(57)【要約】  水溶性を有し、熱に安定なキヌレニンモノオキシゲナーゼを提供する。  以下の性質（ａ）〜（ｈ）を有するキヌレニンモノオキシゲナーゼ。（ａ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ又はそれらの誘導体、及び酸素存在下で、Ｌ−キヌレニンと反応させることで、ＮＡＤ（Ｐ）＋又はそれらの誘導体、及び３−ヒドロキシキヌレニンを産生する（ｂ）原核生物を由来とする（ｃ）水溶性である（ｄ）ｐＨ９．０において、２５℃で３０分間静置後の残存活性が７０％以上である（ｅ）ｐＨ７．５において、４０℃で６０分間静置後の残存活性が６０％以上である（ｆ）Ｌ−キヌレニンに特異的に作用し、Ｌ−トリプトファンへの作用性が５％以下である（ｇ）分子量が４０ｋＤａ〜６０ｋＤａである（ｈ）フラビンを補酵素とする
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の性質（ａ）〜（ｈ）を有するキヌレニンモノオキシゲナーゼ。
（ａ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ又はそれらの誘導体、及び酸素存在下で、Ｌ−キヌレニンと反応させることで、ＮＡＤ（Ｐ）＋又はそれらの誘導体、及び３−ヒドロキシキヌレニンを産生する
（ｂ）原核生物を由来とする
（ｃ）水溶性である
（ｄ）ｐＨ９．０において、２５℃で３０分間静置後の残存活性が７０％以上である
（ｅ）ｐＨ７．５において、４０℃で６０分間静置後の残存活性が６０％以上である
（ｆ）Ｌ−キヌレニンに特異的に作用し、Ｌ−トリプトファンへの作用性が５％以下である
（ｇ）分子量が４０ｋＤａ〜６０ｋＤａである
（ｈ）フラビンを補酵素とする
【請求項２】
原核生物がDeltaproteobacteria網、又はXanthomonadales目に属する群より選択される、請求項１に記載のキヌレニンモノオキシゲナーゼ。
【請求項３】
原核生物がPseudoxanthomonas属、Myxococcus属、Dyella属、又はRhodanobacter属に属する群より選択される、請求項２に記載のキヌレニンモノオキシゲナーゼ。
【請求項４】
原核生物がPseudoxanthomonas suwonensis、Myxococcus stipitatus、Dyella japonica及びRhodanobacter denitrificansより選択される、請求項３に記載のキヌレニンモノオキシゲナーゼ。
【請求項５】
キヌレニンモノオキシゲナーゼのアミノ酸配列が、配列番号６〜９で示される配列のいずれか１つと９０％以上の類似性を有する配列である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のキヌレニンモノオキシゲナーゼ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のキヌレニンモノオキシゲナーゼを用いたＬ−キヌレニンの測定方法。
【請求項７】
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ又はそれらの誘導体、及びキヌレニンモノオキシゲナーゼを作用させることで、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）からなる群より選択される１種以上の変化を測定する、請求項６記載のキヌレニンの測定方法。
（ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ又はそれらの誘導体の減少量
（ｉｉ）ＮＡＤ（Ｐ）＋又はそれらの誘導体の増加量
（ｉｉｉ）３−ヒドロキシキヌレニンの増加量
（ｉｖ）Ｌ−キヌレニンの減少量
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のキヌレニンモノオキシゲナーゼを含むキヌレニン測定キット。
【請求項９】
ｐＨ９．０以上の液体組成物又は液体組成物の乾燥品を含む、請求項８記載のキヌレニン測定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キヌレニンモノオキシゲナーゼ、それを用いたキヌレニンの測定方法、及び該キヌレニンモノオキシゲナーゼを含むキヌレニン測定キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−キヌレニンは、Ｌ−トリプトファンの代謝物として生体内に存在することが知られており、医療分野において測定意義が各種検討されている。試料中のＬ−キヌレニン濃度測定においては、キヌレニンモノオキシゲナーゼ（ＫＭＯ）を利用する例が知られている。例えば、ヒト由来又はPseudomonas fluorescence由来のキヌレニンモノオキシゲナーゼを使用した例が報告されている（非特許文献１、特許文献１）。ヒトなどの真核生物由来のキヌレニンモノオキシゲナーゼは膜タンパク酵素であるため、大腸菌などでの大量生産が困難であり、また可溶化のために界面活性剤を併用する必要がある。キヌレニンモノオキシゲナーゼの可溶化のためにタグを付与する方法も知られているが、この方法は酵素タンパクあたりの活性が低下するという問題が報告されている（非特許文献２）。一方、原核生物由来のP.fluorescence由来のキヌレニンモノオキシゲナーゼは水溶性であり、大腸菌を用いて取得することが比較的容易である（非特許文献３）。しかしながら、P.fluorescence由来のキヌレニンモノオキシゲナーゼは熱に対して不安定であるため、特許文献１においては、主に２５℃で測定されている。また、他の原核生物由来のキヌレニンモノオキシゲナーゼとして、Cytophaga由来のものも知られているが、これは不溶性であるため、可溶化のために界面活性剤を使用することが必要とされている（非特許文献４）。このように、耐熱性を有する水溶性のキヌレニンモノオキシゲナーゼは知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１７−６３７８６号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】平成28年度日本臨床衛生検査技師会中四国支部医学検査学会（第49回）、175. キヌレニン酵素的測定法の基礎的検討
【非特許文献２】Protein Expression and Purification 95 (2014) 96-103
【非特許文献３】Protein Expression and Purification 51 (2007) 324-333
【非特許文献４】Chemistry & Biology 10 (2003) 1195-1204
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
前述のように、大量生産が可能であり、生体試料中のキヌレニン測定に有用なキヌレニンモノオキシゲナーゼの開発が望まれている。本発明は、水溶性であり、かつ熱安定性を有するキヌレニンモノオキシゲナーゼを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記課題を解決するために、本発明者らは、原核生物からのスクリーニングをし、遺伝子クローニング、培養及び精製した酵素の特性を検討した。その結果、驚くべきことに、今回取得した原核生物由来の酵素が、キヌレニンモノオキシゲナーゼ活性を有しており、水溶性で、かつP.fluorescence由来のキヌレニンモノオキシゲナーゼと比べて熱安定性を有することを見出した。加えて、これらの酵素はアルカリ性での安定性及びＬ−キヌレニンへの基質特異性が高いことも見出し、本発明を完成した。【０００７】
本発明は、以下の［１］〜［９］に関する。
［１］  以下の性質（ａ）〜（ｈ）を有するキヌレニンモノオキシゲナーゼ。
（ａ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ又はそれらの誘導体、及び酸素存在下で、Ｌ−キヌレニンと反応させることで、ＮＡＤ（Ｐ）＋又はそれらの誘導体、及び３−ヒドロキシキヌレニンを産生する
（ｂ）原核生物を由来とする
（ｃ）水溶性である
（ｄ）ｐＨ９．０において、２５℃で３０分間静置後の残存活性が７０％以上である
（ｅ）ｐＨ７．５において、４０℃で６０分間静置後の残存活性が６０％以上である
（ｆ）Ｌ−キヌレニンに特異的に作用し、Ｌ−トリプトファンへの作用性が５％以下である
（ｇ）分子量が４０ｋＤａ〜６０ｋＤａである
（ｈ）フラビンを補酵素とする
［２］  原核生物がDeltaproteobacteria網、又はXanthomonadales目に属する群より選択される、［１］に記載のキヌレニンモノオキシゲナーゼ。
［３］  原核生物がPseudoxanthomonas属、Myxococcus属、Dyella属、又はRhodanobacter属に属する群より選択される、［２］に記載のキヌレニンモノオキシゲナーゼ。
［４］  原核生物がPseudoxanthomonas suwonensis、Myxococcus stipitatus、Dyella japonica及びRhodanobacter denitrificansより選択される、［３］に記載のキヌレニンモノオキシゲナーゼ。
［５］  キヌレニンモノオキシゲナーゼのアミノ酸配列が、配列番号６〜９で示される配列のいずれか１つと９０％以上の類似性を有する配列である、［１］〜［４］のいずれか１項に記載のキヌレニンモノオキシゲナーゼ。
［６］  ［１］〜［５］のいずれか１項に記載のキヌレニンモノオキシゲナーゼを用いたＬ−キヌレニンの測定方法。
［７］  ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ又はそれらの誘導体、及びキヌレニンモノオキシゲナーゼを作用させることで、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）からなる群より選択される１種以上の変化を測定する、［６］記載のキヌレニンの測定方法。
（ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ又はそれらの誘導体の減少量
（ｉｉ）ＮＡＤ（Ｐ）＋又はそれらの誘導体の増加量
（ｉｉｉ）３−ヒドロキシキヌレニンの増加量
（ｉｖ）Ｌ−キヌレニンの減少量
［８］  ［１］〜［５］のいずれかに記載のキヌレニンモノオキシゲナーゼを含むキヌレニン測定キット。
［９］  ｐＨ９．０以上の液体組成物又は液体組成物の乾燥品を含む、［８］記載のキヌレニン測定キット。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、水溶性及び熱安定性を有するキヌレニンモノオキシゲナーゼが得られた。本酵素は水溶性であるため、可溶化を目的として界面活性剤を使用する必要がなく、さらに本酵素は熱に安定であるため、生化学自動分析装置の測定温度である３７℃での測定が可能である。従来酵素を使用した場合は、反応中の熱失活による感度低下が認められるために、測定時に過剰量の酵素を使用する必要があったが、酵素量を低減することができる。さらに本酵素は、ｐＨ安定性（特にアルカリへの耐性）を有しているため、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ又はそれらの誘導体と酵素を混合した、ｐＨ９．０以上のキヌレニン測定キットの調製が容易にできる。本酵素はいずれもＬ−キヌレニンに対する基質特異性も高いので、その結果、生体試料中のＬ−キヌレニンの測定が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】各キヌレニンモノオキシゲナーゼを使用したＬ−キヌレニン（L-Kyn）濃度測定時の吸光度（ΔＡｂｓ３４０）との関係を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
１．キヌレニンモノオキシゲナーゼ
１−１．キヌレニンモノオキシゲナーゼの性質
（ａ）キヌレニンモノオキシゲナーゼ活性
本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼ（以下、本酵素と称することがある）は、Ｌ−キヌレニンを基質とする酸化還元酵素である。本酵素をＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ又はそれらの誘導体、及び酸素の存在下（好気的条件）で、Ｌ−キヌレニンと反応させることで、Ｌ−キヌレニンの酸化反応が起こり、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋又はＮＡＤ（Ｐ）＋誘導体及び３−ヒドロキシキヌレニンが産生される。
なお、以下本明細書において、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨをＮＡＤ（Ｐ）Ｈと、ＮＡＤ＋及びＮＡＤＰ＋をＮＡＤ（Ｐ）＋と総称する。
【００１２】
本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼを触媒とする反応は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ及びそれらの誘導体から選択される電子供与体の存在下に行われる。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの誘導体とは、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの誘導体であり、ＮＡＤＨやＮＡＤＰＨと同様の電子供与性を有し、ＮＡＤＨやＮＡＤＰＨの安定性向上、モル吸光係数の上昇等のために使用することができる。本発明においては、キヌレニンモノオキシゲナーゼによる反応が進むのであれば、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの誘導体の種類は特に限定されず、例えば、チオＮＡＤＨや特開２０１２−２２４６３８号公報で示されるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ誘導体等、公知のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ誘導体を使用することができる。
【００１３】
キヌレニンモノオキシゲナーゼ活性の測定は、例えば、以下の試薬及び条件で行うことができる（「活性測定法１」とする）。測定方法は以下に限定されず、測定に問題がない範囲で適宜試薬及び／又は条件を変更することができる。
１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）０．６ｍＬ、７．５ｍＭ  ＮＡＤＰＨ溶液０．１ｍＬ、１ｍＭ  Ｌ−キヌレニン溶液０．３ｍＬ、超純水１．９５ｍＬを光路長１ｃｍの石英セル内で混合し、３７℃で１０分間加温後、酵素サンプル０．０５ｍＬを添加し、３７℃で反応を開始する。反応開始後から３４０ｎｍの吸光度変化を測定し、１分間あたりの３４０ｎｍの吸光度の減少量（ΔＡｂｓ３４０／分）を測定し、式１に従いキヌレニンモノオキシゲナーゼ活性を算出する。ＮＡＤＰＨのモル吸光係数は、基質であるキヌレニンも３４０ｎｍで吸収を有していることを考慮して、前述の非特許文献３に従い、６．７［ｍＭ−１ｃｍ−１］で計算することとする。
なお、上記活性測定法１のＮＡＤＰＨ溶液をより安価なＮＡＤＨ溶液に置き換えて測定することも可能である。
【００１４】
【数１】
2019142935.tif 000003
【００１５】
式１中、「３．０」は反応液の液量［ｍＬ］、「６．７」はモル吸光係数［ｍＭ−１ｃｍ−１］、「１．０」は光路長［ｃｍ］、「０．０５」は使用した酵素の液量［ｍＬ］である。
【００１６】
（ｂ）由来
本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼは、大腸菌、酵母、カビのような微生物を宿主とした組換え微生物での大量生産が可能であり、水溶性を示し、また原核生物に由来するものが好ましい。原核生物由来であれば特に限定されないが、本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼは、原核生物がDeltaproteobacteria網、又はXanthomonadales目に属する群由来のものが好ましく、Pseudoxanthomonas属、Myxococcus属、Dyella属、又はRhodanobacter属に属する微生物に由来することがより好ましい。この中でも、Pseudoxanthomonas suwonensis、Myxococcus stipitatus、Dyella japonica又はRhodanobacter denitrificansがより好ましい。
【００１７】
（ｃ）水溶性
本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼは、水溶性である。具体的には、培養後の酵素収集において、界面活性剤等による可溶化工程を必要とせず、可溶性画分に酵素タンパクが存在していればよく、好ましくは１ｍＬの水に対する溶解度が、０．１ｍｇ以上であり、より好ましくは１ｍｇ以上である。タンパク濃度の測定方法としては、ＢＳＡ（牛血清アルブミン）を標準物質とし、ブラッドフォード法による比色法により測定が可能である。
【００１８】
（ｄ）アルカリ安定性
本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼはアルカリ性での安定性を有する。アルカリ溶液中で、２５℃で３０分間静置後の残存キヌレニンモノオキシゲナーゼ活性が７０％以上である場合に、アルカリ安定性を有する、と判断する。具体的には、本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼは、１．０ｍｇ／ｍＬの酵素をｐＨ９．０又はｐＨ９．５のグリシン−ＮａＯＨ緩衝液及び２５℃の条件において３０分間静置した後の残存活性が、処理前の酵素活性を１００％とした場合にそれぞれ７０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上である。
【００１９】
（ｅ）熱安定性
本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼは熱安定性を有する。４０℃で６０分間静置後の残存キヌレニンモノオキシゲナーゼ活性が７０％以上である場合に、温度安定性を有する、と判断する。具体的には、本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼは、１．０ｍｇ／ｍＬの酵素をｐＨ７．５のリン酸カリウム緩衝液及び４０℃の条件において６０分間静置した後の残存活性が、処理前の酵素活性を１００％とした場合に６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、更に好ましくは８０％以上である。
【００２０】
（ｆ）基質特異性
本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼは、基質特異性に優れている。例えば、Ｌ−キヌレニンに対する反応性に対して、少なくともＬ−トリプトファンに対する反応性が低い。生体試料においては、Ｌ−トリプトファンはＬ−キヌレニンの前駆体であり、さらにＬ−トリプトファンの含有量はＬ−キヌレニンよりも多量であることが一般的であり、トリプトファンへの反応性も高い酵素だとキヌレニンの測定に正確を期すことが困難なことがある。本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼは、Ｌ−トリプトファンに比べてＬ−キヌレニンへの特異性が高いことから、Ｌ−トリプトファンが共存する場合であっても、Ｌ−キヌレニン量又は濃度を正確に測定することが可能である。具体的には、本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼは、活性測定法１に従い、Ｌ−キヌレニン、及びＬ−キヌレニンをＬ−トリプトファン又はＤ−キヌレニン（Ｌ−キヌレニンの光学異性体）に変えてそれぞれ測定すると、Ｌ−トリプトファンに対する反応性がＬ−キヌレニンに対する反応性に対して５％以下であり、好ましくは２．５％以下であり、より好ましくは１％以下である。また、Ｄ−キヌレニンに対する反応性がＬ−キヌレニンに対する反応性に対して２０％以下であり、より好ましくは１５％以下であり、さらに好ましくは６％以下である。
【００２１】
（ｇ）分子量
本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼを構成するポリペプチド部分の分子量は、好ましくは４０〜６０ｋＤａであり、より好ましくは４５〜５５ｋＤａであり、さらに好ましくは５０〜５２ｋＤａである。
【００２２】
「ポリペプチド部分」とは、実質的に糖鎖が結合していない状態のキヌレニンモノオキシゲナーゼを意味する。ポリペプチド部分の分子量は、クローニングされたキヌレニンモノオキシゲナーゼのアミノ酸配列から計算により求めることができる。クローニングされていないキヌレニンモノオキシゲナーゼであって、微生物によって生産された本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼが糖鎖結合型である場合は、それを熱処理や糖加水分解酵素によって処理することにより、糖鎖を除去した状態（すなわち、「ポリペプチド部分」）にし、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で分子量を測定することができる。実質的に糖鎖が結合していない状態とは、熱処理や糖加水分解酵素によって処理された糖鎖結合型キヌレニンモノオキシゲナーゼに不可避的に残存する糖鎖の存在を許容する。よって、キヌレニンモノオキシゲナーゼが本来的に糖鎖結合型でない場合は、それ自体が「ポリペプチド部分」に相当する。
【００２３】
糖鎖結合型キヌレニンモノオキシゲナーゼから糖鎖を除去する手段は、特に制限されないが、例えば、糖鎖結合型のキヌレニンモノオキシゲナーゼを１００℃で１０分間加熱処理をして変性させた後、Ｎ−グリコシダーゼＦ（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）を用いて３７℃で６時間処理することにより実施することができる。
【００２４】
本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼに糖鎖が結合している場合、その分子量は、キヌレニンモノオキシゲナーゼ活性、基質特異性、及びＬ−キヌレニンに対する親和性などにネガティブに影響しない限り特に制限されない。例えば、糖鎖が結合した状態の本発明キヌレニンの分子量は、５０〜９０ｋＤａであることが好ましい。糖鎖結合型のキヌレニンモノオキシゲナーゼは、酵素をより安定にするという観点及び水溶性を高めるという観点から好ましい。
【００２５】
（ｈ）補酵素
本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼは好ましくは、フラビンを補酵素とする、フラビン結合型の酵素である。
【００２６】
その他、本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼの酵素特性としては、至適ｐＨ、至適温度も挙げられる。概ね以下の範囲内であるが、本発明においては、本範囲に制限されないものとする。
【００２７】
・至適ｐＨ
本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼの至適ｐＨは、ｐＨ６．２〜８．８の範囲内である。本明細書において、至適ｐＨは、酵素終濃度を０．０５Ｕ／ｍＬとし、複数のｐＨを示す緩衝液（酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０〜５．０）、クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０〜６．０）、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０〜８．０）、ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．０〜９．０）又はグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．５〜９．５））を用いて、後述の活性測定法２で酵素活性を測定することで求める。各緩衝液中で測定した内の一番高い活性値を１００％とした場合に、９０％以上の活性値を示すｐＨ範囲を至適ｐＨとする。
【００２８】
・至適温度
本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼの至適温度は、３５〜４５℃の範囲内である。本明細書において、至適温度は、酵素終濃度０．２５Ｕ／ｍＬとし、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中における各温度での酵素活性を前述の活性測定法１で測定、比較することにより求める。
【００２９】
１−２．キヌレニンモノオキシゲナーゼのポリペプチド
本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼは、上記（ａ）〜（ｈ）の特性を示すポリペプチドであるか、及び／又は、下記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれかのポリペプチドであれば、特に制限されない。
（Ｉ）配列番号６〜９によって示されるいずれか１つのアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ＩＩ）配列番号６〜９によって示されるいずれか１つのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が残基の置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位したアミノ酸配列からなり、キヌレニンモノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチド；
（ＩＩＩ）配列番号６〜９に示されるいずれか１つのアミノ酸配列と相同性を有するアミノ酸配列からなり、キヌレニンモノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチド。
【００３０】
「数個」とは、キヌレニンモノオキシゲナーゼ活性が維持される限り制限されないが、例えば、全アミノ酸数の１０％未満の個数であり、より好ましくは５％未満の個数、更に好ましくは２％未満の個数である。例えば、好ましくは多くとも４５個、４０個、３０個、２０個、１０個又は５個と例示できる。
【００３１】
アミノ酸の置換の種類は、特に制限されないが、キヌレニンモノオキシゲナーゼの表現型に顕著な影響を与えないという観点から保存的アミノ酸置換が好ましい。また、一又は数個の変異は、位置指定突然変異導入法やランダム突然変異導入法など公知の手法を利用して、後述する本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼをコードするＤＮＡに変異を導入することによって実施することが可能である。
【００３２】
キヌレニンモノオキシゲナーゼの活性を維持するという観点からは、キヌレニンモノオキシゲナーゼの活性部位又は基質結合部位に影響を与えない程度に、機能性を付与するような配列の付加や、Ｎ末端、Ｃ末端又は、任意の配列の内、少なくとも１つを削除してもよい。なお、これらの処理によって、（ｇ）で示す分子量の範囲を逸脱する場合、付加又は削除前の分子量が（ｇ）の範囲であるのなら、本発明の「ポリペプチド部分」と同等とみなすことができる。
【００３３】
「相同性を有するアミノ酸配列」とは、類似性が好ましくは少なくとも９０％又は９５％、より好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％のアミノ酸配列であること、又は同一性が好ましくは少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９８％又は９９％のアミノ酸配列であることを意味する。
【００３４】
類似性は、表１のスコア表（ＧＥＮＥＴＹＸ（登録商標）の説明書  ｐ．２２０  Ａ．１８  ホモロジースコア表  Ａ．１８．２  アミノ酸、参考文献：Atlas of Protein Sequence and Structure Vol.5 (1978)）を用いて、アライメント時にスコアが０以上になる文字数÷アライメント長で算出された値である。配列解析ソフトである、ＧＥＮＥＴＹＸ（（登録商標）、株式会社ゼネティックス製）を用いて算出できる。詳細には、該ソフトを初期設定で使用し、アミノ酸配列同士のホモロジー解析を行い、Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙとして算出される。
同一性は、ＧＥＮＥＴＹＸを初期設定で使用し、アミノ酸配列同士のホモロジー解析により算出されたｉｄｅｎｔｉｔｙの値に基づく。
【００３５】
【表１】
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【００３６】
２．キヌレニンモノオキシゲナーゼの取得方法
２−１．キヌレニンモノオキシゲナーゼをコードするＤＮＡ
本発明のＤＮＡは、上記（ａ）〜（ｈ）の特性を示すポリペプチドをコードするＤＮＡであるか、及び／又は、下記の（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかのＤＮＡである。
（Ａ）前記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；
（Ｂ）配列番号２〜５に示される塩基配列からなるＤＮＡ；
（Ｃ）配列番号２〜５に示される塩基配列との同一性が７０％以上である塩基配列からなり、かつキヌレニンモノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（Ｄ）配列番号２〜５に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを含み、かつキヌレニンモノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（Ｅ）配列番号２〜５に示される塩基配列において、１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位されている塩基配列であり、かつキヌレニンモノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【００３７】
本明細書のキヌレニンモノオキシゲナーゼ活性を有する酵素をコードするＤＮＡは、そのアミノ酸配列に対応する塩基配列を有するＤＮＡのことをいう。したがって、コドンの縮重によって相違するＤＮＡも含まれる。本発明のＤＮＡがコードするアミノ酸配列を有するタンパク質は、キヌレニンモノオキシゲナーゼ活性を有する。本発明のＤＮＡは、配列番号２〜５に示される塩基配列との同一性が７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、よりさらに好ましくは９８％以上である塩基配列を有する。
【００３８】
塩基配列の同一性は、ＧＥＮＥＴＹＸの塩基配列同士のホモロジー解析により算出されたｉｄｅｎｔｉｔｙの値に基づく。
【００３９】
本発明のＤＮＡは、それがコードするタンパク質が前記キヌレニンモノオキシゲナーゼ活性を有する限り、配列番号２〜５に示される塩基配列のいずれかに相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであってもよい。ここで「ストリンジェントな条件下でのハイブリダイズ」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。
【００４０】
具体的な条件としては、例えば、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸、ｐＨ７．２）、５×デンハート（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’s）溶液、０．１％  ＳＤＳ、１０％  デキストラン硫酸及び１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡの溶液を４２℃インキュベーションした後、バックグラウンド除去のために、０．２×ＳＳＣ中４２℃で洗浄する条件を例示することができる。
【００４１】
前記（Ｅ）のＤＮＡに関し、「数個」とは前記「１−２．キヌレニンモノオキシゲナーゼのポリペプチド」の項に記載したものと同義である。
【００４２】
本発明のＤＮＡは、配列番号２〜５の配列情報を基に、標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法などにより取得することができるが、化学的ＤＮＡ合成法によっても取得することができる。
【００４３】
標準的な遺伝子工学的手法としては、具体的には、スクリーニングによりキヌレニンモノオキシゲナーゼを産生していると思われる適当な起源微生物を選定した後、それら起源微生物の染色体ＤＮＡを抽出し、本発明のＤＮＡ配列（例えば、配列番号２〜５の塩基配列）に特有の適当なプライマーを使用し、ＰＣＲなどにより目的のＤＮＡを取得する手法を指す。
【００４４】
なお、増幅させたＤＮＡ断片の単離精製は、例えばゲル電気泳動法や市販の精製キットを用いることで可能である。
【００４５】
本発明のＤＮＡを使用することにより、本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼを容易に大量に、安定して製造することができる。
【００４６】
２−２．キヌレニンモノオキシゲナーゼ生産株の取得 
２−１で取得したＤＮＡを、公知の方法に従い、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、真菌（酵母、アスペルギルス属などの子嚢菌、担子菌等）、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞などに導入することで、生産株を取得することができる。本発明において、生産株については特に制限されないが、本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼは原核生物由来であるので、大腸菌の宿主／ベクター系で発現させるのが一般的である。
【００４７】
大腸菌の宿主／ベクター系としては、公知のpUC系、pBluescriptII、pET発現システム、pGEX発現システム、pCold発現システムなどが例示できる。また、必要に応じて、シャペロンやリゾチームなどの共発現を行うことも可能である。本発明においては、宿主としては、E.coli JM109、E.coli BL21(DE3)、ベクターとしては、pUC系又はpET系のプラスミドが好ましい。
【００４８】
なお、その他の宿主／ベクター系としては、宿主が酵母の場合は、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Candida utilis、Pichia pastoris等が例として挙げられ、ベクターとしてはpAUR101、pAUR224、pYES2等が挙げられる。宿主がカビである場合は、例えば、Aspergillus oryzae，Aspergillus niger等を例示することができる。
【００４９】
本発明のＤＮＡの宿主への導入手段は特に制限されないが、例えば、本発明のＤＮＡを含むベクターを、宿主細胞に導入し、本発明のＤＮＡが導入された形質転換体を得ることで、キヌレニンモノオキシゲナーゼの生産菌株を取得することができる。宿主細胞は、本発明のＤＮＡを発現してキヌレニンモノオキシゲナーゼを生産することが可能である限り、特に制限されない。具体的には、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、カビ、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができる。大腸菌の場合は、市販のコンピテントセルを使用することで容易に形質転換が可能である。
【００５０】
本発明の形質転換体は、本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼを産生する能力を有するため、それを用いて効率的に本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼを製造することが可能となる。
【００５１】
２−３．キヌレニンモノオキシゲナーゼの製造方法
本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼは、本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼの生産能を有する微生物や細胞を培養することによって製造することができる。培養に供される微生物や細胞は、本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼを産生する能力を有する限り特に制限されないが、例えば、前記アミノ酸配列６〜９をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号２〜５の塩基配列）を用いて形質転換した組換え大腸菌を好適に利用することができる。
【００５２】
培養法及び培養条件は、本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼが生産される限り特に限定されない。すなわち、キヌレニンモノオキシゲナーゼが生産されることを条件として、使用する微生物や細胞の生育に適合した方法及び条件を適宜設定できる。以下に、微生物の培養条件として、培地、培養温度、及び培養時間を例示する。
【００５３】
培地としては、通常の微生物培養用培地が使用でき、炭素源、窒素源、ビタミン類、無機物、その他使用する微生物が必要とする微量栄養素を程よく含有するものであれば、合成培地、天然培地のいずれも使用可能である。炭素源としては、グルコース、スクロース、ラクトース、デキストリン、澱粉、グリセリン、糖蜜などが使用できる。窒素源としては、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの無機塩類、ＤＬ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸などのアミノ酸類、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカーなどの窒素含有天然物が使用できる。ビタミン類としては、リボフラビン、ピリドキシン、ナイアシン（ニコチン酸）、チアミンなどが使用できる。無機物としては、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化第二鉄などが使用できる。さらに、タンパク質の発現の調整に必要な化合物、例えばイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）や乳糖等を適宜添加してもよい。
【００５４】
培養条件としては、キヌレニンモノオキシゲナーゼの生産に適した培養条件であれば特に限定されないが、培養温度は１０℃から４５℃、かつｐＨ５からｐＨ１０の範囲で行うのが好ましい。培養期間は回分培養であれば、１日から８日以内の範囲が好ましいが、流加培養や連続培養による生産量増大を行うのであれば、生産性が最適と判断される範囲で期間を延ばすことができる。また、培養法としては例えば振盪培養法、ジャー・ファーメンターによる好気的深部培養法が利用できる。
【００５５】
培養物中からキヌレニンモノオキシゲナーゼを得る方法は、通常のタンパク質の精製方法が使用できる。キヌレニンモノオキシゲナーゼが菌体内にある場合は、生産菌を培養後、培養液を遠心分離して培養微生物を得たのち、適当な方法で該培養微生物を破砕及び／又は溶菌処理し、処理液から遠心分離などによって上清液を得ることで、また、キヌレニンモノオキシゲナーゼが培地中に分泌されている場合は、生産菌を培養後、培養液を遠心分離して上清液を得ることで、それぞれ粗酵素液を取得することができる。
【００５６】
これらの粗酵素液に含まれるキヌレニンモノオキシゲナーゼは、限外ろ過、塩析、溶媒沈殿、熱処理、透析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水吸着クロマトグラフィー、ゲルろ過、アフィニティクロマトグラフィーなどの適当な精製操作を組み合わせることによって精製できる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
【００５７】
本酵素を組換えタンパク質として得る場合、種々の修飾が可能である。例えば、本酵素をコードするＤＮＡと他の適当なＤＮＡとを同じベクターに挿入し、当該ベクターを用いて組換えタンパク質の生産を行えば、任意のペプチドやタンパク質が連結された組換えタンパク質からなる本酵素を得ることができる。また、糖鎖及び／又は脂質の付加や、Ｎ末端やＣ末端のプロセッシングが生ずるような修飾を施してもよい。以上のような修飾により、組換えタンパク質の抽出、精製の簡便化及び／又は生物学的機能の付加等が可能である。
【００５８】
３．キヌレニンモノオキシゲナーゼを使用したキヌレニンの測定方法
本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼを用いたキヌレニンの測定方法は、当該技術分野において確立されている。よって、公知の方法に従い、本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼを用いて、各種試料中のキヌレニンの量又は濃度を測定することができる。本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼを、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ又はそれらの誘導体の存在下、Ｌ−キヌレニンと反応させることによって、ＮＡＤ（Ｐ）＋又はそれらの誘導体及び３−ヒドロキシキヌレニンが産生される。この反応における物質の増減をモニタすることにより、Ｌ−キヌレニンの量又は濃度を測定することができる。その態様は特に制限されないが、例えば、
（ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ又はそれらの誘導体の減少量、
（ｉｉ）ＮＡＤ（Ｐ）＋又はそれらの誘導体の増加量、
（ｉｉｉ）３−ヒドロキシキヌレニンの増加量、又は
（ｉｖ）Ｌ−キヌレニンの減少量
を測定することにより、キヌレニンの量又は濃度を測定することができる。
【００５９】
本発明における、キヌレニンの量又は濃度の測定は、試料に本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼを添加することにより実施することができる。キヌレニンを含有する試料は、特に制限されないが、例えば、体液（例えば、血液、尿、唾液等）、飲料、食品等を挙げることができる。
【００６０】
（ｉ）キヌレニンモノオキシゲナーゼ（ＫＭＯ）を触媒として、Ｌ−キヌレニンが酸化され、それに伴い、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ又はそれらの誘導体が減少する。このＮＡＤ（Ｐ）Ｈ又はそれらの誘導体の減少量を測定することにより、Ｌ−キヌレニンの測定を行うことができる。具体的には、Ｌ−キヌレニンを含む試料に対して、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ又はそれらの誘導体を含む緩衝液（ｐＨ５〜１０）を混合し、ＫＭＯを加えることによる、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの吸収極大波長（３４０ｎｍ）における吸光度の減少量を測定することによって行うことができる。又は、更にＮＡＤ（Ｐ）Ｈを高感度で測定する反応を組み合わせてもよく、例えば、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈに対しテトラゾリウム塩と電荷キャリアを混合し生成した物質の吸光度の減少量を測定するという手法、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈに対しレサズリンとジアホラーゼを混合し生成した物質の減少量を蛍光測定するという手法、又は化学発光や電気化学的検出が可能な試薬類と混合して測定するという手法があげられる。
【００６１】
（ｉｉ）キヌレニンモノオキシゲナーゼを触媒として、キヌレニンが酸化され、それに伴い、電子供与体であるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ又はそれらの誘導体よりＮＡＤ（Ｐ）＋又はＮＡＤ（Ｐ）＋誘導体が生成する。この増加量を測定することにより、キヌレニンの測定を行うことができる。具体的には、（ｉｉ−１）ＮＡＤ（Ｐ）＋又はＮＡＤ（Ｐ）＋誘導体に由来する蛍光測定、又は（ｉｉ−２）酵素サイクリング法で行うことができる。
【００６２】
（ｉｉ−１）ＮＡＤ（Ｐ）＋又はＮＡＤ（Ｐ）＋誘導体に由来する蛍光測定は、公知文献（Chem Commun (Camb). 2013, 49(98):11500-2）に記載の方法によって行うことができる。具体的には、ＮＡＤ（Ｐ）＋とアセトフェノン、２−アセチルベンゾフランなどを反応させ、生じた蛍光物質を蛍光で測定することができる（文献中の表２）。
（ｉｉ−２）酵素サイクリング法は、例えば、特許文献１の実施例４に記載の方法に準じて行うことができる。
【００６３】
（ｉｉｉ）キヌレニンモノオキシゲナーゼは、キヌレニンを酸化して３−ヒドロキシキヌレニンを生成する。この３−ヒドロキシキヌレニンの増加量を測定することにより、キヌレニンの測定を行うことができる。具体的には、例えば、特許文献１の実施例３に記載の方法に準じて行うことができる。
【００６４】
（ｉｖ）Ｌ−キヌレニンが酸化されることにより、３−ヒドロキシキヌレニンが生成し、基質であるＬ−キヌレニンの量が減少する。このＬ−キヌレニンの減少量を測定することにより、Ｌ−キヌレニンの測定を行うことができる。Ｌ−キヌレニンの減少量は、Ｌ−キヌレニンの蛍光を測定することによって行うことができる（臨床化学、1975、第３巻、第４号、426-434）。Ｌ−キヌレニンは３７０ｎｍで励起され、４９０ｎｍの蛍光を出す。一方、Ｌ−キヌレニンの代謝物である３−ヒドロキシキヌレニンは蛍光を発しないため蛍光の減少量からＬ−キヌレニン濃度を推定することができる。
【００６５】
Ｌ−キヌレニンの測定条件は、ｐＨ、温度、反応時間など用いられる試薬の安定性やキヌレニンモノオキシゲナーゼや併せて使用する酵素の至適反応条件、及び／又は想定される測定環境に応じて適宜設定することができる。例えば、本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼの安定性を鑑み、２０〜５０℃、好ましくは２５〜４５℃、更に好ましくは３０〜４０℃の温度で、ｐＨ５．０〜１０．０、好ましくはｐＨ６．０〜９．０の範囲内で、０．５分〜１時間、好ましくは１分間〜３０分間反応に付すことによって行うことができる。
【００６６】
生体試料の測定では、測定に支障となる可能性のある還元物質、夾雑蛋白質、金属イオン等の少なくとも１つを公知の方法で除去する前処理工程を含んでも良い。還元物質としては例えば、ビリルビン、尿酸や還元型アスコルビン酸等が挙げられる。例えば、ビリルビンの低減のための前処理工程としてビリルビンオキシダーゼによる処理が挙げられ、尿酸の低減のための前処理工程としてウリカーゼによる処理が挙げられ、又アスコルビン酸の低減のための前処理工程としてアスコルビン酸オキシダーゼによる処理等が挙げられる。さらに、過酸化水素やペルオキシダーゼによる処理も行うことができる。夾雑蛋白質は例えば、過塩素酸やトリクロロ酢酸等の除蛋白剤で低減することができる。金属イオンは、例えば、金属キレート剤で低減することができる。金属キレート剤は特に限定されないが、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ビシン（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン）、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミンペンタ酢酸）、ＣｙＤＴＡ（トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−四酢酸）等が好適に用いられる。
【００６７】
本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼは、トリプトファンに対するキヌレニンへの選択性が高いため、必ずしも必要ではないが、より正確な測定のために、任意で試料中の夾雑物の影響を実質的に除いてもよい。例えば、一般に生体試料中のＬ−トリプトファン濃度は、Ｌ−キヌレニン濃度の１０〜１００倍程度と考えられるため、Ｌ−トリプトファンのＬ−キヌレニン測定への影響を抑えることが好ましい。
【００６８】
Ｌ−トリプトファンの影響を低減する場合は、Ｌ−トリプトファンに作用する酵素を用いて、試料中のＬ−トリプトファンを低減する工程を含む、Ｌ−キヌレニンの測定方法が好ましい。該工程は、キヌレニンモノオキシゲナーゼによる反応に先立ち、前処理として行うのが好ましい。Ｌ−トリプトファン低減工程のため、Ｌ−トリプトファンに作用する酵素を使用することが好ましい。Ｌ−トリプトファンに作用する酵素は、Ｌ−キヌレニンに実質的に作用しない酵素が好ましく、トリプトファンオキシダーゼやトリプトファナーゼ等が例示できる。トリプトファンオキシダーゼはカタラーゼと組み合わせて使用するのが好ましい。
【００６９】
酵素使用量は、Ｌ−トリプトファン量を低減できれば特に限定されないが、トリプトファンオキシダーゼの場合、試料中の濃度が０．１〜１００Ｕ／ｍＬ程度であることが好ましく、１〜１０Ｕ／ｍＬ程度であることがより好ましい。トリプトファンオキシダーゼにカタラーゼを組み合わせる場合、試料中の濃度が０．１〜１０，０００Ｕ／ｍＬ程度であることが好ましく、１〜１，０００Ｕ／ｍＬ程度であることがより好ましい。トリプトファナーゼの場合、試料中の濃度が０．０１〜１０Ｕ／ｍＬ程度であることが好ましく、０．１〜２Ｕ／ｍＬ程度であることがより好ましい。
【００７０】
４．キヌレニン測定キット
本発明はまた、本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼを含む測定キットに関する。典型的には、キットの組成物は、本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼに加えて、緩衝液、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈ誘導体からなる群から選択される電子供与体を含む。好ましくは、少なくとも１回の測定に十分な量のキヌレニンモノオキシゲナーゼを含んでいればよいが、１試料当り０．００１から２００Ｕ程度が好ましく、０．０５から５０Ｕ程度がより好ましい。また、本発明のキヌレニン測定キットの組成物は、保存又はキヌレニンの測定に適した溶液（例えば、緩衝液）中に溶解した組成物の状態、又は凍結乾燥された状態（例えば、粉末状）であるのが望ましい。
【００７１】
本発明のキヌレニン測定キットは、キヌレニンの測定を行うための試薬として用いることができる。なお、ＮＡＤＨやＮＡＤＰＨはｐＨ８．０以下において分解されやすいことから、本キットの組成物を液体状態で保持する場合には、弱アルカリ性、例えばｐＨ８．５以上が好ましく、ｐＨ９．０以上であることがより好ましく、ｐＨ９．５以上であることが更に好ましい。また、緩衝液としては、ｐＨを弱アルカリ領域に調整できれば特に制限されないが、例えば、ＴＡＰＳ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸）、ＣＨＥＳ（２−シクロへキシルアミノエタンスルホン酸）、グリシン−ＮａＯＨ、炭酸−炭酸水素ナトリウムなどを用いることができる。
【００７２】
また、キヌレニンモノオキシゲナーゼ、緩衝液及び電子供与体以外の組成物として、例えば、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）若しくは卵白アルブミン、糖類（例えば、トレハロースなど）若しくは糖アルコール類（例えば、マルチトール、ソルビトール、グリセロールなど）、カルボキシル基含有化合物、アルカリ土類金属化合物、アンモニウム塩、硫酸塩、酵素と反応しないアミノ酸類、フラビン類又はタンパク質等から成る群より選ばれる安定化剤又は抗酸化剤等、当業者に公知の安定化成分を適宜含有させることで、該酵素や試薬成分の熱安定性や保存安定性を高めることができる。また、前記安定化剤やその他物質を、反応性、特異性、乾燥性及び／又は溶解性等を向上又は改善する目的で、前記試薬組成物に使用することもできる。
【実施例】
【００７３】
本発明を以下の実施例により説明するが、本発明は以下の実施例に限定されない。【００７４】
実施例１
キヌレニンモノオキシゲナーゼの取得
原核生物に対するスクリーニングにより、キヌレニンモノオキシゲナーゼを産生する種々の菌株を選定した。各菌株の染色体ＤＮＡを抽出し、該ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うなどして、キヌレニンモノオキシゲナーゼ（ＫＭＯ）活性を有すると思われる複数の遺伝子（配列番号２〜５のＤＮＡ配列）をそれぞれ取得した。なお、前記ＰＣＲには、本発明者らによって別途解明していたＫＭＯ配列を基に設計したプライマーを使用した。配列番号２はPseudoxanthomonas suwonensis（P.suwと略す）、配列番号３はMyxococcus stipitatus（M.stiと略す）、配列番号４はDyella japonica（D.japと略す）、配列番号５はRhodanobacter denitrificans（R.denと略す）由来のＤＮＡ配列である。なお、比較例として、特許文献１に従い、公知のPseudomonas fluorescence（P.fluと略す）由来のアミノ酸配列（配列番号１）をコードする遺伝子も取得した。各遺伝子をpET-21a(+)ベクターに挿入後、得られたベクターを各々大腸菌BL21(DE3）コンピテントセル（バイオダイナミクス研究所社製）に導入して、各組換え大腸菌を取得した。各組換え大腸菌をＬＢ培地で培養して得られた菌体を各々破砕後、遠心して得られた上清を硫安分画及びイオン交換クロマトグラフィーに供し、水溶性の各精製酵素を取得した。各精製酵素を電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供し、ほぼ単一バンドまで精製されたことを確認した。さらに、前述の活性測定法１で記載した、キヌレニンモノオキシゲナーゼ活性測定法により、いずれの精製酵素もキヌレニンモノオキシゲナーゼ活性を有することを確認した。【００７５】
その結果、P.suw、M.sti、D.jap及びR.den由来の４種の新規キヌレニンモノオキシゲナーゼの大腸菌組換え酵素、並びに特許文献１記載のP.flu由来のキヌレニンモノオキシゲナーゼの大腸菌組換え酵素を取得することができた（以下、それぞれP.suw由来ＫＭＯ、M.sti由来ＫＭＯ、D.jap由来ＫＭＯ及びR.den由来ＫＭＯ、並びにP.flu由来ＫＭＯとする）。なお、P.suw由来ＫＭＯは配列番号６、M.sti由来ＫＭＯは配列番号７、D.jap由来ＫＭＯは配列番号８及びR.den由来ＫＭＯは配列番号９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を有している。最終的に得られた新規ＫＭＯ溶液のタンパク濃度は、それぞれ７．４、６．３、６．０、及び１．７ｍｇ／ｍＬであった。また活性測定の際に、電子供与体にＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを使用した場合で比較すると、活性比（ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ）は、P.suw由来ＫＭＯは１．５、M.sti由来ＫＭＯは１．０、P.flu、D.jap及びR.den由来ＫＭＯは０．５であり、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを適宜選択できることが分かった。【００７６】
実施例２
キヌレニンモノオキシゲナーゼの特性評価１
（１）熱安定性
前記のP.suw由来ＫＭＯ、M.sti由来ＫＭＯ、D.jap由来ＫＭＯ及びR.den由来ＫＭＯ、並びにP.flu由来ＫＭＯを５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）存在下、４０℃で６０分間加熱し、前述の活性測定法１で記載した、キヌレニンモノオキシゲナーゼ活性測定法により加熱処理後の酵素溶液の残存活性を評価した。残存活性は４℃で６０分間静置した酵素の活性を１００％としたときの相対値として得た。結果は表２に示す通りであった。【００７７】
【表２】
2019142935.tif 000005
【００７８】
P.flu由来ＫＭＯは４０℃、１時間の加温により活性が大幅に減少したのに対し、本発明の新規ＫＭＯは全て、１時間後でも活性を保持していた。【００７９】
（２）基質特異性
各ＫＭＯの基質特異性を評価した。キヌレニンモノオキシゲナーゼ活性の測定を行うための試薬及び条件は、前述の活性測定法１で記載した通りである。【００８０】
このうち、基質のＬ−キヌレニンをそれぞれ、Ｌ−トリプトファン、Ｄ−キヌレニンに変えて測定した。Ｌ−キヌレニンの作用性を１００％としたときの、Ｌ−トリプトファン及びＤ−キヌレニンへの作用性は表３に示す通りであった。【００８１】
【表３】
2019142935.tif 000006
【００８２】
（３）分子量
各酵素の分子量を、配列番号６〜９に記載のアミノ酸配列のアミノ酸組成から算出した。本結果は表４に示す通りであった。【００８３】
【表４】
2019142935.tif 000007
【００８４】
（４）ｐＨ安定性（アルカリへの耐性）
タンパク濃度１ｍｇ／ｍＬの各ＫＭＯを、２００ｍＭグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０又はｐＨ９．５）の存在下、２５℃で３０分間処理した。３０分経過後に、１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で希釈しｐＨを中性に戻した。その後、前述の活性測定法１で記載した方法でキヌレニンモノオキシゲナーゼ活性を測定した。残存活性は処理開始時の酵素の活性を１００％とした場合の相対値として得た。結果は表５に示す通りであった。【００８５】
【表５】
2019142935.tif 000008
【００８６】
以上より、本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼは、いずれも、ｐＨ９．０又はｐＨ９．５という、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類を安定に保持することが可能なアルカリ条件下において、公知のP.flu由来のキヌレニンモノオキシゲナーゼよりも高い安定性を有することが明らかになった。【００８７】
（５）補酵素
各ＫＭＯに対し分光光度計による２００−７００ｎｍにおける吸収スペクトルを測定した。その結果、ＦＡＤに由来する特徴的なスペクトルが得られたこと、及び配列番号６〜９に記載のアミノ酸配列がいずれもＦＡＤ酵素のコンセンサス配列であるＧＸＧＸＸＧを含んでいることから、本発明のＫＭＯはいずれもＦＡＤが補酵素であると判断した（Ｇはグリシン、Ｘは任意のアミノ酸を指す）。【００８８】
実施例３
ＫＭＯを使用したＬ−キヌレニン濃度の測定
Ｌ−キヌレニンを含む試料に対して、ＫＭＯを作用させ、ＮＡＤＰＨの減少量（３４０ｎｍの吸光度の減少量）から試料中のＬ−キヌレニン濃度を測定した。１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）０．６ｍＬ、３ｍＭ  ＮＡＤＰＨ溶液０．１ｍＬ、Ｌ−キヌレニン溶液０．３ｍＬ、超純水１．９５ｍＬを光路長１ｃｍの石英セル中で混合した。このとき、添加するＬ−キヌレニン溶液の濃度を５０μＭ、１００μＭ、１５０μＭ、２００μＭにし、またＬ−キヌレニンの代わりに超純水を加えたサンプルも用意した。３７℃で１０分間加温後、３４０ｎｍの吸光度を測定しブランク値とした。３Ｕ／ｍＬのＫＭＯ酵素又は超純水０．０５ｍＬを添加し、１分後の３４０ｎｍの吸光度を測定し、得られた値から対応するブランク値を差し引いた（測定値Ａ）。Ｌ−キヌレニンを含まない試料の測定値Ａから、各Ｌ−キヌレニン濃度の測定値Ａを差し引いた（測定値Ｂ）。Ｘ軸にＬ−キヌレニン（L-Kyn）濃度、Ｙ軸に測定値Ｂ（ΔＡｂｓ３４０）をプロットして検量線を作成した。【００８９】
その結果、図１に示すように、比較例のP.flu由来ＫＭＯを使用した場合に比べて、本発明のＫＭＯを使用した場合には、いずれも傾きが高くなっていた（参考にΔＡｂｓ３４０の数値データを表６に示す）。なお、P.flu由来ＫＭＯに関しては、図１又は表６には示していないが、活性として２倍量のＫＭＯを使用することで、本発明のＫＭＯと同じような結果が得られた。すなわち、従来のＫＭＯが反応中に失活していたのに対し、本発明のＫＭＯは熱安定性が高いために失活しないことによって、反応性が約２倍になっており、本発明のＫＭＯを使用することで、従来のＫＭＯに比べてより少ない酵素量での測定が可能になることが分かった。【００９０】
【表６】
2019142935.tif 000009
【００９１】
実施例４
キヌレニン測定キットの調製
ＫＭＯ終濃度０．５Ｕ／ｍＬ、ＮＡＤＰＨ終濃度２５０μＭ、５０ｍＭ  グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０）からなる溶液を調製することで、キヌレニン測定キットを取得した。本キットに対し、測定用の緩衝液及び試料を混合し、３７℃で反応させた結果、反応液中の３４０ｎｍの吸光度変化が認められ、試料中のキヌレニン濃度の測定が可能であることが分かった。
また、本溶液を凍結乾燥することで、乾燥物としてキヌレニン測定キットを取得することができた。【００９２】
実施例５
キヌレニンモノオキシゲナーゼの特性評価２
実施例１で取得したキヌレニンモノオキシゲナーゼについて、酵素の至適温度及び至適ｐＨを測定した。【００９３】
至適温度は、酵素終濃度０．２５Ｕ／ｍＬとし、前述の活性測定法１に記載のキヌレニンモノオキシゲナーゼ活性測定法により測定、比較し、求めることとした。測定温度を種々変化させて、活性値が最も高い温度を至適温度とした。P.flu 由来ＫＭＯは、２５、３０、３５及び４０℃で評価し、それ以外のＫＭＯは、２５、３７及び４５℃で評価した。その結果を表７に示す。至適温度は３５〜４５℃の範囲内であった。【００９４】
至適ｐＨは、マイクロプレートを用いて測定を行った。ｐＨの異なる１Ｍの緩衝液（酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０、４．５、５．０）、クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０、５．５、６．０）、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０、６．５、７．０、７．５、８．０）、ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．０、８．５、９．０）又はグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．５、９．０、９．５））を用いて８０ｍＭの各緩衝液を調製し、酵素反応液に使用した。マイクロプレートに、８０ｍＭの各ｐＨの緩衝液５０μＬと、１ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、０．８ｍＭ  Ｌ−キヌレニンからなる溶液５０μＬを混合した後に０．１Ｕ／ｍＬの酵素溶液１００μＬを混合し、２５℃で５分間反応させた。酵素反応により生じたヒドロキシキヌレニンを測定するため、反応液から５０μＬをサンプリングし、２００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、０．８ｍＭフェリシアン化カリウムからなる溶液５０μＬと混合した。速やかに発色するので、発色後直ちに４５０ｎｍの吸光度をプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ３８４、モレキュラーデバイス社製）にて測定した。２００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、０．８ｍＭ  フェリシアン化カリウムからなる溶液の４５０ｎｍの吸光度をブランクとし、その値を差し引いた値で活性の評価をした（「活性測定法２」とする）。なお、酵素反応液のｐＨをｐＨ計で測定し、その測定値を実際のｐＨとした。各酵素の測定において、一番高い活性値を１００％とした場合に、９０％以上の活性値を示すｐＨ範囲を至適ｐＨとした。本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼの至適ｐＨは６．２〜８．８の範囲内であり、それぞれの酵素の至適ｐＨは表７の通りであった。また、各酵素において一番高い活性値を示したｐＨも併せて示した。【００９５】
【表７】
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【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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