(57)【要約】  本発明は、有機物、水素発生型発酵細菌及び水素資化性メタン生成菌を含む反応液を準備する準備ステップと、水素資化性メタン生成菌の活性ピーク温度Ｔ＋５℃以上の温度で、水素発生型発酵細菌により反応液を発酵させて水素ガスを生成する生成ステップと、を備える、水素ガス生成方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機物、水素発生型発酵細菌及び水素資化性メタン生成菌を含む反応液を準備する準備ステップと、
前記水素資化性メタン生成菌の活性ピーク温度Ｔ＋５℃以上Ｔ＋１０℃以下の温度で、前記水素発生型発酵細菌により前記反応液を発酵させて水素ガスを生成する生成ステップと、を備え、
前記準備ステップにおいて、堆積層の帯水層に由来し、前記水素発生型発酵細菌及び前記水素資化性メタン生成菌を含む地下水に、前記有機物を添加することにより、前記反応液を準備する、水素ガス生成方法。
【請求項２】
前記水素資化性メタン生成菌の阻害剤を使用しない、請求項１に記載の水素ガス生成方法。
【請求項３】
有機物、水素発生型発酵細菌及び水素資化性メタン生成菌を含む反応液を収容する水素ガス生成槽と、
前記水素ガス生成槽の温度を制御する制御部と、
前記水素発生型発酵細菌及び前記水素資化性メタン生成菌を含む堆積層の地下水を汲み上げ、前記地下水中の少なくとも前記水素発生型発酵細菌及び前記水素資化性メタン生成菌を前記水素ガス生成槽に供給する地下水供給部と、
前記有機物を前記水素ガス生成槽に供給する有機物供給部と、を備え、
前記制御部は、前記水素ガス生成槽の温度を、前記水素資化性メタン生成菌の活性ピーク温度Ｔ＋５℃以上Ｔ＋１０℃以下の温度に制御することで、前記水素発生型発酵細菌により前記反応液を発酵させて水素ガスを生成させる、水素ガス生成システム。
【請求項４】
有機物、水素発生型発酵細菌及び水素資化性メタン生成菌を含む第１の反応液を収容する水素ガス生成槽と、
前記水素ガス生成槽の温度を制御する第１の制御部と、
有機物、水素発生型発酵細菌及び水素資化性メタン生成菌を含む第２の反応液を収容するメタン生成槽と、
前記メタン生成槽の温度を制御する第２の制御部と、を備え、
前記第１の制御部は、前記水素ガス生成槽の温度を、前記水素資化性メタン生成菌の活性ピーク温度Ｔ＋５℃以上の温度に制御することで、前記水素発生型発酵細菌により前記反応液を発酵させて水素ガスを生成させ、
前記第２の制御部は、前記メタン生成槽の温度を、前記水素資化性メタン生成菌の活性ピーク温度Ｔ＋５℃未満に制御することで、前記反応液から、前記水素発生型発酵細菌と前記水素資化性メタン生成菌によりメタンを生成させる、水素ガス及びメタン生成システム。
【請求項５】
前記水素発生型発酵細菌及び前記水素資化性メタン生成菌を含む堆積層の地下水を汲み上げ、前記地下水中の少なくとも前記水素発生型発酵細菌及び前記水素資化性メタン生成菌を前記水素ガス生成槽及び前記メタン生成槽のそれぞれに供給する地下水供給部と、
前記有機物を前記水素ガス生成槽に供給する第１の有機物供給部と、
前記有機物を前記メタン生成槽に供給する第２の有機物供給部と、を更に備える、請求項４に記載の水素ガス及びメタン生成システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水素ガス生成方法、水素ガス生成システム、並びに、水素ガス及びメタン生成システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
水素ガスの生成方法として、有機物を分解して水素ガスと二酸化炭素を生成する水素発生型発酵細菌と、水素ガス及び二酸化炭素からメタンを生成する水素資化性メタン生成菌とを含む反応液を利用した方法が提案されている。この方法では、水素資化性メタン生成菌による水素ガスの資化を抑制するため、例えば、２−ブロモメタンスルホン酸塩（ＢＥＳ）等の水素資化性メタン生成菌の増殖を特異的に阻害する試薬が用いられている（非特許文献１〜２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Baito,K., Imai, S., Matsushita, M., Otani, M., Sato, Y., and Kimura, H., "Biogasproduction using anaerobic groundwater containing a subterranean microbialcommunity associated with the accretionary prism", MicrobialBiotechnology, 8, 837-845 (2015)
【非特許文献２】ZinderH.S., Anguish, T., and Cardwell, C.S., "Selective Inhibition by2-Bromoethanesulfonate of Methanogenesis from Acetate in a ThermophilicAnaerobic Digestor", Applied and Environmental Microbiology, 47, 1343-1345(1983)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
水素資化性メタン生成菌阻害剤としてＢＥＳを用いる場合、水素ガスを生成するために、例えば、水素発生型発酵細菌及び水素資化性メタン生成菌を含む反応液１ｍ3あたり、約６０万円ものＢＥＳの費用がかかることから、当該反応液を用いた水素ガス生成の実用化には、経済的なハードルがある。このような事情から、水素資化性メタン生成菌阻害剤を使用しなくても、水素発生型発酵細菌及び水素資化性メタン生成菌を含む反応液から水素ガスを生成する方法が求められている。【０００５】
そこで、本発明の目的は、水素資化性メタン生成菌阻害剤を使用しなくても、水素発生型発酵細菌及び水素資化性メタン生成菌を含む反応液から水素ガスを効率よく生成する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、水素発生型発酵細菌及び水素資化性メタン生成菌を含む反応液を、水素資化性メタン生成菌の活性ピーク温度Ｔ＋５℃以上の温度で培養することにより、水素資化性メタン生成菌阻害剤を使用しなくても、効率よく水素ガスを生成することができることを見出した。本発明は、この知見に基づくものである。【０００７】
本発明の一側面は、有機物、水素発生型発酵細菌及び水素資化性メタン生成菌を含む反応液を準備する準備ステップと、水素資化性メタン生成菌の活性ピーク温度Ｔ＋５℃以上の温度で、水素発生型発酵細菌により反応液を発酵させて水素ガスを生成する生成ステップと、を備える、水素ガス生成方法である。【０００８】
生成ステップにおいて、水素資化性メタン生成菌の活性ピーク温度Ｔ＋２０℃以下の温度で水素発生型発酵生菌により反応液を発酵させてよい。水素ガス生成方法において、水素資化性メタン生成菌の阻害剤を使用しなくてよい。【０００９】
準備ステップにおいて、堆積層中の帯水層に由来し、水素発生型発酵細菌及び水素資化性メタン生成菌を含む地下水に、有機物を添加することにより、反応液を準備してよい。【００１０】
本発明の他の一側面は、有機物、水素発生型発酵細菌及び水素資化性メタン生成菌を含む反応液を収容する水素ガス生成槽と、水素ガス生成槽の温度を制御する制御部と、を備え、制御部は、水素ガス生成槽の温度を、水素資化性メタン生成菌の活性ピーク温度Ｔ＋５℃以上の温度に制御することで、水素発生型発酵細菌を特異的に増殖させて水素ガスを生成する、水素ガス生成システムである。【００１１】
水素ガス生成システムは、水素発生型発酵細菌及び水素資化性メタン生成菌を含む堆積層の地下水を汲み上げ、地下水中の少なくとも水素発生型発酵細菌及び水素資化性メタン生成菌を水素ガス生成槽に供給する地下水供給部と、有機物を水素ガス生成槽に供給する有機物供給部と、を更に備えていてよい。【００１２】
本発明の他の一側面は、有機物、水素発生型発酵細菌及び水素資化性メタン生成菌を含む第１の反応液を収容する水素ガス生成槽と、水素ガス生成槽の温度を制御する第１の制御部と、有機物、水素発生型発酵細菌及び水素資化性メタン生成菌を含む第２の反応液を収容するメタン生成槽と、メタン生成槽の温度を制御する第２の制御部と、を備え、第１の制御部は、水素ガス生成槽の温度を、水素資化性メタン生成菌の活性ピーク温度Ｔ＋５℃以上の温度に制御することで、水素発生型発酵細菌により反応液を発酵させて水素ガスを生成させ、第２の制御部は、メタン生成槽の温度を、水素資化性メタン生成菌の活性ピーク温度Ｔ＋５℃未満に制御することで、反応液から、水素発生型発酵細菌と水素資化性メタン生成菌によりメタンを生成させる、水素ガス及びメタン生成システムである。【００１３】
水素ガス及びメタン生成システムは、水素発生型発酵細菌及び水素資化性メタン生成菌を含む堆積層の地下水を汲み上げ、地下水中の少なくとも水素発生型発酵細菌及び水素資化性メタン生成菌を水素ガス生成槽及びメタン生成槽のそれぞれに供給する地下水供給部と、有機物を水素ガス生成槽に供給する第１の有機物供給部と、有機物をメタン生成槽に供給する第２の有機物供給部と、を更に備えていてよい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、水素資化性メタン生成菌阻害剤を使用しなくても、水素発生型発酵細菌及び水素資化性メタン生成菌を含む反応液から水素ガスを効率よく生成する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】一実施形態に係る水素ガス及びメタン生成システムの模式図である。
【図２】一実施形態に係る水／ガス／電気／熱の自家的供給システムの模式図である。
【図３】堆積層の地下水を用いた水素ガス、メタン及び二酸化炭素ガス生成を示すグラフである。
【図４】堆積層の地下水を用いた水素ガス、メタン及び二酸化炭素ガス生成を示すグラフである。
【図５】堆積層の地下水を用いて生成されたガスの中の水素ガス、メタン及び二酸化炭素の割合を示すグラフである。
【図６】堆積層の地下水を用いた水素ガス、メタン及び二酸化炭素ガス生成を示すグラフである。
【図７】堆積層の地下水を用いた水素ガス、メタン及び二酸化炭素ガス生成を示すグラフである。
【図８】堆積層の地下水を用いて生成されたガスの中の水素ガス、メタン及び二酸化炭素の割合を示すグラフである。
【図９】堆積層の地下水を用いた水素ガス、メタン及び二酸化炭素ガス生成を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。
【００１７】
〔水素ガス生成方法〕
本実施形態に係る水素ガス生成方法は、有機物、水素発生型発酵細菌及び水素資化性メタン生成菌を含む反応液を準備する準備ステップと、水素資化性メタン生成菌の活性ピーク温度Ｔ＋５℃以上の温度で、水素発生型発酵細菌を増殖させ、反応液中の有機物から水素ガスを生成する生成ステップと、を備える。
【００１８】
（準備ステップ）
準備ステップでは、有機物、水素発生型発酵細菌及び水素資化性メタン生成菌を含む反応液を準備する。
【００１９】
有機物としては、水素発生型発酵細菌により利用されるものであれば特に制限されない。具体的には、例えば、グルコース、ペプトン及び酵母エキス、並びにこれらの混合物が挙げられる。
【００２０】
有機物として、食品残渣、汚泥、家畜の糞尿などの余剰有機物を用いることができる。また、米、芋類及び麦類等の穀類を粉末化した穀類粉も好適に用いることができる。特に、輸入事故米及び汚染米等の食品として利用できない米を使用すれば、バイオマスの有効利用につながる。さらに、食料需給と競合しないセルロース系バイオマスも好適に利用できる。
【００２１】
水素発生型発酵細菌は、有機物を嫌気的に分解し水素ガス（Ｈ２）と二酸化炭素（ＣＯ２）を生成する微生物である。水素資化性メタン生成菌は、水素ガス（Ｈ２）と二酸化炭素（ＣＯ２）からメタンを生成する微生物である。
【００２２】
水素資化性メタン生成菌は、温度Ｔ（℃）に活性ピークを有している。水素資化性メタン生成菌の活性ピーク温度Ｔは、５℃間隔で反応液中の微生物を培養したときに、メタンの生成量が最も多くなる温度として定義される。水素資化性メタン生成菌の活性ピーク温度Ｔは、好ましくは、１０℃以上、３０℃以上、又は６０℃以上であり、４０℃以下、６０℃以下、又は９０℃以下である。水素資化性メタン生成菌の活性ピーク温度Ｔは、例えば、１０℃以上９０℃以下、１０℃以上６０℃以下、１０℃以上４０℃以下、３０℃以上９０℃以下、３０℃以上６０℃以下、３０℃以上４０℃以下、又は６０℃以上９０℃以下であってよい。
【００２３】
水素発生型発酵細菌の活性ピーク温度は、水素資化性メタン生成菌の活性ピーク温度Ｔに対して、Ｔ＋５℃以上、Ｔ＋１０℃以上、又はＴ＋１５℃以上であってよく、Ｔ＋３０℃以下、Ｔ＋２５℃以下、Ｔ＋２０℃以下、Ｔ＋１５℃以下、又はＴ＋１０℃以下であってよい。水素発生型発酵細菌の活性ピーク温度は、水素資化性メタン生成菌の活性ピーク温度Ｔに対して、例えば、Ｔ＋５℃以上Ｔ＋３０℃以下、Ｔ＋５℃以上Ｔ＋２５℃以下、Ｔ＋５℃以上Ｔ＋２０℃以下、Ｔ＋５℃以上Ｔ＋１５℃以下、Ｔ＋５℃以上Ｔ＋１０℃以下、Ｔ＋１０℃以上Ｔ＋３０℃以下、Ｔ＋１０℃以上Ｔ＋２５℃以下、Ｔ＋１０℃以上Ｔ＋２０℃以下、Ｔ＋１５℃以上Ｔ＋３０℃以下、Ｔ＋１５℃以上Ｔ＋２５℃以下、又はＴ＋１５℃以上Ｔ＋２０℃以下であってよい。水素発生型発酵細菌の活性ピーク温度は、５℃間隔で反応液中の微生物を培養したときに、水素ガスの生成量が最も多くなる温度として定義される。
【００２４】
反応液の溶存酸素濃度は、０．０１％（ｗ／ｖ）未満であることが好ましく、０％（ｗ／ｖ）、すなわち検出限界以下であることがより好ましい。
【００２５】
反応液に含まれる微生物の細胞数（細胞密度）は、１０3〜１０9ｃｅｌｌｓ／ｍＬであることが好ましく、１０７〜１０9ｃｅｌｌｓ／ｍＬであることがより好ましい。微生物の細胞数とは、準備ステップにおいて準備する反応液に含まれる水素発生型発酵細菌及び水素資化性メタン生成菌の合計細胞数である。
【００２６】
準備ステップでは、堆積層の帯水層に由来し、水素発生型発酵細菌及び水素資化性メタン生成菌を含む地下水に、有機物を添加することにより、反応液を準備してよい。本明細書における地下水には、堆積層の地下水から溶存しているガス（例えば、メタン）が除去された液も含まれる。
【００２７】
堆積層の地下水は、溶存酸素濃度が低いことから、嫌気的な発酵による水素ガス生成に好適である。堆積層の地下水は、季節変動及び天候による影響がないため、安定供給が可能である。堆積層の地下水は、堆積層の地下１００ｍ以深の帯水層に由来する溶存酸素濃度が検出限界以下の嫌気的な地下水であればよく、堆積層の地下１，０００ｍ以深の帯水層に由来する嫌気的な地下水であることが好ましい。堆積層の地下水には硫化水素等の腐食性ガスがほとんど含まれていないため、装置の腐食等もより抑制される。なお、「地下１００ｍ」等とは、鉛直方向に向かう地表面からの距離を意味する。堆積層の地下水は、付加体の地下水であってもよい。「付加体」とは、海洋プレートが海溝で陸側プレートの下に沈み込む際に、海洋プレートの上の堆積物がはぎ取られ、陸側プレートに付加して形成される堆積層である。「付加体」は上記条件を満たす堆積層であればよく、西南日本の太平洋側に分布する付加体に限定されるものではない。また、堆積層は付加体に限定されるものではない。
【００２８】
水素発生型発酵細菌及び水素資化性メタン生成菌は、堆積層の地下水に由来する微生物であってよい。水素発生型発酵細菌及び水素資化性メタン生成菌としては、これに限定されるものではないが、例えば、Clostridium thermocellum、Desulfotomaculumsalinum、Desulfotomaculum ruminis、Desulfotomaculum putei、Thermotoga lettingae、Moorella thermoacetica、Syntrophus gentianae、Prolixibacter bellariivorans、Olsenella uli、Syntrophothermus lipocalidus、Brumimicrobiummesophilum、Methanobacterium aarhusense、Methanobacterium alcaliphilum、Methanothermobactortherautotrophicusが挙げられる。
【００２９】
（生成ステップ）
生成ステップでは、水素資化性メタン生成菌の活性ピーク温度Ｔ＋５℃以上の温度で、水素発生型発酵細菌を増殖させ、反応液中の有機物から水素ガスを生成する。
【００３０】
反応液に含まれる有機物を水素発生型発酵細菌が嫌気的に分解することにより水素ガスが生成する。有機物を、Ｔ＋５℃以上の温度で、水素発生型発酵細菌により発酵させると共に、水素資化性メタン生成菌による水素ガスの消費及びメタンの生成が阻害されるため、水素ガスが最終生成物として得られる。すなわち、生成ステップでは、水素資化性メタン生成菌阻害剤を使用することなく、水素ガス生成が可能である。ここで、水素資化性メタン生成菌阻害剤としては、例えば、クロロホルム、２−ブロモエタンスルホン酸ナトリウムが挙げられる。
【００３１】
生成ステップでは、Ｔ＋５℃以上の温度で水素発生型発酵細菌により反応液を発酵させればよく、Ｔ＋１０℃以上の温度で水素発生型発酵細菌により反応液を発酵させてもよく、Ｔ＋１５℃以上の温度で水素発生型発酵細菌により反応液を発酵させてもよい。生成ステップでは、Ｔ＋１０℃以下の温度で水素発生型発酵細菌により反応液を発酵させてもよく、Ｔ＋１５℃以下の温度で水素発生型発酵細菌により反応液を発酵させてもよく、Ｔ＋２０℃以下の温度で水素発生型発酵細菌により反応液を発酵させてもよく、Ｔ＋２５℃以下の温度で水素発生型発酵細菌により反応液を発酵させてもよく、Ｔ＋３０℃以下の温度で水素発生型発酵細菌により反応液を発酵させてもよい。
【００３２】
生成ステップにおいて、反応圧力、反応時間等の条件は、特に制限されるものではない。反応圧力は、例えば、０．１ＭＰａ（大気圧）以上であってよく、０．２５ＭＰａ以下であってよい。反応圧力は、例えば、０．１ＭＰａ（大気圧）〜０．２５ＭＰａであってよい。反応時間は、例えば、１日間以上、１０日間以上、１５日間以上、２０日間以上、３０日間以上、４０日間以上、又は５０日間以上であってよく、１５０日間以下、１４０日間以下、又は１３０日間以下であってもよい。反応時間は、例えば、１日間以上１５０日間以下であってもよい。
【００３３】
反応液が堆積層の地下水に由来する場合、特に、深部堆積層の地下水には通常１０〜２０ＭＰａ程度の圧力がかかっているため、反応圧力をより高く設定することが好ましい。
【００３４】
〔水素ガス及びメタン生成システム〕
図１は、一実施形態に係る水素ガス及びメタン生成システムを示す模式図である。図１に示すように、水素ガス及びメタン生成システム１０００は、水素ガス生成システム１と、メタン生成システム２とから構成されている。
【００３５】
一実施形態に係る水素ガス生成システム１は、有機物、水素発生型発酵細菌及び水素資化性メタン生成菌を含む反応液を収容する水素ガス生成槽１４０と、水素発生型発酵細菌及び水素資化性メタン生成菌を含む堆積層の地下水を汲み上げ、地下水中の少なくとも水素発生型発酵細菌及び水素資化性メタン生成菌を水素ガス生成槽１４０に供給する地下水供給部６００と、地下水供給部６００及び水素ガス生成槽１４０の間に設けられたメタン分離槽１２０とを備えている。地下水供給部６００、メタン分離槽１２０及び水素ガス生成槽１４０のそれぞれの間は、液体が通過可能な配管で接続されている。
【００３６】
地下水供給部６００は、例えば水中ポンプである。地下水供給部６００は、堆積層から微生物を含む地下水を汲み上げ、汲み上げた堆積層の地下水を、配管６１０を通して、バルブ６２０の開放とともにメタン分離槽１２０に送液する。メタン分離槽１２０では、堆積層の地下水に溶存しているメタンが分離される。分離されたメタンは、メタン分離槽１２０に接続されて設けられたメタンタンク４０に回収される。メタンの分離は、メタンタンク４０とメタン分離槽１２０との間のコンプレッサー（Ｃ）にてメタン分離槽１２０の内部を引圧にすることにより行う。分離できなかったメタンは、不活性ガス供給装置（図示せず）から不活性ガスを供給し、堆積層の地下水をバブリングすることにより、メタン分離槽１２０上部のバルブ１２１から排出してよい。
【００３７】
水素ガス生成槽１４０には、メタンを分離した堆積層の地下水がメタン分離槽１２０から供給されると共に、水素ガス生成槽１４０に開閉自在のバルブ５５を介して接続されて設けられた第１の有機物供給部５０から有機物が供給される。このようにして、水素ガス生成槽１４０には、堆積層の地下水に含まれる水素発生型発酵細菌及び水素資化性メタン生成菌と、有機物とを含む反応液が収容される。
【００３８】
水素ガス生成槽１４０では、反応液が収容された状態で、水素発生型発酵細菌を培養することにより反応液を発酵させて、水素ガスを生成する。このとき、水素ガス生成槽１４０に接続されて設けられた第１の制御部６０が、水素ガス生成槽１４０内（反応液）の温度を、水素資化性メタン生成菌の活性ピーク温度Ｔ＋５℃以上の温度に制御する。第１の制御部６０は、水素ガス生成槽１４０内（反応液）の温度を、上記例示した温度に制御してもよい。このようにして生成した水素ガスは、水素ガス生成槽１４０に接続されて設けられた水素ガスタンク４１に回収される。
【００３９】
第１の制御部６０としては、反応液の温度を制御できるものであれば任意のものを用いることができる。第１の制御部６０は、例えば、電熱コイル又は水素ガス生成槽１４０の外部に熱媒体（例えば、水等）を含むパイプ等を巻きつけるものであってもよい。
【００４０】
この水素ガス生成システム１では、例えば、以下に示す方法により水素ガスを発生させることができる。
【００４１】
（ｉ）水素ガス生成槽１４０内部に、不活性ガス供給装置（図示せず）により不活性ガスを供給すると共に、水素ガス生成槽１４０内部のガスを排出し、水素ガス生成槽１４０内部を不活性ガスで置換する。不活性ガスで置換後、水素ガス生成槽を閉鎖系にする。このときの水素ガス生成槽１４０内部の圧力は、通常、大気圧（０．１ＭＰａ）程度である。
【００４２】
（ｉｉ）地下水供給部６００から、メタン分離槽１２０内部に反応液を送液する。このとき、コンプレッサーによりメタン分離槽１２０内部を引圧にし、地下水に溶存しているメタンをメタンタンク４０に回収してもよい。次に、不活性ガス供給装置によりメタン分離槽１２０内部に不活性ガスを供給し、反応液をバブリングすることにより、メタン分離槽１２０内部を不活性ガスで置換する。反応液に溶存しているメタンもバブリングにより不活性ガスで置換される。次に、不活性ガスで置換後のメタン分離槽１２０に、不活性ガスを更に供給することにより、メタン分離槽１２０内部の圧力を水素ガス生成槽１４０内部の圧力よりも高くする。その後、メタン分離槽１２０を閉鎖系にする。このときのメタン分離槽１２０内部の圧力は、通常０．１ＭＰａを超え、０．５ＭＰａ程度以下である。
【００４３】
（ｉｉｉ）有機物供給部５０内部に有機物を注入する。不活性ガス供給装置により有機物供給部５０内部に不活性ガスを供給し、有機物（有機物を含む液）をバブリングすることにより、有機物供給部５０内部を不活性ガスで置換する。有機物に溶存しているガスもバブリングにより不活性ガスで置換される。次に、不活性ガスで置換後の有機物供給部５０に不活性ガスを更に供給することにより、有機物供給部５０内部の圧力を水素ガス生成槽１４０内部の圧力よりも高くする。その後、有機物供給部５０を閉鎖系にする。このときの有機物供給部５０内部の圧力は、通常０．１ＭＰａを超え、０．５ＭＰａ程度以下である。
【００４４】
上記（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の操作は、任意の順序で行うことができる。（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の操作のうち２以上の操作を同時に行ってもよい。
【００４５】
（ｉｖ）有機物供給部５０を水素ガス生成槽１４０と接続する。有機物供給部５０と水素ガス生成槽１４０との圧力差により、有機物供給部５０から水素ガス生成槽１４０内部に有機物が供給される。外部から閉鎖されているため、この有機物の供給は嫌気的に行われる。
【００４６】
（ｖ）メタン分離槽１２０を水素ガス生成槽１４０と接続する。メタン分離槽１２０と水素ガス生成槽１４０との圧力差により、メタン分離槽１２０から、流路を通って、水素ガス生成槽１４０内部に反応液が供給される。外部から閉鎖されているため、この反応液の供給は嫌気的に行われる。
【００４７】
上記（ｉｖ）及び（ｖ）の操作は、任意の順序で行うことができる。（ｉｖ）及び（ｖ）の操作を同時に行ってもよい。好ましくは、（ｉｖ）の操作の後に（ｖ）の操作を行う。このように圧力差を利用して反応液及び有機物を水素ガス生成槽１４０に供給することにより、水素ガス生成槽内でこれらが自発的に混合される。したがって、撹拌装置等が不要となり、水素ガス生成システムの構造を単純化することができ、コンタミネーションのリスク低減、及び低コスト化が可能となる。
【００４８】
（ｖｉ）次いで、嫌気的に水素発生型発酵細菌による発酵を行う。このとき、水素ガス生成槽１４０に接続されて設けられた第１の制御部６０が、水素ガス生成槽１４０内（反応液）の温度を、水素資化性メタン生成菌の活性ピーク温度Ｔ＋５℃以上の温度に制御する。本実施形態に係る水素ガス生成システムは、上記のとおり作動するものであり、溶存酸素等の影響が少ないため、直ぐに嫌気的な発酵を開始することができる。したがって、発酵効率が極めて高い。
【００４９】
発酵により生成した水素ガスは、水素ガスタンク４１により水素ガス生成槽１４０から回収される。回収された水素ガスは、水素ガスタンク４１に貯蔵してもよく、水素ガスタンク４１に他の機器を接続しておき、直接その機器に供給してもよい。
【００５０】
水素ガス生成槽１４０、メタン分離槽１２０及び有機物供給部５０において、これらの装置内部への不活性ガスの供給、水素ガス生成槽１４０とメタン分離槽１２０又は有機物供給部５０との接続は、それぞれの装置に備えられたバルブ、三方コック等を介して行ってよい。バルブの開閉、三方コックの切り替え、及びバルブの開閉のタイミング制御等は手動で行ってもよいし、コンピュータープログラム等により自動で行ってもよい。
【００５１】
一実施形態に係るメタン生成システム２は、有機物、水素発生型発酵細菌及び水素資化性メタン生成菌を含む第２の反応液を収容するメタン生成槽１３０と、水素発生型発酵細菌及び水素資化性メタン生成菌を含む堆積層の地下水を汲み上げ、地下水中の少なくとも水素発生型発酵細菌及び水素資化性メタン生成菌をメタン生成槽１３０に供給する地下水供給部６００と、地下水供給部６００及びメタン生成槽１３０の間に設けられた第２のメタン分離槽１２０とを備えている。地下水供給部６００、メタン分離槽１２０及びメタン生成槽１３０のそれぞれの間は、液体が通過可能な配管で接続されている。
【００５２】
メタン生成槽１３０には、メタンを分離した堆積層の地下水がメタン分離槽１２０から供給されると共に、メタン生成槽１３０に開閉自在のバルブ５５を介して接続されて設けられた第２の有機物供給部５０から有機物が供給される。このようにして、メタン生成槽１３０には、堆積層の地下水に由来する水素発生型発酵細菌及び水素資化性メタン生成菌と、有機物とを含む反応液が収容される。
【００５３】
メタン生成槽１３０では、反応液が収容された状態で、水素発生型発酵細菌と水素資化性メタン生成菌を共生させることにより、反応液中の有機物からメタンを生成する。このとき、メタン生成槽１３０に接続されて設けられた第２の制御部７０が、メタン生成槽１３０内（反応液）の温度を、水素資化性メタン生成菌の活性ピーク温度Ｔ＋５℃未満の温度に制御する。第２の制御部７０は、メタン生成槽１３０内（反応液）の温度を、Ｔ℃以下、又は、Ｔ−１０℃以上、若しくはＴ−１５℃以上の温度に制御してもよい。このようにして生成したメタンは、メタン生成槽１３０に接続されて設けられたメタンタンク４０に回収される。第２の制御部７０は、第１の制御部６０と同様のものであってもよい。
【００５４】
メタン生成システム２では、メタン生成槽１３０及びメタンタンク４０を用いること、並びに、第２の制御部７０が、メタン生成槽１３０内（反応液）の温度を、水素資化性メタン生成菌の活性ピーク温度Ｔ＋５℃未満の温度に制御することを除いては、上記水素ガス生成システムと同様にして、（ｉ）〜（ｖｉ）の方法によりメタンを発生させることができる。
【００５５】
図１に示す水素ガス及びメタン生成システム１０００は、水素ガス生成システム１及びメタン生成システム２に、それぞれ１つ（計２つ）のメタン分離槽１２０を備えているが、メタン分離槽１２０は、１つのみであってもよい。この場合、メタン分離槽１２０は、メタン生成槽１３０及び水素ガス生成槽１４０の双方に接続される。
【００５６】
図１に示す水素ガス及びメタン生成システム１０００では、地下水供給部６００に対して水素ガス生成槽１４０及びメタン生成槽１３０が並列に接続されているが、水素ガス及びメタン生成システムは、例えば、地下水供給部６００に対して、メタン生成槽及び水素ガス生成槽が直列に接続されていてもよい。この場合、地下水供給部、メタン生成槽及び水素ガス生成槽がこの順で接続されており、水素ガス生成槽には、メタン生成槽からメタン生成後の地下水（反応液）が供給されてよい。
【００５７】
〔水／ガス／電気／熱の自家的供給システム〕
図２は、一実施形態に係る水／ガス／電気／熱の自家的供給システム２０００を示す模式図である。水／ガス／電気／熱の自家的供給システム２０００は、水素ガス及びメタン生成システムを備えている。図２に示す水／ガス／電気／熱の自家的供給システム２０００は、水素ガスタンク４１に接続された燃料電池４００と、メタンタンク４０に接続されたガスエンジン３００を有する発電機３１０と、を備える。
【００５８】
ガスエンジン３００を有する発電機３１０、及び燃料電池４００には、特に制限なく、通常用いられるガスエンジン及び発電機、並びに燃料電池を好適に利用できる。発電機３１０及び燃料電池４００で発電された電気は、その一部が地下水供給部６００、及びコンプレッサー（Ｃ）の作動エネルギーとして用いられる（図２中、電気の流れを一点鎖線で示した。）。すなわち、水／ガス／電気／熱の自家的供給システム２０００は外部からの電源供給がなくても動作可能である。
【００５９】
図２に示す一実施形態に係る水／ガス／電気／熱の自家的供給システム２０００は、不活性ガス供給装置３０を更に備えている。不活性ガス供給装置３０は、水素ガス生成槽及びメタン生成槽の系内の雰囲気を嫌気的にするため、並びにメタン分離槽１２０及び第１及び第２の有機物供給部５０の内部の圧力を高めるために用いられる。不活性ガスとしては、例えば、窒素ガス、アルゴンガス及びヘリウムガスが挙げられる。不活性ガスはこれらの１種を単独で、又は２種以上を混合して用いることができる。不活性ガス供給装置３０に含まれる不活性ガスの圧力に特に制限はないが、例えば、１０〜１５ＭＰａとすることができる。
【００６０】
水／ガス／電気／熱の自家的供給システム２０００は、水素ガス生成槽１４０内（反応液）及びメタン生成槽１３０内（反応液）それぞれの温度を制御可能な第１及び第２の制御部を更に備えている。第１及び第２の制御部は、加熱装置であってよい。加熱装置は、例えば、ラジエタ５００及び５２０と、図２中破線及び点線で示した熱媒体の流路と、ファン５１０とを備えるものとすることができる。ラジエタ５２０から冷却した熱媒体を注入する。冷却した熱媒体の注入は任意であるが、これにより過熱しすぎた熱媒体を適切な温度に調整することができる。
【００６１】
熱媒体は、水素ガス生成槽１４０及びメタン生成槽１３０を通過してラジエタ５００に到達する。熱媒体の流路は、例えば、チューブ形状のものとし、水素ガス生成槽１４０及びメタン生成槽１３０の本体周囲に巻きつけるように配置することで効率よく水素ガス生成槽１４０及びメタン生成槽１３０を加熱することができる。
【００６２】
続いて熱媒体は、ラジエタ５００においてファン５１０により一定程度冷却される。冷却された熱媒体は、ガスエンジン３００及び燃料電池４００を通過し、これらからの排熱により加熱される。このとき、同時に、熱媒体によりガスエンジン３００及び燃料電池４００の冷却が行われる。図２中、破線で示した流路は比較的加熱された熱媒体が流れていることを示し、点線で示した流路は比較的冷却された熱媒体が流れていることを示している。熱媒体としては、比熱が高いことから水であることが好ましい。
【００６３】
加熱装置は、上述のように、ガスエンジン３００及び燃料電池４００からの排熱を奪い、これらを冷却するとともに、この排熱を利用して水素ガス生成槽１４０及びメタン生成槽１３０を加温するものである。
【００６４】
水／ガス／電気／熱の自家的供給システム２０００は、二酸化炭素除去装置７００を更に備えていてもよい。二酸化炭素除去装置７００は、メタン生成槽１３０とメタンタンク４０との間に配置される場合と、水素ガス生成槽１４０と水素ガスタンク４１との間に配置される場合とがある。二酸化炭素除去装置７００は、このいずれか一方のみに配置されていてもよく、双方に配置されていてもよい。
【００６５】
メタン生成槽１３０から排出されるガスは、メタンと二酸化炭素を含む。二酸化炭素除去装置７００により二酸化炭素を除去することによって、回収されるガスに含まれるメタンの分圧を高めることができる。二酸化炭素除去後のメタンの分圧には特に制限はないが、７５モル％以上とすることが好ましく、８０モル％以上とすることがより好ましい。これにより、ガスエンジン３００及び発電機３１０での発電効率を高めることができる。
【００６６】
また、水素ガス生成槽１４０から排出されるガスは、水素ガスと二酸化炭素を含む。二酸化炭素除去装置７００により二酸化炭素を除去することによって、回収されるガスに含まれる水素ガスの分圧を高めることができる。二酸化炭素除去後の水素ガスの分圧には特に制限はないが、６０モル％以上とすることが好ましい。これにより、燃料電池４００での発電効率を高めることができる。
【００６７】
二酸化炭素除去装置７００は、生成したメタン（又は水素ガス）及び二酸化炭素を含むガスから二酸化炭素を選択的に除去するものである。二酸化炭素を除去する方法としては、特に限定されず、例えば、化学吸収法、物理吸収法、膜分離法、及び吸着剤による分離法を好適に用いることができる。
【００６８】
化学吸収法は、二酸化炭素を選択的に溶解できるアルカリ性溶液（例えば、アミン及び炭酸カリ水溶液）を吸収液として利用し、二酸化炭素を化学反応によって吸収させる方法である。
【００６９】
物理吸収法は、吸収液（例えば、メタノール及びポリエチレングリコール）を使用して、高圧及び低温下で物理的に二酸化炭素を吸収させる方法である。
【００７０】
膜分離法は、膜（例えば、高分子膜及びセラミック膜）による、各気体の透過速度の違いを利用して、混合ガスから二酸化炭素を分離する方法である。
【００７１】
吸着剤による分離法は、多孔質の吸着剤（例えば、ゼオライト及び活性炭）を用い、高い圧力下で吸着剤に二酸化炭素を吸着させる方法である。
【００７２】
本実施形態に係る二酸化炭素除去装置は、より安価でかつ単純な装置になることから、化学吸収法を利用した装置が好ましい。
【００７３】
水／ガス／電気／熱の自家的供給システム２０００は、脱硫装置７１０を更に備えていてもよい。脱硫装置７１０は、二酸化炭素除去装置７００と同様、メタン生成槽１３０とメタンタンク４０との間に配置される場合と、水素ガス生成槽１４０と水素ガスタンク４１との間に配置される場合とがある。脱硫装置７１０は、このいずれか一方のみに配置されていてもよく、双方に配置されていてもよい。
【００７４】
また、脱硫装置７１０と二酸化炭素除去装置７００とを併用する場合は、脱硫装置７１０と二酸化炭素除去装置７００との配置の順番は任意に設定することができるが、メタン生成槽又は水素ガス生成槽に近い方に脱硫装置７１０を配置することが好ましい。
【００７５】
脱硫装置７１０は、水素ガス生成及びメタン生成の過程で発生する可能性のある硫化水素を除去する装置である。硫化水素を除去することにより、ガスエンジン、燃料電池等の腐食を防ぐことができる。脱硫装置７１０としては、例えば、酸化鉄等を利用した装置が挙げられる。
【００７６】
水／ガス／電気／熱の自家的供給システム２０００は、水、ガス、電気及び熱の４つのインフラを同時に、かつ自家的に供給することができるため、災害時緊急ステーションとして好適に利用できる。
【実施例】
【００７７】
以下、実施例に基づいて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００７８】
［試料と方法］
（中型嫌気培養槽）
本実施例では、大量の微生物を嫌気状態で培養し観察するために作られたステンレス製の中型嫌気培養槽（リアクタータンク）を用いた。メタン生成を目的とした培養槽（メタン生成用リアクタータンク）の容量は１２．２５Ｌ、培養時の液相は５．２３Ｌ、気相は７．０２Ｌである。水素ガス生成を目的とした培養槽（水素ガス生成用リアクタータンク）の容量は１２．１１Ｌ、培養時の液相は５．１２Ｌ、気相は６．９９Ｌである。中型嫌気培養槽は、開放系かつ嫌気状態での培養を可能にするために、培養槽の蓋は密閉性を確保できるものになっており、蓋から下部にかけて液相を鉛直方向に混合しやすくするための板、及び生成ガスを抜くためのシリコンチューブを取り付けることができる排出口を有する。培養槽側面には縦に並んだ３つの排出口があり、それぞれの排出口はブチルゴム栓の上からネジ蓋を締めることで密閉を可能にしている。上段の排出口は１００μＬマイクロシリンジPressure-Lok Precision Analytical Syringe (VICI Precision)によって嫌気状態のガスサンプルを採取し、下段の排出口は同様に培養液の採取ができる仕組みになっている（非特許文献１）。中段の排出口は培養開始時に液相で満たした培養槽から嫌気的ガス置換を行うために用いる。【００７９】
また、側面には内部観察用のガラス窓がついており、回転石の状態及び培養液の状態を確認することができる。本実施例では、開放系での嫌気培養を行うため、培養槽にはガスを抜くためのチューブを蓋に取り付けた。チューブの端を外気と直接触れさせてしまうと嫌気状態を保てないので、Milligas counter (MGC-1, Japan Flow controls, Japan)に繋げた。Milligas counterは生成ガス量を測定することの他にガスを一方向しか通さないため、外気の混入を防ぎ、かつ、嫌気状態を保つことが可能である。培養層内部にはマグネスティックスターラー（MIXcontrol 40, MIXdrive 1HT, 2mag, Muenchen, Germany）を使用することで、高温のインキュベーター内においても液相の撹拌を行いながらの培養を可能にした。【００８０】
（サンプリングサイト）
静岡県静岡市にある小瀬戸温泉、川根温泉及び梅ヶ島温泉において、地下水のサンプリングを行った。小瀬戸温泉は近くに大きな建造物はなく、空き地に存在する。そのため、将来的には地下水に含まれるメタンを利用したエネルギー生産システムの導入に好条件な立地といえる。小瀬戸温泉は、３４°５９’０９”Ｎ，１３８°１７’６５”Ｅの瀬戸川層群に位置し、掘削深度は９１０ｍである。川根温泉では川根温泉ホテル及び道の駅に温泉供給しつつ、地下温水に付随するメタンを利用した発電及び熱生産が行われている。川根温泉は三倉層群に位置し、掘削深度は１，１４８ｍである。梅ヶ島温泉は、安倍川の上流に位置し、掘削深度は１，０００ｍである。【００８１】
（試料の採取とサンプル処理）
小瀬戸温泉でのサンプリングは２０１７年６月２９日に行った。川根温泉でのサンプリングは２０１７年３月１４日に行った。梅ヶ島温泉でのサンプリングは、２０１７年１１月１４日に行った。【００８２】
中型嫌気培養槽、ネジ、蓋、及びブチルゴム栓等は予めオートクレーブ滅菌を行った。嫌気状態でのサンプル採取のために中型嫌気培養槽を沈めることのできるステンレス製のバケツにサンプル地下温水を満たし、これを数分間オーバーフローさせた。マグネスティックスターラー（MIXcontrol 40, MIXdrive 1HT, 2mag, Muenchen, Germany）をサンプリング前に中型嫌気培養槽内に入れた。その中型嫌気培養槽を沈めて培養槽内が地下水で満たされた状態でオーバーフローを約１０分間行い採水口のネジ蓋を締めた。これにより嫌気状態での採水を行った。他に電気伝導度（Electric Conductivity:EC）、ｐＨを測定するため殺菌済みの５０ｍｌ遠沈管（SARSTEDT, Tokyo, Japan）でサンプルを採取した。また、地下温水に含まれる微生物群集の遺伝子解析を行うために１０Ｌの大量濾過用のサンプルも同時に採取した。【００８３】
（環境データの測定）
サンプル採取時に地表での現場水温、酸化還元電位（Oxidation-ReductionPotential:ORP）を測定した。遠沈管に採取したサンプルを使い、ｐＨ、電気伝導度(ElectricConductivity:EC)を測定した。また、この値を用いてＮａＣｌ濃度を算出した。それぞれの測定には温度計ＣＴ−４６０ＷＲ(CUSTOM, Tokyo, Japan)、ＯＲＰ計ＲＭ−２０Ｐ(DKK-TOA,Tokyo,Japan)、ｐＨ計ＣＭ−１４Ｐ(DKK-TOA, Tokyo, Japan)、ＥＣ計ＣＭ−２１Ｐ(DKK-TOA, Tokyo, Japan)を用いた。【００８４】
（中型嫌気培養槽のセットアップ）
地下水が入った中型嫌気培養槽側部の一番下のサンプリング口にチューブで接続した注射針を刺し、ガス置換装置ＧＲ−８(Sanshin, Kanagawa, Japan)を用いて窒素ガスを添加した。同時に、培養槽側部中央のサンプリング口からもチューブを付けた注射針を刺して温泉水を排出した。これにより、培養槽内を嫌気状態に保ったまま、窒素ガスで満たされた気相を作った。混合有機基質は濃度が高すぎるとメタン生成を阻害する可能性が示唆されているので、培養槽での最終濃度０．２２％になるように調整した（北尾高嶺，２００３，嫌気性の生物処理，生物学的排水処理工学，コロナ社，東京，２２７−２４０）。混合有機基質は培養槽上部の投入口から添加した。【００８５】
添加後、中型嫌気培養層をそれぞれ温度設定したインキュベーターに入れ、培養槽上部の採水口の１つにチューブを取り付けた蓋をして、気相のガスを放出できるようにした。また、培養槽側部の一番下のサンプリング口のブチルゴム栓に注射針を刺し、ガス置換装置ＧＲ−８(Sanshin, Kanagawa, Japan)を用いて窒素ガスを添加した。その際、窒素ガスはフィルター（Merck Millipore Ltd.）を用いて滅菌した。この窒素ガスの添加（窒素ガス置換）を約１時間行うことで、地下水に含まれていたメタンを完全に除去した。窒素ガス置換を終えた後、気相より１００μＬのガスを採取し、ガスクロマトグラフＧＣ−２０１４（Ｓｈｉｍａｚｕ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を用いてガス分析を行い、気相がすべて窒素ガスに置換されていることを確認した。有機基質の添加と窒素ガス置換終了後、培養を開始した。培養中は温度を一定とし、液相の均一性を保つために、マグネスティックスターラー（MIXcontrol 40, MIXdrive 1HT, 2mag, Muenchen, Germany）を４００ｒ．ｐ．ｍ．で回転させて鉛直混合を促す板を取り付けた。シリコンチューブの端をMilligas counterに装着した。そして以下の圧力測定、生成ガス量の測定、ガス組成の分析、吸光度の測定をすることで、培養槽の状態を観測した。培養時間が経つにつれて生成ガスが減った段階で新たに有機基質の添加と窒素ガス置換を行った。【００８６】
（生成ガス測定）
採取したガスサンプルに含まれる無機ガス（H２，Ｎ２，ＣＨ４，ＣＯ２）の分析を行うために、熱伝導度検出器（Thermal Conductivity Detector, TCD）を装備したガスクロマトグラフＧＣ−２０１４（Shimadzu, Kyoto, Japan）のセットアップを行った。本機のキャリアガスにはＡｒを使用した。カラム（SHINCARBON ST, Shinwa, Kyoto, Japan）の温度は１５０℃、カラム流量は５０ｍｌｍｉｎ−１、試料気化室の温度は１７０℃、検出器の温度は１７０℃に設定し、ＧＣ−ＦＩＤと同様にガスシリンジを用いて１００μＬのガスを試料気化室に投入し分析した。【００８７】
エリア値の算出にはクロマトパックＣ−Ｒ８Ａ（Shimadzu, Kyoto, Japan）を用い、得られた組成ガスのエリア値からあらかじめ標準ガスの測定によって作成した検量線をもとに各ガスのモル数を求め、気体の状態方程式から１気圧・標準温度における体積を算出した。それぞれのガスの検量線は、純窒素ガス(JAPAN FINE PRODUCTS, Tochigi, Japan)、純メタン（JAPANFINE PRODUCTS, Tochigi, Japan）、二酸化炭素１９．４％、水素ガス８０．６％の混合標準ガス（JAPAN FINE PRODUCTS, Tochigi, Japan）を用いて作成した。ガスクロマトグラフＧＣ−２０１４（Shimadzu, Kyoto, Japan）のセットアップの完了後、以下の操作により、生成ガスの組成分析を行った。【００８８】
培養槽上部の投入口の１つとミリガスカウンターＭＧＣ−１  Ｖ３．３  ＰＭＭＡ  (Ritter,Bochum, Germany)をシリコンチューブで接続し、ガス生成量の定量を行った。ミリガスカウンターの内部はポリマーＳｉｌｏｘ(Ritter, Bochum, Germany)で満たした。ミリガスカウンターにガスが流入すると左右どちらかの計量セルに３．２１ｍｌのガスがたまり、その浮力で計量セルが逆側に傾いて、たまったガスが放出されると同時に、反対側の計量セルに新たに流入したガスがたまるような仕組みになっている。このように計量セルが何回作動したかでガス生成量の定量が可能となる。また、ミリガスカウンターにデータロガーＴＲ−５５ｉ−Ｐ(T&D, Nagano, Japan)を繋ぎ、１時間毎のミリガスカウンターのパルス数を記録した。生成ガスの組成分析には、ガスクロマトグラフィーＧＣ−２０１４(Shimadzu, Kyoto, Japan)を用いた。分析に必要なガスサンプルは、１００μＬマイクロシリンジPressure-Lok Precision Analytical Syringe(VICI Precision, Canada)を用いて、培養槽側部の一番上のサンプリング口から採取した。生成ガスの分析は、２４時間毎に行った。記録された１時間毎のガス生成量と、ガス分析によって求められたガス組成より、水素ガス、メタン、及び二酸化炭素それぞれの生成量を算出した。ガス組成はガス分析の前後１２時間の水素ガス、メタン及び二酸化炭素の生成量の算出に適用した。【００８９】
（メタ１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子解析）
地下温水、及び培養サンプルに対してメタ１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子解析を行った。地下温水サンプルは、１０Ｌポリボトルに地下温水を採取し、氷上で冷却した。滅菌したシリコンチューブをペリスタポンプにセットし、シリコンチューブの先端を地下温水ボトルに差し込み、アルミホイルで口を閉じた。もう片方の先端に孔径０．２２μｍのSterivex-GP filterunit(Millipore, USA)を取り付け、ペリスタポンプを用いて、地下温水をフィルターにより濾過した。濾過後、フィルターにキャップを取り付け、冷凍保存した。【００９０】
培養サンプルは有機基質の添加と窒素ガス置換前の培養サンプルを１０ｍｌ採水し４℃、１０，０００×ｇで１０分間遠心分離し微生物細胞のペレットを作成した。小瀬戸温泉では培養開始から１６日目と５３日目、また、川根温泉では培養開始から１４日目と５０日目に採取した培養サンプルを用いた。採取された培養サンプルはＤＮＡ抽出を行うまで冷凍保存した。濾過した微生物細胞のＤＮＡ抽出はISOIL for Beating Kit(Nippon Gene, Japan)を用いて行った。その後、抽出したＤＮＡを鋳型として１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＶ３、Ｖ４領域をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲにはＰｒｏ３４１ｆとＰｒｏ８０６ｒのプライマーセットを用いた(Takahashi, S., et al “Development of a prokaryotic universal primerfor simultaneous analysis of bacteria and archaea using next-generationsequencing.” PLoS One,9, e105592, (2014))。ＰＣＲ産物である１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子（約４３０ｂｐ）の塩基配列の決定には、次世代シーケンサーＭｉＳｅｑ(Illumina, USA)を用いた。その後、キメラチェックプログラムのＵｓｅａｒｃｈ６．１．５４４＿ｉ８６を用いてキメラ塩基配列を除去した。得られた塩基配列はRDP MultiClassifer ver.2.10.1により相同性検索を行った。相同性９７％以上のものを同一のOperational Taxonomic Unit(OTU)とした。Coverage,Chao1及びShannon指数はQuantitativeInsights Into Microbial Ecology(QIIME)version 1.5.0 pipelineを用いて算出した(Caporaso, J.G., et al, “QIIME allows analysis of high-throughputcommunity sequencing data.” Nature Methods, 7, 335-336 (2010))。【００９１】
［結果］
（環境データの測定結果）
小瀬戸温泉は２０１７年６月２９日のサンプリングにおいて、水温２９．７℃、ＯＲＰ−１９３ｍＶ、ＥＣ４２６ｍＳｍ−１、ｐＨ８．２であった。川根温泉は、２０１７年３月１４日のサンプリングにおいて、水温４８．１℃、ＯＲＰ−２０５ｍＶ、ＥＣ１８９８ｍＳｍ−１、ｐＨ７．５であった。梅ヶ島温泉は、２０１７年１１月１４日のサンプリングにおいて、水温３１．８℃、ＯＲＰ−２８４ｍＶ、ＥＣ１３７．１ｍＳｍ−１、ｐＨ９．０であった。【００９２】
（小瀬戸温泉における結果）
小瀬戸温泉の温度別培養結果を図３〜５に示す。図３（Ａ）〜（Ｅ）は、それぞれ３０℃、４０℃、４５℃、５０℃及び５５℃で培養したときの水素ガス、メタン及び二酸化炭素濃度を示すグラフである。４５℃で培養したときにメタン生成量が最大であったことから、小瀬戸温泉から採取された反応液中の水素資化性メタン生成菌の活性ピーク温度Ｔは４５℃であった。活性ピーク温度Ｔ＋５℃以上（５０℃及び５５℃）で培養した場合、メタンの生成は検出されず、水素ガス及び二酸化炭素の生成が検出された。【００９３】
図４（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれ４５℃及び５５℃で培養したときの水素ガス、メタン及び二酸化炭素濃度を示すグラフである。図４（Ａ）及び（Ｂ）中、矢印で示したタイミングで、ヘッドスペースを窒素ガスで置換し、かつ上記混合有機物を中型嫌気培養槽に添加した。窒素ガスでの置換及び混合有機物の添加は、１６日目、２７日目、４０日目及び５３日目の計４回行った。培養は６８日目に終了させた。【００９４】
図４（Ａ）に示すとおり、培養温度（培養層の設定温度）４５℃では、１６日目以降、水素ガスの生成はほぼ検出されず、メタン及び二酸化炭素の生成が検出された。図４（Ｂ）に示すとおり、培養温度５５℃では、水素ガス及び二酸化炭素の生成が検出され、培養中にメタンの生成は検出されなかった。【００９５】
図５（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれ４５℃及び５５℃で培養したときの生成ガス中の水素ガス、メタン及び二酸化炭素の割合を示す。図５（Ａ）に示すとおり、培養温度４５℃では、生成ガスにおけるメタンの割合は、培養開始直後並びに有機基質の添加及び窒素ガス置換直後を除いて、４０％から５０％程度の間に収まっていた。メタンの最大生成速度は１５日目の１３８．３ｍｌＬ−１ｄａｙ−１であった。図５（Ｂ）に示すとおり、培養温度５５℃では、培養開始直後、並びに有機基質の添加及び窒素ガス置換の直後を除いて、生成ガスにおける水素ガスの割合は５０％前後であった。水素ガスの最大生成速度は１５日目の１５５．４ｍｌＬ−１ｄａｙ−１であった。【００９６】
（川根温泉における結果）
川根温泉の温度別培養結果を図６〜８に示す。図６（Ａ）〜（Ｅ）は、それぞれ４０℃、４５℃、５０℃、５５℃及び６０℃で培養したときの水素ガス、メタン及び二酸化炭素濃度を示すグラフである。５０℃で培養したときにメタン生成量が最大であったことから、小瀬戸温泉から採取された反応液中の水素資化性メタン生成菌の活性ピーク温度Ｔは５０℃であった。活性ピーク温度Ｔ＋５℃以上（５５℃及び６０℃）で培養した場合、水素ガス及び二酸化炭素の生成が検出された。【００９７】
図７（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれ５０℃及び６０℃で培養したときの水素ガス、メタン及び二酸化炭素濃度を示すグラフである。図７（Ａ）及び（Ｂ）中、矢印で示したタイミングで、ヘッドスペースを窒素ガスで置換し、かつ上記混合有機物を中型嫌気培養槽に添加した。窒素ガスでの置換及び混合有機物の添加は、１４日目、２４日目、３６日目及び５０日目の計４回行った。培養は６９日目に終了させた。【００９８】
図７（Ａ）に示すとおり、培養温度（培養層の設定温度）５０℃では、初めに水素ガスの生成を検出したが１４日目以降、水素ガスの検出量は微量であり、生成ガスのほとんどがメタン及び二酸化炭素であった。図７（Ｂ）に示すとおり、培養温度６０℃では、水素ガス及び二酸化炭素の生成が検出され、培養中にメタンの生成は検出されなかった。【００９９】
図８（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれ５０℃及び６０℃で培養したときの生成ガス中の水素ガス、メタン及び二酸化炭素の割合を示す。図８（Ａ）に示すとおり、培養温度５０℃では、生成ガスにおけるメタンの割合は、培養開始直後並びに有機基質の添加及び窒素ガス置換直後を除いて、４０％から５５％程度の間に収まっていた。メタンの最大生成速度は１５日目の９８．９ｍｌＬ−１ｄａｙ−１であった。図８（Ｂ）に示すとおり、培養温度６０℃では、培養開始直後、並びに有機基質の添加及び窒素ガス置換の直後を除いて、生成ガスにおける水素ガスの割合は４０〜６０％前後であった。水素ガスの最大生成速度は４日目の１６０．５ｍｌＬ−１ｄａｙ−１であった。【０１００】
（梅ヶ島温泉における結果）
梅ヶ島温泉の温度別培養結果を図９に示す。図９（Ａ）〜（Ｅ）は、それぞれ３５℃、４０℃、４５℃、５０℃及び５５℃で培養したときの水素ガス、メタン及び二酸化炭素濃度を示すグラフである。４０℃で培養したときにメタン生成量が最大であったことから、梅ヶ島温泉から採取された反応液中の水素資化性メタン生成菌の活性ピーク温度Ｔは４０℃であった。活性ピーク温度Ｔ＋５℃以上（４５℃、５０℃及び５５℃）で培養した場合、メタンの生成は検出されず、水素ガス及び二酸化炭素の生成が検出された。【０１０１】
（地下水・メタン生成・水素ガス生成サンプルの遺伝子解析結果）
小瀬戸温泉の遺伝子解析
小瀬戸温泉の地下水サンプルのArchaea及びBacteriaの含有割合は、Archaeaが５５％、Bacteriaが４５％であった。４５℃で培養を行った反応液中において、Archaeaでは、水素資化性メタン生成菌として知られているMethanobacterialesが優占し、Bacteriaでは、主に発酵を行い水素ガスと二酸化炭素を生成することで知られるClostridialesが優占していた。５５℃で培養を行った反応液中においてArchaeaは、培養開始から１６日目及び５３日目共にほぼ検出されなかった。５５℃で培養を行った反応液中においてBacteriaでは、主に発酵を行い水素ガスと二酸化炭素を生成することで知られるClostridialesが優占していた。【０１０２】
川根温泉の遺伝子解析
川根温泉の地下水サンプルのArchaea及びBacteriaの含有割合はArchaeaが２．７％、Bacteriaが９７％であった。５０℃で培養を行った反応液中において、Archaeaでは水素資化性メタン生成菌として知られているMethanobacterialesが優占し、Bacteriaでは、主に発酵を行い水素ガスと二酸化炭素を生成することで知られるClostridialesが優占していた。６０℃で培養を行った反応液においてArchaeaは培養開始から１４日目及び５０日目共にほぼ検出されなかった。Bacteriaでは、主に発酵を行い水素ガスと二酸化炭素を生成することで知られるClostridialesが優占していた。
【符号の説明】
【０１０３】
１…水素ガス生成システム、２…メタン生成システム、３０…不活性ガス供給装置、４０…メタンタンク、４１…水素ガスタンク、５０…有機物供給部、６０…第１の制御部、７０…第２の制御部、１２０…メタン分離槽、１３０…メタン生成槽、１４０…水素ガス生成槽、６００…地下水供給部、７００…二酸化炭素除去装置、７１０…脱硫装置、１０００…水素ガス及びメタン生成システム、２０００…水／ガス／電気／熱の自家的供給システム。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年8月7日(2019.8.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機物、水素発生型発酵細菌及び水素資化性メタン生成菌を含む反応液を準備する準備ステップと、
前記水素資化性メタン生成菌の活性ピーク温度Ｔ＋５℃以上Ｔ＋１０℃以下の温度で、前記水素発生型発酵細菌により前記反応液を発酵させて水素ガスを生成する生成ステップと、を備え、
前記準備ステップにおいて、堆積層の帯水層に由来し、前記水素発生型発酵細菌及び前記水素資化性メタン生成菌を含む地下水に、前記有機物を添加することにより、前記反応液を準備し、
メタンを生成せず、
前記水素資化性メタン生成菌の阻害剤を使用しない、水素ガス生成方法。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
有機物、水素発生型発酵細菌及び水素資化性メタン生成菌を含む反応液を収容する水素ガス生成槽と、
前記水素ガス生成槽の温度を制御する制御部と、
前記水素発生型発酵細菌及び前記水素資化性メタン生成菌を含む堆積層の地下水を汲み上げ、前記地下水中の少なくとも前記水素発生型発酵細菌及び前記水素資化性メタン生成菌を前記水素ガス生成槽に供給する地下水供給部と、
前記有機物を前記水素ガス生成槽に供給する有機物供給部と、を備え、
前記制御部は、前記水素ガス生成槽の温度を、前記水素資化性メタン生成菌の活性ピーク温度Ｔ＋５℃以上Ｔ＋１０℃以下の温度に制御することで、前記水素発生型発酵細菌により前記反応液を発酵させて水素ガスを生成させ、
前記水素資化性メタン生成菌の阻害剤を使用しない、水素ガス生成システム。
【請求項４】
有機物、水素発生型発酵細菌及び水素資化性メタン生成菌を含む第１の反応液を収容する水素ガス生成槽と、
前記水素ガス生成槽の温度を制御する第１の制御部と、
有機物、水素発生型発酵細菌及び水素資化性メタン生成菌を含む第２の反応液を収容するメタン生成槽と、
前記メタン生成槽の温度を制御する第２の制御部と、を備え、
前記第１の制御部は、前記水素ガス生成槽の温度を、前記水素資化性メタン生成菌の活性ピーク温度Ｔ＋５℃以上の温度に制御することで、前記水素発生型発酵細菌により前記反応液を発酵させて水素ガスを生成させ、
前記第２の制御部は、前記メタン生成槽の温度を、前記水素資化性メタン生成菌の活性ピーク温度Ｔ＋５℃未満に制御することで、前記反応液から、前記水素発生型発酵細菌と前記水素資化性メタン生成菌によりメタンを生成させ、
前記水素資化性メタン生成菌の阻害剤を使用しない、水素ガス及びメタン生成システム。
【請求項５】
前記水素発生型発酵細菌及び前記水素資化性メタン生成菌を含む堆積層の地下水を汲み上げ、前記地下水中の少なくとも前記水素発生型発酵細菌及び前記水素資化性メタン生成菌を前記水素ガス生成槽及び前記メタン生成槽のそれぞれに供給する地下水供給部と、
前記有機物を前記水素ガス生成槽に供給する第１の有機物供給部と、
前記有機物を前記メタン生成槽に供給する第２の有機物供給部と、を更に備える、請求項４に記載の水素ガス及びメタン生成システム。
【請求項６】
前記水素資化性メタン生成菌の活性ピーク温度Ｔが６０℃以下である、請求項１に記載の水素ガス生成方法。
【請求項７】
前記水素資化性メタン生成菌の活性ピーク温度Ｔが５０℃以下である、請求項１又は６に記載の水素ガス生成方法。
【国際調査報告】
2019167956.tif 000011
2019167956.tif 000012