(57)【要約】  高感度で検体中のHPVを検出する方法の提供、特に精液又は尿中のHPVを検出する方法の提供を目的とする。  検体中のHPVをPCR反応により増幅してHPVの感染を検出する方法であって、(a)  第１のPCRにおいて、HPV遺伝子に特異的にハイブリダイズするプライマーに、HPVゲノム、ヒトゲノム、並びにヒトに感染するウイルス及び微生物のゲノムにアニーリングしない配列からなるアダプターを付加したアダプタープライマーの対により増幅し、(b)  第２のPCRにおいて、(a)の増幅産物を前記アダプターに相補的な配列からなるプライマーの対により増幅することを含む、HPVの感染を検出する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中のHPVをPCR反応により増幅してHPVの感染を検出する方法であって、
(a)  第１のPCRにおいて、HPV遺伝子に特異的にハイブリダイズするプライマーに、HPVゲノム、ヒトゲノム、並びにヒトに感染するウイルス及び微生物のゲノムにアニーリングしない配列からなるアダプターを付加したアダプタープライマーの対により増幅し、
(b)  第２のPCRにおいて、(a)の増幅産物を前記アダプターに相補的な配列からなるプライマーの対により増幅することを含む、
HPVの感染を検出する方法。
【請求項２】
検体中のHPVのコピー数が1000コピー/ｍL以下である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
検体中のHPVのコピー数が100コピー/ｍL以下である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
検体中のHPVのコピー数が10コピー/ｍL以下である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
検体が精液又は尿である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
HPV遺伝子に特異的にハイブリダイズするプライマーがHPVのL1遺伝子に特異的にハイブリダイズするプライマーである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
アダプターが、シロイヌナズナの遺伝子の部分配列からなる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
アダプタープライマー対とプライマー対の組合せが以下の(i)〜(vi)のいずれかの組合せである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法：
(i)  配列番号１３及び１４の配列からなるアダプタープライマー対、並びに配列番号１及び２の配列からなるアダプターに相補的な配列からなるプライマー対の組合せ；
(ii)  配列番号１５及び１６の配列からなるアダプタープライマー対、並びに配列番号３及び４の配列からなるアダプターに相補的な配列からなるプライマー対の組合せ；
(iii)  配列番号１７及び１８の配列からなるアダプタープライマー対、並びに配列番号５及び６の配列からなるアダプターに相補的な配列からなるプライマー対の組合せ；
(iv)  配列番号１９及び２０の配列からなるアダプタープライマー対、並びに配列番号７及び８の配列からなるアダプターに相補的な配列からなるプライマー対の組合せ；
(v)  配列番号２１及び２２の配列からなるアダプタープライマー対、並びに配列番号９及び１０の配列からなるアダプターに相補的な配列からなるプライマー対の組合せ；
(vi)  配列番号２３及び２４の配列からなるアダプタープライマー対、並びに配列番号１１及び１２の配列からなるアダプターに相補的な配列からなるプライマー対の組合せ。
【請求項９】
アダプタープライマー対とプライマー対の組合せが以下の(xi)〜(xvi)のいずれかの組合せである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法：
(xi)  配列番号４８及び４９の配列からなるアダプタープライマー対、並びに配列番号３６及び３７の配列からなるアダプターに相補的な配列からなるプライマー対の組合せ；
(xii)  配列番号５０及び５１の配列からなるアダプタープライマー対、並びに配列番号３８及び３９の配列からなるアダプターに相補的な配列からなるプライマー対の組合せ；
(xiii)  配列番号５２及び５３の配列からなるアダプタープライマー対、並びに配列番号４０及び４１の配列からなるアダプターに相補的な配列からなるプライマー対の組合せ；
(xiv)  配列番号５４及び５５の配列からなるアダプタープライマー対、並びに配列番号４２及び４３の配列からなるアダプターに相補的な配列からなるプライマー対の組合せ；
(xv)  配列番号５６及び５７の配列からなるアダプタープライマー対、並びに配列番号４４及び４５の配列からなるアダプターに相補的な配列からなるプライマー対の組合せ；
(xvi)  配列番号５８及び５９の配列からなるアダプタープライマー対、並びに配列番号４６及び４７の配列からなるアダプターに相補的な配列からなるプライマー対の組合せ。
【請求項１０】
(a)  HPV遺伝子に特異的にハイブリダイズするプライマーに、HPVゲノム、ヒトゲノム、並びにヒトに感染するウイルス及び微生物のゲノムにアニーリングしない配列からなるアダプターを付加したアダプタープライマーの対;と
(b)  前記アダプターに相補的な配列からなるプライマーの対を含む、
検体中のHPVをPCR反応により増幅してHPVの感染を検出するためのキット。
【請求項１１】
検体中のHPVのコピー数が1000コピー/ｍL以下である、請求項１０記載のキット。
【請求項１２】
検体中のHPVのコピー数が100コピー/ｍL以下である、請求項１０記載のキット。
【請求項１３】
検体中のHPVのコピー数が10コピー/ｍL以下である、請求項１０記載のキット。
【請求項１４】
検体が精液又は尿である、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１５】
HPV遺伝子に特異的にハイブリダイズするプライマーがHPVのL1遺伝子に特異的にハイブリダイズするプライマーである、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１６】
アダプターが、シロイヌナズナの遺伝子の部分配列からなる、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１７】
アダプタープライマー対とプライマー対の組合せが以下の(i)〜(vi)のいずれかの組合せである、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載のキット：
(i)  配列番号１３及び１４の配列からなるアダプタープライマー対、並びに配列番号１及び２の配列からなるアダプターに相補的な配列からなるプライマー対の組合せ；
(ii)  配列番号１５及び１６の配列からなるアダプタープライマー対、並びに配列番号３及び４の配列からなるアダプターに相補的な配列からなるプライマー対の組合せ；
(iii)  配列番号１７及び１８の配列からなるアダプタープライマー対、並びに配列番号５及び６の配列からなるアダプターに相補的な配列からなるプライマー対の組合せ；
(iv)  配列番号１９及び２０の配列からなるアダプタープライマー対、並びに配列番号７及び８の配列からなるアダプターに相補的な配列からなるプライマー対の組合せ；
(v)  配列番号２１及び２２の配列からなるアダプタープライマー対、並びに配列番号９及び１０の配列からなるアダプターに相補的な配列からなるプライマー対の組合せ；
(vi)  配列番号２３及び２４の配列からなるアダプタープライマー対、並びに配列番号１１及び１２の配列からなるアダプターに相補的な配列からなるプライマー対の組合せ。
【請求項１８】
アダプタープライマー対とプライマー対の組合せが以下の(xi)〜(xvi)のいずれかの組合せである、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載のキット：
(xi)  配列番号４８及び４９の配列からなるアダプタープライマー対、並びに配列番号３６及び３７の配列からなるアダプターに相補的な配列からなるプライマー対の組合せ；
(xii)  配列番号５０及び５１の配列からなるアダプタープライマー対、並びに配列番号３８及び３９の配列からなるアダプターに相補的な配列からなるプライマー対の組合せ；
(xiii)  配列番号５２及び５３の配列からなるアダプタープライマー対、並びに配列番号４０及び４１の配列からなるアダプターに相補的な配列からなるプライマー対の組合せ；
(xiv)  配列番号５４及び５５の配列からなるアダプタープライマー対、並びに配列番号４２及び４３の配列からなるアダプターに相補的な配列からなるプライマー対の組合せ；
(xv)  配列番号５６及び５７の配列からなるアダプタープライマー対、並びに配列番号４４及び４５の配列からなるアダプターに相補的な配列からなるプライマー対の組合せ；
(xvi)  配列番号５８及び５９の配列からなるアダプタープライマー対、並びに配列番号４６及び４７の配列からなるアダプターに相補的な配列からなるプライマー対の組合せ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体中のヒトパピローマウイルスを高感度で検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
子宮頸がんは罹患率の高い悪性腫瘍であり、発がん過程にヒトパピローマウイルス（HPV)が関与し、HPVの感染は子宮頸がんの進行に対する危険因子である。HPVは２本鎖DNAを有するウイルスであり、ヒトの皮膚、粘膜等の上皮に感染する。HPVには多数の型（サブタイプ）が存在し、HPV6型、HPV16型、HPV18型等の型の感染により悪性の子宮頸がんに罹患するおそれがあることが報告されている。【０００３】
従来より、女性の子宮頸部から採取した細胞懸濁液を検体として、PCR法によりHPVの感染が検出されていた。【０００４】
PCR法によるHPVの検出のために多数のプライマーが開発されていた（非特許文献１〜３を参照）。【０００５】
従来の方法では、検体中に105〜107コピー/ｍLのHPVが存在する必要があり、検体中に十分な数のHPVを含ませるためには、子宮頸部や頸管部を強くこする必要があり、苦痛が大きかった。【０００６】
また、男性もHPVに感染し、がんを発症することは稀であるが、性交渉によりセックスパートナーにHPVを感染させてしまうことがあった。HPVは精液中に存在しており、精液を検体として用いて、男性のHPV感染を測定することも可能であるが、精液中のHPVのコピー数は少ないので、従来のPCR法では、高感度で検出することはできなかった。
そのため、従来は男性を対象にHPV感染の検出は行われていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】van den Brule AJ et al., J Clin Microbiol. 1990, 28(12):2739-43.
【非特許文献２】Soderlund-Strand A et al., J Clin Microbiol. 2009, 47(3):541-6.
【非特許文献３】Sotlar K et al., J Clin Microbiol. 2004, 42(7):3176-84.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、高感度で検体中のHPVを検出する方法の提供、特に精液又は尿中のHPVを検出する方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、男性のHPV感染を高感度で測定し、かつ女性のHPV感染を苦痛を与えずに測定する方法について鋭意検討を行った。【００１０】
その結果、HPV遺伝子に特異的にハイブリダイズするプライマーに、HPVゲノム、ヒトゲノム、ヒトに感染するウイルスや微生物のゲノムにアニーリングしない配列からなるアダプターを付加したアダプタープライマーを用いた第１のPCR、及びアダプターに相補的な配列からなるプライマーを用いた第２のPCRの２段階のPCRを行うことにより、検体中のHPVのコピー数が少なくても高感度でHPVを検出し得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。【００１１】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]  検体中のHPVをPCR反応により増幅してHPVの感染を検出する方法であって、
(a)  第１のPCRにおいて、HPV遺伝子に特異的にハイブリダイズするプライマーに、HPVゲノム、ヒトゲノム、並びにヒトに感染するウイルス及び微生物のゲノムにアニーリングしない配列からなるアダプターを付加したアダプタープライマーの対により増幅し、
(b)  第２のPCRにおいて、(a)の増幅産物を前記アダプターに相補的な配列からなるプライマーの対により増幅することを含む、
HPVの感染を検出する方法。
[２]  検体中のHPVのコピー数が1000コピー/ｍL以下である、[１]の方法。
[３]  検体中のHPVのコピー数が100コピー/ｍL以下である、[１]の方法。
[４]  検体中のHPVのコピー数が10コピー/ｍL以下である、[１]の方法。
[５]  検体が精液又は尿である、[１]〜[４]のいずれかの方法。
[６]  HPV遺伝子に特異的にハイブリダイズするプライマーがHPVのL1遺伝子に特異的にハイブリダイズするプライマーである、[１]〜[５]のいずれかの方法。
[７]  アダプターが、シロイヌナズナの遺伝子の部分配列からなる、[１]〜[６]のいずれかの方法。
[８]  アダプタープライマー対とプライマー対の組合せが以下の(i)〜(vi)のいずれかの組合せである、[１]〜[７]のいずれかの方法：
(i)  配列番号１３及び１４の配列からなるアダプタープライマー対、並びに配列番号１及び２の配列からなるアダプターに相補的な配列からなるプライマー対の組合せ；
(ii)  配列番号１５及び１６の配列からなるアダプタープライマー対、並びに配列番号３及び４の配列からなるアダプターに相補的な配列からなるプライマー対の組合せ；
(iii)  配列番号１７及び１８の配列からなるアダプタープライマー対、並びに配列番号５及び６の配列からなるアダプターに相補的な配列からなるプライマー対の組合せ；
(iv)  配列番号１９及び２０の配列からなるアダプタープライマー対、並びに配列番号７及び８の配列からなるアダプターに相補的な配列からなるプライマー対の組合せ；
(v)  配列番号２１及び２２の配列からなるアダプタープライマー対、並びに配列番号９及び１０の配列からなるアダプターに相補的な配列からなるプライマー対の組合せ；
(vi)  配列番号２３及び２４の配列からなるアダプタープライマー対、並びに配列番号１１及び１２の配列からなるアダプターに相補的な配列からなるプライマー対の組合せ。
[９]  アダプタープライマー対とプライマー対の組合せが以下の(xi)〜(xvi)のいずれかの組合せである、[１]〜[７]のいずれかに記載の方法：
(xi)  配列番号４８及び４９の配列からなるアダプタープライマー対、並びに配列番号３６及び３７の配列からなるアダプターに相補的な配列からなるプライマー対の組合せ；
(xii)  配列番号５０及び５１の配列からなるアダプタープライマー対、並びに配列番号３８及び３９の配列からなるアダプターに相補的な配列からなるプライマー対の組合せ；
(xiii)  配列番号５２及び５３の配列からなるアダプタープライマー対、並びに配列番号４０及び４１の配列からなるアダプターに相補的な配列からなるプライマー対の組合せ；
(xiv)  配列番号５４及び５５の配列からなるアダプタープライマー対、並びに配列番号４２及び４３の配列からなるアダプターに相補的な配列からなるプライマー対の組合せ；
(xv)  配列番号５６及び５７の配列からなるアダプタープライマー対、並びに配列番号４４及び４５の配列からなるアダプターに相補的な配列からなるプライマー対の組合せ；
(xvi)  配列番号５８及び５９の配列からなるアダプタープライマー対、並びに配列番号４６及び４７の配列からなるアダプターに相補的な配列からなるプライマー対の組合せ。
[１０]  (a)  HPV遺伝子に特異的にハイブリダイズするプライマーに、HPVゲノム、ヒトゲノム、並びにヒトに感染するウイルス及び微生物のゲノムにアニーリングしない配列からなるアダプターを付加したアダプタープライマーの対;と
(b)  前記アダプターに相補的な配列からなるプライマーの対を含む、
検体中のHPVをPCR反応により増幅してHPVの感染を検出するためのキット。
[１１]  検体中のHPVのコピー数が1000コピー/ｍL以下である、[１０]のキット。
[１２]  検体中のHPVのコピー数が100コピー/ｍL以下である、[１０]のキット。
[１３]  検体中のHPVのコピー数が10コピー/ｍL以下である、[１０]のキット。
[１４]  検体が精液又は尿である、[１０]〜[１３]のいずれかのキット。
[１５]  HPV遺伝子に特異的にハイブリダイズするプライマーがHPVのL1遺伝子に特異的にハイブリダイズするプライマーである、[１０]〜[１４]のいずれかのキット。
[１６]  アダプターが、シロイヌナズナの遺伝子の部分配列からなる、[１０]〜[１５]のいずれかのキット。
[１７]  アダプタープライマー対とプライマー対の組合せが以下の(i)〜(vi)のいずれかの組合せである、[１０]〜[１６]のいずれかのキット：
(i)  配列番号１３及び１４の配列からなるアダプタープライマー対、並びに配列番号１及び２の配列からなるアダプターに相補的な配列からなるプライマー対の組合せ；
(ii)  配列番号１５及び１６の配列からなるアダプタープライマー対、並びに配列番号３及び４の配列からなるアダプターに相補的な配列からなるプライマー対の組合せ；
(iii)  配列番号１７及び１８の配列からなるアダプタープライマー対、並びに配列番号５及び６の配列からなるアダプターに相補的な配列からなるプライマー対の組合せ；
(iv)  配列番号１９及び２０の配列からなるアダプタープライマー対、並びに配列番号７及び８の配列からなるアダプターに相補的な配列からなるプライマー対の組合せ；
(v)  配列番号２１及び２２の配列からなるアダプタープライマー対、並びに配列番号９及び１０の配列からなるアダプターに相補的な配列からなるプライマー対の組合せ；
(vi)  配列番号２３及び２４の配列からなるアダプタープライマー対、並びに配列番号１１及び１２の配列からなるアダプターに相補的な配列からなるプライマー対の組合せ。
[１８]  アダプタープライマー対とプライマー対の組合せが以下の(xi)〜(xvi)のいずれかの組合せである、[１０]〜[１６]のいずれかのキット：
(xi)  配列番号４８及び４９の配列からなるアダプタープライマー対、並びに配列番号３６及び３７の配列からなるアダプターに相補的な配列からなるプライマー対の組合せ；
(xii)  配列番号５０及び５１の配列からなるアダプタープライマー対、並びに配列番号３８及び３９の配列からなるアダプターに相補的な配列からなるプライマー対の組合せ；
(xiii)  配列番号５２及び５３の配列からなるアダプタープライマー対、並びに配列番号４０及び４１の配列からなるアダプターに相補的な配列からなるプライマー対の組合せ；
(xiv)  配列番号５４及び５５の配列からなるアダプタープライマー対、並びに配列番号４２及び４３の配列からなるアダプターに相補的な配列からなるプライマー対の組合せ；
(xv)  配列番号５６及び５７の配列からなるアダプタープライマー対、並びに配列番号４４及び４５の配列からなるアダプターに相補的な配列からなるプライマー対の組合せ；
(xvi)  配列番号５８及び５９の配列からなるアダプタープライマー対、並びに配列番号４６及び４７の配列からなるアダプターに相補的な配列からなるプライマー対の組合せ。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2018-167939号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のHPV遺伝子に特異的にハイブリダイズするプライマーにアダプターを付加したアダプタープライマーを用いた第１のPCR、及びアダプターに相補的な配列からなるプライマーを用いた第２のPCRの２段階のPCRにより、検体中のHPVのコピー数が10コピー/ｍL程度しか存在しない場合でも検出することが可能である。本発明の方法は、HPVのコピー数が少ない精液や子宮頸部から採取した細胞懸濁液や尿を検体として用いた場合でも高感度でHPVを検出することができる。また、本発明により従来行われていなかった、男性のHPV感染の検出を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明で用いたプライマーの配列を示す図である。
【図２】汎用プライマーセット（GP5+とGP6+とのプライマーセット又はMY11とMY09とのプライマーセット）を用いてPCR増幅した結果を示す図である。
【図３】1st PCRにアダプタープライマーセット（adaptor01-GP5+とadaptor02-GP6+とのプライマーセット又はadaptor03-MY11とadaptor04-MY09とのプライマーセット）を用いてPCR増幅した結果を示す図である。
【図４】アダプタープライマーセットとして、adaptor05-GP5+とadaptor06-GP6+とのプライマーセット（図４左）又はadaptor07-GP5+とadaptor08-GP6+とのプライマーセット（図４右）を用いてPCR増幅した結果を示す図である。
【図５】アダプタープライマーセットとして、adaptor09-MY11とadaptor010-MY09とのプライマーセット（図５左）、又はadaptor011-MY11とadaptor012-MY09とのプライマーセット（図５右）を用いてPCR増幅した結果を示す図である。
【図６】尿検体を用いたHPVゲノムDNAの検出の結果を示すアガロースゲル電気泳動像を示す図である。
【図７】汎用されるMY11及びMY09プライマーセットを用いたときのHPV Type 16の検出の結果（図７Ａ）及び、HPV Type 18の検出の結果（図７Ｂ）を示す。
【図８】本発明で用いたHPVの型特異的プライマーを用いたHPV Type 16の検出結果を示す図である。
【図９】本発明で用いたHPVの型特異的プライマーを用いたHPV Type 18の検出結果を示す図である。
【図１０】本発明で用いたHPVの型特異的プライマーの配列を示す図である（その２）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１５】
本発明は、ヒトパピローマウイルス（HPV)の遺伝子をPCRにより増幅して検出する方法であり、本発明の方法により高感度でHPVを検出することができる。すなわち、検体中にHPVが1000コピー/ｍL以下、好ましくは100コピー/ｍL以下、さらに好ましくは10コピー/ｍL以下あるいは10コピー/ｍL未満しか存在しない場合でも検出することができる。
【００１６】
このため、HPVの存在量が少ない男性の精液を検体として用いた場合も検体中のHPVを検出することができる。男性の精液中にHPVが存在する場合、感染による症状が現れることは稀であるが、性交渉によりセックスパートナーに感染してしまうので、精液中のHPVの検出は未然に他者への感染を防ぐという意義がある。また、女性のHPVに感染しているか否かの検査は、綿棒（スワブ）やプラスチック製のブラシ等で子宮頸部や頸管部をこすり、子宮頸部の細胞を採取し、採取した細胞懸濁液中にHPVが存在するかをPCRにより測定する。このとき、HPVを検出するためには、検体中に105〜107コピー/ｍLのHPVが存在する必要があり、検体中に十分な数のHPVを含ませるためには、子宮頸部や頸管部を強くこする必要があり、苦痛が大きかった。
【００１７】
さらに、本発明においては、男性又は女性の尿を検体として用いた場合も検体中のHPVを検出することができる。
【００１８】
本発明において、HPVの遺伝子増幅用アダプタープライマーを用いたアダプターPCRによりHPVの遺伝子を増幅し、HPVを検出する。
【００１９】
本発明の方法において検体としては、男性被験体から採取した精液、女性被験体の子宮頸部から採取した細胞懸濁液、男性被験体又は女性被験体から採取した尿を用いることができる。また、男性被験体又は女性被験体から採取した唾液、組織液、髄液、拭い液、血清、血漿、血液、便等も用いることができる。検体量は精液または尿の場合、５μL〜10ｍL、好ましくは10μ〜１ｍLを用いれば、例えば、精液の場合、５μL〜100μL、好ましくは10μL〜50μL、尿の場合、200μL〜10mL、好ましくは200μL〜５mL、さらに好ましくは500μL〜１mLを用いれば、検体中のHPV遺伝子を増幅することができる。
【００２０】
HPVは約7.9bpの環状２本鎖DNAを有するウイルスであり、ヒトの粘膜や皮膚に感染する。HPVのDNAは、遺伝子発現を調節する領域であるURR（upstream regulatory region）、ウイルスの複製に関与する非構造タンパク質をコードする初期遺伝子群であるE1、E2、E4、E5、E6及びE7の６つの遺伝子、ウイルスキャプシドをコードする後期遺伝子群であるL1及びL2の２つの遺伝子を含む。L1及びL2はウイルス粒子を構成するキャプシドタンパク質であり、宿主細胞への吸着及び侵入に関与する。
【００２１】
本発明の方法で、検出し得るHPVの型として、6b型、16型、18型、31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、53型、56型、58型、59型、67型、68型、69型、70型、73型、82型が挙げられ、この中でも感染により将来的に悪性の子宮頸がんに罹患する可能性が高い6b型、16型、18型の他、日本人において、悪性の子宮頸がんに罹患する可能性が高い53型が好ましい。
【００２２】
HPV 16型のL1遺伝子の塩基配列及びHPV 6b型のL1遺伝子の塩基配列を、それぞれ、配列番号３２及び３３に示す。これらの配列情報あるいは公知のHPVの遺伝子配列情報に基づいてプライマーの配列を設計することができる。
【００２３】
本発明の方法によりHPV遺伝子を増幅させるためには、HPVの遺伝子に特異的にハイブリダイズするプライマーの5'側にアダプター配列を付加したフォワードプライマーとリバースプライマーのプライマー対を用いて第１の増幅（1st PCR)を行い、次いで増幅産物に対してアダプター配列にハイブリダイズするフォワードプライマーとリバースプライマーのプライマー対を用いて第２の増幅（2nd PCR)を行えばよい。HPVの遺伝子に特異的にハイブリダイズするプライマーの5'側にアダプター配列を付加したプライマーは、HPVの領域特異的配列プライマーとアダプターからなり、アダプタープライマーと呼ぶ。
【００２４】
HPVの遺伝子に特異的にハイブリダイズするプライマーの塩基長は、5〜50塩基、好ましくは10〜40塩基、さらに好ましくは15〜35塩基、さらに好ましくは20〜30塩基である。
【００２５】
HPVの遺伝子に特異的にハイブリダイズするプライマー対は、HPV遺伝子の40〜1000塩基、好ましくは200〜300塩基の長さの領域を増幅できるように設計すればよい。すなわち、HPV遺伝子の40〜1000塩基、好ましくは100〜500塩基、さらに好ましくは150〜450塩基の領域の3'側と5'側の両端にハイブリダイズするように設定すればよい。このようなプライマー対を用いることにより、40〜1000塩基、好ましくは100〜500塩基、さらに好ましくは150〜450塩基の長さの増幅産物が得られる。HPVの遺伝子にハイブリダイズするプライマーは各型のHPV遺伝子の塩基配列の連続した塩基配列において、数個、好ましくは1〜5個、さらに好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１個又は２個、さらに好ましくは１個のミスマッチを有していてもよい。この結果、１セットのプライマー対で特定の型のHPVだけではなく、多数の型のHPV遺伝子を増幅することができ、多数の型のHPVを検出することができる。
【００２６】
HPVのL1はHPVの多数の型（サブタイプ）において、保存された領域であり、各型間における配列同一性が高い。本発明の方法においては、好ましくはL1をコードするDNAとハイブリダイズするプライマー対を用いてL1をコードするDNAを増幅すればよい。
【００２７】
ただし、HPVの各型の間で100％の配列同一性で20塩基程度連続する配列は存在しない。そこで、上記のようにHPVの型によっては、プライマーの配列とHPVの遺伝子の配列の間にミスマッチがあってもよい。この場合、例えば、アニーリング温度を下げ、特異性を低下させればよい。また、複数のプライマー対を用いるmultiplex PCRにより増幅してもよい。
【００２８】
HPVのL1遺伝子に特異的な配列として、例えば、公知のHPV検出の汎用プライマー対を用いることができる。このようなプライマー対として、フォワードプライマーGP5+（配列番号２５）とリバースプライマーGP6+（配列番号２６）のプライマー対、フォワードプライマーMY11（配列番号２７）とリバースプライマーMY09（配列番号２８）のプライマー対、フォワードプライマーL1C1（配列番号２９）とリバースプライマーL1C2（配列番号３０）若しくはリバースプライマーL1C2M（配列番号３１）等がある。これらのプライマーについては、例えば、Mori S et al., Cancer Sci, June 2011, vol.102, no.6, pp.1223-1227に記載されている。GP5+とGP6+の間の塩基長は142塩基であり、MY11とMY09の間の塩基長は452塩基であり、L1C1とL1C2若しくはL1C2Mの間の塩基長は253塩基である。
【００２９】
アダプターの塩基長は、10〜40塩基、好ましくは10〜30塩基、さらに好ましくは15〜20塩基である。
【００３０】
アダプターの配列はCG含量やAT含量が高いと高次構造をとりやすくなってしまうので、好ましくはGC含量が50〜65％になるように設計する。また、両端が連結しないように設定する。また、Tm値は50〜70℃、好ましくは55〜65℃、さらに好ましくは60±1℃になるように設計すればよい。
【００３１】
アダプター配列は、検体に存在する可能性があるHPVゲノム、ヒトゲノム、ヒトに感染するウイルスや微生物のゲノム等のアニーリングしないように設計する。好ましくは、人工的に設計した配列とする。例えば、配列が解析されている植物やヒト以外の動物のゲノムの配列からフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列を取得すればよい。人工的な配列や、植物やヒト以外の動物のゲノム配列から設計する場合、Primer3web（http://primer3.ut.ee/)等のPCRプライマー設計ツールを用いて設計することができる。
【００３２】
例えば、高等植物であるイネ、シロイヌナズナ等の遺伝子のゲノム配列からアダプター配列を選択することができる。すなわち、例えば、アダプター配列はシロイヌナズナ遺伝子の配列の部分配列からなり得る。この際、検体中にシロイヌナズナゲノムが混入し増幅が起こるおそれを考慮し、対となるアダプター配列を、それぞれ、シロイヌナズナの異なる染色体の配列から設計することが好ましい。
【００３３】
アダプターとして、例えば、配列番号１〜１２に表す配列からなるadaptor01〜adaptor12が挙げられ、adaptor01とadaptor02、adaptor03とadaptor04、adaptor05とadaptor06、adaptor07とadaptor08、adaptor09とadaptor10、adaptor11とadaptor12の組み合わせで、それぞれ、フォワードプライマー及びリバースプライマーに付加すればよい。配列番号１〜１２に表す配列からなるアダプターは、シロイヌナズナ遺伝子の配列から設計したアダプターである。
【００３４】
さらに、アダプターとして、例えば、それぞれ、配列番号３６〜４７に表す配列からなるadaptor13〜adaptor24が挙げられ、adaptor13とadaptor14、adaptor15とadaptor16、adaptor17とadaptor18、adaptor19とadaptor20、adaptor21とadaptor22、adaptor23とadaptor24の組み合わせで、それぞれ、フォワードプライマー及びリバースプライマーに付加すればよい。配列番号３６〜４７に表す配列からなるアダプターは、シロイヌナズナ遺伝子の配列から設計したアダプターである。
【００３５】
HPVの遺伝子に特異的にハイブリダイズするプライマーへのアダプターの付加は、DNA鎖の末端同士をリン酸ジエステル結合で連結するライゲーションにより行えばよい。ライゲーションは、DNAリガーゼを用いて公知の方法で行うことができる。DNAリガーゼとしては、T4 DNAリガーゼ、大腸菌DNAリガーゼ等の常温性DNAリガーゼを用いることができる。また、耐熱性DNAリガーゼを用いてもよい。
【００３６】
HPVの遺伝子に特異的にハイブリダイズするプライマーとアダプターはリンカーを介して連結していてもよい。リンカーの配列はHPVのゲノム中の配列とは相補的にならないように設計する。リンカーの塩基長は、10塩基以下、好ましくは５塩基以下である。リンカーが存在する場合であっても、アダプタープライマーは、HPVの遺伝子に特異的にハイブリダイズするプライマーにアダプターが付加されたプライマーであるという。
【００３７】
本発明で用いるアダプタープライマーとして、例えば、配列番号１３〜２４で表される塩基配列からなるアダプタープライマーが挙げられる。配列番号１３及び１４のアダプタープライマーは、GP5+にadaptor01を付加したフォワードプライマー（adaptor01-GP5+)とGP6+にadaptor02を付加したリバースプライマー(adaptor02-GP6+)の対であり、配列番号１５及び１６のアダプタープライマーは、MY11にadaptor03を付加したフォワードプライマー(adaptor03-MY11)とMY09にadaptor04を付加したリバースプライマー（adaptor04-MY09)の対であり、配列番号１７及び１８のアダプタープライマーは、GP5+にadaptor05を付加したフォワードプライマー（adaptor05-GP5+)とGP6+にadaptor06を付加したリバースプライマー(adaptor06-GP6+)の対であり、配列番号１９及び２０のアダプタープライマーは、MY11にadaptor07を付加したフォワードプライマー(adaptor07-MY11)とMY09にadaptor08を付加したリバースプライマー（adaptor08-MY09)の対であり、配列番号２１及び２２のアダプタープライマーは、GP5+にadaptor09を付加したフォワードプライマー（adaptor09-GP5+)とGP6+にadaptor10を付加したリバースプライマー(adaptor10-GP6+)の対であり、配列番号２３及び２４のアダプタープライマーは、MY11にadaptor11を付加したフォワードプライマー(adaptor11-MY11)とMY09にadaptor12を付加したリバースプライマー（adaptor12-MY09)の対である。
【００３８】
さらに、本発明で用いるアダプタープライマーとして、例えば、配列番号４８〜５９で表される塩基配列からなるアダプタープライマーが挙げられる。こ配列番号４８及び４９のアダプタープライマーは、L1タンパク質をコードする領域を標的とするL1プライマーの先頭に、それぞれadaptor13及びadapter14を付加したフォワードプライマー（adapter13-16_L1_F1)とリバースプライマー(adapter14-16_L1_R1)の対であり、配列番号５０及び５１のアダプタープライマーは、L1タンパク質をコードする領域を標的とするL1プライマーの先頭に、それぞれadaptor15及びadapter16を付加したフォワードプライマー（adapter15-16_L1_F2)とリバースプライマー(adapter15-16_L1_R2)の対であり、配列番号５２及び５３のアダプタープライマーは、L1タンパク質をコードする領域を標的とするL1プライマーの先頭に、それぞれadaptor17及びadapter18を付加したフォワードプライマー（adapter17-16_L1_F3)とリバースプライマー(adapter18-16_L1_R3)の対であり、配列番号５４及び５５のアダプタープライマーは、L1タンパク質をコードする領域を標的とするL1プライマーの先頭に、それぞれadaptor19及びadapter20を付加したフォワードプライマー（adapter19-18_L1_F1)とリバースプライマー(adapter20-18_L1_R1)の対であり、配列番号５６及び５７のアダプタープライマーは、L1タンパク質をコードする領域を標的とするL1プライマーの先頭に、それぞれadaptor21及びadapter22を付加したフォワードプライマー（adapter21-18_L1_F2)とリバースプライマー(adapter22-18_L1_R2)の対であり、配列番号５８及び５９のアダプタープライマーは、L1タンパク質をコードする領域を標的とするL1プライマーの先頭に、それぞれadaptor23及びadapter24を付加したフォワードプライマー（adapter23-18_L1_F3)とリバースプライマー(adapter24-18_L1_R3)の対である。
【００３９】
本発明のHPVの遺伝子増幅法では、第１のPCRにおいて、上記のアダプタープライマーを用いてPCR伸長反応を行い検体中のHPV遺伝子を増幅する。
【００４０】
PCR反応は、DNAポリメラーゼを用いて通常用いる条件で公知の方法で行えばよい。PCR反応の条件は、プライマーのTm値等に基づいて適宜設定することができる。例えば、検体にプライマーとdNTP混合物やポリメラーゼを含むPCR試薬を添加し、94℃で５分間加熱後、98℃で10秒加熱、45℃で30秒冷却、72℃で30秒加熱を１サイクルとして10〜50サイクル程度繰り返せばよい。用いるポリメラーゼは、限定される、Taqポリメラーゼ等の公知のポリメラーゼをもちることができる。
【００４１】
第１のPCRにより得られる増幅産物は、両側末端にアダプターに相補的な配列を有する。
【００４２】
第２のPCRにおいては、増幅産物中のアダプターに相補的な配列に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドをプライマーとして用い、PCRを行えばよい。該プライマーは好ましくはアダプターと同じ配列であるが、数個、好ましくは1〜5個、さらに好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１個又は２個、さらに好ましくは１個のミスマッチを有していてもよい。該プライマーをアダプター用プライマーと呼ぶことがある。第２のPCRの結果、第１のPCRにより得られた増幅産物がさらに増幅される。
【００４３】
第２のPCRの反応条件は、第１のPCRと同様に、適宜設定することができる。例えば、94℃で５分間加熱後、98℃で10秒加熱、58℃で30秒冷却、72℃で30秒加熱を１サイクルとして10〜50サイクル程度繰り返せばよい。
【００４４】
得られたPCR産物は、アガロースゲル電気泳動により確認することができる。アガロースゲル電気泳動により目的のサイズのDNAが増幅されているか否かを調べればよい。
【００４５】
本発明の方法によれば、検体中のHPVを高感度で検出することができ、検体中のHPVのコピー数が、1000コピー/ｍL、好ましくは100コピー/ｍL、さらに好ましくは10コピー/ｍL程度しか存在しなくても検出することができる。これは、従来のPCRによるHPVの検出法よりも100〜1000倍高い感度である。
【００４６】
本発明は、上記のHPV遺伝子に特異的にハイブリダイズするプライマーに、HPVゲノム、ヒトゲノム、並びにヒトに感染するウイルス及び微生物のゲノムにアニーリングしない配列からなるアダプターを付加したアダプタープライマーの対と前記アダプターに相補的な配列からなるプライマーの対を含む、検体中のHPVをPCR反応により増幅してHPVの感染を検出するためのキットをも包含する。
【００４７】
また、該キットは適宜、PCR反応溶液、酵素、試料を処理するための試薬等を含んでいてもよい。
【実施例】
【００４８】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。【００４９】
[実施例１]  HPVの遺伝子増幅用アダプタープライマーを用いたアダプターPCRの開発
方法
１．  HPV L1配列を含むプラスミドの調製
（１）  HPV Type6b, 16, 18, 53のL1遺伝子領域620塩基をそれぞれ、In-Fusion（登録商標） HD Cloning Kit（タカラバイオ）を用いてpUC19プラスミドへ導入した。【００５０】
（２）  それぞれのL1遺伝子領域が導入されたpUC19プラスミドを精製し、101、103、105、107copy/μlとなるように濃度調整した【００５１】
２．  プライマーにおけるアダプター配列の設計
本法は2回のPCRを行う。1st PCRはHPVのL1遺伝子とアニーリングし、DNAを増幅する既知のプライマーの5’側に20塩基のアダプター配列を付加したプライマーを用いて行う。2nd PCRはアダプター配列のみのプライマーで行う。アダプター配列は検体に含まれることが想定されるHPVゲノム、ヒトゲノム、ヒトに感染するウイルスや微生物のゲノムとアニーリングしない配列とするため、高等植物であるシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のゲノムから設計し、さらにシロイヌナズナゲノムの混入によるPCR増幅を避けるためにペアとなるアダプター配列を、それぞれ異なる染色体から設計したものを選択した。【００５２】
（１）  シロイヌナズナ遺伝子AT1G62710、AT2G22770、AT3G15950、AT4G28520のゲノム配列からPrimer3web（http://primer3.ut.ee/）を用いて、各遺伝子から10セットのフォワードプライマーとリバースプライマー配列を取得した。Primerの塩基長は20、Tm値は60±1℃、GC％は50から65となるよう設定した。【００５３】
（２）  シロイヌナズナ遺伝子AT1G62710、AT3G15950から取得したフォワードプライマーを、アダプター配列として（HPVの検出で汎用される）GP5+, GP6+プライマーセットのGP5＋の5’末端に付加したオリゴDNAを作製した。シロイヌナズナ遺伝子AT2G22770、AT4G28520から取得したリバースプライマーを、アダプター配列としてGP6+の5’末端に付加したオリゴDNAを作製した。【００５４】
（３）  （２）と同様に、シロイヌナズナ遺伝子AT1G62710、AT3G15950から取得したフォワードプライマーをHPVの検出で汎用される MY11, MY9プライマーセットのMY11の5’末端に付加したオリゴDNAを作成し、シロイヌナズナ遺伝子AT2G22770、AT4G28520から取得したリバースプライマーをMY09の5’末端に付加したオリゴDNAを作製した（adaptor01-GP5+, adaptor02-GP6+など）。【００５５】
adaptor01〜adaptor12の塩基配列を図１及び配列番号１〜１２に表す。また、HPV検出用プライマーにadaptor配列を付加したアダプタープライマーであるadaptor01-GP5+、adaptor02-GP6+、adaptor03-MY11、adaptor04-MY09、adaptor05-GP5+、adaptor06-GP6+、adaptor07-MY11、adaptor08-MY09、adaptor09-GP5+、adaptor10-GP6+、adaptor11-MY11、adaptor12-MY09の塩基配列を図１及び配列番号１３〜２４に表す。
GP5+、GP6+、MY11及びMY09の配列を、配列番号２５〜２８に表す。【００５６】
３．  設計したオリゴDNAをプライマーとして使用したPCRの検証
（１）  汎用されているGP5+とGP6+とのプライマーセット、MY11とMY09とのプライマーセット、作成したオリゴDNAプライマーセット（adaptor01-GP5+とadaptor02-GP6+とのプライマーセット、adaptor03-MY11とadaptor04-MY09とのプライマーセット、adaptor05-GP5+とadaptor06-GP6+とのプライマーセット、adaptor07-MY11とadaptor08-MY09とのプライマーセット、adaptor09-GP5+とadaptor10-GP6+とのプライマーセット、adaptor11-MY11とadaptor12-MY09とのプライマーセット）を用いてPCRを行った。PCR酵素はタカラバイオ社のEmeraldAmp（登録商標） MAX PCR Master Mixを用い、１．で調製したプラスミドを鋳型とした。
PCR反応液の組成は以下のとおりであった。【００５７】
GP5+とGP6+とのプライマーセットを用いた場合
２×M.Mix    10.00μl
ddH2O         8.50μl
GP5+(20μM)   0.25μl
GP6+(20μM)   0.25μl
鋳型          1.00μl
トータル     20.00μl
MY11とMY09とのプラーマーセットを用いた場合
２×M.Mix    10.00μl
ddH2O         5.00μl
GP5+(20μM)   2.00μl
GP6+(20μM)   2.00μl
鋳型          1.00μl
トータル     20.00μl【００５８】
PCR装置はApplied Biosystems（登録商標） 2720サーマルサイクラーを用い、PCRプログラムは「94℃-5分, (98℃-10秒, 45℃-30秒, 72℃-30秒)×40サイクル」とした(1st PCR条件）。【００５９】
（２）  （１）の1st PCR産物を1μl分取し、アダプター配列のみのプライマー（adaptor01〜adaptor12）を用いて2回目のPCR(2nd PCR)を行った。PCR酵素はタカラバイオ社のEmeraldAmp（登録商標） MAX PCR Master Mixを用いた。
2nd PCR反応液の組成は以下のとおりであった。【００６０】
adaptor1とadaptor2とのプライマーセットを用いた場合
２×M.Mix        10.00μl
ddH2O             8.50μl
adaptor01(20μM)   0.25μl
adaptor02(20μM)   0.25μl
鋳型              1.00μl
トータル         20.00μl【００６１】
上の例は、1st PCRにadaptor01-GP5+とadaptor02-GP6+とのプライマーセットを用い、2nd PCRに対応するadaptor01とadaptor02とのプライマーセットを用いている。1st PCRにadaptor03-MY11とadaptor04-MY09とのプライマーセット、adaptor05-GP5+とadaptor06-GP6+とのプライマーセット、adaptor07-MY11とadaptor08-MY09とのプライマーセット、adaptor09-GP5+とadaptor10-GP6+とのプライマーセット、又はadaptor11-MY11とadaptor12-MY09とのプライマーセットを用いた場合には、2nd PCRには、それぞれ、adaptor03とadaptor04とのプライマーセット、adaptor05とadaptor06とのプライマーセット、adaptor07とadaptor08とのプライマーセット、adaptor09とadaptor10とのプライマーセット、adaptor11とadaptor12とのプライマーセットを用いればよい。【００６２】
PCRプログラムは「94℃-5分, (98℃-10秒, 58℃-30秒, 72℃-30秒)×40サイクル」とした。【００６３】
（３）  （２）のPCR産物5μlを2％アガロースゲル（蛍光物質として0.002％ MidoriGreen Advance（日本ジェネティクス社）を添加）にアプライし、100Vで25分間電気泳動した。【００６４】
（４）  UVトランスイルミネーターでDNAの検出を行った。【００６５】
結果
（１）汎用プライマーセットを用いた場合
汎用プライマーセット（GP5+とGP6+とのプライマーセット又はMY11とMY09とのプライマーセット）を用いてPCR増幅した結果を図２に示す。図２ＡはHPV type 6及びHPV type 16の結果を示し、図２ＢはHPV type 18及びHPV type 53の結果を示す。【００６６】
図２Ａ及び図２Ｂに示すように、汎用されているGP5+とGP6+とのプライマーセット及びMY11とMY09とのプライマーセットを用いた場合、HPV type 6、16、18及び53を5x104コピー/tubeの濃度で検出することができたが、5x102コピー/tubeの濃度では検出することができなかった。【００６７】
（２）アダプタープライマーセットを用いた場合
1st PCRにアダプタープライマーセット（adaptor01-GP5+とadaptor02-GP6+とのプライマーセット又はadaptor03-MY11とadaptor04-MY09とのプライマーセット）を用いてPCR増幅した結果を図３に示す。図３ＡはHPV type 6及びHPV type 16の結果を示し、図３ＢはHPV type 18及びHPV type 53の結果を示す。【００６８】
図３Ａ及び図３Ｂに示すように、GP5+プライマー及びGP6+プライマーに、それぞれ、adaptor01及びadaptor02を付加したプライマー（adaptor01-GP5+とadaptor02-GP6+）を用いることにより、HPV type 6、16及び18では、101コピー/tubeの濃度で検出することができた。【００６９】
一方、MY11プライマー及びMY09プライマーに、それぞれ、adaptor03及びadaptor04を付加したプライマー（adaptor03-MY11とadaptor04-MY09）を用いた場合は、感度の向上は認められなかった。【００７０】
同様に、図４にアダプタープライマーセットとして、adaptor05-GP5+とadaptor06-GP6+とのプライマーセット（図４Ａ）又はadaptor07-GP5+とadaptor08-GP6+とのプライマーセット（図４Ｂ）を用いてPCR増幅した結果を示す。また、図５にアダプタープライマーセットとして、adaptor09-MY11とadaptor010-MY09とのプライマーセット（図５Ａ）、又はadaptor011-MY11とadaptor012-MY09とのプライマーセット（図５Ｂ）を用いてPCR増幅した結果を示す。【００７１】
図４Ａ及び図４Ｂが示すように、GP5+プライマー及びGP6+プライマーに、それぞれ、adaptor05及びadaptor06を付加したプライマー（adaptor05-GP5+とadaptor06-GP6+）、あるいはGP5+プライマー及びGP6+プライマーに、それぞれ、adaptor07及びadaptor08を付加したプライマー（adaptor07-GP5+とadaptor08-GP6+）では、HPV type 6、16、18及び53で、101コピー/tubeの濃度で検出することができ、感度の向上が認められた。【００７２】
また、図５Ａ及び図５Ｂが示すように、MY11プライマー及びMY09プライマーにそれぞれ、adaptor09及びadaptor010を付加したプライマー（adaptor09-MY11とadaptor010-MY09）、あるいはMY11プライマー及びMY09プライマーに、それぞれ、adaptor011及びadaptor012を付加したプライマー（adaptor011-MY11とadaptor012-MY09）でもHPV type 6、16、18及び53で、101コピー/tubeの濃度で検出することができ、感度の向上が認められた。【００７３】
[実施例２]  検体（精液）を用いたPCR反応
165名の精液20μlに80μlのバッファ1（20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 400mM NaCl, 0.3% SDS, pH8.0）を加えて混和し、95℃で5分間加熱した。【００７４】
次いで、10μlのプロティナーゼK溶液（20 mg/ml, 富士フィルム）、2μlの1M DTT（富士フィルム）を加えて混和し、50℃で10分間加熱した。その後、25℃で16時間インキュベートした。【００７５】
NucleoSpin(登録商標） Tissue XS（マッハライナーゲル社）を用いて、取説に従いDNAを抽出した。HPVの検出のために、1st PCRではadpter01-GP5+（配列番号１３）とadapter02-GP6+（配列番号１４）のセットを用い、2nd PCRでadapter01（配列番号１）とadapter02（配列番号２）のセットを用いた。DNA抽出を確認するために、ヒトβ-globin遺伝子領域を増幅するプライマーセット（GH20/GH21）を用いてPCRを行った。【００７６】
PCR組成はプライマーの量を除いて実施例１と同様であった。用いたプライマー配列は、GH20：GAAGAGCCAAGGACAGGTAC（配列番号３４）、及びGH21：GGAAAATAGACCAATAGGCAG（配列番号３５）であった。【００７７】
PCRプログラムは「94℃-5分, (98℃-10秒, 58℃-30秒, 72℃-30秒)×30サイクル」であった。【００７８】
すべての検体において特異的増幅を確認した。【００７９】
精子から抽出したDNA 1μlを用いて、実施例１に記載の方法で精子からHPVゲノムDNAを検出することができた。【００８０】
【表１】
2020050350.tif 000002
【００８１】
結果を表１に示す。表１に示すように、陽性率が大幅に改善している。【００８２】
[実施例３]  尿検体からのDNA抽出と検出
1 mlの尿検体に200μlの3M 酢酸ナトリウム溶液（ニッポンジーン）、3mlのエタノール（富士フィルム）、50μlの20mg/mlグリコーゲン溶液（ナカライテスク）を加え、転倒混和を10回行った。次いで、マイナス20℃で16時間インキュベートした後、4℃下で16,000×g、30分間遠心分離を行った。ペレットを吸わないように上清を捨て、4 mlの80％エタノールを加えた。その後、4℃下で16,000×g、30分間遠心分離を行った。ペレットを吸わないように上清を捨て、ペレットをNucleoSpin Tissue（登録商標）Tissue（タカラバイオ）に供し、取説に従いDNAを抽出した。【００８３】
以降は、実施例２の精液検体と同じ方法で検出した。【００８４】
増幅したDNAのアガロースゲル電気泳動写真を図６に示す。図６中、左からマーカー検体１〜20の電気泳動像を示す。２番と９番の検体が陽性であり、他は陰性であった。【００８５】
実施例３の結果が示すように、尿から抽出したDNA 1μlを用いて、実施例１に記載の方法で尿からHPVゲノムDNAを検出することができた。【００８６】
[実施例４]  HPVの型特異的プライマーの検証【００８７】
HPV type6, 18のL1タンパク質コード領域をDNA鋳型として使用した。
101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 copy/μLに調整した。
EmeraldAmp（登録商標） MAX PCR Master MixでPCRを行った。
その後、2.5%アガロースゲル（+0.002% MidoriGreen Advance）で電気泳動を行った。【００８８】
1st PCRの反応液の組成は以下のとおりであった。
２×M.Mix        10.00μl
ddH2O             5.00μl
MY11(20μM)       0.25μl
MY09(20μM)       0.25μl
鋳型              1.00μl
トータル         20.00μl【００８９】
1st PCRの条件は、「94℃-5分, (98℃-10秒, 45℃-30秒, 72℃-30秒)×40サイクル」であった。【００９０】
（１）汎用プライマーの検証
汎用されるMY11及びMY09プライマーセットを用いたときの結果を図７に示す。図７ＡはHPV Type 16の検出の結果、図７ＢはHPV Type 18の検出の結果を示す。
汎用されるMY11,MY09プライマーセットはHPV type 16に関しては10コピー/tubeから検出可能であり、type 18に関しては10コピー/tubeから検出可能であった。【００９１】
なお、検体中のHPVが10コピー/ｍL存在すれば、1st PCRに必要な10コピー/tubeが得られる。従って、本発明の方法では、検体中のHPVが10コピー/ｍL存在すれば検出することができる。【００９２】
（２）新規プライマーの検証
1st PCRは、5'末端用に開発したアダプタープライマー配列（adapter13〜24が先頭に付くL1プライマー）を使用した。用いたアダプタープライマーの配列を図１０及び配列番号４８〜５９に示す。【００９３】
1st PCR産物１μlを鋳型とし、2nd PCRを行った。2nd PCRのプライマーはadapter13〜adapter24を使用した。用いたプライマーの配列を図１０及び配列番号３６〜４７に示す。【００９４】
1st PCRの反応液の組成は以下のとおりであった。
２×M.Mix        10.00μl
ddH2O             8.50μl
primer F(20μM)   0.25μl
primer R(20μM)   0.25μl
鋳型              1.00μl
トータル         20.00μl【００９５】
1st PCRの条件は、「94℃-5分, (98℃-10秒, 45℃-30秒, 72℃-30秒)×30サイクル」であった。【００９６】
2nd PCRの反応液の組成は以下のとおりであった。
２×M.Mix        10.00μl
ddH2O             8.50μl
primer F(20μM)   0.25μl
primer R(20μM)   0.25μl
1st PCR産物       1.00μl
トータル         20.00μl【００９７】
2nd PCRの条件は、「94℃-5分, (98℃-10秒, 45℃-30秒, 72℃-30秒)×30サイクル」であった。【００９８】
Type 16の検出結果を図８に、Type 18の検出結果を図９に示す。図８Ａは1stプライマー（アダプタープライマー）セットとして、adapter13-16_L1_F1及びadapter14-16_L1_R1を用い、2ndプライマーセットとして、adapter13及びadapter14を用いたときの結果、図８Ｂは1stプライマー（アダプタープライマー）セットとして、adapter15-16_L1_F2及びadapter16-16_L1_R2を用い、2ndプライマーセットとして、adapter15及びadapter16を用いたときの結果、図８Ｃは1stプライマー（アダプタープライマー）セットとして、adapter17-16_L1_F3及びadapter18-16_L1_R3を用い、2ndプライマーセットとして、adapter17及びadapter18を用いたときの結果を示す。また、図９Ａは1stプライマー（アダプタープライマー）セットとして、adapter19-18_L1_F1及びadapter20-18_L1_R1を用い、2ndプライマーセットとして、adapter19及びadapter20を用いたときの結果、図９Ｂは1stプライマー（アダプタープライマー）セットとして、adapter21-18_L1_F2及びadapter22-18_L1_R2を用い、2ndプライマーセットとして、adapter21及びadapter22を用いたときの結果、図８Ｃは1stプライマー（アダプタープライマー）セットとして、adapter23-18_L1_F3及びadapter24-18_L1_R3を用い、2ndプライマーセットとして、adapter23及びadapter24を用いたときの結果を示す。  adapter13-24はシロイヌナズナAT2G22770.1配列から取得した配列である。【００９９】
図８及び９に示すように、すべてのプライマーで従来法では検出できなかった101コピー/tubeの検出が可能であった。【０１００】
図１０に新規に開発したHPVの型特異的プライマーの配列を示す。
【産業上の利用可能性】
【０１０１】
本発明の方法は高感度でのHPVの検出に利用することができる。
【配列表フリーテキスト】
【０１０２】
配列番号１：プライマー（adaptor01)
配列番号２：プライマー（adaptor02)
配列番号３：プライマー（adaptor03)
配列番号４：プライマー（adaptor04)
配列番号５：プライマー（adaptor05)
配列番号６：プライマー（adaptor06)
配列番号７：プライマー（adaptor07)
配列番号８：プライマー（adaptor08)
配列番号９：プライマー（adaptor09)
配列番号１０：プライマー（adaptor10)
配列番号１１：プライマー（adaptor11)
配列番号１２：プライマー（adaptor12)
配列番号１３：プライマー（adaptor01-GP5+）
配列番号１４：プライマー（adaptor02-GP6+）
配列番号１５：プライマー（adaptor03-MY11)
配列番号１６：プライマー（adaptor04-MY09)
配列番号１７：プライマー（adaptor05-GP5+）
配列番号１８：プライマー（adaptor06-GP6+）
配列番号１９：プライマー（adaptor07-MY11)
配列番号２０：プライマー（adaptor08-MY09)
配列番号２１：プライマー（adaptor09-GP5+）
配列番号２２：プライマー（adaptor10-GP6+）
配列番号２３：プライマー（adaptor11-MY11)
配列番号２４：プライマー（adaptor12-MY09)
配列番号２５：プライマー（GP5+）
配列番号２６：プライマー（GP6+）
配列番号２７：プライマー（MY11)
配列番号２８：プライマー（MY09)
配列番号２９：プライマー（L1C1)
配列番号３０：プライマー（L1C2)
配列番号３１：プライマー（L1C2M)
配列番号３４：プライマー（GH20）
配列番号３５：プライマー（GH21)
配列番号３６：プライマー（adapter13)
配列番号３７：プライマー（adapter14)
配列番号３８：プライマー（adapter15)
配列番号３９：プライマー（adapter16)
配列番号４０：プライマー（adapter17)
配列番号４１：プライマー（adapter18)
配列番号４２：プライマー（adapter19)
配列番号４３：プライマー（adapter20)
配列番号４４：プライマー（adapter21)
配列番号４５：プライマー（adapter22)
配列番号４６：プライマー（adapter23)
配列番号４７：プライマー（adapter24)
配列番号４８：プライマー（adapter13-16_L1_F1)
配列番号４９：プライマー（adapter14-16_L1_R1)
配列番号５０：プライマー（adapter15-16_L1_F2)
配列番号５１：プライマー（adapter16-16_L1_R2)
配列番号５２：プライマー（adapter17-16_L1_F3)
配列番号５３：プライマー（adapter18-16_L1_R3)
配列番号５４：プライマー（adapter19-18_L1_F1)
配列番号５５：プライマー（adapter20-18_L1_R1)
配列番号５６：プライマー（adapter21-18_L1_F2)
配列番号５７：プライマー（adapter22-18_L1_R2)
配列番号５８：プライマー（adapter23-18_L1_F3)
配列番号５９：プライマー（adapter24-18_L1_R3)
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１】
2020050350.tif 000003
【図２】
2020050350.tif 000004
【図３】
2020050350.tif 000005
【図４】
2020050350.tif 000006
【図５】
2020050350.tif 000007
【図６】
2020050350.tif 000008
【図７】
2020050350.tif 000009
【図８】
2020050350.tif 000010
【図９】
2020050350.tif 000011
【図１０】
2020050350.tif 000012
【配列表】
2020050350000001.app
【国際調査報告】
2020050350.tif 000013
2020050350.tif 000014
2020050350.tif 000015
2020050350.tif 000016
2020050350.tif 000017
2020050350.tif 000018