(57)【要約】  細胞（例えば、哺乳類細胞）の分類、生物の階級分類、ウイルスの分類、分子のクラス分類（例えば、活性型と通常型、修飾型と非修飾型、変異型と野生型、ホロ体とアポ体、多量体と単量体、複合体と単体などの分子分類）などに対応した、標的物質を狙ってロジカルに抗体を取得する方法を提供すること。  目的物質を認識する抗体群から、対照物質を認識する抗体群をサブトラクトすることを特徴とする、目的物質を特異的に認識する抗体を取得する方法。
2019230823.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的物質を認識する抗体群から、対照物質を認識する抗体群をサブトラクトすることを特徴とする、目的物質を特異的に認識する抗体を取得する方法。
【請求項２】
抗体がＶＨＨ抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
サブトラクトが次世代シーケンサーの結果の差異を検出する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
抗体が哺乳類細胞の分類用である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
抗体が生物の階級の分類用である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
抗体がウイルスの分類用である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
抗体が分子のクラス分類用である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記目的物質を認識する抗体群から、前記対照物質を認識する抗体群をサブトラクトすることは、前記目的物質を認識する抗体群のアミノ酸配列と、前記対照物質を認識する抗体群のアミノ酸配列と、の比較を行うことを含む、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記目的物質を特異的に認識する抗体は、前記目的物質を認識する抗体群に含まれ、
前記対照物質を認識する抗体群における、前記目的物質を特異的に認識する抗体の数は、所定基準以下である、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか１項に記載の方法により取得された抗体。
【請求項１１】
抗体がペプチドである、請求項１０記載の抗体。
【請求項１２】
目的物質を認識する抗体群のアミノ酸配列と、対照物質を認識する抗体群のアミノ酸配列と、の比較を行うことにより、前記対照物質と比較して前記目的物質を選択的に認識する抗体を特定する工程を含む、抗体の特定方法。
【請求項１３】
前記特定する工程において特定される抗体は、前記目的物質を認識する抗体群に含まれ、
前記対照物質を認識する抗体群における、前記特定する工程において特定される抗体の数は、所定基準以下である、請求項１２に記載の特定方法。
【請求項１４】
前記対照物質は、前記目的物質の標的部位が修飾された構造を有し、
前記特定する工程において特定される抗体は、前記目的物質の前記標的部位を、前記目的物質の他の部位と比較して選択的に認識する、請求項１２又は１３に記載の特定方法。
【請求項１５】
前記抗体を産生する動物に前記目的物質を投与する工程と、
前記動物において誘導された抗体群のうち、前記目的物質を認識する抗体群のアミノ酸配列を解読する工程と、
前記動物において誘導された抗体群のうち、前記対照物質を認識する抗体群のアミノ酸配列を解読する工程と、
をさらに含む、請求項１２から１４のいずれか１項に記載の特定方法。
【請求項１６】
前記動物において誘導された前記抗体群を産生する遺伝子配列を解読する工程をさらに含み、
前記目的物質を認識する抗体群のアミノ酸配列を解読する工程は、
前記解読された遺伝子配列を有する遺伝子が導入されたファージを前記目的物質と相互作用させる工程と、
前記目的物質と結合したファージに導入されている遺伝子配列に対応するアミノ酸配列を、前記目的物質を認識する抗体のアミノ酸配列として特定する工程と、
を含み、
前記対照物質を認識する抗体群のアミノ酸配列を解読する工程は、
前記解読された遺伝子配列を有する遺伝子が導入されたファージを前記対照物質と相互作用させる工程と、
前記対照物質と結合したファージに導入されている遺伝子配列に対応するアミノ酸配列を、前記対照物質を認識する抗体のアミノ酸配列として特定する工程と、
を含む、請求項１５に記載の特定方法。
【請求項１７】
前記動物において誘導された前記抗体群を産生する遺伝子の遺伝子配列を解読する工程は、前記動物から得られたリンパ球に含まれる抗体の遺伝子の遺伝子配列を解読することを含む、請求項１５又は１６に記載の特定方法。
【請求項１８】
前記抗体はＶＨＨ抗体であり、前記動物はアルパカである、請求項１５から１７のいずれか１項に記載の特定方法。
【請求項１９】
請求項１２から１８のいずれか１項に記載の特定方法に従って、前記対照物質と比較して前記目的物質を選択的に認識する抗体のアミノ酸配列を特定する工程と、
前記特定されたアミノ酸配列を有する抗体を製造する工程と、
を含むことを特徴とする、抗体の製造方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の製造方法に従って製造された抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体を取得する方法、抗体の特定方法、抗体の製造方法、及び抗体に関する。より詳しくは、標的物質を特異的に検出する抗体の取得方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、分子活性化ないし分子不活性化に関わる領域、および複合体形成に関わる分子領域を認識する物質の樹立に関して、分子標的創薬の観点から種々検討がなされている。【０００３】
これらの標的領域に作用干渉する分子としては、低分子化合物の場合には、標的分子の活性化や複合体形成に影響を及ぼす事は稀であるために、分子サイズと特異性の高さから、もっぱらモノクローナル抗体について検討が行われている。しかしながら、モノクローナル抗体は偶然の産物であるゆえ、標的エピトープを認識する確率の低さから、目的とするモノクローナル抗体の樹立は、時間的コストおよび経済的コストが高い手法であった。【０００４】
ところで、ラクダ科動物（フタコブラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ等）の血清中には、重鎖抗体と呼ばれる、軽鎖を持たない特殊な抗体が存在することが知られている。重鎖抗体の可変領域ドメインからなる抗体断片は、ＶＨＨ抗体と呼ばれ、抗原に結合できる免疫グロブリンフラグメントとしては最も低分子量のものである。【０００５】
ＶＨＨ抗体は、例えば大腸菌等を用いた方法や、ｃＤＮＡディスプレイ法によるライブラリーからスクリーニングする方法などにより、簡便に合成でき、リフォールディング能が高く、熱変性にも強いため、産業応用の観点から次世代抗体として注目されている（例えば、特許文献１、２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００５−５２０４９４号公報
【特許文献２】特開２０１７−１４１１２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、小さな標的部位を狙ってロジカルに抗体を取得する技術は未だ存在していない。【０００８】
本発明は、標的物質を狙ってロジカルに抗体を取得する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一実施形態に係る方法は、目的物質を認識する抗体群から、対照物質を認識する抗体群をサブトラクトすることを特徴とする、目的物質を特異的に認識する抗体を取得する方法である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、標的物質を特異的に検出する抗体を簡便に効率よく取得することができる。【００１１】
本発明のその他の特徴及び利点は、添付図面を参照とした以下の説明により明らかになるであろう。なお、添付図面においては、同じ若しくは同様の構成には、同じ参照番号を付す。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
添付図面は明細書に含まれ、その一部を構成し、本発明の実施の形態を示し、その記述と共に本発明の原理を説明するために用いられる。【００１３】
【図１】図１は、本発明におけるサブトラクトの態様を模式的に示した図である。
【図２】図２は、本発明の方法により取得された抗体でがん患者の組織切片を細胞組織染色した結果を示す図である。
【図３】図３は、公知のモノクローナル抗体でがん患者の組織切片を細胞組織染色した結果を示す図である。
【図４】図４は、本発明の方法により取得された抗体でＨＥＫ２９３中のＨｅｒ２を細胞組織染色した結果を示す図である。
【図５】図５は、公知のモノクローナル抗体でＨＥＫ２９３中のＨｅｒ２を細胞組織染色した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の抗体取得方法は、目的物質を認識する抗体群から、対照物質を認識する抗体群をサブトラクトすることを特徴とする。本発明において、サブトラクトとは、目的物質に結合した抗体群と対照物質に結合した抗体群を対比して、前者には含まれるが後者に含まれない抗体（群）を見出すことである。具体的には、例えば、図１に示すように、左の目的物質には抗体ａ〜ｏが結合し、右の対照物質には抗体ｄ〜ｏが結合するところ、サブトラクトにより、抗体ａ、ｂ、ｃを目的物質に特異的に結合する抗体として見出すことができる。よって、目的物質と対照物質を種々組み合わせることで、その目的に応じた抗体を簡便に効率よく取得することができる。
【００１５】
本発明において、目的物質と対照物質の組み合わせとしては、その目的に応じて設定することができる。目的としては、具体的には、例えば、細胞の分類、生物の階級分類、ウイルスの分類、分子のクラス分類などが挙げられる。
【００１６】
細胞の分類とは、細胞の状態、発生、種類、経過時間、動物種、分化、周期、遺伝子発現、受精の有無などを分類することを意味する。対象となる細胞としては、例えば、哺乳類細胞、培養細胞、卵細胞、生殖細胞、がん細胞、血球細胞、脊椎動物細胞、非脊椎動物細胞、単核細胞、多核細胞、原核細胞、真核細胞、生細胞、死細胞などが含まれる。具体的には、例えば、細胞状態の分類（例えば、がん細胞と正常細胞の分類）、細胞発生の分類（例えば、分化前細胞と分化後の細胞の分類）、細胞種類の分類（例えば、ＥＳ細胞とｉＰＳ細胞の分類）、細胞発生後の時間経過の分類（例えば、老化細胞と幼若細胞の分類）、細胞の動物種の分類（例えば、ヒトとその他動物などの種の異なる細胞の分類）、細胞の脱核を伴う分化の分類（例えば、赤血球などの脱核前後の細胞の分類）、細胞の増殖周期の分類（例えば、増殖期と非増殖期の細胞の分類）、細胞の遺伝子発現の分類（例えば、活性化前と活性化後の細胞の分類）、卵細胞の受精卵と未受精卵の分類（例えば、受精前と受精後の細胞の分類）などが挙げられる。
【００１７】
生物の階級分類とは、生物の門・網・目・科・属・種などを分類することを意味する。生物としては、例えば、細菌、菌類、線形動物、藻類、プランクトン、クモ類、昆虫類、魚類、両生類、は虫類、哺乳類などが含まれる。具体的には、例えば、グラム陰性菌とグラム陽性菌の分類、大腸菌と緑膿菌などの細菌種の分類；病原性大腸菌と非病原性大腸菌の分類、青カビと白カビなどの菌類の分類；線虫や虫卵の分類、などが挙げられる。
【００１８】
ウイルスの分類とは、ウイルスの種類、型などを分類することを意味する。具体的には、例えば、ヒト免疫不全ウイルスの分類、インフルエンザウイルスの分類、肝炎ウイルスの分類などが挙げられる。
【００１９】
分子のクラス分類とは、タンパク質、糖、脂質、核酸、化合物などの生物を構成している有機化合物や生物が生成する有機化合物の立体構造状態などを分類することを意味する。具体的には、例えば、活性化型と不活性化型の分子の分類、単量体と多量体の分子の分類、単量体と複合体の分子の分類、ヒトとその他の動物の分子の分類、変異型と野生型（非変異型）の分類、各温度における分子の分類、各pHにおける分子の分類、各塩濃度における分子の分類、還元非還元における分子の分類、などが挙げられる。
【００２０】
前記した分類における目的物質と対照物質の組み合わせの好適例を以下に挙げる。
【００２１】
細胞の分類を行う場合の目的物質と対照物質の組み合わせとしては、具体的には、例えば、ｉＰＳ細胞とＥＳ細胞、分化細胞と幹細胞、分化細胞と未分化細胞、がん細胞と正常細胞、老化細胞と幼若細胞、の組み合わせを用いることができる。ｉＰＳ細胞とＥＳ細胞はどちらも幹細胞としての機能を持ち、機能がきわめて似通っているために、通例それぞれのゲノム解析を行うことでのみ分類できるものであるが、それぞれの細胞には異なった分子が存在し得るため、サブトラクトによりｉＰＳ細胞特異的な抗体や、ＥＳ細胞特異的な抗体を見出すことができる。分化細胞と幹細胞はお互い系統分類的には母細胞と娘細胞の関係にあるが、つまり概念として、幹細胞が１回だけ細胞分裂をすることで分化細胞ができる関係にあるが、これらの細胞はわずかだけ異なっているため、サブトラクトにより分化細胞特異的な抗体や、幹細胞特異的な抗体を見出すことができる。分化細胞と未分化細胞はお互い系統分類的には母細胞と娘細胞の関係にあるが、サブトラクトにより分化細胞特異的な抗体を見出すことができる。がん細胞と正常細胞はどちらも同一の細胞を起源としているが、サブトラクトによりがん細胞特異的な抗体や、正常細胞特異的な抗体を見出すことができる。老化細胞と幼若細胞の違いは、誕生してからの経過した時間が異なる同一の細胞であるが、サブトラクトにより老化細胞特異的な抗体や、幼若細胞特異的な抗体を見出すことができる。
【００２２】
生物の階級分類を行う場合の目的物質と対照物質の組み合わせとしては、具体的には、例えば、大腸菌と緑膿菌、病原性大腸菌と非病原性大腸菌、ヒトの腸内細菌と他の動物の腸内細菌、などの組み合わせを用いることができる。大腸菌と緑膿菌はどちらも細菌として分類されるものであるが、ヒトへの病原性という点が異なり、これらの細菌外膜の違いを認識する抗体をサブトラクトにより見いだすことができる。病原性大腸菌と非病原性大腸菌はどちらも大腸菌に分類されるものであるが、ヒトへの病原性という点が異なり、これらの細菌外膜の違いを認識する抗体をサブトラクトにより見いだすことができる。ヒトの腸内細菌と他の動物の腸内細菌はどちらも腸内細菌として分類されるものであるが、宿主が異なり、これらの腸内細菌の細菌外膜の違いを認識する抗体をサブトラクトにより見いだすことができる。
【００２３】
ウイルスの分類を行う場合の目的物質と対照物質の組み合わせとしては、具体的には、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（エイズウイルス）のＡ型とＢ型とＣ型、エボラウイルスのザイール型とスーダン型、ネコ免疫不全ウイルスのＡ型とＢ型とＣ型、ヒトインフルエンザウイルスのＡ型とＢ型、鳥インフルエンザウイルスと豚インフルエンザウイルス、などの組み合わせを用いることができる。ヒト免疫不全ウイルスは外殻表面タンパク質（エンベロープ）の種類によって分類されるので、このエンベロープの違いを特異的に認識する抗体をサブトラクトにより見いだすことができる。エボラウイルスは外殻表面タンパク質（エンベロープ）の種類によって分類されるので、このエンベロープの違いを特異的に認識する抗体をサブトラクトにより見いだすことができる。ネコ免疫不全ウイルスは外殻表面タンパク質（エンベロープ）の種類によって分類されるので、このエンベロープの違いを特異的に認識する抗体をサブトラクトにより見いだすことができる。ヒトインフルエンザウイルスは外殻表面タンパク質（ヘマグルチニン）の種類によって分類されるので、このエンベロープの違いを特異的に認識する抗体をサブトラクトにより見いだすことができる。ヒト以外の動物のインフルエンザウイルスは外殻表面タンパク質（ヘマグルチニン）の種類によって分類されるので、このエンベロープの違いを特異的に認識する抗体をサブトラクトにより見いだすことができる。
【００２４】
分子のクラス分類を行う場合の目的物質と対照物質の組み合わせとしては、具体的には、例えば、活性型と通常型、修飾型と非修飾型、変異型と野生型、ホロ体とアポ体、溶媒条件Ａと溶媒条件Ｂ、多量体と単量体、複合体と単体、の組み合わせを用いることができる。分子の活性型と通常型の組み合わせとしては、例えば、分子にリガンドが結合した活性型と、分子にリガンドが結合していない通常型が挙げられ、これらの違いを認識する抗体をサブトラクトにより見いだすことができる。分子の修飾型と非修飾型の組み合わせとしては、例えば、糖鎖修飾されたタンパク質と糖鎖修飾されていないタンパク質が挙げられ、これらの違いを認識する抗体をサブトラクトにより見いだすことができる。分子の変異型と野生型の組み合わせとしては、例えば、アミノ酸残基が置換したタンパク質と天然に存在するアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられ、これらの違いを認識する抗体をサブトラクトにより見いだすことができる。分子のホロ体とアポ体の組み合わせとしては、例えば、タンパク質にリガンドが結合したホロ体と、タンパク質にリガンドが結合していないアポ体が挙げられ、これらの違いを認識する抗体をサブトラクトにより見いだすことができる。溶媒条件Ａと溶媒条件Ｂの組み合わせとしては、酸性の溶媒（溶媒条件Ａ）とアルカリ性の溶媒（溶媒条件Ｂ）が挙げられ、これらの環境下における分子の違いを認識する抗体をサブトラクトにより見いだすことができる。分子の多量体と単量体の組み合わせとしては、二量体のタンパク質と単量体のタンパク質が挙げられ、これらの違いを認識する抗体をサブトラクトにより見いだすことができる。分子の複合体と単体の組み合わせとしては、タンパク質と抗体が結合した複合体と、タンパク質単体が挙げられ、これらの違いを認識する抗体をサブトラクトにより見いだすことができる。
【００２５】
このように、目的物質と対照物質を適宜設定することができるが、目的物質を特徴付ける部分のみが異なり、その他の部分がなるべく同一になる点を考慮して目的物質と対照物質を組み合わせることで、目的に応じた抗体をより簡便に効率よく取得することができる。
【００２６】
設定された目的物質と対照物質に対しては、任意の抗体を接触させることで、目的物質を認識する抗体群と、対照物質を認識する抗体群を得ることができる。なお、接触させる抗体は、公知の抗体（例えば、市販品の抗体ディスプレイ）であっても、別途調製したものでもよい。調製品としては、動物免疫を行って得られたものであっても、実験器具内で調製して得られたものでもよい。
【００２７】
例えば、動物免疫を行って得られた抗体を用いる場合、ラクダ（ｃａｍｅｌ）、ヒトコブラクダ（ｄｒｏｍｅｄａｒｙ）、ラマ（ｌｌａｍａ）、アルパカ（ａｌｐａｃａ）などを免疫して得られるＶＨＨ抗体が好適に用いられる。ＶＨＨ抗体の取得方法は、公知の方法に従って行うことができる。
【００２８】
抗体の目的物質又は対照物質への接触条件は、用いる物質に応じて、技術常識に従って適宜設定することができる。
【００２９】
かくして、目的物質を認識する抗体群と、対照物質を認識する抗体群を取得でき、これらをサブトラクトすることで、目的物質に特異的に結合する抗体（群）が見出される。なお、サブトラクトにおいては、抗体の存在そのものを判断してサブトラクトできればよく、その手法は特に限定されない。抗体の存在を判断する方法としては、公知の手法を用いることができ、例えば、次世代シーケンサーの結果の差異を検出することでサブトラクトしてもよい。具体的には、次世代シーケンサーによって、目的物質を認識する抗体群と対照物質を認識する抗体群のそれぞれの抗体を解読し、その存在比を判断し、存在比が好ましくは５〜１０倍、より好ましくは１０倍を超えるものを目的物質又は対照物質に特異的に存在する抗体と判断して取得することができる。必要により、内部標準を用いて補正した数値を用いてもよい。また、クラスタリングを行って選択する抗体を処理してもよく、クラスタリングの条件としては、例えば、アミノ酸残基が１つのみ異なる群、アミノ酸残基が２つのみ異なる群、以下、アミノ酸残基がｎ（ｎは３以上の自然数）のみ異なる群、アミノ酸残基が１つのみ異なる群のうち全長アミノ酸残基数が同一の群、アミノ酸残基が２つのみ異なる群のうち全長アミノ酸残基数が同一の群、アミノ酸残基がｎ（ｎは３以上の自然数）のみ異なる群のうち全長アミノ酸残基数が同一の群、等を用いることができる。クラスタリングは、サブトラクトの前、後、両方のいずれで行ってもよい。具体的な態様としては、用いる物質に応じて一概には設定されないが、用いる抗体が１×１０８個程度ある場合、本発明の方法により、例えば、目的物質に特異的に結合する抗体を数個〜数十個程度にまで限定して取得することが可能となる。よって、本発明の抗体取得方法は、抗体のスクリーニング方法でもある。以下に、サブトラクトの一例を示す。
【００３０】
例えば、タンパク質Ａと相互作用するタンパク質Ｂ（例えば、抗体など）が存在する環境下でタンパク質Ａと結合するＶＨＨ抗体のアミノ酸配列群（Ｂ群）を、タンパク質Ａと相互作用するＶＨＨ抗体のアミノ酸配列群（Ａ群）からサブトラクトしたアミノ酸配列群（Ｃ群、Ｃ群＝Ａ群−Ｂ群）を取得する方法について説明する。先ず、Ａ群とＢ群の抗体に対し、例えば、次世代シーケンサーの結果において、出現頻度（リードカウント数）の結果から、Ａ群に含まれているアミノ酸配列（リード数＝２以上）で、かつＢ群には含まれないアミノ酸配列（リード数＝０）を選び（Ｃ０群）、Ａ群に含まれているアミノ酸配列（リード数＝２０以上）のうち、Ｂ群にはその１０分の１以下のリード数しか現れないアミノ酸配列（リード数＝２以上）を選び（Ｃ１／１０群）、Ａ群に含まれているアミノ酸配列（リード数＝４以上）のうち、Ｂ群にはその半分以下のリード数しか現れないアミノ酸配列（リード数＝２以上）を選ぶ（Ｃ１／２群）。次に、Ｃ群はＣ０群とＣ１／１０群とＣ１／２群に含まれるアミノ酸配列を合算したのちに、これら３群間で重複するアミノ酸配列を除いたものの集合とすることができる。また、Ｃ群が本発明の抗体取得方法で得られる抗体群であり、さらに、Ｃ０群、Ｃ１／１０群、Ｃ１／２群の順に抗体のスクリーニング陽性率が高いことが期待できる。
【００３１】
かくして、目的物質に特異的に結合する抗体を取得することができる。前記抗体は、目的物質を認識する抗体群から、対照物質を認識する抗体群をサブトラクトすることにより得られるが、目的物質や対照物質を認識する物質がペプチドである場合は、目的物質に特異的に結合するペプチドとして得ることができる。よって、本発明の一態様として、目的物質を認識するペプチド群から、対照物質を認識するペプチド群をサブトラクトすることにより、目的物質に特異的に結合するペプチドを取得する方法を挙げることができる。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００３３】
実施例１：アルパカにおける、Ｈｅｒ２の免疫応答の誘導
精製したＨｅｒ２の注射による、１頭のアルパカにおける免疫応答は、公知の方法に従って実施した。なお、用いたＨｅｒ２は、ニッケル固相化アフィニティー樹脂（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を使用して、Ｈｅｒ２を過剰発現した腫瘍細胞から調製した。【００３４】
実施例２：Ｈｅｒ２−Ｈｉｓの発現及び精製
ヒトＨｅｒ２の細胞外領域のＮ末端６２４アミノ酸残基と、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ（６×Ｈｉｓ）を使用した。プラスミドは８０ｋＤａのＨｅｒ２−Ｈｉｓ融合タンパク質を発現させ、培養上清に分泌させた。ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）を、Ｈｅｒ２−Ｈｉｓコンストラクトにより一過性にトランスフェクトし、さらに処理するために培養上清を回収した。Ｈｅｒ２−Ｈｉｓ融合体を、ニッケル固相化カラムにより上清から精製した。免疫沈降法によりＨｅｒ２−Ｈｉｓ融合体の機能を評価した。【００３５】
Ｈｅｒ２特異的ｍＡｂ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）は、免疫沈降においてＨｅｒ２−Ｈｉｓ融合体に十分に結合し、このことはＨｅｒ２−Ｈｉｓ融合体の細胞外領域上のＨｅｒｃｅｐｔｉｎの結合部位のコンフォメーションは、劇的な影響を受けていないことを示している。【００３６】
実施例３：ハーセプチンモノクローナル抗体の生成
ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）は、マウスモノクローナル抗体より誘導された、抗Ｈｅｒ２治療用のキメラ抗体（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）である（Ｃａｒｔｅｒ  Ｐ，
Ｐｒｅｓｔａ  Ｌ，  Ｇｏｒｍａｎ  ＣＭ，  Ｒｉｄｇｗａｙ  ＪＢ，  Ｈｅｎｎｅｒ
Ｄ，  Ｗｏｎｇ  ＷＬ，  Ｒｏｗｌａｎｄ  ＡＭ，  Ｋｏｔｔｓ  Ｃ，  Ｃａｒｖｅｒ
ＭＥ，  Ｓｈｅｐａｒｄ  ＨＭ．  Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉ−ｐ１８５ＨＥＲ２  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １９９２  Ｍａｙ  １５；８９（１０）：４２８５−９．）。ハーセプチンのモノクローナル抗体を公知の方法に従って調製した（Ａｎｔｉ−ｅｒｂＢ−２（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ）［４Ｄ５−８（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）］Ａｂｓｏｌｕｔｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ社）。【００３７】
実施例４：Ｈｅｒ２細胞外領域の磁気ビーズへの結合
ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）中で産生されたＨｅｒ２−Ｈｉｓ融合タンパク質は、ニッケル固相化カラムにより培養液上清から精製された。磁気ビーズの製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の推奨条件に従い、タンパク質に含まれる第一級アミノ基と磁気ビーズ表面に存在する活性基（Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）を、５０ｍｇ／ｍＬ  ＥＤＣ（１−エチル−３−（−３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）と５０ｍｇ／ｍＬ  ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）試薬を使い共有結合した。【００３８】
実施例５：Ｈｅｒ２と相互作用するＶＨＨ抗体の選択
Ｈｅｒ２の注射による、免疫応答をおこした１頭のアルパカの血液から、リンパ球を回収した。リンパ球に含まれるＶＨＨ抗体の遺伝子配列群（ＶＨＨ抗体遺伝子ライブラリー）の取得、およびその遺伝子配列群を持つファージ群の作製（ＶＨＨ抗体ファージライブラリー）は、公知の方法を参照して実施した。【００３９】
これらの遺伝子配列群を持つファージ群を、Ｈｅｒ２−Ｈｉｓ融合タンパク質をつけた磁気ビーズに結合させる方法は、磁気ビーズの製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の推奨する条件で実施した。具体的には、Ｈｅｒ２−Ｈｉｓ融合タンパク質をつけた磁気ビーズ２００μＬ分を、１．５ｍＬ容量のサンプルチューブに入れ、さらにファージ（１０００００００個以上）を加えて、ひと晩撹拌することで結合を飽和させた。Ｈｅｒ２−Ｈｉｓ融合タンパク質をつけた磁気ビーズへの結合を飽和させた後、十分量のバッファー（界面活性剤入りトリス緩衝液  中性ｐＨ）で洗った（１ｍＬ、２０分撹拌を４回）。洗浄後にＨｅｒ２−Ｈｉｓ融合タンパク質をつけた磁気ビーズに結合していたファージをプロテアーゼ処理で磁気ビーズからはがして回収した。回収したファージは、ファージ感染用の大腸菌（ＴＧ１コンピテントセル）に感染させて、大腸菌ライブラリーとして保存した。Ｈｅｒ２−Ｈｉｓ融合タンパク質をつけた磁気ビーズに結合してきたＶＨＨ抗体の遺伝子配列群は、作成された大腸菌ライブラリーにプラスミドの形で存在しており、製造業者の推奨する方法で（Ｑｉａｇｅｎ）それらのプラスミドを精製した。【００４０】
実施例６：Ｈｅｒ２と相互作用するタンパク質（ハーセプチンモノクローナル抗体）が存在する環境でＨｅｒ２と結合するＶＨＨ抗体の選択
Ｈｅｒ２−Ｈｉｓ融合タンパク質をつけた磁気ビーズ２００μＬ分を、１μｇのハーセプチンモノクローナル抗体とともに、１．５ｍＬ容量のサンプルチューブに入れ、さらにファージ（１０００００００個以上）を加えて、ひと晩撹拌することで結合を飽和させた。以下、実施例５と同様の方法で、ハーセプチンモノクローナル抗体が結合したＨｅｒ２−Ｈｉｓ融合タンパク質の磁気ビーズに結合してきたＶＨＨ抗体の遺伝子配列群を、プラスミドの形で精製した。【００４１】
実施例７：ＶＨＨ抗体の遺伝子配列群の遺伝子配列の解読
実施例５および実施例６で取得したＶＨＨ抗体の遺伝子配列群に含まれる遺伝子配列は、次世代シーケンス解析により解読した。たとえば、ｉｌｌｕｍｉｎａ＿ＭｉＳｅｑ＿Ａｍｐｌｉｃｏｎ＿Ｄｅｅｐ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ法によって、１０万種類の遺伝子配列を解読することができる。ＶＨＨ抗体の遺伝子配列のうち、５００塩基対以下の部分をターゲット領域として、その部分に含まれる遺伝子配列を解読した。ターゲット領域を増幅するためのプライマーとして５’gaaatacctattgcctacggc（５’側、配列番号１）と５’ggaaccgtagtccggaacgtc（３’側、配列番号２）を設計した。ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）でこれらのプライマーセットを使うことで、ＶＨＨ抗体の遺伝子配列のうち、５００塩基対以下の部分のターゲット領域を増幅した。さらに、次世代シーケンサーに固有の指定配列  ５’TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG−（配列番号３）と５’GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG−（配列番号４）を上記プライマーにそれぞれ融合したプライマーセットを用いることで、製造業者（イルミナ社）が推奨する方法でｉｌｌｕｍｉｎａ＿ＭｉＳｅｑ＿Ａｍｐｌｉｃｏｎ＿Ｄｅｅｐ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ法によるターゲット領域の遺伝子配列を解読した。【００４２】
実施例８：次世代シーケンサーで解読したＶＨＨ抗体の遺伝子配列群をアミノ酸配列群へ翻訳する
遺伝子配列群からアミノ酸配列群への翻訳は、市販の解析ソフトウェアでおこなった（Ｇｅｎｅｔｙｘ社）。これらの遺伝子配列群及びアミノ酸配列群のうち、末端の配列が使用したプライマーと完全に一致するもの、ターゲット領域の塩基長が４０１塩基対以上であるもの、リードカウント数が２以上であるもの、ベクター配列に含まれるヒスタグ配列（６×Ｈｉｓ）を含むもの、を選び出した。さらに、遺伝子配列が異なっていてもアミノ酸配列が同一であるものを合算して、出現頻度（リードカウント数）が高いアミノ酸配列の順にまとめた。【００４３】
実施例９：Ｈｅｒ２と相互作用するＶＨＨ抗体のアミノ酸配列群の取得
実施例８に従い、実施例５で得られたＨｅｒ２と相互作用するＶＨＨ抗体のアミノ酸配列群のリストを作製した。Ｈｅｒ２と相互作用するＶＨＨ抗体のアミノ酸配列は１８６４０種類であった。【００４４】
実施例１０：Ｈｅｒ２と相互作用するタンパク質（ハーセプチンモノクローナル抗体）が存在する環境下でＨｅｒ２と結合するＶＨＨ抗体のアミノ酸配列群の取得
実施例８に従い、実施例６で得られたＨｅｒ２と相互作用するタンパク質（ハーセプチンモノクローナル抗体）が存在する環境下でＨｅｒ２と結合するＶＨＨ抗体のアミノ酸配列群のリストを作製した。Ｈｅｒ２と相互作用するタンパク質（ハーセプチンモノクローナル抗体）が存在する環境下でＨｅｒ２と相互作用するＶＨＨ抗体のアミノ酸配列は１３６７０種類であった。【００４５】
実施例１１：Ｈｅｒ２と相互作用するタンパク質（ハーセプチンモノクローナル抗体）が存在する環境下でＨｅｒ２と結合するＶＨＨ抗体のアミノ酸配列群（Ｂ群）を、Ｈｅｒ２と相互作用するＶＨＨ抗体のアミノ酸配列群（Ａ群）からサブトラクトしたアミノ酸配列群（Ｃ群）を取得する（Ｃ群＝Ａ群−Ｂ群）
具体的には、以下の群に含まれるアミノ酸配列を選択し、Ｃ群を取得した。
Ａ群に含まれているアミノ酸配列（リード数＝２以上）で、かつＢ群には含まれないアミノ酸配列（リード数＝０）を選ぶ（Ｃ０群＝２００種類）。
Ａ群に含まれているアミノ酸配列（リード数＝２０以上）のうち、Ｂ群にはその１０分の１以下のリード数しか現れないアミノ酸配列（リード数＝２以上）を選ぶ（Ｃ１／１０群＝３６０種類）。
Ａ群に含まれているアミノ酸配列（リード数＝４以上）のうち、Ｂ群にはその半分以下のリード数しか現れないアミノ酸配列（リード数＝２以上）を選ぶ（Ｃ１／２群＝５０００種類）。
Ｃ群はＣ０群とＣ１／１０群とＣ１／２群に含まれるアミノ酸配列を合算したのちに、これら３群間で重複するアミノ酸配列を除いたものの集合である（Ｃ群＝５５００種類）。【００４６】
実施例１２：Ｃ群に含まれるアミノ酸配列をコードする遺伝子配列の人工遺伝子合成
Ｃ０群に含まれるアミノ酸配列はいずれも２００アミノ酸残基以下からなり、そのアミノ酸配列をコードする遺伝子配列は、製造業者（ユーロフィン社）が提供する最適化された遺伝子配列（ここでの最適化された遺伝子配列とは、たとえば、合成しやすい、分解されにくい、塩基が偏っていない、配列の繰り返しが少ない、二次構造を取りにくいなどの遺伝子配列のこと）として人工的に合成することができた。人工的に合成された遺伝子は、任意の発現ベクターに組み込むことができた。【００４７】
実施例１３：人工遺伝子がコードするＶＨＨ抗体タンパク質の発現
発現ベクターに組み込んだ人工遺伝子をプラスミドとして大腸菌（ＢＬ２１株）に遺伝子導入することで、人工遺伝子がコードするＶＨＨ抗体タンパク質を大腸菌に発現させることができた。具体的には、人工遺伝子にコードされたアミノ酸配列の発現は、当該大腸菌が対数増殖期にあるときにＩＰＴＧを添加することで行った。発現されたアミノ酸配列（ＶＨＨ抗体にヒスタグが付加されている）は、製造業者（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）が推奨する方法でニッケル固相化樹脂カラムを使って精製した。【００４８】
実施例１４：細胞組織染色でのエピトープオーバーラップの確認
実施例１３で得られた精製ＶＨＨ抗体の一部を使って、細胞組織の蛍光染色を行った。二次抗体としてウサギ抗ヒスタグ抗体（Ａｂｃａｍ社）を、三次抗体として赤色蛍光ラベルした抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社）を使った。同時にハーセプチンモノクローナル抗体でも染色を行った。検出試薬として、二次抗体として緑色蛍光ラベルした抗マウスＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社）を使った。試料としては、ハーセプチンモノクローナル抗体が結合することが既知のがん患者の組織切片を用いた。【００４９】
結果、実施例１３で得られたＶＨＨ抗体（配列番号５）で細胞組織染色した図（図２）は、対照のハーセプチンモノクローナル抗体で細胞組織染色した図（図３）と同様に染色できていることが示された。よって、本発明の方法により取得された抗体は、ハーセプチンモノクローナル抗体が結合するエピトープを特異的に認識することができることが分かる。【００５０】
また、ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）中で産生されたＨｅｒ２に対しても、実施例１３で得られたＶＨＨ抗体は、ハーセプチンモノクローナル抗体と同様に細胞組織染色されることを確認した（図４：実施例１３で得られたＶＨＨ抗体で染色した図、図５：ハーセプチンモノクローナル抗体で染色した図）。【００５１】
上記の実施例では、目的物質（例えばＨｅｒ２）を認識する抗体群のアミノ酸配列と、対照物質（例えばハーセプチンが結合したＨｅｒ２）を認識する抗体群のアミノ酸配列と、が解読された（実施例９，１０）。上記のとおり、解読には次世代シーケンサーなどを用いることができる。そして、このように解読されたアミノ酸配列を比較することにより、対照物質と比較して目的物質を選択的に認識する抗体が特定されている（実施例１１）。アミノ酸配列の比較を容易とするために、また目的物質を選択的に認識する抗体を発見しやすくするために、アミノ酸配列が類似している抗体群を所定の条件に従うクラスタリングによりグループ化してから、それぞれのグループの間でアミノ酸配列を比較してもよいことは、上述のとおりである。【００５２】
アミノ酸配列の比較においては、上述のように、目的物質を認識する抗体群に含まれ、対照物質を認識する抗体群中の数が所定基準以下である抗体を、目的物質を選択的に認識する抗体として特定することができる。例えば、Ｃ０群は、目的物質を認識する抗体群（Ａ群）に含まれ、対照物質を認識する抗体群（Ｂ群）には含まれない抗体群である。また、Ｃ１０群は、Ａ群に含まれ、Ｂ群中の数がＡ群中の数の１０分の１以下である抗体群である。また、Ｃ１／２群は、Ａ群に含まれ、Ｂ群中の数がＡ群中の数の２分の１以下である抗体群である。【００５３】
目的物質と、目的物質を特徴付ける部分のみが異なる対照物質との組み合わせを用いることで、目的物質を特徴付ける部分を選択的に認識する抗体を特定できることは、上述の通りである。上記の実施例では、目的物質としてＨｅｒ２を用い、対照物質としてハーセプチンが結合したＨｅｒ２を用いることで、単にＨｅｒ２を認識するのみならず、Ｈｅｒ２のうちハーセプチンが結合するエピトープ（すなわちＨｅｒ２のハーセプチン結合部位）を選択的に認識する抗体を特定している。この点は、実施例１３で得られたＶＨＨ抗体の染色パターンと、ハーセプチンの染色パターンとが一致することからも理解できる（実施例１４）。このように、対照物質は、上記の実施例で用いられているＨｅｒ２とハーセプチンとの複合体（すなわちハーセプチン結合部位が修飾されたＨｅｒ２）と同様に、目的物質の標的部位が修飾された構造を有していてもよい。このように目的物質と対象物質とを選択することにより、目的物質の標的部位を、目的物質の他の部位と比較して選択的に認識する抗体を特定することができる。なお、目的物質の標的部位を修飾する方法としては、上述のように目的物質にリガンドを結合させる方法、及び、目的物質の標的部位におけるアミノ酸配列を選択的に改変する方法、などが挙げられる。【００５４】
目的物質を認識する抗体群のアミノ酸配列、及び対照物質を認識する抗体群のアミノ酸配列は、上記のとおり、動物免疫を行うことで得ることができる。すなわち、抗体を産生する動物に目的物質を投与したことに応じて動物が生産する、目的物質を認識する抗体群のアミノ酸配列を解読することができる。上記の実施例では、抗体を産生する動物に目的物質を投与し（実施例１）、動物において誘導された抗体群のうち、目的物質を認識する抗体群のアミノ酸配列を解読している。具体的な手法としては、動物において誘導された抗体群を産生する遺伝子配列を解読した上で（実施例５）、解読された遺伝子配列を有する遺伝子が導入されたファージを目的物質と相互作用させ（実施例５）、目的物質と結合したファージに導入されている遺伝子配列に対応するアミノ酸配列を、目的物質を認識する抗体のアミノ酸配列として特定している（実施例７，８）。上記の実施例では、同様に、動物において誘導された抗体群のうち、対照物質を認識する抗体群のアミノ酸配列を解読している。具体的な手法としては、解読された遺伝子配列を有する遺伝子が導入されたファージを対照物質と相互作用させ（実施例６）、対照物質と結合したファージに導入されている遺伝子配列に対応するアミノ酸配列を、対照物質を認識する抗体のアミノ酸配列として特定している（実施例７，９）。なお、上記の実施例では、動物から得られたリンパ球に含まれる抗体の遺伝子の遺伝子配列を解読することにより、動物において誘導された抗体群を産生する遺伝子の遺伝子配列を解読している（実施例５）。【００５５】
実施例１３に示されるように、対照物質と比較して目的物質を選択的に認識する抗体のアミノ酸配列を特定すると、特定されたアミノ酸配列を有する抗体を製造することができる。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明の方法により、目的物質に特異的に結合する抗体（群）を簡便に効率よく取得することができ、例えば、特定のエピトープに対する抗体、該抗体をコードする核酸、検出キット、検出方法、特定の疾患の治療研究に好適に用いることができる。【００５７】
本発明は上記実施の形態に制限されるものではなく、本発明の精神及び範囲から離脱することなく、様々な変更及び変形が可能である。従って、本発明の範囲を公にするために、以下の請求項を添付する。【００５８】
本願は、２０１８年５月３０日提出の日本国特許出願特願２０１８−１０３０２４を基礎として優先権を主張するものであり、その記載内容の全てを、ここに援用する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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