(57)【要約】  本発明は、酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を用いて、Ｄ−キシロースからＤ−ＢＴを効率的に生産できる方法を開発することを目的とする。  本発明は、（Ａ）鉄硫黄タンパク質（Ｆｅ−Ｓタンパク質）をコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチド、及び（Ｂ）上記鉄硫黄タンパク質の生合成を制御するタンパク質をコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドを含む、組換え宿主細胞である。また、（Ｃ）キシロース代謝経路に関与するその他の酵素をコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドをさらに含むことが好ましい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）鉄硫黄タンパク質（Ｆｅ−Ｓタンパク質）をコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドを含み、かつ
（Ｂ）鉄硫黄クラスターの生合成を制御する少なくとも１種のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを過剰発現させた、組換え宿主細胞。
【請求項２】
（Ｃ）キシロース代謝経路に関与するその他の酵素をコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項３】
上記鉄硫黄タンパク質が、キシロネートデヒドラターゼ（ＸｙｌＤ）である、請求項１又は２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項４】
上記鉄硫黄クラスターの生合成を制御するタンパク質が、Ｔｙｗ１である、請求項１から３のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項５】
上記キシロース代謝経路に関与するその他の酵素が、キシロースデヒドロゲナーゼ（ＸｙｌＢ）、２−ケト酸デカルボキシラーゼ（ＫＤＣ）から成る群より選択される少なくとも１種である、請求項１から４のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項６】
上記宿主細胞が、酵母宿主細胞である、請求項１から５のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項７】
上記酵母宿主細胞が、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ブレタノミセス属（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジタ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クロッケラ属（Ｋｌｏｃｃｋｅｒａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、イサトケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、スワニオミセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ヤマダジマ属（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ）、及びパチソレン属（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）からなる群より選択される、少なくとも１種の酵母細胞である、請求項６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞を用いる、Ｄ−ブタントリオールの製造方法。
【請求項９】
Ｄ−ブタントリオールの製造方法であって、
（ａ）鉄硫黄タンパク質をコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドを含み、かつ、鉄硫黄クラスターの生合成を制御する少なくとも１種のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを過剰発現させた組換え宿主細胞を調製する工程、並びに
（ｂ）上記組換え宿主細胞を増殖させる工程
を含むことを特徴とするＤ−ブタントリオールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換え宿主細胞及びＤ−ブタントリオールの新規製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物のキシロース代謝経路としては、ＸＲ／ＸＤＨ経路やＸＩ経路がよく知られている。これらの経路を利用して、Ｄ−キシロースからエタノールやキシリトールの生産も行われている。近年、上記ＸＲ／ＸＤＨ経路やＸＩ経路とは全く異なるキシロース代謝経路であるＤａｈｍｓ／Ｗｅｉｍｂｅｒｇ経路を利用して、Ｄ−キシロネート、Ｄ−１，２，４−ブタントリオール（Ｄ−ＢＴ）、１，４−ブタンジオール等の有用な物質の生産ができることが報告されている（非特許文献１から３参照）。【０００３】
上記Ｄ−ＢＴは様々な医薬品や化成品の原料として利用できるだけでなく、ニトロ化することで、エネルギー物質であるＤ−１，２，４，−ブタントリオールトリナイトレート（Ｄ−ＢＴＴＮ）となる（非特許文献３参照）。このＤ−ＢＴＴＮはロケットの推進剤（プロペラント）や、ニトログリセリンの代替品として利用できる物質である。また、Ｄ−ＢＴＴＮは、ニトログリセリンより衝撃に対して安定であり、かつ凝固点が低い、揮発性が低い、熱安定性が高い等のより優れた性能を有する（非特許文献３参照）。またＤ−ＢＴＴＮは、抗がん剤や抗ウイルス剤等の医薬品の原料としても利用出来るものである。【０００４】
上記Ｄ−ＢＴは、マレイン酸エステルを、還元剤又は触媒を用いて還元することで工業的に生産されている（非特許文献４参照）。具体的には、ジメチルマレイン酸をＮａＢＨ４により化学量論的に還元して生産する方法がよく用いられている。しかし、この方法では１ｔのマレイン酸エステルを還元した場合、副生成物として２〜５ｔのホウ酸塩ができてしまい、大量生産には向いていない。また、銅クロマイト又はルビジウムを触媒に用いた還元法も知られているが、銅クロマイトを用いる方法では有害な六価クロムが放出され環境への負荷が懸念される。一方、ルビジウムを用いる方法では２，９００〜５，０００ｐｓｉの高圧と１３５℃の高温が必要であり、さらに副生成物の生成も問題となる。また、ルビジウム自体が非常に高価であることもスケールアップする際に不都合となる（非特許文献３参照）。【０００５】
そのような中、バイオテクノロジーを用いた効率的なＤ−ＢＴの生産方法が模索されてきた。例えば、微生物を用いたＤ−ＢＴの生産経路はＮｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（非特許文献３参照）により報告されており、近年大腸菌を宿主とした多数の生産報告がある（非特許文献５、６参照）。【０００６】
一方、酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は種々のストレスに耐性があり、遺伝子組換えも容易であることから、リグノセルロース系バイオマスを原料にした物質生産に適した微生物であると考えられている。しかし現在のところ、酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）による上記の生産経路を利用したＤ−ＢＴの生産報告はない。また、このような酵母を利用した発酵生産において、鉄硫黄（Ｆｅ−Ｓ）タンパク質の機能発現が生産性向上の鍵を握っていることが分かってきているが（特許文献１、２参照）、酵母におけるＤ−ＢＴの生産において、目下のところ成功には至っていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開公報２０１１−１０３３００号
【特許文献２】国際公開公報２０１４−１６２０６３号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Toivari MH, Ruohonen L, Richard P, Penttila M, Wiebe MG: Saccharomyces cerevisiae engineered to produce D-xylonate. Appl Microbiol Biotechnol 2010, 88:751-760
【非特許文献２】Toivari M, Nygard Y, Kumpula E, Vehkomaki M-L, Bencina M, Valkonen M, Maaheimo H, Andberg M, Koivula A, Ruohonen L, Penttila M, Wiebe MG: Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for bioconversion of D-xylose to D-xylonate. Metab Eng 2012, 14:427-36
【非特許文献３】Niu W, Molefe MN, Frost JW: Microbial Synthesis of the Energetic Material Precursor 1,2,4-Butanetriol. Journal of the American Chemical Society 2003(Scheme 2):12998-12999
【非特許文献４】Monteith, M.J., Schoefield, D., Bailey M: Process for the preparation of butanetriols. 1998:WO1998008793
【非特許文献５】Cao Y, Niu W, Guo J, Xian M, Liu H: Biotechnological production of 1,2,4-butanetriol: An efficient process to synthesize energetic material precursor from renewable biomass. Sci Rep 2015, 5(November):18149
【非特許文献６】Valdehuesa KNG, Liu H, Ramos KRM, Park SJ, Nisola GM, Lee WK, Chung WJ: Direct bioconversion of d-xylose to 1,2,4-butanetriol in an engineered Escherichia coli. Process Biochem 2014, 49:25-32
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
このような状況の中、本発明者らは、酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を用いて、Ｄ−キシロースからＤ−ＢＴを効率的に生産できる方法を開発することを目的として研究を進めた。なお、以降は、特に表記がない限り、各物質については全てＤ体として頭のＤ−は省略する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ由来のキシロースデヒドロゲナーゼ、キシロネートデヒドラターゼ、そしてＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ由来の２−ケト酸デカルボキシラーゼ（ＫＤＣ）をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに組み込むことで、キシロースからのＢＴ生産が可能となることを確認した。また、ＢＴ生産性を高めるために、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでのＢＴ生産に適したＫＤＣのスクリーニングを行った。さらに、酵母において鉄取り込み量の調節に関与するタンパクの発現を制御することで、鉄硫黄タンパク質であるキシロネートデヒドラターゼ活性を向上させ、ＢＴ生産能の著しい改善に成功した。即ち、本発明の要旨は、以下に示すとおりである。【００１１】
［１］（Ａ）鉄硫黄タンパク質（Ｆｅ−Ｓタンパク質）をコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドを含み、かつ（Ｂ）鉄硫黄クラスターの生合成を制御する少なくとも１種のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを過剰発現させた、組換え宿主細胞。
［２］（Ｃ）キシロース代謝経路に関与するその他の酵素をコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドをさらに含む、［１］に記載の組換え宿主細胞。
［３］上記鉄硫黄タンパク質が、キシロネートデヒドラターゼ（ＸｙｌＤ）である、［１］又は［２］に記載の組換え宿主細胞。
［４］上記鉄硫黄クラスターの生合成を制御するタンパク質が、ＴＹＷ１である、［１］から［３］のいずれかに記載の組換え宿主細胞。
［５］上記キシロース代謝経路に関与するその他の酵素が、キシロースデヒドロゲナーゼ（ＸｙｌＢ）、及び２−ケト酸デカルボキシラーゼ（ＫＤＣ）から成る群より選択される少なくとも１種である、［２］から［４］のいずれかに記載の組換え宿主細胞。
［６］上記宿主細胞が、酵母細胞である、［１］から［５］のいずれかに記載の組換え宿主細胞。
［７］上記酵母細胞が、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ブレタノミセス属（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジタ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クロッケラ属（Ｋｌｏｃｃｋｅｒａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、イサトケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、スワニオミセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ヤマダジマ属（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ）、及びパチソレン属（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）からなる群より選択される、少なくとも１種の酵母細胞である、［６］に記載の組換え宿主細胞。
［８］［１］から［７］のいずれかに記載の組換え宿主細胞を用いる、Ｄ−ブタントリオールの製造方法。
［９］Ｄ−ブタントリオールを製造する方法であって、（ａ）鉄硫黄タンパク質をコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドを含み、かつ、鉄硫黄クラスターの生合成を制御する少なくとも１種のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを過剰発現させた組換え宿主細胞を調製する工程、並びに（ｂ）上記組換え宿主細胞を増殖させる工程を含むことを特徴とするＤ−ブタントリオールの製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によると、酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を用いて、Ｄ−キシロースからＤ−ＢＴを効率的に生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、キシロースからブタントリオールが合成される経路を示した図である。
【図２】図２は、ＢＤ，ＢＤ−ｍｄｌＣ，ＢＤδＤ株の（Ａ）キシロース消費量，（Ｂ）キシロネート生産量，（Ｃ）ＢＴ生産量を示す図である。
【図３】図３は、３種類のＫＤＣ（ＭｄｌＣ，Ａｒｏ１０，ＫｉｖＤ）導入株の（Ａ）キシロース消費量，（Ｂ）キシロネート生産量，（Ｃ）ＢＴ生産量を示す図である。
【図４】図４は、ｋｉｖＤ発現強化株の（Ａ）キシロース消費量，（Ｂ）キシロネート生産量，（Ｃ）ＢＴ生産量を示す図である。
【図５】図５は、各組換え宿主細胞株の最大ＢＴ生産量を示す図である。
【図６】図６は、ＢＤδＤ−２ｔｋｄｃＡ−ＴＹＷ１株及びＢＤδＤ−２ｔｋｄｃＡ−ｔＴＹＷ１株の作製手順を示す図である。
【図７】図７は、各組換え宿主細胞株のＸｙｌＤ活性を示す図である。
【図８】図８は、ＢＤδＤ−２ｔｋｄｃＡ−ＴＹＷ１株及びＢＤδＤ−２ｔｋｄｃＡ−ｔＴＹＷ１株のＢＴ生産量の経時変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の組換え宿主細胞、及びＤ―ブタントリオールの製造方法について詳細に説明する。なお、本明細書において、ＤＮＡやベクターの調製等の分子生物学的手法は、特に明記しない限り、当業者に公知の一般的実験書に記載の方法又はそれに準じた方法により行うことができる。また、本明細書中で使用される用語は、特に言及しない限り、当該技術分野で通常用いられる意味で解釈される。
【００１５】
＜組換え宿主細胞＞
本発明の組換え宿主細胞は、（Ａ）鉄硫黄タンパク質（Ｆｅ−Ｓタンパク質）をコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドを含み、（Ｂ）鉄硫黄クラスターの生合成を制御する少なくとも１種のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを過剰発現させた細胞である。また、（Ｃ）キシロース代謝経路に関与するその他の酵素をコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドをさらに含むことが好ましい。以下に本発明の組換え宿主細胞が含む、上記異種ポリヌクレオチド等について説明する。
【００１６】
（Ａ）鉄硫黄タンパク質（Ｆｅ−Ｓタンパク質）をコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチド
本発明の組換え宿主細胞は（Ａ）鉄硫黄タンパク質（Ｆｅ−Ｓタンパク質）をコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドを含む。本発明の組換え宿主細胞は、効率的な物質生産のために用いられるものであり、この鉄硫黄タンパク質は、宿主細胞内での物質生産に必要な酵素として機能するものである。上記異種由来の鉄硫黄タンパク質を宿主細胞に導入することにより、元来この宿主細胞が備えていない代謝経路が働くようになり、所望の物質生産が可能となる。
【００１７】
本発明に用いる宿主細胞は、当業者にとって周知の宿主細胞のいずれでもよく、原核細胞、真核細胞、例えば細菌細胞、菌類細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞又は植物細胞が含まれる。例示的細菌細胞には、エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、又はバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の任意の種が含まれ、上記には、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）等が含まれる。
【００１８】
本発明に用いる宿主細胞としては、種々のストレスに耐性があり、遺伝子組換えも容易であることから、酵母細胞が好ましい。酵母細胞としては、例えば、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ブレタノミセス属（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジタ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クロッケラ属（Ｋｌｏｃｃｋｅｒａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、イサトケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、スワニオミセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ヤマダジマ属（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ）、パチソレン属（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）等が挙げられる。これらのうち、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）であることがより好ましく、具体的には、例えばＹＰＨ４９９株、Ｓ２８８Ｃ株、ＹＰＨ５００株、ＢＹ４７４１株、ＢＹ４７４２株、Ｗ３０３株、ＣＥＮ．ＰＫ株、ＢＹ４７４３株、ＦＹ４株、ＡＢ９７２株、Ａ３６４Ａ株、ＤＣ５株、Ｘ２１８０−１Ａ株、Ｄ−２７３−１０Ｂ株、ＦＬ１００株、ＪＫ９−３ｄ株、ＲＭ１１−１ａ株、ＳＥＹ６２１０株、ＳＥＹ６２１１株、Ｓｉｇｍａ１２７８ｂ株、ＳＫ１株、ＸＪ２４−２４ａ株、Ｙ５５株、ＹＰＨ５０１株等を用いることができる。中でも、ＹＰＨ４９９株、Ｓ２８８Ｃ株、ＹＰＨ５００株、ＢＹ４７４１株、ＢＹ４７４２株、Ｗ３０３株、ＣＥＮ．ＰＫ株がさらに好ましく、ＹＰＨ４９９株が特に好ましい。
【００１９】
本発明において、「鉄硫黄タンパク質（Ｆｅ−Ｓタンパク質）」とは、酸化数が可変の二、三及び四鉄中心を含む鉄硫黄（Ｆｅ−Ｓ）クラスターの存在で特徴づけられるタンパク質をいう。鉄硫黄（Ｆｅ−Ｓ）クラスターには、２Ｆｅ−２Ｓクラスター、４Ｆｅ−４Ｓクラスター、３Ｆｅ−４Ｓクラスター等があり、鉄硫黄タンパク質（Ｆｅ−Ｓタンパク質）の種類により要求する鉄硫黄（Ｆｅ−Ｓ）クラスターは異なる。本発明における鉄硫黄タンパク質（Ｆｅ−Ｓタンパク質）は、細胞内でのキシロース代謝に関与する酵素のうちで鉄硫黄（Ｆｅ−Ｓ）クラスターを有するタンパク質であり、例えば、キシロネートデヒドラターゼ（ＸｙｌＤ）等が挙げられる。
【００２０】
典型的なＸｙｌＤタンパク質（ペプチド）及びそれをコードするポリヌクレオチドとしては、以下の表１〜２に示すものが挙げられる。なお、下記表１〜２には、典型的なＸｙｌＤタンパク質（ペプチド）及びそれをコードするポリヌクレオチドとして、ＧｅｎｏｍｅＮｅｔに登録されているものの登録名を示している。各登録名に対応する具体的な配列は、http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?K14275+K22186+K22396+4.2.1.82+R02429に開示されている。ＸｙｌＤタンパク質（ペプチド）をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号１のポリヌクレオチドが特に好ましい。それぞれの特定の配列に対して、少なくとも９０％、好ましくは９５％以上の同一性を有するタンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）であり、かつＸｙｌＤ活性を有するタンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）は、本発明において使用可能であると理解される。
【００２１】
【表１】
2019159831.tif 000002
【００２２】
【表２】
2019159831.tif 000003
【００２３】
本発明において「ポリヌクレオチド」という用語は、単一の核酸及び複数の核酸の両方を意味し、ｍＲＮＡ等の核酸分子、プラスミドＲＮＡ、全長のｃＤＮＡ及びその断片等を含む。ポリヌクレオチドは、任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドから構成され、修飾、非修飾のどちらでもよい。一本鎖でも二本鎖でもよく、両者の混合でもよい。
【００２４】
本発明において「異種ポリヌクレオチド」とは、本発明の組換え宿主細胞とは異なる種由来のタンパク質をコードするポリヌクレオチドをいう。例えば、本発明の組換え宿主細胞が酵母細胞である場合、異種ポリヌクレオチドとしては、大腸菌、緑膿菌等のバクテリア由来のポリヌクレオチド等が挙げられる。また、対応する天然遺伝子とは異なる形態で宿主細胞中に再導入された天然コード領域又はその一部も含む。例えば、ゲノム中のその天然位置にはないものも含まれる。なお、本発明の組換え宿主細胞において異種ポリヌクレオチドを導入する目的は、元来その宿主細胞が有していない酵素等のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを異種から導入し、キシロース代謝経路等の代謝経路を機能させ及び／又は亢進させることである。
【００２５】
（ポリヌクレオチドの導入方法）
細胞に異種ポリヌクレオチドを発現させるには、例えば、当該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターで細胞を形質転換させればよい。発現ベクターは、本発明の遺伝子を発現可能な状態で含むものであれば特に限定されず、それぞれの宿主に適したベクターを用いることができる。
【００２６】
本発明の発現ベクターは、上記異種ポリヌクレオチドの上流に転写プロモーター、場合によっては下流にターミネーターを挿入して発現カセットを構築し、このカセットを発現ベクターに挿入することにより作製することができる。あるいは、発現ベクターに転写プロモーターおよび／またはターミネーターがすでに存在する場合には、発現カセットを構築することなく、ベクター中のプロモーターおよび／またはターミネーターを利用して、その間に当該異種ポリヌクレオチドを挿入すればよい。
【００２７】
ベクターに上記異種ポリヌクレオチドを挿入するには、制限酵素を用いる方法、トポイソメラーゼを用いる方法等を利用することができる。また、挿入の際に必要であれば、適当なリンカーを付加してもよい。また、アミノ酸への翻訳にとって重要な塩基配列として、ＳＤ配列やＫｏｚａｋ配列などのリボソーム結合配列が知られており、これらの配列を遺伝子の上流に挿入することもできる。挿入にともない、遺伝子がコードするアミノ酸配列の一部を置換してもよい。
【００２８】
本発明において使用されるベクターは、本発明の遺伝子を保持するものであれば特に限定されず、それぞれの宿主に適したベクターを用いることができる。ベクターとしては、例えば、プラスミドＤＮＡ、バクテリオファージＤＮＡ、レトロトランスポゾンＤＮＡ、人工染色体ＤＮＡなどが挙げられる。
【００２９】
宿主への発現ベクターの導入方法は、宿主に適した方法であれば特に限定されるものではない。利用可能な方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、カルシウムイオンを用いる方法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。組換え宿主細胞における当該ポリヌクレオチドの発現は、当業者に公知の方法に従って定量化することができる。例えば、当該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの、細胞タンパク質全体のパーセントによって表すことができる。また、形質転換した細胞の細胞抽出液を用い、当該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを検出できる抗体を使用したウエスタンブロッティング、あるいは当該ポリヌクレオチドを特異的に検出するプライマーを使用したリアルタイムＰＣＲなどにより確認することができる。
【００３０】
（Ｂ）鉄硫黄クラスターの生合成を制御する少なくとも１種のタンパク質をコードするポリヌクレオチド
本発明の組換え宿主細胞は、鉄硫黄クラスターの生合成を制御する少なくとも１種のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを過剰発現させた細胞である。「鉄硫黄クラスターの生合成を制御するタンパク質」としては、鉄硫黄クラスターの合成を制御するタンパク質、細胞内で鉄硫黄クラスターの運搬に関与しているタンパク質、鉄の感知・取り込み・利用を制御するタンパク質等のいずれであってもよく、最終的に鉄硫黄クラスターの生合成に影響を与えるタンパク質であれば特に限定されない。ここで、鉄の感知・取り込み・利用を制御するタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、鉄の代謝に関与する遺伝子群である鉄（Ｆｅ）レギュロンに含まれる遺伝子であってもよい。
【００３１】
（Ｂ）ポリヌクレオチドとしては組換え宿主細胞でのＢＴ産生を向上させる効果の観点から、細胞内での鉄硫黄（Ｆｅ−Ｓ）クラスターの貯蔵に関与するタンパク質であるＴＹＷ１をコードするポリヌクレオチドが好ましい。このＴＹＷ１をコードするポリヌクレオチドを宿主細胞において過剰発現させることにより、鉄の細胞内への取り込みが促進され、鉄硫黄クラスターが充分に供給されることにより鉄硫黄タンパク質（ＸｙｌＤなど）の活性を向上させることができると考えられる。典型的なＴＹＷ１タンパク質（ペプチド）及びそれをコードするポリヌクレオチドとしては、以下の表３〜５に示すもの及び本願実施例で用いたものが挙げられる。なお、下記表３〜５には、典型的なＴＹＷ１タンパク質（ペプチド）及びそれをコードするポリヌクレオチドとして、ＧｅｎｏｍｅＮｅｔに登録されているものの登録名を示している。各登録名に対応する具体的な配列は、http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?ec:4.1.3.44に開示されている。なお、（Ｂ）ポリヌクレオチドとしては、組換え宿主細胞でのＢＴ産生を効率的に向上させる効果の観点から、配列番号２及び３のポリヌクレオチドが好ましい。それぞれの特定の配列に対して、少なくとも９０％、好ましくは９５％以上の同一性を有するタンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）であり、かつＴＹＷ１活性を有するタンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）は、本発明において使用可能であると理解される。
【００３２】
【表３】
2019159831.tif 000004
【００３３】
【表４】
2019159831.tif 000005
【００３４】
【表５】
2019159831.tif 000006
【００３５】
本発明において「過剰発現」という用語は、本明細書で使用される場合、同一又は関連のポリヌクレオチド若しくは遺伝子の内因性発現よりも高い発現を指す。また、異種ポリヌクレオチド又は遺伝子は、同等の内因性遺伝子の発現よりもその発現が高ければ、あるいは、ポリヌクレオチド又は遺伝子を過剰発現しない手段によって導入された同じポリヌクレオチド又は遺伝子の発現よりもその発現が高ければ、過剰発現に該当する。宿主細胞においてポリヌクレオチドのコピー数を増大させる任意の手段を使用してポリヌクレオチドを過剰発現させることができる。例えば、高コピー数プラスミド、又は制御可能なコピー数を有するプラスミドを使用してもよいし、多数の染色体組込みによって過剰発現としてもよい。
【００３６】
細胞にポリヌクレオチドを過剰発現させるには、例えば、当該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターで細胞を形質転換させればよい。方法の詳細は、上述の「ポリヌクレオチドの導入方法」の項を参照されたい。なお、比較に用いる過剰発現させない細胞は、形質転換させなくてもよいし、当該ポリヌクレオチドを含まない発現ベクターで形質転換させてもよい。組換え宿主細胞における当該ポリヌクレオチドの発現又は過剰発現は、当業者に公知の方法に従って定量化することができる。例えば、当該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの、細胞タンパク質全体のパーセントによって表すことができる。また、形質転換した細胞の細胞抽出液を用い、当該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを検出できる抗体を使用したウエスタンブロッティング、あるいは当該ポリヌクレオチドを特異的に検出するプライマーを使用したリアルタイムＰＣＲなどにより確認することができる。過剰発現させなかった細胞と比較して、過剰発現させた細胞で当該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの発現量が多いこと、好ましくは２倍以上になっていることを確認すること等により、過剰発現されたと判断することができる。
【００３７】
（Ｃ）キシロース代謝経路に関与するその他の酵素をコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチド
「キシロース代謝経路」とは、キシロースからエタノール、キシリトール、Ｄ−キシロネート、Ｄ−１，２，４−ブタントリオール（Ｄ−ＢＴ）、１，４−ブタンジオール等を生産する経路をいい、例えば、ＸＲ／ＸＤＨ経路、ＸＩ経路、Ｄａｈｍｓ／Ｗｅｉｍｂｅｒｇ経路として知られている経路、これらの経路を工業的に利用できるように改変した経路等も含まれる。好ましくは、Ｄ−キシロースからＤ−ブタントリオールを生産するための酵素経路を指す。
【００３８】
「キシロース代謝経路に関与するその他の酵素」とは、キシロース代謝経路に関与する酵素のうちで鉄硫黄タンパク質（Ｆｅ−Ｓタンパク質）に分類されない酵素を指す。例えば、キシロースデヒドロゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、キシルロースリン酸化酵素、キシリトール脱水素酵素、キシロース還元酵素等が挙げられる。これらのうち、本発明においては、Ｄ−キシロースからのＤ−ブタントリオールの生産に関与するキシロースデヒドロゲナーゼ、デカルボキシラーゼが好ましい。典型的なキシロースデヒドロゲナーゼタンパク質（ペプチド）及びそれをコードするポリヌクレオチドとしては、以下の表６〜１０に示すものが挙げられる。なお、下記表６〜８には、典型的なキシロースデヒドロゲナーゼタンパク質（ペプチド）及びそれをコードするポリヌクレオチドとして、ＧｅｎｏｍｅＮｅｔに登録されているものの登録名を示している。各登録名に対応する具体的な配列は、http://www.kegg.jp/dbget-bin/www_bget?ec:1.1.1.175、又はhttp://www.kegg.jp/dbget-bin/www_bget?ec:1.1.1.179に開示されている。
【００３９】
なお、キシロースデヒドロゲナーゼタンパク質としては、組換え宿主細胞でのＢＴ産生を効率的に向上させる効果の観点から、配列番号４のポリヌクレオチドがコードするものが特に好ましい（ＸｙｌＢ）。また、デカルボキシラーゼタンパク質としては、分岐鎖２−ケト酸デカルボキシラーゼ（ＫｄｃＡ）、２−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（ＫｉｖＤ等）、フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ（Ａｒｏ１０等）、ｍｄｌＣが好ましく、分岐鎖２−ケト酸デカルボキシラーゼ（ＫｄｃＡ）、２−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（ＫｉｖＤ等）がより好ましく、組換え宿主細胞でのＢＴ産生を効率的に向上させる効果の観点から配列番号５のポリヌクレオチドがコードする分岐鎖２−ケト酸デカルボキシラーゼ（ＫｄｃＡ）が特に好ましい。それぞれの特定の配列に対して、少なくとも９０％、好ましくは９５％以上の同一性を有するタンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）であり、かつ２−ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）は、本発明において使用可能であると理解される。
【００４０】
【表６】
2019159831.tif 000007
【００４１】
【表７】
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【００４２】
【表８】
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【００４３】
なお、細胞にキシロース代謝経路に関与するその他の酵素をコードする異種ポリヌクレオチドを発現させるには、例えば、当該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターで細胞を形質転換させる等、当業者に公知の方法により行うことができる。方法の詳細は上述の「ポリヌクレオチドの導入」の項を参照されたい。
【００４４】
以上説明したとおり、本発明によると、キシロースデヒドロゲナーゼ、キシロネートデヒドラターゼ、そして２−ケト酸デカルボキシラーゼ（ＫＤＣ）をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに組み込むことで、キシロースからのＢＴ生産が可能となる。さらに、酵母において鉄取り込み量の調節に関与するタンパク（ＴＹＷ１）の発現を制御することで、鉄硫黄タンパク質であるキシロネートデヒドラターゼ活性を向上させ、ＢＴ生産能を著しく改善することができる。
【００４５】
＜本発明のＤ−ブタントリオールの製造方法＞
本発明は、上述の本発明の組換え宿主細胞を用いたＤ−ブタントリオールの製造方法も提供する。本発明のＤ−ブタントリオールの製造方法は、（ａ）鉄硫黄タンパク質をコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドを含み、かつ、鉄硫黄クラスターの生合成を制御する少なくとも１種のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを過剰発現させた組換え宿主細胞を調製する工程、並びに（ｂ）上記組換え宿主細胞を増殖させる工程を含むことを特徴とする。なお、鉄硫黄タンパク質をコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドを含み、かつ、鉄硫黄クラスターの生合成を制御する少なくとも１種のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを過剰発現させた組換え宿主細胞を調製する方法については、各文言の意味も合わせて、上述の組換え宿主細胞の項の記載を参照されたい。
【００４６】
Ｄ−ブタントリオールは、上記（ｂ）工程によって得られた組換え宿主細胞の培養液を回収し、常法に従い、製造系から回収し、適宜濃縮、精製することができる。例えば、Ｄ−ブタントリオールを含む培養液より細胞（菌体）を分離除去した後、蒸留等によりＤ−ブタントリオールを分別する。
【００４７】
また、本発明のＤ−ブタントリオールの製造方法は、上述の本発明の組換え宿主細胞を用いる方法ということもできる。即ち、上述の本発明の組換え宿主細胞の培養液を回収し、常法に従い、製造系から回収し、適宜濃縮、精製することができる。例えば、Ｄ−ブタントリオールを含む培養液より細胞（菌体）を分離除去した後、蒸留等によりＤ−ブタントリオールを分別する。
【実施例】
【００４８】
以下の実施例にて本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。【００４９】
１．１，２，４−ブタントリオール（ＢＴ）生産酵母の作製
はじめに、酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）でＢＴを生産できることを確かめるための実験を行った。図１に示すように、ＢＴは５段階の反応でキシロースから生産することができる。まず、キシロースはキシロースデヒドロゲナーゼによりキシロノラクトンに変換される。キシロノラクトンはキシロノラクトナーゼ又は自然に開環してキシロネートに変換される。キシロネートはキシロネートデヒドラターゼにより、２−ケト−３−デオキシ−キシロネート（ＫＤＸ）に変換される。そして、ＫＤＸは２−ケト酸デカルボキシラーゼによって３，４−ジヒドロキシブタナールに変換される。最後に３，４−ジヒドロキシブタナールはアルコールデヒドロゲナーゼによってＢＴに変換される。これら５段階の反応の内、キシロノラクトンは自然に開環してキシロネートに変換されるため、キシロノラクトナーゼは必ずしも必要ではない。また酵母は複数のアルコールデヒドロゲナーゼを持っており、いずれかのアルコールデヒドロゲナーゼにより５段階目の反応も触媒できると考えられる。そこでまず、キシロースデヒドロゲナーゼ、キシロネートデヒドラターゼ、２−ケト酸デカルボキシラーゼ（ＫＤＣ）をコードする３種類の遺伝子を導入した株を作成した。【００５０】
酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＰＨ４９９株において、キシロースからのキシリトール生成を防ぐために、内生のキシロースレダクターゼ活性をもつＧＲＥ３を欠損させたＹＰＨ４９９ΔＧＲＥ３株を作成した。この株にＢＴ生産のためにまずは、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｃｅｎｔｕｓ由来のキシロースデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｘｙｌＢ）とキシロネートデヒドラターゼ遺伝子（ｘｙｌＤ）を導入して、ＢＤ株を作成した。続いて、この株に、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＢＴ生産においてよく用いられているＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｔｉｄａ由来のＫＤＣ遺伝子（ｍｄｌＣ）を導入することでＢＤ−ｍｄｌＣ株を作成した。（Niu W, Molefe MN, Frost JW: Microbial Synthesis of the Energetic Material Precursor 1,2,4-Butanetriol. Journal of the American Chemical Society 2003(Scheme 2):12998-12999.；Cao Y, Niu W, Guo J, Xian M, Liu H: Biotechnological production of 1,2,4-butanetriol: An efficient process to synthesize energetic material precursor from renewable biomass. Sci Rep 2015, 5(November):18149.；Valdehuesa KNG, Liu H, Ramos KRM, Park SJ, Nisola GM, Lee WK, Chung WJ: Direct bioconversion of d-xylose to 1,2,4-butanetriol in an engineered Escherichia coli. Process Biochem 2014, 49:25-32.；Zhang N, Wang J, Zhang Y, Gao H: Metabolic pathway optimization for biosynthesis of 1,2,4-butanetriol from xylose by engineered Escherichia coli. Enzyme Microb Technol 2016, 93-94:51-58.）ＢＴ生産能を評価するために、ＢＤ株及びＢＤ−ｍｄｌＣ株を用いて１０ｇ／Ｌのグルコースと１０ｇ／Ｌのキシロースを含む培地での発酵試験を行い、代謝物及び各酵素活性を測定した。具体的な実験方法を以下に説明する。【００５１】
ＢＴ生産の宿主には、酵母株、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ４９９［ＭＡＴａ  ｕｒａ３−５２  ｌｙｓ２−８０１  ａｄｅ２−１０１  ｔｒｐ１−  ６３  ｈｉｓ３−Δ２００  ｌｅｕ２−Δ１  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）］を用いた。酵母の培養には、ＳＤ培地［６．７ｇ／Ｌ  ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ，ＵＳＡ），２０ｇ／Ｌ  ｇｌｕｃｏｓｅ］に株の栄養要求性に合わせてアミノ酸・核酸を加えたもの、又はＹＰＤ培地［１０ｇ／Ｌ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ，２０ｇ／Ｌ  Ｂａｃｔｏ−ｐｅｐｔｏｎｅ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），２０ｇ／Ｌ  ｇｌｕｃｏｓｅ］を用いた。培養は３０°Ｃで行った。【００５２】
本研究で作成したプラスミドは全て、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いて作成した。簡単には、制限酵素処理したベクターの末端１５塩基の相同配列を、クローニングする塩基配列の両端にＰＣＲで付加して、ベクターとクローニング配列、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ酵素を混合し５０℃で１５ｍｉｎインキュベートすることで作成した。この研究で使用した遺伝子のうち、Ｃ．ｃｒｅｃｅｎｔｕｓ由来のｘｙｌＢ及びｘｙｌＤ、Ｐ．Ｐｕｔｉｄａ由来のｍｄｌＣ、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ由来ＫｉｖｄはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのコドンに最適化したものをＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ，  ＵＳ）にて人工合成した。本研究で作成したプラスミドを下記表９に示す。【００５３】
【表９】
2019159831.tif 000010
【００５４】
酵母の形質転換はＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Chen DC, Yang BC, Kuo TT: One-step transformation of yeast in stationary phase. Curr Genet 1992, 21:83-84.）によって報告されている、酢酸リチウムを用いたＯｎｅ−ｓｔｅｐ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ法に従い行った。また全ての遺伝子は酵母のゲノム上に相同組替えにより導入した。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ４９９株においてＧＲＥ３をＧ４１８（薬剤）耐性遺伝子で置換することで、ＧＲＥ３破壊株ＹＰＨ４９９ΔＧＲＥ３株を作成した。ＧＲＥ３破壊用のＤＮＡ断片の作成は、Ｙｅａｓｔ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｍａｔ−Ａ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｓｅｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）より取得したＢＹ４７４１ΔＧＲＥ３のゲノムＤＮＡをテンプレートに、プライマーｄＧＲＥ３  Ｆ（５′−ＡＣＴＧＧＡＴＴＡＡＡＡＧＧＧＡＧＣＣＣＡＡＧＧ−３′：配列番号６）：及びｄＧＲＥ３  Ｒ（５′−ＣＣＧＴＧＧＡＧＴＣＴＴＣＧＴＣＡＡＧＴＡＧＴＴＧ−３′：配列番号７）を用いて、ＰＣＲにより作成した。【００５５】
ＢＴ生産の試作株作成の為に、ＹＰＨ４９９ΔＧＲＥ３株にＥｃｏＲＶで切断したプラスミドｐＴＳ−Ａ−ｘｙｌＢＤを導入して、ＢＤ株を作成した。続いてＢＤ株に、プラスミドＰＩＬ−ｍｄｌＣをテンプレートにプライマーＰＩＬ  ｔｒａｎｓ  Ｆ（５′−ＡＴＣＡＴＣＴＣＣＧＡＴＧＡＡＧＣＣＴＣＣＧ−３′：配列番号８）及びＰＩＬ  ｔｒａｎｓ  Ｒ（５′−ＡＴＣＡＣＣＡＡＡＣＡＴＧＴＴＧＣＴＧＧＴＧ−３′：配列番号９）を用いて、ＰＣＲにより作成した、ＬＥＵ２マーカー及びｍｄｌＣを含む断片を形質転換して、ＢＤ−ｍｄｌＣ株を作成した。【００５６】
（発酵試験）
発酵試験に用いる菌体は、まず５ｍＬのＳＤ培地で２４ｈ培養した（６．７ｇ／Ｌ  ｏｆ  ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｄｅｔｒｏｉｔ，  ＭＩ，  ＵＳＡ）  ａｎｄ  ２０  ｇ／Ｌ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｓｅ）。そして、５０ｍＬのＹＰＤ培地にＯＤ６００＝０．１となるように植菌して３０℃、１５０ｒｐｍで２４ｈ培養した。菌体を１０ｍＬの滅菌したＤ．Ｗ．で２度洗浄した後、発酵用培地（１０ｇ／Ｌ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ，５ｇ／Ｌ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ，１０ｇ／Ｌ  グルコース，１０ｇ／Ｌ  キシロース）にＯＤ６００＝５となるように植菌して、全量２０ｍＬの系で、３０℃、２００ｒｐｍで発酵試験を行った。２４ｈ毎にサンプリングを行い、培養上清はＨＰＬＣ及びＧＣ−ＭＳを用いて測定した。【００５７】
（代謝物測定試験）
発酵培地中のグルコース及びキシロース濃度は、ＳＰＲ−Ｐｂカラム（７．８ｍｍ×２５０ｍｍ，ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｓｉｚｅ  ８μｍ；Ｓｈｉｍａｄｚｕ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）とＲＩＤ−１０Ａ検出器を装着した、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）を用いて分析した。ＨＰＬＣは８０℃で０．６ｍＬ／ｍｉｎの流速で稼働した。【００５８】
ＢＴ及びキシロネートの濃度は、ガスクロマトグラフィー／質量分析計（ＧＣ−ＭＳ）（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）により分析した。５μＬの培養上清に、２μＬの１０ｇ／Ｌリビトールを内部標準物質として加えて、ＣｅｎｔｒｉＶａｐ  Ｂｅｎｃｈｔｏｐ  Ｖａｃｕｕｍ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒｓ（Ｌａｂｃｏｎｃｏ，Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ，ＭＯ，ＵＳＡ）を用いて乾燥させた。ＧＣ−ＭＳ分析のためのトリメチルシリル化は以下の手順で行った；乾燥させたサンプルに、ピリジンに溶解させた１００μＬの２０ｍｇ／ｍＬ  Ｏ−メチルヒドロキシルアミン塩酸塩溶液を加え９０分間反応させた（１２００ｒｐｍ，３０℃；Ｍ−ＢＲ−０２２ＵＰ；Ｔａｉｔｅｃ，Ｓａｉｔａｍａ，Ｊａｐａｎ）。そして、５０μＬのＮ−メチル−Ｎ−トリメチルシリルトリフルオロアセトアミド（ＭＳＴＦＡ）を加えて、３０分間反応させた（１２００ｒｐｍ  ａｔ  ３７℃；Ｍ−ＢＲ−０２２ＵＰ；Ｔａｉｔｅｃ）。サンプルは室温で遠心分離（３０００ｇ，５分）して上清を分析に用いた。【００５９】
ＧＣ−ＭＳ（ＧＣＭＳ−ＱＰ２０１０  Ｕｌｔｒａ；Ｓｈｉｍａｄｚｕ）には、ＣＰ−Ｓｉｌ  ８ＣＢカラム（３０ｍ  ｌｅｎｇｔｈ×０．２５ｍｍ  ｉ．ｄ．，ｆｉｌｍ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ  ｏｆ０．２５μｍ；Ａｇｉｌｅｎｔ）を装着して用いた。ＧＣ−ＭＳの各パラメーターの設定は以下の通りである；試料気化室の温度は２３０°Ｃに設定した。サンプル注入量は１μＬでスプリット比は１：２５に設定した。ヘリウムをキャリアーガスに用いて、流量は１．１２ｍＬ／ｍｉｎに設定した。カラム温度は、８０℃で２分間保温したのちに、１５℃／ｍｉｎで３３０℃まで昇温して、３３０℃で６分間保温した。インターフェース温度及びイオン源の温度はそれぞれ、２５０℃と２００℃に設定した。イオン化（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｉｍｐａｃｔ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ；ＥＩ）は７０ｅＶで行った。分析はＦａｓｔ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｓｃａｎ／ＳＩＭ（ＦＡＳＴＴ）モードにより、Ｓｃａｎモード（８５−５００ｍ／ｚ）及びＳｅｌｅｃｔｅｄ  ｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ（ＳＩＭ）モード（ｍ／ｚ  １０３，ａｎｄ  １２９  ｆｏｒ  ＢＴ，ａｎｄ  ｍ／ｚ  １０３  ｆｏｒ  ｒｉｂｉｔｏｌ）を並行して行った。【００６０】
（酵素活性測定試験）
キシロネートデヒドラターゼ（ＸｙｌＤ）活性測定は、チオバルビツール酸法により行った（Kim S, Lee SB: Identification and characterization of Sulfolobus solfataricus D-gluconate dehydratase: a key enzyme in the non-phosphorylated Entner-Doudoroff pathway. Biochem J 2005, 387:271-280.）。酵素反応溶液（４００μＬ；５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．１），５ｍＭ，ＭｇＣｌ２，１２ｍＭ  Ｄ−ｘｙｌｏｎａｔｅ，５０μＬ細胞抽出液）は３０℃で１０分間反応させた。酵素反応は１００μＬの２．０Ｍ  ＨＣｌを加えることで終結させた。反応溶液（５０μＬ）に１２５μＬの２５ｍＭ過ヨウ素酸溶液（０．１２５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４に溶解）を加え２０℃で２０分間反応させたのち、２５０μＬの２％（ｗ／ｖ）亜ヒ酸ナトリウム溶液（０．５Ｍ  ＨＣｌに溶解）を加え反応を終結した。最後に１ｍＬのチオバルビツール酸水溶液を加えて、１００℃で１０分間反応させることで、赤色の発色団を生成させた。発色強度を増強させるために、室温まで冷却したのち等量のＤＭＳＯを反応溶液に加えた。吸光度は５４９ｎｍで測定して、発色団のモル吸光係数には６．７８×１０４Ｍ−１ｃｍ−１を用いた（SKOZA L, MOHOS S: Stable Thiobarbituric Acid Chromophore with Dimethyl Sulphoxide. J Biol Chem 1976, 159:457-462.）。【００６１】
（結果）
上記試験の結果、ＢＤ株及びＢＤ−ｍｄｌＣ株において、グルコースは培養２４ｈで全て消費されていた。一方、両株においてキシロースは培養２４ｈまでに約７ｇ／Ｌが消費され、最終的に培養９６ｈで約９ｇ／Ｌが消費されていた（図２の（Ａ））。培養９６ｈにおけるＢＴの生産量は、ＢＤ株およびＢＤ−ｍｄｌＣ株で１９．３±５．４ｍｇ／Ｌと３１．６±１．９ｍｇ／Ｌであった（図２の（Ｃ））。よって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでもｘｙｌＢ、ｘｙｌＤ、ｍｄｌＣの３種類の遺伝子を導入する事でＢＴが生産できる事が確認できた。また、ｍｄｌＣを導入していないＢＤ株でもＢＴの生産が確認できたことから、内生のＫＤＣによってもＫＤＸからＤＨＢへの変換が行なわれていることが示唆された。なお、ＢＤ及びＢＤ−ｍｄｌＣの２株においてＢＴ生産量は非常に少なかった。原因の１つとして、中間生成物のキシロネートの培地中への蓄積が考えられ、培養９６ｈにおいて、ＢＤ株及びＢＤ−ｍｄｌＣにおいて、キシロネートはそれぞれ７．２±０．４ｇ／Ｌと７．６±０．４ｇ／Ｌ培地中に蓄積していた（図２の（Ｂ））。【００６２】
２．δインテグレーション法によるｘｙｌＤの過剰発現
上記のＢＤ−ｍｄｌＣの発酵試験より、中間生成物のキシロネートが培地中に多量に蓄積していることが確認された。原因としては、キシロネートからＫＤＸへの反応を触媒するＸｙｌＤの活性が低いことが考えられた。そこで、δインテグレーション法によりｘｙｌＤを染色体上に多コピー導入することで発現を強化して、ＸｙｌＤ活性の向上を試みた。なお、δインテグレーションとは、酵母染色体上のレトロトランスホポゾン（Ｔｙ因子）末端の繰り返し配列であるδ配列をターゲットに、目的遺伝子を相同組換えで導入する方法である。δ配列は染色体上に複数あるため、δインテグレーションにより目的遺伝子を多コピー導入できる（Parekh RN, Shaw MR, Wittrup KD: An integrating vector for tunable, high copy, stable integration into the dispersed Ty delta sites of Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol Prog 1996, 12:16-21.）。【００６３】
ＢＤ株の染色体上に、δインテグレーション法によりｘｙｌＤを多コピー導入することで、ｘｙｌＤ発現強化株ＢＤδＤを作成した。具体的には、ｘｙｌＤの多コピー導入株作成の為に、ＢＤ株にＡｓｃＩで切断したプラスミドｐδＷ−ｘｙｌＤを導入して、ＢＤδＤ株を作成した。【００６４】
（結果）
ＢＤδＤ株においてＸｙｌＤ活性が向上していることを確かめるために、上記方法に従ってＸｙｌＤの活性測定を行った。その結果、ＢＤ株及びＢＤδＤ株のＸｙｌＤ活性はそれぞれ、０．２２１±０．０１２及び０．２６９±０．０１４（Ｕ／ｍｇ  ｔｏｔａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）で、ｘｙｌＤの発現強化により約１．２倍のＸｙｌＤ活性の向上が見られた。続いて、ＸｙｌＤの発現強化がＢＴ生産能に与える影響を調べるためにＢＤδＤ株を用いて、グルコース及びキシロースの混合培地で発酵試験を行った。ＢＤδＤ株はＢＤ株およびＢＤ−ｍｄｌＣ株と比べて、培養４８ｈまでを見るとＸｙｌｏｎａｔｅの生産速度はわずかに減少していたが、最終的なＸｙｌｏｎａｔｅの蓄積量に有意な減少は見られなかった（７．５±０．２ｇ／Ｌ）（図２の（Ｂ））。一方、培養９６ｈにおけるＢＤδＤ株のＢＴ生産量は４１．２±４．４ｍｇ／Ｌで、ＫＤＣ遺伝子を導入していないにも関わらずＢＤ−ｍｄｌＣより生産量が増加していた（図２の（Ｃ））。【００６５】
Ｘｙｌｏｎａｔｅの蓄積量がほとんど変化しなかった理由としては、酵母細胞内でのＸｙｌＤ活性が非常に低いことから、過剰発現により酵素を増産してもキシロネートの蓄積を解消するのに十分な活性を得られなかったことが考えられる。また、ＸｙｌＤによって、キシロネートはＫＤＸ（２−Ｋｅｔｏ−３−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｘｙｌｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）へと変換されるが、このＫＤＸ以降の代謝が弱いことが、キシロネートの代謝を停滞させている可能性がある。【００６６】
３．２−ケト酸デカルボキシラーゼ（ＫＤＣ）の検討（スクリーニング）
ＫＤＸ（２−Ｋｅｔｏ−３−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｘｙｌｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）を特異的にＤＨＢ（Ｄ−３，４−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔａｎａｌ）に変換する酵素は知られておらず、この反応が大腸菌でのＢＴ生産のボトルネックになっていると考えられている。しかしながら、これまで導入するＫＤＣ（２−ケト酸デカルボキシラーゼ；２−ｋｅｔｏａｃｉｄ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）の違いがＢＴ生産に与える影響を調べた研究はない。そこで、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてＫＤＸからＤＨＢへの反応を高効率で行うＫＤＣのスクリーニングを行った。ＢＤ株やＢＤδＤ株でもＢＴが生産されていたことから、ＫＤＸに特異性のある酵母内生のＫＤＣが存在していることが考えられる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内生のフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ（Ａｒｏ１０）は広い基質特異性を持っていることから、ＫＤＸからＤＨＢへの反応を触媒している可能性があると考えた。また、過去の報告からＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ由来の２−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（ＫｉｖＤ）も、ｍｄｌＣに加えてＫＤＸからＤＨＢへの反応を触媒することがわかっている（Tai Y, Xiong M, Jambunathan P, Wang JJ, Wang JJ, Stapleton C, Zhang K: Engineering nonphosphorylative metabolism to generate lignocellulose-derived products. Nat Chem Biol 2016, 12:247-253.）。そこでＰ．ｐｔｉｄａ由来のｍｄｌＣに加えて、ＡＲＯ１０及びｋｉｖＤをＢＤδＤ株に導入する候補として選択した。具体的には、ＢＤδＤ株に上記と同様の方法でｍｄｌＣを導入して、ＢＤδＤ−ｍｄｌＣ株を作成した。また、ＢＤδＤ株にＥｃｏＲＶで切断したｐＩＬ−ＡＲＯ１０又はｐＩＬ−ｋｉｖＤを形質転換することで、ＢＤδＤ−ＡＲＯ１０株及びＢＤδＤ−ｋｉｖＤ株を作成した。【００６７】
ｍｄｌＣ、ＡＲＯ１０、ｋｉｖＤの３種類のＫＤＣをそれぞれ導入した株、ＢＤδＤ−ｍｄｌＣ、ＢＤδＤ−ＡＲＯ１０、ＢＤδＤ−ｋｉｖＤを用いて、１０ｇ／Ｌのグルコースと１０ｇ／Ｌのキシロースを含む培地での発酵試験を行い、ＫＤＣの違いがＢＴ生産に与える影響を調べた。３株においてキシロースの消費速度や消費量はほとんど変化が見られなかった。しかし、培養９６ｈにおけるＸｙｌｏｎａｔｅの蓄積量はＢＤδＤ−ｍｄｌＣ、ＢＤδＤ−ＡＲＯ１０、ＢＤδＤ−ｐｋｉｖｄでそれぞれ７．９±０．０，５．８±０．３，６．４±０．２ｇ／Ｌで、ＡＲＯ１０及びｋｉｖＤを導入した株ではＢＤδＤ（７．５±０．２ｇ／Ｌ）に比べて蓄積量の減少がみられた（図３の（Ｂ））。またＢＴ生産量の最大値は、ＢＤδＤ−ｍｄｌＣでは６９．５±６．５ｍｇ／Ｌであったが、ＢＤδＤ−ＡＲＯ１０では１０５．７±７．８ｍｇ／Ｌ、ＢＤδＤ−ｋｉｖＤでは３８４．３±２６．３ｍｇ／Ｌとなった（図３の（Ｃ））。よってｍｄｌＣ、ＡＲＯ１０、ｋｉｖＤの中ではｋｉｖＤが最もＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＢＴ生産に適しており、ｍｄｌＣ導入株に比べてｋｉｖＤ導入株では約４．５倍のＢＴ生産量の向上を示した。【００６８】
４．ｋｉｖＤの発現強化
上記のとおり、３種類のＫＤＣ（ｍｄｌＣ、ＡＲＯ１０、ｋｉｖＤ）導入株の発酵結果より、ＫＤＣの種類がＢＴ生産に大きく影響することが明らかとなった。上記の実験では、３種のＫＤＣは全てＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＰＧＫ１プロモーターを用いて発現させていた。そこで、キシロース存在下でＰＧＫ１より強い発現強度を示すＴＤＨ３プロモーターの制御下でｋｉｖＤ（２−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ）を発現することで、更なるＢＴ生産量の向上を試みた（Lu C, Jeffries T: Shuffling of Promoters for Multiple Genes To Optimize Xylose Fermentation in an Engineered Saccharomyces cerevisiae Strain. Appl Environ Microbiol 2007, 73:6072-6077.）。ＢＤδＤに、ＴＤＨ３プロモーターで制御されるｋｉｖＤを導入することでＢＤδＤ−ｔｋｉｖＤを作成した。更にＢＤδＤ−ｔｋｉｖＤに、ＴＤＨ３プロモーターで制御されるｋｉｖＤをもう１コピー導入することで、合計で２コピーのｋｉｖＤを持つＢＤδＤ−２ｔｋｉｖＤを作成した。具体的には、ｋｉｖＤ発現強化株作成のためにＢＤδＤ株に、ＥｃｏＲＶで切断したｐＩＬ−ｐＴＤＨ３−ｋｉｖＤを形質転換することで、ＢＤδＤ−ｔｋｉｖＤ株を作成した。さらに、ＢＤδＤ−ｋｉｖＤ株にｐＩＵ−ｐＴＤＨ３−ｋｉｖＤを形質転換することで、ＢＤδＤ−２ｔｋｉｖＤ株を作成した。【００６９】
ＢＤδＤ−ｔｋｉｖＤ及びＢＤδＤ−２ｔｋｉｖＤについて、１０ｇ／Ｌのグルコースと１０ｇ／Ｌのキシロースを含む培地を用いて発酵試験を行った。ｋｉｖＤ発現強化株（ＢＤδＤ−ｔｋｉｖＤとＢＤδＤ−２ｔｋｉｖＤ）では、ＰＧＫ１プロモーターでｋｉｖＤを発現させたＢＤδＤ−ｋｉｖＤと比べて、キシロースの消費量やＸｙｌｏｎａｔｅの生産量にはほとんど違いが見られなかった（図４の（Ａ），（Ｂ））。一方、ＢＤδＤ−ｔｋｉｖＤ及びＢＤδＤ−２ｔｋｉｖＤの発酵９６ｈにおけるＢＴ生産量は、５７７．３±３．６ｍｇ／Ｌ及び７６７．９±４５．９ｍｇ／Ｌで（図４の（Ｃ））、それぞれＢＤδＤ−ｋｉｖＤと比べて約１．６倍及び２．１倍のＢＴ生産量を示した。ＢＤδＤ−ｔｋｉｖＤ及びＢＤδＤ−２ｔｋｉｖＤのＢＴ収率はそれぞれ、９．７％及び１２．９％であった。【００７０】
５．ｋｄｃＡの発現
本実験ではｋｉｖＤに加えて、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ由来の別の２−ケト酸デカルボキシラーゼをコードするｋｄｃＡを発現することで更なるＢＴ生産量の向上を試みた。ＢＤδＤに、ＴＤＨ３プロモーターで制御されるｋｄｃＡを導入することでＢＤδＤ−ｔｋｄｃＡを作成した。更にＢＤδＤ−ｔｋｄｃＡに、ＴＤＨ３プロモーターで制御されるｋｄｃＡをもう１コピー導入することで、合計で２コピーのｋｄｃＡを持つＢＤδＤ−２ｔｋｄｃＡを作成した。具体的には、ｋｄｃＡ発現株作成のためにＢＤδＤ株に、ＥｃｏＲＶで切断したｐＩＬ−ｐＴＤＨ３−ｋｄｃＡを形質転換することで、ＢＤδＤ−ｔｋｄｃＡ株を作成した。さらに、ＢＤδＤ−ｔｋｄｃＡ株にｐＩＵ−ｐＴＤＨ３−ｋｄｃＡを形質転換することで、ＢＤδＤ−２ｔｋｄｃＡ株を作成した。ＢＤδＤ−ｔｋｄｃＡ及びＢＤδＤ−２ｔｋｄｃＡについて、１０ｇ／Ｌのグルコースと１０ｇ／Ｌのキシロースを含む培地を用いて発酵試験を行ったところ、ｋｄｃＡ発現株（ＢＤδＤ−ｔｋｄｃＡとＢＤδＤ−２ｔｋｄｃＡ）の発酵９６ｈにおけるＢＴ生産量は、７２２．０±１４．９ｍｇ／Ｌ及び１１５１．４±５８．５ｍｇ／Ｌであった。結果を図５に示した。【００７１】
６．ＴＹＷ１過剰発現によるＸｙｌＤ活性の強化
上記のとおり、ｋｉｖＤに加えて、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ由来の別の２−ケト酸デカルボキシラーゼをコードするｋｄｃＡを発現することで、ＢＴ生産量に増加が見られた。次に、高収率でのＢＴ産生のためにはＸｙｌＤ活性の更なる向上や、酵母細胞内で高活性なキシロネートデヒドラターゼの探索が必要と考えられた。そこで、ＥＲ表層において余剰の鉄硫黄クラスターを隔離しておく役割を果たしているＴＹＷ１というタンパクに着目し、このタンパクの発現を制御することで、ＸｙｌＤ活性やＢＴ生産量に変化がないかを検討した。具体的な実験方法を以下に説明する。【００７２】
本実験において作成した酵母細胞株の作製手順を図６に示した。なお、ＤＮＡオリゴプライマーは全てＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，  ＭＡ，  ＵＳＡ）で購入した。また、全てのＰＣＲ法には、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＮＥＯ−ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いた。【００７３】
（プラスミドの構築）
全てのプラスミドは、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  ＵＳＡ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて作成した。Ｃ．ｃｒｅｃｅｎｔｕｓ  ｘｙｌＢとｘｙｌＤはＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）で合成を行い購入した。Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ＫｄｃＡはＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で合成を行い購入した。【００７４】
ｐＴＳ−Ａ−ｘｙｌＢＤの構築
ｘｙｌＢにＴＤＨ３プロモーターとＴＤＨ３ターミネーターをつなぐために、コドン最適化したｘｙｌＢ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）をテンプレートにプライマーｘｙｌＢ  Ｆ（配列番号１０）とｘｙｌＢ  Ｒ（配列番号１１）を用いてＰＣＲにより得られた断片を、ＮｏｔＩ−ＨＦ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で切断したｐＡＴＰ４０５（Ｉｓｈｉｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４）に接続した。できたプラスミドをテンプレートにプライマーｐＴＤＨ３−ｘｙｌＢ  Ｆ（配列番号１２）とｐＴＤＨ３−ｘｙｌＢ  Ｒ（配列番号１３）を用いてＰＣＲにより、ｐＴＤＨ３−ｘｙｌＢ−ｔＴＤＨ３断片を作成した。【００７５】
ｘｙｌＤにＳＥＤ１  プロモーターとＳＡＧ１  ターミネーターをつなぐために、プラスミドｐＩＢＧ−ＳＳ（Ｉｎｏｋｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４）をテンプレートにプライマーＳＥＤ１ｐ−ＳＡＧ１ｔ  Ｆ（配列番号１４），  ＳＥＤ１ｐ−ＳＡＧ１ｔ  Ｒ（配列番号１５）を用いてＰＣＲにより得られた断片と、コドン最適化したｘｙｌＤ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）をテンプレートにプライマーｘｙｌＤ  Ｆ（配列番号１６）  とｘｙｌＤ  Ｒ（配列番号１７）を用いてＰＣＲにより得られた断片をＩｎ−ｆｕｓｉｏｎで結合した。できたプラスミドをテンプレートにプライマーｐＳＥＤ１−ｘｙｌＤ  Ｆ（配列番号１８）とｐＳＥＤ１−ｘｙｌＤ  Ｒ（配列番号１９）を用いてＰＣＲにより、ｐＳＥＤ１−ｘｙｌＤ−ｔＳＡＧ１断片を作成した。ｐＳＥＤ１−ｘｙｌＤ−ｔＳＡＧ１断片とｐＴＤＨ３−ｘｙｌＢ−ｔＴＤＨ３断片を、ＮｏｔＩ−ＨＦ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）とＸｈｏＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で切断したｐＧＫ４０２  （Ｉｓｈｉｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）にクローニングすることで、ｐＴＳ−Ａ−ｘｙｌＢＤを構築した。【００７６】
ｐδＷ−ｘｙｌＤの構築
ｘｙｌＤに、ＡＤＨ１プロモーターとターミネーターを接続するために、ＰｍｅＩで切断したｐＡＴＰ４０５  （Ｉｓｈｉｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４）に、コドン最適化したｘｙｌＤ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）をテンプレートにプライマーｘｙｌＤ  ２Ｆ（配列番号２０）とｘｙｌＤ  ２Ｒ（配列番号２１）を用いてＰＣＲにより得られた断片をＩｎ−ｆｕｓｉｏｎによりクローニングした。できたプラスミドをテンプレートにプライマーｐＡＤＨ１−ｘｙｌＤ  Ｆ（配列番号２２）とｐＡＤＨ１−ｘｙｌＤ  Ｒ（配列番号２３）を用いてＰＣＲを行い、ＡＤＨ１ｐ−ｘｙｌＤ−ＡＤＨ１ｔ断片を得た。この断片をＳｍａＩで切断したδインテグレーション用ベクターｐδＷ（Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．２００９）にクローニングして、ｘｙｌＤのδインテグレーション用プラスミドｐδＷ  ｘｙｌＤを作成した。【００７７】
ｐＩＬ−ｋｄｃＡ及びｐＩＵ−ｋｄｃＡの構築
Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゲノムＤＮＡをテンプレートに、２セットのプライマーｔｄｈ３ｐ  Ｆ（配列番号２４）とｔｄｈ３ｐ  Ｒ（配列番号２５）またａｄｈ１ｔ  Ｆ（配列番号２６）とａｄｈ１ｔ  Ｒ（配列番号２７）を用いてＰＣＲを行い、ＴＤＨ３  プロモーターとＡＤＨ１ターミネーターを増幅した。これら２つのＰＣＲ断片をテンプレートに、プライマーｔｄｈ３ｐ  Ｆ（配列番号２４）とａｄｈ１ｔ  Ｒ（配列番号２７）を用いてＰＣＲを行いＴＤＨ３ｐ−ＡＤＨ１ｔ断片を作成した。ＴＤＨ３ｐ−ＡＤＨ１ｔ断片を、ＮｏｔＩ−ＨＦ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）とＸｈｏＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で切断したｐＧＫ４０５（Ｉｓｈｉｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）  およびｐＧＫ４０６（Ｉｓｈｉｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）にクローニングすることで、ｐＩＬ  ｔｄｈ３ｐ−ａｄｈ１ｔ  とｐＩＵ  ｔｄｈ３ｐ−ａｄｈ１ｔを作成した。ｋｄｃＡに、ＴＤＨ３プロモーターとＡＤＨ１ターミネーターを接続するために、ＳｍａＩで切断したｐＩＬ  ｔｄｈ３ｐ−ａｄｈ１ｔ  とｐＩＵ  ｔｄｈ３ｐ−ａｄｈ１ｔに、コドン最適化したｋｄｃＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をテンプレートにプライマーｔｄｈ３  ｋｄｃＡ  Ｆ（配列番号２８）とｔｄｈ３  ｋｄｃＡ  Ｒ（配列番号２９）を用いてＰＣＲにより得られた断片をＩｎ−ｆｕｓｉｏｎによりクローニングすることで、ｐＩＬ−ｋｄｃＡおよびｐＩＵ−ｋｄｃＡを作成した。【００７８】
ｐＩＡｕｒ−ＴＹＷ１とｐＩＡｕｒ−ｔＴＹＷ１の構築
ｐＧＫ４０５（Ｉｓｈｉｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）をテンプレートに、プライマーＡＵＲ−ＰＧＫ  Ｆ（配列番号３０）とＡＵＲ−ＰＧＫ  Ｒ（配列番号３１）を用いてＰＣＲを行い、ＰＧＫ１プロモーターとＰＧＫ１  ターミネーターを増幅した。この断片を、ＳｐｈＩ−ＨＦ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）とＳａｃＩ−ＨＦ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で切断したｐＡＵＲ１０１（タカラバイオから購入）にクローニングすることで、ｐＧＫ−Ａｕｒを作成した。ＴＹＷ１及びｔＴＹＷ１にＰＧＫ１プロモーターとＰＧＫ１ターミネーターを接続するために、ＳｍａＩで切断したｐＧＫ−Ａｕｒに、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゲノムＤＮＡをテンプレートにプライマーＴＹＷ１  Ｆ（配列番号３２）とＴＹＷ１  Ｒ（配列番号３３）及びＴＹＷ１  Ｆ（配列番号３２）とｔＴＹＷ１  Ｒ（配列番号３４）を用いてＰＣＲにより得られたＴＹＷ１およびｔＴＹＷ１断片をＩｎ−ｆｕｓｉｏｎによりクローニングすることで、ｐＩＡｕｒ−ＴＹＷ１およびｐＩＡｕｒ−ｔＴＹＷ１を作成した。【００７９】
（形質転換）
酵母の形質転換はＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）によって報告されている、酢酸リチウムを法に従い行った。【００８０】
ＹＰＨ４９９ΔＧＲＥ３株の作成
まずＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ４９９株においてＧＲＥ３をＧ４１８（薬剤）耐性遺伝子で置換することで、ＧＲＥ３破壊株ＹＰＨ４９９ΔＧＲＥ３株を作成した。ＧＲＥ３破壊用のＤＮＡ断片の作成は、Ｙｅａｓｔ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｍａｔ−Ａ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｓｅｔ  （Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｗａｌｔｈａｍ，  ＭＡ，  ＵＳＡ）より取得したＢＹ４７４１ΔＧＲＥ３株のゲノムＤＮＡをテンプレートに、プライマーｄＧＲＥ３  Ｆ  （５′−  ＡＣＴＧＧＡＴＴＡＡＡＡＧＧＧＡＧＣＣＣＡＡＧＧ−３′；配列番号６）及びｄＧＲＥ３  Ｒ  （５′−  ＣＣＧＴＧＧＡＧＴＣＴＴＣＧＴＣＡＡＧＴＡＧＴＴＧ−３′；配列番号７）を用いてＰＣＲにより作成した。テンプレートに用いたＢＹ４７４１ΔＧＲＥ３のゲノムＤＮＡは、Ｄｒ．  ＧｅｎＴＬＥ  （ｙｅａｓｔ）  ｈｉｇｈ−ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｋｉｔ  （Ｔａｋａｒａ，  Ｓｈｉｇａ，  Ｊａｐａｎ）を用いて抽出した。【００８１】
ＢＤ株の作成
プラスミドｐＴＳ−Ａ−ｘｙｌＢＤをＥｃｏＲＶ−ＨＦ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で切断して、ＹＰＨ４９９ΔＧＲＥ３株に形質転換することでＢＤ株を作成した。【００８２】
ＢＤδＤ株の作成
プラスミドｐδＷ−ｘｙｌＤをＡｓｃＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で切断して、ＢＤ株に形質転換することでＢＤδＤ株を作成した。【００８３】
ＢＤδＤ−ｔｋｄｃＡ株の作成
プラスミドｐＩＬ−ｋｄｃＡをＥｃｏＲＶ−ＨＦ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で切断して、ＢＤδＤ株に形質転換することでＢＤδＤ−ｔｋｄｃＡ株を作成した。【００８４】
ＢＤδＤ−２ｔｋｄｃＡ株の作成
プラスミドｐＩＵ−ｋｄｃＡをＥｃｏＲＶ−ＨＦ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で切断して、ＢＤδＤ株に形質転換することでＢＤδＤ−２ｔｋｄｃＡ株を作成した。【００８５】
ＢＤδＤ−２ｔｋｄｃＡ−ＴＹＷ１株の作成
プラスミドｐＩＡｕｒ−ＴＹＷ１をＢｓｉＷＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で切断して、ＢＤδＤ−２ｔｋｄｃＡ株に形質転換することでＢＤδＤ−２ｔｋｄｃＡ−ＴＹＷ１株を作成した。【００８６】
ＢＤδＤ−２ｔｋｄｃＡ−ｔＴＹＷ１株の作成
プラスミドｐＩＡｕｒ−ｔＴＹＷ１をＢｓｉＷＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で切断して、ＢＤδＤ−２ｔｋｄｃＡ株に形質転換することでＢＤδＤ−２ｔｋｄｃＡ−ｔＴＹＷ１株を作成した。【００８７】
発酵試験、培養液の分析（ＢＴの定量）、ＸｙｌＤの活性測定は、上述の方法により行った。各株のＸｙｌＤ活性を図７に示す。また、ＢＴの生産量の経時変化を図８に示す。作成した株においてはＴＹＷ１を過剰発現することで、ＸｙｌＤ活性が高くなった（０．２６Ｕ／ｍｇ  ｔｏｔａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ→０．４０Ｕ／ｍｇ  ｔｏｔａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）。また、ＢＴ最大生産量も顕著に増加した（１．１５ｇ／Ｌ→１．７５ｇ／Ｌ）。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明によると、酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を用いて、Ｄ−キシロースからＤ−ＢＴを効率的に生産することができる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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