(57)【要約】  本発明の課題は、シストセンチュウの無菌化とin vitroの大量増殖系を確立し、孵化試験などの評価試験を安定的に実施できる無菌化シストセンチュウを提供することにある。本発明は、無菌化シストセンチュウを得る方法であって、宿主植物を植えた砂培地で無菌化すべきシストセンチュウを培養すること、および、砂培地に薬剤灌注することを含み、灌注する薬剤が、センチュウの生育に影響を及ぼさない濃度の殺菌剤を含む、前記方法、ならびに、該方法によって得られた無菌化シストセンチュウに関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
無菌化シストセンチュウを得る方法であって、
宿主植物を植えた砂培地で無菌化すべきシストセンチュウを培養すること、および、
砂培地に薬剤灌注することを含み、
灌注する薬剤が、センチュウの生育に影響を及ぼさない濃度の殺菌剤を含む、前記方法。
【請求項２】
殺菌剤が、ＤＭＩ剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＤＭＩ剤が、テブコナゾールである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
殺菌剤の濃度が、有効濃度の２倍〜８００倍希釈した濃度である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
殺菌剤が、さらにストレプトマイシンを含む、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
シストセンチュウが、ジャガイモシストセンチュウ（Globodera rostochiensis）である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法によって得られた、シスト形成能を有する無菌化シストセンチュウ。
【請求項８】
シスト形成能を有する無菌化シストセンチュウ。
【請求項９】
ジャガイモシストセンチュウ（Globodera rostochiensis）である、請求項７または８に記載の無菌化シストセンチュウ。
【請求項１０】
孵化促進物質のスクリーニング用である、請求項７〜９のいずれか一項に記載の無菌化シストセンチュウ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤スクリーニングなどに利用可能な無菌化シストセンチュウを得る方法および該方法で得られた無菌化シストセンチュウに関する。
【背景技術】
【０００２】
シストセンチュウは、特定の宿主にのみ寄生し、宿主が存在しない状態では環境・薬剤耐性を有するシストを形成し、その状態で長期間生存することができる。作付けなどにより宿主が近くに存在するようになると、宿主由来の孵化促進物質を感知して孵化し、宿主に寄生する。例えば、ジャガイモシストセンチュウ（Potato Cyst Nematode：以下、「ＰＣＮ」とも記す）（学名：Globodera rostochiensis）は、ナス科植物などの特定の宿主にのみ寄生し、ジャガイモの根に寄生する難防除害虫であり、世界中で甚大な被害を発生させている。未だ世界的に十分な対策がなされておらず、効果的な防除剤の開発がなされていないのが現状である。また近年、日本（北海道）でＰＣＮと同属のジャガイモシロシストセンチュウ（Globodera pallida）が発生したことが報告され、米国（オレゴン州）では新種のGlobodera ellingtonaeが発見されたことが報告されている（非特許文献１）。これらの新しいシストセンチュウに対する対策も必要となる。【０００３】
シストセンチュウの防除法の１つとして、宿主が作付けされていない土壌に孵化促進物質を施用し、シスト中の卵の孵化を促進させて、シストセンチュウの幼虫を餓死させることなどが試みられている（特許文献１〜３）。【０００４】
一方、シストセンチュウは種々の糸状菌によって寄生されており（非特許文献２）、寄生菌を殺菌するために、例えば、シストに対して次亜塩素酸ナトリウムで表面殺菌を行ったり（非特許文献２）、シストから得られた卵に対してメトキシエチル水銀塩化物で表面殺菌を行ったりしているが（非特許文献３）、いずれも十分なものではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１１−１７３８７５号公報
【特許文献２】特開平９−２９１２号公報
【特許文献３】特開昭６２−２５５４０２号公報
【特許文献４】特開２０１１−２２９４４３号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Zafar A. et al., (2012). "Description of Globodera ellingtonae n. sp. (Nematoda: Heteroderidae) from Oregon". Journal of Nematology 44(1), pages 40-57.
【非特許文献２】Trifonava, Z. and Karadjova, J. (2003). "Fungal parasitism of the cysts and eggs of the Globodera rostochiensis". Journal of Agricultural Sciences Vol. 48, No.1, pages 103-110.
【非特許文献３】Foot, M.A., (1977). "Laboratory rearing of potato cyst nematode; a method suitable for pathotyping and biological studies". New Zealand Journal of Zoology, Vol. 4, pages 183-186.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
シストセンチュウの新たな孵化促進物質の探索においては、シストセンチュウの卵の孵化試験を行う必要がある。一般に、野外（畑）から採取したシストセンチュウを温室にてジャガイモに接種、増殖して得た卵を試験材料として用いているが、本発明者らは、野外から採取したシストセンチュウには菌に汚染しているものがあり、これを温室で増殖を繰り返すと、汚染率が上がってしまい試験材料の卵に汚染卵が含まれると孵化試験等の評価系に大きな影響を及ぼすとの問題を認識するに至った。すなわち、本発明の課題は、シストセンチュウの無菌化とin vitroの大量増殖系を確立し、孵化試験などの評価試験を安定的に実施できる無菌化シストセンチュウを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、かかる課題を解決するために鋭意研究を重ねる中で、通常よりも薄い濃度で殺菌剤を宿主植物の支持体（砂培地）に灌注し、これにシストセンチュウを接種することで次世代の卵を内包したシスト形成能を有する無菌化シストセンチュウを得ることができることを見出し、さらに研究を進めた結果、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、以下に関する。【０００９】
［１］  無菌化シストセンチュウを得る方法であって、
宿主植物を植えた砂培地で無菌化すべきシストセンチュウを培養すること、および、
砂培地に薬剤灌注することを含み、
灌注する薬剤が、センチュウの生育に影響を及ぼさない濃度の殺菌剤を含む、前記方法。
［２］  殺菌剤が、ＤＭＩ剤を含む、前記［１］に記載の方法。
［３］  ＤＭＩ剤が、テブコナゾールである、前記［２］に記載の方法。
［４］  殺菌剤の濃度が、有効濃度の２倍〜８００倍希釈した濃度である、前記［１］〜［３］のいずれか一項に記載の方法。
［５］  殺菌剤が、さらにストレプトマイシンを含む、前記［２］〜［４］のいずれか一項に記載の方法。【００１０】
［６］  シストセンチュウが、ジャガイモシストセンチュウ（Globodera rostochiensis）である、前記［１］〜［５］のいずれか一項に記載の方法。
［７］  前記［１］〜［６］のいずれか一項に記載の方法によって得られた、シスト形成能を有する無菌化シストセンチュウ。
［８］  シスト形成能を有する無菌化シストセンチュウ。
［９］  ジャガイモシストセンチュウ（Globodera rostochiensis）である、前記［７］または［８］に記載の無菌化シストセンチュウ。
［１０］  孵化促進物質のスクリーニング用である、前記［７］〜［９］のいずれか一項に記載の無菌化シストセンチュウ。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の方法によれば、メトキシエチル水銀塩化物などの水銀剤を用いる必要がなく、環境に負荷をかけることなく、安全で容易にシストセンチュウを無菌化することができる。また、本発明の方法により無菌化されたシストセンチュウは、シスト形成能を有し、継代することができる。したがって、本発明によって、シストセンチュウのin vitro培養系が確立された。本発明によれば、無菌化シストセンチュウを、無菌状態を維持、推進しながら、大量に増殖することが可能であり、例えば、孵化促進物質の探索のための大規模スクリーニングを行う場合などに必要となる無菌シストを大量に提供することができる。すなわち、本発明の方法により得られた無菌化シストセンチュウから得られた卵を用いることにより、シストセンチュウに寄生する寄生菌による汚染卵（寄生卵）の影響を受けることがなく、より正確に候補薬剤の孵化を促進する能力を評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本発明の無菌処理による汚染卵率の減少を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、無菌化シストセンチュウを得る方法に関する。ここで「無菌化」とは、シストセンチュウに寄生する寄生菌の数を減ずるか、完全に滅菌することを包含するものであり、例えば、無菌処理によって汚染卵率を低減することによって確認することができる。汚染卵率が、０〜１５％、好ましくは０〜１２％であれば、孵化試験に実質的に影響を与えないとし得る。
【００１４】
本発明に係る方法は、宿主植物を植えた砂培地で無菌化すべきシストセンチュウを培養すること、および、砂培地に薬剤灌注することを含む。ここで灌注する薬剤は、無菌化の標的となる寄生菌に対する殺菌剤であればよく、寄生菌の種類に応じて適宜選択することができる。本発明において用いられる具体的な薬剤としては、例えば、トリホリン、フェナリモル、オキスポコナゾールフマル酸塩、ペフラゾエート、プロクロラズ、トリフルミゾール、シプロコナゾール、ジフェノコナゾール、フェンブコナゾール、ヘキサコナゾール、イミベンコナゾール、イプコナゾール、メトコナゾール、ミクロブタニル、プロピコナゾール、シメコナゾール、テブコナゾール、テトラコナゾールなどのＤＭＩ剤（脱メチル化阻害剤：ステロール生合成におけるC14位の脱メチル化酵素の阻害剤）；チオファネートメチルなどのベンゾイミダゾール系殺菌剤；イミノクタジン酢酸塩、イミノクタジンアルベシル酸塩などのグアニジン系殺菌剤；ナイスタチンなどのポリエン系抗真菌薬；ストレプトマイシン、ゲンタマイシンなどの抗生物質などが挙げられる。
【００１５】
薬剤は、１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。薬剤を組み合わせて用いる場合、抗真菌性のＤＭＩ剤と抗細菌性の抗生物質とを組み合わせて用いることが好ましく、特に、テブコナゾールとストレプトマイシントを組み合わせて用いることが好ましい。
【００１６】
灌注する薬剤の濃度は、センチュウの生育に影響を及ぼさない濃度であり、通常、用いる薬剤の有効濃度（登録処方の濃度）より薄い。灌注する薬剤の濃度は、好ましくは、有効濃度の２倍〜８００倍希釈した濃度、より好ましくは、５倍〜１６０倍希釈した濃度、とくに好ましくは、１０倍〜８０倍希釈した濃度である。
【００１７】
例えば、薬剤としてテブコナゾールを用いる場合、その登録処方の濃度は、１３３〜８００ｐｐｍ程度であるが、本発明においては、例えば、１ｐｐｍ〜５０ｐｐｍ、好ましくは、５ｐｐｍ〜２０ｐｐｍ、より好ましくは、１０ｐｐｍである。テブコナゾールとストレプトマイシンを組み合わせて用いる場合、ストレプトマイシンの濃度は、例えば、０．０５ｐｐｍ〜５０ｐｐｍ、好ましくは、０．５ｐｐｍ〜５ｐｐｍ、より好ましくは、１ｐｐｍである。
【００１８】
本発明の無菌化の標的となり得るシストセンチュウは、例えば、ダイズシストセンチュウ（Heterodera glycines）、クローバーシストセンチュウ（Heterodera trifolii）、テンサイシストセンチュウ（Heterodera schachtii）、イネシストセンチュウ（Heterodera oryzae）、オカボシストセンチュウ（Heterodera elachista）などのヘテロデラ属（Heterodera）の植物寄生性シストセンチュウや、ジャガイモシストセンチュウ（Globodera rostochiensis）、ジャガイモシロシストセンチュウ（Globodera pallida）、Globodera ellingtonae、タバコシストセンチュウ（Globodera tabaccum）、ヨモギシストセンチュウ（Globodera hypolysi）などのグロボデラ属（Globodera）の植物寄生性シストセンチュウが挙げられる。本発明の無菌処理においては、ジャガイモシストセンチュウを標的にする場合が好ましい。
【００１９】
本発明の方法において用いる培養器は、シストセンチュウの培養に用いられる容器であれば特に限定されないが、例えば、ガラス製またはプラスチック製の容器であってよい。容器の大きさは、特に限定されないが、１００ｍｌ〜１０００ｍｌ程度の大きさであればよく、これに砂培地を容器量の１／５〜１／３程度の量を入れ、宿主植物の苗を１〜３本程度植えて培養に用いる。宿主植物の苗は、無菌培養された培養苗であることが好ましい。
本発明の方法において用いる砂培地は、砂土等、農業・園芸用に用いる砂栽培用のものであれば特に限定されない。
【００２０】
また、本発明の方法において用いる宿主植物は、無菌化の標的となるシストセンチュウの宿主植物である。例えば、ジャガイモシストセンチュウを標的とした場合、宿主植物は、ナス科植物であり、好ましくは、ジャガイモである。
本発明の方法においてシストセンチュウを培養する際の培養条件は、２０℃・１６時間明期／日とし、培地に光が当たらないように、培養容器の下部はアルミホイルで覆い遮光した。
【００２１】
本発明は、一態様において、シスト形成能を有する無菌化シストセンチュウに関する。
本発明に係る無菌化シストセンチュウは、シスト形成能を有しており、継代可能であることから、各種の実験用として、また、例えば、孵化促進物質のスクリーニング用として用いることができる。
【００２２】
以下、本発明について、さらに詳細に実施例を用いて説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２３】
［試験例１］ジャガイモシストセンチュウの無菌化の検討（１）
温室内で通常栽培したジャガイモ苗（品種：メークイン）において増殖したジャガイモシストセンチュウ（ＰＣＮ）の幼虫（シスト3日間滅菌水に浸漬し、続いてジャガイモ根浸出液に浸漬処理し、６〜１０日後にシストから遊出してきた孵化幼虫を使用）に対し、エタノール（処理濃度７０％）、次亜塩素酸ナトリウム（処理濃度２．０〜０．００２％）、ＰＰＭ（商標）（PLANT PRESERVATIVE MIXTURE、Plant Cell Technology社）（処理濃度０．２〜０．０００２５％）、微酸性電解水（処理濃度０．２〜０．０００２５％）の夫々を用いて、２分間表面殺菌を行った。表面殺菌を行った幼虫を顕微鏡下で観察し、生存の有無を確認した。また、生存していた幼虫を、無菌的にジャガイモ培養苗（品種：メークイン）を植えた寒天若しくはジュランガム培地（組成：MS培地（和光純薬工業(株)製）、MS Vitamin Solution (Sigma社製)、30％ショ糖、寒天0.8％若しくはジェランガム0.2％）において２０℃で７５日間培養した。幼虫接種の３０日後からシスト形成の有無の観察した。寄生菌に汚染された培養苗の割合を汚染率（％）とした。結果を表１に示す。
【００２４】
【表１】
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【００２５】
表１に示すとおり、次亜塩素酸ナトリウムによる表面処理によって、ＰＣＮの生存を維持しつつ、寄生菌を除去することができることが明らかになった。しかしながら、さらに検討を進めた結果、次亜塩素酸ナトリウム処理した幼虫からはシストが形成されず、孵化試験に利用することができないことが判明した。
【００２６】
［試験例２］ジャガイモシストセンチュウの無菌化の検討（２）
温室内で通常栽培したジャガイモ苗（品種：メークイン）において増殖したＰＣＮの幼虫（シスト3日間滅菌水に浸漬し、続いてジャガイモ根浸出液に浸漬処理し、６〜１０日後にシストから遊出してきた孵化幼虫を使用）を、無菌的にジャガイモ培養苗（品種：メークイン）を植えた砂培地またはセル培土において２０℃で７５日間培養した。培養初日に、砂培地（芝生用目砂（東海砂利(株)製））またはセル培土（ホクサン(株)製）に対し、テブコナゾール（１０ｐｐｍ〜１００ｐｐｍ）およびストレプトマイシン（１ｐｐｍ）を組み合わせた殺菌剤を灌注した。薬剤灌注後３０日目から寄生菌による培養苗の汚染の有無とシスト形成の有無を確認した。試験は３反復行った。結果を表２に示す。
【表２】
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【００２７】
［試験例３］無菌処理シストの回収および継代
温室内で通常栽培したジャガイモ苗（品種：メークイン）において増殖したＰＣＮから回収されたシスト１０粒中の汚染卵率、および、前記シストと同時に回収されたシストを試験例２の試験区１と同様に処理して、培養後に形成されたシスト中の汚染卵率（％）を算出した。なお、汚染卵率（％）は、回収されたシストから得られた卵について、センチュウ計算板（１ｍｌあたり）を用い、顕微鏡下で全卵数（健全卵＋汚染卵）を計数して算出した。結果を表３および表４に示す。
【００２８】
【表３】
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【００２９】
【表４】
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【００３０】
表３に示すとおり、通常栽培したジャガイモ苗において増殖したＰＣＮから回収されたシストの汚染卵率は、１７．３〜３２．３％であった一方で、表４に示すとおり、本発明の無菌処理によって得られたシストの汚染卵率は、４．５〜１０．１％であり、寄生菌による汚染卵が著しく減少したことが明らかになった（図１）。
本発明の無菌処理による無菌化率（％）（汚染卵の減少割合）は、約４７．８〜８２．０％であり、極めて有効に無菌化が達成できた。
【００３１】
さらに実施例２から得られた無菌処理シストから孵化した幼虫を滅菌水で洗浄した後、テブコナゾール(10 ppm)およびストレプトマイシン（1 ppm）を灌注した砂培地を支持体とし、ジャガイモ培養苗（品種：メークイン）を２株植えた容器（１Ｌプラスチック容器）に、１容器あたり９００頭を接種した。接種約１ヵ月後にシスト形成が確認できた。
このようにシスト形成能を有する無菌化シストセンチュウを本発明の無菌処理を行いながら継代することによって、汚染卵率を著しく低減することが可能となり、寄生菌を完全に滅菌することが期待できる。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明によって提供されるシスト形成能を有する無菌化シストセンチュウは、寄生菌による孵化への影響を排除することができるため、孵化促進物質や殺センチュウ剤などの薬剤スクリーニング、孵化誘導のメカニズム解析、微生物農薬開発に向けたセンチュウ寄生性微生物（糸状菌、細菌など）のスクリーニング、宿主植物中のセンチュウの寄生生態や動態の解析、孵化促進物質などの微量物質検出のメカニズム解明に利用することができ、これらにおいて大きな役割を担い得るものである。
【図１】
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【国際調査報告】
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