(57)【要約】（ｉ）〜（ｘｉ）のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ標的分子に対する結合性が配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して増大している、ポリペプチド。AHKLFIGGLPNYLNDDQVKELLTSFGPLKAFNLVKDSATGLSKGYAFCEYVDINVTDQAIAGLNGMQLGDKKLLVQRASVGA（配列番号１）【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ｉ）〜（ｘｉ）のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ標的分子に対する結合性が配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して増大している、ポリペプチド。
（ｉ）配列番号１の８番目から１４番目までのアミノ酸のうちの少なくとも一つが置換されたアミノ酸配列
（ｉｉ）配列番号１の３６番目から４１番目までのアミノ酸のうちの少なくとも一つが置換されたアミノ酸配列
（ｉｉｉ）配列番号１の６３番目から７３番目までのアミノ酸のうちの少なくとも一つが置換されたアミノ酸配列
（ｉｖ）前記（ｉ）と前記（ｉｉ）の両方を満たすアミノ酸配列
（ｖ）前記（ｉ）と前記（ｉｉｉ）の両方を満たすアミノ酸配列
（ｖｉ）前記（ｉ）で定義されたポリペプチドのアミノ酸配列において、配列番号１の１番目から７番目および１５番目から８２番目のアミノ酸配列との対応する位置のアミノ酸配列の配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列
（ｖｉｉ）前記（ｉｉ）で定義されたポリペプチドのアミノ酸配列において、配列番号１の１番目から３５番目および４２番目から８２番目のアミノ酸配列との対応する位置のアミノ酸配列の配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列
（ｖｉｉｉ）前記（ｉｉｉ）で定義されたポリペプチドのアミノ酸配列において、配列番号１の１番目から６２番目および７４番目から８２番目のアミノ酸配列との対応する位置のアミノ酸配列の配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列
（ｉｘ）前記（ｉｖ）で定義されたポリペプチドのアミノ酸配列において、配列番号１の１番目から７番目、１５番目から３５番目、および４２番目から８２番目のアミノ酸配列との対応する位置のアミノ酸配列の配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列
（ｘ）前記（ｖ）で定義されたポリペプチドのアミノ酸配列において、配列番号１の１番目から７番目、１５番目から６２番目、および７４番目から８２番目のアミノ酸配列との対応する位置のアミノ酸配列の配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列
（ｘｉ）前記（ｉ）〜（ｘ）で定義されたポリペプチドの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列
【請求項２】
前記（ｉ）のアミノ酸配列、前記（ｉｉｉ）のアミノ酸配列、前記（ｖ）のアミノ酸配列、前記（ｖｉ）のアミノ酸配列、前記（ｖｉｉｉ）のアミノ酸配列、前記（ｘ）のアミノ酸配列、または、前記（ｘｉ）であって前記（ｉ）、前記（ｉｉｉ）、前記（ｖ）、前記（ｖｉ）、前記（ｖｉｉｉ）、もしくは前記（ｘ）で定義されたポリペプチドの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記（ｉ）のアミノ酸配列、前記（ｉｉ）のアミノ酸配列、前記（ｉｖ）のアミノ酸配列、前記（ｖｉ）のアミノ酸配列、前記（ｖｉｉ）のアミノ酸配列、前記（ｉｘ）のアミノ酸配列、または、前記（ｘｉ）であって前記（ｉ）、前記（ｉｉ）、前記（ｉｖ）、前記（ｖｉ）、前記（ｖｉｉ）、もしくは前記（ｉｘ）で定義されたポリペプチドの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記（ｉ）のアミノ酸配列において、配列番号１の１１番目から１４番目までのアミノ酸のうちの少なくとも一つが置換されている請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
下記（ｘｉｉ）〜（ｘｖｉｉｉ）のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ標的分子に対する結合性が配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して増大している、ポリペプチド。
（ｘｉｉ）配列番号１の１１番目から１４番目までのアミノ酸のうちの少なくとも一つが置換されたアミノ酸配列
（ｘｉｉｉ）配列番号１の３６番目から４１番目までのアミノ酸のうちの少なくとも一つが置換されたアミノ酸配列
（ｘｉｖ）前記（ｘｉｉ）と前記（ｘｉｉｉ）の両方を満たすアミノ酸配列
（ｘｖ）前記（ｘｉｉ）で定義されたポリペプチドのアミノ酸配列において、配列番号１の１番目から１０番目および１５番目から８２番目のアミノ酸配列との対応する位置のアミノ酸配列の配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列
（ｘｖｉ）前記（ｘｉｉｉ）で定義されたポリペプチドのアミノ酸配列において、配列番号１の１番目から３５番目および４２番目から８２番目のアミノ酸配列との対応する位置のアミノ酸配列の配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列
（ｘｖｉｉ）前記（ｘｉｖ）で定義されたポリペプチドのアミノ酸配列において、配列番号１の１番目から１０番目、１５番目から３５番目、および４２番目から８２番目のアミノ酸配列との対応する位置のアミノ酸配列の配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列
（ｘｖｉｉｉ）前記（ｘｉｉ）〜（ｘｖｉｉ）で定義されたポリペプチドの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列
【請求項６】
８番目から１４番目までのアミノ酸のアミノ酸配列が配列番号２〜７のいずれかである請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド。
CHDNSPP   (配列番号２）
DIYPATS  （配列番号３）
TAHSPTH   (配列番号４)
LAPSDNL   (配列番号５)
IAHISLN  （配列番号６）
SDDTYRD  （配列番号７）
【請求項７】
６３番目から７３番目までのアミノ酸のアミノ酸配列が配列番号８〜１３のいずれかである請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項８】
８番目から１４番目までのアミノ酸のアミノ酸配列が配列番号２〜７のいずれかであり、６３番目から７３番目までのアミノ酸のアミノ酸配列が配列番号８〜１３のいずれかである請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド。
CHDNSPP   (配列番号２）
DIYPATS  （配列番号３）
TAHSPTH   (配列番号４)
LAPSDNL   (配列番号５)
IAHISLN  （配列番号６）
SDDTYRD  （配列番号７）
IDRSTGPRSRG  (配列番号８）
ASFFVCVPILH  (配列番号９）
CRRFFTPTCFC  (配列番号１０）
LIGCFHNLCFF  (配列番号１１）
CANGSSSCIPC  (配列番号１２）
TGAVSVAVIYL  (配列番号１３）
【請求項９】
前記標的分子がタンパク質、ペプチド、核酸、多糖、または低分子化合物である請求項１〜８のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸分子。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む組成物。
【請求項１２】
標的分子に対する結合性が配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ポリペプチドに対して増大している、該ポリペプチドの変異型ポリペプチドのスクリーニング方法であって、
配列番号１をコードするヌクレオチドが挿入された発現ベクターに遺伝子断片を挿入し、配列番号１の８番目から１４番目までのアミノ酸の領域、３６番目から４１番目までのアミノ酸の領域、および６３番目から７３番目までのアミノ酸の領域のうちの少なくとも一つへ変異を導入したアミノ酸配列をコードする核酸のライブラリーを作製すること、
前記ライブラリーを標的分子と相互作用させ、結合親和性を測定すること、および
結合親和性を示すファージをクローニングすること
を含む方法。
【請求項１３】
前記ライブラリーを作製することは、
配列番号１の８番目から１４番目までのアミノ酸の領域および６３番目から７３番目までのアミノ酸の領域のうちの少なくとも一方、
配列番号１の８番目から１４番目までのアミノ酸の領域および３６番目から４１番目までのアミノ酸の領域のうちの少なくとも一方、または
配列番号１の１１番目から１４番目までのアミノ酸の領域および３６番目から４１番目までのアミノ酸の領域のうちの少なくとも一方
へ変異を導入したアミノ酸配列をコードする核酸のライブラリーを作製することを含む請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的分子と結合するポリペプチド、該ポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸分子、該ポリペプチドを含む組成物、及び変異型ポリペプチドのスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体分子は生体の免疫機構を利用した手法があるがゆえ、バイオ医薬品や分子認識プローブとして確固たる地位を築いてきた。しかしながら、抗体分子は高分子であり、分子認識機能を有する可変領域断片は、構造安定性が乏しいこと、二量体構造という複雑な構造を有すること等から利用しにくい場面がある。【０００３】
近年、遺伝子工学の発展により、構造的に最小単位のタンパク質を足場構造として、免疫系を使わずに低分子量の大規模な変異体群を微生物で作製することが可能となり、様々なタンパク質構造を足場としてその構造に分子認識機能をもたせた抗体様分子が提案されるようになっている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Drug Discovery Today Volume 20, Number 10, October 2015
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明が解決すべき課題は、抗体よりも低分子で、ヒトへの投与が可能で、標的分子と特異的に結合でき、かつ調製が容易なポリペプチドを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記の目的を達成すべく、バイオインフォマティックの利用と変異導入の寛容性の調査から、本発明では、ヒト由来であって、様々なタンパク質へ融合が容易なHU2AF65の第2RNA結合ドメイン（PDF 2u2f、以下「2u2fポリペプチド」とも称する）を足場構造として、標的細胞に提示されている標的分子に特異的に結合するポリペプチドを創出し、本発明を完成するに至った。【０００７】
すなわち本発明は、以下の項に記載の主題を包含する。
［１］下記（ｉ）〜（ｘｉ）のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ標的分子に対する結合性が配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して増大している、ポリペプチド。【０００８】
（ｉ）配列番号１の８番目から１４番目までのアミノ酸のうちの少なくとも一つが置換されたアミノ酸配列
（ｉｉ）配列番号１の３６番目から４１番目までのアミノ酸のうちの少なくとも一つが置換されたアミノ酸配列
（ｉｉｉ）配列番号１の６３番目から７３番目までのアミノ酸のうちの少なくとも一つが置換されたアミノ酸配列
（ｉｖ）前記（ｉ）と前記（ｉｉ）の両方を満たすアミノ酸配列
（ｖ）前記（ｉ）と前記（ｉｉｉ）の両方を満たすアミノ酸配列
（ｖｉ）前記（ｉ）で定義されたポリペプチドのアミノ酸配列において、配列番号１の１番目から７番目および１５番目から８２番目のアミノ酸配列との対応する位置のアミノ酸配列の配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列
（ｖｉｉ）前記（ｉｉ）で定義されたポリペプチドのアミノ酸配列において、配列番号１の１番目から３５番目および４２番目から８２番目のアミノ酸配列との対応する位置のアミノ酸配列の配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列
（ｖｉｉｉ）前記（ｉｉｉ）で定義されたポリペプチドのアミノ酸配列において、配列番号１の１番目から６２番目および７４番目から８２番目のアミノ酸配列との対応する位置のアミノ酸配列の配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列
（ｉｘ）前記（ｉｖ）で定義されたポリペプチドのアミノ酸配列において、配列番号１の１番目から７番目、１５番目から３５番目、および４２番目から８２番目のアミノ酸配列との対応する位置のアミノ酸配列の配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列
（ｘ）前記（ｖ）で定義されたポリペプチドのアミノ酸配列において、配列番号１の１番目から７番目、１５番目から６２番目、および７４番目から８２番目のアミノ酸配列との対応する位置のアミノ酸配列の配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列
（ｘｉ）前記（ｉ）〜（ｘ）で定義されたポリペプチドの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列
［２］前記（ｉ）のアミノ酸配列、前記（ｉｉｉ）のアミノ酸配列、前記（ｖ）のアミノ酸配列、前記（ｖｉ）のアミノ酸配列、前記（ｖｉｉｉ）のアミノ酸配列、前記（ｘ）のアミノ酸配列、または、前記（ｘｉ）であって前記（ｉ）、前記（ｉｉｉ）、前記（ｖ）、前記（ｖｉ）、前記（ｖｉｉｉ）、もしくは前記（ｘ）で定義されたポリペプチドの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列を有する［１］に記載のポリペプチド。
［３］前記（ｉ）のアミノ酸配列、前記（ｉｉ）のアミノ酸配列、前記（ｉｖ）のアミノ酸配列、前記（ｖｉ）のアミノ酸配列、前記（ｖｉｉ）のアミノ酸配列、前記（ｉｘ）のアミノ酸配列、または、前記（ｘｉ）であって前記（ｉ）、前記（ｉｉ）、前記（ｉｖ）、前記（ｖｉ）、前記（ｖｉｉ）、もしくは前記（ｉｘ）で定義されたポリペプチドの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列を有する［１］に記載のポリペプチド。
［４］前記（ｉ）のアミノ酸配列において、配列番号１の１１番目から１４番目までのアミノ酸のうちの少なくとも一つが置換されている［３］に記載のポリペプチド。
［５］下記（ｘｉｉ）〜（ｘｖｉｉｉ）のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ標的分子に対する結合性が配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して増大している、ポリペプチド。【０００９】
（ｘｉｉ）配列番号１の１１番目から１４番目までのアミノ酸のうちの少なくとも一つが置換されたアミノ酸配列
（ｘｉｉｉ）配列番号１の３６番目から４１番目までのアミノ酸のうちの少なくとも一つが置換されたアミノ酸配列
（ｘｉｖ）前記（ｘｉｉ）と前記（ｘｉｉｉ）の両方を満たすアミノ酸配列
（ｘｖ）前記（ｘｉｉ）で定義されたポリペプチドのアミノ酸配列において、配列番号１の１番目から１０番目および１５番目から８２番目のアミノ酸配列との対応する位置のアミノ酸配列の配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列
（ｘｖｉ）前記（ｘｉｉｉ）で定義されたポリペプチドのアミノ酸配列において、配列番号１の１番目から３５番目および４２番目から８２番目のアミノ酸配列との対応する位置のアミノ酸配列の配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列
（ｘｖｉｉ）前記（ｘｉｖ）で定義されたポリペプチドのアミノ酸配列において、配列番号１の１番目から１０番目、１５番目から３５番目、および４２番目から８２番目のアミノ酸配列との対応する位置のアミノ酸配列の配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列
（ｘｖｉｉｉ）前記（ｘｉｉ）〜（ｘｖｉｉ）で定義されたポリペプチドの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列
［６］８番目から１４番目までのアミノ酸のアミノ酸配列が配列番号２〜７のいずれかである［１］〜［３］のいずれかに記載のポリペプチド。
CHDNSPP   (配列番号２）
DIYPATS  （配列番号３）
TAHSPTH   (配列番号４)
LAPSDNL   (配列番号５)
IAHISLN  （配列番号６）
SDDTYRD  （配列番号７）
［７］６３番目から７３番目までのアミノ酸のアミノ酸配列が配列番号８〜１３のいずれかである［１］〜［３］のいずれかに記載のポリペプチド。
IDRSTGPRSRG  (配列番号８）
ASFFVCVPILH  (配列番号９）
CRRFFTPTCFC  (配列番号１０）
LIGCFHNLCFF  (配列番号１１）
CANGSSSCIPC  (配列番号１２）
TGAVSVAVIYL  (配列番号１３）
［８］８番目から１４番目までのアミノ酸のアミノ酸配列が配列番号２〜７のいずれかであり、６３番目から７３番目までのアミノ酸のアミノ酸配列が配列番号８〜１３のいずれかである［１］〜［３］のいずれかに記載のポリペプチド。
［９］前記標的分子がタンパク質、ペプチド、核酸、多糖、または低分子化合物である［１］〜［８］のいずれかに記載のポリペプチド。
［１０］［１］〜［９］のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸分子。
［１１］［１］〜［９］のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む組成物。
［１２］標的分子に対する結合性が配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ポリペプチドに対して増大している、該ポリペプチドの変異型ポリペプチドのスクリーニング方法であって、
配列番号１をコードするヌクレオチドが挿入された発現ベクターに遺伝子断片を挿入し、配列番号１の８番目から１４番目までのアミノ酸の領域、３６番目から４１番目までのアミノ酸の領域、および６３番目から７３番目までのアミノ酸の領域のうちの少なくとも一つへ変異を導入したアミノ酸配列をコードする核酸のライブラリーを作製すること、
前記ライブラリーを標的分子と相互作用させ、結合親和性を測定すること、および
結合親和性を示すファージをクローニングすること
を含む方法。
［１３］前記ライブラリーを作製することは、
配列番号１の８番目から１４番目までのアミノ酸の領域および６３番目から７３番目までのアミノ酸の領域のうちの少なくとも一方、
配列番号１の８番目から１４番目までのアミノ酸の領域および３６番目から４１番目までのアミノ酸の領域のうちの少なくとも一方、または
配列番号１の１１番目から１４番目までのアミノ酸の領域および３６番目から４１番目までのアミノ酸の領域のうちの少なくとも一方
へ変異を導入したアミノ酸配列をコードする核酸のライブラリーを作製することを含む［１２］に記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、2u2fポリペプチドの構造に基づく変異ポリペプチドが提供される。かかる変異ポリペプチドは安全性が高く、野生型よりも標的分子への結合能が高い。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】標的分子に対する結合性ポリペプチドの抽出条件を示す表。
【図２】候補ポリペプチドの大腸菌での発現量  対  DSCを用いて測定したポリペプチドのTmを示すグラフ。
【図３】ループ構造へのランダム変異の導入によるHU2AF65の第2RNA結合ドメイン(2u2f)のアミノ酸保存度を示す図。
【図４】2u2fポリペプチドの変異導入ループの位置および配列、Tm値、発現量を示す図。
【図５】2u2fポリペプチドのループ領域へ変異を導入した2u2fポリペプチド変異体提示ファージライブラリーの作製を説明する図。
【図６】パニング操作の実験条件を示す図。
【図７】パニング操作の各ラウンドにおける、2u2fポリペプチド変異体を提示したファージ群とHER2の結合性を示すファージELISAのグラフ。各ラウンドの３つのバー：左側  サンプル原液（1倍）、中央  5倍希釈、右側  25倍希釈。
【図８Ａ】パニング操作後にモノクローナル化した2u2fポリペプチド変異体提示ファージ。各モノクローナルファージに提示されているタンパク質の内容の説明。
【図８Ｂ】各モノクローナルファージから配列決定したループ１およびループ２のアミノ酸配列。
【図８Ｃ】各モノクローナルファージの結合性を示すファージELISAのグラフ。各ファージサンプルの３つのバー：右側  サンプル原液（1倍）、中央  5倍希釈、左側  25倍希釈。BSA: ウシ血清アルブミン、HSA: ヒト血清アルブミン。
【図９】h5変異体の各種タンパク質に対する結合性を示すファージELISAのグラフ。各タンパク質サンプルの３つのバー：右側  サンプル原液（1倍）、中央  5倍希釈、左側  25倍希釈。
【図１０】h5変異体の組換えタンパク質のHER2に対する結合性を示すファージELISAのグラフ。各サンプルの３つのバー：左側  サンプル原液（1倍）、中央  5倍希釈、右側  25倍希釈。Buffer：2u2fのクローンを含まないサンプル、WT:野生型(WT）タンパク質を含むサンプル、h5：h5変異体の組換えタンパク質を含むサンプル。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書において、「タンパク質」とは40以上のアミノ酸がペプチド結合で結合されたものを指す。「ポリペプチド」とは10以上のアミノ酸がペプチド結合で結合されたものを指す。
【００１３】
図１に示すように、分子認識機能を有する本発明のポリペプチドを開発するに当たり、PDBから足場タンパク質群を選抜する指標として、タンパク質構造データベース（PDB）に登録されている331016個のタンパク質鎖から、（１）ヒト由来である（安全性）、（２）モノマーである（構造の単純性）、（３）アミノ酸残基が40〜100残基である（低分子量）、（４）２次構造の割合が全体構造の30％以上（設計性）、（５）隣接ループ領域を有する（抗体様分子認識能）、および（６）ループのアミノ酸の少なくとも一方の長さが10残基以上（抗体様分子認識能）のコンピュータによる抽出条件で170個のタンパク質鎖に絞り込み、さらに、（７）ジスルフィド結合がないこと（細胞内での利用可能性）、（８）ループの露出度等の本発明者らの目視による選抜により、最終的に14個の骨格タンパク質候補を選出した。
【００１４】
これら14種類のタンパク質の大腸菌での発現量と熱的安定性(示差走査型カロリメトリー(DSC)を用いて精製したタンパク質のTm値を測定)を評価したところ、14種類中5個（No. 3, 6, 10, 11, 12のタンパク質）が高発現でかつ熱的安定性が高いことが分かった(図２)。
【００１５】
さらに、選択された5つのタンパク質のループ構造へランダム変異を導入したところ、変異体が可溶性タンパク質として発現した率について、HU2AF65の第2RNA結合ドメイン（PDF 2u2f）が最も高い率を示した（表１）。また、この2u2f中の変異を導入したループ領域のアミノ酸の保存度の面から変異体への寛容性を解析したところ（The Consurf Server, URL:http://consurf.tau.ac.il/2016/を利用、図３）、アミノ酸の保存度は低く、変異導入領域として利用し得ることも分かった。
【００１６】
2u2fのループ1, 1', 2ならびに3の位置および配列、Tm値、発現量を図４に示す。ループ1（配列番号２２）は配列番号８番目から１４番目までのアミノ酸領域、ループ１’ （配列番号２４）は配列番号１１番目から１４番目までのアミノ酸領域、ループ2（配列番号２３）は配列番号６３番目から７３番目までのアミノ酸領域、ループ3（配列番号２５）は配列番号３６番目から４１番目までのアミノ酸領域に相当する。
【００１７】
【表１】
2019198693.tif 000002
【００１８】
以上の結果から、タンパク質2u2fを、足場タンパク質のフォーマットとして選定した。
【００１９】
本発明の第一の態様は、（ｉ）〜（ｘｉ）のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ標的分子に対する結合性が配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して増大しているポリペプチドである。
【００２０】
（ｉ）配列番号１の８番目から１４番目までのアミノ酸のうちの少なくとも一つが置換されたアミノ酸配列
（ｉｉ）配列番号１の３６番目から４１番目までのアミノ酸のうちの少なくとも一つが置換されたアミノ酸配列
（ｉｉｉ）配列番号１の６３番目から７３番目までのアミノ酸のうちの少なくとも一つが置換されたアミノ酸配列
（ｉｖ）前記（ｉ）と前記（ｉｉ）の両方を満たすアミノ酸配列
（ｖ）前記（ｉ）と前記（ｉｉｉ）の両方を満たすアミノ酸配列
（ｖｉ）前記（ｉ）で定義されたポリペプチドのアミノ酸配列において、配列番号１の１番目から７番目および１５番目から８２番目のアミノ酸配列との対応する位置のアミノ酸配列の配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列
（ｖｉｉ）前記（ｉｉ）で定義されたポリペプチドのアミノ酸配列において、配列番号１の１番目から３５番目および４２番目から８２番目のアミノ酸配列との対応する位置のアミノ酸配列の配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列
（ｖｉｉｉ）前記（ｉｉｉ）で定義されたポリペプチドのアミノ酸配列において、配列番号１の１番目から６２番目および７４番目から８２番目のアミノ酸配列との対応する位置のアミノ酸配列の配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列
（ｉｘ）前記（ｉｖ）で定義されたポリペプチドのアミノ酸配列において、配列番号１の１番目から７番目、１５番目から３５番目、および４２番目から８２番目のアミノ酸配列との対応する位置のアミノ酸配列の配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列
（ｘ）前記（ｖ）で定義されたポリペプチドのアミノ酸配列において、配列番号１の１番目から７番目、１５番目から６２番目、および７４番目から８２番目のアミノ酸配列との対応する位置のアミノ酸配列の配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列
（ｘｉ）前記（ｉ）〜（ｘ）で定義されたポリペプチドの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列
配列番号１のアミノ酸配列は、野生型のHU2AF65の第2RNA結合ドメイン(2u2f)を構成するアミノ酸配列である。
AHKLFIGGLPNYLNDDQVKELLTSFGPLKAFNLVKDSATGLSKGYAFCEYVDINVTDQAIAGLNGMQLGDKKLLVQRASVGA    （配列番号１）
配列番号１の８番目から１４番目までの領域、配列番号１の３６番目から４１番目までの領域、および配列番号１の６３番目から７３番目までの領域は、2u2fポリペプチドのループ領域に相当する。
【００２１】
（ｖｉ）〜（ｘ）の各々に関し、本発明のポリペプチドは、（ｖｉ）〜（ｘ）で定義されたポリペプチドのアミノ酸配列において、上記配列同一性が好ましくは９５％以上であり、より好ましくは９８％以上である。
【００２２】
本明細書におけるアミノ酸配列または塩基配列における配列同一性に関し、２つのアミノ酸配列または塩基配列における配列同一性を決定するために、配列は比較に最適な状態に前処理される。例えば、一方の配列にギャップを入れることにより、他方の配列とのアラインメントの最適化を行なう。その後、各部位におけるアミノ酸残基または塩基が比較される。第一の配列におけるある部位に、第二の配列の相当する部位と同じアミノ酸残基または塩基が存在する場合、それらの配列は、その部位において同一である。２つの配列における同一性は、配列間での同一である部位数の全部位（全アミノ酸または全塩基）数に対する百分率で示される。アミノ酸配列および塩基配列の同一性は、例えば、Lipman-Pearson法（Science, 227,1435, 1985）等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較することにより決定することができる。
【００２３】
また（ｘｉ）に関し、欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列の数は、１〜５個であることが好ましく、１〜３個であることがより好ましく、１または２個であることが好ましい。
【００２４】
置換されるアミノ酸は、置換後のアミノ酸配列を有するポリペプチドが標的分子に対する結合性を示していれば特に限定されるものではなく、天然型と非天然型とを問わないアミノ酸を使用することができる。天然型アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システイン等が挙げられる。
【００２５】
一実施形態において、本発明のポリペプチドは、上記（ｉ）のアミノ酸配列、上記（ｉｉｉ）のアミノ酸配列、上記（ｖ）のアミノ酸配列、上記（ｖｉ）のアミノ酸配列、上記（ｖｉｉｉ）のアミノ酸配列、上記（ｘ）のアミノ酸配列、または、上記（ｘｉ）であって上記（ｉ）、上記（ｉｉｉ）、上記（ｖ）、上記（ｖｉ）、上記（ｖｉｉｉ）、もしくは上記（ｘ）で定義されたポリペプチドの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列を有し、かつ標的分子に対する結合性が配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して増大しているポリペプチドである。
【００２６】
別の実施形態において、本発明のペプチドは、上記（ｉ）のアミノ酸配列、上記（ｉｉ）のアミノ酸配列、上記（ｉｖ）のアミノ酸配列、上記（ｖｉ）のアミノ酸配列、上記（ｖｉｉ）のアミノ酸配列、上記（ｉｘ）のアミノ酸配列、または、上記（ｘｉ）であって上記（ｉ）、上記（ｉｉ）、上記（ｉｖ）、上記（ｖｉ）、上記（ｖｉｉ）、もしくは上記（ｉｘ）で定義されたポリペプチドの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列を有し、かつ標的分子に対する結合性が配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して増大しているポリペプチドである。
【００２７】
上記実施形態において、上記（ｉ）のアミノ酸配列において、配列番号１の１１番目から１４番目までのアミノ酸のうちの少なくとも一つが置換され得る。
【００２８】
別の実施形態において、本発明のペプチドは、下記（ｘｉｉ）〜（ｘｖｉｉｉ）のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ標的分子に対する結合性が配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して増大している、ポリペプチドである。
【００２９】
（ｘｉｉ）配列番号１の１１番目から１４番目までのアミノ酸のうちの少なくとも一つが置換されたアミノ酸配列
（ｘｉｉｉ）配列番号１の３６番目から４１番目までのアミノ酸のうちの少なくとも一つが置換されたアミノ酸配列
（ｘｉｖ）上記（ｘｉｉ）と上記（ｘｉｉｉ）の両方を満たすアミノ酸配列
（ｘｖ）上記（ｘｉｉ）で定義されたポリペプチドのアミノ酸配列において、配列番号１の１番目から１０番目および１５番目から８２番目のアミノ酸配列との対応する位置のアミノ酸配列の配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列
（ｘｖｉ）上記（ｘｉｉｉ）で定義されたポリペプチドのアミノ酸配列において、配列番号１の１番目から３５番目および４２番目から８２番目のアミノ酸配列との対応する位置のアミノ酸配列の配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列
（ｘｖｉｉ）上記（ｘｉｖ）で定義されたポリペプチドのアミノ酸配列において、配列番号１の１番目から１０番目、１５番目から３５番目、および４２番目から８２番目のアミノ酸配列との対応する位置のアミノ酸配列の配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列
（ｘｖｉｉｉ）上記（ｘｉｉ）〜（ｘｖｉｉ）で定義されたポリペプチドの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列
（ｘｖ）〜（ｘｖｉｉ）の各々に関し、本発明のポリペプチドは、（ｘｖ）〜（ｘｖｉｉ）で定義されたポリペプチドのアミノ酸配列において、上記配列同一性が好ましくは９５％以上であり、より好ましくは９８％以上である。
【００３０】
また（ｘｖｉｉｉ）に関し、欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列の数は、１〜５個であることが好ましく、１〜３個であることがより好ましく、１または２個であることが好ましい。
【００３１】
８番目から１４番目までのアミノ酸のアミノ酸配列は、配列番号２〜７のいずれかであることができる。
CHDNSPP   (配列番号２）
DIYPATS  （配列番号３）
TAHSPTH   (配列番号４)
LAPSDNL   (配列番号５)
IAHISLN  （配列番号６）
SDDTYRD  （配列番号７）
６３番目から７３番目までのアミノ酸のアミノ酸配列は、配列番号８〜１３のいずれかであることができる。
IDRSTGPRSRG  (配列番号８）
ASFFVCVPILH  (配列番号９）
CRRFFTPTCFC  (配列番号１０）
LIGCFHNLCFF  (配列番号１１）
CANGSSSCIPC  (配列番号１２）
TGAVSVAVIYL  (配列番号１３）
別の実施形態において、上記本発明のポリペプチドは、本発明ポリペプチドの８番目から１４番目までのアミノ酸のアミノ酸配列が、配列番号２〜７のいずれかであり、かつ６３番目から７３番目までのアミノ酸のアミノ酸配列が配列番号８〜１３のいずれかである。
【００３２】
標的分子は、本発明のポリペプチドと結合する分子であれば限定されず、タンパク質、ペプチド、核酸、多糖、または低分子化合物であり得る。
【００３３】
タンパク質はアミノ酸が４０個以上ペプチド結合したものであれば特に限定されず、細胞膜受容体、酵素、ホルモン、サイトカイン、増殖因子等が挙げられる。ペプチドはアミノ酸が２個以上３０個未満ペプチド結合したものあれば特に限定されず、神経ペプチド、ホルモン、サイトカイン、増殖因子等が挙げられる。核酸としてはＤＮＡ、ＲＮＡ等が挙げられる。
【００３４】
低分子化合物としては、承認済みの低分子医薬等が挙げられる。
【００３５】
好ましくは、本発明のポリペプチドの標的分子とのファージELISA強度が、未変異の2u2fの該標的分子とのファージELISA強度の10倍以上示す。
【００３６】
本発明の第一態様のポリペプチドは、標的分子に結合する分子として単体で用いることもできるし、抗体または抗体断片の一部として用いることもできる。
【００３７】
本発明の第二態様は、上記の本発明のポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸分子である。なお「核酸」は、一本鎖ポリペプチドをコードする分子であれば、その化学構造および取得経路に特に制限はなく、例えば、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、化学合成ＤＮＡおよびｍＲＮＡ等を含むものとする。
【００３８】
本発明の第三態様は、第二態様の核酸分子を含む発現ベクターである。
【００３９】
本発明のポリペプチドは、当業者に公知の方法、例えば、遺伝子工学的手法または化学合成等の各種手段を用いて製造することが出来る。遺伝子工学的手法としては、例えば、ポリペプチドをコードする核酸を含有する発現ベクターを作製し、このベクターで宿主細胞を形質転換せしめ、該形質転換された宿主細胞を培養してポリペプチドを発現させ、該ポリペプチドを回収・精製することによって製造することが出来る。
【００４０】
ここで「発現ベクター(expression vector) 」は、DNA（通常は二本鎖である）の断片(piece) をいい、該DNAは、その中に外来のDNAの断片を挿入せしめることができる。外来のDNAは、異種DNA(heterologous DNA)として定義され、このものは、対象宿主細胞においては天然では見出されないDNA である。ベクターは、外来DNAまたは異種DNA を適切な宿主細胞に運ぶために使用される。一旦、宿主細胞中に入ると、ベクターは、宿主染色体DNA とは独立に複製することが可能であり、そしてベクターおよびその挿入された（外来）DNA のいくつかのコピーが生成され得る。さらに、ベクターは外来DNAのポリペプチドへの翻訳を可能にするのに不可欠なエレメントを含む。従って、外来DNAによってコードされるポリペプチドの多くの分子が迅速に合成されることができる。
【００４１】
このようなベクターは、適切な宿主中で DNA配列を発現するように、適切な制御配列(control sequence)とそれが機能するように(operably)（即ち、外来DNAが発現できるように）連結せしめられたDNA配列を含有する DNA構築物(DNA construct) を意味している。そうした制御配列としては、転写(transcription) させるためのプロモーター、そうした転写を制御するための任意のオペレーター配列、適切なmRNAリボソーム結合部位をコードしている配列、エンハンサー、リアデニル化配列、および転写や翻訳(translation) の終了を制御する配列等が挙げられる。更にベクターは、当業者に公知の各種の配列、例えば、制限酵素切断部位、薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子（選択遺伝子）、シグナル配列、リーダー配列等を必要に応じて適宜含むことが出来る。これらの各種配列または要素は、外来DNAの種類、使用する宿主細胞、培養培地等の条件に応じて、当業者が適宜選択して使用することが出来る。更に、製造した一本鎖ポリペプチドの検出および精製等を容易にする目的のために、当業者に公知の各種のペプチドタグ（例えば、ｃ−ｍｙｃタグおよびＨｉｓ−ｔａｇ）をコードする配列をポリペプチドに対応する配列の末端等に含ませることが出来る。
【００４２】
該ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、あるいは単純にゲノムの挿入体(genomic insert)等の任意の形態が可能である。一旦、適切な宿主の中に形質転換で導入せしめられると、該ベクターは宿住のゲノムとは独立して複製したり機能するものであり得る。または、該ベクターはゲノムの中に組み込まれるものであってもよい。
【００４３】
本発明のポリペプチドを製造する為に使用する各種の発現ベクターは、当業者であれば、当該技術分野における公知技術を用いて容易に作製することが出来る。
【００４４】
本発明の第四態様は、第三態様の発現ベクターを含む宿主細胞である。
【００４５】
宿主細胞としては当業者に公知の任意の細胞を使用することができるが、例えば、代表的な宿主細胞としては、大腸菌(E. coli) 等の原核細胞、および、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞) 、ヒト由来細胞などの哺乳動物細胞、酵母、昆虫細胞等の真核細胞が挙げることができる。形質転換菌は当業者に公知の任意の抵当な条件・方法で培養することができる。宿主として、例えば、BL21 star(DE3)株、培地として2xYT培地、培養温度28℃前後、0.5 mM 程度のIPTGで発現を誘導することによって、培養上清または可溶性画分における本発明のポリペプチドの収量を大幅に向上させることができ、製造効率を高めることが可能となる。
【００４６】
このような宿主細胞における発現等により得られたポリペプチドは一般に分泌されたポリペプチドとして培養培地から回収されるが、それが分泌シグナルを持たずに直接に産生された場合には宿主細胞溶解物から回収することが出来る。ポリペプチドが膜結合性である場合には、適当な洗浄剤（例えば、トリトン-X100) を使用して膜から遊離せしめることができる。精製操作は当業者に公知の任の方法を適宜組み合わせて行うことが出来る。例えば、必用に応じてＰＥＧ化等の化学修飾を行った後、遠心分離、硫酸アンモニウム沈殿、クロスフロー濃縮、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、イオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相HPLC、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンセファロースでのクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン樹脂クロマトグラフィー（ポリアスパラギン酸カラム等）、クロマトフォーカシング、SDS-PAGE、およびアフィニティクロマトグラフィーによって好適に精製される。アフィニティクロマトグラフィーは、ポリペプチドが有するぺプチドタグとの親和力を利用した効率が高い好ましい精製技術の一つである。
【００４７】
回収されたポリペプチドは不溶性画分に含まれている場合には、精製操作は、ポリペプチドを可溶化し変性状態にした上で行うことが好ましい。この可溶化処理は、エタノールなどのアルコール類、各種試薬類、グアニジン塩酸塩、尿素などの解離剤として当業者に公知の任意の薬剤を使用して行うことが出来る。
【００４８】
以上に示したように、本発明のポリペプチドは、例えば、培養宿主細胞の培養培地上清、ペリプラズマ画分、菌体内可溶性画分、または、菌体内不溶性画分から調製することが可能である。
【００４９】
本発明の第五態様によれば、上記の本発明のポリペプチドを含む組成物が提供される。そのような組成物は医薬組成物であることができる。
【００５０】
本発明の医薬組成物は、第一の態様のポリペプチド、第二の態様の核酸分子、第三の態様の発現ベクター、および第四の態様の宿主細胞から成る群から選ばれた少なくとも一つを有効成分として含有する。
【００５１】
本発明の医薬組成物には、有効成分の種類、薬剤形態、投与方法・目的、投与対象の病態等の各種条件に応じて、有効成分に加えて当業者に周知の薬学上許容し得る各種成分（例えば、担体、賦形剤、緩衝剤、安定化剤、等）を適宜添加することが出来る。
【００５２】
本発明の医薬組成物は、上記各種条件に応じて、錠剤、液剤、粉末、ゲル、および、噴霧剤、或いは、マイクロカプセル、コロイド状分配系（リポソーム、マイクロエマルジョン等）、およびマクロエマルジョン等の種々薬剤形態をとり得る。
【００５３】
投与方法としては、静脈内、腹腔内、脳内、脊髄内、筋肉内、眼内、動脈内、特には胆管内、または病変内経路による注入または注射、および持続放出型システム製剤による方法が挙げられる。本発明の活性物質は、輸液により連続的に、または大量注射により投与されることができる。尚、本発明の医薬組成物を投与する場合には、食作用または細胞傷害活性を有する細胞と共に投与することが好ましい。或いは、投与前に本発明のポリペプチドのような有効成分と上記細胞とを混合することによって、投与前に該抗体を予め該細胞に結合させておくことが好ましい。
【００５４】
本発明の第六の態様によれば、本発明の第一の態様のポリペプチド、第二の態様の核酸分子、第三の態様の発現ベクター、および第四の態様の宿主細胞から成る群から選ばれた少なくとも一つを備えたキットが提供される。キットは、本発明のポリペプチドの他に、ポリペプチドを収容するための容器、注射針、薬学的に許容される媒体、アルコール綿布、絆創膏、または使用方法を記載した指示書等を備えることもできる。
【００５５】
本発明の第七態様は、標的分子に対する結合性が配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ポリペプチドに対して増大している、該ポリペプチドの変異型ポリペプチドのスクリーニング方法であって、
配列番号１をコードするヌクレオチドが挿入された発現ベクターに遺伝子断片を挿入し、配列番号１の８番目から１４番目までのアミノ酸の領域、３６番目から４１番目までのアミノ酸の領域、および６３番目から７３番目までのアミノ酸の領域のうちの少なくとも一つへ変異を導入したアミノ酸配列をコードする核酸のライブラリーを作製すること、
前記ライブラリーを標的分子と相互作用させ、結合親和性を測定すること、および
結合親和性を示すファージをクローニングすること
を含む方法である。
【００５６】
一実施形態では、ライブラリーを作製することは、
配列番号１の８番目から１４番目までのアミノ酸の領域および６３番目から７３番目までのアミノ酸の領域のうちの少なくとも一方、
配列番号１の８番目から１４番目までのアミノ酸の領域および３６番目から４１番目までのアミノ酸の領域のうちの少なくとも一方、または
配列番号１の１１番目から１４番目までのアミノ酸の領域および３６番目から４１番目までのアミノ酸の領域のうちの少なくとも一方
へ変異を導入したアミノ酸配列をコードする核酸のライブラリーを作製することを含む。
【００５７】
変異を有する遺伝子断片の調製方法は当該技術分野で周知であり、当業者には、野生型の核酸配列を鋳型にし、変異を有する核酸配列部分を増幅可能なプライマーのセットを用いて、そのような変異を有する遺伝子断片を作製することができる。
【００５８】
例えば、上記変異を有する遺伝子断片は、配列番号１をコードするヌクレオチドが挿入された発現ベクターを鋳型とし、図５に記載の配列番号１４のプライマーと配列番号１５のプライマーのセット、配列番号１６のプライマーと配列番号１７のプライマーのセット、ならびに配列番号１８のプライマーと配列番号１９のプライマーのセットを用いるか、または配列番号１４のプライマーと配列番号２０のプライマーのセットおよび配列番号２１のプライマーと配列番号１９のプライマーのセットを用いてＰＣＲを行った後、その生成遺伝子断片を鋳型として配列番号１４のプライマーと配列番号１９のプライマーのセットを用いて、もう一度ＰＣＲを行い、変異体の遺伝子断片を作製することができる。
【００５９】
このようなスクリーニング方法によれば、標的分子に対する結合性が野生型よりも高いポリペプチドを、特異的かつ迅速に同定することができる。
【００６０】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【実施例】
【００６１】
実施例１  2u2fポリペプチドを足場タンパク質とした変異体ライブラリーの作製
コドン配列NNTを用いて、HU2AF65の第2RNA結合ドメイン（2u2fポリペプチド）のループ1および2の領域へ変異を導入したライブラリー(Loop12ライブラリー)とループ1および3へ変異を導入しライブラリー(Loop13ライブラリー)とを作製した。具体的には、2u2fの足場タンパク質の遺伝子が挿入されている発現ベクターpET22bを鋳型として、図５の変異導入プライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行った。Loop12ライブラリーの作製には、プライマー primer 1およびプライマー primer 2のセット、プライマー primer 3およびプライマー primer 4のセット、プライマー primer 5およびプライマー primer 6のセットを用いた。Loop13ライブラリーの作製には、プライマー primer 1およびプライマー primer 7のセット、プライマー primer 8およびプライマー primer 6のセットを用いた。【００６２】
PCR後、その生成遺伝子断片とプライマーprimer1およびプライマーprimer6を用いて、もう一度PCRを行い、変異体群の遺伝子断片を調製した。そして、制限酵素処理後、M13ファージのファージミドベクタへ挿入することで、1.1×107(Loop12ライブラリー)および1.1×107(Loop13ライブラリー)の規模をもつ変異体ライブラリーを各々調製した（図５）。【００６３】
実施例２  パニング操作及びHER2に結合親和性を有する2u2fポリペプチドの変異体の取得
HER2は乳がん細胞表面に過剰発現している糖タンパク質である上皮増殖因子受容体である。HER2を標的とした分子を取得するために、疎水性表面加工がなされているイムノチューブに全長HER2を含む水溶液を加え、チューブ表面にHER2を固定化した。そして、水溶液を取り除いた後、スキムミルクでブロッキングをした後、2u2fポリペプチドの変異体を提示したM13ファージライブラリーを含む水溶液を加えた。相互作用後は、界面活性剤(Tween)を含む水溶液で洗浄操作(パニング)を行い、100 mM トリメチルアミン水溶液でファージを解離させて、解離したファージを大腸菌に感染させて、ファージを増幅させた。この操作をHER2固定化量にて4回繰り返すことで、HER2に結合親和性をもつ2u2fポリペプチドの変異体の取得を試みた（図６）。【００６４】
パニング操作の詳細については以下の通りである。【００６５】
イムノチューブ（MAXISORP immune-tube 444202; thermo scientific, USA)にPBS 3 mL、Her2抗原タンパク質を添加し (1stラウンド:0.48 μg、2ndラウンド:0.096 μg、3rdラウンド:1.9 x 10-2 μg、4thラウンド:3.9 x 10-3 μg) 、4℃、一晩静置して固相化させた。PBSで5回洗浄後、3% Skim milk / PBS溶液でイムノチューブ全体をブロッキング(25℃, 30 min)させた後、PBSで5回洗浄した。イムノチューブに3 mlの5%BSA/ 5%HSA /3%Skim milk/ PBSを添加し、50-100 μLのファージライブラリー溶液を加えてボルテックスした後、30 min間室温静置させてからゆるやかに回転攪拌(30 min-1 hr, 6 rpm, 室温)し、再び30 min-1 hr室温静置したのちに0.05% Tween 20/ PBSで10回洗浄した。1 mlの100 mM トリエチルアミン水溶液をチューブに添加し、結合しているファージを溶出後、1 mLの0.5 M Tris-HCl溶液と混合して中和させた。再度1 mlの100 mM トリエチルアミン水溶液を添加し、ゆるやかに回転攪拌(10 min, 6 rpm, 室温)後に先ほどの中和液に回収した。溶出ファージ1.5 mL分をO.D.600が約0.5となるまで培養した大腸菌TG-1に感染させた。30 ℃、45 min-1 hr静置後、10 μLを抜き取り、タイターチェックを行った。残りは遠心操作により上清を除去し、沈降した菌体を2×YTGAプレート2枚にプレーティングすることでファージミドベクターを保持したTG-1をコロニー化させた。【００６６】
回収したコロニーを40 mLの2×YTGA 培地に添加してO.D.600が約0.5となるまで培養し、20 μLのヘルパーファージを添加した。そして、30 ℃、1 hr静置後、133μLの15mg/mlカナマイシンを培地に添加し、30 ℃、一晩振とうした。遠心分離により培地上清を回収し、10 mLの25%PEG6000, 2.5M NaCl溶液を添加し氷上で30 min-2 hr静置後、遠心分離より上清を除去し、沈降したファージに2-3 mL 10%グリセロール/PBS溶液を添加して、次のラウンドのファージライブラリー溶液とした。【００６７】
ラウンドごとのポリクローナルな2u2fポリペプチドの変異体提示ファージを用いて、HER2を標的とした結合評価をファージELISAにて行った。96-wellプレートに1〜2 μg/mLになるようにPBSにて希釈調製した各種Her2断片蛋白質を50 μL添加し，25℃で1時間穏やかにプレートを振盪させて固相化した。その後、溶液を除き150 μLのPBSで1回洗浄した。続いて、PBS/ 0.1% Tween20/ 3% skim milkを150 μL添加し，25℃で1時間ブロッキングした。反応溶液を除き150 μLのPBSで1回洗浄後、精製ファージまたはファージ含有培地上清を50 μL添加し、室温で30分間反応させてから反応溶液を除き、PBS/ 0.1% Tween 20で3回洗浄を行った。続いて、PBS/0.1% Tween20/ 0.5% BSAで5000倍希釈したAnti-M13-HRP (GE healthcare, CT, USA)を50 μL添加して25℃で40分間抗体反応を行った後、反応溶液を除きPBS/ 0.1% Tween 20で3回洗浄した。その後、TMB溶液 (1-Step（登録商標） Ultra TMB-ELISA Substrate Solution; Thermo Fisher Scientific, MA, USA)を50 μL添加することで呈色反応を行い、2M H2SO4溶液を50 μL添加することで反応を停止させた。450 nmの吸光度はプレートリーダー (Synergy（登録商標） H4 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader; BioTek, VT, USA)にて測定した。【００６８】
その結果、Loop12ライブラリーを用いたものは、3および4回目のラウンド後において、標的結合性を示した(図７)。そこで、これらラウンド後のファージをモロクーナル化し、ファージELISAを用いて行ったところ、有望変異体クローンを取得することができた(図８Ａ−Ｃ)。図８Ｃにおいて、3d2、h5、h6、g10、h10及びh11変異体クローンの吸光度は野生型(WT）クローンのそれよりも高く、HER2に対する結合性が増大していることが確認された。特にh5変異体クローンのHER2に対する結合性は顕著に高かった。【００６９】
図８Ｃ中の有望変異体であるh5のモノクローナルファージを用いて、HER2以外のタンパク質(BSA, HSA, リゾチーム, ストレプトアビジン)についてもファージELISAを行ったところ、HER2に優位な結合性を示し、h5変異体は標的特異性をもつことが示された（図９)。【００７０】
さらに、h5変異体を大腸菌で発現させ、不溶性画分から6 M  GdnHCl溶液で可溶化後、希釈法にて巻き戻しを行って、h5変異体の組換えタンパク質を調製した。そして、その変異体のHER2に対する結合評価をELISAにて評価したところ、HER2に対して結合性を示した（図１０）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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