(57)【要約】少なくとも１つのＣＲＥＢＢＰ遺伝子座に変異が導入されている非ヒト遺伝子改変動物であって、当該変異により、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子が、配列番号５のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる変異型ＣＲＥＢＢＰをコードしている、非ヒト遺伝子改変動物を提供する。また、非ヒト動物の少なくとも１つのＣＲＥＢＢＰ遺伝子座に変異を導入することを含む、上記遺伝子改変動物の製造方法を提供する。さらに、上記遺伝子改変動物の、ルビンシュタイン・テイビ症候群のモデルまたは睡眠相前進症候群のモデルとしての使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのＣＲＥＢＢＰ遺伝子座に変異が導入されている非ヒト遺伝子改変動物であって、当該変異により、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子が、配列番号５のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる変異型ＣＲＥＢＢＰをコードしている、遺伝子改変動物。
【請求項２】
変異型ＣＲＥＢＢＰが配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の遺伝子改変動物。
【請求項３】
ＣＲＥＢＢＰ遺伝子が、配列番号１のヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有し、配列番号１の第１１２３位に相当するヌクレオチドが欠損しているヌクレオチド配列を含む、請求項１または２に記載の遺伝子改変動物。
【請求項４】
ＣＲＥＢＢＰ遺伝子が配列番号７のヌクレオチド配列を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の遺伝子改変動物。
【請求項５】
齧歯類である、請求項１〜４のいずれかに記載の遺伝子改変動物。
【請求項６】
マウスである、請求項１〜５のいずれかに記載の遺伝子改変動物。
【請求項７】
非ヒト動物の少なくとも１つのＣＲＥＢＢＰ遺伝子座に変異を導入することを含む、請求項１〜６のいずれかに記載の遺伝子改変動物の製造方法。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかに記載の遺伝子改変動物の、ルビンシュタイン・テイビ症候群のモデルとしての使用。
【請求項９】
ルビンシュタイン・テイビ症候群が睡眠相前進症候群を伴うものである、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれかに記載の遺伝子改変動物の、睡眠相前進症候群のモデルとしての使用。
【請求項１１】
配列番号５または６のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項１２】
配列番号５または６のアミノ酸配列からなる、請求項１１に記載のペプチド。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載のペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項１４】
配列番号１のヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有し、配列番号１の第１１２３位に相当するヌクレオチドが欠損しているヌクレオチド配列、または、配列番号３のヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有し、配列番号３の第１１２６位に相当するヌクレオチドが欠損しているヌクレオチド配列を含む、請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
配列番号７または８のヌクレオチド配列を含む、請求項１３または１４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
ルビンシュタイン・テイビ症候群の判定方法であって、
（１）対象に由来する核酸試料において、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子のヌクレオチド配列を決定すること、
（２）該ヌクレオチド配列がコードするペプチドのアミノ酸配列を決定すること、
（３）該アミノ酸配列が、配列番号５または６のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列である場合に、対象がルビンシュタイン・テイビ症候群に罹患しているか、または、将来的に罹患すると判定すること、
を含む方法。
【請求項１７】
ルビンシュタイン・テイビ症候群の判定方法であって、
（１）対象に由来する核酸試料において、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子が配列番号１の第１１２３位に相当するヌクレオチドまたは配列番号３の第１１２６位に相当するヌクレオチドを欠損しているか否かを決定すること、
（２）ＣＲＥＢＢＰ遺伝子が該ヌクレオチドを欠損している場合に、対象がルビンシュタイン・テイビ症候群に罹患しているか、または、将来的に罹患すると判定すること、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、日本国特許出願第２０１８−１２４６６６号について優先権を主張するものであり、ここに参照することによって、その全体が本明細書中へ組み込まれるものとする。
本願は、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子に変異を導入された遺伝子改変動物、その製造方法、疾患モデルとしてのその使用、または、当該変異の有無を指標とする疾患の判定に関する。
【背景技術】
【０００２】
ルビンシュタイン・テイビ症候群は、精神運動発達遅滞、特異顔貌、幅広い拇指趾等を特徴とする多発奇形症候群である。責任遺伝子は１６ｐ１３．３に座位するCREB-binding protein（ＣＢＰまたはＣＲＥＢＢＰ）遺伝子であることが判明したが、ほとんどが散発例である（非特許文献１〜１８）。ＣＲＥＢＢＰはヒストンアセチルトランスフェラーゼであり、ルビンシュタイン・テイビ症候群はヒストンアセチル化異常症と考えられる。現在のところ根本的治療法はなく、長期的予後を改善するために、早期の合併症の治療が行われている。【０００３】
ルビンシュタイン・テイビ症候群のモデル動物として、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子の広い領域を人為的にノックアウトしたマウスが知られている（非特許文献１９）。このモデルでは、原因となる遺伝子部位は特定されない。また、このモデルが自然界で起こる変異を反映しているか否かは明らかでない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Alari V, et al., "iPSC-derived neurons of CREBBP- and EP300-mutated Rubinstein-Taybi syndrome patients show morphological alterations and hypoexcitability" Stem Cell Research, 2018 May 30;30:130-140
【非特許文献２】Merk DJ, et al., "Opposing Effects of CREBBP Mutations Govern the Phenotype of Rubinstein-Taybi Syndrome and Adult SHH Medulloblastoma" Developmental Cell, 2018 Mar 26;44(6):709-724.e6
【非特許文献３】Menke LA, et al., "Further delineation of an entity caused by CREBBP and EP300 mutations but not resembling Rubinstein-Taybi syndrome" American Journal of Medical Genetics Part A, 2018 Apr;176(4):862-876
【非特許文献４】Eser M, et al., "A case with Rubinstein-Taybi syndrome: A novel frameshift mutation in the CREBBP gene" The Turkish Journal of Pediatrics, 2017;59(5):601-603
【非特許文献５】Rokunohe D, et al., "Rubinstein-Taybi syndrome with multiple pilomatricomas: The first case diagnosed by CREBBP mutation analysis" Journal of Dermatological Science, 2016 Sep;83(3):240-2
【非特許文献６】Menke LA, et al., "CREBBP mutations in individuals without Rubinstein-Taybi syndrome phenotype" American Journal of Medical Genetics Part A, 2016 Oct;170(10):2681-93
【非特許文献７】de Vries TI, et al., "Mosaic CREBBP mutation causes overlapping clinical features of Rubinstein-Taybi and Filippi syndromes" European Journal of Human Genetics, 2016 Aug;24(9):1363-6
【非特許文献８】Wincent J, et al., "CREBBP and EP300 mutational spectrum and clinical presentations in a cohort of Swedish patients with Rubinstein-Taybi syndrome" Molecular Genetics & Genomic Medicine, 2015 Sep 22;4(1):39-45
【非特許文献９】Kamenarova K, et al., "Identification of a novel de novo mutation of CREBBP in a patient with Rubinstein-Taybi syndrome by targeted next-generation sequencing: a case report" Human Pathology, 2016 Jan;47(1):144-9
【非特許文献１０】Huh R, et al., "Letter to the Editor: A Novel Mutation in the CREBBP Gene of a Korean Girl with Rubinstein-Taybi syndrome" Annals of Clinical & Laboratory Science, 2015 Summer;45(4):458-61
【非特許文献１１】Rusconi D, et al., "Characterization of 14 novel deletions underlying Rubinstein-Taybi syndrome: an update of the CREBBP deletion repertoire" Human Genetics, 2015 Jun;134(6):613-26
【非特許文献１２】Yoo HJ, et al., "Whole exome sequencing for a patient with Rubinstein-Taybi syndrome reveals de novo variants besides an overt CREBBP mutation" International Journal of Molecular Sciences, 2015 Mar 11;16(3):5697-713
【非特許文献１３】Spena S, et al., "Insights into genotype-phenotype correlations from CREBBP point mutation screening in a cohort of 46 Rubinstein-Taybi syndrome patients" Clinical Genetics, 2015 Nov;88(5):431-40
【非特許文献１４】Kim SR, et al., "Cryptic microdeletion of the CREBBP gene from t(1;16) (p36.2;p13.3) as a novel genetic defect causing Rubinstein-Taybi syndrome" Annals of Clinical & Laboratory Science, 2013 Fall;43(4):450-6
【非特許文献１５】Marzuillo P, et al., "Novel cAMP binding protein-BP (CREBBP) mutation in a girl with Rubinstein-Taybi syndrome, GH deficiency, Arnold Chiari malformation and pituitary hypoplasia" BMC Medical Genetics, 2013 Feb 23;14:28
【非特許文献１６】Lai AH, et al., "A submicroscopic deletion involving part of the CREBBP gene detected by array-CGH in a patient with Rubinstein-Taybi syndrome" Gene, 2012 May 10;499(1):182-5
【非特許文献１７】Caglayan AO, et al., "A boy with classical Rubinstein-Taybi syndrome but no detectable mutation in the CREBBP and EP300 genes" Genetic counseling, 2011;22(4):341-6
【非特許文献１８】Li C, Szybowska M. "A novel mutation c.4003 G>C in the CREBBP gene in an adult female with Rubinstein-Taybi syndrome presenting with subtle dysmorphic features" American Journal of Medical Genetics Part A, 2010 Nov;152A(11):2939-41
【非特許文献１９】Oike Y, et al., "Mice homozygous for a truncated form of CREB-binding protein exhibit defects in hematopoiesis and vasculo-angiogenesis" Blood, 1999 May 1;93(9):2771-9
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本開示の目的は、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子に変異を導入された遺伝子改変動物に関する。本開示のさらなる目的は、当該変異の有無を指標とする疾患の判定に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、飼育中に自然発生した体格の小さいマウスがルビンシュタイン・テイビ症候群および睡眠相前進症候群の症状を示し、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子に特定の一塩基欠損を有することを見出した。さらに、マウスのゲノムにこの一塩基欠損を導入すると、同様の症状を示した。【０００７】
従って、ある態様では、本願は、少なくとも１つのＣＲＥＢＢＰ遺伝子座に変異が導入されている非ヒト遺伝子改変動物であって、当該変異により、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子が、配列番号５のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる変異型ＣＲＥＢＢＰをコードしている、遺伝子改変動物を提供する。【０００８】
また別の態様では、本願は、非ヒト動物の少なくとも１つのＣＲＥＢＢＰ遺伝子座に変異を導入することを含む、上記遺伝子改変動物の製造方法を提供する。【０００９】
また別の態様では、本願は、上記遺伝子改変動物の、ルビンシュタイン・テイビ症候群のモデルまたは睡眠相前進症候群のモデルとしての使用を提供する。【００１０】
また別の態様では、本願は、配列番号５のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドまたはそれをコードするポリヌクレオチドを提供する。【００１１】
また別の態様では、本願は、ルビンシュタイン・テイビ症候群の判定方法であって、
（１）対象に由来する核酸試料において、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子のヌクレオチド配列を決定すること、
（２）該ヌクレオチド配列がコードするペプチドのアミノ酸配列を決定すること、
（３）該アミノ酸配列が、配列番号５または６のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列である場合に、対象がルビンシュタイン・テイビ症候群に罹患しているか、または、将来的に罹患すると判定すること、
を含む方法を提供する。【００１２】
また別の態様では、本願は、ルビンシュタイン・テイビ症候群の判定方法であって、
（１）対象に由来する核酸試料において、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子が配列番号１の第１１２３位に相当するヌクレオチドまたは配列番号３の第１１２６位に相当するヌクレオチドを欠損しているか否かを決定すること、
（２）ＣＲＥＢＢＰ遺伝子が該ヌクレオチドを欠損している場合に、対象がルビンシュタイン・テイビ症候群に罹患しているか、または、将来的に罹患すると判定すること、
を含む方法を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本開示の変異を有する遺伝子改変動物は、ルビンシュタイン・テイビ症候群または睡眠相前進症候群のモデルとして有用である。また、当該変異の有無を指標として、ルビンシュタイン・テイビ症候群または睡眠相前進症候群を判定し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】代表的な矮小マウスの外貌を示す。
【図２】正常マウスおよび矮小マウスの体長、体重およびＢＭＩを示す。
【図３】正常マウスおよび矮小マウスの鼻背長および両眼間隔を示す。
【図４】正常マウスおよび矮小マウスの血圧および体温を示す。
【図５】正常マウスおよび矮小マウスの体重の推移を示す。
【図６】正常マウスおよび矮小マウスの通常時の摂餌量および体重当たりの摂餌量を示す。
【図７】正常マウスおよび矮小マウスの絶食後の体重および摂餌量を示す。
【図８】正常マウスおよび矮小マウスの血中の成長ホルモンおよびインスリン様成長因子−Ｉの濃度を示す。
【図９】正常マウスおよび矮小マウスのグルコース寛容試験に伴う血糖値の推移を示す。
【図１０】正常マウスおよび矮小マウスのグルコース寛容試験に伴う血糖値およびインスリン値の推移を示す。
【図１１】正常マウスおよび矮小マウスの明暗条件下および恒常暗条件下での行動リズムを示すアクトグラムである。
【図１２】正常マウスおよび矮小マウスのフットプリント試験の結果を示す。
【図１３】正常マウスおよび矮小マウスの握力を示す。
【図１４】高架式十字迷路による不安傾向の測定方法の模式図である。マウスを高架式十字迷路の中央に置き、１０分間の行動軌跡を測定した。
【図１５】正常マウスおよび矮小マウスの高架式十字迷路による不安傾向の測定結果を示す。
【図１６】野生型マウスＣＲＥＢＢＰ遺伝子のヌクレオチド配列を示す。変異型マウスＣＲＥＢＢＰ遺伝子において欠損している第１１２３位のグアニンヌクレオチドを四角で囲んで示す。
【図１７】野生型マウスＣＲＥＢＢＰ遺伝子のヌクレオチド配列（続き）を示す。
【図１８】野生型マウスＣＲＥＢＢＰのアミノ酸配列を示す。
【図１９】野生型ヒトＣＲＥＢＢＰ遺伝子のヌクレオチド配列を示す。変異型マウスＣＲＥＢＢＰ遺伝子において欠損している第１１２３位のグアニンヌクレオチドに相当する第１１２６位のグアニンヌクレオチドを四角で囲んで示す。
【図２０】野生型ヒトＣＲＥＢＢＰ遺伝子のヌクレオチド配列（続き）を示す。
【図２１】野生型ヒトＣＲＥＢＢＰのアミノ酸配列を示す。
【図２２】変異型マウスＣＲＥＢＢＰおよび変異型ヒトＣＲＥＢＢＰのアミノ酸配列を示す。ストップコドンの位置をアスタリスクで示す。
【図２３】野生型マウスＣＲＥＢＢＰおよび変異型マウスＣＲＥＢＢＰのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列のアラインメントの一部を示す。一塩基欠損によりフレームシフトしたアミノ酸配列を四角で囲んで示す。
【図２４】野生型ヒトＣＲＥＢＢＰおよび変異型ヒトＣＲＥＢＢＰのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列のアラインメントの一部を示す。一塩基欠損によりフレームシフトしたアミノ酸配列を四角で囲んで示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書では、数値が「約」の用語を伴う場合、その値の±１０％の範囲を含むことを意図する。例えば、「約２０」は、「１８〜２２」を含むものとする。数値の範囲は、両端点の間の全ての数値および両端点の数値を含む。範囲に関する「約」は、その範囲の両端点に適用される。従って、例えば、「約２０〜３０」は、「１８〜３３」を含むものとする。
【００１６】
特に具体的な定めのない限り、本明細書で使用される用語は、有機化学、医学、薬学、分子生物学、微生物学等の分野における当業者に一般に理解されるとおりの意味を有する。以下にいくつかの本明細書で使用される用語についての定義を記載するが、これらの定義は、本明細書において、一般的な理解に優先する。
【００１７】
ＣＲＥＢＢＰはほぼ全ての細胞に存在しており、ＤＮＡに直接結合することなくタンパク質同士の相互作用を通じて転写を活性化する転写共役因子としての機能を果たしている。ＣＲＥＢＢＰは、ＫＩＸドメインを通じてリン酸化ＣＲＥＢと結合して活性化される。活性化されたＣＲＥＢＢＰは転写複合体の基本因子であるＴＦＩＩＢを介してＲＮＡポリメラーゼに作用し、転写を促進する。ＣＲＥＢＢＰはリン酸化ＣＲＥＢだけではなく、核内ホルモン受容体、Ｍｙｂ、Ｆｏｓ、Ｊｕｎ、ＳＴＳＴ １αなどの多くの転写因子に共通する転写共役因子として機能する。また、ＣＲＥＢＢＰはＨＡＴ活性を有し、ヒストンのアセチル化とそれに伴うクロマチン構造の制御を担い、転写を活性化させる。
【００１８】
本開示において、「ＣＲＥＢＢＰ」および「ＣＲＥＢＢＰ遺伝子」は、いかなる種のものであってもよく、典型的には哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒト等）、特にマウスなどの齧歯類、およびヒトなどの霊長類のＣＲＥＢＢＰまたはＣＲＥＢＢＰ遺伝子である。マウスの野生型ＣＲＥＢＢＰ遺伝子の代表的なヌクレオチド配列を、配列番号１に示す。これは、２４４１個のアミノ酸配列からなる配列番号２のアミノ酸配列を有する野生型ＣＲＥＢＢＰをコードする。マウスのＣＲＥＢＢＰ遺伝子座は１６ｑＡ１である。ヒトの野生型ＣＲＥＢＢＰ遺伝子の代表的なヌクレオチド配列を、配列番号３に示す。これは、２４４２個のアミノ酸配列からなる配列番号４のアミノ酸配列を有する野生型ＣＲＥＢＢＰをコードする。ヒトのＣＲＥＢＢＰ遺伝子座は１６ｐ１３．３である。
【００１９】
ＣＲＥＢＢＰ遺伝子には、配列番号１または３のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する遺伝子も含まれる。「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」に関して、ここで使用されるハイブリダイゼーションは、例えば、Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983) 等に記載される通常の方法に準じて行うことができる。また「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、６×ＳＳＣ（１.５Ｍ ＮａＣｌ、０.１５Ｍ クエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０×ＳＳＣとする）、５０％ホルムアミドを含む溶液中で４５℃にてハイブリッドを形成させた後、２×ＳＳＣで５０℃にて洗浄するような条件（Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6）、および、それと同等のストリンジェンシーをもたらす条件を挙げることができる。さらに、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子には、配列番号１または３で表されるヌクレオチド配列と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する遺伝子が含まれる。
【００２０】
本開示において、変異型ＣＲＥＢＢＰは、３８６個のアミノ酸からなる配列番号５のアミノ酸配列または３８７個のアミノ酸からなる配列番号６のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する。配列番号５の変異型ＣＲＥＢＢＰは、配列番号２のマウス野生型ＣＲＥＢＢＰの第１位〜第３７４位のアミノ酸と、さらに１２個のアミノ酸からなるタンパク質である。配列番号６の変異型ＣＲＥＢＢＰは、配列番号４のヒト野生型ＣＲＥＢＢＰの第１位〜第３７５位のアミノ酸と、さらに１２個のアミノ酸からなるタンパク質である。ある実施態様では、変異型ＣＲＥＢＢＰは、配列番号５または６のアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる。ある実施態様では、変異型ＣＲＥＢＢＰは、配列番号５または６のアミノ酸配列を含む。ある実施態様では、変異型ＣＲＥＢＢＰは、配列番号５または６のアミノ酸配列からなる。これらのアミノ酸配列を有する変異型ＣＲＥＢＢＰは、ＣＲＥＢＢＰの転写活性化機能を実質的に喪失している。
【００２１】
変異型ＣＲＥＢＢＰは、変異型ＣＲＥＢＢＰ遺伝子にコードされる。変異型ＣＲＥＢＢＰ遺伝子は、変異型ＣＲＥＢＢＰをコードする遺伝子であれば、どのような変異を有するＣＲＥＢＢＰ遺伝子であってもよい。ある実施態様では、変異型ＣＲＥＢＢＰ遺伝子は、配列番号１で示されるマウス野生型ＣＲＥＢＢＰ遺伝子のヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有し、配列番号１の第１１２３位に相当するヌクレオチドが欠損しているヌクレオチド配列を含む。ある実施態様では、変異型ＣＲＥＢＢＰ遺伝子は、配列番号１のヌクレオチド配列において、第１１２３位のヌクレオチドが欠損しているヌクレオチド配列（配列番号７）を含む。ある実施態様では、変異型ＣＲＥＢＢＰ遺伝子は、配列番号７のヌクレオチド配列からなる。ある実施態様では、変異型ＣＲＥＢＢＰ遺伝子は、配列番号３で示されるヒト野生型ＣＲＥＢＢＰ遺伝子のヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有し、配列番号３の第１１２６位に相当するヌクレオチドが欠損しているヌクレオチド配列を含む。ある実施態様では、変異型ＣＲＥＢＢＰ遺伝子は、配列番号３のヌクレオチド配列において、第１１２６位のヌクレオチドが欠損している配列（配列番号８）を含む。ある実施態様では、変異型ＣＲＥＢＢＰ遺伝子は、配列番号８のヌクレオチド配列からなる。
【００２２】
「配列番号１の第１１２３位に相当するヌクレオチド」とは、あるＣＲＥＢＢＰ遺伝子のヌクレオチド配列と配列番号１のヌクレオチド配列を最適な状態（ヌクレオチドの一致が最大となる状態）にアラインメントしたときに、配列番号１の第１１２３位のグアニンヌクレオチドと一致する、当該変異型ＣＲＥＢＢＰ遺伝子におけるヌクレオチドを意味する。「配列番号３の第１１２６位に相当するヌクレオチド」も同様に定義される。
【００２３】
本開示において、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列の同一性とは、タンパク質またはオリゴヌクレオチド間の配列の類似の程度を意味し、比較対象の配列の領域にわたって最適な状態（アミノ酸またはヌクレオチドの一致が最大となる状態）にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。配列同一性の数値（％）は両方の配列に存在する同一のアミノ酸またはヌクレオチドを決定して、適合部位の数を決定し、次いでこの適合部位の数を比較対象の配列領域内のアミノ酸またはヌクレオチドの総数で割り、得られた数値に１００をかけることにより算出される。最適なアラインメントおよび配列同一性を得るためのアルゴリズムとしては、当業者が通常利用可能な種々のアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズム、ＦＡＳＴＡアルゴリズムなど）が挙げられる。配列同一性は、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどの配列解析ソフトウェアを用いて決定され得る。
【００２４】
＜遺伝子改変動物＞
本開示において、遺伝子改変動物はヒトを除くいかなる種のものであってもよく、典型的には哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル等）であり得る。ある実施態様では、遺伝子改変動物は齧歯類、特にマウスである。
【００２５】
遺伝子改変動物は、標的遺伝子を改変するための公知の遺伝子改変技術を用いて、非ヒト動物の少なくとも１つのＣＲＥＢＢＰ遺伝子座に変異を導入することにより、製造できる。用いられる公知の遺伝子改変技術としては、ＣＲＩＳＰＲシステム、Transcription Activator-Like Effector Nucleases（ＴＡＬＥＮ）を用いた方法、ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いた方法、相同組換え方法等が挙げられる。中でも、選択的かつ部位特異的に遺伝子を改変できることから、ＣＲＩＳＰＲシステムを利用し得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の詳細は、例えば、Wang, H. et al., Cell, 153, 910-918 (2013) および米国特許第８６９７３５９号に記載されており、これらの文献を引用により本明細書の一部とする。
【００２６】
ＣＲＩＳＰＲシステムを利用して遺伝子改変動物を製造する場合、まず、非ヒト動物由来の受精卵に、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を導入する。導入には、公知の方法、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法等を用いることができる。
【００２７】
野生型Ｃａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣおよびＨＮＨの２つの機能的ヌクレアーゼドメインを有し、これらは各々、ＤＮＡの二本鎖の異なる鎖を切断する。本開示において、「Ｃａｓ９タンパク質」は、ｇＲＮＡ依存的にＤＮＡに結合する能力を有するタンパク質を意味し、ＲｕｖＣおよびＨＮＨヌクレアーゼ活性の両方を有するものも、ＲｕｖＣおよびＨＮＨヌクレアーゼ活性のいずれかまたは両方を有さないものも含まれる。Ｃａｓ９タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ系を有する細菌に由来し得る。ＣＲＩＳＰＲ系を有することが知られている細菌として、例えば、スタフィロコッカス・ピオゲニス、ナイセリア・メニンギティディス（Neisseria meningitidis）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）、トレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）などが挙げられる。Ｃａｓ９タンパク質の代わりに、Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸または当該核酸を含むベクターを使用してもよい。Ｃａｓ９タンパク質、Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸、当該核酸を含むベクターは、特に限定されず、当分野で公知のものを使用できる。
【００２８】
本開示において、「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」は、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡが融合した人工１本鎖ＲＮＡを意味する。ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの間にリンカー配列が存在してもよい。Ｃａｓ９タンパク質はｇＲＮＡの存在下で標的特異的にゲノムＤＮＡに結合できる。ｇＲＮＡの代わりに、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを、分離したＲＮＡ分子の組合せとして使用してもよい。
【００２９】
ｃｒＲＮＡは、細菌の内在性ＲＮＡに由来し、ｇＲＮＡの配列特異性を担う。本開示において、ｃｒＲＮＡは、ゲノムＤＮＡ内の標的配列を含む。標的配列としては、ゲノムＤＮＡ内で、その直後にＰＡＭ配列を有するヌクレオチド配列を選択する。標的配列は、ゲノムＤＮＡのいずれの鎖にあってもよい。標的配列の選択および／またはｇＲＮＡの設計に利用できる数々のツール、および、バイオインフォマティックスにより予想された様々な種の様々な遺伝子についての標的配列のリストを利用することができ、例えば、引用により本明細書の一部とするFeng Zhang lab's Target Finder、Michael Boutros lab's Target Finder (E-CRISP)、RGEN Tools: Cas-OFFinder、CasFinder: Flexible algorithm for identifying specific Cas9 targets in genomes、CRISPR Optimal Target Finder などが挙げられる。ある実施態様では、標的配列は配列番号９のヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列である。ある実施態様では、標的配列は配列番号９のヌクレオチド配列において、１個〜３個のヌクレオチドが付加、欠損および／または置換したヌクレオチド配列である。ある実施態様では、標的配列は配列番号９のヌクレオチド配列である。
【００３０】
Ｃａｓ９タンパク質は、標的配列の直後にＰＡＭ配列を有するいかなるＤＮＡ配列にも結合できる。ＰＡＭ配列は、ゲノムＤＮＡ内の標的配列の直後に存在するが、ｇＲＮＡ内の標的配列の直後には存在しない。ＰＡＭ配列は、Ｃａｓ９タンパク質が由来する細菌の種により異なる。最も広く使用されているＣａｓ９タンパク質はスタフィロコッカス・ピオゲニスに由来し、対応するＰＡＭ配列は、標的配列の３’末端の直後に位置するＮＧＧの配列である。様々な細菌の種とＰＡＭ配列の組合せが知られており、例えば、ナイセリア・メニンギティディス：ＮＮＮＮＧＡＴＴ、ストレプトコッカス・サーモフィラス：ＮＮＡＧＡＡ、トレポネーマ・デンティコラ：ＮＡＡＡＡＣなどが挙げられる。これらの配列において、Ｎは、Ａ、Ｔ、ＧおよびＣのいずれかの塩基を示す。
【００３１】
ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの一部と相補的に結合し、ヘアピン構造を形成する。この構造がＣａｓ９に認識され、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびＣａｓ９の複合体が形成される。従って、ｔｒａｃｒＲＮＡはｇＲＮＡのＣａｓ９タンパク質結合能力を担う。ｔｒａｃｒＲＮＡは、細菌の内在性ＲＮＡに由来し、細菌の種によって異なる配列を有する。本開示において、ｔｒａｃｒＲＮＡは、上記のＣＲＩＳＰＲ系を有することが知られている細菌のものであり得、好ましくは、ゲノム編集に使用するｔｒａｃｒＲＮＡとＣａｓ９タンパク質は、同じ細菌の種に由来する。
【００３２】
所望のｇＲＮＡ配列をコードするＤＮＡをインビトロ転写用ベクターにクローニングし、インビトロで転写することにより、ｇＲＮＡを得ることができる。適するインビトロ転写用ベクターは、当業者に公知である。また、ｇＲＮＡの標的配列以外の配列を含むインビトロ転写用ベクターが当分野で公知である。標的配列のオリゴヌクレオチドを合成し、そのようなベクターに挿入し、インビトロ転写することにより、ｇＲＮＡを得ることができる。インビトロ転写の方法は、当業者に公知である。
【００３３】
ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９タンパク質複合体は、ｇＲＮＡ配列とゲノムＤＮＡ内の標的配列との相補的結合により、標的配列にリクルートされる。ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９タンパク質複合体の標的配列への結合は、Ｃａｓ９タンパク質をゲノム内の標的配列に局在化させ、Ｃａｓ９タンパク質はＤＮＡの両方の鎖を切断し、二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こす。ＤＳＢは、ＮＨＥＪ（非相同末端結合（Non-Homologous End Joining））ＤＮＡ修復経路、または、ＨＤＲ（相同組換え修復）経路により修復され得る。ＮＨＥＪ修復経路は、ＤＳＢの部位にしばしば塩基の挿入／欠損を与え、それはフレームシフトおよび／または停止コドンをもたらし、標的遺伝子のオープンリーディングフレームを破壊し得る。ＨＤＲ経路は、ＤＳＢを修復するために、修復鋳型の存在を必要とする。ＨＤＲでは、修復鋳型の配列が、切断された標的配列に忠実に複写される。修復鋳型とＨＤＲを利用して、標的遺伝子に所望の変異を導入できる。
【００３４】
ＨＤＲによりゲノムＤＮＡ配列内のヌクレオチドを改変するためには、ＨＤＲの際に、所望の配列を含むＤＮＡ修復鋳型が存在しなければならない。ある実施態様では、ＤＮＡ修復鋳型として、ｓｓＯＤＮ（一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド）を用いることができる。ｓｓＯＤＮは、ＤＳＢの上流および下流の配列に高い相同性を有する。各相同性領域の長さと位置は導入しようとする改変のサイズに依存する。適する鋳型の存在下で、ＨＤＲは、Ｃａｓ９タンパク質によるＤＳＢの部位で、特定のヌクレオチドを改変できる。ｓｓＯＤＮを設計する際には、修復された遺伝子がＣａｓ９タンパク質により切断されないように、ｓｓＯＤＮが、直後にＰＡＭ配列を有する標的配列を含まないように設計する。例えば、ＰＡＭ配列に対応する配列をｓｓＯＤＮ中では別の配列にすることにより、ｓｓＯＤＮがＣａｓ９タンパク質により切断されないようにできる。ｓｓＯＤＮの設計方法の詳細は、例えば、引用により本明細書の一部とするYang, H. et al., Cell, 154(6), 1370-9 (2013) に記載されている。ｓｓＯＤＮは、通常、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質と共に細胞に導入される。
【００３５】
Ｃａｓ９タンパク質およびｇＲＮＡを導入した受精卵を対応する非ヒト動物の子宮または卵管へ移植し、発生させることで、遺伝子改変動物を得ることができる。遺伝子改変動物が得られたことは、当分野で知られている様々な方法により確認できる。例えば、表現型を観察することにより、あるいは、標的配列を含むゲノムＤＮＡの配列を解読することにより確認できる。ＨＤＲの場合は、ｓｓＯＤＮに制限酵素切断部位を組み込むことにより、ＲＦＬＰ（制限断片長多型）で評価することも可能である。これらの方法は、当分野で周知である。
【００３６】
遺伝子改変動物には、ヘテロ型（即ち、ゲノム上の一方のアリルが改変されている）およびホモ型（即ち、ゲノム上の両方のアリルが改変されている）の遺伝子改変動物が含まれる。ヘテロ型遺伝子改変動物が好ましい。ヘテロ型遺伝子改変動物同士を交配させることによりホモ型遺伝子改変動物を作製してもよい。
【００３７】
下記実施例に示す通り、本開示の遺伝子改変動物は、少なくとも１つのルビンシュタイン・テイビ症候群の症状を示す。ルビンシュタイン・テイビ症候群の症状として、例えば、精神発達遅滞、小さい体格、低体重、低身長、眼間開離、短い鼻背、停留睾丸、小陰茎、低血圧または低体温が挙げられる。従って、本開示の遺伝子改変動物を、ルビンシュタイン・テイビ症候群のモデル動物として使用できる。また、本開示の遺伝子改変動物では、サーカディアンリズムが前進傾向にある。よって、本開示の遺伝子改変動物を、睡眠相前進症候群を伴うルビンシュタイン・テイビ症候群のモデル動物、または、睡眠相前進症候群のモデル動物としても使用できる。モデル動物は、疾患の原因の解明や、予防方法および治療方法の開発などに有用である。
【００３８】
＜医薬のスクリーニング方法＞
例えば、本開示の遺伝子改変動物をルビンシュタイン・テイビ症候群または睡眠相前進症候群のモデル動物として使用して、当該疾患の処置用の医薬をスクリーニングすることができる。
【００３９】
従って、ある態様では、ルビンシュタイン・テイビ症候群の処置用の医薬をスクリーニングする方法であって、
（ａ）本明細書に開示される遺伝子改変動物に、少なくとも１種の候補物質を投与する工程、および、
（ｂ）候補物質を投与した遺伝子改変動物において、候補物質を投与していない遺伝子改変動物と比較して、ルビンシュタイン・テイビ症候群の症状が改善された場合に、候補物質をルビンシュタイン・テイビ症候群の処置用の医薬として選択する工程、
を含む方法が提供される。
【００４０】
別の態様では、睡眠相前進症候群の処置用の医薬をスクリーニングする方法であって、
（ａ）本明細書に開示される遺伝子改変動物に、少なくとも１種の候補物質を投与する工程、および、
（ｂ）候補物質を投与した遺伝子改変動物において、候補物質を投与していない遺伝子改変動物と比較して、睡眠相前進症候群の症状が改善された場合に、候補物質を睡眠相前進症候群の処置用の医薬として選択する工程、
を含む方法が提供される。
【００４１】
本明細書で使用されるとき、「処置」は、疾患の発症を防止すること、疾患を発症する可能性を低減すること、疾患の原因を軽減または除去すること、疾患の進行を遅延または停止させること、および／または、疾患の症状を軽減、緩和、改善または除去することを意味する。
【００４２】
「候補物質」には、タンパク質、アミノ酸、核酸、脂質、糖質、低分子化合物などの、あらゆる物質が包含される。候補物質は、典型的には、精製、単離されているものを使用できるが、未精製、未単離の粗精製品であってもよい。候補物質は、化合物ライブラリー、核酸ライブラリー、ランダムペプチドライブラリーなどの形態で提供されてもよく、また、天然物として提供されてもよい。候補物質の細胞への導入は、候補物質の種類に応じて、公知の方法により行うことができる。候補物質は１種類でもよく、２種類以上を組み合わせて投与してもよい。
【００４３】
候補物質の投与量および投与回数は、遺伝子改変動物の齢、性別、体重、症状、投与方法等を勘案して適宜調節される。候補物質の投与経路は、経口投与または非経口投与を含み、特に限定されない。例えば、非経口投与は、全身投与でも局所投与でもよく、より具体的には、例えば、気管内投与、髄腔内投与、くも膜下腔投与、頭蓋内投与、静脈内投与、動脈内投与、門脈内投与、皮内投与、皮下投与、経皮投与、筋肉内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、口腔内投与等が挙げられる。遺伝子改変動物は胎児であっても出生後の動物であってもよく、胎児である場合は、候補物質を胎児または母体に投与し得る。
【００４４】
ルビンシュタイン・テイビ症候群の処置用の医薬をスクリーニングする場合、ルビンシュタイン・テイビ症候群の症状が改善されたことは、小さい体格、低体重、低身長、広い眼間、短い鼻背、低血圧または低体温等の症状を観察することにより判定し得る。例えば、候補物質を投与していない遺伝子改変動物と比較して、症状に関する数値を、例えば、約１０％以上、好ましくは約２０％以上、より好ましくは約３０％以上、さらに好ましくは約５０％以上改善する候補物質を、医薬として選択し得る。
【００４５】
睡眠相前進症候群の処置用の医薬をスクリーニングする場合、睡眠相前進症候群の症状が改善されたことは、サーカディアンリズムを観察することにより判定し得る。例えば、候補物質を投与していない遺伝子改変動物と比較して、恒常暗条件下での行動周期を、例えば、約１０％以上、好ましくは約２０％以上、より好ましくは約３０％以上、さらに好ましくは約５０％以上改善する候補物質を、医薬として選択し得る。
【００４６】
＜判定マーカー＞
別の態様では、配列番号５または６のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドが提供され、これは、ルビンシュタイン・テイビ症候群または睡眠相前進症候群の判定マーカーとして使用し得る。別の態様では、配列番号５または６のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供され、これは、ルビンシュタイン・テイビ症候群または睡眠相前進症候群の判定マーカーとして使用し得る。
【００４７】
ＣＲＥＢＢＰ遺伝子に変異があり、当該変異により、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子が配列番号５または６のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドをコードすると、例えば、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子に配列番号１の第１１２３位に相当するヌクレオチドまたは配列番号３の第１１２６位に相当するヌクレオチドの欠損があると、ルビンシュタイン・テイビ症候群または睡眠相前進症候群の原因となり得る。従って、ＣＲＥＢＢＰまたはＣＲＥＢＢＰ遺伝子における当該変異の有無を決定することにより、ルビンシュタイン・テイビ症候群または睡眠相前進症候群を判定することができ、当該変異を含むペプチドまたはポリヌクレオチドは、ルビンシュタイン・テイビ症候群または睡眠相前進症候群を判定するためのマーカーとして有用である。ここで、ポリヌクレオチドには、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ類似体、ＲＮＡ類似体等が含まれる。
【００４８】
＜判定方法＞
別の態様では、上記の判定マーカーを使用するルビンシュタイン・テイビ症候群または睡眠相前進症候群の判定方法が提供される。対象から採取した試料において、上記の変異の有無を決定することにより、疾患の判定を行うことができる。本明細書で使用されるとき、疾患の判定とは、対象が疾患に罹患しているか否か、または、対象が疾患に罹患する可能性があるか否かを判定することを意味する。
【００４９】
対象はいかなる種であってもよく、典型的には哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル等）である。ある実施態様では、対象は齧歯類、特にマウスである。ある実施態様では、対象は霊長類、特にヒトである。対象は胎児を含む。
【００５０】
対象から試料を採取する方法は、通常の公知の方法が用いられる。対象の試料は、例えば、血液、髄液、唾液などの体液、または、口腔粘膜、頭髪などの組織であり得る。対象が胎児である場合は、羊水穿刺または絨毛採取により、対象に由来する試料を採取してもよい。
【００５１】
ペプチドを判定マーカーとして使用する場合、当該ペプチドを認識する抗体等の試薬を用いて、対象から採取した試料における上記の変異の有無を決定する。変異の検出方法は当業者に公知であり、特に限定されない。変異型ペプチドを特異的に認識する試薬を使用することが好ましい。野生型ペプチドも変異型ペプチドも認識する試薬を使用する場合、ペプチドの分子量の差異に基づいて変異を検出してもよい。
【００５２】
ポリヌクレオチドを判定マーカーとして使用する場合、対象の試料から核酸を単離してもよい。核酸を単離する方法は当業者に公知であり、特に限定されない。例えば、市販のＤＮＡまたはＲＮＡを採取するためのキットを使用し得る。ここで、核酸とは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり、ＤＮＡまたはＲＮＡを鋳型にＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法などにより目的の領域、例えば、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子の全長または一部を増幅した断片も含まれる。
【００５３】
次に、核酸における上記の変異の有無を決定する。変異の検出方法は当業者に公知であり、特に限定されない。典型的には、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子のヌクレオチド配列を決定し、該ヌクレオチド配列がコードするペプチドのアミノ酸配列を決定し、配列番号５または６のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するか否かを判定する。
【００５４】
あるいは、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子が配列番号１の第１１２３位に相当するヌクレオチドまたは配列番号３の第１１２６位に相当するヌクレオチドを欠損しているか否かを検出してもよい。その方法として、ＰＣＲ法、アレル特異的ＰＣＲ法、ＰＣＲ−ＳＳＰ法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ダイレクトシーケンス法、ＡＳＯハイブリダイゼーション法、ＤＧＧＥ法、ＲＮａｓｅＡ切断法、化学切断法、ＤＯＬ法、インベーダー法、ＴａｑＭａｎ（登録商標）−ＰＣＲ法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法、ＴＤＩ法、モレキュラー・ビーコン法、ダイナミック・アレルスペシフィック・ハイブリダイゼーション法、パドロック・プローブ法などが挙げられる。
【００５５】
対象から採取した試料に上述の変異が有る場合に、対象がルビンシュタイン・テイビ症候群または睡眠相前進症候群に罹患しているか、または、将来的に罹患すると判定する。あるいは、対象から採取した試料に上述の変異が有る場合に、対象がルビンシュタイン・テイビ症候群または睡眠相前進症候群に罹患している可能性、または、将来的に罹患する可能性が高いと判定する。
【００５６】
＜判定用キット＞
別の態様では、ルビンシュタイン・テイビ症候群または睡眠相前進症候群を判定するためのキットが提供される。キットは、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子に、配列番号５または６のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドをもたらす変異、例えば、配列番号１の第１１２３位に相当するヌクレオチドまたは配列番号３の第１１２６位に相当するヌクレオチドの欠損があるか否かを決定するための手段を含む。
【００５７】
上記の変異の有無を決定するための手段は、特に限定されず、例えば、上記の判定方法において変異の検出に使用する手段、例えば、当該変異が含まれる領域を増幅できるプライマーまたは当該変異が含まれる領域に結合できるプローブであり得る。ある実施態様では、上記の変異の有無を決定するための手段はアレル特異的ＰＣＲ用のプライマーであり、例えば、対象がマウスである場合、配列番号１３および１４のヌクレオチド配列を有するプライマーを使用できる。また、キットは、必要に応じて他の成分を含んでもよい。他の成分は、例えば、試料を採取するための道具（例えば、注射器等）、ポジティブコントロール試料およびネガティブコントロール試料などが挙げられるが、これらに限定されない。上述の方法を行うための手順を記載した書面等を含んでもよい。
【００５８】
本願は、例えば、下記の実施態様を提供する。
［１］少なくとも１つのＣＲＥＢＢＰ遺伝子座に変異が導入されている非ヒト遺伝子改変動物であって、当該変異により、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子が、配列番号５のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる変異型ＣＲＥＢＢＰをコードしている、遺伝子改変動物。
［２］変異型ＣＲＥＢＢＰが配列番号５のアミノ酸配列を含む、第１項に記載の遺伝子改変動物。
［３］変異型ＣＲＥＢＢＰが配列番号５のアミノ酸配列からなる、第１項または第２項に記載の遺伝子改変動物。
［４］変異型ＣＲＥＢＢＰが転写活性化機能を実質的に喪失している、第１項〜第３項のいずれかに記載の遺伝子改変動物。
［５］ＣＲＥＢＢＰ遺伝子が、配列番号１のヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有し、配列番号１の第１１２３位に相当するヌクレオチドが欠損しているヌクレオチド配列を含む、第１項〜第４項のいずれかに記載の遺伝子改変動物。
［６］ＣＲＥＢＢＰ遺伝子が配列番号７のヌクレオチド配列を含む、第１項〜第５項のいずれかに記載の遺伝子改変動物。
［７］ＣＲＥＢＢＰ遺伝子が配列番号７のヌクレオチド配列からなる、第１項〜第６項のいずれかに記載の遺伝子改変動物。
［８］齧歯類である、第１項〜第７項のいずれかに記載の遺伝子改変動物。
［９］マウスである、第１項〜第８項のいずれかに記載の遺伝子改変動物。
［１０］ルビンシュタイン・テイビ症候群のモデルである、第１項〜第９項のいずれかに記載の遺伝子改変動物。
［１１］ルビンシュタイン・テイビ症候群が睡眠相前進症候群を伴うものである、第１０項に記載の遺伝子改変動物。
［１２］睡眠相前進症候群のモデルである、第１項〜第９項のいずれかに記載の遺伝子改変動物。
【００５９】
［１３］非ヒト動物の少なくとも１つのＣＲＥＢＢＰ遺伝子座に変異を導入することを含む、第１項〜第１２項のいずれかに記載の遺伝子改変動物の製造方法。
［１４］ゲノム編集により変異が導入される、第１３項に記載の製造方法。
［１５］ゲノム編集の標的配列が配列番号９のヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列である、第１４項に記載の製造方法。
［１６］ゲノム編集の標的配列が、配列番号９のヌクレオチド配列において、１個〜３個のヌクレオチドが付加、欠損および／または置換したヌクレオチド配列である、第１４項に記載の製造方法。
［１７］標的配列が配列番号９のヌクレオチド配列である、第１５項または第１６項に記載の製造方法。
［１８］所望の変異をもたらすｓｓＯＤＮをさらに使用する、第１４項〜第１７項のいずれかに記載の製造方法。
［１９］第１３項〜第１８項のいずれかに記載の製造方法により製造される、遺伝子改変動物。
［２０］第１項〜第１２項および第１９項のいずれかに記載の遺伝子改変動物の、ルビンシュタイン・テイビ症候群のモデルとしての使用。
［２１］ルビンシュタイン・テイビ症候群が睡眠相前進症候群を伴うものである、第２０項に記載の使用。
［２２］第１項〜第１２項および第１９項のいずれかに記載の遺伝子改変動物の、睡眠相前進症候群のモデルとしての使用。
【００６０】
［２３］配列番号５または６のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド。
［２４］配列番号５または６のアミノ酸配列を含む、第２３項に記載のペプチド。
［２５］配列番号５または６のアミノ酸配列からなる、第２３項または第２４項に記載のペプチド。
［２６］第２３項〜第２５項のいずれかに記載のペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
［２７］配列番号１のヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有し、配列番号１の第１１２３位に相当するヌクレオチドが欠損しているヌクレオチド配列、または、
配列番号３のヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有し、配列番号３の第１１２６位に相当するヌクレオチドが欠損しているヌクレオチド配列、
を含む、第２６項に記載のポリヌクレオチド。
［２８］配列番号７または８のヌクレオチド配列を含む、第２６項または第２７項に記載のポリヌクレオチド。
［２９］配列番号７または８のヌクレオチド配列からなる、第２６項〜第２８項のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【００６１】
［３０］第２３項〜第２５項のいずれかに記載のペプチドの、ルビンシュタイン・テイビ症候群の判定マーカーとしての使用。
［３１］第２６項〜第２９項のいずれかに記載のポリヌクレオチドの、ルビンシュタイン・テイビ症候群の判定マーカーとしての使用。
［３２］ルビンシュタイン・テイビ症候群の判定方法であって、
（１）対象に由来する試料を、第３０項または第３１項に記載の判定マーカーを含むか否かについて試験すること、および、
（２）試料が判定マーカーを含むと判定された場合に、対象がルビンシュタイン・テイビ症候群に罹患しているか、または、将来的に罹患すると判定すること、
を含む方法。
［３３］第２３項〜第２５項のいずれかに記載のペプチドの、睡眠相前進症候群の判定マーカーとしての使用。
［３４］第２６項〜第２９項のいずれかに記載のポリヌクレオチドの、睡眠相前進症候群の判定マーカーとしての使用。
［３５］睡眠相前進症候群の判定方法であって、
（１）対象に由来する試料を、第３３項または第３４項に記載の判定マーカーを含むか否かについて試験すること、および、
（２）試料が判定マーカーを含むと判定された場合に、対象が睡眠相前進症候群に罹患しているか、または、将来的に罹患すると判定すること、
を含む方法。
【００６２】
［３６］ルビンシュタイン・テイビ症候群の判定方法であって、
（１）対象に由来する核酸試料において、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子のヌクレオチド配列を決定すること、
（２）該ヌクレオチド配列がコードするペプチドのアミノ酸配列を決定すること、
（３）該アミノ酸配列が、配列番号５または６のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列である場合に、対象がルビンシュタイン・テイビ症候群に罹患しているか、または、将来的に罹患すると判定すること、
を含む方法。
［３７］ルビンシュタイン・テイビ症候群の判定方法であって、
（１）対象に由来する核酸試料において、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子が配列番号１の第１１２３位に相当するヌクレオチドまたは配列番号３の第１１２６位に相当するヌクレオチドを欠損しているか否かを決定すること、
（２）ＣＲＥＢＢＰ遺伝子が該ヌクレオチドを欠損している場合に、対象がルビンシュタイン・テイビ症候群に罹患しているか、または、将来的に罹患すると判定すること、
を含む方法。
【００６３】
［３８］睡眠相前進症候群の判定方法であって、
（１）対象に由来する核酸試料において、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子のヌクレオチド配列を決定すること、
（２）該ヌクレオチド配列がコードするペプチドのアミノ酸配列を決定すること、
（３）該アミノ酸配列が、配列番号５または６のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列である場合に、対象が睡眠相前進症候群に罹患しているか、または、将来的に罹患すると判定すること、
を含む方法。
［３９］睡眠相前進症候群の判定方法であって、
（１）対象に由来する核酸試料において、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子が配列番号１の第１１２３位に相当するヌクレオチドまたは配列番号３の第１１２６位に相当するヌクレオチドを欠損しているか否かを決定すること、
（２）ＣＲＥＢＢＰ遺伝子が該ヌクレオチドを欠損している場合に、対象が睡眠相前進症候群に罹患しているか、または、将来的に罹患すると判定すること、
を含む方法。
［４０］対象が胎児である、第３２項および第３５項〜第３９項のいずれかに記載の方法。
【００６４】
［４１］ルビンシュタイン・テイビ症候群を判定するためのキットであって、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子に、配列番号５または６のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドをもたらす変異があるか否かを決定するための手段を含む、キット。
［４２］睡眠相前進症候群を判定するためのキットであって、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子に、配列番号５または６のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドをもたらす変異があるか否かを決定するための手段を含む、キット。
［４３］変異があるか否かを決定するための手段が、アレル特異的ＰＣＲ用のプライマーである、第４１項または第４２項に記載のキット。
［４４］プライマーが配列番号１３および配列番号１４のヌクレオチド配列からなる、第４３項に記載のキット。
【００６５】
本明細書で引用するすべての文献は、出典明示により本明細書の一部とする。
上記の説明は、すべて非限定的なものであり、添付の特許請求の範囲において定義される本開示の範囲から逸脱せずに、変更することができる。さらに、下記の実施例は、すべて非限定的な実施例であり、本開示を説明するためだけに供されるものである。
【実施例】
【００６６】
試験１：自然発生した矮小マウスの解析
（１）矮小マウスの出現と維持
Sato T, Kurokawa M, Nakashima Y, Ida T, Takahashi T, Fukue Y, Ikawa M, Okabe M, Kangawa K, Kojima M. Regul Pept. 2008 Jan 10;145(1-3):7-11に記載されるグレリン遺伝子欠損（ghrl+/-）マウスの系統を維持して飼育している間に、小さい体格、特異的顔貌、低姿勢での歩行などの外見的な特徴を有するマウス（以下、矮小マウスと称する）が自然に出現した。矮小マウス（雄）とＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雌）を交配し、第一世代を得た。矮小マウス（雄）とＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雌）を９世代にわたり交配し、矮小マウス（雌）とＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雄）を１世代交配することにより、バッククロス（１０世代）を実行した。その結果、矮小マウスの外見的な特徴は維持された。何らかの遺伝子変異によって矮小形質が出現したと考えられる。【００６７】
（２）矮小マウスの出現比率
矮小マウス（雄）とＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雌）の交配において、正常マウス：矮小マウスの出現比率は、２７７：１３８であった。矮小マウスの性別に拘わらず、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交配すると矮小マウスが産まれること、および、矮小マウスとＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを交配すると、正常マウスと矮小マウスの両方が産まれることから、矮小形質は常染色体優性遺伝していると考えられる。出生比率はメンデルの法則による常染色体優性遺伝の比率と異なるが、矮小個体が食殺されている可能性およびホモ変異個体が胎生致死である可能性が考えられる。【００６８】
（３）矮小マウスの外貌
代表的な矮小マウスの外貌を図１に示す。矮小マウスは、同性の正常なマウスと比較して、体格が小さく、眼間が広く、鼻背長が短いという特徴を有した。【００６９】
（４）身体計測
これ以降の試験では、特記しない限り、雄のマウスを使用した。正常マウスおよび矮小マウスの体長および体重を測定し、ＢＭＩを測定した。結果を図２に示す。矮小マウスの体長および体重は正常マウスよりも小さかったが、ＢＭＩには正常マウスとの有意差は認められなかった。【００７０】
正常マウスおよび矮小マウスの鼻背長および両眼間隔を測定した。結果を図３に示す。矮小マウスの鼻背長は正常マウスよりも有意に短く、両眼間隔は有意に長かった。【００７１】
（５）通常時の血圧および体温
正常マウスおよび矮小マウスの血圧および体温を測定した。結果を図４に示す。矮小マウスの血圧と体温は低い傾向が見られた。矮小マウスの体温は体重と相関する傾向が見られた。【００７２】
（６）血液生化学的検査
正常マウスおよび矮小マウスの血液を、ベストスキャン（セントラル科学貿易）で測定した。結果を下表に示す。矮小マウスでは、アルカリホスファターゼ、カルシウム、無機リン酸の濃度が高く、グルコース濃度が低かった。
【表１】
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【００７３】
（７）体重の推移
正常マウスおよび矮小マウスについて、体重の推移を観察した。結果を図５に示す。矮小マウスは、正常マウスと同様の成長曲線を示した。【００７４】
（８）通常時の摂餌量
正常マウスおよび矮小マウスについて、通常時の２４時間の摂餌量を計量した。結果を図６に示す。矮小マウスの摂餌量は少ないが、体重比では正常マウスとの差は認められなかった。【００７５】
（９）絶食後の体重および摂餌量
正常マウスおよび矮小マウスを２４時間絶食させた。絶食後の体重と、絶食後の再給餌時の摂餌量を計量した。結果を図７に示す。絶食２４時間後の体重減少率は、矮小マウスと正常マウスとで差は認められなかった。【００７６】
（１０）通常時のＧＨおよびＩＧＦ−Ｉ濃度
正常マウスおよび矮小マウスの血中の成長ホルモン（ＧＨ）濃度およびインスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）濃度を測定した。結果を図８に示す。矮小マウスと正常マウスとでＧＨ濃度に差は認められなかったが、矮小マウスのＩＧＦ−Ｉ濃度は正常マウスよりも有意に低かった。【００７７】
（１１）グルコース寛容試験に伴う血糖値の推移
正常マウスおよび矮小マウスを２時間絶食させ、グルコース（２ｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した。結果を図９に示す。矮小マウスは正常マウスよりも耐糖能が有意に高かった。【００７８】
（１２）グルコース寛容試験に伴うインスリン値の推移
正常マウスおよび矮小マウスを２時間絶食させ、グルコース（２ｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した。結果を図１０に示す。矮小マウスのインスリン値は、正常マウスよりも早期に低下した。【００７９】
（１３）行動リズム
正常マウス３匹および矮小マウス４匹を明暗条件下および恒常暗条件下におき、活動量をダブルプロットで記録した。各マウスのアクトグラムを図１１に示す。明暗条件下（各パネル上部）において、矮小マウスの活動周期は正常マウスと同様であった。恒常暗条件下（各パネル下部）において、活動開始時刻に沿って引いた直線の傾きは矮小マウスで小さく、矮小マウスの活動周期が正常マウスよりも短いことが示唆された。恒常暗条件下での活動周期は内因性の概日リズムを反映するため、この結果は、矮小マウスを睡眠相前進症候群のモデルとして使用し得ることを示す。【００８０】
（１４）フットプリント試験（歩行解析）
正常マウスおよび矮小マウスの後肢にインクを塗って紙の上を歩かせ、足跡の歩幅（Hind stride）と横幅（Hind base）を測定した。結果を図１２に示す。矮小マウスでは正常マウスよりも歩行時の横幅が広く、歩幅が狭かった。【００８１】
（１５）握力測定
正常マウスおよび矮小マウスの四肢の握力を、小動物用筋弛緩測定装置（トラクションメーター、#BS-TM-RM、Brain Science idea）により測定した。結果を図１３に示す。矮小マウスの四肢の瞬間的握力および持続的握力は正常マウスよりも弱かった。【００８２】
（１６）高架式十字迷路による不安傾向の測定
正常マウスおよび矮小マウスを高架式十字迷路の中央に置き、１０分間の行動軌跡を記録した（図１４）。結果を図１５に示す。矮小マウスは正常マウスよりも不安レベルが高いか、または、好奇心が低い可能性が認められた。【００８３】
試験２：矮小マウスの責任候補遺伝子の決定
連鎖解析に基づく量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）マッピングを行い、矮小マウスの原因遺伝子が第１６番染色体の３８,９３１,２３８ｂｐより上流に存在することを明らかにした。さらに詳細な部位を特定できるプローブを用いて遺伝子マッピングを行い、矮小マウスの原因遺伝子が第１６番染色体の２１,６７８,４７３ｂｐより上流に存在することを明らかにした。【００８４】
遺伝子マッピング法により特定された領域内で次世代シークエンシングを行い、ヌクレオチド配列を決定した。Ｃｈｒ１６：４,１３８,８３５でＣＧ→Ｃの変異があり、フレームシフトを起こしていることが判明した。この結果は、多個体でのサンガー法によるシークエンス結果とも一致した。【００８５】
野生型マウスＣＲＥＢＢＰ遺伝子のヌクレオチド配列を配列番号２並びに図１６および１７に示す。矮小マウスで発見された変異型ＣＲＥＢＢＰ遺伝子は、配列番号１の第１１２３位に相当するグアニンヌクレオチド（図１６中、四角で囲んで示す）が欠損しており、配列番号３に示すヌクレオチド配列を有した。野生型ＣＲＥＢＢＰおよび変異型ＣＲＥＢＢＰのアミノ酸配列を図１８および図２２に示す。野生型ＣＲＥＢＢＰが２４４１個のアミノ酸からなるのに対し、変異型ＣＲＥＢＢＰはフレームシフトにより３８６個のアミノ酸からなっていた。即ち、矮小マウスでは、ＣＲＥＢＢＰのＣ末端欠損が起こっていた。ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列のアラインメントの一部を図２３に示す。【００８６】
ＣＲＥＢＢＰ遺伝子はルビンシュタイン・テイビ症候群の原因遺伝子の１つであり、常染色体優性遺伝することが知られている。ルビンシュタイン・テイビ症候群の合併症として、低身長、幅広い鼻稜、鼻翼より下方に伸びた鼻中隔が知られており、これらは矮小マウスの特徴と一致する。従って、これらの結果は、矮小マウスをルビンシュタイン・テイビ症候群のモデルとして使用し得ることを示す。【００８７】
試験３：変異型ＣＲＥＢＢＰ遺伝子を有するマウスの作製
マウスゲノム中の下記のヌクレオチド配列に点突然変異を導入するために、ゲノム編集を行った。
Exon 4 ENSMUSE00000295066 241 nt
TCCCAGTTGCAAACATCAGTGGGAATTGTACCCACACAAGCAATTGCAACAGGCCCCACAGCAGACCCTGAAAAACGCAAACTGATACAGCAGCAGCTGGTTCTACTGCTTCATGCCCACAAATGTCAGAGACGAGAGCAAGCAAATGGAGAGGTTCGAGCCTGTTCTCTCCCACACTGTCGAACCATGAAAAACGTTTTGAATCACATGACACATTGTCAGGCTGGGAAAGCCTGCCAAG（配列番号１０）【００８８】
ACGAGAGCAAGCAAATGGAG（配列番号９）のヌクレオチド配列（配列番号１０の下線部の配列）を標的とするｓｇＲＮＡを使用した。
相同染色体の一方を変異させ、他方を変異させないために、下記のヌクレオチド配列を有する２種のノックイン用のオリゴヌクレオチドを使用した。
（１）点突然変異用のｓｓＯＤＮ
TGAAAAACGCAAACTGATACAGCAGCAGCTGGTTCTACTGCTTCATGCCCACAAATGTCAGAGACGAGAGCAAGCAAATGG-GAGGTTCGAGCCTGTTCTCTCCCACACTGTCGAACCATGAAAAACGTTTTGAATCACATGACACATTGTCAGGCTGGGAA（配列番号１１）
（２）サイレント変異用のｓｓＯＤＮ
TGAAAAACGCAAACTGATACAGCAGCAGCTGGTTCTACTGCTTCATGCCCACAAATGTCAGAGACGAGAGCAAGCAAACGGCGAAGTTCGAGCCTGTTCTCTCCCACACTGTCGAACCATGAAAAACGTTTTGAATCACATGACACATTGTCAGGCTGGGAA（配列番号１２）【００８９】
Ｃａｓ９タンパク質１００ｎｇ／ｕｌ、ｓｇＲＮＡ１００ｎｇ／ｕｌ、（１）および（２）のｓｓＯＤＮ各５０ｎｇ／ｕｌをエレクトロポレーション法によりＢ６ＮＪｃｌの受精卵１１９個に導入した。翌日正常に発生が進んだ１１０個を仮親４腹へ移植した。仮親４腹は、すべて自然分娩で出産した。３１匹（雄１０匹、雌２１匹）の産子が得られた。遺伝子型を確認したところ、編集された個体は３１匹中１０匹であり、うちファウンダー候補は２匹であった。ファウンダー候補マウスをＢ６ＮＪｃｌマウスと交配し、産子のＣＲＥＢＢＰ遺伝子の配列を解読したところ、目的の点突然変異が確認された。この方法により人為的に作製された変異型マウスは、自然発生した変異型マウスと同様に、体格が小さく、頭部奇形（両眼乖離および鼻背長の短縮）および歩行異常を示した。これらの結果は、人為的に作製した変異型マウスを、自然発生した変異型マウスと同様に、ルビンシュタイン・テイビ症候群のモデルとして使用し得ることを示す。【００９０】
試験４：アレル特異的ＰＣＲによる変異検出
下記のプライマーおよび反応液を使用して、下記の反応条件のＰＣＲにより、マウスのゲノムＤＮＡを増幅した。下記のプライマーは、マウスのゲノムに試験２で同定された点突然変異がある場合に２０７ｂｐの増幅産物が得られるように設計した。
フォワードプライマー：5'- GACGAGAGCAAGCAAATCGG -3'（配列番号１３）
リバースプライマー：5'- TAGGCAGTGCAGGATTCCAA -3'（配列番号１４）
【表２】
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【表３】
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【００９１】
野生型マウスのゲノムＤＮＡを用いると、核酸は増幅されなかった。自然発生した変異型マウスのゲノムＤＮＡを用いると、核酸は増幅された。従って、この系により当該変異を検出することができる。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
ルビンシュタイン・テイビ症候群は発症機序が未だ不明であり、治療技術も確立されていないので、本開示の遺伝子改変動物にはリサーチツールとしての需要が見込まれる。また、本開示は、ルビンシュタイン・テイビ症候群の遺伝子診断に寄与し得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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