(57)【要約】  ４−ニトロフェニルアラニンから４−アミノ桂皮酸を製造する新規な方法を提供する。本方法は、（１）４−ニトロフェニルアラニンを４−ニトロ桂皮酸に転換し、（２）４−ニトロ桂皮酸を４−アミノ桂皮酸に転換することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
４−ニトロフェニルアラニンから４−アミノ桂皮酸を製造する方法であって、
（１）４−ニトロフェニルアラニンを４−ニトロ桂皮酸に変換し、
（２）４−ニトロ桂皮酸を４−アミノ桂皮酸に変換する
ことを含む方法。
【請求項２】
前記（１）の変換が、配列番号１、３、又は５で表されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、４−ニトロフェニルアラニンを４−ニトロ桂皮酸に変換する活性を有する第１の酵素を用いて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記（１）の変換が、前記第１の酵素を発現するよう改変された第１の宿主細胞を用いて行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の宿主細胞が微生物である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記微生物が細菌である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記（１）の変換が、前記第１の宿主細胞である細菌の休止菌体を用いた休止菌体反応により行われる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記（２）の変換が、配列番号７、９、１１、１３又は１５で表されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、４−ニトロ桂皮酸を４−アミノ桂皮酸に変換する活性を有する第２の酵素を用いて行われる、請求項１〜６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記（２）の変換が、前記第２の酵素を発現する第２の宿主細胞を用いて行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第２の宿主細胞が、前記第２の酵素を発現するよう改変された宿主細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記第２の宿主細胞が微生物である、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
前記微生物が細菌である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記（２）の変換が、前記第２の宿主細胞である細菌の休止菌体を用いた休止菌体反応により行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記休止菌体が培養菌体、粉末菌体、及び固定化菌体からなる群から選択される、請求項６又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記（２）の変換がｐＨ８〜９で行われる、請求項７〜１３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
グルコースから４−アミノ桂皮酸を製造する方法であって、
（ａ）グルコースからフェニルアラニンを産生し、
（ｂ）前記（ａ）で得られたフェニルアラニンをニトロ化して４−ニトロフェニルアラニンに変換し、
（ｃ）請求項１〜１４の何れか一項に記載の方法により、前記（ｂ）で得られた４−ニトロフェニルアラニンから４−アミノ桂皮酸を製造する
ことを含む方法。
【請求項１６】
フェニルアラニンから４−アミノ桂皮酸を製造する方法であって、
（ｂ）フェニルアラニンをニトロ化して４−ニトロフェニルアラニンに変換し、
（ｃ）請求項１〜１４の何れか一項に記載の方法により、前記（ｂ）で得られた４−ニトロフェニルアラニンから４−アミノ桂皮酸を製造する
ことを含む方法。
【請求項１７】
４−ニトロフェニルアラニンから４−ニトロ桂皮酸を製造する方法であって、配列番号１、３、又は５で表されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、４−ニトロフェニルアラニンを４−ニトロ桂皮酸に変換する活性を有する第１の酵素を用いることを含む方法。
【請求項１８】
４−ニトロ桂皮酸から４−アミノ桂皮酸を製造する方法であって、配列番号７、９、１１、１３又は１５で表されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、４−ニトロ桂皮酸を４−アミノ桂皮酸に変換する活性を有する第２の酵素を用いることを含む方法。
【請求項１９】
配列番号１、３、又は５で表されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、４−ニトロフェニルアラニンを４−ニトロ桂皮酸に変換する活性を有する第１の酵素をコードする核酸を担持するベクター。
【請求項２０】
配列番号７、９、１１、１３又は１５で表されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、４−ニトロ桂皮酸を４−アミノ桂皮酸に変換する活性を有する第２の酵素をコードする核酸を担持するベクター。
【請求項２１】
配列番号１、３、又は５で表されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、４−ニトロフェニルアラニンを４−ニトロ桂皮酸に変換する活性を有する第１の酵素を発現するよう改変された宿主細胞。
【請求項２２】
配列番号７、９、１１、１３又は１５で表されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、４−ニトロ桂皮酸を４−アミノ桂皮酸に変換する活性を有する第２の酵素を発現するよう改変された宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオマス由来の芳香族ポリマーの原料モノマーとして有用な４−アミノ桂皮酸を製造するための新規な方法、並びに、斯かる方法に用いられる新規なベクター及び宿主細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
石油資源の枯渇に対する懸念や二酸化炭素排出問題により、再生可能な資源であるバイオマスを利用して燃料・化成品等を生産するシステムの重要性が高まっている。バイオマス由来のポリマーとしては、脂肪族系ポリマーと芳香族ポリマーとが挙げられるが、現在のところ研究・開発が進んでいるのは、主にポリ乳酸を始めとする脂肪族系ポリマーである。ポリ乳酸は耐熱性・耐久性が低いという課題があったが、結晶化度の向上等によりこれらの課題は改善されつつある。一方、芳香族ポリマーは熱安定性や力学強度等の点で優れた物質特性を示すことが多く、エンジニアリングプラスチックの原料等としての利用が期待される。【０００３】
バイオマス由来の芳香族ポリマーの原料モノマーとして特に注目されるのは、４−アミノ桂皮酸である。例えば特許文献１及び非特許文献１には、４−アミノ桂皮酸を原料として高耐熱性の優れた芳香族ポリマーを合成する方法が報告されている。よって、斯かる高耐熱ポリマーの原料のモノマーとして、バイオマスから４−アミノ桂皮酸を高効率で合成することが求められている。【０００４】
本発明者等は、バイオマスのグルコースから４−アミノ桂皮酸を合成する方法として、微生物由来の酵素を用い、まずグルコースからコリスミ酸及び４−アミノフェニルピルビン酸を経て４−アミノフェニルアラニンを合成し（特許文献２）、次いでこの４−アミノフェニルアラニンを４−アミノ桂皮酸に変換する（特許文献３）という経路を開発している。【０００５】
【化１】
2019168203.tif 000002
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１３／０７３５１９号
【特許文献２】国際公開第２０１５／１４１７９１号
【特許文献３】国際公開第２０１５／１１９２５１号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Suvannasara et al., Macromolecules, (2014), 47[5]1586-1593
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者等による前述の４−アミノ桂皮酸の合成法は、優れた方法ではあるものの、反応速度や反応効率等の点でまだ改善の余地があった。【０００９】
本発明の目的は、４−アミノ桂皮酸を合成する新規な方法の提供にある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等は鋭意検討の結果、グルコースからの合成経路が知られている４−ニトロフェニルアラニンを用いて、これをまず４−ニトロ桂皮酸に変換し、次いで４−ニトロ桂皮酸を４−アミノ桂皮酸に変換することにより、グルコースから４−アミノ桂皮酸を合成する新規な経路を確立できることに想到した。更に、４−ニトロフェニルアラニンから４−ニトロ桂皮酸への変換、及び、４−ニトロ桂皮酸から４−アミノ桂皮酸への変換の双方を、生物由来の適切な酵素を用いて実現できることを見出し、本発明を完成させた。【００１１】
即ち、本発明の要旨は以下に存する。
［１］４−ニトロフェニルアラニンから４−アミノ桂皮酸を製造する方法であって、
（１）４−ニトロフェニルアラニンを４−ニトロ桂皮酸に変換し、
（２）４−ニトロ桂皮酸を４−アミノ桂皮酸に変換する
ことを含む方法。
［２］前記（１）の変換が、配列番号１、３、又は５で表されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、４−ニトロフェニルアラニンを４−ニトロ桂皮酸に変換する活性を有する第１の酵素を用いて行われる、［１］の方法。
［３］前記（１）の変換が、前記第１の酵素を発現するよう改変された第１の宿主細胞を用いて行われる、［２］の方法。
［４］前記第１の宿主細胞が微生物である、［３］の方法。
［５］前記微生物が細菌である、［４］の方法。
［６］前記（１）の変換が、前記第１の宿主細胞である細菌の休止菌体を用いた休止菌体反応により行われる、［５］の方法。
［７］前記（２）の変換が、配列番号７、９、１１、１３又は１５で表されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、４−ニトロ桂皮酸を４−アミノ桂皮酸に変換する活性を有する第２の酵素を用いて行われる、［１］〜［６］の方法。
［８］前記（２）の変換が、前記第２の酵素を発現する第２の宿主細胞を用いて行われる、［７］の方法。
［９］前記第２の宿主細胞が、前記第２の酵素を発現するよう改変された宿主細胞である、［８］に記載の方法。
［１０］前記第２の宿主細胞が微生物である、［８］又は［９］の方法。
［１１］前記微生物が細菌である、［１０］の方法。
［１２］前記（２）の変換が、前記第２の宿主細胞である細菌の休止菌体を用いた休止菌体反応により行われる、［１１］の方法。
［１３］前記休止菌体が培養菌体、粉末菌体、及び固定化菌体からなる群から選択される、［６］又は［１２］の方法。
［１４］前記（２）の変換がｐＨ８〜９で行われる、［７］〜［１３］の方法。
［１５］グルコースから４−アミノ桂皮酸を製造する方法であって、
（ａ）グルコースからフェニルアラニンを産生し、
（ｂ）前記（ａ）で得られたフェニルアラニンをニトロ化して４−ニトロフェニルアラニンに変換し、
（ｃ）［１］〜［１４］の方法により、前記（ｂ）で得られた４−ニトロフェニルアラニンから４−アミノ桂皮酸を製造する
ことを含む方法。
［１６］フェニルアラニンから４−アミノ桂皮酸を製造する方法であって、
（ｂ）フェニルアラニンをニトロ化して４−ニトロフェニルアラニンに変換し、
（ｃ）［１］〜［１４］の方法により、前記（ｂ）で得られた４−ニトロフェニルアラニンから４−アミノ桂皮酸を製造する
ことを含む方法。
［１７］４−ニトロフェニルアラニンから４−ニトロ桂皮酸を製造する方法であって、配列番号１、３、又は５で表されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、４−ニトロフェニルアラニンを４−ニトロ桂皮酸に変換する活性を有する第１の酵素を用いることを含む方法。
［１８］４−ニトロ桂皮酸から４−アミノ桂皮酸を製造する方法であって、配列番号７、９、１１、１３又は１５で表されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、４−ニトロ桂皮酸を４−アミノ桂皮酸に変換する活性を有する第２の酵素を用いることを含む方法。
［１９］配列番号１、３、又は５で表されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、４−ニトロフェニルアラニンを４−ニトロ桂皮酸に変換する活性を有する第１の酵素をコードする核酸を担持するベクター。
［２０］配列番号７、９、１１、１３又は１５で表されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、４−ニトロ桂皮酸を４−アミノ桂皮酸に変換する活性を有する第２の酵素をコードする核酸を担持するベクター。
［２１］配列番号１、３、又は５で表されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、４−ニトロフェニルアラニンを４−ニトロ桂皮酸に変換する活性を有する第１の酵素を発現するよう改変された宿主細胞。
［２２］配列番号７、９、１１、１３又は１５で表されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、４−ニトロ桂皮酸を４−アミノ桂皮酸に変換する活性を有する第２の酵素を発現するよう改変された宿主細胞。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、グルコースから４−アミノ桂皮酸を合成する新規な方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、大腸菌での組換産生後に精製したＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、及びＲｇＰＡＬのフェニルアラニン（Ｐｈｅ）及び４−ニトロフェニルアラニン（ｎ−Ｐｈｅ）に対する脱アンモニア酵素活性を示す表である。
【図２】図２は、大腸菌での組換産生後に休止菌体反応に供したＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、及びＲｇＰＡＬによる４−ニトロフェニルアラニンから４−ニトロ桂皮酸への変換活性を示すグラフである。
【図３】図３は、大腸菌での組換産生後に休止菌体反応に供したＣａｍＰＡＬによる４−ニトロフェニルアラニンから４−ニトロ桂皮酸への変換反応の結果を経時的に示すグラフである。
【図４】図４は、大腸菌での組換産生後に休止菌体反応に供したｓｃＦｒｍ２、ｓｃＨｂｎ１、及びｃｄＦＬＤＺによる４−ニトロ桂皮酸から４−アミノ桂皮酸への変換活性を示すグラフである。
【図５】図５は、各菌体量及び各基質量における４−ニトロフェニルアラニンから４−ニトロ桂皮酸への変換活性を示す表である。
【図６】図６は、ＣａｍＰＡＬ産生大腸菌を１．２Ｌ培養後に反応器内での変換反応による４−ニトロフェニルアラニンから４−ニトロ桂皮酸への変換反応の結果を経時的に示したグラフである。
【図７】図７は、精製した４−ニトロ桂皮酸のＨＰＬＣ分析の結果を示すグラフである。
【図８】図８は、ＣａｍＰＡＬ産生大腸菌の培養液にグルコース、フルクトース及びグルセロールを添加して４−ニトロ桂皮酸から４−アミノ桂皮酸（４ＡＣＡ）への変換を行った際の結果を示すグラフである。
【図９】図９は、ＣａｍＰＡＬ産生大腸菌による４−ニトロフェニルアラニンから４−アミノ桂皮酸への変換活性を示すグラフである。
【図１０】図１０は、精製した４ＡＣＡ塩酸塩と４ＡＣＡ（標品）のＨＰＬＣ分析の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を具体的な実施の形態に即して詳細に説明する。但し、本発明は以下の実施の形態に束縛されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、任意の形態で実施することが可能である。
【００１５】
なお、本明細書において「核酸」には、リボ核酸、デオキシリボ核酸、又は何れの核酸の修飾体も含まれる。また、核酸には、一本鎖又は二本鎖の何れも含まれる。また、本発明に係る核酸（遺伝子）は、当業者に公知の公的機関のデータベース又は本明細書に開示する塩基配列に基づき作製したプライマー又はプローブ等を用いて、当業者に公知の任意の方法で調製することができる。例えば、各種のＰＣＲその他の当業者に公知のＤＮＡ増幅技術を用いることにより、該遺伝子のｃＤＮＡとして容易に得ることができる。あるいは、当業者であれば、本明細書中に開示する配列情報に基づいて、適宜既存技術を用いて、核酸を合成することができる。核酸（遺伝子）は、タンパク質又はポリペプチドをコードするものである。ここで、「コードする」とは、本発明に係るタンパク質又はポリペプチドをその活性を備えた状態で発現させるということを意味している。また、「コードする」とは、本発明に係るタンパク質を連続する構造配列（エクソン）としてコードすることと、該タンパク質を適当な介在配列（イントロン）を介してコードすることの両者を含む。
【００１６】
［Ｉ．４−ニトロフェニルアラニンから４−アミノ桂皮酸を製造する方法］
１．概要
本発明の第一の要旨は、４−ニトロフェニルアラニンから４−アミノ桂皮酸を製造する方法（以下適宜「本発明の第一の方法」と略称する。）に関する。本発明の第一の方法は、少なくとも（１）４−ニトロフェニルアラニンを４−ニトロ桂皮酸に変換する工程、及び（２）４−ニトロ桂皮酸を４−アミノ桂皮酸に変換する工程を含む。
【００１７】
グルコースから発酵によりフェニルアラニンを合成する方法（例えば米国特許出願公開第２００１／００４４１３９号：以下文献Ａ、参照）、及び、フェニルアラニンをニトロ化して４−ニトロフェニルアラニンを合成する方法（例えばTakayama et al., BCSJ, 17[3]:109-113：以下文献Ｂ、参照）は、何れも公知である。
【００１８】
そこで本発明者等は、出発原料として４−ニトロフェニルアラニンに着目し、まずこれを４−ニトロ桂皮酸に変換し、次いでこれを４−アミノ桂皮酸に変換することで、グルコースからフェニルアラニン→４−ニトロフェニルアラニン→４−ニトロ桂皮酸を介して４−アミノ桂皮酸を合成する新規な合成経路を確立できることに想到した。
【００１９】
【化２】
2019168203.tif 000003
【００２０】
本発明の第一の方法に含まれる２つの工程は、いずれも生物的手法、化学的手法等の各種の方法を用いることができる。
【００２１】
また、本発明者等は、４−ニトロフェニルアラニンを４−ニトロ桂皮酸に変換する方法の検討に際し、生物由来の広範な酵素を対象として、４−ニトロフェニルアラニンを４−ニトロ桂皮酸に変換する酵素（フェニルアラニンアンモニアリアーゼ）を探索した。探索の結果、本発明者等は、チャノキ（Camellia sinensis）由来の酵素であるＣａｍＰＡＬ、ムラサキ（Lithospermum erythrorhizon）由来の酵素であるＬｉｅＰＡＬ、及び、ロドトルラ・グルチニス（Rhodotorula glutinis）ＪＮ−１由来の酵素であるＲｇＰＡＬを選抜した。
【００２２】
また、４−ニトロ桂皮酸を４−アミノ桂皮酸に変換する方法としては、公知の化学的方法によるニトロ基の還元反応を用いることができるが、本発明者等は更に、４−ニトロ桂皮酸を４−アミノ桂皮酸に変換する変換酵素（ニトロレダクターゼ）を探索した。探索の結果、本発明者等は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来の酵素であるｓｃＦｒｍ２及びｓｃＨｂｎ１、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）由来の酵素であるｃｄＦＬＤＺ、並びに大腸菌（Escherichia coli）由来の酵素であるｎｆｓＡ及びｎｆｓＢを選抜した。
【００２３】
更に本発明者等は、これらの酵素を発現する宿主細胞を用いて、４−ニトロフェニルアラニンを４−ニトロ桂皮酸に、次いで４−ニトロ桂皮酸を４−アミノ桂皮酸に変換することに成功し、本発明の第一の方法を完成させた。
【００２４】
本発明の第一の方法を、前述した公知の方法である、グルコースの発酵によるフェニルアラニンの合成方法（前記文献Ａ参照）、及び、フェニルアラニンのニトロ化による４−ニトロフェニルアラニンの合成方法（前記文献Ｂ参照）と組み合わせれば、グルコースからフェニルアラニン→４−ニトロフェニルアラニン→４−ニトロ桂皮酸を介する新規な合成経路により、４−アミノ桂皮酸を製造することが可能となる。しかも、後述の実施例に示すように、本発明の第一の方法を介するグルコースからの４−アミノ桂皮酸の合成は、本発明者等による従来法（特許文献２及び３）と比較して、反応速度や反応効率等の面で優れており、有利であると言える。
【００２５】
以下、本発明の第一の方法について、詳細に説明する。
【００２６】
２．出発物質：４−ニトロフェニルアラニン
本発明の第一の方法では、出発原料として４−ニトロフェニルアラニンを用いる。４−ニトロフェニルアラニンの種類は制限されず、天然のものでも合成されたものでもよい。４−ニトロフェニルアラニンを合成する種々の手法については後述する。
【００２７】
３．工程（１）：４−ニトロフェニルアラニンの４−ニトロ桂皮酸への変換
本発明の第一の方法では、まず工程（１）として、４−ニトロフェニルアラニンを４−ニトロ桂皮酸へと変換する。本工程（１）を実施する手法は制限されず、例えば生物的手法や化学的手法等、任意の手法を用いることができる。中でも、本発明では４−ニトロフェニルアラニンを４−ニトロ桂皮酸へと変換する酵素（ニトロフェニルアラニンアンモニアリアーゼ：以下適宜「第一の酵素」という。）を用いて、工程（１）を実施することが好ましい。
【００２８】
前記第一の酵素の例としては、チャノキ（Camellia sinensis）由来の酵素であるＣａｍＰＡＬ、ムラサキ（Lithospermum erythrorhizon）由来の酵素であるＬｉｅＰＡＬ、及び、酵母ロドトルラ・グルチニス（Rhodotorula glutinis）ＪＮ−１由来の酵素であるＲｇＰＡＬが挙げられる。ＣａｍＰＡＬタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１に、これをコードするＣａｍＰＡＬ遺伝子の塩基配列の例（大腸菌での発現用にコドンを補正したもの）を配列番号２にそれぞれ示す。また、ＬｉｅＰＡＬタンパク質のアミノ酸配列を配列番号３に、これをコードするＬｉｅＰＡＬ遺伝子の塩基配列の例（大腸菌での発現用にコドンを補正したもの）を配列番号４にそれぞれ示す。また、ＲｇＰＡＬタンパク質のアミノ酸配列を配列番号５に、これをコードするＲｇＰＡＬ遺伝子の塩基配列の例（大腸菌での発現用にコドンを補正したもの）を配列番号６にそれぞれ示す。
【００２９】
ＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、及びＲｇＰＡＬは、後述の実施例に示すように、生物由来の既知のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（phenylalanine ammonia lyase：ＰＡＬ）の中から、本発明者等が探索して得られた酵素である。ＰＡＬはフェニルアラニンを基質とし、これを脱アンモニアして桂皮酸を産生する酵素である。ＰＡＬによるフェニルアラニンの脱アンモニアにより桂皮酸を産生する反応と、ここで目的とする４−ニトロフェニルアラニンの脱アンモニアにより４−ニトロ桂皮酸を産生する反応とは、類似するものの、後者では基質のベンゼン環の４位にあるニトロ基が存在する点で異なる。予想外にも、ＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、及びＲｇＰＡＬは、後述の実施例に示すように、優れた４−ニトロフェニルアラニンから４−ニトロ桂皮酸への変換活性を有し、本発明において好適に使用することができる。
【００３０】
なお、前述のようにＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、及びＲｇＰＡＬは公知の酵素であり、そのアミノ酸配列も公知であるが、これらがニトロ化合物を基質として利用でき、４−ニトロフェニルアラニンから４−ニトロ桂皮酸への変換活性を有とすることは、これまで知られておらず、本発明者等が初めて見出した知見である。
【００３１】
前記第一の酵素の例としては、ＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、及びＲｇＰＡＬのみならず、それらの類似体であって、４−ニトロフェニルアラニンを４−ニトロ桂皮酸へと変換する活性を維持するポリペプチドも挙げられる。ＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、又はＲｇＰＡＬの類似体としては、例えばそのホモログ（オルソログ及びパラログを含む）、又はそのフラグメントが挙げられる。
【００３２】
具体的に、第一の酵素は、配列番号１、３、又は５のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、特に好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列相同性を有することが望ましい。また、第一の酵素は、配列番号１、３、又は５のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、特に好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有することが望ましい。
【００３３】
ここで、２つのアミノ酸配列の「相同性」とは、両アミノ酸配列をアラインメントした際に各対応箇所に同一又は類似のアミノ酸残基が現れる比率であり、２つのアミノ酸配列の「同一性」とは、両アミノ酸配列をアラインメントした際に各対応箇所に同一のアミノ酸残基が現れる比率である。なお、２つのアミノ酸配列の「相同性」及び「同一性」は、例えばBLAST（Basic Local Alignment Search Tool）プログラム（Altschul et al., J. Mol. Biol., (1990), 215(3):403-10）等を用いて求めることが可能である。
【００３４】
また、前記第一の酵素は、配列番号１、３、又は５のアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されてなるアミノ酸配列からなるアミノ酸配列を有するポリペプチドであってもよい。なお、本明細書において「アミノ酸配列において１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加」しているとは、当該アミノ酸配列中のアミノ酸が、そのポリペプチドの構造又は機能に有意に影響することなく改変していることを指す。また、「数個」とは、通常２〜５０個、好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個、更に好ましくは２〜５個の変異（欠失、置換又は付加）が存在することを指す。
【００３５】
また、前記第一の酵素は、配列番号１、３、又は５のアミノ酸配列をコードする塩基配列と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるポリペプチドであってもよい。なお、本明細書において「ストリンジェントな（stringent）条件」とは、核酸同士の選択的且つ検出可能な特異的結合を可能とする条件であり、塩濃度、溶媒（例えばホルムアミド等の有機溶媒）、温度、その他の公知の条件の適当な組み合わせによって定義される。なお、「ストリンジェントな条件」は当業者には周知であるが、具体的にはT.Maniatisら編、Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd ed.(1989）Cold Spring Harbor Laboratory等を参照のこと。具体的な「ストリンジェントな条件」の例としては、約４０〜４５℃、最適には約４２℃で、５×ＳＳＰＥ、０．３％のＳＤＳ、２００μｇ／ｍＬの剪断変性サケ精子ＤＮＡ中で、且つ、極めて低度及び低度のストリンジェンシーの場合は２５％のホルムアミド、培地及び中度〜高度のストリンジェンシーの場合は３５％のホルムアミド、高度及び極めて高度のストリンジェンシーの場合は５０％のホルムアミド中で、標準的なサザンブロッティング法に従って１２〜２４時間のハイブリダイゼーションを行う。その後、最終的には担体材料を２×ＳＳＣ、０．２％のＳＤＳ中で、４５℃（極めて低度のストリンジェンシー）、５０℃（低度のストリンジェンシー）、５５℃（中度のストリンジェンシー）、６０℃（中度〜高度のストリンジェンシー）、６５℃（高度のストリンジェンシー）、又は７０℃（極めて高度のストリンジェンシー）で、１５分間ずつ三回洗浄する。なお、ハイブリダイゼーションは、当業界で公知の方法やそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
【００３６】
前記第一の酵素を調製する方法は制限されない。前記の第一の酵素を産出する生物から目的の酵素を抽出して用いてもよい。また、当業者に公知の公的機関のデータベースに登録されたＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、又はＲｇＰＡＬ遺伝子の塩基配列や、本明細書に開示するＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、又はＲｇＰＡＬ遺伝子の塩基配列（それぞれ配列番号２、４、及び６）を用いて、当業者に公知の各種の手法、例えば化学合成法や遺伝子工学的手法を用いて調製することができる。
【００３７】
具体的に、ＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、又はＲｇＰＡＬについては、例えばチャノキ（Camellia sinensis）、ムラサキ（Lithospermum erythrorhizon）、又はロドトルラ・グルチニス（Rhodotorula glutinis）ＪＮ−１のゲノムライブラリーから、当業者に公知のポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction：ＰＣＲ）等の核酸増幅技術を用いることにより、ＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、又はＲｇＰＡＬ遺伝子をコードする核酸を調製した上で、これらを当業者に公知の手法でプラスミドやウイルス等の各種のベクターに組み込み、適切な宿主細胞に遺伝子組換えにより導入して発現させることにより、ＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、又はＲｇＰＡＬを調製することが可能である。なお、宿主細胞としては、原核細胞でも真核細胞でもよく、原核細胞の場合は真正細菌でも古細菌でもよく、真核細胞の場合は植物細胞でも動物細胞でも真菌細胞でも原生生物細胞でもよい。
【００３８】
また、ＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、又はＲｇＰＡＬの類似体については、例えば、当業者に公知の公的機関のデータベースに登録されたＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、又はＲｇＰＡＬ遺伝子の塩基配列や、本明細書に開示するＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、又はＲｇＰＡＬ遺伝子の塩基配列（それぞれ配列番号２、４、及び６）からなる核酸に対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて変異を導入することにより、ＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、又はＲｇＰＡＬの類似体をコードする核酸を調製する。中でも、遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は、特定の位置に特定の変異を導入できることから有用である。こうして得られたＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、又はＲｇＰＡＬの類似体をコードする核酸を、前述と同様に当業者に公知の手法でプラスミドやウイルス等の各種のベクターに組み込み、適切な宿主細胞に遺伝子組換えにより導入して発現させることにより、ＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、又はＲｇＰＡＬの類似体を調製することが可能である。
【００３９】
なお、遺伝子工学的な手法については、例えばSambrook,J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989等の記載を参照することができる。
【００４０】
前記第一の酵素を用いて工程（１）を実施する手法は特に制限されない。第一の酵素を、酵素反応を生じさせるような条件下で、４−ニトロフェニルアラニンに作用させ、４−ニトロ桂皮酸へと変換させればよい。なお、４−ニトロフェニルアラニンとしては、４−ニトロフェニルアラニンを含む天然生成物や合成生成物等の組成物を精製せずそのまま用いてもよいが、斯かる組成物から当業者に公知の各種の手法で４−ニトロフェニルアラニンを精製して用いてもよい。
【００４１】
前記第一の酵素を４−ニトロフェニルアラニンに作用させる手法の例としては、上記手順により調製された第一の酵素を単離・精製して用いてもよいが、前述の手順により第一の酵素を発現するように宿主細胞を改変して得られた遺伝子組換細胞（以下適宜「第一の細胞」という。）をそのまま用いてもよい。後者の場合、特に宿主細胞として細菌を用い、その休止菌体を用いて４−ニトロフェニルアラニンと共存させ、休止菌体に含まれる第一の酵素を４−ニトロフェニルアラニンに作用させて４−ニトロ桂皮酸へと変換させる手法（以下適宜「休止菌体反応」という。）が好ましい。斯かる休止菌体反応については後述する。
【００４２】
また、第一の酵素を発現する宿主細胞として細菌を用い、その培養液を用いて４−ニトロフェニルアラニンと共存させ、培養液に含まれる第一の酵素を４−ニトロフェニルアラニンに作用させて４−ニトロ桂皮酸へと変換させる手法を取ることもできる。
【００４３】
前記第一の酵素の酵素反応を生じさせるような条件とは、制限されるものではないが、例えば水性溶媒中であれば、そのｐＨは特に制限はされないが、通常７．５以上、中でも８以上が好ましく、また、通常９．５以下、更には９以下が好ましい。また、反応を行う温度は特に制限はされないが、通常２７℃以上、中でも３０℃以上、更には３２℃以上、また、通常４２℃以下、中でも３７℃以下で反応を行うことが好ましく例示できる。
【００４４】
４．工程（２）：４−ニトロ桂皮酸の４−アミノ桂皮酸への変換
本発明の第一の方法では、次に工程（２）として、４−ニトロ桂皮酸を４−アミノ桂皮酸へと変換する。本工程（２）を実施する手法も制限されず、例えば生物的手法や化学的手法等、任意の手法を用いることができる。中でも、本発明では４−ニトロ桂皮酸を４−アミノ桂皮酸へと変換する酵素（ニトロレダクターゼ：以下適宜「第二の酵素」という。）を用いて、工程（２）を実施することが好ましい。
【００４５】
前記第二の酵素の例としては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来の酵素であるｓｃＦｒｍ２及びｓｃＨｂｎ１、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）由来の酵素であるｃｄＦＬＤＺ、並びに大腸菌（Escherichia coli）由来の酵素であるｎｆｓＡ及びｎｆｓＢ等が挙げられる。ｓｃＦｒｍ２タンパク質のアミノ酸配列を配列番号７に、これをコードするｓｃＦｒｍ２遺伝子の塩基配列の例を配列番号８にそれぞれ示す。また、ｓｃＨｂｎ１タンパク質のアミノ酸配列を配列番号９に、これをコードするｓｃＨｂｎ１遺伝子の塩基配列の例を配列番号１０にそれぞれ示す。また、ｃｄＦＬＤＺタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１１に、これをコードするｃｄＦＬＤＺ遺伝子の塩基配列の例を配列番号１２にそれぞれ示す。また、ｎｆｓＡタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１３に、これをコードするｎｆｓＡ遺伝子の塩基配列の例を配列番号１４にそれぞれ示す。また、ｎｆｓＢタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１５に、これをコードするｎｆｓＢ遺伝子の塩基配列の例を配列番号１６にそれぞれ示す。
【００４６】
ｓｃＦｒｍ２、ｓｃＨｂｎ１、ｃｄＦＬＤＺ、ｎｆｓＡ及びｎｆｓＢは、後述の実施例に示すように、生物由来の既知のニトロレダクターゼ及びエン酸レダクターゼ（enoate reductase）の中から、本発明者等が探索して得られた酵素である。これらの酵素は、予想外にも、後述の実施例に示すように、４−ニトロ桂皮酸から４−アミノ桂皮酸への優れた変換活性を有し、本発明において好適に使用することができる。
【００４７】
なお、前述のようにｓｃＦｒｍ２、ｓｃＨｂｎ１、ｃｄＦＬＤＺ、ｎｆｓＡ及びｎｆｓＢはニトロレダクターゼ又はエン酸レダクターゼとして公知の酵素であり、そのアミノ酸配列も公知であるが、これらが４−ニトロ桂皮酸から４−アミノ桂皮酸への変換活性を有し、ニトロレダクターゼとしても使用できることはこれまで知られておらず、本発明者等が初めて見出した知見である。
【００４８】
前記第二の酵素の例としては、これらの酵素自体のみならず、それらの酵素の類似体であって、４−ニトロ桂皮酸を４−アミノ桂皮酸へと変換する活性を維持するポリペプチドも挙げられる。前記の類似体としては、例えばそのホモログ（オルソログ及びパラログを含む）、又はそのフラグメントが挙げられる。
【００４９】
具体的に、前記第二の酵素は、配列番号７、９、１１、１３又は１５のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、特に好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列相同性を有することが望ましい。また、第二の酵素は、配列番号７、９、１１、１３又は１５のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、特に好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有することが望ましい。なお、２つのアミノ酸配列の「相同性」及び「同一性」については、先に説明したとおりである。
【００５０】
また、前記第二の酵素は、配列番号７、９、１１、１３又は１５のアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されてなるアミノ酸配列からなるアミノ酸配列を有するポリペプチドであってもよい。なお、本明細書において「アミノ酸配列において１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加」しているとは、先に説明したとおりである。
【００５１】
また、前記第二の酵素は、配列番号７、９、１１、１３又は１５のアミノ酸配列をコードする塩基配列と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるポリペプチドであってもよい。なお、本明細書において「ストリンジェントな（stringent）条件」とは、先に説明したとおりである。
【００５２】
前記第二の酵素を調製する方法は制限されない。前記の第二の酵素を産出する生物から目的の酵素を抽出して用いてもよい。しかし、当業者に公知の公的機関のデータベースに登録された前記第二の酵素の遺伝子の塩基配列や、本明細書に開示する配列番号８、１０、１２、１４及び１６の遺伝子の塩基配列を用いて、当業者に公知の各種の手法、例えば化学合成法や遺伝子工学的手法を用いて調製することができる。その具体的な手法、特に遺伝子工学的な手法については、先に詳述したとおりである。
【００５３】
前記第二の酵素を用いて工程（２）を実施する手法は特に制限されない。第二の酵素を、酵素反応を生じさせるような条件下で、工程（１）で得られた４−ニトロ桂皮酸に作用させ、４−アミノ桂皮酸へと変換させればよい。なお、工程（１）で得られた４−ニトロ桂皮酸としては、４−ニトロ桂皮酸を含む工程（１）の反応生成物との組成物を精製せずそのまま用いてもよいが、斯かる反応生成物から当業者に公知の各種の手法で４−ニトロ桂皮酸を精製して用いてもよい。
【００５４】
前記第二の酵素を４−ニトロ桂皮酸に作用させる手法の例としては、上記手順により調製された第二の酵素（ｓｃＦｒｍ２、ｓｃＨｂｎ１、ｃｄＦＬＤＺ、ｎｆｓＡ若しくはｎｆｓＢ又はその類似体）を単離・精製して用いてもよいが、前述の手順により第二の酵素を発現するように宿主微生物を改変して得られた遺伝子組換細胞（以下適宜「第二の細胞」という。）をそのまま用いてもよい。後者の場合、特に宿主として細菌を用い、その休止菌体を用いて４−ニトロ桂皮酸と共存させ、休止菌体に含まれる第二の酵素を４−ニトロ桂皮酸に作用させて４−アミノ桂皮酸へと変換させる手法（休止菌体反応）が好ましい。斯かる休止菌体反応については後述する。また、宿主細胞として細菌を用い、その培養液を用いて４−ニトロ桂皮酸と共存させ、培養液に含まれる第一の酵素を４−ニトロ桂皮酸に作用させて４−アミノ桂皮酸へと変換させる手法も好ましい。この場合、前記の細菌としては大腸菌が好ましい。
【００５５】
なお、前記第二の酵素の酵素反応を生じさせるような条件とは、制限されるものではないが、例としては以下が挙げられる。即ち、水性溶媒中であれば、そのｐＨは特に制限はされないが、通常６．５以上、中でも７．０以上が好ましく、また、通常８．５以下、更には８．０以下が好ましい。また、反応を行う温度は特に制限はされないが、通常２７℃以上、中でも３０℃以上、更には３２℃以上、また、通常４２℃以下、中でも３７℃以下で反応を行うことが好ましく例示できる。
【００５６】
５．休止菌体反応
本発明の第一の方法では、前記第一の酵素を用いて工程（１）を実施する際、及び／又は、前記第二の酵素を用いて工程（２）を実施する際に、前記の第一及び／又は第二の酵素を発現する第一及び／又は第二の細胞として細菌の休止菌体を用いた反応（休止菌体反応）を用いることが好ましい（なお、第一の酵素を発現する細菌を以下「第一の細菌」といい、第二の酵素を発現する細菌を以下「第二の細菌」という）。
【００５７】
ここで、細菌の「休止菌体」とは、斯かる細菌の増殖を伴わない菌体を意味する。休止菌体の例としては、細菌を培養して得られた培養菌体や、斯かる培養菌体を凍結乾燥やスプレードライによって粉末にした粉末菌体、斯かる培養菌体を担体に固定化した固定化菌体等が挙げられる。これらの二種以上を組み合わせて使用してもよい。休止菌体の具体例としては、細菌を培養して得られる培養液を遠心分離によって培養上清と菌体とに分け、得られた菌体を生理食塩水で洗浄し、所望の菌体濁度（例えば６００ｎｍでの吸光度が４０）となるように滅菌精製水に懸濁した休止菌体懸濁液を用いることができる。また、斯かる休止菌体懸濁液を凍結乾燥やスプレードライによって粉末にした粉末菌体や、斯かる培養菌体懸濁液中の培養菌体を担体に固定化した固定化菌体等も用いることができる。
【００５８】
斯かる第一又は第二の細菌の休止菌体を、対応する基質（第一の細菌の場合は４−ニトロフェニルアラニン、第二の細菌の場合は４−ニトロ桂皮酸）又はこれを含む組成物（例えば天然生成物、反応生成物等）と、第一又は第二の酵素の酵素反応を生じさせるような条件下で共存させることにより、第一又は第二の細菌の休止菌体に含まれる第一又は第二の酵素を対応する基質に作用させる。第一又は第二の酵素の酵素反応を生じさせるような条件とは、制限されるものではないが、例えばｐＨが通常６．５以上、中でも７以上、また、通常９．５以下、更には９以下の水性溶媒中、通常２７℃以上、中でも３０℃以上、更には３２℃以上、また、通常４２℃以下、中でも３７℃以下の温度で反応を行うことが好ましく例示できる。
【００５９】
なお、本発明の第一の方法では、工程（２）において４−ニトロ桂皮酸を４−アミノ桂皮酸へと変換する手法として、化学的手法を用いることもできる。化学的手法としては、特に限定されることはなく、既知の方法を用いることができる。具体例としては、ニトロ基をアミノ基に変換する化学反応を用いて、４−ニトロ桂皮酸のニトロ基を還元すればよい。ニトロ基の還元方法としては、特に限定はされないが、例えばＢｅｃｈａｍｐ法（例えばA. J. Ann. Chim. Phys. 1854, 42, 186.）や、不均一系接触還元法等の公知の方法を用いることができる。なお、４−ニトロ桂皮酸としては、前記工程（１）で得られた４−ニトロ桂皮酸をそのまま用いてもよいが、公知の方法で適宜精製してから用いてもよい。
【００６０】
６．その他
以上の手順により、（１）４−ニトロフェニルアラニンを４−ニトロ桂皮酸に変換する工程、及び（２）４−ニトロ桂皮酸を４−アミノ桂皮酸に変換する工程を実施することにより、４−ニトロフェニルアラニンから４−アミノ桂皮酸を製造することができる。なお、工程（２）の終了後、当業者に公知の各種の手法で反応生成物から４−アミノ桂皮酸を単離・精製してもよい。
【００６１】
なお、以上の説明はあくまでも本発明の第一の方法の実施の一態様に過ぎない。当業者であれば容易に理解するように、上述の態様に適宜変更を加えて、本発明の第一の方法を実施することが可能である。
【００６２】
例えば、本発明の第一の方法では、前記工程（１）と前記工程（２）を適宜組み合わせて実施することができる。その組合せは限定されるものではないが、通常は、前記工程（１）において前記第一の酵素を用いた酵素反応を実施し、前記工程（２）において前記第二の酵素を用いた酵素反応又は前記の化学的手法を実施する。このうち前記工程（１）では、前記第一の細菌の共存下で酵素反応を行う方法、又は、第一の細菌の休止菌体反応を行うことが好ましい。
【００６３】
なお、前記工程（１）で第一の細菌の共存下で酵素反応を行う場合は、前記工程（２）では前記第二の細菌の共存下で酵素反応を行うか、又は化学的手法で行うことが好ましい。中でも、前記第二の細菌の共存下で酵素反応を行えば、一貫で双方の酵素反応を行うことができ、効率面でより好ましい。また、この場合には第二の細菌として大腸菌を用いることが、コスト低減の観点で更に好ましい。
【００６４】
一方、前記工程（１）で第一の細菌の休止菌体を行う場合には、前記工程（２）では前記第二の細菌の休止菌体反応を行うか、又は化学的手法を行うことが好ましい。中でも、化学的手法で行うことが、４−ニトロ桂皮酸の４−アミノ桂皮酸への変換効率、生産コスト（原材料費、設備投資費、及び人件費等）、及び生産時のＣＯ２削減等の点でより好ましい。
【００６５】
また、以上の説明では工程（１）の実施後に工程（２）を実施する態様を説明したが、工程（１）と工程（２）とを同時に実施することも可能である。この場合、第一及び第二の酵素を、酵素反応を生じさせるような条件下で４−ニトロフェニルアラニンに作用させ、第一の酵素による４−ニトロフェニルアラニンから４−ニトロ桂皮酸への変換と、第二の酵素による４−ニトロ桂皮酸から４−アミノ桂皮酸への変換とを並行して実施すればよい。この場合、単離・精製した第一及び第二の酵素を併用してもよく、第一及び第二の酵素をそれぞれ発現する第一及び第二の細胞を併用してもよく、更には、第一及び第二の酵素を共に発現する単一の遺伝子組換細胞を用いてもよい（これを以下「第三の細胞」という）。第一及び第二の酵素を共に発現する第三の細胞は、第一及び第二の酵素をコードする遺伝子、或いはこれらの遺伝子をそれぞれ担持する第一及び第二のベクターを、単一の宿主細胞に導入し、第一及び第二の酵素を共に発現するように宿主細胞を改変して得ることができる。
【００６６】
［II．グルコースから４−アミノ桂皮酸を製造する方法］
本発明の第二の要旨は、グルコースから４−アミノ桂皮酸を製造する方法（以下適宜「本発明の第二の方法」と略称する。）に関する。本発明の第二の方法は、少なくとも（ａ）グルコースからフェニルアラニンを産生する工程、（ｂ）前記（ａ）で得られたフェニルアラニンをニトロ化して４−ニトロフェニルアラニンに変換する工程、及び、（ｃ）本発明の第一の方法により、前記（ｂ）で得られた４−ニトロフェニルアラニンから４−アミノ桂皮酸を製造する工程を含む。
【００６７】
工程（ａ）における、グルコースからフェニルアラニンを合成する方法としては、例えば前記の文献Ａに記載の方法を用いることができる。
【００６８】
工程（ｂ）における、フェニルアラニンから４−ニトロフェニルアラニンを合成する方法としては、例えば前記の文献Ｂに記載の方法を用いることができる。
【００６９】
工程（ｃ）における、４−ニトロフェニルアラニンから４−アミノ桂皮酸を合成する方法としては、前述した本発明の第一の方法を用いることができる。
【００７０】
［III．フェニルアラニンから４−アミノ桂皮酸を製造する方法］
本発明の第三の要旨は、フェニルアラニンから４−アミノ桂皮酸を製造する方法（以下適宜「本発明の第三の方法」と略称する。）に関する。本発明の第三の方法は、少なくとも（ｂ）フェニルアラニンをニトロ化して４−ニトロフェニルアラニンに変換する工程、及び、（ｃ）本発明の第一の方法により、前記（ｂ）で得られた４−ニトロフェニルアラニンから４−アミノ桂皮酸を製造する工程を含む。
【００７１】
工程（ｂ）における、フェニルアラニンから４−ニトロフェニルアラニンを合成する方法については、本発明の第二の方法について前述したとおりである。
【００７２】
工程（ｃ）における、４−ニトロフェニルアラニンから４−アミノ桂皮酸を合成する方法としては、前述した本発明の第一の方法を用いることができる。
【００７３】
［IV．４−ニトロフェニルアラニンから４−ニトロ桂皮酸を製造する方法］
本発明の第四の要旨は、フェニルアラニンから４−ニトロ桂皮酸を製造する方法（以下適宜「本発明の第四の方法」と略称する。）に関する。本発明の第四の方法は、少なくとも前述の第一の酵素を用いて、フェニルアラニンを４−ニトロ桂皮酸に変換する工程を含む。斯かる工程の詳細については、本発明の第一の方法の工程（１）として先に詳述したとおりである。
【００７４】
［Ｖ．４−ニトロ桂皮酸から４−アミノ桂皮酸を製造する方法］
本発明の第五の要旨は、４−ニトロ桂皮酸から４−アミノ桂皮酸を製造する方法（以下適宜「本発明の第五の方法」と略称する。）に関する。本発明の第五の方法は、少なくとも前述の第二の酵素を用いて、４−ニトロ桂皮酸を４−アミノ桂皮酸に変換する工程を含む。斯かる工程の詳細については、本発明の第一の方法の工程（２）として先に詳述したとおりである。
【００７５】
［VI．ベクター］
本発明の第六の要旨は、前述の第一及び／又は第二の酵素をコードする遺伝子を担持するベクター（なお、第一の酵素をコードする遺伝子を担持するベクターを以下「第一のベクター」といい、第二の酵素をコードする遺伝子を担持するベクターを以下「第二のベクター」といい、第一の酵素をコードする遺伝子及び第二の酵素をコードする遺伝子を共に担持するベクターを以下「第三のベクター」という。）に関する。
【００７６】
第一〜第三のベクターは、前述の第一及び／又は第二の酵素をコードする遺伝子を担持すると共に、これらの遺伝子を宿主細胞内に導入し、発現可能な状態とすることが可能であれば、その種類は限定されない。例えば、宿主細胞のゲノム内に組み込まれるベクターでも、宿主細胞の細胞質内に取り込まれつつ、宿主細胞のゲノムとは独立に共存し、宿主細胞の細胞分裂に従って自律的に複製するベクターであってもよい。また、線状ベクターでも環状ベクターでもよく、一本鎖ベクターでも二本鎖ベクターでもよく、ＤＮＡベクターでもＲＮＡベクターでもよい。更には、プラスミドベクターでも、コスミドベクターでも、フォスミドベクターでも、ウイルスベクターでも、人工染色体ベクターでも、アグロバクテリウム等の細菌ベクターでも、更にはこれら複数の組合せによるバイナリーベクターでもよい。斯かるベクターの種類や構成、構築法等は当業者には周知であり、遺伝子や宿主微生物細胞等の条件に応じて適宜選択すればよい。
【００７７】
第一〜第三のベクターは、前述の第一及び／又は第二の酵素をコードする遺伝子に加えて、宿主細胞中で前記遺伝子の発現を調節する調節配列を更に含むことが好ましい。斯かる調節配列としては、プロモータ、ターミネータ、エンハンサ、ポリＡ付加シグナル、５’−ＵＴＲ（非翻訳領域）、標識又は選抜マーカー遺伝子、マルチクローニング部位、複製開始点等が挙げられる。第一〜第三のベクターにおいては、これらの調節配列が、前述の第一及び／又は第二の酵素をコードする遺伝子と作動可能に連結されることにより、宿主細胞中で前記遺伝子を自律的に発現することが可能な発現カセットとして構築されることが好ましい。斯かる調節配列の種類や構成、構築法等は当業者には周知であり、遺伝子や宿主細胞等の条件に応じて適宜選択すればよい。
【００７８】
［VII．細胞］
本発明の第七の要旨は、前述の第一及び／又は第二の酵素を発現するよう宿主細胞を改変して得られる細胞（なお、前述のように、第一の酵素を発現する細胞を「第一の細胞」といい、第二の酵素を発現する細胞を「第二の細胞」といい、第一及び第二の酵素を共に発現する細胞を「第三の細胞」という。）に関する。
【００７９】
第一〜第三の細胞の元となる宿主細胞の種類は制限されず、原核細胞でも真核細胞でもよく、原核細胞の場合は真正細菌でも古細菌でもよく、真核細胞の場合は植物細胞でも動物細胞でも真菌細胞でも原生生物細胞でもよい。但し、前述の休止菌体反応を行う場合には、宿主細胞としては細菌を用いることが好ましい。
【００８０】
これらの宿主細胞に第一及び／又は第二の酵素をコードする遺伝子を導入することにより、第一及び／又は第二の酵素を発現する第一〜第三の細胞を得ることができる。導入する遺伝子としては、前述の第一及び／又は第二の酵素をコードする遺伝子をそのまま用いてもよく、或いはこれらの遺伝子を担持する前記の第一〜第三のベクターを用いてもよい。遺伝子導入の手法としては、宿主細胞にベクターを感染させる方法や、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（ボンバードメント）法、バキュームインフィルトレーション法等の物理的手法、更にはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９等のゲノム編集法等を用いることができる。
【００８１】
こうして得られた第一〜第三の細胞は、第一及び／又は第二の酵素を一過的に発現するものであってもよく、恒常的に発現するものであってもよい。また、多細胞真核生物の細胞の場合は、これらの遺伝子を発生の全ての段階で発現するものであってもよく、特定の段階のみで発現するものであってもよい。更には、これらの遺伝子を全ての組織・器官で発現するものであってもよく、特定の組織・器官のみで発現するものであってもよい。こうした遺伝子発現時期・部位の制御は、例えば調節配列を適切に選択することにより行うことができる。
【００８２】
なお、本発明における第一〜第三の細胞には、第一及び／又は第二の酵素を発現するよう改変された第一世代の細胞のみならず、斯かる細胞が分裂して得られた次代以降の細胞や、更には斯かる細胞を含む当初個体の有性生殖又は無性生殖により得られる子孫（クローンを含む）の細胞も含まれることとする。また、植物細胞の場合には、当初植物体の繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）から作出される子孫（クローンを含む）の細胞も含まれることとする。
【実施例】
【００８３】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。但し、本発明は以下の実施例にも束縛されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、任意の形態で実施することが可能である。【００８４】
なお、以下の実験では特に別記無き限り、大腸菌（Escherichia coli）株としてＢＬ２１（ＤＥ３）［Novagen, 遺伝子型F-, ompT, hsdSB (rB-mB-), gal (λcI857, ind1, Sam7, nin5, lacUV5-T7gene1), dcm (DE3)］を使用した。また、大腸菌の培養には以下の組成のＬＢ培地（ｐＨ７．０）、又はこれに別記の成分を添加した培地を、オートクレーブを用いて１２１℃、１５分間滅菌してから用いた。【００８５】
【表１】
2019168203.tif 000004
【００８６】
なお、以下の各実施例で使用する高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の測定条件吸光光度計による酵素活性の評価条件を以下に記す。【００８７】
［高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）測定条件］
装置：      Hewlett Packerd社製  1200 infinity series
カラム：    Millipore-Merck社製  Purospher STAR RP-18 endcapped カラム
検出波長：  ２８０ｎｍ
溶離液Ａ：  ２０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．０）
溶離液Ｂ：  １００％メタノール
プログラム：  ０分（Ａ：Ｂ＝９８％：２％）
７分（Ａ：Ｂ＝９８％：２％）
１２分（Ａ：Ｂ＝５０％：５０％）
１７分（Ａ：Ｂ＝５０％：５０％）
１９分（Ａ：Ｂ＝９８％：２％）
２３分（Ａ：Ｂ＝９８％：２％）【００８８】
［吸光光度計による酵素活性の評価条件］
装置    ：BECKMAN COULTER社製DU800 UV/Vis Spectrophotometer
酵素量  ：２ｍｇ／ｍＬ
緩衝溶液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ＝８．６）
基質濃度：０．３ｍＭ〜９．６ｍＭ
容量    ：２００μＬ
測定波長：４−ニトロフェニルアラニンから４−ニトロ桂皮酸 ３８０ｎｍ
フェニルアラニンから桂皮酸 ３０５ｎｍ
測定時間：１０分
測定温度：２５℃【００８９】
〔実施例１〕
［Ｉ．４−ニトロフェニルアラニンから４−ニトロ桂皮酸への変換］
１．プラスミドの構築及び大腸菌への導入
（１）ｐＥＴ２８ａ−ＣａｍＰＡＬの構築及び大腸菌への導入
チャノキ（Camellia sinensis）由来の酵素であるＣａｍＰＡＬを、公知のポリヌクレオチド合成法により人工合成し、引き続き制限酵素ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩにより制限処理した。この制限処理したＣａｍＰＡＬを、制限酵素ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩにより制限処理したプラスミドｐＥＴ２８ａ（Novagen社製）（以下、制限処理ｐＥＴ２８ａという）に対して、ＤＮＡライゲーションキットLigation High Ver.2（東洋紡社製）を用いて連結し、ｐＥＴ２８ａ−ＣａｍＰＡＬを作製した。得られたｐＥＴ２８ａ−ＣａｍＰＡＬを、ヒートショックトランスフォーメンション法により大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した。得られたＣａｍＰＡＬ産生大腸菌株を培養してＣａｍＰＡＬを発現させた。【００９０】
（２）ｐＥＴ２８ａ−ＬｉｅＰＡＬの構築及び大腸菌への導入
ムラサキ（Lithospermum erythrorhizon）由来の酵素であるＬｉｅＰＡＬを、公知のポリヌクレオチド合成法により人工合成した。得られたＬｉｅＰＡＬを、前記ＣａｍＰＡＬの制限処理に用いたものと同じ制限酵素を用いて制限処理した。以下、制限処理したＬｉｅＰＡＬを用いた以外は、前記のｐＥＴ２８ａ−ＣａｍＰＡＬの作製手順と同様の方法で前記制限処理ｐＥＴ２８ａと連結し、ｐＥＴ２８ａ−ＬｉｅＰＡＬを作製した。以下、上記同様の方法により大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した。得られたＬｉｅＰＡＬ産生大腸菌株を培養してＬｉｅＰＡＬを発現させた。【００９１】
（３）ｐＥＴ２８ａ−ＲｇＰＡＬの構築及び大腸菌への導入
ロドトルラ・グルチニス（Rhodotorula glutinis）ＪＮ−１由来の酵素であるＲｇＰＡＬを、公知のポリヌクレオチド合成法により人工合成した。得られたＲｇＰＡＬを、前記ＣａｍＰＡＬの制限処理に用いたものと同じ制限酵素により制限処理した。以下、制限処理したＲｇＰＡＬを用いた以外は、前記のｐＥＴ２８ａ−ＣａｍＰＡＬの作製手順と同様の方法で、前記制限処理ｐＥＴ２８ａと連結し、ｐＥＴ２８ａ−ＲｇＰＡＬを作製した。得られたｐＥＴ２８ａ−ＲｇＰＡＬを、ヒートショックトランスフォーメンション法により大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した。得られたＲｇＰＡＬ産生大腸菌株を培養してＲｇＰＡＬを発現させた。【００９２】
２．精製ＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、及びＲｇＰＡＬの酵素活性の評価
前記のＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、及びＲｇＰＡＬ産生大腸菌株をそれぞれ、３０ｍｇ／Ｌカナマイシン硫酸塩を含むＬＢ培地５ｍＬに植菌し、２８℃で１６時間培養した（以下、前培養ということがある）。その後、これを同培地２００ｍＬに植菌し、Ｏ．Ｄ６００が０．６になるまで培養後、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside：ＩＰＴＧ）を終濃度０．５ｍＭとなるように添加し、さらに３０℃において２０時間培養した。これらの培養の際の回転数は１２０ｒｐｍとした。培養した菌体を集菌し、０．５ＭＮａＣｌを含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ＝７．５）に懸濁し、超音波破砕を行なった。引き続き遠心分離の後に、その上清をＨｉｓ−Ｔｒａｐカラムを用いて精製し、得られた酵素を活性測定に用いた。【００９３】
酵素活性は、吸光光度計を用いて反応生成物の吸収波長の吸光度を１０分間測定することによって測定し定量した。具体的に、フェニルアラニンに対する脱アンモニア酵素活性については、０．３から９．６ｍＭのフェニルアラニンを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ＝８．６）に前記の各酵素を２ｍｇ／ｍＬ加えて反応させ、桂皮酸の生成に由来する３０５ｎｍの波長の吸光度の変化を１０分間測定した。４−ニトロフェニルアラニンに対する脱アンモニア酵素活性については、０．３から９．６ｍＭの４−ニトロフェニルアラニンを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ＝８．６）に前記の各酵素を２ｍｇ／ｍL加えて反応させ、４−ニトロ桂皮酸の生成に由来する３８０ｎｍの波長の吸光度を１０分間測定して定量した。【００９４】
図１は、大腸菌での組換産生後に精製したＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、及びＲｇＰＡＬのフェニルアラニン（Ｐｈｅ）及び４−ニトロフェニルアラニン（ｎ−Ｐｈｅ）に対する脱アンモニア酵素比活性、Ｋｍ、Ｋｃａｔ、及びＫｍ／Ｋｃａｔを示す表である。ＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、及びＲｇＰＡＬの何れも、４−ニトロフェニルアラニンから４−ニトロ桂皮酸への変換活性を有することが分かる。【００９５】
３．ＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、及びＲｇＰＡＬの休止菌体反応による酵素活性の評価
前記のＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、及びＲｇＰＡＬ産生大腸菌株をそれぞれ、４０ｍｇ／Ｌカナマイシン硫酸塩を含む３ｍＬのＬＢ培地を用い、３００ｒｐｍの撹拌、２８℃の条件において１６時間前培養した。この前培養液１ｍＬを４０ｍｇ／Ｌのカナマイシン硫酸塩を含む１００ｍＬのＬＢ培地に植菌し、１２０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で４時間培養した後、０．５ｍＭのＩＰＴＧを添加して、更に２０時間培養した。得られた菌体を反応バッファー（１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ８．５）で２回洗浄した。【００９６】
得られた休止菌体を、反応バッファーに懸濁し、３００ｒｐｍで振盪しながら２８℃で反応させた。２４時間毎に培地に２０ｍＭの４−ニトロフェニルアラニンを追加し、連続して反応させた。定期的に反応上清を採取し、４−ニトロフェニルアラニン及び４−ニトロ桂皮酸の定量を行った。【００９７】
上清を遠心管に写し、遠心分離によって回収し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて反応生成物を定量した。
また、対照として宿主大腸菌を用い、同様の実験を行った。【００９８】
図２は、ＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、及びＲｇＰＡＬ産生大腸菌株の休止菌体反応による２４時間後の反応上清中の４−ニトロ桂皮酸量を示すグラフである。ＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、及びＲｇＰＡＬ産生大腸菌株の何れの休止菌体を用いた場合でも、対照の大腸菌と比べて反応上清中の４−ニトロ桂皮酸量が顕著に上昇しており、ＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、及びＲｇＰＡＬによる４−ニトロフェニルアラニンから４−ニトロ桂皮酸への変換が進行したことが分かる。【００９９】
図３は、ＣａｍＰＡＬ産生大腸菌株の休止菌体反応による反応上清中の４−ニトロフェニルアラニン量及び４−ニトロ桂皮酸量の経時変化を示すグラフである。反応上清中の４−ニトロフェニルアラニン量は２４時間毎に添加に伴い増加するものの、その後は次回添加まで徐々に減少すると共に、反応上清中の４−ニトロ桂皮酸は継続的に増加していることが分かる。ここから、ＣａｍＰＡＬによる４−ニトロフェニルアラニンから４−ニトロ桂皮酸への変換が継続的に進行したことが分かる。【０１００】
［II．４−ニトロ桂皮酸から４−アミノ桂皮酸への変換］
１．プラスミドの構築及び大腸菌への導入
（１）ｐＲＳＦＤｕｅｔ−１−ｓｃＦｒｍ２の構築及び大腸菌への導入
サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来の酵素であるｓｃＦｒｍ２（アミノ酸配列を配列番号７、塩基配列の例を配列番号８にそれぞれ示す。）を、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のゲノムライブラリーから、プライマー５’−ＡＡＣＧＧＡＴＣＣＧＡＴＧＴＣＣＣＣＡＡＣＴＧＧＡＡＡＣ−３’（配列番号１７）及び５’−ＧＣＣＡＡＧＣＴＴＣＡＧＴＧＡＴＡＡＡＣＧＴＴＧＡＴＴＡＣＧ−３’（配列番号１８）を用いてＰＣＲにより増幅した後、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIIIにより制限処理し、同じく制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIIIにより制限処理したプラスミドｐＲＳＦＤｕｅｔ−１（Novagen）に対して、ＤＮＡライゲーションキットLigation High Ver.2（東洋紡社製）を用いて連結し、ｐＲＳＦＤｕｅｔ−１−ｓｃＦｒｍ２を作製した。得られたｐＲＳＦＤｕｅｔ−１−ｓｃＦｒｍ２を、ヒートショックトランスフォーメンション法により大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した。得られたｓｃＦｒｍ２産生大腸菌株を培養してｓｃＦｒｍ２を発現させた。【０１０１】
（２）ｐＲＳＦＤｕｅｔ−１−ｓｃＨｂｎ１の構築及び大腸菌への導入
サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来の酵素であるｓｃＨｂｎ１（アミノ酸配列を配列番号９、塩基配列の例を配列番号１０にそれぞれ示す。）を、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のゲノムライブラリーから、プライマー５’−ＡＡＣＧＧＡＴＣＣＧＡＴＧＴＣＴＧＣＴＧＴＴＧＣＡＡＣ−３’（配列番号１９）及び５’−ＧＣＣＡＡＧＣＴＴＡＡＴＴＧＡＡＧＡＴＴＴＣＡＡＣＡＴＣＧ−３’（配列番号２０）を用いてＰＣＲにより増幅した後、前記ｓｃＦｒｍ２の制限酵素処理と同じ制限酵素処理及びプラスミドへの連結を行い、ｐＲＳＦＤｕｅｔ−１−ｓｃＨｂｎ１を作製した。得られたｐＲＳＦＤｕｅｔ−１−ｓｃＨｂｎ１を、ヒートショックトランスフォーメンション法により大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した。得られたｓｃＨｂｎ１産生大腸菌株を培養してｓｃＨｂｎ１を発現させた。【０１０２】
（３）ｐＲＳＦＤｕｅｔ−１−ｃｄＦＬＤＺの構築及び大腸菌への導入
クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）由来の酵素であるｃｄＦＬＤＺ（アミノ酸配列を配列番号１１、塩基配列の例を配列番号１２にそれぞれ示す。）を、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）のゲノムライブラリーから、プライマー５’−ＣＣＧＧＧＡＴＣＣＡＡＴＧＡＡＧＡＴＴＡＧＴＴＣＴＡＴＧ−３’（配列番号２１）及び５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＡＴＡＴＴＴＡＡＴＧＣＴＡＣ−３’（配列番号２２）を用いてＰＣＲにより増幅した後、前記ｓｃＦｒｍ２の制限酵素処理と同じ制限酵素処理及びプラスミドへの連結を行い、ｐＲＳＦＤｕｅｔ−１−ｃｄＦＬＤＺを作製した。得られたｐＲＳＦＤｕｅｔ−１−ｃｄＦＬＤＺを、ヒートショックトランスフォーメンション法により大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した。得られたｃｄＦＬＤＺ産生大腸菌株を培養してｃｄＦＬＤＺを発現させた。【０１０３】
２．ｓｃＦｒｍ２、ｓｃＨｂｎ１、及びｃｄＦＬＤＺの休止菌体反応による酵素活性の評価
前記のｓｃＦｒｍ２、ｓｃＨｂｎ１、及びｃｄＦＬＤＺ産生大腸菌株をそれぞれ、３０ｍｇ／Ｌカナマイシン硫酸塩を含む３ｍＬのＬＢ培地を用い、３００ｒｐｍで振盪しながら２８℃で１６時間前培養した。この前培養液１ｍＬを３０ｍｇ／Ｌカナマイシン硫酸塩を含む１００ｍＬのＬＢ培地に植菌し、１２０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で４時間培養した後、０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加して、更に２０℃で１２時間培養した。得られた菌体を反応バッファー（１００ｍＭリン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、１ｍＭ硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）、０．５ｍＭ塩化チアミン、ｐＨ７．０）で２回洗浄した。【０１０４】
得られた休止菌体を、２．５ｍＭの４−ニトロ桂皮酸を含む反応バッファーに懸濁し、３００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で１２時間反応させた。反応後、反応上清を採取し、４−アミノ桂皮酸の定量を行った。上清を遠心管に写し、遠心分離によって回収し、前記ＨＰＬＣを用いて反応生成物を定量した。
また、対照として宿主大腸菌を用い、同様の実験を行った。【０１０５】
図４は、大腸菌での組換産生後に休止菌体反応に供したｓｃＦｒｍ２、ｓｃＨｂｎ１、及びｃｄＦＬＤＺによる４−ニトロ桂皮酸から４−アミノ桂皮酸への変換活性を示すグラフを図４に示す。ｓｃＦｒｍ２、ｓｃＨｂｎ１、及びｃｄＦＬＤＺ産生大腸菌株の何れの休止菌体を用いた場合でも、対照の大腸菌と比べて培地上清中の４−アミノ桂皮酸量が顕著に上昇しており、ｓｃＦｒｍ２、ｓｃＨｂｎ１、及びｃｄＦＬＤＺによる４−ニトロ桂皮酸から４−アミノ桂皮酸への変換が進行したことが分かる。また、対照の大腸菌は４−アミノ桂皮酸を生産していた。この結果より、大腸菌は４−ニトロ桂皮酸から４−アミノ桂皮酸への還元反応を生じさせる能力を有していることが証明された。【０１０６】
〔実施例２〕
［III．４−ニトロフェニルアラニンから４−ニトロ桂皮酸への変換］
１．ＣａｍＰＡＬの菌体量と基質量の違いによる変換効率の評価
実施例１に記載のＣａｍＰＡＬ産生大腸菌株を、４０ｍｇ／Ｌカナマイシン硫酸塩を含む５ｍＬのＬＢ培地を用い、攪拌速度３００ｒｐｍの撹拌、２８℃の条件において１６時間前培養した。この前培養液１ｍＬを、以下の組成を有する１００ｍＬのＴＢ培地に、８０ｍｇ／Ｌカナマイシン硫酸塩を加えた後に植菌し、１２０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で４時間培養した後、０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加して、更に２０時間培養した。遠心分離によって培養液から菌体を回収した後、−８０℃で保存した。得られた凍結菌体を１０ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ及び３０ｇ／Ｌに計量した。さらに、基質である４−ニトロフェニルアラニンを４．２ｇ／Ｌ、２１ｇ／Ｌ、４２ｇ／Ｌを計量した。【０１０７】
【表２】
2019168203.tif 000005
【０１０８】
それぞれの菌体と基質を反応バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ８．５）に懸濁し、３００ｒｐｍの撹拌、３７℃の条件において休止菌体反応させた。２４時間反応後の反応液を採取し、４−ニトロフェニルアラニン及び４−ニトロ桂皮酸の定量を行った。それぞれの反応生成物の定量は、得られた（菌体）反応液の上清を遠心管に移し、遠心分離によって回収し、前記ＨＰＬＣを用いて反応生成物を定量した。【０１０９】
図５は、それぞれの菌体量と基質量を反応バッファーに懸濁し、２４時間反応させた結果を示した。この結果から、菌体量２０ｇ／Ｌ及び３０ｇ／Ｌ、且つ、基質量２１ｇ／Ｌの場合に、収率が６０％以上と高い４−ニトロフェニルアラニンから４−ニトロ桂皮酸への変換効率を示した。【０１１０】
２．４−ニトロフェニルアラニンの４−ニトロ桂皮酸への変換反応
２Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ社製：ＢＮＲ−Ｃ−２ＬＳ）を反応器とし、実施例１に記載のＣａｍＰＡＬ産生大腸菌株（菌体量２０ｇ／Ｌ〜３０ｇ／Ｌ）を用いて、基質である４−ニトロフェニルアラニン（基質量２１ｇ／Ｌ）を４−ニトロ桂皮酸へと変換する反応を行った。【０１１１】
具体的には、前記ＣａｍＰＡＬ産生大腸菌株を、１５ｍＬのＬＢ培地に４０ｍｇ／Ｌカナマイシン硫酸塩を添加して用い、３００ｒｐｍで撹拌しながら、２８℃で１６時間前培養した。この前培養液１２ｍＬを、８０ｍｇ／Ｌカナマイシン硫酸塩を加えた１.２ＬのＴＢ培地を含む２Ｌジャーファーメンターに植菌し、通気量３．５Ｌ／分、撹拌速度５００ｒｐｍ、３０℃の条件において４時間培養した。引き続き、この培養液に０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加して、更に２０時間培養した。培養液のＯ．Ｄ６００の値から菌体量を計算したところ、３０ｇ／Ｌであった。【０１１２】
培養終了後、培養液に基質である２１ｇ／Ｌの４−ニトロフェニルアラニンを添加した後、２Ｎ ＮａＯＨ水溶液を用いてｐＨ８．５に調整した。通気をすることなくこの培養液を５００ｒｐｍの撹拌、３７℃の条件において２４時間反応させた。反応中の反応液を採取し、以下の方法で４−ニトロフェニルアラニン及び４−ニトロ桂皮酸を定量した。即ち、反応液を遠心管に移し、遠心分離によって上清を回収し、前記条件のＨＰＬＣを用いて反応生成物を定量した。【０１１３】
図６は、２４時間反応させた後の反応液の分析結果を示すグラフである。この結果から、２１ｇ／Ｌの４−ニトロフェニルアラニンから１８ｇ／Ｌの４−ニトロ桂皮酸へと、高い変換効率で変換されたことが示された。また、通気量を０．０４Ｌ／分に変更して同様の反応を２４時間行った結果、２１ｇ／Ｌの４−ニトロフェニルアラニンから１２ｇ／Ｌの４−ニトロ桂皮酸へと、高い変換効率で変換されたことが示された。【０１１４】
ＣａｍＰＡＬ産生大腸菌の１．２Ｌ反応液から４−ニトロ桂皮酸の精製を行った。２４時間反応させた後、遠心分離によって菌体を除き、反応液上清に１２Ｎ ＨＣｌを加えてｐＨ５に調整することで析出物を得た。析出物を濾過にて回収後、アセトンで洗浄して乾燥させた。乾燥後に回収した固体生成物を、前記条件のＨＰＬＣ分析に供した。【０１１５】
図７は、得られた生成物のＨＰＬＣ分析結果を示すグラフである。この結果によれば、生成物は４−ニトロ桂皮酸であり、４−ニトロフェニルアラニンから４−ニトロ桂皮酸への変換反応が生じたことが示された。また、得られた４−ニトロ桂皮酸の純度は９７％、収率は９３％と、極めて高純度且つ高収率であることが分かった。特に、得られた４−ニトロ桂皮酸の純度は、化学的な還元の手法によって４−アミノ桂皮酸に変換するのに十分な純度である。【０１１６】
〔実施例３〕
［IV．４−ニトロフェニルアラニンから４−アミノ桂皮酸への変換反応］
１．４−ニトロ桂皮酸の４−アミノ桂皮酸への変換に適した炭素源の探索
大腸菌はニトロレダクターゼ（ｎｆｓＡ及びｎｆｓＢ）を有していることが知られている。そこで、大腸菌を用いて４−ニトロ桂皮酸から４−アミノ桂皮酸への還元反応を行った。【０１１７】
まず、実施例１に記載のＣａｍＰＡＬ産生大腸菌株を、実施例２と同様の方法によって１６時間前培養した。この前培養液１ｍＬを、８０ｍｇ／Ｌカナマイシン硫酸塩を加えた１００ｍＬのＴＢ培地に植菌し、１２０ｒｐｍの攪拌、３０℃の条件において４時間培養した後、０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加して、更に１６時間培養した。得られた培養液に２ｇ／Ｌの４−ニトロ桂皮酸を添加し、２Ｎ ＮａＯＨを用いてｐＨ８に調整後、炭素源としてグルコース、フルクトース及びグリセロールを終濃度１０％となるように添加して、３００ｒｐｍの撹拌、３７℃の条件において培養し、２４時間反応させた。【０１１８】
反応中の反応液を採取し、４−アミノ桂皮酸の定量を行った。即ち、反応液を遠心管に移し、遠心分離によって上清を回収し、前記ＨＰＬＣを用いて反応生成物を定量した。【０１１９】
図８は、ＣａｍＰＡＬ産生大腸菌の培養液にグルコース、フルクトース及びグルセロールを終濃度１０％添加した際の４−ニトロ桂皮酸から４−アミノ桂皮酸への変換反応を示すグラフである。この結果より、グルセロールを添加した場合に最も多くの４−アミノ桂皮酸が得られることが示された。また、この４−ニトロ桂皮酸から４−アミノ桂皮酸への変換反応の際に添加する炭素源としては、グリセロールが適していることが分かった。【０１２０】
２．４−ニトロフェニルアラニンの４−アミノ桂皮酸の変換
１Ｌジャーファーメンター（Ｂｉｏｔｔ社製：ＢＭＪ−０１）を用いて、上記のグリセロールを添加した条件下で、４−ニトロフェニルアラニンから４−アミノ桂皮酸への変換を行った。実施例２の前培養液５ｍＬを、８０ｍｇ／Ｌカナマイシン硫酸塩を加えた０．５ＬのＴＢ培地を含む１Ｌジャーファーメンターに植菌し、通気量を０．７Ｌ／分、６４５ｒｐｍの撹拌、３０℃の条件において４時間培養した後、０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加して、更に２０時間培養した。【０１２１】
培養終了後、培養液に７ｇ／Ｌの４−ニトロフェニルアラニン及び終濃度１０％のグリセロールを添加した後、２Ｎ ＮａＯＨを用いてｐＨ８．５に調整した。０．０２Ｌ／分の通気量、６４５ｒｐｍの撹拌及び３７℃の条件において３６時間反応させた。ｐＨは８．０より低くなった場合は、２Ｎ ＮａＯＨを添加した。反応中の反応液を採取し、４−ニトロフェニルアラニン、４−ニトロ桂皮酸及び４−アミノ桂皮酸の定量を行った。【０１２２】
図９は、ＣａｍＰＡＬ産生大腸菌による４−ニトロフェニルアラニンの４−アミノ桂皮酸への変換活性を示すグラフである。この結果より、７ｇ／Ｌの４−ニトロフェニルアラニンを原料として４．７ｇ／Ｌの４−アミノ桂皮酸を生産できることが示された。【０１２３】
０．５Ｌの反応液から４−アミノ桂皮酸の精製を行った。２４時間反応させた反応液から、遠心分離によって菌体を除き、得られた上清に１２Ｎ ＨＣｌを加えてｐＨ３に調整し、６００ｍＬの反応液上清に強酸性陽イオン交換樹脂（三菱ケミカル社製：ダイヤイオンＰＫ２１２ＬＨ）を７００ｇ添加して、１時間撹拌した。樹脂を回収して、樹脂量の２倍量の蒸留水で洗浄し、さらに樹脂量の２倍量のエタノールで洗浄した。樹脂量の１．５倍量の７．５％アンモニア水を加えて４−アミノ桂皮酸を溶出させた。さらに、０．５倍量の７．５％アンモニア水を加えて樹脂をリンス後、４−アミノ桂皮酸を含む溶出液を得た。溶出液をエバポレータ―で濃縮後、１２Ｎ ＨＣｌを用いてｐＨ３に調整した。その後、等量の酢酸エチルを添加して１時間撹拌させ、遠心分離によって酢酸エチル層を回収した。エバポレータ―を用いて酢酸エチルを除去し、４−アミノ桂皮酸の粗精製物を回収した。【０１２４】
４−アミノ桂皮酸の粗精製物をアセトンに溶解後、濾過で不溶解物質を除き、１２Ｎ ＨＣｌを加えて４−アミノ桂皮酸の塩酸塩を析出させた。これを濾過にて回収後、アセトンを用いて洗浄・乾燥させて固体乾燥物を得た。乾燥後に回収した固体生成物を、前記条件のＨＰＬＣ分析に供した。【０１２５】
図１０は、得られた生成物及び４−アミノ桂皮酸（標品）のＨＰＬＣ分析の結果を示すグラフである。この結果によれば、生成物は４−アミノ桂皮酸であり、大腸菌のニトロレダクターゼ（還元反応）を利用した４−ニトロフェニルアラニンから４−アミノ桂皮酸への変換反応が生じたことが示された。また、得られた４−アミノ桂皮酸の純度は９８％と、極めて高純度であることが分かった。４−アミノ桂皮酸の回収率は６０％であった。【０１２６】
〔実施例４〕
［４−ニトロ桂皮酸から４−アミノ桂皮酸への変換］
１．プラスミドの構築及び大腸菌への導入
（１）ｐＣＤＦ Ｄｕｅｔ−１−ｎｆｓＡの構築及び大腸菌への導入
大腸菌（Escherichia coli）由来の酵素であるｎｆｓＡ（アミノ酸配列を配列番号１３、塩基配列の例を配列番号１４にそれぞれ示す。）を、大腸菌（Escherichia coli）のゲノムライブラリーから、プライマー５’−ＣＡＧＡＣＣＡＴＧＧＧＣＡＣＧＣＣＡＡＣＣＡＴＴＧＡＡＣＴＴＡＴＴＴＧＴＧ−３’（配列番号２３）及び５’−ＧＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＣＧＣＧＴＣＧＣＣＣＡＡＣＣＣＴＧ−３’（配列番号２４）を用いてＰＣＲにより増幅した後、制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩにより制限処理し、同じく制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩにより制限処理したプラスミドｐＣＤＦ Ｄｕｅｔ−１（Novagen）に対して、ＤＮＡライゲーションキットLigation High Ver.2（東洋紡社製）を用いて連結し、ｐＣＤＦ Ｄｕｅｔ−１−ｎｆｓＡを作製した。得られたｐＣＤＦ Ｄｕｅｔ−１−ｎｆｓＡを、ヒートショックトランスフォーメンション法により大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した。得られたｎｆｓＡ産生大腸菌株を培養してｎｆｓＡを発現させた。【０１２７】
（２）ｐＣＤＦ Ｄｕｅｔ−１−ｎｆｓＢの構築及び大腸菌への導入
大腸菌（Escherichia coli）由来の酵素であるｎｆｓＢ（アミノ酸配列を配列番号１５、塩基配列の例を配列番号１６にそれぞれ示す。）を、大腸菌（Escherichia coli）のゲノムライブラリーから、プライマー５’−ＣＡＧＡＣＣＡＴＧＧＧＣＧＡＴＡＴＣＡＴＴＴＣＴＧＴＣＧＣＣ−３’（配列番号２５）及び５’−ＧＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＡＣＴＴＣＧＧＴＴＡＡＧＧＴＧＡＴＧ−３’（配列番号２６）を用いてＰＣＲにより増幅した後、前記ｎｆｓＡの制限酵素処理と同じ制限酵素処理及びプラスミドへの連結を行い、ｐＣＤＦ Ｄｕｅｔ−１−ｎｆｓＡを作製した。得られたｐＣＤＦ Ｄｕｅｔ−１−ｎｆｓＢを、ヒートショックトランスフォーメンション法により大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した。得られたｎｆｓＢ産生大腸菌株を培養してｎｆｓＢを発現させた。【０１２８】
２．ｎｆｓＡ、及びｎｆｓＢの休止菌体反応による酵素活性の評価
前記のｎｆｓＡ及びｎｆｓＢ産生大腸菌株をそれぞれ、４０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシン硫酸塩を含む５ｍＬのＬＢ培地を用い、３００ｒｐｍで振盪しながら２８℃で１６時間前培養した。この前培養液１ｍＬを、８０ｍｇ／Ｌストレプトマイシン硫酸塩を含む１００ｍＬのＴＢ培地に植菌し、１２０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で４時間培養した後、０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加して、更に３０℃で１８時間培養した。【０１２９】
得られた菌体を含む培養液に２Ｎ ＮａＯＨを加えてｐＨ８．０に調整し、この培養液に２ｇ／Ｌの４−ニトロ桂皮酸及び終濃度２％のグリセロールを懸濁し、１２０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で１８時間反応させた。反応後、反応液上清を採取し、４−アミノ桂皮酸の定量を行った。上清を遠心管に写し、遠心分離によって回収し、前記ＨＰＬＣを用いて反応生成物を定量した。
また、対照として宿主大腸菌を用い、同様の実験を行った。【０１３０】
結果より、ｎｆｓＡ産生大腸菌株は０．２６ｇ／Ｌの４−アミノ桂皮酸に変換し、ｎｆｓＢ産生大腸菌株は０．７６ｇ／Ｌの４−アミノ桂皮酸に変換し、対照の大腸菌株は０．３２ｇ／Ｌの４−アミノ桂皮酸に変換した。ｎｆｓＡ及びｎｆｓＢによる４−ニトロ桂皮酸から４−アミノ桂皮酸への変換が進行したことが分かる。
【産業上の利用可能性】
【０１３１】
本発明は、バイオマス等のグルコースからの４−アミノ桂皮酸の合成が求められる分野において広く利用でき、産業上の有用性は高い。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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