(57)【要約】【課題】  甲殻類アレルギー治療に有用であると期待される核酸を提供する。【解決手段】  シグナルペプチドをコードする塩基配列、ＬＡＭＰの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、Ｌｉｔ  ｖ  １、Ｌｉｔ  ｖ  ４及びＬｉｔ  ｖ  ３を含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、膜貫通ドメインをコードする塩基配列、並びに、ＬＡＭＰのエンドソーム／リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列を順番に含む核酸であって、キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸：
シグナルペプチドをコードする塩基配列、
ＬＡＭＰの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
Ｌｉｔ  ｖ  １、Ｌｉｔ  ｖ  ４及びＬｉｔ  ｖ  ３を含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
膜貫通ドメインをコードする塩基配列、並びに、
ＬＡＭＰのエンドソーム／リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
【請求項２】
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸：
シグナルペプチドをコードする塩基配列、
ＬＡＭＰの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
Ｌｉｔ  ｖ  １、Ｌｉｔ  ｖ  ４及びＬｉｔ  ｖ  ３を順番に含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
膜貫通ドメインをコードする塩基配列、並びに、
ＬＡＭＰのエンドソーム／リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
【請求項３】
シグナルペプチドがＬＡＭＰのシグナルペプチドである、請求項１又は２に記載の核酸。
【請求項４】
膜貫通ドメインがＬＡＭＰの膜貫通ドメインである、請求項１〜３のいずれかに記載の核酸。
【請求項５】
シグナルペプチドが配列番号２のアミノ酸番号１から２７までのアミノ酸配列からなり、細胞小器官内安定化ドメインが配列番号２のアミノ酸番号２８から３８０までのアミノ酸配列からなり、アレルゲンドメインが、配列番号２のアミノ酸番号３８３から６６６までのアミノ酸配列からなるＬｉｔ  ｖ  １、配列番号２のアミノ酸番号６７１から８６３までのアミノ酸配列からなるＬｉｔ  ｖ  ４及び配列番号２のアミノ酸番号８６８から１０４４までのアミノ酸配列からなるＬｉｔ  ｖ  ３を含むアレルゲンドメインであり、膜貫通ドメインが配列番号２のアミノ酸番号１０４８から１０７０までのアミノ酸配列からなり、エンドソーム／リソソーム標的ドメインが配列番号２のアミノ酸番号１０７９から１０８２までのアミノ酸配列からなる、請求項１〜４のいずれかに記載の核酸。
【請求項６】
配列番号２に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該核酸は、Ｌｉｔ  ｖ  １、Ｌｉｔ  ｖ  ４及びＬｉｔ  ｖ  ３からなる群から選ばれるアレルゲンに対するＴｈ１型免疫を誘導する作用を有する、核酸。
【請求項７】
ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸、又は、
ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該核酸は、Ｌｉｔ  ｖ  １、Ｌｉｔ  ｖ  ４及びＬｉｔ  ｖ  ３からなる群から選ばれるアレルゲンに対するＴｈ１型免疫を誘導する作用を有する、核酸。
【請求項８】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１０】
請求項８に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれかに記載の核酸で形質転換された宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれかに記載の核酸で形質転換された宿主細胞を培養する工程を含む、核酸を生産する方法。
【請求項１３】
請求項１０に記載の発現ベクター及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１４】
甲殻類アレルギーの予防又は治療用医薬組成物である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１０に記載の発現ベクターの予防有効量又は治療有効量を投与する工程を包含する、甲殻類アレルギーを予防又は治療する方法。
【請求項１６】
甲殻類アレルギーの予防又は治療に使用するための、請求項１０に記載の発現ベクター。
【請求項１７】
甲殻類アレルギーの予防又は治療用医薬組成物の製造における、請求項１０に記載の発現ベクターの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬組成物の有効成分として有用であると期待される核酸であり、例えば甲殻類アレルギー治療に有用であると期待される核酸に関する。
【背景技術】
【０００２】
食物アレルギーとは、「食物によって引き起こされる抗原特異的な免疫学的機序を介して生体にとって不利益な症状が惹起される現象」を指し、摂取した食物が原因となり蕁麻疹・湿疹・下痢・咳等の症状を有することを特徴とする。甲殻類アレルギーは成人における主要な食物アレルギーの一つであり、甲殻類アレルギーを惹起するアレルゲンとして、Ｔｒｏｐｏｍｙｏｓｉｎに分類されるＬｉｔ  ｖ  １及びＰｅｎ  ｍ  １、Ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅに分類されるＬｉｔ  ｖ  ２及びＰｅｎ  ｍ  ２、Ｍｙｏｓｉｎ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎに分類されるＬｉｔ  ｖ  ３及びＰｅｎ  ｍ  ３、Ｓａｒｃｏｐｌａｓｍｉｃ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎに分類されるＬｉｔ  ｖ  ４及びＰｅｎ  ｍ  ４等をはじめとする多種多様なアレルゲンが知られている（非特許文献１から４）。【０００３】
現在、甲殻類アレルギーの根本的な治療法はなく、食物除去によるアレルゲン摂取の回避が、アナフィラキシー等の甲殻類アレルギー症状を予防するための唯一の方法である。Ａｌｌｅｒｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  （ＡＳＩＴ）、ＤＮＡプラスミドやＰｅｐｔｉｄｅ−ｂａｓｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ（ＰＩＴ）等の研究も行われているものの、未だ臨床的に有効な治療法は開発されておらず、有効な治療法が求められている（非特許文献４、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０１７、Ｖｏｌ．４９、ｐ．２５２−２５６）。【０００４】
アレルギー疾患は、１）体内に取り込まれたアレルゲンが抗原提示細胞に貪食されてナイーブＴ細胞に抗原提示され、２）ナイーブＴ細胞がＴｈ２細胞へと分化し、３）Ｔｈ２細胞等の免疫細胞からＩＬ−４等のサイトカインが産生され、４）ＩＬ−４によってＢ細胞がＩｇＥを産生し、５）アレルゲンに結合したＩｇＥがマスト細胞に結合することによって引き起こされる。アレルギー疾患患者においては、ＩＦＮ−γ等を産生するＴｈ１細胞が関与するＴｈ１型免疫とＩＬ−４等を産生するＴｈ２細胞が関与するＴｈ２型免疫の拮抗がＴｈ２型優位になり、Ｔｈ２型の炎症免疫反応が起こっていることが知られている（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ’ｓ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｓｅｖｅｎｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ＆  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、２００９）。このように、ＩＦＮ−γはＴｈ１型免疫の指標に、ＩＬ−４はＴｈ２型免疫の指標に、使用され得る。また、マウスにおいては、ＩＦＮ−γが活性化されたＢ細胞におけるＩｇＧ２ａアイソタイプへの優先したクラススイッチを起こさせている一方で、他のすべてのアイソタイプへの応答を抑制する。すなわちＩｇＧ２ａ抗体産生もＴｈ１型免疫の指標に使用され得る。例えば、ＩＬ−４欠損マウスではＩｇＧ２ａ抗体産生が促進され、ＩＦＮ−γ欠損マウスではＩｇＧ２ａ抗体産生が抑制されることが知られている（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ．、２００２、Ｖｏｌ．４、ｐ．５４−５８）。また、アレルゲン免疫療法の作用メカニズムに、Ｂ細胞から産生される抗体が関与しているという報告も存在する。例えば、ヒトにおいては、ＩｇＧはアレルゲンに結合するＩｇＥに拮抗して、アレルゲン−ＩｇＥ複合体形成を阻害し、マスト細胞からのヒスタミン遊離を阻害することが知られている（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０１７、Ｖｏｌ．１４０、ｐ．１４８５−１４９８）。【０００５】
核酸ワクチンの技術の１つとして、リソソーム関連膜タンパク質（ｌｙｓｏｓｏｍｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＬＡＭＰ）を利用した、アレルギー治療のための核酸ワクチンが研究されている。そして、ＬＡＭＰファミリーのメンバーであるＬＡＭＰ−１並びにクリプトメリア・ジャポニカ（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）のアレルゲンであるＣｒｙ  Ｊ１及び／又はＣｒｙ  Ｊ２を含むキメラタンパク質をコードする核酸を含むプラスミドが構築された（特許文献１、非特許文献５）。そして、そのようなプラスミドは、アナフィラキシーの原因となる全身への遊離アレルゲン放出を起こさず、Ｔｈ１型の免疫反応を誘導することが報告されている。また、ＬＡＭＰ−１並びにピーナッツのアレルゲンであるＡｒａ  Ｈ１、Ａｒａ  Ｈ２及びＡｒａ  Ｈ３を含むキメラタンパク質をコードする核酸を含むプラスミドは、マウスモデルでＩｇＥの産生を緩和したことが報告されている（特許文献２）。しかしながら、甲殻類アレルギー治療のための核酸ワクチンは、未だ報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開番号２０１３／１８７９０６号
【特許文献２】国際公開番号２０１５／２００３５７号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】「アレルゴ  ジャーナル  インターナショナル（Ａｌｌｅｒｇｏ  ｊｏｕｒｎａｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）」、（ドイツ）、２０１６；２５（７）：２１０−２１８
【非特許文献２】「ザ・ジャーナル・オブ・アラージー・アンド・クリニカル・イムノロジー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、（米国）、２００９；１２４（１）：１１４−１２０
【非特許文献３】「ザ・ジャーナル・オブ・アラージー・アンド・クリニカル・イムノロジー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、（米国）、２００８；１２２（４）：７９５−８０２
【非特許文献４】「クリニカル・レビューズ・イン・アラージー・アンド・イムノロジー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、（米国）、２０１５；４９（２）：２０３−２１６
【非特許文献５】「ジャーナル・オブ・イムノロジー・リサーチ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、（エジプト）、２０１６；Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ４８５７８６９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、甲殻類アレルギー治療に有用であると期待される核酸を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、甲殻類アレルギー治療のための核酸の作製において相当の創意検討を重ねた結果、ＬＡＭＰ−Ｌｉｔ  ｖ  １−Ｌｉｔ  ｖ  ４−Ｌｉｔ  ｖ  ３プラスミドを作製し（実施例１）、該プラスミドからキメラタンパク質が発現することを確認し（実施例２）、該プラスミドを投与したマウスにおいてＴｈ１型免疫反応が誘導されることを見出した（実施例３、実施例４）。これらの結果、甲殻類アレルギー治療に有用であると期待される核酸を提供し、本発明を完成させた。さらに該プラスミドを投与したマウスにおいて、エビ抗原惹起によるアレルギー症状が緩和されることを見出した（実施例５）。【００１０】
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［１７］に関する。
［１］
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸：
シグナルペプチドをコードする塩基配列、
ＬＡＭＰの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
Ｌｉｔ  ｖ  １、Ｌｉｔ  ｖ  ４及びＬｉｔ  ｖ  ３を含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
膜貫通ドメインをコードする塩基配列、並びに、
ＬＡＭＰのエンドソーム／リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
［２］
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸：
シグナルペプチドをコードする塩基配列、
ＬＡＭＰの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
Ｌｉｔ  ｖ  １、Ｌｉｔ  ｖ  ４及びＬｉｔ  ｖ  ３を順番に含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
膜貫通ドメインをコードする塩基配列、並びに、
ＬＡＭＰのエンドソーム／リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
［３］
シグナルペプチドがＬＡＭＰのシグナルペプチドである、［１］又は［２］に記載の核酸。
［４］
膜貫通ドメインがＬＡＭＰの膜貫通ドメインである、［１］〜［３］のいずれかに記載の核酸。
［５］
シグナルペプチドが配列番号２のアミノ酸番号１から２７までのアミノ酸配列からなり、細胞小器官内安定化ドメインが配列番号２のアミノ酸番号２８から３８０までのアミノ酸配列からなり、アレルゲンドメインが、配列番号２のアミノ酸番号３８３から６６６までのアミノ酸配列からなるＬｉｔ  ｖ  １、配列番号２のアミノ酸番号６７１から８６３までのアミノ酸配列からなるＬｉｔ  ｖ  ４及び配列番号２のアミノ酸番号８６８から１０４４までのアミノ酸配列からなるＬｉｔ  ｖ  ３を含むアレルゲンドメインであり、膜貫通ドメインが配列番号２のアミノ酸番号１０４８から１０７０までのアミノ酸配列からなり、エンドソーム／リソソーム標的ドメインが配列番号２のアミノ酸番号１０７９から１０８２までのアミノ酸配列からなる、［１］〜［４］のいずれかに記載の核酸。
［６］
配列番号２に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該核酸は、Ｌｉｔ  ｖ  １、Ｌｉｔ  ｖ  ４及びＬｉｔ  ｖ  ３からなる群から選ばれるアレルゲンに対するＴｈ１型免疫を誘導する作用を有する、核酸。
［７］
ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸、又は、
ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該核酸は、Ｌｉｔ  ｖ  １、Ｌｉｔ  ｖ  ４及びＬｉｔ  ｖ  ３からなる群から選ばれるアレルゲンに対するＴｈ１型免疫を誘導する作用を有する、核酸。
［８］
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸。
［９］
［１］〜［８］のいずれかに記載の核酸を含む発現ベクター。
［１０］
［８］に記載の核酸を含む発現ベクター。
［１１］
［１］〜［８］のいずれかに記載の核酸で形質転換された宿主細胞。
［１２］
［１］〜［８］のいずれかに記載の核酸で形質転換された宿主細胞を培養する工程を含む、核酸を生産する方法。
［１３］
［１０］に記載の発現ベクター及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
［１４］
甲殻類アレルギーの予防又は治療用医薬組成物である、［１３］に記載の医薬組成物。
［１５］
［１０］に記載の発現ベクターの予防有効量又は治療有効量を投与する工程を包含する、甲殻類アレルギーを予防又は治療する方法。
［１６］
甲殻類アレルギーの予防又は治療に使用するための、［１０］に記載の発現ベクター。
［１７］
甲殻類アレルギーの予防又は治療用医薬組成物の製造における、［１０］に記載の発現ベクターの使用。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の核酸は、甲殻類アレルギーの予防又は治療に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本発明の核酸をマウスに投与した際に誘導されるＬｉｔ  ｖ  １、Ｌｉｔ  ｖ  ３及びＬｉｔ  ｖ  ４特異的ＩｇＧ２ａ抗体産生を示した図である。縦軸は血漿中抗体力価（ｍＵ／ｍＬ）、横軸は各投与群を示す。点線は検出限界を示し、水平線は各投与群の幾何平均値を示す。
【図２】図２は、本発明の核酸を投与したマウスの脾細胞を最終濃度１００μｇ／ｍＬのエビ抽出液、又は最終濃度１０μｇ／ｍＬのＬｉｔ  ｖ  １タンパク質で刺激した際のＩＦＮ−γ産生を示した図である。縦軸は培養上清中ＩＦＮ−γ濃度（ｐｇ／ｍＬ）、横軸は各投与群を示す。点線は検出限界を示し、水平線は各投与群の算術平均値を示す。
【図３】図３は、本発明の核酸を投与したマウスの脾細胞を最終濃度１００μｇ／ｍＬのエビ抽出液、又は最終濃度１０μｇ／ｍＬのＬｉｔ  ｖ  １タンパク質で刺激した際のＩＬ−４産生を示した図である。縦軸は培養上清中ＩＬ−４濃度（ｐｇ／ｍＬ）、横軸は各投与群を示す。点線は検出限界を示し、水平線は各投与群の算術平均値を示す。
【図４】図４は、本発明の核酸をエビ抗原感作マウスに投与した際のエビ抗原腹腔内投与後の体温変化及びアレルギー症状のスコアを示す。体温変化はエビ抗原腹腔内投与直前、１５分、３０分、４５分、６０分における、投与前体温からの変化を示す。縦軸は直腸温度変化（℃）、横軸は時間を示す。プロットは各時点において同一処方内で算術平均した値を示し、縦線は標準誤差を示す。アレルギー症状はエビ抗原腹腔内投与後６０分間で認められた症状を、文献（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ 、２０１３、Ｖｏｌ．１３１、ｐ．２１３−２２１）の判定基準を元に判定した各マウスのスコアを示す。縦軸はアナフィラキシー症状スコア、横軸は各投与群を示す。水平線は各投与群の中央値を示す。＋＋は非感作群に対するＷｉｌｌｃｏｘｏｎ  ｒａｎｋ  ｓｕｍ  ｔｅｓｔによる有意差検定でＰ値が０．０１未満であることを、＊＊は感作群に対するＳｔｅｅｌ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｔｅｓｔによる有意差検定でＰ値が０．０１未満であることを示す。
【図５】図５は、エビ抗原感作マウスに本発明の核酸を投与した際の血漿中のマウス肥満細胞プロテアーゼ１（ｍＭＣＰＴ−１）の濃度を示す。縦軸はｍＭＣＰＴ−１濃度（ｐｇ／ｍＬ）、横軸は各投与群を示す。水平線は各投与群の幾何平均値を示し、＋＋は対数変換後の非感作群に対するＵｎｐａｉｒｅｄ  ｔ  ｔｅｓｔによる有意差検定でＰ値が０．０１未満であることを、＊＊は対数変換後の感作群に対するＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｔｅｓｔによる有意差検定でＰ値が０．０１未満であることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下に、本発明について詳述する。
【００１４】
＜本発明の核酸＞
本発明の核酸には、以下の特徴を有する核酸が含まれる：
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸：
シグナルペプチドをコードする塩基配列、
ＬＡＭＰの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
Ｌｉｔ  ｖ  １、Ｌｉｔ  ｖ  ４及びＬｉｔ  ｖ  ３を含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
膜貫通ドメインをコードする塩基配列、並びに、
ＬＡＭＰのエンドソーム／リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
【００１５】
本発明において、核酸とは、ヌクレオチドが重合してできた任意の長さの塩基配列からなる高分子である。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、及び／又はそれらの類縁体を包含し得る。本発明の核酸は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はそれらの改変された核酸である。１つの実施形態において、本発明の核酸は、ＤＮＡである。
【００１６】
１つの実施形態において、本発明の核酸は、発現ベクターに組み込まれた核酸である。また、１つの実施形態において、本発明の核酸は、プラスミドベクターに組み込まれた核酸である。
【００１７】
本明細書において、「キメラタンパク質」とは、遺伝子組み換え技術を用いて２個以上の遺伝子を融合させた塩基配列によりコードされるタンパク質を意味する。本発明の核酸は、シグナルペプチド、ＬＡＭＰの細胞小器官内安定化ドメイン、Ｌｉｔ  ｖ  １、Ｌｉｔ  ｖ  ４及びＬｉｔ  ｖ  ３を含むアレルゲンドメイン、膜貫通ドメイン並びにＬＡＭＰのエンドソーム／リソソーム標的ドメインをこの順番に含むキメラタンパク質（以下、「本発明に関するキメラタンパク質」という）をコードする塩基配列を含む。
【００１８】
ＬＡＭＰは当業者に周知のタンパク質である（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．、１９９１、Ｖｏｌ．２６６、ｐ．２１３２７−２１３３０）。本明細書においてＬＡＭＰとは、特に限定されないが、ＬＡＭＰ−１、ＬＡＭＰ−２、ＣＤ６３／ＬＡＭＰ−３、ＤＣ−ＬＡＭＰ及びＬＩＭＰ  ＩＩ、並びに、それらのホモログ、オルソログ、パラログ、変異体及び改変体を含む。本発明の１つの実施形態において、ＬＡＭＰはＬＡＭＰ−１である。本発明におけるＬＡＭＰの由来動物は特に限定されないが、１つの実施形態において、ＬＡＭＰはヒトＬＡＭＰである。１つの実施形態において、ヒトＬＡＭＰはヒトＬＡＭＰ−１である。ヒトＬＡＭＰ−１のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号２のアミノ酸番号１から３８０に示されるアミノ酸配列のＣ末端に、配列番号２のアミノ酸番号１０４７から１０８２に示されるアミノ酸配列が結合したアミノ酸配列が挙げられる。
【００１９】
シグナルペプチドの一般的な構造は当業者に周知である（Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２００３、Ｖｏｌ．７２、ｐ．３９５−４４７）。シグナルペプチドは、タンパク質の輸送及び局在化を指示する機能を有する。本発明において使用されるシグナルペプチドとしては、タンパク質の輸送及び局在化を指示する機能を有する限り、任意の適切なシグナルペプチドを選択することが可能である。１つの実施形態において、本発明において使用されるシグナルペプチドは、ＬＡＭＰのシグナルペプチドである。１つの実施形態において、本発明において使用されるＬＡＭＰのシグナルペプチドは、ＬＡＭＰ−１のシグナルペプチドである。
【００２０】
１つの実施形態において、本発明において使用されるシグナルペプチドは、以下の（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列からなる。
（ａ）配列番号２のアミノ酸番号１から２７までのアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列；又は、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸番号１から２７までのアミノ酸配列、又は、配列番号２のアミノ酸番号１から２７までのアミノ酸配列において１〜３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列。
【００２１】
本明細書における「同一性」とは、ＥＭＢＯＳＳ  Ｎｅｅｄｌｅ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２０１５、Ｖｏｌ．４３、ｐ．Ｗ５８０−Ｗ５８４；https:www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/）を用いて、デフォルトで用意されているパラメータによって得られたＩｄｅｎｔｉｔｙの値を意味する。前記のパラメータは以下のとおりである。
Ｇａｐ  Ｏｐｅｎ  Ｐｅｎａｌｔｙ  ＝  １０
Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｄ  Ｐｅｎａｌｔｙ  ＝  ０．５
Ｍａｔｒｉｘ  ＝  ＥＢＬＯＳＵＭ６２
Ｅｎｄ  Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ  ＝  ｆａｌｓｅ
【００２２】
１つの実施形態において、本発明において使用されるシグナルペプチドは、配列番号２のアミノ酸番号１から２７までのアミノ酸配列からなる。
【００２３】
ＬＡＭＰの細胞小器官内安定化ドメインの配列は当業者に周知である（国際公開番号２０１３／１８７９０６号）。ＬＡＭＰの細胞小器官内安定化ドメインは、アレルゲンドメインをタンパク質分解酵素、低ｐＨ、並びに、その他のタンパク質を不安定化させる物質及び条件から保護する機能を有する。本発明において使用されるＬＡＭＰの細胞小器官内安定化ドメインとしては、アレルゲンドメインを、タンパク質分解酵素、低ｐＨ、並びに、その他のタンパク質を不安定化させる物質及び条件から保護する機能を有する限り、任意の適切なＬＡＭＰの細胞小器官内安定化ドメインを選択することが可能である。１つの実施形態において、本発明において使用されるＬＡＭＰの細胞小器官内安定化ドメインは、ＬＡＭＰ−１の細胞小器官内安定化ドメインである。
【００２４】
１つの実施形態において、本発明において使用されるＬＡＭＰの細胞小器官内安定化ドメインは、以下の（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列からなる：
（ａ）配列番号２のアミノ酸番号２８から３８０までのアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列；又は、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸番号２８から３８０までのアミノ酸配列、又は、配列番号２のアミノ酸番号２８から３８０までのアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列。
【００２５】
１つの実施形態において、本発明において使用されるＬＡＭＰの細胞小器官内安定化ドメインは、配列番号２のアミノ酸番号２８から３８０までのアミノ酸配列からなる。
【００２６】
本発明において使用されるアレルゲンドメインは、アレルゲンとしてＬｉｔ  ｖ  １、Ｌｉｔ  ｖ  ４及びＬｉｔ  ｖ  ３を含む。Ｌｉｔ  ｖ  １、Ｌｉｔ  ｖ  ４及びＬｉｔ  ｖ  ３は甲殻類（Ｃｒｕｓｔａｃｅａｎｓ）に広く観察されているアレルゲンである（非特許文献１）。本発明において使用されるＬｉｔ  ｖ  １、Ｌｉｔ  ｖ  ４及びＬｉｔ  ｖ  ３は、抗原性を有する限り、それらの変異体であってもよい。任意のタンパク質が抗原性を有することは、例えば動物に投与することで該タンパク質に対する抗体産生又はＴ細胞応答が惹起されることを観察することで確認することができる（Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ．、２０１２、Ｖｏｌ．４、ｐ．３９７−４０６）。
【００２７】
１つの実施形態において、Ｌｉｔ  ｖ  １は、以下の（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列からなる：
（ａ）配列番号２のアミノ酸番号３８３から６６６までのアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列；又は、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸番号３８３から６６６までのアミノ酸配列、又は、配列番号２のアミノ酸番号３８３から６６６までのアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列。
【００２８】
１つの実施形態において、Ｌｉｔ  ｖ  １は、配列番号２のアミノ酸番号３８３から６６６までのアミノ酸配列からなる。
【００２９】
１つの実施形態において、Ｌｉｔ  ｖ  ４は、以下の（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列からなる：
（ａ）配列番号２のアミノ酸番号６７１から８６３までのアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列；又は、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸番号６７１から８６３までのアミノ酸配列、又は、配列番号２のアミノ酸番号６７１から８６３までのアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列。
【００３０】
１つの実施形態において、Ｌｉｔ  ｖ  ４は、配列番号２のアミノ酸番号６７１から８６３までのアミノ酸配列からなる。
【００３１】
１つの実施形態において、Ｌｉｔ  ｖ  ３は、以下の（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列からなる：
（ａ）配列番号２のアミノ酸番号８６８から１０４４までのアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列；又は、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸番号８６８から１０４４までのアミノ酸配列、又は、配列番号２のアミノ酸番号８６８から１０４４までのアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列。
【００３２】
１つの実施形態において、Ｌｉｔ  ｖ  ３は、配列番号２のアミノ酸番号８６８から１０４４までのアミノ酸配列からなる。
【００３３】
１つの実施形態において、本発明において使用されるアレルゲンドメインは、Ｌｉｔ  ｖ１、Ｌｉｔ  ｖ  ４及びＬｉｔ  ｖ  ３を任意の順番で含む。また、１つの実施形態において、本発明において使用されるアレルゲンドメインは、Ｌｉｔ  ｖ  １、Ｌｉｔ  ｖ  ４及びＬｉｔ  ｖ  ３をこの順番で含む。
【００３４】
１つの実施形態において、本発明において使用されるアレルゲンドメインは、配列番号２のアミノ酸番号３８３から１０４４までのアミノ酸配列からなる。
【００３５】
膜貫通ドメインの一般的な構造は当業者に周知である（Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２００７、Ｖｏｌ．７６、ｐ．１２５−１４０）。膜貫通ドメインはタンパク質を生体膜に係留する機能を有する。本発明において使用される膜貫通ドメインとしては、タンパク質を生体膜に係留する機能を有する限り、任意の適切な膜貫通ドメインを選択することが可能である。１つの実施形態において、本発明において使用される膜貫通ドメインは、ＬＡＭＰの膜貫通ドメインである。１つの実施形態において、本発明において使用されるＬＡＭＰの膜貫通ドメインは、ＬＡＭＰ−１の膜貫通ドメインである。
【００３６】
１つの実施形態において、本発明において使用される膜貫通ドメインは、以下の（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列からなる：
（ａ）配列番号２のアミノ酸番号１０４８から１０７０までのアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列；又は、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸番号１０４８から１０７０までのアミノ酸配列、又は、配列番号２のアミノ酸番号１０４８から１０７０までのアミノ酸配列において１〜２個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列。
【００３７】
１つの実施形態において、本発明において使用される膜貫通ドメインは、配列番号２のアミノ酸番号１０４８から１０７０までのアミノ酸配列からなる。
【００３８】
ＬＡＭＰのエンドソーム／リソソーム標的ドメインの構造は当業者に周知である（国際公開番号１９９４／０１７１９２号）。ＬＡＭＰのエンドソーム／リソソーム標的ドメインはタンパク質をリソソームに輸送する機能を有する。本発明において使用されるＬＡＭＰのエンドソーム／リソソーム標的ドメインとしては、タンパク質をリソソームに輸送する機能を有する限り、任意の適切なＬＡＭＰのエンドソーム／リソソーム標的ドメインを選択することが可能である。１つの実施形態において、本発明において使用されるＬＡＭＰのエンドソーム／リソソーム標的ドメインは、ＬＡＭＰ−１のエンドソーム／リソソーム標的ドメインである。
【００３９】
１つの実施形態において、本発明において使用されるＬＡＭＰのエンドソーム／リソソーム標的ドメインは、配列番号２のアミノ酸番号１０７９から１０８２までのアミノ酸配列、又は、配列番号２のアミノ酸番号１０７９から１０８２までのアミノ酸配列において１個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列からなる。
【００４０】
１つの実施形態において、本発明において使用されるＬＡＭＰのエンドソーム／リソソーム標的ドメインは、配列番号２のアミノ酸番号１０７９から１０８２までのアミノ酸配列からなる。
【００４１】
本発明に関するキメラタンパク質において、シグナルペプチド、ＬＡＭＰの細胞小器官内安定化ドメイン、アレルゲンドメインに含まれる各アレルゲン、膜貫通ドメイン及びＬＡＭＰのエンドソーム／リソソーム標的ドメインは、直接つながっていてもよく、又は、リンカーペプチドを介して間接的につながっていてもよい。使用されるリンカーペプチドは、当業者に適宜に選択され得る。１つの実施形態において、当該リンカーペプチドは１０個以下のアミノ酸からなる。１つの実施形態において、ＬＡＭＰの細胞小器官内安定化ドメインとアレルゲンドメインの間、各アレルゲンの間、及び、アレルゲンドメインと膜貫通ドメインの間に使用されるリンカーペプチドは、ＬｅｕＧｌｕ、ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙ及び、ＧｌｕＰｈｅＴｈｒからなる群から選ばれるリンカーペプチドである。１つの実施形態において、膜貫通ドメインとＬＡＭＰのエンドソーム／リソソーム標的ドメインの間に使用されるリンカーペプチドは、配列番号２のアミノ酸番号１０７１から１０７８までのアミノ酸配列からなるリンカーペプチドである。
【００４２】
１つの実施形態において、本発明の核酸は、以下の核酸である：
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸：
ＬＡＭＰのシグナルペプチドをコードする塩基配列、
ＬＡＭＰの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
Ｌｉｔ  ｖ  １、Ｌｉｔ  ｖ  ４及びＬｉｔ  ｖ  ３を含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
ＬＡＭＰの膜貫通ドメインをコードする塩基配列、並びに、
ＬＡＭＰのエンドソーム／リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
【００４３】
１つの実施形態において、本発明の核酸は、以下の核酸である：
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸：
ＬＡＭＰ−１のシグナルペプチドをコードする塩基配列、
ＬＡＭＰ−１の細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
Ｌｉｔ  ｖ  １、Ｌｉｔ  ｖ  ４及びＬｉｔ  ｖ  ３を含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
ＬＡＭＰ−１の膜貫通ドメインをコードする塩基配列、並びに、
ＬＡＭＰ−１のエンドソーム／リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
【００４４】
１つの実施形態において、本発明の核酸は、以下の核酸である：
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸：
配列番号２のアミノ酸番号１から２７までのアミノ酸配列からなるシグナルペプチドをコードする塩基配列、
配列番号２のアミノ酸番号２８から３８０までのアミノ酸配列からなるＬＡＭＰの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
配列番号２のアミノ酸番号３８３から６６６までのアミノ酸配列からなるＬｉｔ  ｖ  １、配列番号２のアミノ酸番号６７１から８６３までのアミノ酸配列からなるＬｉｔ  ｖ  ４及び配列番号２のアミノ酸番号８６８から１０４４までのアミノ酸配列からなるＬｉｔ  ｖ  ３を含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
配列番号２のアミノ酸番号１０４８から１０７０までのアミノ酸配列からなる膜貫通ドメインをコードする塩基配列、並びに、
配列番号２のアミノ酸番号１０７９から１０８２までのアミノ酸配列からなるＬＡＭＰのエンドソーム／リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
【００４５】
１つの実施形態において、本発明の核酸は、以下の核酸である：
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸：
配列番号２のアミノ酸番号１から２７までのアミノ酸配列からなるシグナルペプチドをコードする塩基配列、
配列番号２のアミノ酸番号２８から３８０までのアミノ酸配列からなるＬＡＭＰの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
配列番号２のアミノ酸番号３８３から６６６までのアミノ酸配列からなるＬｉｔ  ｖ  １、配列番号２のアミノ酸番号６７１から８６３までのアミノ酸配列からなるＬｉｔ  ｖ  ４及び配列番号２のアミノ酸番号８６８から１０４４までのアミノ酸配列からなるＬｉｔ  ｖ  ３を含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
配列番号２のアミノ酸番号１０４８から１０７０までのアミノ酸配列からなる膜貫通ドメインをコードする塩基配列、
配列番号２のアミノ酸番号１０７１から１０７８までのアミノ酸配列からなるペプチドリンカーをコードする塩基配列、並びに、
配列番号２のアミノ酸番号１０７９から１０８２までのアミノ酸配列からなるＬＡＭＰのエンドソーム／リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
【００４６】
１つの実施形態において、本発明の核酸は、以下の核酸である：
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸：
シグナルペプチドをコードする塩基配列、
ＬＡＭＰの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
Ｌｉｔ  ｖ  １、Ｌｉｔ  ｖ  ４及びＬｉｔ  ｖ  ３を順番に含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
膜貫通ドメインをコードする塩基配列、並びに、
ＬＡＭＰのエンドソーム／リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
【００４７】
１つの実施形態において、本発明の核酸は、以下の核酸である：
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸：
ＬＡＭＰのシグナルペプチドをコードする塩基配列、
ＬＡＭＰの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
Ｌｉｔ  ｖ  １、Ｌｉｔ  ｖ  ４及びＬｉｔ  ｖ  ３を順番に含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
ＬＡＭＰの膜貫通ドメインをコードする塩基配列、並びに、
ＬＡＭＰのエンドソーム／リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
【００４８】
１つの実施形態において、本発明の核酸は、以下の核酸である：
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸：
ＬＡＭＰ−１のシグナルペプチドをコードする塩基配列、
ＬＡＭＰ−１の細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
Ｌｉｔ  ｖ  １、Ｌｉｔ  ｖ  ４及びＬｉｔ  ｖ  ３を順番に含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
ＬＡＭＰ−１の膜貫通ドメインをコードする塩基配列、並びに、
ＬＡＭＰ−１のエンドソーム／リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
【００４９】
１つの実施形態において、本発明の核酸は、以下の核酸である：
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸：
配列番号２のアミノ酸番号１から２７までのアミノ酸配列からなるシグナルペプチドをコードする塩基配列、
配列番号２のアミノ酸番号２８から３８０までのアミノ酸配列からなるＬＡＭＰの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
配列番号２のアミノ酸番号３８３から６６６までのアミノ酸配列からなるＬｉｔ  ｖ  １、配列番号２のアミノ酸番号６７１から８６３までのアミノ酸配列からなるＬｉｔ  ｖ  ４及び配列番号２のアミノ酸番号８６８から１０４４までのアミノ酸配列からなるＬｉｔ  ｖ  ３を順番に含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
配列番号２のアミノ酸番号１０４８から１０７０までのアミノ酸配列からなる膜貫通ドメインをコードする塩基配列、並びに、
配列番号２のアミノ酸番号１０７９から１０８２までのアミノ酸配列からなるＬＡＭＰのエンドソーム／リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
【００５０】
１つの実施形態において、本発明の核酸は、以下の核酸である：
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸：
配列番号２のアミノ酸番号１から２７までのアミノ酸配列からなるシグナルペプチドをコードする塩基配列、
配列番号２のアミノ酸番号２８から３８０までのアミノ酸配列からなるＬＡＭＰの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
配列番号２のアミノ酸番号３８３から６６６までのアミノ酸配列からなるＬｉｔ  ｖ  １、配列番号２のアミノ酸番号６７１から８６３までのアミノ酸配列からなるＬｉｔ  ｖ  ４  及び配列番号２のアミノ酸番号８６８から１０４４までのアミノ酸配列からなるＬｉｔ  ｖ  ３を順番に含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
配列番号２のアミノ酸番号１０４８から１０７０までのアミノ酸配列からなる膜貫通ドメインをコードする塩基配列、
配列番号２のアミノ酸番号１０７１から１０７８までのアミノ酸配列からなるペプチドリンカーをコードする塩基配列、並びに、
配列番号２のアミノ酸番号１０７９から１０８２までのアミノ酸配列からなるＬＡＭＰのエンドソーム／リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
【００５１】
本発明の核酸は、本発明に関するキメラタンパク質をコードし、該核酸がヒト又は動物に投与された場合にＬｉｔ  ｖ  １、Ｌｉｔ  ｖ  ４及びＬｉｔ  ｖ  ３からなる群から選ばれるアレルゲンに対するＴｈ１型免疫を誘導する作用を有する限り、特に限定されない。ある核酸がヒト又は動物に投与された場合に、該核酸が上記アレルゲンに対するＴｈ１型免疫を誘導する作用を有するか否かは、例えば実施例３及び／又は実施例４に記載の方法で確認することができる。また、本発明の核酸は、該核酸がヒト又は動物に投与された場合にＴｈ１細胞優位の免疫反応を誘導する作用を有する核酸であってもよい。ある核酸がヒト又は動物に投与された場合に、該核酸がＴｈ１細胞優位の免疫反応を誘導する作用を有するか否かは、例えば実施例４に記載の方法で確認することができる。
【００５２】
１つの実施形態において、本発明の核酸は、以下の核酸である：
配列番号２に示されるアミノ酸配列との同一性が、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％又は９９％以上であるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸。
【００５３】
１つの実施形態において、本発明の核酸は、以下の核酸である：
配列番号２に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸。
【００５４】
１つの実施形態において、本発明の核酸は、以下の核酸である：
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質、又は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列からなるキメラタンパク質、をコードする塩基配列を含む核酸。
【００５５】
１つの実施形態において、本発明の核酸は、以下の核酸である：
配列番号２に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該核酸は、Ｌｉｔ  ｖ  １、Ｌｉｔ  ｖ  ４及びＬｉｔ  ｖ  ３からなる群から選ばれるアレルゲンに対するＴｈ１型免疫を誘導する作用を有する、核酸。
【００５６】
１つの実施形態において、本発明の核酸は、以下の核酸である：
ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸、又は、
ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該核酸は、Ｌｉｔ  ｖ  １、Ｌｉｔ  ｖ  ４及びＬｉｔ  ｖ  ３からなる群から選ばれるアレルゲンに対するＴｈ１型免疫を誘導する作用を有する、核酸。
【００５７】
１つの実施形態において、本発明の核酸は、以下の核酸である：
配列番号２に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該核酸は、Ｌｉｔ  ｖ  １、Ｌｉｔ  ｖ  ４及びＬｉｔ  ｖ  ３に対するＴｈ１型免疫を誘導する作用を有する、核酸。
【００５８】
１つの実施形態において、本発明の核酸は、以下の核酸である：
ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸、又は、
ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該核酸は、Ｌｉｔ  ｖ  １、Ｌｉｔ  ｖ  ４及びＬｉｔ  ｖ  ３に対するＴｈ１型免疫を誘導する作用を有する、核酸。
【００５９】
１つの実施形態において、本発明の核酸は、以下の核酸である：
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸。
【００６０】
１つの実施形態において、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列とは、配列番号１に示される塩基配列である。
【００６１】
本発明の核酸は、その塩基配列に基づき、当該分野で公知の方法を使用して、当業者によって容易に作製され得る。例えば、本発明の核酸は、当該分野で公知の遺伝子合成方法を利用して合成することが可能である。このような遺伝子合成方法としては、国際公開番号９０／０７８６１号に記載の抗体遺伝子の合成方法等の当業者に公知の種々の方法が使用され得る。
【００６２】
本発明の核酸は、一度合成された後には、当該分野で公知の方法を使用して、当業者によって容易に複製され得る。例えば、本発明の核酸は、後述の＜本発明の核酸を生産する方法及び該方法により生産できる核酸＞に記載の方法で、複製することが可能である。
【００６３】
＜本発明の発現ベクター＞
本発明の発現ベクターには、本発明の核酸を含む発現ベクターが含まれる。
【００６４】
本発明の核酸からキメラタンパク質を発現させるために用いる発現ベクターとしては、動物細胞中で本発明の核酸からキメラタンパク質を発現できるものである限り、特に制限されるものではない。１つの実施形態において、本発明の核酸からキメラタンパク質を発現させるために用いる発現ベクターは、ヒト体内においてキメラタンパク質を発現させるために用いることのできる発現ベクターである。本発明に用いる発現ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス）等が挙げられる。１つの実施形態において、本発明に用いる発現ベクターは、プラスミドベクターである。本明細書において、「プラスミド」とは、プラスミドベクターを意味する。
【００６５】
本発明の発現ベクターは、本発明の核酸に機能可能に連結されたプロモーターを含み得る。動物細胞で本発明の核酸からキメラタンパク質を発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ＣＭＶ（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）、ＲＳＶ（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）、ＳＶ４０（ｓｉｍｉａｎ  ｖｉｒｕｓ  ４０）等のウイルス由来プロモーター、アクチンプロモーター、ＥＦ（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）１αプロモーター、ヒートショックプロモーター等が挙げられる。１つの実施形態において、本発明の発現ベクターに含まれるプロモーターは、ＣＭＶプロモーターである。本発明の発現ベクターは、開始コドン及び終止コドンを含み得る。この場合、エンハンサー配列、非翻訳領域、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位、又は複製可能単位等を含んでいてもよい。
【００６６】
１つの実施形態において、本発明の発現ベクターは、以下の核酸を含む発現ベクターである：
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸：
配列番号２のアミノ酸番号１から２７までのアミノ酸配列からなるシグナルペプチドをコードする塩基配列、
配列番号２のアミノ酸番号２８から３８０までのアミノ酸配列からなるＬＡＭＰの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
配列番号２のアミノ酸番号３８３から６６６までのアミノ酸配列からなるＬｉｔ  ｖ  １、配列番号２のアミノ酸番号６７１から８６３までのアミノ酸配列からなるＬｉｔ  ｖ  ４及び配列番号２のアミノ酸番号８６８から１０４４までのアミノ酸配列からなるＬｉｔ  ｖ  ３を含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
配列番号２のアミノ酸番号１０４８から１０７０までのアミノ酸配列からなる膜貫通ドメインをコードする塩基配列、並びに、
配列番号２のアミノ酸番号１０７９から１０８２までのアミノ酸配列からなるＬＡＭＰのエンドソーム／リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
【００６７】
１つの実施形態において、本発明の発現ベクターは、以下の核酸を含む発現ベクターである：
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸：
配列番号２のアミノ酸番号１から２７までのアミノ酸配列からなるシグナルペプチドをコードする塩基配列、
配列番号２のアミノ酸番号２８から３８０までのアミノ酸配列からなるＬＡＭＰの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
配列番号２のアミノ酸番号３８３から６６６までのアミノ酸配列からなるＬｉｔ  ｖ  １、配列番号２のアミノ酸番号６７１から８６３までのアミノ酸配列からなるＬｉｔ  ｖ  ４及び配列番号２のアミノ酸番号８６８から１０４４までのアミノ酸配列からなるＬｉｔ  ｖ  ３を含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
配列番号２のアミノ酸番号１０４８から１０７０までのアミノ酸配列からなる膜貫通ドメインをコードする塩基配列、
配列番号２のアミノ酸番号１０７１から１０７８までのアミノ酸配列からなるペプチドリンカーをコードする塩基配列、並びに、
配列番号２のアミノ酸番号１０７９から１０８２までのアミノ酸配列からなるＬＡＭＰのエンドソーム／リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
【００６８】
１つの実施形態において、本発明の発現ベクターは、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸を含む発現ベクターである。
【００６９】
１つの実施形態において、本発明の発現ベクターは、配列番号１に示される塩基配列を含む核酸を含む発現ベクターである。
【００７０】
１つの実施形態において、本発明の発現ベクターは、配列番号３に示される塩基配列からなる核酸を含む発現ベクターである。
【００７１】
＜本発明の宿主細胞＞
本発明の宿主細胞には、本発明の核酸で形質転換された宿主細胞が含まれる。１つの実施形態において、本発明の宿主細胞は、本発明の発現ベクターで形質転換された宿主細胞である。１つの実施形態において、本発明の宿主細胞は、プラスミドベクターである本発明の発現ベクターで形質転換された宿主細胞である。
【００７２】
本発明の核酸で形質転換される宿主細胞としては、特に限定されないが、核酸の複製に使用し得る細胞である限り、当該分野で公知の細胞を選択することができる。
【００７３】
核酸の複製に使用し得る宿主細胞としては、例えば、本発明の技術分野において通常使用される天然細胞又は人工的に樹立された細胞等種々の細胞（例えば、動物細胞（例えば、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞等）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９等）、細菌（大腸菌等）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属等）等）が挙げられる。１つの実施形態において、大腸菌を宿主細胞として使用することができる。形質転換自体は、公知の方法で実施することができる。
【００７４】
＜本発明の核酸を生産する方法及び該方法により生産できる核酸＞
本発明の核酸を生産する方法には、本発明の核酸又は発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養する工程を含む、核酸又は発現ベクターを生産する方法が含まれる。１つの実施形態において、本発明の核酸を生産する方法は、本発明の核酸で形質転換された宿主細胞を培養し、本発明の核酸を複製する工程を含む。
１つの実施形態において、本発明の核酸を生産する方法は、本発明の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養し、本発明の発現ベクターを複製する工程を含む。
【００７５】
１つの実施形態において、本発明の核酸を生産する方法に使用される宿主細胞は、大腸菌である。大腸菌の培養には、適切な培地、例えば、ＬＢ培地、Ｍ９培地、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ培地、ＳＯＢ培地、ＳＯＣ培地、又は、２×ＹＴ培地等を選択することができる。また、当該大腸菌の培養は、炭素（資化可能な炭素化合物であれば特に限定されず、例えば、グリセリン等のポリオール類、又は、ピルビン酸、コハク酸若しくはクエン酸等の有機酸類）、窒素（大腸菌が利用可能な窒素化合物であれば特に限定されず、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物、又はアンモニア若しくはその塩）、無機物及び無機イオン（特に限定されるものではないが、例えば、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン及び亜鉛）、ビタミン源並びに消泡剤等が適正濃度に制御された環境で行うことができる。また、培養の制御には、ｐＨ、温度、攪拌、空気流、溶存酸素等のパラメータの制御が含まれる。１つの実施形態において、培養の条件は、ｐＨが６．７から７．５、温度が２０から３７℃、及び、攪拌速度が２００から３００ｒｐｍの範囲である。
【００７６】
本発明の核酸を生産する方法は、回収した培養液からライセート（溶菌液）を得る工程を含んでもよい。ライセートは、例えば、回収した培養液をアルカリ溶解法又はボイリング法で処理することで得ることができる。また、ライセートを得る工程には、最終的な溶解物を滅菌ろ過する工程を含んでもよい。
【００７７】
本発明の核酸を生産する方法は、さらに、ライセートから核酸又は発現ベクターを精製する工程を含んでもよい。ライセートからの核酸又は発現ベクターの精製には、イオン交換クロマトグラフィー及び／又は疎水相互作用クロマトグラフィーを用いることができる。ライセートから核酸又は発現ベクターを精製する工程には、限外ろ過及び／又は透析ろ過をする工程を含んでもよい。また、精製の工程の最終処置として、滅菌ろ過をする工程を含んでもよい。
【００７８】
１つの実施形態において、本発明の核酸は、本発明の核酸を生産する方法により生産された核酸である。
【００７９】
１つの実施形態において、本発明の発現ベクターは、本発明の核酸を生産する方法により生産された発現ベクターである。
【００８０】
＜本発明の医薬組成物＞
本発明の医薬組成物には、本発明の核酸、及び、薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物が含まれる。１つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、本発明のベクター、及び、薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物である。本発明の医薬組成物は、当該分野において通常用いられている賦形剤、即ち、薬剤用賦形剤や薬剤用担体等を用いて、通常使用される方法によって調製することができる。これら医薬組成物の剤型の例としては、例えば、注射剤、点滴用剤等の非経口剤が挙げられ、静脈内投与、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与等により投与することができる。製剤化にあたっては、薬学的に許容される範囲で、これら剤型に応じた賦形剤、担体、添加剤等を使用することができる。
【００８１】
１つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、本発明の核酸又は発現ベクター、及び、薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物である。
【００８２】
本発明の核酸又は発現ベクターの投与量は、患者の症状の程度や年齢、使用する製剤の剤型等により異なるが、例えば、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ程度を用いることができる。また、そのような投与量に対応する量の本発明の核酸又は発現ベクターを添加して、製剤化することができる。
【００８３】
本発明の医薬組成物は、Ｌｉｔ  ｖ  １、Ｌｉｔ  ｖ  ４及びＬｉｔ  ｖ  ３から選択されるアレルゲンに起因するアレルギーの予防又は治療剤として用いることができる。また、本発明の医薬組成物は、甲殻類アレルギーの予防又は治療剤として用いることができる。
【００８４】
本発明には、本発明の核酸を含む、アレルギーの予防又は治療用医薬組成物が含まれる。また、本発明には、本発明の核酸の予防有効量又は治療有効量を投与する工程を包含する、アレルギーを治療又は予防する方法が含まれる。また、本発明には、アレルギーの予防又は治療に使用するための、本発明の核酸が含まれる。また、本発明には、アレルギーの予防又は治療用医薬組成物の製造における、本発明の核酸の使用が含まれる。１つの実施形態において、上記アレルギーは、Ｌｉｔ  ｖ  １、Ｌｉｔ  ｖ  ４及びＬｉｔ  ｖ  ３からなる群から選ばれるアレルゲンに起因するアレルギーである。また、１つの実施形態において、上記アレルギーは、Ｌｉｔ  ｖ  １、Ｌｉｔ  ｖ  ４及びＬｉｔ  ｖ  ３からなる群から選ばれるアレルゲンに反応する抗体を有するアレルギー患者が罹患しているアレルギーである。さらに、１つの実施形態において、上記アレルギーは、甲殻類アレルギーである。
【００８５】
１つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、以下の核酸及び薬学的に許容される賦形剤を含む、アレルギーの予防又は治療用医薬組成物である：
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸：
配列番号２のアミノ酸番号１から２７までのアミノ酸配列からなるシグナルペプチドをコードする塩基配列、
配列番号２のアミノ酸番号２８から３８０までのアミノ酸配列からなるＬＡＭＰの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
配列番号２のアミノ酸番号３８３から６６６までのアミノ酸配列からなるＬｉｔ  ｖ  １、配列番号２のアミノ酸番号６７１から８６３までのアミノ酸配列からなるＬｉｔ  ｖ  ４及び配列番号２のアミノ酸番号８６８から１０４４までのアミノ酸配列からなるＬｉｔ  ｖ  ３を含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
配列番号２のアミノ酸番号１０４８から１０７０までのアミノ酸配列からなる膜貫通ドメインをコードする塩基配列、並びに、
配列番号２のアミノ酸番号１０７９から１０８２までのアミノ酸配列からなるＬＡＭＰのエンドソーム／リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
【００８６】
１つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸及び薬学的に許容される賦形剤を含む、アレルギーの予防又は治療用医薬組成物である。
【００８７】
本発明には、本発明の発現ベクターを含む、アレルギーの予防又は治療用医薬組成物が含まれる。また、本発明には、本発明の発現ベクターの予防有効量又は治療有効量を投与する工程を包含する、アレルギーを治療又は予防する方法が含まれる。また、本発明には、アレルギーの予防又は治療に使用するための、本発明の発現ベクターが含まれる。また、本発明には、アレルギーの予防又は治療用医薬組成物の製造における、本発明の発現ベクターの使用が含まれる。１つの実施形態において、上記アレルギーは、Ｌｉｔ  ｖ  １、Ｌｉｔ  ｖ  ４及びＬｉｔ  ｖ  ３からなる群から選ばれるアレルゲンに起因するアレルギーである。また、１つの実施形態において、上記アレルギーは、Ｌｉｔ  ｖ  １、Ｌｉｔ  ｖ  ４及びＬｉｔ  ｖ  ３からなる群から選ばれるアレルゲンに反応する抗体を有するアレルギー患者が罹患しているアレルギーである。さらに、１つの実施形態において、上記アレルギーは、甲殻類アレルギーである。
【００８８】
１つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、以下の核酸及び薬学的に許容される賦形剤を含む発現ベクターを含む、アレルギーの予防又は治療用医薬組成物である：
キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、該塩基配列は、以下の塩基配列を順番に含む塩基配列である、核酸：
配列番号２のアミノ酸番号１から２７までのアミノ酸配列からなるシグナルペプチドをコードする塩基配列、
配列番号２のアミノ酸番号２８から３８０までのアミノ酸配列からなるＬＡＭＰの細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、
配列番号２のアミノ酸番号３８３から６６６までのアミノ酸配列からなるＬｉｔ  ｖ  １、配列番号２のアミノ酸番号６７１から８６３までのアミノ酸配列からなるＬｉｔ  ｖ  ４及び配列番号２のアミノ酸番号８６８から１０４４までのアミノ酸配列からなるＬｉｔ  ｖ  ３を含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、
配列番号２のアミノ酸番号１０４８から１０７０までのアミノ酸配列からなる膜貫通ドメインをコードする塩基配列、並びに、
配列番号２のアミノ酸番号１０７９から１０８２までのアミノ酸配列からなるＬＡＭＰのエンドソーム／リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列。
【００８９】
１つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸を含む発現ベクター及び薬学的に許容される賦形剤を含む、アレルギーの予防又は治療用医薬組成物である。
【００９０】
本発明についてさらに理解を得るために参照する特定の実施例をここに提供するが、これらは例示目的とするものであって、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００９１】
特に断りがない場合は、以下の実施例に記載の工程は、公知の方法に従って実施可能である。また、市販の試薬やキット等を用いる場合には、当該工程は市販品の指示書に従って実施可能である。【００９２】
［実施例１：ＬＡＭＰ−Ｌｉｔ  ｖ  １−Ｌｉｔ  ｖ  ４−Ｌｉｔ  ｖ  ３プラスミドの構築］
配列番号３に示される塩基配列からなるＬＡＭＰ−Ｌｉｔ  ｖ  １−Ｌｉｔ  ｖ  ４−Ｌｉｔ  ｖ  ３プラスミド（以下の塩基配列を順番に含む塩基配列（すなわち、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質をコードする塩基配列）を含む核酸を含む発現ベクター：ＬＡＭＰ−１のシグナルペプチドをコードする塩基配列、ＬＡＭＰ−１の細胞小器官内安定化ドメインをコードする塩基配列、Ｌｉｔ  ｖ  １、Ｌｉｔ  ｖ  ４及びＬｉｔ  ｖ  ３を順番に含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列、ＬＡＭＰ−１の膜貫通ドメインをコードする塩基配列、並びに、ＬＡＭＰ−１のエンドソーム／リソソーム標的ドメインをコードする塩基配列）を構築した。当該プラスミドは、日本国特許第５８０７９９４号の配列番号６に記載のプラスミドのＥｃｏ  ＲＩ−Ｘｈｏ  Ｉサイトに、配列番号１の塩基番号１１４７から３１３２までの塩基配列（Ｌｉｔ  ｖ  １、Ｌｉｔ  ｖ  ４及びＬｉｔ  ｖ  ３を順番に含むアレルゲンドメインをコードする塩基配列）の５’末側にＸｈｏ  Ｉ認識配列、３’末側にＥｃｏ  ＲＩ認識配列を付加した合成ＤＮＡを挿入することで構築することができる。構築したＬＡＭＰ−Ｌｉｔ  ｖ  １−Ｌｉｔ  ｖ  ４−Ｌｉｔ  ｖ  ３プラスミドで大腸菌を形質転換し、液体培養を行った。培養液から遠心分離法により菌体を回収し、一般的なプラスミド抽出精製法（ミニプレップ法）に準じた方法を用いて、増幅したＬＡＭＰ−Ｌｉｔ  ｖ  １−Ｌｉｔ  ｖ  ４−Ｌｉｔ  ｖ  ３プラスミドを得た。【００９３】
［実施例２：ＬＡＭＰ−Ｌｉｔ  ｖ  １−Ｌｉｔ  ｖ  ４−Ｌｉｔ  ｖ  ３キメラタンパク質の発現］
ヒト胎児腎由来２９３Ｔ細胞株を用いてＬＡＭＰ−Ｌｉｔ  ｖ  １−Ｌｉｔ  ｖ  ４−Ｌｉｔ  ｖ  ３キメラタンパク質（配列番号１に示される塩基配列がコードするアミノ酸配列（すなわち配列番号２に示されるアミノ酸配列）からなるキメラタンパク質）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現を評価した。【００９４】
（１）細胞培養及びプラスミド導入
ヒト胎児腎由来２９３Ｔ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社  Ｃａｔ．ＨＣＬ４５１７ ）を、１０％  ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社、Ｃａｔ．ＳＨ３００７０．０３）及び１００倍希釈のペニシリン−ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．１５０７００６３）を含むＤ−ＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｃａｔ．Ｄ５７９６）に懸濁し、６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ社、Ｃａｔ．３８１０−００６）に３×１０5ｃｅｌｌｓ／ウェルずつ播種した。播種した細胞を３７℃、５％  ＣＯ２存在下で一晩培養後、ＬＡＭＰ−Ｌｉｔ  ｖ  １−Ｌｉｔ  ｖ  ４−Ｌｉｔ  ｖ  ３プラスミド：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００  （Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社  Ｃａｔ．１１６６８０２７）＝２．５（μｇ）：１０（μＬ）の混合液を２５０μＬ添加した。さらに、細胞を３７℃、５％  ＣＯ2存在下で一晩培養後、培地を除去し、ＰＢＳで一回洗浄した後、ウェスタンブロッティングに供した。【００９５】
（２）ウェスタンブロッティング
サンプル作製：細胞をプロテアーゼインヒビター（ロシュ  ダイアグノスティックス社  Ｃａｔ．１１８７３５８０）を含むＲＩＰＡバッファー（Ｐｉｅｒｃｅ社  Ｃａｔ．８９９００）にて溶解し、２００００×ｇ、５分間の遠心分離を行い、遠心分離後の上清のタンパク質濃度をＤＣ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社  Ｃａｔ．５００−０１１２）を用いて測定した。タンパク質濃度が２００μｇ／ｍＬになるようにプロテアーゼインヒビターを含むＰＢＳで希釈した上清５μＬに、１００ｍＭ  ＤＴＴを含むＬＤＳサンプルバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社  Ｃａｔ．ＮＰ０００７）５μＬを添加し、７０℃で１０分間加熱処理し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供するサンプルを作製した。【００９６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：前述のサンプルをＮｕＰＡＧＥ（登録商標）  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．ＮＰ０３２３）にアプライし、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）  ＭＯＰＳ  ＳＤＳ  Ｒｕｎｎｉｎｇバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．ＮＰ０００１）中にて、２００Ｖの定電圧で電気泳動を行った。
ブロッティング：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のＧｅｌにＰＶＤＦメンブレン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社  Ｃａｔ．ＬＣ２００５ ）を接触させ、２０％  メタノール含有ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）  Ｔｒａｎｓｆｅｒバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．ＮＰ０００６）を満たしたＸＣｅｌｌ  II  Ｂｌｏｔ  Ｍｏｄｕｌｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．ＥＩ９０５１）中にて、１８０ｍＡで７０分間通電し、ブロッティングを行った。
ブロッキング:Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｏｎｅ（ナカライテスク社、Ｃａｔ．０３９５３−９５）に通電後のメンブレンを浸漬し、室温で１時間振盪した。
１次抗体：Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＬＡＭＰ１抗体（Ｓｉｎｏ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社、Ｃａｔ．１１２１５−ＲＰ０１）を、１０％  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｏｎｅを含むＴＢＳ  Ｔｗｅｅｎ−２０バッファー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．２８３６０）で１０００倍希釈した溶液にメンブレンを浸漬し、４℃で一晩振盪した。
２次抗体：ＴＢＳ  Ｔｗｅｅｎ−２０バッファーでメンブレンを洗浄した。Ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ  ｃｈａｉｎ）ｐＡｂ−ＨＲＰ（ＭＢＬ社、Ｃａｔ．４５８）を、１０％  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｏｎｅを含むＴＢＳ  Ｔｗｅｅｎ−２０バッファーで３０００倍に希釈した液体にメンブレンを浸漬し、室温で１時間振盪した。
検出：ＴＢＳ  Ｔｗｅｅｎ−２０バッファーでメンブレンを洗浄した。ＥＣＬ  ｐｒｉｍｅ  ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、Ｃａｔ．ＲＰＮ２２３２）にメンブレンを浸漬し、ＬｕｍｉＶｉｓｉｏｎ  ＰＲＯ  ４００ＥＸ（アイシン精機株式会社）で画像を検出した。当該画像において、キメラタンパク質に該当するａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＬＡＭＰ１抗体に反応するバンドが検出された。【００９７】
上記試験の結果、ヒト胎児腎由来２９３Ｔ細胞株にＬＡＭＰ−Ｌｉｔ  ｖ  １−Ｌｉｔ  ｖ  ４−Ｌｉｔ  ｖ  ３プラスミドを導入することにより、細胞内でＬＡＭＰ−Ｌｉｔ  ｖ  １−Ｌｉｔ  ｖ  ４−Ｌｉｔ  ｖ  ３キメラタンパク質が発現することが確認された。【００９８】
［実施例３：ＬＡＭＰ−Ｌｉｔ  ｖ  １−Ｌｉｔ  ｖ  ４−Ｌｉｔ  ｖ  ３プラスミド投与によるＩｇＧ２ａ抗体産生誘導］
マウス  ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＩｇＧ２ａ抗体産生誘導の評価を行った。各群８例として、投与開始時６週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌性マウス（日本チャールス・リバー社）の耳に、多価プラスミド群として５μｇのＬＡＭＰ−Ｌｉｔ  ｖ  １−Ｌｉｔ  ｖ  ４−Ｌｉｔ  ｖ  ３プラスミドを含むＰＢＳ溶液２５μＬを１週間毎に３回（Ｄａｙ  ０、７、１４）皮内投与し、最終投与３週間後（Ｄａｙ  ３５）に採血し血漿サンプルを取得した。比較対照には、単価プラスミドミックス群として、各プラスミドにつき５μｇのＬＡＭＰ−Ｌｉｔ  ｖ  １プラスミド（以下の塩基配列を順番に含む塩基配列を含む核酸を含む発現ベクター：配列番号２のアミノ酸番号１から３８０までのアミノ酸配列（以下、実施例３及び４において、ＬＡＭＰ−１のＮ末端という）をコードする塩基配列、配列番号２のアミノ酸番号３８３から６６６までのアミノ酸配列からなるＬｉｔ  ｖ  １アレルゲンドメインをコードする塩基配列、並びに、配列番号２のアミノ酸番号１０４８から１０８２までのアミノ酸配列（以下、ＬＡＭＰ−１のＣ末端という）をコードする塩基配列）、ＬＡＭＰ−Ｌｉｔ  ｖ  ３プラスミド（以下の塩基配列を順番に含む塩基配列を含む核酸を含む発現ベクター：ＬＡＭＰ−１のＮ末端をコードする塩基配列、配列番号２のアミノ酸番号８６８から１０４４までのアミノ酸配列からなるＬｉｔ  ｖ  ３アレルゲンドメインをコードする塩基配列、並びに、ＬＡＭＰ−１のＣ末端をコードする塩基配列）、及びＬＡＭＰ−Ｌｉｔ  ｖ  ４プラスミド（以下の塩基配列を順番に含む塩基配列を含む核酸を含む発現ベクター：ＬＡＭＰ−１のＮ末端をコードする塩基配列、配列番号２のアミノ酸番号６７１から８６３までのアミノ酸配列からなるＬｉｔ  ｖ  ４アレルゲンドメインをコードする塩基配列、並びに、ＬＡＭＰ−１のＣ末端をコードする塩基配列）の混合物（以下、単価プラスミドミックスという）を含むＰＢＳ溶液２５μＬ、並びに、コントロール群としてＰＢＳ  ２５μＬを投与した。抗体価は、１％  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｃａｔ．Ａ８０２２）を含むＰＢＳにて１０倍、１００倍又は１０００倍に希釈した血漿サンプルを用い、ＥＬＩＳＡ法により測定した。抗体価の算出は、エビ抗原（Ｇｒｅｅｒ社、Ｃａｔ．ＲＭＦ３４Ｐ）を免疫したマウスから調製したＬｉｔ  ｖ  １、Ｌｉｔ  ｖ  ３及びＬｉｔ  ｖ  ４特異的抗体を高含有する血漿を標準血漿とし、該標準血漿を段階希釈して検量線を作成することにより行った。その際、標準血漿中の各アレルゲン特異的ＩｇＧ２ａ抗体価を１００Ｕ／ｍＬと定めた。ＥＬＩＳＡ測定は、テストプレートとしてＦ９６  ＭＡＸＩＳＯＲＰ  ＮＵＮＣ−ＩＭＭＵＮＯ  ＰＬＡＴＥ（Ｎｕｎｃ社、Ｃａｔ．４３９４５４）を用い、一般的なＥＬＩＳＡ法に準じて実施した。天然エビ抽出精製タンパク質であるＬｉｔ  ｖ  １（ＩＮＤＯＯＲ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｃａｔ．ＮＡ−ＳＴＭ−１）はＰＢＳで１μｇ／ｍＬに、組み換え精製タンパク質であるＬｉｔ  ｖ  ４（Ｓｙｓｍｅｘ社、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＫＢ：Ｃ７Ａ６３９）及びＬｉｔ  ｖ  ３（Ｓｙｓｍｅｘ社、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＫＢ：Ｂ７ＳＮＩ３）はＰＢＳで２μｇ／ｍＬに調製し、テストプレートに５０μＬ／���ェルで添加し４℃で一晩静置した。テストプレートを洗浄バッファー（ＰＢＳ  Ｔｗｅｅｎ−２０バッファー、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．２８３５２）を用いて３回洗浄した後に１％  ＢＳＡを含むＰＢＳを１００μＬ／ウェルで添加し、室温で１時間静置した。テストプレートを洗浄バッファーで３回洗浄した後に血漿サンプルを５０μＬ／ウェルで添加し、室温で１時間静置した。テストプレートを洗浄バッファーで３回洗浄した後に、１％  ＢＳＡを含むＰＢＳで５００００倍希釈した二次抗体ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ａ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅs社、Ｃａｔ．Ａ９０−１０７Ｐ）を５０μＬ／ウェルで添加し、室温で１時間静置した。テストプレートを洗浄バッファーで３回洗浄した後に、基質溶液であるＴＭＢ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（セラケア社、Ｃａｔ．５０−７６−０３）を５０μＬ／ウェルで添加し、室温にてＬｉｔ  ｖ  １は１０分間、Ｌｉｔ  ｖ  ３は３０分間、Ｌｉｔ  ｖ  ４は６０分間、それぞれ静置した後に、反応停止液（２Ｍ  Ｈ2ＳＯ4）を５０μＬ/ウェルで添加し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。【００９９】
上記試験の結果、ＬＡＭＰ−Ｌｉｔ  ｖ  １−Ｌｉｔ  ｖ  ４−Ｌｉｔ  ｖ  ３プラスミド（多価プラスミド）をマウスに投与することにより、単価プラスミドミックス投与と同程度のＬｉｔ  ｖ  １、Ｌｉｔ  ｖ  ３及びＬｉｔ  ｖ  ４特異的ＩｇＧ２ａ抗体産生が確認された（図１）。以上の結果により、ＬＡＭＰ−Ｌｉｔ  ｖ  １−Ｌｉｔ  ｖ  ４−Ｌｉｔ  ｖ  ３プラスミドは、プラスミドにコードされた全てのアレルゲンについてＴｈ１免疫応答を誘導し、活性化されたＢ細胞のＩｇＧ２ａアイソタイプへのクラススイッチを起こすことが示唆された。【０１００】
［実施例４：ＬＡＭＰ−Ｌｉｔ  ｖ  １−Ｌｉｔ  ｖ  ４−Ｌｉｔ  ｖ  ３プラスミドによるＩＦＮ−γ及びＩＬ−４産生誘導］
ＬＡＭＰ−Ｌｉｔ  ｖ  １−Ｌｉｔ  ｖ  ４−Ｌｉｔ  ｖ  ３プラスミドを投与したマウスから採取した脾細胞をアレルゲンで刺激した際のＩＦＮ−γ及びＩＬ−４産生誘導の評価を行った。実施例３で使用した、ＬＡＭＰ−Ｌｉｔ  ｖ  １−Ｌｉｔ  ｖ  ４−Ｌｉｔ  ｖ  ３プラスミドを投与したマウスを最終投与３週間後（Ｄａｙ  ３５）に屠殺し、脾臓を摘出した。摘出した脾臓から、一般的な方法に従い脾細胞を調製した。調製した脾細胞を１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社、Ｃａｔ．ＳＨ３００７０．０３）及び１００倍希釈のペニシリン−ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社、Ｃａｔ．１５０７００６３）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（シグマ社、Ｃａｔ．Ｒ８７５８）に懸濁し、８×１０5ｃｅｌｌｓ／ウェルの細胞数となるように９６ウェルプレートに播種した。アレルゲン刺激には、エビ抽出液（診断用アレルギースクラッチエキス、トリイ社、承認番号（４０Ａ）４６８８）又はＬｉｔ  ｖ  １（ＩＮＤＯＯＲ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｃａｔ．ＮＡ−ＳＴＭ−１）を用いた。アレルゲン刺激は、脾細胞を播種したウェルに、エビ抽出液又はＬｉｔ  ｖ  １を最終濃度がそれぞれ１００μｇ／ｍＬ又は１０μｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃、５％  ＣＯ2下で７２時間培養する方法にて行い、刺激により脾細胞より培養上清中に放出されたＩＦＮ−γ及びＩＬ−４の濃度をＥＬＩＳＡ法により測定した。ＩＦＮ−γの測定には０．１％  ＢＳＡ及び０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＴＢＳバッファーで１０倍希釈した上清サンプルを用い、ＩＬ−４の測定には１％  ＢＳＡを含むＰＢＳバッファーで３倍希釈した上清サンプルを用いた。ＥＬＩＳＡ測定のテストプレートとしてＦ９６  ＭＡＸＩＳＯＲＰ  ＮＵＮＣ−ＩＭＭＵＮＯ  ＰＬＡＴＥを用いた。ＥＬＩＳＡキットとして、マウスＩＦＮ−γ  ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄシステムズ社、Ｃａｔ．ＤＹ４８５）及びマウスＩＬ−４  ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄシステムズ社、Ｃａｔ．ＤＹ４０４）を用いた。実験は、ＥＬＩＳＡキットの添付プロトコールに準拠して行った。上記試験において、ＬＡＭＰ−Ｌｉｔ  ｖ  １−Ｌｉｔ  ｖ  ４−Ｌｉｔ  ｖ  ３プラスミド（多価プラスミド）投与により、単価プラスミドミックス投与と同程度のエビ抽出液及びＬｉｔ  ｖ  １特異的なＩＦＮ−γ産生を誘導することが確認された（図２）。一方、当該マウスにおいて、多価プラスミド及び単価プラスミドミックス投与により誘導されるエビ抽出液及びＬｉｔ  ｖ  １特異的なＩＬ−４産生量は検出下限値であった（図３）。以上の結果より、ＬＡＭＰ−Ｌｉｔ  ｖ  １−Ｌｉｔ  ｖ  ４−Ｌｉｔ  ｖ  ３プラスミドは、Ｔｈ１細胞優位のＴｈ１型免疫応答を誘導することが示唆された。【０１０１】
［実施例５：ＬＡＭＰ−Ｌｉｔ  ｖ  １−Ｌｉｔ  ｖ  ４−Ｌｉｔ  ｖ  ３プラスミドによるエビ抗原誘発アナフィラキシー症状抑制作用］
ＬＡＭＰ−Ｌｉｔ  ｖ  １−Ｌｉｔ  ｖ  ４−Ｌｉｔ  ｖ  ３プラスミドによるアレルギー治療効果を判定するため、以下に詳述する方法にてアナフィラキシー症状の抑制作用の評価を行った。【０１０２】
（１）エビ抗原経皮感作
７週齢ＢＡＬＢ／ｃ雌性マウス（日本チャールスリバー）の背部の毛をバリカンで剃毛し、ミリＱ水で調製した４％  ＳＤＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｔ．１５５５３０３５）をピペットにて麻酔下マウスの背部に６０μＬずつ塗布した。ケージに戻し自然乾燥させた後、タンパク濃度が５ｍｇ／ｍＬとなるように１．５％  ＮａＨＣＯ3／ＰＢＳで調製したエビ抗原（ＧＲＥＥＲ社、Ｃａｔ．ＲＮＦ３４Ｐ）を、麻酔下マウスの背部に０．３ｍｇ／６０μＬずつピペットで塗布した。対照として６例のマウスにはエビ抗原の代わりに１．５％  ＮａＨＣＯ3／ＰＢＳを６０μＬずつ塗布した。この１連の操作を塗布開始日より週３回、２週間実施した（Ｄａｙ  ０、２、４、７、９、１１）。各群の感作レベルを均一にするため、Ｄａｙ  １４に血漿試料を採取し、実施例３の記載の方法、及び書籍（免疫測定法 基礎から先端まで、生物化学的測定研究会、 小林 典裕、２０１４）に記載されている一般的測定法に準じてＬｉｔ  ｖ  １特異的ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ抗体価を測定し、等数法により群分けを行った。【０１０３】
（２）ＬＡＭＰ−Ｌｉｔ  ｖ  １−Ｌｉｔ  ｖ  ４−Ｌｉｔ  ｖ  ３プラスミドの皮内免疫
（１）にて群分けした各群８例のエビ抗原感作マウスの耳に、０．５μｇ、５μｇ、５０μｇ／２０μＬ  ＰＢＳのＬＡＭＰ−Ｌｉｔ  ｖ  １−Ｌｉｔ  ｖ  ４−Ｌｉｔ  ｖ  ３プラスミド又はコントロールとして２０μＬのＰＢＳを１週間毎に４回（Ｄａｙ  ２１、２８、３５，４２）皮内投与した。また非感作マウス６例にも２０μＬのＰＢＳを同様に皮内投与した。【０１０４】
（３）エビ抗原によるアレルギー症状の誘発
Ｄａｙ  ５０に、１．５％  ＮａＨＣＯ3／ＰＢＳで０．５ｍｇ／ｍＬに調製したエビ抗原をマウス１匹当たり０．１ｍｇ／２００μＬずつ腹腔内投与し、抗原投与前、投与後１５分、３０分、４５分、６０分の直腸温をマウス用体温記録計（エー・アンド・デイ社、Ｃａｔ．ＡＤ−１６８７）を用いて測定した。また抗原投与後６０分間で認められたアレルギー症状を１から５点で採点した。症状の判定は文献（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ 、２０１３、Ｖｏｌ．１３１、ｐ．２１３−２２１）の判定基準に準じて行った。【０１０５】
肥満細胞脱顆粒の程度を測定するため、アレルギー症状誘発６０分後の血漿を採取し、マウス肥満細胞プロテアーゼ１（ｍＭＣＰＴ−１）の血漿中濃度を測定した。ＥＬＩＳＡキットはマウスＭＣＰＴ−１  Ｕｎｃｏａｔｅｄ  ＥＬＩＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．８８−７５０３）を用い、測定は添付プロトコールに準拠して行った。ＥＬＩＳＡ測定のテストプレートとしてＦ９６  ＭＡＸＩＳＯＲＰ  ＮＵＮＣ−ＩＭＭＵＮＯ  ＰＬＡＴＥを用いた。測定値としてはキットに付属の希釈液により１０倍、２００倍、４００００倍希釈した血漿サンプルを調製して測定し、キット付属の標準サンプル検量線範囲に入る希釈倍率の測定結果を採用した。【０１０６】
上記試験の結果より、マウスにおいて、ＬＡＭＰ−Ｌｉｔ  ｖ  １−Ｌｉｔ  ｖ  ４−Ｌｉｔ  ｖ  ３プラスミドはコントロール群と比較して、エビ抗原投与による体温低下の抑制、及びアレルギー症状の緩和をもたらすことを示した（図４）。加えて、症状誘発６０分後の血漿中脱顆粒がＬＡＭＰ−Ｌｉｔ  ｖ  １−Ｌｉｔ  ｖ  ４−Ｌｉｔ  ｖ  ３プラスミド投与により抑制されることを確認した（図５）。これらの結果はＬＡＭＰ−Ｌｉｔ  ｖ  １−Ｌｉｔ  ｖ  ４−Ｌｉｔ  ｖ  ３プラスミドが治療的処置に使用できることを示す。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
本発明の核酸は、甲殻類アレルギーの予防又は治療に有用であることが期待される。また、本発明の核酸を生産する方法は、前記核酸を生産するのに有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１０８】
以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号１で示される塩基配列は、ＬＡＭＰ−Ｌｉｔ  ｖ  １−Ｌｉｔ  ｖ  ４−Ｌｉｔ  ｖ  ３キメラタンパク質をコードする塩基配列であり、配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列は、配列番号１によりコードされるアミノ酸配列である。また、配列番号３で示される塩基配列は、ＬＡＭＰ−Ｌｉｔ  ｖ  １−Ｌｉｔ  ｖ  ４−Ｌｉｔ  ｖ  ３プラスミドの塩基配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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