(57)【要約】  対象タンパク質が封入されたウイルス様粒子であって、前記ウイルス様粒子はＧａｇタンパク質を含み、前記Ｇａｇタンパク質は前記対象タンパク質と２量体を形成している、ウイルス様粒子。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象タンパク質が封入されたウイルス様粒子であって、前記ウイルス様粒子はＧａｇタンパク質を含み、前記Ｇａｇタンパク質は前記対象タンパク質と２量体を形成している、ウイルス様粒子。
【請求項２】
前記Ｇａｇタンパク質及び前記対象タンパク質の一方がＦＫ５０６−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＦＫＢＰ１２）との融合タンパク質であり、他方がＦＫＢＰ１２−ｒａｐａｍｙｃｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １，ＦＲＡＰ１  ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＦＲＢ）との融合タンパク質であり、
前記２量体において、前記ＦＫＢＰ１２と、ラパマイシン又はラパマイシン誘導体と、前記ＦＲＢとが結合している、請求項１に記載のウイルス様粒子。
【請求項３】
前記対象タンパク質がＣａｓファミリータンパク質である、請求項１又は２に記載のウイルス様粒子。
【請求項４】
第１のリボザイム配列及び第２のリボザイム配列に挟まれたｇＲＮＡ配列並びにパッケージングシグナル配列を有するｍＲＮＡ又は前記ｍＲＮＡの自己切断産物が更に封入された、請求項３に記載のウイルス様粒子。
【請求項５】
ゲノム編集された細胞の製造方法であって、前記細胞に請求項４に記載のウイルス様粒子を接種することを含む方法。
【請求項６】
下記工程（１）、（２）を含む、対象タンパク質が封入されたウイルス様粒子の製造方法：
（１）ラパマイシン又はラパマイシン誘導体の存在下で、
細胞に、ＦＫＢＰ１２とＧａｇタンパク質との融合タンパク質、及び、ＦＲＢと対象タンパク質との融合タンパク質、又は、
ＦＲＢとＧａｇタンパク質との融合タンパク質、及び、ＦＫＢＰ１２と対象タンパク質との融合タンパク質、
を発現させる工程、
（２）前記対象タンパク質が封入されたウイルス様粒子を含む培地を得る工程。
【請求項７】
前記工程（１）において、前記融合タンパク質をコードする核酸を、リポフェクション法又はエレクトロポレーション法を用いて前記細胞に導入する、請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
下記工程（１）、（２）を含む、Ｃａｓファミリータンパク質及びｇＲＮＡが封入されたウイルス様粒子の製造方法：
（１）ラパマイシン又はラパマイシン誘導体の存在下で、
細胞に、ＦＫＢＰ１２とＧａｇタンパク質との融合タンパク質、及び、ＦＲＢとＣａｓファミリータンパク質との融合タンパク質、又は、
ＦＲＢとＧａｇタンパク質との融合タンパク質、及び、ＦＫＢＰ１２とＣａｓファミリータンパク質との融合タンパク質、並びに、
第１のリボザイム配列及び第２のリボザイム配列に挟まれたｇＲＮＡ配列並びにパッケージングシグナル配列を有するｍＲＮＡ、
を発現させる工程、
（２）前記Ｃａｓファミリータンパク質及びｇＲＮＡが封入されたウイルス様粒子を含む培地を得る工程。
【請求項９】
前記工程（１）において、前記融合タンパク質又は前記ｍＲＮＡをコードする核酸を、リポフェクション法又はエレクトロポレーション法を用いて前記細胞に導入する、請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
対象タンパク質が封入されたウイルス様粒子の製造用キットであって、
ＦＫＢＰ１２とＧａｇタンパク質との融合タンパク質の発現ベクター、又は、ＦＲＢとＧａｇタンパク質との融合タンパク質の発現ベクターを含む、キット。
【請求項１１】
Ｃａｓファミリータンパク質が封入されたウイルス様粒子の製造用キットであって、
ＦＫＢＰ１２とＧａｇタンパク質との融合タンパク質の発現ベクター、及び、ＦＲＢとＣａｓファミリータンパク質との融合タンパク質発現ベクター、又は、
ＦＲＢとＧａｇタンパク質との融合タンパク質の発現ベクター、及び、ＦＫＢＰ１２とＣａｓファミリータンパク質との融合タンパク質の発現ベクター、
を含む、キット。
【請求項１２】
第１のリボザイム配列及び第２のリボザイム配列に挟まれた、対象ＲＮＡの塩基配列又はマルチクローニングサイト、並びにパッケージングシグナル配列を有するｍＲＮＡの発現ベクターを更に含む、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
対象ＲＮＡが封入されたウイルス様粒子であって、
前記ウイルス様粒子はＧａｇタンパク質を含み、
前記対象ＲＮＡは、第１のリボザイム配列及び第２のリボザイム配列に挟まれた対象ＲＮＡの塩基配列並びにパッケージングシグナル配列を有するｍＲＮＡ又は前記ｍＲＮＡの自己切断産物の形態で封入されている、ウイルス様粒子。
【請求項１４】
下記工程（１）、（２）を含む、対象ＲＮＡが封入されたウイルス様粒子の製造方法：
（１）細胞に、Ｇａｇタンパク質、及び、第１のリボザイム配列及び第２のリボザイム配列に挟まれた対象ＲＮＡの塩基配列並びにパッケージングシグナル配列を有するｍＲＮＡを発現させる工程、
（２）前記細胞の培地中に、前記対象ＲＮＡが、前記ｍＲＮＡ又は前記ｍＲＮＡの自己切断産物の形態で封入された前記ウイルス様粒子を得る工程。
【請求項１５】
前記工程（１）において、前記ｍＲＮＡをコードする核酸を、リポフェクション法又はエレクトロポレーション法を用いて前記細胞に導入する、請求項１４に記載の製造方法。
【請求項１６】
対象ＲＮＡが封入されたウイルス様粒子の製造用キットであって、
Ｇａｇタンパク質の発現ベクター、並びに、
第１のリボザイム配列及び第２のリボザイム配列に挟まれた、対象ＲＮＡの塩基配列又はマルチクローニングサイト、及び、パッケージングシグナル配列を有するｍＲＮＡの発現ベクター、
を含む、キット。
【請求項１７】
請求項１〜４又は１３に記載のウイルス様粒子を有効成分として含む、遺伝子変異を原因とする疾患、感染症又はガンの治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象タンパク質及び／又は対象ＲＮＡが封入されたウイルス様粒子及びその使用に関する。より具体的には、Ｃａｓファミリータンパク質又はＣａｓファミリータンパク質／ＲＮＡ  ＲＮＰ複合体が封入されたウイルス様粒子、前記ウイルス様粒子の製造方法、前記ウイルス様粒子の製造用キット、及び、ゲノムＤＮＡを配列特異的に切断した細胞の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ  ＲＮＰ複合体等のゲノム編集酵素を細胞や生体へ導入することにより、ゲノム上の任意の場所でＤＮＡ切断、塩基置換、エピジェネティック状態の変更等を行うことができる。【０００３】
Ｃａｓ９タンパク質、Ｃａｓ９遺伝子、ｇＲＮＡ等を細胞内へ導入する方法として、脂質を用いたリポフェクション法や脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）法、物理的に導入するエレクトロポレーション法やマイクロインジェクション法、ウイルスの細胞侵入機構を利用するウイルスベクター法等、様々な方法が開発されている。【０００４】
中でも、ウイルスベクター法は広く用いられており、特に、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターやレンチウイルスベクター等は、導入効率が高く細胞毒性が低いことが知られている。【０００５】
しかしながら、ウイルスベクターによる外来遺伝子の発現は長期間持続する。このため、例えば、ウイルスベクター法により細胞内にＣａｓ９遺伝子を導入した場合、細胞内でＣａｓ９タンパク質の発現が長期間持続することになる。その結果、標的配列以外の配列を切断してしまうオフターゲット変異導入リスクが高まってしまう。【０００６】
そこで、ウイルスの複製機構や感染持続機能を排除し、ウイルスの外皮だけから構成されたウイルス様粒子（Ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ、以下、「ＶＬＰ」という場合がある。）を利用して、ウイルスの細胞侵入機構だけを利用する技術が開発されている。ＶＬＰは一度細胞内へ進入すると、内部の外来遺伝子を放出して消滅するため、一過性の発現パターンを示す点が大きな特徴である。ウイルス様粒子は、少なくとも一つ以上のウイルス由来タンパク質を含む、直径１，０００ｎｍ以下の粒子であり、脂質二重膜を持つものと持たないものに分類される。【０００７】
例えば、非特許文献１には、レンチウイルスのＧａｇ構造タンパク質とＣａｓ９タンパク質との融合タンパク質を利用して、Ｃａｓ９タンパク質をＶＬＰの内部に封入する方法が報告されている。【０００８】
また、クロンテック社より、ＶＬＰの内部へのＣａｓ９タンパク質の封入効率を高めたＧｅｓｉｃｌｅシステムが販売されている。Ｇｅｓｉｃｌｅシステムでは、膜局在型蛍光タンパク質であるＣｈｅｒｒｙＰｉｃｋｅｒとＣａｓ９タンパク質を、ｉＤｉｍｅｒｉｚｅ  Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍを利用して、化合物Ａ／Ｃ  Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚｅｒ依存的に会合させることにより、ＶＬＰの内部へのＣａｓ９タンパク質の封入効率を高めている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Choi J. G., et al., Lentivirus pre-packed with Cas9 protein for safer gene editing, Gene Therapy, vol 23, 627-633, 2016.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、非特許文献１に記載の方法では、ＶＬＰへのＣａｓ９タンパク質の封入効率及びゲノム切断効率は低かった。
また、クロンテック社のＧｅｓｉｃｌｅシステムでは、ＣｈｅｒｒｙＰｉｃｋｅｒ蛍光タンパク質がＶＬＰに特異的に取り込まれるわけではないため、Ｃａｓ９の封入効率が不十分な場合がある。【００１１】
さらに、活性のあるＣａｓ９／ｇＲＮＡ  ＲＮＰ複合体を十分量内包したＶＬＰの製造は容易ではなかった。ＶＬＰ内で活性のあるＣａｓ９／ｇＲＮＡ  ＲＮＰ複合体を形成させるには、まず、十分量のＣａｓ９とｇＲＮＡがＶＬＰに封入される必要がある。そして、ｇＲＮＡがＶＬＰに効率良く封入されるには、ｇＲＮＡがＶＬＰ産生細胞内において（核から）細胞質に輸送され、且つ、ＶＬＰの出芽時にその近傍に局在する必要がある。【００１２】
しかしながら、従来の汎用の方法では、ｇＲＮＡは産生細胞の核内に留まり易く、ＶＬＰに封入されにくいという事情があった。【００１３】
そこで、本発明は、対象タンパク質、又は、対象タンパク質及び対象ＲＮＡをウイルス様粒子（ＶＬＰ）に効率よく封入する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記従来技術が抱える課題に対し、発明者らは、ＶＬＰ産生細胞において、対象タンパク質とともにＧａｇタンパク質を発現させ、更にこれらのタンパク質をＦＫ５０６−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＦＫＢＰ１２）又はＦＫＢＰ１２−ｒａｐａｍｙｃｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １，ＦＲＡＰ１  ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＦＲＢ）のいずれか一方との融合タンパク質としてそれぞれ発現させることで、ラパマイシン化合物の存在依存的に前記対象タンパク質が効率良くＶＬＰ内に封入されることを見出した。【００１５】
さらに、発明者らは、ｇＲＮＡの配列を自己スプライシング活性を有する２つのＲＮＡ（Ｓｅｌｆ−ｃｌｅａｖｉｎｇ  ＲＮＡ、以降、リボザイムと呼ぶ場合がある）配列で挟み、その上流にレトロウイルスのパッケージングシグナルを配し、更にＬＴＲプロモーターによって転写制御されるｍＲＮＡとして発現させることで、前記ｍＲＮＡがＶＬＰ内に能動的に封入され、且つ、当該ｍＲＮＡから前記ｇＲＮＡが自動的に切り出されて、従来よりも粒子当たりのＣａｓ９活性が高いＶＬＰが得られることを見出した。
これらの結果に基づき、発明者らは本発明を完成するに至った。【００１６】
すなわち、本発明は以下の態様を含む。
［１］対象タンパク質が封入されたウイルス様粒子であって、前記ウイルス様粒子はＧａｇタンパク質を含み、前記Ｇａｇタンパク質は前記対象タンパク質と２量体を形成している、ウイルス様粒子。
［２］前記Ｇａｇタンパク質及び前記対象タンパク質の一方がＦＫ５０６−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＦＫＢＰ１２）との融合タンパク質であり、他方がＦＫＢＰ１２−ｒａｐａｍｙｃｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １，ＦＲＡＰ１  ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＦＲＢ）との融合タンパク質であり、前記２量体において、前記ＦＫＢＰ１２と、ラパマイシン又はラパマイシン誘導体と、前記ＦＲＢとが結合している、請求項１に記載のウイルス様粒子。
［３］前記対象タンパク質がＣａｓファミリータンパク質である、［１］又は［２］に記載のウイルス様粒子。
［４］第１のリボザイム配列及び第２のリボザイム配列に挟まれたｇＲＮＡ配列並びにパッケージングシグナル配列を有するｍＲＮＡ又は前記ｍＲＮＡの自己切断産物が更に封入された、［３］に記載のウイルス様粒子。
［５］ゲノム編集された細胞の製造方法であって、前記細胞に［４］に記載のウイルス様粒子を接種することを含む方法。
［６］下記工程（１）、（２）を含む、対象タンパク質が封入されたウイルス様粒子の製造方法：（１）ラパマイシン又はラパマイシン誘導体の存在下で、細胞に、ＦＫＢＰ１２とＧａｇタンパク質との融合タンパク質、及び、ＦＲＢと対象タンパク質との融合タンパク質、又は、ＦＲＢとＧａｇタンパク質との融合タンパク質、及び、ＦＫＢＰ１２と対象タンパク質との融合タンパク質、を発現させる工程、（２）前記対象タンパク質が封入されたウイルス様粒子を含む培地を得る工程。
［７］前記工程（１）において、前記融合タンパク質をコードする核酸を、リポフェクション法又はエレクトロポレーション法を用いて前記細胞に導入する、［６］に記載の製造方法。
［８］下記工程（１）、（２）を含む、Ｃａｓファミリータンパク質及びｇＲＮＡが封入されたウイルス様粒子の製造方法：（１）ラパマイシン又はラパマイシン誘導体の存在下で、細胞に、ＦＫＢＰ１２とＧａｇタンパク質との融合タンパク質、及び、ＦＲＢとＣａｓファミリータンパク質との融合タンパク質、又は、ＦＲＢとＧａｇタンパク質との融合タンパク質、及び、ＦＫＢＰ１２とＣａｓファミリータンパク質との融合タンパク質、並びに、第１のリボザイム配列及び第２のリボザイム配列に挟まれたｇＲＮＡ配列並びにパッケージングシグナル配列を有するｍＲＮＡ、を発現させる工程、（２）前記Ｃａｓファミリータンパク質及びｇＲＮＡが封入されたウイルス様粒子を含む培地を得る工程。
［９］前記工程（１）において、前記融合タンパク質又は前記ｍＲＮＡをコードする核酸を、リポフェクション法又はエレクトロポレーション法を用いて前記細胞に導入する、［８］に記載の製造方法。
［１０］対象タンパク質が封入されたウイルス様粒子の製造用キットであって、ＦＫＢＰ１２とＧａｇタンパク質との融合タンパク質の発現ベクター、又は、ＦＲＢとＧａｇタンパク質との融合タンパク質の発現ベクターを含む、キット。
［１１］Ｃａｓファミリータンパク質が封入されたウイルス様粒子の製造用キットであって、ＦＫＢＰ１２とＧａｇタンパク質との融合タンパク質の発現ベクター、及び、ＦＲＢとＣａｓファミリータンパク質との融合タンパク質発現ベクター、又は、ＦＲＢとＧａｇタンパク質との融合タンパク質の発現ベクター、及び、ＦＫＢＰ１２とＣａｓファミリータンパク質との融合タンパク質の発現ベクター、を含む、キット。
［１２］第１のリボザイム配列及び第２のリボザイム配列に挟まれた、対象ＲＮＡの塩基配列又はマルチクローニングサイト、並びにパッケージングシグナル配列を有するｍＲＮＡの発現ベクターを更に含む、［１１］に記載のキット。
［１３］対象ＲＮＡが封入されたウイルス様粒子であって、前記ウイルス様粒子はＧａｇタンパク質を含み、前記対象ＲＮＡは、第１のリボザイム配列及び第２のリボザイム配列に挟まれた対象ＲＮＡの塩基配列並びにパッケージングシグナル配列を有するｍＲＮＡ又は前記ｍＲＮＡの自己切断産物の形態で封入されている、ウイルス様粒子。
［１４］下記工程（１）、（２）を含む、対象ＲＮＡが封入されたウイルス様粒子の製造方法：（１）細胞に、Ｇａｇタンパク質、及び、第１のリボザイム配列及び第２のリボザイム配列に挟まれた対象ＲＮＡの塩基配列並びにパッケージングシグナル配列を有するｍＲＮＡを発現させる工程、（２）前記細胞の培地中に、前記対象ＲＮＡが、前記ｍＲＮＡ又は前記ｍＲＮＡの自己切断産物の形態で封入された前記ウイルス様粒子を得る工程。
［１５］前記工程（１）において、前記ｍＲＮＡをコードする核酸を、リポフェクション法又はエレクトロポレーション法を用いて前記細胞に導入する、［１４］に記載の製造方法。
［１６］対象ＲＮＡが封入されたウイルス様粒子の製造用キットであって、Ｇａｇタンパク質の発現ベクター、並びに、第１のリボザイム配列及び第２のリボザイム配列に挟まれた、対象ＲＮＡの塩基配列又はマルチクローニングサイト、及び、パッケージングシグナル配列を有するｍＲＮＡの発現ベクター、を含む、キット。
［１７］［１］〜［４］又は［１３］に記載のウイルス様粒子を有効成分として含む、遺伝子変異を原因とする疾患、感染症又はガンの治療薬。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、対象タンパク質をウイルス様粒子に効率よく封入する技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】（ａ）はＨＩＶのＧａｇ−Ｐｏｌ（以下、「ＷＴ  Ｇａｇ−ＰｏｌＨＩＶ」という場合がある。）の構造を示す模式図である。（ｂ）は、ＨＩＶのＧａｇ−ＰｏｌのＮ末端にＦＫＢＰ１２ドメインを付加した融合タンパク質（以下、「ＦＫＢＰ１２−Ｇａｇ−ＰｏｌＨＩＶ」という場合がある。）の構造を示す模式図である。（ｃ）は、ＨＩＶのＧａｇのＮ末端にＦＫＢＰ１２ドメインを付加した融合タンパク質（以下、「ＦＫＢＰ１２−ＧａｇＨＩＶ」という場合がある。）の構造を示す模式図である。
【図２】ＳＳＡ−ＥＧＦＰレポーター実験を説明する模式図である。
【図３】実験例１におけるフローサイトメーターによる解析結果を示すグラフである。
【図４】実験例１におけるウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図５】実験例１におけるフローサイトメーターによる解析結果を示すグラフである。
【図６】（ａ）は、ＦＫＢＰ１２ドメインをＶＳＶ−Ｇ（水疱性口内炎ウイルスのエンベロープタンパク質）のＣ末端（細胞質内ドメイン側）に融合した、ＶＳＶＧ−ＦＫＰＢ１２融合タンパク質の発現ベクター（ｐＨＬＳ−ＥＦ１ａ−ＶＳＶＧ−ＦＫＢＰ１２）の構造、及び、ＶＳＶＧ−ＦＫＰＢ１２融合タンパク質を含むＶＬＰの構造を示す模式図である。（ｂ）は、ＦＫＢＰ１２ドメインをＥＧＦＰのＮ末端に融合したＦＫＢＰ１２−ＥＧＦＰ融合タンパク質の発現ベクターの構造、及び、ＦＫＢＰ１２−ＥＧＦＰ融合タンパク質を含むＶＬＰの構造を示す模式図である。（ｃ）は、ＦＫＢＰ１２ドメインをＧａｇＨＩＶのＮ末端に融合したＦＫＢＰ１２−ＧａｇＨＩＶ融合タンパク質の発現ベクターの構造、及び、ＦＫＢＰ１２−ＧａｇＨＩＶ融合タンパク質を含むＶＬＰの構造を示す模式図である。
【図７】実験例２におけるウエスタンブロッティングの結果を示す画像である。
【図８】実験例２における電気泳動の結果を示す画像である。
【図９】図８の結果を数値化したグラフである。
【図１０】実験例３におけるＴ７ＥＩ（Ｔ７  Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ）アッセイの結果を示す画像である。
【図１１】図１０の結果を数値化したグラフである。
【図１２】実験例３におけるフローサイトメーターによる解析結果を示すグラフである。
【図１３】（ａ）〜（ｃ）は、実験例４におけるフローサイトメーターによる解析結果を示すグラフである。
【図１４】実験例５におけるフローサイトメーターによる解析結果を示すグラフである。
【図１５】（ａ）は、ＦＲＢドメインとＣａｓ９タンパク質との融合タンパク質の構造、及び、ＦＫＢＰ１２ドメインとＧａｇＨＩＶとの融合タンパク質の構造を示す模式図である。（ｂ）は、ＧａｇＭＬＶとＣａｓ９タンパク質との融合タンパク質の構造、及び、ＧＡＧ−ＰｏｌＭＬＶの構造を示す模式図である。（ｃ）は、Ｃａｓ９タンパク質とＧａｇ−ＰｏｌＨＩＶとの融合タンパク質の構造、及び、ＧＡＧ−ＰｏｌＨＩＶの構造を示す模式図である。（ｄ）は、実験例６におけるフローサイトメーターによる解析結果を示すグラフである。
【図１６】実験例７におけるフローサイトメーターによる解析結果を示すグラフである。
【図１７】実験例７におけるフローサイトメーターによる解析結果を示すグラフである。
【図１８】（ａ）〜（ｃ）は、実験例８におけるフローサイトメーターによる解析結果を示すグラフである。
【図１９】実験例９における蛍光顕微鏡写真である。
【図２０】（ａ）〜（ｃ）は、ｓｇＲＮＡの発現方法による、ＶＬＰ（ウイルス様粒子）生産細胞におけるｓｇＲＮＡの動態を説明する模式図である。
【図２１】（ａ）及び（ｂ）は、実験例１０におけるＴ７ＥＩアッセイの結果を示すグラフである。
【図２２】（ａ）は、ＲＲＥ配列を含むｓｇＲＮＡの発現ベクターの構造を示す模式図である。（ｂ）は、（ａ）に示す発現ベクターからＰＲＥ配列を除去した発現ベクターの構造を示す模式図である。（ｃ）〜（ｈ）は、実験例１１におけるフローサイトメーターによる解析結果を示すグラフである。
【図２３】実験例１２におけるリアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである。
【図２４】（ａ）〜（ｃ）は、実験例１３におけるフローサイトメーターによる解析結果を示すグラフである。
【図２５】実験例１４におけるフローサイトメーターによる解析結果を示すグラフである。
【図２６】実験例１４におけるフローサイトメーターによる解析結果を示すグラフである。
【図２７】実験例１５におけるフローサイトメーターによる解析結果を示すグラフである。
【図２８】実験例１６におけるＴ７ＥＩアッセイの結果を示す画像である。
【図２９】（ａ）〜（ｃ）は、実験例１７における蛍光顕微鏡写真である。
【図３０】（ａ）〜（ｅ）は、実験例１８におけるフローサイトメーターによる解析結果を示すグラフである。
【図３１】図３０（ａ）〜（ｅ）の結果を数値化したグラフである。
【図３２】（ａ）及び（ｂ）は、２種類のｓｇＲＮＡを送達する方法を説明する模式図である。
【図３３】（ａ）及び（ｂ）は、実験例１９におけるＴ７ＥＩアッセイの結果を示すグラフである。
【図３４】実験例２０における電気泳動の結果を示す画像である。
【図３５】実験例２１における電気泳動の結果を示す画像である。
【図３６】（ａ）〜（ｄ）は、実験例２２におけるフローサイトメーターによる解析結果を示すグラフである。
【図３７】実験例２３における電気泳動の結果を示す画像である。
【図３８】実験例２４におけるフローサイトメーターによる解析結果を示すグラフである。
【図３９】（ａ）は、実験例２５で使用したＥＧｘｘＦＰレポーターコンストラクトの構造を説明する模式図である。（ｂ）は、実験例２５における蛍光顕微鏡による観察結果を示す写真である。（ｃ）は、実験例２５におけるフローサイトメーターによる解析結果を示すグラフである。
【図４０】（ａ）は実験例２６の実験スケジュールを示す図である。（ｂ）は、実験例２６におけるＴ７ＥＩアッセイの結果を示す代表的な画像である。（ｃ）は、実験例２６におけるゲノム編集活性の経時変化を示すグラフである。
【図４１】（ａ）は、実験例２７におけるＴ７ＥＩアッセイの結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例２７において、オフターゲット切断に対するオンターゲット切断の割合を示すグラフである。
【図４２】実験例２８の結果を示すグラフである。
【図４３】（ａ）は、実験例２９における電気泳動の結果を示す画像である。（ｂ）は、（ａ）の結果を数値化したグラフである。（ｃ）は、実験例２９におけるウエスタンブロッティングの結果を示す画像である。
【図４４】（ａ）〜（ｃ）は、実験例３０で作製したＶＬＰの構造を説明する模式図である。
【図４５】実験例３０におけるウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図４６】実験例３０におけるルシフェラーゼ活性の測定結果を示すグラフである。
【図４７】実験例３１におけるインビボ発光・蛍光イメージングの結果を示すグラフである。
【図４８】図４７の結果を数値化したグラフである。
【図４９】実験例３２で用いた遺伝子導入ルシフェラーゼレポーターマウスモデルを説明する図である。
【図５０】（ａ）は、実験例３２において、ＶＬＰの投与後１〜１６０日間のインビボ発光・蛍光イメージングの結果を示す写真である。（ｂ）は、ＶＬＰの投与後１２６日目のインビボ発光・蛍光イメージングの結果を示す代表的な写真である。
【図５１】（ａ）は、実験例３３において、ヒトＴリンパ球細胞株であるＪｕｒｋａｔ細胞にＶＬＰを導入し、Ｔ７ＥＩアッセイを行った結果を示す画像である。（ｂ）は、（ａ）の結果を数値化したグラフである。
【図５２】実験例３３におけるフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。
【図５３】（ａ）は、実験例３３で使用したＳＡＭＨＤ１遺伝子に対するｓｇＲＮＡ＃１及びｓｇＲＮＡ＃２の位置を示す模式図である。（ｂ）は、実験例３３においてヒトｉＰＳ細胞から分化した神経細胞の写真である。（ｃ）は、実験例３３におけるＴ７ＥＩアッセイの結果を示す画像である。
【図５４】（ａ）及び（ｂ）は、実験例３４において、ＥＧＦＰの蛍光を測定した結果を示すグラフである。
【図５５】（ａ）は、実験例３４において、活性Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰ複合体を定量した結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例３４において、挿入欠失変異（Ｉｎｄｅｌ）の誘導を測定した結果を示すグラフである。
【図５６】（ａ）及び（ｂ）は、実験例３５におけるウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図５７】（ａ）及び（ｂ）は、実験例３５において撮影した、ＶＬＰの代表的な電子顕微鏡写真である。（ｃ）及び（ｄ）は、実験例３５においてＶＬＰの粒子径を測定した結果を示すグラフである。
【図５８】（ａ）及び（ｂ）は、実験例３５において、ＶＬＰのブラウン運動計測から粒子径を測定した結果を示すグラフである。
【図５９】（ａ）は、実験例３５におけるＤＮＡ切断活性の標準曲線を示す画像である。（ｂ）は、ＶＬＰ内のＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰ複合体を用いて基質を切断した結果を示す画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
［対象タンパク質が封入されたウイルス様粒子］
１実施形態において、本発明は、対象タンパク質が封入されたウイルス様粒子であって、前記ウイルス様粒子はＧａｇタンパク質を含み、前記Ｇａｇタンパク質は前記対象タンパク質と２量体を形成している、ウイルス様粒子を提供する。
【００２０】
実施例において後述するように、本実施形態のウイルス様粒子（以下、「ＶＬＰ」という場合がある。）によれば、対象タンパク質を効率よく封入することができる。本実施形態のＶＬＰを細胞に侵入させることにより、対象タンパク質を効率よく細胞内に導入することができる。
【００２１】
ＶＬＰとは、ウイルスの複製機構や感染持続機能を排除し、ウイルスの外皮だけから構成された粒子である。本実施形態のＶＬＰはＧａｇタンパク質を含む。Ｇａｇタンパク質としては、レトロウイルス由来のＧａｇタンパク質が挙げられる。Ｇａｇタンパク質としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来のＧａｇタンパク質、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）由来のＧａｇタンパク質等を好適に利用することができる。
【００２２】
ＨＩＶ由来のＧａｇタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１に示し、ＭＬＶ由来のＧａｇタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。Ｇａｇタンパク質は、本実施形態のＶＬＰの効果が得られる限り、変異を有していてもよい。
【００２３】
本実施形態のＶＬＰにおいて、Ｇａｇタンパク質は、マトリックス（ＭＡ）、カプシド（ＣＡ）、ヌクレオカプシド（ＮＣ）等に切断されていてもよいし、これらが結合したままであってもよい。
【００２４】
実施例において後述するように、本実施形態のＶＬＰはレトロウイルス由来のＰｏｌを含まないことが好ましい。ＶＬＰがＰｏｌを含む場合、Ｐｏｌのプロテアーゼにより対象タンパク質が分解されてしまう場合がある。
【００２５】
ところで、ＶＬＰを細胞に侵入させるためには、ウイルス膜と細胞膜との膜融合の過程を必要とする。膜融合の過程を担うのが、エンベロープタンパク質と呼ばれるウイルスタンパク質である。エンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質はエンベロープウイルスのウイルス表面に存在し、膜融合能をもつ。
【００２６】
本実施形態のＶＬＰの外皮は、当該分野において周知のウイルスエンベロープタンパク質を含んでいてもよい。エンベロープタンパク質としては、例えば、レトロウイルス科のウイルス（ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、猫免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、馬伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ヒトＴリンパ好性ウイルス（ＨＴＬＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、猫白血病ウイルス（ＦＬＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、内在性レトロウイルス等）のＥｎｖタンパク質、ラブドウイルス科のウイルス（水泡口炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病ウイルス、モコラウイルス等）のＥｎｖタンパク質（Ｇタンパク質）、アレナウイルス科のウイルス（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）等）のＥｎｖタンパク質、トガウイルス科（シンドビスウイルス等）のＥｎｖタンパク質、パラミクソウイルス科のウイルス（麻疹ウイルス等）のＥｎｖタンパク質（ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質、フュージョン（Ｆ）タンパク質）、オルトミクソウイルス科のウイルス（インフルエンザウイルス等）のエンベロープタンパク質（ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質）等を好適に用いることができる。このうち、ＶＳＶ由来の糖タンパク質であるＶＳＶ−Ｇを特に好適に用いることができる。ＶＳＶ−Ｇのアミノ酸配列を配列番号３に示す。ここで、ＶＬＰを侵入させる対象の宿主細胞としては、ヒト由来の細胞、非ヒト動物由来の細胞、生体内の細胞等が挙げられる。また、生体としてはヒト又は非ヒト動物が挙げられる。
【００２７】
本実施形態のＶＬＰにおいて、対象タンパク質は特に限定されず、例えば、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、人工ヌクレアーゼ等の配列特異的ＤＮＡ切断酵素；Ｏｃｔ３／４タンパク質、Ｓｏｘ２タンパク質、Ｋｌｆ４タンパク質、ｃ−Ｍｙｃタンパク質等の細胞の初期化を誘導するタンパク質；ＭｙｏＤタンパク質、ＧＡＴＡ４タンパク質、ＭＥＦ２Ｃタンパク質、ＴＢＸ５タンパク質、ＦＯＸＡ１タンパク質、ＦＯＸＡ２タンパク質、ＦＯＸＡ３タンパク質、ＨＮＦ４Ａタンパク質、ＡＳＣＬ１タンパク質、ＢＲＮ２タンパク質、ＭＹＴ１Ｌタンパク質等の細胞種を変換するタンパク質；蛍光タンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙ等）；ルシフェラーゼタンパク質等が挙げられる。
【００２８】
対象タンパク質が配列特異的ＤＮＡ切断酵素である場合、本実施形態のＶＬＰを細胞に侵入させることにより、細胞内に配列特異的ＤＮＡ切断酵素を効率よく導入することができる。その結果、ゲノム上の任意の場所でＤＮＡ切断、塩基置換、エピジェネティック状態の変更等を行うことができる。
【００２９】
配列特異的ＤＮＡ切断酵素は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと人工ヌクレアーゼに大別される。配列特異的ＤＮＡ切断酵素はＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼであってもよく、人工ヌクレアーゼであってもよい。
【００３０】
ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼとは、ガイドとなる短鎖ＲＮＡが標的配列に結合し、２つのＤＮＡ切断ドメイン（ヌクレアーゼドメイン）を有するヌクレアーゼをリクルートして配列特異的な切断を誘導する酵素である。ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼとしては、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓファミリータンパク質が挙げられる。
【００３１】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓファミリータンパク質としては、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１（別名Ｃａｓ１２ａ）、Ｃ２Ｃ１（別名Ｃａｓ１２ｂ）、Ｃ２Ｃ２（別名Ｃａｓ１３ａ）、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ１０等が挙げられる。ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓファミリータンパク質のホモログであってもよく、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓファミリータンパク質が改変されたものであってもよい。例えば、２つ存在する野生型のヌクレアーゼドメインの一方を不活性型に改変したニッカーゼ改変型のヌクレアーゼであってもよいし、両方を不活性型に改変したｄＣａｓ９であってもよい。あるいは、標的特異性の向上したＣａｓ９−ＨＦやＨｉＦｉ−Ｃａｓ９、ｅＣａｓ９等であってもよい。また、それらのＣａｓ９に別のタンパク質（酵素等）を融合させたものであってもよい。
【００３２】
Ｃａｓ９は、例えば、化膿性レンサ球菌、黄色ブドウ球菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス等に由来するものが挙げられる。Ｃｐｆ１としては、例えば、アシダミノコッカス、ラクノスピラ、クラミドモナス、フランシセラ−ノビサイダ等に由来するものが挙げられる。
【００３３】
化膿性レンサ球菌由来のＣａｓ９タンパク質（以下、「ＳｐＣａｓ９タンパク質」という場合がある。）のアミノ酸配列を配列番号４に示す。
【００３４】
人工ヌクレアーゼは、標的配列に特異的に結合するように設計・作製されたＤＮＡ結合ドメインと、ヌクレアーゼドメイン（制限酵素であるＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメイン等）とを有する人工制限酵素である。人工ヌクレアーゼとしては、Ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＺＦＮ）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３５】
本実施形態のＶＬＰにおいて、Ｇａｇタンパク質は対象タンパク質と２量体を形成している。ここで、２量体を形成しているとは、可逆的に結合していることを意味する。したがって、Ｇａｇタンパク質は対象タンパク質との融合タンパク質ではないことが好ましい。
【００３６】
Ｇａｇタンパク質と対象タンパク質とが解離可能であることにより、本実施形態のＶＬＰをターゲット細胞に侵入させて対象タンパク質を細胞内に導入した後、Ｇａｇタンパク質と対象タンパク質を解離させ、対象タンパク質を十分に機能させることができる。
【００３７】
また、Ｇａｇタンパク質及び対象タンパク質が２量体を形成することにより、ＶＬＰ生産細胞においてＶＬＰ内に対象タンパク質を効率よく封入することができる。
【００３８】
Ｇａｇタンパク質及び対象タンパク質が２量体を形成する手段は特に限定されないが、例えば、ＦＫ５０６−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＦＫＢＰ１２）とＦＫＢＰ１２−ｒａｐａｍｙｃｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １，  ＦＲＡＰ１  ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＦＲＢ）とがラパマイシン又はラパマイシン誘導体の存在下でヘテロダイマーを形成することを利用することができる。あるいは、ＧＡＩ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ  ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）とＧＩＤ１（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ  ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｄｗａｒｆ１）とがｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ又はＧＡ３−ＡＭの存在下でヘテロダイマーを形成するシステム（例えば、Miyamoto T., et al., Rapid and Orthogonal Logic Gating with a Gibberellin-induced Dimerization System, Nat Chem Biol., 8 (5), 465-470, 2012を参照。）、ＰｙＬ（ＰＹＲ１−ｌｉｋｅ，アミノ酸番号３３〜２０９）とＡＢＩ１（アミノ酸番号１２６〜４２３）とがＳ−（＋）−ａｂｓｃｉｓｉｃ  ａｃｉｄ（ＡＢＡ）存在下でヘテロダイマーを形成することができるシステム（例えば、Liang F. S., et al., Engineering the ABA plant stress pathway for regulation of induced proximity, Sci Signal., 4 (164), rs2, 2011を参照。）等も利用することができる。
【００３９】
なお、本書における「ラパマイシン誘導体」という記載は「ラパマイシン類似体」を包含し、また、「ラパマイシン」及び「ラパマイシン誘導体」を「ラパマイシン化合物」と呼ぶ場合がある。
【００４０】
具体的には、ＶＬＰ産生細胞（外皮構成タンパク質を発現する細胞）をラパマイシン又はラパマイシン誘導体の存在下で培養し、ＶＬＰ産生細胞内で、Ｇａｇタンパク質及び対象タンパク質の一方をＦＫＢＰ１２との融合タンパク質として発現させ、他方をＦＲＢとの融合タンパク質として発現させることにより、ラパマイシン又はラパマイシン誘導体を介してＦＫＢＰ１２ドメインとＦＲＢドメインを２量体化させることができる。
【００４１】
さらに、前記融合タンパク質（ＦＫＢＰ１２ないしはＦＲＢとＧａｇとの融合タンパク質）は、細胞膜への局在を促すアミノ酸配列（以降、細胞膜局在化配列と呼ぶ場合がある）を有していてもよい。ＶＬＰ産生細胞内において前記融合タンパク質が細胞膜に局在することにより、前記ＦＫＢＰ１２ドメイン−ＦＲＢドメイン間相互作用を介して対象タンパク質が効率良く細胞膜近傍にリクルートされて、細胞膜近傍で前記２量体が形成され得る。その結果、ＶＬＰの出芽時に前記２量体がＶＬＰ内に効率良く封入されるため、従来法で作製するよりも多量の対象タンパク質を内包するＶＬＰの製造が可能となる。なお、本開示において細胞膜に局在とは、対象とする分子が、細胞膜を構成する脂質又はタンパク質と直接又は他の因子を介して結合している状態を指す。
【００４２】
細胞膜局在化配列の例としては、ファルネシル化、パルミトイル化、ミリストイル化、ＧＰＩアンカー化等のタンパク質翻訳後修飾を促す配列、疎水性のアミノ酸残基からなる膜貫通ドメインを構成する配列、細胞膜構造中に存在するタンパク質に結合性を有するドメインやペプチド配列などが挙げられる。これらの配列は、特に限定されることはなく、当該分野において周知のものを適宜使用することができる。このうち、タンパク質翻訳後修飾（脂質修飾を含む）を促す配列を好適に用いることができる。
【００４３】
例えば、実施例において後述するように、Ｇａｇタンパク質にＦＫＢＰ１２を融合させ、対象タンパク質にＦＲＢを融合させてもよい。例えば、対象タンパク質がＣａｓ９タンパク質である場合、Ｇａｇタンパク質のＮ末端側にＦＫＢＰ１２を融合させることが好ましい。また、Ｃａｓ９タンパク質のＮ末端側にＦＲＢを融合させることが好ましい。
【００４４】
ＦＫＢＰ１２タンパク質のアミノ酸配列を配列番号５に示し、ＦＲＢタンパク質のアミノ酸配列を配列番号６に示す。ＦＫＢＰ１２タンパク質又はＦＲＢタンパク質は、本実施形態のＶＬＰの効果が得られる限り、変異を有していてもよい。
【００４５】
ラパマイシン誘導体としては、例えば、ＡＰ２１９６７（Ｃ−１６−（Ｓ）−７−ｍｅｔｈｙｌｉｎｄｏｌｅｒａｐａｍｙｃｉｎ）を好適に利用することができる。
【００４６】
［対象タンパク質及び対象ＲＮＡが封入されたウイルス様粒子］
本実施形態のＶＬＰは、対象タンパク質に加えて対象ＲＮＡが更に封入されたものであってもよい。例えば、対象タンパク質がＣａｓファミリータンパク質であり、対象ＲＮＡがｇＲＮＡであってもよい。この場合、ＶＬＰを細胞に侵入させることにより、細胞のゲノムＤＮＡの標的配列部位においてゲノム編集を誘導することができる。
【００４７】
しかしながら、ｇＲＮＡは、通常、１００塩基程度以下の長さの短鎖ＲＮＡである。従来、ｇＲＮＡ等の短鎖ＲＮＡを効率よくＶＬＰに封入することはできなかった。
【００４８】
これに対し、発明者らは、実施例において後述するように、第１のリボザイム配列及び第２のリボザイム配列に挟まれたｇＲＮＡ配列並びにパッケージングシグナル配列を含むｍＲＮＡをＶＬＰ産生細胞中で発現させることにより、当該ｍＲＮＡを効率よくＶＬＰに封入することに成功した。上記ｍＲＮＡは、ＶＬＰ内で、又は、ゲノム編集を誘導する対象の細胞内で、リボザイムの自己切断活性によりｇＲＮＡ部分を切り出して、自己切断産物としてｇＲＮＡを生成する。
【００４９】
すなわち、本実施形態のＶＬＰは、第１のリボザイム配列及び第２のリボザイム配列に挟まれたｇＲＮＡ配列並びにパッケージングシグナル配列を含むｍＲＮＡ又は前記ｍＲＮＡの自己切断産物が更に封入されていてもよい。
【００５０】
パッケージングシグナル配列とは、レトロウイルスのゲノムＲＮＡがウイルス粒子内部に取り込まれるのに必須な塩基配列である。レトロウイルスのゲノムＲＮＡが有するパッケージングシグナル配列は特徴的な２次構造をとり、Ｇａｇタンパク質上のヌクレオカプシド（ＮＣ）に特異的に結合することが知られている。
【００５１】
パッケージングシグナル配列としては、レトロウイルスのΨ配列を好適に用いることができる。また、パッケージングシグナル配列が、Ｇａｇの頭の部分までも含めたＥｘｔｅｎｄｅｄパッケージングシグナル（Ψ＋）であるとＶＬＰへの封入効率が更に向上することが知られている。ＨＩＶ由来のΨの塩基配列を配列番号７に示す。また、ＨＩＶ由来のΨ＋の塩基配列を配列番号８に示す。
【００５２】
上記のｍＲＮＡにおいて、パッケージングシグナル配列の位置は特に限定されない。上記のｍＲＮＡは、例えば、パッケージングシグナル配列、第１のリボザイム配列、ｇＲＮＡ配列、第２のリボザイム配列をこの順に含んでいてもよいし、例えば、第１のリボザイム配列、ｇＲＮＡ配列、第２のリボザイム配列、パッケージングシグナル配列をこの順に含んでいてもよい。
【００５３】
更に、上記のｍＲＮＡは、パッケージングシグナル配列の５’側又は３’側に１個又は複数個の任意のＲＮＡ配列を更に含んでいてもよい。任意のＲＮＡ配列は、例えばタンパク質をコードしていてもよい。
【００５４】
上記のｍＲＮＡが任意のＲＮＡ配列を１個含む場合、上記のｍＲＮＡは、例えば、任意のＲＮＡ配列、パッケージングシグナル配列、第１のリボザイム配列、ｇＲＮＡ配列、第２のリボザイム配列をこの順に含んでいてもよいし、パッケージングシグナル配列、任意のＲＮＡ配列、第１のリボザイム配列、ｇＲＮＡ配列、第２のリボザイム配列をこの順に含んでいてもよいし、第１のリボザイム配列、ｇＲＮＡ配列、第２のリボザイム配列、任意のＲＮＡ配列、パッケージングシグナル配列をこの順に含んでいてもよいし、第１のリボザイム配列、ｇＲＮＡ配列、第２のリボザイム配列、パッケージングシグナル配列、任意のＲＮＡ配列をこの順に含んでいてもよい。
【００５５】
また、上記のｍＲＮＡが複数個の任意のＲＮＡ配列を含む場合、各ＲＮＡ配列は独立して異なる位置に含まれていてもよい。
【００５６】
通常、ｇＲＮＡはＵ６プロモーターやＨ１プロモーター等のポリメラーゼＩＩＩプロモーターから転写される。このため、ｇＲＮＡを長くすることは困難である。これに対し、発明者らは、実施例において後述するように、ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター等のポリメラーゼＩＩプロモーターにより、パッケージングシグナル配列、第１のリボザイム配列、ｇＲＮＡ配列、第２のリボザイム配列をこの順に含む３００塩基以上の長いｍＲＮＡを発現させ、リボザイムの自己切断活性によりｇＲＮＡ部分を切り出すことにより、ＶＬＰへのｇＲＮＡの封入効率が劇的に上昇することを明らかにした。
【００５７】
また、実施例において後述するように、この方法によりＣａｓ９タンパク質及びｇＲＮＡを封入したＶＬＰを細胞に侵入させることにより、従来のＶＬＰと比較して格段に高いゲノム編集活性を得ることができる。
【００５８】
第１のリボザイム配列、第２のリボザイム配列としては、ハンマーヘッド（ＨＨ）リボザイム配列、ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｄｅｌｔａ  ｖｉｒｕｓ（ＨＤＶ）リボザイム配列、Ｖａｒｋｕｄ  ｓａｔｅｌｌｉｔｅリボザイム、ヘアピンリボザイム、ｇｌｍＳリボザイム等を用いることができる。第１のリボザイム配列、第２のリボザイム配列はそれぞれ同一の配列であってもよく、互いに異なる配列であってもよい。
【００５９】
ハンマーヘッド（ＨＨ）リボザイム配列の一例を配列番号９に示す。また、ＨＤＶリボザイム配列の一例を配列番号１０に示す。
【００６０】
ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化型ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との複合体であってもよいし、ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡを組み合わせた単一のｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であってもよい。
【００６１】
ｇＲＮＡがｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの複合体である場合、ＶＬＰに、パッケージングシグナル配列、第１のリボザイム配列、ｃｒＲＮＡ配列、第２のリボザイム配列をこの順に含むｍＲＮＡ、及び、パッケージングシグナル配列、第１のリボザイム配列、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、第２のリボザイム配列をこの順に含むｍＲＮＡの２種類のｍＲＮＡを封入すればよい。
【００６２】
あるいは、例えば、パッケージングシグナル配列、第１のリボザイム配列、ｃｒＲＮＡ配列、第２のリボザイム配列、第３のリボザイム配列、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、第４のリボザイム配列をこの順に含む１種類のｍＲＮＡを封入することもできる。ここで、第３のリボザイム配列、第４のリボザイム配列は、上述した第１のリボザイム配列、第２のリボザイム配列と同様の配列であってよい。また、ｃｒＲＮＡ配列、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の位置を入れ替えることもできる。
【００６３】
この結果、ＶＬＰの内部で、又は、ゲノム編集を誘導する対象の細胞内で、リボザイムの自己切断活性によりｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡが生成され、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの複合体が形成される。
【００６４】
ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの塩基配列は、例えば、次の塩基配列とすることができる。まず、標的塩基配列からプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を除いた塩基配列をスペーサー塩基配列とする。続いて、スペーサー塩基配列の３’末端に、スキャフォールド配列を連結した塩基配列を設計し、ｃｒＲＮＡの塩基配列とする。例えば、標的塩基配列からＰＡＭ配列を除いた塩基配列が「5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’」（配列番号１１）である場合、ｃｒＲＮＡの塩基配列は「5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG-3’」（配列番号１２）とすることができる。また、ｔｒａｃｒＲＮＡの塩基配列は、例えば、「5’-CAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC-3’」（配列番号１３）とすることができる。
【００６５】
また、ｇＲＮＡがｓｇＲＮＡである場合、ＶＬＰに、第１のリボザイム配列及び第２のリボザイム配列に挟まれたｓｇＲＮＡの塩基配列並びにパッケージングシグナル配列を含むｍＲＮＡを封入すればよい。この結果、ＶＬＰの内部で、又は、ゲノム編集を誘導する対象の細胞内で、リボザイムの自己切断活性によりｓｇＲＮＡが生成される。
【００６６】
ｓｇＲＮＡの塩基配列は、例えば、次の塩基配列とすることができる。まず、標的塩基配列からＰＡＭ配列を除いた塩基配列をスペーサー塩基配列とする。続いて、スペーサー塩基配列の３’末端に、スキャフォールド配列を連結した塩基配列を設計する。例えば、標的塩基配列からＰＡＭ配列を除いた塩基配列が「5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’」（配列番号１１）である場合、標的塩基配列を特異的に認識するｓｇＲＮＡの塩基配列は「5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU-3’」（配列番号１４）とすることができる。
【００６７】
本実施形態のＶＬＰにより、医療分野において、新規のゲノム編集治療を提供することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ＲＮＰをＶＬＰに封入して筋肉組織に注入することにより、筋肉細胞内で目的のゲノム編集を誘導することが可能となる。また、肝臓組織に注入することにより、肝臓細胞内で目的のゲノム編集を誘導することが可能となる。
【００６８】
本明細書において、ゲノム編集とは、ＤＮＡ切断、ＤＮＡ一本鎖切断、相同組換え誘導、塩基変換（ｂａｓｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ）、ＤＮＡメチル化の誘導又は除去、遺伝子発現量の制御等を意味する。
【００６９】
また、採取した細胞、例えば造血幹細胞にＶＬＰを接種し、目的のゲノム編集を誘導した細胞を再移植する等のゲノム編集治療が可能となる。このような技術は、遺伝子変異が原因の疾患に対する新規治療法となりうる。その他、ウイルスのレセプターを破壊する感染症治療や、ＣＡＲ−Ｔ細胞と組み合わせたガン治療等へと応用可能であると考えられる。
【００７０】
また、畜産・水産業においても、対象動物の生殖細胞、受精卵、初期胚又は個体にＶＬＰを接種することにより、ゲノム編集部位に応じた品種改良を誘導することができる。
【００７１】
本実施形態のＶＬＰは、相同組み換え（Homologues Recombination；ＨＲ）経路による遺伝子組換えを誘導するためのドナーＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ又は一本鎖ＤＮＡ）を更に含有していてもよい。
【００７２】
［ゲノム編集された細胞の製造方法］
１実施形態において、本発明は、ゲノム編集された細胞の製造方法であって、前記細胞にＣａｓファミリータンパク質及びｇＲＮＡが封入されたＶＬＰを接種することを含む方法を提供する。本実施形態の製造方法により、配列特異的にゲノム編集された細胞を製造することができる。
【００７３】
ここでＶＬＰを細胞に接種するとは、最終的にＶＬＰを細胞に侵入させることを意味する。例えば、ＶＬＰを細胞に接触させることであってもよく、ＶＬＰを細胞の培地に添加すること等であってもよい。
【００７４】
［対象タンパク質が封入されたＶＬＰの製造方法］
１実施形態において、本発明は、対象タンパク質が封入されたＶＬＰの製造方法であって、ラパマイシン又はラパマイシン誘導体の存在下で、細胞に、ＦＫＢＰ１２とＧａｇタンパク質との融合タンパク質、及び、ＦＲＢと対象タンパク質との融合タンパク質の組み合わせ、又は、ＦＲＢとＧａｇタンパク質との融合タンパク質、及び、ＦＫＢＰ１２と対象タンパク質との融合タンパク質の組み合わせ、を発現させることを含み、その結果、前記細胞の培地中に前記対象タンパク質が封入されたＶＬＰが放出される、製造方法を提供する。本実施形態の製造方法により、対象タンパク質が封入されたＶＬＰを製造することができる。
【００７５】
本実施形態の製造方法は、下記工程（１）、（２）を含む、対象タンパク質が封入されたＶＬＰの製造方法であるということもできる。
【００７６】
（１）ラパマイシン又はラパマイシン誘導体の存在下で、細胞に、ＦＫＢＰ１２とＧａｇタンパク質との融合タンパク質、及び、ＦＲＢと対象タンパク質との融合タンパク質、又は、ＦＲＢとＧａｇタンパク質との融合タンパク質、及び、ＦＫＢＰ１２と対象タンパク質との融合タンパク質、を発現させる工程。
（２）前記対象タンパク質が封入されたＶＬＰを含む培地を得る工程。
【００７７】
前記工程（１）において、前記融合タンパク質をコードする核酸を、リポフェクション法又はエレクトロポレーション法（フローエレクトロポレーション法を含む）を用いて前記細胞に導入することが好ましい。また、核酸の導入後に、前記細胞をエンドヌクレアーゼで処理してもよい。
【００７８】
フローエレクトロポレーション法とは、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、タンパク等を種々の細胞に高効率、高生存率で、５０μＬ〜１Ｌ容量のスケールで導入可能なエレクトロポレーション法である。このため、フローエレクトロポレーション法を採用することにより、ＶＬＰを容易に大量生産することが可能になる。
【００７９】
また、実施例において後述するように、フローエレクトロポレーションにより核酸を導入した後、細胞をエンドヌクレアーゼ処理することにより、ＶＬＰの形成量を増大させることができる。これは、エンドヌクレアーゼ処理によって未導入の核酸を除去することにより、細胞の生存率を上昇させることができるためであると考えられる。
【００８０】
また、ＶＬＰを医療応用するためには、動物由来の成分を使用せずに（ｘｅｎｏ−ｆｒｅｅ）、ＶＬＰを製造することが好ましい。このため、細胞の培地は血清不含培地であることが好ましい。
【００８１】
本実施形態の製造方法において、ＦＫＢＰ１２とＧａｇタンパク質との融合タンパク質、ＦＲＢと対象タンパク質との融合タンパク質、ＦＲＢとＧａｇタンパク質との融合タンパク質、ＦＫＢＰ１２と対象タンパク質との融合タンパク質は、ＶＬＰ産生細胞で機能する発現ベクターにより発現させればよい。また、培地中に放出されたＶＬＰは、例えば超遠心、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等により濃縮することができる。
【００８２】
本実施形態の製造方法において、ＶＬＰ、対象タンパク質、ラパマイシン誘導体、Ｇａｇタンパク質、ＦＫＢＰ１２、ＦＲＢについては上述したものと同様である。また、ＶＬＰ産生細胞としては、ヒト細胞、非ヒト動物細胞を利用することができる。しかしながら、ＶＬＰを生体に接種する場合には、免疫原性を低減させる観点から、接種対象の種と同じ種に由来する細胞をＶＬＰ産生細胞に用いることが好ましい。具体的なＶＬＰ産生細胞としては、特に限定されず、例えば、ヒト胎児腎由来細胞株であるＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３細胞等を用いることができる。
【００８３】
本実施形態の製造方法によれば、従来技術と比較して対象タンパク質がＶＬＰに効率よく封入される。このため、ＶＬＰにより多くの対象タンパク質を封入（内包）することができる。ＶＬＰ  １粒子あたりに封入することができる対象タンパク質は、例えば３分子以上であり、４分子以上であることが好ましく、５分子以上であることがより好ましく、６分子以上であることが更に好ましく、７分子以上であることが最も好ましい。
【００８４】
［Ｃａｓファミリータンパク質及びｇＲＮＡが封入されたＶＬＰの製造方法］
１実施形態において、本発明は、Ｃａｓファミリータンパク質及びｇＲＮＡが封入されたＶＬＰの製造方法であって、ラパマイシン又はラパマイシン誘導体の存在下で、細胞に、ＦＫＢＰ１２とＧａｇタンパク質との融合タンパク質、及び、ＦＲＢとＣａｓファミリータンパク質との融合タンパク質の組み合わせ、又は、ＦＲＢとＧａｇタンパク質との融合タンパク質、及び、ＦＫＢＰ１２とＣａｓファミリータンパク質との融合タンパク質の組み合わせ、並びに、第１のリボザイム配列及び第２のリボザイム配列に挟まれたｇＲＮＡ配列並びにパッケージングシグナル配列を含むｍＲＮＡ、を発現させることを含み、その結果、前記細胞の培地中にＣａｓファミリータンパク質及びｇＲＮＡが封入されたＶＬＰが放出される、製造方法を提供する。
【００８５】
本実施形態の製造方法は、下記工程（１）、（２）を含む、Ｃａｓファミリータンパク質及びｇＲＮＡが封入されたＶＬＰの製造方法であるということもできる。
【００８６】
（１）ラパマイシン又はラパマイシン誘導体の存在下で、細胞に、ＦＫＢＰ１２とＧａｇタンパク質との融合タンパク質、及び、ＦＲＢとＣａｓファミリータンパク質との融合タンパク質、又は、ＦＲＢとＧａｇタンパク質との融合タンパク質、及び、ＦＫＢＰ１２とＣａｓファミリータンパク質との融合タンパク質、並びに、第１のリボザイム配列及び第２のリボザイム配列に挟まれたｇＲＮＡ配列並びにパッケージングシグナル配列を有するｍＲＮＡ、を発現させる工程。
（２）前記Ｃａｓファミリータンパク質及びｇＲＮＡが封入されたＶＬＰを含む培地を得る工程。
【００８７】
前記工程（１）において、前記融合タンパク質又は前記ｍＲＮＡをコードする核酸を、リポフェクション法又はエレクトロポレーション法（フローエレクトロポレーション法を含む）を用いて前記細胞に導入することが好ましい。また、核酸の導入後に、前記細胞をエンドヌクレアーゼで処理してもよい。また、細胞の培地は血清不含培地であることが好ましい。フローエレクトロポレーション法、エンドヌクレアーゼ処理については上述したものと同様である。
【００８８】
本実施形態の製造方法によれば、従来技術と比較してＣａｓファミリータンパク質及びｇＲＮＡがＶＬＰに効率よく封入される。このため、ＶＬＰにより多くのＣａｓファミリータンパク質及びｇＲＮＡの複合体（リボヌクレオタンパク質、ＲＮＰ）を封入することができる。ＶＬＰ  １粒子あたりに封入することができるＲＮＰは、例えば３分子以上であり、４分子以上であることが好ましく、５分子以上であることがより好ましく、６分子以上であることが更に好ましく、７分子以上であることが最も好ましい。
【００８９】
本実施形態の製造方法により、Ｃａｓファミリータンパク質及びｇＲＮＡが封入されたＶＬＰを製造することができる。また、培地中に放出されたＶＬＰは、例えば超遠心、ＰＥＧ沈殿、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等により濃縮することができる。
【００９０】
本実施形態の製造方法において、ＶＬＰ、Ｃａｓファミリータンパク質、ｇＲＮＡ、ラパマイシン誘導体、Ｇａｇタンパク質、ＦＫＢＰ１２、ＦＲＢ、パッケージングシグナル配列、リボザイム配列、ＶＬＰ産生細胞については上述したものと同様である。
【００９１】
本実施形態の製造方法において、ＦＫＢＰ１２とＧａｇタンパク質との融合タンパク質、ＦＲＢとＣａｓファミリータンパク質との融合タンパク質、ＦＲＢとＧａｇタンパク質との融合タンパク質、ＦＫＢＰ１２とＣａｓファミリータンパク質との融合タンパク質、第１のリボザイム配列及び第２のリボザイム配列に挟まれたｇＲＮＡ配列並びにパッケージングシグナル配列を含むｍＲＮＡは、ＶＬＰ産生細胞で機能する発現ベクターにより発現させればよい。
【００９２】
特に、第１のリボザイム配列及び第２のリボザイム配列に挟まれたｇＲＮＡ配列並びにパッケージングシグナル配列を含むｍＲＮＡはポリメラーゼＩＩプロモーターにより発現させることが好ましい。ポリメラーゼＩＩプロモーターとしては、例えばＬＴＲプロモーター（レンチウイルスの５’ＬＴＲ）、ＥＦ１αプロモーター等が挙げられる。ＬＴＲプロモーターとしては、ＨＩＶの５’ＬＴＲを特に好適に用いることができる。
【００９３】
また、第１のリボザイム配列及び第２のリボザイム配列に挟まれたｇＲＮＡ配列並びにパッケージングシグナル配列を含むｍＲＮＡをＬＴＲプロモーターにより発現させる場合には、ＶＬＰ産生細胞にＴａｔタンパク質を発現させることが好ましい。
【００９４】
［対象タンパク質が封入されたＶＬＰの製造用キット］
１実施形態において、本発明は、対象タンパク質が封入されたＶＬＰの製造用キットであって、ＦＫＢＰ１２とＧａｇタンパク質との融合タンパク質の発現ベクター、又は、ＦＲＢとＧａｇタンパク質との融合タンパク質の発現ベクターを含む、キットを提供する。本実施形態のキットにより、対象タンパク質が封入されたＶＬＰを製造することができる。
【００９５】
本実施形態のキットにおいて、ＶＬＰ、対象タンパク質、Ｇａｇタンパク質、ＦＫＢＰ１２、ＦＲＢについては上述したものと同様である。
【００９６】
本実施形態のキットは、ＦＫＢＰ１２と対象タンパク質との融合タンパク質の発現ベクター作製用ベクター、ＦＫＢＰ１２と対象タンパク質との融合タンパク質の発現ベクター、ＦＲＢと対象タンパク質との融合タンパク質の発現ベクター作製用ベクター、ＦＲＢと対象タンパク質との融合タンパク質の発現ベクター等を更に含んでいてもよい。
【００９７】
ここで、ＦＫＢＰ１２と対象タンパク質との融合タンパク質の発現ベクター作製用ベクターとは、例えば、プロモーターの下流にＦＫＢＰ１２をコードする遺伝子及びマルチクローニングサイトを含むベクターが挙げられる。
【００９８】
本明細書において、マルチクローニングサイトとは、制限酵素に認識される１種又は複数の塩基配列が並んだ領域である。マルチクローニングサイトにおいて、制限酵素部位は１個であってもよいし、複数であってもよい。
【００９９】
上記のベクターのマルチクローニングサイトに対象タンパク質をコードする遺伝子を組み込むことにより、ＦＫＢＰ１２と対象タンパク質との融合タンパク質の発現ベクターを作製することができる。ここで、マルチクローニングサイトは、ＦＫＢＰ１２をコードする遺伝子の５’側に位置していてもよいし、３’側に位置していてもよい。
【０１００】
同様に、ＦＲＢと対象タンパク質との融合タンパク質の発現ベクター作製用ベクターとは、例えば、プロモーターの下流にＦＲＢをコードする遺伝子及びマルチクローニングサイトを含むベクターが挙げられる。このマルチクローニングサイトに対象タンパク質をコードする遺伝子を組み込むことにより、ＦＲＢと対象タンパク質との融合タンパク質の発現ベクターを作製することができる。ここで、マルチクローニングサイトは、ＦＲＢをコードする遺伝子の５’側に位置していてもよいし、３’側に位置していてもよい。
【０１０１】
本実施形態のキットは、ラパマイシン又はラマパイシン誘導体、ＶＬＰ産生用細胞等を更に含んでいてもよい。ラパマイシン又はラマパイシン誘導体、ＶＬＰ産生用細胞については上述したものと同様である。
【０１０２】
［Ｃａｓファミリータンパク質が封入されたＶＬＰの製造用キット］
１実施形態において、本発明は、Ｃａｓファミリータンパク質が封入されたＶＬＰの製造用キットであって、ＦＫＢＰ１２とＧａｇタンパク質との融合タンパク質の発現ベクター、及び、ＦＲＢとＣａｓファミリータンパク質との融合タンパク質発現ベクターの組み合わせ、又は、ＦＲＢとＧａｇタンパク質との融合タンパク質の発現ベクター、及び、ＦＫＢＰ１２とＣａｓファミリータンパク質との融合タンパク質の発現ベクターの組み合わせ、を含む、キットを提供する。本実施形態のキットにより、Ｃａｓファミリータンパク質が封入されたＶＬＰを製造することができる。
【０１０３】
本実施形態のキットにおいて、ＶＬＰ、Ｃａｓファミリータンパク質、Ｇａｇタンパク質、ＦＫＢＰ１２、ＦＲＢについては上述したものと同様である。
【０１０４】
例えば、実施例において後述するように、Ｇａｇタンパク質にＦＫＢＰ１２を融合させ、Ｃａｓファミリータンパク質にＦＲＢを融合させてもよい。この場合、Ｇａｇタンパク質のＮ末端側にＦＫＢＰ１２を融合させることが好ましい。また、Ｃａｓファミリータンパク質のＮ末端側にＦＲＢを融合させることが好ましい。
【０１０５】
本実施形態のキットは、第１のリボザイム配列及び第２のリボザイム配列に挟まれた、対象ＲＮＡの塩基配列又はマルチクローニングサイト、並びにパッケージングシグナル配列を含むｍＲＮＡの発現ベクターを更に含んでいてもよい。この場合、本実施形態のキットにより、Ｃａｓファミリータンパク質及び対象ＲＮＡを封入したＶＬＰを製造することができる。
【０１０６】
ここで、パッケージングシグナル配列、リボザイム配列については上述したものと同様である。また、対象ＲＮＡとしては、短鎖ＲＮＡが挙げられ、例えばｇＲＮＡが挙げられる。本明細書において、短鎖ＲＮＡとしては、例えば２００塩基程度以下、例えば１５０塩基程度以下、例えば１００塩基程度以下の長さのＲＮＡが挙げられる。
【０１０７】
第１のリボザイム配列及び第２のリボザイム配列に挟まれたマルチクローニングサイト並びにパッケージングシグナル配列を含むｍＲＮＡの発現ベクターのマルチクローニングサイトに対象ＲＮＡをコードするＤＮＡ断片を組み込むことにより、第１のリボザイム配列及び第２のリボザイム配列に挟まれた対象ＲＮＡの塩基配列並びにパッケージングシグナル配列を含むｍＲＮＡの発現ベクターを作製することができる。
【０１０８】
本実施形態のキットは、ラパマイシン又はラマパイシン誘導体、ＶＬＰ産生用細胞等を更に含んでいてもよい。ラパマイシン又はラマパイシン誘導体、ＶＬＰ産生用細胞については上述したものと同様である。
【０１０９】
［対象ＲＮＡが封入されたＶＬＰ］
１実施形態において、本発明は、対象ＲＮＡが封入されたＶＬＰであって、前記ＶＬＰはＧａｇタンパク質を含み、前記対象ＲＮＡは、第１のリボザイム配列及び第２のリボザイム配列に挟まれた対象ＲＮＡの塩基配列並びにパッケージングシグナル配列を含むｍＲＮＡ又は前記ｍＲＮＡの自己切断産物の形態で封入されている、ＶＬＰを提供する。
【０１１０】
本実施形態のＶＬＰは、対象タンパク質の代わりに対象ＲＮＡが封入されている点において上述したＶＬＰと主に異なっている。
【０１１１】
実施例において後述するように、本実施形態のＶＬＰによれば、対象ＲＮＡを効率よく封入することができる。本実施形態のＶＬＰを細胞に侵入させることにより、対象ＲＮＡを効率よく細胞内に導入することができる。
【０１１２】
対象ＲＮＡとしては、短鎖ＲＮＡが挙げられる。本明細書において、短鎖ＲＮＡとしては、例えば２００塩基程度以下、例えば１５０塩基程度以下、例えば１００塩基程度以下の長さのＲＮＡが挙げられる。対象ＲＮＡとしては、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｇＲＮＡ等が挙げられる。
【０１１３】
本実施形態のＶＬＰにおいて、ＶＬＰ、Ｇａｇタンパク質、パッケージングシグナル配列、リボザイム配列、ｇＲＮＡについては上述したものと同様である。
【０１１４】
［対象ＲＮＡが封入されたＶＬＰの製造方法］
１実施形態において、本発明は、対象ＲＮＡが封入されたＶＬＰの製造方法であって、細胞に、Ｇａｇタンパク質、及び、第１のリボザイム配列及び第２のリボザイム配列に挟まれた対象ＲＮＡの塩基配列並びにパッケージングシグナル配列を含むｍＲＮＡを発現させることを含み、その結果、前記細胞の培地中に、前記対象ＲＮＡが封入されたウイルス様粒子が放出され、前記対象ＲＮＡは、前記ｍＲＮＡ又は前記ｍＲＮＡの自己切断産物の形態で前記ウイルス様粒子に封入されている、製造方法を提供する。
【０１１５】
本実施形態の製造方法は、下記工程（１）、（２）を含む、対象ＲＮＡが封入されたＶＬＰの製造方法であるということもできる。
【０１１６】
（１）細胞に、Ｇａｇタンパク質、及び、第１のリボザイム配列及び第２のリボザイム配列に挟まれた対象ＲＮＡの塩基配列並びにパッケージングシグナル配列を有するｍＲＮＡを発現させる工程。
（２）前記対象ＲＮＡが、前記ｍＲＮＡ又は前記ｍＲＮＡの自己切断産物の形態で封入されたＶＬＰを含む培地を得る工程。
【０１１７】
前記工程（１）において、前記ｍＲＮＡをコードする核酸を、リポフェクション法又はエレクトロポレーション法（フローエレクトロポレーション法を含む）を用いて前記細胞に導入することが好ましい。また、核酸の導入後に、前記細胞をエンドヌクレアーゼで処理してもよい。また、細胞の培地は血清不含培地であることが好ましい。フローエレクトロポレーション法、エンドヌクレアーゼ処理については上述したものと同様である。
【０１１８】
本実施形態の製造方法により、対象ＲＮＡが封入されたＶＬＰを製造することができる。本実施形態の製造方法において、ＶＬＰ、Ｇａｇタンパク質、パッケージングシグナル配列、第１のリボザイム配列、対象ＲＮＡ、第２のリボザイム配列、ＶＬＰ産生細胞については上述したものと同様である。また、培地中に放出されたＶＬＰは、例えば超遠心、ＰＥＧ沈殿、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等により濃縮することができる。
【０１１９】
本実施形態の製造方法によれば、従来技術と比較して対象ＲＮＡがＶＬＰに効率よく封入される。このため、ＶＬＰにより多くの対象ＲＮＡを封入することができる。ＶＬＰ  １粒子あたりに封入することができる対象ＲＮＡは、例えば３分子以上であり、４分子以上であることが好ましく、５分子以上であることがより好ましく、６分子以上であることが更に好ましく、７分子以上であることが特に好ましく、８分子以上であることが最も好ましい。
【０１２０】
［対象ＲＮＡが封入されたＶＬＰの製造用キット］
１実施形態において、本発明は、対象ＲＮＡが封入されたＶＬＰの製造用キットであって、Ｇａｇタンパク質の発現ベクター、並びに、第１のリボザイム配列及び第２のリボザイム配列に挟まれた、対象ＲＮＡの塩基配列又はマルチクローニングサイト、及び、パッケージングシグナル配列を含むｍＲＮＡの発現ベクターを含む、キットを提供する。本実施形態のキットにより、対象ＲＮＡが効率よく封入されたＶＬＰを製造することができる。
【０１２１】
本実施形態のキットにおいて、ＶＬＰ、対象ＲＮＡ、パッケージングシグナル配列、リボザイム配列、マルチクローニングサイトについては上述したものと同様である。
【０１２２】
上述したように、第１のリボザイム配列及び第２のリボザイム配列に挟まれたマルチクローニングサイト並びにパッケージングシグナル配列を含むｍＲＮＡの発現ベクターのマルチクローニングサイトに対象ＲＮＡをコードするＤＮＡ断片を組み込むことにより、第１のリボザイム配列及び第２のリボザイム配列に挟まれた対象ＲＮＡの塩基配列並びにパッケージングシグナル配列を含むｍＲＮＡの発現ベクターを作製することができる。
【０１２３】
また、上述したように、ＶＬＰ産生細胞内で、Ｇａｇタンパク質、及び、第１のリボザイム配列及び第２のリボザイム配列に挟まれた対象ＲＮＡの塩基配列並びにパッケージングシグナル配列を含むｍＲＮＡを発現させると、ｍＲＮＡ上のパッケージングシグナル配列は特徴的な２次構造をとり、Ｇａｇタンパク質上のヌクレオカプシド（ＮＣ）に特異的に結合し、ＶＬＰに効率よく封入される。
【０１２４】
本実施形態のキットは、ＶＬＰ産生用細胞等を更に含んでいてもよい。ＶＬＰ産生用細胞については上述したものと同様である。
【０１２５】
［遺伝子変異を原因とする疾患、感染症又はガンの治療薬］
１実施形態において、本発明は、上述したウイルス様粒子を有効成分として含む、遺伝子変異を原因とする疾患、感染症又はガンの治療薬を提供する。遺伝子変異を原因とする疾患としては、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、筋硬直性ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、血友病、先天性脳症、フェニルケトン尿症、ビオプテリン代謝異常症、メープルシロップ尿症、ホモシスチン尿症、白皮症、色素性乾皮症等が挙げられるがこれらに限定されない。本実施形態の治療薬を投与して、ゲノム編集によりエクソンスキッピングを誘導したり、遺伝子変異を修復したり、異常遺伝子を削除することにより、遺伝子変異を原因とする疾患を治療することができる。
【０１２６】
感染症としては、エイズ、Β型肝炎、ＥＢＶ感染症等が挙げられる。本実施形態の治療薬を投与して、感染したウイルスや細菌の遺伝子を破壊することにより、あるいはウイルスや細菌の感染に必要なセレプター遺伝子を破壊することにより、感染症をを治療することができる。
【０１２７】
本明細書において、「ガン」とは、上皮細胞から発生する癌に限られず悪性腫瘍全体を意味する。ガンとしては、先天性小児ガン等が挙げられる。本実施形態の治療薬を投与して、ガン細胞の生存に必須の遺伝子やガン遺伝子を破壊したり、ガン抑制遺伝子の変異を修復することにより、ガンを治療することができる。
【０１２８】
本実施形態の治療薬の投与方法、投与量は特に限定されず、患者の症状、体重、年齢、性別等に応じて適宜決定すればよい。例えば、注射剤の形態で、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与すること等が挙げられる。
【０１２９】
［その他の実施形態］
１実施形態において、本発明は、対象タンパク質が封入されたＶＬＰ、対象ＲＮＡが封入されたＶＬＰ、又は、対象タンパク質及び対象ＲＮＡが封入されたＶＬＰの有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、遺伝子変異が原因の疾患、感染症、又は、ガンの治療方法を提供する。
【０１３０】
１実施形態において、本発明は、遺伝子変異が原因の疾患、感染症又はガンの治療のための、対象タンパク質が封入されたＶＬＰ、対象ＲＮＡが封入されたＶＬＰ、又は、対象タンパク質及び対象ＲＮＡが封入されたＶＬＰを提供する。
【０１３１】
１実施形態において、本発明は、遺伝子変異が原因の疾患の治療薬、感染症の治療薬又はガンの治療薬を製造するための、対象タンパク質が封入されたＶＬＰ、対象ＲＮＡが封入されたＶＬＰ、又は、対象タンパク質及び対象ＲＮＡが封入されたＶＬＰの使用を提供する。
【０１３２】
上記各実施形態において、対象タンパク質が封入されたＶＬＰ、対象ＲＮＡが封入されたＶＬＰ、対象タンパク質及び対象ＲＮＡが封入されたＶＬＰについては上述したものと同様である。
【０１３３】
上記各実施形態において、ＶＬＰは、対象タンパク質、又は対象タンパク質及び対象ＲＮＡが封入されたＶＬＰである。対象タンパク質はＣａｓファミリータンパク質であり、対象ＲＮＡはｇＲＮＡであってもよい。あるいは、ＶＬＰは、対象ＲＮＡが封入されたＶＬＰであり、対象ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｇＲＮＡ等であってもよい。
【実施例】
【０１３４】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【０１３５】
［実験方法］
（細胞培養）
ヒト胎児腎由来細胞株であるＨＥＫ２９３Ｔ細胞、レポーターコンストラクトであるＥＧｘｘＦＰを導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞（以下、「ＨＥＫ２９３Ｔ  ＥＧｘｘＦＰ細胞」という場合がある。）、ヒトＤＭＤ遺伝子のエクソン４５の５’側（スプライシングアクセプター付近）を標的とするｓｇＲＮＡ  ＤＭＤ＃１（標的配列を配列番号１５に示す。）を恒常的に発現させたＨＥＫ２９３Ｔ  ＥＧｘｘＦＰ細胞は、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン及びストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地で培養した。【０１３６】
健常人由来ｉＰＳ細胞（４０４Ｃ２株及び１３８Ｄ２株）は、ｉＭａｔｉｘ５１１−Ｅ８でコートした培養皿上にて、ＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０３Ｎ培地（味の素ヘルシーサプライ株式会社）で培養した。デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）患者由来ｉＰＳ細胞は、ｉＭａｔｉｘ５１１−Ｅ８でコートした培養皿上にて、ＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０３Ｎ培地で培養した。【０１３７】
マウス横紋筋由来細胞株であるＣ２Ｃ１２細胞は、１５％ウシ胎児血清、０．１ｍＭ必須アミノ酸、１００ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、ペニシリン及びストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地で培養した。【０１３８】
Ｃ２Ｃ１２細胞の分化誘導培地には、５％ウマ血清、０．１ｍＭ必須アミノ酸、１００ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．５％ペニシリン及びストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地を用いた。【０１３９】
（ＶＬＰの作製方法）
３×１０６個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１０ｃｍプレートに播種した。続いて、翌日にｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて、ｐＨＬＳ−ＥＦ１ａ−ＦＫＢＰ１２−ＧａｇＨＩＶ（配列番号１６）１０μｇ、ｐＨＬＳ−ＥＦ１ａ−ＦＲＢ−ＳｐＣａｓ９−Ａ（配列番号１７）１０μｇ、ｐＬ−ｓｉｎ−ＲＧＲ−ＡｍＣｙａｎ−Ａ（配列番号１８）１０μｇ、ｐｃＤＮＡ３．１−ＴａｔＨＩＶ（配列番号１９）２μｇ、ｐＭＤ−ＶＳＶＧ（配列番号２０）５μｇをトランスフェクションした。なお、これらの各発現ベクターは、実験により適宜変更した。【０１４０】
続いて、翌日に培地を３００ｎＭのＡＰ２１９６７（クロンテック社）を含む新しい培地１０ｍＬに交換した。続いて、トランスフェクションから３６〜４８時間後に培養液上清を回収し、ポアサイズ０．４５μｍのシリンジフィルターで細胞の残骸を除去し、Ａｖａｎｔｉ  ＪＸＮ−３０遠心機（ベックマン・コールター社）を用いて１００，０００×ｇで３時間遠心し、ＶＬＰを濃縮した。【０１４１】
続いて、ＶＬＰを含む沈殿を１００μＬのＨＢＳＳ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）に再懸濁し、１．５ｍＬチューブに分注して−８０℃で保存した。【０１４２】
（ＶＬＰの細胞導入）
１ウェルあたり２．５×１０４〜５．０×１０４個のＨＥＫ２９３Ｔ  ＥＧｘｘＦＰ細胞を４８ウェルプレートに播種した。続いて、翌日にＶＬＰ溶液を加え、その３日後にＬＳＲ３  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを用いてＥＧＦＰの蛍光を解析した。【０１４３】
（Ｔ７ＥＩアッセイ）
ＭｏｎｏＦａｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ジーエルサイエンス株式会社）を用いてプロトコル通りに培養細胞からゲノムＤＮＡを回収した。続いて、ゲノムＤＮＡ  １００ｎｇと増幅領域に対するプライマー、及びＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ株式会社）を用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物をＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）を用いて精製した。【０１４４】
続いて、４００ｎｇのＰＣＲ産物をＮＥＢｕｆｆｅｒ  ２．１バッファー（ＮＥＢ社）中で、９５度、５分間熱変性後、ゆっくり温度を下げることで再アニーリングさせた。温度は、９５℃から８５℃まで−２℃／秒、８５℃から２５℃まで−０．１℃／秒で低下させた。続いて、１０ユニットのＴ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｔ７ＥＩ）酵素を加え、３７℃で１５分間反応させた。続いて、ＥＤＴＡを６ｍＭになるように加えて反応を停止させた。続いて、ＤＳ１０００  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｃｒｅｅｎ  ＴａｐｅとＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ  ２２００（アジレントテクノロジーズ社）を用いて切断産物を解析した。【０１４５】
［実験例１］
（ＶＬＰによるＣａｓ９送達の検討）
Ｇａｇ−Ｐｏｌ又はＧａｇを用いたＶＬＰでＣａｓ９タンパク質を送達し、ＳＳＡ−ＥＧＦＰレポーター実験を行い、ゲノム編集効率を評価した。【０１４６】
図１（ａ）はＨＩＶのＧａｇ−Ｐｏｌ（以下、「ＷＴ  Ｇａｇ−ＰｏｌＨＩＶ」という場合がある。）の構造を示す模式図である。図１（ａ）に示すように、Ｇａｇ部分は、マトリックス（ＭＡ）、カプシド（ＣＡ、ｐ２４とも呼ばれる。）、ヌクレオカプシド（ＮＣ）、ｐ６（トランスフレーム）から構成される。また、Ｐｏｌは、プロテアーゼ（ＰＲ）、逆転写酵素（ＲＴ）、ＲＮａｓｅ  Ｈ（ＲＮ）、インテグラーゼ（ＩＮ）から構成される。【０１４７】
図１（ｂ）は、ＨＩＶのＧａｇ−ＰｏｌのＮ末端にＦＫＢＰ１２ドメインを付加した融合タンパク質（以下、「ＦＫＢＰ１２−Ｇａｇ−ＰｏｌＨＩＶ」という場合がある。）の構造を示す模式図である。ＦＫＢＰ１２はＦＫ５０６結合タンパク質である。【０１４８】
図１（ｃ）は、ＨＩＶのＧａｇのＮ末端にＦＫＢＰ１２ドメインを付加した融合タンパク質（以下、「ＦＫＢＰ１２−ＧａｇＨＩＶ」という場合がある。）の構造を示す模式図である。【０１４９】
Ｐｏｌの一部であるプロテアーゼ（ＰＲ）は、もともとＧａｇ−Ｐｏｌタンパク質の特定部位（図１中、ハサミマークで示す。）を切断する活性を持つ。一方、ＰＲを含むＰｏｌを削除したＶＬＰでは、プロテアーゼターゲット配列は残るが、プロテアーゼが供給されないため、タンパク質切断は発生しない。【０１５０】
図２は、ＳＳＡ−ＥＧＦＰ（以下、「ＥＧｘｘＦＰ」という場合がある。）レポーター実験を説明する模式図である。細胞としては、ヒトＤｙｓｔｒｏｐｈｉｎ（ＤＭＤ）遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡを恒常的に発現し、ＥＧｘｘＦＰレポーターコンストラクト（配列番号２１）がゲノムに挿入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を使用した。ＥＧｘｘＦＰレポーターコンストラクトは、前記ｓｇＲＮＡの標的配列を含む配列がＥＧＦＰ  ｃＤＮＡ配列中に挿入されていることにより、機能的なＥＧＦＰタンパク質が発現しないようにデザインされたコンストラクトである。【０１５１】
図２に示すように、この細胞にＣａｓ９が封入されたＶＬＰを導入すると、Ｃａｓ９タンパク質と前記ｓｇＲＮＡの複合体（ＲＮＰ複合体）が形成されて、前記挿入配列が切断される。続いて、切断されたＥＧＦＰ  ｃＤＮＡは一本鎖アニーリング（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓｔｒａｎｄ  Ａｎｎｅａｌｉｎｇ、ＳＳＡ）により修復され、この結果、機能的なＥＧＦＰが発現して、ＥＧＦＰの蛍光が観察できるようになる。この実験系では、細胞におけるＥＧＦＰの蛍光をフローサイトメーターで定量することにより、細胞集団中においてＣａｓ９タンパク質による標的遺伝子の切断効率（ゲノム編集効率）を評価することができる。【０１５２】
まず、ダルナビル（Ｄａｒｕｎａｖｉｒ、ＨＩＶのプロテアーゼ阻害剤）の存在下又は非存在下で、ＨＩＶ由来の野生型Ｇａｇ−ＰｏｌＨＩＶ又はＦＫＢＰ１２−Ｇａｇ−ＰｏｌＨＩＶで構成され、ＦＲＢドメインを融合させたＣａｓ９タンパク質（以下、「ＦＲＢ−Ｃａｓ９タンパク質」という場合がある。）を封入したＶＬＰ（図１の（ａ）と（ｂ））を作製した。なお、ＦＫＢＰ１２ドメインとＦＲＢ（ＦＫＢＰ１２−ｒａｐａｍｙｃｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ１、ＦＲＡＰ１  ｆｒａｇｍｅｎｔ）ドメインは、ラパマイシン類似薬の存在下でヘテロダイマーを形成することが知られている。【０１５３】
続いて、作製した各ＶＬＰ（１５μＬ）を、ＨＥＫ２９３Ｔ  ＥＧｘｘＦＰレポーター細胞（５×１０４個、ｓｇＲＮＡ発現有り）に導入した。続いて、３日後にフローサイトメーターでＧＦＰ陽性細胞の割合を解析した。【０１５４】
図３は、フローサイトメーターによる解析結果を示すグラフである。図３中、縦軸はＧＦＰ陽性細胞の割合を示す。その結果、ＷＴ  Ｇａｇ−ＰｏｌＨＩＶ  ＶＬＰよりも、ＦＫＢＰ１２−Ｇａｇ−ＰｏｌＨＩＶ  ＶＬＰの方が、ＦＲＢ−Ｃａｓ９送達によるゲノム編集効率が高いことが明らかとなった（ダルナビル非添加群間の比較）。さらに、ＶＬＰ作製時に細胞にＨＩＶプロテアーゼ阻害剤であるダルナビルを添加すると、ＦＫＢＰ１２−Ｇａｇ−ＰｏｌＨＩＶ  ＶＬＰを導入した細胞において、ゲノム編集効率がより一層向上したことが明らかとなった（図３中、矢印は、ゲノム編集効率の向上を示す。）。【０１５５】
続いて、上記の各ＶＬＰ中のＦＫＢＰ１２−Ｇａｇ−ＰｏｌＨＩＶと、ＨＡタグを持つＦＲＢ−Ｃａｓ９タンパク質をウエスタンブロッティングにより定量した。図４は、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図４に示すように、ＶＬＰ作製時に細胞にＨＩＶプロテアーゼ阻害剤であるダルナビルを添加したものでは、ダルナビル非添加のものと比べて、ＦＫＢＰ１２−Ｇａｇ−ＰｏｌＨＩＶ（図４中の「ｐ５５＋１２」）とＨＡタグを持つＦＲＢ−Ｃａｓ９タンパク質（図４中の「Ｆｕｌｌ  ｌｅｎｇｔｈ」）の量が大幅に増加していた。一方、ダルナビル非添加のものでは、ダルナビル添加のものに比べて、より低分子の分子種（図４中の「ｐ４１＋１２」、「ｐ２４  Ｃａｐｓｉｄ」，「Ｃｌｅａｖｅｄ  １，２」）が増加していた（ダルナビル＋と−間での比較）。すなわち、ダルナビルを添加したものでは、Ｇａｇタンパク質の切断とＣａｓ９タンパク質の分解が抑制されることが明らかとなった。【０１５６】
続いて、ＦＫＢＰ１２−Ｇａｇ−ＰｏｌＨＩＶからＰｏｌ部分を削除したＦＫＢＰ１２−ＧａｇＨＩＶ（図１の（ｃ））を用いてＦＲＢ−Ｃａｓ９タンパク質を封入したＶＬＰを作製し、ＳＳＡ−ＥＧＦＰレポーター実験によりゲノム編集効率を検討した。図５は、フローサイトメーターによる解析結果を示すグラフである。図５中、縦軸はＧＦＰ陽性細胞の割合を示す。【０１５７】
その結果、ＦＫＢＰ１２−Ｇａｇ−ＰｏｌＨＩＶ  ＶＬＰよりも、ＦＫＢＰ１２−ＧａｇＨＩＶ  ＶＬＰのほうが、ＦＲＢ−Ｃａｓ９送達によるゲノム編集効率が高いことが明らかとなった。【０１５８】
これらの結果より、Ｇａｇタンパク質をＰｏｌまで含む形で発現させると、Ｐｏｌ中のプロテアーゼの作用により、Ｇａｇタンパク質だけでなくＣａｓ９タンパク質も分解されることも明らかとなった。よって、Ｇａｇタンパク質をＰｏｌまで含む形で発現させる方法で製造された従来のＶＬＰ（例として、非特許文献１）では、Ｐｏｌから発現するプロテアーゼによってＣａｓ９タンパク質が分解されるためにＶＬＰ内に保持されるＣａｓ９タンパク質量が少なく、それゆえ十分なレベルのゲノム切断効率が得られなかったと考えられる。【０１５９】
［実験例２］
（ＦＫＢＰ１２ドメイン結合箇所の検討１）
ＦＲＢ−Ｃａｓ９の送達のために、ＦＫＢＰ１２ドメインをＶＬＰのどこに局在させるのがよいか検討した。【０１６０】
図６（ａ）は、ＦＫＢＰ１２ドメインをＶＳＶ−Ｇ（水疱性口内炎ウイルスのエンベロープタンパク質）のＣ末端（細胞質内ドメイン側）に融合した、ＶＳＶＧ−ＦＫＰＢ１２融合タンパク質の発現ベクター（ｐＨＬＳ−ＥＦ１ａ−ＶＳＶＧ−ＦＫＢＰ１２）の構造、及び、ＶＳＶＧ−ＦＫＰＢ１２融合タンパク質を含むＶＬＰの構造を示す模式図である。ＶＳＶ−Ｇは指向性（トロピズム）が広く、レンチウイルスやレトロウイルスのシュードタイプウイルス作製に一般に用いられるエンベロープタンパクであり、本開示に係るＶＬＰ外皮の主構成成分である。よって、このベクターから発現する前記融合タンパク質のＦＫＰＢ１２ドメイン部分は、ＶＬＰの外皮内側膜上に突き出た形で存在する（膜上局在）。【０１６１】
図６（ｂ）は、ＦＫＢＰ１２ドメインをＥＧＦＰのＮ末端に融合したＦＫＢＰ１２−ＥＧＦＰ融合タンパク質の発現ベクターの構造、及び、ＦＫＢＰ１２−ＥＧＦＰ融合タンパク質を含むＶＬＰの構造を示す模式図である。このベクターから発現する前記融合タンパク質のＦＫＰＢ１２ドメイン部分は、ＶＬＰの内部に存在する（細胞質局在）。【０１６２】
図６（ｃ）は、ＦＫＢＰ１２ドメインをＧａｇＨＩＶのＮ末端に融合した、Ｎ末端にミリストイル化シグナルを有するＦＫＢＰ１２−ＧａｇＨＩＶ融合タンパク質の発現ベクターの構造、及び、ＦＫＢＰ１２−ＧａｇＨＩＶ融合タンパク質を含むＶＬＰの構造を示す模式図である。このベクターから発現する前記融合タンパク質のＦＫＰＢ１２ドメイン部分は、ＶＬＰの外皮膜内側に結合した状態で存在する（膜内側局在）。【０１６３】
まず、ラパマイシン類似薬であるＡＰ２１９６７の存在下又は非存在下で、ＶＳＶＧ−ＦＫＰＢ１２融合タンパク質、ＦＫＢＰ１２−ＥＧＦＰ融合タンパク質、ＦＫＢＰ１２−ＧａｇＨＩＶ融合タンパク質をそれぞれ含み、ＦＲＢ−Ｃａｓ９を封入したＶＬＰを作製した。【０１６４】
続いて、各ＶＬＰに含まれるＦＲＢ−Ｃａｓ９タンパク質量を定量した。具体的には、濃縮した各ＶＬＰをＬｙｓｉｓバッファー（１２０ｎＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、５％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、プロテアーゼ阻害剤）中で溶解し、プロテインシンプル社の全自動ウエスタンブロット装置Ｗｅｓを用いて抗Ｃａｓ９抗体を用いたウエスタンブロッティングを行った。図７は、ウエスタンブロッティングの結果を示す画像である。【０１６５】
その結果、図７中、矢印で示すように、ＶＬＰに封入されたＣａｓ９量は、ＦＫＰＢ１２ドメインをＶＳＶ−Ｇ（膜上局在）やＥＧＦＰ（細胞質局在）に結合させたＶＬＰよりも、ＧａｇＨＩＶ（膜内側局在）と結合させたＶＬＰで高いことが明らかとなった。【０１６６】
続いて、ＶＬＰに含まれるＣａｓ９タンパク質量を検定するため、試験管内でのＤＮＡ切断活性を測定した。具体的には、濃縮した各ＶＬＰにＬｙｓｉｓバッファーを添加し、氷上で１０分間静置してＶＬＰを溶解した。【０１６７】
続いて、Ｃａｓ９タンパク質を含むＶＬＰ溶解産物を、ジストロフィン標的配列を含んだＤＮＡ（７００ｂｐ）、及び、試験管内転写（ＩＶＴ）反応で作製した、ヒトＤＭＤ遺伝子のエクソン４５の５’側（スプライシングアクセプター付近）を標的とするｓｇＲＮＡ  ＤＭＤ＃１（標的配列を配列番号１５に示す。）と共にバッファー（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、５％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．５％ＢＳＡ）中で混合し、３７℃で１時間反応させた。反応後、ｓｇＲＮＡを除去するためにＲＮａｓｅ  Ａを加えて３７℃で３０分間反応させた。さらに、タンパク質を除去するためにｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋを加えて５０℃で２０分間反応させた。【０１６８】
続いて、これらのサンプルを２２００  ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ（ｈｉｇｈ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｄ１０００  ＴａｐｅＳｃｒｅｅｎ、アジレント・テクノロジー社）を用いて電気泳動し、ジストロフィン標的配列を含んだＤＮＡが切断された割合を測定した。【０１６９】
図８は、電気泳動の結果を示す画像である。また、図９は、図８の結果を数値化したグラフである。その結果、ＦＫＢＰ１２−ＧａｇＨＩＶを含むＶＬＰが最も切断活性が高く、更にＦＫＢＰ１２とＦＲＢの２量体化を誘導するＡＰ２１９６７の添加により、Ｃａｓ９のＶＬＰへの封入効率が向上したことが明らかとなった。【０１７０】
［実験例３］
（ＦＫＢＰ１２ドメイン結合箇所の検討２）
ＦＲＢ−Ｃａｓ９の送達のために、ＦＫＢＰ１２ドメインをＶＬＰのどこに結合させるのがよいか検討した。【０１７１】
ｓｇＲＮＡ  ＤＭＤ＃１（標的配列を配列番号１５に示す。）を恒常的に発現させた、ＨＥＫ２９３Ｔ  ＥＧｘｘＦＰ細胞に実験例２と同様の各ＶＬＰを導入後、ゲノム上の標的ＤＭＤ遺伝子の切断活性をＴ７ＥＩアッセイで測定した。【０１７２】
具体的には、まず、各ＶＬＰをｓｇＲＮＡ  ＤＭＤ＃１（標的配列を配列番号１５に示す。）を恒常的に発現させたＨＥＫ２９３Ｔ  ＥＧｘｘＦＰ細胞に導入した。続いて、３日後に各細胞からゲノムＤＮＡを抽出した。続いて、ゲノム上のＤＭＤ遺伝子の標的領域をＰＣＲで増幅した。続いて、ＰＣＲ産物をカラム精製し、得られたＤＮＡ  ４００ｎｇを用いて、Ｔ７ＥＩアッセイにより変異導入効率を測定した。【０１７３】
図１０は、Ｔ７ＥＩアッセイの結果を示す画像である。また、図１１は、図１０の結果を数値化したグラフである。また、図１２は、本実験例の各細胞における、ＥＧｘｘＦＰレポーターコンストラクトからのＧＦＰ陽性細胞の割合をフローサイトメーターによって解析した結果を示すグラフである。【０１７４】
その結果、ＦＫＢＰ１２−ＧａｇＨＩＶを含むＶＬＰが最も切断活性が高く、更にＦＫＢＰ１２とＦＲＢの２量体化を誘導するＡＰ２１９６７の添加により、Ｃａｓ９のＶＬＰへの封入効率が向上したことが明らかとなった。【０１７５】
［実験例４］
（ＶＬＰへのＣａｓ９タンパク質の封入効率の検討１）
ＭＬＶ（Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ）由来Ｇａｇを用いてＣａｓ９タンパク質を封入したＶＬＰ（以下、「ＦＫＢＰ１２−ＧａｇＭＬＶ  ＶＬＰ」という場合がある。）及びＨＩＶ由来Ｇａｇを用いてＣａｓ９タンパク質を封入したＶＬＰ（以下、「ＦＫＢＰ１２−ＧａｇＨＩＶ  ＶＬＰ」という場合がある。）を作製し、Ｃａｓ９タンパク質の送達効率を検討した。【０１７６】
具体的には、ｓｇＲＮＡ  ＤＭＤ＃１（標的配列を配列番号１５に示す。）を恒常的に発現させた、ＨＥＫ２９３Ｔ  ＥＧｘｘＦＰ細胞（２．５×１０４個）に、１０μＬの各ＶＬＰを接種した。対照として、ＶＬＰを接種しなかった細胞を用意した。続いて、３日後に各細胞サンプルのＥＧｘｘＦＰレポーターコンストラクトの蛍光をフローサイトメーターによって解析した。【０１７７】
図１３（ａ）〜（ｃ）は、フローサイトメーターによる解析結果を示すグラフである。図１３（ａ）は対照細胞の結果であり、図１３（ｂ）はＦＫＢＰ１２−ＧａｇＭＬＶ  ＶＬＰを接種した結果であり、図１３（ｃ）はＦＫＢＰ１２−ＧａｇＨＩＶ  ＶＬＰを接種した結果である。その結果、ＦＫＢＰ１２−ＧａｇＭＬＶ  ＶＬＰよりもＦＫＢＰ１２−ＧａｇＨＩＶ  ＶＬＰの方がＣａｓ９タンパク質の送達効率が高いことが明らかとなった。【０１７８】
［実験例５］
（ＶＬＰへのＣａｓ９タンパク質の封入効率の検討２）
ＡＰ２１９６７の存在下又は非存在下で、ＦＲＢドメインをＮ末端に結合させたＣａｓ９、ＦＲＢドメインをＣ末端に結合させたＣａｓ９、及び、ＦＲＢドメインをＮ末端とＣ末端の両方に結合させたＣａｓ９をそれぞれ含むＶＬＰを作製し、ＶＬＰへのＣａｓ９タンパク質の封入効率を検討した。【０１７９】
ＡＰ２１９６７はＦＲＢドメインの２０９８残基目のスレオニンをロイシンに置換したＦＲＢ（Ｔ２０９８Ｌ）に特異的に結合することが知られている。このため、ＦＲＢとしてはＦＲＢ（Ｔ２０９８Ｌ）を使用した。【０１８０】
具体的には、ｓｇＲＮＡ  ＤＭＤ＃１（標的配列を配列番号１５に示す。）を恒常的に発現させた、ＨＥＫ２９３Ｔ  ＥＧｘｘＦＰ細胞（２．５×１０４個）に、１５０ｎｇのｐ２４量相当の各ＶＬＰを接種した。続いて、３日後に各細胞サンプルのＥＧｘｘＦＰレポーターコンストラクトの蛍光をフローサイトメーターによって解析した。【０１８１】
図１４は、フローサイトメーターによる解析結果を示すグラフである。図１４中、縦軸はＧＦＰ陽性細胞の割合を示す。その結果、いずれのＶＬＰにおいてもＡＰ２１９６７依存的なＣａｓ９タンパク質の送達が認められた。また、Ｃａｓ９タンパク質のＮ末端にＦＲＢドメインを結合させた場合が最もＣａｓ９タンパク質の送達効率が高いことが明らかとなった。【０１８２】
［実験例６］
（ＶＬＰへのＣａｓ９タンパク質の封入効率の検討３）
ＦＫＢＰ１２ドメインとＦＲＢドメインの結合を介してＣａｓ９タンパク質をＶＬＰに封入した場合と、Ｃａｓ９タンパク質をＧａｇに直接融合させてＶＬＰに封入した場合でＶＬＰへのＣａｓ９タンパク質の封入効率を検討した。【０１８３】
図１５（ａ）は、ＦＲＢドメインとＣａｓ９タンパク質との融合タンパク質の構造、及び、ＦＫＢＰ１２ドメインとＧａｇＨＩＶとの融合タンパク質の構造を示す模式図である。この場合、ＡＰ２１９６７を介した２量体化によりＣａｓ９タンパク質がＶＬＰに封入される。【０１８４】
また、図１５（ｂ）は、ＧａｇＭＬＶとＣａｓ９タンパク質との融合タンパク質の構造、及び、ＧＡＧ−ＰｏｌＭＬＶの構造を示す模式図である。この場合、ＶＬＰ粒子形成を促進するために、Ｇａｇ−ＰｏｌＭＬＶを追加した。【０１８５】
また、図１５（ｃ）は、Ｃａｓ９タンパク質とＧａｇ−ＰｏｌＨＩＶとの融合タンパク質の構造、及び、ＧＡＧ−ＰｏｌＨＩＶの構造を示す模式図である。この場合、ＶＬＰ粒子形成を促進するために、Ｇａｇ−ＰｏｌＨＩＶを追加した。【０１８６】
具体的には、ｓｇＲＮＡ  ＤＭＤ＃１（標的配列を配列番号１５に示す。）を恒常的に発現させた、ＨＥＫ２９３Ｔ  ＥＧｘｘＦＰ細胞に、各ＶＬＰを接種した。続いて、３日後に各細胞サンプルのＥＧｘｘＦＰレポーターコンストラクトの蛍光をフローサイトメーターによって解析した。【０１８７】
図１５（ｄ）はフローサイトメーターによる解析結果を示すグラフである。図１５（ｄ）中、縦軸はＧＦＰ陽性細胞の割合を示す。その結果、Ｃａｓ９タンパク質を直接ＧａｇやＧａｇ−Ｐｏｌに融合して作製したＶＬＰよりも、ＦＫＢＰ１２ドメインとＦＲＢドメインの結合を利用して作製したＶＬＰの方がＣａｓ９タンパク質の送達効率が高いことが明らかとなった。【０１８８】
［実験例７］
（ＡＰ２１９６７の濃度の検討）
ヘテロ２量化リガンドである、ＡＰ２１９６７の濃度を０、３、３０、３００ｎＭに変化させてＶＬＰを作製した。続いて、ｓｇＲＮＡ  ＤＭＤ＃１（標的配列を配列番号１５に示す。）を恒常的に発現させた、ＨＥＫ２９３Ｔ  ＥＧｘｘＦＰ細胞（５×１０４個）に、各ＶＬＰを接種した。続いて、３日後に各細胞サンプルのＥＧｘｘＦＰレポーターコンストラクトの蛍光をフローサイトメーターによって解析した。【０１８９】
図１６、図１７はフローサイトメーターによる解析結果を示すグラフである。図１６、図１７中、縦軸はＧＦＰ陽性細胞の割合を示す。その結果、ＶＬＰ作製時のＡＰ２１９６７の濃度依存的にゲノム編集効率が向上する蛍光が認められた。また、ＡＰ２１９６７存在下で作製したＶＬＰは、ＶＬＰの接種量依存的にＣａｓ９を送達してゲノム編集を誘導することができることが明らかとなった。【０１９０】
［実験例８］
（ＦＲＢドメインの検討）
ＡＰ２１９６７は２０９８残基目のスレオニンをロイシンに置換したＦＲＢドメイン（Ｔ２０９８Ｌ）に特異的に結合することが知られている。一方、２０９８残基目のスレオニンをアラニンに置換したＦＲＢドメイン（Ｔ２０９８Ａ）はＡＰ２１９６７との結合能を失うことが知られている。【０１９１】
そこで、各ＦＲＢドメインを含むＣａｓ９を用いてＶＬＰを作製し、ゲノム編集効率を測定した。具体的には、ｓｇＲＮＡ  ＤＭＤ＃１（標的配列を配列番号１５に示す。）を標的とするｓｇＲＮＡを恒常的に発現させた、ＨＥＫ２９３Ｔ  ＥＧｘｘＦＰ細胞に、各ＶＬＰを接種した。続いて、３日後に各細胞サンプルのＥＧｘｘＦＰレポーターコンストラクトの蛍光をフローサイトメーターによって解析した。【０１９２】
図１８（ａ）〜（ｃ）は、フローサイトメーターによる解析結果を示すグラフである。図１８（ａ）〜（ｃ）中、縦軸はＧＦＰ陽性細胞の割合を示す。また、「＋」はＡＰ２１９６７の存在下でＶＬＰを作製した結果であることを示し、「−」はＡＰ２１９６７の非存在下でＶＬＰを作製した結果であることを示す。【０１９３】
その結果、ＦＲＢドメイン（Ｔ２０９８Ａ）変異体と結合したＣａｓ９タンパク質を含むＶＬＰでは、ＡＰ２１９６７依存的なＣａｓ９送達が阻害されることが明らかとなった。この結果は、Ｃａｓ９タンパク質の効率的な送達のためには、ＦＲＢドメイン（Ｔ２０９８Ｌ）を介したＣａｓ９タンパク質とＧａｇとの２量体化が必要であることを更に支持するものである。【０１９４】
［実験例９］
（ＦＲＢ−Ｃａｓ９タンパク質の局在の検討）
ＦＲＢ−Ｃａｓ９タンパク質の細胞内における局在を検討した。具体的には、ＦＲＢ−ＳｐＣａｓ９（核移行シグナル付き）に、蛍光タンパク質であるｍＣｈｅｒｒｙを結合させた融合タンパク質を含むＶＬＰを作製した。続いて、濃縮したＶＬＰ（８μＬ）を４８ウェルプレート上のＨＥＫ２９３Ｔ細胞（５×１０４個）に接種し、接種２０時間後にＫｅｙｅｎｃｅ  ＢＸ−７００顕微鏡の２０倍対物レンズを用いてｍＣｈｅｒｒｙの蛍光を解析した。【０１９５】
図１９は、解析結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図１９中、「ＤＡＰＩ」は４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールで核を染色した結果であることを示し、「ｍＣｈｅｒｒｙ」は、ｍＣｈｅｒｒｙの蛍光を検出した結果であることを示し、「Ｍｅｒｇｅ」はＤＡＰＩの蛍光とｍＣｈｅｒｒｙの蛍光をマージした結果であることを示す。その結果、ＦＲＢ−Ｃａｓ９タンパク質は核に局在することが確認された。図１９中、矢印は核に局在したｍＣｈｅｒｒｙの蛍光を示す。【０１９６】
［実験例１０］
（ｓｇＲＮＡのＶＬＰへの封入方法の検討１）
図２０（ａ）〜（ｃ）は、ｓｇＲＮＡの発現方法による、ＶＬＰ生産細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）におけるｓｇＲＮＡの動態を説明する模式図である。【０１９７】
図２０（ａ）は、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターを用いてｓｇＲＮＡを転写した場合を示す模式図である。ｓｇＲＮＡは１００塩基程度の短いＲＮＡであるため、多くの場合、Ｕ６やＨ１プロモーター等のポリメラーゼＩＩＩプロモーターを用いて転写される。しかしながら、この場合、図２０（ａ）に示すように、ｓｇＲＮＡが主に核内に集積することが報告されている。【０１９８】
図２０（ｂ）は、ポリメラーゼＩＩプロモーターを用いてｍＲＮＡを転写した場合を示す模式図である。ｓｇＲＮＡの前後に自己切断配列であるリボザイム（ハンマーヘッド（ＨＨ）リボザイム及びｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｄｅｌｔａ  ｖｉｒｕｓ（ＨＤＶ）リボザイム）を付加することにより、本来のｓｇＲＮＡより長いｍＲＮＡとしてポリメラーゼＩＩプロモーター（ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター等）から転写することが可能である。この場合、図２０（ｂ）に示すように、ｍＲＮＡは細胞質に分布する。【０１９９】
図２０（ｃ）は、本実験例で検討した、ｓｇＲＮＡのＶＬＰへの封入方法を説明する模式図である。本実験例では、ｍＲＮＡとして転写されるｓｇＲＮＡを、より効率的にＶＬＰに封入させるために、ｍＲＮＡにＨＩＶ由来のパッケージングシグナル（Ψ）を付加することを検討した。パッケージングシグナル（Ψ）は、ＭＬＶやＨＩＶ等のレトロウイルスやレンチウイルスが、自身のゲノムｍＲＮＡをウイルス粒子に取り込ませるために備えている配列である。【０２００】
Ｇａｇタンパク質とパッケージングシグナルが結合することにより、ウイルス粒子中にウイルスゲノムｍＲＮＡが取り込まれることが知られている。発明者らは、この機構をｓｇＲＮＡのＶＬＰへの封入に応用することを検討した。【０２０１】
なお、パッケージングシグナル配列はＧａｇの頭の部分までも含めたＥｘｔｅｎｄｅｄパッケージングシグナル（Ψ＋）の方がウイルス粒子中への取り込み効率が高いことが知られている。本実験例においてもΨ＋配列を用いた。なお、この部分のＧａｇにおける開始コドンには変異が入れてあり、タンパク質は翻訳されないようになっている。【０２０２】
本実験例では、まず、Ｕ６プロモーターからｓｇＲＮＡを転写させた場合（図２１（ａ）及び（ｂ）中、「Ｕ６」と示す。）、ＬＴＲプロモーターから、Ψ＋を含むｍＲＮＡとしてｓｇＲＮＡが転写されるが、リボザイム配列を含まない場合（図２１（ａ）及び（ｂ）中、「ＬＴＲ−Ψ  ｎ．ｒ．」と示す。）、ＥＦ１αプロモーターからΨ＋とリボザイム配列を持つｓｇＲＮＡが転写される場合（図２１（ａ）及び（ｂ）中、「ＥＦ１ａ」と示す。）、ＨＩＶ  ＬＴＲプロモーターを活性化するＴａｔタンパク質の存在下（図２１（ａ）及び（ｂ）中、「ＬＴＲ−Ψ  ＋Ｔａｔ」と示す。）又は非存在下（図２１（ａ）及び（ｂ）中、「ＬＴＲ−Ψ  −Ｔａｔ」と示す。）において、Ψ＋とリボザイム配列を持つｓｇＲＮＡが転写される場合について、ＦＲＢ−Ｃａｓ９の存在下でそれぞれＶＬＰを作製した。続いて、ＶＬＰ生産細胞のゲノムＤＮＡを回収し、ＤＭＤ遺伝子の標的塩基配列をＴ７ＥＩアッセイで解析し、ゲノム編集効率を検証した。【０２０３】
図２１（ａ）は、ＶＬＰ生産細胞におけるＴ７ＥＩアッセイの結果を示すグラフである。その結果、Ｕ６プロモーターが最も活性型ｓｇＲＮＡを多く転写できることが明らかとなった。また、ポリメラーゼＩＩプロモーター（ＬＴＲ又はＥＦ１α）からｍＲＮＡとして転写させた場合、リボザイム配列を持っていればｓｇＲＮＡとして切り出され、ゲノム編集を誘導できることが明らかとなった。【０２０４】
続いて、作製した各ＶＬＰ  １、３及び１０μＬを、ＨＥＫ２９３Ｔ  ＥＧｘｘＦＰレポーター細胞（５×１０４個）にそれぞれ導入した。続いて、３日後にフローサイトメーターでＧＦＰ陽性細胞の割合を解析した。【０２０５】
図２１（ｂ）は、フローサイトメーターによる解析結果を示すグラフである。図２１（ｂ）中、縦軸はＧＦＰ陽性細胞の割合を示す。その結果、ＶＬＰ生産細胞で高いゲノム編集活性を示したＵ６プロモーターでは、ＶＬＰへのｓｇＲＮＡの封入効率が低く、ゲノム編集活性が高くない結果となった。【０２０６】
一方、Ｔａｔタンパク質存在下において、ＬＴＲプロモーターからΨ＋とリボザイム配列を持つｓｇＲＮＡを転写させた場合（図２１（ｂ）中、「ＬＴＲ−Ψ  ＋Ｔａｔ」と示す。）、ＶＬＰを介したｓｇＲＮＡの送達効率が最も高いことが明らかとなった。【０２０７】
［実験例１１］
（ｓｇＲＮＡのＶＬＰへの封入方法の検討２）
ＨＩＶ  Ｒｅｖタンパク質は、ＲＮＡ上のＲＲＥ（Ｒｅｖ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）配列に結合し、ＰＲＥを持つウイルスＲＮＡを細胞質に輸送することが知られている。そして、ほとんどのレンチウイルスベクターにはＲＲＥ配列が組み込まれている。実験例１０で使用したｓｇＲＮＡの発現ベクターにもＲＲＥ配列が含まれていたため、Ｒｅｖタンパク質の必要性を検討した。【０２０８】
具体的には、Ｒｅｖタンパク質の存在下又は非存在下、ＲＲＥ配列の存在下又は非存在下において、それぞれＶＬＰを生産し、ゲノム編集効率を検討した。図２２（ａ）は、ＲＲＥ配列を含むｓｇＲＮＡの発現ベクター（配列番号２２）の構造を示す模式図である。また、図２２（ｂ）は、図２２（ａ）に示す発現ベクターからＰＲＥ配列を除去した発現ベクター（配列番号２３）の構造を示す模式図である。【０２０９】
ｓｇＲＮＡはＨＩＶ  ＬＴＲプロモーターより転写されており、ＨＩＶ  ＬＴＲプロモーターの活性化のためにはＨＩＶのＴａｔタンパク質が必要である。そこで、Ｔａｔタンパク質の存在下又は非存在下、Ｒｅｖタンパク質の存在下又は非存在下で、図２２（ａ）に示す発現ベクターからｓｇＲＮＡを転写させてＶＬＰを作製し、作製した各ＶＬＰによるゲノム編集効率を解析した。【０２１０】
具体的には、各ＶＬＰをＨＥＫ２９３Ｔ  ＥＧｘｘＦＰレポーター細胞にそれぞれ導入し、３日後にフローサイトメーターでＧＦＰ陽性細胞の割合を解析した。図２２（ｃ）〜（ｆ）は、フローサイトメーターによる解析結果を示すグラフである。図２２（ｃ）〜（ｆ）中、「−Ｔａｔ」はＴａｔタンパク質の非存在下でＶＬＰを作製した結果であることを示し、「＋Ｔａｔ」はＴａｔタンパク質の存在下でＶＬＰを作製した結果であることを示し、「−Ｒｅｖ」はＲｅｖタンパク質の非存在下でＶＬＰを作製した結果であることを示し、「＋Ｒｅｖ」はＲｅｖタンパク質の存在下でＶＬＰを作製した結果であることを示す。その結果、Ｔａｔタンパク質の存在下で高いゲノム編集効率が観察された。また、Ｒｅｖタンパク質の存在下と非存在下でゲノム編集効率は同程度であった。【０２１１】
また、Ｔａｔタンパク質の存在下又は非存在下で、図２２（ｂ）に示す発現ベクターからｓｇＲＮＡを転写させてＶＬＰを作製し、作製した各ＶＬＰによるゲノム編集効率を解析した。具体的には、各ＶＬＰをＨＥＫ２９３Ｔ  ＥＧｘｘＦＰレポーター細胞にそれぞれ導入し、３日後にフローサイトメーターでＧＦＰ陽性細胞の割合を解析した。【０２１２】
図２２（ｇ）及び（ｈ）は、フローサイトメーターによる解析結果を示すグラフである。図２２（ｇ）及び（ｈ）中、「−Ｔａｔ」はＴａｔタンパク質の非存在下でＶＬＰを作製した結果であることを示し、「＋Ｔａｔ」はＴａｔタンパク質の存在下でＶＬＰを作製した結果であることを示し、「−ＰＲＥ」はＰＲＥ配列を除去した発現ベクターでＶＬＰを作製した結果であることを示す。その結果、ＰＲＥ配列が存在しなくても高いゲノム編集効率が得られることが明らかとなった。【０２１３】
以上の結果から、ｓｇＲＮＡの発現ベクターにはＲＲＥ配列が不要であり、Ｒｅｖタンパク質も不要であることが明らかとなった。【０２１４】
［実験例１２］
（ｓｇＲＮＡのＶＬＰへの封入方法の検討３）
上述したように、ｓｇＲＮＡはＨＩＶ  ＬＴＲプロモーターより転写されており、ＨＩＶ  ＬＴＲプロモーターの活性化のためにはＨＩＶのＴａｔタンパク質が必要である。そこで、ＶＬＰ生産細胞においてＴａｔタンパク質の存在下及び非存在下で、ＶＬＰ産生細胞におけるｓｇＲＮＡの発現量をリアルタイムＰＣＲにより定量した。また、ＶＬＰ中のｓｇＲＮＡの量も同様にして定量した。【０２１５】
図２３はリアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである。図２３中、縦軸はｓｇＲＮＡの発現量（相対値）を示し、「＋」は存在下であることを示し、「−」は非存在下であることを示し、「ＮＤ」は検出限界以下であったことを示す。【０２１６】
その結果、ＶＬＰ生産細胞においてＴａｔタンパク質を共発現させることにより、ｓｇＲＮＡの発現量及びＶＬＰへのｓｇＲＮＡの封入量を増加させることができることが明らかとなった。【０２１７】
［実験例１３］
（ｓｇＲＮＡのＶＬＰへの封入方法の検討４）
ｓｇＲＮＡ発現ベクターにおけるパッケージングシグナル（Ψ＋）の効果を検討した。具体的には、Ψ＋を有するｓｇＲＮＡ発現ベクター又はΨ＋を削除したｓｇＲＮＡ発現ベクターを用いてＶＬＰを作製した。【０２１８】
続いて、各ＶＬＰをＨＥＫ２９３Ｔ  ＥＧｘｘＦＰレポーター細胞にそれぞれ導入し、３日後にフローサイトメーターでＧＦＰ陽性細胞の割合を解析した。図２４（ａ）〜（ｃ）は、フローサイトメーターによる解析結果を示すグラフである。図２４（ａ）はＶＬＰを接種しなかった対照の結果であり、図２４（ｂ）はΨ＋を削除したｓｇＲＮＡ発現ベクターを用いて作製したＶＬＰの結果であり、図２４（ｃ）はΨ＋を有するｓｇＲＮＡ発現ベクターを用いて作製したＶＬＰの結果である。【０２１９】
その結果、ｓｇＲＮＡ発現ベクターからΨ＋を削除すると、ＶＬＰを介したｓｇＲＮＡの送達効率が減少したことが明らかとなった。この結果は、ｓｇＲＮＡの封入効率を高めるためには、パッケージングシグナルが重要であることを示す。【０２２０】
［実験例１４］
（ｓｇＲＮＡ発現ベクターにおけるｓｇＲＮＡのコピー数の検討）
ＥＦ１αプロモーターの制御下で、リボザイムで挟まれたｓｇＲＮＡ（以下、「ＲＧＲ」という場合がある。）を発現するベクターにおいて、ｓｇＲＮＡカセットを１コピーから４コピーまで増加させ、ゲノム編集効率を検討した。【０２２１】
具体的には、各ＶＬＰをＨＥＫ２９３Ｔ  ＥＧｘｘＦＰレポーター細胞にそれぞれ導入し、３日後にフローサイトメーターでＧＦＰ陽性細胞の割合を解析した。図２５は、フローサイトメーターによる解析結果を示すグラフである。図２５中、ＥＦ１αプロモーターの制御下において、（ｉ）はｓｇＲＮＡカセットを１コピー有するｓｇＲＮＡ発現ベクターの構造を示す模式図であり、（ｉｉ）はｓｇＲＮＡカセットを２コピー有するｓｇＲＮＡ発現ベクターの構造を示す模式図であり、（ｉｉｉ）はｓｇＲＮＡカセットを３コピー有するｓｇＲＮＡ発現ベクターの構造を示す模式図であり、（ｉｖ）はｓｇＲＮＡカセットを４コピー有するｓｇＲＮＡ発現ベクターの構造を示す模式図である。【０２２２】
その結果、ＥＦ１αプロモーターの制御下において、ｓｇＲＮＡ発現ベクターに最大４コピーまでのｓｇＲＮＡを含めた場合においてもＶＬＰを生産でき、ｓｇＲＮＡを送達してゲノム編集を誘導することができることが明らかとなった。【０２２３】
続いて、ＬＴＲプロモーターの制御下で、リボザイムで挟まれたｓｇＲＮＡ（以下、「ＲＧＲ」という場合がある。）を発現するベクターにおいて、ｓｇＲＮＡカセットを１コピーから４コピーまで増加させ、ゲノム編集効率を検討した。【０２２４】
具体的には、各ＶＬＰをＨＥＫ２９３Ｔ  ＥＧｘｘＦＰレポーター細胞にそれぞれ導入し、３日後にフローサイトメーターでＧＦＰ陽性細胞の割合を解析した。図２６は、フローサイトメーターによる解析結果を示すグラフである。図２６中、（ｉ）はｓｇＲＮＡカセットを１コピー有するｓｇＲＮＡ発現ベクターの構造を示す模式図であり、（ｉｉ）はｓｇＲＮＡカセットを２コピー有するｓｇＲＮＡ発現ベクターの構造を示す模式図であり、（ｉｉｉ）はｓｇＲＮＡカセットを３コピー有するｓｇＲＮＡ発現ベクターの構造を示す模式図であり、（ｉｖ）はｓｇＲＮＡカセットを４コピー有するｓｇＲＮＡ発現ベクターの構造を示す模式図である。【０２２５】
その結果、ＬＴＲプロモーターの制御下において、ｓｇＲＮＡ発現ベクターに最大４コピーまでのｓｇＲＮＡを含めた場合においてもＶＬＰを生産でき、ｓｇＲＮＡを送達してゲノム編集を誘導することができることが明らかとなった。【０２２６】
［実験例１５］
（ＶＬＰによるＣａｓ９タンパク質及びｓｇＲＮＡの同時送達１）
ＦＲＢ−Ｃａｓ９タンパク質及びｓｇＲＮＡ（ＲＧＲ）を同時に封入したＶＬＰを作製した。続いて、作製したＶＬＰをＨＥＫ２９３Ｔ  ＥＧｘｘＦＰレポーター細胞に導入し、３日後にフローサイトメーターでＧＦＰ陽性細胞の割合を解析した。図２７は、フローサイトメーターによる解析結果を示すグラフである。その結果、ＶＬＰの用量依存的に非常に高い効率でゲノム編集活性が観察された。【０２２７】
［実験例１６］
（ＶＬＰによるＣａｓ９タンパク質及びｓｇＲＮＡの同時送達２）
ＦＲＢ−Ｃａｓ９タンパク質及びｓｇＲＮＡ（ＲＧＲ）を同時に封入したＶＬＰを作製した。続いて、作製したＶＬＰ  １．２５、２．５、５、１０、２０μＬを導入したヒトｉＰＳ細胞（４０４Ｃ２株）に導入した。続いて、３日後にゲノムＤＮＡを回収し、標的塩基配列であるＤＭＤ遺伝子領域をＰＣＲで増幅し、Ｔ７ＥＩアッセイによりゲノム編集効率を検討した。図２８は、Ｔ７ＥＩアッセイの結果を示す画像である。その結果、ＶＬＰの用量依存的に、非常に高い効率でゲノム編集活性が観察された。【０２２８】
［実験例１７］
（既存システムとの比較）
エキソソーム様小胞（Ｇｅｓｉｃｌｅ）を用いてＣａｓ９タンパク質／ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰ複合体を送達するシステム（Ｇｅｓｉｃｌｅシステム、クロンテック社）と、ＶＬＰを用いたシステムとの比較を行った。【０２２９】
Ｇｅｓｉｃｌｅシステムは、Ｃａｓ９タンパク質／ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰ複合体と赤色蛍光タンパク質ＣｈｅｒｒｙＰｉｃｋｅｒがＧｅｓｉｃｌｅの中で会合し、Ｇｅｓｉｃｌｅ内に効率よく封入されるシステムである。赤色蛍光タンパク質ＣｈｅｒｒｙＰｉｃｋｅｒとは、赤色蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙとトランスフェリンレセプター膜アンカードメインの融合タンパク質である。【０２３０】
本実験例では、まず、ＶＳＶ−ＧだけでＶＬＰを作製し、Ｃａｓ９タンパク質及びｓｇＲＮＡを自由拡散によって封入したＶＬＰ（図２９中、「ＶＳＶＧ  Ｏｎｌｙ  ＶＬＰ」と示す。）、Ｇｅｓｉｃｌｅシステム（クロンテック社、図２９中、「Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｇｅｓｉｃｌｅ  Ｓｙｓｔｅｍ」と示す。）、ＦＲＢ−Ｃａｓ９タンパク質及びΨ＋を有するｓｇＲＮＡ発現ベクターから発現させたｓｇＲＮＡを封入したＦＫＢＰ１２−ＧａｇＨＩＶ  ＶＬＰ（図２９中、「ＦＫＢＰ１２−ＧａｇＨＩＶ  ＶＬＰ」と示す。）をそれぞれ作製した。【０２３１】
続いて、各ＶＬＰ又はＧｅｓｉｃｌｅ  ５μＬをＨＥＫ２９３Ｔ  ＥＧｘｘＦＰレポーター細胞（２．５×１０４個）に接種し、７２時後に蛍光顕微鏡及びフローサイトメトリーにより解析した。【０２３２】
図２９（ａ）〜（ｃ）は、ＧＦＰの蛍光を観察した蛍光顕微鏡写真である。また、図２９（ｄ）は、フローサイトメーターによる解析結果を示すグラフである。図２９（ｄ）中、縦軸はＧＦＰ陽性細胞の割合を示す。その結果、ＦＫＢＰ１２−ＧａｇＨＩＶ  ＶＬＰが、他のＶＬＰ又はＧｅｓｉｃｌｅと比較して、顕著に高いゲノム編集効率を示すことが明らかとなった。【０２３３】
［実験例１８］
（ＶＬＰによるＣａｓ９タンパク質及びｓｇＲＮＡの同時送達３）
様々なＶＬＰでＣａｓ９タンパク質及びｓｇＲＮＡを同時に送達し、ゲノム編集効率を検討した。【０２３４】
具体的には、まず、次の（ａ）〜（ｅ）のＶＬＰを作製した。（ａ）ＶＳＶ−ＧだけでＶＬＰを作製し、Ｃａｓ９タンパク質及びｓｇＲＮＡを自由拡散によって封入したＶＬＰ（図３０中、「ＶＳＶＧ  Ｏｎｌｙ  ＶＬＰ」と示す。）。（ｂ）Ｃａｓ９タンパク質のＣ末端にＧａｇ−ＭＬＶを直接融合して封入したＶＬＰ（図３０中、「Ｃａｓ９−Ｇａｇ−ＰｏｌＨＩＶ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＶＬＰ」と示す。）。ＶＬＰ粒子形成を促進するために、Ｇａｇ−ＰｏｌＨＩＶを追加した。（ｃ）Ｃａｓ９タンパク質のＮ末端にＧａｇＭＬＶを直接融合して封入したＶＬＰ（図３０中、「ＧａｇＭＬＶ−Ｃａｓ９  Ｆｕｓｉｏｎ  ＶＬＰ」と示す。）。ＶＬＰ粒子形成を促進するために、Ｇａｇ−ＰｏｌＭＬＶを追加した。（ｄ）Ｃａｓ９をＦＲＢと融合し、また、ＧａｇＭＬＶにＦＫＢＰ１２を融合することで、ＡＰ２１９６７を介した２量体化によりＣａｓ９を封入したＶＬＰ（図３０中、「ＦＫＢＰ１２−ＧａｇＭＬＶ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＶＬＰ」と示す。）。（ｅ）Ｃａｓ９をＦＲＢと融合し、ＧａｇＨＩＶにＦＫＢＰ１２を融合することで、ＡＰ２１９６７を介した２量体化によりＣａｓ９を封入したＶＬＰ（図３０中、「ＦＫＢＰ１２−ＧａｇＨＩＶ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＶＬＰ」と示す。）。【０２３５】
続いて、作製した各ＶＬＰをＨＥＫ２９３Ｔ  ＥＧｘｘＦＰレポーター細胞に導入し、３日後にフローサイトメーターでＧＦＰ陽性細胞の割合を解析した。図３０（ａ）〜（ｅ）は、フローサイトメーターによる解析結果を示すグラフである。図３０（ａ）〜（ｅ）は、それぞれ上述した（ａ）〜（ｅ）のＶＬＰを細胞に導入した結果である。また、図３１は、図３０（ａ）〜（ｅ）の結果を数値化したグラフである。図３１中、縦軸はＧＦＰ陽性細胞の割合を示す。その結果、ＦＫＢＰ１２−ＧａｇＨＩＶ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＶＬＰとＦＫＢＰ１２−ＧａｇＭＬＶ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＶＬＰで非常に高い効率でゲノム編集活性が観察された。【０２３６】
［実験例１９］
（２種類のｓｇＲＮＡのＶＬＰ送達の検討１）
２種類のｓｇＲＮＡをＶＬＰで細胞に送達する場合、別々のｓｇＲＮＡを封入した２種類のＶＬＰを共導入する方法と、２種類のｓｇＲＮＡを封入した１種類のＶＬＰを導入する方法が想定される。図３２（ａ）及び（ｂ）は、これらの方法を説明する模式図である。図３２（ａ）は、別々のｓｇＲＮＡを封入した２種類のＶＬＰを共導入する方法を説明する模式図である。また、図３２（ｂ）は、２種類のｓｇＲＮＡを封入した１種類のＶＬＰを導入する方法を説明する模式図である。本実験例では、これらの２つの方法で２種類のｓｇＲＮＡを細胞に送達する検討を行った。【０２３７】
まず、Ｃａｓ９及びヒトＤＭＤ遺伝子のエクソン４５の５’側（スプライシングアクセプター付近）を標的とするｓｇＲＮＡ  ＤＭＤ＃１（標的配列を配列番号１５に示す。）を封入したＶＬＰ（以下、「ＤＭＤ１  ＶＬＰ」という場合がある。）と、Ｃａｓ９及び３’側（スプライシングドナー付近）を標的とするｓｇＲＮＡ  ＤＭＤ＃２３（標的配列を配列番号２４に示す。）を封入したＶＬＰ（以下、「ＤＭＤ２３  ＶＬＰ」という場合がある。）の２種類のＶＬＰを作製した。【０２３８】
続いて、これらのＶＬＰ  １０μＬずつを単独で又は混合して、２．５×１０４個ずつ１２ウェルプレートに播種した４種類の標的ｉＰＳ細胞に導入した。標的ｉＰＳ細胞として、健常者由来ｉＰＳ細胞株である４０４Ｃ２株及び１３８３Ｄ２株、エクソン４４欠損ＤＭＤ患者由来のｉＰＳ細胞（以下、「ΔＥｘ４４  ｉＰＳ  Ｃｅｌｌｓ」という場合がある。）、エクソン４６〜４７欠損ＤＭＤ患者由来ｉＰＳ細胞（以下、「ΔＥｘ４６〜４７  ｉＰＳ  Ｃｅｌｌｓ」という場合がある。）を用いた。続いて、各ｉＰＳ細胞からゲノムＤＮＡをそれぞれ抽出し、各標的部位におけるゲノム編集効率をＴ７ＥＩアッセイにて計測した。【０２３９】
図３３（ａ）及び（ｂ）は、Ｔ７ＥＩアッセイの結果を示すグラフである。図３３（ａ）はｓｇＲＮＡ  ＤＭＤ＃１（標的配列を配列番号１５に示す。）の標的部位におけるゲノム編集効率を示すグラフであり、図３３（ｂ）はｓｇＲＮＡ  ＤＭＤ＃２３（標的配列を配列番号２４に示す。）の標的部位におけるゲノム編集効率を示すグラフである。【０２４０】
その結果、ｉＰＳ細胞株ごとにゲノム編集効率の違いは見られたが、ｓｇＲＮＡ  ＤＭＤ＃１（標的配列を配列番号１５に示す。）を封入したＶＬＰと、ｓｇＲＮＡ  ＤＭＤ＃２３（標的配列を配列番号２４に示す。）を封入したＶＬＰを共導入しても、単独ＶＬＰの場合と同等のゲノム編集効率が確認できた。【０２４１】
［実験例２０］
（２種類のｓｇＲＮＡのＶＬＰ送達の検討２）
実験例１９と同様にして作製した、Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡ  ＤＭＤ＃１（標的配列を配列番号１５に示す。）を封入したＶＬＰと、Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡ  ＤＭＤ＃２３（標的配列を配列番号２４に示す。）を封入したＶＬＰ  １０μＬずつを単独で又は混合して、２．５×１０４個ずつ１２ウェルプレートに播種した２種類の標的ｉＰＳ細胞に導入した。標的ｉＰＳ細胞として、健常者由来ｉＰＳ細胞株である４０４Ｃ２株及び１３８３Ｄ２株を用いた。続いて、各ｉＰＳ細胞からゲノムＤＮＡをそれぞれ抽出し、双方のｓｇＲＮＡの標的部位を含む３００塩基の領域をＰＣＲで増幅し、電気泳動システム（２２００  ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ、アジレント・テクノロジー社）を用いた解析を行った。【０２４２】
図３４は、電気泳動の結果を示す画像である。その結果、２種類のＶＬＰを共導入することにより、両者の標的部位間のゲノム配列を切り取る約１５０塩基の大きな欠損を誘導することができたことが確認された。【０２４３】
この方法は、例えばアウトオブフレーム変異により正常ジストロフィンタンパク質が発現できない場合に、特定の単独又は複数のエクソンを削除することによりエクソンスキッピングを誘導し、タンパク質の読み枠を回復させることにも応用することができる。【０２４４】
［実験例２１］
（２種類のｓｇＲＮＡのＶＬＰ送達の検討３）
ｓｇＲＮＡ  ＤＭＤ＃１（標的配列を配列番号１５に示す。）及びｓｇＲＮＡ  ＤＭＤ＃２３（標的配列を配列番号２４に示す。）を１つの発現ベクターにタンデムに搭載し、１種類のＶＬＰ中にＣａｓ９及び２種類のｓｇＲＮＡを同時に封入したＶＬＰ（以下、「Ｔａｎｄｅｍ１／２３」という場合がある。）を作製した。【０２４５】
続いて、作製したＶＬＰを、ＤＭＤ患者由来のｉＰＳ細胞に導入した。ＤＭＤ患者由来のｉＰＳ細胞として、エクソン４４欠損ＤＭＤ患者由来のｉＰＳ細胞（以下、「ΔＥｘ４４  ｉＰＳ  Ｃｅｌｌｓ」という場合がある。）、及び、エクソン４６〜４７欠損ＤＭＤ患者由来ｉＰＳ細胞（以下、「ΔＥｘ４６〜４７  ｉＰＳ  Ｃｅｌｌｓ」という場合がある。）を用いた。【０２４６】
また、比較のために、実験例１９と同様にして作製した、Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡ  ＤＭＤ＃１（標的配列を配列番号１５に示す。）を封入したＶＬＰと、Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡ  ＤＭＤ＃２３（標的配列を配列番号２４に示す。）を封入したＶＬＰを混合して導入した細胞も用意した。【０２４７】
続いて、各ｉＰＳ細胞からゲノムＤＮＡをそれぞれ抽出し、双方のｓｇＲＮＡの標的部位を含む３００塩基の領域をＰＣＲで増幅し、電気泳動システム（２２００  ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ、アジレント・テクノロジー社）を用いた解析を行った。【０２４８】
図３５は、電気泳動の結果を示す画像である。その結果、２種類のｓｇＲＮＡを同時に封入したＶＬＰを用いた場合においても、両者の標的部位間のゲノム配列を切り取る約１５０塩基の大きな欠損を誘導することができたことが確認された。【０２４９】
［実験例２２］
（ＶＬＰを用いる方法と他の方法との比較１）
ＨＥＫ２９３Ｔ  ＥＧｘｘＦＰ細胞に、ＶＬＰを用いる方法及び他の方法により、Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡを導入した。続いて、３日後に各細胞サンプルのＥＧｘｘＦＰレポーターコンストラクトの蛍光をフローサイトメーターによって解析した。【０２５０】
具体的には、次の（ａ）〜（ｄ）の方法により、Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡを導入した。（ａ）対照として、Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡのいずれも導入しない細胞を用意した。（ｂ）Ｃａｓ９発現プラスミド０．５μｇ及びｓｇＲＮＡ発現プラスミド０．５μｇを、リポフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥ  ６又はＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ、プロメガ社）によりＨＥＫ２９３Ｔ  ＥＧｘｘＦＰ細胞に導入した（図３６中、「Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ」と示す。）。（ｃ）精製Ｃａｓ９タンパク質（１μｇ）とｓｇＲＮＡ（０．２５μｇ）を混合して複合体（リボヌクレオタンパク質、ＲＮＰ）を形成し、リポフェクション試薬（ＣＲＩＳＰＲ−ＭＡＸ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）によりＨＥＫ２９３Ｔ  ＥＧｘｘＦＰ細胞に導入した（図３６中、「ＲＮＰ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ」と示す。）。（ｄ）ＶＬＰ（５０μＬ）を用いてＳｐＣａｓ９及びｓｇＲＮＡをＨＥＫ２９３Ｔ  ＥＧｘｘＦＰ細胞に導入した（図３６中、「ＶＬＰ」と示す。）。【０２５１】
図３６（ａ）〜（ｄ）は、フローサイトメーターによる解析結果を示すグラフである。図３６（ａ）〜（ｄ）は、それぞれ上述した（ａ）〜（ｄ）の細胞を解析した結果である。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞はもともと遺伝子導入効率が高い細胞であり、プラスミドＤＮＡ導入やＲＮＰ導入により十分高効率でゲノム編集が可能であるが、ＶＬＰにより、これらの既存の方法と同等以上のゲノム編集活性を示すことが明らかとなった。【０２５２】
［実験例２３］
（ＶＬＰを用いる方法と他の方法との比較２）
ヒトｉＰＳ細胞株である４０４Ｃ２細胞に、ＶＬＰを用いる方法及び他の方法により、Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡを導入した。続いて、２日後に、Ｔ７ＥＩアッセイにより、ｓｇＲＮＡ  ＤＭＤ＃１（標的配列を配列番号１５に示す。）の標的部位である、ヒトＤＭＤ遺伝子のエクソン４５の５’側（スプライシングアクセプター付近）の領域のゲノム編集効率を検討した。【０２５３】
具体的には、次の（ａ）〜（ｆ）の方法により、Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡを導入した。（ａ）Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡのいずれも導入せず、Ｔ７ＥＩアッセイにおいてＴ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｔ７ＥＩ）を添加しなかった（図３７中、「Ｎｏ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，−Ｔ７ＥＩ」と示す。）。（ｂ）Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡのいずれも導入せず、Ｔ７ＥＩアッセイにおいてＴ７ＥＩを添加した（図３７中、「Ｎｏ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，＋Ｔ７ＥＩ」と示す。）。（ｃ）Ｃａｓ９発現プラスミド０．５μｇ及びｓｇＲＮＡ発現プラスミド０．５μｇを、リポフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥ  ６又はＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ、プロメガ社）により４０４Ｃ２細胞に導入した（図３７中、「ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，＋Ｔ７ＥＩ」と示す。）。（ｄ）精製Ｃａｓ９タンパク質（１μｇ）とｓｇＲＮＡ（０．１２５μｇ）を混合して複合体（リボヌクレオタンパク質、ＲＮＰ）を形成し、リポフェクション試薬（ＣＲＩＳＰＲ−ＭＡＸ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）により４０４Ｃ２細胞に導入した（図３７中、「ＲＮＰ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，＋Ｔ７ＥＩ」と示す。）。（ｅ）ＶＬＰ（８０μＬ）を用いてＳｐＣａｓ９及びｓｇＲＮＡ  ＤＭＤ＃１（標的配列を配列番号１５に示す。）を４０４Ｃ２細胞に導入した（図３７中、「ＤＭＤ１  ＶＬＰ，＋Ｔ７ＥＩ」と示す。）。（ｆ）ＶＬＰ（８０μＬ）を用いてＳｐＣａｓ９及びｓｇＲＮＡ  ＤＭＤ＃２３（標的配列を配列番号２４に示す。）を４０４Ｃ２細胞に導入した（図３７中、「ＤＭＤ２３  ＶＬＰ，＋Ｔ７ＥＩ」と示す。）。【０２５４】
図３７は、電気泳動の結果を示す画像である。ヒトｉＰＳ細胞は、ＦｕＧＥＮＥ試薬を用いたリポフェクションによるプラスミドＤＮＡ導入は困難であり、ＲＮＰ導入によりゲノム編集誘導が可能であるが、ＶＬＰにより、ＲＮＰ導入と同等のゲノム編集活性を示すことが明らかとなった。【０２５５】
［実験例２４］
（筋細胞へのＶＬＰ導入による効率的なゲノム編集１）
ＶＬＰを用いてマウス筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２にゲノム編集を誘導する検討を行った。具体的には、まず、ＥＧｘｘＦＰレポーターコンストラクトを導入したマウス筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２を、コラーゲンＩコートした１２ウェルプレートに２．５×１０４個／ウェルで播種した。【０２５６】
続いて、細胞に、ＦＲＢ−Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡ  ＤＭＤ＃１（標的配列を配列番号１５に示す。）を封入したＶＬＰ  ０、１、３、１０、３０μＬを接種した。続いて、３日後にフローサイトメーターでＧＦＰ陽性細胞の割合を解析した。【０２５７】
図３８は、フローサイトメーターによる解析結果を示すグラフである。図３８中、縦軸は細胞数を示し、横軸はＧＦＰの蛍光強度を示す。また、グラフの右側にＧＦＰ陽性細胞の割合を示す。その結果、ＶＬＰの接種量依存的に非常に高い効率でゲノム編集が誘導されたことが明らかとなった。【０２５８】
［実験例２５］
（筋細胞へのＶＬＰ導入による効率的なゲノム編集２）
マウス筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２を筋繊維に分化誘導させた後に、ＶＬＰを用いてゲノム編集を誘導する検討を行った。具体的には、まず、ＥＧｘｘＦＰレポーターコンストラクトを導入したマウス筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２を、コラーゲンＩコートした１２ウェルプレートに２．５×１０４個／ウェルで播種した。【０２５９】
続いて、培地を分化誘導培地（ＤＭＥＭ、５％ウマ血清、１００ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００ｍＭ  ２メルカプトエタノール、ペニシリン＆ストレプトマイシン）に交換し、４日間かけて筋繊維に分化誘導した。【０２６０】
続いて、２０μＬのＶＬＰを接種した。ＶＬＰとして、Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡ  ＤＭＤ＃１（標的配列を配列番号１５に示す。）を封入したＶＬＰ（以下、「ＤＭＤ１  ＶＬＰ」という場合がある。）又はＣａｓ９及びｓｇＲＮＡ  ＤＭＤ＃２３（標的配列を配列番号２４に示す。）を封入したＶＬＰ（以下、「ＤＭＤ２３  ＶＬＰ」という場合がある。）を接種した。続いて、接種４日後に、ＥＧｘｘＦＰレポーターコンストラクトの蛍光を蛍光顕微鏡（キーエンス社）又はフローサイトメトリーで解析した。【０２６１】
図３９（ａ）は、本実験例で使用したＥＧｘｘＦＰレポーターコンストラクトの構造を説明する模式図である。図３９（ａ）に示すように、ＥＧｘｘＦＰレポーターコンストラクトは、ｓｇＲＮＡ  ＤＭＤ＃１（標的配列を配列番号１５に示す。）の標的配列だけを持ち、ｓｇＲＮＡ  ＤＭＤ＃２３（標的配列を配列番号２４に示す。）の標的配列は持たない。このため、ＤＭＤ１  ＶＬＰを接種した場合にのみ、ＥＧｘｘＦＰレポーターコンストラクトの切断が誘導される。【０２６２】
図３９（ｂ）は、蛍光顕微鏡による観察結果を示す写真である。図３９（ｂ）中、「Ｂｒｉｇｈｔ  Ｆｉｅｌｄ」は明視野（位相差）観察画像であることを示し、「ＧＦＰ  Ｆｉｅｌｄ」はＧＦＰの蛍光検出画像であることを示す。その結果、ＤＭＤ１  ＶＬＰを導入した場合にのみ、ＥＧｘｘＦＰレポーターコンストラクトにおけるゲノム編集が誘導され、ＧＦＰの蛍光が観察されたことが明らかとなった。【０２６３】
図３９（ｃ）はフローサイトメーターによる解析結果を示すグラフである。図３９（ｃ）中、縦軸はＧＦＰ陽性細胞の割合を示す。その結果、ＤＭＤ１  ＶＬＰを導入した場合にのみ、ＥＧｘｘＦＰレポーターコンストラクトにおけるゲノム編集が誘導され、ＧＦＰの蛍光が観察されたことが明らかとなった。【０２６４】
一般的に分化した細胞は細胞増殖が止まり、遺伝子導入やゲノム編集が困難となる。これに対し、ＶＬＰを用いることにより、分化した細胞においても効率的にゲノム編集を誘導できることが明らかとなった。【０２６５】
［実験例２６］
（ＶＬＰ導入によるゲノム編集活性の経時変化）
ＶＬＰ導入によるゲノム編集活性の経時変化を検討した。具体的には、まず、４０４Ｃ２  ｉＰＳ細胞を、１．０×１０５細胞／２４ウェルプレートの細胞密度で播種した。続いて、Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡを封入したＶＬＰを接種した。続いて、経時的にゲノムＤＮＡを回収し、Ｔ７ＥＩアッセイによりゲノム編集効率を測定した。【０２６６】
図４０（ａ）は実験スケジュールを示す図である。図４０（ｂ）は、Ｔ７ＥＩアッセイの結果を示す代表的な画像である。図４０（ｃ）は、ゲノム編集活性の経時変化を示すグラフである。その結果、Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡをＶＬＰで導入後、８時間ではゲノム編集活性が認められないことが明らかとなった。また、ＶＬＰの導入から１２時間後以降において、徐々にゲノム編集が蓄積し、３６〜時間後にほぼプラトーに達することが明らかとなった。【０２６７】
［実験例２７］
（ＶＬＰシステムの安全性の検討１）
ＶＥＧＦＡ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡ（標的配列を配列番号２５に示す。）は、目的外配列での変異導入が起こりやすいことが報告されている。そこで、一過性の発現を示すＶＬＰ導入において、目的部位及び目的外部位でのゲノム編集効率を検討した。【０２６８】
まず、Ｃａｓ９及びＶＥＧＦＡ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡ（標的配列を配列番号２５に示す。）を封入したＶＬＰ（図４１中、「ＶＥＧＦＡ  ＶＬＰ」と示す。）を作製した。続いて、作製したＶＬＰ  １００、２００、３００ｎｇ（ｐ２４量相当）を、５×１０４個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞に接種した。【０２６９】
また、比較のために、Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡを発現するプラスミドＤＮＡを導入した細胞も用意した。続いて、３日後に各細胞からゲノムＤＮＡを回収し、ＶＥＧＦＡの標的部位領域（Ｏｎ−Ｔａｒｇｅｔ）におけるゲノム編集効率をＴ７ＥＩアッセイにより検討した。また、標的配列と類似の非標的部位領域（Ｏｆｆ−Ｔａｒｇｅｔ）におけるゲノム編集効率をＴ７ＥＩアッセイにより検討した。【０２７０】
下記表１に、ｓｇＲＮＡの標的配列、Ｏｎ−Ｔａｒｇｅｔ配列、Ｏｆｆ−Ｔａｒｇｅｔ配列を示す。【０２７１】
【表１】
2020013317.tif 000002
【０２７２】
図４１（ａ）は、Ｔ７ＥＩアッセイの結果を示すグラフである。図４１（ａ）中、「ＤＮＡ  Ｐｌａｓｍｉｄ」は、Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡを発現するプラスミドＤＮＡを導入した結果であることを示し、「Ｅｍｐｔｙ  Ｐｌａｓｍｉｄ」は空のプラスミドＤＮＡを導入した結果であることを示す。【０２７３】
図４１（ｂ）は、オフターゲット切断に対するオンターゲット切断の割合を示すグラフである。図４１（ｂ）中、「ＶＥＧＦＡ  ＤＮＡ  Ｐｌａｓｍｉｄ」は、Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡを発現するプラスミドＤＮＡを導入した結果であることを示し、「ＶＥＧＦＡ  ＶＬＰ」はＶＬＰを導入した結果であることを示す。【０２７４】
その結果、ＶＬＰを３００ｎｇ（ｐ２４量相当）導入した細胞の標的部位領域において、プラスミドＤＮＡを導入した細胞におけるゲノム編集効率以上のゲノム編集効率が観察された。【０２７５】
また、プラスミドＤＮＡの導入では、オフターゲット部位への意図しない変異導入が確認された。これに対し、ＶＬＰの導入では、オフターゲット部位に変異導入は確認されなかった。ＶＬＰの導入では、Ｃａｓ９の存在時間が短く、オフターゲット部位に変異が導入される前に消失するため、プラスミドＤＮＡ導入と比較して標的塩基配列特異性が高いことが確認された。【０２７６】
［実験例２８］
（ＶＬＰシステムの安全性の検討２）
ＨＥＫ２９３Ｔ  ＥＧｘｘＦＰ細胞（１×１０５個）にＣａｓ９及びｓｇＲＮＡ  ＤＭＤ＃１（標的配列を配列番号１５に示す。）を封入したＶＬＰ  ６μＬを導入して、ゲノム編集を誘導した。また、比較のために、空のＶＬＰを同量導入した細胞も用意した。【０２７７】
続いて、４８時間後にゲノム編集効率をフローサイトメーターで測定した。また、生存した細胞数をトリパンブルーで染色し、自動細胞計測機（名称「Ｃｏｕｎｔｅｓｓ  ＩＩ」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いてカウントした。【０２７８】
図４２は、結果を示すグラフである。図４２中、上段はフローサイトメーターによる解析結果を示すグラフである。グラフの縦軸はＧＦＰ陽性細胞の割合を示す。また、「ＤＭＤ１  ＶＬＰ」はＣａｓ９及びｓｇＲＮＡ  ＤＭＤ＃１（標的配列を配列番号１５に示す。）を封入したＶＬＰを導入した結果であることを示し、「Ｅｍｐｔｙ  ＶＬＰ」は空のＶＬＰを導入した結果であることを示し、「Ｎｏｔ  ｔｒｅａｔｅｄ」は、何もしていないＨＥＫ２９３Ｔ  ＥＧｘｘＦＰ細胞の結果であることを示す。また、図４２下段は生存した細胞数をカウントした結果を示すグラフである。グラフの縦軸は細胞数を示す。その結果、十分なゲノム編集活性を示すＶＬＰ導入条件下においても、生存した細胞数はほとんど減少しておらず、ＶＬＰの細胞毒性が低いことが確認された。【０２７９】
［実験例２９］
（ヒト骨格筋細胞におけるエクソンスキッピングの誘導）
本発明に係るＶＬＰがヒト骨格筋細胞においてもエクソンスキッピングを誘導できるか否かを検討した。まず、ドキシサイクリン誘導性にＭＹＯＤ１遺伝子を発現する、エクソン４４欠損ＤＭＤ患者由来ｉＰＳ細胞の培地にドキシサイクリンを添加してＭＹＯＤ１遺伝子を過剰発現させることにより、骨格筋細胞に分化誘導した。【０２８０】
続いて、実験例１９と同様にして作製した、Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡ  ＤＭＤ＃１（標的配列を配列番号１５に示す。）を封入したＶＬＰ（以下、「ＤＭＤ１  ＶＬＰ」という場合がある。）と、Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡ  ＤＭＤ＃２３（標的配列を配列番号２４に示す。）を封入したＶＬＰ（以下、「ＤＭＤ２３  ＶＬＰ」という場合がある。）１０μＬずつを単独で又は混合して、得られたヒト骨格筋細胞に導入した。【０２８１】
続いて、各ヒト骨格筋細胞から全ＲＮＡをそれぞれ抽出して、ＲＴ−ＰＣＲによりＤＭＤ遺伝子のｃＤＮＡのエクソン４５を含む領域をＰＣＲで増幅し、電気泳動システム（２２００  ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ、アジレント・テクノロジー社）を用いた解析を行った。【０２８２】
図４３（ａ）は、電気泳動の結果を示す画像である。図４３（ａ）の上側の矢印で示すバンドはエクソン４５を含むｃＤＮＡに由来するバンドである。また、図４３（ａ）の下側の矢印で示すバンドはエクソンスキッピングによりエクソン４５を有しないｃＤＮＡに由来するバンドである。【０２８３】
また、図４３（ｂ）は、図４３（ａ）の結果を数値化したグラフである。図４３（ｂ）では、図４３（ａ）における上側のバンド及び下側のバンドの合計強度に対する下側のバンドの強度の割合をエクソン４５のエクソンスキッピング効率（％）として示す。図４３（ａ）及び（ｂ）中、「ＤＭＤ１」はＤＭＤ１  ＶＬＰを示し、「ＤＭＤ２３」はＤＭＤ２３  ＶＬＰを示し、「＋」はヒト骨格筋細胞に導入したことを示し、「−」はヒト骨格筋細胞に導入しなかったことを示す。また、図４３（ｂ）中、「＊＊＊＊」は、ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡによる解析の結果、Ｐ＜０．０００１で有意差が存在することを示す。【０２８４】
その結果、ＤＭＤ１  ＶＬＰを単独で導入することにより、ヒト骨格筋細胞において、約３６％の効率でエクソン４５のエクソンスキッピングを誘導することができたことが明らかとなった。一方、ＤＭＤ２３  ＶＬＰを単独で導入した場合には、エクソンスキッピング効率は低いことが明らかとなった。これに対し、ＤＭＤ１  ＶＬＰ及びＤＭＤ２３  ＶＬＰの２種類のＶＬＰを共導入することにより、約９２％の非常に高い効率でエクソンスキッピングを誘導できたことが明らかとなった。【０２８５】
また、各ヒト骨格筋細胞におけるジストロフィンタンパク質の発現を検討した。具体的には、プロテインシンプル社の全自動ウエスタンブロット装置Ｗｅｓを用いて抗ジストロフィン抗体を用いたウエスタンブロッティングを行った。また、ローディングコントロールとして、ミオシン重鎖タンパク質を検出した。また、対照として、ジストロフィンｃＤＮＡを過剰発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を同様に解析した。【０２８６】
図４３（ｃ）は、ウエスタンブロッティングの結果を示す画像である。図４３（ｃ）中、「ＤＹＳ  Ｃｔｒｌ．」は対照の結果であることを示し、「ＤＭＤ１」はＤＭＤ１  ＶＬＰを単独で導入した結果であることを示し、「ＤＭＤ２３」はＤＭＤ２３  ＶＬＰを単独で導入した結果であることを示し、「ＤＭＤ１＋２３」はＤＭＤ１  ＶＬＰ及びＤＭＤ２３  ＶＬＰを共導入した結果であることを示す。【０２８７】
その結果、ヒト骨格筋細胞におけるジストロフィンタンパク質の発現量は、エクソンスキッピング効率と相関し、ＤＭＤ１  ＶＬＰ及びＤＭＤ２３  ＶＬＰの２種類のＶＬＰを共導入することにより高いジストロフィンタンパク質の発現を誘導することができたことが明らかとなった。【０２８８】
この結果は、アウトオブフレーム変異により正常ジストロフィンタンパク質が発現できない場合に、特定の単独又は複数のエクソンを削除することにより、エクソンスキッピングを誘導し、タンパク質の読み枠を回復させることができることを示す。【０２８９】
［実験例３０］
（ルシフェラーゼを封入したＶＬＰの作製）
ルシフェラーゼタンパク質を封入したＶＬＰを作製した。図４４（ａ）〜（ｃ）は、本実験例で作製したＶＬＰの構造を説明する模式図である。図４４（ａ）は、ＨＩＶのＧａｇのＮ末端にＦＫＢＰ１２ドメインを付加した融合タンパク質（以下、「ＦＫＢＰ１２−ＧａｇＨＩＶ」という場合がある。）の発現コンストラクトの構造を示す模式図である。図４４（ｂ）は、ＦＲＢドメインを融合させたルシフェラーゼタンパク質（以下、「ＦＲＢ−Ｌｕｃ」という場合がある。）の発現コンストラクトの構造を示す模式図である。図４４（ｃ）は、ＦＫＢＰ１２−ＧａｇＨＩＶ及びＦＲＢ−ＬｕｃをＶＬＰに封入する様子を示す模式図である。【０２９０】
ラパマイシン類似薬であるＡＰ２１９６７の存在下又は非存在下で、ＦＲＢ−Ｌｕｃ、ＦＫＢＰ１２−ＧａｇＨＩＶ、ＶＳＶ−Ｇを、図４５に示す組み合わせでＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現させ、ＶＬＰを作製した。図４５中、「＋」は導入したことを示し、「−」は導入しなかったことを示す。【０２９１】
続いて、上記の各ＶＬＰ中のＦＲＢ−Ｌｕｃ、ＦＫＢＰ１２−Ｇａｇ、ＶＳＶ−Ｇをウエスタンブロッティングにより定量した。図４５は、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。その結果、ＡＰ２１９６７の存在下で作製したＶＬＰでは、非存在下と比較して多くのルシフェラーゼタンパク質が封入されたことが確認された。【０２９２】
続いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を９６ウェルプレートに播種し、上記の各ＶＬＰを導入した。続いて、１６時間後に細胞を破砕して、ルシフェラーゼ活性を測定した。図４６はルシフェラーゼ活性の測定結果を示すグラフである。図４６中、「対照」はＦＲＢ−Ｌｕｃを含まないＶＬＰの結果を示す。また、「Ｌｕｃ  ＶＬＰ」は、ＦＲＢ−Ｌｕｃ、ＦＫＢＰ１２−ＧａｇＨＩＶ及びＶＳＶ−Ｇを発現させて作製したＶＬＰの結果を示す。また、「−」はＡＰ２１９６７の非存在下で作製したＶＬＰの結果であることを示し、「＋」はＡＰ２１９６７の存在下で作製したＶＬＰの結果であることを示す。【０２９３】
その結果、ＡＰ２１９６７の存在下で作製したＶＬＰは、ＡＰ２１９６７の非存在下で作製したＶＬＰと比較して１２倍のルシフェラーゼタンパク質をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に送達したことが明らかとなった。【０２９４】
［実験例３１］
（ＶＬＰを用いた生体内におけるタンパク質の送達）
ＶＬＰを用いて生体内へとタンパク質を送達する検討を行った。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、実験例３０で作製したＬｕｃ  ＶＬＰ  ３０μＬ又は６０μＬを腓腹筋内投与した。また、対照としてＰＢＳを投与した群も用意した。続いて、１６時間後、２日後及び３日後に、ルシフェラーゼの発光を検出した。【０２９５】
具体的には、解析の５〜１５分前にイソフルランを用いてマウスを麻酔し、ルシフェリン３ｍｇ／匹を静脈内投与した。続いて、ＩＶＩＳイメージング装置（パーキンエルマー社）を用いたインビボ発光・蛍光イメージングによりルシフェラーゼの発光を検出した。【０２９６】
図４７は、ＩＶＩＳ解析の結果を示す写真である。また、図４８は図４７の結果を数値化したグラフである。その結果、Ｌｕｃ  ＶＬＰを注射したマウスの筋肉付近において、用量依存的にルシフェラーゼの発光が観察された。また、肝臓その他の臓器への漏出はほぼ認められなかった。また、Ｌｕｃ  ＶＬＰの導入から３日以内にルシフェラーゼタンパク質の完全な消失が認められた。この結果は、ＶＬＰによるタンパク質の送達が一過性であることを示す。【０２９７】
［実験例３２］
（生体内におけるエクソンスキッピングの誘導）
ＶＬＰを用いて生体内でエクソンスキッピングを誘導する検討を行った。図４９は、本実験例で用いたルシフェラーゼレポーターノックインマウスモデルを説明する図である。図４９に示すように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＧｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒ遺伝子座にゲノム編集によりルシフェラーゼレポーター遺伝子をノックインした。このルシフェラーゼレポーター遺伝子には、ヒトＤＭＤ遺伝子のエクソン４５及びその５’側及び３’側のイントロンが導入されていた。【０２９８】
図４９に示すように、このエクソン４５がスプライシングの過程でルシフェラーゼｍＲＮＡに取り込まれるとはアウトオブフレームとなるため、正常なルシフェラーゼタンパク質を発現することができない。しかしながら、このルシフェラーゼレポーターノックインマウスモデルに、実験例１９と同様のＤＭＤ１  ＶＬＰ及びＤＭＤ２３  ＶＬＰを導入すると、エクソン４５のエクソンスキッピングを誘導し、正常なルシフェラーゼタンパク質を発現させることが可能となる。【０２９９】
上記のルシフェラーゼレポーターノックインマウスモデルに、実験例１９と同様のＤＭＤ１  ＶＬＰ  ５０μＬ及びＤＭＤ２３  ＶＬＰ  ５０μＬを腓腹筋内投与した。続いて、実験例３１と同様にして、ＩＶＩＳイメージング装置（パーキンエルマー社）を用いたインビボ発光・蛍光イメージングにより、経時的にルシフェラーゼの発光を検出した。【０３００】
図５０（ａ）は、ＶＬＰの投与後１〜１６０日間のＩＶＩＳ解析の結果を示す写真である（ｎ＝５）。また、図５０（ｂ）は、ＶＬＰの投与後１２６日目のＩＶＩＳ解析の結果を示す代表的な写真である。その結果、ＶＬＰを注射した部位に特異的に、エクソンスキッピングによるルシフェラーゼの発現が認められた。【０３０１】
Ｌｕｃ  ＶＬＰを注射した場合と異なり、ＤＭＤ１  ＶＬＰ及びＤＭＤ２３  ＶＬＰの１回の投与により、３日後にはルシフェラーゼの活性が認められ、７日後にはプラトーに達し、その後少なくとも１６０日間ルシフェラーゼの活性が検出された。この結果は、マウスの筋肉内において、安定的にエクソン４５のエクソンスキッピングが維持されたことを示す。【０３０２】
［実験例３３］
（ＶＬＰを用いた様々な細胞におけるゲノム編集）
Ｃａｓ９及び様々な標的配列に対するｓｇＲＮＡを封入したＶＬＰを様々な細胞に導入し、ゲノム編集効率を検討した。【０３０３】
《Ｔリンパ球細胞》
図５１（ａ）は、ヒトＴリンパ球細胞株であるＪｕｒｋａｔ細胞に、ＨＩＶの共受容体であるＣＣＲ５遺伝子に対するｓｇＲＮＡ（標的配列を配列番号２８に示す。）及びＣａｓ９を封入したＶＬＰを導入し、Ｔ７ＥＩアッセイによりゲノム編集効率を測定した結果を示す写真である。また、図５１（ｂ）は、図５１（ａ）の結果を数値化したグラフである。その結果、ＶＬＰの導入により用量依存的に挿入欠失変異（Ｉｎｄｅｌ）が導入され、最大４８％に達したことが明らかとなった。【０３０４】
《単球細胞》
ヒト単球細胞株であるＵ９３７細胞にＥＦＧＰを安定的に発現させた細胞（ＥＧＦＰ−Ｕ９３７）に、ＥＧＦＰ遺伝子に対するｓｇＲＮＡ（標的配列を配列番号２９に示す。）及びＣａｓ９を封入したＶＬＰを導入した。また、対照として、Ｕ９３７細胞にＳＡＭＨＤ１遺伝子を安定的に発現させた細胞（ＳＡＭＨＤ１−Ｕ９３７）にもＣａｓ９及びＥＧＦＰ遺伝子に対するｓｇＲＮＡ（標的配列を配列番号２９に示す。）を封入したＶＬＰを導入した。続いて、ＶＬＰの導入から３日後に、ＥＧＦＰの蛍光をフローサイトメトリーにより解析した。【０３０５】
図５２は、フローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。図５２中、「−」はＶＬＰを導入しなかったことを示し、「＋」はＶＬＰを導入したことを示す。その結果、ＶＬＰを導入した群では、ＶＬＰを導入しなかった群と比較して、ＥＧＦＰの蛍光強度の平均値が約５０％に減少したことが明らかとなった。【０３０６】
《神経細胞》
ヒトｉＰＳ細胞にＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２遺伝子（ＮＧＮ２−ＩＲＥＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ）を過剰発現させることにより、大脳皮質ニューロン様の神経細胞に分化させた。続いて、得られた神経細胞にＳＡＭＨＤ１遺伝子に対するｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９を封入したＶＬＰを導入した。ＳＡＭＨＤ１遺伝子に対するｓｇＲＮＡとしては、ｓｇＲＮＡ＃１（標的配列を配列番号３０に示す。）及びｓｇＲＮＡ＃２（標的配列を配列番号３１に示す。）の２種類をそれぞれ使用した。【０３０７】
図５３（ａ）は、ＳＡＭＨＤ１遺伝子に対するｓｇＲＮＡ＃１及びｓｇＲＮＡ＃２の位置を示す模式図である。図５３（ｂ）は、ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導した神経細胞の写真である。図５３（ｃ）は、Ｔ７ＥＩアッセイによりゲノム編集効率を測定した結果を示す画像である。図５３（ｃ）中、「ａｎｔｉ−ＳＡＭＨＤ１  ＶＬＰ」は、Ｃａｓ９及びＳＡＭＨＤ１遺伝子に対するｓｇＲＮＡを封入したＶＬＰを示し、「−」はＶＬＰを導入しなかったことを示し、「＃１」はｓｇＲＮＡ＃１を封入したＶＬＰを導入したことを示し、「＃２」はｓｇＲＮＡ＃２を封入したＶＬＰを導入したことを示す。【０３０８】
その結果、ＶＬＰの導入により、先天性脳症の関連遺伝子であるＳＡＭＨＤ１遺伝子を効率的にゲノム編集できることが明らかとなった。挿入欠失変異（Ｉｎｄｅｌ）の導入効率はｓｇＲＮＡ＃１及びｓｇＲＮＡ＃２のいずれのｓｇＲＮＡを用いた場合においても約３６％であった。【０３０９】
［実験例３４］
（ＶＬＰの大量生産）
医療応用を目指し、動物由来の成分を使用せずに（ｘｅｎｏ−ｆｒｅｅ）、ＶＬＰを大量生産する方法を検討した。まず、ＳＶ４０ラージＴ抗原を発現し、血清不含培地で浮遊培養可能なＨＥＫ２９３細胞株を樹立した。【０３１０】
《エレクトロポレーション条件の検討》
フローエレクトロポレーション装置（「ＭａｘＣｙｔｅ  ＳＴＸ」、ＭａｘＣｙｔｅ社）を用いて、低エレクトロポレーションエネルギー条件である「Ｅ４」又は高エレクトロポレーションエネルギー条件である「Ｅ９」で、上記のＨＥＫ２９３細胞に、ＶＬＰを形成するための発現ベクターを導入した。【０３１１】
発現ベクターとしては、ＦＫＢＰ１２−ＧａｇＨＩＶの発現ベクター、ＦＲＢ−ＳｐＣａｓ９の発現ベクター、リボザイムで挟まれたｓｇＲＮＡ（以下、「ＲＧＲ」という場合がある。）の発現ベクター、ＴａｔＨＩＶの発現ベクター、ＶＳＶＧの発現ベクターを使用した。【０３１２】
エレクトロポレーション後、エンドヌクレアーゼ（「ｂｅｎｚｏｎａｓｅ」、メルク社）の存在下又は非存在下で４０分間細胞をインキュベートした。続いて、細胞の培地にＡＰ２１９６７を添加し、１００ｒｐｍで撹拌しながら浮遊培養した。【０３１３】
続いて、エレクトロポレーションから３６〜４８時間後に培養液上清を回収し、ポアサイズ０．４５μｍのシリンジフィルターで細胞の残骸を除去し、Ａｖａｎｔｉ  ＪＸＮ−３０遠心機（ベックマン・コールター社）を用いて１００，０００×ｇで３時間遠心し、ＶＬＰを回収した。【０３１４】
続いて、各条件で作製したＶＬＰを、レポーターコンストラクトであるＥＧｘｘＦＰを導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞（以下、「ＨＥＫ２９３Ｔ  ＥＧｘｘＦＰ細胞」という場合がある。）にそれぞれ導入した。続いて、３日後にフローサイトメーターを用いて各細胞のＥＧＦＰの蛍光を測定し、ゲノム編集効率を測定した。【０３１５】
図５４（ａ）は、ＥＧＦＰの蛍光を測定した結果を示すグラフである。その結果、「Ｅ９」のエレクトロポレーション条件でエレクトロポレーションを行い、エレクトロポレーション後、細胞をエンドヌクレアーゼ処理した場合が最もゲノム編集効率が高いことが明らかとなった。この結果は、上記の条件において最もＶＬＰの形成量が多かったことを示す。【０３１６】
《Ｔａｔ及びＡＰ２１９６７の検討》
フローエレクトロポレーション装置（「ＭａｘＣｙｔｅ  ＳＴＸ」、ＭａｘＣｙｔｅ社）を用いて、Ｅ９の条件でＶＬＰを作製した。ここで、ＴａｔＨＩＶの発現ベクターの存在下又は非存在下、ＡＰ２１９６７の存在下又は非存在下の条件を検討した。【０３１７】
続いて、各条件で作製したＶＬＰを、ＨＥＫ２９３Ｔ  ＥＧｘｘＦＰ細胞にそれぞれ導入した。続いて、３日後にフローサイトメーターを用いて各細胞のＥＧＦＰの蛍光を測定し、ゲノム編集効率を測定した。【０３１８】
図５４（ｂ）は、ＥＧＦＰの蛍光を測定した結果を示すグラフである。その結果、ＴａｔＨＩＶ及びＡＰ２１９６７の存在下でＶＬＰを作製した場合が最もゲノム編集効率が高いことが明らかとなった。この結果は、ＴａｔＨＩＶ及びＡＰ２１９６７の存在が、ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９のＶＬＰへの封入に重要であることを更に支持するものである。【０３１９】
《接着培養と浮遊培養によるＶＬＰ作製の比較》
１０ｃｍディッシュを４８枚用い、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む培地でＨＥＫ２９３Ｔ細胞を接着培養し、リポフェクション試薬を用いて各発現ベクターを導入することにより、合計４８０ｍＬスケールでＶＬＰを作製した。【０３２０】
また、２４０ｍＬ培地の１Ｌフラスコを２つ用い、動物由来の成分を使用しない血清不含培地でＨＥＫ２９３細胞を浮遊培養し、フローエレクトロポレーションで各発現ベクターを導入することにより、４８０ｍＬスケールでＶＬＰを作製した。【０３２１】
続いて、各ＶＬＰを一晩遠心して濃縮した。続いて、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを用いてＶＬＰを溶解し、基質（ジストロフィン標的配列を含んだＤＮＡ、７００ｂｐ）と反応させて、活性Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰ複合体の存在量を定量した。定量には、実験例２と同様にして、組換えｓｐＣａｓ９タンパク質及び化学合成したｓｇＲＮＡを用いて作成した標準曲線を使用した。【０３２２】
図５５（ａ）は、活性Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰ複合体を定量した結果を示すグラフである。図５５（ａ）中、「４８×１０ｃｍ」は接着培養により作製したＶＬＰの結果を示し、「２×１Ｌ」は浮遊培養により作製したＶＬＰの結果を示す。【０３２３】
その結果、血清不含培地を用いた浮遊培養により、合計８．１μｇのＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰ複合体を作成できたことが明らかとなった。これは、同じスケールで血清含有培地を用いた接着培養により作製したＶＬＰと比較して約３０％少なかった。しかしながら、医療応用のためには、動物由来の成分は使用すべきでない。以上の結果は、浮遊培養によるＶＬＰの作製はスケールアップすることができ、工業的に生産して医療応用することができることを示す。【０３２４】
また、図５５（ｂ）はｓｇＲＮＡ  ＤＭＤ＃１（標的配列を配列番号１５に示す。）を含む活性ＲＮＰ複合体を０．２６μｇ含むＶＬＰを、ＤＭＤ患者由来のｉＰＳ細胞に導入して挿入欠失変異（Ｉｎｄｅｌ）の誘導を測定した結果を示すグラフである。図５５（ｂ）中、「Ｎｏ  ＲＮＰ」はＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰ複合体を導入しなかったことを示し、「ＲＮＰ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐ．」は、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰ複合体をエレクトロポレーションにより導入したことを示す。【０３２５】
その結果、ＶＬＰは、１０μｇの組換えＲＮＰをｉＰＳ細胞にエレクトロポレーションした場合と比較してより高い効率で挿入欠失変異を誘導したことが明らかとなった。この結果は、ＶＬＰが標的細胞に効率的にＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ＲＮＰを送達し、高い切断活性を発揮することを示す。【０３２６】
［実験例３５］
（ＶＬＰ粒子の解析）
ＶＬＰ粒子のサイズ、ＶＬＰ  １粒子内の活性Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰ複合体の分子数を解析した。まず、ＶＬＰをモノリス型シリカカラムに吸着させた。続いて、ＮａＣｌ濃度を０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．６５Ｍ、１Ｍにそれぞれ調整したバッファーで抽出して精製した。続いて、各塩濃度で溶出した溶出画分に含まれるＶＬＰをウエスタンブロッティングに供し、ＳｐＣａｓ９タンパク質及びカプシド（ＣＡ、ｐ２４とも呼ばれる。）を検出した。【０３２７】
図５６（ａ）はＳｐＣａｓ９タンパク質のウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。また、図５６（ｂ）はｐ２４のウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。その結果、塩濃度０．６５Ｍ及び塩濃度１Ｍの溶出画分にＶＬＰが含まれていると考えられた。【０３２８】
《粒子径の測定》
続いて、精製したＶＬＰを電子顕微鏡で観察し、粒子径を測定した。図５７（ａ）は塩濃度０．６５Ｍの溶出画分に含まれていたＶＬＰの代表的な電子顕微鏡写真である。また、図５７（ｂ）は塩濃度１Ｍの溶出画分に含まれていたＶＬＰの代表的な電子顕微鏡写真である。また、図５７（ｃ）は、電子顕微鏡写真に基づいて、塩濃度０．６５Ｍの溶出画分に含まれていたＶＬＰの粒子径（長径と短径）を測定した結果を示すグラフである。また、図５７（ｄ）は、電子顕微鏡写真に基づいて、塩濃度１Ｍの溶出画分に含まれていたＶＬＰの粒子径（長径と短径）を測定した結果を示すグラフである。【０３２９】
図５８（ａ）は、市販の装置（「ＮａｎｏＳｉｇｈｔ」、マルバーン・パナリティカル社）を用いて、塩濃度０．６５Ｍの溶出画分に含まれていたＶＬＰの粒子径を測定した結果を示すグラフである。また、図５８（ｂ）は、市販の装置（「ＮａｎｏＳｉｇｈｔ」、マルバーン・パナリティカル社）を用いて、塩濃度１Ｍの溶出画分に含まれていたＶＬＰの粒子径を測定した結果を示すグラフである。図５８（ａ）及び（ｂ）中、縦軸はＶＬＰの濃度（１０６個／ｍＬ）を示し、横軸は粒子径（ｎｍ）を示す。【０３３０】
《Ｃａｓ９の分子数の解析》
ＶＬＰ  １粒子内のＣａｓ９タンパク質の分子数（活性Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰ複合体の分子数）を解析した。まず、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを用いて、塩濃度０．６５Ｍの溶出画分に含まれていたＶＬＰ及び塩濃度１Ｍの溶出画分に含まれていたＶＬＰを溶解し、基質（ジストロフィン標的配列を含んだＤＮＡ、７００ｂｐ）と反応させて、活性Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰ複合体の存在量を定量した。定量には、実験例２と同様にして、組換えｓｐＣａｓ９タンパク質及び化学合成したｓｇＲＮＡを用いて作成した標準曲線を使用した。【０３３１】
図５９（ａ）は標準曲線を示す画像である。また、図５９（ｂ）は塩濃度０．６５Ｍ及び１Ｍの溶出画分にそれぞれ含まれていたＶＬＰ内のＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰ複合体を用いて基質（ジストロフィン標的配列を含んだＤＮＡ、７００ｂｐ）を切断した結果を示す画像である。図５９（ａ）及び（ｂ）中、「％  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ」は切断された基質の割合（切断活性）を示す。【０３３２】
その結果、塩濃度０．６５Ｍの溶出画分中のＣａｓ９タンパク質の濃度は、３．４μｇ／ｍＬと計算された。また、塩濃度１Ｍの溶出画分中のＣａｓ９タンパク質の濃度は、１３．３μｇ／ｍＬと計算された。下記表２に、ＶＬＰの粒子径、ＶＬＰの濃度、Ｃａｓ９タンパク質の濃度、ＶＬＰ１粒子あたりのＣａｓ９タンパク質の分子数の計算値を示す。【０３３３】
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【０３３４】
本発明によれば、対象タンパク質をウイルス様粒子に効率よく封入する技術を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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