(57)【要約】  本発明は、細胞足場としてのファイバーシート上で神経細胞を培養することにより、神経ネットワークの機能的成熟化を促進する方法を提供する。
2020013269.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞足場を用いて神経細胞を培養することを含む、神経ネットワークを機能的に成熟化させる方法。
【請求項２】
前記細胞足場が高分子材料で形成されたファイバーシートである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ファイバーシートが、配向性構造、非配向性構造または配向性と非配向性との混合構造を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ファイバーシートが、ポリリジン、ポリオルニチン、ラミニン、フィブロネクチン、マトリゲル（登録商標）およびゲルトレックス（登録商標）から選ばれる細胞外マトリックスタンパク質でコーティングされた、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記ファイバーシートが、ポリエチレンイミンでコーティングされた、請求項２または３に記載の方法。
【請求項６】
前記神経細胞が、細胞足場上および／または細胞足場内で３次元構造を形成した、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記神経細胞が、初代培養細胞または多能性幹細胞由来の神経細胞である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記初代培養細胞または前記多能性幹細胞由来の神経細胞が、哺乳類由来の神経細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記神経細胞が、グルタミン酸作動性、ドーパミン作動性、γ-アミノ酪酸作動性、モノアミン作動性、ヒスタミン作動性またはコリン作動性の神経細胞を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法を使用して機能的に成熟化させた神経細胞を用いる、神経活動の評価方法。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法を使用して機能的に成熟化させた神経細胞を微小電極アレイと接触させ、該神経細胞の細胞外電位を測定することを含む、神経活動の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経細胞を培養することにより得られる神経ネットワークの機能的成熟化を促進する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品開発における安全性評価において、神経毒性は、心毒性や肝毒性と並び、医薬品開発が中止される主な原因の一つである。そのため、医薬品開発の初期段階から的確な神経毒性評価が必要であるが、非臨床試験における神経毒性の評価は、動物実験による症状観察や脳の病理組織評価などのin vivo評価系が主体であり、より簡便なin vitroで神経毒性を評価する系は確立されていない。認知機能などの中枢神経系の高次機能の評価においては、実験動物を用いた行動解析、脳組織損傷実験および病理組織評価、またノックアウト動物を用いた解析などのin vivo評価系が挙げられる。しかしながら、これらのin vivo評価系は手技的に煩雑である。これに対して、in vitro試験法は、簡便に実施することができ、また多数の化合物の評価も容易に行うことができる。【０００３】
ヒト由来神経細胞を用いたin vitroでの有効性評価や毒性評価は、通常２次元で培養した細胞を用いて行われている。神経細胞からは、長い突起である軸索と、複雑に分岐した短い樹状突起が伸びており、これらの神経突起は、別の神経細胞とつながり、神経回路である神経ネットワークを形成する。神経活動は、神経ネットワークにおいて複数の神経細胞が相互に作用することで発現する電気活動に基づくため、ヒト由来神経細胞の機能を指標とする有効性評価や毒性評価において、単離神経細胞または多能性幹細胞から誘導した神経細胞を、微小電極アレイ（microelectrode array、以下MEAと略す）上に分散培養させることにより神経回路網を再構成し、細胞外電位を測定することにより神経活動を観察する手法が開発されている（非特許文献１）。微小電極アレイ測定法は、電極アレイチップ上に神経細胞を２次元で分散培養し、自発的電気活動が生じてシナプス伝播が観察されるまで培養した後、神経細胞の機能評価を行う方法である。この手法により、実際に神経毒性を評価する検討が報告されている（非特許文献２および３）。【０００４】
神経細胞の培養は一般に困難とされているが、神経細胞が接着する足場を提供して、神経細胞の増殖を促進する様々な手段が報告されている。例えば、多孔性の３次元ハイドロゲルに、ポリカプロラクトンまたはゼラチンと混合したポリカプロラクトンから成るマイクロファイバーを整列して埋め込んだ足場に神経細胞を播種することにより、神経細胞の増殖が促進されることが報告されている（非特許文献４）。また、医療用材料などへの応用を目的として、細胞の足場として用いる足場材料に関する報告がいくつかある。例えば、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリウレタン、ポリエステル、フッ素系高分子、ポリ乳酸、ポリビニルアルコールなどで構成されるナノファイバー、またはタンパク質成分を吸着させた該ナノファイバーにより構成される細胞足場材料を使用し、細胞培養または組織再生を有効に行う（特許文献１）；中空糸膜メッシュとナノファイバー層とを有する細胞足場材料を使用する３次元細胞培養により、培養細胞への栄養や酸素の供給および培養細胞からの代謝老廃物の除去を高い効率で行う（特許文献２）；ゼラチン、コラーゲンもしくはセルロースを含有するナノファイバー、または架橋された該ナノファイバーにより構成される細胞足場材料を使用し、多能性幹細胞の大量供給を行う、および細胞死を抑制する（特許文献３）；ポリグリコール酸を支持体として用い、その上にポリグリコール酸やゼラチンなどからなるナノファイバーを塗布した細胞足場材料を使用し、ヒト多能性幹細胞の増殖率を向上させる（特許文献４）などが報告されている。しかしながら、MEAによる細胞外電位測定において、神経細胞を培養することにより得られ、生体組織に類似した機能を発現する神経ネットワークを、早期に成熟化させる方法については報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2006-254722
【特許文献２】特開2011-239756
【特許文献３】特開2013-247943
【特許文献４】WO2016/068266
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Odawara, A., et al. Scientific Reports 2016 May 18;6:26181.
【非特許文献２】Kraushaar, U., et al. Stem Cell-Derived Models in Toxicology, Methods in Pharmacology and Toxicology, 293-308, Mike Clements and Liz Roquemore (eds.), Springer Science New York 2017.
【非特許文献３】Schmidt, B. Z., et al. Arch Toxicol (2017) 91:1-33.
【非特許文献４】Lee, S-. J., et al. Tissue Eng Part A. 2017 Jun;23(11-12):491-502.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ヒト特有の副作用などを検出するためには、ヒト由来の神経細胞を用いることが望ましいが、ヒト由来神経細胞は機能的に成熟する速度が遅いことが実用化する上での課題となっている。MEA上に直接播種した神経細胞は、生体組織に類似した機能を発現し、神経活動測定に使用できるまでには長期の培養が必要とされている。しかしながら、長期の培養により、細胞の剥離や凝集、また細菌などのコンタミネーションが生じ、神経活動を評価する上で悪影響が出る可能性がある。培養する際の細胞密度を高めると、神経ネットワーク機能の成熟化が促進されるが、その一方で神経細胞が凝集し、スフェロイドとなる傾向がある。MEA上で分散培養した神経細胞がスフェロイドを形成すると、該スフェロイドはMEAから部分的に剥離し、細胞と接触する電極数が減るため、安定的に神経活動を測定することができない。さらに、高い細胞密度で神経細胞を培養すると、酸素と栄養が細胞集団の内部まで十分に到達せず、細胞が死滅する場合がある。また、２次元培養した神経細胞から得られる細胞外電位は微弱であり、神経活動を高い精度で解析するためには、S/N比の向上が必要である。本発明は、これらの問題点を克服することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記の従来技術の問題点を克服することを目的とし、鋭意検討した結果、細胞足場としてのファイバーシート上で神経細胞を培養することにより、神経ネットワークの機能的成熟化を促進する方法を見出し、本発明を完成するに至った。【０００９】
すなわち、本発明の目的は、以下の発明により達成される。
（１）細胞足場を用いて神経細胞を培養することを含む、神経ネットワークを機能的に成熟化させる方法。
（２）前記細胞足場が高分子材料で形成されたファイバーシートである、１に記載の方法。
（３）前記ファイバーシートが、配向性構造、非配向性構造または配向性と非配向性との混合構造を有する、２に記載の方法。
（４）前記ファイバーシートが、ポリリジン、ポリオルニチン、ラミニン、フィブロネクチン、マトリゲル（登録商標）およびゲルトレックス（登録商標）から選ばれる細胞外マトリックスタンパク質でコーティングされた、２または３に記載の方法。
（５）前記ファイバーシートが、ポリエチレンイミンでコーティングされた、２または３に記載の方法。
（６）前記神経細胞が、細胞足場上および／または細胞足場内で3次元構造を形成した、１〜５のいずれかに記載の方法。
（７）前記神経細胞が、初代培養細胞または多能性幹細胞由来の神経細胞である、１〜６のいずれかに記載の方法。
（８）前記初代培養細胞または前記多能性幹細胞由来の神経細胞が、哺乳類由来の神経細胞である、７に記載の方法。
（９）前記神経細胞が、グルタミン酸作動性、ドーパミン作動性、γ-アミノ酪酸作動性、モノアミン作動性、ヒスタミン作動性またはコリン作動性の神経細胞を含む、１〜８のいずれかに記載の方法。
（１０）１〜９のいずれかに記載の方法を使用して機能的に成熟化させた神経細胞を用いる、神経活動の評価方法。
（１１）１〜９のいずれかに記載の方法を使用して機能的に成熟化させた神経細胞を微小電極アレイと接触させ、該神経細胞の細胞外電位を測定することを含む、神経活動の評価方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ファイバーシートにより形成された細胞足場を用いて神経細胞を培養することにより、細胞接着性が向上し、培養中の細胞剥離の低減などを含む安定した培養が可能となる。その結果、形成される神経ネットワークの機能的成熟化が促進される。本発明により機能的に成熟化させた神経細胞を用いると、微小電極アレイの電極から、播種した神経細胞が脱離することがなく、スパイク発火および同期バースト発火などの神経活動の測定が可能になるまでの期間が短縮される。さらに、神経細胞の凝集が抑制されるため、高頻度のスパイク発火および強い同期バースト発火を観察することができる。本発明の方法により機能的に成熟化させた神経細胞は、神経毒性評価や神経疾患に対する薬物スクリーニングなどに有用である。【００１１】
本発明により神経細胞を培養すると、ファイバーシートを構成するファイバーが神経細胞の支持体となり、細胞凝集が抑制されるため、細胞が積層化し、細胞同士が接触した状態であってもスフェロイドが形成されず、平面状で高密度に積層された３次元培養が可能となる。かかる高密度培養により、神経細胞のスパイク発火頻度の上昇およびシナプス伝播による強い同期バースト発火を早期に観察することができる。すなわち、神経細胞の機能的成熟化が早期に実現される。また、神経細胞を高密度で平面状に培養できるため、MEA上で細胞と接触する電極数が多く、安定して電気信号を取得することが可能となる。さらに、測定時に神経細胞を含む細胞足場をMEA上に載せて測定できることから、あらかじめMEA上で神経細胞を培養する必要がなく、培養期間中の電極の汚染を避けることができる。そのため、電極インピーダンスを低インピーダンス状態にしたまま測定できるため、外来ノイズの影響を受けにくく、S/N比が高くなる。また、あらかじめMEA上で神経細胞を培養する必要がないため、MEAプローブの稼働率も向上する。さらに、神経細胞の培養期間が短縮されるので、細胞培養に要する経費の削減が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ヒトiPS細胞由来神経細胞を、8×105細胞／cm2の密度で、配向性PLGAファイバーシート上（Ａ）またはMEAプローブ上（Ｂ）に播種し、3週間培養した後の細胞の状態を示す光学顕微鏡写真（倍率×4）である。
【図２】16個（4個×4個）の微小電極が配置されたMEAプローブを用いて測定するiPS細胞由来神経細胞の細胞外電位に対する細胞足場および細胞播種密度の影響を示す図である。Ａ〜Ｃの各図の上段のヒストグラムは、16個の微小電極で測定されたスパイク数の積算値の時間変化を示す図である（縦軸：array-wide spike detection rate（AWSDR、スパイク数／秒））。Ａ〜Ｃの各図の下段は、各電極で経時的に測定されたスパイクを示す図である（縦軸：電極のチャネル番号）。（Ａ）MEAプローブ上に、8×105細胞／cm2で細胞を直接播種し、4週間培養した。（Ｂ）配向性PLGAファイバーシート上に、8×105細胞／cm2で細胞を播種し、4週間培養した。（Ｃ）配向性PLGAファイバーシート上に、24×105細胞／cm2で細胞を播種し、4週間培養した。
【図３】神経細胞のスパイク発火頻度および薬物応答性に対する細胞足場および細胞播種密度の影響を示す図である。ヒトiPS細胞由来神経細胞を、配向性PSファイバーシート上に、3×105細胞／cm2または12×105細胞／cm2の密度で播種した。MEAプローブ上には、3×105細胞／cm2で播種した。これらを2、4および6週間培養した。培養後、MEAにより自発スパイク数を5分間測定した。結果は、平均±標準誤差（MEAプローブn=4, ファイバーシートn=2）で示される。（Ａ）2週間培養後の自発スパイク数を示す図である。（Ｂ）4週間培養後の自発スパイク数を示す図である。（Ｃ）6週間培養後の自発スパイク数（「添加前」と表示）および4-アミノピリジン（100μM）添加後（「添加後」と表示）の自発スパイク数を示す図である。
【図４】ヒトiPS細胞由来神経細胞（XCL-1ニューロン、XCell Science社）の細胞外電位を、16個（4個×4個）の微小電極が配置されたMEAプローブを用いて測定した結果を示す図である。Ａ〜Ｃの各図の上段のヒストグラムは、16個の微小電極で測定されたスパイク数の積算値の時間変化を示す図である（縦軸：array-wide spike detection rate（AWSDR、スパイク数／秒））。Ａ〜Ｃの各図の下段は、各電極で経時的に測定されたスパイクを示す図である（縦軸：電極のチャネル番号）。（Ａ）MEAプローブ上に、3×105細胞／cm2で細胞を直接播種し、4週間培養した。（Ｂ）配向性PSファイバーシート上に、3×105細胞／cm2で細胞を播種し、4週間培養した。（Ｃ）配向性PSファイバーシート上に、9×105細胞／cm2で細胞を播種し、4週間培養した。（Ｄ）10分間で測定された総スパイク数を表す図である。結果は、平均±標準誤差（MEAプローブn=12、ファイバーシートn=6）で示される。
【図５】ヒトiPS細胞由来大脳皮質ニューロン（Axol Bioscience社）の細胞外電位を、16個（4個×4個）の微小電極が配置されたMEAプローブを用いて測定した結果を示す図である。Ａ〜Ｃの各図の上段のヒストグラムは、16個の微小電極で測定されたスパイク数の積算値の時間変化を示す図である（縦軸：array-wide spike detection rate（AWSDR、スパイク数／秒））。Ａ〜Ｃの各図の下段は、各電極で経時的に測定されたスパイクを示す図である（縦軸：電極のチャネル番号）。（Ａ）MEAプローブ上に、8×105細胞／cm2で細胞を直接播種し、4週間培養した。（Ｂ）配向性PSファイバーシート上に、8×105細胞／cm2で細胞を播種し、4週間培養した。（Ｃ）配向性PSファイバーシート上に、24×105細胞／cm2で細胞を播種し、4週間培養した。（Ｄ）10分間で測定された総スパイク数を表す図である。結果は、平均±標準誤差（MEAプローブn=5、ファイバーシートn=6）で示される。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明において使用される細胞足場は、高分子材料で生成されたファイバーで構成される。細胞足場は、好ましくは、ファイバーを集積したシートの形状を有するファイバーシートである。該ファイバーシートは配向性構造、非配向性構造または配向性と非配向性との混合構造を有することができる。配向性構造とは、ファイバーシートを構成するファイバーが一方向に配置され、該一方向の角度を0°とした場合、80％以上のファイバーが±30°の範囲内に存在する構造である。配向性構造において、ファイバー間の距離（隣接するファイバーの芯線間の距離）は特に限定されないが、5〜50 μmであるのが好ましい。非配向性構造とは、ファイバーの方向がランダムに配置された構造である。ファイバーを構成する高分子材料としては、生分解性または非生分解性の高分子材料が好ましく、例えば、PLGA (ポリ乳酸ポリグリコール酸)、ポリスチレン（PS）、ポリスルホン（PSU）およびポリテトラフルオロエチレン（PTFE）が挙げられるが、これらに限定されない。ファイバーシートを構成するファイバーの直交断面の直径は、特に限定されないが、例えば0.1〜8 μｍであり、好ましくは0.5〜7 μｍであり、より好ましくは1〜6 μｍである。ファイバーシートの厚さは、例えば1〜40 μｍであり、好ましくは5〜35 μｍであり、より好ましくは10〜30 μｍである。ファイバーシートを構成するファイバーの空隙率は、用いる高分子材料によって変動し得る。該空隙率は特に限定されないが、例えば10〜50％であり、好ましくは15〜45％であり、より好ましくは20〜40％である。ここで空隙率とは、ファイバーシート平面の一定面積に対する、ファイバーが存在していない面積の比率のことである。
【００１４】
ファイバーシートは、例えば、高分子材料を含む溶液からエレクトロスピニング法によって製造することができる。配向性構造を有するファイバーシートを製造する場合は、特に限定されないが、例えば回転ドラムを用い、該ドラムを回転させながら、ノズルから該ドラムの回転面に対して高分子材料を含む溶液を噴霧し、回転ドラム上で形成されたファイバーを巻き取ることにより、ファイバーシートを製造することができる。非配向性構造を有するファイバーシートを製造する場合は、高分子材料を含む溶液を平坦なプレート上に噴霧することにより、ファイバーシートを製造することができる。配向性構造と非配向性構造との混合構造を有するファイバーシートを製造する場合は、例えば、配向性構造および非配向性構造のファイバーシートを製造する上記の製造方法を組み合わせて製造することができる。
【００１５】
ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）シートは、例えば、市販されている住友電工株式会社のポアフロン（登録商標）を使用することができる。
【００１６】
高分子材料の溶液としては、使用する高分子材料を、室温で10〜30重量％で溶解する有機溶媒であればよく、例えば1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノール(HFIP)、N,N-ジメチルホルムアミド（DMF）などが挙げられる。
【００１７】
ファイバーシートは、周囲をフレームで固定または保持することができる。フレームをファイバーシートに固定または保持する場合は、細胞培養に影響を及ぼさなければ特に限定されないが、例えば市販の生体適合性粘着剤、例えばシリコーン一液縮合型RVTゴム（信越化学、カタログ番号KE-45）を用いて、フレームとファイバーシートとを接着することができる。
【００１８】
フレームの素材は、細胞培養に影響を及ぼさなければ特に限定されない。例えば、ポリジメチルシロキサン（PDMS）、PS、ポリカーボネート、ステンレスなどが例示される。フレームの厚さは、特に限定されないが、0.1〜4 mm、好ましくは0.25〜3 mm、より好ましくは0.5〜2 mmである。フレームの形状は、使用目的によって変えることができ、縦長×横長が、それぞれ2 mm×2 mm〜15 mm×15 mmが好ましく、円形または多角形である。
【００１９】
神経細胞を播種した細胞足場、例えばファイバーシート、またはファイバーシートの周囲をフレームで固定もしくは保持した該ファイバーシートは、細胞培養ディッシュまたは複数のウェルを有するマルチウェルプレートに含まれるウェルの少なくとも一つにそのまま配置することができる。
【００２０】
本明細書において、神経細胞とは、細胞体、樹状突起及び軸索から構成される神経単位を意味し、ニューロンとも呼ばれる。神経細胞は、神経細胞が産生する神経伝達物質の違いにより分類することができ、神経伝達物質としては、ドーパミン、ノルアドレナリン、アドレナリンおよびセロトニンなどのモノアミン、アセチルコリン、γ−アミノ酪酸、グルタミン酸などの非ペプチド性神経伝達物質、また、副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）、α−エンドルフィン、β−エンドルフィン、γ−エンドルフィン、バソプレッシンなどのペプチド性神経伝達物質が挙げられる。例えば、ドーパミン、アセチルコリンおよびグルタミン酸を伝達物質とする神経細胞を、それぞれドーパミン作動性ニューロン、コリン作動性ニューロンおよびグルタミン酸作動性ニューロンという。
【００２１】
神経細胞としては、初代培養細胞を用いることができる。初代培養細胞は、生体内において本来有する細胞機能を多く保持しているため、生体内における薬物などの影響を評価する系として重要である。初代培養細胞としては、哺乳類、例えばマウスもしくはラットのげっ歯類、またはサルもしくはヒトの霊長類の中枢神経系および末梢神経系の神経細胞を使用することができる。これらの神経細胞を調製および培養するに際し、動物の解剖方法、組織採取方法、神経分離・単離方法、神経細胞培養用培地、培養条件などは、培養する細胞の種類および細胞の目的に応じて、公知の方法より選択することができる。市販の初代培養神細胞製品としては、例えばロンザ社（スイス）のラット脳神経細胞およびScienCell Research Laboratories社（米国）のヒト脳神経細胞を用いることができる。
【００２２】
神経細胞としては、さらに多能性幹細胞由来の神経細胞を用いることができる。多能性幹細胞としては、例えば胚性幹細胞（ES細胞）やiPS細胞がある。多能性幹細胞を、公知の神経分化誘導方法を用いて分化誘導することにより、様々なタイプの神経細胞を得ることができる。例えば、文献（Honda et al. Biochemical and Biophysical Research Communications 469 (2016) 587-592）に記載の低分子化合物を用いた分化誘導方法によって神経細胞を得ることができる。また、市販の多能性幹細胞由来の神経細胞製品、例えば、セルラーダイナミックスインターナショナル社（米国）のiCellニューロン、Axol Bioscience社（英国）の各種神経幹細胞、BrainXell社（米国）の各種神経細胞の前駆細胞およびXCell Science社（米国）のXCL-1ニューロンを用いることもできる。これらの市販神経細胞は、付属の培養液を使用して培養することができる。
【００２３】
神経細胞は、哺乳類の脳由来のグリア細胞または哺乳類のiPS細胞から分化させたグリア細胞と共に培養することができる。グリア細胞としては、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミクログリアなどが挙げられる。また、アストロサイトを培養したあとの培養液（アストロサイト培養上清）を神経細胞用培養液に、終濃度5〜30％で添加し培養することもできる。
【００２４】
神経ネットワークとは、細長い突起である軸索と複数の複雑に分枝した樹状突起とを有する神経細胞が、これらの神経突起を介して別の神経細胞とつながり、その結果形成された神経回路である。神経回路において、神経細胞（シナプス前細胞）が電気的に発火（活動電位の変化）すると、軸索を伝わった電気信号は、シナプスにおいて、シナプス前細胞から次の神経細胞（シナプス後細胞）の樹状突起に神経伝達物質を介して電気信号を伝達する。軸索と樹状突起とが接続している部位がシナプスである。本明細書において、神経ネットワークの機能的な成熟化とは、神経ネットワークを形成する神経細胞が機能的に成熟化した状態を指す。機能的に成熟化した神経ネットワークでは、神経細胞のスパイク発火頻度の上昇およびスパイクのシナプス伝播による強い同期バースト発火が観察される。ここでスパイク発火とは、神経細胞の活動電位の急激な変化であり、また同期バースト発火とは、神経ネットワークを形成する神経細胞が、シナプス伝播により同時期に発火する現象である。
【００２５】
本明細書において、神経ネットワークは、幹細胞由来神経細胞、株化神経細胞、初代神経細胞、培養過程で神経細胞へ分化する幹細胞および神経前駆細胞など、ならびにグリア細胞などの神経組織を構成する細胞から選ばれる１種以上の細胞を、単細胞ではなく、複数個の細胞を細胞足場上で培養することにより形成される。
【００２６】
ファイバーシートまたはフレームで周囲を固定または保持したファイバーシートに対して、培養液に懸濁した神経細胞を、1×104〜4×106細胞／cm2、好ましくは1×105〜4×106細胞／cm2、より好ましくは8×105〜4×106細胞／cm2、さらに好ましくは2×106〜4×106細胞／cm2の高密度で播種して、培養液を1〜7日間隔で交換しながら培養することによって、神経細胞が均一に３次元構造を形成した神経ネットワークを形成させることができる。３次元構造を形成するとは、神経細胞がファイバーシートの片面または両面上およびファイバーシート内に入り込んで生育した状態をいう。配向性構造を有するファイバーシート上に神経細胞を播種した場合、神経細胞は、ファイバーシートを構成するファイバーに沿って接着し、ファイバーの配向方向に沿って伸展する。ファイバーシート上に神経細胞を播種し、培養すると、ファイバーシートを使用せず、培養シャーレに直接播種した場合に認められる培養中の細胞の凝集やスフェロイド形成がなく、また細胞の剥離もなく、均一に広がった状態で細胞が維持される。
【００２７】
ファイバーシートは、播種した神経細胞の接着および伸展を促進するため、ポリリジン、ポリオルニチン、ラミニン、フィブロネクチン、マトリゲル（登録商標）もしくはゲルトレックス（登録商標）などの細胞外マトリックスタンパク質、またはカチオン性の水溶性ポリマーであるポリエチレンイミンでコーティングしてもよい。コーティングは、上記細胞外マトリックスタンパク質またはポリエチレンイミンを生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、細胞培養液などに溶解した溶液に、ファイバーシートを浸漬することにより行うことができる。
【００２８】
本発明において使用する、神経細胞を播種した細胞足場、例えばファイバーシートまたはファイバーシートの周囲をフレームで固定もしくは保持した該ファイバーシートは、微小電極アレイと接触させ、該細胞足場に含まれる神経細胞の細胞外電位を5％CO2、37℃環境下で測定することができる。微小電極アレイには基板上に平面微小電極が多数配置されており、複数の細胞からの電気信号を同時に観測することができる。
【００２９】
神経活動を測定する手段として、微小電極アレイ以外に、カルシウム感受性色素およびカルシウム感受性蛍光タンパク質などの蛍光カルシウムインジケーターならびに電位感受性色素および電位感受性蛍光タンパク質などの蛍光電位インジケーターが用いられる（Grienberger, C. and Konnerth, A., Neuron 73, 862-885, 2012; Antic, S. D., et al. J Neurophysiol 116: 135-152, 2016; Miller, E. W., Curr Opin Chem Biol. 33: 74-80, 2016）。これらのインジケーターを使用して、本発明の神経細胞デバイスに含まれる神経細胞のカルシウムや電位の変動を、セルイメージング装置によって測定することもできる。
【実施例】
【００３０】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに限定されない。
【実施例１】
【００３１】
〔ファイバーデバイスの作製〕
（１）ランダムファイバーシートの作製
PLGA（SIGMA P1941）またはPSU（SIGMA 182443）を、HFIP（和光純薬、089-04233）によって20重量%濃度になるように室温で溶解し、その溶解液をシリンジ（Norm-Ject Syringes 5 ml容量、大阪ケミカル）に充填後、ナノファイバー電界紡糸装置NANON-03（株式会社メック）に装着し、プレートコレクター上に、PLGAの場合、針直径22 G、電圧：20 kVおよび送り速度：1 ml/hの条件下で、また、PSUの場合、針直径27G、電圧：15 kVおよび送り速度：1 ml/hの条件下でランダムファイバーシートを作製した。
（２）配向性ファイバーシートの作製
配向性PLGAファイバーシートは、PLGA（SIGMA P1941）をHFIP（和光純薬、089-04233）によって20重量%濃度になるように室温で溶解し、その溶解液をシリンジ（Norm-Ject Syringes 5 ml容量、大阪ケミカル）に充填後、ナノファイバー電界紡糸装置NANON-03（株式会社メック）に装着し、ドラムコレクター上に針直径22 G、電圧：20 kV、送り速度：1 ml/hおよび回転速度：750 rpmの条件下で作製した。配向性PSファイバーシートは、PS（Fluka）をDMF（N,N-ジメチルホルムアミド、和光純薬）によって30重量%濃度になるように室温で溶解し、その溶解液をシリンジ（Norm-Ject Syringes 5 ml容量、大阪ケミカル）に充填後、ナノファイバー電界紡糸装置NANON-03（株式会社メック）に装着し、ドラムコレクター上に針直径25 G、電圧：10 kV、送り速度：1.5 ml/hおよび回転速度：2000 rpmの条件下でファイバーシートを作製した。
（３）ファイバーシートへのフレーム接着
作製されたファイバーシートに、シリコーン一液縮合型RVTゴム（信越化学、カタログ番号KE-45）を用いて、ポリカーボネート製のフレーム（15 mm×15 mm）またはステンレス製の円形フレーム（外径6 mm、内径3 mm）を接着させ、ファイバーデバイスを作製した。
【実施例２】
【００３２】
〔ヒトiPS細胞由来神経細胞の培養〕
実施例１で作製した配向性PLGAファイバーシートに対し、SureBond（登録商標）コーティング溶液（Axol Bioscience社（英国）、カタログ番号ax0052）を加え、5％CO2環境下、37℃で1時間前処理した。コーティング処理した配向性PLGAファイバーシートおよびMEA電極チップMEDプローブ標準4×4配列／MED-PG515Aおよび4×4配列／MED-Q2430M、アルファメッドサイエンティフィック社）を細胞足場として使用し、ヒトiPS細胞由来大脳皮質ニューロン（Axol Bioscience社（英国）、カタログ番号ax0019）を、8×105細胞／cm2の密度で、これらの細胞足場上に播種した。これらを、BrainPhys培地（STEMCELL technologies社、米国）を用いて、5％CO2、37℃のインキュベータ中で2週間培養した。培養後、得られた細胞を光学顕微鏡で観察した結果を、配向性PLGAファイバーシート上の細胞については図１Ａに示し、またMEA電極チップ上の細胞については図１Ｂに示した。MEA電極チップ上では、細胞が凝集してスフェロイド状となり、電極から脱離することが示された。一方、配向性PLGAファイバーシート上では、細胞が均一に広がって生育していることが示された。
【実施例３】
【００３３】
〔細胞足場上で培養した神経細胞のMEAによる細胞外電位測定（１）〕
ヒトiPS細胞由来大脳皮質ニューロン（Axol Bioscience社、英国）を、細胞足場として実施例１で作製した配向性PLGAファイバーシート上に、8×105細胞／cm2または24×105細胞／cm2の密度で播種し、実施例２と同一の条件下で4週間、5％CO2、37℃のインキュベータ中で培養した。得られた細胞シートを微小電極アレイ（MEA）プローブ（MED64システム、アルファメッドサイエンティフィック社）上に載せて、細胞とMEAプローブの電極とを接触させ、神経活動（スパイク発火および同期バースト発火）を測定した。並行して、MEAプローブ上に直接神経細胞を8×105細胞／cm2で播種し、4週間、5％CO2、37℃のインキュベータ中で培養し、同様に神経活動を測定した。それらの結果を図２に示した。MEAのプローブ上に直接播種した細胞（従来方法）に比較して、配向性PLGAファイバーシート上に高密度で播種した細胞では、MEAプローブ上の細胞では神経活動が十分に観察されない時期に、高頻度でスパイクが確認されることが示された。また、強い同期バーストが観察された。配向性PLGAファイバーシート上で、高頻度のスパイクおよび強い同期バーストが生じる現象は、8×105細胞／cm2の密度で播種した場合より、より高密度の24×105細胞／cm2で播種した場合に顕著に観察された。これらのことより、配向性PLGAファイバーシートを用いて神経細胞を培養することにより、形成された神経ネットワークの機能的成熟化が促進されたことが示された。さらに、配向性PLGAファイバーシートに対して神経細胞をより高密度で播種することにより、機能的成熟化が促進されることも示された。
【実施例４】
【００３４】
〔神経細胞のスパイク発火頻度および薬物応答性に対する細胞足場および細胞播種密度の影響〕
実施例１で作製した配向性PSファイバーシートを、ポリ-D-リジンおよびラミニンによりコーティング処理した。コーティング処理した配向性PSファイバーシート上に、ヒトiPS細胞由来ニューロン（XCL-1ニューロン、XCell Science社、米国）を、3×105細胞／cm2（低密度播種）または12×105細胞／cm2（高密度播種）の密度で播種し、5％CO2、37℃のインキュベータ中で2、4および6週間培養後、実施例３と同様にして神経活動を測定した。並行して、MEAプローブ上に直接神経細胞を3×105細胞／cm2で播種し、同様に神経活動を測定した。6週間培養時の神経活動を測定した後、ニューロンの培養液に100μM 4-アミノピリジン（4-AP）を添加し、引き続き神経活動を測定した。これらの結果を図３Ａ〜Ｃに示した。【００３５】
神経細胞を播種して所定期間培養した後、MEAプローブ上に直接播種した細胞と、配向性PSファイバーシート上に低密度播種または高密度播種した細胞との間で、神経活動であるスパイク発火の頻度を比較した。2週間培養後では、MEAプローブ上に直接播種した細胞（従来方法）に比較して、配向性PSファイバーシート上に高密度播種した細胞において高頻度でスパイクが確認された（図３Ａ）。一方、4週間培養後では、配向性PSファイバーシート上に低密度播種した細胞において、従来方法による細胞と比較して、高頻度でスパイクが確認された（図３Ｂ）。6週間培養後では、従来方法による細胞（MEAプローブ上に直接播種した細胞）と比較して、播種密度に関わらず、配向性PSファイバーシート上に播種した細胞において高頻度でスパイクが確認された。高頻度のスパイクは、配向性PSファイバーシート上に低密度播種した細胞に比較して、高密度播種した細胞において顕著に観察された（図３Ｃ）。【００３６】
6週間培養した神経細胞の薬物応答性を検討するため、4-APを神経細胞の培養液に添加し、スパイク発火の頻度に対する効果を測定した。4-APは、細胞膜上のカリウムチャネルをブロックすることにより、神経細胞の膜電位の変化を誘導する薬物である。4-APの添加により、MEAプローブ上に直接播種した細胞および配向性PSファイバーシート上に低密度播種または高密度播種した細胞は、すべて4-APに対して応答し、4-AP無添加の場合と比較してスパイク数を増加させた（図３Ｃ）。しかしながら、従来方法による細胞（MEAプローブ上に直接播種した細胞）と比較して、配向性PSファイバーシート上に播種した細胞においてスパイク数が多く、この現象は、配向性PSファイバーシート上に高密度で神経細胞を播種した場合に明瞭であった。これらの結果より、配向性PSファイバーシートを用いて神経細胞を培養することにより、神経ネットワークの機能的成熟化が促進されたことが示された。さらに、配向性PSファイバーシートに対して神経細胞をより高密度で播種することにより、機能的成熟化が促進されることが示された。
【実施例５】
【００３７】
〔細胞足場上で培養した神経細胞のMEAによる細胞外電位測定（２）〕
実施例１（３）で作製したステンレス製の円形フレームを装着した配向性PSファイバーシートを、卓上プラズマ処理装置（ストレックス社）を用いるプラズマ処理によって親水化した後、ポリ-D-リジンおよびラミニンによりコーティング処理した。コーティング処理した配向性PSファイバーシート上に、ヒトiPS細胞由来神経細胞（XCL-1ニューロン、XCell Science社、米国）を、3×105細胞／cm2または9×105細胞／cm2の密度で、またはヒトiPS細胞由来大脳皮質ニューロン（Axol Bioscience社、英国）を、8×105細胞／cm2または24×105細胞／cm2の密度で播種し、5％CO2、37℃のインキュベータ中で4週間培養した。得られた細胞シートを、微小電極アレイ（MEA）MED64-Presto（アルファメッドサイエンティフィック社）のプローブ上に載せて、細胞とMEAプローブの電極とを接触させ、神経活動電位を測定した。並行して、MEAプローブ上に直接神経細胞を、3×105細胞／cm2（XCell Science社、XCL-1ニューロンの場合）または8×105細胞／cm2（Axol Bioscience社、ヒトiPS細胞由来大脳皮質ニューロンの場合）で播種し、4週間培養した。【００３８】
ヒトiPS細胞由来神経細胞XCL-1ニューロン（XCell Science社）における細胞外電位の測定結果を図４に示した。図４ＡおよびＢの比較により、同じ細胞播種密度であっても、配向性PSファイバーシートを用いて培養した細胞において、MEAプローブ上で培養した細胞より強い同期バーストが観察された。また、配向性PSファイバーシートに対して高密度で細胞を播種し、培養した細胞は、低密度で細胞播種した場合およびMEAプローブ上に直接播種した場合と比較して、高頻度のスパイク発火および強い同期バースト発火が観察された（図４ＣおよびＤ）。【００３９】
ヒトiPS細胞由来大脳皮質ニューロン（Axol Bioscience社）における細胞外電位の測定結果を図５に示した。配向性PSファイバーシート上に播種して培養した細胞では、MEAプローブ上に直接播種して培養した細胞に比較して、高頻度のスパイク発火および強い同期バースト発火が明瞭に観察された。【００４０】
以上の結果より、異なる供給元の神経細胞を用いる場合であっても、ファイバーシートを用いる本発明の方法により、神経ネットワークを形成する神経細胞の機能的な成熟が促進されることが確認された。
【図１】
2020013269.tif 000003
【図２】
2020013269.tif 000004
【図３】
2020013269.tif 000005
【図４】
2020013269.tif 000006
【図５】
2020013269.tif 000007
【国際調査報告】
2020013269.tif 000008
2020013269.tif 000009
2020013269.tif 000010
2020013269.tif 000011