(57)【要約】  第１流路部材に形成された第１マイクロ流路と、第２流路部材に形成され、平面視で少なくとも一部が前記第１マイクロ流路に重なり、かつ、前記第１マイクロ流路との間に段部が形成された第２マイクロ流路と、厚さ方向に貫通する複数の孔を有し、前記第１流路部材と前記第２流路部材の間に配置されて前記第１マイクロ流路と前記第２マイクロ流路を仕切る多孔膜と、前記第１流路部材又は前記第２流路部材と前記多孔膜との間に設けられ、前記多孔膜より剛性が高く、前記多孔膜の少なくとも前記段部に面する部分を補強する補強部材と、を有するマイクロ流路デバイス、が提供される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１流路部材に形成された第１マイクロ流路と、
第２流路部材に形成され、平面視で少なくとも一部が前記第１マイクロ流路に重なり、かつ、前記第１マイクロ流路との間に段部が形成された第２マイクロ流路と、
厚さ方向に貫通する複数の孔を有し、前記第１流路部材と前記第２流路部材の間に配置されて前記第１マイクロ流路と前記第２マイクロ流路を仕切る多孔膜と、
前記第１流路部材又は前記第２流路部材と前記多孔膜との間に設けられ、前記多孔膜より剛性が高く、前記多孔膜の少なくとも前記段部に面する部分を補強する補強部材と、
を有するマイクロ流路デバイス。
【請求項２】
前記第１マイクロ流路と前記第２マイクロ流路は平面視で一部が離間しており、
前記段部は、前記第１マイクロ流路と前記第２マイクロ流路が平面視で合流する合流部分に形成されている、
請求項１に記載のマイクロ流路デバイス。
【請求項３】
前記第１マイクロ流路の幅は前記第２マイクロ流路の幅より狭く、
前記段部は、前記第１マイクロ流路と前記第２マイクロ流路の幅の差によって形成されている、
請求項１に記載のマイクロ流路デバイス。
【請求項４】
前記補強部材は、前記多孔膜全体を覆う大きさとされており、
前記多孔膜が前記第１マイクロ流路又は前記第２マイクロ流路に面する部分において、前記補強部材にはスリットが形成されている、
請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のマイクロ流路デバイス。
【請求項５】
前記補強部材の前記スリットの幅は、前記第１マイクロ流路及び前記第２マイクロ流路の幅以下とされている、請求項４に記載のマイクロ流路デバイス。
【請求項６】
前記補強部材は、ポリエチレンテレフタレートから成る膜部材である、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のマイクロ流路デバイス。
【請求項７】
前記補強部材は、ポリプロピレンから成る膜部材である、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のマイクロ流路デバイス。
【請求項８】
前記補強部材の厚さは１２μｍ以上とされている、請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載のマイクロ流路デバイス。
【請求項９】
前記補強部材の厚さは、前記第１マイクロ流路及び前記第２マイクロ流路の深さより薄くされている、請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載のマイクロ流路デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、マイクロ流路デバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロ流路と呼ばれるマイクロメートルオーダーの幅の流路を有するデバイス（以下、「マイクロ流路デバイス」と呼ぶ。）が知られている。例えば特許第５４１５５３８号公報には、マイクロ流路デバイスとして、多孔質膜で仕切られた第一中央マイクロチャネル及び第二マイクロチャネルを有する臓器模倣装置が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第５４１５５３８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
特許第５４１５５３８号公報に開示されている臓器模倣装置において、上側の第一中央マイクロチャネルと下側の第二中央マイクロチャネルは、平面視で中央部分が重なり、かつ、入口ポート及び出口ポートが離間しており、第一中央マイクロチャネルと下側の第二中央マイクロチャネルが平面視で合流する合流部分に段部が形成されている。【０００５】
第一中央マイクロチャネルと下側の第二中央マイクロチャネルとの間に段部が形成されていることにより、例えば第１マイクロチャネルに細胞懸濁液を流して多孔質膜の表面に細胞層を形成する際に、細胞懸濁液の液圧によって多孔質膜が撓むことで段部と多孔質膜との間に隙間が生じる。また、細胞層の形成後にも同様に、第一中央マイクロチャネルに試験液（例えば血液希釈液、ＦＩＴＣ−マイクロビーズ等のトレーサーを含む液体）を流して試験を行う際に、試験液の液圧によって段部と多孔質膜との間に隙間が生じる。【０００６】
このとき、段部と多孔質膜との間の隙間に細胞懸濁液中の細胞、又は試験液中の赤血球、トレーサーが流れ込んで挟まり、細胞層、赤血球、又はトレーサーの一部が下側の第二中央マイクロチャネル内に位置してしまう虞がある。この場合、臓器模倣装置を用いて例えば細胞、赤血球、又はトレーサーの透過性試験を行う際、隙間に挟まった細胞、赤血球、又はトレーサーがあたかも第一中央マイクロチャネルから多孔質膜を通って第二中央マイクロチャネルへ漏れ出たように見えるため、透過性試験を正確に行うことが難しかった。【０００７】
本開示は、第１マイクロ流路と第２マイクロ流路との間に形成された段部と多孔膜との間に隙間が生じることを抑制し、この隙間に細胞、赤血球、又はトレーサーが流れ込むことを抑制することができるマイクロ流路デバイスを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示の第１態様に係るマイクロ流路デバイスは、第１流路部材に形成された第１マイクロ流路と、第２流路部材に形成され、平面視で少なくとも一部が第１マイクロ流路に重なり、かつ、第１マイクロ流路との間に段部が形成された第２マイクロ流路と、厚さ方向に貫通する複数の孔を有し、第１流路部材と第２流路部材の間に配置されて第１マイクロ流路と第２マイクロ流路を仕切る多孔膜と、第１流路部材又は第２流路部材と多孔膜との間に設けられ、多孔膜より剛性が高く、多孔膜の少なくとも段部に面する部分を補強する補強部材と、を有する。【０００９】
上記構成によれば、第１マイクロ流路と第２マイクロ流路との間に段部が形成されており、多孔膜の段部に面する部分が補強部材によって補強されている。このため、第１マイクロ流路又は第２マイクロ流路に細胞懸濁液を流して多孔膜の表面に細胞層を形成する際に、細胞懸濁液の液圧によって多孔膜が撓んで段部と多孔膜との間に隙間が生じることを抑制することができ、この隙間に細胞が流れ込むことを抑制することができる。【００１０】
同様に、第１マイクロ流路又は第２マイクロ流路に試験液を流して試験を行う際に、試験液の液圧によって多孔膜が撓んで段部と多孔膜との間に隙間が生じることを抑制することができ、この隙間に赤血球、又はトレーサーが流れ込むことを抑制することができる。【００１１】
本開示の第２態様に係るマイクロ流路デバイスは、第１態様に係るマイクロ流路デバイスにおいて、第１マイクロ流路と第２マイクロ流路は平面視で一部が離間しており、段部は、第１マイクロ流路と第２マイクロ流路が平面視で合流する合流部分に形成されている。【００１２】
上記構成によれば、第１マイクロ流路と第２マイクロ流路が平面視で合流する合流部分に形成された段部において、多孔膜を補強部材で補強することによって段部と多孔膜との間に隙間が生じることを抑制することができる。【００１３】
本開示の第３態様に係るマイクロ流路デバイスは、第１態様に係るマイクロ流路デバイスにおいて、第１マイクロ流路の幅は第２マイクロ流路の幅より狭く、段部は、第１マイクロ流路と第２マイクロ流路の幅の差によって形成されている。【００１４】
上記構成によれば、第１マイクロ流路と第２マイクロ流路の幅の差によって形成された段部において、多孔膜を補強部材で補強することによって段部と多孔膜との間に隙間が生じることを抑制することができる。【００１５】
本開示の第４態様に係るマイクロ流路デバイスは、第１〜第３態様のいずれか１つの態様に係るマイクロ流路デバイスにおいて、補強部材は、多孔膜全体を覆う大きさとされており、多孔膜が第１マイクロ流路又は第２マイクロ流路に面する部分において、補強部材にはスリットが形成されている。【００１６】
上記構成によれば、補強部材によって多孔膜全体を覆うことで、多孔膜をより補強することができる。また、補強部材にスリットを形成することで、細胞、赤血球、又はトレーサーが多孔膜を介して第１マイクロ流路と第２マイクロ流路との間を移動する際に、細胞、赤血球、又はトレーサーの移動が補強部材によって阻害されることを抑制することができる。【００１７】
本開示の第５態様に係るマイクロ流路デバイスは、第４態様に係るマイクロ流路デバイスにおいて、補強部材のスリットの幅は、第１マイクロ流路及び第２マイクロ流路の幅以下とされている。【００１８】
上記構成によれば、補強部材のスリットの幅が第１マイクロ流路及び第２マイクロ流路の幅以下とされている。このため、補強部材のスリットの幅が第１マイクロ流路及び第２マイクロ流路の幅より大きい場合と比較して、第１マイクロ流路と第２マイクロ流路との間に形成された段部と多孔膜との間に隙間ができることをより抑制することができる。【００１９】
本開示の第６態様に係るマイクロ流路デバイスは、第１〜第５態様のいずれか１つの態様に係るマイクロ流路デバイスにおいて、補強部材は、ポリエチレンテレフタレートから成る膜部材である。【００２０】
上記構成によれば、補強部材が細胞培養に影響を及ぼし難いポリエチレンテレフタレートから成る膜部材とされているため、補強部材に含まれる成分が第１マイクロ流路内又は第２マイクロ流路内の細胞等に影響を及ぼすことを抑制することができる。【００２１】
本開示の第７態様に係るマイクロ流路デバイスは、第１〜第５態様のいずれか１つの態様に係るマイクロ流路デバイスにおいて、補強部材は、ポリプロピレンから成る膜部材である。【００２２】
上記構成によれば、補強部材が細胞培養に影響を及ぼし難いポリプロピレンから成る膜部材とされているため、補強部材に含まれる成分が第１マイクロ流路内又は第２マイクロ流路内の細胞等に影響を及ぼすことを抑制することができる。【００２３】
本開示の第８態様に係るマイクロ流路デバイスは、第１態様〜第７態様のいずれか１つの態様に係るマイクロ流路デバイスにおいて、補強部材の厚さは１２μｍ以上とされている。【００２４】
上記構成によれば、ポリエチレンテレフタレートから成る補強部材の厚さを１２μｍ以上とすることで、補強部材の厚さが１２μｍ未満とされている構成と比較して、補強部材の剛性を高めることができ、補強部材によって多孔膜をより強固に補強することができる。【００２５】
本開示の第９態様に係るマイクロ流路デバイスは、第１〜第８態様のいずれか１つの態様に係るマイクロ流路デバイスにおいて、補強部材の厚さは、第１マイクロ流路及び第２マイクロ流路の深さより薄くされている。【００２６】
上記構成によれば、補強部材の厚さが第１マイクロ流路及び第２マイクロ流路の深さより薄くされている。このため、補強部材の厚さが第１マイクロ流路及び第２マイクロ流路の深さより大きい場合と比較して、第１マイクロ流路又は第２マイクロ流路に細胞懸濁液を流して多孔膜の表面に細胞層を形成する際に、補強部材によって多孔膜への細胞の播種が阻害されることを抑制することができる。
【発明の効果】
【００２７】
本開示によれば、第１マイクロ流路と第２マイクロ流路との間に形成された段部と多孔膜との間に隙間が生じることを抑制し、この隙間に細胞、赤血球、又はトレーサーが流れ込むことを抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】第１実施形態におけるマイクロ流路デバイスの全体構造を示す斜視図である。
【図２】第１実施形態におけるマイクロ流路デバイスの全体構造を示す分解斜視図である。
【図３】第１実施形態におけるマイクロ流路デバイスを平面視した状態を示す透視図である。
【図４】図３におけるＡ−Ａ線断面図である。
【図５】図３におけるＢ−Ｂ線断面図である。
【図６】第１実施形態におけるマイクロ流路デバイスの多孔膜を示す平面図である。
【図７】図６におけるＣ−Ｃ線断面図である。
【図８】第２実施形態におけるマイクロ流路デバイスの全体構造を示す分解斜視図である。
【図９】第２実施形態におけるマイクロ流路デバイスを平面視した状態を示す透視図である。
【図１０Ａ】実施例のマイクロ流路デバイスに細胞懸濁液を流した状態を示す拡大平面図である。
【図１０Ｂ】図１０ＡにおけるＤ−Ｄ線断面図である。
【図１１Ａ】比較例のマイクロ流路デバイスに細胞懸濁液を流した状態を示す拡大平面図である。
【図１１Ｂ】図１１ＡにおけるＥ−Ｅ線断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
（第１実施形態）
以下、本開示の第１実施形態について図１〜７を用いて説明する。なお、以下の実施形態は本開示を例示するものであり、本開示の範囲を制限するものではない。また、各構成の説明を容易にするため、図中の各構成の寸法を適宜変更している。このため、図中の縮尺は実際とは異なっている。
【００３０】
＜流路ユニット＞
図１に示すように、本実施形態のマイクロ流路デバイス１０は、厚さ方向に積層された第１流路部材１２と第２流路部材１４とで構成された流路ユニット１６を有している。第１流路部材１２は、一例としてＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）等の弾性を有する透明な材料で構成されており、第２流路部材１４は、一例としてＣＯＰ（シクロオレフィンポリマー）等の剛性を有する透明な材料で構成されていることが好ましい。
【００３１】
なお、第１流路部材１２及び第２流路部材１４を構成する材料としては、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）、ＣＯＰ（シクロオレフィンポリマー）の他、エポキシ系樹脂、ウレタン系樹脂、スチレン系熱可塑性エラストマー、オレフィン系熱可塑性エラストマー、アクリル系熱可塑性エラストマー、ポリビニルアルコール等が挙げられる。
【００３２】
図２に示すように、第１流路部材１２の下面、すなわち第２流路部材１４との対向面１２Ａには、第１マイクロ流路１８が形成されている。第１マイクロ流路１８は、流入口１８Ａ、流出口１８Ｂ、及び流入口１８Ａと流出口１８Ｂとを連通し、略直線状に延びる流路部１８Ｃを有している。
【００３３】
同様に、第２流路部材１４の上面、すなわち第１流路部材１２との対向面１４Ａには、第２マイクロ流路２０が形成されている。第２マイクロ流路２０は、流入口２０Ａ、流出口２０Ｂ、及び流入口２０Ａと流出口２０Ｂとを連通し、略直線状に延びる流路部２０Ｃを有している。
【００３４】
ここで、図３に示すように、第１マイクロ流路１８の流入口１８Ａ及び流出口１８Ｂは、第２マイクロ流路２０の流入口２０Ａ及び流出口２０Ｂと平面視で離間した位置に設けられている。一方、第１マイクロ流路１８の流路部１８Ｃは、第２マイクロ流路２０の流路部２０Ｃと平面視で重なる位置に設けられている。
【００３５】
これにより、図３、図４に示すように、第１マイクロ流路１８と第２マイクロ流路２０との合流部分、すなわち流入口１８Ａ、２０Ａと流路部１８Ｃ、２０Ｃとの間、及び流出口１８Ｂ、２０Ｂと流路部１８Ｃ、２０Ｃとの間に段部２２がそれぞれ形成されている。
【００３６】
また、図３、図５に示すように、第１マイクロ流路１８の流路部１８Ｃの幅は、第２マイクロ流路２０の流路部２０Ｃの幅より狭くなっており、流路部１８Ｃと流路部２０Ｃの幅の差によって段部２４が形成されている。
【００３７】
図２に示すように、第１流路部材１２には、第１流路部材１２を厚さ方向に貫通し、下端が第１マイクロ流路１８の流入口１８Ａ及び流出口１８Ｂに連通する貫通孔２６Ａ、２６Ｂと、下端が第２マイクロ流路２０の流入口２０Ａ及び流出口２０Ｂに連通する貫通孔２８Ａ、２８Ｂと、がそれぞれ形成されている。
【００３８】
また、第１流路部材１２の上側には、第１流路部材１２の上面全体を覆う大きさの保持プレート３０が設けられている。保持プレート３０及び第２流路部材１４の互いに対応する位置には、厚さ方向に貫通する複数（本実施形態では８つ）のボルト孔３２がそれぞれ形成されている。
【００３９】
一方、第１流路部材１２の外周面には、ボルト孔３２に対応する位置に凹部３４がそれぞれ形成されており、流路ユニット１６の凹部３４の外側には、保持プレート３０と第２流路部材１４との間隔を規定する複数（本実施形態では８つ）のスペーサ３６がそれぞれ設けられている。
【００４０】
スペーサ３６は、内径がボルト孔３２の内径と略同じ大きさとされた円筒形状の部材であり、ボルト孔３２に対応する位置にそれぞれ配置されている。また、保持プレート３０と第２流路部材１４は、ボルト孔３２及びスペーサ３６に挿通されてナット３８で固定された複数のボルト４０により、後述する補強部材５４とともに接合されている。
【００４１】
なお、保持プレート３０には、第１流路部材１２の貫通孔２６Ａ、２６Ｂ、２８Ａ、２８Ｂにそれぞれ連通する貫通孔４２Ａ、４２Ｂ、４４Ａ、４４Ｂがそれぞれ形成されている。貫通孔４２Ａ、４２Ｂ、４４Ａ、４４Ｂには、図示しないチューブがそれぞれ接続されており、チューブを通して第１マイクロ流路１８及び第２マイクロ流路２０に溶液や細胞懸濁液等が流入し、第１マイクロ流路１８及び第２マイクロ流路２０から溶液や細胞懸濁液等が流出する。
【００４２】
＜多孔膜＞
第１流路部材１２及び第２流路部材１４の対向面１２Ａ、１４Ａ間には、多孔膜４６が配置されている。多孔膜４６は、一例として疎水性の有機溶媒に溶解可能な疎水性ポリマーから成る。なお、疎水性の有機溶媒は、２５℃の水に対する溶解度が１０（ｇ／１００ｇ水）以下の液体である。
【００４３】
疎水性ポリマーとしては、ポリスチレン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリフッ化ビニリデン、ポリヘキサフルオロプロペン、ポリビニルエーテル、ポリビニルカルバゾール、ポリ酢酸ビニル、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエステル（例えば、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリエチレンサクシネート、ポリブチレンサクシネート、ポリ乳酸、ポリ−３−ヒドロキシブチレート等）、ポリラクトン(例えば、ポリカプロラクトン等)、ポリアミド又はポリイミド（例えば、ナイロン、ポリアミド酸等）、ポリウレタン、ポリウレア、ポリブタジエン、ポリカーボネート、ポリアロマティックス、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリシロキサン誘導体、セルロースアシレート（例えば、トリアセチルセルロース、セルロースアセテートプロピオネート、セルロースアセテートブチレート）などのポリマーが挙げられる。
【００４４】
これらのポリマーは、溶剤への溶解性、光学的物性、電気的物性、膜強度、弾性等の観点から、必要に応じてホモポリマー、コポリマー、ポリマーブレンド又はポリマーアロイとしてよい。また、これらのポリマーは、１種単独で又は２種以上を混合して使用してよい。なお、多孔膜４６の素材は疎水性ポリマーには限られず、細胞の接着性の観点等から種々の素材を選択することが可能である。
【００４５】
多孔膜４６の上面４６Ａ及び下面４６Ｂ（以下、上面４６Ａ及び下面４６Ｂを合わせて「主面」と呼ぶことがある。）は、第１マイクロ流路１８及び第２マイクロ流路２０の流路部１８Ｃ、２０Ｃを略覆う大きさとされており、第１マイクロ流路１８と第２マイクロ流路２０とを仕切っている。具体的には、多孔膜４６の上面４６Ａが第１マイクロ流路１８に面しており、多孔膜４６の下面４６Ｂが第２マイクロ流路２０に面している。
【００４６】
図６、図７に示すように、多孔膜４６には、厚さ方向に貫通する複数の孔４８が形成されており、多孔膜４６の上面４６Ａ及び下面４６Ｂには孔４８の開口４８Ａがそれぞれ設けられている。また、図６に示すように、開口４８Ａは平面視で円形状とされている。開口４８Ａ同士は互いに離間して設けられており、隣合う開口４８Ａの間には平坦部５０が延在している。なお、開口４８Ａは円形状には限られず、多角形状や楕円形状とされていてもよい。
【００４７】
複数の開口４８Ａは規則的に配置されており、本実施形態では一例として、ハニカム状に配置されている。ハニカム状の配置とは、平行六辺形（好ましくは正六角形）又はこれに近い形状を単位とし、これら図形の頂点及び対角線の交点に開口４８Ａの中心が位置する配置である。ここで「開口の中心」とは、開口４８Ａの平面視における中心を意味する。
【００４８】
なお、開口４８Ａの配置はハニカム状に限られず、格子状又は面心格子状とされていてもよい。格子状の配置とは、平行四辺形（言うまでもないが、正方形、長方形、菱形が含まれる。好ましくは正方形）又はこれに近い形状を単位とし、これら図形の頂点に開口の中心が位置する配置である。面心格子状の配置とは、平行四辺形（言うまでもないが、正方形、長方形、菱形が含まれる。好ましくは正方形）又はこれに近い形状を単位とし、これら図形の頂点及び対角線の交点に開口の中心が位置する配置である。
【００４９】
図７に示すように、多孔膜４６の孔４８は球体の上端及び下端を切り取った球台形状とされている。また、互いに隣合う孔４８同士は、多孔膜４６の内部において連通孔５２によって連通している。
【００５０】
１つの孔４８は、隣合う全部の孔４８と連通していることが好ましく、本実施形態のように複数の孔４８の開口４８Ａがハニカム状に配置されている場合、１つの孔４８は、６つの連通孔５２によって隣合う６つの孔４８とそれぞれ連通している。なお、孔４８はバレル形状や円柱形状、又は多角柱形状等とされていてもよく、また、連通孔５２は隣合う孔４８同士を繋ぐ筒状の空隙とされていてもよい。
【００５１】
なお、多孔膜４６の主面の少なくとも細胞が播種される領域は、フィブロネクチン、コラーゲン（例えば、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、又はＶ型コラーゲン）、ラミニン、ビトロネクチン、ゼラチン、パールカン、ニドゲン、プロテオグリカン、オステオポンチン、テネイシン、ネフロネクチン、基底膜マトリックス及びポリリジンからなる群から選択される少なくとも１種によって被覆されていることが好ましい。また、多孔膜４６の孔４８内も、これらの少なくとも１種によって被覆されていることが好ましい。多孔膜４６を被覆することで、細胞の接着性を高めることが可能となる。
【００５２】
また、多孔膜４６は細胞が接着して増殖する足場であるところ、多孔膜４６の開口率が高いほど、また、多孔膜４６の膜厚が薄いほど、一方の面の細胞と他方の面の細胞との間の細胞間相互作用（cell-cell interaction）、即ち、液性因子による情報伝達及び細胞どうしの接触（cell-cell contact）の少なくとも一方が活発になる。多孔膜４６の主面での細胞培養時における細胞間相互作用が活発になるほど、生体内の組織に近似した機能を有するモデルを製造することが可能となる。
【００５３】
孔４８が形成された多孔膜４６を作製する方法としては、例えばナノプリント法や結露法の他、エッチング法、サンドブラスト法、プレス成形等の方法が挙げられる。ナノプリント法とは、凹凸形状を有する型に多孔膜４６を構成する素材を流し込む、又は型を、多孔膜４６を構成する素材に押し当てることにより、孔４８を作製する方法である。また、結露法とは、多孔膜４６を構成する素材の表面を結露させ、水滴を型として孔４８を形成する方法である。
【００５４】
結露法は、他の方法と比較して、多孔膜４６の膜厚を薄くすることができるとともに、空隙率や開口４８Ａの開口率を大きくすることが可能であり、また、多孔膜４６内に連通孔５２を設けることが可能である。このため、本実施形態では、多孔膜４６を結露法によって作製している。結露法の詳細は、例えば、特許第４９４５２８１号公報、特許第５４２２２３０号公報、特開２０１１−７４１４０号公報、特許第５４０５３７４号公報に記載されている。
【００５５】
＜補強部材＞
図１〜図５に示すように、多孔膜４６と第２流路部材１４の対向面１４Ａとの間には、多孔膜４６より剛性が高い補強部材５４が配置されている。補強部材５４は、一例として、ポリエチレンテレフタレートから成る膜部材とされており、多孔膜４６全体を覆う大きさとされている。具体的には、補強部材５４は、第２流路部材１４の対向面１４Ａと略同じ大きさとされており、多孔膜４６における第１マイクロ流路１８と第２マイクロ流路２０との間に形成された段部２２、２４に面する部分を覆っている。
【００５６】
また、補強部材５４の厚さは、１２μｍ以上、かつ第１マイクロ流路１８又は第２マイクロ流路２０の深さより薄くされていることが好ましく、具体的には、補強部材５４の厚さは、１２μｍ以上４００μｍ以下であることがより好ましく、１２μｍ以上２００μｍ以下であることがさらに好ましい。
【００５７】
また、補強部材５４の剛性は、補強部材５４の上に鋼球を載せた際の補強部材５４の変形量を測定することで評価可能である。具体的には、Φ５０ｍｍの穴があいた厚さ３ｍｍのＳＵＳ（ステンレス）製のプレートを準備し、７０ｍｍ角の補強部材５４の４辺を両面テープ（日東電工製Ｎｏ．５０００ＮＳ）によってプレート上に固定する。そして、補強部材５４の上から穴の中心部に直径１１ｍｍ、重さ５．５ｇの鋼球を載せ、その際の穴の中心部における補強部材５４の下方向への変形量を、レーザー変位計（キーエンス製ＬＫ−Ｇ８５）によってプレート下から測定する。
【００５８】
上記の評価方法では、補強部材５４の剛性が高いほど変形量は小さくなり、上記の評価方法を用いた場合に、補強部材５４の変形量は３ｍｍ以下であることが好ましく、１ｍｍ以下であることがより好ましい。
【００５９】
なお、補強部材５４は、少なくとも多孔膜４６より剛性が高くされていればよく、また、細胞培養に影響を及ぼし難い材料で構成されていればよい。細胞培養に影響を及ぼし難い材料としては、例えばポリエチレンテレフタレートの他、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）等のシリコーン系の材料、ポリスチレン、ＰＥＮ（ポリエチレンナフタレート）、ポリプロピレン、ＣＯＰ（シクロオレフィンポリマー）、ＰＥ（ポリエチレン）等が挙げられる。また、補強部材５４の必要とされる厚さも、補強部材５４の材質によって適宜定められる。
【００６０】
図２に示すように、補強部材５４における第２流路部材１４のボルト孔３２に対応する位置には、複数（本実施形態では８つ）のボルト孔５６が形成されており、補強部材５４はボルト４０によって保持プレート３０及び第２流路部材１４に接合されている。また、補強部材５４における第２マイクロ流路２０の流入口２０Ａ及び流出口２０Ｂに対応する位置には、貫通孔５７がそれぞれ形成されている。
【００６１】
また、多孔膜４６が第１マイクロ流路１８及び第２マイクロ流路２０に面する部分において、補強部材５４にはスリット５８が形成されている。具体的には、図３に示すように、スリット５８は、第１マイクロ流路１８の流路部１８Ｃ及び第２マイクロ流路２０の流路部２０Ｃと平面視で重なる位置に設けられており、スリット５８の幅は、第１マイクロ流路１８の流路部１８Ｃの幅と略同じ幅とされている。なお、スリット５８の幅は、少なくとも第１マイクロ流路１８の流路部１８Ｃの幅以下とされていればよい。
【００６２】
＜作用及び効果＞
本実施形態によれば、第１マイクロ流路１８と第２マイクロ流路２０との合流部分に段部２２が形成されており、第１マイクロ流路１８の流路部１８Ｃと第２マイクロ流路２０の流路部２０Ｃの幅の差によって段部２４が形成されている。また、多孔膜４６の段部２２、２４に面する部分が、補強部材５４によって覆われることによって補強されている。
【００６３】
このため、例えば第１マイクロ流路１８に細胞懸濁液を流して多孔膜４６の上面４６Ａに細胞層を形成する際に多孔膜４６に細胞懸濁液の液圧が加わった場合であっても、多孔膜４６が第２マイクロ流路２０側に撓むことを補強部材５４によって抑制することができる。これにより、段部２２、２４と多孔膜４６との間に隙間が生じることを抑制することができ、この隙間に細胞が流れ込むことを抑制することができる。
【００６４】
また、本実施形態では、補強部材５４が多孔膜４６全体を覆う大きさとされているため、補強部材５４が多孔膜４６の一部のみを覆う大きさとされている構成と比較して、多孔膜４６をより補強することができる。
【００６５】
さらに、多孔膜４６が第１マイクロ流路１８及び第２マイクロ流路２０に面する部分において、補強部材５４にはスリット５８が形成されている。このため、例えば細胞、赤血球、又はトレーサーの透過性試験等を行う際に、補強部材５４のスリット５８及び多孔膜４６を介して第１マイクロ流路１８と第２マイクロ流路２０との間を細胞、赤血球、又はトレーサーが移動することができ、細胞、赤血球、又はトレーサーの移動が補強部材５４によって阻害されることを抑制することができる。
【００６６】
特に本実施形態では、補強部材５４のスリット５８の幅が第１マイクロ流路１８の流路部１８Ｃの幅と略同じ幅とされている。このため、補強部材５４のスリット５８の幅が流路部１８Ｃの幅より大きい場合と比較して、段部２４と多孔膜４６との間に隙間ができることをより抑制することができる。また、補強部材５４のスリット５８の幅が流路部１８Ｃの幅より小さい場合と比較して、細胞、赤血球、又はトレーサーの移動が補強部材５４によって阻害されることをより抑制することができる。
【００６７】
また、本実施形態によれば、補強部材５４が生体適合性を有するポリエチレンテレフタレート等から成る膜部材とされている。このため、補強部材５４に含まれる成分が第１マイクロ流路１８内又は第２マイクロ流路２０内の細胞等に影響を与えることを抑制することができる。
【００６８】
また、補強部材５４の厚さは、１２μｍ以上、かつ第１マイクロ流路１８又は第２マイクロ流路２０の深さより薄くされている。このため、補強部材５４の厚さが１２μｍ未満とされている構成と比較して、補強部材５４の剛性を高めることができ、補強部材５４によって多孔膜４６をより強固に補強することができる。
【００６９】
さらに、補強部材５４の厚さが第１マイクロ流路１８及び第２マイクロ流路２０の深さより大きい場合と比較して、第１マイクロ流路１８又は第２マイクロ流路２０に細胞懸濁液を流して多孔膜４６の表面に細胞層を形成する際に、補強部材５４によって多孔膜４６への細胞の播種が阻害されることを抑制することができる。
【００７０】
（第２実施形態）
次に、本開示の第２実施形態について図８、図９を用いて説明する。なお、各構成の説明を容易にするため、図中の各構成の寸法を適宜変更している。このため、図中の縮尺は実際とは異なっている。また、第１実施形態と同様の構成については同じ符号を付して説明を省略する。
【００７１】
図８に示すように、本実施形態のマイクロ流路デバイス６０は、第１実施形態のマイクロ流路デバイス１０と同様に、第１マイクロ流路６８が形成された第１流路部材６２と第２マイクロ流路７０が形成された第２流路部材６４とを有している。
【００７２】
第１マイクロ流路６８と第２マイクロ流路７０は多孔膜４６によって仕切られており、第１実施形態と同様に、流入口６８Ａ、７０Ａ、流出口６８Ｂ、７０Ｂ、及び流入口６８Ａ、７０Ａと流出口６８Ｂ、７０Ｂとを連通し、略直線状に延びる流路部６８Ｃ、７０Ｃをそれぞれ有している。
【００７３】
図９に示すように、第１マイクロ流路６８の流入口６８Ａ及び流出口６８Ｂは、第２マイクロ流路７０の流入口７０Ａ及び流出口７０Ｂと平面視で離間した位置に設けられている。また、第１マイクロ流路６８の流路部６８Ｃは、第２マイクロ流路７０の流路部７０Ｃと平面視で重なる位置に設けられている。
【００７４】
これにより、第１マイクロ流路６８と第２マイクロ流路７０との合流部分、すなわち流入口６８Ａ、７０Ａと流路部６８Ｃ、７０Ｃとの間、及び流出口６８Ｂ、７０Ｂと流路部６８Ｃ、７０Ｃとの間に段部７２がそれぞれ形成されている。一方、本実施形態では、第１マイクロ流路６８の流路部６８Ｃの幅と、第２マイクロ流路７０の流路部７０Ｃの幅は略同じ大きさとなっている。
【００７５】
多孔膜４６と第２流路部材６４の対向面６４Ａとの間には、多孔膜４６より剛性が高い一対の補強部材７４が配置されている。一対の補強部材７４は、一例として、ポリエチレンテレフタレート等から成る矩形状の膜部材とされており、一対の補強部材７４の厚さは、１２μｍ以上、かつ第１マイクロ流路１８及び第２マイクロ流路２０の深さより薄くされている。
【００７６】
また、一対の補強部材７４は、多孔膜４６における第１マイクロ流路６８と第２マイクロ流路７０との間に形成された段部７２に面する部分をそれぞれ覆う大きさとされている。さらに、一対の補強部材７４は、互いに間隔をあけて配置されており、一対の補強部材７４間に第１マイクロ流路６８の流路部６８Ｃ及び第２マイクロ流路７０の流路部７０Ｃが位置している。
【００７７】
＜作用及び効果＞
本実施形態によれば、第１マイクロ流路６８と第２マイクロ流路７０との合流部分に段部７２が形成されており、多孔膜４６の段部７２に面する部分が、一対の補強部材７４によってそれぞれ覆われることによって補強されている。
【００７８】
このため、例えば第１マイクロ流路６８に細胞懸濁液を流して多孔膜４６の上面４６Ａに細胞層を形成する際に多孔膜４６に細胞懸濁液の液圧が加わった場合であっても、多孔膜４６が第２マイクロ流路７０側に撓むことを補強部材７４によって抑制することができる。これにより、段部７２と多孔膜４６との間に隙間が生じることを抑制することができ、この隙間に細胞、赤血球、又はトレーサーが流れ込むことを抑制することができる。
【００７９】
また、本実施形態によれば、一対の補強部材７４は、互いに間隔をあけて配置されており、一対の補強部材７４間に第１マイクロ流路６８の流路部６８Ｃ及び第２マイクロ流路７０の流路部７０Ｃが位置している。このため、例えば細胞、赤血球、又はトレーサーの透過性試験等を行う際に、第１マイクロ流路６８と第２マイクロ流路７０との間の細胞、赤血球、又はトレーサーの移動が補強部材７４によって阻害されることを抑制することができる。
【００８０】
（その他の実施形態）
以上、本開示の実施形態の一例について説明したが、本開示は、上記に限定されるものでなく、上記以外にも、その主旨を逸脱しない範囲内において種々変形して実施可能である。
【００８１】
例えば第１、第２実施形態では、補強部材５４、７４が多孔膜４６と第２流路部材１４、６４の対向面１４Ａ、６４Ａとの間に設けられていたが、補強部材５４、７４は、第１流路部材１２、６２の対向面１２Ａ、６２Ａと多孔膜４６との間に設けられていてもよい。
【００８２】
また、第１、第２実施形態では、第１流路部材１２、６２の上側に保持プレート３０が設けられ、ボルト４０によって保持プレート３０と第２流路部材１４、６４とが接合されていた。しかし、保持プレート３０は設けられていなくてもよく、第１流路部材１２、６２と第２流路部材１４、６４とが、接着、溶着、吸着（自己吸着）等で互いに接合されていてもよい。
【実施例】
【００８３】
以下、本開示の実施例及び比較例について説明する。なお、本開示は以下の実施例により限定的に解釈されるべきものではない。【００８４】
＜マイクロ流路デバイスの作製＞
まず、多孔膜として、孔がハニカム状に配置されたポリカーボネートから成る膜部材を準備し、多孔膜をコラーゲンで被覆した後、多孔膜の両面に滅菌紙を貼り付けた。次に、多孔膜の下面の滅菌紙をピンセットによって剥がし、第２マイクロ流路が形成された第２流路部材の上に多孔膜を載置して多孔膜と第２流路部材とを接合した。【００８５】
次に、多孔膜の上面の滅菌紙をピンセットによって剥がし、顕微鏡を確認しながら第１流路部材と第２流路部材の位置を合わせ、第１マイクロ流路が形成された第１流路部材を多孔膜の上に載置して多孔膜と第１流路部材とを接合した。【００８６】
また、第１流路部材の上部に保持プレートを載置し、スペーサを介して保持プレートと第２流路部材とをボルト及びナットで締め付けることにより、基となるマイクロ流路デバイスを作製した。なお、マイクロ流路デバイスの第１マイクロ流路の幅及び深さは２００μｍ、第２マイクロ流路の幅及び深さは４００μｍとされている。【００８７】
［実施例１］
実施例１では、上述した第１実施形態と同様の構成のマイクロ流路デバイスを作製した。具体的には、基となるマイクロ流路デバイスの多孔膜と第２流路部材との間に、補強部材として中央部にスリットを形成したポリプロピレンから成る膜部材を挟み込んだマイクロ流路デバイスを作製した。なお、補強部材の大きさは第２流路部材の対向面（主面）と略同じ大きさとされており、補強部材の厚さは１００μｍとされ、補強部材の剛性は、前述の鋼球を用いた評価方法にて変形量が０．５ｍｍとされている。【００８８】
［実施例２］
実施例２では、上述した第２実施形態と同様の構成のマイクロ流路デバイスを作製した。具体的には、基となるマイクロ流路デバイスの多孔膜と第２流路部材との間に、補強部材としてポリエチレンテレフタレートから成る一対の膜部材を挟み込んだマイクロ流路デバイスを作製した。なお、補強部材の大きさはそれぞれ３ｍｍ四方とされており、補強部材の厚さはそれぞれ１２μｍとされ、補強部材の剛性は、前述の鋼球を用いた評価方法にて変形量が１ｍｍとされている。また、補強部材は、第１マイクロ流路と第２マイクロ流路の合流部分にそれぞれ配置されている。【００８９】
［比較例１］
比較例１では、補強部材を配置せず、基となるマイクロ流路デバイスをそのまま用いた。【００９０】
［比較例２］
比較例２では、基となるマイクロ流路デバイスの多孔膜と第２流路部材との間に、補強部材としてポリエチレンテレフタレートから成る一対の膜部材を挟み込んだマイクロ流路デバイスを作製した。なお、補強部材の大きさはそれぞれ３ｍｍ四方とされており、補強部材の厚さはそれぞれ２μｍとされている。また、補強部材は、第１マイクロ流路と第２マイクロ流路の合流部分にそれぞれ配置されている。【００９１】
＜細胞の観察＞
上記の実施例１、実施例２、比較例１、及び比較例２のマイクロ流路デバイスの多孔膜に細胞を播種し、その細胞を観察した。具体的には、まず、骨髄由来間葉系幹細胞（Lonza社）の懸濁液を濃度３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌで調整し、２００μＬの懸濁液を下側の第２マイクロ流路に注入した。次に、マイクロ流路デバイスを反転し、ＣＯ２インキュベータ内において３７℃で３時間静置した後、毎分０．７μＬの速度で培地を流し、一晩培養した。【００９２】
次に、CellTracker Orange（ThermoFischer社）で染色したｉＰＳ細胞由来の血管内皮細胞（ＣＤＩ社 iCell EC）の懸濁液を濃度１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌで調整し、２００μＬの懸濁液を上側の第１マイクロ流路に注入した。【００９３】
その後、実施例１、実施例２、比較例１、及び比較例２のマイクロ流路デバイスにおいて、蛍光顕微鏡を用い、第１マイクロ流路に注入したｉＰＳ細胞由来の血管内皮細胞の分布をそれぞれ観察した。実施例１の観察結果を図１０Ａ、図１０Ｂに示し、比較例１の観察結果を図１１Ａ、図１１Ｂに示す。なお、図１０Ａ、図１０Ｂ、図１１Ａ、及び図１１Ｂでは、ｉＰＳ細胞由来の血管内皮細胞のみを図示している。【００９４】
実施例１では、図１０Ａ、図１０Ｂに示すように、ｉＰＳ細胞由来の血管内皮細胞Ｓが第１マイクロ流路内に留まっていることが確認できた。一方、比較例１では、図１１Ａ、図１１Ｂに示すように、ｉＰＳ細胞由来の血管内皮細胞Ｓの一部が第２マイクロ流路内に位置し、このため、あたかもｉＰＳ細胞由来の血管内皮細胞Ｓが第２マイクロ流路内に漏れ出たように見えることが確認できた。【００９５】
なお、図示を省略するが、実施例２及び比較例２についても、実施例１及び比較例１の観察結果と同様の結果となった。具体的には、実施例２では、ｉＰＳ細胞由来の血管内皮細胞Ｓが第１マイクロ流路内に留まっていたのに対し、比較例２では、ｉＰＳ細胞由来の血管内皮細胞Ｓの一部が第２マイクロ流路内に位置し、ｉＰＳ細胞由来の血管内皮細胞Ｓが第２マイクロ流路内に漏れ出たように見えることが確認できた。【００９６】
２０１８年３月２日に出願された日本国特許出願２０１８−０３７５１１号の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。【００９７】
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
【符号の説明】
【００９８】
１０、６０ マイクロ流路デバイス
１２、６２ 第１流路部材
１２Ａ、６２Ａ 対向面
１４、６４ 第２流路部材
１４Ａ、６４Ａ 対向面
１６ 流路ユニット
１８、６８ 第１マイクロ流路
１８Ａ、６８Ａ 流入口
１８Ｂ、６８Ｂ 流出口
１８Ｃ、６８Ｃ 流路部
２０、７０ 第２マイクロ流路
２０Ａ、７０Ａ 流入口
２０Ｂ、７０Ｂ 流出口
２０Ｃ、７０Ｃ 流路部
２２、２４、７２ 段部
２６Ａ、２６Ｂ、２８Ａ、２８Ｂ 貫通孔
３０ 保持プレート
３２、５６ ボルト孔
３４ 凹部
３６ スペーサ
３８ ナット
４０ ボルト
４２Ａ、４２Ｂ、４４Ａ、４４Ｂ 貫通孔
４６ 多孔膜
４６Ａ 上面
４６Ｂ 下面
４８ 孔
４８Ａ 開口
５０ 平坦部
５２ 連通孔
５４、７４ 補強部材
５７ 貫通孔
５８ スリット
【図１】
2019168118.tif 000003
【図２】
2019168118.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
2019168118.tif 000013
【図１１Ａ】
2019168118.tif 000014
【図１１Ｂ】
2019168118.tif 000015
【国際調査報告】
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