(57)【要約】  哺乳動物細胞宿主に外来遺伝子由来タンパク質の高レベル生産能を与える哺乳動物細胞用発現ベクターを提供する。ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子欠損宿主細胞染色体上の転写ホットスポットにプラスミドDNAが組み込まれ、ヒポキサンチン・チミジン（以下HTと記載する）不含培地生育株として、セレクトされる仕組みを持つ発現ベクターに遍在性クロマチンオープニングエレメント（ubiquitously acting chromatin opening element (UCOE)）を導入することにより、形質転換体における目的のタンパク質の生産量を増加させた。
2019225372.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む発現ベクター：
（ａ）コドンを改変した翻訳障害性ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子カセット（翻訳障害性DHFR遺伝子カセット）であって、翻訳障害性DHFR遺伝子カセットのコドンが、アラニンはGCA、アルギニンはCGA、アスパラギンはAAU、アスパラギン酸はGAU、システインはUGU、グルタミンはCAA、グルタミン酸はGAA、グリシンはGGU、ヒスチジンはCAU、ロイシンはUUA、リシンはAAA、プロリンはCCA、フェニルアラニンはUUU、セリンはUCA、トレオニンはACU、チロシンはUAU、および／又はバリンはGUAに改変されており、コドンの改変領域が、DHFR遺伝子の5'末端からDHFR遺伝子の全長の３０％以上である、翻訳障害性DHFR遺伝子カセット；
（ｂ）転写活性プロモーターと安定性ポリアデニレーションシグナルの間に外来遺伝子組み込み用クローニングサイトを含む遺伝子カセット；および
（ｃ）遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）。
【請求項２】
請求項１（ａ）に記載の翻訳障害性DHFR遺伝子カセットが、プロモーターとして非哺乳動物細胞の遺伝子を由来とするプロモーター、又はエンハンサー部分を除去したプロモーターを使用していることを特徴とする請求項1に記載の発現ベクター。
【請求項３】
UCOEが配列番号１のヌクレオチド配列を含む請求項１または２に記載の発現ベクター。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の発現ベクターに外来遺伝子を組み込む工程、および該発現ベクターによりジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子欠損宿主細胞を形質転換させる工程を含む、外来遺伝子由来タンパク質を生産する形質転換体の製造方法。
【請求項５】
以下（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、外来遺伝子由来タンパク質の生産方法：
（ａ）請求項１〜３のいずれかに記載の発現ベクターに外来遺伝子を組み込む工程、
（ｂ）該発現ベクターによりジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子欠損宿主細胞を形質転換させる工程、
（ｃ）該形質転換体をヒポキサンチン・チミジン不含培地で培養する工程、
（ｄ）培養された形質転換体から外来遺伝子由来タンパク質を回収する工程。
【請求項６】
請求項５（ｃ）の工程において、Chemically Defined medium（CD培地）あるいはCD培地に非動物性の添加物を加えた培地で培養することを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
以下（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、外来遺伝子由来タンパク質を生産する形質転換体のスクリーニング方法：
（ａ）請求項１〜３のいずれかに記載の発現ベクターに外来遺伝子を組み込む工程、
（ｂ）該発現ベクターによりジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子欠損宿主細胞を形質転換させる工程、
（ｃ）該形質転換体をヒポキサンチン・チミジン不含培地で培養する工程。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれかに記載の発現ベクターに外来遺伝子が組み込まれた、外来遺伝子発現ベクター。
【請求項９】
請求項８記載の外来遺伝子発現ベクターにより形質転換された宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ベクターおよびその利用に関し、より詳細には、哺乳動物細胞宿主に外来遺伝子由来タンパク質の高レベル生産能を与える哺乳動物細胞用発現ベクターに関する。本発明の発現ベクターは、特に、大腸菌や酵母を宿主とした遺伝子組換では十分な活性が得られ難く、哺乳類独特の糖鎖修飾や折りたたみが必要である哺乳動物タンパク質の生産に適する。
【背景技術】
【０００２】
組換えタンパク質生産用ベクターは数多く開発され、大腸菌を代表とする細菌、酵母を代表とする真核微生物および昆虫細胞を宿主とする発現系では、タンパク質の発現量も多い。しかしながら哺乳類独特のタンパク質を発現させる場合、正常な立体構造をとらなかったり、糖鎖付加等の翻訳後修飾に問題があることが多い。そこで哺乳類細胞を宿主とした発現系の確立が必要となるが、一般的に発現量が低い場合が多い。また、昆虫細胞よりも高等な動物細胞に対しては組換えウイルスベクターを用いた発現系も使用されるが、組換えウイルスベクターを発現タンパク質から除く作業は極めて煩雑であり、さらにウイルスベクター自体の危険性も否定できない。【０００３】
哺乳動物細胞を宿主とした組換えタンパク質生産の事例は、組織性プラスミノーゲンアクチベータ（特許文献１）、エリスロポエチン（特許文献２、非特許文献１−３）、IFN-γ（非特許文献４）、IFN-β（特許文献３、非特許文献５）などに見られる。また、モノクローナル抗体の遺伝子組換え生産に関しても数多くの報告がある（特許文献４−６、非特許文献６−８）。さらに哺乳動物細胞用高発現ベクターとしてpNOW/CMV-AA（特許文献７）が挙げられる。このベクターを用いたコングルチニンの生産量は、培養４日間で最大11.8μg/mLであった。しかしながら、これらの事例において組換えタンパク質の十分な生産量が得られているとは考え難い。【０００４】
哺乳動物細胞、特にチャイニーズハムスター卵巣細胞（以下CHO細胞）を用いた医薬品の製造は安全が確認されており、現在一般的な手法となっている。哺乳動物細胞を用いた組換えタンパク質製造において、その生産性を上げることは、コストの削減・医療費の抑制などの面から非常に重要である。そのため、効率的な遺伝子導入により高レベル生産能を有する形質転換体を作製するための発現ベクターの開発が必須である。【０００５】
哺乳動物細胞において組換えタンパク質の高レベル生産を容易に行うためには、効率的な遺伝子導入が必要である。効率的な遺伝子導入とは、クローンのセレクションが容易であるにも拘わらず、高レベル生産性クローンが得られる確率が高いことである。すなわち、被形質転換細胞全体に対して薬剤選択後の生存細胞クローン数が相対的に少なく、それにより高レベル生産性クローンのセレクションが容易であること、さらに目的とするタンパク質を生産する細胞の数が少ないにも拘わらず高レベル生産性クローンが出現する期待値が大きいことである。得られる細胞の数が多いとその分セレクションに時間と労力を要することになり効率が悪く、また潜在的に高レベル生産能をもつクローンを見落とす可能性も高い。【０００６】
高レベル生産能とは、遺伝子導入により得られた形質転換細胞クローンにおける組換えタンパク質の発現量が多いことであり、これはおもに発現ベクターの性質、性能に由来すると考えられる。遺伝子発現のレベルは染色体上の位置により著しく異なることが見出されており（非特許文献９）、染色体上の転写活性の高い領域（以下、転写ホットスポット）に目的遺伝子が導入されることで、組換えタンパク質の生産レベルが高くなると予想される。【０００７】
鈴木らは、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子欠損宿主細胞染色体上の転写ホットスポットにプラスミドDNAが組み込まれ、ヒポキサンチン・チミジン（以下HTと記載する）不含培地生育株として、セレクトされる仕組みを持つ発現ベクターの開発に成功した（特許文献８）。ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）は核酸塩基の生合成に必要なため、遺伝情報物質としてDNA を用いる全ての生物に必須の酵素である。そのためジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子欠損宿主細胞は核酸の成分であるHTを含まない培地では生育することができない。目的タンパク質遺伝子とDHFR遺伝子を組込んだコンストラクトをジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子欠損宿主細胞に導入し、HT不含条件で培養することによって、目的タンパク質を発現する細胞をセレクションすることができる。この方法は、目的タンパク質遺伝子とネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子を組込んだコンストラクトを導入し、G418でセレクションする方法に比べ、DHFR阻害剤であるMTXで遺伝子増幅することが可能であるため、目的タンパク質の高生産株を得るのにより適している。結果、高レベルで安定的なタンパク質の生産を可能にする発現ベクターを構築できた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開昭59-183693号
【特許文献２】特開2002-45191号
【特許文献３】特開平７-265084号
【特許文献４】特開平７-67648号
【特許文献５】特開平6-30788号
【特許文献６】特開平6-217786号
【特許文献７】特開平10-179169号
【特許文献８】特許第5704753号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Fermentation Bioengineering,4,257頁,1989年
【非特許文献２】Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83,6465頁,1986年
【非特許文献３】Biotechnology,6,67頁,1988年,
【非特許文献４】Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 80,4564頁,1983年
【非特許文献５】Cytotechnology,4,173頁,1990年
【非特許文献６】Biotechnology,10,169頁,1992年
【非特許文献７】J.Immunol.Methods,125,191頁,1989年
【非特許文献８】Biotechnology,10,1455頁,1992年
【非特許文献９】Annu.Rev.Cell Biol.,6,679頁,1990年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、哺乳動物細胞宿主に外来遺伝子由来タンパク質の高レベル生産能を与える哺乳動物細胞用発現ベクターを提供することを目的とする。また、本発明は、該ベクターを利用した形質転換体の製造方法、および該ベクターを利用した外来遺伝子由来タンパク質の生産方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、鈴木らが開発した、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子欠損宿主細胞染色体上の転写ホットスポットにプラスミドDNAが組み込まれ、ヒポキサンチン・チミジン（以下HTと記載する）不含培地生育株として、セレクトされる仕組みを持つ発現ベクターに普遍的クロマチンオープニングエレメント（ubiquitously acting chromatin opening element (UCOE)）を導入することにより、形質転換体における目的のタンパク質の生産量を増加させるとともに、発現安定性を高めることに成功した。
本発明の要旨は以下の通りである。
（１）下記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む、発現ベクター：
（ａ）コドンを改変した翻訳障害性ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子カセット（翻訳障害性DHFR遺伝子カセット）であって、翻訳障害性DHFR遺伝子カセットのコドンが、アラニンはGCA、アルギニンはCGA、アスパラギンはAAU、アスパラギン酸はGAU、システインはUGU、グルタミンはCAA、グルタミン酸はGAA、グリシンはGGU、ヒスチジンはCAU、ロイシンはUUA、リシンはAAA、プロリンはCCA、フェニルアラニンはUUU、セリンはUCA、トレオニンはACU、チロシンはUAU、および／又はバリンはGUAに改変されており、コドンの改変領域が、DHFR遺伝子の5'末端からDHFR遺伝子の全長の３０％以上である、翻訳障害性DHFR遺伝子カセット；
（ｂ）転写活性プロモーターと安定性ポリアデニレーションシグナルの間に外来遺伝子組み込み用クローニングサイトを含む遺伝子カセット；および
（ｃ）遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）。
（２）（１）（ａ）に記載の翻訳障害性DHFR遺伝子カセットが、プロモーターとして非哺乳動物細胞の遺伝子を由来とするプロモーター、又はエンハンサー部分を除去したプロモーターを使用していることを特徴とする（１）に記載の発現ベクター。
（３）UCOEが配列番号１のヌクレオチド配列を含む（１）または（２）に記載の発現ベクター。
（４）（１）〜（３）のいずれかに記載の発現ベクターに外来遺伝子を組み込む工程、および該発現ベクターによりジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子欠損宿主細胞を形質転換させる工程を含む、外来遺伝子由来タンパク質を生産する形質転換体の製造方法。
（５）以下（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、外来遺伝子由来タンパク質の生産方法：
（ａ）（１）〜（３）のいずれかに記載の発現ベクターに外来遺伝子を組み込む工程、
（ｂ）該発現ベクターによりジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子欠損宿主細胞を形質転換させる工程、
（ｃ）該形質転換体をヒポキサンチン・チミジン不含培地で培養する工程、
（ｄ）培養された形質転換体から外来遺伝子由来タンパク質を回収する工程。
（６）（５）（ｃ）の工程において、Chemically Defined medium（CD培地）あるいはCD培地に非動物性の添加物を加えた培地で培養することを特徴とする、（５）に記載の方法。
（７）以下（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、外来遺伝子由来タンパク質を生産する形質転換体のスクリーニング方法：
（ａ）（１）〜（３）のいずれかに記載の発現ベクターに外来遺伝子を組み込む工程、
（ｂ）該発現ベクターによりジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子欠損宿主細胞を形質転換させる工程、
（ｃ）該形質転換体をヒポキサンチン・チミジン不含培地で培養する工程。
（８）（１）〜（３）のいずれかに記載の発現ベクターに外来遺伝子が組み込まれた、外来遺伝子発現ベクター。
（９）（８）記載の外来遺伝子発現ベクターにより形質転換された宿主細胞。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2018-99704及び特願2018-168591の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】pDC62c5-U533コンストラクトを示す図である。それぞれ、PCMV5：ヒトサイトメガロウイルスプロモーターとアデノウイルスプロモーターの融合プロモーターであるCMV5 プロモーター（Nucleic Acid Research, 30, 2頁, 2002年）、PABGH : ウシ成長ホルモン遺伝子ポリアデニレーションシグナル、UCOE：遍在性クロマチンオープニングエレメント、PdSV: エンハンサーを欠失させたシミアンウイルス４０プロモーター、mDHFR: 翻訳障害性ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、SV40pA：Simian Virus 40由来ポリアデニレーションシグナル、AMP：大腸菌中での選択マーカー（β- ラクタマーゼ遺伝子）、ori：pUCプラスミド由来の複製起点を示す。また、AscI、AsiSI、NotI、SbfIは制限酵素切断部位を示す。
【図２】pDC62c5-U533-OMLHコンストラクトを示す図である。それぞれ、PCMV5：ヒトサイトメガロウイルスプロモーターとアデノウイルスプロモーターの融合プロモーターであるCMV5 プロモーター（Nucleic Acid Research, 30, 2頁, 2002年）、IgL-OM：Omalizmab抗体軽鎖cDNA、PABGH : ウシ成長ホルモン遺伝子ポリアデニレーションシグナル、UCOE：遍在性クロマチンオープニングエレメント、IgH-OM：Omalizmab抗体重鎖cDNA、PdSV: エンハンサーを欠失させたシミアンウイルス４０プロモーター、mDHFR: 翻訳障害性ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、SV40pA：Simian Virus 40 ポリアデニレーションシグナル、AMP：大腸菌中での選択マーカー（β- ラクタマーゼ遺伝子）、ori：pUCプラスミド由来の複製起点を示す。また、AscI、AsiSI、NotI、SbfIは制限酵素切断部位を示す。
【図３】pDC61-OMLHコンストラクトを示す図である。それぞれ、PCMV：ヒトサイトメガロウイルスプロモーター（Nucleic Acid Research, 30, 2頁, 2002年）、INRBG：ウサギβ-グロビン遺伝子イントロン配列、IgL-OM：Omalizmab抗体軽鎖cDNA、PABGH : ウシ成長ホルモン遺伝子ポリアデニレーションシグナル、IgH-OM：Omalizmab抗体重鎖cDNA、PdSV: エンハンサーを欠失させたシミアンウイルス４０プロモーター、mDHFR: 翻訳障害性ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、SV40pA：Simian Virus 40 ポリアデニレーションシグナル、AMP：大腸菌中での選択マーカー（β- ラクタマーゼ遺伝子）、ori：pUCプラスミド由来の複製起点を示す。また、AscI、AsiSI、NotI、SbfIは制限酵素切断部位を示す。
【図４】pNC32c-U533-OMLHコンストラクトを示す図である。それぞれ、PCMV：ヒトサイトメガロウイルスプロモーター（Nucleic Acid Research, 30, 2頁, 2002年）、IgL-OM：Omalizmab抗体軽鎖cDNA、SV40pA：Simian Virus 40 ポリアデニレーションシグナル、UCOE：遍在性クロマチンオープニングエレメント、IgH-OM：Omalizmab抗体重鎖cDNA、PSV40:シミアンウイルス４０プロモーター、NTP: ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子、SV40pA：Simian Virus 40 ポリアデニレーションシグナル、AMP：大腸菌中での選択マーカー（β- ラクタマーゼ遺伝子）、ori：pUCプラスミド由来の複製起点を示す。また、AscI、AsiSI、NotI、SbfIは制限酵素切断部位を示す。
【図５】pUCOE-Hu-P2-OMLHコンストラクトを示す図である。それぞれ、UCOE：遍在性クロマチンオープニングエレメント、PgpCMV：モルモットサイトメガロウイルスプロモーター（Nucleic Acid Research, 30, 2頁, 2002年）、IgL-OM：Omalizmab抗体軽鎖cDNA、SV40pA：Simian Virus 40 ポリアデニレーションシグナル、IgH-OM：Omalizmab抗体重鎖cDNA、PPGK: マウス フォスフォグリセレートキナーゼ プロモーター、PUR: ピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、PAC2：補体第2因子遺伝子ポリアデニレーションシグナル、AMP：大腸菌中での選択マーカー（β- ラクタマーゼ遺伝子）、ori：pUCプラスミド由来の複製起点を示す。また、AscI、AsiSI、NotI、SbfIは制限酵素切断部位を示す。
【図６】pDC62c5-U533-OMLH（本発明の発現ベクター）、pDC61-OMLH（従来ベクター）、pNC32c-U533-OMLH（コントロールベクター）又はpUCOE-Hu-P2/OMLH（Millipore社べクター）をトランスフェクションしたCHO細胞により産生された抗体発現量の分布を示す（３日間培養）。
【図７】pDC62c5-U533-OMLH（本発明の発現ベクター）又はpDC61-OMLH（従来ベクター）をトランスフェクションしたCHO細胞により産生された抗体量の変化を示す（培養開始からの週数1-12）。
【図８】外来遺伝子挿入部位が一つであるpDC62c5-U533コンストラクトを示す図である。それぞれ、PCMV5：ヒトサイトメガロウイルスプロモーターとアデノウイルスプロモーターの融合プロモーターであるCMV5 プロモーター（Nucleic Acid Research, 30, 2頁, 2002年）、PABGH : ウシ成長ホルモン遺伝子ポリアデニレーションシグナル、UCOE：遍在性クロマチンオープニングエレメント、PdSV: エンハンサーを欠失させたシミアンウイルス４０プロモーター、mDHFR: 翻訳障害性ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、SV40pA：Simian Virus 40由来ポリアデニレーションシグナル、AMP：大腸菌中での選択マーカー（β- ラクタマーゼ遺伝子）、ori：pUCプラスミド由来の複製起点を示す。また、AscI、AsiSI、ClaIは制限酵素切断部位を示す。
【図９】pDC62c5-U533ベクターにより樹立した高発現CHO細胞株によるイヌCTLA-4-Igの発現。14日間の培養における各日数でのイヌCTLA-4-Ig発現量と生細胞数を示す。
【図１０】培養上清より精製したイヌCTLA-4-IgのSDS-PAGE像。還元条件および非還元条件下でイヌCTLA-4-Igを電気泳動しCBB染色により可視化した。還元条件では45 kDa付近に、非還元条件では90 kDa付近に単一のバンドが見られ、目的以外のバンドはほぼ検出されなかった。
【図１１】pDC62c5-U533-TRLHコンストラクトを示す図である。
【図１２】pDC62c5-U533-TRLH（本発明の発現ベクター）を導入したCHO細胞により産生された抗体発現量の分布を示す（３日間培養）。
【図１３】pDC62c5-U533-TRLH（本発明の発現ベクター）をトランスフェクションしたCHO細胞により産生された抗体量の変化を示す（生産性試験培養開始からの週数0-10）。
【図１４】pDC62c5-U533-OMLH（本発明の発現ベクター）をトランスフェクションしたCHO細胞(Clone01-10)を播いたプレートから得られたクローン各々を60 nM MTX存在下に培養して得られた細胞株により産生された抗体量を示す（３日間培養）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明者らは、DHFR遺伝子のコドンを哺乳動物において使用頻度の最も低いものに改変して、DHFRの発現性を極めて減衰させたものにすることにより、組み込まれるプラスミド遺伝子がジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子欠損宿主細胞染色体上の極めて高い発現性をもつ位置に導入されない限り、形質転換体ではあってもHTが含まれない培地におけるセレクションに対して生存が困難であるようにした。また、プラスミド遺伝子にUCOE（遍在性クロマチンオープニングエレメント）を導入することにより、形質転換体における目的のタンパク質の生産量を増加させるとともに、発現安定性を高めるようにした。
【００１４】
すなわち、本発明は、哺乳動物宿主細胞において遺伝子組換えタンパク質の高レベル生産を誘導するための発現ベクターを提供する。
本発明の発現ベクターは、バックボーンベクター上に、下記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含むことによって構築される。
（ａ）コドンを哺乳動物において使用頻度の最も低いものに改変し発現を微弱化させた翻訳障害性ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子カセット（翻訳障害性DHFR遺伝子カセット）
（ｂ）プロモーターとポリアデニレーションシグナルの間に外来遺伝子組み込み用クローニングサイトを含む遺伝子カセット
（ｃ）遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）。
【００１５】
本発明は、DHFR遺伝子カセット（シストロン）の構成として、DHFR遺伝子のコドンを哺乳動物において使用頻度の最も低いコドンに改変し、DHFRの発現誘導性を低下させたプロモーターを使用し、遺伝子導入により形質転換された宿主細胞におけるDHFRの発現機構を著しく障害せしめるものである。本発明において、「遺伝子カセット」とは、プロモーター、構造遺伝子、ポリアデニレーションシグナル（polyA）を基本構成とする転写・翻訳によりタンパク質を発現する単位を意味するが、これらのいずれかに関連するかもしくは任意のDNA配列を挿入配列として含んでいてもよい。本発明の、DHFR遺伝子カセットはプロモーターを弱化しただけのものとは異なり、転写ホットスポットへプラスミド遺伝子が導入されたHT不含培地生育株を特異的に獲得できるよう導くことから、「翻訳障害性DHFR遺伝子カセット」と定義する。
【００１６】
本発明において「哺乳動物において使用頻度の最も低いコドン」とは、ヒトにおいて使用頻度の最も低いコドンを好ましい例として挙げることができる。ヒトにおいて使用頻度の最も低いコドンとしては、Kimらの文献（Gene, 199,293頁,1997年）に開示されたコドンを挙げることができる。より具体的なコドンとして、アラニンはGCA、アルギニンはCGA、アスパラギンはAAU、アスパラギン酸はGAU、システインはUGU、グルタミンはCAA、グルタミン酸はGAA、グリシンはGGU、ヒスチジンはCAU、ロイシンはUUA、リシンはAAA、プロリンはCCA、フェニルアラニンはUUU、セリンはUCA、トレオニンはACU、チロシンはUAU、および／又はバリンはGUAを例示することができるが、コドンはこれらに限定されるものではない。
【００１７】
本発明において「発現を微弱化する」とは、遺伝子の発現が転写および／又は翻訳の段階で弱められていることを示し、具体的にはコドンを上記「哺乳動物において使用頻度の最も低いコドン」に改変することにより得ることができる。
該「翻訳障害性DHFR遺伝子カセット」において、コドンが改変される領域は特に制限されるものではないが、遺伝子カセットの全長の３０％以上（例えば、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、又は１００％）の領域におけるコドンが改変されることが好ましい。コドンの改変領域の範囲は、ベクターの他の条件を考慮して任意に決定することができる。
【００１８】
該「翻訳障害性DHFR遺伝子カセット」のプロモーターとしては、哺乳動物細胞では通常発現し難いタンパク質遺伝子のプロモーター（例えば、非哺乳動物細胞の遺伝子を由来とするプロモーター）を由来とするもの、または通常のプロモーターからエンハンサーを除去したものを使用でき、より具体的には、SV40のウイルス抗原プロモーターからエンハンサー領域を除去したものか（Mol.Cell Biol.,6,2593頁,1986年)、またはこれと同等に発現性の極めて低いプロモーターを使用することが好ましい。
【００１９】
プラスミドDNAのジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子欠損宿主細胞染色体上の転写ホットスポットへの組み込みは、DHFR遺伝子カセットの持つ特性からHTを含まない培地におけるセレクションにより結果的に達成されることになるが、染色体上の転写ホットスポットにおける外来遺伝子由来タンパク質の発現自体は強力に誘導される必要がある。このため、タンパク質遺伝子を組み込むクローニングサイト（以下、CSと記載する）のプロモーターおよびポリアデニレーションシグナル（以下、polyAと称する）は最も強い発現誘導性をもつものの中から選択するとよい。プロモーターとしては、ヒトサイトメガロウイルスImmediate Early（hCMV MIE:Cell,41,521頁,1985年）プロモーター、ヒトサイトメガロウイルスプロモーターとアデノウイルスプロモーターの融合プロモーターであるCMV5 プロモーター（Nucleic Acid Research, 30, 2頁, 2002年）、β-アクチンプロモーター（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,4831頁,1987年）、polyAにはウシ成長ホルモン由来のpolyA配列（DNA, 5,115頁,1986年）等が挙げられる。クローニングサイトは、制限酵素切断部位により構成される。制限酵素切断部位としては、Asc I、AsiS I、Acc65I、BamHI、BclI、BsaI、BsiWI、BstBI、BstEI、Bsu36I、DraIII、EagI、FseI、KpnI、MboI、Nhe I、Not I、PacI、RsrII、SalI、Sbf I、SexAI、SgfI、XcmI等が挙げられる。本明細書中ではこの目的とするタンパク質遺伝子を組み込むクローニングサイトをもつDNA断片を「遺伝子発現カセット」と称する。
【００２０】
UCOEとは、偏在的に高発現している遺伝子に近接して存在するDNAエレメントで、オープンクロマチン環境を形成することにより、その近隣に導入された遺伝子がメッセンジャーRNAに転写される可能性を最大限に高め、ひいては導入された遺伝子がコードしているタンパク質の発現量を最大とする能力を有する。また、UCOEはプロモーター領域のDNAメチル化を抑制することによるアンチサイレンシング活性を有し、長期にわたる継代培養による導入された遺伝子の転写活性の低下を抑制し、ひいては導入された遺伝子がコードしているタンパク質の発現量の低下を抑制することができる。そのため、本発明の発現ベクターにUCOEを導入することにより、形質転換体における目的のタンパク質の生産量を増加させるとともに、発現安定性を高めることが期待できる。
後述の実施例で発現ベクターに導入したUCOEのヌクレオチド配列を配列番号１に示す。本発明の目的を達成する限り、配列番号１のヌクレオチド配列には、ヌクレオチド塩基の置換、ヌクレオチドの欠失や挿入などの変異が導入されてもよい。発現ベクターに導入するUCOEの個数は、１つ又はそれ以上であってもよい。UCOEの導入部位は、発現しようとする遺伝子カセットを挟む形で存在するとよい。
【００２１】
本発明の発現ベクターは、選択マーカーとして薬剤耐性遺伝子（例えば、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子など）、複製起点（例えば、pUC 由来の複製起点、ColE1由来の複製起点、p15A由来の複製起点、pSC101由来の複製起点など）を搭載するとよい。
【００２２】
本発明の発現ベクターとしては、実施例で具体的に記載した発現ベクター（pDC62c5-U533）を例示することができるが、これに制限されるものではない。
また、本発明は、上記発現ベクターに外来遺伝子を組み込む工程、および該発現ベクターによりジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子欠損宿主細胞を形質転換させる工程を含む、外来遺伝子由来タンパク質を生産する形質転換体の製造方法を提供する。該形質転換体は、外来遺伝子由来タンパク質の高レベル生産能およびHTを含まない培地における生育能を有しうる。
具体的には、発現させたいタンパク質をコードする外来遺伝子を本発明の発現ベクターのクローニングサイト（以下、CSと記載）に組み込んだ後、トランスフェクション法（ここで言うトランスフェクション法とはリポフェクチン法、エレクトロポーレーション法、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション法など当業者が周知の方法を挙げることができる）を利用して該発現ベクターによりジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子欠損宿主細胞を形質転換し、HTを含まない培地における耐性でセレクションを行い、タンパク質の高生産性形質転換体を得る方法が挙げられる。例えば、pDC62c5-U533の場合、Asc IとSbf Iの間に外来遺伝子cDNAを挿入するとよい。外来遺伝子が抗体遺伝子である場合は、pDC62c5-U533のAsc IとAsiS Iの間に抗体軽鎖遺伝子cDNAを、Not IとSbf Iの間に抗体重鎖遺伝子cDNAを挿入するとよい。pDC62c5-U533においては、Asc IとAsiS I、ならびにNot IとSbf Iがクローニングサイトとなる。例えば、外来遺伝子挿入部位が一つであるpDC62c5-U533の場合、Asc IとAsiS Iの間に外来遺伝子 cDNAを挿入するとよい。外来遺伝子挿入部位が一つであるpDC62c5-U533においては、Asc IとAsiS Iがクローニングサイトとなる。外来遺伝子にはKozakを付加して、本発明の発現ベクターに組み込むとよい。Kozakは最適化されるとよく、最適化されたKozakの配列を配列番号２に示す。Kozakは外来遺伝子cDNAの開始コドンの上流に付加するとよい。
本発明は、本発明の発現ベクターに外来遺伝子が組み込まれた、外来遺伝子発現ベクターも提供する。
【００２３】
本発明において宿主細胞としては、外来遺伝子由来タンパク質の発現に適した細胞であれば特に制限はないが、好ましくはジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子欠損哺乳動物細胞、より好ましくはジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を欠損したチャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）を挙げることができる。
HT不含培地におけるセレクションで生存した形質転換細胞の多くは既に相対的にタンパク質の高い発現レベルを達成しているが、その中からさらに高レベル生産能をもつ形質転換細胞を選択するために、タンパク質の発現レベルの測定をしてもよい。
本発明は、本発明の外来遺伝子発現ベクターにより形質転換された宿主細胞も提供する。
【００２４】
また、本発明は、以下（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、外来遺伝子由来タンパク質の生産方法を提供する。
（ａ）本発明の発現ベクターに外来遺伝子を組み込む工程
（ｂ）該発現ベクターによりジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子欠損宿主細胞を形質転換させる工程
（ｃ）該形質転換体をHT不含培地で培養する工程
（ｄ）培養された形質転換体から外来遺伝子由来タンパク質を回収する工程
本発明において、上記（ｃ）の工程においては、HT不含培地で培養を行うことにより、高効率のタンパク質発現を示す形質転換体（コロニー）を選択することが出来る。選択された形質転換体は、引き続き同じ培地において培養を続けてもよいし、他の培地、例えば大量発現用の培地に移して培養を行ってもよい。
本発明において、形質転換体を培養又は馴化させる培地は特に制限されないが、好ましくは無血清培地、より好ましくはCD培地あるいはCD培地に非動物性の添加物（例えば、塩類やアミノ酸、糖、ビタミン類、組換えインスリン、組換えトランスフェリン ）を加えた培地を例示することができる。
本発明において培養された形質転換体から外来遺伝子由来タンパク質を回収する際には、当業者に公知の方法（フィルトレーション（濾過）、遠心分離、およびカラム精製等）でタンパク質を精製してもよい。外来遺伝子由来タンパク質は、精製を容易にするなどの目的で、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることも可能である。
【００２５】
さらに、本発明は、以下（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、外来遺伝子由来タンパク質を生産する形質転換体のスクリーニング方法を提供する。
（ａ）本発明の発現ベクターに外来遺伝子を組み込む工程
（ｂ）該発現ベクターによりジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子欠損宿主細胞を形質転換させる工程
（ｃ）該形質転換体をHT不含培地で培養する工程
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明の実施例を説明する。【００２７】
〔実施例１〕pDC62c5-U533の作製
pDC6（特許5704753）を改変して、本発明のベクターであるpDC62c5-U533を構築した。バックボーンベクターpDC62c5-U533の全塩基配列を配列番号３に記載する。pDC62c5-U533は、6067-6630の領域に、DHFRの塩基配列を５‘末端から１８０塩基の範囲で、コドンを哺乳動物において使用頻度の最も低いものに改変した翻訳障害性DHFR遺伝子が導入されている（図１）。また、1339-2889、4234-5784および9771-11321の領域に、UCOEが導入されている。UCOEの塩基配列を配列番号１に記載する。【００２８】
〔実施例２〕pDC62c5-U533-OMLHの作製
pDC62c5-U533の塩基配列No1098-No1108を配列番号４に記載のヒトオマリズマブ抗体（OMLH）軽鎖をコードするcDNA（開始コドンの上流に最適化したKozakが付加されている）に置換し、また、pDC62c5-U533の塩基配列No3993-No4004を配列番号５に記載のヒトオマリズマブ抗体（OMLH）重鎖をコードするcDNA（開始コドンの上流に最適化したKozakが付加されている）に置換して、pDC62c5-U533-OMLH（図２）を構築した。最適化したKozakの配列を配列番号２に記載する。
遺伝子導入前に制限酵素ClaIを用いて、ベクターを線状化した。【００２９】
〔実施例３〕pDC62c5-U533-OMLHのCHO細胞への導入、セレクション、生産性試験及び発現安定性試験
18 μｇのpDC62c5-U533-OMLHをリポフェクチン法（FreeStyle MAX Reagent, Life Technologiesを使用）を用いて125 mL容のカルチャーフラスコ(Erlenmeyer Flask, Baffled, 125 mL, Vent Cap, cat#431405, corning)中の15,000,000個のCHO細胞（CHO DG44 cell）に遺伝子導入した。
導入方法については製造業者の使用説明書に従った。遺伝子導入４８時間後に細胞数を計測した後、細胞を4mM GlutaMAX-I (Life Technologies)を含むCD OptiCHO培地(Life Technologies)にて希釈した。９６ウェルマイクロタイタープレート中に4,000 cells/wellの濃度で12,000 cells/wellの非遺伝子導入細胞と混合した後、１０枚（960ウェル）に播き、8％炭酸ガス存在下で３７℃、約３週間培養し、生存した細胞から任意に35株のHT不含培地耐性クローンを選択した。新たに９６ウェルマイクロタイタープレート中に16,000 cells/wellの濃度で12,000 cells/wellの非遺伝子導入細胞と混合した後、10枚（960ウェル）に播き、8％炭酸ガス存在下で３７℃、約３週間培養し、生存した細胞から任意に71株のHT不含培地耐性クローンを選択し合計106株を得た。得られたHT不含培地耐性クローンについては、4mM GlutaMAX-I (Life Technologies)を含むCD OptiCHO培地(Life Technologies)とともに２４ウェルプレートに移し、細胞が各ウェル底面積の１／３以上を占めるまで培養した。２４ウェルプレートにて増殖した細胞については4mM GlutaMAX-I (Life Technologies)を含むCD OptiCHO培地(Life Technologies)とともに6ウェルプレートに移し、細胞が各ウェル底面積の１／３以上を占めるまで培養した。
各株1 mLを滅菌チューブに取り、300 ×g、7分間遠心した。上清を捨て、細胞を0.55mLの新しい培地（4mM GlutaMAX-I (Life Technologies)を含むCD OptiCHO培地(Life Technologies)）に懸濁し、細胞数を計測した。生細胞密度を2 ×10^5 cells/mLになるように培地で希釈後、0.4mLを新しい24ウェルプレートに移し、8％炭酸ガス存在下で３７℃、７２時間回転振盪培養(125 rpm)した。培養後、細胞数を計測して、9300 ×g、２分間遠心分離し上清を回収した。
続いて培養上清中のIgG濃度をELISA法にて測定した。その結果、最大産生クローンのIgG産生量は28.5 μg/mL/3daysであり、10 μg/mL以上のIgGを産生した株は106株中16株(15.1%)であった(図6)。
次にIgG産生量上位10株を選択し、発現安定性試験を行った。発現安定性試験では、各株の凍結ストックから継代培養を開始した。継代培養では、細胞を2 ×10^5 cells/mLになるように希釈後、３ないしは４日回転振盪培養し、これをまた2 ×10^5 cells/mLになるように希釈することを繰り返し実施した。回転振盪培養開始０、７、１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７２、７９、８６日目に細胞密度2 ×10^5 cells/mL, 0.4 mLに細胞を調整して24 well-plate上で７２時間回転振盪培養(125 rpm)して、回収した培養上清のIgG産生量をELISAにて測定した。10株のIgG産生量は0週で28.5〜13.0 mg/L であり、 12週目には 15.6〜3.8 mg/Lであった。pDC62c5-U533-OMLH導入細胞の発現安定性については、8週目まで凍結ストック作製前の70%以上のIgG産生能を保持していたのは10株中7株、50%以上70%未満が2株、50%未満が1株であり、12週目の時点では70%以上保持株は2株、50%以上70%未満が5株、50%未満が3株であった(図7)。【００３０】
〔実施例４〕pDC61の作製
pDC6（特許5704753）の塩基配列No3182-No5843  を配列番号7に記載の配列に置換して、pDC61を構築した。バックボーンベクターpDC61の全塩基配列を配列番号6に記載する。【００３１】
〔実施例５〕pDC61/OMLHの作製
pDC61の塩基配列No1267-No1273を配列番号8に記載のヒトオマリズマブ抗体（OMLH）軽鎖をコードするcDNAに置換し、また、pDC61の塩基配列No2765-No2771を配列番号9に記載のヒトオマリズマブ抗体（OMLH）重鎖をコードするcDNAに置換して、pDC61/OMLH（図3）を構築した。
遺伝子導入前に制限酵素ClaIを用いて、ベクターを線状化した。【００３２】
〔実施例6〕pDC61/OMLHのCHO細胞への導入、セレクション、生産性試験及び発現安定性試験
18 μｇのpDC61/OMLHをリポフェクチン法（FreeStyle MAX Reagent, Life Technologiesを使用）を用いて125 mL容のカルチャーフラスコ(Erlenmeyer Flask, Baffled, 125 mL, Vent Cap, cat#431405, corning)中の15,000,000個のCHO細胞（CHO DG44 cell）に遺伝子導入した。導入方法については製造業者の使用説明書に従った。遺伝子導入４８時間後に細胞数を計測した後、細胞を4mM GlutaMAX-I (Life Technologies)を含むCD OptiCHO培地(Life Technologies)にて希釈した。９６ウェルマイクロタイタープレート中に40,000 cells/wellの濃度で12,000 cells/wellの非遺伝子導入細胞と混合した後、１０枚（960ウェル）に播き、8％炭酸ガス存在下で３７℃、約３週間培養し、生存した細胞から任意に118株のHT不含培地耐性クローンを選択した。得られたHT不含培地耐性クローンについては、4mM GlutaMAX-I (Life Technologies)を含むCD OptiCHO培地(Life Technologies)とともに２４ウェルプレートに移し、細胞が各ウェル底面積の１／３以上を占めるまで培養した。２４ウェルプレートにて増殖した細胞については4mM GlutaMAX-I (Life Technologies)を含むCD OptiCHO培地(Life Technologies)とともに6ウェルプレートに移し、細胞が各ウェル底面積の１／３以上を占めるまで培養した。各株1 mLを滅菌チューブに取り、300 ×g、7分間遠心した。上清を捨て、細胞を0.55mLの新しい培地（4mM GlutaMAX-I (Life Technologies)を含むCD OptiCHO培地(Life Technologies)）に懸濁し、細胞数を計測した。生細胞密度を2 ×10^5 cells/mLになるように培地で希釈後、0.4mLを新しい24ウェルプレートに移し、8％炭酸ガス存在下で３７℃、７２時間回転振盪培養(125 rpm)した。培養後、細胞数を計測して、9300 ×g、２分間遠心分離し上清を回収した。続いて培養上清中のIgG濃度をELISA法にて測定した。その結果、最大産生クローンのIgG産生量は16.4 μg/mL/3daysであり、10 μg/mL以上のIgGを産生した株は118株中2株(1.7%)であった(図6)。
次にIgG産生量上位10株を選択し、発現安定性試験を行った。発現安定性試験では、各株の凍結ストックから継代培養を開始した。継代培養では、細胞を2 ×10^5 cells/mLになるように希釈後、３ないしは４日回転振盪培養し、これをまた2 ×10^5 cells/mLになるように希釈することを繰り返し実施した。回転振盪培養開始０、７、１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７２、７９、８６日目に細胞密度2 ×10^5 cells/mL, 0.4 mLに細胞を調整して24 well-plate上で７２時間回転振盪培養(125 rpm)して、回収した培養上清のIgG産生量をELISAにて測定した。10株のIgG産生量は0週で16.4〜3.1 mg/L であり、 12週目には 6.3〜0.1 mg/Lであった。pDC61/OMLH導入細胞の発現安定性については、8週目まで凍結ストック作製前の70%以上のIgG産生能を保持していたのは10株中3株、50%以上70%未満が2株、50%未満が5株であり、12週目の時点では70%以上保持株は0株、50%以上70%未満が5株、50%未満が5株であった。【００３３】
〔実施例７〕pNC32c-U533の作製
pDC61（実施例４で作製）を改変して、本発明のベクターであるpNC32c-U533を構築した。バックボーンベクターpNC32c-U533の全塩基配列を配列番号10に記載する。pNC32c-U533は、塩基配列No5196-No5990の領域に、ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼの遺伝子が導入されている。また、塩基配列No867-No2417、No3291-No4841およびNo9130-No10680の領域に、UCOEが導入されている。UCOEの塩基配列を配列番号１に記載する。【００３４】
〔実施例８〕pNC32c-U533-OMLHの作製
pNC32c-U533の塩基配列No 658-No 668を配列番号11に記載のヒトオマリズマブ抗体（OMLH）軽鎖をコードするcDNAに置換し、また、pNC32c-U533の塩基配列No 3081-No 3092を配列番号12に記載のヒトオマリズマブ抗体（OMLH）重鎖をコードするcDNAに置換して、pNC32c-U533-OMLH（図4）を構築した。
遺伝子導入前に制限酵素ClaIを用いて、ベクターを線状化した。【００３５】
〔実施例９〕pNC32c-U533-OMLHのCHO細胞への導入、セレクション、生産性試験
18 μｇのpNC32c-U533-OMLHをリポフェクチン法（FreeStyle MAX Reagent, Life Technologiesを使用）を用いて125 mL容のカルチャーフラスコ(Erlenmeyer Flask, Baffled, 125 mL, Vent Cap, cat#431405, corning)中の15,000,000個のCHO細胞（CHO DG44 cell）に遺伝子導入した。導入方法については製造業者の使用説明書に従った。遺伝子導入４８時間後に細胞数を計測した後、4 mM GlutaMAX-I (Life Technologies)および400 μg/mL G418 sulfate (Wako), 1×HT Supplement(Life Technologies)を含むCD OptiCHO培地(Life Technologies)にて細胞を希釈した。９６ウェルマイクロタイタープレート中に800 cells/wellの濃度で12,000 cells/wellの非遺伝子導入細胞と混合した後、１０枚（960ウェル）に播き、8％炭酸ガス存在下で３７℃、約３週間培養し、生存した細胞から任意に105株のG418耐性クローンを選択した。得られたG418耐性クローンについては、4 mM GlutaMAX-I (Life Technologies)および400 μg/mL G418 sulfate (Wako), 1×HT Supplement(Life Technologies)を含むCD OptiCHO培地(Life Technologies)とともに２４ウェルプレートに移し、細胞が各ウェル底面積の１／３以上を占めるまで培養した。２４ウェルプレートにて増殖した細胞については4 mM GlutaMAX-I (Life Technologies)および400 μg/mL G418 sulfate (Wako), 1×HT Supplement(Life Technologies)を含むCD OptiCHO培地(Life Technologies)とともに6ウェルプレートに移し、細胞が各ウェル底面積の１／３以上を占めるまで培養した。各株1 mLを滅菌チューブに取り、300 ×g、7分間遠心した。上清を捨て、細胞を0.55mLの新しい培地（4 mM GlutaMAX-I (Life Technologies)および400 μg/mL G418 sulfate (Wako), 1×HT Supplement(Life Technologies)を含むCD OptiCHO培地(Life Technologies)）に懸濁し、細胞数を計測した。生細胞密度を2 ×10^5 cells/mLになるように培地で希釈後、0.4mLを新しい24ウェルプレートに移し、8％炭酸ガス存在下で３７℃、７２時間回転振盪培養(125 rpm)した。
培養後、細胞数を計測して、9300 ×g、２分間遠心分離し上清を回収した。続いて培養上清中のIgG濃度をELISA法にて測定した。その結果、最大産生クローンのIgG産生量は2.6 μg/mL/3daysであり、10 μg/mL以上のIgGを産生した株は105株中0株であった。【００３６】
〔実施例１０〕UCOE-Hu-P2 /OMLHの作製
市販のベクターであるUCOE（登録商標） Expression Vector - Human 4kb Puro Set (メルク社cat#5.04867.0001)の塩基配列No5309-No5311を配列番号13に記載の配列と置換することで制限酵素BstBI認識サイトを増設した(UCOE-Hu-P2)。
UCOE-Hu-P2上のFseI認識サイトおよびBstBI認識サイトを使用し、配列番号14に記載の、ヒトオマリズマブ抗体軽鎖（OML）をコードするcDNAおよびSimian Virus 40 ポリアデニレーションシグナル(SV40pA)、モルモットサイトメガロウイルスプロモーター(PgpCMV)、ヒトオマリズマブ抗体重鎖（OMH）をコードするcDNAを連結した配列をUCOE-Hu-P2に挿入し、UCOE-Hu-P2 /OMLH（図5）を構築した。
遺伝子導入前に制限酵素HindIIIを用いて、ベクターを線状化した。【００３７】
〔実施例１１〕UCOE-Hu-P2 /OMLHのCHO細胞への導入、セレクション、生産性試験
18 μｇのUCOE-Hu-P2 /OMLHをリポフェクチン法（FreeStyle MAX Reagent, Life Technologiesを使用）を用いて125 mL容のカルチャーフラスコ(Erlenmeyer Flask, Baffled, 125 mL, Vent Cap, cat#431405, corning)中の15,000,000個のCHO細胞（CHO DG44 cell）に遺伝子導入した。導入方法については製造業者の使用説明書に従った。遺伝子導入４８時間後に細胞数を計測した後、4 mM GlutaMAX-I (Life Technologies)および100 μg/mL Puromycin dihydrochloride (Thermo Fisher Scientific), 1×HT Supplement(Life Technologies)を含むCD OptiCHO培地(Life Technologies)にて細胞を希釈した。
９６ウェルマイクロタイタープレート中に4,000 cells/wellの濃度で12,000 cells/wellの非遺伝子導入細胞と混合した後、１０枚（960ウェル）に播き、8％炭酸ガス存在下で３７℃、約３週間培養し、生存した細胞から任意に33株のpuromycin耐性クローンを選択した。新たに９６ウェルマイクロタイタープレート中に16,000 cells/wellの濃度で12,000 cells/wellの非遺伝子導入細胞と混合した後、10枚（960ウェル）に播き、8％炭酸ガス存在下で３７℃、約３週間培養し、生存した細胞から任意に84株のpuromycin耐性クローンを選択し合計117株を得た。得られたpuromycin耐性クローンについては、4 mM GlutaMAX-I (Life Technologies)および100 μg/mL Puromycin dihydrochloride (Thermo Fisher Scientific), 1×HT Supplement(Life Technologies)を含むCD OptiCHO培地(Life Technologies)とともに２４ウェルプレートに移し、細胞が各ウェル底面積の１／３以上を占めるまで培養した。２４ウェルプレートにて増殖した細胞については4 mM GlutaMAX-I (Life Technologies)および100 μg/mL Puromycin dihydrochloride (Thermo Fisher Scientific), 1×HT Supplement(Life Technologies)を含むCD OptiCHO培地(Life Technologies)とともに6ウェルプレートに移し、細胞が各ウェル底面積の１／３以上を占めるまで培養した。各株1 mLを滅菌チューブに取り、300 ×g、7分間遠心した。上清を捨て、細胞を0.55mLの新しい培地（4 mM GlutaMAX-I (Life Technologies)および100 μg/mL Puromycin dihydrochloride (Thermo Fisher Scientific), 1×HT Supplement(Life Technologies)を含むCD OptiCHO培地(Life Technologies)）に懸濁し、細胞数を計測した。生細胞密度を2 ×10^5 cells/mLになるように培地で希釈後、0.4mLを新しい24ウェルプレートに移し、8％炭酸ガス存在下で３７℃、７２時間回転振盪培養(125 rpm)した。培養後、細胞数を計測して、9300 ×g、２分間遠心分離し上清を回収した。続いて培養上清中のIgG濃度をELISA法にて測定した。その結果、最大産生クローンのIgG産生量は4.7μg/mL/3daysであり、10 μg/mL以上のIgGを産生した株は117株中0株であった。【００３８】
〔実施例１２〕pDC62c5-U533を用いたイヌCTLA-4-Igの発現
実施例１で作製したpDC62c5-U533の塩基配列No2896-No5784（PCMV5、PABGH及びUCOEの塩基配列）の領域を欠くpDC62c5-U533（外来遺伝子挿入部位が一つである（AscIとAsisSIの間））を当業者に周知の方法で作製した。
イヌCTLA-4およびイヌIgG-Dの遺伝子配列は、The National Center for Biotechnology Information (NCBI) に既に登録されている (GenBank accession number; NM_001003106.1およびAF354267.1)。イヌCTLA-4の予想細胞外領域と、イヌIgG-Dのヒンジ部、CH2およびCH3領域を結合させたアミノ酸配列を作製し、CHO細胞に対するコドン最適化を行った（配列番号１５（アミノ酸配列）および配列番号１６（コドン最適化後ヌクレオチド配列））。その後、AscI制限酵素認識配列、KOZAK配列、イヌCTLA-4-Ig配列、AsiSI制限酵素認識配列を上記の順で配置するように遺伝子合成を行った。合成した遺伝子鎖を、外来遺伝子挿入部位が一つであるpDC62c5-U533（配列番号１７；図８）のクローニングサイト（塩基配列No1098-No1108；PRCMV5とPABGHの間にあるAscIおよびAsiSI制限酵素認識配列）へ制限酵素認識配列を利用して上記の順で配置するように組み込み、イヌCTLA-4-Ig発現ベクターを構築した。この発現ベクターを制限酵素ClaIにより線状化したのち、ジヒドロ葉酸還元酵素欠損細胞であるCHO DG44細胞（CHO-DG44(dhfr-/-）)へLipofectamine LTX（Thermo Fisher Scientific社）を用いてトランスフェクションした。遺伝子導入48時間後に、チミジンおよびヒポキサンチンを含まないOpti-CHO培地（Life Technologies社、4 mM GlutaMAX-I (Life Technologies社)を含む）に培地交換し、選択することにより安定発現細胞株を得た。さらに限界希釈法により細胞のクローニングを行い、高発現クローンをドットブロット法および3日間の振盪培養試験により選抜した。樹立されたイヌCTLA-4-Ig高発現CHO-DG44細胞クローンを、4 mM GlutaMAX-I (Life Technologies社)を含むDynamis培地（Life Technologies社）に馴化させ、5 ×10^5 cells/mL、液量30 mL、125 mL容のカルチャーフラスコ（Corning社）にて14日間の振盪培養（125 rpm, 37℃, 8% CO2）を行った。培養3，5，7，10日目に3倍濃度に調製したEfficientFeed B+（Life Technologies社）を3.3% v/v、さらに培養3，5，7日目に45%グルコース溶液（関東化学社）をそれぞれ終濃度 4, 4, 6 g/Lとなるように培地に添加した。この結果、14日目の培養上清中におよそ300 mg/LのイヌCTLA-4-Ig組み換えタンパク質を発現した（図９）。なお、培養上清中のイヌCTLA-4-Ig濃度はヤギ抗イヌIgG1ポリクローナル抗体（Bethyl Laboratories社）を用いたサンドイッチELISA法により定量し、生細胞数はトリパンブルー染色により死細胞を除外してカウントした。
産生したイヌCTLA-4-Igは上清よりAb-Capcher ExTra（プロテインA変異体、ProteNova社）を用いて精製を行った。レジンへの結合はオープンカラム法を用い、平衡化バッファーおよび洗浄バッファーとしてリン酸緩衝生理食塩水 (PBS; pH 7.4) を使用した。溶出バッファーには0.1 M Glycine-HClを、中和バッファーには1M Tris-HClを使用した。PD-MidiTrap G-25 (GE Healthcare社) を用いてバッファーをPBSに置換した。0.2 μmのフィルターを通し、実験に供するまで4 °Cにて保存した。タンパク質の濃度はPierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific社)により定量し、以後の実験に用いた。
精製したイヌCTLA-4-Igの純度を確かめるため、SDS-PAGEおよびCBB染色によりIgタンパク質の検出を行った。SuperSep Ace 5-20%グラジエントゲル（Wako社）を用いて、イヌCTLA-4-Igを還元条件下および非還元条件下にて電気泳動した。Quick-CBB kit（和光純薬工業社）により染色を行った後、蒸留水中で脱色を行った。還元条件では約45 kDa、非還元条件では約90 kDaに相当する分子量の位置にバンドが見られた。アミノ酸配列から計算されるイヌCTLA-4-Igの分子量は二量体で約79 kDa、単量体で約39.5 kDaであり、糖鎖修飾などの影響により大きめの分子量の位置にバンドが出たものと考えられた。夾雑タンパク質と考えられるバンドはほぼ視認されなかった（図１０）。【００３９】
〔実施例13〕pDC62c5-U533-TRLHの作製
pDC62c5-U533の塩基配列No1098-No1108を配列番号18に記載のヒトトラスツズマブ（TRLH）軽鎖をコードするcDNA（開始コドンの上流に最適化したKozakが付加されている）に置換し、また、pDC62c5-U533の塩基配列No3993-No4004を配列番号19に記載のヒトトラスツズマブ（TRLH)重鎖をコードするcDNA（開始コドンの上流に最適化したKozakが付加されている）に置換して、pDC62c5-U533-TRLH（図11）を構築した。最適化したKozakの配列を配列番号２に記載する。
遺伝子導入前に制限酵素ClaIを用いて、ベクターを線状化した。【００４０】
〔実施例14〕pDC62c5-U533-TRLHのCHO細胞への導入、セレクション、生産性試験および発現安定性試験
18 μｇのpDC62c5-U533-TRLHをリポフェクチン法（FreeStyle MAX Reagent, Life Technologiesを使用）を用いて125 mL容のカルチャーフラスコ(Erlenmeyer Flask, Baffled, 125 mL, Vent Cap, cat#431405, Corning)中の15,000,000個のCHO細胞（CHO DG44 cell）に遺伝子導入した。
導入方法については製造業者の使用説明書に従った。遺伝子導入４８時間後に細胞数を計測した後、細胞を4mM GlutaMAX-I (Life Technologies)を含むCD OptiCHO培地(Life Technologies)にて希釈した。９６ウェルマイクロタイタープレート中に400 cells/wellの濃度で12,000 cells/wellの非遺伝子導入細胞と混合した後、１2枚（1152ウェル）に播き、8％炭酸ガス存在下で３７℃、約３週間培養し、生存した細胞から任意に188株のHT不含培地耐性クローンを選択した。得られたHT不含培地耐性クローンについては、4mM GlutaMAX-I (Life Technologies)を含むCD OptiCHO培地(Life Technologies)とともに２４ウェルプレートに移し培養した。
各株0.6 mLを滅菌チューブに取り、300 ×g、7分間遠心した。上清を捨て、細胞を0.3 mLの新しい培地（4mM GlutaMAX-I (Life Technologies)を含むCD OptiCHO培地(Life Technologies)）に懸濁し、細胞数を計測した。生細胞密度を2 ×10^5 cells/mLになるように培地で希釈後、0.4mLを新しい24ウェルプレートに移し、8％炭酸ガス存在下で３７℃、７２時間回転振盪培養(125 rpm)した。培養後、細胞数を計測して、9300 ×g、２分間遠心分離し上清を回収した。
続いて培養上清中のIgG濃度をELISA法にて測定した。その結果、最大産生クローンのIgG産生量は47.8 μg/mL/3daysであり、10 μg/mL以上のIgGを産生した株は188株中81株(43.1%)であった(図12)。
次にIgG産生量上位10株を選択し、発現安定性試験を行った。発現安定性試験では、各株の凍結ストックから継代培養を開始した。馴化培養には4mM GlutaMAX-I (Life Technologies)を含むCD OptiCHO培地(Life Technologies)および4mM GlutaMAX-I (Life Technologies)を含むDynamis medium (Life Technologies)を使用し、75:25、50:50、25:75と継代ごとに後者の比率を上げることにより、細胞の馴化を行った。馴化後に発現安定性試験を開始した。試験期間中の継代培養では4mM GlutaMAX-I (Life Technologies)を含むDynamis medium (Life Technologies)を使用して、細胞を2 または1.5 ×10^5 cells/mLになるように希釈後、３ないしは４日間回転振盪培養し、これをまた2 または1.5×10^5 cells/mLになるように希釈することを繰り返し実施した。試験培養開始０、７、１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７0日目に細胞密度2 ×10^5 cells/mL, 0.4 mLに細胞を調整して24 well-plate上で７２時間回転振盪培養(125 rpm)して、回収した培養上清のIgG産生量をELISAにて測定した。10株のIgG産生量は0週で50.9〜16.5 mg/L であり、 10週目には 37.7〜0.5 mg/Lであった。pDC62c5-U533-TRLH導入細胞の発現安定性については、8週目まで凍結ストック作製前の70%以上のIgG産生能を保持していたのは10株中8株、50%以上70%未満が1株、50%未満が1株であり、10週目の時点では70%以上保持株は9株、50%未満が1株であった(図13)。【００４１】
〔実施例15〕pDC62c5-U533-OMLHを導入したCHO細胞のMTXセレクションおよび生産性試験
実施例3で得られたIgG産生量上位10株(Clone01-10)について、各株の凍結ストックから2,3回継代培養した後、4 mM GlutaMAX-I (Life Technologies)および60 nM MTX (Wako)を含むCD OptiCHO培地(Life Technologies)にて細胞を希釈した。1株ごとに、９６ウェルマイクロタイタープレート中に1,3,10,30,100,300,1000,3000,10000 cells/wellの濃度で12,000 cells/wellの非遺伝子導入細胞と混合した後、各濃度2枚ずつ１０枚（960ウェル）に播き、8％炭酸ガス存在下で３７℃、３,4週間培養し、生存した細胞から任意にMTX耐性クローンを選択した。得られたクローンを２４ウェルプレートに移し、細胞が各ウェル底面積の１／３以上を占めるまで培養した。２４ウェルプレートにて増殖した細胞については各株0.5 mLを滅菌チューブに取り、300 ×g、7分間遠心した。上清を捨て、細胞を0.3 mLの新しい培地（4 mM GlutaMAX-I (Life Technologies)および60 nM MTX (Wako)を含むCD OptiCHO培地(Life Technologies)）に懸濁し、細胞数を計測した。生細胞密度を2 ×10^5 cells/mLになるように培地で希釈後、0.4 mLを新しい24ウェルプレートに移し、8％炭酸ガス存在下で３７℃、７２時間回転振盪培養(125 rpm)した。培養後、細胞数を計測して、9300 ×g、２分間遠心分離し上清を回収した。続いて培養上清中のIgG濃度をELISA法にて測定した(図14)。
Clone01については、播いて29-32日後に1,3,10 cells/wellの濃度で播いたプレートから、18クローンを得た。最大産生クローンのIgG産生量は58.0 μg/mL/3daysであり、親株(28.5 μg/mL/3days)の2.0倍となった。
Clone02については、播いて22-32日後に1,3 cells/wellの濃度で播いたプレートから、24クローンを得た。最大産生クローンのIgG産生量は105.5 μg/mL/3daysであり、親株(25.8 μg/mL/3days)の4.1倍となった。
Clone03については、播いて22-32日後に1,3 cells/wellの濃度で播いたプレートから、19クローンを得た。最大産生クローンのIgG産生量は78.7 μg/mL/3daysであり、親株(23.0 μg/mL/3days)の3.4倍となった。
Clone04については、播いて22-32日後に1 cells/wellの濃度で播いたプレートから、33クローンを得た。最大産生クローンのIgG産生量は83.7 μg/mL/3daysであり、親株(20.9 μg/mL/3days)の4.0倍となった。
Clone05については、播いて27-39日後に1,3 cells/wellの濃度で播いたプレートから、23クローンを得た。最大産生クローンのIgG産生量は71.0 μg/mL/3daysであり、親株(19.2 μg/mL/3days)の3.7倍となった。
Clone06については、播いて26-39日後に3,10,30 cells/wellの濃度で播いたプレートから、16クローンを得た。最大産生クローンのIgG産生量は56.2 μg/mL/3daysであり、親株(18.4 μg/mL/3days)の3.0倍となった。
Clone07については、播いて29-39日後に3,10,30 cells/wellの濃度で播いたプレートから、8クローンを得た。最大産生クローンのIgG産生量は65.3 μg/mL/3daysであり、親株(17.1 μg/mL/3days)の3.8倍となった。
Clone08については、播いて27-41日後に100,300,1000 cells/wellの濃度で播いたプレートから、24クローンを得た。最大産生クローンのIgG産生量は47.9 μg/mL/3daysであり、親株(15.1 μg/mL/3days)の3.1倍となった。
Clone09については、播いて26-41日後に100,1000,3000,10000 cells/wellの濃度で播いたプレートから、12クローンを得た。最大産生クローンのIgG産生量は21.9 μg/mL/3daysであり、親株(14.3 μg/mL/3days)の1.5倍となった。
Clone10については、播いて22-39日後に1,3,10 cells/wellの濃度で播いたプレートから、18クローンを得た。最大産生クローンのIgG産生量は131.4 μg/mL/3daysであり、親株(13.0 μg/mL/3days)の10.1倍となった。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明により、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子欠損哺乳動物細胞を宿主として高レベルの外来遺伝子由来タンパク質生産を可能にする発現ベクターを提供することができる。また、哺乳動物本来の翻訳後修飾および高い生物活性を有するタンパク質を生産できる。それゆえ、バイオ医薬品等のタンパク質性有用物質の生産原価を大幅に引き下げることができる。
さらに、本発明によるタンパク質の生産方法は、ウイルスや微生物を使用しないため、安全性の高いタンパク質生産が可能である。
【配列表フリーテキスト】
【００４３】
＜配列番号1＞UCOEのヌクレオチド配列
GGCCCTCCGCGCCTACAGCTCAAGCCACATCCGAAGGGGGAGGGAGCCGGGAGCTGCGCGCGGGGCCGCCGGGGGGAGGGGTGGCACCGCCCACGCCGGGCGGCCACGAAGGGCGGGGCAGCGGGCGCGCGCGCGGCGGGGGGAGGGGCCGGCGCCGCGCCCGCTGGGAATTGGGGCCCTAGGGGGAGGGCGGAGGCGCCGACGACCGCGGCACTTACCGTTCGCGGCGTGGCGCCCGGTGGTCCCCAAGGGGAGGGAAGGGGGAGGCGGGGCGAGGACAGTGACCGGAGTCTCCTCAGCGGTGGCTTTTCTGCTTGGCAGCCTCAGCGGCTGGCGCCAAAACCGGACTCCGCCCACTTCCTCGCCCGCCGGTGCGAGGGTGTGGAATCCTCCAGACGCTGGGGGAGGGGGAGTTGGGAGCTTAAAAACTAGTACCCCTTTGGGACCACTTTCAGCAGCGAACTCTCCTGTACACCAGGGGTCAGTTCCACAGACGCGGGCCAGGGGTGGGTCATTGCGGCGTGAACAATAATTTGACTAGAAGTTGATTCGGGTGTTTCCGGAAGGGGCCGAGTCAATCCGCCGAGTTGGGGCACGGAAAACAAAAAGGGAAGGCTACTAAGATTTTTCTGGCGGGGGTTATCATTGGCGTAACTGCAGGGACCACCTCCCGGGTTGAGGGGGCTGGATCTCCAGGCTGCGGATTAAGCCCCTCCCGTCGGCGTTAATTTCAAACTGCGCGACGTTTCTCACCTGCCTTCGCCAAGGCAGGGGCCGGGACCCTATTCCAAGAGGTAGTAACTAGCAGGACTCTAGCCTTCCGCAATTCATTGAGCGCATTTACGGAAGTAACGTCGGGTACTGTCTCTGGCCGCAAGGGTGGGAGGAGTACGCATTTGGCGTAAGGTGGGGCGTAGAGCCTTCCCGCCATTGGCGGCGGATAGGGCGTTTACGCGACGGCCTGACGTAGCGGAAGACGCCTTAGTGGGGGGGAAGGTTCTAGAAAAGCGGCGGCAGCGGCTCTAGCGGCAGTAGCAGCAGCGCCGGGTCCCGTGCGGAGGTGCTCCTCGCAGAGTTGTTTCTCCAGCAGCGGCAGTTCTCACTACAGCGCCAGGACGAGTCCGGTTCGTGTTCGTCCGCGGAGATCTCTCTCATCTCGCTCGGCTGCGGGAAATCGGGCTGAAGCGACTGAGTCCGCGATGGAGGTAACGGGTTTGAAATCAATGAGTTATTGAAAAGGGCATGGCGAGGCCGTTGGCGCCTCAGTGGAAGTCGGCCAGCCGCCTCCGTGGGAGAGAGGCAGGAAATCGGACCAATTCAGTAGCAGTGGGGCTTAAGGTTTATGAACGGGGTCTTGAGCGGAGGCCTGAGCGTACAAACAGCTTCCCCACCCTCAGCCTCCCGGCGCCATTTCCCTTCACTGGGGGTGGGGGATGGGGAGCTTTCACATGGCGGACGCTGCCCCGCTGGGGTGAAAGTGGGGCGCGGAGGCGGGACTTCTTATTCCCTTTCTAAAGCACGCTGCTTCGGGGGCCACGGCGTCTCCTCGGA
＜配列番号2＞最適化されたKozak配列を示す。この配列中で、ATGは開始コドンとなる。
CCGCCGCCACCATGG
＜配列番号3＞pDC62c5-U533の全配列
CGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCCTCACTCTCTTCCGCATCGCTGTCTGCGAGGGCCAGCTGTTGGGCTCGCGGTTGAGGACAAACTCTTCGCGGTCTTTCCAGTACTCTTGGATCGGAAACCCGTCGGCCTCCGAACGGTACTCCGCCACCGAGGGACCTGAGCGAGTCCGCATCGACCGGATCGGAAAACCTCTCGAGAAAGGCGTCTAACCAGTCACAGTCGCAAGGTAGGCTGAGCACCGTGGCGGGCGGCAGCGGGTGGCGGTCGGGGTTGTTTCTGGCGGAGGTGCTGCTGATGATGTAATTAAAGTAGGCGGTCTTGAGACGGCGGATGGTCGAGGTGAGGTGTGGCAGGCTTGAGATCCAGCTGTTGGGGTGAGTACTCCCTCTCAAAAGCGGGCATGACTTCTGCGCTAAGATTGTCAGTTTCCAAAAACGAGGAGGATTTGATATTCACCTGGCCCGATCTGGCCATACACTTGAGTGACAATGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAAGGCGCGCCGCGATCGCGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGAGGATCTCCGCGGGGCCCTCCGCGCCTACAGCTCAAGCCACATCCGAAGGGGGAGGGAGCCGGGAGCTGCGCGCGGGGCCGCCGGGGGGAGGGGTGGCACCGCCCACGCCGGGCGGCCACGAAGGGCGGGGCAGCGGGCGCGCGCGCGGCGGGGGGAGGGGCCGGCGCCGCGCCCGCTGGGAATTGGGGCCCTAGGGGGAGGGCGGAGGCGCCGACGACCGCGGCACTTACCGTTCGCGGCGTGGCGCCCGGTGGTCCCCAAGGGGAGGGAAGGGGGAGGCGGGGCGAGGACAGTGACCGGAGTCTCCTCAGCGGTGGCTTTTCTGCTTGGCAGCCTCAGCGGCTGGCGCCAAAACCGGACTCCGCCCACTTCCTCGCCCGCCGGTGCGAGGGTGTGGAATCCTCCAGACGCTGGGGGAGGGGGAGTTGGGAGCTTAAAAACTAGTACCCCTTTGGGACCACTTTCAGCAGCGAACTCTCCTGTACACCAGGGGTCAGTTCCACAGACGCGGGCCAGGGGTGGGTCATTGCGGCGTGAACAATAATTTGACTAGAAGTTGATTCGGGTGTTTCCGGAAGGGGCCGAGTCAATCCGCCGAGTTGGGGCACGGAAAACAAAAAGGGAAGGCTACTAAGATTTTTCTGGCGGGGGTTATCATTGGCGTAACTGCAGGGACCACCTCCCGGGTTGAGGGGGCTGGATCTCCAGGCTGCGGATTAAGCCCCTCCCGTCGGCGTTAATTTCAAACTGCGCGACGTTTCTCACCTGCCTTCGCCAAGGCAGGGGCCGGGACCCTATTCCAAGAGGTAGTAACTAGCAGGACTCTAGCCTTCCGCAATTCATTGAGCGCATTTACGGAAGTAACGTCGGGTACTGTCTCTGGCCGCAAGGGTGGGAGGAGTACGCATTTGGCGTAAGGTGGGGCGTAGAGCCTTCCCGCCATTGGCGGCGGATAGGGCGTTTACGCGACGGCCTGACGTAGCGGAAGACGCCTTAGTGGGGGGGAAGGTTCTAGAAAAGCGGCGGCAGCGGCTCTAGCGGCAGTAGCAGCAGCGCCGGGTCCCGTGCGGAGGTGCTCCTCGCAGAGTTGTTTCTCCAGCAGCGGCAGTTCTCACTACAGCGCCAGGACGAGTCCGGTTCGTGTTCGTCCGCGGAGATCTCTCTCATCTCGCTCGGCTGCGGGAAATCGGGCTGAAGCGACTGAGTCCGCGATGGAGGTAACGGGTTTGAAATCAATGAGTTATTGAAAAGGGCATGGCGAGGCCGTTGGCGCCTCAGTGGAAGTCGGCCAGCCGCCTCCGTGGGAGAGAGGCAGGAAATCGGACCAATTCAGTAGCAGTGGGGCTTAAGGTTTATGAACGGGGTCTTGAGCGGAGGCCTGAGCGTACAAACAGCTTCCCCACCCTCAGCCTCCCGGCGCCATTTCCCTTCACTGGGGGTGGGGGATGGGGAGCTTTCACATGGCGGACGCTGCCCCGCTGGGGTGAAAGTGGGGCGCGGAGGCGGGACTTCTTATTCCCTTTCTAAAGCACGCTGCTTCGGGGGCCACGGCGTCTCCTCGGAGAATTCCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCCTCACTCTCTTCCGCATCGCTGTCTGCGAGGGCCAGCTGTTGGGCTCGCGGTTGAGGACAAACTCTTCGCGGTCTTTCCAGTACTCTTGGATCGGAAACCCGTCGGCCTCCGAACGGTACTCCGCCACCGAGGGACCTGAGCGAGTCCGCATCGACCGGATCGGAAAACCTCTCGAGAAAGGCGTCTAACCAGTCACAGTCGCAAGGTAGGCTGAGCACCGTGGCGGGCGGCAGCGGGTGGCGGTCGGGGTTGTTTCTGGCGGAGGTGCTGCTGATGATGTAATTAAAGTAGGCGGTCTTGAGACGGCGGATGGTCGAGGTGAGGTGTGGCAGGCTTGAGATCCAGCTGTTGGGGTGAGTACTCCCTCTCAAAAGCGGGCATGACTTCTGCGCTAAGATTGTCAGTTTCCAAAAACGAGGAGGATTTGATATTCACCTGGCCCGATCTGGCCATACACTTGAGTGACAATGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAAGCGGCCGCCCTGCAGGGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGAGGATCTCCGCGGGGCCCTCCGCGCCTACAGCTCAAGCCACATCCGAAGGGGGAGGGAGCCGGGAGCTGCGCGCGGGGCCGCCGGGGGGAGGGGTGGCACCGCCCACGCCGGGCGGCCACGAAGGGCGGGGCAGCGGGCGCGCGCGCGGCGGGGGGAGGGGCCGGCGCCGCGCCCGCTGGGAATTGGGGCCCTAGGGGGAGGGCGGAGGCGCCGACGACCGCGGCACTTACCGTTCGCGGCGTGGCGCCCGGTGGTCCCCAAGGGGAGGGAAGGGGGAGGCGGGGCGAGGACAGTGACCGGAGTCTCCTCAGCGGTGGCTTTTCTGCTTGGCAGCCTCAGCGGCTGGCGCCAAAACCGGACTCCGCCCACTTCCTCGCCCGCCGGTGCGAGGGTGTGGAATCCTCCAGACGCTGGGGGAGGGGGAGTTGGGAGCTTAAAAACTAGTACCCCTTTGGGACCACTTTCAGCAGCGAACTCTCCTGTACACCAGGGGTCAGTTCCACAGACGCGGGCCAGGGGTGGGTCATTGCGGCGTGAACAATAATTTGACTAGAAGTTGATTCGGGTGTTTCCGGAAGGGGCCGAGTCAATCCGCCGAGTTGGGGCACGGAAAACAAAAAGGGAAGGCTACTAAGATTTTTCTGGCGGGGGTTATCATTGGCGTAACTGCAGGGACCACCTCCCGGGTTGAGGGGGCTGGATCTCCAGGCTGCGGATTAAGCCCCTCCCGTCGGCGTTAATTTCAAACTGCGCGACGTTTCTCACCTGCCTTCGCCAAGGCAGGGGCCGGGACCCTATTCCAAGAGGTAGTAACTAGCAGGACTCTAGCCTTCCGCAATTCATTGAGCGCATTTACGGAAGTAACGTCGGGTACTGTCTCTGGCCGCAAGGGTGGGAGGAGTACGCATTTGGCGTAAGGTGGGGCGTAGAGCCTTCCCGCCATTGGCGGCGGATAGGGCGTTTACGCGACGGCCTGACGTAGCGGAAGACGCCTTAGTGGGGGGGAAGGTTCTAGAAAAGCGGCGGCAGCGGCTCTAGCGGCAGTAGCAGCAGCGCCGGGTCCCGTGCGGAGGTGCTCCTCGCAGAGTTGTTTCTCCAGCAGCGGCAGTTCTCACTACAGCGCCAGGACGAGTCCGGTTCGTGTTCGTCCGCGGAGATCTCTCTCATCTCGCTCGGCTGCGGGAAATCGGGCTGAAGCGACTGAGTCCGCGATGGAGGTAACGGGTTTGAAATCAATGAGTTATTGAAAAGGGCATGGCGAGGCCGTTGGCGCCTCAGTGGAAGTCGGCCAGCCGCCTCCGTGGGAGAGAGGCAGGAAATCGGACCAATTCAGTAGCAGTGGGGCTTAAGGTTTATGAACGGGGTCTTGAGCGGAGGCCTGAGCGTACAAACAGCTTCCCCACCCTCAGCCTCCCGGCGCCATTTCCCTTCACTGGGGGTGGGGGATGGGGAGCTTTCACATGGCGGACGCTGCCCCGCTGGGGTGAAAGTGGGGCGCGGAGGCGGGACTTCTTATTCCCTTTCTAAAGCACGCTGCTTCGGGGGCCACGGCGTCTCCTCGGAACCGGTTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAAGCTGCAGATGGTACGACCATTAAATTGTATTGTAGCAGTATCACAAAATATGGGTATTGGTAAAAATGGTGATTTACCATGGCCACCATTACGAAATGAATTTAAATATTTTCAACGAATGACTACTACTTCATCAGTAGAAGGTAAACAAAATTTAGTAATTATGGGTCGAAAAACTTGGTTTTCAATTCCTGAGAAGAATCGACCTTTAAAGGACAGAATTAATATAGTTCTCAGTAGAGAACTCAAAGAACCACCACGAGGAGCTCATTTTCTTGCCAAAAGTTTGGATGATGCCTTAAGACTTATTGAACAACCGGAATTGGCAAGTAAAGTAGACATGGTTTGGATAGTCGGAGGCAGTTCTGTTTACCAGGAAGCCATGAATCAACCAGGCCACCTCAGACTCTTTGTGACAAGGATCATGCAGGAATTTGAAAGTGACACGTTTTTCCCAGAAATTGATTTGGGGAAATATAAACTTCTCCCAGAATACCCAGGCGTCCTCTCTGAGGTCCAGGAGGAAAAAGGCATCAAGTATAAGTTTGAAGTCTACGAGAAGAAAGACTAAAGATCCGTGACATAATTGGACAAACTACCTACAGAGATTTAAAGCTCTAAGGTAAATATAAAATTTTTAAGTGTATAATGTGTTAAACTACTGATTCTAATTGTTTGTGTATTTTAGATTCCAACCTATGGAACTGATGAATGGGAGCAGTGGTGGAATGCCTTTAATGAGGAAAACCTGTTTTGCTCAGAAGAAATGCCATCTAGTGATGATGAGGCTACTGCTGACTCTCAACATTCTACTCCTCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGAAGACCCCAAGGACTTTCCTTCAGAATTGCTAAGTTTTTTGAGTCATGCTGTGTTTAGTAATAGAACTCTTGCTTGCTTTGCTATTTACACCACAAAGGAAAAAGCTGCACTGCTATACAAGAAAATTATGGAAAAATATTCTGTAACCTTTATAAGTAGGCATAACAGTTATAATCATAACATACTGTTTTTTCTTACTCCACACAGGCATAGAGTGTCTGCTATTAATAACTATGCTCAAAAATTGTGTACCTTTAGCTTTTTAATTTGTAAAGGGGTTAATAAGGAATATTTGATGTATAGTGCCTTGACTAGAGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGGCCCATCGATGCCGACGTAGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGGCCCTCCGCGCCTACAGCTCAAGCCACATCCGAAGGGGGAGGGAGCCGGGAGCTGCGCGCGGGGCCGCCGGGGGGAGGGGTGGCACCGCCCACGCCGGGCGGCCACGAAGGGCGGGGCAGCGGGCGCGCGCGCGGCGGGGGGAGGGGCCGGCGCCGCGCCCGCTGGGAATTGGGGCCCTAGGGGGAGGGCGGAGGCGCCGACGACCGCGGCACTTACCGTTCGCGGCGTGGCGCCCGGTGGTCCCCAAGGGGAGGGAAGGGGGAGGCGGGGCGAGGACAGTGACCGGAGTCTCCTCAGCGGTGGCTTTTCTGCTTGGCAGCCTCAGCGGCTGGCGCCAAAACCGGACTCCGCCCACTTCCTCGCCCGCCGGTGCGAGGGTGTGGAATCCTCCAGACGCTGGGGGAGGGGGAGTTGGGAGCTTAAAAACTAGTACCCCTTTGGGACCACTTTCAGCAGCGAACTCTCCTGT
ACACCAGGGGTCAGTTCCACAGACGCGGGCCAGGGGTGGGTCATTGCGGCGTGAACAATAATTTGACTAGAAGTTGATTCGGGTGTTTCCGGAAGGGGCCGAGTCAATCCGCCGAGTTGGGGCACGGAAAACAAAAAGGGAAGGCTACTAAGATTTTTCTGGCGGGGGTTATCATTGGCGTAACTGCAGGGACCACCTCCCGGGTTGAGGGGGCTGGATCTCCAGGCTGCGGATTAAGCCCCTCCCGTCGGCGTTAATTTCAAACTGCGCGACGTTTCTCACCTGCCTTCGCCAAGGCAGGGGCCGGGACCCTATTCCAAGAGGTAGTAACTAGCAGGACTCTAGCCTTCCGCAATTCATTGAGCGCATTTACGGAAGTAACGTCGGGTACTGTCTCTGGCCGCAAGGGTGGGAGGAGTACGCATTTGGCGTAAGGTGGGGCGTAGAGCCTTCCCGCCATTGGCGGCGGATAGGGCGTTTACGCGACGGCCTGACGTAGCGGAAGACGCCTTAGTGGGGGGGAAGGTTCTAGAAAAGCGGCGGCAGCGGCTCTAGCGGCAGTAGCAGCAGCGCCGGGTCCCGTGCGGAGGTGCTCCTCGCAGAGTTGTTTCTCCAGCAGCGGCAGTTCTCACTACAGCGCCAGGACGAGTCCGGTTCGTGTTCGTCCGCGGAGATCTCTCTCATCTCGCTCGGCTGCGGGAAATCGGGCTGAAGCGACTGAGTCCGCGATGGAGGTAACGGGTTTGAAATCAATGAGTTATTGAAAAGGGCATGGCGAGGCCGTTGGCGCCTCAGTGGAAGTCGGCCAGCCGCCTCCGTGGGAGAGAGGCAGGAAATCGGACCAATTCAGTAGCAGTGGGGCTTAAGGTTTATGAACGGGGTCTTGAGCGGAGGCCTGAGCGTACAAACAGCTTCCCCACCCTCAGCCTCCCGGCGCCATTTCCCTTCACTGGGGGTGGGGGATGGGGAGCTTTCACATGGCGGACGCTGCCCCGCTGGGGTGAAAGTGGGGCGCGGAGGCGGGACTTCTTATTCCCTTTCTAAAGCACGCTGCTTCGGGGGCCACGGCGTCTCCTCGGAAAGCTT
＜配列番号4＞開始コドンの上流に最適化したKozakが付加されている抗体（OMLH）軽鎖遺伝子cDNAのヌクレオチド配列
CGCGCCCCGCCGCCACCATGGGTTGGTCTTGTATCATCTTATTTTTAGTTGCTACTGCTACTGGTGTTCATTCTGATATACAGCTCACCCAAAGCCCATCATCTCTGTCTGCAAGCGTCGGCGACAGGGTGACCATTACCTGTCGCGCAAGCCAAAGCGTTGACTACGACGGCGACAGCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCTCCTAAGCTGCTGATCTATGCCGCCTCCTACCTTGAATCTGGAGTGCCTTCTCGTTTTTCCGGCTCAGGGTCCGGAACTGATTTTACCCTGACCATTTCCTCCCTCCAGCCCGAGGATTTTGCCACTTACTACTGTCAGCAGTCCCACGAGGACCCATATACATTCGGACAAGGTACAAAGGTAGAAATCAAGCGTACGGTGGCTGCCCCATCCGTGTTCATATTTCCTCCTAGCGACGAACAACTCAAGTCCGGTACCGCCAGCGTGGTCTGCCTGTTGAACAATTTTTATCCAAGAGAAGCTAAGGTCCAGTGGAAGGTTGACAACGCCCTTCAGTCCGGAAATAGCCAAGAGAGCGTCACCGAACAGGACTCCAAGGACAGTACATACTCACTGAGCTCTACACTGACCCTTTCTAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTCTACGCATGCGAAGTGACCCATCAGGGACTCAGTAGCCCTGTAACAAAGAGTTTTAATCGAGGCGAGTGCTAAGCGAT
＜配列番号5＞開始コドンの上流に最適化したKozakが付加されている抗体（OMLH）重鎖遺伝子cDNAのヌクレオチド配列
GGCCGCCCGCCGCCACCATGGAATTTGGTTTATCTTGGGTTTTTTTAGTTGCTTTATTAAGAGGTGTTCAATGTGAGGTGCAGTTGGTCGAATCCGGCGGCGGACTCGTGCAACCAGGCGGAAGTTTGCGGCTGTCCTGCGCAGTGTCTGGTTACAGCATCACCTCCGGGTATAGCTGGAACTGGATCCGCCAGGCTCCTGGAAAGGGGCTTGAGTGGGTGGCTTCCATTACCTACGACGGCTCCACTAACTATAACCCGAGCGTCAAAGGCAGAATCACCATCTCTCGGGACGACTCAAAGAATACCTTCTACCTGCAGATGAACTCACTGAGGGCCGAAGATACCGCAGTTTACTACTGCGCCAGGGGGTCCCACTATTTCGGCCACTGGCACTTCGCCGTGTGGGGACAGGGCACACTCGTGACCGTTAGTAGCGCTAGCACCAAAGGCCCCTCTGTGTTCCCACTTGCTCCCTCCAGTAAATCTACCTCCGGAGGAACCGCAGCCCTCGGCTGCCTGGTGAAGGATTACTTCCCAGAGCCCGTCACCGTCTCTTGGAACTCCGGAGCCTTGACTAGCGGAGTGCACACTTTCCCTGCTGTATTGCAGTCCAGCGGCTTGTATTCACTGAGTAGCGTCGTCACCGTGCCTTCAAGCAGCCTCGGGACACAGACATACATATGTAATGTCAACCATAAGCCATCAAACACTAAAGTTGATAAAAAGGTGGAACCTAAGAGTTGCGATAAGACCCATACCTGTCCTCCTTGCCCTGCTCCTGAGCTGCTGGGAGGCCCTAGCGTGTTTCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAAGATACACTGATGATTTCCCGCACACCTGAAGTAACATGTGTCGTGGTTGATGTGAGTCACGAGGATCCAGAGGTCAAGTTTAATTGGTACGtGGACGGAGTGGAGGTGCACAACGCTAAGACTAAGCCTCGGGAGGAACAGTACAACAGCACATACCGCGTGGTCAGCGTTTTGACTGTGCTGCATCAAGACTGGCTCAATGGAAAGGAATACAAGTGCAAGGTCTCTAATAAAGCCCTCCCCGCTCCTATTGAGAAGACTATTTCTAAAGCCAAGGGCCAGCCTCGCGAACCTCAGGTATATACTTTGCCACCCTCTCGCGAAGAAATGACAAAGAATCAGGTCTCACTCACTTGCCTCGTCAAAGGGTTTTACCCTTCTGACATCGCTGTCGAATGGGAAAGTAATGGTCAGCCAGAAAACAATTACAAGACTACTCCACCAGTGCTCGATTCTGATGGAAGTTTCTTTCTCTACAGTAAGCTCACTGTGGACAAATCTCGCTGGCAGCAGGGTAACGTATTCTCATGCTCCGTGATGCATGAAGCCCTCCACAACCATTACACCCAGAAGAGCCTGTCTCTGAGCCCAGGCAAGTAACCTGCA
＜配列番号6＞pDC61の全配列
CGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGTTAACTGGCTTATCGAAATTGTCGAGGAGAACTTCAGGGTGAGTTTGGGGACCCTTGATTGTTCTTTCTTTTTCGCTATTGTAAAATTCATGTTATATGGAGGGGGCAAAGTTTTCAGGGTGTTGTTTAGAATGGGAAGATGTCCCTTGTATCACCATGGACCCTCATGATAATTTTGTTTCTTTCACTTTCTACTCTGTTGACAACCATTGTCTCCTCTTATTTTCTTTTCATTTTCTGTAACTTTTTCGTTAAACTTTAGCTTGCATTTGTAACGAATTTTTAAATTCACTTTTGTTTATTTGTCAGATTGTAAGTACTTTCTCTAATCACTTTTTTTTCAAGGCAATCAGGGTATATTATATTGTACTTCAGCACAGTTTTAGAGAACAATTGTTATAATTAAATGATAAGGTAGAATATTTCTGCATATAAATTCTGGCTGGCGTGGAAATATTCTTATTGGTAGAAACAACTACATCCTGGTCATCATCCTGCCTTTCTCTTTATGGTTACAATGATATACACTGTTTGAGATGAGGATAAAATACTCTGAGTCCAAACCGGGCCCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGCGGCCGCCCCGGGGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGACTCGAGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGTTAACTGGCTTATCGAAATTGTCGAGGAGAACTTCAGGGTGAGTTTGGGGACCCTTGATTGTTCTTTCTTTTTCGCTATTGTAAAATTCATGTTATATGGAGGGGGCAAAGTTTTCAGGGTGTTGTTTAGAATGGGAAGATGTCCCTTGTATCACCATGGACCCTCATGATAATTTTGTTTCTTTCACTTTCTACTCTGTTGACAACCATTGTCTCCTCTTATTTTCTTTTCATTTTCTGTAACTTTTTCGTTAAACTTTAGCTTGCATTTGTAACGAATTTTTAAATTCACTTTTGTTTATTTGTCAGATTGTAAGTACTTTCTCTAATCACTTTTTTTTCAAGGCAATCAGGGTATATTATATTGTACTTCAGCACAGTTTTAGAGAACAATTGTTATAATTAAATGATAAGGTAGAATATTTCTGCATATAAATTCTGGCTGGCGTGGAAATATTCTTATTGGTAGAAACAACTACATCCTGGTCATCATCCTGCCTTTCTCTTTATGGTTACAATGATATACACTGTTTGAGATGAGGATAAAATACTCTGAGTCCAAACCGGGCCCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGCGCGCCTCTAGAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGAGGATCTCCGCGGTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAAGCTGCAGATGGTACGACCATTAAATTGTATTGTAGCAGTATCACAAAATATGGGTATTGGTAAAAATGGTGATTTACCATGGCCACCATTACGAAATGAATTTAAATATTTTCAACGAATGACTACTACTTCATCAGTAGAAGGTAAACAAAATTTAGTAATTATGGGTCGAAAAACTTGGTTTTCAATTCCTGAGAAGAATCGACCTTTAAAGGACAGAATTAATATAGTTCTCAGTAGAGAACTCAAAGAACCACCACGAGGAGCTCATTTTCTTGCCAAAAGTTTGGATGATGCCTTAAGACTTATTGAACAACCGGAATTGGCAAGTAAAGTAGACATGGTTTGGATAGTCGGAGGCAGTTCTGTTTACCAGGAAGCCATGAATCAACCAGGCCACCTCAGACTCTTTGTGACAAGGATCATGCAGGAATTTGAAAGTGACACGTTTTTCCCAGAAATTGATTTGGGGAAATATAAACTTCTCCCAGAATACCCAGGCGTCCTCTCTGAGGTCCAGGAGGAAAAAGGCATCAAGTATAAGTTTGAAGTCTACGAGAAGAAAGACTAAAGATCCGTGACATAATTGGACAAACTACCTACAGAGATTTAAAGCTCTAAGGTAAATATAAAATTTTTAAGTGTATAATGTGTTAAACTACTGATTCTAATTGTTTGTGTATTTTAGATTCCAACCTATGGAACTGATGAATGGGAGCAGTGGTGGAATGCCTTTAATGAGGAAAACCTGTTTTGCTCAGAAGAAATGCCATCTAGTGATGATGAGGCTACTGCTGACTCTCAACATTCTACTCCTCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGAAGACCCCAAGGACTTTCCTTCAGAATTGCTAAGTTTTTTGAGTCATGCTGTGTTTAGTAATAGAACTCTTGCTTGCTTTGCTATTTACACCACAAAGGAAAAAGCTGCACTGCTATACAAGAAAATTATGGAAAAATATTCTGTAACCTTTATAAGTAGGCATAACAGTTATAATCATAACATACTGTTTTTTCTTACTCCACACAGGCATAGAGTGTCTGCTATTAATAACTATGCTCAAAAATTGTGTACCTTTAGCTTTTTAATTTGTAAAGGGGTTAATAAGGAATATTTGATGTATAGTGCCTTGACTAGAGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGGCCCATCGATGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTT
＜配列番号7＞pDC6内の配列と置換した配列(pDC61)
AATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCA
＜配列番号8＞pDC61の塩基配列No1267-No1273  と置換したヒトオマリズマブ抗体（OMLH）軽鎖をコードするcDNA
GGCCGCCACCATGGGTTGGTCTTGTATCATCTTATTTTTAGTTGCTACTGCTACTGGTGTTCATTCTGATATACAGCTCACCCAAAGCCCATCATCTCTGTCTGCAAGCGTCGGCGACAGGGTGACCATTACCTGTCGCGCAAGCCAAAGCGTTGACTACGACGGCGACAGCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCTCCTAAGCTGCTGATCTATGCCGCCTCCTACCTTGAATCTGGAGTGCCTTCTCGTTTTTCCGGCTCAGGGTCCGGAACTGATTTTACCCTGACCATTTCCTCCCTCCAGCCCGAGGATTTTGCCACTTACTACTGTCAGCAGTCCCACGAGGACCCATATACATTCGGACAAGGTACAAAGGTAGAAATCAAGCGTACGGTGGCTGCCCCATCCGTGTTCATATTTCCTCCTAGCGACGAACAACTCAAGTCCGGTACCGCCAGCGTGGTCTGCCTGTTGAACAATTTTTATCCAAGAGAAGCTAAGGTCCAGTGGAAGGTTGACAACGCCCTTCAGTCCGGAAATAGCCAAGAGAGCGTCACCGAACAGGACTCCAAGGACAGTACATACTCACTGAGCTCTACACTGACCCTTTCTAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTCTACGCATGCGAAGTGACCCATCAGGGACTCAGTAGCCCTGTAACAAAGAGTTTTAATCGAGGCGAGTGCTAAC
＜配列番号9＞pDC61の塩基配列No2765-No2771と置換したヒトオマリズマブ抗体（OMLH）重鎖をコードするcDNA
CGCGCCACCATGGAATTTGGTTTATCTTGGGTTTTTTTAGTTGCTTTATTAAGAGGTGTTCAATGTGAGGTGCAGTTGGTCGAATCCGGCGGCGGACTCGTGCAACCAGGCGGAAGTTTGCGGCTGTCCTGCGCAGTGTCTGGTTACAGCATCACCTCCGGGTATAGCTGGAACTGGATCCGCCAGGCTCCTGGAAAGGGGCTTGAGTGGGTGGCTTCCATTACCTACGACGGCTCCACTAACTATAACCCGAGCGTCAAAGGCAGAATCACCATCTCTCGGGACGACTCAAAGAATACCTTCTACCTGCAGATGAACTCACTGAGGGCCGAAGATACCGCAGTTTACTACTGCGCCAGGGGGTCCCACTATTTCGGCCACTGGCACTTCGCCGTGTGGGGACAGGGCACACTCGTGACCGTTAGTAGCGCTAGCACCAAAGGCCCCTCTGTGTTCCCACTTGCTCCCTCCAGTAAATCTACCTCCGGAGGAACCGCAGCCCTCGGCTGCCTGGTGAAGGATTACTTCCCAGAGCCCGTCACCGTCTCTTGGAACTCCGGAGCCTTGACTAGCGGAGTGCACACTTTCCCTGCTGTATTGCAGTCCAGCGGCTTGTATTCACTGAGTAGCGTCGTCACCGTGCCTTCAAGCAGCCTCGGGACACAGACATACATATGTAATGTCAACCATAAGCCATCAAACACTAAAGTTGATAAAAAGGTGGAACCTAAGAGTTGCGATAAGACCCATACCTGTCCTCCTTGCCCTGCTCCTGAGCTGCTGGGAGGCCCTAGCGTGTTTCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAAGATACACTGATGATTTCCCGCACACCTGAAGTAACATGTGTCGTGGTTGATGTGAGTCACGAGGATCCAGAGGTCAAGTTTAATTGGTACGtGGACGGAGTGGAGGTGCACAACGCTAAGACTAAGCCTCGGGAGGAACAGTACAACAGCACATACCGCGTGGTCAGCGTTTTGACTGTGCTGCATCAAGACTGGCTCAATGGAAAGGAATACAAGTGCAAGGTCTCTAATAAAGCCCTCCCCGCTCCTATTGAGAAGACTATTTCTAAAGCCAAGGGCCAGCCTCGCGAACCTCAGGTATATACTTTGCCACCCTCTCGCGAAGAAATGACAAAGAATCAGGTCTCACTCACTTGCCTCGTCAAAGGGTTTTACCCTTCTGACATCGCTGTCGAATGGGAAAGTAATGGTCAGCCAGAAAACAATTACAAGACTACTCCACCAGTGCTCGATTCTGATGGAAGTTTCTTTCTCTACAGTAAGCTCACTGTGGACAAATCTCGCTGGCAGCAGGGTAACGTATTCTCATGCTCCGTGATGCATGAAGCCCTCCACAACCATTACACCCAGAAGAGCCTGTCTCTGAGCCCAGGCAAGTAAT
＜配列番号10＞バックボーンベクターpNC32c-U533の全塩基配列
CGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGTTAACTGGCTTATCGAAATTGGCGCGCCGCGATCGCCCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCTCCGCGGCCCTCCGCGCCTACAGCTCAAGCCACATCCGAAGGGGGAGGGAGCCGGGAGCTGCGCGCGGGGCCGCCGGGGGGAGGGGTGGCACCGCCCACGCCGGGCGGCCACGAAGGGCGGGGCAGCGGGCGCGCGCGCGGCGGGGGGAGGGGCCGGCGCCGCGCCCGCTGGGAATTGGGGCCCTAGGGGGAGGGCGGAGGCGCCGACGACCGCGGCACTTACCGTTCGCGGCGTGGCGCCCGGTGGTCCCCAAGGGGAGGGAAGGGGGAGGCGGGGCGAGGACAGTGACCGGAGTCTCCTCAGCGGTGGCTTTTCTGCTTGGCAGCCTCAGCGGCTGGCGCCAAAACCGGACTCCGCCCACTTCCTCGCCCGCCGGTGCGAGGGTGTGGAATCCTCCAGACGCTGGGGGAGGGGGAGTTGGGAGCTTAAAAACTAGTACCCCTTTGGGACCACTTTCAGCAGCGAACTCTCCTGTACACCAGGGGTCAGTTCCACAGACGCGGGCCAGGGGTGGGTCATTGCGGCGTGAACAATAATTTGACTAGAAGTTGATTCGGGTGTTTCCGGAAGGGGCCGAGTCAATCCGCCGAGTTGGGGCACGGAAAACAAAAAGGGAAGGCTACTAAGATTTTTCTGGCGGGGGTTATCATTGGCGTAACTGCAGGGACCACCTCCCGGGTTGAGGGGGCTGGATCTCCAGGCTGCGGATTAAGCCCCTCCCGTCGGCGTTAATTTCAAACTGCGCGACGTTTCTCACCTGCCTTCGCCAAGGCAGGGGCCGGGACCCTATTCCAAGAGGTAGTAACTAGCAGGACTCTAGCCTTCCGCAATTCATTGAGCGCATTTACGGAAGTAACGTCGGGTACTGTCTCTGGCCGCAAGGGTGGGAGGAGTACGCATTTGGCGTAAGGTGGGGCGTAGAGCCTTCCCGCCATTGGCGGCGGATAGGGCGTTTACGCGACGGCCTGACGTAGCGGAAGACGCCTTAGTGGGGGGGAAGGTTCTAGAAAAGCGGCGGCAGCGGCTCTAGCGGCAGTAGCAGCAGCGCCGGGTCCCGTGCGGAGGTGCTCCTCGCAGAGTTGTTTCTCCAGCAGCGGCAGTTCTCACTACAGCGCCAGGACGAGTCCGGTTCGTGTTCGTCCGCGGAGATCTCTCTCATCTCGCTCGGCTGCGGGAAATCGGGCTGAAGCGACTGAGTCCGCGATGGAGGTAACGGGTTTGAAATCAATGAGTTATTGAAAAGGGCATGGCGAGGCCGTTGGCGCCTCAGTGGAAGTCGGCCAGCCGCCTCCGTGGGAGAGAGGCAGGAAATCGGACCAATTCAGTAGCAGTGGGGCTTAAGGTTTATGAACGGGGTCTTGAGCGGAGGCCTGAGCGTACAAACAGCTTCCCCACCCTCAGCCTCCCGGCGCCATTTCCCTTCACTGGGGGTGGGGGATGGGGAGCTTTCACATGGCGGACGCTGCCCCGCTGGGGTGAAAGTGGGGCGCGGAGGCGGGACTTCTTATTCCCTTTCTAAAGCACGCTGCTTCGGGGGCCACGGCGTCTCCTCGGAGAATTCCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGTTAACTGGCTTATCGAAATTGCGGCCGCCCTGCAGGCCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGACTCCGCGGGGCCCTCCGCGCCTACAGCTCAAGCCACATCCGAAGGGGGAGGGAGCCGGGAGCTGCGCGCGGGGCCGCCGGGGGGAGGGGTGGCACCGCCCACGCCGGGCGGCCACGAAGGGCGGGGCAGCGGGCGCGCGCGCGGCGGGGGGAGGGGCCGGCGCCGCGCCCGCTGGGAATTGGGGCCCTAGGGGGAGGGCGGAGGCGCCGACGACCGCGGCACTTACCGTTCGCGGCGTGGCGCCCGGTGGTCCCCAAGGGGAGGGAAGGGGGAGGCGGGGCGAGGACAGTGACCGGAGTCTCCTCAGCGGTGGCTTTTCTGCTTGGCAGCCTCAGCGGCTGGCGCCAAAACCGGACTCCGCCCACTTCCTCGCCCGCCGGTGCGAGGGTGTGGAATCCTCCAGACGCTGGGGGAGGGGGAGTTGGGAGCTTAAAAACTAGTACCCCTTTGGGACCACTTTCAGCAGCGAACTCTCCTGTACACCAGGGGTCAGTTCCACAGACGCGGGCCAGGGGTGGGTCATTGCGGCGTGAACAATAATTTGACTAGAAGTTGATTCGGGTGTTTCCGGAAGGGGCCGAGTCAATCCGCCGAGTTGGGGCACGGAAAACAAAAAGGGAAGGCTACTAAGATTTTTCTGGCGGGGGTTATCATTGGCGTAACTGCAGGGACCACCTCCCGGGTTGAGGGGGCTGGATCTCCAGGCTGCGGATTAAGCCCCTCCCGTCGGCGTTAATTTCAAACTGCGCGACGTTTCTCACCTGCCTTCGCCAAGGCAGGGGCCGGGACCCTATTCCAAGAGGTAGTAACTAGCAGGACTCTAGCCTTCCGCAATTCATTGAGCGCATTTACGGAAGTAACGTCGGGTACTGTCTCTGGCCGCAAGGGTGGGAGGAGTACGCATTTGGCGTAAGGTGGGGCGTAGAGCCTTCCCGCCATTGGCGGCGGATAGGGCGTTTACGCGACGGCCTGACGTAGCGGAAGACGCCTTAGTGGGGGGGAAGGTTCTAGAAAAGCGGCGGCAGCGGCTCTAGCGGCAGTAGCAGCAGCGCCGGGTCCCGTGCGGAGGTGCTCCTCGCAGAGTTGTTTCTCCAGCAGCGGCAGTTCTCACTACAGCGCCAGGACGAGTCCGGTTCGTGTTCGTCCGCGGAGATCTCTCTCATCTCGCTCGGCTGCGGGAAATCGGGCTGAAGCGACTGAGTCCGCGATGGAGGTAACGGGTTTGAAATCAATGAGTTATTGAAAAGGGCATGGCGAGGCCGTTGGCGCCTCAGTGGAAGTCGGCCAGCCGCCTCCGTGGGAGAGAGGCAGGAAATCGGACCAATTCAGTAGCAGTGGGGCTTAAGGTTTATGAACGGGGTCTTGAGCGGAGGCCTGAGCGTACAAACAGCTTCCCCACCCTCAGCCTCCCGGCGCCATTTCCCTTCACTGGGGGTGGGGGATGGGGAGCTTTCACATGGCGGACGCTGCCCCGCTGGGGTGAAAGTGGGGCGCGGAGGCGGGACTTCTTATTCCCTTTCTAAAGCACGCTGCTTCGGGGGCCACGGCGTCTCCTCGGAACCGGTTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAAGCTGCAGATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGATCCGTGACATAATTGGACAAACTACCTACAGAGATTTAAAGCTCTAAGGTAAATATAAAATTTTTAAGTGTATAATGTGTTAAACTACTGATTCTAATTGTTTGTGTATTTTAGATTCCAACCTATGGAACTGATGAATGGGAGCAGTGGTGGAATGCCTTTAATGAGGAAAACCTGTTTTGCTCAGAAGAAATGCCATCTAGTGATGATGAGGCTACTGCTGACTCTCAACATTCTACTCCTCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGAAGACCCCAAGGACTTTCCTTCAGAATTGCTAAGTTTTTTGAGTCATGCTGTGTTTAGTAATAGAACTCTTGCTTGCTTTGCTATTTACACCACAAAGGAAAAAGCTGCACTGCTATACAAGAAAATTATGGAAAAATATTCTGTAACCTTTATAAGTAGGCATAACAGTTATAATCATAACATACTGTTTTTTCTTACTCCACACAGGCATAGAGTGTCTGCTATTAATAACTATGCTCAAAAATTGTGTACCTTTAGCTTTTTAATTTGTAAAGGGGTTAATAAGGAATATTTGATGTATAGTGCCTTGACTAGAGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGGCCCATCGATGCCGACGTAGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGGCCCTCCGCGCCTACAGCTCAAGCCACATCCGAAGGGGGAGGGAGCCGGGAGCTGCGCGCGGGGCCGCCGGGGGGAGGGGTGGCACCGCCCACGCCGGGCGGCCACGAAGGGCGGGGCAGCGGGCGCGCGCGCGGCGGGGGGAGGGGCCGGCGCCGCGCCCGCTGGGAATTGGGGCCCTAGGGGGAGGGCGGAGGCGCCGACGACCGCGGCACTTACCGTTCGCGGCGTGGCGCCCGGTGGTCCCCAAGGGGAGGGAAGGGGGAGGCGGGGCGAGGACAGTGACCGGAGTCTCCTCAGCGGTGGCTTTTCTGCTTGGCAGCCTCAGCGGCTGGCGCCAAAACCGGACTCCGCCCACTTCCTCGCCCGCCGGTGCGAGGGTGTGGAATCCTCCAGACGCTGGGGGAGGGGGAGTTGGGAGCTTAAAAACTAGTACCCCTTTGGGACCACTTTCAGCAGCGAACTCTCCTGTACACCAGGGGTCAGTTCCACAGACGCGGGCCAGGGGTGGGTCATTGCGGCGTGAACAATAATTTGACTAGAAGTTGATTCGGGTGTTTCCGGAAGGGGCCGAGTCAATCCGCCGAGTTGGGGCACGGAAAACAAAAAGGGAAGGCTACTAAGATTTTTCTGGCGGGGGTTATCATTGGCGTAACTGCAGGGACCACCTCCCGGGTTGAGGGGGCTGGATCTCCAGGCTGCGGATTAAGCCCCTCCCGTCGGCGTTAATTTCAAACTGCGCGACGTTTCTCACCTGCCTTCGCCAAGGCAGGGGCCGGGACCCTATTCCAAGAGGTAGTAACTAGCAGGACTCTAGCCTTCCGCAATTCATTGAGCGCATTTACGGAAGTAACGTCGGGTACTGTCTCTGGCCGCAAGGGTGGGAGGAGTACGCATTTGGCGTAAGGTGGGGCGTAGAGCCTTCCCGCCATTGGCGGCGGATAGGGCGTTTACGCGACGGCCTGACGTAGCGGAAGACGCCTTAGTGGGGGGGAAGGTTCTAGAAAAGCGGCGGCAGCGGCTCTAGCGGCAGTAGCAGCAGCGCCGGGTCCCGTGCGGAGGTGCTCCTCGCAGAGTTGTTTCTCCAGCAGCGGCAGTTCTCACTACAGCGCC
AGGACGAGTCCGGTTCGTGTTCGTCCGCGGAGATCTCTCTCATCTCGCTCGGCTGCGGGAAATCGGGCTGAAGCGACTGAGTCCGCGATGGAGGTAACGGGTTTGAAATCAATGAGTTATTGAAAAGGGCATGGCGAGGCCGTTGGCGCCTCAGTGGAAGTCGGCCAGCCGCCTCCGTGGGAGAGAGGCAGGAAATCGGACCAATTCAGTAGCAGTGGGGCTTAAGGTTTATGAACGGGGTCTTGAGCGGAGGCCTGAGCGTACAAACAGCTTCCCCACCCTCAGCCTCCCGGCGCCATTTCCCTTCACTGGGGGTGGGGGATGGGGAGCTTTCACATGGCGGACGCTGCCCCGCTGGGGTGAAAGTGGGGCGCGGAGGCGGGACTTCTTATTCCCTTTCTAAAGCACGCTGCTTCGGGGGCCACGGCGTCTCCTCGGAAAGCTT
＜配列番号11＞pNC32c-U533の塩基配列No 658-No 668  と置換したヒトオマリズマブ抗体（OMLH）軽鎖をコードするcDNA
CGCGCCACCATGGGTTGGTCTTGTATCATCTTATTTTTAGTTGCTACTGCTACTGGTGTTCATTCTGATATACAGCTCACCCAAAGCCCATCATCTCTGTCTGCAAGCGTCGGCGACAGGGTGACCATTACCTGTCGCGCAAGCCAAAGCGTTGACTACGACGGCGACAGCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCTCCTAAGCTGCTGATCTATGCCGCCTCCTACCTTGAATCTGGAGTGCCTTCTCGTTTTTCCGGCTCAGGGTCCGGAACTGATTTTACCCTGACCATTTCCTCCCTCCAGCCCGAGGATTTTGCCACTTACTACTGTCAGCAGTCCCACGAGGACCCATATACATTCGGACAAGGTACAAAGGTAGAAATCAAGCGTACGGTGGCTGCCCCATCCGTGTTCATATTTCCTCCTAGCGACGAACAACTCAAGTCCGGTACCGCCAGCGTGGTCTGCCTGTTGAACAATTTTTATCCAAGAGAAGCTAAGGTCCAGTGGAAGGTTGACAACGCCCTTCAGTCCGGAAATAGCCAAGAGAGCGTCACCGAACAGGACTCCAAGGACAGTACATACTCACTGAGCTCTACACTGACCCTTTCTAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTCTACGCATGCGAAGTGACCCATCAGGGACTCAGTAGCCCTGTAACAAAGAGTTTTAATCGAGGCGAGTGCTAAGCGAT
＜配列番号12＞pNC32c-U533の塩基配列No 3081-No 3092と置換したヒトオマリズマブ抗体（OMLH）重鎖をコードするcDNA
GGCCGCCACCATGGAATTTGGTTTATCTTGGGTTTTTTTAGTTGCTTTATTAAGAGGTGTTCAATGTGAGGTGCAGTTGGTCGAATCCGGCGGCGGACTCGTGCAACCAGGCGGAAGTTTGCGGCTGTCCTGCGCAGTGTCTGGTTACAGCATCACCTCCGGGTATAGCTGGAACTGGATCCGCCAGGCTCCTGGAAAGGGGCTTGAGTGGGTGGCTTCCATTACCTACGACGGCTCCACTAACTATAACCCGAGCGTCAAAGGCAGAATCACCATCTCTCGGGACGACTCAAAGAATACCTTCTACCTGCAGATGAACTCACTGAGGGCCGAAGATACCGCAGTTTACTACTGCGCCAGGGGGTCCCACTATTTCGGCCACTGGCACTTCGCCGTGTGGGGACAGGGCACACTCGTGACCGTTAGTAGCGCTAGCACCAAAGGCCCCTCTGTGTTCCCACTTGCTCCCTCCAGTAAATCTACCTCCGGAGGAACCGCAGCCCTCGGCTGCCTGGTGAAGGATTACTTCCCAGAGCCCGTCACCGTCTCTTGGAACTCCGGAGCCTTGACTAGCGGAGTGCACACTTTCCCTGCTGTATTGCAGTCCAGCGGCTTGTATTCACTGAGTAGCGTCGTCACCGTGCCTTCAAGCAGCCTCGGGACACAGACATACATATGTAATGTCAACCATAAGCCATCAAACACTAAAGTTGATAAAAAGGTGGAACCTAAGAGTTGCGATAAGACCCATACCTGTCCTCCTTGCCCTGCTCCTGAGCTGCTGGGAGGCCCTAGCGTGTTTCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAAGATACACTGATGATTTCCCGCACACCTGAAGTAACATGTGTCGTGGTTGATGTGAGTCACGAGGATCCAGAGGTCAAGTTTAATTGGTACGtGGACGGAGTGGAGGTGCACAACGCTAAGACTAAGCCTCGGGAGGAACAGTACAACAGCACATACCGCGTGGTCAGCGTTTTGACTGTGCTGCATCAAGACTGGCTCAATGGAAAGGAATACAAGTGCAAGGTCTCTAATAAAGCCCTCCCCGCTCCTATTGAGAAGACTATTTCTAAAGCCAAGGGCCAGCCTCGCGAACCTCAGGTATATACTTTGCCACCCTCTCGCGAAGAAATGACAAAGAATCAGGTCTCACTCACTTGCCTCGTCAAAGGGTTTTACCCTTCTGACATCGCTGTCGAATGGGAAAGTAATGGTCAGCCAGAAAACAATTACAAGACTACTCCACCAGTGCTCGATTCTGATGGAAGTTTCTTTCTCTACAGTAAGCTCACTGTGGACAAATCTCGCTGGCAGCAGGGTAACGTATTCTCATGCTCCGTGATGCATGAAGCCCTCCACAACCATTACACCCAGAAGAGCCTGTCTCTGAGCCCAGGCAAGTAACCTGCA
＜配列番号13＞UCOE-Hu-Pの塩基配列No5309-No5311と置換した、BstBI認識サイトを含む配列
CCTAGTAGTAGTAGTAGTTCGAAG
＜配列番号14＞ヒトオマリズマブ抗体軽鎖（OML）をコードするcDNAおよびSimian Virus 40 ポリアデニレーションシグナル(SV40pA)、モルモットサイトメガロウイルスプロモーター(PgpCMV)、ヒトオマリズマブ抗体重鎖（OMH）をコードするcDNAを連結した配列
CCCACCATGGGTTGGTCTTGTATCATCTTATTTTTAGTTGCTACTGCTACTGGTGTTCATTCTGATATACAGCTCACCCAAAGCCCATCATCTCTGTCTGCAAGCGTCGGCGACAGGGTGACCATTACCTGTCGCGCAAGCCAAAGCGTTGACTACGACGGCGACAGCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCTCCTAAGCTGCTGATCTATGCCGCCTCCTACCTTGAATCTGGAGTGCCTTCTCGTTTTTCCGGCTCAGGGTCCGGAACTGATTTTACCCTGACCATTTCCTCCCTCCAGCCCGAGGATTTTGCCACTTACTACTGTCAGCAGTCCCACGAGGACCCATATACATTCGGACAAGGTACAAAGGTAGAAATCAAGCGTACGGTGGCTGCCCCATCCGTGTTCATATTTCCTCCTAGCGACGAACAACTCAAGTCCGGTACCGCCAGCGTGGTCTGCCTGTTGAACAATTTTTATCCAAGAGAAGCTAAGGTCCAGTGGAAGGTTGACAACGCCCTTCAGTCCGGAAATAGCCAAGAGAGCGTCACCGAACAGGACTCCAAGGACAGTACATACTCACTGAGCTCTACACTGACCCTTTCTAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTCTACGCATGCGAAGTGACCCATCAGGGACTCAGTAGCCCTGTAACAAAGAGTTTTAATCGAGGCGAGTGCTAAGCGATCGCGCTAGCGCGGCCACGTAGTCGACTACGTAGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTGGCCGCGACTCTAGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAACCGGTTATGTTACTTGGCAGAGGCCGCATGGAAAGTCCCTGGACGTGGGACATCTGATTAATACGTGAGGAGGTCAGCCATGTTCTTTTTGGCAAAGGACTACGGTCATTGGACGTTTGATTGGCATGGGATAGGGTCAGCCAGAGTTAACAGTGTTCTTTTGGCAAAGGGATACGTGGAAAGTCCCGGGCCATTTACAGTAAACTGATACGGGGACAAAGCACAGCCATATTTAGTCATGTATTGCTTGGCAGAGGGTCTATGGAAAGTCCCTGGACGTGGGACGTCTGATTAATATGAAAGAAGGTCAGCCAGAGGTAGCTGTGTCCTTTTTGGCAAAGGGATACGGTTATGGGACGTTTGATTGGACTGGGATAGGGTCAGCCAGAGTTAACAGTGTTCTTTTGGCAAAGGAAACGTGGAAAGTCCCGGGCCATTTACAGTAAACTGATACTGGGACAAAGTACACCCATATTTAGTCATGTTCTTTTTGGCAAAGAGCATCTGGAAAGTCCCGGGCAGCATTATAGTCACTTGGCAGAGGGAAAGGGTCACTCAGAGTTAAGTACATCTTTCCAGGGCCAATATTCCAGTAAATTACACTTAGTTTTATGCAAATCAGCCACAAAGGGGATTTTCCCGGTCAATTATGACTTTTTCCTTAGTCATGCGGTATCCAATTACTGCCAAATTGGCAGTACATACTAGGTGATTCACTGACATTTGGCCGTCCTCTGGAAAGTCCCTGGAAACCGCTCAAGTACTGTATCATGGTGACTTTGCATTTTTGGAGAGCACGCCCCACTCCACCATTGGTCCACGTACCCTATGGGGGAGTGGTTTATGAGTATATAAGGGGCTCCGGTTTAGAAGCCGGGCAGAGCGGAATTCGAGCTCCCTGCAGGTTAGTTAAGTTAACGGCGCGCCACCATGGAATTTGGTTTATCTTGGGTTTTTTTAGTTGCTTTATTAAGAGGTGTTCAATGTGAGGTGCAGTTGGTCGAATCCGGCGGCGGACTCGTGCAACCAGGCGGAAGTTTGCGGCTGTCCTGCGCAGTGTCTGGTTACAGCATCACCTCCGGGTATAGCTGGAACTGGATCCGCCAGGCTCCTGGAAAGGGGCTTGAGTGGGTGGCTTCCATTACCTACGACGGCTCCACTAACTATAACCCGAGCGTCAAAGGCAGAATCACCATCTCTCGGGACGACTCAAAGAATACCTTCTACCTGCAGATGAACTCACTGAGGGCCGAAGATACCGCAGTTTACTACTGCGCCAGGGGGTCCCACTATTTCGGCCACTGGCACTTCGCCGTGTGGGGACAGGGCACACTCGTGACCGTTAGTAGCGCTAGCACCAAAGGCCCCTCTGTGTTCCCACTTGCTCCCTCCAGTAAATCTACCTCCGGAGGAACCGCAGCCCTCGGCTGCCTGGTGAAGGATTACTTCCCAGAGCCCGTCACCGTCTCTTGGAACTCCGGAGCCTTGACTAGCGGAGTGCACACTTTCCCTGCTGTATTGCAGTCCAGCGGCTTGTATTCACTGAGTAGCGTCGTCACCGTGCCTTCAAGCAGCCTCGGGACACAGACATACATATGTAATGTCAACCATAAGCCATCAAACACTAAAGTTGATAAAAAGGTGGAACCTAAGAGTTGCGATAAGACCCATACCTGTCCTCCTTGCCCTGCTCCTGAGCTGCTGGGAGGCCCTAGCGTGTTTCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAAGATACACTGATGATTTCCCGCACACCTGAAGTAACATGTGTCGTGGTTGATGTGAGTCACGAGGATCCAGAGGTCAAGTTTAATTGGTACGtGGACGGAGTGGAGGTGCACAACGCTAAGACTAAGCCTCGGGAGGAACAGTACAACAGCACATACCGCGTGGTCAGCGTTTTGACTGTGCTGCATCAAGACTGGCTCAATGGAAAGGAATACAAGTGCAAGGTCTCTAATAAAGCCCTCCCCGCTCCTATTGAGAAGACTATTTCTAAAGCCAAGGGCCAGCCTCGCGAACCTCAGGTATATACTTTGCCACCCTCTCGCGAAGAAATGACAAAGAATCAGGTCTCACTCACTTGCCTCGTCAAAGGGTTTTACCCTTCTGACATCGCTGTCGAATGGGAAAGTAATGGTCAGCCAGAAAACAATTACAAGACTACTCCACCAGTGCTCGATTCTGATGGAAGTTTCTTTCTCTACAGTAAGCTCACTGTGGACAAATCTCGCTGGCAGCAGGGTAACGTATTCTCATGCTCCGTGATGCATGAAGCCCTCCACAACCATTACACCCAGAAGAGCCTGTCTCTGAGCCCAGGCAAGTAATCTAGATT
＜配列番号15＞イヌCTLA-4-Igのアミノ酸配列
MAGFGFRRHGAQPDLASRTWPCTALFSLLFIPVFSKGMHVAQPAVVLASSRGVASFVCEYGSSGNAAEVRVTVLRQAGSQMTEVCAATYTVEDELAFLDDSTCTGTSSGNKVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYVGMGNGTQIYVIDPEPCPDSDPKESTCKCISPCPVPESLGGPSVFIFPPKPKDILRITRTPEITCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQPREQQFNSTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIGLPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSPKELSSSDTVTLTCLIKDFFPPEIDVEWQSNGQPEPESKYHTTAPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDTFTCAVMHEALQNHYTDLSLSHSPGK
＜配列番号16＞イヌCTLA-4-Igのコドン最適化後ヌクレオチド配列
ATGGCTGGATTTGGATTCAGAAGGCACGGAGCCCAGCCCGACCTGGCATCTCGCACTTGGCCCTGTACCGCACTGTTTTCACTGCTGTTCATCCCAGTGTTCAGCAAGGGAATGCACGTGGCTCAGCCAGCTGTGGTGCTGGCTTCCAGCAGAGGCGTGGCTTCCTTCGTGTGCGAGTACGGCTCTTCCGGCAACGCCGCTGAGGTGAGAGTGACCGTGCTGAGGCAGGCTGGCTCCCAGATGACAGAGGTGTGCGCCGCTACCTATACAGTGGAGGACGAGCTGGCTTTCCTGGACGATAGCACCTGTACAGGCACCAGCTCTGGCAACAAGGTCAATCTGACCATCCAGGGCCTGCGCGCCATGGATACAGGCCTGTACATCTGTAAGGTGGAGCTGATGTATCCCCCTCCATACTATGTGGGCATGGGCAATGGCACCCAGATCTACGTGATCGACCCCGAGCCTTGCCCAGACTCTGATCCAAAGGAGTCGACATGCAAGTGTATCTCTCCATGTCCTGTGCCAGAGAGCCTGGGAGGACCTTCCGTGTTCATCTTTCCCCCTAAGCCAAAGGATATCCTGAGGATCACACGGACCCCTGAGATCACCTGCGTGGTGCTGGACCTGGGAAGGGAGGATCCAGAGGTGCAGATCTCCTGGTTCGTGGACGGCAAGGAGGTGCATACCGCTAAGACACAGCCCAGAGAGCAGCAGTTTAACTCCACCTATCGCGTGGTGAGCGTGCTGCCTATCGAGCACCAGGATTGGCTGACAGGCAAGGAGTTTAAGTGCCGGGTGAATCATATCGGCCTGCCCTCTCCTATCGAGAGGACCATCTCCAAGGCTAGGGGACAGGCTCACCAGCCAAGCGTGTACGTGCTGCCACCCTCTCCTAAGGAGCTGTCCAGCTCTGACACAGTGACCCTGACATGTCTGATCAAGGACTTCTTTCCTCCAGAGATCGACGTGGAGTGGCAGTCCAACGGCCAGCCAGAGCCCGAGAGCAAGTATCATACCACAGCCCCCCAGCTGGACGAGGATGGCTCTTACTTCCTGTATTCCAAGCTGAGCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCGATACCTTTACATGTGCTGTGATGCACGAAGCCCTGCAGAATCATTACACCGACCTGTCACTGTCCCACTCCCCTGGCAAATAA
＜配列番号17＞外来遺伝子挿入部位が一つであるpDC62c5-U533の全塩基配列
CGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCCTCACTCTCTTCCGCATCGCTGTCTGCGAGGGCCAGCTGTTGGGCTCGCGGTTGAGGACAAACTCTTCGCGGTCTTTCCAGTACTCTTGGATCGGAAACCCGTCGGCCTCCGAACGGTACTCCGCCACCGAGGGACCTGAGCGAGTCCGCATCGACCGGATCGGAAAACCTCTCGAGAAAGGCGTCTAACCAGTCACAGTCGCAAGGTAGGCTGAGCACCGTGGCGGGCGGCAGCGGGTGGCGGTCGGGGTTGTTTCTGGCGGAGGTGCTGCTGATGATGTAATTAAAGTAGGCGGTCTTGAGACGGCGGATGGTCGAGGTGAGGTGTGGCAGGCTTGAGATCCAGCTGTTGGGGTGAGTACTCCCTCTCAAAAGCGGGCATGACTTCTGCGCTAAGATTGTCAGTTTCCAAAAACGAGGAGGATTTGATATTCACCTGGCCCGATCTGGCCATACACTTGAGTGACAATGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAAGGCGCGCCGCGATCGCGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGAGGATCTCCGCGGGGCCCTCCGCGCCTACAGCTCAAGCCACATCCGAAGGGGGAGGGAGCCGGGAGCTGCGCGCGGGGCCGCCGGGGGGAGGGGTGGCACCGCCCACGCCGGGCGGCCACGAAGGGCGGGGCAGCGGGCGCGCGCGCGGCGGGGGGAGGGGCCGGCGCCGCGCCCGCTGGGAATTGGGGCCCTAGGGGGAGGGCGGAGGCGCCGACGACCGCGGCACTTACCGTTCGCGGCGTGGCGCCCGGTGGTCCCCAAGGGGAGGGAAGGGGGAGGCGGGGCGAGGACAGTGACCGGAGTCTCCTCAGCGGTGGCTTTTCTGCTTGGCAGCCTCAGCGGCTGGCGCCAAAACCGGACTCCGCCCACTTCCTCGCCCGCCGGTGCGAGGGTGTGGAATCCTCCAGACGCTGGGGGAGGGGGAGTTGGGAGCTTAAAAACTAGTACCCCTTTGGGACCACTTTCAGCAGCGAACTCTCCTGTACACCAGGGGTCAGTTCCACAGACGCGGGCCAGGGGTGGGTCATTGCGGCGTGAACAATAATTTGACTAGAAGTTGATTCGGGTGTTTCCGGAAGGGGCCGAGTCAATCCGCCGAGTTGGGGCACGGAAAACAAAAAGGGAAGGCTACTAAGATTTTTCTGGCGGGGGTTATCATTGGCGTAACTGCAGGGACCACCTCCCGGGTTGAGGGGGCTGGATCTCCAGGCTGCGGATTAAGCCCCTCCCGTCGGCGTTAATTTCAAACTGCGCGACGTTTCTCACCTGCCTTCGCCAAGGCAGGGGCCGGGACCCTATTCCAAGAGGTAGTAACTAGCAGGACTCTAGCCTTCCGCAATTCATTGAGCGCATTTACGGAAGTAACGTCGGGTACTGTCTCTGGCCGCAAGGGTGGGAGGAGTACGCATTTGGCGTAAGGTGGGGCGTAGAGCCTTCCCGCCATTGGCGGCGGATAGGGCGTTTACGCGACGGCCTGACGTAGCGGAAGACGCCTTAGTGGGGGGGAAGGTTCTAGAAAAGCGGCGGCAGCGGCTCTAGCGGCAGTAGCAGCAGCGCCGGGTCCCGTGCGGAGGTGCTCCTCGCAGAGTTGTTTCTCCAGCAGCGGCAGTTCTCACTACAGCGCCAGGACGAGTCCGGTTCGTGTTCGTCCGCGGAGATCTCTCTCATCTCGCTCGGCTGCGGGAAATCGGGCTGAAGCGACTGAGTCCGCGATGGAGGTAACGGGTTTGAAATCAATGAGTTATTGAAAAGGGCATGGCGAGGCCGTTGGCGCCTCAGTGGAAGTCGGCCAGCCGCCTCCGTGGGAGAGAGGCAGGAAATCGGACCAATTCAGTAGCAGTGGGGCTTAAGGTTTATGAACGGGGTCTTGAGCGGAGGCCTGAGCGTACAAACAGCTTCCCCACCCTCAGCCTCCCGGCGCCATTTCCCTTCACTGGGGGTGGGGGATGGGGAGCTTTCACATGGCGGACGCTGCCCCGCTGGGGTGAAAGTGGGGCGCGGAGGCGGGACTTCTTATTCCCTTTCTAAAGCACGCTGCTTCGGGGGCCACGGCGTCTCCTCGGAGAATTCaaatgggACCGGTTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAAGCTGCAGATGGTACGACCATTAAATTGTATTGTAGCAGTATCACAAAATATGGGTATTGGTAAAAATGGTGATTTACCATGGCCACCATTACGAAATGAATTTAAATATTTTCAACGAATGACTACTACTTCATCAGTAGAAGGTAAACAAAATTTAGTAATTATGGGTCGAAAAACTTGGTTTTCAATTCCTGAGAAGAATCGACCTTTAAAGGACAGAATTAATATAGTTCTCAGTAGAGAACTCAAAGAACCACCACGAGGAGCTCATTTTCTTGCCAAAAGTTTGGATGATGCCTTAAGACTTATTGAACAACCGGAATTGGCAAGTAAAGTAGACATGGTTTGGATAGTCGGAGGCAGTTCTGTTTACCAGGAAGCCATGAATCAACCAGGCCACCTCAGACTCTTTGTGACAAGGATCATGCAGGAATTTGAAAGTGACACGTTTTTCCCAGAAATTGATTTGGGGAAATATAAACTTCTCCCAGAATACCCAGGCGTCCTCTCTGAGGTCCAGGAGGAAAAAGGCATCAAGTATAAGTTTGAAGTCTACGAGAAGAAAGACTAAAGATCCGTGACATAATTGGACAAACTACCTACAGAGATTTAAAGCTCTAAGGTAAATATAAAATTTTTAAGTGTATAATGTGTTAAACTACTGATTCTAATTGTTTGTGTATTTTAGATTCCAACCTATGGAACTGATGAATGGGAGCAGTGGTGGAATGCCTTTAATGAGGAAAACCTGTTTTGCTCAGAAGAAATGCCATCTAGTGATGATGAGGCTACTGCTGACTCTCAACATTCTACTCCTCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGAAGACCCCAAGGACTTTCCTTCAGAATTGCTAAGTTTTTTGAGTCATGCTGTGTTTAGTAATAGAACTCTTGCTTGCTTTGCTATTTACACCACAAAGGAAAAAGCTGCACTGCTATACAAGAAAATTATGGAAAAATATTCTGTAACCTTTATAAGTAGGCATAACAGTTATAATCATAACATACTGTTTTTTCTTACTCCACACAGGCATAGAGTGTCTGCTATTAATAACTATGCTCAAAAATTGTGTACCTTTAGCTTTTTAATTTGTAAAGGGGTTAATAAGGAATATTTGATGTATAGTGCCTTGACTAGAGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGGCCCATCGATGCCGACGTAGCGCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGGCCCTCCGCGCCTACAGCTCAAGCCACATCCGAAGGGGGAGGGAGCCGGGAGCTGCGCGCGGGGCCGCCGGGGGGAGGGGTGGCACCGCCCACGCCGGGCGGCCACGAAGGGCGGGGCAGCGGGCGCGCGCGCGGCGGGGGGAGGGGCCGGCGCCGCGCCCGCTGGGAATTGGGGCCCTAGGGGGAGGGCGGAGGCGCCGACGACCGCGGCACTTACCGTTCGCGGCGTGGCGCCCGGTGGTCCCCAAGGGGAGGGAAGGGGGAGGCGGGGCGAGGACAGTGACCGGAGTCTCCTCAGCGGTGGCTTTTCTGCTTGGCAGCCTCAGCGGCTGGCGCCAAAACCGGACTCCGCCCACTTCCTCGCCCGCCGGTGCGAGGGTGTGGAATCCTCCAGACGCTGGGGGAGGGGGAGTTGGGAGCTTAAAAACTAGTACCCCTTTGGGACCACTTTCAGCAGCGAACTCTCCTGTACACCAGGGGTCAGTTCCACAGACGCGGGCCAGGGGTGGGTCATTGCGGCGTGAACAATAATTTGACTAGAAGTTGATTCGGGTGTTTCCGGAAGGGGCCGAGTCAATCCGCCGAGTTGGGGCACGGAAAACAAAAAGGGAAGGCTACTAAGATTTTTCTGGCGGGGGTTATCATTGGCGTAACTGCAGGGACCACCTCCCGGGTTGAGGGGGCTGGATCTCCAGGCTGCGGATTAAGCCCCTCCCGTCGGCGTTAATTTCAAACTGCGCGACGTTTCTCACCTGCCTTCGCCAAGGCAGGGGCCGGGACCCTATTCCAAGAGGTAGTAACTAGCAGGACTCTAGCCTTCCGCAATTCATTGAGCGCATTTACGGAAGTAACGTCGGGTACTGTCTCTGGCCGCAAGGGTGGGAGGAGTACGCATTTGGCGTAAGGTGGGGCGTAGAGCCTTCCCGCCATTGGCGGCGGATAGGGCGTTTACGCGACGGCCTGACGTAGCGGAAGACGCCTTAGTGGGGGGGAAGGTTCTAGAAAAGCGGCGGCAGCGGCTCTAGCGGCAGTAGCAGCAGCGCCGGGTCCCGTGCGGAGGTGCTCCTCGCAGAGTTGTTTCTCCAGCAGCGGCAGTTCTCACTACAGCGCCAGGACGAGTCCGGTTCGTGTTCGTCCGCGGAGATCTCTCTCATCTCGCTCGGCTGCGGGAAATCGGGCTGAAGCGACTGAGTCCGCGATGGAGGTAACGGGTTTGAAATCAATGAGTTATTGAAAAGGGCATGGCGAGGCCGTTGGCGCCTCAGTGGAAGTCGGCCAGCCGCCTCCGTGGGAGAGAGGCAGGAAATCGGACCAATTCAGTAGCAGTGGGGCTTAAGGTTTATGAACGGGGTCTTGAGCGGAGGCCTGAGCGTACAAACAGCTTCCCCACCCTCAGCCTCCCGGCGCCATTTCCCTTCACTGGGGGTGGGGGATGGGGAGCTTTCACATGGCGGACGCTGCCCCGCTGGGGTGAAAGTGGGGCGCGGAGGCGGGACTTCTTATTCCCTTTCTAAAGCACGCTGCTTCGGGGGCCACGGCGTCTCCTCGGAAAGCTT
＜配列番号18＞開始コドンの上流に最適化したKozakが付加されている抗体（TRLH）軽鎖遺伝子cDNAのヌクレオチド配列
CGCGCCCCGCCGCCACCATGGGTTGGTCTTGTATCATCTTATTTTTAGTTGCTACTGCTACTGGTGTTCATTCTGATATACAGATGACCCAAAGCCCATCATCTCTGTCTGCAAGCGTCGGCGACAGGGTGACCATTACCTGTCGCGCAAGCCAAGACGTTAATACAGCAGTGGCTTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCTCCTAAGCTGCTGATCTATAGCGCCTCCTTTCTTTATTCTGGAGTGCCTTCTCGTTTTTCCGGCTCAAGGTCCGGAACTGATTTTACCCTGACCATTTCCTCCCTCCAGCCCGAGGATTTTGCCACTTACTACTGTCAGCAGCACTATACCACACCACCTACATTCGGACAAGGTACAAAGGTAGAAATCAAGCGTACGGTGGCTGCCCCATCCGTGTTCATATTTCCTCCTAGCGACGAACAACTCAAGTCCGGTACCGCCAGCGTGGTCTGCCTGTTGAACAATTTTTATCCAAGAGAAGCTAAGGTCCAGTGGAAGGTTGACAACGCCCTTCAGTCCGGAAATAGCCAAGAGAGCGTCACCGAACAGGACTCCAAGGACAGTACATACTCACTGAGCTCTACACTGACCCTTTCTAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTCTACGCATGCGAAGTGACCCATCAGGGACTCAGTAGCCCTGTAACAAAGAGTTTTAATCGAGGCGAGTGCTAAGCGAT
＜配列番号19＞開始コドンの上流に最適化したKozakが付加されている抗体（TRLH）重鎖遺伝子cDNAのヌクレオチド配列
GGCCGCCCGCCGCCACCATGGAATTTGGTTTATCTTGGGTTTTTTTAGTTGCTTTATTAAGAGGTGTTCAATGTGAGGTGCAGTTGGTCGAATCCGGCGGCGGACTCGTGCAACCAGGCGGAAGTTTGCGGCTGTCCTGCGCAGCCTCTGGTTTTAACATCAAAGATACCTATATTCATTGGGTACGCCAGGCTCCTGGAAAGGGGCTTGAGTGGGTGGCTCGAATTTACCCAACCAATGGCTACACTCGGTATGCCGACAGCGTCAAAGGCAGATTCACCATCTCTGCAGACACATCAAAGAATACCGCTTACCTGCAGATGAACTCACTGAGGGCCGAAGATACCGCAGTTTACTACTGCTCCAGGTGGGGGGGGGACGGCTTCTACGCCATGGATTACTGGGGACAGGGCACACTCGTGACCGTTAGTAGCGCTAGCACCAAAGGCCCCTCTGTGTTCCCACTTGCTCCCTCCAGTAAATCTACCTCCGGAGGAACCGCAGCCCTCGGCTGCCTGGTGAAGGATTACTTCCCAGAGCCCGTCACCGTCTCTTGGAACTCCGGAGCCTTGACTAGCGGAGTGCACACTTTCCCTGCTGTATTGCAGTCCAGCGGCTTGTATTCACTGAGTAGCGTCGTCACCGTGCCTTCAAGCAGCCTCGGGACACAGACATACATATGTAATGTCAACCATAAGCCATCAAACACTAAAGTTGATAAAAAGGTGGAACCTAAGAGTTGCGATAAGACCCATACCTGTCCTCCTTGCCCTGCTCCTGAGCTGCTGGGAGGCCCTAGCGTGTTTCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAAGATACACTGATGATTTCCCGCACACCTGAAGTAACATGTGTCGTGGTTGATGTGAGTCACGAGGATCCAGAGGTCAAGTTTAATTGGTACGTGGACGGAGTGGAGGTGCACAACGCTAAGACTAAGCCTCGGGAGGAACAGTACAACAGCACATACCGCGTGGTCAGCGTTTTGACTGTGCTGCATCAAGACTGGCTCAATGGAAAGGAATACAAGTGCAAGGTCTCTAATAAAGCCCTCCCCGCTCCTATTGAGAAGACTATTTCTAAAGCCAAGGGCCAGCCTCGCGAACCTCAGGTATATACTTTGCCACCCTCTCGCGAAGAAATGACAAAGAATCAGGTCTCACTCACTTGCCTCGTCAAAGGGTTTTACCCTTCTGACATCGCTGTCGAATGGGAAAGTAATGGTCAGCCAGAAAACAATTACAAGACTACTCCACCAGTGCTCGATTCTGATGGAAGTTTCTTTCTCTACAGTAAGCTCACTGTGGACAAATCTCGCTGGCAGCAGGGTAACGTATTCTCATGCTCCGTGATGCATGAAGCCCTCCACAACCATTACACCCAGAAGAGCCTGTCTCTGAGCCCAGGCTAACCTGCA
【図１】
2019225372.tif 000003
【図２】
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【図３】
2019225372.tif 000005
【図４】
2019225372.tif 000006
【図５】
2019225372.tif 000007
【図６】
2019225372.tif 000008
【図７】
2019225372.tif 000009
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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