(57)【要約】  癌の予後を精度高く評価するための手法を提供する。患者由来の癌組織中又は患者由来の癌細胞を含む癌微小環境を再構成する組織中の癌細胞と間質細胞のそれぞれにおけるEMT関連分子の発現レベルを測定し、そのレベルに基づいて患者の予後を予測する方法。
2019203254.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者由来の癌組織中又は患者由来の癌細胞を含み癌微小環境が再現される組織中で癌細胞と間質細胞のそれぞれにおけるEMT関連分子の発現レベルを測定し、そのレベルに基づいて患者の予後を予測する方法。
【請求項２】
少なくとも間質細胞において、EMT関連分子の発現レベルが上昇している場合に、患者の予後が不良と予測する請求項１記載の方法。
【請求項３】
癌細胞と間質細胞の両方において、EMT関連分子の発現レベルが上昇している場合に、患者の予後が不良と予測する請求項２記載の方法。
【請求項４】
EMT関連分子がNOTCH3である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
癌患者の予後を予測する方法であって、
a. 患者由来の癌組織又は患者由来の癌細胞を含む癌微小環境を再構成する組織を用意すること、
b. 患者由来の癌組織中又は患者由来の癌細胞を含み癌微小環境が再現される組織中で癌細胞と間質細胞のそれぞれにおけるEMT関連分子の発現レベルを測定すること、及び
c. 癌細胞と間質細胞のそれぞれにおけるEMT関連分子の発現レベルに基づき、癌患者の予後が良好又は不良と予測すること
を含む前記方法。
【請求項６】
癌患者の予後の予測及び/又は治療の方法であって、
a. 患者由来の癌組織又は患者由来の癌細胞を含む癌微小環境を再構成する組織を用意すること、
b. 患者由来の癌組織中又は患者由来の癌細胞を含み癌微小環境が再現される組織中で癌細胞と間質細胞のそれぞれにおけるEMT関連分子の発現レベルを測定すること、
c. 癌細胞と間質細胞のそれぞれにおけるEMT関連分子の発現レベルに基づき、癌患者の予後が良好又は不良と予測すること、及び/又は
d. 癌細胞と間質細胞のそれぞれにおけるEMT関連分子の発現レベルに基づき、治療方法を選択して、治療を開始すること
を含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、上皮間葉転換関連分子を用いた癌評価法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子マーカーを用いた膵癌の予後予測法としては、以下の報告がある。主に癌細胞が発現する分子を指標とする方法と間質細胞が発現する分子を指標とする方法が報告されている。
1) 膵癌において発現する分子を対象とする評価
膵癌では、CA19-9，Span-1，CA50，CA242，Dupan-2, TAG-72, 尿中フコース等の糖鎖抗原の発現が亢進する。これらのマーカーは、膵癌の検出には一定の効果があるとされる(非特許文献１〜５)。しかしながら、これらのマーカーはヒト膵癌の治療の奏功性や抵抗性を予測する上で有用か否かは明確では無い。
2) 間質において発現する分子を対象とする評価
膵癌間質において発現する分子群を対象とする検討が行われているが、癌の治療抵抗性に正に働くか、負に働くか議論が分かれており、一定の解には至っていない（膵癌について：非特許文献６〜８、他の癌について：非特許文献９〜１４）。
（膵癌間質, IRAK4） Cancer Res. 2018 Jan 23. pii: canres.1366.2017
Tumor-stroma IL-1β-IRAK4 feedforward circuitry drives tumor fibrosis, chemoresistance, and poor prognosis in pancreatic cancer.（非特許文献６）
Zhang D, Li L, Jiang H, Li Q, Wang-Gillam A, Yu J, Head R, Liu J, Ruzinova MB, Lim KH. 
（膵癌間質, TGBbeta） Cancer Res. 2017 Dec 19. pii: canres.2320.2017.
Inactivation of cancer-associated-fibroblasts (CAF) disrupts oncogenic signaling in pancreatic cancer cells and promotes its regression.
Dauer P, Zhao X, Gupta VK, Sharma NS, Kesh K, Gnamlin P, Dudeja V, Vickers SM, Banerjee S, Saluja A. （非特許文献７）
（膵癌間質, ヒアルロン酸） Cancer Cell. 2012 Mar 20;21(3):418-29. doi: 10.1016/j.ccr.2012.01.007.
Enzymatic targeting of the stroma ablates physical barriers to treatment of pancreatic ductal adenocarcinoma.
Provenzano PP, Cuevas C, Chang AE, Goel VK, Von Hoff DD, Hingorani SR. （非特許文献８）
（乳癌, TGFbeta, SDF1）Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Nov 16;107(46):20009-14. Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts.
Kojima Y, et al. （非特許文献９）
（乳癌, YAP）Nat Cell Biol. 2013 Jun;15(6):637-46. Mechanotransduction and YAP-dependent matrix remodelling is required for the generation and maintenance of cancer-associated fibroblasts.
Calvo F, et al. （非特許文献１０）
（乳癌, MMP11）Cell Oncol (Dordr). 2018 Mar 1. doi: 10.1007/s13402-018-0371-y. Cancer-associated fibroblasts affect breast cancer cell gene expression, invasion and angiogenesis.
Eiro N, et al. （非特許文献１１）
（大腸癌、卵巣癌、肺癌、胃癌）Br J Cancer. 2018 Feb 6;118(3):435-440. A core matrisome gene signature predicts cancer outcome.
Yuzhalin AE, et al. （非特許文献１２）
（大腸癌, IL-6）Br J Cancer. 2014 Jan 21;110(2):469-78. Interleukin-6 released by colon cancer-associated fibroblasts is critical for tumour angiogenesis: anti-interleukin-6 receptor antibody suppressed angiogenesis and inhibited tumour-stroma interaction.
Nagasaki T, et al. （非特許文献１３）
（大腸癌, IL-6）Int J Cancer. 2016 Apr 15;138(8):1971-81. CD90(+) stromal cells are the major source of IL-6, which supports cancer stem-like cells and inflammation in colorectal cancer.
Huynh PT, et al. （非特許文献１４）
3) 膵癌特異的な遺伝子変異を対象とする評価
膵癌の進展に関与する遺伝子群（K-ras変異, TP53変異）を対象とする検討が行われているが、膵癌の術後治療の予後予測での有用性は示されていない（非特許文献１５、１６）。【０００３】
特許文献では、以下のような分子マーカーを用いた膵癌の評価法が示されている。
特許第6062103号（特許文献１）(S100P発現)：膵管内乳頭粘液性腫瘍（IPMN）か否かを判別するための手法であり、上皮間葉転換などの細胞間相互作用に関わる分子の評価では無い。再発癌の評価における有用性も明らかとなっていない。
特許第5931874号（特許文献２）(細胞外マトリクス分解酵素群の発現)：膵癌の有無の可能性について試験するための方法である。また、治療の奏功を調べるための手法であるが、予後予測法ではない。また、上皮間葉転換などの細胞間相互作用に関わる分子の評価では無い。再発癌の評価における有用性も明らかとなっていない。
特許第5773315号（特許文献３）(CXCL4L1)、特開2017-158545（特許文献４）(microRNA)、特開2017-108686（特許文献５）(AMAP1, EPB41L5) 等：いずれも癌細胞と間質の相互作用による影響を考慮した手法ではない。再発癌の評価における有用性も明らかとなっていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ni XG, Bai XF, Mao YL, Shao YF, Wu JX, Shan Y, Wang CF, Wang J, Tian YT, Liu Q, Xu DK, Zhao P. The clinical value of serum CEA, CA19-9, and CA242 in the diagnosis and prognosis of pancreatic cancer. Eur J Surg Oncol, 31, 164─169, 2005.
【非特許文献２】Nakao A, Oshima K, Nomoto S, Takeda S, Kaneko T, Ichihara T, Kurokawa T, Nonami T, Takagi H. Clinical usefulness of CA19-9 in pancreatic carcinoma. Semin Surg Oncol, 15, 15-22, 1998.
【非特許文献３】Safi F, Schlosser W, Falkenreck S, Beger HG. Prognostic value of CA19-9 serum course in pancreatic cancer. Hepatogastroenterology, 45, 253-259, 1998.
【非特許文献４】Montgomery RC, Hoffman JP, Riley LB, Rogatko A, Ridge JA, Eisenberg BL. Prediction of recurrence and survival by post-resection CA19-9 values in patients with adenocarcinoma of the pancreas. Ann Surg Oncol, 4, 551-556, 1997.
【非特許文献５】Ferrone CR, Finkelstein DM, Thayer SP, Muzikansky A, Fernandez-delCastillo C, Warshaw AL. Perioperative CA19-9 levels can predict stage and survival in patients with resectable pancreatic adenocarcinoma. J Clin Oncol, 24, 2897-2902, 2006.
【非特許文献６】Cancer Res. 2018 Jan 23. pii: canres.1366.2017Tumor-stroma IL-1β-IRAK4 feedforward circuitry drives tumor fibrosis, chemoresistance, and poor prognosis in pancreatic cancer.
【非特許文献７】Cancer Res. 2017 Dec 19. pii: canres.2320.2017.Inactivation of cancer-associated-fibroblasts (CAF) disrupts oncogenic signaling in pancreatic cancer cells and promotes its regression.Dauer P, Zhao X, Gupta VK, Sharma NS, Kesh K, Gnamlin P, Dudeja V, Vickers SM, Banerjee S, Saluja A.
【非特許文献８】Cancer Cell. 2012 Mar 20;21(3):418-29. doi: 10.1016/j.ccr.2012.01.007.Enzymatic targeting of the stroma ablates physical barriers to treatment of pancreatic ductal adenocarcinoma.Provenzano PP, Cuevas C, Chang AE, Goel VK, Von Hoff DD, Hingorani SR.
【非特許文献９】Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Nov 16;107(46):20009-14. Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts.Kojima Y, et al.
【非特許文献１０】Nat Cell Biol. 2013 Jun;15(6):637-46. Mechanotransduction and YAP-dependent matrix remodelling is required for the generation and maintenance of cancer-associated fibroblasts.Calvo F, et al.
【非特許文献１１】Cell Oncol (Dordr). 2018 Mar 1. doi: 10.1007/s13402-018-0371-y. Cancer-associated fibroblasts affect breast cancer cell gene expression, invasion and angiogenesis.Eiro N, et al.
【非特許文献１２】Br J Cancer. 2018 Feb 6;118(3):435-440. A core matrisome gene signature predicts cancer outcome.Yuzhalin AE, et al.
【非特許文献１３】Br J Cancer. 2014 Jan 21;110(2):469-78. Interleukin-6 released by colon cancer-associated fibroblasts is critical for tumour angiogenesis: anti-interleukin-6 receptor antibody suppressed angiogenesis and inhibited tumour-stroma interaction.Nagasaki T, et al.
【非特許文献１４】Int J Cancer. 2016 Apr 15;138(8):1971-81. CD90(+) stromal cells are the major source of IL-6, which supports cancer stem-like cells and inflammation in colorectal cancer.Huynh PT, et al.
【非特許文献１５】Pancreas. 2013 Mar;42(2):216-22., Genetic alterations of K-ras, p53, c-erbB-2, and DPC4 in pancreatic ductal adenocarcinoma and their correlation with patient survival. Shin SH, Kim SC, Hong SM, Kim YH, Song KB, Park KM, Lee YJ.
【非特許文献１６】Int J Gastrointest Cancer. 2006;37(4):139-45. The association between selected risk factors for pancreatic cancer and the expression of p53 and K-ras codon 12 mutations. Fryzek JP, Garabrant DH, Schenk M, Kinnard M, Greenson JK, Sarkar FH.
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第6062103号
【特許文献２】特許第5931874号
【特許文献３】特許第5773315号
【特許文献４】特開2017-158545
【特許文献５】特開2017-108686
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
癌は個性を持つとされ、患者毎に薬剤感受性が異なる。それぞれの患者に有効な抗癌剤を選択するための指標が必要であるものの、有効な手法が確立されていない。例えば、膵癌は代表的な難治癌であり、既存の抗癌剤に対して高い治療抵抗性を示す。膵癌の化学療法ではゲムシタビンやTS-1といった薬剤が広く用いられており、これらの薬剤を用いた治療が標準治療として採用されている。しかしながら、これらの薬剤の感受性は患者毎に異なることが明らかとなっている。患者毎に有効な薬剤を選択する必要があるものの、客観的な選択基準が確立されていない課題がある。あるいは、各患者で治療効果の低い薬剤を使用し続けることは患者のQOLの低下につながることがある。これらのことから、薬剤感受性を予測するための客観的指標を確立することが重要である。【０００７】
癌の治療抵抗性では癌微小環境が重要な役割を担っている。癌は、癌細胞、間質細胞（間葉系細胞、血管内皮細胞、免疫担当細胞など）およびこれらの細胞から産生される細胞外マトリクスから構成され、それぞれの癌で特徴的な構造が形成される。癌を構成する細胞の間では、様々なレベルの細胞間相互作用が生じ、癌に特有な微小環境が形成されると考えられている。本発明者らは、膵癌細胞と間質細胞（間葉系細胞、血管内皮細胞）を三次元的に共培養し、間質を伴うヒト膵癌組織（膵癌オルガノイド）を再構成する手法を確立した。この手法により作製された膵癌オルガノイド内あるいは、オルガノイドから形成される移植組織体（ゼノグラフト）内では癌の微小環境が再現され、膵癌細胞の薬剤抵抗性が亢進することが確認されている。発明者らは、膵癌患者から分離したプライマリ膵癌細胞、間葉系細胞を用いてプライマリ膵癌オルガノイドを再構成することができることを明らかにしており、膵癌オルガノイドの薬剤抵抗性が患者の治療抵抗性と相関することを見いだしている。膵癌オルガノイド内で癌細胞と間質細胞の細胞間相互作用に関わる分子の中には、癌細胞の治療抵抗性に直接的に関与する分子が含まれると考えられる。従って、膵癌オルガノイド内で癌の治療抵抗性に関与する分子を同定し、この分子を用いて癌の評価を行うことにより、従来よりも高い精度で癌の予後予測を実施することができると考えられる。【０００８】
本発明は、癌の予後を精度高く評価するための手法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、癌の薬剤耐性を惹起する上皮間葉転換に着目し、上皮間葉転換関連分子の発現を癌細胞と間質細胞の双方で評価することにより、癌の予後を精度高く評価するための手法である。【００１０】
癌の治療抵抗性には、癌細胞と間質細胞の相互作用が深く関わる。多くの癌において、膵癌細胞が間質（癌関連繊維芽細胞、血管内皮細胞、細胞外マトリクス）からのシグナルを受け、上皮細胞から間葉系細胞への特性変化（上皮間葉転換 (Epithelial Mesenchymal Transition: EMT)）が進行すると、Partial EMTと呼ばれる状態に移行することが確認されている。上皮間葉転換の進行は膵癌細胞の薬剤抵抗性を亢進させるはたらきがあることが確認されている。上皮間葉転換関連分子は癌の治療標的となるのみならず、予後予測マーカーに有益と考えられる。しかしながら、予後予測に有益な上皮間葉転換関連分子は同定されていない。【００１１】
上皮間葉転換が進行する上では、癌細胞と間質細胞との相互作用が重要である。本発明者らはこれまでに、豊富な間質を伴うヒト膵癌組織の再現法を開発し、癌オルガノイドを用いて上皮間葉転換を再現出来ることを確認している。また、癌オルガノイドを対象とする薬剤評価を実施し、薬剤感受性に関与する上皮間葉転換関連分子の抽出系を確立した。この手法を用いて同定されたNOTCH3はヒト膵癌の薬剤感受性と相関し、さらに、予後予測に有益であることを明らかにした。【００１２】
以上の様に、プライマリ癌オルガノイドを用いて候補マーカーの発現と薬剤評価を行う手法は、抗癌剤感受性に関与するマーカー分子の絞り込みを可能とする。同手法は、癌の予後予測の評価に有用であることを明らかにした。【００１３】
本発明は、これらの知見に基づいて、完成された。【００１４】
本発明の要旨は以下の通りである。
（１）患者由来の癌組織中又は患者由来の癌細胞を含む癌微小環境を再構成する組織中の癌細胞と間質細胞のそれぞれにおけるEMT関連分子の発現レベルを測定し、そのレベルに基づいて患者の予後を予測する方法。
（２）少なくとも間質細胞において、EMT関連分子の発現レベルが上昇している場合に、患者の予後が不良と予測する（１）記載の方法。
（３）癌細胞と間質細胞の両方において、EMT関連分子の発現レベルが上昇している場合に、患者の予後が不良と予測する（２）記載の方法。
（４）EMT関連分子がNOTCH3である（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）癌患者の予後を予測する方法であって、
a. 患者由来の癌組織又は患者由来の癌細胞を含み癌微小環境が再構成する組織を用意すること、
b. 患者由来の癌組織中又は患者由来の癌細胞を含む癌微小環境を再構成する組織中の癌細胞と間質細胞のそれぞれにおけるEMT関連分子の発現レベルを測定すること、及び
c. 癌細胞と間質細胞のそれぞれにおけるEMT関連分子の発現レベルに基づき、癌患者の予後が良好又は不良と予測すること
を含む前記方法。
（６）癌患者の予後の予測及び/又は治療の方法であって、
a. 患者由来の癌組織又は患者由来の癌細胞を含む癌微小環境を再構成する組織を用意すること、
b. 患者由来の癌組織中又は患者由来の癌細胞を含む癌微小環境を再構成する組織中の癌細胞と間質細胞のそれぞれにおけるEMT関連分子の発現レベルを測定すること、
c. 癌細胞と間質細胞のそれぞれにおけるEMT関連分子の発現レベルに基づき、癌患者の予後が良好又は不良と予測すること、及び/又は
d. 癌細胞と間質細胞のそれぞれにおけるEMT関連分子の発現レベルに基づき、治療方法を選択して、治療を開始すること
を含む前記方法。【００１５】
これまでに、分子発現に基づき膵癌の治療抵抗性を評価する試みが複数行われているが、臨床において有効な分子の同定には至っていない。その理由は、以下の通りである。
1)癌治療に有益な薬剤を選択する客観的な方法が確立されていない。
2)ヒト癌細胞の上皮間葉転換を再現する評価系が存在しておらず、上皮間葉転換に関与する機能分子の理解が不足している。
3)従来の評価指標は癌細胞のみ、あるいは、間質細胞のみで発現する分子に着目したものであり、癌微小環境の評価となっていない。【００１６】
本発明では膵癌細胞の薬剤感受性に関与することが明らかとなっている上皮間葉転換関連分子（例えばNOTCH3）について、その発現を癌細胞と間葉系細胞の双方で評価することにより、患者予後を評価する。この手法を用いることにより、ヒト膵癌組織内で生じている膵癌細胞と癌間質の相互作用を直接評価することが可能となる。そのため、従来よりも高い精度で、癌の特性（薬剤感受性など）を評価することが可能となる。【００１７】
本発明を用いることにより、1) 患者毎に治療効果の高い薬剤を選択するための手法の確立、2) 抗がん剤の投与症例の絞り込み（不要な抗癌剤投与の回避）の手法の確立が期待される。また、本評価法を薬剤評価に応用することにより、3) 治療効果の高い新規抗癌剤を効率良く同定することが可能になると考えられる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、癌患者の予後を精度高く評価することが可能となった。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2018‐80581の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】プライマリヒト膵癌オルガノイドを対象とした抗癌剤（ゲムシタビン）の薬剤感受性評価の結果を示す。
【図２】プライマリヒト膵癌オルガノイドの薬剤抵抗性に関与する分子の探索手法を示す。
【図３】プライマリ膵癌オルガオイドにおけるEMT関連分子の発現亢進を示す（Gene Set Enrichment Analysis (GSEA)解析）。
【図４】上皮間葉転換（EMT）を介する癌の治療抵抗性機構を示す。
【図５】膵癌オルガノイドから形成されたゼノグラフトにおけるEMTマーカーの検出結果を示す。
【図６】NOTCH3は間質豊富な膵癌オルガノイドで発現が亢進し、抗癌剤投与後のオルガノイドで発現が持続することを示す。図6Aにゲムシタビン投与前後での膵癌オルガノイド由来ゼノグラフト（Org）あるいは膵癌シスト由来ゼノグラフト（Cyst）でのNOTCH分子群の発現状態を示す。図6Bに免疫染色結果の定量結果を示す。サイトケラチン7(CK7)を発現する膵癌細胞におけるNOTCH分子群の発現結果を示す。図6Cでは膵癌細胞におけるNOTCH下流シグナルの発現解析結果を示す。図6Dに膵癌の原発巣と間質を有する膵癌オルガノイドでのNOTCH3の発現状態を示す。Smooth muscle actin(SMA)は間葉系細胞のマーカーとして使用した。図6Eは術後にゲムシタビン（GEM）あるいは、TS-1治療を行った患者の生存期間を示す。手術時の膵癌組織における癌細胞でのNOTCH3発現、および間質細胞でのNOTCH3発現に基づき生存数をプロットした。
【図７】抗癌剤投与後の膵癌組織におけるNOTCH3陽性細胞の特性評価の結果を示す。
【図８】膵癌オルガノイド由来ゼノグラフトを対象としたNOTCH3阻害剤と抗癌剤の併用治療の検討結果を示す。
【図９】再発膵癌に対するNOTCH3・ゲムシタビン併用治療効果の検討結果を示す。
【図１０】NOTCH3阻害剤治療後の膵癌組織における間質量の減少を示す。
【図１１】NOTCH3阻害剤治療後組織におけるEMT関連分子の発現を示す。
【図１２】膵癌オルガノイドにおける上皮間葉転換の亢進を示す。
【図１３】膵癌の抗癌剤投与過程におけるNOTCH3発現を示す。
【図１４】再発膵癌に対するNOTCH3・ゲムシタビン併用治療効果の検討結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２１】
本発明は、患者由来の癌組織中又は患者由来の癌細胞を含む癌微小環境を再構成する組織中の癌細胞と間質細胞のそれぞれにおけるEMT関連分子の発現レベルを測定し、そのレベルに基づいて患者の予後を予測する方法を提供する。
【００２２】
患者由来の組織は、癌患者から切除した組織であるとよい。
【００２３】
患者由来の癌細胞を含む癌微小環境を再構成する組織は、患者由来のプライマリ癌細胞、継代された癌細胞、株化された癌細胞などから作製された癌オルガノイド、癌オルガノイドから作製されたゼノグラフトなどを例示することができる。
【００２４】
本発明において、「癌オルガノイド」とは、癌細胞とその他の細胞から構成される細胞凝集体である。複数の細胞間での細胞間相互作用を再現することが可能である。癌オルガノイドは、癌微小環境を再現するものであるとよく、例えば、間質が豊富である。
【００２５】
癌オルガノイドの間質の豊富さを定量する手法はいくつかある。
a: 間葉系細胞のマーカー（α-SMA）を指標とした免疫染色による定量（図７参照）。原発巣（61%程度）に対して、後述の実施例で作製した膵癌オルガノイド（10:7:20）は59%程度であった。本発明の癌オルガノイドは、この定量方法により、1〜1000 ％であるとよく、好ましくは、10〜500％であり、より好ましくは、10〜300 ％である（免疫染色による陽性率）。
b: 間質内の細胞外マトリックス（膵癌の場合は、ヒアルロン酸・コラーゲンなど）の定量（コラーゲンについては、シリウス赤染色による定性解析、シリウス赤染色後の偏光顕微鏡像解析による定量解析が可能である（図８参照）。後述の実施例では、原発巣（74%程度）に対して、膵癌オルガノイド（10:7:20）は44%程度であった。本発明の癌オルガノイドは、この定量方法により、1〜1000％であるとよく、好ましくは、10〜500％であり、より好ましくは、10〜300％である。
c: 間質内にヒアルロン酸やコラーゲンが蓄積すると、組織の硬度が増加する。組織の硬さを指標として判断することも可能である。
【００２６】
多くの場合、癌組織は、癌細胞の他に間質と呼ばれる部分がある。間質には、線維芽細胞などの間葉系細胞の他、血管、リンパ管、神経などを構成する細胞（血液細胞、血管細胞、免疫細胞など）、炎症をつかさどる細胞（炎症細胞）などの多種類の細胞、これらの細胞の間に存在するコラーゲンなどからなる結合組織が存在して、特徴的な構造を形成している。これを癌微小環境と呼ぶ。
【００２７】
癌オルガノイドは、癌間質を含む癌微小環境を再現するとよい。癌オルガノイドは、癌微小環境の他、さらに、腺管構造を再現するとよい。腺管構造は、上皮性の特性を有する癌細胞によって形成されうる。
【００２８】
また、癌オルガノイドは、癌の治療抵抗性、浸潤・転移及び再発からなる群より選択される少なくとも１つを再現するとよい。癌の治療抵抗性としては、薬剤感受性、放射線感受性、免疫療法感受性、栄養療法感受性などを例示することができる。「癌の再発」とは、切除後に再び癌が現れること、抗がん剤治療、放射線治療、免疫療法、栄養療法、それらの組合せの治療で消滅した癌が再び現れること、あるいは縮小した癌が再び大きくなることをいい、治療した部位の近くで起こるだけでなく、別の場所に転移として見つかることも含む概念である。
【００２９】
癌の種類は、特に限定されるわけではなく、肝臓癌、腎臓癌、悪性脳腫瘍、膵臓癌、胃癌、肺癌などいかなるものであってもよい。後述の実施例では、膵癌オルガノイドを作製した。
【００３０】
癌オルガノイドは、例えば、癌細胞を間葉系細胞及び血管内皮細胞と共培養することにより作製することができる。培養は、三次元（3D）培養であるとよい。癌オルガノイドの再構成に適した3D培養技術は、Nature, 25;499(7459):481-4, 2013、Nat Protoc. 9(2):396-409, 2014、Cell Stem Cell, 7;16(5):556-65, 2015などで報告されている。また、培養容器としては、WO2014/196204などに開示されたもの、市販されているもの（例えば、クラレ社のElplasiaなど）などを用いるとよい。
【００３１】
癌細胞は、ヒト癌原発巣より分離した癌組織を用いて樹立したプライマリ癌細胞株や継代された細胞、株化された細胞であってもよい。癌の種類は、特に限定されるわけではなく、肝臓癌、腎臓癌、悪性脳腫瘍、膵臓癌、胃癌、肺癌などいかなるものであってもよい。癌は、主としてヒト由来のものを用いるが、ヒト以外の動物（例えば、実験動物、愛玩動物、使役動物、競走馬、闘犬などに利用される動物、具体的には、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、イヌ、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ニワトリなど）由来の癌細胞を用いてもよい。
【００３２】
本明細書において、「血管内皮細胞」とは、血管内皮を構成する細胞、又はそのような細胞に分化することのできる細胞をいう。ある細胞が血管内皮細胞であるかどうかは、マーカータンパク質、例えば、TIE2、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、CD41が発現しているかどうかを調べることにより確認できる（前記マーカータンパク質のいずれか一つあるいは複数が発現していれば血管内皮細胞であると判断できる。）。血管内皮細胞は、分化したものであっても、未分化なものであってもよい。血管内皮細胞が、分化した細胞であるかどうかは、CD31、CD144により、確認することができる。当業者間で使用されている用語のうち、endothelial cells、umbilical vein endothelial cells、endothelial progenitor cells、endothelial precursor cells、vasculogenic progenitors、hemangioblast（HJ. joo, et al. Blood. 25;118(8):2094-104.(2011)）などは本発明における血管内皮細胞に含まれる。好ましい血管内皮細胞は、臍帯静脈由来の血管内皮細胞である。血管内皮細胞は、血管から採取したり、あるいは、人工多能性幹細胞（iPS細胞）、胚性幹細胞（ES細胞）などの多能性幹細胞から公知の方法に従って作製することができる。血管内皮細胞は、主としてヒト由来のものを用いるが、ヒト以外の動物（例えば、実験動物、愛玩動物、使役動物、競走馬、闘犬などに利用される動物、具体的には、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、イヌ、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ニワトリなど）由来の血管内皮細胞を用いてもよい。
【００３３】
本明細書において、「間葉系細胞」とは、主として中胚葉に由来する結合織に存在し、組織で機能する細胞の支持構造を形成する結合織細胞であるが、間葉系細胞への分化運命が決定しているが、まだ間葉系細胞へ分化していない細胞も含む概念である。間葉系細胞は、分化したものであっても、未分化なものであってもよい。ある細胞が未分化間葉系細胞であるかどうかは、マーカータンパク質、例えば、Stro-1、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD133、CD271、Nestinが発現しているかどうかを調べることにより確認できる（前記マーカータンパク質のいずれか一つあるいは複数が発現していれば未分化間葉系細胞であると判断できる。）。また、前項のマーカーのいずれも発現していない間葉系細胞は分化間葉系細胞と判断できる。当業者間で使用されている用語のうち、mesenchymal stem cells、mesenchymal progenitor cells、mesenchymal cells（R. Peters, et al. PLoS One. 30;5(12):e15689.(2010)）などは本発明における間葉系細胞に含まれる。好ましい間葉系細胞は、骨髄由来の間葉系細胞（特に、間葉系幹細胞）である。間葉系細胞は、骨髄、脂肪組織、胎盤組織、臍帯組織、歯髄等の組織から採取したり、あるいは、人工多能性幹細胞（iPS細胞）、胚性幹細胞（ES細胞）などの多能性幹細胞から公知の方法に従って作製することができる。間葉系細胞は、主としてヒト由来のものを用いるが、ヒト以外の動物（例えば、実験動物、愛玩動物、使役動物、競走馬、闘犬などに利用される動物、具体的には、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、イヌ、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ニワトリなど）由来の間葉系細胞を用いてもよい。
【００３４】
共培養における三種類の細胞の培養比は癌オルガノイドが形成できる範囲内であれば特に限定されないが、好適な細胞の数比は、癌細胞：血管内皮細胞：間葉系細胞＝10：1〜100：1〜100であり、より好適には、癌細胞：血管内皮細胞：間葉系細胞＝10：1〜100：5〜100である。癌細胞20万個程度、血管内皮細胞14万個程度、間葉系細胞20万個程度を共培養して、大きさが10〜50000マイクロメートル程度（直径）の癌オルガノイドを形成させることができる。本発明に用いる場合、癌オルガノイドの大きさは、10〜30000マイクロメートル程度（直径）であるとよい。
【００３５】
培養の際に使用する培地は、癌オルガノイドが形成されるものであればどのようなものでもよいが、血管内皮細胞培養用の培地、癌細胞培養用の培地、前記２つの培地を混合したものなどを使用することが好ましい。血管内皮細胞培養用の培地はどのようなものを使用してもよいが、hEGF（組換えヒト上皮細胞成長因子）、VEGF（血管内皮細胞成長因子）、ヒドロコルチゾン、bFGF、アスコルビン酸、IGF1、FBS、Antibiotics(例えば、ゲンタマイシン、アンフォテリシンBなど)、Heparin、L-Glutamine、Phenolred、BBEの少なくとも１種を含むものを使用するのが好ましい。血管内皮細胞培養用の培地としては、EGM-2 BulletKit（Lonza社製）、EGM BulletKit（Lonza社製）、VascuLife EnGS Comp Kit（LCT社製）、Human Endothelial-SFM Medium（Thermo Fisher Scientific社製）、ヒト微小血管内皮細胞増殖培地（TOYOBO社製）などを用いることができる。癌細胞培養用の培地はどのようなものを使用してもよく、例えば、DMEM培地が挙げられる。膵癌オルガノイドの作製には、DMEM：EGM=1:1の培地が適していることが確認されている。
【００３６】
細胞の培養にあたっては、足場材料を用いる必要はないが、三種類の細胞の混合物を間葉系細胞が収縮可能なゲル状支持体上で培養するとよい。
【００３７】
間葉系細胞の収縮は、（顕微鏡、ないし肉眼で）形態学的に立体組織形成を認めることや、薬さじなどによる回収に伴い組織の形状が保たれる強度を有することを示すなど（Takebe et al. Nature, 499(7459), 481-484, 2013）のようにして確認することができる。
【００３８】
支持体は、適正な硬さ（例えば、ヤング率200kPa以下(マトリゲルをコートした形状が平坦なゲルの場合など)であるが、支持体の適正な硬さはコーティングと形状によって変化しうる。）を有するゲル状基材であるとよく、そのような基材としては、ハイドロゲル（例えば、アクリルアミドゲル、ゼラチン、マトリゲルなど）などを例示することができるが、それらに限定されることはない。なお、目的とする集合体の形・サイズ・量に応じて、支持体の硬さは均一である必然性はなく、硬さに空間的・時間的な勾配を設定することやパターン化することが可能である。支持体の硬さが均一である場合には、支持体の硬さは、好ましくは、100kPa以下、より好ましくは1〜50kPaである。ゲル状支持体は、平面であってもよいし、あるいは、ゲル状支持体の培養する側の断面がＵ又はＶ字の形状であるとよい。ゲル状支持体の培養する側の断面がＵ又はＶ字の形状であることにより、支持体の培養面に細胞が集まるようになり、より少ない数の細胞及び／又は組織で細胞集合体が形成されるので有利である。また、支持体に、化学的・物理的な修飾を施してもよい。修飾物質としては、マトリゲル、ラミニン、エンタクチン、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチンなどを例示することができる。
【００３９】
ゲル状培養支持体の硬さに空間的な勾配を設定した一例は、中心部の硬さが周辺部の硬さより固いゲル状培養支持体である。中心部の硬さは、200kPa以下が適正であり、周辺部の硬さは、中心部より柔らかければよいが、支持体の中心部と周辺部の適正な硬さはコーティングと形状によって変化しうる。ゲル状培養支持体の硬さに空間的な勾配を設定した別の一例は、周辺部の硬さが中心部の硬さより固いゲル状培養支持体である。
【００４０】
パターン化したゲル状培養支持体の一例は、中心部の硬さが周辺部の硬さより固いというパターンを１個以上有するゲル状培養支持体である。中心部の硬さは、200kPa以下が適正であり、周辺部の硬さは、中心部より柔らかければよいが、支持体の中心部と周辺部の適正な硬さはコーティングと形状によって変化しうる。パターン化したゲル状培養支持体の別の一例は、周辺部の硬さが中心部の硬さより固いというパターンを１個以上有するゲル状培養支持体である。周辺部の硬さは、200kPa以下が適正であり、中心部の硬さは、周辺部より柔らかければよいが、支持体の中心部と周辺部の適正な硬さはコーティングと形状によって変化しうる。
【００４１】
培養時の温度は特に限定されないが、30〜40℃とするのが好ましく、37℃とするのが更に好ましい。
【００４２】
培養期間は特に限定されないが、1〜60日とするのが好ましく、1〜7日とするのが更に好ましい。
【００４３】
本発明者らは、ヒト癌原発巣より分離した癌組織を用いてプライマリ癌細胞株を樹立し、このプライマリ癌細胞株を用いて、癌オルガノイドを作製することにも成功した。この方法は、タンパク質分解酵素及びRhoキナーゼ（ROCK）阻害剤の存在下で、癌組織を消化してから、癌細胞の凝集体を得ること、前記凝集体を継代した後、癌細胞を分離すること、前記癌細胞を間葉系細胞及び血管内皮細胞と共培養して、癌オルガノイドを形成させることを含む。タンパク質分解酵素及びRhoキナーゼ阻害剤とともに、デオキシリボヌクレアーゼの存在下で、癌組織を消化してもよい。
【００４４】
癌組織を消化するには、タンパク質分解酵素及びRhoキナーゼ阻害剤を添加した（さらに、デオキシリボヌクレアーゼを添加してもよい）培地（例えば、DMEM培地）中で癌組織を37℃で適当な時間（後述の実施例では、20分）インキュベートするとよい。培地中のRhoキナーゼ阻害剤の濃度は、10μM程度であるとよい。Rhoキナーゼ阻害剤としては、Y-27632（R&D）を例示することができる。培地には、FBSを添加するとよい。
【００４５】
癌細胞の凝集体（癌シスト）は、ゲル（例えば、マトリゲル）内に包埋した状態で継代するとよい。継代時の癌シストの分散には、Rhoキナーゼ阻害剤を添加した分散液（例えば、TrypLE (Thermo Fisher Scientific社)）を用いるとよい。その後、培地交換をして、新しいゲル内に包埋するとよい。
【００４６】
継代後の癌シストを分散液（例えば、TrypLE (Thermo Fisher Scientific社)）で処理し、その後、血管内皮細胞及び間葉系細胞と共培養するとよい。癌細胞と血管内皮細胞及び間葉系細胞との共培養は前述した通りである。
【００４７】
癌微小環境を再現する、再構成された癌オルガノイドを非ヒト動物に移植することにより、癌微小環境を再現する、ゼノグラフトを作製することができる。癌微小環境は癌間質を含むとよい。再構成された癌オルガノイドがさらに腺管構造を再現するとよい。また、ゼノグラフト自身がさらに腺管構造を再現してもよい。腺管構造は、上皮性の特性を有する癌細胞によって形成されうる。ゼノグラフトは、癌の治療抵抗性、浸潤・転移及び再発からなる群より選択される少なくとも１つを再現するとよい。癌オルガノイドは、プライマリ癌細胞や継代された細胞より再構成されたものであっても、株化された細胞より再構成されたものであってもよい。癌オルガノイド由来ゼノグラフトは、癌の治療抵抗性、浸潤・転移及び再発からなる群より選択される少なくとも１つを再現しうる。また、癌オルガノイド由来ゼノグラフトは、薬剤トランスポーターの発現を再現しうる。さらに、癌オルガノイド由来ゼノグラフトは、腫瘍血管を有してもよい。癌オルガノイド由来ゼノグラフトは、腫瘍血管に特徴的な薬剤漏れ出しを再現しうる。これらの癌オルガノイド由来ゼノグラフトは、癌細胞を間葉系細胞及び血管内皮細胞と共培養することで形成された癌オルガノイドを非ヒト動物に移植することにより作製することができる。癌の種類は、特に限定されるわけではなく、肝臓癌、腎臓癌、悪性脳腫瘍、膵臓癌、胃癌、肺癌などいかなるものであってもよい。後述の実施例では、膵癌オルガノイドからゼノグラフトを作製した。間葉系細胞の比率が高い細胞混合比の膵癌オルガノイドから作製されたゼノグラフトは、間質が豊富であり、薬剤感受性が低下する傾向が認められた。本発明に用いる場合、癌オルガノイド由来ゼノグラフトの大きさは、10〜5000立方ミリメートル程度であるとよい。移植の対象となる非ヒト動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、イヌ、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ニワトリなどを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。
【００４８】
癌オルガノイド及び癌オルガノイド由来ゼノグラフトは、癌の治療抵抗性、浸潤・転移及び再発からなる群より選択される少なくとも１つの評価に用いることができる。
【００４９】
癌オルガノイドを用いて、癌の治療抵抗性を評価する場合は、癌オルガノイドに癌の治療と同等の処置を施し（例えば、薬剤の添加、放射線の照射、免疫療法剤の添加、栄養素の添加など）、適当な時間経過後に、生存している癌細胞数をカウントし、IC50値を算出するとよい。
【００５０】
癌オルガノイド由来ゼノグラフトを用いて、癌の治療抵抗性を評価する場合は、癌オルガノイドを非ヒト動物に移植し、形成されるゼノグラフトの体積が適当な大きさになった時点で、癌の治療を開始し、適当な頻度で治療薬を投与した後、ゼノグラフトを摘出し、その体積を測定するとよい。
【００５１】
癌の治療薬としては、既存の癌治療薬（放射線も含む）、癌治療薬の候補化合物などが挙げられる。
【００５２】
癌オルガノイドを用いて、癌の浸潤・転移を評価する場合は、例えば、トランスウェルなどを用いた遊走および浸潤アッセイを用いて癌オルガノイドからの細胞遊走を観察するとよい。
【００５３】
癌オルガノイド由来ゼノグラフトを用いて、癌の浸潤・転移を評価する場合は、癌オルガノイドを非ヒト動物に移植し、形成されるゼノグラフトの体積が適当な大きさになった後の適当な時間経過後に、遠隔転移が想定される組織内での癌細胞コロニーあるいは癌細胞を観察したりするとよい。
【００５４】
癌オルガノイドを用いて、癌の再発を評価する場合は、癌オルガノイドに癌の治療と同等の処置を施し（例えば、薬剤の添加、放射線の照射、免疫療法剤の添加、栄養素の添加など）、癌細胞の消滅あるいは減少が観察された後に前記癌の治療と同等の処置を施すことを中止し、適当な時間経過後に、生存している癌細胞数あるいは癌オルガノイドのサイズをカウントするとよい。
【００５５】
癌オルガノイド由来ゼノグラフトを用いて、癌の再発を評価する場合は、癌オルガノイドを非ヒト動物に移植し、形成されるゼノグラフトの体積が適当な大きさになった時点で、癌の治療を開始し、適当な頻度で投与して、ゼノグラフトの消滅あるいは減少が観察された後、癌の治療を中止し、適当な時間経過後に、ゼノグラフトの体積あるいは構成細胞数を測定するとよい。
【００５６】
癌の浸潤・転移を評価する方法及び癌の再発を評価する方法は、癌の治療薬のスクリーニングに利用することもできる。このスクリーニングにより、癌の浸潤・転移を治療及び／又は予防する薬や癌の再発予防に効果的な薬を見つけることができる。
【００５７】
プライマリ癌オルガノイド（ヒト癌原発巣より分離した癌組織を用いて樹立したプライマリ癌細胞株から作製した癌オルガノイド）の薬剤感受性は患者の術後再発と関連することが確認されている。このことから、癌オルガノイド及び癌オルガノイドから作製したゼノグラフトの治療抵抗性は患者予後と相関すると考えられる。患者の癌細胞由来の癌オルガノイド及び／又はゼノグラフトが治療感受性である場合は、患者は術後に再発しないと予測され、患者の癌細胞由来の癌オルガノイド及び／又はゼノグラフトが治療抵抗性である場合は、患者は術後に再発すると予測される。
【００５８】
癌オルガノイド由来のゼノグラフトを担持する非ヒト動物は、癌の治療抵抗性、浸潤・転移又は再発の評価、癌の予後予測などに用いることができる。非ヒト動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、イヌ、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ニワトリなどを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。
【００５９】
本発明において、患者由来の癌組織中又は患者由来の癌細胞を含む癌微小環境を再構成する組織中の癌細胞と間質細胞のそれぞれにおけるEMT関連分子の発現レベルを測定する。
【００６０】
EMT関連分子とは、上皮特性を有する癌細胞の形質を間葉系細胞の形質に変化させる作用を持つ分子群を指し、EMT関連分子としては、E-cadherin (CDH1), ZEB1. ZEB2, SNAIL1, SNAIL2, TWIST1, SMAD2, SMAD3, N-cadherin(CDH2), TGFB1, TNF, IL1B, EGF, ERBB2, ERBB3, VEGFA, VIM, EPCAM, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, DELTA, HEY1, HEY2, JAG2, JAK, STAT1, STAT3, MMP3, PI3K, PETEN, AKT1, AKT2, AKT3, MTOR, HIF1A, RAS, RAF1, MAP2K1, ERK1, MAPK1, MAP3K1, MAPK14, MAPK8, NFKB1, IRAK1, IRAK2, IRAK3, IRAK4, TRAF1, TRAF2などが知られているが、これらに限定されるわけではない。
【００６１】
「予後」とは、予想される医学的な状態（健康状態）に関する見解（見通し）をいう。例えば「予後が良い」や「予後良好」と言えば、見通しがよいことを意味する。反対に「予後が悪い」や「予後不良」とは、見通しが悪いことを表す。「予後」の意味は疾患や病状によって異なり、例えば、癌などでは「生存期間」の長さを意味することが多く、生命予後という用語が用いられることもある。
【００６２】
患者は、何らかの癌治療（手術（外科治療）、薬物療法（抗がん剤治療）、放射線治療、造血幹細胞移植、免疫療法など）を受けているとよい。
【００６３】
本発明の患者の予後予測方法において、少なくとも間質細胞において、EMT関連分子の発現レベルが上昇している場合に、患者の予後が不良と予測することができる。癌細胞と間質細胞の両方において、EMT関連分子の発現レベルが上昇している場合に、患者の予後が不良と予測することができ、間質細胞において、EMT関連分子の発現レベルが上昇しているが、癌細胞においては、EMT関連分子の発現レベルが上昇していない場合よりも、生存期間が短いことが予想される。また、逆に、少なくとも間質細胞において、EMT関連分子の発現レベルが上昇していない場合に、患者の予後が良好と予測することができる。
【００６４】
EMT関連分子の発現レベルの測定は、遺伝子発現レベルの測定であっても、蛋白質発現レベルの測定であってもよい。遺伝子発現レベルの測定は、RT-PCR法、リアルタイムPCR、マイクロアレイ解析、RNAシークエンス解析などによって行うことができ、蛋白質発現レベルの測定は、免疫染色法、ウエスタンブロット法などによって行うことができる。
【００６５】
「EMT関連分子の発現レベルが上昇している」とは、癌治療の前よりも癌治療の後で上昇していること、健常者の発現レベルと比較して上昇していること、のいずれであってもよい。
【００６６】
「発現レベルの上昇」は、統計学的に有意差が認められる程度の上昇であればよく、p値が0.05未満等程度の上昇を例示することができる。
【００６７】
本発明者らは、手術後に、膵癌治療薬（ゲムシタビンあるいはTS-1）を用いた化学療法が施された患者を対象として、手術時に摘出された膵癌患者の摘出組織（膵癌組織アレイ）におけるNOTCH3の発現と予後の関係の検討において、膵癌細胞と膵癌間質細胞において、それぞれ、NOTCH3の発現を評価したところ、癌細胞と間質細胞の双方においてNOTCH3発現量が低い患者は、生存期間が長いことが明らかとなった。また、膵癌細胞のみでNOTCH3発現が高い患者は、癌細胞と間質細胞の双方においてNOTCH3発現量が低い患者と同程度の生存期間を示すことが確認された。しかしながら、膵癌間質のみでNOTCH3発現が高い患者は、膵癌細胞のみでNOTCH3発現が高い患者と比べて、生存期間が短いことが確認された。これにより、癌間質におけるNOTCH3発現が膵癌患者の予後にインパクトを有することが明らかとなった。なお、癌細胞と間質細胞の双方でNOTCH3発現が高い患者は、上記よりも生存期間が短いことが確認された。
【００６８】
よって、本発明は、癌患者の予後を予測する方法であって、
a. 患者由来の癌組織又は患者由来の癌細胞を含む癌微小環境を再構成する組織を用意すること、
b. 患者由来の癌組織中又は患者由来の癌細胞を含む癌微小環境を再構成する組織中の癌細胞と間質細胞のそれぞれにおけるEMT関連分子の発現レベルを測定すること、及び
c. 癌細胞と間質細胞のそれぞれにおけるEMT関連分子の発現レベルに基づき、癌患者の予後が良好又は不良と予測すること
を含む前記方法を提供する。
【００６９】
本方法により、特定の薬剤の治療効果が低いと予測された場合は、別の薬剤の投与あるいは、別の治療法（放射線治療など）を行うことが有益と考えられる。また、特定の薬剤の投与を中止することで、副作用の低減を図ることができると考えられる。
膵癌の標準的な治療は、手術（外科療法）、薬物療法（化学療法）、放射線治療である。通常、これらのうちの一つ、あるいは複数を組み合わせた治療が行われる。手術が可能な場合は、手術と薬物療法を組み合わせて治療を行うことが多い。手術ができない場合には、放射線治療や薬物療法が行われる。手術の方法は、膵頭十二指腸切除術、膵体尾部切除術、膵全摘手術、バイパス手術がある。放射線治療で用いられる放射線は、電磁波と粒子線の2種類に大きく分けられる。電磁波には、X線、γ（ガンマ）線などが含まれる。粒子線には、α（アルファ）線、β（ベータ）線、電子線、陽子線、炭素を代表とする粒子線、中性子線などがある。薬物療法については、（1）術後補助化学療法では、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤（TS-1：ティーエスワン）単剤療法、ゲムシタビン単剤治療が行われ、（2）手術ができない場合や再発した場合の化学療法では、FOLFIRINOX療法（フルオロウラシル［5-FU］＋レボホリナートカルシウム＋イリノテカン＋オキサリプラチン）、ゲムシタビン（ジェムザール）＋ナブパクリタキセル（アブラキサン）併用療法、ゲムシタビン単剤治療、ゲムシタビン+エルロチニブ（タルセバ）併用療法、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤（TS-1：ティーエスワン）などが行われ、放射線治療と組み合わせて実施されることもある。
【００７０】
よって、本発明は、癌患者の予後の予測及び/又は治療の方法であって、
a. 患者由来の癌組織又は患者由来の癌細胞を含む癌微小環境を再構成する組織を用意すること、
b. 患者由来の癌組織中又は患者由来の癌細胞を含む癌微小環境を再構成する組織中の癌細胞と間質細胞のそれぞれにおけるEMT関連分子の発現レベルを測定すること、
c. 癌細胞と間質細胞のそれぞれにおけるEMT関連分子の発現レベルに基づき、癌患者の予後が良好又は不良と予測すること、及び/又は
d. 癌細胞と間質細胞のそれぞれにおけるEMT関連分子の発現レベルに基づき、治療方法を選択して、治療を開始すること
を含む前記方法も提供する。
【実施例】
【００７１】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
〔実施例１〕
プライマリヒト膵癌オルガノイドを対象とした抗癌剤（ゲムシタビン）の薬剤感受性評価（図１）
プライマリヒト膵癌細胞（膵癌患者から切除した組織から単離した細胞を増やしたもの）にルシフェラーゼ遺伝子を導入した後、プライマリ膵癌細胞の基本培地とEGM培地 (Lonza) の1:1混合液を使用して、ストロマ細胞（ヒト間葉系幹細胞（hMSC）、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）いずれもLonza社）との三次元共培養を行い（プライマリヒト膵癌細胞：hMSC：HUVEC＝10:7:20）、豊富な間質を持つプライマリヒト膵癌オルガノイドを再構成した。再構成されたプライマリヒト膵癌オルガノイドに各濃度の抗癌剤（ゲムシタビン）を添加し、それぞれの薬剤感受性を評価した。豊富な間質を持つプライマリヒト膵癌オルガノイド（図中赤線●）は、プライマリヒト膵癌細胞のみで構成される群（図中青線■）と比べて、抗癌剤の抵抗性が亢進している。【００７２】
プライマリヒト膵癌オルガノイドの薬剤抵抗性に関与する分子の探索（図２）
間質豊富なプライマリヒト膵癌オルガノイドは、抗癌剤に対して高い治療抵抗性を示した。癌間質を介した膵癌細胞の治療抵抗性亢進についてのメカニズムを明らかにするため、間質豊富なプライマリヒト膵癌オルガノイドと膵癌細胞との間における遺伝子発現および蛋白質発現を比較した。間質豊富なプライマリヒト膵癌オルガノイドより分離した膵癌細胞と膵癌細胞単独培養後の膵癌細胞の間の遺伝子発現状態をマイクロアレイ解析により比較したところ、EMT関連因子、癌の悪性度への関連が報告された因子、腫瘍形成に関与することが報告された分子が多数抽出された。また、間質豊富なプライマリヒト膵癌オルガノイドと膵癌細胞の培養上清を対象としたプロテオーム解析（セクレトーム解析）を行ったところ、EMT関連分子（NOTCH3等）が複数抽出された。【００７３】
プライマリ膵癌オルガオイドにおけるEMT関連分子の発現亢進の確認（図３）
間質豊富なプライマリヒト膵癌オルガノイドとプライマリヒト膵癌細胞の間で遺伝子発現状態を比較するため、各々のtotalRNAを用いてマイクロアレイデータ（Agilent社）を取得し、得られたアレイデータを用いてGene Set Enrichment Analysis (GSEA)解析を行った。双方のサンプル間で変動する遺伝子群がいずれの遺伝子セットに該当するかを検討したところ、膵癌オルガノイドは膵癌細胞のみと比べてEMT遺伝子セットが遺伝子発現データ中で有意に変動することが確認された。図中左側が膵癌オルガノイドの発現遺伝子、右側が膵癌細胞の発現遺伝子を示し、EMT関連遺伝子の検出頻度が左側で優位に高いことが確認された。【００７４】
上皮間葉転換（EMT）を介する癌の治療抵抗性機構（図４）
固形癌では癌細胞が治療抵抗性を獲得する過程において、癌細胞の特性が上皮様から間質様に変化することが知られている（上皮間葉転換：Epithelial-Mesenchymal Transition : EMT）。多くの癌においてEMTへの移行期（Partial EMT）より癌細胞の薬剤抵抗性が亢進することが報告されている。【００７５】
膵癌オルガノイドから形成されたゼノグラフトにおけるEMTマーカーの検出（図５）
前述の方法で作製した膵癌オルガノイドあるいは、膵癌シストをDMEM/F12培地で洗浄したのち、ピペットを用いて細かく分散して、DMEM/F12培地とマトリゲルの混合液（1:1混合液）中に懸濁し、200ulプラスティックチップを用いて回収し、重度免疫不全マウス（NSGマウス、チャールズリバー）の背部皮下に移植してゼノグラフトを作製した（膵癌オルガノイド由来ゼノグラフト、膵癌シスト由来ゼノグラフト）。膵癌オルガノイドから形成されたゼノグラフト（Organoid）でEMTマーカー（ZEB2, pSMAD2/3, N-CADHERIN）の発現を評価したところ（免疫染色法）、CK7を発現する膵癌細胞においてEMTマーカーの発現亢進が生じることが確認された。また、膵癌オルガノイドから形成されたゼノグラフトは、ゲムシタビン治療を施した後（ゼノグラフトのサイズが100mm3に達した後、ゲムシタビン（90mg/kg）を3日毎に腹腔内投与した。）においても、EMT関連分子の発現が亢進していることが確認された（図5は、治療開始後30日目の組織を示す。）。【００７６】
NOTCH3は間質豊富な膵癌オルガノイドで発現が亢進し、抗癌剤投与後のオルガノイドで発現が持続する（図６）
膵癌オルガノイドから形成されたゼノグラフト（Org）、膵癌シストから形成されたゼノグラフト（Cyst）においてNOTCH分子群の発現を評価した（免疫染色法）。間質豊富な膵癌オルガノイドで発現が亢進し、抗癌剤投与に発現が持続する分子としてNOTCH3が同定された。NOTCH3の発現は膵癌細胞と膵癌間質細胞の双方で亢進することが確認された。図6Aにゲムシタビン投与前後での膵癌オルガノイド由来ゼノグラフトあるいは膵癌シスト由来ゼノグラフトでのNOTCH分子群の発現状態を示す。図6Bに免疫染色結果の定量結果を示す。サイトケラチン7(CK7)を発現する膵癌細胞におけるNOTCH分子群の発現結果を示す。図6Cでは膵癌細胞におけるNOTCH下流シグナルの発現解析結果を示す。図6Dに膵癌の原発巣と間質を有する膵癌オルガノイドでのNOTCH3の発現状態を示す。Smooth muscle actin(SMA)は間葉系細胞のマーカーとして使用した。図6Eは術後にゲムシタビン（GEM）あるいは、TS-1治療を行った患者の生存期間を示す。手術時の膵癌組織における癌細胞でのNOTCH3発現、および間質細胞でのNOTCH3発現に基づき生存頻度をプロットした。【００７７】
抗癌剤投与後の膵癌組織におけるNOTCH3陽性細胞の特性評価（図７）
プライマリヒト膵癌オルガノイドに由来するゼノグラフトに膵癌治療薬（ゲムシタビン）を投与し（ゲムシタビン（90mg/kg）を3日毎に腹腔内投与した。）、治療後に残存する膵癌細胞の特性を検討した。図７は、治療開始後30日目の組織を示す。治療後に残存した膵癌細胞はNOTCH3の発現が高く（免疫染色法）、また、細胞増殖が亢進していることが確認された。膵癌細胞におけるNOTCH3の発現を3段階に分類し（Ki67染色像（核）を基準に細胞を分類し、細胞周囲のNOTCH3の発現の強さで分類した。全体の発現量を元に、NOTCH3発現なし、弱染色、強染色の三段階で評価した。）、それぞれの群でKi67を発現し、増殖性を示す膵癌細胞の頻度を検討した。その結果、抗癌剤治療後に残存するNOTCH3強陽性細胞では、増殖している細胞の割合が高いことが確認された。NOTCH3陽性細胞は、抗癌剤に高い薬剤抵抗性を示すことが確認された。【００７８】
膵癌オルガノイド由来ゼノグラフトを対象としたNOTCH3阻害剤と抗癌剤の併用治療（図８）
NOTCH3阻害作用を有する阻害剤（LY 3039478 (10 mg/kg, Eli Lilly)）がヒト膵癌の治療に有効か否かを検討した。重度免疫不全マウス（NSGマウス、チャールズリバー）背部皮下にプライマリヒト膵癌オルガノイドを移植し、ゼノグラフトが一定のサイズ（100mm3）に達した時点から治療を開始した。膵癌治療薬であるゲムシタビンの投与群、NOTCH3阻害剤の投与群、ゲムシタビンとNOTCH3阻害剤の双方の投与群（併用群）、未治療群について腫瘍サイズの変化を検討した。NOTCH3阻害剤投与群では、ゲムシタビン治療群に近い治療効果が確認されるものの、膵癌組織の増大を完全に抑制することは困難であった。一方で、NOTCH3阻害剤とゲムシタビンの併用治療群では、膵癌組織の増大が強く抑制され、併用治療の有効性が明らかとなった。図中右に各治療後の膵癌ゼノグラフトのマクロ像およびHE染色像を示す。【００７９】
再発膵癌に対するNOTCH3・ゲムシタビン併用治療効果の検討（図９）
膵癌は癌の進展が早く、再発・転移が高頻度に生じる。再発した膵癌に対する有効な治療法は確立されておらず、新たな治療法の確立が必須である。再発膵癌の治療におけるNOTCH3阻害剤の有効性を検証するため、プライマリヒト膵癌オルガノイドを重度免疫不全マウス（NSGマウス、チャールズリバー）に移植し、腫瘍サイズが一定（100mm3）に達した時点からゲムシタビン投与を施した。投与後、腫瘍サイズが減少した後、ゲムシタビン投与を中断すると膵癌の増殖が亢進することが確認された。本手法は、膵癌の再発を再現するモデルとして有益であることが確認された。
また、同再発モデルの治療にNOTCH3が有益か否かを検討した。腫瘍サイズが一定（100mm3）に達した時点からNOTCH3阻害剤、ゲムシタビン投与を行い、腫瘍サイズの変化を検討したところ、NOTCH3阻害剤あるいはゲムシタビンのいずれかを投与することで腫瘍サイズの増加を抑制できることが確認された。さらに、NOTCH3阻害剤とゲムシタビンの併用治療の効果を検討したところ、併用群では再発後の腫瘍サイズが大きく減少することが確認された。膵癌の再発にNOTCH3阻害剤とゲムシタビンの併用治療が有効であることが確認された。図中右に各治療後の膵癌ゼノグラフトのマクロ像およびHE染色像を示す。【００８０】
NOTCH3阻害剤治療後の膵癌組織における間質量の減少（図１０）
膵癌オルガノイド由来ゼノグラフトについてNOTCH3阻害剤、ゲムシタビン、併用治療を実施した後の間質量をシリウスレッド染色により評価した。図中左側上段に治療後のゼノグラフトのHE染色像、下段にシリウスレッド染色像を示す。NOTCH3阻害剤を用いて治療すると、膵癌組織中のシリウスレッド陽性領域が減少することが明らかとなった（右図）。また、図中央は、細胞核の染色により膵管部位での細胞の重層化の程度を評価し、平均値で示した。グラフ上の点は個々の膵管部位を示す。【００８１】
NOTCH3阻害剤治療後組織におけるEMT関連分子の発現（図１１）
NOTCH3治療後の膵癌組織においてEMT関連分子の発現を評価したところ（免疫染色）、NOTCH3阻害剤投与群においてEMT関連分子を発現する細胞が減少することが確認された（左図）。それぞれの治療群においてEMT関連分子・細胞増殖マーカー・幹細胞マーカー・細胞外マトリクス・繊維化マーカーの発現を評価したところ（免疫染色）、NOTCH3阻害剤とゲムシタビン併用群ではこれらの分子が抑制されることが明らかとなった。一方、NOTCH3阻害剤とゲムシタビン併用群では、カスパーゼ活性などのアポトーシスマーカーの発現が亢進することが確認された（右図）。【００８２】
膵癌オルガノイドにおける上皮間葉転換の亢進（図１２）
左図：膵癌オルガノイド（PCO）移植後に形成されたゼノグラフト、膵癌細胞のみから形成されたゼノグラフト、ヒト膵癌組織におけるNカドヘリンおよびEカドヘリンの発現を示す（免疫染色法）。膵癌オルガノイド由来のゼノグラフトでは、膵癌細胞から形成されたゼノグラフトと比べて、癌細胞におけるNカドヘリン発現が亢進し、Partial EMTへの移行が確認された。
右図：抗癌剤投与前の膵癌オルガノイド由来ゼノグラフトおよび膵癌細胞由来ゼノグラフトにおけるEMT関連分子の発現を示す（免疫染色法）。膵癌オルガノイド由来ゼノグラフトでは、抗癌剤投与前からEMT関連分子の発現が高く、抗癌剤治療後においてもEMT関連分子の高い発現が維持されている。【００８３】
膵癌の抗癌剤投与過程におけるNOTCH3発現（図１３）
膵癌オルガノイド移植後に形成されたゼノグラフトあるいは、膵癌細胞単独移植後に形成されたゼノグラフトにおけるNOTCH3発現を示す（免疫染色法）。膵癌オルガノイド移植群では、治療開始前よりNOTCH3陽性細胞の存在頻度が高い。【００８４】
再発膵癌に対するNOTCH3・ゲムシタビン併用治療効果の検討（図１４）
膵癌オルガノイドの抗癌剤抵抗性に関与する上皮間葉転換関連分子（NOTCH3）の発現が膵癌患者の予後と相関するか否かを検討した。手術後に、膵癌治療薬（ゲムシタビンあるいはTS-1）を用いた化学療法が施された患者を対象として、手術時に摘出された膵癌患者の摘出組織（膵癌組織アレイ）におけるNOTCH3の発現と予後の関係を検討した。
膵癌細胞と膵癌間質細胞において、それぞれ、NOTCH3の発現を評価したところ（免疫染色法）、癌細胞と間質細胞の双方においてNOTCH3発現量が低い患者は、生存期間が長いことが明らかとなった。また、膵癌細胞のみでNOTCH3発現が高い患者は、癌細胞と間質細胞の双方においてNOTCH3発現量が低い患者と同程度の生存期間を示すことが確認された（図１４中(1)）。しかしながら、膵癌間質のみでNOTCH3発現が高い患者は、膵癌細胞のみでNOTCH3発現が高い患者と比べて、生存期間が短いことが確認された（図１４中(3),(4)）。これにより、癌間質におけるNOTCH3発現が膵癌患者の予後にインパクトを有することが明らかとなった。なお、癌細胞と間質細胞の双方でNOTCH3発現が高い患者は、上記よりも生存期間が短いことが確認された（図中１４中(4)）。
なお、術後治療のプロトコル別にNOTCH3の発現と予後を検討したところ、ゲムシタビン治療群とTS-1治療群のいずれにおいても、間質におけるNOTCH3の発現が予後の悪さと相関することが確認された。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明は、癌患者の予後予測に利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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