(57)【要約】  Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属に属する細菌を有効成分として含有する、トリプシン活性を抑制するための組成物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属に属する細菌を有効成分として含有する、トリプシン活性を抑制するための組成物。
【請求項２】
前記Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属に属する細菌が、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃｌａｒａ及びＰａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｘｙｌａｎｉｐｈｉｌａからなる群から選択される少なくとも１の細菌である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属に属する細菌が、配列番号：１〜３のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属に属する細菌が、
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２７７５にて特定されるＰａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃｌａｒａに属する細菌株、
Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃｌａｒａ  ＪＣＭ１４８５９Ｔ株及び
Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｘｙｌａｎｉｐｈｉｌａ  ＪＣＭ１４８６０Ｔ株
からなる群から選択される少なくとも１の細菌株である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｒｄａｅ及びＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓからなる群から選択される少なくとも１の細菌を更に含有する、請求項１〜４のうちのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｒｄａｅが、配列番号：４に記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌であり、前記Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓが、配列番号：５に記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｒｄａｅが、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２７７６にて特定されるＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｒｄａｅに属する細菌株であり、前記Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓが、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２７７７にて特定されるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓに属する細菌株である、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２７７５にて特定されるＰａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃｌａｒａに属する細菌株。
【請求項９】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２７７６にて特定されるＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｒｄａｅに属する細菌株。
【請求項１０】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２７７７にて特定されるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓに属する細菌株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属に属する細菌を有効成分として含有する、トリプシン活性を抑制するための組成物に関する。また、本願は、米国特許仮出願６２／７２８９０８号（２０１８年９月１０日出願）及び米国特許仮出願６２／７９４１４５号（２０１９年１月１８日出願）に対する優先権を主張し、当該出願の開示内容は、参照によって本願明細書中に援用される。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの消化管には、約１００兆個の腸内細菌が生息していると考えられている。これは、約３７兆個のヒト体細胞よりも遥かに多くの腸内細菌が我々と共存し、腸内細菌叢を形成していることになる。腸内細菌学が提唱されて以来、様々な研究が行われてきた。実際、近年の無菌動物を用いた実験により、腸内細菌叢が宿主免疫系の成熟や宿主の機能に対して様々な影響を与えていることが明らかになってきている。例えば、腸内細菌は、病原性微生物とニッチを競合することで病原性微生物の定着や増殖の抑制に貢献している。また、肥満のヒトの腸内細菌はＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓが少なく、その便を移植された無菌マウスは体脂肪が増加する。【０００３】
加えて、ノトバイオート技術の普及により、腸内細菌全体から個々の細菌種が、宿主免疫系に与える詳細な研究も報告され始めている。例えば、健常者から単離したＣｌｏｓｔｒｉｄｉａ群の１７菌株が、マウス大腸で制御性Ｔ細胞を誘導し、宿主の炎症を緩和する（非特許文献１）。また、マウス小腸に生息するセグメント細菌（ｓｅｇｍｅｎｔｅｄ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｂａｃｔｅｒｉａ（ＳＦＢ））が、小腸上皮に接着することで、強力にＴｈ１７細胞を誘導する（非特許文献２）。さらに、クローン病（Ｃｒｏｈｎ病、ＣＤ）患者の唾液から単離したＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅはマウス大腸に異所性に定着することで、強力にＴｈ１細胞を誘導し大腸炎を惹起する（非特許文献３）。このように、腸内細菌と宿主免疫系に関する研究は多くある一方で、個々の腸内細菌種と便中に存在する宿主由来のタンパク質に着目した詳細な研究は少ない（非特許文献４〜７）。【０００４】
また、宿主由来のタンパク質において、トリプシンは、膵臓から分泌されるタンパク質分解酵素のひとつとして知られている。最近になって、大腸以遠での活性型トリプシンの残存は、様々な疾患の発症や増悪に関与することが示唆されている。具体的には、炎症性腸疾患（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ、ＩＢＤ）患者、特にＣＤ患者の便中に、トリプシンがその活性を維持したままの状態で残存することが報告されている（非特許文献８．９）。また、ヒトの腸内細菌の大きな構成要素として知られるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属がＩＢＤ患者で減少していることや（非特許文献９）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属を構成するある種の細菌が便中のトリプシンの失活に関与することが示唆されているが（非特許文献１０）、詳細な研究はほとんどない。【０００５】
このような現状を鑑み、トリプシン活性を抑制できる細菌を単離することができれば、ＩＢＤに対する新たな治療戦略として、トリプシン活性を抑制させる細菌療法の開発に繋がる可能性が期待できるが、そのような細菌は未だ単離されてない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ａｔａｒａｓｈｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ５００，２３２−２３６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１２３３１（２０１３）．
【非特許文献２】Ａｔａｒａｓｈｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  １６３，３６７−３８０，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１５．０８．０５８（２０１５）．
【非特許文献３】Ａｔａｒａｓｈｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５８，３５９−３６５，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｎ４５２６（２０１７）．
【非特許文献４】Ｐａｌｍ，Ｎ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  １５８，１０００−１０１０，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１４．０８．００６（２０１４）．
【非特許文献５】Ｋａｗａｍｏｔｏ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４１，１５２−１６５，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｉｍｍｕｎｉ．２０１４．０５．０１６（２０１４）．
【非特許文献６】Ｐｌａｎｅｒ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ５３４，２６３−２６６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１７９４０（２０１６）．
【非特許文献７】Ｂｕｎｋｅｒ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４３，５４１−５５３，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｉｍｍｕｎｉ．２０１５．０８．００７（２０１５）．
【非特許文献８】ｖａｎ  ｄｅ  Ｍｅｒｗｅ，Ｊ．Ｐ．＆Ｍｏｌ，Ｇ．Ｊ．Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ２４，１−４，ｄｏｉ：１０．１１５９／０００１９８７６７（１９８２）．
【非特許文献９】Ｍｉｄｔｖｅｄｔ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ８，ｅ６６０７４，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００６６０７４（２０１３）．
【非特許文献１０】Ｒａｍａｒｅ，Ｆ．，Ｈａｕｔｅｆｏｒｔ，Ｉ．，Ｖｅｒｈｅ，Ｆ．，Ｒａｉｂａｕｄ，Ｐ．＆Ｉｏｖａｎｎａ，．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６２，１４３４−１４３６（１９９６）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、トリプシン活性を抑制できる細菌を単離し、当該細菌を有効成分として含有する、トリプシン活性を抑制するための組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ＳＰＦマウスと無菌マウス（Ｇｅｒｍ−Ｆｒｅｅマウス、ＧＦマウス）の盲腸内容物について、網羅的タンパク質解析（プロテオーム解析）を行い、７１３種の宿主由来のタンパク質を同定した。ＳＰＦマウスと比較して、ＧＦマウスの盲腸内容物中には、４５種のタンパク質が有意に多く存在していた。これらのうち、存在量に特に顕著な差が認められた、タンパク質分解酵素のトリプシン（Ａｎｉｏｎｉｃ  ｔｒｙｐｓｉｎ−２：ＰＲＳＳ２）に着目した。【０００９】
トリプシンは、膵臓の外分泌腺から分泌される消化管酵素で、強力なタンパク質分解酵素であり、原因不明のＩＢＤとの関連が示唆されている。そこで、膵臓組織における、トリプシン前駆体であるトリプシノーゲンの発現量及び分泌量を検討したが、ＳＰＦマウスとＧＦマウス間の差は認められなかった。一方で、腸内容物中のトリプシン活性については、小腸では有意差を認めなかったが、盲腸以遠では、ＳＰＦマウスにおいて有意な活性低下が認められた。以上から、腸内細菌が盲腸以遠でのトリプシン活性を低下させる因子と考えられた。【００１０】
次に、健常人ボランティア６名の便検体をＧＦマウスに投与し、ヒト菌叢定着マウスとしたところ、便中のトリプシン活性は検体群毎に異なっていた。そこで、便中のトリプシン活性を低下させる菌株の同定を行った。最もトリプシン活性が低下していたヒト菌叢定着マウスの盲腸内容物を、別のＧＦマウスに投与し、様々な抗菌スペクトルの抗生物質を投与しながら、便中のトリプシン活性を評価した。その結果、アンピシリンを投与したマウス群において、便中のトリプシン活性の有意な低下が認められた。その中で、最もトリプシン活性が低下したマウスについて、盲腸内容物に含まれる菌を嫌気条件下で培養し、トリプシン活性を低下させる菌３５株を単離した。さらに、トリプシン活性を低下させる責任菌の絞り込みを行った。上述した様々な抗菌スペクトルの抗生物質を投与した際のマウス便中における腸内細菌の相対占有率とトリプシン活性値のＳｐｅａｒｍａｎ順位相関解析に基づいて、菌株を絞り込み、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃｌａｒａ（Ｐ．ｃｌａｒａ）、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｒｄａｅ（Ｐ．ｍｅｒｄａｅ）、及びＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ（Ｂ．ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ）の３菌株がトリプシン活性を低下させることが明らかになった、また最終的にＰ．ｃｌａｒａ単菌がトリプシン活性抑制における責任菌であることを見出した。【００１１】
さらに、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属に属する他の細菌（Ｐ．ｘｙｌａｎｉｐｈｉｌａ）についても評価した結果、Ｐ．ｃｌａｒａ同様に、トリプシン活性を抑制できることが明らかになった。【００１２】
本発明は、かかる知見に基づき創作されたものであり、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属に属する細菌を有効成分として含有する、トリプシン活性を抑制するための組成物に関し、より詳しくは以下を提供するものである。
＜１＞  Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属に属する細菌を有効成分として含有する、トリプシン活性を抑制するための組成物。
＜２＞  前記Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属に属する細菌が、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃｌａｒａ及びＰａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｘｙｌａｎｉｐｈｉｌａからなる群から選択される少なくとも１の細菌である、＜１＞に記載の組成物。
＜３＞  前記Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属に属する細菌が、配列番号：１〜３のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌である、＜１＞に記載の組成物。
＜４＞  前記Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属に属する細菌が、
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２７７５にて特定されるＰａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃｌａｒａに属する細菌株（Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃｌａｒａ  １Ｃ４株）、
Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃｌａｒａ  ＪＣＭ１４８５９Ｔ株及び
Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｘｙｌａｎｉｐｈｉｌａ  ＪＣＭ１４８６０Ｔ株
からなる群から選択される少なくとも１の細菌株である、＜１＞に記載の組成物。
＜５＞  Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｒｄａｅ及びＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓからなる群から選択される少なくとも１の細菌を更に含有する、＜１＞〜＜４＞のうちのいずれか一項に記載の組成物。
＜６＞  前記Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｒｄａｅが、配列番号：４に記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌であり、前記Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓが、配列番号：５に記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌である、＜５＞に記載の組成物。
＜７＞  前記Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｒｄａｅが、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２７７６にて特定されるＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｒｄａｅに属する細菌株（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｒｄａｅ  １Ｄ４株）であり、前記Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓが、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２７７７にて特定されるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓに属する細菌株（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ  ３Ｈ３株）である、＜５＞に記載の組成物。
＜８＞  受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２７７５にて特定されるＰａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃｌａｒａに属する細菌株（Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃｌａｒａ  １Ｃ４株）。
＜９＞  受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２７７６にて特定されるＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｒｄａｅに属する細菌株（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｒｄａｅ  １Ｄ４株）。
＜１０＞  受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２７７７にて特定されるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓに属する細菌株（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ  ３Ｈ３株）。【００１３】
また、大腸に残存する活性型トリプシンは、以前より、潰瘍性大腸炎やクローン病として知られているＩＢＤの発症や症状の増悪への関与が示唆されている。そこで、本発明者らは、大腸炎モデルマウスを用いて、前記３菌株のトリプシン活性を抑制させる効果に基づく、炎症の緩和を検証した。ＩＬ−１０遺伝子欠損マウスにＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓを感染させて大腸炎を誘導するモデルでは、前記３菌株の投与により、その発症が抑制される傾向が認められた。また、ＤＳＳ誘導大腸炎モデルにおいて、大腸炎の発症が有意に抑制された。【００１４】
したがって、かかる知見に基づき、本発明は、以下のトリプシン活性に起因する疾患を治療、改善又は予防するための医薬組成物、及び方法も提供する。
＜１１＞  Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属に属する細菌、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｒｄａｅ及びＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓからなる群から選択される少なくとも１の細菌を有効成分として含有する、トリプシン活性に起因する疾患を治療、改善又は予防するための医薬組成物。
＜１２＞  Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属に属する細菌が、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃｌａｒａ及びＰａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｘｙｌａｎｉｐｈｉｌａからなる群から選択される少なくとも１の細菌である、＜１１＞に記載の医薬組成物。
＜１３＞  Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属に属する細菌が、配列番号：１〜３のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌である、＜１１＞に記載の医薬組成物。
＜１４＞  Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属に属する細菌が、
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２７７５にて特定されるＰａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃｌａｒａに属する細菌株（Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃｌａｒａ  １Ｃ４株）、
Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃｌａｒａ  ＪＣＭ１４８５９Ｔ株及び
Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｘｙｌａｎｉｐｈｉｌａ  ＪＣＭ１４８６０Ｔ株
からなる群から選択される少なくとも１の細菌株である、＜１１＞に記載の医薬組成物。
＜１５＞  前記Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｒｄａｅが、配列番号：４に記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌である、＜１１＞〜＜１４＞のいずれか一項に記載の医薬組成物。
＜１６＞  前記Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｒｄａｅが、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２７７６にて特定されるＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｒｄａｅに属する細菌株（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｒｄａｅ  １Ｄ４株）である、＜１１＞〜＜１４＞のいずれか一項に記載の医薬組成物。
＜１７＞  前記Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓが、配列番号：５に記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌である、＜１１＞〜＜１６＞のいずれか一項に記載の医薬組成物。
＜１８＞  前記Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓが、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２７７７にて特定されるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓに属する細菌株（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ  ３Ｈ３株）である、＜１１＞〜＜１６＞のいずれか一項に記載の医薬組成物。
＜１９＞  前記トリプシン活性に起因する疾患が炎症性腸疾患である、＜１１＞〜＜１８＞のいずれか一項に記載の医薬組成物。
＜２０＞  前記炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎（ＵＣ：Ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ  ｃｏｌｉｔｉｓ）及びクローン病（ＣＤ：Ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）のいずれか１の疾患である、＜１９＞に記載の医薬組成物。
＜２１＞  Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属に属する細菌、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｒｄａｅ及びＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓからなる群から選択される少なくとも１の細菌を、対象に摂取させ、該対象におけるトリプシン活性に起因する疾患を治療、改善又は予防する方法。
＜２２＞  Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属に属する細菌が、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃｌａｒａ及びＰａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｘｙｌａｎｉｐｈｉｌａからなる群から選択される少なくとも１の細菌である、＜２１＞に記載の方法。
＜２３＞  Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属に属する細菌が、配列番号：１〜３のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌である、＜２１＞に記載の方法。
＜２４＞  Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属に属する細菌が、
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２７７５にて特定されるＰａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃｌａｒａに属する細菌株（Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃｌａｒａ  １Ｃ４株）、
Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃｌａｒａ  ＪＣＭ１４８５９Ｔ株及び
Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｘｙｌａｎｉｐｈｉｌａ  ＪＣＭ１４８６０Ｔ株
からなる群から選択される少なくとも１の細菌株である、＜２１＞に記載の方法。
＜２５＞  前記Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｒｄａｅが、配列番号：４に記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌である、＜２１＞〜＜２４＞のいずれか一項に記載の方法。
＜２６＞  前記Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｒｄａｅが、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２７７６にて特定されるＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｒｄａｅに属する細菌株（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｒｄａｅ  １Ｄ４株）である、＜２１＞〜＜２４＞のいずれか一項に記載の方法。
＜２７＞  前記Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓが、配列番号：５に記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌である、＜２１＞〜＜２６＞のいずれか一項に記載の方法。
＜２８＞  前記Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓが、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２７７７にて特定されるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓに属する細菌株（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ  ３Ｈ３株）である、＜２１＞〜＜２６＞のいずれか一項に記載の方法。
＜２９＞  前記トリプシン活性に起因する疾患が炎症性腸疾患である、＜２１＞〜＜２８＞のいずれか一項に記載の方法。
＜３０＞  前記炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎及びクローン病のいずれか１の疾患である、＜２９＞に記載の方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、トリプシン活性を抑制することが可能となる。特に腸内トリプシン活性を抑制することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】異なる飼育施設に由来するＳＰＦマウスについて、盲腸内容物中（便）のトリプシン活性を評価した結果を示す、グラフである。図中、横軸に記載の「ＧＦ」、「Ｒｉｋｅｎ」、「ＳＬＣ」、｛Ｃｌｅａ」及び「Ｃｈａｒｌｅｓ」は、無菌マウス〈ＧＦマウス）、理研で維持されたＳＰＦマウス、日本エスエルシー株式会社で維持されたＳＰＦマウス、日本クレア株式会社で維持されたＳＰＦマウス及び日本チャールズ・リバー株式会社で維持されたＳＰＦマウスを示し、縦軸は各盲腸内容物中のトリプシン活性を示す。
【図２】日本の健常者ボランティアの便（Ａ、Ｂ、Ｃ、ＣII、Ｄ、Ｅ、Ｈ及びＧ）中のトリプシン活性を評価した結果を示す、グラフである。図中の横軸は各健常者ボランティアを示し、縦軸は便中のトリプシン活性を示す。なお、便  Ｃ及びＣIIの提供者は同一の健常者ボランティアである。
【図３】日本の健常者ボランティアの便（Ａ〜Ｆ）をＧＦマウスに経口的に胃内投与して、ヒト菌叢化マウス（Ａ〜Ｆ）を作成し、便中のトリプシン活性を評価した結果を示す、グラフである。図中の横軸は各ヒト菌叢化マウス及びＧＦマウスを示し、縦軸は便中のトリプシン活性を示す。
【図４】健常者ボランティアの便  ＣIIをＧＦマウスに経口的に胃内投与し、その２４時間後から、抗生物質（Ａｂｘ）のアンピシリン（Ａｍｐ）、タイロシン（Ｔｙｌｏｓｉｎ）又はメトロニダゾール（ＭＮＺ）を自由飲水により投与したマウスについて、便中のトリプシン活性を経時的に評価した結果を示す、グラフである。図中の横軸は、抗生物質を投与してからの日数を示し、縦軸は便中のトリプシン活性を示す。なお、図中においては、健常者ボランティアの便  ＣIIのみを投与した（抗生物質は投与していない）ＧＦマウス（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、便も抗生物質も投与していないＧＦマウス（ＧＦ）を評価した結果も示す。評価した個体数は以下のとおりである。Ｃｏｎｔｒｏｌ：Ａｍｐ：ＭＮＺ：Ｔｙｌｏｓｉｎ：ＧＦ＝４：５：５：４：２。Ａｍｐ投与時の活性推移は、抗生物質未投与群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）と同じ傾向である事から、活性低下に寄与する菌群はＡｍｐ耐性菌と推測された。そこで、Ａｍｐ投与群の便サンプルから、菌の単離培養を行い、下記図５に示す計３５菌株を得た。続いて、抗生物質投与開始から１２日目の各個体の菌叢を、メタ１６ＳｒＤＮＡ解析により導出した。更に、菌叢を構成する各菌種の相対占有率と、その個体のトリプシン活性値について、相関解析を行い、トリプシン活性の低下に寄与する菌種を推定した。
【図５】図４に示すＡｍｐ投与群の便サンプルから単離した計３５菌株の、１６ＳｒＤＮＡ配列の相同性に基づく系統樹を示す。図中の表記は、左から順に、帰属された菌種名、１６ＳｒＤＮＡ解析の代表ＯＴＵ  Ｎｏ．、命名した単離菌株を示す。
【図６】前記単離３５菌を定着させたマウス便中のトリプシン活性を経時的に評価した結果を示す、グラフである。図中の横軸は、菌又便を投与してからの日数を示し、縦軸は便中のトリプシン活性を示す。単離した３５菌をＧＦマウスに投与し（図中「３５ｍｉｘ」）、腸内トリプシン活性を評価したところ、菌の由来する便の移植（図中「ＣII  ｈｕｍａｎ  ｆａｃｅｓ」）と比較して、同等以上の効果が認められた。
【図７】菌叢とトリプシン活性のＳｐｅａｒｍａｎ’ｓ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎを示す図である。より具体的には、無相関検定Ｐ値がＰ＜０．０５を満たす菌種について、相関係数ρの昇順に表現した結果を示す図である。各個体の便中トリプシン活性値に、その存在量が相関する菌株をＳｐｅａｒｍａｎ’ｓ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎから推定した。このうち、負の相関が強い９菌株（左側からの９菌）に着目した。
【図８】図７に示すＳｐｅａｒｍａｎ’ｓ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎで強い負の相関が認められた９菌株（９−ｍｉｘ）を定着させたマウス便中のトリプシン活性を経時的に評価した結果を示す、グラフである。また下記図９に示す６菌株（６−ｍｉｘ）又は３菌株（３−ｍｉｘ）を定着させたマウスについても同様に評価した。図中の横軸は、各菌カクテルを投与してからの日数を示し、縦軸は便中のトリプシン活性を示す。
【図９】図７に示すＳｐｅａｒｍａｎ’ｓ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎで強い負の相関が認められた９菌株の系統樹を示す。図中に示すとおり、９菌株は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属に属する３菌株（図中「Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ」）とＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属以外の６菌株（図中「Ｎｏｎ−Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ」）に分けられる。
【図１０】単離培養菌によるトリプシンタンパク質の分解を評価した結果を示す、写真である。トリプシンを含むＧＦマウス盲腸内容物と各菌を混合して、嫌気培養したのち、トリプシンタンパク質の有無をウェスタンブロッティングにより評価した。図中、「Ｐｃ」はマウス膵臓内容物（活性型トリプシンを含む）、「ｗ／ｏ  ｂａｃｔｅｒｉａ」はＧＦマウス盲腸内容物（菌とは混合しない）を評価した結果を示す。「６−ｍｉｘ」及び「３−ｍｉｘ」は、図８及び９に示した前記６菌株及び３菌株を各々混合したマウス盲腸内容物を評価した結果を示す。「６  ｓｔｒａｉｎｓ」は、前記６菌株（１Ｂ２〜６７１Ｂ８）を各々混合したマウス盲腸内容物を評価した結果を示す。「３  ｓｔｒａｉｎｓ」は、前記３菌株（１Ｃ４〜３Ｈ３）を各々混合したマウス盲腸内容物を評価した結果を示す。３ｍｉｘ及び３ｍｉｘの構成菌のひとつであるＰ．ｃｌａｒａ単菌のみ、トリプシンタンパク質の消失が認められた。つまり、Ｐ．ｃｌａｒａ菌がトリプシンを分解する事で、トリプシン活性が抑制されると考えられる。
【図１１】トリプシン活性抑制菌カクテルの定着による潰瘍性大腸炎（ＵＣ）様炎症の発生抑制を評価した結果を示すグラフである。ＩＬ１０−／−マウスに、上述のトリプシン活性抑制菌３ｍｉｘ又はトリプシン活性非抑制菌６ｍｉｘを投与したのち、ＵＣ様腸炎を誘導するＫａ１１Ｅ１２を感染させ、マウス便中のトリプシン活性を経時に検出した。図中、横軸は各菌カクテルを投与してからの経過時間を示す。縦軸は便中のトリプシン活性を示す。「１１Ｅ１２」はＩＬ１０−／−マウスにＫａ１１Ｅ１２のみを投与した結果を示し、「１１Ｅ１２＋６ｍｉｘ」及び「１１Ｅ１２＋３ｍｉｘ」は、ＩＬ１０−／−マウスに、３ｍｉｘ及び６ｍｉｘを各々投与したのち、Ｋａ１１Ｅ１２を投与した結果を示す。「ＧＦ」は無菌マウスを評価した結果を示す。「３ｍｉｘ」はＩＬ１０−／−マウスに３ｍｉｘのみを投与した結果を示す。
【図１２】図１１に示したマウスにおいて、Ｋａ１１Ｅ１２投与３週間後の腸内炎症レベルを評価した結果を示す、ドットプロット図である。図中、横軸の表記は、図１１と同じである。縦軸は、便中の炎症マーカー（リポカリン−２、ＬＣＮ２）の濃度を示す。
【図１３】Ｐ．ｃｌａｒａ及びその類縁菌種によるトリプシンタンパク質の分解を評価した結果を示す、写真である。図中、「Ｐｃ」はマウス膵臓内容物（活性型トリプシンを含む）、「ｗ／ｏ  ｂａｃｔｅｒｉａ」はＧＦマウス盲腸内容物（菌とは混合しない）を評価した結果を示す。「１Ｃ４」は、本発明において単離されたＰ．ｃｌａｒａ菌株  １Ｃ４（図１０  参照）を混合したマウス盲腸内容物を評価した結果を示す。「ＪＣＭ１４８５９」は、１Ｃ４とは異なるＰ．ｃｌａｒａ菌の別株を混合したマウス盲腸内容物を評価した結果を示す。「ＪＣＭ１４８６０」は、Ｐ．ｃｌａｒａ菌の類縁種であるＰ．ｘｙｌａｎｉｐｈｉｌａ菌株を混合したマウス盲腸内容物を評価した結果を示す。図１３に示すとおり、いずれの株もトリプシン分解活性が認められた。Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａに属する菌は、上述の２種  ＪＣＭ１４８５９及びＪＣＭ１４８６０のみが知られている。この事から、トリプシン分解活性は、ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属に共通する活性と推定される。
【図１４】トリプシン（ｍＰＲＳＳ２）とＰ．ｃｌａｒａ菌由来タンパク質とのクロスリンク試験の結果を、トリプシンを検出対象とするウェスタンブロッティングにより解析した結果を示す、写真である。図中、「ｍＰＲＳＳ２＋Ｐ．ｃｌａｒａ」はｍＰＲＳＳ２と単にインキュベートしたＰ．ｃｌａｒａ菌の細胞溶解液を解析した結果を示し、「ｍＰＲＳＳ２＋Ｐ．ｃｌａｒａ  Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋ」は、ｍＰＲＳＳ２とインキュベートし、更にクロスリンク反応を施したＰ．ｃｌａｒａ菌の細胞溶解液を解析した結果を示し、「Ｐ．ｃｌａｒａ」は、ｍＰＲＳＳ２とはインキュベーションせずにＰ．ｃｌａｒａの細胞溶解液を解析した結果を示し、「Ｐ．ｃｌａｒａ  Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋ」は、ｍＰＲＳＳ２とはインキュベーションせずに、クロスリンク反応を施し、Ｐ．ｃｌａｒａの細胞溶解液を解析した結果を示す。「ｍＰＲＳＳ２＋ＥＧＥＦ」は、ｍＰＲＳＳ２を添加したＥＧＥＦ培地を解析した結果を示し、「ｍＰＲＳＳ２＋Ｐ．ｃｌａｒａ」は、ｍＰＲＳＳ２及びＰ．ｃｌａｒａをインキュベーションした後のＥＧＥＦ培地を解析した結果を示し、「Ｐ．ｃｌａｒａ  ｏｎｌｙ」は、Ｐ．ｃｌａｒａのみをインキュベーションした後のＥＧＥＦ培地を解析した結果を示す。図中、「ｍＰＲＳＳ２」はウェスタンブロッティングにより検出されるｍＰＲＳＳ２のバンドの位置を示し、「Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ（ａｐｐｒｏｘ。２５０ｋＤ）」は、ｍＰＲＳＳ２（約３２ｋＤａ）に吸着又は結合して形成されたＰ．ｃｌａｒａ菌由来タンパク質（２２０ｋＤａ程度）との複合体のバンドの位置を示す。「Ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ」は、ウェスタンブロッティングにより検出された非特異的バンドの位置を示す。
【図１５】トリプシン活性阻害試験の結果を示す、写真である。具体的には、トリプシン活性阻害剤にて処理したヒトＰＲＳＳ２（ｈＰＲＳＳ２）（図中「ＴＬＣＫ（＋）」）又は未処理のｈＰＲＳＳ２（図中「ＴＬＣＫ（−）」）と、各菌（Ｐ．Ｃｌａｒａ  １Ｃ４、Ｐ．ｍｅｒｄａｅ  １Ｄ４又はＰ．ｘｙｌａｎｉｐｈｉｌａ）とをインキュベートし、ｈＰＲＳＳ２をウェスタンブロッティングにより検出した結果を示す、写真である。なお、図中「ｎｏｎｅ」は菌非存在下にてトリプシンのみをインキュベーションした結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
後述の実施例に示すとおり、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属に属する細菌が、トリプシンの活性を抑制することが明らかになった。したがって、本発明は、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属に属する細菌を有効成分として含有する、トリプシン活性を抑制するための組成物を提供する。
【００１８】
「トリプシン」は、エンドペプチダーゼ、セリンプロテアーゼの一種である。また、膵液に含まれる消化酵素の一種で、塩基性アミノ酸のカルボキシ基側のペプチド結合を加水分解する活性を有する。本発明においてその活性が抑制されるトリプシンとしては特に制限はないが、好ましくは、陰イオン性トリプシンであり、より好ましくはＡｎｉｏｎｉｃ−ｔｒｙｐｓｉｎ−２（ＰＲＳＳ２）である。ＰＲＳＳ２は典型的に、ヒト由来であればＮＣＢＩ  レファレンス配列：ＮＰ＿００２７６１にて規定されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＮＣＢＩ  レファレンス配列：ＮＭ＿００２７７０にて規定される塩基酸配列がコードするアミノ酸配列からなるポリペプチド）が挙げられ、マウス由来であればＮＣＢＩ  レファレンス配列：ＮＰ＿０３３４５６にて規定されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＮＣＢＩ  レファレンス配列：ＮＭ＿００９４３０にて規定される塩基酸配列がコードするアミノ酸配列からなるポリペプチド）が挙げられる。なお、本発明にかかるＰＲＳＳ２は、これら典型的なアミノ酸配列をもって特定されるポリペプチドのみならず、機能的に活性なその誘導体、機能的に活性なそのフラグメント、その相同体、高ストリンジェンシー条件又は低ストリンジェンシー条件下で、これらポリペプチドをコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体も含まれる。また、このような誘導体、フラグメント、相同体又は変異体には、前記特定のアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％（好ましくは７０％、より好ましくは８０％、さらに好ましくは９０％、より好ましくは９５％、特に好ましくは９９％）の相同性を有するポリペプチドが含まれる。
【００１９】
「トリプシン活性」については、上述のとおり、通常、塩基性アミノ酸（リシン、アルギニン）のカルボキシ基側のペプチド結合を加水分解する活性を意味する。しかしながら、後述の実施例において示すとおり、本発明において、トリプシン活性の抑制は、トリプシンの分解によって奏される。また当該分解は、トリプシンの自己分解（自己消化）の促進によって誘導されることも、後述の実施例において示唆される。したがって、本発明において抑制される「トリプシン活性」において、自己分解する活性は除外される。また、本発明において「トリプシン活性の抑制」は、トリプシン分解の促進、トリプシン自己分解の促進とも言い換えることが出来る。
【００２０】
「トリプシン活性の抑制」は、当業者であれば、例えば、標識した基質ペプチドの分解の程度を、当該標識を検出することによって、評価することができる（例えば、後述の実施例に示す「Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ａｂｃａｍ  ａｂ１１１７５０）」）。また、後述の実施例に示すとおり、トリプシンの分解の程度を、トリプシンを検出対象とする免疫学的検出法（例えば、ウェスタンブロッティング）を評価することによっても行なうことができる。なお、本発明において「抑制」には完全な抑制（阻害）も含まれる。
【００２１】
本発明の組成物において、トリプシン活性を抑制するために有効成分として含まれる「Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ（パラプレボテラ）属に属する細菌」は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｉａ綱、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ目、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ科、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属に属する細菌であり、例えば、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃｌａｒａ（パラプレボテラ  クララ、Ｐ．ｃｌａｒａ）、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｘｙｌａｎｉｐｈｉｌａ（パラプレボテラ  キシラニフィラ、Ｐ．ｘｙｌａｎｉｐｈｉｌａ）が挙げられる。
【００２２】
Ｐ．ｃｌａｒａとしては、例えば、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２７７５にて特定されるＰａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃｌａｒａに属する細菌株（Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃｌａｒａ  １Ｃ４株）、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃｌａｒａ  ＪＣＭ１４８５９Ｔ株が挙げられる。
【００２３】
Ｐ．ｘｙｌａｎｉｐｈｉｌａとしては、例えば、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｘｙｌａｎｉｐｈｉｌａ  ＪＣＭ１４８６０Ｔ株が挙げられる。
【００２４】
なお、「Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃｌａｒａ  ＪＣＭ１４８５９Ｔ株」及び「Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｘｙｌａｎｉｐｈｉｌａ  ＪＣＭ１４８６０Ｔ株」は、理化学研究所バイオリソース研究センター（ＲＩＫＥＮ  ＢＲＣ）微生物材料開発室（ＪＣＭ）より入手することができる。
【００２５】
また、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属に属する細菌としては、配列番号：１〜３のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌が挙げられる。なお、配列番号：１〜３に記載の塩基配列は各々、前記Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃｌａｒａ  １Ｃ４株、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃｌａｒａ  ＪＣＭ１４８５９Ｔ株及びＰａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｘｙｌａｎｉｐｈｉｌａ  ＪＣＭ１４８６０Ｔ株の１６ＳｒＲＮＡの配列を示す。
【００２６】
また、本発明のトリプシン活性を抑制するための組成物は、前述のＰａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属に属する細菌の他、当該菌を腸内において定着し易くするという観点から、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｒｄａｅ及びＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓからなる群から選択される少なくとも１の細菌を更に含有するものであっても良い。
【００２７】
「Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｒｄａｅ（パラバクテロイデス  メルダエ」としては、例えば、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２７７６にて特定されるＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｒｄａｅに属する細菌株（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｒｄａｅ  １Ｄ４株）が挙げられる。また、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｒｄａｅとしては、配列番号：４に記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌が挙げられる。なお、配列番号：４に記載の塩基配列は、前記Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｒｄａｅ  １Ｄ４株の１６ＳｒＲＮＡの配列を示す。
【００２８】
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ（バクテロイドス  ユニフォルミス）としては、例えば、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２７７７にて特定されるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓに属する細菌株（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ  ３Ｈ３株）が挙げられる。また、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓとしては、配列番号：５に記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌が挙げられる。配列番号：５に記載の塩基配列は、前記Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ  ３Ｈ３株の１６ＳｒＲＮＡの配列を示す。
【００２９】
なお、本発明における「少なくとも９０％の同一性」とは、各塩基配列に対する同一性が、好ましくは９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上）、特に好ましくは９９％以上である。
【００３０】
本発明の組成物に含まれる細菌は、生菌であってもよく、死菌体であってもよい。また、前記細菌に含まれる物質（タンパク質、核酸、脂質、糖質、糖鎖等）、該細菌の分泌産物、該細菌による代謝産物であってもよい。また、本発明の組成物を複合して用いることができ、結果として併用して摂取又は吸収される場合（併用組成物の場合）、前述の細菌は２種以上の組成物の中に分けて存在することもできる。
【００３１】
本発明のトリプシン活性を抑制するための組成物は、医薬組成物（医薬品、医薬部外品等）、飲食品（動物用飼料を含む）、あるいは研究目的（例えば、インビトロやインビボの実験）に用いられる試薬の形態であり得る。また、本発明の組成物は、トリプシン活性を抑制するため、該活性に起因する疾患の治療、予防又は改善のための医薬組成物、飲食品として用いられる。
【００３２】
本発明の組成物は、公知の製剤学的方法により製剤化することができる。例えば、カプセル剤、錠剤、丸剤、液剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、トローチ剤、舌下剤、咀嚼剤、バッカル剤、ペースト剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤、乳剤、塗布剤、軟膏剤、硬膏剤、パップ剤、経皮吸収型製剤、ローション剤、吸引剤、エアゾール剤、注射剤、坐剤等として、経口的、非経口的（例えば、腸管内、筋肉内、静脈内、気管内、鼻内、経皮、皮内、皮下、眼内、膣、腹腔内、直腸若しくは吸入）、又はこれらの複数の組み合わせからなる経路による投与用に使用することができる。
【００３３】
これら製剤化においては、薬理学上若しくは飲食品として許容される担体、具体的には、滅菌水、生理食塩水、緩衝液、培地、植物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、芳香剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、無痛化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等と適宜組み合わせることができる。
【００３４】
また、これら製剤化においては、腸管内におけるトリプシン活性をより効率的に抑制する等の観点から、特に経口投与を目的とする製剤においては、本発明の組成物を腸管内に効率良く送達することを可能にする組成物と組み合わせてもよい。このような腸管内への送達を可能とする組成物については特に制限されることなく、公知の組成物を適宜採用することができ、例えば、ｐＨ感受性組成物、腸管までの放出を抑制する組成物（セルロース系ポリマー、アクリル酸重合体及び共重合体、ビニル酸重合体及び共重合体等）、腸管粘膜特異的に接着する生体接着性組成物（例えば、米国特許第６．３６８．５８６号明細書に記載のポリマー）、プロテアーゼ阻害剤含有組成物、腸管内酵素によって特異的に分解される組成物）が挙げられる。
【００３５】
また、医薬組成物として用いる場合には、トリプシン活性に起因する疾患の治療、予防又は改善に用いられる公知の物質（例えば、抗炎症剤、免疫抑制剤）を更に含んでいてもよく、またかかる物質と併用してもよい。
【００３６】
本発明の組成物を飲食品として用いる場合、当該飲食品は、例えば、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品、栄養補助食品、病者用食品、あるいは動物用飼料であり得る。飲食品の具体例としては、発酵飲料、油分を含む製品、スープ類、乳飲料、清涼飲料水、茶飲料、アルコール飲料、ドリンク剤、ゼリー状飲料等の液状食品、炭水化物含有食品、畜産加工食品、水産加工食品；野菜加工食品、半固形状食品、発酵食品、菓子類、レトルト製品、電子レンジ対応食品等が挙げられる。さらには、粉末、穎粒、錠剤、カプセル剤、液状、ペースト状又はゼリー状に調製された健康飲食品も挙げられる。なお、本発明における飲食品の製造は、当該技術分野に公知の製造技術により実施することができる。当該飲食品においては、トリプシン活性に起因する疾患の改善又は予防に有効な成分（例えば、栄養素等）を添加してもよい。また、当該改善等以外の機能を発揮する他の成分あるいは他の機能性食品と組み合わせることによって、多機能性の飲食品としてもよい。
【００３７】
本発明の組成物の製品（医薬品、医薬部外品、飲食品、試薬等）又はその説明書は、トリプシン活性を抑制するため、又はトリプシン活性に起因する疾患を治療、改善若しくは予防するために用いられる旨の表示を付したものであり得る。また、飲食品に関しては、形態及び対象者等において一般食品との区別がつくよう、保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品）として健康機能の表示を、本発明の組成物の製品等に付したものであり得る。ここで「製品又は説明書に表示を付した」とは、製品の本体、容器、包装等に表示を付したこと、あるいは製品の情報を開示する説明書、添付文書、宣伝物、その他の印刷物等に表示を付したことを意味する。また、本発明の組成物は、キットの態様であってもよい。
【００３８】
また、上述のとおり、上述の細菌等を用い、公知の製剤化技術により、医薬組成物を製造することができる。したがって、本発明は、トリプシン活性に起因する疾患を治療、改善又は予防するための医薬組成物を製造するための、本発明の腸内細菌等の使用をも提供する。
【００３９】
＜トリプシン活性に起因する疾患の治療方法等＞
本発明は、上述の組成物、又はそれらの有効成分となる上述の細菌（「本発明の医薬組成物等又はそれらの有効成分等」とも称する）を、対象に摂取させることを特徴とする、対象におけるトリプシン活性を抑制する方法、該対象における免疫を抑制する方法、又は該対象におけるトリプシン活性に起因する疾患を治療、改善又は予防する方法をも提供するものである。
【００４０】
本発明において、「トリプシン活性に起因する疾患」とは、トリプシン活性によって誘発された疾患を意味し、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病、炎症性腸疾患といった慢性炎症性腸疾患等）が挙げられる。
【００４１】
本発明において、「治療、改善」には、前記疾患からの完全な回復のみならず、上記疾患の症状を緩和、またはその進行を抑制することも含まれる。「予防」には上記疾患の発症を抑制する又は遅延させ、またその再発を抑制することが含まれる。
【００４２】
本発明の医薬組成物等又はそれらの有効成分等は、ヒトを含む動物を対象として使用することができるが、ヒト以外の動物としては特に制限はなく、種々の家畜、家禽、ペット、実験用動物等を対象とすることができる。また、本発明の医薬組成物等又はそれらの有効成分等の摂取対象としては、トリプシン活性に起因する疾患を罹患しているものならず、当該疾患を罹患しているおそれのあるもの、また前記疾患の症状が緩和又は消失（寛解）したものも含まれる。
【００４３】
本発明の医薬組成物等又はそれらの有効成分等の摂取方法としては、特に制限はなく、経口投与であってもよく、また非経口投与（例えば、腸管内への投与）であってもよいが、経口投与である場合には、本発明の医薬組成物等又はそれらの有効成分等の効果をより向上させるという観点から、本発明の医薬組成物等又はそれらの有効成分等の摂取対象は、プロトンポンプ阻害剤（ＰＰＩ）等の摂取により胃酸の産生を減少させておくことが好ましい。
【００４４】
また、本発明の医薬組成物等又はそれらの有効成分等を摂取させる場合、その摂取量は、対象の年齢、体重、疾患の症状、健康状態、組成物の種類（医薬品、飲食品等）、摂取方法等に応じて、当業者であれば適宜選択することができる。
【００４５】
以上、本発明のトリプシン活性に起因する疾患を治療、改善若しくは予防するための組成物、又は方法の好適な実施形態について説明したが、当該組成物又は方法は上記実施形態に限定されるものではない。
【００４６】
後述の実施例に示すとおり、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属に属する細菌、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｒｄａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓの投与により、ＩＬ−１０遺伝子欠損マウスにＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓを感染させて大腸炎を誘導するモデルにおける発症が抑制される傾向が認められた。また、ＤＳＳ誘導大腸炎モデルにおいても、大腸炎の発症が有意に抑制された。
【００４７】
したがって、本発明は、以下のトリプシン活性に起因する疾患を治療、改善又は予防するための医薬組成物、及び方法も提供する。
【００４８】
Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属に属する細菌、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｒｄａｅ及びＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓからなる群から選択される少なくとも１の細菌を有効成分として含有する、トリプシン活性に起因する疾患を治療、改善又は予防するための医薬組成物。
【００４９】
Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属に属する細菌、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｒｄａｅ及びＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓからなる群から選択される少なくとも１の細菌を、対象に摂取させ、該対象におけるトリプシン活性に起因する疾患を治療、改善又は予防する方法。
【００５０】
＜新規細菌＞
後述の実施例において示すとおり、下記３菌株は、本発明者らによって初めて単離培養された黄色ブドウ球菌株である。また、これらの有用性も上述のとおりである。したがって、本発明は、以下の菌株も提供するものである。
【００５１】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２７７５にて特定されるＰａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃｌａｒａに属する細菌株（Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃｌａｒａ  １Ｃ４株）。
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２７７６にて特定されるＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｒｄａｅに属する細菌株（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｒｄａｅ  １Ｄ４株）。
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２７７７にて特定されるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓに属する細菌株（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ  ３Ｈ３株）。
【００５２】
なお、いずれの細菌株も、２０１８年８月３０日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）  特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室）に寄託されている。
【実施例】
【００５３】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。また、本実施例は、以下に示す材料及び方法を用いて行なった。【００５４】
（無菌マウス）
Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ  Ｊｃｌノトバイオートマウス（日本クレア株式会社、４〜８週齢）を、飼育用ビニールアイソレータ（無菌アイソレータ、株式会社アイシーエム；ＩＣＭ−１Ｂ）内にて自由飲水給餌条件で１週間以上飼育し、環境馴化させた。【００５５】
（ＳＰＦマウス）
Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ  ＳＰＦマウス（４〜８週齢）を、理化学研究所バイオリソース研究センター、日本ＳＬＣ株式会社、日本クレア株式会社、あるいは日本チャールズ・リバー株式会社より取得し、ＳＰＦ環境下で、自由飲水給餌条件で１週間以上飼育し、環境馴化させた。【００５６】
（盲腸内容物のプロテオーム解析）
マウスをイソフルラン麻酔下でサクリファイスして、盲腸内容物を採取し、−８０℃で保存した。凍結保存したサンプルを氷上で融解し、ＲＩＰＡ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ（コスモ・バイオ株式会社；ＡＫＲ−１９０）を５倍重量加えて充分攪拌した。４℃，１５，０００×ｇで２０分間遠心し、タンパク質が溶存した上清を取得した。【００５７】
タンパク質溶液と同体積量の３０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）溶液（ナカライテスク；３７２１１−５５）を混合して、４℃で３０分間静置したのち、４℃，１５，０００×ｇで２０分間遠心して上清を除去し、タンパク質の沈殿物を取得した。アセトンへの再分散と再沈殿を２回繰り返し、沈殿を精製した。【００５８】
終濃度  １２ｍＭ  デオキシコール酸ナトリウム（ＳＤＣ，ナカライテスク；０２８８９−７２），１２ｍＭ  ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ，ナカライテスク；３１６２３−３２）を溶解した１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９．０緩衝液（ニッポンジーン；３１６−９０３８５）を、タンパク質濃度が２．０μｇ／μＬとなるように添加し、５秒間の超音波処理を４回繰り返して再溶解した。ＴａＫａＲａ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（タカラバイオ；Ｔ９３００Ａ）を用いて、ＢＣＡ法によりタンパク質濃度を定量し、１．０μｇ／μＬにメスアップした。【００５９】
１．０μｇ／μＬ  タンパク質溶液２０μＬに、１００ｍＭ  ジチオスレイトール（ナカライテスク；１４１２８−９１）水溶液を２μＬ添加し、５０℃で３０分加熱し、ジスルフィド結合を還元した。更に３７５ｍＭ  ヨードアセトアミド（ナカライテスク；１９３０２−５４）水溶液を２μＬ添加して室温で３０分間反応させ、チオール基をアルキル化した。４００ｍＭシステイン（ナカライテスク；１１５４８−５２）水溶液を４μＬ添加して１０分間反応させ、残存するヨードアセトアミドをクエンチした。５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム（ナカライテスク；０８８８７−５４）水溶液８０μＬ、２００ｎｇ／μＬ  リシルエンドペプチダーゼ（和光純薬；１２５−０５０６１）溶液２μＬ、及び２００ｎｇ／μＬトリプシン（和光純薬；２０２−１５９５１）溶液２μＬを添加し、３７℃で一晩反応させ、タンパク質をペプチド断片化した。【００６０】
５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ，ナカライテスク；３４９０１−２１）水溶液３０μＬを加えたのち、酢酸エチル（ナカライテスク；１４７４７−６５）２００μＬで液−液抽出を行い、ＳＤＣ及びＳＬＳを除去した。遠心エバポレーター処理により、溶存有機溶媒を除去した。０．１％ＴＦＡ水溶液１００μＬを加えて、室温１５，０００×ｇで１５分間遠心し、不溶物を除去した。Ｃ１８  Ｔｉｐｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック；８７７８２）で脱塩処理後、終濃度  ３％アセトニトリル（ナカライテスク；００４３０−２５）０．１％ギ酸（ナカライテスク；０８９６５−８２）水溶液に溶解した。ＳＣＩＥＸ社ＴｒｉｐｌｅＴＯＦ５６００システムを用いてＬＣ−ＭＳ測定し、ＳＷＡＴＨ  Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎを利用してプロテオーム解析を行った。【００６１】
（マウス便あるいはヒト健常者ボランティア便取得）
健常者ボランティア＃Ａ〜Ｇ便、あるいはマウス便サンプルを、２０体積％グリセロール溶解ＰＢＳで５倍重量に希釈し、１００μｍ径フィルタで濾過したものを、ストック液として−８０℃で保存した。【００６２】
（便中トリプシン活性の測定）
凍結便サンプルを常温に融解後、０．９％ＮａＣｌ水溶液に分散し、その上清のトリプシン活性をＰｒｏｔｅａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ａｂｃａｍ  ａｂ１１１７５０）のプロトコールに従って測定した。【００６３】
（ヒト健常者ボランティア便由来菌の定着マウスの作成）
上記（マウス便あるいはヒト健常者ボランティア便取得）にて作成したストック液を常温にて融解し、ＰＢＳで１０倍容量に希釈した。２００μＬの該希釈液を無菌マウスの胃内に経口投与した。さらに１ヶ月間、無菌アイソレータ内にて自由飲水給餌条件で飼育して、移植便中の菌を該マウスに定着させた。また、これらマウスについても、上記（便中トリプシン活性の測定）に記載の方法にてトリプシン活性を測定した。【００６４】
（ヒト健常者ボランティア便由来菌の定着マウスの作成、及び抗生物質投与による定着菌の排除）
前記（ヒト健常者ボランティア便由来菌の定着マウスの作成）おいて、自由飲水をアンピシリン、メトロニダゾールあるいはタイロシンの２００ｍｇ／Ｌ水溶液に変更し、さらに１ヶ月間飼育して、各抗生物質に非耐性の菌の排除を行った。上記（マウス便あるいはヒト健常者ボランティア便取得）に記載の方法にて、投与過程のマウスの便サンプルを取得した、また、上記（便中トリプシン活性の測定）に記載の方法にてトリプシン活性を測定した。【００６５】
（マウス便からのＤＮＡ抽出）
１００μｍ径フィルタで濾過した便サンプル液１００μｌに、１５ｍｇリゾチーム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ  ｆｒｏｍ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ｅｇｇ  ｗｈｉｔｅ；  Ｌ４９１９）と５μｌ  ＲＮａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＰｕｒｅＬｉｎｋ  ＲＮａｓｅ  Ａ（２０ｍｇ／ｍＬ）；１２０９１−０２１）を溶解した１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／１０ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．０，以下ＴＥ１０と称する）８００μｌを加え、３７℃で１時間振盪した。続いて、アクロモペプチダーゼ（登録商標）（Ｗａｋｏ；０１５−０９９５１）２，０００Ｕを添加し、３７℃で３０分間振盪し、溶菌した。【００６６】
２０％  ＳＤＳ  ＴＥ１０溶液  ５０μｌと、２０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（Ｒｏｃｈｅ，Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，ＰＣＲ  Ｇｒａｄｅ；０３１１５８５２００１）を溶解したＴＥ１０溶液５０μｌを加え、５５℃で６０分間振盪した。【００６７】
Ｐｈｅｎｏｌ／Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ／Ｉｓｏａｍｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ  （２５：２４：１）（Ｗａｋｏ；３１１−９０１５１）による液−液抽出法によりＤＮＡを抽出し、エタノール沈殿により細菌ゲノムＤＮＡを得た。【００６８】
（マウス便の菌叢解析）
細菌ゲノムＤＮＡについて、ＴａＫａＲａ  ＥｘＴａｑ（タカラバイオ；ＲＲ００１Ａ）を用いてＰＣＲ反応を行い、１６Ｓ  ｒＤＮＡのＩｌｌｕｍｉｎａ社Ｍｉｓｅｑシーケンス用アンプリコンを作成した。プライマー配列は以下の通りである（Ｎｉｓｈｉｊｉｍａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ  ＤＮＡ  Ｒｅｓ  ２３  １２５−１３３  ２０１６）。
２７Ｆｏｒｗａｒｄ−ｍｏｄ：（５’−ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣ＊＊ｉｎｄｅｘ＊＊ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＡＧＲＧＴＴＴＧＡＴＹＭＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’）
インデックス配列に隣接する両配列を、配列番号：１０及び１１に示す。
３３８Ｒｅｖｅｒｓｅ：（５’−ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ＊＊ｉｎｄｅｘ＊＊ＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＴＧＣＴＧＣＣＴＣＣＣＧＴＡＧＧＡＧＴ−３’）
インデックス配列に隣接する両配列を、配列番号：１２及び１３に示す。【００６９】
Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ（登録商標）  ＸＰ（ベックマンコールター；Ａ６３８８２）及びＭｉｎ  Ｅｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン；２８００４）を用いてアンプリコンを精製し、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）  ｄｓＤＮＡ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック；Ｐ７５８９）及びＫＡＰＡ  ｌｉｂｒａｒｙ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス；０７９６０１６６００１）を用いてアンプリコンのＤＮＡ濃度を定量した。各アンプリコンの混合物の平均ＤＮＡ長を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザ  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ＤＮＡ  キット（アジレント・テクノロジー；５０６７−４６２６）を用いて測定し、アンプリコンのモル濃度を算出した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＭｉｓｅｑ  １６ＳｒＤＮＡゲノム解析プロトコールにしたがって、ライブラリの変性及びハイブリダイゼーション溶液の調製を行い、Ｍｉｓｅｑ（イルミナ；ＳＹ−４１０−１００３）及びＭｉｓｅｑ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  ｖ３（イルミナ；ＭＳ−１０２−３００３）を用いてシーケンシングを行った。【００７０】
得られた配列データについて、サンプル毎にクオリティの高い３０００リードをランダムに選択し、ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ  ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  ｕｎｉｔ（ＯＴＵ）代表配列のデータベースアサイン法による菌種帰属により、菌叢データを得た。データベースは、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｔａｘｏｎｏｍｙ）、ＲＤＰ（ｈｔｔｐ：／／ｒｄｐ．ｃｍｅ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／）を用い、各データベースへのＧＬＳＥＡＲＣＨ（ｈｔｔｐ：／／ｎｅｂｃ．ｎｏｘ．ａｃ．ｕｋ／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｄｏｃｓ／ｇｌｓｅａｒｃｈ．ｈｔｍｌ）のトップヒットのうち、最も相同性の高い結果を、菌種帰属に採用した（Ｎｉｓｈｉｊｉｍａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ  ＤＮＡ  Ｒｅｓ  ２３  １２５−１３３  ２０１６）。【００７１】
（菌の単離）
便サンプル投与１２日後の便をＰＢＳで希釈し、以下の培地を用いて１０％  ＣＯ２嫌気環境下で培養し、形成したコロニーを単離した。
ＥＧ  ｅｘｔ．培地、ｍＧＡＭ培地、Ｓｃｈａｅｄｌｅｒ培地（Ｗａｋｏ；５１７−４５８０５）、ＢＬ培地（Ｎｉｓｓｕｉ；５４３０）ＣＭ０６１９培地（Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｔ．Ｄ．ａｎｄ  Ｃｈａｌｇｒｅｎ  Ｓ．（１９７６）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１０．９２６−９２８．）を基本培地として、終濃度５％の馬血液または馬脱繊維血液を添加した培地のアガープレートを用いた。特に、ＣＭ０６１９培地については、所定のサプリメントを添加したＳＲ０１０７選択培地あるいはＳＲ０１０８選択培地（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｘｏｉｄ．ｃｏｍ／ＵＫ／ｂｌｕｅ／ｐｒｏｄ＿ｄｅｔａｉｌ／ｐｒｏｄ＿ｄｅｔａｉｌ．ａｓｐ？ｐｒ＝ＣＭ０６１９）も同様に用いた。【００７２】
（系統樹の作成）
統計分析ソフトＲ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／）のパッケージａｐｅを用いて、菌叢解析時の帰属に用いたＯＴＵの代表配列に基づいて、単離した３５菌の１６ＳｒＤＮＡ配列の類似度に基づく系統樹を作成した。【００７３】
（単離３５菌定着による腸内トリプシン活性の抑制）
上記（菌の単離）にて単離した各菌を、ＥＧ  ｅｘｔ．培地、ｍＧＡＭ培地、Ｓｃｈａｅｄｌｅｒ培地、ＢＬ培地あるいはＣＭ０６１９培地で、それぞれ３７℃，１０％ＣＯ２嫌気環境下で１〜３日間培養した。定常期に至った菌液を等容量ずつ混和し、２００μＬを実施例１の無菌マウスの胃内に経口投与した。無菌アイソレータ内にて自由飲水給餌条件で飼育して、菌を定着させた。また、上記（便中トリプシン活性の測定）にしたがってトリプシン活性を測定した。【００７４】
（Ｓｐｅａｒｍａｎの順位相関分析）
便投与１２日後の、１６ＳｒＤＮＡに基づく腸内菌叢解析から得られた、各構成菌の相対占有率と、その便のトリプシン活性値について、Ｓｐｅａｒｍａｎの順位相関分析行った。菌の相対占有率とトリプシン活性値の相関係数ρが、ρ≦−０．５であり、かつ、該無相関検定のＰ値が、Ｐ＜０．０５である菌群を、トリプシン活性抑制菌の候補として推定した。【００７５】
（選択菌カクテルによる腸内トリプシン活性の抑制）
前記（Ｓｐｅａｒｍａｎの順位相関分析）にて、トリプシン活性抑制菌の候補として推定した９菌株について、上記（単離３５菌定着による腸内トリプシン活性の抑制）に記載の方法に準じて、菌定着マウスの作成及びその腸内トリプシン活性の測定を行った。また、前記９菌株について、バクテロイデス属３菌株と、非バクテロイデス属６菌株に区分して、菌定着マウスの作成及びその腸内トリプシン活性の測定を行った。【００７６】
（トリプシン活性抑制菌カクテルの定着６による潰瘍性大腸炎（ＵＣ）様炎症の発生抑制）
ＩＬ１０−／−マウス（４〜８週齢、ジャクソン・ラボラトリー）を、上記（無菌マウス）に記載の方法に準じて無菌飼育した。また上記（選択菌カクテルによる腸内トリプシン活性の抑制）に記載の方法に準じて、単離したバクテロイデス属３菌株あるいは非バクテロイデス属６菌株を経口投与して定着させた。該経口投与から１週間後に、以下の手順で、ＵＣ様の炎症の誘導処置を行った。ＵＣ患者より単離されたＫ．ａｅｒｏｍｏｂｉｌｉｓ  １１Ｅ１２株（Ａｔａｒａｓｈｉ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５８，３５９  ２０１７）を、Ｓｃｈａｅｄｌｅｒ培地で３７℃，１０％ＣＯ２嫌気環境下で１〜３日間培養し、定常期に至った菌液１−２×１０８ＣＦＵ／２００μｌを、マウスの胃内に経口投与した。継続して、無菌アイソレータ内にて自由飲水給餌条件で更に３週間飼育し、菌を定着させた。１１Ｅ１２株投与３週間後の、腸内トリプシン活性の測定を、上記（便中トリプシン活性の測定）に記載の方法に準じて行った。また、炎症の指標として、便中のＬｉｐｏｃａｌｉｎ−２レベルをＥＬＩＳＡ法により測定した（ａｂｃａｍ；Ｍｏｕｓｅ  Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ−２  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ；ａｂ１９９０８３）。【００７７】
（培養菌によるトリプシン活性の抑制）
３７℃，１０％ＣＯ２嫌気環境下で１〜３日間培養して定常期に至った、上記（Ｓｐｅａｒｍａｎの順位相関分析）にて選抜された各９菌の培養液に、無菌マウスの盲腸内容物を無菌水で５０倍に希釈したトリプシン含有液を、同体積量混合し、更に同条件で１２時間培養した。【００７８】
１０，０００×ｇで１５分間遠心し、菌体を含まない上清を取得した。ローディングバッファー（ＢｉｏＲａｄ；１６１０７３９）と混合し、メルカプトエタノール還元及び熱変性処理ののち、ＳＤＳ−トリシンＰＡＧＥを行った。続いて、Ｔｒｉｓ−グリシンバッファー中で電圧印加し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｅｒｃｋ；ＩＳＥＱ０７８５０）へ転写した。抗Ａｎｉｏｎｉｃ  ｔｒｙｐｓｉｎ−２ウサギ抗体を１次抗体として、Ａｎｔｉ−ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ  ｃｈａｉｎ）（Ｒａｂｂｉｔ）ｐＡｂ−ＨＲＰ（ＭＢＬ；Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．４５８）を２次抗体として用い、Ｃｈｅｍｉ−Ｌｕｍｉ  Ｏｎｅ  Ｓｕｐｅｒ（ナカライテスク；０２２３０−１４）による化学発光を利用して、Ａｎｉｏｎｉｃ  ｔｒｙｐｓｉｎ−２タンパク質の有無を確認した。【００７９】
（Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ菌によるトリプシン活性の抑制）
ＪＣＭ１４８５９（Ｐ．ｃｌａｒａ株）及びＪＣＭ１４８６０（Ｐ．ｘｙｌａｎｉｐｈｉｌａ株）を、理化学研究所  バイオリソース研究センター（ＲＩＫＥＮ  ＢＲＣ）  微生物材料開発室（ＪＣＭ）より取得し、ＥＧ  ｅｘｔ．培地で、それぞれ３７℃，１０％ＣＯ２嫌気環境下で１〜３日間培養した。定常期に至った菌液を、上記（培養菌によるトリプシン活性の抑制）に記載の方法に準じて処理し、ウェスタンブロッティングの結果から、トリプシンの分解活性を評価した。【００８０】
（Ｐ．ｃｌａｒａ由来タンパク質とトリプシンとのクロスリンク試験）
１５０μｇ／ｍｌ  ｍＰＲＳＳ２／ＰＢＳ溶液２５μｌと、嫌気条件でＥＧＥＦ培地中で培養し定常期に達したＰ．ｃｌａｒａ  １Ｃ４株（ＯＤ６００＞１．０）１５０μｌと、新鮮なＥＧＥＦ培地７５μｌを混合し、３７℃で３５分間インキュベートした。室温、４，０００×ｇで５分間遠心分離し、上清を回収した（図１４中の「ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ」サンプルに該当）。８００μｌのＰＢＳに菌を再分散した後、室温、４，０００×ｇで遠心分離し、上清を除くことで、未吸着のｍＰＲＳＳ２タンパク質を除去した。１０ｍＭ  ＤＳＳＯ／ＰＢＳ水溶液２５０μｌに菌を再分散し、室温で１５分間静置することで、菌構成物及び吸着物にランダムな共有結合の架橋を形成させた。さらに、２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ水溶液（ｐＨ８．０）３０μｌを加え、室温で５分間静置することで、未反応のＤＳＳＯをクエンチした。室温、４，０００×ｇ条件で５分間遠心分離し、上清を除去した。８００ｕｌのＰＢＳに菌を再分散したのち、同条件で遠心分離し、上清を除いて洗浄した。１％  ＳＤＳ／１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／５ｍＭ  ＥＤＴＡ組成の細胞溶解液を添加して菌を破砕したのち、４℃、２０，０００×ｇ条件で５分間遠心分離し、上清として細胞破砕液を得た（図１４中の「Ｐｅｌｌｅｔ」サンプルに該当）。ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔサンプル及びＰｅｌｌｅｔサンプルをＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇに供し、ｍＰＲＳＳ２特異的抗体を化学発光で検出することで、ｍＰＲＳＳ２と結合したタンパク質を検出した。なお、本法に用いた試薬等は以下のとおりである。
ｍＰＲＳＳ２：マウスリコンビナントＰＲＳＳ２タンパク質（Ｈｉｓ  Ｔａｇ）（Ｓｉｎｏ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社５０３８３−Ｍ０８Ｈ）
ＤＳＳＯ：ジスクシンイミジルスルホキシド（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社Ａ３３５４５）
ＳＤＳ：１０％−ＳＤＳ溶液より調製（ナカライテスク社３０５６２−０４）
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ：１ｍｏｌ／ｌ−トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）より調製（ナカライテスク社０６９３８−４４）
ＥＤＴＡ：０．５ｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ溶液（ｐｈ８．０）より調製（ナカライテスク社０６８９４−１４）
ＰＢＳ：ダルベッコりん酸緩衝生理食塩水（Ｃａ，Ｍｇ不含）  （ナカライテスク社１４２４９−９５）
ＷＢ検出用一次抗体：Ａｎｔｉ−６−Ｈｉｓ，  Ｒａｂｂｉｔ−Ｐｏｌｙ（フナコシ社Ａ１９０−１１４Ａ、４００倍希釈して使用）
ＷＢ検出用二次抗体：Ａｎｔｉ−ＩｇＧ  （Ｒａｂｂｉｔ）  ｐＡｂ−ＨＲＰ（ＭＢＬ  Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．４５８、４００倍希釈して使用）
ＷＢ検出用試薬：ケミルミワンＬ  （ナカライテスク社０７８８０−５４）。【００８１】
（トリプシン活性阻害試験）
１ｍｇ／ｍｌ  ｈＰＲＳＳ２／ＰＢＳ水溶液に、５倍ｍｏｌ量ＴＬＣＫのＤＭＳＯ溶液を添加し、室温で３時間静置して、ＴＬＣＫ修飾を施したトリプシン活性を有しないＴＬＣＫ−ｈＰＲＳＳ２とした。Ｓｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ２５カラムクロマトグラフィにて、未反応のＴＬＣＫを除去し、限外ろ過膜による濃縮を経て、ＴＣＬＫ−ｈＰＲＳＳ２を精製した。嫌気条件でＥＧＥＦ培地中で培養し定常期に達したＰ．ｃｌａｒａ菌を、室温、４，０００×ｇ条件で５分間遠心分離してＰＢＳに菌を再分散したのち、同条件での遠心分離と上清除去を更に１回行い、ＥＧＥＦ培地成分を除去した菌を得た。ＰＢＳに分散した菌と、ＴＣＬＫ−ｈＰＲＳＳ２／ＰＢＳ溶液を混合し、２０ｎｇ／μｌ  ＴＬＣＫ−ｈＰＲＳＳ２、菌濃度ＯＤ＝０．９の条件で、嫌気条件の３７℃環境にて３時間静置した。菌液を室温、４，０００×ｇ条件で５分間遠心分離し、その上清中のｈＰＲＳＳ２を、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇにより検出した。なお、本法に用いた試薬等は以下のとおりである。
ｈＰＲＳＳ２：ヒトＰＲＳＳ２／トリプシン２タンパク質（リコンビナント）（ＬＳＢｉｏ社ＬＳ−Ｇ２０１６７−５）
ＴＬＣＫ：トリプシンインヒビター  トシル−Ｌ−リシル−クロロメタン塩酸塩（ＡＢＣＡＭ社ａｂ１４４５４２）
Ｓｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ２５：プレパック  ディスポーザブル  ＰＤ−１０  カラム（ＧＥヘルスケア社１７０８５１０１）
ＷＢ検出用一次抗体：Ａｎｔｉ−ＰＲＳＳ２／Ｔｒｙｐｓｉｎ  ２  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＩＨＣ−ｐｌｕｓ（ＬＳＢｉｏ社ＬＳ−Ｂ１５１８５−５０、４００倍希釈して使用）
ＷＢ検出用二次抗体：Ａｎｔｉ−ＩｇＧ  （Ｒａｂｂｉｔ）  ｐＡｂ−ＨＲＰ（ＭＢＬ  Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．４５８、４００倍希釈して使用）
ＷＢ検出用試薬：ケミルミワンＬ  （ナカライテスク社０７８８０−５４）。【００８２】
（実施例１）
［無菌マウスの便中には活性型トリプシンが多い］
理化学研究所で維持されたＳＰＦマウス（理研・ＳＰＦマウス）とＧＦマウスの盲腸内容物の網羅的タンパク質解析（ｓｈｏｔｇｕｎ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、プロテオーム解析）を行った。【００８３】
その結果、図には示さないが、７１３種の宿主由来タンパク質が検出され、そのうち４５種のタンパク質がＧＦマウスの盲腸内容物中に有意に多く存在していた。これらの中で、特に顕著に多く存在し、ＩＢＤとの関連が報告されている、タンパク質分解酵素のトリプシン（Ａｎｉｏｎｉｃ  ｔｒｙｐｓｉｎ−２：ＰＲＳＳ２）に着目した。【００８４】
次に、理研・ＳＰＦマウス及びＧＦマウスの、便中のトリプシンの活性測定及びウエスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ、ＷＢ）に基づくタンパク質量の評価を行った。【００８５】
その結果、図には示さないが、トリプシン活性は、理研・ＳＰＦマウスと比較して、ＧＦマウスにて有意に高かった。また、トリプシンのタンパク質量は、ＧＦマウスで多かった。さらに、理研・ＳＰＦマウス及びＧＦマウスの遠位大腸の腸管断面を、免疫組織化学染色して観察したところ、ＧＦマウスにはトリプシンが多量に存在していた。【００８６】
以上より、ＧＦマウスの盲腸以遠の大腸内には、理研・ＳＰＦマウスと比較して多くの活性型トリプシンが存在する事が判明した。【００８７】
［炎症性腸疾患と炎症モデルマウスの便中には活性型トリプシンが多い］
日本の潰瘍性大腸炎（ＵＣ）及びクローン病（ＣＤ）に罹患するＩＢＤ患者の便サンプルについて、トリプシンの活性測定及びそのタンパク質量の評価を行った。比較対象として、日本の健常者ボランティアの便サンプルを評価した。その結果、図には示さないが、健常者の便と比較して、ＵＣやＣＤの患者の便には、有意に多くの活性型トリプシンが認められた。【００８８】
また、大腸炎モデルマウスとして知られるＩＬ−１０遺伝子欠損マウス（ＩＬ１０−／−マウス）の炎症時の便中トリプシン活性を評価したところ、ＷＴマウスの便中のトリプシン活性と比較して、有意にトリプシン活性が高かった。大腸に残存する活性型トリプシンは、ＩＢＤの発症やその病態の増悪への関与の可能性が報告されている。上述の一連の結果は、既報を支持するものである。【００８９】
［ＧＦマウスでは盲腸以遠に活性型トリプシン活性が残存する］
消化管内の部位別のトリプシン活性を、理研・ＳＰＦマウスとＧＦマウスについて比較した。その結果、図には示さないが、小腸では、両者に有意差は認められなかったが、盲腸以遠では、ＧＦマウスの方が有意に高かった。また、トリプシンの分泌を主に担う膵臓組織におけるトリプシン前駆体・トリプシノーゲン（ＰＲＳＳ２）の発現量及び分泌量をＲＴ−ｑＰＣＲ及びＷＢで確認したところ、両者に有意差は認められなかった。【００９０】
一連の結果から、ＧＦマウスの盲腸以遠におけるトリプシン活性の亢進は、膵臓組織から正常に分泌されたトリプシンの、異常な残存に起因すると考えられる。その要因の一つとして、盲腸以遠に定着する腸内細菌の関与が考えられる。つまり、ＳＰＦマウスでは、盲腸以遠に定着した腸内細菌が活性型トリプシンを減少させる機能を司り、ＧＦマウスでは、腸内細菌が存在しないために活性型トリプシンが残存すると想定した。【００９１】
［マウスの盲腸以遠の腸内細菌叢がそのトリプシン活性に影響を与える］
ＳＰＦマウスの腸内細菌叢は、飼育施設毎に特有に維持されている事が知られている。そこで、盲腸以遠の定着した腸内細菌とそのトリプシン活性の関連性を評価するため、異なる飼育施設に由来するＳＰＦマウスについて、盲腸内容物中のトリプシン活性とその菌叢を評価した。理研・ＳＰＦマウスと、日本エスエルシー株式会社、日本チャールズ・リバー株式会社、及び日本クレア株式会社で維持されたＳＰＦマウス（以下、ＳＬＣ・ＳＰＦマウス、Ｃｈａｒｌｅｓ・ＳＰＦマウス及び  Ｃｌｅａ・ＳＰＦマウス）を比較した。【００９２】
その結果、図１に示すとおり、盲腸内容物中のトリプシン活性については、理研・ＳＰＦマウス及びＳＬＣ・ＳＰＦマウスは同等に低い水準であり、Ｃｈａｒｌｅｓ・ＳＰＦ及びＣｌｅａ・ＳＰＦマウスは前者２施設のマウスと比較して有意に高かった。また、図には示さないが、腸内細菌叢については、理研・ＳＰＦマウス及びＳＬＣ・ＳＰＦマウスの２群と、Ｃｈａｒｌｅｓ・ＳＰＦマウス及びＣｌｅａ・ＳＰＦマウスの２群間において、ＵｎｉＦｒａｃ−ＰＣｏＡ上での顕著な差が認められた。以上から、飼育環境の違いに伴う腸内細菌叢の違いが、盲腸以遠のトリプシン活性に影響を与える事が判った。さらに、特定の腸内細菌種が、トリプシン活性を低下させる可能性が示唆された。【００９３】
［健常者の腸内細菌がマウスのトリプシン活性を低下させる］
上述の検討から、マウスにおいて、大腸の炎症への関与が疑われる盲腸以遠のトリプシン活性を、特定の腸内細菌種が低下させる可能性が示唆された。この仮説に基づけば、特定の腸内細菌種を盲腸以遠に定着させる事で、トリプシン活性を抑制し、ひいては大腸の炎症の緩和が期待できる。そこで将来的な臨床応用を想定し、ヒト由来の腸内細菌を用いたトリプシン活性の制御について検討した。【００９４】
先ず、日本の健常者ボランティア（ドナーＡ〜Ｆ）の便をＧＦマウスに経口的に胃内投与して、ヒト菌叢化マウス（Ａ〜Ｆ）を作成し、便中のトリプシン活性を評価した。【００９５】
その結果、図３に示すとおり、Ｂを除いて、マウス便中のトリプシン活性は、理研・ＳＰＦマウスの場合と同等に低い水準であった。この事から、マウストリプシンの活性を低下させる、ヒト由来の腸内細菌種が存在する事が判った。【００９６】
（実施例２）
［健常者の便由来の３５菌株は、マウス便中トリプシン活性を低下させる］
前述の検討において特に低いトリプシン活性を示した健常者ボランティアＣの便について、盲腸以遠のトリプシン活性を低下させる細菌種の探索を行った。健常者ボランティアＣの便をＧＦマウスに経口的に胃内投与し、その２４時間後から、抗生物質のアンピシリン（Ａｍｐ）、タイロシン（Ｔｙｌｏｓｉｎ）、あるいはメトロニダゾール（ＭＮＺ）を自由飲水により投与した。【００９７】
その結果、図４に示すとおり、抗生物質非投与群及びアンピシリン投与群では、便中のトリプシン活性は菌の投与前と比較して顕著に低下した。一方で、タイロシン投与群及びメトロニダゾール投与群では、便中のトリプシン活性は高く維持された。以上の結果から、トリプシン活性を低下させる腸内細菌種はアンピシリンに耐性で、タイロシン及びメトロニダゾールに感受性の菌種と判明した。【００９８】
続いて、アンピシリン投与群の中で最もトリプシン活性値が低下した個体の盲腸内容物を、嫌気チャンバー内にて異なる組成の培地中で培養し、計４３２個のコロニーを得た。１６ＳｒＲＮＡ解析に基づく菌株照合の結果、図５に示すとおり、ドナーＣ便に由来するヒト腸内細菌３５菌株が単離されたと判った。【００９９】
単離した３５菌株は、ドナーＣの便の腸内細菌叢を構成する菌種の約８０％を占めることから、ＧＦマウスに投与する事で、ドナーＣの腸内に類似する菌叢及び環境が形成されると期待できる。そこで、この３５菌株を個別培養して混合した菌液（以下、３５−ｍｉｘ）をＧＦマウスに経口的に胃内投与し、盲腸以遠のトリプシン活性を経時的に評価した。【０１００】
その結果、図６に示すとおり、３５−ｍｉｘ投与２日後には、便中のトリプシン活性値は有意に低下した。投与９日目においても、便中の活性型トリプシンの量は低い水準で維持されていた。以上の結果から、３５−ｍｉｘを投与すると、マウスの盲腸以遠におけるトリプシンの活性が低下すると判った。【０１０１】
［健常者の便より単離した９菌株は、マウス便中トリプシン活性を低下させる］
前述のトリプシン活性を低下させる機能を有する３５菌株のうち、その機能を司る責任菌の同定を行った。具体的には、各種抗生物質を投与しながら健常者ボランティア  ドナーＣの便由来の菌をＧＦマウスに定着させる検討において、抗生物質投与１２日後の、１６ＳｒＲＮＡ解析に基づく腸内細菌の相対占有率と便中トリプシン活性値のＳｐｅａｒｍａｎ順位相関解析を行った。【０１０２】
その結果、図７に示すＳｐｅａｒｍａｎ順位相関解析において、便中のトリプシン活性と負の相関を示した菌株のうち、特に相関係数の有意確率がｐ＜０．０５の９菌株に着目した。次に、該９菌株を個別培養して混合した菌液（以下、９−ｍｉｘ）を、ＧＦマウスに経口的に胃内投与し、便中のトリプシンの活性及びそのタンパク質の量を評価した。その結果、図８に示すとおり、９−ｍｉｘ投与群において、便中のトリプシン活性は有意に低下した。また図には示さないが、活性型トリプシンのタンパク質量はＷＢの検出限界以下に減少していた。以上の結果から、責任菌は該９菌株中に含まれる事が示唆された。【０１０３】
［健常者の便より単離した３菌株はマウス便中トリプシン活性を低下させる］
前述の９菌株は、図９に示すとおり、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属の３菌株を含む群と非Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属の６菌株に分類できる。トリプシンの活性を低下させる機能が系統的に保存されていると仮定する場合、責任菌はいずれか一方の群にのみ含まれると考えられる。そこで、上記検討と同様に、前者のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属を投与した群（以下、３−ｍｉｘ投与群）及び後者の非Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓを投与した群（以下、６−ｍｉｘ投与群）について評価した。【０１０４】
その結果、図８に示すとおり、３−ｍｉｘ投与群では、便中のトリプシン活性は有意に低下し、６−ｍｉｘ投与群では減少しなかった。以上の結果から、責任菌は前記３菌株中に含まれる事が示唆された。【０１０５】
［健常者の便より単離したＰａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃｌａｒａはマウストリプシンの量を低下させる］
責任菌の更なる絞り込みを目的として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにてトリプシンと単培養した菌を共存させ、トリプシンのタンパク質量の変化を評価した。【０１０６】
先ず、嫌気チャンバー内において、Ｈｉｓ−ｔａｇ修飾されたリコンビナントのマウストリプシンと、上記にて責任菌の候補と論じた９−ｍｉｘ、６−ｍｉｘあるいは３−ｍｉｘを共培養し、１２時間後の培養液中のトリプシンのタンパク質量を評価した。【０１０７】
その結果、図には示さないが、９−ｍｉｘあるいは３−ｍｉｘとの共培養では、トリプシンの減少が認められ、６−ｍｉｘとの共培養では認められなかった。この結果は、上述のｉｎ  ｖｉｖｏでの責任菌の絞り込み検討の結果と合致する。つまり、このｉｎ  ｖｉｔｒｏの評価法は、責任菌の更なる絞り込みに有効と考えられる。加えて、このｉｎ  ｖｉｔｒｏの評価の結果が、上述のｉｎ  ｖｉｖｏの評価の結果と合致することは、トリプシン活性の低下の機構には、ホストの大腸組織は関与せず、細菌のみが関与している事を示唆している。【０１０８】
続いて、９−ｍｉｘを構成する各菌を単菌毎にトリプシンと共培養し、同様に評価した。その結果、図１０に示すとおり、３−ｍｉｘを構成するＰ．ｃｌａｒａ  １Ｃ４株と共培養した場合においてのみ、トリプシンのタンパク質量の減少が認められた。【０１０９】
一連の評価結果から、ドナーＣの便に由来するＰ．ｃｌａｒａ  １Ｃ４株が、マウスのトリプシンのタンパク質量を減少させる責任菌であることが判った。【０１１０】
［Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃｌａｒａはヒトのトリプシンのタンパク質量を減少させる］
前述のとおり、健常者の便から単離したＰ．ｃｌａｒａ  １Ｃ４株がマウスの活性型トリプシンの量を減少させる事を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実証した。次に、前述のｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験系をヒトのトリプシンに適用し、その機能の有効性を検証した。すなわち、嫌気チャンバー内において、単培養したＰ．ｃｌａｒａ  １Ｃ４株とリコンビナントのヒトトリプシンを共培養し、１２時間後のトリプシン量をＷＢにより評価した。その結果、図には示さないが、Ｐ．ｃｌａｒａ  １Ｃ４株と共培養した場合にのみ、ヒトトリプシンのタンパク質量の減少が認められた。以上の結果から、健常者の便から単離したＰ．ｃｌａｒａ  １Ｃ４株は、ヒトのトリプシンのタンパク質量を減少させることが判明した。【０１１１】
（実施例３）
［トリプシン活性を低下させる細菌カクテル投与により大腸組織の炎症が抑制される］
大腸炎モデルマウスを用いて、同定した前記３菌株（３−ｍｉｘ）の炎症の緩和の可能性を検討した。大腸炎モデルマウスには、ＩＬ１０−／−腸炎発症モデル及びＤＳＳ誘導モデルを選択した。前者については、ＩＬ１０−／−マウス個体を無菌化したのち、ＵＣ患者の便中から単離された腸炎誘導菌であるＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ  １１Ｅ１２株を感染させたモデルを適用した。【０１１２】
トリプシン活性を低下させる３−ｍｉｘ、あるいはトリプシン活性に関与しない６−ｍｉｘを、ＩＬ１０−／−ＧＦマウスに経口的に胃内投与し、その７日後にＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ  １１Ｅ１２株単菌の培養液を同様に投与して大腸炎を誘導した。投与３週間後までの便中のトリプシン活性を評価した。また、投与３週間後までに誘導された炎症の程度を、便中のリポカリン濃度と、大腸の組織学的観察に基づく炎症スコアにより評価した。【０１１３】
その結果、図１１に示すとおり、１１Ｅ１２株投与群、並びに１１Ｅ１２株及び６−ｍｉｘ投与群において便中の高いトリプシン活性が認められたのに対し、１１Ｅ１２株及び３−ｍｉｘ投与群においては、トリプシン活性が低く抑えられていた。また、図１２に示すとおり、３−ｍｉｘ投与群では、６−ｍｉｘ投与群と比較して、便中リポカリン濃度が低い傾向にあった。さらに、図には示していないが、組織学的炎症スコアも有意に低かった。【０１１４】
同様の検討をＤＳＳ誘導モデルマウスに対して実施した。ＧＦマウスに３−ｍｉｘあるいは６−ｍｉｘを投与し、その１４日後から７日間、２．０％ＤＳＳ水溶液を自由飲水により投与して大腸炎を誘導した。ＤＳＳ投与１０日後までに誘導された炎症の程度を、体重の変動、大腸の組織学的観察に基づく炎症スコア、及び炎症マーカーの発現量により評価した。その結果、６−ｍｉｘ投与群に比べて、３−ｍｉｘ投与群では、体重減少の割合が低かった。また、ＴＮＦ−α及びＩＬ６をはじめとする各炎症マーカー遺伝子の発現量も有意に低かった。【０１１５】
以上の検討結果から、３−ｍｉｘを投与すると、大腸組織の炎症が抑制される事が判った。【０１１６】
（実施例４）
［Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属はトリプシン活性を低下させる］
Ｐ．ｃｌａｒａ  １Ｃ４株に認められたトリプシン活性を低下させる機能の、類縁菌株における保存性を評価した。【０１１７】
理化学研究所バイオリソース研究センター（ＲＩＫＥＮ  ＢＲＣ）微生物材料開発室より入手したＰ．ｃｌａｒａ  ＪＣＭ１４８５９株、及び２０１８年１１月時点の系統樹分類にてＰａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属に属する２種のうちのもう一方に該当するＰａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｘｙｌａｎｉｐｈｉｌａ（Ｐ．ｘｙｌａｎｉｐｈｉｌａ）ＪＣＭ  １４８６０株について、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのトリプシン活性の低減能を検証した。マウスの盲腸内容物に由来するトリプシン溶液を、各菌の培養液と混合して、嫌気条件で１２時間インキュベートしたのち、ＷＢにより活性型トリプシンのタンパク質量を評価した。【０１１８】
その結果、図１３に示すとおり、いずれのＰａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ株と混合した場合においても、トリプシンのタンパク質量はＷＢの検出限界以下であった。【０１１９】
以上の結果から、２０１８年１１月時点の系統樹分類にてＰａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属に分類される菌種はすべて、マウス由来の活性型トリプシンの量を低下させることが判った。【０１２０】
（実施例５）
［クロスリンク試験］
図１４に示すとおり、ｍＰＲＳＳ２とＰ．ｃｌａｒａ菌を混合し、ＤＳＳＯで架橋を形成させた場合にのみ、２５０ｋＤａ付近にバンドが検出された。これは、ｍＰＲＳＳ２を含まず架橋を形成させた場合には認められないことから、ｍＰＲＳＳ２とＰ．ｃｌａｒａ菌の構成タンパク質から成る複合タンパク質と推定された。ｍＰＲＳＳ２が約３２ｋＤａのタンパク質である事を鑑みれば、Ｐ．ｃｌａｒａ菌を構成する２２０ｋＤａ程度のあるタンパク質に対して、トリプシンは優先的に吸着もしくは結合していると考えられる。【０１２１】
この結果より、トリプシンタンパク質の分解現象は、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属菌が保有する特定のタンパク質に対して、トリプシンが結合する現象を伴いながら、誘導されると考えられる。【０１２２】
［トリプシン活性阻害試験］
図１５に示すとおり、ＴＬＣＫ阻害剤を修飾していないｈＰＲＳＳ２とＰａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属菌を混合した場合、ｈＰＲＳＳ２由来のバンドが薄化しており、ｈＰＲＳＳ２の分解が誘導された。一方で、ＴＬＣＫを修飾してトリプシン活性を失ったＴＬＣＫ−ｈＰＲＳＳ２の場合は、ｈＰＲＳＳ２の分解が誘導されなかった。ＴＬＣＫが不可逆結合に基づくトリプシン活性阻害剤である事を鑑みれば、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属菌によるトリプシンの分解は、トリプシンの自己分解の促進によるものと考えられる。【０１２３】
以上の［クロスリンク試験］及び［トリプシン活性阻害試験］の結果から、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属菌によるトリプシンの分解は、トリプシンの自己分解の促進効果に基づき、トリプシンタンパク質が、菌の特定のタンパク質に結合することで誘導されると考えることができる。
【産業上の利用可能性】
【０１２４】
以上説明したように、本発明によれば、トリプシン活性を抑制することが可能となる。したがって、トリプシン活性に起因する疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病等の炎症性腸疾患）の治療及び予防等において有用である。
【受託番号】
【０１２５】
（１）識別の表示：１Ｃ４
（２）受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２７７５
（３）受託日：２０１８年８月３０日
（４）寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構
（１）識別の表示：１Ｄ４
（２）受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２７７６
（３）受託日：２０１８年８月３０日
（４）寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構
（１）識別の表示：３Ｈ３
（２）受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２７７７
（３）受託日：２０１８年８月３０日
（４）寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構
【図１】
2020054728.tif 000002
【図２】
2020054728.tif 000003
【図３】
2020054728.tif 000004
【図４】
2020054728.tif 000005
【図５】
2020054728.tif 000006
【図６】
2020054728.tif 000007
【図７】
2020054728.tif 000008
【図８】
2020054728.tif 000009
【図９】
2020054728.tif 000010
【図１０】
2020054728.tif 000011
【図１１】
2020054728.tif 000012
【図１２】
2020054728.tif 000013
【図１３】
2020054728.tif 000014
【図１４】
2020054728.tif 000015
【図１５】
2020054728.tif 000016
【配列表】
2020054728000001.app
【国際調査報告】
2020054728.tif 000017
2020054728.tif 000018
2020054728.tif 000019
2020054728.tif 000020
2020054728.tif 000021
2020054728.tif 000022
2020054728.tif 000023
2020054728.tif 000024