(57)【要約】  より生体小腸に近い特徴を有する腸管オルガノイドを多能性幹細胞から作製することを課題とする。（１）多能性幹細胞を内胚葉様細胞へと分化させる工程、（２）工程（１）で得られた内胚葉様細胞を腸管幹細胞様細胞へと分化させる工程、（３）工程（２）で得られた腸管幹細胞様細胞を、上皮成長因子、線維芽細胞増殖因子、TGFβ受容体阻害剤、GSK-3β阻害剤及びROCK阻害剤の存在下で培養する工程、（４）工程（３）後の細胞を培養し、スフェロイドを形成させる工程、（５）工程（４）で形成されたスフェロイドを分化させ、腸管オルガノイドを形成させる工程であって、上皮成長因子、BMP阻害剤及びWntシグナル活性化剤の存在下での培養を含む工程によって、多能性幹細胞から腸管オルガノイドを作製する。また、工程（５）で形成された腸管オルガノイドを構成する細胞を、上皮成長因子及びTGFβ受容体阻害剤の存在下で平面培養し、平面培養系を作製する。平面培養の際、気液培養を利用し、絨毛構造を有する高機能な評価系の構築を図る。
2020091020.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（１）〜（５）を含む、多能性幹細胞から腸管オルガノイドを作製する方法：
（１）多能性幹細胞を内胚葉様細胞へと分化させる工程；
（２）工程（１）で得られた内胚葉様細胞を腸管幹細胞様細胞へと分化させる工程；
（３）工程（２）で得られた腸管幹細胞様細胞を、上皮成長因子、線維芽細胞増殖因子、TGFβ受容体阻害剤、GSK-3β阻害剤及びROCK阻害剤の存在下で培養する工程；
（４）工程（３）後の細胞を培養し、スフェロイドを形成させる工程；
（５）工程（４）で形成されたスフェロイドを分化させ、腸管オルガノイドを形成させる工程であって、上皮成長因子、BMP阻害剤及びWntシグナル活性化剤の存在下での培養を含む工程。
【請求項２】
基底膜成分をコートした培養面を用いて工程（３）の培養を行う、請求項１に記載の作製方法。
【請求項３】
前記基底膜成分がラミニン511又はそのE8断片である、請求項２に記載の作製方法。
【請求項４】
工程（３）において継代操作を行う、請求項１〜３のいずれか一項に記載の作製方法。
【請求項５】
前記継代操作の回数が１回又は２回である、請求項４に記載の作製方法。
【請求項６】
線維芽細胞増殖因子がFGF2、FGF4又はFGF10であり、TGFβ受容体阻害剤がA-83-01であり、GSK-3β阻害剤がCHIR99021、SB216763、CHIR98014、TWS119、Tideglusib、SB415286、BIO、AZD2858、AZD1080、AR-A014418、TDZD-8、LY2090314、IM-12、Indirubin、Bikinin又は1-Azakenpaulloneであり、ROCK阻害剤がY-27632である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の作製方法。
【請求項７】
工程（３）の培養期間が２日間〜１４日間である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の作製方法。
【請求項８】
工程（４）の培養において、均一な形状及び大きさの複数のウェルが細胞低接着性又は細胞非接着性の培養面に形成された培養容器を使用し、複数のスフェロイドをまとめて形成させる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の作製方法。
【請求項９】
水溶液中に３次元的網目構造を形成する材料を添加した液体培地を工程（５）の培養に用い、工程（４）で形成させた複数のスフェロイドがまとめて浮遊培養される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の作製方法。
【請求項１０】
前記材料が高分子ゲル及び多糖からなる群より選択される一以上の材料である、請求項９に記載の作製方法。
【請求項１１】
前記材料が脱アシル化ジェランガムを含む、請求項９に記載の作製方法。
【請求項１２】
BMP阻害剤がNogginであり、Wntシグナル活性化剤がR-spondin-1である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の作製方法。
【請求項１３】
工程（５）の培養期間が１２日間〜３６日間である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の作製方法。
【請求項１４】
工程（５）の培養を、上皮成長因子、BMP阻害剤及びWntシグナル活性化剤に加え、MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びγ−セクレターゼ阻害剤の存在下で行う、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の作製方法。
【請求項１５】
工程（５）の培養を、上皮成長因子、BMP阻害剤及びWntシグナル活性化剤に加え、MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤及びTGFβ受容体阻害剤の存在下で行う、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の作製方法。
【請求項１６】
前記多能性幹細胞が人工多能性幹細胞又は胚性幹細胞である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の作製方法。
【請求項１７】
前記多能性幹細胞がヒト人工多能性幹細胞である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の作製方法。
【請求項１８】
前記ヒト人工多能性幹細胞が、腸疾患の患者由来の人工多能性幹細胞である、請求項１７に記載の作製方法。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の作製方法で得られた腸管オルガノイド。
【請求項２０】
請求項１９に記載の腸管オルガノイドを用いた、被検物質の体内動態又は毒性を評価する方法。
【請求項２１】
前記体内動態が、代謝、吸収性、膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、又は薬物トランスポーターの誘導である、請求項２０に記載の評価方法。
【請求項２２】
以下の工程（Ｉ）及び（ＩＩ）を含む、請求項２１に記載の方法：
（Ｉ）請求項１９に記載の腸管オルガノイドに被検物質を接触させる工程；
（ＩＩ）被検物質の代謝、吸収性、膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、又は薬物トランスポーターの誘導、或いは毒性を測定・評価する工程。
【請求項２３】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の作製方法で得られた腸管オルガノイドに腸疾患の病態を誘導することを特徴とする、腸疾患モデルの作製方法。
【請求項２４】
請求項１９に記載の腸管オルガノイドを含む、移植材料。
【請求項２５】
以下の工程（１）〜（６）を含む、多能性幹細胞から腸管細胞層を作製する方法：
（１）多能性幹細胞を内胚葉様細胞へと分化させる工程；
（２）工程（１）で得られた内胚葉様細胞を腸管幹細胞様細胞へと分化させる工程；
（３）工程（２）で得られた腸管幹細胞様細胞を、上皮成長因子、線維芽細胞増殖因子、TGFβ受容体阻害剤、GSK-3β阻害剤及びROCK阻害剤の存在下で培養する工程；
（４）工程（３）後の細胞を培養し、スフェロイドを形成させる工程；
（５）工程（４）で形成されたスフェロイドを分化させ、腸管オルガノイドを形成させる工程であって、上皮成長因子、BMP阻害剤及びWntシグナル活性化剤の存在下での培養を含む工程；
（６）工程（５）で形成された腸管オルガノイドを構成する細胞を、上皮成長因子及びTGFβ受容体阻害剤の存在下で平面培養する工程。
【請求項２６】
工程（６）の培養を、上皮成長因子及びTGFβ受容体阻害剤に加え、cAMP活性化物質の存在下で行う、請求項２５に記載の作製方法。
【請求項２７】
工程（６）の培養を、上皮成長因子及びTGFβ受容体阻害剤に加え、cAMP活性化物質とγ−セクレターゼ阻害剤の存在下で行う、請求項２５に記載の作製方法。
【請求項２８】
工程（６）の培養を、上皮成長因子及びTGFβ受容体阻害剤に加え、cAMP活性化物質とGSK-3β阻害剤の存在下で行う、請求項２５に記載の作製方法。
【請求項２９】
工程（６）の平面培養の少なくとも一部を気液培養にする、請求項２５に記載の作製方法。
【請求項３０】
前記気液培養を、上皮成長因子及びTGFβ受容体阻害剤に加え、cAMPシグナルを活性化する因子の存在下で行う、請求項２９に記載の作製方法。
【請求項３１】
前記因子がcAMP誘導体、cAMP分解酵素阻害剤又はcAMP活性化物質である、請求項３０に記載の作製方法。
【請求項３２】
前記因子がフォルスコリンである、請求項３０に記載の作製方法。
【請求項３３】
請求項２５〜３２のいずれか一項に記載の方法で得られた腸管細胞層。
【請求項３４】
請求項３３に記載の腸管細胞層を用いた、被検物質の体内動態又は毒性を評価する方法。
【請求項３５】
前記体内動態が、代謝、吸収性、膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、又は薬物トランスポーターの誘導である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
以下の工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む、請求項３４又は３５に記載の方法：
（ｉ）請求項３３に記載の腸管細胞層を用意する工程；
（ｉｉ）前記腸管細胞層に被検物質を接触させる工程；
（ｉｉｉ）前記腸管細胞層を透過した被検物質を定量し、被検物質の代謝、吸収性、膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、又は薬物トランスポーターの誘導、或いは毒性を評価する工程。
【請求項３７】
以下の工程（Ｉ）及び（ＩＩ）を含む、請求項３４又は３５に記載の方法：
（Ｉ）請求項３３に記載の腸管細胞層に被検物質を接触させる工程；
（ＩＩ）被検物質の代謝、吸収性、膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、又は薬物トランスポーターの誘導、或いは毒性を測定・評価する工程。
【請求項３８】
請求項２５〜３２のいずれか一項に記載の作製方法で得られた腸管細胞層に腸疾患の病態を誘導することを特徴とする、腸疾患モデルの作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は多能性幹細胞由来の腸管オルガノイドを作製する方法及びその用途に関する。本出願は、２０１８年１１月２日に出願された日本国特許出願第２０１８−２０７１０８号に基づく優先権、及び２０１９年５月１５日に出願された日本国特許出願第２０１９−０９２３３６号に基づく優先権を主張するものであり、当該特許出願の全内容は参照により援用される。
【背景技術】
【０００２】
小腸は経口投与された医薬品の体内動態を考える上で非常に重要な臓器である。非臨床試験の段階においてヒト小腸における薬物の動態（吸収、排泄、代謝）を総合的に評価するためには初代小腸上皮細胞の利用が望ましいが、これは入手自体が困難である。近年、新規in vitro評価系として、腸管組織を模倣した３次元組織構造体（オルガノイド）が注目されている。腸管オルガノイドは、腸疾患の研究および治療のための重要なツールとして大きく期待されている。現在ヒト組織由来腸管オルガノイドが実験的に使用されているが、侵襲性が非常に高く、入手及び安定供給は非常に困難である。そこで、侵襲性が低く、疾患モデルとしても利用可能なヒト人工多能性幹（iPS）細胞由来腸管オルガノイドが注目されている。【０００３】
また、ヒト以外の哺乳動物は疾患モデルや生物医学的研究に有用である。特に、創薬研究において実験動物として用いられるカニクイザルはヒトと非常に類似している点が多く、薬物代謝酵素やトランスポーターのアミノ酸配列は90〜95％の相同性が認められ、基質特異性が類似している。そのため非臨床試験の段階において、カニクイザルを用いてin vivo並びにin vitroの相関性を確認することで、より正確にヒトを予測することが可能である。【０００４】
ES細胞やiPS細胞から２次元（2D）培養で腸管上皮細胞を作製したこと（例えば特許文献１、２を参照）、及びマトリゲル等を利用した３次元（3D）培養で腸管オルガノイドを作製したこと（例えば、特許文献３、４、非特許文献１〜４）が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１４／１３２９３３号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２０１２／０６０３１５号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２０１６／０９３２２２号パンフレット
【特許文献４】特開２００６−２３９１６９号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Drug Metab. Pharmacokinetic Vol.29 (1). P.44-51 (2014)
【非特許文献２】Nature, Vol.470, P.l05-109 (2011)
【非特許文献３】Stem Cells, vol.24, P.2618-2626 (2006)
【非特許文献４】Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol.391 (1), No.7, P.38-42 (2010)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
現在用いられている分化誘導法で作製した腸管オルガノイドでは、腸の構造が未熟であるため、腸管で構成されている絨毛−クリプト構造が反映できない。また、マトリゲル包埋による培養が主流であるが、培養体積が限られるため、ハイスループット解析など大量に腸管オルガノイドを必要とする用途への適用は困難である。そこで本発明は、より生体小腸に近い特徴を有する腸管オルガノイドを多能性幹細胞から作製することを第１の課題とし、腸管オルガノイドの作製効率の向上を第２の課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決すべく本発明者らは、分化誘導時の培養条件（特に低分子化合物の組合せや継代操作の有無）に独自の工夫を加え、その有効性ないし効果を検証した。その結果、生体腸管構造に近い構造を有するとされているbuddingな腸管オルガノイドを作製することに成功した。即ち、より生体小腸に近い特徴を有する腸管オルガノイドを作製する条件が見出された。また、培養方法を改良することにより、均一性の高い、腸管オルガノイドを大量に作製することに成功した。一方、作製した腸管オルガノイドの有用性を検討したところ、薬物スクリーニング系等への利用・適用が可能な実用性の高いものであることが明らかとなった。尚、新規組合せに採用した因子はいずれも安価でロット間差の少ない低分子化合物であり、この特徴は、腸管オルガノイドの作製コストの低減に加え、腸管オルガノイドの品質及び信頼性の向上等をもたらす。【０００９】
更に検討を加えた結果、最終段階の浮遊培養の際に特定の低分子化合物を追加することによって腸管オルガノイドの高機能化に成功した。一方、腸管オルガノイドから細胞を回収し、細胞層を形成させることにより、ハイスループット解析により適した二次元評価モデルの構築にも成功するとともに、その際の高機能化に有効な条件を見出した。【００１０】
以下の発明は、主として、以上の成果に基づく。
［１］以下の工程（１）〜（５）を含む、多能性幹細胞から腸管オルガノイドを作製する方法：
（１）多能性幹細胞を内胚葉様細胞へと分化させる工程；
（２）工程（１）で得られた内胚葉様細胞を腸管幹細胞様細胞へと分化させる工程；
（３）工程（２）で得られた腸管幹細胞様細胞を、上皮成長因子、線維芽細胞増殖因子、TGFβ受容体阻害剤、GSK-3β阻害剤及びROCK阻害剤の存在下で培養する工程；
（４）工程（３）後の細胞を培養し、スフェロイドを形成させる工程；
（５）工程（４）で形成されたスフェロイドを分化させ、腸管オルガノイドを形成させる工程であって、上皮成長因子、BMP阻害剤及びWntシグナル活性化剤の存在下での培養を含む工程。
［２］基底膜成分をコートした培養面を用いて工程（３）の培養を行う、［１］に記載の作製方法。
［３］前記基底膜成分がラミニン511又はそのE8断片である、［２］に記載の作製方法。
［４］工程（３）において継代操作を行う、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の作製方法。
［５］前記継代操作の回数が１回又は２回である、［４］に記載の作製方法。
［６］線維芽細胞増殖因子がFGF2、FGF4又はFGF10であり、TGFβ受容体阻害剤がA-83-01であり、GSK-3β阻害剤がCHIR99021、SB216763、CHIR98014、TWS119、Tideglusib、SB415286、BIO、AZD2858、AZD1080、AR-A014418、TDZD-8、LY2090314、IM-12、Indirubin、Bikinin又は1-Azakenpaulloneであり、ROCK阻害剤がY-27632である、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の作製方法。
［７］工程（３）の培養期間が２日間〜１４日間である、［１］〜［６］のいずれか一項に記載の作製方法。
［８］工程（４）の培養において、均一な形状及び大きさの複数のウェルが細胞低接着性又は細胞非接着性の培養面に形成された培養容器を使用し、複数のスフェロイドをまとめて形成させる、［１］〜［７］のいずれか一項に記載の作製方法。
［９］水溶液中に３次元的網目構造を形成する材料を添加した液体培地を工程（５）の培養に用い、工程（４）で形成させた複数のスフェロイドがまとめて浮遊培養される、［１］〜［８］のいずれか一項に記載の作製方法。
［１０］前記材料が高分子ゲル及び多糖からなる群より選択される一以上の材料である、［９］に記載の作製方法。
［１１］前記材料が脱アシル化ジェランガムを含む、［９］に記載の作製方法。
［１２］BMP阻害剤がNogginであり、Wntシグナル活性化剤がR-spondin-1である、［１］〜［１１］のいずれか一項に記載の作製方法。
［１３］工程（５）の培養期間が１２日間〜３６日間である、［１］〜［１２］のいずれか一項に記載の作製方法。
［１４］工程（５）の培養を、上皮成長因子、BMP阻害剤及びWntシグナル活性化剤に加え、MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びγ−セクレターゼ阻害剤の存在下で行う、［１］〜［１３］のいずれか一項に記載の作製方法。
［１５］工程（５）の培養を、上皮成長因子、BMP阻害剤及びWntシグナル活性化剤に加え、MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤及びTGFβ受容体阻害剤の存在下で行う、［１］〜［１３］のいずれか一項に記載の作製方法。
［１６］前記多能性幹細胞が人工多能性幹細胞又は胚性幹細胞である、［１］〜［１５］のいずれか一項に記載の作製方法。
［１７］前記多能性幹細胞がヒト人工多能性幹細胞である、［１］〜［１５］のいずれか一項に記載の作製方法。
［１８］前記ヒト人工多能性幹細胞が、腸疾患の患者由来の人工多能性幹細胞である、［１７］に記載の作製方法。
［１９］［１］〜［１８］のいずれか一項に記載の作製方法で得られた腸管オルガノイド。
［２０］［１９］に記載の腸管オルガノイドを用いた、被検物質の体内動態又は毒性を評価する方法。
［２１］前記体内動態が、代謝、吸収性、膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、又は薬物トランスポーターの誘導である、［２０］に記載の評価方法。
［２２］以下の工程（Ｉ）及び（ＩＩ）を含む、［１９］に記載の方法：
（Ｉ）［１９］に記載の腸管オルガノイドに被検物質を接触させる工程；
（ＩＩ）被検物質の代謝、吸収性、膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、又は薬物トランスポーターの誘導、或いは毒性を測定・評価する工程。
［２３］［１］〜［１７］のいずれか一項に記載の作製方法で得られた腸管オルガノイドに腸疾患の病態を誘導することを特徴とする、腸疾患モデルの作製方法。
［２４］［１９］に記載の腸管オルガノイドを含む、移植材料。
［２５］以下の工程（１）〜（６）を含む、多能性幹細胞から腸管細胞層を作製する方法：
（１）多能性幹細胞を内胚葉様細胞へと分化させる工程；
（２）工程（１）で得られた内胚葉様細胞を腸管幹細胞様細胞へと分化させる工程；
（３）工程（２）で得られた腸管幹細胞様細胞を、上皮成長因子、線維芽細胞増殖因子、TGFβ受容体阻害剤、GSK-3β阻害剤及びROCK阻害剤の存在下で培養する工程；
（４）工程（３）後の細胞を培養し、スフェロイドを形成させる工程；
（５）工程（４）で形成されたスフェロイドを分化させ、腸管オルガノイドを形成させる工程であって、上皮成長因子、BMP阻害剤及びWntシグナル活性化剤の存在下での培養を含む工程；
（６）工程（５）で形成された腸管オルガノイドを構成する細胞を、上皮成長因子及びTGFβ受容体阻害剤の存在下で平面培養する工程。
［２６］工程（６）の培養を、上皮成長因子及びTGFβ受容体阻害剤に加え、cAMP活性化物質の存在下で行う、［２５］に記載の作製方法。
［２７］工程（６）の培養を、上皮成長因子及びTGFβ受容体阻害剤に加え、cAMP活性化物質とγ−セクレターゼ阻害剤の存在下で行う、［２５］に記載の作製方法。
［２８］工程（６）の培養を、上皮成長因子及びTGFβ受容体阻害剤に加え、cAMP活性化物質とGSK-3β阻害剤の存在下で行う、［２５］に記載の作製方法。
［２９］工程（６）の平面培養の少なくとも一部を気液培養にする、［２５］に記載の作製方法。
［３０］前記気液培養を、上皮成長因子及びTGFβ受容体阻害剤に加え、cAMPシグナルを活性化する因子の存在下で行う、［２９］に記載の作製方法。
［３１］前記因子がcAMP誘導体、cAMP分解酵素阻害剤又はcAMP活性化物質である、［３０］に記載の作製方法。
［３２］前記因子がフォルスコリンである、［３０］に記載の作製方法。
［３３］［２５］〜［３２］のいずれか一項に記載の方法で得られた腸管細胞層。
［３４］［３３］に記載の腸管細胞層を用いた、被検物質の体内動態又は毒性を評価する方法。
［３５］前記体内動態が、代謝、吸収性、膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、又は薬物トランスポーターの誘導である、［３４］に記載の方法。
［３６］以下の工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む、［３４］又は［３５］に記載の方法：
（ｉ）［３３］に記載の腸管細胞層を用意する工程；
（ｉｉ）前記腸管細胞層に被検物質を接触させる工程；
（ｉｉｉ）前記腸管細胞層を透過した被検物質を定量し、被検物質の代謝、吸収性、膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、又は薬物トランスポーターの誘導、或いは毒性を評価する工程。
［３７］以下の工程（Ｉ）及び（ＩＩ）を含む、［３４］又は［３５］に記載の方法：
（Ｉ）［３３］に記載の腸管細胞層に被検物質を接触させる工程；
（ＩＩ）被検物質の代謝、吸収性、膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、又は薬物トランスポーターの誘導、或いは毒性を測定・評価する工程。
［３８］［２５］〜［３２］のいずれか一項に記載の作製方法で得られた腸管細胞層に腸疾患の病態を誘導することを特徴とする、腸疾患モデルの作製方法。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】新規腸管オルガノイド作製法によって作製した腸管オルガノイドの形態。（A）コントロール群（分化誘導7日目にてEZSPHERE（登録商標）上に細胞を播種し、腸管オルガノイドを形成した群）。（B）分化誘導7日目にてiMatrix 511上に播種し、培地5を用いて11日目まで培養した細胞。2日毎に継代した。（C）分化誘導7日目にてiMatrix 511上に播種し、培地5を用いて14日目まで培養した細胞。2日毎に継代した。（D）CHIR99021に代えてSB216763（2 μmol/mL）を使用して培養した細胞。（E）CHIR99021に代えてSB415286（10 μmol/mL）を使用して培養した細胞。（F）CHIR99021に代えてCHIR98014（200 nmol/mL）を使用して培養した細胞。（G）CHIR99021に代えて(2'Z,3'E)-6-Bromoindirubin-3'-oxime（1 μmol/mL）を使用して培養した細胞。（H）CHIR99021に代えてAZD1080（2 μmol/mL）を使用して培養した細胞。（I）CHIR99021に代えてLY2090314（4 μmol/mL）を使用して培養した細胞。スケールバー 500 μm。
【図２】新規腸管オルガノイド作製法による腸管オルガノイドの遺伝子発現。平均 ± S.D. (n = 3)。コントロール: 分化誘導7日目時点の細胞。11日目: 分化誘導7日目にてiMatrix 511 silk上に播種し、培地5を用いて11日目まで培養した細胞。14日目: 分化誘導7日目にてiMatrix 511 silk上に播種し、培地5を用いて14日目まで培養した細胞。継代あり群は、2日毎に継代し、iMatrix 511 silk上に播種し、培地5を用いて培養した。継代なし群は、継代することなく、培地5を用いて培養した。成人小腸のmRNA発現量を1とした。
【図３】新規腸管オルガノイド作製法による腸管オルガノイドの形態学的解析。（A）HE染色。スケールバー 100 μm。（B）アルシアンブルー染色。スケールバー 100 μm。（C）免疫蛍光染色。DAPI：核染色。スケールバー 50 μm。
【図４】新規腸管オルガノイド作製法による腸管オルガノイドの特徴。平均 ± S.D. (n = 3)。成人結腸のmRNA発現量を1とした。
【図５】新規腸管オルガノイド作製法による腸管オルガノイドの薬物トランスポーターの遺伝子発現解析および免疫蛍光染色。（A）新規腸管オルガノイド作製法による腸管オルガノイドの薬物動態関連遺伝子発現。平均 ± S.D. (n = 3)。成人小腸のmRNA発現量を1とした。（B）新規腸管オルガノイド作製法による腸管オルガノイドの免疫蛍光染色。DAPI：核染色。スケールバー 50 μm。
【図６】EZSPHERE播種直前の細胞のmRNA発現解析。平均 ± S.D. (n = 3)。コントロール: 分化誘導7日目時点の細胞。11日目: 分化誘導7日目にてiMatrix 511 silk上に播種し、培地5を用いて11日目まで培養した細胞。14日目: 分化誘導7日目にてiMatrix 511 silk上に播種し、培地5を用いて14日目まで培養した細胞。継代あり群は、2日毎に継代し、iMatrix 511 silk上に播種し、培地5を用いて培養した。継代なし群は、継代することなく、培地5を用いて培養した。コントロールのmRNA発現量を1とした。
【図７−１】TNF-α添加による炎症性腸疾患モデルの作製。（A）炎症性腸疾患モデル作製プロトコール。B）TNF-αおよびインフリキシマブ添加による腸管オルガノイドのmRNA発現解析。平均 ± S.D. (n = 3)。コントロールのmRNA発現量を1とした。（C）TNF-αおよびインフリキシマブ添加による腸管オルガノイドの免疫蛍光染色。DAPI：核染色。スケールバー 50 μm。
【図７−２】図７の続き。
【図８】TNF-αおよびTGF-β添加による線維化モデルの作製。（A）線維化モデル作製プロトコール。（B）TNF-α＋TGF-βおよびTGF-β阻害剤（SB431542、Repsox）添加による腸管オルガノイドのmRNA発現解析。平均 ± S.D. (n = 3)。コントロールのmRNA発現量を1とした。
【図９】ヒトiPS細胞から腸管オルガノイドへの分化プロトコールと分化誘導に使用した培地一覧。PS（100 units/mLペニシリンG、100 μg/mLストレプトマイシン）。
【図１０】低分子化合物添加による腸管オルガノイドの遺伝子発現の変化。分化開始後19日目から分化終了時まで低分子化合物を添加した（1: 20 μmol/mL PD98059、5 μmol/mL 5-アザ-2’-デオキシシチジン、0.5μmol/mL A-83-01。2: 20 μmol/mL PD98059、5 μmol/mL 5-アザ-2’-デオキシシチジン、0.5μmol/mL A-83-01、2.5 μmol/mL DAPT）。平均 ± S.D. (n = 3)でデータを示した。成人小腸のmRNA発現量を1とした。
【図１１−１】作製した新規平面培養系のmRNA発現解析（A）と膜抵抗値測定（B）。腸管オルガノイド: 分化誘導34日目の腸管オルガノイド、平面培養: 腸管オルガノイドをiMatrix 511 silk上に継代し、培地７（図９を参照）に低分子化合物(30 μmol/mLフォルスコリン、2.5μmol/mL DAPT、3 μmol/mL CHIR99021）を添加して7日間培養した細胞。コントールは低分子化合物非添加。成人小腸のmRNA発現量を1とした。(n = 1)
【図１１−２】図１１の続き。
【図１２】新規平面培養系を用いたCYP3A4の誘導試験。腸管オルガノイドをiMatrix 511 silk上に継代し、培地７及び低分子化合物（30 μmol/mLフォルスコリン、2.5 μmol/mL DAPT（播種後96時間）、3 μmol/mL CHIR99021（播種後96時間）、10 μmol/mL Y-27632（播種後24時間））を用いて8日間培養した細胞を誘導剤（DMSO: 溶媒、リファンピシン: 3 μmol/mL、活性型ビタミンD3: 10 nmol/mL）に48時間曝露した。DMSOのmRNA発現量を1とした。(n = 1)
【図１３】気液培養および低分子化合物添加による絨毛様構造の形成。(A-E) 腸管オルガノイドをiMatrix 511 silk上に継代し、低分子化合物（2.5 μmol/mL DAPT（播種後96時間）、3 μmol/mL CHIR99021（播種後96時間）、10 μmol/mL Y-27632（播種後24時間））を含む培地７、及び検討因子（A: A 83-01非添加、30 μmol/mLフォルスコリン。B: A 83-01添加、フォルスコリン非添加。C: A 83-01添加、30 μmol/mLフォルスコリン。D: A 83-01添加、1 mmol/mL 8-Br-cAMP。E: A 83-01添加、500 μmol/mL IBMX)を用いて10日間培養した。スケールバー 100 μm。(F) (C)のプロトコールで作製した平面培養系をq PCRでそのmRNA発現量を測定した。平均 ± S.D. (n = 3)でデータを示した。成人小腸のmRNA発現量を1とした。
【図１４−１】ヒトiPS細胞から腸管オルガノイドへの分化に対する多糖類ポリマー（FP001、FP003）の効果。平均 ± S.D. (n = 3)でデータを示した。小腸の値を基準（小腸＝1）とした。*P < 0.05, **P < 0.01 vs マトリゲル
【図１４−２】図１４の続き。
【図１４−３】図１４の続き。
【図１４−４】図１４の続き。
【図１５】多糖類ポリマー（FP001、FP003）を用いて分化誘導したヒト腸管オルガノイドの形態学的観察。(A)-(C)：明視野観察。スケールバー 500μm。(D)-(F)：HE染色。スケールバー 100μm。
【図１６】多糖類ポリマー（FP001、FP003）を用いて分化誘導したヒト腸管オルガノイドの免疫蛍光染色。(A)-(C)：Villin/OLFM4。(D)-(F):CDX2（腸管系譜の細胞）/MUC2。(G)-(I)：E-cad（上皮細胞接着因子）/CHGA（Chromogranin A）。(J)-(L):Ki67（増殖細胞マーカー）/LGR5（幹細胞マーカー）。(M)-(O):E-cad/Lyso（Lysozyme）。(P)-(R):Vim（Vimentin：線維芽細胞マーカー）/α-SMA（平滑筋マーカー）。(S)-(U):Occludin（タイトジャンクション）。(V)-(X): ABCG2/BCRP（排出トランスポーター）。DAPI：核染色。スケールバー 50μm。
【図１７】多糖類ポリマー（FP001、FP003）を用いて分化誘導したヒト腸管オルガノイドのローダミン123を用いたABCB1/MDR1の機能評価。ABCB1/MDR1の阻害剤としてベラパミル（100μmol/L）を用いた。平均 ± S.D. (n = 3でデータを示した。コントロール群（阻害剤非添加）の値を基準（コントロール群= 1）とした。*P < 0.05 vs コントロール群。
【図１８】多糖類ポリマー（FP001、FP003）を用いて分化誘導したヒト腸管オルガノイドのヘキスト33342を用いたABCG2/BCRPの機能評価。ABCG2/BCRPの阻害剤としてKo143（20μmol/L）を用いた。平均 ± S.D. (n = 3)でデータを示した。コントロール群（阻害剤非添加）の値を基準（コントロール群= 1）とした。*P < 0.05 vs コントロール群。
【図１９】多糖類ポリマー（FP001、FP003）を用いて分化誘導したヒト腸管オルガノイドのCYP3A4誘導能。(A)平均 ± S.D. (n = 3)でデータを示した。コントロール; 誘導剤非添加群。**P < 0.01, *P < 0.05 vs コントロール群。コントロール群の値を基準（コントロール群= 1）とした。(B)平均 ± S.D. (n = 4)でデータを示した。コントロール; 誘導剤非添加群。**P < 0.01, *P < 0.05 vs コントロール群。
【図２０】多糖類ポリマーを用いて分化誘導したヒト腸管オルガノイドのCYP3A4代謝活性。平均 ± S.D. (n = 4) でデータを示した。コントロール; ケトコナゾール非添加群。N.D.; 検出されず。**P < 0.01, *P < 0.05 vs コントロール群。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
１．腸管オルガノイドを作製する方法
本発明は多能性幹細胞から腸管オルガノイドを作製する方法（以下、「本発明の作製方法」とも呼ぶ。）に関する。本発明によれば、生体の腸管組織と類似の特性を示す（腸管組織を模倣した）３次元組織構造体である腸管オルガノイドが得られる。
【００１３】
「多能性幹細胞」とは、生体を構成するすべての細胞に分化しうる能力（分化多能性）と、細胞分裂を経て自己と同一の分化能を有する娘細胞を生み出す能力（自己複製能）とを併せ持つ細胞をいう。分化多能性は、評価対象の細胞を、ヌードマウスに移植し、三胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）のそれぞれの細胞を含むテラトーマ形成の有無を試験することにより、評価することができる。
【００１４】
多能性幹細胞として、胚性幹細胞（ES細胞）、胚性生殖細胞（EG細胞）、人工多能性幹細胞（iPS細胞）等を挙げることができるが、分化多能性及び自己複製能を併せ持つ細胞である限り、これに限定されない。好ましくはES細胞又はiPS細胞を用いる。更に好ましくはiPS細胞を用いる。多能性幹細胞は、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒトやチンパンジー、カニクイザルなどの霊長類、マウスやラットなどのげっ歯類）の細胞、特に好ましくはヒトの細胞である。
【００１５】
ES細胞は、例えば、着床以前の初期胚、当該初期胚を構成する内部細胞塊、単一割球等を培養することによって樹立することができる（Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual， Second Edition， Cold Spring Harbor Laboratory Press（1994） ;Thomson，J. A. et al.，Science，282， 1145-1147（1998））。初期胚として、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を用いてもよい（Wilmut et al.（Nature， 385， 810（1997））、Cibelli et al. （Science， 280， 1256（1998））、入谷明ら（蛋白質核酸酵素， 44， 892 （1999））、Baguisi et al. （Nature Biotechnology， 17， 456 （1999））、Wakayama et al. （Nature， 394， 369 （1998）; Nature Genetics， 22， 127 （1999）; Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 96， 14984 （1999））、Rideout III et al. （Nature Genetics， 24， 109 （2000）、Tachibana et al. （Human Embryonic Stem Cells Derived by Somatic Cell Nuclear Transfer, Cell, 153, 1228-1238（2013））。初期座として、単為発生胚を用いてもよいKim et al. （Science， 315， 482-486 （2007））、Nakajima et al. （Stem Cells， 25， 983-985 （2007））、Kim et al. （Cell Stem Cell， 1， 346-352 （2007））、Revazova et al. （Cloning Stem Cells， 9， 432-449 （2007））、Revazova et al.（Cloning Stem Cells， 10， 11-24 （2008））。上掲の論文の他、ES細胞の作製についてはStrelchenko N., et al. Reprod Biomed Online. 9: 623-629, 2004；Klimanskaya I., et al. Nature 444: 481-485, 2006；Chung Y., et al. Cell Stem Cell 2: 113-117, 2008；Zhang X., et al Stem Cells 24: 2669-2676, 2006；Wassarman, P.M. et al. Methods in Enzymology, Vol.365, 2003等が参考になる。尚、ES細胞と体細胞の細胞融合によって得られる融合ES細胞も、本発明の作製方法に用いられる胚性幹細胞に含まれる。
【００１６】
ES細胞の中には、保存機関から入手可能なもの、或いは市販されているものもある。例えば、ヒトES細胞については京都大学再生医科学研究所（例えばKhES-1、KhES-2及びKhES-3）、WiCell Research Institute、ESI BIOなどから入手可能である。
【００１７】
ES細胞は、始原生殖細胞を、LIF、bFGF、SCFの存在下で培養すること等により樹立することができる（Matsui et al.， Cell， 70， 841-847 （1992）、Shamblott et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 95 （23）, 13726-13731 （1998）、Turnpenny et al.， Stem Cells， 21（5）， 598-609， （2003））。
【００１８】
「人工多能性幹細胞（iPS細胞）」とは、初期化因子の導入などにより体細胞をリプログラミングすることによって作製される、多能性（多分化能）と増殖能を有する細胞である。人工多能性幹細胞はES細胞に近い性質を示す。iPS細胞の作製に使用する体細胞は特に限定されず、分化した体細胞でもよいし、未分化の幹細胞でもよい。また、その由来も特に限定されないが、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒトやチンパンジー、カニクイザルなどの霊長類、マウスやラットなどのげっ歯類）の体細胞、特に好ましくはヒトの体細胞を用いる。iPS細胞は、これまでに報告された各種方法によって作製することができる。また、今後開発されるiPS細胞作製法を適用することも当然に想定される。
【００１９】
腸疾患の患者由来のiPS細胞（患者の体細胞から調製したiPS細胞）を用いることにすれば、疾患特異的な腸管オルガノイドを作製することが可能となる。当該iPS細胞は、患者から採取された体細胞（例えば皮膚、血液、単核球など）から調製される。ここでの腸疾患の例として難治性炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎）、ポリープ、大腸がん、薬剤性腸炎などを挙げることができる。疾患特異的な腸管オルガノイドは腸管病態モデルとして有用であり、薬剤評価系への利用や、疾患の機序（発症、病態形成、進展に関する分子メカニズムなど）の解明への貢献を期待できる。
【００２０】
iPS細胞作製法の最も基本的な手法は、転写因子であるOct3/4、Sox2、Klf4及びc-Mycの４因子を、ウイルスを利用して細胞へ導入する方法である（Takahashi K, Yamanaka S: Cell 126 (4), 663-676, 2006; Takahashi, K, et al: Cell 131 (5), 861-72, 2007）。ヒトiPS細胞についてはOct4、Sox2、Lin28及びNonogの４因子の導入による樹立の報告がある（Yu J, et al: Science 318(5858), 1917-1920, 2007）。c-Mycを除く３因子（Nakagawa M, et al: Nat. Biotechnol. 26 (1), 101-106, 2008）、Oct3/4及びKlf4の２因子（Kim J B, et al: Nature 454 (7204), 646-650, 2008）、或いはOct3/4のみ（Kim J B, et al: Cell 136 (3), 411-419, 2009）の導入によるiPS細胞の樹立も報告されている。また、遺伝子の発現産物であるタンパク質を細胞に導入する手法（Zhou H, Wu S, Joo JY, et al: Cell Stem Cell 4, 381-384, 2009; Kim D, Kim CH, Moon JI, et al: Cell Stem Cell 4, 472-476, 2009）も報告されている。一方、ヒストンメチル基転移酵素G9aに対する阻害剤BIX-01294やヒストン脱アセチル化酵素阻害剤バルプロ酸（VPA）或いはBayK8644等を使用することによって作製効率の向上や導入する因子の低減などが可能であるとの報告もある（Huangfu D, et al: Nat. Biotechnol. 26 (7), 795-797, 2008; Huangfu D, et al: Nat. Biotechnol. 26 (11), 1269-1275, 2008; Silva J, et al: PLoS. Biol. 6 (10), e 253, 2008）。遺伝子導入法についても検討が進められ、レトロウイルスの他、レンチウイルス（Yu J, et al: Science 318(5858), 1917-1920, 2007）、アデノウイルス（Stadtfeld M, et al: Science 322 (5903), 945-949, 2008）、プラスミド（Okita K, et al: Science 322 (5903), 949-953, 2008）、トランスポゾンベクター（Woltjen K, Michael IP, Mohseni P, et al: Nature 458, 766-770, 2009; Kaji K, Norrby K, Pac a A, et al: Nature 458, 771-775, 2009; Yusa K, Rad R, Takeda J, et al: Nat Methods 6, 363-369, 2009）、或いはエピソーマルベクター（Yu J, Hu K, Smuga-Otto K, Tian S, et al: Science 324, 797-801, 2009）を遺伝子導入に利用した技術が開発されている。
【００２１】
iPS細胞への形質転換、即ち初期化（リプログラミング）が生じた細胞はFbxo15、Nanog、Oct/4、Fgf-4、Esg-1及びCript等の多能性幹細胞マーカー（未分化マーカー）の発現などを指標として選択することができる。選択された細胞をiPS細胞として回収する。
【００２２】
iPS細胞は、例えば、国立大学法人京都大学又は国立研究開発法人理化学研究所バイオリソースセンターから提供を受けることもできる。
【００２３】
本明細書において「分化させる」、「誘導する」との用語は、特定の細胞系譜に沿って分化するように働きかけることを意味する。本発明では、多能性幹細胞を腸管オルガノイドへと分化させる。本発明の作製方法は大別して５段階の培養工程、即ち、（１）多能性幹細胞を内胚葉様細胞へと分化させる工程（工程（１））と、工程（１）で得られた内胚葉様細胞を腸管幹細胞様細胞へと分化させる工程（工程（２））と、工程（２）で得られた腸管幹細胞様細胞を、上皮成長因子、線維芽細胞増殖因子、TGFβ受容体阻害剤、GSK-3β阻害剤及びROCK阻害剤の存在下で培養する工程（工程（３））と、工程（３）後の細胞を培養し、スフェロイドを形成させる工程（工程（４））と、工程（４）で形成されたスフェロイドを分化させ、腸管オルガノイドを形成させる工程であって、上皮成長因子、BMP阻害剤及びWntシグナル活性化剤の存在下での培養を含む工程（工程（５））を含む。以下、各工程の詳細を説明する。
【００２４】
＜工程（１）  内胚葉様細胞への分化＞
この工程では多能性幹細胞を培養し、内胚葉様細胞へと分化させる。換言すれば、内胚葉様細胞への分化を誘導する条件下で多能性幹細胞を培養する。多能性幹細胞が内胚葉様細胞に分化する限り、培養条件は特に限定されない。例えば、常法に従い、アクチビンAを添加した培地で培養する。この場合、培地中のアクチビンAの濃度を例えば10 ng/mL〜200 ng/mL、好ましくは20 ng/mL〜150 ng/mLとする。細胞の増殖率や維持等の観点から、培地に血清又は血清代替物（Knockout serum replacement(KSR)など）を添加することが好ましい。血清はウシ胎仔血清に限られるものではなく、ヒト血清や羊血清等を用いることもできる。血清又は血清代替物の添加量は例えば0.1%(v/v)〜10%(v/v)である。
【００２５】
Wnt／β−カテニンシグナル経路の阻害剤（例えば、ヘキサクロロフェン、クエルセチン、WntリガンドであるWnt3a）を培地に添加し、内胚葉様細胞への分化の促進を図ってもよい。
【００２６】
工程（１）として２段階の培養を行うことにしてもよい。１段階目の培養では比較的低濃度の血清（例えば、0.1%(v/v)〜1%(v/v)）を添加した培地で行い、続く２段階目の培養では一段階目の培養よりも血清濃度を高めた培地（血清濃度を例えば1%(v/v)〜10%(v/v)）で行う。このように２段階の培養を採用することは、１段階目の培養により未分化細胞の増殖を抑制し、続く２段階目により分化した細胞を増殖させる点で好ましい。
【００２７】
工程（１）の期間（培養期間）は例えば１日間〜１０日間、好ましくは２日間〜７日間である。工程（１）として２段階の培養を採用する場合には１段階目の培養期間を例えば１日間〜７日間、好ましくは２日間〜５日間とし、２段階目の培養期間を例えば１日間〜６日間、好ましくは１日間〜４日間とする。
【００２８】
＜工程（２）  腸管幹細胞様細胞への分化＞
この工程では、工程（１）で得られた内胚葉様細胞を培養し、腸管幹細胞様細胞へと分化させる。換言すれば、腸管幹細胞様細胞への分化を誘導する条件下で内胚葉細胞を培養する。内胚葉様細胞が腸管幹細胞様細胞へ分化する限り、培養条件は特に限定されない。工程（１）に供する多能性幹細胞としてヒト細胞を用いた場合には、好ましくは、FGF4（線維芽細胞増殖因子４）とWntアゴニスト（例えばWnt3a、BML-284、2-Amino-4-(3,4-(methylenedioxy)benzylamino)-6-(3-methoxyphenyl)pyrimidine等）の存在下で培養を行う。FGF4として好ましくはヒトFGF4（例えばヒト組換えFGF4）を用いる。一方、工程（１）に供する多能性幹細胞としてカニクイザル細胞やアカゲザル細胞、チンパンジー細胞等を用いた場合には、好ましくは、FGF2（線維芽細胞増殖因子２）とGSK-3阻害剤（例えばCHIR99021、CHIR98014、BIO、SB415286、SB216763、TWS119、A1070722等）の存在下で培養を行う。FGF2として例えばヒトFGF2（例えばヒト組換えFGF2）を用いる。
【００２９】
典型的には、工程（１）を経て得られた細胞集団又はその一部を、選別することなく工程（２）に供する。一方で、工程（１）を経て得られた細胞集団の中から内胚葉様細胞を選別した上で工程（２）を実施することにしてもよい。内胚葉様細胞の選別は例えば、細胞表面マーカーを指標にしてフローサイトメーター（セルソーター）で行えばよい。
【００３０】
「FGF4とWntアゴニストの存在下」とは、FGF4とWntアゴニストが培地中に添加された条件と同義である。従って、FGF4とWntアゴニストの存在下での培養を行うためには、FGF4とWntアゴニストが添加された培地を用いればよい。FGF4の添加濃度の例を示すと100ng/mL〜5μg/mL、好ましくは300ng/mL〜1μg/mLである。また、Wntアゴニストの添加濃度の例（Wnt3aの場合）を示すと、100ng/mL〜5μg/mL、好ましくは300ng/mL〜1μg/mLである。
【００３１】
同様に、「FGF2とGSK-3阻害剤の存在下」とは、FGF2とGSK-3阻害剤が培地中に添加された条件と同義である。従って、FGF2とGSK-3阻害剤の存在下での培養を行うためには、FGF2とGSK-3阻害剤が添加された培地を用いればよい。FGF2の添加濃度の例を示すと50ng/mL〜2.5μg/mL、好ましくは150ng/mL〜500ng/mLである。また、GSK-3阻害剤の添加濃度の例（CHIR99021の場合）を示すと、600nmol/L〜60μmol/L、好ましくは1μmol/L〜20μmol/Lである。
【００３２】
尚、例示した化合物、即ち、Wnt3a、CHIR99021とは異なる化合物を使用する場合の添加濃度については、使用する化合物の特性と、例示した化合物の特性の相違（特に活性の相違）を考慮すれば、当業者であれば上記濃度範囲に準じて設定することができる。また、設定した濃度範囲が適切であるか否かは、後述の実施例に準じた予備実験によって確認することができる。
【００３３】
工程（２）の期間（培養期間）は例えば２日間〜１０日間、好ましくは３日間〜７日間である。当該培養期間が短すぎると、期待される効果（分化効率の上昇、腸管幹細胞としての機能の獲得の促進）が十分に得られない。他方、当該培養期間が長すぎると、分化効率の低下を引き起こす。
【００３４】
腸管幹細胞様細胞へ分化したことは、例えば、腸管幹細胞マーカーの発現を指標にして判定ないし評価することができる。腸管幹細胞マーカーの例を挙げると、ロイシンリッチリピートを含むGタンパク質共役受容体５（LGR5）、エフリンB2受容体（EphB2）である。
【００３５】
＜工程（３）  腸管への分化方向の誘導＞
この工程では、工程（２）で得られた腸管幹細胞様細胞を、上皮成長因子、線維芽細胞増殖因子、TGFβ受容体阻害剤、GSK-3β阻害剤及びROCK阻害剤の存在下で培養する。理論に拘泥する訳ではないが、後述の実験結果を踏まえると、当該工程を、「幹細胞性を維持させつつ腸管へと分化方向を誘導する段階」として理解することができる。この工程を経ることは、最終的に得られる腸管オルガノイドの形態（絨毛−クリプト様構造を示す）及び機能（腸管マーカーや薬物トランスポーターが成人小腸に近い遺伝子発現を示す）に重要であり、本発明の最大の特徴の一つといえる。
【００３６】
典型的には、工程（２）を経て得られた細胞集団又はその一部を、選別することなく工程（３）に供する。一方で、工程（２）を経て得られた細胞集団の中から腸管幹細胞様細胞を選別した上で工程（３）を実施することにしてもよい。腸管幹細胞様細胞の選別は例えば、細胞表面マーカーを指標にしてフローサイトメーター（セルソーター）で行えばよい。
【００３７】
「上皮成長因子、線維芽細胞増殖因子、TGFβ受容体阻害剤、GSK-3β阻害剤及びROCK阻害剤の存在下とは、これらの化合物が培地中に添加された条件と同義である。従って、上皮成長因子、線維芽細胞増殖因子、TGFβ受容体阻害剤、GSK-3β阻害剤及びROCK阻害剤の存在下での培養を行うためには、これらの化合物が添加された培地を用いればよい。
【００３８】
線維芽細胞増殖因子としてはFGF2、FGF4又はFGF10を採用するとよい。これらFGFファミリーの２つ又は３つを組み合わせて使用してもよい。TGFβ受容体阻害剤として例えばA-83-01を用いることができる。GSK-3β阻害剤としてCHIR99021、SB216763、CHIR98014、TWS119、Tideglusib、SB415286、BIO、AZD2858、AZD1080、AR-A014418、TDZD-8、LY2090314、IM-12、Indirubin、Bikinin、1-Azakenpaulloneを例示することができる。ROCK阻害剤として例えばY-27632を用いることができる。
【００３９】
上皮成長因子の添加濃度の例を示すと10 ng/mL〜500 ng/mL、好ましくは50 ng/mL〜200 ng/mLである。同様に、線維芽細胞増殖因子の添加濃度の例（FGF2の場合）を示すと5 ng/mL〜200 ng/mL、好ましくは20 ng/mL〜50 ng/mLであり、TGFβ受容体阻害剤の添加濃度の例（A-83-01の場合）を示すと0.1μM〜5μM、好ましくは0.3μM〜3μMであり、GSK-3β阻害剤の添加濃度の例（CHIR99021の場合）を示すと0.5μM〜100μM、好ましくは1μM〜30μMであり、ROCK阻害剤の添加濃度の例（Y-27632の場合）を示すと1μM〜50μM、好ましくは3μM〜30μMである。
【００４０】
尚、例示した化合物、即ち、FGF2、A-83-01、CHIR99021、Y-27632とは異なる化合物を使用する場合の添加濃度については、使用する化合物の特性と、例示した化合物の特性の相違（特に活性の相違）を考慮すれば、当業者であれば上記濃度範囲に準じて設定することができる。また、設定した濃度範囲が適切であるか否かは、後述の実施例に準じた予備実験によって確認することができる。
【００４１】
上記の化合物（上皮成長因子、線維芽細胞増殖因子、TGFβ受容体阻害剤、GSK-3β阻害剤及びROCK阻害剤）に加え、血清代替物も併用するとよい。即ち、好ましくは、上記化合物及び血清代替物が培地中に添加された条件で培養する。血清代替物とは、一般にiPS細胞やES細胞等をその未分化な状態を維持させたままで培養するため、分化誘導因子を含む血清の代わりとして使用される組成物である。好ましくは、ノックアウト血清代替物（Knockout serum replacement(KSR)）を用いる。血清代替物の添加濃度の例（KSRの場合）を示すと5%(v/v)〜20%(v/v)、好ましくは5%(v/v)〜15%(v/v)である。
【００４２】
工程（３）の培養には、細胞接着性の培養面を備える培養容器が使用される。細胞接着性の培養面として、好ましくは、基底膜成分（例えばラミニン、IV型コラーゲン、エンタクチン、ビトロネクチン、フィブロネクチン）又はその断片をコートしたものを用いるとよい。特に、ラミニン511又はそのE8断片でコートした培養面を採用するとよい。ラミニン511のE8断片については、その組換え体（組換えヒトラミニン511-E8タンパク質）を高純度に精製した製品（製品名：iMatrix-511、製造：株式会社ニッピ、販売：株式会社マトリクソーム）が市販されている。尚、培養容器は特に限定されず、例えば、ディッシュ、フラスコ、マルチウェルプレート等を用いることができる。
【００４３】
工程（３）の期間（培養期間）は例えば２日間〜１４日間、好ましくは３日間〜１２日間である。当該培養期間が短すぎると、期待される効果（即ち、絨毛−クリプト様構造を有し、機能的な腸管オルガノイドを形成するために必要な分化方向の誘導）が十分に得られない。尚、継代操作を繰り返すことにすれば、当該培養期間をより長く設定することも可能である。
【００４４】
好ましい態様では、工程（３）において継代操作を行う。即ち、工程（３）の途中で継代培養を行う。継代操作は、特に、腸管上皮幹細胞様細胞の純化（純度、均一性の向上）及びより選択的に腸管へ分化誘導すること、に有効であると考えられる。このことは、後述の実施例に示した実験によって偶然にも明らかになったことであり、本願発明の特異性や価値ないし意義を理解する上で極めて重要である。
【００４５】
継代操作の回数は、例えば１〜５回、好ましくは１〜３回、更に好ましくは１回又は２回である。継代操作が多すぎれば細胞へのダメージが大きくなり、作製効率の低下に繋がる。継代操作の手順は常法に従えばよい。例えばコンフルエント又はサブコンフルエントになった際に細胞の一部を採取して別の培養容器に移し、培養を継続する。細胞の回収には細胞解離液などを利用すればよい。細胞解離液としては、例えば、トリプシン-EDTA、コラゲナーゼIV、メタロプロテアーゼ等のタンパク分解酵素等を単独で又は適宜組み合わせて用いることができる。細胞障害性が少ないものが好ましい。このような細胞解離液として、例えば、ディスパーゼ（エーディア）、TrypLE （Invitrogen）又はアキュターゼ（MILLIPORE）等の市販品が入手可能である。
【００４６】
＜工程（４）  スフェロイドの形成＞
この工程では、工程（３）を経た細胞を培養し、スフェロイドを形成させる。スフェロイドを形成させるためには浮遊培養が適する。浮遊培養では、通常、細胞低接着性又は細胞非接着性の培養面（例えば、ポリマー材料やハイドロゲル等の処理／結合により細胞低接着性／細胞非接着性が付与された培養面）を備える培養容器が使用され、培養面から離れた状態（即ち浮遊状態）で細胞を培養する。浮遊培養に用いる培養容器は特に限定されず、例えば、ディッシュ、フラスコ、マルチウェルプレート、チューブ、トレイ、培養バック等を用いることができる。好ましくは、細胞低接着性又は細胞非接着性の培養面に均一な形状及び大きさの複数のウェルが形成された培養容器（一般にパターンプレートと呼ばれる。具体例として、AGCテクノグラス株式会社が提供するEZSPHERE（登録商標）、株式会社クラレが提供するElplasia等を挙げることができる）を使用し、複数のスフェロイドをまとめて形成させる。このようにすれば、効率よくスフェロイドを形成させることができ、ひいては腸管オルガノイドの作製効率が向上する。
【００４７】
浮遊培養に際しては、培養面に対する非接着状態を維持できる限り、細胞／細胞塊を静置培養してもよいし、旋回培養や振とう培養することにしてもよい。好ましくは、ここでの浮遊培養を静置培養により行う。静置培養は特別の装置が不要であること、細胞への衝撃ないしダメージも少ないことが期待されること、培養液の量も少なくできることなど、多くの利点を有する。
【００４８】
スフェロイドを形成可能な限り、培養条件は特に限定されない。典型的には、幹細胞性を維持しつつスフェロイドを形成させるために、上皮成長因子（EGF）、BMP阻害剤及びWntシグナル活性化剤の存在下、即ち、これらの成分が添加された培地を用いて浮遊培養する。
【００４９】
上皮成長因子を用いることにより、細胞増殖を促進させる効果を期待できる。また、BMP阻害剤を用いることにより、幹細胞の分化を抑制し、幹細胞性を維持する効果を期待できる。Wntシグナル活性化剤には幹細胞の増殖と幹細胞性を維持する効果を期待できる。
【００５０】
BMP阻害剤として例えばNogginを用いることができる。また、Wntシグナル活性化剤として例えばR-spondin-1を用いることができる。
【００５１】
上皮成長因子の添加濃度の例を示すと10 ng/mL〜500 ng/mL、好ましくは50 ng/mL〜200 ng/mLである。BMP阻害剤の添加濃度の例（Nogginの場合）を示すと10 ng/mL〜500 ng/mL、好ましくは50 ng/mL〜200 ng/mLである。同様に、Wntシグナル活性化剤の添加濃度の例（R-spondin-1の場合）を示すと10 ng/mL〜1000 ng/mL、好ましくは50 ng/mL〜500 g/mLである。
【００５２】
尚、例示した化合物、即ち、Noggin、R-spondin-1とは異なる化合物を使用する場合の添加濃度については、使用する化合物の特性と、例示した化合物の特性の相違（特に活性の相違）を考慮すれば、当業者であれば上記濃度範囲に準じて設定することができる。また、設定した濃度範囲が適切であるか否かは、後述の実施例に準じた予備実験によって確認することができる。
【００５３】
工程（４）の期間（培養期間）は例えば１日間〜１０日間、好ましくは２日間〜７日間である。当該培養期間が短すぎると、十分な大きさのスフェロイドが形成されない。他方、当該培養期間が長すぎると、必要以上にスフェロイドが大きくなり、内部の細胞がネクローシスを起こすおそれがある。好ましくは、直径が100μm〜200μm程度のスフェロイドを形成させる。例えば、直径が400〜500μm、深さが100〜200μmのウェルが均一に形成されたパターンプレートの使用によって、当該サイズのスフェロイドを形成させることができる。
【００５４】
＜工程（５）  腸管オルガノイドの形成＞
この工程では、工程（４）で形成されたスフェロイドを分化させ、腸管オルガノイドを形成させる。この工程において積極的な分化誘導は必須ではなく、一態様（第１態様）では工程（４）と同一又は類似の培地条件で培養を行う。具体的には、上皮成長因子、BMP阻害剤及びWntシグナル活性化剤の存在下、即ち、これらの成分が添加された培地を用いて培養する。各化合物の具体例や添加濃度も工程（４）の場合と同様である。尚、工程（５）の期間（培養期間）は例えば１２日間〜３６日間である。
【００５５】
スフェロイドから腸管オルガノイドを形成させるため、工程（５）の培養は浮遊培養で行う。ここでの浮遊培養には、好ましくは、水溶液中に３次元的網目構造を形成する材料を添加した液体培地を用い、工程（４）で形成させた複数のスフェロイドをまとめて（即ち、一つの培養容器内に複数のスフェロイドが併存した状態で）浮遊培養する。即ち、好ましい態様では、工程（４）で形成させたスフェロイドの一部（但し２個以上）又は全部が、特徴的な液体培地を使用した浮遊培養に供されることになる。
【００５６】
水溶液中に３次元的網目構造を形成する材料（以下、「粘性材料」と呼ぶ）を用いることにより、網目構造にスフェロイドが捕捉ないしトラップされ、或いは培地の粘性が高まってスフェロイドの動きが制限され、スフェロイドの会合や凝集を防止できる。従って、複数のスフェロイドをまとめて浮遊培養することができ、効率的な腸管オルガノイドの形成が可能となる。
【００５７】
粘性材料として、例えば、高分子ゲル、多糖を用いることができる。高分子ゲルの例は、コラーゲン、高分子ヒドロゲル、マトリゲルTM（通常のマトリゲル、成長因子の含有量を少なくしたグロースファクターリデュースト（GFR）マトリゲル等）である。多糖の例はジェランガムや、結晶セルロース、ナノセルロース、カルボキシセルロース、カルボキシメチルセルロースなどである。２種類以上の材料を併用することにしてもよい。
【００５８】
好ましい一態様では、粘性材料として、アニオン性の官能基を有する高分子化合物が用いられる。アニオン性の官能基としては、カルボキシ基、スルホ基、リン酸基及びそれらの塩が挙げられ、カルボキシ基またはその塩が好ましい。本発明に用いる高分子化合物は、前記アニオン性の官能基の群より選択される１種又は２種以上を有するものを使用できる。ここでの高分子化合物の好ましい具体例としては、特に制限されるものではないが、単糖類（例えば、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース、ヘプトース等）が１０個以上重合した多糖類が挙げられ、より好ましくは、アニオン性の官能基を有する酸性多糖類が挙げられる。ここにいう酸性多糖類とは、その構造中にアニオン性の官能基を有すれば特に制限されないが、例えば、ウロン酸（例えば、グルクロン酸、イズロン酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸）を有する多糖類、構造中の一部に硫酸基又はリン酸基を有する多糖類、或いはその両方の構造を持つ多糖類であって、天然から得られる多糖類のみならず、微生物により産生された多糖類、遺伝子工学的に産生された多糖類、或いは酵素を用いて人工的に合成された多糖類も含まれる。より具体的には、ヒアルロン酸、ジェランガム、脱アシル化ジェランガム、ラムザンガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン、ザンタンガム、ヘキスロン酸、フコイダン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリチン硫酸、ケラト硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ラムナン硫酸及びそれらの塩からなる群より選択される１種又は２種以上から構成されるものが例示される。多糖類は、好ましくは、ヒアルロン酸、脱アシル化ジェランガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン又はそれらの塩であり、低濃度の使用で目的を達成できることなどを考慮すると、最も好ましくは、脱アシル化ジェランガムである。ここでいう塩とは、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウムといったアルカリ金属の塩、カルシウム、バリウム、マグネシウムといったアルカリ土類金属の塩又はアルミニウム、亜鉛、銅、鉄、アンモニウム、有機塩基及びアミノ酸等の塩が挙げられる。
【００５９】
上記高分子化合物（多糖類等）の重量平均分子量は、好ましくは10，000〜50，000，000であり、より好ましくは100，000〜20，000，000、更に好ましくは1，000，000〜10，000，000である。例えば、当該分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）によるプルラン換算で測定できる。
【００６０】
更に、脱アシル化ジェランガムはリン酸化したものを使用することもできる。当該リン酸化は公知の手法で行うことができる。
【００６１】
本発明においては、上記多糖類を複数種（好ましくは２種）組み合わせて使用することができる。多糖類の組み合わせの種類は、スフェロイドの会合や凝集を防止できるものであれば特に限定されないが、好ましくは、当該組合せは少なくとも脱アシル化ジェランガム又はその塩を含む。即ち、好適な多糖類の組合せには、脱アシル化ジェランガム又はその塩、及び脱アシル化ジェランガム又はその塩以外の多糖類（例、キサンタンガム、アルギン酸、カラギーナン、ダイユータンガム、メチルセルロース、ローカストビーンガム又はそれらの塩）が含まれる。具体的な多糖類の組み合わせとしては、脱アシル化ジェランガムとラムザンガム、脱アシル化ジェランガムとダイユータンガム、脱アシル化ジェランガムとキサンタンガム、脱アシル化ジェランガムとカラギーナン、脱アシル化ジェランガムとザンタンガム、脱アシル化ジェランガムとローカストビーンガム、脱アシル化ジェランガムとκ−カラギーナン、脱アシル化ジェランガムとアルギン酸ナトリウム、脱アシル化ジェランガムとメチルセルロース等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
本発明に用いる粘性材料の更に好ましい具体例としては、ヒアルロン酸、脱アシル化ジェランガム、ダイユータンガム、カラギーナン及びキサンタンガム、並びにそれらの塩が挙げられ、最も好ましい例としては脱アシル化ジェランガムまたはその塩が挙げられる。脱アシル化ジェランガムの場合、市販のもの、例えば、三晶株式会社製「KELCOGEL（シーピー・ケルコ社の登録商標）CG-LA」、三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製「ケルコゲル（シーピー・ケルコ社の登録商標）」等を使用することができる。また、ネイティブ型ジェランガムとして、三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製「ケルコゲル（シーピー・ケルコ社の登録商標）HT」等を使用することができる。特に好ましい粘性材料の例として、日産化学工業株式会社が提供するポリマーFP001又はポリマーFP003を挙げることができる。尚、ポリマーFP001は日産化学工業株式会社製の三次元培養培地FCeM（登録商標）シリーズの配合成分であり、ポリマーFP003は同FCeM（登録商標）Advance Preparation Kitの配合成分である。
【００６３】
粘性材料の使用量、即ち、培地への添加量は、期待される上記効果を発揮できる限り特に限定されないが、例えば、培地の粘度が5 mPas・s〜2000 mPas・sになるように粘性材料の使用量を調整する。培地の粘度が低すぎると、スフェロイドの会合や凝集を防止するという効果が得られなくなる。一方、培地の粘度が高すぎると、操作性（取扱い）に影響し（例えば、回収操作が煩雑となる）、培地成分の細胞への供給に影響が出るおそれもある。尚、粘性材料の使用量の具体例としてマトリゲルの場合を示すと、通常の使用（即ち３次元培養用の基材としての使用）における使用量の1％〜10％程度にするとよい。また、脱アシル化ジェランガムの場合、0.001％〜1.0％（w/v）、好ましくは0.003％〜0.5％（w/v）、より好ましくは0.005％〜0.3％（w/v）、更に好ましくは0.01％〜0.05％（w/v）、最も好ましくは、0.01％〜0.03％（w/v）培地中に添加するとよい。
【００６４】
浮遊培養に用いる培養容器は、特に限定されず、例えば、ディッシュ、フラスコ、マルチウェルプレート、チューブ、トレイ、培養バック等を用いることができる。
【００６５】
本発明の他の一態様（第２態様）では、上皮成長因子、BMP阻害剤及びWntシグナル活性化剤に加え、MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びγ−セクレターゼ阻害剤の存在下で工程（５）の培養を行い、積極的な分化誘導を行う。MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びγ−セクレターゼ阻害剤の組合せを用いる点は本発明において特に特徴的であり、分化誘導効率の向上、腸管オルガノイドの成熟化の促進に寄与する。第２態様に使用する因子の内、上皮成長因子、BMP阻害剤及びWntシグナル活性化剤の具体例や添加濃度等については第１態様と同様であるため、その説明を省略する。一方、MEK1/2阻害剤としてPD98059、PD184352、PD184161、PD0325901、U0126、MEK inhibitor I、MEK inhibitor II、MEK1/2 inhibitor II、SL327を挙げることができる。同様に、DNAメチル化阻害剤として5-アザ-2’-デオキシシチジン、5-アザシチジン、RG108、ゼブラリンを挙げることができる。TGFβ受容体阻害剤については、好ましくは、TGF-β受容体ALK4、ALK5、ALK7の一以上に対して阻害活性を示すものを用いるとよい。例えば、A-83-01、SB431542、SB-505124、SB525334、D4476、ALK5 inhibitor、LY2157299、LY364947、GW788388、RepSoxが当該条件を満たす。γ−セクレターゼ阻害剤の例を挙げると、N-[(3,5-difluorophenyl) acetyl]-L-alanyl-2-phenyl-1,1-dimethylethyl ester-glycine (DAPT)、L-685,458、Compound E (CAS 209986-17-4)、(R)-Flurbiprofen、BMS299897、JLK6、LY-411575、R04929097、MK-0752、SCP0004、SCP0025、gamma-Secretase Inhibitor XI、gamma-Secretase Inhibitor XVI、gamma-Secretase Inhibitor I、gamma-Secretase Inhibitor VII、Semagacestat (LY450139)、gamma-Secretase Inhibitor III、Compound 34、BMS-708163、Compound W、YO-01027 (Dibenzazepine)、Avagacestat (BMS-708163)である。尚、４種類の化合物、即ちMEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びγ−セクレターゼ阻害剤を追加するのではなく、γ−セクレターゼ阻害剤を除く３種類の化合物（MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤及びTGFβ受容体阻害剤）を追加することにしてもよい。
【００６６】
MEK1/2阻害剤の添加濃度の例（PD98059の場合）を示すと4μM〜100μM、好ましくは10〜40μMである。同様にDNAメチル化阻害剤の添加濃度の例（5-アザ-2’-デオキシシチジンの場合）を示すと、1μM〜25μM、好ましくは2.5μM〜10μMであり、TGFβ受容体阻害剤の添加濃度の例（A-83-01の場合）を示すと0.1μM〜2.5μM、好ましくは0.2μM〜1μMであり、γ−セクレターゼ阻害剤の添加濃度の例（DAPTの場合）を示すと1 nM〜20μM、好ましくは0.1μM〜10μMである。
【００６７】
尚、例示した化合物、即ち、PD98059、5-アザ-2’-デオキシシチジン、A-83-01、DAPTとは異なる化合物を使用する場合の添加濃度については、使用する化合物の特性と、例示した化合物の特性の相違（特に活性の相違）を考慮すれば、当業者であれば上記濃度範囲に準じて設定することができる。また、設定した濃度範囲が適切であるか否かは、後述の実施例に準じた予備実験によって確認することができる。
【００６８】
第２態様において、好ましくは、工程（５）として、以下の工程（５−１）と工程（５−２）をこの順序で行う。この態様では、工程（５）に特徴的な低分子化合物の組合せ（即ち、MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びγ−セクレターゼ阻害剤の組合せ）を工程（５−２）で用いることになる。
【００６９】
＜工程（５−１）＞
この工程は、４種の低分子化合物（MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びγ−セクレターゼ阻害剤）の組合せによる積極的な分化誘導を促す前の準備の段階として位置付けることができる。この工程を介在させることにより、スフェロイドの成長が促され、機能的な腸管オルガノイドの構築に有利となる。この工程の培養は、工程（４）と同条件（即ち、上皮成長因子、BMP阻害剤及びWntシグナル活性化剤の存在下での浮遊培養）で行うことができるが、好ましくは、水溶液中に３次元的網目構造を形成する材料（粘性材料）を添加した液体培地を用い、工程（４）で形成させた複数のスフェロイドをまとめて浮遊培養することで、操作性及び効率性の向上を図る。
【００７０】
工程（５−１）の期間（培養期間）は例えば３日間〜１５日間、好ましくは６日間〜１２日間である。当該培養期間が短すぎると、スフェロイドが小さく細胞死を起こしやすい。他方、当該培養期間が長すぎると、低分子化合物による十分な効果が得られない。
【００７１】
＜工程（５−２）＞
この工程では、上皮成長因子、BMP阻害剤及びWntシグナル活性化剤に加えて、MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びγ−セクレターゼ阻害剤の存在下での浮遊培養を行い、積極的な分化誘導を促し、腸管オルガノイドを形成させる。培養条件は上記工程（５−１）の培養条件と同様であるため、その説明を省略する。
【００７２】
工程（５−２）の期間（培養期間）は例えば３日間〜２１日間、好ましくは９日間〜１８日間である。当該培養期間が短すぎると、十分な機能向上につながらない。他方、当該培養期間が長すぎると、スフェロイドに対するダメージにより、細胞死を起こす可能性がある。
【００７３】
本発明の別の一態様（第３態様）では、MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及び上皮成長因子（EGF）の存在下（以下、この条件を「第１条件」と呼ぶ）、且つcAMPが細胞へ供給される条件下（以下、この条件を「第２条件」と呼ぶ）で工程（５）の培養を行い、積極的な分化誘導を行う。第１条件については、上記第２態様に準ずるため、その説明を省略する。一方、第２条件、即ち、cAMPが細胞へ供給される条件とは、細胞内へ取り込み可能な化合物であって、細胞内に取り込まれるとcAMPとして作用する化合物が存在する条件と同義である。従って、第２条件を満たすためには、例えば、細胞内へと取り込み可能なcAMP誘導体が添加された培地を用いればよい。cAMP誘導体としてPKA活性剤（例えば、8-Br-cAMP(8-Bromoadenosine-3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt, CAS Number : 76939-46-3)、6-Bnz-cAMP(N6-Benzoyladenosine-3',5'-cyclic monophosphate sodium salt salt, CAS Number : 1135306-29-4)、cAMPS-Rp((R)-Adenosine, cyclic 3',5'-(hydrogenphosphorothioate) triethylammonium salt, CAS Number : 151837-09-1)、cAMPS-Sp((S)-Adenosine, cyclic 3',5'-(hydrogenphosphorothioate) triethylammonium salt, CAS Number : 93602-66-5)、Dibutyryl-cAMP(N6,O2'-Dibutyryl adenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt salt, CAS Number : 16980-89-5)、8-Cl-cAMP(8-Chloroadenosine- 3', 5'- cyclic monophosphate salt, CAS Number : 124705-03-9)）、Epac活性剤（Rp-8-Br-cAMPS(8-Bromoadenosine 3',5'-cyclic Monophosphothioate, Rp-Isomer . sodium salt, CAS Number : 129735-00-8)、8-CPT-cAMP(8-(4-Chlorophenylthio)adenosine 3',5'-cyclic monophosphate, CAS Number : 93882-12-3)、8-pCPT-2'-O-Me-cAMP(8-(4-Chlorophenylthio)-2'-O-methyladenosine 3',5'-cyclic monophosphate monosodium, CAS Number : 634207-53-7)等）を採用することができる。cAMP誘導体の添加濃度の例（8-Br-cAMPの場合）を示すと、0.1 mM〜10 mM、好ましくは0.2 mM〜5 mM、更に好ましくは0.5 mM〜2 mMである。尚、例示した化合物、即ち、8-Br-cAMPとは異なる化合物を使用する場合の添加濃度については、使用する化合物の特性と、例示した化合物（8-Br-cAMP）の特性の相違（特に活性の相違）を考慮すれば、当業者であれば上記濃度範囲に準じて設定することができる。また、設定した濃度範囲が適切であるか否かは、予備実験によって確認することができる。
【００７４】
第３態様では、好ましくは、工程（５）として、以下のＡ〜Ｃのいずれかの培養工程を行う。
＜培養工程Ａ＞
培養工程Ａでは、（ａ−１）MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及び上皮成長因子の存在下での培養と、当該培養に続く、（ａ−２）MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及び上皮成長因子の存在下、且つcAMPが細胞へ供給される条件下での培養を行う。即ち、cAMPが細胞へ供給される条件の有無で異なる２段階の培養を行う。このようにすれば、腸管上皮細胞への分化促進、成熟化、機能獲得の効果が得られる。（ａ−１）の培養の期間は例えば１日間〜５日間である。同様に、（ａ−２）の培養の期間は例えば３日間〜１５日間である。尚、特に説明しない事項（各培養に使用可能な化合物、各化合物の添加濃度等）については、上記の対応する説明が援用される。
【００７５】
（ａ−２）の培養を、MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及び上皮成長因子に加えてcAMP分解酵素阻害剤も存在する条件で行うことにしてもよい。当該条件を採用すると、cAMPの分解阻害によって細胞内cAMP濃度の低下が抑えられ、腸管上皮への分化誘導、特に腸管上皮細胞としての機能の獲得が促されることを期待できる。即ち、当該条件は、より機能的な腸管オルガノイドの調製に有利なものである。cAMP分解酵素阻害剤として、IBMX (3-isobutyl-1-methylxanthine) (MIX)、Theophylline、Papaverine、Pentoxifylline (Trental)、KS-505、8-Methoxymethyl-IBMX、Vinpocetine (TCV-3B)、EHNA、Trequinsin (HL-725)、Lixazinone (RS-82856)、(LY-186126)、Cilostamide (OPC3689)、Bemoradan (RWJ-22867)、Anergrelide (BL4162A)、Indolidan (LY195115)、Cilostazol (OPC-13013)、Milrinone (WIN47203)、Siguazodan (SKF-94836)、5-Methyl-imazodan (CI 930)、SKF-95654、Pirilobendan (UD-CG 115 BS)、Enoximone (MDL 17043)、Imazodan (CL 914)、SKF-94120、Vesnarinone (OPC 8212)、Rolipram (Ro-20-1724)、(ZK-62711)、Denbufyll'ine、Zaprinast (M&B-22, 948)、Dipyridamole、Zaprinast (M&B-22, 948)、Dipyridamole、Zardaverine、AH-21-132、Sulmazol (AR-L 115 BS)を例示することができる。cAMP分解酵素阻害剤の添加濃度の例（IBMXの場合）を示すと、0.05 mM〜5 mM、好ましくは0.1 mM〜3 mM、更に好ましくは0.2 mM〜1 mMである。尚、例示した化合物、即ち、IBMXとは異なる化合物を使用する場合の添加濃度については、使用する化合物の特性と、例示した化合物（IBMX）の特性の相違（特に活性の相違）を考慮すれば、当業者であれば上記濃度範囲に準じて設定することができる。また、設定した濃度範囲が適切であるか否かは、予備実験によって確認することができる。
【００７６】
（ａ−２）の培養の後に、MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及び上皮成長因子の存在下での培養（（ａ−３）の培養）を行うことにしてもよい。この培養の期間は例えば１日間〜１０日間とする。この培養を行うと腸管上皮細胞への分化促進、成熟化、機能獲得の効果が得られる。
【００７７】
＜培養工程Ｂ＞
培養工程Ｂでは、（ｂ−１）MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及び上皮成長因子の存在下、且つcAMPが細胞へ供給される条件下での培養と、当該培養に続く、（ｂ−２）MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤、上皮成長因子及びcAMP分解酵素阻害剤の存在下での培養を行う。このように、cAMPが細胞へ供給される条件で培養した後、cAMP分解酵素阻害剤が存在する条件で培養すると、腸管上皮細胞への分化促進、成熟化、機能獲得の効果が得られる。（ｂ−１）の培養の期間は例えば３日間〜１５日間である。同様に、（ｂ−２）の培養の期間は例えば３日間〜１５日間である。尚、特に説明しない事項（各培養に使用可能な化合物、各化合物の添加濃度等）については、上記の対応する説明が援用される。
【００７８】
（ｂ−１）の培養を、MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及び上皮成長因子に加えてcAMP分解酵素阻害剤も存在する条件で行うことにしてもよい。当該条件を採用すると、早い段階から細胞内cAMP濃度の低下が抑えられ、腸管上皮への分化誘導、特に腸管上皮細胞としての機能の獲得が促されることを期待できる。即ち、当該条件は、より機能的な腸管オルガノイドの効率的な調製に有利なものである。
【００７９】
（ｂ−２）の培養の後に、MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及び上皮成長因子の存在下での培養（（ｂ−３）の培養）を行うことにしてもよい。この培養の期間は例えば１日間〜１０日間とする。この培養を行うと腸管上皮細胞への分化促進、成熟化、機能獲得の効果が得られる。
【００８０】
＜培養工程Ｃ＞
培養工程Ｃでは、（ｃ−１）MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及び上皮成長因子の存在下、且つcAMPが細胞へ供給される条件下での培養を行う。（ｃ−１）の培養の期間は例えば３日間〜１５日間である。尚、特に説明しない事項（各培養に使用可能な化合物、各化合物の添加濃度等）については、上記の対応する説明が援用される。
【００８１】
（ｃ−１）の培養を、MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及び上皮成長因子に加えてcAMP分解酵素阻害剤も存在する条件（cAMPが細胞へ供給される条件も併用される）で行うことにしてもよい。当該条件を採用すると、cAMPを細胞へ供給しつつ、細胞内cAMP濃度の低下を抑えることができる。従って、細胞内cAMPを高レベルに維持するために有効な条件となり、腸管上皮細胞への効率的な分化誘導が促されることを期待できる。
【００８２】
（ｃ−１）の培養の後に、MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及び上皮成長因子の存在下での培養（（ｃ−２）の培養）を行うことにしてもよい。この培養の期間は例えば１日間〜１０日間とする。この培養を行うと腸管上皮細胞への分化促進、成熟化、機能獲得の効果が得られる。
【００８３】
本発明の更に別の一態様（第４態様）では、MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤、上皮成長因子及びcAMP活性化物質を併用して工程（５）の培養を行い、積極的な分化誘導を行う。分化誘導の際、cAMP活性化物質を使用することで、細胞内のcAMPレベルを積極的に上昇させる。「MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤、上皮成長因子及びcAMP活性化物質を併用する」とは、工程（５）を構成する１又は２以上の培養を行うため、これら全ての化合物が必要とされることいい、これら全ての化合物が同時に使用されること、即ち、これら全ての化合物が添加された培地を用いた培養が行われることを必須の条件として要求するものではない。
【００８４】
第４態様における工程（５）は１又は２以上の培養によって構成される（詳細は後述する）。工程（５）を構成する各培養では、例えば、上皮成長因子及びcAMP活性化物質が必須の成分として添加された培地、MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及び上皮成長因子が必須の成分として添加された培地、上皮成長因子が必須の成分として添加された培地、MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤、上皮成長因子及びcAMP活性化物質が必須の成分として添加された培地等が用いられる。
【００８５】
MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及び上皮成長因子については、上記第３態様の条件１と同様であるため、その説明を省略する。cAMP活性化物質としては、フォルスコリン、インドメタシン、NKH477（コルホルシンダロパート）、細胞由来毒素タンパク質（百日咳毒素、コレラ毒素）、PACAP-27、PACAP-38、SKF83822等を用いることができる。フォルスコリンはアデニル酸シクラーゼ活性化作用を示し、細胞内cAMPの合成を促進する。cAMP活性化物質の添加濃度の例（フォルスコリンの場合）を示すと、1μM〜200μM、好ましくは5μM〜100μMである。尚、例示した化合物、即ち、フォルスコリンとは異なる化合物を使用する場合の添加濃度については、使用する化合物の特性と、例示した化合物（フォルスコリン）の特性の相違（特に活性の相違）を考慮すれば、当業者であれば上記濃度範囲に準じて設定することができる。また、設定した濃度範囲が適切であるか否かは、後述の実施例に準じた予備実験によって確認することができる。
【００８６】
第４態様における工程（５）を上記の条件に加え、cAMPが細胞へ供給される条件（「追加条件１」と呼ぶ）及びcAMP分解酵素阻害剤が存在する条件（「追加条件２」と呼ぶ）、或いはこれらのいずれかの条件の下で行うことにしてもよい。追加条件１は上記第３態様の第１条件と同様である。また、追加条件２は上記第３態様の培養工程Ａ〜Ｃで採用され得る条件と同様である。
【００８７】
第４態様では、好ましくは、工程（５）として、以下のＡ〜Ｄのいずれかの培養工程を行う。
＜培養工程Ａ＞
培養工程Ａでは、（ａ−１）上皮成長因子及び細胞内cAMP合成促進剤の存在下での培養と、当該培養の後に行われる、（ａ−２）MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及び上皮成長因子の存在下での培養を行う。このように２段階の培養を行えば、腸管上皮細胞への分化促進、成熟化、機能獲得の効果が期待できる。（ａ−１）の培養の期間は例えば２日間〜１０日間、好ましくは４日間〜８日間であり、（ａ−２）の培養の期間は例えば９日間〜２９日間、好ましくは７日間〜２７日間である。尚、特に説明しない事項（各培養に使用可能な化合物、各化合物の添加濃度等）については、上記の対応する説明が援用される。
【００８８】
（ａ−１）の培養をcAMPが細胞へ供給される条件（「追加条件１」と呼ぶ）及びcAMP分解酵素阻害剤が存在する条件（「追加条件２」と呼ぶ）、或いはこれらのいずれかの条件で行うことにしてもよい。（ａ−２）の培養も同様である。追加条件１及び追加条件２の詳細は上記の通りである。
【００８９】
＜培養工程Ｂ＞
培養工程Ｂでは、（ｂ−１）上皮成長因子の存在下での培養と、当該培養の後に行われる、（ｂ−２）MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤、上皮成長因子及び細胞内cAMP合成促進剤の存在下での培養を行う。このように２段階の培養を行えば、腸管上皮細胞への分化促進、成熟化、機能獲得の効果が期待できる。（ｂ−１）の培養の期間は例えば２日間〜１０日間、好ましくは４日間〜８日間であり、（ｂ−２）の培養の期間は例えば９日間〜１９日間、好ましくは７日間〜１７日間である。尚、特に説明しない事項（各培養に使用可能な化合物、各化合物の添加濃度等）については、上記の対応する説明が援用される。
【００９０】
（ｂ−１）の培養をcAMPが細胞へ供給される条件（追加条件１）及びcAMP分解酵素阻害剤が存在する条件（追加条件２）、或いはこれらのいずれかの条件で行うことにしてもよい。（ｂ−２）の培養も同様である。追加条件１及び追加条件２の詳細は上記の通りである。
【００９１】
（ｂ−２）の培養の後に、MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及び上皮成長因子の存在下での培養（（ｂ−３）の培養）を行うことにしてもよい。この培養の期間は例えば１日間〜１０日間とする。この培養を行うと腸管上皮細胞への分化促進、成熟化、機能獲得の効果を期待できる。
【００９２】
＜培養工程Ｃ＞
培養工程Ｃでは、（ｃ−１）上皮成長因子及び細胞内cAMP合成促進剤の存在下での培養と、当該培養の後に行われる、（ｃ−２）MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤、上皮成長因子及び細胞内cAMP合成促進剤の存在下での培養を行う。このように２段階の培養を行えば、腸管上皮細胞への分化促進、成熟化、機能獲得の効果が期待できる。（ｃ−１）の培養の期間は例えば２日間〜１０日間、好ましくは４日間〜８日間であり、（ｃ−２）の培養の期間は例えば９日間〜１９日間、好ましくは７日間〜１７日間である。尚、特に説明しない事項（各培養に使用可能な化合物、各化合物の添加濃度等）については、上記の対応する説明が援用される。
【００９３】
（ｃ−１）の培養をcAMPが細胞へ供給される条件（追加条件１）及びcAMP分解酵素阻害剤が存在する条件（追加条件２）、或いはこれらのいずれかの条件で行うことにしてもよい。（ｃ−２）の培養も同様である。追加条件１及び追加条件２の詳細は上記の通りである。
【００９４】
（ｃ−２）の培養の後に、MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及び上皮成長因子の存在下での培養（（ｃ−３）の培養）を行うことにしてもよい。この培養の期間は例えば１日間〜１０日間とする。この培養を行うと腸管上皮細胞への分化促進、成熟化、機能獲得の効果を期待できる。
【００９５】
＜培養工程Ｄ＞
培養工程Ｄでは、（ｄ−１）MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤、上皮成長因子及び細胞内cAMP合成促進剤の存在下での培養を行う。この培養工程は、培養操作が簡便であること、腸管上皮細胞への分化に対してより効果的であること、化合物であるため安定した効果が期待できること等の点で特に有利である。（ｄ−１）の培養の期間は例えば１５日間〜２５日間、好ましくは１７日間〜２３日間である。尚、特に説明しない事項（各培養に使用可能な化合物、各化合物の添加濃度等）については、上記の対応する説明が援用される。
【００９６】
（ｄ−１）の培養をcAMPが細胞へ供給される条件（追加条件１）及びcAMP分解酵素阻害剤が存在する条件（追加条件２）、或いはこれらのいずれかの条件で行うことにしてもよい。追加条件１及び追加条件２の詳細は上記の通りである。
【００９７】
（ｄ−１）の培養の後に、MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及び上皮成長因子の存在下での培養（（ｄ−２）の培養）を行うことにしてもよい。この培養の期間は例えば１日間〜１０日間とする。この培養を行うと腸管上皮細胞への分化促進、成熟化、機能獲得の効果を期待できる。
【００９８】
本発明を構成する各工程における、その他の培養条件（培養温度など）は、動物細胞の培養において一般に採用されている条件とすればよい。即ち、例えば37℃、5%CO2の環境下で培養すればよい。また、基本培地として、イスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）（GIBCO社等）、ハムF12培地（HamF12）（SIGMA社、Gibco社等）、ダルベッコ変法イーグル培地（D-MEM）（ナカライテスク株式会社、シグマ社、Gibco社等）、グラスゴー基本培地（Gibco社等）、RPMI1640培地等を用いることができる。二種以上の基本培地を併用することにしてもよい。工程（４）及び工程（５）においては、上皮細胞の培養に適した基本培地（例えばD-MEMとハムF12培地の混合培地、D-MEM）を用いることが好ましい。培地に添加可能な成分の例としてウシ血清アルブミン（BSA）、抗生物質、2-メルカプトエタノール、PVA、非必須アミノ酸（NEAA）、インスリン、トランスフェリン、セレニウムを挙げることができる。
【００９９】
本発明を構成する工程（１）、工程（２）の途中で継代培養を行ってもよい。例えばコンフルエント又はサブコンフルエントになった際に細胞の一部を採取して別の培養容器に移し、培養を継続する。細胞の回収には細胞解離液などを利用すればよい。細胞解離液としては、例えば、トリプシン-EDTA、コラゲナーゼIV、メタロプロテアーゼ等のタンパク分解酵素等を単独で又は適宜組み合わせて用いることができる。細胞障害性が少ないものが好ましい。このような細胞解離液として、例えば、ディスパーゼ（エーディア）、TrypLE （Invitrogen）又はアキュターゼ（MILLIPORE）等の市販品が入手可能である。分散（離散）状態となるように、回収後の細胞をセルストレイナーなどで処理した後に継代培養に供するとよい。一方、本発明を構成する各工程において、必要に応じて培地交換が行われる。例えば、２４時間〜３日に１回の頻度で培地交換するとよい
【０１００】
上記の通り、工程（３）については継代培養を行うことが好ましい。また、工程（５）において継代培養（例えば１回〜５回）を行うことも可能である。この場合の継代操作は例えば以下の手順に従えばよい。まず、細胞塊（スフェロイド）を回収し、必要に応じて洗浄した後、スフェロイド用の分散／解離液（例えばThermo Fisher Scientific社のEDTAや、Roche社のDispase II、STEMCELL Technologies社のGentle Cell Dissociation Reagent）で処理する。続いて、ピペッティング操作などによって分散、懸濁させた後、播種し、培養を継続する。
【０１０１】
継代培養や培地交換に伴う、細胞の回収の際には、細胞死を抑制するためにY-27632等のROCK阻害剤（Rho-associated coiled-coil forming kinase/Rho結合キナーゼ）で予め細胞を処理しておくとよい。
【０１０２】
以上で説明した本発明によれば、生体腸管構造に近い構造を有する腸管オルガノイド、即ちbuddingな腸管オルガノイドを作製することができる。本発明の腸管オルガノイドはその構造に加え、機能面でも生体の腸管に近似し、腸管に特徴的な薬物動態学的な機能、具体的には代謝（吸収、排出）機能を発揮する。このような機能的な腸管オルガノイドであることは、各種トランスポーター（ペプチドトランスポーター、排出トランスポーター、有機アニオントランスポーター等）の発現、薬物代謝酵素の発現／活性などによって評価することができる。また、薬物応答性の有無や程度も、腸管オルガノイドの機能性を評価する指標として有用である。ペプチドトランスポーターの例はSLC15A1/PEPT1（SLC（solute carrier）ファミリーメンバー15A1/ペプチドトランスポーター1）であり、排出トランスポーター例は、ABCB1/MDR1（ATP結合カセットトランスポーターB1/多剤耐性タンパク1）、ABCC2/MRP2（ATP結合カセットトランスポーターC2/多剤耐性関連タンパク質2）、ABCG2/BCRP（ATP結合カセットトランスポーターG2/乳ガン耐性タンパク）であり、有機アニオントランスポーターの例はSLCO2B1/OATP2B1（SLC（solute carrier）有機アニオントランスポーター2B1）であり、薬物代謝酵素の例は、CYP3A4（シトクロムP450 3A4）、CYP3A8（シトクロムP450 3A8）である。薬物応答性の評価には、例えば、リファンピシン又はビタミンD受容体を介した薬物代謝酵素CYP3A（例えば、ヒトの場合はCYP3A4、カニクイザルの場合はCYP3A8）の発現誘導を指標にできる。
【０１０３】
尚、CDX2（Caudal-type ホメオボックス2）、Chromogranin A、E-cad（E-cadherin；上皮カドヘリン）、LGR5（ロイシンリッチリピートを含むGタンパク質共役型受容体）、Lysozyme（リゾチーム）、MUC2（ムチン2糖タンパク）、OLFM4（オルファクトメジン4）、Villin（ビリン）、Vim（Vimentin；ビメンチン）等も腸管オルガノイドの構造又は機能性を評価する上で有用である。
【０１０４】
２．腸管細胞層を作製する方法
本発明は別の局面として、生体の腸管組織と類似の特性を示す腸管細胞層を作製する方法（以下、「本発明の腸管細胞層作製方法」とも呼ぶ）を提供する。本発明の腸管細胞層作製方法は、上記局面で得られる腸管オルガイドを利用するものであり、腸管オルガノイドを平面培養に供し（即ち、２次元培養系への移行・変換）、細胞層を形成させる。具体的には、本発明の腸管細胞層作製方法は以下の工程（１）〜（６）によって特徴付けられる。
（１）多能性幹細胞を内胚葉様細胞へと分化させる工程
（２）工程（１）で得られた内胚葉様細胞を腸管幹細胞様細胞へと分化させる工程
（３）工程（２）で得られた腸管幹細胞様細胞を、上皮成長因子、線維芽細胞増殖因子、TGFβ受容体阻害剤、GSK-3β阻害剤及びROCK阻害剤の存在下で培養する工程
（４）工程（３）後の細胞を培養し、スフェロイドを形成させる工程
（５）工程（４）で形成されたスフェロイドを分化させ、腸管オルガノイドを形成させる工程であって、上皮成長因子、BMP阻害剤及びWntシグナル活性化剤の存在下での培養を含む工程
（６）工程（５）で形成された腸管オルガノイドを構成する細胞を、上皮成長因子及びTGFβ受容体阻害剤の存在下で平面培養する工程
【０１０５】
工程（１）〜（５）は第１の局面と同様であるため、その説明を省略する。工程（５）に続く工程（６）では、工程（５）で形成された腸管オルガノイドを構成する細胞を、上皮成長因子及びTGFβ受容体阻害剤の存在下で平面培養する。換言すれば、形成された腸管オルガノイドから細胞を回収して二次元培養系に移し、特定の条件で培養する。典型的には、腸管オルガノイドから回収した細胞集団又はその一部を選別することなく平面培養に供する。腸管オルガノイドからの細胞の回収には細胞解離液などを利用すればよい。細胞解離液としては、例えば、トリプシン-EDTA、コラゲナーゼIV、メタロプロテアーゼ等のタンパク分解酵素等を単独で又は適宜組み合わせて用いることができる。細胞障害性が少ないものが好ましい。このような細胞解離液として、例えば、ディスパーゼ（エーディア）、TrypLE （Invitrogen）又はアキュターゼ（MILLIPORE）等の市販品が入手可能である。また、セルストレイナーなどで処理し、細胞の分散性を高めるとよい。尚、細胞の回収の際には、細胞死を抑制するためにY-27632等のROCK阻害剤（Rho-associated coiled-coil forming kinase/Rho結合キナーゼ）で予め細胞を処理しておくとよい。
【０１０６】
工程（６）の培養条件である、「上皮成長因子及びTGFβ受容体阻害剤の存在下」とは、これらの化合物が培地中に添加された条件と同義である。従って、上皮成長因子及びTGFβ受容体阻害剤の存在下での培養を行うためには、これらの化合物が添加された培地を用いればよい。TGFβ受容体阻害剤として例えばA-83-01を用いることができる。
【０１０７】
上皮成長因子の添加濃度の例を示すと10 ng/mL〜500 ng/mL、好ましくは50 ng/mL〜200 ng/mLである。同様に、TGFβ受容体阻害剤の添加濃度の例（A-83-01の場合）を示すと0.1μM〜5μM、好ましくは0.3μM〜3μMである。尚、例示した化合物、即ち、A-83-01とは異なる化合物を使用する場合の添加濃度については、使用する化合物の特性と、例示した化合物の特性の相違（特に活性の相違）を考慮すれば、当業者であれば上記濃度範囲に準じて設定することができる。また、設定した濃度範囲が適切であるか否かは、後述の実施例に準じた予備実験によって確認することができる。
【０１０８】
好ましくは、上皮成長因子及びTGFβ受容体阻害剤に加え、cAMP活性化物質の存在下で工程（６）の培養を行い、形成される細胞層の高機能化を図る。更に好ましくは、cAMP活性化物質と併せてγ−セクレターゼ阻害剤及び／又はGSK-3β阻害剤を追加し、形成される細胞層の更なる高機能化を図る。
【０１０９】
cAMP活性化物質としては、フォルスコリン、インドメタシン、NKH477（コルホルシンダロパート）、細胞由来毒素タンパク質（百日咳毒素、コレラ毒素）、PACAP-27、PACAP-38、SKF83822等を用いることができる。また、γ−セクレターゼ阻害剤の例を挙げると、N-[(3,5-difluorophenyl) acetyl]-L-alanyl-2-phenyl-1,1-dimethylethyl ester-glycine (DAPT)、L-685,458、Compound E (CAS 209986-17-4)、(R)-Flurbiprofen、BMS299897、JLK6、LY-411575、R04929097、MK-0752、SCP0004、SCP0025、gamma-Secretase Inhibitor XI、gamma-Secretase Inhibitor XVI、gamma-Secretase Inhibitor I、gamma-Secretase Inhibitor VII、Semagacestat (LY450139)、gamma-Secretase Inhibitor III、Compound 34、BMS-708163、Compound W、YO-01027 (Dibenzazepine)、Avagacestat (BMS-708163)である。一方、GSK-3β阻害剤としてCHIR99021、SB216763、CHIR98014、TWS119、Tideglusib、SB415286、BIO、AZD2858、AZD1080、AR-A014418、TDZD-8、LY2090314、IM-12、Indirubin、Bikinin、1-Azakenpaulloneを例示することができる。
【０１１０】
cAMP活性化物質の添加濃度の例（フォルスコリンの場合）を示すと1μM〜200μM、好ましくは5μM〜100μMである。同様に、γ−セクレターゼ阻害剤の添加濃度の例（DAPTの場合）を示すと1 nM〜20μM、好ましくは0.1μM〜10μMであり、GSK-3β阻害剤の添加濃度の例（CHIR99021の場合）を示すと0.5μM〜100μM、好ましくは1μM〜30μMである。尚、例示した化合物、即ち、フォルスコリン、DAPT、CHIR99021とは異なる化合物を使用する場合の添加濃度については、使用する化合物の特性と、例示した化合物の特性の相違（特に活性の相違）を考慮すれば、当業者であれば上記濃度範囲に準じて設定することができる。また、設定した濃度範囲が適切であるか否かは、後述の実施例に準じた予備実験によって確認することができる。
【０１１１】
工程（６）の培養には、細胞接着性の培養面を備える培養容器が使用される。細胞接着性の培養面として、好ましくは、基底膜成分（例えばラミニン、IV型コラーゲン、エンタクチン、ビトロネクチン、フィブロネクチン）又はその断片をコートしたものを用いるとよい。特に、ラミニン511又はそのE8断片でコートした培養面を採用するとよい。ラミニン511のE8断片については、その組換え体（組換えヒトラミニン511-E8タンパク質）を高純度に精製した製品（製品名：iMatrix-511、製造：株式会社ニッピ、販売：株式会社マトリクソーム）が市販されている。尚、培養容器は特に限定されず、例えば、ディッシュ、フラスコ、マルチウェルプレート等を用いることができる。
【０１１２】
一態様では、半透過性膜（多孔性膜）の上で細胞を培養し、細胞層を形成させる。具体的には、例えば、インサートを備えた培養容器（例えば、コーニング社が提供するトランズウェル（登録商標））を使用し、インサート内に細胞を播種して培養することにより細胞層を得る。この態様によれば、細胞層を透過した被検物質の定量によって評価を行う評価系への利用に適した細胞層が得られることになる。尚、評価系の構築方法やその利用方法等は後述する（４．腸管細胞層の用途の欄）。
【０１１３】
好ましい一態様では、（６）の平面培養の少なくとも一部を気液培養にする。例えば、半透過性膜に細胞を播種し、細胞が培養面（即ち半透過性膜）に接着した後、気液培養へと切り替える。好ましくは、細胞層が形成されたのを確認後に気液培養へ切り替える。気液培養への切り替えの時期（タイミング）の目安は播種から３時間後〜３日後（例えば６時間後、８時間後、１２時間後、２４時間後、３６時間後、４８時間後、６０時間後）であるが、細胞の状態やその他の条件（例えば使用する培養基材）によって細胞が培養面に接着するまでの時間や細胞層が形成されるまでの時間は変動し得るため、予備実験によって切り替えの時期を決定するか、或いは播種後に細胞を観察し、適切なタイミングで気液培養へ切り替えるとよい。
【０１１４】
用語「気液培養」とは、細胞表面の全体（但し、培養面への接着部分や他の細胞と接触ないし接着した部分等を除く）が培地に接触するのではなく、細胞表面の一部が気相に接触した状態で培養することをいう。例えば、上記のごとき、インサートを備えた培養容器（典型的には、インサートとその受け皿となるウェルプレートから構成される）を使用することにし、インサート内に細胞を播種し、細胞が接着した後（好ましくは細胞層が形成された後）にインサート内の培養液を除去すれば、細胞の上面側に気相、細胞の下面側（即ちインサートに接着した側）に液相（培地）が存在する状態となり、気液培養を開始することができる。一方、インサート内の培養液を除去するのではなく、ウェル内の培養液を除去し、細胞の上面側に液相、細胞の下面側に気相が存在する状態を形成させ、気液培養を行ってもよい。
【０１１５】
気液培養は、上皮成長因子及びTGFβ受容体阻害剤に加え、cAMPシグナルを活性化する因子の存在下、即ち、これら３種類の物質が添加された培地を用いて実施するとよい。cAMPシグナルを活性化する因子としてcAMP誘導体、cAMP分解酵素阻害剤又はcAMP活性化物質を用いることができる。これらの中の二つ以上の物質を併用してもよい。
【０１１６】
cAMP誘導体としてPKA活性剤（例えば、8-Br-cAMP(8-Bromoadenosine-3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt, CAS Number : 76939-46-3)、6-Bnz-cAMP(N6-Benzoyladenosine-3',5'-cyclic monophosphate sodium salt salt, CAS Number : 1135306-29-4)、cAMPS-Rp((R)-Adenosine, cyclic 3',5'-(hydrogenphosphorothioate) triethylammonium salt, CAS Number : 151837-09-1)、cAMPS-Sp((S)-Adenosine, cyclic 3',5'-(hydrogenphosphorothioate) triethylammonium salt, CAS Number : 93602-66-5)、Dibutyryl-cAMP(N6,O2'-Dibutyryl adenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt salt, CAS Number : 16980-89-5)、8-Cl-cAMP(8-Chloroadenosine- 3', 5'- cyclic monophosphate salt, CAS Number : 124705-03-9)）、Epac活性剤（Rp-8-Br-cAMPS(8-Bromoadenosine 3',5'-cyclic Monophosphothioate, Rp-Isomer . sodium salt, CAS Number : 129735-00-8)、8-CPT-cAMP(8-(4-Chlorophenylthio)adenosine 3',5'-cyclic monophosphate, CAS Number : 93882-12-3)、8-pCPT-2'-O-Me-cAMP(8-(4-Chlorophenylthio)-2'-O-methyladenosine 3',5'-cyclic monophosphate monosodium, CAS Number : 634207-53-7)等）を採用することができる。cAMP誘導体の添加濃度の例（8-Br-cAMPの場合）を示すと、0.1 mM〜10 mM、好ましくは0.2 mM〜5 mM、更に好ましくは0.5 mM〜2 mMである。尚、例示した化合物、即ち、8-Br-cAMPとは異なる化合物を使用する場合の添加濃度については、使用する化合物の特性と、例示した化合物（8-Br-cAMP）の特性の相違（特に活性の相違）を考慮すれば、当業者であれば上記濃度範囲に準じて設定することができる。また、設定した濃度範囲が適切であるか否かは、予備実験によって確認することができる。
【０１１７】
cAMP分解酵素阻害剤として、IBMX (3-isobutyl-1-methylxanthine) (MIX)、Theophylline、Papaverine、Pentoxifylline (Trental)、KS-505、8-Methoxymethyl-IBMX、Vinpocetine (TCV-3B)、EHNA、Trequinsin (HL-725)、Lixazinone (RS-82856)、(LY-186126)、Cilostamide (OPC3689)、Bemoradan (RWJ-22867)、Anergrelide (BL4162A)、Indolidan (LY195115)、Cilostazol (OPC-13013)、Milrinone (WIN47203)、Siguazodan (SKF-94836)、5-Methyl-imazodan (CI 930)、SKF-95654、Pirilobendan (UD-CG 115 BS)、Enoximone (MDL 17043)、Imazodan (CL 914)、SKF-94120、Vesnarinone (OPC 8212)、Rolipram (Ro-20-1724)、(ZK-62711)、Denbufyll'ine、Zaprinast (M&B-22, 948)、Dipyridamole、Zaprinast (M&B-22, 948)、Dipyridamole、Zardaverine、AH-21-132、Sulmazol (AR-L 115 BS)を例示することができる。cAMP分解酵素阻害剤の添加濃度の例（IBMXの場合）を示すと、0.05 mM〜5 mM、好ましくは0.1 mM〜3 mM、更に好ましくは0.2 mM〜1 mMである。尚、例示した化合物、即ち、IBMXとは異なる化合物を使用する場合の添加濃度については、使用する化合物の特性と、例示した化合物（IBMX）の特性の相違（特に活性の相違）を考慮すれば、当業者であれば上記濃度範囲に準じて設定することができる。また、設定した濃度範囲が適切であるか否かは、予備実験によって確認することができる。
【０１１８】
cAMP活性化物質としては、フォルスコリン、インドメタシン、NKH477（コルホルシンダロパート）、細胞由来毒素タンパク質（百日咳毒素、コレラ毒素）、PACAP-27、PACAP-38、SKF83822等を用いることができる。cAMP活性化物質の添加濃度の例（フォルスコリンの場合）を示すと、1μM〜200μM、好ましくは5μM〜100μMである。尚、例示した化合物、即ち、フォルスコリンとは異なる化合物を使用する場合の添加濃度については、使用する化合物の特性と、例示した化合物（フォルスコリン）の特性の相違（特に活性の相違）を考慮すれば、当業者であれば上記濃度範囲に準じて設定することができる。また、設定した濃度範囲が適切であるか否かは、後述の実施例に準じた予備実験によって確認することができる。
【０１１９】
気液培養は例えば３日〜２１日間、好ましくは４日〜１８日間、更に好ましくは５日〜１４日間行う。尚、典型的には好気的条件下で気液培養を行うが、嫌気的条件を採用することにしてもよい。
【０１２０】
工程（６）の期間（培養期間）は例えば１２日間〜３６日間である。工程（６）の途中で継代培養を行ってもよい。例えばコンフルエント又はサブコンフルエントになった際に細胞の一部を採取して別の培養容器に移し、培養を継続する。細胞の回収には細胞解離液などを利用すればよい。細胞解離液としては、例えば、トリプシン-EDTA、コラゲナーゼIV、メタロプロテアーゼ等のタンパク分解酵素等を単独で又は適宜組み合わせて用いることができる。細胞障害性が少ないものが好ましい。このような細胞解離液として、例えば、ディスパーゼ（エーディア）、TrypLE （Invitrogen）又はアキュターゼ（MILLIPORE）等の市販品が入手可能である。分散（離散）状態となるように、回収後の細胞をセルストレイナーなどで処理した後に継代培養に供するとよい。一方、工程（６）において、必要に応じて培地交換が行われる。例えば、２４時間〜３日に１回の頻度で培地交換するとよい。継代培養や培地交換に伴う、細胞の回収の際には、細胞死を抑制するためにY-27632等のROCK阻害剤（Rho-associated coiled-coil forming kinase/Rho結合キナーゼ）で予め細胞を処理しておくとよい。
【０１２１】
その他の培養条件（培養温度など）は、動物細胞の培養において一般に採用されている条件とすればよい。即ち、例えば37℃、5%CO2の環境下で培養すればよい。基本培地は特に限定されないが、好ましくは、上皮細胞の培養に適した基本培地（例えばD-MEMとハムF12培地の混合培地、D-MEM）を用いる。培地に添加可能な成分の例としてウシ血清アルブミン（BSA）、抗生物質、2-メルカプトエタノール、PVA、非必須アミノ酸（NEAA）、インスリン、トランスフェリン、セレニウムを挙げることができる。
【０１２２】
後述の通り（４．腸管細胞層の用途の欄）、腸管細胞層は、腸管オルガノイドと同様、腸管（特に小腸）での薬物動態（吸収、代謝など）の評価や毒性の評価、或いは炎症性腸疾患モデルや線維化モデル等の作製に有用であり、二次元であるが故に、よりハイスループットな解析を可能とする。また、腸内細菌叢との共培養系の構築及びそれを利用したアッセイなどへの利用も期待できる。
【０１２３】
３．腸管オルガノイドの用途
本発明の第２の局面は本発明の作製方法で得られた腸管オルガノイドの用途に関する。第１の用途として各種アッセイが提供される。本発明の腸管オルガノイドは腸管、特に小腸のモデル系に利用可能であり、腸管、特に小腸での薬物動態（吸収、代謝など）の評価や毒性の評価に有用である。換言すれば、本発明の腸管オルガノイドは、化合物の体内動態の評価や毒性の評価にその利用が図られる。
【０１２４】
具体的には、本発明の腸管オルガノイドを用いて被検物質の代謝、吸収性、膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、薬物トランスポーターの誘導、毒性等を試験することができる。即ち、本発明は、腸管オルガノイドの用途の一つとして、被検物質の代謝、吸収性、膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、薬物トランスポーターの誘導、毒性等を評価する方法を提供する。当該方法では、（Ｉ）本発明の作製方法で得られた腸管オルガノイドに被検物質を接触させる工程と、（ＩＩ）被検物質の代謝、吸収性、膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、又は薬物トランスポーターの誘導、或いは毒性を測定・評価する工程を行う。
【０１２５】
工程（Ｉ）での「接触」は、典型的には、培地に被検物質を添加することによって行われる。被検物質の添加のタイミングは特に限定されない。従って、被検物質を含まない培地で培養を開始した後、ある時点で被検物質を添加することにしても、予め被検物質を含む培地で培養を開始することにしてもよい。
【０１２６】
被検物質には様々な分子サイズの有機化合物又は無機化合物を用いることができる。有機化合物の例として核酸、ペプチド、タンパク質、脂質（単純脂質、複合脂質（ホスホグリセリド、スフィンゴ脂質、グリコシルグリセリド、セレブロシド等）、プロスタグランジン、イソプレノイド、テルペン、ステロイド、ポリフェノール、カテキン、ビタミン（B1、B2、B3、B5、B6、B7、B9、B12、C、A、D、E等）を例示できる。医薬品、栄養食品、食品添加物、農薬、香粧品（化粧品）等の既存成分或いは候補成分も好ましい被検物質の一つである。植物抽出液、細胞抽出液、培養上清などを被検物質として用いてもよい。２種類以上の被検物質を同時に添加することにより、被検物質間の相互作用、相乗作用などを調べることにしてもよい。被検物質は天然物由来であっても、或いは合成によるものであってもよい。後者の場合には例えばコンビナトリアル合成の手法を利用して効率的なアッセイ系を構築することができる。
【０１２７】
被検物質を接触させる期間は任意に設定可能である。接触期間は例えば１０分間〜３日間、好ましくは１時間〜１日間である。接触を複数回に分けて行うことにしてもよい。
【０１２８】
工程（Ｉ）の後、被検物質の代謝、吸収性、膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、又は薬物トランスポーターの誘導、或いは毒性を測定・評価する（工程（ＩＩ））。工程（Ｉ）の直後、即ち、被検物質の接触の後、実質的な時間間隔を置かずに代謝等を測定・評価しても、或いは、一定の時間（例えば１０分〜５時間）を経過した後に代謝等を測定・評価することにしてもよい。代謝の測定は、例えば、代謝産物の検出によって行うことができる。この場合には、通常、工程（Ｉ）後の培養液をサンプルとして、予想される代謝産物を定性的又は定量的に測定する。測定方法は代謝産物に応じて適切なものを選択すればよいが、例えば、質量分析、液体クロマトグラフィー、免疫学的手法（例えば蛍光免疫測定法（FIA法）、酵素免疫測定法（EIA法））等を採用可能である。
【０１２９】
典型的には、被検物質の代謝産物が検出されたとき、「被検物質が代謝された」と判定ないし評価する。また、代謝産物の量に応じて被検物質の代謝量を評価することができる。代謝産物の検出結果と、被検物質の使用量（典型的には培地への添加量）に基づき、被検物質の代謝効率を算出することにしてもよい。
【０１３０】
腸管オルガノイドにおける薬物代謝酵素（シトクロムP450（特にヒトではCYP3A4、カニクイザルではCYP3A8）、ウリジン2リン酸-グルクロン酸転移酵素（特にUGT1A8、UGT1A10）、硫酸転移酵素（特にSULT1A3など））の発現を指標として被検物質の代謝を測定することも可能である。薬物代謝酵素の発現はmRNAレベル又はタンパク質レベルで評価することができる。例えば、薬物代謝酵素のmRNAレベルに上昇を認めたとき、「遺伝子レベルでの発現量が上昇した」と判定することができる。同様に、薬物代謝酵素の活性に上昇を認めたとき、「被検物質が代謝された」と判定することができる。代謝産物を指標として判定する場合と同様に、薬物代謝酵素の発現量に基づいて定量的な判定・評価を行うことにしてもよい。
【０１３１】
被検物質の吸収を評価するためには、例えば、培養液中の被検物質の残存量を測定する。通常、工程（Ｉ）後の培養液をサンプルとして被検物質を定量する。測定方法は被検物質に応じて適切なものを選択すればよい。例えば、質量分析、液体クロマトグラフィー、免疫学的手法（例えば蛍光免疫測定法（FIA法）、酵素免疫測定法（EIA法））等を採用可能である。典型的には、培養液中の被検物質の含有量の低下を認めたとき、「被検物質が吸収された」と判定・評価する。また、低下の程度に応じて被検物質の吸収量ないし吸収効率を判定・評価することができる。尚、細胞内に取り込まれた被検物質の量を測定することによっても、吸収の評価は可能である。
【０１３２】
尚、代謝の測定・評価と吸収の測定・評価を同時に又は並行して行うことにしてもよい。
【０１３３】
後述の実施例に示す通り、本発明の作製方法で得られた腸管オルガノイドは腸疾患の病態を再現し得る。そこで、本発明の腸管オルガノイドの第２の用途として、腸疾患モデル、その作製方法、及びそれを利用したアッセイ等が提供される。
【０１３４】
本発明の腸管オルガノイドを利用すれば腸疾患モデル、例えば、炎症性腸疾患の病態モデル、炎症性腸疾患の炎症によって進行する組織の線維化を再現する病態モデル（線維化症モデル）、がん病態モデル等を作製し得る。炎症性腸疾患の病態モデルの作製には、例えば、TNF-α、IFN-γ、IL-1、IL-6、IL-17a等の炎症性サイトカイン（一つ又は二以上の組合せ）の存在下で本発明の腸管オルガノイドを培養し、炎症ないし障害を誘導すればよい。免疫細胞との共培養を利用して病態モデルを作製することにしてもよい。一方、線維化症モデルの作製には例えば、TGF-βを用いて、或いはTNF-αとTNF-βを併用して線維化を誘導すればよい。
【０１３５】
腸疾患モデルは薬物スクリーニングに有用である。即ち、腸疾患モデルを用いれば、腸疾患に有効な物質（医薬品の有効成分又はリード化合物）をスクリーニングするためのin vitro評価系を構築することができる。当該評価系では、腸疾患モデルが再現する病態に対する被検物質の作用や影響を調べ、その有効性が評価される。
【０１３６】
本発明の作製方法で得られた腸管オルガノイドの第３の用途として腸管オルガノイドを含む移植材料が提供される。本発明の移植材料は各種腸疾患（例えば難治性炎症性腸疾患）の治療に適用可能である。特に、障害された（機能不全を含む）腸管組織の再生・再建用の材料としての利用が想定される。即ち、再生医療への貢献を期待できる。本発明の移植材料はそのままで、或いはマトリゲルやコラーゲンゲル包埋等の処理をした後、移植材料として利用することができる。また、各種腸疾患病態モデルとしての治療薬候補化合物のスクリーニングや病態メカニズムの解明研究のような利用形態も想定される。細胞の保護を目的としてジメチルスルホキシド（DMSO）や血清アルブミン等を、細菌の混入を阻止することを目的として抗生物質等を、細胞の活性化、増殖又は分化誘導などを目的として各種の成分（ビタミン類、サイトカイン、成長因子、ステロイド等）を本発明の移植材料に含有させてもよい。さらに、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）を本発明の移植材料に含有させてもよい。
【０１３７】
本発明の移植材料はin vivo実験系の構築にも利用可能である。例えば、ヒト多能性幹細胞を用いて作製した腸管オルガノイドを含む移植材料をマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ブタ、カニクイザル、アカゲザル、チンパンジー等の実験動物に移植し、ヒト化動物（ヒト腸管モデル）を作製することができる。このようなヒト化動物は薬物動態や毒性試験等の実験に特に有用であり、経口薬に対する初回通過効果の影響や薬剤性腸炎等の研究への貢献が期待される。
【０１３８】
腸疾患の患者由来のiPS細胞を用いて作製した腸管オルガノイドについては、腸管病態モデルとして、薬剤評価系に利用できる他、腸疾患の発症、病態形成及び／又は進展の機序の解明を目指した研究における各種実験にも利用可能である。
【０１３９】
４．腸管細胞層の用途
本発明の更なる局面は腸管細胞層の用途に関する。腸管細胞層は、腸管オルガノイドと同様、腸管（特に小腸）での薬物動態（吸収、代謝など）の評価や毒性の評価に有用である。腸管細胞層を利用したアッセイは二次元評価系となり、よりハイスループットな解析を可能にする。
【０１４０】
具体的には、本発明の腸管細胞層を用いて被検物質の代謝、吸収性、膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、薬物トランスポーターの誘導、毒性等を試験することができる。即ち、本発明は、腸管細胞層の用途として、被検物質の代謝、吸収性、膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、薬物トランスポーターの誘導、毒性等を評価する方法（第１の態様）を提供する。当該方法では、（ｉ）本発明の腸管細胞層作製方法で得られた腸管細胞層を用意する工程と、（ｉｉ）前記腸管細胞層に被検物質を接触させる工程と、（ｉｉｉ）前記腸管細胞層を透過した被検物質を定量し、被検物質の代謝、吸収性、膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、又は薬物トランスポーターの誘導、或いは毒性を測定・評価する工程を行う。
【０１４１】
工程（ｉ）では、典型的には、腸管オルガノイドから回収した細胞を半透過性膜（多孔性膜）の上で培養することで形成された腸管細胞層を用意する。
【０１４２】
工程（ｉｉ）は、腸管オルガノイドを用いた評価方法の工程（Ｉ）と同様であるため、その説明を省略する
【０１４３】
工程（ｉｉｉ）では、細胞層を透過した被検物質を定量する。例えば、トランズウェル（登録商標）のようなインサートを備えた培養容器を使用した場合には、インサートを透過した被検物質、即ち、細胞層を介して上部もしくは下部容器内に移動した被検物質を、被検物質に応じて、質量分析、液体クロマトグラフィー、免疫学的手法（例えば蛍光免疫測定法（FIA法）、酵素免疫測定法（EIA法））等の測定方法で定量する。定量結果（細胞層を透過した被検物質の量）と被検物質の使用量（典型的には培地への添加量）に基づき、被検物質の代謝、吸収性、膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、又は薬物トランスポーターの誘導、或いは毒性を測定・評価する。尚、この態様の評価方法は、特に被検物質の代謝、吸収性又は膜透過性の評価に有用である。
【０１４４】
本発明は別の態様（第２の態様）として、以下の工程、即ち、（Ｉ）本発明の腸管細胞層作製方法で得られた腸管細胞層に被検物質を接触させる工程と、（ＩＩ）被検物質の代謝若しくは吸収、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、薬物トランスポーターの誘導、又は毒性を測定・評価する工程、を含む評価方法を提供する。
【０１４５】
工程（Ｉ）及び工程（ＩＩ）はそれぞれ、腸管オルガノイドを用いた評価方法の工程（Ｉ）及び工程（ＩＩ）と同様であるため、その説明を省略する。
【０１４６】
本発明の腸管細胞層の第２の用途として、腸疾患モデル、その作製方法、及びそれを利用したアッセイ等が提供される。即ち、腸管オルガノイドと同様、本発明の腸管細胞層を利用すれば腸疾患モデル、例えば、炎症性腸疾患の病態モデル、炎症性腸疾患の炎症によって進行する組織の線維化を再現する病態モデル（線維化症モデル）、がん病態モデル等を作製し得る。各病態モデルの作製方法は腸管オルガノイドの場合に準ずればよい。本発明の腸管細胞層を利用して作製した腸疾患モデルは、腸管オルガノイドの場合と同様、例えば薬物スクリーニングに有用である。
【実施例】
【０１４７】
＜iPS細胞由来の腸管オルガノイドの作製＞
機能的な腸管オルガノイドを作製する新規方法の創出を目指し、以下の検討を行った。尚、二次元培養系（平面培養）がハイスループット解析に有用であることに注目し、作製した腸管オルガノイドから細胞を回収し、病態モデル及び薬物スクリーニングに利用可能な二次元の評価モデルの作製が可能であるかについても検討した。【０１４８】
１．方法
（１）細胞
ヒトiPS細胞（iPS-51：Windy）は、ヒト胎児肺線維芽細胞MRC-5にoctamer binding protein 3/4（OCT3/4）、sex determining region Y-box 2（SOX2）、kruppel-like factor 4（KLF4）、v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog（avian）（c-MYC）を、パントロピックレトロウイルスベクターを用いて導入後、ヒトES細胞様コロニーをクローン化したものであり、国立成育医療研究センター梅澤明弘博士よりご供与いただいた。フィーダー細胞はマウス胎仔線維芽細胞（MEF）を使用した。【０１４９】
（２）培地
MEFの培養には10%ウシ胎仔血清（FBS）、2 mmol/L L-グルタミン（L-Glu）、1%非必須アミノ酸（NEAA）、100 units/mLペニシリンG、100 μg/mLストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を用いた。MEFの剥離液には0.05%トリプシン-エチレンジアミン四酢酸（EDTA）を、MEFの保存液にはセルバンカー1を用いた。ヒトiPS細胞の維持培養には20%ノックアウト血清代替物（KSR）、0.8% NEAA、2 mmol/L L-Glu、0.1 mmol/L 2-メルカプトエタノール（2-MeE）、5 ng/mL線維芽細胞増殖因子（FGF）2を含むDMEM Ham’s F-12（DMEM/F12）を用いた。ヒトiPS細胞の剥離液には1 mg/mLコラゲナーゼIV、0.25%トリプシン、20% KSR、1 mmol/L塩化カルシウムを含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いた。ヒトiPS細胞の保存液には霊長類ES/iPS細胞用凍結保存液を用いた。【０１５０】
（３）ヒトiPS細胞の培養
ヒトiPS細胞はマイトマイシンC処理を施したMEF（6×105 cells/100 mmディッシュ）上に播種し、5% CO2/95% air条件下CO2インキュベーター中37℃にて培養した。ヒトiPS細胞の継代は、3〜5日培養後、1:2〜1:3のスプリット比で行った。ヒトiPS細胞は解凍48時間後に培地を交換し、それ以降は毎日交換した。【０１５１】
（４）ヒトiPS細胞の腸管オルガノイドへの分化
ヒトiPS細胞の腸管オルガノイドへの分化は、継代時にヒトiPS細胞用培地にて30倍に希釈したマトリゲル（成長因子除去）にてコートした培養ディッシュに播種し、35 ng/mL FGF2を含むStemSure（登録商標） hPSC 培地にて培養し、未分化コロニーの占める割合が約80%になった状態で開始した。100 ng/mLアクチビンA、100 units/mLペニシリンG、100 μg/mLストレプトマイシン、2 mmol/L L-Gluを含むロズウェルパーク記念研究所（RPMI）培地で1日間、0.2% FBS、100 ng/mLアクチビンA、100 units/mLペニシリンG、100 μg/mLストレプトマイシン、2 mmol/L L-Gluを含むRPMI培地で1日間、2% FBS、100 ng/mLアクチビンA、100 units/mLペニシリンG、100 μg/mLストレプトマイシン、2 mmol/L L-Gluを含むRPMI培地で1日間培養することで内胚葉に分化させた。その後、2% FBS、500 ng/mL FGF4、3 μmol/L CHIR99021、100 units/mLペニシリンG、100 μg/mLストレプトマイシンを含むRPMI+グルタマックス培地で4日間培養することで腸管幹細胞へ分化させた。FGF4、CHIR99021処理後、Y-27632（Rho結合キナーゼ阻害剤）を10 μmol/Lとなるように添加し、5% CO2/95% air条件下CO2インキュベーター中37℃にて60分間処理した細胞を0.05%トリプシン-EDTAにて剥離し、40 μmナイロンメッシュのセルストレーナーにて細胞塊を砕き、PBS（-）にて0.16 μg/mLに希釈した iMatrix 511 silkをコーティングした100 mm dish 上に2.0×106細胞を播種した。細胞は、1% グルタマックス、10% KSR、100 units/mLペニシリンG、100 μg/mLストレプトマイシン、100 ng/mL上皮成長因子（EGF）、30 ng/mL FGF2、0.5 μmol/L A-83-01、3 μmol/L CHIR99021、10 μmol/L Y-27632を含むAdvanced-DMEM/F12で培養した。その後、2日毎に、最大2回、細胞をアキュターゼにて剥離し、PBS（-）にて0.16 μg/mLに希釈した iMatrix 511 silkをコーティングした100 mm dish上に2.0×106細胞を播種した。細胞は、1% グルタマックス、10% KSR、100 units/mLペニシリンG、100 μg/mLストレプトマイシン、100 ng/mL上皮成長因子（EGF）、30 ng/mL FGF2、0.5 μmol/L A-83-01、3 μmol/L CHIR99021、10 μmol/L Y-27632を含むAdvanced-DMEM/F12で培養した。2あるいは3日後、同様に剥離した後、3.0×106細胞を100 mm EZSPHERE（登録商標）上に播種した。その後、1% グルタマックス、2% B27 supplement、1% N2 supplement、100 units/mLペニシリンG、100 μg/mLストレプトマイシン、100 ng/mL EGF、100 ng/mL Noggin、200 ng/mL R-spondin-1、10 μmol/L Y-27632を含むAdvanced-DMEM/F12で2日間培養後、1% グルタマックス、2% B27 supplement、1% N2 supplement、100 units/mLペニシリンG、100 μg/mLストレプトマイシン、100 ng/mL EGF、100 ng/mL Noggin、200 ng/mL R-spondin-1、成長因子を除去したマトリゲル3%を含むAdvanced-DMEM/F12で21日間超低接着100 mm dish上で浮遊培養することで腸管オルガノイドへ分化させた。以下の実験では、分化誘導7日目にてEZSPHERE（登録商標）上に細胞を播種し、腸管オルガノイドを形成した群をコントロール群とした。尚、以上の培養方法（分化プロトコール）の概要を図９に示す。【０１５２】
分化誘導終了34日目から炎症性腸疾患モデルの作製および線維化モデルを作製するため96時間30 ng/mL TNF-αもしくは48時間30 ng/mL TNF-α＋2 ng/mL TGF-βをそれぞれ添加した。また、これらの反応を抑制するため、炎症性腸疾患モデルでは抗TNF-α抗体である100 ng/mLインフリキシマブを、線維化モデルではTGF-β阻害剤である20 μM SB431542、もしくは20 μM Repsoxをそれぞれ同じ時間添加した。尚、腸管オルガノイドの高機能化を目指し、分化誘導19日目から分化誘導終了までPD98059、5-アザ-2’-デオキシシチジン、A-83-01およびN-[(3,5-difluorophenyl) acetyl]-L-alanyl-2-phenyl-1,1-dimethylethyl ester-glycine (DAPT)を添加した場合の効果も検討した。【０１５３】
（５）腸管オルガノイドのトランズウェル（登録商標）およびマルチウェルプレートへの継代および平面培養
低分子化合物（PD98059、5-アザ-2’-デオキシシチジン、A-83-01、DAPT）を非添加の条件、又は低分子化合物（PD98059、5-アザ-2’-デオキシシチジン、A-83-01、DAPT）を添加の条件で腸管オルガノイドへ、もしくは新規培養法に依り作製した高機能腸管オルガノイド（１９〜３４日間培養したもの）に対してY27632を10 μmol/Lとなるように添加し、5% CO2/95% air条件下CO2インキュベーター中37℃にて24時間処理した細胞を細胞剥離液（0.05%トリプシン-EDTA）にて剥離し、40 μmナイロンメッシュのセルストレーナーにて細胞塊を砕いた。iMatrix 511 silkをコーティングしたトランズウェル（登録商標）インサートもしくはマルチウェルプレート上に3.0×105cells/cm2の濃度で細胞を播種した。播種後24時間Y-27632（10 μM）で処理した。その後、培地７（図９参照）で6〜14日間培養した。培養の際、様々な化合物を添加し、最適な条件を探索した。【０１５４】
（６）総リボ核酸（RNA）抽出
総RNAはヒトiPS細胞の分化誘導終了後、Agencourt RNAdvence Tissueの添付マニュアルに従い抽出した。【０１５５】
（７）逆転写反応
相補的DNA（cDNA）の合成は、ReverTra Ace qPCR RT Master Mixを使用し、添付マニュアルに従い行った。【０１５６】
（８）Real-Time RT-PCR法
Real-Time RT-PCRはKAPA SYBR Fast qPCR Kitを用い、cDNAを鋳型にして、反応は添付マニュアルに従い行った。結果は内在性コントロールとしてヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPRT）を用いて補正した。【０１５７】
（９）ヘマトキシリン−エオシン（HE）染色及びアルシアンブルー染色
分化誘導終了後、腸管オルガノイドを4%パラホルムアルデヒドにて固定し、OCTコンパウンドにて凍結包埋した。厚さ10μmの凍結切片を作製後、スライドガラスに貼り付け、HE染色では、マイヤーヘマトキシリン及びエオシンアルコールを使用して染色した。アルシアンブルー染色では、pH2.5におけるアルシアンブルーを染色し、核染色としてヌクレアファストレッドを使用した。【０１５８】
（１０）免疫蛍光染色
分化誘導終了後、腸管オルガノイドを4%パラホルムアルデヒドにて固定し、OCTコンパウンドにて凍結包埋した。厚さ10μmの凍結切片を作製後、スライドガラスに貼り付け、抗原の賦活化を行った。5% FBS溶液にて30分間ブロッキングし、一次抗体を4℃で1晩反応させた。その後、スライドガラスを洗浄し、二次抗体を室温で1時間反応させ、核染色として4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）を用いた。封入作業を行い、Zeiss LSM510共焦点レーザー顕微鏡を用いて、蛍光を観察した。【０１５９】
本検討で使用したマーカー遺伝子の特徴を以下に示す。
α-SMA（alpha-smooth muscle actin。平滑筋マーカー）
ABCB1/P-gp（ATP結合カセットトランスポーターB1/多剤耐性タンパク1、P糖タンパク質。排出トランスポーター）
ABCG2/BCRP（ATP結合カセットトランスポーターG2/乳ガン耐性タンパク。排出トランスポーター）
APOB（アポリポタンパク質B。小腸で主に合成され、小腸からの脂質吸収に必須な役割を担う）
APOC3（アポリポタンパク質C3。小腸で主に合成され、小腸からの脂質吸収に必須な役割を担う）
BRACHYURY（Tボックスとよばれる新規のDNA結合ドメインをもつ転写制御因子をコードし、後方中胚葉の形成に重要）
Caspase-3（Cas）（カスパーゼ3。アポトーシスの実行に関わるタンパク質）
CD34（細胞表面糖タンパク質。中胚葉系に由来する造血、血管内皮前駆細胞マーカー）
CDX2（Caudal-type ホメオボックス2。腸管上皮細胞の増殖・分化に関与している転写因子）
ChromograninA（CHGA）（分泌顆粒中に存在する特異的なタンパク質。腸管内分泌細胞マーカー）
Collagen type 1（colla-1）（細胞外マトリックスの主成分。線維性コラーゲン）
CYP3A4（腸管における主要な薬物代謝酵素）
E-cadherin（E-cad）（上皮カドヘリン。細胞表面に存在する糖タンパク質の一群で、細胞接着をつかさどる分子）
Fibronectin（フィブロネクチン。巨大な糖タンパク質で、細胞接着分子として機能）
FLK1（KDR 活性型キナーゼ。早期中胚葉マーカー）
HOXA13（動物の胚発生の初期において組織の前後軸および体節制を決定する遺伝子HOX。結腸特異的マーカー）
ISX（腸管特異的ホメオボックス。腸管上皮化生や細胞増殖に関与）
LGR5（ロイシンリッチリピートを含むGタンパク質共役型受容体。腸管幹細胞のマーカー）
Lysozyme（Lyso）（真正細菌の細胞壁を構成する多糖類を加水分解する酵素。腸管パネート細胞マーカー）
MUC2（ムチン2糖タンパク。杯細胞マーカー）
Occludin（オクルディン。タイトジャンクション（密着結合）の形成に関わる主要なタンパク質）
SATB2（結腸、直腸上皮細胞に特異的に発現するタンパク質）
SLC15A1/PEPT1（SLC（solute carrier）ファミリー メンバー15A1/ペプチドトランスポーター1。小腸の頂側膜側に発現している）
Villin（ビリン。微絨毛の主要な構成成分。吸収上皮細胞マーカー）
Vimentin（Vim）（ビメンチン。間葉系細胞に特有の中間径フィラメント）
ZO-1（密着結合の形成に関わる主要なタンパク質）【０１６０】
２．結果・考察
（１）新規腸管オルガノイド作製法による腸管オルガノイドの形態
分化誘導開始から34日後の腸管オルガノイドの形態を観察したところ、コントロール群では、sphericalな構造をしていた（図１Ａ）。継代処理した腸管オルガノイドでは、絨毛−クリプト様構造を有するbuddingな構造をしていた（図１Ｂ、Ｃ）。継代培養時にGSK3阻害剤としてCHIR99021を使用しているが、他6種のGSK3阻害剤を用いて腸管オルガノイドを作製した。全てのGSK3阻害剤処理をした腸管オルガノイドにおいて、絨毛−クリプト様構造を有するbuddingな構造を確認した（図１Ｄ〜Ｉ）。【０１６１】
（２）新規腸管オルガノイド作製法による腸管オルガノイドの遺伝子発現
分化誘導開始から34日後の腸管オルガノイドの遺伝子発現をコントロール群および成人小腸と比較したところ、吸収上皮細胞マーカーであるvillin、杯細胞マーカーであるMUC2や腸管特異的転写因子であるCDX2、ISXの発現は継代操作を行うことで、非常に高い発現を示した。一方、パネート細胞マーカーであるlysozymeや腸管内分泌細胞マーカーであるchromogranin Aの発現はコントロール群と同程度であった（図２）。【０１６２】
（３）新規腸管オルガノイド作製法による腸管オルガノイドの形態学的解析
HE染色やアルシアンブルー染色の結果から、腸管オルガノイドは分泌細胞を含む細胞集団であることが分かった（図３Ａ、Ｂ）。また、免疫蛍光染色により、腸管を構成している様々な細胞（吸収上皮細胞、腸管幹細胞、杯細胞、腸管内分泌細胞、パネート細胞、間葉系細胞）のマーカーの発現が認められた（図３Ｃ）。したがって、腸管オルガノイドはこれらの細胞を含む腸管組織類似体であることが示唆された。【０１６３】
（４）新規腸管オルガノイド作製法による腸管オルガノイドの特徴
腸管オルガノイドでは、小腸マーカーであるAPOB、APOC3の発現が非常に高く、結腸マーカーであるHOXA13、SATB2の発現が低かった（図４）。以上の結果から、腸管オルガノイドは小腸に近い特徴を有している可能性が示唆された。【０１６４】
（５）新規腸管オルガノイド作製法による腸管オルガノイドの薬物トランスポーターの遺伝子発現解析および免疫蛍光染色
トランスポーターであるPEPT1遺伝子発現は成人小腸に近い値を示したが、P-gpの発現はやや低かった（図５Ａ）。免疫蛍光染色の結果から、タイトジャンクションタンパク質であるoccludinやZO-1、薬物トランスポーターであるPEPT1やBCRPの発現は腸管オルガノイドの管腔に沿って局在していることが確認された（図５Ｂ）。以上の結果から、小腸で発現する薬物トランスポーターが確認され、さらに、腸管オルガノイドの管腔側が刷子縁膜側に相当することが示唆された。また、形態学的な観察により、腸管オルガノイドは絨毛様構造を有していることが示唆された。【０１６５】
（６）新規腸管オルガノイド作製法は中胚葉系の分化誘導を抑制した
分化誘導時のEZSPHEREへ播種する直前のそれぞれの細胞の状態について、mRNA発現を解析した。その結果、腸管特異的転写因子であるCDX2の発現は、継代操作や培地5の影響によらず同程度であったが、中胚葉系マーカーであるBRACHYURY、CD34、FLK1の発現は培地5を用いて培養することで下がり、さらに継代操作を行うことでその発現はさらに減少した（図６）。以上の結果から、培地5と継代操作を合わせて行うことで、選択的に腸管へと分化方向が誘導される可能性が示唆された。【０１６６】
（７）腸管オルガノイドを用いた炎症性腸疾患モデルの作製
新規分化誘導法による腸管オルガノイドを用いて、炎症性腸疾患モデルが作製可能か検討するため、主要な要因とされている炎症性サイトカインであるTNF-αを分化誘導終了34日目から96時間添加した（図７Ａ）。TNF-αを添加することでvillin、MUC2の遺伝子発現が減少し、TNF-αの発現は増加した。また、その発現変動は抗TNF-α抗体であるインフリキシマブにより抑制された（図７Ｂ）。次に、免疫蛍光染色にて、タイトジャンクションタンパク質およびアポトーシスマーカーの発現を確認した。TNF-αを添加することでタイトジャンクション構造が崩れている様子が観察された。また、Caspase-3陽性細胞数も増加していた。さらに、これらの変化はインフリキシマブ添加群では認められなかった（図７Ｃ）。炎症性腸疾患では、生体内で、炎症性サイトカイン等の影響により、腸管上皮細胞が障害を受けることで、タイトジャンクションが崩れ、粘液分泌細胞である杯細胞が減少することが報告されている。したがって、TNF-α添加により、in vitro評価系において、簡便に炎症性腸疾患の病態モデルを作製でき、薬物スクリーニングにも利用可能である可能性が示唆された。【０１６７】
（８）腸管オルガノイドを用いた線維化モデルの作製
炎症性腸疾患において慢性的に引き起こされる炎症によって進行する組織の線維化をin vitroで再現するため、主要な要因とされているTNF-αとTGF-βを分化誘導終了34日目から48時間添加した（図８Ａ）。TNF-αとTGF-βを添加することで、線維化マーカーであるα-SMA、vimentin、fibronectin、collagen type 1のmRNA発現が増加した。一方、上皮細胞マーカーであるE-cadherinの発現は減少した。さらに、これら線維化マーカーの発現変動は、TGF-β阻害剤であるSB431542とRepsoxにより抑制された（図８Ｂ）。以上の結果から、TNF-αとTGF-βの添加により、線維化症モデルの作製が可能であることが示唆された。また、線維化マーカーが増加し、上皮細胞マーカーが減少したことから線維化に関わる上皮間葉転換を再現できる可能性が示唆された。【０１６８】
（９）腸管オルガノイドへの低分子化合物添加の効果
信頼性や正確性がより高い薬物スクリーニング系等への利用に向け、より生体の機能に近い、即ち高機能な腸管オルガノイドを作製するため、分化に効果的であると考えられる低分子化合物を添加して培養を行った。その結果、CYP3A4やMUC2などのmRNAの発現上昇が認められた（図１０）。【０１６９】
（１０）ハイスループット解析へ応用可能な新規平面培養系の作製
病態モデルや薬物スクリーニングにより適した平面培養系を作製するため、腸管オルガノイドから回収した細胞をトランズウェル（登録商標）インサートに播種して細胞層を形成させ、その特性を検討した。腸管オルガノイド作製時に低分子化合物（PD98059、5-アザ-2’-デオキシシチジン、A-83-01、DAPT）を添加しなかった群において、いくつかの培養パターンで膜抵抗値の上昇及び安定が認められた（図１１Ｂ）。低分子化合物添加群においてはすべてのパターンにおいて膜抵抗値の上昇が確認されなかった。ある程度の膜抵抗値の上昇が認められた4つの群においてmRNAの発現量を測定した。フォルスコリンを単独で、又はDAPT若しくはCHIR99021と組み合わせて添加した群において腸管マーカーであるCDX2や腸管幹細胞マーカーであるLGR5が高発現し、CYP3A4やMUC2の発現も確認された（図１１Ａ）。以上より、作製した平面培養系は薬物スクリーニングに有用であるといえる。また、フォルスコリン、DAPT、CHIR99021の添加により、さらなる機能の向上も見込めることが示唆された。尚、膜抵抗値の顕著な上昇を認めた条件、即ち、フォルスコリンとDAPTの併用は高機能化に特に有効といえる。【０１７０】
（１１）新規平面培養系を用いたCYP3A4の誘導試験
作製した新規平面培養系において、腸管で主要な代謝酵素であるCYP3A4の誘導試験を行った。q PCRでmRNA発現量を比較し薬物応答性を評価した。リファンピシンを処理することで約900倍、活性型ビタミンD3を処理することで約1700倍CYP3A4のmRNA発現量が上昇した（図１２）。この結果は、作製した新規平面培養系ではPXRおよびVDRを介して代謝酵素が誘導されることを示唆する。【０１７１】
（１２）絨毛様構造を有する平面培養系の作製
平面培養開始から24時間以上経過後、インサートの下側（ウェル）のみに培地を加えて気液培養を行った。さらにcAMPシグナルを活性化し、分化誘導の促進を試みた。培地は培地７に低分子化合物を添加したものを使用し、cAMPシグナルを活性化する因子としてはフォルスコリン、8-bromo-cAMP（8-Br-cAMP）及び3-isobutyl-1-methylxanthine（IBMX）を使用した。気液培養を行い、cAMPシグナルを活性化することで絨毛様構造を有する平面培養系の作製に成功した（図１３Ｂ−Ｆ）。また、TGF-β阻害剤であるA 83-01を添加しないとき絨毛様構造の形成は見られなかった（図１３Ａ）。これらの結果から、平面培養系における組織様構造の構築にcAMPシグナルやTGF-βシグナルが強く関与していると示唆された。【０１７２】
３．結論
以上の結果より、本研究では、ヒトiPS細胞から、より生体小腸に近い特徴を有するbuddingな腸管オルガノイドの作製に成功した。作製した腸管オルガノイドでは、腸管マーカーおよび薬物トランスポーターともに成人小腸に近い遺伝子発現を示した。作製した腸管オルガノイドは絨毛−クリプト様構造を有していることが示唆された。また、EZSPEHREと浮遊培養により、均一な腸管オルガノイドの大量培養に成功した。一方、炎症性腸疾患や線維化モデルをそれぞれ疾患の要因となっている主要なサイトカインを添加することで作製でき、これら病態に対する薬物スクリーニング系としても有用である可能性が示唆された。また、作製した腸管オルガノイドを平面培養に移すことで、よりハイスループット解析に有用なモデルを作製できると示唆された。更に、気液培養を行うことにより、絨毛構造を有する高機能な評価系の構築に成功した。この評価系は社会的利用に向けた利便性と評価系としての機能を両立しており、創薬研究、食品関連研究、腸内細菌叢との共培養研究、腸管細胞感染研究等において非常に有用であると考えられる。【０１７３】
＜浮遊培養条件の検討＞
分化促進及びより高い機能の獲得、並びに異種動物由来成分を使用しない培養系の構築を目指し、腸管オルガノイドを作製する際、マトリゲルの代替として多糖類ポリマーを使用した培地を用いて浮遊培養を行った。【０１７４】
１．方法
（１）細胞
ヒトiPS細胞（iPS-51：Windy）は、ヒト胎児肺線維芽細胞MRC-5にoctamer binding protein 3/4（OCT3/4）、sex determining region Y-box 2（SOX2）、kruppel-like factor 4（KLF4）、v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog（avian）（c-MYC）を、パントロピックレトロウイルスベクターを用いて導入後、ヒトES細胞様コロニーをクローン化したものであり、国立成育医療研究センター梅澤明弘博士よりご供与いただいた。フィーダー細胞はマウス胎仔線維芽細胞（MEF）を使用した。【０１７５】
（２）培地
MEFの培養には10%ウシ胎仔血清（FBS）、2 mmol/L L-グルタミン（L-Glu）、1%非必須アミノ酸（NEAA）、100 units/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を用いた。MEFの剥離液には0.05%トリプシン-エチレンジアミン四酢酸（EDTA）を、MEFの保存液にはセルバンカー1を用いた。ヒトiPS細胞の維持培養には20%ノックアウト血清代替物（KSR）、0.8% NEAA、2 mmol/L L-Glu、0.1 mmol/L 2-メルカプトエタノール（2-MeE）、5 ng/mL線維芽細胞増殖因子（FGF）2を含むDMEM Ham’s F-12（DMEM/F12）を用いた。ヒトiPS細胞の剥離液には1 mg/mLコラゲナーゼIV、0.25%トリプシン、20% KSR、1 mmol/L塩化カルシウムを含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いた。ヒトiPS細胞の保存液には霊長類ES/iPS細胞用凍結保存液を用いた。【０１７６】
（３）ヒトiPS細胞の培養
ヒトiPS細胞はマイトマイシンC処理を施したMEF（6×105 cells/100 mmディッシュ）上に播種し、5% CO2/95% air条件下CO2インキュベーター中37℃にて培養した。ヒトiPS細胞の継代は、3〜5日培養後、1:2〜1:3のスプリット比で行った。ヒトiPS細胞は解凍48時間後に培地を交換し、それ以降は毎日交換した。【０１７７】
（４）ヒトiPS細胞の腸管オルガノイドへの分化
ヒトiPS細胞の腸管オルガノイドへの分化は、継代時にヒトiPS細胞用培地にて30倍に希釈した、成長因子を除去したマトリゲルをコートした培養ディッシュに播種し、35 ng/mL FGF2を含むStemSure（登録商標） hPSC 培地にて培養した。未分化コロニーの占める割合が約80%になった状態で開始した。100 ng/mLアクチビンA、100 units/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシン、2 mmol/L L-Gluを含むロズウェルパーク記念研究所（RPMI）培地で1日間、0.2% FBS、100 ng/mLアクチビンA、100 units/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシン、2 mmol/L L-Gluを含むRPMI培地で1日間、2% FBS、100 ng/mLアクチビンA、100 units/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシン、2 mmol/L L-Gluを含むRPMI培地で1日間培養することで内胚葉に分化させた。その後、2% FBS、500 ng/mL FGF4、3μmol/L CHIR99021、100 units/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシンを含むRPMI＋グルタマックス培地で4日間培養することで腸管幹細胞へ分化させた。FGF4、CHIR99021処理後、Y-27632（Rho結合キナーゼ阻害剤）を10μmol/Lとなるように添加し、5% CO2/95% air条件下CO2インキュベーター中37℃にて60分間処理した細胞を0.05%トリプシン-EDTAにて剥離し、40μmナイロンメッシュのセルストレイナーにて細胞塊を砕き、3.0×106細胞を100 mm EZSPHERE（登録商標）上に播種した。その後、2 mmol/L L-Glu、2% B27 supplement、1% N2 supplement、100 units/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシン、100 ng/mL上皮成長因子（EGF）、100 ng/mL Noggin、200 ng/mL R-spondin-1、10μmol/L Y-27632を含むAdvanced-DMEM/F12で3日間培養後、2 mmol/L L-Glu、2% B27 supplement、1% N2 supplement、100 units/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシン、100 ng/mL EGF、100 ng/mL Noggin、200 ng/mL R-spondin-1、成長因子を除去したマトリゲル3%もしくは多糖類ポリマー（脱アシル化ジェランガム）を含むAdvanced-DMEM/F12で24日間超低接着6ウェルプレート上で浮遊培養することで腸管オルガノイドへ分化させた。また、分化開始19日目から34日目まで、以前我々が見出した低分子化合物であるPD98059（20μmol/L）、5-アザ-2’-デオキシシチジン（5μmol/L）、A-83-01（0.5μmol/L）に加え、5μmol/L N-[(3,5-ジフルオロフェニル) アセチル]-L-アラニル-2-フェニル-1, 1-ジメチルエチルエステル-グリシン（DAPT）を添加した。薬物代謝酵素の誘導剤処理は、2 mmol/L L-Glu、2% B27 supplement、1% N2 supplement、100 units/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシン、100 ng/mL EGF、100 ng/mL Noggin、200 ng/mL R-spondin-1、成長因子を除去したマトリゲル3%もしくは多糖類ポリマー（脱アシル化ジェランガム）を含むAdvanced-DMEM/F12に1α,25-ジヒドロキシビタミンD3（VD3）を1μmol/Lとなるよう添加し、回収前72時間培養することで行った。多糖類ポリマーは日産化学工業株式会社よりご供与いただいたFP001もしくはFP003を培地中濃度0.015%（w/v）で使用し、腸管オルガノイドへの分化に及ぼす影響について検討した。【０１７８】
（５）総リボ核酸（RNA）抽出
総RNAはヒトiPS細胞の分化誘導終了後、Agencourt RNAdvence Tissueの添付マニュアルに従い抽出した。【０１７９】
（６）逆転写反応
相補的DNA（cDNA）の合成は、ReverTra Ace qPCR RT Master Mixを使用し、添付マニュアルに従い行った。【０１８０】
（７）Real-Time RT-PCR法
Real-Time RT-PCRはKAPA SYBR Fast qPCR Kitを用い、cDNAを鋳型にして、反応は添付マニュアルに従い行った。結果は内在性コントロールとしてヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPRT）を用いて補正した。【０１８１】
（８）ヘマトキシリン−エオシン（HE）染色
分化誘導終了後、腸管オルガノイドを4％パラホルムアルデヒドにて固定し、OCTコンパウンドにて凍結包埋した。厚さ10μmの凍結切片を作製後、スライドガラスに貼り付け、マイヤーヘマトキシリン及びエオシンアルコールを使用して染色した。【０１８２】
（９）免疫蛍光染色
分化誘導終了後、腸管オルガノイドを4％パラホルムアルデヒドにて固定し、OCTコンパウンドにて凍結包埋した。厚さ10μmの凍結切片を作製後、スライドガラスに貼り付け、抗原の賦活化を行った。5% FBS溶液にて30分間ブロッキングし、一次抗体を4℃で1晩反応させた。その後、スライドガラスを洗浄し、二次抗体を室温で1時間反応させ、核染色として4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）を用いた。封入作業を行い、Zeiss LSM510共焦点レーザー顕微鏡を用いて、蛍光を観察した。【０１８３】
（１０）ローダミン123の輸送実験
分化誘導終了後、腸管オルガノイドをローダミン123を含むHBSSで37℃にてインキュベーションした。HBSSは、137 mmol/L塩化ナトリウム、5.4 mmol/L塩化カリウム、0.81 mmol/L硫酸マグネシウム、0.44 mmol/Lリン酸二水素カリウム、0.34 mmol/Lリン酸水素二ナトリウム、1.3 mmol/L塩化カルシウム、4.2 mmol/L炭酸水素ナトリウム、5.6 mmol/L D-グルコース、10 mmol/L HEPESを含むpH 7.4のものを用いた。インキュベーション終了後、氷冷したPBSで細胞を洗浄することにより取り込みを停止させた。37℃に温めたPBSにて4時間インキュベーションすることにより、ローダミン123をオルガノイド外に放出させた。その後、Synergy HTX マイクロプレートリーダーを用いて上清の蛍光強度を測定した。輸送実験終了後、タンパク定量を行い、蛍光強度をタンパク量で補正した。【０１８４】
（１１）ヘキスト33342の輸送実験
分化誘導終了後、腸管オルガノイドをヘキスト33342を含むHBSSで37℃にてインキュベーションした。インキュベーション終了後、氷冷したPBSで細胞を洗浄することにより取り込みを停止させた。37℃に温めたPBSにて4時間インキュベーションすることにより、ヘキスト33342をオルガノイド外に放出させた。その後、Synergy HTX マイクロプレートリーダーを用いて上清の蛍光強度を測定した。輸送実験終了後、タンパク定量を行い、蛍光強度をタンパク量で補正した。【０１８５】
（１２）薬物代謝実験
分化誘導終了後、腸管オルガノイドを5μmol/Lミダゾラムを含む培地（2 mmol/L L-Glu、2% B27 supplement、1% N2 supplement、100 units/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシンを含むAdvanced-DMEM/F12）で37℃にてインキュベーションし、24時間経過後、培地をサンプリングした。代謝活性は、液体クロマトグラフィー-マススペクトロメーター（LC-MS/MS）を用いて測定した培地中の1-水酸化ミダゾラムの量より算出した。代謝実験終了後、タンパク定量を行い、代謝活性をタンパク量で補正した。【０１８６】
本検討では、以下のマーカー遺伝子、即ち、α-SMA、ABCB1/MDR1、ABCG2/BCRP、CDX2、Chromogranin A、CYP3A4、E-cad（E-cadherin）、Ki67（G1 期、S 期、G2 期、M 期にある細胞に発現。増殖細胞マーカー）、LGR5、Lysozyme、MUC2、Occludin、OLFM4、PXR（プレグナンX受容体。CYP3A4などの転写調節に関与する核内受容体）、Sucrase-isomaltase（膜貫通II型糖タンパク質。腸の上皮細胞の刷子縁に発現している）、SLC15A1/PEPT1、Villin、Vim（Vimentin）を使用した。【０１８７】
２．結果・考察
（１）多糖類ポリマーを用いたヒト腸管オルガノイドへの分化誘導
ヒトiPS細胞から腸管オルガノイドへの分化誘導の際に添加する多糖類ポリマーの影響について調べた。その結果、FP001およびFP003を添加した群で腸管関連遺伝子やCYP3A等をはじめとする様々な薬物動態関連遺伝子のmRNA発現量が増加した。特にFP001を加えた群で成長因子を除去したマトリゲル3％を加えたコントロール群に比べ、腸管での主要な薬物代謝酵素であるシトクロムP450（CYP）3A4で3.7倍、ペプチドの取り込みトランスポーターであるSLC15A1/PEPT1で4.1倍、排出トランスポーターであるABCB1/MDR1で4.5倍、など多くの薬物動態関連遺伝子のmRNA発現が上昇した。また、腸管を構成している細胞マーカーであるVillin（吸収上皮細胞）、sucrase-isomaltase（上皮細胞の刷子縁）、MUC2（杯細胞）、LGR5（腸管幹細胞）はコントロール群に比べ、同程度もしくはそれ以上のmRNA発現を示した。（図１４）。【０１８８】
（２）多糖類ポリマーを用いて分化誘導したヒト腸管オルガノイドの形態学的観察
マトリゲル及び多糖類ポリマーを用いて分化誘導したヒトiPS細胞由来腸管オルガノイドは球状の形をしていた（図１５Ａ−Ｃ）。HE染色の結果から、多糖類ポリマーを用いて分化誘導したヒト腸管オルガノイドにおいても管腔が確認された（図１５Ｄ−Ｆ）。【０１８９】
（３）多糖類ポリマーを用いて分化誘導したヒト腸管オルガノイドの免疫蛍光染色
免疫蛍光染色により、腸管を構成している様々な細胞（吸収上皮細胞、腸管幹細胞、杯細胞、腸管内分泌細胞、パネート細胞、間葉系細胞）および排出トランスポーターやタイトジャンクションのマーカーの発現が認められた（図１６）。したがって、腸管オルガノイドはこれらの細胞を含む腸管組織類似体であることが示唆された。【０１９０】
（４）多糖類ポリマーを用いて分化誘導したヒト腸管オルガノイドのローダミン123を用いたABCB1/MDR1の機能評価
排出トランスポーターであるABCB1/MDR1の基質であるローダミン123および阻害剤であるベラパミルを用いて、ABCB1/MDR1の機能評価を行った。ローダミン123の腸管オルガノイド内への排出が認められ、その排出方向の輸送はベラパミルにより抑制された（図１７）。このことから、多糖類ポリマーを用いて分化誘導したヒト腸管オルガノイドは、ABCB1/MDR1の機能を有していることが示唆された。【０１９１】
（５）多糖類ポリマーを用いて分化誘導したヒト腸管オルガノイドのヘキスト33342を用いたABCG2/BCRP の機能評価
排出トランスポーターであるABCG2/BCRPの基質であるヘキスト33342および阻害剤であるKo143を用いて、ABCG2/BCRPの機能評価を行った。ヘキスト33342の腸管オルガノイド内への排出が認められ、その排出方向の輸送はKo143により抑制された（図１８）。このことから、多糖類ポリマーを用いて分化誘導したヒト腸管オルガノイドは、ABCG2/BCRPの機能を有していることが示唆された。【０１９２】
（６）多糖類ポリマーを用いて分化誘導したヒト腸管オルガノイドのCYP3A4誘導能
CYP3Aの誘導剤である1α,25-ジヒドロキシビタミンD3（VD3）を用いて、CYP3A4のmRNA発現誘導について検討を行った。コントロール群に比べ、VD3添加群で有意にCYP3A4のmRNA発現が誘導された（図１９Ａ）。また、VD3添加群において、有意にミダゾラムの代謝活性が上昇し（図１９Ｂ）、CYP3A4のタンパク質レベルでの誘導が認められた。このことから、多糖類ポリマーを用いて分化誘導したヒト腸管オルガノイドではCYP3A4の薬物応答性を有していることが示唆された。【０１９３】
（７）多糖類ポリマーを用いて分化誘導したヒト腸管オルガノイドのCYP3A4代謝活性
CYP3A4の基質であるミダゾラムとその阻害剤であるケトコナゾールを用いて、CYP3A4の代謝活性を評価した。ヒト腸管オルガイドにおいて、ミダゾラムの代謝活性が認められ、その活性はケトコナゾールの添加により有意に阻害された（図２０）。したがって、多糖類ポリマーを用いて分化誘導したヒト腸管オルガノイドでは、CYP3A4の代謝能を有していることが示唆された。【０１９４】
３．結論
以上の結果より、本研究では、ヒトiPS細胞から腸管オルガノイドへの分化において有用な浮遊剤（粘性材料）を新たに見出すことができた。また、この方法によって作製した腸管オルガノイドは、排出トランスポーターの輸送機能に加え、薬物代謝酵素活性および誘導能を有するなど、腸管に特徴的な様々な薬物動態学的機能を有していることが明らかとなった。さらに、FP001およびFP003は多糖類のポリマーであり異種動物由来成分を含まないため、腸管オルガノイドを再生医療に用いる際に使用する培養材料として極めて有用であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１９５】
本発明は、生体腸管構造に近い構造の腸管オルガノイドの作製を可能にする。本発明で採用する因子の組合せは安価でロット間差の少ない低分子化合物である。この特徴は実用性の点において極めて重要であり、本発明によれば、腸管オルガノイドの作製コストの低減、腸管オルガノイドの品質及び信頼性の向上等がもたらされる。本発明によって作製されたbuddingな腸管オルガノイドには様々な用途への適用を期待できる。例えば、in vitro評価系（薬効、毒性、薬物動態の評価）、難治性炎症腸疾患等の腸管病態モデルの作製及びそれを用いた病態機序の解明、生体（ヒト、実験動物等）への移植に利用され得る。【０１９６】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１４−４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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