(57)【要約】【課題】  本発明は、ケロイドの発症に関する分子生物学的機構に基づいた、慢性炎症性疾患の新たな治療ターゲット及び治療法を提供することを目的とする。【解決手段】  本発明は、特定のNEDD4スプライシングバリアントタンパク質の発現を抑制する及び／又は活性を阻害する物質を有効成分として含有する、慢性炎症性疾患の予防及び／又は治療のための医薬に関する。また、採取された組織におけるNEDD4スプライシングバリアントタンパク質又はmRNAを検出する工程を含む、被験者の慢性炎症性疾患への易罹患性の判定方法及び慢性炎症性疾患に対する前記医薬による処置の適応性の判定方法、NEDD4タンパク質の発現を抑制する及び／又は活性を阻害する物質を有効成分として含有する慢性炎症性疾患の予防及び／又は治療のための医薬、並びにNEDD4の特定のSNPを検出する工程を含む、被験者の慢性炎症性疾患への易罹患性の判定方法もまた提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
NEDD4スプライシングバリアント3 タンパク質の発現を抑制する及び／又は活性を阻害する物質を有効成分として含有する、皮膚、腱又は腱周囲組織において発症する慢性炎症性疾患の予防及び／又は治療のための医薬。
【請求項２】
前記タンパク質の発現を抑制する物質が、NEDD4スプライシングバリアント3 mRNAの発現を抑制する又は当該mRNAからの当該タンパク質の翻訳を阻害する阻害性核酸である、請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
前記タンパク質の活性を阻害する物質が、当該タンパク質に特異的に結合する抗体又はその誘導体である、請求項１に記載の医薬。
【請求項４】
慢性炎症性疾患が、ケロイド、肥厚性瘢痕、乾癬、アトピー性皮膚炎、水疱性類天疱瘡、強皮症又はデュプイトラン拘縮である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項５】
被験者から採取された検体におけるNEDD4スプライシングバリアント3 タンパク質又はNEDD4スプライシングバリアント3 mRNAの発現量を測定する工程、測定された発現量を健常者から採取された検体におけるNEDD4スプライシングバリアント3 タンパク質又はNEDD4スプライシングバリアント3 mRNAの発現量と比較する工程、及び被験者における発現量が健常者における発現量よりも多い場合、被験者は皮膚、腱又は腱周囲組織において発症する慢性炎症性疾患に罹患しやすいと判定する工程を含む、被験者の慢性炎症性疾患への易罹患性を判定する方法。
【請求項６】
慢性炎症性疾患が、ケロイド、肥厚性瘢痕、乾癬、アトピー性皮膚炎、水疱性類天疱瘡、強皮症又はデュプイトラン拘縮である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
被験者から採取された検体におけるNEDD4スプライシングバリアント3 タンパク質又はNEDD4スプライシングバリアント3 mRNAの発現量を測定する工程、測定された発現量を健常者から採取された検体におけるNEDD4スプライシングバリアント3 タンパク質又はNEDD4スプライシングバリアント3 mRNAの発現量と比較する工程、並びに被験者における発現量が健常者における発現量よりも多い場合、NEDD4スプライシングバリアント3 タンパク質の発現を抑制する及び／又は活性を阻害する物質を有効成分として含有する医薬による処置が当該被験者における皮膚、腱又は腱周囲組織において発症する慢性炎症性疾患に適応可能であると判定する工程を含む、慢性炎症性疾患に対する前記医薬による処置の適応性を判定する方法。
【請求項８】
慢性炎症性疾患が、ケロイド、肥厚性瘢痕、乾癬、アトピー性皮膚炎、水疱性類天疱瘡、強皮症又はデュプイトラン拘縮である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
NEDD4タンパク質の発現を抑制する及び／又は活性を阻害する物質を有効成分として含有する、慢性炎症性疾患（ただしケロイドを除く）の予防及び／又は治療のための医薬。
【請求項１０】
前記タンパク質の発現を抑制する物質が、当該タンパク質をコードするmRNAの発現を抑制する又は当該mRNAからの当該タンパク質の翻訳を阻害する阻害性核酸である、請求項９に記載の医薬。
【請求項１１】
前記タンパク質の活性を阻害する物質が、当該タンパク質に特異的に結合する抗体又はその誘導体である、請求項９に記載の医薬。
【請求項１２】
慢性炎症性疾患が、関節炎、肥厚性瘢痕、乾癬、アトピー性皮膚炎、水疱性類天疱瘡、強皮症又はデュプイトラン拘縮である、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項１３】
被験者から採取された検体において、NEDD4遺伝子をコードするゲノム配列中に存在する配列番号43に示される塩基配列の26番目の塩基における遺伝子多型であるrs8032158を検出する工程、及び前記遺伝子多型における遺伝子型がC/C又はC/Tである場合、被験者は慢性炎症性疾患（ただしケロイドを除く）に罹患しやすいと判定する工程を含む、被験者の慢性炎症性疾患（ただしケロイドを除く）への易罹患性を判定する方法。
【請求項１４】
慢性炎症性疾患が、肥厚性瘢痕、乾癬、アトピー性皮膚炎、水疱性類天疱瘡、強皮症又はデュプイトラン拘縮である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
NEDD4スプライシングバリアント3 mRNAの発現を検出するためのプライマーセット又はプローブを含む、皮膚、腱又は腱周囲組織において発症する慢性炎症性疾患への易罹患性を判定するためのキット。
【請求項１６】
NEDD4スプライシングバリアント3 タンパク質に対する特異抗体を含む、皮膚、腱又は腱周囲組織において発症する慢性炎症性疾患への易罹患性を判定するためのキット。
【請求項１７】
NEDD4スプライシングバリアント3 mRNAの発現を検出するためのプライマーセット又はプローブを含む、皮膚、腱又は腱周囲組織において発症する慢性炎症性疾患の医薬による処置の適応性を判定するためのキットであって、前記医薬がNEDD4スプライシングバリアント3 タンパク質の発現を抑制する及び／又は活性を阻害する物質を有効成分として含有する医薬である、前記キット。
【請求項１８】
NEDD4スプライシングバリアント3 タンパク質に対する特異抗体を含む、皮膚、腱又は腱周囲組織において発症する慢性炎症性疾患の医薬による処置の適応性を判定するためのキットであって、前記医薬がNEDD4スプライシングバリアント3 タンパク質の発現を抑制する及び／又は活性を阻害する物質を有効成分として含有する医薬である、前記キット。
【請求項１９】
NEDD4遺伝子をコードするゲノム配列中に存在する、配列番号43に示される塩基配列の26番目の塩基における遺伝子多型であるrs8032158を検出するためのプライマーセット又はプローブを含む、慢性炎症性疾患（ただしケロイドを除く）への易罹患性を判定するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、NEDD4スプライシングバリアントタンパク質の発現を抑制する及び／又は活性を阻害する物質を有効成分とする慢性炎症性疾患の予防及び／又は治療のための医薬、NEDD4スプライシングバリアントタンパク質の発現量を指標とした慢性炎症性疾患への易罹患性判定方法、慢性炎症性疾患に対する前記医薬による処置の適応性の判定方法、NEDD4タンパク質の発現を抑制する及び／又は活性を阻害する物質を有効成分とする慢性炎症性疾患の予防及び／又は治療のための医薬、並びにNEDD4遺伝子上のSNPを指標とした慢性炎症性疾患への易罹患性判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ケロイド（keloid）は、外傷又は手術等による瘢痕の線維成分が過剰に増殖する、免疫細胞群が関与する慢性炎症性皮膚疾患である。組織学的所見の特徴としては、真皮線維芽細胞の増殖と細胞外マトリクスであるコラーゲン線維の不規則かつ過剰な増生を主体とする。ケロイドは、良性線維増殖性病変に分類されているが、赤褐色に隆起した硬い腫瘤が形成されることで容姿が損なわれたり、また多くの場合、激しい痒みや痛みを伴ったり、特に腫瘤の形が複雑で表面の凹凸が激しいものは深部感染による排膿を繰り返したり等、患者のQOLを大きく損なう疾患の１つである。【０００３】
日本人のケロイド患者を対象としたゲノム解析によって見出されたケロイド感受性遺伝子（susceptability gene）の１つとして、NEDD4（neural precursor cell expressed developmentally down-regulated protein 4, E3 ubiquitin protein ligase；NEDD4-1とも呼ばれる）が知られている（非特許文献１）。NEDD4遺伝子にコードされるタンパク質は、ユビキチンリガーゼの一つであり、膜タンパク質の制御やシグナル伝達への関与、タンパク質分解等に関与することが知られている。【０００４】
ケロイドとNEDD4との関係については、前述のNakashimaらの報告の他に、NEDD4が線維芽細胞の増殖能及び浸潤性を高め、またフィブロネクチン及びＩ型コラーゲンの発現を増加させて細胞外マトリクスの過剰蓄積に関与するとの報告（非特許文献２）があり、NEDD4の発現上昇がケロイドの形成に関与し得ると考えられている。また、NEDD4と炎症性疾患との関連については、NEDD4遺伝子とHIVのgag遺伝子及びenv遺伝子とを共投与したマウスにおいて、脾臓細胞のgag応答性IL-6発現が亢進するとの報告（非特許文献３）がある。なお、用語「NEDD4」は、本明細書では、NEDD4遺伝子、当該NEDD4遺伝子にコードされるユビキチンリガーゼであるNEDD4タンパク質又はそれらを纏めて表す用語であり、特に明示して断らない限り、いずれを意味するかは文脈に応じて定められる。【０００５】
ケロイドの治療は、外用療法（例としてステロイド軟膏やクリームの塗布）、内服療法（例としてトラニラスト）、ステロイド局所注射療法等の薬物を用いた方法の他、冷凍療法、手術療法、放射線療法等を追加又は組み合わせて行われている。しかしながら、外傷を誘因とする線維成分の過剰増殖に関する分子生物学的機構が解明されていないこともあり、有効かつ再発等の副作用が少ない治療法は確立されていないのが現状である。【０００６】
また、ケロイドの類縁病変である肥厚性瘢痕（Hypertrophic scar）や乾癬、褥瘡といった他の慢性炎症性皮膚疾患、これに加えて、関節炎等の皮膚以外の部位に生じる慢性炎症性疾患についても、その予防及び／又は治療のための有効な医薬の開発が依然として望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Nakashima et al., Nat. Genet., 2010, 42, 768-771.
【非特許文献２】Chung et al., Proc. Jpn. Acad. Ser. B 2011, 87, 563-73.
【非特許文献３】Lewis et al., PLoS One. 2014, 9(3), e91267.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ケロイドの発症に関する分子生物学的機構に基づいた、慢性炎症性疾患の新たな治療ターゲット及び治療法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ケロイド患者の皮膚組織において特定のNEDD4のスプライシングバリアント（splicing variant、transcript variantともいう）の発現が亢進していること、及び当該スプライシングバリアントがIL-6及びNF-κBが関与する炎症回路を正に制御していることを見出し、以下の発明を完成させた。【００１０】
（１）NEDD4スプライシングバリアント3（SP3）タンパク質の発現を抑制する及び／又は活性を阻害する物質を有効成分として含有する、皮膚、腱又は腱周囲組織において発症する慢性炎症性疾患の予防及び／又は治療のための医薬。
（２）前記タンパク質の発現を抑制する物質が、SP3 mRNAの発現を抑制する又は当該mRNAからの当該タンパク質の翻訳を阻害する阻害性核酸である、（１）に記載の医薬。
（３）前記タンパク質の活性を阻害する物質が、当該タンパク質に特異的に結合する抗体又はその誘導体である、（１）に記載の医薬。
（４）慢性炎症性疾患が、ケロイド、肥厚性瘢痕、乾癬、アトピー性皮膚炎、水疱性類天疱瘡、強皮症又はデュプイトラン拘縮である、（１）〜（３）のいずれか一項に記載の医薬。
（５）被験者から採取された検体におけるSP3タンパク質又はSP3 mRNAの発現量を測定する工程、測定された発現量を健常者から採取された検体におけるSP3タンパク質又はSP3 mRNAの発現量と比較する工程、及び被験者における発現量が健常者における発現量よりも多い場合、被験者は皮膚、腱又は腱周囲組織において発症する慢性炎症性疾患に罹患しやすいと判定する工程を含む、被験者の慢性炎症性疾患への易罹患性を判定する方法。
（６）慢性炎症性疾患が、ケロイド、肥厚性瘢痕、乾癬、アトピー性皮膚炎、水疱性類天疱瘡、強皮症又はデュプイトラン拘縮である、（５）に記載の方法。
（７）被験者から採取された検体におけるSP3タンパク質又はSP3 mRNAの発現量を測定する工程、測定された発現量を健常者から採取された検体におけるSP3タンパク質又はSP3 mRNAの発現量と比較する工程、並びに被験者における発現量が健常者における発現量よりも多い場合、SP3タンパク質の発現を抑制する及び／又は活性を阻害する物質を有効成分として含有する医薬による処置が当該被験者における皮膚、腱又は腱周囲組織において発症する慢性炎症性疾患に適応可能であると判定する工程を含む、慢性炎症性疾患に対する前記医薬による処置の適応性を判定する方法。
（８）慢性炎症性疾患が、ケロイド、肥厚性瘢痕、乾癬、アトピー性皮膚炎、水疱性類天疱瘡、強皮症又はデュプイトラン拘縮である、（７）に記載の方法。
（９）NEDD4タンパク質の発現を抑制する及び／又は活性を阻害する物質を有効成分として含有する、慢性炎症性疾患（ただしケロイドを除く）の予防及び／又は治療のための医薬。
（１０）前記タンパク質の発現を抑制する物質が、当該タンパク質をコードするmRNAの発現を抑制する又は当該mRNAからの当該タンパク質の翻訳を阻害する阻害性核酸である、（９）に記載の医薬。
（１１）前記タンパク質の活性を阻害する物質が、当該タンパク質に特異的に結合する抗体又はその誘導体である、（９）に記載の医薬。
（１２）慢性炎症性疾患が、関節炎、肥厚性瘢痕、乾癬、アトピー性皮膚炎、水疱性類天疱瘡、強皮症又はデュプイトラン拘縮である、（９）〜（１１）のいずれか一項に記載の医薬。
（１３）被験者から採取された検体において、NEDD4遺伝子をコードするゲノム配列中に存在する配列番号43に示される塩基配列の26番目の塩基における遺伝子多型であるrs8032158を検出する工程、及び前記遺伝子多型における遺伝子型がC/C又はC/Tである場合、被験者は慢性炎症性疾患（ただしケロイドを除く）に罹患しやすいと判定する工程を含む、被験者の慢性炎症性疾患（ただしケロイドを除く）への易罹患性を判定する方法。
（１４）慢性炎症性疾患が、肥厚性瘢痕、乾癬、アトピー性皮膚炎、水疱性類天疱瘡、強皮症又はデュプイトラン拘縮である、（１３）に記載の方法。
（１５）SP3 mRNAの発現を検出するためのプライマーセット又はプローブを含む、皮膚、腱又は腱周囲組織において発症する慢性炎症性疾患への易罹患性を判定するためのキット。
（１６）SP3タンパク質に対する特異抗体を含む、皮膚、腱又は腱周囲組織において発症する慢性炎症性疾患への易罹患性を判定するためのキット。
（１７）SP3 mRNAの発現を検出するためのプライマーセット又はプローブを含む、皮膚、腱又は腱周囲組織において発症する慢性炎症性疾患の医薬による処置の適応性を判定するためのキットであって、前記医薬がSP3タンパク質の発現を抑制する及び／又は活性を阻害する物質を有効成分として含有する医薬である、前記キット。
（１８）SP3タンパク質に対する特異抗体を含む、皮膚、腱又は腱周囲組織において発症する慢性炎症性疾患の医薬による処置の適応性を判定するためのキットであって、前記医薬がSP3タンパク質の発現を抑制する及び／又は活性を阻害する物質を有効成分として含有する医薬である、前記キット。
（１９）NEDD4遺伝子をコードするゲノム配列中に存在する、配列番号43に示される塩基配列の26番目の塩基における遺伝子多型であるrs8032158を検出するためのプライマーセット又はプローブを含む、慢性炎症性疾患（ただしケロイドを除く）への易罹患性を判定するためのキット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ケロイドの発症に関する分子生物学的機構に基づいた、ケロイド又はこれを含む慢性炎症性疾患に対する有効かつ再発等の副作用が少ない新たな予防及び／又は治療のための医薬を提供することができる。また、被験者の慢性炎症性疾患への易罹患性を判定する方法及びキットも提供され、これにより慢性炎症性疾患に罹患しやすいことが発症前に判明した被験者に対して予防的に上記医薬を投与することが可能になり、慢性炎症性疾患の発症を効果的に予防することができる。さらに慢性炎症性疾患に対する上記医薬による処置の適応性を判定する方法及びキットも提供され、これをコンパニオン診断として利用することで、上記医薬の効果的かつ効率的な使用が実現される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】正常皮膚組織及びケロイド皮膚組織由来のケラチノサイトにおけるNEDD4の各スプライシングバリアント（SP1〜SP7）mRNAの相対的発現量を示すグラフである。
【図２】正常皮膚組織及びケロイド皮膚組織を抗SP3タンパク質抗体を用いて免疫染色した画像である。
【図３】SP1又はSP3を強制発現させたHEK293T細胞におけるTNFα刺激下でのIL-6プロモーター活性及びNF-κBプロモーター活性を示すグラフである。
【図４】SP3の発現を抑制するsiRNAを導入したH4細胞におけるIL-6及びTNFα刺激下でのIL-6 mRNA及びSP3 mRNAの相対的発現量を示すグラフである。
【図５】SP3の発現を抑制するsiRNAを導入したH4細胞におけるTNFα刺激下でのNF-κB p65サブユニットのリン酸化を示すウェスタンブロット画像である。
【図６】NEDD4の全スプライシングバリアントの発現を抑制するsiRNA（si5-NEDD4、si6-NEDD4、si7-NEDD4）を導入したHaCat細胞におけるIL-6及びIL-17刺激下でのIL-6 mRNA及びNEDD4 mRNAの相対的発現量を示すグラフである。
【図７】NEDD4の全スプライシングバリアントの発現を抑制するsiRNA（si5-NEDD4、si6-NEDD4、si7-NEDD4）を導入したH4細胞におけるIL-6及びIL-17刺激下でのIL-6 mRNA及びNEDD4 mRNAの相対的発現量を示すグラフである。
【図８】NEDD4の全スプライシングバリアントの発現を抑制するshRNA（NEDD4 sh-1、NEDD4 sh-2）を投与した関節リウマチモデル動物における臨床スコアの変化を示すグラフである。
【図９】NEDD4の全スプライシングバリアントの発現を抑制するsiRNAを投与した皮膚炎モデル動物における耳の肥厚の変化を示すグラフである。
【図１０】慢性炎症性皮膚疾患の患者におけるNEDD4遺伝子のSNP頻度を示すグラフである。
【図１１】慢性炎症性皮膚疾患及び腱周囲組織疾患の患者におけるNEDD4遺伝子のSNP頻度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の第1の態様は、SP3タンパク質の発現を抑制する及び／又は活性を阻害する物質を有効成分として含有する、皮膚、腱又は腱周囲組織において発症する慢性炎症性疾患の予防及び／又は治療のための医薬に関する。
【００１４】
ヒトNEDD4には7種類のスプライシングバリアントSP1〜SP7が存在し、うちSP6を除く6種類はタンパク質をコードしている。ヒトゲノム上のNEDD4遺伝子の塩基配列は、NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）にNG_051072.1として登録されている。また、SP1、SP2、SP3、SP4、SP5及びSP7のmRNAの塩基配列は、NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）にNM_006154、NM_198400、NM_001284338、NM_001284339、NM_001284340及びNM_001329212として、これらのアミノ酸配列はNCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）にそれぞれNP_006145.2、NP_940682.2、NP_001271267.1、NP_001271268.1、NP_001271269.1及びNP_001316141として、それぞれ登録されている。本発明においては、上記の配列を有するNEDD4遺伝子又はスプライシングバリアントに加えて、天然に存在するこれらの変異体も利用することができる。
【００１５】
後の実施例に示されるように、本発明者らは、SP3タンパク質の発現が健常人の正常皮膚組織と比較してケロイド患者の患部組織において亢進していることを見出した。また、SP3の強制発現によりIL-6及びNF-κBのプロモーター活性が上昇すること、SP3の発現を特異的に阻害することで炎症回路を亢進させるIL-6及びNF-κBの発現及び活性化が抑制されることが確認された。
【００１６】
炎症回路（Inflammation amplifier）とは、本発明者らにより報告された慢性炎症の病態を誘導する分子機構である。線維芽細胞、ケラチノサイト、血管内皮細胞等のI型コラーゲン陽性の非免疫細胞に炎症刺激が加わると、非免疫細胞自身及び誘導されたT細胞から産生されたIL-6及びIL-17等のサイトカインにより非免疫細胞内でNF-κB経路とSTAT3経路とが同時に活性化され、IL-6をはじめとしたサイトカイン、ケモカイン、増殖因子等の産生が相乗的に増加する。産生されたIL-6は非免疫細胞自身に作用して炎症回路を亢進し、またケモカインや増殖因子は細胞浸潤を生じさせて恒常性を破綻させる。この炎症回路の持続的な亢進が慢性炎症の病態を誘導することが実験的に証明されている（Ogura et al., Immunity., 2008, 29(4),628-36.; Murakami et al., J. Exp. Med., 2011, 208(1), 103-14.; Murakami et al., Cell Reports, 2013, 3(3), 946-59.）。
【００１７】
以上から、SP3タンパク質の発現を抑制する及び／又は活性を阻害する物質は、皮膚組織や腱、腱周囲組織を構成する線維芽細胞やケラチノサイトにおいて炎症回路の亢進を抑制し、慢性炎症が病態を誘導する慢性炎症性疾患の予防及び／又は治療のための医薬の有効成分として利用可能であると期待される。
【００１８】
本発明の第１の態様である医薬は、SP3タンパク質の発現を抑制する及び／又は活性を阻害する物質を有効成分として含有する。ここで「有効成分として含有する」とは、有効量のかかる物質を含有することを意味する。また有効量は、疾患の予防及び／又は治療に有効な量を意味し、用法、対象者の年齢、疾患の状態その他の条件に応じて適宜決定される。
【００１９】
SP3タンパク質の発現を抑制する及び／又は活性を阻害する物質は、NEDD4遺伝子からのSP3のmRNA（SP3 mRNAともいう）の発現を抑制することができる物質、すなわちNEDD4遺伝子から転写されたmRNAのSP3 mRNAへの選択的スプライシングを阻害することができる物質、若しくはスプライシング後の成熟SP3 mRNAを分解することができる物質であってもよく、SP3 mRNAからのタンパク質翻訳を阻害することができる物質であってもよく、又はSP3タンパク質に結合してその機能を阻害する物質であってもよい。
【００２０】
SP3タンパク質の発現を抑制する物質の典型例としては、NEDD4遺伝子又はSP3 mRNAの公知の塩基配列を基にして当業者が設計、作製することができる、アンチセンスRNA又はsiRNA等の阻害性核酸を挙げることができる。
【００２１】
また、siRNAの塩基配列を含むshRNA、適当な発現プロモーターの支配下に置かれることで上記アンチセンスRNA又はsiRNA等を転写誘導することのできるDNA、及び上記アンチセンスRNA又はsiRNA等の塩基配列の一部が修飾されてヌクレアーゼによる分解に対する安定性が高められたRNAも、上記アンチセンスRNA又はsiRNAと機能的に等価な核酸として、本発明にいう発現を抑制する物質に包含される。ヌクレアーゼによる分解に対する安定性を向上させるための修飾としては、2'O-メチル化、2'-F化、4'-チオ化等を挙げることができる。
【００２２】
また、上記RNAのリボヌクレオチドの一部が、対応するデオキシリボヌクレオチド又はヌクレオチド類似体に置き換えられたキメラRNAもまた、本発明にいう発現を抑制する物質に包含される。ヌクレオチド類似体としては、例えば、5位修飾ウリジン又はシチジン、例えば5-（2-アミノ）プロピルウリジン、5-ブロモウリジン等；8位修飾アデノシン又はグアノシン、例えば8-ブロモグアノシン等；デアザヌクレオチド、例えば7-デアザ-アデノシン等；O-又はN-アルキル化ヌクレオチド、例えばN6-メチルアデノシン等を挙げることができる。
【００２３】
SP3タンパク質の活性を阻害する物質の典型例としては、SP3タンパク質に特異的に結合してその活性を中和することができる抗SP3タンパク質抗体、ユビキチンリガーゼを阻害する物質等を挙げることができる。
【００２４】
第1の態様において利用される前記特異抗体は、SP3タンパク質に結合するが、他のタンパク質にほとんど又は全く結合しない抗体であり、SP3タンパク質に対する高い結合親和性を有する抗体と表すこともできる。SP3タンパク質に対する高い結合親和性を有する抗体は、例えば10-7 M以下、好ましくは10-8 M以下、より好ましくは10-9 M以下の解離定数KDを持つ抗体である。
【００２５】
特異抗体は、由来する動物種により制限されない。また、特異抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体のいずれであってもよい。加えて、特異抗体は、免疫グロブリン全長からなる抗体であってもよく、又はF(ab’)2、Fab、diabody、Fv、ScFv、Sc(Fv)2等の抗体の一部からなる抗体断片といった抗体誘導体であってもよい。
【００２６】
特異抗体は、好ましくは遺伝子組換え手法で作製された組換えヒトSP3タンパク質又はその断片、例えばSP3タンパク質の431〜455番目のアミノ酸からなるペプチド等を抗原として、ウサギ、マウス、ラット等の適当な実験動物への免疫によるポリクローナル抗体作製方法、免疫動物由来のB細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマを利用する又は抗体ファージライブラリーを利用するモノクローナル抗体作製方法を含む一般的な抗体作製方法によって調製することができる。
【００２７】
第1の態様の医薬は、上に例示した物質以外の、SP3タンパク質の発現を抑制する及び／又は活性を阻害することのできる物質を有効成分とするものであってもよい。そのような物質は、例えば組み換えNEDD4遺伝子からのSP3 mRNAの発現抑制能のスクリーニング、又は組み換えSP3タンパク質を用いた活性阻害能のスクリーニングを通じて探索することができる。
【００２８】
後の実施例に示されるように、SP3の発現阻害によって炎症回路を亢進させるIL-6及びNF-κBの発現及び活性化が抑制される。したがって、本発明は、SP3タンパク質の発現を抑制する及び／又は活性を阻害する物質を有効成分として含有する、抗炎症剤、又はIL-6若しくはNF-κBの発現抑制剤若しくは活性化抑制剤も提供する。
【００２９】
第1の態様の医薬は、上述の有効成分以外の薬物又は緩衝剤、抗酸化剤、保存剤、タンパク質、親水性ポリマー、アミノ酸、キレート化剤、非イオン性界面活性剤、賦形剤、安定化剤、担体等の薬学的に許容される成分と医薬組成物を形成し又は製剤化して、使用することができる。薬学的に許容される成分は当業者において周知であり、当業者が通常の実施能力の範囲内で、例えば第十七改正日本薬局方その他の規格書に記載された成分から製剤の形態に応じて適宜選択して使用することができる。
【００３０】
第1の態様の医薬又はこれを含む医薬組成物により予防及び／又は治療することができる、皮膚、腱又は腱周囲組織において発症する慢性炎症性疾患は、SP3タンパク質又はSP3 mRNAの発現が亢進している、皮膚、腱又は腱周囲組織において発症する慢性炎症性疾患であればよい。このような疾患の例としては、ケロイド、肥厚性瘢痕、自己免疫性水疱症、強皮症、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、湿疹、乾癬、褥瘡、水疱性類天疱瘡、脱毛症、デュプイトラン拘縮等が挙げられ、ケロイド、肥厚性瘢痕、乾癬、アトピー性皮膚炎、水疱性類天疱瘡、強皮症又はデュプイトラン拘縮が、特にケロイドが、予防及び／又は治療の対象として好ましい。
【００３１】
第1の態様の医薬又はこれを含む医薬組成物は、患部又は患部となることが想定される部位（例えばケロイド予防における創傷部位等）の皮膚、腱又は腱周囲組織にその有効量が送達される限り任意の経路で投与することができるが、当該部位への局所投与がより好ましい。また、かかる医薬又は医薬組成物の製剤は、皮膚、腱又は腱周囲組織への局所投与に適した製剤、例えば軟膏剤、湿布剤又は注射剤等であることが好ましい。
【００３２】
第1の態様の医薬は、皮膚、腱又は腱周囲組織における慢性炎症性疾患の治療を必要とする又はその発症のおそれのある対象に投与されることで、慢性炎症性疾患の症状を緩和する、寛解する又はその発症を予防することが可能である。すなわち本発明の第1の態様は、皮膚、腱又は腱周囲組織における慢性炎症性疾患の治療を必要とする又はその発症のおそれのある対象者にSP3タンパク質の発現を抑制する及び／又は活性を阻害する物質の有効量を投与することを含む、慢性炎症性疾患の予防及び／又は治療方法と表すこともできる。予防及び／又は治療方法における医薬の有効量、医薬を含む製剤、態様、投与方法等は、本発明の一態様である医薬において説明したとおりである。
【００３３】
本発明の別の態様は、被験者から採取された検体におけるSP3タンパク質又はSP3 mRNAの発現量を測定する工程、測定された発現量を健常者から採取された検体におけるSP3タンパク質又はSP3 mRNAの発現量と比較する工程、及び被験者における発現量が健常者における発現量よりも多い場合、被験者は皮膚、腱又は腱周囲組織において発症する慢性炎症性疾患に罹患しやすいと判定する工程を含む、被験者の慢性炎症性疾患への易罹患性を判定する方法に関する。本態様は、前記３つの工程を含む、被験者の慢性炎症性疾患への易罹患性を判定するためのデータの収集方法、又は易罹患性の判定を補助する方法と表すこともできる。
【００３４】
本発明者らは、ケロイド患者の患部皮膚組織においてSP3タンパク質の発現が亢進していることに加えて、組織から分離され初代培養を経たケラチノサイトにおいてもSP3 mRNAの発現が亢進していることを見出した。腫瘤という環境から独立した状態に置かれたケラチノサイトにおいてもSP3の発現が亢進しているという事実は、ケロイド患者の皮膚組織においてはケロイド発症というイベントから独立してSP3の発現が亢進していることを示すものである。当該患者は、創傷による炎症刺激がトリガーとなって炎症回路が進行し、SP3がこれを亢進させた結果、慢性炎症状態が誘導されてケロイド発症に至ったものと推測される。したがって、被験者から採取された皮膚検体におけるSP3発現量のデータは、当該被験者がケロイドを発症しやすい体質であるか否かを、すなわち被験者のケロイドへの易罹患性を判定するためのデータとなり得る。さらに、SP3が炎症回路の正の制御因子であることからすると、SP3の発現が亢進している被験者はケロイド以外の慢性炎症性疾患にも罹患しやすいものと考えられることから、被験者から採取された検体におけるSP3発現量のデータは、当該被験者の慢性炎症性疾患への易罹患性を判定するためのデータにもなり得る。
【００３５】
検体としては、被験者から採取した皮膚、腱若しくは腱周囲組織、これから分離される細胞、又はそれらから抽出される細胞抽出液やtotal RNA等を用いることができる。
【００３６】
採取された検体におけるSP3発現量の測定は、SP3 mRNAの発現量を定量的に測定することができる公知の方法、又はSP3タンパク質を定量的に測定することができる公知の方法によって行うことができる。
【００３７】
SP3 mRNAの発現量を定量的に測定することができる公知の方法の例としては、SP3 mRNAの塩基配列を基に設計される適当な塩基配列からなるプライマーのセットを用いたPCR法、SP3 mRNA又はこれに相補的なDNA若しくはRNA（cDNA若しくはcRNA）に特異的にハイブリダイズし得るプローブを用いたハイブリダイゼーション法、前記プローブが固定化されたチップを用いたマイクロアレイ法、RNAシーケンシング法を挙げることができる。SP3 mRNAの発現量の測定は、好ましくは定量RT-PCR法、典型的にはリアルタイムRT-PCR法によって行われる。
【００３８】
定量RT-PCR法においては、SP3 mRNAから逆転写反応によってcDNAを合成し、これを特異的に増幅するプライマーセットを用いて、SP3 mRNAの発現量が測定される。プライマーセットは、SP3 mRNAから逆転写されたcDNAとアニールし、当該cDNA又はその一部を特異的に増幅することができるものであれば、cDNAとのアニーリング部位や増幅領域の長さといった条件に制限はなく、当業者はこれらの条件を適宜選択することができる。ここで特異的に増幅するとは、SP3 mRNAから逆転写されたcDNAを増幅することができるが、NEDD4の他のスプライシングバリアントを含む他のmRNAに相補的なcDNAをほとんど又は全く増幅しないことを意味する。プライマーセットのうちの少なくとも１つのプライマーの配列は、SP3 mRNAから逆転写されたcDNAに選択的にアニールするように設計することが好ましい。また、プライマーの長さに特に制限はないが、典型的には15〜30塩基である。
【００３９】
TaqMan（登録商標）アッセイを利用したリアルタイムRT-PCR法においては、プライマーセットに加えて、増幅領域に特異的にハイブリダイズし得る標識プローブが用いられる。TaqMan（登録商標）アッセイではプローブの特異的ハイブリダイゼーションに基づいて増幅産物を検出することから、この方法で用いられるプライマーセットは、SP3 mRNAから逆転写されたcDNAを他の鋳型DNAよりも優先的に増幅することができればよく、必ずしも特異的に増幅することは必要とされない。
【００４０】
TaqMan（登録商標）アッセイを利用したリアルタイムRT-PCR法を用いる好ましい実施形態において、プライマーセットの例は、配列番号11及び12に示される塩基配列からなるプライマーの組み合わせであり、プローブの例は配列番号10に示される塩基配列である。
【００４１】
ハイブリダイゼーション法及びマイクロアレイ法においては、SP3 mRNA又はこれに相補的なcDNA若しくはcRNAに特異的にハイブリダイズし得るプローブを用いて、SP3 mRNAの発現量が測定される。プローブは、SP3 mRNA又はこれに相補的なcDNA若しくはcRNAに特異的にハイブリダイズすることができるものであれば、ハイブリダイズする位置やハイブリダイズする領域の長さといった条件に制限はなく、当業者はこれらの条件を適宜選択することができる。またプローブは、SP3 mRNA又はこれに相補的なcDNA若しくはcRNAに特異的にハイブリダイズすることができる限り、その塩基配列において１又はそれ以上の置換、欠失、付加を含んでいてもよい。
【００４２】
特異的にハイブリダイズするとは、SP3 mRNA又はこれに相補的なcDNA若しくはcRNAにハイブリダイズすることができるが、NEDD4の他のスプライシングバリアントを含む他のmRNA又はこれに相補的なcDNA若しくはcRNAにほとんど又は全くハイブリダイズしないことを意味する。プローブの配列は、SP3 mRNA又はこれに相補的なcDNA若しくはcRNAにのみ存在する塩基配列に基づいて設計することが好ましい。また、プローブの長さに特に制限はなく、例えば10〜500塩基であることができる。
【００４３】
プローブは、SP3 mRNA又はこれに相補的なcDNA若しくはcRNAにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸であってもよい。当業者は、ストリンジェンシーに影響を及ぼす温度、プローブ濃度、プローブの長さ、反応時間、イオン強度、塩濃度といった種々の要素を考慮して、ストリンジェントな条件を適宜設定し、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るプローブを設計することができる。ストリンジェントな条件は、例えば5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、50℃の条件である。
【００４４】
プライマーセット及びプローブは、採用される測定方法の原理及びSP3 mRNA又はこれに相補的なcDNA若しくはcRNAの塩基配列に基づいて、当業者が適宜設計し、一般的な核酸合成方法又は遺伝子工学的方法によって調製することができる。また、プライマーセット及びプローブは、採用される測定方法の原理に応じて、蛍光物質（例えば、Cy3、Cy5、FITC、Alexa Flour等）、放射性同位体（例えば、3H、14C、32P、35S、125I、131I等）、酵素、ビオチン、ストレプトアビジンその他の標識化合物によって標識されていてもよい。
【００４５】
SP3タンパク質の発現量を定量的に測定することができる公知の方法の例としては、SP3タンパク質に特異的に結合する抗体を用いたELISA法、RIA法、インサイツハイブリダイゼーション法、イムノブロット法等の定量的イムノアッセイを挙げることができる。
【００４６】
SP3タンパク質に特異的に結合する抗体は、SP3タンパク質に結合するが、他のタンパク質にほとんど又は全く結合しない抗体であり、SP3タンパク質に対する高い結合親和性を有する抗体と表すこともできる。SP3タンパク質に対する高い結合親和性を有する抗体は、例えば10-7 M以下、好ましくは10-8 M以下、より好ましくは10-9 M以下の解離定数KDを持つ抗体である。
【００４７】
特異抗体は、由来する動物種により制限されない。また、特異抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体のいずれであってもよい。加えて、特異抗体は、免疫グロブリン全長からなる抗体であってもよく、又はF(ab’)2、Fab、diabody、Fv、ScFv、Sc(Fv)2等の抗体の一部からなる抗体断片といった抗体誘導体であってもよい。
【００４８】
特異抗体は、好ましくは遺伝子組換え手法で作製された組換えヒトSP3タンパク質又はその断片、例えばSP3タンパク質の431〜455番目のアミノ酸からなるペプチド等を抗原として、ウサギ、マウス、ラット等の適当な実験動物への免疫によるポリクローナル抗体作製方法、免疫動物由来のB細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマを利用する又は抗体ファージライブラリーを利用するモノクローナル抗体作製方法を含む一般的な抗体作製方法によって調製することができる。
【００４９】
特異抗体は、蛍光物質（例えば、FITC、ローダミン、ファロイジン、蛍光タンパク質等）、金等のコロイド粒子、Luminex（登録商標、ルミネックス社）等の蛍光マイクロビーズ、重金属（例えば、金、白金等）、色素タンパク質（例えば、フィコエリトリン、フィコシアニン等）、放射性同位体（例えば、3H、14C、32P、35S、125I、131I等）、酵素等（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等）、ビオチン、ストレプトアビジンその他の標識化合物によって標識されていてもよい。
【００５０】
被験者から採取された検体におけるSP3の発現量を、健常者から採取された検体におけるSP3の発現量と比較し、被験者における発現量が健常者における発現量よりも多い場合、被験者は皮膚、腱又は腱周囲組織において発症する慢性炎症性疾患に罹患しやすいと判定することができる。ここで健常者とは、当該慢性炎症性疾患に罹患していない又は罹患する可能性が低い者を意味する。健常者から採取された検体におけるSP3発現量のデータは、被験者から採取された検体と同時に測定されたものであっても、予め用意されたものであってもよい。
【００５１】
易罹患性の判定対象となる、皮膚、腱又は腱周囲組織において発症する慢性炎症性疾患は上述のとおりであり、例えばケロイド、肥厚性瘢痕、自己免疫性水疱症、強皮症、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、湿疹、乾癬、褥瘡、水疱性類天疱瘡、脱毛症、デュプイトラン拘縮等が挙げられ、好ましくはケロイド、肥厚性瘢痕、乾癬、アトピー性皮膚炎、水疱性類天疱瘡、強皮症又はデュプイトラン拘縮、特に好ましくはケロイドである。
【００５２】
加えて、被験者におけるSP3の発現量が健常者における発現量よりも多いことは、当該被験者の慢性炎症性疾患への易罹患性を意味するだけでなく、当該被験者がSP3タンパク質の発現を抑制する及び／又は活性を阻害する物質を有効成分として含有する医薬による処置に適していることも意味する。したがって、本発明は、被験者から採取された検体におけるSP3タンパク質又はSP3 mRNAの発現量を測定する工程、測定された発現量を健常者から採取された検体におけるSP3タンパク質又はSP3 mRNAの発現量と比較する工程、並びに被験者における発現量が健常者における発現量よりも多い場合、SP3タンパク質の発現を抑制する及び／又は活性を阻害する物質を有効成分として含有する医薬による処置が当該被験者における皮膚、腱又は腱周囲組織において発症する慢性炎症性疾患に適応可能であると判定する工程を含む、慢性炎症性疾患に対する前記医薬による処置の適応性を判定する方法をさらなる態様として提供する。本態様の判定方法における用語の意味は、易罹患性の判定方法における意味と同様である。また本態様は、前記３つの工程を含む、慢性炎症性疾患に対する前記医薬による処置の適応性を判定するためのデータの収集方法、又は適応性の判定を補助する方法と表すこともできる。
【００５３】
例えば、皮膚、腱又は腱周囲組織において慢性炎症性疾患を発症していない被験者におけるSP3の発現量が健常者より多い場合、上記医薬は当該被験者において慢性炎症性疾患に対する予防的処置として有効であると予測される。また、皮膚、腱又は腱周囲組織において慢性炎症性疾患を既に発症している当該被験者におけるSP3の発現量が健常者より多い場合、上記医薬は当該被験者において慢性炎症性疾患に対する治療的処置として有効であると予測される。本態様の判定方法は、このように上記医薬が慢性炎症性疾患に有効であると予測される場合に上記医薬による処置が慢性炎症性疾患に適応可能であると判定するものであり、上記医薬の使用のためのコンパニオン診断の方法として有用である。
【００５４】
本態様の判定方法は、第一の態様の医薬の投与と組み合わせて実施することができる。すなわち、被験者から採取された検体におけるSP3タンパク質又はSP3 mRNAの発現量を測定する工程、測定された発現量を健常者から採取された検体におけるSP3タンパク質又はSP3 mRNAの発現量と比較する工程、被験者における発現量が健常者における発現量よりも多い場合、被験者は皮膚、腱又は腱周囲組織において発症する慢性炎症性疾患に罹患しやすいと判定する工程、並びに慢性炎症性疾患に罹患しやすいと判定された被験者にSP3タンパク質の発現を抑制する及び／又は活性を阻害する物質の有効量を投与する工程を含む、被験者の慢性炎症性疾患への易罹患性を判定し、慢性炎症性疾患を予防及び／又は治療する方法も、本発明の一態様である。
【００５５】
本発明のさらなる別の態様は、NEDD4タンパク質の発現を抑制する及び／又は活性を阻害する物質を有効成分として含有する、慢性炎症性疾患の予防及び／又は治療のための医薬を提供する。
【００５６】
本発明者らは、関節リウマチに類似した慢性炎症性関節炎を自然発症するモデル動物にIL-6等の炎症性サイトカインを投与して関節炎を発症させる実験系及び動物皮膚へのイミキモドの塗布によって皮膚炎を発症させる実験系において、NEDD4の発現を阻害することができる阻害性核酸の投与により関節炎及び皮膚炎の症状が改善されることを確認した。このことから、NEDD4タンパク質の発現を抑制する及び／又は活性を阻害する物質は、関節炎及び皮膚炎を含む慢性炎症性疾患の予防及び／又は治療のための医薬の有効成分として利用可能であると期待される。
【００５７】
NEDD4タンパク質の発現を抑制する及び／又は活性を阻害する物質としては、NEDD4遺伝子からのmRNAの発現を抑制することができる物質、当該mRNAからのタンパク質翻訳を阻害することができる物質、又はNEDD4タンパク質に結合してその機能を阻害する物質が挙げられる。なお、ここでいうNEDD4タンパク質とは、NEDD4タンパク質の６つのスプライシングバリアントの一部又は全てを意味する。
【００５８】
NEDD4タンパク質の発現を抑制する物質の典型例としては、NEDD4遺伝子の公知の塩基配列を基にして当業者が設計、作製することができる、アンチセンスRNA又はsiRNA等の阻害性核酸を挙げることができる。本態様において利用可能な阻害性核酸は、第1の態様の医薬における阻害性核酸と同じく、アンチセンスRNA又はsiRNAと機能的に等価な核酸及びキメラRNAを包含する。NEDD4タンパク質の発現を抑制する物質は、NEDD4タンパク質の各スプライシングバリアントのmRNAに共通する塩基配列を認識し、これを破壊する又はその翻訳を阻害するものであり得る。
【００５９】
NEDD4タンパク質の活性を阻害する物質の典型例としては、NEDD4タンパク質に特異的に結合してその活性を中和することができる抗NEDD4抗体、ユビキチンリガーゼを阻害する物質等を挙げることができる。
【００６０】
NEDD4タンパク質に特異的に結合する抗体は、NEDD4タンパク質に結合するが、他のタンパク質にほとんど又は全く結合しない抗体であり、NEDD4タンパク質に対する高い結合親和性を有する抗体と表すこともできる。NEDD4タンパク質に対する高い結合親和性を有する抗体は、例えば10-7 M以下、好ましくは10-8 M以下、より好ましくは10-9 M以下の解離定数KDを持つ抗体である。
【００６１】
特異抗体は、由来する動物種により制限されない。また、特異抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体のいずれであってもよい。加えて、特異抗体は、免疫グロブリン全長からなる抗体であってもよく、又はF(ab’)2、Fab、diabody、Fv、ScFv、Sc(Fv)2などの抗体の一部からなる抗体断片であってもよい。
【００６２】
特異抗体は、好ましくは遺伝子組換え手法で作製された組換えヒトNEDD4タンパク質又はその断片、例えばNEDD4タンパク質の各スプライシングバリアントに共通するアミノ酸配列からなるペプチド等を抗原として、ウサギ、マウス、ラット等の適当な実験動物への免疫によるポリクローナル抗体作製方法、免疫動物由来のB細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマを利用する又は抗体ファージライブラリーを利用するモノクローナル抗体作製方法を含む一般的な抗体作製方法によって調製することができる。
【００６３】
NEDD4タンパク質の活性を阻害する物質は、NEDD4タンパク質の各スプライシングバリアントに共通するアミノ酸配列を認識し、これに特異的に結合して活性を中和する抗体であり得る。
【００６４】
本態様の医薬は、上に例示した物質以外の、NEDD4タンパク質の発現を抑制する及び／又は活性を阻害する物質を有効成分とするものであってもよい。そのような物質は、例えば組み換えNEDD4遺伝子からのmRNAの発現抑制能のスクリーニング、又は組み換えNEDD4タンパク質を用いた活性阻害能のスクリーニングを通じて探索することができる。
【００６５】
本態様の医薬における有効量及び他の配合成分は、第1の態様の医薬について説明されたものと同様である。
【００６６】
本態様の医薬又はこれを含む医薬組成物により予防及び／又は治療することができる慢性炎症性疾患としては、前述の皮膚、腱又は腱周囲組織において発症する慢性炎症性疾患に加えて、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、ベーチェット病、シェーグレン症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、自己免疫性副腎機能障害、真正赤血球性貧血、多発性硬化症、自己免疫性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎等が挙げられ、関節リウマチが予防及び／又は治療の対象として好ましい。また、特定の実施形態においては、ケロイドを除く慢性炎症性疾患に、ケロイド及び肥厚性瘢痕を除く慢性炎症性疾患に、又は慢性炎症性皮膚疾患を除く慢性炎症性疾患が、本態様の医薬による予防及び／又は治療の対象として好ましい。
【００６７】
本態様の医薬又はこれを含む医薬組成物は、患部又は患部となることが想定される部位にその有効量が送達される限り任意の経路で投与することができ、筋内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、局所投与等、非経口的に投与されることが好ましい。また、かかる医薬又は医薬組成物の製剤は、投与経路に適した製剤、例えば注射剤、軟膏剤、湿布剤又は点滴剤等であることが好ましい。
【００６８】
本態様の医薬は、慢性炎症性疾患の治療を必要とする又はその発症のおそれのある対象に投与されることで、慢性炎症性疾患の症状を緩和する、寛解する又はその発症を予防することが可能である。すなわち本発明のさらなる別の態様は、慢性炎症性疾患の治療を必要とする又はその発症のおそれのある対象者にNEDD4タンパク質の発現を抑制する及び／又は活性を阻害する物質の有効量を投与することを含む、慢性炎症性疾患の予防方法及び／又は治療方法として表すこともできる。予防及び／又は治療方法における医薬の有効量、医薬を含む製剤、態様、投与方法等は、上で説明したとおりである。
【００６９】
本発明のまた別の態様は、被験者から採取された検体において、NEDD4遺伝子をコードするゲノム配列中に存在する、配列番号43に示される塩基配列の26番目の塩基における遺伝子多型であるrs8032158を検出する工程、及び前記遺伝子多型における遺伝子型がC/C又はC/Tである場合、被験者は慢性炎症性疾患に罹患しやすいと判定する工程を含む、被験者の慢性炎症性疾患への易罹患性を判定する方法に関する。本態様は、前記２つの工程を含む、被験者の慢性炎症性疾患への易罹患性を判定するためのデータの収集方法、又は易罹患性の判定を補助する方法と表すこともできる。
【００７０】
本発明のさらなる別の態様は、被験者から採取された検体において、NEDD4遺伝子をコードするゲノム配列中に存在する、配列番号43に示される塩基配列の26番目の塩基における遺伝子多型であるrs8032158を検出する工程、及び前記遺伝子多型における遺伝子型がC/C又はC/Tである場合、SP3タンパク質の発現を抑制する及び／又は活性を阻害する物質を有効成分として含有する医薬による処置が当該被験者における慢性炎症性疾患に適応可能であると判定する工程を含む、慢性炎症性疾患に対する前記医薬による処置の適応性を判定する方法に関する。また本態様は、前記２つの工程を含む、慢性炎症性皮膚疾患に対する前記医薬による処置の適応性を判定するためのデータの収集方法、又は適応性の判定を補助する方法と表すこともできる。
【００７１】
遺伝子多型rs8032158は、NEDD4遺伝子における一塩基多型（SNP）の一つであり、NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）にNG_051072.1として登録されているNEDD4遺伝子の塩基配列の96068番目に位置する塩基が、その相補鎖においてチミン（T）からシトシン（C）に置換されるSNPである（NEDD4遺伝子は15番染色体DNAのreverse鎖がセンス鎖のため、NG_051072.1では96068番目はアデニン（A）となっている）。rs8032158は、第15染色体の55902679番目に位置する。当該SNPは、日本人のケロイド患者においてケロイド発症との間の関連性が報告されている（Nakashima et al., Nat. Genet., 2010, 42, 768-771.）。
【００７２】
本発明者らは、ケロイド患者のみならず、他の慢性炎症性疾患の患者においても健常者より多い割合で当該SNPが存在することを見出した。当該SNPはケロイド以外の慢性炎症性疾患においても疾患発症と相関するものと推測され、当該SNPに基づいて慢性炎症性疾患への易罹患性を判定することが可能であると期待される。また、炎症回路を亢進して慢性炎症病態を誘導するという生体におけるNEDD4の役割を考慮すると、当該SNPがケロイド以外の慢性炎症性疾患にも存在するという知見は、NEDD4タンパク質又はそのスプライシングバリアントであるSP3タンパク質の発現を抑制する及び／又は活性を阻害する物質を有効成分として含有する上述の態様の医薬がこれらの慢性炎症性疾患に奏功することを示唆するものである。
【００７３】
SNPの検出は、被験者から調製されたゲノムDNAを用いて行うことができる。ゲノムDNAは、被験者から採取される任意の生物学的試料、例えば血液、唾液、リンパ液、気道粘液、骨髄液、尿、精液、腹腔液等の体液、又はバイオプシー等によって得られる組織細胞等から、常法にしたがって抽出、精製、調製することができる。
【００７４】
SNPの検出は、当業者に知られた従来の方法に従って行われる。そのような方法としては、例えばNASBA法、LCR法、SDA法、LAMP法、TaqMan（登録商標）PCR等のPCRによって増幅されるSNPを含む増幅断片を利用する方法、DNAシーケンサー等を用いたSNPを含む塩基配列を直接決定する方法、SNPに特異的なプローブを用いたハイブリダイゼーション法、DNAチップ、Geneチップ、マイクロチップ、ビーズアレイ等を含むマイクロアレイによる検出方法、ミスマッチ部位の化学的切断を利用した方法（CCM: chemical cleavageof mismatches）、プライマー伸長法（PEX）又はインベーダー法等を挙げることができるが、これらには限定されない。
【００７５】
PCRによって増幅されるSNPを含む増幅断片を利用する方法の１つの例は、対象のSNPを有する場合にのみ増幅断片が生じるよう、センスプライマー又はアンチセンスプライマーの一方がそのSNPにハイブリダイズするように設計されたプライマーセットを用いた方法である。かかるプライマーセットを使用することにより、増幅断片が生じたかどうかで標的のSNPを検出することが可能となる。
【００７６】
また、増幅断片を利用する別の方法は、標的のSNPを含む領域が増幅されるように設計されたプライマーセットを用いる方法である。かかるプライマーセットを用いた方法によると、増幅断片のサイズ、塩基配列、高次構造、制限部位の有無等の差異に基づいてSNPを検出することができる。例えば、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動などを用いたときの増幅断片の移動度の違いから、標的のSNPを検出することができる。
【００７７】
ハイブリダイゼーションによるSNPの検出は、SNPに特異的なプローブを用いて行うことができる。プローブは、標的のSNPを含むゲノムDNA上の塩基配列に特異的にハイブリダイズすることができるものであればよく、例えば標的SNPを含む連続する少なくとも10塩基以上、好ましくは10〜100塩基の配列、より好ましくは10〜50塩基のゲノムDNA塩基配列にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを用いることができる。またプローブは、標的SNPに対応する塩基がほぼ中心部に存在するように配列を設計するのが好ましい。
【００７８】
プローブは、標的SNPに特異的である限り、すなわち標的SNPを含む連続する少なくとも10塩基以上のゲノムDNA塩基配列にハイブリダイズするが、他の配列とはハイブリダイズしない限り、１又はそれ以上の置換、欠失、付加を含んでいてもよい。プローブは、必要に応じて、蛍光物質や放射性物質等の適当な手段により標識してもよい。
【００７９】
また標的SNPを含む連続する少なくとも10塩基以上のゲノムDNA塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドをプローブとして用いてもよい。ストリンジェントな条件は、上で述べたとおりである。
【００８０】
検出されたSNPがホモ型又はヘテロ型である場合、すなわち当該SNPにおける遺伝子型がC/C又はC/Tである場合、とりわけC/Cである場合、被験者は、慢性炎症性疾患に罹患しやすいと判定することができる。易罹患性の判定対象となる慢性炎症性疾患としては、皮膚、腱又は腱周囲組織において発症する慢性炎症性疾患が好ましく、例えばケロイド、肥厚性瘢痕、自己免疫性水疱症、強皮症、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、湿疹、乾癬、褥瘡、水疱性類天疱瘡、脱毛症、デュプラトイン拘縮等が挙げられる。好ましい易罹患性の判定対象は、ケロイドを除く慢性炎症性疾患、例えば肥厚性瘢痕、乾癬、アトピー性皮膚炎、水疱性類天疱瘡、強皮症、褥瘡、脱毛症又はデュプラトイン拘縮であり、特に肥厚性瘢痕、乾癬、アトピー性皮膚炎、水疱性類天疱瘡、強皮症又はデュプイトラン拘縮である。
【００８１】
本発明の別の態様は、皮膚、腱又は腱周囲組織において発症する慢性炎症性疾患への易罹患性を判定するためのキットであって、SP3 mRNAの発現を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ又はSP3タンパク質に対する特異抗体を含む、前記キットに関する。
【００８２】
本発明のまた別の態様は、皮膚、腱又は腱周囲組織において発症する慢性炎症性疾患に対する医薬による処置の適応性を判定するためのキットであって、SP3 mRNAの発現を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ又はSP3タンパク質に対する特異抗体を含み、前記医薬がSP3タンパク質の発現を抑制する及び／又は活性を阻害する物質を有効成分として含有する医薬である、前記キットに関する。
【００８３】
本発明のさらなる別の態様は、NEDD4遺伝子をコードするゲノム配列中に存在する、配列番号43に示される塩基配列の26番目の塩基における遺伝子多型であるrs8032158を検出するためのプライマーセット又はプローブを含む、慢性炎症性疾患（ただしケロイドを除く）への易罹患性を判定するためのキットに関する。
【００８４】
本発明の別の異なる態様は、慢性炎症性疾患に対する医薬による処置の適応性を判定するためのキットであって、NEDD4遺伝子をコードするゲノム配列中に存在する、配列番号43に示される塩基配列の26番目の塩基における遺伝子多型であるrs8032158を検出するためのプライマーセット又はプローブを含み、前記医薬がSP3タンパク質の発現を抑制する及び／又は活性を阻害する物質を有効成分として含有する医薬である、前記キットに関する。
【００８５】
上記キットに含まれるプライマーセット、プローブ、特異抗体及びこれらの使用方法の説明は、上で述べたとおりである。また上記キットは、プライマーセット、プローブ又は特異抗体に加えて、それぞれの測定又は検出方法に応じて、例えばdNTP、酵素、標識用又は検出用試薬、コントロール用試薬（例えば、ポジティブ又はネガティブコントロール用のオリゴヌクレオチド又は抗原）、緩衝液、pH調整剤、安定剤、固相支持体、反応容器、取扱説明書等をさらに含んでもよい。
【００８６】
プライマーセット又はプローブを含む上記キットは、GAPDHやアクチンといったハウスキーピング遺伝子を検出する内部コントロール用のプライマーセット又はプローブをさらに含んでもよい。また、特異抗体を含む上記キットは、SP3タンパク質に結合した特異抗体を検出するために蛍光物質、西洋ワサビペルオキシダーゼ（Horse Radish Peroxidase）等の標識物質をコンジュゲートした２次抗体や、前記特異抗体と異なる部位でSP3タンパク質と結合する抗体をさらに含んでもよい。
【００８７】
以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００８８】
実施例１．ケロイド患者におけるSP3の発現解析
１）検体の採取
北海道大学大学院医学研究科、医の倫理委員会に承認された研究計画において、ヘルシンキ宣言に基づいた本研究の内容説明を受けて研究協力に同意したケロイド患者から腫瘤計14検体（耳介7、体幹5、肩1、頸部1）及び非ケロイド患者から正常皮膚計5検体（体幹4、肩1）をそれぞれ採取し、以下の実験に使用した。【００８９】
２）リアルタイムPCRによるスプライシングバリアントの発現解析
腫瘤及び正常皮膚組織（各N=5〜7）より常法に従ってケラチノサイト及び線維芽細胞をそれぞれ分離し、ケラチノサイトはKGM-Gold（商標） Keratinocyte Growth Medium（Clonetics, Lonza）培地、線維芽細胞は10%ウシ胎児血清添加Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium（DMEM ; Life Technologies）培地で初代培養を行った。スピンカラム法（ISOSPIN Cell & Tissue, DNase Ｉ(RNase free) Set, NIPPON GENE）により、初代培養細胞からtotal RNAを調製した。total RNAからM-MLV Reverse Transcriptase（Promega）を用いた逆転写反応を行ってcDNAを調製した。【００９０】
cDNAに対して、KAPA PROBE（登録商標） FAST qPCR Master Mix(2×) Kit ABI Prism（KAPA BIOSYSTEMS）並びに表１に示すプライマー及びプローブを用いたTaqManプローブ法によるリアルタイムPCRを行い、NEDD4のスプライシングバリアントであるSP1〜SP5及びSP7の発現量を、GAPDHを内在性コントロールとした検量線法によって解析した。
【表１】
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【００９１】
ケラチノサイトにおける定量結果を図１に示す。正常皮膚と比較してケロイドにおいてSP3 mRNAの発現が亢進していること、SP3以外のスプライシングバリアントについては正常皮膚組織とケロイド組織とで発現量に有意な差がないことが確認された。線維芽細胞においても同様の傾向が認められた。【００９２】
３）免疫組織染色による皮膚組織におけるSP3タンパク質の発現解析
NEDD4スプライシングバリアント1及び7に存在しないNEDD4のエクソン6に相当するアミノ酸配列を有するペプチド（CQININGELERPHSQMNKNHGILRR（配列番号22）、NEDD4-SP3アミノ酸の431〜455番目に相当）を用いてSP3識別抗体（SP3431-455特異抗体）を作製した（コスモ・バイオ株式会社）。一次抗体としてSP3識別抗体を、２次抗体としてビオチン標識抗ウサギIgGモノクローナル抗体（Vector）を用いて、ケロイド患者の腫瘤及び非ケロイド患者の正常皮膚の切片に対して免疫組織学的染色を行った。【００９３】
代表的な免疫組織染色像を図２に示す。正常皮膚組織と比較して、ケロイドの皮膚組織においては表皮、真皮の両方でSP3タンパク質の発現が亢進していることが確認された。【００９４】
実施例２．SP1又はSP3による炎症回路の亢進
NCBIにNM_006154として登録されているNEDD4 SP1に対応するDNA又はNM_001284338として登録されているNEDD4 SP3に対応するDNAをpEF-BOSベクター（Nucleic Acids Res. 18, 5322, 1990）に組み込み、NEDD4 SP1又はNEDD4 SP3の発現ベクターを構築した。IL-6プロモーター下にホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するpGL4.32[luc2P/ IL-6 -RE/Hygro]（Promega）又はNFκBプロモーター下にホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するpGL4.32[luc2P/ NF-κB -RE/Hygro]（Promega）、及び内部コントロールであるウミシイタケルシフェラーゼの発現ベクターpGL4.32（Promega）でそれぞれ予め形質転換された2種のHEK293T細胞に、NEDD4 SP1又はNEDD4 SP3の発現ベクターをトランスフェクションした。トランスフェクションしたHEK293T細胞をTNFα（50ng/ml）で刺激し、刺激から５時間後に細胞を回収し、TNFα刺激存在下又は非存在下におけるIL-6プロモーター又はNF-κBプロモーターのプロモーター活性の変化をdual luciferase assayにより評価した。ルシフェラーゼ活性の測定は、Dual Luciferase Assay System（Promega）を用いて、ルミノメータ（GloMax（登録商標）-Multi Detection System、Promega）で行い、ホタルルシフェラーゼ反応による発光強度をウミシイタケルシフェラーゼ反応による発光強度で補正した。【００９５】
ルシフェラーゼアッセイの結果を図３に示す。縦軸は補正後の発光強度を表す。SP1及びSP3の強制発現によりIL-6プロモーター活性及びNF-κBプロモーター活性の上昇が認められ、またSP3はSP1よりも強くプロモーター活性を上昇させることが確認された。【００９６】
実施例３．炎症回路に対するSP3阻害性核酸の効果
１）IL-6 mRNA発現に対する効果
ヒト神経膠腫細胞株（H4細胞）にNEDD4 SP3に対する siRNA（GCAAGACAAGAGAUGAUUUtt（配列番号23）、Ambion Silencer Select siRNA、Thermo Fisher Scientific）及びコントロールsiRNA（Ambion Silencer Select siRNA、Thermo Fisher Scientific）をLipofectamine RNAiMAX（Thermo Fisher Scientific）を用いてトランスフェクションしNEDD4 SP3のノックダウン細胞を作出した。コントロール細胞とノックダウン細胞に対してIL-6 + TNFαで刺激した後、IL-6のmRNA発現をqPCR（プライマー配列：GGTACATCCTCGACGGCATCT（配列番号24）およびGTGCCTCTTTGCTGCTTTCAC（配列番号25）により測定した。またノックダウン効率をNEDD4 SP3の発現を指標に確認した。発現量はいずれもハウスキーピング遺伝子GAPDH（プライマー配列：GAGTCAACGGATTTGGTCGT（配列番号26）およびCGCTCCTGGAAGATGGTG（配列番号27））に対する相対量を表す。【００９７】
結果を図４に示す。NEDD4 si-SP3を導入したH4細胞は、si-controlを導入したH4細胞と比べて、TNF-α刺激下でのNEDD4 SP3 mRNAの発現量が4.2%にまで低下しており、NEDD4 si-SP3によるノックダウンが確認された。NEDD4 si-SP3を導入したH4細胞は、si-controlを導入したH4細胞と比べて、IL-6及びTNF-α刺激時のIL-6 mRNA発現量が41.0%にまで低下しており、NEDD4 si-SP3により炎症回路の亢進が抑制されることが示された。【００９８】
２）NF-κBのリン酸化に対する効果
ヒト神経膠腫細胞株（H4細胞）にNEDD4 SP3に対する siRNA（GCAAGACAAGAGAUGAUUUtt（配列番号23）、Ambion Silencer Select siRNA、Thermo Fisher Scientific）及びコントロール siRNA（Ambion Silencer Select siRNA、Thermo Fisher Scientific）をLipofectamine RNAiMAX（Thermo Fisher Scientific）を用いてトランスフェクションしNEDD4 SP3のノックダウン細胞を作出した。コントロール細胞とNEDD4 SP3ノックダウン細胞に対してTNFα（50ng/ml）で刺激を加えた。刺激後0、5、15、及び30分に細胞を溶解し、全細胞分画を回収した。全細胞成分分画の抽出には高塩濃度の細胞融解バッファー（NaCl 600 mM）を用いて細胞を融解し、十分にvortexを行った後、4℃で30分間緩徐に転倒混和して撹拌し、高速（15000 rpm）で30分間遠心し、細胞残渣を除いた上清を全細胞成分分画として回収した。すべての工程において、細胞融解バッファーには1/100量のprotease inhibitor（Sigma Aldrich）を添加した。得られたサンプルは全て2-メルカプトエタノールを含むSDS sample bufferで95℃5分間煮沸させた後、5-12%濃度勾配のSDS-PAGEゲル（和光純薬工業）でBio-Radのウエットウエスタンブロットシステムを用いてポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAGE）を行った。それらのサンプルについて、western blottingにより、p65のリン酸化状態を評価した。抗リン酸化p65（Ser536）抗体（Cell Signaling Technology）、抗p65抗体（Santa Cruz）、及び内在性コントロールとして抗tubulin抗体（Sigma-Aldrich）を用いて、二次抗体にはhorseradish peroxidase標識抗体（Southern Biotech）を用い、Pierce ECL Western Blotting Substrate（Thermo Fisher）によって化学発光したものを、現像機FPM100（富士メディカルフィルム）でフィルムに感光しそれぞれの蛋白を検出した。【００９９】
結果を図５に示す。NEDD4 si-SP3を導入したH4細胞は、si-controlを導入したH4細胞と比べて、NF-κB p65サブユニットのser536におけるリン酸化が抑制されており、この結果からもNEDD4 si-SP3により炎症回路の亢進が抑制されることが示された。【０１００】
実施例４．炎症回路に対するNEDD4阻害性核酸の効果
ヒト角化細胞株（HaCaT細胞）もしくは神経膠腫細胞株（H4 細胞）にNEDD4の siRNA（全バリアントをノックダウンする3種類のsiRNA：（si5: GAUCACCUCUCUUACUUCAt（配列番号28）、si6: GGAAGAUCCAAGAUUGAAAt（配列番号29）、si7: GGCGAUUUGUAAACCGAAUtt（配列番号30）、Ambion Silencer Select siRNA、Thermo Fisher Scientific）もしくはコントロールsiRNA（Ambion Silencer Select siRNA、Thermo Fisher Scientific）をLipofectamine RNAiMAX（Thermo Fisher Scientific）を用いてトランスフェクションし、NEDD4のノックダウン細胞を作出した。コントロール細胞とNEDD4ノックダウン細胞に対してIL-6 + IL-17で刺激した後、IL-6のmRNA発現をqPCR（プライマー配列：GGTACATCCTCGACGGCATCT（配列番号24）およびGTGCCTCTTTGCTGCTTTCAC（配列番号25））により測定した。またノックダウン効率をNEDD4（プライマー配列：ATGGCAAACTGTTGGATGGT（配列番号31）およびGGTCCAATTCTGTTGGGTCA（配列番号32））の発現を指標に確認した。発現量はハウスキーピング遺伝子GAPDH（プライマー配列：GAGTCAACGGATTTGGTCGT（配列番号26）およびCGCTCCTGGAAGATGGTG（配列番号27））に対する相対量を表す。【０１０１】
HaCat細胞の結果を図６に、H4細胞の結果を図７に示す。両細胞において、３種のNEDD4 siRNAはいずれも、IL-6＋IL-17刺激時のNEDD4 mRNAの発現亢進を抑制すると共に、IL-6 mRNAの発現亢進も抑制しており、NEDD4 siRNAにより炎症回路の亢進が抑制されることが示された。【０１０２】
実施例５．関節リウマチモデル動物におけるNEDD4阻害性核酸の効果
ヒト関節リウマチ症の疾患モデルとして、慢性炎症性の関節炎を発症するF759マウス（Atsumi et al., J. Exp. Med. 2002, 196(7), 979-90.）を用いた。8週齢のF759マウス（n=3）に試験0日目、2日目及び4日目の各日、3.6×105 TU/doseのNEDD4全スプライシングバリアントに対するshRNAを発現するレンチウイルス（NEDD4 sh-1-RNA: TRCN0000092433（配列番号33）; NEDD4 sh-2-RNA: TRCN0000092435（配列番号34）、Sigma Aldrich）をPBSに溶解して後肢関節に注射投与した。次いで、試験5日目、6日目及び7日目の各日、100 ngのヒトIL-6（Toray）及び100 ngのマウスIL-17A（Biolegend）をPBSに溶解して後肢関節に注射投与し、関節炎を誘導した。レンチウイルスの代わりにPBSのみを注射投与したマウス（n=3）を対照群（NTC）とした。試験開始から30日目にわたり、関節炎の病状を臨床スコアにより評価した。臨床スコアの判定は、既報（J Exp Med. 2011 Jan 17;208(1):103-14.）に従って行った。【０１０３】
臨床スコアの推移を図８に示す。NEDD4遺伝子の発現をノックダウンするshRNAを後肢関節に注射投与することで、IL-6及びIL-17によって誘導される関節炎の病状の進展を抑制することができた。【０１０４】
実施例６．皮膚炎モデル動物におけるNEDD4阻害性核酸の効果
論文に準じて（Kanemaru et al., Exp Dermatol 2015;24(6):436-42.；Morimura et al., J Dermatol Sci 2016;82(3):175-88.)、C57BL/6マウスの耳介にsiRNA混合物（2.8 ulのローション・クリーム（Johnson & Johnson）と4.7 ulの20 uM siRNAを含む）を塗布した（試験0日目、1日目、2日目及び3日目）。siRNAとしては、コントロールsiRNA（Dharmakon社のAccell Non-targeting siRNA #1）、NEDD4の全スプライシングバリアントをノックダウンするsiRNA（Dharmakon社のSMARTpool-Accell Nedd4 siRNA；配列番号35〜38）、又はNF-κB p65サブユニットの発現をノックダウンするp65 siRNA（Dharmakon社のSMARTpool-Accell Rela (p65) siRNA；配列番号39〜42）を用いた。試験1日目、2日目及び3日目においては、Toll様受容体7アゴニストであるイミキモド（ベセルナクリーム5%、持田製薬）を2.5 ulを同じ耳介部分に塗布して、皮膚炎症を誘導した。皮膚炎症の度合いは、マイクロキャリパーを用いて耳の肥厚を計測することで評価した。【０１０５】
耳の肥厚の推移を図９に示す。NEDD4遺伝子の発現をノックダウンするsiRNAは、NF-κB p65サブユニットの発現をノックダウンするsiRNAと同様に、イミキモドによって誘導される皮膚炎の病状の進展を抑制することができた。【０１０６】
実施例７．慢性炎症性皮膚疾患患者におけるNEDD4遺伝子のSNP解析
１）検体の採取
実施例１において使用したケロイド患者からの腫瘤検体及び非ケロイド患者からの正常皮膚検体に加えて、乾癬患者（n=5）、肥厚性瘢痕患者（n=4）、強皮症患者（n=3）からそれぞれの患部の皮膚検体を採取し、以下の実験に使用した。【０１０７】
２）NEDD4遺伝子のSNP解析
摘出された皮膚組織の一部を分割切除し、速やかにPAXgene（登録商標） Tissue Container（QIAGEN）の中に投入して一晩、4°Cで反応させた。その後皮膚組織を取り出しPAXgene Tissue Stabilizer（QIAGEN）の中に投入し使用するまで-20℃で保存した。PAXgene Tissue Stabilizer中に保存された組織の一部（10 mg相当量）を、AllPrep DNA/RNA Mini Kit（QIAGEN）を用いてRNA、ゲノムDNAとして抽出した。抽出されたゲノムDNAに対して、NEDD4遺伝子内のイントロン領域に存在するrs8032158 SNP（配列TTGGGAAAAAACTAGCTTATAATAA[C/T]ATAGGTAGTTTATAACATTTATTAA（配列番号43）の[C/T]で示される塩基、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/?term=rs8032158）を確認する目的でPCRダイレクトシークエンスを施行した。使用したプライマーの配列はCGACTGCATGGTGGCTTTAT（配列番号44）およびTCCTGACTAGCGGCGATTAC（配列番号45）である。PCRの増幅条件は、98°C/10秒間の熱変性、60°C/30秒間のアニーリング、72°C/30秒間のcDNA複製反応を35回繰り返した。PCR産物をWizard（登録商標） SV Gel and PCR Cean-Up System（Promega）を用いて精製した。精製したPCR産物10 ngに対してBigDye（登録商標） Terminator v3.1 Cycle Squencing Kit（Applied Biosystems）を用いてシークエンス反応（プライマー配列：CGACTGCATGGTGGCTTTAT（配列番号44））を行った。シークエンス反応の条件は、96°C/10秒間の熱変性、50°C/5秒間のアニーリング、60°C/4分間のcDNA複製反応を25回繰り返した。シークエンス反応産物はエタノール沈殿にて精製後、ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer（Applied Biosystems）にてシークエンス解析を行った。【０１０８】
NEDD4遺伝子のSNP頻度を図１０に示す。既報のとおり、ケロイド患者由来検体においてTからCへの置換が、特にホモ型のC/Cが高頻度で認められた。C/Cは、肥厚性瘢痕患者由来検体及び強皮症患者由来検体においても見出された。【０１０９】
実施例８．慢性炎症性の皮膚疾患及び腱周囲組織疾患の患者におけるNEDD4遺伝子のSNP解析
以下の皮膚検体を用いて、実施例６と同様の手法でNEDD4遺伝子のSNP解析を行った。
対照の正常皮膚検体：非ケロイド患者（健常人；n=10）、手根管症候群患者（Control (Dupuytren）；n=7）
患者の患部皮膚検体：ケロイド（n=20）、乾癬（n=5）、肥厚性瘢痕（n=4）、強皮症（n=3）、水疱性類天疱瘡（n=10）、アトピー性皮膚炎（n=9）、デュプイトラン拘縮（n=10）【０１１０】
NEDD4遺伝子のSNP頻度を図１１に示す。実施例７で確認されたケロイド、肥厚性瘢痕及び強皮症に加えて、水疱性類天疱瘡、アトピー性皮膚炎及びデュプイトラン拘縮の患者皮膚検体においてホモ型のC/Cが検出された。C/Cの遺伝子型とNEDD4 SP3の高発現は相関関係にあることから、これらの疾患においてNEDD4 SP3が増加していてい、NEDD4 SP3の発現抑制物質や活性阻害物質がこれらの疾患に奏功することが期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年12月2日(2019.12.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＥＤＤ４スプライシングバリアント３ｍＲＮＡの発現を抑制する若しくは当該ｍＲＮＡからのＮＥＤＤ４スプライシングバリアント３タンパク質の翻訳を阻害する阻害性核酸、ＮＥＤＤ４スプライシングバリアント３タンパク質に特異的に結合する抗体及び当該抗体の誘導体よりなる群から選択される少なくとも１つの物質を有効成分として含有する、ケロイドの予防及び／又は治療のための医薬。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
被験者から採取された検体におけるＮＥＤＤ４スプライシングバリアント３タンパク質又はＮＥＤＤ４スプライシングバリアント３ｍＲＮＡの発現量を測定する工程、測定された発現量を健常者から採取された検体におけるＮＥＤＤ４スプライシングバリアント３タンパク質又はＮＥＤＤ４スプライシングバリアント３ｍＲＮＡの発現量と比較する工程、及び被験者における発現量が健常者における発現量よりも多い場合、被験者はケロイドに罹患しやすいと判定する工程を含む、被験者のケロイドへの易罹患性を判定する方法。
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
被験者から採取された検体におけるＮＥＤＤ４スプライシングバリアント３タンパク質又はＮＥＤＤ４スプライシングバリアント３ｍＲＮＡの発現量を測定する工程、測定された発現量を健常者から採取された検体におけるＮＥＤＤ４スプライシングバリアント３タンパク質又はＮＥＤＤ４スプライシングバリアント３ｍＲＮＡの発現量と比較する工程、並びに被験者における発現量が健常者における発現量よりも多い場合、ＮＥＤＤ４スプライシングバリアント３ｍＲＮＡの発現を抑制する若しくは当該ｍＲＮＡからのＮＥＤＤ４スプライシングバリアント３タンパク質の翻訳を阻害する阻害性核酸、ＮＥＤＤ４スプライシングバリアント３タンパク質に特異的に結合する抗体及び当該抗体の誘導体よりなる群から選択される少なくとも１つの物質を有効成分として含有する医薬による処置が当該被験者におけるケロイドに適応可能であると判定する工程を含む、ケロイドに対する前記医薬による処置の適応性を判定する方法。
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
ＮＥＤＤ４  ｍＲＮＡの発現を抑制する若しくは当該ｍＲＮＡからのＮＥＤＤ４タンパク質の翻訳を阻害する阻害性核酸、ＮＥＤＤ４タンパク質に特異的に結合する抗体及び当該抗体の誘導体よりなる群から選択される少なくとも１つの物質を有効成分として含有する、関節リウマチ又は乾癬の予防及び／又は治療のための医薬。
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
（削除）
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
（削除）
【請求項１４】
（削除）
【請求項１５】
ＮＥＤＤ４スプライシングバリアント３ｍＲＮＡの発現を検出するためのプライマーセット又はプローブを含む、ケロイドへの易罹患性を判定するためのキット。
【請求項１６】
ＮＥＤＤ４スプライシングバリアント３タンパク質に対する特異抗体を含む、ケロイドへの易罹患性を判定するためのキット。
【請求項１７】
ＮＥＤＤ４スプライシングバリアント３ｍＲＮＡの発現を検出するためのプライマーセット又はプローブを含む、ケロイドの医薬による処置の適応性を判定するためのキットであって、前記医薬がＮＥＤＤ４スプライシングバリアント３ｍＲＮＡの発現を抑制する若しくは当該ｍＲＮＡからのＮＥＤＤ４スプライシングバリアント３タンパク質の翻訳を阻害する阻害性核酸、ＮＥＤＤ４スプライシングバリアント３タンパク質に特異的に結合する抗体及び当該抗体の誘導体よりなる群から選択される少なくとも１つの物質を有効成分として含有する医薬である、前記キット。
【請求項１８】
ＮＥＤＤ４スプライシングバリアント３タンパク質に対する特異抗体を含む、ケロイドの医薬による処置の適応性を判定するためのキットであって、前記医薬がＮＥＤＤ４スプライシングバリアント３ｍＲＮＡの発現を抑制する若しくは当該ｍＲＮＡからのＮＥＤＤ４スプライシングバリアント３タンパク質の翻訳を阻害する阻害性核酸、ＮＥＤＤ４スプライシングバリアント３タンパク質に特異的に結合する抗体及び当該抗体の誘導体よりなる群から選択される少なくとも１つの物質を有効成分として含有する医薬である、前記キット。
【国際調査報告】
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