(57)【要約】本発明が解決しようとする課題は、分離対象物質の分離方法に用いることができ、純度の高い精製物を得ることができるコアシェル粒子を提供することにある。本発明のコアシェル粒子（Ｃ）は、磁性金属酸化物粒子（Ａ）を含有する磁性シリカ粒子であるコア層（Ｐ）と、前記コア層（Ｐ）の表面上に形成された平均厚みが３〜３０００ｎｍのシリカ層であるシェル層（Ｑ）とを有するコア−シェル型状のコアシェル粒子であって、前記コア層（Ｐ）が含有する前記磁性金属酸化物粒子（Ａ）の重量割合が、コア層（Ｐ）の重量を基準として、６０〜９５重量％であり、前記コアシェル粒子（Ｃ）の粒度分布の変動係数が５０％以下である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁性金属酸化物粒子（Ａ）を含有する磁性シリカ粒子であるコア層（Ｐ）と、
前記コア層（Ｐ）の表面上に形成された平均厚みが３〜３０００ｎｍのシリカ層であるシェル層（Ｑ）とを有するコア−シェル型状のコアシェル粒子であって、
前記コア層（Ｐ）が含有する前記磁性金属酸化物粒子（Ａ）の重量割合が、コア層（Ｐ）の重量を基準として、６０〜９５重量％であり、
粒度分布の変動係数が５０％以下であるコアシェル粒子（Ｃ）。
【請求項２】
前記コアシェル粒子（Ｃ）の粒度分布の変動係数が１０〜５０％である請求項１に記載のコアシェル粒子。
【請求項３】
前記磁性金属酸化物粒子（Ａ）の体積平均粒子径が１〜５０ｎｍである請求項１又は２に記載のコアシェル粒子。
【請求項４】
前記コアシェル粒子（Ｃ）の体積平均粒子径が０．５〜２０μｍである請求項１〜３のいずれか１項に記載のコアシェル粒子。
【請求項５】
前記磁性金属酸化物粒子（Ａ）が、酸化鉄を含有する請求項１〜４のいずれか１項に記載のコアシェル粒子。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のコアシェル粒子（Ｃ）を用いて、試料（Ｅ）中の分離対象物質（Ｄ）を分離する分離精製方法。
【請求項７】
前記分離対象物質（Ｄ）が目的物質（Ｄ１）であって、前記目的物質（Ｄ１）を含む試料（Ｅ１）と前記コアシェル粒子（Ｃ）とを接触させ、前記コアシェル粒子（Ｃ）と前記目的物質（Ｄ１）との複合体（Ｆ１）を形成する複合体形成工程と、
磁力で前記複合体（Ｆ１）を前記試料（Ｅ１）から分離する複合体分離工程と、
前記複合体（Ｆ１）から前記目的物質（Ｄ１）を解離させて目的物質（Ｄ１）を得る目的物質解離工程とを含む、請求項６に記載の分離精製方法。
【請求項８】
前記目的物質解離工程の後、前記コアシェル粒子（Ｃ）を回収するコアシェル粒子回収工程を含む請求項７に記載の分離精製方法。
【請求項９】
前記回収工程の後、回収された前記コアシェル粒子（Ｃ）を用いて、前記複合体形成工程、前記複合体分離工程及び前記目的物質解離工程を行う請求項８に記載の分離精製方法。
【請求項１０】
前記分離対象物質（Ｄ）が非目的物質（Ｄ２）であって、目的物質（Ｄ１）及び前記非目的物質（Ｄ２）を含む試料（Ｅ２）と前記コアシェル粒子（Ｃ）とを接触させて、コアシェル粒子（Ｃ）と非目的物質（Ｄ２）との複合体（Ｆ２）を形成させる複合体形成工程と、
磁力で前記複合体（Ｆ２）を前記試料（Ｅ２）から分離することにより前記試料（Ｅ２）から前記非目的物質（Ｄ２）を除去し、前記目的物質（Ｄ１）を含む前記試料（Ｅ２１）を得る非目的物質除去工程とを含む、請求項６に記載の分離精製方法。
【請求項１１】
前記非目的物質除去工程の後、前記複合体（Ｆ２）から前記コアシェル粒子（Ｃ）を回収するコアシェル粒子回収工程を含む請求項１０に記載の分離精製方法。
【請求項１２】
前記回収工程の後、回収された前記コアシェル粒子（Ｃ）を用いて、前記複合体形成工程及び非目的物質除去工程を行う請求項１１に記載の分離精製方法。
【請求項１３】
前記非目的物質（Ｄ２）の種類が複数である請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の分離精製方法。
【請求項１４】
前記分離対象物質（Ｄ）が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、細胞、ウイルス、細菌及びタンパク質からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項６〜１３のいずれか１項に記載の分離精製方法。
【請求項１５】
前記コアシェル粒子（Ｃ）が、前記分離対象物質（Ｄ）と結合する物質（Ｇ）が表面に固定化されているコアシェル粒子（Ｃ１）である請求項６〜１４のいずれか１項に記載の分離精製方法。
【請求項１６】
前記物質（Ｇ）が、前記分離対象物質（Ｄ）と結合する官能基（Ｊ）を有する請求項１５に記載の分離精製方法。
【請求項１７】
前記官能基（Ｊ）が、アミノ基及びアンモニウム基からなる群から選ばれる少なくとも１種の基である請求項１６に記載の分離精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はコアシェル粒子及びコアシェル粒子を用いた分離対象物質の分離精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来は、タンパク質等の生物由来物質を試料から分離する方法として、カラムクロマトグラフィーを用いた精製法が行われている。しかしながら、カラムクロマトグラフィー法による精製法は、タンパク質等を大量かつ高純度に精製するためには巨大なカラムや大量のバッファーを必要とし、さらに精製に長い時間を必要とするため、コストが高くなるといった問題がある。【０００３】
そこで、磁力によって容易に分離、回収が可能な技術として、磁性シリカ粒子を用いたタンパク質の精製する技術が開示されている（特許文献１）。しかし、この方法で得られた精製物は、目的のタンパク質以外のタンパク質の含有量が多く、精製物の純度が不十分であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１６−９０５７０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明が解決しようとする課題は、分離対象物質の分離方法に用いることができ、純度の高い精製物を得ることができるコアシェル粒子を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、本発明に到達した。
即ち本発明は、磁性金属酸化物粒子（Ａ）を含有する磁性シリカ粒子であるコア層（Ｐ）と、
前記コア層（Ｐ）の表面上に形成された平均厚みが３〜３０００ｎｍのシリカ層であるシェル層（Ｑ）とを有するコア−シェル型状のコアシェル粒子であって、
前記コア層（Ｐ）が含有する前記磁性金属酸化物粒子（Ａ）の重量割合が、コア層（Ｐ）の重量を基準として、６０〜９５重量％であり、
粒度分布の変動係数が５０％以下であるコアシェル粒子（Ｃ）；前記コアシェル粒子（Ｃ）を用いて、試料（Ｅ）中の分離対象物質（Ｄ）を分離する分離精製方法である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のコアシェル粒子を用いて、分離対象物質を含有する試料を分離することで、試料中から純度の高い精製物を得ることができる。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明のコアシェル粒子（Ｃ）は、
磁性金属酸化物粒子（Ａ）を含有する磁性シリカ粒子であるコア層（Ｐ）と、
前記コア層（Ｐ）の表面上に形成された平均厚みが３〜３０００ｎｍのシリカ層であるシェル層（Ｑ）とを有するコア−シェル型状のコアシェル粒子である。
また、前記コア層（Ｐ）が含有する前記磁性金属酸化物粒子（Ａ）の重量割合が、コア層（Ｐ）の重量を基準として、６０〜９５重量％である。
また、前記コアシェル粒子（Ｃ）の粒度分布の変動係数が５０％以下である。
【０００９】
本発明のコアシェル粒子（Ｃ）は、後に詳述する本発明の分離方法［試料（Ｅ）中の分離対象物質（Ｄ）を分離する物質の分離方法］の使用に特に適している。
本発明における分離対象物質（Ｄ）とは、試料（Ｅ）中に含まれる複数の物質（生物由来の物質等）の混合物中の目的物質（Ｄ１）又は非目的物質（Ｄ２）を意味する。
なお、目的物質（Ｄ１）とは、最終的に、試料（Ｅ）から精製した物として得たい物質を意味する。
非目的物質（Ｄ２）とは、最終的に、試料（Ｅ）から除去したい物質を意味する。
ここで、本発明における試料（Ｅ）としては、生物由来の試料［生体体液（血清、血液、リンパ液、腹水及び尿等）、各種細胞類及び培養液等］を始め、後に詳述する目的物質（Ｄ１）及び／又は非目的物質（Ｄ２）を含有する混合物等が挙げられる。
【００１０】
本発明におけるコアシェル粒子（Ｃ）は、前述の通り、磁性金属酸化物粒子（Ａ）を含有する磁性シリカ粒子であるコア層（Ｐ）と、前記コア層（Ｐ）の表面上に形成された平均厚みが３〜３０００ｎｍのシリカ層であるシェル層（Ｑ）とを有する。
前記のコア層（Ｐ）は、磁性金属酸化物粒子（Ａ）がシリカのマトリックス中に分散された球体であることが好ましい。
シェル層（Ｑ）はシリカ以外の他の成分を含有していてもよい。
【００１１】
本発明における磁性金属酸化物粒子（Ａ）は、フェリ磁性、強磁性、又は超常磁性であってよい。上記の中でも、磁気分離後に残留磁化が残らず迅速に再分散させることが可能な超常磁性が好ましい。ここで超常磁性とは、外部磁場の存在下で物質の個々の原子磁気モーメントが整列し誘発された一時的な磁場を示し、外部磁場を取り除くと、部分的な整列が損なわれ磁場を示さなくなることをいう。
【００１２】
前記の磁性金属酸化物粒子（Ａ）としては、鉄、コバルト、ニッケル及びこれらの合金等の酸化物が挙げられるが、磁界に対する感応性が優れていることから、酸化鉄が特に好ましい。磁性金属酸化物粒子（Ａ）は、１種を単独で用いても２種以上を併用してもよい。
【００１３】
磁性金属酸化物粒子（Ａ）に用いられる酸化鉄としては、公知の種々の酸化鉄を用いることができる。酸化鉄の内、特に化学的な安定性に優れることから、マグネタイト、γ−ヘマタイト、マグネタイト−α−ヘマタイト中間酸化鉄及びγ−ヘマタイト−α−ヘマタイト中間酸化鉄が好ましく、大きな飽和磁化を有し、外部磁場に対する感応性が優れていることから、マグネタイトが更に好ましい。
【００１４】
前記のコア層（Ｐ）が含有する磁性金属酸化物粒子（Ａ）は、体積平均粒子径が１〜５０ｎｍであることが好ましく、更に好ましくは１〜３０ｎｍであり、特に好ましくは１〜２０ｎｍである。
前記の磁性金属酸化物粒子（Ａ）の体積平均粒子径が１ｎｍ以上の場合は合成が容易であり、体積平均粒子径が５０ｎｍ以下の場合はシリカのマトリックスに均一に分散させることが容易である。
【００１５】
本発明における磁性金属酸化物粒子（Ａ）の体積平均粒子径は、任意の２００個の磁性金属酸化物粒子（Ａ）について走査型電子顕微鏡（例えば、日本電子株式会社製「ＪＳＭ−７０００Ｆ」）で観察して測定された粒子径の体積平均値である。
磁性金属酸化物粒子（Ａ）の体積平均粒子径は、後述の磁性金属酸化物粒子（Ａ）作製時の金属イオン濃度を調節することにより制御することができる。また、分級等の方法によっても磁性金属酸化物粒子（Ａ）の体積平均粒子径を所望の値にすることができる。
【００１６】
本発明におけるコア層（Ｐ）の重量に基づく磁性金属酸化物粒子（Ａ）の重量割合の下限は、６０重量％、好ましくは６５重量％であり、上限は９５重量％、好ましくは８０重量％である。
磁性金属酸化物粒子（Ａ）の重量割合が６０重量％未満の場合、得られたコアシェル粒子（Ｃ）の磁性が十分でないため、実際の用途面における分離操作に時間がかかる。また、磁性金属酸化物粒子（Ａ）の重量割合が９５重量％を超える場合、その合成が困難である。
【００１７】
磁性金属酸化物粒子（Ａ）の製造方法は、特に限定されないが、Ｍａｓｓａｒｔにより報告されたものをベースとして水溶性鉄塩及びアンモニアを用いる共沈殿法（Ｒ．Ｍａｓｓａｒｔ，ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓ．Ｍａｇｎ．１９８１，１７，１２４７）、及び、水溶性鉄塩の水溶液中の酸化反応を用いた方法等により合成することができる。
【００１８】
本発明のコアシェル粒子（Ｃ）は、前述の通り、コア−シェル形状の粒子であり、コア層（Ｐ）の表面上にシェル層（Ｑ）が形成されている。
【００１９】
本発明におけるシェル層（Ｑ）の平均厚みは、コアシェル粒子（Ｃ）を樹脂（エポキシ樹脂等）に包埋してミクロトームで切断した断面を、透過型電子顕微鏡で観察して得られる像の画像解析から測定することが出来る。シェル層（Ｑ）の平均厚みとは、透過型電子顕微鏡（例えば（株）日立製作所製「Ｈ−７１００」）で観察して測定された任意の１００個のコアシェル粒子（Ｃ）のシェル層（Ｑ）の厚みの平均値である。シェル層（Ｑ）の厚みとは、１個のコアシェル粒子（Ｃ）における膜厚が最も薄い部分と最も厚い部分の平均値である。
【００２０】
シェル層（Ｑ）の平均厚みは、３〜３０００ｎｍであり、好ましくは１０〜８００ｎｍであり、更に好ましくは５０〜８００ｎｍであり、特に好ましくは５０〜５００ｎｍであり、最も好ましくは５０〜２００ｎｍである。平均厚みが３ｎｍ未満の場合、シェル層（Ｑ）が形成されていることの効果が得られず分離対象物質（Ｄ）の分離量が低下し、平均厚みが３０００ｎｍを超えるものは合成が困難である。
【００２１】
コアシェル粒子（Ｃ）の体積平均粒子径は、好ましくは０．５〜２０μｍ、更に好ましくは１〜１０μｍ、特に好ましくは１．１〜５μｍである。
コアシェル粒子（Ｃ）の体積平均粒子径が０．５μｍ以上の場合、分離回収の際の時間を短縮できる傾向にある。また、コアシェル粒子（Ｃ）の平均粒子径が２０μｍ以下の場合、比表面積を比較的大きくできるため、分離対象物質（Ｄ）の分離量を多くすることができ、結合効率が増加する傾向にある。
更に、コアシェル粒子（Ｃ）の体積平均粒子径が１．１μｍ以上であり、かつ後に詳述するコアシェル粒子（Ｃ）の粒度分布の変動係数が２１〜３５％の場合は、分離対象物質（Ｄ）の分離性が向上する。
本明細書における「分離性」について、分離対象物質（Ｄ）が、目的物質（Ｄ１）である場合と、分離対象物質（Ｄ）が非目的物質（Ｄ２）である場合に、場合分けして説明する。
分離対象物質（Ｄ）が目的物質（Ｄ１）である場合、「分離性が向上する」とは、試料（Ｅ）からコアシェル粒子（Ｃ）を用いて抽出した成分中の目的物質（Ｄ１）の純度（割合）が高くなることを意味する。
また、分離対象物質（Ｄ）が非目的物質（Ｄ２）である場合、「分離性が向上する」とは、試料（Ｅ）からコアシェル粒子（Ｃ）を用いて非目的物質（Ｄ２）を除外した後の成分中の非目的物質（Ｄ２）の割合が低くなることを意味する。
【００２２】
本発明におけるコアシェル粒子（Ｃ）の体積平均粒子径は、例えばレーザー回折・散乱式粒子径分布測定装置（マイクロトラック・ベル株式会社製「マイクロトラックＭＴ３３００」）で測定して得られる体積平均粒子径である。
【００２３】
コアシェル粒子（Ｃ）の体積平均粒子径は、コア層（Ｐ）の体積平均粒子径とシェル層（Ｑ）の平均厚みを制御することにより制御することができる。コア層（Ｐ）の体積平均粒子径は、後述の水中油型エマルションを作製する際の混合条件（せん断力等）を調節して水中油型エマルションの粒子径を調整することにより制御することができ、シェル層（Ｑ）の平均厚みは、後述のシェル層（Ｑ）形成時の（アルキル）アルコキシシランの量、触媒量及び反応時間等を調節することにより制御することができる。
また、コア層（Ｐ）及びコアシェル粒子（Ｃ）の体積平均粒子径は、製造時の水洗工程の条件変更及び分級等の方法によっても所望の値とすることができる。
【００２４】
本発明において、コアシェル粒子（Ｃ）の粒度分布の変動係数は、前述の通り、５０％以下である。変動係数が５０％を超えると、分離対象物質（Ｄ）の分離性が悪化する。
また分離対象物質（Ｄ）の分離性を更に高める観点から、コアシェル粒子（Ｃ）の粒度分布の変動係数の下限は、１０％以上であることが好ましく、更に好ましくは１３％以上であり、特に好ましくは２０％以上であり、最も好ましくは２１％以上である。
また、分離対象物質（Ｄ）の分離性を更に高める観点から、コアシェル粒子（Ｃ）の粒度分布の変動係数の上限は、３５％以下であることが好ましい。
コアシェル粒子（Ｃ）の粒度分布の変動係数は、下記測定方法により測定することができる。
＜変動係数の測定方法＞
本発明における変動係数は、例えばレーザー回折・散乱式粒子径分布測定装置（マイクロトラック・ベル株式会社製「マイクロトラックＭＴ３３００」）で測定して得られる体積平均粒子径（ｄ）と標準偏差（ＳＤ）とを数式（１）に当てはめることにより得られる値である。
変動係数（％）＝ＳＤ／ｄ×１００      （１）
【００２５】
コアシェル粒子（Ｃ）の粒度分布の変動係数は、コアシェル粒子を分級してその変動係数を調整することができる。
例えば、粒子径が比較的大きいコアシェル粒子は、遠心分離により沈降させることで、除去することができる。また、粒子径が比較的小さいコアシェル粒子は、遠心分離後、沈降しなかった微粒子が存在している上澄み液を取り除くことで、除去できる。
【００２６】
本発明のコアシェル粒子（Ｃ）におけるシェル層（Ｑ）の平均厚みと、コア層（Ｐ）の粒子径との比率［シェル層（Ｑ）の平均厚み／コア層（Ｐ）の粒子径］は、０．００１〜１０であることが好ましく、更に好ましくは０．０２〜１．５であり、特に好ましくは０．０４〜１．５である。
上記の比率が０．００１以上の場合、分離対象物質（Ｄ）の分離性が向上する。
また、上記の比率が１０以下の場合、分離対象物質（Ｄ）の分離性が向上する。
ここで、上記の比率の計算において、シェル層（Ｑ）の平均厚みは上記で説明した方法により求めた値を用いる。また、上記の比率の計算において、コア層（Ｐ）の粒子径は、上記で説明した「コアシェル粒子（Ｃ）の体積平均粒子径」及び「シェル層（Ｑ）の平均厚み」の値を用いて、以下の計算式により求めることができる。
コア層（Ｐ）の粒子径＝コアシェル粒子（Ｃ）の体積平均粒子径−２×シェル層（Ｑ）の平均厚み
【００２７】
また、コアシェル粒子（Ｃ）におけるシェル層（Ｑ）の平均厚みと、コア層（Ｐ）の粒子径との比率［シェル層（Ｑ）の平均厚み／コア層（Ｐ）の粒子径］が、０．０２〜１．５であり、かつ、コアシェル粒子（Ｃ）の粒度分布の変動係数が２１〜３５％である場合は、分離対象物質（Ｄ）の分離性が大きく向上する。
【００２８】
次に、本発明におけるコアシェル粒子（Ｃ）の製造方法について説明する。
本発明におけるコアシェル粒子（Ｃ）の製造方法は、以下の２工程を少なくとも経る製造方法により製造できる。
（工程１）磁性金属酸化物粒子（Ａ）を含有する（アルキル）アルコキシシランの水中油型エマルションを作製して、（アルキル）アルコキシシランの加水分解重縮合反応を行い、磁性金属酸化物粒子（Ａ）がシリカに包含されたコア層（Ｐ）を製造する工程。
（工程２）コア層（Ｐ）の表面にて（アルキル）アルコキシシランを加水分解重縮合反応させ、シェル層（Ｑ）を形成する工程。
以下、上記の工程について説明する。
【００２９】
まず、工程１について説明する。
本発明におけるコア層（Ｐ）の製造方法としては、磁性金属酸化物粒子（Ａ）及び前記磁性金属酸化物粒子（Ａ）の重量に基づいて３０〜１０００重量％の（アルキル）アルコキシシランを含有する分散液（Ｂ１）（以下、単に「分散液（Ｂ１）」とも記載する）と、水、非イオン性界面活性剤及び（アルキル）アルコキシシランの加水分解用触媒を含有する溶液（Ｂ２）（以下、単に「溶液（Ｂ２）」とも記載する）とを混合して、水中油型エマルションを作製し、（アルキル）アルコキシシランの加水分解重縮合反応を行い、磁性金属酸化物粒子（Ａ）がシリカに包含された粒子を製造する方法等が挙げられる。
（アルキル）アルコキシシランの加水分解重縮合反応後、遠心分離及び磁石等を用いて固液分離することによりコア層（Ｐ）が得られる。
上記及び以下において、（アルキル）アルコキシシランとは、アルキルアルコキシシラン及び／又はアルコキシシランを意味する。
【００３０】
使用する（アルキル）アルコキシシランとしては、下記一般式（１）で表される化合物が挙げられる。
Ｒ１（４−ｎ）Ｓｉ（ＯＲ２）ｎ    （１）
一般式（１）中、Ｒ１及びＲ２は、炭素数１〜１０の１価の炭化水素基を表す。また、当該炭化水素基の水素の一部は、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、メルカプト基又はグリシジルオキシ基で置換されていてもよい。
【００３１】
炭素数１〜１０の１価の炭化水素基としては、炭素数１〜１０の脂肪族炭化水素基（メチル基、エチル基、ｎ−又はｉｓｏ−プロピル基、ｎ−又はｉｓｏ−ブチル基、ｎ−又はｉｓｏ−ペンチル基及びビニル基等）、炭素数６〜１０の芳香族炭化水素基（フェニル基等）及び炭素数７〜１０の芳香脂肪族基（ベンジル基等）等が挙げられる。
【００３２】
一般式（１）におけるｎは１〜４の整数を表す。但し、ｎが１のアルキルアルコキシシランを用いる場合は、ｎが２〜４の（アルキル）アルコキシシランと併用する必要がある。反応後の粒子の強度及び粒子表面のシラノール基の量の観点からｎは４であることが好ましい。
【００３３】
一般式（１）で表される化合物の具体例としては、アルコキシシラン（テトラメトキシシラン、テトラエトキシシラン、テトライソプロポキシシラン及びテトラブトキシシラン等）；
アルキルアルコキシシラン（メチルトリメトキシシラン及びメチルトリエトキシシラン等）；
アミノ基で置換されたアルキル基を有するアルキルアルコキシシラン［３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルエトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン及びＮ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン等］；
カルボキシル基で置換されたアルキル基を有するアルキルアルコキシシラン（７−カルボキシヘプチルトリエトキシシラン及び５−カルボキシペンチルトリエトキシシラン等）；
水酸基で置換されたアルキル基を有するアルキルアルコキシシラン（３−ヒドロキシプロピルトリメトキシシラン及び３−ヒドロキシプロピルエトキシシラン等）；
メルカプト基で置換されたアルキル基を有するアルキルアルコキシシラン（３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン及び３−メルカプトプロピルトリエトキシシラン等）；
グリシジルオキシ基で置換されたアルキル基を有するアルキルアルコキシシラン（３−グリシジルオキシプロピルトリメトキシシラン及び３−グリシジルオキシプロピルトリエトキシシラン等）等が挙げられる。
（アルキル）アルコキシシランは、１種類を単独で用いても２種以上を併用してもよい。
【００３４】
（アルキル）アルコキシシランの使用量は、磁性金属酸化物粒子（Ａ）の重量に対して、３０〜１，０００重量％であることが好ましく、更に好ましくは４０〜５００重量％である。（アルキル）アルコキシシランの使用量が、磁性金属酸化物粒子（Ａ）の重量に対して３０重量％以上の場合、磁性金属酸化物粒子（Ａ）の表面が均一に被覆されやすくなる。また、（アルキル）アルコキシシランの使用量が磁性金属酸化物粒子（Ａ）の重量に対して、１０００重量％以下の場合、磁力による回収時間を短縮できる。
【００３５】
水の使用量は、磁性金属酸化物粒子（Ａ）の重量に対して５００〜５０，０００重量％であることが好ましく、１，０００〜１０，０００重量％であることが更に好ましい。
【００３６】
更に、コア層（Ｐ）の合成において、溶液（Ｂ２）等に水溶性有機溶媒等を含有させてもよい。
前記の水溶性有機溶媒としては、２５℃における水への溶解度が１００ｇ／水１００ｇ以上である、炭素数１〜４の１価のアルコール（メタノール、エタノール及びｎ−又はｉｓｏ−プロパノール等）、炭素数２〜９のグリコール（エチレングリコール及びジエチレングリコール等）、アミド（Ｎ−メチルピロリドン等）、ケトン（アセトン等）、環状エーテル（テトラヒドロフラン及びテトラヒドロピラン等）、ラクトン（γ−ブチロラクトン等）、スルホキシド（ジメチルスルホキシド等）及びニトリル（アセトニトリル等）等が挙げられる。
これらの内、コアシェル粒子（Ｃ）の粒子径の均一性の観点から、炭素数１〜４の１価のアルコールが好ましい。水溶性有機溶媒は、１種類を単独で用いても２種以上を併用してもよい。
【００３７】
水溶性有機溶媒の使用量は、水の重量に対して、１００〜５００重量％であることが好ましい。
【００３８】
前記の非イオン性界面活性剤としては、
炭素数８〜２４の１価のアルコール（デシルアルコール、ドデシルアルコール、ヤシ油アルキルアルコール、オクタデシルアルコール及びオレイルアルコール等）のアルキレンオキサイド（以下、アルキレンオキサイドをＡＯと略記）付加物；
炭素数３〜３６の２〜８価のアルコール（グリセリン、トリメチロールプロパン、ペンタエリスリトール、ソルビット及びソルビタン等）のＡＯ付加物；
炭素数６〜２４のアルキルを有するアルキルフェノール（オクチルフェノール及びノニルフェノール等）のＡＯ付加物；
ポリプロピレングリコールのエチレンオキサイド付加物及びポリエチレングリコールのプロピレンオキサイド付加物；
炭素数８〜２４の脂肪酸（デカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸及びヤシ油脂肪酸等）のＡＯ付加物；
前記の３〜３６の２〜８価のアルコールの脂肪酸エステル及びそのＡＯ付加物［ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０及びＴＷＥＥＮ（登録商標）８０等］；
アルキルグルコシド（Ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−ドデカノイルスクロース及びｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド等）；並びに、
ショ糖の脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド及びこれらのＡＯ付加物（ポリオキシエチレン脂肪酸アルカノールアミド等）等が挙げられる。
これらは、１種類を単独で用いても２種以上を併用してもよい。
前記の非イオン性界面活性剤の説明におけるＡＯとしては、エチレンオキサイド、プロピレンオキサイド及びブチレンオキサイド等が挙げられ、その付加形式はブロック付加であってもランダム付加であってもよい。
また、ＡＯの付加モル数としては、アルコール、フェノール又は脂肪酸１モルあたり、１〜５０モルであることが好ましく、１〜２０モルであることが更に好ましい。
【００３９】
これらの非イオン性界面活性剤の内、水への溶解度及び粘度の観点から、炭素数８〜２４の１価のアルコールのエチレンオキサイド１〜５０モル（好ましくは１〜２０モル）付加物（ポリオキシエチレンアルキルエーテル及びポリオキシエチレンアルケニルエーテル等）であることが好ましい。
また、これらの非イオン性界面活性剤の内、最終的に得られたコアシェル粒子（Ｃ）を用いて分離精製した際に、分離対象物質（Ｄ）の分離性を高める観点から好ましいのは、炭素数８〜２４のアルケニル基を有する１価のアルコール（オレイルアルコール等）のエチレンオキサイド１〜５０モル（好ましくは１〜２０モル）付加物である。
【００４０】
非イオン性界面活性剤の使用量は、磁性金属酸化物粒子（Ａ）の重量に対して、１０〜１，０００重量％であることが好ましく、１００〜５００重量％であることが更に好ましい。非イオン性界面活性剤の使用量が、磁性金属酸化物粒子（Ａ）の重量に対して１０重量％以上又は１，０００重量％以下であると、エマルションが安定し、生成する粒子の粒度分布が狭くなる傾向がある。
【００４１】
工程１で用いる溶液（Ｂ２）の使用量は、分散液（Ｂ１）が含有する磁性金属酸化物粒子（Ａ）の重量に対して、１，０００〜１０，０００重量％であることが好ましく、１，５００〜４，０００重量％であることが更に好ましい。
非イオン性界面活性剤を含む水溶液の使用量が、磁性金属酸化物粒子（Ａ）の重量に対して１，０００重量％以上又は１０，０００重量％以下であると、エマルションが安定し、生成する粒子の粒度分布が狭くなる傾向がある。
【００４２】
前記の（アルキル）アルコキシシランの加水分解用触媒としては、ルイス酸及び塩酸等を用いることができ、具体的には、無機酸（塩酸等）、有機酸（酢酸等）、無機塩基化合物（アンモニア等）及びアミン化合物（エタノールアミン等）等を用いることができる。
加水分解用触媒の使用量は、（アルキル）アルコキシシランの重量に対して、１〜１０００重量％であることが好ましく、２〜５００重量％であることが更に好ましい。
【００４３】
前記の分散液（Ｂ１）と溶液（Ｂ２）との混合方法は特に限定されず、後述の設備を使用して一括混合することもできるが、コアシェル粒子（Ｃ）の粒子径の均一性の観点から、溶液（Ｂ２）を撹拌しながら分散液（Ｂ１）を滴下する方法が好ましい。
【００４４】
分散液（Ｂ１）と溶液（Ｂ２）とを混合する際の設備としては、一般に乳化機、分散機として市販されているものであれば特に限定されず、例えば、ホモジナイザー（ＩＫＡ社製）、ポリトロン（キネマティカ社製）及びＴＫオートホモミキサー（プライミクス（株）製）等のバッチ式乳化機、エバラマイルダー（（株）在原製作所製）、ＴＫフィルミックス、ＴＫパイプラインホモミキサー（プライミクス（株）製）、コロイドミル（（株）神鋼環境ソリューション製）、クリアミックス（エムテクニック社製）、スラッシャー、トリゴナル湿式微粉砕機（日本コークス工業（株）製）、キャピトロン（（株）ユーロテック製）及びファインフローミル（太平洋機工（株）製）等の連続式乳化機、マイクロフルイダイザー（みづほ工業（株）製）、ナノマイザー（ナノマイザー（株）製）及びＡＰＶガウリン（ガウリン社製）等の高圧乳化機、膜乳化機（冷化工業（株）製）等の膜乳化機、バイブロミキサー（冷化工業（株）製）等の振動式乳化機、超音波ホモジナイザー（ブランソン社製）等の超音波乳化機等が挙げられる。
これらの内、粒子径の均一化の観点から、ＡＰＶガウリン、ホモジナイザー、ＴＫオートホモミキサー、エバラマイルダー、ＴＫフィルミックス、ＴＫパイプラインホモミキサー及びクリアミックス（エムテクニック社製）が好ましい。
【００４５】
（アルキル）アルコキシシランの加水分解重縮合反応の温度は、１０〜１００℃であることが好ましく、更に好ましくは２５〜６０℃である。また、反応時間は、好ましくは０．５〜５時間、更に好ましくは１〜２時間である。
【００４６】
次に、工程２について説明する。
本発明におけるシェル層（Ｑ）の形成方法としては、工程１で得られるコア層（Ｐ）と、（アルキル）アルコキシシランと、（アルキル）アルコキシシランの加水分解用触媒と、水と、必要であれば、更に水溶性有機溶媒とを混合して、（アルキル）アルコキシシランの加水分解重縮合反応を行い、コア層（Ｐ）の表面にシリカを含有するシェル層（Ｑ）を形成する方法等が挙げられる。
【００４７】
工程２で使用する（アルキル）アルコキシシランとしては、工程１の説明で例示した（アルキル）アルコキシシランが挙げられ、好ましいものも同様である。
【００４８】
前記のシェル層（Ｑ）を形成する反応において、コア層（Ｐ）の濃度は、反応溶液の重量を基準として５０重量％未満であることが好ましく、２０重量％未満であることが更に好ましい。
コア層（Ｐ）の濃度が５０重量％未満であると、コア層（Ｐ）が溶液中に均一に分散しシェル層（Ｑ）が均一に形成されやすくなり、シリカを介してコア層（Ｐ）同士が凝集することも抑制できる。
【００４９】
前記のシェル層（Ｑ）を形成する反応において、（アルキル）アルコキシシランの濃度は、反応溶液の重量を基準として５０重量％未満であることが好ましく、２０重量％未満であることが更に好ましい。
（アルキル）アルコキシシランの濃度が溶液中に５０重量％未満であると、シリカを介してコア層（Ｐ）同士が凝集することを抑制でき、シリカのみからなる粒子、その凝集物及びそれらとコア層（Ｐ）からなる凝集物の生成も抑制できる。
【００５０】
工程２で使用する（アルキル）アルコキシシランの加水分解用触媒としては、工程１の説明で例示した加水分解用触媒を用いることができる。
加水分解用触媒の使用量は、（アルキル）アルコキシシランの重量に対して、１〜２０００重量％であることが好ましく、２〜１０００重量％であることが更に好ましい。
【００５１】
水の使用量は、反応溶液の重量［反応に用いるコア層（Ｐ）、（アルキル）アルコキシシラン、加水分解用触媒、水、及び水溶性有機溶媒等の合計重量］に対して、０．０１〜９９．９重量％であることが好ましく、０．１〜９９．９重量％であることが更に好ましい。
水の使用量が（アルキル）アルコキシシランの重量に対して、０．０１重量％以上であると、（アルキル）アルコキシシランの加水分解の反応速度が遅くなりすぎず、所望の平均厚さのシェル層（Ｑ）を形成するための反応時間を短縮することができる。
【００５２】
水溶性有機溶媒は用いても、用いなくても良く、用いる場合は１種類を単独で用いても２種以上を併用してもよい。
水溶性有機溶媒としては、工程１の説明で例示した水溶性有機溶媒が挙げられ、好ましいものも同様である。
【００５３】
上記に加えて、反応中のコア層（Ｐ）の分散性を良くするために、非イオン性界面活性剤等を用いることができる。
非イオン性界面活性剤としては、工程１の説明で例示した非イオン性界面活性剤が挙げられ、好ましいものも同様である。
【００５４】
工程２における（アルキル）アルコキシシランの加水分解重縮合反応の温度は、０〜９０℃であることが好ましく、更に好ましくは１５〜５０℃である。
また工程２における（アルキル）アルコキシシランの加水分解重縮合反応の反応時間は、１〜５時間であることが好ましく、好ましくは１〜３時間である。
【００５５】
本発明におけるコアシェル粒子（Ｃ）は、シリカ層であるシェル層（Ｑ）を有するため、粒子の表面にシラノール基を有する。
このため、所定種類の分離対象物質（Ｄ）をその表面に結合することができる。
【００５６】
前記のコアシェル粒子（Ｃ）は、前述の通り、コアシェル粒子（Ｃ）が有するシラノール基により、分離対象物質（Ｄ）をその表面に結合させることができる。
具体的には、コアシェル粒子（Ｃ）が有するシラノール基と、分離対象物質（Ｄ）であるＤＮＡのヌクレオチド鎖との錯体を、カオトロピック塩（グアニジンチオシアン酸塩、グアニジン塩酸塩及び過塩素酸ナトリウム等）を介して結合させる方法（特開２０１４−１７６３９３号公報に記載のカオトロピック塩を介した錯体形成反応等）等が挙げられる。
【００５７】
また、分離対象物質（Ｄ）が、コアシェル粒子（Ｃ）と直接結合しない場合には、コアシェル粒子（Ｃ）の表面に、分離対象物質（Ｄ）と結合する物質（Ｇ）を固定化してもよい。このような物質（Ｇ）を表面に固定化することにより、分離対象物質（Ｄ）を、物質（Ｇ）を介してコアシェル粒子（Ｃ）に結合させることができる。以下、このように物質（Ｇ）が表面に固定化されたコアシェル粒子を、「コアシェル粒子（Ｃ１）」とも記載する。
また、分離対象物質（Ｄ）は、目的物質（Ｄ１）又は非目的物質（Ｄ２）であってもよく、物質（Ｇ）は、目的物質（Ｄ１）又は非目的物質（Ｄ２）と結合する物質であれば特に限定されない。
物質（Ｇ）と、分離対象物質（Ｄ）との結合は特異的であっても非特異的であってもよいが、分離対象物質（Ｄ）と物質（Ｇ）との結合は特異的であることが好ましい。
分離対象物質（Ｄ）と物質（Ｇ）との結合は特異的である場合、本発明のコアシェル粒子（Ｃ）を用いた分離精製方法において、分離対象物質（Ｄ）の分離性が向上する。
【００５８】
本発明における分離対象物質（Ｄ）と特異的に結合する物質（Ｇ）としては、例えば「抗原」−「抗体」間反応、「糖鎖」−「タンパク質」間反応、「糖鎖」−「レクチン」間反応、「酵素」−「インヒビター」間反応、「タンパク質」−「ペプチド鎖」間反応、「染色体又はヌクレオチド鎖」−「ヌクレオチド鎖」間反応、「ヌクレオチド鎖」−「タンパク質」間反応等の相互反応によって分離対象物質（Ｄ）と結合するもの等が挙げられる。
上記各組合せにおいて何れか一方が分離対象物質（Ｄ）である場合、他の一方が分離対象物質（Ｄ）と特異的に結合する物質（Ｇ）である。
例えば、分離対象物質（Ｄ）が「抗原」であるときは、物質（Ｇ）は「抗体」である。また、分離対象物質（Ｄ）が「抗体」であるときは、物質（Ｇ）は「抗原」である。
その他の上記各組合せにおいても同様である。
【００５９】
なお、本発明において用いられる抗体には、蛋白質分解酵素（パパイン及びペプシン等）、及び、化学的分解により生じる分解産物［Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント等］も含まれる。
【００６０】
本発明における、コアシェル粒子（Ｃ）に、分離対象物質（Ｄ）と特異的に結合する物質（Ｇ）を固定化する方法としては、コアシェル粒子（Ｃ）に物質（Ｇ）を物理吸着させる方法も挙げられる。また、より効率良く物質（Ｇ）を固定化させる観点から、グルタルアルデヒド、カルボジイミド化合物、ストレプトアビジン、ビオチン及び官能基を有するアルキルアルコキシシラン（Ｈ）からなる群から選ばれる少なくとも１種の有機化合物（Ｋ）をコアシェル粒子（Ｃ）の表面に結合させ、それらを介して物質（Ｇ）をコアシェル粒子（Ｃ）に固定化させてもよい。
これらの有機化合物（Ｋ）の内、特定の物質（Ｇ）を固定化させる観点から更に好ましいのは、官能基を有するアルキルアルコキシシラン（Ｈ）である。
【００６１】
上記アルキルアルコキシシラン（Ｈ）が有する官能基としては、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、メルカプト基及びグリシジルオキシ基等が挙げられ、アルキルアルコキシシラン１分子中に異なる種類の官能基を有していてもよい。
【００６２】
コアシェル粒子（Ｃ）の表面に官能基を有するアルキルアルコキシシラン（Ｈ）を結合させる方法としては、前記の方法でコアシェル粒子（Ｃ）を作製する際に、工程２で用いる（アルキル）アルコキシシランとして、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、メルカプト基又はグリシジルオキシ基で置換されたアルキル基を有するアルキルアルコキシシランを使用する方法；及びこれらの置換基を有しない（アルキル）アルコキシシランを使用してコアシェル粒子（Ｃ）を作製した後、コアシェル粒子（Ｃ）を、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、メルカプト基又はグリシジルオキシ基で置換されたアルキル基を有するアルキルアルコキシシランで処理する方法等が挙げられる。
【００６３】
後者の方法の具体例としては、コアシェル粒子（Ｃ）を、その濃度が溶媒の重量に対して０．１〜５０重量％になるように溶媒に分散し、この分散液にアミノ基、カルボキシル基、水酸基、メルカプト基又はグリシジルオキシ基で置換されたアルキル基を有するアルキルアルコキシシランの溶液を添加して、室温で加水分解縮合反応を行う方法等が挙げられる。
【００６４】
この方法における溶媒は、用いるアルキルアルコキシシランの溶解性に応じて適宜選択され、水に可溶なアミノ基、カルボキシル基、水酸基又はメルカプト基で置換されたアルキル基を有するアルキルアルコキシシランを用いる場合は、水又は水とアルコールとの混合溶媒等を用いることが好ましく、水に溶解しにくいグリシジルオキシ基で置換されたアルキル基を有するアルキルアルコキシシランを用いる場合、酢酸ブチル等を用いることが好ましい。
【００６５】
アミノ基、カルボキシル基、水酸基、メルカプト基又はグリシジルオキシ基で置換されたアルキル基を有するアルキルアルコキシシランの使用量は、物質（Ｇ）を固定化する前のコアシェル粒子（Ｃ）の重量を基準として０．０００１〜１００重量％であることが好ましい。
０．０００１重量％以上であると、コアシェル粒子（Ｃ）の表面に十分な量の官能基を導入することができる。また、１００重量％以下であるとコアシェル粒子（Ｃ）同士が反応して結合することを抑制することができる。
【００６６】
グルタルアルデヒド、カルボジイミド化合物、ストレプトアビジン又はビオチンをコアシェル粒子（Ｃ）の表面に結合させる方法は特に限定されないが、例えば、以下のようにして結合させることができる。
アルデヒド基を有するグルタルアルデヒド及びカルボキシル基を有するビオチンは、アミノ基で置換されたアルキル基を有するアルキルアルコキシシランが表面に結合したコアシェル粒子（Ｃ）と反応させることで、コアシェル粒子（Ｃ）の表面に結合させることができる。
また、アミノ基を有するストレプトアビジン、及び、カルボジイミド基を有するカルボジイミド化合物は、カルボキシル基で置換されたアルキル基を有するアルキルアルコキシシランが表面に結合したコアシェル粒子（Ｃ）と反応させることで、コアシェル粒子（Ｃ）の表面に結合させることができる。
【００６７】
有機化合物（Ｋ）を介して物質（Ｇ）をコアシェル粒子（Ｃ）に固定化する方法は、物質（Ｇ）の種類に応じて、有機化合物（Ｋ）を適宜選択すればよい。
例えば、ストレプトアビジン骨格を有する物質（Ｇ）を固定化する場合、有機化合物（Ｋ）としてビオチンを選択し、公知の方法で固定化することができる。
また、ビオチン骨格を有する物質（Ｇ）を固定化する場合、有機化合物（Ｋ）としてストレプトアビジンを選択し、公知の方法で固定化することができる。
また、アミノ基を有する物質（Ｇ）を固定化する場合、有機化合物（Ｋ）としてグルタルアルデヒドを選択し、公知の方法で固定化することができる。
また、カルボキシル基を有する物質（Ｇ）を固定化する場合、有機化合物（Ｋ）としてカルボジイミド化合物を選択し、公知の方法で固定化することができる。
【００６８】
また、有機化合物（Ｋ）として、官能基を有するアルキルアルコキシシラン（Ｈ）を使用する場合、アルキルアルコキシシラン（Ｈ）が有する官能基に応じて、以下のような物質（Ｇ）を結合させることができる。
例えば、アルキルアルコキシシラン（Ｈ）が有する官能基がアミノ基である場合は、カルボキシル基、カルボニル基及び／又はアルデヒド基を有する物質（Ｇ）を、公知の方法で固定化することができる。
また、アルキルアルコキシシラン（Ｈ）が有する官能基がカルボキシル基である場合は、アミノ基を有する物質（Ｇ）を、公知の方法で固定化することができる。
また、アルキルアルコキシシラン（Ｈ）が有する官能基が水酸基である場合は、カルボキシル基を有する物質（Ｇ）を、公知の方法で固定化することができる。
また、アルキルアルコキシシラン（Ｈ）が有する官能基がメルカプト基である場合は、メルカプト基を有する物質（Ｇ）を、公知の方法で固定化することができる。
また、アルキルアルコキシシラン（Ｈ）が有する官能基がグリシジルオキシ基である場合は、アミノ基及び／又は水酸基を有する物質（Ｇ）を、公知の方法で固定化することができる。
【００６９】
また、有機化合物（Ｋ）に別の化合物を反応させ、それを介して物質（Ｇ）をコアシェル粒子（Ｃ）に固定化してもよい。
例えば、有機化合物（Ｋ）として、アミノ基を有するアルキルアルコキシシランを用いる場合、無水コハク酸と反応させて、カルボキシル基を生成させても良い。この場合、アミノ基を有する物質（Ｇ）を、公知の方法で固定化することができる。
このような方法としては、塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）を用いた方法等が挙げられる。
【００７０】
また、本発明における分離対象物質（Ｄ）と非特異的に結合する物質（Ｇ）としては、共有結合、水素結合、疎水性相互作用及びイオン結合等によって分離対象物質（Ｄ）と結合する官能基（Ｊ）を有するものが挙げられる。
水溶液中で迅速かつ強固に結合できる観点から、官能基（Ｊ）としては、アミノ基及びアンモニウム基等が好ましい。
【００７１】
アミノ基としては、１〜３級アミノ基等が挙げられる。また、アンモニウム基としては、前記の１〜３級アミノ基と酸（塩酸、臭酸、ヨウ酸、酢酸、硫酸、硝酸及びリン酸等）との塩及び第４級アンモニウム基等が挙げられる。
ここで、１級アミノ基を有する基としては、アミノ基、アミノメチル基、アミノエチル基、アミノプロピル基等のアミノアルキル基、３−アミノ−１−エトキシプロピル基、１−アミノ−エトキシメチル基等のアミノアルコキシアルキル基等が挙げられる。
２級アミノ基としては、１つの炭化水素基で置換されたアミノ基が挙げられる。２級アミノ基を有する基としては、Ｎ−アルキルアミノアルキル基が含まれ、Ｎ−メチルアミノエチル基、Ｎ−エチルアミノエチル基等のＮ−アルキルアミノアルキル基、イミダゾイル基等が挙げられる。
３級アミノ基としては、２つの炭化水素基で置換されたアミノ基が挙げられる。３級アミノ基を有する官能基としては、Ｎ−ジメチルアミノエチル基、Ｎ−ジメチルアミノプロピル基、Ｎ−ジエチルアミノエチル基、Ｎ−ジブチルアミノエチル基等が挙げられる。
第４級アンモニウム基としては、３つの炭化水素基で置換されたアンモニウム基が挙げられる。４級アンモニウム基を有する官能基としては、トリメチルアンモニウム基、トリエチルアンモニウム基等のトリアルキルアンモニウム基等が挙げられる。
第４級アンモニウム基の対イオンとなる成分としては、水酸化物イオン及び酸由来のアニオン等が挙げられる。酸としては、塩酸、臭酸、ヨウ酸、酢酸、硫酸、硝酸及びリン酸等が挙げられる。
【００７２】
アミノ基あるいはアンモニウム基を含有する物質（Ｇ）をコアシェル粒子に固定化させる方法としては、前記の方法でコアシェル粒子（Ｃ）を作製する際に、工程２で用いる（アルキル）アルコキシシランとして、アミノ基で置換されたアルキル基を有するアルキルアルコキシシランを使用する方法以外にも、コアシェル粒子（Ｃ）とアミノ基又はアンモニウム基を有する化合物とを反応させる下記に詳述する方法等が挙げられる。
【００７３】
コアシェル粒子（Ｃ）と１〜３級アミノ基又は第４級アンモニウム基を有する化合物とを反応させる方法として、具体的には以下の方法が挙げられる。
１級アミノ基を有する化合物を反応させる方法としては、例えば、アルキレンジアミンとコアシェル粒子（Ｃ）のヒドロキシル基及び／又はカルボキシル基とを反応させる方法が挙げられる。
なお、コアシェル粒子（Ｃ）のヒドロキシル基とは、シェル層（Ｑ）が有するシラノール基由来の基、又は、ヒドロキシル基を有するアルキルアルコキシシラン由来の基のことである。
また、コアシェル粒子（Ｃ）のカルボキシル基とは、カルボキシル基を有するアルキルアルコキシシラン由来の基のことである。
具体的には、カルボキシル基を予めカルボジイミド化合物と反応させ、アシルイソ尿素｛Ｒ’−Ｎ＝Ｃ（ＯＣＯＲ）−ＮＨ−Ｒ’（−ＯＣＯＲがカルボキシ基を有するコアシェル粒子（Ｃ）に由来する部分）｝を得た後、アルキレンジアミンをこのアシルイソ尿素に加えることによって、コアシェル粒子（Ｃ）に、１級アミノ基を有する化合物をアミド結合できる。
１級アミノ基を有する化合物の結合量は、分離対象物質（Ｄ）の分離性の観点から、物質（Ｇ）を固定化する前のコアシェル粒子（Ｃ）の重量を基準として、０．０１〜１０ｍｍｏｌ／ｇが好ましい。
【００７４】
２級アミノ基を有する化合物を反応させる方法としては、例えば、Ｎ−アルキルアミノアルキルアミンとコアシェル粒子（Ｃ）のヒドロキシル基及び／又はカルボキシル基とを反応させる方法が挙げられる。
具体的には、カルボキシル基を予めカルボジイミド化合物と反応させ、アシルイソ尿素｛Ｒ’−Ｎ＝Ｃ（ＯＣＯＲ）−ＮＨ−Ｒ’（−ＯＣＯＲがカルボキシ基を有するコアシェル粒子（Ｃ）に由来する部分）｝を得た後、Ｎ−アルキルアミノアルキルアミンをこのアシルイソ尿素に加えることによって、コアシェル粒子（Ｃ）に２級アミノ基を有する化合物をアミド結合できる。２級アミノ基を有する化合物の結合量は、分離対象物質（Ｄ）の分離能の観点から、物質（Ｇ）を固定化する前のコアシェル粒子（Ｃ）の重量を基準として、０．０１〜１０ｍｍｏｌ／ｇが好ましい。
【００７５】
３級アミノ基を有する化合物を反応させる方法としては、例えば、Ｎ−ジアルキルアミノアルキルクロリドとコアシェル粒子（Ｃ）のヒドロキシル基及び／又はカルボキシル基とを反応させる方法が挙げられる。
具体的には、ＮａＯＨ（水酸化ナトリウム）存在下、水溶液中で反応させることで、コアシェル粒子（Ｃ）のカルボキシル基とエステル結合又はコアシェル粒子（Ｃ）のヒドロキシル基とエーテル結合させることができる。
【００７６】
第４級アンモニウム基を有する化合物を反応させる方法としては、例えば、Ｎ−グリシジル−トリアルキルアンモニウムクロリドとコアシェル粒子（Ｃ）のカルボキシル基及び／又はヒドロキシル基とを反応させる方法が挙げられる。
具体的には、４級アンモニウム塩触媒存在下、水溶液中で反応させることで、コアシェル粒子（Ｃ）のカルボキシル基とエステル結合、又はコアシェル粒子（Ｃ）のヒドロキシル基とエーテル結合させることができる
【００７７】
次に、本発明のコアシェル粒子（Ｃ）を用いて、試料（Ｅ）中の分離対象物質（Ｄ）を分離する分離精製方法について、以下に２つの例をあげて説明する。
なお、これらの分離精製方法は、本発明の分離精製方法でもある。
【００７８】
（第１の分離精製方法）
第１の分離精製方法は、分離対象物質（Ｄ）が目的物質（Ｄ１）であり、目的物質（Ｄ１）を含む試料（Ｅ１）から目的物質（Ｄ１）を抽出・精製する方法である。
第１の分離精製方法は、（１）複合体形成工程、（２）複合体分離工程、及び、（３）目的物質解離工程を含む。
以下、各工程について説明する。
【００７９】
（１）複合体形成工程
本工程では、目的物質（Ｄ１）を含む試料（Ｅ１）とコアシェル粒子（Ｃ）とを接触させ、コアシェル粒子（Ｃ）と目的物質（Ｄ１）との複合体（Ｆ１）を形成する。
複合体（Ｆ１）は、コアシェル粒子（Ｃ）に目的物質（Ｄ１）が直接結合して形成されていてもよい。
また、コアシェル粒子（Ｃ）が目的物質（Ｄ１）と結合する物質（Ｇ）を有しており、複合体（Ｆ１）は、コアシェル粒子（Ｃ）に目的物質（Ｄ１）が、物質（Ｇ）を介して結合することにより形成されていてもよい。
【００８０】
（２）複合体分離工程
次に、磁力で複合体（Ｆ１）を試料（Ｅ１）から分離する。
複合体（Ｆ１）は、コアシェル粒子（Ｃ）を含み、コアシェル粒子（Ｃ）は、磁性金属酸化物粒子（Ａ）を有するので、複合体（Ｆ１）は、磁力により集めることができる。
その後、残りの試料（Ｅ１）を除去することにより、複合体（Ｆ１）を試料（Ｅ１）から分離することができる。
このような方法としては、例えば、反応槽の外側から磁石等の磁力により複合体（Ｆ１）を集め、上澄み液（試料（Ｅ１）から目的物質（Ｄ１）が除かれた試料（Ｅ１１））を排出し、複合体（Ｆ１）を分離する方法が挙げられる。
【００８１】
また、複合体（Ｆ１）に付着した夾雑物を除去するために、分離後の複合体（Ｆ１）を洗浄液で洗浄してもよい。洗浄操作は１〜１０回繰り返しても良い。
洗浄液としては、生理食塩水及びリン酸緩衝液等を用いることができる。
また、洗浄液には界面活性剤が含まれていても良い。界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤が好ましい。
非イオン性界面活性剤としては、炭素数８〜２４の１価のアルコール（デシルアルコール、ドデシルアルコール、ヤシ油アルキルアルコール、オクタデシルアルコール及びオレイルアルコール等）のアルキレンオキサイド（以下、アルキレンオキサイドをＡＯと略記）付加物；
炭素数３〜３６の２〜８価のアルコール（グリセリン、トリメチロールプロパン、ペンタエリスリトール、ソルビット及びソルビタン等）のＡＯ付加物；
炭素数６〜２４のアルキルを有するアルキルフェノール（オクチルフェノール及びノニルフェノール等）のＡＯ付加物；
ポリプロピレングリコールのエチレンオキサイド付加物及びポリエチレングリコールのプロピレンオキサイド付加物；
炭素数８〜２４の脂肪酸（デカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸及びヤシ油脂肪酸等）のＡＯ付加物；
前記の３〜３６の２〜８価のアルコールの脂肪酸エステル及びそのＡＯ付加物［ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０及びＴＷＥＥＮ（登録商標）８０等］；
アルキルグルコシド（Ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−ドデカノイルスクロース及びｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド等）；並びに、
ショ糖の脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド及びこれらのＡＯ付加物（ポリオキシエチレン脂肪酸アルカノールアミド等）等が挙げられる。
これらは、１種類を単独で用いても２種以上を併用してもよい。
前記の非イオン性界面活性剤の説明におけるＡＯとしては、エチレンオキサイド、プロピレンオキサイド及びブチレンオキサイド等が挙げられ、その付加形式はブロック付加であってもランダム付加であってもよい。
また、ＡＯの付加モル数としては、アルコール、フェノール又は脂肪酸１モルあたり、１〜５０モルであることが好ましく、１〜２０モルであることが更に好ましい。
これらの非イオン性界面活性剤の内、水への溶解度及び粘度の観点から、炭素数８〜２４の１価のアルコールのエチレンオキサイド１〜５０モル（好ましくは１〜２０モル）付加物（ポリオキシエチレンアルキルエーテル及びポリオキシエチレンアルケニルエーテル等）であることが好ましい。
【００８２】
複合体（Ｆ１）を試料（Ｅ１）から分離する操作は、１〜１０回繰り返すことが好ましい。この操作を繰り返すことにより、試料（Ｅ１）から多くの複合体（Ｆ１）を分離することができる。
【００８３】
（３）目的物質解離工程
次に、複合体（Ｆ１）から目的物質（Ｄ１）を解離させて目的物質（Ｄ１）を得る。
複合体（Ｆ１）から目的物質（Ｄ１）を解離させる方法としては、特に限定されないが、コアシェル粒子（Ｃ）と、目的物質（Ｄ１）との結合を阻害する物質を加えることにより、目的物質（Ｄ１）を解離させる方法等が挙げられる。
コアシェル粒子（Ｃ）と目的物質（Ｄ１）との結合を阻害する物質としては、目的物質（Ｄ１）及び物質（Ｇ）の種類により異なるが、ｐＨ差、塩濃度差、温度差及び界面活性剤の作用により結合を阻害する物質等が挙げられる。結合を阻害できる界面活性剤としては、ラウリル硫酸塩及びドデシルベンゼンスルホン酸塩等が挙げられる。
また、複合体（Ｆ１）が、前記のカオトロピック塩を介したコアシェル粒子（Ｃ）と目的物質（Ｄ１）の錯体の場合、コアシェル粒子（Ｃ）と目的物質（Ｄ１）との結合を阻害する物質として、高濃度のＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ  Ｂｕｆｆｅｒ等を用いることができる。
なお、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ  Ｂｕｆｆｅｒは、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンが５０ｍＭ以上、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウムが１０ｍＭ以上のものであることが好ましい。
【００８４】
以上の工程を経て、目的物質（Ｄ１）を分離精製することができる。
この方法で目的物質（Ｄ１）を得る場合、複合体形成工程において、目的物質（Ｄ１）を選択的にコアシェル粒子（Ｃ）に結合させることができるので（分離対象物質（Ｄ）の分離性に優れるため）、得られる分離精製物中の目的物質（Ｄ１）の純度を高くすることができる。
【００８５】
第１の分離精製方法では、（３）目的物質解離工程の後、コアシェル粒子（Ｃ）を回収するコアシェル粒子回収工程を行ってもよい。
上記（３）目的物質解離工程において、コアシェル粒子（Ｃ）と目的物質（Ｄ１）とは解離している。
このようなコアシェル粒子（Ｃ）を回収することにより、再利用可能となる。
そのため、回収工程の後、回収されたコアシェル粒子（Ｃ）を用いて、上記（１）複合体形成工程、（２）複合体分離工程及び（３）目的物質解離工程を繰り返し行ってもよい。
前記のコアシェル粒子（Ｃ）の再利用において、再び接触させる試料（Ｅ１）は、前記の試料（Ｅ１１）であって、目的物質（Ｄ１）が残存している試料であっても良い。
コアシェル粒子（Ｃ）を再利用することにより、目的物質（Ｄ１）の分離精製のコストを抑えることができる。
【００８６】
（第２の分離精製方法）
第２の分離精製方法は、分離対象物質（Ｄ）が非目的物質（Ｄ２）であり、目的物質（Ｄ１）及び非目的物質（Ｄ２）を含む試料（Ｅ２）から非目的物質（Ｄ２）を除去することにより、目的物質（Ｄ１）を精製する方法である。
第２の分離精製方法は、（１）複合体形成工程、及び、（２）非目的物質除去工程とを含む。
以下、各工程について説明する。
【００８７】
（１）複合体形成工程
本工程では、目的物質（Ｄ１）及び非目的物質（Ｄ２）を含む試料（Ｅ２）とコアシェル粒子（Ｃ）とを接触させて、コアシェル粒子（Ｃ）と非目的物質（Ｄ２）との複合体（Ｆ２）を形成させる。
複合体（Ｆ２）は、コアシェル粒子（Ｃ）に非目的物質（Ｄ２）が直接結合して形成されていてもよい。
また、コアシェル粒子（Ｃ）が非目的物質（Ｄ２）と結合する物質（Ｇ）を有しており、複合体（Ｆ２）は、コアシェル粒子（Ｃ）に非目的物質（Ｄ２）が、物質（Ｇ）を介して結合することにより形成されていてもよい。
【００８８】
（２）非目的物質除去工程
次に、磁力で複合体（Ｆ２）を試料（Ｅ２）から分離することにより試料（Ｅ２）から非目的物質（Ｄ２）を除去し、目的物質（Ｄ１）を含む試料（Ｅ２１）を得る。
複合体（Ｆ２）は、コアシェル粒子（Ｃ）を含み、コアシェル粒子（Ｃ）は、磁性金属酸化物粒子（Ａ）を有するので、複合体（Ｆ２）は、磁力により集めることができる。
その後、残りの試料（Ｅ２１）を回収することにより、複合体（Ｆ２）を試料（Ｅ２１）から分離することができる。
このような方法としては、例えば、反応槽の外側から磁石等の磁力により複合体（Ｆ２）を集め、上澄み液を回収し、試料（Ｅ２１）を分離する方法が挙げられる。
【００８９】
また、試料（Ｅ２１）中から非目的物質（Ｄ２）が充分に除去できていない場合には、試料（Ｅ２１）を用いて、（１）複合体形成工程及び（２）非目的物質除去工程を繰り返してもよい。これにより試料（Ｅ２１）中の非目的物質（Ｄ２）がさらに除去されることになる。
【００９０】
第２の分離精製方法では、非目的物質（Ｄ２）の種類が複数であり、複数種類の非目的物質（Ｄ２）が試料（Ｅ２）に含まれていてもよい。
この場合、各非目的物質（Ｄ２）と結合できる１種又は複数種のコアシェル粒子（Ｃ）を用いることにより、試料（Ｅ２）から、複数の非目的物質（Ｄ２）を除去することができる。
【００９１】
以上の工程を経て、目的物質（Ｄ１）を含む試料（Ｅ２１）を分離精製することができる。
試料（Ｅ２１）からさらに目的物質（Ｄ１）を得る方法としては、濾過や蒸留等、公知の方法を用いることができる。
この方法で目的物質（Ｄ１）を得る場合、複合体形成工程において、コアシェル粒子（Ｃ）に選択的に非目的物質（Ｄ２）を結合させることができるので、非目的物質（Ｄ２）を除外した後の成分中の非目的物質（Ｄ２）の割合が低くなる。その結果、試料（Ｅ２１）中の目的物質（Ｄ１）の割合を高くすることができる。
【００９２】
第２の分離精製方法では、非目的物質除去工程の後、複合体（Ｆ２）からコアシェル粒子（Ｃ）を回収するコアシェル粒子回収工程を含んでいてもよい。
複合体（Ｆ２）からコアシェル粒子（Ｃ）を回収する方法としては、特に限定されないが、コアシェルシェル粒子（Ｃ）と、非目的物質（Ｄ２）との結合を阻害する物質を加えることにより、コアシェル粒子（Ｃ）を解離させる方法が挙げられる。
コアシェル粒子（Ｃ）と非目的物質（Ｄ２）との結合を阻害する物質としては、非目的物質（Ｄ２）及び物質（Ｇ）の種類により異なるが、ｐＨ差、塩濃度差、温度差及び界面活性剤の作用により結合を阻害する物質等が挙げられる。結合を阻害できる界面活性剤としては、ラウリル硫酸塩及びドデシルベンゼンスルホン酸塩等が挙げられる。
また、複合体（Ｆ２）が、前記のカオトロピック塩を介したコアシェル粒子（Ｃ）と非目的物質（Ｄ２）の錯体の場合、コアシェル粒子（Ｃ）と非目的物質（Ｄ２）との結合を阻害する物質として、高濃度のＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ  Ｂｕｆｆｅｒ等を用いることができる。
なお、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ  Ｂｕｆｆｅｒとしては、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンが５０ｍＭ以上、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウムが１０ｍＭ以上のものであることが好ましい。
【００９３】
このようなコアシェル粒子（Ｃ）を回収することにより、再利用可能となる。
そのため、コアシェル粒子回収工程の後、回収されたコアシェル粒子（Ｃ）を用いて、上記（１）複合体形成工程、及び、（２）非目的物質除去工程を繰り返し行ってもよい。
前記のコアシェル粒子（Ｃ）の再利用において、再び接触させる試料（Ｅ２）は、前記の試料（Ｅ２１）であって、非目的物質（Ｄ２）が残存している試料であっても良い。
コアシェル粒子（Ｃ）を再利用することにより、目的物質（Ｄ１）の分離精製のコストを抑えることができる。
【００９４】
本発明の分離精製方法における目的物質（Ｄ１）としては、タンパク質［アルブミン、ヘモグロビン、ミオグロビン、トランスフェリン、プロテインＡ、Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ）、脂質蛋白質、酵素、免疫グロブリン、免疫グロブリンの断片、血液凝固関連因子、抗体、抗原及びホルモン等］、
核酸［デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）等］、
薬物［抗てんかん薬、抗生物質、テオフィリン等］、
ウイルス［Ｃ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ヘパドナウイルス、アデノウイルス、ラブドウイルス、フラビウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、オソミクソウイルス等］、
細菌［Ｏ−１５７、ピロリ菌、サルモネラ菌等］、
細胞［脂肪細胞、ＥＳ細胞、肝細胞、幹細胞、内皮細胞、上皮細胞、筋細胞、内分泌細胞、外分泌細胞、神経細胞、腫瘍細胞、ＩＰＳ細胞等］等が挙げられる。
前記の酵素としては、アルカリ性ホスファターゼ、アミラーゼ、酸性ホスファターゼ、γ−グルタミルトランスフェラーゼ（γ−ＧＴＰ）、リパーゼ、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）、レニン、プロテインキナーゼ（ＰＫ）、チロシンキナーゼ等が挙げられる。
前記の脂質蛋白質としては、高比重リポ蛋白質（ＨＤＬ）、低比重リポ蛋白質（ＬＤＬ）、超低比重リポ蛋白質等が挙げられる。
前記の免疫グロブリンとしては、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等が挙げられる。
前記の免疫グロブリンの断片としては、Ｆｃ部、Ｆａｂ部、Ｆ（ａｂ）２部等が挙げられる。
前記の血液凝固関連因子としては、フィブリノーゲン、フィブリン分解産物（ＦＤＰ）、プロトロンビン、トロンビン等が挙げられる。
前記の抗体としては、抗ストレプトリジンＯ抗体、抗ヒトＢ型肝炎ウイルス表面抗原抗体（ＨＢｓ抗原）、抗ヒトＣ型肝炎ウイルス抗体、抗リュウマチ因子等が挙げられる。
前記の抗原としては、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）等が挙げられる。
前記のホルモンとしては、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、甲状腺ホルモン（ＦＴ３、ＦＴ４、Ｔ３、Ｔ４）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、エストラジオール（Ｅ２）等が挙げられる。
なお、前記の抗原及び抗体としては、癌マーカー［α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ１９−９、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）等］及び心疾患マーカー［トロポニンＴ（ＴｎＴ）、ヒト脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体Ｎ端フラグメント（ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）等］として知られている物質等も挙げられる。
上記したものの中でも、核酸、抗原、抗体及びホルモン等が好ましい。
【００９５】
本発明における非目的物質（Ｄ２）は、試料（Ｅ）中に含まれる物質の中で目的物質（Ｄ１）を除いた物質のうち少なくとも一つを意味する。即ち、非目的物質（Ｄ２）の種類は複数であっても良い。
例えば、試料（Ｅ）が血清であり、血清中に含まれる癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を目的物質（Ｄ１）とする場合、血清中に含まれる他の成分［タンパク質（アルブミン、抗体及びＣＥＡ以外の抗原等）、脂質及び無機物等］のうち少なくとも一つが非目的物質（Ｄ２）である。
【００９６】
本発明において、分離対象物質（Ｄ）は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、細胞、ウイルス、細菌及びタンパク質からなる群から選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。
【実施例】
【００９７】
以下、実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。以下、特に定めない限り、％は重量％、部は重量部を示す。【００９８】
製造例１：コアシェル粒子（Ｃ１−１）の作成
＜磁性金属酸化物粒子（Ａ）の作製＞
反応容器に塩化鉄（ＩＩＩ）６水和物１８６部、塩化鉄（ＩＩ）４水和物６８部及び水１２８８部を仕込んで溶解させて５０℃に昇温し、撹拌下温度を５０〜５５℃の保持しながら、２５重量％アンモニア水２８０部を１時間かけて滴下し、水中にマグネタイト粒子を得た。得られたマグネタイト粒子に分散剤であるオレイン酸６４部を加え、２時間撹拌を継続した。室温に冷却後、デカンテーションにより固液分離して得られたオレイン酸が吸着したマグネタイト粒子を水１０００部で洗浄する操作を３回行い、更にアセトン１０００部で洗浄する操作を２回行い、４０℃で２日間乾燥させることで、体積平均粒子径が１５ｎｍの磁性金属酸化物粒子（Ａ−１）を得た。【００９９】
＜コア層（Ｐ）の作製＞
磁性金属酸化物粒子（Ａ）８０部をテトラエトキシシラン２４０部に加えて分散し、分散液（Ｂ１）を調製した。次に、反応容器に水５０５０部、２５重量％アンモニア水溶液３５００部、エマルミン２００（三洋化成工業（株）製）４００部を加えてクリアミックス（エムテクニック（株）製）を用いて混合し溶液（Ｂ２）を得た。５０℃に昇温後、クリアミックスを回転数６，０００ｒｐｍで攪拌しながら、上記分散液（Ｂ１）を溶液（Ｂ２）に１時間かけて滴下後、５０℃で１時間反応させた。反応後、２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して微粒子の存在する上澄み液を除き、磁性金属酸化物粒子（Ａ−１）を８３重量％含有するコア層（Ｐ−１）を得た。【０１００】
＜コアシェル粒子（ＰＣ）の作製＞
反応容器にコア層（Ｐ−１）８０部、脱イオン水２５００部、２５重量％アンモニア水溶液２６０部、エタノール２５００部、テトラエトキシシラン１２００部を加えてクリアミックス（エムテクニック社製）を用いて混合し、クリアミックスの回転数６，０００ｒｐｍで攪拌しながら２時間反応させた。反応後、２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して微粒子の存在する上澄み液を除去した。遠心分離後沈殿した粒子に脱イオン水を４０００部加えて粒子を再分散させ、分散した粒子を、容器の外側から磁石を接触させることにより集磁して、上澄み液を除く操作を１０回行い、コアシェル粒子（ＰＣ−１）を得た。【０１０１】
＜コアシェル粒子（ＰＣ）の分級工程＞
得られたコアシェル粒子（ＰＣ−１）を含有する固相に水５０００部を加えて粒子を分散させて２８００ｒｐｍで１分間遠心分離後、微粒子の存在する上澄み液を除く操作を４回行った（遠心分離工程１）。
続いて、得られた固相に水５０００部を加えて粒子を分散させて６００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上澄み液を回収することで、沈降した大きな粒子径の粒子を除去する操作を１回行った（遠心分離工程２）。
更に、磁石を用いて粒子を集磁し上澄み液を除去した。その後、水５０００部を加えてコアシェル粒子を分散させた後に、磁石を用いて粒子を集磁し、上澄み液を除去する操作を１０回（洗浄工程１）行い、コアシェル粒子（Ｃ−１）を得た。【０１０２】
＜抗ＡＦＰ抗体を担持するコアシェル粒子（Ｃ１）の作製＞
１重量％γ−アミノプロピルトリエトキシシラン含有水溶液４００ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に分級後のコアシェル粒子（Ｃ−１）５０ｍｇを加え、２５℃で１時間反応させ、磁石で粒子を集磁後、液をアスピレーターで吸引除去した。次いで脱イオン水４００ｍＬを加えてコアシェル粒子を分散させ、磁石で粒子を集磁後、液をアスピレーターで吸引除去してコアシェル粒子を洗浄した。この洗浄操作を４回行った。
次いで、この洗浄後のコアシェル粒子を０．５重量％無水コハク酸含有エタノール溶液１００ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に加え、２５℃で２時間反応させた。そして、磁石で粒子を集磁後、液をアスピレーターで吸引除去した。次いで、脱イオン水４００ｍＬを加えてコアシェル粒子を分散させ、磁石で粒子を集磁後、液をアスピレーターで吸引除去してコアシェル粒子を洗浄した。この洗浄操作を３回行った。
次いで、この洗浄後のコアシェル粒子を０．５重量％塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）及び０．５重量％Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）含有水溶液４００ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に加え、２５℃で１時間反応させた。そして、磁石で粒子を集磁後、液をアスピレーターで吸引除去した。
次に、２５ｍＭモルホリノエタンスルホン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を２００ｍＬ加えて粒子を再分散させた後、再び磁石で粒子を集磁し、液をアスピレーターで吸引除去するコアシェル粒子の洗浄操作を実施した。この洗浄操作を３回行った。
更にこの洗浄後のコアシェル粒子を、抗ＡＦＰポリクローナル抗体（ダコ・サイトメーション（株）より購入）を２０μｇ／ｍＬの濃度で含む１００ｍＭモルホリノエタンスルホン酸緩衝液（ｐＨ５．０）４００ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に加え、２５℃で３時間反応させた。反応後、磁石で粒子を集磁後、液をアスピレーターで吸引除去した。
次に、２５ｍＭモルホリノエタンスルホン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を２００ｍＬ加えて粒子を再分散させた後、再び磁石で粒子を集磁し、液をアスピレーターで吸引除去するコアシェル粒子の洗浄操作を実施した。この洗浄操作を３回行い、コアシェル粒子（Ｃ１−１）を得た。これを０．１重量％のＢｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ  ＣＥ５１０（ＪＳＲ（株）製）を含有する０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）５０ｍＬに浸漬し４℃で保存した。【０１０３】
製造例２〜４、製造例９〜１１及び製造例１５〜１６：コアシェル粒子（Ｃ１−２）〜（Ｃ１−４）、（Ｃ１−９）〜（Ｃ１−１１）及び（Ｃ１−１５）〜（Ｃ１−１６）の作成
製造例１の「コアシェル粒子（ＰＣ）の分級工程」において、表１に記載の条件とする以外は製造例１と同様の操作を行い、コアシェル粒子（Ｃ１−２）〜（Ｃ１−４）、（Ｃ１−９）〜（Ｃ１−１１）及び（Ｃ１−１５）〜（Ｃ１−１６）を得た。【０１０４】
製造例５：コアシェル粒子（Ｃ１−５）の作成
製造例１の「コアシェル粒子（ＰＣ）の作製」において、テトラエトキシシラン１２００部に代えてテトラエトキシシランを１５部用い、また「コアシェル粒子（ＰＣ）の分級工程」において、表１に記載の条件とした以外は、製造例１と同様の操作を行い、コアシェル粒子（Ｃ１−５）を得た。【０１０５】
製造例６：コアシェル粒子（Ｃ１−６）の作成
製造例１の「コアシェル粒子（ＰＣ）の作製」において、テトラエトキシシラン１２００部に代えてテトラエトキシシランを１５０部用い、また「コアシェル粒子（ＰＣ）の分級工程」において、表１に記載の条件とした以外は、製造例１と同様の操作を行い、コアシェル粒子（Ｃ１−６）を得た。【０１０６】
製造例７：コアシェル粒子（Ｃ１−７）の作成
製造例１の「コアシェル粒子（ＰＣ）の作製」において、テトラエトキシシラン１２００部に代えてテトラエトキシシランを３０００部用い、また「コアシェル粒子（ＰＣ）の分級工程」において、表１に記載の条件とした以外は、製造例１と同様の操作を行い、コアシェル粒子（Ｃ１−７）を得た。【０１０７】
製造例８：コアシェル粒子（Ｃ１−８）の作成
製造例１の「コアシェル粒子（ＰＣ）の作製」において、テトラエトキシシラン１２００部に代えてテトラエトキシシランを１００００部用い、また「コアシェル粒子（ＰＣ）の分級工程」において、表１に記載の条件とした以外は、製造例１と同様の操作を行い、コアシェル粒子（Ｃ１−８）を得た。【０１０８】
製造例１２：コアシェル粒子（Ｃ１−１２）の作成
製造例２の「コア層（Ｐ）の作製」の作成において、磁性金属酸化物粒子（Ａ）８０部に代えて、磁性金属酸化物粒子（Ａ）６０部用いた以外は、製造例２と同様の操作を行い、コアシェル粒子（Ｃ１−１２）を得た。【０１０９】
製造例１３：コアシェル粒子（Ｃ１−１３）の作成
製造例２の「コア層（Ｐ）の作製」の作成において、磁性金属酸化物粒子（Ａ）８０部に代えて、磁性金属酸化物粒子（Ａ）１００部用いた以外は、製造例２と同様の操作を行い、コアシェル粒子（Ｃ１−１３）を得た。【０１１０】
製造例１４：コアシェル粒子（Ｃ１−１４）の作成
製造例２の「コアシェル粒子（ＰＣ）の作製」の作成において、テトラエトキシシラン１２００部に代えてテトラエトキシシランを６００部用いた以外は、製造例２と同様の操作を行い、コアシェル粒子（Ｃ１−１４）を得た。【０１１１】
比較製造例１：比較用の粒子（Ｃ１’−１）の作成
製造例１の「コア層（Ｐ）の作製」において、エマルミン２００の代わりにＮＳＡ−１７（三洋化成工業（株）製）を使用し、また、製造例１の「コアシェル粒子（ＰＣ）の分級工程」において、表１に記載の条件とする以外は、製造例１と同様の操作を行い、比較用の粒子（Ｃ１’−１）を得た。【０１１２】
比較製造例２：比較用の粒子（Ｃ１’−２）の作成
製造例１の「コア層（Ｐ）の作製」において、エマルミン２００の代わりにＮＳＡ−１７（三洋化成工業（株）製）を使用し、また、製造例１の「コアシェル粒子（ＰＣ）の分級工程」において、表１に記載の条件とする以外は製造例１と同様の操作を行い、比較用の粒子（Ｃ１’−２）を得た。【０１１３】
比較製造例３：比較用の粒子（Ｃ１’−３）の作成
製造例１で得たコア層（Ｐ−１）を比較用の粒子（ＰＣ’−１）として、以下の操作を実施した。
＜粒子（ＰＣ’）の分級工程＞
製造例１の「コア層（Ｐ）の作製」の操作で得た磁性シリカ粒子［粒子（ＰＣ’−１）］全量に水５０００部を加えて粒子を分散させて１６００ｒｐｍで１分間遠心分離後、微粒子の存在する上澄み液を除く操作を２０回（遠心分離工程１）行った（遠心分離工程１）。
続いて、得られた固相に水５０００部を加えて粒子を分散させて８００ｒｐｍで１分間遠心分離することにより、大きな粒子径の粒子を沈降させて除去する操作を１回行った（遠心分離工程２）。
更に、磁石を用いて粒子を集磁し上澄み液を除去した。その後、水５０００部を加えて粒子を分散させた後に、磁石を用いて粒子を集磁し、上澄み液を除去する操作を１０回（洗浄工程１）行い、粒子（Ｃ’−３）を得た。【０１１４】
＜抗ＡＦＰ抗体を担持する粒子（Ｃ１’）の作製＞
１重量％γ−アミノプロピルトリエトキシシラン含有水溶液４００ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に分級後の粒子（Ｃ’−３）５０ｍｇを加え、２５℃で１時間反応させ、磁石で粒子を集磁後、液をアスピレーターで吸引除去した。次いで脱イオン水４００ｍＬを加えて粒子を分散させ、磁石で粒子を集磁後、液をアスピレーターで吸引除去して粒子を洗浄した。この洗浄操作を４回行った。
次いで、この洗浄後の粒子を０．５重量％無水コハク酸含有エタノール溶液１００ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に加え、２５℃で２時間反応させた。そして、磁石で粒子を集磁後、液をアスピレーターで吸引除去した。次いで、脱イオン水４００ｍＬを加えて粒子を分散させ、磁石で粒子を集磁後、液をアスピレーターで吸引除去して粒子を洗浄した。この洗浄操作を３回行った。
次いで、この洗浄後の粒子を０．５重量％塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）及び０．５重量％Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）含有水溶液４００ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に加え、２５℃で１時間反応させた。そして、磁石で粒子を集磁後、液をアスピレーターで吸引除去した。
次に、２５ｍＭモルホリノエタンスルホン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を２００ｍＬ加えて粒子を再分散させた後、再び磁石で粒子を集磁し、液をアスピレーターで吸引除去する粒子の洗浄操作を実施した。この洗浄操作を３回行った。
更にこの洗浄後の粒子を、抗ＡＦＰポリクローナル抗体（ダコ・サイトメーション（株）より購入）を２０μｇ／ｍＬの濃度で含む１００ｍＭモルホリノエタンスルホン酸緩衝液（ｐＨ５．０）４００ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に加え、２５℃で３時間反応させた。反応後、磁石で粒子を集磁し、液をアスピレーターで吸引除去した。
次に、２５ｍＭモルホリノエタンスルホン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を２００ｍＬ加えて粒子を再分散させた後、再び磁石で粒子を集磁し、液をアスピレーターで吸引除去する粒子の洗浄操作を実施した。この洗浄操作を３回行い、比較用の粒子（Ｃ１’−３）を得た。これを０．１重量％のＢｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ  ＣＥ５１０（ＪＳＲ（株）製）を含有する０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）５０ｍＬに浸漬し４℃で保存した。【０１１５】
比較製造例４：比較用の粒子（Ｃ１’−４）の作成
比較製造例４の「粒子（ＰＣ’）の分級工程」において、表１に記載の条件とする以外は比較製造例１と同様にして、粒子（Ｃ１’−４）を得た。【０１１６】
製造例１〜１６及び比較製造例１〜４で得た磁性金属酸化物粒子（Ａ−１）、コアシェル粒子（Ｃ１−１）〜（Ｃ１−１６）及び比較用の粒子（Ｃ１’−１）〜（Ｃ１’−４）について、以下の通り、評価した。【０１１７】
＜磁性金属酸化物粒子（Ａ）の体積平均粒子径の測定方法＞
走査型電子顕微鏡（型番：ＪＳＭ−７０００Ｆ、メーカー名：日本電子株式会社）を用いて、任意の２００個の磁性金属酸化物粒子（Ａ）を観察して粒子径を測定し、体積平均粒子径を求めた。結果は表１に記載した。【０１１８】
＜磁性金属酸化物粒子（Ａ）の重量割合の測定方法＞
製造例１の「コア層（Ｐ）の作製」の操作で得たコア層（Ｐ）の任意の２０個について、走査型電子顕微鏡（型番：ＪＳＭ−７０００Ｆ、メーカー名：日本電子株式会社）で観察し、エネルギー分散型Ｘ線分光装置（型番：ＩＮＣＡ  Ｗａｖｅ／Ｅｎｅｒｇｙ、メーカー名：オックスフォード社）により磁性金属酸化物粒子（Ａ）の含有量を測定してその平均値を含有量Ｓとした。また、同測定にてシリカの含有量を測定しその平均値を含有量Ｔとした。以下の計算式にて、磁性金属酸化物粒子（Ａ）の重量割合を求めた。結果は表１に記載した。
磁性金属酸化物粒子（Ａ）の重量割合（重量％）＝［（Ｓ）／（Ｓ＋Ｔ）］×１００【０１１９】
＜コアシェル粒子（Ｃ１）の体積平均粒子径及び変動係数の測定方法＞
コアシェル粒子（Ｃ１−１）〜（Ｃ１−１６）及び比較用の粒子（Ｃ１’−１）〜（Ｃ１’−４）の体積平均粒子径及び変動係数は、各製造例で得たコアシェル粒子を含有するリン酸緩衝液を試料とし、レーザー回折・散乱式粒子径分布測定装置（マイクロトラック・ベル株式会社製「マイクロトラックＭＴ３３００」）を用いて測定した。結果は表１に記載した。【０１２０】
＜シェル層（Ｑ）の平均厚みの測定方法＞
コアシェル粒子（ＰＣ）の分級工程で得たコアシェル粒子（Ｃ）又は粒子（ＰＣ’）の分級工程で得た比較用の粒子（Ｃ’）をエポキシ樹脂に包埋してミクロトームで切断した断面を透過型電子顕微鏡（型番「Ｈ−７１００」、（株）日立製作所製）で観察し、コアシェル粒子（Ｃ）（又は比較用の粒子（Ｃ’））の膜厚が最も厚い部分と最も薄い部分の平均値から膜厚を求めた。更に任意の１００個のコアシェル粒子（Ｃ）（又は比較用の粒子（Ｃ’））について上記と同様にして膜厚を求め、その平均値をシェル層（Ｑ）の平均厚みとした。結果は表１に記載した。【０１２１】
＜実施例１〜１６及び比較例１〜４：コアシェル粒子（Ｃ）を用いたタンパク質の分離＞
製造例１〜１６で得たコアシェル粒子（Ｃ１−１）〜（Ｃ１−１６）及び比較製造例１〜４で得た比較用の粒子（Ｃ１’−１）〜（Ｃ１’−４）を用いて、以下の方法で、試料（Ｅ）中の分離対象物質（Ｄ）［タンパク質］の分離を実施した。
また、分離操作後に得られた溶液について、以下の方法で「全タンパク質濃度」、「ＡＦＰ濃度」及び「ＡＦＰ純度」を評価した。【０１２２】
＜分離操作：ヒト血清からのＡＦＰの抽出＞
［コアシェル粒子（Ｃ１）の回収］
製造例で得たコアシェル粒子（Ｃ１）を含む０．０２Ｍリン酸緩衝液５ｍＬについて、容器の外側から磁石を接触させることにより、コアシェル粒子（Ｃ１）を集磁し、そのまま上澄み液を除去することにより、コアシェル粒子（Ｃ１）を回収した。【０１２３】
［複合体形成工程］
次に、目的物質としてαフェトプロテイン（ＡＦＰ）を１６６０ｎｇ／ｍＬ含むヒト血清液１０ｍＬを、上澄み液を除去したコアシェル粒子（Ｃ１）に加え転倒攪拌を１時間行い、コアシェル粒子（Ｃ１）とＡＦＰとの複合体（Ｃ１−ＡＦＰ）を形成させた。【０１２４】
［複合体分離工程］
反応後、容器の外側から磁石を接触させることにより、複合体（Ｃ１−ＡＦＰ）を集磁し、そのまま上澄み液を除去することにより、複合体（Ｃ１−ＡＦＰ）を回収した。【０１２５】
［目的物質解離工程］
得られた複合体（Ｃ１−ＡＦＰ）に、０．１重量％サンノニックＳＳ−１２０（三洋化成工業（株）製）を含む生理食塩水１ｍＬを加えて粒子を分散させた後に、磁石で集磁し、上澄み液を除く洗浄操作を２回行った。
次に、０．５重量％ラウリル硫酸ナトリウム水溶液０．２５ｍＬを加え１時間転倒攪拌し、複合体（Ｃ１−ＡＦＰ）からＡＦＰを解離させた。磁石でコアシェル粒子（Ｃ１）を集磁し、上澄み液（ＸＡ−１）をピペットで取り出した。集磁したコアシェル粒子（Ｃ１）に再び０．５重量％ラウリル硫酸ナトリウム水溶液０．２５ｍＬを加え１時間転倒攪拌した後、集磁して上澄み液（ＸＢ−１）をピペットで取り出した。上澄み液（ＸＡ−１）と上澄み液（ＸＢ−１）を混合し、ＡＦＰを含む溶液（Ｘ−１）を得た。【０１２６】
＜全タンパク質濃度＞
紫外可視分光光度計ＵＶ−１８００（株式会社島津製作所製）を用いて、ＡＦＰを含む溶液（Ｘ−１）の吸光度（光路長１０ｍｍ）を測定し、下記式より全タンパク質濃度を算出した（２８０ｎｍにおける吸光度が１．０の場合、全タンパク質濃度が１ｍｇ／ｍＬであるとした。）。結果を表２に記載した。
全タンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）＝２８０ｎｍにおける吸光度（光路長１０ｍｍ）【０１２７】
＜ＡＦＰ濃度＞
ＡＦＰを含む溶液（Ｘ−１）をスフィアライト検体希釈液［富士フイルム和光純薬（株）製］で１０００倍希釈し、自動化学発光酵素免疫分析装置「ＳｐｈｅｒｅＬｉｇｈｔ  Ｗａｋｏ」［富士フイルム和光純薬（株）製］を用いてＡＦＰ濃度を測定した。得られた測定値を１０００倍して溶液（Ｘ−１）のＡＦＰ濃度を算出した。結果を表２に記載した。【０１２８】
＜ＡＦＰ純度＞
ＡＦＰ純度を下記式により算出した。結果は表２に記載した。
ＡＦＰ純度（％）＝ＡＦＰ濃度／全タンパク質濃度×１００【０１２９】
【表１】
2019240045.tif 000002
【０１３０】
【表２】
2019240045.tif 000003
【０１３１】
表２の通り、本発明の方法で得た分離対象物質（Ｄ）［ＡＦＰ］を含む溶液は、比較用の粒子を使用する方法で得た分離対象物質（Ｄ）を含む溶液と比較して、分離対象物質（Ｄ）以外の物質の含有量が少なく、純度の高い溶液であることがわかる。【０１３２】
＜実施例１７〜２３及び比較例５：コアシェル粒子（Ｃ）を用いたＤＮＡの分離＞
上記の製造例のコアシェル粒子（ＰＣ）の分級工程又はコアシェル粒子（ＰＣ’）の分級工程で得られるコアシェル粒子（Ｃ−１）〜（Ｃ−４）、コアシェル粒子（Ｃ−１１）及び比較用の粒子（Ｃ’−２）を用いて、以下の方法で、コアシェル粒子（Ｃ）の体積平均粒子径及び変動係数を測定し、また、試料（Ｅ）中の分離対象物質（Ｄ）［ＤＮＡ］の分離を実施した。【０１３３】
＜コアシェル粒子（Ｃ）の体積平均粒子径及び変動係数の測定方法＞
コアシェル粒子（Ｃ−１）〜（Ｃ−４）、コアシェル粒子（Ｃ−１１）及び比較用の粒子（Ｃ’−２）の体積平均粒子径及び変動係数は、各製造例で得たコアシェル粒子を含有するリン酸緩衝液を試料とし、レーザー回折・散乱式粒子径分布測定装置（マイクロトラック・ベル株式会社製「マイクロトラックＭＴ３３００」）を用いて測定した。結果は表３に記載した。【０１３４】
［コアシェル粒子（Ｃ）の回収］
１）コアシェル粒子２９６ｍｇをガラス製容器に入れ、１０ｍＬの純水をサンプル瓶に加えた後にボルテックス・ミキサーで撹拌することで、コアシェル粒子（Ｃ）の分散液を得た。
２）１．５ｍＬマイクロチューブに６００μＬのコアシェル粒子（Ｃ）の分散液を採取し、上澄み液を除去した。【０１３５】
［複合体形成工程］
３）ＤＮＡ水溶液〔ＤＮＡ［デオキシリボ核酸、サケ精液由来、富士フイルム和光純薬（株）製］を２．４０ｍｇ／ｍｌの濃度で、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ  Ｂｕｆｆｅｒ［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン：１０ｍＭ、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム：２ｍＭ、ｐＨ７．８６］に溶解させた水溶液〕１５０μｌ及びＢＳＡ水溶液〔ＢＳＡを２．４０ｍｇ／ｍｌの濃度で、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ  Ｂｕｆｆｅｒ［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン：１０ｍＭ、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム：２ｍＭ、ｐＨ７．８６］に溶解させた水溶液〕１５０μｌの混合液を試料（Ｅ）［ＤＮＡを目的物質（Ｄ１）として、ＢＳＡを不純物として含有する試料］として、２）で得たマイクロチューブに加えた。
４）カオトロピック塩水溶液〔表３に記載した種類のカオトロピック塩を６Ｍとなるように、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ  Ｂｕｆｆｅｒ［（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン：１０ｍＭ、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム：２ｍＭ、ｐＨ７．８６］で溶解させた水溶液〕９００μｌを、３）で得たマイクロチューブに加えた。
５）振とう培養器を用いて、４）で得たマイクロチューブを振とうし（３７℃、３５０ｒｐｍ、２．０ｈｒ）、複合体（Ｃ−ＤＮＡ）を得た。【０１３６】
［複合体分離工程］
６）５）で得たマイクロチューブの上澄み液を除去した。次いで、７０体積％エタノール水溶液９００μＬを加えて粒子を分散させた後に、容器の外側から磁石を接触させることにより、複合体（Ｃ−ＤＮＡ）を集磁し、そのまま上澄み液を除去する洗浄操作を１０回繰り返した。これにより、複合体（Ｃ−ＤＮＡ）を回収した。【０１３７】
［目的物質解離工程］
７）その後、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ  Ｂｕｆｆｅｒ［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン：５０ｍＭ、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム：１０ｍＭ、ｐＨ７．８６］を、６）で得たマイクロチューブに４００μＬ加え、５分ごとに１５秒間ボルテックス・ミキサーで撹拌する操作を３回繰り返すことで、複合体（Ｃ−ＤＮＡ）からＤＮＡ等を解離させた。その後、磁石でコアシェル粒子（Ｃ）を集磁し、上澄み液をピペットで取り出し、ＤＮＡ等を含有する溶液を回収した。【０１３８】
＜ＤＮＡ濃度及びＢＳＡ濃度の測定＞
［測定前処理］
７）の操作で回収した溶液１００μＬを、脱塩・バッファー交換用自然落下カラム（ＰＤ−１０、ＧＥヘルスケア社製）に全量滴下した後、純水を溶出液として用いて、ＤＮＡ濃度測定用及びＢＳＡ濃度測定用の試料を得た。
具体的には、まず、７）の操作で回収した溶液１００μＬを前記のカラムに添加した。その後、溶出液として純水１，１００μＬをカラムに添加し、自然落下して得られる溶出液を、マイクロチューブで回収する操作を６回繰り返した。なお、回収に用いるマイクロチューブは毎回交換した。
ＤＮＡが溶出される３〜６回目の操作時に得られるマイクロチューブ中の溶液を、２００μＬずつ抜き取り、等積混合を行って得られたＤＮＡ溶液の濃度を以下の方法で測定した。
同様に、ＢＳＡが溶出される３〜６回目の操作時に得られるマイクロチューブ中の溶液２００μＬずつを抜き取り、等積混合を行って得られたＢＳＡ溶液の濃度を以下の方法で測定した。【０１３９】
［ＤＮＡ濃度の測定］
分光光度計を用い２６０ｎｍにおける吸光度を測定した。
濃度既知のＤＮＡ［デオキシリボ核酸、サケ精液由来、富士フイルム和光純薬（株）製］標準液を用いた場合の吸光度との関係を示す検量線を作製し、検量線を用いて、上記ＤＮＡの濃度を求めた。この値を元に、７）の操作で回収した溶液中のＤＮＡ濃度を換算して求めた値を表３に記載する。【０１４０】
［ＢＳＡ濃度の測定］
Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡＴＭ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（ＴＨＥＲＭＯ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）のＲｅａｇｅｎｔ  Ａ溶液とＲｅａｇｅｎｔ  Ｂ溶液とＲｅａｇｅｎｔ  Ｃ溶液とを２５：２４：１の比率で混合し、混合液（Ｍ）を得た。
ＢＳＡ溶液１００μＬに混合液（Ｍ）を１００μＬ加え、３７℃で２時間静置した。
２時間後に、静置後の混合物を９６穴プレート（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製）に１穴につき１００μＬを分注し、次いで５６２ｎｍの吸光度でプレートリーダー（コロナ電気株式会社製ＭＴＡ−３２）を用いて吸光度を測定した。
濃度既知のＢＳＡ標準液を用いた場合の吸光度との関係を示す検量線を作製し、検量線を用いて、上記ＢＳＡの濃度を求めた。この値を元に、７）の操作で回収した溶液中のＢＳＡ濃度を換算して求めた値を表３に記載する。【０１４１】
【表３】
2019240045.tif 000004
【０１４２】
表３の通り、本発明の方法で得た分離対象物質（Ｄ）［ＤＮＡ］を含む溶液は、比較用の粒子を使用する方法で得た分離対象物質（Ｄ）を含む溶液と比較して、分離対象物質（Ｄ）以外の物質（ＢＳＡ）の含有量が少なく、純度の高い溶液であることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【０１４３】
本発明のコアシェル粒子を用いた分離対象物質の分離方法は、タンパク質（抗体及び抗原等）の精製、ＲＮＡ及びＤＮＡの精製、並びに、細菌及びウイルスの除去等に幅広く適用でき、医薬品等の原料の精製、診断等における検査対象物質の抽出に応用できる点で有用である。
特に、前記の分離対象物質（Ｄ）が目的物質（Ｄ１）である場合は、最終的に得られる精製物の純度が高いため、特に、医薬品等の原料の精製用途に極めて適している。
【国際調査報告】
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2019240045.tif 000006