(57)【要約】  高感度で抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法の効果を予測可能にする新規マーカー及びその用途を提供することを課題とする。ロイシンリッチリピート含有免疫グロブリンスーパーファミリー（ISLR）からなる、抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法の効果を予測するバイオマーカーが提供される。
2019159825.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロイシンリッチリピート含有免疫グロブリンスーパーファミリー（ISLR）からなる、抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法の効果を予測するバイオマーカー。
【請求項２】
被検者由来の腫瘍組織中の細胞におけるISLRの発現を指標にすることを特徴とする、抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法の効果を予測する方法。
【請求項３】
前記細胞が、腫瘍細胞以外の有核細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が線維芽細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
以下のステップ（１）〜（３）を含む、請求項２〜４のいずれか一項に記載の効果予測方法：
（１）被検者から採取された腫瘍組織検体を用意するステップ、
（２）前記腫瘍組織検体中の細胞におけるISLRの発現を調べるステップ、
（３）ステップ（２）の結果に基づき、抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法の効果を予測するステップであって、ISLRの高い発現が、抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法に効果を期待できることを表す、ステップ。
【請求項６】
ステップ（２）において、ISLR陽性細胞の数、及び／又はISLR陽性細胞とISLR陰性細胞の比率に基づき、ISLRの発現レベルが決定される、請求項５に記載の効果予測方法。
【請求項７】
以下のステップ（４）を更に含む、請求項５又は６に記載の効果予測方法：
（４）予測結果に基づき、効果を期待できない被検者を治療対象から除外するステップ。
【請求項８】
以下のステップ（４’）を更に含む、請求項５又は６に記載の効果予測方法：
（４’）予測結果に基づき、被検者の治療方針を決定又は変更するステップ。
【請求項９】
前記被検者が悪性黒色腫、非小細胞性肺癌、腎細胞癌、頭頚部癌、胃癌、ホジキンリンパ腫、尿路上皮癌、乳癌、膵癌又は大腸癌の患者である、請求項２〜８のいずれか一項に記載の効果予測方法。
【請求項１０】
ISLR検出用試薬を含む、抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法の効果予測用キット。
【請求項１１】
前記ISLR検出用試薬がin situハイブリダイゼーションプローブである、請求項１０に記載の効果予測用キット。
【請求項１２】
前記ISLR検出用試薬が抗ISLR抗体である、請求項１０に記載の効果予測用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗PD-1(programmed cell death protein-1)抗体／抗ＰＤ−Ｌ１(Programmed death-ligand 1)抗体療法の効果の予測に有用なバイオマーカー及びその用途に関する。本出願は、２０１８年２月１４日に出願された日本国特許出願第２０１８−０２４５５６号に基づく優先権を主張するものであり、当該特許出願の全内容は参照により援用される。
【背景技術】
【０００２】
抗PD-1抗体療法は悪性黒色腫、非小細胞性肺癌、腎細胞癌、頭頚部癌、胃癌、古典的ホジキンリンパ腫、尿路上皮癌、悪性胸膜中皮腫といった多くの悪性疾患の治療に用いられている（例えば、非特許文献１、２を参照）。また、抗PD-L1抗体療法もメルケル細胞癌、非小細胞肺癌の治療に用いられている。多くの治験が進行中であり、適応の範囲は今後ますます拡大していくと思われる。しかしながら、経済毒性が高いことや、抗PD-1抗体薬／抗PD-L1抗体薬に反応しない患者（ノンレスポンダー）が存在すること等の問題があり、治療開始前に抗PD-1抗体薬／抗PD-L1抗体薬による効果を予測するマーカーの開発が急務となっている。【０００３】
現在、商業ベースの効果予測用マーカーとして、非小細胞性肺癌に対してペムブロリズマブを使用する際にコンパニオン診断薬PD-L1（Programmed death-ligand 1）が用いられているが、実際の作用機序が当初の想定と異なることが証明され（非特許文献３）、臨床で使用するバイオマーカーとしてPD-L1は不適切である可能性が強まってきている。実際、PD-L1の発現の有無に関わらず抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法が効果を認める症例もあり（非特許文献４、５、９）、また、偽陰性・偽陽性の問題もある。【０００４】
現在検討されているマーカーとして腫瘍浸潤リンパ球（TILs）、Immunoscore（登録商標）（非特許文献８を参照）、腫瘍の遺伝子変異総量（TMB）、変異関連ネオアンティジェン（MANAs）、血清マーカー等があるが、手技が煩雑であることや費用が高いこと、或いは適用対象が限定されることなどの問題を抱え、2018年12月に高頻度マイクロサテライト不安定性(MSI-High)を有する固形がんに対してペムブロリズマブが承認された他には実用化には至っていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１７／０２２４７２号パンフレット
【特許文献２】米国特許出願公開第２００５／０２６０６３９  Ａ１号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】オプジーボ（登録商標）点滴静注20mg／オプジーボ（登録商標）点滴静注100mg 添付文書 改訂第21版（2018年11月）
【非特許文献２】キイトルーダ（登録商標）点滴静注20mg／キイトルーダ（登録商標）点滴静注100mg 添付文書 改訂第9版（2018年12月）
【非特許文献３】Hui E, Cheung J, Zhu J, Su X, Taylor MJ, Wallweber HA, Sasmal DK, Huang J, Kim JM, Mellman I, et al. (2017) T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition. Science 355(6332), 1428-1433.
【非特許文献４】Brahmer J, Reckamp KL, Baas P, Crino L, Eberhardt WE, Poddubskaya E, Antonia S, Pluzanski A, Vokes EE, Holgado E, et al. (2015) Nivolumab versus docetaxel in advanced squamous-cell non small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine 373, 123-135.
【非特許文献５】Kang YK, Boku N, Satoh T, Ryu MH, Chao Y, Kato K, Chung HC, Chen JS, Muro K, Kang WK, et al. (2017) Nivolumab in patients with advanced gastric or gastro-oesophageal junction cancer refractory to, or intolerant of, at least two previous chemotherapy regimens (ONO-4538-12, ATTRACTION-2): a randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 3 trial. Lancet 390(10111), 2461-2471.
【非特許文献６】Walter K, Omura N, Hong SM, Griffith M, Vincent A, Borges M, Goggins M. (2010) Overexpression of smoothened activates the sonic hedgehog signaling pathway in pancreatic cancer-associated fibroblasts. Clinical Cancer Research. 16(6), 1781-9.
【非特許文献７】Allinen M, Beroukhim R, Cai L, Brennan C, Lahti-Domenici J, Huang H, Porter D, Hu M, Chin L, Richardson A, et al. (2004) Molecular characterization of the tumor microenvironment in breast cancer. Cancer cell. 6(1), 17-32.
【非特許文献８】Galon J, Costes A, Sanchez-Cabo F, Kirilovsky A, Mlecnik B, Lagorce-Pages C, Tosolini M, Camus M, Berger A, Wind P, et al. (2006). Type, density, and location of immune cells within human colorectal tumors predict clinical outcome. Science. 313(5795), 1960-4.
【非特許文献９】Fehrenbacher L, Spira A, Ballinger M, Kowanetz M, Vansteenkiste J, Mazieres J, Park K, Smith D, Artal-Cortes A, Lewanski C, Braiteh F, Waterkamp D, He P, Zou W, Chen DS, Yi J, Sandler A, Rittmeyer A; POPLAR Study Group. (2016). Atezolizumab versus docetaxel for patients with previously treated non-small-cell lung cancer (POPLAR): a multicentre, open-label, phase 2 randomised controlled trial. Lancet. 387(10030), 1837-46
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
以上の通り、抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法の効果を予測できる新規バイオマーカーの登場が切望されている。そこで本発明は、高感度で抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法の効果を予測可能にする新規マーカー及びその用途を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決すべく研究を進める中、本発明者らはロイシンリッチリピート含有免疫グロブリンスーパーファミリー（ISLR：immunoglobulin superfamily containing leucine-rich repeat）に着眼した。肺癌、乳癌、膵癌などの癌関連線維芽細胞（腫瘍組織の間質細胞の一つ）においてISLRが発現していることが知られているが（特許文献１、２、非特許文献６、７）、癌関連線維芽細胞におけるISLRの発現の意義、その機能などは不明である。そこで、肺癌臨床検体を用い、癌関連線維芽細胞におけるISLRの発現と抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法の効果との関係に注目して各種実験を行うことにした。詳細な検討の結果（後述の実施例を参照）、ISLRの発現と抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法の効果との間に高い相関が認められた。即ち、抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法の効果を予測するマーカーとして、癌関連線維芽細胞におけるISLRの発現が極めて有用であることが判明した。尚、ISLRの発現と治療効果の予測との関係に関して、抗PD-1抗体療法と抗PD-L1抗体療法は同様の傾向を示した（図５−１〜図８−２）。【０００９】
抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法が悪性黒色腫、非小細胞性肺癌、腎細胞癌、頭頚部癌、胃癌、ホジキンリンパ腫、尿路上皮癌、悪性胸膜中皮腫などに広く適用されること、これらの癌／悪性腫瘍の発生・進展等に一定の共通性が認められること、更には肺癌、乳癌、膵癌、大腸癌の癌関連線維芽細胞でISLRの発現が認められることからすれば、抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法が適用され得る様々な癌／悪性腫瘍においても同様にISLRが効果予測マーカーとして機能することを合理的に期待できる。【００１０】
以下の発明は上記の成果及び考察に基づく。
［１］ロイシンリッチリピート含有免疫グロブリンスーパーファミリー（ISLR）からなる、抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法の効果を予測するバイオマーカー。
［２］被検者由来の腫瘍組織中の細胞におけるISLRの発現を指標にすることを特徴とする、抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法の効果を予測する方法。
［３］前記細胞が、腫瘍細胞以外の有核細胞である、［２］に記載の方法。
［４］前記細胞が線維芽細胞である、［２］に記載の方法。
［５］以下のステップ（１）〜（３）を含む、［２］〜［４］のいずれか一項に記載の効果予測方法：
（１）被検者から採取された腫瘍組織検体を用意するステップ、
（２）前記腫瘍組織検体中の細胞におけるISLRの発現を調べるステップ、
（３）ステップ（２）の結果に基づき、抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法の効果を予測するステップであって、ISLRの高い発現が、抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法に効果を期待できることを表す、ステップ。
［６］ステップ（２）において、ISLR陽性細胞の数、及び／又はISLR陽性細胞とISLR陰性細胞の比率に基づき、ISLRの発現レベルが決定される、［５］に記載の効果予測方法。
［７］以下のステップ（４）を更に含む、［５］又は［６］に記載の効果予測方法：
（４）予測結果に基づき、効果を期待できない被検者を治療対象から除外するステップ。
［８］以下のステップ（４’）を更に含む、［５］又は［６］に記載の効果予測方法：
（４’）予測結果に基づき、被検者の治療方針を決定又は変更するステップ。
［９］前記被検者が悪性黒色腫、非小細胞性肺癌、腎細胞癌、頭頚部癌、胃癌、ホジキンリンパ腫、尿路上皮癌、乳癌、膵癌又は大腸癌の患者である、［２］〜［８］のいずれか一項に記載の効果予測方法。
［１０］ISLR検出用試薬を含む、抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法の効果予測用キット。
［１１］前記ISLR検出用試薬がin situハイブリダイゼーションプローブである、［１０］に記載の効果予測用キット。
［１２］前記ISLR検出用試薬が抗ISLR抗体である、［１０］に記載の効果予測用キット。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】肺癌の手術検体を用いた腫瘍間質におけるISLRの発現。RNA in situハイブリダイゼーション法によってISLRの発現を調べた。黒矢頭で示した細胞がISLR発現細胞である。この検体はISLRの発現が高いものである。
【図２】肺癌の手術検体を用いた腫瘍間質におけるISLRの発現。RNA in situハイブリダイゼーション法によってISLRの発現を調べた。黒矢頭で示した細胞がISLR発現細胞である。白矢頭で示した細胞は正常組織でも観察される炭粉貪食細胞である。この検体はISLRの発現が低いものである。
【図３】肺癌を診断するときの生検検体を用いた腫瘍間質におけるISLRの発現。RNA in situハイブリダイゼーション法によってISLRの発現を調べた。黒矢頭で示した細胞がISLR発現細胞である。この検体はISLRの発現が高いものである。
【図４】肺癌を診断するときの生検検体を用いた腫瘍間質におけるISLRの発現。RNA in situハイブリダイゼーション法によってISLRの発現を調べた。この検体にはISLR発現細胞は確認できなかった。
【図５−１】腫瘍間質におけるISLRの発現の高低で患者（抗PD-１抗体療法を実施した患者のみ）を2群に区別した表である。ISLR発現レベルの高低の2群間には、年齢層の偏り、性別の偏り、サブタイプの偏り、EGFR変異陽性肺癌の偏り、PD-L1の発現レベルの偏りは認めなかった。但し、ISLRの発現が高い群が、低い群より高齢者が多い。尚、TPSは腫瘍細胞におけるPD-L1陽性細胞の割合である。
【図５−２】腫瘍間質におけるISLRの発現の高低で患者（抗PD-1抗体療法を実施した患者と抗PD-L1抗体療法を実施した患者を含む）を2群に区別した表である。抗PD-L1抗体療法を実施した患者も含む集団では年齢・性別・サブタイプ・EGFR変異陽性癌・PD-L1の発現レベルのいずれにおいても偏りは認めなかった。尚、TPSは腫瘍細胞におけるPD-L1陽性細胞の割合である。
【図６−１】腫瘍間質におけるISLRの発現の高低と効果との相関（抗PD-1抗体療法を実施した患者での評価）。ISLRの発現が高い群では、低い群より病勢制御率及び客観的奏効率が有意に高いことが示される。
【図６−２】腫瘍間質におけるISLRの発現の高低と効果との相関（抗PD-1抗体療法を実施した患者と抗PD-L1抗体療法を実施した患者を含む評価）。ISLRの発現が高い群では、低い群より病勢制御率及び客観的奏効率が有意に高いことが示される。尚、抗PD-L1抗体療法を実施した患者9名の内7名はISLR高発現であり、3名に治療効果が認められ、7名で病勢制御された。対照的に、ISLR低発現の患者2名（全員）に治療効果が得られなかった。
【図７−１】ISLRの発現の高低で全生存期間を評価した結果（グラフ）である（抗PD-1抗体療法を実施した患者での評価）。ISLRの発現が高い群の方が低い群より、全生存期間を有意に延長することが示される。尚、全生存期間とは、追跡開始時点（つまり、抗PD-1抗体療法を開始した日）から死亡（理由は問わない）までの期間である。
【図７−２】ISLRの発現の高低で全生存期間を評価した結果（グラフ）である（抗PD-1抗体療法を実施した患者と抗PD-L1抗体療法を実施した患者を含む評価）。ISLRの発現が高い群の方が低い群より、全生存期間を有意に延長することが示される。尚、全生存期間とは、追跡開始時点（つまり、抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法を開始した日）から死亡（理由は問わない）までの期間である。
【図８−１】ISLRの発現の高低で無増悪生存期間を評価した結果（グラフ）である（抗PD-1抗体療法を実施した患者での評価）。ISLRの発現が高い群の方が低い群より、無増悪生存期間を有意に延長することが示される。尚、無増悪生存期間とは追跡開始時点（つまり、抗PD-1抗体療法を開始した日）から病勢が悪化（新たな病変の出現や、評価病変の大きさの増加、死亡）するまでの期間である。
【図８−２】ISLRの発現の高低で無増悪生存期間を評価した結果（グラフ）である（抗PD-1抗体療法を実施した患者と抗PD-L1抗体療法を実施した患者を含む評価）。ISLRの発現が高い群の方が低い群より、無増悪生存期間を有意に延長することが示される。尚、無増悪生存期間とは追跡開始時点（つまり、抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法を開始した日）から病勢が悪化（新たな病変の出現や、評価病変の大きさの増加、死亡）するまでの期間である。
【図９】癌細胞におけるPD-L1の発現レベルと効果との関係を示す表である。いずれの発現レベルにおいても効果が認められた（即ち、発現レベルと効果との間に相関がない）。尚、TPSは腫瘍細胞におけるPD-L1陽性細胞の割合である。
【図１０】PD-L1の発現レベルで全生存期間を評価した結果（グラフ）である。PD-L1の発現レベルと全生存期間の間に関連は認めなかった。
【図１１】PD-L1の発現レベルで無増悪生存期間を評価した結果（グラフ）である。PD-L1の発現と無増悪生存期間との間に関連は認めなかった。
【図１２】腫瘍間質におけるISLRの発現の高低で患者（抗PD-1抗体療法又は抗PD-L1抗体療法を実施した患者を含まない）を2群に区別した表である。ISLR発現レベルの高低の2群間には、年齢、性別、TNM分類のT分類、N分類および病期(ステージ)に偏りは認めなかった。但し、ISLRの発現が高い群が、低い群より腺癌が少なく、EGFR変異陽肺癌も少ない。
【図１３】ISLRの発現の高低で全生存期間を評価した結果（グラフ）である。ISLRの発現が高い群の方が低い群より、全生存期間が有意に短いことが示される。尚、全生存期間とは、追跡開始時点（この場合は、手術した日）から死亡（理由は問わない）までの期間である。
【図１４】ISLRの発現の高低で無病生存期間を評価した結果（グラフ）である。ISLRの発現と無病生存期間との間に有意な関連を認めなかった。尚、無病生存期間とは、追跡開始時点（この場合は、手術した日）から再発・死亡（理由は問わない）までの期間である。
【図１５】ISLRの発現の高低で腺癌に限定して全生存期間を評価した結果（グラフ）である。ISLRの発現が高い群の方が低い群より、全生存期間が有意に短いことが示される。尚、全生存期間とは、追跡開始時点（この場合は、手術した日）から死亡（理由は問わない）までの期間である。
【図１６】ISLRの発現の高低で扁平上皮癌に限定して全生存期間を評価した結果（グラフ）である。ISLRの発現と全生存期間との間に有意な関連を認めなかった。尚、全生存期間とは、追跡開始時点（この場合は、手術した日）から死亡（理由は問わない）までの期間である。
【図１７】ISLRの発現の高低で、TCGAに登録されている肺腺癌患者の全生存期間を評価した結果（グラフ）である。ISLRの発現と全生存期間との間に有意な関連を認めなかった。尚、全生存期間とは、追跡開始時点から死亡（理由は問わない）までの期間である。
【図１８】ISLRの発現の高低で、TCGAに登録されている肺扁平上皮癌患者の全生存期間を評価した結果（グラフ）である。ISLRの発現と全生存期間との間に有意な関連を認めなかった。尚、全生存期間とは、追跡開始時点から死亡（理由は問わない）までの期間である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
１．抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法の効果を予測するバイオマーカー
本発明の第１の局面は、その発現が抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法の効果との間に相関を認めたマーカー分子、即ち「抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法の効果を予測するバイオマーカー」に関する。「抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法の効果を予測するバイオマーカー」とは、抗PD-1抗体薬又は抗PD-L1抗体薬を用いた治療法（本明細書において「抗PD-1抗体／抗PD-1抗体療法」と呼ぶ）の効果の予測に有用な生体分子のことをいう。本発明の「抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法の効果を予測するバイオマーカー」（以下、略して「本発明のマーカー」と呼ぶこともある）を利用すれば、抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法の効果の予測、即ち、抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法に治療効果を期待できるか（治療効果を発揮するか否か）を判定することができる。従って、本発明のマーカーは抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法へ反応する患者と反応しない患者を区別するための客観的判断材料を提供する。特に、抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法へ反応しない患者（ノンレスポンダー）を特定ないし選択する上で本発明のマーカーは利用価値が高い。
【００１３】
本明細書において「生体分子」とは、生体中に見出される分子（化合物）をいう。本発明では特定の生体分子をバイオマーカーとして用いるが、その利用（典型的には効果予測方法への適用）に際しては、生体から分離された検体／試料中の生体分子が用いられることになる。
【００１４】
本発明のマーカーはロイシンリッチリピート含有免疫グロブリンスーパーファミリー（ISLR：immunoglobulin superfamily containing leucine-rich repeat）からなる。ISLRは細胞膜結合型又は分泌型の分子であり、肺癌、乳癌、膵癌などにおいて高発現が認められている（例えば、特許文献２、非特許文献６、７を参照）。
【００１５】
公共のデータベースに登録されているISLRのアミノ酸配列とそれをコードする遺伝子配列を添付の配列表に示す。配列番号と配列の対応関係は以下の通りである。
配列番号１：ISLRのアミノ酸配列（NCBI Reference Sequence: NP_005536.1, immunoglobulin superfamily containing leucine-rich repeat protein precursor [Homo sapiens].）
配列番号２：ISLRのcDNA配列（GeneID:3671、NCBI Reference Sequence: NM_005545.3, Homo sapiens immunoglobulin superfamily containing leucine-rich repeat (ISLR), transcript variant 1, mRNA.）
【００１６】
ISLRにはバリアント（variant 2）の配列（Homo sapiens immunoglobulin superfamily containing leucine-rich repeat (ISLR), transcript variant 2, mRNA、アミノ酸配列：NP_958934.1、cDNA配列：NM_201526.1）が知られている。当該バリアントのアミノ酸配列は上記のアミノ酸配列（配列番号１）と同一である。
【００１７】
抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法は、上記の通り、様々な癌／悪性腫瘍の治療に利用されている。例えば、ニボルマブ（商品名「オプジーボ（登録商標）」）、ペムブロリズマブ（商品名「キイトルーダ（登録商標」）等の抗PD-1抗体薬が、アベルマブ（商品名「バベンチオ（登録商標）」）、アテゾリズマブ（商品名「テセントリク（登録商標）」）、デュルバルマブ(商品名「イミフィンジ（登録商標）」等の抗PD-L1抗体薬が臨床応用されている。
【００１８】
用語「抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法の効果」には、抗PD-1抗体薬／抗PD-L1抗体薬を単独で用いた治療法の効果の他、抗PD-1抗体薬／抗PD-L1抗体薬と抗PD-1抗体薬／抗PD-L1抗体薬以外の医薬との併用療法の効果も含まれる。従って、抗PD-1抗体薬／抗PD-L1抗体薬と抗PD-1抗体薬／抗PD-L1抗体薬以外の医薬との併用療法（例えば、ニボルマブとイピリムマブ（抗CTLA-4抗体薬）の併用）の効果の予測にも本発明を利用し得る。換言すれば、併用療法に適合しない（有意義な治療効果を期待てきない）患者を特定ないし選択する手段としても本発明の利用が図られる。
【００１９】
２．抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法の効果を予測する方法
本発明の第２の局面は本発明のマーカーの用途に関し、抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法の効果を予測する方法（以下、「本発明の効果予測方法」と呼ぶことがある）を提供する。本発明の効果予測方法では、被検者由来の腫瘍組織中の細胞におけるISLRの発現を指標として抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法の効果を予測する。典型的には、以下のステップ（１）〜（３）が実施されることになる。
（１）被検者から採取された腫瘍組織検体を用意するステップ
（２）前記腫瘍組織検体中の細胞におけるISLRの発現を調べるステップ
（３）ステップ（２）の結果に基づき、抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法の効果を予測するステップであって、ISLRの高い発現が、抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法に効果を期待できることを表す、ステップ
【００２０】
ステップ（１）
ステップ（１）では被検者に由来する腫瘍組織検体を用意する。抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法の適用が予定又は検討されている患者が被検者となる。従って、通常、被検者は抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法が適用され得る疾患、例えば、悪性黒色腫、非小細胞性肺癌、腎細胞癌、頭頚部癌、胃癌、ホジキンリンパ腫、尿路上皮癌、乳癌、膵癌又は大腸癌に罹患した患者である。被検者から採取された腫瘍組織（癌細胞と線維芽細胞を含む）が検体として用いられる。例えば、病理検査・病理診断のために採取された腫瘍組織（一般に生検試料、生検組織等と呼ばれる）や手術の際に採取された腫瘍組織（一般に手術検体、手術材料等と呼ばれる）を検体として用いることができる。腫瘍組織は原発部位（原発巣）又は転移巣から採取される。検体は、本発明の実施に先立って調製される。即ち、本発明の効果予測方法は、検体を調製するための患者への処置ないし施術（腫瘍組織の採取・単離）を含むものではない。
【００２１】
腫瘍細胞と線維芽細胞が混在する腫瘍組織が検体として用いられる。腫瘍組織に腫瘍細胞以外の有核細胞が存在すれば線維芽細胞も混在していると推定し、当該腫瘍組織を検体として用いることができる
【００２２】
ステップ（２）
ステップ（２）では、腫瘍組織検体中の細胞におけるISLRの発現を調べる。腫瘍組織検体献体には腫瘍細胞が含まれるため、好ましくは、腫瘍組織検体中の腫瘍細胞以外の有核細胞を特定し、当該細胞でのISLRの発現を調べる。また、全有核細胞から腫瘍細胞、リンパ球、顆粒球、血管内皮細胞及びマクロファージを除外したものを線維芽細胞の集団（全線維芽細胞）とし、当該集団でのISLRの発現を調べることにしてもよい。「ISLRの発現」を調べるため、ISLR mRNA又はISLRタンパク質を標的とした検出を行う。即ち、ISLR mRNA又はISLRタンパク質の発現が検出される。本発明ではISLR mRNA又はISLRタンパク質の発現に関して定性的又は定量的な検出が行われることになる。
【００２３】
ISLR mRNAの発現の検出は、ISLR mRNAに特異的なプライマー又はプローブを利用した各種方法、例えばin situハイブリダイゼーション法、RT-PCR、定量PCR、ノーザンブロッティング等によって実施することができる。他方、ISLRタンパク質の発現を検出する場合、ISLRタンパク質に特異的結合性を示す物質を用い、免疫学的手法（例えば免疫組織化学）を採用するとよい。免疫学的手法によれば感度のよい検出が可能である。また、操作も比較的簡便である。ISLRタンパク質に特異的結合性を示す物質として通常は抗体が用いられるが、ISLRに特異的結合性を有し、その結合を検出ないし測定可能な物質であれば抗体に限らず採用できる。
【００２４】
生体組織の免疫組織化学的染色では、一般に、(1)固定・パラフィン包埋（又は凍結包埋）、(2)脱パラフィン（凍結包埋の場合は不要）、(3)一次抗体反応、(4)標識試薬の添加、(5)発色反応、及び(6)脱水・透徹・封入の操作を順に行う。必要に応じて、一次抗体反応の前に、抗原賦活処理、内因性ペルオキシダーゼ除去処理（標識物質としてペルオキシダーゼを使用する場合）、非特異的反応の阻害（ウシ血清アルブミン溶液などによる処理）等が行われる。また、必要に応じて、脱水・透徹・封入の前に核染色（例えばマイヤーのヘマトキシリンを使用できる）が行われる。尚、生体組織の免疫組織化学的染色法については様々な文献及び成書を参照することができる（例えば、「酵素抗体法、改訂第３版」、渡辺慶一、中根一穂編集、学際企画）。
【００２５】
ステップ（３）
ステップ（３）では、ステップ（２）の結果に基づき、抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法の効果を予測する。「抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法の効果を予測する」とは、抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法を実施した場合に治療効果が得られるか否か又は治療効果が得られる可能性を判定することと同義である。本発明では、臨床検体を用いた検討において、腫瘍組織検体中の細胞におけるISLRの発現と、抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体が治療効果を発揮することが正の相関を示した事実に基づき、「ISLRの高い発現が、抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法に効果を期待できることを表す」との指標ないし判定基準を採用する。従って、典型的には、腫瘍組織検体中の細胞におけるISLRの発現が高いことを根拠として、抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法が効果を発揮すると判定し、腫瘍組織検体中の細胞におけるISLRの発現が低いことを根拠として、抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法が効果を発揮しないと判定する。但し、以下に示す例のように、発現レベル（程度）に応じて、抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法が効果を発揮する確率（可能性）を判定することにしてもよい。
【００２６】
ISLRの発現レベルは、例えば、ISLR陽性細胞の数、ISLR陽性細胞とISLR陰性細胞の比率を単独で用いて、又はこれらを併用して決定することができる。以下、発現レベルを決定する方法の例を示す。
【００２７】
腫瘍組織を観察し（例えば光学顕微鏡を用いて肉眼的に観察する）、腫瘍細胞、リンパ球、顆粒球、血管内皮細胞及びマクロファージを除外した全有核細胞中のISLR陽性細胞の割合が一定の値（例えば、10％〜25％の範囲内の数値。具体例は10％、15％、20％、25％）以上を「発現レベルが高い」とし、それ未満を「発現レベルが低い」とする。そして、発現レベルが高ければ「抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法が効果を発揮する」と判定し、発現レベルが低ければ「抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法が効果を発揮しない」と判定する。
【００２８】
ISLR陽性細胞の割合を３段階以上（例えば３段階、４段階又は５段階）に区分けし、定量的な判定をすることにしてもよい。この態様の具体例（４段階に区分した場合の一例）を示すと、ISLR陽性細胞の割合が5%未満        の場合に発現レベル１、ISLR陽性細胞の割合が5％以上10％未満の場合に発現レベル２、ISLR陽性細胞の割合が10％以上15％未満の場合に発現レベル３、ISLR陽性細胞の割合が15％以上20％未満の場合に発現レベル４とし、発現レベル１であれば抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法が効果を発揮する確率は20％未満、発現レベル２であれば抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法が効果を発揮する確率は20％以上50％未満、発現レベル３であれば抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法が効果を発揮する確率は50％以上80％未満、発現レベル４であれば抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法が効果を発揮する確率は80％以上と判定する。
【００２９】
ISLRの発現の高低を分ける基準値、発現レベルの区分及び各区分に関連付けられる判定結果等は、予備実験等を通して設定することができる。尚、本発明における判定・評価は、医師や検査技師など専門知識を有する者の判断によらずとも自動的／機械的に行うことができる。
【００３０】
本発明による予測結果は、抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法に反応しない者を特定・選択する上で有用な情報を提供する。そこで本発明の一態様では、予測結果に基づき、効果を期待できない被検者を治療対象から除外する（ステップ（４））。効果を期待できない被検者を治療対象から除外することは、効果を期待できる被検者を治療対象として特定又は選択することと同義である。従って、このステップにより、抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法が適合する患者が特定ないし選択されることになる。
【００３１】
予測結果を患者の治療方針の決定又は変更に利用することもできる。そこで本発明の別の一態様では、予測結果に基づき、被検者の治療方針を決定又は変更する（ステップ（４’））。治療方針は予測結果に応じて設計ないし選択される。典型的には、抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法に治療効果が期待できると予測された場合、被検者（患者）には抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法の適用を推奨できる。他方、抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法に治療効果が期待できないと予測された場合、被検者（患者）は抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法の治療対象から除外されるべきであり、他の治療法（例えば、従来の薬物療法、放射線療法、緩和ケア、手術療法、免疫療法）が推奨される。
【００３２】
以上のように、本発明を利用すれば患者毎により適切な治療方針を立てることができる。その結果、不要な治療を行わずに済み、患者の負担軽減、副作用の回避、医療費削減等の利益が得られる。また、抗PD-1抗体薬／抗PD-L1抗体薬による治療を躊躇していた症例に対しては、より早く治療介入でき、治療効果（例えば、癌進行ないし増悪の阻止）の増大を図ることができる。
【００３３】
３．抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法の効果予測用キット
本発明は抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法の効果を予測するためのキットも提供する。当該キットを利用すれば、本発明の効果予測方法を簡便に実施することができる。本発明の効果予測用キットはISLR検出用の試薬を必須の要素として含む。検出手段に応じて適切な試薬が選択される。例えば、検出手段がin situハイブリダイゼーション法の場合、効果予測用キットにはISLR mRNAを標的としたin situハイブリダイゼーションプローブが効果予測用キットの主要構成要素として含まれることになる。in situハイブリダイゼーションプローブは常法で調製すればよい。
【００３４】
一方、免疫組織化学を検出手段とした効果予測用キットであれば、ISLRタンパク質に特異的結合性を示す物質（以下、「結合分子」と呼ぶ）がISLR検出用試薬として効果予測用キットに含まれることになる。結合分子の例として、ISLRタンパク質を特異的に認識する抗体、核酸アプタマー及びペプチドアプタマーを挙げることができる。結合分子は、ISLRタンパク質に対する特異的結合性を有する限り、その種類や由来などは特に限定されない。また、抗体の場合、ポリクローナル抗体、オリゴクローナル抗体（数種〜数十種の抗体の混合物）、及びモノクローナル抗体のいずれでもよい。ポリクローナル抗体又はオリゴクローナル抗体としては、動物免疫して得た抗血清由来のIgG画分のほか、抗原によるアフィニティー精製抗体を使用できる。Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、dsFv抗体などの抗体断片であってもよい。
【００３５】
結合分子は常法で調製すればよい。市販品が入手可能であれば、当該市販品を用いても良い。例えば、抗体であれば免疫学的手法、ファージディスプレイ法、リボソームディスプレイ法などを利用して調製することができる。免疫学的手法によるポリクローナル抗体の調製は次の手順で行うことができる。抗原（ISLR又はその一部）を調製し、これを用いてマウスやラット或いはウサギ等の動物に免疫を施す。生体試料を精製することにより抗原を得ることができる。また、組換え型抗原を用いることもできる。組換え型抗原は、例えば、ISLRをコードする遺伝子（遺伝子の一部であってもよい）を、ベクターを用いて適当な宿主に導入し、得られた組換え細胞内で発現させることにより調製することができる。
【００３６】
免疫惹起作用を増強するために、キャリアタンパク質を結合させた抗原を用いてもよい。キャリアタンパク質としてはKLH（Keyhole Limpet Hemocyanin）、BSA（Bovine Serum Albumin）、OVA（Ovalbumin）などが使用される。キャリアタンパク質の結合にはカルボジイミド法、グルタルアルデヒド法、ジアゾ縮合法、MBS（マレイミドベンゾイルオキシコハク酸イミド）法などを使用できる。一方、ISLR又はその一部を、GST、βガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク、又はヒスチジン（His）タグ等との融合タンパク質として発現させた抗原を用いることもできる。このような融合タンパク質は、汎用的な方法により簡便に精製することができる。
【００３７】
必要に応じて免疫を繰り返し、十分に抗体価が上昇した時点で採血し、遠心処理などによって血清を得る。得られた抗血清をアフィニティー精製し、ポリクローナル抗体とする。
【００３８】
一方、モノクローナル抗体については次の手順で調製することができる。まず、上記と同様の手順で免疫操作を実施する。必要に応じて免疫を繰り返し、十分に抗体価が上昇した時点で免疫動物から抗体産生細胞を摘出する。次に、得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合してハイブリドーマを得る。続いて、このハイブリドーマをモノクローナル化した後、目的タンパク質に対して高い特異性を有する抗体を産生するクローンを選択する。選択されたクローンの培養液を精製することによって目的の抗体が得られる。一方、ハイブリドーマを所望数以上に増殖させた後、これを動物（例えばマウス）の腹腔内に移植し、腹水内で増殖させて腹水を精製することにより目的の抗体を取得することもできる。上記培養液の精製又は腹水の精製には、プロテインG、プロテインA等を用いたアフィニティークロマトグラフィーが好適に用いられる。また、抗原を固相化したアフィニティークロマトグラフィーを用いることもできる。更には、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、硫安分画、及び遠心分離等の方法を用いることもできる。これらの方法は単独ないし任意に組み合わされて用いられる。
【００３９】
ISLRへの特異的結合性を保持することを条件として、得られた抗体に種々の改変を施すことができる。このような改変抗体をISLR検出用試薬としてもよい。
【００４０】
特異的結合分子として標識化抗体を使用すれば、標識量を指標に結合抗体量を直接検出することが可能である。従って、より簡便な検査法を構築できる。その反面、標識物質を結合させた抗体を用意する必要があることに加えて、検出感度が一般に低くなるという問題点がある。そこで、標識物質を結合させた二次抗体を利用する方法、二次抗体と標識物質を結合させたポリマーを利用する方法など、間接的検出方法を利用することが好ましい。ここでの二次抗体とは、ISLRタンパク質に特異的な抗体に対して特異的結合性を有する抗体である。例えば、ISLRタンパク質に特異的な抗体をウサギ抗体として調製した場合には抗ウサギIgG抗体を二次抗体として使用することができる。ウサギやヤギ、マウスなど様々な種の抗体に対して使用可能な標識二次抗体が市販されており（例えばフナコシ株式会社やコスモ・バイオ株式会社など）、本発明の試薬に応じて適切なものを適宜選択して使用することができる。
【００４１】
標識物質の例は、ペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ及びグルコース−６−リン酸脱水素酵素などの酵素、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRITC）及びユーロピウムなどの蛍光物質、ルミノール、イソルミノール及びアクリジニウム誘導体などの化学発光物質、NADなどの補酵素、ビオチン、並びに131I及び125Iなどの放射性物質である。
【００４２】
本発明の効果予測方法を実施する際に使用するその他の試薬（緩衝液、反応用試薬、標識試薬、発色試薬等）や容器、装置等を本発明のキットに含めてもよい。また、標準試料として本発明のバイオマーカー分子又はその断片をキットに含めることが好ましい。尚、通常、本発明の効果予測用キットには取り扱い説明書が添付される。
【実施例】
【００４３】
抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法の効果を予測するマーカーの開発を目指し、以下の検討を行った。
１．肺癌の組織検体におけるISLRの発現（手術検体）
（１）方法
肺癌に対して切除手術が行われた患者より得られた検体を用い、ACD（Advanced Cell Diagnostics）社のRNAscope（登録商標）を利用し、RNA in situ ハイブリダイゼーション法にてISLRの発現を調べた。扁平上皮癌は中心部や壊死部を除き辺縁部を、腺癌やその他の癌種では浸潤部を、観察範囲が重複しないよう適当な4カ所を選択し、40倍の対物レンズにて観察した。尚、RNAscope（登録商標）を利用したRNA in situ ハイブリダイゼーション法の手順1〜13（以降の実施例でも同様）を以下に示す。
1. 検体（パラフィンブロック）を4μmで薄切
2. 翌日以降7日以内に、60℃のオーブンで1時間加熱処理し、キシレンにて脱パラフィン処理する。
3. 100%エタノールにて脱水し、5分以上風乾する。
4. 過酸化水素水（ACD社製）にて10分間処理した後、賦活液（ACD社製）で15-30分（99℃以上）賦活処理する。
5. 100%エタノールにて脱水し、完全に乾くまで5分以上風乾する。
6. プロテアーゼ（ACD社製）にてタンパク質を40℃で30分消化する。
7. ISLRのターゲットプローブ（ACD社製）を用い、40℃で2-3時間のプローブハイブリダイゼーション。
8. 5×SSC中で翌日まで保存する。
9. 40℃の条件下、Amp1（ACD社製）による30分間の処理、Amp2（ACD社製）による15分間の処理、Amp3（ACD社製）による30分間の処理、Amp4（ACD社製）による15分間の処理を順に行う。
10. 室温でAmp5（ACD社製）による30-60分間の処理とAmp6（ACD社製）による15分間の処理を行う。
11. DABで10-15分処理して発色させる。
12. H＆Eで対比染色した後、エタノール・キシレンで脱水・透徹し、封入する。
13. 4dot/細胞以上あるいはクラスター形成を陽性細胞と定義し、観察する。
尚、7〜10では、都度、洗浄緩衝液（ACD社製）で2分間×2回のスライド洗浄が行われる。【００４４】
（２）結果・考察
結果を図１、２に示す。発現レベルが高い患者（図１）と低い患者（図２）が存在した。即ち、肺癌の癌関連線維芽細胞におけるISLRの発現が確認された。【００４５】
２．肺癌の癌関連線維芽細胞におけるISLRの発現（生検検体）
（１）方法
肺癌に対して診断目的に生検が行われた患者より得られた検体を用い、ACD（Advanced Cell Diagnostics）社のRNAscope（登録商標）を利用し、RNA in situ ハイブリダイゼーション法にてISLRの発現を調べた。上記１．の方法でも十分であるが、より精密に検討するために、腫瘍細胞と癌関連線維芽細胞が混在する、あるいは近傍に存在する部位を4カ所まで選択し、40倍の対物レンズにて観察した。尚、腫瘍細胞以外の有核細胞が存在すれば癌関連線維芽細胞も混在しているものと判断した。【００４６】
（２）結果・考察
結果を図３、４に示す。腫瘍細胞と癌関連線維芽細胞が混在する、あるいは近傍に存在する検体においてISLRの発現を判別することが可能であり、発現レベルが高い患者（図３）と低い患者（図４）が存在することが確認された。【００４７】
３．肺癌の癌関連線維芽細胞におけるISLRの発現と抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法の効果との相関
（１）方法
上記１．及び２．の方法でも十分であるが、更に精密に検討するために、上記１．及び２．の実験で観察した視野（1つあたり92792.53μm2）内の腫瘍組織に認められる全有核細胞から腫瘍細胞、リンパ球、顆粒球、血管内皮細胞及びマクロファージを可能な限り除外したもの（「全線維芽細胞」とする）の内、ISLR陽性細胞の割合を5％刻みで算定した。この「全線維芽細胞中のISLR陽性細胞の割合」が20％以上を高発現、20％未満を低発現とした。但し、細胞の種別の判断に難渋した場合は全て母数としてカウントし、核が判別できない陽性シグナルはカウントしなかった。【００４８】
以上のようにISLRの発現を高低の2群に区分し、医療記録に紐付けされる画像記録からiRECIST（Seymour L, Bogaerts J, Perrone A, Ford R, Schwartz LH, Mandrekar S, Lin NU, Litiere S, Dancey J, Chen A et al. (2017) iRECIST: guidelines for response criteria for use in trials testing immunotherapeutics. Lancet Oncology, 18(3):e143-e152）に従って腫瘍縮小効果判定*(iCR, iPR, iSD, iUPDの決定)を行った。ISLRの発現の高低とiBOR*（最良総合効果）でiCR又はiPRを達成した患者の割合との相関を調べた。また、医療記録から患者の生存状況や病気の進行状況などの予後情報を確認し、ISLRの発現の高低と予後との相関を調べた。以下、iRECISTを利用した腫瘍縮小効果判定の方法を以下に説明する。尚、ISLRの発現レベルと患者の背景との関係を図５−1（抗PD-1抗体療法を実施した患者のみ）と図５−２（抗PD-1抗体療法を実施した患者と抗PD-L1抗体療法を実施した患者を含む）に示す。【００４９】
＜iRECISTを利用した腫瘍縮小効果判定＞
ベースライン評価：治療開始前に実施した最新の胸部あるいは胸腹部造影CT(5mmスライス)により腫瘍性病変の特定を行い、それぞれの病変を「測定可能病変」と「測定不能病変」に分類した。腫瘍径の計測はCTの横断面像にて行い、3次元構築画像による矢状断や冠状断での計測は用いなかった。
測定可能病変の定義：以下の1)又は2)に該当する病変を測定可能病変とした。
1) 以下のいずれかを満たす、リンパ節病変以外の病変(非リンパ節病変)
5mm以下のスライス厚のCTにて最大径10mm以上
5mmを超えるスライス厚のCTにて最大径がスライス厚の2倍以上
2) 5mm以下のスライス厚のCTにて短径15mm以上のリンパ節病変
（短径が10mm以上15mm未満のリンパ節病変は測定不能病変であり、短径が10mm未満のリンパ節は病変ではない）
上記以外のすべての病変を測定不能病変とした。【００５０】
登録時に認められた測定可能病変のうち、径（非リンパ節病変は長径、リンパ節病変は短径）の大きい順に5個まで、1臓器あたり最大2個までを選択して標的病変とした。選択の際には、測定可能病変を有する臓器ができるだけ満遍なく含まれることと、繰り返し計測の際の再現性すなわち測りやすさを考慮して選択した（径が大きくても測りにくい病変は避けた）。選択した標的病変について、すべての標的病変の径の和（以下、径和）を算出した。以下の「標的病変の効果判定規準」に従って腫瘍縮小効果の判定を行った。非標的病変については、別に設定した効果判定規準（非標的病変の効果判定規準）に従って効果の判定を行った。【００５１】
標的病変の効果判定規準
iCR（完全奏功）：すべての非リンパ節標的病変が消失し、すべてのリンパ節標的病変の短径が10mm未満となった場合
iPR（部分奏功）：標的病変の径和が、ベースラインの径和に比し30％以上小さくなった場合
iSD（安定）：PRに該当する腫瘍縮小やPDに該当する腫瘍増大を認めない場合
iUPD（病勢進行）：標的病変の径和が、それまでのもっとも小さい径和に比して20％以上大きくなり、かつ絶対値で5mm以上増加した場合、あるいは新規に病変が出現した場合【００５２】
非標的病変の効果判定規準
iCR：すべての非リンパ節非標的病変が消失し、すべてのリンパ節非標的病変の短径が10mm未満となった場合
Non-iCR/Non-iUPD（非iCR/非iUPD）：1つ以上の非リンパ節非標的病変が消失しない、または1つ以上のリンパ節非標的病変の短径が10 mm以上で、明らかな増悪を認めない場合
iUPD：非標的病変の「明らかな増悪(：標的病変の腫瘍量の減少を遙かに上回る程度の非標的病変の腫瘍量の増加)」
NE（評価不能）：なんらかの理由で検査が行えなかった場合、またはCR、Non-CR/non-PD、PDのいずれとも判定できない場合（今回の検討ではこれに該当するものは認められなかった）【００５３】
総合効果は標的病変の効果、非標的病変の効果、新病変出現の有無の組み合わせ、およびその4週以上前の総合効果を加味して判定した。直前の総合効果でiUPDと判定されており、かつさらなる腫瘍の増大やさらなる新規の病変の出現が確認された場合にはiCPD（確認された病勢進行）と判定した。最良総合効果（iBOR）は総合評価を経時的に評価して、最もよい効果を最良総合効果と判定した。その時に、iCR、iPR又はiSDを達成する以前に確認されたiUPDは無視するものとした。【００５４】
（２）結果・考察
結果を図６−１（抗PD-1抗体療法を実施した患者での評価）と図６−２（抗PD-1抗体療法を実施した患者と抗PD-L1抗体療法を実施した患者を含む評価）に示す。ISLRの発現が高い患者において、よりよい効果が得られることが確認された。即ち、癌関連線維芽細胞におけるISLRの発現が高いことが客観的奏効割合と相関し、これが治療への反応性を規定する因子、つまり効果予測マーカーであることが示された。【００５５】
４．肺癌の癌関連線維芽細胞におけるISLRの発現と抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法実施患者の生存との相関
（１）方法
上記３と同様に、上記１．及び２．の実験で観察した視野（1つあたり92792.53μm2）内の腫瘍組織に認められる全有核細胞から腫瘍細胞、リンパ球、顆粒球血管内皮細胞及びマクロファージを可能な限り除外したもの（全線維芽細胞）の内、ISLR陽性細胞の割合を5％刻みで算定した。この「全線維芽細胞中のISLR陽性細胞の割合」が20％以上を高発現、20％未満を低発現とした。但し、細胞の種別の判断に難渋した場合は全てカウントし、核が判別できない陽性シグナルはカウントしなかった。【００５６】
以上のようにISLRの発現を高低の2群に区分し、医療記録から患者の生存状況や病気の進行状況などの予後情報を確認し、ISLRの発現の高低と、全生存期間、無増悪生存期間との相関を調べた。【００５７】
（２）結果・考察
結果を図７−１（抗PD-1抗体療法を実施した患者での評価）と図７−２（抗PD-1抗体療法を実施した患者と抗PD-L1抗体療法を実施した患者を含む評価）、及び図８−１（抗PD-1抗体療法を実施した患者での評価）と図８−２（抗PD-1抗体療法を実施した患者と抗PD-L1抗体療法を実施した患者を含む評価）に示す。ISLRの発現が高い患者において、よりよい予後が得られることが判明した。即ち、癌関連線維芽細胞におけるISLRの発現が高いことが予後と相関した。この結果は、上記３．の実験で示された、ISLRの発現が高いことが効果予測マーカーであるとする結果を支持するものである。【００５８】
５．PD-L1の発現と抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法の効果との関係（比較例）
今回の検討に使用した手術検体と生検検体を用い、キイトルーダのコンパニオン診断薬と同様の自動染色装置・方法で免疫染色（抗PD-L1抗体(Clone:22C3)を使用）を実施し、癌細胞におけるPD-L1の発現レベルと抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法の効果との関係を調べた。その結果、PD-L1の発現レベルと効果との間（図９）又は全生存期間との間（図１０）又は無増悪生存期間との間（図１１）に相関は認められなかった。【００５９】
６．抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法を実施していない肺癌患者の癌関連線維芽細胞におけるISLRの発現と手術後の生存との相関
（１）方法
上記１．とは異なる患者群（図１２）において、上記４．と同様に、ISLRの発現を高低の2群に区分し、医療記録から患者の生存状況や病気の進行状況などの予後情報を確認し、ISLRの発現の高低と、全生存期間、無病生存期間との相関を調べた。【００６０】
（２）結果・考察
結果を図１３〜図１６に示す。ISLRの発現が高い患者において、抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法を実施していない場合では、より予後が悪くなることが判明した。即ち、癌関連線維芽細胞におけるISLRの発現が高いことはよい予後とは相関しない。この結果は、ISLRの発現が予後予測マーカーにはならない一方で、抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法の治療効果を予測するマーカーとして極めて有用であることを強く支持する。【００６１】
７．ISLRの発現と予後との相関 (比較例)
米国NIHが保有するThe Cancer Genome Atlas (TCGA)のデータベースより目的の遺伝子の発現の高低で予後との相関をみるアプリケーションOncoLnc (http://www.oncolnc.org/ Anaya J. OncoLnc: linking TCGA survival data to mRNAs, miRNAs, and lncRNAs. Peer J Computer Science. 2016;2:e67)を用いて、ISLRの発現と予後との相関を調べた。その結果、ISLRの発現と全生存期間との間には腺癌（図１７）および扁平上皮癌（図１８）のいずれにおいても、有意な関連を認めなかった。【００６２】
８．まとめ
ISLRの発現レベルによれば、抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体への反応性と関連すると言われているマーカーPD-L1では予測し得なかった集団においても（図９〜１１）、抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法の効果を高感度に予測できることが示された。また、抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法を実施していない患者集団（図１３〜１６）や米国NIHの保有するデータベースTCGAの肺癌患者集団（図１７、１８）の予後情報から、ISLRの発現の高低は良好な予後予測マーカーでないことが示された。ISLRの発現を指標にすれば、特に癌治療の分野で重要かつ有用な、効果が見込みにくい患者の選択が可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明は抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法の効果を予測する手段を提供する。本発明によれば抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法の効果を高感度に予測できる。予測結果を利用すれば、患者毎により適切な治療方針を立てることができる。特に、抗PD-1抗体／抗PD-L1抗体療法に反応しない患者を特定し、治療対象から除外することができることは、患者の負担軽減や治療効果の増大（早期に別の治療を選択することによる）をもたらす上、医療経済にも多いに貢献する。【００６４】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図１】
2019159825.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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