(57)【要約】  本発明は、式（Ｉ）で表される、バレロラクトン(Valerolactone)系新規化合物である。2019160150.tif 000036［式中、Xはアリル基、アリール基、エチニル基、あるいはブテニル基。Yは単結合あるいはヒドロキシメチレン基、Zは酸素、メチレン基、イミド基である。式中、Ｙは、単結合又はヒドロキシメチレン基である。ｍは０又は１であり、ｎは１又は２である。］
2019160150.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で表される、バレロラクトン(Valerolactone)系新規化合物。
【化１】
2019160150.tif 000033
［式中、Xはアリル基、アリール基、エチニル基、あるいはブテニル基。Yは単結合あるいはヒドロキシメチレン基、Zは酸素、メチレン基、イミド基である。式中、Ｙは、単結合又はヒドロキシメチレン基である。ｍは０又は１であり、ｎは１又は２である。］
【請求項２】
前記式（Ｉ）で表される化合物が、下記(I-1)である、
【化２】
2019160150.tif 000034
請求項１記載のバレロラクトン(Valerolactone)系新規化合物。
【請求項３】
請求項１記載の前記式（Ｉ）式で表される化合物を含有する医薬。
【請求項４】
前記式（Ｉ）式で表される化合物として、立体異性体、薬学的に許容される塩、及び、薬学的に許容される溶媒和物のなくとも１種を含有する請求項３記載の医薬。
【請求項５】
薬学的に許容される担体を含有する、請求項３記載の医薬。
【請求項６】
神経変性疾患、又は、脳卒中を治療又は予防する、請求項３記載の医薬。
【請求項７】
前記神経変性疾患が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である、請求項６記載の医薬。
【請求項８】
前記式（Ｉ）で表される化合物が、下記(I-1)である、
【化３】
2019160150.tif 000035
請求項３記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バレロラクトン(Valerolactone)系新規化合物、及び、医薬に関する。詳しくは、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含む神経変性疾患、及び、脳卒中の治療に有効な薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
難病である筋萎縮性側索硬化症（Amyotrophic lateral sclerosis：ＡＬＳ）では、随意運動を司る皮質脊髄路（錐体路）の上位及び下位の運動神経が進行性に変性脱落することで最終的に呼吸筋が麻痺し、人工呼吸下意思伝達のできない無動の状態に陥る。本疾患に対する治療薬は、現在２剤のみである。グルタミン酸神経伝達阻害剤であるリルゾール（riluzole；2-amino-6-(trifluoromethoxy)benzothiazole）は、ＡＬＳに対して、わずかな（２〜３カ月）延命効果を示す（非特許文献１）。また、ラジカルスカベンジャーであるエダラボン（edaravone；3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one）は、ＡＬＳにおける機能障害の進行抑制薬として近年追加認可された。【０００３】
我が国の脳卒中患者は約１１８万人であり、脳梗塞の死亡者は年間１３万人に上る。脳卒中のうち８割を占める脳梗塞（虚血性脳卒中）は、深部大脳皮質細動脈の血栓性閉塞（ラクナ梗塞）、心原性塞栓による塞栓症、及び脳血流量低下を伴う動脈血栓症などに基づき、突然の意識障害、及び神経機能障害（一側性感覚消失と運動性麻痺）などを生じる。脳卒中の直接の原因は血液凝固に基づく血栓であるが、梗塞性脳卒中において急性期（数分で発症）に症状が最大となり、一部の進行性脳卒中では２４〜４８時間かけて脳組織の損傷が段階的に進行する。この進行期に生じる不可逆的な脳機能障害即ち神経細胞死には、興奮性アミノ酸であるグルタミン酸の過剰放出及びそれに伴った酸化ストレスが関与している。事実、進行性脳卒中患者の脳脊髄液には正常に比べてグルタミン酸濃度が有意に高い（非特許文献２）。発作の治療にはｔ−ＰＡ（プラスミノ―ゲン活性化剤）等を発作４．５時間以内に適用する方法が最善である。しかし、再灌流が不可能な場合、虚血部位の周辺領域であるペヌンブラにおいては、発作から時間が経過すると共にＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体を介した神経細胞内への過剰なＣａ２＋流入等が起こり、同時に、活性酸素種が上昇すると共に炎症反応と相まって神経細胞のアポトーシス及びネクローシスを生じ、その部位は不可逆的機能不全に陥る（非特許文献３）。エダラボンはフリーラジカルを捕捉する作用によりこの過程を抑制することができるが、本剤を適用できる時間が発作後２４時間までと限られている。一方、実験的治療では有効なＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体拮抗薬も副作用が強く、適用されている薬品はない（非特許文献４）。保存的療法として、抗血小板療法（アルガトロバンなど）が用いられるのみである。【０００４】
これまでに、病態研究に基づく新たな低分子ＡＬＳ治療薬候補として、（１）運動神経保護（生存維持）作用、（２）抗酸化作用、（３）抗グルタミン酸神経毒性、（４）抗炎症等の作用に着目した分子群が、ＡＬＳモデル動物の実験的治療において有効性を示した。しかしながら、それらの低分子ＡＬＳ治療薬候補のうち、コエンザイムＱ１０、Ｎ−アセチルシステイン、メチコバラミン、及びグルタチオンは、臨床試験において有効性を示さなかった。【０００５】
また、神経保護作用のあるタンパク質の投与若しくは当該タンパク質コード遺伝子をウイルスベクターにより導入する試みも、かなりの数が臨床試験まで進んだ。中でも、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）は、運動神経脱落を防ぐ作用が期待されたが、臨床試験は第３相で不成功に終わった（非特許文献５）。【０００６】
第３のＡＬＳ治療戦略としては、細胞移植が挙げられる。胎児由来運動神経のほか、神経保護因子を供給可能なグリア細胞の脊髄への移植が試みられた。さらに、拒絶反応の少ないｉＰＳ細胞、間葉系幹細胞等の移植も試みられたが、これまでのところ、症状改善などの有効性は示されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Forostyak S and Sykova E, Neuroprotective Potential of Cell-Based Therapies in ALS: From Bench to Bedside. Front Neurosci. 2017 Oct 24;11:591.
【非特許文献２】Davalos a, Castillo J, Serena J, Noya M. Stroke, Duration of glutamate release after acute ischemic stroke. (1997) 28, 708-710.
【非特許文献３】Rothman SM, Olney JW., Glutamate and the pathophysiology of hypoxic--ischemic brain damage. (1986) Ann.Neurol. 19, 105-111.
【非特許文献４】Grotta J, Clark W, Coull B, Pettigrew C, Mackay B, Goldstein LB, Meissner I, Murphy D, LaRue L. Stroke, Safety and tolerability of the glutamate antagonist CGS 19755 (Selfotel) in patients with acute ischemic stroke. Results of a phase IIa randomized trial. (1995) 26, 602-605.
【非特許文献５】Sorenson EJ et al., Subcutaneous IGF-1 is not beneficial in 2-year ALS trial. Neurology. 2008 Nov 25;71(22):1770-5.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記のとおり、ＡＬＳ治療薬として承認されている薬剤は現在２剤のみであり、それらのＡＬＳ治療効果も高いとはいえない。そのため、新たなＡＬＳ治療薬の開発が望まれている。また、ＡＬＳには、複数の要因が関連すると考えられることから、既存薬とは異なる作用機序を有する薬剤の開発が求められている。また、上記のとおり、亜急性期に使用できる虚血性脳卒中の治療薬で適用可能なものはなく、亜急性期の虚血性脳卒中に適用可能な薬剤の開発が求められている。【０００９】
本発明は上記事情に鑑みて為されたものであり、ＡＬＳを含む神経変性疾患の治療又は予防するための医薬として利用される新規化合物を提供することを目的とする。また、新規の進行期の脳梗塞の進行の抑制剤として使用可能な医薬として利用される新規化合物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、式（Ｉ）で表される、バレロラクトン(Valerolactone)系新規化合物であることを特徴とする。
【化１】
2019160150.tif 000003
［式中、Xはアリル基、アリール基、エチニル基、あるいはブテニル基。Yは単結合あるいはヒドロキシメチレン基、Zは酸素、メチレン基、イミド基である。ｍは０又は１であり、ｎは１又は２である。］【００１１】
前記式（Ｉ）で表される化合物は、好適には、下記（I-1）式である。
【化２】
2019160150.tif 000004
である。【００１２】
本発明は、さらに、前記式で表される、バレロラクトン(Valerolactone)系新規化合物を、主成分、主要成分、有効成分、又は、有用成分として、用途に応じて、所定量、例えば、用途を達成するための最低含有量以上限度含有量以下の範囲で含有する医薬、又は、医薬組成物である。前記化合物(I)の医薬用途としては、好ましくは、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）等の神経変性疾患、又は、脳卒中を、治療、及び/又は、予防する医薬である。発明者が後述のとおり、前記化合物(I)を、複数の個体に、1mg/Kg、5mg/Kg、10mg/Kgの量で、適用したところ、いずれの場合にも、薬効が確認された。したがって、有効投与量は、例えば、1mg/Kg以上10mg/Kg以下の範囲内で選択されたものでよい。さらに、発明者が、前記化合物を継続的に投与した複数の個体の血液、主要臓器を確認したところ、副作用、或いは、有害事象に相当するような異常は観察されなかった。なお、前記医薬は、前記式で表される化合物、その立体異性体、それらの薬学的に許容される塩、及び、それらの薬学的に許容される溶媒和物の少なくとも１種、並びに、薬学的に許容される担体を含むものでよい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ＡＬＳを含む神経変性疾患の治療又は予防するための医薬、及び当該医薬の有効成分等として利用される新規化合物が提供される。さらに、新規の進行期の脳梗塞の進行の抑制剤として使用可能な医薬、及び、当該医薬が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】Ｐｌｅｏｓｐｏｒａｌｅｓ  ｓｐ．ＮＵＨ３２２株の培養液からの化合物（Ｉ−１）及び化合物（Ｉ−２）の単離フローを示す。
【図２】Ｐｌｅｏｓｐｏｒａｌｅｓ  ｓｐ．ＮＵＨ３２２株の培養液からの化合物（Ｉ−３）及び化合物（Ｉ−４）の単離フローを示す。
【図３Ａ】化合物（Ｉ−１）の１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹ及びＨＭＢＣの相関を示す。
【図３Ｂ】化合物（Ｉ−１）のＮＯＥＳＹの相関を示す。
【図３Ｃ】化合物（Ｉ−１）のｄｉｆ．ＮＯＥの結果を示す。
【図４Ａ】化合物（Ｉ−２）の１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹ及びＨＭＢＣの相関を示す。
【図４Ｂ】化合物（Ｉ−２）のＮＯＥＳＹの相関を示す。
【図５Ａ】化合物（Ｉ−３）の１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹ及びＨＭＢＣの相関を示す。
【図５Ｂ】化合物（Ｉ−３）のＮＯＥＳＹの相関を示す。
【図６】ＮＵＨ３２２株培養液の酢酸エチル粗抽物（３２２−Ｅｘｔ）及び化合物（Ｉ−１）（ＹＹ−１）のＲＯＳアッセイの結果を示す。縦軸は、３０μｇ／ｍＬ（１２０μＭ）ｔｒｏｌｏｘ（陽性対照）に対する相対強度を示す。３回以上行った被験物質の濃度については、標準誤差を求め、その結果を平均値±標準誤差で示す。
【図７】ＮＵＨ３２２株培養液の酢酸エチル粗抽出物（３２２−Ｅｘｔ）及び化合物（Ｉ−１）（ＹＹ−１）のＯＤＡＰ−ＥＡアッセイの結果を示す。縦軸は、４ｍＭ  Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ；陽性対照）に対する相対強度を示す。３回以上行った被験物質の濃度については、標準誤差を求め、その結果を平均値±標準誤差で示す。
【図８】ＮＵＨ３２２株培養液の酢酸エチル粗抽物（３２２−Ｅｘｔ）及び化合物（Ｉ−１）（ＹＹ−１）のＤｕａｌ−ルシフェラーゼアッセイの結果を示す。縦軸は、溶媒（ＤＭＳＯ）に対する相対強度を示す。３回以上行った被験物質の濃度については、標準誤差を求め、その結果を平均値±標準誤差で示した。上図は、ホタルルシフェラーゼの発光強度を示し、下図は、ウミシイタケルシフェラーゼの発光強度を示す。
【図９】実施例３の投与試験１におけるマウスの体重の推移を示す。生後約１２５日までのそれぞれの群のマウス体重の平均値±標準誤差を示した。縦軸はマウスの体重の平均を示し、横軸は生後日数を示す。「ＹＹ−１（１）」は、ＹＹ−１（１ｍｇ／ｋｇ）投与群を示し、「ＹＹ−１（１０）」は、ＹＹ−１（１０ｍｇ／ｋｇ）投与群を示す。
【図１０Ａ】実施例３の投与試験１におけるマウスの生存日数をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法により解析した結果を示す。ＹＹ−１（１０ｍｇ／ｋｇ）投与群の解析結果である。
【図１０Ｂ】実施例３の投与試験１におけるマウスの生存日数をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法により解析した結果を示す。ＹＹ−１（１ｍｇ／ｋｇ）投与群の解析結果である。
【図１１Ａ】実施例３の投与試験２におけるマウスの運動障害発生までの日数をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法により解析した結果を示す。
【図１１Ｂ】実施例３の投与試験２におけるマウスの生存日数をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法により解析した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
[医薬組成物]
一実施形態において、本発明は、下記一般式（Ｉ）で表される化合物、その立体異性体、それらの薬学的に許容される塩、及びそれらの薬学的に許容される溶媒和物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物、並びに薬学的に許容される担体を含む、医薬、あるいは、医薬組成物を提供する。
【化１】
2019160150.tif 000005
［式中、Xはアリル基、アリール基、エチニル基、あるいはブテニル基。Yは単結合あるいはヒドロキシメチレン基、Zは酸素、メチレン基、イミド基である。ｍは０又は１であり、ｎは１又は２である。］
【００１６】
上記一般式（Ｉ）で表される化合物には、立体異性体が存在し得る。一般式（Ｉ）は、それら立体異性体を代表して表す場合がある。以下、一般式（Ｉ）で表される化合物及びその立体異性体を「化合物（Ｉ）」ともいう。化合物（Ｉ）としては、それらの立体異性体を、各々単独で用いてもよいし、それら立体異性体の混合物を用いてもよい。「立体異性体」は、エナンチオマー及びジアステレオマーを包含する。
【００１７】
化合物（Ｉ）の具体例としては、下記化合物（Ｉ−１）〜（Ｉ−４）が挙げられる。
【００１８】
【化２】
2019160150.tif 000006
【００１９】
化合物（Ｉ）は、薬学的に許容される塩の形態であってもよい。「薬学的に許容される塩」とは、化合物（Ｉ）の薬理作用（ＲＯＳ消去作用、興奮毒性軽減作用、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ遺伝子毒性軽減作用等）を阻害しない塩を意味する。薬学的に許容可能な塩は、特に制限されず、例えば、アルカリ金属（ナトリウム、カリウムなど）との塩；アルカリ土類金属（マグネシウム、カルシウムなど）との塩；有機塩基（ピリジン、トリエチルアミンなど）との塩、アミンとの塩、有機酸（酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸など）との塩、及び無機酸（塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸など）との塩等が挙げられる。化合物（Ｉ）の薬学的に許容される塩としては、アルカリ金属との塩が好適に例示される。
【００２０】
化合物（Ｉ）は、薬学的に許容される溶媒和物の形態であってもよい。「溶媒和物」とは、化合物（Ｉ）が溶媒と形成した錯体である。「薬学的に許容される溶媒和物」とは、化合物（Ｉ）の薬理作用を阻害しない溶媒和物を意味する。化合物（Ｉ）の溶媒和物は、特に制限されず、例えば、水和物、エタノール溶媒和物等が挙げられる。また、化合物（Ｉ）は、薬学的に許容される塩の溶媒和物の形態であってもよい。
【００２１】
本実施形態の医薬組成物は、化合物（Ｉ）、化合物（Ｉ）の薬学的に許容される塩、化合物（Ｉ）の薬学的に許容される溶媒和物、及び化合物（Ｉ）の薬学的に許容される塩の溶媒和物からなる群より選択される２種以上の混合物を含んでいてもよい。以下、化合物（Ｉ）、化合物（Ｉ）の薬学的に許容される塩、化合物（Ｉ）の薬学的に許容される溶媒和物、及び化合物（Ｉ）の薬学的に許容される塩の溶媒和物をまとめて、「化合物（Ｉ）等」という場合がある。
【００２２】
本実施形態の医薬組成物の適用疾患は特に限定されないが、神経変性疾患ならびに脳卒中が好適に例示される。したがって、化合物（Ｉ）等を含む、神経変性疾患又は脳卒中を治療又は予防するための医薬組成物は、本実施形態の医薬組成物の好適な例である。「神経変性疾患」とは、進行性の神経細胞死が生じる疾患をいう。神経変性疾患としては、ＡＬＳ、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、多系統萎縮症、脊髄小脳変性症、球脊髄性筋萎縮症、脊髄性筋萎縮症、原発性側索硬化症等が挙げられるが、これらに限定されない。「脳卒中」とは、脳の血管に血液循環障害が生じる疾患をいう。脳卒中は、血栓症や梗塞症に起因する脳梗塞を包含するが、これに限定されない。
【００２３】
後述する実施例で示すように、化合物（Ｉ）は、（１）活性酸素種（Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ：ＲＯＳ消去能）、（２）グルタミン酸受容体を介した運動神経の興奮性細胞死（Ｅｘｃｉｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）抑制作用、及び（３）ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ遺伝子の導入による異常タンパク質出現による悪影響（Ｐｒｏｔｅｉｎｏｐａｔｈｙ）の排除作用が確認された化合物である。さらに、ＡＬＳモデルマウスを用いたｉｎ  ｖｉｖｏ試験において、生存性及び運動障害発現の延長傾向が認められた。したがって、化合物（Ｉ）は、前記（１）〜（３）に関連する神経変性疾患に好適に用いることができる。そのような神経変性疾患としては、ＡＬＳ等が例示される。中でも、本実施形態の医薬組成物は、ＡＬＳを治療又は予防するために好適に用いることができる。また、脳卒中では、亜急性期に、ＲＯＳの上昇による炎症反応、及びＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体を介した神経細胞内への過剰なＣａ２＋流入等により、神経細胞のアポトーシス及びネクローシスが生じる。化合物（Ｉ）は、前記（１）及び（２）の作用を有するため、脳卒中（特に亜急性期の脳卒中）を治療するために好適に用いることができる。
【００２４】
また、化合物（１）は、上記（１）〜（３）の活性の中でも、（２）運動神経の興奮性細胞死抑制作用が高い点に特徴がある。そのため、例えば、ラジカルスカベンジャーであるエダラボンで効果が認められなかった対象（神経変性疾患に罹患している患者など）に対して、本実施形態の医薬組成物を適用してもよい。
【００２５】
本実施形態の医薬組成物の適用対象は、神経変性疾患を発症する動物であることが好ましい。例えば、本実施形態の医薬組成物は、ヒト、又はヒト以外の哺乳類に好適に使用することができる。ヒト以外の哺乳類は、特に限定されないが、霊長類（サル、チンパンジー、ゴリラなど）、げっ歯類（マウス、ハムスター、ラットなど）、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ等が挙げられる。
【００２６】
本実施形態の医薬組成物は、化合物（Ｉ）等に加えて、少なくとも１種の薬学的に許容される担体を含み得る。「薬学的に許容される担体」とは、有効成分の生理活性を阻害せず、且つ、その投与対象に対して実質的な毒性を示さない担体を意味する。「実質的な毒性を示さない」とは、その成分が通常使用される投与量において、投与対象に対して毒性を示さないことを意味する。薬学的に許容される担体は、典型的には非活性成分とみなされる、公知のあらゆる薬学的に許容され得る成分を包含する。薬学的に許容される担体は、特に限定されないが、例えば、溶媒、希釈剤、ビヒクル、賦形剤、流動促進剤、結合剤、造粒剤、分散化剤、懸濁化剤、湿潤剤、滑沢剤、崩壊剤、可溶化剤、安定剤、乳化剤、充填剤、保存剤（例えば、酸化防止剤）、キレート剤、矯味矯臭剤、甘味剤、増粘剤、緩衝剤、着色剤等が挙げられる。薬学的に許容される担体は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００２７】
本実施形態の医薬組成物は、他の成分を含んでいてもよい。他の成分は、特に限定されず、医薬分野において常用されるものを特に制限なく使用することができる。また、本医薬組成物は、化合物（Ｉ）以外の活性成分を含んでいてもよい。活性成分としては、例えば、ビタミン類及びその誘導体類、消炎剤、抗炎症剤、血行促進剤、刺激剤、ホルモン類、刺激緩和剤、鎮痛剤、細胞賦活剤、植物・動物・微生物エキス、鎮痒剤、消炎鎮痛剤、抗真菌剤、抗ヒスタミン剤、催眠鎮静剤、精神安定剤、抗高血圧剤、降圧利尿剤、抗生物質、麻酔剤、抗菌性物質、抗てんかん剤、冠血管拡張剤、生薬、止痒剤、角質軟化剥離剤等が挙げられるが、これらに限定されない。他の成分は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００２８】
本実施形態の医薬組成物の剤型は、特に制限されず、医薬品製剤として一般的に用いられる剤型とすることができる。本実施形態の医薬組成物は、経口製剤であってもよく、非経口製剤であってもよい。経口製剤としては、例えば、錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、細粒剤、液剤、ドロップ愛、乳剤等が例示される。非経口製剤としては、例えば、注射剤、坐剤、軟膏、スプレー剤、外用液剤、点耳剤、点眼剤、点鼻剤、吸入剤等が例示される。これらの剤型の医薬組成物は、定法（例えば、日本薬局方記載の方法）に従って、製剤化することができる。
【００２９】
本実施形態の医薬組成物の投与経路は、特に限定されず、経口又は非経口経路で投与することができる。なお、非経口経路は、経口以外の全ての投与経路、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、鼻腔内、皮内、点眼、脳内、直腸内、腟内及び腹腔内等への投与を包含する。また、投与は、局所投与であっても全身投与であってもよい。
【００３０】
本実施形態の医薬組成物は、化合物（Ｉ）の治療的有効量を投与することができる。「治療的有効量」とは、対象疾患の治療又は予防のために有効な薬剤の量を意味する。例えば、本実施形態の医薬組成物が神経変性疾患を治療又は予防するためのものである場合、化合物（Ｉ）等の治療的有効量は、神経変性疾患の進行を遅らせることができる量であり得る。治療的有効量は、患者の症状、体重、年齢、及び性別等、並びに医薬組成物の剤型、及び投与方法等によって適宜決定すればよい。例えば、本実施形態の医薬組成物は、化合物（Ｉ）等の１回の投与量として、投与対象の体重１ｋｇあたり、０．０１〜５００ｍｇとすることができる。前記投与量は、０．１５〜５００ｍｇ／ｋｇであってもよく、０．５〜３００ｍｇ／ｋｇであってもよく、１〜２００ｍｇ／ｋｇであってもよく、１〜１００ｍｇ／ｋｇであってもよい。
【００３１】
本実施形態の医薬組成物は、単位投与形態あたり、治療的有効量の化合物（Ｉ）等を含んでいてもよい。例えば、本実施形態の医薬組成物における化合物（Ｉ）等の含有量は、０．０１〜８０質量％であってもよく、０．０５〜５０質量％であってもよく、０．１〜３０質量％であってもよい。
【００３２】
本実施形態の医薬組成物の投与間隔は、患者の症状、体重、年齢、及び性別等、並びに医薬組成物の剤型、及び投与方法等によって適宜決定すればよい。投与間隔は、例えば、数時間毎、１日１回、２〜３日に１回等とすることができる。
【００３３】
本実施形態の医薬組成物は、他の医薬と併用して用いてもよい。例えば、他の神経変性疾患治療薬と併用して用いることができる。例えば、本実施形態の医薬組成物をＡＬＳに適用する場合には、リルゾール、エダラボン等と併用してもよい。
【００３４】
＜化合物（Ｉ）の製造方法＞
化合物（Ｉ）は、プレオスポラ目(Ｐｌｅｏｓｐｏｒａｌｅｓ)に属する真菌であるＰｌｅｏｓｐｏｒａｌｅｓ  ｓｐ．  ＮＵＨ３２２株（以下、「ＮＵＨ３２２株」ともいう。）の培養液から単離された化合物である。そのため、本菌株の培養液から、公知の単離・精製技術を組み合わせて、単離・精製を行なうことにより、製造することができる。あるいは、公知の化学反応を組み合わせて化学合成することにより、製造することができる。
【００３５】
（ＮＵＨ３２２株の培養液を用いる方法）
化合物（Ｉ）は、Ｐｌｅｏｓｐｏｒａｌｅｓ  ｓｐ．  ＮＵＨ３２２株（以下、「ＮＵＨ３２２株」ともいう。）の培養液から単離された化合物であり、ＮＵＨ３２２株の培養液から単離・精製することができる。ＮＵＨ３２２株は、日本国長野県上田市菅平高原のアカマツ落葉から単離された糸状菌である。ＮＵＨ３２２株は、２０１８年１月３１日付で、  受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６２４として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に国内寄託されている。そして、２０１９年２月１３日付で、同センターは、受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＢＰ-０２６２４として、国内受託したＮＵＨ３２２株の国際寄託への移管請求を受領した。この受領番号に係る移管請求に対して、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約における受託証が交付される。以下に、ＮＵＨ３２２株からの化合物（Ｉ）の単離方法の具体例を示す。
【００３６】
まず、ＮＵＨ３２２株の液体培養を行なう。ＮＵＨ３２２株の液体培養は、真菌類の培養に一般的に用いられる液体培地を用いて行うことができる。ＮＵＨ３２２株の液体培養用培地としては、例えば、実施例に記載のＧＰ培地等が挙げられる。培養は、真菌類の培養に、一般的に用いられる培養条件を用いることができる。培養条件としては、例えば、２０〜３０℃（例えば、２５℃）での振とう培養（例、１５０ｒｐｍ）が例示される。培養期間は、特に限定されないが、例えば、定常状態になるまで培養してもよい。培養期間としては、１〜４週間、又は２〜３週間等が例示される。
【００３７】
ＮＵＨ３２２株の培養後、培養液をブフナーロート等を用いて濾過し、菌糸と培地とを分離する。前記濾過により得られたろ液を酢酸エチル抽出し、次いで、シリカゲルクロマトグラフィー、及び高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＨＰＬＣ）を行なうことにより、化合物（Ｉ）を単離することができる。
【００３８】
より具体的には、前記ろ液の酢酸エチル抽出は、ろ液に等量の酢酸エチルを加え、室温で１〜５時間程度攪拌することにより行うことができる。次いで、酢酸エチル層を回収し、ロータリーエバポレーター等で濃縮することにより、ＮＵＨ３２２株の培養液の酢酸エチル抽出物を得ることができる。
【００３９】
シリカゲルカラムクロマトグラフィーは、前記酢酸エチル抽出物をメタノール等の有機溶媒に溶解してシリカゲルカラムにロードし、適切な展開溶媒を用いて分画することにより行うことができる。充填剤は、市販のものを特に制限なく用いることができ、例えば、Ｗａｋｏｇｅｌ（登録商標）  Ｃ−２００（和光純薬）が例示される。展開溶媒としては、例えば、酢酸エチル／ヘキサン混合溶媒を用いることができる。
【００４０】
ＨＰＬＣは、例えば、移動溶媒として、アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）／水（Ｈ２Ｏ）混合溶媒を用いて行うことができる。ＨＰＬＣ用カラムは、市販のものを特に制限なく用いることができ、例えば、Ｋａｓｅｉｓｏｒｂ  ＬＣ  ＯＤＳ−ＰＨ  Ｓｕｐｅｒ（東京化成工業）が例示される。
【００４１】
例えば、上記化合物（Ｉ−１）は、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにおいて、酢酸エチル／ヘキサン＝１／１の画分を採取し、当該画分のＨＰＬＣ（移動溶媒：ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ＝２５／７５）を行い、５番目のピーク画分を採取することにより、得ることができる。
【００４２】
上記化合物（Ｉ−２）は、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにおいて、酢酸エチル／ヘキサン＝１／１の画分を採取し、当該画分のＨＰＬＣ（移動溶媒：ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ＝２５／７５）を行い、３番目のピーク画分を採取し、さらに、当該画分のＨＰＬＣ（ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ＝２２／７８）を行い、１番目のピーク画分を採取することにより、得ることができる。
【００４３】
上記化合物（Ｉ−３）は、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにおいて、酢酸エチル／ヘキサン＝１／０の画分を採取し、当該画分のＨＰＬＣ（移動溶媒：ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ＝１８／８２）を行い、７番目のピーク画分を採取することにより、得ることができる。
【００４４】
上記化合物（Ｉ−４）は、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにおいて、酢酸エチル／ヘキサン＝１／０の画分を採取し、当該画分のＨＰＬＣ（移動溶媒：ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ＝１８／８２）を行い、４番目のピーク画分を採取することにより、得ることができる。
【００４５】
（化学合成法）
化合物（Ｉ）は、公知の化学反応を適宜組み合わせて化学合成してもよい。
例えば、化合物（Ｉ−４）は、Ｎａｇａｒａｐｕ  ｅｔ  ａｌ．（Tetrahedron 68 (2012) 5829-5832.）に記載の方法により製造することができる。具体的な合成経路の一例を以下に示す。下記化学式中、「ＬｉＨＭＤＳ」は、ヘキサメチルジシラザンリチウムを表す。
【００４６】
【化３】
2019160150.tif 000007
【００４７】
例えば、上記の化合物（Ｉ−１）、化合物（Ｉ−２）及び化合物（Ｉ−３）は、以下に示す合成経路で製造することができる。なお、下記の合成経路では、代表して化合物（Ｉ−１）についての合成法を記載する。下記化学式中、「ＴＢＳＣｌ」は、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルクロロシランを表す。「ＴＢＡＦ」は、フッ化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムを表す。
【００４８】
【化４】
2019160150.tif 000008
【００４９】
［化合物］
一実施形態において、本発明は、下記一般式（Ｉ−１）で表される化合物、その立体異性体、それらの薬学的に許容される塩、及びそれらの薬学的に許容される溶媒和物からなる群より選択される化合物を提供する。
【００５０】
【化５】
2019160150.tif 000009
2019160150.tif 000010
【００５１】
化合物（Ｉ−１）の立体異性体としては、下記化合物（Ｉ−２）及び化合物（Ｉ−３）が挙げられる。
【００５２】
【化６】
2019160150.tif 000011
【００５３】
化合物（Ｉ−１）又はその立体異性体の薬学的に許容される塩については、上述の［医薬組成物］で例示したものと同様のものが挙げられる。化合物（Ｉ−１）又はその立体異性体の薬学的に許容される溶媒和物についても、上述の［医薬組成物］で例示したものと同様のものが挙げられる。
【００５４】
上記化合物（Ｉ−１）及びその立体異性体は、上述の［医薬組成物］における＜化合物（Ｉ）の製造方法＞で記載した方法により得ることができる。
【００５５】
［他の実施形態］
一実施形態において、本発明は、神経変性疾患を治療又は予防するための医薬組成物の製造における、上記一般式（Ｉ）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、及びそれらの薬学的に許容される溶媒和物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物の使用を提供する。
【００５６】
一実施形態において、本発明は、神経変性疾患を治療又は予防に使用するための、上記一般式（Ｉ）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、及びそれらの薬学的に許容される溶媒和物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物の使用を提供する。
【００５７】
一実施形態において、本発明は、上記一般式（Ｉ）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、及びそれらの薬学的に許容される溶媒和物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を対象（例、神経変性疾患に罹患している患者など）に投与することを含む、神経変性疾患の治療方法を提供する。
【００５８】
一実施形態において、本発明は、神経変性疾患を治療又は予防するための、上記一般式（Ｉ）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、及びそれらの薬学的に許容される溶媒和物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物の使用を提供する。
上記実施形態において、神経変性疾患は、ＡＬＳであることが好ましい。
【実施例】
【００５９】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００６０】
［実施例１］化合物の単離
日本大学薬学部が所有する天然物フラクション・化合物ライブラリーの一部として、真菌抽出液ライブラリーを作製した。後述するＯＤＡＰ−ＥＡアッセイ、Ｄｕａｌ−ルシフェラーゼアッセイ、及びＲＯＳアッセイの結果に基づき、Ｐｌｅｏｓｐｏｒａｌｅｓ  ｓｐ．  ＮＵＨ３２２株（以下、「ＮＵＨ３２２株」という。）の抽出液を選抜した。ＮＵＨ３２２株は、日本国長野県上田市菅平高原のアカマツ落葉より採取された菌である。【００６１】
クリーンベンチ内で真菌ストックから培地片ごとコーンミールアガール（ＣＭＡ）平板培地に植菌を行い、その後２週間程度、菌糸を伸ばすまで２５℃で培養した。平板培地上に菌糸が十分に伸びたことを確認し、平板培地を２ｍｍの格子状に切り、培地片ごと約１５片をグルコース−ペプトン（ＧＰ）液体培地に植菌した。植菌後、２５℃、１５０ｒｐｍで、３週間、振盪培養を行った。培養後、ブフナーロートを用いて培養物を濾過し、菌糸と培地とを分離した。濾過した培地に酢酸エチルを等量加えて、室温下マグネティックスターラーで約３時間撹拌した。その後、酢酸エチル層を回収してロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、酢酸エチル抽出物（１５８２．２ｍｇ）を得た。ＣＭＡ平板培地とＧＰ液体培地の組成を表１及び表２に示す。【００６２】
【表１】
2019160150.tif 000012
【００６３】
【表２】
2019160150.tif 000013
【００６４】
前記酢酸エチル抽出物（１５８２．２ｍｇ）をメタノールで溶解し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２  Ｃ．Ｃ．：Ｗａｋｏｇｅｌ（登録商標）  Ｃ−２００）により分画した。展開溶媒には、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）／ヘキサン及びメタノール（ＭｅＯＨ）を用い、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン＝１／５，１／１，１／０の画分、及びＭｅＯＨ画分を得た。【００６５】
次いで、上記ＥｔＯＡｃ／ヘキサン＝１／１の画分を、ＨＰＬＣ（Ｋａｓｅｉｓｏｒｂ  ＬＣ  ＯＤＳ−ＰＨ  Ｓｕｐｅｒ；東京化成工業）により分画した。移動溶媒には、ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ＝２５／７５を用いた。ＨＰＬＣにより分離された５番目の画分から化合物（Ｉ−１）を得た（２０９．５ｍｇ）。【００６６】
ＨＰＬＣにより分離された３番目のピークを採取し、さらに、ＨＰＬＣ（Ｋａｓｅｉｓｏｒｂ  ＬＣ  ＯＤＳ−ＰＨ  Ｓｕｐｅｒ；東京化成工業）により分画した。移動溶媒には、ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ＝２２／７８を用いた。その１番目の画分から化合物（Ｉ−２）を得た（１．８ｍｇ）。【００６７】
また、上記ＥｔＯＡｃ／ヘキサン＝１／０の画分を、ＨＰＬＣ（Ｋａｓｅｉｓｏｒｂ  ＬＣ  ＯＤＳ−ＰＨ  Ｓｕｐｅｒ；東京化成工業）により分画した。移動溶媒には、ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ＝１８／８２を用いた。ＨＰＬＣにより分離された７番目の画分から化合物（Ｉ−３）を得た（１．１ｍｇ）。また、ＨＰＬＣにより分離された４番目の画分から化合物（Ｉ−４）を得た（５．０ｍｇ）。【００６８】
上記化合物の単離フローを図１及び図２に示す。【００６９】
［実施例２］化合物の構造解析
＜使用機器＞
化合物の構造解析には、以下の機器を使用した。
ＮＭＲ装置：JEOL JNM-ECX500
Spectrometer using 3.0 mm microcells（Sigemi）
質量分析計：Xevo G2-S QTof Quadrupole Time of Flight Mass Spectrometer（Waters）
旋光計：JASCO P-1020 Automatic Polarimeter（日本分光）
赤外分光光度計：JASCO FT/IR-4100 FT-IR Spectrometer（日本分光）
紫外可視分光光度計：JASCO V-730BIO UV-VIS Spectrophotometer（日本分光）
円二色性分散計：JASCO J-600 Circular Dichroism spectrometer（日本分光）【００７０】
＜化合物（Ｉ−１）の構造解析＞
化合物（Ｉ−１）は、淡黄色の油状物質であり、ＨＲＴＯＦＭＳ分析の結果から、分子式Ｃ１０Ｈ１４Ｏ３［m/z 205.0841 [M+Na]+ (calcd for C10H14O3Na 205.0841, unsat 4)］であることが明らかになった。化合物（Ｉ−１）の比旋光度は、［α］１７Ｄ  −２．７９°（ｃ５．７１，ＭｅＯＨ）であった。また、ＦＴ／ＩＲの測定結果に基づき、３４２２ｃｍ−１の吸収からヒドロキシ基の存在が、１７６５ｃｍ−１の吸収からカルボニル基の存在が示唆された。さらに、ＵＶスペクトルにおいて、λｍａｘ（ＭｅＯＨ）ｎｍ（ｌｏｇε）：２４０．８（５．３８），２８０．０（５．８２）に極大が認められた。１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、ＤＥＰＴ（distortionless enhancement by polarization transfer）及びＨＭＱＣ（heteronuclear multiple quantum correlation）のスペクトル解析結果より、メチル基１、メチレン基２、メチン基６、四級炭素１の存在が示唆された。【００７１】
１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹ（correlation spectroscopy）により、Ｈ−３／Ｈ−４／Ｈ−５／Ｈ−６／Ｈ−７／Ｈ−８／Ｈ−９／Ｈ−１０／Ｈ３−１１の相関が観測されたことから、Ｃ−３〜Ｃ−１１が結合していることが示唆された。Ｈ−６の化学シフトが低磁場側（δＨ  ４．４８）にシフトしていることから、Ｃ−６にＯ原子が結合していることが示唆された。Ｈ−３／Ｃ−２，Ｈ−６／Ｃ−２へのＨＭＢＣ（heteronuclear multiple bond connectivity）の相関が観測されたことから、化合物（ａ１−１）はラクトンを含む六員環構造を有していることが推定された。また、Ｈ−５の化学シフトが低磁場側（δＨ  ４．５２）にシフトしていることから、Ｃ−５はヒドロキシ基を有していることが示唆された。重水を添加して１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定したところ、δＨ  ３．００のシグナルが消失したことから、ヒドロキシ基のシグナルであると推定した。【００７２】
相対立体構造は、ｄｉｆ．ＮＯＥ（difference nuclear overhauser effect）、ＮＯＥＳＹ（nuclear overhauser effect spectroscopy）、及びカップリングコンスタントを用いて推定した。ＮＯＥＳＹによる相関は、Ｈ−５／Ｈ−７，Ｈ−７／Ｈ−９，Ｈ−９／Ｈ３−１１，Ｈ−６／Ｈ−８，Ｈ−８／Ｈ−１０に見られ、ｄｉｆ．ＮＯＥによってＯＨ−５／Ｈ−６が観測されたことから、Ｈ−５をα位、Ｈ−６をβ位であると相対立体構造を推定した。側鎖Ｃ−７〜Ｃ−８，Ｃ−９〜Ｃ−１０は、カップリングコンスタントがそれぞれＪＨ−７，Ｈ−８＝１５Ｈｚ，ＪＨ−９，Ｈ−１０＝１５Ｈｚであることからもこの推定は支持された。【００７３】
１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹ及びＨＭＢＣの相関を図３Ａに示し、ＮＯＥＳＹの相関を図３Ｂに示し、ｄｉｆ．ＮＯＥの結果を図３Ｃに示す。また、１Ｈ  ＮＭＲ及び１３Ｃ  ＮＭＲの測定結果（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）を表３に示す。【００７４】
【表３】
2019160150.tif 000014
【００７５】
以上の結果より、化合物（Ｉ−１）は、下記式（Ｉ−１）で表される相対立体構造を有すると決定した。【００７６】
【化７】
2019160150.tif 000015
【００７７】
＜化合物（Ｉ−２）の構造解析＞
化合物（Ｉ−２）は、淡黄色の油状物質であり、ＨＲＴＯＦＭＳ分析の結果から、分子式Ｃ１０Ｈ１４Ｏ３[m/z 205.0839 [M+Na]+ (calcd for C10H14O3Na 205.0841, unsat 4)]であることが明らかになった。化合物（Ｉ−２）の比旋光度は、［α］１６Ｄ  ＋３６．９°（ｃ０．１１，ＭｅＯＨ）であった。また、ＦＴ／ＩＲの測定結果に基づき、カルボニル基２の存在が示唆された｛νｍａｘ（ＫＢｒ）３４４７，１６３８ｃｍ−１｝。さらに、ＵＶスペクトルの測定において、λｍａｘ（ＭｅＯＨ）ｎｍ（ｌｏｇε）：２４０．８（５．４７），２９５．２（５．４１）に極大が認められた。１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、ＤＥＰＴ及びＨＭＱＣのスペクトル解析結果より、メチル基１、メチレン基２、メチン基６、四級炭素１の存在が示唆された。【００７８】
１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹ及びＨＭＢＣの相関から、化合物（Ｉ−２）の平面構造は化合物（Ｉ−１）と同じであると示唆された。【００７９】
相対立体構造は、ＮＯＥＳＹ及びカップリングコンスタントを用いて推定した。ＮＯＥＳＹの測定により、Ｈ−５／Ｈ−９，Ｈ−７／Ｈ３−１１の相関が観測されたことから、下記式（Ｉ−２）で表される相対立体構造を決定した。Ｃ−７〜Ｃ−８，Ｃ−９〜Ｃ−１０のカップリングコンスタントが、ＪＨ−７，Ｈ−８＝１１．０Ｈｚ，ＪＨ−９，Ｈ−１０＝１４．０Ｈｚであることからもこの推定は支持された。【００８０】
１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹ及びＨＭＢＣの相関を図４Ａに示し、ＮＯＥＳＹの相関を図４Ｂに示す。また、１Ｈ  ＮＭＲ及び１３Ｃ  ＮＭＲの測定結果（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）を表４に示す。【００８１】
【表４】
2019160150.tif 000016
【００８２】
【化８】
2019160150.tif 000017
【００８３】
＜化合物（Ｉ−３）の構造解析＞
化合物（Ｉ−３）は、淡黄色の油状物質であり、ＨＲＴＯＦＭＳ分析の結果から、分子式Ｃ１０Ｈ１４Ｏ３[m/z 205.0841 [M+Na]+ (calcd for C10H14O3Na 205.0841, unsat 4)]であることが明らかになった。化合物（Ｉ−３）の比旋光度は［α］１７Ｄ  −１６．１°（ｃ０．０９，ＭｅＯＨ）であった。また、ＦＴ／ＩＲの測定結果に基づき、３４４８ｃｍ−１の吸収からヒドロキシ基が、１６３３ｃｍ−１の吸収からカルボニル基の存在が示唆された。さらに、ＵＶスペクトルの測定はλｍａｘ（ＭｅＯＨ）ｎｍ（ｌｏｇε）：２３１．８（６．５６）に極大が認められた。１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、ＤＥＰＴ及びＨＭＱＣのスペクトル解析結果より、メチル基１、メチレン基２、メチン基６、四級炭素１の存在が示唆された。【００８４】
１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹ及びＨＭＢＣの相関から、化合物（Ｉ−３）の平面構造は化合物（Ｉ−１）と同じであると示唆された。【００８５】
相対立体構造は、ＮＯＥＳＹ及びカップリングコンスタントを用いて推定した。ＮＯＥＳＹの測定により、Ｈ−５／Ｈ−７，Ｈ−９／Ｈ３−１１の相関が観測されたことから、下記式（Ｉ−３）で表される相対立体構造を推定した。Ｃ−７〜Ｃ−８，Ｃ−９〜Ｃ−１０のカップリングコンスタントは、ＪＨ−７，Ｈ−８＝６．０Ｈｚ，ＪＨ−９，Ｈ−１０＝１１．５Ｈｚであることからもこの推定は支持された。【００８６】
１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹ及びＨＭＢＣの相関を図５Ａに示し、ＮＯＥＳＹの相関を図５Ｂに示す。また、１Ｈ  ＮＭＲ及び１３Ｃ  ＮＭＲの測定結果（ＣＤ３ＯＤ，５００ＭＨｚ）を表５に示す。【００８７】
【表５】
2019160150.tif 000018
【００８８】
【化９】
2019160150.tif 000019
【００８９】
＜化合物（Ｉ−４）の構造解析＞
化合物（Ｉ−４）の１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲの測定値は、菌類Ｓｐｈａｅｒｏｐｓｉｓ  ｓａｐｉｎｅａの代謝産物であるサピノフラノンＡ（Sapinofuranone A）の文献値と一致した（Evidente A et al., J Nat Prod. 1999 Feb;62(2):253-6.）。化合物（Ｉ−４）の１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲの測定結果を以下に示す。【００９０】
1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) δH 2.37 (1H, dt, J=16.0, 1.5 Hz, H-2), 2.49 (1H, m, H-2), 1.62 (1H, m, H-3), 1.87 (1H, m, H-3), 3.50 (1H, ddd, J=9.5, 6.0, 3.0 Hz, H-4), 3.93 (1H, brt, J=6.0 Hz, H-5), 5.62 (1H, dd, J=15.0, 7.0 Hz, H-6), 6.22 (1H, dd, J=15.0, 10.5 Hz, H-7), 6.08 (1H, ddd, J=15.0, 10.5, 1.5 Hz, H-8), 5.70 (1H, dq, J=15.0, 7.0 Hz, H-9), 1.74 (3H, d, J=7.0 Hz, H-10).【００９１】
13C-NMR (CD3OD, 500 MHz) δC 178.0 (C-1), 31.7 (C-2), 29.0 (C-3), 75.0 (C-4), 76.8 (C-5), 130.8 (C-6), 133.6 (C-7), 132.5 (C-8), 130.3 (C-9), 18.2 (C-10).【００９２】
化合物（Ｉ−４）は、サピノフラノンＡと同じ構造であり、下記式（Ｉ−４）で表される構造を有すると決定した。【００９３】
【化１０】
2019160150.tif 000020
【００９４】
［実施例３］細胞を用いた活性試験
運動神経（ＭＮ）は、随意運動の伝達路である錐体路を形成する主要な細胞であり、グルタミン酸入力により興奮する。ＡＬＳの病理機序において、ＭＮが細胞死を起こす条件としては、酸化ストレス（脳・脊髄の虚血時、神経炎症時等における、ＭＮ自身若しくは周囲の細胞に由来する活性酸素種ＲＯＳ及び活性窒素種ＲＮＳによる酸化的障害、酸素呼吸の障害、アポトーシス等の惹起)、興奮毒性（過剰なグルタミン酸刺激による細胞内Ｃａ２＋のオーバーロード等に随伴するＣａ２＋依存性のカルパインによる重要タンパク質ＴＤＰ−４３等の切断など)、異常タンパク質の蓄積とそれによる障害(変性ＳＯＤｌタンパク質等の異常タンパク質凝集体の出現と処理不能に基づく細胞代謝異常：ｐｒｏｔｅｉｎｏｐａｔｈｙ)が挙げられる。これらの仮説に基づき、化合物（Ｉ−１）（以下、「ＹＹ−１」という場合がある。）について、（１）培地の血清不足によるＲＯＳ発生の抑制作用、（２）グルタチオン欠乏下での興奮毒性の抑制作用、（３）一時的に発現させたＳＯＤｌ―Ｇ９３Ａによる細胞死の抑制作用、を試験した。【００９５】
＜細胞及び培地＞
マウス運動神経株化細胞、ＮＳＣ−３４細胞（Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ−Ｓｐｉｎａｌ  Ｃｏｒｄ  ３４）は、Ｄｒ．Ｎｅｉｌ  Ｃａｓｈｍａｎより慶應義塾大学を経由して恵与された。マウス運動神経芽腫細胞、Ｎ２ａ細胞（Ｎｅｕｒｏ  ２ａ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。【００９６】
試験に用いた培地の組成を表６〜１０に示す。Ｒｉｃｈ培地はＮＳＣ３４細胞の培地に用い、ＭＥＭ培地はＮ２ａ細胞の培養に用いた。【００９７】
【表６】
2019160150.tif 000021
【００９８】
【表７】
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【００９９】
【表８】
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【０１００】
【表９】
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【０１０１】
【表１０】
2019160150.tif 000025
【０１０２】
＜使用器具・装置・試薬＞
試験に使用した器具・装置・試薬は、以下のとおりである。
・微量高速遠心分離機 CF16RX II (Hitachi)
・ＣＯ２インキュベーターMCO-175 (SANYO)
・クリーンベンチ MCV-B131F (SANYO)
・Fatal Bovine Serum (FBS) (HyClone SH30070)
・Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (SIGMA D5796)
・Minimum Essential Medium (MEM) (SIGMA M4655)
・100X Penicillin/Streptomycin（Invitrogen 15140, 10,000 U/mL penicillinおよび 10,000 mg/mL streptomycin含有)【０１０３】
（ＲＯＳアッセイ）
・蛍光マイクロプレートリーダー BMG LABTECH FLUOStar OPTIMA (BMG LABTECH)
・ヘモサイトメーター Tiefe 0.100 mm 1/400 mm Thoma (NITIRIN)
・DMEM ([-]phenol red) (GIBCO Invitrogen 31053-028) 
・CM-H2DCFDA (5-(and-6)chlromethyl-2,7-dichlorodihydrofluoresceindiacetate、acetyl ester) (Invitrogen) 
・Trolox (CALBIOCHEM) 
・96 well plate (IWAKI 3860-096)【０１０４】
（ＯＤＡＰ−ＥＡアッセイ）
・DMEM (-Met/-Cys) (GIBCO Invitrogen 21013-024) 
・DMEM/F12+GlutamaMAX-1（Invitrogen 10565-018）
・Horse serum (HS) (GIBCO Invitrogen 26050) 
・200 mM L-glutamine (GIBCO 25030)
・L-β-ODAP (β-N-oxalyl-L-α,β-diaminopropionic acid, Lathyrus Technologies社製（Hyderabad500 007, India）から個人輸入) 
・Ethacrynic Acid (Lot 105K1850) (SIGMA E4754-1G) 
・N-acetyl cysteine (NAC) (Lot 129K1944V) (SIGMA A7250-5G) 
・AlamarBlue (Lot 150844SA) (Nalgene) 【０１０５】
（Ｄｕａｌ−ルシフェラーゼアッセイ）
・Opti-MEM (GIBCO 31985-070)
・P3x plasmid  (空ベクター)
・G93A plasmid  (SOD1-G93A遺伝子ベクター)
・pGL4SV40 plasmid  (ホタルルシフェラーゼ)
・pGL4TK plasmid  (ウミシイタケルシフェラーゼ)
・Lipofectamine 2000 (Lot 1457325) (Invitrogen 11668-030)
・N-2’-O-dibutyryladenosine 3’,5’-cyclic monophosphate sodium salt (db-cAMP) (SIGMA D0627)
・Lactacystin (SIGMA L6785)
・5 × Passive Lysis Buffer (Promega E194A)
・Stop & Glow Buffer (Promega E641A)
・Stop & Glow Substrate  (Promega E640A)
・Luciferase Assay Buffer II (Promega E195A)
・Luciferase Assay Substrate (Promega E151A)
・ルミノメーター (Luminescencer-PSN) (ATTO BIO-INSTRUMENT)
・ルミノメーターチューブ (BD Falcon)
・シェイカー Titramax 100 (Heidolph)【０１０６】
＜ＲＯＳアッセイ＞
ＲＯＳアッセイは、細胞が血清除去ストレス下でＲＯＳを生成させ、被験物質が当該ＲＯＳを消去する能力について評価する試験である。ＲＯＳアッセイでは、血清（ＦＢＳ）を除去した培地でＮＳＣ−３４細胞を培養し、その際に生じるＲＯＳの上昇をＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡ）を用いて測定することにより行った。【０１０７】
ＮＳＣ−３４細胞をｐｈｅｎｏｌ  ｒｅｄ  ｆｒｅｅ  ＤＭＥＭ培地に懸濁し、ＮＳＣ−３４細胞を目的濃度４×１０４個／ウェルで２００μＬ／ウェルずつ９６ウェルプレートに播種した。前記ウェルプレートを、３７℃、５％ＣＯ２条件下のインキュベーター内で一晩インキュベートし、細胞を定着させた。【０１０８】
次いで、９６ウェルプレートから培地をすべて除去し、ＤＭＥＭ（［−］ｐｈｅｎｏｌ  ｒｅｄ）を２００μＬ／ウェルずつ加え、次いでＤＭＳＯに溶解した被験物質（もしくは溶媒のみ）を１μＬ／ウェルずつ添加した。前記ウェルプレートを、３７℃、５％ＣＯ２条件下のインキュベーター内で３時間インキュベートした後、ＤＭＥＭ（［−］ｐｈｅｎｏｌ  ｒｅｄ）を１１０μＬ／ウェルずつ除去し、５μＭ  ＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを１０μＬ／ウェルずつ加えて、インキュベーター内に１時間置いた。１時間後、蛍光プレートリーダーを用いて、蛍光強度（励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を測定した。【０１０９】
上記ＲＯＳアッセイの被験物質として、３週間培養後のＮＵＨ３２２株培養液を酢酸エチルで抽出した粗抽出物（３２２−Ｅｘｔ）と、ＹＹ−１とを用いた。３２２−Ｅｘｔ及びＹＹ−１は、１０、３０又は１００μｇ／μＬの濃度で、それぞれＤＭＳＯに溶解して使用した。試験は、４連で２〜４回行った。陽性対照には、３０μｇ／ｍＬ（１２０μＭ）のｔｒｏｌｏｘを用いた。被験物質で得られた測定結果から、ｔｒｏｌｏｘに対する相対強度を下記式（１）により算出した。下記式（１）中、「蛍光強度（サンプル）」は、被験物質（ＤＭＳＯに溶解した３２２−Ｅｘｔ又はＹＹ−１）を添加してインキュベートした試料の蛍光強度を表し、「蛍光強度（溶媒）」は、ＤＭＳＯのみを添加してインキュベートした試料の蛍光強度を表し、「蛍光強度（陽性対照）」は、３０μｇ／ｍＬのｔｒｏｌｏｘを添加してインキュベートした試料の蛍光強度を表す。【０１１０】
【数１】
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【０１１１】
結果を図６に示す。ＹＹ−１は、濃度依存的なＲＯＳ消去（抗酸化）活性を示したことから、ｔｒｏｌｏｘの約２０％程度のＲＯＳ消去作用があることが確認された。ＹＹ−１は同濃度において３２２−Ｅｘｔの約４０％の活性を示した。【０１１２】
＜ＯＤＡＰ−ＥＡアッセイ＞
ＯＤＡＰ−ＥＡアッセイは、ミトコンドリアの酸化ストレス下でのグルタミン酸受容体を介した興奮毒性というＡＬＳの原因の一部をＬ−β−ＯＤＡＰ及びエタクリン酸（ＥＡ）により再現し、被験物質が当該興奮毒性を軽減する作用について評価する試験である。ＯＤＡＰ−ＥＡアッセイは、運動神経興奮毒性に対する軽減作用を測定する試験として、本発明者らにより開発された（Kusama-Eguchi K, et al., Food Chem Toxicol., 49, 636-643 (2011).）。ＯＤＡＰ−ＥＡアッセイでは、分化させたＮＳＣ−３４細胞に、ミトコンドリアのグルタチオンレベル低下作用を有するエタクリン酸（ＥＡ）、及び神経毒性アミノ酸であるＬ−β−ＯＤＡＰを添加して、ＮＳＣ−３４細胞に興奮毒性を生じさせ、被験物質による前記興奮毒性の軽減作用を評価する。【０１１３】
ＮＳＣ−３４細胞をコンフルエントになるまで６ｍＬディッシュ中のＲｉｃｈ培地で培養した後、ディッシュ内のＲｉｃｈ培地を除去した。次いで、３７℃に温めておいたＰｏｏｒ培地をディッシュに加えて、３７℃、５％ＣＯ２条件下のインキュベーター内で培養した。１日１回のＰｏｏｒ培地の入れ替えを、３〜５回程度行い、ＮＳＣ−３４細胞の分化を促進させた。【０１１４】
上記のように分化させたＮＳＣ−３４細胞をＰｏｏｒ培地に懸濁し、目的濃度４×１０４個／ウェルで２００μＬ／ウェルずつ９６ウェルプレートに播種した。前記ウェルプレートを、３７℃、５％ＣＯ２条件下のインキュベーター内で一晩インキュベートし、細胞を定着させた。【０１１５】
次いで、ウェルプレート内のＰｏｏｒ培地をすべて除去し、ＢＭ−Ｅを２００μＬ／ウェルずつ加えた後、被験物質を１μＬ／ウェルずつ加えて、インキュベーター内に２０〜２２時間ほど置いた。【０１１６】
次いで、ウェルプレート内の培地を１１０μＬずつ除去し、あらかじめ室温に戻しておいたＡｌａｍａｒＢｌｕｅを１０μＬ／ウェルずつ加え、３７℃、５％ＣＯ２条件下のインキュベーター内に置いた。約１時間後、蛍光プレートリーダーを用いて、蛍光強度（励起波長：５４４ｎｍ、蛍光波長：５９０ｎｍ）を測定した。【０１１７】
上記ＯＤＡＰ−ＥＡアッセイの被験物質として、３週間培養後のＮＵＨ３２２株培養液を酢酸エチルで抽出した粗抽出物（３２２−Ｅｘｔ）と、ＹＹ−１とを用いた。３２２−Ｅｘｔ及びＹＹ−１は、図７に示す各濃度で、それぞれＤＭＳＯに溶解して使用した。試験は、同一系４本ずつの実験を２〜５回行った。陽性対照には、最終濃度４ｍＭのＮＡＣを用いた。被験物質で得られた測定結果から、ＮＡＣに対する相対強度を下記式（２）により算出した。下記式（２）中、「蛍光強度（サンプル）」は、被験物質（ＤＭＳＯに溶解した３２２−Ｅｘｔ又はＹＹ−１）を添加してインキュベートした試料の蛍光強度を表し、「蛍光強度（溶媒）」は、ＤＭＳＯのみを添加してインキュベートした試料の蛍光強度を表し、「蛍光強度（陽性対照）」は、４ｍＭのＮＡＣを添加してインキュベートした試料の蛍光強度を表す。【０１１８】
【数２】
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【０１１９】
結果を図７に示す。３２２−Ｅｘｔは、試験したほとんどの濃度でＯＤＡＰ−ＥＡ毒性軽減作用を示さなかった。一方、ＹＹ−１は、０．１〜１００μｇ／ｍＬ（０．５５〜５５０μＭ）のすべての濃度で、強いＯＤＡＰ−ＥＡ毒性軽減作用を示した。４ｍＭ  ＮＡＣに対する相対強度は、０．１〜３．０μｇ／ｍＬ（０．５５〜１６．５μＭ）のＹＹ−１を添加した場合に最も高く、約２０％弱程度を示した。この結果から、このＹＹ−１は、３２２−Ｅｘｔ中に存在する化合物の中で、ＯＤＡＰ−ＥＡ毒性軽減活性を有する主要な化合物であることが判明した。【０１２０】
＜Ｄｕａｌ−ルシフェラーゼアッセイ＞
ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａは、家族性ＡＬＳの原因遺伝子であり、ｐｒｏｔｅｉｎｏｐａｔｈｙの背景をなす。Ｄｕａｌ−ルシフェラーゼアッセイは、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ遺伝子をマウス運動神経芽腫細胞（Ｎ２ａ細胞）に導入し、被験物質が当該遺伝子の細胞への一時的導入により生じる神経毒性を回復させる作用について評価する試験である。Ｄｕａｌ−ルシフェラーゼアッセイでは、２種類のルシフェラーゼのプラスミドを、ＳＯＤ１−Ｇ９３ＡプラスミドとともにＮ２ａ細胞にレポーターとして導入し、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ導入細胞の生存率をＡＴＰ依存性生物発光により評価する。【０１２１】
（２４ウェルプレートへのＮ２ａ細胞の播種）
Ｎ２ａ細胞をＭＥＭ培地に懸濁し、目的濃度１０×１０４個／ウェルで５００μＬ／ウェルずつ２４ウェルプレートに播種した。次いで、３７℃、５％ＣＯ２条件下のインキュベーター内に１日置いて細胞を定着させた。【０１２２】
（トランスフェクション）
Ｐ３ｘプラスミド（空ベクター）又はＧ９３Ａプラスミド（ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ遺伝子ベクター）に、ｐＧＬ４ＳＶ４０プラスミド（ホタルルシフェラーゼ遺伝子ベクター）及びｐＧＬ４ＴＫプラスミド（ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子ベクター）を加え、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭを用いて混合プラスミド液とした。前記混合プラスミド液に、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭＴＭ及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００の混合液を添加し、５分間、室温で放置して、トランスフェクション用プラスミド液を調製した。【０１２３】
上記でＮ２ａ細胞を定着させた２４ウェルプレート内の培地をすべて除去し、あらかじめ３７℃に温めておいたＯｐｔｉ−ＭＥＭを４００μＬ／ウェルずつ加えた。次いで、前記トランスフェクション用プラスミド液を１００μＬ／ウェルずつ加えた。その後、３７℃、５％ＣＯ２条件下のインキュベーター内に、前記プレートを置いてトランスフェクションを行った。６時間後、プレートから培地を除去し、２μＭ  ジブチリル−ｃＡＭＰを含んだＭＥＭ５００μＬ／ウェルずつ加えた。次いで、被験物質を０．５μＬ／ウェルずつ加え、３７℃、５％ＣＯ２条件下のインキュベーター内で１日インキュベートした。次いで、２ｍＭのラクタシスチン(プロテアソーム阻害剤)を０．５μＬ／ウェルずつ加え、さらに１日、３７℃、５％ＣＯ２条件下のインキュベーター内で、インキュベートした。【０１２４】
（生物発光の測定）
３日目に、前記２４ウェルプレートから培地を除去し、１×ＰＢＳを５００μＬ／ウェルずつ加えて数分後に除去することにより、ウェル内を洗浄した。１×Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒを１００μＬ／ウェルずつ加え、室温下で１５分間、シェイカーで振蕩（２１５ｒｐｍ）して、細胞を２４ウェルプレートからはがした。ウェル内をピペッティングして細胞溶解物を回収し、全量を１．５ｍＬマイクロチューブに移して、１３，２００ｒｐｍ、４℃で１分間遠心分離した。【０１２５】
５０μＬのＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＩＩ（ＬＡＲ  ＩＩ）を入れたルミノメーターチューブを用意し、そこに前記遠心分離後の上清を１０μＬ加えて３回ピペッティングしてから、ルミノメーターを用いてホタルルシフェラーゼの発光強度を測定した。測定後すぐに、Ｓｔｏｐ  ＆  Ｇｌｏｗ  Ｒｅａｇｅｎｔを５０μＬ加えて軽くボルテックスし、ルミノメーターでウミシイタケルシフェラーゼの発光強度を測定した。ＬＡＲ  ＩＩ及びＳｔｏｐ  ＆  Ｇｌｏｗ  Ｒｅａｇｅｎｔの組成を表１１に示す。【０１２６】
【表１１】
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【０１２７】
上記Ｄｕａｌ−ルシフェラーゼアッセイの被験物質として、３週間培養後のＮＵＨ３２２株培養液を酢酸エチルで抽出した粗抽出物（３２２−Ｅｘｔ）と、ＹＹ−１とを用いた。３２２−Ｅｘｔ及びＹＹ−１は、図８に示す各濃度で、それぞれＤＭＳＯに溶解して使用した。試験は、１系について１または２本ずつ行い、３２２−ｅｘｔは２回、ＹＹ−１は３〜５回行った。陽性対照には、レスベラトロール（ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）を用いた。被験物質（サンプル）で得られた測定結果から、下記式（３）により、相対強度を算出した。陽性対照についても、同様に相対強度を算出した。下記式（２）中、「発光強度（サンプル）」は、被験物質（ＤＭＳＯに溶解した３２２−Ｅｘｔ又はＹＹ−１）を添加してインキュベートした試料の発光強度を表し、「発光強度(溶媒)」は、ＤＭＳＯのみを添加してインキュベートした試料の蛍光強度を表す。【０１２８】
【数３】
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【０１２９】
結果を図８に示す。ＹＹ−１は、０．１μｇ／ｍＬ（０．５５μＭ）と１μｇ／ｍＬ（５．５μＭ）において、陽性対照の発光強度を４０％程度上回り、３３２−Ｅｘｔと同等程度のＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ遺伝子毒性回復活性を示した。この結果から、このＹＹ−１は、３２２−Ｅｘｔ中に存在する化合物の中で、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ遺伝子毒性回復活性を有する主要な化合物であることが判明した。【０１３０】
［実施例４］ＡＬＳモデルマウスを用いたｉｎ  ｖｉｖｏ試験
ＹＹ−１は、上記実施例３において３種の活性を有していた。また、ＮＵも３２２細胞の主代謝産物であり大量に単離することが可能であったことから、ＡＬＳモデル動物を用いた実験的治療を行い、ｉｎ  ｖｉｖｏでの活性の評価を行った。全ての動物実験は、日本学術会議「動物実験の適正な実施に向けたガイドライン」ならびに「日本大学動物実験運営内規」に従い、大学許可動物実験として行われた。【０１３１】
＜ＡＬＳモデルマウスの作製＞
（マウスの飼育環境）
日本大学薬学研究所実験動物センターにて、２５℃恒温かつ恒湿の条件で、８：００〜２０：００照明下で飼育した。実験動物の飼育は１ケージにつき１匹で行い、床敷及びケージは１週間に１回新しいものと交換した。水飲みは滴瓶とし、動物用飲水として濾過されたものを入れ、中身は２日ごとに取り替えた。餌はＭＦ（飼育用飼料）を与え、常に一定の量を餌入れに入れて自由摂取させた。【０１３２】
（交配）
試験には、自家繁殖させたＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ遺伝子を保持するＡＬＳモデルマウスを用いた。初代のマウスの作製は、米国Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから、生後６週齢のＳＯＤ１−Ｇ９３ＡトランスジェニックマウスであるＢ６ＳＪＬ−Ｔｇ（ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／Ｊの雄マウスを父親として導入し、母親に生後８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊの雌マウスを用意して、これらを１週間同じケージに入れて交配を行った。【０１３３】
この交配によって生まれた子マウスのＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ遺伝子の保持をジェノタイピングによって確認した後、生後６週程度からＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウスと掛け合わせ、戻し交配１回目マウス（ＦｕＢｋ１）を作製した。また、このＦｕＢｋ１の雄マウスに掛け合わせる雌マウスの作製も同時期に行った。ＳＪＬ／Ｊ雄マウスに、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウスを掛け合わせて、子マウス（Ｆ１）を作製した。【０１３４】
上記のようにして作製された戻し交配１回目のＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ遺伝子保持の雄マウス（ＦｕＢｋ１）と正常遺伝子の雌マウス（Ｆ１）とを用いて戻し交配を行って、生まれたマウスを戻し交配２回目マウス（ＦｕＢｋ２）とし、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ遺伝子を保持していた雄マウスを、後述する予備試験に使用した。ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ遺伝子を保持していた雄マウス（ＦｕＢｋ２）を、さらにＦ１の雌マウスと掛け合わせ、戻し交配３回目のマウス（ＦｕＢｋ３）および戻し交配４回目（ＦｕＢｋ４）のマウスを作製し、後述する本試験に使用した。【０１３５】
（ジェノタイピング）
ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ遺伝子保持の親マウスから、全ての子マウスにＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ遺伝子が遺伝するわけではないため、生まれた子マウス全てに対してジェノタイピングを行いＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ遺伝子を保持しているか判別した。ジェノタイピングは、マウスの尻尾からＤＮＡを抽出し、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ遺伝子増幅用プライマーを用いてＰＣＲを行い、アガロースゲル電気泳動によりＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ遺伝子断片の増幅を確認することにより行った。【０１３６】
＜被験物質の評価方法＞
被験物質は、マウスの生存日数及び運動機能の二点に基いて評価した。生存日数については、マウスが死（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  ｄｅａｔｈを含む）と判定されるまでの日数を評価した。運動機能については、Ｒｏｔａ−ｒｏｄ法を用いての運動試験により評価した。【０１３７】
（生存性の判定）
正向反射が消失し、２０秒以内に正しい姿勢に戻れなかったマウスを死（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  ｄｅａｔｈ）と判定した。【０１３８】
（運動能力の測定；Ｒｏｔａ−ｒｏｄテスト）
Ｒｏｔａ−ｒｏｄテストは、ＲＯＴＡ−ＲＯＤ  ＴＲＥＡＤＭＩＬＬ  ｆｏｒ  ＭＩＣＥ  ＭＫ−６００（Ｍｕｒｏｍａｃｈｉ）を用いて行った。被験対象マウスのＡＬＳ様症状の発症時期を調べるため、マウスの運動機能の測定を週１回Ｒｏｔａ−ｒｏｄ法にて行った。測定方法は、あらかじめ３回以上歩行訓練したマウスを用いて、１５ｒｐｍ（レベル４）で、丸太の回転速度についていけなくなり落下するまでの秒数を測定した。３００秒間歩行を続けられたものを未発症（運動遂行）と判断した。落下した場合は、１０分休ませてから再測定を実施し、再び運動持続時間を測定した。２回３００秒以下で落下したものを発症とし、落下するまでの秒数も併せて測定した。【０１３９】
＜統計処理＞
試験結果は、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法により解析し、Ｌｏｇ−Ｒａｎｋ検定又はＷｉｌｃｏｘｏｎ検定によりｐ値と中央値を求めた。発症後の運動障害は各ポイントの値についてＴ検定により行った。【０１４０】
＜投与試験１＞
（被験対象動物）
遺伝子変異のない正常な雌と掛け合わせることで作製された戻し交配２回目のマウス（ＦｕＢｋ２）のうち、ジェノタイピングによりＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ遺伝子保持と判定された生後約６０日（ｐｒｅｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ期）の雄マウス合計１６匹を被験対象動物とした。【０１４１】
（被験物質の調製法及び投与方法）
被験物質は、２．５％ＤＭＳＯ溶液を溶媒として、表１２に示す濃度で調製した。被験物質は、滅菌済みのディスポーザブル経口ゾンデを用いて、マウスに経口投与した。表１３に従い、体重に対応した量の被験物質をマウスに投与した。投与群を表１２に示すように割り振り、生後６０日から１日１回、被験物質を１００μＬ／１０ｇ（体重）にて経口投与した。【０１４２】
【表１２】
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【０１４３】
（体重推移）
図９に、被験物質投与期間中の投与試験１で行ったマウスの体重の推移を示す。体重は週２回測定した。図９中、「ＹＹ−１（１）」は、ＹＹ−１（１ｍｇ／ｋｇ）投与群を示し、「ＹＹ−１（１０）」は、ＹＹ−１（１０ｍｇ／ｋｇ）投与群を示す。ＹＹ−１のいずれの投与群においても、顕著な体重減少は確認されなかったことから、ＹＹ−１の本ＡＬＳモデルマウスに対する毒性は低いと推測された。さらに、体重減少は筋肉減少に基づくと考えられることから、ＹＹ−１にはＡＬＳ患者における筋肉減少に有効である可能性が高い。【０１４４】
＜投与試験２＞
（被験対象動物）
図１０Ａは、実施例３の投与試験１におけるマウスの生存日数をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法により解析した結果であり、ＹＹ−１（１０ｍｇ／ｋｇ）投与群の解析結果である。図１０Ｂは、実施例３の投与試験１におけるマウスの生存日数をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法により解析した結果であり、ＹＹ−１（１ｍｇ／ｋｇ）投与群の解析結果である。ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ遺伝子遺伝子を保持する戻し交配３回目のマウス（ＦｕＢｋ３）のうち、ジェノタイピングによりＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ遺伝子を保持していると判定された雌雄マウス合計５１匹を被験対象動物とした。【０１４５】
（被験物質の調製方法及び投与方法）
被験薬は、１％ＤＭＳＯ＋２％Ｔｗｅｅｎ２０溶液を溶媒とし、表１４に示す濃度で調製した。被験物質は、滅菌済みのディスポーザブル経口ゾンデを用いて、マウスに経口投与した。上記表１３に従い、体重に対応した量の被験物質をマウスに投与した。投与群を表１４に示すように割り振り、生後約４５日から１日１回、被験物質を０．１ｍＬ／１０ｇ (体重)にてマウスに経口投与した（５ｍｇ／ｋｇ）。【０１４６】
【表１３】
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【０１４７】
（運動障害）
図１１Ａに、マウスの運動障害発現までの日数をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法により解析した結果を示す。図１１Ａ中、「ＹＹ−１」は、ＹＹ−１（５ｍｇ／ｋｇ）投与群を示す。ＹＹ−１（５ｍｇ／ｋｇ）投与群では、対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に対し、運動機能障害発現までの日数を、平均値で約６日、中央値で７日延長する傾向が認められた（ｐ＝０．１２）。【０１４８】
（生存日数）
図１１Ｂに、マウスの生存日数をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法により解析した結果を示す。ＹＹ−１（５ｍｇ／ｋｇ）投与群では、対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に対し、生存日数を、平均値で約５日、中央値で８日延長する傾向が認められた（ｐ＝０．０９０）。【０１４９】
＜投与試験３＞
（被験対象動物）
ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ遺伝子遺伝子を保持する戻し交配３回目の雄マウスを、さらに戻し交配させて作製された戻し交配４回目のマウス（ＦｕＢｋ４）のうち、ジェノタイピングによりＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ遺伝子を保持していると判定された雌マウス合計５２匹を被験対象動物とした。【０１５０】
（被験物質の調製方法及び投与方法）
被験薬は、１％ＤＭＳＯを溶媒とし、表１４に示す濃度で調製した。被験物質は、生後１０５日から１日１回、滅菌済みのディスポーザブル経口ゾンデを用いて０．１ｍＬ／１０ｇ（体重）にてマウスに投与した(１０ｍｇ／ｋｇ)。
【表１４】
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【０１５１】
（運動障害）
図１２Ａに、マウスの運動障害の経過を解析した結果を示す。生後１５．３週―１８．３週の期間に投与群と対照群の間に有意差が見られ、運動機能障害において約７日の遅延効果が認められた。
【０１５２】
（生存日数）
図１２Ｂに、マウスの生存日数をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法により解析した結果を示す。ＹＹ−１投与群では、対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に対し、生存日数を、平均値で約６日、中央値で５日有意に延長した（ｐ＝０．０２９）。【０１５３】
以上の結果より、ＹＹ−１は、ＡＬＳ治療薬候補として有望であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１５４】
本発明によれば、ＡＬＳを含む神経変性疾患の治療又は予防するための医薬組成物、及び当該医薬組成物の有効成分として利用される新規化合物が提供される。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【国際調査報告】
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