(57)【要約】  本発明の目的は、汎用性が高く、より安全性の高い薬物の膜透過促進技術を提供することである。  前記課題は、本発明の分子量１０００以上の高分子化合物であって、１個のアルギニン、又は１個以上のアルギニンを含む２〜６鎖長の塩基性ペプチドを側鎖の末端に有し、そしてアルギニンに由来するグアニジノ基を０．５〜２０ｍｍｏｌ／ｇ含む前記高分子化合物によって解決することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子量１０００以上の高分子化合物であって、
１個のアルギニン、又は１個以上のアルギニンを含む２〜６鎖長の塩基性ペプチドを側鎖の末端に有し、そしてアルギニンに由来するグアニジノ基を０．５〜２０ｍｍｏｌ／ｇ含む前記高分子化合物。
【請求項２】
前記高分子化合物の主鎖が、親水性高分子、アニオン性高分子、及び多糖誘導体からなる群から選択される１種又は２種以上の組み合わせである、請求項１に記載の高分子化合物。
【請求項３】
前記１個のアルギニン、又は塩基性ペプチドの末端が−ＣＯＮＨ２基である、請求項１又は２に記載の高分子化合物。
【請求項４】
前記塩基性ペプチドが、アルギニン及びグリシンからなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の、高分子化合物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の高分子化合物を含む細胞への化合物導入促進剤。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の高分子化合物及び薬物を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高分子化合物及びそれを用いた細胞内化合物導入促進剤に関する。本発明によれば、薬物などの化合物を効率的に細胞内に導入することができる。
【背景技術】
【０００２】
ペプチド、タンパク質、抗体、及び核酸などのバイオ医薬品は、疾患の原因となる標的分子に対する特異性が極めて高く、疾患の治療に有効だと考えられている。２０１５年に上市された新薬の約半数がバイオ医薬品であり、今後更に増加するものと考えられる。前記バイオ医薬品の薬物動態学的な特性として、低膜透過性が挙げられる。高い水溶性、及び高分子量に起因する前記の特性のために、多くのバイオ医薬品は侵襲性の高い注射剤として開発されている。従って、患者の苦痛を伴うばかりでなく、医師による投薬管理及び高い生産コストなどの問題があり、バイオ医薬品の注射剤化は医療費高騰の一因になっている。【０００３】
一方、局所の投与部位における薬物の膜透過を促進し、全身血中に移行させ、標的部位へ効率的に到達させる吸収促進の技術開発は、ＤＤＳ研究の１つの主要な分野である。脂溶性改善、又はトランスポーターによる認識などに基づくプロドラッグが典型的な技術として挙げられるが、低分子有機化合物が主であり、バイオ医薬品での成功例はない。クラシカルな吸収促進剤として、カプリン酸ナトリウムがアンピシリン坐剤の添加剤として用いられた例があるが、極めて限定的である。バイオ医薬品の吸収性を改善し、経口投与又は経鼻投与などの患者による投薬管理を可能とし、そして医療費を抑制できるＤＤＳ技術の開発が求められている。【０００４】
ＨＩＶウイルスの感染機構の研究において、高い細胞膜透過性を有するタンパク質が見出され、このタンパク質を用いた膜透過促進技術が研究されている。具体的には、前記ＨＩＶウイルスタンパク質の一次構造をもとに、膜透過ペプチドが開発され、ＤＤＳキャリアとして精力的に研究されている。膜透過ペプチドは、アルギニン及びリジンなどの塩基性アミノ酸に富む１０残基程度の側鎖オリゴペプチドであり、代表的なものとしてオリゴアルギニン、又はペネトラチンなどが知られている。【０００５】
本発明者らは、膜透過ペプチドの技術を応用し、核酸若しくはタンパク質等の水溶性高分子量物質、又は薬物を、簡便且つ高い効率で、細胞内や粘膜内へ導入できる高分子化合物及び多糖誘導体について開示した（特許文献１及び２）。これらの高分子化合物及び多糖誘導体を用いることにより、煩雑な前処理を行わなくとも低膜透過性化合物を高い効率で細胞内や粘膜内へ導入が可能となった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１６／１３６７０７号
【特許文献２】国際公開第２０１６／１３６７０８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前記特許文献１及び２に記載の高分子化合物及び多糖誘導体が利用している８アミノ酸鎖長を中心とする膜透過ペプチドやそれよりも長鎖の膜透過ペプチドは、価格が高く、そのコストダウンを実現しない限り、医薬品添加剤として開発することは困難であった。
また、依然として若干の細胞毒性があるため、更に細胞に安全な薬物の膜透過促進技術の開発が望まれていた。
本発明の目的は、汎用性が高く、より安全性の高い薬物の膜透過促進技術を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、安全性の高い薬物の膜透過促進技術について、鋭意研究した結果、驚くべきことに、６アミノ酸鎖長以下の塩基性ペプチドを側鎖の末端に含む高分子化合物によって、上記課題を解決できることを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］分子量１０００以上の高分子化合物であって、１個のアルギニン、又は１個以上のアルギニンを含む２〜６鎖長の塩基性ペプチドを側鎖の末端に有し、そしてアルギニンに由来するグアニジノ基を０．５〜２０ｍｍｏｌ／ｇ含む前記高分子化合物、
［２］前記高分子化合物の主鎖が、親水性高分子、アニオン性高分子、及び多糖誘導体からなる群から選択される１種又は２種以上の組み合わせである、［１］に記載の高分子化合物、
［３］前記１個のアルギニン、又は塩基性ペプチドの末端が−ＣＯＮＨ２基である、［１］又は［２］に記載の高分子化合物、
［４］前記塩基性ペプチドが、アルギニン及びグリシンからなる、［１］〜［３］のいずれかに記載の、高分子化合物、
［５］［１］〜［３］のいずれかに記載の高分子化合物を含む細胞への化合物導入促進剤、及び
［６］［１］〜［３］のいずれかに記載の高分子化合物及び薬物を含む医薬組成物、
に関する。
本明細書は、
［７］［１］〜［４］のいずれかに記載の高分子化合物及び薬物（特には、低膜透過性薬物）を混合する工程、及び薬物の有効量を治療対象に投与する工程を含む、薬物の投与方法、
［８］薬物（特には、低膜透過性薬物）の投与における使用のための［１］〜［４］のいずれかに記載の高分子化合物、及び
［９］［１］〜［４］のいずれかに記載の高分子化合物の医薬組成物の製造のための使用、
を開示する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の高分子化合物によれば、側鎖の塩基性ペプチドは、６アミノ酸鎖長以下であり、例えば１個のアルギニンでも本発明の効果が得られることから、従来のオクタアルギニンなどの長鎖の膜透過性ペプチドと比較すると、低コストで化合物導入促進剤を製造することができる。また、本発明の高分子化合物によれば、効率的に薬物などの化合物を細胞内に導入でき、且つ細胞毒性が低いため、安全に薬物などを導入することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
［１］高分子化合物
本発明の高分子化合物は、分子量１０００以上の高分子化合物であって、１個のアルギニン、又は１個以上のアルギニンを含む２〜６鎖長の塩基性ペプチドを側鎖の末端に有し、そしてアルギニンに由来するグアニジノ基を０．５〜２０ｍｍｏｌ／ｇ含む。
【００１１】
《分子量》
高分子化合物の分子量は、本発明の効果が得られる限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えば下限は１０００以上であり、好ましくは５０００以上であり、より好ましくは１万以上であり、より好ましくは５万以上であり、より好ましくは１０万以上であり、より好ましくは２０万以上であり、より好ましくは３０万以上である。分子量の上限は、例えば５０００万以下であり、好ましくは４０００万以下であり、より好ましくは３０００万以下であり、より好ましくは２０００万以下であり、更に好ましくは１０００万以下である。前記分子量の上限値と下限値とは、任意の組み合わせの範囲で実施することができる。高分子化合物の分子量が小さすぎる場合や高分子化合物の分子量が大きすぎる場合には、本発明の効果が十分に得られない場合がある。
本明細書において、分子量は重量平均分子量である。重量平均分子量とは、水系溶媒を用いてＧＰＣ分析を行った場合の重量平均分子量であって、プルラン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）換算の重量平均分子量を意味する。
【００１２】
《１個のアルギニン又は塩基性ペプチド》
本発明の高分子化合物は、１個のアルギニンを側鎖の末端に有するか、又は１個以上のアルギニンを含む２〜６鎖長の塩基性ペプチドを側鎖の末端に有する。１個のアルギニン又は塩基性ペプチドを有することにより、本発明の高分子化合物は、薬物などの化合物を効率的に細胞内に導入することができる。
前記２〜６鎖長の塩基性ペプチドは、少なくとも１つのアルギニンを含むが、アルギニンの個数の下限は好ましくは２個以上であり、より好ましくは３個以上である。上限は６個以下であり、好ましくは５個以下であり、より好ましくは４個以下である。塩基性ペプチドに含まれる２個以上のアルギニンは、塩基性ペプチドに連続して含まれてもよく、不連続に含まれてもよい。前記塩基性ペプチドに含まれるアルギニンの上限値と下限値とは、本発明の効果が得られる限りにおいて、任意の組み合わせの範囲で実施することができる。
前記２〜６鎖長の塩基性ペプチドの鎖長は、２〜６鎖長である限りにおいて、特に限定されるものではないが、ある態様では２〜６鎖長であり、ある態様では２〜５鎖長であり、ある態様では２〜４鎖長であり、ある態様では２〜３鎖長であり、ある態様では３〜６鎖長であり、ある態様では３〜５鎖長であり、ある態様では３〜４鎖長であり、ある態様では４〜６鎖長であり、ある態様では４〜５鎖長である。これらの塩基性ペプチドにおいて、すべてのアミノ酸がアルギニンでもよく、１個以上のアルギニン以外のアミノ酸（例えばグリシン）を含んでもよい。
【００１３】
塩基性ペプチドは、全体として塩基性ペプチドである限りにおいて、アルギニン以外のアミノ酸を含んでもよい。アルギニン以外のアミノ酸としては、塩基性アミノ酸（例えば、オルニチン、リジン、ヒドロキシリジン又はヒスチジン）、中性アミノ酸（例えば、アラニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、又はバリン）、酸性アミノ酸（アスパラギン酸、又はグルタミン酸）が挙げられるが、好ましくは塩基性アミノ酸又は中性アミノ酸であり、より好ましくは塩基性アミノ酸である。アルギニン以外のアミノ酸の数は、好ましくは５個以下であり、より好ましくは４個以下であり、更に好ましくは３個以下であり、更に好ましくは２個以下であり、更に好ましくは１個以下であり、最も好ましくは０個である。
塩基性ペプチドに含まれるアミノ酸は、Ｌ体又はＤ体のいずれであってもよく、細胞及び導入しようとする水溶性高分子量物質に応じて適宜選択される。なお、本明細書中でアミノ酸と記載する場合、特に断らない限り、α−アミノ酸を意味する。
例えば、２〜６鎖長の塩基性ペプチドとしては、ＲＲ（Ｒはアルギニンを表す。以下同様）、ＲＲＲ、ＲＲＲＲ、ＲＲＲＲＲ、若しくはＲＲＲＲＲＲのペプチド、又は１個のアルギニンと１個のグリシンの組み合わせの２鎖長の塩基性ペプチド、２個のアルギニンと１個のグリシンとの３鎖長の塩基性ペプチド、３個のアルギニンと１個のグリシンとの４鎖長の塩基性ペプチド、２個のアルギニンと２個のグリシンとの４鎖長の塩基性ペプチド、４個のアルギニンと１個のグリシンとの５鎖長の塩基性ペプチド、３個のアルギニンと２個のグリシンとの５鎖長の塩基性ペプチド、５個のアルギニンと１個のグリシンとの６鎖長の塩基性ペプチド、４個のアルギニンと２個のグリシンとの６鎖長の塩基性ペプチド、又は３個のアルギニンと３個のグリシンとの６鎖長のペプチドが挙げられる。グリシンとアルギニンの並びは限定されるものではないが、アルギニンが側鎖の末端に位置するものが好ましい。
【００１４】
塩基性ペプチドは、下記一般式（１）：
【化１】
2020013265.tif 000002
（式中、Ｘ１は、アルギニン、塩基性アミノ酸、中性アミノ酸、又は酸性アミノ酸から末端アミノ基及び末端カルボキシル基を除いた残基を表し、そしてＸ１の少なくとも１つはアルギニン残基であり、ａは２〜６の整数である）、又は
下記一般式（２）：
【化２】
2020013265.tif 000003
（式中、Ｘ１は、アルギニン、塩基性アミノ酸、中性アミノ酸、又は酸性アミノ酸から末端アミノ基及び末端カルボキシル基を除いた残基を表し、そしてＸ１の少なくとも１つはアルギニン残基であり、ａは２〜６の整数である）
で表すことができる。
前記式（１）で表される塩基性ペプチドの末端は−ＣＯＮＨ２基である。塩基性ペプチドの末端は−ＣＯＯＨ（カルボキシル基）であってもよいが、末端が−ＣＯＮＨ２基（又はＮＨ２基）であることにより、得られる細胞内化合物導入促進剤又は医薬組成物の分散性が向上することがある。
【００１５】
《主鎖》
本明細書における高分子化合物の主鎖は、１個のアルギニンを含む側鎖以外の部分、又は１個以上のアルギニンを含む２〜６鎖長の塩基性ペプチドを含む側鎖以外の部分を意味する。具体的には、主鎖は、１本鎖の主鎖でもよく、グラフト重合した主鎖でもよい。主鎖は、一般的には化合物内で最も長い炭素鎖を意味し、部分的にヘテロ原子で置換されていてもよい。主鎖は環構造を有してもよく、最も長くなる経路を主鎖とする。
本発明の高分子化合物は、例えば一本鎖の高分子化合物又はグラフト重合体（以下、まとめて主鎖高分子と称することがある）に、末端に１個のアルギニンを含む側鎖、又は末端に１個以上のアルギニンを含む２〜６鎖長の塩基性ペプチドを含む側鎖を結合させることによって製造することができる。
前記主鎖高分子は、特に限定されるものではなく、親水性高分子、アニオン性高分子、又は多糖誘導体を挙げることができるが、親水性高分子又は多糖誘導体が好ましい。本明細書において、親水性高分子とは、水溶性高分子、または水中で膨潤する高分子を意味する。水溶性高分子は常圧下で２５℃の水に０．１質量％以上の量で均一に溶解する高分子をいう。
【００１６】
親水性高分子としては、特に限定されるものではないが、例えば、グアーガム、アガロース、マンナン、グルコマンナン、ポリデキストロース、リグニン、キチン、キトサン、カラギーナン、プルラン、コンドロイチン硫酸、セルロース、ヘミセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、カチオンデンプン、デキストリンの多糖類又は多糖類の変性物；アルブミン、カゼイン、ゼラチン、ポリグルタミン酸（ポリ−γ−グルタミン酸又はポリ−α−グルタミン酸）、ポリリジン等の水溶性タンパク質又は水溶性ポリペプチド；ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリ（アクリル酸ヒドロキシエチル）、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリＮ−ビニルアセトアミド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ（２−アミノエチルアクリレート）、ポリ（２−アミノエチルメタクリレート）、アクリル酸／アクリルアミド共重合物、メタクリル酸／アクリルアミド共重合物、アクリル酸／Ｎ−イソプロピルアクリルアミド共重合物、メタクリル酸／Ｎ−イソプロピルアクリルアミド共重合物、アクリル酸／Ｎ−ビニルアセトアミド共重合物、メタクリル酸／Ｎ−ビニルアセトアミド共重合物、アクリル酸／マレイン酸共重合物、メタクリル酸／マレイン酸共重合物、アクリル酸／フマル酸共重合物、メタクリル酸／フマル酸共重合物、エチレン／マレイン酸共重合物、イソブチレン／マレイン酸共重合物、スチレン／マレイン酸共重合物、アルキルビニルエーテル／マレイン酸共重合物、アルキルビニルエーテル／フマル酸共重合物等のビニル系親水性高分子；水溶性ポリウレタン等が挙げられる。
【００１７】
多糖誘導体としては、特に限定されるものではないが、例えばカルボキシメチル化デンプン、カルボキシメチル化セルロース、カルボキシメチル化βグルコース等のカルボキシメチル化多糖誘導体、ペクチン、ペクチン酸、ヒアルロン酸、又はアルギン酸が挙げられる。
アニオン性高分子は、側鎖にアニオン性基を有する高分子である。アニオン性高分子中の「アニオン性基」は、両性高分子に関して上述したアニオン性基から適宜選択しうる。
アニオン性基は一態様として、カルボキシル基、カルボキシ基、リン酸基、スルホン酸基、硝酸基、ボロン酸基を含む。アニオン性高分子の具体的な例としては、特に限定されるものではないが、例えば、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリグルタミン酸、カルボキシルメチル化ポリヒスチジン、ヒアルロン酸、アルギン酸、又はポリアスパラギン酸等が挙げられる。
主鎖高分子は、前記の親水性高分子、アニオン性高分子、及び多糖誘導体の中の１種又は２種以上の組み合わせを、適宜用いることができる。
【００１８】
前記主鎖高分子は、アルギニン又は塩基性ペプチド（又はアルギニンを含む側鎖、又は塩基性ペプチドを含む側鎖）を容易に結合させるために、カルボキシル基、又はアミノ基を有する主鎖高分子が好ましい。カルボキシル基を有することにより、アルギニンなどのアミノ酸のアミノ基と容易に結合することができる。また、アミノ基を有することにより、アルギニンなどのアミノ酸のカルボキシル基と容易に結合することができる。
【００１９】
前記主鎖高分子は、限定されるものではないが、膜透過性を有さないものが好ましく、グアニジノ基を有さないものが好ましい。主鎖高分子がグアニジノ基を有さない、又は膜透過性を有さないことにより、本発明の高分子化合物自体は、細胞に取り込まれにくく、非共有結合で緩く共存している薬物などの化合物のみが細胞に取り込まれやすいものと考えられる。
【００２０】
《側鎖》
本発明の高分子化合物の側鎖は、末端側に１個のアルギニン、又は１個以上のアルギニンを含む２〜６鎖長の塩基性ペプチドを含む限りにおいて、特に限定されるものではない。すなわち、本明細書において、側鎖とは末端側に１個のアルギニンを含む鎖、又は１個以上のアルギニンを含む２〜６鎖長の塩基性ペプチドを含む鎖を意味する。また、側鎖の末端とは、主鎖から分岐して再び主鎖に結合しない分岐鎖の末端部分を意味する。
末端側に１個のアルギニンを含む側鎖、及び１個以上のアルギニンを含む２〜６鎖長の塩基性ペプチドを含む側鎖は、そのアルギニン又は塩基性ペプチドの主鎖側に、任意の鎖を含むことができる。任意の鎖は、特に限定されるものではないが、例えばリンカーペプチドが挙げられる。
【００２１】
リンカーペプチドを構成するアミノ酸としては、中性アミノ酸又はω−アミノアルカン酸が挙げられる。中性アミノ酸としては、例えば、アラニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、及びヒドロキシプロリン等が挙げられ、ω−アミノアルカン酸としては、３−アミノプロパン酸、４−アミノブタン酸、５−アミノペンタン酸、６−アミノヘキサン酸、７−アミノヘプタン酸、８−アミノオクタン酸、９−アミノノナン酸、１０−アミノデカン酸、及び１１−アミノウンデカン酸等が挙げられ、これらの任意の組み合わせでもよい。細胞に導入される化合物の導入効率が上がることから、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、セリン、トレオニン、フェニルアラニンが好ましく、グリシン、アラニン、セリンが更に好ましく、グリシンが最も好ましい。
リンカーペプチドの鎖長は、本発明の効果が得られる限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えば１〜３０であり、好ましくは１〜２０であり、より好ましくは１〜１０であり、更に好ましくは１〜５である。
【００２２】
《グアニジノ基》
本発明の高分子化合物は、アルギニンに由来する下記式（３）：
【化３】
2020013265.tif 000004
で表されるグアニジノ基を０．５〜２０．０ｍｍｏｌ／ｇ含むが、好ましくは１．０〜１０．０ｍｍｏｌ／ｇであり、より好ましくは１．０〜８．０ｍｍｏｌ／ｇであり、更に好ましくは１．５〜８．０ｍｍｏｌ／ｇである。０．５ｍｍｏｌ／ｇよりも小さいと本発明の効果が得られず、２０．０ｍｍｏｌ／ｇよりも大きいと導入する対象によっては毒性が強く生じてしまう。グアニジノ基の含有量が、前記範囲であることにより、効率的に薬物などの化合物を細胞内に導入できる。
発明の高分子化合物のグアニジノ基の含有量は、限定されるものではないが、例えば高分子化合物の１Ｈ−ＮＭＲを測定して、高分子の主鎖由来の水素原子及びアルギニン由来の水素原子を測定し、アルギニン由来の基の含量を計算する。この結果から、高分子化合物当たりのグアニジノ基の密度を算出することができる。具体的な測定方法は、実施例に示す。
【００２３】
《高分子化合物の製造方法》
本発明の高分子化合物の製造方法は特に限定されず、例えば１個のアルギニンを含む側鎖を有する重合性モノマー、又は１個以上のアルギニンを含む２〜６鎖長の塩基性ペプチドを含む側鎖を有する重合性モノマーを重合して製造してもよい。また、前記主鎖高分子に、前記１個のアルギニンを含む側鎖（例えば、１個のアルギニン）又は１個以上のアルギニンを含む２〜６鎖長の塩基性ペプチドを含む側鎖（例えば、１個以上のアルギニンを含む２〜６鎖長の塩基性ペプチド）を導入して製造してもよい。しかしながら、製造の容易さの点から、前記主鎖高分子に、１個のアルギニンを含む側鎖（例えば、１個のアルギニン）又は１個以上のアルギニンを含む２〜６鎖長の塩基性ペプチドを含む側鎖（例えば、１個以上のアルギニンを含む２〜６鎖長の塩基性ペプチド）を導入して製造することが好ましい。
主鎖高分子がカルボキシル基を有する場合は、カルボキシル基にアルギニン又は塩基性ペプチドのアミノ基をペプチド反応させることにより、高分子化合物を製造することができる。カルボキシル基とアミノ基との反応は、公知の方法を用いればよく、例えば、カルボキル基をＮ−ヒドロキシコハク酸イミドによりスクシイミドエステル化した後、アミノ基を反応させる方法等が挙げられる。
一方、主鎖高分子がアミノ基を有する場合は、アミノ基にアルギニン又は塩基性ペプチドのカルボキシル基をペプチド反応させることにより得ることができる。アルギニンを含む側鎖又は１個以上のアルギニンを含む２〜６鎖長の塩基性ペプチドを含む側鎖の固定法は、本法に限るものではなく、一般的に知られている化学反応を用いて、固定化できる。
また、前記主鎖高分子が、カルボキシル基又はアミノ基を末端に有する側鎖を有する主鎖高分子である場合は、それらのカルボキシル基又はアミノ基に１個のアルギニン、又は１個以上のアルギニンを含む２〜６鎖長の塩基性ペプチドを結合させることによっても、本発明の高分子化合物を製造することができる。
【００２４】
本発明の高分子化合物は、後述の化合物導入促進剤、又は医薬組成物の製造のために用いることができる。従って、本発明の使用は、化合物導入促進剤、又は疾患の治療又は予防用医薬の製造のための使用である。
【００２５】
［２］化合物導入促進剤
本発明の化合物導入促進剤は、本発明の高分子化合物を含む。前記高分子化合物を含むことにより、薬物などの化合物を細胞内に効率的に導入することができる。
【００２６】
《細胞へ導入される化合物》
本発明の化合物導入促進剤によって、細胞へ導入される化合物は、特に限定されるものではなく、タンパク質（ペプチド）、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質、糖質、又は低分子化合物が挙げられる。特には、細胞への導入効率の低い低膜透過性化合物を、細胞内に導入するために使用できる。
低膜透過性化合物としては、例えば、インスリン及びインスリン分泌促進剤（例えば、エキセンディン−４、ＧＬＰ−１）などのペプチド・タンパク性医薬品、ステロイドホルモン、非ステロイド系鎮痛抗炎症剤、精神安定剤、抗高血圧薬、虚血性心疾患治療薬、抗ヒスタミン薬、抗喘息薬、抗パーキンソン薬、脳循環改善薬、制吐剤、抗うつ薬、抗不整脈薬、抗凝固薬、抗痛風薬、抗真菌薬、抗痴呆薬、シェーングレン症候群治療薬、麻薬性鎮痛薬、ベータ遮断薬、β１作動薬、β２作動薬、副交感神経作動薬、抗腫瘍薬、利尿薬、抗血栓薬、ヒスタミンＨ１レセプター拮抗薬、ヒスタミンＨ２レセプター拮抗薬、抗アレルギー薬、禁煙補助薬、ビタミン等の医薬品；デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）及びこれらの類似体又は誘導体（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエートＤＮＡ等）等の核酸化合物；酵素、抗体、糖タンパク質、転写因子等のペプチド化合物；プルラン、アミロペクチン、アミロース、グリコーゲン、シクロデキストリン、デキストラン、ヒドロキシエチルデキストラン、マンナン、セルロース、デンプン、アルギン酸、キチン、キトサン、ヒアルロン酸等の多糖誘導体およびそれらの誘導体等が挙げられる。
【００２７】
本発明の化合物導入促進剤が、適用される細胞は、動物、植物、又は細菌等のいずれの細胞でもよいが、低膜透過性化合物の導入効率の点から、噛乳動物（例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、フェレット、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、モルモット、ハムスター、スナネズミ、マウス、又はラット）の細胞が好ましい。細胞への化合物の導入は、in vivoで行われてもよく、in vitroで行われてもよい。
【００２８】
本発明の化合物導入促進剤は、前記高分子化合物以外に希釈剤又は添加剤などを含むことができる。希釈剤としては、精製水、アルコール類（例えば、エタノール）、注射用蒸留水、生理用食塩水、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）、又はポリソルベート８０が挙げられる。また、希釈剤以外の添加剤としては、湿潤剤、懸濁剤、甘味剤、芳香剤、又は防腐剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解剤、又は溶解補助剤などを含むことができる。
【００２９】
本発明の化合物導入促進剤は、化合物（特には、低膜透過性化合物）の細胞への導入に用いることができる。すなわち、本発明の使用は、化合物導入促進剤の化合物（特には、低膜透過性化合物）の細胞へ導入のための使用である。
【００３０】
［３］医薬組成物
本発明の医薬組成物は、薬物及び本発明の高分子化合物を含む。前記高分子化合物を含むことにより、薬物を細胞内に効率的に導入することができる。
【００３１】
《薬物》
本発明の医薬組成物に含まれる薬物は、特に限定されるものではないが、例えばインスリン及びインスリン分泌促進剤（例えば、エキセンディン−４、ＧＬＰ−１）などのペプチド・タンパク性医薬品、ステロイドホルモン、非ステロイド系鎮痛抗炎症剤、精神安定剤、抗高血圧薬、虚血性心疾患治療薬、抗ヒスタミン薬、抗喘息薬、抗パーキンソン薬、脳循環改善薬、制吐剤、抗うつ薬、抗不整脈薬、抗凝固薬、抗痛風薬、抗真菌薬、抗痴呆薬、シェーングレン症候群治療薬、麻薬性鎮痛薬、ベータ遮断薬、β１作動薬、β２作動薬、副交感神経作動薬、抗腫瘍薬、利尿薬、抗血栓薬、ヒスタミンＨ１レセプター拮抗薬、ヒスタミンＨ２レセプター拮抗薬、抗アレルギー薬、禁煙補助薬、ビタミン等の医薬品、抗体医薬等が挙げられる。
【００３２】
本発明の医薬組成物は、薬剤及び高分子化合物以外に希釈剤又は添加剤などを含むことができる。希釈剤としては、精製水、アルコール類（例えば、エタノール）、注射用蒸留水、生理用食塩水、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）、又はポリソルベート８０が挙げられる。また、希釈剤以外の添加剤としては、湿潤剤、懸濁剤、甘味剤、芳香剤、又は防腐剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解剤、又は溶解補助剤などを含むことができる。
【００３３】
本発明の医薬組成物の投与量は、有効成分の活性の強さ、症状、投与対象の年齢、又は性別等を考慮して、適宜決定することができる。例えば、経口投与の場合、その投与量は、通常、成人（体重６０ｋｇとして）において、１日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは０．１〜５０ｍｇである。非経口投与の場合、注射剤の形では、１日につき０．０１〜５０ｍｇ、好ましくは０．０１〜１０ｍｇである。
【００３４】
《薬物の投与方法》
本発明の薬物の投与方法は、前記高分子化合物及び薬物（特には、低膜透過性薬物）を混合する工程、及び薬物の有効量を治療対象に投与する工程を含む。本発明の薬物の投与方法においては、前記高分子化合物を限定することなく用いることができ、投与される薬物も特に限定されるものではない。更に、本発明の薬物の投与方法によれば、薬物を効率的に細胞に導入することができる。
【００３５】
《薬物投与用高分子化合物》
本発明の高分子化合物は、薬物（特には、低膜透過性薬物）の投与における使用のための高分子化合物である。すなわち、薬物投与用の高分子化合物であり、前記高分子化合物及び薬物を限定することなく、用いることができる。本発明の高分子化合物は、薬物を効率よく細胞に投与することができる。
【００３６】
《医薬組成物の製造への使用》
本発明の使用は、前記高分子化合物の医薬組成物の製造のための使用である。医薬組成物の製造においては、高分子化合物及び薬物を含む医薬組成物を製造する。医薬組成物の製造においては、本発明の高分子化合物を用いることを除いては、公知の医薬組成物の製造方法に従って、医薬組成物を製造することができる。
【００３７】
《作用》
本発明の高分子化合物が、効率的に薬物などの化合物を細胞内に導入できる機構は、詳細に解明されたわけではない。しかしながら、以下のように推定することができる。しかしながら、本発明は以下の推定によって限定されるものではない。
本発明の高分子化合物は、１個のアルギニンを含む側鎖、又は１個以上のアルギニンを含む２〜６鎖長の塩基性ペプチドを含む側鎖を有している。この側鎖に含まれるアルギニンはグアニジノ基を有しており、本発明の高分子化合物はグアニジノ基を０．５〜２０ｍｍｏｌ／ｇ含んでいる。前記の範囲のグアニジノ基を有していることにより、高分子化合物が細胞膜に近づいた時に、細胞のマクロピノサイトーシスが誘発されると考えられる。細胞は、アルギニン等を含む高分子化合物を、マクロピノサイトーシスにより取り込もうとするが、巨大分子である高分子化合物を取り込むことが困難である。一方、高分子化合物に共存する薬物などの化合物は、高分子化合物と比較して分子量が小さいために、細胞内に取り込まれると考えられる。すなわち、本発明の高分子化合物はグアニジノ基を０．５〜２０ｍｍｏｌ／ｇ含んでいることにより、細胞のマクロピノサイトーシスを誘発することが可能であり、それによって共存する薬物などの化合物が、細胞内に取り込まれると推定される。一方、高分子化合物の主鎖高分子は、１個のアルギニンを含む側鎖、又は１個以上のアルギニンを含む２〜６鎖長の塩基性ペプチドを含む側鎖を結合できれば、マクロピノサイトーシスを誘発でき、本発明の効果を発揮できると推定される。従って、本発明の高分子化合物において、前記主鎖高分子は特定の主鎖高分子に限定されるものではない。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、特に限定のない限り、実施例中の「部」や「％」は質量基準によるものである。【００３９】
《実施例１》
本実施例では、主鎖高分子として、アクリル酸／Ｎ−ビニルアセトアミド共重合体を用いて、１個のアルギニンを側鎖に有する高分子化合物を調製した。【００４０】
（アクリル酸／Ｎ−ビニルアセトアミド共重合体のスクシンイミド体の合成）
特開平０８−０８１４２８の実施例１４を参考に、アクリル酸ナトリウム３０．０ｇ及びＮ−ビニルアセトアミド７０．０ｇを原料として、常法に従って共重合体（ＮＶＡ−ＡＡＮａポリマー）を合成した。
続いて、カラム管に陽イオン交換樹脂（ＩＲ１２０Ｂ，オルガノ製）を充填し、５．０ｗｔ％ＮＶＡ−ＡＡＮａポリマー水溶液１３０．０ｇを２．６ｍＬ／ｍｉｎにて通液することで、ＮＶＡ−ＡＡポリマー水溶液を得た。得られたＮＶＡ−ＡＡポリマー水溶液を凍結乾燥し、ＮＶＡ−ＡＡポリマーを５．７ｇ得た。
３００ｍＬの５つ口フラスコに、ＮＶＡ−ＡＡポリマー（５．０ｇ）及びＤＭＦ（１４２．０ｇ）を仕込み、氷浴にて１０℃以下に冷却した。この溶液に、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドのＤＭＦ溶液５８．２ｇ（０．２ｇ／ｍＬ）を、２．０ｍＬ／ｍｉｎで滴下した。更に、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドのＤＭＦ溶液６６．２ｇ（０．４ｇ／ｍＬ）を、１．０ｍＬ／ｍｉｎで滴下した。氷浴下１時間攪拌した後、室温に昇温し２４時間撹拌した。反応溶液を吸引濾過して濾液を回収し、アセトニトリル２Ｌを用いて再沈殿した。その後、沈殿をアセトン２Ｌにて洗浄し吸引濾過により固体を回収した。得られた固体を減圧乾燥することでスクシンイミドエステル化されたＮＶＡ−ＡＡポリマー（ＮＶＡ−ＡＡポリマーＯＳｕ体）５．４ｇを得た。【００４１】
（塩基性ペプチドの導入）
ＮＶＡ−ＡＡポリマーＯＳｕ体１０．０ｍｇをＤＭＦ１．０ｍＬに溶解した。この溶液に、モノ−Ｌ−アルギニン（ＮＨ２−Ｒ１／Ｌ、メルク製）のＤＭＦ溶液（７７．５ｍｇ／ｍＬ）０．２ｍＬとトリエチルアミン（ＴＣＩ製）０．０２ｍＬを混合し、５０℃で２４時間撹拌した。その後イオン交換水１．０ｍＬで希釈し、セルロース透析チューブ（シームレスセルロースチューブ、スペクトラム製）に入れ、チューブの両端を縛った後、イオン交換水を用いて５日間透析を行った。精製後チューブ内液を凍結乾燥し、モノ−Ｌ−アルギニンが導入された高分子化合物（以下、ＮＶＡ−ＡＡ−Ｒ１／Ｌと称することがある）を１１．５ｍｇ得た。ＧＰＣ測定により、分子量３７５０００（ＰＥＧ／ＰＥＯ換算）であった。【００４２】
（グアニジノ基の測定）
得られた高分子化合物について、１Ｈ−ＮＭＲを測定することによりアルギニン由来の基の含量を求め、この結果から、高分子化合物あたりのグアニジノ基の密度を算出した。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ＝４．１６−３．７５（ｂｒ，１Ｈ），３．５０−３．３１（ｂｒ，０．６７Ｈ）
具体的には以下の手順で行った。まず、アルギニンが導入される前のＮＶＡ−ＡＡポリマーの１Ｈ−ＮＭＲを測定することにより、下記構造式（４）の「繰り返しユニット」のｘ／（ｙ＋ｚ）比を算出する。
続いて、下記式（４）の（＊１）の１つの水素原子と、（＊２）の２つの水素原子の積分値からｘ／ｚを算出する。これらの結果からｘ／ｙ／ｚ比が得られる。（実施例１では１４／１．３２／４．６８）
なお、ここでいう「繰り返しユニット」とは、高分子化合物の主鎖を構成するモノマー単位（実施例１ではＮ−ビニルアセトアミド由来部分、アクリル酸由来部分及びペプチド鎖の結合したアクリル酸由来部分）の構成比に基づく繰り返し構造をいう。主鎖がランダム共重合体の場合は、便宜上、構成比に基づくブロック状の配列が繰り返されるものとして「繰り返しユニット」として扱う。
１つの繰り返しユニット（実施例１ではｘ／ｙ／ｚ＝１４／１．３２／４．６８から成る）に含まれるグアニジノ基のモル数は、塩基性ペプチドに含まれるアルギニンの繰り返し数とｚを掛け合わせることによって、単位構造式中に含まれるグアニジノ基のモル数を算出することができる（なお、本実施例においては、アルギニンが１個であるため、アルギニンの繰り返し数は１である）。
得られた「グアニジノ基のモル数」を、上記ｘ／ｙ／ｚ比を有する単位構造式の分子量（便宜上の重量）で除することによって、高分子化合物のグアニジノ基の密度を算出した。結果を表１に示す。
【化４】
2020013265.tif 000005
【００４３】
《実施例２》
本実施例では、主鎖高分子として、アクリル酸／Ｎ−ビニルアセトアミド共重合体を用いて、２個のアルギニンを側鎖に有する高分子化合物を調製した。
モノ−Ｌ−アルギニンに代えて、２個のＬ−アルギニンからなる塩基性ペプチド（ＮＨ２−Ｒ２／Ｌ）を使用したことを除いては、実施例１の操作を繰り返して、２個のアルギニンが導入された高分子化合物（以下、ＮＶＡ−ＡＡ−Ｒ２／Ｌと称することがある）を１６．５ｍｇ得た。ＧＰＣ測定により、分子量４８２０００（ＰＥＧ／ＰＥＯ換算）であった。グアニジノ基の密度は実施例１と同様に算出した。結果を表１に示す。【００４４】
《実施例３》
本実施例では、主鎖高分子として、アクリル酸／Ｎ−ビニルアセトアミド共重合体を用いて、４個のアルギニンを側鎖に有する高分子化合物を調製した。
モノ−Ｌ−アルギニンに代えて、４個のＬ−アルギニンからなる塩基性ペプチド（ＮＨ２−Ｒ４／Ｌ）を使用したことを除いては、実施例１の操作を繰り返して、４個のアルギニンが導入された高分子化合物（以下、ＮＶＡ−ＡＡ−Ｒ４／Ｌと称することがある）を２０．３ｍｇ得た。ＧＰＣ測定により、分子量５３１０００（ＰＥＧ／ＰＥＯ換算）であった。グアニジノ基の密度は実施例１と同様に算出した。結果を表１に示す。【００４５】
《比較例１》
本比較例では、主鎖高分子として、アクリル酸／Ｎ−ビニルアセトアミド共重合体を用いて、８個のアルギニンを側鎖に有する高分子化合物を調製した。
モノ−Ｌ−アルギニンに代えて、８個のＬ−アルギニンからなる塩基性ペプチド（ＮＨ２−Ｒ８／Ｌ）を使用したことを除いては、実施例１の操作を繰り返して、８個のＬ−アルギニンが導入された高分子化合物（以下、ＮＶＡ−ＡＡ−Ｒ８／Ｌと称することがある）を１７．８ｍｇ得た。ＧＰＣ測定により、分子量６７１０００（ＰＥＧ／ＰＥＯ換算）であった。グアニジノ基の密度は実施例１と同様に算出した。結果を表１に示す。【００４６】
《比較例２》
本比較例では、主鎖高分子として、アクリル酸／Ｎ−ビニルアセトアミド共重合体を用いて、８個のアルギニンを側鎖に有する高分子化合物を調製した。
モノ−Ｌ−アルギニンに代えて、８個のＤ−アルギニンからなる塩基性ペプチドを使用したことを除いては、実施例１の操作を繰り返して、８個のＤ−アルギニンが導入された高分子化合物（以下、ＮＶＡ−ＡＡ−Ｒ８／Ｄと称することがある）を１７．８ｍｇ得た。ＧＰＣ測定により、分子量６１１０００（ＰＥＧ／ＰＥＯ換算）であった。グアニジノ基の密度は実施例１と同様に算出した。結果を表１に示す。【００４７】
《細胞への取り込みの評価》
前記実施例１〜３、及び比較例１〜２で得られた高分子化合物を用いて、細胞へのＦＩＴＣ−ＯＶＡの取り込みを測定した。
２４穴プレートの各ウエルに、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞（ＣＨＯ細胞）のＨａｍ’ｓＦ１２培地懸濁液（２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）５００μＬを播種し、炭酸ガスインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で２４時間、前培養した。上清を除去しリン酸緩衝生理食塩水５００μＬで２回洗浄した後、フルオレセイン標識−オボアルブミン（ＦＩＴＣ−ＯＶＡ；サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）のＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地溶液（終濃度５μｇ／ｍＬ）２５０μＬを添加した。次に、実施例１〜３及び比較例１〜２で得られた高分子化合物を、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地溶液に溶解した溶液（終濃度１μｇ／ｍＬ）２５０μＬ添加して、炭酸ガスインキュベーターで２時間培養した。上清の培地溶液を除去し、リン酸緩衝生理食塩水５００μＬで２回洗浄した後、トリプシンＥＤＴＡ溶液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）１００μＬを添加して、培養したＣＨＯ細胞をプレートから剥離、分散させた。次にトリパンブルー溶液４００μＬを添加して細胞を懸濁させ、マイクロチューブに回収した。回収した細胞懸濁液を、セルストレーナーを通過させ、フローサイトメトリーによりＭＦＩ（平均蛍光強度）を測定した。コントロールとして、アクリル酸／Ｎ−ビニルアセトアミド共重合体のみを添加したもの（主鎖高分子）、４個のアルギニンからなる塩基性ペプチドのみを添加したもの（Ｒ４／Ｌ）、ＦＩＴＣ−ＯＶＡのみを添加したもの（ＦＩＴＣ−ＯＶＡ）、細胞のみのもの（細胞）を実施した。結果を表１に示す。
細胞外のＦＩＴＣ−ＯＶＡはトリパンブルーにより消光して蛍光を発せず、細胞内に導入されたＦＩＴＣ−ＯＶＡのみが蛍光を発する。ＭＦＩは細胞１個当たりの蛍光強度の平均値を示すことから、ＭＦＩの値が大きい程、水溶性高分子化合物であるＦＩＴＣ−ＯＶＡが細胞内に取り込まれたことを表している。
また、フローサイトメトリー解析によりＦＩＴＣ−ＯＶＡの「取り込み効率」を算出した。「取り込み効率」とは、細胞のみ測定した場合の自家蛍光強度の最大値を基準とし、ＦＩＴＣ−ＯＶＡを細胞に取り込ませた際、基準値よりも大きい細胞数の割合を測定したものである。
結果を表１に示す。【００４８】
《細胞毒性の評価》
Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ＬＤＨ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ−ＷＳＴ（同仁化学）を用いて、細胞毒性を測定した。
９６穴プレートの各ウエルにＣＨＯ細胞のＨａｍ’ｓＦ１２培地懸濁液（２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）１００μＬを播種し、炭酸ガスインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で２４時間、前培養した。実施例１〜３および比較例１〜２で得られた高分子化合物をＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地溶液に溶解した溶液（終濃度５μｇ／ｍＬ）を２２０μＬ、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地を低コントロールウエルにＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地を２２０μＬ、高コントロールウエルに２００μＬ、バックグラウンドウエル（細胞のいないウエル）に２２０μＬ添加して、炭酸ガスインキュベーターで１．５時間培養した。その後、高コントロールウエルにＬｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ２０μＬを加え、炭酸ガスインキュベーター内で更に３０分間培養した。各ウエルから上清１００μＬを取り、測定用９６穴マイクロプレートに移した。すべてのウエルにＷｏｒｋｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  １００μＬ加え、遮光下、室温で３０分間呈色反応を実施し、その後すべてのウエルにＳｔｏｐ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ５０μＬを加えた。プレートリーダーを用いて４９０ｎｍの吸光度を測定し、細胞毒性（％）を算出した。結果を表１に示す。【００４９】
【表１】
2020013265.tif 000006
実施例１〜３で得られた高分子化合物を用いた場合、コントロールの４．０４〜４．３６のＭＦＩと比較して、３０．１３〜１６６．７０の高いＭＦＩを示した。また、細胞への取り込み効率についても、実施例２及び３の高分子化合物は、比較例１のものとほぼ同等の取り込み効率を示し、実施例１の高分子化合物も７６％の細胞に取り込まれていた。一方、細胞毒性については、比較例１−１及び１−２の８．７％及び８．９％と比較して、実施例１〜３の高分子化合物は、１．５％〜６．９％の低い細胞毒性を示した。【００５０】
《実施例４》
本実施例では、主鎖高分子として、ヒアルロン酸（分子量３０，０００）を用いて、２個のグリシン及び２個のアルギニンを側鎖に有する高分子化合物を調製した。
ヒアルロン酸（ＴＣＩ製、平均分子量：３０，０００）２０．０ｍｇを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．８ｍＬに６０℃にて攪拌することで溶解させた。この溶液に、０．１５ｍＬのＤＭＳＯに溶解した１８ｍｇのＮ−ヒドロキシコハク酸イミドを添加し、更に０．１５ｍＬのＤＭＳＯに溶解した３４．０ｍｇのジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を添加して、室温２４時間撹拌した。析出した固体を濾過により濾別し、スクシンイミドエステル化されたヒアルロン酸のＤＭＳＯ溶液を得た。このスクシンイミドエステル化されたヒアルロン酸のＤＭＳＯ溶液へ、２個のグリシン及び２個のＬ−アルギニンからなる塩基性ペプチド（ＮＨ２−Ｇ２Ｒ２／Ｌ、ＳＩＧＭＡ製）のＤＭＳＯ溶液（１１６ｍｇ／ｍＬ）０．４０ｍＬとトリエチルアミン（ＴＣＩ製）０．０４ｍＬを混合し、室温にて２４時間撹拌した。反応後、反応溶液をイオン交換水１ｍＬで希釈し、セルロース透析チューブ（シームレスセルロースチューブ、スペクトラム社製）に入れ、チューブ両端を縛った後、イオン交換水を用いて５日間透析を実施した。その後、チューブ内液を凍結乾燥し、２個のアルギニンが導入された高分子化合物（以下、ＨＡ（３０ｋ）−Ｇ２Ｒ２／Ｌと称することがある）を１４．０ｍｇ得た。【００５１】
（グアニジノ基の測定）
得られた高分子化合物（ＨＡ−Ｇ２Ｒ２／Ｌ）について、１Ｈ−ＮＭＲを測定することによりアルギニン由来の基の含量を求め、この結果から、高分子化合物あたりのグアニジノ基の密度を算出した。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ＝３．４５−３．３４（ｂｒ，１．６４Ｈ），２．２６−２．１２（ｂｒ，３Ｈ）
具体的には以下の手順で行った。
まず、下記式（５）の（＊３）の３つの水素原子と、（＊４）の２つの水素原子の積分値から、ｌ／ｍ比を算出する。（実施例４では０．４１／０．５９）
１つの繰り返しユニット（実施例４ではｌ／ｍ＝０．４１／０．５９から成る）に含まれるグアニジノ基のモル数は、塩基性ペプチドに含まれるアルギニンの繰り返し数とｌを掛け合わせることによって、単位構造式中に含まれるグアニジノ基のモル数を算出することができる（なお、本実施例４においては、アルギニンが２個であるため、アルギニンの繰り返し数は２である）。
得られた「グアニジノ基のモル数」を、下記ｌ／ｍ比を有する単位構造式の分子量（便宜上の重量）で除することによって、高分子化合物のグアニジノ基の密度を算出した。結果を表２に示す。
【化５】
2020013265.tif 000007
【００５２】
《実施例５》
本実施例では、主鎖高分子として、分子量２２万のヒアルロン酸を用いて、２個のグリシン及び２個のアルギニンを側鎖に有する高分子化合物を調製した。
分子量３万のヒアルロン酸に代えて分子量２２万のヒアルロン酸を用いたことを除いては、実施例４の操作を繰り返して、２個のグリシン及び２個のＬ−アルギニンが導入された高分子化合物（以下、ＨＡ（２２０ｋ）−Ｇ２Ｒ２と称することがある）を２１．０ｍｇ得た。
本実施例では、グアニジノ基濃度の異なる２種類のＨＡ（２２０ｋ）−Ｇ２Ｒ２／Ｌを得た。表２においては、それぞれ実施例５−１、及び実施例５−２と記載する。グアニジノ基の密度は実施例４と同様に算出した。結果を表２に示す。【００５３】
《細胞への取り込みの評価》
前記実施例４〜５で得られた高分子化合物を用いて、細胞へのＦＩＴＣ−ＢＳＡの取り込みを測定した。ＦＩＴＣ−ＯＶＡに代えて、フルオレセイン標識−牛血清アルブミン（ＦＩＴＣ−ＢＳＡ；サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用い、実施例４〜５で得られた高分子化合物、主鎖高分子、Ｇ２Ｒ２を添加する際の濃度、およびＦＩＴＣ−ＢＳＡの濃度を変更したことを除いては、前記実施例１〜３、及び比較例１〜２の細胞への取り込みの評価の操作を繰り返した。結果を表２に示す。【００５４】
【表２】
2020013265.tif 000008
実施例４〜５で得られた高分子化合物を用いた場合、コントロールの４．２６〜５．０５のＭＦＩと比較して、４２．７１〜１７６１．４８の高いＭＦＩを示した。【００５５】
≪実施例６≫
本実施例では、主鎖高分子として、γ−ポリグルタミン酸（以下、γ−ＰＧＡと略記する）を用いて、１個のアルギニンを側鎖に有する高分子化合物を調整した。【００５６】
(γ-ＰＧＡのスクシンイミド体の合成)
γ-ＰＧＡ（和光純薬工業製、平均分子量２００,０００〜５００,０００）１０ｍｇ及びＤＭＳＯ１．０ｍＬを仕込み、７０℃で撹拌溶解した後、室温まで冷却した。この溶液にＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドのＤＭＳＯ溶液２４８．８ｍｇ（０．１２ｇ／ｍＬ）及び、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドのＤＭＳＯ溶液２３６．３ｍｇ（０．０６７ｇ／ｍＬ）を混合し、室温で２４時間撹拌した。続いて、反応溶液を吸引濾過し濾液を回収することで、スクシンイミド化されたγ−ＰＧＡ（γ−ＰＧＡ−ＯＳｕ体）のＤＭＳＯ溶液を得た。【００５７】
（塩基性ペプチドの導入）
γ−ＰＧＡ−ＯＳｕ体のＤＭＳＯ溶液に、モノ−Ｌ−アルギニン（ＮＨ２−Ｒ１／Ｌ、メルク製）のＤＭＳＯ溶液（７２．３ｍｇ／ｍＬ）４２８．９ｍｇとトリエチルアミン（ＴＣＩ製）０．０２ｍＬを混合し、室温で２４時間撹拌した。その後イオン交換水２．０ｍＬで希釈し、セルロース透析チューブ（シームレスセルロースチューブ、スペクトラム製）に入れ、チューブの両端を縛った後、イオン交換水を用いて５日間透析を行った。精製後チューブ内液を凍結乾燥し、ジ−Ｌ−アルギニンが導入された高分子化合物（以下、γ−ＰＧＡ−Ｒ２／Ｌと称することがある）を８．８ｍｇ得た。ＧＰＣ測定により、分子量７，１８０（ＰＥＧ／ＰＥＯ換算）であった。【００５８】
（グアニジノ基の測定）
得られた高分子化合物（γ−ＰＧＡ−Ｒ１／Ｌ）について、１Ｈ−ＮＭＲを測定することによりアルギニン由来の基の含量を求め、この結果から、高分子化合物あたりのグアニジノ基の密度を算出した。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ＝３．２０−３．０５（ｂｒ，０．６７Ｈ），２．４９−２．１９（ｂｒ，１Ｈ）
具体的には以下の手順で行った。
まず、下記式（６）の（＊５）の２つの水素原子と、（＊６）の２つの水素原子の積分値から、ｐ／ｑ比を算出する。（実施例６では０．３３／０．６７）
１つの繰り返しユニット（実施例６ではｐ／ｑ＝０．３３／０．６７から成る）に含まれるグアニジノ基のモル数は、塩基性ペプチドに含まれるアルギニンの繰り返し数とｑを掛け合わせることによって、単位構造式中に含まれるグアニジノ基のモル数を算出することができる（なお、本実施例６においては、アルギニンが１個であるため、アルギニンの繰り返し数は１である）。
得られた「グアニジノ基のモル数」を、下記ｐ／ｑ比を有する単位構造式の分子量（便宜上の重量）で除することによって、高分子化合物のグアニジノ基の密度を算出した。結果を表３に示す。
【化６】
2020013265.tif 000009
【００５９】
《実施例７》
本実施例では、主鎖高分子として、γ−ＰＧＡを用いて、２個のアルギニンを側鎖に有する高分子化合物を調製した。
モノ−Ｌ−アルギニンに代えて、２個のＬ−アルギニンからなる塩基性ペプチド（ＮＨ２−Ｒ２／Ｌ）を使用したことを除いては、実施例６の操作を繰り返して、２個のアルギニンが導入された高分子化合物（以下、γ−ＰＧＡ−Ｒ２／Ｌと称することがある）を２０．２ｍｇ得た。ＧＰＣ測定により、分子量１３，９００（ＰＥＧ／ＰＥＯ換算）であった。グアニジノ基の密度は実施例６と同様に算出した。結果を表３に示す。【００６０】
《実施例８》
本実施例では、主鎖高分子として、γ−ＰＧＡを用いて、４個のアルギニンを側鎖に有する高分子化合物を調製した。
モノ−Ｌ−アルギニンに代えて、４個のＬ−アルギニンからなる塩基性ペプチド（ＮＨ２−Ｒ４／Ｌ）を使用したことを除いては、実施例６の操作を繰り返して、４個のアルギニンが導入された高分子化合物（以下、γ−ＰＧＡ−Ｒ４／Ｌと称することがある）を２１．１ｍｇ得た。ＧＰＣ測定により、分子量７,６３０（ＰＥＧ／ＰＥＯ換算）であった。グアニジノ基の密度は実施例６と同様に算出した。結果を表３に示す。【００６１】
《実施例９》
本実施例では、主鎖高分子として、γ−ＰＧＡを用いて、１個のグリシン及び２個のアルギニンを側鎖に有する高分子化合物を調製した。
モノ−Ｌ−アルギニンに代えて、１個のグリシン及び２個のＬ−アルギニンからなる塩基性ペプチド（ＮＨ２−Ｇ１Ｒ２／Ｌ）を使用したことを除いては、実施例６の操作を繰り返して、１個のグリシン及び２個のアルギニンが導入された高分子化合物（以下、γ−ＰＧＡ−Ｇ１Ｒ２／Ｌと称することがある）を２９．３ｍｇ得た。ＧＰＣ測定により、分子量１４，０００（ＰＥＧ／ＰＥＯ換算）であった。グアニジノ基の密度は実施例６と同様に算出した。結果を表３に示す。【００６２】
《細胞への取り込みの評価》
前記実施例６〜１０で得られた高分子化合物を用いて、細胞へのＦＩＴＣ−ＯＶＡの取り込みを測定した。
２４穴プレートの各ウエルに、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞（ＣＨＯ細胞）のＨａｍ’ｓＦ１２培地懸濁液（２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）５００μＬを播種し、炭酸ガスインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で２４時間、前培養した。上清を除去しリン酸緩衝生理食塩水５００μＬで２回洗浄した後、フルオレセイン標識−オボアルブミン（ＦＩＴＣ−ＯＶＡ；サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）のＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地溶液（終濃度１μｇ／ｍＬ）２５０μＬを添加した。次に、実施例６〜１０で得られた高分子化合物を、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地溶液に溶解した溶液（終濃度５μｇ／ｍＬ）２５０μＬ添加して、炭酸ガスインキュベーターで２時間培養した。上清の培地溶液を除去し、リン酸緩衝生理食塩水５００μＬで２回洗浄した後、トリプシンＥＤＴＡ溶液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）１００μＬを添加して、培養したＣＨＯ細胞をプレートから剥離、分散させた。次にトリパンブルー溶液４００μＬを添加して細胞を懸濁させ、マイクロチューブに回収した。回収した細胞懸濁液を、セルストレーナーを通過させ、フローサイトメトリーによりＭＦＩ（平均蛍光強度）を測定した。コントロールとして、γ−ＰＧＡのみを添加したもの（主鎖高分子）、４個のアルギニンからなる塩基性ペプチドのみを添加したもの（Ｒ４／Ｌ）、ＦＩＴＣ−ＯＶＡのみを添加したもの（ＦＩＴＣ−ＯＶＡ）、細胞のみのもの（細胞）を実施した。結果を表３に示す。
細胞外のＦＩＴＣ−ＯＶＡはトリパンブルーにより消光して蛍光を発せず、細胞内に導入されたＦＩＴＣ−ＯＶＡのみが蛍光を発する。ＭＦＩは細胞１個当たりの蛍光強度の平均値を示すことから、ＭＦＩの値が大きい程、水溶性高分子化合物であるＦＩＴＣ−ＯＶＡが細胞内に取り込まれたことを表している。
また、フローサイトメトリー解析によりＦＩＴＣ−ＯＶＡの「取り込み効率」を算出した。「取り込み効率」とは、細胞のみ測定した場合の自家蛍光強度の最大値を基準とし、ＦＩＴＣ−ＯＶＡを細胞に取り込ませた際、基準値よりも大きい細胞数の割合を測定したものである。
結果を表３に示す。【００６３】
《細胞毒性の評価》
Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ＬＤＨ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ−ＷＳＴ（同仁化学）を用いて、細胞毒性を測定した。
９６穴プレートの各ウエルにＣＨＯ細胞のＨａｍ’ｓＦ１２培地懸濁液（２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）１００μＬを播種し、炭酸ガスインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で２４時間、前培養した。実施例６〜１０で得られた高分子化合物をＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地溶液に溶解した溶液（終濃度５μｇ／ｍＬ）を２２０μＬ、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地を低コントロールウエルにＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地を２２０μＬ、高コントロールウエルに２００μＬ、バックグラウンドウエル（細胞のいないウエル）に２２０μＬ添加して、炭酸ガスインキュベーターで１．５時間培養した。その後、高コントロールウエルにＬｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ２０μＬを加え、炭酸ガスインキュベーター内でさらに３０分間培養した。各ウエルから上清１００μＬを取り、測定用９６穴マイクロプレートに移した。すべてのウエルにＷｏｒｋｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  １００μＬ加え、遮光下、室温で３０分間呈色反応を実施し、その後すべてのウエルにＳｔｏｐ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ５０μＬを加えた。プレートリーダーを用いて４９０ｎｍの吸光度を測定し、細胞毒性（％）を算出した。結果を表３に示す。【００６４】
【表３】
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実施例６〜９で得られた高分子化合物を用いた場合、コントロールの３．２〜４．４のＭＦＩと比較して、１３〜３６の高いＭＦＩを示した。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明の高分子化合物は、低膜透過性の薬剤などの細胞への導入に用いることができる。
【国際調査報告】
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