(57)【要約】  重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１〜３がそれぞれ配列番号２〜４のアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号５〜７のアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体又はその断片；  重鎖ＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号２〜４のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号５〜７のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ＫＫ−ＬＣ−１タンパク質に対する結合性を有する、モノクローナル抗体又はその断片；又は  重鎖ＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号２〜４のアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号５〜７のアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体又はその断片と競合し、ＫＫ−ＬＣ−１タンパク質に対する結合性を有する、モノクローナル抗体又はその断片。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかのモノクローナル抗体又はその断片。
（ｉ）重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１〜３が、それぞれ配列番号２〜４のアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号５〜７のアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体又はその断片
（ｉｉ）重鎖ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号２〜４のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号５〜７のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、Ｋｉｔａｋｙｕｓｈｕ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｔｉｇｅｎ−１（ＫＫ−ＬＣ−１）タンパク質に対する結合性を有する、モノクローナル抗体又はその断片
（ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号２〜４のアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号５〜７のアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体又はその断片と競合し、ＫＫ−ＬＣ−１タンパク質に対する結合性を有する、モノクローナル抗体又はその断片
【請求項２】
固定された生体試料中のＫＫ−ＬＣ−１タンパク質に対する結合性を有する、請求項１に記載のモノクローナル抗体又はその断片。
【請求項３】
前記生体試料が架橋固定剤で固定されている、請求項２に記載のモノクローナル抗体又はその断片。
【請求項４】
前記架橋固定剤が、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド又はグルタルアルデヒドである、請求項３に記載のモノクローナル抗体又はその断片。
【請求項５】
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに対する結合性を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその断片。
【請求項６】
配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに対する結合性を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその断片。
【請求項７】
受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５２７であるハイブリドーマ細胞株により産生される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその断片。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその断片を備える、癌の検出キット。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその断片をコードする核酸。
【請求項１０】
固定された生体試料に、請求項１〜７のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその断片を反応させる工程を備える、癌の検出方法。
【請求項１１】
受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５２７である、ハイブリドーマ細胞株。
【請求項１２】
生体試料中のＫＫ−ＬＣ−１タンパク質を検出する方法であって、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド又はその部分ペプチドを検出する工程を備える方法。
【請求項１３】
前記部分ペプチドが、配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モノクローナル抗体及びその使用に関する。より具体的には、モノクローナル抗体又はその断片、癌の検出キット、癌の検出方法、及びハイブリドーマ細胞株に関する。本願は、２０１７年１１月１４日に、日本に出願された特願２０１７−２１８８７２号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
Ｋｉｔａｋｙｕｓｈｕ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｔｉｇｅｎ−１（ＫＫ−ＬＣ−１）は、様々な癌に発現するマーカーとして使用できることが明らかになりつつある（例えば、特許文献１を参照）。したがって、ＫＫ−ＬＣ−１を簡便に検出することができる技術を開発することは重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第６０２８２５３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、ＫＫ−ＬＣ−１を簡便に検出する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は以下の態様を含む。
［１］以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかのモノクローナル抗体又はその断片。
（ｉ）重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１〜３が、それぞれ配列番号２〜４のアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号５〜７のアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体又はその断片
（ｉｉ）重鎖ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号２〜４のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号５〜７のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ＫＫ−ＬＣ−１タンパク質に対する結合性を有する、モノクローナル抗体又はその断片
（ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号２〜４のアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号５〜７のアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体又はその断片と競合し、ＫＫ−ＬＣ−１タンパク質に対する結合性を有する、モノクローナル抗体又はその断片
［２］固定された生体試料中のＫＫ−ＬＣ−１タンパク質に対する結合性を有する、［１］に記載のモノクローナル抗体又はその断片。
［３］前記生体試料が架橋固定剤で固定されている、［２］に記載のモノクローナル抗体又はその断片。
［４］前記架橋固定剤が、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド又はグルタルアルデヒドである、［３］に記載のモノクローナル抗体又はその断片。
［５］配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに対する結合性を有する、［１］〜［４］のいずれかに記載のモノクローナル抗体又はその断片。
［６］配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに対する結合性を有する、［１］〜［５］のいずれかに記載のモノクローナル抗体又はその断片。
［７］受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５２７であるハイブリドーマ細胞株により産生される、［１］〜［６］のいずれかに記載のモノクローナル抗体又はその断片。
［８］［１］〜［７］のいずれかに記載のモノクローナル抗体又はその断片を備える、癌の検出キット。
［９］［１］〜［７］のいずれかに記載のモノクローナル抗体又はその断片をコードする核酸。
［１０］固定された生体試料に、［１］〜［７］のいずれかに記載のモノクローナル抗体又はその断片を反応させる工程を備える、癌の検出方法。
［１１］受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５２７である、ハイブリドーマ細胞株。
［１２］生体試料中のＫＫ−ＬＣ−１タンパク質を検出する方法であって、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド又はその部分ペプチドを検出する工程を備える方法。
［１３］前記部分ペプチドが、配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである、［１２］に記載の方法。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、ＫＫ−ＬＣ−１を簡便に検出する技術を提供することができる。本発明により、例えば、免疫組織染色によりＫＫ−ＬＣ−１の発現を検出することが可能になる。また、抗ＫＫ−ＬＣ−１モノクローナル抗体は半永久的に供給することが可能であり、診断薬として好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】実験例２の結果を示すグラフである。
【図２】（ａ）〜（ｄ）は、実験例３における免疫組織染色の結果を示す写真である。
【図３】（ａ）〜（ｄ）は、実験例４における免疫組織染色の結果を示す写真である。
【図４】（ａ）〜（ｃ）は、実験例５における免疫組織染色の結果を示す写真である。
【図５】（ａ）及び（ｂ）は、実験例６における免疫組織染色の結果を示す写真である。
【図６】実験例８におけるエピトープマッピングの結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
［モノクローナル抗体又はその断片］
１実施形態において、本発明は、固定された生体試料中のＫＫ−ＬＣ−１タンパク質に対する結合性を有する、モノクローナル抗体又はその断片を提供する。このようなハイブリドーマ細胞株を取得することは困難であったが、実施例において後述するように、発明者らは、固定された生体試料中のＫＫ−ＬＣ−１タンパク質に反応することができるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を樹立することに成功した。ＫＫ−ＬＣ−１タンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＰ＿００１０１７９７８．１であり、そのアミノ酸配列を配列番号８６に示す。
【０００９】
本明細書において、モノクローナル抗体の断片としては、従来知られている抗体断片が挙げられ、より具体的には、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。
【００１０】
本実施形態のモノクローナル抗体又はその断片は、動物を免疫して得られたものであってもよいし、ファージライブラリ等を用いたスクリーニングにより得られたものであってもよい。また、本実施形態のモノクローナル抗体又はその断片は、後述するバイブリドーマ株から産生されたものであってもよいし、遺伝子組換え体であってもよい。遺伝子組換え体の宿主は、特に限定されず、例えば、大腸菌、酵母等の微生物、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞等であってもよい。
【００１１】
本実施形態のモノクローナル抗体又はその断片は、例えば免疫組織染色に好適に用いることができる。従来、免疫組織染色に用いることができる抗ＫＫ−ＬＣ−１モノクローナル抗体は存在しなかった。本実施形態のモノクローナル抗体又はその断片は、半永久的に供給することが可能であり、品質管理も容易であるため、例えば診断薬として好適に用いることができる。
【００１２】
本実施形態において、固定された生体試料とは、架橋固定剤で固定された生体試料であることが好ましい。すなわち、本実施形態のモノクローナル抗体又はその断片が検出対象とするＫＫ−ＬＣ−１タンパク質は、架橋固定剤で固定された生体試料中に存在するものであることが好ましい。本実施形態のモノクローナル抗体又はその断片は、このような生体試料中のＫＫ−ＬＣ−１タンパク質であっても良好に反応することができる。上述したように、従来、固定された生体試料の免疫組織染色に用いることができる抗ＫＫ−ＬＣ−１モノクローナル抗体は存在しなかった。ここで、架橋固定剤としては、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド等が挙げられる。
【００１３】
本実施形態のモノクローナル抗体又はその断片は、受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５２７であるハイブリドーマ細胞株により産生されたものであることが好ましい。なお、受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５２７であるハイブリドーマ細胞株により産生されたモノクローナル抗体又はその断片は、固定された生体試料中のＫＫ−ＬＣ−１タンパク質のみならず、固定されていない生体試料中のＫＫ−ＬＣ−１タンパク質に対しても結合性を有する。
【００１４】
本実施形態のモノクローナル抗体又はその断片は、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに対する結合性を有するものであることが好ましい。実施例において後述するように、受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５２７であるハイブリドーマ細胞株により産生されたモノクローナル抗体は、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに対する結合性を有する。
【００１５】
本実施形態のモノクローナル抗体又はその断片は、配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに対する結合性を有するものであることが更に好ましい。実施例において後述するように、発明者らは、エピトープマッピングにより、モノクローナル抗体が認識するエピトープを特定した。その結果、受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５２７であるハイブリドーマ細胞株により産生されたモノクローナル抗体が、配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに対する結合性を有することが明らかとなった。なお、後述するように、このモノクローナル抗体は、配列番号１２に記載のアミノ酸配列において、Ｃ末端のセリン残基、Ｎ末端のアスパラギン残基、Ｎ末端のアスパラギン残基及びＮ末端から２番目のリジン残基が欠失したペプチドに対しても結合性を有する可能性がある。
【００１６】
本実施形態のモノクローナル抗体又はその断片は、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかであってよい。
（ｉ）重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１〜３が、それぞれ配列番号２〜４のアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号５〜７のアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体又はその断片。
（ｉｉ）重鎖ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号２〜４のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号５〜７のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ＫＫ−ＬＣ−１タンパク質に対する結合性を有する、モノクローナル抗体又はその断片。
（ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号２〜４のアミノ酸配列からなり、軽鎖ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号５〜７のアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体又はその断片と競合し、ＫＫ−ＬＣ−１タンパク質に対する結合性を有する、モノクローナル抗体又はその断片。
【００１７】
配列番号２〜４は、それぞれ、受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５２７であるハイブリドーマ細胞株により産生されたモノクローナル抗体の重鎖ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列である。また、配列番号５〜７は、それぞれ、受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５２７であるハイブリドーマ細胞株により産生されたモノクローナル抗体の軽鎖ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列である。
【００１８】
すなわち、本実施形態のモノクローナル抗体又はその断片は、受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５２７であるハイブリドーマ細胞株により産生されたモノクローナル抗体と同一の重鎖ＣＤＲ１〜３及び軽鎖ＣＤＲ１〜３を有していてもよい。
【００１９】
あるいは、本実施形態のモノクローナル抗体又はその断片は、固定された生体試料中のＫＫ−ＬＣ−１タンパク質に対する結合性を有する限り、受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５２７であるハイブリドーマ細胞株により産生されたモノクローナル抗体の重鎖ＣＤＲ１〜３及び軽鎖ＣＤＲ１〜３に対して、変異を有する重鎖ＣＤＲ１〜３及び軽鎖ＣＤＲ１〜３を有していてもよい。
【００２０】
すなわち、本実施形態のモノクローナル抗体又はその断片は、重鎖ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号２〜４のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、軽鎖ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号５〜７のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するものであってもよい。
【００２１】
ここで、１若しくは数個とは、例えば１〜１０個であってもよく、例えば１〜５個であってもよく、例えば１〜３個であってもよい。
【００２２】
本実施形態のモノクローナル抗体又はその断片は、配列番号８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有するものであってもよい。
【００２３】
あるいは、本実施形態のモノクローナル抗体又はその断片は、受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５２７であるハイブリドーマ細胞株により産生されたモノクローナル抗体又はその断片と競合し、ＫＫ−ＬＣ−１タンパク質に対する結合性を有する、モノクローナル抗体又はその断片であってもよい。
【００２４】
ここで、対象の抗体が競合するとは、例えば、ＫＫ−ＬＣ−１タンパク質に、受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５２７であるハイブリドーマ細胞株により産生されたモノクローナル抗体を反応させた後に、対象の抗体を反応させた場合に、受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５２７であるハイブリドーマ細胞株により産生されたモノクローナル抗体とＫＫ−ＬＣ−１タンパク質との結合を少なくとも一部解離させて、ＫＫ−ＬＣ−１タンパク質と結合することを意味する。
【００２５】
ここで、少なくとも一部とは、上記のＫＫ−ＬＣ−１タンパク質のモル数の１０％以上であってもよく、３０％以上であってもよく、５０％以上であってもよく、７０％以上であってもよく、９０％以上であってもよい。
【００２６】
本実施形態のモノクローナル抗体又はその断片はヒト型化されていてもよい。ヒト型抗体としては、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体等が挙げられる。ここで、キメラ抗体とは、可変領域が非ヒト動物由来の抗体であり、定常領域の少なくとも一部がヒト由来の抗体である抗体を意味する。また、ヒト化抗体とは、重鎖及び軽鎖の相補性決定領域のみが非ヒト動物由来の抗体であり、定常領域及びフレームワーク領域がヒト由来の抗体である抗体を意味する。また、完全ヒト抗体とは、相補性決定領域を含めて全体がヒト由来の抗体を意味する。モノクローナル抗体又はその断片が、ヒト型抗体又はその断片であれば、ヒトに投与しても免疫原性が低いため、アナフィラキシーショック等の副作用を抑制することができる。したがって、本実施形態のモノクローナル抗体又はその断片がヒト型抗体又はその断片であれば、ヒトに投与することができる。
【００２７】
［核酸］
１実施形態において、本発明は上述したモノクローナル抗体又はその断片をコードする核酸を提供する。
【００２８】
本実施形態の核酸は、重鎖ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号２〜４のアミノ酸配列又は配列番号２〜４のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、軽鎖ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号５〜７のアミノ酸配列又は配列番号５〜７のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、固定された生体試料中のＫＫ−ＬＣ−１タンパク質に対する結合性を有するモノクローナル抗体又はその断片をコードするものであることが好ましい。
【００２９】
本実施形態の核酸は、重鎖可変領域遺伝子の塩基配列が配列番号１０の塩基配列を有し、軽鎖可変領域遺伝子の塩基配列が配列番号１１の塩基配列を有するものであってもよい。あるいは、本実施形態の核酸は、コードするモノクローナル抗体又はその断片が固定された生体試料中のＫＫ−ＬＣ−１タンパク質に対する結合性を有する限り変異を有していてもよい。
【００３０】
すなわち、本実施形態の核酸は、重鎖可変領域遺伝子の塩基配列が、配列番号１０の塩基配列に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９９％以上の配列同一性を有し、軽鎖可変領域遺伝子の塩基配列が、配列番号１１の塩基配列に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９９％以上の配列同一性を有するものであってもよい。
【００３１】
ここで、基準塩基配列に対する、対象塩基配列の配列同一性は、例えば次のようにして求めることができる。まず、基準塩基配列及び対象塩基配列をアラインメントする。ここで、各塩基配列には、配列同一性が最大となるようにギャップを含めてもよい。続いて、基準塩基配列及び対象塩基配列において、一致した塩基の塩基数を算出し、下記式（１）にしたがって、配列同一性を求めることができる。
配列同一性（％）＝一致した塩基数／対象塩基配列の総塩基数×１００  （１）
【００３２】
本実施形態の核酸はベクターに含まれていてもよい。また、当該ベクターは上述したモノクローナル抗体又はその断片を発現可能な発現ベクターであってもよい。また、上記のベクターは、例えば、大腸菌、酵母等の微生物、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞等の宿主に導入されていてもよい。すなわち、１実施形態において、本発明は、上記のベクターが導入された宿主を提供する。
【００３３】
［癌の検出キット］
１実施形態において、本発明は、上述したモノクローナル抗体又はその断片を備える、癌の検出キットを提供する。本実施形態のキットによれば、固定された生体試料の免疫組織染色により、簡便に癌を検出することができる。固定された生体試料としては、上述したものと同様のものが挙げられ、例えば固定された組織薄切切片であってもよい。
【００３４】
本実施形態のキットが検出対象とする癌としては、例えば、胃癌、肺癌、乳癌、大腸癌、食道癌、膵臓癌、胆道癌、胆嚢癌、十二指腸癌、大腸癌、肝癌、脳腫瘍、子宮癌、卵巣癌、白血病、骨肉腫、中皮腫、精巣腫瘍、消化管間質腫瘍等が挙げられる。
【００３５】
［癌の検出方法］
１実施形態において、本発明は、固定された生体試料に、上述したモノクローナル抗体又はその断片を反応させる工程を備える、癌の検出方法を提供する。本実施形態の検出方法は、癌に罹患しているか否かを診断するためのデータ収集方法であるということもできる。なお、データ収集方法は医師が判断する工程を含まない。
【００３６】
本実施形態の検出方法により、固定された生体試料中にＫＫ−ＬＣ−１タンパク質が検出された場合、当該生体試料が由来する患者には、ＫＫ−ＬＣ−１を標的とした癌治療の適用が有効であると判断することができる。
【００３７】
本実施形態の方法が検出対象とする癌としては、例えば、胃癌、肺癌、乳癌、大腸癌、食道癌、膵臓癌、胆道癌、胆嚢癌、十二指腸癌、大腸癌、肝癌、脳腫瘍、子宮癌、卵巣癌、白血病、骨肉腫、中皮腫、精巣腫瘍、消化管間質腫瘍等が挙げられる。
【００３８】
本実施形態の方法により、簡便に癌を検出することができる。本実施形態の方法は、上述したモノクローナル抗体又はその断片により実現可能となったものである。
【００３９】
［ハイブリドーマ細胞株］
１実施形態において、本発明は、受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５２７である、ハイブリドーマ細胞株を提供する。本実施形態のハイブリドーマ細胞株を培養することにより、上述したモノクローナル抗体を製造することができる。また、製造したモノクローナル抗体をペプシンやパパインで切断すること等により、抗体断片を得ることができる。
【００４０】
［生体試料中のＫＫ−ＬＣ−１タンパク質を検出する方法］
１実施形態において、本発明は、生体試料中のＫＫ−ＬＣ−１タンパク質を検出する方法であって、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド又はその部分ペプチドを検出する工程を備える方法を提供する。また、上記の部分ペプチドは、配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドであることが好ましい。本実施形態の方法によれば、固定された生体試料中のＫＫ−ＬＣ−１タンパク質であっても検出することができる。
【００４１】
ところで、配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、配列番号８６にアミノ酸配列を示すＫＫ−ＬＣ−１タンパク質の第８９〜１００番目のアミノ酸に相当する。また、ＫＫ−ＬＣ−１タンパク質の第８０〜１０１番目のアミノ酸からなるペプチドは、血液中に分泌されることが知られている。したがって、配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを検出することにより、血液中に分泌されたＫＫ−ＬＣ−１タンパク質の部分ペプチドを検出することができる。
【００４２】
［その他の実施形態］
１実施形態において、本発明は、患者由来の固定された生体試料に、上述したモノクローナル抗体又はその断片を反応させる工程と、前記生体試料中にＫＫ−ＬＣ−１タンパク質が検出された場合に、前記患者にＫＫ−ＬＣ−１を標的とした癌治療を適用する工程と、を含む、癌の治療方法を提供する。
【００４３】
ＫＫ−ＬＣ−１を標的とした癌治療としては、例えば、ＫＫ−ＬＣ−１タンパク質を癌抗原として用いた癌免疫療法、細胞膜上に発現したＫＫ−ＬＣ−１タンパク質を標的とする分子標的治療等が挙げられる。上記分子標的治療は、ＫＫ−ＬＣ−１タンパク質を認識する抗体医薬を用いた治療であってもよい。
【実施例】
【００４４】
［実験例１］
（ハイブリドーマ細胞株の樹立）
配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するペプチドでマウスを免疫し、約３０クローンのハイブリドーマ細胞株を樹立した。【００４５】
［実験例２］
（ＥＬＩＳＡ法によるモノクローナル抗体の反応性の確認）
免疫したペプチドを抗原としたＥＬＩＳＡ法により、モノクローナル抗体の反応性を確認した。具体的には、まず、９６ウェルプレートに、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するペプチドを固定化した。また、対照として、ペプチドを固定化せず、ブロッキングのみ行った９６ウェルプレートを用いた。ブロッキングにはスキムミルク溶液を使用した。【００４６】
続いて、９６ウェルプレートをブロッキングし、樹立した各ハイブリドーマ細胞株の培養上清を添加して反応させた。また、比較のために、ノーマルマウス血清を反応させたウェルも用意した。続いて、未反応のモノクローナル抗体を洗浄除去し、抗マウス２次抗体を反応させて発色基質を添加し、発色させた。続いて、プレートリーダーを用いて各ウェルの吸光度を測定した。【００４７】
図１は、ＥＬＩＳＡ法によるモノクローナル抗体の反応性を測定した結果を示すグラフである。図１中、横軸はハイブリドーマ細胞株のクローン名を示す。クローン名「３４Ｂ３」が、受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５２７であるハイブリドーマ細胞株である。【００４８】
その結果、ＥＬＩＳＡ法においてＫＫ−ＬＣ−１タンパク質との反応性を示すモノクローナル抗体が多数得られたことが確認された。【００４９】
［実験例３］
（免疫組織染色によるモノクローナル抗体の反応性の確認１）
作製したモノクローナル抗体を用いて、ホルムアルデヒド固定された、精巣腫瘍患者の正常領域及び腫瘍領域の組織切片、胃癌患者の胃組織の正常領域及び腫瘍領域の組織切片を染色した。その結果、樹立した約３０クローンのハイブリドーマ細胞株のうちの１クローンが産生するモノクローナル抗体のみが、オートクレーブによる賦活化の下処理を行なった免疫組織染色においてＫＫ−ＬＣ−１タンパク質を染色することができることが明らかとなった。【００５０】
免疫組織染色においてＫＫ−ＬＣ−１タンパク質を染色することができるモノクローナル抗体を産生したハイブリドーマ細胞株を、独立行政法人製品評価技術基盤機構（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に国内寄託した（受託日：２０１７年８月３日、受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２５２７、細胞名「２７７  ３４Ｂ３  ２０１７０１２３」）。その後、当該ハイブリドーマ細胞株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２５２７）を、国際寄託へと移管した（国際受託当局：独立行政法人製品評価技術基盤機構（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）、受託日：２０１８年１０月１０日、受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５２７、細胞名「２７７  ３４Ｂ３  ２０１７０１２３」）。【００５１】
図２（ａ）〜（ｄ）は、ハイブリドーマ細胞株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５２７）から得られたモノクローナル抗体を用いた免疫組織染色の結果を示す写真である。いずれも倍率は４００倍であった。【００５２】
図２（ａ）は精巣腫瘍患者の正常領域の組織切片の染色結果を示す写真である。また、図２（ｂ）は精巣腫瘍の一種であるセミノーマの組織切片の染色結果を示す写真である。また、図２（ｃ）は胃癌患者の胃組織の正常領域の組織切片の染色結果を示す写真である。図２（ｄ）は胃癌患者の胃組織の腫瘍領域の組織切片の染色結果を示す写真である。【００５３】
その結果、いずれの組織切片の染色においても、ＫＫ−ＬＣ−１タンパク質が染色されたことが確認された。この結果から、ハイブリドーマ細胞株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５２７）から得られたモノクローナル抗体が、固定された生体試料中のＫＫ−ＬＣ−１タンパク質に対する結合性を有していることが明らかとなった。なお、本実験例で使用した胃癌患者の腫瘍領域及び正常領域のいずれの組織においても、ＫＫ−ＬＣ−１遺伝子の発現は陽性であった。【００５４】
また、以上の結果から、ＥＬＩＳＡ法において反応性が高いモノクローナル抗体であっても、免疫組織染色で反応性を示すとは限らないことが明らかとなった。【００５５】
［実験例４］
（免疫組織染色によるモノクローナル抗体の反応性の確認２）
ハイブリドーマ細胞株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５２７）から得られたモノクローナル抗体の反応性を検討した。具体的には、ハイブリドーマ細胞株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５２７）から得られたモノクローナル抗体を、ハイブリドーマ細胞株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５２７）の樹立時にマウスの免疫に用いたペプチドで吸収した後、実験例３と同様にして免疫組織染色を行い、反応性を検討した。また、比較のために、吸収操作に供していないモノクローナル抗体を用いた免疫組織染色も行った。【００５６】
モノクローナル抗体の吸収操作には、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するペプチドを０．０５ｍｇ／ｍＬの終濃度で使用した。また、吸収操作は４℃で一晩行った。【００５７】
図３（ａ）〜（ｄ）は、免疫組織染色の結果を示す写真である。いずれも倍率は２００倍であった。図３（ａ）及び（ｂ）は胃癌患者の胃組織の腫瘍領域の組織切片の染色結果を示す写真である。図３（ａ）は吸収操作を行っていないモノクローナル抗体を用いた免疫染色の結果である。また、図３（ｂ）は吸収操作後のモノクローナル抗体を用いた免疫染色の結果である。【００５８】
また、図３（ｃ）及び（ｄ）は胃癌患者の胃組織の正常領域の組織切片の染色結果を示す写真である。図３（ｃ）は吸収操作を行っていないモノクローナル抗体を用いた免疫染色の結果である。また、図３（ｄ）は吸収操作後のモノクローナル抗体を用いた免疫染色の結果である。【００５９】
その結果、吸収操作を行ったモノクローナル抗体ではＫＫ−ＬＣ−１に対する反応性が消失することが明らかとなった。この結果は、作製したモノクローナル抗体が、ＫＫ−ＬＣ−１に対する特異的な反応性を有することを示す。なお、本実験例で使用した胃癌患者の腫瘍領域及び正常領域のいずれの組織においても、ＫＫ−ＬＣ−１遺伝子の発現は陽性であった。【００６０】
［実験例５］
（免疫組織染色によるモノクローナル抗体の反応性の確認３）
ハイブリドーマ細胞株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５２７）から得られたモノクローナル抗体の反応性を更に検討した。具体的には、ハイブリドーマ細胞株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５２７）から得られたモノクローナル抗体を用いて、実験例３と同様にして免疫組織染色を行い、反応性を検討した。ここで、組織切片として、胃癌患者の胃組織の正常領域及び腫瘍領域であって、ＫＫ−ＬＣ−１遺伝子の発現が陰性であった試料を用いた。【００６１】
図４（ａ）〜（ｃ）は、ハイブリドーマ細胞株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５２７）から得られたモノクローナル抗体を用いた免疫組織染色の結果を示す写真である。いずれも倍率は４００倍であった。【００６２】
図４（ａ）は胃癌患者の胃組織の正常領域であって、ＫＫ−ＬＣ−１遺伝子の発現が陰性であった組織切片の染色結果を示す写真である。また、図２（ｂ）及び（ｃ）は胃癌患者の胃組織の腫瘍領域であって、ＫＫ−ＬＣ−１遺伝子の発現が陰性であった組織切片の染色結果を示す写真である。【００６３】
その結果、いずれの組織切片の染色においても、ＫＫ−ＬＣ−１タンパク質は検出されなかった。この結果は、ハイブリドーマ細胞株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５２７）から得られたモノクローナル抗体が、固定された生体試料中のＫＫ−ＬＣ−１に対する特異的な反応性を有することを更に支持するものである。【００６４】
［実験例６］
（免疫組織染色によるモノクローナル抗体の反応性の確認４）
ハイブリドーマ細胞株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５２７）から得られたモノクローナル抗体の反応性を、市販の抗ＫＫ−ＬＣ−１ポリクローナル抗体（型式「ＨＰＡ００４７７３」、シグマアルドリッチ社）の反応性と比較した。【００６５】
具体的には、ハイブリドーマ細胞株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５２７）から得られたモノクローナル抗体（培養上清を１／８０希釈したもの）及び市販の抗ＫＫ−ＬＣ−１ポリクローナル抗体（型式「ＨＰＡ００４７７３」、シグマアルドリッチ社、１／５０希釈したもの）を用いて、実験例３と同様にして免疫組織染色を行い、反応性を検討した。ここで、組織切片として、ＫＫ−ＬＣ−１遺伝子が強く発現している精巣試料を用いた。【００６６】
図５（ａ）及び（ｂ）は、免疫組織染色の結果を示す写真である。いずれも倍率は４００倍であった。図５（ａ）はハイブリドーマ細胞株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５２７）から得られたモノクローナル抗体を用いた染色結果を示す写真である。また、図５（ｂ）は市販の抗ＫＫ−ＬＣ−１ポリクローナル抗体（型式「ＨＰＡ００４７７３」、シグマアルドリッチ社）を用いた染色結果を示す写真である。【００６７】
その結果、ハイブリドーマ細胞株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５２７）から得られたモノクローナル抗体では、固定された生体試料中のＫＫ−ＬＣ−１を良好に検出できたのに対し、市販の抗ＫＫ−ＬＣ−１ポリクローナル抗体では、固定された生体試料中のＫＫ−ＬＣ−１を染色できないことが明らかとなった。この結果は、ハイブリドーマ細胞株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５２７）から得られたモノクローナル抗体の有用性を示すものである。【００６８】
［実験例７］
（モノクローナル抗体の塩基配列及びアミノ酸配列の同定）
ハイブリドーマ細胞株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５２７）から全ＲＮＡを調製し、逆転写してｃＤＮＡを調製した。続いて、定法により、抗体重鎖可変領域遺伝子及び抗体軽鎖可変領域遺伝子の塩基配列をシークエンスした。【００６９】
同定された重鎖可変領域遺伝子の塩基配列を配列番号１０に示し、軽鎖可変領域遺伝子の塩基配列を配列番号１１に示す。また、塩基配列から推定される重鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号８に示し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号９に示す。【００７０】
また、重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列を配列番号２に示し、重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列を配列番号３に示し、重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号４に示す。また、軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列を配列番号５に示し、軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列を配列番号６に示し、軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号７に示す。【００７１】
［実験例８］
（モノクローナル抗体が認識するエピトープの解析）
エピトープマッピングにより、ハイブリドーマ細胞株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５２７）が産生するモノクローナル抗体の抗原を特定した。具体的には、まず、ＫＫ−ＬＣ−１タンパク質のアミノ酸配列に基づいて、Ｎ末端側の位置を１アミノ酸残基ずつずらした７３種類の１５アミノ酸残基のペプチドを合成し、ペプチドアレイを作製した。７３種類のペプチドのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１３〜８５に示す。【００７２】
続いて、このペプチドアレイにモノクローナル抗体を反応させ、反応性を有するペプチドを特定した。モノクローナル抗体は１／１００及び１／５００に希釈し、それぞれ反応させた。【００７３】
図６はエピトープマッピングの結果を示すグラフである。その結果、モノクローナル抗体が、ＬＳＭＶＥＮＫＬＶＥＬＥＨＴＬ（配列番号６３）〜ＶＥＬＥＨＴＬＬＳＫＧＦＲＧＡ（配列番号７１）付近のペプチドに結合性を有することが明らかとなった。【００７４】
モノクローナル抗体が結合したペプチドに共通するアミノ酸配列を特定した結果、このモノクローナル抗体のエピトープはＮＫＬＶＥＬＥＨＴＬＬＳ（配列番号１２）であることが明らかとなった。なお、配列番号１２に記載のアミノ酸配列の全体がモノクローナル抗体との結合に必須であるか否かを決定するためには、更なる検討が必要である。すなわち、このモノクローナル抗体は、配列番号１２に記載のアミノ酸配列において、Ｃ末端のセリン残基が欠失したペプチド、Ｎ末端のアスパラギン残基が欠失したペプチド、及び、Ｎ末端のアスパラギン残基及びＮ末端から２番目のリジン残基が欠失したペプチドに対しても結合性を有する可能性がある。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明によれば、ＫＫ−ＬＣ−１を簡便に検出する技術を提供することができる。本発明により、例えば、免疫組織染色によりＫＫ−ＬＣ−１の発現を検出することが可能になる。また、抗ＫＫ−ＬＣ−１モノクローナル抗体は半永久的に供給することが可能であり、診断薬として好適に用いることができる。
【受託番号】
【００７６】
ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５２７
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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