(57)【要約】  Ａβタンパク質の産生を特異的に阻害し、アルツハイマー病に対する治療及び／又は予防の為の薬剤の有効成分となる化合物を提供する。本発明にかかるＡβタンパク質特異的産生抑制剤は、配列番号１に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWVYRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)を含み、βセクレターゼ及びγセクレターゼの双方の活性を阻害することを特徴とする。配列番号１に記載されているアミノ酸配列からなるペプチドはアルツハイマー病の予防及び／又は治療に利用できる。
2020040106.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓ４ペプチド(FGBTWDYWVYR、ＢはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)のＮ末側及び／又はＣ末側に、一つ又は複数のＲを付加したＳ４’ペプチド、又は、
該Ｓ４’ペプチドのアミノ酸配列においてＶ又は該ＶのＣ末側のＹが欠失又は置換されているアミノ酸配列からなるＳ４’’ペプチド
を含み、βセクレターゼ及び／又はγセクレターゼの活性を阻害することを特徴とする、Ａβタンパク質特異的産生抑制剤。
【請求項２】
配列番号１に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWVYRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)を含み、βセクレターゼ及び／又はγセクレターゼの活性を阻害することを特徴とする、請求項1記載のＡβタンパク質特異的産生抑制剤。
【請求項３】
配列番号１に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWVYRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)を含み、βセクレターゼの活性を阻害することを特徴とする、請求項1記載のＡβタンパク質特異的産生抑制剤。
【請求項４】
配列番号１に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWVYRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)を含み、γセクレターゼの活性を阻害することを特徴とする、請求項1記載のＡβタンパク質特異的産生抑制剤。
【請求項５】
配列番号３に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWVYRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)を含み、βセクレターゼ及び／又はγセクレターゼの双方の活性を阻害することを特徴とする、請求項1記載のＡβタンパク質特異的産生抑制剤。
【請求項６】
配列番号４に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(RFGBTWDYWVYR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)を含み、βセクレターゼ及び／又はγセクレターゼの双方の活性を阻害することを特徴とする、請求項1記載のＡβタンパク質特異的産生抑制剤。
【請求項７】
配列番号６に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWYRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)を含み、βセクレターゼ及び／又はγセクレターゼの双方の活性を阻害することを特徴とする、請求項1記載のＡβタンパク質特異的産生抑制剤。
【請求項８】
配列番号７に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWVRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)を含み、βセクレターゼ及び／又はγセクレターゼの双方の活性を阻害することを特徴とする、請求項1記載のＡβタンパク質特異的産生抑制剤。
【請求項９】
配列番号１に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWVYRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)、配列番号３に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWVYRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)、配列番号４に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(RFGBTWDYWVYR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)、配列番号６に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWYRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)、又は、配列番号７に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWVRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)を含むことを特徴とする、アルツハイマー病の予防及び／又は治療剤。
【請求項１０】
配列番号１に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWVYRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)。
【請求項１１】
配列番号３に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWVYRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)。
【請求項１２】
配列番号４に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(RFGBTWDYWVYR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)。
【請求項１３】
配列番号６に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWYRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)。
【請求項１４】
配列番号７に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWVRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)。
【請求項１５】
アルツハイマー病を治療及び／又は予防するための、医薬の製造のための、配列番号１にて示されるアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWVYRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)、配列番号３に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWVYRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)、配列番号４に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(RFGBTWDYWVYR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)、配列番号６に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWYRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)、又は、配列番号７に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWVRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)の使用。
【請求項１６】
軽度認知障害(MCI)を治療及び／又は予防するための、医薬の製造のための、配列番号１にて示されるアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWVYRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)、配列番号３に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWVYRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)、配列番号４に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(RFGBTWDYWVYR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)、配列番号６に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWYRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)、又は、配列番号７に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWVRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ａβタンパク質特異的産生抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
認知症は８５歳以上の日本人口の約２５％が発症するcommon diseaseであるが、アルツハイマー病(Alzheimer's disease)がそのうち約半数を占めている。アルツハイマー病は、認知機能低下や人格の変化を主な症状とする認知症の一種である。現在の日本には３００万人を超えるアルツハイマー病患者が推計され、今後の高齢化に従い患者数は増加の一途を辿る。【０００３】
アルツハイマー病の発症のメカニズムとしてアミロイドカスケード説が提唱されている。アミロイドカスケードとは、加齢に伴うアミロイド蓄積が引き金となり、炎症反応、異常蛋白であるタウの神経細胞内蓄積、最終的には神経細胞の機能不全や変性（細胞死）に至る複雑な経路の呼称である。即ち、非特許文献１及び非特許文献２に記載されるように、Ａβタンパク質は、細胞膜貫通タンパク質であるアミロイド前駆体タンパク質（以下、本明細書にてＡＰＰと称することがある。）がβセクレターゼによって切断された細胞膜貫通タンパク質であるβＣＴＦ（Ｃ９９）が、更にγセクレターゼにて切断されて細胞膜から遊離し、脳内にて蓄積するものと考えられている。【０００４】
γセクレターゼにて切断されたＣ９９はＡβタンパク質と、ＡＩＣＤとに分けられることが知られており、ＡＰＰがβセクレターゼによって切断されることにより、ｓＡＰＰβが遊離することも知られている（図１）。【０００５】
以上のことから、βセクレターゼの阻害剤及びγセクレターゼの阻害剤は、アルツハイマー病の原因タンパク質である、Ａβタンパク質の蓄積を抑制する効果を発揮する剤として考えられる。【０００６】
ところが、それぞれ膜貫通タンパク質であるＰｅｎ−２、プレセニリン、ニカストリン、及びＡｐｈ−１を含む複合体として知られるγセクレターゼは、アスパラギン酸プロテアーゼに属し、上述のＡＰＰのみならずＡＰＬＰ１、ＡＰＬＰ２、Ｎｏｔｃｈ、Ｊａｇｇｅｄ２、Ｄｅｌｔａ１、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＣＤ４４、ＥｒｂＢ４、Ｎｅｃｔｉｎ１、ＬＲＰ１等といった膜貫通タンパク質、レセプター等も基質とするプロテアーゼである。【０００７】
従って、Ａβタンパク質の産生抑制作用を得るために、Ｌ−６８５，４５８、ＤＡＰＴ、ＬＹ−４１１，５７５等といったγセクレターゼの活性阻害剤を使用すれば、上述のＣ９９以外のタンパク質に対するγセクレターゼのプロテアーゼとしての酵素活性までもが抑制されてしまい、かかる阻害剤をそのまま薬剤として用いれば、副作用が生じるといった可能性が危惧されている。【０００８】
例えば、γセクレターゼの阻害剤の１つであるＬＹ−４１１，５７５は、胸腺を萎縮させることや脾臓における成熟Ｂ細胞の細胞数を減少させること等が報告されており、このような阻害剤をそのまま医薬組成物とした場合、免疫等の点で副作用を引き起こす可能性が示唆されている（非特許文献３）。さらに、γセクレターゼの酵素活性そのものを低下させると、皮膚の異常、扁平上皮ガン、脾臓の肥大等を引き起こすことも報告されている（非特許文献４）。【０００９】
非ステロイド性抗炎症薬（以下、本明細書でＮＳＡＩＤｓと称することがある。）がＡβタンパク質の産生抑制剤として有効であるといった知見が存在するが、いくつかの家族性アルツハイマー病（例えば、プレセニリンの変異を有する場合。）には、効果がないことが知られている（非特許文献５）。さらに軽度認知障害やアルツハイマー病患者から分離したγセクレターゼは活性が変化しており、Ａβ４２を低下させるγセクレターゼモヂュレーターの効果が低いことがわかった（非特許文献６）。【００１０】
また、βＣＴＦの細胞外領域であるＮ末端にＦＬＡＧタグを付して発現させた場合、抗ＦＬＡＧ抗体の存在下では、γセクレターゼによる分解が見られない（非特許文献７）。【００１１】
特許文献１と２には、γセクレターゼが切断するたんぱく質の特性（長さ）に着目し、γセクレターゼがＡβのもととなるたんぱく質（Ｃ９９）の先端部分を捕らえて切断することにより、Ａβを産生することに着目し、そして、Ｃ９９の先端部分に結合するベプチド試薬（Ｃ９９結合ペプチド）を開発し、その効果を検討したところ、γセクレターゼがＣ９９の先端部分を捕らえることができず、切断できないことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特許６１６８９９８号公報
【特許文献２】Funamoto,S.et al. Nat.Commun.2013;4:2529. doi:10.1038/ncomms3529
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Yankner BADuffy LK, Kirschner DA.1990.Neurotrophic and neurotoxic effects of amyloid beta protein: Reversal by tachykinin neuropeptides. Science 250:p.279-p.282.
【非特許文献２】Hyman BT. 1998. New neuropathological criteria for Alzheimer disease. Arch. Neural. 55:p.1174-p.1176.
【非特許文献３】Wong,G.  T.et  al.J.Biol.Chem.2004;279:12876-12882
【非特許文献４】Choi,S.H.et  al.J.Neurosci.2007;27:13579-13580
【非特許文献５】Page,R.M.et  al.J.Biol.Chem.2008;283:677-683
【非特許文献６】Kakuda,N.et  al.EMBO  Mol.Med.2012;4:344-352
【非特許文献７】Shah,S.et  al.Cell.2005;122:435-447
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、Ａβタンパク質の産生を特異的に阻害し、アルツハイマー病に対する治療及び／又は予防の為の薬剤の有効成分となる化合物を開発することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明にかかるＡβタンパク質特異的産生抑制剤は、配列番号２に記載されているＳ４ペプチド(FGBTWDYWVYR、ＢはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)のＮ末側及び／又はＣ末側に、一つ又は複数のＲを付加したＳ４’ペプチド、又は、該Ｓ４’ペプチドのアミノ酸配列においてＶ又は該ＶのＣ末側のＹが欠失又は置換されているアミノ酸配列からなるＳ４’’ペプチドを含み、βセクレターゼ及び／又はγセクレターゼの活性を阻害することを特徴とする。【００１６】
本発明にかかるＡβタンパク質特異的産生抑制剤は、配列番号１に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWVYRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)を含み、βセクレターゼ及びγセクレターゼの双方の活性を阻害することを特徴とする。【００１７】
本発明にかかるＡβタンパク質特異的産生抑制剤は、配列番号１に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWVYRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)を含み、βセクレターゼの活性を阻害することを特徴とする。【００１８】
本発明にかかるＡβタンパク質特異的産生抑制剤は、配列番号１に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWVYRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)を含み、γセクレターゼの活性を阻害することを特徴とする。【００１９】
本発明にかかるＡβタンパク質特異的産生抑制剤は、配列番号３に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWVYRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)を含み、βセクレターゼ及び／又はγセクレターゼの双方の活性を阻害することを特徴とする。【００２０】
本発明にかかるＡβタンパク質特異的産生抑制剤は、配列番号４に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(RFGBTWDYWVYR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)を含み、βセクレターゼ及び／又はγセクレターゼの双方の活性を阻害することを特徴とする。【００２１】
本発明にかかるＡβタンパク質特異的産生抑制剤は、配列番号６に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWYRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)を含み、βセクレターゼ及び／又はγセクレターゼの双方の活性を阻害することを特徴とする。【００２２】
本発明にかかるＡβタンパク質特異的産生抑制剤は、配列番号７に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWVRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)を含み、βセクレターゼ及び／又はγセクレターゼの双方の活性を阻害することを特徴とする。【００２３】
本発明にかかるアルツハイマー病の予防及び／又は治療剤は、配列番号１に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWVYRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)、配列番号３に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWVYRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)、配列番号４に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(RFGBTWDYWVYR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)、配列番号６に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWYRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)、又は、配列番号７に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWVRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)を含むことを特徴とする。【００２４】
本発明にかかるペプチドは、配列番号１に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWVYRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)である。【００２５】
本発明にかかるペプチドは、配列番号３に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWVYRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)である。【００２６】
本発明にかかるペプチドは、配列番号４に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(RFGBTWDYWVYR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)である。【００２７】
本発明にかかるペプチドは、配列番号６に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWYRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)である。【００２８】
本発明にかかるペプチドは、配列番号７に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWVRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)である。  本発明にかかるペプチドの使用は、アルツハイマー病を治療及び／又は予防するための、医薬の製造のための、配列番号１にて示されるアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWVYRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)、配列番号３に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWVYRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)、配列番号４に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(RFGBTWDYWVYR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)、配列番号６に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWYRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)、又は、配列番号７に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWVRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)の使用である。【００２９】
本発明にかかるペプチドの使用は、軽度認知障害(MCI)を治療及び／又は予防するための、医薬の製造のための、配列番号１にて示されるアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWVYRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)、配列番号３に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWVYRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)、配列番号４に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(RFGBTWDYWVYR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)、配列番号６に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWYRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)、又は、配列番号７に記載されているアミノ酸配列からなるペプチド(FGBTWDYWVRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)の使用である。
【発明の効果】
【００３０】
本発明によれば、Ａβタンパク質の産生を特異的に阻害することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】Ａβタンパク質、Ｃ９９、ＡＰＰ、ｓＡＰＰβ、及びＡＩＣＤと、γセクレターゼ並びにβセクレターゼの切断部位を示す模式図である。
【図２】ペプチド#4、S4、S4R、S4RR及びRS4において、in vitro γセクレターゼアッセイ結果(biochemical assay)であり、Ａβタンパク質の産生とＮｏｔｃｈタンパク質の切断の確認結果を示す図である。
【図３】ペプチド#4、S4、S4R、S4RR及びRS4において、in vitro 培養細胞でのアッセイ結果(cell-based assay)であり、細胞内に産生されるAβ量と細胞外に分泌されるAβ量を示す図である。
【図４】ペプチドS4R及びS4RRにおいて、in vitro 培養細胞でのアッセイ結果(cell-based assay)であり、細胞外に分泌されるAβ量を示す図である。
【図５】ペプチドT4Δ、W5Δ、D6Δ及びY7Δにおいて、in vitro 培養細胞でのアッセイ結果(cell-based assay)であり、細胞内に産生されるAβ量と細胞外に分泌されるAβ量を示す図である。
【図６】ペプチドW8Δ、V9Δ及びY10Δにおいて、in vitro 培養細胞でのアッセイ結果(cell-based assay)であり、細胞内に産生されるAβ量と細胞外に分泌されるAβ量を示す図である。
【図７】ペプチドS4RRを腹腔内投与したマウスの大脳中のＡβの減少を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
【００３３】
本実施形態にかかるＡβタンパク質特異的産生抑制剤は、Ｓ４ペプチド(FGBTWDYWVYR、ＢはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である)のＮ末側及び／又はＣ末側に、一つ又は複数のＲを付加したＳ４’ペプチド、又は、該Ｓ４’ペプチドのアミノ酸配列においてＶ又は該ＶのＣ末側のＹが欠失又は置換されているアミノ酸配列からなるＳ４’’ペプチドを含み、βセクレターゼ及び／又はγセクレターゼの活性を阻害する。
【００３４】
Ｓ４’ペプチドは、特に限定されるものではないが、例えば下記である。
FGBTWDYWVYRR(配列番号３)  →Ｓ４Ｒ
RFGBTWDYWVYR(配列番号４)  →ＲＳ４
RFGBTWDYWVYRR(配列番号８) 
RRFGBTWDYWVYRR(配列番号９) 
RFGBTWDYWVYRRR(配列番号１０)
RRFGBTWDYWVYR(配列番号１１)
FGBTWDYWVYRRR(配列番号１)  →Ｓ４ＲＲ
RRFGBTWDYWVYRRR(配列番号１２)
Ｓ４’’ペプチドは、特に限定されるものではないが、例えば下記である。
FGBTWDYWYRRR(配列番号６)  →V9Δ
FGBTWDYWVRRR(配列番号７)  →Y10Δ
好ましくは本実施形態にかかるＡβタンパク質特異的産生抑制剤は、配列番号１に記載されているアミノ酸配列からなるペプチドを含み、具体的にはそのペプチドはFGBTWDYWVYRRRである。ここでBはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である。このペチドは改変型Ｃ９９結合ペプチド(Ｓ４ＲＲ)と称することが可能である。
【００３５】
配列番号１にて示されるアミノ酸配列を有する本発明にかかるペプチドにおいて、２番目のグリシンのカルボキシル基と上記L-4,4’ビフェニルアラニンのアミド基がペプチド結合しており、４番目のスレオニンのアミド基と上記L-4,4’ビフェニルアラニンのアミド基がペプチド結合している。
【００３６】
本発明にかかるペプチドは、適宜修飾が施されていてもよい。具体的には、ビオチン修飾、蛍光色素修飾、糖鎖修飾、脂質修飾等が挙げられ、これらの何れかに限定されるものではない。このような修飾箇所は、特に限定されるものではなく、ペプチド内部、ペプチドのＣ末端、又はペプチドのＮ末端の何れであってもよい。これらの修飾方法は、公知の方法を採用すればよく、特に限定されるものではない。
【００３７】
本発明にかかるペプチドはＣ９９のＮ末端領域に結合する。Ｃ９９とは、βＣＴＦとも称され、ＡＰＰ（例えばＮＣＢＩのAccession No Q95241.1等に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質）が、βセクレターゼによって切断された産物であるために、Ｃ９９のＮ末端領域に結合するということは、ＡＰＰに結合するということ同意である。そして、Ｃ９９のＮ末端領域とは、ＡＰＰからすれば、βセクレターゼの切断認識部位付近に該当するものである。そのため本発明にかかるペプチドは、βセクレターゼの活性阻害剤として有用である。
【００３８】
また、Ｃ９９のＮ末端領域付近はγセクレターゼによっても認識及び切断され、切断後の断片がＡβタンパク質（例えばＮＣＢＩのAccession No 1Z0Q_A、1BA6_A）に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質）として産生されるため、Ｃ９９のＮ末端領域に結合するということは、Ａβタンパク質に結合するということ同じ意味である。
【００３９】
本発明にかかるペプチドは、種々の溶媒に可溶であり、その具体的な溶媒は特に限定されることはないが、例えば水、ＰＢＳ、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ等の溶媒が挙げられる。また、これらの溶媒を二種以上組み合わせて用いてもよい。
【００４０】
本発明にかかるペプチドは、Ｃ９９のＮ末端領域に結合する。上述のように当該領域は、γセクレターゼのＣ９９切断認識部位付近に該当する領域であることから、γセクレターゼの活性阻害剤として有用である。このように本発明にかかるペプチドは、βセクレターゼ及びγセクレターゼの双方の活性を阻害する。
【００４１】
本発明にかかるペプチドは、公知の方法によって作製することが出来る。具体的には、ペプチド合成機などを用いた化学的な製造方法を採用してもよいし、ペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸を宿主細胞に導入して、生化学的な合成方法を採用してもよい。
【００４２】
本発明にかかるペプチドは上述のようにＣ９９のＮ末端領域に結合する。本発明にかかるペプチドは、このような現象に基づいて機能を発揮するために、ＡＰＰ以外の他の基質に対するβセクレターゼ活性もγセクレターゼ活性も阻害しない傾向となる。即ち、本発明のペプチドは、ＡＰＰ特異的なβセクレターゼ阻害活性及びγセクレターゼ阻害活性を有する。
【００４３】
Ｃ９９特異的とは、Ｃ９９とその他の候補基質が同時に存在している場合に、Ｃ９９をより活性を阻害する基質として選択する傾向であることを示す。
【００４４】
本発明にかかるペプチドに、本発明にかかるペプチド以外の他の成分が含有される場合、その具体的な他の成分は、βセクレターゼ及びγセクレターゼの双方の活性阻害効果を減少させない限り、特に限定されるわけではないが、例えば防腐剤、殺菌剤、安定剤等といった公知の剤が含まれていてもよい。
【００４５】
上述した本発明にかかるペプチドは、アルツハイマー病の予防及び／又は治療における使用に好適である。また、上述した本発明にかかるペプチドは、アルツハイマー病の治療及び／又は予防するための、医薬の製造のための使用に好適である。
【００４６】
本発明にかかるアルツハイマー病治療及び／または予防剤は、上述の本発明のペプチドを含むものであるが、当該ペプチドは特にＡβタンパク質特異的産生抑制作用を発揮することから、本発明にかかるアルツハイマー病治療及び／又は予防剤は、副作用が低いといった顕著な効果を発揮する。
【００４７】
本発明にかかるアルツハイマー病の治療及び／又は予防剤に、本発明にかかるペプチド以外の他の成分が含有される場合、その具体的な他の成分は、アルツハイマー病の治療及び／又は予防効果を減少させない限り、薬学的に許容可能な担体或いは添加物が含まれていてもよい。
【００４８】
薬学的に許容可能な担体又は添加物とは、任意の担体、希釈剤、賦形剤、懸濁剤、潤滑剤、アジュバント、媒体、乳化剤、吸収剤、保存剤、界面活性剤、着色剤、香料、或いは甘味料を意味し、これらの中でも公知のものを適宜採用すればよい。
【００４９】
本発明にかかるアルツハイマー病の治療及び／又は予防剤の剤型は、たとえば錠剤、散剤、シロップ剤、ハップ剤、注射剤、点滴剤等が挙げられ、特に限定はされないが、注射剤又は点滴剤とすることが好ましい。このような注射剤や点滴剤は、水性であっても、非水性であっても、懸濁性であっても良い。また、用時調製型の剤型であってもよい。
【００５０】
本発明にかかるアルツハイマー病の治療及び／又は予防剤は、アルツハイマー病に罹患した患者に投与する工程を含む免疫疾患の治療方法における利用可能性を有している。また、アルツハイマー病の病態や症状を発症していないものの、アルツハイマー病の素因を持ち得る患者に投与する工程を含むアルツハイマー病の予防方法における利用可能性も有する。さらに、アルツハイマー病発症前段階の軽度認知障害（例えばＭＭＳＥ２６点以下等）を呈する者においても利用可能性を有する。軽度認知障害（MCI）は、認知症に至らない程度の認知機能障害が生じる症例であり、基本的な日常生活に支障がない状態ではあるが、重要な約束を忘れたり、初めての場所へ旅行することが困難となる等の症状が生じる疾患である。MCIの段階でもアルツハイマー型認知症と同様にアルツハイマー病の原因である脳内アミロイドベータの蓄積が認められる。そのため本発明にかかるペプチドは、MCIを治療及び／又は予防するための、医薬の製造のために使用できる。
【００５１】
本発明のアルツハイマー病患者とは、特に限定はされないが、例えば、記憶障害、見当識障害、学習障害、注意障害、空間認知機能、問題解決能力の障害等といった、徐々に進行する認知障害等の症状を呈する患者であり、その所見として画像診断等で大脳皮質に老人斑（Ａβタンパク質の沈着像）が存在すると診断される患者；びまん性の脳萎縮が存在すると診断される患者；タウタンパク質、Ａβ等の髄液バイオマーカー、血液バイオマーカー等で診断された患者であればよい。
【００５２】
本発明にかかるアルツハイマー病の治療及び／又は予防剤の投与量並びに投与方法は、対象とする患者の性別、人種、年齢、全身状態、疾患の重篤度等に応じて、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの範囲で適宜設定することができる。
【００５３】
本発明にかかるアルツハイマー病の治療及び／又は予防剤は、上記の量を一日に一度に投与してもよく、数回に分けて投与してもよい。また、上記疾患に対する治療効果を有する範囲において、投与間隔は、毎日、隔日、毎週、隔週、２〜３週毎、毎月、隔月または２〜３ヶ月毎でもよい。投与方法は、例えば経口、筋肉内、静脈内、動脈内、くも膜下腔内、皮内、腹腔内、鼻腔内、肺内、眼内、腟内、頸部内、直腸内、皮下等へ投与する方法が挙げられ、特に限定はされない。
【実施例】
【００５４】
１．ペプチドの作製
配列番号１〜７に記載されているアミノ酸配列からなるペプチドをペプチドスクリーニング技術にて製造した。
配列番号１  S4RR  FGBTWDYWVYRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である
配列番号２  S4    FGBTWDYWVYR、  BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である
配列番号３  S4R   FGBTWDYWVYRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である
配列番号４  RS4   RFGBTWDYWVYR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である
配列番号５  ＃4   MHLVICDCYCTTDICYCYSCTPN
配列番号６  V9Δ  FGBTWDYWYRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である
配列番号７  Y10Δ  FGBTWDYWVRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である
下記に示す実験において、上述の配列番号１〜７に示すアミノ酸配列を有するペプチドは全てＤＭＳＯに溶かした状態で使用した。【００５５】
２．可溶化γセクレターゼ活性評価
・γセクレターゼ画分の調製
HEK293の破砕液から100,000 x G １時間の超遠心の沈殿を膜画分とし、これを250 mMショ糖と1% CHAPSO（界面活性剤）を含むPIPES緩衝液で可溶化後、100,000 x G １時間の超遠心で得た上清をγセクレターゼ画分とした（Nakuda et al., J. Biol. Chem. 2006）。【００５６】
・γセクレターゼ基質の調製
sf9細胞にγセクレターゼ基質（C99やNotch）のバキュロウイルスを感染させ、３６時間後に細胞を遠心で回収した。細胞の沈殿をPEPES緩衝液で懸濁し（0.5 ml程度）、等量の2% NP-40を含むPEPES緩衝液で可溶化し、100,000 x G １時間の超遠心で上清を得た。この上清に対して、抗FLAG抗体アガロースビーズを添加し、一晩撹拌し基質タンパク質を回収する。ビーズから基質タンパク質を0.2 Mグリシン（pH 2.0）で溶出し、Tris緩衝液で中和後に、タンパク質定量を行い、精製標品とした。【００５７】
・ペプチド
各種ペプチド#4、S4、S4R、S4RR及びRS4(配列番号１〜５)は、Fmoc固相合成法を利用したintavis社ResPeP SLDペプチド合成機で、またはSynPeptide社に合成委託した。いずれの場合もN末にアセチル基、C末にアミド基の修飾をした。各ペプチドはDMSOに溶解し、20 mM溶液を調製した。【００５８】
・各種ペプチドのγセクレターゼ反応系での評価（Biochemical assay）
γセクレターゼ画分を、250 mMショ糖と各種プロテアーゼ阻害剤カクテルを含むPIPES緩衝液で４倍に希釈しγセクレターゼ溶液とした。γセクレターゼ溶液に、１／１０量の1%ホスファチジルコリンと各種基質ならびに所定の濃度の各種ペプチドを添加し、37℃で４時間反応させた。ウエスタンブロット法により反応液中の産生A?量やNotch切断量を検討した。結果を図２に示す。図２に示されるように、S4は1μM〜10μMにおいてAβ量を十分に減少させていないが、S4R、RS4及びS4RRのいずれも1μM〜10μMにおいてAβ量を十分に減少させた。またS4R、RS4及びS4RRのいずれも1μM〜10μMにおいてNotch切断を抑制していた。【００５９】
３．培養細胞での解析
ＡＰＰタンパク質を安定に発現し、且つ、一過的にＮｏｔｃｈを発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞（７ＷＤ１０細胞）に対して、各種ペプチド#4、S4、S4R、S4RR及びRS4(配列番号１〜５)を作用させて、Ａβタンパク質の産生と、Ｎｏｔｃｈタンパク質の切断を確認する実験を行った。【００６０】
上記細胞の培養液に、上記５種類のペプチドをそれぞれ最終濃度が１０、２０、並びに４０μＭとなるように添加した。その後、細胞培養液（Ｍｅｄｉｕｍ）或いは細胞破砕液（Ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）中に含まれるｓＡＰＰβ、ＮＩＣＤ、Ｃ９９（βＣＴＦ）、及びＡβタンパク質（細胞溶解液中に存在するものをintracellular Aβとし、細胞培養液中に存在するものをextracellular Aβとする）それぞれ認識する抗体を用いたウエスタンブロッティング法にて確認した。【００６１】
図３では、全てのペプチドを添加した場合に、その添加した濃度にかかわらず細胞溶解液中にＮＩＣＤの存在量を減少させないことが明らかに示されている。そのため配列番号１にかかるペプチドが他のペプチドと同様に基質特異性があることが示されている。【００６２】
また、図３では、配列番号１にかかるペプチドが他のペプチドと比較して優れたＣ９９の減少効果を示しており、また配列番号１にかかるペプチドが他のペプチドと比較して、優れたβセクレターゼの活性阻害効果を有することを示している。【００６３】
また、配列番号１にかかるペプチドが他のペプチドと比較して優れたＡβタンパク質の減少効果を示しており、また配列番号１にかかるペプチドが他のペプチドと比較して、優れたγセクレターゼの活性阻害効果を有することを示している。【００６４】
配列番号３にかかるペプチドS4R及び配列番号４にかかるペプチドRS4は、ともに細胞内に産生されるAβを十分には減少させてはいない。しかし、配列番号３にかかるペプチドS4R及び配列番号４にかかるペプチドRS4は、ともにS4と比較して、細胞外に分泌されるAβを十分に減少させている。APPはN末端側が細胞外に配向し、細胞膜を1回貫通する膜タンパク質で、まずβセクレターゼで細胞外ドメインが切断されてC99となり、さらにC99がγセクレターゼによって切断され、約40個のアミノ酸でできたAβとなるが、このとき細胞内で産生されるAβ42は少量作られ、細胞外に分泌されるAβ40は多く産生される。S4R及びRS4は、ともに、多く産生される細胞外に分泌されるAβを十分に減少させる点において、S4と比較して優れた効果を有する。【００６５】
図４は、S4R及びS4RRにおいて、細胞外に分泌されるAβの減少量をグラフ化したものである。S4R及びS4RRはともに濃度依存的に細胞外に分泌されるAβ量を減少させていることが明白である。なお図４には記載していないが図３に示されているようにRS4も濃度依存的に細胞外に分泌されるAβ量を減少させる。【００６６】
４．短鎖化ペプチドの検討
下記に記載されているアミノ酸配列からなるペプチドをFmoc固相合成法を利用したintavis社ResPeP SLDペプチド合成機で製造した。N末にアセチル基、C末にアミド基の修飾をした。各ペプチドはDMSOに溶解し、20 mM溶液を調製した。
配列番号１３  T4Δ  FGBTWDYWYVRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である
配列番号１４  W5Δ  FGBTWDYWYVRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である
配列番号１５  D6Δ  FGBTWDYWYVRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である
配列番号１６  Y7Δ  FGBTWDYWYVRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である
配列番号１７  W8Δ  FGBTWDYWYVRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である
配列番号６  V9Δ  FGBTWDYWYRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である
配列番号７  Y10Δ  FGBTWDYWVRRR、BはＬ-4,4’ビフェニルアラニン残基である
24-wellプレートに、2.5 × 104細胞/ wellの密度でAPPとΔE Notchを共発現するCHO細胞を播種し、翌日に所定の濃度の各種ペプチドを含む培地と交換した。ペプチドの最終濃度は10μMであった。24時間培養後、ウエスタンブロット法により、分泌A?量やNotch切断量などを検討した。図５は、T4Δ、W5Δ、D6Δ及びY7Δにおいて、細胞内に産生されるAβ量及び細胞外に分泌されるAβ量を検討したものである。図６は、W8Δ、V9Δ及びY10Δにおいて、細胞内に産生されるAβ量及び細胞外に分泌されるAβ量を検討したものである。図５及び図６に示されるように４位、５位、６位、７位又は８位の欠失は、細胞内に産生されるAβ量の抑制活性を喪失させるとともに、細胞外に分泌されるAβ量の抑制活性を喪失させる。しかしながら図５及び図６に示されるように９位又は１０位の欠失は、細胞内に産生されるAβ量の抑制活性が維持されており、細胞外に分泌されるAβ量の抑制活性も維持していることが判明した。【００６７】
５．動物への投与
１０匹のＡＰＰノックインマウス(ノックイン技法により作製されたマウス)の腹腔内に、ＤＭＳＯに溶解した配列番号１にかかるペプチドを２００，４００，１０００nmol/マウス投与した。投与は５日連続して行い、５日の後にマウスを安楽死させ、大脳を摘出した。【００６８】
摘出した大脳を公知の方法で溶解し、抗４Ｇ８抗体で免疫沈降を行った後に、抗マウスＡβ抗体を用いたウエスタンブロッティングに供した。陰性対照として、ＤＭＳＯのみを投与した群（１０匹）も同様に実験を行った。【００６９】
また、ウエスタンブロッティングでは、２、１０、５０、及び２００ｐｇのゲッ歯類由来のＡβを標準物質として実験を行った。【００７０】
図７に示されるように配列番号１にかかるペプチドを腹腔内投与したマウスでは、大脳中のＡβを示すバンドが減少する事が明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
アルツハイマー病の予防及び／又は治療に利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【００７２】
配列番号１〜５：合成ペプチド
【図１】
2020040106.tif 000003
【図２】
2020040106.tif 000004
【図３】
2020040106.tif 000005
【図４】
2020040106.tif 000006
【図５】
2020040106.tif 000007
【図６】
2020040106.tif 000008
【図７】
2020040106.tif 000009
【配列表】
2020040106000001.app
【国際調査報告】
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2020040106.tif 000011
2020040106.tif 000012
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