦＭ６を含む、請求項４に記載の標的物質のポリマーレプリカの製造方法。
【請求項７】
前記結合性基ＢＧ１がアミノ基である、請求項４〜６のいずれかに記載の標的物質のポリマーレプリカの製造方法。
【請求項８】
前記可逆的連結基ＲＶ１がジスルフィド基であり、前記結合性基ｂｇ１がチオール基である、請求項４〜７のいずれかに記載の標的物質のポリマーレプリカの製造方法。
【請求項９】
前記タンパク質が糖複合体であり、
前記結合性基ＢＧ２が糖基、前記可逆的連結基ＲＶ２がボロン酸ｃｉｓジオールエステル基、前記結合性基ｂｇ２がボロン酸基である、請求項４〜８のいずれかに記載の標的物質のポリマーレプリカの製造方法。
【請求項１０】
請求項４〜９のいずれかに記載の標的物質のポリマーレプリカの製造方法によって得られる、標的物質のポリマーレプリカ。
【請求項１１】
請求項２の標的物質のポリマーレプリカ又は請求項５〜９のいずれかに記載の標的物質のポリマーレプリカの製造方法によって得られる標的物質のポリマーレプリカの、前記基板上の第２分子インプリントポリマー表面で、前記結合性基ｂｇ１と結合性基ｂｇ２とに、それぞれ、前記結合性基ｂｇ１と反応して可逆的連結基ＲＶ１を形成する反応性基及びビニル基を有する機能性モノマーＦＭ１１１と、前記結合性基ｂｇ２と反応して可逆的連結基ＲＶ２を形成する反応性基及びビニル基を有する機能性モノマーＦＭ１１２を反応させる工程１１と、
前記基板上の第２分子インプリントポリマーにビニルモノマーを添加し、前記ビニルモノマーを介して基板Ｓ３を積層し、前記機能性モノマーＦＭ１１１，ＦＭ１１２の前記ビニル基と共重合させることで分子インプリンティングを行う工程１２と、
前記可逆的連結基ＲＶ１及び前記可逆的連結基ＲＶ２を切断して前記標的物質のポリマーレプリカ基板を剥離することにより、基板Ｓ３と、前記第２分子インプリントポリマーを鋳型とする凹部と、前記凹部表面に切断残基である結合性基ｂｇ１’及び結合性基ｂｇ２’を有する第３分子インプリントポリマーを得る工程１３と、
前記結合性基ｂｇ１’及び結合性基ｂｇ２’の少なくともいずれかに、結合性基ＢＧ１及び結合性基ＢＧ２の少なくともいずれかと相互作用するポストインプリンティング化合物及び／又はシグナル物質を結合させる工程１４と、
を含む、基板センサの製造方法。
【請求項１２】
前記標的物質がタンパク質であり、
前記工程１２において、前記ビニルモノマーが、塩基性基及びビニル基を有する機能性モノマーＦＭ１２を含む、請求項１１に記載の基板センサの製造方法。
【請求項１３】
前記結合性基ＢＧ１がアミノ基である、請求項１１又は１２に記載の基板センサの製造方法。
【請求項１４】
前記可逆的連結基ＲＶ１がジスルフィド基であり、前記結合性基ｂｇ１’がチオール基である、請求項１１〜１３のいずれかに記載の基板センサの製造方法。
【請求項１５】
前記タンパク質が糖複合体であり、
前記結合性基ＢＧ２が糖基、前記可逆的連結基ＲＶ２がボロン酸ｃｉｓジオールエステル基、前記結合性基ｂｇ２’がボロン酸基である、請求項１１〜１４のいずれかに記載の基板センサの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的物質のポリマーレプリカ基板及びその製造方法、並びに基板センサの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）は、標的分子を鋳型とし、その周囲にモノマー分子を集積させるとともに架橋剤によって共重合し、共重合後、鋳型である標的分子を洗い出すことによって作製される人工高分子である。ＭＩＰには、鋳型による分子インプリント空間が形成されており、この空間が標的分子を特異的に認識することを利用して、抗体に代わる人工材料として期待されている。【０００３】
分子インプリントポリマーを作製する具体的な例として、例えば特許文献１に、標的タンパク質に対する特異的認識空間を有する分子インプリントポリマーを製造するための方法であって、上記標的タンパク質を構成する分子の反応性基（１）を介して、末端にビニルモノマー基を有し且つ末端以外の部分に切断性基（１）を有する機能性モノマー（Ｉ）を複数結合させる工程（ここで、上記切断性基（１）は、ジスルフィド結合基、イミノ結合基、ボロン酸ｃｉｓジオールエステル基、またはカルボン酸エステル基を示す）；上記標的タンパク質を構成する分子の反応性基（２）を介して、末端にビニルモノマー基を有し且つ末端以外の部分に切断性基（２）を有する機能性モノマー（ＩＩ）を複数結合させる工程（ここで、上記切断性基（２）は、ジスルフィド結合基、イミノ結合基、ボロン酸ｃｉｓジオールエステル基、またはカルボン酸エステル基であって、上記切断性基（１）とは異なる基を示す）；基材上に自己組織化単分子膜を形成する工程；上記自己組織化単分子膜の表面へ、上記標的タンパク質を結合させる工程；ビニルモノマーを添加し、上記機能性モノマー（Ｉ）および上記機能性モノマー（ＩＩ）のビニルモノマー基と共重合させる工程；少なくとも上記切断性基（１）および切断性基（２）を切断することにより、上記標的タンパク質を除去する工程；上記切断性基（１）を切断することにより生成する基に、上記反応性基（１）と相互作用するポストインプリンティング化合物を複数結合させるか、または、上記切断性基（２）を切断することにより生成する基に、上記反応性基（２）と相互作用するポストインプリンティング化合物を複数結合させる工程；および、  上記切断性基（１）を切断することにより生成する基または上記切断性基（２）を切断することにより生成する基であって、上記ポストインプリンティング化合物を結合させなかった基に、蛍光レポーター化合物を複数結合させる工程を含むことを特徴とする方法が記載されている。このように作製された、標的タンパク質に対する特異的認識空間を有する分子インプリントポリマーは、基板センサ等として利用することが期待される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１７−１９９９２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＭＩＰの作製時には、鋳型として、精製された標的分子が必要となる。しかしながら、標的分子は一般的に高価であり入手困難性が高い。そうでありながら、標的分子は、不安定なだけでなく、鋳型としてＭＩＰの合成に供された後には、除去される工程で分解等の処理を受けるため、使い捨てにされるのが通常である。このため、センサ基板の製造効率は極めて悪く、標的分子のＭＩＰによる基板センサ自体が希少且つ高価となるため、量産には遠く及ばない。【０００６】
本発明者は、鋳型としての標的分子を節約するため、分子インプリンティング技術を用いて標的分子のポリマーレプリカを得て、このようなポリマーレプリカを標的分子に見立て、人工鋳型として利用する手法に着眼した。【０００７】
標的分子のポリマーレプリカは、具体的には、標的分子を鋳型として作製されたＭＩＰ（第１インプリントポリマー）が有する凹状の分子インプリンティング空間をさらなる分子インプリンティングの鋳型として利用し、当該さらなる分子インプリンティングにより凸状のＭＩＰ（第２インプリントポリマー）として得ることが考えられる。【０００８】
しかしながら、ポリマーレプリカを鋳型としてさらに分子インプリンティングを行って基板センサを作製したとしても、ＭＩＰを鋳型とする分子インプリンティングが繰り返されることで、元の標的分子が有していた表面情報（官能基の位置情報と定性的情報）はもはや正確には受け継がれなくなる。このため、最終的に、ポリマーレプリカを鋳型として作製した基板センサの感度は悪くなる。【０００９】
そこで、本発明は、分子インプリンティング技術において標的分子が有していた表面情報（官能基の位置情報と定性的情報）を正確に受け継ぐことができる、標的分子のポリマーレプリカを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は鋭意検討の結果、繰り返される分子インプリンティングの鋳型となる対象それぞれにおいて、先に、表面情報の要となる結合性基に可逆的連結基を介してビニル基を導入しておき、その後の分子インプリンティング工程で、鋳型側に導入したビニル基とモノマーを共重合させることで、ＭＩＰに鋳型の表面情報（官能基の位置情報と定性的情報）を正確に模倣できることを見出した。本発明は、この知見に基づき、さらに検討を重ねることにより完成された。すなわち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。【００１１】
項１．  少なくとも結合性基ＢＧ１及び結合性基ＢＧ２を含む複数種の結合性基を表面に有する標的物質のポリマーレプリカであって、前記標的物質を鋳型とする第１分子インプリントポリマーを鋳型とする第２分子インプリントポリマーで構成されており、
前記ポリマーレプリカが、その表面において、前記標的物質の表面の前記結合性基ＢＧ１の位置に応じた位置に結合性基ｂｇ１、及び前記結合性基ＢＧ２の位置に応じた位置に結合性基ｂｇ２を少なくとも有する、標的物質のポリマーレプリカ。
項２．  基板と、前記基板の表面上に設けられた、凸部を有するポリマー膜とを更に含み、
前記凸部が、前記第２分子インプリントポリマーで構成されている、項１に記載の標的物質のポリマーレプリカ。
項３．  前記標的物質がタンパク質であり、
前記結合性基ＢＧ１及び結合性基ＢＧ２が、カルボキシル基、アミノ基及び糖基の少なくとも２種であり、
前記結合性基ｂｇ１及び結合性基ｂｇ２が、カルボキシル基、チオール基及び糖基の少なくとも２種である、項１又は２に記載の標的物質のポリマーレプリカ。
項４．  複数種の結合性基を表面に有する標的物質に、前記結合性基のうちの少なくとも結合性基ＢＧ１を介して、ビニル基及び可逆的連結基ＲＶ１を有する機能性モノマーＦＭ１を結合させる工程１と、
基板Ｓ１上に、前記結合性基のうちの結合性基ＢＧ２を反応させ、可逆的連結基ＲＶ２を介して前記標的物質を固定する工程２と、
前記基板Ｓ１上でビニルモノマーを添加し、前記ビニル基と共重合させることで分子インプリンティングを行う工程３と、
前記可逆的連結基ＲＶ１及び可逆的連結基ＲＶ２を切断して前記標的物質を除去することにより、前記標的物質を鋳型とする凹部と前記凹部表面に切断残基である結合性基ｂｇ１’及び結合性基ｂｇ２’とを含む第１分子インプリントポリマーを得る工程４と、
前記第１分子インプリントポリマーの結合性基ｂｇ１’と結合性基ｂｇ２’とに、それぞれ、前記結合性基ｂｇ１’と反応して可逆的連結基ＲＶ１を形成する反応性基及びビニル基を有する機能性モノマーＦＭ５１と、前記結合性基ｂｇ２’と反応して可逆的連結基ＲＶ２を形成する反応性基及びビニル基を有する機能性モノマーＦＭ５２を反応させる工程５と、
前記第１分子インプリントポリマー上にビニルモノマーを添加し、前記機能性モノマーＦＭ５１，ＦＭ５２の前記ビニル基と共重合させることで分子インプリンティングを行う工程６と、
前記可逆的連結基ＲＶ１及び前記可逆的連結基ＲＶ２を切断して前記第１分子インプリントポリマーを除去することにより、切断残基である結合性基ｂｇ１及び結合性基ｂｇ２を有する第２分子インプリントポリマーを得る工程７と、を含む、標的物質のポリマーレプリカの製造方法。
項５．  前記工程６において、前記第１分子インプリントポリマー上に前記ビニルモノマーを添加し、前記ビニルモノマーを介して基板Ｓ２を積層し、前記機能性モノマーＦＭ５１，ＦＭ５２の前記ビニル基と共重合させることで分子インプリンティングを行い、
前記工程７において、前記可逆的連結基ＲＶ１及び前記可逆的連結基ＲＶ２を切断して前記第１分子インプリントポリマーを除去することにより、基板Ｓ２と、前記基板Ｓ２の表面上に切断残基である結合性基ｂｇ１及び結合性基ｂｇ２を有する第２分子インプリントポリマーを得る、項４に記載の標的物質のポリマーレプリカの製造方法。
項６．  前記標的物質がタンパク質であり、
前記工程３において、前記ビニルモノマーが、塩基性基及びビニル基を有する機能性モノマーＦＭ３を含み、
前記工程６において、前記ビニルモノマーが、酸性基ｂｇ３及びビニル基を有する機能性モノマーＦＭ６を含む、項４に記載の標的物質のポリマーレプリカの製造方法。
項７．  前記結合性基ＢＧ１がアミノ基である、項４〜６のいずれかに記載の標的物質のポリマーレプリカの製造方法。
項８．  前記可逆的連結基ＲＶ１がジスルフィド基であり、前記結合性基ｂｇ１がチオール基である、項４〜７のいずれかに記載の標的物質のポリマーレプリカの製造方法。
項９．  前記タンパク質が糖複合体であり、
前記結合性基ＢＧ２が糖基、前記可逆的連結基ＲＶ２がボロン酸ｃｉｓジオールエステル基、前記結合性基ｂｇ２がボロン酸基である、項４〜８のいずれかに記載の標的物質のポリマーレプリカの製造方法。
項１０．  項４〜９のいずれかに記載の標的物質のポリマーレプリカの製造方法によって得られる、標的物質のポリマーレプリカ。
項１１．  項２の標的物質のポリマーレプリカ又は項５〜９のいずれかに記載の標的物質のポリマーレプリカの製造方法によって得られる標的物質のポリマーレプリカの、前記基板上の第２分子インプリントポリマー表面で、前記結合性基ｂｇ１と結合性基ｂｇ２とに、それぞれ、前記結合性基ｂｇ１と反応して可逆的連結基ＲＶ１を形成する反応性基及びビニル基を有する機能性モノマーＦＭ１１１と、前記結合性基ｂｇ２と反応して可逆的連結基ＲＶ２を形成する反応性基及びビニル基を有する機能性モノマーＦＭ１１２を反応させる工程１１と、
前記基板上の第２分子インプリントポリマーにビニルモノマーを添加し、前記ビニルモノマーを介して基板Ｓ３を積層し、前記機能性モノマーＦＭ１１１，ＦＭ１１２の前記ビニル基と共重合させることで分子インプリンティングを行う工程１２と、
前記可逆的連結基ＲＶ１及び前記可逆的連結基ＲＶ２を切断して前記標的物質のポリマーレプリカ基板を剥離することにより、基板Ｓ３と、前記第２分子インプリントポリマーを鋳型とする凹部と、前記凹部表面に切断残基である結合性基ｂｇ１’及び結合性基ｂｇ２’を有する第３分子インプリントポリマーを得る工程１３と、
前記結合性基ｂｇ１’及び結合性基ｂｇ２’の少なくともいずれかに、結合性基ＢＧ１及び結合性基ＢＧ２の少なくともいずれかと相互作用するポストインプリンティング化合物及び／又はシグナル物質を結合させる工程１４と、
を含む、基板センサの製造方法。
項１２．  前記標的物質がタンパク質であり、
前記工程１２において、前記ビニルモノマーが、塩基性基及びビニル基を有する機能性モノマーＦＭ１２を含む、項１１に記載の基板センサの製造方法。
項１３．  前記結合性基ＢＧ１がアミノ基である、項１１又は１２に記載の基板センサの製造方法。
項１４．  前記可逆的連結基ＲＶ１がジスルフィド基であり、前記結合性基ｂｇ１’がチオール基である、項１１〜１３のいずれかに記載の基板センサの製造方法。
項１５．  前記タンパク質が糖複合体であり、
前記結合性基ＢＧ２が糖基、前記可逆的連結基ＲＶ２がボロン酸ｃｉｓジオールエステル基、前記結合性基ｂｇ２’がボロン酸基である、項１１〜１４のいずれかに記載の基板センサの製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、分子インプリンティング技術において標的分子が有していた表面情報を正確に受け継ぐことができる、標的分子のポリマーレプリカが提供される。さらに、当該標的分子のポリマーレプリカを人工鋳型として用いた分子インプリンティングによって、当該標的分子に対する感度が高い基板センサが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明における標的物質を模式的に示す。
【図２】本発明の標的分子のポリマーレプリカを模式的に示す。
【図３】本発明の標的分子のポリマーレプリカの製造方法における工程１を模式的に示す。
【図４】本発明の標的分子のポリマーレプリカの製造方法における工程２〜工程４を模式的に示す。
【図５】本発明の標的分子のポリマーレプリカの製造方法における工程５〜工程７を模式的に示す。
【図６】本発明の基板センサの製造方法を模式的に示す。
【図７】第１分子インプリントポリマー（鋳型として標的物質ＡＦＰを用いて作製）を用いたＳＰＲによるＡＦＰ検出において得られた、ＡＦＰ濃度に対するＳＰＲシグナル変化を示す吸着等温線を示す。
【図８】蛍光分子導入前の基板（比較例）及び導入後の基板（実施例；本発明の基板センサ）における蛍光強度の比較（ａ）、及び、第３分子インプリントポリマーを有する基板センサ（鋳型として第２分子インプリントポリマーを有するポリマーレプリカ基板を用いて作製）を用いた蛍光顕微鏡測定によるＡＦＰ検出において得られた、ＡＦＰ濃度に対する蛍光強度変化を示す吸着等温線（ｂ）を示す。
【図９】本発明の基板センサに対するタンパク質の選択的吸着試験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
［１．標的物質のポリマーレプリカ］
本発明の標的物質のポリマーレプリカは、標的物質の表面にある官能基情報（具体的には、官能基の位置情報と定性的情報）を模倣した合成ポリマー構造物である。図１に標的物質の例（具体的には、肝がんのバイオマーカーであるα−Ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＦＰ））を模式的に示し、図２（ａ）及び図２（ｂ）に、図１の標的物質のポリマーレプリカの例を模式的に示す。
【００１５】
標的物質は、複数種の結合性基を表面に有している物質であれば特に限定されない。また、本発明において、結合性基とは、共有結合又は非共有結合が可能な官能基をいう。非共有結合としては、水素結合、イオン結合、静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用などが挙げられる。標的物質が有している結合性基としては特に限定されないが、例えば、アミノ基等の塩基性基； cisジオール基を有する、単糖基、オリゴ糖基、多糖基等の糖基；チオール基；水酸基、フェノール性水酸基；カルボキシル基等の酸性基；エピトープ構造を有する抗原決定基；フェニル基、インドール基、イミダゾイル基等の芳香族基等が挙げられる。本発明においては、標的物質が有する結合性基を、結合性基ＢＧ１、結合性基ＢＧ２、結合性基ＢＧ３・・・と記載する。本発明においては、複数種の結合性基として、少なくとも結合性基ＢＧ１及び結合性基ＢＧ２を有する。本発明において、標的物質が有する結合性基と、当該標的物質が有する結合性基に対する結合性基と、両結合性基により形成される結合の種類との組み合わせの例を以下に挙げる。
【００１６】
【表１】
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【００１７】
標的物質の具体例としては、低分子物質及びタンパク質が挙げられる。低分子物質としては、医薬、農薬、環境ホルモン等が挙げられ、タンパク質としては、抗体、疾患マーカー、ワクチン、酵素等が挙げられる。なお、本発明において、タンパク質には、ペプチド、及び糖基が結合した糖タンパク質も包含するものとする。また、抗体には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、ＳｃＦｖ等も包含されるものとする。好ましい標的物質としてはタンパク質が挙げられる。標的物質がタンパク質である場合、アミノ酸残基の側鎖が上記の結合性基をなす。そのような場合の具体的な結合性基としては、リシン残基、Ｎ末端のアミノ基；アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、Ｃ末端のカルボキシ基；システイン残基のチオール基；セリン残基、トレオニン残基の水酸基；チロシン残基のフェノール性水酸基等が挙げられる。より好ましい標的物質としては糖タンパク質が挙げられる。標的物質がタンパク質である場合、さらに糖基（cisジオール基）が上記の結合性基をなす。
【００１８】
図１の標的物質であるＡＦＰは、結合性基として、結合性基ＢＧ１（この例ではアミノ基）、結合性基ＢＧ２（この例では糖基）、及び結合性基ＢＧ３（この例ではカルボキシル基）を有している。
【００１９】
図２（ａ）の標的物質のポリマーレプリカは、基板と一体化されている。つまり、基板上に凸部が設けられており、当該凸部が当該ポリマーレプリカとして機能するものである。具体的には、図２（ａ）に示す標的物質のポリマーレプリカは、基板Ｓ２と、基板Ｓ２の表面上に設けられた、凸部を有するポリマー膜とを含む。凸部（ポリマーレプリカ部）は、少なくとも結合性基ｂｇ１（この例ではチオール基）及び結合性基ｂｇ２（この例では糖基）を含む複数種の結合性基を表面に有する。図２（ａ）の例は、糖タンパク質ＡＦＰのポリマーレプリカであるため、さらに結合性基ｂｇ３（この例ではカルボキシル基）も表面に有する。なお、図２（ａ）の標的物質のポリマーレプリカには、一枚の基板Ｓ２に凸状のポリマーレプリカ部が複数形成されていることが好ましい。図２（ｂ）の標的物質のポリマーレプリカは、粒子状である。
【００２０】
ポリマーレプリカは、図１の標的物質を鋳型とする第１分子インプリントポリマーを鋳型とする第２分子インプリントポリマーで構成されている。つまり、ポリマーレプリカは、図１の標的物質を鋳型とする分子インプリンティングで得られるネガティブタイプの第１分子インプリントポリマーを得た後、その第１分子インプリントポリマー鋳型とする分子インプリンティングで得られるポジティブタイプの第２分子インプリントポリマーである。ポリマーレプリカをなす第２分子インプリントポリマーは、２回の分子インプリンティングを経た分子インプリントポリマーであることから、通常、標的物質の表面形状がおおよそ写し取られた、標的物質に似た形状を有する。
【００２１】
ポリマーレプリカは、その表面において、複数の結合性基を有する。本発明においては、ポリマーレプリカが有する結合性基を、結合性基ｂｇ１、結合性基ｂｇ２、結合性基ｂｇ３・・・と記載する。本発明においては、複数種の結合性基として、少なくとも結合性基ｂｇ１及び結合性基ｂｇ２を有する。図２（ａ）及び図２（ｂ）の例において、ポリマーレプリカは、標的物質の表面の結合性基ＢＧ１の位置に応じた位置に結合性基ｂｇ１を有し、結合性基ＢＧ２の位置に応じた位置に結合性基ｂｇ２を有し、結合性基ＢＧ３の位置に応じた位置に結合性基ｂｇ３を有する。
【００２２】
なお、結合性基ｂｇ１が結合性基ＢＧ１に応じた位置に存在するとは、仮に、標的物質と当該標的物質のポリマーレプリカとを空間上で重ね合わせたとすると、（i）結合性基ｂｇ１が空間上で結合性基ＢＧ１と同じ位置、又は略同じ位置（例えば、物質ｓが結合性ＢＧ１を介して標的物質に特異的結合するものである場合、物質ｓが結合性基ｂｇ１を介して同様にポリマーレプリカにも特異的結合できる程度に、結合性基の位置が同等であること）に存在するか、又は、（ii）結合性基ｂｇ１の空間上の位置が、結合性基ＢＧ１と同じでも略同じでもないが、結合性基ＢＧ１との間を、低分子化合物（たとえば、後述する、結合性基ＢＧ１と相互作用するポストインプリンティング化合物及び／又はシグナル物質）が介在する程度の距離を隔てた近傍の位置であることをいう。標的物質のポリマーレプリカが有する複数の結合性基のうち少なくとも一種は、標的物質の結合性基と同じ又は略同じ位置に存在する。
【００２３】
図２（ａ）及び図２（ｂ）に示すポリマーレプリカが有する結合性基ｂｇ１、結合性基ｂｇ２、結合性基ｂｇ３は、それぞれ、標的物質が有する結合性基ＢＧ１、結合性基ＢＧ２、結合性基ＢＧ３に対応する。ポリマーレプリカが有する結合性基は、標的物質が有する結合性基と同じ又は同種（例えば、単糖基、オリゴ糖基及び多糖基は、糖を基本構成としている点が共通するため同種の基とし、抗体基及びパラトープは、抗原認識部位を基本構成としている点が共通するため同種の基とする。）であってもよいし、異なっていてもよい。図２（ａ）及び図２（ｂ）の例においては、ポリマーレプリカが有する結合性基ｂｇ１はチオール基で、対応する結合性基ＢＧ１はアミノ基であり、ポリマーレプリカが有する結合性基ｂｇ２は単糖基で、対応する結合性基ＢＧ２は多糖基であり、ポリマーレプリカが有する結合性基ｂｇ３はカルボキシル基で、対応する結合性基ＢＧ３はカルボキシル基である。
【００２４】
つまり、ポリマーレプリカはその表面に、対応する標的物質が有する官能基の位置に応じた位置に、標的物質が有する官能基の種類に応じた種類の官能基を有する。つまり、標的物質の表面にある官能基情報（具体的には、官能基の位置情報と定性的情報）が正確に模倣されている。
【００２５】
このように、ポリマーレプリカは、標的物質の表面にある官能基情報が正確に模倣されているため、それ自体が、標的物質の分子認識材料を作製するための分子インプリンティングにおける鋳型として有用となる。つまり、生体物質である標的物質自体を鋳型に用いなくとも、当該標的物質の分子認識材料を作製することが可能になる。また、ポリマーレプリカは合成ポリマー材料であるため、化学的安定性及び物理的安定性に極めて優れており、鋳型としての有用性は生体物質である標的物質と比べて格段に向上する。さらに、ポリマーレプリカは安価に製造できるうえに鋳型として再利用が可能であり、一般的に高価で希少な生体物質である標的物質を鋳型に用いる場合と比べてコスト性も各段に向上する。
【００２６】
ポリマーレプリカの構成要素及びポリマーレプリカの製造方法については、次の「２．標的物質のポリマーレプリカの製造方法」で詳述する。
【００２７】
［２．標的物質のポリマーレプリカの製造方法］
図３〜図５を参照して、本発明のポリマーレプリカの製造方法について説明する。本発明のポリマーレプリカの製造方法は、標的物質を鋳型とする第１分子インプリントポリマー（１ｓｔ ＭＩＰ）を作製する工程１〜工程４と、第１分子インプリントポリマーを鋳型とする第２分子インプリントポリマー（２ｎｄ ＭＩＰ）つまりポリマーレプリカ部分を作製する工程５〜７とを含む。
【００２８】
［工程１：標的物質へのビニル基の導入］
工程１では、複数種の結合性基を表面に有する標的物質に、前記結合性基のうちの少なくとも結合性基ＢＧ１を介して、ビニル基及び可逆的連結基ＲＶ１を有する機能性モノマーＦＭ１を結合させる。これによって、標的物質の少なくとも結合性基ＢＧ１に、可逆的連結基ＲＶ１を介してビニル基が導入される。図示された態様では、標的物質であるＡＦＰの側鎖アミノ基（結合性基ＢＧ１）に対して、ビニル基及びジスルフィド基（可逆的連結基ＲＶ１）を有する機能性モノマーＦＭ１が導入される。
【００２９】
機能性モノマーＦＭ１は、具体的には、例えば以下の構造を有する。
Ｗ−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｑ1・・・  （Ｉ）
【００３０】
上記式中、Ｗはビニルモノマー基を示す。ビニルモノマー基は、分子インプリントポリマーを形成するための他のビニルモノマーと共重合が可能であるものであれば特に制限されないが、例えば、ビニル基、メチルビニル基、クロロビニル基、（メタ）アクリル酸エステル基、メタクリル酸エステル基等が挙げられる。好ましくは（メタ）アクリル酸エステル基、より好ましくは図示されるようなメタクリル酸エステル基が挙げられる。
【００３１】
ＸおよびＺは、独立して、単結合またはリンカー基を示す。特に、得られる標的物質のポリマーレプリカ基板において、標的物質の結合性基（例えば結合性基ＢＧ１）の位置に応じた位置に結合している結合性基（例えば結合性基ｂｇ１）が、結合性基ＢＧ１とは異種の結合性基である場合、Ｚはリンカー基であることが好ましい。この場合、後述の、標的物質のポリマーレプリカ基板から基板センサを作製する方法において、結合性基ｂｇ１’と、検出すべき標的物質の結合性基ＢＧ１がアプローチする位置との間にスペースを生じさせることができ、このスペースにより、結合性基ｂｇ１’に結合させられる物質（具体的には、後述の工程１４で述べるポストインプリンティング化合物及び／又はシグナル物質）の配設空間を容易に確保することができる。
【００３２】
リンカー基としては、例えば、炭素数１〜６、好ましくは２〜６のアルキレン基、アミノ基（−ＮＨ−）、エーテル基（−Ｏ−）、カルボニル基（−Ｃ（＝Ｏ）−）、エステル基（−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−または−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−）、アミド基（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−または−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−）、スルホキシド基（−Ｓ（＝Ｏ）−）、スルホニル基（−Ｓ（＝Ｏ）2−）、およびこれら２以上が結合した基が挙げられる。２以上の上記基が結合して上記リンカー基が構成されている場合、当該結合数としては、５以下または４以下が好ましく、３以下または２がより好ましい。リンカー基としては、好ましくは図示されるようなアルキレン基が挙げられる。
【００３３】
Ｙは、可逆的連結基を示す。なお、本発明においては、一般的に、可逆的連結基は切断（開裂）及び結合が可逆的である二価以上の基を意味し、可逆的部分の結合様式は、共有結合及び非共有結合を問わない。可逆的連結基の具体例としては、後述の表２第１欄の基が挙げられる。しかしながら、機能性モノマーＦＭ１においては、Ｙで示される可逆的連結基は、可逆的部分の結合様式が共有結合であるもの、つまり、共有結合の切断（開裂）及び共有結合が可逆的である二価以上の基を意味する。具体的には、後述の表２第１欄の基のうち、可逆部分の結合様式が共有結合であるものが挙げられる。このような可逆的連結基は、水素結合など非共有結合に比べて比較的安定であり、重合反応時にも安定的に維持され、特異的認識空間の形成に寄与する一方で、比較的切断され易いことから、重合反応後における鋳型化合物の除去が容易でもある。また、可逆的連結基は、例えば、還元剤、比較的低温での加熱、比較的穏和な条件での加水分解、光照射などで切断することができる。例えばカルボン酸エステル基は、タンパク質を構成するアミド結合よりも切断され易く、比較的穏和な条件での加水分解により選択的に切断することができ、また、カルボン酸エステル基の中でもｏ−ニトロベンジルエステル基は、光照射でも選択的な切断が可能である。
【００３４】
なお、本発明においては、一般的に、可逆的連結基を、可逆的連結基ＲＶ１、可逆的連結基ＲＶ２、可逆的連結基ＲＶ３・・・と記載し、可逆的連結基ＲＶ１、可逆的連結基ＲＶ２、可逆的連結基ＲＶ３・・・に対して、それら可逆的連結基の切断によって生じる切断残基を、それぞれ、結合性基ｂｇ１及び結合性基ｂｇ１’、結合性基ｂｇ２及び結合性基ｂｇ２’、結合性基ｂｇ３及び結合性基ｂｇ３’・・・と記載する。本発明において、可逆的連結基、可逆的連結基の切断により生じる切断残基（結合性基）の組み合わせの例と、可逆部分の結合の様式とを以下に挙げる。
【００３５】
【表２】
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【００３６】
Ｑ1は、結合性基ＢＧ１に対する結合性基を示す。結合性基ＢＧ１に対する結合性基は、結合性基ＢＧ１と共有結合を形成可能な基を、結合性基ＢＧ１の種類に応じて、当業者が適宜決定することができる。結合性基ＢＧ１に対する結合性基の具体例は、上述の表１中欄の例示のうち、結合性基ＢＧ１と共有結合を形成する基から選択することができる。また、標的物質の結合性基がカルボキシル基である場合は、予め、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ニトロフェノール、ペンタフルオロフェノールなどを用いて活性エステル化することで共有結合性基に改変しておいてもよい。図示された態様では、結合性基ＢＧ１に対する結合性基として、カルボン酸活性エステル基（Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウムによる活性エステル基）を用いる。
【００３７】
標的物質の結合性基ＢＧ１と機能性モノマーＦＭ１との反応は、公知の方法により行うことができる。例えば、標的物質の結合性基がアミノ基である場合、機能性モノマーＦＭ１の結合性基がカルボン酸エステル基であれば、標的物質と機能性モノマーＦＭ１とを混合することで反応させればよいし、機能性モノマーＦＭ１の結合性基がカルボン酸であれば、標的物質と機能性モノマーＦＭ１を、アミド結合を形成するための脱水縮合剤存在下で反応させればよい。
【００３８】
［工程２：基板への標的物質の固定］
工程２では、基板Ｓ１上に標的物質を固定する。標的物質は、標的物質の結合性基のうち、工程１でビニル基の導入に用いた結合性基とは異なる結合性基（図示された例では、結合性基ＢＧ２）を基板Ｓ１上で反応させ、可逆的連結基ＲＶ２を介して基板Ｓ１上に固定させられる。基板Ｓ１上には予め表面修飾基を結合させることで表面修飾を行っておき、表面修飾基の末端に存在する結合性基と、標的物質の結合性基ＢＧ２との間の結合性を利用して、標的物質を固定することができる。例えば、図示されるように、基板Ｓ１上に予め自己組織化単分子膜（ＳＡＭ：Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）を形成しておき、ＳＡＭ末端（ＳＡＭ表面）の結合性基と、標的物質の結合性基ＢＧ２との間の結合性を利用して、標的物質を固定することが好ましい。ＳＡＭは、基板Ｓ１へ化学結合していると共に、基板Ｓ１上に分子が分子間力により密に且つ規則的に整列していることから、安定で均一である。
【００３９】
表面修飾される基板Ｓ１の材質としては、表面修飾基を有する表面修飾試薬と反応するものであれば特に制限されず、金属、ガラス、樹脂などが挙げられる。例えばＳＡＭを形成するための基板Ｓ１を構成する金属としては、金が汎用されているが、銀、銅、白金、パラジウムなども用いることができる。また、ガラス基板又はテフロン（登録商標）基板上にこれら金属の薄膜を形成したものも金属基板として利用可能である。また、後述の表面プラズモン共鳴測定法や水晶振動子マイクロバランス法などの測定方法に適した金属基板が市販されているため、このような市販の金属基板を用いてもよい。また、樹脂としては、ポリ（メタ）アクリレート、ポリスチレン、ＡＢＳ（アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体）、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリウレタン、シリコーン樹脂、フッ素樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂等が挙げられる。
【００４０】
ＳＡＭのような表面修飾を形成するための表面修飾試薬としては、基板Ｓ１表面に対する結合性基（例えば、基板Ｓ１が金属基板の場合、金属基板表面と結合可能なチオール基または酢酸チオエステル基が挙げられる）を一方の端部に有し、標的物質の結合性基ＢＧ２に対する結合性基を他端に有する、炭素数８以上の直鎖アルカンが挙げられる。当該他端における、標的物質の結合性基ＢＧ２に対する結合性基の具体例は、表１中欄に例示される基から選択することができる。なお、ＳＡＭのような表面修飾を形成するための表面修飾試薬として、さらに、基板Ｓ１表面に対する結合性基を一方の端部に有し、重合開始基を他端に有する、炭素数８以上の直鎖アルカンを混合してもよい。この場合、重合開始基は、後述の工程３における共重合反応における重合開始剤として機能する。以下において、基板Ｓ１表面の表面修飾としてＳＡＭを形成する場合を代表して説明する。
【００４１】
標的分子が糖タンパク質である場合は、図示されるように基板Ｓ１への固定のための結合性基ＢＧ２として糖基を用い、基板Ｓ１上にはボロン酸基を固定しておくことが好ましい。また、標的分子がタンパク質又は糖タンパク質である場合は、基板Ｓ１への固定のための結合性基ＢＧ２として当該標的分子のエピトープを用い、基板Ｓ１上には当該エピトープに対するパラトープを固定しておくことが好ましい。これらの場合、基板Ｓ１上に固定される複数の標的分子の向きが揃う点で好ましい。
【００４２】
基板Ｓ１として金属基板を用いる場合、金属基板上へのＳＡＭの形成は、常法に従えばよい。例えば、ＳＡＭ形成分子をエタノールなどに溶解し、得られた溶液に金属基板を常温で所定時間（例えば３０分間以上４８時間程度以下）浸漬すれば、当該分子がチオエーテル結合を介して金属基板表面に結合し、且つ分子間力により配向しつつ密に集合し、ＳＡＭが形成される。或いは、上記工程１において例示したリンカー基を介して、ＳＡＭ形成分子を段階的に延長してもよい。その場合には、標的タンパク質の固定に利用する結合性基を最終末端に導入するようにし、同様に、ＳＡＭ末端基として結合性基に加えて重合開始基も設ける場合は、重合開始基を最終末端に導入するようにすればよい。次いで、過剰のＳＡＭ形成分子を洗浄により除去した後、乾燥すればよい。
【００４３】
また、基板Ｓ１としてガラス基板を用いる場合には、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）などのシランカップリング剤で表面にアミノ基などの反応性基を導入することにより、ＳＡＭの形成が可能である。
【００４４】
ＳＡＭの形成後、ＳＡＭ末端の結合性基に標的物質の結合性基ＢＧ２を反応させることで、標的物質を基板Ｓ１上に固定する。ＳＡＭと、固定化された標的物質との間には、可逆的連結基ＲＶ２を介在させる。可逆的連結基ＲＶ２により、後記の工程４において、第１分子インプリントポリマーからの標的物質の除去が可能になる。可逆的連結基ＲＶ２の具体例としては、上述の表２の第１欄から選択することができる。
【００４５】
可逆的連結基ＲＶ２は、ＳＡＭと標的物質との間のリンカー基中に含まれていてもよいが、ＳＡＭ末端の結合性基と標的物質の結合性基ＢＧ２との反応の結果形成されるものであってもよい。好ましくは、ＳＡＭ末端の結合性基と標的物質の結合性基ＢＧ２との反応の結果形成されるものである。具体的には、図示されるように、ＳＡＭ末端の結合性基としてボロン酸基を導入しておき、標的物質を構成する結合性基ＢＧ２である糖基と反応させることで、可逆的連結基ＲＶ２であるボロン酸ｃｉｓジオールエステル基を形成することができる。あるいは、ＳＡＭの末端にチオール基または活性チオール基を導入し、標的物質のシステイン由来のチオール基、又はリンカー基導入試薬により導入されたチオール基を反応させることで、可逆的連結基ＲＶ２としてジスルフィド結合を形成することもできる。
【００４６】
なお、基板Ｓ１と固定された標的物質との間に介在する可逆的連結基ＲＶ２は、工程１でビニル基とともに導入した可逆的連結基ＲＶ１と、同じであってもよいし異なっていてもよい。
【００４７】
標的物質の固定にかかる反応条件は、基板Ｓ１上の結合性基と標的物質の結合性基ＢＧ２との組み合わせに応じて、当業者が適宜選択することができる。例えば、ＳＡＭ末端の結合性基がボロン酸基、標的物質における結合性基ＢＧ２が糖基である場合や、ＳＡＭ末端の結合性基がピリジルジスルフィド基、標的物質における結合性基ＢＧ２がチオール基である場合等は、反応が容易であるため、溶媒中、基板Ｓ１と標的物質とを接触させることで反応を進行させることができる。
【００４８】
あるいは、工程２において、例えば、ＳＡＭ末端の結合性基がパラトープ、標的物質における結合性基ＢＧ２がエピトープである場合のように、分子間特異的相互作用を利用して標的物質を基板Ｓ１に固定させる場合には、例えば、当該相互作用が有効となるような緩衝液中で基板Ｓ１と標的物質とを接触させればよい。
【００４９】
標的物質の固定の確認は、例えば、基板Ｓ１として表面プラズモン共鳴測定法や水晶振動子マイクロバランス法などに用いられる金属基板を使用した場合には、それぞれ表面プラズモン共鳴測定法と水晶振動子マイクロバランス法とにより行うことができる。標的物質の固定完了後は、基板を洗浄することで目的の固定化標的物質を精製することができる。
【００５０】
［工程３：分子インプリンティング（第１分子インプリントポリマー1st MIPの合成）］
工程３では、基板Ｓ１上でビニルモノマーを添加し、工程２で固定した標的物質を鋳型とする分子インプリンティングを行う。具体的には、基板Ｓ１表面上で、工程１で標的物質に導入されたビニル基、ビニルモノマー、および鋳型としての標的物質が共存する重合反応系が構築されることにより、リビングラジカル重合が進行する。ビニルモノマーは、工程１で標的物質に導入されたビニル基と共重合させられ、標的物質の周りにポリマーマトリックス（第１分子インプリントポリマー）を形成する。
【００５１】
重合反応系に添加するビニルモノマーは、工程１で標的物質に導入されたビニル基（つまり機能性モノマーＦＭ１のビニルモノマー基）と共重合可能なビニル基構造を有するものであれば特に制限されず、当業者が適宜選択することができる。工程３において合成する第１分子インプリントポリマーは、後述工程６の第２分子インプリントポリマーの合成時における鋳型として利用するため、ビニルモノマーとしては、生体適合性ポリマーを含んでいなくてよい。第１インプリントポリマーの後述工程６における鋳型として適した特性を備えさせる観点から、ビニルモノマーとしては、ポリマー硬度のコントロールが容易である点で、水溶性のアクリルアミドが好ましい。モノマーの総量に対し、アクリルアミドのモル数の割合としては、例えば５０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは９０％以上が挙げられる。
【００５２】
また、ビニルモノマーには、機能性モノマーＦＭ３を含んでもよい。機能性モノマーＦＭ３は、具体的には、例えば以下の構造を有する。
Ｗ−Ｘ−Ｑ3・・・  （II）
【００５３】
上記式中、Ｗはビニルモノマー基、Ｘは単結合又はリンカー基を示し、それぞれ、工程１で説明した機能性モノマーＦＭ１におけるＷ及びＸとして例示した基から選択される。
【００５４】
Ｑ3は、標的物質を構成する結合性基ＢＧ３に対する結合性基ｂｇ３’を示す。結合性基ＢＧ３に対する結合性基ｂｇ３’は、好ましくは、結合性基ＢＧ３と非共有結合（可逆的連結基ＲＶ３）を形成可能な基を、結合性基ＢＧ３の種類に応じて、当業者が適宜決定することができる。結合性基ＢＧ３に対する結合性基ｂｇ３’の具体例は、上述の表１中欄の例示（又は表２第３欄の例示）のうち、非共有結合性の基から選択することができる。図示された態様では、結合性基ＢＧ３として、タンパク質部分の側鎖酸性基（好ましくはカルボキシル基）が想定されており、当該結合性基ＢＧ３に対する結合性基ｂｇ３’として、塩基性基を用いる。当該塩基性基としては、アミノ基、環状２級アミノ基（たとえば、ピロリジル基、ピペリジ基）、ピリジル基、イミダゾール基、グアニジン基から選択することができ、好ましくは２級アミノ基（たとえば、ピロリジル基、ピペリジ基）が挙げられ、より好ましくはピロリジル基が挙げられる。このような機能性モノマーＦＭ３をビニルモノマーに含ませて共重合することによって、得られる第１分子インプリントポリマーにおいて、標的物質における結合性基ＢＧ３と機能性モノマーＦＭ３由来の結合性基ｂｇ３’とが可逆的連結基ＲＶ３である水素結合を形成することができる。
【００５５】
また、重合反応系には、ビニルモノマーに加えて、架橋剤を併用してもよい。架橋剤としては、２以上のビニルモノマー基がリンカー基により結合された化合物を挙げることができる。具体的な架橋剤の例としては、一般式Ｗ−Ｘ−Ｗ（式中、Ｗはビニルモノマー基、Ｘはリンカー基を示す。）で表される化合物が挙げられる。架橋剤を構成するビニルモノマー基Ｗ及びリンカー基Ｘについても、上述と同様である。より具体的な架橋剤としては、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、エチレングリコールジメタクリレート等の低分子架橋剤が挙げられる。架橋剤の使用量に関しては、架橋により得られる第１インプリントポリマーに鋳型の表面情報をより正確に受け継がせる観点、及び／又は第１インプリントポリマーの後述工程６における鋳型としての適度な強度を備えさせる観点から、ビニルモノマーと架橋剤の合計モル数に対する架橋剤のモル数の割合として例えば５％以上、好ましくは１０％以上、より好ましくは１５％以上、さらに好ましくは１８％以上が挙げられる。また、第１インプリントポリマーが後述の工程６での分子インプリンティングの鋳型として使用された後、工程７で除去される時に、容易に除去可能となる程度の高すぎない硬度に制御する観点から、ビニルモノマーと架橋剤の合計モル数に対する架橋剤のモル数の割合として例えば３０％以下、好ましくは２５％以下、より好ましくは２２％以下が挙げられる。つまり、ビニルモノマーと架橋剤の合計モル数に対する架橋剤のモル数の割合の具体的な範囲としては、５〜３０％、５〜２５％、５〜２２％、１０〜３０％、１０〜２５％、１０〜２２％、１８〜３０％、１８〜２５％、１８〜２２％が挙げられる。
【００５６】
重合反応系には、さらに、重合触媒として、遷移金属または遷移金属化合物と配位子とから形成される遷移金属錯体を含むことが好ましく、さらに還元剤を用いることがより好ましい。遷移金属または遷移金属化合物としては、金属銅又は銅化合物が挙げられ、銅化合物としては塩化物、臭素化物、ヨウ素化物、シアン化物、酸化物、水酸化物、酢酸化物、硫酸化物、硝酸化物、好ましくは臭素化物が挙げられる。配位子としては、多座アミンが好ましく、具体的には二座〜六座配位子が挙げられる。これらの中でも、好ましくは二座配位子が挙げられ、より好ましくは２，２−ビピリジル、４，４’−ジ−（５−ノニル）−２，２’−ビピリジル、Ｎ−（ｎ−プロピル）ピリジルメタンイミン、Ｎ−（ｎ−オクチル）ピリジルメタンイミン等が挙げられ、より好ましくは２，２−ビピリジルが挙げられる。還元剤としては、アルコール、アルデヒド、フェノール類及び有機酸化合物等が挙げられ、好ましくは有機酸化合物が挙げられる。有機化合物としては、クエン酸、シュウ酸、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩、アスコルビン酸エステル等が挙げられ、好ましくはアスコルビン酸、アスコルビン酸塩、アスコルビン酸エステル等が挙げられ、より好ましくはアスコルビン酸が挙げられる。
【００５７】
工程３における共重合条件は、当業者によって適宜決定される。例えば、アクリルアミドといったモノマーは水溶性であるので、水系溶媒存在下で、少なくとも、標的物質が固定された基板に、ビニルモノマーを添加し、重合開始剤（基板Ｓ１のＳＡＭ末端に結合させた重合開始基を利用してもよい）により重合を開始することができる。重合温度は常温、さらには０℃以上１２０℃以下程度でよく、重合時間は１０分間以上５０時間以下程度とすることができる。共重合反応後は、使用した溶媒などで基板を洗浄し、余分な試薬を除去することが好ましい。
【００５８】
［工程４：標的物質の除去］
工程４では、可逆的連結基ＲＶ１及び可逆的連結基ＲＶ２を切断して標的物質を除去する。これによって、標的物質を鋳型とする凹部と当該凹部表面に切断残基である結合性基ｂｇ１’及び結合性基ｂｇ２’を含む、ネガティブタイプの第１分子インプリントポリマーを得る。図示された態様では、可逆的連結基ＲＶ１及び可逆的連結基ＲＶ２に加えて、可逆的連結基ＲＶ３も切断され、結合性基ｂｇ１’及び結合性基ｂｇ２’に加えて、結合性基ｂｇ３’も含む第１分子インプリントポリマーを得る。結合性基ｂｇ１’、結合性基ｂｇ２’及び結合性基ｂｇ３’は、それぞれ、可逆的連結基ＲＶ１、可逆的連結基ＲＶ２及び可逆的連結基ＲＶ３の切断残基であり、その具体例としては、表２の第３欄に挙げた通りである。
【００５９】
可逆的連結基の切断は、それぞれの可逆的連結基の種類に応じて当業者が適宜決定することができる。例えば、図示されたように、可逆的連結基ＲＶ１としてジスルフィド結合、可逆的連結基ＲＶ２としてボロン酸cisジオールエステル基、可逆的連結基ＲＶ３として水素結合である場合は、ジスルフィド結合やボロン酸cisジオールエステル基を開裂する条件に供すればよい。より具体的には、常温下、適切な溶媒中、工程３で得られた第１分子インプリントポリマーが形成された基材に、ジスルフィド結合を開裂させる還元剤を接触させ、ボロン酸cisジオールエステルを加水分解可能なｐＨに供すればよい。還元剤としては、例えば、トリス（２−カルボキシエチルホスフィン）（ＴＣＥＰ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリブチルホスフィン（ＴＢＰ）等が挙げられる。これによって、共有結合性の可逆的連結基ＲＶ１及び可逆的連結基ＲＶ２が切断されるとともに、水素結合である可逆的連結基ＲＶ３も切断される。可逆的連結基の切断後は、第１分子インプリントポリマーが形成された基板を洗浄することが好ましい。
【００６０】
このようにして、第１分子インプリントポリマーが得られる。第１分子インプリントポリマーは、後述工程におけるさらなる分子インプリンティングで鋳型として利用される。このため、第１インプリントポリマーは、好ましくは、通常のセンサ基板として用いられる分子インプリントポリマーとは異なるポリマー構成を有する。つまり第１インプリントポリマーは、生体適合性等の分析時に必要となる特性が要求されず、鋳型としての機械的特性を満たしていればよい。より好ましくは、第１インプリントポリマーは、結合性基ｂｇ１’、結合性基ｂｇ２’及び結合性基ｂｇ３’を与えるモノマー由来の部分を除き、ポリアクリルアミドを主成分として、さらに好ましくはポリアクリルアミドのみで構成される。
【００６１】
［工程５：第１分子インプリントポリマーへのビニル基の導入］
工程５では、第１分子インプリントポリマーの凹部表面における少なくとも結合性基ｂｇ１’及び結合性基ｂｇ２’を介して、それぞれ、ビニル基を有する機能性モノマーＦＭ５１及び機能性モノマーＦＭ５２を結合させる。また、後述するように、機能性モノマーＦＭ５１及び機能性モノマーＦＭ５２は、それぞれ、結合性基ｂｇ１’と反応して可逆的連結基ＲＶ１を形成可能な基及び結合性基ｂｇ２’と反応して可逆的連結基ＲＶ２を形成可能な基を有する。このため、工程４によって、第１分子インプリントポリマーの凹部表面における少なくとも結合性基ｂｇ１’及び結合性基ｂｇ２’に、それぞれ可逆的連結基ＲＶ１及び可逆的連結基ＲＶ２を介してビニル基が導入される。
【００６２】
機能性モノマーＦＭ５１は、具体的には、例えば以下の構造を有する。
Ｗ−Ｘ−Ｑ51・・・  （III）
【００６３】
上記式（III）中、Ｗはビニルモノマー基、Ｘは単結合又はリンカー基を示し、それぞれ、工程１で説明した機能性モノマーＦＭ１におけるＷ及びＸとして例示した基から選択される。
【００６４】
Ｑ51は、結合性基ｂｇ１’に対する結合性基を示す。結合性基ｂｇ１’に対する結合性基は、結合性基ｂｇ１’と反応して可逆的連結基ＲＶ１を形成可能な基を、結合性基ｂｇ１’の種類に応じて、当業者が適宜決定することができる。結合性基ｂｇ１’に対する結合性基の具体例は、上述の表２の第２欄の基のうち、共有結合性の基が挙げられる。
【００６５】
機能性モノマーＦＭ５２は、具体的には、例えば以下の構造を有する。
Ｗ−Ｘ−Ｑ52・・・  （IV）
【００６６】
上記式（IV）中、Ｗはビニルモノマー基、Ｘは単結合又はリンカー基を示し、それぞれ、工程１で説明した機能性モノマーＦＭ１におけるＷ及びＸとして例示した基から選択される。また、機能性モノマーＦＭ５２におけるビニルモノマー基Ｗ及び単結合又はリンカー基Ｘは、上述の機能性モノマーＦＭ５１におけるビニルモノマー基Ｗ及び単結合又はリンカー基Ｘと、同じであってもよいし異なっていてもよい。
【００６７】
Ｑ52は、結合性基ｂｇ２’に対する結合性基を示す。結合性基ｂｇ２’に対する結合性基は、結合性基ｂｇ２’と反応して可逆的連結基ＲＶ２を形成可能な基を、結合性基ｂｇ２’の種類に応じて、当業者が適宜決定することができる。結合性基ｂｇ２’に対する結合性基の具体例は、上述の表２の第２欄の基のうち、共有結合性の基が挙げられる。本発明においては、通常、機能性モノマーＦＭ５１における結合性基Ｑ51は、機能性モノマーＦＭ５２における結合性基Ｑ52とは異なる。
【００６８】
機能性モノマーＦＭ５１及び機能性モノマーＦＭ５２の反応条件は、結合性基ｂｇ１’及び結合性基ｂｇ２’との組み合わせに応じて、当業者が適宜選択することができる。また、機能性モノマーＦＭ５１及び機能性モノマーＦＭ５２の結合順序は特に限定されず、結合性基ｂｇ１’及び結合性基ｂｇ２’それぞれとの反応条件（温度、時間、ｐＨ、溶媒の種類等）の異同、結合性基ｂｇ１’及び結合性基ｂｇ２’との反応条件下それぞれにおける可逆的連結基ＲＶ２及び可逆的連結基ＲＶ１の安定性等を考慮して、当業者が適宜決定することができる。例えば、機能性モノマーＦＭ５１及び機能性モノマーＦＭ５２を同一反応系内で反応させて可逆的連結基ＲＶ１及び可逆的連結基ＲＶ２を同時に反応させてもよいし、機能性モノマーＦＭ５１を反応させて可逆的連結基ＲＶ１を形成した後に、機能性モノマーＦＭ５２を反応させて可逆的連結基ＲＶ２を形成してもよいし、機能性モノマーＦＭ５２を反応させて可逆的連結基ＲＶ２を形成した後に、機能性モノマーＦＭ５１を反応させて可逆的連結基ＲＶ１を形成してもよい。例えば図示されるように、機能性モノマーＦＭ５１が、結合性基ｂｇ１’であるチオール基に対するピリジルスルフィド基を有し、機能性モノマーＦＭ５２が、結合性基ｂｇ２’であるボロン酸基に対する糖基を有している場合、いずれも反応が容易であるが、まず、適当な溶媒中で、機能性モノマーＦＭ５１を添加して反応を行い洗浄した後に、別の適当な溶媒中で、機能性モノマーＦＭ５２を添加して反応を行い洗浄することができる。
【００６９】
［工程６：分子インプリンティング（第２分子インプリントポリマー2nd MIPの合成）］
工程６では、第１分子インプリントポリマー上にビニルモノマーを添加し、第１分子インプリントポリマーを鋳型とする分子インプリンティングを行う。工程５で第１分子インプリントポリマーに導入されたビニル基、ビニルモノマー、および鋳型としての第１分子インプリントポリマーが共存する重合反応系が構築される。ビニルモノマーは、工程５で導入したビニル基と共重合させられ、第１分子インプリントポリマーの凹部の周りにポリマーマトリックス（第２分子インプリントポリマー）を形成する。
【００７０】
図２（ａ）に示すような基板と一体化したポリマーレプリカを製造する場合は、ビニルモノマーを介して基板Ｓ２を積層し、基板Ｓ２と第１分子インプリントポリマーとの間で重合反応系が構築される。図２（ｂ）に示すような粒子状のポリマーレプリカを製造する場合は、第１分子インプリントポリマーの凹部内で重合反応系が構築される。
【００７１】
基板Ｓ２の材質としては、金属、ガラス、樹脂など、特に制限されないが、金属基板の材質としては、金、銀、銅、白金、パラジウムなどが挙げられ、好ましくは金が挙げられる。また金属基板は、ガラス基板又はテフロン（登録商標）基板上にこれら金属の薄膜を形成したものであってもよい。また、樹脂としては、ポリ（メタ）アクリレート、ポリスチレン、ＡＢＳ（アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体）、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリウレタン、シリコーン樹脂、フッ素樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂等が挙げられる。基材Ｓ１が金属基板（但しガラス基板が積層されていないもの）の場合、基板Ｓ２は上述のいずれであってもよいが、後述工程７をより容易にする観点から、好ましくは金属基板（但しガラス基板が積層されていないもの）であることが好ましい。基材Ｓ１がガラス基板又は金属薄膜を有するガラス基板である場合、基板Ｓ２は、後述工程７を容易にする観点から、金属基板（但しガラス基板が積層されていないもの）である。
【００７２】
基板Ｓ２は、重合開始基を末端に有するイニファーターで表面修飾しておくことが好ましい。基板Ｓ２上の表面修飾における重合開始基は、基板Ｓ１における重合開始基と異なっていればよい。表面修飾を形成したイニファーターは、基板Ｓ２へ化学結合していると共に、基板Ｓ２上に分子が分子間力により密に且つ規則的に整列していることから、安定で均一である。
【００７３】
本発明で用いることができるイニファーターとしては特に限定されず、基板Ｓ２への結合性基と重合開始基とを有する化合物であればよい。好ましいイニファーターの一般式を下記式に示す。
【００７４】
【化１】
2020079979.tif 000004
【００７５】
上記式（Ｖ）で示されるイニファーターは、基板Ｓ２に対する結合性基Ｘと、自己組織化用のリンカー基（炭素数１〜２０のアルキレン基）と、ジチオカルバマートタイプの重合開始基（チオカルボニルチオ基（Ｓ＝Ｃ（−Ｓ−）−）を介した遊離基（−ＮＲ1Ｒ2））とを有する。
【００７６】
結合性基Ｘは、基板Ｓ２の材質に応じて適宜決定することができるが、例えば、チオール基、酢酸チオエステル基等が挙げられ、好ましくはチオール基が挙げられる。炭素数１〜２０のアルキレン基は、結合性基Ｘによって固定されたイニファーター分子をvan der Waals力によって密に且つ規則的に整列させ、安定したＳＡＭ膜を形成する。このような観点から、炭素数１〜２０のアルキレン基は、好ましくは５〜２０、より好ましくは１０〜２０のアルキレン基であることが好ましい。遊離基（−ＮＲ1Ｒ2）におけるＲ1及びＲ2は、互いに同じ又は異なっていてよい。例えば、Ｒ1及びＲ2は、アルキル基、シクロアルキル基、アリール基、アレニル基、複素環基、好ましくはアルキル基から選択されてもよいし、Ｒ1及びＲ2は、それらが結合している窒素と一緒になって、複素環を形成していてもよいし、Ｒ1及びＲ2は、場合により、ホスフェート、ホスホネート、スルホネート、エステル、ハロゲン、ニトリル、アミド、およびヒドロキシ基で置換されていてもよいし、Ｒ1及びＲ2は場合により、酸素、窒素または硫黄などの１個以上のカテナリーヘテロ原子で置換されていてもよい。好ましくは、Ｒ1及びＲ2は炭素数１〜６、より好ましくは２〜４のアルキル基であり、好ましくはエチル基である。
【００７７】
重合反応系に添加するビニルモノマーは、工程５で第１分子インプリントポリマーに導入されたビニル基（つまり機能性モノマーＦＭ５１及び機能性モノマーＦＭ５２のビニルモノマー基）と共重合可能なビニル基を有するものであれば特に制限されず、当業者が適宜選択することができる。
【００７８】
例えば、ビニルモノマーの好ましい例として、生体適合性モノマーが挙げられる。図２（ａ）に示すような基板一体型のポリマーレプリカを製造する場合、当該ポリマーレプリカが後述工程５におけるポスト分子インプリンティング及び工程６における分子インプリンティングに用いられる際に、添加されるモノマー（後述機能性モノマーＦＭ１１１，ＦＭ１１２，ＦＭ６）の非特異的吸着を抑制する観点から、ビニルモノマーとして生体適合性モノマーを用いることがより好ましい。生体適合性モノマーとは、生体適合性ポリマーを構成可能なモノマーをいう。生体適合性ポリマーは、好ましくは親水性ポリマーであり、より具体的には双性イオンポリマーが挙げられる。双性イオンポリマーを構成可能な双性イオンモノマーは、酸性官能基（たとえば、リン酸基、硫酸基、およびカルボキシル基など）に由来するアニオン基と、塩基性官能基（たとえば、１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基および４級アンモニウム基など）に由来するカチオン基との両方を１分子中に含む。たとえば、ホスホベタイン、スルホベタイン、およびカルボキシベタインなどが挙げられ、より好ましくはホスホベタインが挙げられる。
【００７９】
スルホベタインとしては、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３’−メタクリロイルアミノプロパンアミニウムインナーソルト（ＳＰＢ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（４−スルホブチル）−３’−メタクリロイルアミノプロパンアミニウムインナーソルト（ＳＢＢ）などが挙げられる。カルボキシベタインとしては、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（１−カルボキシメチル）−２’−メタクリロイロキシエタンアミニウムインナーソルト（ＣＭＢ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２−カルボキシエチル）−２’−メタクリロイロキシエタンアミニウムインナーソルト（ＣＥＢ）などが挙げられる。ホスホベタインとしては、ホスホリルコリン基を側鎖に有する分子が挙げられ、さらに好ましくは、２−メタクリロイロキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）が挙げられる。
【００８０】
モノマーの総量に対し、生体適合性モノマーのモル数の割合としては、例えば５０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上が挙げられる。
【００８１】
また、ビニルモノマーには、機能性モノマーＦＭ６を含んでもよい。機能性モノマーＦＭ６は、具体的には、例えば以下の構造を有する。
Ｗ−Ｘ−Ｑ6・・・  （VI）
【００８２】
上記式（VI）中、Ｗはビニルモノマー基、Ｘは単結合又はリンカー基を示し、それぞれ、工程１で説明した機能性モノマーＦＭ１におけるＷ及びＸとして例示した基から選択される。
【００８３】
Ｑ6は、結合性基ｂｇ３’に対する結合性基ｂｇ３を示す。結合性基ｂｇ３’に対する結合性基ｂｇ３は、好ましくは、結合性基ｂｇ３’と非共有結合（可逆的連結基ＲＶ３）を形成可能な基を、結合性基ｂｇ３’の種類に応じて、当業者が適宜決定することができる。結合性基ｂｇ３’に対する結合性基ｂｇ３の具体例は、上述の表２第２欄の例示のうち、非共有結合性の基から選択することができる。図示された態様では、結合性基ｂｇ３’として塩基性基が想定されており、当該結合性基ｂｇ３’に対する結合性基ｂｇ３として、カルボキシル基を用いる。このような機能性モノマーＦＭ６をビニルモノマーに含ませて共重合することによって、得られる第２分子インプリントポリマーにおいて、鋳型である第１分子インプリントポリマーにおける結合性基ｂｇ３’と機能性モノマーＦＭ６由来の結合性基ｂｇ３とが可逆的連結基ＲＶ３である水素結合を形成することができる。
【００８４】
また、重合反応系には、ビニルモノマーに加えて、架橋剤を併用してもよい。架橋剤としては、２以上のビニルモノマー基がリンカー基により結合された化合物を挙げることができる。具体的な架橋剤の例としては、一般式Ｗ−Ｘ−Ｗ（式中、Ｗはビニルモノマー基、Ｘはリンカー基を示す。）で表される化合物が挙げられる。架橋剤を構成するビニルモノマー基Ｗ及びリンカー基Ｘについても、上述と同様である。より具体的な架橋剤としては、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、エチレングリコールジメタクリレート等の低分子架橋剤が挙げられる。架橋剤の使用量に関しては、架橋により得られる第２インプリントポリマーの適度な強度を得る観点や、第２インプリントポリマーに鋳型である第１インプリントポリマーの表面情報をより正確に受け継がせる観点から、ビニルモノマーと架橋剤の合計モル数に対する架橋剤のモル数の割合として例えば５％以上、好ましくは１０％以上、より好ましくは１５％以上、さらに好ましくは１８％以上が挙げられる。また、第２インプリントポリマーが図２（ａ）に示すような基板一体型である場合に第２インプリントポリマーが後述の工程１２での分子インプリンティングの鋳型として使用された後、工程１３で除去される時に、基板同士を剥離させることで容易に除去可能となる程度の高すぎない硬度に制御する等の観点から、ビニルモノマーと架橋剤の合計モル数に対する架橋剤のモル数の割合として例えば３０％以下、好ましくは２５％以下、より好ましくは２２％以下が挙げられる。つまり、ビニルモノマーと架橋剤の合計モル数に対する架橋剤のモル数の割合の具体的な範囲としては、５〜３０％、５〜２５％、５〜２２％、１０〜３０％、１０〜２５％、１０〜２２％、１８〜３０％、１８〜２５％、１８〜２２％が挙げられる。
【００８５】
重合反応系には、さらに、重合触媒として、遷移金属または遷移金属化合物と配位子とから形成される遷移金属錯体を含むことが好ましく、さらに還元剤を用いることがより好ましい。遷移金属錯体及び還元剤については、工程３において記載したものを用いることができる。
【００８６】
工程６における共重合条件は、当業者によって適宜決定される。例えば、生体適合性ポリマーは水溶性であるので、水系溶媒存在下で、基板Ｓ１上の第１分子インプリントポリマーに、ビニルモノマーを添加し、重合開始剤により重合を開始することができる。また、重合開始剤が光重合性開始剤である場合は、光照射条件下で反応を開始する。
【００８７】
図２（ａ）に示すような基板と一体化したポリマーレプリカを製造する場合は、反応液は、第１分子インプリントポリマー表面とそれに積層された基板Ｓ２との間を満たす。基板Ｓ２の表面がイニファーターで修飾されている場合は、当該イニファーターを重合開始剤として利用してもよい。図２（ｂ）に示すような粒子状のポリマーレプリカを製造する場合は、第１分子インプリントポリマー上の反応液の層ができるだけ薄くなるように液量を調整する。これによって、第１分子インプリントポリマーの各凹部からそれぞれ独立した状態（粒子状態）の第２分子インプリントポリマーが得られる。さらに、重合反応系を構築する前に、第１分子インプリントポリマーの凹部内のみに重合開始剤を入れておくことで、より容易に独立した状態の第２分子インプリントポリマーが得られる。
【００８８】
重合温度は０℃以上１２０℃以下程度、好ましくは常温（５℃以上３５℃以下、好ましくは１０℃以上３０℃以下）でよく、重合時間は１０分間以上５０時間以下程度とすることができる。共重合反応後は、使用した溶媒などで第２分子インプリントポリマーを洗浄し、余分な試薬を除去することが好ましい。
【００８９】
［工程７：第１分子インプリントポリマーの除去］
工程７では、可逆的連結基ＲＶ１及び可逆的連結基ＲＶ２を切断して第１分子インプリントポリマーを除去する。これによって、第２分子インプリントポリマーを得る。工程６で基板Ｓ２を用いた場合は、図２（ａ）に示すような、第１分子インプリントポリマーを鋳型とする凸部と当該凸部表面に切断残基である結合性基ｂｇ１及び結合性基ｂｇ２を含むポジティブタイプの第２分子インプリントポリマーを得る。工程６で基板Ｓ２を用いなかった場合は、図２（ｂ）に示すような、第１分子インプリントポリマーを鋳型とする粒子状で、表面に切断残基である結合性基ｂｇ１及び結合性基ｂｇ２を含むポリマーレプリカを得る。
【００９０】
図示された態様では、可逆的連結基ＲＶ１及び可逆的連結基ＲＶ２に加えて、可逆的連結基ＲＶ３も切断され、結合性基ｂｇ１及び結合性基ｂｇ２に加えて、結合性基ｂｇ３も含む第２分子インプリントポリマーを得る。結合性基ｂｇ１、結合性基ｂｇ２及び結合性基ｂｇ３は、それぞれ、可逆的連結基ＲＶ１、可逆的連結基ＲＶ２及び可逆的連結基ＲＶ３の切断残基であり、その具体例としては、表２の第２欄に挙げた通りである。
【００９１】
可逆的連結基の切断は、それぞれの可逆的連結基の種類に応じて当業者が適宜決定することができる。例えば、図示されたように、可逆的連結基ＲＶ１としてジスルフィド結合、可逆的連結基ＲＶ２としてボロン酸cisジオールエステル基、可逆的連結基ＲＶ３として水素結合である場合は、ジスルフィド結合及び／又はボロン酸cisジオールエステル基を還元する条件に供すればよい。より具体的には、常温下、適切な溶媒中、工程６で得られた基板Ｓ１及び基板Ｓ１上の第１分子インプリントポリマーと第２分子インプリントポリマーとの複合体を、還元剤を含む液中に浸漬させればよい。還元剤としては、例えば、トリス（２−カルボキシエチルホスフィン）（ＴＣＥＰ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリブチルホスフィン（ＴＢＰ）等が挙げられる。これによって、共有結合性の可逆的連結基ＲＶ１及び可逆的連結基ＲＶ２が切断されるとともに、水素結合である可逆的連結基ＲＶ３も切断される。
【００９２】
還元反応後は、基板Ｓ１（及び基板Ｓ１上の第１分子インプリントポリマー）から第２分子インプリントポリマーを取り出す。図２（ａ）に示すような基板一体型のポリマーレプリカを製造する場合は、第２分子インプリントポリマーの取り出しを、基板Ｓ１（及び基板Ｓ１上の第１分子インプリントポリマー）と基板Ｓ２（及び基板Ｓ２上の第２分子インプリントポリマー）とを剥離させることで容易に行える点で好ましい。なお、図２（ｂ）に示すような粒子状のポリマーレプリカを製造する場合は、第１分子インプリントポリマー及び第２分子インプリントポリマーのいずれか一方を樹脂に代えてシリカゲルで構成することで、第２分子インプリントポリマーの取り出しをより容易にすることができる。例えば、第１分子インプリントポリマーの方をシリカゲルで構成した場合、第１分子インプリントポリマーを溶解させることで第２分子インプリントポリマーをより容易に取り出すことができる。
【００９３】
このようにして、「１．標的物質のポリマーレプリカ」で述べた標的物質のポリマーレプリカが得られる。
【００９４】
［３．基板センサの製造方法］
図６を参照して、本発明の基板センサの製造方法について説明する。本発明の基板センサの製造方法は、標的物質のポリマーレプリカ（図２（ａ）に示すような基板一体型のポリマーレプリカ）を鋳型とする第３分子インプリントポリマー（３ｒｄ ＭＩＰ）を作製する工程１１〜１３と、第３分子インプリントポリマーにプストインプリンティング化合物及び／又はシグナル物質を結合する工程１４とを含む。
【００９５】
［工程１１：第２分子インプリントポリマーへのビニル基の導入］
工程１１では、標的物質のポリマーレプリカ基板上で、凸部（凸状のポリマーレプリカ部）表面における少なくとも結合性基ｂｇ１及び結合性基ｂｇ２を介して、それぞれ、ビニル基を有する機能性モノマーＦＭ１１１及び機能性モノマーＦＭ１１２を結合させる。また、後述するように、機能性モノマーＦＭ１１１及び機能性モノマーＦＭ１１２は、それぞれ、結合性基ｂｇ１と反応して可逆的連結基ＲＶ１を形成可能な基及び結合性基ｂｇ２と反応して可逆的連結基ＲＶ２を形成可能な基を有する。このため、工程１１によって、第２分子インプリントポリマーの凸部表面における少なくとも結合性基ｂｇ１及び結合性基ｂｇ２に、それぞれ可逆的連結基ＲＶ１及び可逆的連結基ＲＶ２を介してビニル基が導入される。
【００９６】
機能性モノマーＦＭ１１１は、上記式（III）におけるＱ51が、結合性基ｂｇ１に対する結合性基ｂｇ１’であることを除いて、上述の工程４において用いられる機能性モノマーＦＭ５１と同様である。また、機能性モノマーＦＭ１１２は、上記式（III）におけるＱ52が、結合性基ｂｇ２に対する結合性基ｂｇ２’であることを除いて、上述の工程４において用いられる機能性モノマーＦＭ５２と同様である。結合性基ｂｇ１に対する結合性基ｂｇ１’は、結合性基ｂｇ１と反応して可逆的連結基ＲＶ１を形成可能な基を、結合性基ｂｇ１の種類に応じて、当業者が適宜決定することができる。結合性基ｂｇ１に対する結合性基ｂｇ１’の具体例は、上述の表２の第３欄の基のうち、共有結合性の基が挙げられる。結合性基ｂｇ２に対する結合性基ｂｇ２’は、結合性基ｂｇ２と反応して可逆的連結基ＲＶ１を形成可能な基を、結合性基ｂｇ２の種類に応じて、当業者が適宜決定することができる。結合性基ｂｇ２に対する結合性基ｂｇ２’の具体例は、上述の表２の第３欄の基のうち、共有結合性の基が挙げられる。機能性モノマーＦＭ１１１及び機能性モノマーＦＭ１１２の反応条件等についても上述の工程４における反応条件等と同様である。
【００９７】
［工程１２：分子インプリンティング（第３分子インプリントポリマー3rd MIPの合成）］
工程１２では、第２分子インプリントポリマー上にビニルモノマーを添加し、ビニルモノマーを介して基板Ｓ３を積層した状態で、第２分子インプリントポリマーを鋳型とする分子インプリンティングを行う。具体的には、基板Ｓ３表面上で、工程１１で第２分子インプリントポリマーに導入されたビニル基、ビニルモノマー、および鋳型としての第２分子インプリントポリマーが共存する重合反応系が構築されることにより、リビングラジカル重合が進行する。ビニルモノマーは、工程１１で導入した機能性モノマーＦＭ１１１，ＦＭ１１２のビニル基と共重合させられ、第２分子インプリントポリマーの凸部の周りにポリマーマトリックス（第３分子インプリントポリマー）を形成する。
【００９８】
基板Ｓ３の材質としては、金属、ガラス、及び樹脂など、特に制限されない。樹脂としては、ポリ（メタ）アクリレート、ポリスチレン、ＡＢＳ（アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体）、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリウレタン、シリコーン樹脂、フッ素樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂等が挙げられる。センサ基板を光学的分析用途で作製する場合は、透光性を有する材料であることが好ましく、無色透明の材料であることがより好ましい。この観点からは、基板Ｓ３の材質としては、無色透明のガラス、無色透明の樹脂が好ましく挙げられる。
【００９９】
基材Ｓ２が金属基板（但しガラス基板が積層されていないもの）の場合、基板Ｓ３は上述のいずれであってもよいが、後述工程１４をより容易にする観点から、好ましくは金属基板（但しガラス基板が積層されていないもの）、樹脂であることが好ましい。基材Ｓ２がガラス基板又は金属薄膜を有するガラス基板である場合、基板Ｓ３は、後述工程１４を容易にする観点から、金属基板（但しガラス基板が積層されていないもの）又は樹脂である。
【０１００】
基板Ｓ３上には予め表面修飾基を結合させることで表面修飾を行っておくことが好ましい。例えば、図示されるように、基板Ｓ３上に予め自己組織化単分子膜（ＳＡＭ：Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）を形成しておくことが好ましい。ＳＡＭは、基板Ｓ３へ化学結合していると共に、基板Ｓ３上に分子が分子間力により密に且つ規則的に整列していることから、安定で均一である。以下において、基板Ｓ３表面の表面修飾としてＳＡＭを形成する場合を代表して説明する。
【０１０１】
ＳＡＭを形成するための分子としては、基板Ｓ３表面に対する結合性基（例えば、基板Ｓ１が金属基板の場合、金属基板表面と結合可能なチオール基または酢酸チオエステル基が挙げられる）を一方の端部に有し、重合開始基を他端に有する、炭素数８以上の直鎖アルカンが挙げられる。この場合、重合開始基は、後述の工程３における共重合反応における重合開始剤として機能する。基板Ｓ３上に表面される重合開始基は、基板Ｓ２で用いた重合開始基と異なっていればよい。
【０１０２】
基板Ｓ３として金属基板を用いる場合、金属基板上へのＳＡＭの形成は、常法に従えばよい。例えば、ＳＡＭ形成分子をエタノールなどに溶解し、得られた溶液に金属基板を常温で３０分間以上４８時間程度浸漬すれば、当該分子がチオエーテル結合を介して金属基板表面に結合し、且つ分子間力により配向しつつ密に集合し、ＳＡＭが形成される。或いは、上記工程１において例示したリンカー基を介して、ＳＡＭ形成分子を段階的に延長してもよい。その場合には、重合開始基を最終末端に導入するようにすればよい。次いで、過剰のＳＡＭ形成分子を洗浄により除去した後、乾燥すればよい。
【０１０３】
また、基板Ｓ３としてガラス基板を用いる場合には、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）などのシランカップリング剤で表面にアミノ基などの反応性基を導入することにより、ＳＡＭの形成が可能である。
【０１０４】
重合反応系に添加するビニルモノマーは、工程１１で標的物質に導入されたビニル基（つまり機能性モノマーＦＭ１１１及び機能性モノマーＦＭ１１２のビニルモノマー基）と共重合可能なビニル基構造を有するものであれば特に制限されず、当業者が適宜選択することができる。
【０１０５】
例えば、ビニルモノマーの好ましい例として、生体適合性モノマーが挙げられる。生体適合性モノマーとは、生体適合性ポリマーを構成可能なモノマーをいう。生体適合性ポリマーは生体親和性に優れるため、得られるセンサ基板が、血液などの生体試料の分析に適しているという利点がある。
【０１０６】
生体適合性ポリマーは、好ましくは親水性ポリマーであり、より具体的には双性イオンポリマーが挙げられる。双性イオンポリマーを構成可能な双性イオンモノマーは、酸性官能基（たとえば、リン酸基、硫酸基、およびカルボキシル基など）に由来するアニオン基と、塩基性官能基（たとえば、１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基および４級アンモニウム基など）に由来するカチオン基との両方を１分子中に含む。たとえば、ホスホベタイン、スルホベタイン、およびカルボキシベタインなどが挙げられ、より好ましくはホスホベタインが挙げられる。
【０１０７】
スルホベタインとしては、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３’−メタクリロイルアミノプロパンアミニウムインナーソルト（ＳＰＢ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（４−スルホブチル）−３’−メタクリロイルアミノプロパンアミニウムインナーソルト（ＳＢＢ）などが挙げられる。カルボキシベタインとしては、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（１−カルボキシメチル）−２’−メタクリロイロキシエタンアミニウムインナーソルト（ＣＭＢ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２−カルボキシエチル）−２’−メタクリロイロキシエタンアミニウムインナーソルト（ＣＥＢ）などが挙げられる。ホスホベタインとしては、ホスホリルコリン基を側鎖に有する分子が挙げられ、さらに好ましくは、２−メタクリロイロキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）が挙げられる。
【０１０８】
モノマーの総量に対し、生体適合性モノマーのモル数の割合としては、例えば５０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上が挙げられる。
【０１０９】
ビニルモノマーの他の例としてノニオンポリマーも挙げられる。ノニオンポリマーは、得られるセンサ基板を非特異的吸着が低減されたものとして得られる利点がある。ノニオンポリマーの例としては、ポリエーテル系高分子（たとえばポリ（エチレングリコール））を有するビニルモノマーが挙げられる。
【０１１０】
また、ビニルモノマーには、機能性モノマーＦＭ１２を含んでもよい。機能性モノマーＦＭ１２は、具体的には、例えば以下の構造を有する。
Ｗ−Ｘ−Ｑ12・・・  （II）
【０１１１】
上記式中、Ｗはビニルモノマー基、Ｘは単結合又はリンカー基を示し、それぞれ、工程１で説明した機能性モノマーＦＭ１におけるＷ及びＸとして例示した基から選択される。
【０１１２】
Ｑ12は、標的物質のポリマーレプリカ基板の凸状ポリマーレプリカ部における結合性基ｂｇ３に対する結合性基ｂｇ３’を示す。結合性基ｂｇ３に対する結合性基ｂｇ３’は、好ましくは、結合性基ｂｇ３と非共有結合（可逆的連結基ＲＶ３）を形成可能な基を、結合性基ｂｇ３の種類に応じて、当業者が適宜決定することができる。結合性基ｂｇ３に対する結合性基ｂｇ３’の具体例は、上述の表１中欄の例示（又は表２第３欄の例示）のうち、非共有結合性の基から選択することができる。図示された態様では、結合性基ｂｇ３として、タンパク質部分の側鎖カルボキシル基を模したカルボキシル基が想定されており、当該結合性基ｂｇ３に対する結合性基ｂｇ３’として、塩基性基を用いる。当該塩基性基としては、アミノ基、環状２級アミノ基（たとえば、ピロリジル基、ピペリジ基）、ピリジル基、イミダゾール基、グアニジン基から選択することができ、好ましくは２級アミノ基（たとえば、ピロリジル基、ピペリジ基）が挙げられ、より好ましくはピロリジル基が挙げられる。このような機能性モノマーＦＭ１２をビニルモノマーに含ませて共重合することによって、得られる第３分子インプリントポリマーにおいて、凸状ポリマーレプリカ部における結合性基ｂｇ３と機能性モノマーＦＭ１２由来の結合性基ｂｇ３’とが可逆的連結基ＲＶ３である水素結合を形成することができる。
【０１１３】
また、重合反応系には、ビニルモノマーに加えて、架橋剤を併用してもよい。架橋剤としては、２以上のビニルモノマー基がリンカー基により結合された化合物を挙げることができる。具体的な架橋剤の例としては、一般式Ｗ−Ｘ−Ｗ（式中、Ｗはビニルモノマー基、Ｘはリンカー基を示す。）で表される化合物が挙げられる。架橋剤を構成するビニルモノマー基Ｗ及びリンカー基Ｘについても、上述と同様である。より具体的な架橋剤としては、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、エチレングリコールジメタクリレート等の低分子架橋剤が挙げられる。架橋剤の使用量に関しては、架橋により得られる第３インプリントポリマーの適度な強度を得る観点、及び／又は第２インプリントポリマーに鋳型である第２インプリントポリマーの表面情報をより正確に受け継がせる観点から、ビニルモノマーと架橋剤の合計モル数に対する架橋剤のモル数の割合として例えば５％以上、好ましくは１０％以上、より好ましくは１５％以上、さらに好ましくは１８％以上が挙げられる。また、第３インプリントポリマーが後述の工程１３で除去される時に、基板同士を剥離させることで容易に除去可能となる程度の高すぎない硬度に制御する観点から、ビニルモノマーと架橋剤の合計モル数に対する架橋剤のモル数の割合として例えば３０％以下、好ましくは２５％以下、より好ましくは２２％以下が挙げられる。つまり、ビニルモノマーと架橋剤の合計モル数に対する架橋剤のモル数の割合の具体的な範囲としては、５〜３０％、５〜２５％、５〜２２％、１０〜３０％、１０〜２５％、１０〜２２％、１８〜３０％、１８〜２５％、１８〜２２％が挙げられる。
【０１１４】
重合反応系には、さらに、重合触媒として、遷移金属または遷移金属化合物と配位子とから形成される遷移金属錯体を含むことが好ましく、さらに還元剤を用いることがより好ましい。遷移金属錯体及び還元剤については、工程３において記載したものを用いることができる。
【０１１５】
工程１２における共重合条件は、当業者によって適宜決定される。例えば、生体適合性ポリマーは水溶性であるので、水系溶媒存在下で、基板Ｓ２上の第２分子インプリントポリマーに、ビニルモノマーを添加し、重合開始剤（基板Ｓ３の表面で重合開始基を有するＳＡＭが形成されている場合は、当該重合開始基を利用してもよい）により重合を開始することができる。反応液は、第２分子インプリントポリマー表面とそれに積層された基板Ｓ３との間を満たす。重合温度は０℃以上１２０℃以下程度、好ましくは常温（５℃以上３５℃以下、好ましくは１０℃以上３０℃以下）でよく、重合時間は１０分間以上５０時間以下程度とすることができる。共重合反応後は、使用した溶媒などで基板を洗浄し、余分な試薬を除去することが好ましい。
【０１１６】
［工程１３：第２分子インプリントポリマーの除去］
工程１３では、可逆的連結基ＲＶ１及び可逆的連結基ＲＶ２を切断して第２分子インプリントポリマーを除去する。これによって、第２分子インプリントポリマーを鋳型とする凹部と当該凹部表面に切断残基である結合性基ｂｇ１’及び結合性基ｂｇ２’を含むネガティブタイプの第３分子インプリントポリマーを得る。図示された態様では、可逆的連結基ＲＶ１及び可逆的連結基ＲＶ２に加えて、可逆的連結基ＲＶ３も切断され、結合性基ｂｇ１’及び結合性基ｂｇ２’に加えて、結合性基ｂｇ３’も含む第２分子インプリントポリマーを得る。結合性基ｂｇ１’、結合性基ｂｇ２’及び結合性基ｂｇ３’は、それぞれ、可逆的連結基ＲＶ１、可逆的連結基ＲＶ２及び可逆的連結基ＲＶ３の切断残基であり、その具体例としては、表２の第３欄に挙げた通りである。
【０１１７】
可逆的連結基の切断は、それぞれの可逆的連結基の種類に応じて当業者が適宜決定することができる。例えば、図示されたように、可逆的連結基ＲＶ１としてジスルフィド結合、可逆的連結基ＲＶ２としてボロン酸cisジオールエステル基、可逆的連結基ＲＶ３として水素結合である場合は、ジスルフィド結合やボロン酸cisジオールエステル基を還元する条件に供すればよい。より具体的には、常温下、適切な溶媒中、工程１２で得られた基板Ｓ２及び基板Ｓ２上の第２分子インプリントポリマーと基板Ｓ３及び基板Ｓ３上の第３分子インプリントポリマーの複合体を還元剤を含む液中に浸漬させればよい。還元剤としては、例えば、トリス（２−カルボキシエチルホスフィン）（ＴＣＥＰ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリブチルホスフィン（ＴＢＰ）等が挙げられる。これによって、共有結合性の可逆的連結基ＲＶ１及び可逆的連結基ＲＶ２が切断されるとともに、水素結合である可逆的連結基ＲＶ３も切断される。還元反応後は、基板Ｓ２（及び基板Ｓ２上の第２分子インプリントポリマー）と基板Ｓ３（及び基板Ｓ３上の第３分子インプリントポリマー）とを剥離させる。
【０１１８】
このようにして、第２分子インプリントポリマーの凸状ポリマーレプリカ部を鋳型とする分子インプリント空間として形成された凹部を有する第３分子インプリントポリマーを得ることができる。第２分子インプリントポリマーが、対象物質表面の官能基情報を正確に模倣しているため、第３分子インプリントポリマーの凹部は、標的物質の特異的認識部位（つまり、標的物質を特異的に取り込むことが可能な空間）として機能することができる。
【０１１９】
［工程１４：ポストインプリンティング化合物及び／又はシグナル物質の導入］
工程１４では、結合性基ｂｇ１’及び結合性基ｂｇ２’の少なくともいずれかに、結合性基ＢＧ１及び結合性基ＢＧ２の少なくともいずれかと相互作用するポストインプリンティング化合物及び／又はシグナル物質を結合させる。好ましくは、標的物質の結合性基と対応する結合性基が、標的物質の結合性基と異種である結合性基に対して、ポストインプリンティング化合物及び／又はシグナル物質を結合させることが好ましい。また、ポストインプリンティング化合物及び／又はシグナル物質の結合による効果をより効果的に得るため、ポストインプリンティング化合物及び／又はシグナル物質は、結合性基ｂｇ１’及び結合性基ｂｇ２’のうち、特異的認識空間（凹部）内に複数存在する結合性基（図示された態様においては、結合性基ｂｇ１’）に対して結合することが好ましい。
【０１２０】
ポストインプリンティング化合物の場合、特異的認識空間（凹部）内に結合させたポストインプリンティング化合物は、標的物質が特異的認識空間に認識されると、当該標的物質の結合性基と相互作用することで、特異的認識空間の標的物質に対する親和性及び／又は選択性を向上させる。
【０１２１】
例えば、標的物質の結合性基と対応する結合性基が、標的物質の結合性基と異種である結合性基ｂｇ１’にポストインプリンティング化合物を結合させると、結合させられたポストインプリンティング化合物の位置は、当該特異的認識空間に進入する検出すべき標的物質の結合性基ＢＧ１の位置に対応する。このため、基板センサの使用時に標的物質が当該特異的認識空間に進入すると、ポストインプリンティング化合物と標的物質の結合性基ＢＧ１とが相互作用する。このため、当該特異的認識空間の標的物質に対する選択性と親和性とが向上する。
【０１２２】
ポストインプリンティング化合物は、標的物質の結合性基ＢＧ１に対する結合性基を有する。このような結合性基としては、上記表１の中欄に示す結合性基が挙げられる。結合性基ＢＧ１とポストインプリンティング化合物との位置に基づく効果をより良好に得る観点からこのような結合性基は、上記工程１における式（I）中Ｚで示すリンカー基を介して結合されていることが好ましい。
【０１２３】
シグナル物質の場合、特異的認識空間（凹部）内に標的物質が認識されると、当該特異的認識空間内のシグナル物質に由来するシグナル強度が変化すること又はスペクトルが変化（例えばピークがシフト）することで、分析対象試料中における標的物質の有無又はその濃度を容易に測定することが可能になるため、標的物質に対する検出感度を顕著に向上させる。
【０１２４】
シグナル物質としては、具体的なシグナル物質としては、特異的認識空間内への標的タンパク質の挿入が妨げられない程度の大きさを有するものであれば特に限定されない。また、特異的認識部位への標的物質の進入により検知されるシグナル強度が変化したり、スペクトルが変化（例えばピークがシフト）したりするものを特に限定されることなく用いることができる。たとえば、蛍光物質、放射性元素含有物質、磁性物質等が挙げられる。検出容易性等の観点から、シグナル物質としては蛍光物質であることが好ましい。蛍光物質としては、フルオレセイン系色素、インドシアニン色素などのシアニン系色素、ローダミン系色素などの蛍光色素などが挙げられる。放射性元素含有物質としては、18Fなどの放射性同位体でラベルした、糖、アミノ酸、核酸などが挙げられる。磁性物質としては、フェリクロームなどの磁性体を有するもの、フェライトナノ粒子、ナノ磁性粒子などにみられるものが挙げられる。
【０１２５】
また、シグナル物質は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を引き起こす蛍光色素ペアの一方として構成することもできる。ＦＲＥＴを引き起こす蛍光色素ペアとしては特に限定されず、シグナル物質としてドナー色素及びアクセプター色素のいずれを選択するかも限定されない。好ましくは、シグナル物質としてドナー色素を選択することができる。ＦＲＥＴを引き起こす蛍光色素のペアを構成するドナー色素／アクセプター色素の具体例としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）／テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７／Ｃｙ５.５、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ６４７／Ｃｙ５.５、Ｒ−フィコエリトリン（Ｒ−ＰＥ）／アロフィコシアニン（ＡＰＣ）等が挙げられる。
【０１２６】
このようにして、基板Ｓ３と、基板Ｓ３上に設けられた、標的物質の特異的認識部位を有する第３分子インプリントポリマーと、特異的認識部位に結合させられた、ポストインプリンティング化合物及び／又はシグナル物質と、を有するセンサ基板が得られる。本発明のセンサ基板の製造方法は、標的物質を鋳型に用いなくとも、対象物質表面の官能基情報を正確に模倣しているポリマーレプリカ基板を鋳型に用いることで標的物質の分子認識材料を作製することが可能となる。鋳型が合成ポリマーで構成されているため、その化学的安定性及び物理的安定性並びに各段に向上したコスト性から、極めて効率的にセンサ基板を製造することが可能となる。このため、医療分野、環境・水質分析分野、及び食品分野等で使用される分析ツールや分析キットの創出を容易にすることができる。
【０１２７】
［標的物質の分析］
基板センサを用いて標的物質を分析するには、基板センサ表面上に、標的物質を含む分析試料液を接触させる。
【０１２８】
分析試料液としては特に限定されず、標的物質を精製又は粗精製する処理を経たものであってもよいし、そのような処理を経ていないものであってもよい。なお、当該処理としては、超遠心分離、限外ろ過、連続フロー電気泳動、サイズフィルターを用いたろ過、ゲルろ過クロマトグラフィー等が挙げられる。分析試料液の具体例としては、生体試料（血液、乳汁、尿、唾液、リンパ液、髄液、羊水、涙液、汗、鼻漏等の体液試料）、環境・水質試料、及び食品試料等が挙げられる。
【０１２９】
基板センサの表面上に標的物質を含む分析試料を接触させると、標的物質が基板センサの表面の特異的認識部位に特異的に捕捉される。特異的認識部位にシグナル物質が結合している場合、標的物質が特異的認識部位に特異的に捕捉されると、シグナル物質が標的物質によって遮蔽されるため、シグナル物質から検知されるシグナル強度が変化する。このシグナル強度の変化によって標的物質が検出される。
【０１３０】
また、基板センサにおけるシグナル物質を、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を引き起こす蛍光色素ペアの一方となるように構成している場合、分析試料中の標的物質に予め当該蛍光色素ペアの一方を結合させておく。この場合、標的物質が特異的認識部位に特異的に捕捉されると、シグナル物質の蛍光色素と標的物質の蛍光色素とが近接するため、ＦＲＥＴにより蛍光が放射される。このＦＲＥＴによる蛍光放射によって標的物質が検出される。
【実施例】
【０１３１】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。【０１３２】
標的物質ＡＦＰへのビニル基導入（工程１）
ＡＦＰ溶液（AFP Liquid in tris buffered saline, pH 7.5 with sodium azide, LeeBioSolutions）を限外ろ過（４℃，１４０００×ｇ，１０分）し、ＡＦＰが１ｍｇ／ｍＬとなるように１０ｍＭ phosphate buffer（ｐＨ７．４）に再分散させた。２００μＬ（２００μｇ，２．９ｎｍｏｌ）をエッペンドルフチューブに入れ、ＡＦＰに対して機能性モノマーＦＭ１（Ｍ．Ｗ．＝４４９．４５）が１０等量となるように１ｍｇ／ｍＬの機能性モノマーＦＭ１溶液（１０ｍＭ phosphate buffer（ｐＨ７．４））を加え、４℃で１４時間反応させた。反応後、未反応のＦＭ１を除去するためＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５（ＭＷＣＯ：３０ｋＤａ）を用いて１０ｍＭ phosphate buffer（ｐＨ７．４）で希釈し、限外ろ過（４℃，１４０００×ｇ，１０分）を３回行った。ＦＭ１の導入数は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ｍａｔｒｉｘ：シナピン酸、ｍｅｔｈｏｄ：ＩｇＧ  ｌｉｎｅｒ）のピークシフトから算出した。【０１３３】
金基板修飾
エタノールで洗浄した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）金基板を２０分間ＵＶ−Ｏ3クリーニングした。ＳＡＭを形成する化合物として、ａｍｉｎｏ−ＥＧ6−ｕｎｔｅｃａｎｔｈｉｏｌ（Ｍｗ：５０４．１６）及びＢｉｓ［２−（２−ｂｒｏｍｏｉｓｏｂｕｔｙｒｙｌｏｘｙ）ｕｎｄｅｃｙｌ］ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ（Ｍｗ：７０４．７）をいずれも０．５ｍＭとなるように溶解させたＥｔＯＨ溶液（２ｍＬ）に金基板を浸漬（３０℃、１８ｈ）させ、末端基としてアミノ基及び原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）開始基を有するＳＡＭ（ｍｉｘｅｄ−ＳＡＭ）で表面修飾を行った。修飾後の金基板をＥｔＯＨ及びＭＩｌｌｉ−Ｑ水で洗浄し、Ｎ2で乾燥させた。乾燥後の基板は真空デシケータにて保管した。さらに、アミノ基にフェニルボロン酸基を導入するため、３−フルオロ−４−カルボキシフェニルボロン酸（ＣＦＰＢＡ）を１ｍＭ、及び４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ−ＭＭ）を１０ｍＭとなるようにＥｔＯＨ（２ｍＬ）に溶解させ、その溶液に、ｍｉｘｅｄ−ＳＡＭ修飾基板を浸漬させ、２５°Ｃで３ｈインキュベーションした。反応後の基板はＭｅＯＨ、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で洗浄し、Ｎ2で乾燥させた。【０１３４】
標的物質ＡＦＰの固定化（工程２）
得られたｍｉｘｅｄ−ＳＡＭ修飾基板上に、１０μｇ／ｍＬのＦＭ１−ＡＦＰ溶液１００μＬを滴下し、２５°Ｃで１ｈインキュベーションした。その後基板をリン酸緩衝液にて洗浄し、ＡＦＰ固定化金基板を得た。【０１３５】
第１分子インプリントポリマー（１ｓｔ  ＭＩＰ）の合成（工程３）
ピリジニウムメタクリレート（ＰｙＭ；２５０μＭ）、アクリルアミド（ＡＡｍ，４０ｍＭ）、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ＭＢＡＡ；１０ｍＭ）を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）４．５ｍＬにそれぞれ溶解させ、さらに２，２’−Ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ（２ｍＭ）及びＣｕＢｒ2（１ｍＭ）を加え、凍結脱気窒素置換を行うことにより、プレポリマー溶液を調製した。別途、アスコルビン酸（６．２５ｍＭ）Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水溶液を調製し、同様に凍結脱気窒素置換を行った。ＡＦＰ固定化金基板をシュレンクフラスコ内に入れ、プレポリマー溶液を加えて十分に脱気窒素置換した後、アスコルビン酸溶液（４００μＬ）をシリンジで添加し、もう一度脱気窒素置換を行った。その後、フラスコを４０°Ｃに設定したウォーターバスに浸漬させ表面開始原子移動ラジカル重合反応を１時間行った。重合後の基板はＭｉｌｌｉ−Ｑ水にて洗浄し、１０ｍＭリン酸緩衝液中で保存した。【０１３６】
鋳型（ＡＦＰ）の除去（工程４）
銅を除くため、重合後の基板を５０ｍＭのＥＤＴＡ−４Ｎａ水溶液５ｍＬに浸漬させ、振とうしながら２５°Ｃで１ｈ反応させた。その後、重合後のジスルフィド結合の還元及び鋳型ＡＦＰの除去を行うため、２０ｍＭのＴＣＥＰ水溶液５ｍＬに浸漬させ、振とうしながら２５°Ｃで５ｈ反応させた。【０１３７】
鋳型（第１分子インプリントポリマー）へのビニル基導入（工程５）
第１分子インプリントポリマー（１ｓｔ  ＭＩＰ）にジスルフィド交換反応を利用してビニル基を導入するため、１ｍＭのピリジルジチオエチルメタクリルアミド溶液（５０％ＭｅＯＨ，ｖ／ｖ）１００μＬを滴下して反応させた（２５℃、ｏｖｅｒ  ｎｉｇｈｔ）。５０％ＭｅＯＨ（ｖ／ｖ）、リン酸緩衝液で洗浄後、更に１ｍＭのグリコシルエチルメタクリルアミド（ＧＭＡ）溶液（１０ｍＭリン酸緩衝液，ｐＨ７．４）１００μＬを滴下して２５°Ｃで１ｈ反応させた。【０１３８】
金基板修飾
洗浄した日本分光株式会社製金基板にシリコンシートをかぶせ、１．０ｍＭのイニファーター（Ｉｎｉｆｅｒｔｅｒ）−ＳＨ（下記式、Ｍｗ：３９２．７）を溶解させたＥｔＯＨ溶液１００μＬを滴下し、重合開始基で表面修飾を行った（３０℃、１８ｈ）。修飾後の金基板はＥｔＯＨで洗浄し、Ｎ2で乾燥させた。【０１３９】
【化２】
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【０１４０】
第２分子インプリントポリマー（２ｎｄ  ＭＩＰ）合成（工程６）
アクリル酸（１ｍＭ）、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ；４０ｍＭ）、及びＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ＭＢＡＡ；１０ｍＭ）を、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解させ、凍結脱気窒素置換を行った。１００μＬのプレポリマー溶液を第１分子インプリントポリマー上に滴下後、金基板を積層し、ＫｅｙＣｈｅｍ−Ｌｕｍｉｎｏ（紫外発光ＬＥＤ、ピーク波長３６５ｎｍ）を用いて窒素フロー下にて重合反応を３時間行った。【０１４１】
鋳型（第１分子インプリントポリマー）の除去（工程７）
重合反応後の積層物を２０ｍＭのＴＣＥＰ水溶液に２５℃で３ｈ浸漬させ、基板同士を剥離した。これによって、標的物質ＡＦＰのポリマーレプリカ基板を得た。【０１４２】
第２分子インプリントポリマーへのビニル基導入（工程１１）
ポリマーレプリカ基板の第２分子インプリントポリマー（２ｎｄ  ＭＩＰ）にジスルフィド交換反応を利用してビニル基を導入するため、１ｍＭのピリジルジチオエチルメタクリルアミド溶液（５０％ＭｅＯＨ，ｖ／ｖ）１００μＬを滴下して反応させた（２５℃、ｏｖｅｒ  ｎｉｇｈｔ）。５０％ＭｅＯＨ（ｖ／ｖ）、リン酸緩衝液で洗浄後、更に１ｍＭの３−フルオロ−４−カルボキシフェニルボロン酸（ＣＦＰＢＡ）溶液（１０ｍＭリン酸緩衝液，ｐＨ７．４）１００μＬを滴下して２５°Ｃで１ｈ反応させた。その後、１００μＬのリン酸緩衝液で１回洗浄した。【０１４３】
ガラス板の表面修飾
２５ｍｍ角のガラス基板（厚さ約０．５ｍｍ）を、ピランハ溶液（濃Ｈ2ＳＯ4：Ｈ2Ｏ2＝３：１，ｖ／ｖ）で３０分洗浄し、ＭｅＯＨ，純水，ＥｔＯＨでかけ流し洗浄し、すぐに、プラスチックシャーレに調製した１ｗ％のＡＰＴＥＳ溶液に基板を浸漬させ、２５℃で１時間静置した。その後、ＥｔＯＨでかけ流し洗浄して１１０℃のホットプレートにて１５分焼成し、ガラス基板表面をアミノ化した。得られた基板を２−ブロモイソ酪酸（５ｍＭ）、ＥＤＣ（７．５ｍＭ）、ＮＨＳ（７．５ｍＭ）を溶解させたＤＭＳＯ溶液に浸漬させ２５℃、２時間反応させ、Ｂｒ化した。その後、ＤＭＳＯ，ＥｔＯＨで基板をかけ流し洗浄し、Ｎ2ガスで乾燥させた。得られたＢｒ修飾ガラス板は、１２．５ｍｍ角にカットして重合反応に使用した。【０１４４】
第３分子インプリントポリマー（３ｒｄ  ＭＩＰ）の合成（工程１２）
ピリジニウムメタクリレート（ＰｙＭ；１ｍＭ）、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ；４０ｍＭ）、及びＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ＭＢＡＡ；１０ｍＭ）、２，２’−ビピリジン（２ｍＭ）、ＣｕＢｒ2（１ｍＭ）を、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（総量で５００μＬ）に溶解させ、凍結脱気窒素置換を行い、モノマー溶液を調製した。別途、アスコルビン酸（６．２５ｍＭ）のＭｉｌｌｉ−Ｑ水溶液を調製し、同様に凍結脱気窒素置換を行った。いずれの溶液もグローブボックス中に入れ、容器内を窒素置換した。その後、モノマー溶液にアスコルビン酸水溶液４０μＬを入れ混合し、このプレポリマー溶液１００μＬをポリマーレプリカ基板の第２分子インプリントポリマー上に滴下後、ブロモ基で表面修飾したガラス基板を積層し、三角フラスコ中に入れ、セプタムで密封した。積層状態でグローブボックスから出し、再度脱気窒素置換後、別途脱気窒素置換しておいたモノマー溶液及びアスコルビン酸水溶液の混合溶液を１００μＬ追添加し、脱気窒素置換した後４０℃ウォーターバスに浸漬させて静置し、重合反応を１時間行った。【０１４５】
鋳型（第２分子インプリントポリマー）の除去（工程１３）
銅を除くため、重合後の基板を５０ｍＭのＥＤＴＡ−４Ｎａ水溶液に浸漬させ、振とうしながら２５°Ｃで１ｈ反応させた。その後、２０ｍＭのＴＣＥＰ水溶液に浸漬（２５℃、ｏｖｅｒ  ｎｉｇｈｔ）させ、基板同士を剥離した。【０１４６】
蛍光分子の導入（工程１４）
鋳型分子除去後、ジスルフィド基を導入したローダミン蛍光試薬の１ｍＭ水溶液（５０％ＭｅＯＨ，ｖ／ｖ）を基板上に１００μＬ滴下し、カバーガラスで封をした状態で２５°Ｃでｏｖｅｒ  ｎｉｇｈｔ反応させた。反応後の基板はＭｅＯＨと純水とで洗浄した。これによって、基板センサを得た。【０１４７】
センサ基板ＡＦＰのＡＦＰ（標的物質）結合能評価
１．第１分子インプリントポリマー（１ｓｔ  ＭＩＰ）のＡＦＰ結合性試験（参考例）
表面プラズモン共鳴測定装置に、工程４で得られた第１分子インプリントポリマー基板をセッティング後、ベースラインが安定化するまでランニングバッファーを送液した。安定化後、２０ｍＭのＴＣＥＰ水溶液（２００μＬ：１０分）をインジェクションし、その後１％のＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００リン酸緩衝液溶液（２０μＬ：１分）、１ＭのＮａＣｌ水溶液（２０μＬ：１分）、Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ溶液（２０μＬ：１分）で基板の洗浄を行った。ＲＵ値が下がらなくなったところで、０ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ（０ｎＭ，０．００７ｎＭ，０．０１４ｎＭ，０．０７２ｎＭ，０．１４ｎＭ，０．７２ｎＭ，１．４５ｎＭ）のＡＦＰ（１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４））溶液をインジェクションしてＳＰＲ測定を行った。【０１４８】
測定は以下のように装置内でメソッドを組み、オートサンプラーで段階状にＡＦＰ溶液のインジェクションを行った。
・ランニングバッファー：１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）
・流速：２０μＬ／分、接触時間：１分（インジェクションボリューム：２０μＬ）
・設定温度：２５℃
（１）ランニングバッファーを送液し、送液開始後５分の値をベースラインの値として得た。
（２）タンパク質をインジェクションした（１分間）。インジェクション終了後５分の値をデータの点として得た。
（３）次点の濃度のタンパク質をインジェクションした。インジェクション終了後５分の値をデータの点として得た。△Ｒｕ値はベースラインから各タンパク質のデータ点の差を採用した。【０１４９】
図７に、第１分子インプリントポリマー基板（鋳型として標的物質ＡＦＰを用いて作製）を用いたＳＰＲによるＡＦＰ検出において得られた、ＡＦＰ濃度に対するＳＰＲシグナル変化を示す吸着等温線を示す。得られた吸着等温線よりカーブフィッティングソフトウエアを用いて結合定数を算出したところ、Ｋd＝６．２×１０-11［Ｍ］と算出された。【０１５０】
２．第３分子インプリントポリマー（３ｒｄ  ＭＩＰ）のＡＦＰ結合性試験（実施例）
工程１４で得られた、第３分子インプリントポリマーを有するセンサ基板をガラスボトムディッシュに入れ、３ｍＬの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に浸漬させた。０．５μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬのＡＦＰ溶液３μＬを添加し（終濃度０ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ（０ｎＭ，０．００７ｎＭ，０．０１４ｎＭ，０．０７２ｎＭ，０．１４ｎＭ，０．７２ｎＭ，１．４５ｎＭ））、マグネチックスターラーで２０分撹拌しながらインキュベーションし、各ＡＦＰ濃度における基板の蛍光強度を蛍光顕微鏡にて測定した。測定条件は、光量１００％、対物レンズｘ４、Ｃｙ３フィルタ、露光時間０．１秒、１６ｂｉｔ、測定箇所は、基板内の５０×５０ｐｉｘｅｌを９点とした。【０１５１】
また、工程１３で得られた、蛍光分子導入前の基板についても、ガラスボトムディッシュに入れ、３ｍＬの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に浸漬させて測定を行った（比較例）。【０１５２】
図８（ａ）に、蛍光分子導入前の基板（比較例）及び導入後の基板（実施例）における蛍光強度の比較を示す。図８（ｂ）に、第３分子インプリントポリマーを有する基板センサ（鋳型として第２分子インプリントポリマーを有するポリマーレプリカ基板を用いて作製）を用いた蛍光顕微鏡測定によるＡＦＰ検出において得られた、ＡＦＰ濃度に対する蛍光強度変化を示す吸着等温線を示す。得られた吸着等温線よりカーブフィッティングソフトウエアを用いて結合定数を算出したところ、Ｋd＝１．２×１０-11［Ｍ］と算出された。【０１５３】
基板センサの選択性評価
工程１４で得られた、第３分子インプリントポリマーを有するセンサ基板をガラスボトムディッシュに入れ、３ｍＬの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に浸漬させた。終濃度が１．４５ｎＭとなるようＡＦＰを添加し、マグネチックスターラーで２０分撹拌しながらインキュベーションした後、基板センサの蛍光強度を蛍光顕微鏡にて測定した。ＡＦＰ吸着実験後の基板については、１０ｍＭのＧｌｙ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２．５、３ｍＬ、５分撹拌）×３回、０．５ｗｔ％のＳＤＳ水溶液（３ｍＬ、５分撹拌）×３回、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、３ｍＬ、５分撹拌）×３回にて洗浄を行った。続いて、コントロールタンパク質として、HSA(66.5KDa)、fibrinogen(340KDa)、γ-globrin(from Human Blood)(150KDa)についても終濃度が1.45nMになるよう添加し、それぞれ、ＡＦＰの場合と同様の操作を行い、基板センサの蛍光強度の測定及び洗浄を行った。タンパク質吸着試験の結果を図９に示す。
【符号の説明】
【０１５４】
ＢＧ１，ＢＧ２，ＢＧ３…（標的物質の）結合性基
ｂｇ１，ｂｇ２，ｂｇ３…結合性基
ｂｇ１’，ｂｇ２’，ｂｇ３’…結合性基
ＲＶ１，ＲＶ２，ＲＶ３…可逆的連結基
ＦＭ１，ＦＭ３，ＦＭ５１，ＦＭ５２，ＦＭ６，ＦＭ１２，ＦＭ１１１，ＦＭ１１２…機能性モノマー
Ｓ１，Ｓ２，Ｓ３…基板
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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